THÈSE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE Spécialité : Biodiversité, Ecologie et Environnement Arrêté ministériel : 7 août 2006
Présentée par Rodolphe Poupardin
Thèse dirigée par Stéphane Reynaud et codirigée par Jean-Philippe David préparée au sein du Laboratoire d’Ecologie Alpine (LECA) dans l'École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant (EDCSV)
Interactions gènes-environnement chez les moustiques et leur impact sur la résistance aux insecticides
Thèse soutenue publiquement le Vendredi 4 Mars 2011 devant le jury composé de : Mme Chantal Dauphin-Villemant Chargée de recherche au CNRS, Paris - Rapporteur Mme Hélène Roche Ingénieure de recherche au CNRS, Paris - Rapporteur Mme Catherine Bourgouin Directrice de recherche à l’Institut Pasteur, Paris - Examinatrice Mr René Feyereisen Directeur de recherche à l’INRA, Sophia-Antipolis - Examinateur Mme Mylène Weill Directrice de recherche au CNRS, Montpellier - Examinatrice Mr Patrick Ravanel Professeur à l’Université de Grenoble - Président
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A ma famille,
pour leur soutien et leur aide
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Remerciements
Cette thèse marque la fin de cinq belles années au sein de l‟écosystème que forme le laboratoire d‟Ecologie Alpine (de la première année de Master à aujourd‟hui). Beaucoup de personnes m‟ont soutenu et marqué à différents niveaux. J‟aimerais aujourd‟hui pouvoir les remercier :
Jean-Philippe David, pour m‟avoir fait découvrir le monde de la recherche ! Je suis arrivé en Master 1 au LECA où tu m‟as offert l‟opportunité de faire un stage avec toi et je ne le regrette pas. Tu m‟as formé, soutenu et inculqué les notions qui m‟ont permis d‟évoluer et d‟avancer. Je te suis très reconnaissant pour ton encadrement exemplaire (que ce soit derrière une pipette ou un bar à Liverpool) et pour cela, j‟espère que nous continuerons un bon bout de chemin ensemble professionnellement et amicalement parlant. Tu es un exemple pour moi !
Stéphane Reynaud, pour ton encadrement et ta bonne humeur indéfectible! Travailler pendant ces 4 années avec toi (Master 2 et thèse) aura été un plaisir que ce soit professionnellement et humainement. Tu m‟as donné ta confiance et ton aide, je t‟en remercie. Bien sûr, je n‟oublierai jamais nos longues discussions « intellectuelles et philosophiques » du matin au café. Toi et Jean-Phi avez formé une superbe et très efficace codirection de thèse!
Patrick Ravanel, j‟étais encore sous Biactol© (comprendre en licence de biologie sous anti acnéique) que tu m‟as inoculé le virus de l‟écotoxicologie ! Tu m‟as aussi surtout donné l‟envie d‟enseigner. J‟aimerais te remercier pour cela mais aussi de m‟avoir accueilli au sein de l‟équipe « Perturbations environnementales et xénobiotiques ». T‟avoir comme tuteur pendant mon monitorat aura été un bonheur.
Les membres du Jury, Chantal Dauphin-Villemant, Hélène Roche, Catherine Bourgouin, Mylène Weill et René Feyereisen pour avoir accepté d‟évaluer mon travail. C‟est un honneur pour moi que de vous avoir aujourd‟hui. J‟aimerais remercier spécialement les rapporteurs Chantal et Hélène pour leur efficacité quant aux délais relativement serrés. Bien sûr, Cette thèse ne serait pas sans les personnes qui m‟ont conseillé et dirigé au cours de mes différents comités de thèse à savoir Vincent Corbel, Laurence Després, Gaëlle Le Goff, mais aussi Chantal Dauphin-Villemant et Catherine Bourgouin.
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Pierre Taberlet et Irène Till-Bottraud pour m‟avoir accueilli au laboratoire. Irène, je te remercie sincèrement pour ton soutien.
Romain Blanc-Mathieu et Farid Khelalfa pour avoir été d‟excellents stagiaires et maintenant de très bons amis. J‟ai été très heureux de vous avoir connu. Romain, prochain rendez-vous en Angleterre !
Sébastien Marcombe, Ali Lamari et Emilie Guittard avec qui j‟ai pris grand plaisir à collaborer pendant ma thèse. Sébastien, ces quelques bières euh… microarrays avec toi nous auront permis de bien nous connaître, j‟espère que nos chemins se recroiseront ! Ali, la prochaine fois, c‟est moi qui débarquerai en Tunisie, non pas avec une blouse, mais plutôt un short et une crème UV50. Enfin, Emilie, même si à nous deux, nous avons réalisé un holocauste entomologique (injecter plusieurs centaines de larves ne nous garantit pas une place au Paradis), j‟ai été très heureux de cette collaboration.
Mes collègues du bureau 219, notamment Angélique San-Miguel et Asam Riaz qui vont profondément me manquer ! Angélique, ta jovialité permanente et ton sourire ont été la lumière du bureau 219 ! Asam, ta gentillesse, ta serviabilité (ce n‟est pas tous les jours qu‟un collègue vient vous aider à quatre heures du matin pour des expérimentations) et ton sens de l‟humour vont me manquer…j‟espère sincèrement vous revoir mes amis.
Je n‟oublie pas Guillaume Tétreau et sa méthode pédagogique révolutionnaire (ou l‟art de fixer l‟attention des étudiants) ; Mathieu Faure, mon digne héritier en tant que responsable cafétaria (organe vital du laboratoire) ; Mickael Catinon, mon ex-colloque ; Ozgür Kilinc, le pire ennemi des 35h ; Fabrice Grassein, mon maître en photographie et collègue de café attitré ; Alexia Chandor-proust, notre prêtresse en biochimie ; Emma Rosseto et Charlène Thedevuide, militantes de la cause blonde ; Catherine Fallecker, collègue et surtout amie ; Marie-Audrey Quintana, ma voisine de bureau durant quelques mois qui a su me supporter; Nicolas Legay, alias Dexter ; Jacky Girel, premier expert mondial en contrepèterie.
Un remerciement particulier à Lucile Sage pour sa gentillesse et tous les services qu‟elle m‟a rendus. Lucile, cette thèse, je te la dois en partie.
Je voudrais remercier également Michel Tissut, puits de science et premier être vivant connu à vivre une symbiose académique avec un épagneul Breton nommé « Bibi », je n‟oublierai pas nos conversations sérieuses et moins sérieuses … ; Sylvie Veyrenc, pour son
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« doux caractère » que j‟aime tant et son aide ; Thierry Gaude, avec qui je partage de nombreuses passions comme le bricolage et la photo mais aussi Olivier Lontin, personne pour qui moi et mon ordinateur sommes très reconnaissants!
Un grand merci à Delphine Rioux, Christian Miquel, Carole Poillot et Armelle Monier pour leur aide et leur gentillesse lors de mes expérimentations sur la plate-forme MarMol. Je n‟oublie pas les autres personnes du troisième étage que j‟ai côtoyées à savoir Alice Valentini, Aurélie Bonin, Wasim Shehzad et Frédéric Laporte.
J‟ai eu l‟occasion durant ma thèse de faire plusieurs aller-retour à l‟école de médecine tropicale de Liverpool (LSTM) où j‟ai été très bien accueilli et accompagné… tellement bien accueilli que j‟y retourne pour un post-doctorat. Merci à Hilary Ranson, Clare Strode, Christopher Jones et les autres membres du LSTM.
J‟ai également pu faire connaissance grâce à Catherine Bourgouin avec Isabelle Dusfour et Romain Girod de l‟Institut Pasteur de Guyane. Même si à cause de l‟emploi du temps et de l‟enchaînement des événements, je n‟ai pu donner suite à un projet de collaboration, j‟aimerais les remercier vivement pour le temps, la gentillesse et l‟aide qu‟ils ont su me consacrer et j‟espère sincèrement pouvoir travailler un jour avec eux.
Si j‟ai beaucoup aimé enseigner, c‟est grâce à certaines personnes avec qui j‟ai travaillé comme Muriel Raveton et Serge Aubert qui m‟ont fait confiance mais aussi Patrick, Nelly et Caro du CUBE, merci à vous !
Un laboratoire, c‟est énormément de démarches administratives compliquées. Heureusement, grâce à Kim Pla et Florence Sagnimorte, cela s‟est transformé en un jeu d‟enfant. Je peux l‟avouer aujourd‟hui, bon nombre d‟ordres de mission et de bons de commande n‟étaient que des prétextes pour vous voir, merci à vous ! Par la même occasion, j‟aimerais remercier Laurence Salson-Rivière de l‟UFR de Bio.
Je n‟omets pas les personnes qui ont quitté le LECA : Joëlle Patouraux, Joëlle Claustre, Bénédicte Poncet, Margot Paris, Fabien Laurent, Thomas Bouchardy et Julien Sérandour (alias Rourou).
Enfin, j‟aimerais remercier de tout mon coeur mes parents et mon frère à qui je dois énormément pour leur soutien inconditionnel et sans faille ainsi que pour leurs sacrifices. Un grand merci à ma tendre coach personnelle et bien aimée, Juliette.
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Avant propos
Cette thèse sur articles déposée à l‟école doctorale Chimie et Sciences du Vivant (EDCSV) de l‟Université Joseph Fourier (UJF) résume le travail réalisé depuis Octobre 2007.
Les trois premières années de cette thèse ont été financées par un contrat d‟allocataire de recherche couplé à contrat de moniteur. Depuis Octobre 2010, je suis financé grâce à un poste d‟Attaché Temporaire à l‟Enseignement et à la Recherche (ATER) à l‟UFR de biologie de l‟UJF. Les expérimentations ont été financées par l‟Agence National de la Recherche (ANR 07SEST014 MOSQUITO-ENV). Ce travail a donné lieu à la rédaction de sept articles (5 publiés, 1 soumis et 1 sous presse), à quatre communications de congrès (3 présentations orales et 1 poster) et à l‟encadrement de deux stagiaires (1 étudiant en Master 1ère année « Biodiversité, Ecologie et Environnement » et 1 étudiant en 3ème année de Licence de Biologie). Cette thèse m‟aura également permis de découvrir et d‟apprécier l‟enseignement qui me paraît, aujourd‟hui, indispensable pour la recherche.
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Table des matières
Chapitre I : Introduction générale
I/ Biologie et écologie des moustiques ...... 6
1/ Biologie et cycle de vie des moustiques...... 6
2/ Ecologie des gîtes larvaires...... 8
II/ Les moustiques : problèmes générés et lutte ...... 9
1/ Problèmes d‟ordres sanitaire et vétérinaire ...... 9
β/ L‟homme en lutte contre les moustiques ...... 10
III/ Des insectes qui résistent ...... 13
1/ La résistance aux pesticides, un modèle d‟adaptation rapide...... 13
2/ Les mécanismes de résistances aux insecticides chez les moustiques ...... 14
2-1/ Résistance comportementale ...... 15 2-2/ Résistance cuticulaire ...... 15 2-3/ Résistance par modification des cibles ...... 16 2-4/ Résistance métabolique ...... 18
3/ Les enzymes de détoxication ...... 19
3-1/ Enzymes à cytochrome P450 (CYPs) ...... 21 3-2/ Carboxylestérases ou estérases (COEs) ...... 27 3-3/ Glutathion S-transférases (GSTs) ...... 29 IV/ Environnement et contaminants ...... 31
1/ Un peu d‟histoire et quelques chiffres...... 31
2/ Milieux aquatiques : un cocktail explosif...... 33
V/ Contexte et objectifs de la thèse ...... 35
1/ Contexte de l‟étude et hypothèses de la thèse ...... 35
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2/ Modèle biologique utilisé ...... 36
3/ Approche expérimentale ...... 37
Chapitre II : Impact à court terme des polluants sur la réponse des moustiques aux insecticides
I/ Impact des xénobiotiques sur la tolérance des moustiques aux insecticides ...... 42
1/ Impact d‟une exposition larvaire aux xénobiotiques sur leur tolérance aux insecticides chimiques (Publications I et II) ...... 42
1-1/ Choix des xénobiotiques et pré-exposition des larves de moustiques ...... 42 1-2/ Bioessais sur larves de moustiques exposées ou non à des polluants ...... 44
β/ Impact d‟une exposition larvaire aux xénobiotiques sur la tolérance des moustiques adultes aux insecticides...... 44
II/ Recherche des mécanismes impliqués...... 46
1/ Au niveau biochimique (Publications I et II) ...... 46
2/ Au niveau transcriptomique (Publications I, II et III) ...... 47
2-1/ Approche par puces à ADN (Publications I et II) ...... 48 2-2/ Approche par séquençage du transcriptome (Publication III) ...... 49
3/ Caractérisation des profils transcriptionnels de gènes candidats potentiellement impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques (Publication IV)...... 52
Chapitre III : Impact à long terme des polluants sur la résistance des moustiques aux insecticides
I/ Les polluants peuvent-ils influencer la sélection des mécanismes de résistances aux insecticides chez les moustiques ? (Publication V) ...... 108
1/ Approche expérimentale utilisée ...... 108
2/ Résultats obtenus ...... 110
2-1/ Tolérance des souches à la perméthrine ...... 110 1
2-2/ Etude des variations de transcription des gènes ...... 110
3/ Discussion ...... 116
3-1/ Résistance des souches à la perméthrine ...... 117 3-2/ Etude des variations de transcription des gènes ...... 118
II/ Etude de la résistance aux insecticides des populations d’Aedes aegypti en Martinique (Publications VI et VII) ...... 122
1/ Etude des mécanismes de résistance d‟une population d’Aedes aegypti de la Martinique (Publication VI)...... 122
β/ Etude de la résistance aux insecticides de différentes populations d‟Aedes aegypti en Martinique : Distribution, mécanismes et relation avec les facteurs environnementaux (Publication VII)...... 124
Chapitre IV : Validation fonctionnelle
I/ Approche par ingestion d’ARN double brins ...... 221
1/ Production in vitro des ARNs double brins ...... 221
2/ Production in vivo des ARNs double brins par des bactéries ...... 223
II/ Approche par injection d’ARNdb...... 227
Chapitre V : Discussion et perspectives
I/ Impact à court terme des xénobiotiques environnementaux ...... 233
1/ Complexité des interactions entre les réponses aux xénobiotiques et aux insecticides . 233
2/ Mécanismes impliqués dans les interactions biotiques entre polluants et insecticides chez les moustiques ...... 234
γ/ L‟environnement, un cocktail de molécules ...... 237
II/ Impact des xénobiotiques environnementaux sur le long terme...... 240
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1/ Approche expérimentale en laboratoire ...... 240
2/ Validation sur le terrain ...... 241
III/ L’approche « gène candidat »: une stratégie pour identifier les gènes impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques ...... 242
1/ Une multitude de candidats potentiels ...... 242
2/ Validation fonctionnelle ...... 246
IV/ Conclusion ...... 249
Bibliographie…….………………………………………..………………………………..253
Annexe…………………..…………………………………………………………………..273
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Chapitre I Introduction générale
I/ Biologie et écologie des moustiques
1/ Biologie et cycle de vie des moustiques
Apparus il y a plus de 170 millions d‟années, les moustiques, ou Culicidae, appartiennent à la classe des insectes de l‟embranchement des arthropodes. Caractérisés par une paire d‟ailes, ces diptères comptent plus de 3500 espèces réparties majoritairement au sein des trois genres principaux Aedes, Anopheles et Culex (Resh et Cardé 2003). Grâce à leurs fortes capacités d‟adaptation et de vol, ils sont aujourd‟hui présents partout dans le monde, là où se trouve de l‟eau non gelée, essentielle pour leur développement.
Les moustiques sont des insectes holométaboles. Leur développement passe par une phase larvaire aquatique avant le stade adulte aérien entrecoupé d‟une courte phase nymphale (Figure 1) (Clements 1992). Selon les genres, les femelles moustiques gravides pondent leurs œufs de différentes manières. Les oeufs d‟Aedes sont généralement déposés sur un substrat humide à l‟interface air/eau (entre 100 et β00 par femelle). Résistants à la dessiccation, ils peuvent parfois patienter pendant plus d‟un an jusqu‟à la prochaine mise en eau du gîte. Les femelles du genre Culex pondent plus d‟une centaine d‟oeufs à la surface de l‟eau sous forme de barquettes alors que les œufs du genre Anopheles sont pondus individuellement à la surface de l‟eau. Dans la plupart des cas, une diminution de la teneur en oxygène de l‟eau, liée en partie à la présence importante de matières organiques est l‟élément déclencheur de l‟éclosion.
Après l‟éclosion, la phase larvaire se divise en quatre stades distincts séparés par trois mues successives. La durée de cette phase larvaire varie selon les espèces de Culicidae, la température du milieu, la densité larvaire ainsi que la disponibilité en nourriture. Dans les zones tropicales, elle ne dure que quelques jours pour des espèces telles que Aedes aegypti et Aedes albopictus alors qu‟en zone tempérée, elle peut durer plusieurs mois chez le moustique Aedes rusticus (Clements 1992).
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Les larves de moustiques sont généralement considérées comme détritivores bien qu‟elles se nourrissent aussi de micro-organismes vivants tels que les bactéries et les algues (Clements 1992). La nourriture est amenée vers l‟entrée du canal alimentaire des larves par l‟intermédiaire d‟une paire de brosses buccales. Les Anopheles ont tendance à rester en surface et à filtrer les fines particules à l‟interface air/eau (« filtreurs de surface») tandis que les larves d‟Aedes se positionnent plus en profondeur pour « brouter » les sédiments et collecter des particules plus grosses grâce à leurs pièces buccales de type « brouteurs- collecteurs ». Enfin, les larves de Culex se nourrissent de façon intermédiaire en filtrant l‟eau et en collectant les fines particules présentes dans la colonne d‟eau (« filtreurs-collecteurs ») (Clements 1992). Après les quatre stades larvaires, s‟ensuit le stade nymphal ou pupal au cours duquel de profonds changements permettent à l‟insecte de passer de l‟état aquatique à l‟état aérien. Au cours de ce stade qui dure en moyenne 1 à γ jours, l‟insecte ne se nourrit pas.
Figure 1 : Cycle de développement du moustique Aedes aegypti en milieu tropical
Une fois la métamorphose accomplie, les moustiques mâles émergent en premier à la surface de l‟eau, suivis des femelles β4 à 48 heures après. Les adultes se nourrissent de saccharides généralement trouvés dans les nectars végétaux. Après l‟accouplement, les femelles ont besoin pour le développement et la maturation de leurs œufs d‟un apport important de protéines qu‟elles obtiennent par l‟intermédiaire d‟un repas de sang sur un hôte vertébré. Selon les espèces de moustiques, les hôtes ciblés pour le repas de sang peuvent être plus ou moins spécifiques. Par exemple, les femelles de Culex pipiens se nourrissent essentiellement sur des oiseaux (ornithophiles) tandis que d‟autres espèces comme Ae. 7 albopictus ou bien An. gambiae se nourrissent sur les êtres humains et sont donc considérées comme anthropophiles (Salvan et Mouchet 1994, Takken et Knols 1999). La fécondation des œufs se produit lors de la ponte grâce au stockage du sperme des mâles par la femelle dans une spermathèque.
2/ Ecologie des gîtes larvaires.
Les moustiques, selon leur genre et leur espèce, utilisent une grande variété écologique de gîtes pour le développement de leurs larves (Figure 2). Différents paramètres tels que la couleur, l‟humidité, ainsi que la présence de certains composés chimiques volatiles jouent un rôle crucial pour le choix du site d‟oviposition par les femelles (Maire 1983, Serandour et al. 2010). Généralement, les gîtes larvaires sont caractérisés par de l‟eau douce stagnante plus ou moins riche en matière organique. Pour la plupart des espèces, les femelles pondent dans des gîtes temporaires, là où la profondeur de l‟eau est peu importante, notamment afin de limiter la prédation.
Ainsi, les moustiques de l‟espèce C. pipiens peuvent coloniser des milieux fortement pollués. Dans le sud de la France, on les rencontre dans les fosses septiques, caves, vides sanitaires inondés, égouts à ciel ouvert et bassins de lagunage (Gabinaud et al. 1985, Sinegre et al. 1988). A l‟opposée, les Anopheles, préfèrent coloniser des gîtes plus ruraux avec une eau peu chargée en matière organique. Chez les Aedes, Ae. albopictus est une espèce dominante en zone péri-urbaine alors qu‟Ae. aegypti l‟est plutôt en milieu fortement urbanisé. Ae. aegypti colonise principalement les gîtes artificiels, comme les récipients de stockage d‟eau (récupérateurs d‟eau de pluies, coupelles de pot de fleurs) et détritus abandonnés (pneus, bidons). Ae. albopictus quant à elle est une espèce plus opportuniste présente dans les gîtes artificiels ou naturels tels que les creux d‟arbres, feuilles au sol (Salvan et Mouchet 1994).
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C Figure 2 : Exemples de quelques gîtes larvaires. Stockage de bois (A), pots de A fleurs (B), stockage de pneus (C), creux d‟arbres (D), zone humide temporaire (E). D
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II/ Les moustiques : problèmes générés et lutte