CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y DE EDUCACIÓN SUPERIOR DE ENSENADA

PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS CON ORIENTACIÓN EN ACUICULTURA

ANÁLISIS CITOGENÉTICO EN TRES ESPECIES DE ABULONES DE BAJA CALIFORNIA MEDIANTE PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES

TESIS Para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de DOCTOR EN CIENCIAS

Presenta: Cristian Jorge Gallardo Escarate

Ensenada, Baja California, México, Abril de 2005.

INDICE GENERAL

Acta de aprobación de tesis...... i

Resumen...... ii

Abstract...... iii

Dedicatoria ...... iv

Agradecimientos ...... v

Indice de figuras ...... vii

Indice de tablas...... x

...... 1

...... 8

Generales...... 8

Específicos ...... 8

...... 9

III. 1. Importancia de abulones en acuicultura ...... 9

III. 2. Introducción a la genética de abulones...... 11

III.3. El valor de estudios citogenéticos ...... 15 1. 3. 1. Citogenética molecular...... 16 1. 3. 2. Citogenética de organismos acuáticos ...... 19 1. 3. 3. Citogenética de moluscos ...... 19 1. 3. 4. Implicaciones de tamaño genómico...... 22 1. 3. 5. Análisis de imágenes como una herramienta en citogenética...... 25

...... 28

IV. 1. Obtención de cariotipos en abulones a partir de larvas...... 28 4. 1. 1. Obtención de organismos ...... 28 4. 1. 2. Obtención de placas metafásicas...... 29 4. 1. 3. Tratamiento hipotónico...... 29 4. 1. 4. Fijación...... 29 4. 1. 5. Confección de preparaciones ...... 29 4. 1. 6. Desarrollo de cariotipos...... 30

IV. 2. Procedimientos de FISH para la localización cromosómica de genes ...... 31 4. 2. 1. FISH para ADNr 18S+5.8S+ 28S ...... 31 4. 2. 2. FISH para regiones Teloméricas y GATA...... 34 4. 2. 3. Detección inmunocitoquímica ...... 35

IV. 3. Relaciones cromosómicas entre Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata.....35

IV. 4. Desarrollo de un método para estimar tamaño genómico mediante análisis de imagenes fluorescentes ...... 36 4. 4. 1. Material biológico ...... 36 4. 4. 2. Recolección de muestras y preparación celular para tinción de ADN ...... 37 4. 4. 3. Captura de imágenes ...... 38 4. 4. 4. Análisis de imágenes fluorescentes...... 39

IV. 5. Estimación de contenido de ADN cromosómico en abulón rojo H. rufescens ...... 41 4. 5. 1. Preparación de cromosomas y tinción de ADN...... 41 4. 5. 1. Análisis de imágenes en contenidos de ADN cromosómicos...... 41 4. 5. 2. Análisis estadístico ...... 42

IV. 6. Estimación de tamaño genómico en Argopecten purpuratus ...... 42 4. 6. 1. Material biológico ...... 42 4. 6. 2. Obtención de hemocitos y tinción fluorescente de ADN...... 43 4. 6. 3. Análisis estadístico ...... 43

...... 44

V. 1. Cariotipo cuantitativo de Haliotis rufescens...... 44

V. 2. Cariotipo cuantitativo de Haliotis fulgens ...... 47

V. 3. Cariotipo cuantitativo de Haliotis corrugata...... 50

V. 4. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis rufescens ...... 53

V. 5. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis fulgens...... 55

V. 6. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis corrugata ...... 56

V. 7. Relaciones cromosómicas entre H. rufescens, H. fulgens y H. corrugata...... 60

V. 8. Estimación de tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescentes...... 63 5. 8. 1. La naturaleza del desvanecimiento DAPI-fluorescentes...... 63 5. 8. 2. La relación entre desvanecimiento DAPI-fluorescente y tamaño genómico....69

V. 9. Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo del Pacífico Haliotis rufescens ..75

V. 10. Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus.82 5. 10. 1. Mediciones morfológicas...... 82 5. 10. 2. Análisis de tamaño genómico mediante desvanecimiento fluorescente ...... 82

...... 87

VI. 1. Relaciones cromosómicas entre Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata.....87

VI. 2. Desarrollo de citogenética molecular en moluscos: aplicación en abulones de Baja California ...... 92

VI. 3. Desarrollo de un método de cuantificación de contenido de ADN genómico mediante análisis de imágenes fluorescentes ...... 96

VI. 4. Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo Haliotis rufescens ...... 100

VI. 5. Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus mediante análisis de imágenes fluorescentes ...... 102

...... 105

...... 109

i

TESIS DEFENDIDA POR Cristian Jorge Gallardo Escarate Y APROBADA POR EL SIGUIENTE COMITÉ

Dr. Josué Álvarez Borrego Dr. Miguel Ángel del Río Portilla

Director del Comité Co-Director del Comité

Dra. Carmen Paniagua Chávez Dr. Axayácatl Rocha Olivares

Miembro del Comité Miembro del Comité

Dr. Jorge de la Rosa Vélez

Miembro del Comité

Dra. Mónica Hernández Rodríguez Dr. Federico Graef Ziehl

Coordinador del Programa de Director de Estudios de Posgrado

Posgrado en Ciencias con Orientación en Acuicultura

Abril de 2005 ii

RESUMEN de la tesis que presenta Cristian Gallardo Escarate, presentada como requisito parcial para la obtención del grado de DOCTOR EN CIENCIAS con especialidad en ACUICULTURA. Ensenada, Baja California, México. Abril de 2005.

ANÁLISIS CITOGENÉTICO DE TRES ESPECIES DE ABULONES DE BAJA CALIFORNIA MEDIANTE PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES

Resumen aprobado por:

Dr. Josué Álvarez Borrego Dr. Miguel Ángel del Río Portilla Director del Comité Co-Director del Comité

El objetivo fundamental de la citogenética es analizar cómo la estructura y comportamiento de los cromosomas garantizan la conservación de la información genética a través de la herencia. Asimismo se estudian las variaciones que afectan a los cromosomas, sus consecuencias genéticas y sus implicaciones evolutivas. El objetivo del presente trabajo doctoral fue caracterizar citogenéticamente tres especies de abulones de Baja California mediante procedimientos de análisis de imágenes. Para lo cual, se obtuvieron células larvales de Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata. El análisis cariotípico mostró que las tres especies estudiadas presentan un número diploide de 2n=36 cromosomas. Sin embargo, la relación de longitudes de los brazos cromosómicos mostró que H. rufescens posee 8M+9SM+1ST pares cromosómicos, H. fulgens posee 8M+8SM+2ST y H. corrugata posee 10M+7SM+1ST. El uso de sondas ribosómicas mediante FISH, permitió la localización de dos clusters de genes ribosómicos 18S-5.8S-28S que integran las NOR’s. De este modo, en todas las especies estudiadas se localizó un NOR sobre el cromosoma 4, mientras que un segundo NOR fue observado sobre el cromosoma 5 de H. rufescens, cromosoma 11 de H. fulgens y cromosoma 2 de H. corrugata. Adicionalmente, regiones teloméricas (TTAGGG)n y (GATA)n fueron encontradas en el genoma de los abulones mediante FISH para estos tipos de secuencias. Los análisis estadísticos sobre la morfología cromosómica, mostraron que de los 18 pares cromosómicos de cada especie, 8 pares son similares en las tres especies estudiadas, 3 pares son propios de H rufescens, 7 pares de H. fulgens y 2 pares de H. corrugata. Las relaciones cromosómicas mostraron que H. rufescens y H. corrugata son entre sí citogenéticamente más similares que cualquiera de ellas con respecto a H. fulgens. Adicionalmente, el presente trabajo propuso un nuevo método de estimación de tamaño genómico mediante la cuantificación de desvanecimiento DAPI-fluorescente. La relación entre los valores de desvanecimiento fluorescente de un organismo u especie y su tamaño genómico fue encontrada estadísticamente significativa (p<0.001) y lineal (r = 0.99). Una aplicación directa fue desarrollada para cuantificar el contenido de ADN cromosómico en H. rufescens y para estimar el tamaño genómico de dos poblaciones de Argopecten purpuratus. En conclusión, el presente trabajo doctoral aporta nueva información citogenética de tres especies de abulones de Baja California. Asimismo, aporta con el desarrollo de un nuevo método de estimación de tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescente.

Palabras clave: Cariotipos, FISH, H. rufescens, H. fulgens, H. corrugata, análisis de imágenes, tamaño genómico.

iii

ABSTRACT of the Thesis presented by Cristian Gallardo Escarate as a partial requirement to obtain the DOCTOR IN SCIENCE degree with orientation in AQUACULTURE. Ensenada, Baja California, México. April 2005.

CITOGENETIC ANALYSIS OF THREE ABALONE SPECIES FROM BAJA CALIFORNIA BY MEANS OF DIGITAL IMAGE PROCESSING

Abstract approved by:

Dr. Josué Álvarez Borrego Dr. Miguel Ángel del Río Portilla Director del Comité Co-Director del Comité

The fundamental aim of the cytogenetics is to analyze how both structural and behavior of the chromosomes guarantee the conservation of the genetics information throughout the inheritance. Likewise, the variations that could be affect to the chromosomes, its genetic consequences, and evolutionary implications are studied. The aim of the present doctoral work was to characterize cytogenetically three abalone species from Baja California by means of image analysis procedures. Thus, larvae cells were obtained from Haliotis rufescens, H. fulgens, and H. corrugata. Karyotype analysis showed that all studied species have a diploid number of 2n=36 chromosomes. However, the relationship of chromosomal arms lengths showed that H. rufescens has 8M+9SM+1ST chromosome pairs, H. fulgens has 8M+8SM+2ST, and H. corrugata has 10M+7SM+1ST. The using of ribosomal probes by means of FISH, allowed to locate two clusters of ribosomal genes 18S-5.8S-28S that form the NOR’s. In this way, in all the studied abalone species was localized one NOR onto the chromosome 4, while one second NOR was observed onto the chromosome 5 of H. rufescens, chromosome 11 of H. fulgens, and chromosome 2 of H. corrugata. Furthermore, both telomeric (TTAGGG)n and (GATA)n regions were found in the abalone’s genome by means of FISH for these kinds of sequences. Statistical analyses carried out on the chromosomal morphology showed that in the 18 chromosome pairs of each species, 8 pairs are similar in the three studied species, and 3 pairs belongs to H rufescens, 7 pairs to H. fulgens, and 2 pairs to H. corrugata. Chromosome relationships showed that both H. rufescens and H. corrugata are cytogenetically most similar than anyone with respect to H. fulgens. In addition, the present work proposed a new method for genome size estimation by means of DAPI-fluorescent fading quantification. The relationship between the fluorescent fading values of an organism or species, and its genome size was found statistically significative (p<0.001) and lineal (r = 0.99). A direct application was performed in order to quantify the chromosomal DNA content in H. rufescens, and to estimate genome size of two populations of Argopecten purpuratus. In conclusions, the present doctoral work contributes with new cytogenetic information of three abalone species from Baja California. Likewise, It is contributes with a new method for genome size estimation by mean of fluorescent image analysis.

Key words: Karyotypes, FISH, H. rufescens, H. fulgens, H. corrugata, image analysis, genome size.

iv

A mí amada Paty y a mi hijo Cristian Ignacio v

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo económico, a través a los siguientes proyectos de investigación: - Proyecto 36075-B "Procesado Automático de Partículas Biogénicas", a cargo del Dr. Josué Álvarez Borrego. - Proyecto 33018-B “Marcadores genéticos en el abulón Haliotis spp.”, a cargo del Dr. Miguel Ángel del Río-Portilla. - Programa Integral de Fortalecimiento del Posgrado, Departamento de Acuicultura, CICESE.

Al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada por el apoyo económico, a través a los siguientes proyectos: - Proyecto Interno CICESE 7090, de la División de Física Aplicada, Departamento de Óptica "Procesamiento de Patrones Complejos y de Superficies Marinas", a cargo del Dr. Josué Álvarez Borrego. - Proyecto Interno CICESE 6555, de la División de Oceanología, Departamento Acuicultura "Genética molecular de especies acuiculturales", a cargo del Dr. Miguel Ángel del Río-Portilla.

Al programa de Becas para Estudios de Postgrado de la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICyT) convenio BID, Chile.

Al programa de Becas para Estudios de Postgrado de la Organización de los Estados Americanos (OEA).

vi

Al Dr. Josué Álvarez-Borrego por haberme recibido desde el fin del mundo como aprendiz. Por el valor o la locura de inculcarme la ciencia interdisciplinaria. Por su amistad.

Al Dr. Miguel Ángel del Río-Portilla por la búsqueda del equilibrio entre las imágenes y la genética. Por las discusiones entorno a la hipótesis, a la metodología y a los cromosomas.

A la Dra. Laureana Rebordinos de la Universidad de Cádiz, España y a su equipo de trabajo durante la estancia de investigación en el Laboratorio de Genética.

Al M en C Mario A. Bueno por su ayuda en el procesado de imágenes y por su amistad en todo momento.

A la Sociedad Cooperativa de Producción Pesquera (SCPP), Pescadores Nacionales de Abulón (PNA), S.C. de R.L. por el apoyo logístico durante las estancias de investigación en Isla de Cedros y de manera muy especial al Oceanólogo José Guadalupe González Avilés por su ayuda en la obtención de larvas de abulón. Por mostrarme que la experiencia en laboratorio vale más que cualquier protocolo.

A los Doctores Carmen Paniagua, Axayácatl Roche y Jorge de la Rosa, miembros del Comité de tesis, por las sugerencias y disposición durante todo el trabajo doctoral.

Finalmente, a mi pequeña gran familia que desde el otro lado del mundo me han brindado su apoyo incondicional en todo momento.

vii

LISTA DE FIGURAS Figura Página

1 Relaciones filogenéticas entre especies de abulones de California 12 sugerida mediante comparación inmunocitoquímica de hemocianinas (Meyer, 1967). Diagrama obtenido de Leighton (2000).

2 Relaciones filogenéticas de abulones californianos y japoneses 13 inferida a partir de secuencias de ADN del gen lisina en espermatozoides. Diagrama tomado de Lee y Vacquier (1995).

3 Esquema de procedimiento de obtención de placas metafásicas desde 30 larvas de abulón.

4 Procedimiento general de medición de tamaño genómico a través de 40 la cuantificación del desvanecimiento fluorescente de ADN.

5 Cromosomas de Haliotis rufescens. a) Imagen digital de placa 45 metafásica, b) Cariotipo de H. rufescens.

6 Carioidiograma de Haliotis rufescens. M, metacéntrico; SM, 47 submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.

7 Cariotipo de Haliotis fulgens (2n=36). 48

8 Carioidiograma de Haliotis fulgens. M, metacéntrico; SM, 50 submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.

9 Cariotipo de Haliotis corrugata (2n=36). 51

10 Carioidiograma de Haliotis corrugata. M, metacéntrico; SM, 53 submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.

11 Arreglo cariotípico de Haliotis rufescens con hibridación in situ 54 fluorescente para sonda de gen ribosomal mayor 18S-5.8S-28S.

12 FISH en Haliotis rufescens. a) Cromosomas mitóticos metafásicos 57 después del tratamiento con sonda telomérica (TTAGGG)n, b) Núcleo interfásico con sonda telomérica, c) Cromosomas mitóticos después de ser marcado con sonda (GATA)n, d) Núcleo interfásico marcado con sonda (GATA)n.

viii

LISTA DE FIGURAS (continuación) Figura Página

13 FISH en Haliotis fulgens. a) Cromosomas mitóticos hibridados con 58 sonda ADNr 18S-5.8S-28S, b) Núcleo interfásico con sonda ADNr, c) Cromosomas metafásicos con sonda telomérica (TTAGGG)n, d) Núcleo interfásico con sonda telomérica, e) Cromosomas metafásicos hibridados con sonda (GATA)n, f) Núcleo interfásico con sonda (GATA)n. Flechas azules indican regiones NOR en cromosomas homólogos. Flechas amarillas muestran heteromorfismos de NOR entre cromátidas hermanas. Flechas blancas indican señales intersticiales de ADNr.

14 FISH en Haliotis corrugata. a) Cromosomas mitóticos hibridados con 59 sonda ADNr 18S-5.8S-28S. b) Núcleo interfásico con sonda ADNr. c) Cromosomas metafásicos después de aplicar FISH con sonda telomérica (TTAGGG)n. d) Núcleo interfásico con sonda telomérica. e) Cromosomas metafásicos hibridados con sonda (GATA)n. f) Núcleo interfásico con sonda (GATA)n. flechas azules indican regiones NOR en cromosomas homólogos. Flechas amarillas muestran heteromorfismos de NOR entre cromátidas hermanas. Flechas blancas indican señales intersticiales de ADNr.

15 Dendrograma que muestra el patrón de agrupamiento obtenido para la 60 morfología cromosómica de Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata usando análisis UPGMA. La escala muestra el número de cromosomas de morfología similar.

16 Secuencia de imágenes de desvanecimiento fluorescente en núcleos 64 de eritrocito en tilapia, Oreochromis mossambicus. La barra de color indica la intensidad pixélica de 0 a 255.

17 Perfiles de desvanecimiento DAPI-fluorescente para distintos tipos 66 celulares. EZT, espermatozoides de tilapia. ERT, eritrocitos de tilapia. EZR, espermatozoides de abulón rojo. ERTr, eritrocitos de trucha arco iris.

18 Imagen digital DAPI-fluorescente descompuesta en los tres canales de 67 color (rojo, verde y azul) en eritrocitos de tilapia.

ix

LISTA DE FIGURAS (continuación) Figura Página

19 Descomposición de canales RGB en perfiles de desvanecimiento 68 fluorescente. EZT, espermatozoides de tilapia. EZR, espermatozoides de abulón rojo. ERT, eritrocitos de tilapia. ERTr, eritrocitos de trucha arco iris.

20 Relación de integral de desvanecimiento fluorescente (ID) con el 69 contenido genómico haploide y diploide en eritrocitos de tilapia Mozambica.

21 Estimación de la media de la integral de desvanecimiento (ID) en 71 espermatozoides de tres especies de abulones. EZR; abulón rojo. EZAZ; abulón azul. EZAM; abulón amarillo.

22 Estimación de la varianza de la integral de desvanecimiento (ID) en 72 espermatozoides de tres especies de abulones. EZR; abulón rojo. EZAZ; abulón azul. EZAM; abulón amarillo.

23 Modelo lineal entre tamaño genómico e integral de desvanecimiento. 73 Espermatozoides: EZ, de tilapia; EZR, de abulón rojo; EZAZ, de abulón azul; EZAM, de abulón amarillo. Hemocitos: HemAZ, de abulón rojo; Heme, de abulón rojo; HemAM, de abulón amarillo. Eritrocitos: ERT, de tilapia; ERTr, de trucha arco iris.

24 a) Imagen original de placa metafásica teñida con DAPI. b) Imagen 75 digital convertida en pseudocolor o en 256 niveles de brillo.

25 Procedimiento de análisis de ADN cromosómico fluorescente. a) 76 Mediciones cromosómicas. b) Imagen en pseudocolor. c) Máscara binaria para detección de borde. d) Región de ADN cromosómico de interés obtenido por multiplicación entre (b) y (c).

26 Secuencia de desvanecimiento fluorescente en cromosoma 16 de H. 77 rufescens.

27 Curva desvanecimiento fluorescente en cromosoma 16 de H. 77 rufescens.

28 Contenido medio de ADN en cromosomas de H. rufescens (n=18). 79 Las barras representan dos desviaciones estándar.

x

LISTA DE FIGURAS (continuación) Figura Página

29 Correlación entre contenido de ADN cromosómico y longitud 80 cromosómica en H. rufescens. Los números representan el par cromosómico según el cariotipo. Líneas discontinuas representan el error estándar del modelo.

30 Correlación entre contenido de ADN cromosómico y área 81 cromosómica en H. rufescens. Los números representan el par cromosómico según el cariotipo. Líneas discontinuas representan el error estándar del modelo.

31 Variación de valor-C en población Arica de A. purpuratus. El valor-C 84 fue calculado por aproximación de desvanecimiento fluorescente en núcleos de hemocitos.

32 Variación de valor-C en población Tongoy de A. purpuratus. El 85 valor-C fue calculado por aproximación de desvanecimiento fluorescente en núcleos de hemocitos.

xi

LISTA DE TABLAS Tabla Página

I Algunas Superfamilias del Orden Archaeogastropoda y su número 21 cromosómico diploide. Simbología: * en Patterson, 1969; + en Jarayabhand et al., 1998.

II Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico 46 para Haliotis rufescens (2n=36).

III Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico 49 para Haliotis fulgens (2n=36).

IV Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico 52 para Haliotis corrugata (2n=36).

V Análisis estadísticos usando pruebas de ANOVA y Tukey. Un par 61 cromosómico fue considerado igual entre dos especies, sólo si ambos brazos no muestran diferencia significativa (p<0.05). (BC) brazo corto, (BL) brazo largo, (ND) no existe diferencia significativa, (S) si existe diferencia significativa, (=) el par es igual en las tres especies, (R) el par es propio de H. rufescens, (F) el par es propio de H. fulgens, (C) el par es propio de H. corrugata.

VI Matriz de similitud cromosómica entre H. rufescens, H. fulgens y H. 62 corrugata.

VII Valor medio y desviación estándar de ID para las especies de valor-C 70 conocido.

VIII Intervalos de confianza (95%) de α , β y ϕ en ajuste de modelo lineal 74 calculado mediante análisis de Fisher.

IX Contenido de ADN en cromosomas de Haliotis rufescens y su 78 conversión a Mega pares de base (Mpb).

X Medición de tamaños genómicos en dos poblaciones de A. purpuratus 83 mediante análisis de imágenes fluorescentes (n=15 individuos).

XI Prueba ANOVA para tamaños genómicos de dos poblaciones de A. 86 purpuratus.

1

Los abulones han sido conocidos por el hombre desde hace largo tiempo. La primera mención de estos gastrópodos marinos en la literatura fue realizada en la 4ta centuria A.C. por Aristóteles en su cuarto libro, capitulo 4, sección 13, sobre el sistema digestivo:

“...... pero en la patella de campo como algunas personas suelen llamarle, u oreja de mar (haliotis), como es llamada por otros, el excremento sale por debajo de la concha, la cual es perforada. El estómago también es distinto, encontrándose detrás de la boca, y de esta manera, es el ovarium en este animal. La posición de todas estas partes puede ser observada en disecciones”

Publicaciones taxonómicas sobre la familia Haliotidae comienzan con Linnaeus (1758), quien describe las primeras siete especies con su sistema de nomenclatura binominal. Este trabajo fue continuado por Gmelin (1791), quien adhiere además otros veinte taxa. Reevé 2

(1846) describe 42 nuevos taxa y escribe en el mismo año la totalidad de la familia

Haliotidae (Geiger y Poppe, 2000).

Los abulones se distribuyen en aguas templadas y tropicales, estando ausentes en regiones cercanas a los polos. Probablemente el tipo de sustrato (hábitat rocoso) y el alimento (algas pardas), explicaría la ausencia de especies en la costa Noreste de América donde predominan condiciones arenosas. Sin embargo, no se han encontrado especies de abulones en la costa oeste de América del Sur, donde el hábitat predominante es similar al encontrado en la costa oeste de Norte América. Dicho patrón en la distribución de especies de abulones, limitada a ciertas regiones es una incógnita. Sin embargo, parte de la respuesta de cómo los abulones han predominado la costa Noroeste de América desde Alaska hasta

Baja California, México, puede ser encontrada en la barrera de aguas cálidas, entre las dos

áreas templadas cercanas al lado del ecuador. No obstante, la ocurrencia de dos especies de abulones en las islas Galápagos e isla Cocos, Costa Rica, invalidan este argumento en cierto grado, dado que las corrientes oceánicas facilitarían la dispersión a estas islas en particular (Geiger y Poppe, 2000).

El interés de estudiar las distintas especies que componen la familia Haliotidae se encuentra no tan sólo en las características particulares de radiación evolutiva, sino también en el fuerte interés comercial (Oakes y Ponte, 1996). En este sentido, actualmente la producción mundial de abulón es encabezada por Australia y Japón con producciones de alrededor de 5,000 toneladas métricas durante el año 2002. Sin embargo, sólo por concepto de acuicultura la producción mundial de abulón fue liderada en el 2002 por países asiáticos como China (4,500 ton) y Taiwán (3,000 ton). En México, durante el mismo período se alcanzó una captura alrededor de 1,000 toneladas métricas, en comparación con las 4,500 3

toneladas producidas entre 1970-1980. Por concepto de acuicultura, actualmente México produce 53 toneladas, las cuales son aportadas principalmente por abulón rojo y azul

(FISTECH, 2004).

Lo anterior hace evidente que durante las últimas tres décadas la actividad pesquera del abulón en la costa de California y Baja California haya declinado. Lo cual puede ser atribuido principalmente a un estado de sobreexplotación, la ocurrencia de eventos climatológicos y potenciado a su vez por la aparición de enfermedades en poblaciones naturales y de cultivo (Tegner et al., 1989; Leighton, 2000; Lafferty et al., 2004). En este sentido, estudios que abordan aspectos como reproducción, fisiología, nutrición y genética del abulón han sido llevados a cabo para suplir la demanda de este recurso a través de la acuicultura (Hahn, 1989; González y Scoresby, 1996; Elliott, 2000; Del Río-Portilla y

González-Avilés, 2001; Durazo-Beltrán et al., 2004).

En referencia a la aplicación de estudios genéticos de abulones en acuicultura, éstos han sido abordados desde distintas perspectivas. Algunas de ellas como mejora genética

(Powers et al., 1996), criopreservación de gametos provenientes de reproductores elegidos con valor genético (Gwo, 2000), marcadores moleculares asociados a un fenotipo particular

(QTLs) que puedan ser utilizados para asistir programas de selección (Kirby et al., 1998; Li et al., 2002; Evans et al., 2004), producción de híbridos interespecíficos (Owen et al., 1971;

Brown, 1995), producción monosexual (Fujino et al., 1990), producción de triploides (Arai et al., 1986; Fujino et al., 1987; Kudo et al., 1991; Zhang et al., 1998; Maldonado et al.,

2001), manipulación genética (Powers et al., 1995; Tsai et al., 1997) y programas de selección mediante la utilización de marcadores a nivel poblacional (Huang y Hanna, 1998;

Elliott et al., 2000; Hamm y Burton, 2000; Rothaus et al., 2003). 4

Dentro del ámbito de estudios genéticos aplicados a la acuicultura, han despertado gran atención aquellos relacionados con las manipulaciones citogenéticas de organismos marinos (Greg, 2001; Beaumont y Hoare, 2003). En abulones se han aplicado exitosamente procedimientos de inducción a ginogénesis mediante la incorporación citoplasmática de núcleos espermáticos inactivados por irradiación con luz ultravioleta (Fujino et al., 1990;

Li et al., 2000). En contraste, procedimientos de androgénesis en moluscos se han reportados como poco exitosos (Wada, 2000), siendo hasta el momento su aplicación en organismos marinos restringida sola a peces (Pandian y Kirankumar, 2003; Tariq et al.,

2004).

Probablemente una de las aplicaciones citogenéticas en acuicultura que ha sido reportada más ampliamente es la referida a manipulaciones de ploidías o cromosómicas

(Beaumont y Fairbrother, 1991; Greg, 2001; Beaumont y Hoare, 2003). En este sentido, organismos triploides y tetraploides han sido utilizados principalmente en el cultivo de tilapias (Byamungu et al., 2001), ciprínidos (Basavaraju et al., 2002) y salmónidos

(Johnson et al., 2004). En referencia a moluscos, Stanley et al. (1981) fueron los primeros en reportar la producción de triploides en la ostra Crassostrea virginica mediante la incubación de los embriones en citocalasina-B. Desde entonces, han sido numerosas las metodologías desarrolladas para obtener triploides, entre las cuales se encuentran choques de temperatura, presión hidrostática, agentes químicos como la cafeína, citocalasina-B y 6-

Dimetilaminopurina (6-DMAP) (Beaumont y Fairbrother, 1991; von Brand-Skopnik y

Ibarra-Humphries, 2002). El interés en desarrollar biotecnologías de ploidía radica en que los organismos inducidos presentan esterilidad parcial o total, lo cual resulta en la canalización alterna de la energía que sería utilizada para reproducción hacia crecimiento 5

somático (Nell, 2002). En abulones, el uso de organismos triploides en granjas de cultivo representa una alternativa que permitiría acortar los tiempos requeridos por los abulones para llegar a una talla comercial (~5 años). Los principales estudios de inducción a poliploidía fueron desarrollados principalmente en abulones japoneses (Arai et al., 1986;

Fujino et al., 1987; Kudo et al., 1991; Zhang et al., 1998) y australianos (Liu et al., 2004a;

Liu et al., 2004b; Liu et al., 2004c).

Paralelamente a estudios de manipulaciones cromosómicas, han sido llevados a cabo la descripción cariológica de 15 especies de abulones (Gallardo-Escarate et al., 2004), siendo actualmente descritas para la familia Haliotidae 65 especies (Lindberg, 1992; Geiger y

Poppe, 2000). Según Geiger y Groves (1999) la mayoría de los estudios cromosómicos en abulones han sido realizados en las regiones Mediterránea, Indo-Pacífico y Pacífico Norte, revelando que el número cromosómico en abulones varía entre los 2n=28~36. En referencia a haliótidos nativos del Pacífico Noroeste o costa de California sólo han sido descritos citogenéticamente H. cracherodii (Minkler, 1977) y H. rufescens (Gallardo-Escarate et al.,

2004). Sin embargo, actualmente es considerado que en las costas de California habitan siete especies; H. k. kamtschatkana, H. kamtschatkana assimilis, H. corrugata, H. cracherodii, H. fulgens, H. rufescens, H. sorenseni y H. walallensis con distribución desde

Alaska hasta la Baja California central en México (Cox, 1962). Adicionalmente, análisis taxonómicos recientes ha unido a dos de estas como subespecies de H. kamtschatkana

(Leighton, 2000).

Actualmente, estudios citogenéticos en abulones se han limitado a la descripción cariológica, siendo escasos los estudios de caracterización cromosómica. Sin embargo, avances recientes en técnicas de biología molecular han permitido la caracterización y 6

localización de secuencias o regiones cromosómicas en otras especies de moluscos, principalmente bivalvos. Adicionalmente, varios tipos de secuencias han resultado muy

útiles como sondas en estudios de caracterización de la cromatina mediante hibridación in situ fluorescente (FISH). Una de ellas es la secuencia repetida (GATA)n que permite detectar la presencia de este microsatélite, y por tanto la presencia de regiones A-T en el genoma de los organismos. Esta secuencia se ha descrito en un amplio rango de eucariontes y en algunos casos se ha observado una asociación con el sexo (Jones y Singh, 1985). Hasta el momento, en moluscos sólo se ha estudiado en F. lignaria (Vitturi et al., 2000a), M. neritoides (Colomba et al., 2002) y en el caracol Cerethium vulgatum (Vitturi et al., 2002).

Por otro lado, la secuencia telomérica que se encuentra en los cromosomas de todos los vertebrados (TTAGGG)n, también se ha analizado en otros organismos mediante FISH. En invertebrados su distribución es más heterogénea. Así, se encuentra en los cromosomas de algunas especies como el gastrópodo M. neritoides (Colomba et al., 2002) pero ausente en otras como Oxynoe olivacea (Vitturi et al., 2000b). Su estudio resulta por tanto de gran interés dentro del análisis filogenético, ya que se pueden considerar como específicas de grupos (Blackburn, 2001).

Conjuntamente con la aplicación de técnicas moleculares en citogenética, en los últimos años ha recibido gran interés la integración de procedimientos de análisis de imágenes

(Netten, 1997). Esto ha permitido obtener mayor información en imágenes fluorescentes adquiridas tanto desde microscopía confocal, como de microscopía convencional de epifluorescencia (Schwarzacher y Heslop-Harrison, 2000). En referencia a análisis de imágenes cromosómicas, actualmente están disponible numerosos programas de cómputo, sin embargo, muchos de ellos están diseñados específicamente para preparaciones 7

humanas, otros vertebrados y plantas. Dichos programas se han desarrollado con diversas aplicaciones citogenéticas desde búsqueda de placas metafásicas sobre una preparación, generación automática de cariotipos, medición cuantitativa de señal de fluorescencia y posición, patrones de condensación cromosómica, alineamiento cromosómico, entre otras.

(Schrock et al., 1996; Kato y Fukui, 1998; Houtsmuller et al., 2000; Gray et al., 2002;

Weierich et al., 2003; Langer et al., 2004).

En referencia a aplicaciones de análisis de imágenes en invertebrados marinos, han sido escasos los estudios llevados a cabo en comparación con los existentes para vertebrados y plantas. Probablemente la principal limitación de aplicación de procedimientos de análisis de imágenes en citogenética de invertebrados y específicamente de moluscos, sea que las preparaciones cromosómicas provienen desde larvas y no desde cultivos celulares como en el caso de vertebrados y plantas. Esto conlleva a que las variaciones cromosómicas morfológicas debidas al grado de condensación del ADN pueden originar errores en la identificación adecuada del cariotipo de una especie o individuo. En este sentido, en la ostra del Pacífico Crassostrea virginica se ha descrito que la variación individual de longitudes cromosómicas debida a factores de condensación es de alrededor de 5% (Zhang et al.,

1999a).

El presente trabajo doctoral plantea un estudio citogenético de tres especies de abulones presentes en Baja California. Asimismo, se propone el desarrollo y utilización de análisis de imágenes como procedimientos alternativos a la cariología clásica en moluscos. Lo anterior permitirá reducir el error ocasionado por las mediciones manuales, al permitir realizar aproximaciones más cuantitativas y detalladas de la naturaleza de los cromosomas.

8

Generales

1. Aportar nueva información citogenética de tres especies de abulones de Baja California.

2. Desarrollar procedimientos de análisis de imágenes que permitan caracterizar

citogenéticamente a Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata.

Específicos

1. Establecer protocolos citogenéticos para la obtención de cariotipos de H. rufescens, H.

fulgens y H. corrugata a partir de larvas.

2. Aplicar procedimientos de FISH para la localización cromosómica de genes.

3. Establecer relaciones citogenéticas en las tres especies de abulones estudiadas.

4. Desarrollar y aplicar un nuevo método para estimar tamaño genómico mediante análisis

de imágenes fluorescentes.

5. Validar la utilización de análisis de imágenes en el estudio citogenético. 9

III. 1. La Importancia de las abulones en la acuicultura

Los abulones son gastrópodos marinos herbívoros que integran un solo género (Haliotis), siendo uno de los gastrópodos más primitivos evolutivamente. Su hábitat natural son sustratos rocosos (Hahn, 1989). Existen aproximadamente entre 65 y 55 especies de abulón en todo el mundo, los cuales se distribuyen en ambos hemisferios (Lindberg, 1992; Geiger y Poppe, 2000). Las especies de abulón más grandes se localizan en aguas templadas y las más pequeñas en aguas tropicales. La mayoría de las especies de abulón se encuentran distribuidas en el Pacífico sur, el Pacífico central y en parte del Océano Indico. El abulón en su ambiente natural se encuentra en las costas de la mayoría de las aguas templadas y tropicales con excepción de Sudamérica y la costa Noroeste de Norteamérica (Geiger y

Poppe, 2000). 10

El abulón tiene una gran demanda como alimento en el mercado mundial

(principalmente el asiático), se consume en diferentes presentaciones, y cada una de estas varía en precio que puede fluctuar desde los 32 dólares americanos por kilogramo de producto entero congelado, hasta los 1,200 dólares americanos por kilogramo de producto seco. Al tomarse en cuenta los costos que implica el proceso, manejo y mercadeo para los productos procesados, así como los altos precios que se pagan por las diferentes presentaciones del abulón, la ganancia neta tiende a reflejar un precio promedio por organismo similar al obtenido por el producto entero congelado (Gordon y Cook, 2001).

La pesquería comercial del abulón en las costas de Norteamérica empezó hace 150 años y los primeros cultivos comenzaron en la década de los 60s (McBride, 1998). En México, el cultivo de abulón es una actividad que se ha intensificado como resultado de la disminución de las capturas de las diferentes especies que habitan la zona Noroeste del país

(Tegner et al., 1989; Gordon y Cook, 2001). Las especies que se capturan en esta zona son principalmente el abulón azul (Haliotis fulgens), el abulón rojo (H. rufescens), el abulón amarillo (H. corrugata) y el abulón negro (H. chracherodi) (Celis-Ceseña, 1996). El abulón en diversos países del mundo se ha cultivado exitosamente desde la etapa de larva hasta lograr organismos adultos en condiciones controladas (Hahn, 1989). Sin embargo, existen etapas críticas en el cultivo de abulón, como lo es la inducción al asentamiento de las larvas, la metamorfosis y la nutrición de postlarvas (Kawamura et al., 1998). Actualmente la producción mundial por concepto de acuicultura de abulón es liderada por países asiáticos como China y Taiwán con producciones para el año 2002 de 4,500 y 3,000 toneladas métricas respectivamente. La pesquería comercial durante el año 2002 fue encabezada por Australia y Japón con producciones de alrededor de 5,000 toneladas 11

métricas. En México, durante el mismo período se alcanzó una producción de alrededor de

1,000 toneladas métricas, en comparación con las 4,500 toneladas producidas entre 1970-

1980 (FISTECH, 2004). Por concepto de acuicultura, en México sólo son cultivados el abulón rojo y el abulón azul en granjas de producción comercial (McBride, 1998), siendo la producción para el año 2002 de 53 toneladas (FISTECH, 2004).

III. 2. Introducción a la genética de abulones

Estudios genéticos llevados a cabo en la familia Haliotidae pueden ser sintetizados mediante el análisis de dos aproximaciones. La primera en referencia a la distribución biogeográfica y evolutiva de los representantes actuales de haliótidos y la segunda en referencia a estudios de genética poblacional conducentes a la mantención de la variabilidad genética en poblaciones naturales y de cultivo. Estudios genéticos conducentes a determinar las relaciones evolutivas y biogeográficas de abulones, radican principalmente en que la taxonomía y sistemática de la familia permanece hoy en día inconclusa. En este sentido, el número de especies varía ampliamente de un autor a otro, por ejemplo Cox

(1962) describe 130 especies mientras que Lindberg (1992) y Geiger y Poppe (2000) reportan 65 y 55 especies de abulones respectivamente. Probablemente, la confusión en el número de especies sea debida a que dichos estudios fueron basados principalmente en caracteres fenotípicos como morfología de la concha, la cual puede variar considerablemente dentro de una especie (Talmadge, 1963). Adicionalmente, pocos estudios cladísticos en abulones han sido desarrollados integrando evidencias como caracteres morfológicos, ecología y datos moleculares. Estudios sobre isoezimas usando 12

electroforesis de proteínas han proporcionado las primeras evidencias sobre las relaciones filogenéticas en varias especies de abulones (Brown y Murray, 1992; Brown, 1993). Sin embargo, ellos no han permitido comparar especies relacionadas distantemente y en ocasiones los árboles filogenéticos inferidos desde polimorfismos isoenzimáticos no concuerdan con los árboles basados en análisis de ADN nuclear o mitocondrial (Karl y

Avise, 1992). Las primeras evidencias de relaciones filogenéticas entre especies de abulones de California fueron obtenidas mediante comparación de pigmentos sanguíneos

(hemocianinas) por Meyer (1967). El grado de interacción entre antígeno y anticuerpo mostró que H. rufescens, H. sorenseni, H. kamtschatkana assimilis estarían cercanamente relacionada, mientras que H. corrugata, H. fulgens, H. walallensis aparecen moderadamente más distante. Adicionalmente, el análisis sugirió que H. cracherodii sería una especie con una mayor diferenciación genética (Fig. 1).

Figura 1. Relaciones filogenéticas entre especies de abulones de California sugerida mediante comparación inmunocitoquímica de hemocianinas (Meyer, 1967). Diagrama obtenido de Leighton (2000). 13

Resultados obtenidos a través de herramientas moleculares de ADN, han demostrado ser en general congruentes con las relaciones inmunocitoquímicas encontradas por Meyer

(1967). Sin embargo, H. cracherodii ha sido reportado más relacionado a H. corrugata y ambos a su vez con los abulones japoneses H. gigantea y H. discus hannai. Adicionalmente este estudio dejó a una distancia genética mayor a H. fulgens en comparación con las otras especies de abulones Californianos (Fig. 2).

Figura 2. Relaciones filogenéticas de abulones californianos y japoneses inferida a partir de secuencias de ADN del gen lisina en espermatozoides. Diagrama tomado de Lee y Vacquier (1995).

Estudios en poblaciones naturales de abulones han descrito la presencia de híbridos interespecíficos en seis especies de abulones en la costa de California (Owen et al., 1971).

Adicionalmente, Leighton y Lewis (1982) llevaron a cabo una serie de cruzas 14

experimentales con cuatro especies de abulones. Cruzas entre H. rufescens, H. corrugata,

H. fulgens y H. sorenseni, demostraron que es posible obtener entre un 30-60% de desarrollo embrionario en fertilizaciones efectuadas dentro de los primeros 30 minutos posdesove. Asimismo, entre hembras de H. rufescens y machos de H. fulgens son capaces de producir F1 y F2 fértiles. La evidencia observada en torno a la producción de híbridos interespecíficos demuestra que las especies de abulones en California poseen una alta afinidad filogenética. La concepción genético-poblacional de especie se entiende como un sistema biológico discreto e integrado de organismos reproductivamente aislados de otros sistemas de características similares (Reig, 1983). Desde un punto de vista genético, los reordenamientos cromosómicos, entre otros factores, constituyen importantes mecanismos involucrados en el aislamiento reproductivo poscigótico (Fontdevila, 1987). En este sentido debido a la escasa información cariológica disponible, actualmente no existen estudios filogenéticos en abulones que integren este tipo de análisis y que permitan a su vez generar estudios comparativos.

En referencia a estudios de genética poblacional conducentes al mantenimiento de la variabilidad genética de cultivo, éstos han sido exitosamente aplicados en programas de selección (Beaumont y Hoare, 2003). Sin embargo, la aplicación de esta tecnología para mejoramiento genético en acuicultura ha demostrado ser demasiado lenta, por lo cual son pocos los estudios en abulones en esta área (Jonasson et al., 1997). Sin embargo, algunos estudios han sugerido que el crecimiento en abulones de cultivo está condicionado entre otros agentes por factores genéticos, con lo cual programas de selección se presentan como una alternativa para mejorar este carácter (Hara, 1990). Para entender la relación entre la variación genética y un carácter de valor económico, es necesario establecer y evaluar 15

numerosas líneas familiares, por lo cual para acceder a esta información es necesario la mantención de un gran número de organismos, lo cual dificulta aún más la aplicabilidad del procedimiento de selección, ya sea en familia o en masa (Elliott, 2000). Alternativamente, los programas de selección pueden ser sustentados mediante el uso de marcadores moleculares que permitan asistir la selección de organismos reproductores. En este contexto, investigaciones conducentes a establecer regiones microsatélites en abulones

(Kirby et al., 1998; Li et al., 2002) se presentan como una alternativa dentro de la mejora genética en abulones de cultivo.

III.3. El valor de estudios citogenéticos

A través del análisis citogenético, es posible describir el número cromosómico de una célula u organismo. El establecimiento de la identidad cromosómica es el primer paso para los estudios de mapeo genómico. También pueden ser utilizados en análisis taxonómicos, dado que cada especie posee un cariotipo distintivo, en términos de número y morfología cromosómica. Asimismo, mediante el análisis citogenético es posible reconocer y caracterizar los progenitores de un híbrido, además identificar un organismo poliploide

(Gersen y Keagle, 1999).

El estudio del número cromosómico, estructura, función y comportamiento con relación a la herencia genética, es una parte integral en la citogenética. Los cromosomas son reconocidos como portadores de ADN en eucariontes, dado que proveen la base estructural para la transmisión de la información genética. Las características morfológicas de los cromosomas han sido estudiadas con microscopía de alta resolución aunado a tinciones 16

específicas de ADN. De esta forma, características morfológicas comunes como constricción primaria (centrómero) en diferentes posiciones a lo largo del cromosoma ha permitido la identificación y clasificación cromosómica (Levan et al., 1964). Sin embargo, dado que las características centrales de estructura y función de los cromosomas están definidas a nivel del ADN, el análisis citogenético ha integrado información sobre la estructura molecular, con lo cual se ha descubierto la forma en que los genes están organizados dentro de los cromosomas, definiendo así su funcionalidad (Appels et al.,

1998; Allen et al., 1999).

El estudio de los cromosomas ha tenido un mayor impacto en estudios de mapeo genómico en distintas especies tanto animales como vegetales. La identificación de regiones específicas de ADN mediante técnicas moleculares permite observar microscópicamente la localización de estas regiones en los cromosomas (Schwarzacher y

Heslop-Harrison, 2000). Adicionalmente, el entendimiento de la estructura cromosómica provee una medida de análisis de los cambios secundarios que pueden ocurrir durante procedimientos de ingeniería genética y manipulación cromosómica (Appels et al., 1998).

1. 3. 1. Citogenética molecular

El hallazgo de técnicas para identificar genomas y cromosomas en preparaciones cromosómicas ha representado un gran progreso en la citogenética vegetal y animal, ya que disponer de marcadores cromosómicos permite estudiar la organización del genoma y la arquitectura nuclear. Las técnicas de bandeos permiten revelar zonas de ADN altamente repetido (heterocromatina constitutiva), pero no diferencian la composición molecular del

ADN. En ausencia de bandas marcadoras no es posible identificar cromosomas con 17

morfología similar. Además en especies alógamas suele existir polimorfismo para número y posición de zonas heterocromáticas, lo que dificulta la caracterización cromosómica y la detección de regiones con presencia de introgresión. Un notable ejemplo de polimorfismo en bandas heterocromáticas lo constituye el estudio de líneas y razas nativas de maíz

(Poggio et al., 2000). Los marcadores moleculares combinados con la citogenética han resultado ser de gran utilidad para entender la organización cromosómica y la distribución física de las secuencias repetidas (Gersen y Keagle, 1999). El gran potencial de las técnicas de hibridación in situ resulta de combinar información acerca de la morfología nuclear o cromosómica con la información molecular de la estructura de las secuencias. Aunque estas técnicas se conocen desde los 60s utilizando marcación radioactiva, en organismos marinos se comenzó a aplicar a fines de la década de los 80s debido a la gran disponibilidad de secuencias clonadas para ser utilizadas como sondas. Además, la posibilidad de utilizar

ADN genómico total como sonda (GISH) y modernos sistemas de marcación y detección no radioactivos han impulsado el uso de esta técnica en forma rutinaria, complementando los resultados obtenidos por metodologías más clásicas. Mediante la aplicación de estas técnicas se obtienen datos que podrán ser utilizados en estudios de sistemática, filogenia, biodiversidad, evolución, mejoramiento y biotecnología (Sessions, 1996).

La hibridación in situ (ISH) de sondas de ácidos nucleicos en preparaciones cromosómicas involucra cuatro pasos fundamentales que son: 1) obtener una sonda marcando secuencias de ADN, 2) reacción de hibridación entre la sonda y el ADN blanco

(cromosomas), ambos desnaturalizados previamente. Las secuencias complementarias de la sonda y del ADN de los cromosomas hibridarán, en relación a su homología, 3) remoción de la sonda que no se unió o que se hibridó en forma inespecífica, 4) Detección de la 18

hibridación y visualización de la hibridación a través de fluorocromos (Wilkinson, 1998;

Schwarzacher y Heslop-Harrison, 2000).

Una de las aplicaciones de la técnica de “fluorescent in situ hybridization” (FISH) es la obtención de un mapa físico, funcional y estructural del genoma utilizando secuencias de distinto origen como sondas. El análisis de la organización física de secuencias repetidas, genes, secuencias clonadas, rDNA, transgenes, retrovirus, etc., permite identificar cromosomas, analizar la arquitectura nuclear del genoma y verificar hipótesis acerca de la relación entre posición y función de determinadas secuencias. Otras aplicaciones de esta técnica consisten en determinar la distribución y posición de material cromosómico extraespecífico, la existencia de apareamiento y recombinación intergenómica, la existencia de segregación preferencial (responsables de herencia no mendeliana de algunos tipos cromosómicos), la presencia y tipo de rearreglos cromosómicos y analizar la segregación de determinados cromosomas en estudios evolutivos y programas de mejoramiento genético. Estos son relevantes para comprender la relación entre estos fenómenos y variaciones en la expresión génica (Wilkinson, 1998).

La hibridación in situ utilizando ADN genómico total como sonda (GISH o Genomic

ISH) revela homologías específicas del ADN, principalmente en lo que respecta a secuencias repetidas y ha permitido realizar aportes relevantes en estudios evolutivos, sistemáticos y en mejoramiento tanto animal como vegetal. Esta técnica ha facilitado, por ejemplo, el reconocimiento de especies parentales en híbridos y poliploides, analizar afinidades genómicas interespecíficas, detectar reestructuraciones cromosómicas, corroborar que en el núcleo existen dominios espaciales de genomas o secuencias particulares, detectar la existencia de apareamiento intergenómico y recombinación 19

(Marasek et al., 2004). Además, permite analizar la organización nuclear y desarrollo cromosómico en especies e híbridos; detectar la presencia de cromosomas o segmentos cromosómicos introgresantes en planes de mejoramiento; analizar afinidades genómicas interespecíficas en cuanto a variación en secuencias de ADN repetitivo (Pita et al., 2003).

1. 3. 2. Citogenética de organismos acuáticos

Probablemente la mayor parte de los estudios citogenéticos en organismos acuáticos están basados principalmente en peces y en moluscos. En referencia a peces, diversos estudios citogenéticos han sido llevados a cabo principalmente en salmónidos, ciprínidos y cíclidos

(Mandrioli et al., 2000; Inafuku et al., 2002; Porto-Foresti et al., 2002; Martins et al.,

2004). Dentro de estos estudios, un especial interés ha despertado el estudio de la distribución genómica de regiones de ADN altamente repetitivas, ADN satélite, regiones teloméricas, ADNr 45S y 5S, y elementos nucleótidos intercalados (SINEs y LINEs)

(Martins et al., 2004). Recientemente, estudios citogenéticos relacionados con los mecanismos de determinación sexual en peces han generado un especial interés debido a la posibilidad de producir líneas monosexuales en el cultivo de algunas especies (Devlin y

Nagahama, 2002). Sin embargo, en peces es posible encontrar un amplio espectro de mecanismos genéticos de determinación sexual, con lo cual los estudios de mapeo cromosómico permanecen aún inconclusos (Nanda et al., 2003).

1. 3. 3. Citogenética de moluscos

Antes de la década de los 70s, estudios de citogenética en moluscos fueron realizados principalmente con base en el número cromosómico de las especies (Patterson, 1969). 20

Posteriormente, técnicas basadas en tinciones cromosómicas, medidas de longitud relativa, proporción de brazos e índices centroméricos han proporcionado información sobre la morfología de los cromosomas, permitiendo la comparación entre cariotipos a nivel inter e intraespecífico (Nakamura, 1986; Thiriot-Quiévreux, 1990; Insua y Thiriot-Quiévreux,

1991; Thiriot-Quiévreux, 1994; Ladrón de Guevara et al., 1996; Jarayabhand et al., 1998;

Park et al., 2000).

Entre los moluscos, los ostrélidos han sido los más extensamente estudiados en cuanto a aspectos genéticos, esto último, debido probablemente a su importancia comercial. De las veintidós especies de la familia Ostrelidae que han sido estudiadas citogenéticamente todas poseen un número diploide de 2n=20, excepto por una especie, Dendrostrea folium, la cual posee un complemento cromosómico de 2n=18 (Ieyama y Inaba, 1974). Esta estabilidad en el número de los cromosomas no refleja necesariamente una igualdad morfológica, ya que existen variaciones tanto en forma como en tamaño y, por lo tanto, en el contenido de

ADN. Estos polimorfismos pueden ser explicados por procesos de naturaleza

Robertsoniana, los cuales pueden incluir fisión cromosómica (paracéntrica o pericéntrica) o fusión de brazos cromosómicos. El proceso de fisión ocasionaría un aumento en el número cromosómico, mientras que la fusión de brazos o segmentos cromosómicos probablemente ocasionaría una disminución en el número de cromosomas de la especie. En ambos casos la morfología de los cromosomas cambia por aumento o disminución de segmentos (Gersen y

Keagle, 1999). Estudios de polimorfismos cromosómicos en moluscos han sido llevados a cabo en el gastrópodo Nucella lapillus usando técnicas de tinción de plata y FISH para la región organizadora de nucleolos (Pascoe y Dixon, 1994; Pascoe et al., 1996; Pascoe et al.,

2004). 21

Tabla I. Algunas Superfamilias del Orden Archaeogastropoda y su número cromosómico diploide. Simbología: * en Patterson, 1969; + en Jarayabhand et al., 1998. ESPECIE 2N REFERENCIA Superfamilia Pleurotomariacea Familia Haliotidae Haliotis tuberculata 28 Colombera & Tagliaferri, 1983 + Haliotis lamellosa 28 Colombera & Tagliaferri, 1983 + Haliotis diversicolor 32 Nakamura, 1985 + Haliotis exigua 32 Aria et al., 1988 + Haliotis planata 32 Aria et al., 1988 + Haliotis varia 32 Nakamura, 1986 + Haliotis asinina 32 Jarayabhand et al., 1998 Haliotis ovina 32 Jarayabhand et al., 1998 Haliotis japonica 34 Nishikawa, 1962 * Haliotis aquatilis 34 Nishikawa, 1962 + Haliotis cracherodii 36 Minkler, 1977 + Haliotis discus discus 36 Aria et al., 1982 + Haliotis discus hannai 36 Aria et al., 1982 + Haliotis madaka 36 Nakamura, 1986 + Haliotis rufescens 36 Gallardo-Escarate et al., 2004 Haliotis fulgens 36 Presente estudio Haliotis corrugata 36 Presente estudio Superfamilia Fissurellacea Familia Fissurellidae Clypina picta 34 Nishikawa, 1962 * Macrochisma sinensis 32 Nishikawa, 1962 * Macrochisma dilatata 32 Nishikawa, 1962 * Fissurella latimarginata 32 Amar, 2003 Fissurella costata 32 Amar, 2003 Fissurella maxima 32 Amar, 2003 Superfamilia Patellacea Familia Acmaeidae Patelloida saccharina l. 18 Nishikawa, 1962 * Patelloida pygmaea 18 Nishikawa, 1962 * Patelloida lampaniccla 18 Nishikawa, 1962 * Notacmea schrenckii 18 Nishikawa, 1962 * Notacmea conccina 18 Nishikawa, 1962 * Notacmea fuscoviridis 18 Nishikawa, 1962 * Familia Patellidae Cellana toreuma 18 Nishikawa, 1962 * Cellana eucosmia 18 Nishikawa, 1962 * Cellana nigroilneata 18 Nishikawa, 1962 * Patella vulgata 18 Vitturi et al., 1982 Superfamilia Trochacea Familia Trochidae Cantharidus callichroa 36 Nishikawa, 1962 * Gibbula richardi 36 Vitturi et al., 1982 Thalotia japonica 36 Nishikawa, 1962 * Monodonta labio 36 Nishikawa, 1962 * Monodonta neritoides 36 Nishikawa, 1962 * Tegula lischke 36 Nishikawa, 1962 * Tegula nigerrima 36 Nishikawa, 1962 * Tegula pleifferi c. 36 Nishikawa, 1962 * Tegula toreuma 36 Nishikawa, 1962 * Stomatella lyrata 42 Nishikawa, 1962 * Familia Turbinidae Turbo cornutus 36 Nishikawa, 1962 * Lunella coronata c. 36 Nishikawa, 1962 * Astralium haematragum 36 Nishikawa, 1962 * Superfamilia Neritacea Familia Neritidae Puperita japonica 22 Nishikawa, 1962 * Clithon retropictus 24 Patterson, 1967a * Septaria sp. 24 Natarajan (pers. com.) * Dostia violacea 28 Patterson, 1967a * Familia Helicinidae Paleohelicina sp. 36 Burch, 1967a * Pluropoma sp. 36 Burch, 1967a * Pluropoma sp. 36 Burch, 1967a * 22

En el Orden Archaeogastropoda al cual pertenece a la familia Haliotidae existen datos cariotípicos para 5 Superfamilias, 8 Familias y 53 especies (Tabla I). El número diploide más pequeño y conservado corresponde a especies de Patellacea, todas con 2n=18. En las otras Superfamilias, el número diploide varía entre 22 y 42 (Patterson, 1969; Vitturi et al.,

1982; Jarayabhand et al., 1998; Amar, 2003; Gallardo-Escarate et al., 2004). Para el caso de los abulones, la mayoría de los estudios cromosómicos han sido realizados en las regiones del Indo-Pacífico (Geiger y Groves, 1999). Sin embargo, el registro cariológico proveniente de quince especies de abulones, revela que la familia Haliotidae posee un número cromosómico que varia entre los 2n=28~36.

1. 3. 4. Implicaciones de tamaño genómico

Dentro del análisis citogenético, recientemente han recibido una gran atención las relaciones evolutivas implicadas en el contenido de ADN nuclear en plantas y animales.

Las primeras mediciones detalladas del contenido de ADN nuclear fueron realizadas en la década de los 40s, varios años antes de que Watson y Crick propusieran la estructura molecular del ADN. En los años siguientes Hewson Swift desarrolló el concepto de “valor-

C” en referencia a la fase haploide de ADN en plantas. Posteriormente Mirsky y Ris

(1951), llevaron a cabo el primer estudio sistemático de tamaño genómico en animales, incluyendo representantes de todas las cinco superclases de vertebrados así como también de algunos invertebrados. A partir de estos resultados preliminares se hizo evidente que el contenido de ADN varía enormemente entre las especies y que esta variación no guarda relación con la noción intuitiva de la complejidad del organismo. Posteriormente, esta observación fue reafirmada en los años siguientes a medida que aumentaron los estudios 23

sobre tamaño genómico, denominando así a esta característica de los organismos como la

“Paradoja del valor-C” (Thomas, 1971). Pocos años después junto con el descubrimiento del ADN no-codificante la paradoja fue resuelta, sin embargo, numerosos cuestionamientos permanecen hasta hoy en día inconclusos, llevando a denominar este tipo de estudios como el “enigma del valor-C” (Gregory, 2001b). En este sentido, gran interés ha despertado los mecanismos por los cuales el ADN no-codificante se distribuye o se pierde a través del genoma. Asimismo, los procesos por los cuales existe una mantención diferencial o supresión entre las especies, además de las implicanciones citológicas y fisiológicas del tamaño genómico (Vinogradov, 1995).

El tamaño genómico en eucariontes varía más de 200,000 veces incluyendo a los protistas. En animales, el rango es aproximadamente de 2,500 veces mientras que en los vertebrados son alrededor de 350 veces (Gregory, 2001a). Actualmente, han sido descritos los tamaños genómicos de aproximadamente 3000 animales (Gregory, 2001a) y cerca de

4000 plantas (Bennett y Leitch, 2001), así como una variedad de hongos, protistas y bacterias.

El conocimiento del tamaño genómico de una especie no sólo es relevante en términos generales de cuestionamientos biológicos, sino también puede ser útil en la clasificación de organismos conjuntamente con la información cariológica de una especie. Probablemente hoy en día en el clima de la biología molecular, el aspecto más importante del tamaño genómico sea que éste es un factor importante para el desarrollo de futuros proyectos genómicos de secuenciación, así como para estudios de estructura genómica y evolución

(Gregory, 2002). 24

La relevancia de la información obtenida a través del estudio de tamaño genómico ha ocasionado una intensificación en el desarrollo de metodologías capaces de estimar de manera más precisa la cantidad de ADN nuclear, con lo cual, diversos métodos se han utilizado para cuantificar ADN nuclear (Hardie et al., 2002). Algunas de las primeras metodologías de estimación de tamaño genómico estuvieron basadas en técnicas de extracción de ADN genómico. Sin embargo, esta técnica fue reportada como imprecisa debido a que era necesario conocer la concertación celular desde la cual se había realizado el proceso de extracción del ADN (Hardie et al., 2002). Posteriormente, estas técnicas de extracción fueron reemplazadas por metodologías densitométricas, las cuales están basadas en la cuantificación de la coloración de muestras sometidas a reacción de Feulgen.

Brevemente, las técnicas densitométricas parten de la premisa que la intensidad de coloración es directamente proporcional con la cantidad de ADN presente. La cantidad de tinción, es determinada mediante la cantidad de luz que es absorbida (densidad), sin embargo, la cuantificación de densidad no es posible realizarse directamente, con lo cual debe ser estimada indirectamente a través de la transmitancia. La transmitancia de una muestra debe ser calculada mediante la diferencia entre la luz incidente que pasa a través de un objeto (por ejemplo un núcleo) y la luz total transmitida (Hardie et al., 2002). A pesar que los métodos densitométricos son actualmente muy utilizados para estimar tamaño genómico(Gregory, 2003), debido a que han integrado algunos procedimientos de análisis de imágenes, la principal desventaja es que la luz al pasar por una muestra será afectada por los fenómenos propios de la luz como difracción, reflexión y refracción, con lo cual la medición precisa de la luz transmitida total podría afectar la cuantificación de la absorbancia o densidad. Como una alternativa a las tinciones densitométricas, es posible 25

cuantificar la intensidad de fluorescencia mediante el uso de tinciones específicas para

ADN. En este sentido, la fluorometría se ha desarrollado tanto para mediciones estáticas o cuantificación directa en un solo plano o en mediciones dinámicas como en el caso de la citometría de flujo. En el caso de mediciones estáticas, se han desarrollados microscopios especiales capaces medir directamente la fluorescencia desde un frotis celular, con lo cual ha sido posible determinar niveles de ploidía tanto en espermatozoides como en organismos poliploides (Uchimura et al., 1989; Ishibashi et al., 2003). En referencia a la citometría de flujo, probablemente es la técnica con mayor aceptación y difusión en cuanto a medición de tamaño genómico (Dolezel et al., 2004). Desde su desarrollo a finales de los 70s para detectar contenidos anómalos de ADN en células cancerígenas, la citometría de flujo se ha vuelto esencial en la investigación del tamaño genómico de animales y plantas (Tiersch et al., 1989; Rodriguez-Juiz et al., 1996). Brevemente, este método consiste en tratar una muestra de células en suspensión con fluorocromos ADN-específicos. La medición de la fluorescencia se realiza mediante la incidencia de un haz de luz láser sobre un flujo de células teñidas con el fluorocromo (Martínez et al., 1990). Esta técnica ha sido descrita como rápida y precisa (Haynes, 1988). Sin embargo, presenta algunas limitaciones como la necesidad de células en suspensión, un gran número de células por análisis y evidentemente un mayor costo de equipamiento.

1. 3. 5. Análisis de imágenes como una herramienta en citogenética

El mayor desarrollo de tecnologías de análisis de imágenes ha estado asociado sin duda a estudios de citogenética humana (Schrock et al., 1996; Trask, 2002). Asimismo, las aplicaciones citogenéticas moleculares han aumentado considerablemente mediante el uso 26

de nuevas tecnologías de análisis de imágenes. Modernos dispositivos de captura de imágenes han permitido la visualización de señales de fluorescencia indetectables para el ojo humano. De esta forma, es posible obtener información cuantitativa y, conjuntamente con análisis matemáticos, procesar una mayor cantidad de información (Young, 1996). Sin embargo, la mayoría de los estudios citogenéticos en invertebrados disponibles hasta ahora, establecen las diferencias cromosómicas entre especies a partir del análisis cariológico clásico. Los cromosomas son clasificados cualitativamente en categorías (metacéntrico, submetacéntrico, subtelocéntrico y telocéntrico) con base en la relación de la longitud entre el brazo largo y brazo corto de cada par cromosómico (Levan et al., 1964). Este método separa la variación continua de la posición del centrómero en clases discretas y no considera el tamaño absoluto de cada cromosoma. Este procedimiento considera diferentes a pares cromosómicos similares que caen en distintas clases cualitativas o considera iguales a pares que, siendo distintos caen dentro de la misma categoría. Sin embargo, variaciones morfológicas debidas al grado de condensación del ADN en los cromosomas pueden originar errores en la identificación adecuada del cariotipo de una especie o individuo

(Appels et al., 1998). Lo anterior ha hecho necesario la búsqueda de modificaciones a la metodología clásica propuesta por Levan et al. (1964) y de nuevos procedimiento de identificación y clasificación cromosómica. En este sentido los métodos de biología molecular aplicados en citogenética, conjuntamente con la aplicación de procedimientos de análisis de imágenes, han aportado con nueva información en torno al grado de diferenciación genómica de los cromosomas (Netten, 1997). Adicionalmente, la integración de análisis estadísticos en las mediciones morfométricas de los cromosomas ha permitido verificar diferencias significativas en el tamaño medio de brazos cromosómicos en algunas 27

especies de fissurélidos, pectínidos y ostrélidos (Ladrón de Guevara et al., 1996; Gajardo et al., 2002; Amar, 2003). Otro tipo de aproximación es la utilización de herramientas computacionales, en este sentido la utilización de análisis de imágenes permite reducir el error ocasionado por las mediciones manuales, generando resultados más cuantitativos y detallados de la naturaleza morfológica de los cromosomas (Schrock et al., 1996). En la ostra Crassostrea virginica, se ha descrito a través de mediciones digitales que la variación individual cromosómica en larvas es del 5%, lo cual estaría relacionado directamente con las variaciones morfológicas debidas tanto a factores biológicos como a diferentes grados de condensación del ADN durante el ciclo celular (Zhang et al., 1999a).

Recientemente en los últimos años han adquirido mayor atención a las técnicas de identificación mediante la utilización del teorema de convolución. En un principio esta aplicación fue centrada en la industria militar. Sin embargo, a partir de los años 70s se ha incluido en el reconocimiento óptico-digital de imágenes cada vez más complejas como objetos movidos, rotados, escalados, degradados o fuera de foco. Esto ha dado lugar al desarrollo de técnicas invariantes, es decir, técnicas que reconocen como idénticos a objetos iguales a pesar de tener cambios de posición, escala, rotación, entre otras. Sin embargo el procesamiento invariante es una tarea difícil y motivo por el cual, las técnicas encaminadas a resolver este problema son variadas (Pech-Pacheco y Álvarez-Borrego, 1998; Alvarez-

Borrego y Chávez-Sánchez, 2001; Castro-Longoria et al., 2001; Alvarez-Borrego et al.,

2002; Fájer-Ávila y Álvarez-Borrego, 2002; Pech Pacheco et al., 2002; Villalobos-Flores et al., 2002; Castro-Longoria et al., 2003; Pech Pacheco et al., 2003).

28

IV. 1. Obtención de cariotipos en abulones a partir de larvas

4.1.1. Obtención de organismos

Para el presente estudio se utilizaron ejemplares adultos maduros de abulón rojo Haliotis rufescens, azul H. fulgens y amarillo H. corrugata. Los ejemplares de abulón rojos fueron obtenidos de la granja de Abulones Cultivados S.A., localizada en el Ejido Eréndira. Los ejemplares de abulón amarillo y azul fueron colectados desde Isla de Cedros (28°03’N;

115°8’W). Ambas localidades ubicadas en Baja California, México. Los organismos fueron mantenidos y acondicionados para desovar tanto en el laboratorio húmedo del

Departamento de Acuicultura, CICESE como en el laboratorio de producción larval de la

Cooperativa de Pescadores Nacionales del Abulón, Isla de Cedros. 29

4. 1. 2. Obtención de placas metafásicas

Para la obtención de placas metafásicas se utilizaron larvas 24 h pos-fertilización (Fig. 3).

Como antimitótico se utilizó colchicina, que es un alcaloide que impide la formación del huso mitótico deteniendo las células en metafase. Las larvas recién recolectadas fueron puestas en un medio con colchicina 0.05% disuelta en agua de mar microfiltrada a temperatura ambiente por 4 h.

4. 1. 3. Tratamiento hipotónico

La hipotonía permite que las células aumenten de volumen, facilitando la técnica de aplastado o goteo, mejorando así la dispersión de los cromosomas. Las larvas fueron tratadas con agua de mar microfiltrada al 50% durante 30 minutos.

4. 1. 4. Fijación

Se utilizó Carnoy modificado (metanol: ácido acético, 3:1) recién preparado, a una temperatura de 4 ºC aproximadamente. El fijador frío se deslizó lentamente por las paredes del tubo Eppendorf de 1.5 ml para evitar dañar el tejido. Se realizaron 3-4 cambios por decantación y duración de 30 minutos cada uno. Las muestras se mantuvieron en solución

Carnoy por aproximadamente una semana y posteriormente en etanol al 70% a 4ºC.

4. 1. 5. Confección de preparaciones

El tejido fue disgregado con ácido acético 50% a temperatura ambiente en un tubo de 1.5 ml. Luego de mantenerlo en forma vertical y sin moverlo durante 10 minutos, se extrajo el sobrenadante con una pipeta Pasteur. El líquido se goteó sobre un portaobjeto precalentado entre 40-50ºC y desde una altura aproximada de treinta centímetros. Las preparaciones se 30

dejaron secar al aire. En el caso de los abulones azul y amarillos se tiñeron los cromosomas con DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) en buffer fosfato salino (1xPBS) pH 7.4 a una concentración 0.5 µg/ml por períodos que variaron entre 10-20 minutos. En el caso del abulón rojo se utilizó sólo contraste de fases.

Figura 3. Esquema de procedimiento de obtención de placas metafásicas desde larvas de abulón.

4.1.6. Desarrollo de cariotipos

La figura 3 muestra el procedimiento general de obtención de placas metafásicas desde larvas de abulón. Adicionalmente, las mejores placas metafásicas fueron capturadas digitalmente a 1000x en un microscopio de epifluorescencia (Leica modelo DMRXA2) equipado con una cámara digital a color de 36-bits y 3.3 MegaPixel (Leica modelo 31

DC300). Las imágenes capturadas fueron utilizadas para obtener dos tipos de aproximaciones. La primera fue obtener valores morfométricos de los brazos de cada cromosoma a través del programa Image Pro-Plus versión 3.0 (Copyright© 1993-1998

Media Cybernetics). Las mediciones fueron usadas para determinar la longitud relativa de los cromosomas (longitud del par cromosómico / longitud total del juego cromosómico x

100) y el índice centromérico de cada cromosoma (longitud del brazo corto / longitud total del cromosoma x 100). Con las mediciones de las mejores placas metafásicas se construyó el cariotipo promedio. Asimismo, el ordenamiento de los cromosomas fue realizado con base en la nomenclatura propuesta por Levan et al. (1964).

IV. 2. Procedimientos de FISH para la localización cromosómica de genes

4. 2. 1. FISH para ADNr 18S+5.8S+ 28S

4. 2. 1. 1. Obtención de sondas para ADNr 18S+5.8S+ 28S

Para obtener la sonda ribosomal que hibridara sobre las regiones cromosómicas que contenían ADNr, se utilizó la sonda pDm238 (Roiha et al., 1981) clonada en el plásmido pBR322. Esta sonda contiene los genes 18S, 5.8S y 28S y los espaciadores de Drosophila melanogaster, abarcando una región de 12 kb. El plásmido se mantuvo en células bacterianas de E. coli (cepa JM109) cultivadas en medio LB (Luria-Bertani; bactotriptona

1%, extracto de levadura 0.5%, cloruro sódico 1%, agar 1.5%) y ampicilina (60 µg/ml).

Para almacenar y mantener la cepa bacteriana es posible obtener 800 µl de la cepa en su fase exponencial más una concentración de final de ampicilina de 100 µg/ml en medio LB sin agar. A los 800 µl de cepa se agregan 200 µl de glicerol al 10%, posteriormente se 32

almacenó en tubos de 1.5 ml a -20°C. Para reactivar la cepa y proceder a extraer el plásmido, se descongeló la cepa almacenada y se inoculó en medio LB sin agar con ampicilina 60 µg/ml durante toda la noche y en agitación constante a 37°C. La recolección de las bacterias se obtuvo por centrifugación. La extracción del plásmido se realizó mediante el Kit para purificación de ADN plasmídico, NucleoSpin®Plasmid QuickPure

(Macherey-Nagel) según instrucciones del fabricante.

4. 2. 1. 2. Marcaje de sonda ribosómica obtenida desde ADN plasmídico

La sonda fue marcada con digoxigenina, esteroide presente en las especies vegetales

Digitalis purpurea y D. lanata. Esta molécula se incorpora al ADN enzimáticamente por el método de “Nick translation”, el cual se basa en la facultad de la DNAsa I para producir, a bajas concentraciones de la enzima y en presencia de Mg+2, cortes en el ADN producidos al azar. La ADN Polimerasa I de E. coli sinteriza en dirección 5’→3’ ADN complementario utilizando como cebador el extremo 3’-OH del corte. La actividad exonucleasa 5’→3’ de esta misma enzima elimina simultáneamente nucleótidos en la dirección de síntesis. Uno de los nucleótidos añadidos es un análogo de la timina, el dUTP marcado con la molécula digoxigenina. Para el presente estudio se utilizó el Kit DIG-Nick translation Mix

(Boehringer Mannheim) según instrucciones del fabricante. Este kit contiene tampón de reacción en glicerol (50%), ADN polimerasa I, ADNsa I, dATP 0.25mM, dCTP 0.25mM, dGTP 0.25mM, dTTTP 0.17mM y DIG-11-dUTP 0.08mM. La reacción se llevó a cabo en un volumen de 20 µl conteniendo 1 µg de ADN, 4 µl de la solución del kit y agua destilada.

La mezcla se incubó durante 90 minutos a 15°C. Después de la incubación, se colocó en hielo. 33

El marcaje es considerado óptimo cuando el tamaño de los fragmentos producidos está comprendido en un rango de 200-500 nucleótidos. Para comprobar el tamaño de los fragmentos se tomó una alícuota de 3 µl de la mezcla y se añadió 1µl de tampón de carga

(glicerol 30%, azul de bromofenol 0.5%). Posteriormente se desnaturalizó a 95°C durante 3 minutos manteniéndose posteriormente en hielo durante otros 3 minutos. El tamaño de los fragmentos se determinó en un gel de agarosa al 2% en tampón 1xTAE más un marcador de peso molecular. En aquellos casos en los que se obtuvieron fragmentos mayores de 500 nucleótidos se continuó con la incubación a 15°C durante 30 minutos más, verificándose nuevamente el tamaño de los fragmentos. En el momento en que se alcanza el tamaño adecuado de pares de bases, se detuvo la reacción con EDTA 1µl 0.5 M (pH 8.0) e incubación durante 10 minutos a 65°C.

Una vez realizado el marcaje de la sonda, se añadió a la mezcla 6 µl de ADN de esperma de salmón (10 mg/ml) y 6 µl de ARN de levadura (10 mg/ml). Posteriormente la sonda se precipita en etanol 100% y acetado de sodio 3 M durante toda la noche a -20°C.

Al día siguiente se recogió el precipitado por centrifugación y se lavó con etanol al 70% frío. Posteriormente, se secó el ADN mediante centrifugación y se resuspendió en una solución de hibridación (Formamida 50%, 2xSSC, fosfato sódico 50mM y dextransulfato

10%) a la concentración de 4ng/ µl (250 µl). Dentro del proceso de hibridación fue necesaria la desnaturalización del ADN tanto de la sonda marcada como del ADN cromosómico, que en el caso de los genes ribosomales se realizó a la vez. Para desnaturalizar los portaobjetos y las sondas, se agregaron 20 µl de la solución de hibridación que contiene la sonda y se llevaron los portaobjetos a 72ºC en una placa calefactora. El proceso de hibridación fue realizado durante toda la noche a 37°C. 34

Posteriormente se realizaron los siguientes lavados pos-hibridación: 3x5 min en 50% formamida 2xSSC a 44ºC, 3x5 min en 0.1XSSC a 60 ºC, 1x5 min. 2XSSC, 1x5 min en

TNT y 1x30 min en TNB a temperatura ambiente.

4. 2. 2. FISH para regiones Teloméricas y GATA

4. 2. 2. 1. Obtención de sondas para regiones Teloméricas y GATA

Hibridación in situ de fluorescencia fue llevada a cabo para determinar la presencia de secuencias altamente repetidas en abulones. Para la cual en el presente estudio se utilizaron las sondas de secuencias teloméricas (TTAGGG)n y el microsatélite (GATA)n. Ambas sondas fueron amplificadas mediante PCR en volúmenes de reacción de 50µl y en ausencia de template usando (TTAGGG)5 y (CCCTAA)5 y (GATA)7 y (TATC)7 como iniciadores respectivamente (Ijdo et al., 1991). Las condiciones de PCR fueron: 10 ciclos a 94°C por 1 min, 55°C por 30 sec, 72°C por 1 min y treinta ciclos de PCR de amplificación estándar a una temperatura de anillamiento de 60°C. El anillamiento escalonado de los iniciadores proporciona una plantilla de cadena simple para la extensión de la Taq polimerasa. De esta forma, en los primeros 10 ciclos de la PCR mientras se forman más plantillas, éstas sirven a su vez como iniciadores y plantillas de los siguientes ciclos de la PCR, dando lugar a una población heterogénea de moléculas que constan de arreglos de repeticiones de varias longitudes (de 2-25KB en el caso de regiones teloméricas). Los productos de PCR fueron visualizados mediante electroforesis en 2% de gel de agarosa. El marcaje de la sonda de

ADN fue realizado mediante el método de Nick translation conjugado con digoxigenina. La hibridación in situ se llevó a cabo en condiciones similares a las descritas anteriormente para el gen ADNr, seguido por tres lavados pos-hibridación por 5 min cada uno a 42°C 35

(sonda telomérica) o 37°C (sonda GATA) en 50% de formamida en 2xSSC, pH 7.0, tres cambios de 5 min a 37°C en 2xSSC, pH 7.0, 5 min en 4xSSC/0.1% Tween20 a temperatura ambiente, 5 min en 1xPBS/0.1%Tween20/1% Reactivo bloqueador, 30 min en 1xPBS con

1% de Reactivo bloqueador.

4. 2. 3. Detección inmunocitoquímica

Para la detección y amplificación de la señal de hibridación, las preparaciones cromosómicas fueron incubadas con anticuerpos anti-digoxigenina de ratón a 0.5 µg/ml y detectada con anti-ratón de conejo conjugado con fluoresceína isothiocyanato (FITC) a 0.2

µg/ml, y finalmente para amplificar las señales de fluorescencia con anti-conejo de cabra conjugado con FITC a una concentración de 0.1 µg/ml. Las placas cromosómicas fueron sobreteñidas y montadas con 30 µl de IP-V 500 ng/ml (ioduro de propidio más Vectashield antidesvanecimiento). Las imágenes fluorescentes de FISH fueron obtenidas mediante un microscopio de epifluorescencia (Axioskop 2 plus, Zeiss) y grabadas mediante un cámara digital (CoolSnap, Photometrics ® Inc.).

IV. 3. Relaciones cromosómicas entre Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata

Con finalidad de establecer relaciones citogenéticas entre las tres especies de abulones se realizó un análisis morfométrico cromosómico mediante la utilización de análisis de imágenes. Adicionalmente se contrastaron los valores obtenidos para cada cariotipo promedio mediante la construcción de carioidiogramas según Spotorno (1985). Dicho método emplea los valores de las mediciones estandarizadas como porcentaje del juego 36

haploide. Con los valores porcentuales de cada par cromosómico se calcularon para cada brazo, su longitud promedio, desviación estándar e intervalos de confianza al 95%.

De esta forma, se estableció y comparó el grado de similitud cariotípica entre las especies estudiadas, las medidas cromosómicas porcentuales del brazo corto (%BC) y brazo largo (%BL) de cada par cromosómico fueron transformadas al arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción, para evitar restricciones de distribución. Las diferencias de ambos brazos fueron probadas independientemente para cada par cromosómico usando un análisis de varianza de una vía y una prueba a posteriori de comparaciones múltiples de

Tukey. Como regla general, un par cromosómico fue considerado igual entre dos especies, sólo si ambos brazos no mostraron diferencia significativa de tamaño (P < 0.05). Con la información obtenida de la prueba Tukey, se construyó una matriz de similitud especie- especie, donde se representó el número de cromosomas de igual morfología entre cada especie. Finalmente, para representar gráficamente los resultados, se construyó un dendrograma mediante un análisis UPGMA (Unweighted Pair Grouping Method of

Averanges). Los análisis antes mencionados fueron realizados mediante el paquete estadístico STATISTICA® 6.1 (Copyright® StatSoft, Inc. 1998-2002).

IV. 4. Desarrollo de un método para estimar tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescentes

4. 4. 1. Material biológico

Para determinar las relaciones entre el tamaño genómico y desvanecimiento fluorescente de

ADN, se utilizaron distintas especies de valor-C conocido (cantidad total de ADN 37

contenido dentro del complemento haploide medida en picogramos (pg)). Peces: tilapia

Mozámbica, Oreochromis mossambicus valor-C=0.81 pg (Cui et al., 1991) y trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss valor-C=2.40 pg (Hardie y Hebert, 2003). Moluscos: abulón rojo, Haliotis rufescens valor-C=1.8 pg, abulón azul, H. fulgens valor-C =1.70 pg y abulón amarillo, H. corrugata valor-C = 2.0 pg (Hinigardner, 1974).

4. 4. 2. Recolección de muestras y preparación celular para tinción de ADN

Para la estimación de tamaño genómico en peces se utilizaron eritrocitos así como núcleos de espermatozoides. La sangre de los peces fue recolectada por punción del arco braquial con una jeringa de 1.5 ml. Previamente, los peces fueron anestesiados con hydroxyl-phenol

(0.2 mg/ml). Monocapas de células de glóbulos rojos fueron adheridas sobre los portaobjetos según Hardie et al. (2002). Posteriormente, los frotis fueron dejados secar al aire junto con metanol como solución fijadora. Después de la fijación, los frotis fueron deshidratados mediante el incremento del grado de etanol (70%, 90% y 100%), dos cambios por 5 minutos cada vez y finalmente almacenados a 4°C. Las muestras de espermatozoides fueron obtenidas de tilapias en estado reproductivo mediante masaje abdominal. Los frotis de espermatozoides fueron fijados sobre portaobjetos con solución de

Carnoy fresco (metanol: ácido acético, 3:1) a 4°C y posteriormente dejados secar al aire.

Para la recolección de muestras en moluscos, se utilizaron hemocitos y espermatozoides de abulones. La hemolinfa fue obtenida directamente desde el nódulo sinusal cardiaco mientras que los espermatozoides fueron obtenidos por inducción al desove de ejemplares adultos según Morse et al. (1977). Los frotis fueron procesados de manera similar a las muestras de espermatozoides de tilapia. 38

Las células fijadas sobre los portaobjetos fueron lavadas tres veces con tampón fosfato salino (1xPBS; (13 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM Na2HPO4, 0.2 mM KH2PO4, pH 7.4) por 15 minutos. Posteriormente, los frotis fueron incubados con tinción de DAPI en oscuridad por 25 minutos a temperatura de laboratorio. La solución de DAPI fue preparada con 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma Chemical; St. Louis, MO) en 1xPBS a una concentración de 0.5 µg/ml. Esta concentración permitió obtener imágenes fluorescentes con la menor cantidad de fluorocromo adherido al citoplasma (sobretinción).

4. 4. 3. Captura de imágenes

Para la captura digital de imágenes fluorescentes se programó una subrutina de captura mediante el programa QWIN (Copyright® by Imaging Systems Ltd, Cambridge, U. K.,

1997). La subrutina permitió capturar una imagen digital de 348 X 258 píxeles cada 1600 milisegundos durante un período de desvanecimiento fluorescente en el mismo campo de observación. Adicionalmente, el programa almacenó las imágenes capturadas en un archivo para su análisis. Las condiciones de captura fueron; tiempo de exposición de CCD de 509 milisegundos, gamma igual a 1 (respuesta lineal) y profundidad de color de 8 bits/canal.

Para la medición de fluorescencia, se utilizó un microscopio motorizado de epifluorescencia modelo Leica DMRXA2, equipado con una cámara color de 36-bits modelo Leica DC300 (3.3 Mega Pixels). Las condiciones de fluorescencia fueron; filtro de excitación de UV 340-380 nm, espejo dicromático DM 400 nm, filtro de supresión LP 425, banda de absorción AB 435-485 nm y lente objetivo Fluotar PL 63X/0.7.

39

4. 4. 4. Análisis de imágenes fluorescentes

El análisis de imágenes fue llevado a cabo mediante el desarrollo de un algoritmo específicamente construido con lenguaje MATLAB (Copyright© 1984-2000, The

MathWorks, Inc.). El algoritmo fue construido con la finalidad de procesar la información de la intensidad de fluorescencia durante un período de desvanecimiento DAPI- fluorescente. Para lo cual, se midió la intensidad de fluorescencia mediante una ventana de

13x13 píxeles alrededor del núcleo. Esta ventana fue utilizada para estimar el promedio de la intensidad “ADN-DAPI fluorescente” o formalmente como intensidad media pixélica

(IMP). Las imágenes fluorescentes fueron convertidas desde color a 256 niveles de brillo (8 bits/canal). Adicionalmente, el algoritmo permitió analizar simultáneamente numerosos núcleos sobre la muestra. De esta forma, el proceso generó una captura secuencial durante un período de desvanecimiento fluorescente hasta la pérdida total de fluorescencia del

ADN. Gráficamente, si unimos todos los puntos IMP durante un período de pérdida de fluorescencia, el área bajo la curva representará una función de integración de desvanecimiento fluorescente (ID) como:

n ID = ∑(IMP) i ∗ ∆t (1) i=1 donde el subíndice i representa el número de imágenes en un período de desvanecimiento y

∆t el intervalo entre la captura de imágenes. Así ID representa la función integral mediante la suma de la intensidades medias pixélicas a través del período de desvanecimiento fluorescente del ADN. 40

Adicionalmente, se construyeron una serie de algoritmos con la finalidad de estimar el número de núcleos necesarios para obtener un valor representativo de ID y determinar la información de brillo que contribuye cada canal RGB. Después de obtener los valores de

ID para cada tipo celular utilizado como referencia se ajustaron los resultados a un modelo lineal entre ID y el tamaño genómico reportado para las especies de referencia.

Adicionalmente se obtuvo el 95% de intervalo de confianza para los descriptores de la ecuación lineal. La figura 4 muestra el procedimiento general de la medición de tamaño genómico a través de la cuantificación del desvanecimiento fluorescente de ADN.

Figura 4. Procedimiento general de medición de tamaño genómico a través de la cuantificación del desvanecimiento fluorescente de ADN. 41

IV. 5. Estimación de contenido de ADN cromosómico en abulón rojo Haliotis rufescens

4. 5. 1. Preparación de cromosomas y tinción de ADN

La obtención de cromosomas fue realizada según la metodología descrita anteriormente en el punto IV. 1. Asimismo las preparaciones cromosómicas se tiñeron con la solución de

DAPI descrita en el punto 4. 4. 2, para estimar contenido de ADN según el método propuesto de desvanecimiento fluorescente.

4. 5. 1. Análisis de imágenes en contenidos de ADN cromosómicos

La captura de imágenes fue realizada mediante la programación en QWIN descrita en el punto 4. 4. 3 pero modificado para capturar un imagen digital de 2088 X 1550 píxeles y con un tiempo de exposición de CCD de 209 milisegundos. El procedimiento de análisis de imágenes fue llevado a cabo por tres algoritmos desarrollados en MATLAB. El primer algoritmo fue construido en orden de obtener sub-imágenes de 51 X 51 píxeles a partir de las imágenes inicialmente capturadas de 2088 X 1550 píxeles. Cada sub-imagen de 51 X 51 píxeles contiene un solo cromosoma metafásico, el cual fue capturado secuencialmente durante un período de desvanecimiento fluorescente. La identificación del tipo cromosómico contenido en la sub-imagen fue realizada según el cariotipo de H. rufescens.

El segundo algoritmo fue usado para generar una máscara binaria (valores pixélicos 0 y 1) sobre el contorno del cromosoma. El propósito de ésta máscara fue filtrar las intensidades pixélicas del fondo de la imagen mediante la multiplicación entre la imagen fluorescente y la máscara binaria. De esta forma, fue posible obtener la mayor cantidad de información sólo del ADN cromosómico. El tercer algoritmo fue generado para estimar los valores de 42

ID para cada tipo cromosómico. La estimación de ID fue realizada similarmente a lo descrito en el punto 4. 4. 3.

4. 5. 2. Análisis estadístico

Para obtener las variaciones del contenido de ADN de cada par homólogo, se estimó el porcentaje de variación de ADN cromosómico y su contribución a la variación total del tamaño genómico. Estos cálculos fueron realizados mediante un ANOVA de una vía y una prueba a posteriori Tukey. Los supuestos de ANOVA, distribución normal y homogeneidad de varianza fueron comprobados usando las pruebas de Kolmogorov-

Smirnov y de Bartlett respectivamente. Los análisis estadísticos fueron realizados mediante el paquete estadístico STATISTICA® 6.1 (Copyright® StatSoft, Inc. 1998-2002).

IV. 6. Estimación de tamaño genómico en Argopecten purpuratus

4. 6. 1. Material biológico

Treinta ejemplares de A. purpuratus provenientes de dos poblaciones fueron utilizados para estimar su tamaño genómico promedio. Quince ejemplares fueron recolectados desde una población silvestre en la localidad de Arica (18° 28' Sur) y quince fueron recolectadas desde una población de cultivo en Bahía Tongoy (30° 15’ Sur), ambas áreas están localizadas al norte de Chile. Datos de longitud (lc), ancho (anc) y altura (alc) de concha fueron obtenidos para cada ejemplar. Asimismo se calculó la proporción de anc/lc y alc/lc.

43

4. 6. 2. Obtención de hemocitos y tinción fluorescente de ADN

El tamaño genómico de A. purpuratus fue estimado a través de núcleos de hemocitos en ejemplares adultos (8-9 cm. de altura de concha). La hemolinfa fue extraída desde el músculo aductor de animales vivos usando una jeringa de insulina. Posteriormente, la hemolinfa fue fijada sobre portaobjetos con solución Carnoy (metanol: ácido acético, 3:1) a

4°C. La estimación del tamaño genómico fue realizada según el procedimiento descrito en los puntos 4. 4. 2 – 4. 4. 4.

4. 6. 3. Análisis estadístico

En referencia a las longitudes de concha y a las proporciones anc/lc and alc/lc, estas fueron comparados entre las poblaciones mediante una prueba t. Para obtener la variación de tamaño genómico tanto a nivel intraespecífico como a nivel interpoblacional, distintos análisis estadísticos fueron realizados para estimar el porcentaje de variación a cada nivel muestreal (individuo y poblaciones) y su contribución a la variación total del tamaño genómico. El coeficiente de variación fue estimado desde la dispersión de los valores de contenido de ADN individual (desviación estándar * 100). Asimismo se realizaron análisis de varianza anidado de una y dos vías mediante la utilización del paquete estadístico

STATISTICA® 6.1.

44

V. 1. Cariotipo cuantitativo de Haliotis rufescens

Para la obtención del cariotipo de H. rufescens, varias imágenes digitales fueron capturadas y procesadas para eliminar ruido y bajo contraste. Después de procesar la imagen fue posible obtener imágenes cromosómicas de mejor contraste y por tanto, fue posible realizar mediciones más exactas de la morfología de los cromosomas. La figura 5a muestra una placa metafásica sin teñir y mejorada mediante procesamiento de imágenes. Las observaciones cariológicas en células larvales de abulón rojo mostraron un número diploide igual a 36 cromosomas. La distribución relativa de longitudes cromosómicas fue derivada para obtener el cariotipo del abulón rojo del Pacífico Haliotis rufescens (Figura 5b). Los valores medios y desviaciones estándar de los 18 pares cromosómicos se muestran en la

Tabla II. 45

Figura 5. Cromosomas de Haliotis rufescens. a) Imagen digital de placa metafásica, b) Cariotipo de H. rufescens.

La relación de longitudes de los brazos cromosómicos fue utilizada para graficar el cardiograma representativo para la especie. Este indicó que el abulón rojo posee ocho pares metacéntricos (1, 3, 6, 7, 14, 15, 17 y 18), nueve pares submetacéntricos (2, 4, 5, 8, 9, 10, 46

11, 12 y 13) y un par cromosómico clasificado como subtelocéntrico (16). Los pares cromosómicos 14 y 17 fueron difíciles de identificar debido principalmente al traslape de sus respectivas longitudes porcentuales cromosómicas (Fig. 6).

Tabla II. Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico para Haliotis rufescens (2n=36).

Longitud total Longitud Índice Cromosoma Tipo* (µm) relativa (%) Centromérico Par no. Cromosómico (media ± de) (media ± de) (media ± de) 1 5.67 ± 0.19 6.52 ± 0.56 43.95 ± 0.15 M 2 5.58 ± 0.07 6.42 ± 1.03 32.53 ± 0.18 SM 3 5.39 ± 0.06 6.20 ± 0.55 46.91 ± 0.11 M 4 5.30 ± 0.10 6.09 ± 0.78 31.30 ± 0.13 SM 5 5.24 ± 0.01 6.03 ± 0.91 29.91 ± 0.09 SM 6 5.20 ± 0.03 5.97 ± 0.26 44.66 ± 0.15 M 7 5.08 ± 0.13 5.84 ± 0.44 41.68 ± 0.03 M 8 5.07 ± 0.07 5.83 ± 0.68 31.72 ± 0.29 SM 9 4.99 ± 0.07 5.74 ± 1.01 26.38 ± 0.15 SM 10 4.65 ± 0.04 5.34 ± 0.80 28.97 ± 0.13 SM 11 4.63 ± 0.09 5.32 ± 0.70 29.70 ± 0.13 SM 12 4.58 ± 0.02 5.26 ± 0.52 34.67 ± 0.08 SM 13 4.50 ± 0.04 5.17 ± 0.78 27.59 ± 0.17 SM 14 4.44 ± 0.07 5.10 ± 0.17 46.23 ± 0.21 M 15 4.32 ± 0.05 4.96 ± 0.31 42.74 ± 0.20 M 16 4.31 ± 0.05 4.95 ± 1.63 16.31 ± 0.14 ST 17 4.46 ± 0.06 4.45 ± 0.27 45.56 ± 0.15 M 18 3.75 ± 0.07 4.31 ± 0.34 44.48 ± 0.19 M * M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico. 47

5

T ST SM M

4 2 5 1 16 4 8 3 9 11 10 6 7

o 13 3 12 15 17 18 14

% Brazo larg % Brazo 2

1

0 012345 % Brazo corto

Figura 6. Carioidiograma de Haliotis rufescens. M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.

V. 2. Cariotipo cuantitativo de Haliotis fulgens

Cromosomas metafásicos de abulón azul H. fulgens, mostraron un número diploide de

2n=36 (Fig. 7). Los valores medios y de desviación estándar de la longitud total, longitud relativa e índice centromérico fueron estimados a partir de las mediciones de brazos cromosómicos usando análisis de imágenes (Tabla III). La longitud máxima de los cromosomas fue 6.07 ± 0.12 µm y la mínima fue de 3.13 ± 0.21 µm. El carioidiograma obtenido para el abulón azul mostró que esta especie posee ocho pares metacéntricos (1, 3, 48

6, 9, 10, 16, 17 y 18), ocho pares submetacéntricos (2, 4, 5, 7, 8, 11, 12 y 13), y dos pares de cromosomas subtelocéntricos (14 y 15) (Fig. 8).

Figura 7. Cariotipo de Haliotis fulgens (2n=36).

49

Tabla III. Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico para Haliotis fulgens (2n=36).

Longitud total Longitud Índice Cromosoma Tipo* (µm) relativa (%) Centromérico Par no. Cromosómico (media ± de) (media ± de) (media ± de) 1 6.07 ± 0.12 8.00 ± 0.27 47.45 ± 0.16 M 2 5.06 ± 0.81 6.67 ± 0.12 34.09 ± 0.15 SM 3 4.84 ± 0.11 6.37 ± 0.38 48.37 ± 0.17 M 4 4.72 ± 0.68 6.23 ± 0.49 39.81 ± 0.18 SM 5 4.16 ± 0.93 5.48 ± 0.22 34.16 ± 0.14 SM 6 4.62 ± 0.35 6.08 ± 0.12 44.69 ± 0.13 M 7 4.56 ± 0.68 6.01 ± 0.07 39.41 ± 0.10 SM 8 4.41 ± 0.79 5.82 ± 0.40 37.27 ± 0.17 SM 9 4.24 ± 0.49 5.59 ± 0.20 42.74 ± 0.15 M 10 4.14 ± 0.36 5.45 ± 0.10 43.77 ± 0.12 M 11 4.04 ± 0.69 5.32 ± 0.20 37.98 ± 0.15 SM 12 3.98 ± 0.87 5.24 ± 0.26 34.51 ± 0.09 SM 13 3.81 ± 0.51 5.02 ± 0.31 40.59 ± 0.15 SM 14 3.86 ± 1.38 5.09 ± 0.21 24.73 ± 0.14 ST 15 3.63 ± 1.29 4.78 ± 0.25 24.82 ± 0.17 ST 16 3.50 ± 0.25 4.61 ± 0.19 44.97 ± 0.12 M 17 3.13 ± 0.08 4.13 ± 0.23 48.29 ± 0.20 M 18 3.13 ± 0.21 4.13 ± 0.22 45.20 ± 0.09 M * M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico.

50

5

T ST 2 SM M 1

4 14 4 5 8 7 6 15 11 3 12 9

o 3 10 13 16

18 17

% Brazo larg 2

1

0 012345 % Brazo corto

Figura 8. Carioidiograma de Haliotis fulgens. M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.

V. 3. Cariotipo cuantitativo de Haliotis corrugata

Las metafases examinadas en el abulón amarillo H. corrugata, mostraron un número cromosómico diploide de 2n=36 (Fig. 9). La longitud cromosómica total mostró un máximo de longitud cromosómica de 5.82 ± 0.12 µm y un mínimo de 3.46 ± 0.05 µm, adicionalmente se obtuvieron los valores de longitud relativa e índice centromérico (Tabla

IV). Mediante el arreglo de pares cromosómicos, el cariotipo consistió en diez pares 51

metacéntricos (1, 3, 6, 9, 10, 11, 14, 15, 17 y 18), siete pares submetacéntricos (2, 4, 5, 7, 8,

12 y 13), y un par de cromosomas subtelocéntricos (16) (Fig. 10).

Figura 9. Cariotipo de Haliotis corrugata (2n=36).

52

Tabla IV. Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico para Haliotis corrugata (2n=36).

Longitud total Longitud Índice Cromosoma Tipo* (µm) relativa (%) Centromérico Par no. Cromosómico (media ± de) (media ± de) (media ± de) 1 5.82 ± 0.12 7.28 ± 0.27 48.02 ± 0.06 M 2 5.00 ± 0.08 6.26 ± 0.12 35.90 ± 0.11 SM 3 4.82 ± 0.03 6.03 ± 0.38 46.70 ± 0.05 M 4 4.80 ± 0.06 6.00 ± 0.49 39.95 ± 0.08 SM 5 4.59 ± 0.02 5.74 ± 0.22 36.93 ± 0.06 SM 6 4.53 ± 0.06 5.66 ± 0.12 43.81 ± 0.09 M 7 4.52 ± 0.05 5.66 ± 0.07 34.51 ± 0.09 SM 8 4.45 ± 0.02 5.57± 0.40 36.91 ± 0.08 SM 9 4.44 ± 0.04 5.55 ± 0.20 49.16 ± 0.07 M 10 4.34 ± 0.01 5.43 ± 0.10 41.09 ± 0.07 M 11 4.32 ± 0.08 5.40 ± 0.20 47.98 ± 0.16 M 12 4.29 ± 0.02 5.36 ± 0.26 37.38 ± 0.04 SM 13 4.24 ± 0.02 5.30 ± 0.31 34.82 ± 0.08 SM 14 4.22 ± 0.09 5.28 ± 0.21 44.74 ± 0.10 M 15 4.07 ± 0.03 5.09 ± 0.25 47.04 ± 0.03 M 16 4.03 ± 0.02 5.04 ± 0.19 22.44 ± 0.04 ST 17 4.01 ± 0.01 5.02 ± 0.23 48.59 ± 0.02 M 18 3.46 ± 0.05 4.32 ± 0.22 45.50 ± 0.07 M * M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico.

53

5

T ST SM M 2 4 1 16 7 5 4 8 13 3 12 10 6

o 3 14 11 9 15 17 18 Brazo% larg 2

1

0 012345

% Brazo corto

Figura 10. Carioidiograma de Haliotis corrugata. M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.

V. 4. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis rufescens

Arreglos cariotípicos en cromosomas de abulón rojo conjuntamente con FISH-ADNr, permitió visualizar los principales sitios de localización de los clusters 18S-5.8S-28S. La sonda de ADNr produjo intensas señales de hibridación sobre los telómeros de los brazos largos de dos pares de cromosomas submetacéntricos (pares 4 y 5). Los cromosomas metafásicos obtenidos desde larvas mostraron heteromorfismos de FISH-ADNr entre cromátidas hermanas (par 7) y señales bajas de hibridación en zonas cromosómicas intersticiales. Estas señales intersticiales fueron encontradas tanto en cromosomas 54

submetacéntricos como en subtelocéntricos (pares 8 y 16 respectivamente) (Fig. 11). Sin embargo, la localización específica de estas regiones de baja señal de hibridación mostró una alta variabilidad citogenética en todas las metafases analizadas. Adicionalmente heteromorfismos en la localización de los principales cluster de FISH-ADNr, fueron observados entre cromosomas ambos homólogos del par 12 y 13 (Fig. 11).

Figura 11. Arreglo cariotípico de Haliotis rufescens con hibridación in situ fluorescente para sonda de gen ribosomal mayor 18S-5.8S-28S. 55

La aplicación de hibridación fluorescente in situ mediante un sonda de ADN de la región telomérica, mostró que esta especie presenta una secuencia hexamérica altamente repetitiva (TTAGGG)n similar a la descrita en vertebrados. Las señales de hibridación fueron localizadas en las regiones terminales de todos los tipos cromosómicos analizados

(Fig. 12a). La visualización de núcleos interfásicos marcados con la sonda telomérica

(TTAGGG)n permitió evidenciar que las regiones teloméricas presentan una distribución periférica al núcleo (Fig. 12b). Adicionalmente, la hibridación con sondas del microsatélite

(GATA)n fue observada en el genoma de H. rufescens (Fig. 12c). Sin embargo, la localización de estas regiones fue muy variable, tanto en regiones intersticiales cromosómicas como en las regiones teloméricas. Esto último fue posible observarlo en núcleos interfásicos hibridados con la sonda (GATA)n (Fig. 12d).

V. 5. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis fulgens

Hibridaciones in situ mediante la sonda de ADNr 18S-5.8S-28S mostró la localización de los principales cluster de ADNr sobre las regiones teloméricas de los brazos largos en dos pares cromosómicos submetacéntricos (pares 4 y 11). Cromosomas metafásicos obtenidos desde larvas mostraron heteromorfismo en la localización de NOR entre cromatidas hermanas, asimismo fueron localizadas bajas señales de hibridación en regiones cromosómicas intersticiales principalmente en cromosomas de tipo submetacéntricos. Sin embargo, la localización específica de las regiones con baja señal de hibridación mostró ser altamente variable (Fig. 13a y 13b). 56

Después de aplicar los procedimientos de hibridación in situ con sonda telomérica

(TTAGGG)n sobre cromosomas mitóticos de abulón azul, estos mostraron fuertes señales de hibridación en la regiones teloméricas de los cromosomas analizados (Fig. 13c). La visualización de núcleos interfásicos hibridados con la sonda telomérica permitió corroborar la distribución periférica de estas regiones (Fig. 13d). Asimismo, con la finalidad de comprobar la existencia del microsatellite (GATA)n, cromosomas de H. fulgens mostraron una evidente señal de hibridación en todos los bivalentes analizados (Fig.

13e). La localización de estas regiones microsatélites fueron encontradas tanto en las regiones intersticiales como en las regiones teloméricas (Fig. 13f).

V. 6. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis corrugata

La localización de las regiones NOR mediante la sonda de ADNr 18S-5.8S-28S, fue encontrada para el caso de abulón amarillo sobre las regiones teloméricas de dos pares cromosómicos del tipo submetacéntrico (pares 2 y 4). Heteromorfismos en la localización de NORs fueron encontrados entre cromátidas hermanas. Asimismo, la presencia de regiones de hibridación en intersticiales fue observada tanto en cromosomas metacéntricos como en submetacéntricos. La localización de zonas de hibridación de baja intensidad de fluorescencia fue encontrada altamente variable a lo largo del genoma en H. corrugata

(Fig. 14a y 14b).

Las sondas teloméricas (TTAGGG)n mostraron la presencia de este tipo de secuencia en las regiones teloméricas de todos los cromosomas de abulón amarillo (Fig. 14c). FISH sobre núcleos interfásicos mostraron una distribución periférica de la secuencia (Fig. 14d). 57

La presencia del microsatélite (GATA)n fue corroborada en cromosomas de H. corrugata

(Fig. 14e). Sin embargo, la localización de estas secuencias mostró ser altamente variable

(Fig. 14f).

Figura 12. FISH en Haliotis rufescens. a) Cromosomas mitóticos metafásicos después del tratamiento con sonda telomérica (TTAGGG)n, b) Núcleo interfásico con sonda telomérica, c) Cromosomas mitóticos después de ser marcado con sonda (GATA)n, d)

Núcleo interfásico marcado con sonda (GATA)n. 58

Figura 13. FISH en Haliotis fulgens. a) Cromosomas mitóticos hibridados con sonda ADNr 18S-5.8S-28S, b) Núcleo interfásico con sonda ADNr, c) Cromosomas metafásicos con sonda telomérica (TTAGGG)n, d) Núcleo interfásico con sonda telomérica, e) Cromosomas metafásicos con hibridados con sonda (GATA)n, f) Núcleo interfásico con sonda (GATA)n. Flechas azules indican regiones NOR en cromosomas homólogos. Flechas amarillas muestran heteromorfismos de NOR entre cromatidas hermanas. Flechas blancas indican señales intersticiales de ADNr. 59

Figura 14. FISH en Haliotis corrugata. a) Cromosomas mitóticos hibridados con sonda ADNr 18S-5.8S-28S, b) Núcleo interfásico con sonda ADNr, c) Cromosomas metafásicos después de aplicar FISH con sonda telomérica (TTAGGG)n, d) Núcleo interfásico con sonda telomérica, e) Cromosomas metafásicos con hibridados con sonda (GATA)n, f)

Núcleo interfásico con sonda (GATA)n. Flechas azules indican regiones NOR en cromosomas homólogos. Flechas amarillas muestran heteromorfismos de NOR entre cromatidas hermanas. Flechas blancas indican señales intersticiales de ADNr. 60

V. 7. Relaciones cromosómicas entre H. rufescens, H. fulgens y H. corrugata

Los 18 pares de cada especie de abulón fueron representados de acuerdo a sus respectivos carioidiogramas, los cuales clasifican a cada par cromosómico de acuerdo a la posición del centrómero. En la tabla V se muestran los resultados de los análisis estadísticos realizados para cada par cromosómico. La comparación se realizó considerando todas las combinaciones posibles entre las tres especies estudiadas. Un par cromosómico fue considerado igual entre dos especies, sólo si ambos brazos no mostraban diferencia significativa de tamaño (P < 0.05). Al analizar par a par los cariotipos de las tres especies, mediante la información descrita en los carioidiogramas y análisis estadísticos aplicados, se observó que los pares cromosómicos del 1 al 5 no difieren en tipo cromosómico (M, SM,

M, SM, SM respectivamente). De igual forma, los análisis estadísticos indican que no existen diferencias significativas entre las tres especies. El par cromosómico 6 fue metacéntrico para las tres especies, sin embargo la mayor diferencia de longitud fue encontrada en abulón rojo. El cromosoma 7 fue submetacéntrico en abulón amarillo y azul, pero metacéntrico en abulón rojo. A su vez este par mostró una diferencia significativa en comparación con abulón azul y amarillo. El cromosoma 8 fue clasificado como submetacéntrico en las tres especies. Sin embargo, en abulón azul se encontraron diferencias significativas en longitud con respecto a las otras especies. Los cromosomas 9,

10 y 11 fueron principalmente metacéntricos excepto en el abulón rojo que fue clasificado como submetacéntrico. Los análisis estadísticos mostraron que estos cromosomas son altamente variables en longitud entre las tres especies estudiadas.

61

Tabla V. Análisis estadísticos usando pruebas de ANOVA y Tukey (n=10 placas metafásicas por especie). Un par cromosómico fue considerado igual entre dos especies, sólo si ambos brazos no muestran diferencia significativa (p<0.05). (BC) brazo corto, (BL) brazo largo, (ND) no existe diferencia significativa, (S) si existe diferencia significativa, (R) el par es propio de H. rufescens, (F) el par es propio de H. fulgens, (C) el par es propio de H. corrugata.

H. rufescens H. corrugata H. fulgens x x x H. corrugata H. fulgens H. rufescens ______

Cromosoma BC BL BC BL BC BL Resultado 1 N N N N N N ND 2 N N N N N N ND 3 N N N N N N ND 4 N N N N N N ND 5 N N N N N N ND 6 S N N N S N R 7 S S S N N N R 8 N N S N S S F 9 S N S N S N R, C y F 10 N N S N S N F 11 S N S S N N C 12 N N S N S S F 13 N N S S N S F 14 N N S S S S F 15 N N S S S S F 16 N N S N S N F 17 N N N N N N ND 18 N N N N N N ND 62

Los cromosomas 12 y 13 fueron submetacéntricos en las tres especies. No obstante, las mayores diferencias significativas fueron encontradas en abulón azul. Los cromosomas 14 y 15 fueron clasificados como metacéntricos en abulón amarillo y rojo, y como submetacéntrico en abulón azul. Del mismo modo, las mayores diferencias estadísticas se encontraron en esta especie de abulón. El par 16 fue descrito como submetacéntrico en abulón rojo y amarillo, excepto en abulón azul clasificado como metacéntrico y estadísticamente diferente. Los cromosomas 17 y 18 no mostraron diferencias significativas en longitud cromosómica, como tampoco en el tipo cromosómico metacéntrico en las tres especies analizadas. Finalmente, de los análisis estadísticos se puede concluir que de los 18 pares que posee cada uno de los cariotipos promedios, 8 pares son iguales en las tres especies estudiadas, 3 son propios H rufescens, 7 de H. fulgens y 2 de H. corrugata (Tabla

V). Por otro lado, rufescens comparte 9 pares cromosómicos con H. fulgens y 14 pares con

H. corrugata. A la vez, H. fulgens comparte 8 pares cromosómicos con H. corrugata

(Tabla VI).

Tabla VI. Matriz de similitud cromosómica entre H. rufescens, H. fulgens y H. corrugata.

H. rufescens H. fulgens H. corrugata

H. rufescens * 9 14

H. fulgens * 8

H. corrugata *

63

De la matriz de similitud especie-especie, que muestra el número de pares similares que existen entre cada especie (Tabla VI), se obtuvo un dendrograma usando un análisis

UPGMA (Fig. 15). En éste se observa que H. rufescens y H. corrugata son entre sí más similares que cualquiera de ellas con respecto a H. fulgens.

Figura 15. Dendrograma que muestra el patrón de agrupamiento obtenido para la morfología cromosómica de Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata usando análisis UPGMA. La escala muestra el número de cromosomas de morfología similar.

V. 8. Estimación de tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescentes

5. 8. 1. La naturaleza del desvanecimiento DAPI-fluorescente

Con la finalidad de establecer la relación entre el desvanecimiento DAPI-fluorescente y el tamaño genómico, se compararon los perfiles de desvanecimiento en núcleos de distintos 64

tipos celulares de tilapia Mozambica, abulón rojo, azul y amarillo y trucha arco iris. Con la finalidad de visualizar el período de desvanecimiento fluorescente, la Figura 16 muestra sólo doce imágenes de núcleos de eritrocitos de tilapia teñidos con DAPI. La secuencia muestra un período entre t = 1.6 a t = 192 segundos a diferentes intervalos de tiempo. La secuencia muestra que la fluorescencia decrece rápidamente bajo la exposición de luz ultravioleta. La intensidad de fluorescencia fue visualizada por intensidad pixélica de 256 niveles de brillo.

Figura 16. Secuencia de desvanecimiento fluorescente en eritrocitos de tilapia, Oreochromis mossambicus. La barra de color indica la intensidad pixélica de 0 a 255.

Para comparar el desvanecimiento fluorescente en diferentes especies y por tanto diferentes tamaños genómicos, se obtuvieron los perfiles de desvanecimiento en espermatozoides (EZT) y eritrocitos (ERT) de tilapia Mozambica, espermatozoides de abulón rojo (EZR) y eritrocitos de trucha arco iris (ERTr). Los perfiles ADN-DAPI 65

mostraron una disminución de la intensidad de fluorescencia en función del tiempo de exposición a luz ultravioleta (UV). La variabilidad de los perfiles en diferentes frotis, mostró que la dispersión de los datos ocurre principalmente en los primeros 20 segundos de exposición a luz UV, después de este intervalo de tiempo el perfil de desvanecimiento se vuelve más estable independientemente del número de campos medidos. Asimismo, fue posible observar una diferencia en los tiempos requeridos para que ocurra completamente el desvanecimiento, de esta forma el tiempo guarda relación con el tipo celular analizado (Fig.

17).

El fluorocromo DAPI unido al ADN emite fluorescencia principalmente en el intervalo de longitudes de onda del color azul. Sin embargo, en imágenes digitales el color es aportado por la contribución de tres canales; rojo, verde y azul (RGB). Con la finalidad de estudiar la contribución de los tres canales RGB, y así determinar cual de ellos aporta la mayor información de intensidad durante el período de desvanecimiento. Se analizaron los perfiles de fluorescencia descompuestos en los tres canales RGB. La figura 18 muestra una imagen de eritrocito de tilapia teñida con DAPI y descompuesta en los tres canales RGB.

Se observa que el canal azul es el canal que aporta la mayor cantidad de información en comparación con los canales verde y rojo respectivamente. Sin embargo, la mayor cantidad de información de intensidad aportada por el canal azul, puede estar afectada por ruido de fondo. En tal caso la intensidad medida no necesariamente puede provenir del núcleo. 66

Figura 17. Perfiles de desvanecimiento DAPI-fluorescente para distintos tipos celulares. EZT, espermatozoides de tilapia. ERT, eritrocitos de tilapia. EZR, espermatozoides de abulón rojo. ERTr, eritrocitos de trucha arco iris. 67

Figura 18. Imagen digital DAPI-fluorescente descompuesta en los tres canales de color (rojo, verde y azul) en eritrocitos de tilapia.

Para determinar si la contribución de cada canal RGB fue similar en los tipos celulares de referencia e independiente al tamaño genómico, se obtuvieron perfiles de desvanecimiento para cada canal de color por separado. De esta forma, cada canal (RGB), fue graficado conjuntamente con un perfil promedio de los tres canales (Fig. 19). Este análisis mostró que durante el período de desvanecimiento, el canal azul fue el que aportó la mayor cantidad de información de brillo, mientras que los canales verde y rojo contribuyeron en menor grado. El canal verde mostró una posición intermedia entre los otros perfiles, lo cual indicó que este canal posee la capacidad de atenuar las altas intensidades del canal azul producido por el ruido de fondo e incrementar la baja señal 68

obtenida por el canal rojo. En este sentido, es posible trabajar sólo con el canal verde para establecer una curva representativa de desvanecimiento fluorescente. Sin embargo, el trabajar sólo con un canal incrementa los tiempos de cómputo debido a que es necesario generar una rutina adicional que extraiga el canal verde desde la imagen RGB. A partir de estos resultados, las mediciones realizadas de desvanecimiento fluorescente en el presente trabajo, fueron realizadas mediante la correlación de los tres canales de color RGB, el cual no requiere ningún procesamiento adicional (Fig. 19).

Figura 19. Descomposición de canales RGB en perfiles de desvanecimiento fluorescente. EZT, espermatozoides de tilapia. EZR, espermatozoides de abulón rojo. ERT, eritrocitos de tilapia. ERTr, eritrocitos de trucha arco iris. 69

5. 8. 2. La relación entre el desvanecimiento DAPI-fluorescente y el tamaño genómico

Los perfiles de desvanecimiento de fluorescencia fueron usados para estimar el área bajo la curva mediante una función de integración o integral de desvanecimiento (ecuación 1). Para verificar la hipótesis, que la integral de desvanecimiento (ID) era función del tamaño genómico de una célula, se estimaron los valores de ID en espermatozoides y eritrocitos de tilapia Mozambica. El valor estimado para espermatozoides ID = 2266.51, mostró ser equivalente a la mitad del valor obtenido para eritrocitos ID = 4521.44. Esta relación representa los valores de tamaños genómicos haploide y diploide para O. mossambicus

(Fig. 20).

Figura 20. Relación de integral de desvanecimiento fluorescente (ID) con el contenido genómico haploide y diploide en eritrocitos de tilapia Mozambica. 70

Los valores medios de ID para cada especie utilizada en el presente estudio como referencia se muestran en la Tabla VII.

Tabla VII. Valor medio y desviación estándar de ID para las especies de valor-C conocido.

Especie Tipo celular n Valor ID O. mossambicus espermatozoide 362 2229.4 ± 99.9 O. mossambicus eritrocito 244 4495.3 ± 83.8 O. mykiss eritrocito 721 15205.2 ± 47.9 H. rufescens espermatozoide 264 5312.8 ± 114.8 H. rufescens hemocito 371 11667.1 ± 117.9 H. fulgens espermatozoide 374 4972.3 ± 130.4 H. fulgens hemocito 214 10592.1 ± 157.2 H. corrugata espermatozoide 399 6404.1 ± 129.5 H. corrugata hemocito 239 12953.2 ± 289.9

Con el objetivo de estimar la variabilidad de los valores de ID en un tipo celular específico y de esta forma calcular el tamaño muestreal necesario para obtener un valor representativo de ID. Una aproximación gráfica, fue desarrollada para estimar el número de núcleos en el cual los descriptores se estabilizan. De esta forma se generaron números aleatorios para ordenar los valores y graficarlos. Esto minimizó el efecto del campo sobre el punto de estabilización del valor ID. De este modo, el punto de estabilización fue representativo del tamaño muestreal. El análisis fue realizado para cada uno de las especies y tipos celulares estudiados. La figura 21 muestra gráficamente la dispersión del promedio

ID a medida que se incrementa el número de núcleos espermáticos en abulones. Del mismo modo, el análisis de la dispersión de la varianza mostró ser estable después de los 100 núcleos medidos. (Fig. 22). 71

Figura 21. Estimación de la media de la integral de desvanecimiento (ID) en espermatozoides de tres especies de abulones. EZR; abulón rojo. EZAZ; abulón azul. EZAM; abulón amarillo. 72

Figura 22. Estimación de la varianza de la integral de desvanecimiento (ID) en espermatozoides de tres especies de abulones. EZR; abulón rojo. EZAZ; abulón azul. EZAM; abulón amarillo. 73

De acuerdo a los resultados obtenidos mediante la medición de ID en los distintos tipos celulares, se procedió a ajustar dichos datos a un modelo lineal junto con los valores de tamaño genómico descritos para dichas especies. A partir del modelo se estimaron los descriptores α y β, con los cuales se determinó la ecuación de la recta:

yˆ =3337.2xˆ + 596.8 ( 2 ) donde xˆ e yˆ representan los valores de tamaño genómico e integral de desvanecimiento

(ID) respectivamente. El valor de correlación obtenido para la relación entre ID y tamaño genómico fue de r = 0.99 (Fig. 23).

Figura 23. Modelo lineal entre tamaño genómico e integral de desvanecimiento. Espermatozoides: EZ, de tilapia; EZR, de abulón rojo; EZAZ, de abulón azul; EZAM, de abulón amarillo. Hemocitos: HemAZ, de abulón rojo; Heme, de abulón rojo; HemAM, de abulón amarillo. Eritrocitos: ERT, de tilapia; ERTr, de trucha arco iris. 74

Para estimar los intervalos de confianza al 95% se determinó la esperanza matemática (Ε) mediante un análisis de Fisher, donde Ε(r) =ϕ , Ε(αˆ)=α y Ε (βˆ) = β (Tabla VIII).

Tabla VIII. Intervalos de confianza (95%) de α , β y ϕ calculado en sobre el modelo lineal.

-95% Parámetros +95% 3321. 8 ≤ α ≤ 3358. 5 581. 4 ≤ β ≤ 805. 8 0.596 ≤ ϕ ≤ 0.999

En referencia a la aplicación del modelo lineal (ecuación 2) para calcular tamaño genómico en muestras problema, se obtuvo la siguiente ecuación:

⎡(IDu + βˆ)⎤ ADNu = ⎢ ⎥ ( 3) ⎣ αˆ ⎦

donde ADNu = valor de tamaño genómico desconocido y IDu = valor medio de ID obtenido para la muestra. Los valores (αˆ ) y (βˆ) representan los valores de pendiente de la recta e intercepto, los cuales a su vez integran la variación del modelo lineal al incrementar el número tipos celulares medidos. De esta forma, la ecuación de la recta podría cambiar a medida que se aumenta el número de puntos, ajustándose cada vez más al valor real de intercepto y pendiente. Sin embargo, al calcular los intervalos de confianza se puede considerar que la ecuación tendrá un comportamiento lineal dentro de los límites de la esperanza matemática (E) calculada en la tabla VIII. Adicionalmente, ésta ecuación es válida únicamente para el intervalo de tamaño genómico 0.81 ≤ ADNu ≤ 4.8 pg. 75

V. 9. Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo del Pacífico Haliotis rufescens

Con la finalidad de determinar la intensidad de fluorescencia en cromosomas teñidos con

DAPI se obtuvo la información de brillo en imágenes de 8 bits, esto permitió convertir las imágenes digitales en pseudocolor para visualizar y cuantificar la intensidad de fluorescencia mediante 256 niveles de brillo (Fig. 24).

Figura 24. a) Imagen original de placa metafásica teñida con DAPI. b) Imagen digital convertida en pseudocolor o en 256 niveles de brillo.

En el presente estudio se utilizó el método de desvanecimiento fluorescente con la finalidad de estimar contenido de ADN cromosómico en abulón rojo H. rufescens. El procedimiento para obtener la medición de fluorescencia a partir de ADN cromosómico se muestra en la figura 25. El primer paso fue identificar y clasificar según el cariotipo de H. rufescens, cada cromosoma capturado a través de mediciones digitales (Fig. 25a). Las imágenes fluorescentes fueron transformadas a pseudocolor en 256 niveles de brillo (Fig.

25b). Con la finalidad de discriminar el trasfondo de la imagen, se generó una máscara binaria capaz de detectar el borde cromosómico (Fig. 25c). Finalmente, la aplicación de la 76

máscara sobre la imagen en pseudocolor (multiplicación entre (b) y (c)) permitió discriminar la información de brillo proveniente del ADN cromosómico (Fig. 25d).

Figura 25. Procedimiento de análisis de ADN cromosómico fluorescente. a) Mediciones cromosómicas, b) Imagen en pseudocolor, c) Máscara binaria para detección de borde, d) Región de ADN cromosómico de interés obtenido por multiplicación entre (b) y (c).

Para demostrar el desvanecimiento fluorescente en un solo cromosoma, la figura 26 muestra una secuencia de imágenes desde la exposición inicial a luz ultravioleta hasta la pérdida total de fluorescencia. Del mismo modo, se obtuvo la curva de desvanecimiento mediante la aplicación de la ecuación 1. La figura 27 muestra la curva de desvanecimiento del cromosoma 16 de H. rufescens. 77

Figura 26. Secuencia de desvanecimiento fluorescente en cromosoma 16 de H. rufescens.

Figura 27. Curva desvanecimiento fluorescente en cromosoma 16 de H. rufescens. 78

Mediante la aplicación del modelo lineal obtenido en la ecuación 3 se determinó el contenido de ADN para cada tipo cromosómico de H. rufescens (Tabla IX). Los valores mayores de contenido de ADN cromosómico fueron encontrados en el par cromosómico 1, mientras que la cantidad menor de ADN fue encontrada en el par cromosómico 18.

Tabla IX. Contenido de ADN en cromosomas de Haliotis rufescens y su conversión a Mega pares de base (Mpb).

Contenido medio de Desviación Cromosoma Mpb* ADN (pg) estándar (pg) 1 0.1106 0.0045 108,201 2 0.1051 0.0098 102,752 3 0.1035 0.0053 101,175 4 0.1010 0.0093 98,824 5 0.0999 0.0077 97,655 6 0.0976 0.0072 95,490 7 0.0997 0.0089 97,474 8 0.0982 0.0099 96,087 9 0.0994 0.0063 97,243 10 0.1006 0.0094 98,393 11 0.0975 0.0104 95,319 12 0.0979 0.0085 95,757 13 0.0969 0.0075 94,784 14 0.0958 0.0087 93,690 15 0.0934 0.0090 91,355 16 0.0939 0.0076 91,825 17 0.0917 0.0077 89,640 18 0.0890 0.0060 87,056 Total 1.7717 0.0050 1,732,720

* Número de pares de base = masa en pg x 0.978x109 (Dolezel et al., 2003). 79

El análisis de varianza realizado para detectar los efectos de variabilidad del contenido de ADN en cromosomas de Haliotis rufescens, mostró diferencias significativas entre los tipos cromosómicos (p<0.001). No obstante, un análisis a posteriori mediante una prueba de Tukey, mostró diferencias estadísticas sólo entre los cromosomas extremos, específicamente entre los cromosomas 1 - 4 y cromosomas 13 -18 (p<0.05). El contenido medio de ADN mostró un incremento significativo desde el cromosoma 18 al par cromosómico 1 (p<0.001) (Fig. 28). La mayor variabilidad de contenidos de ADN fue observada entre los cromosomas 2, 4, 8, 11 y 15.

Figura 28. Contenido medio de ADN en cromosomas de H. rufescens (n=18). Las barras representan dos desviaciones estándar.

80

La correlación entre el contenido de ADN cromosómico y el tamaño cromosómico fue probada mediante la medición tanto de longitud como el área cromosómica. El valor de correlación encontrado fue estadísticamente significativo (p<0.001) para la relación

ADN/longitud (r = 0.8783) (Fig. 29) y ADN/área (r = 0.9066) (Fig. 30). Sin embargo, este aumento en el valor de correlación no fue estadísticamente significativo (p>0.05).

Figura 29. Correlación entre contenido de ADN cromosómico y longitud cromosómica en H. rufescens. Los números representan el par cromosómico según el cariotipo. Líneas discontinuas representan el error estándar del modelo.

81

Figura 30. Correlación entre contenido de ADN cromosómico y área cromosómica en H. rufescens. Los números representan el par cromosómico según el cariotipo. Líneas discontinuas representan el error estándar del modelo.

Con el propósito de determinar el contenido de pares de base de cada cromosoma, se asumió que el número de pares de base (pb) es equivalente a la masa en picogramos (pg) x

0.978x109 pb (Dolezel et al., 2003). Adicionalmente, la cantidad total de contenido de ADN cromosómico obtenido por la suma de todos los valores cromosómicos fue equivalente al tamaño genómico de H. rufescens, 1.7717 ± 0.0050 pg o 1,732,724 convertidos en Mega pares de bases (Mpb).

82

V. 10. Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus

5. 10. 1. Mediciones morfológicas

La longitud media de concha fue registrada en 7.69 ± 1.290 y 6.97 ±0.481 cm para las poblaciones de Tongoy y Arica respectivamente, mientras que la razones alc/lc fue 1.063 ±

0.027 y 1.064 ± 0.021, y las razones anc/lc fueron 0.339 ±0.019 y 0.443 ± 0.023, respectivamente. El análisis estadístico no mostró diferencias significativas entre las medias de longitud de concha (t(17)=2.03, p=0.058) o entre las medias de la razones anc/lc (t(28)= -

0.12, p=0.90) para ambas poblaciones. No obstante, la media de las razones alc/lc de la población de Tongoy fue estadísticamente menor que la población de Arica (t(28)= -13.50, p<0.0001).

5. 10. 2. Análisis de tamaño genómico mediante desvanecimiento fluorescente

La población de Arica mostró un mínimo de tamaño genómico o valor-C de 0.932 pg y un máximo de 1.179 pg de ADN. El número total de núcleos medidos fue de 5,628. La variación individual (desviación estándar) fue menor que 0.32 pg de ADN en todos los organismos muestreados. La población de Tongoy en cambio, mostró un tamaño genómico mínimo de 1.044 pg de ADN y un máximo valor de 1.285 pg de ADN en 7,538 núcleos medidos. La variación individual fue entre 0.105 pg y 0.397 pg (Tabla X).

83

Tabla X. Medición de tamaños genómicos en dos poblaciones de A. purpuratus mediante análisis de imágenes fluorescentes (n=15 individuos).

Ejemplares de Número de Desviación Valor-C Arica núcleos estándar 1 420 1.106 0.177 2 168 1.023 0.094 3 387 1.053 0.319 4 116 1.063 0.130 5 194 1.120 0.156 6 601 1.088 0.093 7 930 1.103 0.148 8 595 1.043 0.249 9 370 0.932 0.121 10 457 1.094 0.150 11 257 1.016 0.319 12 379 0.994 0.259 13 333 1.078 0.148 14 223 1.179 0.314 15 188 1.089 0.172 Total 5,628 1.057* 0.057*

Ejemplares de Número de Desviación Valor-C Tongoy núcleos estándar 1 463 1.164 0.284 2 446 1.084 0.181 3 135 1.082 0.105 4 427 1.201 0.389 5 654 1.044 0.243 6 485 1.197 0.173 7 942 1.261 0.300 8 396 1.106 0.171 9 555 1.231 0.285 10 450 1.198 0.267 11 486 1.070 0.172 12 502 1.285 0.397 13 662 1.093 0.210 14 515 1.141 0.216 15 420 1.106 0.177 Total 7,538 1.139* 0.066*

*Valores medio 84

La variación inter-individuos (n=15) fue menor al 6% para ambas poblaciones

(coeficiente de variación). Mientras que la variación del tamaño genómico mostró una estabilidad tanto en media como en varianza cercana a los 1000 núcleos medidos (Fig. 31 y

Fig. 32). En este contexto, es posible obtener un valor-C representativo en un tamaño muestreal de 150 núcleos medidos por organismo.

Figura 31. Variación de valor-C en población Arica de A. purpuratus. El valor-C fue calculado por aproximación de desvanecimiento fluorescente en núcleos de hemocitos.

La población de Arica mostró un tamaño genómico de 1.057 ± 0.057 pg de ADN. Los intervalos de confianza calculados al 95% fueron 1.026 ≤ valor-C ≤ 1.089 pg de ADN. La población de Tongoy mostró un valor-C de 1.139 ± 0.066 pg de ADN. Los intervalos de confianza calculados fueron 1.102 ≤ valor-C ≤ 1.175 pg de ADN. 85

Figura 32. Variación de valor-C en población Tongoy de A. purpuratus. El valor-C fue calculado por aproximación de desvanecimiento fluorescente en núcleos de hemocitos.

El análisis de varianza realizado para detectar diferencias a nivel individual y poblacional del tamaño genómico de A. purpuratus, mostró que existen diferencias estadísticas entre ambas poblaciones (p=0.0011). De este modo, el tamaño genómico de la población de Tongoy fue significativamente mayor comparado con organismos de la población de Arica, 1.139 ± 0.066 pg y 1.057 ± 0.057 pg respectivamente. La contribución de los diferentes niveles muestreales (individuos, población y error) al total de la varianza del tamaño genómico fue analizado mediante una prueba ANOVA de dos vías anidado

(Tabla XI). La subdivisión de los porcentajes de varianza atribuidos a cada nivel mostró que la varianza del error (variación intra-individual) representa <1% del total. De este 86

modo, la mayor parte de la variación en el tamaño genómico ocurre entre las poblaciones.

Adicionalmente, el análisis de la variación inter-individual mostró que existen diferencias estadísticamente significativas cercanas al 6% de contenido de ADN nuclear para ambas poblaciones.

Tabla XI. Prueba ANOVA para tamaños genómicos de dos poblaciones de A. purpuratus.

Fuente de variación SC GL MC F p Población 15.87 1 15.87 277.3 <0.001 Individuo (dentro de población) 59.82 28 2.12 37.0 <0.001 Error 739.67 12926 0.06

87

VI. 1. Relaciones cromosómicas entre Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata

La concepción genético-poblacional de especie se entiende como un sistema biológico discreto e integrado de organismos reproductivamente aislados de otros sistemas de características similares (Maynard, 1989). Dentro de los factores que llevarían a la diferenciación de especies, la segregación espacial no constituye un requisito ineludible para que surja el aislamiento reproductivo. Desde un punto de vista genético, los reordenamientos cromosómicos, entre otros factores, constituyen importantes mecanismos involucrados en el aislamiento reproductivo poscigótico, por su incidencia en la meiosis de los eventuales híbridos (Maynard, 1989). Las inversiones pericéntricas y las translocaciones de brazos cromosómicos, combinados con cambios como borrados y duplicaciones en tándem de secuencias de ADN de mediana y alta repetición, así como las 88

secuencias dispersas transponibles, son reordenamientos que han sido claves en la especiación de varios taxa de animales (Fontdevila, 1987). Estos reordenamientos, llevarían a variaciones en la morfología cromosómica basados en cambios de la longitud relativa de los brazos cromosómicos involucrados, así como a modificaciones en el tamaño absoluto de los cromosomas (Bianchi et al., 1988).

La distribución simpátrica de Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata, permite suponer la existencia de mecanismos que impiden, al menos parcialmente, el flujo génico entre estas especies. Los mecanismos de aislamiento reproductivo pueden ser clasificados en: pre-copulatorios (aislamiento estacional-hábitat, etológico y mecánico) y pos- copulatorios (mortalidad gamética, mortalidad cigótica, inviabilidad del híbrido y esterilidad híbrida) (Maynard, 1989). Sin embargo, estudios en poblaciones naturales de abulones han descrito la presencia de híbridos en seis especies de abulones en la costa de

California (Owen et al., 1971). La evidencia de hibridación natural en poblaciones de abulones fue aportada por características morfológicas intermedias y reacciones inmunológicas. Posteriormente, Leighton y Lewis (1982) llevaron a cabo una serie de cruzas experimentales con cuatro especies de abulones. Cruzas entre hembras de H. rufescens y machos de H. corrugata, H. fulgens y H. sorenseni, demostraron que es posible obtener entre un 30-60% de desarrollo embrionario en fertilizaciones efectuadas dentro de los primeros 30 minutos posdesove. En los cruces realizados entre hembras de H. rufescens y machos de H. fulgens se observan que las F1 y F2 son fértiles. Las mejores tasas de crecimiento fueron encontradas en híbridos de H. rufescens x H. sorenseni y H. rufescens x H. fulgens respectivamente. La evidencia aportada por el registro de híbridos naturales (Owen et al., 1971), así como las cruzas experimentales, demuestra que existe una 89

estrecha relación filogenética entre las especies de haliótidos de la costa de California y

Baja California. Asimismo, las diferencias en los porcentajes de desarrollo embrionario y supervivencia larvaria encontradas en los experimentos de cruzas (Leighton y Lewis,

1982), se pueden explicar en términos de inestabilidad cromosómica del híbrido, sin embargo, dichos estudios no han sido realizados hasta el momento.

Las primeras evidencias de las relaciones filogenéticas en abulones de California fueron aportadas mediante comparación de hemocianinas por Meyer (1967). El grado de interacción inmunológica mostró que H. rufescens, H. sorenseni, H. kamtschatkana assimilis estarían cercanamente relacionadas, mientras que H. corrugata, H. fulgens, H. walallensis aparecen moderadamente distantes. Adicionalmente, el análisis mostró que H. cracherodii sería una especie con una mayor diferenciación genética (Fig. 1).

Posteriormente, los análisis de secuenciación de la lisina llevados a cabo por Lee y

Vacquier (1995) y Swanson y Vacquier (1998) mostraron que H. cracherodii se encuentra más relacionado con H. corrugata y ambos a su vez con los abulones japoneses H. gigantea y H. discus hannai. Adicionalmente estos estudios dejaron a una distancia genética mayor a

H. fulgens en comparación con las otras especies de abulones Californianos (Fig. 2).

Recientemente, estudios realizados por Coleman y Vacquier (2002) en secuenciación de

ITS (internal transcribed spacer) de genes ribosomales de la subunidad 5.8S, mostraron que esta última a pesar de ser altamente conservada dentro del género Haliotis y no aporta información relevante para la reconstrucción filogenética, los ITS1 e ITS2 proveen información de longitud y composición de base similar a la encontrada en la mayoría de los eucariontes (Badwin, 1992). Los alineamientos de las secuencias ITS en todas las especies de abulones de California confirma la presencia de dos principales agrupamientos. El 90

primero conformado por H. sorenseni, H, walallensis y H. rufescens y el segundo conformado por H. corrugata y en estrecha relación con los abulones japoneses como H. discus hannai. Las especies de H. fulgens y H. cracherodii aparecen filogenéticamente más distantes con respecto a los agrupamientos anteriores. En este sentido, la evidencia aportada por el presente estudio en cuanto a la comparación cromosómica en tres especies de abulones de Baja California, es congruente con la evidencia aportada por los estudios de secuenciación de genes, debido a que muestra que H. rufescens y H. corrugata son entre sí más similares que cualquiera de ellas con respecto a H. fulgens. Del mismo modo, los análisis estadísticos muestran que de los 18 pares cromosómicos que posee cada uno de los cariotipos promedios, 8 pares son iguales en las tres especies estudiadas, 7 son propios de

H. fulgens, 3 de H rufescens, y 2 de H. corrugata. De acuerdo a Thiriot-Quiévreux (1994) dentro de la evolución cromosómica de ciertos organismos acuáticos es frecuente encontrar un incremento en tipos cromosómicos submetacéntricos y telocéntricos debido principalmente a procesos de fisión cromosómica. En este sentido, el bajo número de cromosomas propios de H. corrugata, así como un mayor número de pares metacéntricos

(10 pares) con respecto a las otras especies estudiadas demuestra una condición basal o filogenéticamente muy cercana a los abulones japoneses como H. discus hannai.

Adicionalmente, dada la evidencia cromosómica descrita es posible ubicar a H rufescens en una posición evolutivamente intermedia, mientras que la mayor cantidad de cromosomas propios de H. fulgens demuestra que esta especie se encuentra filogenéticamente más alejada y probablemente con cambios cromosómicos más recientes evolutivamente. El análisis de similitud cromosómica o patrón de agrupamiento demuestra que H. rufescens comparte más pares cromosómicos con H. corrugata (14 pares) con lo cual quedan unidos 91

dentro de un grupo, mientras que el menor número de cromosomas compartidos H. fulgens

(menos del 50%) deja fuera del agrupamiento al abulón azul (Fig. 15).

En referencia a la distribución biogeográfica de la familia Haliotidae, se han propuesto tres hipótesis; modelos del borde Pacífico, Indo-Pacífico y Tethys (Geiger y Groves, 1999).

El modelo del borde Pacifico, sustenta que el origen de la familia estaría en la zona del

Noreste de Australia. En este sentido, el punto de radiación de la familia estaría relacionado con procesos de dispersión larval provenientes desde Japón. Por otra parte, el modelo Indo-

Pacífico describe a esta zona como centro de radiación, debido principalmente a la alta correlación existente entre la diversidad actual de una especie y de su origen biogeográfico.

El tercer modelo denominado Tethys, sustenta la radiación de la familia desde el

Mediterráneo (mar de Tethys) hasta el Pacifico nororiental. Según este modelo, la radiación puede ser explicada con base en el número cromosómico de las especies de abulones actualmente descritas, el cual se incrementa desde el Mediterráneo, siendo representativo

H. tuberculata (2n = 28) (Arai y Wilkins, 1986), moviéndose hacia la región Indo-Pacífico

(2n =32) (Jarayabhand et al., 1998) y finalmente llegando hasta la región del Pacifico Norte

(2n=36) (Nakamura, 1986). No obstante, los antecedentes cariotípicos de esta última región han sido aportados principalmente por especies distribuidas en la costa del Pacífico occidental, mientras que el abulón negro, Haliotis cracherodii (2n=36) (Minkler, 1977), era la única especie reportada para la costa del Pacífico oriental de Baja California. En este contexto, la información cariotípica descrita para H. rufescens (8M+9SM+1ST), H. fulgens

(8M+8SM+2ST) y H. corrugata (10M+7SM+1ST), aporta nueva información para haliótidos distribuidos sobre la costa de California. El número cromosómico diploide descrito en las tres especies estudiadas (2n=36), corrobora una condición conservada entre 92

las especies de abulones del Pacífico Norte. Con lo cual el presente estudio aporta nuevos antecedentes para sustentar el modelo de Tethys en cuanto a la distribución biogeográfica de la familia Haliotidae.

VI. 2. Desarrollo de citogenética molecular en moluscos: aplicación en abulones de Baja

California

En las últimas décadas, los estudios citogenéticos realizados en moluscos marinos están viviendo un desarrollo muy rápido debido a la introducción de nuevas técnicas moleculares.

Así, las técnicas clásicas de bandeo han ido completándose con otras más precisas de caracterización y localización de secuencias o regiones cromosómicas. Sin embargo, a pesar de esta revolución técnica, el estudio de especies de las que se tiene un desconocimiento citogenético casi absoluto, hace imprescindible el uso de todo tipo de herramientas para una mejor aproximación al conocimiento cromosómico de estas especies.

Así, por ejemplo, en la década de los 80s, los trabajos en moluscos se limitaban al cariotipo, análisis de la aneuploidía (Thiriot-Quiévreux, 1984), bandeos G y C y algunos análisis de regiones organizadoras del nucleolo (NORs) (Thiriot-Quiévreux y Ayraud,

1982; Dixon et al., 1986). En la década de los 90s, el número de especies a las que se aplicaron estas técnicas aumentaron (Thiriot-Quiévreux y Insua, 1992) y las técnicas usadas se ampliaron a otras como las técnicas de bandeo de restricción y el uso de fluorocromos, que junto a las de bandeo C permitieron analizar, entre otras, secuencias heterocromáticas presentes en los cromosomas (Martínez-Lage et al., 1994). Sin embargo, no fue sino hasta finales de los 90s, cuando aparecen los primeros trabajos moleculares usando FISH de 93

genes ribosómicos en moluscos con interés comercial como los mejillones del género

Mytilus (Insua y Méndez, 1998) y en ostiones del género Crassostrea (Zhang et al., 1999b), junto con análisis descriptivos de las Ag-NOR y bandeo G (Leitao et al., 1999) en C. angulata. A partir del año 2000, el número de especies de moluscos que se analizaron con

FISH aumentó: Donax trunculus (Plohl et al., 2002), Oxynoe olivacea (Vitturi et al.,

2000b), Fasciolaria lignaria (Vitturi et al., 2000a), Melarhaphe neritoides (Colomba et al.,

2002) y en C. angulata aparecen trabajos de variabilidad de Ag-NOR y los primeros resultados de FISH con genes ribosómicos (Cross et al., 2003).

Para la localización de los genes ribosómicos las técnicas que se emplean son varias.

Por un lado la de impregnación argéntica (AgNOR) que detecta las NOR que han estado activos en la interfase anterior a la metafase en estudio. Sin embargo, a pesar de la utilidad de esta técnica, se puede subestimar la existencia de otras regiones con genes ribosómicos y por ello se utiliza la tinción con CMA3 que detecta las secuencias ricas en G-C asociadas a los NOR. Esta técnica permite ver cambios estructurales como variaciones en el número de copias de estos genes. Por último, el uso de sondas ribosómicas en las hibridaciones in situ de fluorescencia, permiten localizar con precisión los genes que codifican para las subunidades 18S-5.8S-28S que forman los NORs. La mayoría de los trabajos realizados en moluscos se han centrado en los bivalvos, principalmente en los que tienen mayor valor comercial. Así los NORs se ha localizado mediante FISH en varias especies de ostiones, mejillones y almejas (Martínez-Expósito et al., 1997; Insua et al., 1999; Zhang et al.,

1999b; Xu et al., 2001; Cross et al., 2003; Wang et al., 2004).

En referencia a abulones y en nuestro conocimiento, sólo existe un estudio de localización de NOR mediante impregnación argéntica en el abulón japonés H. discus 94

hannai (Okumura et al., 1999). Dicho estudio, localiza terminalmente a los NOR en los brazos largos de dos pares cromosómicos. Sin embargo, la localización específica mostró ser altamente variable entre cromosomas metacéntricos así en como submetacéntricos.

Estos resultados pueden deberse a que las Ag-NOR sólo pueden ser observadas en estados transcripcionalmente activos. La tinción de plata sólo es capaz de teñir a las NOR cuando estás se expresan durante la última interfase, debido a que la plata se une a un complejo

ácido proteico asociado con el nucléolo y ARN (Jordan, 1987). Adicionalmente, la utilización de FISH permite identificar específicamente todos los clusters del gen ribosómico, independientemente de su estado transcripcional. En este contexto, el presente estudio en abulones es el primero en describir la localización física de los genes que codifican las subunidades mayores ribosómicas (18S-5.8S-28S) mediante la aplicación de

FISH. De acuerdo a nuestros resultados dicho gen fue localizado en las regiones teloméricas de los brazos largos en dos pares cromosómicos submetacéntricos. En H. rufescens las principales señales de hibridación de NOR se encontraron en los pares 4 y 5, mientras que en H. fulgens y H. corrugata se observaron en los pares cromosómicos 4 -11, y 2 - 4 respectivamente. La condición conservada del tipo cromosómico (submetacéntrico) de los NOR y la similitud del cromosoma 4 con presencia del gen en las tres especies, probablemente evidencie el origen filogenético común. No obstante, la presencia de polimorfismos en la localización del gen entre cromatidas hermanas y cromosomas homólogos fue encontrada altamente variable, así como la presencia de señales de hibridación intersticial de baja intensidad. Este resultado puede indicar la variabilidad del número de copias del gen en el genoma, así como sus posibles errores de síntesis durante la replicación del ADN. En este sentido, la variabilidad de los clusters del gen también se han 95

reportado en otras especies de moluscos (Pascoe et al., 1996; Martínez-Expósito et al.,

1997; Torreiro et al., 1999; Cross et al., 2003).

Dentro de las aplicaciones de FISH, varios tipos de secuencias han resultado muy útiles como sondas en los estudios de caracterización de la cromatina. Una de ellas es la secuencia repetida telomérica (TTAGGG)n que se encuentra en los cromosomas de todos los vertebrados. En invertebrados su distribución es más heterogénea. Así, se encuentra en los cromosomas de moluscos como Crassostrea gigas (Guo y Allen, 1997), Melarhaphe neritoides (Colomba et al., 2002) y Cerethium vulgatum (Vitturi et al., 2002), pero ausente en otras como Oxynoe olivacea (Vitturi et al., 2000b). Su estudio resulta por tanto de gran interés para el análisis filogenético, ya que son consideradas específicas de grupos

(Blackburn, 2001). Adicionalmente, la aplicación de sondas teloméricas en el presente estudio, demostró que esta secuencia es encontrada fundamentalmente en los telómeros de los cromosomas de abulones, lo cual hace evidente el alto grado de conservación de esta secuencia entre los eucariotas.

Por otro lado, la secuencia repetida GATA también se ha analizado en otros organismos mediante FISH. La utilización de sondas GATA en el presente estudio de abulones permitió detectar la presencia de este microsatélite, y por tanto la presencia de secuencias altamente repetitivas de A-T en el genoma de los organismos. No obstante, la localización específica de este microsatélite mostró ser altamente variable. Por otro lado, esta secuencia se ha descrito en un amplio rango de eucariota y en algunos casos se ha observado una asociación con el sexo (Jones y Singh, 1985). Hasta el momento, en moluscos sólo se ha estudiado en F. lignaria (Vitturi et al., 2000a) y M. neritoides (Colomba et al., 2002). El presente estudio aporta con el registro de tres especies más. 96

Finalmente en los últimos años existe un gran interés por el estudio de la organización y localización de los genes ADNr 5S, que forman la otra familia multigénica de los genes ribosómicos. Los genes de ADNr 5S se agrupan en repeticiones en tandem en los que cada repetición consiste en una región codificante muy conservada de 120 pb y un espaciador no transcrito (NTS) de longitud y secuencia muy variable. En muchos organismos los genes que codifican las subunidades mayores (18S-5.8S-28S) se encuentran en diferente posición en el genoma que los del ADNr 5S (Drouin y Moniz de Sá, 1995). Sin embargo, también se ha descrito co-localizados en el genoma mediante FISH (Drouin y Moniz de Sá, 1995;

Mandrioli et al., 2000; Martins y Galetti Jr., 2001). Todo esto, unido a la alta diferenciación de los NTS entre especies, hace de este gen un perfecto marcador citogenético de gran interés para los estudios evolutivos en especies relacionadas. Hasta el momento, existen muy pocos trabajos realizados en organismos marinos, y en moluscos sólo se ha realizado en los mejillones M. edulis y M. galloprovincialis (Insua et al., 2001), el berberecho C. edule (Insua et al., 1999), el pectínido A. opercularis (Insua et al., 1998), el prosobranquio

M. neritoides (Colomba et al., 2002).

VI. 3. Desarrollo de un método de cuantificación de contenido de ADN genómico mediante análisis de imágenes fluorescente

El tamaño genómico es conocido por variar considerablemente entre especies, no obstante es relativamente constante entre individuos de una misma especie (Hancock, 2002). De este modo, el grado de variabilidad entre las especies ha sido descrito como más de 200,000 veces entre los eucariontes (Gregory, 2001b). Sin embargo, la mayor o menor cantidad de 97

ADN no guarda ninguna relación con la complejidad del organismo. Diversas hipótesis han sido propuestas para explicar esta variación de tamaño genómico. La teoría del gen egoísta sugiere que la acumulación de ADN genómico a través del tiempo evolutivo puede ser resultado del proceso de replicación celular, de esta forma el aumento de tamaño genómico cesa cuando éste comienza a comprometer la viabilidad celular (Orgel y Crick, 1980). De acuerdo a lo anterior, tamaños celulares mayores pueden tolerar mayor cantidad de ADN y de esta forma influenciar en el grado de adecuación biológica de una especie a través de un efecto nucleoesquelético (Cavalier-Smith, 1978). De esta forma, el tamaño genómico puede ser considerado como un carácter selectivo debido a que un aumento en el tamaño celular necesita asimismo un incremento nuclear para preservar el balance metabólico (Cavalier-

Smith y Beaton, 1999).

Avances recientes en computación y la tecnología de análisis de imágenes han permitido obtener estimaciones rápidas y confiables de la cantidad de ADN nuclear que poseen diversas especies (Hardie et al., 2002). En este sentido, la densitometría mediante análisis de imágenes ha sido ampliamente aceptada como un método preciso de cuantificación de ADN genómico (Bertino et al., 1994) y de esta forma utilizado en la estimación de tamaño genómico tanto en plantas como en animales (Hardie et al., 2002).

No obstante, la desventaja de esta metodología radica básicamente en dos aspectos; el protocolo de tinción o específicamente de reacción de Feulgen y el proceso de cuantificación. La reacción de Feulgen se ha utilizado principalmente en densitometría de

ADN debido a que la coloración obtenida en presencia de ADN obedece a una serie de reacciones químicas, con lo cual la intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de ADN contenido en un núcleo. Sin embargo, para que ocurra la reacción de 98

Feulgen se necesario producir una hidrólisis del contenido nuclear y de esta forma dejar en contacto el reactivo de Schiff (principal componente de la reacción) con el ADN genómico. Las condiciones de la hidrólisis han sido realizadas tanto en un medio de ácido débil (HCl 1N a 60°C) o en un medio ácido fuerte (HCl 5 N a 20-30°C). De esto, se puede considerar que las condiciones de reacción son altamente variables entre protocolos y tipos celulares estudiados, con lo cual es necesario una estandarización rigurosa tanto de los reactivos, fijación de muestra y tiempos de hidrólisis (Schulte, 1991). En referencia al proceso de cuantificación, la densitometría de Feulgen requiere cuantificar la absorbancia de la luz sobre los núcleos teñidos dado que ésta es directamente proporcional a su concentración. Sin embargo, la medición de absorbancia es relativamente compleja, por lo cual debe ser estimada indirectamente a través de la transmitancia. En este sentido, la transmitancia representa la luz incidente que no es alterada por algún medio capaz de absorberla. La problemática de esta aproximación, es que la captura digital desprecia los fenómenos intrínsicos de la luz como son reflexión y refracción. De este modo, la luz que pasa a través de una muestra siempre será afectada por partículas, suciedad, edad de la muestra, tipos celulares, etc.

En el campo de la microscopía de fluorescencia, el retardo en el desvanecimiento de la fluorescencia desde imágenes iniciales de alta intensidad a imágenes de mayor ruido de fondo producto de la pérdida de fluorescencia, es uno de los factores más importantes en la obtención de calidad fotográfica (Ono et al., 2001). Dentro de la variedad de fluorocromos existentes específicos para ADN, el DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole) es el más ampliamente utilizado debido a su intensidad fluorescencia. Sin embargo, la fluorescencia de DAPI se pierde rápidamente al ser expuesto a luz ultra violeta y especialmente bajo 99

condiciones optimas de observación como longitud de onda de máxima excitación y lentes objetivos de alta apertura numérica (Johnson y Nogueira-Araujo, 1981). Por otro lado, el proceso fotoquímico bajo el cual la fluorescencia decrece no ha sido explicado en su totalidad, existiendo algunas teorías que sugieren procesos oxidativos y desnaturalización de proteínas asociadas a ADN (Hirschfeld, 1979; Johnson et al., 1982). Adicionalmente, con la finalidad de retardar el proceso de desvanecimiento se han propuesto diversos métodos en microscopía (Ono et al., 2001), no obstante todos ellos se basan en tratar de remover o disminuir la difusión de oxigeno de la muestra teñida con algún fluorocromo. La idea es tratar de disminuir el proceso oxidativo del fluorocromo y de esta forma retardar la pérdida de fluorescencia. Debido a esto, actualmente todas las observaciones fluorescentes en microscopía utilizan medios de montaje capaces de aumentar la viscosidad de la muestra y así retardar la difusión de oxígeno.

De acuerdo con los resultados aquí obtenidos, se encontró evidencia que el desvanecimiento fluorescente en núcleos teñidos con DAPI es función del tiempo de exposición a luz ultravioleta. Mediante procedimientos de análisis de imágenes fue posible estimar el área bajo la curva de desvanecimiento y de esta forma establecer una unidad de medida (integral de desvanecimiento, ID) de la pérdida de fluorescencia en núcleos teñidos con DAPI. Adicionalmente, mediante la estimación de IDs en varios tipos nucleares, se observó que dicho proceso es característico de una especie en particular o tipo celular específico. En este sentido, el presente estudio demostró mediante la comparación de IDs provenientes tanto de espermatozoides como de eritrocitos de tilapia Mozambica, que el comportamiento del desvanecimiento fluorescente guarda una estrecha relación con las cantidades de ADN nuclear haploide y diploide respectivamente. Ahora bien, si los valores 100

de ID son característicos de una especie o tipo nuclear específico, su relación con diferentes tamaños nucleares puede ser ajustado a un modelo matemático. En este contexto, el presente estudio determinó que existe una relación lineal entre el tamaño genómico y el valor calculado de ID. De este modo, dado que el valor de ID medido en un tipo celular específico es directamente proporcional con respecto al tamaño genómico, es posible entonces estimar tamaños genómicos desconocidos mediante la aplicación de la ecuación lineal propuesta en el presente trabajo doctoral.

VI. 4. Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo Haliotis rufescens

Por varias décadas los cromosomas han sido analizados mediante técnicas convencionales cariológicas, las cuales dependen de la caracterización de patrones de bandeo a lo largo de cada cromosoma en particular. La mayor desventaja de los patrones de bandeo es la limitada resolución en algunas especies (Langer et al., 2004). Alternativamente, análisis cromosómicos computarizados se han aplicado principalmente en cromosomas de mamíferos, con lo cual actualmente existen una variedad de paquetes computacionales capaces de agilizar los análisis citogenéticos clínicos en humanos (Weierich et al., 2003).

En plantas, sistemas analizadores de imágenes cromosómicas, han permitido aplicar procedimientos de identificación y clasificación cromosómica en una variedad de estudios de citogenética vegetal (Fukui et al., 1998; Kato y Fukui, 1998; Lee et al., 2004).

Alternativamente, la estimación de contenidos de ADN cromosómico se ha utilizado como una vía de identificación y mapeo cromosómico (Dolezel et al., 2004). Sin embargo, el principal método aplicado para estimar contenido de ADN cromosómico, ha sido la 101

citometría de flujo. Dicha técnica, emplea cromosomas aislados en una suspensión con presencia de uno o dos fluorocromos. Mediante la incidencia de un láser sobre los cromosomas es posible obtener un registro de la cantidad de ADN a través de la cuantificación de la fluorescencia. La desventaja de este método, es que requiere un gran número de cromosomas en suspensión para minimizar las variaciones debidas a patrones de condensación (Langlois et al., 1982).

Estudios citogenéticos en invertebrados y en especial en moluscos son particularmente problemáticos debido al pequeño tamaño cromosómico. Adicionalmente, la aplicación de citometría de flujo en cromosomas de moluscos se ve dificultada por la actual imposibilidad de obtener líneas celulares in vitro (Rinkevich, 1999). En este contexto, el presente estudio representa un método alternativo para estimar contenido de ADN cromosómico en moluscos mediante análisis de imágenes fluorescentes. Nuestros resultados, mostraron una correlación positiva (p<0.001) entre el contenido de ADN y los respectivos tamaños cromosómicos de H. rufescens, de este modo los valores de correlación estimados fueron superiores al 87%. Las variaciones encontradas entre el tamaño cromosómico y la cantidad de ADN pueden ser debidas a variaciones en los patrones de condensación cromosómica. En este sentido, según Zhang et al. (1999a) es posible encontrar en moluscos una variación morfológica de los cromosomas de alrededor del 9% entre diferentes placas metafásicas provenientes de distintas preparaciones y tejidos.

No obstante, a pesar de existir dicha variabilidad morfológica la suma de contenidos individuales de ADN cromosómico (1.7717 ± 0.0050 pg), muestra una estrecha relación el tamaño genómico descrito para H. rufescens (1.8 pg) (Hinigardner, 1974).

102

VI. 5. Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus mediante análisis de imágenes fluorescentes

La estimación del tamaño genómico del bivalvo A. purpuratus, fue planteado inicialmente como una aplicación directa del método propuesto de desvanecimiento fluorescente en una especie en la cual hasta el momento no existen antecedentes de su valor-C, a pesar que han sido descritas otras características citogenéticas como constitución cariotípica y localización de NOR (Gajardo et al., 2002; von Brand-Skopnik y Ibarra-Humphries, 2002).

Nuestros resultados mostraron diferencias estadísticamente significativas en dos poblaciones de A. purpuratus (p=0.0011). La población de Tongoy mostró un tamaño genómico significativamente mayor con respecto a la población de Arica, con valores medios de 1.139±0.066 pg y 1.057±0.057 pg de ADN respectivamente. Según Dolezel et al. (2003), 1 pg es equivalente a 0.978 x 109 pb, de esta forma la diferencia entre ambas poblaciones fue de 8.019 x 107 pb. Los valores encontrados de variación de tamaño genómico a nivel inter-individual fue equivalente al 6% de contenido de ADN genómica para ambas poblaciones. En este contexto, Rodriguez-Juiz et al. (1996) describieron una variación significativa del contenido de ADN nuclear entre individuos de la misma especie, así como también entre diferentes especies de bivalvos. Dicho estudio mostró que un alto porcentaje de la variación del tamaño genómico fue localizada a nivel de especies (97%), mientras que a nivel de individuos de la misma especie la variación encontrada fue del 7%.

Estos datos y nuestros resultados (6%) sugieren que una fracción significante del genoma en moluscos es capaz de variar entre individuos de la misma especie sin consecuencias fenotípicas o biológicas. Adicionalmente el valor-C descrito en el presente estudio para A. 103

purpuratus fue encontrado muy cercano a A. irradians (valor-C = 1.2 pg) y dentro del intervalo descrito para otras especies de pectínidos.

La explicación de la variación del tamaño genómico en las dos poblaciones estudiadas de A. purpuratus puede centrarse en diferentes aspectos de la evolución del contenido de

ADN en eucariontes. Estudios recientes en poblaciones de Drosophila han descrito cambios en el tamaño genómico producidos por la activación de elementos transponibles

(ETs) y asociados con la incursión de los organismos en nuevos hábitats (Viera et al.,

2002). El principal cuestionamiento que emerge de este resultado es que el número de sitios de inserción de ETs sobre las zonas de eucromatina solo contribuye con el 5 a 9% de la variación total de tamaño genómico observada. Esto sugiere que la variación del tamaño genómico puede ser causada por otros factores (Kidwell, 2002), así como también por la inserción de ETs en la eucromatina. Un antecedente importante es que las poblaciones utilizadas para estimar el tamaño genómico de A. purpuratus provinieron tanto de una población silvestre (Arica) como de una población de cultivo (Tongoy). En este sentido es difícil atribuir que el aumento del tamaño genómico en la población de Tongoy sea debido a un proceso de domesticación. Sin embargo, en las últimas tres décadas esta especie de bivalvo se han cultivado exhaustivamente en Bahía de Tongoy, Chile (Gajardo y Núñez,

1992). Probablemente, el manejo de la producción larval y el método de selección de semilla hayan originado un proceso selectivo hacia un genotipo en particular, lo cual puede evidenciarse por el análisis morfológico realizado en los organismos utilizados para estimar el tamaño genómico. Dicho análisis mostró diferencias estadísticas (p<0.0001) entre la morfología de la concha de ejemplares de Tongoy (más aplanados) y ejemplares de Arica

(menos aplanados). En referencia a estudios genéticos poblacionales en esta especie, 104

desafortunadamente se han realizado pocos estudios utilizando marcadores de ADN (von

Brand-Skopnik y Ibarra-Humphries, 2002). Sin embargo, análisis cariotípicos en A. purpuratus (Gajardo et al., 2002) mostraron evidencia de diferencias cromosómicas a nivel poblacional y particularmente en 7 pares cromosómicos de los 32 pares de la especie.

Dicho estudio, utilizó dos poblaciones de cultivo y una de origen silvestre.

105

A través de la utilización de procesamiento de imágenes es posible mejorar imágenes capturadas con presencia de ruido y bajo contraste. Su aplicación en citogenética nos permitirá obtener mediciones más exactas sobre la morfología cromosómica al mejorar la calidad de las imágenes.

Las observaciones cariológicas en células larvales de abulón rojo Haliotis rufescens, abulón azul H. fulgens y abulón amarillo H. corrugata, mostraron un número diploide igual a 36 cromosomas.

La relación de longitudes de los brazos cromosómicos fue utilizada para graficar el cardiograma representativo para la especie. Éste indicó que el abulón rojo posee ocho pares metacéntricos (1, 3, 6, 7, 14, 15, 17 y 18), nueve pares submetacéntricos (2, 4, 5, 8, 9, 10,

11, 12 y 13) y un par cromosómico clasificado como subtelocéntrico (16). El carioidiograma obtenido para el abulón azul mostró que esta especie posee ocho pares 106

metacéntricos (1, 3, 6, 9, 10, 16, 17 y 18), ocho pares submetacéntricos (2, 4, 5, 7, 8, 11, 12 y 13), y dos pares de cromosomas subtelocéntricos (14 y 15). Para el abulón amarillo el cariotipo consistió en diez pares metacéntricos (1, 3, 6, 9, 10, 11, 14, 15, 17 y 18), siete pares submetacéntricos (2, 4, 5, 7, 8, 12 y 13), y un par de cromosomas subtelocéntricos

(16).

El uso de sondas ribosómicas a través de hibridaciones in situ de fluorescencia (FISH) en las tres especies de abulones estudiadas, permitió la localización cromosómica de los genes que codifican para las subunidades 18S-5.8S-28S y que forman principalmente las

NORs. Dicha sondas evidenciaron en las tres especies, dos principales clusters del gen ribosómico localizados en las regiones teloméricas de cromosomas del tipo submetacéntricos. Del mismo modo, las tres especies comparten un NOR localizado en el cromosoma 4, mientras que el segundo NOR fue observado en el cromosoma 5 en abulón rojo, cromosoma 11 en abulón y cromosoma 2 en abulón amarillo.

La aplicación de FISH mediante sondas teloméricas (TTAGGG)n y (GATA)n, demostraron la presencia de estos tipos de secuencias en el genoma de las tres especies de abulones estudiadas. La secuencia hexamérica fue localizada en las regiones terminales de todos los tipos cromosómicos analizados, mientras que las secuencias microsatélites

(GATA)n fueron observadas dispersas dentro del genoma de abulones.

Los análisis estadísticos sobre la morfología cromosómica, mostraron que de los 18 pares que posee cada uno de los cariotipos promedios, 8 pares son iguales en las tres especies estudiadas, 3 son propios de H rufescens, 7 de H. fulgens y 2 de H. corrugata. Las relaciones cromosómicas encontradas evidencian que H. rufescens comparte 9 pares con H. fulgens y 14 pares con H. corrugata. A la vez, H. fulgens comparte 8 pares con H. 107

corrugata. De este modo, mediante una análisis de similitud es posible inferir que H. rufescens y H. corrugata son entre sí citogenéticamente más similares que cualquiera de ellas con respecto a H. fulgens.

Dentro del análisis citogenético es posible incluir el estudio de las variaciones de tamaño genómico a nivel específico y poblacional. En este sentido, el presente estudio propone un nuevo método de estimación de tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescentes.

Los perfiles desvanecimiento ADN-DAPI en distintos tipos nucleares y por tanto distintos tamaños genómicos demuestran que existe una disminución de la intensidad de fluorescencia en función del tiempo de exposición a la longitud de onda de excitación del fluorocromo (ultravioleta).

La intensidad de fluorescencia de DAPI unido a ADN es posible estimarla mediante la conversión de imágenes fluorescentes a imágenes de 8 bits/canal o 256 niveles de brillo.

Adicionalmente, la integración de la función de desvanecimiento permite establecer una unidad de medición de la pérdida de fluorescencia con base en el área de desvanecimiento.

Los valores de ID son función del tamaño genómico de una célula, dado que dichos valores guardan relación entre los valores de tamaños genómicos haploide y diploide.

La dispersión de los valores ID muestra ser estable en términos de media y varianza después de los 100 medidos por organismo.

La relación entre los valores de ID de un organismo u especie y su tamaño genómico es estadísticamente significativa (p<0.001) y lineal (r = 0.99). 108

Mediante la aplicación de la ecuación lineal yˆ =3337.2xˆ + 596.8 , obtenida a través del modelo propuesto es posible estimar tamaños genómico en otros organismos dentro del intervalo 0.81 ≤ ADNu ≤ 4.8 pg.

Una aplicación del método de estimación de tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescentes, es la cuantificación de contenido de ADN cromosómico. De esta forma, existe una correlación mayor a 87% entre el tamaño cromosómico y el contenido de

ADN.

El método de estimación de contenido de ADN cromosómico representa una alternativa en la cuantificación directa de ADN en cromosomas de invertebrados, dada la imposibilidad de aplicar procedimientos de citometría de flujo al no disponer hasta el momento de líneas celulares in vitro.

A través de la aplicación del método de desvanecimiento fluorescente se determinó el tamaño genómico en dos poblaciones del bivalvo Argopecten purpuratus. El valor-C calculado para la población de Tongoy mostró un tamaño genómico significativamente mayor (p=0.0011) con respecto a la población de Arica, con valores medios de 1.139±0.066 pg y 1.057±0.057 pg de ADN respectivamente. Los valores encontrados de variación de tamaño genómico a nivel inter-individual fue equivalente al 6% de contenido de ADN genómica para ambas poblaciones.

109

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