Normes OEPP EPPO Standards

BlackwellOxford,EPPBulletin1365-2338OEPP/EPPO,33OriginalEPPODiagnostic Standards UK OEPP/EPPOArticle Publishing protocols 2003 for Ltd.Bulletin regulated pests European and Mediterranean Plant Protection Organization Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes

Diagnostic protocols for regulated pests Protocoles de diagnostic pour les organismes réglementés

PM 7/17

European and Mediterranean Plant Protection Organization 1, rue Le Nôtre, 75016 Paris, France

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246 Diagnostic protocols for regulated pests

Approval Approbation EPPO Standards are approved by EPPO Council. The date of approval Les Normes OEPP sont approuvées par le Conseil de l’OEPP. La date appears in each individual standard. In the terms of Article II of the d’approbation ﬁgure dans chaque norme. Selon les termes de l’Article IPPC, EPPO Standards are Regional Standards for the members of II de la CIPV, il s’agit de Normes régionales pour les membres de EPPO. l’OEPP.

Review Révision EPPO Standards are subject to periodic review and amendment. The Les Normes OEPP sont sujettes à des révisions et des amendements next review date for this EPPO Standard is decided by the EPPO périodiques. La prochaine date de révision de cette Norme OEPP est Working Party on Phytosanitary Regulations. décidée par le Groupe de travail pour l’étude de la réglementation phytosanitaire.

Amendment record Enregistrement des amendements Amendments will be issued as necessary, numbered and dated. The Des amendements seront préparés si nécessaire, numérotés et datés. dates of amendment appear in each individual standard (as Les dates de révision ﬁgurent (si nécessaire) dans chaque norme appropriate). individuelle.

Distribution Distribution EPPO Standards are distributed by the EPPO Secretariat to all EPPO Les Normes OEPP sont distribuées par le Secrétariat de l’OEPP à tous member governments. Copies are available to any interested person les Etats membres de l’OEPP. Des copies sont disponibles, sous certaines under particular conditions upon request to the EPPO Secretariat. conditions, auprès du Secrétariat de l’OEPP pour toute personne intéressée.

Scope Champ d’application EPPO Diagnostic Protocols for Regulated Pests are intended to be used Les protocoles de diagnostic de l’OEPP pour les organismes réglementés by National Plant Protection Organizations, in their capacity as bodies sont destinés aux Organisations Nationales de Protection des Végétaux, responsible for the application of phytosanitary measures to detect en leur qualité d’autorités responsables de l’application de mesures phyto- and identify the regulated pests of the EPPO and/or European Union sanitaires pour la détection et l’identification des organismes nuisibles lists. réglementés des listes de l’OEPP et/ou de l’Union européenne. In 1998, EPPO started a new programme to prepare diagnostic L’OEPP a initié en 1998 un nouveau programme de préparation de protocols for the regulated pests of the EPPO region (including the protocoles de diagnostic pour les organismes réglementés de la région EU). The work is conducted by the EPPO Panel on Diagnostics and OEPP (y compris l’UE). Le travail est réalisé par le Groupe d’experts other specialist Panels. The objective of the programme is to develop an OEPP sur le diagnostic et d’autres Groupes d’experts spécialisés. internationally agreed diagnostic protocol for each regulated pest. The L’objectif du programme est de développer, pour chaque organisme protocols are based on the many years of experience of EPPO experts. nuisible réglementé, un protocole de diagnostic approuvé internation- The first drafts are prepared by an assigned expert author(s). They are alement. Les protocoles reposent sur les nombreuses années d’expéri- written according to a ‘common format and content of a diagnostic ence des experts de l’OEPP. La première version d’un protocole est protocol’ agreed by the Panel on Diagnostics, modified as necessary préparée par un expert. Elle est rédigée suivant le ‘format et contenu to fit individual pests. As a general rule, the protocol recommends a communs d’un protocole de diagnostic’ approuvé par le Groupe particular means of detection or identification which is considered to d’experts sur le diagnostic, modifié, le cas échéant, dans les cas indiv- have advantages (of reliability, ease of use, etc.) over other methods. iduels. En règle générale, un protocole recommande un moyen de Other methods may also be mentioned, giving their advantages/ détection ou d’identification particulier considéré avoir des avantages disadvantages. If a method not mentioned in the protocol is used, it sur les autres (du point de vue de la fiabilité, la facilité d’utilisation, should be justified. etc.). D’autres méthodes sont parfois mentionnées, en précisant leurs avantages/inconvénients. Des justifications doivent être fournies si on utilise une méthode qui n’est pas mentionnée dans le protocole. Many protocols include laboratory tests involving the use of chem- Ces protocoles font souvent appel à des analyses de laboratoire icals or apparatus which may present a certain hazard. In all cases, local basées sur l’utilisation de produits chimiques ou d’appareils qui peu- safety procedures should be strictly followed. vent présenter un certain danger. Il est important, dans tous les cas, de suivre rigoureusement les procédures locales de sécurité. The use of names of chemicals or equipment in these EPPO Stand- L’utilisation de noms de produits chimiques ou de matériel dans ces ards implies no approval of them to the exclusion of others that may Normes OEPP n’implique aucune approbation particulière et n’exclut also be suitable. pas l’utilisation d’autres produits chimiques ou matériel adéquats.

References Références EPPO/CABI (1996) Quarantine Pests for Europe, 2nd edn. CAB Interna- EPPO/CABI (1996) Organismes de Quarantaine pour l’Europe (2ème edn). tional, Wallingford (GB). CAB International, Wallingford (GB).

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EU (2000) Council Directive 2000/29/EC of 8 May 2000 on protective CIPV (1993) Principes de Quarantaine Végétale liés au Commerce Inter- measures against the introduction into the Community of organisms national. NIMP no. 1. Secrétariat de la CIPV, FAO, Rome (IT). harmful to plants or plant products and against their spread within CIPV (1999) Glossaire des Termes Phytosanitaires. NIMP no. 5. Secrétariat the Community. Ofﬁcial Journal of the European Communities L169, de la CIPV, FAO, Rome (IT). 1Ð112. FAO (1997) Convention Internationale pour la Protection des Végétaux FAO (1997) International Plant Protection Convention (new revised text). (nouveau texte révisé). FAO, Rome (IT). FAO, Rome (IT). OEPP/EPPO (1999) Normes OEPP PM 1/2(8) Listes A1 et A2 d’organismes IPPC (1993) Principles of Plant Quarantine as related to International de quarantaine de l’OEPP. In: Normes OEPP PM1 Mesures Phytosani- Trade. ISPM no. 1. ISPM Secretariat, Rome (IT). taires Générales, pp. 5Ð17. OEPP/EPPO, Paris (FR). IPPC (1999) Glossary of Phytosanitary Terms. ISPM no. 5. IPPC Secretar- UE (2000) Directive du Conseil 2000/29/EC du 8 mai 2000 concernant les iat, FAO, Rome (IT). mesures de protection contre l’introduction dans la Communauté OEPP/EPPO (1999) EPPO Standards PM 1/2(8) EPPO A1 and A2 lists of d’organismes nuisibles aux végétaux ou aux produits végétaux et contre quarantine pests. In: EPPO Standards PM1 General Phytosanitary Meas- leur propagation à l’intérieur de la Communauté. Journal Ofﬁciel des ures, pp. 5Ð17. OEPP/EPPO, Paris (FR). Communautés Européennes L169, 1Ð112.

Definitions Définitions Regulated pest: a quarantine pest or regulated non-quarantine pest. Organisme nuisible réglementé: organisme de quarantaine ou organisme réglementé non de quarantaine. Quarantine pest: a pest of potential economic importance to the area Organisme de quarantaine: organisme nuisible qui a une importance endangered thereby and not yet present there, or present but not widely potentielle pour l’économie de la zone menacée et qui n’est pas encore distributed and being officially controlled. présent dans cette zone ou bien qui y est présent mais n’y est pas largement disséminé et fait l’objet d’une lutte officielle.

Outline of requirements Vue d’ensemble EPPO Diagnostic Protocols for Regulated Pests provide all the Les protocoles de diagnostic de l’OEPP pour les organismes information necessary for a named pest to be detected and positively réglementés donnent toutes les informations nécessaires à la détection identified by a general expert (i.e. an entomologist, mycologist, et l’identification d’un organisme nuisible donné par un expert virologist, bacteriologist, etc.) but not necessarily a specialist on the généraliste (c’est à dire un entomologiste, mycologue, virologue, organism or its taxonomic group. Each protocol begins with some short bactériologiste, etc.), et pas nécessairement par un spécialiste de general information on the pest (its appearance, relationship with other l’organisme ou du groupe taxonomique. Chaque protocole débute avec organisms, host range, effects on host, geographical distribution and its de brèves informations générales sur l’organisme nuisible (aspect, identity) and then gives details on the detection, identification, relations avec d’autres organismes, gamme d’hôte, effets sur l’hôte, comparison with similar species, requirements for a positive diagnosis, répartition géographique et identité), puis donne des détails sur la list of institutes or individuals where further information on that détection, l’identification la comparaison avec des espèces similaires, organism can be obtained, references (on the diagnosis, detection/ les exigences pour un diagnostic positif, une liste d’instituts ou extraction method, test methods). d’individus susceptibles de fournir des informations supplémentaires sur cet organisme, des références (sur le diagnostic, la méthode de détection/extraction, les méthodes de test).

Existing EPPO Standards in this series Normes OEPP déjà existantes dans cette série Thirteen EPPO Standards on Diagnostic Protocols have already been Treize protocoles de diagnostic OEPP ont déjà été approuvées et approved and published. Each standard is numbered in the style PM 7/ publiées. Chaque norme est individuellement numérotée: par exemple la 4 (1), meaning an EPPO Standard on Phytosanitary Measures (PM), in norme PM 7/4 (1) est une Norme OEPP sur les mesures phytosanitaires series no. 7 (Diagnostic Protocols), in this case standard no. 4, ﬁrst (PM), appartenant à la série 7 (protocoles de diagnostic); il s’agit dans version. The existing standards are: ce cas de la Norme 4, 1ère version. Les normes existantes sont:

PP 7/1 (1) Ceratocystis fagacearum. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 31, 41Ð44 PP 7/2 (1) Tobacco ringspot nepovirus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 31, 45Ð51 PP 7/3 (1) Thrips palmi. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 31, 53Ð60 PP 7/4 (1) Bursaphelenchus xylophilus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 31, 61Ð69 PP 7/5 (1) Nacobbus aberrans. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 31, 71Ð77 PP 7/6 (1) Chrysanthemum stunt pospiviroid. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 32, 245Ð253 PP 7/7 (1) Aleurocanthus spiniferus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 32, 255Ð259 PP 7/8 (1) Aleurocanthus woglumi. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 32, 261Ð265 PP 7/9 (1) Cacoecimorpha pronubana. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 32, 267Ð275 PP 7/10 (1) Cacyreus marshalli. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 32, 277Ð279 PP 7/11 (1) Frankliniella occidentalis. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 32, 281Ð292 PP 7/12 (1) Parasaissetia nigra. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 32, 293Ð298 PP 7/13 (1) Trogoderma granarium. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 32, 299Ð310

EuropeanBlackwellOxford,EPPBulletin1365-2338OEPP/EPPO,34OriginalDiagnosticGuignardia UK OEPP/EPPOArticle Publishing citricarpaprotocols 2003 for Ltd.Bulletin regulated pests and Mediterranean Plant Protection Organization PM 7/17(1) Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes

Diagnostic protocols for regulated pests Protocoles de diagnostic pour les organismes réglementés

Guignardia citricarpa

Speciﬁc scope Champ d’application spéciﬁque This standard describes a diagnostic protocol for Guignardia Cette norme décrit un protocole de diagnostic pour Guignardia citricarpa. citricarpa.

Speciﬁc approval and amendment Approbation et amendement spéciﬁque First approved in 2002-09. Première approbation en 2002-09.

Introduction Introduction Guignardia citricarpa is a damaging pathogen on Citrus spp., Guignardia citricarpa est un pathogène important des Citrus spp. et est occurring in many areas where Citrus is cultivated including Asia, présent dans de nombreuses régions agrumicoles y compris en Asie, Australia, South America and Southern Africa (EPPO/CABI, 1997). Australie, Amérique du Sud et sud de l’Afrique (EPPO/CABI, 1997). La The disease has not been reported from Europe or North America. It maladie n’a pas été signalée en Europe ou en Amérique du Nord. Il is mainly a foliage and fruit disease, causing blemishes of the rind s’agit principalement d’une maladie du feuillage et des fruits. Les (‘black spot’) which makes the fruits unfit for the fresh-fruit market. dépréciations de la peau des fruits (‘tache noire’) les excluent du marché Heavy infection near the pedicel of the developing fruit may lead to des fruits frais. Les infections importantes à proximité du pédicelle des premature fruit drop. Losses may be substantial and costs for fruits en développement peuvent entraîner leur chute prématurée. Les chemical control can be significant. pertes peuvent être importantes, ainsi que le coût de la lutte chimique. Phytosanitary regulations cover fruits of Citrus, Fortunella, Poncirus Les réglementations phytosanitaires concernent les fruits de Citrus, and their hybrids1, other than fruits of resistant Citrus aurantium. Fortunella, Poncirus et leurs hybrides1, autres que les fruits de Citrus They should originate from countries or areas recognized to be free aurantium qui est résistant. Ils doivent provenir de pays ou de zones from ‘pathogenic strains’ of G. citricarpa or at least the orchard and reconnues exemptes de ‘souches pathogènes’ de G. citricarpa ou, au the fruits should be free from symptoms caused by ‘pathogenic minimum, le verger et les fruits doivent être exempts de symptômes causés strains’ of G. citricarpa. The regulations refer to strains of G. citricarpa par les ‘souches pathogènes’ de G. citricarpa. Les réglementations pathogenic to citrus because non-pathogenic, endophytic strains phytosanitaires se réfèrent aux souches de G. citricarpa pathogènes sur of G. citricarpa have been reported from symptomless Citrus plants Citrus, car des souches non pathogènes et endophytes de G. citricarpa as well as from host plants other than Citrus (Chiu, 1955; McOnie, ont été signalées sur des plants de Citrus ne présentant pas de symptômes 1964). These non-pathogenic strains have been considered to be ainsi que sur des plantes-hôtes autres que Citrus (Chiu, 1955; McOnie, saprophytic forms (Sutton & Waterston, 1966) or avirulent strains 1964). Ces souches non pathogènes sont considérées comme des formes of G. citricarpa (Kotzé, 2000), but McOnie (1964) considered that saprophytes (Sutton & Waterston, 1966) ou des souches non virulentes these strains belong to a distinct Guignardia species (or, perhaps, de G. citricarpa (Kotzé, 2000), mais McOnie (1964) a suggéré qu’elles variety or form). Baayen et al. (2002) have recently confirmed appartiennent peut-être à une espèce de Guignardia distincte (ou peut- the latter and have shown that such strains belong to a distinct species, être à une variété ou forme). Baayen et al. (2002) ont récemment con- Guignardia mangiferae (anamorph Phyllosticta capitalensis), a firmé cette dernière hypothèse et ont montré l’appartenance à l’espèce common endophyte in many plant families. G. mangiferae can distincte Guignardia mangiferae (anamorphe Phyllosticta capitalen- be distinguished from G. citricarpa by cultural, morphological and sis), endophyte commun sur de nombreuses familles de plantes. G. molecular characters, and has never been found associated with typical mangiferae peut être distingué de G. citricarpa par des caractères mor- black-spot symptoms (Baayen et al., 2002). G. mangiferae is also phologiques, culturaux et moléculaires, et n’a jamais été trouvé associé known as G. endophyllicola, G. psidii, Phyllosticta anacardiacearum, avec des symptômes typiques de tache noire (Baayen et al., 2002). G.

1Poncirus and its hybrids are citrus rootstocks, so that their fruits are not 1Poncirus et ses hybrides sont des porte-greffe, et leurs fruits ne sont in practice traded. pas commercialisés.

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and P. theacearum, all of which are junior synonyms of the same mangiferae est également connu sous les noms suivants: G. endophyl- fungus. licola, G. psidii, Phyllosticta anacardiacearum et P. theacearum (tous synonymes du même champignon). This protocol is designed for the diagnosis of the citrus black-spot Ce protocole est destiné au diagnostic de G. citricarpa, distinct fungus, G. citricarpa proper, as distinct from the harmless but morpho- de l’espèce inoffensive mais morphologiquement semblable G. logically similar species G. mangiferae, previously referred to as ‘non- mangiferae, précédemment appelée ‘souche non pathogène de pathogenic strains of G. citricarpa’. G. citricarpa’.

Identity Identité Name: Guignardia citricarpa Kiely Nom: Guignardia citricarpa Kiely Anamorph: Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Van der Aa Anamorphe: Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Van der Aa Synonyms: Phoma citricarpa McAlpine Synonymes: Phoma citricarpa McAlpine Phyllostictina citricarpa (McAlpine) Petrak Phyllostictina citricarpa (McAlpine) Petrak Synanamorph: Leptodothiorella sp. Synanamorphe: Leptodothiorella sp. Taxonomic position: Fungi: Ascomycota: Dothideales Classement taxonomique: Fungi: Ascomycota: Dothideales Bayer computer code: GUIGCI Code informatique Bayer: GUIGCI Phytosanitary categorization: EPPO A1 list no. 194, EU Annex Catégorisation phytosanitaire: Liste A1 de l’OEPP no. 194; designation II/A1 (strains pathogenic to citrus). Désignation Annexe UE II/A1 (souches pathogènes aux Citrus).

Detection Détection

Disease symptoms on fruits Symptômes de maladie sur les fruits Fruit symptoms vary to such an extent that confusion exists regarding Les symptômes sur les fruits varient tellement que leurs their characteristics and description (Schüepp, 1961; Kotzé, 2000). The caractéristiques et leur description ne sont pas claires (Schüepp, 1961; various types overlap, and the names used to indicate symptom types Kotzé, 2000). Les différents types de symptômes se recoupent, et les are not consistent. Symptoms are known as hard spot, shot-hole spot, noms utilisés pour les désigner ne sont pas cohérents. Les symptômes false melanose, speckled blotch, freckle spot, virulent spot (described sont décrits sous la forme de ‘tache dure’, ‘tache criblée’, ‘fausse below), or types A, B, C, and D lesions (not described here). Three main mélanose’, ‘moucheture’, ‘tache de rousseur’, ‘tache virulente’ (décrits types exist. ci-dessous), ou de lésions de type A, B, C et D (qui ne sont pas décrites ici). Trois types principaux existent. Hard spot/shot-hole spot: shallow lesions with a small central grey Tache dure/tache criblée: lésions peu profondes, de 3Ð10 mm de diamètre, to tan crater usually with a dark brown rim, 3Ð10 mm in diameter avec un petit cratère central gris à marron normalement délimité par (Fig. 1A,C,G). This symptom usually appears after the fruit has started une bordure brun foncé (Fig. 1A,C,G). Ces symptômes apparaissent to turn orange or yellow. Often, but not always, pycnidia can be seen généralement après que le fruit ait commencé à devenir orange ou inside the spots as tiny and slightly elevated black dots in the grey to tan jaune. Souvent, mais pas toujours, des pycnides peuvent être observées ﬁeld (Fig. 1F). A magnifying glass or dissecting microscope is needed dans les taches sous forme de petits points noirs légèrement convexes to see these clearly. dans la partie grise à marron (Fig. 1F). Une loupe ou une loupe binoculaire sont nécessaires pour les observer clairement. Freckle spot/speckled blotch/false melanose: on mature fruits, usu- Fausse mélanose/moucheture/tache de rousseur: sur les fruits mûrs, de ally after harvest, small (1Ð3 mm in diameter), slightly depressed spots petites taches (1Ð3 mm de diamètre) légèrement concaves apparaissent, appear (Fig. 1B, D, E). These spots may be grey to tan, or reddish, or généralement après la récolte (Fig. 1B,D,E). Elles peuvent être grises,

Fig. 1 Symptoms of citrus black spot, caused by Guignardia citricarpa on orange (Citrus sinensis) and lemon (C. limon) fruits. (A) Orange fruit with severe black spot symptoms (the lesions are of the hard-spot type, except for those on the middle and right hand oranges which are beginning to spread, i.e. virulent spot). (B) Lemon fruit with predominantly freckle-spot lesions (the larger lesions contain pycnidia). (C) Orange fruit with freckle and hard- spot lesions. (D and E) Freckle-spot symptoms on orange and lemon fruits (spots are always depressed in the peel, and may be concolorous with the healthy peel Ð left hand lesions in D and E Ð or have a dark brown rim Ð other lesions). (F) Lesions with pycnidia from orange fruits. (G) Hard-spot lesions from orange fruits (pycnidia may or may not be present inside the lesions). (H) Virulent spot on orange fruit (pycnidia are present in some areas). Symptômes de la maladie de la tache noire, causée par Guignardia citricarpa sur orange (Citrus sinensis) et citron (C. limon). (A) Oranges avec des symptômes sévères de tache noire (les lésions sont de type tache dure, sauf pour les lésions des oranges du centre et de droite qui commencent à se disséminer, c’est-à-dire tache virulente). (B) Citron avec des lésions de type tache de rousseur dominantes (les lésions les plus grandes contiennent des pycnides du champignon). (C) Oranges avec des lésions de tache de rousseur et de tache dure. (D and E) Symptômes de type tache de rousseur sur orange et citrons (les taches sont toujours concaves et peuvent être de la même couleur que la peau saine-lésions de gauche, D et E Ð ou avoir une bordure brun foncé – autres lésions. (F) Lésions avec pycnides sur oranges. (G) Lésions de type tache dure sur orange (pycnides présentes, ou non, à l’intérieur des lésions). (H) Tache virulente sur orange (pycnides présentes à certains endroits). (A) Courtesy P. Barkley, copyright Biological and Chemical Research Institute, Rydalmere (AU); (B) courtesy and copyright Centrum voor Landbouwkundig Onderzoek, Merelbeke (BE); (CÐG) courtesy and copyright Plant Protection Service, Wageningen (NL).

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274 Guignardia citricarpa

brownish, or not discoloured at all. Often, but not always, they have a marron, rougeâtres, brunâtres ou être de la même couleur que la partie dark red or brown rim. Pycnidia are only incidentally present in freckle saine. Elles ont souvent, mais pas toujours, une bordure rouge foncé ou spot lesions (Fig. 1A). Freckle spots often occur as satellite spots brune. Exceptionnellement, des pycnides sont présentes dans les taches around hard-spot lesions. Many intermediates occur between these de rousseur (Fig. 1A), qui sont souvent situées autour des taches dures. spots and the previous type. De nombreux intermédiaires existent entre ces taches et le type de symptômes précédent. Virulent lesions: spots may coalesce to form ‘virulent’ spots (Fig. 1H Lésions virulentes: les taches peuvent fusionner pour former des and the right hand orange lesion in Fig. 1A). This is the most damaging taches virulentes (Fig. 1H et la lésion sur orange à droite sur la form because it extends deeply into the peel. Spots turn brown to black, Fig. 1A). Il s’agit de la forme qui cause le plus de dégâts car elle s’étend develop a leathery texture and may cover the entire fruit. profondément dans la peau. Les taches deviennent brunes à noires, développent une texture qui ressemble à du cuir et couvrent parfois l’ensemble du fruit.

Disease symptoms on leaves and twigs Symptômes de maladie sur les feuilles et les rameaux Symptoms ﬁrst appear on mature leaves and petioles as tiny circular red Les symptômes apparaissent d’abord sur les feuilles matures et les to red-brown spots, visible on both leaf surfaces. With time, the centres pétioles sous forme de minuscules taches circulaires rouge à rouge- of the spots darken with an even darker brown to black ring. Spots brun, visibles aux deux faces des feuilles. Avec le temps, le centre des remain small, not exceeding 3 mm. Leaf lesions often have yellow taches s’assombrit et elles s’entourent d’un anneau encore plus foncé, halos. brun à noir. Les taches restent petites et ne dépassent pas 3 mm. Sur les feuilles, les lésions ont souvent des halos jaunes.

Identiﬁcation Identiﬁcation

Procedures Procédures The diagnostic procedure for G. citricarpa depends on the material that La procédure de diagnostic pour G. citricarpa dépend du matériel à is to be examined. Plants for planting of Citrus, Fortunella, Poncirus examiner. Les végétaux destinés à la plantation de Citrus, Fortunella, and their hybrids, and also detached leaves or twigs, should be Poncirus et leurs hybrides, ainsi que des feuilles détachées ou de examined by procedure A (below). Spread of G. citricarpa to rameaux, doivent être examinés par la procédure A (ci-dessous). La continents previously free from the disease is assumed to have taken dissémination de G. citricarpa vers des continents précédemment exempts place mainly through infected plants for planting (nursery stock and de la maladie s’est sûrement produite à cause de matériel de pépinière other plant material, e.g. for botanical gardens), rather than through infecté, ou autre matériel végétal (par ex. destiné aux jardins botaniques), infected fruits. Indeed, most EPPO countries prohibit the import of plutôt que par des fruits infectés. En fait, la plupart des pays OEPP plants for planting of these genera from most origins, so procedure A interdisent l’importation de végétaux destinés à la plantation de ces mostly in practice refers to material detained in quarantine. Fruits genres de la plupart des origines, et la procédure A concerne en pratique should be examined by procedures B or C when carrying black spot surtout du matériel détenu en quarantaine. Les fruits doivent être symptoms indicative of G. citricarpa (hard spot, freckle spot or virulent examinés par les procédures B ou C lorsqu’ils portent des symptômes spot). If pycnidia are present, procedure B should be used and if not de tache noire indicatifs de G. citricarpa (tache dure, fausse mélanose procedure C. ou lésions virulentes). Si des pycnides sont présentes, la procédure B doit être utilisée. Dans le cas contraire, utiliser la procédure C.

Procedure A Procédure A Leaves and twigs should be cultured on appropriate media. The cultures Mettre en culture des feuilles et des rameaux sur un milieu approprié. obtained should be identified using classical means (growth rate, Identifier les cultures obtenues, à l’aide de méthodes classiques (taux de pigment production, size and shape of the conidia, thickness of the croissance, production de pigment, taille et forme des conidies, conidial sheath) or PCR testing according to the methods given below. épaisseur de l’enveloppe conidienne) ou de la PCR, selon les méthodes Classical identification of Guignardia-like cultures requires 7Ð14 days, décrites ci-dessous. L’identification classique des cultures pouvant and is possible as soon as mature pycnidia have been produced. être Guignardia demande 7–14 jours et elle est possible dès que des Cultures of G. citricarpa produce the characteristic conidia, grow pycnides mûres ont été produites. Les cultures de G. citricarpa slowly on cherry agar, and produce a yellow pigment on oatmeal produisent des conidies caractéristiques, se développent lentement agar (details on growth and morphology are given below under sur gélose de cerise, et produisent un pigment jaune sur gélose d’avoine ‘Identification methods’). Guignardia-like cultures that do not produce (des détails sur la croissance et la morphologie sont donnés ci-dessous mature pycnidia within 14 days or do not fulfil the other requirements sous ‘méthodes d’identification’). Les cultures pouvant être Guignardia should be further analysed by PCR testing. mais qui ne produisent pas de pycnides mûres en 14 jours ou ne remplissent pas les autres exigences doivent être analysées par PCR.

Procedure B Procédure B Microscopical preparations should be made from the pycnidia to ensure Des préparations microscopiques des pycnides doivent être préparées that the structures seen are G. citricarpa. Acervuli of Colletotrichum pour s’assurer que les structures observées sont celles de G. citricarpa. gloeosporioides and C. acutatum, anamorphs of two fungi that are Les acervules de Colletotrichum gloeosporioides et C. acutatum,

commonly present in citrus peel, may look very much like pycnidia. anamorphes de deux champignons communs sur la peau des Citrus, Whereas these species generally live in the peel as harmless ressemblent parfois beaucoup à des pycnides. Ces espèces sont en endophytes, their acervuli may be present in lesions caused by G. général des endophytes inoffensifs de la peau, mais leurs acervuli sont citricarpa. Hyphae of non-pathogenic G. mangiferae may also be parfois présentes dans les lésions de G. citricarpa. Les hyphes de G. present in the lesions, but G. mangiferae does not produce pycnidia mangiferae (non pathogène) peuvent également être présentes dans in lesions. les lésions, mais G. mangiferae ne produit pas de pycnides dans les lésions.

Procedure C Procédure C Two methods are available for diagnosing black spot lesions without Deux méthodes peuvent être utilisées pour le diagnostic des lésions de pycnidia. The first relies on incubation for 5 days of detached lesions, G. citricarpa en l’absence de pycnides. La première utilise l’incubation cut from the peel, under conditions conducive to pycnidium formation pendant 5 jours de lésions découpées dans la peau, en conditions (Brodrick & Rabie, 1970). The fact that, in vitro, these lesions produce favorables à la formation de pycnides (Brodrick & Rabie, 1970). La pycnidia containing conidia with the size and shape of G. citricarpa présence de lésions produisant des pycnides contenant des conidies confirms that they were caused by G. citricarpa. If no lesions produce ayant la taille et la forme de celles de G. citricarpa confirme que ces pycnidia, the fruits are considered free from the pathogen. The method lésions sont dues à G. citricarpa. Les fruits sur lesquels aucune lésion will not result in false positives, but its efficacy is no more than 50%. ne produit de pycnides sont considérés exemptes du pathogène. La méthode ne produit pas de faux-positifs, mais son efficacité ne dépasse pas 50%. The second method is a direct PCR test on the lesions. The method La deuxième méthode est un test de PCR direct sur les lésions. Elle is based on the use of ITS sequence-based primers with specificity for repose sur l’utilisation d’amorces spécifiques pour G. citricarpa basées G. citricarpa and was developed at the University of Oregon (US) and sur la séquence ITS. Cette méthode a été mise au point par l’Université Plant Research International, Wageningen (NL). It has been validated d’Oregon (US) et Plant Research International, Wageningen (NL) et at the Plant Protection Service, Wageningen (NL). The method is a été validée par le Service de protection des végétaux, Wageningen rapid (2 days), will not result in false positives and has an efficacy of (NL). La méthode est rapide (2 jours), ne produit pas de faux-positifs 90% per lesion. A reliability above 99% can easily be achieved by et a une efficacité de 90% par lésion. Une fiabilité supérieure à 99% independent testing of multiple lesions. peut être facilement obtenue par des tests indépendants sur des lésions multiples. Culturing of lesions on appropriate media followed by classical La culture de lésions sur un milieu approprié suivie de l’identifica- identification of the fungus or PCR testing is also possible. However, tion classique du champignon ou de test PCR est aussi possible. this approach is inferior to the previous two methods. Culturing and Cependant, cette approche est moins bonne que les deux méthodes classical identification will require 14 days, with an efficacy of < 10%. précédentes. La mise en culture et l’identification classique demandent Culturing followed by PCR of cultures is more time-consuming than 14 jours, avec une efficacité inférieure à 10%. La mise en culture suivie direct PCR, and no more reliable. de la PCR demande plus de temps que la PCR directe, et n’est pas plus fiable.

Isolation and culturing of the fungus Isolement et culture du champignon

Media Milieu de culture Cherry decoction agar (CHA). Simmer 1 kg of cherries (without stones Gélose de cerise (CHA): amener à ébullition 1 kg de cerises (sans and petioles) in 1 L of boiling tap water for 2 h, filter and bottle. noyaux ni queues) dans 1 L d’eau du robinet et laisser mijoter pendant Sterilize bottles for 30 min at 110 °C. Separately sterilize 0.8 L water 2 h. Filtrer et mettre en bouteilles. Stériliser 30 min à 110 °C. Stériliser and 20 g Technical agar no. 3 at 121 °C for 15 min, add 0.2 L of the séparément 0,8 L d’eau et 20 g de gélose technique no. 3 à 121 °C above cherry extract and mix well (pH 4.5), and resterilize for 5 min at pendant 15 min, ajouter 0,2 L de l’extrait de cerise ci-dessus, bien 102 °C. mélanger (pH 4,5), et stériliser à nouveau pendant 5 min à 102 °C. Potato dextrose agar (PDA). Commercially available (Difco). Gélose de pomme de terre-dextrose (PDA): commercialisée (Difco). Oatmeal agar (OA). Wrap 30 g oatmeal flakes in cloth and hang in pan Gélose d’avoine (OA): envelopper 30 g de flocons d’avoine dans un of tap water; bring to the boil and simmer for 2 h; squeeze and filter linge et suspendre dans une casserole d’eau du robinet; amener à through cloth. Sterilize 15 min at 121 °C. Add 20 g Technical Agar no. ébullition et laisser mijoter pendant 2 h; presser et filtrer à travers le 3 to 1 L of the oatmeal extract and sterilize 15 min at 121 °C. linge. Stériliser pendant 15 min à 121 °C. Ajouter 20 g de gélose technique no. 3 à 1 L de l’extrait d’avoine et stériliser pendant 15 min à 121 °C.

Isolation Isolement Plant material (leaves, twigs) should be surface-disinfected with 50% Le matériel végétal (feuilles, rameaux) doit être désinfecté en surface ethanol or 1% sodium hypochlorite for 0.5 min, then dissected and avec de l’éthanol à 50% ou de l’hypochlorite de sodium à 1% pendant aseptically placed on the isolation medium. Isolations should be made 0,5 min, puis être disséqué et placé en conditions aseptiques sur le on cherry decoction agar (CHA), a medium on which pycnidia are milieu d’isolement. Les isolements doivent être réalisés sur gélose de readily formed, or PDA amended with 50 µg mL−1 penicillin and cerise (CHA), milieu sur lequel les pycnides sont facilement formées, 50 µg mL−1 streptomycin. Slow-growing, dark cultures possibly ou sur gélose de pomme de terre-dextrose à laquelle on rajoute de la representing Guignardia citricarpa should be transferred to CHA for pénicilline pour une concentration ﬁnale de 50 µg mL−1 et de la

growth-rate testing, and to OA for evaluating pigment production. The streptomycine pour une concentration ﬁnale de 50 µg mL−1. Les cultures original cultures should be placed under near-UV to induce sporulation sombres à croissance lente pouvant être Guignardia citricarpa doivent at 22 °C. être transférées sur CHA pour un test du taux de croissance, et sur OA pour évaluer la production de pigments. Les cultures initiales doivent être exposées aux UV proches pour induire la sporulation à 22 °C.

Incubation of lesions for stimulating pycnidium formation Incubation de lésions pour stimuler la formation des pycnides Fruits are disinfected with a tissue drenched in 1% sodium Désinfecter les fruits avec du papier absorbant trempé dans de hypochlorite, washed thoroughly with tap water and dried. Parts of l’hypochlorite de sodium à 1%, les laver soigneusement à l’eau du the peel carrying black spot lesions without pycnidia are removed robinet et les sécher. Les parties de la peau portant des lésions sans with a cork borer (7 mm diameter) or a scalpel blade, and placed pycnides sont prélevées avec une tarière à écorce (7 mm de diamètre) aseptically in 9-cm-diameter Petri dishes with wet ﬁlter paper at the ou une lame de scalpel, et placées en conditions aseptiques dans des bottom. The Petri dishes are kept moist and are incubated under boites de Petri de 9 cm de diamètre tapissées d’un papier ﬁltre humide. continuous illumination for 5 days at 27 °C. After 5 days, lesions are Les boites de Petri sont gardées humides et incubées sous lumière examined for the presence of pycnidia of G. citricarpa (examine a continue pendant 5 jours à 27 °C. Après 5 jours, les lésions sont slide preparation under the microscope). When available, 40 lesions examinées pour la présence de pycnides de G. citricarpa (examiner une should be tested. préparation au microscope). 40 lésions doivent être testées (si elles sont présentes).

Examination of cultured isolates Examen des isolats en culture After 14 days, pycnidia should have formed and a watery squash Après 14 jours, les pycnides se sont formées et une préparation aqueuse preparation of the pycnidium (or the conidial slime oozing from it) des pycnides (ou des exsudats conidiens qui en sortent) est examinée au should be examined under the microscope. Cultures are identified as G. microscope. Les cultures sont identifiées comme étant G. citricarpa citricarpa when they produce the characteristic conidia, grow slowly lorsqu’elles produisent les conidies caractéristiques, se développent on cherry agar, and produce a yellow pigment on oatmeal agar (for lentement sur gélose de cerise et produisent un pigment jaune sur details see below). Guignardia-like cultures that do not produce ripe gélose d’avoine (voir des détails ci-dessous). Les cultures pouvant être pycnidia within 14 days or do not fulfil the other requirements should Guignardia et qui ne produisent pas de pycnides mûres en 14 jours ou be further analysed by PCR testing. Cultures should be retained on ne remplissent pas les autres exigences doivent être analysées par PCR. CHA slants in a refrigerator (4 °C) and transferred twice a year. Les cultures doivent être conservées sur milieu CHA incliné au réfrigérateur (4 °C) et repiquées deux fois par an.

Growth characteristics in culture Caractéristiques de croissance en culture Colonies grow slowly (16Ð33 mm on CHA at 22 °C in 7 days). The Les colonies se développent lentement (16Ð33 mm sur CHA à 22 °C en mycelium is submerged, dark, forming a plectenchymatous crust 7 jours). Le mycélium est immergé, sombre et forme une croûte (Fig. 2D). Stromata develop within 8 days as hard, black masses, with plectenchymateuse (Fig. 2D). Les stromas se développent en 8 jours et one to numerous conidial and spermatial cavities in the upper region. constituent des masses dures et noires, avec une ou de nombreuses Ripe pycnidia generally form in 10Ð14 days. On OA, high amounts of cavités conidiennes ou spermatiennes dans leur partie supérieure. Les a distinctive yellow pigment are produced that diffuses into the medium pycnides sont normalement mûres après 10Ð14 jours. Sur OA, de around the colony. The pigment is only weakly produced on other grandes quantités de pigment jaune caractéristique sont produites et media. diffusent dans le milieu autour de la colonie. La production de pigment est faible sur les autres milieux.

Morphology Morphologie Data on morphology of G. citricarpa varies considerably, partly Les données sur la morphologie de G. citricarpa varient because of the confusion about the identity of pathogenic and non- considérablement, en partie à cause des confusions sur l’identité des pathogenic strains. The data given below is based on Sutton & souches pathogènes et non pathogènes. Les données ci-dessous sont Waterston (1966) and van der Aa (1973), as revised and amended by tirées de Sutton & Waterston (1966) et van der Aa (1973), et ont été Baayen et al. (2002). révisées et amendées par Baayen et al. (2002). Ascocarps: perithecia exclusively formed on dead leaves, not in fruit Ascocarpes: périthèces formés exclusivement sur les feuilles mortes, or leaf lesions or on media; solitary or aggregated, globose to pyriform, et pas dans les lésions des fruits, feuilles ou milieux de culture; immersed, dark brown to black, 125Ð360 µm diameter; wall up to five solitaires ou agrégés, globuleux ou piriformes, immergés, brun sombre cells thick, sclerotioid on the outside, pseudoparenchymatous and à noir, 125Ð360 µm de diamètre; paroi jusqu’à cinq cellules thin-walled within, ostiole papillate, circular, 10Ð17.5 µm diameter. d’épaisseur, sclérotioïdes à l’extérieur, pseudoparenchymateuse et à Paraphyses and periphyses absent. paroi fine à l’intérieur, à papilles et ostioles, circulaires, 10Ð17,5 µm de diamètre. Paraphyses et périphyses absentes. Asci: clavate cylindrical, shortly stipitate, 8-spored, 40Ð65 × 12Ð Asques: claviformes cylindriques, à stipes courts, à huit spores, 40Ð 15 µm; ascus wall thick, bitunicate. 65 × 12Ð15 µm, paroi épaisse, bituniquées. Ascospores: aseptate, hyaline, multiguttulate, cylindrical but swollen in Ascospores: sans cloison, hyalines, à plusieurs guttules, cylindriques the middle, ends obtuse, each with a colourless appendage, 12.5Ð mais renflées au centre, extrémité obtuse, chacune avec un appendice 16 × 4.5Ð6.5 µm. incolore, 12,5Ð16 × 4,5Ð6,5 µm.

Fig. 2 Conidium morphology and colony characteristics after 7 days growth on various media of Guignardia citricarpa and G. mangiferae. (A) Conidia of G. citricarpa with thin mucoid sheath. (B and C) Conidia of G. mangiferae with thick mucoid sheath (C Ð differential interference contrast Ð scale bar = 10 µm). (D) Colonies of G. citricarpa growing slowly on oatmeal agar (top), malt extract agar (middle), and cherry decoction agar (bottom) and showing the yellow halo just around the colony (arrows). (E) Colonies of G. mangiferae growing faster and without yellow pigment. Morphologie conidienne et colonies après 7 jours de croissance sur différents milieux, pour Guignardia citricarpa et G. mangiferae. (A) Conidies de G. citricarpa avec une couche mucoïde ﬁne. (B and C) Conidies de G. mangiferae avec une couche mucoïde épaisse (C – contraste interférentiel différentiel DIC – échelle = 10 µm). (D) Colonies de G. citricarpa à croissance lente sur gélose d’avoine (haut), gélose de malt (milieu), et gélose de cerise (bas), et présentant un halo jaune juste autour de la colonie (ﬂèches). (E) Colonies de G. mangiferae à croissance plus rapide et sans pigment jaune. Courtesy W. van Lienden, Plant Protection Service, Wageningen (NL) (cultures); G. Verkleij, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht (NL) (conidia).

Pycnidia: formed in fruit and leaf lesions, also amphigenous on dead Pycnides: formées dans les lésions des fruits et des feuilles, également leaves, solitary, sometimes aggregated, globose, immersed, mid-to- amphigènes sur les feuilles mortes, solitaires, parfois agrégées, dark brown, 70Ð330 µm diameter, wall up to four cells thick, sclerotioid globuleuses, immergées, de couleur brun moyen à foncé, 70Ð330 µm on the outside, pseudoparenchymatous within, ostiole darker, slightly de diamètre, paroi jusqu’à quatre cellules d’épaisseur, sclérotioïde à papillate, circular, 10Ð15 µm diameter. l’extérieur, pseudoparenchymateuse à l’intérieur, ostiole plus sombre, légèrement papillé, circulaire, 10Ð15 µm de diamètre. Conidia: obovate to elliptical, hyaline, aseptate, multiguttulate, apex Conidies: obovoïdes à elliptiques, hyalines, sans cloison, à plusieurs slightly ﬂattened with a colourless subulate appendage, base truncate, guttules, apex légèrement aplati avec un appendice subulé incolore, base 9.4Ð12.7 × 5.0Ð8.5 µm, surrounded by a barely visible (< 1.5 µm caduque, 9,4Ð12,7 × 5,0Ð8,5 µm, entourées d’une couche incolore et thick) colourless gelatinous coat (Fig. 2A), formed as blastospores gélatineuse à peine visible (< 1,5 µm d’épaisseur) (Fig. 2A), formées comme from hyaline, unicellular, cylindrical conidiophores up to 9 µm long. blastospores sur des conidiophores hyalins, unicellulaires, cylindriques Conidia and the conidial sheath are best studied in slide preparations et mesurant jusqu’à 9 µm de longueur. Les conidies et leurs enveloppes using a microscope equipped with differential interference contrast or, sont étudiées de préférence avec un microscope équipé de contraste preferentially, using Indian Black ink, in which the sheath will be lucent interférentiel différentiel (DIC) ou, de préférence, à l’aide d’encre de against a black background. Chine noire, dans laquelle la couche externe sera brillante sur un fond noir. Spermatial state: in the form-genus Leptodothiorella; formed both in Stade spermatien: du type Leptodothiorella; formés en culture pure et pure culture and on the host; spermatia dumbbell-shaped, seldom sur l’hôte; spermaties en forme d’haltères (rarement cylindriques), cylindrical, straight or slightly curved, 5Ð8 × 0.5Ð1 µm. droites ou légèrement incurvées, 5–8 × 0,5Ð1 µm.

PCR testing Test de PCR Primers: a primer pair (GCF3ÐGCR7) has been developed by G. C. Amorces: une paire d’amorces (GCF3–GCR7) a été élaborée par G. C. Carroll (University of Oregon, US) and P. J. M. Bonants (Plant Carroll (Université d’Oregon, US) et P. J. M. Bonants (Plant Research Research International, Wageningen, NL) for the detection of G. International, Wageningen, NL) pour la détection de G. citricarpa par citricarpa by the polymerase chain reaction (PCR)1. This test PCR1. Ce test permet de distinguer G. citricarpa de l’endophyte differentiates G. citricarpa from the common citrus endophyte, G. commun des citrus G. mangiferae et des autres espèces de Guignardia, mangiferae, and other species of Guignardia, Phyllosticta, and other Phyllosticta et autres champignons présents sur les fruits de fungi occurring on citrus fruits. The protocol has been validated on a Citrus. Le protocole a été validé sur une vaste collection mondiale des large, worldwide culture collection of both Guignardia species, and can deux espèces de Guignardia, et peut être appliqué directement sur les be directly performed on lesions. No more than two lesions should be lésions. Deux lésions au plus doivent être extraites et amplifiées pour extracted and amplified per Eppendorf vial. The primer sequences are chaque microtube de type Eppendorf. Les séquences des amorces GCF3: 5′-AAAAAGCCGCCCGACCTACCT-3′ and GCR7: 5′- sont GCF3: 5′-AAAAAGCCGCCCGACCTACCT-3′ et GCR7: 5′- TGTCCGGCGGCCAG-3′. TGTCCGGCGGCCAG-3′. DNA extraction: for testing pure cultures of the fungus, DNA should Extraction de l’ADN: pour le test des cultures pures, l’ADN fongique be extracted using appropriate methods (e.g. Baayen et al., 2002). For doit être extrait à l’aide de méthodes appropriées (par ex. Baayen et al., testing symptomatic fruits, lesions are dissected from the peel, and 2002). Pour le test des fruits présentant des symptômes, des lésions sont placed in 1.5 mL Eppendorf vials with sand in 300 µL cell lysis solu- prélevées sur la peau, et mises dans des microtubes de 1,5 mL avec du tion (Puregene-kit Gentra/Biozym). 1.5 µL Proteinase K (20 mg mL−1) sable dans 300 µL d’une solution de lyse cellulaire (Puregene-kit is added, the mixture is incubated at 55 °C for 1.5 h, and cooled Gentra/Biozym). 1,5 µL de Proteinase K (20 mg mL−1) sont ajoutés, down to room temperature. 100 µL protein precipitation solution le mélange est incubé à 55 °C pendant 1,5 h et refroidi à température (Puregene-kit Gentra/Biozym) is added, the mixture is vortexed for ambiante. 100 µL d’une solution de précipitation protéique (Puregene- 20 s, kept on ice for 5 min, centrifuged at 14 000 rev min−1 for 3 min, kit Gentra/Biozym) sont ajoutés, le mélange est agité au vortex and the supernatant transferred to a clean Eppendorf vial, mixed with pendant 20 s, conservé sur glace pendant 5 min et centrifugé à 14 000 300 µL isopropanol, and centrifuged at 14 000 rev min−1 for 5 min. The rev min−1 pendant 3 min. Le surnageant est transféré dans un microtube pellet is washed with 70% ethanol, dried, suspended in 20 µL TE buffer de 1,5 mL stérile, mélangé à 300 µL d’isopropanol et centrifugé à (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, pH 8.0), 1 µL RNAse (4 mg mL−1) is 14 000 rev min−1 pendant 5 min. Le dépôt est lavé avec de l’éthanol à added, and the mixture is incubated at 37 °C for 30 min. The volume is 70%, séché et mis en suspension dans 20 µL de tampon TE (10 mm made up to 50 µL with TE buffer, and purified over a spin column Tris-HCl, 1 mm EDTA, pH 8.0). 1 µL d’ARNse (4 mg mL−1) est (Bio-Rad) filled with PVPP (Sigma). ajouté et le mélange est incubé à 37 °C pendant 30 min. Le volume est complété à 50 µL avec du tampon TE et purifié dans une colonne Spin (Bio-Rad) remplie de PVPP (Sigma). Amplification and analysis: the reaction mixture should contain 5 µL Amplification et analyse: le mélange réactionnel contient: 5 µL de DNA suspension; 2.5 µL of 10× concentrated reaction buffer contain- suspension d’ADN; 2,5 µL de tampon de réaction 10× contenant µ µ µ µ ′ µ µ ing 1.5 mm MgCl2; 1.5 L 1 mm dNTPs; 0.25 L of a 60- m solution 1,5 mm MgCl2; 1,5 L d 1 mm dNTPs; 0,25 L d’une solution de 60 m of each primer; 0.25 µL internal control; 0.2 µL Taq DNA polymerase de chaque amorce; 0,25 µL de témoin interne; 0,2 µL de polymérase (5 U µL−1; Roche); MilliQ water to final volume of 25 µL). The internal Taq (5 U µL−1; Roche); 15,05 µL d’eau MilliQ (volume final 25 µL). control, developed from heterologous Lolium perenne DNA, is available Le témoin interne, développé à partir de d’ADN de Lolium perenne upon request from P. J. M. Bonants (Plant Research International, hétérologue, est disponible sur demande auprès de P. J. M. Bonants (Plant Wageningen, NL; for address see below); amplification of 10 pg of Research International, Wageningen, NL; voir l’adresse ci-dessous); the internal standard with the primer pair GCF3ÐGCR7 will generate a l’amplification de 10 pg du témoin interne avec la paire d’amorces 230-bp amplicon. Amplification is performed in thin-walled PCR tubes GCF3–GCR7 génère un amplicon de 230 pb. L’amplification doit être in a DNA thermal cycler with heated lid, programmed as follows: 1 réalisée dans des tubes de PCR à paroi fine dans un thermocycleur à cycle for 2 min at 94 °C followed by 30 cycles for 30 s at 94 °C, 30 s at couvercle chauffant, programmé ainsi: un cycle de 2 min à 94 °C, suivi 65 °C, and 60 s at 72 °C. One cycle for 10 min at 72 °C should be de 30 cycles de 30 s à 94 °C, 30 s à 65 °C et 60 s à 72 °C, et enfin un conducted after the 30 cycles. After amplification, 10 µL of the reaction cycle de 10 min à 72 °C. Après l’amplification, 10 µL du mélange de mixture is loaded onto a 1.0% agarose gel in 0.5× TBE buffer, separated réaction sont mis sur un gel d’agarose à 1,0% dans un tampon TE 0,5×, by electrophoresis, stained with ethidium bromide, and viewed and soumis à électrophorèse, colorés au bromure d’éthidium, et observés et photographed under UV light. A negative control (no DNA target) photographiés sous UV. Un témoin négatif (sans ADN cible) doit être should be included in every experiment to test for contamination as well inclus dans chaque expérience pour tester la contamination, ainsi qu’un as a positive control (DNA from a reference strain of the pathogen). témoin positif (ADN d’une souche de référence du pathogène).

1The Citrus Black Spot pathogen primers and their use in diagnostic 1Le(s) amorce(s) de G. citricarpa et leur utilisation dans des tests de assays are the subject of an international patent application by the diagnostic sont soumises à l’application d’un brevet international par University of Oregon. No express or implied rights for their use are l’Université d’Oregon. Cette publication ne donne aucun droit explicite provided under any patent applications, trade secrets or other ou implicite pour l’utilisation de ce brevet. Les personnes souhaitant proprietary rights via this publication. Those desiring to use or license utiliser ou acquérir une licence des droits de brevet sont invitées à the patent rights are asked to contact the University of Oregon to contacter l’Université d’Oregon: Ofﬁce of Technology Transfer, 1238 request permission to do so at the following address: Ofﬁce of University of Oregon, Eugene, OR 97403, USA (or e-mail: Technology Transfer, 1238 University of Oregon, Eugene, OR 97403, [email protected]). USA (or e-mail: [email protected]).

The positive control, but not the negative control, should yield an Le témoin positif, mais pas le témoin négatif, doit produire un ampli- amplicon of 490 bp. Strains yielding an amplicon of this size can be con de 490 pb. Les souches produisant un amplicon de cette taille sont identiﬁed as G. citricarpa. Samples not yielding such an amplicon can identiﬁées comme étant G. citricarpa. Les échantillons ne produisant be considered negative for G. citricarpa only when the 230 bp internal pas d’amplicon de cette taille peuvent être considérés négatifs pour G. standard amplicon was properly produced. citricarpa seulement si l’amplicon de 230 pb du témoin interne a été correctement produit.

Comparison with similar species Comparaison avec des espèces similaires Lesions caused by G. citricarpa can be very similar to those caused by Les lésions causées par G. citricarpa peuvent être très similaires à Alternaria alternata pv. citri, Colletotrichum spp., Diaporthe citri, celles d’Alternaria alternata pv. citri, Colletotrichum spp., Diaporthe Mycosphaerella citri, Septoria spp., mechanical and insect damage citri, Mycosphaerella citri, Septoria spp., ainsi qu’à des dégâts (Snowdon, 1990). In particular, Alternaria alternata pv. citri and mécaniques ou d’insectes (Snowdon, 1990). Alternaria alternata Colletotrichum spp. may cause small, sharply black-rimmed, depressed pv. citri et Colletotrichum spp., en particulier, peuvent provoquer de lesions that are closely similar to tiny black-spot lesions. By themselves, petites lésions concaves nettement délimitées de noir et ressemblant symptoms are not always sufficiently distinctive. It follows that beaucoup à des petites lésions de la maladie des taches noires. Les diagnosis relies either on culturing the fungus (or incubation of lesions) symptômes ne sont donc pas toujours suffisamment distinctifs en followed by classical identification of the fungus, or on direct PCR eux-mêmes. Par conséquent, le diagnostic repose soit sur la culture du testing of the lesion. champignon (ou l’incubation des lésions) suivie de l’identification classique, soit sur le test de PCR direct des lésions. In pure culture, G. citricarpa (Fig. 2D) closely resembles the com- En culture pure, G. citricarpa (Fig. 2D) ressemble fortement à mon citrus endophyte G. mangiferae (Fig. 2E). PCR testing according l’endophyte commun des agrumes G. mangiferae (Fig. 2E). Le test de to the present protocol will produce a 490-bp amplicon only with G. cit- PCR du présent protocole produit un amplicon de 490 pb seulement ricarpa. Classical identification is possible by combining pigmentation avec G. citricarpa. L’identification classique est possible en combinant on OA (a yellow pigment is produced by most strains of G. citricarpa la pigmentation sur OA (pigment jaune produit par la plupart des but not by G. mangiferae), growth rate on CHA (G. citricarpa < 35 mm souches de G. citricarpa, et pas par G. mangiferae), le taux de diameter in 7 days on CHA; G. mangiferae generally > 40 mm diame- croissance sur CHA (G. citricarpa < 35 mm de diamètre en 7 jours; G. ter although the range of the latter overlaps with that of G. citricarpa), mangiferae généralement > 40 mm de diamètre en 7 jours bien que ce and thickness of the mucoid conidial sheath [< 1.5 µm in G. citricarpa taux recoupe parfois celui de G. citricarpa), et l’épaisseur de la couche (Fig. 2A); > 1.5 µm in G. mangiferae (Fig. 2B,C)]. Upon prolonged mucoïde conidienne [< 1,5 µm chez G. citricarpa (Fig. 2A); > 1,5 µm culturing, only G. mangiferae will produce perithecia. chez G. mangiferae (Fig. 2B,C)]. En cas de culture prolongée, seul G. mangiferae produit des périthèces.

Reference cultures Cultures de référence Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, the Netherlands. Fax +31 30 251 2097. CT Utrecht, Netherlands. Fax +31 30 251 2097.

Requirements for a positive identification Exigences pour une identification positive The procedures for diagnosis and identification described in this Les procédures de détection et d’identification décrites dans ce protocol should have been followed. protocole doivent avoir été suivies. The fungus should have been identified unambiguously through the Le champignon doit avoir été identifié sans ambiguïté par la présence presence of pycnidia with the characteristic conidia inside the lesions, dans les lésions de pycnides et conidies caractéristiques, ou par la mise or through culturing and classical morphology, or through PCR testing. en culture et la morphologie classique, ou par PCR. The disease symptoms, growth characteristics and morphology of Les symptômes de maladie, les caractéristiques de croissance et de the fungus, and/or PCR amplicon produced should be in accordance morphologie du champignon et les amplicons de PCR produits doivent with the descriptions in the protocol. In the case of PCR testing, the pos- être conformes aux descriptions données dans ce protocole. Dans le cas itive but not the negative control should have produced a 490-bp ampli- des tests de PCR, le témoin positif (mais pas le témoin négatif) doivent con, and the internal standard should have produced an 230-bp avoir produit un amplicon de 490 pb, et le témoin interne doit avoir pro- amplicon. duit un amplicon de 230 pb.

Report on the diagnosis Rapport sur le diagnostic A report on the execution of the protocol should include: Le rapport sur la mise en oeuvre du protocole doit comporter: • information on the origin of the infected material; • des informations sur l’origine du matériel infecté; • an indication of the magnitude of the infection (how many fruits, • l’étendue de l’infection (nombre de fruits, feuilles ou rameaux leaves or twigs were infected); infectés); • a description of the disease symptoms (preferably including photo- • une description des symptômes de maladie (de préférence avec des graphs), showing whether or not pycnidia and conidia were present photographies), montrant la présence ou l’absence de pycnides et de inside these; conidies dans les lésions;

• if pycnidia and conidia were not present inside lesions, an indication • s’il n’y a pas de pycnides et de conidies dans les lésions, des préci- of the method followed for diagnosis; sions sur la méthode utilisée pour le diagnostic; • if the fungus was cultured, a description of the growth characteristics • si le champignon a été mis en culture, une description des caractéris- and sporulation of the fungus in vitro, and a description of the conidia tiques de croissance et de sporulation du champignon in vitro, une produced in culture, the pigmentation of the culture on OA, and the description des conidies produites en culture, de la pigmentation de growth rate on CHA (preferably including drawings or photographs); la culture sur gélose d’avoine (OA) et du taux de croissance sur gélose de cerise (CHA) (avec de préférence des dessins ou photographies); • if the lesions were incubated, a description of the pycnidia containing • si les lésions sont incubées, une description des pycnides, contenant conidia of G. citricarpa; des conidies de G. citricarpa; • if cultures, leaves, twigs or fruit lesions were PCR-tested, confirma- • si les cultures, ou les lésions sur les feuilles, rameaux ou fruits, ont tion of the PCR results, including prints of the PCR analyses; été testées par PCR, une confirmation des résultats de la PCR, y compris des impressions des analyses; • comments on the certainty or uncertainty of the identification. • des commentaires sur les certitudes ou les doutes sur l’identification. If possible, a pure culture of the pathogen should be retained. The Si possible, une culture pure du pathogène doit être conservée. Lor- examined plant material need not be retained. sque cela est possible, il n’est pas nécessaire de conserver le matériel végétal étudié. Further information/Renseignements supplémentaires Further information on this organism can be obtained from:/Des renseigne- black spot fungus, Guignardia citricarpa, identified as a cosmopolitan ments supplémentaires sur cet organisme peuvent être obtenus auprès de: endophyte of woody plants, Guignardia mangiferae (Phyllosticta capi- Mycology Section, Plant Protection Service, PO Box 9102, 6700 HC talensis). Phytopathology 92, 464Ð477. Wageningen, Netherlands (Fax +31 317 421 701; Tel. +31 317 496 111). Brodrick HT & Rabie CJ (1970) Light and temperature effects on symptom Inquiries about the availability of the PCR primers should be directed development and sporulation of Guignardia citricarpa, on Citrus sinen- to Dr Philip Loux via e-mail ([email protected]) or by mail sis. Phytophylactica 2, 157Ð164. to the Office of Technology Transfer, 1238 University of Oregon, Chiu RJ (1955) Studies on black spot of citrus. Journal of Agriculture and Eugene, OR 97403, USA (attn of Dr Philip Loux). Forestry 9, 1Ð18. EPPO/CABI (1997) Guignardia citricarpa. In: Quarantine Pests for Europe, 2nd edn, pp. 773Ð781. CAB International, Wallingford (GB). Acknowledgements/Remerciements Kotzé JM (2000) Black spot. In: Compendium of Citrus Diseases (Ed. by Timmer, LW, Garnsey, SM & Graham, JH), 2nd edn, pp. 23Ð25. APS This protocol was originally drafted by:/Ce protocole a été initialement Press, St Paul (US). préparé par McOnie KC (1964) The latent occurrence in citrus and other hosts of a Guig- R. P. Baayen, Plant Protection Service, Wageningen (Netherlands) nardia easily confused with G. citricarpa, the citrus black spot pathogen. P. J. M. Bonants, Plant Research International, PO Box 26, 6700 AA Phytopathology 54, 40Ð43. Wageningen (Netherlands) Schüepp H (1961) [Studies on Guignardia citricarpa, the agent of black G. C. Carroll, 1210 University of Oregon, Eugene, Oregon (USA) spot disease on citrus.]. Phytopathologische Zeitschrift 40, 258Ð271 (in German). Snowdon AL (1990) A Colour Atlas of Post-Harvest Diseases and Disorders References/Références of Fruits and Vegetables, Vol. I. General Introduction and Fruits. Wolfe van der Aa HA (1973) Studies in Phyllosticta. Studies in Mycology 5, 1Ð110. Scientific Ltd, London (GB). Baayen RP, Bonants PJM, Verkley G, Carroll GC, van der Aa HA, de Weerdt Sutton BC & Waterston JM (1966) Guignardia citricarpa. CMI Descrip- M, van Brouwershaven IR, Schutte GC, Maccheroni W, Glienke de tions of Pathogenic Fungi and Bacteria no. 85. CAB International, Wall- Blanco C & Azevedo JL (2002) Non-pathogenic isolates of the citrus ingford (GB).