Interacción entre Corthylus zulmae Wood y hongos ambrosiales y su relación en la muerte descendente de árboles de Alnus acuminata HBK

CARLOS MARIO OSPINA PENAGOS 98520984

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRÍA EN CIENCIAS- ENTOMOLOGÍA MEDELLÍN, COLOMBIA 2015 Interacción entre Corthylus zulmae Wood y hongos ambrosiales y su relación en la muerte descendente de árboles de Alnus acuminata HBK

Carlos Mario Ospina Penagos

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de Magister en Ciencias – Entomología.

DIRECTOR PABLO BENAVIDES MACHADO Ing. Agrónomo, Ph. D Centro Nacional de Investigaciones de Café, Cenicafé - FNC.

CODIRECTOR ADRIANA ORTIZ REYES – Zootecnista, Ph.D Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín

ASESORES

BERTHA LUCÍA CASTRO CAICEDO - Ing. Agrónomo, Msc, Ph.D. Centro Nacional de Investigaciones de Café, Cenicafé - FNC

ZULMA NANCY GIL PALACIO . Ing. Agrónomo, Ph. D. Centro Nacional de Investigaciones de Café, Cenicafé.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRÍA EN CIENCIAS – ENTOMOLOGÍA MEDELLÍN, 2015

Dedicatoria

A Inés María, mi pequeña, porque fue su tiempo, porque a pesar de no comprender lo que estaba yo haciendo, supo esperar con paciencia, con sabiduría….como si supiera que ese es el gran secreto.

A ti Adriana, porque fuiste el apoyo constante, el silencio cómplice, el regazo donde siempre quiero estar.

A ti mamá, mi primera maestra, la que me enseño que es con perseverancia que se logran las cosas, que siempre me creyó capaz, así la meta a lograr estuviera por encima de mi capacidad.

A ti papa que “dormiste” antes de que vieras este sueño hecho realidad, desde allí, desde donde estés, gracias… muchas gracias.

Agradecimientos

Al Centro Nacional de Investigaciones de Café – Cenicafé, por brindarme las condiciones logísticas y técnicas para el desarrollo del presente trabajo.

Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural - MADR, por la financiación de ésta investigación, la cual se desarrolló bajo el contrato “Proyecto 2- 2007k4 683-532.- Biología, hábitos y alternativas de control de Corthylus zulmae en plantaciones de aliso (Alnus acuminata ssp. acuminata ) en la cuenca del Río Blanco, Manizales”.

A la Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín, especialmente a los docentes de la Maestría en Ciencias- Entomología, por contribuir a mi formación profesional.

Al Dr. Pablo Benavides, porque en todos los procesos de este proyecto, particularmente los más difíciles, siempre nos estuvo acompañando y orientando.

A la Profesora Adriana Ortiz, porque siempre creyó en el proyecto y a pesar de la intermitencia en su desarrollo no decayó en su disponibilidad de orientarlo.

A la Ingeniera Zulma Nancy Gil, a quién se le debe, no solo por merecimiento si no por su curiosidad investigativa, que el insecto objeto del trabajo lleve su nombre.

A la Dra. Bertha Lucía Castro, quién nos asesoró y ayudó en este campo tan amplio y a veces complicado, de los hongos Ophiostomatoides.

A los profesores Rodrigo Vergara y Mauricio Marín; evaluadores de este trabajo, ya que sus aportes además de ser muy valiosos, ayudaron a engrandecer el documento aquí presentado.

A la empresa Aguas de Manizales especialmente a los Ingenieros Jorge Uribe Jaramillo y Carlos Enrique Restrepo, por permitirnos la realización de la investigación en sus plantaciones de aliso.

Agradecimiento especial a la Ing. Eliana Andrea Rincón y al Técnico Forestal Carlos Augusto Ramírez, quienes estuvieron en todo momento en el trabajo de campo y laboratorio.

A los compañeros del proyecto de investigación, viverista Carlos Alberto Ospina, Bióloga Adriana Cifuentes Carvajal, Ing. Mary Luz Lesmes, Ing. Alexander Godoy Bautista, Ing. Jorge Jaramillo, Técnico Freddy Alberto Sánchez, Técnico Mario López López, Ing. Natalia Aldaz.

Muchas gracias al profesor Alejandro Toro, director del laboratorio de microscopia electrónica de la Universidad Nacional - Sede Medellín y al Ing. Juan Pablo, por su buena disposición, por el interés y por la gran ayuda en el desarrollo de esta investigación

Al profesor Gonzalo Abril, inquieto siempre con estos temas, con gran disponibilidad de ayuda y dispuesto a guiarnos y asesorarnos.

1

Al colega y compañero John Alexander Pulgarín, por su asesoría y colaboración en la taxonomía de la subfamilia Scolytinae.

Al Tecnólogo Juan Carlos Ortiz, disciplina de Entomología, ya que parte del registro fotográfico aquí presentado es de su autoría, al igual que de Adriana Cifuentes Carvajal.

A la Bióloga Gloria Cecilia Camayo, por su disposición y actitud incondicional para ayudarnos en el registro de las imágenes del microscopio de contraste de fases.

Al Ing. Cristian Olaya, quién puso a disposición de la investigación su conocimiento y además nos permitió la utilización de los equipos del laboratorio de Virología del CIAT.

Al Ingeniero José David Rubio, quien nos adentró en este mundo de los insectos ambrosiales.

Al Microbiólogo Juan Carlos López Núñez, quien siempre estuvo presto a ayudarnos en cada fase del trabajo.

A la Profesora Ángela Vásquez, del laboratorio de Anatomía de la Madera, porque fue esa guía necesaria en un momento de pocas respuestas.

A la Dra. Carmenza Góngora por sus valiosos aportes en la revisión de este documento.

Al compañero y amigo Everardo de Jesús Pérez, por todo su apoyo.

A mis hermanos y sobrinos, porque son mi familia y todos y cada uno tienen algo que ver con este trabajo.

En general a todas las personas que de una u otra manera estuvieron involucrados en este trabajo.

Muchas gracias.

I

Resumen

En Colombia el aliso, Alnus acuminata H.B.K ssp acuminata , es la especie nativa más cultivada en la franja altitudinal de 1.800 a 2.800 m, en las cordilleras Central y Oriental, en ecosistemas andinos denominados “Bosques de Niebla”. Cuenta con un área reforestada de 4.930 ha. Hasta el año 2000, este cultivo se encontraba libre de plagas; sin embargo, a mediados de ese año, se registró una nueva especie para la ciencia, Corthylus zulmae Wood 2007 (Coleoptera: Curculionidae, Scolytinae), perforando troncos de árboles en la Reserva de Río Blanco, la cual surte de agua al 40% de la ciudad de Manizales. El ataque se evidenció por la presencia en el tronco de perforaciones de 2 mm, exudado en el punto de perforación, acumulación de aserrín blanquecino, marchitamiento, defoliación, formación de rebrotes basales y, en casos extremos, muerte del árbol. Esta investigación tuvo como objetivos evaluar los daños e incidencia por C. zulmae en diferentes poblaciones de aliso en el país, comprobar la presencia de estructuras de micangia en C. zulmae como condición básica para ser considerada una especie ambrosial y determinar la relación que existe entre C. zulmae , los hongos asociados y la muerte descendente de los árboles de aliso. Las hipótesis de trabajo fueron que C. zulmae se encontraba presente de manera exclusiva en la reserva Río Blanco del municipio de Manizales; que poseía micangias a través de las cuales transporta y mantiene hongos vasculares y que Ceratocystis fimbriata es transportado a través de micangias y causa la muerte en aliso. Para esto, se estableció la distribución del insecto a nivel nacional, para lo cual se muestrearon 22 reservorios naturales de aliso, donde se registró la presencia del insecto mediante un muestreo sistemático. Se realizaron fijaciones en resina Spurr de los insectos y evaluaciones de cortes de tejido en microscopio de luz. Igualmente observaciones en microscopio de barrido electrónico (SEM) y barrido ambiental (ESEM) para detectar estructuras de micangia. Finalmente, se evaluó la interacción entre el insecto C. zulmae, la especie arbórea aliso y los hongos asociados a partir de muestras de insectos, lesiones de árboles en campo y a partir de suelo circundante. Se identificaron los hongos a través de claves taxonómicas y huellas moleculares vía PCR con marcadores ITS. La primera hipótesis de trabajo fue corroborada parcialmente dado que el ataque de C. zulmae , a pesar de no ser exclusivo de la reserva Río Blanco, se limitó al departamento de Caldas, específicamente en los municipios de Manizales, Villamaría y Neira. Se identificaron micangias en las patas anteriores, en la zona pre-coxal de machos de C. zulmae , corroborando la segunda hipótesis de trabajo, lo que permite considerar a esta especie de insecto como un escarabajo ambrosial. Se identifica a Candida sp. como posible microorganismo ambrosial a partir del cual se pueden estar alimentando los estados biológicos de C. zulmae en los túneles al interior de los árboles de aliso. Las perforaciones realizadas por el insecto parecen ser usadas por hongos fitopatógenos que posteriormente ocasionan el marchitamiento y muerte de los árboles. Los hongos fitopatógenos mas comunes correspondieron a Ophiostoma sp. y Fusarium oxysporum . Ceratocystis fimbriata no fue aislado durante este estudio, lo cual no permitió corroborar la tercera hipótesis de trabajo. Se presentan los resultados preliminares de posibles hongos fitopatógenos que pueden afectar plantas de aliso a partir de hongos transportados por C. zulmae u oportunistas que penetran a los árboles a partir de las heridas causadas por el insecto.

Palabras clave: Scolytinae , Micangias, Levadura, hongos Ophiostomatoides, Pesotum sp., Fusarium oxysporum, Candida sp.

II

Abstract

Alder tree, Alnus acuminata H.B.K ssp acuminata , in Colombia, is the most cultivated native tree species, with a reforested area near 5,000 ha, that supports the matches industry. It is found at Central and East Cordilleras in the Andean “Cloud Forest”. Alder trees were free of pests until the year 2000; however, by the middle of that year, a new species for science was registered, Corthylus zulmae Wood 2007 (Coleoptera: Curculionidae), boring tree trunks at the Río Blanco forest reservation, which provides water to 40% of the population in the city of Manizales. The insect attack was evident by 2 mm holes in the trunks, an exuded, sawdust accumulation, tree decaying, basal re- growing and, in extreme cases, killing the tree. The objectives of this research were to evaluate the damages and infestation by C. zulmae in different alder tree populations throughout the country, to corroborate the presence of mycangia in C. zulmae as a basic condition to consider it as an ambrosial species and to determine the relation among C. Zulmae , associated fungi and the killing of alder trees. We hypothesized that C. zulmae was exclusive of Rio Blanco reservation at the municipality of Caldas, that this insect had mycangia that were used to maintain and transport vascular fungi that killed alder trees, and that the fungus Ceratocystis fimbriata was the plant pathogen transported and able to kill the trees. To pursue those objectives, we established the distribution of the insect at national level, sampling 22 natural alder tree reservoirs, where we registered the presence of the species through a systematic sampling procedure. Furthermore, we fixated insects in Spurr resin collected from the field in order to detect mycangia structures using light microscopy, furthermore we used microscopy SEM and ESEM; finally, we evaluated the interaction among C. zulmae, alder trees and their associated fungi, using isolates from insects, affected trees and surrounding soil samples. We identified fungi species using morphological characters and ITS molecular fingerprints. Preliminarily, we performed pathogenicity tests of some fungi strains using nursery plants. The first hypothesis was partially corroborated since, even the insect was not found exclusively in the Rio Blanco reservation and it attacked alder trees in the nearby municipalities of Manizales, Villamaría y Neira, all located at the department of Caldas. Mycangia were identified at the anterior legs of C. zulmae males, in the pre-coxal area, proving the second hypothesis that now allows considering this species as an ambrosial beetle. Candida sp. was isolated and identified as the possible ambrosia microorganism from which C. zulmae life stages might be feeding in the interior of the galleries inside alder trees. The galleries made by the insects appear to be used by plant pathogen fungi that later caused desiccation and finally kill the trees. The most common plant pathogens isolated in this research were Ophiostoma sp. and Fusarium oxysporum . Ceratocystis fimbriata was not isolated during this study, which leads to the no confirmation of the third hypothesis. Here we present preliminary information on the possible plant pathogen species that affect alder trees that were transported by C. zulmae or that penetrate the trees as opportunistic fungi using the lesions caused by the insect.

Keywords: Scolytinae , Mycangia, Yeast, Ophiostomatoid fungi, Pesotum sp., Fusarium oxysporum, Candida sp .

III

INTRODUCCIÓN 1

OBJETIVOS 3

Objetivo general 3

Objetivos específicos 3

HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN 3

CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES 4

1.1 Corthylus zulmae en Colombia 4 1.1.1. Descripción morfológica de Corthylus zulmae Wood 6

1.2. Aspectos relevantes de la relación simbiótica insecto- hongo ambrosial en la subfamilia Scolytinae (Coleoptera: Curculionidae). 8

1.3. Microorganismos asociados a las lesiones causadas por Corthylus zulmae Wood en Alnus acuminata HBK ssp. acuminata. 16 1.3.1 Hongos Ophiostomatoides 16 1.3.2 Ceratocystis fimbriata Ellis & Halsted (Microascales) y su relación con las lesiones hechas por insectos 17 1.3.3. Fusarium spp. (Hypocreales), en lesiones hechas por insectos. 20

1.4. BIBLIOGRAFÍA 21

CAPÍTULO 2. EVALUACIÓN DE DAÑO E INCIDENCIA DE Corthylus zulmae EN POBLACIONES DE ALISO EN COLOMBIA 32

2.1 INTRODUCCIÓN 32

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS 32 2.2.1. Plantaciones de aliso evaluadas. 32 Plantaciones en la cuenca de Rio blanco, Fincas La Fe y Procuenca. 32 Plantaciones de diferentes edades establecidas en otros departamentos: 32 Sistemas Agroforestales o Silvopastoriles. 33 Evaluación de incidencia de C. zulmae en diferentes zonas del país 35 2.2.2. Colecta de muestras de insectos 35 De las poblaciones de aliso, donde C. zulmae no estaba reportada 35

2.3. RESULTADOS 36 2.3.1 Evaluación de incidencia de C. zulmae en diferentes zonas del país 36

2.4. DISCUSIÓN 40

2.5. BIBLIOGRAFÍA 41 IV

CAPÍTULO 3. COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ESTRUCTURAS DE MICANGIA EN Corthylus zulmae 43

3.1 Antecedentes 43

3.2. Estructuras de micangia en insectos ambrosiales 43

3.3 MATERIALES Y MÉTODOS 44 3.3.1 Fijación de insectos en resina Spurr, para obtención de cortes histológicos 44 3.3.2 Montaje de insectos para observación de estructuras en microscopia electrónica de barrido (SEM) y de barrido ambiental (ESEM). 46 Microscopia electrónica de barrido (SEM) 46 Microscopia Electrónica de Barrido Ambiental (ESEM) 47

3.4 RESULTADOS 48 3.4.1. Fijación de insectos en resina Spurr. 48 3.4.2. Microscopia electrónica de barrido (SEM) 48 3.4.3. Microscopia Electrónica de Barrido Ambiental (ESEM) 50 3.4.4. Descripción de micangia en Corthylus zulmae Wood. 55

3.5. DISCUSION 57

3.6 BIBLIOGRAFÍA 58

CAPÍTULO 4. DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN ENTRE Corthylus zulmae , LOS HONGOS ASOCIADOS Y LA MUERTE DESCENDENTE DE LOS ÁRBOLES DE ALISO. 61

4.1. Relación entre C. zulmae y hongos ambrosiales 61 4.1.1. INTRODUCCIÓN 61

4.2 MATERIALES Y MÉTODOS 61 4.2.1. Colecta de muestras 62 Muestras de insectos 62 Muestras de madera 62 Colecta de muestras de suelo 62 4.2.2. Procesamiento de muestras de insectos 62 4.2.3. Procesamiento de muestras de madera 63 4.2.4. Procesamiento de muestras de suelo 64 4.2.5. Identificación de microorganismos. 64 Identificación taxonómica con base en caracteres morfológicos 64 Identificación a partir de PCR 65

4.3 RESULTADOS 66 4.3.1. Identificación de microorganismos asociados a las lesiones causadas por Corthylus zulmae Wood. 66 4.3.2. Identificación de hongos a partir de los insectos 70 Caracterizacion molecular de los microorganismos transportados por el insecto. 70 Caracterizacion morfológica de los microorganismos asociados a los insectos 72 Aislamientos de los microorganismos de insectos colectados en la galería. 73 V

4.3.3. Identificación de microorganismos asociados a las lesiones en la madera, causadas por C. zulmae Wood 75 Caracterizacion molecular de los microorganismos asociados. 78 Descripción morfólogica de los microorganismos asociados, por cada tipo de lesión. 80 4.3.4. Identificación de hongos a partir de muestras de suelo 89 Caracterizacion molecular de los microorganismos asociados. 90 Caracterizacion morfológica de los microorganismos asociados 91

4.4. DISCUSIÓN 92

4.5. BIBLIOGRAFÍA 94

5. CONCLUSIONES 97

A. ANEXO. EVALUACIÓN PRELIMINAR DE PATOGENICIDAD DE MICROORGANISMOS ENCONTRADOS EN LAS LESIONES HECHAS POR CORTHYLUS ZULMAE WOOD EN ALNUS ACUMINATA 98

A.1. INTRODUCCIÓN 98

A.2. MATERIALES Y MÉTODOS 98 A.2.1. Sitios de evaluación 98 A.2.2. Hongos a evaluar en las diferentes pruebas de patogenicidad 98 A.2.3. Metodología de inoculación 99 A.2.4. Análisis estadístico 101

A.3 RESULTADOS 101 A.3.1. Pruebas de patogenicidad de hongos transportados en el cuerpo de C. zulmae 101 A.3.2. Pruebas de patogenicidad de hongos encontrados en la madera afectada por acción de C. zulmae 103 A.3.3. Pruebas de patogenicidad de hongos encontrados en el suelo de plantaciones afectadas por C. zulmae 107

A.4 DISCUSIÓN 110

A.5 BIBLIOGRAFÍA 112

B. ANEXO. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN DE HONGOS ENCONTRADOS EN LAS LESIONES HECHAS POR Corthylus zulmae. 114

C. ANEXO. PROTOCOLOS DE SIEMBRA DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS DE CULTIVO. 115

D. ANEXO. PROTOCOLO DE FIJACIÓN EN RESINA SPURR. 117

E. ANEXO. PROTOCOLO DE FIJACIÓN EN RESINA SPURR (MODIFICADO). 118 VI

F. ANEXO. SOLUCIÓN CARNOY 121

G. ANEXO. ANÁLISIS DE VARIANZA DE LAS PRUEBAS DE PATOGENICIDAD REALIZADAS DE LOS AISLAMIENTOS DEL CUERPO DE LOS INSECTOS, DEL SUELO DE PLANTACIONES AFECTADAS Y DE LAS LESIONES EN MADERA. 122

LISTA DE FIGURAS

Figura 1-1: Síntomas del ataque de C. zulmae en árboles de aliso. 5 Figura 1-2: Insectos inicialmente identificados como causantes de muerte descendente en plantaciones de aliso en Manizales. 6 Figura 1-3: Estados de desarrollo de C. zulmae. . 7 Figura 1-4: Morfología de C. zulmae . a 8 Figura 1-5: a. Vista dorsal del protórax de hembra de Hypothenemus hampei , mostrando el arreglo de asperitos y setas . 15 Figura 2-1. Sitios de muestreo donde se evaluó la distribución de aliso con respecto a C. zulmae y la caracterización de ecotipos 1 y 2. 33 Figura 2-2. Especies de la subfamilia Scolytinae, encontrados en Salento, Quindío. .... 37 Figura 2-3. Daños causados por insecto barrenador del género Corthylus sp. en Duitama y Arcabuco...... 38 Figura 2-4. Plantación de aliso ubicada en el corregimiento de Obonuco, departamento de Nariño...... 38 Figura 2-5. Insecto causante de daño en las plantaciones de Aliso, en El Encano y Obonuco...... 38 Figura 2-6. Insectos causantes de daño Gigante (Huila) a. Amphicranus sp. b. Xyleborus sp. c. Hypothenemus sp. d. Corthylus sp...... 39

Figura 3-1. Protocolo de inclusión en resina Spurr (Adaptado de Mercer et al. , 1979).... 45 Figura 3- 2. Proceso de seccionamiento y tinción...... 46 Figura 3-3. Adultos de C. zulmae deshidratados cubiertos por película de oro antes de ser observados al microscopio de barrido...... 47 Figura 3-4. Corte realizado en hembra de Corthylus zulmae . a. 30X; b. Protórax antes de realizar corte en el ultramicrótomo...... 48 Figura 3-5. Resultados del Corte hecho en el protórax de la hembra de C. zulmae (5x), con coloración de azul de toluidina...... 48 Figura 3-6. Conidias de F. oxysporum en el pronoto de los machos de C. zulmae ...... 49 Figura 3-7. a- d. Transporte de uredosporas de Puccinia sp., en las maxilas de los machos de C. zulmae...... 49 Figura 3-8. Uredospora de Puccinia sp. en el prosternum de las hembras...... 50 Figura 3-9.Morfología de adultos machos de C. zulmae ...... 51 Figura 3-10. Morfología de adultos hembra de C. zulmae ...... 52 Figura 3-11. Estructuras de machos y hembras, para observación de micangias...... 53 Figura 3-12. Coxas anteriores de hembra de C. zulmae, vista ventral ...... 54 Figura 3-13. Invaginaciones presentes en las coxas anteriores en machos de C. zulmae como punto terminal de la micangia...... 55 Figura 3-14. Forma de micangia en C. zulmae ...... 57 Figura 4-1. a. Gradiente de amplificación de ITS con los cebadores ITS1/ITS4. b. Electroforesis de la purificación de ADN, duplicando el primer. 66 Figura 4-2. Siembra de insectos hembras de Corthylus zulmae en PDA...... 70 Figura 4-3. Siembra de insectos machos de C. zulmae en PDA...... 70 VII

Figura 4-4.a. Gradiente de amplificación de ITS con los cebadores ITS1/ITS4, para 7 de los aislamientos...... 72 Figura 4-5.a. Perfil de la amplificación de la PCR. Aislamientos 1 – 6: obtenidos a partir de adultos, hembras y machos de C. zulmae en medios de cultivo...... 72 Figura 4-6.Crecimiento en medio PDA de los microorganismos asociados al cuerpo de hembras de Corthylus zulmae ...... 73 Figura 4-7. Crecimiento en medio PDA de los microorganismos asociados al cuerpo de adultos machos de C. zulmae ...... 73 Figura 4-8. Aislamientos del cuerpo de adultos machos de C. zulmae creciendo en PDA ...... 74 Figura 4-9. Aislamientos del cuerpo de adultos machos de C. zulmae creciendo en PDA ...... 74 Figura 4-10: Aislamientos del cuerpo de adultos de hembras de C. zulmae creciendo en PDA ...... 74 Figura 4-11. Aislamientos del cuerpo de adultos de C. zulmae , creciendo en PDA ...... 75 Figura 4-12.Aislamientos del cuerpo de machos de C. zulmae a ...... 75 Figura 4-13. Lesión tipo 1 causada cuando C. zulmae perfora árboles de aliso...... 76 Figura 4-14. Lesión tipo 2. Detalle de la galería construida por C. zulmae ...... 77 Figura 4-15. Lesión tipo 3, coloración oscura en la galería una vez el insecto la ha abandonado...... 77 Figura 4-16. Lesión tipo 4. a - c Manchado en forma irregular, concentrado en el duramen del árbol y disperso en dirección radial...... 78 Figura 4-17. Electroforesis en gel de agarosa 1% del ADN total. Aislamientos 1 – 6: obtenidos a partir de Insectos. 7...... 79 Figura 4-18. a. Electroforesis en gel de agarosa 1% del ADN total. Aislamientos 1 – 6: obtenidos a partir de Insectos. 7 ...... 79 Figura 4-19. Muestras control de material sano, sembrado en varios medios de cultivo y observados 15 días después de la siembra a 23° C ± 2...... 80 Figura 4-20. Lesión causada por F. solani , al perforar los árboles de aliso...... 80 Figura 4-21.a. Manchado en madera por F. oxysporum, en las inmediaciones de las perforaciones ...... 81 Figura 4-22. Formación de cámara pupal de C. zulmae al interior de la galería ...... 82 Figura 4-23. Desarrollo de Candida sp., en diferentes medios de cultivo...... 83 Figura 4-24. Estructuras de reproducción de Candida sp., en EMA y SDA, aislada de galería, 12 dds, a 25°C, bajo oscuridad...... 84 Figura 4-25. Crecimiento micelial de Mucor hiemalis , en las galerías de árboles afectados...... 85 Figura 4-26. Sinemas de Pesotum sp., creciendo directamente en las galerías hechas por Corthylus zulmae, o a lo largo de las lesiones realizadas por el insecto...... 86 Figura 4-27. Crecimiento de Pesotum sp. en diferentes medios de cultivo, 12 dds, a 25°C, bajo oscuridad...... 87 Figura 4-28. Ophiostoma sp., desarrollado en galerías hechas por C. zulmae ...... 88 Figura 4-29.Aislamiento de ascomatas de Ophiostoma sp., creciendo en galería hecha por Corthylus zulmae ...... 89 Figura 4-30.“Trampeo” utilizado para aislamiento de microorganismos del suelo...... 89 Figura 4-31.a. Gradiente de amplificación de ITS con los cebadores ITS1/ITS4. b. Electroforesis de la purificación del ADN ...... 90 Figura 4-32. a. Colonia de Trichoderma sp. en PDA- 7 días después de la Siembra...... 91 Figura 4-33. Aislamientos de Fusarium oxysporum presente en el suelo de plantaciones afectadas...... 91 Figura 4-34. Crecimiento en PDA de Mucor hiemalis 18 dds ...... 92 VIII

Figura A-1. Pruebas de patogenicidad en aliso. 100 Figura A-2. Metodología de inoculación por herida, cubierta con algodón y parafilm. 101 Figura A-3. Evaluación de la patogenicidad en árboles de aliso, de los hongos transportados en el cuerpo de C. zulmae ...... 103 Figura A-4.Evaluación de la patogenicidad en árboles de aliso, de los hongos transportados en el cuerpo de C. zulmae ...... 103 Figura A-5: Resultado de la prueba de patogenicidad de los aislamientos realizados de las lesiones en madera...... 106 Figura A-6. Desarrollo de Pesotum sp., 15 dds a 25°C, bajo oscuridad...... 107 Figura A-7.Prueba de patogenicidad para microorganismos aislados del suelo ...... 109

LISTA DE TABLAS

Tabla 1-1: Insectos de la subfamilia Scolytinae con presencia de estructuras de micangia, y consideradas como plagas en especies forestales ...... 11 Tabla 1-2: Insectos de la subfamilia Scolytinae que transportan hongos en otras estructuras de su cuerpo diferentes a micangias...... 15 Tabla 1-3: Especies de Ceratocystis o sus estados anamorfos asociados con insectos descortezadores de la subfamilia Scolytinae...... 18 Tabla 2-1: Plantaciones de aliso donde se realizó la evaluación de afectación por barrenadores de la subfamilia Scolytinae. 34 Tabla 2-2: Distribución de C. zulmae asociada las diferentes poblaciones de aliso en el país...... 36 Tabla 2-3: Porcentajes de incidencia, en los sitios de muestreo, evaluados en el departamento de caldas...... 40 Tabla 4-1: Fincas en los municipios de Manizales, Villamaría y Neira, de donde fueron colectadas las muestras de Insectos, de lesiones en madera y de suelo. 61 Tabla 4-2: Microrganismos aislados de cada fuente de afectación por C. zulmae: en la madera, en el suelo o transportada por el insecto...... 67 Tabla 4-3: Aislamientos asociados al cuerpo de los insectos ...... 71 Tabla 4-4: Resultado de la secuenciación de los aislamientos hechos de los microorganismos transportados por insectos...... 71 Tabla 4-5: Resultado de la secuenciación de los aislamientos hechos de los microorganismos transportados por insectos, lesiones tipo 1 y 2...... 79 Tabla 4-6: Aislamientos asociados al suelo y fragmentos de madera sembrados en suelo, procedente de plantaciones afectadas por C. zulmae ...... 90 Tabla 4-7: Resultados de la secuenciación...... 90 Tabla A-1: Hongos a evaluar en pruebas de patogenicidad, de acuerdo a la forma de aislamiento: insecto-madera-suelo. 99 Tabla A-2: Cálculo de media y desviación estándar de las lesiones (en cm) causadas por los hongos transportados por el insecto...... 102 Tabla A-3: Cálculo de media y desviación estándar de las lesiones causadas en la madera por la acción de C. zulmae ...... 104 Tabla A-4:Análisis de varianza para las pruebas de patogenicidad de los hongos aislados de las lesiones en la madera...... 104 Tabla A-5: Cálculo de media y desviación estándar, de pruebas de patogenicidad de aislamientos obtenidos del suelo de plantaciones afectadas por C. zulmae ...... 108 Tabla A-6: Análisis de varianza para las pruebas de patogenicidad de los hongos aislados del suelo de plantaciones afectadas...... 108 IX

Lista de Símbolos y abreviaturas

Símbolo o Abreviatura Término o Definición A Adenina ADE Agua Destilada Estéril ADN Ácido Desoxirribonucleico ARN Ácido Ribonucleico ARNasa Ribonucleasa A ATP Adenosin Tri - fosfato Buffer EB Equivalente a 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 C Citosina °C Grado centígrado CaCl 2 Cloruro de Calcio cc Centímetro cúbico Cf Concentración final Ci Concentración inicial cm Centímetro CM Cuadrado Medio CP Control positivo (Reacciones PCR) CV Coeficiente de Variación dds Días después de la siembra ddi Días después de la inoculación dNTPs Desoxirribonucleótidos trifosfatos. EDTA Ácido etilendiaminotetraacético. EMA Extracto Malta Agar ESEM Microscopio Electrónico de Barrido Ambiental Fc F Calculada g Gramo G Guanina G.L Grados de Libertad. GYM Medio glucosa- Extracto de levadura ha Hectárea h Horas HCl Ácido clorhídrico ITS Secuencias Internas Transcritas K2HPO 4 Fosfato de potasio dibásico kb Kilobase, equivalente a 1000 pares de bases ADN l Litro M Molar mg Miligramo MgCl 2 Cloruro de Magnesio mL Mililitro min Minutos mm Milímetro mM Milimolar msn metros sobre el nivel del mar N Normal NaCl Cloruro de Sodio. X

Símbolo o Abreviatura Término o Definición NaOH Hidróxido de Sodio ng Nanogramo nm Nanómetro pa Pascales p/v Concentración peso a volumen pb En las reacciones de PCR, pares de bases. PCR Reacción en cadena de la polimerasa PDA Medio Papa Dextrosa Agar pH Potencial de Hidrógeno Pr. Nivel de Probabilidad PBS Solución tampón fosfato salino o Buffer fosfato salino QIAquick Kit de purificación de PCR r2 Coeficiente de determinación rADN ADN ribosomal RAPD Random Amplified Polymorphic DNA rARN ARN ribosomal RFLP Polimorfismo en longitud de fragmentos de restricción rpm Revoluciones por minuto s Segundos S.C Suma de Cuadrados SCAR Caracterización de Secuencias de regiones amplificadas SDA Sabouraud Dextrosa Agar SDS Dodecilsulfato sódico, formula (C 12 H25 NaO 4S) SEM Microscopia Electrónica de Barrido spp Designación para varias especies en el mismo taxón ssp Corresponde a la subespecie T Timina TAE Solución tampón mezcla de Tris y EDTA. Taq Polimerasa termoestable, procedente de Thermus aquaticus (bacteria). Tm Temperatura de disociación Tris (hidroximetil) aminometano, fórmula (HOCH 2)3CNH 2. U Uracilo UV Ultravioleta V Voltios v/v Concentración Volumen a Volumen var. Variedad Vf Volumen final Vi Volumen inicial Vol Volúmenes µl Microlitro µm Micrómetro µ Micra Å Angstrom

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INTRODUCCIÓN

En Colombia el aliso, Alnus acuminata H.B.K ssp acuminata , es una especie presente en las cordilleras Central y Oriental, se le encuentra conformando los ecosistema andinos conocidos como “Bosques de Niebla”. Es la especie nativa de mayor área sembrada en la franja altitudinal 1.800-2.700 m en el país, con un área reforestada de 4.930 ha, en la cual se presentan dos ecotipos; el primero de tamaño arbóreo (> a 25 m de altura) y ubicado en la cordillera Central, y el segundo, menor a 20 m de altura, con pubescencia ferrugínea, localizado en la cordillera Oriental (Restrepo y Bellefleur, 1996; Ospina et al. , 2005; Marulanda et al., 2006; Cifuentes, 2011).

Hasta el año 2000 no se tenían reportes de plagas que atacaran al aliso. Existían referencias de algunos insectos que generaban daños menores o temporales, como es el caso del picudo del aliso ( Oxydia olivata Dognin) reportado por Villegas y Bustillo (1986), y de los comedores de follaje Chalcophana sp., Diabrotrica sp. y Chaetocnema sp. (Coleoptera: Chrysomelidae) reportados por Ospina et al. , (2005). En el año 2004, Gil et al. (2004), reportaron a Corthylus zulmae Wood 2007 (Coleoptera: Curculionidae) como el principal causante del daño generado en los troncos de árboles vivos, de las plantaciones ubicadas en la Reserva de Río Blanco (Manizales, Caldas). La incidencia del ataque de C. zulmae en estas poblaciones fluctuó entre 4,7% a 30% (Granados y González, 2002) y hasta 35%, en lotes de 55 años de edad (Medina, 2003). Además de la presencia del insecto y del daño causado, la afectación se incrementó debido a la dificultad de poder realizar alguna intervención en la plantación, que permitiera reducir la incidencia ya que cualquier acción afectaría de modo directo la calidad de agua.

La Federación Nacional de Cafeteros y su Programa de Investigación Científica, a cargo de Cenicafé, ante la presencia de esta afectación en las plantaciones de aliso, ubicadas en la zona de reserva forestal de Río Blanco, inició los trabajos de evaluación de la incidencia de la plaga y la presencia de enfermedades asociadas a ésta, en unión con la Asociación de Productores Agroforestales (Agroforestal) y el proyecto forestal para la cuenca del río Chinchiná (Procuenca).

El daño se evidenció por la presencia de perforaciones en el tronco, de 2 mm de diámetro aproximadamente, un exudado que se produjo como reacción del árbol y acumulación de aserrín blanquecino en la parte inferior del orificio de entrada. Luego, se observó marchitamiento del árbol, seguido de la defoliación y de una alta formación de rebrotes basales e intermedios; en casos extremos hubo muerte del árbol (Gil et al. , 2004; Jaramillo et al. , 2011). C. zulmae ataca cualquier individuo de aliso, pero su mayor frecuencia se presenta en árboles recién caídos (por acción del viento), tocones verdes o

2 aquellos que se encuentran estresados por condiciones ambientales extremas, por “vejez”, por factores de crecimiento desfavorables o dañados como consecuencia de tormentas o de otros insectos barrenadores (Ospina et al. , 2005; Jaramillo et al. , 2011).

Al igual que muchas de las especies de escolítidos considerados como xilomicetófagos (e.d se alimentan de hongos, dentro de túneles excavados dentro de madera sana); C. zulmae está asociado con hongos en las perforaciones de entrada y en sus galerías. Los hongos al desarrollarse en el xilema producen muerte vascular, causando manchado o decoloración, debilitamiento de la madera por pudrición y pérdida de calidad.

Preliminarmente, este insecto se asoció con los hongos Fusarium spp . y Ceratocystis fimbriata (Gil et al. , 2004; Ospina et al. , 2005), los cuales debieron ser transportados mediante la adherencia de conidias al cuerpo del insecto o a través de micangias; éstas se describen como estructuras pareadas, de origen ectodérmico o invaginaciones en la cutícula del insecto, las cuales sirven para el almacenamiento, transporte y cultivo selectivo de hongos; éstos son nombrados como hongos ambrosiales (Batra, 1966; Francke - Grossman, 1967; Furniss et al. , 1987). Esta relación de tipo mutualista, entre escarabajos y algunas especies de hongos, está basada en la dependencia nutricional de los escarabajos con el hongo ambrosial (Batra, 1966), de allí su denominación de escarabajos ambrosiales. Inicialmente, los adultos construyen las galerías y allí depositan los hongos para que se establezcan; posteriormente, las hembras ovipositan en las galerías y cuidan su descendencia (Normark et al. , 1999). Cuando las larvas eclosionan el micelio es utilizado como única fuente de alimento de todos los instares larvales, hasta el estado adulto (Kuhnholz et al. , 2001; Farrell et al. , 2001 ; Hulcr et at. , 2007 ).

Los hongos simbiontes de escarabajos ambrosiales pertenecen en su mayoría a la división Ascomycota, orden Ophiostomatales, género Ophiostoma spp. Los estados anamorfos de Ophiostoma (Sordariomycetes, Ophiostomatales) son los más frecuentemente transportados por insectos ambrosiales y encontrados en galerías: Leptographium, Sporothrix , Verticicladiella y Pesotum (Kirk et al. , 2008; Cannon & Kirk, 2007). En este grupo Ascomycota, también se incluyen levaduras y ciertos hongos, catalogados como antagonistas, del género Hypocrea (Hypocreomycetidae, Hypocreaceae) o su anamorfo Trichoderma Pers. (Hanlin, 1998; Samuels, 2006; Cannon & Kirk, 2007; Fraedrich et al. , 2008).

En el presente trabajo se evaluó la distribución de C. zulmae en las poblaciones naturales de aliso en Colombia y, en los sitios con afectación , se evaluó la incidencia y severidad del ataque. Posteriormente se identificaron los microorganismos asociados a los daños mediante el uso de claves taxonómicas y pruebas de confirmación molecular. Se determinó la presencia de micangias en C. zulmae en machos y hembras mediante técnicas ópticas de microscopía de barrido a presión ambiental y se identificaron los posibles hongos asociados a las estructuras del insecto. Se corroboraron preliminarmente los posibles agentes causales de la muerte de aliso a través de pruebas de patogenicidad con los microorganismos aislados de campo.

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OBJETIVOS

Objetivo general

Determinar la simbiosis entre Corthylus zulmae y hongos ambrosiales, y su relación con la muerte descendente en árboles de aliso.

Objetivos específicos

• Evaluar la afectación e incidencia por C. zulmae en diferentes poblaciones de aliso en el país.

• Comprobar la presencia de estructuras de micangia en C. zulmae.

• Determinar la relación que existe entre C. zulmae , los hongos asociados y la muerte descendente de los árboles de aliso.

HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN

Corthylus zulmae se encuentra presente de manera exclusiva en la reserva Río Blanco del municipio de Manizales.

Corthylus zulmae posee micangias y a través de éstas transporta y mantiene hongos vasculares, que pueden causar la muerte a árboles de aliso.

Ceratocystis fimbriata es el hongo transportado a través de micangias y es quien causa la muerte en aliso.

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CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

El aliso es una especie ampliamente distribuida en América, principalmente en zonas de media y alta montaña, desde México hasta el norte de Argentina. Tres subespecies están ampliamente distribuidas en Latinoamérica: Alnus acuminata H.B.K. ssp. acuminata a través de los Andes, desde el Oeste de Venezuela hasta el Noroeste de Argentina. A. acuminata ssp. arguta (Schlech.) Furlow, en Centroamérica, desde la Sierra Madre en el Sur de México, en el Sudeste de Guatemala, Salvador, Centro de Costa Rica hasta el Sureste de Panamá; y A. acuminata ssp. glabrata , (Fernald) Furlow en el Centro, Nordeste y Sur de México (Restrepo y Bellefleur, 1996).

En Colombia, A. acuminata H.B.K ssp. acuminata , esta presente en las cordilleras Central y Oriental, conformando los ecosistemas andinos conocidos como “Bosques de Niebla”, que hacen parte de las zonas secas, húmedas y muy húmedas del premontano, montano y montano bajo (Holdridge, 1978; Del Valle y González, 1988). En el país, la madera es la base de la industria fosforera, además de utilizarse para construcciones ligeras, postes de cercas, cajas fúnebres, palos para pinchos y bombones, y su fibra es utilizada en la industria del papel (Ospina et al. , 2005).

En el año 1999, el área sembrada era de aproximadamente 890 ha (Ministerio del Medio Ambiente, 1999), pero en los últimos años la extensión ocupada por esta especie está cerca a las 4.930 ha, debido a que proyectos como el programa del Río Magdalena KFW, la Empresa Aguas de Manizales, el proyecto de Reforestación Procuenca y algunas Corporaciones Autónomas Regionales (CAR’s), usan el aliso como principal especie para reforestación en zonas montañosas, en cuencas que surten acueductos veredales/municipales o para el mejoramiento y conservación de áreas degradadas; debido a que aporta nitrógeno y materia orgánica al suelo y su hojarasca es de fácil descomposición (Briceño, 2002).

1.1 Corthylus zulmae en Colombia

Las plagas asociadas al aliso han sido poco estudiadas. Villegas y Bustillo (1986), reportaron a Oxydia olivata (Lepidoptera: Geometridae), sin mayores consecuencias, debido a que posterior a la defoliación ejercida por las larvas, los árboles recuperaron su follaje y la plaga desapareció. También se identificaron algunos comedores de follaje como Chalcophana sp., Nodonata sp. y Diabrotica sp. (Coleoptera: Chrysomelidae) y Macrodactylus sp. (Coleoptera: Melolonthidae), que no representaron daños económicos (Ospina et al. , 2005). A mediados del año 2000, las plantaciones de aliso de la reserva

5 forestal protectora de Río Blanco, la cual surte de agua el 40% de la ciudad de Manizales, se vieron afectadas por un insecto determinado como Corthylus zulmae Wood n. sp. (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae, Tribu: Corthylini). (Wood, 2007).El ataque se evidencia por perforaciones en el tronco, de 2 mm de diámetro aproximadamente, un exudado y la acumulación de aserrín blanquecino en el orificio de entrada (Figura 1-1). En árboles barrenados se presenta marchitamiento, defoliación total, formación de brotes basales e intermedios y en casos extremos el árbol muere (Gil et al. , 2004; Jaramillo et al. , 2011). Figura 1-1: Síntomas del ataque de C. zulmae en árboles de aliso. a. Perforaciones de 2 mm b. Acumulación de aserrín c. Múltiples perforaciones en un área de 40 cm 2. d. Altura de barrenado (hasta 1,50 m). e. Formación de rebrotes basales. f. Inicio de manchado de la madera. g y h. Exudación marcada.

a b c d

2mm

2mm

e f g h

Son varias las especies de Corthylus reportadas en Colombia. C. coffeae , n. sp., identificada como una nueva especie, asociada a café ( Coffea arabica ), en Caicedonia (Valle del Cauca). C. ater Schedl. n. status, el cual guarda sinonimia con la especie C. columbianus Schedl, y sin claridad de la especie arbórea que afecta. C. transversus Eichhoff, recolectado en Nueva Granada, y C. macrocerus Eichhoff, sin reseña de especie perenne que ataca. C. pseudoandinus Wood n. sp. y C. andinus Wood n. sp., en Piedras Blancas, corregimiento de Santa Elena, municipio de Medellín. C. pseudoandinus, se reportó en plantaciones de Pinus spp. y ciprés (Cupressus lusitanica) , C. andinus en individuos de la familia Rubiaceae y en Meriania nobilis (Melastomataceae) (Wood, 2007) y C. zulmae (Gil et al. , 2004; Jaramillo et al. , 2011, Wood 2007) afectando 174 ha de las 702 sembradas desde 1950 en la reserva Río Blanco, en un rango

6 altitudinal entre 2.240 y 3.120 m (Gil et al. , 2004) en incidencias de ataque entre 13% y 70%, en focos de infestación concentrados en espacios abiertos (Granados y González, 2002). Los daños en aliso fueron inicialmente relacionados con otras especies de insectos (Figura 1-2).

Figura 1- 2: Insectos inicialmente identificados como causantes de muerte descendente en plantaciones de aliso en Manizales. a. Adulto de Gnathotrichus sp.; b. Adulto de Amphicranus sp.

a b

1.1.1. Descripción morfológica de Corthylus zulmae Wood

Corthylus zulmae fue descrito por el taxónomo Stephen L. Wood, en el año 2003, a partir de ejemplares obtenidos en la cuenca del Río Blanco (Wood, 2007).

Los huevos son blanquecinos translúcidos, de forma elíptica, de 0,73 mm de largo por 0,46 mm de ancho, aproximadamente (Jaramillo et al. , 2011). La larva es blanca, apoda y en forma de “C”, con las mandíbulas esclerotizadas, la sutura epicraneal gruesa en la parte terminal (Figura 1-3). La pupa es blanca cremosa, exarata, el lado dorsal superior de la mandíbula está bien marcado, pero se va perdiendo gradualmente con su desarrollo. Sus apéndices labrados, a medida que se desarrollan, oscurecen sus alas posteriores y cabeza; presentando luego una coloración marrón en todo su cuerpo, tomando la coloración típica de la especie (Gil et al. , 2004; Wood, 2007; Jaramillo, 2011).

El adulto mide 3,0 ± 0,1 mm de largo y 1,16 mm de ancho. El cuerpo es robusto, la cabeza y el tórax de color marrón a negro, y en la parte anterior de los élitros presentan una mancha de color marrón – amarillo, el resto es marrón – negro, en las áreas superior y lateral del pronoto presenta líneas de dientecillos. El declive de los élitros es levemente cóncavo y de color rojo oscuro, sin gránulos o protuberancias (Gil et al. , 2004; Wood, 2007).

da e b c

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Figura 1- 3: Estados de desarrollo de C. zulmae. a. Huevos creciendo en galería; b y c . Larva alimentándose de micelio; d. Larva quiescente; e. Adulto inmaduro; f. Adulto maduro (Fotografías a, Jaramillo, 2010; b, c y e; Franco 2004, d, Gil et al. , 2004).

a b c

d e f

La especie presenta dimorfismo sexual; las hembras tienen la fachada cóncava con setas cortas y abundantes, la clava de la antena es muy larga, con el margen anterior ornamentado por un mechón de setas largas (Figura 1-4). El macho presenta la fachada convexa, sin setas, la porra de la antena no presenta mechón de setas (Gil et al. , 2004; Wood, 2007). El color de las patas es marrón – amarillo. El lado posterior de las tibias anteriores es engrosado y en el lado externo tiene más de dos dientes pequeños; presenta una espina en la base posterior de la tibia (Gil et al. , 2004; Wood, 2007).

El tracto digestivo es similar a otras especies de la subfamilia Scolytinae caso Dendroctonu s spp. (Zúñiga et al. , 1994; Díaz et al., 2000). Gnathotrichus, Ips y Scolytus (Shendl, 1931; Schneider et al. , 1969) presenta una forma característica dividida en tres regiones, intestino anterior o estomodeo, intestino medio o mesenteron, e intestino posterior o proctodeo. El buche se encuentra recubierto por espinas prominentes, fusionado con el proventrículo, cuya función es el almacenamiento temporal y la digestión parcial del alimento. La presencia de una cantidad de espinas en el buche es una característica que no se presenta en otros escarabajos barrenadores (Schneider et al. , 1969; Zúñiga et al. , 1994; Díaz et al. , 2000).

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Figura 1- 4: Morfología de C. zulmae . a y b. Hembra en posición superior y ventral; c y e. Clava de la antena de la hembra ornamentada por un mechón de setas largas; d y f. Declive del macho, con fachada convexa, la porra de la antena sin mechón de setas.

a b

c

e

1.2. Aspectos relevantes de la relación simbiótica insecto- hongo ambrosial en la subfamilia Scolytinae (Coleoptera: Curculionidae). La subfamilia Scolytinae es un grupo relativamente grande, con aproximadamente 6.000 especies descritas (Wood, 1982). Con base en su alimentación pueden clasificarse en grupos floeófagos, xilomicetófagos, xilófagos, myelófagos, herbífagos y espermófagos; siendo los causantes de las mayores pérdidas económicas los floeófagos y xilomicetófagos (Atkinson y Equihua-Martínez, 1986). Las especies floeófagas se alimentan en primera instancia en el floema y son conocidas como descortezadoras, predominan en las regiones templadas y son los géneros considerados de mayor importancia son Dendroctonus , Ips y Scolytus (Lie y Bakke 1981; Drooz, 1985).

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En los trópicos predominan los xilomicetófagos, conocidos como escarabajos ambrosiales; se alimentan primariamente de hongos que crecen en la madera, los cuales introducen en sus hospedantes, cultivándolos allí. Por lo general, son polífagos, con un alto número de especies arbóreas hospedantes, colonizan principalmente árboles estresados o en decadencia (Lindelöw et al. , 1992). La estrategia de los insectos para encontrar el árbol hospedante es compleja. Al parecer está mediada por la liberación de compuestos químicos por parte de las plantas, tales como kairomonas, volátiles (principalmente etanol), que segregan cuando éstas se encuentran debilitadas, estresadas o son atacadas por insectos u otros agentes (Byers, 1992; Flechtmann et al. , 1995; Flechtmann, 2000; Jaramillo et al. , 2011). Al parecer el hospedante debe estar debilitado o estresado para facilitar la entrada del insecto; pero debe estar vivo, con una humedad mayor al 45%, para garantizar el crecimiento, de lo que en el futuro será, la alimentación de la progenie (Francke - Grosmann, 1967).

El modo de acción de estos insectos se caracteriza por perforar el xilema y floema de árboles en pie o recién caídos, tocones verdes o árboles estresados. Los adultos, machos o hembras, excavan inicialmente las galerías, las cuales consisten en una perforación de entrada, que posteriormente se divide en varios túneles, que corresponden a las cámaras de cría, donde se alojan los insectos para su alimentación. Las larvas se encuentran en cámaras especiales, el patrón de galerías es característico de cada especie, los túneles de alimentación y las cámaras larvales están libres de mohos o algún crecimiento micelial y de heces de insectos (Normark et al. , 1999; Barbosa y Wagner, 1988; Kuhnholz et al. , 2001). Cuando los adultos construyen las cámaras y galerías, revisten estas áreas con un hongo simbionte característico de cada especie de coleóptero, denominado ambrosial. Estos hongos a su vez, son conservados en estructuras especializadas llamadas micangias o micetangias (Francke - Grosmann, 1963; Barbosa y Wagner, 1988).

Este comportamiento se describe para la especie Dendroctonus frontalis Zimm., donde las hembras penetran al árbol, producen feromonas que atraen otros individuos, los cuales a su vez liberan otros volátiles atrayendo un mayor número de descortezadores, ampliando la infestación (Billings et al. , 1979). Después de que los individuos han invadido el árbol, se detiene la producción de atrayentes, los huevos eclosionan y las larvas pequeñas y blancas comienzan a alimentarse de un hongo ambrosial que crece en galerías construidas en la corteza interna. A medida que las larvas se desarrollan, se mueven hacia la corteza externa, donde cambian a pupas, y luego, a adultos (Farris, 1969). Se creía que el método de transmisión de hongos ambrosiales era por el canal alimentario o la adherencia de la espora del hongo al cuerpo del escarabajo. Es evidente, que muchos escarabajos tienen órganos específicos para transportar y proteger el hongo. La presencia de estas estructuras de micangia han sido verificadas en alrededor de 50 especies de escarabajos de la subfamilia Scolytinae (Tabla 1-1) (Francke-

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Grosmann, 1963). La estructura y localización de la micangia varía según la especie; usualmente están presentes en el género del insecto que inicia el ataque al árbol, que por lo general es la hembra (Francke- Grosmann, 1963).

Las micangias se describen como estructuras pareadas de origen ectodérmico, presentes principalmente en hembras, cerca de las regiones glandulares del cuerpo, las cuales varían de simples depresiones (a manera de agujeros), en la superficie de la cutícula, grupos de setas o intrusiones en el protórax que capturan esporas de hongos, hasta estructuras más complejas, con setas raspadoras y glándulas secretoras, que se ubican en la pleura protorácica y promesonotal (Francke- Grosmann, 1967). Definiciones recientes las describen como invaginaciones del tegumento en la cutícula del insecto, pueden tener gran variedad de formas, y sirven para el almacenamiento, transporte y cultivo selectivo de hongos (Furniss et al. , 1987; Beaver, 1989; Fraedrich et al. , 2008). Se ubican en partes del cuerpo como las mandíbulas, élitros y el tórax, y los hongos son transmitidos verticalmente de madres o padres a su progenie, mediante secreciones mucosas que protegen o proveen nutrientes al simbionte (Beaver, 1989). En muchas especies los hongos ambrosiales en las micangias, se mezclan con levaduras, hongos de la mancha azul u otros microorganismos. Las levaduras también pueden ser mantenidas y transportadas en secreciones aceitosas en la superficie del cuerpo. Ello se creía aceleraba el crecimiento del hongo ambrosial y tornaba la madera más disponible para el crecimiento de los hongos (Francke- Grosmann, 1963).

En esta relación mutualista, el beneficio por el hongo es colonizar otros hospedantes a través del transporte de sus estructuras de reproducción en las micangias de los insectos ambrosiales. La ganancia por parte del insecto es garantizar la alimentación de las larvas, a través del micelio del hongo que crece en las galerías y cámaras de cría del hospedante. Los insectos tienen la capacidad de utilizar ergosterol, además la enzima fenol oxidasa adquirida del hongo durante la alimentación, puede aumentar la capacidad de un insecto para detoxificar los fenoles de la madera encontrados durante el barrenado; proceso que es anterior a la oviposición (Francke- Grosmann, 1963).

Los sitios de ubicación de la micangia en el insecto, de mayor referencia a nivel mundial, están publicados en los trabajos de Francke- Grosmann en los años 1963 y 1967.

1. Órganos en forma de saco en el protórax 2. Cavidades poco profundas en la región pleural del protórax 3. Bolsillos dorsales formados por la membrana integumental entre el nota- torácico 4. Cavidades o bolsillos esclerotizados en la base del élitro 5. Cavidad subcoxal 6. Micangia oral 7. Poros glandulares solos o en grupos.

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Tabla 1-1: Insectos de la subfamilia Scolytinae con presencia de estructuras de micangia, y consideradas como plagas en especies forestales

Ubicación de la Quién posee Nombre científico Hongos asociados Referencia micangia la micangia Ceratocystis piceae Corthylus columbianus Tubos glandulares Wilson, 1959; Kabir (Münch) B. K. Bakshi , Machos Schedl. en el protórax and Giese, 1966. Pichia sp. Tubos glandulares C. piceae (Münch) B. K. C. schaufussi Schedl. Machos Schedl 1962 en el protórax Bakshi Leptographium pyrinum Dendroctonus Protórax Davidson; Ophiostoma Hembras Six et al. ,1996 adjuntus Blandford adjuncti R.W. Davidson L. pyrinum Davidson ; O. D. approximatus Dietz Protórax Hembras Six et al., 1996 adjuncti R.W. Davidson. Entomocorticium dendroctoni H.S. Paine, 1984; Six et D. brevicomis Lec. Protórax Whitney , Ceratocystis Hembras al., 1999 minor (Hedgc.) J. Hunt , Ceratocystiopsis sp. E. dendroctoni .S. Bridges, 1983, 1987; Whitney Ceratocystis Paine, 1984; Bridges minor (Hedgc.) J. Hunt D. frontalis Zimm. Protórax Hembras et al. , 1985; Cook et Ceratocystiopsis al. , 1987, Six, et al. , ranaculosus Bridges et 1999. Perry. Six et al., 1996; Six Ophiostoma clavigerum Machos y D. jeffreyi Hopk. Maxilas et al. , 1997; Six et (Rob. – Jeff & R.W.) Hembras al. , 1998. Bleiker et al. , 2009; Ophiostoma clavigerum Machos y Whitney and Farris, D. ponderosae Hopk. Cardines Maxilares (Rob. – Jeff & R.W.); Hembras 1970 ; Six et al. , Ophiostoma montium 1997; Six et al. , 1998 Ophiostoma dryocoetidis Dryocoetes confusus Molnar, 1965; Farris, Mandíbula (W.B. Kendr. & Molnar) Hembras Sw. 1969. de Hoog & R.J. Scheff. Ensanchamiento Gnathotrichus Endomycopsis Batra 1963; Francke- de las cavidades Hembras materiarius Fitch. fasciculata L.R. Batra Grosmann, 1967. precoxales

Ensanchamiento Doane and Gilliland G. retusus Leconte de las cavidades Ceratocystis spp. Machos 1929; Farris, 1965, precoxales Roeper et al., 1980. Ambrosiella sulcati A. Ensanchamiento Funk Funk, 1970; Farris G. sulcatus Leconte de las cavidades Raffaelea sulcati A. Machos 1965 precoxales Funk Graphium spp. Hypothenemus Protórax Fusarium solani Hembras Beaver, 1986. curtipennis Schendl.

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Ubicación de la Quién posee Nombre científico Hongos asociados Referencia micangia la micangia

Pterocyclon bicallosum Invaginación entre Monilia sp. Hembras Schedl., 1962 Schedl. mentum y pregula

Hyalorhinocladiella Francke- Grosmann macrospora 1967. Ips acuminatus Mandíbulas Hembra (Gyllenhal, 1827) Ophiostoma clavatum; Ophiostoma brunneo- Vilarri, 2012. ciliatum Alargamiento de Pterocyclon Doane and Gilliland las cavidades Monilia sp. Hembras brasiliense Schedl. 1929; Schedl. 1962 precoxales Alargamiento de Verrall 1943, P. detigerum las cavidades Monilia brunea Verrall Hembras Francke- Grosmann, precoxales 1963a Alargamiento de P. fasciatum Say. las cavidades Monilia sp. Hembras Schedl., 1962 precoxales Alargamiento de Francke - Grosmann, P. mali Fitch. las cavidades Monilia brunea Verrall Hembras 1963 ; Verrall, 1943 precoxales Holtermannia Pytioborus spp. Protórax Hembras Furniss et al. , 1987 corniformis Kobayasi Dos tubos Ambrosiella ferruginea Trypodendron betulae glandulares en el Leach et al. , 1934; (Math.-Käärik) L.R. Hembras Swaine protórax y la Roeper et al. , 1980. Batra cavidad precoxal Protórax, cavidad Monilia ferruginea Math.- Francke - Grosmann, T. lineatum Fabricius Hembras precoxal Käärik 1956, 1958 Bolsas esclerotizadas en Francke- Grosmann, Xyleborinus saxeseni Ambrosiella sulfurea la base de los Hembras 1956; Roeper et al. , Ratz. Batra élitros, entre pro y 1980, Batra 1963. mesonoto. Xyleborus obesus Bolsas entre pro y Ambrosiella hartigii Hembras Roeper et al. , 1980. Leconte mesonoto Batra Bolsas entre pro y Cephalosporium X. affinis Eichh. mesonoto Hembras Verrall, 1943 pallidum Verrall

Bolsas entre pro y Monilia sp. X. bicornis Eggers. Hembras Muller, 1933 mesonoto Fusarium sp. Ambrosiella xylebori Bolsas Brader ex Arx & intersegmentales Hennebert X. compactus Eichh entre pro y Cephalosporium Hembras Brader, 1964 mesonoto rubescens Schimon , Fusarium lateritium Nees

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Ubicación de la Quién posee Nombre científico Hongos asociados Referencia micangia la micangia Bothryodiplodia Gregory, 1954 theobromae Pat. Cladosporium cladosporoides Brown, 1954 b (Fresen.) G.A. de Vries, Colletotrichum Meiffren, 1957; coffearum Nocack , Lhoste and Roche, Pestalotia coffeicola 1959. Sawada Monilia aff. candida Neger, 1911 Peck Bolsas Ambrosiella xylebori intersegmentales X. discolor Blandford Brader ex Arx & Hembras Schedl., 1962. entre pro y Hennebert mesonoto Goethe, 1895; Bolsas Beauverie, 1910; intersegmentales Monilia candida Peck X. dispar Eichhoff. Hembras Neger 1911; Francke entre pro y Ceratocystis spp. - Grosmann, 1956 y mesonoto 1958 X. ferrugineus Bolsas entre pro y Fusarium solani (Mart.) Hembras Kok, 1979 Fabricius mesonoto Sacc Bolsas Monacrosporium Neger, 1911; Gadd X. fornicatus Eichhoff membranosas en ambrosium Gadd & Hembras and Loss, 1947; la base mandíbula Loos Fernando 1959. Raffaelea lauricola T.C. Área proximal a Fraedrich et al. , X. glabratus Eichhoff. Harr., Fraedrich & Hembras mandíbulas 2008. Aghayeva Bolsas esclerotizadas en X. gracilis Eichh Raffaelea sp. Hembras Schedl, 1962 la base de los élitros. Bolsas entre pro y Monilia sp., Fusarium X. habercorni Eggers Hembras Muller, 1933 mesonoto sp.

Bolsas entre pro y Cephalosporium X. pecanis Hopk. Hembras Verrall 1943 mesonoto pallidum Verrall

Bolsas entre pro y Ambrosiella hartigii X. sayi Hopkins. Hembras Roeper et al. , 1980. mesonoto Batra Ambrosiella xylebori X. semiopacus Bolsas entre pro y Brader, 1964; Schedl Brader ex Arx & Hembras Eichhoff mesonoto 1962. Hennebert Batra 1963; and Bolsa membranosa Ascoidea asiática Batra X. velatus Sampson Hembras Francke- Grosmann, base mandíbula & Francke-Grosmann 1963 Francke- Grosmann, Bolsas entre pro y Mortirella sp. ; Raffaelea X. monographus Fabr. Hembras 1958.; Schedl 1962; mesonoto montetyi M. Morelet , Gebhardt et al. , 2004

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Ubicación de la Quién posee Nombre científico Hongos asociados Referencia micangia la micangia Xylosandrus Bolsas entre pro y Fusarium solani (Mart.) Delgado y Couturie, Hembras compactus Eichh. mesonoto Sacc. 2004 Fusarium spp. Francke- Grosmann, Bolsas entre pro y X. germanus Blandford Ceratocystis ulmi Hembras 1956.; Buchanan mesonoto (Buisman) C. Moreau 1940 Bolsas entre pro y Ambrosiella beaveri sp. X. mutilatus Blandford Hembras Six et al ., 2009. mesonoto nov. Six, De Beer & W.D

X. crassiusculus Bolsas entre pro y Ambrosiella roeperi sp . Harrington et al. , Hembras Motschulsky mesonoto nov TC Harr. & McNew 2014. Pequeñas Aspergillus flavus Link Francke - Grosmann, Xyloterinus politus Say cavidades a cada Penicillium sp., Hembras 1963, 1967; Maclean lado del .protórax Fusarium sp. and Giese, 1968 Ceratocystis ambrosia Bakshi 1951 B.K. Bakshi Mathiesen – Käärik Monilia ferruginea Xyloterus domesticus Protórax, cavidad 1953; Francke - Math.-Käärik ; Hembras Erichson precoxal Grosmann, 1956, Ceratocystis spp. 1958 Monilia candida Peck Harting, 1844 Protórax, cavidad Ceratocystis piceae Hadorn 1933; Bakshi precoxal Leptographium 1950, 1952 lundbergi Protórax, cavidad Harting 1844; Monilia candida Peck X. lineatus Erichson precoxal Hembras Hadorn 1933 Protórax, cavidad Mathiesen – Käarik precoxal Monilia ferruginea 1953; Francke - Math.-Käärik Grosmann, 1956, 1958 Dos tubos glandulares en el X. retusus LeConte Monilia candida Peck. Hembras Leach, 1940 protórax y la cavidad precoxal *Adaptada de Francke- Grosmann 1967 y Rubio, 2003.

Existen otras estructuras no tan complejas como las micangias, pero que igualmente son utilizadas por los insectos para el transporte de hongos (Figura 1-5) (Morales et al. , 2000). Algunas de estas estructuras son presentadas en la tabla 1-2.

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Figura 1- 5: a. Vista dorsal del protórax de hembra de Hypothenemus hampei , mostrando el arreglo de asperitos y setas; b. Ampliación de un asperito con una sola seta atrapando esporas de hongos (Tomado de Morales et al. , 2000 ).

Tabla 1-2: Insectos de la subfamilia Scolytinae que transportan hongos en otras estructuras de su cuerpo diferentes a micangias .

Órgano que Escarabajo transporta el Hongo asociado Referenciado por hongo Scolytus ventralis Trichosporium Livingston y Berryman, Prosternum Le Conte 1868 symbioticum 1972. Ips sexdentatus Ophiostoma Levieux et al. , 1989. Börner 1776 brunneociliatum Ceratocystis polonica Ips typographus Ophiostoma bicolor Furniss et al. , 1990. Linnaeus 1758 O. penicillatum Harrington y Zambino, Dendroctonus Prosternum, Ophiostoma minus 1990; Mathre, 1964; brevicomis Le élitros O. nigrocarpum Rumbold, 1936; Conte 1876 Whitney, 1971. Harrington y Zambino, D. frontalis Prosternum, Ophiostoma minus 1990; Mathre, 1964; Zimmermann élitros O. nigrocarpum Rumbold, 1936; Whitney, 1971. Hypothenemus Setas Fusarium solani Morales et al. , 2000. hampei Ferrari (asperitos) Setas Hsiau and Harrington, Pityoborus sp. Entomocorticium sp. (asperitos) 2003.

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1.3. Microorganismos asociados a las lesiones causadas por Corthylus zulmae Wood en Alnus acuminata HBK ssp. acuminata.

En trabajos previos realizados por la Federación de Cafeteros, en plantaciones de aliso en la reserva Río Blanco, se observaron tres tipos de lesiones en el tallo, una vez el insecto perforó los árboles. La primera, una mancha de color café rojiza que avanza longitudinalmente de acuerdo con la galería, afectando los haces vasculares y células del parénquima, siendo esta lesión la más frecuente y de la cual fue posible aislar dos especies de Fusarium : F. solani y Fusarium sp. Una segunda lesión café, que afecta directamente tejidos del parénquima en la albura del tronco y haces vasculares, y la tercera en forma radial en los haces vasculares; de estas dos últimas lesiones se reportó a Ceratocystis sp. como el agente causal (Gil et al. , 2004).

1.3.1 Hongos Ophiostomatoides

A pesar de varios intentos de clasificación del grupo, hoy la taxonomía de los hongos Ophiostomatoides no se ha clarificado. Los caracteres de identificación antes de 1967 eran de tipo morfológico. En general, existen dos propuestas taxonómicas del grupo: Una de ellas, considera a Ceratocystis y Ophiostoma como congéneres (Arx, 1974). La segunda reconoce a Ophiostoma como un género diferente de Ceratocystis (Hoog and Scheffer, 1984; Samuels, 2003). En esta última, los autores restringen a Ceratocystis las especies que presentan anamorfos fialídicos del género Chalara , Charaliopsis y Thielaviopsis , mientras que las especies de estados asexuales Sporothrix, Grosmannia y Leptographium forman conidias simpoidales y blásticas, y las ubican en Ophiostoma (Samuels, 2003).

Los hongos Ophiostomatoides producen estados sexuales similares morfológicamente, pero muy diversos en sus estados anamorfos. La variabilidad de formas y de mecanismos de dispersión de sus esporas les proveen adaptabilidad, situación que se evidencia por su capacidad de afectar nuevos hospedantes cuando son introducidos en diversos ecosistemas (Wingfield et al., 1993). Comprenden un grupo artificial de más de 250 especies divididas entre los géneros Ophiostoma, Fragosphaeria, Ceratocystiopsis; como géneros que forman estados telemorfos, Grosmannia, Leptographium, Graphilbum, Leptographium , Pesotum , Hyalorhinocladiella , Sporothrix , Ambrosiella , Raffaelea, Dryadomyces como estados anamorfos (Harrington, 1981; Hoog y Scheffer, 1984; Hausner et al., 1993; Wingfield et al., 1993; Hausner y Reid, 2003; De Beer et al. , 2013).

Estas nuevas características, implican que se divida en tres grupos, cada uno con un género que lo representa: Ceratostomella (Hedgcock, 1906; Davidson, 1942), Ophiostoma (Siemaszko, 1939; Von Arx, 1952) y Ceratocystis (Bakshi, 1951; Moreau 1952; Hunt, 1956; Wright y Cain, 1961; Griffin, 1968; Olchowecki y Reid, 1974; Upadhyay, 1981; Wingfield et al. , 1993). Recientemente, ante nuevos elementos, pueden diferenciarse dos grupos: Ophiostoma (Ophiostomatales) y Ceratocystis (Microascale s).

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Los hongos Ophiostomatoides producen estados sexuales, similares morfológicamente, pero muy diferentes y diversos en sus estados anamorfos. Igualmente dentro de ellos se diferencian tres géneros con telemorfos conocidos, Ophiostoma , Ceratocystiopsis y Fragosphaeria (De Beer et al. , 2013).

El género Ophiostoma tipifica el orden Ophiostomatales sensu (De Beer y Wingfield, 2013). Ophiostoma sp. Syd. & P. Syd., incluye patógenos virulentos como O. ulmi (Buisman) Nannf. y O. novo ulmi Brassier, causantes de la muerte de árboles de olmos y abetos en Europa. Se caracteriza por presentar ascocarpos globosos, subglobosos o con forma de botella, oscuros, hialinos o suavemente coloreados, ostiolados (peritecios) o cerrados totalmente (cleistotecios) (De Beer y Wingfield, 2013). Los ascocarpos ostiolados tienen cuellos largos, que pueden terminar en penachos de hifas, las ascas con formas clavadas a subesféricas o fusiformes. Ascosporas hialinas, usualmente unicelulares (algunas bicelulares con un septo medio) y de formas variadas (De Beer y Wingfield, 2013), dispuestas en cabezuelas pegajosas, al final de largos cuellos elevados de los ascomatas o en conidióforos que parecen estar adaptados específicamente para ser dispersados por artrópodos (Marín, 2004; Wingfield et al. , 1993). Los estados anamorfos identificados para Ophiostoma corresponden a Sporothrix , Pesotum , Hyalorhinocladiella; Raffaelea , Leptographium , Grosmannia y Graphilbum (De Beer y Wingfield, 2013).

1.3.2 Ceratocystis fimbriata Ellis & Halsted (Microascales) y su relación con las lesiones hechas por insectos

Ceratocystis se describió por primera vez a finales del siglo pasado y su importancia se hizo evidente cuando el hongo Ophiostoma ulmi (antes Ceratocystis ulmi ), causó una epidemia sobre las plantaciones de olmos de Europa ( Ulmus minor Miller) (Wingfield et al. , 1993). La especie más importante a nivel mundial, debido a que causa los mayores daños en plantaciones forestales es Ceratocystis fimbriata.

C. fimbriata Ellis & Halsted, es un hongo cosmopolita que presenta un amplio rango de hospedantes: café ( Coffea arabica ), caucho ( Hevea brasiliensis ), cacao ( Theobroma cacao ), mango ( Mangifera indica ), coco ( Cocos nucifera ), cítricos ( Citrus s pp.) y almendro ( Prunus persica ), entre otros (Echandi, 1955) (Tabla 1-3).

En cítricos, la acción de C. fimbriata se caracteriza por una exudación de sustancias gomosas a través de ramas y tallos, amarillamiento progresivo de las hojas y necrosis en forma de manchas oscuras en los tejidos xilemáticos y del cambium (Capera et al. , 1995). Esta misma sintomatología, aunada a lesiones tipo chancros en los tallos y manchas moradas y oscuros producto de la muerte vascular en la madera, se ha observado en otras especies como tambor ( Schizolobium parahyba ) y nogal cafetero (Cordia alliodora ) (Ospina et al. , 2004 y 2010). En caucho ( Hevea brasiliensis ) la afectación en la corteza presenta un color más oscuro que el normal, hasta tornarse rojo púrpura. En el xilema aparecen manchas lineales de color azul a violáceo (Montes de Oca, 1981).

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C. fimbriata fue reportado por primera vez en Colombia en 1932, afectando cultivos de café (Castaño, 1951; Marín, 2004). Actualmente se encuentra disperso en toda la región cafetera del país, incrementando su afectación y severidad, produciendo pérdidas económicas (Castro, 1998; Marín, 2004). Los síntomas de plantas afectadas van desde el amarillamiento del follaje, secamiento de las ramas desde el ápice hasta la base, marchitamiento y secamiento del individuo afectado. Las lesiones mecánicas y las heridas hechas por insectos, atraídos por los aromas de los frutos, constituyen el principal modo de ingreso de este patógeno (Pontis, 1951).

El hongo C. fimbriata , es el más frecuente en los aislamientos realizados de las muestras afectadas por Corthylus zulmae (Gil et al., 2004; Jaramillo et al., 2011). Se considera que el insecto es un medio importante para la dispersión de este patógeno; sin embargo, es necesario determinar la relación del hongo y el insecto, y las condiciones para que el patógeno finalmente provoque la muerte del árbol (Gil et al. , 2004).

Tabla 1-3: Especies de Ceratocystis o sus estados anamorfos asociados con insectos descortezadores de la subfamilia Scolytinae.

Hongo que causa Escarabajo Referencia afectación

Grosmann, 1931; Ips typographus L., Siemaszko, 1939. Ceratocystis penicillata (Grossm.) C. Moreau Hylurops palliatus Gyll., Hylastes Mathiesen Käärk 1950; cunicularis Er., Pytiogenes Mathiesen Käärk, 1953. chalcographus L., P. quadridens

Siemaszko, 1939, Francke - Ips sexdentatus Boern. Grosmann, 1952 C. ips (Rumb.) C. Moreau Orthotomicus proximus Eichh Mathiesen Käärk, 1953.

C. brunneo- ciliate Ips sexdentatus Boern Mathiesen Käärk, 1953. C.Moreau .

Rennerfelt, 1950; Mathiesen C. cana (Math.) C. Myelophilus minor Htg Käärk, 1953 Francke - Moreau Grosmann, 1952

Ips acuminatus Gyll. Ips Mathiesen Käärk, 1953, C. clavata (Math.) Hunt sexdentatus Boern Francke - Grosmann, 1952.

Dryocoetes autographus Ratz. C. autographa Bakshi Bakshi, 1951. Hylurgops palliatus

C. galeiformis Bakshi Hylurgops palliates, H. Bakshi, 1951.

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Hongo que causa Escarabajo Referencia afectación

cunicularis, Dryocoetes autographus Ratz

C. polonica (Siem.) Ips typographus L. Siemasszko, 1939 Moreau

C. flocosa (Math.) Hunt. Ips typographus L. Mathiesen Käärk, 1953,

C. albida (Math_Kää.) Ips typographus L. Mathiesen Käärk, 1953, Hunt.

Ips typographus L Siemasszko, 1939 C. minuta (Siem) Hunt... Myelophilus minor Htg Mathiesen Käärk, 1953 Ips calligraphus G erm. Ips Rumbold, 1931 grandicollis Eichh. Ips pini Say Rumbold 1931; Leach et al. , Ips avulses Eichh. (1934). C. ips (Rumbold) C. Ips oregoni Eichh . Rumbold, 1936 Moreau Rumbold, 1936; Mathre, Ips plastographus Lec. 1964. Ips ponderoseae Sw .; Ips confusus Lec. ; Ips emarginatus Mathre, 1964 b. Lec. C. dryocoeti Kendrik & Dryocetes confuses Sw. Kendrick y Molnar, 1965 Molnar Dendroctonus frontalis Zimm. Rumbold, 1931; Caird, 1935.

Rumbold, 1931; Mathre, Dendroctonus brevicomis Lec. C. minor (Hedge) Hunt. 1964

Dendroctonus pseudotsugae Rumbold, 1936; Hopk. Davidson,1955

C. piceaperda (Rumb.) C. Rumbold, 1941; Taylor, Dendroctonus piceaperda Hopk. Moreau 1940.

Dendroctonus ponderosae Hopk; Rumbold, 1941; Taylor, Dendroctonus jeffreyi Hopk. ; Ips 1940; Robinson 1962. C. montium (Rumb.) Hunt. emarginatus Lec.

Ips confusus Mathre, 1964

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Hongo que causa Escarabajo Referencia afectación

Rumbold, 1941; Davidson, Dendroctonus monticolae 1966

C. schrenkiana (Rumb). Dendroctonus monticolae, D. Mathre, 1964 Hunt valens

Robinson y Grinchencko, C. huntii Rob. et. Gvinch. Dendroctonus monticolae, 1964.

Raffaelea sp. Xyleborus glabratus Fraedrich et al. , (2008).

C. fimbriata Ellis & Corthylus zulmae Gil et al. , (2004). Halsted

1.3.3. Fusarium spp. (Hypocreales), en lesiones hechas por insectos.

Fusarium es un género difundido globalmente, contiene especies de patógenos importantes que afectan la agricultura y horticultura en el mundo. Igualmente, contiene un número de especies que son importantes productoras de micotoxinas, y otras, que son reconocidas como patógenas para humanos (Sumerrel et al. , 2010). Por lo general, afecta todo tipo de especies vegetales, arbóreas, arbustivas y rastreras, incluidos cultivos semestrales o anuales (Nelson et al. , 1983). Puede ser un invasor primario o secundario, siendo la mayor parte de sus especies saprófitas. Son patógenos facultativos, capaces de sobrevivir en el agua y suelo, alimentándose de materiales en descomposición (Carillo, 2003). Fusarium es un género polifilético, un grupo cuya taxonomía ha sido compleja y controversial, sin un número definido de especies, aunque se estiman entre 550 Kirk et al. , (2008) y 850 Mycobank, (2015). De todas las patologías causadas por las diferentes especies de Fusarium spp., la más importante y que afecta una mayor cantidad de hospedantes es Fusarium oxysporum Schltdl. (Nelson et al. , 1981). La mayoría de las especies de Fusarium están en capacidad de producir una o más micotoxinas con varios gradientes de toxicidad (Bottalico y Perrone, 2002).

F. oxysporum , de acuerdo al sustrato y al sitio donde se desarrolla, puede presentar una variedad de caracteres morfológicos. Creciendo en medios de cultivo PDA, a menudo presenta algunos matices de naranja, púrpura o amarillo (Nelson et al. , 1983). Además, muta frecuentemente con formas que progresivamente llegan a tener más micelio aéreo y un decrecimiento en esporodoquios, esclerocios o algunas formas pionotales (Carrillo, 2003), que dan al hospedante una apariencia amarillenta a naranja (Nelson et al. , 1983).

Fusarium solani (Mart.) Sacc , presenta crecimiento rápido en medio PDA, las colonias de color crema a blanco, las cuales son luego cubiertas con esporodoquios confluentes que dan la apariencia de pionotos y el color de la superficie crema, azul-verdosa, o azul pero no naranja. Algunos clones pueden mostrar un color púrpura oscuro en la parte más

21 superior y otros un pigmento violeta oscuro (Nelson et al. , 2003). Produce abundantes microconidias unicelulares, en microconidióforos ramificados con fiálides simples que nacen en la parte lateral de la hifa, posee macroconidias multicelulares, hialinas, en forma de canoa o curvadas, célula basal redondeada terminando en forma de pie (Gil et al. , 2004). Las clamidosporas abundantes, dispuestas en forma individual o en cadenas terminales cortas.

Los telemorfos producen peritecios y pertenecen a los géneros Cosmospora, Gibberella, Nectria , Monographella y Plectosporium (Samuels et al. , 2001). Ambas especies; F. solani y F. oxysporum , son heterotálicas, por lo que rara vez presentan estados sexuales. Ocasionalmente, se suele observar a Nectria haematococca Berk. & Br., como telemorfo de F. solani; para F. oxysporum no se conoce su estado sexual (Nelson et al., 2003; Carillo, 2003 ).

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32

CAPÍTULO 2. EVALUACIÓN DE DAÑO E INCIDENCIA DE Corthylus zulmae EN POBLACIONES DE ALISO EN COLOMBIA

2.1 INTRODUCCIÓN

Trabajos previos reportaron que el aliso en el país presenta dos ecotipos; el primero con una variedad de porte arbóreo, con poca pubescencia, distribuida en la Cordillera Central y el segundo de un crecimiento medio, con porte arbustivo y pubescencia ferruginosa, ubicado a lo largo de la Cordillera Oriental (Restrepo y Bellefleur 1986; Ospina et al., 2005; Marulanda et al., 2006; y Cifuentes 2011). Este estudio tuvo como objetivo evaluar la afectación e incidencia de Corthylus zulmae en las poblaciones de aliso presentes en Colombia, con la hipótesis de que este insecto plaga es exclusivo de árboles de la reserva Río Blanco en la ciudad de Manizales.

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.2.1. Plantaciones de aliso evaluadas. Se seleccionaron 22 poblaciones de aliso establecidas como plantación (16 sitios), sistema silvopastoril (5) o rodal natural (1), para ser muestreadas y determinar el grado de afectación por C. zulmae (Figura 2-1). Los sitios evaluados se agruparon por estar desarrollándose bajo el mismo sistema de cultivo; plantación, rodal natural o sistema agroforestal. En todos los sitios evaluados la variable indicadora de la presencia del insecto correspondía a la observación de perforaciones, rebrotes basales, decaimiento del árbol y evidencias de lesiones por hongos.

Plantaciones en la cuenca de Rio blanco, Fincas La Fe y Procuenca.

Localizadas en el municipio de Manizales, departamento de Caldas, ubicadas en altitudes que van desde 2240 hasta 3750 m; la pluviosidad promedio al año de 2500 mm y temperatura de 15°C (Tabla 2-1). En la finca La Fe, vereda Gallinazo, municipio de Villamaría, departamento de Caldas, se evaluó una plantación de 17 años de edad, ubicada en altitudes que van desde 2800 m hasta 3400 m. Igualmente se evaluaron poblaciones de 8 años de edad en el proyecto de reforestación para la cuenca del rio Chinchiná – Procuenca, Agroindustrias la Florida, Fundación Ecológica Cafetera –FEC y algunos reforestadores particulares, en los municipios de Manizales y de Neira.

Plantaciones de diferentes edades establecidas en otros departamentos:

Se evaluaron plantaciones de diferentes edades ubicadas en los departamentos de Huila (Gigante), Nariño (Pasto), Quindío (Salento), Tolima (Herveo), Risaralda (Dosquebradas) y Antioquia (Medellín -Corregimiento de Santa Elena) (Figura 2-1).

33

Sistemas Agroforestales o Silvopastoriles.

Se muestrearon poblaciones de aliso establecidas como sistema silvopastoril, en asociación con ganado productor de leche. Bajo este sistema se ubicaron sitios de muestreo en los departamento de Caldas (Neira), en Boyacá (Duitama y Arcabuco) y Nariño (Pasto).

Figura 2-1. Sitios de muestreo donde se evaluó la distribución de aliso con respecto a C. zulmae y la caracterización de ecotipos 1 y 2.

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Tabla 2-1: Plantaciones de aliso donde se realizó la evaluación de afectación por barrenadores de la subfamilia Scolytinae .

Altitud % de Zona de Vida*, temperatura y Depto. Localidad T° C. (m) Incidenc. precipitación Bosque muy húmedo Montano Bajo (bmh- MB). Humedad relativa Antioquia Santa Elena 17 2500 0 del 75% y precipitación promedio anual de 2550 mm. Bosque húmedo Montano Bajo Boyacá Arcabuco 13 2739 0 (bh- MB). Precipitación promedio anual de 1800 mm. Bosque húmedo Montano Bajo (bh- MB), humedad relativa del Boyacá Duitama 16 2590 16,6 70%, con meses lluviosos abril- mayo, octubre-noviembre. Bosque muy húmedo Montano 2240 a Bajo (bmh- MB). Humedad relativa Caldas Manizales 11 13% 3790 del 80% y precipitación promedio anual de 2500 mm. Bosque muy húmedo premontano (bmh-PM). Humedad del 94%, Caldas Neira 18 1969 26% precipitación promedio anual de 2350 mm... Bosque muy húmedo Montano 17 a 2100 a Bajo (bmh- MB). Humedad relativa Caldas Pensilvania 0 19 3800 del 80%, precipitación promedio anual 1800 mm. Bosque muy húmedo Montano 2600 a Bajo (bmh- MB). Humedad relativa Caldas Villamaría 11 26% 3800 del 90%, precipitación promedio anual 2800 mm. Bosque húmedo Montano bajo (bh-MB), 70% de humedad relativa Huila Gigante 17 2050 16% y una precipitación promedio anual de 1368 mm Pasto (El Nariño 14 2559 13,3% Bosque húmedo Montano (bh- M). Encano) Precipitación media anual de 1700 Pasto Nariño 13 2945 13,3% mm. (Obonuco) Salento (La 2200 a Bosque húmedo Montano Bajo Quindío 15,1 13,3 Montaña) 4750 (bh- MB). Precipitación promedio Salento (La 2500 a anual de 1820mm y Humedad Quindío 15,1 6,6 Marina) 4750 relativa del 85%. Bosque muy húmedo pre-Montano (bmh- PM). Humedad relativa de Risaralda Dosquebradas 18 2050 16,5 73% y precipitación promedio anual de 2739 mm. Bosque muy húmedo Montano Bajo (bmh- MB). 63% de humedad Tolima Padua 17 1930 0 relativa, precipitación promedio anual de 2350 mm. Clasificación basada en el sistema de zonas de vida de Holdridge, 1978 .

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Evaluación de incidencia de C. zulmae en diferentes zonas del país

Para la evaluación de la incidencia de Corthylus zulmae , en las diferentes poblaciones de aliso en el país, se utilizó un muestreo de tipo sistemático, definido como 1 en k; donde k fue igual al número de árboles en el lote dividido en 30; correspondiente al tamaño de la muestra por lote. El cociente entre el total de árboles presentes en el lote y la unidad de muestreo (30 árboles) permitió seleccionar los árboles a muestrear, sobre los cuales se identificaron los daños causados por insectos y se identificaron las especies presentes. El porcentaje de incidencia se obtuvo mediante la división del número de árboles muestreados (30) sobre aquellos con presencia de lesiones del barrenador. Este muestreo permitió una confiabilidad del 95% y un error de estimación del 5%.

2.2.2. Colecta de muestras de insectos

De las poblaciones de aliso, donde C. zulmae no estaba reportada .

Del total de 30 árboles muestreados por lote se determinó la proporción de individuos afectados por el barrenador. En los árboles seleccionados se identificaron los daños del insecto plaga, tales como perforaciones, acumulación de aserrín, exudados y galerías de oviposición. Igualmente se inspeccionaron los troncos caídos que se encontraban alrededor de la unidad de muestreo, para determinar la presencia del barrenador y corroborar si se limitaba a árboles en pie.

Los insectos fueron colectados de los árboles, a partir de las perforaciones. Se tomaron trozos de tallo de 25 cm, los cuales fueron debidamente etiquetados y llevados al laboratorio de cría en Cenicafé. La identificación se realizó en el Museo Entomológico de Cenicafé – Marcial Benavides (MEMB), Chinchiná, Planalto y en el Museo Entomológico “Francisco Luis Gallego” de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín.

De las poblaciones de aliso donde se encontraba C. zulmae

Para C. zulmae , se hizo la colecta directa de los individuos en las perforaciones y galerías. Los insectos fueron colectados en la finca La Fe, municipio de Villamaría (Caldas) y la Finca el Popal, municipio de Manizales, transportados en trozos de madera de aliso, que contenían galerías causadas por C. zulmae, hasta el laboratorio de Entomología de Cenicafé. Se colectaron los individuos adultos y se separaron por sexo, posteriormente se fijaron en glutaraldehído al 2,5%, en buffer fosfato de potasio 0,1 M, pH = 7,2 por 24 horas.

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2.3. RESULTADOS

2.3.1 Evaluación de incidencia de C. zulmae en diferentes zonas del país

En la tabla 2-2, se registró la evaluación realizada en las poblaciones de aliso en el país, con miras a determinar la presencia o ausencia de C. zulmae .

Tabla 2-2: Insectos asociados a las diferentes poblaciones de aliso en el país.

Localidad Sistema de Ecotipo Especie asociada Identificación plantación Museo Entomológico Salento - Plantación Hylocurus sp. Tribu arbóreo Francisco Luis Quindio comercial Hylesini Gallego Arcabuco y Museo Entomológico Sistema Duitama – arbustivo Corthylus sp. Francisco Luis silvopastoril Boyacá. Gallego Corregimiento Museo Entomológico Plantación de Obonuco - arbustivo Chramesus sp. Francisco Luis comercial Nariño. Gallego Museo Entomológico Corregimiento Sistema arbustivo Chramesus sp. Francisco Luis de El Encano. silvopastoril Gallego Museo Entomológico Amphicranus sp.; Francisco Luis Plantación Xyleborus sp.; Gigante-Huila arbóreo Gallego. comercial Hypothenemus sp. Museo Entomológico ; Corthylus sp. Marcial Benavides Manizales, Plantación Corthylus zulmae Villamaría- arbóreo Dr. Steven Wood comercial Wood, Neira –Caldas.

De las plantaciones en la Reserva Forestal La Montaña (Salento), perteneciente a la Corporación Autónoma Regional del Quindío- CRQ – Salento, en las fincas La Montaña a 2860 m y La Marina 2950m, la vegetación predominante correspondió a Palma de Cera (Ceroxylon quindiuense ) y especies introducidas como Eucalipto ( Eucalyptus grandis ), Pino ( Pinus patula ) y Ciprés ( Cupressus lusitanica ). El aliso es utilizado con fines de protección para la cuenca del río Quindío y las laderas del cerro Morro Gacho, por lo que alcanzan a desarrollar rodales de tamaño importante. En ambos lotes se pudo observar árboles de aliso debilitados por ataque de barrenadores y síntomas propios de infestación (Cifuentes, 2011). No hubo incidencia de C. zulmae en ninguno de los lotes; sin embargo, se observó 13% de daño causado por coleópteros pertenecientes a la subfamilia Scolytinae, Tribu Hylesinini y un 6,6% de incidencia causado por un insecto perteneciente a la Tribu Micracini, del género Hylocurus sp. (Cifuentes, 2011) (Figura 2- 2).

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Figura 2-2. Especies de la subfamilia Scolytinae, encontrados en Salento, Quindío. a y b. Daño causado por barrenador de aliso, de la tribu Hylesinini a. Vista frontal, b. Vista ventral. c y d. Insecto causante del daño, perteneciente a la Tribu Micracini, especie Hylocurus sp. (c. Vista superior, d. Vista frontal) (Fotografías Cifuentes, 2011).

a b

c d

En sistemas silvopastoriles con aliso en Boyacá, se evaluaron dos lotes: finca Monte Suárez a 2739 m.s.n.m., en el municipio de Arcabuco y sector de la Esperanza, municipio de Duitama a 2591 m (Cifuentes, 2011). En el primer lote no hubo afectación por insectos, mientras que en el segundo hubo un 13% de árboles con perforaciones en los primeros 1,50 m de altura, acumulación de aserrín, exudado, machado de la madera y galerías de oviposición (Figura 2-3). El individuo causante de la afectación fue identificado como Corthylus sp. (Gómez et al ., 2007).

En el departamento de Nariño fueron evaluadas seis poblaciones ubicadas en los corregimientos de Obonuco y el Encano. La primera evaluación se realizó en el sector denominado “Lechería”, corregimiento de Obonuco a 2945 m, con temperaturas de hasta 13°C (Figura 2-4). La segunda población se ubicó en el Corregimiento El Encano, Laguna de La Cocha, en la cual se encontró aliso plantado en pequeños rodales o en sistemas silvopastoriles. En el 13,3% de los árboles evaluados se evidenció la presencia de barrenadores (Figura 2-4). Los insectos fueron identificados pertenecen a la tribu Phloeosinini, especie Chramesus sp. (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) (Figura 2- 5). Corthylus zulmae no fue detectada.

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Figura 2-3. Daños causados por insecto barrenador del género Corthylus sp. en Duitama y Arcabuco. a y b. Corthylus sp. en vista frontal. c – f. Signos de ataque causados por el barrenador, en el municipio de Arcabuco, Boyacá. (Fotografías Cifuentes, 2011).

a b c

d e f

Figura 2-4. Plantación de aliso ubicada en el corregimiento de Obonuco, departamento de Nariño. a. Sector lechería. b. Corregimiento de El Encano c. Perforación y manchado de la madera (Fotografías Cifuentes, 2011).

a b c

Figura 2-5. Insecto causante de daño en las plantaciones de aliso, en El Encano y Obonuco. a y b. Chramesus sp. a. Adulto Hembra. b. Adulto Macho

a b

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En el departamento del Huila se evaluó la población más grande de aliso presente en el sur del país, con alrededor de 746 ha. Fueron pocos los árboles que presentaron afectación por insectos. Las plantaciones y rodales naturales del aliso, se ubican en un rango altitudinal de 2050 hasta los 2600 m, con temperatura promedio de 17°C, 70% de humedad relativa y una precipitación promedio anual de 1368 mm. Fueron varias las lesiones encontradas en los árboles infestados: perforaciones de diámetro variables, 1 a 3 mm, con acumulación de aserrín en la entrada de los orificios y en las perforaciones. Se observó una mancha de color pardo- rojiza en los sitios de perforación. No se encontraron galerías. De los sitios de perforación se aislaron los insectos descritos en la figura 2-6.

Figura 2-6. Insectos causantes de daño Gigante (Huila) a. Amphicranus sp. b. Xyleborus sp. c. Hypothenemus sp. d. Corthylus sp.

a b

c d

En los municipios de Manizales (reserva de Rio blanco), Villamaría y Neira, departamento de Caldas , s e encontró C. zulmae como la especie de mayor incidencia en las plantaciones de aliso. Se observó que el rango altitudinal en la cual se encontraba el insecto oscilaba entre los 2240 a 3120 m. y que el porcentaje de incidencia estuvo entre el 5% y el 25 % (Tabla 2-3). El insecto afectó árboles entre tres y más de 50 años, tanto en plantaciones como en regeneración natural.

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Tabla 2-3: Porcentajes de incidencia, en los sitios de muestreo, evaluados en el departamento de caldas. (Fuente Cifuentes, 2011).

DEPARTAMENTO MUNICIPIO LOTE % INCIDENCIA Caldas Manizales El Popal 13% Caldas Manizales El Bosque 0 Caldas Villamaría Agroindustria la Florida 0 Caldas Manizales Fundación Ecológica Cafetera 12% Caldas Villamaría Morena 16,6% Caldas Villamaría La Fe 24,13% Caldas Neira Termopila 0 Caldas Pensilvania San José 0 Caldas Pensilvania La Granja 0 Caldas Pensilvania Truchas 0 Caldas Manizales Licorera de Caldas 4,7% Caldas Neira Berlín* 18,5%

* Por decisión del propietario, una vez se determinó este porcentaje de incidencia, la población fue eliminada

2.4. DISCUSIÓN

La primera hipótesis de trabajo fue corroborada parcialmente dado que el ataque de C. zulmae , a pesar de no ser exclusivo de la reserva Río Blanco, se limitó al departamento de Caldas, específicamente en los municipios de Manizales, Villamaría y Neira. En otras poblaciones cercanas a estas, como Pensilvania o Herveo (Tolima), no se encontró C. zulmae , pero si otros individuos de la familia Curculionidae, subfamilia Scolytinae. Contrasta con lo reportado para Alnus acuminata en Costa Rica donde Scolytodes alni (Curculionidae: Scolytinae) es un barrenador común que ataca todas las poblaciones de aliso en el país (Russo, 1990; Arguedas y Reggio 1991; Cornelius y Masis, 1995; Cornelius et al ., 1996, Espinoza y Arguedas, 2005). Se pudo evidenciar la presencia de dos nuevas especies de Corthylus sp. en las poblaciones de Gigante (Huila) y Arcabuco y Duitama (Boyacá). La distribución tan restringida de la especie, puede deberse a lo referenciado por Wood (1982), donde manifiesta que los escarabajos descortezadores y ambrosiales, se mueven normalmente distancias cortas, aunque ocasionalmente, pueden quedar atrapados por el viento y ser llevados a distancias hasta de 15 km.

En la reserva forestal de Rio blanco el rango altitudinal en el cual se presentó el insecto oscilaba entre 2240 hasta 3120 m. La incidencia del ataque varió entre 18 y el 21,5% y los focos de infección concentrándose en individuos ubicados en las vías de acceso a la plantación, bordes de caminos, y los de mayor edad (40 años), lo cual corrobora los estudios realizados por Franco (2004), Granados y González (2003) y Medina (2003). En la finca la Fe, se encontró que los niveles de infestación se incrementaron rápidamente en los periodos secos, alcanzado niveles hasta del 38% en plantaciones sin manejo

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(Jaramillo et al. , 2011). El rango altitudinal en el cual se mueven los insectos, fue demostrado por Perusquina (1978) en México, donde identificó como las especies de Dendroctonus spp., que atacan las poblaciones de Pinus spp. en México, se mueven en rangos altitudinales cortos; D. frontalis Zimm, ataca a Pinus prenglei entre 1600- 2200m. D. mexicanus en P. oocarpa entre 1500 y 2500 y D. adjuntus en P. hartwegii entre 2700- 3800 m.

En las demás plantaciones de aliso en el país, otros insectos de la subfamilia Scolytinae (Coleoptera: Curculionidae), se encontraron causando igual afectación. En el Quindío, la afectación es por género Hylocurus e individuos de la tribu Hylesinini . En Nariño, la afectación se produjo por insectos del genero Chramesus sp. Para Boyacá, el ataque se presentó por insectos del Género Corthylus sp., el cual presenta diferencias marcadas en su morfología con C. zulmae . En las plantaciones ubicadas en Gigante, Huila los insectos encontrados corresponden a Gnathotrichus sp., Amphicranus sp. e Hypothenemus sp.

2.5. BIBLIOGRAFÍA

ARGUEDAS G., M.; REGGIO, F. S. Observaciones sobre la biología de Scolytodes alni Wood (Coleoptera: Scolytidae) descortezador del jaúl (Alnus acuminata ). Manejo Integrado de Plagas.23-25 p. 1991

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WOOD, S.L. Bark and ambrosia beetles of North and Central America (Coleoptera: Scolytidae) a taxonomic monograph. Utah: The great basin naturalist, 1982.1359 p.

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CAPÍTULO 3. COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ESTRUCTURAS DE MICANGIA EN Corthylus zulmae

3.1 Antecedentes

El término simbiosis fue introducido por Anton de Bary en 1879, y lo definió como “una asociación permanente entre dos o más organismos distintos, durante una parte de su ciclo de vida” (De Bary, 2008). Dentro de estas interacciones mutualistas realizadas por los insectos, la simbiosis entre insecto y hongo ambrosial, ha sido documentada y estudiada. La existencia de una historia de evolución compartida entre organismos simbiontes, en algunos casos, podría catalogarse como obligatoria, y que éstos siguen fielmente la huella del hospedante a través de la evolución. Desde hace 60 millones de años, aproximadamente, antes de la aparición de la agricultura, tres grupos de insectos pertenecientes a la termitas, subfamilia Macrotermitinae (Aanen et al. , 2002; Gullan y Cranston, 2000), hormigas de la tribu Attini (Hölldobler y Wilson 1990; Caldera et al. , 2009) y escarabajos de las subfamilias Scolytinae y Platypodinae (Farrell et al. , 2001; Hulcr et al. , 2007), en forma independiente, evolucionaron la habilidad de cultivar hongos para su alimentación (Mueller y Gerardo 2002). La relación insecto-hongo ambrosial es una relación mutualista existente entre escarabajos y algunas especies de hongos (hongos ambrosiales), basados en una dependencia nutricional de los escarabajos con el hongo ambrosial (Batra, 1966). Una de las adaptaciones más funcionales de la mayoría de los insectos ambrosiales son las micangias (algunas veces llamadas micetangias), las cuales son órganos especializados para la transmisión de esporas y elementos miceliales del hongo simbionte. Las micangias pueden desarrollarse en varias partes del cuerpo como la cavidad oral, pro-coxa, protórax, mesotórax, bases de los élitros, entre otras (Francke- Grosmann, 1967).

3.2. Estructuras de micangia en insectos ambrosiales

Las micangias se describen como estructuras pareadas de origen ectodérmico, presentes principalmente en hembras, cerca de las regiones glandulares del cuerpo. Definiciones más recientes las describen como invaginaciones en la cutícula del insecto, las cuales pueden tener gran variedad de formas y sirven para el almacenamiento, transporte y cultivo selectivo de hongos (Furniss et al. , 1987). Las estructuras varían de simples depresiones (a manera de agujeros) en la superficie de la cutícula, grupos de setas o intrusiones en el protórax, que capturan esporas de hongos, hasta complejas invaginaciones equipados con setas raspadoras y glándulas secretoras (Francke- Grosmann, 1967). Estructuras más complejas se ubican en la pleura (protorácica y

44 promesonotal) y a menudo están relacionadas con células glandulares, productoras de aceite, las cuales son las responsables de mantener la viabilidad de los hongos y del cultivo selectivo de éstos.

En cuanto a las familias que poseen este tipo de estructuras, estudios morfológicos y moleculares, sugieren que Scolytinae y Platypodinae, representan uno o posiblemente dos clados en la familia Curculionidae. Ambas subfamilias presentan variación en las estrategias reproductivas (monogamia, poligamia, pérdida del genoma paternal, partenogénesis y eusocialidad) y sus dos principales estrategias de alimentación lo constituyen el floema para el caso de los descortezadores y los hongos en escarabajos ambrosiales. No obstante, se encontró que la relación Scolytinae – hongo, representa un gradiente de dependencia, que incluye escarabajos que se alimentan de hongos propagados en el floema, barrenadores de ramas que se propagan en la madera y la presencia de insectos ambrosiales que consumen xilema del hospedante (Roeper, 1995).

3.3 MATERIALES Y MÉTODOS

Para la búsqueda de estructuras de micangia u otros tipos de invaginaciones en adultos de C. zulmae se aplicaron dos metodologías: La primera fue la fijación de estructuras del insecto en resina Spurr, con el objetivo de observar estructuras de micangia a través de cortes histológicos y tinción de tejidos. La segunda técnica fue la observación directa de estructuras ectodermales en un microscopio electrónico de barrido o SEM (Scanning Electron Microscope) o microscopio electrónico de barrido ambiental (ESEM).

3.3.1 Fijación de insectos en resina Spurr, para la obtención de cortes histológicos

La fijación es un proceso previo que debe hacerse para observar estructuras de micangia al interior de los individuos. Para ello, se utilizaron diez hembras y diez machos de C. zulmae , los cuales se ubicaron durante 18 h en viales de vidrio, con 2 ml de una solución de glutaraldehído al 2,5% y paraformaldehído al 1% en solución tampón fosfato salino

PBS a pH de 7,2. El PBS se preparó con 7,3 g de NaCl, 2,38 g de Na 2HPO 4 y 2,72 g de

KH 2PO 4 en 100 de agua destilada.

Mediante este proceso se definió si las estructuras fueron observables, mediante los cortes realizados. El número de cortes se definió entre 15 a 20, y se concentraron en cuatro regiones: protórax, pronoto y mesonoto, coxas y maxilas. Los cortes se observaron en un microscopio de luz, para detectar invaginaciones cuticulares. Se utilizó la técnica de inclusión en resina Spurr, propuesta por Mercer et al. (1979), modificada por Rubio (2003) y adaptada en el laboratorio de virología del CIAT (Figura 3-1). Como control se utilizaron adultos de H. hampei (Coleoptera: Curculionidae, Scolytinae) del pie de cría de Cenicafé.

Los individuos se prefijaron, para lo cual, tanto hembras como machos se depositaron en un recipiente con agua y luego se dispusieron en una estufa a 37°C, por 24 horas. Posteriormente, los insectos se lavaron durante 24 h en viales, con 2 ml de fosfato

45 milloning. Para la preparación del fosfato se prepararon tres soluciones madre de fosfato de sodio monobásico al 2%, hidróxido de sodio al 2,25% y glucosa al 5,4%, y se tomaron 41,5 ml, 10 ml y 5 ml, de cada una de las soluciones, respectivamente. La deshidratación se hizo pasando los insectos durante 15 min por etanol concentrado al 50%, 70%, 80%, 90% y 100%, y por doble inmersión en acetona. La preimbibición se hizo en acetona y resina Spurr en relación (3:1), (1:1) y (1:3), durante 1 h en cada solución. La resina se preparó en cámara de extracción con 4 ml de ERL 4206, 5 ml de DER 736, 12 ml de NSA y 1 ml de DMAE (Anexo D). Los insectos se imbibieron en resina Spurr durante 18 h, para proseguir con la inclusión. Una vez imbibidos se pasaron a moldes, con la adición de una nueva preparación de resina Spurr.

Figura 3-1. Protocolo de inclusión en resina Spurr (Adaptado de Mercer et al. , 1979)

Lavado en Fosfato Milloning 24 h

Vacío Fijación en Deshidratación en: 1 h Glutaraldehido Etanol 50% 30 m 18 h Etanol 70% 30 m Etanol 80% 30 m Etanol 90% 30 m Etanol absoluto 30 m Acetona 30 m Acetona 30 m

Preimbibición Imbibición 1 h 18 h

acetona: resina acetona: resina acetona: resina resina 100% (3:1) (1:1) (1:3)

Polimerización 72 h

resina 100% 6 h

En el laboratorio de virología del CIAT, al bloque seleccionado por la posición del tejido que se deseaba observar, se le hicieron cortes de 900 nm con el ultramicrótomo (MT 6000 Sorvall ® Instruments Dupont) (Figura 3-2), en la sección transversal de las coxas

46 anteriores de una hembra y se tiñeron con azul de toluidina (1 vol. toluidina al 2% y 1 vol. de acetato bórico al 2%). Los cortes se ubicaron en una lámina cubre objetos sobre una gota de agua destilada estéril, la cual se evaporó ubicando la lámina en una estufa a 38°C. Aquellos cortes que quedaron adheridos a la lámina, se tiñeron con una gota de azul de toluidina al 1%, sobre la estufa, durante 40 segundos. En el microscopio de luz pudo observarse la parte del pronoto y las coxas de la muestra, al igual que las patas.

Figura 3- 2. Proceso de seccionamiento y tinción. a. Polímero; b. Ultramicrótomo MT 6000; c. Corte del polímero; d. Montaje de los cortes; e. Deshidratación; f. Tinción con azul de toluidina.

a b

d

e

c f

3.3.2 Fijación y montaje de insectos para observación de estructuras en microscopia electrónica de barrido (SEM) y microscopia electrónica de barrido ambiental (ESEM).

Microscopia electrónica de barrido (SEM)

Se utilizó la metodología propuesta por Kent (2008) y adaptada por el laboratorio de virología del CIAT. Los adultos, 10 hembras y 10 machos de C. zulmae, se fijaron en

47 glutaraldehído al 2,5%, en buffer fosfato de potasio 0,1 M, pH = 7,2 por 24 h; posteriormente, los insectos fueron deshidratados, durante quince min, a través de diferentes concentraciones de etanol (25%-50%-75%-90%), y por último, se realizó una triple inmersión (15 min) en etanol absoluto. Luego, las muestras se sumergieron en etanol:xileno (1:1) durante 12 h; seguidamente se transfirieron a etanol al 100%, por 20 min. Finalmente, se lavaron con agua destilada para remover las impurezas externas.

Los insectos se secaron a punto crítico en un equipo Tousimis ® 780 (Rockville, MD), reemplazando el etanol de las muestras por CO 2. Los insectos deshidratados se colocaron sobre un portaobjeto adherido con cinta transparente de doble faz, en posición lateral, dorsal y ventral. Las muestras se sometieron a fase de metalizado con oro y paladio de 18 nm, cubiertas con un pulverizador, en un equipo Anatech ® LTD y visualizadas en el Microscopio Electrónico de Barrido (JEOL JSM-820, Tokio), del laboratorio de virología del CIAT, Palmira (Valle) (Figura 3-3).

Figura 3-3. Adultos de C. zulmae deshidratados cubiertos por película de oro antes de ser observados al microscopio de barrido.

Microscopia Electrónica de Barrido Ambiental (ESEM)

Para esta técnica no era necesario que los individuos fueran fijados en glutaraldehído, pero sí debían deshidratarse para tener una mayor fijación; por ello, los insectos fueron inmersos en una solución de alcohol al 50%, durante una hora.

Los especímenes adultos se colocaron sobre un portaobjeto adherido con cinta transparente de doble faz en posición lateral, dorsal y ventral, con 20 individuos; 10 machos y 10 hembras. Una vez montados los insectos, se incluyeron en bachelita (en frío), durante 17 a 20 min, luego se depositaron en una cámara de presión a 80 pa y un voltaje de 15 kv, durante 15 min, aproximadamente.

Posteriormente, por espacio de 120 s, las muestras se impregnaron de una capa de 8 µm de oro paladio; este recubrimiento permitió que la imagen pudiera ser generada por las ondas eléctricas que chocaron contra el objeto, y luego se sometieron a un vacío durante

48

8 a 10 min. Para la observación de las estructuras, se utilizó un microscopio de barrido a presión ambiental (ESEM), marca JEOL-JSM 59 10LV, de la Universidad Nacional de Colombia- Sede Medellín.

3.4 RESULTADOS

3.4.1. Fijación de insectos en resina Spurr.

El protocolo de fijación propuesto por Mercer et al. (1979) y modificado por Rubio (2003), no permitió una buena fijación ni la obtención de cortes de calidad de C. zulmae , por lo tanto, se modificó el procedimiento que permitió realizar los cortes sin desgarre de tejido (Anexo D). Sin embargo, a pesar de obtener cortes en la cabeza y en las coxas anteriores de las hembras de C. zulmae, los resultados no permitieron observar con claridad estructuras de micangia (Figuras 3-4 y3-5).

Figura 3-4. Corte realizado en hembra de Corthylus zulmae . a. 30X; b. Protórax antes de realizar corte en el ultramicrótomo.

a b

Figura 3-5. Resultados del Corte hecho en el protórax de la hembra de C. zulmae (5x), con coloración de azul de toluidina.

a

3.4.2. Microscopia electrónica de barrido (SEM)

Las observaciones realizadas mediante Microscopia electrónica de barrido (SEM) permitieron observar que en diferentes estructuras del cuerpo de los insectos (machos y hembras) se alojaban esporas de diferentes especies de hongos. En el pronoto de los

49 machos se observaron conidias de Fusarium oxysporum (Hypocreales: Nectriaceae) (Figura 3-6).

Figura 3-6. Conidias de F. oxysporum en el pronoto de los machos de C. zulmae

En algunas partes del cuerpo se observaron uredosporas de Puccinia sp. (Pucciniales: Puccinia); lo que sugiere la capacidad de esta especie para transportar microorganismos en las setas y otras prominencias del cuerpo, que parasitarían tejidos en árboles hospedantes (figura 3-7). Estas se observaron en las hembras en los palpos maxilares y en el prosterno y en los machos en las maxilas (figura 3-8).

Figura 3-7. a- d. Transporte de uredosporas de Puccinia sp., en las maxilas de los machos de C. zulmae. (2300 X- SEM laboratorio de virología, CIAT).

50

Es probable que la asociación de algunos de los microorganismos encontrados en el integumento del insecto (tanto hembras como machos) sea de tipo casual o inquilinista, ya que Corthylus zulmae presentó una gran cantidad de setas que favorecen la adherencia de cuerpos fructíferos de microorganismos. A pesar de los resultados no se observó la presencia de micangias en alguno de los dos géneros.

Figura 3-8. Uredospora de Puccinia sp. en el prosternum de las hembras. (55 X, 120 X, 950- 4000 X, SEM laboratorio de virología, CIAT).

3.4.3. Microscopia Electrónica de Barrido Ambiental (ESEM)

El montaje de los insectos en diferentes posiciones permitió definir con mayor claridad las diferencias morfológicas entre machos y hembras (Figuras 3-9 y3-10), y observar posibles puntos de localización de las estructuras de micangia.

En posición ventral se pudo observar el aparato bucal, constituido por maxilas, mandíbulas y el labium, además de las coxas de las patas anteriores y la zona del episterno y prosterno. En posición lateral se observó la zona del meso y metatórax, la fachada, antenas, epistoma y pronoto. En aquellos montados en vista superior se observó el pronoto, la zona cervical, las antenas y los élitros desplegados. Bajo la misma orientación se montaron partes de insectos como la cabeza, las patas, los élitros y otros órganos, buscando una mejor orientación que facilitara encontrar las estructuras de interés (Figura 3-11).

Bajo esta técnica se descartaron zonas del insecto donde se encuentran las micangias para otras especies, de acuerdo con referencias en otros países. Se optó por buscar los puntos de mayor acumulación de estructuras fungosas o una alta concentración de esporas o crecimiento de micelio.

51

Figura 3-9.Morfología de adultos machos de C. zulmae . a. Vista superior de antenas; b. Vista frontal de antenas y omatidios; c. Declive de su parte terminal; d. Vista ventral donde se observan esternitos St3 a St7, región anal y pigidium; e. Vista ventral, acercamiento invaginación coxas anteriores, 200X; f. Mandíbulas, palpos labiales y maxilares y labrum, 90X (Fotografías ESEM- Universidad Nacional Medellín) .

a b

c d

e f

52

Figura 3-10. Morfología de adultos hembra de C. zulmae . a. y b. Vista ventral de la cabeza, donde se observan las antenas clavadas, con mechón de setas y omatidios, 60x; c. Mandíbulas y antenas clavadas 55x; d. Mandíbulas y palpos maxilares 270x; e. Patas (Coxas, trocánter) 55x; f. Fémur en donde se observa acumulación de esporas de hongos 300x (Fotografías ESEM- Universidad Nacional Medellín) .

a b

c d

e f

53

Figura 3-11. Estructuras de machos y hembras, para observación de micangias. a. Vista superior de omatidios, antena y mandíbulas de hembra de C. zulmae . b. Mandíbulas. c. Mentón, palpos labiales y palpos maxilares. d. Palpo maxilar. e y f. Pronoto y zona cervical de macho. g y h. Pronoto y zona cervical hembra. i y j. Vista Fontal del macho donde se observar la zona del meso y metatórax. k Tibia, tarsos y uña tarsal. l. proventrículo. (ESEM, laboratorio de mmicroscopía Universidad Nacional).

a c

b

d e f

g h i

j k

l

54

En el análisis de las imágenes se pudo observar que las hembras transportan esporas de hongos en los puntos de mayor concentración de setas como las tibias, tarsos, en el pronoto, en la región cervical y en las mandíbulas. Para los machos pudo notarse que los puntos de mayor acumulación de micelio y estructuras de reproducción de hongos, corresponden a la zona de las coxas anteriores, en el mesotórax, mandíbulas y maxilas, y en menor proporción en la región de las tibias y los tarsos.

Figura 3-12. Coxas anteriores de hembra de C. zulmae, vista ventral .a. Mayor separación con respecto a patas posteriores y esternitos 1 a 7. b, c, y d. Coxas anteriores; mas separadas sin presencia de crecimiento de micelio y esporas presentes solo en los pelos que protegen las patas y la zona ventral. (Fotografías ESEM, laboratorio de microscopia Universidad Nacional).

a b

c d

Los machos presentaron un crecimiento abundante de micelio blanquecino, que cubre algunas partes del pronoto, la mayor parte de las maxilas y de la zona pre-coxal de las patas anteriores. Además, hay una diferencia marcada entre hembras y machos a nivel de la zona pre-coxal de las patas anteriores, ya que en los machos están más juntas, casi se tocan las coxas y los trocánteres, mientras que en las hembras las coxas están más separadas (Figuras 3-12 y 3-13).

55

Figura 3-13. Invaginaciones presentes en las coxas anteriores en machos de C. zulmae como punto terminal de la micangia a. Coxas anteriores en C. zulmae b. Conexión entre la cabeza, maxilas y coxas anteriores del adulto de C. zulmae . c . Acumulación de micelio en entrada a la micangia ubicada en la coxa anterior. d. Forma y tamaño de la invaginación 28 a 35 µm. e. invaginación abierta. f. Invaginación abierta, donde se observa la parte terminal del tubo micangial, terminando en forma cónica. (ESEM laboratorio de microscopia Universidad Nacional).

a b

c d

e f

3.4.4. Descripción de micangia en Corthylus zulmae Wood.

No fue posible determinar con claridad la forma en que el tubo micangial se pliega en la zona pronotal, más sí se observaron manchas fungosas ectodermales que reflejan las

56 zonas por donde el tubo micangial se extiende, se pliega y se distribuye en el cuerpo de C. zulmae . Son tres los puntos de mayor acumulación o crecimiento de micelio blanco, que permite definir la extensión de la micangia desde la zona del pronoto, pasando por los cardos maxilares, extendiendóse por la pleura hasta la zona subcoxal de las patas anteriores de los machos de C. zulmae .

El tubo micangial termina en una invaginación en la zona pre-coxal de las patas anteriores de los machos. La invaginación es de forma ovoide, con un pequeño agujero, con dimesiones de 23 ± 2 µm de ancho por 34 ± 5 µm, cubierta de unos pelos de mayor tamaño y con gran acumulación de micelio y pequeñas conidias de Pesotum sp. (Ophiostomatales: Ophiostomataceae). En la hembra, en esta zona, no se observa esta invaginación ni acumulación de micelio blanquecino.

La longitud total de este tubo, desde su origen en la zona del pronoto hasta la zona prosterno- subcoxal anterior, puede tener una extensión hasta de 4,5 mm (4,2 ± 0,3 mm). El diámetro del tubo varía de 38 ± 6 µm en la parte superior, cerca al pronoto en la zona aledaña a las mandíbulas y cardos maxilares, disminuyendo el diámetro hasta 16 ± 2 µm en la parte basal final, la cual termina en una cavidad precoxal abierta (Figura 3-14). El tubo es doblemente plegado en la parte distal cónica, ya que reduce su diámetro casi a la mitad, para crear una o más curvas adicionales. Por encima de la zona pre-coxal, a nivel interno puede observarse una estructura ectodermal con una gran concentración de setas y una alta producción de micelio; esta estructura corresponde a la micangia de C. zulmae . La micangia es de forma ovoide- elipsoidal, con el diámetro mayor de 148±7 µm y diámetro menor de 58±4 µm, densamente cubierto de pelos, donde en cada pelo hay formación de un pseudomicelio . Cada invaginación donde nacen los pelos, de forma redondeada, con un tamaño de 5±1 µm, está densamente cubierta por micelio y pueden observarse conidias de un hongo micelial.

57

Figura 3-14. Forma de micangia en C. zulmae . a y b. Manchado en el integumento del individuo que refleja la forma de distribución interna del tubo micangial. c. depresiones donde nacen los pelos en la zona del pronoto d. Parte basal del tubo micangial que termina en la zona subcoxal anterior. e. Tubo micangial, doblemente plegado, con crecimiento de micelio en su parte externa. f - h. Micangia en la zona subcoxal anterior, obsérvese la llegada allí del tubo micangial y la acumulación de micelio. i. Pared interna de la micangia donde se observa acumulación de micelio en cada invaginación y conidias de hongo micelial alrededor de éstas. (ESEM, laboratorio de microscopia Universidad Nacional). a b c

d e f

g h i

3.5. DISCUSIÓN

Se identificaron micangias en las patas anteriores, en la zona pre-coxal de machos de C. zulmae , corroborando la segunda hipótesis de trabajo, lo que permite considerar a esta especie de insecto como un escarabajo ambrosial. En general, las micangias están asociadas a las hembras de las subfamilias Scolytinae y Platypodinae (Coleoptera: Curculionidae), (Farris y Funk, 1965; Francke-Grosmann, 1947). La ocurrencia de tal órgano en el macho es peculiar a un pequeño número de géneros, entre ellos Gnathotrichus spp. y Corthylus spp. (Farris, 1963; Finnegan, 1963). Las micangias están localizadas en ciertas partes del cuerpo del insecto, como en las mandíbulas, élitros,

58 pronoto y tórax, y los hongos son transmitidos verticalmente de la madre a su progenie (Beaver, 1986). La micangia que presenta C. zulmae es una estructura ectodermal, con concentración de setas y producción de micelio a nivel interno. Puede observarse a través de la acumulación de micelio, en las depresiones ectodermales del pronoto, en las maxilas y mandíbulas, en la pleura y en la zona precoxal. La acumulación del micelio se da por la presencia de un tubo micangial interno, que va desde el pronoto hasta las coxas de las patas anteriores. La longitud de este tubo es de 4,2 ± 0,3 mm, ligeramente más corto que en C. columbianus , de 4,69± 035 mm. El diámetro del tubo varía de 38 ± 6 µm en el pronoto, disminuyendo hasta 16 ± 2 µm en la cavidad precoxal abierta; para el caso de C. columbianus el tamaño varía de 130±2 µm, disminuyendo hasta 35 µm, lo cual lo hace más grueso (Giese, 1967). El tubo micangial termina en una invaginación abierta, en la zona pre-coxal de las patas anteriores de los machos. La invaginación es de forma ovoide, con un pequeño agujero, con dimensiones de 23 ± 2 µm de ancho por 34 ± 5 µm, cubierta por setas de mayor tamaño y con gran acumulación de micelio.

Este resultado concuerda con lo descrito por Giese (1967), en la micangia encontrada en C. columbianus y las encontradas en Gnathotrichus sulcatus (Funk, 1970; Farris, 1965); en G. retusus (Doane and Gilliland, 1929; Farris, 1965; Roeper et al. , 1980) y G. materiarius (Batra, 1963; Francke- Grosmann, 1967), las cuales son definidas como un ensanchamiento de las cavidades precoxales. En Dendroctonus ponderosae se presenta esta misma forma de micangia, pero en este insecto se encuentra en los cardines maxilares de las hembras, con un tamaño 15 µm en el eje menor y 28 µm en el eje mayor (Whitney y Farris, 1970).

Al ser el macho el portador de la micangia se sugieren los roles tanto de macho como de hembra, en la reproducción y alimentación de las crías. Ambos sexos tendrían la capacidad de perforar. El macho debe ser el responsable de excavar el sistema de galería, incluyendo las cámaras de desarrollo larval, ya que debe dejar creciendo el hongo ambrosial en las cámaras de cría para que, una vez haya eclosionado los huevos, las larvas puedan alimentarse. Al parecer, cuando realiza la excavación hay una ligera presión en la parte baja del pronoto, produciendo una sustancia aceitosa donde viaja el hongo (Kabir y Giese, 1966; Giese, 1967), la cual es liberada a través de las invaginaciones presentes en las coxas anteriores, garantizando así que las larvas una vez emerjan del huevo, puedan alimentarse del micelio (Wilson, 1959; Kabir y Giese, 1966; Whitney y Farris, 1970; Henriques et al. , 2006).

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CAPÍTULO 4. DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN ENTRE Corthylus zulmae , LOS HONGOS ASOCIADOS Y LA MUERTE DESCENDENTE DE LOS ÁRBOLES DE ALISO.

4.1. Relación entre C. zulmae y hongos ambrosiales

4.1.1. INTRODUCCIÓN

Por lo general el ataque de árboles hospedantes por parte de insectos de la subfamilia Scolytinae es seguido por la proliferación de hongos que pueden tener o no relación con estos. Algunos de los hongos que inician su desarrollo son denominados de tipo oportunista y su calificativo se debe a que aprovechan la lesión hecha por el insecto para propagarse al interior del hospedante. En otras oportunidades hay una simbiosis entre ambos; coleóptero-hongo, siendo los hongos bajo esta asociación denominados como de tipo ambrosial, donde ambos están adaptados morfológicamente para esta interacción simbiótica (Six, 2003).

El objetivo de este estudio fue aislar e identificar posibles hongos ambrosiales a partir de muestras de insectos colectados de las galerías, así como árboles afectados y suelo circundante. Se hipotetiza que Ceratocystis fimbriata es el hongo transportado a través de micangias y causa la muerte en aliso.

4.2 MATERIALES Y MÉTODOS

El análisis de los microorganismos asociados a C. zulmae , que afectan a las poblaciones de aliso, se realizó en lotes que presentaban porcentajes de incidencia superiores al 10% (Tabla 4-1). Los lotes seleccionados fueron: El Popal, La Morena, La Fe y Berlín.

Tabla 4-1: Fincas en los municipios de Manizales, Villamaría y Neira, de donde se fueron colectadas las muestras de Insectos, de lesiones en madera y de suelo.

DEPARTAMENTO MUNICIPIO LOTE % INCIDENCIA Caldas Manizales El Popal 13% Caldas Villamaría Morena 16,6% Caldas Villamaría La Fe 24,13% Caldas Neira Berlín* 18,5%

*Por decisión del propietario, una vez se terminaron los muestreos la población fue eliminada.

62

4.2.1. Colecta de muestras

Muestras de insectos

Los insectos fueron colectados mediante dos técnicas. La primera en árboles con presencia de lesiones, agujeros de perforación, galerías y manchado de la madera, se tomaron trozos de tallo de 25 cm, que fueron debidamente etiquetados y llevados al laboratorio de cría en Cenicafé. La segunda correspondió a la toma directa de los insectos en las perforaciones y galerías. Una vez acopiados, fueron seleccionados por sexo, depositados en viales y fijados en glutaraldehído al 2,5% en buffer fosfato de potasio 0,1 M, pH = 7,2, por 24 horas.

Muestras de madera

Se identificaron cuatro tipos de lesión que se produce en la madera del árbol de aliso, cuando es afectado por C. zulmae . Lesión tipo 1 , cuando hay perforación en el árbol, pero el insecto lo abandona. Lesión tipo 2 , cuando hay construcción de galería. Tipo 3 , cuando el insecto abandona la galería e inicia la degradación de la madera por hongos descomponedores. Tipo 4, cuando hay manchado de la madera y muerte vascular.

Por cada tipo de lesión se tomaron secciones de 4 a 5 cm de longitud, las cuales fueron procesadas en el laboratorio de preparación de muestras de la disciplina de Fitopatología, en Cenicafé, Planalto (Chinchiná, Caldas). Bajo el estereoscopio se observó y describió el tipo de lesión, además de la presencia de signos o estructuras de microorganismos en los tejidos de las galerías causadas por el insecto. La identificación de los aislamientos se realizó en los laboratorios de fitopatología de Cenicafé y de virología del Centro de Agricultura Tropical – CIAT.

Colecta de muestras de suelo

Se recolectaron muestras de suelo alrededor o en la base de individuos afectados por C. zulmae. Los sitios de evaluación fueron aquellos de una alta afectación, como los suelos de la Cuenca de Río blanco y de la finca El Popal en Manizales y de la Finca la Fe en Villamaría, Caldas. Todas las muestras allí obtenidas, fueron conducidas al laboratorio de fitopatología de Cenicafé, para proceder al aislamiento de hongos siguiendo la metodología propuesta por Castro (1994) y Wingfield et al. (1991).

4.2.2. Procesamiento de muestras de insectos

Los insectos fueron transportados desde los sitios de muestreo en trozos de madera de aliso, que contenían galerías causadas por C. zulmae, hasta el laboratorio de Entomología de Cenicafé, para extraer tanto machos como hembras vivas y posteriormente ser desinfestados en permanganato de potasio al 1%. Se acopiaron un total de 25 individuos; machos y hembras. Una vez desinfestados y separados machos y

63 hembras, se procedió a la siembra en diferentes medios de cultivo. Para ello bajo la cámara de flujo laminar, fueron introducidos en forma independiente dentro de cajas de Petri, para que se desplazaran sobre los medios de cultivo, sembrados con PDA y EMA. Las cajas de Petri, fueron depositadas en incubadora, bajo oscuridad, durante 15 días a una temperatura de 25°C. Cuando hubo crecimiento de colonias de hongos se repicaron a nuevas cajas de Petri hasta obtener cultivos puros para su posterior identificación. La observación de estas estructuras de reproducción se hizo al microscopio de luz o al microscopio de contraste de fases. Para las colonias allí obtenidas (Tabla 3-2), se logró el desarrollo de estructuras de reproducción lo que permitió su identificación con las claves de Hanlin (2000) y Barnett (1998). Se corroboró la identificación de los aislamientos, mediante PCR de los ITS del ADN.

4.2.3. Procesamiento de muestras de madera

Para el aislamiento de microorganismos a partir de fragmentos de madera con diferentes grados de afectación, se tomaron secciones de tejidos y se siguieron tres metodologías. 1) Siembra en medios de cultivo, 2) Obtención directa de estructuras mediante siembra en trozos de zanahoria, bajo cámara húmeda y 3) Aislamiento de posibles levaduras mediante dilución en agua destilada estéril.

Para el método 1, de cada muestra se seccionaron trozos de 0,5 cm, los cuales se desinfestaron por inmersión en hipoclorito de sodio al 10% y agua destilada estéril, durante 3 min, y se secaron a temperatura ambiente. Bajo cámara de flujo laminar, la muestra de madera se depositó en cajas de Petri con el medio de cultivo PDA + Tiamina; 5.0 mg/l de medio; EMA, EMYA, SDA, Preparación Jugo V-8 Agar (Anexo C). Posteriormente, las siembras en medios de cultivo, se ubicaron en incubadora a una temperatura de 25°C. Para obtener cultivos puros, una vez se obtuvo crecimiento de colonias fungosas o bacterianas (3-6 días de observación), se realizaron resiembras de cada colonia en nuevas cajas de Petri, con medios de cultivo a base de PDA y EMA + Tiamina (100µg/l).

En el segundo caso, para la obtención directa de microorganismos como Ophiostoma o Ceratocystis, o algunos de sus estados asexuales, se utilizó la técnica de la zanahoria; es decir trozos de las muestras recolectadas se colocaron dentro de rodajas de zanahoria, dejándose en cámaras húmedas dentro de cajas de Petri; la cámara húmeda compuesta por papel toalla y agua destilada (Moller y De Vay, 1968). Las cajas se dejaron en cuarto oscuro bajo temperatura ambiente (22-25°C), hasta la obtención de estructuras características; peritecios o ascomas. Cuando se presentó crecimiento de estos, se pasaron a cajas de Petri con medio de cultivo Agar + jugo V-8 + antibiótico (100 mg/l rifampicina) (Marín et al. , 2003). Se realizaron transferencias a nuevas cajas de Petri con el medio de cultivo hasta obtener colonias puras de los microorganismos, para su posterior identificación.

64

En el tercer caso, cuando se observó crecimiento de levaduras en las galerías, se aislaron mediante la técnica de dilución, utilizando una aguja fina y estéril con la que se tomaron pequeñas porciones de la levadura y se depositaron en tubos de ensayo con agua destilada estéril. Posteriormente esta dilución se sembró en cajas de Petri conteniendo los medios - SDA y medio líquido GYM –050. Las cajas de Petri se dejaron en incubadora, bajo oscuridad a temperatura ambiente (25°C) hasta obtener crecimiento de colonias observando su consistencia y coloración.

La medición del crecimiento de las colonias se realizó en momentos puntuales de la evaluación: 7, 10, 12 y 15 dds. Para ello se tomaron de 3 a 5 réplicas de cada aislamiento y bajo el estereoscopio se hizo el registro del tamaño de la colonia en mm. El crecimiento diario promedio se obtuvo mediante la división del tamaño en mm de la colonia y el número de días a la cual se realizó la evaluación

Adicionalmente se colectaron trozos de madera de aliso sin perforaciones ni lesiones y se les realizó el mismo proceso que a las muestras anteriores.

4.2.4. Procesamiento de muestras de suelo

Para el aislamiento de los hongos en el suelo, se utilizó el sistema de trampeo, que emplea la introducción en el suelo de tallos tiernos de aliso descortezados, de 5 cm de longitud; de tal forma que al estar el hongo presente, ocurra el crecimiento de los peritecios en los tallos, en un período de una a dos semanas (Castro, 1994). Una vez obtenidos peritecios, se separaron suspensiones de ascosporas en tubos eppendorf de 1,5 ml con una solución de 0.5% v/v de Tritón X-100 en agua destilada estéril y se procedió a la inoculación de pequeños pedazos de madera de aliso, ubicados en caja petri bajo condiciones de cámara húmeda. Luego de realizar el procedimiento dos veces se almacenaron los aislamientos en viales con agua destilada estéril a 4°C. Posteriormente, fueron sembradas en los diferentes medios de cultivo utilizados para esta evaluación. Luego de obtenido el medio de cultivo óptimo para el crecimiento del hongo, se procedió a la evaluación de las colonias, observación de estructuras de reproducción y determinación de la tasa de crecimiento.

4.2.5. Identificación de microorganismos.

Identificación taxonómica con base en caracteres morfológicos

A partir de cultivos puros obtenidos, se realizaron sus identificaciones mediante caracterización del cultivo; técnicas morfológicas y moleculares. De cada cultivo se evaluó la consistencia y coloración. Las características morfológicas se determinaron con un microscopio de contraste de fases, con aumentos hasta de 100X, produciendo imágenes con un efecto óptico característico de relieve “3-D”. Las estructuras allí observadas se caracterizaron y compararon con las claves de Barnett y Hunter (1998),

65 de Hanlin (1998), y Cepero de García et al ., (2012) para el filo Ascomycota, Nelson et al. (1983) para Fusarium spp.

Identificación a partir de PCR

En aquellos cultivos donde no fue posible obtener estructuras de reproducción se identificaron mediante amplificación y secuenciación de espaciadores internos transcritos (ITS) de ADN ribosomal. La extracción del ADN se hizo de acuerdo al protocolo de microextracción de Lee y Taylor (1990), con algunas modificaciones (Anexo B). La integridad del ADN se analizó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio (1µl/gel de una solución de 10 mg/ml), a 70 V durante 1 hora en buffer TAE 1X. La observación de las bandas se hizo bajo luz ultravioleta en el analizador de imágenes Image Master VDS Software 2.0 (Hoeffer Pharmacia Biotech).

Los partidores universales ITS1 e ITS4 se utilizaron para amplificar ADN de los aislamientos mediante PCR:

ITS 1: 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3' ITS 4: 5'-TCC CTT TCA ACA ATT TCA CG-3'

La PCR se realizó en un volumen total de 25 µL, la cual contuvo 0,2 mM de dNTPs, 0,2

µM de los partidores ITS 1 de tampón de amplificación de PCR, 0,25 mM de MgCl 2, 1 U Taq ADN polimerasa (Invitrogen®) y 25 ηg de ADN molde. La amplificaci ón se realiz ó en el termociclador PTC-220, donde el programa incluyó un ciclo inicial de 3 min a 94ºC, seguido por 35 ciclos de 30 min a 94ºC, 40 min a 57ºC, y 20 min a 72ºC.

Los fragmentos generados se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa 0,8%. El gel se tiñó con bromuro de etidio para visualizar los fragmentos bajo luz UV. Los pesos moleculares de los fragmentos de ADN se calcularon utilizando el marcador de peso molecular 1 kb plus de Invitrogen®. Teniendo en cuenta la calidad del ADN; la cual se realizó por espectrofotometría, se hizo una nueva reacción duplicando la cantidad del partidor (cebador) y adicionando cuatro veces la cantidad de ADN, para secuenciar los fragmentos amplificados, previa purificación del ADN. Para purificar el ADN, se utilizó el kit para purificación de ADN de QIAGEN®. Se adicionaron 5 vol. de buffer PB a un volumen de la reacción y se llevó a una columna QIAquick. La mezcla se centrifugó a 13000 rpm durante 1 min, descartando el fluido. Posteriormente se adicionaron 750 µl de buffer PE, se centrifugo dos veces a 13000 rpm durante 1 min, descartando en cada paso el fluido.

La columna se ubicó en un tubo nuevo y se adicionó al centro de la membrana 40 µl de buffer EB (10 mM Tris-HCl, pH 8,5). Se dejó durante 3 min a temperatura ambiente y se centrifugó a 13000 rpm durante 2 min. El resultado de la purificación se observó mediante la electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%.

66

Los pesos moleculares de los fragmentos de ADN se calcularon utilizando el marcador de peso molecular 1 kb plus de Invitrogen® (Figura 4-1). Teniendo en cuenta la calidad del PCR, se hizo una nueva reacción duplicando la cantidad de primer y adicionando cuatro veces la cantidad de ADN, para secuenciar los fragmentos amplificados, previa purificación del ADN. Como control negativo (CN) se utilizó Buffer.

Las secuencias obtenidas con los inciadores ITS1-ITS4, se alinearon con las secuencias disponibles en el banco de genes del GenBank (NCBI), mediante el programa BLAST y un análisis filogenético con el Software MEGA 4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis. De los valores generados por el BLAST solo se bajaron las secuencias con el valor de identidad (%) más alto, para poder ser comparadas con los aislamientos obtenidos en este estudio. Los pesos aproximados de las bandas obtenidas con los cebadores ITS1 –ITS4, oscilaban entre los 500 y 650 pb. La salida del BLAST, para el caso del análisis de muestras de ADN diferentes, se organizó por contigs, con superposición de segmentos de ADN, organizados de arriba hacia debajo de acuerdo a su mayor valor de Identidad (%).

Figura 4-1. a. Gradiente de amplificación de ITS con los cebadores ITS1/ITS4. b. Electroforesis de la purificación de ADN, duplicando el cebador (CP).

Muestra MW CP CP mw CP CP Muestra ADN . ADN

500 pb 500 pb

CP Control positivo

4.3 RESULTADOS

4.3.1. Identificación de microorganismos asociados a las lesiones causadas por Corthylus zulmae Wood.

La tabla 4-2 presenta un resumen de los microorganismos que se aislaron por cada uno de los aspectos definidos: Los transportados por insectos, los aislados de la madera; lesiones tipo 1, 2, 3 y 4 (definidas en metodología) y de suelo de plantaciones afectadas por C. zulmae . Cada microorganismo es identificado mediante una serie de características propias como su procedencia, de donde se aisló, cuales son los aspectos de la colonia y estructuras microscópicas.

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Tabla 4- 2: Microrganismos aislados de cada fuente de afectación por C. zulmae: en la madera, en el suelo o transportada por el insecto.

Posible Procedencia Sitio de Características Estructuras Identificación Identificación geográfica aislamiento coloniales microscópicas morfológica molecular Cordyceps Manizales y Color blanco, sinensis (Berk) No Villamaría – No hubo descripción Insecto textura Sacc. identificación Fincas Popal y morfológica. algodonosa. Identidad morfológica La Fe máxima 99. % Phoma Colonia verde glomerata Manizales y oscura a olivácea. (Corda) No Villamaría – No hubo descripción Insecto Reverso de Wollenw. & identificación Fincas Popal y morfológica. color marrón Hochapfel. morfológica La Fe oscuro a Identidad negro, máxima 96. % Colonia Manizales y algodonosa, Hypocrea lixii No Villamaría – Insecto verde clara, No hubo descripción Pat .Identidad identificación Fincas Popal y circulo morfológica. máxima 99% morfológica La Fe concéntrico de color crema. Periconia Micelio compuesto de macrospinosa Manizales y hifas ramificadas, Colonia de Lefebvre & No Villamaría – septadas, hialinas a Insecto color café A.G. Johnson, identificación Fincas Popal y claro, textura marrón pálidas, lisas a in Lefebvre. . morfológica La Fe polvorienta. verruculosas de 3-6 µm Identidad de ancho máxima 93% Colonia de textura Manizales y algodonosa, Microdochium No Villamaría – Insecto color café No hubo descripción sp. Identidad identificación Fincas Popal y claro, con morfológica. máxima 93% morfológica La Fe pequeño estroma central. Manizales y Colonia de Cladosporium No Villamaría – textura No hubo descripción Insecto sp. Identidad identificación Fincas Popal y polvorienta, morfológica. La Fe color mostaza. máxima 100% morfológica Phanerochaet e sordida (P. Manizales y Colonia de Karst.) J. No Villamaría – textura No hubo descripción Insecto Erikss. & identificación Fincas Popal y cremosa, color morfológica. La Fe café claro. Ryvarden morfológica Identidad máxima 97% Marasmius Manizales y Colonia de cladophylus No Villamaría – textura No hubo descripción Insecto Berk. identificación Fincas Popal y cremosa, color morfológica. La Fe mostaza. Identidad morfológica máxima 99% Manizales y Insecto Colonia de No hubo descripción Hypocrea No

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Posible Procedencia Sitio de Características Estructuras Identificación Identificación geográfica aislamiento coloniales microscópicas morfológica molecular Villamaría – textura morfológica. koningii Lieckf. identificación Fincas Popal y aterciopelada, Identidad morfológica La Fe color crema máxima 99% claro, halo central con pequeño estroma rosado claro. Formación de Colonia de pseudomicelio por Manizales y textura filamentación precoz de Candida sp. Villamaría – cremosa, Insecto Blastoconidias. Identidad Candida sp. Fincas Popal y butiracea. Clamidoconidas de forma La Fe Color crema a máxima 88% esférica, pared gruesa y blancuzco. solitarias. Microconidias Crecimiento unicelulares hialinas de 3,53 mm día. Fusarium 11x 5 µm, macroconidias Abundante solani (Mart.) Manizales y Xilema hialinas, curvadas (3-5 micelio aéreo, No Sacc, Clave Villamaría – (madera) tabiques), cilíndricas, de color rosado identificación de Nelson et Rio Blanco y (lesión tipo 19 x 5 µm. Monofiálides pálido en PDA molecular. al ., 1983. La Fe. 1) con y sin ramificar. y crema a Descripción Clamidospora individual blanco en Gil et al ., 2004 o en pares, globosa, 5,2 SDA. x 5 µm. Crecimiento 4 Microconidias ovales, de mm día. 8,4 x 2,4 µm producidas Fusarium Fusarium Abundante en fiálides simples. , oxysporum oxysporum Manizales y Xilema micelio aéreo, macroconidias (Schlent). (Schlent). Villamaría – (madera) color rosado fusiformes, 3-5 tabiques, Emend. Snyd. Emend. Snyd. Rio Blanco y (lesiones claro, en PDA, cilíndricas, de 41,2 x 4,7 & Hans & Hans. La Fe tipo 1 y 4) matices µm, producidas en Clave de Identidad púrpuras, esporodoquios laterales. Nelson et al ., máxima 99% bronce o Clamidospora individual 1983. naranja. o en pares, 4,5 x 5,3 µm. Crecimiento Blastoconidias unidas de linealmente, formando Manizales y pseudomicelio pseudohifas. Xilema Villamaría –, aeróbico, Artroconidas de 1,5 x 9,5 Candida sp. Clave de (madera) Popal, Rio blanco, tenue, µm., globosas de 6-12 Identidad Kurtzman, (lesiones Blanco y La débil, con la µm de diámetro. Células máxima 88% 1998. tipo 2) Fe. parte central vegetativas esféricas a ligeramente elongadas, 2,5 x 11,0 elevada. µm. Esporangios globosos, hasta de 70 µm de Manizales y En PDA Mucor Xilema diámetro. Esporangioforo Villamaría –, Crecimiento hiemalis Claves de (madera) liso, de 8- 14 µm de Popal, Rio de 3,5 mm día, Wehmer. Schipper, (lesiones ancho. Esporas Blanco y La color crema Identidad 1973. tipo 3) elipsoidales, tamaño Fe. amarillento. máxima 88% variable; 4 -8,7 por 2,7 a 5,4 µm. Manizales y Xilema En PDA Sinemas con talos No Pesotum sp.

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Posible Procedencia Sitio de Características Estructuras Identificación Identificación geográfica aislamiento coloniales microscópicas morfológica molecular Villamaría –, (madera) crecimiento de oscuros a negros. identificación Determinación Popal, Rio (lesiones 6 mm día, Cabezuelas blancas y molecular Bertha Lucía Blanco y La tipo 4) color rosa luego naranja- rojizas. Castro- Fe. pálido a Individual o formando Jolanda Roux cremoso. En pequeños coremios. EMA 5,3 mm Conidias holoblásticas, día, coloración aseptadas, elipsoides a de blanco ovoides de 4,8 a 7,65 µm cremoso a de largo por 2,6 a 6,3 café µm. En PDA coloración Ascocarpos ostiolados, cremosa a de color negro, con café claro (a cuello largo de 75-140 Ophiostoma Manizales y los 7 días) µm de diámetro por 230- Xilema sp. Villamaría –, posteriormente 640 µm de largo. No (madera) Ref. De Beer Popal, Rio café Ascosporas unicelulares, identificación (lesiones et a l., 2013. Blanco y La amarillenta y hialinas, aseptadas, molecular tipo 4) Bertha Lucía Fe. al final cilíndricas (forma de Castro grisáceo con almohada), 9- 12,9 µm. un halo central de largo por 4,2 a 6,2 µm blanco de ancho. grisáceo. Crecimiento 2 mm día. 5 dds Microconidias ovales, de color rosado 8,4 x 2,4 µm producidas claro, y centro en fiálides simples, Fusarium Manizales y rosado. 15 macroconidias oxysporum Clave de Villamaría – dds, micelio fusiformes, 3-5 tabiques, Suelo (Schlent). Nelson et al ., Fincas Popal y color café cilíndricas, de 41,2 x 4,7 Emend. Snyd. 1983. La Fe. claro, con µm, producidas en & Hans círculo esporodoquios laterales. periférico Clamidospora individual crema y centro o en pares, 4,5 x 5,3 µm. rosado. Colonia Manizales y algodonosa de Micelio hialino. Conidios Clave de Villamaría – Trichoderma Suelo crecimiento verdes. Conidióforos Jaklitsch, Fincas Popal y sp . verde oscuro ramificados. 2009. La Fe. en PDA. Esporangios globosos, hasta de 70 µm de En PDA Mucor Manizales y diámetro. Esporangioforo Crecimiento hiemalis Clave de Villamaría – liso, de 8- 14 µm de Suelo de 3,5 mm día, Wehmer. Schipper, Fincas Popal y ancho. Esporas color crema Identidad 1973 La Fe. elipsoidales, tamaño amarillento. máxima 88% variable; 4 -8,7 por 2,7 a 5,4 µm.

70

4.3.2. Identificación de hongos a partir de los insectos

Los insectos una vez se desplazaban sobre el medio de cultivo (Figuras 4-2 y 4-3), liberaban estructuras de reproducción de hongos, los cuales iban germinando y desarrollando la colonia sobre este, semejando una situación similar al ataque del insecto al árbol.

Figura 4-2. Siembra de insectos hembras de Corthylus zulmae en PDA a. Inicio del recorrido por la caja petri en medio de cultivo. b. Crecimiento de micelio 7 días posterior a la siembra. c. Crecimiento en forma radial de los hongos trasportadas por la hembra.

a b c

Figura 4-3. Siembra de insectos machos de C. zulmae en PDA a. Recorrido del macho por la caja petri en medio de cultivo . b. Crecimiento de pseudomicelio. c. Crecimiento de pseudomicelio en forma irregular dentro del medio de cultivo.

a b c

Caracterizacion molecular de los microorganismos transportados por el insecto.

En la tabla 4-3 se presenta la descripción de las colonias desarrolladas cuando los insectos se desplazaban a través del medio de cultivo. Se realizaron dos procesos de siembra, el primero de insectos colectados en cámaras de cría, aún con presencia de pseudomicelio (figuras 4-4 y 4-5) y el segundo de galerías abandonadas con crecimiento de hongos miceliales (figura 4-6 a 4-9). En la tabla 4-4 se presenta los resultados de la

71 secuenciación de los aislamientos. El gradiente de amplificación de los ITS y la electroforesis es presentado en la figuras 4-4 y 4-5.

Tabla 4-3: Aislamientos asociados al cuerpo de los insectos

Adulto Código Descripción Macho Hembra 1. fig. 4-4 X Colonia de color blanco, textura algodonosa. 2. fig. 4-4 X Colonia aterciopelada, verde oscura a olivácea. Reverso de color marrón oscuro a negro. 4. fig. 4-4 X Colonia algodonosa, verde clara, circulo concéntrico de color crema. 5. fig. 4-4 X Colonia de color café claro, textura polvorienta. 6. fig. 4-4 X Colonia de textura algodonosa, color crema, con pequeño halo central color café claro. 7. fig. 4-4 X Colonia de textura cremosa, color café claro. Colonia aterciopelada, verde oscura a marrón. Centro 8. fig. 4-4 X marrón oscuro 1. fig. 4-5 X Colonia de textura polvorienta, flocosa, color mostaza. Colonia de textura polvorienta, cremosa, color café 2. fig. 4-5 X claro, con crecimiento oscuro donde se desplaza el insecto. 4. fig. 4-5 X Colonia de textura cremosa, color blanco- cremoso, con bordes de color marrón. 5. fig. 4-5 X Colonia de textura aterciopelada, color rosado pálido, halo central con pequeño estroma rosado claro. Consistencia cremosa, butiracea, de color amarillento a 6. fig. 4-5 X blanco. Reverso de color blanco.

Tabla 4-4: Resultado de la secuenciación de los aislamientos hechos de los microorganismos transportados por insectos.

Max. E Cobe Cod. Resultado Macho Hembra Ident. (%) value (%) 1. fig. 4-4 Cordyceps sinensis 99 0 85 X 2. fig. 4-4 Phoma glomerata 96 0 96 X 4. fig. 4-4 Hypocrea lixii 99 0 98 X 5. fig. 4-4 Hypocrea lixii 98 0 71 X 6. fig. 4-4 Periconia macrospinosa 93 0 96 X 7. fig. 4-4 Phoma glomerata 97 0 96 X 8. fig. 4-4 Microdochium sp. 92 0 96 X 1. fig. 4-5 Cladosporium sp 100 0 99 X 2. fig. 4-5 Phanerochaete sordida 97 0 97 X 4. fig. 4-5 Marasmius cladophyllus 99 0 95 X 5. fig. 4-5 Fusarium oxysporum 99 0 98 X 6. fig. 4-5 Candida sp . 99 0 100 X

Cód: código; Max Ident: máxima identidad; Cobe: cobertura

72

Figura 4-4.a. Gradiente de amplificación de ITS con los cebadores ITS1/ITS4, para 7 de los aislamientos. b. Electroforesis de la purificación del ADN .

mw 1 2 CP 4 5 6 7 8 CN mw mw 1 2 CP 4 5 6 7 8 CN mw

500 pb 500 pb Mw: 1 kb plus Mw 1 kb plus CP: control positivo CP: control positivo CN: control negativo CN: control negativo

Figura 4-5.a. Perfil de la amplificación de la PCR. Aislamientos 1 – 6: obtenidos a partir de adultos, hembras y machos de C. zulmae en medios de cultivo. b. Perfil de la amplificación de la purificación del ADN. Aislamientos 1 – 6: obtenidos a partir de adultos de C. zulmae .

mw 1 2 3 4 5 6 7 8 9 mw mw 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CN mw

603 pb

mw: Phix174/HaeIII mw: Phix174/HaeIII

Caracterizacion morfológica de los microorganismos asociados a los insectos

Las colonias que se desarrollaron fueron inicialmente caracterizadas, por su forma y la tonalidad que presentaban (Tabla 4-3). Una vez obtenidas se relacionaban con la lesión que estaban produciendo en la madera, tanto los machos (Figuras 4-6), como las hembras (Figura 4-7).

El proceso de caracterización morfológica de los aislamientos obtenidos a partir de la siembra de individuos adultos se realizó a través de la identificación molecular. Para la mayoría de los aislamientos, considerados como patógenos débiles o antagonistas, no se corroboró la identificación con características morfológicas. Para los hongos identificados como saprófitos o que su patología podría producir daños en la madera se realizó la identificación de caracteres morfológicos.

73

Figura 4-6.Crecimiento en medio PDA de los microorganismos asociados al cuerpo de hembras de Corthylus zulmae a. Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. b. Hypocrea lixii Pat. c. Microdochium sp.

a b c

Figura 4-7. Crecimiento en medio PDA de los microorganismos asociados al cuerpo de adultos machos de C. zulmae a y b. Phoma glomerata (Corda) Wr. & Hochapf c. Periconia macrospinosa Lefebvre & Aar. G. Johnson.

a b c

Aislamientos de los microorganismos de insectos colectados en la galería.

Se realizó la siembra de individuos que estaban dentro de las galerías, que ya no se estaban alimentando y se les realizó el mismo proceso anterior. Los resultados de la secuenciación de estos aislamientos son presentados en la tabla 3-4. Las colonias que se desarrollaron fueron inicialmente caracterizadas, por su forma y la tonalidad que presentaban, para poder relacionarlas con la lesión que estaban produciendo en la madera (Figuras 4-8 a 4-12). No hubo descripción de sus características morfológicas.

74

Figura 4-8. Aislamientos del cuerpo de adultos machos de C. zulmae creciendo en PDA . a. Crecimiento micelial de Cladosporium sp. b. Crecimiento de micelio, 40X. c. Conidióforos de Cladosporium sp., 40X.

a b c

Figura 4-9. Aislamientos del cuerpo de adultos machos de C. zulmae creciendo en PDA . a. Crecimiento micelial de Phanerochaete sordida (P. Karst.) J. Erikss. & Ryvarden b y. c . Clamidosporas 40X .

a b c

Figura 4-10: Aislamientos del cuerpo de adultos de hembras de C. zulmae creciendo en PDA . a. Crecimiento micelial de Marasmius cladophylus Berk ., 15 días dds b. Crecimiento de micelio 25 días dds . c. Micelio y Clamidospora 40X.

a b c

75

Figura 4-11. Aislamientos del cuerpo de adultos de C. zulmae , creciendo en PDA al 2%, a 25°C, bajo oscuridad. a y b. Fusarium oxysporum Schlent. Emend. Snyd. & Hans. [S&H, M&C] en adultos machos, 18 dds. b y c. Formación de microconidias en fiálides cortas.

a b c d c

Figura 4-12. Aislamientos del cuerpo de machos de C. zulmae a - b crecimiento de pseudomicelio de Candida sp . en PDA, 18 dds a 25°C, bajo oscuridad. c. Crecimiento en jugo V8, 8 dds. d. Blastoconidias de Candida sp. e. Clamidoconidias (40X). f. Formación de pseudomicelio por unión de blastoconidias, 40X. (Fotografías e-i microscopio de luz, tinción azul de metileno).

a b c

d e f

4.3.3. Identificación de microorganismos asociados a las lesiones en la madera, causadas por C. zulmae Wood

El procesamiento de las muestras de madera permitió identificar diferentes tipos de lesiones, producidas por el ataque de C. zulmae , las cuales pudieron ser catalogadas de tipo 1 a tipo 4, de acuerdo al nivel de daño y a la afectación producida a la madera de

76 aliso. El tipo de daño asociado a la lesión, así como los microorganismos asociados se presentan a continuación.

Lesión tipo 1. Se presenta cuando el árbol es perforado por C. zulmae y no hay construcción de galerías. Es la lesión más frecuente, por lo general las perforaciones se encuentran vacías y la madera presenta un manchado inicial de color marrón oscuro a ferruginoso, que avanza longitudinalmente a la perforación, manchando incluso la corteza de una tonalidad parda ferruginosa (Figura 3-13).

Figura 4-13. Lesión tipo 1 causada cuando C. zulmae perfora árboles de aliso. a, b y c. Manchado marrón a pardo- ferruginoso. d, e y f. Avance de la lesión, tonalidad rojiza a pardo-rojiza, afectando tanto corteza como xilema.

d e f

Lesión tipo 2 . Hay construcción de galería por parte del insecto, se presenta un manchado en la madera de color pardo rojizo, que avanza longitudinalmente de acuerdo con la forma de la galería, afectando los haces vasculares y las células del parénquima. (Figura 4-14).

C. zulmae hace galerías poco ramificadas, extendidas en un plano horizontal. El eje principal de la galería penetra más profundo que cualquiera de sus ramas, puede extender hasta 7 bifurcaciones; pero 3 – 4 bifurcaciones es lo más común. Las cámaras son utilizadas para la cría de huevos, para la alimentación de las larvas y para el desarrollo de los individuos hasta su madurez, son cortas, 5 - 6,5 mm de largo y alrededor de 2,5 mm de diámetro (Figura 4-14)

77

Figura 4-14. Lesión tipo 2 . Detalle de la galería construida por C. zulmae . a. Elaboración de la galería principal. b. y c. Galería principal y ramificación. d. Galería principal discontinua y 4 ramificaciones. e. Galería principal más profunda f y g. Crecimiento de micelio y hasta 7 ramificaciones (número máximo encontrado).

a b c d

e f g

La Lesión tipo 3 se produce cuando las larvas de C. zulmae , han abandonado la galería y agotado el alimento que allí crecía. La galería toma una coloración oscura e inicia un crecimiento blanquecino, a manera de moho, que produce ablandamiento y degradación de la madera (Figura 3-15). Esta lesión precede la presencia de hongos causantes de la muerte vascular.

Figura 4-15. Lesión tipo 3, c oloración oscura en la galería una vez el insecto la ha abandonado. a. Galería recién abandonada b – d. Crecimiento blanco, a manera de moho, creciendo al interior de las galerías. e - f. Lesión oscura producto del necrosamiento del xilema.

a b c

e f

d

78

La lesión tipo 4 , corresponde a un manchado irregular, oscuro, en forma radial en el xilema, el cual es producto de la muerte vascular (Figura 4-16). Aunque se presenta en la totalidad de la altura donde está el ataque del insecto, el tamaño de la lesión es mucho mayor en la base del árbol. El manchado se produce por la muerte vascular, que ocasiona que no haya una buena circulación de nutrientes desde la raíz a las hojas, del árbol, ocasionando inicialmente una alta emisión de rebrotes y posteriormente la muerte descendente de los individuos.

Figura 4-16. Lesión tipo 4 . a - c Manchado en forma irregular, concentrado en el duramen del árbol y disperso en dirección radial. d -f. Manchado de color pardo rojizo, dispuesto en forma radial, unidireccional, producto de la muerte vascular

a b c

d e f

Caracterizacion molecular de los microorganismos asociados.

La identificación de los microorganismos presentes en las lesiones, catalogadas como de tipo 1 a 4, se realizó mediante PCR, con marcadores ITS1 a ITS4. El resultado de la electroforesis y de la amplificación del ADN, se presentan en la figura 3-17a. Al editar los resultados de la secuenciación mediante el programa BLASTN y al compararlos con las secuencias inscritas en el banco de genes del GenBank, se obtuvieron los resultados presentados en tabla 3-5. La integridad del ADN se determinó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% teñido con bromuro de etidio (Figura 4-17b). Los fragmentos de ADN utilizados corresponden a una longitud de 603 pb (Figura 4-18).

79

Figura 4-17. a. Electroforesis en gel de agarosa 1% del ADN total. Aislamientos 1 – 6: obtenidos a partir de Insectos. 7. Aislamiento de pseudomicelio cámara pupal. 8: macerado directo del hongo de la galería (lesión tipo 2). 9. aislamiento de galería. b. Perfil de la amplificación de la purificación del ADN. mw 1 2 3 4 5 6 7 8 9 mw mw 1 2 3 4 5 6 7 8 9 mw

mw: Phix174/HaeIII mw: Phix174/HaeIII

Figura 4-18 . a. Electroforesis en gel de agarosa 1% del ADN total. Aislamientos 1 – 6: obtenidos a partir de Insectos. 7. Aislamiento de pseudomicelio cámara pupal. 8: macerado directo del hongo de la galería (lesión tipo 2). 9. aislamiento de galería. CN. Control negativo. mw 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CN mw

603 pb mw: Phix174/HaeIII

Tabla 4-5: Resultado de la secuenciación de los aislamientos hechos de los microorganismos transportados por insectos, lesiones tipo 1 y 2.

Máx E Cob. Aislamiento Resultado Ident. (%) value (%) 8- fig. 4-17 Contaminado - - - Fusarium sp. 100 0 100 5- fig. 4-17 Fusarium oxysporum 99 0 100 7- fig. 4-17 Clonostachys sp. 99 0 97 9- fig. 4-17 Hypocrea koningii 99 0 98 3- fig. 4-17 Hongo no cultivado 99 0 97 4- fig. 4-17 Marasmius cladophyllus 99 0 95 6- fig. 4-17 Candida sp. 88 0 90

Aisl: aislamiento Max Iden: máxima identidad E val: value Cob : cobertura

80

Descripción morfólogica de los microorganismos asociados, por cada tipo de lesión.

Las muestras que contenían cada una de las lesiones fueron procesadas e identificados los hongos filamentosos y levaduras asociadas, a cada una de ellas. En cada uno de los aislamientos realizados, eran sembrados muestras control o testigo de material sano, lo que permitió en un momento dado inferir la presencia de contaminantes (Figura 4-19).

Figura 4-19. Muestras control de material sano, sembrado en varios medios de cultivo y observados 15 días después de la siembra a 23° C ± 2. a. EMYA b. PDA. c. Sabouraud

a b c

Lesiones tipo 1. Esta lesión fue la más frecuente en el campo, y de allí se aislaron dos especies de Fusarium, los cuales morfológica y molecularmente se identificaron como Fusarium solani (Mart.) y Fusarium oxysporum (Schlent.) (Figuras 4-20 y 4-21). La especie Fusarium solani , solo se encontró en los puntos de perforación recientes.

Figura 4-20. Lesión causada por F. solani , al perforar los árboles de aliso. a. Manchado pardo- ferruginoso. b. crecimiento en PDA 12 dds. c. Crecimiento en Sabouraud 12 dds. d. Formación de micelio aéreo y de microconidias (40X) e. Microconidias y conidióforo, (40X). f. Conidióforo (100X). g. Macroconidias (100X).

a b c

d e f g

81

Figura 4-21 .a. Manchado en madera por F. oxysporum, en las inmediaciones de las perforaciones . b. Crecimiento de F. oxysporum en PDA 7 dds. c. En sabouraud 7 dds d. En PDA 7 dds, coloración naranja oscuro. e. Microconidias producidas en fiálides cortas, 40X f. Microconidias en falsas cabezuelas, 40X. g - h. Variabilidad de macro y microconidias. i - k. presencia de células en la parte axial y basal en macroconidias 100X. l - n. Clamidosporas 100x. l. Solitarias. n y m. En pares. (Fotografías en microscopio de contraste de fases).

a b

c d

e f g h

i j k

l m n

82

Lesión tipo 2. Esta lesión se presenta cuando el insecto, para el desarrollo de su progenie, elabora la galería y una vez elaborada, se inicia el crecimiento micelial de un hongo del cual se alimentan las larvas una vez estas eclosionan. Durante los diferentes estados de desarrollo larval del insecto, este hongo es la fuente única de alimento. (Figura 4-22).

Figura 4- 22. Formación de cámara pupal de C. zulmae al interior de la galería a y b . Crecimiento de hongo del cual se alimentaran las larvas. c. Alimentación de la larva recién emergida del hongo que crece en cámara de empupación. d. Últimos estados larvales aun alimentándose de hongo (Fotografías a y b. Jorge Jaramillo et al. , 2011, c y d. Franco 2004).

a b

c d

El crecimiento del hongo que se observa en las cámara púpales, fue repicado a diferentes medios de cultivo (Anexo C), para observar estructuras de reproducción, que se utilizaron como caracteres morfológicos, para obtener una identificación taxonómica de la especie que allí se estaba desarrollando. Se identificó la levadura Candida sp.

En PDA la morfología de la colonia presentó un crecimiento aeróbico blanco - tenue, débil, de consistencia mantequillosa (butirácea), brillante o semi- brillante, ligeramente convexo, con una pequeña depresión central. En EMA y SDA, 12 días después de la siembra, a una temperatura de 25 °C, presentó una colonia blanca, extendida en forma radial, con la parte central ligeramente elevada, a manera de un pequeño pezón; por el reverso se observó una coloración parda - ferruginosa. En estos dos medios de cultivo Candida sp. produjo pseudomicelio. En Jugo V8 Agar, las colonias fueron blancas,

83 esparcidas, muy poco uniformes, aplastadas y con poca formación de pseudomicelio (Figura 4-23 y 4-24).

Figura 4-23 . Desarrollo de Candida sp., en diferentes medios de cultivo. a. Colonias de crecimiento en medio EMA, 12 dds. b. En jugo V8, 12 dds. c. En PDA 12 dds. d y e. Desarrollo de tubo germinal (filamentación precoz), 100 X. f. Formación de blastoconidias y de tubo germinativo, el cual da origen a pseudohifas, 100X g y h. Células vegetativas dividiéndose por meiosis, para obtención de ascosporas (100X). i-k. Clamidosporas, como estructuras de resistencia y de acumulación de nutrientes (100X). (Fotografías en microscopio de contraste de Fases), (40X).

a b c

d e f g

f h i j k

j

84

Figura 4-24 . Estructuras de reproducción de Candida sp., en EMA y SDA, aislada de galería, 12 dds, a 25°C, bajo oscuridad. a. Formación de pseudohifas por unión de artroconidias. b. Formación de artroconidias. c y e. Formación de células vegetativas (40X). d - i. Células vegetativas (100X). f - g. Células vegetativas creciendo directamente sobre pseudohifas (40X) h. Células vegetativas dividiéndose para liberación de ascosporas. j. Formación de pseudomicelio por unión de artroconidias y liberación de células vegetativas (40X). k. formación de pseudomicelio por división de pseudohifas l. Formación de pseudomicelio por entrecruzamiento de pseudohifas. (Fotografías microscopio de contraste de Fases).

a b c d

e f h

j

g

i j k l

Lesiones tipo 3 : Se presenta cuando el insecto ha abandonado la cámara pupal y la galería se cubre de micelio y de esporangios. El hongo aislado correspondió al género Mucor y la especie Mucor hiemalis Wehmer (Figura 3-25). Las colonias en PDA fueron de color crema a amarillenta, de textura algodonosa, crecimiento de 3,5 mm día en promedio, bajo oscuridad a temperatura ambiente de 25 º C.

La lesión estuvo cubierta por una gran cantidad de esporangioforos de color crema blancuzco. Esporangioforo liso, con gotas aceitosas dentro, 8-12 µm, hasta 14 µm de ancho, usualmente simple, y posteriormente ramificado (Figura 4-25). Esporangios globosos, inicialmente amarillentos y luego de tonalidad de marrón – pálido, 39 µm hasta

85

65 µm de diámetro; la mayoría entre 35-47 µm de diámetro. En las descripciones de Baijal y Mehrotra (1965), definen tamaño de esporangios hasta de 70 µm.

Figura 4- 25. Crecimiento micelial de Mucor hiemalis , en las galerías de árboles afectados. a - c Esporangioforo largo (fotografía al Estereoscopio). d -e. Colonia blanco cremosa, creciendo en PDA y f -g. Esporas ligeramente oblongas, liberados del esporangio; 40X, fotografías tomadas en agua destilada mediante microscopía de luz. h. Esporangioforo, columella y esporas, 40X. i. Liberación de esporas y collar en columella, 40X (Fotografías h – i microscopio de contraste de fases).

a b c

d e f

g h i

Lesiones tipo 4 . Se pudo observar en las cámaras de cría que una vez las larvas han finalizado su desarrollo y han agotado el micelio en las galerías, se inicia el crecimiento de estructuras de reproducción de hongos vasculares; peritecios, sinemas o esporangióforos. Una vez los adultos abandonaban la cámara pupal y el hongo utilizado para su construcción es agotado, las galerías van tomando una coloración negra y alrededor de la galería se observa un manchado de color marrón – rojizo claro. La lesión de este tipo se presenta por la acción hongos fitopatógenos, siendo dos tipos de hongos los más frecuentemente encontrados, ambos pertenecientes al grupo de los Ascomycetes. El primero correspondió a hongos Ophiostomatoides, en su fase asexual o

86 anamorfa, identificada como Pesotum sp. y su fase telemorfa o sexual Ophiostoma sp. La lesión producida, fue de forma irregular, marrón oscura, dispuesta en forma radial y de una mayor concentración en la base del árbol (Figuras 4-26, 4-27, 4-28 y 4-29). El segundo tipo correspondió a Fusarium oxysporum (Schlent.) , la cual se dispuso en forma longitudinal, paralela a la perforación hecha por el insecto y de color pardo-ferruginosa.

Figura 4- 26. Sinemas de Pesotum sp., creciendo directamente en las galerías hechas por Corthylus zulmae, o a lo largo de las lesiones realizadas por el insecto. a - c. Sinemas con cabezuelas de color blanco. d - g. Sinemas de cabezuelas color rojo - anaranjado.

a b c d

e f g

Las formas sexuales comúnmente producen ascomata con cuellos, largos, terminando en gotas pegajosas, que son fácilmente dispersables por insectos. Las estructuras asexuales presentan conidióforos erectos, con esporas pegajosas en sus ápices (Figura 22).

El género anamorfo Pesotum, fue establecido para clasificar especies que presentaban conidióforos sinematosos o mononematosos, con células conidiogenas, con proliferación en forma simpoidal (Wingfield et al, 1991). Alrededor de 11 especies, inicialmente identificadas como Graphium y relacionadas con Ophiostoma fueron transferidas a Pesotum (De Beer et al, 2013 )

Sinemas Con talos oscuros; café oscuro a negro, con conidióforos de igual forma que Penicillium, al final con una cabezuela viscosa (limosa) de color inicialmente blanco y luego naranja- rojizo. Se desarrollan en forma individual o pequeños grupos, por lo que los coremios son pequeños.

87

Figura 4-27 . Crecimiento de Pesotum sp. en diferentes medios de cultivo, 12 dds, a 25°C, bajo oscuridad. a. en Jugo V8 b. en PDA. c. En SDA. d - e. Sinemas de Pesotum y liberación de conidias (40X). f. Conidióforos unidos por la base y con desarrollo simpoidal. g. Conidiogénesis en Pesotum sp. h- i. Desarrollo simpoidal en conidióforos de Pesotum sp. (40X). j-k. Conidias holoblásticas en forma reniforme de Pesotum sp. (100X). l-m Conidias de Pesotum sp. creciendo directamente en la coxa anterior del macho de C. zulmae (Fotografías d – g; i – k en microscopio de contraste de fases; l - m Microscopio de Barrido Ambiental (SEM), laboratorio de Virología del CIAT).

a b c

d e f

g h i

j k l m

88

Figura 4- 28 .Ophiostoma sp., desarrollado en galerías hechas por C. zulmae . a y b. Ascomatas creciendo en rama de aliso. c y d. Ascomatas (peritecios), creciendo en madera puesta en cámara húmeda (a - d fotografías al estereoscopio). e y f. Crecimiento de micelio y formación base del ascoma. g y h. Formación base del peritecio. i - j. Peritecio y ascocarpo con hifas ostiolares. k – n. Ascosporas cilíndricas, hialinas, aseptadas 100x (Fotografías e-k, Microscopio de luz, aumento 40 X, sin tinción y en agua destilada. l - n, microscopio de contraste de fases).

a b c

d e f

g h i j

k l m n

89

Figura 4-29.Aislamiento de ascomatas (peritecios) de Ophiostoma sp., creciendo en galería hecha por Corthylus zulmae . a. Crecimiento de ascomatas en galerías. b. crecimiento en PDA al 2%, 7 dds a 25°C, bajo oscuridad. c. Crecimiento en PDA al 2%, 15 dds.

a b c

4.3.4. Identificación de hongos a partir de muestras de suelo

Se colectaron muestras de suelo de las plantaciones afectadas por C. zulmae en la finca el Popal y La Fe, respectivamente. Una vez en el laboratorio de Fitopatología de Cenicafé, fueron ubicadas en cajas galleteras y extraídos los fragmentos de ramas y restos de hojarasca.

El suelo se humedeció con agua destilada, se sembraron los tallos tiernos de aliso previamente descortezados y se colocaron rodajas de zanahoria sobre la superficie (Figura 3-30). Los tallos de aliso y las rodajas de zanahoria se desinfestaron mediante inmersión en hipoclorito de sodio al 0,1%, y posterior lavado con agua destilada estéril.

Figura 4-30 . “Trampeo” utilizado para aislamiento de microorganismos del suelo. a y b. rodajas de zanahoria y tallos “tiernos” de aliso descortezados, sembrados en muestras e suelo. c. Porción de suelo entre rodajas de zanahoria a manera de Sándwich.

a b c

Las estructuras de los microorganismos que crecieron en las rodajas de zanahoria y en los tallos de aliso, se sembraron en PDA, y se repicaron a los 7 días para obtener el cultivo puro. Los aislamientos que se obtuvieron se ilustran en las figuras 4-32 a 4-34.

90

Caracterizacion molecular de los microorganismos asociados.

La identificación se realizó mediante la comparación de las estructuras de los microorganismos observadas al microscopio con los géneros de las claves de Hanlin (1998) y Barnett y Hunter (1998). Igualmente la identificación de estas colonias, se realizó mediante PCR de los (ITS) del ADN. (Figura 4-31).

Se codificaron los aislamientos, con base en la forma y coloración que presentaba la colonia en PDA (Tabla 4-6), y con igual codificación se realizó la identificación mediante PCR (Tabla 4-7).

Tabla 4- 6: Aislamientos asociados al suelo y fragmentos de madera sembrados en suelo, procedente de plantaciones afectadas por C. zulmae .

Código Suelo Corteza Descripción S1 X Colonia algodonosa, de color rosado claro. C6 X Colonia granulosa, color verde oliva C5 X Colonia algodonosa, coloración rosa con tintes naranja. C1 X Colonia de textura algodonosa, color crema claro,

Figura 4-31.a. Gradiente de amplificación de ITS con los cebadores ITS1/ITS4. b. Electroforesis de la purificación del ADN

Tabla 4- 7: Resultados de la secuenciación.

Cód. Resultado Max E value Cobe Ident (%) (%) S1 Fusarium oxysporum 99 0 79 C6 Trichoderma sp. 99 0 97 C5 Fusarium oxysporum 99 0 99 Ambomucor seatoinflatus 88 0 94 C1 Mucor hiemalis 86 0 96

Cód: código Max Ident: máxima identidad Cobe: cobertura

91

Al alinear las secuencias de las muestras S1 (aislado del suelo) y C5 (aislado de la madera enferma), se encontró una identidad del 99%, lo que sugiere que la especie Fusarium oxysporum encontrado en las lesiones tipo 4, probablemente ingresaron al árbol a través de las heridas causadas por C. zulmae .

Caracterizacion morfológica de los microorganismos asociados

Figura 4-32 . a. Colonia de Trichoderma sp. en PDA- 7 días después de la Siembra. b. conidias de color verde c. Micelio y conidias de Trichoderma sp.

a b c

Figura 4-33. Aislamientos de Fusarium oxysporum presente en el suelo de plantaciones afectadas. a. Crecimiento en PDA al 2%, 7 dds a 25°C, bajo oscuridad. b. 12 dds. c. 25 dds. d. Microconidias y formación profusa de micelio aéreo. e. Microconidias y formación de Clamidosporas. f. Microconidias producidas en fiálides cortas (Fotografías d-f en microscopio de contraste de fases).

a b c

d e f c

92

Figura 4-34 :a. Crecimiento en PDA de Mucor hiemalis 18 días después de la siembra, a 25°C, bajo oscuridad. b. Formación de columella y liberación de esporangiosporas. c. Esporangiosporas de paredes lisas y elipsoidales. (Fotografías b-c en microscopio de contraste de fases).

a b c

4.4. DISCUSIÓN

De manera preliminar se identifica a Candida sp. como posible microorganismo ambrosial a partir del cual se pueden estar alimentando los estados biológicos de C. zulmae en los túneles al interior de los árboles de aliso. Las perforaciones realizadas por el insecto parecen ser usadas por hongos fitopatógenos que posteriormente ocasionan el marchitamiento y muerte de los árboles. Los hongos fitopatógenos mas comunes correspondieron a Ophiostoma sp. y Fusarium oxysporum . Los resultados aquí encontrados no permiten corroborar la tercera hipótesis de trabajo, dado que Ceratocystis fimbriata no fue aislado de ninguno de los individuos estudiados.

Uno de los mayores daños en los árboles de aliso se presenta con la formación de las galerías y cámaras de cría de la progenie, ya que los insectos excavan galerías en la madera, con cuatro a siete ramificaciones, lo cual puede producir heridas de hasta 10 cm de profundidad. La importancia del daño, producida por barrenadores de la subfamilia Scolytinae, es ratificada por Rojas y Gallardo (2004), en plantaciones de Pinus radiata en Chile, donde la afectación por Hylastes ater , Hylurgus ligniperda y Orthotomicus erosus , alcanzó niveles de daño económico, además de la facultad de estos individuos para afectar y matar árboles vivos o árboles debilitados, caídos o trozas de madera dejadas en el terreno.

Los hongos de mayor frecuencia encontrados al interior de las galerías hechas por C. zulmae en árboles de aliso, en los aislamientos hechos corresponden al hongo Pesotum sp. y su estado telemorfo Ophiostoma sp. El crecimiento de pseudomicelio presente en las galerías y las micangias de los machos de C. zulmae , corresponden a la levadura Candida sp., la cual en los BLAST de la PCR realizada, tiene una probabilidad del 82% de ser C. mycetangii Kurtzman (Kurtzman, 2000). Se debate si esta levadura puede tener un uso como ambrosial, o si bien se trata de alguna contaminación. En Corthylus

93 columbianus , se reporta la levadura Pichia sp. (Kabir y Giese, 1966) como microorganismo ambrosial. En Persea borbonia igualmente se presenta una levadura creciendo en las galerías hechas por Xyleborus glabratus , previo al desarrollo del hongo simbionte Raffaelea lauricola; el cual es hongo causante de la muerte de esta especie (Fraedrich et al ., 2008).

Las lesiones causadas por Ophiostoma en aliso, muestran un manchado irregular producto de la muerte vascular, evidenciándose más en la zona basal del árbol. Esta muerte vascular, trae como consecuencia la interrupción en la conducción de nutrientes del suelo a través del xilema hacia la copa, produciendo rebrotes basales y decaimiento del árbol. La mayoría de las especies de Ophiostoma y sus anamorfos son patógenos débiles o saprofíticos, y se asocian con insectos descortezadores (Jacobs et al. , 2003). El género Ophiostoma causa el manchado azul de la madera y produce pérdidas económicas importantes en bosques de coníferas (Gibbs, 1993). Dendroctonus adjunctus , transporta esporas de Ophiostoma spp., en sus micangias dispersando las esporas por las galerías sinuosas que produce en el fuste del árbol y contribuye de manera importante a la muerte del árbol por el bloqueo del transporte de sustancias en los sistemas de conducción (Cibrián, 1995). En México se han reportado 17 hongos pertenecientes a los órdenes Ophiostomatales y Microascales en coníferas y latifoliadas (Cibrián et al ., 2007). En este estudio Ophiostoma ips fue la más patogénica en árboles de Pinus hartwegii de tres años de edad. Lieutier et al . (1989), coincide en calificar a Ophiostoma sp., como un hongo débil que causa un manchado azul en la madera en coníferas; dentro de esta categoría se encuentran las especies, O. minus , O. montium , O. penicillatum y O. picea (Seifert, 1993).

Además de los hongos presentes en las galerías, existen otros tipos que juegan un papel importante en el éxito de colonización de un hospedante por parte de un insecto. Algunos hongos saprofíticos son los encargados de descomponer la celulosa y tienen una relación de comensalismo, Henriques et al . (2006), como es el caso de Mucor hiemalis y Cladosporium sp., los cuales descomponen la madera para que hongos vasculares como Fusarium oxysporum y Ophiostoma sp., puedan desarrollarse de una mejor manera. Al igual que en C. zulmae , en C. columbianus , se encontraron las especies F. oxysporum y F. solani ., aisladas no solo de la galería, sino además de las estructuras del xilema manchadas (Kabir y Giese, 1966).

En el proceso de infestación de Quercus suber L., por Platypus cylindricus , de las galerías hechas por el insecto y del exoesqueleto, fue posible aislar hongos antagonistas, que tienen como función inhibir el desarrollo de hongos fitopatógenos, que en un momento dado pueden limitar el crecimiento del hongo ambrosial o de aquellos de los cuales se alimentan las larvas (Henriques et al . 2006), tal es el caso de Hypocrea lixii e Hypocrea koningii y de sus estados anamorfos Trichoderma sp. y Gliocladium sp. Kabir y Giese (1967), encontraron especies de Fusarium spp., causantes de la mancha roseo- púrpura en pino del sureste y de madera vieja de las cosechas, igualmente se encontró que Gliocladium sp. y Trichoderma sp. (anamorfos de Hypocrea spp.), producen un

94 manchado pardo ferruginoso, que se da por necrosis de tejido vascular. En plantaciones de Quercus suber atacadas por Platypus cylindricus , fue posible aislar los diferentes estados anamorfos de Hypocrea como Acremonium sp., Gliocladium sp. y Trichoderma sp., tanto en las galerías, como en las micangias y exoesqueleto de insectos machos y hembras (Henriques et al ., 2006).

La morfología de la subfamilia Scolytinae, implica unos cuerpos densamente cubiertos por setas y pelos, organizados de tal manera que es posible el transporte involuntario de una serie de patógenos causantes de enfermedades en muchas especies forestales. La hipótesis a demostrar es si los microorganismos encontrados al interior del árbol, son transportados en estructuras ectodermales o por adherencia al cuerpo del insecto o a través de las lesiones mecánicas o abióticas hechas en el árbol.

Son pocas las referencias que se tienen para el género Pesotum sp., como causante de muerte en especies perennes. En Ecuador, en la especie Schizolobium parahyba , se encontró Pesotum (anamorfo de Ophiostoma quercus ) asociado a lesiones en los tallos de esta especie. En pruebas de patogenicidad realizadas en invernadero se encontró que no era patogénico (Geldenhuis et al., 2004). Algunos estados anamorfos de Ophiostomataceae como Raffaelea sp., pueden realmente ser patógenos como ocurre con la asociación de Raffaelea lauricola con la especie Xyleborus glabratus , para producir la muerte del Laurel Rojo ( Persea borbonica ) (Fraedrich, 2008).

Dado que el aislamiento de cultivos puros de los microorganismos aquí reportados fue difícil de obtener en este estudio, se presenta en anexo las evaluaciones preliminares de patogenicidad de algunos aislamientos, sobre plantas de aliso en condiciones de vivero e invernadero ( Anexo A).

4.5. BIBLIOGRAFÍA

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5. CONCLUSIONES

La especie Alnus acuminata H.B.K. ssp acuminata , en el país, tiene definido dos ecotipos, el primero de porte arbóreo con muy poca pubescencia, distribuida en la cordillera central y el macizo colombiano y el otro de crecimiento medio, con porte arbustivo, con pubescencia ferruginosa, que se desarrolla a lo largo de la altillanura de la cordillera oriental hasta Mérida en Venezuela.

El insecto Corthylus zulmae , tiene una distribución restringida, encontrándose en los municipios de Manizales, Villamaría y Neira, en el departamento de Caldas, lo cual le confiere características de comportamiento endémico. Se le encontró afectando solo árboles de A. acuminata HBK ssp acuminata del ecotipo porte arbóreo. En las demás plantaciones de aliso en el país, otros insectos de la subfamilia Scolytinae como Hylocurus sp., Chramesus sp., Gnathotrichus sp. y Amphicranus sp. (Coleoptera: Curculionidae), se encontraron causando igual afectación.

C. zulmae posee micangias en las patas anteriores, en la zona pre-coxal de los machos, lo que permite considerar el insecto como un escarabajo ambrosial. La micangia es ectodermal, la cual consta de un tubo micangial interno, que va desde el pronoto hasta las coxas de las patas anteriores, con una longitud de 4,2 ± 0,3 mm y un diámetro de 38 ± 6 µm, terminando en una invaginación abierta de forma ovoide, con un pequeño agujero en la zona pre-coxal de las patas anteriores de los machos, con dimensiones de 23 ± 2 µm de ancho por 34 ± 5 µm, cubierta por setas de mayor tamaño y con gran acumulación de micelio.

Se identificó, de manera preliminar, a la levadura Candida sp. como posible microorganismo ambrosial a partir del cual se pueden estar alimentando los estados biológicos de C. zulmae. Las perforaciones realizadas por el insecto parecen ser usadas por hongos fitopatógenos que posteriormente ocasionan el marchitamiento y muerte de los árboles de aliso.

Los hongos de mayor frecuencia encontrados al interior de las galerías hechas por C. zulmae corresponden al hongo Ophiostoma sp. (anamorfo Pesotum sp.) y Fusarium oxysporum. En las pruebas de patogenicidad; Pesotum sp., y F. oxysporum presentaron los mayores niveles de daño, lo que permite catalogarlos como posibles patógenos en aliso.

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A. Anexo. Evaluación preliminar de patogenicidad de microorganismos encontrados en las lesiones hechas por Corthylus zulmae Wood en Alnus acuminata

A.1. INTRODUCCIÓN

Existen varias formas de entrada de posibles patógenos al interior de los árboles de aliso, una vez éstos han sido perforados por C. zulmae . La primera, es a través del mismo insecto que llevan los microorganismos en las setas que recubren su cuerpo; la segunda, con la entrada de hongos oportunistas a través de las perforaciones causadas por el insecto. Para descartar o confirmar los agentes causantes de la muerte descendente de individuos de aliso, se realizaron pruebas de patogenicidad con los microorganismos aislados de las lesiones de aliso y el posterior aislamiento sobre nuevas lesiones.

A.2. MATERIALES Y MÉTODOS

A.2.1 Sitios de evaluación

Se realizaron pruebas de patogenicidad en condiciones controladas (invernadero) y en vivero (a la intemperie), sobre plántulas de aliso de 12 meses de edad, ubicadas en el vivero forestal La Coca de Cenicafé, La Granja (Chinchiná, Caldas) vereda Planalto, a una altitud de 1350 m, con temperatura promedio de 21,8°C y una precipitación de 2580 mm.

Para las evaluaciones, tanto en invernadero como en vivero, se tomaron cinco plantas, que no presentaran algún tipo de daño, las cuales se dispusieron de manera aleatoria, sin arreglo espacial, para ser inoculadas con cada uno de los aislamientos de microorganismos obtenidos en los aislamientos anteriores. Se incluyeron plantas testigo a las cuales se les aplicó ADE y medio de cultivo puro AGAR.

A.2.2 Hongos a evaluar en las diferentes pruebas de patogenicidad

Se evaluaron los hongos de la tabla A-1, los cuales correspondieron a los aislados de cada una de las lesiones producidas en las interacciones entre insecto- árbol- suelo. Se categorizó la patogenicidad de cada aislamiento de acuerdo con el tamaño de la lesión y el manchado en la madera, producto de la muerte vascular que presentaba en el individuo inoculado. No se utilizaron técnicas de cortes histológicos y tinción de tejido necrosado para confirmación de acción patogénica, debido a que no se disponían de los equipos y reactivos, que en el momento solo se encontraban en el CIAT.

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Tabla A-1: Hongos a evaluar en pruebas de patogenicidad, de acuerdo a la forma de aislamiento: insecto-madera-suelo .

Tipo de aislamiento a evaluar Transportado por el Aisl . Suelo de plantaciones Insecto (macho y Lesión en la madera afectadas hembra) 1 Cordyceps sinensis Pesotum sp. Fusarium oxysporum 2 Phoma glomerata Fusarium oxysporum Mucor hiemalis 3 Hypocrea lixii Hypocrea koningii Fusarium oxysporum 4 Hypocrea lixii Clonostachys sp. Trichoderma sp. 5 Periconia macrospinosa Candida sp . Fusarium oxysporum 6 Phoma glomerata Mucor hiemalis 7 Microdochium sp. . Cladosporium sp. 8 Cladosporium sp 9 Phanerochaete sordida 10 Marasmius cladophyllus 11 Fusarium oxysporum

La primera prueba de patogenicidad se realizó a partir de siete aislamientos de hongos transportados en el cuerpo de adultos de C. zulmae ; tres asociados a adultos machos y cuatro a los cuerpos de las hembras (Tabla A-1).

La información no se constató con los caracteres morfológicos. En la segunda prueba de patogenicidad se evaluaron los hongos encontrados en las galerías (lesiones tipo 2) y en los sitios donde se produjo manchado vascular y necrosis de células del xilema (lesiones tipo 3 y 4). La tercera prueba de patogenicidad se realizó con los hongos encontrados en el suelo, de plantaciones afectadas por C. zulmae.

A.2.3 Metodología de inoculación

La inoculación de hongos fitopatógenos consistió en la transferencia de cualquier estructura infectiva del patógeno. Varios tipos de inóculo como esporas, esclerocios, microesclerocios, clamidosporas o fragmentos de micelio, se usaron para ser inoculados (Couto y Gonc ąlves, 2007).

Para la realización de las pruebas de patogenicidad se utilizaron dos métodos de inoculación: a. Se hizo una herida en forma de U invertida, a 20 cm del tallo, con un bisturí desinfestado y flameado (alcohol al 90%). Posteriormente, se inoculó una porción de 5 mm 2 del crecimiento del microorganismos en medio de cultivo, se cubrió con un algodón humedecido con agua destilada estéril, para crear una cámara húmeda, y se selló con cinta para evitar contaminaciones y la caída del inóculo (Figura A-1).

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b. Se realizó una punción en el tallo con una pinza estéril de 0,45 a 0,65 cm de profundidad y se inoculó con suspensión de esporas para cada hongo. En la punción se colocaron cinco gotas (aproximadamente 0,2 ml) de una suspensión de micelio triturado en agua destilada (Nuñez et al. , 1992) (Figura A-2).

Las suspensiones de los inóculos se prepararon a partir de colonias con 25 días de crecimiento (máximo), a las que se les extrajeron las ascosporas o conidias, removiéndolas de las cabezas de los peritecios o las conidias de los sinemas. Para el caso de las levaduras, a través de observaciones al microscopio, se confirmó la presencia de blastoconidias o artroconidias. Las estructuras de reproducción fueron homogeneizadas en agua destilada con Tween 80 al 0,01%.

La concentración para F. oxysporum fue de 2,5 x 10 6 microconidias por mililitro, para Pesotum sp. 1 x 10 6 conidias/ml, y para los demás hongos a evaluar, incluidas las levaduras, 2,5 x 10 6 microconidias/ml. Para la preparación de la suspensión, se vertió en agua destilada sobre las colonias esporuladas en cajas Petri. Para remover el máximo de esporas de hongo creciendo en el medio de cultivo se utilizó un pincel suave. Luego, de haber removido las esporas con el pincel, éstas se filtraron en suspensión y se removieron los restos del micelio. Para el caso de los hongos, donde solo se produjo micelio, no se realizó inoculación. Figura A- 1: Pruebas de patogenicidad en aliso. a- d. Inoculación en herida en forma de “u”. e- g. Inoculación por punción.

a b c d

e f g

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Figura A- 2: Metodología de inoculación por herida, cubierta con algodón y parafilm. a y b. Punción sellada con algodón humedecido con agua destilada. c y d. Sellamiento de orificio con cinta parafilm y adecuación de cámara húmeda. (Fotografías Eliana Rincón).

a b c d

El sitio de inoculación se cubrió con un algodón humedecido en agua destilada estéril, 2- 3 mm abajo del punto de punción y se selló con cinta de “ parafilm ” durante 10 días, fijando al tronco toda el área inoculada con una cinta adhesiva. La evaluación se hizo un mes después de la inoculación, descubriendo los inóculos con la ayuda de una navaja desinfestada con alcohol al 90%, midiendo la presencia y avance de lesiones.

A.2.4 Análisis estadístico

Para la evaluación de la patogenicidad de los aislamientos se realizó la medición del tamaño de la lesión para cada uno de los microorganismos. El criterio de presencia de estructuras de hongo correspondía a la comparación de necrosis en el tejido, con respecto al control negativo (CN).

Para la medición del tamaño de lesión de cada aislamiento y comparación con el testigo, se utilizó una prueba de varianza de una sola vía, donde en primera instancia se determinó si había diferencia significativa de al menos un tratamiento de los hongos inoculados con respecto al control negativo.

Cuando hubo diferencia se procedió con la prueba de Dunnet, para comparar las medias de los tratamientos con la media del control (testigo), así se determinaron los aislamientos que presentan diferencia significativa con respecto al control (Anexo G).

A.3 RESULTADOS

A.3.1. Pruebas de patogenicidad de hongos transportados en el cuerpo de C. zulmae

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A cada uno de los hongos aislados del cuerpo de los insectos adultos, machos y hembras, se les realizó la prueba de patogenicidad para evaluar su potencial de daño). El tipo de daño y el tamaño de la lesión se evaluaron 25 días después de la inoculación. La longitud de la lesión corresponde al promedio de los cinco árboles inoculados, por cada hongo aislado (Figuras A-3 y A-4) y comparado con el control negativo (CN). Los parámetros de estadística descriptiva se presentan en la tabla A-2.

Tabla A- 2: Cálculo de media y desviación estándar de las lesiones (en cm) causadas por los hongos transportados por el insecto.

Desviación Tratamientos Observaciones Media estándar Cordyceps sinensis 5 0 0 CN 5 4,96 0,45 Phoma glomerata 1 5 5,2 0,26 Hypocrea lixii 5 6.0 0,63 Phoma glomerata 2 5 6,1 0.46 Microdochium sp. 5 6,9 0,45 Hypocrea sp. 5 8.0 0,447 Periconia macrospinosa 5 8,8 0,82 CN: control negativo: agua destilada.

Dado que el control negativo presentó lesión a partir del cual no se realizaron aislamientos, la información de este bioensayo deben ser considerados preliminares. C. sinensis no causó lesión al ser inoculado. Al parecer, es transportado en el cuerpo de adultos hembras de C. zulmae, es un hongo antagonista que inhibe el desarrollo de otros insectos o artrópodos, que en un momento dado pueden convertirse en predadores de larvas de C. zulmae .

Hypocrea lixii, corresponde al estado telemorfo de Trichoderma harzianum Rifai (Chaverri y Samuels, 2002) . Hypocrea es el género tipo de la familia Hypocreaceae, descrito por Fries en 1825, ampliamente esparcido y con un número estimado de 171 especies, aproximadamente, que crecen en madera en descomposición y a menudo asociado con otros hongos de tipo anamorfo. Los estados anamorfos del género Hypocrea, corresponden a Gliocladium, Acremonium, Trichoderma y Verticillium (Jaklitsch,2009). Este microorganismo podría inhibir el crecimiento de hongos contaminantes o patogénicos, que en un momento dado pueden inhibir el crecimiento del hongo simbionte del cual se alimentan las larvas.

El aislamiento 7 corresponde a la especie Phoma glomerata 2, la cual es conocida como patógeno para plantas, pero en muy pocas oportunidades referida su patogenicidad en humanos y animales. El aislamiento 6 corresponde a Periconia macrospinosa Lefebvre & A.G. Johnson, el cual está catalogado como patógeno débil para plantas según Lefebvre et al . (1949), pero que se comportó como saprófito, causando una gran lesión de 9,2 cm.

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El aislamiento 8, corresponde a Microdochium sp., y al igual que lo reportado para Periconia, están catalogados como hongos patogénicos débiles. No es un hongo que esté reportado como causante de enfermedades en especies perennes.

Las Figuras A-3 y A-4, presentan los resultados de las pruebas de patogenicidad de estos hongos aislados del cuerpo de los adultos de C. zulmae . Figura A- 3. Evaluación de la patogenicidad en árboles de aliso, de los hongos transportados en el cuerpo de C. zulmae . a. C. sinensis . b. P. glomerata c. Control negativo (CN). d. H. lixii

a b c d

Figura A- 4.Evaluación de la patogenicidad en árboles de aliso, de los hongos transportados en el cuerpo de C. zulmae . a. H. lixii . b. P. macrospinosa . c. P. glomerata . d. Microdochium sp.

a b c d

A.3.2 Pruebas de patogenicidad de hongos encontrados en la madera afectada por acción de C. zulmae

Se realizaron las pruebas de patogenicidad de los hongos encontrados en las galerías activas y abandonadas, hechas por C. zulmae y de los fragmentos de madera que presentaban manchado vascular. El tamaño de la lesión se evaluó 25 días después de la inoculación. La longitud de la lesión (en cm), corresponde al promedio de los cinco árboles inoculados, por cada hongo aislado (Tabla A-3) y comparado con el control negativo (CN), al cual se le aplicó AGAR. La utilización de AGAR buscó evitar una posible confusión entre oxidación de tejido y lesión en el tallo.

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El análisis de los valores encontrados en las lesiones ocurridas en la madera (Tabla A-3), muestra los promedios más altos en los aislamientos Fusarium oxysporum y Pesotum sp., lo cual puede indicar que son los de mayor patogenicidad.

Tabla A- 3: Cálculo de media y desviación estándar de las lesiones causadas en la madera por la acción de C. zulmae

Desviación Tratamientos Observaciones Media estándar CN 5 1,18 0,259 Cladosporium sp. 5 3,82 0,389 Phanerochaete sordida 5 4,52 0,415 Candida sp. 5 5,08 0,421 Marasmius cladophyllus 5 8,12 0,396 Hypocrea koningii 5 10,28 0,766 Pesotum sp. 5 11,26 0,391 Fusarium oxysporum 5 14,28 0,409 CN. Control negativo: Agar

El análisis de varianza para esta segunda prueba de patogenicidad dio como resultado diferencia significativa entre el control negativo (AGAR) y los aislamientos evaluados (Tabla A-4). Es decir, los hongos aislados de las lesiones en la madera afectada por C. zulmae , al ser inoculados en tallos de aliso sanos, producen lesiones significativas al compararse con el CN.

Tabla A- 4: Análisis de varianza para las pruebas de patogenicidad de los hongos aislados de las lesiones en la madera.

Valor crítico Fuente de variación S.C. G.L. CM F Probabilidad para F Modelo 680,9 7 97,27 476,8 1,7064E-30 2,31 Error 6,5 32 0,20 Total 687,4 39

Para la identificación de los aislamientos que presentaban diferencia significativa con respecto al CN se realizó la prueba de Dunnett (Anexo G), a un nivel de significancia del 5%. El tamaño de la lesión promedio que presentó el CN fue de 1,2 cm. La evaluación correspondió a la lesión externa que desarrollaba la madera al ser inoculada con el hongo evaluado. Para la confirmación de la lesión producida por cada aislamiento no se realizaron cortes histológicos.

La prueba de Dunnett confirmó que todos los aislamientos son patogénicos, ya que presentan diferencia significativa con respecto al CN. Las diferencias de medias de los tratamientos con el CN, permite inferir que los hongos de mayor patogenicidad corresponden a Fusarium oxysporum con 13,1 cm y Pesotum sp. 10,08 cm. Igualmente, los que presentan menores valores en las diferencias de medias son la levadura Candida sp. con 3,9 cm, el hongo P. sordida con 3,34 cm y Cladosporium sp. 2,64 cm.

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La identificación de los microorganismos re-aislados de las pruebas de patogenicidad, se realizó mediante el análisis genético, por medio de PCR de los (ITS) de las secuencias ribosomales del ADN, de la manera descrita en el Capítulo 4.

El hongo P. sordida es reportado como un Basidiomycete de la familia Phanerochaetaceae. Es de distribución mundial, especialmente en el hemisferio norte, como un saprófito en maderas duras y ocasionalmente en maderas blandas, causándoles la pudrición radical blanca (Burdsall, 1985). Cladosporium sp., perteneciente al orden Dothideomycetes de la familia Davidiellaceae, patógeno de diferentes especies vegetales, es catalogado como un patógeno débil.

La prueba de patogenicidad del aislamiento identificado como Candida sp., presenta un manchado tenue, tonalidad pardo clara, poco acentuada, que puede asemejarse a oxidación de tejido (Figura A5). La diferencia de medias con respecto al CN, en la prueba de Dunnett, permitió definir el tamaño de la lesión en 3,9 cm.

Marasmius cladophylus , Basidiomycete de la Familia Marasmiaceae, es un saprófito colonizador de madera, que puede llegar a ser un patógeno importante. El tamaño de lesión promedio respecto al CN es de 6,94 cm. El cuerpo fructífero de esta especie es de tipo omfalinoides, con píleo de color rojo.

El hongo Pesotum sp., en la prueba de patogenicidad alcanzó una lesión promedio de 10,08 cm. Para su identificación no fue posible utilizar la técnica de PCR, ya que dio una buena amplificación, en la electroforesis marco bien la banda, pero el ADN se degradó y en el Blast el hit apareció como hongo contaminado. Dada la dificultad de su identificación mediante esta técnica, las lesiones fueron sembradas en diferentes medios de cultivo y sus estructuras de crecimiento y reproducción confrontadas con claves taxonómicas y publicaciones recientes (Geldenhuis et al ., 2004; Seifert et al. , 2013) (Figura A-6).

El mayor tamaño de lesión se presentó en F. oxysporum , con una diferencia promedio de 13,1 cm. Este microorganismo es reportado en la literatura como endófito y fitopatógeno. Es una especie de importancia fitopatológica, cuenta con un gran número de plantas hospedantes y, por ello, uno de los que más daños económicos tiene reportados. La especie ataca diversas especies de árboles, causando marchitamiento vascular y muerte descendente de éstos. Abbas et al. (1995), reportaron como F. oxysporum, produce una micotoxina llamada fumonicina, la cual causa la muerte de Pinus strobus L.

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Figura A- 5: Resultado de la prueba de patogenicidad de los aislamientos realizados de las lesiones en madera. a. CN. b. Cladosporium sp. c. P. sordida. d. M. cladophyllus. e. H. koningii. f. Candida sp. g. y h. Pesotum sp. i. F. oxysporum.

a b c

d e f

g h i

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Figura A- 6. Desarrollo de Pesotum sp., 15 dds a 25°C, bajo oscuridad. a. En EMA al 2%. b. Sabouraud. c. Jugo V8. f y g. Sinemas de Pesotum sp. formados en Jugo V8 (100X). (Fotografías f y g microscopia de contraste de fases).

a b c

d e

A.3.3 Pruebas de patogenicidad de hongos encontrados en el suelo de plantaciones afectadas por C. zulmae

Se evaluó la patogenicidad de los microorganismos aislados del suelo, de plantaciones donde había afectación por C. zulmae y se presentaba la muerte descendente de individuos de aliso. Para comprobar la virulencia de los aislamientos se tuvo en cuenta que los hongos aislados estuvieran asociados a heridas en el tallo realizadas por el insecto. El tamaño de la lesión se evaluó 25 días después de la inoculación. La longitud de la lesión (en cm), corresponde al promedio de los cinco árboles inoculados, por cada hongo aislado y comparado con el control negativo (CN) (Tabla A-5), al cual se le aplicó AGAR como CN.

El análisis de los valores encontrados en las lesiones ocurridas en el suelo, muestra los más altos promedios en los aislamientos Fusarium oxysporum y Pesotum sp., lo cual puede indicar que son los de mayor patogenicidad.

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Tabla A- 5: Cálculo de media y desviación estándar, de las pruebas de patogenicidad de los aislamientos obtenidos del suelo de plantaciones afectadas por C. zulmae

Desviación Tratamientos Observaciones Media estándar CN 5 1,18 0,26 Cladosporium sp. 5 1,1 0,20 Fusarium oxysporum 1 5 9,18 0,45 Fusarium oxysporum 2 5 10,04 0,38 Fusarium oxysporum 3 5 13.5 0,40 Mucor hiemalis 1 5 1,10 0,20 Mucor hiemalis 2 5 3,72 0,19 Trichoderma sp. 5 5,48 0,28 CN. Control negativo: Agar

El análisis de varianza para esta tercera prueba de patogenicidad dio como resultado que hay diferencia significativa entre el control negativo (AGAR) y los aislamientos evaluados (tabla A-6). Es decir, los hongos aislados del suelo de plantaciones afectadas por C. zulmae , al ser inoculados en tallos de aliso sanos, producen lesiones significativas al compararse con el CN.

Tabla A- 6: Análisis de varianza para las pruebas de patogenicidad de los hongos aislados del suelo de plantaciones afectadas .

Fuente de Valor crítico S.C. G.L. CM F Probabilidad variación para F Modelo 792,47 7 113,21 1256,14 <.0001 2,313 Error 2,884 32 0.09013 Total 795.354 39

Para la identificación de los aislamientos que presentaban diferencia significativa con respecto al CN se realizó la prueba de Dunnett (Anexo G), a un nivel de significancia del 5%. El tamaño de la lesión promedio que presentó el CN es de 1,2 cm. La evaluación correspondió a la lesión externa que desarrollaba la madera al ser inoculada con el hongo evaluado (Figura A7). Para la confirmación de la lesión producida por cada aislamiento no se realizaron cortes histológicos.

La prueba de Dunnett confirmó que los hongos Cladosporium sp. y M. hiemalis , aislados del suelo, no son patogénicos, debido a que la diferencia de medias de la lesión producida por ambos hongos al ser inoculados fue de 0,444, y la diferencia mínima significativa de 0,5244. Las diferencias de medias de los tratamientos con el CN confirman que los hongos de mayor patogenicidad corresponden a Fusarium oxysporum con 12,32 cm, para el aislamiento más patogénico, 4,30 cm para el hongo Trichoderma sp. y 2,54 cm para un segundo aislamiento de Mucor hiemalis .

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Las pruebas de patogenicidad confirmaron el parasitismo de los aislamientos y descartaron los microorganismos saprófitos (contaminantes). Dos de los aislamientos no fueron evaluados en las pruebas de patogenicidad, Trichoderma viridae y Pestalotia sp., ya que los medios de cultivo al parecer estaban contaminados, especialmente por Pestalotia sp.

Figura A- 7.Prueba de patogenicidad para microorganismos aislados del suelo a. F. oxysporum; b. F. oxysporum (aislamiento 2); c. d. Trichoderma sp.; e. F. oxysporum; f. M. hiemalis ; g. M. hiemalis (aislamiento 2); h. Cladosporium sp.; i. control negativo

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Trichoderma sp., ocurre a lo largo de las perforaciones y de galerías. Al parecer por su carácter antagonista y por su frecuencia no solo en el suelo sino al interior de los árboles perforados, permite suponer que es un hongo fácilmente transportado por los insectos de la subfamilia Scolytinae, en sus setas y pelos.

Mucor hiemalis es un moho frecuente en la madera. Su propagación se facilita ya que al establecerse en el xilema, emiten abundante micelio, el cual actúa como descomponedor, sirviendo a su vez de alimento a insectos perforadores. Aunque esta especie no se reporta como fitopatógena, en las pruebas de patogenicidad realizadas, alcanzó a desarrollar lesiones en la madera, hasta de 5 cm de longitud.

Las mayores lesiones se presentaron en los aislamientos de Fusarium oxysporum, aislado del suelo y del xilema de trozos de rama sembrados en suelo, los cuales tuvieron longitudes de lesión de: 10,0 cm, 9,2 cm, 13,5 cm. Al alinear las secuencias de los aislamientos S1 (aislado del suelo) y C5 (aislado de la madera afectada por el hongo), se encontró que genéticamente eran idénticos, y correspondían a la misma especie F. oxysporum.

A.4 DISCUSIÓN

Los aislamientos hechos en los individuos adultos, machos y hembras, de C. zulmae , muestran preliminarmente una tendencia de diferenciación en el tipo de hongo que es transportado por cada uno de ellos. En la hembra se encontraron esporas o conidias de hongos entomopatógenos o antagonistas adheridas a su cuerpo. Se destacó el crecimiento del hongo Cordyceps sinensis , el cual no produjo lesión al ser inoculado, y es reportado como controlador de otros insectos competidores, ya que se reproduce y desarrolla dentro de las larvas de insectos plaga (Liu et al ., 2001). Lo anterior confirma la baja proporción de especies coexistentes con C. zulmae , en los muestreos realizados, donde sólo se identificó a Rhizophagus sp. (Coleoptera: Monotomidae) y un individuo de la familia Staphylinade (Coleoptera) en las perforaciones y galerías hechas por C. zulmae (Cifuentes, 2011) .

Fusarium oxysporum es un hongo facultativo, que puede ser antagonista, saprofito o fitopatógeno. Con respecto a aliso, su comportamiento es similar al de la marchitez vascular letal y la muerte de palmas ornamentales y de aceite (Elliot, 2010), donde la entrada al hospedante se da por la adherencia al insecto que lo perfora. F. oxysporum está presente en todos los puntos de afectación analizados, en las perforaciones hechas por el insecto, en el suelo, en las galerías y en exoesqueleto del insecto, ya que las conidias permite que se adhieran fácilmente al cuerpo de C. zulmae y así ser transportadas. En las pruebas de patogenicidad realizadas, el mayor tamaño en la lesión lo presentó F. oxysporum, con valores hasta de 14,3 cm y un manchado vascular pardo ferruginoso marcado. Henriques et al . (2006), reportaron que Fusarium sp. transportado

111 por Platypus cylindricus F., produce el decaimiento y muerte de Quercus suber y se encuentra en la galería hecha por el insecto, más no en la micangia.

Las lesiones que producen otros hongos en las evaluaciones, muestran un tipo de comportamiento saprófito. En esta categoría se encuentran especies como Mucor hiemalis, el cual puede descomponer celulosa o ser antagonista con otros hongos que son patogénicos para la progenie (Henriques et al ., 2006), en esta caso de C. zulmae. Las pruebas de patogenicidad muestran a M. hiemalis como un patógeno débil, ya que el tamaño de la lesión fue pequeño, menos de 5 cm. Al parecer la presencia de Mucor en la galería está también relacionada con un efecto acaricida que este hongo posee, como lo muestra Hrabák (2000), en su trabajo con Aphis mellifera , donde logró demostrar la micosis que puede generar en Varroa destructor, principal plaga en sus colmenas.

En la misma categoría pueden ubicarse Phanerochaete sordida y Cladosporium sp., al ser descomponedores de madera y causantes de pudrición. Su comportamiento de tipo oportunista puede observarse porque el desarrollo promedio de la lesión es bajo, comparado con el CN, de 3,34 cm y 2,64 cm, respectivamente. Es probable que puedan ayudar en el proceso de degradación de la madera, pero no se ve una clara relación simbionte con C. zulmae . Whitney y Farris (1970), encontraron en los aislamientos de la galería hecha por Dendroctonus ponderosae , con los hongos Cladosporium sp. y Penicillium sp., realizando una función similar. Henriques et al . (2006), reportaron cómo en las galerías hechas por Platypus cylindricus , en árboles de Quercus suber , se encuentran una serie de hongos saprófitos como Aspergillus spp., Gliocladium spp., Paecilomyces sp., en relación de comensalismo con el insecto.

Una segunda categoría son hongos de tipo antagonista, que pueden ser clasificados como auxiliares, al no estar presentes en las cámaras de cría o en estructuras especializadas de los insectos, pero ayudan a que el insecto pueda controlar otros hongos que son patógenos y evitar que se contamine la única fuente de alimento para las larvas como es la levadura, (Batra, 1966; Batra 1985; Henriques et al ., 2006). Dentro de este grupo de hongos se encuentran Clonostachys y específicamente C. rosea, el cual puede controlar el asentamiento de hongos fitopatógenos, como es Phoma glomerata . El efecto de estos hongos ha logrado controlar enfermedades como la pudrición radical en manzano, generada por Phytophthora cactorum (Carreño et al, 2006); Botrytis cinerea , en viveros forestales afectando Eucalyptus globulus y Pinus radiata en Chile (Molina et al, 2006).

En esta misma categoría Hypocrea lixii; (telemorfo de Trichoderma harzianum ), crece en madera en descomposición y a menudo asociado con otros hongos de tipo mitospórico. Los estados anamorfos del género Hypocrea; como Gliocladium, Acremonium, Trichoderma y Verticillium (Jaklitsch, 2009), fueron aislados en las galerías hechas por Platypus cylindricus en árboles de Quercus suber L., (Henriques et al. , 2006), en los cuales fue posible identificar los diferentes estados anamorfos de Hypocrea . Este microorganismo estaría ejerciendo un control natural sobre la especie, inhibiendo el

112 crecimiento de hongos contaminantes o patogénicos, que en un momento dado pueden limitar el crecimiento del hongo simbionte del cual se alimentan las larvas.

Las pruebas de patogenicidad para la levadura muestran a Candida sp . como patógeno débil, ya que fue baja la afectación y el tamaño de la lesión, de 5,1 cm, comparativamente con otros aislamientos. La lesión causada por Pesotum sp., en aliso alcanzo una longitud de 11,3 cm a los 25 ddi, en plántulas de 18 meses, presentando manchado de la madera, sin afectación a nivel foliar. Algunas anamorfos como Leptographium serpens, L. terebrantis, L. lundbergii, L. procerum, que atacan Pinus spp., pueden llegar a causar lesiones en el floema y matar a los árboles con inoculaciones artificiales (Rioux y Quellette, 1991).

Las pruebas de patogenicidad permiten definir cómo el decaimiento y muerte descendente del aliso es causado por la combinación de dos hongos que producen su muerte vascular; Fusarium oxysporum y Ophiostoma sp. (anamorfo Pesotum sp.). En Pinus radiata y P. elliottii , se comprobó el efecto patogénico de Ophiostoma ips , y sus estados anamorfos ( Leptographium sp.), transportados por las hembras de Dendroctonus adjunctus en sus micangias (Zhou et al. , 2001). Ophiostoma ips , se considera un patógeno débil como O. minus, Leptographium terebrantis y L. Wingfield, que pueden llegar a causar alguna lesión sobre el floema o matar el árbol cuando son inoculadas en masa (Zhou et al., 2002; Gibbs, 1993). En Sudáfrica se reporta a O. ips en Pinus caribeae , P. elliottii y P. radiata , de dos años de edad, causando lesiones de 33,3 mm sin presentar síntomas externos a nivel de follaje (Zhou et al., 2002).

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B. Anexo. Protocolo de extracción de ADN de hongos encontrados en las lesiones hechas por Corthylus zulmae.

Protocolo de extracción de ADN, metodología de Lee y Taylor 1990, con algunas modificaciones.

Los aislamientos cultivados en PDA, fueron repicados en medio líquido glucosa – extracto de levadura – peptona (GYM), a 26°C, durante 5 días. El micelio producido se filtró al vacío con papel Whatman No. 1, lavando los residuos del medio líquido con agua destilada estéril (ADE), se secó por presión con papel absorbente y se almacenó en papel aluminio a –70°C.

El micelio se maceró en nitrógeno líquido en un mortero de porcelana. Se llevaron 400 mg del micelio pulverizado a un tubo eppendorf con 500 µl de buffer de extracción (50Mm Tris-HCl pH 7,2, 50Mm EDTA, 3% SDS, 1M NaCl, 1% mercaptoetanol); se mezcló por inversión por tres min y se maceró en un molino cónico durante 2 min.

115

La solución se incubó a baño María a 65°C por 1 h, mezclándola 1 vez por inversión, se centrifugó a 14000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. La fase acuosa se recuperó en un tubo eppendorf (400-500µl), se le adicionó 5µl de una solución de ARNasa (10 mg/ml) y se llevó a incubación a 37°C, durante una h, mezclando los tubos por inversión.

Una vez realizada la digestión del ARN, se adicionaron 500µl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1). El tubo se mezcló mediante inversión durante 2 min, se centrifugó a 14000 rpm por 5 min y se recuperó la fase acuosa (400 – 500 µl). Al sobrenadante se le adicionaron 500 µl de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), mezclando el tubo por inversión durante 2 min, luego se centrifugó a 14000 rpm por 5 min y se recuperó la fase acuosa (400 - 500µl).

A la fase acuosa recuperada (sobrenadante), se le agregaron 0,1 vol. de acetato de sodio 0,3M en etanol absoluto (1200 µl aproximadamente), mezclando el tubo por inversión durante 1 min para precipitar el ADN. La muestra se incubó a -20°C, durante toda la noche. La muestra se centrifugó a 14000 rpm por 15 min, se desechó el sobrenadante y se lavó el precipitado con etanol al 70%.

El precipitado se secó al vacio durante 10 min y se resuspendió en 50µl ADE, conservando la dilución a –20°C. La integridad del ADN se determinó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio (1µl/gel de una solución de 10 mg/ml), a 70 V durante 1 hora en buffer TAE 1X. La observación de las bandas se hizo bajo luz ultravioleta en el analizador de imágenes Image Master VDS Software 2.0 (Hoeffer Pharmacia Biotech).

C. Anexo. Protocolos de siembra de microorganismos en medios de cultivo.

Para cada una de las soluciones nutritivas empleadas se diseñó el protocolo de siembra para una preparación de 200 ml. Una vez hecha la dilución y se haya preparado la cantidad de medio de cultivo necesario, se reparte la cantidad preparada en erlenmeyers se tapa y se esteriliza en el autoclave. Una vez finalizada la esterilización, el medio se deja enfriar a temperatura ambiente y se sirve en cajas de petri; 15 ml por cada plato petri, vertiendo el medio fundido y estéril dentro de ellas. El medio se sirvió en un medio aséptico llamada cámara de flujo laminar, donde es necesario estar esterilizando mediante la llama continua de un mechero Bunsen.

Una vez servidos, los medios pueden conservarse a temperatura ambiente, pero para reducir su deshidratación y el consiguiente cambio en las concentraciones de sus componentes es preferible conservarlos a 4ºC.

116

Posteriromente se llevan a un Shaker a 110 rpm y 26°C, una vez se enfrían, se sirvieron en caja petri 15 ml por caja petri. Posteiormente se observan las colonias de crecimiento durante 5 a 6 días.

Preparación de medios de cultivo.

C.1 Agar- Agar (AA) (Couto y Gonçalvez, 2007)

Componente Cantidad Agar 20 g Agua destilada 1000 mL

C.2 Papa Dextrosa Agar (PDA) (Couto y Gonçalvez, 2007)

Componente Cantidad PDA 39 g Agua destilada 1000 mL

C.3 Extracto Malta Agar (EMA ) (Couto y Gonçalvez, 2007)

Componente Cantidad Extracto de malta 30 g Agar -Agar 15 g Peptona mycological 5 g Agua destilada 1000 mL

C.4 Extracto Malta - Levadura Agar (EMYA ): Componente Cantidad Extracto de malta levadura Agar (EM YA) 41 g Peptona mycological 15 g Agar - Agar 15 g Agua destilada 1000 mL

C.5 Extracto Malta - Levadura Agar (EMYA ) para pruebas de identificación con ITS :

Componente Cantidad Extracto de levadura 1,03 g Peptona mycological 10 g Glucosa 40 g Agua destilada 1000 mL

Al momento de sembrar. 6 mg de Tiamina: 0,006 gr Estreptomicina (Ampicilina) 120 mg, se requieren 0,12 gr.

C.6 Sabouraud Dextrosa Agar

Componente Cantidad Neopeptona 10 g

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Componente Cantidad Dextrosa 40 g Agar 15 g Agua destilada 1000 mL

C.6.1 Sabouraud Dextrosa Agar

Componente Cantidad Sabouraud 100 mL Agua destilada 1000 mL

C.7 Preparación Jugo V-8 Agar (Couto y Gonçalvez, 2007)

Componente Cantidad Jugo V8 zanahoria 200 mL Carbonato de calcio (CaCO 3) 3 g Agar -Agar 13 g Agua destilad a 1000 mL

D. Anexo. Protocolo de Fijación en resina Spurr.

Protocolo de inclusión en resina Spurr, propuesto por Mercer et al (1979), modificado por Rubio (2003)

Prefijación: Los insectos, hembras y machos, se depositan en un recipiente con suficiente agua y luego en estufa a 37°C, por 24 h.

Fijación: Para este proceso se utiliza varios compuestos químicos como (Glutaraldehído, paraformaldehído y formaldehido), tetróxido de osmio y permanganato de potasio, dejando a los insectos durante seis horas o más en esta solución. La técnica de mayor utilización es la inmersión durante seis horas en Glutaraldehído al 2%.

Lavado: Después de 12 horas se procede a lavar los individuos en solución tampón (fosfato 0,1 M; pH=6,9) por 15 horas.

Postfijación: Garantiza que las sustancias químicas no se degraden. Para ello se hizo la inmersión en Tetróxido de osmio (OsO 4) por 30 min.

Lavado: Después de la Postfijación se debieron lavar los especímenes con solución tampón (fosfato 0,1 M; pH=6,9) por 15 min.

Deshidratación: Debido a que las resinas empleadas en la inclusión no se mezclan con los fijadores acuosos, se emplea un disolvente intermedio que se mezcla tanto con el fijador como con la resina. Para la deshidratación se utilizan diferentes concentraciones

118 de etanol (50%-70%-80%-100%), durante cinco min en cada caso, para luego pasar en acetona: etanol en relación 1:1 por 10 min, a temperatura ambiente, terminando con una inmersión en acetona, por 10 min.

Pre- imbibición: En una solución de acetona – resina Spurr, en relación (3:1; 1:1; 1:3). A temperatura ambiente durante una hora o más.

Imbibición : Luego se pasa a imbibición en resina Spurr, durante una hora o más en la misma solución, siendo finalmente retirados de la resina .

Polimerización : Su propósito es la de manejar el tejido en un medio sólido que tenga la fuerza suficiente para poder obtener cortes finos. Después de imbibición se pasa a moldes adicionándole una nueva preparación de resina Spurr, depositándolos en horno con la misma resina, a 60 ° C por 48 horas, donde la resina es polimerizada quedando muy compacta y dura.

Corte : Luego de polimerizados los insectos, se cortan en secciones que van desde 1-4 µm en un ultramicrótomo marca LKB, equipado con cuchilla de vidrio.

Tinción: Los cortes fueron ubicados en portaobjetos, los cuales fueron teñidos con azul de toluidina

Montaje de cortes : Los cortes teñidos no soportan la desecación, por ello se cubre con una solución como Bálsamo de Canadá.

E. Anexo. Protocolo de Fijación en resina Spurr (Modificado).

Protocolo de fijación en resina Spurr, basado en la propuesta de Mercer et al ., 1979, Modificado por Rubio 2003 y adaptado por Centro Interamericano de Agricultura Tropical - CIAT, 2012.

Preparación de PBS a pH de 7,2.

Componente Cantidad NaCl 7,3 g Na2HPO4 2,38 g

KH 2PO 4 2,72 g Agua destilada 100 mL

119

Preparación de Fosfato millonig a pH de 7,2 a 7,6. Componente Cantidad s/n A: Fosfato de sodio monobásico 2% 41,5 mL g s/n B: Hidróxido de sodio al 2,25% 10,0 mL g s/n C: Glucosa al 5,4% 5,0 mL

Para la determinación del mejor protocolo de fijación se trabajó con varias concentraciones, para la obtención de una optima polimerización de la resina Spurr y una mayor fijación para individuos muy queratinizados, como es el caso de C. zulmae .

E.1 Primera fijación

Producto Epon® 812, SPI-Pon™ 812 Presentación producto

450gm NSA 250gm ERL 4221 250gm DER 736 30gm DMAE

E.1.1 Preparación de Resina Spurr Componente Cantidad A Raldita (ERL4421) 4 mL Epon (DER 736) 5 mL DDSA (NSA) endurecedor 12 mL DMB 3O 1 mL

E.1.2 Pre - imbibición

Acetona: Resina (3:1) Acetona: Resina (1:1) Acetona:Resina (1:3)

E.1.3 Imbibición

Resina Spurr (100%) durante 18 horas

E.2 Segunda fijación: Producto Epon ® 812, SPI-Pon™ 812

450gm NSA 225gm ERL 4221 225gm DER 736 25gm DMAE

120

E.2.1 Preparación de resina. Componente Cantidad A Raldita (ERL4421) 8 mL Epon (DER 736) 10 mL DDSA (NSA) endurecedor 24 mL DMB 3O 2 mL

E.2.2 Pre - imbibición

Acetona: Resina (3:1) Acetona: Resina (1:1) Acetona:Resina (1:3)

E.2.3 Imbibición

Resina Spurr (100%) durante 18 horas

E.3 fijación y preparación de resina, protocolo CIAT

E.3.1 Preparación de Resina Componente Cantidad ERL 4206 (V8) vinyl cyclohexene dioxide 10 mL DER 736 (D16) diglycidyl ether polypropylene glycol 4 mL NSA (N8_Endurecedor) Nonenyl succinic anhydride 2,6 mL DMAE (D7_acelerador) dimethylamino ethanol 0,5 mL

E.3.2 Pre- imbibición

Acetona: Resina (3:1) ) durante una hora Acetona: Resina (1:1) ) durante una hora Acetona:Resina (1:3) ) durante una hora

E.3.3 Imbibición

Resina Spurr 100%. Durante 18 horas. una hora. se agitan los insectos para una mayor imbibición. Posteriromente se dejan los insectos durante toda la noche y se sumergen hasta el fondo de los pozos contenedores.

E.3.4 Polimerización Resina Spurr (100%) durante 6 horas a 62°C. . Para una mayor fijación, se deben mantener los reactivos en el desecador. Todas las pipetas y agitadores deben ser nuevos. Por el menisco de la resina medir un ml por

121 encima. Revolver antes de adiconar el acelerador DMAE. Los insectos imbibidos no se pueden dejar secar, por ello antes de servir deben ser pasados a los moldes en una gota de resina. Se revuelve suavemente la resina y se sirven los pozos, casi llenos, donde son ubicados los insectos. 30 min después se ubican los letreros de identificación, los cuales se ubican primero de forma vertical, se deja caer suavamente sobre los pozos llenos y se punzan para que queden en el fondo. Una hora y media posterior se completa la resina llenado en su totalidad el pozo.

E.4 Preparación de resina. Componente Cantidad A Raldita (ERL4421) 10 mL Epon (DER 736) 5 mL DDSA (NSA) endurecedor 26 mL DMB 3O 0,4 mL

E.2.2 Pre - imbibición

Acetona: Resina (3:1) Acetona: Resina (1:1) Acetona:Resina (1:3)

E.2.3 Imbibición

Resina Spurr (100%) durante 18 horas

E.2.4. Polimerización: Resina Spurr (100%) durante 6 horas a 62°C.

F. Anexo. Solución Carnoy

Componente Cantidad Cloroformo 3 ml Etanol absoluto 6 ml Acido acetico glacial 1 ml Cloruro férrico 1g

122

G. Anexo. Análisis de Varianza de las pruebas de patogenicidad realizadas de los aislamientos del cuerpo de los insectos, del suelo de plantaciones afectadas y de las lesiones en madera.

Análisis de varianza de las pruebas de patogenicidad de los hongos transportados por Corthylus zulmae .

Valor Fuente de variación G.L. S.C. CM F Probabilidad crítico para F Modelo 7 249,0 35,57 145,27 <.0001 2,313 Error 32 7,84 0,25 Total 39 256,84

Prueba de Dunnet para comparación de todos los aislamientos obtenidos del insecto con el control negativo (CN). Parámetro Alfa G.L CME Valor crítico Diferencia mínima de Dunnett significativa (DMS) 0.05 32 0.244875 2.76173 0.8643

Prueba de Dunnett de comparación de medias

Dunnett's t Tests for INSECTO

Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 32 Error Mean Square 0.244875 Critical Value of Dunnett's t 2.76173 Minimum Significant Difference 0.8643

Comparisons significant at the 0.05 level are indicated by ***. Difference TRAT Between Simultaneous 95% Comparison Means Confidence Limits

Periconia macrospinosa - CN 3.8400 2.9757 4.7043 *** Hypocrea sp.. - CN 3.0400 2.1757 3.9043 *** Microdochium sp.. - CN 1.9000 1.0357 2.7643 *** Phoma glomerata 2 - CN 1.1800 0.3157 2.0443 *** Hypocrea lixii - CN 1.0400 0.1757 1.9043 *** Phoma glomerata 1 - CN 0.2400 -0.6243 1.1043 Cordyceps sinensis - CN -4.9600 -5.8243 -4.0957 ***

La significancia en la comparación a un nivel de 0,05 está dada por ***.

123

Análisis de varianza para las pruebas de patogenicidad de los hongos aislados de las lesiones en la madera.

ANÁLISIS DE VARIANZA Valor Fuente de variación S.C. G.L. CM F Probabilidad crítico para F Modelo 680,9 7 97,27 476,8 1,7064E-30 2,31 Error 6,5 32 0,20 Total 687,4 39

Prueba de Dunnett para comparación de todos los aislamientos obtenidos de las lesiones en la madera con el control negativo (CN).

Parámetro Alfa G.L CME Valor crítico Diferencia mínima de Dunnett significativa (DMS) 0,05 32 0.204 2.76173 0.7889

Prueba de Dunnett de comparación de medias

Dunnett's t Tests for LESION MADERA

Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 32 Error Mean Square 0.204 Critical Value of Dunnett's t 2.76173 Minimum Significant Difference 0.7889

Comparisons significant at the 0.05 level are indicated by ***.

Difference TRAT Between Simultaneous 95% Comparison Means Confidence Limits

Fusarium oxysporum - CN 13.1000 12.3111 13.8889 *** Pesotum sp. -CN 10.0800 9.2911 10.8689 *** Hypocrea coningii - CN 9.1000 8.3111 9.8889 *** Marasmius cladophyllus - CN 6.9400 6.1511 7.7289 *** Candida sp.. -CN 3.9000 3.1111 4.6889 *** Phanerochaete sordida - CN 3.3400 2.5511 4.1289 *** Cladosporium sp. - CN 2.6400 1.8511 3.4289 ***

Significancia en la comparación a un nivel de 0,05 está indicado por ***.

124

Análisis de varianza para las pruebas de patogenicidad de los hongos aislados del suelo de plantaciones afectadas por C. zulmae .

ANÁLISIS DE VARIANZA Valor Fuente de variación S.C. G.L. CM F Probabilidad crítico para F Modelo 792,5 7 113,2 1256,1 0,00 2,3 Error 2,9 32 0,09 Total 795,4 39

Prueba de Dunnet para comparación de todos los aislamientos obtenidos del SUELO con el control negativo (CN).

Parámetro Alfa G.L CME Valor Diferencia mínima crítico de significativa (DMS) Dunnett 0,05 32 0,090125 2.76173 0,5244

Prueba de Dunnett de comparación de medias

Dunnett's t Tests for SUELO NOTE: This test controls the Type I experimentwise error for comparisons of all treatments against a control.

Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 32 Error Mean Square 0.090125 Critical Value of Dunnett's t 2.76173 Minimum Significant Difference 0.5244

Comparisons significant at the 0.05 level are indicated by ***.

Difference TRAT Between Simultaneous 95% Comparison Means Confidence Limits

Fusarium oxysporum 3 - CN 12.3200 11.7956 12.8444 *** Fusarium oxysporum 2 - CN 8.8600 8.3356 9.3844 *** Fusarium oxysporum 1 - CN 8.0000 7.4756 8.5244 *** Trichoderma sp. - CN 4.3000 3.7756 4.8244 *** Mucor hiemalis 2 - CN 2.5400 2.0156 3.0644 *** Cladosporium sp. - CN -0.0800 -0.6044 0.4444 Mucor hiemalis 1 - CN -0.0800 -0.6044 0.4444

La significancia en la comparación a un nivel de 0,05 está dada por ***