Untersuchungen Zur Transmission Des Über Den Histamin-4-Rezeptor Induzierten Juckreizsignals

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Transmission des über den Histamin-4-Rezeptor induzierten Juckreizsignals

INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Jenny Wilzopolski Brunsbüttel

Hannover 2017

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Reinhard Mischke

Tag der mündlichen Prüfung: 06.11.2017

Die Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft.

"Leicht ist das Leben für keinen von uns. Doch was nützt das, man muß Ausdauer haben und Zutrauen zu sich selbst. Man muß daran glauben, für eine bestimmte Sache begabt zu sein, und diese Sache muß man erreichen, koste es was es wolle." -Marie Curie-

Für meine Familie

III

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ...... iv Abbildungsverzeichnis ...... viii Tabellenverzeichnis ...... x Abkürzungsverzeichnis ...... xii 1. Einleitung ...... 1 2. Literaturübersicht ...... 4 2.1. Juckreiz ...... 4 2.1.1. Ursachen ...... 4 2.1.1.1. Botenstoffe ...... 5 2.1.2. Mechanismen und Neurophysiologie ...... 7 2.2. Histamin ...... 11 2.3. Histaminrezeptoren ...... 12 2.3.1. Intrazellulärer Signalweg des histamininduzierten Juckreizes in sensorischen Neuronen ...... 13 2.4. Histamin-4-Rezeptor ...... 16 2.4.1. Vorkommen und Funktion ...... 16 2.5. TRP-Ionenkanäle ...... 18 2.5.1. Vorkommen, Funktion und Wirkmechanismen ...... 20 2.5.1.1. Beteiligung am Juckreizgeschehen ...... 21 2.5.2. TRPV1-Kanal ...... 24 2.5.3. TRPA1-Kanal ...... 25 2.6. Juckreizmodelle in der Tiermedizin ...... 27 2.6.1. Einflüsse auf die Juckreizantwort im Mausmodell ...... 29 2.6.1.1. Mausstämme ...... 29 2.6.1.2. Geschlecht ...... 30 2.6.1.3. Alter ...... 31 2.6.1.4. Äußere Einflüsse ...... 31 3. Material und Methoden ...... 33 3.1. Material, Geräte und Tiere ...... 33

IV Inhaltsverzeichnis

3.1.1. Material für In-vivo-Versuche ...... 33 3.1.1.1 Agonisten ...... 33 3.1.1.2. Antagonisten/Inhibitoren ...... 34 3.1.2. RT-PCR Genotypisierung ...... 34 3.1.3. Material für die Zellkultur ...... 35 3.1.4. Material für Ca2+-Influx-Messungen ...... 36 3.1.5. Allgemeine Materialien/Verbrauchsmaterialien ...... 36 3.1.6. Puffer und Lösungen ...... 38 3.1.7. Versuchstiere ...... 39 3.2. Versuchsübersicht ...... 41 3.3. In-vivo-Versuche ...... 42 3.3.1. Bewertung des Kratzverhaltens ...... 43 3.3.2. Versuche zum Kratzverhalten nach 4-Methylhistamin-Injektion bei verschiedenen Mausstämmen ...... 43 3.3.3. In-vivo-Untersuchungen zur Transmission des histamininduzierten Juckreizsignals .... 44 3.3.3.1. Dosis-Wirkungs-Untersuchungen ...... 44 3.3.3.2. Einfluss von TRP-Kanal-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ...... 44 3.3.3.3. Einfluss von Phospholipase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ...... 45 3.3.3.4. Einfluss von Proteinkinase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ...... 46 3.3.3.5. Einfluss eines Adenylylzyklase-Inhibitors auf histamininduzierten Juckreiz ...... 46 3.3.3.6. Untersuchungen an TRPV1- und TRPA1-Knockout-Mäuse ...... 47 3.3.3.6.1. Genotypisierung der TRPV1- und TRPA1-Knockout-Mäusen ...... 47 3.3.3.7. Einfluss von ZNS- und nicht-ZNS-gängigen Histamin-4-Rezeptor-Antagonisten auf histamininduzierten Juckreiz ...... 50 3.4. In-vitro-Untersuchungen ...... 50 3.4.1. Funktionelle Untersuchungen an Spinalganglienneuronen zur Transmission des Juckreizsignals mittels Ca2+-Influx-Messungen ...... 50 3.4.1.1 Isolierung und Kultivierung von murinen Spinalganglienneuronen ...... 50 3.4.1.2. Ca2+-Influx-Messungen an Spinalganglienneuronen ...... 51 3.4.1.2.1. Auswertung der Ca2+-Influx-Messungen ...... 53 3.4.2. In-vitro-Versuche zum Vergleich der Rezeptorexpression auf Spinalganglien bei verschiedenen Mausstämmen ...... 54

Inhaltsverzeichnis

3.4.2.1. Funktionelle Rezeptoruntersuchungen an murinen Spinalganglienneuronen verschiedener Mausstämme mittels Ca2+-Influx Messungen ...... 54 3.5. Statistische Auswertung ...... 55 4. Ergebnisse ...... 56 4.1. In-vivo-Versuche ...... 56 4.1.1. Kratzverhalten nach intradermaler 4-Methylhistamin-Injektion bei vier unterschiedlichen Mausstämmen ...... 56 4.1.2. Dosis-Wirkungsbeziehung verschiedener Histaminrezeptor-Agonisten bei CD-1- Mäusen ...... 58 4.1.3. In-vivo-Untersuchungen zur Transmission des über den H4R induzierten Juckreizsignals im Mausmodell ...... 60 4.1.3.1. Einfluss von TRP-Kanal-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ...... 60 4.1.3.1.1. Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 auf histamininduzierten Juckreiz ...... 60 4.1.3.1.2. Einfluss des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz ...... 61 4.1.3.1.3. Einfluss von TRPA1- und TRPV1-Kanal-Inhibitoren auf über den H4R induzierten Juckreiz ...... 62 4.1.3.2. Einfluss von Phospholipase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ...... 64 4.1.3.2.1. Einfluss des Phospholipase A2-Inhibitors Quinacrin auf histamininduzierten Juckreiz ...... 64 4.1.3.2.2. Einfluss des Phospholipase C-Inhibitors U73122 auf histamininduzierten Juckreiz ...... 66 4.1.3.3. Einfluss von Proteinkinase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz ...... 68 4.1.3.3.1 Einfluss des Proteinkinase A-Inhibitors H89 auf histamininduzierten Juckreiz ...... 68 4.1.3.3.2 Einfluss des Proteinkinase C-Inhibitors Bisindolylmaleimid I auf histamininduzierten Juckreiz ...... 70 4.1.3.4. Einfluss des Adenylylzyklase-Inhibitors SQ22536 auf histamininduzierten Juckreiz 72 4.1.4. Untersuchungen am Knockout-Modell ...... 73 4.1.4.1. Histamininduzierter Juckreiz bei TRPV1-/-- und TRPA1-/--Mäusen ...... 73 4.1.4.1.1. Genotypisierung ...... 73 4.1.5. Einfluss von ZNS- und nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten auf über den H4R induzierten Juckreiz ...... 76 4.1.6. Vergleichbarkeit des Kratzverhaltens zwischen den einzelnen Versuchstagen ...... 77 4.1.6.1. Vergleichbarkeit des histamininduzierten Kratzverhaltens ...... 77

Inhaltsverzeichnis

4.1.6.2. Vergleichbarkeit des HTMT-induzierten Kratzverhaltens ...... 78 4.1.6.3. Vergleichbarkeit des 4-methylhistamininduzierten Kratzverhaltens ...... 78 4.1.6.4. Vergleichbarkeit des ST-1006-induzierten Kratzverhaltens ...... 79 4.2. In-vitro-Untersuchungen zur Transmission des Juckreizsignals mittels Ca2+-Influx Messungen ...... 80 4.2.1. Einfluss des spezifischen H4R-Antagonisten JNJ7777120 auf den über den H4R induzierten intrazellulären Ca2+-Anstieg in Spinalganglienneuronen ...... 80 4.2.2. Einfluss des spezifischen H1R-Antagonisten Diphenhydramin auf den über den H1R induzierten intrazellulären Ca2+-Anstieg in Spinalganglienneuronen ...... 82 4.2.3. Einfluss des TRP-Kanal-Inhibitors Ruthenium Red auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstieg in Spinalganglienneuronen ...... 84 4.2.4. Einfluss des TRPA1-Kanal-Inhibitors HC-030031 auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstieg in Spinalganglienneuronen ...... 86 4.2.5. Einfluss des TRPV1-Kanal-Inhibitors SB366791 auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstieg in Spinalganglienneuronen ...... 88 4.3. Vergleichende Untersuchungen des histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneurone bei verschiedenen Mausstämmen ...... 90 5. Diskussion ...... 93 5.1. Einfluss des Mausstammes auf die über den H4R induzierte Juckreizantwort ...... 94 5.2. Histaminrezeptor-Liganden im Juckreizgeschehen ...... 97 5.3. Effekt von TRP-Kanälen auf den über den H4R induzierten Juckreiz ...... 97 5.3.1. Wechselseitige Regulation des TRPV1- und TRPA1-Kanals ...... 99 5.4. Einfluss verschiedener Effektormoleküle auf den histamininduzierten Juckreiz ...... 101 5.5. Einfluss der ZNS-Gängigkeit von H4R-Antagonisten auf über den H4R induzierten Juckreiz ...... 105 5.6. Schlussfolgerung und Ausblick ...... 106 6. Zusammenfassung ...... 109 7. Summary ...... 112 8. Literaturverzeichnis ...... 114 9. Anhang ...... 151 9.1. Tabellen ...... 151 9.2. Danksagung ...... 163

VII

Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: In der Haut von Effektorzellen freigesetzte pruritogene Botenstoffe ...... 6 Abbildung 2: Zentrale Juckreizverarbeitung, modifiziert...... 10 Abbildung 3: Strukturformel Histamin...... 13 Abbildung 4: Putativer Signalweg des über den H1R induzierten Juckreizes...... 14 Abbildung 5: Phylogenetischer Stamm humaner TRP-Kanäle...... 19 Abbildung 6: Verhaltensantworten von Mäusen nach Substanzinjektion in die Wange...... 29 Abbildung 7: Fura-2 Bindung an Ca2+ nach Abspaltung der AM-Gruppen durch Esterasen...52 Abbildung 8: Dosis-Wirkungsbeziehung des 4-methylhistamininduzierten Juckreizes vergleichend bei BALB/c-, C57BL/6-, NMRI- und CD-1-Mäusen...... 57 Abbildung 9: Untersuchungen zum Kratzverhalten nach intradermaler Gabe verschiedener Histaminrezeptor-Liganden in unterschiedlichen Konzentrationen bei CD-1-Mäusen...... 59 Abbildung 10: Einfluss verschiedener Dosierungen des TRPA1-Inhibitors HC-030031 auf den histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...... 60 Abbildung 11: Einfluss verschiedener Dosierungen des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...... 61 Abbildung 12: Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 und des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...... 63 Abbildung 13: Einfluss des TRPV1-Inhibitors SB366791 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen ...... 64 Abbildung 14: Einfluss des Phospholipase A2-Inhibitors Quinacrin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...... 65 Abbildung 15: Einfluss des Phospholipase C-Inhibitors U73122 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...... 67 Abbildung 16: Einfluss des Proteinkinase A Inhibitors H89 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...... 69 Abbildung 17: Einfluss des intradermal applizierten Proteinkinase C-Inhibitors Bisindolylmaleimid auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...... 71 Abbildung 18: Einfluss des Adenylylzyklase-Inhibitors SQ22536 auf histamininduzierten Juckreiz...... 72 Abbildung 19: Untersuchungen zum histamininduzierten Juckreiz bei TRPV1-/--, TRPA1-/-- und TRPV1-/-TRPA1-/--Mäusen im Vergleich zum Wildtyp (C57BL/6-Mäuse)...... 74 Abbildung 20: Genotypisierung der TRPA1-/-- und Wildtyp-Mäuse exemplarisch dargestellt...... 75 Abbildung 21: Genotypisierung der TRPV1-/-- und Wildtyp-Mäuse exemplarisch dargestellt...... 75 Abbildung 22: Einfluss des ZNS-gängigen (JNJ7777120) und des nicht-ZNS-gängigen (JNJ39594906) H4R-Antagonisten auf 4-MH-induzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen...... 76 Abbildung 23: Vergleichende Darstellung des histamininduzierten Juckreizes verschiedener

VIII

Abbildungsverzeichnis

Versuchstage bei CD-1-Mäusen...... 77 Abbildung 24: Vergleichende Darstellung des HTMT-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen...... 78 Abbildung 25: Vergleichende Darstellung des 4-MH-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen...... 78 Abbildung 26: Vergleichende Darstellung des ST-1006-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen...... 79 Abbildung 27: Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ7777120 auf den über den H4R induzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen...... 80 Abbildung 28: Veränderung des über den H4R induzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen nach JNJ7777120-Applikation...... 81 Abbildung 29: Einfluss des H1R-Antagonisten Diphenhydramin auf den über den H1R induzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen...... 82 Abbildung 30: Veränderung des über den H1R induzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen nach Diphenhydramin-Applikation...... 83 Abbildung 31: Einfluss des TRP-Kanal-Inhibitors Ruthenium Red auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1- Mäusen...... 84 Abbildung 32: Veränderung des histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen nach Ruthenium Red-Applikation...... 85 Abbildung 33: Einfluss des TRPA1-Kanal-Inhibitors HC-030031 auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen...... 86 Abbildung 34: Veränderung des histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen nach HC-030031-Applikation...... 87 Abbildung 35: Einfluss des TRPV1-Kanal-Inhibitors auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen...... 88 Abbildung 36: Veränderung des histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneurone von CD-1-Mäusen nach SB366791-Applikation...... 89 Abbildung 37: Vergleichende Untersuchung des stimulusinduzierten intrazellulären Ca2+- Anstiegs in Spinalganglienneuronen bei verschiedenen Mausstämmen...... 91 Abbildung 38: Vergleichende Darstellung der auf Histamin- oder 4-Methylhistamin- Stimulation mit einem Ca2+-Influx reagierenden Zellen...... 92

Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Übersicht über die Histaminrezeptoren und ihre Funktionen...... 15 Tabelle 2: Ausgewählte Histamin-4-Rezeptor-Liganden...... 18 Tabelle 3: Pruritogene, ihre Rezeptoren und ihre im nachgeschalteten intrazellulären Signalweg wirksamen TRP-Kanäle auf sensorischen Neuronen...... 23 Tabelle 4: Ausgewählte TRPV1-Kanal-Liganden...... 25 Tabelle 5: Ausgewählte TRPA1-Kanal-Liganden...... 27 Tabelle 6: Zur Genotypisierung der TRPV1-/-- und TRPA1-/--Mäuse verwendete Primer...... 35 Tabelle 7: Substanzen, deren Einfluss auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden überprüft werden sollte...... 43 Tabelle 8: Für die In-vivo-Versuche verwendete Histaminrezeptor-Agonisten und ihre durch lokale Applikation untersuchten Mengen...... 44 Tabelle 9: Verwendete TRP-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen...... 45 Tabelle 10: Verwendete Phospholipase (PL)-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen...... 45 Tabelle 11: Verwendete Proteinkinase (PK)-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen...... 46 Tabelle 12: Verwendeter Adenylylzyklase-Inhibitor und seine untersuchte Dosierung...... 47 Tabelle 13: Die bei der Genotypisierung der TRPV1-/-- und TRPA1-/--Mäuse zu erwartenden PCR Produktgrößen in Basenpaaren...... 48 Tabelle 14: Zusammensetzung der Ansätze für die Genotypisierung der TRPA1-/--Mäuse nach Herstellerangaben...... 48 Tabelle 15: Cyclereinstellungen für die Genotypisierung der TRPA1-/--Mäuse nach Herstellerangaben...... 48 Tabelle 16: Zusammensetzung der Ansätze für die Genotypisierung der TRPV1-/--Mäuse nach Herstellerangaben...... 49 Tabelle 17: Cyclereinstellungen für die Genotypisierung der TRPV1-/--Mäuse nach Herstellerangaben...... 49 Tabelle 18: Verwendete Histamin-4-Rezeptor-Antagonisten zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von 4-Methylhistamin und ihre untersuchten Dosierungen...... 50 Tabelle 19: Zur Neuronenstimulation verwendete Agonisten und ihre Konzentrationen...... 53 Tabelle 20: Verwendete Antagonisten/Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf den intrazellulären Ca2+-Influx in Spinalganglienneurone nach Agonistenstimulation...... 53 Tabelle 21: Stimuli für die Ca2+-Influx-Messungen und ihre eingesetzten Konzentrationen..54 Tabelle 22: Ermittelte Dosierungen der Histaminrezeptor-Agonisten für die weitere

Tabellenverzeichnis

Verwendung...... 58 Tabelle 23: Anzahl der Kratzattacken nach intradermaler 4-Methylhistamin-Injektion vergleichend bei BALB/c-, C57BL/6-, NMRI- und CD-1- Mäusen in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 151 Tabelle 24: Dosis-Wirkungsbeziehung verschiedener Histaminrezeptor-Agonisten bei CD-1- Mäusen: Anzahl der Kratzattacken in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 152 Tabelle 25: Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 153 Tabelle 26: Einfluss des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 153 Tabelle 27: Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 und des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 154 Tabelle 28: Einfluss des TRPV1-Inhibitors SB366791 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 155 Tabelle 29: Einfluss des Phospholipase A2-Inhibitors Quinacrin auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 155 Tabelle 30: Einfluss des Phospholipase C-Inhibitors U73122 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 156 Tabelle 31: Einfluss des Proteinkinase A-Inhibitors H89 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 157 Tabelle 32: Einfluss des Proteinkinase C-Inhibitors Bisindolylmaleimid I auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 158 Tabelle 33: Einfluss des Adenylylzyklase-Inhibitors SQ22536 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 159 Tabelle 34: Histamininduzierter Juckreiz bei TRPV1-/--und TRPA1-/--Mäusen: Anzahl der Kratzattacken in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 160 Tabelle 35: Einfluss ZNS- und nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten auf die Anzahl der Kratzattacken bei über den H4R induziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 160 Tabelle 36: Vergleichbarkeit des Kratzverhaltens zwischen den einzelnen Versuchstagen: Anzahl der Kratzattacken in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min...... 161

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ® Registered Trademark TM Unregistered Trademark % Prozent ± Plus/Minus °C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter µmol Mikromol 12-HETE 12-hydroxyeicosatetraenoic acid 4-MH 4-Methylhistamin Abb. Abbildung AD atopische Dermatitis AITC Allylisothiocyanat ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare bzw. beziehungsweise ca. circa Ca²+ Calcium cAMP cyklisches Adenosinmonophosphat cDNA komplementäre DNA cm Centimeter

CO2 Kohlendioxid DAG Diacylglycerol DC Dendritische Zelle(n) DMSO Dimethylsulfoxid DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DRG dorsal root ganglia (Spinalganglien) et al. et alii, und andere FKS Fetales Kälberserum

XII

Abkürzungsverzeichnis

g Gramm g Erdbeschleunigung GPCR g-coupled protein receptor (G-Protein gekoppelter Rezeptor) h hora/Stunde H1R Histamin-1-Rezeptor(en) H2R Histamin-2-Rezeptor(en) H3R Histamin-3-Rezeptor(en) H4R Histamin-4-Rezeptor(en) HTMT Histamin-Trifluoromethyl-Toluidin Dimaleat i.d. intradermal IL Interleukin(e) i.p. intraperitoneal IP3 Inositoltriphosphat Kbp Kilobasenpaare KCl Kaliumchlorid kDa Kilodalton l Liter lat. Latein mg Milligramm min. Minuten ml Millgramm mmol Millimol MW Mittelwert n Anzahl der Proben/Tiere NaCl Natriumchlorid NGF Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor) nmol nanomol PBS phosphate-buffered saline (Phosphatgepufferte Salzlösung) PCR Polymerase Kettenreaktion

XIII

Abkürzungsverzeichnis

PGE2 Prostaglandin E2 PIP2 Phosphatidylinositol-4.5-Bisphosphat PIRT phosphoinositide-interacting regulator of transient receptor potential channels PKA Proteinkinase A PKC Proteinkinase C PKCε Proteinkinase Cε PLA Phospholipase A PLC Phospholipase C PLCß3 Phoshpholipase Cß3 Real-time RT-PCR Echtzeit Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion TNFα Tumor Nekrose Faktor α TRP transient receptor potential TRPA transient receptor potential ankyrin# TRPC transient receptor potential canonical TRPM transient receptor potential melastin TRPML transient receptor potentialmucolipin TRPN transient receptor NO-mechano potential TRPP transient receptor potentialpolycistic TRPV transient receptor potentialvanilloid u. a. unter anderem v. a. vor allem z. B. Zum Beispiel ZNS Zentrales Nervensystem z. T. zum Teil

XIV

Einleitung

1. Einleitung Juckreiz (Pruritus, lat. von prurire) ist eine unangenehme Sinneswahrnehmung, unter der sowohl Menschen als auch Tiere leiden. Diese führt zu Abwehrverhalten in Form von Kratzen, Reiben und Scheuern (NUTTALL u. MCEWAN 2006).

Im Laufe der Jahre gab es diverse Theorien über die Entstehung und Weiterleitung des Juckreizes. Zunächst nahm man an, dass Juckreiz nur eine unterschwellige Form des Schmerzes sei (VON FREY 1922). Jüngere Forschung weist darauf hin, dass es für Juckreiz spezifische Nervenfasern in der Haut gibt (SCHMELZ et al. 1997). Ebenso scheinen die Signalwege für Juckreiz und Schmerz voneinander getrennt zu sein (SCHMELZ et al. 1997; ANDREW u. CRAIG 2001; TOTH et al. 2015). Dennoch beeinflussen sich diese beiden unangenehmen Sinneswahrnehmungen gegenseitig (MURRAY u. WEAVER 1975; WARD et al. 1996; YOSIPOVITCH et al. 2007).

Obwohl viele Mechanismen, die am Juckreizgeschehen beteiligt sind, noch nicht aufgedeckt sind, ist mittlerweile eine Vielzahl von beteiligten Botenstoffen bekannt (KREMER et al. 2014; STORAN et al. 2015; MOLLANAZAR et al. 2016). Der wohl am besten charakterisierte Mediator ist das ubiquitär im Körper vorkommende biogene Amin Histamin (SIMONE et al. 1987; SIMONE et al. 1991; KREMER et al. 2014). Es übernimmt neben der Juckreizauslösung viele weitere physiologische und pathophysiologische Funktionen im Körper (BÄUMER u. ROSSBACH 2010). Physiologisch ist es u. a. beteiligt an der Magensäuresekretion, der Regulation des Schlaf-Wachzyklus, dem Appetit und der Gedächtnisbildung (BÄUMER u. ROSSBACH 2010). Juckreizentstehung und Beteiligung an allergischen und entzündlichen Reaktionen gehören zu den pathophysiologischen Geschehnissen, bei denen Histamin eine bedeutende Rolle spielt (BÄUMER u. ROSSBACH 2010). Hierbei wirkt es über vier verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (Histaminrezeptoren; GANTZ et al. 1991a, b; YAMASHITA et al. 1991; LOVENBERG et al. 1999; LIU et al. 2001a). Diese wurden nach der Reihenfolge ihrer Entdeckung benannt (Histamin-1-Rezeptor bis Histamin-H4-Rezeptor; H1R – H4R), wobei hauptsächlich der H1R und der H4R am Juckreizgeschehen beteiligt sind. Dem H3R wird auch eine Rolle im Juckreizgeschehen zugeschrieben, diese ist aber eher inhibierender Natur (ROSSBACH et al. 2011).

Einleitung

Die Weiterleitung des Juckreizsignals wird insbesondere über die Transient Receptor Potential-Ionenkanäle (TRP-Kanäle) vermittelt (KITTAKA u. TOMINAGA 2017). Sechs Unterfamilien gehören der Familie der TRP-Kanäle an (NILIUS u. OWSIANIK 2011). Insbesondere der Transient Receptor Potential Vanilloid 1-Kanal (TRPV1-Kanal) ist nachweislich am Mechanismus der Weiterleitung des histamininduzierten Juckreizsignals beteiligt (SHIM et al. 2007), aber auch bei anderen Juckreizmediatoren spielt er eine Rolle (z. B. IL-31; CEVIKBAS et al. 2014). Ob weitere TRP-Kanäle am histaminassoziierten Juckreiz beteiligt sind, ist noch nicht hinreichend bekannt. Zudem ist bislang nicht untersucht, ob Unterschiede in der Signalweiterleitung zwischen über den H1R und H4R induzierten Juckreiz vorliegen. Ein häufig im Zusammenhang mit sowohl akutem als auch chronischem Juckreiz auftauchender TRP-Kanal ist der Transient Receptor Potential Ankyrin 1-Kanal (TRPA1-Kanal; ZHANG 2015). Dieser stellt somit ein mögliches Ziel zur Behandlung pruritischer Erkrankungen dar.

Juckreiz kann sehr vielfältige Ursachen haben. Hierbei sind nicht nur Haut-, sondern auch eine Vielzahl anderer Erkrankungen, von inneren bis hin zu psychisch bedingten, zu beachten. Eine meist mit starkem Juckreiz einhergehende, allergisch entzündliche Erkrankung ist die atopische Dermatitis (AD). Beim Hund ist dieses Krankheitsbild die am meisten mit Juckreiz assoziierte Hauterkrankung. Sie stellt außerdem bei Säuglingen und Kleinkindern eine der am häufigsten vorkommenden chronischen Hauterkrankungen dar (bis zu 20 % der Kinder betroffen). Sie tritt jedoch auch noch im Erwachsenenalter auf (WILLIAMS et al. 1999; SILVERBERG u. HANIFIN 2013; WALLACH u. TAIEB 2014).

In atopischer Haut konnten erhöhte Histaminspiegel nachgewiesen werden (RUZICKA u. GLUCK 1983). Dennoch haben die vielfach therapeutisch eingesetzten H1R-Antagonisten hier keine anti-pruritische Wirkung (YOSIPOVITCH et al. 2003). Der Einsatz von H4R- Antagonisten, v. a. in Kombination mit H1R-Antagonisten, hat im Mausmodell eine sowohl anti-inflammatorische als auch anti-pruritische Wirkung (KÖCHLING et al. 2017). Der H4R scheint eine vielversprechende Zielstruktur zur Behandlung pruritogener Erkrankungen zu sein (THURMOND 2015).

Trotz vieler Studien zur anti-pruritischen Wirkung des H4R ist der Signalweg des über den H4R induzierten Juckreizes weiterhin unbekannt. Ebenso ist unbekannt, welche der TRP-

Einleitung

Kanäle und anderen Moleküle oder Enzyme an der Weiterleitung des über den H4R ausgelösten Signals beteiligt sind. Diese Studie soll dazu beitragen, Teile des Signalwegs der über den H4R induzierten Juckreizweiterleitung aufzudecken und somit neue Therapieansätze für allergische Erkrankungen, die mit Juckreiz einhergehen, aufzudecken. Hierzu werden sowohl in In-vivo- als auch in In-vitro-Modellen verschiedene TRP-Kanal-Inhibitoren nach Stimulation mit H4R-Agonisten getestet. Weiterhin werden im In-vivo-Modell diverse Proteinkinase-, Phospholipase- und Adenylyzyklase-Inhibitoren untersucht, für welche teilweise bereits eine Beteiligung an der histamininduzierten Juckreizweiterleitung gezeigt wurde (KREMER et al- 2014).

Literatur

2. Literaturübersicht

2.1. Juckreiz Im siebzehnten Jahrhundert definierte der aus Tübingen stammende Arzt Samuel Hafenreffer Juckreiz als eine unangenehme Empfindung, die Kratzen mit den Fingernägeln oder anderen Gegenständen hervorruft (HAFENREFFER 1660). Juckreiz und die damit einhergehende Kratzantwort dienen vor allem zum Schutz des Körpers vor potentiell gefährlichen Organismen und schädlichen Substanzen, welche in Kontakt mit der Haut gekommen sind (PAUS et al. 2006). Die Juckreizempfindung und verschiedene Formen des Kratzverhaltens finden sich in einer Vielzahl von Spezies von Nagern über Vögel bis hin zum Menschen. Der Mensch zeigt Juckreiz vorwiegend in Form von Kratzen mit den Händen, Scheuern und Reiben. Im Gegensatz dazu zeigen z. B. Hunde neben Scheuern der betroffenen Stelle ein Kratzen mit der Hinterpfote und ein Belecken oder Beknabbern (NUTTALL u. MCEWAN 2006). Ähnlich verhält es sich auch bei den vielfach in der Forschung verwendeten Mäusen und Ratten (SHIMADA u. LAMOTTE 2008). Chronischer Pruritus geht in den meisten Fällen mit Sekundärläsionen einher. Durch die Traumatisierung der Haut werden Entzündungsmediatoren, wie z. B. Interleukine (IL-2, IL-4, IL-13, IL31), Tumornekrose Faktor α (TNFα), Leukotriene und Prostaglandine (PGE1/2) ausgeschüttet. Dies wiederum verstärkt den Juckreiz (TOTH et al. 2015). Dieser als „Juck- Kratz-Zyklus“ (itch-scratch cycle) bezeichnete Kreislauf ist häufig resistent gegenüber topischen oder systemischen Therapien (KLEIN u. CLARK 1999). Chronischer Juckreiz bedeutet für die Betroffenen erheblichen Stress und kann u. a. zu Leistungs- und Konzentrationsschwäche, Schlafstörungen, Veränderungen der Essgewohnheiten, Depressionen und sogar Angststörungen führen (SHEEHAN-DARE et al. 1990; LEADER et al. 2015; MOLLANAZAR et al. 2016; REICH et al. 2016). Somit ist bei diesen Patienten die Lebensqualität, je nach Intensität des Juckreizes, z. T. sehr stark vermindert.

2.1.1. Ursachen Pruritus ist ein bei sehr vielen Hauterkrankungen vorkommendes Symptom, z. B. bei allergischen Reaktionen, bakteriellen oder fungalen Infektionen, cutanem T-Zellymphom, Psoriasis (Schuppenflechte), atopischer Dermatitis (Neurodermitis, AD) oder

Literatur

Ektoparasitenbefall (LEADER et al. 2015). In der caninen Dermatologie ist dieser mit einem Vorkommen von über 30 Prozent das am häufigsten vorkommende klinische Symptom (OLIVRY u. BÄUMER 2015), aber auch eine große Bandbreite an nicht mit der Haut assoziierten Erkrankungen kann zu Juckreiz führen. Hierzu zählen viele innere Erkrankungen, welche beim Hund eine untergeordnete Rolle spielen, (neurogener Juckreiz) wie z. B. Entzündungen und Infektionen, Hyperthyroidismus, chronische Lebererkrankungen, Nierenversagen, metabolische Erkrankungen (z. B. Eisenmangel) und sogar einige Krebserkrankungen, wie das Hogkin’s Lymphom (LEADER et al. 2015). Ebenso können neurologische und psychosomatische (z. B. Akrenbelecken beim Hund, Parasitenwahn beim Menschen) Erkrankungen ursächlich für Juckreiz sein. Zu den neurologischen Erkrankungen, die mit Pruritus einhergehen können, zählt die beim Cavalier King Charles Spaniel sehr häufig auftretende Syringomyelie (Chiara-ähnliche Malformation). Beim Menschen sind hier die postherpetische Neuralgie nach einer überstandenen Gürtelrose, einige Hirntumoren, multiple Sklerose oder auch Nervenkompressionen und -irritationen (Brachioradialer Juckreiz) zu nennen (OAKLANDER et al. 2003; TOTH et al. 2015). Pruritus kann auch nach Medikamentenapplikation entstehen, entweder in Form einer allergischen Reaktion auf die applizierte Substanz (z. B. Penicilline) oder durch Aktivierung oder Hemmung von bestimmten Rezeptoren, z. B. von Opioidrezeptoren (UMEUCHI et al. 2003; GANESH u. MAXWELL 2007).

2.1.1.1. Botenstoffe So wie es verschiedene Ursachen für Juckreiz gibt, so gibt es auch keinen universellen Botenstoff für diesen. In den letzten zehn bis zwanzig Jahren wurde eine Vielzahl an Botenstoffen entdeckt. Diese lösen entweder direkt durch Bindung an Rezeptoren oder indirekt durch Freisetzung anderer Juckreizmediatoren Juckreiz aus. Zum Großteil sind ihre Wirkmechanismen noch ungeklärt (KREMER et al. 2014). Der wohl am besten untersuchte Juckreizmediator ist das biogene Amin Histamin (SIMONE et al. 1987; SIMONE et al. 1991; KREMER et al. 2014). Daneben gibt es allerdings noch eine große Bandbreite weiterer Botenstoffe wie z. B. Serotonin, Proteasen und Kinine (Trypsin, Chymotrypsin, Bradykinin, Kallikrein), Zytokine (z. B. IL-4, IL-31, TSLP, TNFα), Prostaglandine (PGE2, PGD2), Opioide, Nervenwachstumsfaktor (NGF) und Neuropeptide (Substanz P, Neurokinin A) (PAUS et al. 2006; STEINHOFF et al. 2006; KREMER et al. 2014; STORAN et al. 2015;

Literatur

MOLLANAZAR et al. 2016). Die Botenstoffe werden in histaminerg und nicht-histaminerg unterteilt. Abbildung 1 zeigt beispielhaft die Vielfalt der bei der Juckreizentstehung involvierten Botenstoffe und der von ihnen aktivierten Rezeptoren.

Zelle

Makrophage

MOLLANAZAR et al. (2016)

nach

phileund Keratinozyten) in der Hautsetzen

Keratinozyten

Nervenendigung in der Haut Nervenendigung

Neutrophiler

Zellen], Mastzellen, Eosinophile, Neutro

Eosinophiler

:der In Haut vonEffektorzellen freigesetzte pruritogene Botenstoffe

Abbildung Effektorzellen (z. LymphozytenB. [T verschiedenepruritogene Mediatoren frei, diewelche auf den terminalen derEnden sensorischen Nervenfasern exprimierten Rezeptoren in Hautder aktivieren.

Histamin Mastzelle

Literatur

2.1.2. Mechanismen und Neurophysiologie Viele Studien zur Aufdeckung der molekularen Juckreizmechanismen zeigen, dass vor allem das periphere Nervensystem kutane sensorische Stimuli in elektrische Signale umwandelt und diese an das zentrale Nervensystem weiterleitet (KITTAKA u. TOMINAGA 2017). Exogene und endogene Stimuli, ausgeschüttet von Immun-, Epithel- oder Endothelzellen, induzieren die Aktivierung von Signalkaskaden von der Peripherie über DRGs und das Rückenmark zum zentralen Nervensystem (ZNS). Über einen direkten Axon-Reflex-Mechanismus setzen Nervenendigungen Neuropeptide frei. Diese verstärken die Juckreizantwort durch die Stimulation der Freisetzung weiterer prurizeptiver Mediatoren aus Mast-, Endothel- und Epithelzellen (STEINHOFF et al. 2006). Eine der ersten Theorien zur Juckreizweiterleitung ist die „Intensitätstheorie“ (intensity theory of itch). Hierbei gehen Forscher davon aus, dass Juckreiz eine milde Form von Schmerz darstellt und dass die selben Neuronen für die Schmerz- und Juckreizsensation verantwortlich sind (VON FREY 1922). Heute weiß man, dass geringe Mengen schmerzauslösender Mittel (Algogene) keinen Juckreiz auslösen (TOTH et al. 2015). Ein alternativer Gedanke ist die sogenannte „Spezifitätstheorie“ (labeled-line theory/specificity theory of itch). Hier geht man davon aus, dass es ein autonomes prurizeptives System gibt, das unabhängig von der Schmerzempfindung besteht. Dieses Modell geht davon aus, dass spezielle Rezeptorstrukturen und neuronale Signalwege existieren, die ausschließlich Juckreiz verarbeiten (SCHMELZ et al. 1997; ANDREW u. CRAIG 2001; TOTH et al. 2015). Dies steht im Widerspruch zur Beobachtung, dass die chemische Ablation sensorischer Neurone mit Capsaicin Defizite, sowohl in der Juckreizempfindung als auch in der Nozizeption, verursachen (TOTH et al. 2015). Weiterhin wurde die Entdeckung gemacht, dass schmerzhafte und mechanische Stimuli die Juckreizempfindung unterdrücken können (MURRAY u. WEAVER 1975; WARD et al. 1996; YOSIPOVITCH et al. 2007). Ein pharmakologisch angewandtes Beispiel ist der Schmerz auslösende TPRV1-Agonist Capsaicin, welcher topisch als antipruritische Substanz eingesetzt wird (SHIM u. OH 2008). Hier wird vermutet, dass dieser eine juckreizlindernde Wirkung durch seine schmerzauslösenden Effekte hervorruft (SHIM u. OH 2008). Eine Art Kompromiss zwischen den beiden genannten Theorien stellt die sogenannte „Selektivitätstheorie“ (selectivity theory of itch) dar. Diese besagt, dass juckreizsensitive

Literatur

Neurone eine spezifische Untergruppe der nozizeptiven Neurone darstellen. Diese Theorie bietet eine Erklärung zu den Mechanismen, warum es durch Capsaicin zu einer gleichzeitigen Verminderung von Schmerz und Juckreiz durch eine Desensibilisierung kommt (TOTH et al. 2015). Bis heute ist nicht eindeutig geklärt, welche der beiden letztgenannten Theorien eine bessere Erklärung zur Juckreizweiterleitung darstellt (TOTH et al. 2015). Es ist weiterhin möglich, dass Schmerz und Juckreiz über zwei anatomisch separate neuronale Wege weitergeleitet werden, obwohl einige Substanzen, wie Capsaicin, beide Wege ansprechen können. Die Vermutung liegt nahe, dass es zwei verschiedene, aber nicht völlig voneinander unabhängige Signalwege gibt, die sich einige molekularen Mechanismen wie z. B. die TRP- Kanäle, teilen (TOTH et al. 2015). BICKFORD (1939) stellte schon früh die Hypothese auf, dass Juckreiz, ebenso wie Schmerz, über feine C-Fasern vermittelt wird. Die sogenannten polymodalen C-Fasern machen ca. 80 % der C-Fasern aus und können durch verschiedene chemische, mechanische und thermische Reize aktiviert werden (SCHMIDT et al. 1997). Die meisten dieser Fasern reagieren nicht bis sehr schwach auf Histamin (HANDWERKER et al. 1991). Die übrigen 20 % der Fasern sind hauptsächlich mechano-insensitive Nozizeptoren. Sie werden durch chemische Stimuli entweder direkt durch Kontakt mit den Mediatoren, oder indirekt durch die Ausschüttung juckreizübermittelnder Substanzen, z. B. aus Mastzellen, aktiviert (SCHMIDT et al. 1995; SCHMIDT et al. 1997) und können aufgrund einer Entzündung auf mechanische Reize sensibilisiert werden. In dieser letzten Gruppe befinden sich einige Untereinheiten (ca. 20 %), die sehr stark und langanhaltend auf Histamin, aber nicht auf mechanische Stimuli, reagieren (SCHMELZ et al. 1997). Insgesamt machen diese juckreizvermittelnden C-Fasern nur ca. 5 % der gesamten afferenten C-Fasern beim Menschen aus (SCHMELZ et al. 1997). Diese marklosen Fasern haben ein großes Innervationsgebiet in der Dermis-/Epidermisgrenze (SCHMELZ et al. 1997). Beim Juck-Kratzreflex leiten die aktivierten C-Fasern in den oberen Hautschichten elektrische Signale zu den oberflächlichen Schichten des Dorsalhorns des Rückenmarks weiter (SCHMELZ et al. 1997). Vom Rückenmark wird das Signal über spinothalamische Projektionen an den Thalamus weitergeleitet und von dort in den Inselcortex projiziert (ANDREW u. CRAIG 2001; SIMONE et al. 2004). Des Weiteren werden von dort motorische Areale aktiviert, die vermutlich für die stattfindende Juckreizantwort in Form von Kratzen verantwortlich sind

Literatur

(MOCHIZUKI et al. 2003; PAUS et al. 2006). Zu den aktivierten Arealen zählen der primäre und sekundäre somatosensorische Cortex, der prämotorische und supplementäre motorische Cortex, der inferiore parietale Lobus, das Cerebellum, und einige Regionen im Temporallappen (PAUS et al. 2006; TOTH et al. 2015). Abbildung 2 zeigt einige der aktivierten Hirnregionen und ihre Funktionen. Es scheint zudem, dass der durch andere nicht- histaminerge Mediatoren ausgelöste Juckreiz über vom Histamin unabhängige Wege an das ZNS weitergeleitet wird (STEINHOFF et al. 2006). Als Beispiel sei hier der durch die Haare der Juckbohne (mucuna pruriens) ausgelöste Juckreiz genannt, der über den Protease aktivierten Rezeptor 2 (PAR2) vermittelt wird (DAVIDSON et al. 2007; JOHANEK et al. 2007; NAMER et al. 2008). Intradermales Einbringen dieser Haare führte in der Studie von NAMER et al. (2008) zu einer Aktivierung von mechanosensitiven, Histamin-insensitiven C- Fasern. Dies führte zur Annahme, dass es verschiedene Typen von Juckreiz-weiterleitenden Neuronen in der Peripherie gibt. NAKANO et al. (2008) untersuchten diese These durch Auswertung der Fos-Expressionsmuster nach Gabe verschiedener Juckreizstimuli. Die intradermale Gabe von Histamin oder SLIGR-NH2 zeigte, dass unterschiedliche Neuronenpopulationen in verschiedenen Regionen des Dorsalhorns aktiviert werden. RINGKAMP et al. (2011) zeigten zusätzlich, dass auch myelinisierte A-Fasern an der Juckreizempfindung, ausgelöst durch die Juckbohne, beteiligt sind. PAPOIU et al. (2012) konnten zudem nachweisen, dass es durch die Juckreizauslösung mit verschiedenen Substanzen (hier Histamin und Juckbohne) zu unterschiedlichen Aktivierungsmustern im Gehirn kommt. Dennoch wird immer eine gemeinsame Menge an Kernstrukturen aktiviert. Ebenso verhält es sich bei chronischem Juckreiz. Je nach Ursache für diesen (z. B. AD, Psoriasis, Nierenversagen) kommt es zu unterschiedlichen Akivitätsprofilen des ZNS (MOLLANAZAR et al. 2016).

Literatur

Motorische Antwort Räumliche, zeitliche und Kratzen Intensitätsaspekte; Lokalisierung schädlicher Noxen SMA

PMA

Vergnügen/Belohnung, Aversion, Zielsetzung, Entscheidungsfindung; Affektives Zwanghaftes Kratzen Verhalten, Aversion, Leiden Modulation, Interaktion, Schmerz, Inhibition Juckreiz

Prurizeptive afferente Fasern Prurizeptive Projektionsneurone, Lamina I

Haut Rückenmark

Abbildung 2: Zentrale Juckreizverarbeitung, modifiziert nach PAUS et al. (2006) Primäre prurizeptive afferente Neurone der Haut aktivieren spinale Neurone der Lamina I des Dorsalhorns des Rückenmarks. Diese projizieren in den Thalamus. Direkte exzitatorische Verbindungen des Thalamus beinhalten den anterioren cingulären Cortex (ACC), den Inselcortex (Insula) und die primären und sekundären somatosensorischen Cortices. Zusammenfassend dargestellt sind die möglichen Funktionen der bei bildgebenden Studien aktivierten Hirnregionen. SMA = supplementärer motorischer Cortex, PMA = prämotorischer Cortex, PF = präfrontaler Cortex, OrbitoF = orbitofrotnaler Cortex, PAG = periaqueduktales Grau,SI/SII = primärer und sekundärer somatosensorischer Cortex

Literatur

2.2. Histamin

Das biogene Amin Histamin, oder auch 2-(4-Imidazolyl)ethylamin (C5H9N3), ist im Körper ubiquitär verbreitet. Es zählt zu den Gewebshormonen und befindet sich u. a. in der Haut, der Lunge, der Schleimhaut des Magen-Darm-Trakts sowie im Hypothalamus (DALE u. LAIDLAW 1910; BEST et al. 1927; SCHWARTZ et al. 1991). Gespeichert wird es in höheren Mengen in intrazellulären Vesikeln der Mastzellen (RILEY 1953), eosinophilen und basophilen Granulozyten (GRAHAM et al. 1955) sowie enterochromaffin-ähnlichen (ECL) Zellen der Magenschleimhaut (PRINZ et al. 2003). Nach Entdeckung des ß-Imidazolylethylamins im Mutterkorn (BARGER u. DALE 1910) wurden kurze Zeit später, noch bevor die Rezeptortheorie weitgehend akzeptiert war, die ersten Wirkungen des Histamins entdeckt (BARGER u. DALE 1910; DALE u. LAIDLAW 1910). Unter anderem konnte gezeigt werden, dass es bei einer Histaminapplikation durch eine Vasodilatation zu einer Blutdrucksenkung bis hin zum tödlichen Schock kommen kann. Die Bezeichnung "Histamin" wurde wenige Jahre später von DALE u. RICHARDS (1918) eingeführt. Eine erste Isolation aus tierischem Gewebe gelang fast 20 Jahre nach der Entdeckung (BEST et al. 1927), wodurch der Beweis erbracht wurde, dass Histamin ein im lebenden Organismus natürlich vorkommender Stoff ist und dort physiologische Funktionen übernimmt. Histamin moduliert die Funktion von antigenpräsentierenden Zellen (dendritischen Zellen, Makrophagen), T-Zellen, B-Zellen, epithelialen und endothelialen Zellen. Weiterhin beeinflusst es die Proliferation von T-Zellen, die Zytokinsekretion von dendritischen Zellen und die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Monozyten (z. B. ICAM-1; BÄUMER u. ROSSBACH 2010). Hieraus ergibt sich seine Funktion als wichtiger Mediator bei Entzündungsreaktionen. Bei intradermaler Injektion von Histamin kommt es zu der sogenannten „triple response“. Diese setzt sich zusammen aus lokal begrenzter Hautrötung, Erythem (diffuse Rötung) und juckender Quaddelbildung (LEWIS u. ZOTTERMAN 1927). Eine große Bedeutung kommt Histamin bei der allergischen Reaktion des Soforttyps zu (Typ-I-Allergie; BÄUMER u. ROSSBACH 2010). Schon seit langer Zeit werden in diesem Zusammenhang H1R-Antagonisten zur Therapie von z. B. allergischer Rhinitis oder Urtikaria eingesetzt (ORTONNE 2012; CHURCH 2017). Über die verschiedenen Histaminrezeptoren übernimmt dieses Amin im Körper vielschichtige physiologische und pathophysiologische Aufgaben (BÄUMER u. ROSSBACH 2010).

Literatur

2.3. Histaminrezeptoren Heute kennt man vier G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die Histamin als Liganden besitzen. Nach der Reihenfolge ihrer Entdeckung, welche eine Zeitspanne von fast 100 Jahren abdeckt, werden sie Histamin-1- bis -4-Rezeptor genannt (H1R-H4R). 1930 bis 1940 wurden die ersten Substanzen entwickelt, die die Histaminwirkung blockierten (H1R-Antagonisten). Man stellte fest, dass dies über eine kompetitive Bindung an einen Rezeptor passierte, der heute als H1R bekannt ist (WELLS et al. 1945). Diese ersten Antihistaminika bildeten die Basis für sehr erfolgreiche und z. T. bis heute eingesetzte Medikamente. Nichtsdestotrotz wurden durch diese Substanzen, da sie nicht alle durch Histamin ausgelösten Reaktionen hemmen konnten, eine Vielzahl neuer Fragen aufgeworfen. Diese führten zu der Annahme, dass es einen weiteren Histaminrezeptor geben könnte, den H2R (ASH u. SCHILD 1966). Ähnlich wurde der H3R entdeckt - es fiel auf, dass einige Histaminrezeptor-Liganden, deren Pharmakologie nicht zu der Wirkung vom H1R und H2R passten, Histaminwirkungen im Gehirn beeinflussten (ARRANG et al. 1983). Ab den 1990er Jahren wurden neue Rezeptoren fast nur noch über die Identifizierung ihrer Gensequenz entdeckt und nicht mehr ausschließlich über ihre Pharmakologie. In den frühen 90er Jahren wurde die cDNA des H1R und H2R das erste Mal kloniert (GANTZ et al. 1991a; GANTZ et al. 1991b; DEBACKER et al. 1993). Für den H3R gelang dies erst Ende der 90er-Jahre (LOVENBERG et al. 1999). Durch die Entdeckung der Gensequenzen wurde ein neues Werkzeug geschaffen, um weitere homologe Sequenzen in bestehenden Datenbanken zu finden. Auf diesem Weg fand man einen Rezeptor, der zu ca. 35 % mit dem H3R übereinstimmte und eine sehr hohe Affinität zu Histamin besaß (LIU et al. 2001a). Dieser Rezeptor ist heute als H4R bekannt und wurde von sechs unabhängig voneinander arbeitenden Forschungsgruppen nahezu gleichzeitig beim Menschen charakterisiert und kloniert (NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000; LIU et al. 2001a; MORSE et al. 2001; NGUYEN et al. 2001; ZHU et al. 2001). Im Gegensatz zum H3R war der H4R eine Neuentdeckung und seine Funktion(en) dadurch vollkommen unbekannt. Erste Hinweise lieferte die nachgewiesene Expression im Knochenmark (NAKAMURA et al. 2000; LIU et al. 2001a) und auf hämatopoetischen Zellen (NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000), welche bekannt dafür sind, im inflammatorischen Geschehen und bei Immunantworten beteiligt zu sein. Eine Übersicht über die Histaminrezeptoren findet sich in Tabelle 1.

Literatur

Abbildung 3: Strukturformel Histamin https://chem.nlm.nih.gov/chemidplus/name/histamine (abgerufen: 22.08.2017)

2.3.1. Intrazellulärer Signalweg des histamininduzierten Juckreizes in sensorischen Neuronen Ein möglicher Signalweg des über den H1R induzierten Juckreizes wurde von KREMER et al. (2014) beschrieben. Der an ein G-Protein gekoppelte H1R wird durch Histamin oder andere H1R-Agonisten stimuliert. Dadurch aktiviert er das membranassoziierte Enzym Phospholipase Cß3 (PLCß3), welches über drei G-Proteinuntereinheiten mit dem H1R verbunden ist (Gαq, G11, Gßγ; KREMER et al. 2014). Dieses Enzym katalysiert die Hydrolysierung des Membranphospholipids Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat (PIP2) in die second messenger Diacylglycerol (DAG) und Inositoltriphosphat (IP3) (HAN et al. 2006). DAG aktiviert die Proteinkinase Cε (PKCε), welche den TRPV1-Kanal phosphoryliert und somit aktiviert (PRESCOTT u. JULIUS 2003). Die Aktivierung des TRPV1-Kanals führt zu dessen Öffnung und macht das Durchtreten von positiv geladenen Ionen wie Natrium, Kalium und Calcium möglich. Dies wiederum führt zu einer Depolarisation, wodurch spannungsabhängige Natriumkanäle aktiviert werden, die ein Aktionspotential entlang der Nervenfaser generieren und so zur Juckreizempfindung führen (KIM et al. 2004; PAUS et al. 2006; SHIM et al. 2007). Es wurde zudem gezeigt, dass die Entfernung des oben genannten PIP2 den TRPV1 disinhibiert (PRESCOTT et al. 2003). Für die PIP2-abhängige Aktivierung des TRPV1 wird das Membranprotein phosphoinositide-interacting regulator of transient receptor potential channels (PIRT) benötigt (KIM et al. 2008; PATEL et al. 2011). Ein weiterer Weg zur Aktivierung des TRPV1-Kanals nach Aktivierung des H1R führt über die direkte Aktivierung des Enzyms Phospholipase A2 (PLA2). Diese führt zu einem Ca2+-

Literatur

Anstieg und zur Freisetzung von Arachidonsäure. Welche wiederum durch das Enzym Lipoxygenase (LO), zu diversen Produkten metabolisiert wird, darunter z. B. zur 12-Hydroperoxyeicosatetraenoischen Säure (12-HPETE). 12-HPETE selbst aktiviert nun den TRPV1-Kanal (KIM et al. 2004; SHIM et al. 2007). Histamininduzierter Juckreiz kann neben H1R-Antagonisten auch durch andere Inhibitoren an jeder Stufe dieses Signalweges inhibiert werden (Abb. 4). SHIM et al. (2007) zeigten z. B., dass der intradermal durch Histamin induzierte Juckreiz bei CD-1-Mäusen auch durch PLA2-, 12-LO- und TRPV1-Inhibitoren reduziert werden kann. Zu beachten ist hierbei, dass trotz allem einige der Neurone, die auf Histamin mit einer Erhöhung des intrazellulären Calciums reagieren, nicht auf Capsaicin reagieren (11,4 %) und somit TRPV1 nicht exprimieren (KIM et al. 2004; SHIM et al. 2007). Dies lässt vermuten, dass noch andere Mechanismen beteiligt sind. Des Weiteren sind die Signalweiterleitungsmechanismen für den H4R, der auch von Histamin aktiviert wird, noch weitestgehend unbekannt. Es ist jedoch bekannt, dass selektives Aktivieren dieses Rezeptors sowohl zu einer Erhöhung des intrazellulären Calciums in sensorischen Neuronen, als auch zu einer Juckreizantwort bei Tieren führt (BELL et al. 2004; ROSSBACH et al. 2011). Die Arbeit von JIAN et al. (2016) zeigte, dass auch beim H4R der TRPV1-Kanal und die Phospholipase C (PLC) eine Rolle spielen. Weitere Mechanismen der nachgeschalteten Signalkaskade wurden noch nicht untersucht.

Histamin H1-Rezeptor spannungs- abhängige Na+-Kanäle

Depolarisation Aktionspotentiale

Abbildung 4: Putativer Signalweg des über den H1R induzierten Juckreizes, modifiziert nach KREMER et al. (2014)

Literatur

Tabelle 1: Übersicht über die Histaminrezeptoren und ihre Funktionen, modifiziert nach BÄUMER u. ROSSBACH (2010)

Rezeptor H1R H2R H3R H4R Expressions- Nervenzellen, glatte Nervenzellen, glatte Histaminerge Mastzellen, gewebe Muskulatur in Muskulatur im Neurone, Eosinophile, Respirations-, Respirationstrakt Eosinophile, Basophile, DCs, Gastrointestinal-, und den Gefäßen, Monozyten, (DCs) T-Lymphozyten, Urogenitaltrakt und Partietalzellen der Monozyten, Gefäßen, Magenschleimhaut, Neutrophile, Hepatozyten, Hepatozyten, Nervenzellen, Endothel- und Chondrozyten, dermale Epithelzellen, Endothel- und Fibroblasten, Neutrophile, Epithelzellen, endokrine Zelle des Eosinophile, Neutrophile, Gastrointestinaltrakts Monozyten, DCs, T- Eosinophile, und B-Lymphozyten Monozyten, DCs, T- und B-Lymphozyten Physiologische Kontratkion glatter Glanduläre Neurotransmitterfrei- Chemotaxis, Funktion Muskelzellen, Sekretion, setzung, Steuerung Zytokin-/Chemokin- Erhöhung Entspannung glatter von Schlaf und produktion von Gefäßpermeabilität, Muskulatur Nahrungsaufnahme Immunzellen Schlaf-Wach-Zyklus

Pathologische Typ-I-Allergie Säure-induzierte Kognitive Inflammation, Relevanz (z. B. Urtikaria, Gastritis, Störungen, Obesitas Juckreiz Rhinokonjunktivitis) gastroinestinale Juckreiz Ulzerationen

G-Protein Gq,11 Gαs Gi/o Gi/os Agonisten N-methylhistapro- Amthamin, Immethridine 4-Methylhistamin, difen, HTMT, Apromodin ST-1006 2-Pyridylethylamin Antagonisten/ Chlorpheniramin, Cimetidin, Ranitidin Tripolisant, JNJ7777120, Inverse Agonisten Diphenhydramin, Pitolisant JNJ39758979, Loratadin,Cetirizin JNJ39594906 Deslorotadin, Fexofenandin

DC = dendritische Zelle; HTMT = Histamin-Trifluoromethyl-Toluidin-Dimaleat

Literatur

2.4. Histamin-4-Rezeptor Der H4R wurde von NAKAMURA et al. (2000) aus humaner Leukozyten-DNA kloniert und ist ein 44-kDa Protein mit 390 Aminosäuren. Auch er gehört zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Die Aminosäuresequenz des H4Rs stimmt mit der des H3Rs zu 35 - 43 % überein (NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000; LIU et al. 2001a; MORSE et al. 2001; NGUYEN et al. 2001; ZHU et al. 2001). NGUYEN et al. (2001) zeigten zudem eine 58 %ige Homologie der Transmembranedomänen des H3Rs und des H4Rs. Kurz nach der ersten Klonierung beim Menschen folgte die Klonierung des H4R in anderen Spezies wie Ratte, Maus, Meerschweinchen, Schwein, Affe und Hund (LIU et al. 2001b; ODA et al. 2002; ODA et al. 2005; JIANG et al. 2008). Dabei stellte man fest, dass es zwischen den einzelnen Spezies große Unterschiede in der Homologie dieser Rezeptoren gibt. Dies spiegelt sich auch in der unterschiedlichen Wirkungspotenz/Bindungsaffinität der einzelnen Agonisten und Antagonisten bei den Spezies wider (LIU et al. 2001b).

2.4.1. Vorkommen und Funktion Im Zuge der Entdeckung wurde der H4R in einer Vielzahl von Geweben detektiert, u. a. in Herz, Niere, Leber, Lunge, Pankreas, Skelettmuskulatur, Leukozyten, Prostata, Dünndarm, Milz, Hoden, Knochenmark und Lymphknoten (NAKAMURA et al. 2000). Später wurde der H4R auch auf humanen Hautmastzellen (LIPPERT et al. 2004) oder auf Nervenzellen der Spinalganglien und im Rückenmark nachgewiesen (STRAKHOVA et al. 2009). Die Angaben zur Expression im Gehirn variieren je nach Autor. STRAKHOVA et al. (2009) zeigten eine Expression des H4R in Cortex, Cerebellum, Hirnstamm, Amygdala, Thalamus und Striatum. LIU et al. (2001b) konnten eine Expression im Gehirn dagegen nicht bestätigen. Neben dem H1R spielt auch der H4R eine große Rolle bei der Juckreizentstehung. Da Antihistaminika (H1R-Antagonisten) zwar wirksam in der Reduktion von Urtikaria und allergischer Rhinitis sind, aber keine Wirkung bei anderen pruritischen Erkrankungen wie der AD zeigen, stellte sich mit der Entdeckung des H4R die Frage, ob dieser für den nicht über den H1R mediierten Juckreiz verantwortlich sei. Mit H4R-Agonisten konnte in verschiedenen Studien im Mausmodell Juckreiz ausgelöst (BELL et al. 2004; DUNFORD et al. 2007; ROSSBACH et al. 2011) und mit dem spezifischen Antagonisten JNJ7777120 geblockt

Literatur

werden (DUNFORD et al. 2007; YAMAURA et al. 2009). Auch für H4R-Antagonisten mit anderer chemischer Struktur konnte dies gezeigt werden (BELL et al. 2004; COWART et al. 2008; LIU et al. 2008; KOENIG et al. 2010; SHIN et al. 2012; SAVALL et al. 2014). Ebenso konnte bei H4R-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtypmäusen kein oder nur wenig Juckreiz durch Histamin oder H4R-Agonisten ausgelöst werden (DUNFORD et al. 2007; YU et al. 2010). Weiterhin hemmten H4R-Antagonisten bei Mäusen den Juckreiz ausgelöst durch Substanz P (YAMAURA et al. 2009), Haptene (ROSSBACH et al. 2009; SUWA et al. 2011) und auch in verschiedenen Dermatitis-Modellen (COWDEN et al. 2010a; OHSAWA u. HIRASAWA 2012). Diese und weitere präklinische dermatologische Studien zeigten, dass H4R-Antagonisten gegen pruritische Erkrankungen wie die AD wirksam sein könnten. Des Weiteren konnte der H4R Agonist 4-Methylhistamin ebenso wie Histamin eine Degranulation der Mastzellen auslösen. Dieser Effekt konnte durch JNJ7777120 geblockt werden (JEMIMA et al. 2014). Weiterhin kam es wie bei den eosinophilen Granulozyten zu einem intrazellulären Ca2+-Anstieg und zu einer histamininduzierten Chemotaxis (REHER et al. 2012), welche in H4R-defizienten Mäusen nicht vorhanden war (HOFSTRA et al. 2003) . Die Effekte auf Mastzellen und Eosinophile deuten ebenfalls auf eine Beteiligung an Erkrankungen wie der AD und Asthma hin. Dies wurde durch verschiedene Arbeiten belegt. Die Blockade des H4R bewirkte eine Reduktion der Entzündungsreaktion in verschiedenen Asthma- und AD-Modellen (COWDEN et al. 2010a; SEIKE et al. 2010; SUWA et al. 2011; MATSUSHITA et al. 2012; OHSAWA u. HIRASAWA 2012; THURMOND et al. 2014; ROSSBACH et al. 2016). Es gab bereits erste klinische Studien am Menschen, in denen die antipruritische Wirkung von H4R-Antagonisten getestet wurden. Der potente und selektive H4R-Antagonist JNJ39758979 hat hier gezeigt, dass er die histamininduzierte Juckreizantwort beim gesunden Probanden im Vergleich zu der Placebo-Gruppe reduzieren konnte (KOLLMEIER et al. 2014). In einer Phase 2a Studie an Patienten mit moderater AD, konnte mit dieser Substanz ebenfalls eine Verbesserung im Pruritus-Score erzielt werden. Leider musste diese Studie aufgrund zweier Fälle von Agranulozytose abgebrochen werden. Diese Nebenwirkung wurde vermutlich durch reaktive Metaboliten des Antagonisten ausgelöst und nicht durch den Antagonismus am H4R selbst (MURATA et al. 2015). In einer aktuellen Phase-IIa-Studie reduzierte der H4R- Antagonist ZPL-389 die klinischen Symptome, inklusive des Juckreizes, von Patienten mit

Literatur

milder oder moderater AD (WERFEL et al. 2016). Weitere H4R-Antagonisten wurden in klinischen Studien getestet. Ihre Ergebnisse wurden bis zum heutigen Zeitpunkt aber nicht publiziert (THURMOND 2015). Weitere präklinische Daten lassen vermuten, dass eine Kombination aus H1R- und H4R-Antagonisten bessere Wirkungen in der Therapie pruritischer Erkrankungen erzielen kann, als die Hemmung des H1R oder H4R alleine (DUNFORD et al. 2007; ROSSBACH et al. 2009; OHSAWA u. HIRASAWA 2012; KÖCHLING et al. 2017). Neben der Linderung des Juckreizes wurden weitere Parameter dieser Erkrankungen verbessert. Tabelle 2 zeigt eine Übersicht über einige H4R-Liganden. Aufgrund der großen Homologie des H4R zum H3R sind einige für den H3R entwickelte Substanzen auch am H4R wirksam und werden deshalb ebenfalls in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2: Ausgewählte Histamin-4-Rezeptor-Liganden

H4R-Agonisten H3R/H4R-Agonisten H4R-Antagonisten H3R/H4R-Antagonisten

OUP-16 Immepip JNJ7777120 Thioperamid 4-Methylhistamin Imetit JNJ10191584 (VUF6002) VUF-8430 (R)-α-Methylhistamin JNJ28307474 Dimaprit VUF5222 JNJ40279486 ST-1006 (Compound32) JNJ39758979 Clobenpropit Clozapin Burimamid

(LIU et al. 2001a; HASHIMOTO et al. 2003; JABLONOWSKI et al. 2003; THURMOND et al. 2004; LIM et al. 2005; VENABLE et al. 2005; LIM et al. 2006; SANDER et al. 2009; COWDEN et al. 2010b; ISTYASTONO et al. 2011; ROSETHORNE u. CHARLTON 2011; SAVALL et al. 2011; THURMOND et al. 2014)

2.5. TRP-Ionenkanäle In den letzten drei Jahrzehnten haben sich die TRP-Kanäle in der biomedizinischen Forschung immer mehr in den Vordergrund gedrängt. Die TRP-Kanäle sind wenig spannungssensitive und nicht-selektive Calcium-durchlässige Kanäle. Sie bilden die TRP- Ionenkanal Superfamilie und wurden zuerst in Drosophila beschrieben (COSENS u. MANNING 1969; MONTELL u. RUBIN 1989). In verschiedenen Spezies wurden über 100

Literatur

TRP-Gene identifiziert (NILIUS u. OWSIANIK 2011). In Säugetieren besteht die TRP- Kanal-Familie aus sechs Subfamilien (TRPC [canonical], TRPV [vanilloid], TRPM [melastin], TRPA [ankyrin], TRPML [mucolipin], TRPP [polycystic]; MINKE 2010). In Invertebraten und Fischen findet man eine siebte Unterfamilie, die der TRPN(NO-mechano- potential-/NOMP-C)-Familie (MINKE 2010). Je nach Spezies variiert die Anzahl der Kanäle in den einzelnen Subfamilien (NILIUS u. OWSIANIK 2011). Generell bestehen die TRP- Kanäle aus sechs Transmembrandomänen (S1-S6) mit einer Pore zwischen S5 und S6 (WU et al. 2010).

Abbildung 5: Phylogenetischer Stamm humaner TRP-Kanäle, modifiziert nach NILIUS u. OWSIANIK (2011) Sequenzhomologieanalysen zeigen, dass alle TRP-Kanäle in sieben Gruppen mit verschiedenen Eigenschaften eingeteilt werden können. Es wurde der TRPC2 von der Maus und der TRPN1 vom Fisch für die Analyse verwendet, da TRPC2 beim Menschen nur ein Pseudogen darstellt und TRPN beim Säugetier nicht vorhanden ist. Hiermit sollen die Relationen zwischen den einzelnen Subfamilien gezeigt werden

Literatur

2.5.1. Vorkommen, Funktion und Wirkmechanismen Die TRP-Kanäle sind ubiquitär im Organismus verteilt (NILIUS u. OWSIANIK 2011). Viele Zellen exprimieren mehrere TRP-Kanalproteine gleichzeitig. Obwohl viele ihrer Funktionen unbekannt sind, lässt ihre weite Verbreitung darauf schließen, dass ihre biologischen Funktionen und Aktivierungsmechanismen sehr vielfältig sind (NILIUS u. OWSIANIK 2011). Die meisten befinden sich in der Plasmamembran und spielen eine essentielle Rolle bei der Kontrolle/Modulation vom Influx und den transzellulären Transportmechanismen von Ca2+, Mg2+ und Spurenelementen (NILIUS u. OWSIANIK 2011). Die TRP-Kanäle sind beteiligt an der sensorischen Transduktion, Reaktion auf thermische Reize, nozizeptive Stimuli, Berührung, Osmolarität, Pheromone sowie andere intra- und extrazelluläre Reize (NILIUS u. OWSIANIK 2011). Sie sind aber auch an motorischen Funktionen, wie der Muskelkontraktion und der vasomotorischen Kontrolle beteiligt (NILIUS u. OWSIANIK 2011). Einige der TRP-Kanäle findet man hauptsächlich in einer Reihe sensorischer Neurone. Dies führt zu der Annahme, dass speziell diese an der Erkennung sowohl von nozizepitven als auch von prurizeptiven Reizen beteiligt sind. In sensorischen Neuronen der Spinal- und Trigeminalganglien sind TRPV1, TRPV2, TRPV4, TRPM2, TRPM3, TRPM8 und TRPA1 exprimiert (KITTAKA u. TOMINAGA 2017). Weiterhin sind der TRPV3 und TRPV4 in Keratinozyten zu finden (PEIER et al. 2002; CHUNG et al. 2004). Diverse Studien zeigten, dass einige Membranphospholipide eine direkte Wirkung auf die Regulation der TRP-Kanalaktivität haben (KARASHIMA et al. 2008; KIM et al. 2008). Viele sind vor allem sehr sensitiv auf PIP2 (KARASHIMA et al. 2008; NILIUS et al. 2008; ROHACS 2014; HILLE et al. 2015). Des Weiteren sind einige membranständige Enzyme ebenfalls sensitiv auf PIP2, wodurch sie direkt oder indirekt die TRP-Kanal-Funktion beeinflussen (KIM et al. 2008). Die Phosphorylierung der Kanäle, z. B. durch die Proteinkinase C (PKC), kann einen direkt aktivierenden Mechanismus darstellen, oder den Kanal für andere Stimuli sensitivieren (BHAVE et al. 2003). Weiterhin kann es durch die Aktivität der PKC bei einigen Kanälen, z. B. TRPM8, zu einer Dephosphorylierung und somit zu einer Deaktivierung des Kanals kommen (PREMKUMAR et al. 2005). Die Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) und der PLC führen häufig zu einer Potenzierung der TRPV1- abhängigen Antworten (BHAVE et al. 2003; WU et al. 2010).

Literatur

2.5.1.1. Beteiligung am Juckreizgeschehen Viele Signalkaskaden von diversen Juckreizmediatoren sind assoziiert mit denen der TRP- Kanäle. Diese, und im Speziellen die thermosensitiven, sind in primären sensorischen Neuronen und Hautkeratinozyten exprimiert (KITTAKA u. TOMINAGA 2017). Diese thermosensitiven Ionenkanäle reagieren auf vielfältige Stimuli wie Säuren (CATERINA et al. 1997; DHAKA et al. 2009), Alkalien (FUJITA et al. 2008; DHAKA et al. 2009), Osmolaritätsveränderungen (STROTMANN et al. 2000), künstliche Substanzen (FUJITA et al. 2007) und Phytochemikalien (CATERINA et al. 1997; XU et al. 2006). TRPV1 und TRPA1 sind, wie anhand von Tabelle 3 zu erkennen ist, die beiden an der Juckreizweiterleitung hauptbeteiligten TRP-Ionenkanäle. Zudem gibt es eine Reihe von Beweisen, dass der TRPV1 eine Schlüsselrolle in der Signaltransduktion von Histamin spielt (KIM et al. 2004; SHIM et al. 2007). Weiterhin ist auch für TRPV3, TRPV4, TRPC3 bekannt, dass sie an der Juckreizweiterleitung einiger Pruritogene beteiligt sind (Tab. 3). Dies macht sie zu einem guten Ziel zur Behandlung sowohl von akutem als auch chronischen Juckreiz. Dies könnte ebenfalls auf ein Zusammenspiel oder zumindest eine enge Verbindung zwischen beiden Kanälen hindeuten. Einige der nicht-histaminergen Pruritogene wie das IL- 31 oder Leukotrien B4 (LTB-4) benötigen z. B. sowohl den TRPV1 als auch den TRPA1 zur Weiterleitung des Juckreizsignals (Tab. 3). Bisher wird aufgrund einiger Studien angenommen, dass der histaminerge und der nicht-histaminerge Juckreiz durch komplett unabhängige Signalwege gesteuert werden (ROBERSON et al. 2013). Hierbei wird postuliert, dass TRPV1-exprimierende Neurone hauptsächlich an histaminergem und TRPA1- exprimierende Neurone an nicht-histaminergem Juckreiz beteiligt sind (WILSON et al. 2011; ROBERSON et al. 2013). Dennoch gibt es in diesen und anderen Studien auch Ungereimtheiten. ROBERSON et al. (2013) beispielsweise zeigten, dass eine Subpopulation (39,2 %) der auf Histamin sensitiven Neurone auf den spezifischen TRPA1-Agonisten AITC reagierten und 69,6 % der positiv auf Histamin reagierenden Neurone auf den spezifischen TRPV1-Agonisten Capsaicin. Leider macht der Autor hier keine Angabe zur möglichen Schnittmenge der gemeinsam auf Histamin, Capsaicin und AITC reagierenden Zellen. Generell ist bekannt, dass der TRPA1 in einer Subpopulation der TRPV1-exprimierenden Neurone vorhanden ist (STORY et al. 2003; GOUIN et al. 2017). Die Expression von TRPV1 und TRPA1 auf nicht-neuronalen Zellen (Keratinozyten, Mastzellen, DCs, Endothelzellen)

Literatur

spielt in der Nozizeption ebenfalls eine Rolle und ist weiterhin beteiligt an der Verstärkung inflammatorischer Prozesse (GOUIN et al. 2017). Für einige weitere TRP-Kanäle ist bekannt, dass sie an der Regulation der Mediatorfreisetzung und Hautbarrierefunktionen beteiligt sind und somit eine Rolle bei der Entstehung pruritischer (Haut-)Erkankungen spielen. Der TRPV2-Kanal ist laut einer Studie von ZHANG et al. (2012a) an der Mastzelldegranulation, verursacht durch physikalische Stimuli, beteiligt. Bei einer sogenannten Gain-of-Function- Mutation des TRPV3 (Gly573Ser) verursachte dies in Mäusen neben Haarlosigkeit und Dermatitis zusätzlich starken Juckreiz (ASAKAWA et al. 2006). Beim Menschen kommt es bei dem Olmstedt-Syndrom durch die gleiche Mutation ebenfalls zu ausgeprägtem Juckreiz (LIN et al. 2012). Eine mögliche Rolle wird diesem Kanal auch bei dem durch trockene Haut verursachten Juckreiz zugeschrieben (YAMAMOTO-KASAI et al. 2012). In einem TRPM4-/--Mausmodell konnte gezeigt werden, dass die Migration der Mastzellen dysreguliert ist. Ebenso zeigten diese Tiere eine erhöhte Mastzelldegranulation und Mediatorenfreisetzung (SHIMIZU et al. 2009). Als Zielstruktur zur systemischen Therapie von anaphylaktischen oder lokalen allergischen Reaktionen, ist der TRPM4 jedoch aufgrund seiner weiten Verbreitung und Beteiligung an verschiedenen physiologischen Funktionen (z. B. Herzschlagentstehung) nicht, oder nur mit starker Limitierung geeignet (TOTH et al. 2015). Urämische Patienten entwickeln aufgrund einer Hypomagnesiämie Juckreiz. Der TRPM6 und TRPM7 spielen eine Rolle in der Mg2+-Homöostase und könnten demnach hypothetisch bei der Juckreizentstehung durch einen Magnesiummangel beteiligt sein (TOTH et al. 2015). TRPM8 scheint nicht im Juckreizgeschehen involviert zu sein (TOTH et al. 2015). Dahingegen macht es den Eindruck, dass dieser Ionenkanal positive Effekte auf die Regeneration der Hautbarriere hat. In einer Studie wurde bei haarlosen Mäusen nach einer Barrierestörung mit einer TRPM8-Agonistenbehandlung die Regeneration potenziert (DENDA et al. 2010). TRPC1 ist bekannt dafür in der Epidermis von Morbus-Darier- Patienten überexprimiert zu sein. Durch Mutationen im SERCA2b-Gen kommt es zu schweren Differenzierungsstörungen der Keratinozyten in Begleitung mit intensivem Juckreiz (PANI et al. 2006). Eine verminderte Expression von TRPC1, TRPC3, TRPC4, TRPC5, TRPC6, und TRPC7 wurde in Keratinozyten von Psoriasis-Patienten gefunden (LEUNER et al. 2011). SUN et al. (2012) brachten zudem eine Dysfunktion des TRPC6 mit der

Literatur

Pathogenese der AD in Verbindung und postulieren, dass eine verstärkte Aktivierung dieses Ionenkanals eine neue Möglichkeit in der Behandlung der AD darstellen könnte.

Tabelle 3: Pruritogene, ihre Rezeptoren und ihre im nachgeschalteten intrazellulären Signalweg wirksamen TRP-Kanäle auf sensorischen Neuronen, modifiziert nach ZHANG (2015)

Pruritogen Rezeptor Aktivierte Ionenkanäle Referenzen Histamin H1R, H3R, H4R TRPV1, andere? (KIM et al. 2004; SHIM et al. 2007; TRPV4 * IMAMACHI et al. 2009; ROSSBACH et al. 2011; ROBERSON et al. 2013; AKIYAMA et al. 2016; CHEN et al. 2016; JIAN et al. 2016) Chloroquin MrgprA3 TRPV1, TRPA1, TRPC3, (WILSON et al. 2011; TRPV4** ROBERSON et al. 2013; THAN et al. 2013; AKIYAMA et al. 2016; FUKUYAMA et al. 2017) SLIGRL, BAM8-22 MrgprC11 TRPA1, TRPV1 (WILSON et al. 2011; ROBERSON et al. 2013; AKIYAMA et al. 2016) ET-1 ETAR TRPA1 (IMAMACHI et al. 2009; TRPV4 * LIANG et al. 2011; CHEN et al. 2016) Cowhage PAR2, PAR 4 TRPA1? (REDDY et al. 2008) Trypsin PAR2 TRPV1 (COSTA et al. 2008) IL-31 IL-31 RA TRPV1, TRPA1 (OH et al. 2013; CEVIKBAS et al. 2014)

Serotonin 5-HT2 TRPV4 (AKIYAMA et al. 2016)

5-HT7 TRPA1 (MORITA et al. 2015) TSLP TSLPR TRPA1 (WILSON et al. 2013) LTB4 BLT1 TRPV1, TRPA1 (FERNANDES et al. 2013) ß-Alanin MrgprD ? (LIU et al. 2012) Gallensäuren TGR5 TRPA1 (ALEMI et al. 2013; LIEU et al. 2014)

LPA LPA5 TRPV1, TRPA1 (KITTAKA et al. 2017)

H2O2 TRPA1 (LIU u. JI 2012) Imiquimod TLR7? TRPV1 (indirekt) (LIU et al. 2010; KIM et al. 2011)

* spielt eine Rolle als Prurizeptor auf epidermalen Keratinozyten **erhöhte Antwort bei Mäusen im Knockout-Modell

Literatur

2.5.2. TRPV1-Kanal Die TRPV-Subfamilie besteht aus sechs Kanälen (WU et al. 2010), die sich in zwei Gruppen aufteilt: V1/V2/V3/V4 und V5/V6 (CLAPHAM et al. 2005). Die Familie wurde nach dem aus dieser Gruppe zuerst entdeckten und am besten untersuchten Ionenkanal, dem Vanilloid- Rezeptor 1, benannt (CATERINA et al. 1997). Weiterhin ist der TRPV1 auch als Capsaicin- Rezeptor bekannt (CATERINA et al. 1997). Er ist sehr stark auf myelinisierten (Aδ) und unmyelinisierten (C) nozizeptiven Fasern von Spinal-, Trigeminalganglienneuronen und denen des Ganglion Nodosum exprimiert (HELLIWELL et al. 1998; CATERINA 2000). In weitaus geringeren Mengen ist er in menschlicher Haut, einschließlich Keratinozyten, dermalen Mastzellen, DCs, Haarfollikelkeratinozyten und Sebozyten der Talgdrüsen zu finden (TOTH et al. 2015). TRPV1 wird durch diverse externe Reize, z. B. durch erhöhte Temperaturen (> 43 °C) und dem prototypischen Agens Capsaicin (isoliert aus der Chilischote), aktiviert (CATERINA et al. 1997). Er wird aber auch durch andere interne Stimuli wie Veränderungen des pH-Wertes, sowohl bei der Azidose als auch der Alkalose (DHAKA et al. 2009), Bradykinin (CHUANG et al. 2001; SHIN et al. 2002), Adenosintriphosphat (ATP; TOMINAGA et al. 2001), verschiedenen Neuropeptiden, z. B. Nerve Growth Factor (NGF), Neurotrophin-3 und -4 (LAZAR et al. 2004), proinflammatorischen Zytokinen (NICOL et al. 1997; ZHANG et al. 2005) oder Lipoxygenaseprodukte (HWANG et al. 2000; SHIN et al. 2002) aktiviert. Seine Aktivierung führt seinerseits zusätzlich zur Freisetzung von Zytokinen und anderen Mediatoren (z. B. Interleukine, Prostaglandine und Wachstumsfaktoren), welche zu einer Juckreizauslösung/-verstärkung führen können (VRIENS et al. 2009; TOTH et al. 2015). In Tabelle 3 ist erkennbar, dass diverse Pruritogene für ihre Signalübertragung auf den TRPV1 angewiesen sind. Aus diesem Grunde besteht die Möglichkeit, dass es verschiedene Untereinheiten von TRPV1-exprimierenden Neuronen gibt, die darauf spezialisiert sind, die Signale von spezifischen Pruritogengruppen zu verarbeiten. Alternativ ist jedes TRPV1- exprimierende Neuron mit multiplen Mechanismen ausgestattet, um die Signale der verschiedenen Mediatoren zu verarbeiten und eine Juckreizantwort auszulösen (IMAMACHI et al. 2009). Weiterhin kommt dem TRPV1, neben der Juckreizempfindung, eine wichtige Rolle bei der Schmerzempfindung und der Thermosensation zu. Er kann deshalb auch als polymodaler Nozizeptor bezeichnet werden (TOTH et al. 2015).

Literatur

Einige TRPV1-Antagonisten wurden in Hinblick auf ihre analgetische Wirkung in klinischen Studien der Phase II getestet. Diese wurden aufgrund unvorhergesehener Nebenwirkungen, z. B. Hyperthermie und beeinträchtigter Hitze-Schmerz-Empfindung, nicht weiter verfolgt (TOTH et al. 2015). Pilotstudien mit dem TRPV1-Antagonisten PAC-14028 zeigten positive Effekte auf die Juckreizlinderung in Modellen der AD (YUN et al. 2011; LIM u. PARK 2012). Im durch Dermatophagoides farinae (Hausstaubmilbe) und Oxazolon ausgelösten Maus-Modell für AD konnte die Substanz die Dermatitis-assoziierten Hautbarriereschädigungen verhindern und gleichzeitig die Symptome der AD lindern (YUN et al. 2011; LIM u. PARK 2012). Diese Daten müssen allerdings noch an Patienten mit AD überprüft werden.

Tabelle 4: Ausgewählte TRPV1-Kanal-Liganden

Agonisten Inhibitoren Capsaicin Capsazepin Anandamid SB 366791 Olvanil AMG 9810 Capsiat JNJ 17203212 Resinferatoxin (Ruthenium Red) Piperin

(…) = antagonistisch sowohl am TRPV1- als auch an anderen TRP-Kanälen . (SZOLCSANYI et al. 1990; AMANN u. MAGGI 1991; CATERINA et al. 1997; KWAK et al. 1998; ROSS et al. 2001; IIDA et al. 2003; GUNTHORPE et al. 2004; GAVVA et al. 2005; MCNAMARA et al. 2005; BHATTACHARYA et al. 2007; VRIENS et al. 2009)

2.5.3. TRPA1-Kanal Bis heute findet man in der TRPA-Familie nur einen Kanal, den TRPA1. Dieses Protein enthält mindestens 14 Ankyrin-Wiederholungen, wodurch diese Subfamilie ihren Namen erhielt (griechisch agkyra = Anker; NILIUS u. OWSIANIK 2011). Diese gehören zu den Bindungsproteinen und interagieren mit zytoskelettalen Komponenten. Dieser Ionenkanal wird durch eine Reihe verschiedener Stimuli aktiviert. Hierzu gehören einige Inhaltstoffe von Knoblauch, Zimt, Wasabi und Senföl, aber auch reizende Mittel wie Formaldehyd und das in

Literatur

Rauch enthaltende Acrolein (BAUTISTA et al. 2006). Weiterhin wird er aktiviert durch endogene Moleküle wie Sauerstoff- oder Stickstoffradikale und 4-Hydroxynonenal (BANDELL et al. 2004; JORDT et al. 2004; PATAPOUTIAN et al. 2009; WILSON et al. 2011). Der TRPA1-Kanal ist, wie in Tabelle 3 ersichtlich, bekannt dafür, an der Juckreizweiterleitung diverser nicht-histaminerger Pruritogene beteiligt zu sein. Weiterhin ist er involviert in der Entzündungsentstehung, der Schmerzweiterleitung und der Kälteempfindung (< 17 °C) (STORY et al. 2003; BANDELL et al. 2004; BAUTISTA et al. 2006; PATAPOUTIAN et al. 2009). Der TRPA1 ist hauptsächlich auf sensorischen Neuronen zu finden. Dennoch wurde er auch auf einigen nicht neuronalen Zellen nachgewiesen, z. B. Lungenfibroblasten, Melanozyten und epidermalen Keratinozyten (ATOYAN et al. 2009; NASSINI et al. 2012). In Letzteren scheint er an der Regulation der Hautbarriere beteiligt zu sein. Bei Mäusen, denen mit Hilfe von sogenanntem „tape stripping“ die oberen Hautschichten mit Tesafilm abgetragen und somit die Hautbarriere geschädigt wurde, wurde die Barrierewiederherstellung durch Applikation eines TRPA1-Agonisten verbessert. Bei der Gabe eines TRPA1-Inhibitors wurde dieser Prozess verlangsamt (DENDA et al. 2010). Eine Stimulation von TRPA1 auf Normal Human Keratinocytes (NHEK-Zellen) führte zu einer Synthese der proinflammatorischen Interleukine IL-1α und IL-1ß (ATOYAN et al. 2009). Des Weiteren verursachte eine topische Applikation von Cinnamaldehyd (TRPA1-Agonist) bei Mäusen eine Hautentzündung (SILVA et al. 2011). Zusätzlich wurde die zentrale Rolle des TRPA1 am Entzündungsgeschehen von LIU et al. (2013) gezeigt. Im Kontaktdermatitis- Modell resultierte eine genetische Ablation oder eine pharmakologische Blockade des TRPA1 in einer Verringerung des Hautödems, der Keratinozytenhyperplasie, Leukozyteninfiltration und des Kratzverhaltens von Mäusen nach Oxazolongabe. Zusätzlich waren die inflammatorischen Zytokine und endogenen Pruritogene in der Haut reduziert. Dies wird gestützt durch die Untersuchungen von OH et al. (2013). Sie zeigten, dass die Expression des TRPA1 in den sensorischen Nerven der Haut, den Mastzellen und der Epidermis in Hautstanzen von AD-Patienten im Vergleich zur gesunden Kontrolle stark erhöht war. Die Rolle des TRPA1 bei der AD erscheint nach den bisherigen Daten multifaktoriell und zum Teil sogar widersprüchlich zu sein. Jegliche Therapie, die den TRPA1 inhibiert, hat den Vorteil der Juckreizlinderung, stellt aber gleichzeitig eine Hinderung der Barrierewiederherstellung dar. Der TRPA1 wird u. a. in den nachgeschalteten Signalwegen

Literatur

von PLC-stimulierenden G-Protein gekoppelten Rezeptoren aktiviert und depolarisiert möglicherweise Nozizeptoren als Reaktion auf proalgetische Agenzien wie Bradykinin, Histamin, Serotonin oder ATP (CLAPHAM et al. 2005).

Tabelle 5: Ausgewählte TRPA1-Kanal-Liganden

Agonisten Inhibitoren Allylisothiocyanat (AITC) HC-030031 Icilin GRC17536 ∆9-Tetrahydrocannabinol (THC) A-967079 Allicin (Ruthenium Red) Acrolein Cinnamaldehyd

(…) = antagonistisch sowohl am TRPA1 als auch an anderen TRP Kanälen. (STORY et al. 2003; BANDELL et al. 2004; JORDT et al. 2004; BAUTISTA et al. 2006; MCNAMARA et al. 2007; CHEN et al. 2011; MUKHOPADHYAY et al. 2014)

2.6. Juckreizmodelle in der Tiermedizin Das perfekte Tiermodell für künstlich induzierten Juckreiz oder Schmerz wäre eines, bei dem die Antwort des Tieres analog zu der des Menschen ist. Kriterien hierfür sind, dass das Versuchstier in der Lage ist, zwischen Juckreiz und Schmerz zu unterscheiden und dies auch mit unterschiedlichem Verhalten ausdrückt (LAMOTTE et al. 2011). Letzteres ist besonders wichtig, da ein Tier, im Gegensatz zum Menschen, nicht verbal zum Ausdruck bringen kann, welche Empfindungen es hat. Unter den vielen Grundlagenexperimenten, die zur Erforschung der Signalkaskade des Juckreizes durchgeführt werden, ist die einfachste und quantitativste Methode das Auszählen von Kratzattacken, die zur Injektionsstelle bestimmter Substanzen hin gerichtet sind. Diese Methode wird besonders häufig bei kleinen Nagern, wie z. B. Mäusen, angewendet. Das älteste Modell hierfür ist über 20 Jahre alt. Bei diesem werden chemische Substanzen in den Nacken appliziert („nape injection“-Modell) und nachfolgend werden die Kratzattacken, die auf diese Stelle gerichtet sind, über einen festgelegten Zeitraum gezählt (KURAISHI et al. 1995). Da die Maus diese Stelle nur mit ihrer Hinterpfote erreichen kann, eignet sich dieses Modell nicht zur Unterscheidung pruritogener und nozizeptiver

Literatur

Stimuli (SHIMADA u. LAMOTTE 2008). Nichtsdestotrotz ist dies das Standardmodell in der Juckreizforschung. Später kam ein Modell hinzu, bei dem die zu testenden Substanzen in die Wange appliziert werden („cheek injection“-Modell). Bei diesem werden Kratzattacken gezählt, die mit der ipsilateralen Hinterpfote auf die Wange in die die pruritogene Substanz appliziert wurde, gerichtet sind. Dieses Modell erlaubt es, zwischen Schmerz und Juckreiz zu unterscheiden. Bei einer Schmerzreaktion wischen sich die Mäuse mit der ipsilateralen Vorderpfote über die Wange (Abb. 6; SHIMADA u. LAMOTTE 2008; AKIYAMA et al. 2010). Einer der Nachteile dieses Modells könnte sein, dass sich die Juckreiz- und Schmerzmechanismen von Kopf und Körper unterscheiden (LAMOTTE et al. 2011). Somit ist unsicher, inwiefern sich aus diesem Modell Rückschlüsse auf den Menschen ziehen lassen können. Eine weitere Körperregion zu der multiple Verhaltensmuster gerichtet sein können, ist bei Mäusen die Hinterpfote (sogenanntes „hind paw injection“-Modell). Hierbei werden die zu untersuchenden Subtanzen in die plantare Fläche der Hinterpfote injiziert (TSUDA et al. 1999). Ein Belecken der Pfote wird nach Applikation nozizeptiver Stimuli (Algogene), wie z. B. Capsaicin und Formalin, gesehen. Beknabbern dagegen gilt als Ausdruck für eine Juckreizempfindung (HAGIWARA et al. 1999). Bei diesem Modell kommt es zu einem erhöhten „Grundrauschen“, da sich die Mäuse zu Reinigungs- und Pflegezwecken die Pfote belecken und beknabbern, nachdem diese zum Bekratzen anderer Körperstellen genutzt wurde (LAMOTTE et al. 2011). Des Weiteren kommt es nach Histaminapplikation nur zu einer sehr schwachen Reaktion - vermutlich, weil der Juckreiz durch die konstante mechanische Stimulation der Pfote durch das Laufen und Stehen auf der Einstreu gelindert wird (IMAMACHI et al. 2009). Weiterhin wurde eine Stelle des Körpers gesucht, an der möglichst keine zufälligen Verhaltensmuster (z. B. Putzen) ausgeübt werden, die zu einer Verfälschung der Ergebnisse führen könnten. Mit der Wade hat man bei der Maus eine Körperregion gefunden, die dieses Kriterium erfüllt („calf injection“-Modell). Bei der Injektion in diese verursachen schmerzhafte Stimuli ein Belecken, während juckreizauslösende Stimuli vorwiegend ein Beknabbern hervorrufen (LAMOTTE et al. 2011). Tatsächlich ist es aber möglich, dass die Tiere sich nicht wirklich beißen, sondern mit ihren Incisivi über die Haut kratzen (LAMOTTE et al. 2011). Sowohl für das Wangen- als auch für das Hinterpfoten- und Wadeninjektionsmodell ist ein

Literatur

erhöhter technischer Aufwand notwendig, da man sehr genau beobachten muss, welches Verhalten ausgeübt wird. Vor allem das Belecken und Beknabbern sind mit einer schlechten Bildqualität und bei normaler Geschwindigkeit kaum voneinander zu unterscheiden (LAMOTTE et al. 2011), während für das Nackeninjektionsmodell die technischen Anforderungen nicht erhöht sind.

A. B.

Abbildung 6: Verhaltensantworten von Mäusen nach Substanzinjektion in die Wange, modifiziert nach SHIMADA u. LAMOTTE (2008) A. Wischen über die Injektionsstelle mit der ipsilateralen Vorderpfote nach einem schmerzhaften Stimulus B. Kratzen an der Injektionsstelle.

2.6.1. Einflüsse auf die Juckreizantwort im Mausmodell Beim Menschen ist zu beachten, dass es zu interindividueller Variabilität bei der Juckreizausprägung kommen kann (GREEN et al. 2006). Aber auch bei Tieren kommt es aufgrund diverser Einflussfaktoren zu einer Beeinflussung der Intensität der Juckreizantwort. Allen voran ist darauf zu achten, dass allein schon die Dosierung des Pruritogens einen Einfluss auf die Stärke der Juckreizantwort hat (GREEN et al. 2006).

2.6.1.1. Mausstämme Die Auswahl des richtigen Mausstammes ist essentiell für die Etablierung eines guten Juckreizmodells. Unter der Vielzahl an für die Forschung zur Verfügung stehenden Mausstämmen, befinden sich wenige, die für die Juckreizforschung gut geeignet sind. Vergleichende Untersuchungen haben ergeben, dass nicht alle Stämme gleich empfindlich auf die jeweilig applizierten Stimuli reagierten. INAGAKI et al. (2001) haben in zwölf

Literatur

verschiedenen Mausstämmen gezeigt, dass die Juckreizantwort nach intradermaler Histamingabe (50 nmol/ 20 µl) sehr stark variierte. Sie konnten u. a. zeigen, dass die vielfach verwendeten Mäuse des Stammes BALB/c kaum auf Histamingabe reagierten, während sich die Mäuse des ICR(CD1)-Stammes sehr intensiv kratzten. Weiterhin konnte bei Mäusen der Stämme C57BL/6, WBB6F1-+/+ und WBB6F1W/Wv eine geringe, aber signifikante Juckreizantwort hervorgerufen werden. Mit Serotonin (50 nmol/20 µl) konnte bei elf von zwölf Stämmen Juckreiz ausgelöst werden. Hierbei fiel aber erneut auf, dass sich die ICR-Mäuse in dem Beobachtungszeitraum ca. doppelt so oft kratzten wie die anderen verwendeten Stämme. Eine spätere Studie von GREEN et al. (2006) an elf verschiedenen Inzuchtstämmen zeigte ähnliche Ergebnisse für subkutane Injektionen von Histamin und Chloroquin. In der gleichen Arbeit hat die Arbeitsgruppe die gewonnen Daten mit früheren Daten aus Schmerzversuchen verglichen und konnte eine negative Korrelation zwischen Schmerz und Juckreiz erkennen. Mausstämme, die sehr sensitiv auf Schmerzreize reagierten, waren eher resistent gegen Juckreiz und vice versa. Es ist also darauf zu achten, dass der ausgewählte Mausstamm maßgeblich die Juckreizantwort auf gewisse applizierte Substanzen beeinflusst. Dieses Phänomen ist nicht nur auf Mäuse beschränkt. Auch für den Menschen wurde herausgefunden, dass es Unterschiede in der Stärke des Juckreizes im Vergleich verschiedener ethnischer Gruppe gibt (HAJDARBEGOVIC u. THIO 2012; LEADER et al. 2015).

2.6.1.2. Geschlecht Ein weiterer Einflussfaktor auf die Ausprägung der Juckreizantwort ist das Geschlecht. GREEN et al. (2006) zeigten in ihrer Studie, dass sich weibliche Mäuse nach subkutaner Chloroquininjektion im Durchschnitt häufiger kratzten (+ 23 %) als männliche. Dies konnte jedoch nicht für alle untersuchten Stämme bestätigt werden. Ähnliches konnte für SLIGRL- NH2-induzierten Juckreiz bei Mäusen gezeigt werden (YAMAURA et al. 2014). Obwohl nicht statistisch signifikant, konnten auch bei anderen getesteten Substanzen Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Tieren erkannt werden: bei dem durch Substanz P ausgelösten Juckreiz kratzen sich z. B. die weiblichen Mäuse häufiger (+ 31 %) als die männlichen. In einem chronischen Juckreizmodell konnten YAMAURA et al. (2014) im Unterschied zu einigen Studien beim Mensch keinen Unterschied zwischen den Geschlechtern erkennen. Dies steht im Widerspruch dazu, dass auch in einem Modell für

Literatur

mögliche, mit Juckreiz einhergehende Autoimmunerkrankungen gezeigt werden konnte, dass sich die dort untersuchten weiblichen Mäuse mehr kratzten als die männlichen (UMEUCHI et al. 2005). Diese Befunde bestätigen die Daten aus mehreren humanen Studien, bei denen gezeigt wurde, dass es bei chronischem Juckreiz einen Geschlechtsunterschied gibt. Auch hier kratzten sich Frauen häufiger als Männer (STAENDER et al. 2013; MARTÍN-BRUFAU et al. 2017).

2.6.1.3. Alter Obwohl es in der Humanmedizin widersprüchliche Daten zur Assoziation des Auftretens von Juckreiz und dem Alter der Individuen gibt (REA et al. 1976; DALGARD et al. 2007; STÄNDER et al. 2010; CHINNIAH u. GUPTA 2014; WEISSHAAR 2016), haben MATTERNE et al. (2013) in ihrer Arbeit eine Korrelation zwischen dem Alter der Patienten und der Häufigkeit des Auftretens von chronischem Juckreiz erkennen können. Hiernach scheint die Anzahl der mit Juckreiz einhergehenden Hauterkrankungen im Alter anzusteigen.

2.6.1.4. Äußere Einflüsse Experimentator und auch laborassoziierte Umwelteinflüsse könnten die Juckreizantwort der Tiere beeinflussen. Dies wurde schon für Schmerzexperimente gezeigt (CHESLER et al. 2002b; CHESLER et al. 2002a). Zu diesen Einflüssen könnten z. B. die Tageszeit, Luftfeuchtigkeit und Besatzdichte der Käfige (veränderte Hormonspiegel durch sozialen Stress) zählen. Der Experimentator hat nach oben genannten Studien höchstwahrscheinlich auch einen Einfluss auf das Verhalten der Tiere. Ob bzw. in welchem Maße sich diese Daten aus den Schmerzstudien auf Juckreizstudien übertragen lassen, ist unklar. Generell sind Mäuse durch männliche Experimentatoren gestresster als durch weibliche (FESSENDEN 2014). Zudem sollte ein Wechsel der Experimentatoren während einer Studie vermieden werden, da dies zu Veränderungen im Verhalten der Tiere führen kann (FESSENDEN 2014). Weiterhin sollte vermieden werden, Studien mit Mäusen die gerade aufgewacht sind, oder deren Käfige gerade gewechselt wurden, durchzuführen (FESSENDEN 2014). Die Lichtstärke und Umgebungsgeräusche (z. B. Schritte auf dem Gang) sind weitere Einflüsse, die das Verhalten von Mäusen beeinflussen können (FESSENDEN 2014). Weiterhin kann die Phase des Östruszyklus der Maus Einfluss auf ihr Verhalten haben (FESSENDEN 2014). Erhöhter psychologischer Stress, z. B. durch Wassermangel, schwierige Aufgaben oder hartes

Literatur

Training, erhöhen ebenfalls die Juckreizantwort bei Mäusen (AMANO et al. 2008; ORITA et al. 2010; SPRADLEY et al. 2012; ZHAO et al. 2013) und auch beim Menschen (VERHOEVEN et al. 2009; TRAN et al. 2010). Juckreiz hat zudem eine sehr starke soziale Komponente. Bei Menschen ist der „ansteckende“ Juckreiz, ebenso wie das ansteckende Gähnen, weit verbreitet (PROVINE 2014). Auch bei Mäusen konnte gezeigt werden, dass Tiere, bei denen keine Pruritogenapplikation stattfand, sich kratzten, wenn sie andere Mäuse beobachten konnten, die dieses Verhalten ausübten (YU et al. 2017).

Material und Methoden

3. Material und Methoden

3.1. Material, Geräte und Tiere

3.1.1. Material für In-vivo-Versuche Tierschermaschine Aesculap GT420 Aesculap Suhl GmbH, Suhl, Deutschland Videokamera Legria HF S21 Canon Deutschland GmbH, Krefeld, Deutschland 8-channel Security Camera System Amcrest Technologies, Houston, Tx, USA Sterile isotone Kochsalzlösung 0,9 % Teknova, Hollister, CA, USA PBS 10x solution Corning, New York, NY, USA Aqua ad injectionem B. Braun, Melsungen AG, Melsungen Deutschland Methylcellulose Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Sterile Einmalspritzen, 1 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Sterile Einmalkanülen (30 G x ½“; 26 G x ½“) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland 3.1.1.1 Agonisten Histamin-Dihydrochlorid Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

ST-1006 (H4R-Agonist) Prof. Dr. H. Stark, Johann Wolfgang Goethe Universität, Frankfurt/Main 4-Methylhistamin-Dihydrochlorid (H4R-Agonist) Tocris Bioscience, Bristol, UK HTMT -Dimaleat (Histamine trifluoromethyl Tocris Bioscience, Bristol, UK toluidide; H1R-Agonist) 2-Pyridylehtylamin-Dihydrochlorid Tocris Bioscience, Bristol, UK (H1R-Agonist) Amthamin-Dihydrobromid (H2R-Agonist) Tocris Bioscience, Bristol, UK Pitolisant (inverser H3R-Agonist) Prof. Dr. H. Stark, Johann Wolfgang Goethe Universität, Frankfurt/Main Capsaicin (TRPV1-Agonist) Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA

Material und Methoden

Allylisothiocyanat 94 % (TRPA1-Agonist) Acros organics, NJ, USA

3.1.1.2. Antagonisten/Inhibitoren JNJ7777120 (H4R-Antagonist) Prof. Dr. H. Stark, Johann Wolfgang Goethe Universität, Frankfurt/Main JNJ39594906 (H4R-Antagonist) Prof. Dr. R. Leurs, Vrije Universiteit Amsterdam, Niederlande Diphenhydramin-Hydrochlorid West Ward Pharmaceuticals, Eatontown, (H1R-Antagonist) NJ, USA Capsazepin (TRPV1-Inhibitor) Cayman chemical, Ann Arbor, MI, USA SB366791 (TRPV1-Inhibitor) Cayman chemical, Ann Arbor, MI, USA HC-030031 (TRPA1-Inhibitor) Cayman chemical, Ann Arbor, MI, USA Ruthenium Red, 98 % Reinheit Acros organics, NJ, USA (TRPV1-/TRPA1-Inhibitor) H89-Dihydrochloride (PKA-Inhibitor) abcam Biochemicals, Cambridge, UK U73122 (PLC-Inhibitor) Tocris Bioscience, Bristol, UK SQ22536 (AC-Inhibitor) abcam Biochemicals, Cambridge, UK Bisindolylmaleimid I (PKC-Inhibitor) Tocris Bioscience, Bristol, UK Quinacrin (PLA2-Inhibitor) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

3.1.2. RT-PCR Genotypisierung 2-Log DNA ladder (0,1-10 kbp) New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA EZ-Vision® DNA Dye as Loading Buffer 6x Amresco, Solon, OH, USA Agarose Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA iCycler Biorad, Hercules, CA, USA ChemiDocTM MP Imaging System Biorad, Hercules, CA, USA Taq DNA-Polymerase (1 U/μl), dNTPack Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA

Material und Methoden

Die Gensequenzen für die Primer wurden von The Jackson Laboratory (Bar Habor, Maine, USA) bereitgestellt (Tab.6), die Primer wurden von Eton Bioscience (Research Triangle Park, NC, USA) bezogen.

Tabelle 6: Zur Genotypisierung der TRPV1-/-- und TRPA1-/--Mäuse verwendete Primer

Primer Sequenz TRPA1-/- Mutant Forward/oIMR8645 5’-CCT CGA ATC GTG GAT CCA CTA GTT CTA GAT-3’ Mutant Reverse/oIMR8646 5’-GAG CAT TAC TTA CTA GCA TCC TGC CGT GCC-3’ Wildtyp Forward/oIMR9179 5’-TCC TGC AAG GGT GAT TGC GTT GTC TA-3’ Wildtyp Reverse/oIMR9180 5’-TCA TCT GGG CAA CAA TGT CAC CTG CT-3’ TRPV1-/- Mutant Forward/oIMR1627 5‘-TAA AGC GCA TGC TCC AGA CT-3‘ Wildtyp Forward/19922 5‘-TGG CTC ATA TTT GCC TTC AG-3’ Wildtype/Mutant reverse/ 5’-CAG CCC TAG GAG TTG ATG GA-3’ Common/19923

3.1.3. Material für die Zellkultur Glass Coverslips, 18 mm, rund Warner Instruments, Hamden, CT, USA Poly-L-lysin-Hydrobromid Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA Laminin Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA Kollagenase aus Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA Dispase II (5 U/ml) in Hanks ausgewogener Stemcell Technologies, Vancouver, Salzlösung (Hank’s Balanced Salt Solution) Canada Fetales Kälberserum Premium (FKS) Mediatech Inc., Manassas, VA, USA Dulbeccos Modifikation des Eagle’s Medium mit 1 g/l glucose L-glutamin & Natriumpyruvat Corning, Manassas, VA, USA Penicillin/Streptomycin Lösung, 100 x Corning, Manassas, VA, USA Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS), Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, 1x, flüssig USA Sterile 12-Wellplatten Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Brutschrank HERA cell 150 Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

Material und Methoden

3.1.4. Material für Ca2+-Influx-Messungen Quick change chamber for 18 mm Warner Instruments, Hamden, CT, USA Fura-2-Acetylmethylester Biotium, Freemont, CA, USA Mikroskop Nikon TE200 Nikon Instruments, Melville, NY, USA Objektiv Nikon S-Fluor 20x Nikon Instruments, Melville, NY, USA CLARA CCD Nikon Instruments, Melville, NY, USA ET Fura 2 Filter Set MTD Quadfl CBE Nikon Instruments, Melville, NY, USA Xenon Lamp 75W For MBF33441 Nikon Instruments, Melville, NY, USA NIS-Elements Nikon Instruments, Melville, NY, USA SH-27B In-line Solution Heater Warner Instruments, Hamden, CT, USA Heater Controller Cable Assembly CC-28 Warner Instruments, Hamden, CT, USA 35 mm Quick Exchange Platform Model QE-1 Warner Instruments, Hamden, CT, USA Dual Channel Heater Control Model TC-344C Warner Instruments, Hamden, CT, USA Series 20 Stage Adapter for Nikon TE200 Warner Instruments, Hamden, CT, USA Complete Perfusion Valve Control System Warner Instruments, Hamden, CT, USA Dedicated Workstation Vacuum System Warner Instruments, Hamden, CT, USA CBL Bead Therm F/Heat Controllers Warner Instruments, Hamden, CT, USA Polye Tubing PE-160 10’ Warner Instruments, Hamden, CT, USA Rack Mount Kit Warner Instruments, Hamden, CT, USA Power Cord Kit Warner Instruments, Hamden, CT, USA

3.1.5. Allgemeine Materialien/Verbrauchsmaterialien Analytische Feinwaage Mettler Toledo AG104 Mettler, Columbus, OH, USA Lichtmikroskop Zeiss 465224 Zeiss, Jena, Deutschland Kühlzentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland Rasierklingen VWR international, Radnor, PA, USA Pipetten Eppendorf, Hamburg, Deutschland Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Material und Methoden

Pipettenfilterspitzen Neptune Scientific, San Diego, CA, USA Sterile Polypropylen-Röhrchen (15/50 ml) Greiner Bio-One GmbH, Steinheim, Deutschland Eppendorf Gefäße (1,5/2 ml) Eppendorf, Hamburg, Deutschland Feine Pinzetten Dumont, Montignez, Schweiz Kimwipes Kimtech Science Brand Kimberly Clark Professional Vortexmixer Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA HERACell 150i CO2 Inkubator Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA Wasserbad "Sciera Hot Shaker" Bellco Glass Inc.,Vineland, NJ, USA) Magnetrührer Heidolph Instruments, Schwabach, Germany ϕ340 pH/Termperature Meter Beckman Coulter, Brea, CA, USA Dimethylsulfoxid Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA Wasserfreies Ethanol VWR international, Radnor, PA, USA Calciumchlorid (CaCl) Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA Magnesiumchlorid (MgCl) Acros organics, NJ, USA Kaliumchlorid (KCl) Sigma-Aldrich, St.Louis, USA

Natriumhydrogenphosphat (NaH2PO4) Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA Natriumchlorid (NaCl) Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Sigma cell culture, St.Louis, MI, USA Dextrose, wasserfrei Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck, Darmstadt, Deutschland

Ammoniumchlorid (NH4Cl) Merck, Darmstadt, Deutschland

Dinatrium-Ethylamintetraessigsäure (Na2EDTA) Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumhydroxid (NaOH) VWR international, Radnor, PA, USA

Material und Methoden

Tris-Base (NH2C(CH2OH)3) Merck, Darmstadt, Deutschland

Borsäure (H3BO3) Sigma-Aldrich, St.Louis, MI, USA Ethylamintetraessigsäure (EDTA) Sigma-Aldrich, St.Louis, MI, USA Tris 1 mM VWR international, Radnor, PA, USA Ethylamintetraessigsäure (EDTA) 1 M Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland

3.1.6. Puffer und Lösungen Ca2+-Influx-Messungen

Lockes-Puffer 7,94 g NaCl 0,41 g KCl

0,24 g MgCl2

0,32 g CaCl2

0,08 g NaH2PO4

1,2 g NaHCO3 1,96 g Dextrose Aqua bidest. ad 1000 ml, pH 7,3-7,4

Zellkultur

PBS 0,2 g KH2PO4 x 2H2O 0,2 g KCl

1,44 g Na2HPO4 x 2H2O

8,0 g NaCl Aqua bidest. ad 1000 ml, pH 7,4

Hämolysepuffer 8,29 g NH4Cl

0,037 g Na2EDTA

0,839 g NaHCO3 Aqua bidest. ad 1000 ml, pH 7,3

Material und Methoden

Genotypisierung Tail Lysis Buffer 500 mg NaOH 100 ml 1 M EDTA Aqua bidest. ad 500 ml Neutralisationspuffer 20 ml 1 mM Tris 480 ml Aqua bidest.

Gelektrophorese TBE-Puffer 10x 1 g NaOH 108 g Tris Base 55 g Borsäure 7,4 g EDTA Aqua bidest. ad 1000 ml

Agarose Gel 1,5 % 3,0 g Agarose 200 ml 1xTBE Puffer

3.1.7. Versuchstiere Für die In-vivo-Versuche wurden weibliche BALB/c- (BALB/cAnNCrl), NMRI- (Clr:NMRI (Han)) und CD-1-Mäuse (Crl:CD-1) (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Deutschland) sowie weibliche und männliche C57BL/6J-Mäuse (The Jackson Laboratory; Bar Harbor, Me, USA) bezogen. Weiterhin wurden weibliche und männliche TRPV1-Knockout-Mäuse (B6.129X1-Trpv1tm1Jul/J), auch als TRPV1-/- bezeichnet, und TRPA1-Knockout-Mäuse (B6;129P-Trpa1tm1Kykw/J), auch als TRPA1-/- bezeichnet, von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Me, USA) bezogen. Deren Nachkommen wurden nach Genotypisierung für die Juckreizversuche genutzt. Ein Doppel-Knockout-Stamm für einen gleichzeitigen Knockout des TRPV1- und TRPA1-Kanals (TRPV1-/-/TRPA1-/-) wurde vom Labor von Dr. Santosh Mishra am College of Veterinary Medicine der North Carolina State University (Raleigh, NC, USA) selbst aus den oben genannten Stämmen gezüchtet und ebenfalls genotypisiert. Die Tiere waren zu Beginn der Untersuchungen sechs bis acht Wochen alt, klinisch gesund und

Material und Methoden

wogen je nach Mausstamm 20 - 30 g. Die Mäuse wurden in Gruppen zu viert oder sechst pro Käfig in einem 12-Stunden-Hell/Dunkelzyklus bei 22 °C Raumtemperatur gehalten. Pelletfutter (Altromin 1824 und LabDiet 5001) und Wasser standen ad libitum zur Verfügung. Die Mäuse wurden in Makrolonkäfigen Typ III (6er Gruppen) oder Typ II (4er Gruppen, Allentown IVC cages) gehalten. Diese waren mit Einstreu aus Weichholzgranulat (Altromin und Anderson Bed-o' Cobs 1/4") und Nistmaterial (Ancare Nestlets) oder Mäusehäusern (Mouse House, Tecniplast, Italien) ausgestattet. Für die Isolierung der Spinalganglienneurone für intrazelluläre Ca2+-Messungen wurden weibliche BALB/cAnNCrl- und C57BL/6NCrl- (Charles River Laboratories, Raleigh, NC, USA) im Alter von vier bis acht Wochen verwendet. Die CD-1-Mäuse für die Ca2+-Messungen wurden selbst gezüchtet, um sicherzustellen, dass zu jedem Zeitpunkt Tiere im gleichen Alter vorhanden waren. Die Versuche wurden von der Bezirksregierung Hannover (Aktenzeichen AZ 33.19-42502-04- 16/2213) und vom North Carolina State University Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol No. 16-038-B (1) und IACUC Protocol No. 16-038-B (1)) genehmigt.*

*Ein Teil der Versuche wurde im Rahmen eines Auslandsaufenthaltes in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Wolfgang Bäumer an der North Carolina State University in Raleigh, NC, USA durchgeführt.

Material und Methoden

3.2. Versuchsübersicht Ziel der vorliegenden Studie war es, Erkenntnisse zu dem intrazellulären Signalweg des über den H4R induzierten Juckreizes zu gewinnen. Hierfür sollte zunächst in Anlehnung an INAGAKI et al. (2001) ermittelt werden, ob es durch die Injektion eines H4R-Agonisten bei verschiedenen Mausstämmen zu Unterschieden in der Ausprägung des Kratzverhaltens kommt. Hierzu wurde das Kratzverhalten von vier verschiedenen Mausstämmen (CD-1, BALB/c, C57BL/6, NMRI) nach intradermaler Injektion von 4-Methylhistamin untersucht. Die CD-1-Mäuse zeigten sich hier am sensitivsten und wurden ausschließlich für die weiteren Untersuchungen verwendet. Zunächst wurden Dosis-Wirkungs-Untersuchungen mit Histamin, H1R-, H2R- und H4R-Agonisten an CD-1-Mäusen und mit den dort ermittelten Dosierungen alle weiteren Versuche durchgeführt. Im weiteren Verlauf der Studie sollte zunächst festgestellt werden, ob eine zentrale Wirksamkeit von H4R-Antagonisten zur Inhibition des über den H4R induzierten Juckreizes notwendig ist oder ob eine periphere Wirkung ausreicht. Hierzu wurde die antipruritische Wirkung des ZNS-gängigen H4R- Antagonisten JNJ7777120 mit der des nicht-ZNS-gängigen JNJ39594906 auf durch Histamin und über den H4R induzierten Juckreiz untersucht. Im Hauptteil der Studie wurde zur Untersuchung des intrazellulären H4R-Signalweges zunächst die Beteiligung der TRP-Kanäle TRPV1 und TRPA1 am durch Histamin ausgelösten Juckreiz ermittelt. Hierbei und bei allen weiteren Untersuchungen lag der Fokus auf dem über den H4R induzierten Juckreiz. Daher wurde die Wirkung der TRPV1- und TRPA1-Inhibitoren auf den intradermal induzierten Juckreiz untersucht. Zum gleichen Zweck wurde bei TRPV1-/--, TRPA1-/-- und TRPV1-/-/TRPA1-/--Mäusen mit C57BL/6-Hintergrund das Kratzverhalten bei histamininduziertem Juckreiz beurteilt. Zur Ermittlung der an den nachgeschalteten Signalwegen der TRP-Kanäle beteiligten intrazellulären Signalmoleküle wurde, in Anlehnung an den für den histamininduzierten Juckreiz beschriebenen Transmissionsweg, der Einfluss von Phospholipasen, Proteinkinasen und Adenylylzyklasen auf den histamininduzierten Juckreiz untersucht (KREMER et al. 2014). Im letzten Teil der Studie wurde versucht, in vitro die Beteiligung von TRP-Kanälen am intrazellulären H4R-Signalweg sensorischer Neurone zu zeigen. Hierzu wurden Spinalganglienneuronen mittels Ca2+-Influx-Messungen nach Stimulation mit Histamin, H1R- und H4R-Agonisten analysiert. Weiterhin wurde eruiert, ob die Reaktionen durch eine

Material und Methoden

Behandlung mit einem generellen TRP-Kanal-Inhibitor, einem TRPA1- oder einem TRPV1- Kanal-Inhibitor gehemmt werden konnten. Zur weiteren Untersuchung der in vivo gefundenen Unterschiede im Kratzverhalten wurde vergleichend der Histamineinfluss auf die Reaktivität der Neurone verschiedener Mausstämme untersucht.

3.3. In-vivo-Versuche Als Parameter für Juckreiz wurde das Kratzverhalten der Mäuse nach intradermaler Injektion von Histamin, H1R-, H2R-, H4R-Agonisten oder dem dazugehörigen Vehikel (Lösemittel der Substanzen) analysiert. Zur Untersuchung des Einflusses von Histaminrezeptor-Antagonisten oder spezifischer Inhibitoren der intrazellulären Signalwege (Tab. 7), wurden die Mäuse mit den einzelnen Testsubstanzen oder Vehikel vorbehandelt und nach 30 Min. Juckreiz durch intradermale Injektion von Histamin, H1R-, H2R- oder H4R-Agonisten ausgelöst. Die Versuche fanden meist an Gruppen von sechs bis neun Mäusen statt. Jede Maus wurde bis zu viermal für Juckreizversuche verwendet. Zwischen den einzelnen Versuchen lagen mindestens zwei Wochen, wodurch sichergestellt werden sollte, dass sich keine Rückstände der verwendeten Substanzen mehr in den Versuchstieren befanden, ebenso um diese nicht unnötig hohem Stress auszusetzen. Die Mäuse wurden 24 h vor Versuchsbeginn mit einer Schermaschine im Nacken rasiert. Unmittelbar nach der Juckreizinduktion wurden die Tiere in durchsichtige Plastikkäfige (13 x 20 x 12 cm; Höhe x Breite x Tiefe) gesetzt. Die Mäuse wurden über 30 Minuten mit einer Kamera gefilmt und die Juckreizantwort anschließend am Computer visuell ausgewertet. Damit eine ungestörte Ausprägung des normalen Kratzverhaltens beobachtet werden konnte, befand sich zum Zeitraum der Aufnahme der Tiere kein Personal im Versuchsraum.

Material und Methoden

Tabelle 7: Substanzen, deren Einfluss auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden überprüft werden sollte

TRPV1-Inhibitor Capsazepin, SB366791 SHIM et al. (2007); TERADA et al. (2013) TRPA1-Inhibitor HC-030031 LIU et al. (2013) Phospholipase A2-Inhibitor Quinacrin KIM et al. (2004) Phospholipase C-Inhibitor U73122 LIANG et al. (2010) Proteinkinase A-Inhibitor H89 LIANG et al. (2010) Proteinkinase-C-Inhibitor Bisindolylmaleimid I LIANG et al. (2010) Adenylylzyklase-Inhibitor SQ22536 LIANG et al. (2010) H4R-Antagonist JNJ7777120, JNJ39594906 THURMOND et al. (2004); FUNKE et al. (2015)

3.3.1. Bewertung des Kratzverhaltens Als Kratzattacke gewertet wurde in Anlehnung an KURAISHI et al. (1995), wenn sich die Maus mit ihrer Hinterpfote im Applikationsbereich kratzte. Als eine Kratzattacke galt eine Serie von Kratzbewegungen mit der Hinterpfote an der Applikationsstelle bis zum Absetzen oder Beknabbern der Pfote. Eine solche Attacke kann mehrere Sekunden andauern (SHIMADA u. LAMOTTE 2008). Nicht berücksichtigt wurden bei der Auswertung Kratzbewegungen, die zu anderen Körperstellen hin gerichtet waren, wie z. B. zum Gesicht oder zur seitlichen Bauchwand. Weiterhin nicht mit einbezogen wurden Beknabbern und Belecken der Applikationsstelle. Die Beobachtung erfolgte per Videoanalyse. Die Videos wurden für eine spätere Auswertung und zu Archivierungszwecken gespeichert.

3.3.2. Versuche zum Kratzverhalten nach 4-Methylhistamin-Injektion bei verschiedenen Mausstämmen Den Mäusen der Stämme BALB/c, CD1, NMRI und C57BL/6 wurde am Versuchstag 4-Methylhistamin in verschiedenen Konzentrationen (5/50/100/250/500 nmol/50 µl NaCl) intradermal in die Nackenhaut appliziert. Als Vehikelkontrolle wurden 50 µl sterile Natriumchloridlösung (NaCl) i.d. appliziert.

Material und Methoden

3.3.3. In-vivo-Untersuchungen zur Transmission des histamininduzierten Juckreizsignals 3.3.3.1. Dosis-Wirkungs-Untersuchungen Zunächst wurden Dosis-Wirkungs-Untersuchungen durch intradermale Applikation der zu untersuchenden Histaminrezeptor-Agonisten durchgeführt, um die für die Versuche beste Dosierung zu ermitteln. Die in Tabelle 8 genannten Dosierungen wurden immer mit einer Vehikelinjektion (NaCl) verglichen. Als optimale Dosierung wurde die geringste Dosierung angesehen, die einen statistisch signifikanten Unterschied zur Vehikelkontrolle zeigte.

Tabelle 8: Für die In-vivo-Versuche verwendete Histaminrezeptor-Agonisten und ihre durch lokale Applikation untersuchten Mengen

Substanz Angesprochene Rezeptoren Applizierte Menge (nmol/50 µl) Histamin H1R, H2R, H3R, H4R 5, 10, 25, 50, 75, 100 2-Pyridylethylamin H1R 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 1000 HTMT H1R, H2R 50, 100, 250, 500 Amthamin H2R 10, 50, 100, 250, 500 Pitolisant H3R (inverser Agonist) 50 4-Methylhistamin H2R, H4R 5, 10, 25, 50, 75, 100 ST-1006 H4R 5, 10, 25, 50, 75, 100 Vehikelkontrolle 50 µl NaCl

3.3.3.2. Einfluss von TRP-Kanal-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz Zur Untersuchung einer möglichen Beteiligung der TRP-Kanäle wurden die Mäuse intraperitoneal mit einem der TRPV1-Kanal-Inhibitoren, einem TRPA1-Kanal-Inhibitor oder Vehikel vorbehandelt. Nach 30 Min. wurde der Juckreiz durch intradermale Injektion von Histamin (25 nmol/50 µl), 2-Pyridylethylamin (1 µMol/50 µl), HTMT (100 nmol/50 µl), Pitolisant (50 nmol/50 µl), 4-Mehtylhistamin (50 nmol/50 µl) oder ST-1006 (50 nmol/50 µl) ausgelöst. Die verwendeten Dosierungen der TRPV1- und TRPA1-Inhibitoren sind in Tabelle 9 zu finden. Am Beispiel vom durch Histamin ausgelösten Juckreiz wurde eine Dosis- Wirkungs-Kurve zum TRPA1-Inhibitor HC-030031 (20,40,60 mg/kg) durchgeführt.

Material und Methoden

Tabelle 9: Verwendete TRP-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen

Substanz Inhibierter Kanal Dosierung (in 200 µl) Capsazepin TRPV1 6 mg/kg i.p. SB366791 TRPV1 0,5 mg/kg i.p. HC-030031 TRPA1 20, 40, 60 mg/kg i.p. Vehikelkontrolle 10 % DMSO (in PBS) i.p. i.p. = intraperitoneal; Die verwendeten Dosierungen wurden aus der Literatur übernommen und z. T. anhand früherer Versuche angepasst (SHIM et al. 2007; NGUYEN et al. 2010; FERNANDES et al. 2013; LIU et al. 2013; TERADA et al. 2013).

3.3.3.3. Einfluss von Phospholipase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz Zur Untersuchung einer möglichen Beteiligung der Phospholipasen A2 (PLA2) und C (PLC) wurden die Tiere mit einem PLA2-Inhibitor intraperitoneal oder mit einem PLC-Inhibitor intradermal vorbehandelt. Nach 30 Min. wurde der Juckreiz durch intradermale Injektion von Histamin (25 nmol/50 µl), HTMT (100 nmol/50 µl), 4-Methylhistamin (50 nmol/50 µl) oder ST-1006 (50 nmol/50 µl) ausgelöst. Die Dosierungen der PLA2- und PLC-Inhibitoren sind in Tabelle 10 zu finden.

Tabelle 10: Verwendete Phospholipase (PL)-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen

Substanz Inhibiertes Enzym Dosierung Applikationsroute und -volumen Quinacrin PLA2 20 mg/kg i.p., 200 µl U73122 PLC 50 pmol/50 µl i.d., 50 µl Vehikel zu Aqua ad injectionem i.p., 200 µl Quinacrin Vehikel zu U73122 2 % DSMO (in NaCl) i.d., 50 µl

PLA2 = Phospholipase A2; PLC = Phospholipase C; i.p. = intraperitoneal; i.d. = intradermal; Die verwendeten Dosierungen wurden aus der Literatur übernommen (SHIM et al. 2007; LIANG et al. 2010).

Material und Methoden

3.3.3.4. Einfluss von Proteinkinase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz Zur Untersuchung einer möglichen Beteiligung der Proteinkinasen A (PKA) und C (PKC) wurden die Mäuse mit einem PKA-Inhibitor oder einem PKC-Inhibitor vorbehandelt. Nach 30 Min. wurde der Juckreiz durch intradermale Injektion von Histamin (25 nmol/50 µl), HTMT (100 nmol/50 µl), 4-Methylhistamin (50 nmol/50 µl) oder ST-1006 (50 nmol/50 µl) ausgelöst. Die Dosierungen der PLA2- und PLC-Inhibitoren sind in Tabelle 11 zu finden.

Tabelle 11: Verwendete Proteinkinase (PK)-Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von Histaminrezeptor-Liganden und ihre jeweiligen untersuchten Dosierungen

Substanz Inhibiertes Enzym Dosierung Applikationsroute und -volumen H89 PKA 10 mg/kg i.p., 200 µl Bisindolylmaleimid I PKC 2 µg i.d., 50 µl (BIM) 5 µg Vehikelkontrolle zu 10 % DMSO i.p., 200 µl H89 Vehikelkontrolle zu 5 % DMSO (in NaCl) i.d. 50 µl BIM

PKA = Proteinkinase A; PKC = Proteinkinase C; i.p. = intraperitoneal; i.d. = intradermal; Die verwendeten Dosierungen wurden aus der Literatur übernommen (LIANG et al. 2010; REBER et al. 2012).

3.3.3.5. Einfluss eines Adenylylzyklase-Inhibitors auf histamininduzierten Juckreiz Zur Untersuchung einer möglichen Beteiligung von Adenylzyklasen wurden die Mäuse mit einem Adenylylzyklase-Inhibitor vorbehandelt. Nach 30 Min. wurde der Juckreiz durch intradermale Injektion von Histamin (25 nmol/ 50 µl), HTMT (100 nmol/50 µl), 4- Methylhistamin (50 nmol/50 µl) oder ST-1006 (50 nmol/50 µl) ausgelöst. Die Dosierungen der PLA2- und PLC-Inhibitoren sind in Tabelle 12 zu finden.

Material und Methoden

Tabelle 12: Verwendeter Adenylylzyklase-Inhibitor und seine untersuchte Dosierung

Substanz Inhibiertes Enzym Applikationsmenge SQ22536 Adenylylzyklasen 500 nmol/50 µl i.d. Vehikelkontrolle 2 % DSMO (in NaCl) i.d. i.d. = intradermal; Die verwendeten Dosierungen wurden aus der Literatur übernommen (LIANG et al. 2010).

3.3.3.6. Untersuchungen an TRPV1- und TRPA1-Knockout-Mäuse An den TRPV1-/-- und TRPA1-/--Mäusen wurde das Kratzverhalten nach Gabe von Histamin (800 nmol/ 50 µl), HTMT (100 nmol/ 50 µl), 4-Methylhistamin (100/500 nmol/ 50 µl) oder ST-1006 (100 nmol/ 50 µl) im Vergleich zum Wildtyp untersucht. Zusätzlich erfolgte eine vergleichende Untersuchung nach 4-Methylhistamin- oder ST-1006-Gabe bei drei TRPV1-/-/TRPA1-/--Mäusen in oben genannten Konzentrationen.

3.3.3.6.1. Genotypisierung der TRPV1- und TRPA1-Knockout-Mäusen Für die Genotypisierung wurde genomische DNA aus der Schwanzspitze verwendet. Hierzu wurde den Mäusen beim Absetzen von dem Muttertier mit Scherenschlag ein Stück der Schwanzspitze entfernt und anschließend die Schnittwunde mit Gewebekleber verschlossen. Die Schwanzspitzen wurden jeweils in 400 µl Tail Lysis Buffer über Nacht bei 60 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Proben in 600 µl Neutralisationspuffer gegeben, gemischt und 3 Min. bei 1200 x g zentrifugiert. Die Überstände wurden in den angegebenen Mengen (Tab. 14 und 16) für die PCR verwendet. Die Mengen für die Ansätze und die Programmeinstellungen für den Cycler sind den Tabellen 14 bis 17 zu entnehmen. Nach erfolgter PCR wurden die Proben auf ein 1,5 %iges Agarosegel aufgetragen. Hierfür wurden 10 µl der Probe mit 1 µl EZ-Vision® DNA Dye as Loading Buffer versetzt und davon 10 µl auf das Gel aufgetragen. Ein DNA-Standard wurde auf jedem Gel mitaufgetragen. Die Detektion der PCR-Banden fand unter UV-Licht statt. Die zu erwartenden Größen der PCR- Produkte sind in Tabelle 13 aufgeführt.

Material und Methoden

Tabelle 13: Die bei der Genotypisierung der TRPV1-/-- und TRPA1-/--Mäuse zu erwartenden PCR Produktgrößen in Basenpaaren (base pairs; bp)

TRPV1 TRPA1 Wildtyp 289 bp 317 bp Mutante/Knockout 176 bp 184 bd Heterozygote 176 bp und 289 bp 184 bp und 317 bp

Tabelle 14: Zusammensetzung der Ansätze für die Genotypisierung der TRPA1-/--Mäuse nach Herstellerangaben

Reagenz Menge pro Probe in µl Finale Konzentration RNAse freies Wasser 2,76 10 x AB PCR Buffer II 1,2 1 x

25 mM MgCl2 0,96 2 mM 2,5 mM dNTP 0,96 0,2 mM 20 µM oIMR8645 0,6 1 µM 20 µM oIMR8646 0,6 1 µM 20 µM oIMR9179 0,6 1 µM 20 µM oIMR9180 0,6 1 µM 5 µM DNA Loading Dye 1,66 0,69 mM 5 U/µl Taq DNA Polymerase 0,06 0,03 U/µl DNA 2,0*

*eine Probe als Negativkontrolle mit RNAse freiem Wasser statt DNA.

Tabelle 15: Cyclereinstellungen für die Genotypisierung der TRPA1-/--Mäuse nach Herstellerangaben

Schritt Temperatur °C Zeit Notiz 1 94 3 Min.

2 94 30 s Schritt 2-4 3 68 30 s 35x wiederholen 4 72 30 s 5 72 2 Min. 6 10 ∞

Material und Methoden

Tabelle 16: Zusammensetzung der Ansätze für die Genotypisierung der TRPV1-/--Mäuse nach Herstellerangaben

Reagenz Menge pro Probe in µl Finale Konzentration RNAse freies Wasser 4,25 10 x AB PCR Buffer II 2,4 1 x

25 mM MgCl2 0,96 2 mM 10 mM dNTP 0,24 0,2 mM 20 µM oIMR1627 0,3 0,5 µM 20 µM 19922 0,3 0,5 µM 20 µM 19923 0,3 0,5 µM 5 µM DNA Loading Dye 1,2 0,5 mM 2,5 U/µl Taq DNA Polymerase 0,05 0,01 U/µl DNA 2,0*

*eine Probe wird als Negativkontrolle mit RNAse freiem Wasser statt DNA angesetzt.

Tabelle 17: Cyclereinstellungen für die Genotypisierung der TRPV1-/--Mäuse nach Herstellerangaben

Schritt Temperatur °C Zeit Notiz 1 94 2 Min.

2 94 20 s 3 65 15 s - 0,5 °C pro Zyklus senken

4 68 10 s 5 Schritt 2 – 4 10 x wiederholen 6 94 15 s 7 60 15 s 8 72 10 s

9 Schritt 6 – 8 28 x wiederholen 10 72 2 Min.

11 10 ∞

Material und Methoden

3.3.3.7. Einfluss von ZNS- und nicht-ZNS-gängigen Histamin-4-Rezeptor-Antagonisten auf histamininduzierten Juckreiz

Zur Untersuchung der juckreizhemmenden Wirkung von einem ZNS- im Vergleich mit einem nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten wurden die Mäuse mit einem von diesen vorbehandelt und nach 30 Min. wurde der Juckreiz durch intradermale Injektion von 4-Methylhistamin (50 nmol/50 µl) ausgelöst. Die Dosierungen der H4R-Antagonisten sind in Tabelle 18 zu finden.

Tabelle 18: Verwendete Histamin-4-Rezeptor-Antagonisten zur Untersuchung ihres Einflusses auf das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von 4-Methylhistamin und ihre untersuchten Dosierungen

Substanz ZNS-gängig Dosierung (in 200 µl) JNJ7777120 Ja 20 mg/kg i.p. JNJ39594906 Nein 20 mg/kg i.p. Vehikelkontrolle Aqua ad injectionem i.p.

Die verwendeten Dosierungen wurden aus der Literatur übernommen (DUNFORD et al. 2006).

3.4. In-vitro-Untersuchungen

3.4.1. Funktionelle Untersuchungen an Spinalganglienneuronen zur Transmission des Juckreizsignals mittels Ca2+-Influx-Messungen

3.4.1.1 Isolierung und Kultivierung von murinen Spinalganglienneuronen Um Spinalganglienneurone (dorsal root ganglion; DRG) für In-vitro-Versuche zu gewinnen, wurden entlang der gesamten Wirbelsäule die entsprechenden Ganglien herauspräpariert

(15 – 20 pro Maus). Die Mäuse wurden hierzu mittels CO2-Begasung getötet und ausgeblutet. Auf dem Bauch liegend, wurde zunächst die Haut entfernt und mit einer Einmalrasierklinge die Muskulatur von der darunter liegenden Wirbelsäule entfernt. Zwischen dem Os occipitale und dem ersten Halswirbel wurde mit einer Schere die Wirbelsäule bzw. das Rückenmark durchtrennt und der Kopf unter den Thorax geklappt. In dieser Position wurde die Maus auf einer festen Unterlage fixiert und die Wirbelsäule möglichst langgestreckt. Mit einer feinen Schere wurde die Wirbelsäule auf voller Länge beidseitig dorsolateral über den Processus transversus eröffnet. Dies geschah möglichst unter Schonung der Dura mater. Durch zur

Material und Methoden

Seite Schieben des Rückenmarkes wurden die Ganglien zwischen den Wirbelkörpern sichtbar. Mit einer sehr feinen Präzisionspinzette und einer sehr feinen Schere wurden die Ganglien herauspräpariert und in einem Enzymmix (Collagenase 2,5 mg/ml und Dispase I 2,5 U/ml HBSS) auf Eis gesammelt und anschließend im Wasserbad bei 37 °C für 30 Min. inkubiert. Danach wurden die Zellen mit einer sterilen Pasteurpipette vereinzelt und für weitere 30 Min. im Wasserbad inkubiert. Hiernach wiederholte sich der Pipettiervorgang. Anschließend wurde die Einzelzellsuspension in ein 15 ml Polypropylen-Röhrchen überführt und die Reaktion mit ca. 5 ml Medium (DMEM, 10 % FKS, 10 % Penicillin/Streptomycin) abgestoppt. Anschließend erfolgten zwei Waschschritte, bei denen die in Medium resuspendierte Einzelzellsuspension zweimal bei 290 x g für 3 Min. zentrifugiert wurde. Die Überstände wurden dekantiert. Nach dem zweiten Waschschritt wurden die Zellen in Medium resuspendiert und als 20 µl-Tropfen auf die beschichtete Mitte der Deckgläschen gegeben und im Brutschrank zwei Stunden bei 37 °C und 5 % CO2-Gehalt inkubiert. Anschließend wurden 500 µl Medium auf die Zellen gegeben und über Nacht im Brutschrank inkubiert. Die Deckgläschen wurden im Vorfeld in einer 12 Well-Platte über Nacht mit einem 25 µl Laminin- (0,1 mg/ml) und Poly-L-Lysin- (0,1 mg/ml) Tropfen beschichtet und am nächsten Morgen mehrfach mit sterilem Wasser gewaschen, durch Lufttrocknung getrocknet und bis zur Nutzung bei Raumtemperatur gelagert.

3.4.1.2. Ca2+-Influx-Messungen an Spinalganglienneuronen Die Fura-2-ratiometrischen Ca2+-Messungen wurden in Anlehnung an Rossbach et al. (2011) durchgeführt. Nach einer 30 - 40 minütigen Inkubation der Zellen mit 2 µmol/l des

Fluorophors Fura-2-Acetylmethylester (Fura-2-AM; C44H47N3O24) wurden die Deckgläschen mit den darauf befindlichen Zellen in die Messkammer gelegt und während des gesamten Versuches mit Lockes-Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min perfundiert. Fura-2-AM gelangt durch passive Diffusion in die Zelle. In der Zelle werden die AM- Gruppen durch Esterasen abgespalten und so Fura-2 aktiviert. Diese Messkammer wurde auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop platziert und die Fluoreszenz mit alternierendem UV- Licht von 340 und 380 nm angeregt. Das bei 510 nm emittierte Licht wurde alle 500 ms durch eine an die UV-Lampe angeschlossene Kamera aufgenommen. Vor jeder Messung wurden die regions of interest (ROIs) festgelegt, indem mit einem Markierungstool die einzelnen

Material und Methoden

Zellen markiert wurden. Die Software misst spezifisch in diesen Bereichen die Fluoreszenzänderungen des durch das Fluorophor nach Anregung emittierten Lichtes und stellt diese als Kurve dar. In ungebundenem Zustand wird Fura-2 durch Licht der Wellenlänge 380 nm angeregt. Sobald es in der Zelle an Ca2+ bindet, verändert es seine Konformität (Abb. 7) und wird von Licht der Wellenlänge 340 nm erregt. Reagiert eine Zelle auf eine der applizierten Testsubstanzen, gelangt Ca2+ in die Zelle und wird vom Fluorophor gebunden. Daraufhin verändert sich das Verhältnis von ungebundenem zu gebundenem Fura-2, was sich in der Verhältnisänderung des emittierten Lichtes von 340/380 nm widerspiegelt. Um mechanische Reaktionen der Zellen während der Substanzapplikation auszuschließen, wurden zu Beginn jeder Messung 50 µl des Lockes-Puffers oder entsprechender Vehikel (0,05 % Ethanol oder DMSO) zu den verwendeten Substanzen mit einer Pipette auf die Zellen gegeben. Zellen, die hier eine Reaktion über dem Schwellenwert von 10 % über der Basallinie zeigten, fanden in der Auswertung keine Berücksichtigung. Die Neurone wurden mit verschiedenen Agonisten (Tab. 19) stimuliert, nach einer Waschphase von 2 Minuten mit einem TRP-Antagonisten (Tab. 20) behandelt und 10 – 30 Sekunden später erneut mit dem zuvor eingesetzten Agonisten stimuliert. Zur Kontrolle der Spezifität der durch die Histaminrezeptorliganden ausgelösten Reaktionen wurden einige aktivierte Zellen mit einem H1R- oder einem H4R-Antagonisten behandelt (Tab. 20). Nur Zellen, die am Ende mit einem Ca2+-Influx auf eine Capsaicin (1 µmol/l) oder KCl-Gabe (150 mmol/l) reagierten, wurden in die Auswertung mit einbezogen.

Abbildung 7: Fura-2 Bindung an Ca2+ nach Abspaltung der AM-Gruppen durch Esterasen http://www.dojindo.com/Images/Product%20Photo/F014_fig1.jpg (abgerufen: 17.08.2017)

Material und Methoden

Tabelle 19: Zur Neuronenstimulation verwendete Agonisten und ihre Konzentrationen

Stimulanz Zielstruktur Konzentration HTMT H1R, H2R 0,1 mmol/l 4-Methylhistamin H2R, H4R 0,1 mmol/l ST-1006 H4R 0,1 mmol/l Histamin H1R, H2R, 1 mmol/l H3R, H4R

Die Konzentrationen wurden nach Angaben in der Literatur verwendet oder aus früheren Versuchen abgeleitet (ROSSBACH et al. 2011; FUKUYAMA et al. 2017).

Tabelle 20: Verwendete Antagonisten/Inhibitoren zur Untersuchung ihres Einflusses auf den intrazellulären Ca2+-Influx in Spinalganglienneurone nach Agonistenstimulation

Antagonist/Inhibitor Zielstruktur Konzentration Diphenhydramin H1R 10 µmol/l JNJ7777120 H4R 10 µmol/l Ruthenium Red TRP-Kanäle 1 µmol/l, 10 µmol/l HC-030031 TRPA1 1 µmol/l, 10 µmol/l SB366791 TRPV1 1 µmol/l, 10 µmol/l

Die Konzentrationen wurden nach Angaben in der Literatur ausgewählt oder aus früheren Versuchen abgeleitet (JIAN et al. 2016).

3.4.1.2.1. Auswertung der Ca2+-Influx-Messungen

Änderungen in dem Verhältnis von 340 zu 380 nm (R/R0; R0 = initiale Ratio) von > 10 % wurden als positive Reaktion auf eine Substanz interpretiert. Eine Inhibition wurde dementsprechend als erfolgreich gewertet, wenn die untersuchte Zelle nach erneuter Stimulation den Schwellenwert von 10 % nicht mehr erreichte. Die positiv auf einen Stimulus reagierenden Neuronen werden als Prozent der totalen Neuronen ausgedrückt.

Material und Methoden

3.4.2. In-vitro-Versuche zum Vergleich der Rezeptorexpression auf Spinalganglien bei verschiedenen Mausstämmen

3.4.2.1. Funktionelle Rezeptoruntersuchungen an murinen Spinalganglienneuronen verschiedener Mausstämme mittels Ca2+-Influx Messungen Die Messungen wurden, wie in 3.4.1.2. beschrieben, an Spinalganglienneuronen von jeweils vier BALB/c-, CD-1- und C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Analog zu den 3.3. beschriebenen In-vivo-Versuchen in 3.3.1. wurde hier der Fokus auf den H2/4R-Agonisten 4-Methylhistamin gelegt. Tabelle 21 zeigt die für diesen Versuch verwendeten Stimuli.

Tabelle 21: Stimuli für die Ca2+-Influx-Messungen und ihre eingesetzten Konzentrationen

Stimulanz Zielstruktur Konzentration 4-Methylhistamin H2R, H4R 0,1 mmol/l Histamin H1R, H2R, 1 mmol/l H3R, H4R Capsaicin TRPV1 1 µmol/l AITC TRPA1 1 µmol/l

Die Konzentrationen wurden nach Angaben in der Literatur verwendet oder aus früheren Versuchen abgeleitet (ROSSBACH et al. 2011; FUKUYAMA et al. 2017). AITC = Allyisothiocyanat

Material und Methoden

3.5. Statistische Auswertung Die Ergebnisse der In-vivo-Versuche wurden mittels Kastengraphik (Boxplots) mit Median, oberem/unterem Quartil und Minimum/Maximum angegeben. Diese Antennen stellen in diesem Fall die minimalen und maximalen Werte der Untersuchungsergebnisse dar. Die statisitsche Auswertung erfolgte mit GraphPadPrism (Version 7, GraphPad Software Inc.). Hierbei wurde davon ausgegangen, dass die Stichproben nicht normalverteilt sind (Stichprobenartige Tests der Versuchsergebnisse auf Normalverteilung mittels D-Agostino- Pearson omnibus normality test und Shapiro-Wilk normality test). Daraus ergab sich die Anwendung des nicht parametrischen Kruskal-Wallis-Tests und als Post-hoc-Test der ebenfalls nicht parametrische Mann-Whitney-U-Test. Die Einzelwerte zu den durchgeführten Versuchen befinden sich in den Tabellen im Anhang. Die reaktiven Zellen der Ca2+-Influx-Messungen wurden als Prozent der Gesamtneurone dargestellt. Eine statistische Auswertung der Inhibition wurde mittels des Exakten Test nach Fisher durchgeführt. Bei allen Versuchen wurde hierbei ein Signifikanzwert (p) von unter 0,05 als statistisch signifikantes Ergebnis gewertet. P-Werte von 0,05 bis 0,09 wurden als Werte mit Tendenz zur Signifikanz angesehen und in der Post-hoc-Analyse weiterhin berücksichtigt. Bei multiplen Vergleichen erfolgte keine Berechnung der Korrektur nach Bonferroni.

Ergebnisse

4. Ergebnisse

4.1. In-vivo-Versuche

4.1.1. Kratzverhalten nach intradermaler 4-Methylhistamin-Injektion bei vier unterschiedlichen Mausstämmen Zunächst wurde das Kratzverhalten von zwei Inzuchtstämmen (BALB/c, C57BL/6) und zwei Auszuchtstämmen (NMRI, CD-1) nach intradermaler Gabe verschiedener Mengen von 4-Methylhistamin (4-MH) untersucht (Abb.8). In NMRI- und BALB/c-Mäusen konnte kein signifikanter Anstieg des Kratzverhaltens im Vergleich zu der Kontrollgruppe (NaCl) in applizierten Mengen von bis zu 500 nmol/50 µl ausgelöst werden. In BALB/c-Mäusen zeigte sich nach Injektion von 500 nmol/50 µl eine tendenzielle Erhöhung der Anzahl der Kratzattacken im Vergleich zur Kontrollgruppe. Eine Erhöhung der Injektionsmenge auf 1 µmol/50 µl führte zu einem signifikanten Anstieg der Kratzantwort (siehe Anhangstabellen). CD-1-Mäuse zeigten ab einer Menge von 500 nmol/50 µl einen signifikanten Anstieg des Kratzverhaltens, C57BL/6-Mäuse bereits ab 100 nmol/50 µl. Weiterhin ist erkennbar, dass sich bei 5 und 50 nmol/50 µl die CD-1-Mäuse im Vergleich zu den anderen Mäusen signifikant mehr kratzten. Aufgrund der Ergebnisse wurde der CD-1- Auszuchtstamm für die weiteren Juckreizversuche genutzt. Zusätzlich wurden einige Teilversuche mit dem C57BL/6-Inzuchtstamm durchgeführt.

Ergebnisse

; ;

* l

* o

Test).

m -

U Mäusen

l - -

0 1

- 5

2 Whitney

m -

n und CD

0 - o

* 0

l 0

5 µl; N/A = nicht untersucht.

, NMRI

n -

l 5

a N

C57BL/6

l ,

o -

* n

ignifikanzen beziehen sich auf die Anzahl der

* l

o 0

2 Injektionsvolumen von 50

0 o

0 p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann

0 *** o

* :

* m

l 5

; ; die mit " * " angegebenen S

* l

intradermal appliziertes

* o

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0 Gruppe

- o 0

N 5 m

* 0

* 5 o

A l

0 o

N 0 m

amininduzierten Juckreizes vergleichend bei BALB/c n

l ) 0

) 5 4

5 m 0

) n

6 0 l

8 5

auf die jeweilige NaCl 1 C

5 , a

) , N methylhist 1

mittels Kastengraphiken mit unteren (25 %)/ oberen (75 %) Quartilen und Minimum/Maximum -

9 0

3 sich

= 0

, 0

p l 0

des des 4 o

p = :

= m

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: 0

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W m

T K n

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( 5 W

6 2 K / m

(

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(

L l

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R m Mäuse im Vergleich zu denen der anderen untersuchten Mausstämme

1 Test.

L - -

n - 7

M 0

A 5 D

Wirkungsbeziehung o

5 -

B C N C m

Wallis

l 5 -

a : Dosis

N 8 angegebenen Signifikanzen beziehen

0 0 0 0 0

6 pro Gruppe. Die angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf ein

0 5 0 5 –

2 1 1

mit * 4 4 K r a t z a t t a c k e n /

3 0

M i

Abbildung Beobachtungszeitraum: 30 n = Die Kratzattacken der CD KWT = Kruskal

Ergebnisse

4.1.2. Dosis-Wirkungsbeziehung verschiedener Histaminrezeptor-Agonisten bei CD-1-Mäusen Zur Bestimmung der im weiteren Verlauf der Studie zu verwendenden Dosierungen wurde für die eingesetzten Histaminrezeptor-Liganden eine Dosis-Wirkungs-Beziehung an sechs bis acht Wochen alten CD-1-Mäusen ermittelt (Abb. 9). Histamin zeigte ab einer Menge von 25 nmol/50 µl einen signifikanten Anstieg des Kratzverhaltens im Vergleich zur Kontrollgruppe. 2-Pyridylethylamin zeigte erst ab einer Injektionsmenge von 1 µmol/ 50 µl einen signifikanten Anstieg. HTMT und 4-MH zeigten ab 50 nmol/50 µl einen signifikanten Anstieg. Sowohl ST-1006 als auch Amthamin zeigten einen signifikanten Anstieg des Kratzverhaltens bereits ab 10 nmol/50 µl. Die aus diesen Versuchen ermittelten Dosierungen, die in den weiteren Untersuchungen verwendet wurden, sind Tabelle 22 zu entnehmen.

Tabelle 22: Ermittelte Dosierungen der Histaminrezeptor-Agonisten für die weitere Verwendung

Substanz Angesprochene Rezeptoren Applizierte Menge in nmol/50 µl Histamin H1R, H2R, H3R, H4R 25 HTMT H1R, H2R 100 2-Pyridylethylamin H1R 1000 4-Methylhistamin H2R, H4R 50 ST-1006 H4R 50

Ergebnisse

H ista m in 2 -P y rid y leth y la m in KWT: p = 0,0006 KWT: p = 0,0029

4 0 0 ** 4 0 0

n n

i 3 5 0

3 0 0 3 0 0 **

0 3

3 *

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e k

k 2 0 0 2 0 0

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t t

t 1 5 0 1 5 0

z t

t 1 0 0 1 0 0

r K K 5 0 5 0

0 0 l l l l l l l l l l l e o o o o o o e o o o k k i m m m m m m i m m m h h e n n n n n n e n n µ 5 0 5 0 5 0 0 0 1 V 1 2 5 7 0 V 5 0 1 2 5

H T M T A m th am in KWT: p = 0,0057 4 0 0 KWT: p = 0,0032 4 0 0

n i

3 5 0 i 3 5 0

3 0 0 3 0 0 0

** 0

2 5 0 / 2 5 0 **

n e

** ** e k

2 0 0 k 2 0 0 * c

c * a

a **

t t

t 1 5 0

t 1 5 0 a

a *

z t

1 0 0 t 1 0 0

r r

K 5 0

0 0 l l l l l l l l l l l e o o o o e o o o o o k k i m m m m i m m m m m h n n n n h e e n n n n n 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V 5 0 5 0 V 1 5 0 5 0 1 2 5 1 2 5

4 - M e th y lh ista m in S T -1 0 0 6 KWT: p = 0,2769 KWT: p = 0,0738

4 0 0 4 0 0

n i

3 5 0 i 3 5 0

3 0 0 3 0 0

0 0

3 * *

2 5 0 / 2 5 0 n

n **

e k

2 0 0 k 2 0 0 c

c *

t t

1 5 0 t 1 5 0 **

z t

1 0 0 t 1 0 0

r K

5 0 K 5 0

0 0

l l l l l l l l l l l l l e o o o o o l e o o o o o o k o k i m m m m m i m m m m m m h n n n n n m h n n n n n n e n e V 5 0 5 0 5 0 V 5 0 5 0 5 0 1 2 5 7 0 1 2 5 7 0 1 1

Abbildung 9: Untersuchungen zum Kratzverhalten nach intradermaler Gabe verschiedener Histaminrezeptor-Liganden in unterschiedlichen Konzentrationen bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 6 pro Gruppe. Die angegebenen Mengen beziehen sich auf ein Injektionsvolumen von 50 µl. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige NaCl-Gruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). KWT = Kruskal-Wallis-Test.

Ergebnisse

4.1.3. In-vivo-Untersuchungen zur Transmission des über den H4R induzierten Juckreizsignals im Mausmodell

4.1.3.1. Einfluss von TRP-Kanal-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz

4.1.3.1.1. Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 auf histamininduzierten Juckreiz Die intraperitoneale Vorbehandlung mit dem TRPA1-Inhibitor HC-030031 zeigte bei einer Dosierung von 60 mg/kg einen hemmenden Effekt auf den durch Histamin ausgelösten Juckreiz (Abb. 10).

A . H ista m in B . H ista m in

4 0 0 4 0 0

n n

i 3 5 0

3 0 0 3 0 0

2 5 0 / 2 5 0

e k

2 0 0 k 2 0 0

t t

t 1 5 0

z t

1 0 0 t 1 0 0 a

a *

r r

K 5 0

0 0 V e h ik e l 2 0 m g /k g 4 0 m g /k g V e h ik e l H C -0 3 0 0 3 1

Abbildung 10: Einfluss verschiedener Dosierungen des TRPA1-Inhibitors HC-030031 auf den histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe (10 % DMSO): *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). A.: Kratzverhalten nach Histamin-Applikation (25 nmol/50 µl, i.d.) nach systemischer (i.p.) Vorbehandlung mit verschiedenen Dosierungen des TRPA1-Inhibiors HC-030031; n = 5 – 6 pro Gruppe. B.: Inhibition von histamininduziertem (25 nmol/50 µl, i.d.) Juckreiz durch HC-030031 (60 mg/kg, i.p.); n = 7 pro Gruppe.

Ergebnisse

4.1.3.1.2. Einfluss des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz Die intraperitoneale Vorbehandlung mit dem TRPV1-Inhibitor Capsazepin zeigte sowohl bei einer Dosierung von 4 mg/kg als auch 6 mg/kg einen signifikant hemmenden Effekt auf den durch Histamin ausgelösten Juckreiz (Abb. 11).

B . A . H ista m in H ista m in

4 0 0 4 0 0

n n

i 3 5 0

3 0 0 3 0 0

/ 2 5 0 2 5 0

e k

k 2 0 0 2 0 0

t t

t 1 5 0 1 5 0 a

a *

z t

t 1 0 0 1 0 0 * * *

r K K 5 0 5 0

0 0 V e h ik e l C a p sa z e p in 4 m g /k g V e h ik e l C a p sa z e p in 6 m g /k g

Abbildung 11: Einfluss verschiedener Dosierungen des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe (10 % DMSO): *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). A. Inhibition von histamininduziertem (25 nmol/50 µl, i.d.) Juckreiz durch Vorbehandlung mit Capsazepin (4 mg/kg) ; n = 7 – 8 pro Gruppe. B. Inhibition von histamininduziertem (25 nmol/50 µl, i.d.) Juckreiz durch Vorbehandlung mit Capsazepin (6 mg/kg, i.p.); n = 8 – 9 pro Gruppe.

Ergebnisse

4.1.3.1.3. Einfluss von TRPA1- und TRPV1-Kanal-Inhibitoren auf über den H4R induzierten Juckreiz Die intraperitoneale Vorbehandlung mit HC-030031 (TRPA1-Inhibitor) oder Capsazepin (TRPV1-Inhibitor) hemmte sowohl den histamin- als auch den 4-MH-induzierten Juckreiz. Das zusätzlich getestete SB366791 (TRPV1-Inhibitor) zeigte in der verwendeten Dosierung (0,5 mg/kg) jedoch keinen hemmenden Effekt (Abb. 12). ST-1006-induzierter Juckreiz wurde dagegen nur durch den TRPA1-Inhibitor, nicht jedoch durch den TRPV1-Inhibitor Capsazepin gehemmt. SB366791 zeigte dennoch eine signifikante Hemmung des ST-1006-induzierten Kratzverhaltens (Abb. 12). Bei dem durch den H1R/H2R-Agonisten HTMT ausgelösten Juckreiz kam es nur durch die TRPV1-Inhibitioren Capsazepin und SB366791 (p = 0,0650; Mann-Whitney-U-Test) zu einer Reduktion. Sowohl bei dem H1R- Agonisten 2-Pyridylethylamin als auch bei dem inversen H3R-Agonisten Pitolisant kam es zu keiner signifikanten Reduktion des Kratzverhaltens nach intraperitonealer Injektion der Inhibitoren HC-030031 und Capsazepin (Abb. 13).

Ergebnisse

H ista m in H T M T KWT: p = 0,0011 KWT: p = 0,0011

4 0 0 4 0 0

n i

i 3 5 0 3 5 0

3 0 0 3 0 0

/ 2 5 0 2 5 0

e k

k 2 0 0 2 0 0

t t

t 1 5 0 1 5 0 **

a z

z *** t

t 1 0 0 * 1 0 0

r r

K 5 0 K 5 0

0 0 V e h ik e l H C -0 3 0 0 3 1 C a p sa z e p in V e h ik e l H C -0 3 0 0 3 1 C a p sa z e p in

2 -P y rid y leth y la m in P ito lisa n t

4 0 0 KWT: p = 0,1494 4 0 0 KWT: p = 0,0874

n i

3 5 0 i 3 5 0

3 0 0 3 0 0

/ 2 5 0 2 5 0

e k

k 2 0 0 2 0 0

t t

t 1 5 0 1 5 0

z t

t 1 0 0 1 0 0

r r

K 5 0 K 5 0

0 0 V e h ik e l H C -0 3 0 0 3 1 C a p sa z e p in V e h ik e l H C -0 3 0 0 3 1 C a p sa z e p in

4 -M eth y lh ista m in S T -1 0 0 6

4 0 0 KWT: p = 0,0012 4 0 0 KWT: p = 0,0144

n i

i 3 5 0 3 5 0

3 0 0 3 0 0

/ 2 5 0 2 5 0

e k

k 2 0 0 2 0 0

t t

t 1 5 0 1 5 0 a

a *** ***

z t

t 1 0 0 1 0 0 a

a *

r K K 5 0 5 0

0 0 V e h ik e l H C -0 3 0 0 3 1 C a p sa z e p in V e h ik e l H C -0 3 0 0 3 1 C a p sa z e p in

Abbildung 12: Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 und des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 8 – 9 pro Gruppe (Pitolisant: n = 6). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Dosierungen je 200 µl i.p. Injektion: HC-030031: 60 mg/kg, Capsazepin: 6 mg/kg, Vehikel = 10 % DMSO. Applizierte Mengen der Histaminrezeptor-Liganden: Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 2-Pyridylethylamin: 1 µmol/ 50 µl, Pitolisant: 50 nmol/ 50 µl), 4-MH: 50 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl. KWT = Kruskal- Wallis-Test.

Ergebnisse

H ista m in H T M T S T -1 0 0 6

4 0 0 4 0 0 4 0 0

3 5 0 3 5 0 3 5 0

n n

i i

M M 3 0 0 M

3 0 0 3 0 0

0 0

3 3

/ /

2 5 0 / 2 5 0 2 5 0

n n

e e

k k

2 0 0 k 2 0 0 2 0 0

c c

a a

t t

1 5 0 t 1 5 0 1 5 0

a a

z z

t t

a a

1 0 0 a 1 0 0 1 0 0 *

r r

K K 5 0 K 5 0 5 0

0 0 0 V e h ik e l S B 3 6 6 7 9 1 V e h ik e l S B 3 6 6 7 9 1 V e h ik e l S B 3 6 6 7 9 1

Abbildung 13: Einfluss des TRPV1-Inhibitors SB366791 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 8 – 10 pro Gruppe. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Dosierungen je 200 µl i.p. Injektion: SB366791: 0,5 mg/kg; Vehikel = 0,5 % DMSO. Applizierte Mengen der Histaminrezeptor-Liganden: Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl.

4.1.3.2. Einfluss von Phospholipase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz

4.1.3.2.1. Einfluss des Phospholipase A2-Inhibitors Quinacrin auf histamininduzierten Juckreiz Die intraperitoneale Vorbehandlung mit dem Phospholipase A2-Inhibitor Quinacrin hemmte sowohl den ST-1006- als auch den 4-MH-induzierten Juckreiz signifikant (Abb. 14). Auf den durch HTMT oder Histamin ausgelösten Juckreiz hatte es einen hemmenden, aber nicht signifikanten Effekt.

Ergebnisse

H ista m in H T M T

4 0 0 4 0 0

3 5 0 3 5 0

i M

3 0 0 M 3 0 0

2 5 0 / 2 5 0

e k

2 0 0 k 2 0 0

t t

1 5 0 t 1 5 0

t a

1 0 0 a 1 0 0

r K 5 0 K 5 0

0 0 V e h ik e l Q u in a c r in V e h ik e l Q u in a c r in

4 -M eth y lh ista m in S T -1 0 0 6

4 0 0 4 0 0

3 5 0 3 5 0

i M

3 0 0 M 3 0 0

2 5 0 / 2 5 0

e k

2 0 0 k 2 0 0

a t

t * t

1 5 0 t 1 5 0

t a

1 0 0 a 1 0 0 r

** r K K 5 0 5 0

0 0 V e h ik e l Q u in a c r in V e h ik e l Q u in a c r in

Abbildung 14: Einfluss des Phospholipase A2-Inhibitors Quinacrin auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellungen mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); ST-1006/HTMT: n = 10 pro Gruppe, Histamin/4-MH: n = 5 – 6 pro Gruppe). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Dosierungen je 200 µl aqua ad injectionem i.p. Injektion: Quinacrin: 20 mg/kg. Applizierte Mengen der Histaminrezeptor-Liganden: Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 4-MH 50 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl.

Ergebnisse

4.1.3.2.2. Einfluss des Phospholipase C-Inhibitors U73122 auf histamininduzierten

Juckreiz Die lokale, intradermale Vorbehandlung mit dem Phospholipase C-Inhibitor U73122 hemmte einzig den HTMT-induzierten Juckreiz (Abb. 15). Auf den durch Histamin, ST-1006 oder

4-MH ausgelösten Juckreiz hatte es keinen Effekt.

Ergebnisse

H ista m in H T M T

4 0 0 4 0 0

3 5 0 3 5 0

i M

3 0 0 M 3 0 0

* * /

2 5 0 / 2 5 0

e k

2 0 0 k 2 0 0

t t

1 5 0 t 1 5 0

t a

1 0 0 a 1 0 0

r K 5 0 K 5 0

0 0 V e h ik e l U 7 3 1 2 2 V e h ik e l U 7 3 1 2 2

4 -M eth y lh ista m in S T -1 0 0 6

4 0 0 4 0 0

3 5 0 3 5 0

n n

i i M

M 3 0 0 3 0 0

0 0

3 3

/ 2 5 0 2 5 0

n n

e e k

k 2 0 0 2 0 0

c c

a a

t t t

t 1 5 0 1 5 0

a a

z z

t t a

a 1 0 0 1 0 0

r r K K 5 0 5 0

0 0 V e h ik e l U 7 3 1 2 2 V e h ik e l U 7 3 1 2 2

Abbildung 15: Einfluss des Phospholipase C-Inhibitors U73122 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 9 – 10 pro Gruppe. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Dosierungen: U73122: 50 pmol/ 50 µl i.d. Applizierte Mengen der Histaminrezeptor-Liganden: Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 4-MH: 50 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl.

Ergebnisse

4.1.3.3. Einfluss von Proteinkinase-Inhibitoren auf histamininduzierten Juckreiz

4.1.3.3.1 Einfluss des Proteinkinase A-Inhibitors H89 auf histamininduzierten Juckreiz Die intraperitoneale Vorbehandlung mit dem Proteinkinase A-Inhibitor H89 hemmte ausschließlich den 4-MH-induzierten Juckreiz (Abb. 16). Bei dem durch Histamin oder ST-1006 induzierten Juckreiz war eine leichte aber nicht signifikante Reduktion erkennbar. Auf den HTMT-induzierten Juckreiz zeigte der Inhibitor keinen Effekt im Vergleich zur Vehikelgruppe.

Ergebnisse

H ista m in H T M T

4 0 0 4 0 0

3 5 0 3 5 0

i M

M 3 0 0 3 0 0

/ 2 5 0 2 5 0

e k

k 2 0 0 2 0 0

t t

t 1 5 0 1 5 0

t a

a 1 0 0 1 0 0

r K K 5 0 5 0

0 0 V e h ik e l H 8 9 V e h ik e l H 8 9

4 -M eth y lh ista m in S T -1 0 0 6

4 0 0 4 0 0

3 5 0 3 5 0

i M

3 0 0 M 3 0 0

2 5 0 / 2 5 0

e k

2 0 0 k 2 0 0

t t

1 5 0 t 1 5 0 a

*** a

t a

1 0 0 a 1 0 0

r K 5 0 K 5 0

0 0 V e h ik e l H 8 9 V e h ik e l H 8 9

Abbildung 16: Einfluss des Proteinkinase A Inhibitors H89 auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 8 – 9 pro Gruppe. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Dosierungen je 200 µl 10 % DMSO i.p. Injektion: H89: 10 mg/kg. Applizierte Mengen der Histaminrezeptor-Liganden: Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 4-MH: 50 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl.

Ergebnisse

4.1.3.3.2 Einfluss des Proteinkinase C-Inhibitors Bisindolylmaleimid I auf histamininduzierten Juckreiz Durch lokale, intradermale Vorbehandlung mit dem Proteinkinase C-Inhibitor Bisindolylmaleimid I (BIM) kam es nach Histaminapplikation bei allen drei untersuchten Konzentrationen zu einer signifikanten Verstärkung des ausgelösten Juckreizes, wobei hierbei keine dosisabhängige Veränderung zu erkennen war (Abb. 17). Die 10 µg/50 µl Dosierung des BIMs wurde nur bei Histamin getestet, da es zu relativ starken Blutungen aus der Injektionsstelle kam. Bei dem durch den H4R-Agonisten ST-1006-induzierten Juckreiz verhält es sich ähnlich wie bei Histamin, wobei eine klare Dosisabhängigkeit zu erkennen war. Mit steigender Inhibitor-Dosierung verstärkte sich der ausgelöste Juckreiz. Bei dem durch HTMT ausgelösten Juckreiz war eine dosisabhängige Inhibition durch BIM zu erkennen, welche in einer Dosierung von 5 µg/ 50 µl signifikant war. Bei dem 4-MH- induzierten Juckreiz war kein Unterschied zwischen den Gruppen zu erkennen.

Ergebnisse

H ista m in H T M T KWT: p = 0,0056 KWT: p = 0,0532 5 0 0 5 0 0

4 5 0 4 5 0

n i

i 4 0 0 4 0 0

0 3 5 0 3 5 0

/ 3 0 0 3 0 0

e k

k 2 5 0 * * 2 5 0 c

c *

a t

t 2 0 0 2 0 0 *

t a

a *

z t

t 1 5 0 1 5 0

a r

r 1 0 0 1 0 0

K K 5 0 5 0 0 0 V e h ik e l 2 µ g 5 µ g 1 0 µ g V e h ik e l 2 µ g 5 µ g

4 -M eth y lh ista m in S T -1 0 0 6 KWT: p = 0,4106 KWT: p = 0,0010 *** 5 0 0 5 0 0

4 5 0 4 5 0

n n i

i 4 0 0 4 0 0

M M

0 3 5 0 3 5 0 **

3 3

/ 3 0 0 3 0 0

n n

e e k

k 2 5 0 2 5 0

c c

a a t

t 2 0 0 2 0 0

t t

a a

z z t

t 1 5 0 1 5 0

a a r

r 1 0 0 1 0 0

K K 5 0 5 0 0 0 V e h ik e l 2 µ g 5 µ g V e h ik e l 2 µ g 5 µ g

Abbildung 17: Einfluss des intradermal applizierten Proteinkinase C-Inhibitors Bisindolylmaleimid auf histamininduzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 8 – 12 pro Gruppe (BIM 10 µg/50 µl: n = 4). Die angegebenen Mengen beziehen sich auf ein Injektionsvolumen von 50 µl. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe (5 % DMSO): *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). Intradermal applizierte Mengen der Histaminrezeptor- Liganden: Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 4-MH: 50 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl. KWT = Kruskal-Wallis-Test.

Ergebnisse

4.1.3.4. Einfluss des Adenylylzyklase-Inhibitors SQ22536 auf histamininduzierten Juckreiz Die lokale, intradermale Vorbehandlung mit dem Adenylylzyklase-Inhibitor SQ22536 zeigte bei keiner der untersuchten Substanzen einen juckreizhemmenden Effekt (Abb. 18).

H ista m in H T M T

4 0 0 4 0 0

3 5 0 3 5 0

i M

3 0 0 M 3 0 0

2 5 0 / 2 5 0

e k

2 0 0 k 2 0 0

t t

1 5 0 t 1 5 0

t a

1 0 0 a 1 0 0

r K K 5 0 5 0

0 0 V e h ik e l S Q 2 2 5 3 6 V e h ik e l S Q 2 2 5 3 6

4 -M eth y lh ista m in S T -1 0 0 6

4 0 0 4 0 0

3 5 0 3 5 0

i M

M 3 0 0 3 0 0

/ 2 5 0 2 5 0

e k

k 2 0 0 2 0 0

t t

t 1 5 0 1 5 0

t a

a 1 0 0 1 0 0

r K K 5 0 5 0

0 0 V e h ik e l S Q 2 2 5 3 6 V e h ik e l S Q 2 2 5 3 6

Abbildung 18: Einfluss des Adenylylzyklase-Inhibitors SQ22536 auf histamininduzierten Juckreiz Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 9 pro Gruppe. Die angegebenen Mengen beziehen sich auf ein Injektionsvolumen von 50 µl. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Intradermal applizierte Mengen : SQ22536: 50 nmol/50 µl, Histamin: 25 nmol/ 50µl, HTMT: 100 nmol/50 µl, 4-MH: 50 nmol/50 µl, ST-1006: 50 nmol/50 µl.

Ergebnisse

4.1.4. Untersuchungen am Knockout-Modell

4.1.4.1. Histamininduzierter Juckreiz bei TRPV1-/-- und TRPA1-/--Mäusen Es wurde das Kratzverhalten nach intradermaler Injektion verschiedener Histaminrezeptor- Liganden untersucht. Abbildung 19 zeigt die Anzahl an Kratzattacken nach Applikation von Histamin, 4-MH oder ST-1006. Die Juckreizantwort nach Histamin-Injektion war sowohl bei den TRPA1-/-- als auch bei den TRPV1-/--Mäusen im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen reduziert. Nach 4-MH-Injektion ist die Juckreizantwort in den TRPV1-/--Mäusen ebenfalls reduziert. Bei den TRPA1-/--Mäusen scheint die Reaktion unverändert. Bei den TRPV1-/-/TRPA1-/--Mäusen gab es ebenfalls eine signifikante Reduktion der Juckreizantwort. Diese ist im Vergleich zu der TRPV1-/--Gruppe stärker reduziert. Nach ST-1006-Applikation ist eine leichte Reduktion ohne Signifikanz bei den TRPV1-/--Mäusen zu erkennen. Eine statistisch signifikante und etwa gleich starke Reduktion in der Juckreizantwort gab es bei den TRPA1-/-- und bei den TRPV1-/-/ TRPA1-/--Mäusen.

4.1.4.1.1. Genotypisierung Bei den homozygoten TRPA1-/--Mäusen entsteht ein PCR-Produkt durch die Anlagerung der Primer oIMR8645 und oIMR8646 von 184 bp, bei den Wildtypen durch die Anlagerung von oIMR9179 und oIMR9180 ein Produkt von 289 bp (Abb. 20). Bei den Heterozygoten entstehen durch die Anlagerung beider Primer zwei Produkte von 184 und 289 bp Größe. Bei den TRPV1-/--Mäusen entsteht ein PCR-Produkt von 176 bp durch Anlagerung der beiden Primer oIMR1627 und 19923. Bei den Wildtypen entsteht durch die Anlagerung der Primer 19922 und 19923 ein Produkt von 289 bp (Abb. 21). Bei den Heterozygoten entstehen durch die zusätzliche Anlagerung von oIMR1627 und 19993 zwei Produkte mit einer Größe von 176 bzw. 289 bp. Für die Genotypisierung der TRPV1-/-/TRPA1-/--Mäuse gilt das oben Beschriebene gleichermaßen. Für jedes Tier wurden zwei separate Durchgänge für TRPV1 und TRPA1 durchgeführt. Zur Kontaminationskontrolle diente eine Wasserprobe. Diese blieb negativ (nicht abgebildet).

Ergebnisse

N a C l H ista m in KWT: p = 0,8451 KWT: p = 0,0038

2 0 0 2 0 0

1 5 0 1 5 0

e k

1 0 0 k 1 0 0

t t

a *

a **

z t

5 0 t 5 0

K K

0 0 /- /- T /- /- W T 1 - 1 - W 1 - 1 - P A P V P A P V T R T R T R T R

4 -M eth y lh ista m in S T -1 0 0 6 KWT: p = 0,0053 KWT: p = 0,0053

2 0 0 2 0 0

M M * 1 5 0

1 5 0 0

e e

k 1 0 0 k

1 0 0 c

t t

** a a

z * z

t 5 0 * t

5 0 a a

* r

K K 0 0 T -/- -/- -/- T -/- -/- -/- W A 1 V 1 A 1 W A 1 V 1 A 1 R P R P R P R P R P R P T T /-/T T T -/T 1 - 1 -/ P V P V T R T R

Abbildung 19: Untersuchungen zum histamininduzierten Juckreiz bei TRPV1-/--, TRPA1-/-- und TRPV1-/- TRPA1-/--Mäusen im Vergleich zum Wildtyp (C57BL/6-Mäuse) Kratzverhalten nach intradermaler Injektion von 50 µl NaCl, Histamin (800 nmol/50 µl), 4-MH (500 nmol/ 50 µl) und ST-1006 (100 nmol/ 50 µl). Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 6 pro Gruppe (TRPV1-/-TRPA1-/-: n = 3). Angegebene Signifikanzen beziehen sich, außer anders angegeben, auf die Wildtypgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann- Whitney-U-Test). Wt = Wildtyp-Mäuse; KWT = Kruskal-Wallis-Test.

Ergebnisse

TRPA1-/- Wildtyp

300 bp

200 bp

100 bp

Abbildung 20: Genotypisierung der TRPA1-/-- und Wildtyp-Mäuse exemplarisch dargestellt Die Mäuse wurden mittels RT-PCR genotypisiert. Die TRPA1-/--Mäuse wiesen eine spezifische Bande von 187 bp und die Wildtyp-Mäuse von 317 bp auf.

TRPV1-/- Wildtyp

300 bp

200 bp

100 bp

Abbildung 21: Genotypisierung der TRPV1-/-- und Wildtyp-Mäuse exemplarisch dargestellt Die Mäuse wurden mittels RT-PCR genotypisiert. Die TRPV1-/--Mäuse wiesen eine spezifische Bande von 176 bp und die Wildtyp-Mäuse von 289 bp auf. bp

Ergebnisse

4.1.5. Einfluss von ZNS- und nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten auf über den H4R induzierten Juckreiz Nach intraperitonealer Vorbehandlung mit dem ZNS-gängigen H4R-Antagonisten JNJ7777120 konnte der durch 4-MH-induzierte Juckreiz signifikant gehemmt werden. Im Gegensatz dazu konnte ein solcher Effekt durch eine intraperitoneale Vorbehandlung mit dem nicht ZNS-gängigen H4R-Antagonisten JNJ39594906 nicht erzielt werden. Abb. 22 zeigt beide Antagonisten im Vergleich.

2 5 0 2 5 0

i i

M 2 0 0

/ n

n 1 5 0 1 5 0

a t

t 1 0 0 1 0 0

a z

z *

t a

a 5 0 5 0

K K

0 0 V e h ik e l J N J 7 7 7 7 1 2 0 V e h ik e l J N J 3 9 5 9 4 9 0 6

Abbildung 22: Einfluss des ZNS-gängigen (JNJ7777120) und des nicht-ZNS-gängigen (JNJ39594906) H4R-Antagonisten auf 4-MH-induzierten Juckreiz bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8). Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Vehikelgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Mann- Whitney-U-Test). Dosierungen je 200 µl i.p. Injektion: JNJ7777120: 20 mg/kg (n = 6), JNJ39594906: 20 mg/kg (n = 9), Vehikel = Aqua ad injectionem. Dosierung 4-MH: 50 nmol/ 50 µl.

Ergebnisse

4.1.6. Vergleichbarkeit des Kratzverhaltens zwischen den einzelnen Versuchstagen Um die Reproduzierbarkeit des durch die Histaminrezeptor-Agonisten Histamin, HTMT, 4-MH und ST-1006 ausgelösten Juckreizes beurteilen zu können, wurden die Vehikelgruppen aus den oben aufgeführten Versuchen miteinander verglichen.

4.1.6.1. Vergleichbarkeit des histamininduzierten Kratzverhaltens Bei dem Vergleich des histamininduzierten Juckreizes zwischen den einzelnen Versuchstagen zeigten sich bis zum siebten Versuchstag keine signifikanten Unterschiede im Kratzverhalten der Mäuse nach intradermaler Applikation von Histamin (25 nmol/ 50 µl. Die Werte an Tag acht und neun weichen vermutlich aufgrund des Alters der verwendeten Substanz signifikant von denen der übrigen Versuchstage ab (p = 0,0001 – 0,0040; Mann-Whitney-U-Test)

H ista m in

4 0 0 KWT: p = 0,0002 n

i 3 5 0 M

3 0 0

/ 2 5 0

n e

k 2 0 0

a t

t 1 5 0

a z

t 1 0 0

a r

K 5 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Abbildung 23: Vergleichende Darstellung des histamininduzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8); n = 6 – 12 pro Gruppe. Intradermal applizierte Menge: Histamin: 25 nmol/50 µl, i.d.. KWT = Kruskal-Wallis-Test.

Ergebnisse

4.1.6.2. Vergleichbarkeit des HTMT-induzierten Kratzverhaltens Bei dem Vergleich des durch intradermale Gabe von HTMT induzierten Juckreizes zwischen den einzelnen Versuchstagen waren außer bei Tag fünf im Vergleich zu Tag vier und sechs (p = 0,0056; Mann-Whitney-U-Test) keine signifikanten Unterschiede erkennbar.

H T M T KWT: p = 0,0026

4 0 0 n

i 3 5 0 M

3 0 0

/ 2 5 0

n e

k 2 0 0

a t

t 1 5 0

a z

t 1 0 0

a r

K 5 0

0 1 2 3 4 5 6 7

Abbildung 24: Vergleichende Darstellung des HTMT-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastegraphiken (siehe Abb.8); n = 6 – 10 pro Gruppe. Intradermal applizierte Menge: HTMT: 100 nmol/50 µl. KWT = Kruskal-Wallis-Test.

4.1.6.3. Vergleichbarkeit des 4-methylhistamininduzierten Kratzverhaltens Bei dem Vergleich des 4-MH-induzierten Juckreizes zwischen den einzelnen Versuchstagen war die Juckreizantwort der Mäuse an den Tagen eins bis drei signifikant niedriger (p = 0,0004 – 0,0260; Mann-Whitney-U-Test) als die Antwort nach Anbruch einer neuer Charge 4-MH ab Versuchstag vier.

4 -M eth y lh ista m in KWT: p = 0,0007

4 0 0 n

i 3 5 0 M

3 0 0

/ 2 5 0

n e

k 2 0 0

a t

t 1 5 0

a z

t 1 0 0

a r

K 5 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

Abbildung 25: Vergleichende Darstellung des 4-MH-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken (siehe Abb. 8) n = 6-10 pro Gruppe. Intradermal applizierte Menge: 4-MH: 50 nmol/50 µl. KWT = Kruskal-Wallis-Test.

Ergebnisse

4.1.6.4. Vergleichbarkeit des ST-1006-induzierten Kratzverhaltens Bei dem Vergleich des intradermal durch ST-1006 induzierten Juckreizes waren zwischen den einzelnen Versuchstagen keine statistisch signifikanten Unterschiede erkennbar.

S T -1 0 0 6 KWT: p = 0,6505

4 0 0 n

i 3 5 0 M

3 0 0

/ 2 5 0

n e

k 2 0 0

a t

t 1 5 0

a z

t 1 0 0

a r

K 5 0

0 1 2 3 4 5 6 7

Abbildung 26: Vergleichende Darstellung des ST-1006-induzierten Juckreizes verschiedener Versuchstage bei CD-1-Mäusen Beobachtungszeitraum: 30 Min. Darstellung mittels Kastengraphiken; n = 6 – 10 pro Gruppe. Intradermal applizierte Menge: ST-1006: 50 nmol/50 µl. KWT = Kruskal-Wallis-Test.

Ergebnisse

4.2. In-vitro-Untersuchungen zur Transmission des Juckreizsignals mittels Ca2+-Influx Messungen Von den untersuchten DRG-Neuronen reagierten 13 % auf Histamin (1 mmol/l), 4 % auf HTMT (100 µmol/l), 5 % auf 4-MH (100 µmol/l) und 5 % auf ST-1006 (100 µmol/l).

4.2.1. Einfluss des spezifischen H4R-Antagonisten JNJ7777120 auf den über den H4R induzierten intrazellulären Ca2+-Anstieg in Spinalganglienneuronen Nach einem ersten Stimulus mit den H4R-Agonisten ST-1006 oder 4-MH (100 µmol/l) wurde nach einer ca. zweiminütigen Waschphase der spezifische H4R-Antagonist JNJ7777120 (10 µmol/l) appliziert und direkt nachfolgend wieder der vorherig verwendete Agonist (Abb.28 A/B). JNJ7777120 konnte sowohl den 4-MH- als auch den ST-1006-induzierten Ca2+-Influx in die getesteten Neurone inhibieren (Abb. 27 ).

2 0

K o n tr o lle

e n

o J N J 7 7 7 7 1 2 0 1 0 µ m o l/l

r 1 5

t m

a 1 0

e 5

* * * %

0 4 -M H S T -1 0 0 6

4-Methylhistamin ST-1006 Kontrolle 9/196 (5 %) 9/166 (5 %) JNJ7777120 10 µmol/l 1/196 (0,5 %) 0/166 (0 %) Abbildung 27: Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ7777120 auf den über den H4R induzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen Inhibitorischer Effekt von JNJ7777120 (10 µmol/l) auf den intrazellulären Ca2+-Anstieg nach Stimulation mit 4-MH (100 µmol/l) oder ST-1006 (100 µmol/l) dargestellt als Prozent der gesamt getesteten Neurone. Die Anzahl der positiv auf einen der H4R-Agonisten reagierenden Neurone, im Verhältnis zu den gesamt getesteten, sind in der dazugehörigen Tabelle zu finden. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Kontrollgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Exakter Test nach Fisher); DRG-Neurone von n = 3 von CD-1-Mäusen.

Ergebnisse

nach

Neuronen.

Mäusen -

1 - 0 0 6 6 3

3 ux in DRG ) l /

) Infl l

l - / o l

l 2+ o m l C m m C

K Neurone. Die Abbildungen zeigen in m 0

0 -

K 0 5 0 0

0 nm nm Fluoreszenzintensitätsverhältnisses) 1

5 3 ( 1

(

µmol/l) µmol/l) Ca

Influx in DRG

- 2+ 0

0 in in Spinalganglienneuronen von CD 4 4

2 eränderung des 340/380

)

induzierten (100 µmol/l) Ca

Anstiegs

/ - l 6 ) 0 l o

) 2+ 0 / l 2 l 0 / ) ) 0

m MH 1 l o ) s 1

s - l H 2 µ o 7 - ( / (

0 m 1 l

7 t T 0 8 t m 8 M o µ 7 i 7 i

0 - 1 S 1 µ 7 e 7 e

0 1 4 m 7 (

J Anstiegs (V 0 0 Z Z

µ - 7

1 1 N ( ( J

0 2+ J 1 N (

induzierten (100

1006 - 0 0 2 2 1

µmol/l) auf den 4

) l / 0 l 0

6 µmol/l) auf den ST 6 6 o

0 m ) 1 l µ - /

l T 0 o 0 S H 1 m e e ( l l M µ l l

- o o 0 4 r r 0 t t

n n ( o

K K 0 0 5 0 5 0 5 5 0 5 0 5 ......

2 2 1 1 0

n o r m a l i s i e r t e

R a t i o

3 4 0 / 3 8 0

n m n o r m a l i s i e r t e

R a t i o

3 4 0 / 3 8 0

n m . .

A B Veränderung des über den H4R induzierten intrazellulären Ca

Applikation

- 28

Inhibitorischer Effekt von JNJ7777120 (10

ms Intervallen aufgezeichnete Beispielaufnahmen des zytosolischen Ca

Inhibitorischer Effekt von JNJ7777120 (10

Abbildung JNJ7777120 A.: B.: 500 einesjeweils einzelnes Neurons.

Ergebnisse

4.2.2. Einfluss des spezifischen H1R-Antagonisten Diphenhydramin auf den über den H1R induzierten intrazellulären Ca2+-Anstieg in Spinalganglienneuronen Nach einem ersten Stimulus mit dem H1R-Agonisten HTMT (100 µmol/l) wurde nach einer zweiminütigen Waschphase der spezifische H1R-Antagonist Diphenhydramin (10 µmol/l) appliziert und direkt nachfolgend wieder der vorherig verwendete Agonist (Abb. 30). Diphenhydramin konnte den HTMT-induzierten Ca2+-Influx in die getesteten Neurone inhibieren (p = 0,0605; Exakter Test nach Fisher, Abb. 29 ).

2 0

n o

r 1 5

t m

a 1 0

e 5

0 K o n tr o lle D ip h e n h y d r a m in

HTMT Kontrolle 7/113 (6%) Diphenhydramin 10 µmol/l 1/113 (1%)

Abbildung 29: Einfluss des H1R-Antagonisten Diphenhydramin auf den über den H1R induzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen Inhibitorischer Effekt von Diphenhydramin (10 µmol/l) auf den intrazellulären Ca2+-Anstieg nach Stimulation mit HTMT (100 µmol/l), dargestellt als Prozent der gesamt getesteten Neurone. Die Anzahl der positiv auf den H1R-Agonisten reagierenden Neurone, im Verhältnis zu den gesamt getesteten, sind in der dazugehörigen Tabelle zu finden. DRG-Neurone von n = 3 CD-1-Mäusen.

Ergebnisse 0 2 )

/ h

l nm nm

zeigt zeigt

nac

C m K

0 5

1 Mäusen

(

1 - 0 6

Neuronen. Die Abbildung - 0

0 in DRG

tiegs (Veränderung des 340/380

Ans

Influx

2+ 2+ )

l in Spinalganglienneuronen von CD n

i l o T ) m l 0 / a m 4 l

M µmol/l) Ca

2 µ o d

T Anstiegs y 0

m - H h ) 0

µ 2+ s n 1 ( ( e 0

1 t h i ( p i e D

induzierten (100 - 0 8

Neurons.

µmol/l) auf den HTMT

1 ) l

l o

m M 0 µ 6

T 0 H 0 1 (

e tsverhältnisses) eineseinzelnen l

Applikation -

ms Intervallen aufgezeichnete Beispielaufnahme des zytosolischen Ca

Veränderung des über den H1R induzierten intrazellulären Ca

t :

n 30 o K 0 5 0 5 0 5

. . . . .

2 2 1 1 0

n o r m a l i s i e r t e

R a t i o

3 4 0 / 3 8 0

Abbildung Diphenhydramin Inhibitorischer Effekt von Diphenhydramin (10 eine in Fluoreszenzintensitä 500

Ergebnisse

4.2.3. Einfluss des TRP-Kanal-Inhibitors Ruthenium Red auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstieg in Spinalganglienneuronen Nach einem initialen Stimulus mit dem Kontrollpuffer erfolgte eine erste Stimulation mit einem der verwendeten Histaminrezeptor-Liganden. Darauffolgend wurde nach einer ca. zweiminütigen Waschphase der TRP-Kanal-Inhibitor Ruthenium Red (1 oder 10 µmol/l) appliziert und direkt nachfolgend wieder der vorherig verwendete Agonist (Abb. 32 A/B). Ruthenium Red konnte sowohl den durch Histamin als auch den durch HTMT induzierten Ca2+-Influx in die getesteten Neurone dosisabhängig inhibieren (Abb. 31). Ruthenium Red konnte in einer Dosierung von 10 µmol/l sowohl den ST-1006 (p = 0,0509)- als auch den 4- MH (p = 0,0532)-induzierten Ca2+-Influx leicht, aber nicht statistisch signifikant reduzieren.

K o n tr o lle R u th e n iu m R e d 1 µ m o l/l 2 0

R u th e n iu m R e d 1 0 µ m o l/l

n o

r 1 5

t m

a 1 0

s e

G *

* * r

e 5

% * 0 H is ta m in 4 -M H S T -1 0 0 6 H T M T

Histamin 4-Methylhistamin ST-1006 HTMT Kontrolle 21/128 (16 %) 14/318 (4 %) 11/131 (11 %) 11/275 (4 %) Ruthenium Red 1 µmol/l 6/128 (5 %) 7/286 (2 %) 8/131 (6 %) 5/206 (2 %) Ruthenium Red 10 µmol/l 5/90 (6 %) 4/270 (1 %) 3/131 (2 %) 1/213 (0,5 %)

Abbildung 31: Einfluss des TRP-Kanal-Inhibitors Ruthenium Red auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen Inhibitorischer Effekt von Ruthenium Red (1 oder 10 µmol/l) auf den intrazellulären Ca2+-Anstieg nach Stimulation mit Histamin (1 mmol/l), 4-MH (100 µmol/l), ST-1006 (100 µmol/l) oder HTMT (100 µmol/l) dargestellt als Prozent der gesamt getesteten Neurone. Die Anzahl der positiv auf einen der Histaminrezeptor- Liganden reagierenden Neurone, im Verhältnis zu den gesamt getesteten, sind in der dazugehörigen Tabelle zu finden. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Kontrollgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Exakter Test nach Fisher); DRG-Neurone von n = 3 – 4 CD-1-Mäusen.

Ergebnisse

nm nm

henium

Rut

mmol/l): Die

Inhibitorischer Inhibitorischer

nach

B.:

Mäusen )

) - l l /

/ 1 l

l - o o l l m m 0 C 0 C 8 8 m m K 4

K 4 0 0 5 5 1 1 (

( am am Beispiel von Histamin (1

0 Anstiegs (Veränderung des 340/380 2

2 - 4

4 2+ d d ) e e l n ) / ) i ) R l l l R n

/ auf auf histamininduzierten Juckreiz /

i o

/ l

m l

o Neuronen o a m o m

m - m t 0 a 0 m u s m u t m 6 m i i 6 i

s µ 3 m n i µ

3 n 1

H e ( 0 e 1 0 H h ( 1 h 1 t ( t (

u solischen Ca u R R 0 0 0 0

3 Ruthenium Red

in in Spinalganglienneuronen von CD

Influx in DRG

- )

) 2+ s s ( (

t t i i e e d 0 ) 0 Z e l Z n 4 /

4 Anstiegs i l R 2

) - 2

o l

m /

l 2+ d a m m o t e s ) u m i l i R m

) n /

l i l n 1

µ H

/ Kein Effekt von ( l e

m 1 m

o : h ( a m t u t 0 i 0 m u

s A. 8 m i 8 n µ

1 R e 1 1 H 1 ( h ( t u R

0 2 2 1 1 ) l n / i ) l l n /

o n Juckreiz i l m 0 0 o

a µmol/l) µmol/l) auf den stimulusinduzierten Ca m 6 m 6

s a m m i e e t

l l s l l m 1 i H

( o o 1 H r r ( t t n n o o K K 0

(1 oder 10

0 5 0 5 0 5 0 5

......

2 1 1 0 2 1 1 0

n o r m a l i s i e r t e

R a t i o

3 4 0 / 3 8 0

n m n o r m a l i s i e r t e

R a t i o

3 4 0 / 3 8 0

. m ms Intervallen aufgezeichnete Beispielaufnahmen des zyto

auf auf histamininduzierte

Ruthenium Red

Veränderung des histamininduzierten intrazellulären Ca

32 Ruthenium Red

Einfluss von

Applikation

Abbildung Red A./B.: Abbildungen zeigen in Fluoreszenzintensitätsverhältnisses) jeweils 500 eines einzelnen Neurons. Effektvon

Ergebnisse

4.2.4. Einfluss des TRPA1-Kanal-Inhibitors HC-030031 auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstieg in Spinalganglienneuronen Nach einem initialen Stimulus mit dem Kontrollpuffer erfolgte eine erste Stimulation mit einem der verwendeten Histaminrezeptor-Liganden. Darauffolgend wurde nach einer ca. zweiminütigen Waschphase der TRPA1-Inhibitor HC-030031 (1 oder 10 µmol/l) appliziert und direkt nachfolgend wieder der vorherig verwendete Agonist (Abb. 34 A/B). HC-030031 konnte sowohl den histamin- als auch den 4-MH-induzierten Ca2+-Influx in die getesteten Neurone inhibieren (Abb. 33). Ebenso hatte er in einer Dosierung von 10 µmol/50 µl einen leichten, aber nicht statistisch signifikanten Hemmeffekt auf den ST-1006-induzierten Ca2+-Influx (p = 0,0908).

K o n tr o lle 2 0 H C -0 3 0 0 3 1 1 µ m o l/l

e H C -0 3 0 0 3 1 1 0 µ m o l/l

n o

r 1 5

t m

a 1 0

e G

* r

e 5 * *

% *

0 H is ta m in 4 -M H S T -1 0 0 6 H T M T

Histamin 4-Methylhistamin ST-1006 HTMT Kontrolle 31/234 (13 %) 15/330 (5 %) 17/434 (4 %) 7/270 (3 %) HC-030031 1 µmol/l 7/161 (4 %) 7/283 (3 %) 6/224 (3 %) 3/136 (2 %) HC-030031 10 µmol/l 8/146 (5 %) 1/183 (0,5 %) 6/339 (2 %) 1/166 (1 %)

Abbildung 33: Einfluss des TRPA1-Kanal-Inhibitors HC-030031 auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen Inhibitorischer Effekt von HC-030031 (1 oder 10 µmol/l) auf den intrazellulären Ca2+-Anstieg nach Stimulation mit Histamin (1 mmol/l), 4-MH (100 µmol/l), ST-1006 (100 µmol/l) oder HTMT (100 µmol/l) dargestellt als Prozent der gesamt getesteten Neurone. Die Anzahl der positiv auf einen der Histaminrezeptor-Liganden reagierenden Neurone, im Verhältnis zu den gesamt getesteten, sind in der dazugehörigen Tabelle zu finden. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Kontrollgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Exakter Test nach Fisher); DRG-Neurone von n = 4 – 6 von CD-1-Mäusen.

Ergebnisse

nm nm

030031

- mmol/l): Die

l / l l

/ nach HC o l

o m m µ

µ 0

1 1

) 1 1 l 3 3 /

e Mäusen Mäusen l 0 0

l - o l 0 0

l 1 o 0 3 3

m - r 0 C t 8 0 0 - - 8 m 4 n K

) 4 o C C l 0 / l 5 K H H

o 1 ( l m %) %) %) C

m K

0 0 5 0 2 1 2

4 Anstiegs (Veränderung des 340/380 (

4 -

030031 auf histamininduzierten Juckreiz

T 2+

HTMT (3 7/270 (2 3/136 (1 1/166 - M ) l T n / i ) 1 l

l H ) o 3 / 1 )

l m l n l / 0 i 3 / l a 0 o m %) l 0 0 t

0 o 6 %) %) s m

o Neuronen am Beispiel von Histamin (1 6 3 m m

0 i 3

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< 0

0 p 0

3 6 3 0

0 in Spinalganglienneuronen von CD 1 ) - )

s Influx in DRG

( - ( S

t Kein Kein Effekt von HC

t 2+ i %) i %) e

0 Z

0 : Z 4 4 2

Anstiegs

A. - ) l n /

i 2+ l

) Methylhistamin ) l o - 3 n l / m 1 i / l 4 (5 15/330 (3 7/283 (0,5 1/183 ) 0 l a m 3 l o t 0 / o * m 0 l s 3 m a i m

0 o

m t 0 0 s 3 1 H - 0 µ

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0 8 %) -

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( (

Neurons. C 1 H M %) %)

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0 0 Histamin (13 31/234 (4 7/161 (5 8/146 2 2

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a m n ) t i l ol/l s n / m i i l

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m ls eines ei i H

1 10 l

o o 1 H ( r r

t t n n o o K K 0 030031 030031 0 - -

0 5 0 5 0

030031 aufhistamininduzierten Juckreiz. 0 5 0 5 0 5 0 5

2 1 1

. . . .

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G e s a m t n e u r o n

2 1 1 0 e

2 1 1 0

Kontrolle HC HC

n o r m a l i s i e r t e

R a t i o

3 4 0 / 3 8 0

n m ms Intervallen aufgezeichnete Beispielaufnahmen des zytosolischen Ca . n o r m a l i s i e r t e

R a t i o

3 4 0 / 3 8 0

n m . . C A

030031 (1 oder 10 -

Veränderung des histamininduzierten intrazellulären Ca

Einfluss von HC

Inhibitorischer HC Effektvon

Abbildung Applikation A./B. Abbildungen zeigen in 500 Fluoreszenzintensitätsverhältnisses) jewei B.:

Ergebnisse

4.2.5. Einfluss des TRPV1-Kanal-Inhibitors SB366791 auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstieg in Spinalganglienneuronen Nach einem initialen Stimulus mit dem Kontrollpuffer erfolgte eine erste Stimulation mit einem der verwendeten Histaminrezeptor-Liganden. Darauffolgend wurde nach einer ca. zweiminütigen Waschphase der TRPA1-Inhibitor SB366791 (1 oder 10 µmol/l) appliziert und direkt nachfolgend wieder der vorherig verwendete Agonist (Abb. 36 A/B). SB366791 konnte sowohl den histamin-, 4-MH-, ST-1006 als auch den HTMT-induzierten Ca2+-Influx in die getesteten Neurone inhibieren (Abb. 35).

K o n tr o lle 2 0 S B 3 6 6 7 9 1 1 µ m o l/l

e S B 3 6 6 7 9 1 1 0 µ m o l/l

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Abbildung 35: Einfluss des TRPV1-Kanal-Inhibitors auf den histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneuronen von CD-1-Mäusen Inhibitorischer Effekt von SB366791 (1 oder 10 µmol/l) auf den intrazellulären Ca2+-Anstieg nach Stimulation mit Histamin (1 mmol/l), 4-MH (100 µmol/l), ST-1006 (100 µmol/l) oder HTMT (100 µmol/l) dargestellt als Prozent der gesamt getesteten Neurone. Die Anzahl der positiv auf einen der Histaminrezeptor-Liganden reagierenden Neurone, im Verhältnis zu den gesamt getesteten, sind in der dazugehörigen Tabelle zu finden. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die jeweilige Kontrollgruppe: *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05 (Exakter Test nach Fischer); DRG-Neurone von n = 4 – 6 von CD-1-Mäusen.

Ergebnisse

nm nm

itorischer

mmol/l): Die

Inhib

nach SB366791

B.:

Mäusen

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) Neuronen am Beispiel von Histamin (1 ) l l n 1 l 1 /

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Influx in DRG - ) ) s

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/ Kein Effekt von SB366791 auf histamininduzierten Juckreiz. l i l n

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m A. o 6 s t m i 6 s

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l µmol/l) µmol/l) auf den stimulusinduzierten Ca l

l o o r r t t n n o o K K 0 0 0 5 0 5 0 5 0 5 ......

2 1 1 0

ms Intervallen aufgezeichnete Beispielaufnahmen des zytosolischen Ca n o r m a l i s i e r t e

R a t i o

3 4 0 / 3 8 0

n m n o r m a l i s i e r t e

R a t i o

3 4 0 / 3 8 0

n m . . A

nisses), jeweils eines einzelnen 500

Veränderung des histamininduzierten intrazell

Einfluss von SB366791 (1 oder 10

Abbildung Applikation A./B.: Abbildungen zeigen, in Fluoreszenzintensitätsverhält Effektvon SB366791 histamininduziertenauf Juckreiz

Ergebnisse

4.3. Vergleichende Untersuchungen des histamininduzierten intrazellulären Ca2+-Anstiegs in Spinalganglienneurone bei verschiedenen Mausstämmen Die aus den Mausstämmen CD-1, BALB/c und C57BL/6 isolierten DRG-Neurone wurden nacheinander mit den Stimuli 4-MH (100 µmol/l), Histamin (1 mmol/l), AITC (1 µmol/l), Capsaicin (1 µmol/l) und KCl (150 mmol/l) behandelt (Abb. 37 A). Bei allen drei Stämmen reagierten ungefähr gleich viele Neurone auf 4-MH (3 – 4 %). In dieser Neuronenpopulation war bei den C57BL/6-Mäusen ein signifikant größerer Prozentsatz ebenfalls sensitiv auf die Gabe von AITC und Capsaicin als bei den CD-1- (p < 0,08) oder BALB/c-Mäusen (p < 0,04). Bei den C57BL/6-Mäusen waren insgesamt weniger Neurone histaminpositiv als bei den BALB/c- (p < 0,003) oder CD-1-Mäusen (p < 0,07). Dennoch reagierte in dieser Neuronenpopulation bei den C57BL/6-Mäusen ein signifikant größerer Prozentsatz ebenfalls auf die Gabe von AITC und Capsaicin als bei den CD-1- (p < 0,02) oder BALB/c-Mäusen (p < 0,002). Ebenfalls reagierten hier mehr Zellen auf eine AITC-Exposition als bei den BALB/c-Mäusen (p < 0,04). Weiterhin gab es bei den C57BL/6-Mäusen kein Histamin- positives Neuron, das nicht auf einen weiteren Stimulus (AITC, Capsaicin oder AITC/Capsaicin) reagierte. Dieser Unterschied war signifikant gegenüber den BALB/c- (p < 0,001) und ebenfalls erkennbar im Vergleich zu den CD-1-Mäusen (p < 0,008). Nach AITC-Exposition reagierten signifikant mehr Neurone mit einem Ca2+-Anstieg bei den C567BL/6- als bei den BALB/c- (p < 0,005) oder CD-1-Mäusen (p < 0,002). Nach einer Capsaicin-Stimulation reagierten bei den BALB/c- im Vergleich zu den CD-1- (p < 0,08) und C57BL/6-Mäusen (p < 0,0009) weniger Neurone mit einem Ca2+-Anstieg. Insgesamt waren bei den über den H4R induzierten juckreizsensitiven Stämmen (CD-1, C57BL/6) die Mehrheit der H4R-sensitiven Neurone AITC- und Capsaicin-positiv. Bei den BALB/c-Mäusen war die Mehrheit der 4-MH-sensitiven Neurone Capsaicin-positiv. Die statistischen Signifikanzen wurden mittels des Exakten Tests nach Fisher ermittelt. Eine Übersicht über alle untersuchten Neurone ist in Abb. 37 B und eine Gegenüberstellung der auf 4-MH und Histamin reagierenden Neurone in Abb. 38 zu finden.

Ergebnisse

0 Vergleichende

) 5

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%) 6

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Anstiegs in Spinalganglienneuronen bei verschiedenen

jeweils jeweils eine ca. 2 minütige Waschphase.

2+ C57BL/6 (3 13/419 %) (12 49/419 (38 158/419 (24 99/419 0 ) l 0 / l 3 C o )

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1. -

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2 2 1 1 0 0

. n o r m a l i s i e r t e

R a t i o

3 4 0 / 3 8 0 B

: Vergleichende Untersuchung des stimulusinduzierten intrazellulären Ca

teristischer Verlauf eines stimulusinduzierten zytosolischen Ca

mmol/l). Zwischen der Applikation der einzelnen Stimuli (m

Charak

Abbildung Mausstämmen A.: Neurons nach aufeinanderfolgender Exposition mit Kontrollpuffer, 4 (150 Darstellung der auf die Gabe verschiedener Stimuli mit einem int Neuronen deruntersuchten Mausstämme BALB/c, C57BL/6 und CD

Ergebnisse

% 7

1 7 5 1 3 %

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+/Caps +

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im Diagramm dargestellt: keine MH (100

9 AITC 1 % 3

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5 9 1

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% -

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% +

7 7 %

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- C57BL/6

1) die Unterschiede der Subpopulationen der auf 4 - %

µmol/l;

oder 4

2 -

positiven Neurone dargestellt.

- - 2 3 % 2 3 2 +

), Capsaicin

s oder Histamin

eagierenden Zellen. Diese Neurone werden in vier Gr - a

MH AITC +

% - +

+ %

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3 Anstieg r

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T T : Vergleichende Darstellung der auf Histamin I I

A A 38

Methylhistamin AITC - 4 µ (100 Histamin (1 mm

zentwerte in Relation zurGesamtzahl der 4

mmol/l) mit einem intrazellulären Ca

Die Die Tortendiagramme zeigen im Stammvergleich (BALB/c, C57BL/6, CD

Abbildung (1 Reaktion ( Pro %

9 3 %

92 8

6 %

7 4 Diskussion

5. Diskussion Der mit einer Vielfalt von Erkrankungen assoziierte Juckreiz kann für die Betroffenen eine starke psychische Belastung darstellen und deren Lebensqualität erheblich mindern (SHEEHAN-DARE et al. 1990; KARASHIMA et al. 2008; LEADER et al. 2015; MOLLANAZAR et al. 2016; REICH et al. 2016; PALLER et al. 2017). Trotz einer großen Bandbreite an zur Verfügung stehenden Therapiemöglichkeiten ist es häufig nicht möglich, diese Empfindung erfolgreich zu reduzieren (KLEIN u. CLARK 1999; STÄNDER et al. 2017). Dies trifft sowohl auf Menschen als auch auf Tiere zu. Neue vielversprechende Therapiemöglichkeiten zur Behandlung der caninen AD scheinen derzeit die Januskinase (JAK)-Inhibitoren und monoklonale IL-31-Antikörper, welche für Hunde in Deutschland zugelassen sind, zu sein (MICHELS et al. 2016; FUKUYAMA et al. 2017; MOYAERT et al. 2017; OLIVRY u. BÄUMER 2017). JAK-Inhibitoren befinden sich ebenfalls schon in humanen klinischen Studien und erweisen sich dort als wirksam zur Behandlung chronisch- pruritischer Erkrankungen (FELDMAN et al. 2016). Einige JAK-Inhibitoren sind bereits für andere Indikationen, wie z. B. für die Myelofibrose, zugelassen (KEOHANE et al. 2013). Da zahlreiche Mediatoren am Juckreiz beteiligt sind (Abb. 1), gibt es keine universell effektive pharmakologische Therapie für alle pruritischen Erkrankungen (PAUS et al. 2006; STEINHOFF et al. 2006; KREMER et al. 2014). Häufig kommt es bei einigen chronischen Erkrankungen, wie z. B. der AD, zu einem Zusammenspiel oder einer wechselseitigen Beeinflussung/Freisetzung von Entzündungs- und Juckreizmediatoren (TOTH et al. 2015). Dies könnte möglicherweise eine Therapie mit einer Kombination aus mehreren Medikamenten erforderlich machen (NUTTALL et al. 2014). Für mögliche neue Therapieansätze ist es wichtig, die Signaltransduktionswege der am Juckreizgeschehen beteiligten Mediatoren weiter aufzuklären, um eventuelle Überschneidungspunkte zu finden und diese therapeutisch nutzen zu können. Der erst in der letzten Dekade entdeckte H4R spielt eine Rolle beim histamininduzierten Juckreizgeschehen. Obwohl in den letzten Jahren eine Vielzahl an Studien zur Funktion des H4R in der histamininduzierten Juckreizentstehung, durchgeführt wurden, sind die molekularen Mechanismen und die intrazellulären nachgeschalteten Signalwege weiterhin unbekannt (BELL et al. 2004; DUNFORD et al. 2007; COWDEN et al. 2010b; ROSSBACH et al. 2011). Ziel dieser Arbeit

Diskussion

war es daher, Schritte des bisher weitestgehend unbekannten Signalübertragungsweges des über den H4R induzierten Juckreizes zu untersuchen. Dabei wurde ein besonderes Augenmerk auf die bekanntermaßen an vielen physiologischen Prozessen, u. a. der Juckreizentstehung, beteiligten TRP-Kanäle gelegt (KITTAKA u. TOMINAGA 2017). Weiterhin wurden einige den TRP-Kanälen vorgeschalteten Effektormoleküle in ihrer Fähigkeit, den über den H4R induzierten Juckreiz zu beeinflussen, untersucht.

5.1. Einfluss des Mausstammes auf die über den H4R induzierte Juckreizantwort Schon aus anderen Forschungsbereichen ist bekannt, dass nicht alle Tiere bzw. Mausstämme zur Beantwortung der großen Variation an vorhandenen Fragestellungen geeignet sind (PLAYFAIR 1968; BECK et al. 2000; GREEN et al. 2006). Die richtige Auswahl des zur Fragestellung passenden Modells ist besonders wichtig, um keine fehlleitenden oder widersprüchlichen Daten zu generieren. KURAISHI et al. (1995) postulierten, z. B. zunächst anhand einer Studie an ddY-Mäusen, dass Histamin in Mäusen keinen Juckreiz auslöst. In späteren Studien wurde im Gegenteil gezeigt, dass einzelne Mausstämme unterschiedlich sensitiv auf Juckreizstimuli, wie z. B. Histamin, reagierten (INAGAKI et al. 2001; BELL et al. 2004; GREEN et al. 2006). INAGAKI et al. (2001) konnten Mäuse des Inzuchtstammes C57BL/6 und des Auszuchtstammes CD-1 als am sensitivsten gegenüber der Gabe von Histamin identifizieren, wobei die CD-1-Mäuse sich durch eine mehr als doppelt so hohe Reaktion auf die getestete lokal applizierte Menge von 50 nmol/50 µl auszeichneten. Ebenso geben BELL et al. (2004) in ihrer Studie an, dass die CD-1-Mäuse 30-mal sensitiver auf Histamin reagierten als die Mäuse des Inzuchtstammes BALB/c. Diese Ergebnisse konnten in der vorliegenden Studie durch einen Vergleich der Kratzantwort nach intradermaler 4-MH- Gabe von jeweils zwei In- (BALB/c; C57BL/6) und Auszuchtstämmen (NMRI; CD-1) nachvollzogen werden. Wie erwartet, zeigten sich die Mäuse des Stammes CD-1 sowie des Stammes C57BL/6 auch für über den H4R induzierten Juckreiz am sensitivsten. Schon ab einer intradermal applizierten Menge von 5 nmol/50 µl war die durch 4-MH ausgelöste Kratzantwort bei den CD-1-Mäusen signifikant stärker als bei den anderen getesteten Mausstämmen. Die Mäuse der Stämme BALB/c und NMRI stellten sich bis zu einer Menge von 500 nmol/50 µl als wenig bis gar nicht sensitiv heraus. Wenig sensitiv bedeutet in diesem Fall, dass sich die BALB/c-Mäuse erst in einer sehr hohen Applikationsmenge (1 µmol/50 µl) stärker zu kratzen begannen. Im Zusammenhang mit den Angaben von INAGAKI et al.

Diskussion

(2001), SHIM et al. (2007), FERNANDES et al. (2013), LAURINO et al. (2015) führten diese Ergebnisse zu der Entscheidung, CD-1-Mäuse für die vorliegende Studie zu nutzen. Warum es zu solchen Unterschieden in der Juckreizantwort kommt, ist nicht bekannt. Eine Möglichkeit könnte darin bestehen, dass die an der Juckreizweiterleitung beteiligten Rezeptoren und Ionenkanäle bei den verschiedenen Mausstämmen unterschiedlich stark exprimiert werden. In der eigenen Studie wurde daher die Sensitivität der aus CD1-, BALB/c- und C57BL/6-Mäusen isolierten DRG-Neurone auf 4-MH, Histamin, AITC und Capsaicin untersucht. Bei den drei untersuchten Stämmen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der auf 4-MH-Gabe reagierenden Neurone (3 – 4 %). Diese Angaben stimmen mit den in der Literatur für die Sensitivität auf H4R-Stimuli zu findenden (3 – 10 %; ROSSBACH et al. 2011; JIAN et al. 2016) überein. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass sowohl der TRPV1- als auch der TRPA1-Kanal sowohl an histamin- als auch 4-MH-induziertem Juckreiz beteiligt sind. Dies ist daran zu erkennen, dass bei den beiden in dieser Studie für über den H4R induzierten juckreizsensitiven Stämmen die Mehrheit der 4-MH-sensitiven Neurone AITC- und Capsaicin-positiv waren, wohingegen bei dem H4R- insensitiven Stamm die Mehrheit der 4-MH-positiven Neurone nur Capsaicin-positiv waren. Interessanterweise reagierten bei dem histaminsensitiven Stamm C57BL/6 weniger Neurone (12 %) auf eine Histamin-Stimulation als bei den beiden anderen Stämmen (16 – 19 %). In der verfügbaren Literatur liegen die Werte der histaminsensitiven DRG-Neurone von Labornagern bei 11 – 16 % (HAN et al. 2006; KAJIHARA et al. 2010). Erneut reagierten bei den C57BL/6-Mäusen mehr Zellen auf AITC-, AITC- und Capsaicin-Stimulation als bei den beiden anderen Stämmen. Möglicherweise wird dadurch die geringere Anzahl an histaminsensitiven Neuronen im Vergleich zu dem in vivo ebenfalls hoch histaminsensitiven CD-1-Stamm ausgeglichen. Auffallend ist zudem, dass bei dem histamininsensitiven Stamm BALB/c etwa ein gleicher Teil der 4-MH- bzw. histaminsensitiven auf AITC, Capsaicin, AITC und Capsaicin oder auf keinen der Simuli sensitiv reagierte. Die Proportion der nicht auf Capsaicin- oder AITC-Gabe reagierenden Zellen war bei diesem Stamm höher als bei den anderen Stämmen. Hierzu sind keine Literaturangaben verfügbar, die diese Ergebnisse erklären könnten. Eventuell könnte dies aber ein Grund sein, weshalb die Mäuse des BALB/c- Stammes weniger sensitiv auf histamininduzierten Juckreiz reagierten. Anhand der durchgeführten Untersuchungen ist es jedoch noch nicht möglich, eine eindeutige Aussage zu

Diskussion

den Ursachen der stammspezifischen Unterschiede in der Sensitivität auf Histamin zu treffen. Verschiedene Faktoren sind hierbei zu beachten, zunächst wurden in der vorliegenden Arbeit alle und nicht nur die hautspezifischen Neurone untersucht. Eine Untersuchung z. B. über eine retrograde Färbung der hautspezifischen DRG-Neurone mit einem Fluoreszenzmarker könnte in nachfolgenden Studien hilfreich sein (ROSSBACH et al. 2011). Auch ist zu beachten, dass weitere Zellen im Organismus an der Juckreizentstehung beteiligt sind und dass es sich bei der Weiterleitung um ein komplexes Gefüge aus Botenstoffen, Rezeptoren und Effektormolekülen handelt, die sowohl das Geschehen als auch sich gegenseitig beeinflussen. Vor kurzem konnte z. B. gezeigt werden, dass TRP-Kanäle auf Keratinozyten ebenfalls in das Juckreizgeschehen involviert seien (CHEN et al. 2016). Weiterhin beschrieben RU et al. (2017), dass TRPA1- und TRPV1-Kanäle zwar in den durch intradermale Applikation von Pruritogenen ausgelösten Juckreiz involviert sind, aber bei der initialen Auslösung des Juckreizsignales keine Rolle spielten. Sie konnten in einem neu entwickelten Haut-Nerven- Präparat zeigen, dass histaminerge und nicht-histaminerge Agonisten in großen Teilen die gleiche Subpopulation der TRPV1- und TRPA1-exprimierenden C-Fasern aktivierten. Im Widerspruch dazu steht, dass ein gezieltes Ausschalten trigeminaler histaminerger Fasern den nicht-histaminergen Juckreiz nicht beeinflusste (ROBERSON et al. 2013). Diese Diskrepanz reflektiert die Unterschiede im spinalen und trigeminalen System und bedarf weiterer Untersuchungen (GAMPER 2017). Auch zeigten RU et al. (2017) interessanterweise, dass die Antwort der juckreizspezifischen peripheren C-Fasern von TRPA1-/-- oder TRPV1-/-/TRPA1-/--Mäusen auf die pruritogenen Substanzen Histamin, Chloroquin und Ovalbumin im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen unverändert war. Im Zusammenhang mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit und den Angaben von SHIM et al. (2007) und WILSON et al. (2011), die eine Beteiligung sowohl des TRPV1- als auch des TRPA1-Kanals am Juckreizgeschehen verschiedener Pruritogene nachwiesen, könnten die Erkenntnisse von RU et al. (2017) dafür sprechen, dass diese Kanäle zwar beteiligt sind am Juckreizgeschehen, aber an anderer Stelle als auf den Nervenendigungen der juckreizspezifischen Fasern (GAMPER 2017). Weiterhin zeigen diese Daten, dass die Untersuchung der DRG-Neurone zur Detektion der stammspezifischen Unterschiede in der Ausprägung der Juckreizantwort allein nicht ausreicht, um dieses Ziel zu erreichen. Eventuell liegen die Unterschiede direkt

Diskussion

am Ort des Ursprungs des Juckreizsignals, bei nicht-neuronalen Zellen, und nicht erst auf der Ebene der sensorischen Neurone oder im ZNS.

5.2. Histaminrezeptor-Liganden im Juckreizgeschehen Sowohl eine Aktivierung des H1R als auch des H4R führt zur Juckreizentstehung (BELL et al. 2004; ROSSBACH et al. 2011). Es konnte aber auch gezeigt werden, dass H3R- Antagonisten Juckreiz auslösen (ROSSBACH et al. 2011). Obwohl auch eine mögliche Rolle des H2R an der Entstehung allergischer Erkrankungen bekannt ist (CATALDI et al. 2014), scheint er in der Juckreizentstehung keine wesentliche Rolle zu spielen. BELL et al. (2004) konnten durch lokale Gabe des H2R-Agonisten Dimaprit in Mengen von bis zu 40 µmol/50 µl keinen Juckreiz auslösen. Diese Untersuchung fand allerdings an jeweils nur drei Tieren des histamininsensitiven Maustammes BALB/c statt. Aufgrund in der vorliegenden Studie zum Teil auftretender Unterschiede in der Inhibition des durch die beiden H4R-Agonisten ST-1006 und 4-MH ausgelösten Juckreizes (4-MH ist zusätzlich H2R-agonistisch wirksam), wurde an CD-1-Mäusen eine Dosis-Wirkungs-Untersuchung mit dem H2R-Agonisten Amthamin durchgeführt. Amthamin ist ein hochselektiver H2R-Agonist mit einer etwa zehnfach höheren Potenz am H2R als der selektive H2R-Dimaprit (POLI et al. 1993). Amthamin zeigte wider Erwarten einen dosisabhängigen biphasischen Anstieg im Kratzverhalten im Vergleich zum Vehikel. Bisher ist nicht bekannt, ob Amthamin auf weitere Zielstrukturen abseits des H2R Effekte hat (LIM et al. 2005). Es erscheint daher durchaus möglich, dass der H2R aufgrund von den bereits diskutierten Stammunterschieden in ihrer Sensitivität auf Histamin fälschlicherweise als nicht am Juckreizgeschehen beteiligt eingestuft wurde (INAGAKI et al. 2001; BELL et al. 2004; GREEN et al. 2006).

5.3. Effekt von TRP-Kanälen auf den über den H4R induzierten Juckreiz TRPV1 und TRPA1 sind nicht selektive Ionenkanäle, die vor allem auf sensorischen Neuronen exprimiert sind und eine Rolle im Juckreizgeschehen spielen (NILIUS u. OWSIANIK 2011; KITTAKA u. TOMINAGA 2017). Mehrere Autoren demonstrierten, dass der TRPV1-Kanal am histamininduzierten Juckreiz und Ca2+-Influx in DRG-Neuronen beteiligt ist (KIM et al. 2004; SHIM et al. 2007). Weiterhin postulieren JIAN et al. (2016), dass der TRPV1-, aber nicht der TRPA1-Kanal, an über den H4R induziertem Juckreiz beteiligt sei. Hierbei ist zu beachten, dass in der Studie der H3R/H4R-Agonist Immepip mit

Diskussion

einer stärkeren Affinität zum H3R (pki = 9,3) als zum H4R (pki = 7,7) in einer relativ hohen Dosierung (1 µmol/100 µl) genutzt wurde (LIM et al. 2005). Weiterhin wurde der TRPA1- Antagonist HC-030031 nur bei dem immepipinduzierten Ca2+-Influx in DRG-Neurone, aber nicht bei dem durch Immepip-ausgelösten Juckreiz untersucht. Bisher wurde davon ausgegangen, dass der TRPA1-Kanal nicht am histamininduzierten Juckreiz beteiligt sei (WILSON et al. 2011; KITTAKA u. TOMINAGA 2017). Auffallend ist, dass in keiner der genannten Studien durch Histamin oder über den H4R induzierter Juckreiz komplett mit TRPV1-Inhibitoren geblockt werden konnte (SHIM et al. 2007; JIAN et al. 2016). Ebenso war der histamininduzierte Juckreiz in TRPV1-/- nicht komplett aufgehoben (SHIM et al. 2007). Daher liegt die Vermutung hier nahe, dass noch weitere TRP-Kanäle am histamininduzierten Juckreiz beteiligt sein könnten. ROBERSON et al. (2013) zeigten beispielsweise eine histaminsensitive Population von aus männlichen CD-1-Mäusen isolierten Trigeminalganglienneuronen, von denen ca. 39 % ebenfalls sensitiv auf AITC reagierten. Diese Angabe deckt sich in etwa mit den in dieser Studie erhobenen Daten der histaminsensitiven DRG-Neurone der CD-1- und C57BL/6-Mäuse. Leider wurde nicht darauf eingegangen, wie viele dieser auf Histamin reagierenden Neurone sowohl AITC- als auch Capsaicin-positiv waren. Weitere Hinweise auf eine Beteiligung vom TRPA1-Kanal an der intrazellulären Weiterleitung des durch Histamin induzierten Signals geben ZHANG et al. (2015). In den neonatalen DRG-Neuronen von C57BL/6-Mäusen sind in der histaminsensitiven Neuronenpopulation 13 % als AITC, 42 % als Capsaicin und 41 % sowohl als AITC- als auch als Capsaicin-positiv detektiert worden. Diese Daten konnten in der vorliegenden Studie bei C57BL/6-Mäusen (4 - 8 Wochen) ebenfalls bestätigt werden. Weiterhin konnte sowohl in vivo als auch in vitro bestätigt werden, dass der TRPV1-Kanal sowohl an durch histamin-, über den H1R als auch an über den H4R induziertem Juckreiz beteiligt ist. TRPV1-Inhibitoren (Capsazepin, SB366791) konnten sowohl den Juckreiz als auch den Ca2+-Influx in DRG-Neurone nach Stimulation reduzieren. Zudem konnte sowohl in vivo als auch in vitro zum ersten Mal gezeigt werden, dass der TRPA1-Kanal ebenfalls am durch Histamin und am über den H4R induzierten Juckreiz beteiligt ist. Hier konnte der TRPA1-Kanal-Inhibitor HC-030331 sowohl den Juckreiz als auch den Ca2+-Influx in DRG- Neurone hemmen. Ebenso wie beim TRPV1-Inhibitor konnte aber keine vollständige Reduktion erreicht werden. Weiterhin waren sowohl der durch Histamin als auch der über den

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H4R induzierte Juckreiz in TRPV1-/-- und TRPA1-/-- im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen reduziert. Bei den TRPV1-/-/TRPA1-/--Mäusen war im Vergleich zum Wildtyp der über den H4R induzierte Juckreiz ebenfalls verringert. Dennoch kam es bei allen drei Knockout- Stämmen zu keinem vollständigen Ausbleiben des Juckreizes. Eine Erklärung hierfür könnte mit der Arbeit von CHEN et al. (2016) möglich sein. Sie fanden heraus, dass TRPV4-Kanäle auch auf Keratinozyten am histamininduzierten Juckreiz beteiligt sind. Weiterhin zeigten RU et al. (2017), dass auf peripheren histaminsensitiven C-Fasern die TRP-Kanäle nicht an der initialen Weiterleitung des Juckreizsignals beteiligt zu sein scheinen. Diese Arbeiten demonstrieren, dass nicht-neuronale Strukturen an der Entstehung des Juckreizgeschehens beteiligt sind und ihre Rolle weiter evaluiert werden muss. Bei dem Vergleich der Daten mittels pharmakologischer Inhibition bei CD-1- und den Knockout-Mäusen auf C57BL/6- Hintergrund muss beachtet werden, dass es zu geringen Abweichungen in den Ergebnissen kam. Bei den TRPA1-/--Mäusen zeigte sich kein Unterschied in der Juckreizauslösung nach 4-MH-Stimulation im Vergleich zum Wildtyp. Bei den TRPV1-/-- war im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen ein tendenzieller aber nicht signifikanter Unterschied in der Juckreizantwort nach ST-1006-Applikation zu erkennen. Aufgrund der Stammunterschiede war eine 100 %ige Vergleichbarkeit nicht gegeben. Dennoch konnten im Wesentlichen die gewonnenen Daten aus den Versuchen der pharmakologischen Inhibition nachvollzogen werden. Hierbei ist zu beachten, dass in der Studie an den Knockout-Mäusen eine gemischtgeschlechtliche Population untersucht wurde. Bei den Untersuchungen zur pharmakologischen Inhibition wurden dagegen nur weibliche Tiere verwendet, die als sensitiver gegenüber Juckreizstimuli gelten (GREEN et al. 2006; YAMAURA et al. 2014). Eine 100 %ige Vergleichbarkeit war deswegen nicht gegeben. Ob die geschlechtsspezifischen Unterschiede auch für histamininduzierten Juckreiz gelten, ist bisher nicht weiter untersucht worden. Es ist zu bedenken, dass die beiden Teilstudien zwar durch denselben Experimentator, aber in zwei verschiedenen Laboratorien durchgeführt wurden. CHESLER et al. (2002b) zeigten, dass Umweltfaktoren Einfluss auf das Verhalten der Mäuse und somit auf den Ausgang einer Studie haben können.

5.3.1. Wechselseitige Regulation des TRPV1- und TRPA1-Kanals Zusätzlich zu der Co-Expression des TRPV1- und TRPA1-Kanals auf einigen sensorischen Nerven und nicht-neuronalen Zellen, wie Keratinozyten, wurde von GOUIN et al. (2017) eine

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funktionelle Interaktion zwischen diesen beiden Kanälen entdeckt (Kreuzsensibilisierung/Desensibilisierung). Dieses Wechselspiel zwischen den Kanälen könnte bei der inflammatorischen thermalen Hyperalgesie, kutanen neurogenen Entzündung und Schmerzen eine Rolle spielen (AKOPIAN et al. 2007; PATIL et al. 2010; FISCHER et al. 2014; SPAHN et al. 2014; MASUOKA et al. 2017). Bei dieser wechselseitigen Beeinflussung scheint die Konzentration des zytosolischen Ca2+, welches den TRPV1- und den TRPA1- Kanal sensibilisiert oder desensibilisiert, eine wichtige Rolle zu spielen. Es konnte bereits gezeigt werden, dass sich die durch Capsaicin oder Senföl ausgelösten Ca2+-Einströme durch die Erhöhung des intrazellulären Ca2+ gegenseitig desensibilisierten (AKOPIAN et al. 2007). PATIL et al. (2010) zeigten die Rolle des Ca2+-Influx über den TRPV1-Kanal als sekundären Mechanismus zur Desensibilisierung des TRPA1-Kanals. Weiterhin wurde aufgedeckt, dass diese beiden Kanäle über physische und funktionelle Interaktionen in der Plasmamembran, z. B. von sensorischen Neuronen, miteinander interagieren (AKOPIAN et al. 2007; FISCHER et al. 2014). MASUOKA et al. (2017) zeigten weiterhin, dass der TRPA1-Kanal auf den DRG-Neuronen die Funktion des TRPV1-Kanals über die Regulation der basalen Ca2+- Konzentration unterdrückt. Basale Ca2+-Einströme in AITC-sensitiven Neuronen werden durch TRPA1-Antagonisten leicht abgeschwächt. Dies deutet auf einen tonischen TRPA1- abhängigen Ca2+-Einstrom in die sensorischen Neurone hin. So könnte es möglich sein, dass eine spontane Aktivierung des TRPA1-Kanals durch endogene Substanzen die durch nahegelegene TRPV1-Kanäle induzierte Ca2+-Erhöhung inhibiert. Dies könnte erklären, warum in der vorliegenden Studie nach einer Stimulation mit dem TRPA1-Agonisten je nach Mausstamm nur 15 – 24 % der Neurone auf eine Stimulation mit Capsaicin reagierten. In der Literatur werden Werte von 34 – 78 % für Capsaicin-positive Neurone angegeben (HAN et al. 2006; SHIM et al. 2007; ROSSBACH et al. 2011; JIAN et al. 2016; FUKUYAMA et al. 2017). Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass der TRPA1-Kanal die nachfolgende Stimulation durch einen TRPV1-Agonisten hemmt und beide Kanäle im Juckreizgeschehen miteinander agieren oder sich gegenseitig beeinflussen.

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5.4. Einfluss verschiedener Effektormoleküle auf den histamininduzierten Juckreiz Die Gα- und Gßγ-Untereinheiten der GPCRs stimulieren diverse Effektormoleküle, wie z. B. Adenylyl- und Guanylylzyklasen, Phosphodiesterasen, PLA2 und PLC. Dadurch wird zusätzlich zur Steigerung des intrazellulären Ca2+ und der Öffnung einer Reihe von Ionenkanälen, die Produktion verschiedener, sekundärer Botenstoffe (second messenger), wie z. B. cAMP, cGMP, DAG, IP3 oder Arachidonsäure, aktiviert oder inhibiert (MARINISSEN u. GUTKIND 2001). Diese Effektormoleküle spielen eine Schlüsselrolle in der Vermittlung der Signalübertragung von den GPCRs zum intrazellulären Signalnetzwerk. Durch die Aktivierung der PLC kommt es über sekundäre Botenstoffe zu einer Potenzierung TRPV1- abhängiger Antworten (WU et al. 2010). PLC-mediierte Signalwege spielen eine wichtige Rolle bei der sensorischen Signalübertragung (JIAN et al. 2016). Es ist bereits bekannt, dass der PLC-Signalweg in den durch TSLP-induzierten Juckreiz der AD involviert ist (WILSON et al. 2013). WILSON et al. (2013) konnten in ihrer Studie zeigen, dass dieser Signalweg für die funktionelle Verbindung des TSLP-Rezeptors und des TRPA1-Kanals benötigt wird. Eine Vorbehandlung der Mäuse mit dem PLC-Inhibitor U73122 führte zu einer Reduktion der TSLP-induzierten Juckreizantwort. Ebenfalls wurde in einem spezifischen Knockout-Modell in vivo und in vitro gezeigt, dass eine PLC-Isoform, die in den DRG-Neuronen prädominante PLCß3, in die Weiterleitung des histamininduzierten Juckreizes über den H1R auf nozizeptiven Neuronen der C-Fasern involviert ist (HAN et al. 2006). Dies passt zu der Feststellung, dass eine Reduktion des durch histamininduzierten Ca2+-Influx in DRG-Neurone durch den PLC-Inhibitior U73122 möglich ist (NICOLSON et al. 2002). In der vorliegenden Studie konnte U73122 (50 pmol/ 50 µl; i.d.) den durch HTMT-, aber nicht den histamin-, 4- MH- oder ST-1006-induzierten Juckreiz hemmen. Von JIAN et al. (2016) wurde hingegen mit dieser Substanz der durch den H3R/H4R-Agonisten Immepip induzierte Juckreiz und der intrazelluläre Ca2+-Influx in DRG-Neurone inhibiert. Hierbei ist zu beachten, dass die

Affinität des in der Studie von JIAN et al. (2016) verwendeten Immepips zum H3R (pki = 9,3) größer ist als zum H4R (pki = 7,7) (LIM et al. 2005). Inwiefern dies eine Rolle spielt, ist unklar, da bisher lediglich für den inversen H3R-Agonisten Pitolisant die Fähigkeit zur Juckreizinduktion im Mausstamm BALB/c nachgewiesen wurde (ROSSBACH et al. 2011). BELL et al. (2004) haben mit einer dem Immepip verwandten Substanz, dem Imetit

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(H3R/H4R-Agonist), ebenfalls Juckreiz bei BALB/c-Mäusen ausgelöst und mit dem H3R/H4R-Antagonisten Thioperamid gehemmt. Diese Untersuchung erlaubt keine Unterscheidung zwischen dem H3R und dem H4R. Ein weiterer Unterschied zu der vorliegenden Studie ist, dass JIAN et al. (2016) Mäuse des Stammes C57BL/6 beider Geschlechter und eine deutlich höhere Menge von U73122 (1 µmol/100 µl i.d.) verwendeten. An dieser Stelle ist zu berücksichtigen, dass die Substanz U73122 weitere Effekte, z. B. eine TRPA1- und PLC-Aktivierung, zu haben scheint. Überraschenderweise haben KLEIN et al. (2011) entgegen aller Annahmen in einem zellfreien Mizellensystem gezeigt, dass U73122 die Aktivität der humanen PLCß3 und weiterer, aufgereinigter PLCs dosis und zeitanhängig steigerte. In elektrophysiologischen Untersuchungen an CHO-Zellen (immortalisierte Zelllinie aus Ovarien einer chinesischen Hamsterart) konnte zudem mit einer Dosierung von 1 µmol/l eine direkte Aktivierung des TRPA1-Kanals erzielt werden (KARASHIMA et al. 2008). Weiterhin haben HOU et al. (2004) in einem spezifischen PLC-Assay gezeigt, dass diese Substanz zwar den Isotyp PLCß2, aber PLCß1, PLCß3 und PLCß4 in ihrer Fähigkeit, PIP2 zu hydrolisieren, kaum bis gar nicht hemmte. Mit dem PLC-Inhibitor U73122 generierte Daten sollten demnach mit Vorsicht interpretiert werden. Somit war eine Reproduktion der Daten von HAN et al. (2006) nicht erreichbar und eine Beteiligung der PLC an über den H4R induziertem Juckreiz nicht auszuschließen oder zu bestätigen. KIM et al. (2004) zeigten, dass der histamininduzierte Ca2+-Influx in sensorische Neurone von Ratten über den PLA2/LO/TRPV1-Signalweg vermittelt wird. Diese Beobachtung wurde durch eine In-vivo-Untersuchung belegt und die Rolle der PLA2 im histamininduzierten Juckreizgeschehen gezeigt (SHIM et al. 2007). Der PLA2-Inhibitor Quinacrin hemmte den durch Histamin ausgelösten Juckreiz signifikant. In der vorliegenden Studie konnte dies nachvollzogen werden. Der histamin- und HTMT-induzierte Juckreiz wurden zwar nicht signifikant reduziert, aber sowohl der 4-MH- als auch ST-1006-induzierte Juckreiz signifikant gehemmt. Dies stellt den ersten Nachweis einer Beteiligung der PLA2 am über den H4R induzierten Juckreiz dar. Warum in der vorliegenden Studie keine signifikante Hemmung des histamininduzierten Juckreizes erreicht wurde, konnte nicht abschließend geklärt werden. Für beide Studien wurden weibliche CD-1-Mäuse und Quinacrin in identischer Dosierung verwendet (20 mg/kg, i.p.). Die Unterschiede bestanden darin, dass in der Arbeit von SHIM et al. (2007) Histamin in einer deutlich niedrigeren Menge (8 nmol/50 µl) lokal appliziert wurde

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und die Mäuse sich in einem Beobachtungsraum von 20 Min. häufiger kratzten als die Versuchstiere in der vorliegenden Studie in 30 Min. Die Formation von intrazellulären Signalmolekülen wie DAG und IP3 verursacht eine intrazelluläre Ca2+-Freisetzung. Hierdurch erfolgt eine Aktivierung der PKC, welche in einer Öffnung der TRP-Kanäle TRPV1 oder TRPA1 resultiert (EXTON 1996; BHAVE et al. 2003). Aus dieser Tatsache wurde geschlossen, dass dieses Effektormolekül über den PLC- Signalweg eine Rolle beim über den H1R induzierten Juckreiz spielt (KREMER et al. 2014). In einer humanen Epithelzelllinie (HeLa-Zellen) konnte u. a. gezeigt werden, dass es durch die Aktivierung des H1Rs zu einer Erhöhung des intrazellulären Ca2+ kommt und so der PKC- Signalweg aktiviert wird (TILLY et al. 1990; LU et al. 2016). Die inhibierende Wirkung des PKC-Inhibitors BIM (2/5 µg/50 µl; i.d.) konnte in einer Studie von LIANG et al. (2010) an durch Endothelin-1 induzierten Juckreiz (ET-1; 100 pmol/50 µl; i.d.) gezeigt werden. In der vorliegenden Studie konnte in den in vivo getesteten Konzentrationen ein hemmender Effekt des PKC-Inhibitors BIM auf den über den H1R induzierten Juckreiz gezeigt und somit die These von KREMER et al. (2014) bestätigt werden. Im Gegensatz dazu wurden aber sowohl der histamin- als auch der ST-1006-induzierte Juckreiz durch Hemmung der PKC verstärkt. Dieses Ergebnis könnte ebenfalls ein Indiz auf eine Beteiligung weiterer pathophysiologischer Mechanismen sein. Für den TRPM8-Kanal beispielsweise ist beschrieben, dass es durch PKC-Aktivität zu einer Dephosphorylierung und somit zu einer Deaktivierung des Kanals kommt (PREMKUMAR et al. 2005). Unter der Annahme einer Beteiligung am Juckreizgeschehen, würde eine Aktivierung der PKC zu einer Hemmung und eine Inhibition zu einer Verstärkung des Juckreizes führen. Eine Beteiligung des TRPM8-Kanals am Juckreizgeschehen konnte bislang nicht nachgewiesen werden. Eine mögliche inhibitorische Funktion ist dennoch nicht ausgeschlossen (TOTH et al. 2015). Tatsächlich scheinen Mediatoren, wie Bradykinin und Histamin, die Aktivität des TRPM8-Kanals zu hemmen (ZHANG et al. 2012b; TOTH et al. 2015). Bislang scheint es dazu aber keine In-vivo- Untersuchungen zu geben. Einzige Hinweise auf eine oben beschriebenen Beteiligung am Juckreizgeschehen lieferten HAN et al. (2012), die eine juckreizlindernde Wirkung des TRPM8-Agonisten Icilin des bei der Erkrankung Lichen sclerosus et atrophicus sekundär auftretenden, vulvären Juckreizes beschrieben. In der vorliegenden Studie wurde weiterhin der Effekt eines PKA-Inhibitors auf

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histamininduzierten Juckreiz untersucht. Die Aktivierung von PKA führt z. B. zu einer Potenzierung/Aktivierung von TRPV1- und TRPA1-abhängigen Antworten auf verschiedene Stimuli (PREMKUMAR u. AHERN 2000; DE PETROCELLIS et al. 2001; BHAVE et al. 2003; SCHMIDT et al. 2009; KREMER et al. 2014). KIM et al. (2016) demonstrierten die Aktivierung des cAMP/PKA-Signalwegs durch den H1R in Neuronen des Nucleus suprachiamaticus (SCN) im Gehirn. Hier konnte gezeigt werden, dass der PKA-Inhibitor H89 (10 µmol/l) den durch den H1R-Agonisten 2-Pyridylethylamin (100 µmol/l) ausgelösten Ca2+-Influx hemmte. In der vorliegenden Arbeit konnte für die getestete Dosierung (10 mg/kg; i.p.) gezeigt werden, dass der über den H4R- im Gegensatz zum über den H1R induzierten Juckreiz durch den PKA-Inhibitor gehemmt und somit möglicherweise über dessen Signalweg vermittelt wird. In verschiedenen Zellen und Organen von Säugetieren führt eine H1R-Stimulation zur Aktivierung der AC, welche aus ATP den sekundären Botenstoff cAMP bildet (MARLEY et al. 1991; MARUKO et al. 2005; KIM et al. 2016). Mittels ELISA konnte z. B. eine Steigerung der cAMP-Produktion in SCN-Neuronen nach Stimulation mit einem H1R- Agonisten (100 µmol/l) gemessen werden (KIM et al. 2016). MARUKO et al. (2005) fanden zudem heraus, dass dieser Effekt über die Gβγ-Untereinheit des H1Rs initiiert wird. Die intrazellulären cAMP-mediierten Effekte werden zum größten Teil über PKA, aber auch durch PKC vermittelt (DA CUNHA et al. 2004; LIANG et al. 2010). Aus diesem Grunde erschien es sinnvoll, den Effekt der den Proteinkinasen vorgeschalteten AC auf histamininduzierten Juckreiz zu untersuchen. LIANG et al. (2010) demonstrierten bereits die Potenz des in dieser Studie ebenfalls verwendeten AC-Inhibitors SQ22536, den ET-1- induzierten Juckreiz in vivo dosisabhängig (3 – 300 nmol/50 µl; i.d.) zu hemmen. In der vorliegenden Studie konnte in der getesteten applizierten Menge (500 nmol/50 µl) kein Effekt auf den histamininduzierten Juckreiz erzielt werden. Trotz dieses Fundes ist eine Vermittlung des über den H4R induzierten Juckreizsignals über den AC/PKA-Signalweg nicht auszuschließen. Zumal eine Beteiligung der PKA in dieser Studie bereits gezeigt und der AC- Inhibitor nur in einer einzigen Dosierung getestet wurde. Weiterhin ist nicht auszuschließen, dass es über einen AC/PKC-Signalweg zu einer Verstärkung des über den H4R induzierten Juckreizes kam. Eine sich hieraus ergebene Hypothese könnte demnach lauten, dass es durch die gegenteiligen Effekte des PKA- und PKC-Signalwegs auf den über den H4R induzierten

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Juckreiz zu keinem Effekt auf die Signalweiterleitung durch einen AC-Inhibitor kommt. In diesem Fall wäre die in dieser Studie gewählte Methode nicht passend zur Eruierung der Beteiligung der AC am über den H4R induzierten Juckreiz. Weiterhin wäre es möglich, dass nur einer dieser beiden Signalwege über die AC vermittelt wird und die getestete Dosierung des AC-Inhibitors nicht ausreichte, um einen messbaren Effekt zu erzielen.

5.5. Einfluss der ZNS-Gängigkeit von H4R-Antagonisten auf über den H4R induzierten Juckreiz Obwohl viele der immunologischen Funktionen des H4Rs erwiesen sind, ist über die Expression und Funktion des H4R im ZNS wenig bekannt. Seit der Entdeckung des H4Rs wird dessen funktionelle Präsenz im peripheren und zentralen Nervensystem kontrovers diskutiert (SCHNEIDER u. SEIFERT 2016). Die mRNA des H4Rs konnte in humanen DRGs, dem Rückenmark und einigen Hirnregionen (Hippocampus, Cortex, Cerebellum, Amygdala, Thalamus, Striatum und Hirnstamm) nachgewiesen werden (STRAKHOVA et al. 2009). Weiterhin wurde eine erhöhte H4R-Expression im Putamen und dem Nucleus caudatus bei Parkinson-Patienten ermittelt (SHAN et al. 2012). SANNA et al. (2017) zeigten, dass der H4R verschiedene neurophysiologische Funktionen wie Lokomotion, Angst, Nozizeption und Fressverhalten beeinflusst (SANNA et al. 2017). Diese an H4R-/--Mäusen durchgeführten Untersuchungen bestätigten die Wichtigkeit der Integrität und Funktionalität des neuronalen H4R in der histaminergen Regulation neuronaler Funktionen. Weiterhin konnte mittels intrazerebroventrikulärer H4R-Agonistengabe ein schmerzzreduzierender Effekt, z. B. bei neuropathischen Schmerzen, erzielt werden (SANNA et al. 2015). In Anlehnung an diese Funde sollte in einem Teilversuch der vorliegenden Studie geprüft werden, ob für über den H4R induzierten Juckreiz eine solche zentrale Komponente ebenfalls eine Rolle spielt. Um dies aufzuklären, wurden ein ZNS- und ein nicht-ZNS-gängiger H4R- Antagonist vergleichend an 4-MH-induziertem Juckreiz untersucht. FUNKE et al. (2015) konnten mittels PET-Untersuchungen an Ratten zeigen, dass JNJ7777120 ins Gehirn aufgenommen wird, JNJ39594906 hingegen nicht. In den vorliegenden Untersuchungen konnte alleinig JNJ7777120 den durch 4-MH-induzierten Juckreiz hemmen. Der über den H4R induzierte Juckreiz scheint demnach einer zentralen Steuerung zu unterliegen. Erste

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Untersuchungen mit dem P-Glykoprotein (PGP)-Inhibitor Tariquidar (nicht abgebildet) zeigen, dass JNJ39594906 kein Substrat dieses Multidrug-Rezeptors ist.

5.6. Schlussfolgerung und Ausblick Das Modelltier Maus scheint, unter der Voraussetzung man wählt einen für die zu untersuchenden Substanzen sensitiven Stamm, als Modell für die Juckreizforschung gut geeignet zu sein. Die Reproduzierbarkeit des durch verschiedene Stimuli ausgelösten Juckreizes konnte in den an CD-1-Mäusen durchgeführten Versuchen gezeigt werden. Im Kontext mit der vorhandenen Literatur zeigen die Daten, wie wichtig es ist, den für die Fragestellung richtigen Stamm einer Spezies auszuwählen, um widersprüchliche oder fehlleitende Ergebnisse zu vermeiden. Es konnte in Anlehnung an INAGAKI et al. (2001) gezeigt werden, dass von den getesteten Mausstämmen nur CD-1 und C57BL/6 gegenüber dem über den H4R induzierten Juckreiz sensitiv waren. Erste weiterführende Untersuchungen zeigten Unterschiede in der Sensitivität der auf 4-MH und Histamin reagierenden Zellen für TRPV1- und TRPA1-Agonisten in vitro. Dies könnten erste Hinweise auf eine mögliche Co- Expression dieser Kanäle mit den Histaminrezeptoren auf DRG-Neuronen darstellen. Eventuelle Unterschiede in den Rezeptor-Expressionsmustern bei einzelnen Mausstämmen könnten eine Klärung für die unterschiedlichen Sensitivitäten auf Histamin oder H4R- Agonisten darstellen. Dies könnte in Folgeversuchen mittels quantitativer Echtzeit-PCR (real- time quantitative PCR, qPCR) und mittels immunhistochemischer Färbung untersucht werden. In der vorliegenden Studie konnten weiterhin einige grundlegende, neue Erkenntnisse zur Übertragung des über den H4R induzierten Juckreizsignals in vivo und in vitro herausgearbeitet werden. Eine Beteiligung des TRPV1-Kanals am über den H1R und H4R induzierten Juckreiz wurde bestätigt. Daneben konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass der TRPA1-Kanal an histamin- und an über den H4R induziertem Juckreiz beteiligt ist. Hierbei konnten in vivo durch pharmakologische Inhibition gewonnene Daten sowohl an Knockout-Mäusen als auch in vitro an DRG-Neuronen bestätigt werden. Durch gezieltes Gewinnen der H4R-sensitiven Neurone nach erfolgter Ca2+-Influx-Messung könnte in der Zukunft mittels Einzelzell-qPCR (single cell qPCR) ermittelt werden, welche der TRP-Kanäle gleichzeitig mit dem H4R auf den Neuronen exprimiert werden. Diese Untersuchung in

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Verbindung mit den durch die Ca2+-Influx-Messungen gewonnenen Daten erlauben im Weiteren Rückschlüsse auf eine funktionelle Co-Expression mit dem H4R. Ob und inwiefern sich die beiden an der Signalweiterleitung vieler pruritogener Stubstanzen beteiligten Kanäle (TRPV1/TRPA1) zur Therapie von chronisch-pruritischen Erkrankungen eignen, muss in entsprechenden Modellen, z. B. der AD (Ovalbumin-, Nc/Nga-Modell) oder der Psoriasis (Imiquimod-Modell), untersucht werden. Eine sehr aktuelle Studie zeigt, dass die JAK- Inhibitoren Oclacitinib und Tofacitinib neben einer Wirkung auf an Entzündung und Juckreiz beteiligten Zytokinen (z. B. IL-2, IL-4, IL-6, IL-13, IL-31) auch eine direkte Wirkung auf den TRPV1-Kanal haben. In Einklang mit dieser Erkenntnis konnte in der zitierten Studie ebenfalls gezeigt werden, dass die JAK-Inhibitoren histamininduzierten Juckreiz reduzieren können (FUKUYAMA et al. 2017). Diese Daten erscheinen sehr vielversprechend in Hinblick auf eine effiziente Therapie von pruritischen Erkrankungen, da diese Substanzklasse mit ihrer breiten Wirkweise verschiedene Teile der Signalwege diverser Pruritogene abdeckt.

Des Weiteren konnte selbst in einem Versuch mit TRPV1-/-/TRPA1-/--Mäusen kein komplettes Ausbleiben der über den H4R induzierten Juckreizantwort erreicht werden. Neueste Erkenntnisse zeigen, dass weitere nicht-neuronale Zellen, wie Keratinozyten, eine wichtige Rolle in der initialen Weiterleitung des histamininduzierten Juckreizes über den TRPV4-Kanal spielen (CHEN et al. 2016). Diese sollten ebenfalls in Folgeversuchen Beachtung finden. Ebenfalls konnte in der vorliegenden Studie herausgearbeitet werden, dass die Effektormoleküle PLA2 und PKA einen stimulierenden Effekt auf den über den H4R induzierten Juckreiz besitzen, wohingegen das Molekül PKC einen inhibierenden Effekt zu haben scheint. Weitere Untersuchungen sind hier notwendig, um die genauen Mechanismen und die verantwortlichen Isotypen zu identifizieren. Eine Methode hierfür könnten z. B. spezifische Phospholipase und Proteinkinase-Knockout-Mäuse darstellen (HAN et al. 2006; KIRSCHNER et al. 2009). Weiterhin wäre es möglich, Ca2+-Influx-Messungen mit den bereits in dieser Studie verwendeten Inhibitoren nach H4R-Stimulation an DRG-Neuronen durchzuführen. Aufgrund der mangelnden Spezifizität einiger dieser Substanzen reicht diese Methode allein nicht als Beweis. Eine weitere interessante Herangehensweise wären Versuche mittels Western-Blot vergleichend an H4R-/-- und dazugehörigen Wildtyp-Mäusen. Hier

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Diskussion

könnte nach Stimulation von DRG-Neuronen mit H4R-Agonisten die Aktivität der Effektormoleküle indirekt mit Hilfe spezifischer, enzymgekoppelter Antikörper über Chemilumineszenz bestimmt werden. Dabei lassen sich aktivierte und nicht-aktivierte Formen der Effektoren und ihrer Isotypen differenzieren und Unterschiede zwischen Knockout- und Wildtyp-Mäusen ermitteln. Weiterhin ist es möglich, über cAMP-Bestimmung die Beteiligung dieser sekundären Botenstoffe an der Signalweiterleitung auf den DRG-Neuronen zu überprüfen (KIM et al. 2016). Eine Vorbehandlung mit den in vivo verwendeten Substanzen mit anschließender Stimulation mittels H4R-Agonisten kann weitere Aufschlüsse über die genauen intrazellulären Wirkmechanismen, die zwischen H4R und cAMP vermitteln, geben. Zum ersten Mal konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass auch der H2R möglicherweise am Juckreizgeschehen beteiligt ist. Dies muss an weiteren histaminsensitiven Mausstämmen und mit dem Einsatz weiterer H2R-Agonisten validiert werden. Gegebenenfalls müssen die gewonnenen Daten mit den eingesetzten H1R/H2R- und H2R/H4R-Agonisten darauffolgend neu evaluiert werden. Zusätzlich zu diesen Erkenntnissen konnte gezeigt werden, dass der über den H4R induzierte Juckreiz einer zentralen Steuerung obliegt. Weitere Untersuchungen zur Absicherung der hier generierten Daten mit anderen ZNS- und nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten sind notwendig. Auch bleibt zu prüfen, über welche Multidrug-Transporter die Penetration der Blut-Hirn-Schranke des nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten JNJ39495906 verhindert wird. Mit dieser Erkenntnis wären mit entsprechenden Inhibitoren Untersuchungen möglich, bei denen jene nicht-ZNS-gängigen H4R-Antgonisten im ZNS verbleiben und eine antipruritische Wirkung erzielen. Weiterhin könnten Untersuchungen mittels intrathekaler Injektionen zur Umgehung der Blut-Hirn-Schranke durchgeführt werden, um weitere Erkenntnisse zu einer etwaigen Erhöhung der inhibitorischen Aktivität der Antagonisten, im Vergleich zur oralen oder intraperitonealen Gabe, zu gewinnen.

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Zusammenfassung

6. Zusammenfassung Jenny Wilzopolski

Untersuchungen zur Transmission des über den Histamin-4-Rezeptor induzierten Juckreizsignals.

Histamin ist seit langem als Juckreizmediator bekannt. Es entfaltet seine Wirkung über vier G-proteingekoppelte Rezeptoren, die Histamin-1 – 4-Rezeptoren (H1 – 4R). Der H1R und H4R scheinen Schlüsselrollen bei der Weiterleitung des histamininduzierten Juckreizes zu spielen. Aktuelle Publikationen deuten auf eine Beteiligung des transient receptor potential vanilloid receptor 1 (TRPV1)-Kanals am histamininduzierten Juckreiz hin. Neben dem TRPV1-Kanal spielt auch der transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1)-Kanal eine Schlüsselrolle in der Weiterleitung von akuten, pruritogenen Stimuli. Die Rolle dieses Kanals und weiterer mit der Aktivierung der TRP-Kanäle assoziierter Effektormoleküle bei histamininduziertem Juckreiz ist bisher unklar.

Ziel dieser Arbeit war es, Teile des intrazellulären Signalweges des H4R zu ermitteln. Hierfür wurde zunächst die Sensitivität der vier Mausstämme BALB/c, C57BL/6, NMRI und CD-1 gegenüber einer intradermalen Gabe des H4R-Agonisten 4-Methylhistamin (4-MH) untersucht. Es zeigten sich, wie bereits für Histamin beschrieben, C57BL/6- und CD-1-Mäuse am sensitivsten. Letztere wurden für die weiteren Untersuchungen genutzt. In Juckreizverhaltensstudien an diesen Mäusen konnte die Beteiligung des TRPV1-Kanals am über den H1R und H4R induzierten Juckreiz mittels TRPV1-Inhibitoren bestätigt und mit TRPV1-/--Mäusen untermauert werden. Zudem konnte hier zum ersten Mal gezeigt werden, dass auch der TRPA1-Kanal an der Übertragung des über H4R induzierten Juckreizsignals beteiligt ist. Sowohl der histamin- als auch der über den H4R induzierte Juckreiz waren durch TRPA1-Inhibitoren und im TRPA1-/--Mausmodell im Vergleich zum Wildtyp reduziert. Für eine Bestätigung in vitro wurden DRG-Neurone aus CD-1-Mäusen isoliert und mittels Ca2+- Influxmessungen untersucht. Hier konnte ebenfalls der durch Histamin und der über den H4R induzierte intrazelluläre Ca2+-Anstieg durch TRPA1- und TRPV1-Inhibitoren reduziert werden. Eine Applikation des als TRPV1/TRPA1-Kanal-Inhibitor verwendeten Ruthenium Red und auch Verhaltensuntersuchungen an TRPV1-/-/TRPA1-/--Mäusen brachten überraschenderweise keine vollständige Reduktion der über den H4R induzierten Reaktion.

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Zusammenfassung

Dies deutet auf eine Beteiligung weiterer Strukturen/Ionenkanäle am intrazellulären Signalweg des H4Rs in DRG-Neuronen hin. Um weitere, dem H4R nachgeschaltete Effektormoleküle zu ermitteln, wurde der Einfluss von Proteinkinase A/C (PKA/PKC)-, Phospholipase A2/C (PLA2/PLC)- und Adenylylzyklase (AC)-Inhibitoren auf den histamininduzierten Juckreiz untersucht. Für den über den H1R induzierten Juckreiz konnten eine Beteiligung der PLA2, PLC und PKC bestätigt werden. Für den über den H4R induzierten Juckreiz konnte eine Beteiligung der PLA2 und PKA gezeigt werden. Die Rolle der PKC scheint beim intrazellulären Signalweg des H4R eine inhibitorische Rolle zu spielen. Durch ihre Inhibition wurde der über den H4R induzierte Juckreiz dosisabhängig verstärkt. Eine Beteiligung der PLC konnte nicht bestätigt werden. Der verwendete AC-Inhibitor zeigte in der verwendeten Dosierung keinen Effekt auf histamininduzierten Juckreiz. Im weiteren Verlauf wurde die Fähigkeit des H2R-Agonisten Amthamin Juckreiz auszulösen evaluiert. Überraschenderweise konnte die verwendete Substanz in CD-1-Mäusen dosisabhängig Juckreiz auslösen. Der H4R ist im ZNS exprimiert und übernimmt dort verschiedene, neurophysiologische Funktionen wie Lokomotion, Angst und Nozizeption. Inwiefern der H4R den Juckreiz zentral reguliert, wurde mittels eines ZNS- und eines nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten überprüft. Interessanterweise konnte nur der ZNS-gängige Antagonist den über den H4R induzierten Juckreiz hemmen, was auf eine zentrale Steuerung schließen lässt. Schließlich wurde mittels Ca2+-Influx-Messungen untersucht, ob es Unterschiede in der Sensitivität der DRG-Neurone der Mausstämme BALB/c, C57BL/6 und CD-1 auf Histamin-, H4R-, TRPA1- und TRPV1-Agonisten gibt. Insgesamt waren bei den auf über den H4R induzierten juckreizsensitiven Stämmen (CD-1, C57BL/6) die Mehrheit der H4R-sensitiven Neurone AITC- und Capsaicin-positiv. Bei den insensitiven BALB/c-Mäusen war die Mehrheit der 4-MH-sensitiven Neurone dagegen nur Capsaicin-positiv. Diese Daten sprechen ebenfalls für eine Beteiligung des TRPV1- und TRPA1-Kanals an der Weiterleitung des intrazellulären Signals des H4R und geben Hinweise darauf, dass unterschiedliche Ionenkanal-/Rezeptor-Expressionsmuster für die Sensitivität der verschiedenen Mausstämme auf Juckreizstimuli wichtig sein könnten. Aus den vorliegenden Ergebnissen ist zu schließen, dass TRPV1, TRPA1, PLA2, PKA und PKC an der Übertragung des über den H4R induzierten Juckreizsignals beteiligt sind. Zudem

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Zusammenfassung

offenbaren sie erste Erkenntnisse in Hinblick auf eine mögliche zentrale Regulation des über den H4R induzierten Juckreizes. Weiterhin legt die vorliegende Studie die Beteiligung des H2R an der Juckreizentstehung und stammspezifische Unterschiede in der Sensibilität gegenüber verschiedener Stimuli auf zellulärer Ebene dar.

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Summary

7. Summary Jenny Wilzopolski

Investigations on the transmission of the histamin-4-receptor-induced itch signal.

Histamine has long been recognized as a classical inducer of pruritus. It acts via four G protein-coupled receptor subtypes, the histamine 1 – 4 receptors (H1-4R). The H1R and the H4R seem to play key roles in the mediation of histamine-induced itch. Recent publications indicate the involvement of the transient receptor potential vanilloid channel 1 (TRPV1) in histamine-induced itch. Beside TRPV1 also the transient receptor potential ankyrin 1 channel (TRPA1) plays a key role in acute itch stimuli transduction. This channel is involved in non- histaminergic itch pathways, but its role and that of other effector molecules in histamine- induced itch is unclear.

Aim of this study was to elucidate parts of the intracellular signalling pathway of the H4R. First the sensitivity of four different mouse strains, namely BALB/c, C57BL/6, NMRI and CD-1, to intradermal H4R-agonist application was examined. As shown for histamine C57BL/6 and CD-1 mice were most sensitive. The latter were used for the present studies. Itch-scratch experiments indicated the involvement of the TRPV1 channel in H1R- and H4R- induced itch as demonstrated by means of TRPV1 inhibitors and TRPV1-/- mice. Additionally the involvement of the TRPA1 channel in the transmission of H4R-induced itch could be shown for the first time. Both histamine- and H4R-induced itch were reduced by a TRPA1 inhibitor and in TRPA1-/- mice. These results were corroborated by in vitro studies in DRG neurons isolated from CD-1 mice. Both histamine- and H4R-induced intracellular Ca2+ increase were blocked by TRPV1 and TRPA1 inhibitors. However, neither the application of the dual TRPV1/TRPA1 inhibitor ruthenium red nor the knock out of the TRPV1 and TRPA1 genes could completely diminish H4R-induced reactions. This might be a hint for the involvement of further ion channels or stimulation pathways. The effect of protein kinase A/C (PKA/PKC), phospholipase A2/C (PLA2/PLC) and adenylyl cyclase (AC) inhibitors on H4R- induced itch have been examined to determine further downstream mechanisms of the H4R. For the H1R-induced itch the involvement of PLA2, PLC and PKC could be confirmed. For the H4R-induced itch an involvement of PLA2 und PKA could be shown. Activation of PKC seems rather to have an inhibitory effect on the transmission of the H4R-induced signal: By

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Summary

inhibition of PKC the H4R-induced itch was increased. PLC involvement couldn't be confirmed. Additionally the AC-inhibitor showed no effect in the dose tested. Additionally the ability of the H2R-agonist amthamine to induce pruritus has been elucidated. Surprisingly it induced dose dependent itch in CD-1 mice. The H4R is expressed in the CNS and is involved in neurophysiologic functions as locomotion, anxiety and nociception. Whether the H4R-induced pruritus has such a central component was investigated by using antagonists which either do or do not penetrate the blood brain barrier. Interestingly only the substance that could cross the blood brain barrier was able to inhibit H4R-induced itch. Thus H4R-induced itch seems to be centrally regulated. Finally, differences in the sensitivity of DRG-neurons isolated from BALB/c, C57BL/6 and CD-1 mice to histamine, H4R-, TRPV1- and TRPA1-agonists has been examined. In total most of the H4R sensitive neurons from CD-1 and C57BL/6 mice were both TRPV1 and TRPA1 positive. Most of these neurons from BALB/c mice have been only TRPV1 positive. These data emphasize the mutual role of TRPV1 and TRPA1 in H4R-induced itch in CD-1 and C57BL/6 mice. They also indicate that different channel/receptor expression patterns might play an important role in the strain specific pruritogen sensitivity.

In summary this study reveals the involvement of TRPV1, TPRA1, PLA2, PKA and to a certain extent of PKC in the transmission of the H4R-induced itch signal. It also suggests a central regulation of H4R-induced pruritus. Furthermore it shows the involvement of the H2R in the onset of pruritus and strain differences in stimulus sensitivity on a cellular level.

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150

Anhang

9. Anhang

9.1. Tabellen In-vivo-Versuche

Tabelle 23: Anzahl der Kratzattacken nach intradermaler 4-Methylhistamin-Injektion vergleichend bei BALB/c-, C57BL/6-, NMRI- und CD-1- Mäusen in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Vehikel 4-MH 4-MH 4-MH 4-MH 4-MH 4-MH 5 nmol/ 50 µl 50 nmol/50 µl 100 nmol/50 µl 250 nmol/50 µl 500 nmol/50 µl 1 µmol/ 50 µl 4 25 57 5 32 63 116

26 11 22 5 20 52 36

30 5 19 17 26 68 46

18 3 6 11 5 70 26 BALB/c 29 17 5 28 21 18 54

17 29 22 19 10 18 56

11 23 23 104

4 15 18 113

4 12 12 93

11 6 24 69 C57BL/6 8 6 19 65

12 21 47 74 20 29 37 4 10 17 8 25 0 4 6 1

37 0 35 32 10 6

4 4 20 17 27 33 NMRI 10 6 16 10 30 5

17 1 64 33 26 19

23 57 78 1 39 110

29 54 62 64 66 160

1 26 24 36 21 43 35 -

CD 20 24 43 14 2 51 64 18 51 27 102

36 28 28 23 41

151

Anhang

Tabelle 24: Dosis-Wirkungsbeziehung verschiedener Histaminrezeptor-Agonisten bei CD-1-Mäusen: Anzahl der Kratzattacken in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Applikationsmenge (nmol/50 µl) Vehikel 5 10 25 50 75 100 250 500 1000 27 17 52 37 77 133 89

34 0 6 118 137 35 154

71 37 9 83 70 239 119

43 22 59 101 49 59 65 Histamin 20 106 32 133 124 233 358 24 31 37 85 205 117 285

47 25 61 68 3 41 77 44 55 91

20 24 23 78 36 37 85 16 60 71 9 6 24 32 11 141 91 21 56 113

3 20 20 15 77 25 32 60 44 265

18 31 22 15 83 9 13 35 100 109 Pyridylethylamin

- 75 111 49 35 21 62 47 169 2 60 48

12 116 148 145 36 32 189 159 113 217

16 74 123 168 161

54 97 79 104 136 HTMT 10 61 98 87 206 23 104 188 331 253

51 97 114 81 72 57

16 218 34 44 65 85

40 110 79 66 60 134

thamin 66 121 91 90 93 93

Am 24 149 135 49 89 102 34 59 139 60 168 128

41 14 34 131 140 71 36

61 27 119 94 243 61 155

53 20 131 54 94 12 18

54 172 16 9 64 11 23

59 76 60 4 112 88 141

Methylhistamin - 4 71 67 16 139 244 119 158 21 29 120 83 106 21 98

60 22 164 134 67 104 70

16 63 27 83 114 75 197

1006

- 18 27 26 94 45 82 141 ST 39 77 71 14 71 11 41 13 20 77 8 56 96 71

152

Anhang

Tabelle 25: Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Histamin (25 nmol/50 µl) Histamin (25 nmol/50 µl)

Vehikel HC-030031 HC-030031 Vehikel HC-030031 20 mg/kg 40 mg/kg 60 mg/kg

52 31 86 150 4 35 92 8 1 18 87 44 130 36 5

47 9 50 69 6 94 32 51 292 43 66 25 86 11

115 12

Tabelle 26: Einfluss des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Histamin (25 nmol/50 µl) Histamin (25 nmol/50 µl) Vehikel Capsazepin Vehikel Capsazepin 4 mg/kg 6 mg/kg 115 42 93 78 75 51 150 93 100 18

36 28 94 71 69 22 113 37 292 57 53 23 86 88 70 68 12 92 20 127 63 41

153

Anhang

Tabelle 27: Einfluss des TRPA1-Inhibitors HC-030031 und des TRPV1-Inhibitors Capsazepin auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Histamin (25 nmol/50 µl) HTMT (100 nmol/50 µl) Vehikel HC-030031 Capsazepin Vehikel HC-030031 Capsazepin 60 mg/kg 6 mg/kg 60 mg/kg 6 mg/kg 75 23 51 85 169 11 100 23 18 128 113 18 94 20 71 203 153 100 113 8 37 218 106 66 53 10 23 192 103 39 70 27 68 105 41 46 92 28 20 62 133 84 127 84 63 102 216 48 41 136 124 16

2-Pyridylethylamin (1 µmol/50 µl) Pitolisant (50 nmol/50 µl) Vehikel HC-030031 Capsazepin Vehikel HC-030031 Capsazepin 60 mg/kg 6 mg/kg 60 mg/kg 6 mg/kg 131 88 23 36 54 67 38 80 53 117 16 59 285 64 72 94 62 124 149 70 22 30 38 149 132 42 147 79 38 61 177 45 109 70 64 107 45 139 56 122 67 117 132 114

4-Methylhistamin (50 nmol/50 µl) ST-1006 (50 nmol/50 µl) Vehikel HC-030031 Capsazepin Vehikel HC-030031 Capsazepin 60 mg/kg 6 mg/kg 60 mg/kg 6 mg/kg 160 44 35 135 36 10 244 97 71 54 8 102 204 62 31 172 54 89 87 21 38 137 37 31 145 39 77 17 41 106 81 3 90 29 19 59 83 17 19 88 0 121 50 13 71 86 36 139 159 19 34 67 3

154

Anhang

Tabelle 28: Einfluss des TRPV1-Inhibitors SB366791 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Histamin HTMT ST-1006 (25 nmol/50 µl) (100 nmol/50 µl) (50 nmol/50 µl) Vehikel SB366791 Vehikel SB366791 Vehikel SB366791 0,5 mg/kg 0,5 mg/kg 0,5 mg/kg 18 22 102 53 32 47 88 111 75 47 136 14 50 23 77 29 77 73 132 46 99 40 22 30 67 23 50 98 116 18 94 73 73 97 136 8 62 55 101 69 56 14 28 33 120 79 15 29 62 28 28 31

Tabelle 29: Einfluss des Phospholipase A2-Inhibitors Quinacrin auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Histamin HTMT (25 nmol/50 µl) (100 nmol/50 µl) Vehikel Quinacrin Vehikel Quinacrin 20 mg/kg 20 mg/kg 83 40 102 23 113 59 241 90 80 51 122 93 67 44 113 55 16 43 160 62 106 55 74 70 144 65 70 104 48 249 160

4-Methylhistamin ST-1006 (50 nmol/50 µl) (50 nmol/50 µl) Vehikel Quinacrin Vehikel Quinacrin 20 mg/kg 20 mg/kg 88 52 32 29 140 48 65 55 29 14 70 126 111 28 206 136 137 27 124 61 180 20 64 15 67 60 75 39 93 15 82 46

155

Anhang

Tabelle 30: Einfluss des Phospholipase C-Inhibitors U73122 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Histamin HTMT (25 nmol/50 µl) (100 nmol/50 µl) Vehikel U73122 Vehikel U73122 50 pmol/50 µl 50 pmol/50 µl 259 138 141 68 55 110 171 48 118 90 164 140 168 97 246 231 98 131 160 105 116 42 350 113 145 72 177 148 109 99 153 86 194 120 139 91

4-Methylhistamin ST-1006 (50 nmol/50 µl) (50 nmol/50 µl) Vehikel U73122 Vehikel U73122 50 pmol/50 µl 50 pmol/50 µl 129 251 59 127 89 63 74 104 194 79 60 161 130 172 68 127 130 140 37 31 263 37 52 96 261 142 109 73 183 115 38 27 85 192 50 21

156

Anhang

Tabelle 31: Einfluss des Proteinkinase A-Inhibitors H89 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Histamin HTMT (25 nmol/50 µl) (100 nmol/50 µl) Vehikel H89 Vehikel H89 10 mg/kg 10 mg/kg 199 64 40 119 188 119 150 79 100 84 107 73 55 90 46 48 211 91 64 60 253 135 282 47 91 142 132 105 244 49 115 132 62 169 45 163

4-Methylhistamin ST-1006 (50 nmol/50 µl) (50 nmol/50 µl) Vehikel H89 Vehikel H89 10 mg/kg 10 mg/kg 201 99 30 74 139 106 69 76 129 22 29 30 91 18 82 17 119 37 139 43 127 39 48 41 154 15 21 50 120 49 162 20 96 37 44

157

Anhang

Tabelle 32: Einfluss des Proteinkinase C-Inhibitors Bisindolylmaleimid I auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Histamin (25 nmol/50 µl) HTMT (100 nmol/50 µl) Vehikel BIM BIM BIM Vehikel BIM BIM 2 µg/ 5 µg/ 10 µg/ 2 µg/50 µl 5 µg/50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 49 151 74 104 96 13 38 46 116 24 129 109 36 30 45 133 141 79 68 193 59 58 138 148 133 129 91 17 90 199 192 197 16 32 51 59 130 156 35 81 59 72 138 148 185 165 68 77 91 177 31 153 26 50 44 129 117 54 72 108 76 28 209 70 35 43 66

4-Methylhistamin (50 nmol/50 µl) ST-1006 (50 nmol/50 µl) Vehikel BIM BIM Vehikel BIM BIM 2 µg/50 µl 5 µg/50 µl 2 µg/50 µl 5 µg/50 µl

162 126 115 38 79 196 126 241 117 116 170 195 180 60 278 100 299 497 75 81 100 45 107 290 199 75 78 53 164 250 117 38 115 146 132 273 104 286 110 40 305 257 124 86 163 74 129 204 112 108 105 199 79

158

Anhang

Tabelle 33: Einfluss des Adenylylzyklase-Inhibitors SQ22536 auf die Anzahl der Kratzattacken bei histamininduziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Histamin HTMT (25 nmol/50 µl) (100 nmol/50 µl) Vehikel SQ22539 Vehikel SQ22539 50 nmol/50 µl 50 nmol/50 µl 39 42 141 222 75 38 171 171 20 25 164 245 13 48 246 174 34 17 160 74 43 29 350 84 130 113 177 73 59 30 153 115 63 61 139 83

4-Methylhistamin ST-1006 (50 nmol/50 µl) (50 nmol/50 µl) Vehikel SQ22539 Vehikel SQ22539 50 nmol/50 µl 50 nmol/50 µl 129 245 59 152 89 90 74 112 194 286 60 47 130 122 68 61 1030 93 37 50 263 293 52 77 261 45 109 134 183 33 38 79 85 233 50 82

159

Anhang

Tabelle 34: Histamininduzierter Juckreiz bei TRPV1-/--und TRPA1-/--Mäusen: Anzahl der Kratzattacken in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

NaCl Histamin (800 nmol/50 µl) Wiltyp TRPV1-/- TRPA1-/- Wiltyp TRPV1-/- TRPA1-/- 131 88 23 36 54 67 38 80 53 117 16 59 285 64 72 94 62 124 149 70 22 30 38 149 132 42 147 79 38 61 177 45 109 70 64 107 45 139 56 122 67 117 132 114

4-Methylhistamin (500 nmol/50 µl) ST-1006 (100 nmol/50 µl) Wiltyp TRPV1-/- TRPA1-/- TRPV1-/-/ Wiltyp TRPV1-/- TRPA1-/- TRPV1-/-/ TRPA1-/- TRPA1-/- 160 44 35 135 36 10 244 97 71 54 8 102 204 62 31 172 54 89 87 21 38 137 37 31 145 39 77 17 41 106 81 3 90 29 19 59 83 17 19 88 0 121 50 13 71 86 36 139 159 19 34 67 3

Tabelle 35: Einfluss ZNS- und nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten auf die Anzahl der Kratzattacken bei über den H4R induziertem Juckreiz in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

4-Methylhistamin 4-Methylhistamin (50 nmol/50 µl) (50 nmol/50 µl) Vehikel JNJ777120 Vehikel JNJ39594906 20 mg/kg 20 mg/kg 36 12 83 79 42 39 66 119 56 20 224 2 49 46 47 59 142 10 124 58 59 14 38 69 16 63 85 58 49

160

Anhang

Tabelle 36: Vergleichbarkeit des Kratzverhaltens zwischen den einzelnen Versuchstagen: Anzahl der Kratzattacken in einem Beobachtungszeitraum von 30 Min.

Versuchstag 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 37 79 115 75 83 259 199 49 39 118 52 93 100 113 55 188 46 75 83 35 150 94 80 118 100 45 20 101 87 36 113 67 168 55 58 13

133 47 69 53 16 98 211 90 34

85 94 292 70 106 116 253 51 43

86 92 145 91 59 130

Histamin 127 109 244 68 59 (25 nmol/50 µl)) (25 nmol/50 194 62 26 63 72 28 35 148 85 102 141 40 96 141 159 128 241 171 150 109 171

123 203 122 164 107 68 164

79 218 113 246 46 129 246

98 192 160 160 64 197 160

188 105 55 350 282 156 350 HTMT

62 70 177 132 148 177 (100 nmol/50 µl) (100 nmol/50 102 65 153 115 177 153 136 104 139 45 126 139 249

161

Anhang

Versuchstag 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 78 83 36 140 160 88 129 201 162 129 62 66 42 243 244 140 89 139 126 89

36 224 56 94 204 29 194 129 180 194

43 47 49 64 87 111 130 91 75 130

18 124 142 112 145 137 130 119 199 130

28 38 59 244 81 180 263 127 117 263

Methylhistamin Methylhistamin

(50 nmol/50 µl) (50 nmol/50 -

4 16 83 261 154 104 261 85 50 183 120 124 183 159 85 96 85

106 135 32 59 69 38 59 67 54 65 74 29 116 74 114 172 70 60 82 100 60

45 137 206 68 139 45 68

71 17 124 37 48 53 37

006

- 56 29 64 52 21 146 52 ST

88 67 109 162 40 109 (50 nmol/50 µl) (50 nmol/50 86 75 38 74 38 67 93 50 105 50 82

162

Anhang

9.2. Danksagung Meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann gilt ganz besonderer Dank für die Überlassung des interessanten und vielschichtigen Themas und die engagierte Betreuung. Weiterhin möchte ich mich an dieser Stelle für die großzügige Förderung bedanken, die mir so vieles ermöglicht und mir eine Vielzahl an wertvollen Erfahrungen gebracht hat.

Herrn Prof. Dr. Wolfgang Bäumer möchte ich ebenfalls einen besonderen Dank aussprechen für die großartige Chance, die er mir mit einem Aufenthalt in seiner Arbeitsgruppe an der North Carolina State University ermöglicht hat. Ein herzliches Dankeschön für die tolle Aufnahme, das mir entgegengebrachte Vertrauen und die Förderung meiner Person.

Weiterhin gilt ein sehr großes Danke an Frau Dr. Kristine Roßbach für eine tolle Betreuung, das stets offene Ohr und die unermüdliche Korrekturarbeit.

Danke an unsere lieben Biologielaborantinnen Caro, Viki, Sonja und Alina für ihre Hilfe im Labor. Vor allem gilt mein Dank Alina, ohne die ich an der Videoauswertung der Juckreizversuche verzweifelt wäre. Danke auch für die vielen tollen Gespräche und die stets aufbauenden Worte auch außerhalb der Arbeit.

Danke auch an alle weiteren Kolleginnen in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Kietzmann für ein stets angenehmes Arbeitsklima. Danke an Jessi für die lieben Ratschläge und Tipps. Und obwohl unsere gemeinsame Zeit am Institut nicht sonderlich lang war möchte ich auch Gesine ganz herzlich für die vielen tollen Gespräche, ihre Unterstützung und Hilfe danken.

Meinen Mitdoktoranden Paula, Kathi, Lucie, Carmen, Elli, Gustav und den beiden Davids danke ich für eine tolle gemeinsame Zeit am Institut. Danke an meine Bürokollegen David und David, dass ihr es in der Endphase so tapfer mit mir und meinen Launen ausgehalten und mich immer aufgebaut habt.

Ein großer Dank geht an die Deutsche Forschungsgemeinschaft für die finanzielle Unterstützung dieses Projekts.

Dr. Santosh Mishra, Department of Molecular Biomedical Sciences, NCSU, Raleigh, USA, danke ich für die Bereitstellung der TRP-Knockout-Mäuse und die vielen konstruktiven Ideen.

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Danke an alle meine Korrekturleserlinge für eure Mühe alles so schnell durchzuarbeiten.

Ein großes Dankeschön gilt allen meinen Freunden, die mich immer unterstützt und an mich geglaubt haben. Danke für alles. Ganz besonderer Dank gilt dabei Wencke, die mich immer wieder vom Schreibtisch holte, wenn ich anfing zu verzweifeln und die immer zur rechten Zeit wusste was nötig war, um mich wieder auf Kurs zu bringen. Danke, dass es dich gibt.

Mein besonderer Dank geht an meine Familie für die Liebe und Unterstützung, die sie mir während des Studiums und der Promotion haben zu Teil werden lassen. Meine tiefste Dankbarkeit gilt meiner Mutter, die mir, egal wie schwer es war, immer alles ermöglicht und mir immer den Rücken gestärkt hat. Danke Mama!

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