ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD

ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaena

meridensis(B.L. Rob.) R.M. King&H. Rob., sinonimia: Eupatorium

meridenseRobinson.

(ASTERACEAE). UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS ESCUELA DE BIOANÁLISIS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES

ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD

ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE

Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob., sinonimia:

Eupatorium meridense Robinson.

(ASTERACEAE).

BACHILLERES: NOVOA P. YOMAIRA. GUÉDEZ C. MARY A. TUTORA: DIOLIMAR BUITRAGO.

MÉRIDA, JULIO DEL 2012. Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

AGRADECIMIENTOS.

En primer lugar el agradecimiento más grande a Dios por acompañarnos todos los días durante este largo trayecto de nuestras vidas, por haber consolado nuestros corazones cuando tuvimos que pasar situaciones difíciles, ahora gracias a él culminamos un escalón más en nuestras vidas para empezar uno nuevo.

A nuestros padres trabajadores incansables, gracias por el apoyo tan grande que desde niñas nos brindaron, hoy logramos cumplir con éxito uno de nuestros propósitos más grandes, por sus consejos tan valiosos que definitivamente nos han conducido por el camino correcto, por habernos animado constantemente a seguir adelante. A ustedes dedicamos estas palabras y todos los éxitos que podamos alcanzar. Los amamos.

A la profesora Diolimar Buitrago en calidad de Directora de tesis y a la profesora María Eugenia Lucena por compartirnos sus experiencias y conocimientos, y sobre todo por haber confiado en nosotras para llevar a cabo la realización de este proyecto. MIL GRACIAS. A todo el personal del Instituto de Investigaciones de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis por habernos dado la oportunidad y brindaros todos los medios para realizar nuestro proyecto de Grado.

A la Ilustre Universidad de los Andes, por abrirnos sus puertas y permitirnos formar parte de esta gran casa de estudio.

i Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

DEDICATORIA.

Nuestro Proyecto de Grado la dedicamos con todo nuestro amor a Dios por estar a nuestro lado siempre, por darnos valor y brindarnos la fortaleza que tanto necesitamos y por habernos regalado una familia tan maravillosa.

A nuestros padres que nos dieron la oportunidad de formarnos como profesionales, por el inmenso apoyo que nos dieron, por haber confiado en nosotras porque siempre me dieron aliento para seguir luchando.

ii Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

RESUMEN

En el presente trabajo se determinó los componentes químicos del aceite esencial de Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob. y se evaluó la actividad antibacteriana del aceite esencial extraído de las partes aéreas frescas contra cepas de referencia grampositivas: Staphylococcus aureus ATCC 25923 y

Enterococcus faecalis ATCC29212; y gramnegativas: Escherichia coli ATCC

25922, Pseudomona aeruginosa ATCC27853 y Klebsiella pneumoniae ATCC

23357. El aceite se obtuvo por el método de hidrodestilación empleando la trampa de Clevenger con un rendimiento de 0,063 %. Su composición química se determinó por Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas, identificándose 11 compuestos que corresponden en su mayoría a sesquiterpenos monociclicos que constituyen el 97,75% del total de compuestos, seguido de monoterpenos con un 0,28%, aldehído 0,54% y alqueno 0,87%. Los componentes mayoritarios resultaron ser los sesquiterpenos: α – zingibereno (65,26%), α – curcumeno (13,74%), α - humuleno (8,20), β – sesquifelandreno (4,06%) y β - cariofileno (2,93%). La actividad antibacteriana se realizó por el Método de

Difusión en Agar con Discos y se determinó la Concentración Inhibitoria Mínima

(CIM), el aceite esencial fue activo contra las cepas de Staphylococcus aureusATCC 25923, Streptococcus faecalisATCC 29212 y Klebsiella pneumoniaeATCC 23357, con halos que oscilan entre 6 a 11 mm de diámetro y una Concentración Inhibitoria Mínima de 10 μg/mL.

iii Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

ÍNDICE DE CONTENIDO Pág

I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………….………. 1

II. ANTECEDENTES……………………………………………………….…….. 5

A. Antecedentes del género……………………………………………….……. 5

A.1. Descripción del género Chromolaena……………………………….…….. 10

A.1.1. Descripción de la especie Chromolaena meridensis (B. L. Rob.) R.M. King & H. Rob., sinonimia: Eupatorium meridense Robinson………… 11

A.1.2. Distribución de la especie Chromolaena meridensis (B. L. Rob.) 12 R.M. King & H. Rob., en Venezuela……………………………………………

A.2. Química del género Chromolaena……………………………………….... 12

A.3. Usos del género Chromolaena…………………………………………..… 20

A.4. Actividad biológica………………………………………………...………… 21

A.4.1. Actividad antibacteriana de especies del género Chromolaena…….. 21

A.4.2. Otras actividades biológicas…………………………………………….. 22

III. MARCO TEÓRICO...... 23

A. Aceites esenciales…………………………………………………………...… 23

A.1. Definición…………………………………………………………………..… 23

A.2. Distribución y localización………………………………………………….. 23

A.3. Propiedades físicas...... 24

A.4. Composición...... 24

A.4.1. Terpenoides...... 25

A.4.1.1. Monoterpenos...... 25

A.4.1.2. Sesquiterpenos...... 26

A.4.1.3. Biosíntesis de terpenos...... 26

iv Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

A.5. Propiedades farmacológicas de los aceites esenciales...... 28

. Poder antiséptico...... 28

. Propiedades espasmolíticas y sedantes...... 28

. Propiedades irritantes...... 28

A.6. Algunos usos de los Aceites esenciales...... 29

A.7. Procedimientos de obtención de los aceites esenciales...... 30

A.7.1. Por arrastre en vapor de agua...... 30

A.7.2. Por expresión...... 31

A.7.3. Por extracción con solventes orgánicos...... 31

A.8. Métodos de análisis de los aceites esenciales...... 32

A.8.1. Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas 32 (CG/EM)......

B. Determinación de la actividad antibacteriana de los aceites esenciales... 35

B.1. Bacteria...... 35

B.1.1. Bacterias grampositivas...... 37 a. Staphylococcus aureus...... 37 b. Streptococcus faecalis (Enterococos)...... 37

B.1.2. Bacterias gramnegativas...... 38 a. Escherichia coli...... 38 b. Pseudomona aeruginosa...... 39 c. Klebsiella pneumoniae...... 39

B.2. Antibiótico...... 40

B.3. Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites 43 esenciales......

v Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

B.3.1. Método de Difusión en Agar...... 44

B.3.1.1. Método de Kirby-Bauer...... 45

B.3.2. Método de dilución...... 46

B.3.2.1. Concentración inhibitoria mínima (CIM)...... 47

IV. PROBLEMA...... 48

V. HIPÓTESIS...... 49

VI. OBJETIVOS...... 50

A. Objetivo general...... 50

A.1. Objetivos específicos...... 50

VII. MATERIALES Y MÉTODOS...... 51

A. Material vegetal...... 51

A.1. Recolección e identificación del material vegetal……………………….. 51

A.2. Clasificación taxonómica...... 52

B. Obtención y análisis del aceite esencial de Chromolaena meridensis (B. 52 L. Rob.) R.M. King & H. Rob......

B.1. Obtención del aceite por el Método de Hidrodestilación...... 52

B.2. Cromatografía de Gases (CG)...... 53

B.2.1. Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG- 55 EM)......

C. Evaluación de la actividad antibacteriana...... 56

C.1. Preparación de los inoculos bacterianos...... 56

C.2. Preparación de las placas de Petri Agar Müeller-Hinton...... 56

C.3. Impregnación de los discos...... 58

C.4. Incubación...... 61

vi Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

C.5. Lectura de la prueba...... 61

C.6. Concentración inhibitoria mínima (CIM)...... 61

D. Diseño Experimental...... 63

VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN...... 65

IX. CONCLUSIONES...... 75

ANEXOS...... 76

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 83

vii Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

ÍNDICE DE FIGURAS Pág

FIGURA 1: UNIDAD DE ISOPRENO...... 26 BIOSÍNTESIS DE MONOTERPENOS Y FIGURA 2: SESQUITERPENOS...... 27 FIGURA 3: DIAGRAMA DE UN CROMATÓGRAFO DE GASES...... 34 FIGURA 4: TIPOS DE ANTIÓBIÓTICOS Y SUS BLANCOS DE ACCIÓN 42 LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA DEL LUGAR DE FIGURA 5: RECOLECCIÓN DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis.. 51 FIGURA 6: Chromolaena meridensis...... 52

DESARROLLO DEL PROCESO DE OBTENCIÓNDEL FIGURA 7: ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIEChromolaena meridensis...... 54

CROMATÓGRAFO DE GASES ACOPLADO A UN FIGURA 8: ESPECTROMETRO DE MASAS MARCA HEWLETT PACKARD 5973...... 55 PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MEDIO FIGURA 9: MÜELLER - HINTON...... 57 FIGURA 10: ESTERILIZACIÓN DE LOS DISCOS DE PAPEL DEFILTRO 59 FIGURA 11: IMPREGNACIÓN DE LOS DISCO DE PAPEL DE FILTRO.... 59 REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA UBICACIÓN DE FIGURA 12: LOSDISCOS 60 IMPREGNADOS...... CROMATÓGRAMA DEL ACEITE ESENCIAL DE LAS FIGURA 13: PARTESAÉREAS DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis...... 67 ESTRUCTURAS QUÍMICAS DE LOS COMPONENTES FIGURA 14: MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena meridensis...... 69

viii Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

INDICE DE TABLAS Pág

TABLA I: TRIBUS DE LA FAMILIA ASTERACEAE...... 7

TABLA II: LISTADO DE LOS GÉNEROS QUE INTEGRAN LA TRIBU EUPATORIEAE...... 8

TABLA III: ESPECIES DEL GÉNERO Chromolaena...... 9

TABLA IV: COMPOSICIÓN QUÍMICA DE ALGUNAS ESPECIES DEL GÉNERO Chromolaena...... 13

TABLA V: COMPONENTES VÓLATILES DEL GÉNERO Chromolaena 16

TABLA VI: USOS MEDICINALES DEL GÉNERO Chromolaena...... 20

TABLA VII: ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL GÉNERO Chromolaena...... 21

TABLA VIII: CLASIFICACIÓN BACTERIANA SEGÚN SU COLORACIÓN...... 36

TABLA IX: MICROORGANISMOS Y CONTROLES POSITIVOS UTILIZADOS...... 60

TABLA X: CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y ORGANOLÉPTICAS DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis...... 65

TABLA XI: COMPONENTES VOLÁTILES DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena meridensis...... 68 TABLA XII: ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis...... 72

ix Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

ÍNDICE DE CUADROS Pág.

CUADRO 1: COMPONENTES QUÍMICOS DE Chromolaena meridensis.. 15

CUADRO 2: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena odorata...... 17 CUADRO 3: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena laevigata...... 17 CUADRO 4: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena squalidum, Chromolaena amygdalinum y Chromolaena conyzoides...... 18

CUADRO 5: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena macrophyllum...... 18 CUADRO 6: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena marginatum...... 18

x Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

INDICE DE ANEXOS Pág

ANEXO 1: VOUCHER DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis UBICADO EN EL HERBARIO MERF...... 77

ANEXO 2: EQUIPO DE HIDRODESTILACIÓN EMPLEANDO LA TRAMPA DE CLEVENGER...... 78

ANEXO 3: DISCOS DE PAPEL DE FILTRO DE 4 MILIMETRO DE DIÁMETRO...... 79

ANEXO 4: COLOCACIÓN DE LOS DISCOS IMPREGNADOS CON EL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena meridensis Y DMSO...... 79

ANEXO 5: ENSAYO DE LA CEPA DE E. coli ATCC 25922...... 80

ANEXO 6: ENSAYO DE LA CEPA DE K. pneumoniae ATCC 23357...... 80

ANEXO 7: ENSAYO DE LA CEPA DE P. aeruginosa ATCC 27853...... 81

ANEXO 8: ENSAYO DE LA CEPA DE S. aureus ATCC 25933...... 81

ANEXO 9: ENSAYO DE LA CEPA DE E. faecalis ATCC 29212...... 82

xi Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

I. INTRODUCCIÓN

En el largo período de la evolución humana y durante mucho tiempo, la inclinación del hombre hacia el concepto mágico-religioso de su cultura, le llevo a aplicar su curiosidad y a buscar en la naturaleza remedios de gran valor terapéutico para combatir diversas enfermedades (Albornoz, 1997).

La necesidad de procurarse alimentos y medicamentos, comenzó probablemente, probando una y otra vez o también observando el hábito de los animales salvajes cuando discriminaban las plantas, escogiendo las adecuadas para su nutrición y evitando las venenosas. No cabe duda que los humanos han tenido que experimentar situaciones desagradables para conocer las plantas beneficiosas.

Cuando una especie se comprobaba que tenía acción beneficiosa en un individuo, se le daba a otro y si se notaba el mismo efecto sobre éste, entonces se aceptaba y generalizaba su consumo (Albornoz, 1980).

El conocimiento de la interrelación hombre, animales y plantas, surgió en los pueblos primitivos (Albornoz, 1980). Estos pueblos adquirieron información sobre las propiedades medicinales de gran número de plantas propias de su medio ambiente, dichos conocimientos generalmente los han acumulados determinados individuos, sacerdotes, hechiceros, curanderos. etc., quienes los han transmitido

1 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

de generación en generación a determinados aprendices y a sus descendientes, dejando útiles descripciones de plantas medicinales y de su utilidad (Domínguez,

1973).

En la actualidad se sigue intensificando la investigación científica de las plantas medicinalescon el fin de extraer y separar sustancias con actividad biológica o terapéutica(Albornoz, 1980), cubriendo aspectos adicionales, como la estructura de los constituyentes químicos, datos espectroscópicos, síntesis y biosíntesis de una gran variedad de compuestos propios de una especie o productos naturales también denominados metabolitos secundarios (Marcano y Hasegawa, 1991).

Durante el año 1978, se publicaron en el mundo numerosos trabajos científicos que informaron de unos 6500 productos aislados, de los cuales un 40% eran desconocidos anteriormente y de este grupo un 10% mostró ser potenciales agentes terapéuticos (Albornoz, 1980).

Los productos naturales son sustancias de origen orgánico e inorgánico que se encuentran en la naturaleza y que pueden ser aislados y procesados por el hombre. Su formación comienza con la fotosíntesis, luego de la cual los fragmentos pequeños se recombinan para generar las grandes moléculas

(Albornoz, 1997). Hay muchas clases o categorías de sustancias naturales, productos del metabolismo vegetal, que se han clasificado según origen, carácter

2 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

químico, similitud estructural molecular o su acción farmacológica (Albornoz,

1980).Dentro de las estructuras vegetales se encuentran los aceites esenciales, estos pueden localizarse en sus flores, hojas, frutos y hasta raíces o en toda la planta (Domínguez, 1973).

Los aceites esenciales son generalmente líquidos aromáticos, miscibles con lípidos y solventes lipófilos; incoloros, particularmente cuando están frescos, ya que al oxidarse se resinifican y toman color oscuro (lo cual se previene depositándolos en recipientes de vidrio de color ámbar totalmente llenos y cerrados perfectamente) (Albornoz, 1980). Son empleados en perfumería, en la industria alimenticia o como fuente de materia prima (Domínguez, 1973). Las familiasricas en aceites esenciales son:Lauráceas, Mirtáceas, Umbellíferas,

Pináceas, Rutáceas, Labiadas, Verbenáceas y Asteraceas (Marcano yHasegawa,

2002).Dentro de esta últimase encuentran numerosos géneros y especiesque han sido objeto de estudios, en esta ocasiónse estudiará el aceite esencial deChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob., que hasta 1970 se denominaba Eupatorium meridense Robinson(Aristeguieta, 1964). Los componentes volátiles de esta especie no han sido estudiados, por lo que el presente estudiose basó en la extracción e identificación de

3 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

loscompuestosquímicos volátilesyanálisis antibacterianodel aceite esencial de

Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.

4 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

II. ANTECEDENTES

A. Antecedentes del género

La familia Asteraceae denominada también Compuesta estáabundantemente representada en la flora de Venezuela y constituye junto con las Orquídeas,

Gramíneas, Leguminosas y Rubiáceas las familias dominantes en el país

(Aristeguieta, 1964). Es la segunda con mayor número de especies dentro de las

Angiospermas después de las Orchidaceae, agrupa entre 23.000 - 30.000 especies y 1.500 géneros y se encuentra ampliamente distribuida en el mundo

(Bremer, 1994).En Venezuela se encuentra distribuida desde el nivel de mar hasta los sitios más elevados de los páramos andinos, casi en contacto con las nieves perpetuas, donde escasamente es posible el desarrollo de plantas superiores

(Badillo, 2001). Al considerar la distribución de las Compuestas en Venezuela, el país puede ser dividido en 3 regiones: a) Costa y Llano; b) Andes y Codillera costera; c) región Guayanesa. De estas 3 regiones, la primera es pobre en endemismo y números de especies de Compuestas. Las dos últimas, en cambio, representan las áreas de mayor concentración de Compuestas con un alto grado de endemismo (Badillo, 2001).

5 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

Las Compuestas son plantas heliófilas en casi su totalidad y se hacen dominantes y muy diversificadas en sitios con temperaturas bajas, así se explica que en un país tropical como Venezuela, la gran concentración de especies de Compuestas esté localizada en las partes Andino - Cordillera Costera y alta Guayana; pues son regiones montañosas de gran elevación con temperaturas baja, en cambio la

Costa y el Llano ofrecen una topografía plana o de poca elevación, con temperaturas altas, y por ello el número de especies de Compuestas es muy reducido en comparación con la gran variedad que se observa en las dos regiones mencionadas (Badillo, 2001).

Esta familia distribuye sus géneros en 13 tribus (tabla I) (Badillo, 2001). En

Venezuela está representada por 204 géneros y 784 especies nativas o naturalizadas, incluyendo 13 géneros y 189 especies endémicas (más 2 subespecies y 5 variedades) (Hokche et al, 2008). Dentro de esta familia se encuentran desde árboles, pasando por arbustos y subarbustos, hasta plantas herbáceas (Moreno et al, 2006).

La tribu Eupatoriaea está bien representada en el país, las especies de esta tribu están contenidas en varios géneros (tabla II), los de mayor número de especies

6 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

corresponden a Eupatorium, Mikania y Chromolaena, este último con un total de

30 especies (tabla III) (Badillo, 2001).

TABLA I: TRIBUS DE LA FAMILIA ASTERACEAE I. BARNADESIEAE

II. MUTISIEAE

III. CARDUEAE

IV. LACTUCEAE

V. VERNONIEAE

VI. LIABEAE

VII. PLUCHEEAE

VIII. GNAPHALIEAE

IX. ASTEREAE

X. ANTHEMIDEAE

XI. SENECIONEAE

(Badillo,XII. 20 HELIANTHEAE(Badillo, 2001). XIII. EUPATORIEAE

(Badillo, 2001).

7 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

TABLA II: LISTADO DE LOS GÉNEROS QUE INTEGRAN LA TRIBU EUPATORIEAE

AdenostemmaForster FleishmanniaSchultz-Bip

AgeratinaSpach Guayania R. King et H. Rob.

Ageratum L Hebeclinium D C.

Asplundianthus R. King et H. Rob. Heterocondylus R. King et H. Rob.

Austroeupatorium R. King et H. Rob. Idiothamnus R. King et H. Rob.

Ayapana R. King et H. Rob. Imeria R. King et H. Rob.

Badilloa R. King et H. Rob. Isocarpha R. Br.

Barrosoa R. King et H. Rob. KoanophyllonArruda da Camara

Bartlettina R. King et H. Rob. LepidesmianKlatt

Brickellia Elliot Lourteigia R. King et H. Rob.

Campuloclinium D C. MikaniaWilld

Chromolaena D C. Oxylobu(Mociño ex D C.) A. Gray

Conocliniopsis R. King et H. Rob. Siapaea Cav.

Critonia P. Browne Stevia Cav.

Critoniella R. King et H. Rob. Steyemarkina R. King et H. Rob.

Eupatorium L. TrichogoniaGardn

(Badillo, 2001).

8 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

TABLA III: ESPECIES DEL GÉNEROChromolaena

Chromolaena aridicola Badillo Chromolaena persericea R. King et H. Rob.

Chromolaena bathyphlebia (B. Rob.) R. King et H. Chromolaena pharcidodes (B. Rob.) R. King et H. Rob. Rob. Chromolaena columbiana (Heering) R. King et H. Chromolaena ponsae Badillo Rob. Chromolaena farinosa (B. Rob.) R. King et H. Rob. Chromolaena santanensis (Aristeg.) R. King et H. Rob. Chromolaena ivifolia (L) R. King et H. Rob. Chromolaena squalid (DC.) R. King et H. Rob.

Chromolaena laevigata (Lam) R. King et H. Rob. Chromolaena steyermarkiana (Badillo) R. King et H. Rob. Chromolaena larensis (Badillo) R. King et H. Rob. Chromolaena subscandens (Hieron.) R. King et H. Rob. Chromolaena leptocephala (DC.) R. King et H. Chromolaena ternicapitulata Pruski Rob. Chromolaena maximiliani (Schroeder ex DC.) A. Chromolaena thurnii (B. Rob.) R. King et H. Rob. King et H. Rob. Chromolaena meridensis (B. Robinson) R. King et Chromolaena trujillensis (B. Rob.) R. King et H. H. Rob. Rob. Chromolaena molina (B. Rob.) R. King et H. Rob. Chromolaena tyleri (B. Rob.) R. King et H. Rob.

Chromolaena moritensis (Aristeg.) R. King et H. Chromolaena urticoides (Schultz-Bip. ex Hieron.) Rob. R. King et H. Rob. Chromolaena moritziana (Schultz-Bip. ex Hieron.) Chromolaena voglii (B. Rob.) H. Huber, Mitt. R. King et H. Rob. Chromolaena odorata (L) R. King et H. Rob. Chromolaena xestolepidoides (Wurdack) R. King et H. Rob. Chromolaena pellia (Klatt) R. King et H. Rob. Chromolaena xestolepis (B. Rob.) R. King et H. Rob.

(Badillo, 2001).

9 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

Esta familia ha sido motivo de muchos estudios químicos que han llevado al descubrimiento de interesantes estructuras químicas, resultando varias de ellas promisorias de ser utilizadas,como insecticidas, en la industria de los alimentos, como aromatizantes, edulcorantes, Además, los estudios químicos sistematizados han servido de soporte a estudios taxonómicos (De Pérez, 1994). En Venezuela sus múltiples propiedades medicinales han sido ampliamente estudiadas (Gil et al,

2003), sus numerosas especies vegetales poseen aproximadamente 26% de acción contra afecciones gastrointestinales, 16% contra enfermedades esqueleto muscular y un 13% en enfermedades dermatológicas (Arrázola et al, 2002).

A.1. Descripción del géneroChromolaena

Las especies del género Chromolaena se presentan en cabezuelas homogéneas y organizadas, por lo general de muchas flores, hermafroditas. Hierbas, frútices, arbustos hasta pequeños árboles. Hojas casi siempre opuestas, por lo general con inflorescencias corimbosas (Aristeguieta, 1964).

A.1.1.Descripción de la especieChromolaena meridensis (B.L. Rob.)

R.M. King & H. Rob., sinonimia: Eupatorium meridenseRobinson

10 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

Planta fruticosa, erecta; tallos redondeados, cortamente pubescentes. Hojas opuestas, brevemente pecioladas, lanceoladas atenuado-acuminada en ambos extremos, 4-8 cm de largo, 1-2 cm de ancho, brillantes, puberulentas y marcadamente rugosas, densamente piloso-glandulosas y prominentemente reticuladovenosas por debajo, erenuladas o subenteras, cartáceas, 3-nervadas desde cerca de la base, pecíolos alrededor de 0.5 cm de largo. Inflorescencias corimbos terminales, redondeados, compuestos. Cabezuelas numerosas, cortamente pediceladas o subsésiles, conteniendo unas diez flores. Involucro delgado, cilíndrico, de 7-8 mm de largo, 5-6 seriado; brácteas oblonglas, redondeadas o subtruncadas arriba, cilioladas en los márgenes y subglabras o puberulentas y glándulas en el dorso. Receptáculo convexo, glabro. Corolas puberulento-glandulosas en el ápice, 4,5-5 mm de largo. Aquenios de 3-3,5 mm de largo, glandulosos en las costillas. Papus amarillento y un poco más corto que las corolas, de 3,5-4 mm de largo (Aristeguieta, 1964).

A.1.2. Distribución de la especieChromolaena meridensis(B.L. Rob.)

R.M. King & H. Rob., en Venezuela

Esta especie es endémica de Venezuela y se encuentra ampliamente distribuida en la región andina: estado Mérida (Chachopito, cerca de San Rafael, Mucurubá,

11 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

alrededores de Mérida y La Azulita), estado Trujillo (entre Trujillo y

Boconó)(Aristeguieta, 1964).

A.2. Química del géneroChromolaena

Del género Chromolaena se han estudiado diversas especies como: C. leivensis,

C. opadoclinia, C. odorata, C. arnottiana,C. morii, C. collina, C. connivens, C. glaberrima, C. pseudoinsignis, C. chasleae, y se han determinadocompuestos de tipo: sesquiterpenos, triterpenos, flavonoides, ácidos grasos cíclicos,sesquiterpenlactonas, alcaloides pirrolizidínicos, germacranólidos, diterpenos(ent-clerodanosy derivados del labdano) yprostaglandinas provenientesde ácidos grasos libres(Rodríguez y Torrenegra, 2007).En la tabla IV y Vse presentan los componentes químicos y volátiles hallados en algunas especies del géneroChromolaena respectivamente, incluyendo los componentes químicos encontrados enChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.

(Cuadro 1).

TABLA IV: COMPOSICIÓN QUÍMICA DE ALGUNAS ESPECIES DEL GÉNERO Chromolaena

Especie Componentes Lugar Fuente

12 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

bibliográfica Saponinas, flavonoides, Esteroides libres, Perú (Fuertes et al, Chromolaena laevigata triterpenoides, Aza- 2010)

Chromolaenatequenda Cetoácidosesteroideles, (estructuralmenteTaninos, Cundinamarca (Sanabria et mensis relacionadosAlcaloides con Colombia al, 1989) prostaglandinas) Alcaloides Chromolaena odorata pirrolizidínicos, México (Gómezet al, (Monoésteres de 2011) retronecina y supininas)

Alcaloides pirrolizidínicos España (Gómez et al, con núcleo de necina 2011) Acetilivalina, Epazoyina Chromolaena pulchella Acido-hardwikiico, 7,8- seco-7,8-oxacassan-17- México (Torres, aleufol, 2011) Deoxipodofilotoxina Geraniina Chromolaenaperglabra Esteroides, Flavonoides Boyacá – (Rodríguez y Colombia Torrenegra, 2007)

13 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

5,4-dihidroxi-7-metoxiflavonol, Chromolaena meridensis CUADRO 1: COMPONENTESΒ-estigmasterol, QUÍMICOSDE Hidroquinona, Chromolaenasubscand Cundinamarca (Torrenegra Eicosanol ens Colombia et al, 2007)

Chromolaenabullata Flavonoides Colombia (Santander et al, 2007)

Flavonoides Colombia (Castañeda et al, 2007)

Flavonoides (cianidina), Taninos (gelatinasal), Colombia (Sanabria y Esteroides y/o triterpenoides, Chromolaenatacotana Carrero, Flavononol 7-metoxi- 1995) aromadendrina

Chromolaenamoritziana Flavonoides (Kanferol, Mérida- (Hidalgo et Kanferol-3-O-rutinósido, Venezuela al, 1998) Rutina e Isoquercetina)

Ácido 12-oxo-9βH, 13αH-10, Chromolaena 15(Z)-fitodienóico [1] Mérida- (Delgado, meridensis flavonoides: eupatolitina[2] Venezuela 1989) velutina[3],rhamnetina [4]

CONTINUACIÓN DE LA TABLA IV

14 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

OH MeO O COOH OH

O MeO OH OH O

[1] [2]

OMe OH MeO O MeO O OH OH

OH OH O OH O

[3][4]

Especie Componentes % Lugar Fuente Bibliográfica

15 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

α pineno[5] 42,2 TABLA V: COMPONENTES VOLÁTILESβ pineno[6] DEL GÉNERO Chromolaena10,6 pregeijereno [7] 2,8 Chromolaena odorata geijereno [8] 4,7 Nigeria (Owolabi et al, 2010) germacreno D [9] 9,7 β-cariofileno[10] 5,4 Chromolaena laevigata globulol[11] 16,2 germacreno D[9] 8,6 globulol[11] 25,1 oxido de cariofileno[12] 17,4 Chromolaena squalidum β-cariofileno[13] 7,1 germacreno D[9] 10,4 espatulenol[14] 14,2 globulol[11] 25,1 Brasil (Maia et al, 2002) oxido de cariofileno[12] 17,4 Chromolaena conyzoides β-cariofileno[13] 7,1 germacreno D[9] 10,4 espatulenol [14] 14,2 globulol[11] 25,1 oxido de cariofileno[12] 17,4 Chromolaena amygdalinum β-cariofileno[13] 7,1 germacreno D[9] 10,4 espatulenol[14] 14,2 Chromolaena macrophyllum limoneno[15] 23,3 sabineno[16] 46,7 germacreno D[9] 14,8 α-zingibereno[17] 57,5 Chromolaena marginatum α-gurjuneno[18] 19,5 α-bisaboleno[19] 9,7 α-selineno[20] 9

%: Porcentaje de los componentes en el aceite esencial

16 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

CUADRO 2: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena odorata

[5] [6] [7] [8]

[9] [10]

CUADRO 3: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena laevigata

OH

[11] [9]

17 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

CUADRO 4: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena squalidum, Chromolaena amydalinum, y Chromolaena conyzoides

OH O

[11] [12] [13]

HO H

H

[9] [14]

CUADRO 5: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena macrophyllum

[15] [16]

18 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

CUADRO 6: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena marginatum

H

H

[9] [17] [18]

[19] [20]

19 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

A.3. Usos del géneroChromolaena

TABLA VI: USOS MEDICINALES DEL GÉNERO Chromolaena

Especie Uso terapéutico Lugar de Fuente bibliográfica recolección Chromolaena perglabra Actividad significativa in vitro contra Tinjacá (Rodríguez y agentes causante de la enfermedad de (Boyacá - Torrenegra, 2007) Chagas y Leishmaniasis Colombia) Actividad antidiarreica Nigeria (Gutiérrez et al, 2007) Chromolaena odorata Para infecciones de tejidos blandos y Argentina (Grossi, 2009) quemaduras Chromolaena Hookeriana Para calmar la estupefacción Bolivia (Vaera et al, 2002) Actividad antitumoral o Colombia (Santander et al, 2007) Chromolaena bullata inmunorreguladora (sobre células tumorales humanas) Para el dolor de cabeza, como Argentina (Marzocca, 1997) antiséptico y purgante

Chromolaena laevigata Analgésico catártico Argentina (Amat, 1983) Promotor abortivo y para la menstruación Argentina (Martínez, 1981)

Chromolaena odorata Antidiarreica y antipirético Argentina (Freire y Urtubey, 1999) Antiinflamatoria España (Gómez et al, 2011) Chromolaena puchella Anticancerosa México (Torres, 2011)

Disminuye la viabilidad celular de la línea Colombia (Castañeda et al, 2007) Chromolaena tacotana celular K562(línea celular tumoral)

Chromolaena roseorum Las hojas son utilizadas para el dolor de Ecuador (Lajones, 2006) cabeza Chromolaena moritziana Anticatarral, es usado en tratamiento de Mérida- (Hidalgo et al, 1998) la piel y como depurativa Venezuela

20 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

A.4. Actividad biológica

A.4.1. Actividad antibacteriana de especies del género

Chromolaena

TABLA VII. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL GÉNERO Chromolaena

Especie Bacterias sensibles Lugar Fuente bibliográfica

Chromolaenasubcandens Staphylococcus aureus Cundinamarca- (Torrenegra et al, Colombia 2007)

Chromolaena odorata Staphylococcus aureus Cundinamarca- (Sanabria et al, 1998) Colombia Bacillussubtilis

Mycobacterium fortuitum Brucellasp Streptococcus hemolyticus Streptococcus pneumoniae Chromolaenatequendamensis Streptococcus faecalis Cundinamarca- (Sanabriaet al, 1989) Colombia Staphylococcus albus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Micrococcus flavus Sarcinalutea

Klebsiella pneumoniae Bogotá-Silvania Departamento de Chromolaenatacotana Staphylococcus aureus (Sanabriay Carrero, Cundinamarca 1995) Staphylococcus epidermidis

Chromolaenamoritziana Staphylococcus aureus Mérida-Venezuela (Hidalgo et al, 1998)

21 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

A.4.2. Otras actividades biológicas

Se han realizado varios estudios de actividad biológica en Chromolaena odorata, pocos en Chromolaena hirsute y Chromolaena moritziana. Reportándose actividad pesticida, actividad repelente, efecto antiprotozoario, actividad insecticida, actividad tripanocida, actividad antibacteriana, actividad antimicrobacterial, citotoxicidad, efecto antioxidante, mutagenicidad, proliferación de queratocitos humanos y proliferación de fibroblastos entre otros (Rodríguez y Torrenegra,

2007).

22 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

III. MARCO TEÓRICO

A. Aceites esenciales

A.1. Definición

Los aceites esenciales o aceites volátiles se encuentran localizados en células y

órganos particulares o se producen por reacciones químicas en un determinado momento. Generalmente son líquidos y otros sólidos a temperatura ordinaria, casi siempre incoloros pero que por reacción del aire y de la luz toman una coloración amarilla más o menos intensa; con sabor acre y picante; aromáticos. Son solubles en alcohol, éter y ácidos fijos; son insolubles en agua, pero sin embargo, agitadas con agua le comunican parcialmente su olor (Albornoz, 1997).

A.2. Distribución y localización

Los aceites esenciales pueden encontrarse en animales y en plantas (Tyler et al,

1988). Existirían, según Lawrence, 17.500 especies aromáticas. Los géneros capaces de elaborar los constituyentes que componen los aceites esenciales están repartidos en un número limitado de familias, ejemplos: Myrtaceae,

Lauracae, Rutaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Cupressaceae, Poaceae,

Zingiberaceae,Piperaceae, etc (Bruneton, 2001).

23 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

Los aceites volátiles se localizan en determinados sitios de la estructura vegetal, en células normales o modificadas o también en estructuras especializadas tales como cavidades esquizógenas, vasos secretores, pelos glandulares y canales lisígenos(Albornoz, 1980), pueden almacenarse en las flores, igualmente en hojas y, aunque sea menos habitual, en corteza, leño, raíces, rizomas, frutos, semillas, etc (Bruneton, 2001).

A.3. Propiedades físicas

Los aceites esenciales son líquidos a temperatura ambiente, volátiles, lo que los diferencia de los aceites fijos, muy raramente son coloreados. En general, su densidad es inferior a la del agua (los aceites esenciales de sasafrás, clavo o canela, constituyen excepciones). Posee un índice de refracción elevado y la mayoría desvían la luz polarizada, son liposolubles y solubles en los disolventes orgánicos habituales, arrastrables al vapor de agua, son muy poco solubles en ella; no obstante, son lo suficientemente solubles como para comunicarle un olor neto. Esta agua es agua destilada floral (Bruneton, 2001).

A.4. Composición

Químicamente los aceites son mezclas complejas y muy variables de constituyentes que pertenecen, de manera casi exclusiva, a dos grupos

24 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

caracterizados por orígenes biogenéticos distintos: el grupo de los terpenoides por una parte y el grupo de los compuestos aromáticos derivados del fenilpropano, mucho menos frecuente (Bruneton, 2001), dentro de este último los más frecuentes son anetol, eugenol, magnolol y cinamaldehído. Entre los componentes volátiles aislados de las plantas también se encuentran ácidos libres, cetonas y compuestos azufrados como allicina e isotiocianato de alilo (Marcano y Hasegawa,

2002).

A.4.1. Terpenoides

En los aceites esenciales se encuentran únicamente los terpenos más volátiles, es decir, aquellos cuya masa molecular no es demasiado elevada: mono-y sesquiterpenos (Bruneton, 2001).

A.4.1.1. Monoterpenos

Casi siempre se encuentran hidrocarburos. Estos pueden ser acíclicos (mirceno y ocimenos), monociclicos (α- y ү-terpineno, p-cinemo) o biciclicos (pinenos, Δ3 – careno, canfeno, sabineno). A veces constituyen más del 90% del aceite esencial.

También la presencia de numerosas moléculas funcionalizadas: alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, éteres, peróxidos y fenoles (Bruneton, 2001).

25 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

A.4.1.2. Sesquiterpenos

Las variaciones estructurales en esta serie son de la misma naturaleza que en el caso precedente: siendo los más frecuentes hidrocarburos alcoholes y cetonas.

Algunos ejemplos de sesquiterpenos característicos de aceites esenciales son: hidrocarburos mono o policíclicos (β-bisaboleno, β- cariofileno y longifoleno), alcoholes (farnesol, carotol, β-santalol, patchulol), cetonas (nootkatona, cis- longipinano-2,7-diona, β-vetivona), aldehídos (sinensales), ésteres (acetato de cedrilo) (Bruneton, 2001).

A.4.1.3. Biosíntesis de terpenos

Los terpenoides están formados por largas estructuras de diversas familias derivadas de la unidad isopreno C5 (figura 1), los cuales tienen la modalidad de unirse cabeza-cola. Son estructuras típicas que cuentan con esqueletos carbonados representados por (C5)n y son clasificados como: hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterterpenos

(C25), triterpenos (C30) y tetraterpernos (C40) (Dewick, 2002).

FIG. 1: UNIDAD DE ISOPRENO

26 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

Los monoterpenos resultan de la combinación del dimetilalil difosfato (DMAPP) y el isopentenil difosfato (IPP) por medio de la enzima feniltransferasa para producir geranil difosfato (GPP). Los sesquiterpenos se forman adicionándole una unidad

C5 de isopentenil disfofato al geranil difosfato por extensión de la feniltransferasa originando el precursor fundamental de los sesquiterpenos el farnesil difosfato (FPP) (figura 2) (Dewick, 2002).

FIG. 2: BIOSÍNTESIS DE MONOTERPENOS Y SESQUITERPENOS

OPP OPP Dimetilalil PP Isopentenil PP Hermiterpenos (C5) (DMAPP) (C5) (IPP) (C5)

Monoterpenos (C ) OPP 10 Geranil PP (GPP) IPP

OPP Sesquiterpenos (C15) Farnesil PP (FPP)

27 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

A.5. Propiedades farmacológicas de los aceites esenciales

Entre algunas propiedades fundamentales se destacan:

. Poder antiséptico.El poder antiséptico que manifiesta frente a diversas

bacterias patógenas, incluso cepas habitualmente resistentes a los antibióticos.

Algunos aceites esenciales también son activos sobre hongos responsables de

micosis y sobre levaduras (Candida) (Bruneton, 2001).

. Propiedades espasmolíticas y sedantes. Eficaces para disminuir o

suprimir los espasmos gastrointestinales, estimulan la secreción gástrica,

mejora determinados insomnios y trastornos psicosomáticos diversos y

disminución del nerviosismo (Bruneton, 2001).

. Propiedades irritantes.Empleados por vía tópica, provocan aumento de la

microcirculación, sensación de calor y, en ciertos casos, ligera acción

anestésica local. Administrados por vía interna, los aceites esenciales

desencadenan fenómenos de irritación a diferentes niveles (Bruneton, 2001).

28 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

A.6. Algunos usos de los Aceites esenciales

Los aceites esenciales tienen diversos usos como agentes para sazonar la comida y bebidas, así como en la perfumería y cosméticos. En tales productos su actividad antimicrobial se despliega dos veces. Primeramente, los aceites esenciales protegen a los productos contra contaminación microbiana por el retraso del ataque o la inhibición del crecimiento de patógenos. Secundariamente, cuando actúan como aditivos de comida o aplicado como ingrediente del cosmético (Kalemba y Kunicka, 2003).

Los aceites esenciales pueden actuar beneficiosamente en la salud humana. Son una alternativa excelente para las preparaciones sintéticas y ésa es la razón para una valoración extensa de su actividad antimicrobiana (Kalembay Kunicka, 2003).

También se le atribuyen propiedades antisépticas, desinfectantes y antihelmínticas, éstas propiedades se han aprovechado desde hace tiempo y especialmente en el caso de infecciones bronquiales, urinarias y las causadas por cortadas y quemaduras, algunos son diuréticos, sedantes y repelentes (Marcano y

Hasegawa, 2002).

29 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

A.7. Procedimientos de obtención de los aceites esenciales

A.7.1. Por arrastre en vapor de agua

. La hidrodestilación simple consiste en sumergir directamente el material

vegetal a tratar (intacto u ocasionalmente triturado) en un alambique lleno de

agua que a continuación se somete a ebullición. Los vapores heterogéneos se

condensan sobre una superficie fría y el aceite esencial se separará por

diferencia de densidad(Bruneton, 2001).

. En la destilación con vapor saturado, el material no está en contacto con el

agua: el vapor de agua se inyecta a través de la masa vegetal dispuesta sobre

placas perforadas. para acortar el tiempo de tratamiento, limitar la alteración de

los constituyentes del aceite esencial y economizar energía, se puede trabajar

a sobre presión moderada. Como consecuencia de la sobrepresión existe un

aumento de la temperatura y puede sufrir la calidad del producto (Bruneton,

2001).

. La hidrodifusión consiste en impulsar el vapor de agua a muy baja presión a

través de la masa vegetal, de arriba abajo. la composición de los productos

obtenidos es desde un punto de vista cualitativo, sensiblemente diferente de

30 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

los productos obtenidos por los métodos clásicos. el procedimiento permite

ganar tiempo y energía (Bruneton, 2001).

A.7.2. Por expresión

El principio del método es muy simple: las “cascaras” se trituran y el contenido de las glándulas secretoras que se han roto se recuperan por un procedimiento físico.

El procedimiento clásico consiste en ejercer, bajo una corriente de agua, una acción abrasiva sobre la superficie del fruto. Después de eliminar los desechos sólidos, el aceite esencial se separa de la fase acuosa por centrifugación

(Bruneton, 2001).

A.7.3. Por extracción con solventes orgánicos

Se puede usar éter de petróleo, hexano o se exprime el material biológico, estos métodos pueden usarse solos o combinados. La extracción con solventes en condiciones supercríticas ha dado excelente rendimiento y tiene gran potencial para la obtención industrial de los aceites esenciales (Marcano y Hasegawa,

2002).

31 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

A.8. Métodos de análisis de los aceites esenciales

El procedimiento más usado gracias a la volatilidad de los aceites esenciales, es la

Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas (CG/EM) (Marcano y Hasegawa, 2002)

A.8.1. Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de

Masas (CG/EM)

La cromatografía de gases es uno de los métodos físicos de separación más eficaces que se conocen; cada componente de una muestra suministra 3 unidades de información: posición, altura y anchura de los picos en el cromatograma. La posición suministra la información cualitativa y los otros proporcionan la información cuantitativa. Es posible identificar los componentes por la posición de los picos, pero por lo general la ambigüedad es tan grande que el analista ha de completar la información con la obtenida por otros métodos analíticos, siendo preferibles las técnicas multiparamétricas, como la espectroscopia de infrarrojo ola espectrometría de masas (Dabrio, 1973).El principio básico de todas las técnicas cromatográficas es el siguiente: Un fluido (fase móvil) circula a través de una fase estacionaria (sólida o líquida); cuando una mezcla de sustancias se introduce en el sistema, se produce una serie de equilibrios de distribución entre las dos fases,

32 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

generalmente de distinta magnitud para cada componente de la mezcla, por lo que cada uno de ellos se desplazará con diferente velocidad a lo largo del sistema

(Dabrio, 1971).

Los Cromatógrafos de Gases (figura 3) contienen esencialmente:

. Una fuente de gas comprimido. Nos proporciona la fase móvil (gas portador).

Los gases más utilizados son hidrogeno, helio, nitrógeno y argón (Dabrio,

1971).

. Un regulador de presión o flujo de gas portador (Dabrio, 1971).

. Inyector. Dispositivo que permite la introducción de la muestra en la corriente

de gas portador(Dabrio, 1971).

. Columna cromatográfica. Tubo de vidrio o metal (acero inoxidable, cobre,

aluminio, entre otros) de longitud que oscila entre 1 - 200 m, cuyo diámetro

inferior puede ser desde 0,1 a 50 mm, según el tipo de columna. Según como

se encuentre en ella distribuida la fase estacionaria y el valor que alcance la

relación de fase(volumen de fase móvil/ volumen de fase estacionaria) se

originan los diferentes tipos de columnas. La separación de la mezcla se

33 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

realiza en ella, siendo, por tanto, la parte más importante del instrumento

(Dabrio, 1971).

. El horno, en cuyo interior se sitúa la columna, que debe poseer una buena

regulación de temperatura (Dabrio, 1971).

. El detector. Dispositivo que permite medir de una manera continúa una

propiedad física del gas portador, que se modifica ampliamente con la

presencia de muy pequeñas concentraciones de la sustancia a analizar. Está

situada a la salida de la columna (Dabrio, 1971).

. Sistema electrónico de amplificación y medida de la señal eléctrica enviada por

el detector y registrador de la misma (Dabrio, 1971).

FIG. 3: DIAGRAMA DE UN CROMATÓGRAFO DE GASES

Tomado dehttp://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_de_gases

34 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

Ahora bien, la espectrometría de masas es básicamente una técnica en la que los iones obtenidos de una sustancia, en general orgánica, se separan según su relación de masa o carga iónica dando lugar, una vez registrados en forma adecuada al espectro de masas característico de la citada sustancia (Dabrio,

1973). A una molécula se le suministra suficiente energía para obtener fragmentos más pequeños provenientes de la rotura de los diferentes enlaces originales en la molécula y el estudio de estos fragmentos dará una idea de cómo estaban unidos y por tanto, de la estructura molecular(Marcano y Cortés, 1998).

B. Determinación de la actividad antibacteriana de los aceites esenciales

B.1. Bacteria

Células procariotas universalmente distribuidas, algunas de gran importancia médica o industrial, cuyas características principales son:

. Son unicelulares y pueden tener forma esférica, bacilar o espiral (Barrios,

1988).

. Se reproducen asexualmente por fisión binaria (Barrios, 1988).

. Pueden ser fotosintéticas o no (Barrios, 1988).

. Pueden ser inmóviles o móviles mediante flagelos (Barrios, 1988).

35 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

Los métodos de tinción diferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes según sus propiedades de tinción. La tinción de Gram desarrollada por el médico danés Christian Gram en 1884, es el método de tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata de unmétodo de tinción diferencial porque divide a las bacterias en dos clases gramnegativas y grampositivas (Tabla VIII) (Prescott et al,1999).

TABLA VIII. CLASIFICACIÓN BACTERIANA SEGÚN SU COLORACIÓN

CARACTERISTICAS Grampositivas gramnegativas

Reacción al colorante: cristal Retiene el cristal violeta y se No retienen el cristal violeta y violeta observan de color violeta por contraste con la safranina profundo se observan de color rosado

Composición de la pared Baja en lípidos. Peptidoglicano Alta en lípidos. Peptidoglicano celular presente formando una presente en una capa interna monocapa y ácidos teicoicos rigida en poca cantidad, no presenta acidos teicoicos

Susceptibilidad a la Más susceptible Menos susceptible penicilina

Relativamente complejo en Relativamente sencillo muchas especies Requerimiento nutricional

Resistencia a la rotura Más resistente Menos resistente mecánica

Escherichia coli Ejemplos Más resistente Klebsiella pneumoniae Pseudomona aeruginosa

(Pelczar y Chan, 1984).

36 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

B.1.1. Bacterias grampositivas a. Staphylococcus aureus

El género Staphylococcusfigura entre las bacterias patógenas más importantes para el ser humano y son habitantes normales de las vías respiratorias superiores, la piel, el intestino y la vagina. Pueden dividirse en cepas patógenas y relativamente no patógenas, basándose en la síntesis de la enzima coagulasa.Las cepascoagulasa positiva como Staphylococcus aureus son muy resistente al calor, la desecación y la radiación, por encontrarse en fosas nasales y piel de seres humanos pueden penetrar rápidamente en los alimentos y producir enterotoxinas que lo hacen peligros ycausar graves infecciones crónicas como: la intoxicación alimentaria estafilocócica, además de abscesos localizados, síndrome de shock tóxico y síndrome de la piel escaldada (Prescott et al, 1999). b. Streptococcus faecalis(Enterococos)

Los Streptococcus son cocos pequeños de 0,8 a 1 micra de diámetro, con disposición variable desde cocos en cadenas, hasta aislados o en diplococos, la mayoría son capsulados, no forman esporas y raramente producen pigmentos, no tienen cilios, a excepción deStreptococcus faecalis. Se pueden clasificar basándose en su poder de fermentación, forma de agruparse o su acción

37 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

hemolítica; así bien, Streptococcus faecalis se clasifica como no hemolítico. Esta especie se encuentra en las heces humanas, productos lácteos y puede producir endocarditis lenta y enfermedades gastrointestinales (Paraje y Paraje, 1976).

B.1.2. Bacterias gramnegativas a. Escherichia coli

Uno de los principales agente causantes de diarreas es E. coli, esta bacteria circula en la población residente, normalmente sin causar síntomas a causa de la inmunidad proporcionada por la exposición previa a ésta (Prescott et al, 1999).

Debido a que normalmente se encuentran en el intestino (Pelczar y Chan, 1984), los alimentos y el agua contaminada son el medio principal a través del cual se diseminan estas bacterias. Puede causar enfermedad diarreica por varios mecanismos, y en la actualidad se identifican 6 tipos o cepas deE. coli diarreogénicas:E. coli enterotoxígena (ECET), enteroinvasiva (ECEI), enterohemorrágica (ECEH), enteroagregante (ECEAg), difusamente adherente

(ECDA) (Prescott et al, 1999).

38 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

b. Pseudomona aeruginosa

Es un bacilo chico de 1 a 2 micras, generalmente recto, no forma espora ni capsula, es móvil por poseer un flagelo terminal. Se caracterizan por producir uno a más pigmentos como la piocianina y el pigmento eritrogénico. Las infecciones por Pseudomonasadquieren cada vez más importancia, especialmente en ambiente hospitalario. Pseudomona aeruginosa es de escasa virulencia en personas sanas, pero en personas inmunosuprimidas las infecciones se producen con facilidad; son capaces de agravar lesiones ulcerosas de piel y originar septicemia con puerta de entrada en otras lesiones, otitis que pueden causar meningitis, infecciones oculares, intestinales y del aparato respiratorio. El problema de las infecciones por Pseudomonases cada vez más alarmante, en especial si se tiene en cuenta su alta resistencia a los antibióticos (Paraje y

Paraje, 1976). c. Klebsiella pneumoniae

Generalmente se presenta como cocobacilos, rodeados de una capsula grande, son inmóviles y no esporulados. Están especialmente asociados a procesos respiratorios, pudiendo ocasionar faringitis, sinusitis, pleuresías y ciertos tipos de

39 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

neumonías graves; también pueden originar infecciones genitourinarias, meningitis, peritonitis, diarreas en niños y septicemias. Su importancia clínica radica en su gran resistencia a los antibióticos (Paraje y Paraje, 1976).

B.2. Antibiótico

Los antibióticos (AB) son compuestos relativamente sencillos producidos por bacterias u hongos que atacan específicamente a las bacterias. Interfieren en algún paso del metabolismo donde encuentran un blanco adecuado (Sánchez,

2006).

Los antibióticos se pueden clasificar y agrupar basados en la estructura química y mecanismo de acción propuesto (figura 4), y así se considera:

. Compuesto que inhiben la síntesis de pared bacteriana; entre ellos están

penicilina y cefalosporina, que agrupan semejanza estructural, y también

medicamentos disímbolos como cicloserina, vancomicina y bacitracina

(Chambers, 2003).

. Compuestos que actúan de modo directo en la membrana celular del

microorganismo y que afectan su permeabilidad y permiten la fuga de

40 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

compuestos intracelulares; entre ellos están los detergentes como polimixina

(Chambers, 2003).

. Medicamentos que afectan la función de las subunidades ribosómicas 30S o

50S y causan inhibición reversible de la síntesis proteínica; estos productos

bacteriostáticos incluyen cloranfenicol, tetreciclina, eritromicina, clindamicina y

pristinanicinas (Chambers, 2003).

. Compuestos que se unen a la subunidad ribosómica 30S y alteran la síntesis

de proteínas, todo lo cual culmina con la muerte del microorganismo; incluyen

los aminoglucósidos (Chambers, 2003).

. Medicamentos que afectan el metabolismo de ácido nucleíco como las

rifamicinas (por ejemplo rifampicina) que bloquean la polimerasa de ARN y las

quinolonas, que inhiben a las topoisomerasa (Chambers, 2003).

. Antimetabolitos como el trimetropim y las sulfonamidas, que bloquean enzimas

esenciales del metabolismo del fosfato (Chambers, 2003).

 Antivirales de varias clases; entre ella:

41 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

 Análogos de ácido nucleico como aciclovir o ganciclovir, que inhiben de

manera selectiva a la polimerasa de ADN viral, y zidovudina o la

lamivudina, que inhiben a la inversotranscriptasa (Chambers, 2003).

 Inhibidores de inversotranscriptasa no nucleósidos, como nevoparina o

efavirenz (Chambers, 2003).

 Inhibidores de otras enzimas virales esenciales, por ejemplo, inhibidores

de la proteasa de VIH o de la neuraminidasa del virus de la influenza

(Chambers, 2003).

FIG. 4: TIPOS DE ANTIBIÓTICOS Y SUS BLANCOS DE ACCIÓN

42 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

(Sánchez, 2006).

B.3. Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites esenciales

Para la evaluación antimicrobiana de aceites esenciales, se aplica generalmente métodos convencionales probados con capacidades antibióticas. Hay dos técnicas básicas usadas para la valoración de ambas actividades: antibacterial y antimicótica de los aceites esenciales:

. El método de difusión en agar (pozo o disco de papel) (Kalemba y Kunicka,

2003).

. El método de dilución (agar o caldo líquido). Las pruebas y evaluación de la

actividad antimicrobiana de los aceites esenciales son difíciles debido a su

volatilidad, insolubilidad en agua y complejidad (Kalemba y Kunicka, 2003).

Los aceites esenciales son de naturaleza hidrofóbica y de gran viscosidad. Estas características pueden reducir la capacidad de la dilución o pueden usar distribución desigual del aceite a través del medio, aun si se usa un agente correcto disgregante o solubilizante. Se tiene que comprobar si las concentraciones aplicadas del emulsor o del solvente no afectan el crecimiento y diferenciación de los microorganismos de pruebas(Kalemba y Kunicka, 2003).

43 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

Los cultivos de microorganismos se realizan en medios líquidos, bajo condiciones físicas óptimas para las especies individuales. Los microorganismos tienen que alcanzar una fase apropiada del crecimiento y un número especificado de células tienen que ser utilizado para la prueba (Kalemba y Kunicka, 2003).

B.3.1. Método de Difusión en Agar

El principio en que se basa la técnica de ensayo es bastante simple. Cuando se coloca un disco impregnado en el agar en el que previamente se ha inoculado la bacteria objeto de la prueba, el disco capta humedad y la sustancia impregnada difunde rápidamente hacia fuera a través del agar, produciendo un gradiente de concentración. La sustancia impregnada está presente a una concentración alta cerca del disco y afecta incluso a gérmenes mínimamente sensibles (los microorganismos resistentes crecen hasta el disco). A medida que aumenta la distancia desde el disco, disminuye la concentración de la sustancia y solo los patógenos más sensibles resultan dañados. Si la sustancia inhibe el agente bacteriano, en torno al disco se forma un halo claro. Cuanto más ancha es la zona que rodea el disco, más sensible es el patógeno. El diámetro del anillo es también función de la concentración inicial de la sustancia, de su solubilidad y de su tasa de difusión a través del agar (Prescott et al, 2004).

44 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

El aceite esencial no se usa a menudo en forma pura, generalmente se utilizan sus soluciones. Se preparan en capsulas de Petri, soluciones del aceite esencial en diferentes concentraciones y los discos de papel son sometidosa impregnación.

Las placas se almacenan durante algún tiempo para permitir que todos los componentes del aceite esencial se difundan dentro del agar, después se incuban.

La eficacia del aceite esencial es demostrada por tamaño de la zona de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor del disco y se expresa generalmente como el diámetro de esta zona (milímetros o centímetros) (Kalemba y Kunicka,

2003).

B.3.1.1. Método de Kirby-Bauer

En la actualidad, la prueba de difusión en agar mas empleada es el método de

Kirby-Bauer. Consiste en tocar con una asa o aguja de inoculación, 4 o 5 colonias del patógeno que crece en el agar y se emplea para inocular un tubo con caldo de cultivo. El cultivo se incuba durante unas pocas horas hasta que se enturbia ligeramente, luego se toma con un hisopo la suspensión bacteriana y se emplea para inocular el agar de Mϋeller-Hinton, se deja secar y se coloca sobre este los discos impregnados, luego se incuba por 16 o 18 horas y posteriormente se miden los diámetros de inhibición. Finalmente se interpreta empleando una tabla que

45 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

relaciona el diámetro de la zona de inhibición con el grado de resistencia microbiana (Prescott et al, 2004).

B.3.2.Método de dilución

El método de dilución en serie en agar se utiliza para bacterias y hongos y su modificación con caldo líquido se usa solo para hongos. Los cultivos de agar se realizan en cápsulas de Petri o en tubos, mientras que los cultivos líquidos se realizan en frascos cónicos con un volumen de 100 ml de medio. Para el caldo líquido en frascos cónicos, el índice de crecimiento inhibitorio se calcula (% de los cambios en la biomasa del hongo comparando con el cultivo control) (Kalemba yKunicka, 2003).

Los resultados se pueden presentar en dos maneras:

. El índice de inhibición de crecimiento (Kalemba y Kunicka, 2003).

. La concentración inhibitoria mínima (CIM) o la máxima dilución inhibitoria

(MDI)(Kalemba yKunicka, 2003).

46 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

B.3.2.1. Concentración inhibitoria mínima (CIM)

Proporciona cierta idea de la eficacia de un agente quimioterápico. La CIM es la concentración más baja de un fármaco que impide el crecimiento de un determinado patógeno (Prescott et al, 2004).

47 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

IV. PROBLEMA

¿Cuál sería la composición química y la actividad antibacteriana del aceite esencial de la especieChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.

(Asteraceae),recolectadaen San Rafael de Mucuchíes,Mérida- Venezuela, frente a bacterias grampositivas ygramnegativas representativas, pertenecientes a la

Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC)?

48 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

V. HIPÓTESIS

Especies del género Chromolaena presentan compuestos químicos volátiles como monoterpenos, sesquiterpenos y compuestos fenólicos, cabe esperar que en el aceite esencial de la especie Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H.

Rob. (Asteraceae) estén presentes algunos de estos compuestos y manifiesten actividad antibacteriana frente a bacterias grampositivas y gramnegativas representativas, pertenecientes a la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC).

49 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

VI. OBJETIVOS

A. Objetivo general

Determinar la composición química y actividad antibacteriana del aceite esencial deChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.

(Asteraceae),recolectada en San Rafael de Mucuchíes, Mérida- Venezuela, frente a bacterias grampositivas y gramnegativas representativas, pertenecientes a la

Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC).

A.1. Objetivos específicos

. Recolectar e identificar la especie de estudio en San Rafael Mucuchíes,

Mérida-Venezuela.

. Extraer el aceite esencial mediante la técnica de hidrodestilación utilizando una

trampa de Clevenger.

. Separar e identificar los componentes del aceite a través de la técnica

Cromatografía de Gasesacoplada a Espectrometría de Masas.

. Evaluar la actividad antibacteriana del aceite esencial de la especie

Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob. (Asteraceae),

utilizando el Método de Difusión en Agar con discos de papel.

50 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

VII. MATERIALES Y MÉTODOS

A. Material vegetal

A.1. Recolección e identificación del material vegetal

LaespecieChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob., fuerecolectada en el Municipio Rangel. San Rafael de Mucuchíes a 3 km del cementerio vía Las Cañadas. Mérida - Venezuela (figura 5). Luego se realizó la identificación de la especie por elIngeniero Juan Carmona y se dejóuna muestra testigo (voucher) bajo el Nº935 en el Herbario MERF de la Facultad de Farmacia y

Bioanálisis,Universidad de Los Andes.

FIG. 5: LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA DEL LUGAR DE RECOLECCIÓN DE LA ESPECIEChromolaena meridensis.

Tomado de https://www.google.co.ve/imagenes.

51 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

A.2. Clasificación taxonómica

FIG. 6:Chromolaena meridensis

Foto tomada por la Prof. Diolimar (AristeReino:guieta,Plantae 1964) Buitrago. División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Asterales

Familia: Asteraceae

Subfamilia: Asteroideae

Tribu: Eupatorieae

Género: Chromolaena

Especie: Chromolaena meridensis(B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob. .

B.Obtención y análisis del aceite esencial de Chromolaena meridensis(B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.

B.1. Obtención del aceite por el Método de Hidrodestilación

Para obtener el aceite esencial de la especie en estudio, se recolectaron 1600 gr de las partes aéreas del material vegetal fresco yposteriormente se licuaron con agua para lograr mayor rendimiento del aceite. Luego se procedió a la extracción

52 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

delaceite esencial por medio de un equipo de hidrodestilación, empleando la trampa de Clevenger (figura 7).

La temperatura en el balón de extracción empleado, se mantuvo a 80°C por un tiempo de 4 horas aproximadamente para lograr extraer todo el aceite posible contenido en el material vegetal. Al culminar el proceso de extracción se procedió a guardar el aceite en un frasco hermético de color ámbar para resguardarlo de la luz y el oxígeno, se le adicionó sulfato de sodio anhidro para eliminar el exceso de agua y se almacenó entre 4-5 °C.

B.2. Cromatografía de Gases (CG)

El análisis por Cromatografía de Gases fue realizado en un cromatógrafo de marca Hewlett-Packard 6890 con un detector de ionización de llama. Se empleó una columna HP-5 de 30 metros de largo, 0,25 mm de diámetro y 0,25 m de film.

Se usó Helio como gas portador con un flujo de 1 mL/min. Se empleó una temperatura inicial de 60 ºC (1 min) y luego se calentó a razón de 4 ºC/min hasta

260 ºC. El inyector se mantuvo a 200 ºC y el detector a 230 ºC. Se determinaron los índices de Kováts que fueron calculados en relación con una serie de n- alcanos de C8-C24 y comparados con valores reportados en la literatura (Adams,

1995).

53 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

FIG. 7:DESARRORRO DEL PROCESO DE OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis

B.2. Análisis del aceite esencial

54 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

B.2.1. Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de

Masas (CG-EM)

Los análisis se realizaron en un cromatógrafo de gasesmarca Hewlett-Packard

6890 acoplado a un detector de masas HP5973 (figura 8). El cromatógrafo estaba

equipado con una columna capilar HP-5MS (30 m x 0,25 mm diámetro interno y

espesor de película 0,25 m). La temperatura del inyector y el programa fueron los

mismos usados para el análisis CG. Se inyectó una muestra de 1,0 µL de una

solución al 2% del aceite esencial en n-heptano con reparto 100:1. La

identificación de sus componentes seefectúo mediante comparación

computarizada con las bases de datos: Wiley MS Data y NIST 05.

FIG. 8: CROMATÓGRAFO DE GASES ACOPLADO A UN ESPECTROMETRO DE MASAS

55 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

C. Evaluación de la actividad antibacteriana

Para la evaluación de la actividad antibacteriana del aceite esencial de la especieChromolaena meridensis, se seleccionó el Método de Difusión de Agar usando disco de papel. Esta técnica es la más generalizada y reconocida por su precisión y confiabilidad para la evaluación de la actividad antimicrobiana, lo que hace posible una estimación del grado de inhibición del crecimiento del microorganismo de una forma bastante simple. Los parámetros más importantes de este método son, el diámetro del disco de papel, la cantidad del aceite esencial y el tipo de solvente de dispersión (Kalemba y Kunicka, 2003).

C.1. Preparación de los inoculos bacterianos

Cada bacteria fue cultivada en caldo Müeller-Hinton e incubadas a 37ºC durante

18 horas. A partir de este cultivo, se tomó una parte y se diluyó con solución salina fisiológica estéril (0,85%) hasta obtener una turbidez visualmente comparable al patrón McFarland Nº 0,5, equivalente a 106-8 UFC/mL (Velasco et al, 2007).

C.2. Preparación de las placas de Petri Agar Müeller-Hinton

Las cápsulas de Petri de 5-12 cm de diámetro (usualmente 9 cm) se llenaron con

20 ml de caldo de Agar Müeller-Hinton previamente esterilizado (figura 9) y luego

56 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

se dejaron solidificar a 4°C durante varias horas,una vez solidificado se inocularon en forma homogénea cada microorganismo de ensayo en la superficie del agar con un hisopo estéril.

FIG. 9: PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MEDIO AGAR MÜELLER- HINTON

57 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

C.3.Impregnación de los discos

Se utilizaron discos de papel de filtro de 4milímetros (mm) de diámetro previamente esterilizados en cámara de flujo laminar bajo rayos UV durante 12 horas aproximadamente (figura 10). Se realizarondiluciones del aceite esencial conel solvente dimetilsulfóxido (DMSO)y se impregnaron los discoscon 10µl del aceite puroy diluciones del aceite con concentraciones de 30 μg/mL,15 μg/mL y 10

μg/mL. Tambiénse impregnaron los discos con el solventeDMSO el cual se utilizó como control negativo para comprobar la posible actividad de este solvente frente a las bacterias ensayadas (Velasco et al, 2007)(figura 11). Y los controles positivos estuvieron representados por discos de antibióticos comercialeslos cuales inhibieronel crecimiento bacteriano de las cepasensayadas grampositivas y gramnegativas pertenecientes a la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC)

(tabla IX). En seguida se colocaron en la superficie del agar inoculado, de forma equidistante los discos de papel de filtro ya impregnados, el control negativo y controles positivos respectivos para cada microorganismo(figura 12). Los ensayos se realizaron por duplicado.

58 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

FIG. 10: ESTERILIZACIÓN DE LOS DISCOS DE PAPEL DE FILTRO

FIG. 11: IMPREGNACION DE LOS DISCOS DE PAPEL DE FILTRO

59 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

TABLA IX. MICROORGANISMOS Y CONTROLES POSITIVOS UTILIZADOS MICROORGANISMOS CONTROLES POSITIVOS

GRAM POSITIVAS

Erytromicina® (15 μg) Staphylococcus aureus ATCC 25923

Ampicilina® (10μg) Enterococcus faecalis ATCC29212

GRAM NEGATIVAS

Escherichia coli ATCC 25922

Amikacina® (30μg) Pseudomona aeruginosa ATCC27853

Klebsiella pneumoniae ATCC 23357

FIG. 12: REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA UBICACIÓN DE LOS DISCOS IMPREGNADOS

1. Aceite puro de Chromolaena meridensis. 1 2 2. Aceite diluido (30 μg/mL, 15μg/mL, 10μg/mL) deChromolaena meridensis.

3. Control positivo (antibióticos comerciales) 3 4

4. Control negativo (solvente DMSO)

60 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

C.4. Incubación

Posteriormente el medio de cultivo inoculado se dejó en preincubación durante 6 -

7 horas a4 °C y luego se incubaron a37 °C durante 24 horas (De los Ríos et al,

1999).

C.5. Lectura de la prueba

Transcurrido el tiempo de incubación se precedió a realizar la lectura de los halos de inhibición; el diámetro de la zona de inhibición producto de la actividad antibacteriana del aceite se expresó en milímetros (mm) (Velasco et al, 2007).En los casos donde no se observo halo de inhibición la prueba se interpreto como negativa o resistente.

C.6. Concentración inhibitoria mínima (CIM)

Después de la lectura de los halos de inhibición se procedió a realizar la concentración inhibitoria mínima (CIM), necesaria para inhibir la producción y multiplicación del crecimiento visible de las cepas ensayadas que resultaron ser sensibles (positivas) al aceite esencial de la especie Chromolaena meridensis.

Para esto se empleó el método de Difusión en Agar con Discos que se utilizo inicialmente para la determinación de la actividad antibacteriana. Se tomó una

61 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

parte las cepas bacterianas puras con un asa estéril y se colocaron en SSF 0,85

%, que luego fueron comparados con el patrón de turbidez de Mac Farland N° 0.5

(106-8 UFC/mL). La impregnación de los discos de papel de filtro previamente esterilizados en cámara de flujo laminar bajo rayos UV, se realizó condiluciones del aceite en un intervalo de concentraciones entre 1,25 μg/mL y 10 μg/mL.

También se impregnaron los discos con el solvente DMSO y los controles positivos estuvieron representados por los antibióticos comerciales. Los ensayos se realizaron por duplicado. Transcurrido el tiempo de incubación se realizo la lectura de los halos de inhibición.

62 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

D. Diseño Experimental

Recolección.

ecioapiculata

Material vegetal Chromolaena meridensis.

Identificación.

Partes aéreas frescas.

Equipo de Hidrodestilación empleando la trampa de Clevenger.

Frasco hermético color ámbar, 4–5 °C. Adición de sulfatoanhidro.

Separación e identificación por Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas.

63 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

Método de Difusión en Agar usando disco de papel.

Preparación de los inoculos bacterianos en SSF 0,85 % y comparación con el patrón de Turbidez Mac Farland N° 0,5 (106-8 UFC/mL)

Siembra en Agar Müeller - Hinton.

Impregnación de los discos de 4 mm de diámetro con 10 µl del aceite esencial puroy diluido a 30 μg/mL, 15μg/mL y 10 μg/mL de Chromolaena meridensis y con el respectivo solvente (DMSO).

Preincubación.4 °C – 6 a 7 horas.

Incubación.37 °C – 24 horas.

Lecturas de los halos de inhibición.

CIM a las cepas sensibles frente al aceite esencial.

Resultados y discusión.

Conclusión.

64 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El aceite esencial de la especie Chromolaena meridensis (B. L. Rob.) R.M. King &

H. Rob., recolectada en San Rafael de Mucuchíes. Mérida-Venezuela, se obtuvo a partir de las partes aéreas del material vegetal fresco licuadas con agua para un mayor rendimiento del aceite, las cuales se sometieron a un proceso de

Hidrodestilación empleando la trampa de Clevenger. El aceite obtenido presentó las siguientes características físicas y organolépticas (tabla X).

TABLA X: CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y ORGANOLÉPTICAS DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis

CARACTERÍSTICAS ACEITE ESENCIAL

Aspecto Transparente

Color Amarillo

Peso de hojas 1600gr

Volumen del aceite 1 mL

Rendimiento porcentual (%) 0,063

65 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

Luego de la obtención del aceite esencial, se realizóun análisis para conocer su composición química empleando un equipo de Cromatografía de GasesAcoplada a un Espectrómetro de Masas marcaHewlett Packard 5973.En la figura 13 se presenta el cromatograma de las partes aéreas del aceite esencial deChromolaena meridensis.

En la tabla XI se muestran los componentes volátiles presentes, tiempo de retención y abundancia relativa de cada uno de ellos. En total se lograron identificar 11 compuestos que representan más del 99% de los compuestos presentes en el aceite esencial y corresponden en su mayoría a sesquiterpenos monociclicos que constituyen el 97,75% del total de compuestos, seguido de monoterpenos con un 0,28%, aldehído 0,54% y alqueno 0,87%. Los componentes mayoritarios resultaron ser los sesquiterpenos: α – zingibereno (65,26%)[17], α – curcumeno (13,74%)[21], α - humuleno (8,20)[22], β – sesquifelandreno

(4,06%)[23] yβ - cariofileno (2,93%)[24]; cuyas estructuras se representan en la figura 14.

66 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

FIG. 13: CROMATOGRAMA DEL ACEITE ESENCIAL DE LAS PARTES AÉREAS DE LA ESPECIEChromolaena meridensis

67 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

TABLA XI: COMPONENTES VOLÁTILES DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaena meridensis

COMPONENTES TR A % IK cal IK lit

Benzaldehído 5.705 0.54 965 961

Mirceno 6.367 0.13 991 991

α – terpineno 6.650 0.15 1002 1018

α – terpinoleno 9.086 0.87 1092 1088

β - cariofileno 19.592 2.93 1420 1418

α – bergamoteno 20.069 1.98 1438 1436

α - humuleno 20.664 8.20 1459 1454

α – curcumeno 21.500 13.74 1487 1483

α – zingibereno 22.095 65.26 1507 1495

β – bisaboleno 22.319 1.58 1514 1509

β – sesquifelandreno 22.758 4.06 1529 1524

TR: Tiempo de retención obtenido en el equipo CG-EM

A: Área

IKcal: Índice de kováts calculado

IKlit: Índice de kováts de la literatura

68 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

FIG. 14: ESTRUCTURAS QUÍMICAS DE LOS COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DEChromolaena meridensis

SESQUITERPENOS

H

[17] [21] [22]

H H H

[23][24]

69 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

Según la literatura consultada no existen estudios previos sobre la composición química del aceite esencial de Chromolaena meridensis, sin embargo se han estudiado otras especie pertenecientes al género.

En el año 2002 Maia et al, 2002reportó el sesquiterpeno α- zingibereno como componente mayoritario del aceite esencial de Chromolaena marginatum en una proporción de 57,5%, lo cual coincide con los resultados reportados paraChromolaena meridensis, que presenta dicho compuesto en un 65,26%.

En este mismo estudio se reportó el compuestoβ- cariofileno en el aceite esencial deChromolaena squalidum, Chromolaena amygdalinun y Chromolaena conyzoides en proporción de 7,1% para las tres especies, mientras que para

Chromolaenameridensis, este compuesto se encontró en un 2,93%.

Por otra parteOwolabi et al, 2010reportó también en su estudioel compuestoβ- cariofileno,presentecomo uno de los componentesmayoritarios del aceite esencial de Chromolaena odorataen un 5,4%.

Para el estudio de la actividad antibacteriana del aceite esencial de Chromolaena meridensis, se empleó el Método de Difusión en Agar con discos de papel utilizandocepas de referencia grampositivas y gramnegativas, presentando

70 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

actividad inhibitoria frente a las cepas de Staphylococcus aureusATCC 25923,

Streptococcus faecalisATCC 29212 y Klebsiella pneumoniaeATCC 23357, con halos que oscilan entre 6 a 11 mm de diámetro y una concentración inhibitoria mínima de 10 μg/mL . En la tabla a continuación se representan las lecturas de las zonas de inhibición expresadas en milímetro (mm) y CIM.

71 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

TABLA XII: ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis

Zonas de inhibición expresadas en mm

Concentraciones en μg/mL

Aceite 30 15 10 CIM Microorganismos puro

Staphylococcus aureusATCC 25923 11 8 7 5 10

Streptococcus faecalisATCC 29212 10 8 7 7 10

Escherichia coliATCC25922 R R R R _

Pseudomona aeruginosaATCC 27853 R R R R _

Klebsiella pneumoniae ATCC 23357 9 6 6 6 10

R: Resistente

CIM: Concentración Inhibitoria Mínima

ATCC: Colección de Cultivo Tipo Americano

-: No hubo actividad

Rango CIM: 1,25 μg/mL – 10 μg/mL

72 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

La actividad antibacteriana que se manifestó se podría atribuir a la presencia de los compuestosα-zingibereno, β-sesquifelandreno y β-cariofileno, que han sido los responsables de la actividad antibacteriana en otros géneros.

En un estudio realizadoen Turquía porKahriman et al, 2011 se comprobó que el componente mayoritario α- zingibereno presente en el aceite esencial de las hojas deSenecio pandurifolius,demostró una actividad inhibitoria (por el Método de

Difusión en Agar) frente a las cepas de referencia Staphylococcus aureus y

Enterococcus faecalis con halos de inhibición de 15 mm y 12 mm de diámetro respectivamente, resultando la concentración más baja capaz de inhibir las cepas

6,5 μg/mL. Parael caso de Chromolaena meridensisel compuesto α– zingiberenotambién está presente en el aceite esencial de las hojas frescas en mayor proporción y la actividad antibacteriana se manifestó contra las mismas cepas con halos de inhibición para el caso de Staphylococcus aureusde 11 mm de diámetro y Enterococcus faecalisde 10 mm de diámetro, con una Concentración

Inhibitoria Mínima de 10μg/.

Por otra parte en un estudio realizado por El-Baroty etal, 2010se caracterizó la propiedad antibacterial de los compuestos β-sesquifelandreno y β – cariofileno presentes en el aceite esencial extraído del rizoma de jengibre en gran

73 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

proporción, frente a las cepas de referencia: Staphylococcus aureus yKlebsiella pneumoniae.Encontrándose similitud con los resultados reportadosen el presente estudio, dondela actividad inhibitoria se mostró frente a las mismas cepas y los componentes β-sesquifelandreno y β – cariofilenotambién están presentes en el aceite esencial de Chromolaena meridensis.

Aun cuando existen estudios que confirman la actividad inhibitoria de algunos extractos de diferentes especies del género Chromolaena sobre una variedad de cepas bacterianas (Torrenegra et al, 2007; Sanabria et al, 1998; Sanabria et al,

1989; Sanabria y Carrero, 1995; y Hidalgo et al,1998), este es el primer estudio que se realiza para evaluar la actividad inhibitoria del aceite esencial de la especie

Chromolaena meridensis contra cepasde referencia grampositivas

(Staphylococcus aureusATCC 25923 y Streptococcus faecalisATCC 29212) y gramnegativas (Escherichia coliATCC 25922, Pseudomona aeruginosaATCC

27853y Klebsiella pneumoniae ATCC 23357).

74 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

IX. CONCLUSIONES

. El aceite esencial extraído de las partes aéreas de la especie Chromolaena

meridensis por el método de Hidrodestilaciónempleando la trampa de

Clevenger mostró un rendimiento de 0,063%.

. Los componentes identificados de acuerdo al análisis cromatográfico y

espectroscópicoresultaron ser 11 compuestos, en su mayoría sesquiterpenos

monociclicos que representan el 97,75% del total de compuestos, luego

monoterpenos con un 0,28 %, alqueno 0,87 % y aldehído 0,54 %.

. Los componentes mayoritarios del aceite esencial, están representados en su

totalidad por los sesquiterpenos: α – zingibereno (65,26%), α – curcumeno

(13,74%), α - humuleno (8.20), β – sesquifelandreno (4,06%) y β - cariofileno

(2,93%).

. El aceite esencial de Chromolaena meridensis, presentó actividad inhibitoria

frente a tres de las cepas ensayadas: grampositivas (Staphylococcus aureus

ATCC y Streptococcus faecalis ATCC 29212) y gramnegativas (Klebsiella

pneumoniae ATCC 23357); y una Concentración Inhibitoria Mínima de 10

μg/mL.

75 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

76 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

ANEXO 1: VOUCHER DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis UBICADO EN EL HERBARIO MERF

77 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

ANEXO 2: EQUIPO DE HIDRODESTILACION EMPLEANDO LA TRAMPA DE CLEVENGER

78 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

ANEXO 3:DISCOS DE PAPEL DE FILTRO DE 4 MILÍMETROS DE DIÁMETRO

ANEXO 4:COLOCACIÓN DE LOS DISOS IMPREGNADOS CON EL ACEITE ESENCIAL DE C. meridensisy CON DMSO

79 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

ANEXO 5:ENSAYO DE LA CEPA DEE. coli ATCC 25922

ANEXO 6:ENSAYO DE LA CEPA DE K. pneumoniaeATCC 23357

80 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

ANEXO 7: ENSAYO DE LA CEPA DE P. aeruginosaATCC 27853

ANEXO 8: ENSAYO DE LA CEPA DE S. aureusATCC 25923

81 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

ANEXO 9: ENSAYO DE LA CEPA DE E. faecalisATCC 29212

82 Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la Especie Chromolaena meridensis.

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