GALANTAMINA (Gal) Y ENF. ALZHEIMER (EA)

OH H LA BIODIVERSITAT COM A FONT DE O MeO

RECURSOS NATURALS PER NMe UNA EXPLOTACIÓ SOSTENIBLE Galantamina

. Reminyl® Razadyne® (USA)

Dr. JAUME BASTIDA Grup de Productes Naturals Facultat de Farmàcia. UB [email protected] Leucojum aestivum cv Carlton papilio

OTROS ALCALOIDES DE LAS AMARYLLIDACEA OTROS ALCALOIDES DE LAS AMARYLLIDACEA

OH Patente: US2016024074 (A1) Montanina OR1 Narciclasina y Pancratistatina OMe Fracción de alcaloides de los H O O OH bulbos de bifida OR2 Antitumorales. Fase clínica. NH O Inhiben selectivamente: O N H OH O Tratamiento/prevención de: • crecimiento sarcoma M5076 sal de piridinio de O + 3,4-O-fosfato cíclico NH • artritis reumatoide . . P de narciclasina R ,R = • proliferación de leucemia 1 2 O narciclasina R1=R2=H linfocítica P388 • colitis ulcerosa

OH Inducen apoptosis específica en • sepsis HO OR1 cáncer de mama. • osteoporosis H O • infecciones inflamatorias OR2 H NH • artritis psoriásica O Inventores:

OH O Gnieslaw de Oliveira, P.; Pereira Ramos • artritis crónica juvenil Pedrazza, G.; Farinon, M; Ricardo • otras enf. inflamatorias no sal sódica de O Problemas de solubilidad de la Machado, X.; Zuanazzi, J.A.S.; Spies, F. 3,4-O-fosfato cíclico P de pancratistatina R1,R2= + específicas de articulaciones O Na base UFRGS y HCPA (RS, Brasil) pancratistatina R1=R2=H 3 DESARROLLO SOSTENIBLE , CAMBIO CLIMÁTICO Y ECOSISTEMAS UNIVERSIDADES IMPLICADAS ESPAÑA Diversidad Biológica para el Desarrollo Sostenible Universidad de Barcelona MÉXICO Unv Nacional VENEZUELA Autónoma de México Objetivos Específicos Universidad de los Andes COLOMBIA Universidad de Antioquia BRASIL • bioprospección de Universidad del Cauca UF do Espírito Santo UF do Rio Grande do Sul • evaluar los recursos ECUADOR Universidad Tecnológica Indoamérica BOLIVIA • identificar nuevos compuestos Esc. Superior Politécnica Chimborazo Unv Mayor de San Andrés • identificar nuevas fuentes Gal PERÚ PARAGUAY Unv Nacional de Trujillo Unv Nacional de Asunción • bases para aprovechamiento sostenible Unv Nacional de Moquegua • obtención de Gal a nivel de planta piloto CHILE ARGENTINA Universidad de Talca Universidad Nacional de San Juan

> 125 investigadores de diferentes áreas

5 6

LA FAMILIA AMARYLLIDACEAE AMARYLLIDACEAE DE IBEROAMERICA

ANTIGUA familia Amaryllidaceae familia Amaryllidaceae subfam. familia Agapanthaceae subfam. Agapanthoideae a b c d familia Alliaceae subfam. Allioideae APG 2009 NUEVA .

e f g h i

Amaryllidaceae Agapanthaceae Alliaceae j k l m

[a] amazonica, [b] Rhodophiala moelleri, [c] Rhodophiala andicola, [d] littoralis, Chase, Reveal, Fay (2009) Botanical Journal of the Linnean Society 161 : 132-6 7 [e] Sprekelia formosissima, [f] amancaes, [g] Worsleya procera, [h] Zephyranthes grandiflora, 8 [i] Phaedranassa dubia, [j] Hippeastrum calyptratum, [k] Hp. striatum, [l] Hp. argentinum, [m] Hp. psittacinum 1. BIOPROSPECCIÓN: MUESTREO 1. BIOPROSPECCIÓN: ANÁLISIS GENÉTICO

1. Cumplimiento de los requisitos legales: Convenio sobre la Phaedranassa viridiflora Baker Biodiversidad (1993) y Protocolo de Nagoya (2010) 2. Prospección de la Biodiversidad. Recolección 300 g PF 3. Colección de material de Herbario centralizado en la UTI Ecuador (Quito, Ecuador), integrado en el Missouri Botanical . Garden (http://tropicos.org/ ) . 4. Banco de germoplasma . Micropropagación bulbos Prof. Alan Meerow

Oleas, Meerow, Ortega (2016) Genetic structure of the threatened Phaedranassa 9 schizantha (Amaryllidaceae) Botanical Journal of the Linnean Society 1-11

2. ESTUDIO PRELIMINAR: LOS ALCALOIDES 2. ESTUDIO PRELIMINAR: ALCALOIDES PRINCIPALES

12 11 OH 3 2 4 OH HO 4 2 HO 1 MeN 3 3 4a 5' 10 10b H - Lycorina, Lycoris radiata 2 4 10 H 10b HO 4' 6' β 9 10a MeO 9 10a 1 2 HO 1 3 5 1 O 11 4a 6 H H H - Aislamiento: Gerrad, 1877 NH α N 12 O 3' 1' O 8 6a 8 HO β MeO 6a 6 10 10b H 4 2' ' 7 6 7 9 10a O - Caracterización estructural: O 11 norbelladinanorbelladine lycorinalycorine homolycorinahomolycorine 4a OH Nagakawa et al., 1956 : 2 2 2 3 3 . . H 1 OH 1 OMe 1 OH 12 11 11 3 N 10 10 OH 10 H 4 - Numeración: 8 6a O 9 10a 4a 4 O 9 10a 4a 4 O 9 10a O 10b 10b 10b OH 7 6 H 12 H 12 4a Ghosal, Saini & Razdan, 1985 N N NH O 8 6a O 8 6a O 8 6a 6 7 6 7 6 7 crininacrinine haemanthaminahaemanthamine OH O narciclasinanarciclasine OMe Bastida, Lavilla, Viladomat (2006) Chemical and biological aspects of Narcissus 1 OMe 3 alkaloids. In The Alkaloids 63 : 87-179 10 11 11a 2 2 2 4 3 OH O 9 10a OH 1 Bastida, Berkov, Torras, Pigni, de Andrade, Martínez, Codina, Viladomat (2011) H 4a 1 4a 3 O 10 NMe 12 10 10b 9 10a 4 MeO 9 10a Chemical and biological aspects of Amaryllidaceae alkaloids. In Recent Advances O 11 4 10b 12 O 8 6a H N 4a in Pharmaceutical Sciences, 65-100 OH 7 6 11 12 O Berkov, Osorio, Viladomat, Bastida (2019) Chemodiversity, Chemotaxonomy and O 8 6a montaninamontanine 8 6a NMe 7 6 7 6 Chemoecology of Amaryllidaceae alkaloids. In The Alkaloids 83 : 000 12 tazettinatazettine galanthaminegalantamina 2. ESTUDIO PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS 2. ESTUDIO PRELIMINAR: GC-MS 1. Extracción de 300 g PF ‰‰‰ estudios preliminares: caracterizar compuestos a [0.001%] de PF 2. Escasa manipulación 3. Instrumental/técnicas avanzadas . .

Programa de Temperatura: Derivatización: 100-180 °C a 15 °C/min, 180-300 °C a 5°C/min, 5 mg extracto + Piridina (50 µL) mantener 10 min a 300 °C 90 min a 40 °C con BSTFA (50 µL) T Inyector: 250 °C // Flujo (He): 0.8 mL/min Evaporar a sequedad N2 [1mg/mL] // Inyección: 1 µL // Split 1:20 Redisolver en 250 µL de MeOH

- Los valores del Indice de Kovats (RI) de los compuestos se mide con mezcla patrón de alcanos saturados (C9-C36)

13 Torras, Berkov, Jáuregui, Caujapé, Viladomat, Codina, Bastida (2010) Phytochem. Anal. 21 , 80-8

Detección de Galantamina Quimiotipos de Leucojum aestivum en Bulgaria

Ly -chemotype near Black Sea

Hly -chemotype found along Danube, separated from South by Balkans .

Gal -chemotype in the South

El contenido medio de Gal varia de 0.003 a 0.08% (PS) en el Norte, hasta un 0.42% en las poblaciones del Sur. Algunos individuos alcanzan el 0.65% en Gal

Berkov, Georgieva, Kondakova, Viladomat, Bastida, Atanassov, Codina (2013) Biochemical 15 Systematics and Ecology 46 : 152-61 16 . . ACE .DCIGDIANAS EA: ACE,GSK-3 BCE, DOCKING 4. 3. CARACTERIZACIÓNPARCIAL:3. LC-SPE-NMR TYR130 GLU199 Torpedo californica MeO Galantamina SER200 GLY117 O H NMe O H (CD 3 OD) LYS85 MeO Acetilleucovernina O GSK-3 H NH βββ β O ASP200 ASP264 O 60 57 56 51 48 t (min) 3 0 OAc βββ β 100 100 %B 22 5 5 5 5

. . Sellés, Sellés, Viladomat, Bastida, Codina (1999). Sellés, Sellés, Bergoñón, Viladomat, Bastida, Codina (1999). Culture F1 MeO MeO , m/z 3. CARACTERIZACIÓNPARCIAL:3. LC-SPE-NMR 49 n 350 C 350 a r : 129-36: c i HO s s i d 18 5. MICROPROPAGACIÓN5. i n H e H

N 23 O O N H - o M nuevosbrotes NO Formación de x Preparación e i d del bulbodel e 6 O H oscuridad,23±1°C Introducciónal cultivo ln elReports Cell in vitro Esterilización

superficial Plant Cell Tissue and Organ and Tissue Cell Plant in vitroin Obtenciónde 18 twin-scales placabasal : 646-51: Seccionado del bulbodel 18 20 5. MICROPROPAGACIÓN in vitro 5. MICROPROPAGACIÓN in vitro : Leucojum aestivum

Murashige & Skoog Operaciones + Sacarosa 3% previas + Agar 0.8%

BAP-NAA (5:1 mg/L) oscuridad, 23±1°C Brotes t-s Transferencia a medio Bulbo inicial líquido, Sacarosa 6% sin agar ni hormonas .

. BAP 2 mg/mL + NAA 0.15 mg/mL 4-6 semanas Repicaje 15 días

Baby foods Inoculación a medios 30 mL, 110 rpm de Engrosamiento y Fotoperiodo 16/8h Enraizamiento T 23±1°C

MS + Sacarosa 6% + Agar 0.8% arena /turba (1:1)

+ NAA (0.1 mg/L) Trasplante 3 meses después o Carbón activo al suelo

21 22

5. MICROPROPAGACIÓN in vitro : Hippeastrum papilio 5. MICROPROPAGACIÓN in vitro

❶ ❷ ❸ . .

❹ ❺ ❻ aclimatación

❶ Twin scaling on MS + 2 mg/L BAP and 0,1 mg/L NAA, ❷ formation 30 days after scaling, ❸ Bulb formation 50 days after scaling, ❹ Bulb growing in temporary immersion, ❺ ready for planting, ❻ Acclimated bulbs Colque, Viladomat, Bastida, Codina (2002). Journal of Horticultual Science & Biotech. 23 77 : 739-43 6. COMPLETAR CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL 7. ENSAYOS DE LAS ACTIVIDADES in vitro E in vivo HMBC MS, HRMS ααα pf, [ ]D, UV, IR Docking RMN 1D: H1/C13 /DEPT RMN 2D: COSY, HMQC LC-SPE-NMR Micropropagación NOESY, HMBC del material vegetal Elucidación estructural Rayos X, CD MS, RMN (1D/2D), IR, GC-MS HRMS, UV, CD, X-rays . .

NOESY Muestra Extracto LC-DAD Compuesto Puro

Ensayos Biológicos

Estudios in vitro/in vivo Antiprotozoarios Apoptosis enfermedades neurodegenerativas

Rayos X 26

7. ESTUDIO ACTIVIDADES in vitro : INHIBICIÓN ACE/BCE 7. ESTUDIO ACTIVIDADES in vitro : INHIBICIÓN GSK3 βββ

FRACCIÓN DE ALCALOIDES / + SUSTRATO + ALCALOIDE ATP exceso GSK3 βββ

P . . SUSTRATO + + ADP 2) Detección actividad Kinasa ATP remanente a. conversión ADP ‰‰‰ ATP

1) ADP Glo ® Luciferina O HO S N O + Agotar ATP nuevo ATP N S + 1/2 O2 b. Luciferasa / Mg +2

HO S N O

AMP + N S + PPi + CO2 Oxiluciferina Ellman, Courtney, Andres jr, Featherstone (1961) Biochemical Pharmacol. 7: 88-90 López, Bastida, Viladomat, Codina (2002) Life Sciences 71 : 2521-2529 27 Baki, Bielik, Molnár, Szendrei, Keresü (2007) Assay and Drug DevelopmentTechnology 5: 75-83 7. ESTUDIO ACTIVIDADES in vitro : NEUROPROTECCIÓN CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA NEURONAS Núcleos Dendritas Superposición - Cultivos primarios Hoescht MAP 2 Merge

embriones rata Medio Wistar E18 Neuronas corteza cerebral - Ensayo de Citotoxicidad FA LDH FA

(μg/mL) . . DIV 0 6 7 8 0,75 6,00 Glu 125µM 1,50 12,00 - Ensayo de Neuroprotección (toxicidad por Glu) Núcleos condensados de conexiones Pérdida 3,00 24,00 FA Glu LDH Pretratamiento DIV 0 6 7 8

LDH: Lactato Deshidrogenasa Z. carinata

Glu liberación ‰ muerte cél. 0,75µg/mL (pre) FA LDH (colorimétrico) Postratamiento Glu: Glutamato 125 µM, 20min DIV 0 6 7 8

Cortés, Posada, Alvarez, Alzate, Berkov, Cardona-Gómez, Osorio (2015) Life Sci. 122 : 42-50 Z.carinata 0,75µg/mL (post)

7. ESTUDIO ACTIVIDADES in vivo : modelo TRANSGÉNICO 10. PLANTA PILOTO DE EXTRACCIÓN DE Gal

Extracto rico alcaloides 10mg/Kg x2 veces día vehículo DMSO 1% (vía intraperitoneal ) placas β-amiloide ovillos neurofibrilares Z. carinata (6 meses) (15 meses)

3 lotes experimentales . .

- No Transgénicos tratados actividad con vehículo (sol. salina) ansiolítica - Transgénicos tratados con vehículo - Transgénicos tratados con FA visual

Sabogal-Guáqueta, Muñoz-Manco, Ramírez-Pineda, Lamprea-Rodríguez, Osorio, Extracción por parte de la Empresa Cardona-Gómez (2015) Neuropharmacology 93 , 134-45 31 32 . http://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/vol-4 IngredienteFarmacéutico Activo API – Normas CorrectaFabricación Medicamentos de de – NCP /index_en.htm Uso Humano y Veterinario y Humano Uso (01/09/2014)

. Moltes gràcies