Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS

“Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.”

TRABAJO DE TITULACIÓN MODALIDAD TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE LICENCIADO EN BIOLOGÍA

PRESENTA: C. JOSÉ LUIS PAZ ROBLES DIRECTORA: M. EN C. MARIBEL M. LOERA QUEZADA ASESOR: DR. CARLOS RAMÍREZ SERRANO

LAS AGUJAS, ZAPOPAN, JAL., SEPTIEMBRE DEL 2015

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Este trabajo formó parte del proyecto: “Desarrollo de un Protocolo para la Micropropagación de Taxus globosa Schltdl.” Convocatoria CONAFOR- CONACYT-2004-C04-06, financiado por el Comité Técnico y de Administración del Fondo Sectorial para la Investigación, el Desarrollo y la Innovación Tecnológica Forestal.

El presente trabajo se realizó en el Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Dirección: Av. Normalistas 800, Colinas de La Normal, 44270 Guadalajara, Jal. Teléfono: 01 33 3345 5200

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AGRADECIMIENTOS

Al Universo por otorgarme a estos seres maravillosos…..Efraín Paz y Francisca Robles mis Padres….. con quienes comparto parte de sus alelos, siendo ellos autores de lo que soy…..gracias por su soplo de vida, su amor y la trasmisión de sus valores…..los amos. A mi cómplice de aventuras, viajes…camarada de partido, de ideas… ese ser autentico y único que me ha acompañado en lo largo de mi vida…..Mara Paz mi Hermana…..gracias por todo y por darle luz a mi existir. A mis otros ocho hermanos genéticos: Efraín, Adolfo, Claudia, Ricardo, Gerardo, Susana, Rubén y Raúl por ser pilares y formar parte de mi vida, a la cual le han añadido sabor y momentos felices. A mis hermanos espirituales: Olivia Distancia, Ana María Gaspar, Xochitlquetzalli Estrada, Tere Sahagún y Juan P.R. Arana por coincidir en mi camino otorgándole gracia y armonía…los quiero. A los que se me adelantaron en mi camino transformándose en rayos de luz: Ricardo Sainz, Jesús Uribe y a ti Ángel Zúñiga Saavedra por haber estado en los momentos más cruciales de mi existir y darle serenidad a mi vida…siempre estarán presentes en mí… A esos seres que le otorgaron ese toque de investigación y haberme forjado perspectivas en mi formación: Dr. Carlos Ramírez Serrano y M. en C. Maribel Loera Quezada, gracias por haber aportado enriquecido mi conocimiento…. A esos grandes personas que intervinieron y aportaron conocimiento: Dr, Armando Arias, Dra, Lucila Méndez y M.C. Rafael Soltero, gracias a ustedes mi trabajo de investigación fue tomando forma hasta su materialización…gracias.

Con Amor a todos Ustedes……..

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INDICE GENERAL

ÍNDICE DE TABLAS...... iii ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………………iv ABREVIATURAS……………...... v RESUMEN...... vi 1. INTRODUCCIÓN...... 1 1.1 Antecedentes generales…………………………………………………….2 1.1.1 Género Taxus…………………………………………………………..2 1.1.2 Descripción botánica del género Taxus……………………………..4 1.1.3 Utilización e importancia económica del género Taxus…………...5 1.1.4 Taxus globosa Schltdl…………………………………………………7 1.1.5 Historia del paclitaxel………………………………………………...11 1.1.6 Problemática de abastecimiento y fuentes de paclitaxel ………13 1.2 Establecimiento in vitro…………………………………………………….15 1.2.1 Selección del material vegetal………………………………………15 1.2.2 Desinfección del material vegetal…………………………………..17 1.2.3 Condiciones del cultivo e incubación………………………………18 1.2.4 Contaminación in vitro……………………………………………….19 1.2.5 Oxidación in vitro …………………………………………………….20 1.3 Micropropagación…………………………………………………………..23 1.3.1 Proliferación de yemas axilares…………………………………….24 1.3.2 Organogénesis e embriogénesis somática………………………..25 1.3.3 Importancia económica de la micropropagación………………….25 1.3.4 Proliferación de yemas axilares en el género Taxus…………..…26 1.3.5 Organogénesis y embriogénesis somática en el género Taxus...28 1.4 Metabolitos secundarios y cultivo de líneas celulares en suspensión..28 1.4.1 Metabolitos secundarios……………………………………………..28 1.4.2 Cultivo de líneas celulares en suspensión………………………...30 1.4.3 Importancia del cultivo de líneas celulares en suspensión………31 1.4.4 Cultivo de callos en el género Taxus………………………………32 1.4.5 Cultivo de líneas celulares en suspensión en el género Taxus ...35 2. PLANTAMIENTO DEL PROBLEMA………………………………………….37 3. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………...37

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4. HIPÓTESIS………………………………………………………………………38 5. OBJETIVO GENERAL………………………………………………………….38 5.1 Objetivos específicos………………………………………………………38 6. METODOLOGÍA………………………………………………………………...39 6.1 Fase 1: Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl……………39 6.1.1 Material vegetal……………………………………………………….39 6.1.2 Desinfección de los explantes………………………………………39 6.1.3 Medio y condiciones de cultivo……………………………………..41 6.2 Fase 2: Inducción de yemas axilares de Taxus globosa Schltdl……...42 6.2.1 Material vegetal………………………………………………………42 6.2.2 Medio y condiciones de cultivo……………………………………..42 6.3 Fase 3: Inducción de callo en acículas de Taxus globosa Schltdl……43 6.3.1 Material vegetal………………………………………………………43 6.3.2 Medio y condiciones de cultivo para la inducción de callo………43 6.4 Fase 4: Iniciación de la organogénesis indirecta de T. globosa Schltdl 6.4.1 Material vegetal……………………………………………………….43 6.4.2 Medio y condiciones de cultivo para la inducción de brotes adventicios…………………………………………………………….43 6.5 Fase 5: Iniciación del cultivo de líneas celulares en suspensión de Taxus globosa Schltdl……………………………………………………..46 6.5.1 Material vegetal……………………………………………………….46 6.5.2 Medio y condiciones de cultivo para el inicio de líneas celulares en suspensión……………………………………………………….. 46 7. RESULTADOS Y DISCUSIONES...... 47 7.1.1 Desinfección…………………………….………………………………..47 7.1.2 Oxidación…………………………….……………………………………51 7.3 Inducción de las yemas axilares…………….………………………….57 7.4 Inducción de callo………………………………………...... 61 7.5 Inducción de brotes adventicios………………………………………..66 7.6 Iniciación del cultivo de líneas celulares en suspensión…………….68 8. CONCLUSIONES……………………………………………………………….71 9. PERSPECTIVAS………………………………………………………………..73 10. ANEXOS…………………………………………………………………………74 BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..75

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Especies del género Taxus y su ubicación geográfica……..…...... 3 Tabla 2. Clasificación taxonómica de la especie Taxus globosa Schltdl…..……..7 Tabla 3. Eventos históricos del paclitaxel……………………………………..……12 Tabla 4. Diferentes alternativas para la obtención del paclitaxel y alternativas en el cultivo de tejidos vegetales in vitro……………….……………..….14 Tabla 5. Trabajos in vitro en el género Taxus en donde se presentó el proceso de oxidación y su solución………………………………………22 Tabla 6. Proliferación de yemas axilares en el género Taxus…….……………...27 Tabla 7. Propagación in vitro vía organogénesis y embriogénesis somática en el género Taxus………………………………………………………. ..29 Tabla 8. Trabajos in vitro en la inducción de callo en varias especies del género Taxus………………………………………………………………. 32 Tabla 9. Producción de paclitaxel por cultivo de líneas celulares en suspensión en diversas especies de Taxus….………………………… 35 Tabla 10. Nomenclatura de los explantes de los árboles de Taxus globosa…... .39 Tabla 11. Tratamientos utilizados con sus respectivas concentraciones de reguladores de crecimiento para la inducción de yemas axilares…… 43 Tabla 12. Tratamientos con sus respectivas concentraciones de reguladores de crecimiento para la inducción de callo………………………………. 44 Tabla 13. Tratamientos con sus respectivas concentraciones de reguladores crecimiento para la inducción de brotes adventicios………………….. 45 Tabla 14. Porcentajes de contaminación de los grupos controles y experimentales de los 10 árboles utilizados……………………………. 49 Tabla 15. Porcentajes de oxidación de los grupos controles y experimentales de los 10 árboles utilizados.……………………………………………… 52 Tabla 16. Valores determinados por el ANOVA para No Brotes, Tamaño, Color y Apariencia en explantes con meristemo apical….…………… 57 Tabla 17. Valores determinados por la prueba de rangos múltiples (LSD) por tratamiento para el número de brotes en explantes con meristemo apical y decapitados……………………..………….…………………….. 58 Tabla 18. Valores determinados por el ANOVA en los explantes con meristemo apical para No Brotes, Tamaño, Color y Apariencia, en la interacción de las citocininas KIN y 2iP…………………………. ..59 Tabla 19. Valores determinados por la prueba de rangos múltiples (LSD) en el efecto de la concentración de 2iP para el número de brotes en explantes con meristemo apical…………………………………………. 59 Tabla 20. Valores determinados por el ANOVA en los explantes decapitados para No Brotes, Tamaño, Color y Apariencia, en la interacción de las citocinina KIN y 2iP……………………………………………………. 60 Tabla 21. Valores determinados por la prueba de rangos múltiples (LSD) en el efecto de la concentración de 2iP para el número de brotes y la concentración de KIN para la apariencia en explantes decapitados… 60 Tabla 22. Efecto de BA y 2,4-D en la inducción de callo de acículas de Taxus globosa Schltdl. y porcentaje de crecimiento de callo…………63

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Distribución geográfica de las especies del género Taxus...…………...3 Figura 2. Distribución geográfica y nombres comunes asignados en México y Centroamérica de Taxus globosa Schltdl…… ……………………… 9 Figura 3. Taxus globosa Schltdl…………..………………………………………..10 Figura 4. Selección del material vegetal y respuesta morfogénica ………..…....16 Figura 5. Técnicas de cultivo de tejidos in vitro……………………………………24 Figura 6. Proceso de desinfección in vitro deTaxus globosa Schltdl……………40 Figura 7. Contaminación por microorganismos en los explantes de los grupos experimentales después de 30 días de incubación…………..47 Figura 8. Contaminación por hongo endógeno de consistencia algodonosa…..47 Figura 9. Contaminación por hongos exógenos de diferentes formas.…………48 Figura 10. Porcentaje de contaminación de los grupos experimentales por bacteria, hongo endógeno y hongo exógeno…………………………. 49 Figura 11. Porcentaje total de contaminación en los grupos experimentales.....50 Figura 12. Variables de respuesta de los grupos experimentales………………. 51 Figura 13. Explantes pertenecientes al Ar8 del grupo experimental……………. 52 Figura 14. Porcentajes de oxidación de los grupos experimentales…………….. 53 Figura 15. Explantes con diferentes grados de oxidación……………………….…53 Figura 16. Porcentaje total de oxidación……………………………………………. 54 Figura 17. Comparación de los explantes del Ar1 en los dos establecimientos que se le realizaron…...…………………………………………………. 55 Figura 18. Comparación de los explantes del Ar20 en los dos establecimientos que se realizaron………...………………………………………………. 56 Figura 19. Explantes del grupo control del Ar8 del grupo control…………………56 Figura 20. Morfología de los tres tipos de callo en la fase de inducción de callo…………………………………………………………………....….. 62 Figura 21. Inducción de callo a partir de acículas…………………………..………62 Figura 22. Situaciones que se presentaron en el mantenimiento y multiplicación de callo.…………………………………………………... 64 Figura 23. Crecimiento de callo en la inducción de brotes adventicios…………..67 Figura 24. Aspecto de las líneas celulares en suspensión contenidas en los matraces al término de 30 días…………………………………………. 68 Figura 25. Proceso para la iniciación del cultivo de células en suspensión de Taxus globosa Schltdl………………………………………………………………………………. 70

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ABREVIATURAS

2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 2iP 6-(γ,γ dimetilalilamino) purina Ac. Asc. Ácido ascórbico Ac. Cit. Ácido cítrico AIA (IAA) Ácido indol-3-acético AIB (IBA) Ácido indol-3-butírico ANA (NAA) Ácido 1-naftalenacético BAP (BA) 6-bencilaminopurina B5 Medio de cultivo de Gamborg y col., 1968 CA Carbón activado CCC Cloruro de clorocolina DNA Ácido desoxirribonucleico FDA Administración de alimentos y fármacos (Food and Drug Administration)

GA3 Ácido giberélico 3 GC Grupo control GE Grupo experimental KIN 6-furfurilaminopurina MeJA Jasmonato de metilo MS Medio de cultivo de Murashige y Skoog, 1962 Pic Picloram PVP Polivinilpirrolidona RNA Ácido ribonucleico SH Medio de cultivo de Schenk y Hildebrandt, 1972 TDZ Tidiazuron WPM Medio de cultivo de Lloyd y McCown, 1980

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RESUMEN La importancia del género Taxus radica en que todas sus especies producen en su corteza, hojas, tallos y raíces un compuesto denominado paclitaxel, el cual fue aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) para el tratamiento de diversos tipos de cáncer (Oberlies y Kroll, 2004). Por tal motivo, el género Taxus ha sido objeto de investigaciones para la extracción y el aprovechamiento del paclitaxel. Existen varias alternativas para la producción de paclitaxel como son la síntesis química total, la semisíntesis y la producción in vitro por cultivos celulares (Heining y Jennewein, 2009). De todas las especies del género, la menos estudiada es el tejo mexicano, Taxus globosa Schltdl., la cual tiene una distribución discontinua y restringida a microhábitats muy particulares, considerada como rara en las categorías oficiales de conservación de especies (Soto-Hernández y col., 2011). Su preservación es particularmente importante, considerando su distribución restringida y su uso potencial para propósitos medicinales debido a que, como el resto de las especies del género, produce paclitaxel. Al considerar los aspectos botánicos de la especie, además de la importancia económica que representa, es deseable implementar técnicas alternativas para su propagación. Un método que facilita la rápida regeneración de plantas, así como su aprovechamiento sustentable, consiste en el cultivo de células y tejidos vegetales, representando una invaluable ventaja y una promisoria fuente de materia prima para la producción de paclitaxel, ya que a la planta le toma cerca de cien años alcanzar dimensiones adecuadas (diámetro de 25 cm y altura de 6 a 9 m) para la utilización de su corteza (Soto y col., 2000). El objetivo principal del presente trabajo fue el establecimiento in vitro de los explantes de Taxus globosa Schltdl. Se observó el crecimiento de tres tipos diferentes de microorganismos: bacterias, hongos endógenos y hongos exógenos, siendo el porcentaje de contaminación del 12%. También se observó un comportamiento errático en cuestión del proceso de oxidación, sin embargo con la utilización de antioxidantes como el ácido cítrico al 0.3% en acción conjunta con ácido ascórbico al 0.2% se redujo el proceso de oxidación teniendo un 64.6% de explantes verdes, considerándose un porcentaje alto para una especie con la cual no se había trabajado previamente in vitro.

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1. INTRODUCCIÓN

México cuenta con numerosas especies forestales nativas las cuales constituyen uno de los recursos naturales más importantes, además de poseer un gran valor e interés científico, ya sea por su importancia ecológica, por su valioso potencial genético o por ser consideradas como una alternativa económica interesante. Con respecto a este último aspecto, las plantas superiores no sólo proveen de alimentos, fibras y madera, sino también de muchos compuestos tales como aceites, condimentos y productos farmacéuticos. Aunque son recursos renovables, algunas especies son más difíciles de obtener en cantidades suficientes para cubrir la demanda. La destrucción de hábitats naturales, el mal manejo en la explotación de las especies, las prácticas clandestinas, el proceso prolongado que requieren algunas especies en su regeneración natural, así como, las dificultades en las técnicas de cultivo convencionales reducen drásticamente las poblaciones naturales. Tal es el caso de las especies del género Taxus. Un acontecimiento que repercutió a la disminución de poblaciones naturales del género Taxus, principalmente de la especie brevifolia, fue debido a las técnicas implementadas en su inicio para la extracción del paclitaxel. La corteza de T. brevifolia es delgada (cerca de 3 mm); de un árbol de cien años se obtiene en promedio, 3 Kg de corteza, de los cuales se extraen 300 mg de paclitaxel, de tal forma que era necesario el descortezamiento de tres a seis árboles centenarios para la obtención de 1 g de paclitaxel o para el tratamiento de un solo paciente (Zwawiak y Zaprutko, 2014; Soto y col., 2000).

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1.1 Antecedentes generales 1.1.1 Género Taxus La Familia Taxaceae esta conformada por seis géneros: Amentotaxus, Austrotaxus, Cephalotaxus, Pseudotaxus, Taxus y Torreya (Christenhusz y col., 2011). El género Taxus es el más conocido de la familia y el que presenta una distribución más amplia; los individuos de este género comúnmente se conocen como tejos. La denominación latina Taxus proviene del griego “ taxis ” que significa ordenado en filas, característica que poseen todos los miembros del género haciendo referencia al acomodo de sus hojas aciculares decurrentes sobre la rama (Fernández y col., 2004). Existe una base botánica a considerar y es que las especies actuales del género descienden de Paleotaxus un árbol fósil abundante en la mitad del Jurásico hace 200 millones de años (Florin, 1948). Una de las polémicas del género radica en su clasificación taxonómica (Pant, 2000). Otra dificultad se presenta en la determinación de la cantidad de especies, partiendo principalmente por la distribución geográfica y morfológica para su delimitación (Hao y col., 2008), así como, la realización de estudios químicos (van Rozendaal y col., 1999; Dempsey y Hook, 2000; Ge y col., 2008) y genéticos (Gao y col., 2007). Dependiendo del autor, existen variantes en el número de especies propuestas: ocho de acuerdo a Spjut (2007a), nueve según reporta Liguo y col. (1999), diez según Cope (1998), Farjon (2001) y Li y col. (2001) y por último, Spjut (2007b) reporta veinticuatro. La mayor controversia se encuentra en las especies del continente asiático (Möller y col., 2007). La clasificación mayormente aceptada para el género es la de 10 especies propuesta por Farjon (2001), la distribución es, de la siguiente manera: en Norte y Centroámerica las especies: Taxus globosa Schltdl., Taxus canadensis Marsh., Taxus brevifolia Nutt. y Taxus floridana Nutt. En Europa, Norte de África y Zona del Cercano Oriente solo se encuentra la especie Taxus baccata L. y en Asia Oriental se encuentran a las especies Taxus chinensis (Pilg.) Rehd., Taxus cuspidata Sieb. y Zucc., Taxus fuana Nan Li & R.R., Taxus sumatrana (Miq.) de Laub. y Taxus wallichiana Zucc. (Figura 1 y Tabla 1).

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Taxus Taxus bacata Taxus chinensis canadensis Taxus wallichiana Taxus fuana

Taxus brevifolia

Taxus cuspidata Taxus floridana Taxus globosa

Taxus sumatrana

Figura 1. Distribución geográfica de las especies del género Taxus.

Tabla 1. Especies del género Taxus y su ubicación geográfica basado de Farjon (2001).

Especie Nombre Común Distribución Geográfica Europa, norte de África y oeste de Taxus baccata L. Tejo europeo Asia (de Turquía al norte de Irán) Región costa del Pacífico de Taxus brevifolia Tejo del Pacífico Norteamérica (de Alaska a Nutt. o del oeste California) Noreste de Norteamérica: de Taxus canadensis Newfoundland a Manitoba (Canadá) Tejo canadiense Marsh. y de Iowa y Carolina del Norte (EUA) Taxus chiniensis Tejo chino China Rehd. Taxus cuspidata China, Japón, Corea del Norte y Tejo japonés Sieb. oeste de Rusia Taxus floridana Tejo de Florida Endémico del Norte de Florida Nutt. Taxus fuana Nan Tejo chino Oeste del Himalaya Li y R.R. Taxus globosa México, Guatemala, El Salvador y Tejo mexicano Schltdl. Honduras Taxus sumatrana Tejo de Sumatra Indonesia y Filipinas (Miq.) de Laub. Taxus wallichiana Tejo del Desde el oeste de Afganistán, Tibet Zucc. Himalaya hasta China

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1.1.2 Descripción botánica del género Taxus Los árboles del género Taxus son perennifolios; hojas dispuestas en espiral, pero frecuentemente dísticas, cortamente pecioladas. Estróbilos masculinos axilares, solitarios o rara vez en espigas cortas (Liguo y col., 1999). Óvulo solitario sobre una escama terminal, axilar, cubierto por numerosas escamas estériles, anchas, fuertemente imbricadas, las superiores gradualmente más grandes, casi formando una cúpula, lámina ovulífera anular en la antesis, volviéndose prominente con el tiempo, cupulada y truncada, más corta que la semilla; semilla madura ovoide-globosa, testa dura, cubierta parcialmente por un arilo carnoso, en forma de baya, de color rojo brillante, embrión con 2 cotiledones (Zamudio, 1992). Son árboles dioicos, excepto la especie Taxus canadensis la cual es monoica (Allison, 1990) y algunos alcanzan hasta los 25 metros de altura. En general, son árboles longevos, como lo muestran ejemplares ingleses que alcanzan 1,500 años de edad (Centelles e Imperial, 2010). Su gran longevidad radica en su forma peculiar de regeneración, en arboles viejos, se ha observado que a partir del cambium existente en partes superiores del fuste, el tejo es capaz de emitir raíces hacia el interior del tronco hueco, absorbiendo los nutrientes de la madera muerta en proceso de humificación, luego estas raíces internas avanzan hacia abajo hasta alcanzar el suelo, ya sobre la superficie comienzan a desarrollar corteza hasta transformarse en nuevos troncos (Schwentner, 2008). Los lugares donde habitan las plantas de Taxus en el mundo son hondonadas de montañas, cañadas, barrancas y otros lugares sombríos (Zavala-Chávez y col., 2001). Se encuentran aislados o en pequeños grupos, asociados con otros árboles en lugares húmedos y sombreados, parece ser que no toleran los rayos directos del sol y crecen preferentemente en suelos alcálinos. Su amplia distribución geográfica radica en que las aves son atraídas por el color rojo y sabor dulce del arilo que presenta el fruto (el cual es la única estructura del árbol que no es tóxica), los comen y arrojan las semillas como desecho, de este modo participando en su dispersión (Zavala-Chávez y col., 2001).

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1.1.3 Utilización e importancia económica del género Taxus En Europa, antiguamente diferentes pueblos otorgaron a los arboles del tejo características mágico-religiosas, al considerarlos árboles sagrados a causa de su permanente verdor y longevidad, pero también temibles por su toxicidad (Fernández y col., 2004; Blanco y col., 2008). Para los irlandeses era un símbolo de la vida y de la muerte. Usaban su madera para realizar instrumentos religiosos, lo representaban en su alfabeto, promovieron severas leyes y sanciones para el que los dañara (Delahunty, 2007). Los pueblos Celtas construían sus templos y altares cercas de los tejos (Fernández y col., 2004). Los usos económicos de las especies de Taxus en América del Norte datan desde las civilizaciones precolombinas, donde se les utilizaba para hacer armas, objetos para labrar, y cocinar, y también se le utilizaba para realizar objetos de arte (Shemluck y col., 2003). Taxus baccata se hizo popular en los jardines europeos del siglo XVII, fue aprovechada como ornamental primero en Europa y posteriormente en América (Blanco y col., 2008). En general, diversas especies de Taxus se cultivan para una gran variedad de propósitos hortícolas, particularmente en jardines como árboles de ornato o setos (Zavala-Chávez y col., 2001) y localmente se les utiliza como leña y carbón (Zavala-Chávez, 2001). Por las características de su madera, la cual tiene gran flexibilidad y dureza, se le ha empleado desde la antigüedad para la elaboración de armas, especialmente arcos y ballestas (Schwentner, 2008) y fabricación de muebles (Blanco, 2008). En la medicina tradicional se le ha utilizado como abortivo, una de las causas principales de envenenamiento humano (Cope, 2005), por lo que también suele ser llamada el árbol de la muerte, justificado por el carácter tóxico de todas las estructuras del árbol, excepto el arilo. Las Tribus americanas usaban brebajes de T. brevifolia para tratar el reumatismo, fiebre y artritis, mientras que los japoneses empleaban las hojas de T. cuspidata para tratar la diabetes e inducir los abortos (Fernández y col., 2004) Se a demostrado su efectividad como antimicótico (Krauze-Baranowska y Wiwart, 2003), en la ulcerosis (Gurbuz y col., 2004), en la malaria (Pouvelle y col., 1994), anticonvulsivo, analgésico y antipirético (Nisar y col., 2008), antimicobacterial (Erdemoglu y col., 2003), inmunomodulador y antinflamatorio (Sharma y Grag, 2015).

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Se han podido obtener híbridos artificialmente, como es el caso de Taxus x media Rehder., obtenido de Taxus baccata y Taxus cuspidata; y Taxus x hunnewelliana Rehder., obtenido de Taxus cuspidata y Taxus canadensis (Collins y col., 2003). Con respecto a la especie mexicana Taxus globosa Schltdl., los usos locales que se le ha dado son poco conocidos, rara vez se usa como planta de ornato, maderable, curtiente, en la elaboración de carbón, en la construcción y en la confección de ramos de muertos (Zamudio, 1992; García-Aranda y col., 2011). Pero la gran importancia económica del género Taxus radica con el descubrimiento en 1964 de un compuesto extraído de la corteza de Taxus brevifolia Nutt. (tejo del pacífico), del cual en 1971 se determinó su estructura química, recibiendo el nombre de paclitaxel, siendo éste uno de los miembros estructuralmente más complejos de los taxanos alcaloides diterpénicos naturales (Wani y col., 1971). Más tarde se descubrió que todas las especies del género Taxus lo producen en su corteza, hojas, tallos y raíces (Soto y col., 2000; Jennewein y Croteau, 2001), siendo posteriormente aprobado por la FDA (Food Drug Administration) como anticancerígeno y empleado en el tratamiento de diversos tipos de cáncer, como el cáncer ovárico y el de mama (Blanco y col., 2008). Ante esto el género Taxus ha sido objeto de investigaciones para la extracción y el aprovechamiento del paclitaxel. Dada la importancia, principalmente en el sector salud, es necesario implementar alternativas para la extracción de paclitaxel, sin causar impacto en las poblaciones naturales.

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1.1.4 Taxus globosa Schltdl. La familia Taxaceae se encuentra representada en México por el género Taxus con una sola especie, Taxus globosa Schltdl., y su clasificación taxonómica se muestra en la tabla 2.

Tabla 2. Clasificación taxonómica de la especie Taxus globosa Schltdl.

Reino Plantae División Pinophyta Clase Pinopsida Orden Pinales Familia Taxaceae Género Taxus Especie globosa

Taxus globosa Schltdl. fue descrita por primera vez en 1838 por el botánico alemán Diederich Franz Leopnhard von Schlechtendal, con material colectado por Christian Ehrenberg (Shemluck y col., 2003). Se le conoce comúnmente como tejo mexicano, sin embargo, en México recibe otros nombres, según la localidad donde se encuentre: granadillo (Querétaro), mezquitillo (Nuevo León), romerillo (Hidalgo y Veracruz), tacxi ó tlastscal (Oaxaca), chachún ó romerillo colorado (Chiapas) (Contreras-Medina y Luna-Vega, 2001) en Centroamérica como cipresillo y Norteamérica como Mexican yew (Contreras-Medina y col., 2011). Su distribución geográfica es discontinua en el país, se distribuye a lo largo de la Sierra Madre Oriental; al norte en Tamaulipas y Nuevo León; al centro en San Luis Potosí, Hidalgo, Querétaro y Puebla y en el sur en Oaxaca y Chiapas; asimismo, hay poblaciones en Honduras, Guatemala y El Salvador (Contreras- Medina y col., 2011). Habita en lugares poco accesibles (hondonadas de montaña, cañadas, barracas y lugares sombríos), bosques mesófilos de montaña o de coníferas, en un intervalo altitudinal variable, desde los 1000 msnm en Querétaro, hasta los 3000 msnm en Oaxaca (Soto-Hernández y col., 2011) (Figura 2). Nuevo León es el estado que presenta la mayor cantidad de individuos

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. y con el mejor potencial en su regeneración natural (López-Upton y García-Martí, 2015). Es un árbol que alcanza hasta 20 m, a menudo con un solo tronco, siendo en altura el más bajo del género. El tamaño y la forma de la hoja es uno de los caracteres más variables del género. Al parecer, estos caracteres son influenciados altamente por condiciones ambientales en los primeros tiempos del desarrollo de la hoja. En T. globosa, el tamaño de la acícula es variable, hasta 2.0 mm de grosor y 30 mm de longitud (Shemluk y col. 2003) (Figuras 3b y 3c). Su tronco es erecto, de 30 a 50 cm de diámetro, muy ramificado, con las ramas colgantes (Figura 3a) formando una copa redondeada o extendida; la corteza es escamosa de color café claro, que se desprende en fragmentos cuadrados o rectangulares; hojas distribuidas en espiral, las cuales posteriormente se disponen en forma dística o subdística por la torsión del pecíolo, aplanadas, lineares a linearlanceoladas, ligeramente falcadas, ápice agudo, acuminado, base angosta, pecíolo corto, márgenes ligeramente involutos, una sola vena media engrosada, verde oscuras en el haz, más claras en el envés, con hileras de estomas en el envés (Contreras-Medina y Vega-Luna, 2001). Los árboles femeninos presentan brotes primarios sobre los cuales se desarrollan brotes secundarios, que a su vez son portadores de un óvulo terminal que en su eje axilar tiene escamas arregladas helicoidalmente, el cual, al madurar, se cubre con una estructura carnosa de color rojo (arilo), comestible y muy atractiva para las aves (Figura 3d). Los árboles masculinos presentan sus estructuras reproductoras en diminutos estróbilos formadas por 5 a 9 sacos polínicos. Florece de enero a marzo y fructifica de mayo a noviembre (Zavala- Chávez y col., 2001). Las semillas tienen una cubierta carnosa y mucilaginosa de color rojo llamada arilo, presentando una abertura en su parte inferior por la cual se puede ver la semilla. La semilla sin el arilo son piriformes con una longitud de alrededor 6.5 mm y con un peso promedio de 0.44 g en estado maduro, (Ramírez-Sánchez y col., 2011). Taxus globosa se considera rara en las categorías oficiales de conservación de especies (NOM-050-ECOL-2000), y por tal motivo está sujeta a protección especial. La creciente destrucción de los bosques en que habita puede afectar drásticamente a las pocas poblaciones que existen y ocasionar su desaparición, aunado a esto, su crecimiento en su hábitat natural es lento y el

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. número de adultos en estado de reproducción son escasos condicionando a la especie a estar en peligro de desaparecer (López-Upton y García-Martí, 2015). Por tal motivo es importante generar investigaciones para obtener información que permita la repoblación y conservación.

*Los números corresponden en el mapa a las Zonas Naturales Protegidas.

México Ubicación Geográfica Principal Nombre Común Parque Nacional Cumbres de Monterrey1 Nuevo León mezquitillo Zona de Restauracióon Ecológica del Lobo Mexicano Tamaulipas Cerro del Diente, El Cielo y Julilo mezquitillo San Luis Mesa de San Isidro romerillo Potosí Parque Nacional El Chico3 Hidalgo romerillo Reserva de la Biosfera Barranca de Metztitlán Querétaro Reserva de la Biosfera Sierra Gorda2 granadillo Puebla Reserva de la Biosfera Tehuacán-Cuicatlán romerillo Parque Nacional Pico de Orizaba Veracruz romerillo Parque Nacional Cofre de Perote chachún ó Chiapas Meseta Central de Chiapas colorado Tierra de Manejo Comunitario La Tierra del Faisán4 Oaxaca Zona de Conservación Comunitaria Santo Domingo tacxi ó tlastcal Cacalotepec Guatemala Baja Verapaz 5 Reserva de la Biosfera Sierra de las Minas ciprecillo El Progreso Honduras Lempira Parque Nacional Celaque7 6 ciprecillo Santa Bárbara Parque Nacional Montaña de Santa Bárbara El Salvador Chalatenango Reserva Ecológica El Pital ciprecillo

Figura 2. Distribución geográfica y nombres comunes asignados en México y Centroamérica de Taxus globosa Scltdl.

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a

b c

d

Figura 3. Taxus globosa Schltdl. a) Parte aérea de un árbol mostrando sus ramas; b) Segmento de una rama (parte ventral); c) Segmento de una rama (parte dorsal) observándose el acomodo de los estróbilos y d) Estróbilo femenino, apreciando la estructura carnosa de color rojo la cual envuelve la semilla denominada arilo.

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1.1.5 Historia del paclitaxel Químicamente, el paclitaxel es uno de los miembros estructuralmente más complejos de los taxanos, alcaloides diterpénicos naturales, el cual tiene propiedades anticancerígenas (Wani y col., 1971). El pionero en lo que concierne a trabajos sobre el paclitaxel fue el Instituto Nacional de Cáncer (NCI, por sus siglas en inglés) que en la década de los años 50´s puso en marcha un programa para experimentar con extractos de plantas, utilizando dos modelos experimentales: un modelo de tumores in vivo y otro de tumores de líneas celulares in vitro, (Guénard y col., 1993) con la finalidad de encontrar sustancias naturales con propiedades anticancerígenas, en esta fase inicial se sometieron a evaluación más de 110,000 extractos de plantas (Fu y col., 2009). Con la ayuda del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), en 1962 el botánico Arthur Barclay colectó muestras de Taxus brevifolia (Renneberg, 2007). En 1964 Wani y Wall descubrieron una actividad citotóxica en extractos de la corteza de T. brevifolia y aislaron una sustancia cristalina, la cual se denomino paclitaxel (Lesney, 2004). En 1971 Wani y su equipo, determinaron y publicaron la estructura química del paclitaxel. La determinación de la molécula de paclitaxel se realizó mediante la espectrometría de masas y análisis elemental, siendo su fórmula química C47H51NO14 (Wall y Wani, 1995). Wall y Wani (1977) realizaron una investigación sobre la actividad anticancerígena de diversas sustancias en donde el paclitaxel formaba parte, y descubrieron que éste no sólo se encontraba en la corteza de Taxus brevifolia, si no también se encontraba en otras especies del género Taxus. En 1978 se probó en ratones al implantarles tumores mamarios humanos, donde se observó una regresión considerable del tumor y en los años 80´s se demostró su eficacia contra el cáncer de ovario (Guénard y col., 1993; Walsh y Goolman, 2002). En 1979 el equipo al mando de la Dra. Susan Horwitz determinaron la forma de acción del paclitaxel, el cual tiene un novedoso modo de acción: polimeriza y estabiliza los microtúbulos, bloqueando la replicación celular en la fase tardía G2-M del ciclo celular, a diferencia de los agentes clásicos antimitóticos, tales como la colchicina y la vinblastina, los cuales desestabilizan los microtúbulos (Schiff y col., 1979). Posteriormente, debido a los excelentes resultados clínicos en casos de cáncer de ovario, en 1992 fue aprobado por la FDA (Food and Drug

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Administration) para su uso clínico (Jenneweih y Croteau, 2001); Luego en 1994 fue aprobado para tratar el cáncer de mama y en 1997 para tratar el sarcoma de Kaposi en pacientes con SIDA (Oberlies y col., 2004). Su eficacia se ha probado en la regresión de otros tipos de cáncer, como el de pulmón, cabeza, cuello, próstata, esofágico, gastrointestinal, pancreático, hepático, vejiga, melanoma, linfoma de Hodkins, adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas (Fauzee y col., 2011) (Tabla 3). Comúnmente recibe el nombre de Taxol®, nombre con el cual lo comercializa la empresa Bristol-Myers-Squibb, la primera farmacéutica en producir el anticancerígeno. Hoy en día existen otros productos farmacéuticos y nuevas formulaciones en el mercado donde su principio activo es el paclitaxel, como es el caso del Abraxane™ comercializado por la empresa American Pharmaceutical Partners, Incorporated (APP) (Bimer, 2005; Yared y Tkaczuc, 2012). También se ha obtenido su análogo semisintético docetaxel (Taxotere ®) extraído de las acículas del árbol Taxus baccata L. (Yared y Tkaczuk, 2012).

Tabla 3. Eventos históricos del paclitaxel. Año Evento Referencia La NCI de EU pone en marcha un programa para Guenard y col., Años 50´s la experimentación de plantas 1993 1962 Colecta de muestras de T. brevifolia por Barclay Lesney, 2004 Wani y Wall descubren un compuesto químico en Walsh y 1964 T. brevifolia el cual denominan paclitaxel Goolman, 2002 1971 Publicación de la estructura química del paclitaxel Wani y col.,1971 Se descubre que el paclitaxel tiene propiedades Wall y Wani, 1977 anticancerígenas y que todas las especies del 1977 género Taxus lo contienen Schiff y col., 1979 Se determina su mecanismo de acción 1979 Se prueba su eficacia contra el cáncer de ovario y Schiff y Horwitz, Años 80´s su efectividad contra tumeres mamarios 1980 La FDA aprueba su uso clínico en el tratamiento Jenneweih y 1992 del cáncer de ovario Croteau, 2001 Se obtiene la síntesis química total. Nicolaou y col., 1994-1997 Se aprueba para el uso clínico del tratamiento de 1994 cáncer de mama y sarcoma de Kaposi. Se aprueba su eficacia en diferentes tipos de Heinstein y Años 90´s cáncer Chang, 1994 Búsqueda de alternativas para su obtención

Actualidad comercial, siendo el Cultivo de Tejidos Vegetales Tabata, 2004 una opción para el abastecimiento

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1.1.6 Problemática de abastecimiento y fuentes del paclitaxel Hasta hace pocos años, la corteza de Taxus brevifolia era la única fuente del paclitaxel. El problema se acrecentó en la década de los años 90’s, ya que, aproximadamente era necesario el descortezamiento de 4,000 árboles del tejo del pacífico para proporcionar 360 g de paclitaxel para los ensayos clínicos tempranos, y esto aumentó a 38,000 árboles para 25 kg de paclitaxel para el tratamiento de 12,000 pacientes (Mann, 2002). Sin embargo, su abastecimiento a partir de las fuentes naturales no ha podido satisfacer la demanda para usos clínicos debido a la escasez de poblaciones naturales del género Taxus, el período de dormancia que tienen las semillas, el lento crecimiento de los árboles y al bajo contenido de paclitaxel en su corteza (40-100 mg/kg). Otras fuentes alternativas para el suministro del alcaloide incluyen la extracción a partir de otras especies de Taxus (Luo y col., 2001), semisíntesis a partir de precursores de taxanos, síntesis química y producción in vitro por cultivos celulares (Tabla 4). La síntesis total es una ruta demasiado costosa, debido a la serie de procesos complicados que se requieren para la obtención de paclitaxel (Walji y McMillan, 2007). Aunque la semisíntesis es actualmente la mayor fuente de paclitaxel, la obtención del precursor 10-deacetylbaccatin III aún constituye un problema, además que el contenido de taxoides es muy variable debido a factores ambientales y epigenéticos, por el lento crecimiento de los árboles y además se necesita un proceso de purificación el cual es muy costoso. Por otro lado, el cultivo celular de Taxus spp. se considera una de las más prometedoras fuentes de paclitaxel y compuestos relacionados (Tabata, 2004). El cultivo in vitro de células en suspensión a partir de callos ha sido piedra angular como herramienta promisoria para el abastecimiento, la optimización de la tasa de producción y el incremento del paclitaxel. Mientras tanto la propagación in vitro de las diferentes especies de Taxus sigue siendo la clave para la conservación de las poblaciones naturales. La producción de paclitaxel por medio del cultivo de callos y células en suspensión se ha realizado en T. chinensis (Pérez y col., 2004), T. wallichiana (Hien y col., 2004), T. brevifolia (Khosroushahi y col., 2011), T. baccata (Ashrafi y col., 2010) y T. globosa (Tapia y col., 2013). En los últimos 20 años se ha trabajado en la regeneración in vitro en varias especies de Taxus: se ha realizado la micropropagación de T. baccata (Abbasin y col., 2010; Sapam y Laisram 2012); la organogénesis de T. wallichiana (Datta y

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. col., 2006; Hussain y col., 2013); la embriogénesis somática de T. brevifolia (Chee, 1996) y T. wallichiana (Datta y Jha, 2008), así como la micropropagación de T. mairei a partir de explantes derivados de árboles maduros (Chang y col., 2001) y la propagación por yemas axilares de T. baccata, a partir de embriones cigóticos (Majada y col., 2000).

Tabla 4. Diferentes alternativas para la obtención del paclitaxel y alternativas en el cultivo de tejidos vegetales in vitro. Denis y col., 1988 Kingston y col., 1992 Semisíntesis Wender y Mucciaro, 1992 (a partir de precursores de taxanos) Jenkins, 1996 Gennari y col., 1997 Holton y col., 1994 a,b Nicolaou y col., 1994 Síntesis Química Total Danishetsky y col., 1996 Morihira y col., 1998 Kusama y col., 2000 Chee, 1996 Embriogénesis Somática Datta y Jha, 2008 Chee, 1995 Organogénesis Datta y col., 2006 Das y col., 2008 Majada y col., 2000 Cultivo de Tejidos Proliferación de Yemas Nhut y col., 2007 in vitro axilares Ewald, 2007 Abbasin y col., 2010 Chee, 1994 Germinación Zarek, 2007 Cultivos Celulares en Tang y col., 2001 Suspensión Bruňáková y col., 2005

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1.2 Establecimiento in vitro El nombre de cultivo in vitro de tejidos vegetales indica el hecho de que todo el cultivo de alguna estructura vegetal (semillas, frutos, hojas, tallos, raíces etc.) se realiza bajo condiciones de asepsia en un medio nutritivo generalmente gelificado, en recipientes de vidrio y en condiciones ambientales controladas, en la espera de una respuesta morfogénica (George y Debergh, 2008). Según Kane (2002) en la micropropagación de cualquier especie vegetal se requiere de cinco etapas fundamentales: a) Selección y preparación de la planta donadora. b) Establecimiento del cultivo aséptico. c) Proliferación de brotes axilares. d) Enraizamiento. e) Transferencia al medio ambiente natural. El establecimiento in vitro es la etapa de iniciación y es determinante, ya que es donde se observa si realmente la manipulación de los tejidos vegetales están en condiciones de asepsia. Los procesos que afectan el éxito o fracaso de esta etapa incluye: la selección del material vegetal, la eliminación de los microorganismos contaminantes de la superficie del explante y del medio de cultivo, así como las condiciones de cultivo e incubación de los explantes. La duración de esta etapa es variable y depende de cada especie, pero durante este período aparecen las primeras variables de respuesta esperadas (Hall, 2000).

1.2.1 Selección del material vegetal La selección del explante es fundamental en el establecimiento de tejidos vegetales, ya que estos deben ser fisiológicamente competentes para provocar la respuesta morfogénica apropiada. En general los tejidos más jóvenes, como las puntas de brotes terminales o axilares se regeneran mejor que otros tejidos del tallo más viejos y maduros. Las yemas florales y las inflorescencias inmaduras a menudo se regeneran con bastante facilidad. En relación a las yemas y a los órganos de almacenamiento se deben tomar en consideración los patrones de letargo estacional. Debido a que la capacidad de varios tejidos para responder en ciertas formas específicas parece ser debida a capacidades internas inherentes, obviamente la selección del explante es de gran importancia en la determinación

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. del éxito de la operación. El manejo apropiado de las plantas madre puede ser importante para obtener una regeneración exitosa y reducir la contaminación. Puede ser útil cultivar las plantas madres en condiciones de luz y temperatura controlada a fin de producir desarrollo de material en el estado fisiológico adecuado. En plantas leñosas es recomendable seleccionar material juvenil sano (Kane, 2000; George y Debergh, 2008). La reducción de los contaminantes superficiales de las plantas madre ayuda en el proceso de desinfección. En general, las plantas madres cultivadas en macetas en el medio protegido de invernadero son mejores fuentes de explantes que las cultivadas en la intemperie o que crecen en su medio natural (Wickremesinhe y Arteca, 1993). Un factor importante a considerar consiste en la selección del explante inicial (semillas, brotes, hojas), ya que dependiendo de éste es la respuesta morfogénica figura 4.

2. Desinfección del material vegetal

1. Selección del 3. Establecimiento del

material vegetal material vegetal in vitro

Germinación Semillas in vitro Embriogénesis somática

Hojas Organogénesis Cultivo de callos

Brotes Proliferación de yemas axilares

Figura 4. Selección del material vegetal y respuestas morfogénicas.

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1.2.2 Desinfección del material vegetal La desinfección en el establecimiento in vitro es de suma importancia, ya que consiste en la eliminación de los microorganismos contaminantes (hongos y bacterias principalmente) de la superficie del explante, ya que si no se eliminaran, éstos afectarían al crecimiento normal del explante compitiendo por nutrientes del medio de cultivo ocasionándole su muerte. La contaminación in vitro por mohos, bacterias o levaduras principalmente es considerado como uno de los problemas más severos que se presentan en los laboratorios de cultivo de tejidos vegetales, que repercuten en la investigación y en el comercio. Por lo tanto, es indispensable que se cuente con un protocolo para desinfectar o remover de los tejidos vegetales los microorganismos contaminantes (hongos, bacterias) y otros contaminantes sin dañar tanto la capacidad de regeneración del explante (Niedz y Bausher, 2002). Los agentes desinfectantes utilizados incluye antibióticos y fungicidas, alcoholes, cloruro de mercurio, compuestos halógenos (clorina, bromita e iodina) y peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) (Niedz y Bausher, 2002). En general, se puede indicar que casi siempre se utilizan soluciones de hipoclorito de calcio o de sodio (ampliamente disponibles con diferentes marcas comerciales como blanqueadores domésticos), los cuales liberan al cloro como agente desinfectante activo. Las concentraciones de hipoclorito de sodio, generalmente se utilizan al 6% y con alcohol al 70% (Chang y col., 2001; Zarek, 2007). También otros han utilizado en sus protocolos de desinfección peróxido de hidrógeno (Majada y col., 2000), cloruro de mercurio (Datta y col., 2006) y nitrato de plata (Ibrahim y col., 2011). Usualmente, antes de poner el material vegetativo en contacto con el agente desinfectante, se sumerge en alcohol etílico al 70% con el cual se eliminan las ceras y grasas de la superficie vegetal y se permite una mejor penetración del agente desinfectante en el material. Algunos alcoholes (etílico, metílico ó isopropílico) en concentraciones del 70 al 75% también se emplean como desinfectantes, pero son muy tóxicos para el material vegetal, de manera que su empleo está restringido a inmersiones de corta duración y a la esterilización de superficies externas. Posteriormente con la finalidad de incrementar el efecto del agente desinfectante se recomienda adicionar a la solución un agente

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. humectante, tal es el caso de Tween. Por último, los agentes desinfectantes son eliminados por medio de varios lavados con agua bidestilada estéril. El tipo de agente desinfectante utilizado, la concentración y el tiempo de desinfectación debe ser determinado dependiendo la especie vegetal con la que se va a trabajar, la sensibilidad del tipo de material vegetativo (fitotoxicidad) y el costo (Beyl, 2000; Niedz y Bausher, 2002). La mayoría de los microorganismos se encuentran en la superficie de los tejidos vegetales, sin embargo, existen evidencias de la presencia de algunos de ellos en la parte interna de las plantas los cuales son conocidos como microorganismos endógenos (endófitos). En el caso de las coníferas hay la evidencia de organismos endógenos (Liu y col., 2007) y particularmente en el género Taxus sp. (Rivera-Orduña y col., 2010).

1.2.3 Condiciones de cultivo e incubación En esta etapa del establecimiento in vitro se da a conocer las medidas apropiadas que se van ha implementar para favorecer el cultivo, las cuales estarán sujetas a las características de la especie con la que se está trabajando y también al proceso morfogénico que se este realizando y a las variables de respuesta que se pretenden evaluar. En esas medidas se encuentran todos los elementos que conforman al medio de cultivo, como son: el medio basal, la fuente de carbono, los aditivos orgánicos e inorgánicos adicionales, los reguladores de crecimiento y el agente gelificante principalmente, indicando como se van a utilizar y las cantidades que se van ha emplear. En general, la elección del medio basal va a depender de la especie con la que se quiera trabajar. Por ejemplo, el medio basal de Murashige y Skoog (1962) (MS) es el más ampliamente utilizado para la regeneración de muchas especies vegetales, pero existen medios basales específicos tal es el caso del medio de Lloyd y McCown (1980) el cual es utilizado para plantas leñosas (Beyl, 2000). Las concentraciones y el tipo de reguladores de crecimiento que se van a utilizar será en cuestión de la variable morfogénica que se pretende obtener. Las auxinas juegan un rol importante para la elongación y aumento de volumen celular, la dominancia apical, la formación de raíces adventicias y la embriogénesis somática. Generalmente cuando la concentración de auxinas es

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. baja, favorece a la iniciación de raíces, y cuando la concentración es alta, se promueve la formación de callos. En contraste las citocininas promueven la división celular y estimulan la iniciación y crecimiento de brotes in vitro. Generalmente cuando la concentración de citocininas es alta induce la formación de brotes adventicios e inhibe la formación de raíces, también son las promotoras de la formación de brotes axilares y el rompimiento de la dominancia apical de las auxinas (Beyl, 2000). También se señala el tipo de contenedor que se va a utilizar, el pH con el que se ajustará el medio de cultivo, así como la forma y las condiciones como se va a trabajar (utilización de autoclave, trabajar en campana de flujo láminar, entre otros). Por último se fijan las características de incubación, que principalmente son el fotoperíodo, la temperatura y en el caso de cultivos de células en suspensión la velocidad de agitación, todas éstas condiciones estarán sujetas de acuerdo con el tipo de material vegetal con el que se esta trabajando.

1.2.4 Contaminación in vitro Un aspecto principal del establecimiento in vitro de cualquier tipo de explante es el control de los microorganismos, que en condiciones in vitro pueden ser un serio problema. Para obtener un establecimiento con un porcentaje elevado de asepsia se deben de eliminar los microorganismos externos (exógenos) presentes en los explantes. También se deben de eliminar los microorganismos internos (endógenos) si se presentan en el cultivo in vitro (Bhojwani y Dantu, 2013). Los microorganismos tanto endógenos como exógenos incluyen mohos, bacterias, levaduras y otros microorganismos, que se encuentran presentes literalmente en todas partes: en el aire, en la superficie de las plantas, manos y demás. Las esporas de estos organismos se mueven en las corrientes de aire, en particular sobre las partículas de polvo. Para controlar esos organismos, se deben desinfectar los explantes, las herramientas y las áreas de trabajo para remover tales contaminantes de sus superficies. Todo este trabajo debe de realizarse en áreas especiales de transferencia en la cual se eliminen todos esos contaminantes y se hayan tomado precauciones para prevenir la recontaminación.

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La reducción de los contaminantes superficiales comienza con el control de las plantas madres utilizadas como fuentes de explantes. De ordinario los contaminantes están presentes sólo en la superficie de las partes de plantas, aunque pueden estar alojados en grietas, entre las escamas de las yemas o en otras partes y a veces resulta bastante difícil eliminarlos. Las estructuras internas, como los puntos de crecimiento de las yemas, el interior de semillas y frutos, tienden a estar relativamente libres de organismos patógenos. Sin embargo, si la planta esta creciendo en una atmósfera húmeda, los micelios pueden invadir el interior de la misma y convertirse en un problema persistente (Bhojwani y Dantu, 2013).

1.2.5 Oxidación in vitro El fenómeno oxidación ó fenolización de tejidos vegetales ocurre por la acción de enzimas oxidasas (polifenoloxidasas, fenolasas y tirosinasa monofenoloxidasas), las que son liberadas, sintetizadas o se presentan en sustratos apropiados o en condiciones oxidativas a consecuencia de tejido dañado por heridas o senescencia. Las oxidasas normalmente latentes en la membrana celular y los sustratos retenidos dentro de la vacuola, se unen cuando las células son dañadas o comienza la senescencia. La fuente del explante es importante, ya que los tejidos juveniles usualmente son menos propensos a la oxidación. La época del año también es determinante, debido a que varias especies presentan variación en la liberación de fenoles in vitro durante el año (George, 2008; Azofeifa, 2009). De acuerdo con Pan y Staden (1998) la oxidación in vitro es un fenómeno que ocurre frecuentemente durante las etapas iniciales de cultivo, siendo un gran problema ya que provoca la muerte de los tejidos vegetales debido a la excesiva producción de polifenoles, debido posiblemente por el disparo de reacciones de defensa, principalmente estos compuestos fenólicos son liberados debido a heridas provocadas a las plantas, por lo que es fundamental reducirlos de los tejidos vegetales. En el establecimiento de cultivos in vitro, el proceso de oxidación se considera un obstáculo y un gran impedimento, ya que es letal para los explantes, ocasionando grandes pérdidas (Bhat y Chandel, 1991), presentándose en gran diversidad de especies vegetales, como en monocotiledóneas (Huang y col.,

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2002), dicotiledóneas (Pinto-Sintra, 2007) y en coníferas (Tang y Newton, 2005), en el género Taxus es un problema frecuente en las especies: T. brevifolia (Chee, 1995), T. marei (Chang y col., 2001), T. baccata (Mihaljević y col., 2002) y T. wallichiana (Hien y col., 2004). La oxidación in vitro ocurre con más frecuencia en especies leñosas (Bhat y Chandel, 1991), es variable entre especies y puede presentarse en cualquier tejido u órgano. (Huang y col., 2002). Algo importante que se debe de considerar, es que dentro de una misma especie existen genotipos más predispuestos a oxidarse con mayor facilidad que otros (Li y col., 2007) e inclusive también existe dentro de un mismo explante mayor oxidación de alguna de sus partes (Rivero- Maldonado y col., 2001). Para prevenir la oxidación de los explantes, George (2008) y Azofeifa (2009) recomienda las siguientes medidas, las que suelen combinarse para establecer tratamientos adecuados: a) Minimizar el daño causado al explante, reduciendo el período en el cual está siendo dañado durante la escisión y esterilización. Algunos agentes esterilizantes en particular pueden acentuarlo. b) Remover los compuestos fenólicos producidos, remojando los explantes algunas horas o dejándolos bajo una corriente de agua antes de esterilizar o transferir a condiciones in vitro. Se debe asegurar que los agentes esterilizantes fueron adecuadamente removidos. Aumentar las frecuencias de transferencia y cortar tejidos necrosados evita que se acumulen metabolitos tóxicos alrededor del explante aunque no es una alternativa del todo económica. Los medios líquidos permiten que los fenoles se difundan lejos del explante. Algunos agentes gelificantes como el agar pueden influir, por lo que se recomienda probar con gelrite® ó pytagel®. Una forma común de controlarlos es agregando al medio carbón activado o polivinilpirrolidona. c) Modificar el ambiente de manera que la producción de fenoles no sea óptima: disminuir la intensidad luminosa sobre las plantas madre determina la producción de brotes etiolados o semietiolados. La iniciación en oscuridad por varias semanas logra controlar la producción de fenoles en varias especies. Mantener el tejido a una temperatura ligeramente inferior a la óptima también puede prevenir la oxidación.

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d) Modificar el potencial redox del tejido: mediante antioxidantes, los que pueden ser diluidos en una solución estéril para remojar los explantes después de la esterilización o agregados al medio de cultivo. Remojar los explantes en una solución antioxidante con ácido cítrico y ascórbico también reduce el pH, la que disminuye la actividad de la polifenoloxidasa, cuyo óptimo se encuentra en pH de 6.5. e) Reducir la actividad de las fenolasas y la disponibilidad de sustrato: hay dos iones particularmente asociados a esta actividad: fierro y cobre. Agentes quelantes, como EDTA, actúan también como antioxidantes. f) Alterar la composición del medio y los reguladores de crecimiento usados: generalmente la oxidación es más frecuente en medios con altas concentraciones de sales, como el medio basal MS. Se han registrado el incremento de fenoles en medios con los reguladores de crecimiento 2,4-D, TDZ y KIN.

Dentro del conjunto de trabajos in vitro en el género Taxus los investigadores han utilizado antioxidantes y absorbentes de compuestos fenólicos con el propósito de disminuir la oxidación de los tejidos vegetales (Tabla 5).

Tabla 5. Trabajos in vitro en el género Taxus en donde se presentó el proceso de oxidación y su solución. Proceso in Especie Explante Solución Referencia vitro Taxus Células en Cultivos en 50 mg/L de ácido Hirasuna y col., baccata suspensión suspensión ascórbico 1996 Taxus 2.0 mM de glutamina canadensis Células en Cultivos en 0.5 mM de ácido Ketchum y Taxus suspensión suspensión ascórbico Gibson, 1996 cuspidata 0.5 mM de ácido cítrico 5 mg/L de ácido Taxus Cultivo de Jiaru y col., Callos ascórbico chinensis callos 1999 5 mg/L de Na2S2O3

Taxus Proliferación 1 g/L de carbón Chang y col., mairei Brotes de yemas activado y 100 mg/L de 2001 axilares AgNO3

Taxus Cultivo de Callos 1.5 % de PVP Mihaljevic y baccata callos col.2002

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Proceso in Especie Explante Solución Referencia vitro

Taxus Cultivos en Callos 2 g/L de carbón Hien y col., wallichiana suspensión activado 2004 Taxus Cultivo de Bruňáková y Callos 1.5 % de PVP baccata callos col., 2005 Taxus Cultivo de glicina, ácido aspártico Correa y col., Callos baccata callos y arginina 2006 Taxus 100 mg/L de ácido Semillas Germinación Zarek, 2007 baccata ascórbico 2.0 mM de glutamina Taxus Células en Cultivos en 0.5 mM de ácido Ketchum y col., cuspidata suspensión suspensión ascórbico 2007 0.5 mM de ácido cítrico Taxus Cultivo de 0.5 mg/L de Cloruro de Barrios y col., Callos globosa callos Clorocolina 2009 Taxus Cultivo de Ashrafi y col., Callos 500 mg/L de PVP baccata callos 2010 200 mg/L de ácido Taxus Cultivo de ascórbico Khosroushahi y Callos brevifolia callos 100 mg L de ácido col., 2011 cítrico Taxus Cultivo de Transferencia de callos Barrales-Cureño Callos globosa callos cada 20 días y col., 2010 Taxus Cultivo de Ghafoori y col., Callos 0.1 mM de glutationa baccata . callos 2012 Incubación en oscuridad Taxus Cultivo de 0.1 g/L de ac. Toulabi y col., Callos baccata callos ascórbico 2015 0.1 g/L de ac. cítrico

1.3 Micropropagación La micropropagación constituye una de las líneas de trabajo más importante de la biotecnología moderna dada la magnitud de su aplicación práctica actual, la cual se fundamenta en la clonación del material vegetal élite. El cultivo de tejidos vegetales se refiere al crecimiento o desarrollo de células, tejidos u órganos, aislados de una planta madre, en un medio de cultivo artificial y bajo condiciones de total asepsia. Existen tres técnicas de cultivo de tejidos a partir de los cuales se pueden obtener plantas completas: organogénesis, embriogénesis somática y proliferación de yemas axilares (Figura 5).

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Figura 5. Técnicas de propagación in vitro.

1.3.1 Proliferación de yemas axilares De las tres técnicas de micropropagación la que más se utiliza por ser rentable para una propagación masiva de plantas que conserven sus características genéticas deseadas, sin que exista variación somaclonal, es la proliferación de yemas axilares, la cual consiste en la multiplicación de brotes por la formación repetida de ramas axilares y los nuevos brotes formados sirven como explantes para repetir la proliferación; algunos brotes son finalmente enraizados para formar plántulas las cuales podrán crecer en condiciones ex vitro. La proliferación de yemas axilares se basa en el fenómeno llamado dominancia apical, que es el control regulador de crecimiento que la yema apical ejerce sobre las restantes regiones meristemáticas (yemas axilares) (George, 2008). Si la yema apical se corta mecánicamente se interrumpe la fuente de las hormonas inhibitorias (auxinas) empezando a crecer una o mas yemas axilares, dando origen a un nuevo brote (Cronquist, 1971). La primera teoría para explicar la dominancia apical se basó en el conocimiento de que los ápices con

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. crecimiento activo producen auxinas y que la alta concentración de auxinas suprime el crecimiento de yemas laterales, esta hipótesis se comprobó por medio de experimentos en los cuales se separa el ápice y se reemplaza por un bloque de agar conteniendo auxinas y se observa que la planta crece como si tuviera el ápice (Estrada-Girón, 2007).

1.3.2 Organogénesis y embriogénesis La organogénesis es definida como la aparición de nuevos órganos, observándose la formación de brotes adventicios (raíces y tallos) a partir de segmentos de tejido derivados de varios órganos (hojas, tallos, pétalos, raíces) y se pude obtener de forma directa o indirecta. La organogénesis directa se presenta en el explante inicial sin la previa formación de callo (células no diferenciadas) y en especies cuyos explantes ya están predeterminados para la morfogénesis. En la organogénesis indirecta si existe la desorganización de células (formación de callo) del explante original. Este tipo de propagación clonal es recomendable con fines de mejoramiento genético, ya que existe una gran probabilidad de que se produzca variación genética, también llamada variación somaclonal (Schwartz y Beaty, 2000) lo cual es importante para la búsqueda y manipulación de nuevos genotipos. Esta técnica de micropropagación difiere de la embriogénesis somática, ya que en esta, la formación del nuevo individuo es bipolar: los meristemos apical y radicular se forman simultáneamente a partir de una célula somática (George, 2008).

1.3.3 Importancia económica de la micropropagación La micropropagación puede usarse como una alternativa redituable ya que tiene varias ventajas por encima de los métodos convencionales de propagación vegetativa las cuales sufren varias limitaciones. Debnath y col. (2006) y Malik y col. (2012) enlistan las ventajas que tiene la micropropagación: a) El tiempo es relativamente corto y la producción del número de plantas es grande en un espacio reducido iniciando con un solo explante. b) La multiplicación de las plantas se lleva a cabo en un ambiente controlado, sin estar a expensas de las variaciones climatológicas.

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c) Las nuevas plantas se encuentran libres de microorganismos (hongos, bacterias, virus). d) Es rentable, al reducirse los costos (infraestructura y reactivos). e) A segura el mantenimiento del germoplasma por muchos años. f) Proporción mas alta de la multiplicación de las plantas y puede continuar a lo largo del año independiente del tiempo. Aunado a esto, Sidhu (2010) señala que gracias a la micropropagación se ayuda a conservar las plantas amenazadas, que se pueden realizar mejoras genéticas (producción de clones con características deseadas) y la preservación del material genético se puede realizar por medio de la criopreservación (conservación con temperaturas que van por debajo de -70°C).

1.3.4 Proliferación de yemas axilares en el género Taxus En los últimos 15 años se han realizado protocolos de regeneración in vitro del genero Taxus (Tabla 6). Otro tipo de trabajo que involucra una respuesta morfogénica in vitro fue la realizada por Chee (1995) utilizando tiamina provocó la estimulación de raíces adventicias en Taxus brevifolia. También se han realizado otras investigaciones in vitro para la obtención de plantas, como la germinación de semillas. Se ha realizado la germinación in vitro de varias especies de Taxus sp. (Flores y col., 1993; Chee, 1994), en Taxus marei (Chien y col., 1998), en Taxus wallichiana (Datta y Jha, 2004), en Taxus baccata (Zhiri y col., 2004; Zarek y col., 2007; Davarpanah y col., 2014), en Taxus brevifolia (Luan, 1996), así como en el híbrido Taxus x media Render. (Liao y col., 2006a). En cuanto a la especie Taxus globosa Schltdl., existen pocos estudios y los existentes están principalmente relacionados con aspectos botánicos y ecológicos (Muñoz-Gutiérrez y col., 2009; Soto-Hernández y col., 2011; Contreras-Medina y col., 2011), aunque algunos abordan también aspectos químicos (Guerrero y col., 2000; Ramos-Lobato y col., 2003), farmacológicos (Vargas y col., 2007) y microbiológicos (Rivera-Orduña y col., 2010). Cabe destacar que la propagación in vitro de la especie Taxus globosa tiene ventajas, ya que Shemluck y col. (2003) mencionan que el porcentaje promedio de paclitaxel en sus hojas es mayor que en otras especies de Taxus y recientemente Barrios y col. (2009) encontraron que la producción de paclitaxel es alta en el

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. cultivo de callos (0.0269 mg.g-1 en peso fresco). Aunado a esto, Soto y col. (2000) señalan que la mayor cantidad de paclitaxel se encuentra en el follaje, lo cual es de particular interés debido a que la extracción de este diterpeno se realizaría a partir del follaje y no de la corteza, lo cual contribuiría enormemente a su conservación.

Tabla 6. Proliferación de yemas axilares en el género Taxus.

Reguladores de Especie Etapa Medio Basal Referencia crecimiento Taxus x Inducción de WPM con 1 mg/L de ANA + Mistrzak y col., media yemas axilares vitaminas B5 0.1 mg/L de BA 2015 Inducción de WPM 2 mg/L de BA Sapam y Taxus yemas axilares Laishram, baccata L. Enrraizamiento MS al 50% 4 mg/L de IBA 2012 Taxus Inducción de WPM 6.84 µM de Zeatina Ibrahim y col., baccata L. yemas axilares 2011 Inducción de MS 2 mg/L de BA Taxus yemas axilares Abbasin y col., baccata L. 2010 Enrraizamiento MS al 50% 8 mg/L de IBA Taxus Inducción de Kulkarni y WPM al 50% 0.05 mg/L de KIN baccata spp. yemas axilares Krishnamurthy, wallichiana 2009 Inducción de WPM 20 mg/L de BA Taxus yemas axilares Olędska y col., cuspidata Enrraizamiento WPM al 50% 2.5 mg/L de IBA 2009

Inducción de MS al 50% 1 mg/L de BA Taxus yemas axilares Nhut y col., wallichiana 5 mg/L de IBA ó Enrraizamiento MS al 50% 2007 Zucc. 2.5 mg/L de IBA

Inducción de WPM 1.5 mg/L de Taxus yemas axilares Zeatina ó 2.84 Ewald, 2007 baccata L. Enrraizamiento L9 2 mg/L de IBA Inducción de MS 0.3 mg/L de BA Taxus x yemas axilares Hongbo y col., media Enrraizamiento MS 0.5 mg/L de AIA + 2006 0.5 mg/L de ANA Inducción de WPM 22.19 µM de BA Taxus x yemas axilares Liao y col., media 2006b Enrraizamiento MS 12.30 µM de IBA Inducción de MS al 50% 2.5 mg/L de BA Chang y col., Taxus mairei yemas axilares 2001 Enrraizamiento MS al 50% 2.5 mg/L de IBA Taxus Inducción de Majada y col., WPM 22.19 µM de BA baccata L. yemas axilares 2000

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1.3.5 Organogénesis y embriogénesis somática en el género Taxus La organogénesis en especies leñosas y en confieras está muy bien difundida, y se ha utilizado como principal vía para la propagación masiva de plantas en las últimas décadas (Bonga, 1981; Hicks, 1994). Con respecto a la micropropagación vía organogénesis del género Taxus, Chee (1995) obtuvo a partir de embriones zigóticos la organogénesis directa de la especie Taxus brevifolia, Datta y col. (2006), Das y col. (2008) y Hussain y col. (2013) obtuvieron la organogénesis indirecta de la especie Taxus wallichiana Zucc., mientras que Baharak y col. (2014) realizaron la organogénesis indirecta de la especie Taxus baccata L. (Tabla 7).

1.4 Metabolitos secundarios y cultivo de líneas celulares en suspensión 1.4.1 Metabolitos secundarios Las plantas forman parte de nuestra dieta diaria, además de contener compuestos nutricionales, elaboran compuestos que han sido objeto de estudios por décadas. Dentro de esos compuestos se encuentran los metabolitos primarios (carbohidratos, aminoácidos, lípidos) los cuales desarrollan funciones de la vida básica de la planta, como la división celular y el crecimiento, la respiración, el almacenaje, y la reproducción, mientras que los metabolitos secundarios (alcaloides, terpenos, fenoles, glicósidos, flavonoides, aceites volátiles, taninos, resinas) son otros compuestos de bajo peso molecular, que son elaborados principalmente para el mantenimiento de los procesos de la vida de la planta con su entorno, como estrategia para protegerlas de los depredadores, permitirles competir ventajosamente en su hábitat, atraer polinizadores y simbiontes, inclusive para protegerlas contra el estrés que se va presentando a lo largo de su vida. (Collin, 2001; Namdeo, 2007). En la actualidad los metabolitos secundarios son utilizados para la elaboración de fármacos, pesticidas, colorantes, saborisantes y fragancias, entre otros (Trejo-Tapia y Rodríguez- Monroy, 2007). Los metabolitos secundarios se encuentran distribuidos ampliamente en el reino vegetal, pero los que se encuentran en las plantas superiores son los que han despertado mayor interés, tal es el caso del paclitaxel, el cual es un diterpeno extraído de varias especies del género Taxus el cual tiene propiedades anticancerígenas (Barrales-Cureño y Ramírez-Sepúlveda, 2013).

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Tabla 7. Propagación in vitro vía organogénesis y embriogénesis somática en el genero Taxus. Proceso in vitro/ Medio Reguladores de Especie Referencia Etapa Basal crecimiento Organogénesis Taxus Inducción de B5 al 50% 10 μM de BA brevifolia brotes adventicios Chee, 1995 Nutt. MCM-SH al ABT (polvo Enrraizamiento 50% enrraizador) Organogénesis WPM 50% 2 mg/L de 2,4-D + Inducción de callo + Vit. SH BA 0.5 mg/L Inducción de WPM 50% Taxus 2.5 mg/L de BA brotes adventicios + Vit. SH Datta y col., wallichiana 2 mg/L de 2,4-D + 2006 Zucc. MS + Vit. Diferentes Enrraizamiento NN combinaciones de ANA e IBA Organogénesis 5.0 μM de 2,4-D + Taxus B5 1.0 μM de KIN Inducción de callo Das y col., wallichiana 5.0 μM de 2,4-D + 2008 Zucc. Regeneración WPM 2.0 μM de BA

Organogénesis MS 2 mg/L de 2,4-D Taxus Inducción de callo Hussain y wallichiana Inducción de MS 0.5 mg/L de BA col., 2013 Zucc. brotes adventicios Enrraizamiento MS 50% 8 mg/L de IBA Organogénesis 1mg/L de 2,4-D + MS 50% Inducción de callo 1 mg/L de KIN Taxus Inducción de 3 mg/L de KIN + Baharak y MS baccata L. brotes adventicios 3 mg/L de BA col., 2014 1,2 ó 3 mg/L de Enrraizamiento WPM IBA Embriogénesis 160 μM de 2,4-D + Taxus somática MCM 5μM de BA + brevifolia Inducción de callo 5 μM de ANA Chee, 1996 Nutt. Regeneración MCM 40 μM de ABA Embriogénesis WPM 50% 2 mg/L de ANA + somática Taxus + Vit. SH 0.5 mg/L de BA Inducción de callo Datta y Jha, wallichiana 0.1 mg/L de ANA + 2008 Zucc. Regeneración WPM 0.5 mg/L de BA + 0.5 mg/L de KIN

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El cultivo de tejidos vegetales es una fuente promisoria para el abastecimiento de metabolitos secundarios, por lo que desde hace varias décadas el cultivo de líneas celulares en suspensión es una alternativa para la extracción de paclitaxel y otros taxanos (Maheshwari y col., 2008; Expósito y col., 2009; Malik y col., 2011).

1.4.2 Cultivo de líneas celulares en suspensión Un cultivo de células en suspensión es una extensión del cultivo de callo o de tejidos, consistente en células y/o grupos de ellas dispersas y que están creciendo en un medio de cultivo líquido aerado (Arias y col., 2009). El cultivo de líneas celulares en suspensión consta de tres fases principalmente: 1) Inducción de callo. 2) Establecimiento de líneas celulares en suspensión. 3) Extracción y cuantificación del metabolito secundario. El inicio de las líneas celulares consiste en la inducción de callo, el cual es un conjunto de células parenquimatosas desdiferenciadas que guardan su totipotencialidad (Hellwings y col., 2004). Este es producido a partir de explantes in vitro como resultado de las lesiones y en respuesta a hormonas ya sea endógenas o proporcionadas en el medio de cultivo (Caponetti, 2000). La iniciación de la división celular y la subsiguiente producción de callo requieren que se adicionen en las proporciones adecuadas una citocinina y una auxina. La auxina, en concentraciones de moderadas a elevadas, es el regulador de crecimiento primario que se utiliza para producir callo. Las principales auxinas incluyen al ácido indolácetico (IAA), ácido naftalenaccético (ANA) y el ácido 2,4- dicloro-fenoxiacético (2,4-D), en orden creciente de efectividad. Las citocininas, como la cinetina (KIN) ó benciladenina (BA) se proporciona en menor concentración si no está presente en cantidad adecuada dentro del explante. Aunque exteriormente los cultivos de masas de callo pueden aparecer como masas de células uniformes, en realidad su estructura es relativamente compleja con considerable variación morfológica, fisiológica y genética dentro del callo. El crecimiento sigue un patrón logarítmico típico, presentándose: a) un período lento de inducción de división celular que requiere auxina b) una fase de división celular rápida que implica la síntesis activa de DNA, RNA y proteína, seguida por

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. c) una cesación gradual de la división celular con desdiferenciación en células de parénquima más grandes y en células de tipo vascular (Bourgaud y col., 2001; Filová, 2014). Las suspensiones de células tienen ventajas sobre los cultivos de callos en cuanto a que las células se desarrollan más o menos individualmente, las células tienen más acceso a los nutrientes del medio de cultivo y se evitan algunos de los gradientes y variaciones fisiológicas de los cultivos de callo (Trejo-Tapia y Rodríguez-Monroy, 2007). Un cultivo en suspensión se inicia colocando una porción de callo friable o de tejido homogenizado en un medio líquido, de manera que las células se separen entre sí. Estas células se cultivan en varios aparatos. En uno de ellos (cultivo por lotes), las células se hacen crecer en un matraz colocando en un dispositivo agitador que permite que se mezclen el aire y el líquido. El crecimiento de las células sigue un patrón típico basado en cambios en las tasas de división celular. Primero, las células se dividen con lentitud (fase de retardo), luego con más rapidez (exponencial) incrementando a un estado constante (lineal) seguido por una tasa declinante (desaceleración), hasta que se llega a un estado estacionario. A este estado se le llama curva de crecimiento logarítmico. Se han innovado técnicas para aumentar la concentración de los metabolitos secundarios, como el uso de hongos, bioreactores, bombas de gas, elicitores, adicionamiento de proteínas, carbohidratos u otros (Bourgaud y col., 2001; Hellwings y col., 2004; Tabata, 2004).

1.4.3 Importancia del cultivo de líneas celulares en suspensión Los cultivos celulares vegetales in vitro constituyen actualmente una alternativa para la producción de sustancias de uso farmacéutico, agrícola e industrial, cuya producción comercial por los métodos convencionales (síntesis química) resulta difícil o económicamente no rentable. Estos cultivos in vitro constituyen asimismo una promesa para aumentar el rendimiento de los principios activos presentes en las plantas, así como para controlar más adecuadamente su producción (Veeresham y Chitti, 2013).

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1.4.4 Cultivos de callos en el género Taxus Los callos son una proliferación de células indiferenciadas, que generalmente se utilizan para la extracción de metabolitos secundarios (Pant, 2014). En el género Taxus para la iniciación, la proliferacón y mantenimiento de callos, así como en el cultivo de líneas celulares en suspensión, los medios basales más utilizados son B5 (Gamborg et al., 1968), MS (Murashige y Skoog, 1962) y el WPM (Loyd y McCown, 1981) y frecuentemente se suplementan con compuestos orgánicos como el hidrolizado de caseína, la polivinilpirrolidona (PVP), el ácido ascórbico y otros aminoácidos esenciales como glutamina, ácido aspártico, prolina y fenilalanina (Sabater-Jara y col., 2010). La mayoría de los grupos de investigación ha observado que los mejores reguladores de crecimiento son las auxinas (IBA, NAA, 2,4-D y Picloram) en una concentración de 1.0 a 10.0 mg/l en combinación con las citocininas (BA y KIN) en una concentración de 0.1 a 0.5 mg/l son eficaces para la iniciación de callo (Maheshwari y col., 2008) Tabla 8.

Tabla 8. Trabajos in vitro en la inducción de callo en varias especies del género Taxus. Medio Basal / Morfología Explante Especie Reguladores de de los Referencia Inicial Crecimiento Callos Taxus B5 Friables cuspidata Brotes Fett-Neto y col., 1 mg/L de 2,4-D amarillos Taxus jóvenes 1992 1 mg/L de KIN claros canadensis Taxus B5 Friables Gibson y col., corteza brevifolia 1-2 mg/L 2,4-D café claro 1993 B5 Friables Taxus Brotes Fett-Neto y col., 0.5 mg/L de GA amarillos cuspidata jóvenes 1993 1 mg/L de 2,4-D claros Taxus Tallos Friables brevifolia jóvenes y amarillos B5 Wickremesinhe Taxus maduros claros y 1-2 mg/L 2,4-D y Arteca 1993 baccata cv y en cafés Repandens acículas traslúcidos B5 + Vit NN y KM Cambium 1 mg/L de Picloram Taxus Friables Ketchum y col., (líneas 0.1 mg/L de KIN brevifolia café claro 1995 celulares) 0.1 mg/L de Ga3 0.1 mg/L de ABA Brukhin y col., SH Friables Taxus baccata Brotes 1996 0.03 mM de 2,4-D traslúcidos

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Medio Basal / Morfología Explante Especie Reguladores de de los Referencia Inicial Crecimiento Callos Taxus MS ó B5 Jiaru y col., Brotes Friables chinensis 1 mg/L de 2,4-D 1999 B5 Friables Taxus Tallos 2 mg/L de 2,4-D amarillos Luo y col., 1999 yunnanensis jóvenes 0.5 mg/L de KIN traslucidos Semillas B5 + vit. 2 x MS Friables Taxus maduras e 10 mg/L de 2,4-D café claro Son y col., 2000 cuspidata inmaduras 0.5 mg/L de Ga3 Amarillo Semillas, Friables Taxus x media B5 Tang y col., Brotes y amarillos cv Hicksii 5 mg/L de ANA 2001 Acículas traslucidos MS Friables Semillas 3 mg/L de ANA amarillos 0.5 mg/L de KIN oscuros Mihaljević Taxus baccata MS Friables y col., 2002 Ramas 3 mg/L 2,4-D amarillos jóvenes 0.5 mg/L de KIN claros Taxus B5 Blancos a Ramas Yoshida y col., cuspidata var. 2 mg/L de 2,4-D café jóvenes 2002 nana 0.5 mg/L de KIN amarillentos B5 Taxus Okada y col., Acículas 4 m/L de 2,4-D Café cuspidata 2004 0.5 mg/L de KIN Taxus baccata B5 Friables L. Bruňáková y Brotes 6 mg/L de 2,4-D amarillos Taxus baccata col., 2004 0.5 mg/L de KIN café-claro cv Aureova. B5 Taxus Tallos Friables Hien y col., 4 mg/L de 2,4-D wallichiana jóvenes amarillos 2004 1 mg/L de KIN B5 Friables Brotes Bruňáková y Taxus baccata 3 mg/L de 2,4-D blancos Embriones col., 2005 0.5 mg/L de KIN amarillos

B5 + Vit NN y KM 1 mg/L de Picloram Friables Acículas y Correa y col., Taxus baccata 0.1 mg/L de KIN amarillos tallos 2006 0.1 mg/L de Ga3 translúcidos 0.1 mg/L de ABA

CIM Friables Taxus globosa Barrios y col., Brotes 2.0 mg/L de ANA amarillos 2009 0.1 mg/L de BA traslucidos B5 + 2x Vit B5 Brotes Ashrafi y col., Taxus baccata 4 mg/L de 2,4-D Compactos jóvenes 2010 0.5 mg/L de KIN

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Medio Basal / Morfología Explante Especie Reguladores de de los Referencia Inicial Crecimiento Callos

Taxus WPM modificado Brotes Friables Bulgakov y col., cuspidata 0.5 mg/L de BA Aciculas cafés claros 2011 Taxus baccata 2.0 mg/L de ANA

B5 Taxus Friables 2 mg/L de ANA Khosroushahi y Brotes amarillos brevifolia 1.5 mg/L de AIA col., 2011 cafés 0.2 mg/L de BA Friables Taxus globosa B5 Barrales-Cureño Acículas verdes 4.14 μM de Picloram y col., 2011 traslucidos B5 Taxus baccata Brotes 0.5 mg/L de ANA Friables Ghafoori y col., Acículas 0.4 mg/L de KIN cafés 2012 0.5 mg/L de 2,4-D B5 Taxus globosa Acículas 2mg/L de 2,4-D Friables Tapia y col., Brotes 0.5 mg/L de KIN traslucidos 2013 0.25 mg/L de Ga3 Taxus spp. WV modificado Filová y Rovná, Brotes Friables 2 mg/L de 2,4-D 2011 Taxus B5 Friables Brotes Nhut y col., 4mg/L de 2,4-D Verdes, wallichiana Peciolos 2014 1 mg/L de KIN cafés Taxus x media WR Friables Mistrzak y col., Brotes 5 M picloram cafes 2014 Taxus MS Karimian y col., Brotes 1.0 mg/L de KIN Friables brevifolia 2014 1.5 mg/L de 2,4-D WPM Taxus baccata Friables Mahdinejad y Acículas 2mg/L de ANA café col., 2015 0.25 mg/L de KIN MS Taxus baccata Friables Fakheri y col., Aciculas 2 mg/L de ANA cafe 2015 0.25 mg/L KIN Taxus B5 Friables Yamamoto y Aciculas 0.76 M Acido 5- cuspidata amarillos col., 2015 Aminolevulico Taxus Friables Brotes B5 traslucidos Nan y col., 2015 chinensis Peciolos 1 mg/L de 2,4-D cafes Friables Taxus baccata Brotes B5 Toulabi y col., Amarillos- 2 mg/L de ANA 2015 Verdes

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1.4.5 Cultivos de líneas celulares en suspensión en el género Taxus El cultivo de líneas celulares en suspensión es una alternativa que se ha estado desarrollando en los últimos años (Expósito y col., 2009), para la producción y extracción del paclitaxel. Los cultivos de células en suspensión son normalmente inducidos del cultivo de callos ya establecidos, transfiriendo éstos a un medio líquido conveniente para su crecimiento (Tabata, 2004). Los primeros en realizar el cultivo de líneas celulares para la extracción exitosa del paclitaxel en el género Taxus fueron Christen y col. (1989), también ellos fueron los primeros en patentar la producción de paclitaxel (Christen y col., 1991). Recientemente se han establecido varios cultivos de líneas celulares en el género Taxus (Cusidó y col., 2013), en los cuales su principal objetivo es el incremento en la producción de paclitaxel y otros taxanos. Para incrementar su producción se ha recurrido suplementar a los medios de cultivos con diferentes compuestos, como es el nitrato de plata (Pérez y col., 2004), el cloruro de clorocolina (Barrios y col., 2009), jasmonato de metilo (Yukimune y col., 1996; Furmanowa y col., 1997), diversos tipos de carbohidratos y lípidos (Ketchum y Gibson, 1996; Hirasuna y col., 1996; Yoshida y col., 2002), entre otros. El cultivo de líneas celulares en suspensión en el género Taxus se ha venido desarrollando en las últimas décadas (Tabla 9).

Tabla 9. Producción de paclitaxel por cultivo de líneas celulares en suspensión en diversas especies de Taxus. Producción Produccion de paclitaxel Procedimiento Especie Referencia de paclitaxel (mg/L) por implementado día Ketchum y Taxus 14.78 mg/L Suspensión de líneas 0.527 Gibson, cuspidata (a los 28 días) celulares 1996 Mirjarlili y Taxus 3.4 mg/L Elicitor abiótico 0.377 Linden, cuspidata (a los 9 días) (jasmonato de metilo) 1996

10.3 mg/L Taxus baccata 7.87 48.3 mg/L Elicitor (jasmonato de Yukimune y Taxus brevifolia 3.45 0.5 mg/L metilo) col., 1996 Taxus x media 0.035 (a los 14 días)

Sun y Taxus 2 mg/L 0.142 Biorreactor Linden, cuspidata ( a los 14 días) 1999 Especie Produccion Producción Procedimiento Referencia

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

de paclitaxel de paclitaxel implementado (mg/L ) por día Elicitor abiotico Taxus 36 mg/L Wang y col., 0.972 (solventes organicos y chinensis (a los 37 días) 2001 carbohidratos) Taxus 48 mg/L Elicitor abiótico Zhang y Xu, 4.8 chinensis ( a los 10 días) (solventes orgánicos) 2001 Taxus 565 mg/L Bioreactor adicionando Wang y 40.357 chinensis ( a los 14 días) jasmonato de metilo Zhong 2002 Taxus 14.2 mg/L Ma y col., chinensis var. 0.617 De líneas celulares (a los 23 días) 2002 mairei Taxus 23 mg/L Yuan y col., 1.15 Elicitor (Paclitaxel) cuspidata (a los 20 días) 2002 Elicitor abiótico Taxus 70 mg/L Zhong y 5 (jasmonato de metilo ) chinensis (a los 14 días) col., 2002 en Biorreactor Taxus 5.7 mg/L Elicitor biótico Lan y col., 5.7 chinensis (a las 24 h) (Aspergillus niger) 2003

Elicitor abiótico Taxus 54.4 mg/L Roberts y 3.885 (enzimas digestivas y canadensis (a los 14 días) col., 2003 jasmonato de metilo) Taxus 490 μg/L Shang y chinensis var. 61.25 μg Con magnetic fields (a los 8 días) col., 2004 Mairei Cultivo de protoplastos Naill y Taxus 0.25 mg/L 0.035 con Elicitor abiótico Roberts, cuspidata (a los 7 días) (jasmonato de metilo) 2005 Taxus Aislamiento de hongo Guo y col., chinensis var. 4 – 7 μg 4 – 7 μg endogéno 2006 mairei 19.91 mg/L Elicitor abiotico Bonfill y col., Taxus baccata 0.711 (a los 28 días) (jasmonato de metilo) 2006 Células en suspensión y transformación Taxus 2 a 3 mg/L Ketchum y 0.250 genética con A. cuspidata (a los 12 días) col. 2007 tumefasiens y rhizogenes Taxus 6.4 mg/L Elicitor abiótico Wang y col., 0.533 yunnanensis (a los 12 días) (cerebrosidos) 2007

0.0269 mg/L Elicitor abiótico Barrios y Taxus globosa 0.00067 (a los 40 días) (cloruro de clorocolina) col., 2009

811.222 μg Suspensión de líneas Ashrafi y Taxus baccata 38.62 μg (a los 21 días) celulares col., 2010 2. PLANTAMIENTO DEL PROBLEMA

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Al ser aprobado el paclitaxel por la FDA para su uso clínico como anticancerígeno, las investigaciones se han enfocado a la búsqueda de la mejor técnica para su extracción y producción. El objetivo es el abastecimiento al sector salud, pero debido a su estructura compleja, la síntesis química total es un proceso difícil, y no viable, mientras que para la semisíntesis es necesaria la utilización de precursores naturales, lo que las hace más costosas. A pesar de que existen plantaciones comerciales de Taxus sp., aún se siguen usando árboles de poblaciones silvestres para la extracción del paclitaxel, lo que ha ocasionado una disminución en el número de individuos en sus áreas de distribución natural. Con base en esto, se pretende realizar el establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. con el propósito de reducir el tiempo de aprovechamiento, que sea económica y que ayude a conservar las poblaciones silvestres.

3. JUSTIFICACIÓN Taxus globosa Schltdl. es una especie que en México tiene distribución discontinua y restringida a microhábitats. Su preservación es importante considerando su uso potencial para la producción de paclitaxel. Debido a que su reproducción es principalmente sexual, y que las semillas que produce son pocas con un alto grado de dormancia, y a que es una especie de crecimiento lento, es indispensable implementar alternativas para su propagación. El uso de la biotecnología en los árboles forestales ofrece una gran alternativa, ya que la producción in vitro de plantas de Taxus globosa Schltdl. es una fuente promisoria de paclitaxel, además, en esta especie el alcaloide se localiza en el follaje en mayor proporción que en la corteza, con lo cual se reduciría el tiempo para su aprovechamiento y se preservarían las poblaciones naturales.

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4. HIPOTESIS El empleo adecuado de un medio de cultivo basal y la adición de antioxidantes como el ácido cítrico y el ácido ascórbico en acción conjunta reducen el oscurecimiento (oxidación) de los tejidos establecidos in vitro. El empleo adecuado de un medio de cultivo basal y la acción de citocininas promueven la inducción de yemas axilares en explantes de Taxus globosa Schltdl. con y sin ápice.

5. OBJETIVO GENERAL Realizar el establecimiento in vitro de explantes de Taxus globosa Schltdl. y ensayos para su micropropagación.

5.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 5.1.1 Evaluar la actividad del ácido ascórbico y el ácido cítrico para disminuir la oxidación de explantes de Taxus globosa Schltdl. en el establecimiento in vitro, así como el efecto a la ausencia de luz. 5.1.2 Evaluar los reguladores de crecimiento 6-furfurilaminopurina (KIN) 6-(γ,γ dimetilalilamino) purina (2ip) en explantes de Taxus globosa Schltdl. con meristemo apical y decapitados con la finalidad de inducir yemas axilares. 5.1.3 Evaluar los reguladores de crecimiento 6-bencilaminopurina (BA) y ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) para la formación de callo en acículas de Taxus globosa Schltdl, y posteriormente realizar ensayos preliminares para la inducción de brotes adventicios. 5.4.4 Realizar ensayos preliminares para el establecimiento de cultivos celulares en suspensión de Taxus globosa Schltdl.

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6. METODOLOGÍA 6.1 Fase 1: Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. 6.1.1 Material vegetal Se emplearon explantes maduros (aéreos) de árboles adultos de Taxus globosa Schltdl., con un tamaño alrededor de 4 cm. colectados con el apoyo del Dr. Eduardo Estrada Castillón (Permiso SEMARNAT de colector científico: E. Estrada 16545). Dicho material vegetal proviene de una población ubicada en el Parque Nacional Cumbres de Monterrey, en el ejido La Trinidad, municipio de Montemorelos, Nuevo León. Los árboles se encuentran a una altitud de 1351 msnm y la vegetación predominante es bosque de Carya-Quercus-Pinus. Se colectó material vegetal de 10 árboles diferentes, asignándoseles la nomenclatura descrita en la tabla 10.

Tabla 10. Nomenclatura de los explantes de los árboles de Taxus globosa.

Ar1 Ar6 Ar2 Ar7 Ar3 Ar8 Ar4 Ar9 Ar5 Ar20

De cada árbol se utilizaron 100 explantes para formar el grupo experimental y 20 explantes para formar el grupo control.

6.1.2 Desinfección de los explantes Tanto el grupo control como el grupo experimental se sometieron a un pretratamiento: Para el grupo control se preparó una solución con antrak y bactrol ambos al 1%; para el grupo experimental además de incluir lo anterior, a la solución se le agregó ácido cítrico al 0.5% y polivinilpirrolidona (PVP) al 0.1%. Las dos soluciones con los explantes se mantuvieron bajo oscuridad al cubrirse los envases de plástico herméticos con papel aluminio durante 16 h en constante agitación, esto con la finalidad de reducir el proceso de oxidación que tienen los explantes con el efecto de la luz. Después, los explantes se lavaron y se sometieron a un choque térmico: a 54°C durante 3 minutos y a 4°C durante otros 3 minutos. Luego se sumergieron en etanol al 70% durante 1 minuto.

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Ya en campana de flujo laminar horizontal, se realizó el tratamiento de desinfección: tanto el grupo control como el grupo experimental se sumergieron en hipoclorito de sodio al 2.5% con 5 gotas de tween 20 durante 30 minutos. Después, a ambos se les realizó dos enjuagues con agua bidestilada estéril. Por último se cortó el meristemo apical, la base y las acículas de los explantes antes de transferirlos al medio de cultivo, los explantes del grupo control se mantuvieron en agua bidestilada estéril y los del grupo experimental se sumergieron en una solución con 0.3% de ácido cítrico y 0.2% de ácido ascórbico durante 10 minutos (Figura 6).

Figura 6. Proceso de desinfección de Taxus globosa Schltdl.

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6.1.3 Medio y condiciones de cultivo El medio de cultivo que se empleó tanto para el grupo control como para el grupo experimental fue: medio MS (Murashige y Skoog, 1962) al 50%, 1 mg/L de 6-bencilaminopurina (BA), 5 g/L de carbón activado, 30 g/L de sacarosa y 7.5 g/L de agar. El pH se ajusto a 5.7 usando 0.1 N de NaOH ó 0.1 M de HCl. El medio de cultivo se esterilizó en autoclave a 121°C a una presión de 1 kg/cm2 durante 15 min. El establecimiento se realizó en campana de flujo laminar horizontal. Como contenedores se utilizaron tubos de (25X150 mm), con 7 mL de medio de cultivo, colocándose 2 explantes por tubo. El ensayo duró 4 semanas, donde cada semana se observaron los cambios graduales de los explantes. Los dos grupos del ensayo se mantuvieron en el incubador a una temperatura de 24°C. El grupo control se colocó en un fotoperíodo de 16 h (3000 Lux de intensidad luminosa) (esto con la finalidad de observar el efecto de la luz en la oxidación de los explantes y la influencia de los antioxidantes), mientras el grupo experimental se mantuvo bajo oscuridad total. Las variables de respuesta a evaluar con respecto a oxidación fueron: explantes normales, parcialmente oxidados y totalmente oxidados, donde para los explantes normales se tomaron en cuenta solo aquellos con tallo y acículas verdes; para los explantes parcialmente oxidados se tomaron en cuenta sólo aquellos con acículas oxidadas y tallo verde, y para los explantes totalmente oxidados, aquellos en donde tanto las acículas como el tallo presentaran oxidación. También se registró el porcentaje de contaminación de los explantes, ya sea por bacteria, hongo endógeno o exógeno.

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6.2 Fase 2: Inducción de yemas axilares de Taxus globosa Schltdl. 6.2.1 Material vegetal Se emplearon los brotes de Taxus globosa Schltdl., previamente establecidos in vitro provenientes del genotipo Ar8 del ensayo anterior con un tamaño alrededor de 4 cm.

6.2.1 Medio y condiciones de cultivo Se realizaron dos ensayos. En el primero los explantes conservaron su meristemo apical, mientras que en el otro los explantes se les retiro su ápice. El experimento consistió en 5 repeticiones por tratamiento y se transfirieron al medio con macro y microelementos de WPM (Lloyd y McCown, 1980) suplementado con 20 g/L de sacarosa, vitaminas B5 (Gamborg y col., 1968) y 7 g/L de agar. El pH en todos los tratamientos fue ajustado a un valor de 5.6 antes de ser esterilizados usando 0.1 N de NaOH ó 0.1 M de HCl. El medio de cultivo se esterilizó en autoclave a 121ºC a una presión de 1 kg/cm2 durante 15 min. Los explantes fueron colocados en tubos (25 x 150 mm) que contenían 7 mL de medio de cultivo y la transferencia se realizó en campana de flujo laminar. Los ensayos se incubaron a una temperatura de 25ºC con un fotoperiodo de 16 h (3000 Lux). Se realizó un diseño factorial 4 x 3 donde un factor fue el 6-(γ,γ dimetilalilamino) purina (2iP) en las concentraciones 0.0, 1.0, 4.0 y 7.0 mg/L y el otro 6- furfurilaminopurina (KIN) en las concentraciones 0.0, 5.0 y 10.0 mg/L (Tabla 11).

Análisis estadístico: Las variables a evaluar fueron: número de brotes y tamaño (en centrímetros) para los nuevos brotes y para el brote original se evaluó el color, con una escala ordinal de: 0 = amarillo, 1 = rayado, 2 = verde y la apariencia: 0 = seco, 1 = marchito, 2 = poco vigoroso ó 3 = vigoroso. Los datos se analizaron con el análisis de varianza (ANOVA) y se hicieron comparaciones múltiples de medias mediante prueba LSD.

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Tabla 11. Tratamientos utilizados con sus

respectivas concentraciones de reguladores de crecimiento para la inducción de yemas axilares.

Concentración Tratamiento 2iP KIN Con Sin (mg/L) (mg/L) meristemo meristemo T1 A 0.0 0.0

T2 B 1.0 0.0

T3 C 4.0 0.0

T4 D 7.0 0.0

T5 E 0.0 5.0

T6 F 1.0 5.0

T7 G 4.0 5.0

T8 H 7.0 5.0

T9 I 0.0 10.0

T10 J 1.0 10.0

T11 K 4.0 10.0

T12 L 7.0 10.0

6.3 Fase 3: Inducción de callo en acículas de Taxus globosa Schltdl. 6.3.1 Material vegetal Se emplearon las acículas provenientes de brotes de Taxus globosa Schltdl., previamente establecidos in vitro del genotipo Ar8.

6.3.2 Medio y condiciones de cultivo para la inducción de callo Las acículas se colocaron en cajas de Petri de 100 x 15, con 25 mL de medio por caja, 6 acículas por caja, puestas horizontalmente, 12 repeticiones por tratamiento. Se realizó un diseño factorial 4x5 donde un factor fue BA con cuatro niveles 0.0, 0.1, 0.3 y 0.5 mg/L y el otro 2,4-D con cinco niveles 0.0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 mg/L (Tabla 12). El medio basal fue B5 (Gamborg y col., 1968), suplementado con vitaminas B5 2x, 30 g/L de sacarosa, 10 g/L de agar, ajustado a un pH de 5.8. El medio de cultivo se esterilizó en autoclave a 121ºC a una presión de 1 kg/cm2 durante 15 min. Los tratamientos se incubaron en oscuridad a 24 °C.

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Análisis estadístico: las variables de respuesta fueron la presencia (0) ó ausencia (1) de callo, la coloración: amarillo (0) ó crema (1) y la presencia (0) ó ausencia (1) de fenoles. Los datos se analizaron visualmente.

Tabla 12. Tratamientos con sus respectivas concentraciones de reguladores de crecimiento para inducción de callo.

BA 2,4-D BA 2,4-D Tratamiento Tratamiento (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) T1 0.0 0.0 T11 0.3 0.0 T2 0.0 1.0 T12 0.3 1.0 T3 0.0 2.0 T13 0.3 2.0 T4 0.0 3.0 T14 0.3 3.0 T5 0.0 4.0 T15 0.3 4.0 T6 0.1 0.0 T16 0.5 0.0 T7 0.1 1.0 T17 0.5 1.0 T8 0.1 2.0 T18 0.5 2.0 T9 0.1 3.0 T19 0.5 3.0 T10 0.1 4.0 T20 0.5 4.0

6.4 Fase 4: Iniciación de la organogénesis indirecta de Taxus globosa Schltdl. 6.4.1 Material vegetal Se emplearon los callos obtenidos de la Fase 3, los cuales presentaban las siguientes características: amarillos friables y marrones friables.

6.4.2 Medio y condiciones de cultivo para la inducción de brotes adventicios Se realizó un diseño factorial 6 x 4 donde un factor fue BA y el otro 2,4-D. Para BA fueron 6 niveles 0.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 y 7.0 mg/L y para 2,4-D fueron 4 niveles 0.00, 0.01, 0.03 y 0.06 mg/L (Tabla 13). El medio basal utilizado fue WPM con vitaminas SH, suplementado con 30 g/L de sacarosa. Se le agregó 1 g/L de carbón activado y 7.5 g/L de agar. Fue ajustado a un pH de 5.8 usando 0.1 N de NaOH ó 0.1 M de HCl.

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Los callos se colocaron en cajas de petri de 100 x 15, 2 cajas para cada tratamiento con 30 mL de medio cada una. Una réplica es igual aproximadamente 2 a un 1 cm de callo, 5 callos tratamiento. El medio de cultivo se esterilizó en autoclave a 121ºC a una presión de 1 kg/cm2 durante 15 min. La siembra se realizó en campanas de flujo laminar. Los tratamientos se incubaron a una temperatura de 25°C con un fotoperíodo de 16 h (3000 Lux). Análisis estadístico: en el ensayo, las variables de respuesta fueron: No hubo crecimiento de callo (0) ó Si hubo crecimiento de callo (1), la coloración del callo: marrón oscuro (0), marrón claro (1) ó verde-café (2), la consistencia: compacta (1) ó friable (2), la morfogénesis: no hubo (0), raíz (1), brotes adventicios (2) ó ambas (3) y presencia (1) ó ausencia (2) de oxidación. Los datos se analizaron visualmente.

Tabla 13. Tratamientos con sus respectivas concentraciones de reguladores de crecimiento para inducción de brotes adventicios.

BA 2,4-D BA 2,4 - D Tratamiento Tratamiento (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) TA2 0.0 0.0 TM2 0.0 0.03 TB2 3.0 0.0 TN2 3.0 0.03 TC2 4.0 0.0 TO2 4.0 0.03 TD2 5.0 0.0 TP2 5.0 0.03 TE2 6.0 0.0 TQ2 6.0 0.03 TF2 7.0 0.0 TR2 7.0 0.03 TG2 0.0 0.01 TS2 0.0 0.06 TH2 3.0 0.01 TT2 3.0 0.06 TI2 4.0 0.01 TU2 4.0 0.06 TJ2 5.0 0.01 TV2 5.0 0.06 TK2 6.0 0.01 TW2 6.0 0.06 TL2 7.0 0.01 TX2 7.0 0.06

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6.5 Fase 5: Iniciación del cultivo de líneas celulares en suspensión de Taxus globosa Schltdl. 6.5.1 Material vegetal Se emplearon los callos obtenidos en el proceso de la Fase 3, cultivados durante 7 meses, los cuales presentaban las siguientes características: verdes friables y cremas friables.

6.5.2 Medio y condiciones de cultivo para el inicio de las líneas celulares en suspensión El medio basal fue B5 (Gamborg y col., 1968), suplementado con vitaminas B5 2x, 2 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de sacarosa, 3 g/L de ácido cítrico y 2 g/L de ácido ascórbico, ajustado a un pH de 5.8. Se utilizaron matraces Erlenmeyer de 125 mL a los cuales se les colocó 30 mL de medio de cultivo. No se realizó ningún diseño factorial porque esta fase consistió solamente en la observación del establecimiento de las células en suspensión. Se utilizaron 5 matraces para los callos verdes friables y 5 matraces para los callos cremas friables. Se depósito un agregado celular por matraz, cada agregado celular equivalió a 2 cm2 de callo. El medio de cultivo se esterilizó en autoclave a 121°C a una presión de 1 kg/cm2 durante 15 min. Los matraces se colocaron en un agitador a 125 rpm. El fotoperíodo fue de 16 h a una temperatura de 25°C. Las variables de respuesta fueron el crecimiento ó no crecimiento de células en suspensión, la coloración: crema ó verde de las células en suspensión y la presencia ó ausencia de fenoles. Los datos se analizaron visualmente.

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7. RESULTADOS Y DISCUSIONES 7.1.1 Desinfección El porcentaje de contaminación fue relativamente bajo registrándose sólo un 12%. Se observó el crecimiento de tres tipos de microorganismos: bacterias, hongos endógenos (simbióticos de la planta) y hongos exógenos (epifitos o introducidos por manipulación). En lo que concierne a las bacterias, se observaron dos tipos principales: colonias color blanco y color rosa (Figura 7a, b). Dentro de los hongos endógenos se observaron dos tipos: el primero con consistencia pétrea de color negro-grisáceos que crecía en la base del explante y dentro del medio de cultivo (Figura 7c) y el segundo de consistencia algodonosa que crecía ya sea en el tallo ó en las acículas, teniendo un crecimiento lento hasta cubrir todo explante (Figura 8).

a b c

Figura 7. Contaminación por microorganismos en los explantes de los grupos experimentales después de 30 días de incubación. (a) Bacteria de color rosa en la base del explante. (b) Bacteria de consistencia lechosa. (c) Hongo endógeno de consistencia pétrea de color negro-grisáceo.

a b c

Figura 8. Contaminación por hongo endógeno de consistencia algodonosa. (a) Crecimiento a los 14 días de incubación. (b) Crecimiento a los 21 días. (c) Crecimiento a los 30 días. - 58 -

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Los hongos exógenos fueron variados y a diferencia de los hongos endógenos, estos empezaban su desarrollo sobre la superficie del medio de cultivo o cerca de la base del explante, pero nunca sobre él, teniendo un crecimiento más rápido, llegando a cubrir la superficie del medio e incluso invadir al explante y paredes del tubo de cultivo (Figura 9).

a b c d

Figura 9. Contaminación por hongos exógenos, donde la forma de crecimiento se da en todo el tubo, después de 30 días de incubación. (a) Hongo de color verde. (b) Hongo de algodonoso. (c) Hongo color p ardo y consistencia algodonosa. (d) Hongo color blanco.

Grupos controles: la contaminación solo se observó en los Ar1, Ar8 y Ar9, en los tres casos solamente hubo un 5% respectivamente de cada árbol. La contaminación tanto en el Ar1 como en el Ar8 fue por hongo exógeno de consistencia algodonosa, mientras que en el grupo control del Ar9 la contaminación fue por hongo endógeno de consistencia pétrea (Tabla 14). Grupos experimentales: Los porcentajes de contaminación en los grupos experimentales se pueden apreciar en la tabla 14. El árbol que tuvo mayor contaminación por bacteria fue el Ar8 con un 10%, le siguieron el Ar1 y el Ar20 los dos con 4% respectivamente, los árboles Ar4, Ar5, Ar7 y Ar9 no presentaron contaminación por bacteria (Tabla 14). El árbol que tuvo mayor contaminación por hongo endógeno, fue el Ar9 con un 10% de los explantes, le siguieron el Ar3 con 5% y los Ar2 y Ar20 con 4%, respectivamente (Tabla 14). El árbol que tuvo mayor contaminación por hongo exógeno fue el Ar2 con 15% explantes, siguiéndole el Ar9 con 10% y el Ar7 con 9% de explantes contaminados (Tabla 14). Los árboles que presentaron mayor porcentaje de contaminación fueron: el Ar2, el Ar8 y el Ar9, todos con 20% de explantes contaminados, mientras que el

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Ar4 fue el que presento el porcentaje total menor de contaminación (Figura 10). El porcentaje total de contaminación en los explantes de los grupos experimentales consistió en la sumatoria de los porcentajes de contaminación tanto de bacteria como de hongos endógenos y exógeno (Figura 11).

Tabla 14. Porcentajes de Contaminación de los grupos controles y experimentales de los 10 árboles utilizados.

Total de Conta. CB CHEND CHEXO Conta. (%) Árbol Explantes Total (%) GC GE GC GE GC GE GC GE GC GE GC GE Ar1 20 100 0 4 0 2 1 8 5 14 Ar2 20 100 0 1 0 4 0 15 0 20 Ar3 20 100 0 3 0 5 0 2 0 10 Ar4 20 100 0 0 0 0 0 2 0 2 Ar5 20 100 0 0 0 2 0 6 0 8 Ar6 20 100 0 2 0 3 0 5 0 10 1.5 12 Ar7 20 100 0 0 0 1 0 9 0 10 Ar8 20 100 0 10 0 4 1 6 0 20 Ar9 20 100 0 0 1 10 0 10 5 20 Ar20 20 100 0 4 0 1 0 1 5 6 Total 200 1000 0 24 1 32 2 64 15 120

GC= Grupo Control; GE= Grupo Experimental; CB= Contaminación por Bacteria; CHEND = Contaminación por Hongo Endógeno; CHEXO = Contaminación por Hongo Exógeno; Conta. = Contaminación.

Figura 10. Porcentaje de contaminación de los grupos experimentales por bacteria, hongo endógeno y hongo exógeno de los 10 árboles utilizados.

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6.4% 3.2% Sanos 2.4% Bacteria Hongo 88.0% Endógeno Hongo Exógeno

Figura 11. Porcentaje total de contaminación en los grupos experimentales.

El porcentaje total de contaminación de los grupos experimentales a los 30 días de incubación fue del 12%, observándose que el porcentaje de contaminación es relativamente bajo, por lo que el protocolo es eficaz para el establecimiento in vitro de la especie Taxus globosa Schltdl. Estos resultados son similares a los reportados por Barrales y col. (2011) en el establecimiento de acículas de Taxus globosa Schltdl., quienes reportan un 20% de contaminación. Correa y col. (2006) en el establecimiento de brotes de Taxus baccata, reportan un 3.6% de contaminación y en la misma especie pero con semillas, Majada y col. (2000) mencionan un 14% de contaminación. Chang y col. (2001) tuvieron el 18% de contaminación en el establecimiento de brotes de Taxus marei y por último, Ibrahim y col. (2011) obtuvieron un 15% de contaminación en el establecimiento de brotes de Taxus baccata. Caso contrario es el de los resultados que obtuvieron Hine-Gómez y Valverde-Cerdas (2003) en el establecimiento in vitro de la conífera Cryptomeria japonica (Taxocidaceae), ya que tuvieron un porcentaje de 46.6% de contaminación total a los 30 días de incubación, mencionando que es muy difícil trabajar con material vegetal proveniente de campo sin manejo previo. Nhut y col. (2007) mencionan que la contaminación in vitro también depende del tipo de explante, por lo que en ramas viejas de Taxus wallichiana el riesgo de contaminación es de hasta un 100%, mientras que se reduce hasta 10% en tallos y brotes jóvenes. Asimismo, se recomienda cortar los segmentos de 2 a 2.5 cm y colocarlos verticalmente para reducir el porcentaje de contaminación en brotes jóvenes. La utilización de antibióticos in vitro también reduce la contaminación por bacterias y hongos (Gibson y col., 1993). Otro factor que afecta el índice de

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. contaminación es el mencionado por Jiaru y col. (1999) quienes observaron que la estación del año de colecta del material vegetal es crucial, ya que en la especie Taxus chinensis los explantes colectados en primavera presentaban menos contaminación que los colectados en verano-otoño. Una estrategia para evitar este tipo de contaminación es la utilizada por Kulkarni y Krishnamurthy (2009) que con un pretratamiento con antibióticos durante 16 horas previo al establecimiento in vitro, redujeron del 100% al 10% de contaminación en explantes maduros de Taxus wallichiana.

7.1.2 Oxidación En los grupos experimentales se observaron los tres tipos de respuesta esperada, es decir, explantes verdes (normales), oxidación parcial y oxidación total (Figura 12). Todos los grupos controles tuvieron una oxidación parcial o total, excepto el grupo control del Ar1 y el del Ar8, en los cuales no se presentó oxidación (Tabla 15).

a b c

Figura 12. Variables de respuesta esperadas en los explantes de los grupos experimentales después de 30 días de incubación. (a) Explantes verdes. (b) Explantes parcialmente oxidados. (c) Explantes totalmente oxidados. .

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

Tabla 15. Porcentajes de oxidación de los grupos controles y experimentales de los 10 árboles utilizados.

Explantes Explantes Explantes total- No. Total de normales parcial-oxidados Árbol oxidados (%) explantes (verdes)(%) (%) GC GE GC GE GC GE GC GE Ar1 20 62 0 30 0 8 20 100 Ar2 2 84 10 5 8 11 20 100 Ar3 0 77 0 20 20 3 20 100 Ar4 0 95 0 5 20 0 20 100 Ar5 1 65 3 21 16 14 20 100 Ar6 0 87 0 13 20 0 20 100 Ar7 0 9 0 59 20 32 20 100 Ar8 20 100 0 0 0 0 20 100 Ar9 0 67 0 24 20 9 20 100 Ar20 0 0 15 93 5 7 20 100 Total 43 646 28 270 129 84 200 1000 (%) 21.5 64.6 14 27 64.5 8.4 100 100

GC= Grupo control; GE= Grupo Experimental.

El mejor resultado se obtuvo con el árbol Ar8, ya que el 100% de sus explantes se mantuvieron totalmente verdes (Figura 13), le siguieron el Ar4 con 95%, el Ar6 con 87% y el Ar2 con 84% (Figura 14).

a b

Figura 13. Explantes pertenecientes al Ar8 los cuales a los 3 días de incubación no presentaron ningún tipo de oxidación. (a) Explantes verde. (b) Explantes verdes puestos en una gradilla (vista general).

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

Figura 14. Porcentaje de oxidación de los 10 árboles utilizados de los grupos experimentales después de 30 día de incubación.

Por otro lado, el mayor índice de oxidación parcial en los grupos experimentales se presentó en los explantes del Ar20 con 93% (Figura 15a), siguiéndole el Ar7 con 59% y el Ar1 con 30% (Figura 14). En cuanto al mayor porcentaje de oxidación total en los grupos experimentales se presentó en los explantes del Ar7 con 32 % (Figura 15b), le siguieron el Ar5 con 14% y el Ar2 con 11% (Figura 14).

a

b

Figura 15. Explantes con diferentes grados de oxidación después de 30 días de incubación. (a) Explantes con oxidación parcial pertenecientes al Ar20. (b) Explantes con oxidación total pertenecientes al Ar7. - 64 -

Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

Los porcentajes de oxidación de los grupos experimentales se presentan en la figura 16.

a b

8.4% Normales Normales (Verdes) (Verdes) 21.5% Parcial- 27% Parcial- Oxidados Oxidados 14% 64.6%

Total- Total- Oxidados Oxidados

64.5%

Figura 16. Porcentaje total de oxidación de los 10 árboles utilizados al término de

30 días. (a) grupos controles y (b) grupos experimentales.

La utilización de antioxidantes como el ácido ascórbico y el ácido cítrico ya sea en combinación o en acción independiente son eficaces para la reducción de la oxidación de los explantes. En este trabajo la utilización de una solución de ácido cítrico al 0.3 % y ácido ascórbico al 0.2% fue eficaz para disminuir la oxidación de los explantes, concordando con los resultados de Khosroushahi y col. (2011) quienes lograron la disminución de la oxidación en callos de Taxus brevifolia con la utilización de 200 mg/L de ácido ascórbico y 100 mg/L de ácido cítrico en acción independiente; Toulabi y col. (2015) utilizaron los mismos antioxidantes en acción conjunta pero con 0.1 g/L y observaron que la oxidación disminuyó en cultivos de callos de Taxus baccata. La utilización de 100 ml/L de ácido ascórbico disminuyó la oxidación de semillas de Taxus baccata en el proceso de germinación in vitro (Zarek y col., 2007). Ahmad y col. (2013) recomiendan para reducir el proceso de oxidación de los explantes la utilización de agentes adsorbentes como el carbón activado y la polivinilpirrolidona (PVP), así como antioxidantes como el acido cítrico y el acido ascórbico. Todos estos compuestos, además del ácido cítrico y del ácido ascórbico, se utilizaron para contrarrestar la oxidación de explantes de Taxus globosa Schltdl. en el establecimiento in vitro. Se observaron dos casos particulares del comportamiento de los grupos controles tanto del Ar1 y el Ar20. En el caso del Ar1 el grupo control se conservó

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. verde y el grupo experimental con diferentes grados de oxidación, por lo que se tuvo que realizar un segundo establecimiento en las mismas condiciones para verificar ese comportamiento. Al término del segundo establecimiento del Ar1 el grupo control comenzó a oxidarse parcialmente, y al término de 24 h, la mayoría de los explantes se oxidaron totalmente. Se puede apreciar que el Ar1 en los dos establecimientos tiene un comportamiento disímil (Figura 17). Por lo que se puede decir que es una especie que tiene una forma de comportamiento muy errática en condiciones in vitro.

a b

Figura 17. Comparación de los explantes del Ar1 en los dos establecimientos que se le realizaron. (a) Explantes del grupo control del primer establecimiento sin oxidación después de 30 días de incubación. (b) Explantes del grupo control del segundo establecimiento con diferentes grados de oxidación a las 24 horas de incubación.

El otro caso particular se observó en el grupo control y el grupo experimental del Ar20 ya que después de cuatro semanas del establecimiento, sus explantes se comportaron de una manera similar, ya que estos se oxidaron parcialmente, por lo que se realizó un segundo establecimiento en las mismas condiciones para comprobar su comportamiento. A la primera semana del segundo establecimiento del Ar20, el grupo control tuvo una oxidación parcial que comparándose con el grupo control del primer establecimiento tuvieron un comportamiento similar, caso parecido entre los dos grupos experimentales de los dos establecimientos, ya que estos tuvieron una oxidación parcial, teniendo también un comportamiento similar (Figura 18). En este caso se puede decir que el genotipo Ar20 tuvo un comportamiento similar en los dos establecimientos.

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

En el caso del Ar8 no se realizó un segundo establecimiento ya que el grupo experimental también se conservo verde. Los grupos controles y experimentales de los árboles Ar2, Ar3, Ar4, Ar5, Ar6, Ar7 y Ar9 tuvieron el comportamiento esperado, por lo que no se realizó un segundo establecimiento.

a b

c d

Figura 18. Comparación de los explantes del Ar20 en los dos establecimientos que se realizaron, todos a los 30 días de incubación y

presentando oxidación parcial. (a) Explantes del grupo control del primer establecimiento. (b) Explantes del grupo experimental del primer establecimiento. (c) Explantes del grupo control del segundo

establecimiento. (d) Explantes del grupo experimental del segundo establecimiento.

Un acontecimiento que se presentó fue que en varios explantes del grupo control hubo inducción de brotes axilares, por lo que se pudiera decir que los genotipos dentro de una misma especie tienen diferentes potenciales (Figura 19).

Figura 19. Explantes del grupo control del Ar8 después de 30 días de Incubación, donde se puede apreciar que hubo inducción de yemas axilares.

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

7.3 Inducción de yemas axilares Tanto para el ensayo con los explantes que conservaban su meristemo apical como el ensayo con los explantes decapitados, el ANOVA determinó que solamente el número de brotes tenía un valor de significancia (p>0.05) (Tabla16).

Tabla 16. Valores determinados por el ANOVA para No Brotes, Tamaño, Color y Apariencia en explantes con meristemo apical.

Valor de Valor de P Valor de P Valor de P .Explante P para para para para No Brotes Tamaño Color Apariencia Con meristemo 0.0134 0.0973 0.7716 0.0887 apical Decapitado 0.0051 0.2676 0.5675 0.2623

El Valor de P para ser significativo tiene que tener un valor (p>0.05).

En el ensayo donde los explantes conservaban su meristemo apical, el tratamiento en el cual se obtuvo el mayor número de brotes fue el T4 (7 g/L de 2iP) con un promedio de 5.8 brotes, y en el mismo grupo estadístico se ubicó el tratamiento T9 (10 mg/L de KIN) con un promedio de 4 brotes. Mientras que los tratamientos T3, T2, T10 y T5 fueron los que tuvieron menos brotes con un promedio de uno (Tabla17). En el ensayo donde los explantes se encontraban decapitados (sin ápice), el tratamiento en el cual se obtuvo el mayor número de brotes fue el K (10 mg/L de KIN + 4 mg/L de 2iP) con un promedio de 4.2 brotes, y en el mismo grupo estadístico se ubicó el tratamiento D con un promedio de 3.2 brotes. Mientras que en el tratamiento J (10 mg/L de KIN + 1 mg/L de 2iP) no presento ningún brote (Tabla 17).

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

Tabla 17. Valores determinados por la prueba de rangos múltiples (LSD) por tratamiento para el número de brotes en explantes con meristemo apical y decapitados.

Explantes con Meristemo Apical Explantes Decapitados No. KIN 2iP No. KIN 2iP T* T* Brotes (mg/L) (mg/L) Brotes (mg/L) (mg/L) T1 1.8b 0 0 A 0.6b 0 0 T2 1.0a 0 1 B 0.6b 0 1 T3 1.0a 0 4 C 1c 0 4 T4 5.8d 0 7 D 3.2d 0 7 T5 1.4a 5 0 E 0.4b 5 0 T6 2.75b 5 1 F 0.6b 5 1 T7 2.4b 5 4 G 1.6c 5 4 T8 2.6b 5 7 H 3d 5 7 T9 4.0c 10 0 I 1.2c 10 0 T10 1.2a 10 1 J 0a 10 1 T11 2.6b 10 4 K 4.2e 10 4 T12 3.0b 10 7 L 2.4d 10 7

Los tratamientos seguidos por la misma letra no eran perceptiblemente diferentes en P < 0.05 (En la prueba de rangos múltiples LSD). *T = Tratamiento.

En el ensayo donde los explantes que conservaron su meristemo apical, no se muestra una diferencia estadística significativa en la interacción de las citocininas KIN y 2iP (p >0.05), solamente se observó diferencia estadística (p >0.05) para la citocinina 2iP en el número de brotes y en la apariencia (Tabla 18), donde los tratamiento con la concentración 7 mg/L de 2iP mostró el mayor número de brotes 3.8 (Tabla 19). En la apariencia las concentraciones de 0, 1 y 7 mg/L de 2iP fueron las que mostraban una mejor influencia en el brote original, donde según la escala ordinal corresponde a una apariencia vigorosa (Tabla 18).

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

Tabla 18. Valores determinados por el ANOVA en los explantes con meristemo apical para No Brotes, Tamaño, Color y Apariencia, en la interacción de las citocininas KIN y 2iP.

Valor de Valor de P Valor de P Valor de P Citocinina P para para para para No Brotes Tamaño Color Apariencia A: 2iP 0.0248 0.0516 0.5569 0.0222

B: KIN 0.7933 0.5029 0.2598 0.5922

Interacción AB 0.0226 0.1870 0.8933 0.2712

El Valor de P para ser significativo tiene que tener un valor (p>0.05).

Tabla 19. Valores determinados por la prueba de rangos múltiples (LSD) en el efecto de la concentración de 2iP para el número de brotes en explantes con meristemo apical.

2iP (mg/L) No. Brotes Apariencia 0 2.4b 2.4* 1 1.65ª 2.4333* 4 2.0b 1.9333* 7 3.8c 2.4*

Los tratamientos segu idos por la misma letra no eran perceptiblemente diferentes en P < 0.05 (En la prueba de rangos múltiples LSD) *La escala ordinal propuesta para Apariencia del brote original es: 0 = seco, 1 = marchito, 2 = poco vigoroso ó 3 = vigoroso.

En el caso de los explantes decapitados no hay diferencia estadística significativa (p >0.05), solo se observó diferencia estadística para la citocinina 2iP en el número de brotes y para KIN en la apariencia (Tabla 20), donde los tratamiento con la concentración 7 mg/L de 2iP mostró el mayor número de brotes 2.8 (Tabla 21). En cuanto a la apariencia, la concentración de 10 mg/L de KIN fue la que mostraba una mejor influencia sobre el brote original, donde según la escala ordinal corresponde a una apariencia poco vigorosa, mientras que las concentraciones de 0 y 5 mg/L de KIN le confieren una apariencia marchita (Tabla 21).

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

Tabla 20. Valores determinados por el ANOVA en los explantes decapitados para No Brotes, Tamaño, Color y Apariencia, en la interacción de las citocinina KIN y 2iP.

Valor de Valor de P Valor de P Valor de P Citocinina P para para para para No Brotes Tamaño Color Apariencia A: 2iP 0.0005 0.1108 0.4186 0.5518

B: KIN 0.4868 0.7945 0.2020 0.425

Interacción AB 0.1670 0.3211 0.7468 0.5203

> El Valor de P para ser significativo tiene que tener un valor (p 0.05).

Tabla 21. Valores determinados por la prueba de rangos múltiples (LSD) en el efecto de la concentración de 2iP para el número de brotes y la concentración de KIN para la apariencia en explantes decapitados.

2iP (mg/L) No. Brotes KIN (mg/L) Apariencia 0 0.7333a 0 1.8* 1 0.4a 5 1.8* 4 2.2666b 10 2.25* 7 2.8666c

* La escala ordinal propuesta para Apariencia del brote original es: 0 = seco, 1 = marchito, 2 = poco vigoroso ó 3 = vigoroso Los tratamientos seguidos por la misma letra no eran perceptiblemente diferentes en P < 0.05 (En la prueba de rangos múltiples LSD)

Se ha reportado que las citocininas son esenciales para la inducción de yemas axilares y brotes adventicios en coníferas (González y col., 1998). Según Martínez y col. (1991) las coníferas generalmente producen brotes adventicios en respuesta a la adición de citocininas no combinadas en el medio de cultivo. En los dos ensayos de Taxus globosa Schltdl. el mayor número de brotes axilares se observa con la acción independiente de cada citocinina (Tabla 17) coincidiendo con Abbasin y col. (2010), Sapam y Laishram, (2012) y Chang y col. (2001) que

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. con la acción independiente de BA obtuvieron el mayor número de brotes, los dos primeros en Taxus baccata y el ultimo en Taxus mairei. En el género Taxus no existe un lineamiento para la utilización de citocininas para la inducción de yemas axilares ya que algunos autores han utilizado con éxito la BA (Abbasin y col., 2010; Olęledska y col., 2009; Nhut y col., 2007; Liao y col., 2006a; Chang y col., 2001 y Majada y col., 2000), el 2ip (Ewald, 2007), la KIN (Kulkarni y Krishnamurthy, 2009) la Zeatina (Ibrahim y col., 2011) e inclusive combinación de una auxina (ANA) con una citocinina (BA) ( Mistrzak y col., 2015), para la especie en estudio Taxus globosa Schltdl. coincide con Ewald, (2007), ya que la mayor proliferación de yemas axilares correspondió a la acción independiente de la citocinina 2iP. Otro factor que influye en la proliferación de yemas axilares es la utilización de explantes decapitados con el propósito de romper con la dominancia apical de las auxinas internas de los explantes. Majada y col. (2000) obtuvieron sus mejores resultados en explantes decapitados de Taxus baccata donde obtuvieron un promedio de 3.6 brotes con la concentración de 22.19 µM de BA, contrario a los resultados en este estudio de Taxus globosa Schltdl., ya que la mayor proliferación de yemas axilares se obtuvo en explantes que conservaban su meristemo apical con un promedio de 5.8 brotes con la concentración de 7 mg/L de 2iP.

7.4 Inducción de callo Al término de 4 semanas de incubación, se distinguieron morfológicamente 3 tipos de callo: amarillo friable, marrón compacto y marrón friable (Figura 20). Los resultados obtenidos fueron: los tratamientos con BA, pero sin 2,4-D (T6, T11 y T16) no presentaron inducción de callo, siendo muy similares al tratamiento control (T1) (Figura 21a, b), mientras que la mejor inducción de callo se obtuvo en los tratamientos que contenían solo la auxina 2,4-D (T2, T3, T4 y T5) siendo el tratamiento T5 (4 mg/L de 2,4-D) donde se observó el mayor crecimiento de callo. Este callo fue de color amarillo y con una consistencia friable (Figura 21c). Por el contrario, en los tratamientos tanto con BA como con 2,4-D (T7, T8, T9, T10, T12, T13, T14, T15, T17, T18, T19 y T20), la formación de callo fue mínima, como en el caso del tratamiento T8 (2 mg/L de 2,4-D y 0.1 mg/L de BA), en el cual se observó muy poca inducción de callo, de color crema, poco friable,

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. además de la presencia de fenoles (Figura 21d). Los resultados de la interación de BA y 2,4-D en la inducción de callo se muestran en la tabla 22.

a b c

1 cm 1 cm 1 cm

Figura 20. Morfología de los tres tipos de callos que se observaron en la fase de inducción al término de 4 semanas de incubación: (a) amarillos friables, (b) marrones compactos y (c) marrones friables.

a b

1 cm 1 cm

c d

1 cm 1 cm

Figura 21. Inducción de callo a partir de acículas cultivadas en medio basal B5 durante 4 semanas en obscuridad. (a) Tratamiento control (T1). (b) Tratamiento T6 (0.1 mg/L de BA), que muestra semejanza con el tratamiento control, al no presentar inducción de callo. (c) Callo amarillo friable obtenido del Tratamiento T5 (4 mg/L de 2,4-D ) y (d) Callo poco friable, crema y presencia de fenoles en el Tratamiento (T8) 2 mg/L de 2,4-D y 0.1 mg/L de BA.

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

Tabla 22. Efecto de BA y 2,4-D en la inducción de callo de acículas de Taxus globosa Schltdl y porcentaje de crecimiento de callo.

Porcentaje BA 2,4-D Morfología del Tratamiento de (mg/L) (mg/L) callo inducción de callo (%) T1 0.0 0.0 0 Sin inducción T2 0.0 1.0 83.33 Amarillo friable T3 0.0 2.0 83.33 Amarillo friable T4 0.0 3.0 91.66 Crema friable T5 0.0 4.0 100 Crema friable T6 0.1 0.0 0 Sin inducción T7 0.1 1.0 41.66 Amarillo friable T8 0.1 2.0 41.66 Amarillo friable T9 0.1 3.0 41.66 Amarillo friable T10 0.1 4.0 41.66 Amarillo friable T11 0.3 0.0 0 Sin inducción T12 0.3 1.0 25.00 Compacto café T13 0.3 2.0 25.00 Compacto café T14 0.3 3.0 25.00 Compacto café T15 0.3 4.0 25.00 Compacto café T16 0.5 0.0 0 Sin inducción T17 0.5 1.0 16.00 Compacto café T18 0.5 2.0 16.00 Compacto café T19 0.5 3.0 16.00 Compacto café T20 0.5 4.0 16.00 Compacto café

Se seleccionaron los callos amarillos friables y cremas friables de los tratamientos T2, T3, T4 y T5 para su multiplicación. Se mantuvieron en el medio basal B5 (Gamborg y col., 1968) suplementado con vitaminas 2x B5, 4 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de sacarosa y 10 g/L de agar, ajustado a un pH de 5.8, en oscuridad total a 25°C. El problema de oxidación de los callos se corrigió al agregar al medio de cultivo 1 g/L de carbón activado, este compuesto es importante adicionarlo en los trabajos in vitro ya que es un adsorbente de los compuestos fenólicos que desechan los tejidos vegetales (Thomas, 2008). Los callos se mantuvieron en este medio durante 3 meses, con resiembras mensuales, hasta que en algunos callos se observó el crecimiento de raíces (Figura 22a), esto debido a la concentración elevada de 2,4-D y la oscuridad total. Este proceso morfogénico no es deseable en el establecimiento de líneas celulares en suspensión por lo que se

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. tuvo que corregir el problema. Se siguió con el mismo medio de cultivo solamente que se tuvo que disminuir la concentración de 2,4-D, el cual fue de 3 mg/L. Durante los siguientes 3 meses los callos se mantuvieron con el medio de cultivo y condiciones de incubación anteriores hasta que unos callos conservaron la coloración crema (Figura 22b) y otros se tornaron incoloros (Figura 22c), esto se debio al tiempo prolongado en oscuridad total, por lo que se cambiaron a un fotoperíodo de 16 h. Después del primer mes los callos se tornaron con una coloración verde (Figura 22d). Desde la selección de los callos friables de coloración amarilla y crema hasta que éstos se tornaran verdes, transcurrieron 7 meses, tiempo adecuado en el cual el crecimiento de callo ya eran viables para ser transferidos al medio líquido para la iniciación de las líneas celulares en suspensión y la organogénesis indirecta.

a b

1 cm

1 cm

c d

1 cm

1 cm

Figura 22. Situaciones que se presentaron en el mantenimiento y multiplicación de callo. (a) Rizogénesis, (b) Callos friables color crema, (c) Callo translucido y (d) Callos friables con coloración verde.

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

En la inducción de callos el material vegetal utilizado puede provenir de cualquier tejido u órgano vegetal y puede realizarse en diversidad de especies, pero para su iniciación requiere de varios factores como los componentes químicos minerales del medio utilizado, las concentraciones de los reguladores de crecimiento utilizados, la luz, la temperatura, la humedad y por supuesto la constitución genética de los genotipos de la planta (Caponetti, 2000), la consistencia y el color de los callos también son influenciados por esos mismos factores. Así, en el género Taxus, Hien y col. (2004) realizaron la inducción de callos utilizando tallos jóvenes y acículas de la especie Taxus wallichiana Zucc. siendo estos friables y de color amarillento o verde claro, y con la misma especie pero empleando semillas Datta y col. (2006) obtuvieron callos friables color crema y compactos de color amarillo o verde. Wickremesinhe y col. (1993) utilizando brotes jóvenes, brotes maduros y acículas obtuvieron callos friables ya sea amarillos claros o café claros de varias especies de Taxus. Generalmente los callos adecuados para iniciar una línea celular, tienen una consistencia friable. En este trabajo la mejor inducción de callo se obtuvo con el tratamiento T5 (4 mg/L de 2,4-D), éstos callos eran friables y de color amarillo, coincidiendo con Wickremesinhe y col. (1993) quienes con 1 o 2 mg/L de 2,4-D obtuvieron la mejor inducción de callo en Taxus baccata cv Densiformis y en Taxus brevifolia y con Jiaru y col. (1999) que con 1 mg/L de 2,4-D obtuvieron la mejor inducción de callos en Taxus chilensis, en su estudio el 2,4-D entre otras auxinas probadas fue la que les dio mejor resultado en la inducción de callo. Por el contrario, en este estudio, los tratamientos de BA en combinación con 2,4-D, la formación de callo fue mínima y se observó muy poca inducción, fue de color crema, poco friable, además de la presencia de fenoles. Este resultado difiere con los que obtuvieron otros autores, los cuales con la combinación de auxinas y citocininas obtuvieron los mejores resultados para la inducción de callo, como es el caso de Ashrafi y col. (2010) que con 4 mg/L de 2,4D en combinación de 0.5 mg/L de KIN obtuvieron la mejor inducción de callo en la especie Taxus baccata L., mientras que Hien y col. (2004) con 4 mg/L de 2,4-D en combinación de 1 mg/L de KIN obtuvieron los mejores callos en Taxus wallichiana Zucc. y con la misma especie pero con 2 mg/L de 2,4-D en combinación de 0.5 mg/L de BA Datta y col. (2006) también obtuvieron sus mejores callos.

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl.

El problema de oxidación de los callos se corrigió al agregar al medio de cultivo 1 g/L de carbón activado, el efecto benéfico del carbón activado se atribuye a su capacidad para atrapar sustancias inhibitorias o tóxicas del medio de cultivo que son producidas durante el autoclavado del medio o liberadas por el explante

(Azofeifa, 2009). Existen otras alternativas para evitar este problema, como el utilizado por Ashrafi y col. (2010) quienes evitaron la oxidación de callos de Taxus baccata L. al agregar al medio de cultivo 500 mg/L de PVP (polivinilpirrolidona).

7.5 Inducción de brotes adventicios Al término de 4 semanas de incubación se observó crecimiento de callo en los tratamientos TB2, TD2, TI2, TL2, TN2, TR2, TU2, TV2, TW2 y TX2. Con respecto a la coloración se distinguieron tres diferentes tonalidades: callos café oscuro, callos café claro y callos verde-cafés (Figura 23a, b y c). Con respecto a la consistencia los tratamientos que presentaron callos friables fueron la gran mayoría a excepción de los tratamientos TA2 (control), TE2, TH2 y TT2 (Figura 23d), en los cuales la consistencia de los callos fue compacta. Con respecto al objetivo principal del ensayo, no hubo ninguna inducción de brotes adventicios en ningún tratamiento, y la única respuesta morfogénica consistió en rizogénesis en el tratamiento TR2 (Figura 23e). Con respecto a la oxidación en ningún tratamiento se presentó, ya que se corrigió al adicionar 1 g/L de carbón activado. En la inducción de brotes adventicios de la especie Taxus globosa Schltdl. solo se observó el crecimiento de callo y cambio en su coloración inicial. El explante inicial, la morfología del callo y la concentración de reguladores de crecimiento son factores importantes para obtener brotes adventicios. Datta y col. (2006) obtuvieron el mayor número de brotes adventicios de Taxus wallichiana Zucc., a partir de callos verdes compactos en el medio WPM al 50% con vitaminas SH con la acción de 2.5 mg/L de BA y con la misma especie Hussain y col. (2013) obtuvieron el mayor número de brotes adventicios a partir de callos verdes compactos y café friables usando el medio MS con la acción de 2.0 mg/L de BA y en Taxus brevifolia Nutt., Chee (1995) obtuvo brotes adventicios de callos café friables utilizando el medio B5 al 50% adicionado con 10 μM de BA. En este caso fue necesario para la inducción de brotes adventicios la acción de una sola citocinina. Caso contrario en la investigación de Das y col. (2008) que en callos

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Establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. café friables de Taxus wallichiana Zucc., en el medio WPM con la interacción de 5.0 μM de 2,4-D y 2.0 μM de BA obtuvieron el mayor número de brotes adventicios. Baharak y col. (2014) obtuvieron brotes adventicios de Taxus baccata L. a partir de callos crema friables y café compactos adicionado con 3 mg/L de KIN y 3 mg/L de BA. En estos casos fue necesario la interacción de dos reguladores de crecimiento para la inducción de brotes adventicios. En el caso de Taxus globosa Schltdl. la única respuesta morfogénica que se obtuvo fue la rizogénesis en el tratamiento TR2 (7 mg/L de BA + 0.03 mg/L de 2,4-D). La inducción de raíces de los brotes adventicios se obtiene con la acción de auxinas ya sea en acción conjunta o independiente. Ewald (2007) obtuvieron la rizogénesis en brotes de Taxus baccata L. con la concentración de 2 mg/L de IBA y Hussain y col. (2013), obtuvieron raíces en brotes adventicios de Taxus wallichiana Zucc., con la concentraccion de 8 mg/L de IBA, mencionando que la IBA es la auxina mas eficiente para la formación de raíces en brotes.

a b c

1 cm 1 cm 1 cm

d 1 cm e 1 cm

Figura 23. Crecimiento de callo en la Inducción de brotes adventicios al término de las 4 semanas de incubación. (a) Callo friable café oscuro. (b) Callo friable café claro. (c) Callo friable verde-café. (d) Callo compacto café oscuro y (e) Callo friable verde-café con rizogénesis.

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7.6 Iniciación del cultivo de líneas celulares en suspensión Después de 30 días de incubación de los medios de cultivo en suspensión, se evaluó visualmente las variables de respuesta (crecimiento celular, coloración de los callos y el proceso de oxidación). Se observó el crecimiento de callo y una turbidez del medio líquido, considerándose estas dos respuestas como indicadores del crecimiento celular en suspensión. No se presentaron cambios en la coloración de los clusters éstos conservaron la coloración inicial (cremosa y verde). En cuanto al proceso de oxidación no se presentó debido a los antioxidantes (3 g/L de ácido cítrico con 2 g/L de ácido ascórbico) que fueron agregados al medio de cultivo (Figura 24). Posteriormente se transfirieron al medio basal B5 (Gamborg y col., 1968), suplementado con vitaminas B5 2x, 2 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de sacarosa, 3 g/L de ácido cítrico y 2 g/L de ácido ascórbico, ajustado a un pH de 5.8. Se utilizaron matraces Erlenmeyer de 250 mL a los cuales se les colocó 25 mL de medio de cultivo y se les inoculó 5 mL del medio celular en suspensión. El medio de cultivo se esterilizó en autoclave a 121°C a una presión de 1 kg/cm2 durante 15 minutos. Los matraces se colocaron en un agitador a 125 rpm. El fotoperíodo fue de 16 h, a una temperatura de 25°C. Este procedimiento con el propósito del mantenimiento y multiplicación celular, para posteriores trabajos.

a b

Figura 24. Aspecto de las líneas celulares en suspensión contenidas en los matraces al término de 30 días. (a) Callos friables crema y (b) Callos friables verde.

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En los medios de cultivo celular en suspensión, las células individuales se distribuyen en forma homogénea a través del medio de cultivo y por estar rodeadas del mismo, se facilita la transferencia de nutrientes y oxígeno hacia el citoplasma, y con ello al incremento de metabolitos secundarios (Arias y col., 2009). La acumulación de metabolitos secundarios es un resultado dinámico entre la formación del producto, la transportación, el almacenamiento y la degradación (Vanisree y Tsay, 2004). En las suspensiones celulares es necesario considerar dos etapas en el proceso, una de crecimiento celular seguida de una acumulación del metabolito secundario (Pérez y col., 2004). Durante el proceso se analizó visualmente el crecimiento celular, ya que hubo incremento de los agregados celulares inoculados, así como la turbidez del medio, caso contrario a lo acontecido por Hien y col. (2004) que en el cultivo de células en suspensión de Taxus wallichiana no se presentó en el medio líquido incremento celular, siendo la coloración del medio nítida, considerando estos dos factores como indicadores de que no existió crecimiento celular. El color rojo claro en el medio líquido es indicador de un proceso de oxidación celular (Wickremesinhe y Arteca, 1994; Hirasuna y col., 1996), esta coloración no se presento debido a la incorporación al medio de 3 mg/L de ácido cítrico y de 2 mg/L de ácido ascórbico, ya que estos en acción conjunta actuaron como antioxidantes. Para la acumulación de metabolitos secundarios es importante considerar diversos factores de cultivo. El incremento del paclitaxel en medios de cultivo en suspensión es influenciado por: el medio basal (Fett-Neto y col., 1993), la especie (Yukimune y col., 1996), dentro de una misma especie la línea celular y los reguladores de crecimiento (Ketchum y col., 1995; Ketchum y Gibson, 1996), la luz (Pérez y col., 2004; Tang y col., 2001), la adición de carbohidratos y aminoácidos (Syklowska-Baranek y Furmanowa, 2005; Ketchum y col., 1995) entre otros. En la figura 25 se presenta el proceso que se llevó a cabo para el cultivo de células en suspensión. Este trabajo es importante para futuras investigaciones para el incremento y extracción de paclitaxel en la especie Taxus globosa Schltdl.

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Problema Solución 1 Inducción de Callo Duración 1 mes

Oxidación Agregar 1 g/L de Carbón Selección de Activado Callos B5 + 4 mg/L de 2,4-D Oscuridad Total Friables 24°C Friables Rizogénesis Disminuir a amarillo crema 3 mg/L de 2,4-D 2 Mantenimiento y Multiplicación de Callo Duración 7 meses Coloración Fotoperíodo B5 + 3 mg/L de 2,4-D Traslúcida 16 Hrs luz 1 g/L de Carbón Activado Fotoperíodo 16 Hrs luz 24°C 4 Multiplicación Celular en Suspensión 3 Duración 1 mes

]

]

] Iniciación de ] Cultivo Celulares

] en Suspensión ] ] Duración 1 mes

]

] ] B5 + 2 mg/L de 2,4-D ] 3 g/L de Ac. Cítrico +

]

] 2 g/L de Ac. Ascórbico ] Fotoperíodo 16 Hrs luz Movimiento 125 rpm 25°C Figura 25. Proceso para la iniciación del cultivo de células en suspensión de Taxus globosa Schltdl.

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8. CONCLUSIONES El protocolo de desinfección desarrollado fue efectivo para el establecimiento in vitro de Taxus globosa Schltdl. Un factor importante para la reducción de la oxidación de los explantes fue al mantenerlos en oscuridad total con la adición de PVP al 0.1% y de ácido cítrico al 0.5% a la solución del pretratamiento durante las 16 hrs previas al establecimiento. Se demostró que el grado de oxidación de los explantes se disminuyo considerablemente con la utilización del ácido cítrico y el ácido ascórbico en acción conjunta. En la especie Taxus globosa Schldtl es recomendable que en los ensayos para la proliferación de yemas axilares, los explantes conserven su ápice (meristemo apical) y la acción independiente en concentraciones altas de las citocininas (KIN y 2iP) siendo el 2iP la citocinina que obtuvo mayor promedio de brotes. Cuando al explante se le somete a la decapitación de su meristemo apical, para la mejor inducción de brotes axilares es necesario la interacción de dos citocininas a concentraciones altas. Para estudios posteriores se recomienda para la inducción de brotes adventicios la acción independiente de alguna citocinina. Para la inducción de brotes adventicios a partir de callos en el género Taxus la citocinina que mayormente utilizada es la BA en concentraciones de 1.0 a 3.0 mg/L. El regulador de crecimiento 2,4-D es la auxina que tiene mayor potencial para la inducción de callo. Los callos friables ya sea de coloración amarilla o verde son los que tienen mejores características para ser sometidos a respuestas morfogénicas. En la inducción del callo es importante que el explante inicial se mantenga bajo oscuridad total. Posteriormente durante 2 meses estos callos deben ser transferidos a condiciones de luz. La oxidación y la rizogénesis de los callos se evitaron al agregar al medio de cultivo 1 g/L de carbón activado y se disminuyó la dosis del 2,4-D a 3 mg/L. La oxidación del cultivo celular en suspensión se evitó al agregar 3 mg/L de ácido cítrico en acción conjunta de 2 mg/L de ácido ascórbico.

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9. PERSPECTIVAS La columna vertebral del trabajo de tesis fue la realización del establecimiento in vitro de la especie Taxus globosa Schltdl. la cual se concluyó en forma satisfactoria. Paulatinamente se realizaron otros ensayos con la especie Taxus globosa Schltdl. Se trabajó con la proliferación de yemas axilares, la iniciación de la organogénesis y el cultivo de líneas celulares en suspensión, esto debido a la poca existencia de trabajos biotecnológicos y con el objetivo de ganar paso y conocer más del comportamiento bajo condiciones in vitro de la especie. Para la conclusión del cultivo de líneas celulares en suspensión, se recomienda realizar el monitoreo del crecimiento celular y la extracción del paclitaxel para conocer su concentración, cabe mencionar que el presente trabajo queda como material de apoyo y abre la puerta a futuras líneas de investigacion.

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ANEXO I. Sales minerales componentes de los medios basales MS (Murashige y Skoog, 1962), WPM (Lloyd y McCown, 1980), B5 (Gamborg y col., 1968) y SH (Schenk y Hildebrandt, 1972) y mezclas de vitaminas adicionadas.

Lloyd y Gamborg Schenk y Murashige McCown, y col., Hildebrandt, y Skoog, 1980 1968 1972 Componentes 1962 (MS) (WPM) (B5) (SH) Macronutrientes Concentracion (mg/L)

NH4NO3 1650 400 ------

KNO3 1900 --- 3000 2500

CaCl2 . 2H2O 440 96 150 200

MgSO4 . 7H2O 370 370 500 400

KH2PO4 170 170 ------

Ca (NO3)2 . 4H2O --- 556 ------

K2SO4 --- 990 ------

NaH2PO4 . H2O ------150 300

(NH4)2SO4 ------134 --- Micronutrientes

MnSO4 . 4H2O 22.3 22.3 10 10

ZnSO4 . 7H2O 8.6 8.6 2 1

H3BO3 6.2 6.2 3 5 KI 0.83 --- 0.75 1

Na2MoO4 . 2H20 0.25 0.25 0.25 0.1

CuSO4 . 5H2O 0.025 0.25 0.025 0.2

CoCl2 . 6H2O 0.025 --- 0.025 0.1 Fuente de hierro

FeSO4 . 7H2O 27.8 27.8 28 15 Na2 EDTA . 2H2O 37.3 37.2 --- 20 Vitaminas Mio-Inositol 100 100 100 1000 Acido nicotínico 0.5 --- 1 5 Piridoxina . HCl 0.5 ------0.5 Glicina 2 --- 1 --- Tiamina . HCl 0.1 0.4 10 5

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