РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 429 874 C1 (51) МПК A61K 38/05 (2006.01) A61K 31/405 (2006.01) A61P 1/00 (2006.01) A61P 29/00 (2006.01)

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21)(22) Заявка: 2010115173/15, 16.04.2010 (72) Автор(ы): Середенин Сергей Борисович (RU), (24) Дата начала отсчета срока действия патента: Колик Лариса Геннадьевна (RU), 16.04.2010 Жуков Виктор Николаевич (RU) Приоритет(ы): (73) Патентообладатель(и): C1 2429874 RU (22) Дата подачи заявки: 16.04.2010 Учреждение Российской академии (45) Опубликовано: 27.09.2011 Бюл. № 27 медицинских наук Научно- исследовательский институт фармакологии (56) Список документов, цитированныхвотчетео имени В.В. Закусова Российской академии поиске: Харченко Н.В. идр. Современные медицинских наук (RU) представления о механизме абдоминальной боли. Подходы к лечению // Новости медицины и фармации. - 2003, №8 (136), август, с.14 [он-лайн] [найдено 2011-04-11] Найдено из базы данных YANDEX. RU 2227144 С2, 20.06.2003. US 6127418 А, 03.10.2000. WO 2009/045386 A1, 09.04.2009.

Адрес для переписки:

1 125315, Москва, ул. Балтийская, 8, НИИ

C фармакологии имени В.В. Закусова РАМН

(54) АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ КУПИРОВАНИЯ ВИСЦЕРАЛЬНОЙ БОЛИ 4 (57) Реферат: препятствует проявлению болеутоляющих 7 Предложено применение амида N-(6- свойств ГБ-115, что свидетельствует о

8 фенилгексаноил)глицин-L-три-птофана взаимодействии ГБ-115 спериферическими

9 (ГБ-115, дипептид, ранее известен как опиоидергическими рецепторами. Блокада k- психотропное вещество) вкачествесредства опиоидных рецепторов нор-биналторфимином, 2 для купирования висцеральной боли. Показана селективным антагонистом k-рецепторов,

4 выраженная анальгетическая активность купирует фармакологические эффекты ГБ-115.

2 соединения на модели висцеральной боли (тест ГБ-115 отличает уникальный спектр «корчи»). Анальгетический эффект ГБ-115 по рецепторных взаимодействий и отсутствие силе действия уступает морфину, но побочных эффектов: практически нетоксично,

U сопоставим по выраженности антиноцицепции не вызывает седации и угнетения функций

R с нестероидным противовоспалительным дыхания, свойственных опиоидным средством диклофенаком. Налтрексона иодид, анальгетикам, не обладает ульцерогенными неселективный антагонист периферических эффектами и негативным влиянием на опиоидных рецепторов, полностью кроветворение, присущими НПВС. 6 ил., 3 табл.

Ñòð.: 1

ru RUSSIAN FEDERATION (19) (11) (13) RU 2 429 874 C1 (51) Int. Cl. A61K 38/05 (2006.01) A61K 31/405 (2006.01) A61P 1/00 (2006.01) A61P 29/00 (2006.01)

FEDERAL SERVICE FOR INTELLECTUAL PROPERTY, PATENTS AND TRADEMARKS (12) ABSTRACT OF INVENTION

(21)(22) Application: 2010115173/15, 16.04.2010 (72) Inventor(s): Seredenin Sergej Borisovich (RU), (24) Effective date for property rights: Kolik Larisa Gennad'evna (RU), 16.04.2010 Zhukov Viktor Nikolaevich (RU) Priority: (73) Proprietor(s): C1 2429874 RU (22) Date of filing: 16.04.2010 Uchrezhdenie Rossijskoj akademii meditsinskikh (45) Date of publication: 27.09.2011 Bull. 27 nauk Nauchno-issledovatel'skij institut farmakologii imeni V.V. Zakusova Rossijskoj Mail address: akademii meditsinskikh nauk (RU) 125315, Moskva, ul. Baltijskaja, 8, NII farmakologii imeni V.V. Zakusova RAMN

(54) ANALGESIC AGENT FOR VISCERAL PAIN MANAGEMENT (57) Abstract: displaying analgesic properties that testifies to GB- FIELD: medicine. 115 interaction with peripheral opioid receptors. The SUBSTANCE: what is offered is application of k-opioid receptor blockade by norbinaltorphimine, a amide N-(6-phenylhexanoyl)glycin-L-triptophane selective k-receptor antagonist, arrests (GB-115, dipeptide, previously known as a pharmacological effects of GB-115.

1 psychotropic substance) as an agent for visceral pain EFFECT: drug is characterised by a unique

C management. Evident analgesic activity of the spectrum of receptor reactions and the absence of compound is shown in a visceral pain model side effects, practically nontoxic, does not cause (writhing test). An analgesic effect of GB-115 is sedation and respiratory depression peculiar to

4 exceeded in efficiency by morphine, nevertheless is opioid analgesics, does not exhibit ulcerogenic

7 comparable in antinociception intensity to the effects and action of a hematosis process inherent in nonsteroidal anti-inflammatory drug diclofenac. NSAIDs. 8 Naltrexone iodide, a nonselective peripheral opioid 6 dwg, 3 tbl

9 receptor antagonist completely prevents GB-115 from 2 4 2 U R

Ñòð.: 2

en RU 2 429 874 C1 Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается нового применения известного вещества - амида N-(6-фенилгексаноил) глицин-L-триптофана (ГБ-115) (Патент РФ №2227144, Бюл. №11, 2004) в качестве анальгетического средства для купирования висцеральной боли. 5 Висцеральная боль возникает при раздражении ноцицепторов внутренних органов и отличается от соматической боли диффузным характером распространения, трудностью локализации и сопутствующими автономными рефлекторными реакциями. Принято считать, что болевые ощущения при заболеваниях внутренних 10 органов могут быть вызваны нарушением кровотока в органах, спазмом или судорожными сокращениями гладкой мускулатуры, растяжением стенок полых органов и воспалительными изменениями в органах и тканях. Плотность ноцицепторов особенно высока в брюшине, при воспалении которой возникает острая и интенсивная боль. Патофизиология и механизм возникновения висцеральной боли 15 остаются на сегодняшний день не до конца ясными, и существующие терапевтические подходы для лечения данного вида боли не являются оптимальными (Olesenet A. E. et al. World J Gastroenterol. 2009. January 14; 15(2): 177-181). Использование традиционных опиоидных анальгетиков, агонистов (µ-рецепторов, не всегда оправдано и

20 осложняется наличием побочных эффектов центрального происхождения (эйфория, седация, тошнота). В настоящее время в качестве возможных средств для лечения абдоминальной боли в клинических испытаниях находятся антагонисты 5-НТ3-рецепторов (Gershon M.D., et al. Gastroenterology 2007; 132:397-414), пробиотики (Quigley E.M., Neurogastroenterol Motil 25 2007; 19:166-172), агонисты α2 -иβ3-адренорецепторов (Camilleri M., et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2003; 1:111-121; Celiek S. et al. Gastroenterology 2007; 133:175-183), антагонисты CRF1 рецепторов (Sagami Y. et al. Gut 2004; 53:958-964), антагонисты NMDA-рецепторов (Strigo I.A., Pain 2005; 113: 255-264) и

30 антидепрессанты (Peghini P.L. et al. Gut 1998; 42: 807-813). Одной из наиболее перспективных фармакологических мишеней для лечения висцеральной боли являются периферические опиоидные κ-рецепторы (Bradesi S. et al. Curr Opin Pharmacol. 2008 December; 8(6):697-703). Впервые существование k-опиоидных рецепторов (КОР), функционально 35 отличающихся от µ- иδ-опиоидных рецепторов, было показано в 70-хгодахXX века (Martin et al., J. Pharmacol. Exp.Ther. 1976; 197:517-532). С помощью радиолигандных методов исследования впоследствии доказаны гетерогенность КОР и существование k1- и k2-рецепторов, каждый из которых подразделяется на (k1 a-, k2 a-) 40 и (k1 b-, k2 b-) подтипы (Rothman et al., Peptides. 1990; 11:311-331). Однако, на сегодняшний день удалось клонировать только KOP1, фармакология которого идентична описанному ранее k1-опиоидному рецептору (Simonin et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 1995; 92:7006-7010). Большинство доступных в настоящее время k- агонистов оптимизированы под k1-связывающий сайт или клонированный KOP1. 45 Первые агонисты КОР проявляли выраженные анальгетические свойства на моделях висцеральной боли, которые сохранялись при разнообразных экспериментальных условиях независимо от вида животных (мыши или крысы), органов-мишеней (двенадцатиперстная кишка, толстая кишка, желчный пузырь, 50 брюшина), природы повреждающего агента (растяжение или химическое раздражение), анестезированных или находящихся в сознании животных, типа боли (основной или воспалительной), а также химической природы k-агонистов (Diop et al., Eur J Pharmacol. 1994 Dec 12; 271(1):65-71; Burton & Gebhart, J Pharmacol Exp Ther. 1998

Ñòð.: 3

DE RU 2 429 874 C1 May; 285(2):707-15; Sengupta et al., Pain. 1999 Feb; 79(2-3): 175-85; Joshi SK. et al. The Journal of Neuroscience, August 1, 2000, 20(15):5874-5829; Sandner-Kiesling et al., Pain. 2002 Mar; 96(l-2): 13-22; Kamp EH et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2003 Mar; 284(3): G434-44), при этом не вызывая эйфории, угнетения дыхания и нарушений функций 5 ЖКТ (Rivie're P.J.M. and Junien, J.L. In: Drug Development, Molecular Targets for GI Diseases, eds. Gaginella, T.S. & Guglietta A. Totowa, NJ: Humana Press. 2000, 203-238). Экспериментальное висцеральное воспаление снижает болевой порог, повышая ответ на боль и усиливая анальгетический потенциал k-агонистов (Langlois et al., Eur J 10 Pharmacol. 1997 Apr 18; 324(2-3):211-7; Burton & Gebhart, J Pharmacol Exp Ther. 1998 May; 285(2):707-15; Sengupta et al., Pain. 1999 Feb; 79(2-3): 175-85). Использованные модели висцеральной боли предполагают, что k1-рецепторы, опосредующие ответ агонистов КОР, расположены на периферии, так как их эффекты блокируются периферическими опиоидными антагонистами, не проникающими через ГЭБ (Sandner-Kiesling et al., 15 Pain. 2002 Mar; 96(1-2):13-22). В настоящее время имеется относительно мало информации об эффективности k- агонистов в клинических исследованиях при терапии висцеральной боли. Fedotozine значительно превосходил плацебо-эффект в снижении абдоминальной

20 боли при неязвенной диспепсии (Fraitag et al., Dig Dis Sci. 1994 May; 39(5): 1072-7) и синдроме раздраженного кишечника (CPK)(Dapoigny M. et al. Digest Dis Sci 1995; 40: 2244-2249), а также увеличивал болевой порог при растяжении кишечника у пациентов сСРК(Delvaux et al. Gastroenterology. 1999, 116(1):38-45). Серия работ Gebhart's (1998) показала, что анальгетическое действие fedotozine опосредовано угнетением Na- 25 каналов на первичных афферентных нейронах наряду с центральными эффектами на МОР и КОР (Su X. et al. J Neurophysiol 1998; 80:3112-3119). После получения негативных результатов на второй фазе клинических испытаний дальнейшая разработка препарата прекратилась.

30 Данные об антиноцицептивной активности asimadoline весьма противоречивы: в одних работах он оказался эффективным средством для снятия абдоминальной боли при СРК (Delvaux et al., Aliment Pharmacol Ther. 2004 Jul 15; 20(2):237-46), авдругих нет (Szarka L.A. et al., Clin Gastroenterol Hepatol 2007; 5:1268-1275). В крупномасштабном (596 пациентов) исследовании asimadoline в течение 4-х месяцев 35 значительно сокращал боль и дискомфорт при СРК у пациентов с умеренной болью (Mangel A.W. et al. Aliment Pharmacol Ther 2008; 28:239-249). Другими авторами отмечена способность asimadoline вызывать гипералгезию при лечении невисцеральной постоперационной боли (Machelska H. et al. J Pharmacol Exp Ther 1999;

40 290:354-61). Пилотные клинические испытания выявили способность производных ацетамида проникать через ГЭБ, вызывать дисфорию, седацию и гипералгезию (Rivie're, P.J.M. and Junien, J.L. In: Drug Development, Molecular Targets for GI Diseases, eds. Gaginella, T.S. & Guglietta A., Totowa, NJ: Humana Press. 2000, 203-238), что остановило использование 45 агонистов КОР первого поколения и инициировало поиски селективных периферических k-агонистов среди соединений пептидной природы. В основе новой стратегии лежала идея создания более крупных пептидных молекул, не проникающих через ГЭБ и не вызывающих центральных побочных эффектов (Табл.1). Не все

50 попытки, однако, оказались удачными. Так, Е-2078, синтетический L-аминокислотный аналог динорфина 1 ‐ 8, проявлял центральные эффекты и вызывал анальгезию в том числе и неопиоидной природы (Butelman E.R. et al. Psychopharmacology (Beri) 1999; 143: 190-6). Экспериментальные исследования FE200041, D-аминокислотного тетрапептида,

Ñòð.: 4 RU 2 429 874 C1 продемонстрировали наличие антиноцицептивных свойств, которые реализуются через взаимодействие с периферическими КОР (Vanderah TW et al. J Pharmacol Exp Ther 2004; 310:326-33). Последующая оценка его доработанного аналога, FE200665 (CR665) выявила периферическую антиноцицептивную активность в широком диапазоне доз 5 на экспериментальных моделях висцеральной боли. В настоящее время CR665 передан на клинические испытания (Vanderah T.W. et al. Eur J Pharmacol 2008; 583:62-72).

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ñòð.: 5 RU 2 429 874 C1

5

10

15

20

25

30

Таким образом, пептидные агонисты КОР проявляют высокую анальгетическую активность на различных моделях висцеральной боли. Эти эффекты опосредуются 35 через периферические КОР и, возможно, в качестве дополнительного механизма, через натриевые каналы, расположенные на периферических окончаниях первичных чувствительных афферентов. Анальгетический потенциал k-агонистов в условиях висцеральной боли усиливается в присутствии воспаления(Riviere P. J.M., Junien J.L. In

40 Dmg Development, Molecular Targets for GI Diseases 2000. Totowa, NJ: Humana Press; 203- 238.eds. Gaginella, T.S. & Guglietta A.). В целом фармакологический профиль k-агонистов предполагает, что периферические селективные k-агонисты должны быть эффективны для лечения висцеральной боли различной этиологии, включая абдоминальную хирургию, 45 связанную с постоперационной болью и непроходимостью кишечника, панкреатическую боль, дисменорею и функциональные расстройства, такие как синдром раздраженного кишечника и диспепсия. Опыты проведены на беспородных мышах-самцах массой 24-29 г. Животных в течение 6 суток до начала эксперимента содержали в условиях вивария по 20 особей в 50 клетке с предоставлением воды и стандартного брикетированного корма ad libitum при нормальном 12-часовом световом режиме. Эксперименты проводили с 09:00 до 15: 00 ч.

Ñòð.: 6 RU 2 429 874 C1 Дляисследованияиспользовали: соединение ГБ-115 (0.05-20.0 мг/кг, п/о, за 40 мин), ретропептидный аналог эндогенного тетрапептида холецистокинина (синтезирован в НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН), агонист опиоидных рецепторов морфина гидрохлорид (3.0 и 5.0 мг/кг, в/б, за 20 мин) (Sigma Chemical Co.), диклофенак 5 натрия (20.0 мг/кг, п/о, за 40 мин) ииндометацин(25.0 мг/кг, п/о, за 40 мин) как препараты сравнения (Sigma Chemical Co.), неселективный антагонист опиоидных рецепторов налоксона гидрохлорид (1.0 мг/кг, п/к, за 20 MHH)(Sigma Chemical Co.), антагонист периферических опиоидных рецепторов налтрексона иодид 10.0 мг/кг, п/к, 10 за 30 мин) (синтезирован в НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН), селективный антагонист k-опиоидных рецепторов норбиналторфимин (5.0 мг/кг, в/б, за 20 мин), агонист k-опиоидных рецепторов и антагонист мю-опиоидных рецепторов пентазоцин (2.0 мг/кг, п/к, за 30 мин) (Sigma Chemical Co.). Все вещества растворялись в воде дистиллированной, за исключением ГБ-115, которыйрастворяливводе 15 дистиллированной с добавлением Твин-80. Тест «корчи» выполнен в соответствии с ранее описанной методикой (Collier Н.О. et al. Pharmacol.Chemother., 1968, 32, 295-310). Животным вводили морфин (5.0 мг/кг), ГБ-115, пентазоцин, атакженалоксон, налтрексона иодид и нор-биналторфимин за 15

20 мин до морфина и ГБ-115, и воду дистиллированную в качестве контроля (п/о, за 40 мин) до внутрибрюшинной (в/б) инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты. Количество лордозов («корчей») подсчитывали у каждого животного в течение 15 мин сразу после введения уксусной кислоты. Тест «hot plate» («горячая пластинка») использовали для определения латентного 25 периода реакции. Все животные отбирались за 1 час до тестирования на основе базовой реактивности в данной модели с удалением мышей, остававшихся на нагретой до 56±0.5°С медной пластине дольше 15 секунд. Латентный период в 30 сек расценивали как 100% анальгезию. Фиксировали время появления реакции избегания

30 (прыжок или/и лизание задней лапы) у мышей после введения морфина, ГБ-115 (10.0 мг/кг, п/о, за 40 мин), налоксона (за 15 мин до морфина и ГБ-115), налтрексона иодида (за 15 мин до морфина и ГБ-115) и воды дистиллированной в качестве контроля. Тест «tail-flick» («отдергивание хвоста»). С помощью анальгезиметра «analgesia 35 test, tail flick type 812»фирмыHugo Sachs Electronic (Германия) регистрировали время отдергивания хвоста от момента нанесения локального теплового воздействия. Изучаемые вещества вводили в тех же дозах и сроки, что и в тесте «hot plate». Все животные отбирались за 24 часа по результатам фонового тестирования в данной

40 установке за исключением тех особей, которые оставались без реакции более 4 сек. Латентный период в 30 сек расценивали как 100% анальгезию. Данные представлены в % от максимально возможного эффекта (МВЭ) = (латентный период реакции после введения соединения минус фоновый латентный период реакции)/(максимальное время экспозиции минус фоновый латентный период 45 реакции) × 100% (Le Bars D., M. Gozariu M. and Cadden S.W. Pharmacol. Rev., 2001; 53(4), 597-652). Все препараты вводили в объеме 0.1 мл/10 гмассыживотного. Статистическая обработка данных проведена с помощью однофакторного

50 дисперсионного анализа ANOVA с последующим использованием непараметрического критерия Mann-Whitney U Test для независимых групп. Радиолигандный анализ. Способность ГБ-115 вытеснять высокоаффинные лиганды нейрорецепторов из мест связывания изучена в соответствии с протоколами компании

Ñòð.: 7 RU 2 429 874 C1 Сеrер (Франция) (http://www/cerep.com). Взаимодействие ГБ-115 с рекомбинантными µ-опиоидными рецепторами (МОР) человека изучали на клеточной линии НЕК-293 (Wang L. et al., J Neurochem. 1994 Nov; 63(5): 1726-30) с применением [3H]DAMGO в концентрации 0.08 nМвкачестве 5 ‐9 ‐10 меченого лиганда и вещества сравнения - DAMGO (IC5 0=1,3·10 M, Кi=5,5·10 М, nН=1,1). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 10 мкМ налоксона. Время инкубации с клеточной линией составляло 120 мин при температуре 22°С. Взаимодействие ГБ-115 с рекомбинантными δ2 - опиоидными рецепторами (DOP) 10 человека изучали на клеточной линии СНО (Simoni M. et al., J Endocrinol. 1994 May; 141 (2):3 59-67) с использованием в качестве меченого лиганда [3H]DADLE в ‐9 ‐10 концентрации 0.5 nМ. Вещество сравнения - DPDPE (IC5 0=1,6·10 М, Ki=9,8·10 M, nН=1,3). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 10 мкМ налтрексона. 15 Время инкубации с клеточной линией составляло 120 мин при температуре 22°С. Взаимодействие ГБ-115 с рекомбинантными κ-опиоидными рецепторами (КОР) крысы изучали на клеточной линии СНО (Meng et al., Proc Nati Acad Sci USA. 1993 Nov 1; 90(21):9954-8). В качестве меченого лиганда использовали [3H] 69593 в ‐9 ‐10 20 концентрации 1.0 nМ. Вещество сравнения - U 50488 (IС5 0=1,0·10 M, Ki=6,7·10 M, nН=1,2). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 10 мкМ налоксона. Время инкубации с клеточной линией составляло 60 мин при температуре 22°С. Величины IС5 0 и коэффициент Хилла (nН) были определены с использованием нелинейного регрессионного анализа кривых конкурентного вытеснения с 25 аппроксимацией кривой уравнением Хилла. Величина Ki рассчитывалась согласно уравнению Ченга-Прусоффа (Y.Cheng, W.H.Prusoff, Biochemical pharmacology, 1973; 22(23), 3099-3108). Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

30 Пример 1. Антиноцицептивные свойства ГБ-115 при продолжительной стимуляции. Тест «корчи» позволяет оценить как периферические, так и центральные механизмы антиноцицепции и рекомендуется в качестве простого метода для скрининга соединений, влияющих на ноцицептивные процессы, индуцированные воспалением (Vogel H.G., Vogel W.H. Dmg discovery and evaluation. Pharmacological assays. 35 Berlin, Heidelberg: Springer-Veriag; 1997. p.360-420). Уксусная кислота 0.75% при внутрибрюшинном введении раздражает серозные оболочки и провоцируют стереотипное поведение у мышей и крыс, которое характеризуется абдоминальными сжатиями, движениями всего тела (особенно задних конечностей) и снижением

40 двигательной активности. Подобное поведение рассматривается как рефлекторное и считается доказательством проявления висцеральной боли (Ness T.J., Gebhart G.F. Pain. 1990; 41:167-234). Этот метод чувствителен, предсказуем и позволяет зафиксировать антиноцицептивные эффекты даже слабых анальгетиков (Hunskaar S. J Neurosci Methods. 1985 Jun; 14(1):69-76). 45 В тесте «корчи» установлено, что соединение ГБ-115 вдиапазонедоз0.1-20.0 мг/кг обладает выраженной анальгетической активностью у мышей при химической стимуляции, обусловленной внутрибрюшинным введением уксусной кислоты (фиг.1). Развитие эффекта ГБ-115 отмечается с увеличением дозы, достигая при дозе 10.0 мг/кг

50 максимального угнетения реакций на 76,3% по сравнению с контролем (р<0.0001). Последующее увеличение дозы дипептида до 20.0 мг/кг приводит к ослаблению анальгезии до 43,9% (р<0.05). Эффект соединения ГБ-115 вдозе10.0 мг/кг уступает по силе морфину (5.0 мг/кг),

Ñòð.: 8 RU 2 429 874 C1 который уменьшает ноцицептивные проявления на 95,5% (р<0.001), и сопоставим с анальгетической активностью нестероидного противовоспалительного средства диклофенака (20.0 мг/кг) (фиг.2). Болеутоляющий эффект морфина полностью купируется налоксоном (фиг.3А) ине 5 зависит от блокады периферических опиоидных рецепторов налтрексоном иодидом (фиг.3В). Сдругойстороны, предварительная блокада опиоидных рецепторов налоксоном частично (на 29,8%) снимает антиноцицептивный эффект соединения ГБ-115 по сравнению с контролем (фиг.3А). Налтрексона иодид препятствует 10 проявлению анальгетической активности ГБ-115, восстанавливая порог болевой чувствительности до контрольных значений (фиг.3В). Установлено, что блокада КОР селективным антагонистом КОР норбиналторфимином (5.0 мг/кг, i.p.) препятствовала проявлению антиноцицептивной активности ГБ-115 (10.0 мг/кг) втесте«корчи»умышей. Пентазоцин (2.0 мг/кг, s.c.), 15 агонист КОР, выбранный в качестве препарата сравнения, также статистически значимо снижал число абдоминальных сокращений у животных (р<0.01). Данный эффект устранялся на фоне предварительной блокады КОР нор-биналторфимином. Пример 2. Антиноцицептивные свойства ГБ-115 в условиях непродолжительной

20 термической стимуляции. При кратковременном термическом раздражении, как правило, стимуляции подвергаются кожные покровы, а висцеральные и скелетно-мышечные ткани не вовлекаются, что позволяет дифференцировать анальгетические свойства изучаемого соединения не только по модальности раздражителя, но и по характеру вызываемой 25 боли. При помещении животных на нагретую до постоянной температуры металлическую пластинку у них возникает двухкомпонентная поведенческая реакция, выражающаяся в «лизании лапы» и «прыжке». Подобное избегание расценивается как

30 ответ на супраспинальном уровне. Известно, что опиоиды преимущественно влияют на «лизание», а более слабые анальгетики (например, парацетамол и ацетилсалициловая кислота) увеличивают латентный период реакции «прыжка». Для повышения специфичности и чувствительности данного теста мы измеряли латентный период первой реакции избегания вне зависимости от ее характера (Carter, Pain. 1991 35 Nov; 47(2):211-20). В ответ на термическую стимуляцию в тесте «hot plate» соединение ГБ-115 статистически значимо ослабляло ноцицептивную реакцию только в максимально изученной дозе (20.0 мг/кг), (фиг.5), значительно уступая в этих условиях по силе

40 действия морфину (Табл.1). Для выявления возможных антиноцицептивных свойств соединения ГБ-115 на спинальном уровне использовали тест «отдергивания хвоста», основанный на приложении теплового луча к ограниченной поверхности хвоста мыши, что провоцирует резкое его отдергивание. Увеличение времени удержания хвоста 45 интерпретируется как анальгетическое действие. Считается, что данный тест эффективен преимущественно для выявления опиоидных анальгетиков (Le Bars D., M. Gozariu M. and Cadden S.W. Pharmacol. Rev., 2001; 53(4), 597-652). Установлено, что соединение ГБ-115 с возрастанием дозы постепенно

50 статистически значимо увеличивает латентный период реакции отдергивания хвоста в тесте «tail flick» (до 281,2% при дозе 10.0 мг/кг), также уступая морфину по силе действия (фиг.5, Табл.1). При увеличении дозы до 20.0 мг/кг соединение ГБ-115 не проявляет антиноцицептивного эффекта в данном тесте (фиг.6).

Ñòð.: 9 RU 2 429 874 C1

Таблица 1 Влияние соединения ГБ-115 на ноцицептивные реакции в условиях непродолжительной термической стимуляции в сравнении с диклофенаком и морфином Способ Латентный период реакции, % от МВЭ. Вещества Дозы (мг/кг) 5 введения Тест "горячая пластинка" Тест "отдергивание хвоста" Контроль - per os 3.9±5.6 1.6±0.5 Диклофенак 20.0 per os 5.3±3.9 4.3±1.4 Морфин 3.0 i.p. 51.3±9.7*** 7.1±1.7*** ГБ-115 10.0 per os 20.6±9.2 4.5±0.5*** 10 Примечание: данные представлены в виде M±SEM; * - p<0.05, *** - р<0.001 статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой, ### - р<0.001 по сравнению с группой морфина, х-р<0.05 по сравнению с группой ГБ-115, Marm-Whitney U test;количество животных в группе от 6 до 14.

Предварительная неселективная блокада опиоидных рецепторов налоксоном препятствует проявлению вызываемой морфином анальгезии и частично купирует 15 болеутоляющее действие ГБ-115 в тесте «отдергивание хвоста» по сравнению с контрольной группой (Табл.2). Налтрексона иодид, антагонист периферических опиоидных рецепторов, не влияет на антиноцицептивные свойства морфина, вто время как эффективность ГБ-115 статистически значимо уменьшается по сравнению с 20 самостоятельным действием дипептида (р<0.05) и не отличается от контрольной группы.

Таблица 2 Влияние блокады центральных и периферических опиоидных рецепторов на проявление ноцицептивных эффектов ГБ-115 Способ Латентный период реакции, % от МВЭ. 25 Вещества Дозы (мг/кг) введения Тест "горячая пластинка" Тест "отдергивание хвоста"

Вода дистил.(контроль) - п/о 3.9+5.6 1.6+0.5 Вода + - п/о Морфин 5.0 в/б 64.0+12.5*** 46.4+15.0*** 30 Налоксон + 1.0 п/к морфин 5.0 в/б -6.7+9.0### -0.2+9.0### 10.0 п/к Налтрексона иодид + 47.7+16.7** 33.8+12.9*** Морфин 5.0 в/б 35 Вода + - п/о ГБ-115 10.0 п/о 20.6+9.2 4.5+0.5*** Налоксон + 1.0 п/к 10.9+4.4 3.1+0.3*, х ГБ-115 10.0 п/о

Налтрексона иодид + 10.0 п/к 14.4+13.6 2.6+0.8 х 40 ГБ-115 10.0 п/о Примечание: данные представлены как M+SEM; * - р<0.05, *** - р<0.001 статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой, ### - р<0.001 по сравнению с группой вода + морфин, х - р<0.05 по сравнению с группой вода+ГБ-115, Mann- Whitney U test; количество животных в группе от 6 до 14.

45 Пример 3. Нейрорецепторных механизмов действия ГБ-115 В результате радиолигандного анализа было установлено, что ГБ-115 вдиапазоне микромолярных концентраций взаимодействует с к-опиоидными рецепторами (КОР): ‐5 ‐5 IC5 0=1.6·10 M, Ki=1.0·10 М, nН=0.5 ПриизучениивзаимодействияГБ-115 сµ-(МОР) иδ2(DOP) - опиоидными 50 рецепторами установлены следующие параметры рецепторного взаимодействия: ‐4 ‐5 ‐4 ‐4 IC5 0=1,3·10 М, Ki=5,5·10 М, nН=0,4 (МОР) и IС5 0=1,7·10 М, Ki=1,0·10 М, nН=0,8 (DOP) соответственно. Значения параметров IС5 0 и Ki для ГБ-115 находятся в области

Ñòð.: 10 RU 2 429 874 C1 высоких концентраций, что свидетельствует об отсутствии специфического взаимодействия МОР и DOP рецепторами. Следующий этап исследования был посвящен клеточному функциональному анализу, в ходе которого было выявлены агонистичные свойства ГБ-115 по 5 ‐4 отношению к КОР в концентрации ЕС5 0=1.6·10 , для стандартного КОР агониста U ‐9 50488 величина ЕС5 0=1.0·10 Таким образом, результаты, полученные при исследовании взаимодействия ГБ-115 с опиоидными рецепторами in vitro полностью соответствуют установленным 10 фармакологическим эффектам ГБ-115, раскрывают первичные механизмы его действия как анальгетика и определяют дальнейшие перспективы фармакологического изучения и применения в фармакотерапии. Пример 4. Сравнительная характеристика соединения ГБ-115 сдругими

15 анальгетиками по наличию побочных эффектов. 1. Острая токсичность При сопоставлении токсических свойств ГБ-115 с препаратами сравнения (диклофенаком и пентазоцином) имеет существенные преимущества: ЛД5 0 для ГБ-115 не определено в дозах более 3500 мг/кг у крыс и более 6000 мг/кг у мышей. 20

Препарат Вид животных Путь введения ЛД5 0, мг/кг Ссылки Arzneimittel-Forschung. Drug Research. Vol.30, Pg. 1398, крысы п/о 62.5 1980. Диклофенак п/о 170.0 Pharmazie. Vol.37, Pg. 148, 1982. мыши в/б 345.0 Arzneimittel-Forschung. Drug Research. Vol.43, Pg. 44, 1993. 25 крысы п/о 1110.0 Kiso to Rinsho. Clinical Report. Vol.4, Pg. 2145, 1970. Пентазоцин п/о 305.0 Acta Medicia Okayama. Vol.35, Pg. 179, 1981. мыши в/б 85.0 Chemical and Pharmaceutical Bulletin. Vol.24, Pg.2912, 1976. <3500 Определение ЛД не представлялось возможным в связи с крысы п/о 5 0 отсутствием гибели животных. ГБ-115 30 <6000 Определение ЛД не представлялось возможным в связи с мыши п/о 5 0 отсутствием гибели животных.

Около 30% больных, принимающих нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), оказываются госпитализированными в связи с различными 35 осложнениями (Wilson Let al. Curr Ther Res 2004; 62: 835-50). Согласно результатам клинических исследований, образование многочисленных язв (ульцерогенез), кровотечение и воспаление в ЖКТ являются основными побочными эффектами, связанными с использованием в медицинской практике НПВС, втомчисле диклофенака натрия, индометацина и аспирина (Nakashima S. et al. Aliment Pharmacol 40 Ther 2005; 21 Suppi 2: 60-66; Ramirez-Alcantara V et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2009 Aug 27). При изучении хронической токсичности ГБ-115 при его ежедневном пероральном введении в течение шести месяцев в дозах 0.1 и 10.0 мг/кг установлено, что указанное

45 соединение не оказывает повреждающего действия на систему крови и не вызывает патологически значимых изменений биохимических показателей сыворотки крови у исследованных животных и физико-химических свойств мочи у крыс; не вызывает морфологических и гистологических изменений в органах и тканях крыс и кроликов; не обладает местно-раздражающим действием. 50 2. Влияние на функции дыхательной системы По данным литературы, в отличие от агонистов µ-опиоидных рецепторов, селективные κ-агонисты вызывают анальгезию, сопровождающуюся незначительным угнетением дыхания (Bowdle Т.А. Drug Saf. 1998 Sep; 19(3): 173-89). В экспериментах in

Ñòð.: 11 RU 2 429 874 C1 vitro показано, что агонист κ-рецепторов, вчастностиU50,488, угнетает как частоту, так и амплитуду дыхания (Takita K.et al. Brain Res. 1997 Dec 5; 778(1):233-41). Изучение влияния ГБ-115 на частоту дыхательных движений проводили на белых крысах самцах с массой тела 250-300 г, наркотизированных уретаном (1300 мг/кг, в/б). 5 Частоту дыхательных движений регистрировали с помощью специального датчика, закрепленного на грудной клетке животных и соединенного через прибор «Biopack» (США) скомпьютером«Pentium IV». ГБ-115 вводили в дозе 50.0 мг/кг, в/б. По полученной кривой рассчитывали частоту дыхания. Экспериментальные данные 10 обрабатывали статистически, значимость различий определяли с помощью непараметрического критерия Фридмана и метода множественных сравнений по Dannett's test. Опыты показали, что соединение ГБ-115 в изучаемой дозе не вызывало патологических форм дыхания: апноэ, дыхания Чейн-Стокса, Биота, Кусмауля, 15 агонального. Вместестем, вещество вызывало статистически значимое урежение частоты дыхательных движений на 30-60 минутах после введения, однако этот показатель не выходил за пределы референтных значений нормы для наркотизированных крыс (60-140 дыхательных движений в минуту) (табл.3).

20 Таким образом, соединение ГБ-115 обладает несомненным преимуществом по сравнению с имеющимися агонистами κ-рецепторов, не влияя на функции дыхания у животных.

Таблица 3

25 Влияние соединения ГБ-115 (50 мг/кг, в/б) на частоту дыхания у наркотизированных крыс Время после введения ГБ-115, мин Исходный. уровень 5 10203060 114,5 107,5 105,0 101,0 97,0* 89,5* 100,0÷117,0 101,0÷114,0 92,0÷111,0 87,0÷114,0 84,0÷103,0 80,0÷101,0 Примечание: данные представлены в виде медианы, 25% и 75% процентили, число животных n=6; * р≤0,05 - по отношению к 30 исходному уровню.

3. Влияние на двигательную активность В научной литературе встречается много сообщений о влиянии κ-агонистов на двигательную активность. Так, пентазоцин вызывал небольшую седативную реакцию 35 у пациентов с биполярными расстройствами (Cohen B.M. and Murphy В. Int J Neuropsychopharmacol. 2008 Mar; 11(2):243-7). Быстрое, но непродолжительное нарушение координации движения отмечалось в эксперименте под действием синтетического κ-агониста U69,593 (Fantegrossi WE et al. Behav Pharmacol. 2005 Dec;

40 16(8):627-33). Asimadoline, селективный агонист κ-опиоидных рецепторов, вызывал дисфорию и седацию (М.Camilleri Neurogastroenterol Motil. 2008 Sep; 20(9): 971-979). Для оценки нарушения координации движения, походки и равновесия использовали тест «вращающийся стержень». На горизонтальный стержень диаметром 2.5 см и скоростью вращения 10 оборотов в минуту помещали мышей и фиксировали время 45 удерживания на стержне. Неспособность животных сохранять равновесие на стержне в течение 120 сек под влиянием изучаемого соединения рассматривали как проявление нарушения координации движений. ГБ-115 вдозах0.1, 1.0, 10.0 и 20.0 мг/кг и воду дистиллированную в качестве контроля вводили перорально за 40 мин до тестирования. (Todd W. Vanderah et al. Journal of Pharmacology and Experimental 50 Therapeutics; 2004; 310:326-333). Установлено, что в течение периода наблюдения (120 сек) все животные сохраняли способность удерживаться на вращающемся стержне. Таким образом, вдиапазоне

Ñòð.: 12 RU 2 429 874 C1 анальгетических доз ГБ-115 не вызывает седативного эффекта и нарушения координации движения у животных. Таким образом, соединение ГБ-115 представляет собой новый пептидный анальгетик для перорального применения, преимущественно направленный на 5 купирования висцеральной боли и реализующий свое действие через периферические k- опиоидные рецепторы. Краткое описание чертежей На фиг.1 изображено влияние ГБ-115 на число абдоминальных сокращений у 10 мышей, вызванных уксусной кислотой 0.75%. Данные представлены в виде M±SEM; по оси абсцисс: дозы ГБ-115, мг/кг, по оси ординат: число корчей; статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой показаны при *-р<0.05, ***-р<0.001 согласно непараметрическому критерию Mann-Whitney U test; количество животных в группе от 9 до 25. 15 На фиг.2 изображено влияние ГБ-115 (10.0 мг/кг, п/о), морфина (5.0 мг/кг, в/б) и диклофенака (20.0 мг/кг, п/о) на поведение животных в тесте «корчи». Данные представлены в виде M±SEM; по оси абсцисс: 1-й столбик - контроль, 2-й столбик - морфин, 3-й столбик - диклофенак, 4-й столбик - ГБ-115; по оси ординат: количество

20 корчей; ***-р<0.001 статистически достоверные различия по сравнению с контролем; Mann-Whitney U test; количество животных в группе от 9 до 21. На фиг.3 показано, что в тесте «корчи» неселективная блокада опиоидных рецепторов налоксоном полностью купирует эффекты морфина (5.0 мг/кг, в/б) и частично ГБ-115 (10.0 мг/кг, в/б) (фиг.А); блокада периферических опиоидных 25 рецепторов налтрексоном иодидом препятствует проявлению антиноцицептивной активности ГБ-115, не влияя на действие морфина у мышей (фиг.В). Данные представлены в виде M±SEM. На фиг.3А по оси абсцисс: 1-й столбик - контроль, 2-й столбик - морфин, 3-й столбик - морфин+налоксон, 4-й столбик - ГБ-115, 5-й столбик -

30 ГБ-115+налоксон; по оси ординат: количество корчей. На фиг.3В по оси абсцисс: 1-й столбик - контроль, 2-й столбик - морфин, 3-йстолбик- морфин+налтрексона иодид, 4- й столбик - ГБ-115, 5-й столбик - ГБ-115+налтрексона иодид; по оси ординат: количество корчей; *-р<0.05, ***-р<0.001 статистически достоверные различия по сравнению с контролем, х-р<0.05 по сравнению с группой ГБ-115, Маnn-Whitney U test; 35 количество животных в группе от 10 до 15. На фиг.4 изображено влияние блокады κ-опиоидных рецепторов норбиналторфимином на проявление антиноцицептивной активности ГБ-115 (10.0 мг/кг, в/б) в тесте «корчи» у мышей. Данные представлены в виде M±SEM; по оси

40 абсцисс: 1-йстолбик- контроль, 2-й столбик - ГБ-115, 3-й столбик - норбиналторфимин +ГБ-115, 4-й столбик - пентазоцин, 5-йстолбик- норбиналторфимин+пентазоцин; по оси ординат: количество корчей; ** - р<0.01 достоверные различия по сравнению с контрольной группой, ## - р<0.01 по сравнению с группой ГБ-115, х-р<0.05 по сравнению с группой пентазоцина, Mann-Whitney U test; 45 количество животных в группе от 10 до 15. На фиг.5 показано влияние ГБ-115 (10.0 мг/кг, в/б) на латентный период реакции избегания в тесте «горячая пластинка» у мышей. Данные представлены в виде M±SEM; по оси абсцисс: дозы ГБ-115, мг/кг; по оси ординат: максимально возможный

50 эффект (МВЭ), %; *-р<0.05 статистически достоверные различия по сравнению с контролем, Mann-Whitney U test; количество животных в группе от 9 до 15. На фиг.6 изображено влияние ГБ-115 (10.0 мг/кг, в/б) на латентный период реакции избегания в тесте «отдергивание хвоста» у мышей. Данные представлены в виде

Ñòð.: 13 RU 2 429 874 C1 M±SEM; по оси абсцисс: дозы ГБ-115, мг/кг; по оси ординат: максимально возможный эффект (МВЭ), %; ** - р<0.01, *** - р<0.001 статистически достоверные различия по сравнению с контролем, Mann-Whitney U test; количество животных в группе от 9 до 15.

5 Формула изобретения Применение амида N-(6-фенилгексаноил)глицин-L-триптофана в качестве анальгетического средства для купирования висцеральной боли.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ñòð.: 14

CL RU 2 429 874 C1

Ñòð.: 15

DR RU 2 429 874 C1

Ñòð.: 16 RU 2 429 874 C1

Ñòð.: 17