Euphorbia Tirucalli Linnean, Bredemeyera Floribunda Willd E Bredemeyera Brevifolia Benth

Prospecção química e biológica de espécies coletadas na caatinga: Euphorbia tirucalli Linnean, Bredemeyera floribunda Willd e Bredemeyera brevifolia Benth

Maria de Fátima Rocha de Lima Tese de Doutorado Natal/RN, junho de 2019

Maria de Fátima Rocha de Lima

PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DE ESPÉCIES COLETADAS NA CAATINGA: Euphorbia tirucalli Linneau, Bredemeyera floribunda Willd. e Bredemeyera brevifolia Benth

Tese apresentada ao programa de pós- graduação em Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de doutor em química.

Orientadora: Profa. Dra. Renata Mendonça de Araújo

Natal-RN 2019

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Francisco Gurgel De Azevedo - Instituto Química - IQ

Lima, Maria de Fátima Rocha de. Prospecção química e biológica de espécies coletadas na caatinga: Euphorbia tirucalli Linneau, Bredemeyera floribunda Willd. e Bredemeyera brevifolia Benth / Maria de Fátima Rocha de Lima. - Natal: UFRN, 2021. 203f.: il.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra - CCET, Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Química (PPGQ). Orientador: Dra. Renata Mendonça de Araújo.

1. Euphorbia tirucalli - Tese. 2. Bredemeyera floribunda - Tese. 3. Bredemeyera brevifolia - Tese. 4. Compostos fenólicos - Tese. 5. Flavonoides - Tese. 6. Atividade biológica - Tese. I. Araújo, Renata Mendonça de. II. Título.

RN/UF/BSIQ CDU 543.9(043.2)

Elaborado por FERNANDO CARDOSO DA SILVA - CRB-759/15

Natal-RN 2019

Dedico este trabalho a minha filha, Analice Rocha de Lima, por ser a motivação dos meus esforços.

Ao meu esposo, Adailton Ribeiro de Lima Filho, pessoa indispensável em minha caminhada.

E ao meu pai, José de Oliveira Rocha, pessoa que irei amar eternamente, mesmo não estando mais ao meu lado.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Jeová Deus, o responsável por minha existência, e por me conceder bondade imerecida.

À minha filha, Analice, meu amor maior, que mudou minha vida, minhas atitudes e me ensinou a amar de forma incondicional.

Ao meu esposo, Adailton, meu braço direito, esquerdo e minhas duas pernas, por tanto ter me ajudado, e sem o qual eu não estaria concluindo esta etapa de minha vida.

Aos meus pais, por terem me ensinado a verdadeira educação e por serem eternos em minha vida. Em especial ao meu pai, José de Oliveira Rocha, que tanto me admirava e esperava por este momento, que não está mais comigo, mas que o amarei eternamente.

A minha irmã, Vilma, pelo companheirismo e carinho recebido ao longo de todos esses anos.

À minha orientadora, Renata Mendonça, pela oportunidade ao aceitar-me como sua orientanda, pelo estímulo, compreensão, disposição e construção do conhecimento.

A professora Grazielle Tavares, por sua amizade, dedicação, apoio, pelos seus conselhos e sugestões, além das palavras de ânimos que sempre me incentivaram.

A professora Lívia Nunes, por sua contribuição em conhecimento, pela amizade e por sempre estar disposta a me ajudar.

Ao doutor Braz por bondosamente nos ajudar com seu conhecimento na elucidação estrutural de algumas moléculas.

A técnica Elânia, pela contribuição nas análises de RMN.

Ao professor Matheus Pedrosa e sua aluna Juliana Félix, pela maravilhosa contribuição nos testes antiofídicos.

A professora Márcia Vanusa e ao Bruno Oliveira, por suas contribuições com testes antimicrobianos.

A aluna de iniciação científica, Luziene, por sua amizade, dedicação, companheirismo e pela grande ajuda no trabalho de bancada.

As minhas queridas amigas de laboratório, Jannyely, Mayra e Marcela, que fizeram parte do meu dia a dia, compartilhando os conhecimentos, dificuldades, alegrias e porque não tristezas, pelo companheirismo de sempre, por toda paciência, compreensão, parceria e amizade formada.

Aos demais amigos do Laboratório de Isolamento e Síntese de Compostos Orgânicos (LISCO), Nayara, Monara, Sarah, Erivaldo, Djalan, André, Rusceli e Edson

pelo conhecimento compartilhado, pelo companheirismo de sempre. Meu muito obrigado. E a todos os demais alunos que passaram por lá, pelas amizades formadas.

A todos os funcionários, professores e amigos do Instituto de Química que ajudaram de certa forma no desenvolvimento desta tese.

A universidade Federal do Rio Grande do Norte e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa de pesquisa e suporte financeiro.

Por fim a todos que de alguma forma participaram da construção deste trabalho e que contribuíram para que esse momento se tornasse uma realidade, e que não foi citado aqui, obrigada!

“Deus é nosso refúgio e nossa força, uma ajuda encontrada prontamente em tempos de aflição. Por isso é que não teremos medo, ainda que a terra se transforme, ainda que os montes caiam nas profundezas do mar, ainda que as águas do mar façam estrondos e espumem, ainda que sua turbulência faça os montes tremer.” (Sal. 46:1-3)

RESUMO

LIMA, M. F. R. Prospecção química e biológica de espécies coletadas na Caatinga: Euphorbia tirucalli, Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia. 2019. 204 f. Tese (Doutorado em Química) – programa de pós-graduação em Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil, 2019.

O bioma Caatinga constitui um importante potencial de formação vegetal, com inúmeras espécies reportadas na literatura pelo amplo espectro de atividades biológicas e diversidade química apresentada. Diante do potencial deste bioma, o presente trabalho aborda a investigação química e biológica de três espécies de plantas coletadas na caatinga nordestina: Euphorbia tirucalli Linn., Bredemeyera floribunda Willd. e Bredemeyera brevifolia Benth. A análise por LC-MS, em modo negativo, aplicada aos extratos das três espécies permitiu avaliar o perfil fitoquímico das espécies e assim constatar os flavonoides como classe de metabólitos predominante. O estudo químico dos extratos hexânico da parte aérea e etanólico das raízes de E. tirucalli, aplicando técnicas cromatográficas, permitiu o isolamento de cinco constituintes: dois já isolados na espécie, a β-amirina e o ácido 4-O-metil-gálico, além de três compostos inéditos na espécie, a ampelopsina, a miricetina e ácido 3,3'-dimetoxielágico-4-O-α- raminopiranosídeo. A avaliação da atividade antioxidante dos extratos de E. tirucalli frente ao DPPH e ABTS possibilitou constatar que o extrato etanólico das raízes apresentou melhor eficiência frente aos dois radicais, enquanto dentre os compostos isolados a myricetin apresentou melhor inibição dos radicais com IC50 de 22,62 μg/mL para o DPPH e de 53,22 μg/mL para o ABTS. A avaliação das atividades antimicrobianas permitiu constatar que apenas os extratos etanólicos apresentaram potenciais antibacterianos e antifúngicos, enquanto que todos os compostos isolados mostraram efeito inibitório contra cepas de S. aureus, E. coli, S.brasiliensis e C. Albicans, com maior efeito para a miricetina e ampelopsina. O estudo das espécies do gênero Bredemeyera também se mostrou promissor. Tratamentos cromatográficos aplicados ao extrato hidroalcoólico das raízes de B. floribunda permitiu o isolamento de dois compostos, o (2E) -3’-(3,4,5-trimetóxifenil) -prop-2-enoato de metila e o 1,7- dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona ambos já isolados na espécie, enquanto os procedimentos cromatográficos aplicados ao extrato etanólico dos talos levou ao isolamento de três flavonoides, a rutina, o canferol e a quercetina sendo os dois últimos isolados pela primeira vez na espécie. O estudo do extrato hidroalcoólico das raízes de B. brevifolia permitiu a identificação de duas flavonas, a 5,7,4’-trihidroxi-3’- metoxiflavona e a 5,7,2’,3’,4’-pentahidroxi-6,4’-dimetoxiflavona da fração clorofórmica e o isolamento desta primeira flavona na fração acetato. A avaliação da atividade enzimática in vitro frente a peçonha da espécie Bothrops jararaca, mostrou resultados relevantes, pois permitiu constatar que a peçonha de B. jararaca foi totalmente inibida pelo extrato hidroalcoólico das raízes B. brevifolia, mostrando-se ser um dado muito interessante devido a relevância dessa classe de toxinas nos envenenamentos ofídicos. Este estudo contribuiu para o conhecimento químico e biológico das três espécies estudadas, com novas moléculas isoladas para cada espécie, além de dados biológicos inéditos associados a atividade antiofídica do gênero Bredemeyera e a atividade antimicrobiana de Euphorbia tirucalli.

Palavras-Chave: Euphorbia tirucalli. Bredemeyera floribunda. Bredemeyera brevifolia. Terpenos. Compostos fenólicos. Ácido elágico. Flavonoides. Atividade biológica.

ABSTRACT

The Caatinga biome constitutes an important potential of vegetal formation, with numerous species reported in the literature for the broad spectrum of biological activities and chemical diversity presented. Due chemistry and biological potential of this biome, the present study approaches the phytochemical investigation of three plant species collected in the northeastern caatinga: Euphorbia tirucalli Linn., Bredemeyera floribunda Willd. and Bredemeyera brevifolia Benth. The LC-MS analysis, in negative mode, applied to the extracts of the three species allowed the evaluation of the phytochemical profile of the species and thus found the flavonoids as the predominant class of metabolites. The chemical study of the hexane and ethanolic extracts from aerial parts and roots of E. tirucalli, respectively, using chromatographic techniques, allowed the isolation of five constituents: two already isolated in the species, β-amyrin and 4-O-methyl-gallic acid, and three unpublished compounds in the species, ampelopsin, myricetin and 3,3'-dimethoxyellagic acid-4-O-α-rhamnopyranoside. The evaluation of the antioxidant activity from E. tirucalli extracts against DPPH and ABTS showed the potential of the ethanolic root extract against both radicals, whereas among the compounds isolated myricetin showed the best inhibition of radicals with IC50 of 22.62 μg/mL for DPPH and 53.22 μg/mL for ABTS. The evaluation of antimicrobial activities showed antibacterial and antifungal potential of the ethanolic extracts, while all the isolated compounds showed inhibitory effect against strains of S. aureus, E. coli, S.brasiliensis and C. Albicans, with greater effect for myricetin and ampelopsin. The study of species of the genus Bredemeyera was also promising. Chromatographic treatments applied to the hydroalcoholic extract of B. floribunda roots allowed the isolation of two compounds, methyl (2E)-3'-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-prop-2-enoate and 1,7- dihydroxy-3,4,8-trimethoxixantone both already isolated in the species, while the chromatographic procedure applied to the ethanolic extract of the stems led to the isolation of three flavonoids, rutin, canferol and quercetin being the last two isolates for the first time in the species. The study of the hydroalcoholic extract from B. brevifolia roots allowed the identification and isolation of two flavones, 5,7,4'-trihydroxy-3'- methoxyflavone and 5,7,2',3',4'-pentahydroxy-6, 4'-dimethoxyflavone. The evaluation of the in vitro enzymatic activity against Bothrops jararaca venom showed relevant results, since it was verified that B. jararaca venom was totally inhibited by the hydroalcoholic extract of B. brevifolia roots, proving to be a very interesting data because the relevance of this class of toxins in snake poisoning. This study contributed to the chemical and biological knowledge of the three species studied, with new isolated molecules for each species, as well as unpublished biological data associated with Bredemeyera antiofidic activity and Euphorbia tirucalli antimicrobial activity.

Key words: Euphorbia tirucalli. Bredemeyera floribunda. Bredemeyera brevifolia. Terpenes. Phenolic compounds. Ellagic acid. Flavonoids. Biological activities.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1– Imagem das três espécies trabalhadas nesta pesquisa: (A) Euphorbia tirucalli, (B) Bredemeyera floribunda e (C) Bredemeyera brevifolia...... 29

Figura 2 – Redução do DPPH por antioxidante...... 35

Figura 3 – Estabilização do radical ABTS por um antioxidante e sua formação pelo persulfato de potássio...... 36

Figura 4 – Serpente da espécie Bothrops jararaca...... 37

Figura 5 – Foto da espécie Euphorbia tirucalli Linn...... 57

Figura 6- Derivado de forbol (1) e ingenol (2) isolados por Fürstenberger e Hecker em 1977...... 63

Figura 7- Derivado de Phorbol (3) isolado por Kinghom 1979...... 63

Figura 8- Estrutura dos dois triterpenos, o Euphol (4) e o Tirucallol (5) isolados por Nes et al em 1984...... 64

Figura 9 – Estrutura dos dois terpenos, o 4-deoxiphorbol (6) e o 4-deoxi-4α-phorbol (7) isolados por Fürstenberger e Hecker em 1985...... 64

Figura 10- Estrutura dos dois triterpenos, o glut-5-en-3-β-ol (8) e o cicloart-23-eno-3- β,25-diol (9) isolados por Khan e colaboradores em 1987...... 65

Figura 11- Estrutura do Cicloeuphordenol (11) isolados do látex de E. tirucalli por Khan e colaboradores em 1988 do...... 65

Figura 12- Estrutura do Ciclotirucanenol (12) isolados do látex de E. tirucalli por Khan e colaboradores em 1988...... 65

Figura 13- Estrutura do triterpenos, Euphorcinol (13) isolados por Khan e colaboradores em 1989...... 66

Figura 14- Estrutura do Euforginol (14) isolados da casca do caule de E. tirucalli por Rasool e colaboradores em 1989...... 66

Figura 15 – Estrutura do Ingol (15) isolados do látex fresco de E. tirucalli por Khan e Malik em 1990...... 67

Figura 16 – Obtenção dos extratos hexânicos e etanólicos da parte aérea e das raízes de Euphorbia tirucalli...... 77

Figura 17 – Fracionamento do extrato hexânicos da parte aérea e do estrato etanol das raízes de Euphorbia tirucalli...... 78

Figura 18 – Cromatograma de LC-MS para avaliar o perfil dos compostos presentes no extrato etanólico das raízes de Euphorbia tirucalli ...... 83

Figura 19 – Espectros de massas com fragmentos MS dos compostos identificados de 1-15 e suas respectivas estruturas...... 85

Figura 20 – Espectro na região do infravermelho referente a estrutura da ET-1...... 90

1 Figura 21 – Espectro de RMN H da ET-1 (CDCl3, 500 MHz)...... 91

13 Figura 22 – Espectro de RMN C da ET-1 (CDCl3, 125 MHz)...... 92

Figura 23 – Espectro de RMN DEPT 135° de ET-1 (CDCl3, 125 MHz)...... 92

Figura 24 – Estrutura química de ET-1, β-amirina, (3-β-hidroxi-oleon-12-en-3ol)...... 94

Figura 25 – Espectro na região do infravermelho referente a estrutura da ET-2...... 94

Figura 26 – Espectro de RMN 1H da ET-2 (DMSO, 500 MHz)...... 95

Figura 27 – Espectro de RMN de correlação heteronuclear 1H 13C-HSQC de ET-2, (DMSO, 125 MHz)...... 95

Figura 28 – Espectro de RMN 13C da ET-2 (DMSO, 125 MHz)...... 96

Figura 29 – Espectro de RMN de correlação heteronuclear 1H, 13C-HSQC de ET-2, (DMSO, 125 MHz)...... 97

Figura 30 – Estrutura química de ET-2, ácido 4-O-metil-gálico...... 98

Figura 31 – Espectro na região do infravermelho referente a estrutura da ET-3...... 99

Figura 32 – Espectro de RMN 1H da ET-3 (DMSO, 500 MHz)...... 99

Figura 33 – Espectro de RMN 13C da ET-3, DMSO, 125 MHz...... 100

Figura 34 – Espectro de RMN de correlação heteronuclear 1H, 13C-HSQC de ET-3, (DMSO, 500 MHz)...... 101

Figura 35 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C- HMBC de ET-3 (DMSO, 500 MHz)...... 102

Figura 36 – Estrutura química de ET-3, Ampelopsina (dihidromicetina)...... 103

Figura 37 – Espectro na região do infravermelho referente à estrutura da ET-4...... 103

Figura 38 – Espectro de RMN 1H da ET-4 (DMSO, 500 MHz)...... 104

Figura 39 – Espectro de RMN 13C DEPTq de ET-4 (DMSO, 125 MHz)...... 105

Figura 40 – Espectro de correlação heteronuclear RMN 2D-HSQC (DMSO, 500 MHz) de ET-4...... 106

Figura 41 – Estrutura química de ET-4, miricetina...... 107

Figura 42 – Espectro na região do infravermelho referente a estrutura de ET-5...... 108

Figura 43 – Espectro de RMN 1H de ET-5 (DMSO, 300 MHz)...... 109

Figura 44 – Espectro de RMN bidimensional de correlação homonuclear 1H, 1H – COSY de ET-5 (DMSO, 300 MHz)...... 109

Figura 45 – Espectro de RMN 13C de ET-5 (300 MHz, DMSO)...... 110

Figura 46 – Espectro de RMN 13C-DEPTq (DMSO, 300 MHz) de ET-5...... 111

Figura 47 – Espectro de correlação heteronuclear RMN 2D-HSQC (DMSO, 300 MHz) de ET-5...... 111

Figura 48 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C- HMBC (DMSO, 300 MHz) de ET-5...... 112

Figura 49 – Estrutura química ET-5, ácido 3,3'-dimetoxielágico-4-O-α- raminopiranosídeo...... 113

Figura 50 – Foto da espécie Bredemeyera floribunda Willd...... 131

Figura 51 – Foto da espécie Bredemeyera brevifolia Benth...... 135

Figura 52 – Obtenção e fracionamento dos extratos das raízes de Bredemeyera floribunda Willd...... 148

Figura 53 – Obtenção e fracionamento dos extratos dos talos de Bredemeyera floribunda Willd...... 149

Figura 54 – Obtenção e fracionamento do extrato das raízes de Bredemeyera brevifolia...... 150

Figura 55 – Obtenção dos extratos do talo de Bredemeyera brevifolia...... 151

Figura 56– Cromatogramas do perfil dos extratos de Bredemeyera floribunda obtidos por análise de LC-MS. A: cromatograma do extrato hidroalcoólico das raízes, B: cromatograma do extrato etanólico dos talos...... 156

Figura 57 – Espectros de massas com fragmentos MS dos compostos identificados nas raízes e talos de Bredemeyera floribunda, e suas respectivas estruturas...... 158

Figura 58 – Espectro de RMN 1H da BFR-1, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 161

Figura 59 – Espectro de RMN 13C DEPTq da BFR-1, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 162

Figura 60 – Estrutura química do derivado cinâmico...... 163

Figura 61 – Espectro de RMN 1H da BFR-2, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 163

Figura 62 – Espectro de RMN 13C DEPTq da BFR-2, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 164

Figura 63 – Estrutura química da xantona trimetoxilada, 1,7-dihidroxi-3,4,8- trimetoxixantona...... 165

Figura 64 – Espectro de RMN 1H da BFT-1, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 166

Figura 65 – Espectro de RMN 13C da BFT-1, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 167

Figura 66 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C- HMBC da BFT-1, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 167

Figura 67 – Estrutura química do flavonol, canferol...... 168

Figura 68 – Espectro de RMN 1H da BFT-2, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 169

Figura 69 – Espectro de RMN 13C da BFT-2, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 170

Figura 70 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C- HSQC da BFT-2, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 170

Figura 71 – Estrutura química do flavonol, quercetina...... 171

Figura 72 – Espectro de RMN 1H da BFT-3, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 172

Figura 73 – Espectro de RMN 13C DEPTq da BFT-3, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 173

Figura 74 – Estrutura química do flavonoide rutina...... 174

Figura 75 – Cromatogramas do perfil químico dos extratos de Bredemeyera brevifolia obtidos por análise de LC-MS. A: cromatograma do extrato hidroalcoólico das raízes, B: cromatograma do extrato etanólico dos talos...... 176

Figura 76 – Espectros de massas com fragmentos MS dos compostos identificados nas raízes e talos de Bredemeyera brevifolia, e suas respectivas estruturas...... 178

Figura 77 – Espectro de RMN 1H da BBR-1, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 181

Figura 78 – Espectro de RMN 13C DEPTq da BBR-1, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 182

Figura 79 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C – HSQC da BBR-1, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 183

Figura 80 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C – HMBC da BBR-1, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 184

Figura 81 – Estruturas químicas das flavonas 5,7,4’-trihidroxi-3’-metoxiflavona e 5,7,2’,3’,4’-pentahidroxi-6,4’dimetoxiflavona...... 185

Figura 82 – Espectro de RMN 1H da BBR-2, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 186

Figura 83 – Espectro de RMN 13C DEPTq da BBR-2, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 187

Figura 84 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C- HSQC da BBR-2, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 187

Figura 85 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C- HMBC da BBR-2, (DMSO-d6, 300 MHz)...... 188

Figura 86 – Estruturas químicas de 5,7,4’-trihidroxi-3’-metoxiflavona ...... 189

Figura 87 – Avaliação da atividade inibitória dos extratos hidroalcoólicos das espécies Bredemeyera floribunda (BFREA) e Bredemeyera brevifolia (BBREA) contra a atividade proteolítica da peçonha da serpente Bothrops jararaca...... 190

Figura 88 – Avaliação da atividade inibitória dos extratos hidroalcoólicos das espécies Bredemeyera floribunda (BFREA) e Bredemeyera brevifolia (BBREA) contra a atividade fosfolipásica da peçonha da serpente Bothrops jararaca...... 190

Figura 89 – Avaliação da atividade inibitória dos extratos hidroalcoólicos das espécies Bredemeyera floribunda (BFREA) e Bredemeyera brevifolia (BBREA) contra a atividade hialuronidásica da peçonha da serpente Bothrops jararaca...... 191

LISTA DE QUANDRO

Quadro 1 – Constituintes isolados de plantas do gênero Euphorbia...... 58

Quadro 2 – Estrutura química dos compostos isolados de Euphorbia tirucalli...... 68

Quadro 3 – Partes da planta Euphorbia tirucalli utilizadas para extração e as respectivas denominação dos extratos obtidos...... 73

Quadro 4 – Quantidades de reagentes utilizados na saponificação...... 73

Quadro 5 – Proporções de solventes e volumes para a obtenção das frações de 1-14 a partir da fração ETPAE-H-C-insap...... 74

Quadro 6 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das raízes (ETR-E)...... 75

Quadro 7 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração ETR-H-A-(5)...... 75

Quadro 8 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração ETR-E-A-(7)...... 76

Quadro 9 – Quantidades de material botânico seco utilizado nas extrações e rendimento obtido dos extratos ETPAE-H, ETPAE-E, ETR-H e ETR-E da espécie Euphorbia tirucalli...... 82

Quadro 10– Compostos identificados no extrato das raízes da espécie Euphorbia tirucalli usando análise de LC-MS/MS em modo de ionização negativo...... 84

1 13 Quadro 11 – Dados de RMN de H e C (CDCL3, 500 MHz) de ET-1 e comparação com os dados da literatura (CDCL3, 500 MHz)...... 93

Quadro 12 – Dados de RMN de 1 H e 13C (DMSO, 500 MHz) de ET-2 e comparação com os dados da literatura (DMSO, 400 MHz) (ABHISHEK, et al., 2019)...... 98

Quadro 13 – Dados de RMN de 1 H e 13C (DMSO, 500 MHz) de ET-3 e comparação com os dados da literatura (H2O, 125 MHz) (WOO, et al., 2012)...... 102

Quadro 14 – Dados de RMN de 1 H e 13C (DMSO, 500 MHz) de ET-4 e comparação com os dados da literatura (DMSO-d6, 500 MHz) (MOK & LEE, 2013)...... 107

Quadro 15 – Dados de RMN de 1 H e 13C (DMSO, 300 MHz) de ET-5 e comparação com os dados da literatura (DMSO-d6, 400 MHz) (YE, et al., 2007)...... 113

Quadro 16 – Dados referentes aos resultados da atividade antioxidande frente aos radicais DPPH e ABTS...... 115

Quadro 17 – Atividade antimicrobiana expressa como concentração inibitória mínima (CIM), concentração bactericida mínima (CBM) e concentração fungicida mínima (CFM)...... 116

Quadro 18 – Estruturas químicas dos constituintes isolados da espécie Bredemeyera floribunda...... 132

Quadro 19 – Estrutura química dos constituintes isolados da espécie Bredemeyera brevifolia...... 136

Quadro 20 – Dados referente a extração das raízes de Bredemeyera floribunda...... 137

Quadro 21 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico Sephadex do extrato BFREA...... 138

Quadro 22 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico Sephadex do extrato BFREA-M-(3,4)...... 138

Quadro 23 – Dados referente a extração dos talos de Bredemeyera floribunda...... 140

Quadro 24 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do extrato etanólico do talo de Bredemeyera floribunda (BFTE)...... 140

Quadro 25 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico flash da fração BFTE- CA-(5-8)...... 141

Quadro 26 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração BFTE-CA- (5-8)-CA-(8-10)...... 141

Quadro 27 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico Sephadex da fração BFTE-M-(9)...... 142

Quadro 28 – Dados referente a extração das raízes de Bredemeyera brevifolia...... 143

Quadro 29 – Dados da partição líquido-líquido do extrato BBREA de Bredemeyera brevifolia...... 144

Quadro 30 – Proporções de solventes e volumes para a obtenção das frações de 1-18 a partir da fração BBREA-C...... 144

Quadro 31 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração clorofórmica, BBREA-C...... 145

Quadro 32 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico Sephadex da fração BBREA-Ac...... 146

Quadro 33 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do tipo “flash” da fração BBREA-Ac-M-[15-17] após análise por CCDs...... 146

Quadro 34 – Dados referente a extração por maceração dos talos de Bredemeyera brevifolia...... 147

Quadro 35 – Quantidades de material botânico seco utilizado nas extrações e rendimento obtido dos extratos BFREA, BFTH e BFTE, da espécie Bredemeyera floribunda...... 155

Quadro 37 – Dados de RMN de 1H e 13C DEPTq (DMSO-d6, 300 MHz) de BFR-1, e comparação com os dados da literatura (CDCL3, 500 MHz) (CAVALCANTE, 2015)...... 162

Quadro 38 – Dados de RMN de 1H e 13C DEPTq (DMSO-d6, 300 MHz) da xantona trimetoxilada, BFR-2, e comparação com os dados da literatura (CDCL3, 500 MHz) (CAVALCANTE, 2015)...... 165

Quadro 39 – Dados de RMN de 1H e 13C (DMSO-d6, 300 MHz) de BFT-1, Canferol, e comparação com os dados da literatura (SINGH, et al., 2008)...... 168

Quadro 40 – Dados de RMN de 1H e 13C (DMSO-d6, 300 MHz) de BFT-2, Quercetina, e comparação com os dados da literatura (LALLEMAND & DUTEIL, 1977)...... 171

Quadro 41 – Dados de RMN de 1H e 13C (DMSO-d6, 300 MHz) de BFT-3, Rutina, e comparação com os dados da literatura (CAVALCANTE, 2015) (MeOD, 300 MHz)...... 174

Quadro 42 – Quantidades de material botânico seco utilizado nas extrações e rendimento obtido dos extratos BBREA, BBTH e BBTE da espécie Bredemeyera brevifolia...... 175

Quadro 44 – Dados de RMN de 1H e 13C (DMSO-d6, 300 MHz) de BBR-1A, mistura de xantonas, e comparação com os dados da literatura (WAGNER, et al., 1976; KONGKUM, et al., 2012) (DMSO-d6)...... 185

Quadro 45 – Dados de RMN de 1H e 13C (DMSO-d6, 300 MHz) de BBR-2 e comparação com os dados da literatura (WAGNER, et al., 1976) (DMSO-d6)...... 189

ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CBM Concentração Inibitória Mínima CC Cromatografia em Coluna CCD Cromatografia em Camada Delgada CENAUREMN Centro Nordestino de Aplicação de Uso da Ressonância Magnética Nuclear CFM Concentração Fungicida Mínima CHCl3 Clorofórmio CIM Concentração Inibitória Mínima COSY Homonuclear Correlation Spectroscopy (Espectroscopia de Correlação Homonuclear) d dupleto DAMPs Damage-associated molecular patterns (padrões moleculares associados a danos) DEPT Distortionls Liquid Cromatography (Aumento de Sinal por Transferência de Polarização) dd Duplo dupleto DMSO Dimetil sulfóxido ETPAE-E Extrato Etanólico da Parte Aérea de Euphorbia tirucalli ETRE-E Extrato Etanólico da Raiz de Euphorbia tirucalli ETPAE-H Extrato Hexânico da Parte Aérea de Euphorbia tirucalli ETR-E Extrato Hexânico da Raiz de Euphorbia tirucalli FPP Farnesil pirofosfato FTIR-ATR Fourier-Transform Infrared Spectroscopy and Attenuated Total Reflectance (Espectroscopia no Infravermelho Com transformada de Fourier e Reflexão Total) HMBC Heteronuclear Multiple Band Correlation (Correlação Heteronuclear à Múltiplas Ligações) HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation (Correlação Quântica Simples Heteronuclear) Hz Hertz IC50 Concentração de Inibição Média IL-1β Interleucina 1β IL-6 Interleucina 6 IV Infravermelho J Constante de Acoplamento LC-MS Liquid Cromatography Mass Spectrometry (Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa sequencial) LISCO Laboratório de Isolamento e Síntese de Compostos Orgânicos m multipleto MEC Matriz Extracelular MHz Mega Hertz ND Não determinado PAL Fenilalanina amonialiase Pf Ponto de fusão ppm ppm Partes por milhão RDA Retro Diels-Alder RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1

s simpleto t tripleto TNF-α Tumor necrosis fator α (fator de necrose tumoral α) UV Ultravioleta δ Deslocamento Químico

SUMÁRIO

ORGANIZAÇÃO DA TESE ...... 26

CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL ...... 27

1.1. INTRODUÇÃO ...... 27

1.2. OBJETIVO GERAL...... 30

1.3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...... 31 1.3.1. A QUÍMICA DE PRODUTOS NATURAIS ...... 31 1.3.2. CAATINGA ...... 32 1.3.3. METABOLISMO VEGETAL ...... 32 1.3.4. ATIVIDADES BIOLÓGICAS ...... 34 1.3.4.1. Atividade Sequestradora de radicais com DPPH ...... 34 1.3.4.2. Atividade Sequestradora de radicais com ABTS ...... 35 1.3.4.3. Atividades Enzimáticas da peçonha de Bothrops jararaca ...... 36

1.4. METODOLOGIA GERAL ...... 39 1.4.1. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS ...... 39 1.4.1.1. Cromatografia de Absorção em Coluna (CC) ...... 39 1.4.1.2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ...... 39 1.4.1.3. Cromatografia de Exclusão ...... 40 1.4.2. MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS ...... 40 1.4.2.1. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ...... 40 1.4.2.2. Espectroscopia na Região do Infravermelho (IV) ...... 41 1.4.3. OUTROS MÉTODOS DE ANÁLISE ...... 41 1.4.3.1. Ponto de fusão (pf)...... 41 1.4.3.2. Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa (CL- EM) ...... 42

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 44

CAPÍTULO 2 - PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau ...... 54

2.1. OBJETIVO GERAL...... 54

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 54

2.3. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO ...... 55

2.3.1. CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS ...... 55 2.3.1.1. Família Euphorbiaceae ...... 55 2.3.1.2. Gênero Euphorbia ...... 56 2.3.1.3. Espécie Euphorbia tirucalli ...... 56 2.3.2. CONSTITUINTES BIOATIVOS ISOLADOS ...... 57 2.3.2.1. Aspecto Químico do gênero Euphorbia ...... 58 2.3.2.2. Aspecto Químico da espécie Euphorbia tirucalli ...... 62 2.3.3. USO DE Euphorbia tirucalli NA MEDICINA POPULAR...... 71

2.4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA O ESTUDO

FITOQUÍMICO DE EUPHORBIA TIRUCALLI ...... 72 2.4.1. MATERIAL VEGETAL ...... 72 2.4.2. OBTENÇÃO DOS EXTRATO HEXÂNICO E ETANÓLICO DA PARTE AÉREA E DAS RAÍZES DE Euphorbia tirucalli ...... 72 2.4.3. OBTENÇÃO DOS CONSTITUINTES INSAPONIFICÁVEIS DO EXTRATO ETPAE-H...... 73 2.4.3.1. Saponificação ...... 73 2.4.3.2. Fracionamento Cromatográfico da fração ETPAE-H-C-insap ... 74 2.4.4. FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO ETANÓLICO DAS RAÍZES DE Euphorbia tirucalli (ETR-E) ...... 74 2.4.4.1. Fracionamento Cromatográfico da fração ETR-E-A-(5) ...... 75 2.4.4.2. Fracionamento Cromatográfico da fração ETR-E-AM-(7) ...... 76 2.4.5. ATIVIDADES BIOLÓGICAS ...... 79 2.4.5.1. Atividade sequestradora de radical Livre de Euphorbia tirucalli com o radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) ...... 79 2.4.5.2. Atividade sequestradora de radical Livre de Euphorbia tirucalli com o radical 2’,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS-+) ...... 79 2.4.5.3. Atividades Antimicrobianas de Euphorbia tirucalli ...... 80 2.4.5.3.1. Cepas ...... 80 2.4.5.3.2. Preparação do Inóculo ...... 81 2.4.5.3.3. Concentração Inibitória Mínima (CIM) ...... 81 2.4.5.3.4. Concentração Bactericida e fungicida Mínima (CBM/CFM) ...... 81

2.5. RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÕES ...... 82 2.5.1. CÁLCULO DE RENDIMENTO DOS EXTRATOS BRUTOS...... 82

2.5.2. AVALIAÇÃO DO PERFIL FITOQUÍMICO DO EXTRATO ETANÓLICO DE Euphorbia tirucalli POR ANÁLISE DE LC-MS 82 2.5.3. ISOLAMENTO E DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE Euphorbia tirucalli ...... 89 2.5.3.1. Determinação Estrutural de ET-1 ...... 89 2.5.3.2. Determinação Estrutural de ET-2 ...... 94 2.5.3.3. Determinação Estrutural de ET-3 ...... 98 2.5.3.4. Determinação Estrutural de ET-4 ...... 103 2.5.3.5. Determinação Estrutural de ET-5 ...... 107 2.5.4. AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS ...... 114 2.5.4.1. Atividade Sequestradora de radicais dos Extratos ETPAE-E, ETPAE-H, ETR-E e ETR-H ...... 114 2.5.4.2. Atividade Antimicrobiana dos Extratos e dos Compostos Isolados ET-3, ET-4 e ET-5 ...... 115 2.6. CONCLUSÃO ...... 117

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 119

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd E Bredemeyera brevifolia Benth ...... 128

3.1. OBJETIVO GERAL...... 128

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 128

3.3. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO ...... 129 3.3.1. CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS ...... 129 3.3.1.1. Família Polygalaceae ...... 129 3.3.1.2. Gênero Bredemeyera ...... 130 3.3.1.3. Espécie Bredemeyera floribunda Willd...... 130 3.3.1.3.2. Usos medicinais da espécie Bredemeyera floribunda Willd ...... 134 3.3.1.4. Espécie Bredemeyera brevifolia Benth...... 135 3.3.1.4.1. Aspecto Químico da espécie Bredemeyera brevifolia Benth ...... 135 3.3.1.4.2. Usos medicinais da espécie Bredemeyera brevifolia Benth...... 136

3.4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL PARA O ESTUDO

FITOQUÍMICO DE BREDEMEYERA FLORIBUNDA ...... 137 3.4.1. MATERIAL VEGETAL DE Bredemeyera floribunda ...... 137

3.4.2. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DAS RAÍZES DE Bredemeyera floribunda ...... 137 3.4.2.1. Extratos das Raízes ...... 137 3.4.3. FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO DAS RAÍZES DE Bredemeyera floribunda (BFREA) ...... 138 3.4.3.1. Fracionamento cromatográfico da fração BFREA-M-(3,4) ...... 138 3.4.3.1.1. Subfracionamento da fração BFREA-M-(3-4)-M-(4-8) ...... 139 3.4.4. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DOS TALOS DE Bredemeyera floribunda ...... 139 3.4.4.1. Extratos dos Talos ...... 139 3.4.5. FRACIONAMENTO DO EXTRATO DOS TALOS DE Bredemeyera floribunda (BFTE)...... 140 3.4.5.1. Fracionamento cromatográfico da fração BFTE-CA-(5-8) ...... 140 3.4.5.1.1. Tratamento cromatográfico aplicado a fração BFTE-CA-(5-8)-CA-(8- 10) 141 3.4.5.2. Tratamento cromatográfico da fração BFTE-M-(9) ...... 142

3.5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL PARA O ESTUDO

FITOQUÍMICO DE BREDEMEYERA BREVIFOLIA ...... 143 3.5.1. MATERIAL VEGETAL DE Bredemeyera brevifolia ...... 143 3.5.2. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DAS RAÍZES DE Bredemeyera brevifolia ...... 143 3.5.2.1. Extratos das Raízes ...... 143 3.5.3. FRACIONAMENTO DO EXTRATO DAS RAÍZES DE Bredemeyera brevifolia (BBREA) ...... 144 3.5.3.1. Fracionamento cromatográfico da fração BBREA-C...... 144 3.5.3.2. Fracionamento cromatográfico da fração BBREA-Ac ...... 145 3.5.3.2.1. Fracionamento cromatográfico da fração BBREA-Ac-M-(15-17) .. 146 3.5.4. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DOS TALOS DE Bredemeyera brevifolia ...... 147 3.5.4.1. Extratos dos Talos ...... 147

3.6. ATIVIDADES ENZIMÁTICAS DAS ESPÉCIES BREDEMEYERA

FLORIBUNDA E BREDEMEYERA BREVIFOLIA CONTRA A PEÇONHA

DE BOTHROPS JARARACA ...... 152 3.6.1. PEÇONHA OFÍDICA ...... 152

3.6.2. ENSAIOS ENZIMÁTICOS IN VITRO...... 152 3.6.2.1. Inibição da Atividade Proteolítica sobre a Azocaseína ...... 152

3.6.2.2. Inibição da Atividade Fosfolipase A2 ...... 153 3.6.2.3. Inibição da Atividade Hialuronidase ...... 154 3.6.3. ANÁLISE DOS DADOS ...... 154

3.7. RESULTADOS E DISCUSSÕES ...... 155 3.7.1. CÁLCULO DE RENDIMENTO DOS EXTRATOS BRUTOS DE Bredemeyera floribunda ...... 155 3.7.2. AVALIAÇÃO DO PERFIL FITOQUÍMICO DOS EXTRATOS HIDROALCOÓLICO DAS RAÍZES E ETANÓLICO DOS TALOS DE Bredemeyera floribunda POR ANÁLISE DE LC-MS ...... 155 3.7.3. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DAS RAÍZES DE Bredemeyera floribunda ...... 160 3.7.3.1. Determinação Estrutural de BFR-1...... 160 3.7.3.2. Determinação Estrutural de BFR-2...... 163 3.7.4. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DOS TALOS DE Bredemeyera floribunda ...... 165 3.7.4.1. Determinação Estrutural de BFT-1 ...... 165 3.7.4.2. Determinação Estrutural de BFT-2 ...... 168 3.7.4.3. Determinação Estrutural de BFT-3 ...... 171 3.7.5. CÁLCULO DE RENDIMENTO DOS EXTRATOS BRUTOS DE Bredemeyera brevifolia ...... 175 3.7.6. AVALIAÇÃO DO PERFIL FITOQUÍMICO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DAS RAÍZES E ETANOL DOS TALOS DE Bredemeyera brevifolia POR ANÁLISE DE LC-MS ...... 175 3.7.7. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DAS RAÍZES DE Bredemeyera brevifolia ...... 181 3.7.7.1. Determinação Estrutural de BBR-1 ...... 181 3.7.7.2. BBR-2 ...... 186 3.7.8. INVESTIGAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS DA PEÇONHA DA SERPENTE Bothrops jararaca FRENTE OS EXTRATOS HIDROAOCOÓLICOS DAS RAÍZES DE Bredemeyera floribunda Willd E Bredemeyera brevifolia Benth ...... 189 3.8. CONCLUSÃO ...... 193

REFERÊNCIAS BICBLIOGRÁFICAS...... 195

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 200

4.1. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 200

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁCAS ...... 203

ORGANIZAÇÃO DA TESE

Para melhor entendimento, a presente tese está apresentada em forma de capítulos referentes ao estudo focado no tema central proposto para o projeto de pesquisa – Prospecção química e biológica de espécies da caatinga: Euphorbia tirucalli Linneau, Bredemeyera floribunda Willd. e Bredemeyera brevifolia Benth. Capítulo 1 – Apresentação geral – faz uma breve introdução de todo o conteúdo da tese; apresenta os objetivos gerais, comuns a todos os procedimentos experimentais; aborda os principais conteúdos que dão embasamento a tese e a metodologia geral comum aos estudos. Capítulo 2 – Prospecção química e biológica de Euphorbia tirucalli Linneau – relata o estudo botânico da espécie Euphorbia tirucalli Linneau; o levantamento dos constituintes bioativos isolados; a metodologia empregada para o desenvolvimento deste estudo e os resultados obtidos referentes a metodologia empregada. Capítulo 3 – Prospecção química e biológica de Bredemeyera floribunda Willd. e de Bredemeyera brevifolia Benth – apresenta o estudo botânico e levantamento bibliográfico acerca dos compostos químicos isolados das espécies Bredemeyera floribunda Willd. e Bredemeyera brevifolia Benth; a metodologia empregada a qual fez uso de técnicas cromatográficas clássicas e por fim os resultados obtidos resultante desta metodologia. Capítulo 4 – Considerações finais – apresenta um resumo dos principais resultados alcançados deste estudo.

26 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

1.1. INTRODUÇÃO

As plantas sempre tiveram significante papel na vida da humanidade, tanto como fonte de alimento, quanto como recursos terapêuticos, assim, o conhecimento das propriedades curativas das plantas foi sendo adquirido ao decorrer do tempo e estes têm sido transmitidos de geração a geração, fazendo com que estas sejam as principais fontes utilizadas como tratamento na medicina popular (LIMA et al., 2013). O uso de plantas na medicina popular é justificado por estas apresentarem uma ampla diversidade de metabólitos secundários com atividades biológicas diferenciadas, que leva a cada ano, a busca por novos conhecimentos das principais propriedades farmacológicas das espécies vegetais e suas possíveis aplicações para o desenvolvimento de novos medicamentos (RIBEIRO et al., 2014). A química de produtos naturais, ou fitoquímica, como é conhecida atualmente é a área do conhecimento responsável pelo estudo das investigações biossintéticas de substâncias naturais produzidas pelo metabolismo secundário de organismos vivos, bem como pela caracterização estrutural e a avaliação de propriedades biológicas, (BRAZ-FILHO, 2010; BERLINCK, et al., 2017). Esta área do conhecimento teve um desenvolvimento relativamente lendo até os anos 60, contudo, com o surgimento e aperfeiçoamento de técnicas cromatográficas e espectroscópicas, a química de produtos naturais vem ganhando aumento significativo (BERLINCK, et al., 2017). Dentro da grande biodiversidade que o Brasil possui, podemos aqui nos reportar ao bioma da Caatinga, região que apresenta formação vegetação exclusivamente brasileira (SILVA, 2013). Sua vegetação possui uma grande extensão, sendo representada por mais de 4.500 espécies distribuída por uma vegetação xerófila diversificada, sendo caracterizada em por espécies lenhosas de pequeno porte, herbáceas, cactáceas e bromeliáceas (RAMALHO et al., 2009). Dentre a ampla variedade de plantas existentes na Caatinga, as pertencentes à família Euphorbiaceae são amplamente utilizadas na cultura tradicional popular para fins terapêuticos, pois algumas de suas espécies já identificadas contêm compostos bioativos que conferem a essas plantas potenciais para o tratamento de várias doenças (PUSZTAI et al., 2007; LAGE et al., 2010). Assim, estudos mostram que plantas do gênero Euphorbia (Euphorbiaceae) têm sido utilizadas no tratamento de edemas,

27 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL inflamações, tumores, verrugas e em especial no tratamento contra o câncer, doença letal que tem ameaçado a saúde dos serem humanos (PAN et al., 2011; SHI et al., 2017; WANG et al, 2010; YI et al., 2012). Dentre as espécies do gênero Euphorbia, podemos aqui destacar a espécie Euphorbia tirucalli Linneau, Figura 1, conhecida popularmente como “avelós” (CAXITO, et al., 2017). E. tirucalli é um arbusto que pode crescer até 12 m de altura, com galhos lisos e cilíndricos no formato de lápis, flores pequenas e frutos na forma de cápsula, classificado como uma planta suculenta e produtora de um látex branco. É uma planta originária da África, mas que acabou por ser aclimatada no Brasil por volta de 1982, especialmente em áreas de clima quente como o Norte e Nordeste, para fins ornamentais (MACHADO, 2007; MALI & PANCHAL, 2017; TOFANELLI, 2011). De acordo com a literatura, a espécie é comumente usada na medicina popular para tratar doenças como sífilis, asma, tosse, dor de ouvido, dor de dente, cólica, parasitas intestinais, doenças de pele, hanseníase, tumores, reumatismo, verrugas e infecções virais (BENJAMIN, et al., 2015; WACZUK, et al., 2015). Quanto a sua composição química, diferentes partes da planta têm sido estudadas, o que levou a constatar a presença de uma variedade de metabólitos, tais como flavonoides, diterpenos, esteróides, alcalóides e taninos como os principais constituintes desta planta, como podemos destacar: β-sitosterol, campesterol, euphol, phorbol, tirucalicina, isoeuforol, taraxerol, tri-metil ácido elágico, β-amirina, entre outros (LIN et al, 2012; MOBARAK et al, 2010; LIN, et al., 2001; KINGHORN, 1979; CHAUHAN & SINGH, 2011). Outra família de grande relevância é Polygalaceae, representada por cerca de 19 gêneros e aproximadamente 1.300 espécies distribuídas por todo o mundo. No Brasil, esta família está representada por sete gêneros e 240 espécies, das quais 110 pertencem ao gênero Polygala (MARQUES & PEIXOTO 2007). No nordeste brasileiro, é relatado o estudo fitoquímico basicamente de duas espécies, a Bredemeyera floribunda Willd., e Bredemeyera brevefolia Benth, Figura 1, duas espécies muito semelhantes, sendo muitas vezes confundidas por suas características estruturas (OLIVEIRA & SILVEIRA, 2000).

28 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

Figura 1– Imagem das três espécies trabalhadas nesta pesquisa: (A) Euphorbia tirucalli, (B) Bredemeyera floribunda e (C) Bredemeyera brevifolia.

Fonte:(https://demonstre.com/avelos-euphorbia- tirucalli);(http://www.plantsoftheworldonline.org); (https://www.inaturalist.org/taxa/273522- Bredemeyera).

A Bredemeyera floribunda Willd conhecida popularmente como “baquipari” ou “raiz-de cobra” é uma espécie de trepadeira, encontrada em forma de arbusto escandentes e lianas, medinho de 2 à 5 metros de altura e comumente distribuída em hábitat de caatinga, cerrado e matas pluviais (LÜDTKE et al., 2008; OLIVEIRA, 2015; ALVES, 2013). Quanto ao seu estudo químico, ainda há poucos relatos, sendo as xantonas, as saponinas e os flavonoides as principais classes de metabólitos. E seus usos medicinais se resumem basicamente ao tratamento de disenteria, reumatismo e hipertensão (CAVALCANTE, 2015; OLIVEIRA, 2015; DAROS, et al., 1996; SILVEIRA, et al., 1995; ALVES, 2013). A espécie Bredemeyera brevifolia Benth é um arbusto muito ramificado chegando a medir até 10 metros de altura, conhecida popularmente como “paquari” além de outras denominações como laça-vaqueiro e cipó de vaqueiro (LIMA, et al., 2018; GOMES & MARQUES, 2002; CARTAXO, 2010; RIBEIRO, et al., 2014, MACÊDO, et al., 2015). Seu aspecto químico foi pouco explorado, contudo há relato do isolamento de três xantonas, além da identificação de diversos ácidos graxos (OLIVEIRA & SILVEIRA, 2000). Na medicina popular, esta espécie é indicada para o tratamento de dores na coluna, reumatismo, gripe e inflamações nos rins (RIBEIRO, et al., 2014; MACÊDO, et al., 2915). As duas espécies de Bredemeyera, são encontradas no Ceará, sendo que a B. floribunda, se encontra na serra de Ibiapaba enquanto a B. brevifolia é encontrada na chapada do Araripe (OLIVEIRA, 2015). Portanto, diante do exposto, e tendo em vista o potencial químico e farmacológico da flora brasileira, em especial a vegetação da Caatinga, o presente trabalho realizou um estudo fitoquímico e biológico das espécies E. tirucalli Linn., B. floribunda Willd e B. brevifolia Benth, afim de contribuir para o conhecimento destas espécies.

29 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

1.2. OBJETIVO GERAL

Contribuir com os estudos fitoquímico e biológico de três espécies da Caatinga: Euphorbia tirucalli, Bredemeyera brevifolia e Bredemeyera floribunda.

30 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

1.3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 1.3.1. A QUÍMICA DE PRODUTOS NATURAIS

Apesar da humanidade, desde seus primórdios, buscar longevidade por meio das plantas e seus extratos, a busca pelos constituintes ativos só começou no século XIX (COSTA, 2011). Friedrich Serturner, em 1806, foi o pioneiro ao isolar um composto com características medicinais, quando isolou o alcaloide morfina da papoula, evento que propiciou uma busca contínua por outros medicamentos derivados de plantas. Em 1824, Pierre-Jean Robiquet isolou a codeína, um antitussígeno (antitussivo) da papoula, e em

1848, George Merck Fraz isolou o alcaloide papaverina com atividade antiespasmódica da mesma planta. Outro exemplo é a cafeína, obtida da espécie Coffea arabica, por Runge em 1820 (DUTRA, et al., 2016). Avalia-se que boa parte dos medicamentos disponíveis seja derivada de fontes naturais e o interesse por estes produtos tem aumentado significativamente em todo o mundo nos últimos anos (NEWMAN & CRAGG, 2016). Este aumento está relacionado a ampla diversidade de metabólitos secundários com diferentes atividades biológicas presentes nas plantas medicinais, o que leva a necessidade de um aprofundamento no conhecimento das propriedades farmacológicas e no desenvolvimento de novos medicamentos (SIMÕES et al., 2010). Dentro das áreas do conhecimento que estão envolvidas na descoberta de substâncias advindas de plantas, podemos citar aqui a fitoquímica, a qual trabalha com isolamento, purificação e caracterização de princípios ativos; e a farmacologia, que estuda os efeitos farmacológicos dos extratos e dos constituintes químicos isolados (ALBUQUERQUE & HANAZAKI, 2006). O Brasil possui a maior biodiversidade do mundo, com cerca de 1,8 milhões de espécies, destas, mais de 45.000 são representadas por espécies de plantas, ou seja, compreendendo de 20 a 22% de todas as espécies de plantas existentes no planeta, segundo os registros do site Sistema de informação sobre a Biodiversidade Brasileira (SIBBR). Isto justifica o fato de a população brasileira ter uma longa tradição no uso de infusão de folhas, caules e raízes de diferentes plantas medicinais para o tratamento de várias condições dolorosas. Em contraste, pesquisas recentes mostram que o mercado de medicamentos derivados de plantas brasileiras ainda é muito pequeno, permanecendo

31 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL restrita à academia, e representando apenas 5% de todos os medicamentos comercializados (DUTRA, et al., 2016).

1.3.2. CAATINGA

A Caatinga corresponde à maior parte do território do Nordeste brasileiro, compreendendo uma área de aproximadamente 884.453 km2, abrange os estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe, Bahia e o norte de Minas Gerais (SILVA & ALBUQUERQUE, 2005; MMA/IBAMA, 2019). A caatinga caracteriza-se pelo seu potencial hídrico reduzido do solo, com acentuado período de estação seca e sua flora nativa apresenta características anatômicas, morfológicas e funcionais especializadas para a sobrevivência destas plantas a estas condições de clima e solo (DRUMOND et al., 2000). Este bioma é denominado por um dos poucos tipos de vegetação, sendo, portanto, considerada como a única formação vegetal exclusivamente brasileira (SILVA, 2013). Sua vegetação possui uma grande diversidade sendo representada por cerca de 4.547 espécies, 159 famílias e 1.141 gêneros, distribuída por uma vegetação xerófila diversificada, sendo caracterizada, em geral, por espécies lenhosas de pequeno porte, herbáceas, cactáceas e bromeliáceas (RAMALHO et al., 2009). De acordo com a literatura regional as espécies da caatinga são comumente usadas na medicina popular, e muitas dessas plantas consideradas como medicamentosas de uso popular têm suas folhas, cascas e raízes vendidas em calçadas e ruas das principais cidades, bem como mercados e feiras livres. Algumas dessas plantas conseguem sobreviver em condições adversas, inclusive após longos períodos de estiagem, e em meio a sua sobrevivência produzem um número considerável de metabólitos secundários o que justifica o apreciável uso destas plantas com fins medicinais (DRUMOND et al., 2000; ALMEIDA & ALBUQUERQUE, 2002; ALBUQUERQUE & ANDRADE, 2002).

1.3.3. METABOLISMO VEGETAL

Há muito tempo, as plantas têm se apresentado como recurso terapêutico, característica a qual está relacionada ao fato de que as plantas produzem uma larga e diversa ordem de componentes orgânicos que pode distingue-se em dois grupos: os metabólitos primários e os metabólitos secundários.

32 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

Os metabólitos primários fazem parte da atividade celular de praticamente todos os seres vivos, desde os organismos unicelulares até o homem e estão relacionados aos processos fotossintéticos, função estrutural, plásticas e de armazenamento de energia. Nesse grupo estão incluídos os lipídeos, protídeos e glicídios que cumpre funções muito diversas nos seres vivos e são também os precursores para os metabólitos secundários (ARCEO-MEDINA et al., 2016). Já os metabólitos secundários são, em princípio, não essenciais para a vida, uma vez que não estão envolvidos com as funções vitais das plantas e não fazem parte do metabolismo básico, mas contribuem consideravelmente para a adaptação das espécies e sua sobrevivência. Estes metabólitos são específicos para um grupo biológico em particular, tal como uma família, um gênero ou uma espécie vegetal sendo produzidos em um órgão ou tecidos específicos da planta e armazenados em outra parte. Apresentam uma vasta variedade estrutural, muitas vezes complexa, com concentrações bastante variadas que vão desde traços às altas concentrações, dependendo da biogênese da planta. (SILVA et al., 2011). Estudos mostraram que os metabólitos secundários de diferentes plantas podem apresentar diferentes mecanismos de ação. Estes têm funções ecológicas importantes nos vegetais, protegendo as plantas contra os herbívoros e infecções por microrganismos patogênicos e também atuam como agentes na competição planta- planta e nas simbioses plantas-microrganismo. Além destes fatores bióticos, a produção de metabólitos secundários pelas plantas também as protege de influências externas, como temperatura, umidade, proteção contra raios UV e deficiência de nutrientes minerais (SARDÁ-RIBEIRO et al., 2008; SIMÕES et al., 2010). Os metabólitos secundários são divididos basicamente em três grupos principais, quimicamente distintos: terpenos, compostos fenólicos e compostos nitrogenados os quais são originados a partir do metabolismo da glicose. Os compostos fenólicos são derivados do ácido chiquímico e ácido mevalônico, os terpenos são produzidos a partir do ácido mevalônico, do piruvato ou do 3-fosfoglicerato, já os alcaloides são provenientes de aminoácidos aromáticos, os quais são derivados do ácido chiquímico, e de aminoácido alifático. Assim, os flavonoides, taninos e ligninas fazem parte dos compostos fenólicos; enquanto os óleos essenciais, saponinas e carotenoides são terpenos; já a nicotina, cafeína e vincristina fazem parte dos alcaloides (PRES, 2004; SIMÕES et al., 2010).

33 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

1.3.4. ATIVIDADES BIOLÓGICAS

Atualmente, o interesse sobre o desenvolvimento de substâncias antioxidantes, principalmente a partir de produtos naturais como plantas, tem ocupado um lugar de destaque dentro da indústria farmacêutica uma vez que os radicais livres e outros oxidantes vêm sendo considerados como causadores de várias doenças como câncer, doenças cardiovasculares e doenças neurológicas, tornando-se assim, relevante a busca por antioxidantes com a capacidade de proteger os organismos dos danos causados pelos radicais livres (SOUSA et al., 2007; SRIDHAR & CHARLES, 2019). As plantas, em sua grande maioria, apresentam importantes valores terapêuticos atribuídos principalmente aos seus constituintes, como os polifenóis. E estes, por sua vez, têm sido bastante estudados por estarem relacionados à atividade antioxidante exercida pelas plantas. Assim, estudos apontam a importância de avaliar as atividades antioxidantes de derivados vegetais. Dentre os métodos para estas avaliações pode-se destacar um método colorimétrico que está relacionado a habilidade dos antioxidantes em neutralizar radicais como DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila) ou ABTS (sal de amônio do ácido 2,2’-azinobis-3-etilbenzenotiazolina-6-sulfonico) (NEGRI, et al., 2009).

1.3.4.1. Atividade Sequestradora de radicais com DPPH

O teste de DPPH consiste em uma das técnicas empregada para detectar a capacidade antioxidante de compostos, a qual consiste em um dos métodos indiretos mais antigos para se determinar a referida atividade, sendo sugerido originalmente em 1950 para se descobrir os doadores de hidrogênio em matérias naturais. Mais tarde, este método foi empregado para determinar o potencial antioxidante de compostos fenólicos isolados, bem como, amostras biologicamente relevantes (ROGINSKY & LISSI, 2005). Uma importante característica deste método está relacionada ao fato deste não envolver condições drásticas de temperatura e oxigenação, uma vez que a molécula de DPPH é bastante conhecida por caracterizar-se como radical orgânico livre estável (DENG, et al., 2011). A metodologia empregada no teste do DPPH consiste na geração de radical e na capacidade da amostra em eliminar ou neutralizar o radical livre, a qual é monitorada através de um espectrofotômetro na região do ultravioleta (UV/visível), e este método pode ser empregado tanto para se determinar a atividade antioxidante de extratos de

34 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL plantas como de substâncias isoladas (LEJA et al, 2007; VOGEL et al, 2005; ARNAO, 2000). Inicialmente, os radicais livres de DPPH apresentam coloração púrpura, devido os mesmos possuírem elétrons livres, e absorvem em um comprimento de onda máximo de aproximadamente entre 515-517 nm. Então, ao sofrerem ação de um antioxidante (AH) ou de uma espécie radicalar (R), o DPPH é reduzido a difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, Figura 2. A partir dos resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade antioxidante (%AA) ou sequestradora de radicais livres e/ou porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional (WILLIAMS, et al., 1995; BORGES, et al., 2011).

Figura 2 – Redução do DPPH por antioxidante.

Fonte: Adaptado de RUFINO, et al., 2007.

1.3.4.2. Atividade Sequestradora de radicais com ABTS

Outro método utilizado para medir a atividade antioxidante é o método ABTS (2,2-azino-bis (etilbenzeno-tiazolina-6-ácido sulfônico) sal diamônio) que consiste na habilidade dos antioxidantes em capturar o cátion ABTS•+. O radical ABTS•+ é um composto cromóforo quimicamente estável, com alta solubilidade em água e apresenta absorbância a 414 nm, com medidas secundárias de absorbância a 645, 734 e 815 nm. É um radical produzido a partir do precursor ácido 2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolina)-6- sulfônico, gerado por reações química ou enzimática, e pode ser solubilizado em meios orgânicos nos quais a atividade antioxidante pode ser determinada, dependendo da natureza dos compostos antioxidantes (RUFINO, et al., 2007; SUCUPIRA, et al., 2012), Figura 3. O método ABTS é utilizado tanto para amostras hidrossolúveis quanto para as mostras lipossolúveis. Além do mais, este método apresenta excelente estabilidade, rapidez, oferece resultados reprodutíveis e vários máximos de absorção, além de

35 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL excelente solubilidade, o que permite a análise de compostos de natureza lipofílica e hidrofílica (KUSKOSKI, et al., 2005).

Figura 3 – Estabilização do radical ABTS por um antioxidante e sua formação pelo persulfato de potássio.

Fonte: Adaptado de RUFINO, 2017.

A metodologia empregada neste método baseia-se na formação do radical ABTS•+, que inicialmente possui coloração azul esverdeada, por meio da reação do ABTS com persulfato de potássio. Em seguida, com a adição de um antioxidante, o radical ABTS•+ é reduzido a ABTS com perda de coloração no meio reacional. Assim, com a perda de cor a porcentagem de inibição do ABTS•+ pode ser determinado em função do Trolox, um padrão submetido às mesmas condições de análise do antioxidante (BORGES, et al., 2011).

1.3.4.3. Atividades Enzimáticas da peçonha de Bothrops jararaca

O ofidismo é um grave problema de saúde pública e geralmente causado por Serpentes do gênero do Bothrops as quais são responsáveis por cerca de 90% dos acidentes em toda a América Latina (GRAZZIOTIN, 2004). O gênero Bothrops (Viperidae) possui mais de 20 espécies já classificadas no território brasileiro e comumente chamadas de “jararacas” (OLIVEIRA, 2015; BRASIL, 2015). Dentre as espécies deste gênero, podemos destacar a espécie Bothrops jararaca, uma serpente terrestre que possui em média 120 cm de comprimento e pode chega a medir até 160 cm. Esta espécie possui coloração extremamente variada, podendo apresentar o dorso de cor bronze, pardo, cinza amarelo ou marrom com uma série de desenhos trapezoidais ou subtriangulares e cabeça usualmente escura, Figura 4.

36 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

Figura 4 – Serpente da espécie Bothrops jararaca.

Fonte: Adaptada de SILVA 2014.

Dentro do gênero Bothrops a espécie Bothrops jararaca é frequentemente a mais abundante em sua área de distribuição ocorrendo no Brasil, Paraguai e Argentina. No Brasil ela é encontrada no sudeste da Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Estende-se a oeste para o extremo leste de Mato Grosso (GRAZZIOTIN, 2004). Quanto aos seus hábitats, esta espécie ocupa uma grande diversidade de hábitats como: florestas tropicais e semitropicais, savanas, campos abertos e regiões cultivadas (GRAZZIOTIN, 2004). A espécie é responsável por um grande número dos acidentes peçonhentos no Brasil, uma vez que a peçonha dessa serpente é rica em toxinas enzimáticas, tais como proteases, fosfolipases A2 e hialuronidases, que vão, em conjunto, desencadear uma série de efeitos tóxicos locais e sistêmicos. Dessa forma, a busca por inibidores para essas toxinas se faz importante e nesse contexto destacam-se os compostos de origem vegetal, que vem sendo apontados como fortes candidatos ao desenvolvimento de novos agentes antiofídicos (ZENI, et al., 2007; MILANI, et al., 1997).

A fosfolipase A2 são enzimas amplamente distribuídas na natureza classificadas em dois tipos: intracelulares, as quais permanecem associadas a membranas e estão envolvidas no metabolismo dos fosfolipídios; e extracelulares, as quais são abundantes

37 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL nos sucos pancreáticos de mamíferos e em venenos de serpentes e insetos. As fosfolipases A2 são capazes de liberar ácidos graxos livres por processos de catalise, dentre eles o ácido araquidônico que é o precursor de eicosanoides presentes na inflamação e os lisofosfolipídios precursores de mediadores bioativos como fator de ativação plaquetária (DA SILVA, 2014; ARAÚJO, 2014). As proteases (metaloproteases e serinoproteases), por sua vez, são enzimas importantes para o veneno de serpentes da família. As serinoproteases são enzimas não letais isoladamente, contudo contribuem para o efeito tóxico dos venenos ofídicos quando em associação com outros componentes proteicos, pois afeta vários passos da cascata da coagulação sanguínea. As metaloproteases são as principais toxinas responsáveis pelo quadro hemorrágico dos acidentes ofídicos, estando entre os principais fatores que contribuem para a letalidade. Algumas metaloproteases não apresentam atividades hemorrágicas, mas agem rompendo a homeostase inibindo a agregação plaquetária ou efeitos pró-inflamatórios (DA SILVA, 2014). As hialuronidases são enzimas que participam da degradação de glicosaminoglicanas, componentes fundamentais da derme. Essas enzimas não tóxicas, contudo, contribuem para o “fator de espalhamento”, ou seja, aumenta a difusão das toxinas durante o envenenamento uma vez que catalisa a hidrólise do ácido hialurônico, o maior componente da matriz extracelular de vertebrados. A enzima é um componente presente em todas as peçonhas ofídicas e suas atividades específicas são bastante variadas entre as diferentes espécies (BORDON, 2012).

38 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

1.4. METODOLOGIA GERAL

Os estudos apresentados nos capítulos 2 e 3 consistiram no uso de técnicas cromatográficas clássicas tal como cromatografia de adsorção e exclusão molecular e as análises das substâncias isoladas foram realizadas empregando métodos espectroscópicos de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono (1H e 13C RMN) uni e bidimensional e espectroscopia na região do infravermelho (IV). Os espectros de massa das substâncias identificadas foram obtidos por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa (CL/EM).

1.4.1. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

O método físico-químico de separação empregado (cromatografia) consiste na migração diferencial dos componentes da mistura por diferença de interação entre a fase móvel (gás, líquido ou um fluido) e a fase estacionária fixa (material a ser colocado na coluna ou numa superfície sólida). A técnica foi empregada para purificação dos compostos da mistura (extrato).

1.4.1.1. Cromatografia de Absorção em Coluna (CC)

Para as cromatografias de absorção em coluna foram empregada gel de sílica 60(Φ μm 63-200) e de sílica 60 para cromatografia “flash” (Φ μm 40-63) da marca Merck. O comprimento e o diâmetro das colunas variaram de acordo com as alíquotas das amostras a serem colunada e as quantidades de gel de sílica utilizadas. A coluna utilizada na cromatografia de adsorção sob pressão média (cromatografia “flash”) foram de vidro resistente à pressão e continham um bulbo no ápice, para armazenamento do solvente. Os eluentes foram utilizados solventes orgânicos comerciais como: hexano

(C6H14), diclorometano (CH2Cl2), clorofórmio (CHCl3), acetato de etila (AcOEt), metanol (MeOH) e água (H2O), puros ou misturas binárias em proporções crescentes de polaridade.

1.4.1.2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Nas cromatografias de camada delgada (CCD) analíticas foi utilizado cromatoplacas de alumínio Al TLC de gel de sílica F254, da Silicycle.

39 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

As análises foram feitas através da exposição das cromatoplacas à radiação de luz ultravioleta (UV) em dois comprimentos de onda (254 e 365 nm), emitidos por lâmpada modelo VL-4. LC da Vilber Lourmat e /ou por aspersão em solução de vanilina (C8H8O3) 3 g/100 ml de etanol e ácido Sulfúrico (H2SO4) 10% em água, seguido de aquecimento à aproximadamente 100°C por 5 minutos. Os eluentes foram utilizados solventes orgânicos comerciais como: hexano

(C6H14), diclorometano (CH2Cl2), clorofórmio (CHCl3), acetato de etila (AcOEt), metanol (MeOH) e água (H2O), puros ou misturas binárias em proporções crescentes de polaridade.

1.4.1.3. Cromatografia de Exclusão

Nas cromatografias de Exclusão Molecular em coluna, os fracionamentos foram efetuados em gel de dextrana Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals, utilizando-se como eluente metanol p.a. da Sigma (MeOH).

1.4.2. MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS

Para fins de caracterização estrutural dos compostos isolados foram empregados os métodos espectroscópicos de ressonância magnética nuclear (RMN) e espectroscopia na região do infravermelho (IV).

1.4.2.1. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e carbono-13 (RMN 13C) uni e bidimensionais, foram obtidos em dois espectrômetros diferentes. Assim, uma parte dos espectros foi obtida em um espectrômetro da Bruker, modelo Avance III MHz, pertencente ao Laboratório de Ressonância magnética Nuclear da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, equipado com campo magnético de 7,0T, que opera nas frequências de 300,13 e 75,47 MHz RMN para hidrogênio (1H) e carbono (13C), respectivamente. E outra parte foi obtida em um espectrômetro Bruker, modelo avance DPX-300 e/ou modelo avance DRX-500, no Centro Nordestino de Aplicação de Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade federal do Ceará (CENAUREMN). O espectrômetro Bruker Avance DRX-300 foi operado nas frequências de 300,13 e 75,47 MHz RMN de 1H e 13C, respectivamente, sob campo magnético de 7,0 T. Enquanto nos experimentos realizados no aparelho Bruker Avance

40 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

DRX-500, foram aplicadas frequências de 500,13 MHz para RMN de 1H e 125,75 MHz para RMN de 13C, sob um campo magnético de 11,7 T. As amostras a serem analisadas foram dissolvidas em alíquotas de 0,5 mL de clorofórmio (CDCl3) deuterado ou dimetil sulfóxido deuterado (DMSO-d6), comercializado pela Cambridge Isotope Laboratories. Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e referenciados. Desta forma, os espectros de Hidrogênio (1H) foram referenciados pelo pico do TMS. As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1H foram indicadas segundo a convenção: simpleto (s), dupleto (d), duplo dupleto (dd), tripleto (t), quarteto (q) e multipleto (m). Nos experimentos unidimensionais de 1H e de 13C foram estabelecidos os seguintes valores para os parâmetros de aquisição, respectivamente: larguras espectrais de 24 e 260 ppm, intervalo para relaxação de 1s e largura de pulso de 90º de 9,60 μs (0 dB) e 10,90 μs (-3 dB) para 1H e 13C, respectivamente. A técnica DEPT (Distortionless

Enhancement by Polarization Transfer), com ângulos de mutação de 135°, CH e CH3 com amplitudes em oposição aos C e CH2, descrito segundo a convenção: C (carbono não hidrogenado), CH (carbono metínico), CH2 (carbono metilênico ou matilidênico) e

CH3 (carbono metílico). Os experimentos bidimensionais de correlação homonuclear (COSY, NOESY) e heteronuclear (HSQC e HMBC), realizados no espectrômetro Bruker, modelo Avance III MHz, foram efetuados em sonda multinuclear de 5 mm, com detecção inversa, empregando-se gradiente de campo, posicionado no eixo z e magnitude de 10 A. Os 1 n valores de J utilizados para os experimentos pertinentes foram JH,C = 145, JH,C = 7, onde n ≥ 2.

1.4.2.2. Espectroscopia na Região do Infravermelho (IV)

Os espectros de absorção na região do infravermelho (FTIR-ATR) foram obtidos em Espectrômetro da Shimadzu, modelo IR Affinity-1, com resolução de 600-4000 cm-1 da Central Analítica do Instituto de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1.4.3. OUTROS MÉTODOS DE ANÁLISE 1.4.3.1. Ponto de fusão (pf)

41 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

Os pontos de fusão das amostras foram determinados em equipamento da Microquímica MQRPF-301, composto por uma placa aquecedora FP82HT e uma unidade de processamento FP90, a uma taxa de aquecimento de 2 °C/min.

1.4.3.2. Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa (CL-EM)

Para a identificação dos constituintes presentes nos extratos das espécies Euphorbia tirucalli, Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia foram preparadas soluções de 1 mg/mL com metanol grau HPLC da Merk de todos os extratos e estas foram submetidas a análise empregando cromatógrafo líquido Dionex Ultimate 3000, consistindo de uma bomba binária, amostrador, forno de coluna e um detector de matriz de diodos. Os constituintes foram separados em uma coluna cromatográfica de fase reversa da Phenomenex modelo Kinetex C-18 (2,0 mm x 50 mm, 4 μm), com vazão de 600 µL/min. A fase móvel foi um gradiente de uma mistura de 0,1% de ácido fórmico em água (A) e 0,1% de ácido fórmico em metanol (B). O gradiente de concentração utilizado inicialmente foi de 95% de A, subindo linearmente até 95% de B em 85 min e permanecendo nesta concentração por 5 min, onde retornou à concentração inicial para balancear a coluna para a próxima injeção. A coluna e o amostrador automático foram mantidos a temperaturas de 40 e 20 ° C, respectivamente. O sistema cromatográfico foi acoplado a um espectrômetro de massas linear triplo de íons tríplice (3200 QTRAP® LC-MS/MS, AB Sciex), com Turbo Ion SprayTM (AB Sciex) como fonte de íons, operando no modo negativo. O controle do instrumento, aquisição de dados e processamento foi realizado utilizando o software Analyst®, 1.5 e Chromeleon®, através da plataforma Dionex Chromatography MS Link. As seguintes condições de detecção foram aplicadas: uma fonte de Turbo Spray de ionização por electrospray (ESI) operando em modo negativo a 600 ° C com as configurações apropriadas: gás de cortina (nitrogênio) 20 psi, gás fonte de íons (GS1) 45 psi, gás de fonte iônica GS2) 45 psi, gás de colisão (nitrogênio) na posição média e tensão Ion Spray − 4500 V. Um aperfeiçoamento Enhanced MS/MS (EMS) como uma varredura de levantamento foi criado para as identificações das espécies desconhecidas. Neste modo, os íons de fragmento são acumulados em Q3, dando melhor sinal-ruído para os espectros de MS/MS detectados. Além disso, o método de aquisição dependente de

42 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL informação (IDA) foi empregado para acionar as varreduras aprimoradas de íons de produto (EPI) analisando os sinais do EMS. O tempo de permanência de cada transição do EMS foi de 450 ms (inclui pausas). A varredura do EPI foi operada de m/z 100 a 1000 a uma taxa de varredura de 4000 Da/s com preenchimento dinâmico na armadilha. Na varredura do EPI, o DP e o CE para o EPI foram de -50 V e 30 eV. Para a aquisição dos cromatogramas e espectros de massa foi utilizado o software PeakView® versão 2.2. Como suporte para análise de identificação dos constituintes químicos foi utilizado banco de dados espectrais como: RIKEN MSn (http://spectra.psc.riken.jp), Mass-Bank (http://www.massbank.jp), Human Metabolome Database (HMDB) (http://www.hmdb.ca/spectra/ms_ms/135937) e o GNPS (https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp?redirect=auth), em que a identificação foi efetuada de acordo com a comparação dos seus espectros de massa e padrões de fragmentação existentes na literatura.

43 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABE, L. T. Ácido elágico em alimentos regionais brasileiros. 2007. 90f. Dissertação (Bromatologia) – Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos Área de Bromatologia, universidade de São Paulo, São Paulo, SP, 2007.

ALBUQUERQUE, U. P.; ANDRADE L. H. C. Uso de plantas em uma comunidade rural no semi-árido do estado de Pernambuco, município de Alagoinha (Nordeste do Brasil). Interciéncia, v. 26, n. 7, p. 336-346, 2002.

ALBUQUERQUE, U.P.; HANAZAKI, N. As pesquisas etnodirigidas na descoberta de novos fármacos de interesse médico e farmacêuticos: fragilidade e perspectivas. Rev. Bras. Farmacogn. 16 (supl.), p. 678-689, 2006.

ALMEIDA, C. F. C. B.; ALBUQUERQUE, U. P. Uso e conservação de plantas medicinais no estado de Pernambuco: um estudo de caso no Agreste. Interciéncia. v. 26, n. 6, p. 276-285. 2002.

ALVES, N. T. Q. Efeito do extrato das raízes de Bredemeyera floribunda Willd sobre a ação local do veneno de Bothrops jararacussu em camundongos. 2013. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Universidade Federal do Ceará – UFC, 2013.

ANDRADE, C.H.S.; BRAZ-FILHO, R.; GOTTLIEB, O.R.; SILVEIRA, E.R. The chemistry of Brasilian Polygalaceae. I. Xanthones from Polygala spectabilis. Journal of Natural Products, v. 40, n. 4, p. 344-346, 1977.

ANGELO, P. M.; JORGE, N. Compostos fenólicos em alimentos – uma breve revisão. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 66, n. 1, p. 1-9, 2007.

ARAÚJO, R. C. C. Isolamento e caracterização funcional de uma fosfolipase A2 de Bothrops jararaca: Avaliação do potencial antitumoral e inflamatório. 2014. 113f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Brasil, 2014.

ARCEO-MEDINA, G.N., ROSADO-AGUILAR, J.A., RODRÍGUEZ-VIVAS, R.I., BORGES-ARGAEZ, R, Synergistic and antagonistic action of fatty acids: sulphides and stilbene against acaricide-resistant Rhipicephalus microplus ticks. Vet. Parasitol, v. 228, p. 121–125, 2016.

ARNAO, M. B. Some methodological problems in the determination of antioxidant activity using chromogen radicals: a practical case. Trends in Food Science & Technology, v. 11, n. 11, p. 419-421, 2000.

44 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, Universidade federal dos vales do Jequitinhonha e Mucuri, diamantina, MG, Brasil, 2010.

BARREIROS, A. L. B. S; DAVID, J.M. Estresse oxidativo: relação entre geração de espécies reativas e defesa do organismo. Quim. Nova, v.29, p.113-123, 2006.

BENJAMIN, M. et al. Phytochemical, Antioxidant and Anti-Cancer Properties of Euphorbia tirucalli Methanolic and Aqueous Extracts. Antioxidants, v. 4, p. 647-661, 2015.

BERLINCK, R. G. S.; BORGES, W. S.; SCOTTI, M. T.; VIEIRA, P. C. A química de produtos naturais do Brasil do século XXI. Química Nova, v. 40, n. 6, p. 706-710, 2017.

BORDON, K. C. F. Caracterização funcional e estrutural da hialuronidase isolada da peçonha de serpentes Crotalus durissus terrificus. 2012. 126f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) – Programa de Pós-graduação em Toxicologia, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – universidade de São Paulo, Ribeirão preto, Brasil, 2012.

BORGES, L. L.; LÚCIO, T. C.; GIL, E. S.; BARBOSA, E. F. Uma abordagem sobre métodos analíticos para determinação da atividade antioxidante em produtos naturais. Enciclopédia Biosfera, v. 7, n. 12, p. 1-20, 2011.

BRASIL. Ministério da Saúde. Portal da Saúde. Acidentes por animais peçonhentos: serpentes. Disponível em: . Acesso em: setembro 2015.

BRAZ-FILHO, R. Contribuição da fotoquímica para o desenvolvimento de um país emergente. Química Nova, v. 33, n.1, p. 229-239, 2010.

CARTAXO, S. L. Diversidade e uso de plantas medicinais em uma área de caatinga em Aiuba-CE, Brasil. 103. 105 f. Dissertação (Mestrado em Bioprospecção Molecular) - Programa de Pós-graduação em Bioprospecção Molecular, Universidade Regional do Cariri, Crato, CE, Brasil, 2009.

CARTAXO, S. L.; SOUZA, M. M. A.; ALBUQUERQUE, U. P. Medicinal plants with bioprospecting potential used semi-arid northeastern Brazil. Journal of Ethnopharmacology, v. 131, p. 326-342, 2010.

CAVALCANTE, G. V. L. Estudo Fitoquímico de Bredemeyera floribunda Willd. 2015. 105f. Dissertação (Mestrado em Química) – Programa de Pós-Graduação em Química. Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil, 2015.

CAXITO, M. L. C.; VICTÓTIO, C. P.; COSTA, H. B.; ROMÃO, W.; KUSTER, R. M.; GATTASS, C. R. Antiproliferative activity of extracts of Euphorbia tirucalli L (Euphorbiaceae) fromthree regions of Brazil. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, v. 16, p. 1013-1020, 2017.

45 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

CHAUHAN, S.; SINGH, A. Impacto f Taraxerol in Combination with Extract of Euphorbia tirucalli Planto n Biological Parameters of Lymnaea acuminata. Ver. Inst. Med. Trop., v. 53, n. 5, p. 265-270, 2011.

Cooperação Técnica MMA/IBAMA. Centro de Sensoriamento Remoto do Ibama - CSR, Agência Brasileira de Cooperação - ABC e Programa das Nações Unidas para o Desenvolvimento - PNUD, Relatório Técnico, 2019.

CORRÊA, R. S. Xantonas oxigenadas bioativas: cristalização, estrutura e suas interações intra e intermoleculares. 2009. 182 f. Dissertação. Física Aplicada. Universidade de São Paulo São Paulo, 2009.

COSTA, L.S. Estudo do uso de Aveloz (Euphorbia tirucalli) no tratamento de doenças humanas: Uma Revisão. 2011. 17 f. TCC (Graduação em Ciências Biológicas) - Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual da Paraíba, Campina Grande, PB, Brasil, 2011.

COSTA, P. M. Triterpeno, saponinas e flavonoides de Licania arianeae (chrysobalanaceae) e Eschweilera longipes (lecythidaceae). 2003. 142 f. Tese. (Pós- Graduação em química Orgânica) – instituto de Ciências Exatas, universidade Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, Brasil, 2003.

DA SILVA, J. F. Atividade Antiofídica do Decocto das Folhas de Jatropha gossypiifolia L. Frente o Veneno de Bothrops jararaca. 2014. 129f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Programa de pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil, 2014.

DAROS, M. R.; MATOS, F. J. A.; PARENTE, J. P. A new triterpenoid saponin, bredemeyeroside B, from the roots of Bredemeyera floribunda. Planta Medica, v. 62, n. 6, p. 523-527, 1996.

DENG, J.; CHENG, W.; YANG, G. A novel antioxidant activity index (AAU) for natural products using the DPPH assay., Food Chemistry, v. 125, n. 4, p. 1430-1435, 2011.

DEWICK, P.M. The biosynthesis of C5-C25 terpenoid compounds. Nat. Prod. Rep. v. 19, n. 2, p. 181–222, 2002.

DRUMOND, M. A.; KIILL, L. H. P.; LIMA, P. C. F.; OLIVEIRA, M. C.; OLIVEIRA, V. R.; ALBUQUERQUE, S. G.; NASCIMENTO, C. E. S.; CAVALCANTE, J. Estratégias para o uso sustentável da biodiverdidade da caatinga. In: Seminário para avaliação e identificação de ações prioritárias para a conservação, utilização sustentável e repartição de benefícios da biodiversidade do bioma Caatinga. Embrapa/Cpatsa, UFPE e Conservation International do Brasil, Petrolina, 2000.

DUTRA, R. C., CAMPOS, M. M., SANTOS, A. R. S., CALIXTO, J. B. Medicinal plants in Brazil: Pharmacological studies, drug Discovery, challinges and perspectives. Pharmacological Research, v. 112, p. 4-29, 2016.

46 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

WACZUK, E. P.; KAMDEM, J. P.; ABOLAJI, A. O.; MEINERZ, D. F.; BRUENO, D. C.; GONZAGA, T. K. S. N.; DOROW, T. S. C.; BOLIGON, A. A.; ATHAYDE, M. L.; ROCHA, J. B. T.; ÁVILA, D. S. Euphorbia tirucalli aqueous extract induces cytotoxicity, genotoxicity and changes in antioxidant gene expression in human leukocytes. Toxicology Research, v. 4. p. 739-748, 2015.

FARAH, A.; MONTEIRO, M. C.; CALADO, V.; FRANCA, A.; TRUGO, L. C. Correlation between cup quality and chemical attributes of Brazilian coffee. Food Chem., v. 98, p. 373-380, 2006.

FELIPE, L. O.; BICAS, J. L. Terpenos, aromas e a química dos compostos naturais. Química Nova na Escola, v. 39, n. 2, p. 120-130, 2017.

GHOSAL, S.; BASUMATARI, P. C.; BANERJEE, S. 1,2,3-Trioxygenated glucosyloxyxanthones from Polygala triphylla. Phytochemistry, v. 20, p. 489-492, 1981.

GOMES, K.; MARQUES, M. C. M. 2002. Polygalaceae. In: WANDERLEY, M. G. L.; SHEPHERD, G. J.; GIULIETTI, A. M.; MELHEM, T. S.; BRITTRICH, V.; KAMEYAMA, C. (eds.) Flora Fanerogâmica do Estado de São Paulo. Instituto de Botânica, São Paulo, v. 2, p. 229-260.

GRAZZIOTIN, A. F. G. Estudo filogeográfico de Bothrops jararaca (Wiel, 1824) baseado no DNA mitocondrial (Squamata: serpentes: Viperidae). 2004. 42f. Dissertação (Mestrado em Zoologia) – Programa de Pós-Graduação em Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Faculdade de Biociências, Porto Alegre, RS, Brasil, 2004.

HABIB, A. M.; REDDY, K. S.; Mccloud, T. G.; CHANG, C.J.; CASSADY, J. M. New xanthones from Psorospermum febrifugum. Journal of Natural Products, v. 50, n. 2, p. 141-145, 1987.

HANSON, J.R. Diterpenoids of terrestrial origin. Natural Products Reports. v. 30, n. 10, p. 1346-1356, 2013.

KINGHORN, A.D. Caracterization of na Irritant 4-deoxyphorbol Diester from Euphorbia tirucalli. Journal of Natural Products, v. 42, n. 1, p. 112-115, 1979.

KITAOKA, N., Lu, X., YANG, B., PETERS, R. J.The Application of Synthetic Biology to Elucidation of Plant Mono-, Sesqui-, and Diterpenoid Metabolism. Molecular Plant. v. 8, n. 1, p. 6-16, 2015.

KRIVORUCHKO, A., NIELSEN, J. Production of natural products through metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Current Opinion in Biotechnology. v. 35, p. 7-15, 2015.

KUSKOSKI, E. M.; ASUERO, A. G.; TRONCOSO, A. M.; MANCINI-FILHO, J.; FETT, R. Aplicación de diversos Métodos químicos para Determinar Actividad Antioxidante en Pulpa de Frutos. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 25, n. 4, p. 726-732, 2005.

47 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

KUSTER, R. M.; ROCHA, L. M. cumarinas, cromonas e xantonas. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; DE MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6. ed. Porto Alegre/Florianópolis: Universidade/ universidade Federal do Rio Grande do Sul/ Da Universidade Federal de Catarina, 2010, 1102p.

LAGE, H., DUARTE, N., COBURGER, C., HILGEROTH, A., FERREIRA, M. J. Antitumor activity of terpenoids against classical and atypical multidrug resistant cancer cells. Phytomedicine, v. 17, n. 6, p. 441-448, 2010.

LATTANZIO, V. Phenolic Compounds: introduction. Natural Products, 2013.

LEJA, M, MARECZEK, A, WYZGOLIK, G, KLEPACZ-BANIAK, J, CZEKONSKA, K. Antioxidative properties of bee pollen in selected plant species. Food Chemistry, v. 100, p. 237-240, 2007.

LIMA, I. G.; ALBUQUERQUE, A. L.; DIAS, A. C. A. A. Flora do Ceará, Brasil: Polygalaceae. Rodriguésia, v. 69, n. 2, p. 673-692, 2018.

LIMA, L.R. et al. Avaliação da atividade antiedematogênica, antimicrobiana e mutagênica das sementes de Amburana cearensis (A. C. Smith) (Imburana-de-cheiro). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, Campinas, v.15, n.3, p.415-422, 2013.

LIN, M. W.; LIN, A. S.; WU, D. C.; WANG, S. S.; CHANG, F. R.; WU, Y. C.; HUANG, Y. B. Euphol from Euphorbia tirucalli selectively inhibits human gastric cancer cellgrowth through the induction of erk1/2-mediated apoptosis. Food Chem.Toxicol., v. 50 p. 4333–4339 2012.

LIN, S.; YEH, C.; YANG, L.; LIU, P.; HSU, F. Fhenolic Compounds from Fornosan Euphorbia tirucalli. Journal of the Chinese Chemical Society, v. 48, p. 105-108, 2001.

LOOMIS, W. D.; CROTEAU, R. In: STUMPF, P. K. Biochemistry of Terpenoids. Lipids: Structure and Function. The Biochemistry of Plants, v 4, c. 13, p. 364-410, 2014.

LÜDTKE, R.; SOUZA-CHIES, T. T.; MIOTTO, S. T. S. Bredemeyera Willd. e Securidaca L. (Polygalaceae) na Região Sul do Brasil. Revista Brasileira de Biociências, v. 6, n. 1, p. 69-79, 2008.

MACÊDO, D. G.; RIBEIRO, D.A.; COUTINHO, H. D.; MENEZES, I R..; SOUZA, M. M. Práticas terapêuticas tradicionais: uso e conhecimento de plantas do cerrado no estado de Pernambuco (Nordeste do Brasil). Blacpma, v. 14, n. 6, p. 491-508, 2015.

MACHADO, M. M. Perfil fitoquímico e avaliação dos principais efeitos biológicos e imunológicos in vitro da Euphorbia tirucalli L. 2007. 105 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil, 2007.

48 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

MALI, P.Y.; PANCHAL, S.S. Euphorbia tirucalli l.: Review on morphology, medicinal uses, phytochemistry and pharmacological activities. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, v. 7, n. 7, p. 603-613, 2017.

MARQUES, M. C. M. & PEIXOTO, A. L. Estudo taxonômico de Polygala subgênero Ligustrina (Chodat) Paiva (Polygalaceae). Rodriguésia, v. 58, n. 1, p. 95-146, 2007.

MARSTON, A.; HAMBURGER, M.; SORDAT-DISERENS, I.; MSONTHI, J. D.; HOSTETTMANN, K.. Xanthones from Polygala syikensis. Phytochemistry, v. 33, n. 4, p. 809-812, 1993.

MAURY, C. M. BIODIVERSIDADE BRASILEIRA: Avaliação e identificação de áreas e ações prioritárias para conservação, utilização sustentável e repartição dos benefícios da biodiversidade nos biomas brasileiros. Brasília, DF, 2002.404 p.

MILANI, R.; JORGE, M. T.; CAMPOS F. P. F.; MARTINS, F. P.; BOUSSO, A.; CARDOSO, J. L. C.; RIBEIRO, L. A.; FAN, H. W.; FRANÇA, F. O. S.; SANO MARTINS, I. S.; CARDOSO, D.; FERNANDES, I. D. O. F.; FERNANDES, J. C.; ALDRED, V. L.; SANDOVAL, M. P.; PUORTO, G.; THEAKSTON, R. D. G.; WARRELL, D. A. Snake bites by Jararacuçu (Bothrops jararacussu): clinicopathological studies of 29 proven cases in São Paulo, Brazil. Quarterly Journal of Medicine, v. 90, p. 323-334, 1997.

MOBARAK, H. M.; EL-SHERBINY, I. M.; ABDEL-MOGIB, M.Triterpenoids and Volatile Componentes of Euphorbia Tirucalli. Mansoura Journal of Chemistry, v. 37, n. 2, p. 43-51, 2010.

NEGI, J. S.; BISHT, V.V K.; SINGH, P.; RAWAT, M. S. M.; JOSHI, G. P. Naturally Occurring Xanthones: Chemistry and Biology. Journal of Applied Chemistry, p. 1-9, 2013.

NEGRI, M. L. S. et al. Atividade das folhas de espinheira-santa-Maytnus ilicifolia Mart. Ex Reiss., secas em diferentes temperaturas. Revista Brasileira de farmacognosia. v. 19(2B), p.553-556, 2009.

NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural Products as sources of new drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products, v. 79, p. 629-661, 2016.

OLIVEIRA, A. N. A. Estudo químico/farmacológico de Bredemeyera Floribunda. [2015]. 62f. Monografia (trabalho de conclusão de Curso) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2015.

OLIVEIRA, A. P.; NEPOMUCENO, J. C. Avaliação dos efeitos genotóxicos e antigenotóxicos do avelós (Euphorbia tirucalli) EM Drosophila melanogaster. Biosci. J., v. 20, n. 2, p. 179-186, 2004.

OLIVEIRA, M. C. F.; SILVEIRA, E. R. Pentaoxygenated xanthones and acids from Bredemeyera brevifolia. Phytochemistry, v. 55, p. 847-851, 2000.

49 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

PAN, L., FANG, P., ZHANG, X., NI, W., LI, L., YANG, L., CHEN, C., ZHENG, Y., LI, C., HAO, X., LIU, H. Tigliane-Type Diterpenoid Glycosides from Euphorbia ficheriana. Jornal of Natural Products, v. 74, p. 1508-1512, 2011.

PEREIRA, B. M. R.; DAROS, M. R.; PARENTE, J.P.; MATOS, F. J.A. Bredemeyeroside D, a novel triterpenoid saponin from Bredemeyera floribunda: A potent snake venom antidote activity on mice. Phytotherapy Research, v. 10, p. 666- 669, 1996.

PERES, V.; NAGEM, T. J., Naturally occurring pentaoxygenated, hexaoxynated and dimeric xanthones: a literature survey. Química Nova, v. 20, n. 4, p. 388-397, 1997.

PRES, L. E. P. Metabolismo secundário. Piracicaba – São Paulo: Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. ESALQ/Universidade de São Paulo, 2004. p. 1-10.

PRIYA, C. L.; RAO, K. V. B. A review on phytochemical and pharmacological profile of Euphorbia tirucalli. Pharmacologyonline, v. 2, p. 384-390, 2011.

PUSZTAI, R.; FERREIRA, M. J.; DUARTE, N.; ENGI, H.; MOLNAR, J. Macrocyclic lathyrane diterpenes as antitumor promoters. Anticancer Res, v. 27, n. 1A, p. 201- 205, 2007.

RAMALHO, C, I.; ANDRADE, A. P.; FÉLIX, L. P.; LACERDA, A. V.; MARACAJÁ, P. B. Flora arbóreo-arbustiva em áreas de caatinga no semiárido baiano, Brasil. Revista Caatinga, v. 22, n. 3, p. 182-190, 2009.

RIBEIRO, D. A.; MACÊDO, D. G.; OLIVEIRA, L. G. S.; SARAIVA, M. E.; OLIVEIRA, S. F.; SPOUZA, M. M. A.; MENEZES, I. R. A. Potencial terapêutico e uso de plantas medicinais em uma área de Caatinga no estado de Ceará, nordeste do Brasil. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 16, n. 4, p. 912-930, 2014.

RODRIGUES, I. V. Desenvolvimento e validação de um método bioanalítico para avaliação farmacocinética de uma mistura binária de triterpenos pentacíclico e de seus metabólitos in vivo. 2014. 98f. Tese (Doutor em Ciências Área de Concentração: Toxicologia) – Programa de Pós-Graduação em Toxicologia, universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Ribeirão Preto, SP, Brasil, 2014.

ROGINSKY, V.; LISSI, E.A. Review of methods to determine chain- breakingantioxidant activity in food. Food Chemistry. V. 92, p. 235-254, 2005.

RUFINO, M. S. M.; ALVES, R. E.; BRITO, E. S.; MORAIS, S. M.; SAMPAIO, C. G.; JIMÉNEZ, J. P.; CALIXTO, F. D. Metodologia Científica: Determinação da atividade Antioxidante total em frutas pela captura do radical livre ABTS. Comunicado Técnico on Line 128, ed. 1, p. 1-4, 2007.

RUFINO, M. S. M.; ALVES, R. E.; MORAIS, S. M.; SAMPAIO, C. G.; PÉREZ- JIMÉNEZ, J.; SAURA-CALIXTO, F. D. Metodologia Científica: determinação da atividade antioxidante total em frutas pela captura do radical livre DPPH. Comunicado Técnico on Line 127, ed. 1, p. 1-4, 2007.

50 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

SANTOS, M. H.; BATISTA, B. L.; DUARTE, S. M. S.; ABREU, C. M. P.; GOUVÊA, C. M. C. P. Influência do processamento e da torrefação sobre a atividade antioxidante do café (Coffea arábica). Química Nova, v. 30, n. 3, p. 604-610, 2007.

SARDÁ-RIBEIRO, V.L., ROLIM, V., BORDIGNON, S., HENRIQUES, A.T., DORNELES, G.G., LIMBERGER, R.P., VON POSER, G. Chemical composition and larvicidal properties of the essential oils from Drimys brasiliensis Miers (Winteraceae) on the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus and the brown dog tick Rhipicephalus sanguineus. Parasitol Res. v. 102, p. 531–535, 2008.

SHI, Qun; SUN, Yi-wei; MENG, Dali. Phytochemical and cytotoxic studies on the roots of Euphorbia fischeriana. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v. 27, p. 266-270, 2017.

SILVA, A. C. O.; ALBUQUERQUE, U. P. Woody medicinal plants of the caatinga in the state of Pernambuco (Northeast Brazil). Acta Botanica Brasilica, v. 19, p. 17-26, 2005.

SILVA, C. M. A. Metabólitos secundários de plantas do semi-árido de Pernambuco- uma inovação no controle de fitopatógenos. 2013. 109f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Fisiologia) -. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Fisiologia, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, Brasil, 2013.

SILVA, F. C.; DUARTE, L. P.; VIEIRA FILHO, S. A. Celastráceas: Fonte de Triterpenos Pentacíclicos com Potencial Atividae Biológica. Revista Virtual de Química, v. 6, n. 5, p. 1205-1220, 2014.

SILVA, J. F. Atividade antiofídica do decocto das folhas de Jatropha gossypiifolia L. frente o veneno de Bothrops jararaca. 2014. 129f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Programa de Pós-Graduação em Ciências farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil, 3014,

SILVA, W.C., MARTINS, J.R.S., CESIO, M.V., AZEVEDO, J.L., HEINZEN, H., DE BARROS, N.M. Acaricidal activity of Palicourea margcravii a species from the Amazon forest, on cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Vet. Parasitol, v. 179, p. 189–194, 2011.

SILVEIRA, E. R.; FALCÃO, M. J.; JÚNIOR, A. M.; KINGSTON, D. G. I.; GLASS, T. E. Pentaoxygenated xanthones from Bredemeyera floribunda. Phytochemistry, v. 39, n. 6, p. 1433-1436, 1995.

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; DE MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. 5ª ed., Porto Alegre/ Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2004.

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; DE MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6. ed. Porto Alegre/Florianópolis: Universidade/ universidade Federal do Rio Grande do Sul/ Da Universidade Federal de Catarina, 2010, 1102p.

51 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

SOUSA C.M.M, SILVA HR, VIEIRA GM, AYRES MCC, COSTA CS, ARAÚJO DS. Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Química Nova, v. 30, n. 2, p. 351-355, 2007.

SUCUPIRA, N. R.; SILVA, A. B.; PEREIRA, G.; COSTA, J. N. Métodos para Determinação da Atividade Antioxidante de Frutos. UNOPAR Ciênc. Biol. Saúde, v. 14, n. 4, p. 263-269, 2012.

SULTANBAWA, M.U.S. Xanthanoids of tropical plants. Tetrahedron, v. 36, p. 1465- 1506, 1980.

TOFANELLI, E. J. et al. Propriedades fitoterápicas de euphorbia tirucalli L.: da etnobotânica a farmacognosia. Revista de Biologia e Farmácia. v. 6, n. 1, 2011.

TOMÁS-BARBERÁN, F. A; GARCÍA-VILLALBA, R.; GONZÁLEZ-SARRÍAS, A.; SELMA, M. V; ESPÍN, J. C. Ellagic acid metabolism by human gut microbiota: consistent observation of three urolithin phenotypes in intervention trials, independent of food source, age, and health status. Journal of agricultural and food chemistry, v. 62, n. 28, p. 6535–8, 16 jul. 2014.

VOGEL, H, GONZALEZ, M, FAINI, F, RAZMILIC, I, RODRIGUEZ, J, SAN MARTIN, J, URBINA, F. Antioxidant properties and TLC characterization of four Chilean haplopappus-species known as bailahue’n. Journal of Ethnopharmacology. 2005.

WANG, G.; TANG, W.; BIDIGARE, R. R. Terpenoids as therapeutic drugs and pharmaceutical agentes. Natural Products, p. 198-227, 2005.

WANG, Y., JI, P., WANG, H., QIN, G. Diterpenoids from Euphorbia esula. Chinese Journal of Natural Medicines, n. 8, v. 2 p. 0094−0096, 2010.

WILLIAMS, W. B.; CUVELIER, M. E.; BERSET, C.Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity. Lebensm. Wiss. Technol, v. 28, p. 25-30, 1995.

XU, R. et al. On the Origins of Triterpenoid Skeletal Diversity. Phytochemistry, v. 65 n. 3, p. 261-91, 2004.

YANG, C.; MA, L.; WEI, Z.; HAN, F.; GAO, J. Advances in Isolation and Synthesis of Xanthone Derivatives. Chinese Herbal Medicines, v. 4, n. 2, p. 87-102, 2012.

YI, W.; WEI, Q.; DI, G.; JING-YU1, L.; YANG-LI, L. Phenols and flavonoids from the aerial part of Euphorbia hirta. Chinese Journal of Natural Medicines, v.10, n. 1, p. 0040-0042, 2012.

ZENI, A. L. B.; BECKER, A.; KRUG, M.; ALBUQUERQUE, C. A. C. Histological and biochemical effects induced by sublethal doses of Bothrops jararacussu venom in mice. Journal of Venom and Animal Toxins including Tropical Diseases, v. 13, n. 3, p. 664-676, 2007.

52 CAPÍTULO 1 – APRESENTAÇÃO GERAL

ŻESŁAWSKA, E.; SKÓRSKA-STANIA, A. The Role of Solvent in Hydrogen Bonding Pattern of Ellagic Acid Crystals. Journal of Chemical Crystallography, v. 43, n. 6, p. 285–291, 1 maio 2013.

ZUANAZZI, J. A. S. MONTANHA, J. A. Flavonoides. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; DE MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6. ed. Porto Alegre/Florianópolis: Universidade/ universidade Federal do Rio Grande do Sul/ Da Universidade Federal de Catarina, 2010, 1102p.

53 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

CAPÍTULO 2 - PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

2.1. OBJETIVO GERAL

Caracterizar a espécie Euphorbia tirucalli e avaliar a capacidade dos extratos e dos compostos isolados como antioxidante frente ao DPPH e o ABTS bem como avaliar a atividade antimicrobiana de ambos.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Preparar extratos orgânicos hexânico e etanólico das raízes e da parte aérea da espécie Euphorbia tirucalli por maceração à temperatura ambiente; • Analisar o perfil fitoquímico dos extratos por LC-MS; • Isolar compostos orgânicos aplicando técnicas cromatográficas em coluna (adsorção e/ou exclusão molecular); • Identificar/caracterizar os compostos isolados por meio de técnicas espectroscópicas de RMN 1H e 13C uni e bidimensionais comparando com dados da literatura; • Avaliar a atividade antioxidante dos extratos da espécie Euphorbia tirucalli e dos compostos isolados; • Avaliar as atividades antimicrobianas dos extratos da espécie Euphorbia tirucalli e dos compostos isolados.

54 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

2.3. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

A pesquisa bibliográfica realizada no SciFinder, no Science Direct (do ano 1980 ao ano 2018) e Euphorbia Planetary Biodiversity Inventory revelaram que a família Euphorbiaceae é amplamente distribuída em regiões de clima tropicais e inclui várias espécies com diferentes categorias de uso como é o caso dos gêneros Croton, Euphorbia e Jatropha. Também apontou que muitas de suas espécies ainda não foram estudadas, o que torna esta uma família com relevante potencial para estudo. (CREPALDI, et al., 2016; GUPTA, at al., 2013; LUCENA, 2009; RIZK, 1987). Quanto à espécie de interesse para este estudo, Euphorbia tirucalli, esta constitui uma das mais importantes espécies do gênero Euphorbia conhecida mundialmente pelos seus usos medicinais. Contudo, a maioria de suas características medicinais é relatada apenas na medicina popular, havendo pouca análise médica laboratorial validada, tornando a espécies de interesse para analisa de sua composição química (GUPTA, at al., 2013; MWINE & DAMME, 2011).

2.3.1. CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS

Neste tópico, abordaremos resumidamente as características botânicas da família Euphorbiaceae, do gênero Euphorbia bem como da espécie Euphorbia tirucalli L.

2.3.1.1. Família Euphorbiaceae

A família Euphorbiaceae, está incluída na ordem Malpighiales, pertencente à classe Magnoliopsida, e constitui uma das famílias mais complexas sobre o ponto de vista taxonômico, com larga variedade morfológica, além de apresentar hábito bastante diversificado, representado por ervas, arbustos, lianas, latescentes e espinascentes. (RODRIGUES, 2007). As espécies pertencentes a esta família possuem um porte herbáceo, por vezes, arbustivo, altura bastante variada dependendo da espécie, podendo atingir alturas superiores a 9 metros ou inferiores a 10 centímetros. Os elementos da família Euphorbiaceae apresentam folhas verdes simples e alternada ou raramente compostas, podendo as vezes apresentar espinhos. As suas flores são bastante distintas, simétricas, apresentando cores claras como amarela ou branca. Os frutos podem surgir como cápsulas, drupas, bagas ou sâmaras, dependendo das espécies observadas. E suas sementes são normalmente lisas e escuras (MACHADO, 2007).

55 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Esta família compreende cerca de 7500 espécies distribuída por 300 gêneros. No Brasil encontra-se 72 gêneros e cerca de 1.100 espécies, de habitat diferentes, espalhadas em todos os tipos de vegetação (RODRIGUES, 2007; CREPALDI, et al., 2016).

2.3.1.2. Gênero Euphorbia

O gênero Euphorbia constitui o maior gênero da família Euphorbiaceae, com cerca de 2000 espécies reconhecidas por suas formas de crescimento notavelmente diversificadas morfologicamente, distribuídas principalmente em gegiões subtropicais e regiões temperadas quentes (EL-CHAZALY & CHAUDHARY, 1993). Inclui plantas bastante conhecidas pelo látex leitoso e abundante, com flores nuas dispostas em um pseudanto denominado ciátio, e algumas espécies do gênero são encontradas como ervas daninhas ou como elementos decorativos (ERNST, et al., 2015). Este genêro está distribuido nos continentes africanos, asiáticos e na América do sul, sendo, entretanto, pouco comum em lugares de clima frio, devido sua predileção por regiões áridas (PENG, 2012). Por possuir vários compostos bioativos em sua constituição, as plantas do gênero Euphorbia são tradicionalmente empregadas na medicina popular como plantas medicinais (ZHANG et al., 2008). Como exemplos, podemos aqui citar a espécie E. hirta utilizada em doenças respiratórias (NOGUEIRA, et al., 2014), e a E. tirucalli comumente utilizada no tratamento de doenças virais (AVELAR, 2010). Assim, muitos estudos têm sido conduzidos no sentido de comprovar as atividades de plantas do gênero Euphorbia e desta forma validar seu uso.

2.3.1.3. Espécie Euphorbia tirucalli

Euphorbia tirucalli Linn. é uma espécie do gênero Euphorbia o qual pertencente a família Euphorbiaceae, esta espécie é popularmente conhecida como “avelós”, contudo, também possuem outras denominações como: árvore-lápis, mata-verruga, árvore de São Sebastião, cega-olho, dedo do diabo, figueira do diabo, labirinto, cabelo- do-diabo, cachorro-pelado, coroa-de-cristo, entre outros (MACHADO, 2007). É uma planta nativa da África, mas que foi climatizada em várias partes da Índia e em países tropicais como Angola, Etiópia, Eritréia, Malaui, Quênia, Ruanda, Maurício, Sudão, Senegal, Uganda, Tanzânia, Zanzibar, Indonésia, Índia, Malásia, Vietnã e Filipinas. No

56 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Brasil sua ocorrência se deu por volta do ano de 1982. Assim, esta planta pode sobreviver em uma ampla gama de habitats, podendo crescer sob condições em que a maioria das outras espécies do gênero Euphorbia não conseguiria crescer, como: áreas tropicais áridas com baixa pluviosidade, em solos pobres erodidos, salinos e altas altitudes. (MWINE & VAN DAMME, 2011; MALI, 2017). Quanto às características morfológicas, esta espécie consiste em um arbusto semilenhoso com aspecto de cacto podendo medir de 4-12 m de altura e cerca de 15-20 cm de diâmetro de tronco; possui cor verde; caule ereto e ramificado; ramos lisos e cilíndricos verticilados; folhas pequenas, simples, esparsas e rudimentares aparecendo apenas nas extremidades dos ramos jovens; flores pequenas; frutos em forma de cápsulas; sementes lisas de cor castanha e seiva leitosa e tóxica (MWINE & VAN DAMME, 2011; THOMAS, et al., 2014), Figura 5.

Figura 5 – Foto da espécie Euphorbia tirucalli Linn.

Fonte: Renata Mendonça Araújo.

2.3.2. CONSTITUINTES BIOATIVOS ISOLADOS

Dentes as principais classes de metabólitos secundários isolados da família Euphorbiaceae pode-se destacar os terpenos, como constituintes majoritários de muitas espécies do gênero Euphorbia, contudo, constituintes fenólicos como flavonoides,

57 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

cumarinas, lignanas, taninos e ácidos fenólicos além de constituintes alcaloides entre outros, são constituintes facilmente presentes. Sendo que a presença destes compostos e as concentrações variam entre as diversas espécies desta família (RIZK, 1987; MACHADO, 2007).

2.3.2.1. Aspecto Químico do gênero Euphorbia

A literatura relata uma grande variedade de compostos bioativos isolados do gênero Euphorbia, tais como alcaloides, flavonoides, taninos, terpenos entre outros, o que faz das plantas desse gênero ser tradicionalmente utilizadas pela cultura popular como plantas medicinais (ZHANG, et al., 2008). Contudo, dentre estas classes, o gênero compreende principalmente compostos que pertence a classe dos terpenóides (ERNST, et al., 2015). O Quadro 1 apresenta algumas espécies do gênero Euphorbia e os nomes de suas respectivas moléculas isoladas.

Quadro 1 – Constituintes isolados de plantas do gênero Euphorbia. Espécie Substância Referência E. bupleuroides 4,20-dideoxi(4α)forbol-12-benzoato-13-isobutirato Aichour et al., 2014 5-hidroperoxicicloart-3β-ol 3β,7β-dihidroxi-4α,14α-dimetil-8β,9β-epoxi-5α-ergosta- 24(28)-eno 25-hidroperoxi- cloart-23E-en-3β-ol 24-metilenocicloartanol Jolquinolida E Cicloart-23Z-en-3β,25-diol Cicloeucale-nol Obtusifoliol Cicloartenol Cicloart-3β,24,25-triol 3β-hidroxicicloart-25-en-24-hidroperoxido Escopoletina Cleomiscosina C Hediotisol A Hediotisol B (–)-catequina (–)- galocatequina β-sitosterol Daucosterol E. ebracteolata α-amirina acetato Liang et al., 2014 β-sitosterol Daucosterol 2,4-dihidroxi-6-metoxi-3-metilacetofenona 2,4-dihidroxi-3-al-6-metoxiacetofenona 3,3'-diacetil-4,4'-dimetoxi-2,2',6,6'-tetrahidroxidifenilmetano Jolquinolida A Jolquinolida B 11-β-hidroxi-ent-abieta-8(14),13(15)-dien-16,12β-olideo Yuexiandajisu D Yuexiandajisu E 3β,19-dihidroxi-1(10), 15-rosadien-2-ona Yuexiandajisu F Hugorenol Antiquorina

58 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Cluitil ferulato Ácido gálico E. esula 16-benzoiloxi-20-deoxiingenol 5-benzoato Wang et al., 2010 Ingenol-3, 20-dibenzoato 13, 16-dibenzoiloxi-20-deoxiingeno-3-benzoato E. fischeriana (+)-niasol Wang et al., 2012; 23(Z)-cicloart-23-en-3β, 25-diol Shi et al., 2017; Cicloart-22-en-3β, 25-diol Liang et al., 2014; Ebracteolataina A Pan et al., 2011 2, 4-dhiidroxi-6-metoxi-3-formil-1-acetofenona Ácido α-linolénico 24-metilenocicloartanol Cicloartenol β-sitosterol 3, 3’-diacetil-4, 4’-dimetoxi-2,2’, 6, 6’-tetrahidroxi difenil metano 2, 4-dihidroxi-6-metoxi-3-metil-1-acetofenona Oleaneno-2α, 3βb-diol Ent-kaurano-3-oxo-16β, 17-acetanide 2-(furan-2-il)-6-(1,2,3,4-tetrahidroxibutil) pirazina Jolquinolida B Ent-(3α, 5β, 8β, 9α, 10β, 12β)-3-hidroxiatis-16-en-14-ona Ent-atisano-3α, 16β, 17-triol Ent-kaurano-3-oxo-17β-ol 12-deoxiforbaldeido-13-hexadecanoato Lupeol acetato Lupeol luteona α-amirina acetato Daucosterol 2,4-dihidroxi-6-metoxi-3-metilacetofenona 2,4-dihidroxi-3-al-6-metoxiacetofenona 3,3'-diacetil-4,4'-dimetoxi-2,2',6,6'-tetrahidroxidifenilmetano Jolquinolida A 17-hidroxijolquinolida A 17-hidroxijolquinolida B Ent-(3α,5β,8α,9β,10α, 12α)-3-hidroxiatis-16-en-14-ona Neriifolena Ent-kaurano-3-oxo-16α,17-diol Ent-16β-H-3-oxokauran-17-ol 12-deoxiforbaldeido-13-hexadecanoato Cluitil ferulato Ácido gálico Ácido 3,4,3'-tri-O-metil elágico Fischerosídeo A Fischerosídeo B Fischerosídeo C Prostratina 12-deoxiforbol-13,20-diacetato 12-deoxiforbol-13-hexadecanoato 12-deoxiforbaldeido-13-hexadecanoato Langduina A Langduina D Ent-13S-hidroxi-16-atiseno-3,14-diona Jolquinolida A 17-hidroxijolquinolida A Jolquinolida B 17-hidroxijolquinolida B E.helioscopia 7β,9α,14β-triacetoxi-3β-benzoiloxi-12β,15β-epoxi-11β-hidroxijatrofa- Lu, at al., 2008 5E-eno 14β-acetoxi-3β-benzoiloxi-7β,9α,15β-trihidroxijatrofa-5E,11E-dieno Euphornina B 7β,9α,14β-triacetoxi-3β-benzoiloxi-15β,17-dihidroxijatrofa- 5E,11E-dieno Euphornina 14α,15β-diacetoxi-3β,7β-dibenzoiloxi-17-hydroxi-9-oxo- 2βH,13βHjatrofa-5E,11E-dieno Euphoscopina C

59 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Helioscopinolideo A Euphornina A Euphornina G Euphoheliosnoide A Euphoheliosnoide B Euphoheliosnoide C Euphoscopina A Euphoscopina B Euphoscopina E Euphoscopina J Helioscopinolideo A Dehidrovomifoliol Ácido fusídico Loliolide E.himalayensis Ácido 4-O-[β-D-xilopiranosil]-3,3’-di-O-metilelágico Liu at al.; 2014 Ácido 3,3’-di-O-metilelágico Esulona A E. hirta Taraxerol acetato Li et al., 2015; Taraxerol Yi et al., 2012 Taraxerona ψ-taraxastane-3,20-diol Friedelina Friedelan-3β-ol 28-hidroxifriedelina Friedelane-3β,29-diol 3β-hidroxi-cicloart-25-en-24-ona 23(E)-25-metoxicicloart-23-en-3β-ol Cicloartenol Ciclolanostan-3β-ol Cicloart-23-en-3β,25-diol Cicloart-23-en-3β,25,28-triol Umbeliferona 6,7,8-trimetoxil-cumarina Escoparona Escopoletina Isoescopoletina Esculetina Daphnoretina (_)-pinoresinol (+)-siringaresinol (_)-pinoresinol glicosídeo (þ)-siringaresinol glicosídeo Ent-caur-16-en-3β-ol 2β, 16α, 19-trihidroxi-ent-caurano 16β, 17-dihidroxi-ent-caurano-3-ona 16α, 17-dihidroxi-ent-caurano-3-ona 3β, 16α, 17-trihidroxi-ent-caurano 16α, 17, 19-trihidroxi-ent-caurano Quercetina Isoramnetina Pinocembrina Canferol Luteolina Ácido gálico E. kansui 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxi-3’-mentilchalcona Peng et al., 2012 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxi-3’,5’-dimentilchalcona (2S)-7-hidroxi-5-metoxi-6,8-dimentilflavanona 5-O-benzoil-3β-hidroxi-20-deoxiingenol 3-O-benzoil-3β-hydroxi-20-deoxiingenol 4-O-acetil-5-O-benzoil-3β-hidroxi-20-deoxiingenol Eufol α-amirina β-amirina Ácido oleanólico Ácido ursólico E. macrorrhiza Macrorilone A Gao et al., 2016 Macrorilone B

60 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Macroripremirsinona A Macrorilatirona A Macrorilatirona B Macrorieufoorona A Macroricasbalona A Macroricasbalona B Macroricasbalona C Jatrofalona Sikkimenoides A Sikkimenoides B Sikkimenoides C Sikkimenoides D Jatrofodiona A Latilagascenes F Jolquinol B 15β-O-benzoil-5α-hidroxiisolatirol Jatrofalactona E. nematocypha 3,5,10,14,15-O-pentaacetil-8-O-benzoilciclomirsinol Chen et al., 2014 Euphorproliderína D Euphorbialoides C Euphorpmliderina B Jolquinolida B 17-hidroxijolquinolida B 17-hidroxijolquinolida A Euphodendriana A 24-metilenocicloartano-3,28-diol Cicloart-25-en-3β,24-diol Tirucala-8,25-dieno-3β,24-diol Inoterpenos A E.retusa Retusolideo A Haba at al.; 2009 Retusolideo B Retusolideo C Retusolideo D Retusolideo E Retusolideo F 24-metileno cicloartanil formato 24-metileno cicloartanil 2É, 4É-decadienoato Tirucala-7, 24-dien-3β-il 2É,4É-decadienoato E. sapinii Lanost-24-en-20-ol-3-tetradecanoato Tsopmo et al., 2011 Euforbol-7-ona 30-nor-hopan-3β-ol-22-ona E.seguieriana 17-hidroximirsinol Oksuz, at al.; 1998 5,14-O-dinicotinoil-8-O-iso-buitril-3,10,15-O-triacetil-ciclomirsinol 7-O-acetil-5-O-benzoil-13,15-dihidroxi-3,18-O-dinicotinoil-14-oxo- latirano E.sikkimensis Sikkimenoide A Yang at al.; 2013 Sikkimenoide B Sikkimenoide C Sikkimenoide D E. stracheyi Stracheyioide A Yang et al., 2014 Stracheyioide B Stracheyioide C Bizantionosídeo B (6R,9S)-3-oxo ionol-β-D-glicopiranosídeo (5)-α- Matenosídeo B Icarisídeo B2 Acido 9β-hidroxicostus Isoalantolactona Ent-11β-hidroxiabieta-8(14),13(15)-dien-16,12-olido (2R,3S,4R,5R,9S,11S,15R)-3,5,15-O-triacetil-14-oxolatira-6(17),12E- dieno Langduina A 3-O-(2′E,4′Z-decadienoil)-20-O-acetilingenol Sikkimenoide E Prostratina 13-O-tetradecanoil-12-deoxiforbol 13-O-tetradecanoil-20-O-acetil-12-deoxiforbol

61 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Fischerosídeo A 13-O-acetilforbol 12-O-tetradecanoilforbol 12-O-tetradecanoil-13-O-acetilforbol 12-O-tetradecanoil-13,20-O-diacetilforbol 12-O-(2′E,4′E-decadienoil)-13-O-acetilforbol Fischerosídeo C 3β-hidroxicicloart- 23-en-25-metil éter 3β-hidroxi-4α,14α-dimetil-5α-ergosta-8,24(28)-dien-7-ona Etil glicopiranosídeo Metil galato Etil galato 4-metoxibenzil-O-β-D-glicopiranosídeo Salidrosídeo 3-hidroxibenzenoetanol 1-O-β-D-glicopiranosil-2-(3-hidroxifenil) etanol 4-O-glicosiloxi-2-hidroxi-6-metoxiacetofenona Coniferina Ácido neoclorogênico metil éster Eleuterosídeo B1 Quercetina-3-O-β-D-galactosídeo Quercetina-3-O-(3″-O-galoil)-β-galactopiranosídeo E. teheranica 3,5,10,14,15-O-pentaacetil-8-O-2’-(metilbutanoil)-ciclomirsinol Ahmad e Jassbi, 1999 5,10,14,15-O-tetraacetil-3-O-nicotinoil-8-O-2’-(metilbutanoil)- ciclomirsinol 3,5,7,15,17-O-pentaacetil-14-O-nicotinoil-17-hidroximirsinol E. tibetica Metil 4-epi-chiquimato-3-O-galato Yang et al., 2014 Ácido 3-O-galoil-chiquímico 3, 7-dimetil-octa-1,7-dieno-3, 6-diol (3S, 5R, 6R, 7E, 9R)-3, 5, 6, 9-tetrahidroxi-7-megastigmane Ent-3β,16-dihidroxiisopimar-7-eno-2,15-diona Forbol-13-acetato (16S)-16,17-dihidroxi-ent-kaurano-3-ona (16,R)-16,17-dihidroxifilocladan-3-ona Ent-16α, 17- dihidroxiatisan-3-ona Ingenol-20-miristinato Ácido gálico Metil galato Etil galato Metil chiquimato 3-hidroxifenil álcool 1-(3-hidroxi)-feniletil-O-β-D-glicopiranosídeo 2,4-dihidroxi-6-metoxi-acetofenona 4-O-glicosi-oxi-2-hidroxi- 6-metoxiacetofenona Ecopoletina Tricina Quercetina Quercetina-3-O-β-D-galactosídeo Quercetina-3-O-β-D-xilopiranosídeo Quercetina-3-O-α-L-arabinofuranosídeo Fonte: Própria, 2019.

2.3.2.2. Aspecto Químico da espécie Euphorbia tirucalli

De acordo com a literatura, o estudo fitoqubímico acerca da espécie Euphorbia tirulli teve início por volta de 1977, quando Fürstenberger e Hecker isolaram forbol e ingenol do extrato acetona do látex de E. tirucalli coletado em Madagascar, os quais são altamente irritantes e sensíveis a autoxidação, Figura 6.

62 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 6- Derivado de forbol (1) e ingenol (2) isolados por Fürstenberger e Hecker em 1977.

(2) (1) Fonte: Própria, 2019.

Em 1979, Kinghorn também isolou um novo derivado de forbol do extrato acetona do lâtex de E. tirucalli por cromatografia em coluna. O diterpeno, 12-0-2Z-4E- octadienoi1-4-deoxiphorbo1-13-acetato que também apresentou alto potencial irritante, Figura 7.

Figura 7- Derivado de Phorbol (3) isolado por Kinghom 1979.

(3)

Fonte: Própria, 2019.

Em 1984, Nes e colaboradores ao realizarem estudo sobre estereoquímica de moléculas de esterol identificaram dois compostos pertencentes a classes dos esterois a partir de Euphorbia tirucalli, o Eufol e o Tirucalol os quais tiveram suas estruturas analisadas por cristalografia, Figura 8.

63 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 8- Estrutura dos dois triterpenos, o Euphol (4) e o Tirucallol (5) isolados por Nes et al em 1984.

(4) (5) Fonte: Própria, 2019.

No ano seguinte, 1985, Fürstenberger e Hecker agora trabalhando com o extrato acetona do látex de E. tirucalli originária da Africa do Sul isolaram outros dois derivados de Phorbol, o 4-deoxiphorbol e o 4-deoxi-4α-phorbol, Figura 9.

Figura 9 – Estrutura dos dois terpenos, o 4-deoxiphorbol (6) e o 4-deoxi-4α-phorbol (7) isolados por Fürstenberger e Hecker em 1985.

(6) (7) Fonte: Própria, 2019.

O estudo fitoquímico com o extrato etanólico da casca do caule fresca e seca de Euphorbia tirucalli realizado por Khan e colaboradores em 1987 levou ao isolamento de dois triterpenos cristalinos, o Glut-5-en-3-β-ol e o Cucloart-23-eno-3-β,25-diol, Figura 10.

64 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 10- Estrutura dos dois triterpenos, o glut-5-en-3-β-ol (8) e o cicloart-23-eno-3-β,25-diol (9) isolados por Khan e colaboradores em 1987.

(8) (9)

Fonte: Própria, 2019.

Ainda no ano de 1988, Kahn e colaboradores trabalhando agora com o látex desta planta, possibilitou o isolamento de um ciclopropano, o Cicloeuphordenol, Figura 11.

Figura 11- Estrutura do Cicloeuphordenol (11) isolados do látex de E. tirucalli por Khan e colaboradores em 1988 do.

(11) Fonte: Própria, 2019.

Ainda em estudo com látex, Khan e colaboradores isolaram mais um novo triterpeno, o Ciclotirucanenol, o qual teve sua estrutura elucidada por métodos espectroscópicos, Figura 12.

Figura 12- Estrutura do Ciclotirucanenol (12) isolados do látex de E. tirucalli por Khan e colaboradores em 1988.

(12) Fonte: Própria, 2019.

65 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Já em 1989, e Kahn colaboradores, ainda em estudos cromatográficos em coluna com a casca do caule de E. tirucalli levou o isolamento de outro triterpeno pentacíclico, o Euphorcinol, Figura 13.

Figura 13- Estrutura do triterpenos, Euphorcinol (13) isolados por Khan e colaboradores em 1989.

(13)

Fonte: Própria, 2019.

Em 1989, Rasool e colaboradores isolaram um novo triterpeno do tipo taraxerana a partir do extrato etanólico da casca do caule, o Euforginol, que foi caracterizdo por espectros de RMN, sendo denominada de Taraxer-14-en-6α-ol, Figura 14.

Figura 14- Estrutura do Euforginol (14) isolados da casca do caule de E. tirucalli por Rasool e colaboradores em 1989.

(14) Fonte: Própria, 2019.

E no ano de 1990, Khan e Malik isoralaram um novo éster diterpeno macrocíclico, ou éster ingol, o éster 3,7-diacetil ingol. Este diterpeno foi obtido a partir do lâtex fresco da espécie Euphorbia tirucalli, Figura 15.

66 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 15 – Estrutura do Ingol (15) isolados do látex fresco de E. tirucalli por Khan e Malik em 1990.

(15) Fonte: Própria, 2019.

Desde então, a composição química de diferentes partes da planta tem sido estudada (látex, caule, haste e raíz), levando ao isolamento de outros importantes constituintes bioativos presentes na espécie Euphorbia tirucalli. Dentre as classes de compostos isolados os terpenos constitui a classe predominate desta espécie, o que caracteriza estes como marcadores taxinônico desta espécie, compreeendendo especialmente os triterpenos e esterois. Aqui se pode destacar o euphol, o álcool triterpênico tetracíclico, o principal constituinte encontrado na seiva de E. tirucalli (DUTRA, 2012). Portanto, foi realizada uma investigação da ocorrência de substâncias isoladas pertencentes a espécie Euphobia tirucalli, no SciFinder e no Science Direct com o título “Euphorbia tirucalli”, “Constituintes de Euphorbia tirucalli” e “Compostos isolados de Euphorbia tirucalli” entre os anos de 1970 à 2018. O resultado desta pesquisa encontra-se no Quadro 2, contendo as estruturas, nomes, partes da planta, classes e as referências correspondentesdos compostos isolados.

67 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Quadro 2 – Estrutura química dos compostos isolados de Euphorbia tirucalli. Estrutura Nome Parte da Classe Referências planta

Tirucallin A Hastes Compostos Yoshida, et Fenólicos al., 1991

(16)

Tirucallin B Hastes Compostos Yoshida, et Fenólicos al.,1991

(17)

Euphorbin F Hastes Compostos Yoshida, et Fenólicos al.,1991

(18)

5-desgalloylstarchyurin Parte aérea Compostos Lin, et al., Fenólicos 2001

(19)

Ácido 3,3´,4-tri-O-metil- Parte aérea Composto Lin, et al., 4´-O-rutinosil elágico fenólico 2001

68 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

(20)

Euforbosterol Parte aérea Esteroide Mobarak, et al, 2010

(21)

β-sitosterol Parte aérea Esteroide Mobarak, et al, 2010)

(22) Parte aérea Composto Mobarak, et fenólico al, 2010

Ácido 3,3´,4´-tri-O-

metilelágico (23) β-amirinona Parte aérea Terpeno Mobarak, et al, 2010

(24) β-amirina Parte aérea. Terpeno MOBARA K, et al, 2010; Rodrigues, 2014)

(25)

Euforginol Casca do Terpeno, Chauhan e caule Singh, 2011

(26) Taraxerol Casca do Terpeno Chauhan e caule Singh, 2011

(27)

Tirucalicina Látex Terpeno Gupta, et al., 2013

(28)

69 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Lupeol Látex Terpeno Gupta, et al., 2013

(29) Euphol Parte aérea Terpeno Mobarak, et al, 2010; Lin, et al, 2012; Chen, et al., 2015; Vuong, et

(30) al., 2015)

(2R,6S,9S)-2-hydroxy-3- Parte aérea Terpeno Xu, et al., oxo-α-ionol 2017

(31)

(6S,9S)-6-hydroxy-3-oxo- Parte aérea Terpeno Xu, et al., α-ionol 2017

(32) (6R,9S)-3-oxo-α-ionol β- Parte aérea Terpeno Xu, et al., D-glicopiranosíde 2017

(33) (6R,9R)-3-oxo-α-ionol β- Parte aérea Terpeno Xu, et al., D-glicopiranosíde 2017

(34)

Fonte: Adaptado de CHEN, et al., 2015; CHAUHAN e SINGH, 2011; GUPTA, et al., 2013; LIN, et al., 2001; LIN, et al, 2012; MOBARAK, et al, 2010; VUONG, et al., 2015; XU, et al., 2017; YOSHIDA, et al.,1991.

De acordo com a literatura outros compostos também fazem parte dos constituintes da espécie E. tirucalli, contudo estes foram apenas mecionados, ou seja, não foi mecionada a metodologica para o isolamento bem como a parte da planta onde os mesmos foram isolados. Dentre estes metabolitos pode-se citar: calotropina, catotoxina, calcilina, gigatina, cianidina 3,5- diglicosídeo, tulipanidina 3- ramnoglicosídeo, euforbol hexacosonato, n-hexacosanol, 12-deoxiphorbol-13-O- fenilacetato-16-O-α-metilbutirato-2-acetato, tiniatoxina, taraxerona, 20-O- acetilresiniferonol-9,13,14-orto-fenil acetato, ingenol triacetato, 12-desoxi-4β- hidroxifobol-13-fenilacetato-20-acetato, cianina, solanesol, euforbosterol, 12,20-

70 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau dideoxiforbol-13-isobutirato eufol, 12-desoxi-4β-hidroxiforbol-13-fenilacetato-20- acetato, ácido fórbico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido Succínico, ácidos gálicos, ácido linoleico, ácido palmítico, ácido 3-3-4-tri-O-metil elágico, ácido 3,3’-di-O-metil elágico, tri-metil ácido elágico, ácido 3,3’-di-O-metilelágico, estigmasterol, canferol, taraxasterol, euforona, taraxerina, euforbina A, cicloartenol, euforona, glicose, ácido sapogenina, hentriacontanol, taraserina, gigatina, ciclo tirucanenol, álcool terpênico, 13-isobutirato, 12, 20-didesoxiforbol, glut-5-en-3-β-ol, 24-metilenocicloartenol, triacetato de engol, 12-desoxi-4β-hidroxiforbol-13-fenil acetato-20-acetato, etc. (CHANDRASEKHAR, 2014; SAMUELSSON, et al., 1992; SILVA, et al., 2007; COSTA, 2011; MWINE & DAMME, 2011).

2.3.3. USO DE Euphorbia tirucalli NA MEDICINA POPULAR

Dentre as plantas do gênero Euphorbia podemos aqui citar Euphorbia tirucalli, utilizada na medicina popular para o tratamento de sífilis, asma, reumatismo, câncer, tumores de pele, tratamento ofídico, como purgativo, expectorante entre outros males do corpo (BETANCUR-GALVIS, et al., 2002; TOFANELLI, 2011). Além do mais, recentemente, E. tirucalli é relatada por apresentar várias propriedades medicinais como: atividade antibacteriana, antioxidante, antifúngica, antiartrítica, proteolítica, larvicida, inseticida, anticâncer etc (PRIYA & RAO, 2011; CHOENE, 2015; CHOENE, 2016). Estas propriedades medicinais da espécie podem estarem relacionadas à gama diversificada de constituintes bioativos presentes, pertencentes principalmente a classe de terpenos e esteróis, como é o caso do álcool euphol, euphorbol, taraxasterol e tirucalol entre vários outros constituintes. Estudos sugerem que o euphol, principal componente ativo isolado de E. tirucalli, representa um agente promissor para o manejo de distúrbios inflamatórios periféricos e centrais bem como por inibir o crescimento de células cancerígenas humana (SILVA, et al., 2007; LIN, 2012).

71 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

2.4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA O ESTUDO FITOQUÍMICO DE Euphorbia tirucalli 2.4.1. MATERIAL VEGETAL

A espécie Euphorbia tirucalli L. utilizada para o estudo fitoquímico foi coletada em maio de 2014 na localidade de Araruna, Paraíba (lat.: -6,458764 e log.: -35,679800) pelo prof. Edilberto Silveira, do Departamento de Química Orgânica da UFC e identificada por comparação com a espécie depositada no Herbário Prisco Bezerra do Departamento de Biologia, sob número de registro EAC 0038702. A coleta do material vegetal das espécies Euphorbia tirucalli para uso científico foi autorizado pelo Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético (SisGen) (Número do cadastro: A12E895).

2.4.2. OBTENÇÃO DOS EXTRATO HEXÂNICO E ETANÓLICO DA PARTE AÉREA E DAS RAÍZES DE Euphorbia tirucalli

Para realização do estudo fitoquímico da espécie Euphorbia tirucalli foram preparados extratos hexânico e etanólico tanto da parte aérea quanto das raízes da mesma. Assim, essas partes da planta foram completamente secas e moídas separadamente utilizando moinho de facas e posteriomente submetidas à duas extrações com hexano e etanol à temperatura ambiente. As extrações foram repetidas três vezes para cada solvente numa proporção de 100 g de material seco para 500 mL de solvente, sempre reaproveitando o solvente de cada extração e devolvendo para o mariote, o material utilizado na extração com hexano foi novamente reutilizado na extração com o etanol. Cada solução resultante foi filtrada e o solvente destilado em evaporador rotativo sob pressão reduzida, para obtenção dos respectivos extratos conforme descrito no Quadro 3. Para nomeação dos extratos foi utilizado o seguinte critério: nome científico da planta, a parte a qual foi trabalhada e solvente empregado para extração. Após a preparação dos extratos, estes foram submetidos à análise por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS), a fim de se avaliar o perfil fitoquímico dos mesmos e em seguida, todos os quatro extratos foram submetidos a procedimentos cromatográficos, contudo iremos aqui citar apenas aquela os quais foram possíveis obter compostos isolados. Todo o procedimento de preparação

72 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau dos extratos como também os fracionamentos cromatográficos estão resumidamente representados na Figura 16 e Figura 17.

Quadro 3 – Partes da planta Euphorbia tirucalli utilizadas para extração e as respectivas denominação dos extratos obtidos. Material Botânico/(g) Denominação* Parte aérea (150,385) ETPAE-H ETPAE-E Raíz (150,572) ETR-H ETR-E *ETPAE-H – extrato hexânico da parte aérea de Euphorbia tirucalli. ETPAE-E – extrato etanólico da parte aérea de Euphorbia tirucalli. ETR-H – extrato hexânico das raízes de Euphorbia tirucalli. ETR-E – extrato etanólico das raízes de Euphorbia tirucalli.

2.4.3. OBTENÇÃO DOS CONSTITUINTES INSAPONIFICÁVEIS DO EXTRATO ETPAE-H 2.4.3.1. Saponificação

A fração ETPAE-H (2,00 g) devido conter bastante gordura, uma vez que se trata de uma fração muito apolar, foi submetida a reação de saponificação afim de se obter os constituintes insaponificáveis. Assim, inicialmente, a amostra foi solubilizada na menor quantidade possível de CHCl3, e em seguida esta foi transferida para um balão de 250 mL juntamente com 15,00 mL de uma solução alcoólica de NaOH (3,00 g/15,00 mL de etanol), conforme informações contidas no Quadro 4.

Quadro 4 – Quantidades de reagentes utilizados na saponificação. Extrato Qtde / (g) NaOH (g) MeOH (mL) ETPAE-H 2,00 3,00 15,00 Fonte: Própria, 2019.

O sistema reacional foi montado e a reação foi mantida sob agitação a 60 °C por duas horas. Posteriormente, adicionou-se ao sistema reacional 24 mL de água destilada, e em seguida o sistema foi transferido para um funil de separação. Então, os insaponificáveis foram extraídos com CHCl3 (3 x 30 mL). Assim, a fração contendo os insaponificáveis, foi seca com sulfato de sódio anidro (NaSO4), filtrada, concentrada por destilação do solvente sob pressão reduzida em evaporador rotativo resultando em 1,21 g e denominada EHPAET-C-insap. A fase hidroalcoólica alcalina, contendo os ácidos graxos foi reservada.

73 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

2.4.3.2. Fracionamento Cromatográfico da fração ETPAE-H-C-insap

A fração ETPAE-H-C-insap (1,00 g) foi submetida à cromatografia em coluna para separação de suas substâncias por diferença de polaridade. Assim, inicialmente, a fração EHPAET-C-insap foi adsorvida em gel de sílica flash numa proporção de 1:3 e pulverizada em gral de porcelana, sendo em seguida, acondicionada sobre 62,71 g de gel de sílica flash, numa coluna cromatográfica (Φ = 3,00 cm). A eluição foi realizada com solventes puros ou mistura binária: hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, sempre seguindo uma ordem crescente de polaridade conforme o Quadro 5.

Quadro 5 – Proporções de solventes e volumes para a obtenção das frações de 1-14 a partir da fração ETPAE-H-C-insap. Eluentes/proporção Volume (mL) Frações Hexano/clorofórmio 30% 200 ETPAE-H-C-insap-HC-(1) Hexano/clorofórmio 50% 200 ETPAE-H-C-insap-HC-(2) Hexano/clorofórmio 90% 250 ETPAE-H-C-insap-HC-(3) Clorofórmio /acetato de etila 20% 200 ETPAE-H-C-insap-CA-(4-7) Clorofórmio /acetato de etila 30% 100 ETPAE-H-C-insap-CA-(8) Clorofórmio /acetato de etila 70% 200 ETPAE-H-C-insap-CA-(9-11) Acetato de etila 100% 100 ETPAE-H-C-insap-A-(12) Acetato de etila/metanol 40% 100 ETPAE-H-C-insap-A-(13) Acetato de etila/metanol 60% 250 ETPAE-H-C-insap-A-(14) Fonte: Própria, 2019.

O fracionamento cromatográfico resultou em 14 frações as quais foram analisadas por CCD e em seguida reunidas conforme semelhança. Na fração ETPAE-H- C-insap-HC-(3) foi observado um precipitado branco amorfo, que após analisada por CCD foi lavada com hexano/clorofórmio na proporção 5:2 e identificou-se uma amostra pura, visível na luz UV (254 e 365 nm) e de cor lilás após pulverização com solução de vanilina e posterior aquecimento. O sólido foi denominado de ET-1e submetido à análise de RMN 1H e 13C, onde análises espectrométricas revelaram a estrutura de um triterpeno.

2.4.4. FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO ETANÓLICO DAS RAÍZES DE Euphorbia tirucalli (ETR-E)

Uma alíquota de 2,00 g do extrato resinoso da raíz, ETR-E, foi adsorvido em gel de sílica “comum” numa proporção de 3:1 e pulverizada em gral de porcelana, e acondicionada sobre 50,00 g de gel de sílica “comum”, numa coluna cromatográfica do tipo filtrante (Φ = 5,00 cm) de 500 mL. Posteriomente, a coluna foi eluida de forma

74 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau gradiente com solventes puros ou misturas binárias de hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol em ordem crescente de polaridade. Este procedimento rendeu 8 frações conforme descrito no Quadro 6.

Quadro 6 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das raízes (ETR-E). Eluentes/proporção Volume (mL) Frações Massa (g) Hexano 100% 100 -- -- Hexano/clorofórmio 50% 300 ETR-E-HC-(1) 0,0149 Clorofórmio 100% 150 ETR-E-C-(2) 0,0303 Clorofórmio /acetato de etila 50% 100 ETR-E-CA-(3) 0,2050 Acetato de etila 100% 100 ETR-E-A-(4) 0,0337 Acetato de etila 100% 100 ETR-E-A-(5) 0,2812 Acetato de etila 100% 100 ETR-E-A-(6) 0,0849 Acetato de etila/metanol 50% 200 ETR-E-AM-(7) 0,9987 Metanol 100% 200 ETR-E-M-(8) 0,2194 Total = 1,8681 Rendimento = 93,40 % Fonte: Própria, 2019.

Por fim, as frações obtidas foram analisadas por comparação em CCD. Observou-se que a fração ETR-E-CA-(3) apresentava um precipitado branco amorfo que após ser lavado com hexano/clorofórmio 10%, forneceu 10 mg de um sólido o qual foi denominado ET-2 e submetido a análises espectrométricas para determinação estrutural. As frações ETR-E-A-(5) e ETR-E-AM-(7) se mostraram promissoras e foram novamente submetidas a processos cromatográficos em coluna.

2.4.4.1. Fracionamento Cromatográfico da fração ETR-E-A-(5)

A fração ETR-E-A-(5) (0,28 g) foi dissolvida em metanol, acondicionadas em uma coluna Sephadex LH-20 (Φ = 2,00 cm), submetida à cromatografia por exclusão e eluída com metanol puro. Este procedimento cromatográfico forneceu 41 frações as qual foram reunidas por comparação de CCD, resultando em 7 frações, Quadro 7.

Quadro 7 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração ETR-H-A-(5). Frações Massa (g) Frações Massa (g) ETR-E-A-(5)-M-(1-15) 0,1573 ETR-E-A-(5)-M-(30-40) 0,0182 ETR-E-A-(5)-M-(16-23) 0,0208 ETR-E-A-(5)-M-(41) 0,0031 ETR-E-A-(5)-M-(24-29) 0,0174 -- -- Total = 0,22 Rendimento = 78,57 % Fonte: Própria, 2019.

75 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

As frações 16-23 e 30-40 apresentaram-se como um sólido amarelo, as quais foram submetidas a uma lavagem com metanol, resultando em 20 mg e 16 mg de material sólidos e foram denominados respectivamente por ET-3 e ET-4. Análise por CCD (solvente: clorofórmio/metanol 20%) revelou uma mancha homogênea, visível na luz UV (254 e 365 ηm) de cor rosa intensa para ET-3 e amarela intensa para a amostra ET-4 ao serem reveladas com solução de vanilina. Assim, a ET-3 e ET-4 foram estruturalmente caracterizadas através de técnicas espectroscópicas.

2.4.4.2. Fracionamento Cromatográfico da fração ETR-E-AM-(7)

A fração ETR-E-AM-(7) (0,99 g), foi adsorvida em 1,98 g de gel de sílica “flash”, pulverizada em grau de porcelana e submetida a fracionamento cromatográfico utilizando coluna cromatográfica (Φ = 3,00 cm) a baixa pressão, com 20,00 g de gel de sílica “flash”, utilizando eluição gradiente como misturas binárias dos seguintes solventes: hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol. Este fracionamento cromatográfico resultou em 17 frações as quais foram analisadas em CCD e reunidas conforme semelhança, Quadro 8. Quadro 8 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração ETR-E-A-(7). Frações Massa (g) Frações Massa (g) ETR-E-AM-(7)-C-(1-3) 0,0234 ETR-E-AM-(7)-AM-(10,11) 0,3626 ETR-E-AM-(7)-CA-(4) 0,0098 ETR-E-AM-(7)-AM-(12) 0,0648 ETR-E-AM-(7)-CA-(5) 0,0193 ETR-E-AM-(7)-AM-(13-17) 0,0771 ETR-E-AM-(7)-AM-(6-9) 0,3241 -- -- Total = 0,88 Rendimento = 88,88 % Fonte: Própria, 2019.

Foi observado que a fração ETR-E-AM-(7)-AM-(6-9) apresentava um precipitado, o qual foi lavado com metanol rendendo 0,0233 g, de um sólido branco amorfo, com ponto de fusão > 300 °C. O sólido foi analisado em CCD, mostrando-se uma mancha uniforme, visível na luz UV (254 e 365 nm) e de cor lilás após pulveriza com solução de vanilina e posterior aquecimento o qual foi denominado ET-5. Análises espectrométricas de RMN deste sólido revelaram a estrutura de um derivado de ácido elágico.

76 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 16 – Obtenção dos extratos hexânicos e etanólicos da parte aérea e das raízes de Euphorbia tirucalli.

Fonte: Própria, 2019.

77 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 17 – Fracionamento do extrato hexânicos da parte aérea e do estrato etanol das raízes de Euphorbia tirucalli.

Fonte: Própria, 2019.

78 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

2.4.5. ATIVIDADES BIOLÓGICAS

Os testes para as avaliações das atividades antioxidantes e antimicrobianas dos extratos brutos e dos compostos isolados da espécie Euphorbia tirucalli foram realizados com a colaboração do Departamento de Medicina tropical da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, por Bruno Oliveira de Veras e Márcia Vanusa da Silva.

2.4.5.1. Atividade sequestradora de radical Livre de Euphorbia tirucalli com o radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)

A avaliação da atividade antioxidante dos extratos e compostos isolados pelo método do sequestro de radical livre foi medida por meio de doação de hidrogênio usando o radical DPPH (BLOIS, 1958). Uma solução de reserva de DPPH metanólica (200 μM) foi adicionalmente diluída em metanol para obter uma absorbância UV-VIS entre 0,6-0,7 a 517 nm, obtendo a solução de trabalho DPPH. Diferentes concentrações da composição (40 μL) foram misturadas com solução de DPPH (250 L) e após 30 min de incubação ao abrigo da luz, as absorbâncias foram lidas ao mesmo comprimento de onda mencionado acima. As medidas foram realizadas em triplicatas e as atividades de inibição foram calculadas com base na porcentagem de DPPH eliminado. A porcentagem de inibição (I%) foi calculada utilizando a seguinte equação: I% = [(Abs0 -

Abs1)/Abs0] x 100, onde Abs0 é a absorbância do controle e Abs1 é a absorbância do composto. Para curva de calibração preparou-se uma solução padrão de Trolox, um antioxidante sintético análogo à vitamina E, na concentração 2 mM. Primeiro, diluiu-se 25 mg deste composto em álcool etílico até completar o volume para 50 mL em balão volumétrico. A partir desta solução, foram preparadas em balões volumétricos de 10 mL, soluções variando a concentração de 10 a 200 μM. Em ambiente escuro, transferiu- se 40 μL de cada solução de Trolox e 240 mL da solução do radical DPPH. A leitura foi realizada após 25 minutos da mistura. O álcool etílico foi utilizado como branco na calibração do equipamento.

2.4.5.2. Atividade sequestradora de radical Livre de Euphorbia tirucalli com o radical 2’,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS-+)

Atividade antioxidante dos extratos e compostos isolados pelo o ensaio ABTS, baseou-se na geração do radical catiônico cromóforo obtido a partir da oxidação de

79 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

ABTS por persulfato de potássio. Para esta análise, foi utilizada a metodologia descrita por Re et al. (1999) com algumas modificações. O radical ABTS-+ foi formado pela reação de 5 mL da solução ABTS-+ 7mM, com 88 μL da solução de persulfato de potássio 140 mM, incubados à temperatura de 25ºC e na ausência de luz durante 16 horas. Uma vez formado, o radical foi diluído com etanol P.A. até a obtenção do valor de absorbância de 0,700±0,020 a 734 nm. Diferentes concentrações dos compostos (10 μL) foram misturados com solução de ABTS-+ (1 mL) e após 6 min de incubação ao abrigo da luz, as absorbâncias foram lidas ao mesmo comprimento de onda mencionado acima. As medidas foram triplicatas e as atividades de inibição foram calculadas com base na porcentagem de ABTS-+ sequestrado. Para curva de calibração preparou-se uma solução padrão de Trolox, um antioxidante sintético análogo à vitamina E, na concentração 2 mM. Primeiro, diluiu-se 25 mg deste composto em álcool etílico até completar o volume para 50 mL em balão volumétrico. A partir desta solução, foram preparadas em balões volumétricos de 10 mL, soluções variando a concentração de 100 a 2000 μM. Em ambiente escuro, transferiu-se 10 μL de cada solução de Trolox com 1 mL da solução do radical ABTS-+. A leitura foi realizada após 6 minutos da mistura. O álcool etílico foi utilizado como branco na calibração do equipamento. A porcentagem de inibição (I%) foi calculada utilizando a seguinte equação: I%

= [(Abs0 -Abs1) /Abs0] x 100, onde Abs0 é a absorbância do controle e Abs1 é a absorbância do composto.

2.4.5.3. Atividades Antimicrobianas de Euphorbia tirucalli

A avaliação das atividades antimicrobianas foi realizada com os extratos hexânico e etanólico tanto da parte aérea como das raízes de E. tirucalli, também foi realizada a atividade antimicrobiana dos três constituintes isolados (ET-3, ET-4 e ET-5).

2.4.5.3.1. Cepas

A atividade antimicrobiana dos extratos e dos compostos isolados de E. tirucalli foram avaliados com as bactérias gram-positiva (Staphylococcus aureus ATCC 6538), bacteria gram-negativa (Escherichia coli ATCC 8739) e fungos (Sporothrix brasiliensis UFPE121 e Candida albicans UFPE0231).

80 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

2.4.5.3.2. Preparação do Inóculo

As bactérias e fungos foram cultivados em ágar Mueller Hinton e Dextrose Sabouraud, respectivamente. Após o período de incubação, as colônias de cada linhagem foram assepticamente transferidas para solução salina estéril (0,8% NaCl). A turbidez das soluções foi padronizada com o padrão 0,5 Mac Farland (106 CFU / mL).

2.4.5.3.3. Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Foram realizadas pelo método de microdiluição para identificar a concentração inibitória mínima (CIM) em microplacas de 96 poços em várias concentrações por diluições seriadas da dissolução em 100 μL de meio de cultura Mueller Hinton (Bacteria) e Dextrose Sabouraud (Fungo), com adição de 10 μL de inóculo contendo 106 UFC/mL de cada linhagem, respectivamente. As células foram incubadas num agitador rotativo a 150 rpm a 37°C durante 48 h. Posteriormente, 10 μL de resazurina 0,001% foi adicionado as placas sendo incubadas por 6 horas. O crescimento foi indicado por mudanças de cor do roxo para rosa (ou incolor) e a menor concentração em que a mudança de cor ocorreu, foi tomada como o CIM. Como controle positivo, foram utilizados antibióticos como tetraciclina e fluconazol. O ensaio foi realizado em triplicata de acordo com os padrões do Instituto de Normas Clínicas e Laboratoriais (INCL, 2018).

2.4.5.3.4. Concentração Bactericida e fungicida Mínima (CBM/CFM)

Para a determinação, alíquotas dos poços antes da CIM foram transferidas para placas de Petri contendo Mueller Hinton Agar (MHA) e Sabouraud Dextrose Agar (SDA), incubadas a 37 °C por 48 horas. Considerou-se CBM/CFM a menor concentração a partir da qual não se observou crescimento microbiano após a cultura. Como controle positivo, foram utilizados antibióticos com tetraciclina e fluconazol. O ensaio foi realizado em triplicata de acordo com os padrões do Instituto de Normas Clínicas e Laboratoriais (INCL, 2018).

81 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

2.5. RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÕES 2.5.1. CÁLCULO DE RENDIMENTO DOS EXTRATOS BRUTOS

A partir de 150,38 da parte aérea (estrutura da planta que se encontra acima do solo, neste caso, os talos e folhas) de E. tirucalli foram obtidos 2,34 g do extrato hexânico e 5,38 g do extrato etanólico, o que equivale a rendimentos de 1,55 e 3,58 %, respectivamente. Enquanto a partir das raízes foram obtidos 0,71 g do extrato hexânico e 3,83 g do extrato etanólico, correspondendo respectivamente a 0,47 e 2,54%. A quantidade de material utilizado e extrato obtido de cada parte do material vegetal encontram-se listado no Quadro 9. Assim, de acordo com o observado foi possível constatar que o extrato hexânico da parte aérea de Euphorbia tirucalli apresentou o melhor rendimento, 3,58 %, quando comparado com os demais extratos. Enquanto que o extrato hexânico da raíz foi o que apresentou o menor rendimento de todos, 0,47 %.

Quadro 9 – Quantidades de material botânico seco utilizado nas extrações e rendimento obtido dos extratos ETPAE-H, ETPAE-E, ETR-H e ETR-E da espécie Euphorbia tirucalli. Material Botânico/(g) Denominação* Qtde. de Extrato/(g) Rendimento (%) Parte aérea (150,385) ETPAE-H 2,3405 g 1,55 ETPAE-E 5,3884 g 3,58 Raíz (150,572) ETR-H 0,7137 g 0,47 ETR-E 3,8342 g 2,54 *ETPAE-H – extrato hexânico da parte aérea de Euphorbia tirucalli. ETPAE-E – extrato etanólico da parte aérea de Euphorbia tirucalli. ETR-H – extrato hexânico das raízes de Euphorbia tirucalli. ETR-E – extrato etanólico das raízes de Euphorbia tirucalli.

2.5.2. AVALIAÇÃO DO PERFIL FITOQUÍMICO DO EXTRATO ETANÓLICO DE Euphorbia tirucalli POR ANÁLISE DE LC-MS

Com o intuito de contribuir com a taxonomia vegetal da espécie E. tirucalli, o extrato etanólico das raízes foi analisado por LC-MS objetivando a identificação do perfil químico. Portanto, a partir da análise do padrão de fragmentação obtido por LCMS-MS do cromatograma, Figura 18, em modo negativo foi possível propor as estruturas dos 13 compostos identificados, dente os quais os flavonoides apresentaram- se como classe de metabólitos secundários majoritários presente no extrato etanólico, o que pode estar relacionado ao fato da análise ter sido realizada em modo negativo, favorecendo assim, a desprotonação de flavonoides.

82 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 18 – Cromatograma de LC-MS para avaliar o perfil dos compostos presentes no extrato etanólico das raízes de Euphorbia tirucalli.

Fonte: Própria, 2019.

Dentre os 13 compostos identificados podem citar: ácido gálico, dihidroxi benzóico, ácido 4-O-metil gálico, ampelopsina, isoquercitrina, rutina, ácido elágico, miricetina, avicularina, quercitrina, tricetina, ácido 3,3'-dimetoxielágico-4-O-α- raminopiranosídeo e quercetina (JIN et al., 2016, LAN, et al., 2013, CHUNG, et al., 2015, ABU-REIDAH, et al., 2015; CHERNONOSOV, et al., 2017; DE NISCO, et al., 2013; MITANI, 2007; VERDU et al., 2013; ZHOU, et al., 2011). O Quadro 10 apresenta a lista dos compostos identificados a partir da análise LC-MS junamente com os seus tempos de retenção (RT), massa detectada no modo de ionização negativo, fórmula molecular, assim como os íons de fragmentos MS/MS. As estruturas dos flavonoides foram facilmente identificadas por comparação, a partir de fragmentos caracteristos desta classe de compostos, em que foi observada formação agliconas com m/z de: 300, 301, e 317, por exemplo.

83 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Quadro 10– Compostos identificados no extrato das raízes da espécie Euphorbia tirucalli usando análise de LC-MS/MS em modo de ionização negativo. Picos Rt [M – H]– MS Identificação Fórmula Referências (Composto) (min) (m/z) (m/z) (Composto) Molecular

1 7,814 169,02 125,00 ácido gálico C7H6O5 (Jin, et al., 2016)

2 11,366 153,06 109,01 ácido dihidroxi C7H6O4 (Jin, et al., benzóico 2016)

3 15,962 183,12 124,07; 140,05; ácido 4-O- C8H8O5 (Lan, et al., 168,04 metilgálico 2013)

4 20,559 319,23 301,24; 193,08; ampelopsina C15H12O8 (Chung, et 151,06; 175,09 al., 2015)

5 36,262 463.17 300,16; 271,14; isoquercitrina C21H20O12 (Zhou et al., 255,12 2011)

6 36,168 609,20 609,19; 463,22; rutina C27H30O16 (Chen et al., 301,25 2015)

7 36,025 301,99 302,15; 229,14 ácido elágico C14H6O8 (Braunberge r et al., 2013)

8 38,425 317,22 317,17; 179,07; miricetina C15H10O8 (Abu-reidah 151,05 et al., 2015)

9 38,491 433,26 433,22; 317,21; avicularina C20H18O11 (Verdu et 259,11 al., 2013)

10 39,682 447,16 301,17; 271,12; quercitrina C21H20O11 (Verdu et 179,09 al., 2013)

6 36.293 609.18 609.19; 463.22; rutina C27H30O16 (Chen et al., 301.25 2015)

11 44,055 301,19 273,13; 299,10; tricetina C15H10O7 (Abu-reidah 179,07; 151,07 et al., 2015)

12 44,168 475,26 301,21; 299,26; ácido 3,3'- C22H20O12 (Braunberge 179,02 dimetoxielágico-4- r et al., O-α- 2013) raminopiranosídeo

13 45,600 301,25 273,04; 179.12; quercetina C15H10O7 (Chen et al., 151,08; 121,09 2015) Fonte: Própria, 2019.

Os espectros de massa dos quinzes compostos identificados, correspondentes às moléculas desprotonadas [M-H]-, bem como suas respectivas estruturas podem ser

84 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau observados na Figura 19, em que foi possível analisar os íons resultantes de suas fragmentações. A identificação dos compostos através da interpretação dos espectros de massa foi possível a partir do conhecimento de alguns padrões de fragmentações. No espectro HPLC-MS, por exemplo, a perda 163 Dalton (Da) é indicativa da presença de hexose (glicose ou galactose), a perda de 133 Da sugere a presença de pentoses (xilose ou arabinose) e a perda de 147 Da pode ser atribuída a presença de uma ramnose, as quais geram agliconas com m/z 301 e 300 característicos de quercetina. A perda de 309 Da é indicativa de uma estrutura dissacarídica do tipo rutinosídeo resultando em agliconas com m/z 301 e 300 de quercetina. Cabe ainda salientar que os pares de íons gerados são caracteríticos de clivagem homolíticas e heterolíticas (BRITO, et al., 2014). As estruturas dos flavonoides foram ainda confirmadas a partir de alguns padrões de fragmentações característicos dessa classe de compostos. O íon m/z 179 resultante de uma fissão de retro Diels-Alder (RDA) entre as posições O-C2 e C2-C3, e o íon m/z 151 também resultante de fissão RDA entre as posições O-C2 e C3-C4 (CELLI, et al., 2011; DAVIS, et al., 2007).

Figura 19 – Espectros de massas com fragmentos MS dos compostos identificados de 1-15 e suas respectivas estruturas. (1) ácido gálico

(2) ácido O-dihidroxi benzóico

85 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

(3) ácido 4-O-metil-gálico

(4) ampelopsina

(5) isoquercitrina

86 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

(6) rutina

(7) ácido elágico

(8) miricetina

87 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

(9) avicularina

(10) quercitrina

(11) tricetina

(12) ácido 3,3'-dimetoxielágico-4-O-α-raminopiranosídeo

88 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

(13) quercetina

Fonte: Própria, 2019.

2.5.3. ISOLAMENTO E DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE Euphorbia tirucalli 2.5.3.1. Determinação Estrutural de ET-1

Tratamento cromatográfico da fração ETPAE-H-C-insap resultante da reação de saponificação do extrato hexânico da parte aérea de E. tirucalli, levou ao isolamento de um sólido branco amorfo (0,014 g) com ponto de fusão de 186-188 °C, (189-191 °C Lit.) (LIU, et al., 2011), observado na fração ETPAE-H-C-insap-HC-(3), o qual foi lavado com uma mistura binária de hexano/clorofórmio 90%, analisado por CCD, e denominado de ET-1. O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 20), mostrou uma banda larga em 3277 cm-1, que corresponde ao estiramento de ligação O-H, caracterizando a presença de grupo hidroxila bem como absorções entre 2945 cm-1 referentes a deformação axial de C-H de alcanos. Também foi observado bandas esqueletais em 1100 cm-1 de C-O de álcool.

89 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 20 – Espectro na região do infravermelho referente a estrutura da ET-1.

Fonte: Própria, 2019.

1 O espectro de RMN H (500 MHz, CDCl3, Figura 21) de ET-1, revelou sinais característicos de hidrogênios de terpenos na região entre δ 0,5 e 2,25 ppm, correspondentes de hidrogênios ligados a carbono metílicos, metilênicos e metinos. Também, foi observado um tripleto em δ 5,24 ppm (J = 11,4 Hz), relativo ao hidrogênio olefínico (H-12) e ainda um dubleto de dubleto em δ 3,25 ppm (J = 4,2; 9,0 Hz), correspondendo ao hidrogênio carbinólico (H-3) que corroboram na caracterização de uma estrutura de triterpenóides do tipo 3β-OH.

90 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

1 Figura 21 – Espectro de RMN H da ET-1 (CDCl3, 500 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

13 No espectro de RMN C (125 MHz, CDCl3 Figura 22), foi observado a presença de trinta linhas espectrais características de composto triterpeno: δ 15,6964; 15,7761; 17,0332; 18,6028; 23,7536; 23,8991; 26,1943; 26,3906; 27,1830; 27,4752; 28,3116; 28,5975; 31,2860; 32,9025; 37,3720; 38,8322; 47,0734; 47,4849; 47,8797; 55,4289; 79,2559; 121,9640 e 145,4112. Assim, o deslocamento químico em δ 145,4112 ppm correspondente a carbono olefínico não hidrogenado (C-13), bem como um sinal em δ 121,9640 ppm que evidencia o carbono olefínico hidrogenado (C-12), estes dois sinais são característicos da dupla ligação da estrutura de triterpenos pentacíclico, β-amirina. A análise do espectro de RMN DEPT 135° confirmou a presença de cinco sinais de carbono do tipo metinos, dez sinais de carbono metilênicos e oito sinais de carbonos metílicos, enquanto os sete sinais característicos de carbono não hidrogenado não foram observados.

91 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

13 Figura 22 – Espectro de RMN C da ET-1 (CDCl3, 125 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

A análise dos espectros de RMN 1H, 13C e DEPT 135° obtidos, Figura 23, bem como por comparação destes com a literatura, Quadro 11, confirmada a estrutura do composto isolado.

Figura 23 – Espectro de RMN DEPT 135° de ET-1 (CDCl3, 125 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

92 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

1 13 Quadro 11 – Dados de RMN de H e C (CDCL3, 500 MHz) de ET-1 e comparação com os dados da literatura (CDCL3, 500 MHz). RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) ET-1 ET-1 Literatura Literatura (DIAS, (DIAS, 2011) 2011) C 4 38,83 38,5 8 40,03 39,8 10 37,18 36,9 13 145,41 145,2 14 41,96 41,7 17 32,90 32,6 20 31,29 31,0 CH 3 79,25 3,25 (1H, dd, J = 4,2; 9,0) 79,3 3,15 (1H, dd, J = 4,4; 10,8) 5 55,42 0,79 (1H, d, J = 11,4) 55,1 0,68 (1H, d, J = 11,0) 9 47,87 47,6 12 121,96 5,24 (1H, t, J = 3,0) 121,7 5,12 (1H, t, J = 3,2) 18 47,49 47,2 CH2 1 38,99 38,7 2 27,47 27,2 6 18,60 18,6 7 32,70 32,4 11 23,75 23,6 15 27,18 26,2 16 26,19 26,1 19 47,07 2,10 (2H, dd, J = 4,5; 13,5) 46,8 1,93 (2H, dd, J = 4,0; 13,7) 21 34,96 34,7 22 37,37 2,00 2H, (2H, m) 37,1 1,80 (2H, m) CH3 23 28,31 0.88 (3H, s) 28,0 0,77 (3H, s) 24 15,69 1,02 (3H, s) 15,4 0,90 (3H, s) 25 15,77 0,84 (3H, s) 15,4 0,73 (3H, s) 26 17,03 1,04 (3H, s) 16,8 0,93 (3H, s) 27 26,39 1,30 (3H, s) 25,9 0,93 (3H, s) 28 28,59 1,18 (3H, s) 28,4 1,07 (3H, s) 29 33,52 0.99 (3H, s) 33,8 0,87 (3H, s) 30 23,89 0,92 (3H, s) 23,7 0,80 (3H, s) Fonte: Própria, 2019.

Portanto, o composto isolado trata-se de um triterpeno pentacíclico da classe dos oleonanos de forma molecular C30H50O conhecido como β-amirina ou 3-β-hidroxi- oleon-12-en-3ol, amplamente encontrado na literatura no gênero Euphorbia, e também já relatado na espécie Euphorbia tirucalli, Figura 24.

93 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 24 – Estrutura química de ET-1, β-amirina, (3-β-hidroxi-oleon-12-en-3ol).

Fonte: Própria, 2019.

2.5.3.2. Determinação Estrutural de ET-2

O composto ET-2 foi obtido da fração ETR-E-A-(3) após tratamento cromatográfico do tipo filtrante, empregando gel de sílica 60(Φ μm 63-200). O composto apresentou-se como um sólido branco amorfo, ponto de fusão 261-263 ºC, (261-262 ºC Lit.) (HATTORI, 1989). O espectro de absorção na região do infravermelho, Figura 25, demostrou absorção entre 3381 cm-1, correspondente a deformação axial de ligação O-H, absorção em 1732 cm-1 de carbonila de ácido C=O, absorção em 1355 cm-1 referentes aos estiramentos da ligação C-O de ácido carboxílico, e ainda foram observadas vibrações de C=C de aromáticos em 1601 cm-1.

Figura 25 – Espectro na região do infravermelho referente a estrutura da ET-2.

Fonte: Própria, 2019.

94 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

No espectro de RMN 1H (300 MHz, DMSO, Figura 26), de ET-2 verificou-se a presença de um singleto em  7,4 ppm (2H), atribuídos aos hidrogênios aromáticos H-2 e H-6. Ainda foi observado um simpleto em  4,0 ppm (3H), referentes aos hidrogênios do grupo metoxila (4-OCH3).

Figura 26 – Espectro de RMN 1H da ET-2 (DMSO, 500 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

A análise do espectro de correlação RMN-HSQC, Figura 27, da substância ET- 2, corroborou com as correlações de hidrogênios e seus respectivos carbonos.

Figura 27 – Espectro de RMN de correlação heteronuclear 1H 13C-HSQC de ET-2, (DMSO, 125 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

95 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

O espectro de RMN 13C DEPTq (125 MHz, DMSO, Figura 28), mostrou basicamente, cinco sinais espectrais. Em  61,0 ppm foi observado sinal característico de grupo metoxila, em  111,7 olefínico (C-2 e C-6) sinal referente a carbono metina, além de regiões características de carbonos oxigenados em  140,2 (4-OCH3), 151,2 (C-3 e C-5) e 158,1 (C=O) ppm.

Figura 28 – Espectro de RMN 13C da ET-2 (DMSO, 125 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

A posição do grupo metoxila no anel aromático foi definitivamente estabelecida pelos acoplamentos observados no espectro de correlação heteronuclear a longa distância 1H, 13C-HMBC, Figura 29. Os hidrogênios H-2 e H-6 mostrou correlação a

3 três ligações ( JC,H) com os carbonos C-2/6 ( 111,7), C-4 ( 140,2) e COOH ( 158,1)

2 e a duas ligações ( JC,H) com o carbono C-3/5 ( 151,2). Ainda foi evidenciado 3 correlação a três ligações ( JC,H) dos hidrogênios da metoxila (OCH3) com o carbono em 140,2 (C-4) ppm.

96 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 29 – Espectro de RMN de correlação heteronuclear 1H, 13C-HSQC de ET-2, (DMSO, 125 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

Com base nos dados discutidos até o momento, bem como os dados disponíveis na literatura, Quadro 12, pode-se confirmar para ET-2 a estrutura de um derivado de ácido gálico, o ácido 4-O-metil-gálico, Figura 30.

97 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Quadro 12 – Dados de RMN de 1 H e 13C (DMSO, 500 MHz) de ET-2 e comparação com os dados da literatura (DMSO, 400 MHz) (ABHISHEK, et al., 2019). RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) (Int., mult., JH,H) (int., mult., JH,H) ET-2 Literatura (ABHISHEK, et al., 2019) C 1 - 121,4 3 151,2 146,4 5 151,2 146,4 4 140,2 139,7 CH 2 111,7 7,47 (1H, s) 110,0 7,03 (1H, s) 6 111,7 7,47 (1H, s) 110,0 7,03 (1H, s) C=O 158,1 169,0 OCH3 61,06 4,02 (3H, s) 52,2 3,80 (3H, s) Fonte: Própria, 2019.

Figura 30 – Estrutura química de ET-2, ácido 4-O-metil-gálico.

Fonte: Própria, 2019.

2.5.3.3. Determinação Estrutural de ET-3

Tratamento cromatográfico em coluna sephadex aplicado a fração ETR-E-A-(5) possibilitou o isolamento de ET-3, como um sólido amarelo, ponto de fusão de 145 - 147 °C (245-246 °C Lit.) (JEON et al., 2008), e solúvel em metanol. No espectro de infravermelho, Figura 31, foi possível observar uma banda larga em 3255 cm-1 que corresponde a estiramento de ligação O-H. Ainda foi possível observar bandas na região de 1630 cm-1 de estiramento de grupo C=O de cetona conjugada e uma banda de intensidade média em 1159 cm-1 correspondente ao estiramento do grupo C-O. O espectro também apresentou banda em 1469 cm-1 características de C=C de aromáticos.

98 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 31 – Espectro na região do infravermelho referente a estrutura da ET-3.

Fonte: Própria, 2019.

O espectro de RMN 1H (500 MHz, DMSO, Figura 32), de ET-3 mostrou dois dubletos característicos de hidrogênios aromáticos em 5,84 (d, H-8, J = 1,2 Hz) e 5,88 (d, H-6, J = 1,2 Hz) meta-posicionados do anel A de flavonoide além da presença de dupletos em 4,40 (d, H-3) e 4,87 (d, H-2). Também foi observado um simpleto integrado para dois hidrogênios em 6,39 ppm (s, H-2’ e H-6’) característicos de hidrogênios aromáticos referentes ao anel B de flavonoides.

Figura 32 – Espectro de RMN 1H da ET-3 (DMSO, 500 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

99 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

A análise dos dados do espectro de RMN 13C de ET-3 (125 MHz, DMSO, Figura 33), permitiu verificar treze sinais espectrais. Destes, cinco são característicos de carbonos mono-hidrogenados ( 83,48; 71,85; 96,36; 95,36 e 107,21), sendo um oxigenado ( 71,85ppm) referente ao C-3, e oito de carbonos não hidrogenados, dos quais cinco são oxigenados (197,61; 163,59; 167,59; 145,93 e 133,71).

Figura 33 – Espectro de RMN 13C da ET-3, DMSO, 125 MHz.

Fonte: Própria, 2019.

1 As correlações existentes no espectro de RMN-HSQC ( JC,H), Figura 24, fizeram atribuições dos sinais de carbonos hidrogenados pertencentes a cada anel inequivocamente.

100 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 34 – Espectro de RMN de correlação heteronuclear 1H, 13C-HSQC de ET-3, (DMSO, 500 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

As correlações observadas no espectro de RMN-HMBC (500 MHz, DMSO, Figura 35), corroborou com a identificação do composto proposto, ao revelar os

2 acoplamentos do hidrogênio H-2 a duas ligações ( JC,H) com os carbonos C-1’( 127,39) e C-3 ( 71,85), ainda foi evidenciado os acoplamento também a duas ligações do hidrogênio H-3 com os carbonos C-2 e C-4 . Os hidrogênios H-2’/H-6’ acoplou a duas ligações com o carbono C-3’/C-5’ (145,93). Enquanto o hidrogênio H-6 mostrou acoplamento com os carbonos C-5 ( 163,59) e C-7 ( 167,59) a duas ligações e os hidrogênios H-8 apresentou acoplamento com os carbonos C-7 ( 167,59) e C-9 ( 162,75).

101 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 35 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C-HMBC de ET-3 (DMSO, 500 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

A reunião dos dados espectroscópicos de ET-3 identificou para este composto a estrutura compatível com a de um flavonoide. Os dados de RMN 13C da literatura também corroborou com a estrutura proposta (WOO, et al., 2012), Quadro 13.

Quadro 13 – Dados de RMN de 1 H e 13C (DMSO, 500 MHz) de ET-3 e comparação com os dados da literatura (H2O, 125 MHz) (WOO, et al., 2012). RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) δC (ppm) δH (ppm) (Int., mult., JH,H) ET-3 Literatura (CHATURVEDULA & HUANG, 2012) C 4 197,6 197,7 - 5 163,5 163,4 - 7 167,5 166,8 - 9 162,7 162,6 - 10 100,5 100,5 - 1’ 127,3 127,2 - 3’ 145,9 145,7 - 4’ 133,7 133,5 - 5’ 145,9 145,7 - CH 2 83,4 4,87 (1H, d, J =10,8) 83,3 4,91 (1H, d, J =12,6) 3 71,8 4,40 (1H, d, J =10,8) 71,7 4,42 (1H, dd, J=12,6; 6,4) 6 96,3 5,88 (1H, d, J =1,9) 95,9 5,86 (1H, d, J = 2,4) 8 95,3 5,84 (1H, d, J =1,9) 95,0 5,91(1H, d, J =2,1) 2’ 107,2 6,39 (2H, s) 106,9 6,40 (1H, s) 6’ 107,2 6,39 (2H, s) 106,9 6,40 (1H, s) Fonte: Própria, 2019.

102 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Portanto, o composto isolado trata-se de um flavonoide do tipo flavanonol, a ampelopsina, isolado pela primeira vez na espécie Euphorbia tirucalli, Figura 36.

Figura 36 – Estrutura química de ET-3, Ampelopsina (dihidromicetina).

Fonte: Própria, 2019.

2.5.3.4. Determinação Estrutural de ET-4

Tratamentos cromatográficos sephadex aplicados a fração ETR-E-A-(5) possibilitou o isolamento de ET-4. O composto apresentou-se como um sólido amarelo amorfo ponto de fusão > 300ºC, (352-355 °C Lit.) (LIN, et al., 2008) e solúvel em metanol. O espectro de absorção na região do infravermelho, Figura 37, exibiu banda de absorção em 3255 cm-1 de estiramento de ligação O-H. também foram observadas bandas na região de 1740 cm-1 de carbonila de cetona conjugada e em 1164 cm-1 de grupo C-O. Na região de 1513 cm-1 foi observada absorção característica de C=C de aromáticos.

Figura 37 – Espectro na região do infravermelho referente à estrutura da ET-4.

Fonte: Própria, 2019.

103 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

No espectro de RMN 1H (500 MHz, DMSO, Figura 38), de ET-4 foi observado dois dupletos, o primeiro em  6,17 (d, H-6) do hidrogênio ligado ao carbono C-6 e o outro em  6,37 (d, H-8) referentes ao carbono C-8, os quais apresentaram acoplamento meta. Ainda, com base nas análises RMN 1H foi observado um simpleto  7,22 característicos de hidrogênios aromáticos, integrado para dois hidrogênios (H-2’/H-6’).

Figura 38 – Espectro de RMN 1H da ET-4 (DMSO, 500 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

No espectro de RMN 13C (125 MHz, DMSO, Figura 39), foi observado a presença de doze sinais espectrais, sendo três sinais característicos de carbonos mono- hidrogenados ( 98,43; 93,45 e 107,36) e nove sinais de carbonos não hidrogenados (136,07; 175,94; 160,83; 164,17; 156,30; 103,09; 120,99; 145,89; 147,01 e 145,89), destes, cinco são característicos de carbonos oxigenados ( 136,07; 145,89; 147,01; 160,83 e 164,17) além de um sinal de carbono carbonílico em  175,94 (C-4).

104 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 39 – Espectro de RMN 13C DEPTq de ET-4 (DMSO, 125 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

A identificação carbonos hidrogenados foram observados a partir da análise do

RMN-HSQC, Figura 40, conforme as seguintes correlações: o dupleto em δH 6,17 ppm

(H-6) com o sinal de carbono em δC 98,43 (C-6) e o sinais do dupleto em δH 6,37 (H-8) com o sinal de carbono em δC 93,45 (C-8). Ainda foi observada a correlação dos hidrogênios em δH 7,22 (H-2’/H-6’) com o carbono em δC 107,36 (C-2’/C-6’).

105 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 40 – Espectro de correlação heteronuclear RMN 2D-HSQC (DMSO, 500 MHz) de ET- 4.

Fonte: Própria, 2019. Portanto, com base nos dados de RMN de 1H e 13C uni e bidimensional, bem como, com dados relatados na literatura, Quadro 14, inferiram para ET-4 a estrutura de um flavonoide do tipo flavonol, inédito na espécie Euphorbia tirucalli, conhecido como miricetina, Figura 41.

106 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Quadro 14 – Dados de RMN de 1 H e 13C (DMSO, 500 MHz) de ET-4 e comparação com os dados da literatura (DMSO-d6, 500 MHz) (MOK & LEE, 2013). RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) δC (ppm) δH (ppm) (Int., mult., JH,H) ET-4 Literatura (MOK & LEE, 2013) C 2 137,0 - 146,8 - 3 136,0 - 135,8 - 4 175,9 - 175,7 - 5 160,8 - 160,7 - 7 164,1 - 163,9 - 9 156,3 - 156,0 - 10 103,0 - 103,0 - 1’ 120,9 - 120,8 - 3’ 145,8 - 145,7 - 4’ 136,0 - 135,9 - 5’ 145,8 - 145,7 - CH 6 98,4 6,17 (1H, d, J=1,1) 98,1 6,18 (d, J=2,0) 8 93,4 6,37 (1H, d, J=1,1) 93,2 6,37 (d, J=2,0) 2’ 107,3 7,22 (1H, s) 107,2 7,24 (s) 6’ 107,3 7,22 (1H, s) 107,2 7,24 (s) Fonte: Própria, 2019.

Figura 41 – Estrutura química de ET-4, miricetina.

Fonte: Própria, 2019.

2.5.3.5. Determinação Estrutural de ET-5

A ET-5 foi obtida da fração ETR-E-AM-(7) após sucessivos tratamentos de purificação cromatográficos em colunas, utilizando-se gel sílica (flash). O composto foi obtido como um sólido branco, amorfo, com ponto de fusão 185-187 °C (188 °C Lit.) (SIRAT, et al., 2010), pouco solúvel na maioria dos solventes comuns, exceto em

DMSO e de forma molecular C20H20O12. No espectro de absorção na região do infravermelho, Figura 42, foi observado uma banda larga em 3300 cm-1, característica de estiramento da ligação O-H de hidroxila, outra banda em 1357 cm-1 característico de estiramento de ligação C-O bem como sinais típicos de sistema aromático entre 1608- 1487 cm-1 condizente com estiramento de ligação C=C. Ainda foi observado absorção

107 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau em 1738 cm-1 referente ao estiramento C=O, evidenciando a existência de carbonila conjugada de lactona.

Figura 42 – Espectro na região do infravermelho referente a estrutura de ET-5.

Fonte: Própria, 2019.

A análise do espectro RMN 1H (300 MHz, DMSO, Figura 43), revelou a presença de dois simpletos em δ 7,78 ppm (s, H-5) e 7,53 pm (s, H-5’) na região de aromáticos, além de um simpleto em δ 5,58 ppm (s, H-1’’) referente ao hidrogênio anoméricos. Também foi evidenciado dois picos intensos, integrado para três hidrogênio cada em δ 4,05 e 4,07 ppm, indicando a presença de grupamento metoxilas. Ainda se constatou a presença de um dupleto em 1,14 ppm (d, H-6’’, j = 6,1) de grupamento metila além de sinais na faixa de δ 3,54 a 3,96 ppm característicos de uma unidade de açúcar, relacionado aos hidrogênios H-2’’, H-3’’, H-4’’ e H-5’’.

108 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 43 – Espectro de RMN 1H de ET-5 (DMSO, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

A atribuição dos hidrogênios da unidade de açúcar foi baseada na análise do espectro de MNR bidimensional de correlação homonuclear 1H, 1H – COSY, Figura 44, através dos acoplamentos entre os sinais dos respectivos hidrogênios. Onde foi possível observar acoplamento entre os hidrogênios em δ 1,14 ppm (H-6’’) e os hidrogênios em δ 3,72; 3,37 e 3,54 ppm(H-3’’, H-4’’ e H-5’’) o que permitiu identificado o glicosídeo como ramnose através dos seus sinais de prótons.

Figura 44 – Espectro de RMN bidimensional de correlação homonuclear 1H, 1H – COSY de ET-5 (DMSO, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

109 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

O espectro de RMN 13C de ET-5 (300 MHz, DMSO, Figura 45), mostrou 22 linhas espectrais, das quais foi possível observar a presença de 16 sinais de carbonos de zona baixa no espectro de RMN 13C, incluindo dois sinais de carbono olefina (=CH–) δ 111,89 (C-5) e 111,89 ppm (C-5’), dois carbono de éster ( –COOR) em δ 158,47 (C-7’) e 158,63 (C-7), seis carbonos oxigenados de carbono aromático em δ 141,26; 142,07; 150,44; 141,78; 140,40 e 153,11 (C-2, C-3, C-4, C-2’, C-3’, C-4’) respectivamente, quatro carbono quaternário aromático em δ 112,18 (C-1); 111,21 (C-1’); 114,32 (C-6) e

112,91 (C-6’) além de dois carbonos metoxilas em δ 61,19 (OCH3-3’) e 61,80 (OCH3- 3). Ainda foi possível evidenciar a presença de cinco deslocamentos químico de carbonos metina oxigenado em δ 100,01; 70,24; 70,62; 71,73 e 70,48 ppm, referentes aos carbonos C-1’’, C-2’’, C-3’’, C-4’’ e C-5’’, bem como um sinal de metila em δ 18,10 ppm indicando a existência de um substituinte glicosídeo, do tipo ramnose.

Figura 45 – Espectro de RMN 13C de ET-5 (300 MHz, DMSO).

Fonte: Própria, 2019.

A análise comparativa com o espectro de RMN 13C-DEPTq, Figura 46, permitiu identificar doze carbonos sp2, sendo dez não hidrogenados, dos quais seis são oxigenados, e dois carbonos mono-hidrogenados; também foi possível constatar a presença de oito carbonos sp3, sendo cinco metínicos e três metílicos (SILVERTEIN et al., 2017).

110 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Figura 46 – Espectro de RMN 13C-DEPTq (DMSO, 300 MHz) de ET-5.

Fonte: Própria, 2019.

Os carbonos hidrogenados foram identificados por RMN-HSQC, Figura 47, através das seguintes correlações: o dupleto em δH 1,14 ppm (H-6’’) com o sinal de carbono em δC 18,10 (C-6’’) e os sinais hidrogêneo em δH 3,54 (H-5’’), 3,37 (H-4’’),

3,72 (H-3’’), 3,96 (H-2’’), 5,58 (H-1’’), 7,78 (H-5), 7,53 (H-5’), 4,05 (OCH3-3’) e 4,07

(OCH3-3) com os sinais de carbono em δC 70,48 (C-5’’), 71,73 (C-4’’), 70,62 (C-3’’),

70,24 (C-2’’), 100,01 (C-1’’), 111,89 (C-5), 111,89 (C-5’), 61,19 (OCH3-3’) e 61,80

(OCH3-3C-9), respectivamente.

Figura 47 – Espectro de correlação heteronuclear RMN 2D-HSQC (DMSO, 300 MHz) de ET- 5.

Fonte: Própria, 2019.

111 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

A estrutura de ET-5 foi confirmada através da análise do espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear a mais de uma ligação (1H, 13C-HMBC), Figura 48. Onde, dentro das correlações observadas, pôde-se constatar o acoplamento entre o hidrogênio em δ 1,14 (H-6’’) a duas ligações como carbono em δ 71,73 (C-4’’). O acoplamento entre o hidrogênio em δ 7,78 (H-5) a duas ligações como carbono em δ 150,44 (C-4) e em 114,32 (C-6), a três ligações com o carbono em δ 112,18 (C-1), 142,07(C-3) e 158,63(C-7) e o acoplamento entre o hidrogênio em δ 7,53 (H-5’) a duas ligações com os carbonos em δ 153,11 (C-4’) e 112,91 (C6’) e três ligações com os carbonos em δ 111,21 (C-1’), 140,40 (C-3’) e 158,47 (C-7’).

Figura 48 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C-HMBC (DMSO, 300 MHz) de ET-5.

Fonte: Própria, 2019.

A reunião de todos os dados espectroscópicos permitiu confirmar a estrutura da ET-5. Os dados referentes aos valores de deslocamento químico de todos os carbonos e hidrogênios, bem como seus acoplamentos encontram-se no Quadro 15.

112 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Quadro 15 – Dados de RMN de 1 H e 13C (DMSO, 300 MHz) de ET-5 e comparação com os dados da literatura (DMSO-d6, 400 MHz) (YE, et al., 2007). RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) δC (ppm) δH (ppm) (Int., mult., JH,H) ET-2 Literatura (YE, et al., 2007) C 1 112,18 111,0 2 141,26 140,9 3 142,07 140,1 4 150,44 150,2 6 114,32 111,9 7 158,63 158.2 1’ 111,21 114,0 2’ 141,78 141,5 3’ 140,40 141,8 4’ 153,11 152,8 6’ 112,91 112,6 7’ 158,47 158,3 CH 5 111,89 7,78 (1H; s) 111,6 7,51 5’ 111,89 7,53 (1H; s) 111,7 7,78 1’’ 100,01 5,58 (1H; s) 99,8 5,57 (s) 2’’ 70,24 3,96 (1H; s) 70,4 3’’ 70,62 3,72 (1H; d, J = 8,7) 70,2 4’’ 71,73 3,72 71,5 5’’ 70,48 3,54 (1H; m) 70,0 CH3 6’’ 18,10 1,14 (3H; d; J = 6,1) 17,9 OCH3 3’ 61,19 4,05 (3H; s) 61,5 4,07 3 61,80 4,07 (3H; s) 60,9 4,06 Fonte: Própria, 2019.

A análise de todos os dados obtidos, e a comparação destes com os disponíveis na literatura para uma substância similar (YE, et al., 2007), permitiu identificar o composto isolado, ET-5, como um derivado de ácido elágico, ácido 3,3'- dimetoxielágico-4-O-α-raminopiranosídeo, Figura 49, inédito na espécie E. tirucalli.

Figura 49 – Estrutura química ET-5, ácido 3,3'-dimetoxielágico-4-O-α-raminopiranosídeo.

Fonte: Própria, 2019.

113 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

2.5.4. AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS 2.5.4.1. Atividade Sequestradora de radicais dos Extratos ETPAE-E, ETPAE-H, ETR-E e ETR-H

A análise dos resultados da atividade sequestradora de radicais livres dos extratos brutos de E. tirucalli indicou que os extratos etanois foram os mais eficientes sequestradores de radicais DPPH e ABTS entre os extratos. Os resultados das atividades estão demonstrados como IC50, Quadro 16.

A medida de IC50, expressa a quantidade de antioxidante necessária para reduzir em 50 % a concentração inicial dos radicais, assim, conforme observado no quadro abaixo, os valores obtidos para os extratos ETPAE-E, ETPAE-H, ETR-E e ETR-H frente ao DPPH foram respectivamente, 252,64; 2147,5; 78,27 e 1066,0 μg/mL. O que nos levar a constatar que o extrato ETR-E apresentou a melhor atividade antioxidante, ou seja, serão necessários 78,27 μg/mL de extrato bruto para redução de 50 % do DPPH, valor este relativamente significante quando comparado a amostra padrão,

Trolox, o qual apresentou IC50 de 49,14 0 μg/mL. Portanto, quanto maior o consumo de

DPPH por uma amostra, menor sua IC50 e consequentemente, maior a sua atividade antioxidante (SOUSA et al, 2007).

Quanto a avaliação frente ao radical ABTS, as medidas de IC50 foram 518,75; 221,22 e 2266,33 μg/mL, para os extratos ETPAE-E, ETR-E e ETR-H, respectivamente, enquanto que para o extrato ETPAE-H não foi determinado nenhum valor. Quando comparado aos demais extratos, o extrato ETR-E apresentou ação antioxidante mais significativa frente ao radical ABTS com IC50 221,22 μg/mL. Este resultado vai de encontro ao obtido para o radical DPPH, pois quanto maior o consumo de ABTS por uma amostra, menor sua IC50 e consequentemente maior a sua atividade antioxidante (PASQUINI-NETTO et al, 2012). Estes resultados preliminares podem ser atribuídos aos constituintes químicos presentes nos extratos, assim, como os extratos etanóis geralmente, têm como constituintes químicos compostos fenólicos com variado número de ligantes hidroxilas e insaturações nas ligações carbono-carbono, estes quando são usados como antioxidantes absorvem radicais livres e inibem a cadeia de iniciação ou interrompem a propagação das reações oxidativas promovidas pelos radicais livres sendo, portanto são mais eficientes como antioxidantes (SILVA, et al., 2010; ÂNGELO & JORGE, 2007).

114 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

Quadro 16 – Dados referentes aos resultados da atividade antioxidande frente aos radicais DPPH e ABTS.

AMOSTRA DPPH IC50 (μg/mL) ABTS•+ IC50 (μg/mL) ETPAE-E 252,64 518,75 ETPAE-H 2147,50 ND* ETR-E 78,27 221,22 ETR-H 1065,00 2266,33 ET-3 114,25 163,75 ET-4 22,62 53,22 ET-5 798,00 1668,6 Padrão Trolox 49.14 112,15 ND* = não determinado (não inibiu os radicais livres).

Os resultados das atividades sequestradoras de radicais livres para os compostos isolados indicaram claramente que o composto ET-4 apresentou melhor inibição de radicais livres com IC50 de 22,62 μg/mL para o DPPH e de 53,22 μg/mL para o ABTS, mostrando-se assim maior eficiência que o padrão Trolox o qual apresentou IC50 de 49,12 para o DPPH e de 112,15 para o ABTS. O composto ET-3 também mostrou uma boa eficiência quando comparado com padrão, apresentando IC50 de 114,25 e 163,75 para o DPPH e ABTS, respectivamente. Quanto ao composto ET-5, porém, não foi observada a mesma tendência de inibição, para o qual foram registrados valores de IC50 de 798,00 60 para o DPPH e de 1668 para ABTS. A baixa eficiência de eliminação de radias do composto ET-5 pode estar relacionada à presença do grupo glicosídeo, uma vez que o açúcar hexose é bastante volumoso podendo inteferir na capitura de radicais e assim apresentar menor efeito (SABUDAK, et al., 2019).

2.5.4.2. Atividade Antimicrobiana dos Extratos e dos Compostos Isolados ET-3, ET-4 e ET-5

Os resultados preliminares das atividades antibacteriana e antifúngica dos extratos e dos compostos isolados (ET-3, ET-4 e ET-5) estão expressos no Quadro 17. Conforme observado, apenas os extratos etanólicos das raízes e da parte aérea de E. tirucalli (ETR-E e ETPAE-E, respectivamente) foram identificados como potenciais agentes antibacterianos e antifúngicos por inibirem o crescimento ou matarem as cepas de bactérias e fungos tais como: S. aureus, E. coli, S.brasiliensis e C. Albicans, estes resultados estão de acordo com os testes realizados por Vale e Orlanda (2011). Contudo, dentre os quatro extratos, o extrato etanólico das raízes apresentou a melhor atividade, com concentrações inibitória mínima (CIM) de 512 e 256 μg/mL contra S. aureus e E.

115 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau coli, respectivamente, e de 1024 μg/mL contra S. brasiliensis e C. albicans. A melhor eficiência nas atividades antimicrobianas deste extrato pode ser atribuída a presença de seus constituintes químicos, em especial os compostos fenólicos, os quais têm sido estudados devido as suas propriedades antibacteriana e antifúngicas, uma vez que estes podem alterar a permeabilidade da célula microbiana, danificar a membrana citoplasmática e até mesmo levar a célula à morte (VIEITEZ, et al., 2018).

Quadro 17 – Atividade antimicrobiana expressa como concentração inibitória mínima (CIM), concentração bactericida mínima (CBM) e concentração fungicida mínima (CFM). S.aureus E. coli S. brasiliensis C. albicans ATCC 6538 ATCC 8739 UFPE121 UFPE0231 Strains CIM CBM CIM CBM CIM CFM CIM CFM μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL ETPAE-E 1024 2048 512 1024 2048 - 1024 2048 ETPAE------H ETR-E 512 1024 256 512 1024 2048 1024 2048 ETR-H ------ET-3 8 16 16 32 512 1024 32 64 ET-4 16 32 8 16 32 64 4 8 ET-5 64 128 128 256 512 1024 128 512 Tetra* 4 8 32 64 - - - - Anf B* - - - - 64 128 8 16 *Tetra-Tetraciclina; Anf B-Anfotericina B.

Dentre os compostos isolados, todos mostraram efeito inibitório contra cepas de bactérias e fungos, com maior efeito para os compostos ET-3 e ET-4. Os agentes S. aureus, E. coli e C. albicans apresentaram alta sensibilidade a substância ET-3 com CIM = 8 μg/mL, 16 μg/mL e 32 μg/mL, respectivamente. Também foi possível observar que o composto ET-4 matou ou inibiu o crescimento de todas as cepas testadas, apresentando CIM de 8 μg/mL e CBM de 16 μg/mL contra E. coli, mostrando-se mais eficácia que o antibiótico Tetraciclina que apresentou CIM de 32 μg/mL e CBM de 64 μg/mL, fato bastante relevante mesmo se tratando de resultados preliminares, uma vez que esta cepa é uma bactéria Gram-, e, portanto, a estrutura de suas paredes favorece uma maior resistência. ET-4 ainda apresentou CIM de 32 μg/mL e CFM de 64 μg/mL contra S. brasiliensis bem como CIM de 4 μg/mL e CFM de 8 μg/mL contra o agente C. albicans, apresentando assim maior potencial que o padrão Anfotericina B. Quanto a substância ET-5 evidenciou CIM de 64 μg/mL, 128 μg/mL, 512 μg/mL e 128 μg/mL contra S. aureus, E. coli, S. brasiliensis e C. albicans, respectivamente.

116 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

2.6. CONCLUSÃO

O método de análise por LC-MS permitiu identificar a estrutura de treze compostos do extrato etanólico, dentre os quais, os flavonoides constituem a classe de metabólitos secundários majoritários com a identificação das estruturas da ampelopsina, isoquercitrina, rutina, miricetina, avicularina, quercitrina, tricetina e quercetina. Além de outros compostos fenólicos, como: o ácido gálico, o ácido dihidroxi benzóico, o ácido 4-O-metil-gálico, o ácido elágico e o ácido 3,3'-dimetoxielágico-4-O-α- raminopiranosídeo. O estudo fitoquímico de E. tirucalli aplicando técnicas cromatográficas clássicas mostrou-se uma ferramenta eficiente, permitindo o isolamento de cinco compostos. Do extrato hexânico da parte aérea (ETPAE-H) foi isolado um terpeno pentacíclico, conhecido na literatura como β-amirina ou o 3-β-hidroxi-oleon-12-em-3-ol (ET-1) já isolado na espécie em questão. Enquanto, a partir de procedimentos cromatográficos aplicados ao extrato etanólico das raízes (ETR-E) foi possível isolar o ácido 4-O-metil- gálico (ET-2), conhecido na literatura, mas isolado pela primeira vez na E. tirucalli. Também foi possível o isolamento de dois flavonoides, o flavonol conhecido como apelopsina (ET-3) e o flavanonol miricetina (ET-4), além de um derivado de ácido elágico, o ácido 3,3'-dimetoxielágico-4-O-α-raminopiranosídeo (ET-5), todos isolados pela primeira vez na espécie E. tirucalli. As análises preliminares das atividades antioxidantes dos extratos brutos frente aos radicais DPPH e ABTS permitiu constatar que os extratos etanólicos foram os mais eficientes sequestradores de radicais livres sendo que o extrato etanólico das raízes

(ETR-E) obteve a maior atividade antioxidante (IC50 de 78,27 μg/mL para DPPH e IC50 de 221,22 μg/mL frente ao ABTS) dentre os extratos analisados, assim, o extrato ETR-E mostrou-se promissor como fonte de agentes contra espécies oxidantes e radicalares. Quanto aos compostos isolados, dos quatros compostos analisados, ET-4 apresentou inibição significativa dos radicais livres com IC50 de 22,62 μg/mL para o DPPH e de 53,22 μg/mL para o ABTS, mostrando-se assim maior eficiência que o padrão Trolox o qual apresentou IC50 de 49,12 para o DPPH e de 112,15 para o ABTS. Analisando os resultados das atividades antibacterianas e antifúngica dos extratos foi possível mais uma vez observa que os extratos etanólicos das raízes e da parte aérea de E. tirucalli foram identificados como potenciais agentes antibacterianos e antifúngicos por inibirem o crescimento ou matarem as cepas de bactérias e fungos tais

117 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau como: S. aureus, E. coli, S.brasiliensis e C. Albicans. Contudo, como era de se esperar, o extrato etanólico das raízes apresentou a melhor atividade, com concentrações inibitória mínima (CIM) de 512 e 256 μg/mL contra S. aureus e E. coli, respectivamente, e de 1024 μg/mL contra S. brasiliensis e C. albicans. Dentre os compostos isolados, ET-3 e ET-4 apresentaram efeitos relevantes. Os agentes S. aureus, E. coli e C. albicans apresentaram alta sensibilidade a substância ET-3 com CIM = 8 μg/mL, 16 μg/mL e 32 μg/mL, respectivamente, enquanto o composto ET-4 matou ou inibiu o crescimento de todas as cepas testadas, apresentando CIM de 8 μg/mL e CBM de 16 μg/mL contra E. coli, mostrando-se relativa eficiência quando comparado com o antibiótico Tetraciclina o qual apresentou CIM de 32 μg/mL e CBM de 64 μg/mL. ET-4 ainda apresentou CIM de 32 μg/mL e CFM de 64 μg/mL contra S. brasiliensis bem como CIM de 4 μg/mL e CFM de 8 μg/mL contra o agente C. albicans, apresentando assim excelente potencial em comparação com o padrão Anfotericina B.

118 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABHISHEK, R. U.; VENKATESH, H. N.; SUDHARSHANA, T. N.; MOHANA, D. C. Antimicrobial Activity of 4-O-methylgallic adic isolated from Phyllanthus polyphyllus L. against foodborne pathogenic bactéria and yeasts. Journal of Biologically Active Products from Nature, v. 9, p. 120-134, 2019.

ABU-REIDAH, I. M.; ALI-SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, R.M.; ARRÁEZ-ROMÁN, D.; SEGURA-CARRETERO, A. HPLC-DAD-ESI-MS/MS screening of bioactive componentes from Rhus coriaria L. (Sumac fruits. Food Chemistry, v. 166, p. 179- 191, 2015.

AHMAD, V.; JASSBI, A. R. New diterpenoids from Euphorbia teheranica. Journal of Producto Natural, v. 62, p. 1016-1018, 1999.

AICHOUR, S., HABA, H., BENKHALED, M., HARAKAT, D., LAVAUD, C. Terpenoids and other constituents from Euphorbia bupleuroides. Phytochemistry Letters, v. 10, p. 198-203, 2014.

ALVES, et al. Avaliação da atividade antioxidante de flavonoides. Diálogos e ciência – Revista da rede ensino FTC, v. 5 n. 1, p. 7-8, 2007.

ÂNGELO, P. M.; JORGE, N. Cmpostos fenólicos em alimentos – uma breve revisão. Ver. Inst. Aldolfo Lutz, v. 66, n. 1, p. 1-9, 2007.

AVELAR, A. A. Detecção in Vitro de Citocinas Intracitoplasmáticas (interferon gama, fator de necrose tumoral, interleucina 4 e interleucina 10) em Leucócitos Humanos Tratados com Extrato Bruto Diluído de Euphorbia tirucalli. 2010. 79f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia de produtos naturais e plantas medicinais) – programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, Universidade federal dos vales do Jequitinhonha e Mucuri, diamantina, MG, Brasil, 2010.

BETANCUR-GALVIS, L. A.; MORALES, G.E.; FORERO, J.E.; ROLDAN, J. Cytotoxic andantiviral activities of colombian medicinal plant extracts of the Euphorbia genus, Memorias Instituto Oswaldo Cruz, v. 97 p. 541–546, 2002.

BRAUNBERGER, C., ZEHL, M., CONRAD, J., FISCHER, S., ADHAMI, H.R., BEIFUSS, U., KRENN, L. LC-NMR, NMR, and LC-MS identification and LC-DAD quantification of flavonoids and ellagic acid derivatives in Drosera peltata. Journal of Chromatography B, v. 932, p. 111–116, 2013.

BRITO, A; RAMIREZ, J. E; ARECHE, C. HPLC-UV-MS Profiles of Phenolic Compounds and Antioxidant Activity of Fruits from Three Citrus Species Consumed in Northern Chile. Molecules, v. 19, p. 17400-17421, 2014.

CASTRO-LÓPES, C., BAUTISTA-HERN, I., GONZ, D., MEDINA-HERRERA, N., AGUIRRE-ARZOLA, V.E. Polyphenolic Profile and Antioxidant Activity of Leaf Purified Hydroalcoholic Extracts from Seven Mexican. Molecules v. 24, p. 1–18, 2019.

119 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

CELLI, G. B; PEREIRA-NETTO, A. B; BETA, T. Comparative Analysis of Total Neotropics Phenolic Content, Antioxidant Activity, and Flavonoids Profile of Fruits from two Varieties of Brazilian cherry (Eugenia uniflora L.) Throughout the Fruit Developmental Stages. Food Research International, v. 44, p. 2442-2451, 2011.

CHANDRASEKHAR, M.; NAGABHUSHANA, H.; SHARMA, S. C.; SUDHEER KUMAR, K. H.; SUNITHA, D. V.; SHIVAKUMARA, C.; NAGABHUSHANA, B. M. Particle size, morphology and color tunable ZnO: Eu3+ nanophosphors via plant látex mediated green combustion synthesis. Journal of Allys and Compounds, v. 584, p. 417-424, 2014.

CHATURVEDULA, V. S. P.; HUANG, R. Isolation and NMR spectral studies of dihydromyricetin. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, v. 2, p. 113-115, 2013.

CHEN, C.; CHEN, Y.; LIN, M.; HUANG, Y.; CHANG, F.; DUH, T.; WU, D.; WU, W.; KAO, Y.; YANG, P. Euphol from Euphorbia tirucalli Negatively Modulates TGF-β Responsiveness via TGF-β Rceptor Segregation inside Membrane Rafts. Research Aticle, v. 10, n. 10, p.1-22, 2015.

CHEN, R., YOU, C., WANG, Y., ZHANG, W., YANG, K., GENG, Z., LIU, Z., DENG, Z., WANG, Y., DU, S. Chemical constituents from the roots of Euphorbia hematophagy hand. -Mazz. Biochemical Systematics and Ecology, v. 57, p. 1-5, 2014.

CHEN, Y., YU, H., WU, H., PAN, Y., WANG, K., JIN, Y., ZHANG, C. Characterization and Quantification by LC-MS/MS of the Chemical Components of the Heating Products of the Flavonoids Extract in Pollen Typhae for Transformation. Molecules, v. 20, p. 18352–18366, 2015.

CHERNONOSOV, A. A.; KARPOVA, E. A.; LYAKH, E. M. Identification of phenolic compounds in Myricaria bracteata leaves by high-performance liquid chromatography with a diode array detector and liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 27, p. 576-579, 2017.

CHOENE, M. S. Screening of South medicinal plants Euphorbia tirucalli for anticâncer properties, 2015, 222f. Tese. (Faculty of Science under the school of Molecular and Cell Biology), University of the Witwatersrand, Guteng, Johannesburg, 2015.

CHOENE, M.; MOTADI, L. Validation of the antiproliferative efects of Euphorbia tirucalli extracts in Breast Cancer cell Lines. Molecular Cell Biology, v. 50, n. 1, p. 98- 110, 2016.

CHUNG, H.; KIM, H.; LEE, Y.; SEONG, J. Effect of deastringency treatment of intact persimmon fruits on the quality of fresh-cut persimmons. Food Chemistry, v. 166, p. 192-197, 2015.

120 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

COSTA, L.S. Estudo do uso de avelós (Euphorbia tirucalli) no tratamento de doenças humanas: Uma Revisão. 2011. 17 f. TCC (Graduação em Ciências Biológicas) - Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual da Paraíba, Campina Grande, PB, Brasil, 2011.

CREPALDI, C. G.; CAMPOS, J. L. A.; ALBUQUERQUE, U. P.; SALES, M. F. Richness and ethnobotany of the family Euphorbiaceae in a tropical semiarid landscape of Northeastern Brazil. South African Journal of Botany, v. 102, p. 157-165, 2016.

DAVIS, B. D. Structural Characterization of Isomeric Flavonoid Glycosides and Metabolites by Metal Complexation and Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Dissertation, The University of Texas at Austin, 2007.

DE NISCO, M.; MANFRA, M.; BOLOGNESE, A.; SOFO, A.; SCOPA, A.; TENORE, G. C.; PAGANO, F.; MILITE, C.; RUSSO, M. T. Nutraceutical properties and polyphenolic profile of berry skin and wine of Vitis vinífera L. (cv. Aglianico). Food Chemistry, v. 140, p. 623-629, 2013.

DERDU, C. F.; GATTO, J.; FREUZE, I.; RICHOMME, P.; LAURENS, F.; GUILET, D. Comparison two methods, UHPLC-UV and UHPLC-MS/MS, for the quantification of polyphenols in cider apple juices. Molecules, v. 18, p. 10213-10227, 2013.

DIAS, O. M. et al. Separação semipreparativa de α e β-amirina por cromatografia líquida de alta eficiência. Química. Nova. v. 34, n. 4, p. 51-56, 2011.

DUTRA, R. C.; SILVA, K. A. B. S.; BENTO, A. F.; MARCON, R.; PASZCUK, A. F.; MEOTTI, F. C.; PIANOWSKI, L. F.; Calixto, J. B. Euphol, a tetracyclic triterpene produces antinociceptive effects in inflammatory and neuropathic pain: The involvement of cannabinoid system. Neuropharmacology, v. 63, p. 593-605, 2012.

EL-CHAZALY, G. A.; CHAUDHARY, R. Pollen morphology of some species of the genus Euphorbia L. Review of Palaeobotany and Palynology. v. 78, p. 293-319, 1993.

Euphorbia Planetary Biodiversity Inventory serpentes. Disponível em: . Acesso em: janeiro 2018.

ERNST, M. et al. Global medicinal uses of Euuphorbia L. (euuphorbiaceae). Journal of Ethnopharmacology, v. 176, p. 90-101, 2015.

FÜRSTENBERGER, G.; HECKER, E. New highly irritant euphorbia factors from latex of Euphorbia tirucalli L. Experientia, v.33, n. 8, p. 986-988, 1977.

FÜRSTENBERGER, G.; HECKER, E. On the active principles of the Euphorbiaceae, XII. Highly unsaturated irritant diterpene esters from Euphorbia tirucalli originating from Madagascas. Journal of Natural Products, v. 49, n. 3, p. 386-397, 1986.

FÜRSTENBERGER, G.; HECKER, E. On the active principles of the spurge family (Euphorbiaceae). XII [1] the irritant and tumor promoting diterpene esters from Euphorbia tirucalli L. originating from South Africa. Z. Naturforsch., v. 40, p. 631- 646, 1985.

121 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

GAO, J.; CHEN, Q.; LIU, Y.; XIN, X.; YILI, A.; AISA, H. A. Diterpenoid constituents of Euphorbia macrorrhiza. Phytochemistry, v. 122, p. 246-253, 2016.

GUPTA, N.; VISHNOI, G.; WAL, A.; WAL, P. medicinal Value of Euphorbia Tirucalli. Systematic Reviews in Pharmacy, v. 4, n. 1, 2013.

HABA, H.; LAVAUD, C.; MAGID, A. A.; BENKHALED, M. Diterpenoids and triterpenóides from Euphorbia retusa. Journal of Products Natuaral, v. 72, p. 1258- 1262, 2009.

HATTORI, M. A bacterial cleavage of the c-glucosyl mangiferin and bergenin. Phytochemistry, v. 28, p. 1289–1290, 1989.

HROBONOVA, K.; LEHOTAY, J.; SKACANI, I. HPLC determination and MS identification of dehydroabietic acid and abietic acid in propolis. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, v. 28, p. 1725-1735, 2005.

JEON, S.H ., CHUN, W., CHOI, Y. J., KWON, Y. S. Cytotoxic Constituents from the Bark of Salix hulteni. Archives of Pharmcal Research v. 31, p. 978–982, 2008.

JIN, J. M.; KIM, I. S.; REHMAN, S. U.; DONG, M. S.; NA, C. S.; YOO, H. H. A Liquid Cromatography-Tandem Mass Spectrosmetry Method for Simultaneous Quantitation of 10 Bioactive Components in Rhus verniciflua Extracts. Journal of Cromatographic science, v. 51, n. 3, p. 390-396, 2016.

KHAN, A. Q.; AHMED, Z.; KAZMI, N.; MALIK, A. Further Triterpenes from the Stem Bark of Euphorbia tirucalli. v. 53, n. 6, p. 577, 1987.

KHAN, A. Q.; AHMED, Z.; KAZMI, N.; MALIK, A. The structure and absolute configuration of Cyclotirucanenol, a new tripterpene from Euphorbia tirucalli Linn. Z. Naturforsch, v. 43, n. 8, p. 1059-1062, 1988.

KHAN, A. Q.; KAZMI, S. N.; AHMED, Z.; MALIK, A. Euphorcinol: A new Pentacyclic Triterpene from Euphorbia tirucalli. Planta Medica, v. 55, p. 290-291, 1989.

KHAN, A. Q.; MALIK, A. A new macrocyclic diterpeno ester from the latex of Euphorbia tirucalli. Journal of Natural Products, v. 53, n. 3, p. 728-731, 1990.

KHAN, A. Q.; RASHEED, T.; KAZMI, S. N.; AHMES, Z. MALIK, A. Cycloeuphordenol, a new triterpene from Euphorbia tirucalli. Phytochemistry, v.27, N. 7, p. 2279-2281, 1988.

KINGHORN, A.D. Caracterization of na Irritant 4-deoxyphorbol Diester from Euphorbia tirucalli. Journal of Natural Products, v. 42, n. 1, p. 112-115, 1979.

LAN, W.; BIAN, L.; ZHAO, X.; JIA, P.; MENG, X.; WU, Y.; WANG, S.; LIAO, S.; YU, J.; ZHENG, X. Liquid Chromatography/Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry for Identification of In Vitro and In Vivo Metabolites of Bornyl Gallate in Rats. Journal of Analytical Methods in Chemistry, v., n., p. 1-11. 2013.

122 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

LI, E.; LIU, K.; ZANG, M.; ZHANG, X. chemical constituents from Euphorbia hirta. Biochemical Systematics and Ecology, v. 62, p. 204-207, 2015.

LIANG, X.; LIU, Z.; CAO, Y.; MENG, D. Chemataxonomc and chemical studies on two plants from genus of Euphorbia: Euphorbia fischeriana and Euphorbia ebracteolata. Biochemical Systematics and Ecology, v.57, p. 345-349, 2014.

LIU, J., DI, D. L., SHI, Y. P. Diversity of Chemical Constituents from Saxifraga montana H . Journal of the Chinese Chemical Society, v. 55, p. 863–870, 2008.

LIN, K.; HUANG, A.; TU, H.; LEE, L.; WU, C.; HOUR, T.; YANG, S. Xanthine oxidase inhibitory triterpenoid and pholoroglucinol from Guttiferaceous plants inhibit growth and induced apoptosis in human NTUB1 cells through a ROS-dependent mechanism. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 59, p. 407-414, 2011.

LIN, S.; YEH, C.; YANG, L.; LIU, P.; HSU, F. Fhenolic Compounds from Fornosan Euphorbia tirucalli. Journal of the Chinese Chemical Society, v. 48, p. 105-108, 2001.

LIU, Q.; LU, D.; JIN, H.; YAN, Z.; LI, X.; YANG, X.; GUO, H.; QIN, B. Allelochemical in the rhizosphere soil of Euphorbia himalayensis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 62, p. 8555-8561, 2014.

LU, Z.; GUAN, S.; LI, X.; CHEN, G.; ZHANG, J.; HUANG, H.; LIU, X.; GUO, D. Cytotoxic diterpenoids from Euphorbia helioscopia. Journal of Natural Product, v.71, p. 873-876, 2008.

LUCENA. M. F. A. Diversidade de Euphorbiaceae (s,l.) no nordeste do Brasil. 2009. 197f. Tese (Doutorado em Biologia Vegetal) – Programa de Pós-graduaçãoem Biologia Vegetal, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, RE, Brasil, 2009.

MITANI, K.; FUJIOKA, M.; UCHIDA, A.; KATAOKA, H. Analysis of abietic acid and dehydroabietic acid in food samples by in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography – mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 1146, p. 61-66, 2007.

123 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

MOBARAK, H. M.; EL-SHERBINY, I. M.; ABDEL-MOGIB, M.Triterpenoids and Volatile Componentes of Euphorbia Tirucalli. Mansoura Journal of Chemistry, v. 37, n. 2, p. 43-51, 2010.

MOK, S.; LEE, S. Identificação of flavonoids and flavonoid rhamnsides from Rhododendron mucronulatum for. albiflorum and their inhibitory activities against aldose reductase. Food Chemistry, v. 136, p. 969-974, 2013.

MWINE, J.; DAMME, P.V. Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) – The miracle tree: Current status of available knowledge. Scientific Reseach and Essays, v.6, n. 23, p. 4905-4914, 2011.

NES, W. D.; WONG, R. Y.; BENSON, M.; LANDREY, J. R.; NES, W.R. Rotational isomerism about the 17(20)-bond of sterids and euphoids as show by the Crystal structures of euphol and tirucalol. Procedures of National Academy of Science, v. 81, p. 5896-5900. 1984.

NEVES, et al. Determinação da atividade antioxidante e do teor de compostos fenólicos e flavonoides totais em amostras de pólen apícola de Apismellifera. Braz. J. Food Technol., v. 2, n. 15, 2008.

NOGUEIRA, P. M. V.; TRESVENZOL, L. M. F.; FIUZA, T. S.; PAULA, J. R.; BARA, M. T. F. Estudo botânico, fitoquímico e fisico-químico de Euphorbia hirta L. (Euphorbiaceae). Rev. Bras. Pi. Med., v.16, n. 3, p. 649-656, 2014.

OKSUZ, S.; GUREK, F.; QIU, S.; CORDELL, G. A. Diterpene Polyesters from Euphorbia seguieriana. Journal of Natural Product, v. 61, p. 1198-1201, 1998.

PASQUINI-NETTO, H.; MANENTE, F. A.; MOURA, E. L.; REGASINI, L. O.; PINTO, M. E. F.; BOLZANI, V. S.; OLIVEIRA, O. M. M. F.; VELLOSA, J. C. R. Avaliação das atividades antioxidantes, anti e pró-hemolíticasdo extrato etanólico das folhas de Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae-Caesalpinioideae). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 14, n. 4, p. 666-672,2012.

PENG, Q. et al. Chemical constituents of Euphorbia kansui. Biochemical Systematics and Ecology. v. 43, p. 64-66, 2012.

PRIYA, C. L.; RAO, K. V. B. A review on phytochemical and pharmacological profile of Euphorbia tirucalli. Pharmacologyonline, v. 2, p. 384-390, 2011.

RASOOL, N.; KHAN, A. Q.; MALIK, A. A taraxerane type tripterpene from Euphorbia tirucalli. Phytochemistry, v. 28, n. 4, p. 1193-1195, 1989.

RIZK, A. M. the chemical constituintes and economic plants of the Euphorbiaceae. Botanical Journal of the Society, v. 94, p. 293-326, 1987.

124 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

RODRIGUES, A. S. As tribos Dalechampieae Mull. Arg. e Manihoteae Melchior (Euphorbiaceae) no Distrito Federal, Brasil. 2007. 104f. Dissertação (Mestrado em Botânica) – Programa de Pós-Graduação em Botânica, universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Brasília, DF, Brasil, 2007.

SABUDAK, T.; OZER, M.; ORAK, H. H.; CALISKAN, H. Antioxidant activity of five new phenolic compounds from Cirsium creticum bubsp. creticum. Phytochemistry Letters, v. 31, p. 181-186, 2019.

SAMUELSSON, G.; FARAH, M. H.; CLAESON, P.; HAGOS, M.; THULIN, M.; HEDBERG, O.; WARFA, A. M.; HASSAN, A. O.; ELMI, A. H.; ABDURAHMAN, A. D.; ELMI, A. S.; ABDI, Y. A.; ALIN, M. H. Inventory of plants used in traditional medicine in Somalia II. Plants of the families Combretaceae to labiatae. Journal of Ethnophamacology, v. 37, p. 47-70, 1992.

SHI, Qun; SUN, Yi-wei; MENG, Dali. Phytochemical and cytotoxic studies on the roots of Euphorbia fischeriana. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v. 27, p. 266-270, 2017.

SILVA, A.C. P.; FARIA, D. E. P. BORGES, N. B. E. S.; SOUZA, I. A. PETERS, V. M.; GUERRA M. O. Toxicological screening of Euphorbia tirucalli l.: developmental toxicitystudies in rats, J. Ethnopharmacol, v. 110, p. 154–159, 2007.

SILVA, M. L. C.; COSTA, R. S.; SANTANA, A. S.; KOBLITZ, M. G. B. Compostos fenólicos, caratenóides e atividade antioxidante em produtos vegetais. Ciência Agrárias, v. 3, p. 669-682, 2010.

SOUSA C.M.M, SILVA HR, VIEIRA GM, AYRES MCC, COSTA CS, ARAÚJO DS. Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Química Nova, v. 30, n. 2, p. 351-355, 2007.

SRIDHAR, K.; CHARLES, A. L. In vitro antioxidante activity of Kyoho grape extracts in DPPH and ABTS assays: Estimation methods for EC50 using advanced statistical programs. Food Chemistry, v. 275, p. 41-49, 2019.

THOMAS, J.; SIVADASAN, M.; AL-ANSARI, A. M.; ALFARHAN, A.; EL- SHEIKH, M.; BASAHI, M.; ALATAR, A. A. New generic and species records for the flora of Saudi Arabia. Saudi Journal of Biological Sciences, v. 21, p. 457-464, 2014.

TOFANELLI, E. J. et al. Propriedades fitoterápicas de euphorbia tirucalli L.: da etnobotânica a farmacognosia. Revista de Biologia e Farmácia, v. 6, n. 1, 2011.

TSOPMO, A.; KAMNAING, P. Terpenoids constituents of Euphorbia sapinii. Phytochemistry Letters, v. 4, p. 218-221, 2011.

VALE, V. V.; ORLANDA, J. F.F. Atividade antimicrobiana do extrato bruto etanólicos das partes aéreas de Euphorbia tirucalli Linneau (Euphorniaceae). Scientia Plena, v. 7, n. 4, p. 1-6, 2011.

125 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

VERDU, C.F., GATTO, J., FREUZE, I., RICHOMME, P., LAURENS, F., GUILET, D. Comparison of two methods, UHPLC-UV and UHPLC-MS/MS, for the quantification of polyphenols in cider apple juices. Molecules, v. 18, p. 10213–10227, 2013.

VIEITEZ, I.; MACEIRAS, L.; JACHMANIÁN, I.; ALBORÉS, S. Antioxidant and antibacterial activity of diferente extracts from herbs abtained by maceration or supercritical technology. The Journal of Supercritical Fluids. v. 133, p. 58-64, 2018.

VUONG, Q.; NGUYEN, V. T.; THANH, D. T.; BHUYAN, D. J.; GOLDSMITH, C. D.; SADEQZADEH, E.; SCARLETT, C. J.; BROWYER, M. Optimization of ultrasound-assisted extraction conditions for eupholfrom the medicinal plant, Euphorbia tirucalli, using response surfacemethodology. Industrial Crops and Products, v. 63, p. 197-202, 2015.

WANG, X.; LIU, L.; KANG, T.; WANG, H. Chemical constituents of Euphorbia fischeriana. Chinese Journal of Natural Medicines, v. 10, n. 4, p. 0299-0302, 2012.

WANG, Y., JI, P., WANG, H., QIN, G. Diterpenoids from Euphorbia esula. Chinese Journal of Natural Medicines, n. 8, v. 2 p. 0094−0096, 2010.

WOO, H.; KANG, H.; NGUYEN, T. T. H.; KIM, G.; PARK, J.; KIM, D.; CHA, J.; MOON, Y.; NAM, S.; KIMURA, A.; KIM, D. Synthesis and characterization of ampelopsin glucosides using dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides B- 1299CB4: glucosylation enhancing physicochemical properties. Enzyme and Mecrobial Technology, v. 51, p. 311-318, 3012.

XU, W.; YANG, J.; ZHU, X.; HU, Y.; XU, S.; LI, Y.; ZHAO, Y. Ionol Derivatives from Euphorbia tirucalli. Records of Natural Products, v. 11, n. 3, p. 285-289, 2017.

YANG, D.; HE, Q.; YANG, Y.; LIU, K.; LI, X. Chemical constituents of Euphorbia tibetica and their biological activities. Chinese Journal of Natural Medicines, v. 12, n. 1, p. 0038-0042, 2014.

YANG, D.; PENG, W.; LI, Z.; WANG, X.; WEI, J.; HE, Q.; YANG, Y.; LIU, K.; LI, X. Chemical constiuents from Euphorbia stracheyi and their biological activities. Fitoterapia, v. 97, p. 211-218, 2014.

YANG, D.; ZHANG, Y.; PENG, W.; WANG, L.; LI, Z.; WANG, X.; LIU, K.; YANG, Y.; LI, H.; LI, X. Jatrophalane-Type diterpenes from Euphorbia sikkimensis. Journal of Natural Products, v. 76, p. 265-269, 2013.

YANG, S.; ZHOU, B.; WISSE, J.; EVANS, R.; WERFF, H.; MILLER, J.; KINGSTON, D. G. I. Three new Ellagic Acid Derivatives from the Bark of Eschweilera coriácea from the Suriname Rainforest. Journal of Natural products, v. 61, n. 7, 1998.

YE, G.; PENG, H.; FAN, M. Ellagic acid derivatives from the stem bark of Dipentodon sinicus. Chemistry of Natural Compounds, v. 43, n. 2, p. 125-126, 2007.

126 CAPÍTULO 2 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DA ESPÉCIE Euphorbia tirucalli Linneau

YI, W.; WEI, Q.; DI, G.; JING-YU1, L.; YANG-LI, L. Phenols and flavonoids from the aerial part of Euphorbia hirta. Chinese Journal of Natural Medicines, v.10, n. 1, p. 0040-0042, 2012.

YOSHIDA, T.; YOKOYAMA, K.; NAMBA, O.; OKUDA, T. Tannins and Related Polyphenols of Euphorbiaceous Plants. VII. Tirucallins A, B and Euphorbin F, Monomeric and Dimeric Ellagitannins from Euphorbia tirucalli L. Chemical e Phamaceutical Bulletin, v. 39, n. 5, p. 1137-1143, 1991.

ZHOU, C.; LIU, Y.; SU, DAN., GAO, G., ZHOU, X.; SUN, L.; BA, X.; CHEN, X.; BI, K. A sensitive LC-MS-MS mathod for simultaneous quantification of two structrural isomrs, hyperoside and isoquercitrin: application to pharmacokinetic studies. Chromatographia, v. 73, p. 353-359, 2011.

ZHANG, W. K., XU, J. K., ZHANG, X. Q., YAO, X. S., YE, W. C. Chemical constituents with antibacterial activity from Euphorbia sororia. Nat Prod Res, v. 22, n. 4, p. 353-359, 2008.

127 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd E Bredemeyera brevifolia Benth

3.1. OBJETIVO GERAL

Estudar fitoquimicamente as espécies Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia e avaliar a capacidade dos extratos hidroalcoólicos das raízes em inibirem os efeitos enzimáticos produzidos pela peçonha da serpente Bothrops jararaca.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Preparar extratos orgânicos hidroalcoólicos (30% água) das raízes e etanólicos dos talos de Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia por maceração; • Avaliar o perfil fitoquímico dos extratos por análise de LC-MS; • Isolar compostos orgânicos através de técnicas cromatográficas clássicas em coluna (adsorção e/ou exclusão molecular); • Elucidar os compostos isolados por meio de técnicas espectroscópicas de RMN 1H e 13C uni e bidimensionais comparando com dados da literatura; • Avaliar a inibição das atividades enzimáticas dos extratos hidroalcoólicos das raízes de Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia, BFREA e BBREA frente à peçonha de Bothrops jararaca;

128 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

3.3. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

As pesquisas bibliográficas realizadas no SciFinder e no Science Direct revelaram que a família Polygalaceae está amplamente distribuída em várias regiões, e ausente apenas na Nova Zelândia e nas zonas árticas e antárticas (LÜDTKE et al., 2008; MARQUES & PEIXOTO, 2007).

3.3.1. CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS

Neste tópico serão bordadas, de forma resumida, as características botânicas da família Polygalaceae, do gênero Bredemeyera bem como das espécies Bredemeyera brevifolia Benth e Bredemeyera floribunda Wild.

3.3.1.1. Família Polygalaceae

A família Polygalaceae é representada por cerca de 19 gêneros e aproximadamente 1.300 espécies distribuídas por todo o mundo, concentrando-se principalmente nas regiões tropicais e temperadas, e sem representação na Nova Zelândia, Polinésia e no Ártico (MARQUES & PEIXOTO 2007). No Brasil, a família está distribuída basicamente em região tropical e representada por sete gêneros como: Barnhartia Gleason, Bredemeyera Willd., Diclidanthera Mart., Monnina Ruiz & Pav., Moutabea Aubl., Polygala L. e Securidaca L, totalizando 240 espécies, destas, 110 espécies pertencem ao gênero Polygala, que representa o principal gênero da família Polygalaceae. Quanto as tribos, a família Polygalaceae é constituída por quatro tipos, Xanthophylleae, Carpolobieae, Polygaleae e Moutabeae. No entanto, os gêneros encontrados na flora brasileira estão incluídos apenas nas tribos Polygaleae e Moutabeae (MARQUES & PEIXOTO 2007). Na região nordeste brasileiro, de acordo com a literatura, é relatado o estudo fitoquímica basicamente de duas espécies, a Bredemeyera brevefolia Willd. e Bredemeyera floribunda Benth (OLIVEIRA & SILVEIRA, 2000). Morfologicamente, as espécies pertencentes a esta família apresenta-se como ervas, subarbusto, arbusto e lianas. Apresenta folhas simples, alternadas ou verticuladas. Suas flores são bissexuadas; duas pétalas rudimentares medianas e duas laterais internas desenvolvidas, seus frutos são geralmente baga, cápsula, núcula ou sâmara e sementes com ou sem endospema (MARQUES & GOMES, 2002).

129 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

Embora o estudo fitoquímico de espécies da família Polygalaceae tenha sido restrito principalmente aos gêneros Polygala e Bredemeyera, esta é bastante conhecida por apresentar em sua composição química, compostos que exibem atividade analgésica, expectorante, sedativas e antifúngicas. Assim, a partir de estudos fitoquímicos à cerda desta família já foram descritos a presença de metabólitos como: saponinas, xantonas, cumarinas, ácidos graxos e fenóis (ANDRADE et al., 1977; SILVEIRA et al., 1995; PERES & NAGEM, 1997).

3.3.1.2. Gênero Bredemeyera

O gênero Bredemeyera está incluído na tribo Polygaleae e apresenta 15 espécies distribuídas em partes da América, México, Paraguai e Argentina, bem como 60 espécies distribuídas na Índia, América do Sul e Austrália (AGUIAR & FILHO, 2008). Na flora Brasileira, a literatura menciona que o gênero Bredemeyera inclui 13 espécies, concentradas principalmente do estado do Amazonas até Minas Gerais e 12 espécies que podem ser encontradas em matas, cerrados, caatingas e restingas de outras regiões. Contudo, a única espécie que se estende até a Região Sul do Brasil é a espécie Bredemeyera floribunda Willd. a qual se distribue amplamente do estado de Roraima até o Paraná (LÜDTKE et al., 2008). Como muitas das espécies desta família, as espécies do gênero Bredemeyera apresentam-se como arbustos escandentes a lianas e ramos cilíndricos; folhas alternas, pecioladas e subdecorrentes; flores alvas ou amareladas e semente amarela-serícea e pequena (MARQUES & GOMES, 2002).

3.3.1.3. Espécie Bredemeyera floribunda Willd.

A espécie Bredemeyera floribunda Willd é conhecida popularmente como “baquipari” mais também possui outras denominações como: raíz de cobra, pacari, marfim-de-rama, pau-rendoso, pau-caixão, pau-gemada, raíz-de-joão-da-costa e botica inteira. Esta espécie constitui um tipo de trepadeira lenhosa pertencente a família Polygalaceae, encontrada em forma de arbusto escandentes e lianas de grande porte, medinho de 2 à 5 metros de altura; ramos cilíndricos densamente pubescente; folhas simples medindo de 7-10 centímetros de comprimento, alternada ou pecioladas; flores reunidas em panículas, alvas, creme ou amareladas; fruto cápsula loculicida, coriácea, bisseminada; sementes estreito-elíptica, dourados e medindo 10 mm de comprimento e

130 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth raízes com casca espessa quase esponjosa e amarga, Figura 50. É geograficamente distribuída na Venezuela, Peru, Paraguai e Brasil, em hábitat de caatinga, cerrado e matas pluviais (LÜDTKE et al., 2008; OLIVEIRA, 2015; ALVES, 2013).

Figura 50 – Foto da espécie Bredemeyera floribunda Willd.

Fonte: http://www.plantsoftheworldonline.org.

3.3.1.3.1. Aspecto Químico da espécie Bredemeyera floribunda Willd

De acordo com a literatura, o estudo fitoquímico da espécie Bredemeyera floribunda teve seu primeiro relato por volta de 1949, contudo, apesar de pouco estudo acerca desta espécie, várias classes de substâncias já foram identificadas e isoladas, dentre essas classes de metabólitos secundários estão principalmente as xantonas, saponinas e flavonoides (CAVALCANTE, 2015). Portanto, como pode ser observado no Quadro 18, desta espécie já foram isoladas três xantonas pentaoxigenadas, a 1,3,7-trihidroxi-4,8-dimetoxixantona, a 1,3,6- trihidroxi-2,7-dimetoxixantona e a dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona; uma xantona hexaoxigenada, a 1,2,7-trihidroxi-4,8-dimetoxixantona; um flavonoide, a rutina; três saponinas, o bredemeyerosídeo B, o bredemeyerosídeo C e o bredemeyerosídeo D; um derivado do ácido cinâmico, o (2E)-metil-3’-(3,4,5-trimetoxifenil)-prop-2-enoato de metila, e dois carboidratos, um derivado do carboidrato manitol, o poliálcool bicíclico e o dissacarídeo sacarose (CAVALCANTE, 2015; OLIVEIRA, 2015; DAROS, et al., 1996; SILVEIRA, et al., 1995; PEREIRA, et al., 1996).

131 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

Quadro 18 – Estruturas químicas dos constituintes isolados da espécie Bredemeyera floribunda.

(36) (35) 1,3,6-trihidroxi-2,7- 1,3,7-trihidroxi-4,8- dimetoxixantona dimetoxixantona (SILVEIRA et al, 1995) (SILVEIRA et al, 1995)

(38) (37) 1,4,7-trihidroxi-3-metoxixantona 1,7-dihidroxi-3,4,8- (CAVALCANTE, 2015) trimetoxixantona (SILVEIRA et al, 1995)

(40) (39) sacarose 1,2,3,7-trihidroxi-4,8- (CAVALCANTE, 2015) dimetoxixantona (CAVALCANTE, 2015)

132 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

(42)

poliálcool bicíclico (41) (CAVALCANTE, 2015)

(2E)-3’-(3,4,5-trimetoxifenil)-prop- 2-enoato de metila (CAVALCANTE, 2015)

(43)

rutina (OLIVEIRA, 2015)

(44)

bredemeyerosídeo B (DAROS, et al., 1996)

133 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

(45)

bredemeyerosídeo D (PEREIRA, et al., 1996)

(46)

bredemeyerosídeo C (PEREIRA, et al., 1996)

Fonte: Própria, 2018.

3.3.1.3.2. Usos medicinais da espécie Bredemeyera floribunda Willd

Quanto ao uso na medicina popular, as raízes de Bredemeyera floribunda são comumente usadas no tratamento de infecções de pele, disenteria amebiana, reumatismo e hipertensão arterial, também agem como agente diurético e hipotensivo. Outro uso relevante na medicina popular atribuída a esta espécie é o tratamento de picada de serpentes, assim, estudos biológicos efetuados com o extrato bruto das raízes demostraram atividades antibotrópicas contra a peçonha do gênero Bothrops (SILVEIRA, 1995; CAVALCANTE, 2015; ALVES, 2013; OLIVEIRA, 2015).

134 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

3.3.1.4. Espécie Bredemeyera brevifolia Benth.

A Bredemeyera brevifolia Benth é uma espécie semelhante a Bredemeyera floribunda diferenciando, principalmente, pelo maior porte. É uma árvore, muito ramificada que chega a medir até 10 metros de altura, possui ramos eretos ou as vezes escandentes e sem espinhos; folhas alternadas de ovais a elípticas; flores alvo- amareladas; e sementes sem sulcos longitudinais, Figura 51. No Brasil, esta espécie é distribuída nas regiões Centro-Oeste, Sudeste e Nordeste, sendo que na região Nordeste a mesma é encontrada nos estados da Bahia, Ceará Pernambuco e Piauí. No Ceará foi encontrada na chapada do Araripe e é conhecida popularmente como “paquari” além de possuir outras denominações como laça-vaqueiro, cipó de vaqueiro e mau-vizinho (LIMA, et al., 2018; MARQUES & GOMES, 2002; CARTAXO, 2010; RIBEIRO, et al., 2014, MACÊDO, et al., 2015).

Figura 51 – Foto da espécie Bredemeyera brevifolia Benth.

Fonte: https://www.inaturalist.org/taxa/273522-Bredemeyera.

3.3.1.4.1. Aspecto Químico da espécie Bredemeyera brevifolia Benth

De acordo com literatura, a espécie Bredemeyera brevifolia é ainda pouco estudada quimicamente, assim, das raízes desta espécie foram isolados até o momento três xantonas, a 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetixixantona, a 1-metoxi-2,3,7,8- dimetilenodioxixantona e a 1,7,8-trimetoxi-2,3-metilenodioxixantona, além da

135 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth identificação de diversos ácidos graxos, como: o ácido palmítico, o ácido oleico, o ácido esteárico, o ácido behênico, o ácido lignocérico e o ácido linoleico (OLIVEIRA & SILVEIRA, 2000), Quadro 19.

Quadro 19 – Estrutura química dos constituintes isolados da espécie Bredemeyera brevifolia.

(47)

1-metoxi-2,3,7,8-dimetilenodioxixantona (OLIVEIRA & SILVEIRA, 2000)

(48)

1,7,8-trimetoxi-2,3-metilenodioxixantona (OLIVEIRA & SILVEIRA, 2000)

(49)

1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona (OLIVEIRA & SILVEIRA, 2000)

Fonte: Adaptado de OLIVEIRA & SILVEIRA, 2000.

3.3.1.4.2. Usos medicinais da espécie Bredemeyera brevifolia Benth

Estudos à cerca do uso medicinal popular da espécie Bredemeyera brevifolia apontam que a espécie é indicada para o tratamento de dores na coluna, reumatismo, gripe e inflamações nos rins sendo utilizada na forma de chá por decocção ou infusão (RIBEIRO, et al., 2014; CARTAXO, 2009; MACÊDO, et al., 2015).

136 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

3.4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL PARA O ESTUDO FITOQUÍMICO DE Bredemeyera floribunda 3.4.1. MATERIAL VEGETAL DE Bredemeyera floribunda

A espécie Bredemeyera floribunda Willd. empregada neste estudo foi coletada por Pinto e Silveira no Ceará em julho de 2014 na localidade da Estrada Porteira-Jardim (lat.: -7,419444 e long.: -39,28422 WGS84) e determinada por Guedes. Sua exsicata encontra-se depositada no Herbário Alexandre Leal Costa, da Universidade Federal da Bahia, com número de registro 008717. A coleta do material vegetal da espécie Bredemeyera floribunda para uso científico foi autorizado pelo Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético (SisGen) (Número do cadastro: A12E895).

3.4.2. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DAS RAÍZES DE Bredemeyera floribunda

O procedimento experimental para o preparo do extrato hidroalcoólico das raízes da espécie Bredemeyera floribunda bem como os fracionamentos cromatográficos aplicados ao extrato está resumidamente representado na Figura 52.

3.4.2.1. Extratos das Raízes

Para o estudo fitoquímico da espécie Bredemeyera floribunda, 100 g do material seco das raízes foi triturado e submetido à extração. O material vegetal seco foi colocado em um Erlenmeyer com etanol/água 30% (cerca de 400 mL de solução) e deixado em repouso por dois dias (ou 48 horas) a temperatura ambiente. Depois de realizadas três extrações sucessivas, a solução resultante contendo os resíduos de cada extração foi filtrada e o solvente evaporado à pressão reduzida, dando origem ao extrato denominado BFREA, conforme descriminados no Quadro 20 a seguir.

Quadro 20 – Dados referente a extração das raízes de Bredemeyera floribunda. Material Botânico/(g) Denominação* Qtde. de Extrato/(g) Raízes (100) BFREA 14,3125 *BFREA – extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera floribunda.

Após as extrações os extratos foram submetidos a procedimentos cromatográficos.

137 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

3.4.3. FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO DAS RAÍZES DE Bredemeyera floribunda (BFREA)

O extrato BFREA (6,0 g) foi submetido a cromatografia de exclusão molecular em gel de dextrina Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals utilizando uma coluna de 5 cm de diâmetro e metanol como eluente. Este procedimento rendeu 28 frações, que após analisadas por CCD foram reunidas de acordo com a suas semelhanças resultando em 5 subfrações conforme descrito no Quadro 21 a seguir. A fração BFREA-M-(3,4) mostrou-se promissora, sendo então submetida à cromatografia de exclusão molecular.

Quadro 21 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico Sephadex do extrato BFREA. Frações Massa (g) BFREA- M-(1) 2,3040 BFREA- M-(2) 1,8987 BFREA- M-(3,4) 1,4864 BFREA- M-(5) 0,0307 BFREA- M-(6) 0,0233 Total = 5,7431 Rendimento = 95,71 % Fonte: Própria, 2019.

3.4.3.1. Fracionamento cromatográfico da fração BFREA-M-(3,4)

A fração BFREA-M-(3,4) 1,4864 g foi submetida à cromatografia de exclusão molecular LH 20. Este procedimento rendeu 15 frações sendo novamente analisadas por CCD e reunidas por semelhança, Quadro 22. Sendo a fração BFREA- M-(3-4)-M-(4-8) submetida novamente à métodos cromatográficos.

Quadro 22 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico Sephadex do extrato BFREA- M-(3,4). Frações Massa (g) BFREA- M-(3,4)-M-(1) 0,0465 BFREA- M-(3,4)-M(2,3) 0,1135 BFREA- M-(3,4)-M-(4-8) 0,6286 BFREA- M-(3,4)-M-(9,10) 0,1573 BFREA- M-(3,4)-M-(11-13) 0,1208 BFREA- M-(3,4)-M-(14,15) 0,1674 Total = 1,2341 Rendimento = 83,02 % Fonte: Própria, 2019.

138 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

3.4.3.1.1. Subfracionamento da fração BFREA-M-(3-4)-M-(4-8)

A subfração BFREA- M-(3-4)-M-(4-8) (0,6286 g) foi mais uma vez submetida à cromatografia de exclusão molecular LH 20, utilizando metanol puro como fase móvel. Agora este procedimento cromatográfico rendeu 11 frações sendo novamente analisadas por CCD e reunidas por semelhança. As frações BFREA- M-(3,4)-M-(4-8)-M-(9) apresentaram um sólido branco amorfo, o qual foi lavado e denominado BFR-1 e em seguida encaminhado para análise de RMN. A fração BFREA- M-(3,4)-M-(4-8)-M-(10) também apresentou um precipitado, de coloração amarelo intensa, o qual foi lavado com metanol, denominado BFR-2 e também submetido a análise de RMN para sua caracterização.

3.4.4. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DOS TALOS DE Bredemeyera floribunda

O procedimento experimental para preparação dos extratos hexânico e etanólico dos talos da espécie Bredemeyera floribunda e os fracionamentos cromatográficos aplicados aos extratos estão resumidamente representados na Figura 53.

3.4.4.1. Extratos dos Talos

O material vegetal dos talos (100 g) de Bredemeyera floribunda foram secos, triturados em moinho de facas e submetido a extração por maceração à frio com os solventes hexano e etanol. A primeira extração foi realizada com hexano a temperatura ambiente, portanto foi colocado o material vegetal em um Erlenmeyer, adicionado solvente até cobrir a amostra totalmente (aproximadamente 400 mL) e o material foi deixado em repouso por um período de 48 horas, este procedimento foi repetido três vezes com o mesmo período de tempo. O material vegetal resultante da extração com hexano foi novamente submetido a extração com etanol repetindo o mesmo procedimento. Por fim, as soluções contendo os resíduos foram filtradas e o solvente evaporado à pressão reduzida, resultando nos extratos: BFTH e BFTE (cabe aqui salientar que o extrato hexânico, BFTH, não foi submetido a fracionamento cromatográfico). A denominação dos extratos utilizou o seguinte critério: nome científico da planta, nome da parte da planta a qual foi trabalhada e solvente empregado. Os respectivos dados dos extratos conforme descriminados acima, estão descritos no Quadro 23.

139 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

Quadro 23 – Dados referente a extração dos talos de Bredemeyera floribunda. Material Botânico/(g) Denominação* Qtde. de Extrato (g) Talos (100) BFTH 0,52 BFTE 5,28 *BFTH – extrato hexânico dos talos de Bredemeyera floribunda. *BFTE – extrato etanólico dos talos de Bredemeyera floribunda.

Assim, após as extrações, os extratos foram submetidos a procedimentos cromatográficos.

3.4.5. FRACIONAMENTO DO EXTRATO DOS TALOS DE Bredemeyera floribunda (BFTE)

O extrato etanólico dos talos (1,8 g) de Bredemeyera floribunda, BFTE, foi submetido a fracionamento cromatográfico do tipo filtrante. Assim, 1,8 g do extrato foi adsorvidos em 5,4 g de sílica, pulverizados em gral de porcelana e submetido a tratamento cromatográfico com sílica em uma coluna de 5,0 cm de diâmetro, utilizando mistura binária dos eluentes: hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol em ordem crescente de polaridade. Este procedimento rendeu 14 frações, que após análise cromatográfica comparativa em CCD, foram reunidas em 7 frações de acordo com suas semelhanças, Quadro 24.

Quadro 24 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do extrato etanólico do talo de Bredemeyera floribunda (BFTE). Frações Massa (g) BFTE-C-(1) 0,0173 BFTE-C-(2) 0,0313 BFTE-CA-(3,4) 0,1037 BFTE-CA-(5-8) 0,4340 BFTE-M-(9) 0,9801 BFTE-Mág-(10-13) 0,0321 BFTE-Ág-(14) 0,0779 Total = 1,6764 Rendimento = 93,13 % Fonte: Própria, 2019.

3.4.5.1. Fracionamento cromatográfico da fração BFTE-CA-(5-8)

A fração BFTE-CA-(5-8) (0,43 g), foi adsorvida em sílica flash (1,3 g) e submetida a fracionamento cromatográfico em coluna (Φ = 3,0 cm), com 50,0 g de sílica “flash”, utilizando como eluentes misturas binárias em ordem crescente de

140 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth polaridade de hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol. Em seguida a análise comparativa por CCD das 16 frações resultantes deste fracionamento, permitiu a reunião de acordo com sua similaridade, resultando em 5 subfrações, Quadro 25.

Quadro 25 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico flash da fração BFTE-CA-(5- 8). Frações Massa (g) BFTE-CA-(5-8)-CA-(1-7) 0,1862 BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10) 0,2185 BFTE-CA-(5-8)-A-(11,12) 0,0426 BFTE-CA-(5-8)-AM-(13-15) 0,0310 BFTE-CA-(5-8)-Ág-(16) 0,0123 Total = 0,49 Rendimento = 89,95 % Fonte: Própria, 2019.

Então, foi observado que a fração BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10) após análise em CCD apresentava apenas duas manchas homogêneas bem como um precipitado amarelo intenso. Assim, a fração foi novamente submetida a processo cromatográfico.

3.4.5.1.1. Tratamento cromatográfico aplicado a fração BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10)

Cerca de 0,2185 g da fração BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10) foi dissolvida em metanol e submetida à cromatografia de exclusão molecular em Sephadex LH-20, eluida com metanol puro em uma coluna aberta (Φ = 2,0 cm). Este procedimento rendeu 23 frações as quais foram analisadas por CCD e reunidas por suas semelhanças, Quadro 26.

Quadro 26 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração BFTE-CA-(5-8)-CA- (8-10). Frações Massa (g) BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10)-M-(1) 0,1104 BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10)-M-(2-7) 0,0281 BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10)-M-(8) 0,0021 BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10)-M-(9) 0,0015 BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10)-M-(10) 0,0053 BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10)-M-(11-15) 0,0611 BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10)-M-(16-23) 0,0123 Total = 0,2004 Rendimento = 91,71 % Fonte: Própria, 2019.

As frações BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10)-M-(11-15) e BFTE-CA-(5-8)-CA-(8-10)- M-(16-23) apresentaram um sólido amarelo intenso que após análise em CCD percebeu-

141 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth se que se tratava de duas amostras puramente distintas, assim, as amostras foram denominadas de BFT-1 e BFT-2, respectivamente, e submetida a análise de RMN 1H e 13C para terem suas estruturas determinadas.

3.4.5.2. Tratamento cromatográfico da fração BFTE-M-(9)

A fração BFTE-M-(9) (0,9801 g) foi dissolvida em 1,0 mL metanol, acondicionada em uma coluna de 5,0 cm de diâmetro e submetida à fracionamento cromatográfico de exclusão molecular em Sephadex LH-20. O procedimento cromatográfico forneceu 21 frações, que foram reunidas, após comparação por CCD, resultando em 4 frações, Quadro 27 .

Quadro 27 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico Sephadex da fração BFTE-M- (9). Frações Massa (g) BFTE-M-(9)-M-(1-6) 0,1422 BFTE-M-(9)-M-(7-11) 0,9626 BFTE-M-(9)-M-(12-20) 0,1667 BFTE-M-(9)-M-(21) 0,0120 Total = 1,2835 Rendimento = 91,63 % Fonte: Própria, 2019.

Na fração BFTE-M-(9)-M-(12-20) foi observado um precipitado, o qual foi submetido a lavagem com metanol, resultando em 0,15 g do material sólido amarelo intenso, denominado de BFT-3. Análise por CCD revelou uma macha visível na luz UV (254 e 365 ηm) e de cor amarela ao ser revela com solução de vanilina. A amostra BFT- 3 foi então caracterizada por espectroscopia de RMN de 1H e 13C.

142 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

3.5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL PARA O ESTUDO FITOQUÍMICO DE Bredemeyera brevifolia 3.5.1. MATERIAL VEGETAL DE Bredemeyera brevifolia

A espécie Bredemeyera brevifolia (Benth.) Klotzsch utilizada para no estudo fitoquímico foi coletada no Ceará em outubro de 2015 (lat.: -3, 910833 e long.: -41, 618889 WGS84), por Guedes, Chagas e Silveira. A identificação foi realizada por Guedes, e sua exsicata encontra-se depositada no Herbário Alexandre Leal Costa, da Universidade Federal da Bahia, com número de registro 008223. A coleta do material vegetal da espécie Bredemeyera brevifolia para uso científico foi autorizado pelo Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético (SisGen) (Número do cadastro: A12E895).

3.5.2. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DAS RAÍZES DE Bredemeyera brevifolia

O procedimento experimental pra preparação do extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera brevifolia como também os fracionamentos cromatográficos aplicados ao extrato estão resumidamente representados na Figura 54.

3.5.2.1. Extratos das Raízes

O estudo fitoquímico da espécie Bredemeyera brevifolia, seguiu a mesma metodologia empregada para espécie Bredemeyera floribunda. Assim, 100 g do material vegetal das raízes depois de triturados foram submetidos à extração exaustiva com etanol/água 30% a temperatura ambiente. E posteriormente, a solução resultante contendo os resíduos foi filtrada e o solvente evaporado à pressão reduzida, dando origem ao extrato denominado BBREA, conforme descriminados no Quadro 28.

Quadro 28 – Dados referente a extração das raízes de Bredemeyera brevifolia. Material Botânico/(g) Denominação* Qtde. de Extrato/(g) Raízes (100) BBREA 18,5500 *BBREA – extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera brevifolia.

143 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

3.5.3. FRACIONAMENTO DO EXTRATO DAS RAÍZES DE Bredemeyera brevifolia (BBREA)

O extrato BBREA (10,0 g) foi submetido à partição líquido-líquido, utilizando como solventes o hexano, o clorofórmio e o acetato de etila. Assim, inicialmente foram adicionados 60 mL de água a mistura e está foi transferida para um funil de separação, onde foram realizadas três extrações: a primeira extração foi realizada com 3 x 80 mL de hexano, resultando na fração BBREA-H; a segunda foi realizada com 3 x 80 mL de clorofórmio, obtendo a fração BBREA-C e a terceira foi extraída com 3 x 80 mL de acetato de etila, obtendo desta forma a fração BBREA-Ac. Então, as frações foram concentradas em evaporador rotativo sob pressão reduzida, Quadro 29.

Quadro 29 – Dados da partição líquido-líquido do extrato BBREA de Bredemeyera brevifolia. Extrato Bruto/(g) Fração* Quantidade (g) BBREA-H 1,3010 Raízes (100) BBREA-C 0,1779 BBREA-Ac 1,3531 *BBREA – extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera brevifolia.

3.5.3.1. Fracionamento cromatográfico da fração BBREA-C

A fração clorofórmica, BBREA-C (0,1779 g), obtida a partir da partição do extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera brevifolia foi submetido procedimento cromatográfico de adsorção com gel de sílica do tipo “comum” para separação de suas substâncias por diferença de polaridade. A eluição gradiente com mistura binária dos solventes hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol com proporções crescente de polaridade rendeu 18 frações, Quadro 30.

Quadro 30 – Proporções de solventes e volumes para a obtenção das frações de 1-18 a partir da fração BBREA-C. Eluentes/proporção Volume (mL) Frações Hexano 100 % 100 -- Hexano/clorofórmio 25 % 200 1 Hexano/clorofórmio 50 % 200 2-10 Hexano/clorofórmio 75 % 100 11-13 Clorofórmio/acetato 25 % 100 14 Clorofórmio/acetato 75 % 100 15 Aceto/metanol 25 % 100 16, 17 Metanol 100 % 100 -- Água 100 % 200 18 Fonte: Própria, 2019.

144 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

Após este procedimento, as frações foram submetidas a analise por CCD e reunidas de acordo com a sua semelhança, Quadro 31.

Quadro 31 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração clorofórmica, BBREA-C. Frações Massa (g) BBREA- C-HC-(1-3) 0,0034 BBREA- C-HC-(4) 0,0045 BBREA- C-HC-(5,6) 0,0075 BBREA- C-HC-(7) 0,0030 BBREA- C-HC-(8-12) 0,0056 BBREA- C-HC-(13) 0,0024 BBREA- C-CA-(14) 0,0010 BBREA- C-CA-(15) 0,0034 BBREA- C-AM-(16) 0,0869 BBREA- C-ACM-(17) 0,0064 BBREA- C-Ág-(18) 0,0311 Total = 0,1552 Rendimento = 87,24 % Fonte: Própria, 2019.

A fração BBREA-C-CA-(14) apresentava um sólido amarelo, rendendo 0,0010 g, que ao ser analisado por CCD, mostrou-se visível na luz UV (254 e 365 nm) e de cor lilás, depois de pulverizado com solução de vanilina e posterior aquecimento, apresentou coloração amarela. A amostra denominada BBR-1 foi então encaminhada a análise espectroscópicas de RMN a fim de determinar sua estrutural.

3.5.3.2. Fracionamento cromatográfico da fração BBREA-Ac

A fração acetato da partição do extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera brevifolia, BBREA-Ac (1,3275 g) foi dissolvida em 2,0 mL de metanol e submetido á cromatografia por exclusão molecular, em uma coluna de 2,0 cm de diâmetro, sendo acondicionada em gel de dextrana Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals utilizando-se metanol puro como fase móvel. O procedimento cromatográfico forneceu 20 frações as quais foram submetidas a analise por CCD e reunidas por semelhança, resultando em 9 frações, Quadro 32.

145 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

Quadro 32 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico Sephadex da fração BBREA- Ac. Frações Massa (g) BBREA- Ac-M-(1-4) 0,0735 BBREA- Ac-M-(5) 0,0151 BBREA- Ac-M-(6,7) 0,3459 BBREA- Ac-M-(8-10) 0,6144 BBREA- Ac-M-(11-14) 0,0596 BBREA- Ac-M-(15-17) 0,0161 BBREA- Ac-M-(18) 0,0002 BBREA- Ac-M-(19) 0,0004 BBREA- Ac-M-(20) 0,0001 Total = 1,1253 Rendimento = 84,76 % Fonte: Própria, 2019.

A análise em CCD revelou que a fração BBREA-Ac-M-(15-17) apresentava apenas duas manchas uniformes de coloração amarela após revelação com solução de vanilina e foi novamente submetida a processo cromatográfico.

3.5.3.2.1. Fracionamento cromatográfico da fração BBREA-Ac-M-(15-17)

Cromatografia sephadex LH 20 aplicada a fração BBREA-Ac-M-(15-17) (0,0161g) utilizando coluna cromatográfica de 2,0 cm de diâmetro e metanol puro como eluente, forneceu 19 frações. Então, a análise comparativa por CCD e posterior reunião das frações conforme suas semelhanças originou 5 novas frações, Quadro 33.

Quadro 33 – Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do tipo “flash” da fração BBREA-Ac-M-[15-17] após análise por CCDs. Frações Massa (g) BBREA- Ac-M-(15-17 )-M-(1-12) 0,0049 BBREA- Ac-M-(15-17 )-M-(13,14) 0,0023 BBREA- Ac-M-(15-17 )-M-(15,17) 0,0028 BBREA- Ac-M-(15-17 )-M-(18) 0,0025 BBREA- Ac-M-(15-17 )-M-(19) 0,0022 Total = 0,0147 Rendimento = 91,30 % Fonte: Própria, 2019.

A análise em CCD revelou que a fração BBREA-Ac-M-(15-17)-MC-(1-12) (0,049 g) apresentava um sólido de cor amarela após revelação com solução de vanilina o qual foi denominado BBR-2. Então a fração foi encaminhada a análise de RMN para posterior caracterização.

146 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

3.5.4. OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DOS TALOS DE Bredemeyera brevifolia

O procedimento experimental para obtenção dos extratos hexânico e etanólico dos talos estão resumidamente representados na Figura 55.

3.5.4.1. Extratos dos Talos

A mesma metodologia empregada na extração dos talos de Bredemeyera floribunda foi também empregada para a extração com os talos de Bredemeyera brevifolia. Portanto, 100 g do material dos talos depois de triturados foram submetidos a três extrações a frio com hexano a temperatura ambiente seguida com extração em etanol. Então, as soluções contendo os resíduos foram filtradas e o solvente evaporado à pressão reduzida, resultando nos extratos: BBTH e BBTE. O Quadro 34 apresenta os dados referentes às extrações dos talos de Bredemeyera brevifolia.

Quadro 34 – Dados referente a extração por maceração dos talos de Bredemeyera brevifolia. Material Botânico (g) Denominação* Qtde. de Extrato (g) Talos (100) BBTH 4,01 BBTE 0,19 *BBTH – extrato hexânico dos talos de Bredemeyera brevifolia. *BBTE – extrato etanólico dos talos de Bredemeyera brevifolia.

O extrato etanólico dos talos de Bredemeyera brevifolia foi submetido a fracionamento cromatográfico, contudo, até o momento não foi possível obter compostos isolados, por este motivo não foi detalhado procedimento experimental.

147 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

Figura 52 – Obtenção e fracionamento dos extratos das raízes de Bredemeyera floribunda Willd.

Fonte: Própria, 2019.

148 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

Figura 53 – Obtenção e fracionamento dos extratos dos talos de Bredemeyera floribunda Willd.

Fonte: Própria, 2019.

149 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

Figura 54 – Obtenção e fracionamento do extrato das raízes de Bredemeyera brevifolia.

Fonte: Própria, 2019.

150 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda Willd. E Bredemeyera brevifolia Benth

Figura 55 – Obtenção dos extratos do talo de Bredemeyera brevifolia.

Fonte: Própria, 2019.

151 CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

3.6. ATIVIDADES ENZIMÁTICAS DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia CONTRA A PEÇONHA DE Bothrops jararaca

A avaliação da atividade enzimática contra a peçonha de Bothrops jararaca dos extratos hidroalcoólicos das raízes de B. floribunda e B. brevifolia foram realizados com a colaboração grupo de tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica (TEcBioFar – UFRN) do Departamento Farmácia da Universidade Federal do Rio grande do Norte sob a responsabilidade do Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa

3.6.1. PEÇONHA OFÍDICA

A peçonha da serpente Bothrops jararaca foi uma gentil doação de Kathleen Fernandes Grego, Instituto Butantan, SP, Brasil. As peçonhas foram obtidas por extração manual de espécimes adultos e então liofilizadas e mantidas a -20ºC até o uso. Soluções de peçonha foram preparadas em tampão fosfato-salino (PBS). A quantidade de peçonha foi expressa em conteúdo de proteína, determinado pelo método de Bradford utilizando albumina como padrão (BRADFORD, 1976). O uso científico das peçonhas foi aprovado pelo Conselho de Gestão do Patrimônio Genético (CGEN) (Número do processo: 010844/2013-9).

3.6.2. ENSAIOS ENZIMÁTICOS IN VITRO 3.6.2.1. Inibição da Atividade Proteolítica sobre a Azocaseína

A atividade proteolítica da peçonha foi determinada colorimetricamente utilizando azocaseína como substrato, conforme descrito previamente na literatura, com pequenas modificações (PEREAÑEZ et al, 2013). Diferentes concentrações de peçonha foram pré-incubadas por 30 min a 37ºC em um volume final de 100 μL. Em seguida, em cada tubo, 100 μL de azocaseína (10

µg/µL em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,4 contendo NaCl 200 mM e CaCl2 5 mM) foram adicionados e incubados por 90 min a 37ºC. A reação enzimática foi interrompida pela adição de 100 μL de ácido tricloroacético 5%. Após 30 min em repouso à temperatura ambiente, os tubos foram centrifugados a 15.000 g por 10 min a 22ºC. O sobrenadante (100 μL) foi removido e misturado com igual volume de NaOH 0,5 M em uma microplaca de 96 poços. Após 10 min a temperatura ambiente, as amostras foram lidas a 440 nm em leitora de microplacas (Epoch-BioTek, Winooski, VT, EUA). 152

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Brancos foram preparados da mesma forma, substituindo o substrato por igual volume de tampão. Uma concentração mínima proteolítica foi definida como a menor quantidade de peçonha capaz de produzir um aumento de 0,2 unidades de absorbância em relação ao controle no qual se incubou apenas substrato (ausência de peçonha). Para os ensaios de inibição, a concentração mínima proteolítica de peçonha (= 3 µg) foi pré-incubada com proporções crescentes de cada extrato, a 37ºC por 30 min, e em seguida o ensaio realizado conforme descrito anteriormente. Os resultados foram expressos como porcentagem de atividade proteolítica em relação ao controle em que apenas peçonha foi incubada (1:0 p/p, peçonha: extrato, considerado 100% de atividade proteolítica), como média ± erro padrão da média, com n = 3.

3.6.2.2. Inibição da Atividade Fosfolipase A2

A atividade fosfolipase A2 da peçonha foi determinada turbidimetricamente utilizando gema de ovo como substrato, conforme descrito previamente na literatura, com pequenas modificações (FÁLIX-SILVA et al., 2017). Primeiramente, gema de ovo foi misturada com PBS na proporção 1:3 (v/v, gema de ovo: PBS) e centrifugada a 400 rpm por 2 min a temperatura ambiente, para a partir do sobrenadante obter-se a suspensão estoque de gema de ovo. A concentração de substrato a ser utilizada nos ensaios foi determinada como aquela com absorbância de 0,6 a 925 nm, que foi uma diluição de 10% da suspensão estoque de gema de ovo em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,4 contendo NaCl 200 mM e CaCl2 5 mM. Para o ensaio, diferentes concentrações de peçonha foram pré-incubadas por 30 min a 37ºC em um volume final de 100 μL. Em seguida, 100 μL de substrato foram adicionados e incubados por 60 min a 37ºC. Passado o período de incubação, a absorbância foi lida a 925 nm, utilizando uma leitora de microplacas (Epoch-BioTek, Winooski, VT, EUA). Brancos foram preparados da mesma forma, substituindo o substrato por igual volume de tampão. Uma concentração mínima fosfolipase A2 foi definida como a menor quantidade de peçonha capaz de produzir um decréscimo de 50% da turbidez em relação ao controle em que se incubou apenas substrato (ausência de peçonha).

Para os ensaios de inibição, a concentração mínima fosfolipase A2 (5 µg) foi pré- incubada com proporções crescentes de cada extrato, a 37ºC por 30 min, e em seguida o ensaio realizado conforme descrito anteriormente. Os resultados foram expressos como

153

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia . porcentagem de atividade fosfolipase A2 em relação ao controle em que apenas peçonha foi incubada (1:0 p/p, peçonha: extrato, considerado 100% de atividade fosfolipase A2), como média ± erro padrão da média, com n = 3.

3.6.2.3. Inibição da Atividade Hialuronidase

A atividade hialuronidase da peçonha foi determinada turbidimetricamente utilizando ácido hialurônico como substrato, conforme descrito previamente na literatura, com pequenas modificações (PAIXÃO-CAVALCANTE et al., 2015). Diferentes concentrações de peçonha foram pré-incubadas por 30 min a 37ºC em um volume final de 80 μL em tampão acetato de sódio 0,2 M, pH 6,0 contendo NaCl 0,15 M. Em seguida, 20 μL de substrato (0,5 µg/µL em tampão acetato) foram adicionados e incubados por 120 min a 37ºC. A reação enzimática foi interrompida pela adição de 200 µL de brometo de hexadeciltrimetilamônio 2,5% em hidróxido de sódio 2%. Após 10 min em repouso à temperatura ambiente, as absorbâncias foram lidas a 440 nm em leitora de microplacas (Epoch-BioTek, Winooski, VT, EUA). Brancos foram preparados da mesma forma, substituindo o substrato por igual volume de tampão. Uma concentração mínima hialuronidase foi definida como a menor quantidade de peçonha capaz de produzir um decréscimo de 50% da turbidez em relação ao controle em que se incubou apenas substrato (ausência de peçonha). Para os ensaios de inibição, a concentração mínima hialuronidase (5 µg) foi pré- incubada com proporções crescentes de cada extrato, a 37ºC por 30 min, e em seguida o ensaio realizado conforme descrito anteriormente. Os resultados foram expressos como porcentagem de atividade hialuronidase em relação ao controle em que apenas peçonha foi incubada (1:0 p/p, peçonha: extrato, considerado 100% de atividade hialuronidase), como média ± erro padrão da média, com n = 3.

3.6.3. ANÁLISE DOS DADOS

Todos os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Análises de variância (ANOVA) de uma via seguido de teste de Tukey foram realizados utilizando o GraphPad Prism versão 5.00 (San Diego, CA, EUA). Valores de P menores que 0,05 foram considerados significativos.

154

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

3.7. RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.7.1. CÁLCULO DE RENDIMENTO DOS EXTRATOS BRUTOS DE Bredemeyera floribunda

As quantidades de materiais das raízes e dos talos das espécies Bredemeyera floribunda empregados para a preparação dos extratos brutos bem como o rendimento referente a cada extrato encontram-se listado Quadro 35.

Quadro 35 – Quantidades de material botânico seco utilizado nas extrações e rendimento obtido dos extratos BFREA, BFTH e BFTE, da espécie Bredemeyera floribunda. Material Botânico/(g) Denominação* Qtde. de Extrato/(g) Rendimento (%) Raízes de Bredemeyera BFREA 14,3125 g 14,31 floribunda (100) Talos de Bredemeyera BFTH 0,5200 g 0,52 floribunda BFTE 5,2800 g 8,28 (100) *BFREA – extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera floribunda. BFTH – extrato hexânico dos talos de Bredemeyera floribunda. BFTE – extrato etanólico dos talos de Bredemeyera floribunda.

Conforme observado no quadro acima, foi possível constatar que o extrato hidroalcoólico das raízes apresentou o melhor rendimento quando comparado aos demais extratos, 14,31 %.

3.7.2. AVALIAÇÃO DO PERFIL FITOQUÍMICO DOS EXTRATOS HIDROALCOÓLICO DAS RAÍZES E ETANÓLICO DOS TALOS DE Bredemeyera floribunda POR ANÁLISE DE LC-MS

A análise de LC-MS aplicada aos extratos de Bredemeyera floribunda, conforme o cromatograma, Figura 56, permitiu prever a partir da análise em bancos de dados (GNPS) que os flavonoides representaram a classe de metabólitos secundários predominantes nesta análise, tanto no extrato hidroalcoólico das raízes quanto no extrato etanólico dos talos.

155

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Fonte: Própria, 2019.

156

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

O Quadro 36 apresenta o tempo de retenção (TR) dos compostos identificados no extrato hidroalcoólico das raízes e no extrato etanólico dos talos, também apresenta a massa exata detectada na ionização em modo negativo, os fragmentos de íons MS/MS dos picos, o nome das estruturas propostas, a fórmula molecular bem como as referências bibliográficas utilizada na identificação dos nove compostos. Dentre os compostos identificados se podem destacar: rutina, naringerina, narcissina, canferol- neohesperidosídeo, isoramnetina-galactosídeo e quercetina (CHEN, et al., 2015; CUYCKENS, et al., 2000).

Quadro 36 – Compostos identificados no extrato hidroalcoólico das raízes e etanol dos talos da espécie Bredemeyera floribunda usando análise de LC-MS/MS em modo de ionização negativo. Pico Rt [M – MS Identificação Fórmula Referências (Composto) (min) H]– Molecular (m/z) (Compostos) (m/z) Constituintes das Raízes 1 36,583 609,16 300,18; rutina C27H30O16 CHEN, et al., 271,21; 2015 179,11; 151,06 2 40,913 477,24 315,13; isoramnetina- C22H22O12 CHEN, et al., 285,22; 270,03 galactosídeo 2015 3 41,338 623,19 315,21; narcissina C28H32O16 CHEN, et al., 300,21; 299,10 2015 4 43,433 271,02 177,00; naringerina C15H10O5 CHEN, et al., 151,02; 119,07 2015 Constituintes dos Talos 5 36,640 609,21 300,19; 271, rutina C27H30O16 CHEN, et al., 07; 151,07 2015 6 40,443 593,16 285,20; canferol- C27H30O15 CUYCKENS, 255,12; 162,99 neohesperidosídeo et al., 2000 7 41,177 623,15 315,18; narcissina C28H32O16 CHEN, et al., 300,17; 299,16 2015 8 44,605 301,16 193,21; quercetina C15H10O7 CHEN, et al., 179,06; 151,09 2015 Fonte: Própria, 2019

Quando se compara os dois extratos brutos (hidroalcoólico das raízes e etanol dos talos) percebe-se que na composição química de ambos os flavonoides é predominante. De acordo com literatura, a rutina e a quercetina já havia sido isolada da espécie Bredemeyera floribunda (OLIVEIRA, 2015; CAVALCANTE, 2015). Os espectros de massa dos compostos identificados, correspondentes às moléculas desprotonadas [M-H]-, e suas respectivas estruturas estão representadas na Figura 57. A partir do conhecimento de alguns padrões de fragmentações foi possível identificar os compostos nos espectros HPLC-MS. A perda 163 Da foi indicativa da presença de hexose gerando aglicona com m/z 315 e 314 característicos de

157

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia . isoramnetina. Também foi evidenciada a perda de 309 Da indicativa de uma estrutura dissacarídica resultando em agliconas com m/z 301 e 300 características de quercetina, m/z 315 e 314 de isoramnetina e m/z 285 e 284 de canferol. Além destes padrões de fragmentações os flavonoides foram ainda confirmados a partir de padrões de fragmentações resultantes de fissão de retro Diels-Alder (RDA) (CELLI, et al., 2011; DAVIS, et al., 2007).

Figura 57 – Espectros de massas com fragmentos MS dos compostos identificados nas raízes e talos de Bredemeyera floribunda, e suas respectivas estruturas. (1e 5) rutina

(2) isoramnetina-galactosídeo

158

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

(3 e 7) narcissina

(4) naringerina

(6) canferol-neohesperidosídeo

159

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

(8) quercetina

Fonte: Própria, 2019.

3.7.3. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DAS RAÍZES DE Bredemeyera floribunda 3.7.3.1. Determinação Estrutural de BFR-1

Sucessivos tratamentos cromatográficos utilizando Sephadex LH-20 aplicado ao extrato etanólico das raízes de Bredemeyera floribunda, BFREA, permitiu o isolamento de um sólido branco amorfo 0,0245 mg, p. f. 91-93 °C e designada BFR-1. A análise do espectro de RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6, Figura 58), de BFR-1, revelou sinais característicos de hidrogênios de dupla ligação, com estereoquímica trans em δ 6,6 (H2', d, J = 15,9 Hz) e δ 7,6 (H3', d, J = 15,9 Hz). O espectro ainda mostrou um singleto integrado para dois hidrogênios em δ 7,0 (2H, s) característico de hidrogênios aromáticos blindados e equivalentes. A análise também permitiu observar absorções para quatro grupos metóxi, um simpleto em δ 3,8 ppm integrado para seis hidrogênios (6H, s), um simpleto em δ 3,7 para três hidrogênios (3H, s) e outro singleto em δ 3,6 integrado também para três hidrogênios (3H, s).

160

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Figura 58 – Espectro de RMN 1H da BFR-1, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

O espectro de RMN 13C DEPTq (300 MHz, DMSO-d6, Figura 59), mostrou dez linhas espectrais. Onde seis sinais observados (105,8; 116,9; 129,4; 139,3; 144,6 e 152,9) foram condizentes com região característica de carbonos sp2, dos quais, três são característicos de carbonos oxigenado não hidrogenados em δ 152,9 para dois carbonos (C-3 e C-5), posto que a molécula se apresenta de forma simétrica no anel aromático e em δ 139,33 (C-4), além de um sinal em δ 129,4 (C-1) de carbono não oxigenado. Também foi observado um sinal em δ 105,8 para dois carbonos hidrogenados (C-2 e C- 6) em virtude da simetria do anel. Ainda foram observados dois sinais de carbonos mono hidrogenados em δ 116,9 (C-2') e em δ 144,61 (C-3'). O espectro também mostrou uma absorção atribuída a carbonila de éster em δ 166,5, além de sinais referentes a quatro metoxilas: um sinal em δ 51,2 (C-7), associado ao carbono sp3 oxigenado ligado a carbonila de éster e outros três sinais característicos de metoxilas ligadas a carbonos aromáticos vicinais, uma dessas metoxilas mais desblindada em δ 59,9 (C-9), indicativa de aglomeração estérica em torno de ambos os grupos metoxilas desblindados centrados em δ 55,8 (C-8 e C-10) que estão ligados a anéis aromáticos.

161

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Figura 59 – Espectro de RMN 13C DEPTq da BFR-1, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

Portanto, baseado na análise dos espectros de RMN 1H, 13C e DEPTq obtidos, bem como por comparação destes com os dados descritos da literatura, Quadro 37, confirmou a estrutura do composto isolado, BFR-1, como sendo um derivado cinâmico, Figura 60, o (2E)-3’-(3,4,5-trimetóxifenil)-prop-2-enoato de metila, já isolado na espécie Bredemeyera floribunda (CAVALCANTE, 2015).

Quadro 37 – Dados de RMN de 1H e 13C DEPTq (DMSO-d6, 300 MHz) de BFR-1, e comparação com os dados da literatura (CDCL3, 500 MHz) (CAVALCANTE, 2015). RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H δC (ppm) δH (ppm) (int., δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., mult., JH,H) JH,H) BFR-1 Literatura (CAVALCANTE, 2015) C 1’ 166,6 167,6 1 129,4 130,1 3 152,9 153,7 4 139,3 140,4 5 152,9 153,7 CH 2’ 116,9 6,6 (1H, d, J=15,9) 117,2 6,3 (1H, d, J =15,9) 3’ 144,6 7,6 (1H, d, J =15,9) 145,0 7,6 (1H, d, J =15,9) 2 105,8 7,0 (1H, s) 105,5 6,7 (1H, s) 6 105,8 7,0 (1H, s) 105,5 6,7 (1H, s) OCH3 7 51,2 51,7 8 55,85 56,4 9 59,9 60,6 10 55,8 56,4 Fonte: Própria, 2019. 162

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Figura 60 – Estrutura química do derivado cinâmico.

Fonte: Própria, 2019.

3.7.3.2. Determinação Estrutural de BFR-2

BFR-2 (0,0623 mg) foi obtido do extrato BFREA a partir dos mesmos tratamentos cromatográficos em Sephadex empregados na obtenção de BFR-1. O composto apresentou-se como um sólido amarelo intenso, com ponto de fusão de 187- 189 °C, e solúvel em metanol o qual foi submetido a análise de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono (RMN 1H e 13C). O espectro de RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6, Figura 61), mostrou dois pares de dupletos em δ 7,2 (1H, d, J = 9,12, H-5), e 7,4 ppm (1H, d, J = 9,12, H-6) orto posicionados. E ainda um simpleto e em δ 6,5 (1H, s, H-2) de hidrogênio aromático blindado. Além disto, foi evidenciado sinais para três grupamentos metoxilas com deslocamento químico em δ 3,7, 3,8 e 3,9 ppm, bem como um sinal em δ 13,1 ppm referente a hidroxila quelada com carbonila em região de campo baixo.

Figura 61 – Espectro de RMN 1H da BFR-2, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

163

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

O espectro de RMN 13C DEPTq (300 MHz, DMSO-d6, Figura 62), indicava a presença de dezessete sinais, sendo um deles em δ 180,6 ppm (C-9) compatível com carbonila de cetona. Além de nove carbonos não hidrogenados com deslocamento em δ 102,4, 114,4, 127,6, 145,4, 145,8, 147,7, 148,8, 157,8, 158,7 e 180,6 (C-8b, C-8a, C-4, C-7, C-8, C-4a, C-4b, C-3, C-1, respectivamente), e três carbonos hidrogenados em δ 94,5 (C-2), 113,3 (C-5) e 123,9 (C-6). Ainda, a análise de RMN 13C evidenciou a presença de três grupos metoxi com absorções em δ 56,2, 60,7 e 60,8.

Figura 62 – Espectro de RMN 13C DEPTq da BFR-2, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

Os valores de RMN de 1H e 13C obtidos foram comparados com valores relatados na literatura (SILVEIRA, et al., 1995; CAVALCANTE, 2015) e disposto no Quadro 38. Os dados confirmaram a estrutura de BFR-2 como sendo o 1,7-dihidroxi- 3,4,8-trimetoxi-xantona, Figura 63, uma xantona já identificada na espécie Bredemeyera floribunda.

164

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Quadro 38 – Dados de RMN de 1H e 13C DEPTq (DMSO-d6, 300 MHz) da xantona trimetoxilada, BFR-2, e comparação com os dados da literatura (CDCL3, 500 MHz) (CAVALCANTE, 2015). RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) BFR-2 Literatura (SILVEIRA, et al., 1995) C 1 158,7 159,3 3 157,8 158,4 4 127,6 127,5 4a 147,7 148,3 4b 148,8 149,4 7 145,4 147,0 8 144,8 145,4 8a 114,4 114,6 8b 102,4 102,2 9 180,6 180,8 CH 2 94,5 6,5 (1H, s) 94,6 6,3 (1H, s) 5 113,2 7,2 (1H, d, J = 9,1) 113,4 7,2 (1H, d, J = 9,0) 6 123,9 7,4 (1H, d, J = 9,1) 124,6 7,3 (1H, d, J = 9,0) OCH3 10 56,2 3,9 (s) 56,4 4,0 11 60,7 3,7 (s) 60,9 3,9 12 60,8 3,8 9s) 61,0 3,8 Fonte: Própria, 2019.

Figura 63 – Estrutura química da xantona trimetoxilada, 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona.

Fonte: Própria, 2019.

3.7.4. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DOS TALOS DE Bredemeyera floribunda 3.7.4.1. Determinação Estrutural de BFT-1

Procedimentos cromatográficos sucessivos realizados com o extrato etanólico dos talos de Bredemeyera floribunda, rendeu uma amostra denominada BFT-1 a qual se apresentou como um sólido amarelo (p.f. > 270 ºC), amorfo e solúvel em metanol. A amostra foi então, analisado por ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono (RMN 1H e 13C).

165

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

O espectro de RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz, Figura 64), mostrou um conjunto de sinais em  8,04 (2H, d, J = 8,76 Hz, H-2’, H-6’) e 6,9 ppm (2H, d, J = 8,76 Hz, H- 3’, H-5’) referentes a um sistema aromático de spin AA’BB’ e dois dupletos em  6,1 e 6,4 ppm (1H, d, J= 1,68 Hz, H-6 e H-8), compatíveis com hidrogênios aromáticos meta- posicionados.

Figura 64 – Espectro de RMN 1H da BFT-1, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

O espectro de RMN 13C-CPD de BFT-1 (DMSO-d6, 300 MHz, Figura 65), exibiu treze linhas espectrais, relacionadas a carbonos sp2 ( 176,3; 164,4; 161,1; 159,6; 156,6; 147,2; 136,1; 129,9; 122,1; 115,9; 103,5; 98,6 e 93,9). A absorção em  176,3 (C-4) foi associada à carbonila de cetona conjugada, enquanto que os sinais em  136,1 (C-3); 147,2 (C-2); 156,6 (C-9); 159,6 (C-9); 161,1 (C-5); 164,4 (C-7) foram associados a carbonos oxigenados. Os carbonos hidrogenados foram identificados por RMN-HSQC através das seguintes correlações: os dupletos em H 6,4 (C-8) e 6,1 (C-6) correlacionados com os sinais de carbono em C 93,9 (C-8) e 98,6 (C-6) respectivamente. Os hidrogênios do sistema AA’BB’ [(H 6,9 (H-3’; H-5’) e 8,0 (H-2’;

H-6’)] apresentou correlações em com os sinais de carbono em [C 115,9 (H-3’; H-5’) e 129,9 (H-2’; H-6’)], respectivamente.

166

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Figura 65 – Espectro de RMN 13C da BFT-1, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

As correlações observadas no espectro de RMN-HMBC (300 MHz, DMSO, Figura 66), corroborou com a identificação do composto, ao revelar os acoplamentos dos hidrogênios H-2’/H-6’ a três ligações com o carbono C-2 (175,2) e dos hidrogênios H-3’/H-5’ também a três ligações com o carbono C-4’ (159,6). Enquanto o hidrogênio H-6 mostrou acoplamento com os carbonos C-5 ( 161,1) e C-7 ( 164,4) a duas ligações e os hidrogênios H-8 apresentou acoplamento com os carbonos C-7 ( 164,4) e C-9 ( 156,6) também a duas ligações.

Figura 66 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C-HMBC da BFT-1, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019

167

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

As análise dos dados de RMN 1H e RMN 13C obtidos e a comparação com os dados disponíveis na literatura (SINGH, et al., 2008), Quadro 39 bem como a análise do espectro de correlação a longa distância HMBC, comprovaram que o metabólito secundário denominado de BFT-1 se trata da estrutura do flavonoide canferol, 3,5,7- triidroxi4-hidr-2-(oxyfenil)-4H-chomen-4-one, já descrito anteriormente na literatura, contudo este composto está sendo isolado pela primeira vez na espécie Bredemeyera floribunda, Figura 67.

Quadro 39 – Dados de RMN de 1H e 13C (DMSO-d6, 300 MHz) de BFT-1, Canferol, e comparação com os dados da literatura (SINGH, et al., 2008). RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) BFT-1 Literatura (SINGH, et al., 2008) C 2 147,2 146,6 3 136,1 135,7 4 176,3 175,9 5 161,1 161,1 7 164,4 164,2 9 156,6 156,8 10 103,5 103,1 1’ 122,1 122,3 4’ 159,6 159,1 CH 6 98,6 6,1 (1H, d, J = 1,6) 97,9 6,0 (1H, d, J = 2,1) 8 93,9 6,4 (1H, d, J = 1,6) 93,1 6,3 (1H, d, J = 2,1) 2’ 129,9 8,0 (1H, d, J = 8,7) 129,2 8,0 (1H, d, J = 9,0) 3’ 115,9 6,9 (2H, d, J = 8,7) 115,3 6,8 (2H, d, J = 9,0) 5’ 115,9 6,9 (2H, d, J = 8,7) 115,3 6,8 (2H, d, J = 9,0) 6’ 129,9 8,0 (1H, d, J = 8,7) 129,2 8,0 (1H, d, J = 9,0) Fonte: Própria, 2019.

Figura 67 – Estrutura química do flavonol, canferol.

Fonte: Própria, 2019.

3.7.4.2. Determinação Estrutural de BFT-2

Procedimentos cromatográficos sucessivos realizados com o extrato etanólico dos Talos de Bredemeyera floribunda, rendeu uma amostra denominada BFT-2 a qual 168

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia . se apresentou como um sólido amarelo (p.f. > 300 ºC), amorfo e solúvel em metanol. A amostra foi então, analisado por ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono (RMN 1H e 13C). O espectro de RMN 1H (DMSO-d6, 300 MH, Figura 68), mostrou um conjunto de sinais em  7,6 (1H, d, J = 2,1, H-2’), 6,8 (1H, d, J = 8,4, H-5’) e 7,5 ppm (1H, dd, J = 2,1, 8,4, H-6’) referentes a um sistema aromático de spin ABX e dois dupletos em  6,1 e 6,4 ppm (1H, d, J= 1,9, H-6 e H-8, respectivamente), compatíveis com hidrogênios aromáticos meta-posicionados.

Figura 68 – Espectro de RMN 1H da BFT-2, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

O espectro de RMN 13C-CPD de BFT-2 (DMSO-d6, 300 MHz, Figura 69), exibiu quinze linhas espectrais, relacionadas a carbonos sp2 ( 176,2; 164,4; 161,1; 156,6; 148,1; 147,2; 145,4; 136,1; 122,4; 120,3; 115,9; 115,4; 103,3; 98,5 e 93,7). A absorção em  176,2 (C-4) foi associada à carbonila de cetona conjugada, enquanto os sinais em  164,4 (C-7); 161,1 (C-5); 156,6 (C-9); 147,2 (C-2); 136,1 (C-3); 148,1 (C- 4’); 145,4 (C-3’) correspondem a carbonos oxigenados.

169

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Figura 69 – Espectro de RMN 13C da BFT-2, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

Os carbonos hidrogenados foram identificados por RMN-HSQC, Figura 70, através das seguintes correlações: os dupletos em H 6,4 (C-8) e 6,1 (C-6) com os sinais de carbono em C 93,7 (C-8) e 98,5 (C-6) e os hidrogênios do sistema ABX [(H 6,8 (H-

5’); 7,5 (H-6’) e 7,6 (H-2’)] com os sinais de carbono em C 115,9 (H-5’); 120,3 (H-6’) e 115,4 (H-2’), respectivamente.

Figura 70 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C-HSQC da BFT-2, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

170

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

A partir da análise dos dados de RMN 1H e RMN 13C obtidos e comparação com os dados disponíveis na literatura (MARTINS et al, 2006; LALLEMAND & DUTEIL, 1977), Quadro 40, pôde-se sugerir para BFT-2 a estrutura do flavonoide quercetina, Figura 71, já descrito anteriormente na literatura, porem isolado pela primeira vez na espécie Bredemeyera floribunda.

Quadro 40 – Dados de RMN de 1H e 13C (DMSO-d6, 300 MHz) de BFT-2, Quercetina, e comparação com os dados da literatura (LALLEMAND & DUTEIL, 1977). RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) BFT-2 Literatura (LALLEMAND & DUTEIL, 1977) C 2 147,2 147,5 3 136,1 136,5 4 176,2 176,5 5 161,1 161,0 7 164,4 166,5 9 156,6 156,7 10 103,3 104,0 1’ 122,4 123,0 3’ 145,4 145,7 4’ 148,1 148,1 CH 6 98,5 6,1 (1H, d, j = 3,0) 99,5 6,1 (1H, d, j = 3,0) 8 93,7 6,4 (1H, d, j = 3,0) 94,5 6,4 (1H, d, j = 3,0) 2’ 115,4 7,6 (1H, d, j = 3,0) 116,5 6,6 (1H, d, j = 3,0) 5’ 115,9 6,8 (1H, d, j = 9,0) 116,0 6,8 (1H, d, j = 9,0) 6’ 120,3 7,5 (1H, dd, j = 3,0; 9,0) 121,0 7,5 (1H, dd, j = 3,0; 9,0) OH 12,4 (1H, s) Fonte: Própria, 2019.

Figura 71 – Estrutura química do flavonol, quercetina.

Fonte: Própria, 2019.

3.7.4.3. Determinação Estrutural de BFT-3

A partir dos tratamentos cromatográficos aplicados ao extrato etanólico dos talos de Bredemeyera floribunda obteve-se um sólido amarelo intenso (p. f. > 200 °C) amorfo

171

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia . solúvel em metanol, o qual foi denominado de BFT-3 e analisado por ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono (RMN 1H e 13C). A análise de RMN 1H de BFT-3 (DMSO-d6, 300 MHz, Figura 72), apresentou sinais característicos de hidrogênios de carboidratos entre  3,0 e 4,5 ppm, bem como absorções de hidrogênios ligados a anel aromático com deslocamentos químico entre  6,1 e 7,6 ppm. Assim, em  6,1(1H; d; J = 2,0; H-6) e 6,3 ppm (1H; d; J = 2,0; H-8) foi observado dois dubleto característicos de hidrogênios com estereoquímica meta e que estão sob efeito de grupos protetores. Também foi evidenciados acoplamentos orto de hidrogênios centrados em 6,8 (1H; d; J = 8,1; H-5’) e 7,5 (1H; dd; J = 2,4, 7,5; H-6’) bem como, deste último (H-6’) com um hidrogênio em  7,5 (1H; d; J = 1,5; H-2’) com acoplamento meta.

Figura 72 – Espectro de RMN 1H da BFT-3, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

O espectro de RMN 13C DEPTq (DMSO-d6, 300 MHz, Figura 73), apresentou vinte e sete linhas espectrais, das quais quinze são características de carbono do tipo sp2. Destas, oito são características de carbonos oxigenados com deslocamento químico em  133,0; 144,6; 148,5; 156,2; 156,3; 160,9; 165,4 e 176,9 ppm (C-3, C-3’, C-4’, C-9, C- 2, C-5, C-7 e C-4, respectivamente) e cinco são carbonos não oxigenados em  93,0; 98,9; 103,1; 115,0; 115,8; 120,8; 121,5 ppm (C-8, C-6, C-10, C-5’, C-2’, C-1’, e C-6’). Ainda foi evidenciado a presença de carbonos típicos sp3 na faixa compreendida entre 17,6 e 105,0 ppm característicos de carboidratos, o que justifica a presença de glicosídeo. Assim, o sinal em  17,6 ppm refere-se a carbono metílico e o sinal em  66,8 ppm é atribuído ao carbono metilênico. Além destes, foi possível ainda observar 172

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia . mais dez carbonos típicos de açúcar em  6,8,0; 69,8; 70.1; 70,3; 71,6; 73,9; 75,7; 76,2 e dois sinais em 100,2 101,2 ppm característicos de carbonos anoméricos (H-5’’’, H-4’’, H-3’’’, H-2’’’, H-4’’’, H-3’’, H-2’’, H-5’’, H-1’’’ e H-1’’, respectivamente).

Figura 73 – Espectro de RMN 13C DEPTq da BFT-3, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

Todas as atribuições descritas de BFT-3 são compatíveis com as absorções de compostos pertencentes a classe de flavonoides. Portanto os dados do composto isolado foram comparados aos dados da literatura (CAVALCANTE, 2015; MOURA, 2011), Quadro 41, o que nos possibilitou constatar que BFR-3, trata-se do flavonoide rutina (Quercetina-3-O-rhamnopiranosil-glucopiranosideo ou 3,3’,4’,5,7-pentahidroxifavona- 3-rhamnoglucosideo), Figura 74, já isolado nas raízes da espécie Bredemeyera floribunda.

173

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Quadro 41 – Dados de RMN de 1H e 13C (DMSO-d6, 300 MHz) de BFT-3, Rutina, e comparação com os dados da literatura (CAVALCANTE, 2015) (MeOD, 300 MHz). RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) BFT-3 Literatura (MOURA, 2011) C 2 156,3 156,5 3 133,0 133,2 4 176,9 177,3 5 160,9 161,2 7 165,4 164,5 9 156,2 156,4 10 103,1 103,7 1’ 120,8 121,5 3’ 144,6 115,2 4’ 148,5 148,5 CH 6 98,9 6,1 (1H, d, j =2,0) 98,7 6,2 (1H, d, j = 2,1) 8 93,0 6,3 (1H, d, j = 2,0) 93,6 6,4 (1H, d, j = 2,1) 2’ 115,8 7,5 (1H, d, j = 1,5) 116,2 7,5 (1H, d, j = 2,0) 5’ 115,0 6,8 (1H, d, j = 8,1) 115,2 6,8 (1H, d, j = 9,0) 6’ 121,5 7,5 (1H, dd, j = 2,4; 7,5) 121,0 7,5 (1H, dd, j = 2,4; 7,8) 1’’ 101,2 5,4(1H, d, j = 7,5) 101,2 5,4 (1H, d, j = 7,2) 2’’ 75,7 75,8 3’’ 73,9 74,0 4’’ 69,8 69,9 5’’ 76,2 76,4 1’’’ 100,5 4,3 (1H, d, j = 7,5) 100,7 4,3 8 (1H, d, j = 1,0) 2’’’ 70,3 70,5 3’’’ 70,1 70,3 4’’’ 71,6 71,8 5’’’ 68,0 68,2 CH2 6’’ 66,8 66,9 CH3 6’’’ 17,6 1,0 (3H, d, j = 6,1) 17,6 0.9 (3H, d, j = 6,0) Fonte: Própria, 2019.

Figura 74 – Estrutura química do flavonoide rutina.

Fonte: Própria, 2019.

174

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

3.7.5. CÁLCULO DE RENDIMENTO DOS EXTRATOS BRUTOS DE Bredemeyera brevifolia

As quantidades de materiais vegetais das raízes e dos talos da espécie Bredemeyera brevifolia empregados para a preparação dos extratos brutos bem como o rendimento referente a cada extrato obtido encontram-se listado no Quadro 42.

Quadro 42 – Quantidades de material botânico seco utilizado nas extrações e rendimento obtido dos extratos BBREA, BBTH e BBTE da espécie Bredemeyera brevifolia. Material Botânico/(g) Denominação* Qtde. de Extrato/(g) Rendimento (%) Raízes de Bredemeyera BBREA 18,5500 g 18,55 brevifolia (100) Talos de Bredemeyera BBTH 0,1947 g 0,19 brevifolia BBTE 4,0109 g 4,01 (100) *BBREA – extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera brevifolia. BBTH – extrato hexânico dos talos de Bredemeyera brevifolia. BBTE – extrato etanólico dos talos de Bredemeyera brevifolia

A partir dos dados observados no quadro acima, foi possível verificar que o extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera brevifolia apresentou o melhor rendimento, 18,55 %, quando comparado aos demais extratos.

3.7.6. AVALIAÇÃO DO PERFIL FITOQUÍMICO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DAS RAÍZES E ETANOL DOS TALOS DE Bredemeyera brevifolia POR ANÁLISE DE LC-MS

A análise de LC-MS aplicada aos extratos da espécie Bredemeyera brevifolia, conforme observado nos cromatogramas A e B, Figura 75, foi possível prever o perfil químico dos extratos da espécie.

175

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Fonte: Própria, 2019.

176

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Com base ao observado no Quadro 43, foram identificados dez constituem nas raízes e talos da espécie Bredemeyera brevifolia. Dentre estes compostos estão: sibiricose A5, hesperetina-C-dihexosídeo, hesperetina-C-dihexosil-pentosídeo, rutina, crisoeriol, taxifolina-glicosídeo, manghaslina e luteolina, (BRITO et al., 2014; CHEN, et al., 2015; S BRITO et al., 2014; SHE, et al., 2011; BRITO, et al., 2014; EMAM, et al., 1998; LIU, et al., 2009).

Quadro 43– Compostos identificados nos extratos hidroalcoólicos das raízes e etanólico dos talos da espécie Bredemeyera brevifolia usando análise de LC-MS/MS em modo de ionização negativo. Pico Rt [M – H]– MSn Identificação Fórmula Referências (Composto) (min) (m/z) Molecular (m/z) (Compostos) Constituintes das Raízes 1 20,031 517,25 337,17; 175,13; sibiricose A5 C22H30O14 SHE, et al., 160,10 2011 2 32,195 625,21 299,23; 284,14; hesperetina- C28H34O16 EMAM, et al., 183,94 C- 1998; LIU, et dihexosídeo al., 2009 3 35,672 757,32 625,25; 299,22; hesperetina- C33H42O20 EMAM, et al., 284,15 C- dihexosil- 1998; LIU, et O-pentosídeo al., 2009 4 36,831 609,17 300,16; 271,20; rutina C27H30O16 CHEN, et al., 179,06 2015 5 52,224 299,21 284,17; 183,10; crisoeriol C16H12O6 RINALDO, et 134,06 al., 2007 Constituintes dos Talos 6 19,974 517,61 179,02; 193,06; sibiricose A5 C22H30O14 SHE, et al., 175,15 2011 7 26,970 465,06 285,17; 179,01; taxifolina- C21H22O12 GÖDECKE, 151,13 glicosídeo et al., 2005 8 33,121 755,33 343,08; manghaslina C33H40O20 KARIOTI, et 300,17;299,10 al., 2011 9 36,616 609,13 300,21; 271,12; rutina C27H30O16 CHEN, et al., 179,08 2015 10 47,086 285,19 242,16; 217,05; luteolina C15H10O6 BRITO, et al., 175,15; 133,11 2014 Fonte: Própria, 2019.

Portanto, assim como foi observado na identificação da espécie Bredemeyera floribunda, também na Bredemeyera brevifolia, os flavonoides constituíram a classe de metabólitos de maior representatividade. Os espectros de massa dos compostos identificados em suas formas desprotonadas [M-H]- bem como suas respectivas estruturas estão representadas na Figura 76. O conhecimento de alguns padrões de fragmentações possibilitou a identificação de alguns compostos nos espectros HPLC- MS. A perda de 309 e 326 Da indicativa de estrutura dissacarídica resultou em agliconas com m/z 301 e 300 e 300 e 299 característica de quercetina e diosmetina

177

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

(referente aos compostos em Rt 32 e 36), a perda de 455 Da expressiva de estrutura polissacarídica (glicosil-rutinosídeo) gerando agliconas com m/z 300 e 301 de quercetina a qual foi atribuída a maghaslina (composto com Rt 33), e a perda 132 e 326 Da foram também indicativas de estruturas polissacarídica a qual gerou a aglicona com m/z 299 característica de diosmetina. Além destes padrões de fragmentações outros flavonoides foram ainda confirmados a partir de padrões de fragmentações resultantes de fissão de retro Diels-Alder (RDA), como a formação do íon m/z 179 entre as posições O-C2 e C-2-C3 e o íon m/z 151 resultante também de uma fissão RDA entre as posições O-C2 e C3-C4, as quais foram observadas para a taxifolina-glicosídeo.

Figura 76 – Espectros de massas com fragmentos MS dos compostos identificados nas raízes e talos de Bredemeyera brevifolia, e suas respectivas estruturas. (1e 6) sibiricose A5

(2) hesperetina-C-dihexosídeo

178

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

(3) hesperetina-C-dihexosil-pentosídeo

(4 e 9) rutina

(5) crisoeriol

179

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

(7) taxifolina-glicosídeo

(8) manghaslina

(10) luteolina

Fonte: Própria, 2019.

180

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

3.7.7. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DAS RAÍZES DE Bredemeyera brevifolia 3.7.7.1. Determinação Estrutural de BBR-1

Tratamento cromatográfico aplicado a fração clorofórmica da partição, BBREA- C, do extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera brevifolia, levou ao isolamento de um sólido amarelo, denominado BBR-1. O espectro de RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz, Figura 77), apresentou sinais característicos de mistura de flavonoides, com absorções referentes a grupos metoxilas em  3,74; 3,88 e 3,89 ppm, o que nos levou a supor que a amostra se tratava de flavonoides metoxilados. Entre  6,0 e 7,6 foi evidenciado nove sinasi característico de hidrogênios aromáticos. Em  6,2 e 6,5 ppm foi observado dois dupletos meta posicionados (1H; d; 2,0) os quais foram atribuídos aos hidrogênios H-6 e H-8 respectivamente, um dupleto orto posicionado em 6,94 (1H, j = 9,0), um dupleto de dupleto em  7,58 (1H; dd; 9,0) com acoplamento orto e meta, um dupleto em  7,55 (1H; d) e um simpleto em  6,91 (1H, s). Ainda foi evidenciado mais três simpleto em  6,44; 7,42 e 6,88.

Figura 77 – Espectro de RMN 1H da BBR-1, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

A análise do espectro de RMN 13C (DMSO-d6, 300 MHz, Figura 78), corroborou para constatar que a amostra se tratava de uma mistura, uma vez que a quantidade de sinais carbono praticamente dobrou. Em  181,63 e 178,89 ppm foi observado duas absorções características de cetonas conjugadas e em 55,70, 55,80 e

181

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

59,80 foi evidenciada a presença de grupos metoxilas. A presença de absorções de carbono sp2 também evidenciava na de mistura.

Figura 78 – Espectro de RMN 13C DEPTq da BBR-1, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

Contudo, a determinação estrutural das moléculas só foi possível a partir das correlações dos espectros bidimensionais. Através das correlações existentes no 1 espectro de RMN-HSQC ( JC,H), Figura 79, foram feitas as atribuições dos carbonos hidrogenados, onde foi possível constatar a presença de nove carbonos sp2 hidrogenado além três carbonos sp3 também hidrogenado. Os hidrogênios em  6,20; 6,44; 6,51; 6,88; 6,94; 6,91; 6,94; 7,42; 7,55 e 7,58 foram atribuídos aos respectivos sinais de carbonos  98,67; 93,68; 93,89; 102,49; 115,61; 103,04; 115,61; 104,31; 110,04 e 120,20.

182

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Figura 79 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C – HSQC da BBR-1, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

O espectro RMN-HMBC, Figura 80, corroborou para diferenciar dois as estruturas dos possíveis flavonoides, ao revelar os acoplamentos dos hidrogênios em: 

2 6,20 (H-6) a duas ligações ( JC,H) com o carbono em  161,27 (C-5) e a três ligações

3 ( JC,H) com os carbonos em  103,53 (C-10) e 93,89 (C-8);  6,51 (H-8) a duas ligações com os carbonos em  164,02 (C-7) e 157,17 (C-9) e a três ligações com os carbonos  103,53 (C-10) e 98,67 (C-6);  6,91 (H-3) a duas ligações com carbonos em  163,50 (C-2) e 181,63 (C-4) e a três ligações com o carbono em  103,53 (C-10);  6,94 (H-5’) a duas ligações com os carbonos em  150,58 (C-4’) e 120,20 (C-6’) e a três ligações apenas com o carbono em  147,87 (C-3’);  7,55 (H-2’) a duas ligações somente com o carbono em  147,87 (C-3’) e a três ligações apenas o carbono em  120,20 (6’); e por fim o hidrogênio em  7,58 (H-6’) fazendo correlação apenas a três ligações com os carbonos em  163,50 (C-2) e 110,04 (C-2’). Os hidrogênios da metoxila (3’-OCH3) mostrou correlação a três ligações com o carbono em  147,87 (C-3’). Esse conjunto de correlações ajudou a identificar uma das estruturas da mistura a qual foi denominada de BBR-1A. No espectro de RMN-HMBC, ainda foi possível identicar outro conjunto de correlações as quais demoninamos de BBR-1B. Ao revelar correlações de três

183

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia . hidrogênios em:  6,44 (H-8) correlacionando-se a duas ligações com os carbonos em  164,02 (C-7) e 157,17 (C-9) e a três ligações com os carbonos em  130,37 (C-6) e 101,57 (C-10);  6,88 (H-3) mostraram correlações a duas ligações com os carbonos em  163,50 (C-2) e 181,63 (C-4) e a três ligações apena com carbono em  103,53 (C-10) enquanto o hidrogênio em  7,42 (H-6’) mostrou correlações apenas a duas ligações com o carbono em  121,34 (C-10). Os hidrogênios das duas metoxilas também evidenciaram correlações, em que os sinais das metoxilas em  3,75 (6-OCH3) apresentou correlações a três ligações com o carbono em 130,37 (C-6) e os hidrogênios da metoxila em 3,88 (5’-OCH3) se correlacionou com o carbono em 146,05 (C-5’) também a três ligações.

Figura 80 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C – HMBC da BBR-1, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

A reunião de todos os dados espectroscópicos, em especial os espectros de RMN 1H, 13C-HSQC e HMBC, bem como os dados disponíveis na literatura (WAGNER, et al., 1976; KONGKUM, et al., 2012), Quadro 44, contribuíram para a identificação das estruturas da mistura, as quais foram denominadas de BBR-1A e BBR-1B como sendo dois flavonoides do tipo flavona, a 5,7,4’-trihidroxi-3’-metoxiflavona e 5,7,2’,3’,4’- pentahidroxi-6,4’dimetoxiflavona, respectivamente, ambas identificadas pela primeira

184

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

vez na Bredemeyera brevifolia e a 5,7,2’,3’,4’-pentahidroxi-6,4’dimetoxiflavona relatada pela primeira vez na literatura, Figura 81.

Quadro 44 – Dados de RMN de 1H e 13C (DMSO-d6, 300 MHz) de BBR-1A, mistura de xantonas, e comparação com os dados da literatura (WAGNER, et al., 1976; KONGKUM, et al., 2012) (DMSO-d6). RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H RMN 1H RMN 13C δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) (int., mult., (int., mult., JH,H) JH,H) BBR-1A Literatura BBR-1B Literatura (WAGNER, et (KONGKUM, et al., 1976) al., 2012) C 2 163,50 - 163,7 163.50 161,2 4 181,63 - 181,8 178.89 182,2 5 161,27 - 157,4 153.71 152,7 6 - - 98,8 130.37 131,3 7 164,04 - 164,2 157.90 157,4 9 157,17 - 161,6 152.24 152,5 10 103,53 - 103,3 101.57 104,1 1’ 121,34 - 120,4 110.67 112,1 3’ 147,87 - 160,8 ND 141,8 4’ 150,58 - 148,0 ND 144,7 CH 3 103,04 6,91 (s) 103,8 102.49 6,88 (s) 108,1 6 98,67 6,20 (d; 2,0) 98,8 - - 131,3 8 93,89 6,51 (d; 2,0) 94,0 93.68 6,44 (s) 94,0 2’ 110,04 7,55 (d) 110,2 - - 143,3 5’ 115,61 6,94 (d; 9,0) 115,8 - - 143,6 6’ 120,20 7,58 (dd; 121,7 104.31 7,42 (s) 108,9 9,0) OCH3 6 - - 59,80 - 60,0 3’ 55,80 3,90 (s) 56,0 - - - 5’ - - 55,70 3,88 (s) - OH 5 - - - 13,3 (s) - Fonte: Própria, 2019.

Figura 81 – Estruturas químicas das flavonas 5,7,4’-trihidroxi-3’-metoxiflavona e 5,7,2’,3’,4’-pentahidroxi-6,4’dimetoxiflavona.

Fonte: Própria, 2019.

185

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

3.7.7.2. BBR-2

Tratamentos cromatográficos aplicados a fração acetato da partição do extrato etanólico das raízes de Bredemeyera brevifolia, BBR-Ac, levou ao isolamento de um sólido amarelo, solúvel em metanol o qual foi denominado BBR-2. O espectro de RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz, Figura 82), mostrou sinais semelhantes da molécula BBR-1A, em que foi possível observar dois dubletos meta posiciona em  5,76 (2H; j = 1,7) e 6,03 (1H; j = 1,7), além de um simpleto em  6,55 ppm (1H, s), um dubleto orto posicionado, centrado em  6,82 (1H, j = 8,2), um dupleto  7,41 (1H, j = 1,7) e dupleto de dupleto em 7,43 (1H; 8,2, 2,3). Também foi evidenciado absorção característica de um grupo metoxila em  3,85 ppm.

Figura 82 – Espectro de RMN 1H da BBR-2, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

O espectro de RMN 13C DEPTq (DMSO-d6, 300 MHz, Figura 83), também evidenciou uma estrutura semelhante à BBR-1A, onde foi observado quatorze sinais espectrais de carbono, sendo seis hidrogenados e uma absorção em  56,87 de grupo metóxi ligado a anel aromático, contudo, alguns sinais talvez não tenham sido evidenciados devido a metodologia de operação empregada.

186

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Figura 83 – Espectro de RMN 13C DEPTq da BBR-2, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019.

Através da análise do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C-HSQC (DMSO-d6, 300 MHz, Figura 84), foi possível correlacionar os hidrogênios pertencentes a seus respectivos carbonos, bem como confirmar a presença do grupo metoxila pela correlação do sinal em  55,87 com o sinal em  3,8. A correlação entre o hidrogênio em H 6,55(1H; s; H-3) ppm com os carbonos em  102,01 (C-3) identificou o esqueleto flavonóidico semelhante deste tipo de estrutura.

Figura 84 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C-HSQC da BBR-2, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019. 187

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Outras correlações foram evidenciadas a partir da análise do espectro de RMN 1H, 13C-HMBC, Figura 85, o qual permitiu observar correlações entre o hidrogênio em

H 6,55 (H-3) com os carbonos em C 162,25 (C-2) e C 180,10 (C-4) a duas ligações e em C 103,43 a três ligações.

Figura 85 – Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C-HMBC da BBR-2, (DMSO-d6, 300 MHz).

Fonte: Própria, 2019. Portanto, com base nos dados espectroscópicos aqui discutidos, Quadro 45, e os dados disponíveis na literatura (WAGNER, et al., 1976) pode-se confirmar para a BBR-2 a mesma estrutura identificada para a BBR-1A, a flavona, 5,7,4’-trihidroxi-3’- metoxiflavona isolada pela primeira vez Bredemeyera brevifolia, Figura 86.

188

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

Quadro 45 – Dados de RMN de 1H e 13C (DMSO-d6, 300 MHz) de BBR-2 e comparação com os dados da literatura (WAGNER, et al., 1976) (DMSO-d6). RMN 13C RMN 1H RMN 13C δC (ppm) δH (ppm) (int., mult., JH,H) δC (ppm) BBR-2 Literatura (WAGNER, et al., 1976) C 2 162,25 - 163,7 4 180,10 - 181,8 5 161,47 - 157,4 7 ND - 164,2 9 ND - 161,6 10 103,43 - 103,3 1’ 120,34 - 120,4 3’ 148,46 - 160,8 4’ 150,38 - 148,0 CH 3 102,01 6,55 (1H, s) 103,8 6 98,80 5,76 (1H, d, j =1,7) 98,8 8 95,41 6,03 (1H, d, j =1,7) 94,0 2’ 109,81 7,41 (1H, d, j =2,1) 110,2 5’ 116,25 6,82 (1H, d, 8,2) 115,8 6’ 121,53 7,43 (1H, dd, 8,2; 2,31) 121,7 OCH3 3’ 55,87 3,8 (3H, s) 56,0 Fonte: Própria, 2019.

Figura 86 – Estruturas químicas de 5,7,4’-trihidroxi-3’-metoxiflavona

Fonte: Própria, 2019.

3.7.8. INVESTIGAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS DA PEÇONHA DA SERPENTE Bothrops jararaca FRENTE OS EXTRATOS HIDROAOCOÓLICOS DAS RAÍZES DE Bredemeyera floribunda Willd E Bredemeyera brevifolia Benth

Para investigar o potencial antiofídico das espécies Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia, os extratos hidroalcoólicos das espécies foram avaliados quanto à capacidade de inibir as atividades enzimáticas in vitro: proteolítica, fosfolipásica e hialuronidásica da peçonha da serpente Bothrops jararaca. Portanto,

189

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia . conforme pode ser observado nas Figura 87, Figura 88 e Figura 89, nenhum dos extratos foi capaz de inibir significativamente as atividades proteolíticas e fosfolipásica da peçonha. Concentrações maiores de extrato foram testadas, porém resultados similares foram encontrados (dados não apresentados). Entretanto, na Figura 89, é possível observar a significativa atividade inibitória a partir da proporção 1:5 (peçonha: extrato, p/p), chegando a 100% de inibição do extrato hidroalcoólico da espécie Bredemeyera brevifolia contra a atividade hialuronidásica de B. jararaca, o que indica o potencial inibitório dos constituintes desta espécie contra hialuronidases.

125 125 100 100 75 75 50 50 25

25 proteolítica % Atividade 0

% Atividade proteolítica % Atividade 1:0 1:1 1:5 1:10 1:25 1:50 0:50 0 1:0 1:1 1:5 1:10 1:25 1:50 0:50 Peçonha: B. floribunda (p/p) Peçonha: B. brevifolia (p/p)

Fonte: Própria, 2019.

125 125

100 100

75 75

50 50

25 25 % Atividade fosfolipase % Atividade 0 fosfolipase % Atividade 0 1:0 1:1 1:5 1:10 1:25 1:50 0:50 1:0 1:1 1:5 1:10 1:25 1:50 0:50 Peçonha: B. brevifolia (p/p) Peçonha: B. floribunda (p/p)

Fonte: Própria, 2019.

190

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

125 125

100 100

75 75

50 50

25 25

% Atividade hialuronidase % Atividade 0 1:0 1:0,1 1:1 1:2,5 1:5 0:5 hialuronidase % Atividade 0 1:0 1:0,1 1:1 1:2,5 1:5 0:5 Peçonha: B. brevifolia (p/p) Peçonha: B. floribunda (p/p)

Fonte: Própria, 2019.

Hialuronidases, popularmente conhecidas como “fatores de espalhamento”, são toxinas que geralmente agem sobre o ácido hialurônico da matriz extracelular (MEC) de tecidos conectivos frouxos, enfraquecendo sua integridade estrutural pela degradação do ácido hialurônico e facilitação da difusão de outras toxinas agindo, portanto, como toxinas auxiliares (KEMPARAJU & GIRISH, 2006; LAUSTSEN, 2016). Além disso, os produtos de degradação do ácido hialurônico agem como padrões moleculares associados a danos (DAMPs) e são imunoestimulatórios e pró-inflamatórios por natureza, ativando uma série de vias inflamatórias e aumentando a expressão de citocinas pró-inflamatórias tais como TNF-α (fator de necrose tumorial α), interleucina 1β (IL-1β) e interleucina 6 (IL-6), agravando a inflamação durante os envenenamentos ofídicos (SUNITHA et al., 2015). Dessa maneira, dada a relevância das hialuronidases, essa classe de toxina é um importante alvo terapêutico para desenvolvimento de agentes antiofídicos. Por isso, a atividade inibitória apresentada pelo extrato de B. brevifolia é interessante para justificar seu uso popular como antiofídica e desperta interesse para descoberta de novos inibidores. Apesar de neste ensaio não ter se observado efeito inibitório frente às classes de toxinas testadas de B. jararaca, de acordo com a literatura, as raízes de Bredemeyera floribunda são popularmente usadas para tratar picada de serpente na região semiárida do Nordeste do Brasil. E estudos anteriores para avaliar a atividade antiofídica do extrato de Bredemeyera floribunda contra peçonha de Bothrops jararacussu, mostraram inibição significativa da atividade proteolítica e da atividade fosfolipase. Resultados estes que podem estar relacionados aos seus constituintes químicos como flavonoides, 191

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia . saponinas triterpénicas e cumarinas encontradas em suas raízes e considerados potentes inibidores de peçonha botrópica. (ALVES, et al., 2019; FERNANDES, 2011). Portanto, os resultados iniciais aqui obtidos se apresentaram bastantes relevante, pois demostraram a potencialidade de espécie Bredemeyera brevifolia como fonte de moléculas antiofídicas, uma vez que o extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera brevifolia apresentou melhor efeito frente às enzimas da peçonha de Bothrops jararaca quando comparado com o extrato hidroalcoólico de Bredemeyera floribunda, fornecendo assim, evidencias para o uso do extrato de B. brevifolia na medicina tradicional brasileira. Contudo, mais estudos serão necessários para melhor avaliar o modo de ação do extrato de B. brevifolia.

192

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

3.8. CONCLUSÃO

A técnica de LC-MS aplicada aos extratos hidroalcoólicos das raízes e etanólicos dos talos das espécies Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia permitiu prever, a partir da análise em banco de dados do GNPS e por comparação com a literatura, que os flavonoides representam a classe de metabólitos secundários mais expressiva em todos os extratos analisados. Estes resultados podem ser decorrentes do fato das análises terem sido realizadas em modo negativo, o que favoreceu a desprotonação dos flavonoides. Na B. floribunda foram identificados rutina, naringerina, narcissina, Isoramnetina-3-galactosídeo, canferol-neohesperidosídeo e quercetina. Enquanto, na B. brevifolia foram identificados sibiricose A5, hesperetina-C- dihexosídeo, hesperetina-C-dihexosil-pentosídeo, rutina, crisoeriol, taxifolina- glicosídeo, manghaslina e luteolina. Os métodos cromatográficos clássicos mostraram-se uma ferramenta útil ao estudo fitoquímico das espécies Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia, possibilitando o isolamento e purificação dos compostos. O extrato hidroalcoólicos das raízes de Bredemeyera floribunda, após sucessivos tratamentos cromatográficos levou ao isolamento do ácido cinâmico, o ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzóico, e uma xantona trimetoxilada, a 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona ambos já isolados na espécie. Enquanto o estudo fitoquímico do extrato etanólico dos talos possibilitou o isolamento de três flavonoides: o canferol e a quercetina isolados pela primeira vez na espécie em questão e também a rutina, molécula já isolada na espécie. O estudo fotoquímico acerca da espécie Bredemeyera brevifolia, por sua vez, levou a identificação de duas flavonas. Da fração clorofórmica, da partição, foram identificadas a 5,7,4’-trihidroxi-3’-metoxiflavona e a 5,7,2’,3’,4’-pentahidroxi-6,4’dimetoxiflavona, sendo esta última relatada pela primeira vez na literatura, e a partir da fração acetato de etila foi possível o isolamento desta primeira flavona aqui já mencionada, a 5,7,4’- trihidroxi-3’-metoxiflavona. A inibição das atividades enzimáticas da peçonha da espécie Bothrops jararaca avaliada in vitro com os extratos hidroalcoólicos das raízes de Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia apresentou resultados bastante promissores. Nas proporções de peçonha: extratos empregados (1:1 a 1:50, p/p) não houve inibição significativa das atividades proteolítica sobre azocaseína e fosfolipase A2. No entanto, a atividade hialuronidase da peçonha de B. jararaca foi totalmente inibida pelo extrato de B.

193

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia . brevifolia, já a partir da proporção 1:5 (peçonha: extrato, p/p), indicando assim o potencial inibitório dos constituintes de B. brevifolia contra hialuronidases.

194

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

REFERÊNCIAS BICBLIOGRÁFICAS

AGUIAR, A. C. A.; FILHO, J. L. M. A família Polygalaceae na planície litorânea de Picinguaba, Ubatuba, São Paulo, Brasil. Revista Brasileira de Biociências, n. 4, v. 6, p. 321-328, 2008.

ALVES, N. T. Q. Efeito do extrato das raízes de Bredemeyera floribunda Willd sobre a ação local do veneno de Bothrops jararacussu em camundongos. [2013]. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Universidade Federal do Ceará – UFC, 2013.

ALVES, N. T. Q.; XIMENES, R. M.; JORGE, R. J. B.; SILVEIRA, J. A. M.; SANTOS, J. V. A.; RODRIGUES, F. A. P.; COSTA, P. H. S.; XAVIER JR, F. A. F.; EVANGELISTA, J. S. A. M.; HAVT, A.; SOARES, V. C. G.; TOYAMA, M. H.; OLIVEIRA, A. N. A.; ARAÚJO, R. M.; ALVES, R. S.; MONTEIRO, H. S. A. Anti- ophidian activity of Bredemeyera floribunda Willd. (Poligalaceae) root extract on the local effects induced by Bothrops jararacussu venom. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, n. 1, v. 52, p. 1-8, 2019.

BRITO, A.; RAMIREZ, J. E.; ARECHE, C.; SEPÚLVEDA, B.; SIMIRGIOTIS, M. J. HPLC-UV-MS profiles of phenolic compounds and antioxidant activity of fruits from three citrus species consumed in Northern Chile. Molecules, v. 19, p. 17400-17421, 2014.

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, p. 248-254, 1976.

CARTAXO, S. L.; SOUZA, M. M. A.; ALBUQUERQUE, U. P. Medicinal plants with bioprospecting potential used semi-arid northeastern Brazil. Journal of Ethnopharmacology, v. 131, p. 326-342, 2010.

CHEN, Y.; HONGLI, Y.; WU, H.; PAN, Y.; WANG, K.; JIN, Y.; ZHANG, C. Characterization and quantification by LC-MS/MS of the Chemical componentes of the heating Products of the flavonoids extract in pollen typhae for transformation rule exploration. Molecules, v. 20, p. 18352-18366, 2015.

195

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

CHEN, Y.; YU, H.; WU, H.; PAN, Y.; WANG, K.; JIN, Y. Characterization and quantification by CL-MS/MS of the Chemical components of the heating Products oh the flavonoids extract in pollen typhae for transformatio rule exploration. Molecules, v. 20, p. 18352-18366, 2015.

CUYCKENS, F.; MA, Y. L.; POCSFALVI, G.; CLAEYS, M. Tandem mass spectral strategies for the structural characterization of flavonoid glycosides. Analusis, n. 10, v. 28, 2000.

DAROS, M. R.; MATOS, F. J. A.; PARENTE, J. P. A new triterpenoid saponin, bredemeyeroside B, from the roots of Bredemeyera floribunda. Planta Medica, v. 62, n. 6, p. 523-527, 1996.

EMAN, A. M.; ELIAS, R.; MOUSSA, A. M.; FAURE, R.; DEBRAUWER, L.; BALANSARD, G. Two flavonoid triglycosides from Buddleja madagascariensis. Phytochemistry, v. 48, n. 4, p. 739-742,1998.

FÉLIX-SILVA, J.; GOMES, J. A. S.; XAVIER-SANTOS, J. B.; PASSOS, J. G. R.; SILVA-JUNIO, A. A.; TAMBOURGI, D. V.; FERNANDES-PEDROSA, M.F. Inhibition of local effects induced by Bothrops erythromelas snake venom: assessment of the effectiveness of Brazilian polyvalent bothropic antivenom and aqueous leaf extract of Jatropha gossypiifolia. Toxicon, v. 125, p. 74-83, 2017.

FERNABDES, R. S. Avaliação da atividade antiofídica do extrato de Serjania erecta Radlk in natura e in vitro: isolamento e caracterização estrutural de compostos bioativos. [2011]. 84 f. Monografia ( Especialização em Toxicologia) - Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011.

GÖDECKE, T.; KALOGA, M.; KOLODZIEJ, H. A phenol glucoside, uncommom coumarins and flavonoid from Pelargonium sidoides DC. Zeitschrift Für Naturforschung B, v. 60, p. 677-682, 2005.

KARIOTI, A.; FURLAN, C.; FRANCESCO, F.; BILIA, A. R. Analysis of the constituents and quality control of Viola odorata aqueous preparations by HPLC-DAD and HPLC-ESI-MS. Anal Bioanal Chem, v. 399, p. 1715-1723, 2011.

KEMPARAJU, K.; GIRISH, K. S. Snake venom hyaluronidase: a therapeutic target. Cell Biochemistry and Function, v. 24, n. 1, p. 7-12, 2006.

KONGKUM, N.; TUCHINDA, P.; POHMAKOTR, M.; REUTRAKUL, V.; PIYACHATURAWAT, P.; JARIYAWAT, S.; SUKSEN, K.; YOOSOOK, C.; KASISIT, J.; NAPASWAD, C. DNA topoisomerase IIα inhibitory and anti-HIV-1 flavones from leaves and twigs of Gardenia carinata. Fitoterapia, v. 83, p. 368-372, 2012.

LALLEMAND, J. Y.; DUTEIL, M. 13C N.m.r. Spectro of quercetin and rutina. Short Communication, v. 9, n. 3, p. 179-180, 1977.

LAUSTSEN, A. H. Toxin synergism in snake venoms. Toxin Reviews, v. 35, n. 3-4, p. 165-170, 2016. 196

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

LIMA, I. G.; ALBUQUERQUE, A. L.; DIAS, A. C. A. A. Flora do Ceará, Brasil: Polygalaceae. Rodriguésia, v. 69, n. 2, p. 673-692, 2018.

LIU, G.; XU, Z.; CHEN, J.; LANG, G.; TIAN, Q.; SHEN, Y.; CHEN, B.; YAO, S. On- line strategies for the Identification of unknown flavone glycoside in Dracocephalun tanguticum Maxim. Journal of Chromatography B, v. 877, p. 2545-2550, 2009.

LÜDTKE, R.; SOUZA-CHIES, T. T.; MIOTTO, S. T. S. Bredemeyera Willd. e Securidaca L. (Polygalaceae) na Região Sul do Brasil. Revista Brasileira de Biociências, v. 6, n. 1, p. 69-79, 2008.

MARQUES, M. C. M. & PEIXOTO, A. L. Estudo taxonômico de Polygala subgênero Ligustrina (Chodat) Paiva (Polygalaceae). Rodriguésia, v. 58, n. 1, p. 95-146, 2007.

MARQUES, M.C.M. & GOMES, K. Polygalaceae In: Wanderley, M.G.L., Shepherd, G.J., Giulietti, A.M., Melhem, T.S., Bittrich, V., Kameyama, C. (eds.) Flora Fanerogâmica do Estado de São Paulo. Instituto de Botânica, São Paulo, v. 2, p. 229- 260, 2002.

MARTINS, L. R. R.; CORTES, L. E. R.; DIAS-FILHO, B. P.; NAKAMURA, C. V.; FEREIRA, A. G.; CORTES, D. A. G. Atribuição dos deslocamentos químicos dos átomos de 1H e 13C do acetato de acantoaustralida. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 16. n. 4, p. 490-496, 2006.

MOURA, A. C. S.; VILEGAS, W.; SANTOS, L. C. Identificação de alguns constituintes químicos de Indigofera hirsuta Linn. (Fabraceae) por CLAE-IES-EM (TOF) e Avaliação da Atividade Antirradicalar. Química Nova, v. 34, n. 7, p. 1136- 1140, 2011.

OLIVEIRA, A. N. A. Estudo químico/farmacológico de Bredemeyera Floribunda. [2015]. 62f. Monografia (trabalho de conclusão de Curso) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2015.

OLIVEIRA, M. C. F.; SILVEIRA, E. R. Pentaoxygenated xanthones and acids from Bredemeyera brevifolia. Phytochemistry, v. 55, p. 847-851, 2000.

PAIXÃO-CAVALCANTE, D. et al. African adders: partial characterization of snake venoms from three Bitis species of medical importance and their neutralization by experimental equine antivenoms. PLoS Neglected Tropical Diseases, v. 9, n. 2, p. e0003419, 2015.

PEREAÑEZ, J. A.; PATINÔ, A. C.; REY-SUAREZ, P.; NÚÑEZ, V.; CASTAÑEDA, I. C. H.; RUCAVADO, A. Glycolic acid inhibits enzymatic, hemorrhagic and edema- inducing activities of BaP1, a P-I metalloproteinase from Bothrops asper snake venom: Insights from docking and molecular modeling. Toxicon, v. 71, p. 41-48, 2013.

197

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

PERES, V.; NAGEM, T. J., Naturally occurring pentaoxygenated, hexaoxynated and dimeric xanthones: a literature survey. Química Nova, v. 20, n. 4, p. 388-397, 1997.

RIBEIRO, D. A.; MACÊDO, D. G.; OLIVEIRA, L. G. S.; SARAIVA, M. E.; OLIVEIRA, S. F.; SPOUZA, M. M. A.; MENEZES, I. R. A. Potencial terapêutico e uso de plantas medicinais em uma áerea de Caatinga no estado de Ceará, nordeste do Brasil. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 16, n. 4, p. 912-930, 2014.

RIBEIRO, D. A.; OLIVEIRA, L. G. S.; MACÊDO, D. G.; MENEZES, I. R. A.; COSTA, J. G. M.; SILVA, M. A. P.; LACERDA, S. R.; SOUZA, M. M. A. Promising medicinal plants for bioprospection in a Cerrado área of Chapada do Araripe, Notheastern Brazil. Journal ofa Ethnopharmacology, v. 155, p. 1522-1533, 2014.

RINALDO, D.; RODRIGUES, C. M.; RODRIGUES, J.; SANNOMIYA, M.; SANTOS, L. C.; VILEGAS, W. New flavone from the leaves of Neea theifera (Nyctaginaceae). Journal of the Brazilian Chemical Socciety, v. 18, p. 1132-1135, 2007.

SHE, G.; BA, Y.; LIU, Y.; LV, H.; WANG, W.; SHI, R. Absorbaple phenylpropenoyl sucroses from Polygala tenuifolia. Molecules, v. 16, p. 5507-5513, 2011.

SILVEIRA, E. R.; FALCÃO, M. J.; JÚNIOR, A. M.; KINGSTON, D. G. I.; GLASS, T. E. Pentaoxygenated xanthones from Bredemeyera floribunda. Phytochemistry, v. 39, n. 6, p. 1433-1436, 1995.

SINGH, R.; SINGH, B.; SINGH, S.; KUMAR, N.; KUMAR, S.; ARORA, S. Anti-free radical activities of Kaempferol isolated from acacia nilótica (L.) Willd. Ex. Del. Toxicology in Vitro, v. 22, p. 1965-1970, 2008.

SUNITHA, K. et al. Inflammation and oxidative stress in viper bite: an insight within and beyond. Toxicon, v. 98, n., p. 89-97, 2015.

WAGNER, H.; CHARI, M.; SONNENBICHLER, J. 13C-NMR- spektren naturlich vorkammender flavonoide. Tetrahedron, v. 21, p. 1799-1802, 1976.

198

CAPÍTULO 3 – PROSPECÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA DAS ESPÉCIES Bredemeyera floribunda E Bredemeyera brevifolia .

199

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS .

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS

4.1. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A técnica de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS) permitiu prever o perfil fitoquímico das três espécies de estudo, Euphorbia tirucalli, Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia, em que foi possível constatar que os flavonoides representaram a classe de compostos predominante, fato que pode estar relacionado ao modo negativo em que foi realizada as análises. Portanto, a análise de LC-MS permitiu identificar treze compostos na E. tirucalli como: ampelopsina, rutina, avicularina, miricetina, quercetina, isoquercitrina, quercitrina e tricetina. Além do ácido gálico e derivados, ácido elágico e o ácido 3,3'-dimetoxielágico-4-O-α- raminopiranosídeo. Nos extratos da espécie Bredemeyera floribunda foram identificados a rutina, naringerina, narcissina, isoramnetina-galactosídeo, canferol- neohesperidosídeo e quercetina. Enquanto, na B. brevifolia foi identificado o crisoeriol, sibiricose A5, hesperetina-C-dihexosídeo, hesperetina-C-dihexosil-pentosídeo, rutina, taxifolina-glicosídeo, manghaslina e luteolina. O emprego de técnicas cromatográficas de adsorção e exclusão molecular mostrou-se uma ferramenta bastante útil no estudo fitoquímico de Euphorbia tirucalli, Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia, uma vez que possibilitou o isolamento e purificação de vários compostos. O estudo fitoquímico de E. tirucalli levou o isolamento de cinco moléculas. Inicialmente, o fracionamento cromatográfico aplicado ao extrato ETPAE-H, permitiu o isolamento e purificação de um triterpeno de ocorrência na espécie, o 3-β-hidroxi- oleon-12-em-3-ol, também conhecido como β-amirina. Já o extrato etanólico das raízes, ETR-E, possibilitou o isolamento de mais quatro compostos. Um derivado de ácido elágico, o ácido 3,3'-dimetoxielágico-4-O-α-raminopiranosídeo, o ácido 4-O-metil-gálico e dois flavonóis, apelopsina e Miricetina, inéditas na espécie. Quanto ao estudo das atividades antioxidantes frente aos radicais DPPH e ABTS todos os extratos brutos foram submetidos a avaliação, contudo, o etanol das raízes,

ETR-E, foi o que apresentou melhor resultado, com IC50 de 78,27 μg/mL frente ao radical DPPH quando comparado com padrão Trolox, o qual apresentou IC50 de 49,14 0

μg/mL e IC50 de 221,22 μg/mL frente ao ABTS o qual foi também comparado com padrão Trolox, que apresentou IC50 de 112,15 μg/mL. Assim, o extrato ETR-E mostrou- 200

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS . se promissor como fonte de agentes contra espécies oxidantes e radicalares. A análise os resultados das atividades antibacterianas e antifúngicas dos extratos permitiu constatar que os extratos etanólicos das raízes e da parte aérea de E. tirucalli foram identificados como potenciais agentes antibacterianos e antifúngicos frente as cepas de S. aureus, E. coli, S.brasiliensis e C. Albicans. Contudo, o extrato etanólico das raízes apresentou a melhor atividade, com concentrações inibitória mínima (CIM) de 512 e 256 μg/mL contra S. aureus e E. coli, respectivamente, e de 1024 μg/mL contra S. brasiliensis e C. albicans. Dentre os compostos isolados, ET-3 e ET-4 apresentaram efeitos relevantes. Os agentes S. aureus, E. coli e C. albicans apresentaram alta sensibilidade a substância ET-3 com CIM = 8 μg/mL, 16 μg/mL e 32 μg/mL, respectivamente, e o composto ET-4 matou ou inibiu o crescimento de todas as cepas testadas, apresentando CIM de 8 μg/mL e CBM de 16 μg/mL contra E. coli, mostrando relativa eficiência quando comparado com o antibiótico Tetraciclina. ET-4 ainda apresentou CIM de 32 μg/mL e CFM de 64 μg/mL contra S. brasiliensis bem como CIM de 4 μg/mL e CFM de 8 μg/mL contra o agente C. albicans, em comparação com o padrão Anfotericina B. Similarmente, o estudo fitoquímico das espécies Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia também se mostrou promissor. O fracionamento cromatográfico aplicado ao extrato hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera floribunda, BFREA, possibilitou o isolamento de duas substâncias, um derivado cinâmico, o (2E)-3’-(3,4,5- trimetoxifenil)-prop-2-enoato, e uma xantona trimetoxilada, a 1,7-dihidroxi-3,4,8- trimetoxixantona, ambos já relatados na literatura bem como na espécie em questão (SILVEIRA, et al., 1995; CAVALCANTE, 2015). Ainda, o fracionamento cromatográfico do extrato BFTE desta mesma espécie, levou ao isolamento de mais três compostos, ambos pertencentes a classe dos flavonoides. O primeiro flavonoides trata- se do canferol, o 3,5,7-triidroxi-2-(4-hidroxyfenil)-4H-chomen-4-one, já descrito na literatura contudo isolado pela primeira vez na espécie. O segundo flavonoides refere-se a quercetina, também isolado pela primeira vez na espécie. Por fim, o terceiro flavonoide remete-se a estrutura da rutina (quercetina-3-O-rhamnopiranosil- glucopiranosidea) substância já isolada nas raízes de Bredemeyera floribunda (CAVALCANTE, 2015). Quanto ao estudo da espécie Bredemeyera brevifolia, o fracionamento aplicado ao extrato hidroalcoólico das raízes, BBREA, levou a identificação duas flavonas, a 5,7,4’-trihidroxi-3’-metoxiflavona e 5,7,2’,3’,4’-pentahidroxi-6,4’dimetoxiflavona sendo que a primeira (5,7,4’-trihidroxi-3’-metoxiflavona) foi posteriomente isolada na 201

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS . fração acetato na mesma espécie. Os extratos hidroalcoólico das raízes de Bredemeyera floribunda e Bredemeyera brevifolia foram ainda investigado quanto a atividade enzimáticas, em que foi possível constatar que nas proporções de peçonha: extratos empregadas (1:1 a 1:50, p/p) não houve inibição significativa das atividades proteolítica sobre azocaseína e fosfolipase A2. No entanto, a atividade hialuronidase da peçonha de B. jararaca foi totalmente inibida pelo extrato de B. brevifolia, já a partir da proporção 1:5 (peçonha: extrato, p/p), o que é um dado muito interessante dada a relevância dessa classe de toxinas nos envenenamentos ofídicos, uma vez que agem como “fatores de espalhamento”. Portanto, os resultados aqui obtidos motivam a continuação do estudo químico das espécies em questão, bem como a investigação de novas atividades farmacológicas do constituinte isolado.

202

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS .

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁCAS

SILVEIRA, E. R.; FALCÃO, M. J.; JÚNIOR, A. M.; KINGSTON, D. G. I.; GLASS, T. E. Pentaoxygenated xanthones from Bredemeyera floribunda. Phytochemistry, v. 39, n. 6, p. 1433-1436, 1995.

203