Universidade de São Paulo Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto Departamento de Química Programa de Pós-Graduação em Química
Estudo fitoquímico deTrichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae-Eupatorieae)
Endler Marcel Borges
Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: Química
RIBEIRÃO PRETO - SP 2006 ENDLER MARCEL BORGES
Estudo Fitoquímico de Trichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae-Eupatorieae)
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Química. Orientadora: Profa. Dra. Dionéia Camilo Rodrigues de Oliveira
Ribeirão Preto 2006
FICHA CATALOGRÁFICA
Borges, Endler Marcel Estudo Fitoquímico de Trichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae-Eupatorieae). Ribeirão Preto, 2006. 82 p. : il. ; 30cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Química. Orientadora: Oliveira, Dionéia Camilo Rodrigues de
1. Asteraceae. 2. Eupatorieae. 3. Trichogonia menthaefolia Gardner.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Endler Marcel Borges Estudo Fitoquímico de Trichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae-Eupatorieae)
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Química
Aprovado em
Banca Examinadora
Prof(a). Dr(a). ______
Instituição ______
Assinatura: ______
Prof(a). Dr(a). ______
Instituição ______
Assinatura: ______
Prof(a). Dr(a). Orientador(a)______
Instituição ______
Assinatura: ______Agradecimentos
À Profa. Dra. Dionéia Camilo Rodrigues de Oliveira, pela orientação.
À Profa. Dra. Diones Aparecida dias pelo incentivo.
Ao Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes pela coleta do material vegetal
Ao Prof. Dr. João Luis Callegari Lopes pela colaboração
À minha avó e pelo apoio, incentivo e compreensão.
À minha mãe e pelo apoio, incentivo e compreensão.
À funcionária Virgínia,da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto pela obtenção dos espectros de RMN.
Ao José Carlos Tomaz, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto pela amizade.
Aos pós-graduandos Humberto Sakamoto e Renata Takeara pelas valiosas lições.
À Mailyn por todo o carinho.
À Poly, pelo incentivo, apoio, auxílio e companheirismo.
Ao CNPq pela concessão da bolsa.
À FAPESP pelo auxílio á pesquisa concedido.
À CAPES pelo auxílio indireto.
A todos aqueles que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
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Sumário
Lista de abreviaturas i Lista de tabelas i Lista de figuras i Resumo i Abstract i Metabólitos isolados i 1. Introdução 01 1.1. Considerações gerais 01 1.2. A fitoquímica e o novo milênio 03 1.3. Família, tribo, subtribo, gênero e espécie 05 2. Objetivos 10 3. Materiais e métodos 11 3.1. Fases estacionárias para cromatografia 11 3.2. Solventes e reagentes 12 3.3. Instrumentos 12 3.4. Métodos 13 3.4.1. Metodologia utilizada nas análises por CG 13 3.4.2. Metodologia para a obtenção dos espectros massas 14 3.4.3. Metodologia para o preparo das amostras a serem cromatografadas 14 4. Procedimento experimental 15 4.1. Coleta e identificação do material vegetal 15 4.2. Preparação dos extratos brutos 15 4.3. Isolamento e purificação dos constituintes químicos do extrato em diclorometano 17 4.3.1. Isolamento dos constituintes químicos das frações obtidas da CLV do extrato em diclorometano 18 4.4. Isolamento dos constituintes químicos do extrato metanólico 21 5. Identificação estrutural 23 5.1. Identificação estrutural do sesquiterpeno 6α-angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno 23 (1) 5.2. Identificação estrutural do triterpeno 3α-hidroxi-olean-12-eno (2) 26 5.3. Identificação estrutural da mistura dos triterpenos presentes na fração 29 TmD-5 (3, 4, 5 e 6) 5.4. Identificação estrutural dos esteróides (7, 8, 9, 10 e 11) 33 5.5. Identificação estrutural do flavonóide ramnocitrina (12) 38 5.6. Identificação estrutural do flavonóide ramnocitrina 41 3-O-β-galactopiranosídeo (13) 6. Conclusões 44 7. Referências bibliográficas 46
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Lista de Abreviaturas
Tr – tempo de retenção relativo Rf - fator de retenção CLV – Cromatografia Líquida a Vácuo CCDC - Cromatografia em Camada Delgada Comparativa CCDP - Cromatografia em Camada Delgada Preparativa CC - Cromatografia em Coluna Clássica CG - Cromatografia de fase Gasosa FID – Flame Ionization Detector EM – Espectrometria de Massas EM-EM – Espectrometria de Massas Seqüencial DEPT 1350 – Distorsioneless Enhancement by Polarization Transfer 1350 HMQC – Detected Heteronuclear Multiple Quantum Coherence PND – Proton Noise Decoupling RMN 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN 13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13 AcOEt – Acetato de Etila
Et2O – Éter Etílico MeOH – Metanol
CH2Cl2 – Diclorometano
CHCl3 – Clorofórmio
DMSO-d6 - Dimetilsulfóxido Deuterado TmD – Extrato bruto de Trichogonia menthaefolia em Diclorometano
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Fitoquímica de espécies de Trichogonia ...... 8
Tabela 2- CLV do extrato em diclorometano da Trichogonia menthaefolia ...... 17
Tabela 3- CC da fração TmD-6 ...... 22
Tabela 4- Dados de RMN 1H da substância 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno comparados com os dados da literatura (Bohlmann et al., 1981b)...... 24
Tabela 5- Dados de RMN obtidos dos espectros de 13C (PND e DEPT 135º) e nos mapas de contorno do HMQC (δ em ppm, CDCl3) ...... 25
13 Tabela 6- Dados de RMN C (δ em ppm, CDCl3) do triterpeno 3α-hidroxi-olean- 12-eno comparados com os valores da β-amirina (Mahato et al, 1994) ...... 28
13 Tabela 7- Dados do espectro de RMN de C (δ em ppm, CDCl3) para β-amirina e lupeol comparados com os dados da literatura (Mahato et al., 1994)...... 30
13 Tabela 8- Dados do espectro de RMN de C (δ em ppm, CDCl3) para pseudotaraxasterol e taraxasterol comparados com os dados da literatura (Mahato et al., 1994)...... 31
Tabela 9- Identificação das substâncias presentes em TmD-5 (Coluna HP-50)...... 32
Tabela 10- Identificação das substâncias presentes em TmD-5 (Coluna HP-1)...... 32
13 Tabela 11- Resultados experimentais de RMN de C (δ em ppm, CDCl3) para os esteróides β-sitosterol e estigmasterol comparados com a literatura (Kojima et al., 1990)...... 35
13 Tabela 12- Resultados experimentais de RMN de C (δ em ppm, CDCl3) para os esteróides estigmast-7-en-3β-ol e espinasterol comparados com a literatura (Kojima et al., 1990)...... 36
Tabela 13- Identificação da mistura de esteróides (coluna HP-50) ...... 37
Tabela 14- Identificação da mistura de esteróides (coluna HP-1) ...... 37
Tabela 15- Dados do espectro de RMN 1H do flavonóide ramnocitrina comparados com a literatura (Barberá et al., 1986) e (Harborne,1995) ...... 39
iv
13 Tabela 16- Dados do espectro de RMN C (δ em ppm, DMSO-d6) do flavonóide ramnocitrina comparados com a literatura (Agrawal et al., 1989) ...... 39
Tabela 17- Dados do espectro de RMN 1H do flavonóide ramnocitrina comparados com os da ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo ...... 42
Tabela 18- Valores de RMN 1H do flavonóide ramnocitrina 3-O-β- galactopiranosídeo comparados com os valores da literatura (Barberá et al., 1986)...... 42
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Esquema representativo da obtenção dos extratos brutos do pó de T. menthaefolia...... 16
Figura 2- Fluxograma do trabalho experimental realizado com o extrato diclorometânico de T. menthaefolia...... 19
Figura 3- Fluxograma do trabalho experimental realizado com o extrato metanólico de T. menthaefolia...... 22
Figura 4- Proposta de fragmentação da ramnocitrina no modo positivo que confirma a metoxila em C7 (March & Miao., 2004) ...... 40
Figura 5- Proposta de fragmentação para a ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13) (March et al., 2006)...... 43
1 Figura 6- Espectro de RMN H (δ em ppm, CDCl3 e 400MHz) do sesquiterpeno 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)...... 48
Figura 7- Expansões de parte do espectro presente na figura 6...... 49
Figura 8- Expansões de parte do espectro presente na figura 6...... 50
13 Figura 9- Espectro de RMN C (PND, δ em ppm; CDCl3, 100MHz) do sesquiterpeno 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)...... 51
13 Figura 10- Espectro de RMN C (DEPT 135º, δ em ppm; CDCl3, 100MHz) do sesquiterpeno 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)...... 52
Figura 11- Mapas de contorno do HMQC...... 53
Figura 12- Expansão dos mapas de contorno do HMQC presente na figura 11 ...... 54
1 Figura 13- Espectro de RMN H (δ em ppm, CDCl3 e 400MHz) do triterpeno 3α- hidroxi-olean-eno (2)...... 55
Figura 14- Expansões de parte do espectro presente na figura 13...... 56
13 Figura 15- Espectro de RMN C (PND, δ em ppm; CDCl3, 100MHz) do triterpeno 3α-hidroxi-olean-eno (2)...... 57
Figura 16- Expansões de parte do espectro presente na figura 15...... 58
13 Figura 17- Espectro de RMN C (DEPT 135º, δ em ppm; CDCl3, 100MHz) do triterpeno 3α-hidroxi-olean-eno (2)...... 59
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Figura 18- Cromatograma obtido por CG da mistura de triterpenos: A- padrão de referência, B- β-sitosterol (7), C- β-amirina (3), D- lupeol (4), E- pseudotaraxasterol (6) e F- taraxasterol (5) (coluna HP-1) ...... 60
Figura 19- Cromatograma obtido por CG da mistura de triterpenos: A- padrão de referência, B- β-sitosterol (7), C- β-amirina (3), D- lupeol (4), E- pseudotaraxasterol (6) e F- taraxasterol (5) (coluna HP-50)...... 61
1 Figura 20- Espectro de RMN H (δ em ppm, CDCl3 e 400MHz) da mistura dos triterpenos (3, 4, 5 e 6)...... 62
13 Figura 21- Espectro de RMN C (PND, δ em ppm; CDCl3, 100MHz) da mistura dos triterpenos (3, 4, 5 e 6)...... 63
13 0 Figura 22- Espectro de RMN C (DEPT 135 , δ em ppm; CDCl3, 100MHz) da mistura dos triterpenos (3, 4, 5 e 6)...... 64
Figura 23- Cromatograma dos padrões dos esteróides: A- padrão de referência, B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7- em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-50)...... 65
Figura 24- Cromatograma dos padrões dos esteróides: A- padrão de referência, B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7- em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-1)...... 65
Figura 25- Análise por CG da mistura dos esteróides: A- padrão de referência, B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7- em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-50)...... 66
Figura 26- Análise por CG da mistura dos esteróides: A- padrão de referência, B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7- em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-1)...... 66
Figura 27- Enriquecimento com padrões na mistura dos esteróides: A- padrão de referência, B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-50)...... 67
1 Figura 28- Espectro de RMN H (δ em ppm; CDCl3, 400MHz) da mistura dos esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)...... 68
Figura 29- Expansões de parte do espectro presente na figura 28...... 69
13 Figura 30- Espectro de RMN C (PND, δ em ppm; CDCl3, 100MHz) da mistura dos esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)...... 70
13 0 Figura 31- Espectro de RMN C (DEPT 135 , δ em ppm; CDCl3, 100MHz) da mistura dos esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)...... 71
1 Figura 32- Espectro de RMN H (δ em ppm; DMSO-d6, 400MHz) do flavonóide ramnocitrina (12)...... 72 vii
Figura 33- Expansões de parte do espectro presente na figura 32...... 73
13 Figura 34- Espectro de RMN C (PND, δ em ppm; DMSO-d6, 100MHz) do flavonóide ramnocitrina (12)...... 74
13 0 Figura 35- Espectro de RMN C (DEPT 135º, δ em ppm; DMSO-d6, 100MHz) do flavonóide ramnocitrina (12)...... 75
Figura 36- EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina (12)...... 76
Figura 37- EM-EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina (12)...... 77
Figura 38- EM-EM no modo positivo do flavonóide ramnocitrina (12)...... 78
Figura 39- Espectro de RMN de 1H do flavonóide ramnocitrina 3-O-β- galactopiranosídeo (13) (δ em ppm, DMSO-d6, 400MHz)...... 79
Figura 40- Expansão de parte do espectro presente na figura 39...... 80
Figura 41- EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina 3-O-β- galactopiranosídeo (13)...... 81
Figura 42- EM-EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina 3-O-β- galactopiranosídeo (13)...... 82
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Resumo
BORGES, E.M. Estudo fitoquímico de Trichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae- Eupatorieae). 2006. 82p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
Neste trabalho estamos apresentando o estudo fitoquímico das partes totais da espécie Trichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae-Eupatorieae). O material vegetal foi coletado em Furnas – MG e a partir do pó seco foram preparados os extratos em diclorometano e em metanol, em seqüência. Do extrato diclorometânico foram isolados: o sesquiterpeno 6α- angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno, o triterpeno 3α-hidroxi-olean-12-eno, os triterpenos lupeol, taraxasterol, pseudotaraxasterol e 3β-hidroxi-olean-12-eno (identificados em mistura), os esteróides β-sitosterol, estigmasterol, campesterol, estimast-7-en-3β-ol e espinasterol (identificados em mistura) e o flavonóide ramnocitrina. Do extrato metanólico foi isolado o flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo. Estas substâncias, após isolamento e purificação por métodos cromatográficos, foram identificadas com o auxílio de várias técnicas espectroscópicas como: EM, EM-EM, RMN de 1H, 13C (PND; DEPT 135º) e a técnica bidimensional HMQC. Na identificação das misturas de triterpenos e esteróides a cromatografia de fase gasosa também foi utilizada.
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Abstract
BORGES, E.M. Phytochemistry study of Trichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae- Eupatorieae). 2006. 82p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
In this study we are presenting the results of the phytochemical investigation of the Trichogonia menthaefoli Gardner (Asteraceae-Eupatorieae). This specie was collected in Furnas – MG. Dicholorometanic and methanolic extracts were prepared from the dried powder plant material. These extracts were fractioned through chromatoghraphic methods. The dichloromethanic extract furnished the: sesquiterpene 6α-angeloyloxy-eudesm-4(15)-ene; triterpenes: 3α-hydroxy-olean-12-ene, lupeol, taraxasterol, pseudo-taraxasterol and 3β- hydroxy-olean-12-ene (identified in mixture) and the steroids: sitosterol, stigmasterol, stigmast-7-en-3β-ol, spinasterol and campesterol (identified in mixture) and the flavonóide rhamnocitrin. The methanolic extract afforded the flavonoid rhamnocitrin 3-O-β- galactopyranoside. Compound identification was performed by using a variety of spectroscopic methods, such as: MS, MS-MS, 1H and 13C NMR and HMQC bidimensional technique. The identification of mixtures (triterpenes and steroids) was also performed by gas chromatography in addition to other spectroscopic methods.
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Metabólitos Isolados
Sesquiterpeno 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1) 14
1 9 2 10 8 3 5 7 4 6 12 11 H 13 15 O 5' 1' 2'
O H 3' 4'
Triterpenos
α 29 30 3 -hidroxi-olean-12-eno (2). 3β-hidroxi-olean-12-eno (3). 29 30 β epi- -amirina (2) 20 21 β-amirina (3) 19 19 20 21 12 18 22 12 18 17 17 22 25 26 13 25 11 11 26 13 H 28 28 9 14 9 14 H 1 16 1 16 2 10 8 2 15 10 8 15 3 H 27 H 4 5 7 3 5 7 27 6 4 6 HO HO H H 20 23 24 23 24 21 19 H 12 18 22 17 25 26 lupeol (4) 11 13 9 14 H 28 1 16 2 10 8 15 H 3 5 7 4 6 27 HO 30 H 23 30 29 24 29 20 19 21 pseudotaraxasterol (6) taraxasterol (5) 20 21 12 H 19 18 22 17 12 H 18 25 11 26 13 17 22 28 25 9 14 H 11 26 13 1 16 H 28 2 10 9 14 8 15 1 16 3 H 27 2 10 8 4 5 7 15 6 3 H 27 HO 4 5 7 H HO 6 23 24 H 23 24
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Esteróides
21 22 28 29 19 12 20 24 17 26 18 11 23 H 13 25 H 9 16 14 27 1 15 2 10 8 H H H H 3 4 OH 7 OH 5 6 estigmasterol (8) β-sitosterol (7)
H
H H campesterol (9) OH
H H OH H H H OH espinasterol (11) estigmast-7-en-3β-ol (10) H
Flavonóides
3' 3' OH OH 2' 2' 4' 4' 8 B 1' 1' O 7 10 O 5' O 10 O 5' OH 1 8 1 OH 2 6' 7 2 6' 6'' A C 3 6 3 O H 5'' 4'' 6 4 5 4 9 9 H 5 OH O 2'' OH 1'' HO H OH O OH O 3'' H H ramnocitrina (12) ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13)
______Introdução 1
1. Introdução
1.1. Considerações gerais
A importância dos produtos naturais é ilustrada por Gragg e colaboradores, em seu trabalho eles verificaram que 157 das 520 (30%) novas drogas aprovadas pela Food and Drug
Administration nos Estados Unidos num período de 12 anos (1983-1994) eram produtos naturais ou seus derivados. Isto é uma evidência da importância e do crescimento da fitoterapia, seja em países pobres onde não existem outras alternativas ou em países ricos onde programas bem direcionados buscam novas alternativas onde os métodos comumente utilizados pelas indústrias farmacêuticas não correspondem as expectativas (Cordell, 2000).
A fitoterapia data de antes do início do cristianismo perfazendo pergaminhos, escritas e conhecimentos transmitidos de pai para filho, que sobreviveram até os dias atuais. Mas foi apenas em 1524 que Paracelsus atentou pela necessidade de descobrirmos o que as plantas medicinais possuíam que era capaz de promover a cura. Foi quando ele escreveu “Archidoxa” do “Arcanum”, o primeiro relato a respeito da procura pelos princípios ativos (Cordell, 2000).
Esta necessidade de descobrir as entidades responsáveis pela cura, as quais foram propostas inicialmente por Paracelsus começou por volta de 1780 com o trabalho de Scheele, onde se estudava os ácidos orgânicos de várias espécies de plantas medicinais. Os trabalhos de Scheele e seus antecessores esbarraram em recursos experimentais extremamente limitados
(Cordell, 2000).
No final do século XIX, a química se constituiu como disciplina científica moderna, com os trabalhos de Lavoisier, Berzelius e Liebig, sendo esta a época em que química e medicina caminharam juntos, foi esta a época em que os mais importantes alcalóides da ______Introdução 2 medicina convencional, tais como morfina, atropina, papaverina, codeína e efedrina foram descobertos (Cordell, 2000).
Foi nesta época que o exemplo mais clássico de medicamento concebido através de produtos naturais, a aspirina (Acido Acetil Salicílico) foi desenvolvido, a história da aspirina começou a alguns milênios na Europa, Ásia e África onde se usava as cascas da Salix alba para combater a febre e a dor, em 1898, Felix Hoffman, sintetizou um composto de caráter menos ácido, acetilando o grupo hidroxila na posição orto, descobrindo assim a aspirina, que hoje comemora um centenário e representa cerca de 1,2% do mercado mundial de medicamentos (Cordell, 2000).
No entanto após a revolução industrial do século XIX, mais especificamente entre
1901 e 1970, teve início a procura de substâncias químicas de origem sintética que pudessem ser utilizadas como medicamentos, o exemplo mais clássico disto são os trabalhos realizados por Ehrlich e outros realizados entre 1909 e 1935 e da descoberta das Sulfas por Ernest
Foumeau (Cordell, 2000).
Este período ficou marcado pela descoberta das mais importantes substâncias sintéticas, tais como: amilocaína, procaína, ácido-5-etil-5-fenilbarbitúrico e a famosa penicilina advinda de experiências com fungos. Iniciando-se assim uma nova era onde as grandes indústrias farmacêuticas estagnaram suas pesquisas com produtos naturais, e as indústrias farmacêuticas começaram a apostar violentamente nos métodos de screening
(Cordell, 2000).
Os métodos de screening utilizando compostos de origem sintética, semi-sintética e química combinatória se mostraram demasiadamente sedutores frente a compostos de origem natural como os extratos de plantas, culturas de fungos e fermentações bacterianas, uma vez que compostos de origem natural geralmente estão presentes como misturas complexas de ______Introdução 3 difícil separação assim como na maioria dos casos, salvo raras exceções, são de difícil elucidação estrutural (Filho & Yunes, 2001).
1.2. A fitoquímica e o novo milênio
Durante os últimos anos a atenção da indústria farmacêutica tem se voltado novamente para os produtos naturais, em especial por causa de três novas drogas de origem vegetal; taxol, etoposídeo e artemisinina (Phillipson, 2001).
O taxol é obtido das cascas do Taxus brevifolia, sendo sua atividade contra o câncer conhecida desde a década de 60, o taxol teve sua estrutura elucidada em 1971 e apenas na década de 90, que o taxol e seu análogo semi-sintético o taxotere tiveram sua eficiência comprovada contra o câncer de ovário e seio. Cabe também ressaltar que para obter 1900g de taxol são necessárias 27.300kg de cascas ou seja aproximadamente 6.000 árvores (Cordell,
1995). A busca por uma fonte de taxol capaz de atender as demandas do mercado, culminou na semi-síntese e na síntese total do taxol, revolucionando a química orgânica sintética
(Viegas et al., 2006).
O etoposídeo é a principal substância presente na resina da Podophyllum peltatum, sendo que esta substância inibe a divisão celular, sendo seu análogo semi-sintético eficiente no combate ao câncer de pulmão e testículos (Phillipson, 2001).
A artemisinina isolada como princípio ativo da Artemisia annua, se mostrou eficaz contra a malária, sendo que a descoberta da mesma impulsionou o desenvolvimento de novas drogas antimaláricas como: β-arteméter, o arte-éter e o artesunato de sódio todos estes derivados semi-sintéticos da artemisinina (Viegas et al., 2006).
As pesquisas com o taxol, etoposídeo e artemisinina impulsionaram a indústrias farmacêuticas a investirem novamente em pesquisas com produtos naturais, sendo que a ______Introdução 4 maior parte dos esforços com produtos naturais tem como objetivo a descoberta de novas drogas anti-câncer, um reflexo disto é que no período de 1983-1994, 61% das novas drogas anti-câncer provinham de produtos naturais (Cordell, 2000). No entanto o principal interesse das pesquisas com produtos naturais, atualmente, não é produzir drogas melhores do que as que já existem no mercado e sim fornecer novas alternativas. Dentre os milhares de exemplos que podem ser dados existem três que convém serem destacados:
O Ginkgo biloba utilizado no controle de problemas vasculares cerebrais, de memória e com propriedades neuroprotetoras ilustra um exemplo de fitoterápico de sucesso. A partir dos extratos dessa planta, Nakanishi e colaboradores isolaram os ginkolídeos-A, B, C, e M que demonstraram importantes propriedades antitrombóticas (Viegas et al., 2006).
Do extrato da erva-de-São-João (Hypericum perforatum), foi isolado a hipericina, utilizada como antidepressivo. Aparentemente, as propriedades atribuídas a este extrato devem-se a hiperforina, que compreende uma mistura de tautômeros. Atualmente na
Alemanha para cada 30 mil receitas de fluoxetina (Prozac) são emitidas 200 mil de
Hypericum sp. (Filho & Yunes, 2001).
O gossipol, obtido do óleo de semente do algodão (Gossypium sp.), foi amplamente utilizado na China como contraceptivo masculino, propriedade confirmada em 1980 (Viegas et al., 2006).
Desta maneira a fitoquímica desempenha um papel importante na medida em que com o isolamento, purificação e identificação estrutural de substâncias químicas, implementa a literatura com informações químicas que podem ser utilizadas, após estudos biológicos, como fontes alternativas frente às drogas existentes no mercado além de fornecer novos modelos de fármacos, para química medicinal (modelagem molecular).
______Introdução 5
1.3. Família, tribo, subtribo, gênero e espécie.
A família Asteraceae (Compositae) é a maior de todas as famílias, compreendendo
1535 gêneros e mais de 23.000 espécies conhecidas, distribuídas por 3 subfamílias e 17 tribos.
Sendo o conceito de subfamília recente, tanto é que as subfamílias Asteroideae e
Cichorioideae se tornaram conhecidas por volta de 1970, e a subfamília Barnadesioideae foi descrita apenas em 1992, por sua vez os conceitos de tribo são bem mais antigos, tendo seu início por volta de 1900 com os trabalhos pioneiros de Henri Cassini e Carl Linnaeus
(Bremer, 1994).
As espécies da família Asteraceae são amplamente distribuídas pelo mundo, mas é particularmente abundante no oeste dos Estados Unidos e do México, no sul do Brasil, ao longo dos Andes, nas Áreas Mediterrâneas, Sudeste Asiático, Ásia Central, Sul da África e
Austrália (Bremer, 1994).
A tribo Eupatorieae compõe a maior parte das asteraceas nas regiões Neotropicais, a qual também se apresenta nos Estados Unidos e Canadá, assim como por todo Hemisfério
Ocidental. Integrantes da tribo que foram introduzidos nas ilhas do pacífico acabaram se espalhando pelo Velho Mundo. Com base nos conceitos atuais, a tribo tem 200 gêneros conhecidos, correspondendo a aproximadamente 10% das asteraceas (King & Robinson,
1987).
Em virtude da grande diversidade da flora ao longo do mundo, esta tribo não é bem compreendida, ocasionando erros nas identificações botânicas. Estudos mais elaborados começaram a serem feitos em 1970. Estes novos estudos levaram os taxonomistas King e
Robinson (1987) a sugerirem um novo sistema de classificação, o qual fez com que surgissem três novos gêneros Ageratina, Ayapana e Campuloclinium cujas espécies pertenciam ao gênero Eupatorium (King & Robinson, 1987). ______Introdução 6
Atualmente não é atribuída grande importância econômica a tribo, no entanto existem exemplos bem claros de espécies importantes como por exemplo: Eupatorium cannabinum usada na Índia no tratamento de úlceras e na Itália na medicina homeopática; espécies de Mikania são usadas na América do Sul e na África no tratamento de mordidas de serpentes; óleos essenciais de Trilisa odoratissima como agente fixador em perfumes e o uso das folhas secas para adicionar sabor ao tabaco; Koanophyllon tinctorium e K. albicaule são poderosos corantes; Stevia rebaudiana é a muito tempo conhecida pelo seu sabor doce e como um possível substituto para o açúcar; Austroeu patorium inulaefolium foi utilizada no Uruguai no controle de natalidade e muitas outras utilidades (King & Robinson, 1987).
Estudo mais recente a respeito da química das espécies da tribo Eupatorieae indica que esta apresenta alcalóides pirrolizidínicos, no entanto estes alcalóides são diferentes dos produzidos pelo seu parente próximo, a tribo Senecioneae (King & Robinson, 1987).
Quanto aos flavonóides, estão presentes em todas as inflorescências das espécies da tribo Eupatorieae especialmente as de coloração amarela (King & Robinson, 1987).
Uma outra característica química importante do grupo é a presença em seus óleos essenciais de benzofuranos, os quais são responsáveis por muitas das espécies da tribo
Eupatorieae serem venenosas. A característica das plantas da tribo apresentar benzofuranos é tão marcante que a presença dos mesmos no gênero Isocarpha foi usada como argumento para colocar este gênero dentro desta tribo (King & Robinson, 1987).
Monoterpenos na forma de derivados do timol, ocorrem esporadicamente dentro da tribo Eupatorieae, estes ocorrem na Bishovia boliviensis, na Mikania officinalis e M. purpurascens, duas espécies endêmicas do Brasil. Já os sesquiterpenos ocorrem largamente ao longo da tribo (King & Robinson, 1987). ______Introdução 7
A subtribo Gyptidinae é uma das maiores subtribos dentro da tribo Eupatorieae. Esta subtribo atinge sua maior diversidade no Cerrado brasileiro onde a subtribo Critoniinae é rara
(King & Robinson, 1987).
Dos 27 gêneros pertencentes à subtribo Gyptidinae, 23 estão concentrados na
América do Sul, estando apenas 2 gêneros concentrados nos Estados Unidos e no México,
Conoclinium e Tamaulipa. O gênero Lourteigia é natural de grandes altitudes ocorrendo ao longo do norte dos Andes. O gênero Neocuatrecasia só é encontrado no Peru e na Bolívia. Os gêneros Trichogonia e Barrosoa estão concentrados no Brasil, apresentando apenas algumas espécies distribuídas pela Venezuela e Colômbia (King & Robinson, 1987).
O gênero Trichogonia é reconhecido pelo papo plumoso que é encontrado na maioria das espécies deste gênero. Em todo caso o gênero Helogyne também apresenta papo plumoso o que pode causar confusão entre as espécies, este gênero é genuinamente brasileiro, sendo uma característica das espécies brasileiras, a presença de glândulas ao longo do tubo da corola
(King & Robinson, 1987).
A espécie T. menthaefolia é endêmica do Brasil e nenhum estudo fitoquímico foi realizado até o momento com esta espécie, assim como nenhuma avaliação biológica do gênero foi conduzida.
Na tabela 01 estão descritas as espécies de Trichogonia que passaram por algum estudo químico.
______Introdução 8
Tabela 01: Fitoquímica de espécies de Trichogonia Espécie Polaridade do extrato Parte da Classes químicas Referências planta Bibliográficas Trichogonia Et2O:éter de petróleo aéreas Sesquiterpenos, Bohlmann et al., prancii 1:2, v:v esteróides e lactonas 1981a sesquiterpênicas
Et2O:éter de petróleo raízes Sesquiterpenos, Bohlmann et al., 1:2, v:v esteróides e derivados 1981a furânicos da acetofenona
Et2O:éter de petróleo aéreas Lactonas Bohlmann et al., 1:2, v:v sesquiterpênicas 1984
Trichogonia Et2O:éter de petróleo aéreas Sesquiterpenos e Bohlmann et al., grazielae 1:2, v:v derivados da 1981a acetofenona
raízes Sesquiterpenos e Bohlmann et al., Et2O:éter de petróleo derivados da 1981a 1:2, v:v acetofenona
Trichogonia Et2O:éter de petróleo aéreas Sesquiterpenos, Bohlmann et al., scottmorii 1:2, v:v sesquiterpenóides, 1981a esteróides e derivados da acetofenona
Trichogonia Et2O:éter de petróleo aéreas Sesquiterpenos, Bohlmann et al., salviaefolia 1:2, v:v esteróides, ácidos 1981a graxos e lactonas sesquiterpênicas
Et2O:éter de petróleo raízes Sesquiterpenos e Bohlmann et al., 1:2, v:v derivados da 1981a acetofenona
MeOH:Et2O: éter de planta Lactona Baruah et al., petróleo total sesquiterpênica e 1985 1:1:1, v:v:v diterpeno
Et2O:éter de petróleo aéreas Diterpenos e lactonas Bohlmann et 1:2, v:v sesquiterpênicas al., 1984
Trichogonia Et2O:éter de petróleo aéreas Sesquiterpenos, Bohlmann et al., villosa 1:2, v:v esteróides, derivados da 1981a acetofenona e lactonas sesquiterpênicas
Et2O:éter de petróleo raízes Sesquiterpenos, Bohlmann et al., 1:2, v:v derivados da 1981a acetofenona e lactonas sesquiterpênicas ______Introdução 9
Et2O:éter de petróleo aéreas Sesquiterpenos, Bohlmann et 1:2, v:v diterpenos e lactonas al., 1984 sesquiterpênicas
Trichogonia Hexano:AcOEt 3:1, v:v aéreas Lactonas Vichnewski et gardneri sesquiterpênicas al., 1985
Trichogonia Et2O:éter de petróleo aéreas Sesquiterpenos, Bohlmann et hirtifolia 1:2, v:v esteróides, derivados da al., 1984 acetofenona, derivados do benzofurano e lactonas sesquiterpênicas
Trichogonia Et2O:éter de petróleo aéreas Sesquiterpenos, Bohlmann et santosii 1:2, v:v esteróides, derivados da al., 1984 acetofenona, cromenos, derivados do isoeugenol, triterpenos e lactonas sesquiterpênicas
Conclusivamente o perfil químico encontrado nas espécies de Trichogonia é expresso pelos sesquiterpenos, lactonas sesquiterpênicas, derivados da acetofenona, esteróides e triterpenos.
______Objetivos 10
2. Objetivos
Tendo em vista a importância do estudo químico e da avaliação biológica de nossa flora nativa, em especial de Asteraceae, em função de sua representativa participação na mesma, considerando que o gênero Trichogonia é genuinamente brasileiro e estando bem representado na família, com apenas oito espécies investigadas quimicamente e que a
Trichogonia menthaefolia Gardner é endêmica do Brasil e nenhum estudo fitoquímico foi conduzido até o momento com esta espécie, parece justificado o estudo da composição química da mesma.
Os objetivos do presente estudo são o isolamento e a identificação de componentes químicos micromoleculares dos extratos diclorometânico e metanólico das partes totais desta espécie vegetal coletada em seu habitat natural.
______Materiais e métodos 11
3. Materiais e métodos
3.1. Fases estacionárias para Cromatografia
Para o preparo de colunas cromatográficas clássicas foram utilizados como fases estacionárias sílica gel 60 específica para colunas, da marca Merck, com tamanho de partícula
62-200 µm, Sephadex LH –20 da marca Sigma, com tamanho de partícula 25-100µ e sílica gel 60 H, com tamanho de partícula de 63-200 µm. As duas primeiras fases estacionárias foram utilizadas em CC e a última em CLV.
Para as análises por CG foram utilizadas colunas HP-1 (metilsilicone) e HP-50
(metilfenilsilicone), ambas com (30m x 0,25mm x 0,25mm).
Para o preparo das CCDC foi utilizado sílica 60GF254, da marca Merck, com tamanho de partícula de 5-40 µm em uma camada de 0,25mm aplicada em placas de vidro de 5x20,
10x20 e 20x20 cm.
Para o preparo das CCDP foi utilizado como fase estacionária sílica gel 60 PF254+366 da marca Merck, em uma camada de 1mm aplicada em placas de vidro 20x20 cm.
______Materiais e métodos 12
3.2. Solventes e Reagentes
Solventes deuterados (CDCl3 e DMSO-d6) das marcas Aldrich e Merck foram utilizados para a obtenção dos espectros de RMN de 1H e de 13C.
Para o fracionamento dos extratos, foram utilizados os solventes de grau comercial, os quais foram submetidos à destilação fracionada.
Para revelar as placas cromatográficas, CCDC e CCDP, foi utilizada uma mistura de anisaldeído/metanol/ácido acético glacial/ácido sulfúrico 1:80:20:5 e luz UV com comprimento de onda de 254 e 366 nm (lâmpada UVGL-25), respectivamente.
3.3. Instrumentos
Os espectros de RMN 1H, 13C, PND, DEPT 135o e HMQC foram registrados em espectrômetro Brucker Avance DRX-400, operando a 400 MHz para o 1H e 100MHz para o
13C.
Para as análises em CG foi utilizado o equipamento Hewlett Packard 5890 serie 2.
Os espectros de massas foram obtidos em um espectrômetro de massas modelo: ultrOTOFQ-ESI-TOF Mass Spectrometer Bruker Daltonics, Billerica, MA, EUA.
______Materiais e métodos 13
3.4. Métodos
3.4.1. Metodologia utilizada nas análises por CG
• Coluna capilar HP-50
Temperatura do injetor: 260oC
Temperatura FID: 330oC
Temperatura da coluna: Gradiente de temperatura 105oC até 200oC (13oC/mim);
200oC até 240oC (5oC/mim – 20mim); 240oC até 280oC (10oC/mim – 10mim).
Gás de arraste: Hidrogênio com Split 1:50
Velocidade Linear: 45cm/seg a 250oC
• Coluna capilar HP-1
Temperatura do injetor: 260oC
Temperatura FID: 330ºC
Temperatura da Coluna: 250oC por 12mim; 250oC até 280oC a 6oC/mim
Gás de Arraste: Hidrogênio com Split 1:50
Velocidade Linear: 46cm3/seg a 250oC
3.4.2. Metodologia para a obtenção dos espectros massas
Condições do experimento: Bomba de Infusão, Fluxo 180µL/h.
Fase móvel para a solubilização: MeOH:H2O (8:2)
O aparelho é de alta resolução necessitando de calibração interna e externa antes de serem realizadas as análises. Usa-se para calibração interna uma solução do sal sódico do ______Materiais e métodos 14
ácido trifluoracético e na calibração externa uma solução de Formiato de Sódio, à 10mM, para adquirir os espectros em alta resolução.
3.4.3. Metodologia para o preparo das amostras a serem cromatografadas
• no CG
As amostras foram adsorvidas em pequena quantidade de sílica gel 60 e aplicadas em uma pipeta de Pasteur e eluída com 10mL de hexano e posteriormente com 15mL de clorofórmio. A solução em hexano é descartada e a solução em clorofórmio é concentrada para posterior análise no CG, antes da qual é solubizada em clorofórmio.
• nas CC com o uso da fase sólida silicagel 60
As amostras foram adsorvidas em pequena quantidade de sílica 60 e aplicadas no topo das CC.
• nas CC com o uso da fase sólida Sephadex LH-20
As amostras foram solubilizadas em metanol e centrifugadas por 5 minutos, posteriormente os precipitados foram retirados e a fase líquida foi aplicada diretamente no topo das CC.
______Procedimento experimental 15
4. Procedimento experimental
4.1. Coleta e identificação do material vegetal
O material vegetal (partes totais) foi coletado em seu habitat natural em Furnas - MG numa estrada de terra a 1 km do mirante da represa, na época da floração em 18/04/1998 pelo
Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes, recebendo o no NPL 130.
Este material vegetal foi identificado como Trichogonia menthaefolia Gardner pelo taxonomista Dr. José L. Panero, do Departamento de Botânica da Universidade do Texas,
Estados Unidos. Uma exsicata do espécimen (no SPFR 04958) encontra-se no Herbário do
Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto -
USP.
4.2. Preparação dos extratos brutos
Após ser estabilizada em estufa de ar circulante à temperatura de 40oC, todas as partes do material coletado foram pulverizadas em moinho de faca.
O pó seco (500g) passou pelo processo de maceração exaustiva, à temperatura ambiente, com solventes em ordem crescente de polaridade (primeiro diclorometano e depois metanol). Em seguida, os solventes foram removidos (sobre pressão reduzida), obtendo-se assim os extratos brutos de média polaridade e de alta polaridade.
______Procedimento experimental 16
Planta Total
Estufa de ar circulante 40oC Moinho de faca
Pó 500g
Maceração com CH2Cl2 a TA
Extrato diclorometânico Resíduo (72g)
Maceração com Metanol a TA
Extrato metanólico Resíduo (18g) (desprezado)
Figura 01: Esquema representativo da obtenção dos extratos brutos do pó de T. menthaefolia
______Procedimento experimental 17
4.3. Isolamento e Purificação dos constituintes químicos do extrato em diclorometano
O fracionamento do extrato bruto em diclorometano foi realizado através de uma CLV utilizando-se 35g do mesmo, em uma coluna de vidro de dimensões compatíveis e 500g de sílica gel 60. A coluna cromatográfica foi eluída com solventes em ordem crescente de polaridade, sendo o volume aproximado de cada fração 500ml, exceto a fração 1 onde o volume de solvente utilizado foi 5L, obtendo-se 144 frações que posteriormente foram reunidas por CCDC.
Tabela 02: CLV do extrato em diclorometano da Trichogonia menthaefolia Eluente Frações Código Massa total (g) Hexano 100% 01 TmD-1 0,24 Hexano/AcOEt 9,5:0,5 02-16 TmD-2 6,42 Hexano/AcOEt 9:1 17-29 TmD-3 1,79 Hexano/AcOEt 8:2 30-43 TmD-4 4,27 Hexano/AcOEt 7:3 44-57 TmD-5 3,86 Hexano/AcOEt 1:1 58-73 TmD-6 4,05 Hexano/AcOEt 3:7 74-84 TmD-7 1,97 Hexano/AcOEt 2:8 85-95 TmD-8 1,23 AcOEt 100% 96-108 TmD-9 2,98 AcOEt/MeOH 9,5:0,5 109-111 TmD-10 0,78 AcOEt/MeOH 9:1 112-122 TmD-11 2,69 AcOEt/MeOH 7:3 123-138 TmD-12 3,48 Etanol 100% 137-144 TmD-13 0,52
______Procedimento experimental 18
4.3.1. Isolamento dos constituintes químicos das frações obtidas da CLV do extrato em diclorometano
A escolha de uma fração para submetê-la às separações cromatográficas foi baseada em três critérios:
Massa da fração: frações cujas massas eram da ordem de unidades de grama ou menor não foram utilizadas.
Análise dos espectros de RMN 1H: a observação das feições espectrais permitiu inferir sobre a presença ou não de micromoléculas que seriam de interesse ao estudo.
Perfil da amostra em CCDC: se a amostra apresentasse poucos pontos na CCDC ela seria submetida a uma CCDP, se a fossem vários pontos ela seria submetida a uma CC. ______Procedimento experimental 19
Extrato diclorometânico (35g)
CLV
TmD-1 TmD-3 TmD-5 TmD-6 TmD-10
CCDP CCDP Análise por CC CC CG
Substância Substância Mistura de CCDP Substância 1 2 triterpenos (12) (162mg) (5mg) (6mg) 3, 4, 5, e 6 (22mg)
Mistura de esteróides (7, 8, 9, 10 e 11) (100mg)
Figura 02: Fluxograma do trabalho experimental realizado com o extrato diclorometânico de T. menthaefolia
______Procedimento experimental 20
Isolamento dos constituintes químicos da fração TmD-1
A fração TmD-1 (237,1mg) foi submetida a uma CCDP utilizando-se clorofórmio como fase móvel, onde o sesquiterpeno 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1) (5mg) foi isolado em Rf: 0,77 apresentando coloração azul frente ao revelador químico.
Isolamento dos constituintes químicos da fração TmD-3
Uma porção da fração TmD-3 (500mg) foi submetida a uma CCDP utilizando-se clorofórmio como fase móvel, onde o triterpeno 3α-hidroxi-olean-12-eno (2) (6mg) foi isolada em Rf: 0,8 apresentando coloração azul frente ao revelador químico.
Isolamento dos constituintes químicos da fração TmD-5
A fração TmD-5 (3,86g) tem aparência de um sólido amorfo branco, a partir da qual os terpenos, β-amirina (3), lupeol (4), taraxasterol (5), pseudotaraxasterol (6) e β-sitosterol
(7), foram identificados em mistura, através das análises do CG de uma pequena quantidade da fração TmD-5 (10mg). Mais detalhes ver no item 5.3.
Isolamento dos constituintes químicos da fração TmD-6
Uma porção da fração TmD-6 (1,2g) foi submetida a uma CC utilizando-se 150g de sílica gel como fase estacionária e eluída com solventes em ordem crescente de polaridade, partindo de 100% de hexano até 100% diclorometano e então metanol:diclorometano 1:1 e metanol 100%. ______Procedimento experimental 21
As frações 28 e 29 (162mg) foram reunidas e submetidas a uma CCDP em
Hexano/AcOEt 7:3 fornecendo a mistura dos esteróides β-sitosterol (7), estigmasterol (8), campesterol (9) (100mg), estigmast-7-en-3β-ol (10) e espinasterol (11) em Rf: 0,32 apresentando absorção intensa na lâmpada de UV nos comprimentos de onda 256 e 366nm.
Esta mistura teve seus constituintes químicos identificados através das análises do CG de uma pequena quantidade da mistura de esteróides (10mg). Mais detalhes ver no item 5.4.
Tabela 03: CC da fração TmD-6 Frações Fase móvel Volume 1-5 Hexano 100% 400ml 6-11 Hexano/CH2Cl2 9,5:0,5 550ml 12-15 Hexano/CH2Cl2 9:1 300ml 16 e17 Hexano/CH2Cl2 7:3 400ml 18 Hexano/CH2Cl2 1:1 100ml 19-25 CH2Cl2 100% 800ml 26 e 27 CH2Cl2/Metanol 200ml 28-32 CH2Cl2/Metanol 500ml 33 e 34 CH2Cl2/Metanol 200ml 35-42 Metanol 100% 700ml
Isolamento dos constituintes químicos da fração TmD-10
Uma porção da fração TmD-10 (532mg) foi submetida a uma CC utilizando-se
Sephadex-LH-20 como fase estacionária e metanol como fase móvel, recolhendo-se frações de 10mL, num total de 55 frações.
As frações 42-50 forneceram o flavonóide ramnocitrina (12) (25mg) praticamente puro.
______Procedimento experimental 22
4.4. Isolamento dos constituintes químicos do extrato metanólico
O extrato metanólico (18,0g) foi dissolvido em 150 mL de metanol, ocorrendo a completa solubilização do mesmo. Em seguida particionou-se com hexano, por 10 vezes
(200mL cada).
A solução metanólica resultante foi concentrada e a massa obtida foi de 8,0g, sendo que apenas 3,23g foi submetido a uma CC utilizando-se Sephadex-LH-20 como fase estacionária e metanol como fase móvel, recolhendo-se 62 frações de 30ml cada.
As frações 43-53 forneceram o flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13)
(32mg).
Extrato metanólico (18g)
-solubilização em metanol -partição com hexano
Solução metanólica Solução hexânica
concentração
Fração metanólica (8,0g)
CC (Sephadex LH-20)
Substância 13 (32,0mg)
Figura 03: fluxograma do trabalho experimental realizado com o extrato metanólico de T. menthaefolia ______Identificação estrutural 23
5. Identificação estrutural
5.1. Identificação estrutural do sesquiterpeno 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1).
6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1) 14
1 9 2 10 8 3 5 7 4 6 12 11 H 13 15 O 5' 1' 2'
O H 3' 4'
A substância 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno, foi identificada pela análise das informações contidas nos espectros de RMN de 1H, 13C, PND, DEPT 135O e HMQC (p. 48-
54).
Esta substância já tinha sido isolada das partes aéreas da Ageratum fastigiatum
(Eupatorieae, Asteraceae, Bohlmann et al.,1981b).
Os principais sinais observados no espectro de RMN 1H (Figuras 06, 07 e 08, p. 48, 49 e 50) foram:
• dubletos em δ0,91 e δ0,89 ambos integrando para 3H cada e com J 7,1 Hz
referentes aos hidrogênios 12 e 13 do grupamento isopropil;
• o singleto em δ0,77 integrado para 3H indica que a estrutura sesquiterpênica
apresenta um grupo metil;
• os singletos largos em δ4,76 e δ4,54 integrados para 1H cada, referem-se aos
hidrogênios do grupo metileno, H-15a e H-15b; ______Identificação estrutural 24
• o dubleto largo em δ2,08 integrando para 1H e com valor de J 10,6 Hz, foi
atribuído ao H-5. Este valor de J é típico de acoplamento axial-axial, por sua
vez a posição axial deste hidrogênio define a junção trans do anel em C5;
• o duplo dubleto em δ5,14 integrando para 1H e J 10,4 e 10,1 Hz, foi atribuído
ao H-6. O valor deste δ infere em um hidrogênio oximetínico e os valores de J
são típicos de acoplamento axial-axial. Tais observações definem a posição
axial deste hidrogênio assim como a de seus vizinhos em C5 e C7;
• os hidrogênios do grupo angelato estão bem evidentes, pelo quádruplo
quadrupleto em δ5,93 integrando para 1H e J 7,2 e 1,5 Hz referente ao
hidrogênio na posição 3’, com os duplos quadrupletos em δ1,89 integrando
para 3H e J 7,2 e 1,5 Hz referente aos hidrogênios da metila na posição 4’ e
com o multipleto em δ1,83 integrando para 3H referente aos hidrogênios da
metila na posição 5’;
Tabela 04: Dados de RMN 1H da substância 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno comparados com os dados da literatura (Bohlmann et al., 1981b)* Hidrogênio δ, J e multiplicidade realizado δ, J e multiplicidade em 270 MHz (literatura) (1) H-3a 2,28; dl; 12,0 2,30; m H-3b 1,95; m 1,94; m H-5 2,08; dl; 11,0 2,08; dl; 10,6 H-6 5,15; dd; 11,0 e 10,0 5,14; dd; 10,4 e 10,1 H-11 1,95; m 1,7; m H-12 0,93; d; 7,0 0,91; d; 7,1 H-13 0,91; d; 7,0 0,89; d; 7,1 H-14 0,79; s 0,77; s H-15a 4,67; sl 4,76; sl H-15b 4,54; sl 4,54; sl H-3´ 5,93; qq; 7,0 e 1,5 5,93; qq; 7,2 e 1,5 H-4´ 1,90; dq; 7,0 e 1,5 1,89; dq; 7,2 e 1,5 H-5´ 1,83; dq; 7,0 e 1,5 1,83; m
* δ em ppm e J em Hz (obtido em CDCl3)
Posteriormente os dados constantes dos espectros de RMN 13C (PND e DEPT 135º) e
HMQC (figuras 09, 10, 11 e 12, p. 51, 52, 53 e 54), corroboraram com a proposta estrutural. ______Identificação estrutural 25
Analisando os espectros de RMN 13C (PND e DEPT 135º) podemos observar os carbonos metilênicos - 1, 2, 8 e 9 - em δ40,21, δ18,30, δ38,08 e δ42,15 respectivamente, sendo que os hidrogênios destes grupos metilênicos não podem ser observados no espectro de
RMN 1H porque os mesmos aparecem na região de δ1,3-1,75. Através dos mapas de contorno do HMQC foi possível observar correlações importantes, confirmando a atribuição dos carbonos.
Tabela 05: Dados de RMN obtidos dos espectros de 13C (PND e DEPT 135º) e nos mapas de contorno do HMQC (δ em ppm, CDCl3). Carbonos Tipos de δ Correlações retiradas do carbonos HMQC C-1 CH2 40,21 1,30-1,75 C-2 CH2 18,30 1,30-1,75 C-3 CH2 24,21 1,94 e 2,30 C-4 C 146,39 C-5 CH 55,98 2,08 C-6 CH 70,92 5,14 C-7 CH 49,51 1,30-1,75 C-8 CH2 38,08 1,30-1,75 C-9 CH2 42,15 1,30-1,75 C-10 C 38,09 C-11 CH 26,14 1,70 C-12 CH3 16,12 0,91 C-13 CH3 21,39 0,89 C-14 CH3 17,57 0,77 C-15 CH2 106,67 4,54 e 4,76 C-1´ C 168,38 C-2´ C 128,71 C-3´ CH 135,69 5,93 C-4´ CH3 15,43 1,89 C-5´ CH3 20,68 1,82
Os espectros de RMN de 1H, 13C (PND, DEPT 135º) e os mapas de contorno do
HMQC se encontram no anexo 01. ______Identificação estrutural 26
5.2. Identificação estrutural do triterpeno 3α-hidroxi-olean-12-eno (2).
29 30
3α-hidroxi-olean-12-eno (2) 20 19 21
12 18 22 11 17 25 26 13 H 28 9 14 16 1 2 10 8 15 H 3 5 27 4 6 7 HO H 23 24
O espectro de RMN 1H (Figuras 13 e 14, p. 55 e 56) apresentou uma grande quantidade de sinais na região de δ1,16-0,86 indicando a presença de substância de natureza terpênica, sendo que na região de δ1,16-0,86 são observados oito singletos com as mesmas integrais (δ1,16, δ1,14, δ1,09, δ1,04, δ1,00 δ0,99, δ0,95 e δ0,85), um multipleto em δ5,62 referente a hidrogênio olefinico e um multipleto em δ3,47 referente a hidrogênio oximetínico.
Os dados dos espectros de RMN 13C (PND e DEPT 135o) (Figuras 15, 16 e 17, p. 57 e 58 e
59) apontaram para um triterpeno da classe olean-12-eno uma vez que os valores de deslocamentos químicos para os carbonos C12 e C13 estão entre ~δ122 e ~δ145 e são observados oito metilas, dez carbonos secundários, cinco carbonos terciários e sete carbonos quaternários. O valor do deslocamento químico do carbono C3 (δ76,37) indica que este tem uma hidroxila ligada em α (Mahato et al., 1994).
Posteriormente a amostra foi submetida a uma análise por CG em uma coluna HP-1, adicionando à amostra padrões de triterpenos. A análise por CG mostrou que o mesmo apresenta Tr (com relação ao colesterol) muito próximo ao da β-amirina, sendo o Tr da amostra 1,317 e o da β-amirina 1,420. ______Identificação estrutural 27
Uma vez que os deslocamentos químicos de RMN 13C e o Tr da substância em análise são muito parecidos com os da β-amirina, concluímos tratar-se de um epímero da β-amirina, ou seja com a hidroxila em C3 na posição axial (α). No intuito de descobrir a influência dos deslocamentos químicos, quando a hidroxila esta em axial ou equatorial (α ou β), comparamos os valores de RMN 13C das substâncias A e B que também são da família olean-
12-eno e diferem entre si apenas na posição da hidroxila.
33,2 23,5
30,9 44,0 34,3 28,2 A 122,1 47,5 36,8
23,0 143,8 32,9 16,4 18,1 32,9 23,6 36,9 49,2 56,1 23,3 27,3 27,8 38,8 37,3 31,0 44,2 34,2 78,8 55,5 33,5 OH 28,2 40,2 176,1 HO O 125,5 47,0 36,2 18,3 23,0 137,5 32,9 15,8 18,0 28,3 15,7 36,7 48,8 56,0 26,2 22,1 27,6 36,7 36,7 76,4 30,9 O 39,9 48,8 179,0 HO O 18,0
28,2 22,1 B
Comparando os valores de RMN de 13C (Mahato et al., 1994) das substâncias A e B podemos observar que os carbonos C3, C5 e C24 são os que sofrem maior influência, com a alteração da estereoquímica da hidroxila na posição 3. Feito esta observação e estendendo esta comparação entre a β-amirina e a substância 2, podemos concluir que as duas substâncias são idênticas diferindo uma da outra apenas pela posição da hidroxila em C3. ______Identificação estrutural 28
A título de comparação os valores de RMN de 13C da substância 2 e da β-amirina estão apresentados na tabela 06.
13 Tabela 06: Dados de RMN C (δ em ppm, CDCl3) do triterpeno 3α-hidroxi-olean-12-eno comparados com os valores da β-amirina (Mahato et al, 1994). Carbonos 3α-hidroxi-olean-12-eno β-amirina 1 35,06 28,7 2 29,70 27,3 3 76,37 79,0 4 39,28 38,8 5 49,66 55,3 6 18,21 18,5 7 30,34 32,8 8 39,28 38,8 9 43,04 47,7 10 37,82 37,7 11 23,63 23,6 12 122,09 121,8 13 141,57 145,5 14 40,81 41,8 15 27,80 26.2 16 27,00 27.0 17 34,60 32,5 18 47,41 47,4 19 não observado 46,9 20 30,08 31,1 21 34,83 34,8 22 36,01 37,2 23 28,94 28,8 24 19,62 15,5 25 18,42 15,6 26 16,21 16,9 27 25,45 26,6 28 32,40 28,4 29 34,52 33,3 30 25,45 23,7
Os espectros de RMN de 1H e de 13C (PND e DEPT 135º) se encontram no anexo 02.
______Identificação estrutural 29
5.3. Identificação estrutural da mistura de triterpenos presentes na fração TmD-5 (3, 4, 5 e 6)
29 30 20 19 20 21 21 19 12 18 12 H 22 17 22 18 25 17 11 26 13 25 26 H 28 11 13 9 14 9 14 H 28 1 16 1 16 2 10 8 15 2 10 8 H 15 3 5 7 27 H 4 6 3 5 7 4 6 27 HO HO H H 23 β 24 -amirina (3) 23 24 lupeol (4) 30 30 29 29 19 20 21 H 19 20 21 12 18 17 22 12 H 18 25 11 26 13 17 22 28 25 9 14 H 11 26 13 1 16 H 28 2 10 9 14 8 15 1 16 3 H 27 2 10 8 4 5 7 15 6 3 5 H 27 HO 4 7 H HO 6 23 24 H 23 taraxasterol (5) 24 pseudotaraxasterol (6)
A fração TmD-5 apresentou em seu espectro de RMN 1H (Figura 20, p. 62) uma
grande quantidade de sinais entre δ0,76 e δ1,07, referente a grupos metílicos e um multipleto
entre δ3,17 e δ3,25 referente aos hidrogênios hidroximetínicos, sendo que todos os triterpenos
identificados na fração TmD-5 - após análise do CG - tem em comum uma hidroxila em β na
posição 3. Quanto aos hidrogênios olefinicos também são observados, aparecendo como
multipletos em δ4,62 e δ4,60.
No espectro de RMN 13C (Figura 21, p.63) também há evidências da presença de
triterpenos devido a grande quantidade de sinais entre δ35,0-14,0 referentes a grupos
metílicos e o sinal em δ79,07 referente a carbono contendo uma hidroxila ligada na posição β,
como é típico da grande maioria dos triterpenos.
A análise do espectro de RMN 13C na região dos carbonos olefinicos foi de grande
importância para a identificação dos triterpenos, uma vez que estes são bem evidentes neste ______Identificação estrutural 30 espectro, com os sinais: δ121,7 (C12) e δ145,2 (C13) (β-amirina); δ151,0 (C20) e δ109,3
(C29) (lupeol); δ139,2 (C20) e δ119,4 (C21) (pseudotaraxasterol) e δ154,6 (C20) e δ107,1
(C30) (taraxasterol) (Olea & Roque, 1990, Mahato et al., 1994).
A título de ilustração todos os valores de RMN 13C dos triterpenos identificados em mistura na fração TmD-5 assim como os respectivos valores da literatura seguem nas tabelas
7 e 8.
13 Tabela 07: Dados do espectro de RMN de C (δ em ppm, CDCl3) para β-amirina e lupeol comparados com os dados da literatura (Mahato et al., 1994). Carbonos β-amirina lupeol literatura experimental literatura experimental 1 28,7 29,4 38,7 38,9 2 27,3 27,4 27,4 27,4 3 79,0 79.0 78,9 79.0 4 38,8 39,0 38,8 38,8 5 55,3 55,4 55,3 55,4 6 18,5 18,2 18,3 18,2 7 32,8 32,8 34,2 34,5 8 38,8 39,3 40,8 40,9 9 47,7 48,6 50,4 50,4 10 37,7 38,7 37,1 38,7 11 23,6 22,6 20,9 22,6 12 121,8 121,7 25,1 28,0 13 145,5 145,2 38,8 40,9 14 41,8 42,0 42,8 50,4 15 26.2 26,2 27,4 27,4 16 27.0 27,4 35,5 34,5 17 32,5 31,9 43,0 38,9 18 47,4 47,2 48,8 48,7 19 46,9 46,8 47,9 46,8 20 31,1 31,9 150,9 151,0 21 34,8 34,5 29,8 29,4 22 37,2 37,1 40,0 39,3 23 28,8 29,4 28,8 29,4 24 15,5 15,4 15,4 15,4 25 15,6 15,4 16,1 16,3 26 16,9 16,3 15,9 16,3 27 26,6 26,7 14,5 14,1 28 28,4 28,0 18,0 18,3 29 33,3 34,0 109,3 109,3 30 23,7 23,7 19,3 19,5 ______Identificação estrutural 31
13 Tabela 08: Dados do espectro de RMN de C (δ em ppm, CDCl3) para pseudotaraxasterol e taraxasterol comparados com os dados da literatura (Mahato et al., 1994) Carbonos pseudotaraxasterol taraxasterol literatura experimental literatura experimental 1 38,8 38,9 38,8 38,8 2 27,4 27,4 27,4 27,8 3 79,0 79,6 79,0 79,0 4 38,8 38,8 38,8 38,8 5 55,3 55,4 55,4 55,4 6 18,3 18,2 18,3 18,2 7 34,3 34,5 34,1 34,5 8 41,1 41,0 40,9 41,0 9 50,4 50,5 50,5 50,5 10 37,1 38,7 37,1 38,7 11 21,6 22,6 21,4 22,6 12 27,6 28,0 26,6 26,7 13 39,2 38,2 39,2 39,4 14 42,3 42,0 42,0 42,0 15 27,0 27,4 26,6 27,4 16 36,6 37,1 38,3 38,8 17 34,4 34,5 34,5 34,5 18 48,8 48,7 48,7 48,7 19 36,6 42,0 39,4 39,3 20 138,8 139,2 154,6 154,6 21 118,9 119,2 25,6 25,6 22 42,2 42,0 38,9 38,9 23 28,8 29,4 28,8 29,4 24 15,4 15,4 15,4 15,4 25 16,3 16,3 16,8 16,4 26 16,1 16,3 15,9 16,3 27 14,8 15,3 14,8 15,3 28 17,7 18,3 19,5 19,5 29 22,5 22,7 25,5 25,5 30 21,7 21,5 107,7 107,1
Convém destacar que o sinal de C21 do pseudotaraxasterol não pode ser observado no espectro de DEPT 135o (Figura 22, p. 64), pelo fato da concentração do pseudotaraxasterol em TmD-5 ser muito menor do que a concentração dos demais triterpenos.
A confirmação dos triterpenos presentes em TmD-5 foi feita por CG, através de análises nas colunas HP-1 e HP-50. As análises foram feitas comparando os tempos de retenções relativos dos picos presentes na mistura de triterpenos com os tempos de retenção relativo de padrões autênticos. Através destas comparações foi possível confirmar a presença ______Identificação estrutural 32 dos terpenos β-amirina (3), lupeol (4), taraxasterol (5), pseudotaraxasterol (6) e β-sitosterol
(7), sendo que os dados referentes às análises por CG (Figuras 18 e 19 - p. 60 e 61) nas colunas HP-50 e HP-1 se encontram nas tabelas 9 e 10.
Tabela 09: Identificação das substâncias presentes em TmD-5 (Coluna HP-50) Compostos Tempo de retenção Tempo de retenção Tempo de (mistura de relativo*(mistura retenção relativo triterpenos) de triterpenos) (Padrões) β-amirina 27,953 1,315 1,315 lupeol 30,456 1,432 1,432 pseudotaraxasterol 34,159 1,606 1,605 taraxasterol 34,843 1,639 1,638 β-sitosterol 25,420 1,195 1,193 *com relação ao colesterol 21,262
Tabela 10: Identificação das substâncias presentes em TmD-5 (Coluna HP-1) Compostos Tempo de retenção Tempo de retenção Tempo de (mistura de relativo*(mistura retenção relativo triterpenos) de triterpenos) (Padrões) β-amirina 16,543 1,269 1,295 lupeol 18,689 1,351 1,351 pseudotaraxasterol 20,555 1,486 1,484 taraxasterol 20,555 1,486 1,486 β-sitosterol 16,543 1,269 1,270 *com relação ao colesterol 13,826
Os espectros de RMN de 1H, 13C (PND e DEPT 135º) e os cromatogramas se encontram no anexo 03.
______Identificação estrutural 33
5.4. Identificação estrutural da mistura de esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)
21 22 28 29 19 12 20 24 17 26 18 11 23 H 13 25 H 9 16 14 27 1 15 2 10 8 H H H H 3 4 OH 7 OH 5 6 estigmasterol (8) β-sitosterol (7)
H
H H campesterol (9) OH
H H OH H H H OH espinasterol (11) estigmast-7-en-3β-ol (10) H
O espectro de RMN 1H (Figuras 28 e 29, p. 68 e 69) da mistura em análise apresenta vários sinais entre δ0,7 e δ1,0 correspondendo a grupos metílicos, vários sinais entre δ1,0 e
δ2,0 que podem ser atribuídos a grupos metilênicos, um multipleto em δ3,5 (H-3) referente à hidrogênios hidroximetínicos, dois duplos dubletos em δ5,0 (H23) e δ5,1 (H22) com J 15 e
8,5Hz e um multipleto em δ5,35 referente a hidrogênios olefinicos. Todos esses sinais no
RMN evidenciam a presença de fitoesteróides (Kojima et al., 1990).
Na literatura (Kojima et al., 1990) os autores descrevem os hidrogênios olefinicos (H-
6) do β-sitosterol (7) e do estigmasterol (8) como um multipleto em δ5,35 e os hidrogênios hidroximetínicos (H-3) como um multipleto em δ3,53. Por sua vez os hidrogênios olefinicos ______Identificação estrutural 34
(H-7) do estigmast-7-en-3β-ol (10) e do espinasterol (11) são descritos como multipletos em
δ5,16 e δ5,15 respectivamente e os hidrogênios hidroximetínicos como multipletos em δ3,60 e δ3,59 respectivamente.
No espectro de RMN 13C (Figuras 30 e 31, p. 70 e 71) a presença de esteróides também é averiguada devido aos sinais:
• δ140,8 e δ121,7: C5 e C6 do β-sitosterol (7);
• δ140,7, δ121,7, δ138,3 e δ129,2: C5, C6, C22 e C23 do estigmasterol (8);
• δ138,3 δ117,5: C7 e C8 do estigmast-7-en-3β-ol (10);
• δ117,5, δ138,3, δ138,6 e δ129,3: C7, C8, C22 e C23 do espinasterol (11);
Estes fitoesteróides tem em comum uma hidroxila em β na posição 3, sendo que os C3 do β-sitosterol (7) e do estigmasterol (8) aparecem em δ71,8 e os C3 do estigmast-7-en-3β-ol
(10) e do espinasterol (11) em δ71,0 (Kojima et al., 1990). Convém destacar que o sinal referente ao carbono C3 dos esteróides estigmast-7-en-3β-ol e espinasterol não pode ser observado no PND, sendo observado apenas no espectro de DEPT 135o com intensidade muito menor que o sinal δ71,8 (veja Figura 31, p.71).
A presença de campesterol (9) não foi evidenciada por RMN 1H e 13C uma vez que esta substância tem seus deslocamentos químicos referentes aos carbonos da ligação dupla idênticos aos do β-sitosterol (7) (o contrário também poderia ser dito).
A título de ilustração todos os valores de RMN 13C dos esteróides identificados em mistura assim como os valores da literatura seguem nas tabelas 11 e 12.
______Identificação estrutural 35
13 Tabela 11: Resultados experimentais de RMN de C (δ em ppm, CDCl3) para os esteróides β-sitosterol e estigmasterol comparados com a literatura (Kojima et al., 1990). Carbonos β-sitosterol estigmasterol literatura experimental literatura experimental 1 37,2 37,3 37,2 37,3 2 31,6 31,9 31,6 31,9 3 71,8 71,8 71,8 71,8 4 42,3 42,3 42,3 42,3 5 140,7 140,8 140,7 140,7 6 121,7 121,7 121,7 121,7 7 31,9 31,9 31,9 31,9 8 31,9 31,9 31,9 31,9 9 50,1 50,2 50,1 50,2 10 36,6 36,5 36,6 36,5 11 21,1 21,1 21,1 21,1 12 39,9 40,5 39,7 40,5 13 42,3 42,3 42,2 42,2 14 56,6 56,9 56,6 56,9 15 24,3 24,4 24,4 24,4 16 28,8 28,9 28,9 28.9 17 56,0 56,0 55,9 56,0 18 11,9 12,1 12,0 12,1 19 19,4 19,4 19,4 19,4 20 36,1 36,5 40,5 40,5 21 18,8 19,0 21,2 21,2 22 33,9 31,9 138,3 138,3 23 26,6 25,4 129,2 129,3 24 45,5 42,3 51,2 51,2 25 29,1 28,9 31,9 31,7 26 19,9 21,1 21,1 21,1 27 19,0 19,4 19,0 19,4 28 23 24,4 25,4 25,4 29 12,0 12,1 12,3 12,3
______Identificação estrutural 36
13 Tabela 12: Resultados experimentais de RMN de C (δ em ppm, CDCl3) para os esteróides estigmast-7-en-3β-ol e espinasterol comparados com a literatura (Kojima et al., 1990). Carbonos estigmast-7-en-3β-ol espinasterol literatura experimental literatura experimental 1 37,1 37,3 37,1 37,3 2 31,4 31,7 31,4 31,7 3 71,0 71,1 71,0 71,1 4 37,9 37,3 38,0 37,3 5 40,2 40,5 40,2 40,5 6 29,6 28,9 29,6 28,9 7 117,4 117,5 117,4 117,5 8 139,6 138,3 139,5 138,3 9 49,4 50,1 49,4 50,1 10 34,4 36,6 34,4 36,6 11 21,5 21,2 21,5 21,2 12 39,5 40,5 39,4 40,5 13 43,4 42,3 43,3 42,3 14 55,0 56,0 55,1 56,0 15 23,0 23,0 23,0 23,0 16 27,9 28,3 28,5 28,3 17 56,0 56,0 55,8 56,0 18 11,8 12,1 12,0 12,1 19 13,0 12,3 13,0 12,3 20 36,6 36,5 40,8 40,5 21 18,9 19 21,4 21,1 22 33,8 31,9 138,8 138,3 23 26,1 25,4 129,4 129,3 24 45,8 42,3 51,2 51,2 25 29,1 28,9 31,9 31,9 26 19,8 21,1 21,1 21,1 27 19,0 19,4 19,4 19,4 28 22,9 21,2 25,4 25,4 29 11,9 12,1 12,3 12,3
Deve ser destacado que sendo as estruturas destes esteróides muito semelhantes, a identificação dos mesmos em mistura utilizando-se apenas métodos físicos não seria possível, desta forma a composição da mistura de esteróides foi confirmada pelas análises em CG
(Figuras 23, 24, 25 e 26 e 27, p. 65, 66 e 67) feitas nas colunas HP-50 e HP-1 utilizando-se os tempos de retenções relativos e o método de enriquecimento com padrões. Nas tabelas 13 e 14 seguem as informações contidas nos cromatogramas.
______Identificação estrutural 37
Tabela 13: Identificação da mistura de esteróides (coluna HP-50). Compostos Tempo de Tempo de retenção retenção (minutos) relativo* Padrões Mistura de Padrões* Mistura de esteróides esteróides** campesterol 24,101 24,052 1,105 1,106 estigmasterol 24,805 24,733 1,137 1,139 β-sitosterol 26,173 26,092 1,200 1,200 estigmast-7-en-3β- 26,698 26,637 1,224 1,224 ol espinasterol 28,146 28,046 1,291 1,291 *com relação ao colesterol 21,805 **com relação ao colesterol 21,744
Tabela 14: Identificação da mistura de esteróides (coluna HP-1) Compostos Tempo de Tempo de retenção retenção (minutos) relativo Padrões Mistura de Padrões* Mistura de esteróides esteróides** campesterol 16,098 15,925 1,162 1,158 estigmasterol 16,726 16,565 1,207 1,205 β-sitosterol 17,465 17,362 1,260 1,263 estigmast-7-en-3β- 17,723 17,525 1,279 1,275 ol espinasterol 18,607 18,427 1,343 1,340 *com relação ao colesterol 13,855 **com relação ao colesterol 13,750
Os espectros de RMN de 1H, 13C, (PND e DEPT 135º) e cromatogramas se encontram no anexo 04.
______Identificação estrutural 38
5.5. Identificação estrutural do flavonóide ramnocitrina (12)
3' OH 2' 4' 8 B 1' O 7 10 O 5' 1 2 6' A C 3 6 4 9 5 OH
OH O
ramnocitrina (12)
Os sinais presentes no espectro de RMN 1H da amostra em análise (Figuras 32 e 33 p.
72 e 73) indicam a presença de flavonóide, uma vez que são observados hidrogênios aromáticos (δ8,2-6,3) e fenólicos (δ12,5-9,5). Os sinais que caracterizam o flavonóide em análise são: dubletos em δ8,09 e δ6,94 com J 9Hz típicos de acoplamento orto no anel B integrando para dois hidrogênios cada, os dubletos em δ6,75 e δ6,35 com J 2Hz, típico de acoplamento meta no anel A integrando para um hidrogênio cada e o singleto em δ3,86 integrando para 3 hidrogênios o que indica a presença de uma metoxila, no entanto a localização da mesma não pode ser feita por simples análise deste espectro, podendo estar nas posições 3, 7 ou 4’.
A comparação entre os valores obtidos de RMN 1H e 13C (Figuras 32, 33, 34 e 35, p.
72-75) com os valores da literatura para o flavonóide ramnocitrina apresentam ótima concordância, como prova disto os valores experimentais e da literatura estão apresentados nas tabelas 15 e 16.
______Identificação estrutural 39
Tabela 15: Dados do espectro de RMN 1H do flavonóide ramnocitrina comparados com a literatura ( Barberá et al., 1986) e (Harborne,1995)* Hidrogênios δ, J e multiplicidade δ, J e multiplicidade δ, J e realizado em 200.13 MHz (Harborne et al., multiplicidade (Barberá et al., 1986) 1995) (12) 6 6,34; (2,2); d 6,39; (2,1); d 6,35; (2,0); d 8 6,73; (2,2); d 6,75; (2,1); d 6,75; (2,0); d 2’ 8,07; (8,8); d 8,10; (8,9); d 8,09; (9,0); d 3’ 6,93; (8,8); d 6,89; (8,9); d 6,94; (9,0); d 5’ 6,93; (8,8); d 6,89; (8,9); d 6,94; (9,0); d 6’ 8,07; (8,8); d 8,10; (8,9); d 8,09; (9,0); d OMe 3,85; s ------3,86; s 5-OH 12,60; sl ------12,48; sl
* δ em ppm e J em Hz (obtidos em DMSO-d6)
13 Tabela 16: Dados do espectro de RMN C (δ em ppm, DMSO-d6) do flavonóide ramnocitrina comparados com a literatura (Agrawal et al., 1989) Carbonos Tipos de carbonos δ experimental δ literatura (Agrawal (12) et al., 1989) C-2 C 147,6 147,2 C-3 C 136,3 135,9 C-4 C 176,4 176,0 C-5 C 160,7 160,3 C-6 C-H 97,9 97,4 C-7 C 165,2 164,9 C-8 C-H 92,4 92,1 C-9 C 156,4 156,1 C-10 C 104,4 104,0 C-1’ C 121,9 121,0 C-2’ C-H 129,9 129,4 C-3’ C-H 115,8 115,4 C-4’ C 159,7 159,3 C-5’ C-H 115,8 115,4 C-6’ C-H 129,9 129,4
Embora os dados de RMN 1H e 13C sejam suficientes para confirmar o flavonóide ramnocitrina, também foi o espectro de massas no modo negativo e EM-EM no modo positivo (Figuras 36 e 38 – p. 76 e 78), onde os picos do íon molecular são condizentes com a ramnocitrina [M-H] 299,0559 e [M+H] 301,0799, respectivamente.
A espectrometria de massas também auxiliou na confirmação da posição da metoxila, feita por EM-EM no modo positivo (Figura 38, p. 78) onde a presença dos fragmentos m/z ______Identificação estrutural 40
121,0347, m/z 179,0430, m/z 167,0412 e m/z 151,0450, confirmam a posição da metoxila em
C-7 (estes fragmentos se encontram propostos na Figura 04). Deve ser destacado que a utilização de EM-EM no modo positivo na determinação da posição de metoxilas no esqueleto de flavonóides é descrita por March e Miao (2004).
A ramnocitrina também foi submetida à EM-EM (Figura 37, p. 77) no modo negativo, mas os fragmentos presentes no espectro não foram conclusivos na determinação da posição da metoxila.
Figura 04: Proposta de fragmentação da ramnocitrina no modo positivo que confirma a metoxila em C7 (March & Miao., 2004).
OH
B O O
A C
OH
OH O O
O O O O H + 133 O + OH OH 179 O OH 121
CO C 167 O OH
O H
O
151 OH
Os espectros de RMN de 1H, 13C (PND e DEPT 135º) e de EM se encontram no anexo
05.
______Identificação estrutural 41
5.6. Identificação estrutural do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13).
3' OH 2' 4' 1' O 10 O 5' OH 8 1 OH 7 2 6' 6'' 6 3 O H 5'' 4'' 5 4 9 H O 2'' OH HO H OH O 1'' 3'' H H β ramnocitrina 3-O- -galactopiranosídeo (13)
O flavonóide ramnocitrina já tinha sido isolado e identificado no estudo do extrato de média polaridade (diclorometano), a comparação direta dos espectros de RMN 1H (Figuras 32 e 33, p. 72 e 73) do flavonóide ramnocitrina com o espectro (Figuras 39 e 40, p. 79 e 80) da sua versão glicosilada levaram a entender que de fato os esqueletos carbônicos eram os mesmos (veja os dados na tabela 17) e o dubleto em δ5,43 de J 7,6Hz indica que o açúcar presente é a β-D-galactopiranose.
De acordo com Barberá et al, (1986) quando um flavonóide é glicosilado na posição 3 ocorre uma alteração nos deslocamentos químicos dos hidrogênios 2’ e 6’, no entanto estas alterações não são previsíveis e geralmente levam a equívocos, mas por sua vez quando um flavonóide é glicosilado na posição 4’ ocorre uma desblindagem dos hidrogênios 3’ e 5’ em torno de 0,3 ppm. Uma vez que o glicosídeo só pode estar nas posições 3 e 4’ e não é observada nenhuma desblindagem em torno de 0,3 ppm nos hidrogênios 3’ e 5’ em relação a ramnocitrina podemos concluir que o açúcar está na posição 3.
A título de comparação os valores de RMN 1H da ramnocitrina 3-O-β- galactopiranosídeo são comparados com os valores da literatura (Barberá et al., 1986) e apresentados na tabela 18.
______Identificação estrutural 42
Tabela 17: Dados do espectro de RMN 1H do flavonóide ramnocitrina comparados com os da ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo* Hidrogênios δ, J e multiplicidade da δ, J e multiplicidade da ramnocitrina ramnocitrina (12) 3-O-β-galactopiranosídeo (13) 6 6,35; (2,0), d 6,39; (2,2), d 8 6,75; (2,0), d 6,75; (2,2), d 2’ 8,09; (9,0), d 8,12; (9,0), d 3’ 6,94; (9,0), d 6,88; (9,0), d 5’ 6,94; (9,0), d 6,88; (9,0), d 6’ 8,09; (9,0), d 8,12; (9,0), d OMe 3,86; s 3,87; s 5-OH 12,48; sl 12,66, sl * δ em ppm e J em Hz (obtidos em DMSO-d6)
Tabela 18: Valores de RMN 1H do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo comparados com os valores da literatura (Barberá et al., 1986)* Hidrogênio δ, J e multiplicidade da δ, J e multiplicidade (13) literatura 6 6,37; (2,1), d 6,39; (2,2), d 8 6,74; (2,1), d 6,75; (2,2), d 2’ e 6’ 8,09; (8,9), d 8,12; (9,0), d 3’ e 5’ 6,88; (8,9), d 6,88; (9,0), d OMe 3,86; s 3,87; s 5-OH 12,60 sl 12,66, sl H’’-1 5,40; (7,5), d 5,43; (7,6), d * δ em ppm e J em Hz (obtidos em DMSO-d6)
A ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo também foi submetida a EM no modo negativo (figuras 41, p. 81) onde o fragmento [M-H] m/z 461,1054 confirma a estrutura proposta. Por sua vez o espectro de EM-EM no modo negativo (Figura 42, p. 82) não foi conclusivo na determinação da posição do açúcar, mas ajudou a confirmar a estrutura proposta. Os fragmentos que ajudaram na confirmação da estrutura são: m/z 298,0461, referente à perda do açúcar e m/z 283,0239, referente à perda da metila do fragmento anterior.
Todos os fragmentos observados no espectro de EM-EM no modo negativo estão descritos na figura 05 de acordo com March et al (2006).
______Identificação estrutural 43
Figura 05: Propostas de fragmentação para a ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13) (March et al., 2006).
O OHOH O O O O H OHOH H H2O H OH O O O HO H O H H H OH HO H OH O O H H OH O m/z 461
CH3 m/z 298
O
O O CO CO m/z 227 m/z 255 O OH O
m/z 283
Os espectros de RMN de 1H, EM e EM-EM no modo negativo se encontram no anexo
06.
______Conclusões 44
6. Conclusões
A meta principal deste trabalho era traçar um perfil fitoquímico de Trichogonia menthaefolia Gardner, com base no isolamento e identificação dos componentes químicos micromoleculares dos extratos diclorometânico e metanólico das partes totais desta espécie vegetal. Neste sentido foram isolados e identificados os compostos:
A partir do extrato diclorometânico:
- 6α-angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1);
- 3α-hidroxi-olean-12-eno (2);
- β-amirina (3), lupeol (4), taraxasterol (5) e pseudotaraxasterol (6) - identificados em mistura;
- β-sitosterol (7) estigmasterol (8), campesterol (9), estigmast-7-em-3β-ol (10) e espinasterol
(11) - identificados em mistura;
- ramnocitrina (12).
A partir do extrato metanólico:
- ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13).
Comparando o perfil fitoquímico das espécies já estudadas por (Bohlmann et al.,
1981a), (Bohlmann et al., 1984), (Baruah et al., 1985) e (Vichnewski et al., 1985) com os resultados obtidos para a Trichogonia menthaefolia, objeto deste estudo, podemos concluir:
Dentre as espécies estudadas e já relatadas na literatura todas apresentaram lactonas sesquiterpênicas, sendo que neste trabalho nenhuma lactona sesquiterpênica foi encontrada, isto não quer dizer que a Trichogonia menthaefolia não tenha lactonas sesquiterpênicas, uma maneira de confirmar se a planta tem esta classe química é fazer uma percolação com diclorometano das folhas e realizar um estudo deste extrato, o que facilitaria o isolamento das mesmas uma vez que as lactonas sesquiterpênicas estarão presentes em maior quantidade no ______Conclusões 45 extrato, sendo que este procedimento não foi realizado no presente trabalho por falta de material vegetal.
Os triterpenos, os esteróides e os sesquiterpenos são comuns nas espécies de
Trichogonia e em membros da família Asteraceae, devendo ser destacado que:
Os triterpenos taraxasterol, acetato de taraxasterol e acetato de lupeol já foram identificados na T. prancii por sua vez o acetato de taraxasterol se mostrou bem comum no gênero sendo identificado também nas espécies T. scottmorii, T. salviaefolia e T. villosa
(Bohlmann et al., 1981a). Os triterpenos pseudotaraxasterol, lupeol, 3β-hidroxi-olean-12-eno e 3α-hidroxi-olean-12-eno foram identificados pela primeira vez no gênero.
A presença de sesquiterpenos são comuns nas espécies de Trichogonia, mas o 6α- angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno é o primeiro sesquiterpeno com esqueleto do tipo eudesmano a ser relatado no gênero.
Os esteróides β-sitosterol e estigmasterol já foram encontrados em T. hirtifolia e o estigmasterol na T. santosii (Bohlmann et al., 1984), sendo que os esteróides campesterol, estigmast-7-em-3β-ol e espinasterol estão sendo identificados pela primeira vez no gênero.
A presença de flavonóides, glicosilados ou não, ainda não havia sido relatada em
Trichogonia provavelmente em virtude dos estudos químicos, presentes na literatura, terem sido realizados somente com extratos de baixa polaridade. O estudo das últimas frações da
CLV do extrato diclorometânico e do extrato metanólico permitiu a identificação dos flavonóides ramnocitrina e ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo respectivamente. ______Referências bibliográficas 46
7. Referências bibliográficas
Agrawal, P. K. Carbon-13 NMR of Flavonoids. Elsevier, p. 152, 1989.
Barberá, O.; Sanz, J. F.; Sánches-Parareda, J.; Marco J. A. Further Flavonol Glycosides from Anthyllis Onobrychioides. Phytochemistry, v.25, p.2361-2365, 1986
Barreiro, E. J.; Fraga, C. A. M.; Araújo Jr, J. X. O uso de matérias-primas vegetais para síntese de fármacos. In: Simões, C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.; Mentz, L. A.; Petrovick, P. R. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. 4ª. edição, Editora da UFSC, 149-164. 1999.
Baruah, N. R.; Zdero, C.; Bohlmann, F.; King, R. M.; Robison, H. Some Sesqui- and Diterpenes from the Tribe Eupatorieae. Phytochemistry, v.24, p.2641-2644, 1985.
Bohlmann, F.; Zdero, C.; Pickard, J.; Robinson, H.; King, R. M. New Types of Sesquiterpene Lactones and Other Constituents from Trichogonia Species. Phytochemistry, v. 20, p.1323- 1333, 1981a.
Bohlmann, F.; Ahmed, M.; King, R. M., Robinson, H. Labdane and Eudesmane Derivates from Ageratum Fastigiatum. Phytochemistry, v. 20, p. 1434-1435, 1981b.
Bohlmann, F.; Zdero, C.; Jakupovic, J.; Gerke, T.; Wallmeyer, M.; King, R. M.; Robinson, H. Neue Sesquiterpenlactone und Rosan-Derivate aus Trichogonia-Arten. Liebigs Ann. Chem, v.1, p.162-185, 1984.
Bremer, K. Asteraceae & Classification. Timber Press, p.13, 40, 1994.
Cordell, A. G. Changing Strategies in Natural Products Chemistry. Phytochemistry, v.40, p. 1585-1612, 1995.
Cordell, A. G. Biodiversity and Drug Discovery – A Symbiotic Relationship. Phytochemistry, v. 55, p. 462-480, 2000.
Filho, V. C. & Yunes, R. A. Estudo Químico de Plantas Medicinais Orientado para a Análise Biológica. Obtenção, Determinação e Modificação Estrutural de Compostos Bioativos. In: Yunes, R. A & Calixto, J. B. Plantas Medicinais sob a Ótica da Química Medicinal Argos - Editoras Universitárias, p. 18-42, 2001.
______Referências bibliográficas 47
Harborne J. B. The Flavonoids. Chapman & Hall, p. 453, 1995.
King, R. M & Robinson, H. The genera of the Eupatorieae (Asteraceae). 21. Monographs in Systematic Botany, p.1-30, 84-136, 1987.
Kojima, H.; Sato, N.; Hatano, A. Sterol Glucosides from Prunella Vulgaris Phytochemistry, v.29, p. 2351-2355, 1990.
Mahato, S. B. & Kundu, A. P. 13C NMR Spectra of Pentacyclic Triterpenoids—A Compilation and Some Salient Features. Phytochemistry, v.37, p.1517-1575, 1994.
March, R. E. & Miao, Xiu-Sheng. A Fragmentation Study of Kaempferol Using Electrospray Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry at High Mass Resolution. International Journal of Mass Spectrometry. v.231, p. 157-167, 2004.
March, R. E.; Lewars, E. G.; Stadey, C. J.; Miao Xiu-Sheng; Zhao, X.; Metcalfe, C. D. A Comparison of Flavonoid Glycosides by Electrospray Tandem Mass Spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry, v.248, p.61–85, 2006.
Olea, R. S. G. & Roque, F. N. Análise de Misturas de Triterpenos por RMN de 13C, Química Nova, v.13, p. 278-281, 1990.
Phillipson, J. D. Phytochemistry and Medical Plants. Phytochemistry. v.56, p. 237-243, 2001
Vichnewski, W.; Kulanthaivel, P.; Goedken, V. L.; Herz, W. Two Sesquiterpene Lactones from Trichogonia Gardneri. Phytochemistry, v. 24, p. 291-296, 1985.
Viegas, C. Jr.; Bolzani, V. S.; Barreiro, E. J. Os Produtos Naturais e a Química Medicinal Moderna. Química Nova, v.28, p.326-337, 2006.
______Anexos 48
Anexo 01: Figuras 06, 07, 08, 09, 10, 11 e 12
2.0943 2.0678 1.9030 1.8986 1.8847 1.8809 1.8292 1.8254 1.8216 0.9181 0.9080 0.9004 0.8910 0.7779 5.9337 5.9267 5.9230 5.9192 5.9160 5.9053 5.9015 5.1716 5.1457 5.1205 4.7537 4.7511 4.5377 4.5358 ntegral I 0.9423 1.0000 1.0193 0.9774
6.0 5.8 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 (ppm) 0.9423 1.0000 1.0193 0.9774 0.9807 3.0835 2.7719 3.0004 3.0929 3.0104
6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 (ppm)
1 Figura 06: Espectro de RMN H (δ em ppm, CDCl3 e 400MHz) do sesquiterpeno 6α- Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)
______Anexos 49 5.9589 5.9552 5.9514 5.9444 5.9406 5.9375 5.9337 5.9267 5.9230 5.9192 5.9160 5.9084 5.9053 5.9015 Integral 1.0000
6.04 6.02 6.00 5.98 5.96 5.94 5.92 5.90 5.88 5.86 5.84 5.82 5.80 (ppm) Integral
1.76 1.72 1.68 1.64 1.60 1.56 1.52 1.48 1.44 1.40 1.36 1.32 1.28 1.24 1.20 1.16 (ppm)
Figura 07: Expansões de parte do espectro presente na figura 06
______Anexos 50 2.0943 2.0678 1.9643 1.9491 1.9340 1.9176 1.9030 1.8986 1.8955 1.8847 1.8809 1.8772 1.8292 1.8254 1.8216 Integral 1.0000 3.1940 2.8349 2.10 2.05 2.00 1.95 1.90 1.85 (ppm) 0.9181 0.9080 0.9004 0.8910 0.8802 0.8625 0.7779 Integral 6.9797 3.2151 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 (ppm)
Figura 08: Expansões de parte do espectro presente na figura 06
______Anexos 51 168.3828 146.3941 135.6798 128.7115 106.6719 77.3367 77.0240 76.7039 70.9212 55.9809 49.5072 42.1534 40.2258 38.0946 38.0801 31.9410 29.7079 29.3733 26.1365 24.2089 22.7033 21.3940 20.6812 18.3026 17.5680 16.1205 15.4295 14.1202 0.0018
160 140 120 100 80 60 40 20 0 (ppm)
13 Figura 09: Espectro de RMN C (PND, δ em ppm; CDCl3, 100MHz) do sesquiterpeno 6α- Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)
______Anexos 52 135.6935 106.6638 70.9059 55.9582 49.4918 42.1453 40.2105 38.0720 29.7071 26.1284 24.2008 22.7024 21.3859 20.6876 18.2800 17.5599 16.1124 15.4359
140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 (ppm)
13 Figura 10: Espectro de RMN C (DEPT 135º, δ em ppm; CDCl3, 100MHz) do sesquiterpeno 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)
______Anexos 53
Figura 11: Mapas de contorno do HMQC
______Anexos 54
Figura 12: Expansão dos mapas de contorno do HMQC presente na figura 11
______Anexos 55
Anexo 02: Figuras 13, 14, 15, 16 e 17
5.6393 5.6241 3.6795 3.6751 3.6675 3.4800 3.4724 3.4655 1.2525 1.1616 1.1427 1.0928 1.0442 1.0038 0.9886 0.9514 0.8491
8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 (ppm)
1 Figura 13: Espectro de RMN H (δ em ppm, CDCl3 e 400MHz) do triterpeno 3α-hidroxi- olean-eno (2)
______Anexos 56 3.4800 3.4724 3.4655 5.6393 5.6241 Integral 0.1299
Integral 5.68 5.66 5.64 5.62 5.60 0.1321 (ppm) 3.56 3.52 3.48 3.44 3.40 (ppm) 1.1616 1.1427 1.0928 1.0442 1.0038 0.9886 0.9514 0.8971 0.8800 0.8623 0.8491 Integral 1.0000 0.4887 0.5437 1.0936 0.6373 0.7407 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 (ppm)
Figura 14: Expansões de parte do espectro presente na figura 13
______Anexos 57 141.5736 122.0871 77.3388 77.2224 77.0187 76.7059 76.3713 49.6693 47.4144 43.0428 40.8170 39.2896 38.9477 37.8275 36.0091 35.0635 34.8307 34.5980 34.5252 33.0996 32.4013 32.0594 32.0376 31.9285 30.3428 30.0809 29.7100 29.4699 29.3681 29.2663 29.1790 28.9462 28.2479 27.7970 25.4548 25.1711 23.6291 22.6980 19.6212 18.4283 18.2101 16.2098 14.1368 -0.0035
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 (ppm)
13 Figura 15: Espectro de RMN C (PND, δ em ppm; CDCl3, 100MHz) do triterpeno 3α- hidroxi-olean-eno (2)
______Anexos 58
49.6693 47.4144 43.0428 40.8170 39.2896 38.9477 37.8275 36.0091 35.0635 34.8307 34.5980 34.5252 33.0996 32.4013 32.0594 32.0376 31.9285
50 49 48 47 46 45 44 43 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 (ppm) 30.0809 29.7100 29.4699 29.3681 29.2663 29.1790 28.9462 28.2479 27.9570 27.7970 25.4548 25.1711 23.6291 22.6980 19.6212 18.4283 18.2101 16.5735 16.2098 14.1368
30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 (ppm)
Figura 16: Expansões de parte do espectro presente na figura 15
______Anexos 59
122.1009 76.3705
124 120 116 112 108 104 100 96 92 88 84 80 76 (ppm) 49.6612 47.4063 43.0275 38.9469 36.0010 35.0554 34.5971 34.5244 33.0915 32.4077 32.0586 32.0368 30.3420 29.7092 28.9381 27.7961 25.4613 23.6283 22.7045 19.6204 18.4348 18.2093 16.2090 14.1432
52 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 (ppm)
13 Figura 17: Espectro de RMN C (DEPT 135º, δ em ppm; CDCl3, 100MHz) do triterpeno 3α- hidroxi-olean-eno (2)
______Anexos 60
Anexo 03: Figuras 18, 19, 20, 21 e 22
D F
C A E B
Figura 18: Cromatograma obtido por CG da mistura de triterpenos: A- padrão de referência, B- β-sitosterol (7), C- β-amirina (3), D- lupeol (4), E- pseudotaraxasterol (6) e F- taraxasterol (5) (coluna HP-1)
______Anexos 61
A F D
C B E
Figura 19: Cromatograma obtido por CG da mistura de triterpenos: A- padrão de referência, B- β-sitosterol (7), C- β-amirina (3), D- lupeol (4), E- pseudotaraxasterol (6) e F- taraxasterol (5) (coluna HP-50)
______Anexos 62 4.6190 4.6133 4.6070 4.6020 4.5673 3.6575 3.6410 3.6240 3.2281 3.2155 3.1997 3.1871
4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 (ppm)
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 (ppm)
1 Figura 20: Espectro de RMN H (δ em ppm, CDCl3 e 400MHz) da mistura dos triterpenos (3, 4, 5 e 6)
______Anexos 63 6263 9603 1922 1913 7197 3920 3324 1430 154. 150. 145. 139. 121. 119. 109. 107.
160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 (ppm)
160 140 120 100 80 60 40 20 0 (ppm) 13 Figura 21: Espectro de RMN C (PND, δ em ppm; CDCl3, 100MHz), da mistura dos triterpenos (3, 4, 5 e 6)
______Anexos 64 6023 3314 1493 1379 121. 109. 107. 79.
130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 (ppm)
13 0 Figura 22: Espectro de RMN C (DEPT 135 , δ em ppm; CDCl3, 100MHz) da mistura dos triterpenos (3, 4, 5 e 6)
______Anexos 65
Anexo 04: Figuras 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 e 31
C E A F B D
Figura 23: Cromatograma dos padrões dos esteróides: A- padrão de referência, B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-50)
B
D A C E
F
Figura 24: Cromatograma dos padrões dos esteróides: A- padrão de referência, B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-1) ______Anexos 66
C
D A B E F
Figura 25: Análise por CG da mistura dos esteróides: A- padrão de referência, B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-50)
C
E A F
D B
Figura 26: Análise por CG da mistura dos esteróides: A- padrão de referência, B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-1) ______Anexos 67
C
A D E
B F
Figura 27: Enriquecimento com padrões na mistura dos esteróides: A- padrão de referência, B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-50)
______Anexos 68 5.3555 5.3429 5.1812 5.1598 5.1433 5.1219 5.0442 5.0228 5.0063 4.9849 3.5529 3.5365 3.5251 3.5125 3.4974 3.4854
7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 (ppm)
1 Figura 28: Espectro de RMN H (δ em ppm; CDCl3, 400MHz) da mistura dos esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)
______Anexos 69 5.3555 5.3429 5.1812 5.1598 5.1433 5.1219 5.0442 5.0228 5.0063 4.9849 Integral 1.0000 0.9438 0.8669 5.45 5.40 5.35 5.30 5.25 5.20 5.15 5.10 5.05 5.00 4.95 4.90 4.85 (ppm) 3.5529 3.5365 3.5251 3.5125 3.4974 3.4854 Integral 1.0239 3.62 3.60 3.58 3.56 3.54 3.52 3.50 3.48 3.46 (ppm)
Figura 29: Expansões de parte do espectro presente na figura 28
______Anexos 70 7492 3270 2712 7137 4658 8082 8678 9513 2452 1541 2911 2184 5091 6799 2577 5158 8969 9292 4159 3685 2262 0953 0735 4078 9859 2577 0540 140. 138. 129. 121. 117. 71. 56. 55. 51. 50. 42. 42. 40. 39. 37. 36. 31. 28. 25. 24. 21. 21. 21. 19. 18. 12. 12.
150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 (ppm)
13 Figura 30: Espectro de RMN C (PND, δ em ppm; CDCl3, 100MHz) da mistura dos esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)
______Anexos 71 3269 2711 7136 138. 129. 121.
152 148 144 140 136 132 128 124 120 116 112 108 104 100 (ppm) 8081 0662 8677 9512 2998 2451 1540 2911 5090 6798 2576 8895 6495 9291 4159 3684 2261 1025 0734 4077 9858 2576 71. 71. 56. 55. 52. 51. 50. 42. 40. 39. 37. 31. 31. 28. 25. 24. 21. 21. 21. 19. 18. 12.
75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 (ppm)
13 0 Figura 31: Espectro de RMN C (DEPT 135 , δ em ppm; CDCl3, 100MHz) da mistura dos esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)
______Anexos 72
Anexo 05: Figuras de 32, 33, 34, 35, 36, 37 e 38
12.4805 12.4558 10.1804 9.5596 9.3486 8.1016 8.0791 6.9510 6.9285 6.3560 Integral 1.0000 1.1372 0.4172 0.7678 13.5 12.0 10.5 9.0 7.5 6.0 4.5 3.0 1.5 0.0 -1.5 (ppm)
1 Figura 32: Espectro de RMN H (δ em ppm; DMSO-d6, 400MHz) do flavonóide ramnocitrina (12)
______Anexos 73 8.1016 8.0791 6.9510 6.9285 6.7554 6.7504 6.3609 6.3560 3.8717 3.8662 3.8564 Integral 3.6883 3.92 3.88 3.84 (ppm) Integral 1.0000 1.1372 0.4172 0.7678 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 (ppm)
Figura 33: Expansões de parte do espectro presente na figura 32
______Anexos 74 176.3673 165.2384 160.6850 159.6667 156.4371 147.5776 136.3251 129.9387 121.9084 115.8057 104.3713 97.8176 92.3477 56.3715 55.9569
180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 (ppm)
13 Figura 34: Espectro de RMN C (PND, δ em ppm; DMSO-d6, 100MHz) do flavonóide ramnocitrina (12)
______Anexos 75 129.9387 115.8130 97.8249 92.3550 56.3788 55.9642 40.2528 40.0419 39.8382
140 120 100 80 60 40 20 0 (ppm)
13 0 Figura 35: Espectro de RMN C (DEPT 135º, δ em ppm; DMSO-d6, 100MHz) do flavonóide ramnocitrina (12)
______Anexos 76
Intens. x104
299.0559
5
4
3
2
255.2341 325.1837
1
0 100 200 300 400 500 600 m/z
121118.d: -MS
Figura 36: EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina (12)
______Anexos 77
Intens.
255.0328
1500
284.0339
1000
271.0629 227.0376
500
299.0567
243.0702
211.0432
0 50 100 150 200 250 300 m/z
9554-MS-MS.d: -MS
Figura 37: EM-EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina (12)
______Anexos 78
Intens. x104
1.50 258.0620
1.25
1.00
167.0412
107.0540
121.0347 0.75
0.50 301.0802 212.0548
286.0568
151.0450 179.0430 0.25 45.0240 98.9891 201.0785 245.6824 227.0795 67.3062 134.0431 55.6070 142.5432
50 100 150 200 250 300 m/z
71118-MS-MS-massamenor.d: +MS, 100%=14813
Figura 38: EM-EM no modo positivo do flavonóide ramnocitrina (12)
______Anexos 79
Anexo 06: Figuras 39, 40, 41 e 42
12.6259 10.2677 8.1259 8.1040 6.8882 6.8657 6.7572 6.7517 6.3896 6.3841 5.4439 5.4247 3.8664
12.0 10.5 9.0 7.5 6.0 4.5 3.0 1.5 0.0 (ppm)
Figura 39: Espectro de RMN de 1H do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13) (δ em ppm, DMSO-d6, 400MHz)
______Anexos 80 8.1259 8.1040 6.8882 6.8657 6.7572 6.7517 6.3896 6.3841 5.4439 5.4247 Integral 1.2561 5.50 5.45 5.40 (ppm) 2.8312 2.8134 1.0000 1.2961 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 (ppm)
Figura 40: Expansão de parte do espectro presente na figura 39
______Anexos 81
Intens. x104
461.1054
8
6
4
2
497.0823
605.1493 713.4694
551.1371
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
3542.d: -MS
Figura 41: EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina 3-O-β- galactopiranosídeo (13)
______Anexos 82
Intens.
3000
283.0239
2500
2000
1500
1000
255.0301
298.0461
500
227.0351 132.5602
0 50 100 150 200 250 300 m/z
6542-MS-MS.d: -MS
Figura 42: EM-EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13)