Itämerensimpukan (Macoma Balthica) Biomarkkerivasteet: Laboratoriokokeet Vähähappisissa Olosuhteissa Ja Mittaukset TBT-Saastuneella Alueella

View metadata, citation and similar papers at core.ac.uk brought to you by CORE

provided by Helsingin yliopiston digitaalinen arkisto

Itämerensimpukan (Macoma balthica) biomarkkerivasteet: laboratoriokokeet vähähappisissa olosuhteissa ja mittaukset TBT-saastuneella alueella

Karoliina Munter

Pro gradu -tutkielma Kesäkuu 2005 Akvaattiset tieteet Bio- ja ympäristötieteiden laitos Helsingin yliopisto HELSINGIN YLIOPISTO − HELSINGFORS UNIVERSITET Tiedekunta/Osasto − Fakultet/Sektion Laitos − Institution Biotieteellinen tiedekunta Bio-ja ympäristötieteiden laitos Tekijä − Författare Karoliina Munter Työn nimi − Arbetets titel Itämerensimpukan (Macoma balthica) biomarkkerivasteet: laboratoriokokeet vähähappisissa olosuhteissa ja mittaukset TBT-saastuneella alueella Oppiaine − Läroämne Akvaattiset tieteet Työn laji − Arbetets art Aika − Datum Sivumäärä − Sidoantal Pro gradu Kesäkuu 2005 63 Tiivistelmä − Referat

Tässä työssä on tutkittu neljän eri molekulaarisen biomarkkerin vasteita itämerensimpukassa (Macoma balthica) laboratoriokokein sekä kenttämittauksin Vuosaaren sataman alueella. Itämeren- simpukka on yleinen pohjaeläin Suomen rannikolla, ja se elää pehmeillä pohjilla kaivautuneena sedimenttiin. Laji hankkii ravintonsa joko suodattamalla tai syömällä pohjalle sedimentoitunutta ainesta. Biomarkkerit ovat mitattavissa olevia stressivasteita yksilötasolla ja sen alapuolella, ja niiden avulla voidaan kuvata mm. eliöiden altistumista erilaisille ympäristömyrkyille. Neljä työssä käytettyä biomarkkerivastetta ovat glutationi-S-transferaasi- (GST), katalaasi- (CAT) ja asetyylikoliiniesteraasi- aktiivisuus (AChE) sekä metallotioneiini (MT). GST:t toimivat vierasainemetabolian toisen vaiheen reaktioissa, ja ne ilmentävät mm. altistumista erilaisille orgaanisille vierasaineille. CAT on antioksi- danttinen entsyymi, joka ilmentää oksidatiivisen stressin tasoa eliössä. AChE toimii neurotoksisten vaikutusten indikaattorina. MT:t sitovat soluissa raskasmetalleja ja toimivat myös antioksidantteina. Laboratoriokokeita simpukoita altistettiin vähähappisille eli hypoksisille olosuhteille ja kahdelle valitulle ympäristömyrkylle, kuparille (Cu) ja tributyylitinalle (TBT). Hapettomat ja vähähappiset olosuhteet ovat yleisiä Itämerellä, ja niiden vaikutusta biomarkkereihin on tutkittu vähän. Sekä kuparia että TBT:a on käytetty antifouling-maaleissa estämään päällyskasvuston kiinnittymistä laivojen ja veneiden pohjiin. TBT:n käyttö on ollut kiellettyä EU:ssa vuoden 2003 alusta, ja käyttörajoituksia on ollut vuodesta 1991 lähtien. Laboratoriokokeita tehtiin kolme, joista ensimmäisessä simpukat altistettiin pelkällä hypoksialle, toisessa hypoksialle ja kuparille (0,2 mg l-1) sekä kolmannessa kokeessa hypoksialle ja kahdelle TBT-pitoisuudelle (0,2 µg TBT-Cl l-1 ja 2 µg TBT-Cl l-1). Hypoksiset olosuhteet eivät vaikuttaneet kahteen mitattuun biomarkkeriin, GST- ja CAT-aktiivisuuteen havaittavasti. Simpukoiden käyttäytyminen erosi selvästi käsittelyiden välillä: hypoksiassa simpukat kurottivat hengityssifonsa äärimmilleen kun kontrollioloissa vain muutamat simpukat pitivät sifojaan ulkona. Myrkylle ja hypoksialle+myrkylle altistetut simpukat pitivät kuorensa suljettuna. Vuosaaren rakenteilla olevan sataman alueella havaittiin keväällä 2003 korkeita TBT- pitoisuuksia sedimentissä. Aluuelta kerättiin viideltä eri asemalta itämerensimpukoita ja sedimentti- näytteitä lokakuussa 2003. Simpukoista ja sedimentistä määritettiin ympäristömyrkypitoisuuksia: TBT:n ja sen metaboliittien DBT:n ja MBT:n, PCB-yhdisteiden, DDT:n ja sen metaboliittien DDD:n ja DDE:n sekä kymmenen metallin (As, Cd, Co, Cr, Cu, Pb, Mn, Ni, Zn ja V) pitoisuudet. Simpukoista mitattiin GST-, CAT- ja AChE-aktiivisuudet sekä MT-pitoisuus. Simpukoissa TBT-pitoisuudet olivat 204–545 µg TBT:a tuorepainokiloa kohden ja sedimentissä 48–6039 µg TBT:a kuivapainokiloa kohden. PCB-yhdisteiden ja DDT:n sekä sen metaboliittien pitoisuudet olivat hyvin alhaisia sekä simpukoissa että sedimentissä. Metallikuormitus ei eronnut merkittävästi asemien välillä. Biomarkkerivasteet eivät eronneet asemien välillä tilastollisesti merkitsevästi. GST- ja CAT-aktiivisuuksien keskiarvot olivat 1,67 ± 0,06 ja 190 ± 9,87 µmol min-1 mg proteiinia-1 (arvo ± keskivirhe). AChE-aktiivisuudet olivat 18 ± 2,7 ja 31 ± 3,3 nmol ACTC min-1 mg proteiinia-1 välillä ja MT-pitoisuudet 317 ± 24 ja 504 ± 4,5 µg g tuorepainoa-1 välillä. Integroitu biomarkkerivaste (IBR) osoitti stressaantuneimpien simpukoiden olevan lähellä vanhaa satama- allasta. Työssä käytetyt biomarkkerit eivät ilmentäneet selvästi TBT:n vaikutuksia, mikä voi johtua joko mitattujen biomarkkerien sopimattomuudesta TBT:lle altistumisen indikaattoriksi tai siitä, että tutkimuksessa ei ollut kunnollista vertailuasemaa. Itämerensimpukoista mitatut korkeat TBT-pitoisuudet ja TBT:n metaboliittien pienet pitoisuudet kertovat tämän yhdisteen hitaasta aineenvaihdunnasta tässä lajissa ja siitä, että itämerensimpukoihin kertyy herkästi TBT:a.

Avainsanat - Nyckelord biomarkkerit, Macoma balthica, hypoksia, Vuosaari, TBT, GST, CAT, AChE ja MT Säilytyspaikka - Förvaringställe Viikin tiedekirjasto, Tvärminnen eläintieteellisen aseman kirjasto Muita tietoja Julkaistu Helsingin yliopiston E-thesis-verkkojulkaisupalvelussa http://ethesis.helsinki.fi/

Sisällysluettelo

1. Johdanto...... 1 1.1. Biomarkkerit...... 1 1.1.1. Vierasainemetabolia: GST-aktiivisuus...... 5 1.1.2. Oksidatiivinen stressi: CAT-aktiivisuus...... 6 1.1.3. Neurotoksiset vaikutukset: AChE-aktiivisuus...... 7 1.1.4. Solun puolustusmekanismit: metallotioneiinit...... 8 1.2. Itämerensimpukka (Macoma balthica L.)...... 9 1.3. Tutkimuksen tausta ja tarkoitus...... 10 1.3.1. Laboratoriokokeet...... 11 1.3.2. Kenttänäytteenotto Vuosaaren sataman alueella...... 15 2. Aineisto ja menetelmät...... 17 2.1. Laboratoriokokeet...... 17 2.1.1. Hypoksialaitteisto...... 17 2.1.2. Hypoksiakoe...... 18 2.1.3. Kuparialtistuskoe...... 20 2.1.4. TBT-altistuskoe...... 23 2.2. Kenttänäytteenotto...... 24 2.2.1. Näytteiden käsittely...... 26 2.2.2. Metallit, organoklooriyhdisteet sekä TBT, DBT ja MBT...... 26 2.3. Biomarkkerianalyysit...... 27 2.4. Aineiston tilastollinen käsittely...... 31 3. Tulokset...... 32 3.1. Laboratoriokokeet...... 32 3.1.1. Hypoksiakoe...... 32 3.1.2. Kuparialtistuskoe...... 35 3.1.3. TBT-altistuskoe...... 36 3.2. Kenttätutkimus...... 37 3.2.1. Butyylitinapitoisuudet...... 37 3.2.2. PCB-yhdisteet...... 38 3.2.3. DDT, DDD ja DDE...... 39 3.2.4. Metallit...... 40

3.2.5. GST...... 41 3.2.6. CAT...... 41 3.2.7. AChE...... 43 3.2.8. MT...... 44 3.2.9. Standardoidut biomarkkerivasteet ja IBR...... 45 4. Tulosten tulkinta...... 47 4.1. Laboratoriokokeet...... 47 4.2. Kenttätutkimus...... 48 4.2.1. TBT-pitoisuudet simpukoissa ja sedimentissä...... 48 4.2.2. Biomarkkerivasteet simpukoissa...... 51 5. Yhteenveto ja johtopäätökset...... 56 6. Kiitokset...... 58 7. Kirjallisuus...... 59 Liitteet 1–5

1. Johdanto

1.1. Biomarkkerit

Ympäristössä esiintyy haitallisia yhdisteitä, jotka aiheuttavat vaikutuksia eliöissä (Chapman 1995). Näitä yhdisteitä voidaan myös kutsua nimellä ympäristömyrkyt. Haitalliset yhdisteet voivat olla joko luonnollisia tai ihmistoiminnasta johtuvia, ja ne voidaan edelleen jakaa kahteen suureen luokkaan, epäorgaanisiin ja orgaanisiin yhdisteisiin. Epäorgaanisiin yhdisteisiin kuuluvat mm. alkuaineina esiintyvät metallit ja metalli-ionit, joiden lukumäärä tunnetaan. Toinen ryhmä, orgaaniset yhdisteet, sisältävät valtavan määrän monimuotoisia yhdisteitä. Vierasaineiksi (engl. xenobiotics) kutsutaan kaikkia eliölle vieraita yhdisteitä, joita eliö ei normaaleissa olosuhteissa kohtaa (McNaught & Wilkinson 1997). Vierasaineet voivat olla sekä luonnollisia, esimerkiksi eliöiden erittämiä myrkkyjä, että ihmisen valmistamia yhdisteitä (Livingstone 1998). Meriympäristön tilaa on perinteisesti seurattu analysoimalla yhdisteiden pitoisuuksia vedessä ja sedimentissä. Tätä lähestymistapaa rajoittaa kuitenkin erilaisten yhdisteiden suuri lukumäärä ympäristössä. Esimerkiksi EU:n vuonna 1981 perustamaan EINECS-kemikaali- rekisteriin on ilmoitettu jo yli 100 000 erilaista yhdistettä, joita tuotetaan teollisesti ja käytetään EU:n alueella (European Chemicals Bureau). Tunnettujen yhdisteiden lisäksi on monia ihmisen toiminnan seurauksena ympäristöön päätyneitä orgaanisia yhdisteitä ja niiden aineenvaihduntatuotteita eli metaboliitteja, joita ei vielä ole tunnistettu (van der Oost ym. 2003). Eliöiden ja elinympäristöjen kannalta keskeistä ei ole kuitenkaan haitallisten yhdisteiden pitoisuudet, vaan niiden vaikutukset eliöissä. Pelkkä yhdisteen olemassaolo ympä- ristössä ei vielä kerro sen mahdollisesti eliöille aiheuttamista vaurioista (van der Oost ym. 2003). Stressitekijät aiheuttavat eliöissä biokemiallisia muutoksia, jotka voivat ilmetä niin solu-, yksilö- ja populaatiotasoilla kuin kokonaisissa ekosysteemeissäkin (Luoma 1996, Walker ym. 2001, Adams 2003). Muutoksia kaikilla näillä tasoilla voidaan käyttää työkaluina yhdisteiden haitallisten vaikutusten havainnoimisessa ja arvioinnissa. Biomarkkerit ovat (antropogeenisen) stressin aikaansaamia vaikutuksia yksilötasolla ja sen alapuolella (Walker ym. 2001). Maailman terveysjärjestö WHO määrittelee biomarkkerin olevan lähes mikä vain mittaus, joka ilmentää vuorovaikutusta biologisen systeemin (eliö) ja mahdollisen kemiallisen, fysikaalisen tai biologisen haittatekijän välillä (WHO 1993). Korkeammilla organisaatiotasoilla näkyviä vaikutuksia kutsutaan puolestaan bioindikaattoreiksi (Walker ym. 2001).

Tällaisia ovat esimerkiksi ilmansaasteille herkät jäkälät, joiden häviämistä voidaan pitää merkkinä kasvaneesta saastekuormituksesta. Biokemiallisia ja solutason biomarkkereita pidetään aikaisina varoitussignaaleina (engl. early warning signal), koska alhaisten organisaatiotasojen muutokset eivät välttämättä ole peruuttamattomia eliön kompensaatiomekanismien vielä toimiessa (Ringwood ym. 1999, Adams 2001). Vasta kun solutason suojelumekanismien kynnys ylitetään, voidaan vauriot havaita kudos- ja elintasolla. Nämä vauriot voivat vaikuttaa yksilön elinkykyyn, jolloin vaikutukset voivat näkyä myös populaatio- ja ekosysteemitasoilla (Adams 2001, 2003). Bio- markkerien etuna on se, että biologiset vasteet on sitä helpompi liittää tiettyyn stressitekijään mitä alhaisemmalla organisaatiotasolla niitä tarkastellaan, toisaalta vasteen ekologinen relevanssi eli merkitys on suurempi korkeammilla organisaatiotasoilla (kuva 1, Chapman 1995, Walker ym. 2001). Ilmiöt ovat lisäksi yleismaailmallisempia solutasolla kuin korkeammilla organisaatiotasoilla, joilla esiintyy enemmän erikoistumista, ja siksi solutason bio- kemialliset vasteet voivat olla samankaltaisia ja käyttökelpoisia monissa erilaisissa eliöissä (van der Oost ym. 2003).

Ekosysteemit

Yhteisötason muutokset

Populaatiotason muutokset

Yksilötaso

Fysiologinen muutos

Biokemiallinen muutos

Kemikaali

kasvava vasteaika v asteen liittäminen tiettyyn yhdisteeseen vaikeutuu vasteen ekologinen merkitys kasvaa

Kuva 1. Biologiset vasteet eri organisaatiotasoilla Walkerin ym. (2001) mukaan.

Biomarkkerit jaetaan yleensä kolmeen ryhmään, jotka ovat altistumista, vaikutusta ja alttiutta ilmentävät biomarkkerit (Monserrat ym. 2003, van der Oost ym. 2003). Altistumista ilmentävät biomarkkerit kattavat haitallisten yhdisteiden tai niiden metaboliittien mittaamisen

eliöstä sekä haitallisen yhdisteen ja solun molekyylin (esim. DNA tai jokin proteiini) välisen reaktion havaitsemisen ja mittaamisen. Nämä mittaukset kertovat eliön altistumisesta haitalliselle yhdisteelle ja tämän altistuksen asteesta, mutta ne eivät kerro haitallisten vaikutusten vakavuudesta (Walker ym. 2001). Vaikutusta ilmentävät biomarkkerit ovat puolestaan mitattavissa olevia biokemiallisia, fysiologisia tai muita muutoksia kudoksissa tai kudos- nesteissä, jotka voidaan yhdistää todennetusti tai mahdollisesti eliön terveydentilaan. Kolmas ryhmä on alttiutta ilmentävät biomarkkerit, jotka kertovat eliön kyvystä reagoida vierasaineille altistumisen jälkeen, eli siitä, miten hyvin eliö pystyy sopeutumaan stressitilanteeseen (Montserrat ym. 2003). Sopeutumiskyky riippuu omasta tai hankitusta ominaisuudesta, joita voidaan potentiaalisesti mitata. Ero eri biomarkkerimääritelmien välillä on hienoinen, koska kaikki biomarkkerit ilmentävät määritelmän mukaisesti stressitekijän jonkinlaista vaikutusta eliössä (Walker ym. 2001). Biomarkkereita luokitellaan lisäksi sen mukaan, ilmentävätkö ne jonkin tietyn stressi- tekijän vaikutusta eli ovatko ne spesifejä vai toimivatko ne yleisenä stressin ilmentäjinä (Adams ym. 2001, Walker ym. 2001). Monien biomarkkerien kohdalla on epävarmuutta siitä, mitkä kaikki tekijät vaikuttavat siihen, jolloin markkerin spesifisyyttä on vaikea määritellä. Biomarkkerien käyttöön liittyy riski havaittujen vaikutusten ali- tai yliarvioimisesta, minkä vuoksi lajikohtaista tutkimusta tarvitaan jokaisen biomarkkerin kohdalla (van der Oost ym. 2003). Tarpeellisen tietotason saavuttamiseksi tarvitaan sekä laboratoriokokeita että kenttähavaintoja. Laboratoriokokeessa selvitetään kontrolloiduissa ja yksinkertaistetuissa olosuhteissa mm. erilaisten yhdisteiden annosvasteet (engl. dose-response), jotka kertovat yhdisteiden myrkyllisyydestä. Kenttähavaintojen avulla saadaan puolestaan tietoa biomarkkerien normaalista tasosta ja luonnollisista tekijöistä johtuvasta vaihtelusta. Luonnollinen vaihtelu esimerkiksi biomarkkereina käytetyissä entsyymeissä vaikuttaa tulosten tulkintaan (Narbonne ym. 1999, Adams 2003). Eliön, sen elinympäristön sekä erilaisten ympäristössä esiintyvien yhdisteiden välillä on monimutkainen vuorovaikutussuhde, johon vaikuttavat mm. ympäristössä tapahtuvat vuodenaikaiset vaihtelut (kuva 2, Sheehan & Power 1999). Ympäristön olosuhteet, kuten lämpötila, suolaisuus, ravinnon saatavuus ja laatu, vaikuttavat eliöihin ja myös niiden tilaa kuvaaviin indikaattoreihin. Vaihtelevat ympäristöolosuhteet vaikuttavat myös erilaisten yhdisteiden biosaatavuuteen ja siihen, miten yhdisteet kulkevat ja muokkaantuvat eliöissä. Eliöiden biokemia riippuu ympäristömyrkkyjen aiheuttaman stressin lisäksi mm. ravinnonlähteestä, lisääntymisvaiheesta, hormonitoiminnasta ja ravitsemuksesta (Sheehan & Power 1999). Molekulaarisissa biomarkkerivasteissa esiintyy näistä tekijöistä johtuen ympäristömyrkyistä riippumatonta ns. taustavaihtelua, johon vaikuttavat mm. vuoden-

aikaiset vaihtelut lämpötilassa ja ravinnon määrässä. Myös muut elinolosuhteiden muutokset, kuten esimerkiksi happipitoisuuden vaihtelut, voivat vaikuttaa vasteisiin.

Eliö

ravinto metabolia ilmasto varastointi kilpailu

Ympäristö Ympäristö- liukoisuus myrkky ym.

Kuva 2. Ekotoksikologian vuorovaikutuskolmio Sheehanin & Powerin (1999) mukaan.

Ympäristön tilan seurannassa käytettyjä biomarkkereita on kehitetty ja tutkittu muutaman vuosikymmenen ajan (Adams 2001, Handy ym. 2003). Toistaiseksi biomarkkereita on käytetty eniten kemiallisten analyysien halvempana korvikkeena (Handy ym. 2003). Bio- markkerien yksi etu on juuri niiden kustannustehokkuus. Muita etuja ovat biologisesti aktii- visiin yhdisteisiin keskittyminen ja mahdollisten odottamattomien yhteisvaikutusten paljas- taminen. Näiden lisäksi biomarkkerivasteet myös usein säilyvät kauemmin mitattavissa kuin helposti hajoavat yhdisteet, joita ei välttämättä havaittaisi kemiallisten yhdisteiden seurannassa (Handy ym. 2003). Biomarkkeriseurannalla, jossa käytetään erilaisia biomarkkereita, on mahdollista saada tärkeää tietoa eliöiden altistumisesta haitallisille yhdisteille ja myös eliöiden yleisestä stressitasosta (van der Oost ym. 2003). Toisin kuin Pohjois-Atlantilla ja Välimerellä, on biomarkkereita käytetty toistaiseksi vain vähän ympäristön tilan seurannassa Itämeren alueella (ICES 2004). Esimerkiksi Oslon ja Pariisin komission (OSPARCOM) Koillis-Atlantin suojeluohjelmaan kuuluvaan yhteis- strategiaan (JAMP) on sisällytetty biologisten vaikutusten seuranta biomarkkerien avulla (OSPAR). Biomarkkerit ovat mukana myös YK:n ympäristöjärjestön UNEP:n ylläpitämässä Välimeren alueen saastumisen arviointiohjelmassa MAP:ssa (UNEP MAP). Monissa Euroo- pan maissa, mm. Iso-Britanniassa, Hollannissa, Belgiassa, Saksassa, Ranskassa, Tanskassa, Ruotsissa ja Norjassa, on lisäksi kansallisia seurantaohjelmia, joissa käytetään biomarkkereita (ICES 2004). Viime vuosina esimerkiksi Euroopan Unionin tukema BEEP-hanke (Biological Effects of Environmental Pollution in Marine Coastal Ecosystems) on tiivistänyt EU-alueen maiden laboratorioiden yhteistyötä ja kehittänyt biomarkkerien käyttövalmiutta EU:n merialueilla (BEEP-hanke).

Tämä tutkimus on keskittynyt neljään biomarkkeriin, jotka edustavat erilaisia stressivasteita ilmentäviä ryhmiä: vierasainemetaboliaa, oksidatiivista stressiä, neurotoksisuutta ja solun erityisten suojamekanismien toimintaa. Näiden biomarkkereiden toimintatapoja on esitelty seuraavassa yksitellen.

1.1.1. Vierasainemetabolia: GST-aktiivisuus

Glutationi-S-transferaasit (GST:t) muodostavat ns. entsyymiperheen, joka toimii vierasainemetabolian eli biotransformaation reaktioissa (Lee 1991a, Fitzpatrick ym. 1997, Solé 2000). Eliöissä toimii erilaisia entsyymejä, joiden tehtävänä on kasvattaa vierasaineiden vesiliukoi- suutta ja siten helpottaa niiden eritystä ulos soluista (Walker ym. 2001). Joissakin tapauksissa lopputulos voi olla eliön kannalta epätoivottu, ja alkuperäisen yhdisteen myrkyllisyys kasvaa vierasainemetabolian myötä. Vierasainemetabolia jaetaan kahteen vaiheeseen (I ja II), joista ensimmäisessä vieras- aineeseen liitetään entsyymien avulla funktionaalinen ryhmä, esimerkiksi hydroksyyliryhmä, ja toisessa vaiheessa konjugoivat entsyymit liittävät muokattuun vierasainemolekyyliin polaarisen osan, esimerkiksi glutationin tai aminohapon (kuva 3). Sekä ensimmäisen vaiheen että toisen vaiheen entsyymejä käytetään biomarkkereina, ensimmäisen vaiheen entsyymeistä esimerkiksi sytokromi P450-entsyymejä ja toisen vaiheen entsyymeistä mm. glutationi-S- transferaaseja.

VAIHE I VAIHE II Vierasaine Metaboliitti Konjugaatti Polaarinen molekyyli

Polaarisuus kasvaa

Kuva 3. Orgaanisten aineiden vierasainemetabolian vaiheet Walkerin ym. (2001) mukaan.

GST:t katalysoivat vierasainemetabolian toisessa vaiheessa glutationin konjugaatiota eli liittymistä endogeenisiin molekyyleihin ja orgaanisiin vierasaineisiin, joissa on elektro- fiilinen keskus (Lee 1991a, taulukko 1). Elektrofiiliset yhdisteet ovat haitallisia soluille, koska ne voivat reagoida mm. DNA:n, RNA:n ja proteiinien kanssa (Lee 1991a). Kun glutationi liittyy vierasainemolekyyliin, molekyylin vesiliukoisuus kasvaa. GST:t voivat myös yksin sitoa vierasaineita ei-katalyyttisesti ja neutralisoida mm. hapen reaktiivisia muotoja (Wright

ym. 2000). Lähes kaikilla organismeilla on GST-entsyymejä ja esimerkiksi sinisimpukalta niitä on löydetty useita erilaisia (Lee 1991a, Sheehan & Power 1999).

Taulukko 1. Työssä käytettyjen biomarkkerien ominaisuuksia. Muokattu lähteestä Montserrat ym. (2003).

Biomarkkeri Spesifisyys Tyyppi Käyttö GST Epäspesifi Altistuminen Konjugaatioreaktioiden havaitseminen CAT Epäspesifi Altistuminen Antioksidanttireaktioiden havaitseminen AChE Spesifi / epäspesifi Altistuminen Neurotoksisten vaikutusten havaitseminen MT Spesifi / epäspesifi Altistuminen Metallialtistuksen havaitseminen

GST-aktiivisuus ilmentää eliön altistumista orgaanisille yhdisteille, ja sitä käytetään orgaanisten yhdisteiden kuormituksen indikaattorina erilaisissa seurantaohjelmissa (Fitzpatrick ym. 1997, ICES 2004). Monet vierasaineet indusoivat GST-aktiivisuutta, mm. PAH-yhdisteet, organoklooriset tuholaismyrkyt (mm. p,p-diklorodifenyylitrikloroetaaani eli DDT), polyklooratut bifenyylit (PCB), polyklooratut dibentso-p-furaanit (PCDD) ja fenoliset antioksi- dantit (Lee 1991a, van der Oost 2003). Kaloissa on todettu vierasainemetabolian ensimmäisen vaiheen entsyymien ilmentävän selkeämmin altistumista vierasaineille kuin toisen vaiheen entsyymien (van der Oost ym. 2003). Haitallisten yhdisteiden aiheuttaman vaihtelun toisen vaiheen entsyymien aktiivisuudessa on arveltu helpommin peittyvän luonnollisen taustavaihtelun alle, koska muutokset niiden aktiivisuuksissa ovat pienempiä. Simpukoiden vierasainemetabolian ensimmäisen vaiheen entsyymien vasteita on tutkittu mm. sinisimpukalla (Mytilus edulis), mutta vasteet ovat olleet heikkoja ja vaihtelevia verrattuna esimerkiksi kalojen vasteisiin (Moore ym. 1980, Solé 2000). Simpukoiden kohdalla onkin tutkimuksissa keskitytty toisen vaiheen entsyymei- hin, kuten GST:in, jonka aktiivisuus on korkea simpukoissa (Livingstone 1998).

1.1.2. Oksidatiivinen stressi: CAT-aktiivisuus

Kaikilla aerobisilla eliöillä on antioksidanttisia entsyymejä, jotka suojaavat soluja hapen reaktiivisten muotojen aiheuttamalta oksidatiiviselta stressiltä (Winston & Di Giulio 1991, Solé 2000). Tähän puolustussysteemiin kuuluu entsyymejä, mm. superoksididismutaasi (SOD), katalaasi (CAT) ja glutationi-S-tranferaasi (GST), sekä muita molekyylejä, kuten glutationi

(GSH) ja metallotioneiini (Wright ym. 2000). Katalaasi on yksi antioksidanttisista entsyy- meistä, ja se katalysoi solujen peroksisomeissa vetyperoksidin (H2O2) hajoamisreaktiota vedeksi ja hapeksi (Claiborne 1985, taulukko 1). Vetyperoksidia muodostuu solun aineen- vaihdunnan reaktioissa ja jota myös UV-säteily sekä erilaiset vierasaineet voivat muodostaa (Sheehan & Power 1999, Solé 2000). Hapen reaktiiviset muodot ovat haitallisia soluille ja ne aiheuttavat mm. DNA-vaurioita ja solukalvojen vaurioitumista (Sheehan & Power 1999). Wrightin ym. (2000) mukaan vetyperoksidia syntyy mm. PCB-yhdisteiden vierasaine- metaboliassa. Kalojen CAT-aktiivisuudet ovat nousseet mm. polyaromaattisille hiilivedyille (PAH) ja PCB-yhdisteille altistumisen seurauksena (van der Oost ym. 2003). Oksidatiivisen stressin puolustusmekanismit ovat lupaava lähtökohta haitallisten aineiden vaikutusten arvioimiseen, mutta järjestelmän monimutkaisuus ja osin tuntemattomuus vaikeuttavat vasteiden tulkintaa (ICES 2004). Mittauksissa puolustusmekanismit eivät aina reagoi ympä- ristömyrkkygradientin mukaisesti, ja syytä tähän ei toistaiseksi tiedetä (ICES 2004). Solén (2000) mukaan sinisimpukoilla (Mytilus sp.) antioksidanttiset entsyymit toimivat kaikkialla simpukassa, mutta niiden aktiivisuus on korkeimmillaan ruuansulatusrauhasessa, joka on erilaisten puolustusentsyymien toiminnan pääkohde.

1.1.3. Neurotoksiset vaikutukset: AChE-aktiivisuus

Asetyylikoliini toimii välittäjäaineena hermosolujen synapseissa (Stryer 1995, Walker ym. 2001). Sitä vapautuu presynaptisesta kalvostosta hermoimpulssin saapuessa ja se kiinnittyy asetyylikoliinireseptoreihin postsynaptisella kalvolla, jolloin hermoimpulssi välittyy eteenpäin. Asetyylikoliiniesteraasi (AChE) hajottaa asetyylikoliinin synapsiraosta, jotta postsynaptinen hermosolu ei ylistimuloidu. Erilaiset yhdisteet, mm. laajalti länsimaissa hyönteismyrkkyinä käytetyt organofosfaatit ja karbamaatit, inhiboivat eli estävät asetyylikoliiniesteraasin toimintaa ja seurauksena on väli- tysainejärjestelmän pettäminen, kouristuksia ja pahimmillaan eliön kuolema (Payne ym. 1996, Walker ym. 2001, taulukko 1). AChE-aktiivisuus on yksi vanhimmista tutkituista biomarkkereista, ja sen on todettu ilmentävän altistumista orgaanisille fosforia sisältäville tuholais- myrkyille ihmisillä ja selkärankaisilla eläimillä (Galloway ym. 2002). AChE-aktiivisuutta on käytetty menestyksekkäästi organofosfaattien myrkyllisyysvaikutusten havaitsemisessa lin- nuilla ja kaloilla (Escartín & Porte 1997). Akvaattisten selkärangattomien vasteet ovat kuitenkin olleet vaikeammin tulkittavissa. Moran ym. (1999) mukaan koliiniesteraasit eivät toimi

simpukoissa yhtä herkkänä OP-altistuksen indikaattorina kuin selkärankaisissa, hyönteisissä sekä sukkulamadoissa. Tuholaismyrkkyjen lisäksi myös metallien, puhdistusaineiden, levämyrkkyjen ja öljyn on todettu inhiboivan AChE-aktiivisuutta (Hamza-Chaffai ym. 1998, Lehtonen ym. 2003, ICES 2004). Tästä syystä AChE-aktiivisuutta ei pidetä enää puhtaasti spesifinä biomarkkerina, vaan enemmän yleisen stressin ilmentäjänä.

1.1.4. Solun puolustusmekanismit: metallotioneiinit

Metallotioneiinit ovat kysteiinipitoisia proteiineja, jotka sitovat metalleja soluissa (Kägi & Schäffer 1988, Viarengo ym. 1999, taulukko 1). Ne sitovat sekä hivenaineina tarvittavia metalleja, esimerkiksi sinkkiä (Zn), kuparia (Cu), että soluille vieraita metalleja, esimerkiksi elohopeaa (Hg) ja kadmiumia (Cd). Toiminnallaan ne suojaavat solua mm. raskasmetalli- ionien kiinnittymiseltä solun rakenteisiin ja poistavat liiallisia määriä soluun tunkeutuvia metalleja. Metallien määrää soluissa säädellään metallotioneiinien lisäksi mahdollisesti myös varastoimalla metalleja solulimaan granuloina (Giuère ym. 2000). Metallotioneiinien synteesi indusoituu raskasmetalli-ionien kertyessä soluun, mutta metallit eivät ole ainoa metallotioneiinin synteesiin vaikuttava tekijä (Viarengo ym. 1999). Erilaiset endogeeniset ja eksogeeniset (sisä- ja ulkosyntyiset) tekijät vaikuttavat synteesin käynnistymiseen, näitä ovat mm. oksidatiivinen stressi, glukokortikoidihormonit, erilaiset stressitekijät kuten kylmyys, kuumuus ja happiolosuhteet (Ebadu ym. 1996, Viarengo ym. 1999). Metallotioneiinit toimivat soluissa myös osana antioksidanttista puolustusjärjestelmää, joka neutraloi hapen reaktiivisia muotoja (Ebadu ym. 1996). Ne toimivat antioksidantteina kahdella tapaa: joko reagoimalla suoraan hapen reaktiivisten muotojen kanssa tai sitomalla oksidatiivista stressiä aiheuttavia raskasmetalli-ioneja, esim. kuparia (English & Storey 2003). Monilla kalalajeilla on havaittu metallotioneiinien pitoisuuden kasvavan annos- vastesuhteessa metallien lisäykseen ja metallotioneiinien tason korreloivan kudoksen metalli- pitoisuuden kanssa (van der Oost ym. 2003). Metallotioneiinien pitoisuuden kasvun on lisäksi todettu olevan simpukoilla kytköksissä soluvaurioihin (Géret ym. 2002, Domouhtsidou ym. 2004). Metallotioneiinit ovat yleisiä useimmissa organismeissa, ja niiden määrä voidaan mitata kudosnäytteistä spektrofotometrisesti (Viarengo ym. 1997, 1999).

1.2. Itämerensimpukka (Macoma balthica L.)

Itämerensimpukka (Macoma balthica), tai toiselta suomenkieliseltä nimeltään liejusimpukka, on yksi Itämeren pohjaeläimistön kaikkein tunnusomaisimpia edustajia (Segerstråle 1939, kuva 4). Sillä on ohut vaalea kuori ja se kasvaa suurimmillaan Suomen rannikolla hieman yli kahden cm:n kokoiseksi. Simpukalla on kaksi hengitysputkea sisään- ja ulosmenevälle vedelle, ja se käyttää lihaksikasta jalkaansa kaivautumiseen. Laji on yleinen Itämeressä sekä hiekka- että liejupohjilla, ja elää Suomen rannikolla kaikilla syvyyksillä matalimman rantavyöhykkeen ulkopuolella. Itämerensimpukan kokonaislevinneisyys kattaa pohjoisen pallonpuoliskon, mutta Itämeren ulkopuolella lajin elinalue on rajoittunut matalaan rantavyöhykkeeseen sitä saalista- vien piikkinahkaisten vuoksi. Itämeressä ei alhaisen suolapitoisuuden vuoksi esiinny piikki- nahkaisia, kuten esimerkiksi meritähtiä.

Kuva 4. Itämerensimpukka eli liejusimpukka. Kuvassa ylhäällä simpukan hengitysputket eli sifot ja alhaalla simpukan kaivautumiseen käyttämä jalka. Kuva: Juha Flinkman.

Itämerensimpukka elää sedimenttiin kaivautuneena, ja se hankkii ravintonsa sisään- hengitysputken avulla joko suodattamalla vapaasta vedestä suspensiota tai syömällä pohjalle sedimentoitunutta ainesta. Näiden ravinnonhankintatapojen välillä ei tosin ole suurta eroa, sillä

sedimentti-vesi-rajapinnassa partikkelit liikkuvat faasista toiseen (Gilbert 1977). Gilbertin mukaan itämerensimpukka käyttää ravinnokseen partikkeleita, jotka ovat suurimmillaan 300 µm kokoisia. Ravintonsa mukana simpukat altistuvat vierasaineille, jotka voivat olla mm. kiinnittyneinä partikkelimaiseen ainekseen vedessä (Solé 2000). Simpukoita on käytetty ympäristön tilan seurannassa jo pitkään (mm. Mussel Watch- ohjelma, Goldberg ym. 1978, Narbonne ym. 1999) ja myös biomarkkeritutkimuksissa on käytetty perinteisesti paljon simpukoita, erityisesti sinisimpukoita (ICES 2004). Itämeren- simpukan biomarkkerivasteita on toistaiseksi tutkittu varsin vähän, toisin kuin esimerkiksi sinisimpukan (Mytilus edulis) vasteita. Simpukat sopivat hyvin ympäristön tilan seurantaan, koska ne ovat laajalle levinneitä, paikallaan pysyviä, helposti kerättäviä ja kestäviä. Lisäksi simpukoiden ravinnonhankintatavan vuoksi niihin kertyy paljon ympäristömyrkkyjä (ICES 2004). Simpukat eivät ole kuitenkaan ongelmattomia kohteita biomarkkeritutkimuksissa, vaan esimerkiksi niiden alhainen metabolianopeus verrattuna äyriäisiin ja kaloihin vaikeuttaa mittauksia. Simpukoiden fysiologiaa ei lisäksi tunneta perinpohjaisesti, mikä voi hankaloittaa tulosten tulkintaa.

1.3. Tutkimuksen tausta ja tarkoitus

Biomarkkereita on käytetty toistaiseksi hyvin vähän Itämeren tilan arvioinnissa, vaikka Itämeri on yksi tutkituimmista merialueista maailmassa. Itämeren erityispiirteiden, joita ovat mm. vähäsuolaisuus, suuret vuodenaikaiset lämpötilanvaihtelut ja laajat hapettomat pohja-alueet, vuoksi on biomarkkerien taustavaihtelu sekä sopivat kohdelajit selvitettävä ennen biomarkkerien laajamittaisempaa käyttöä ympäristön tilan seurannassa. Tässä tutkimuksessa on selvitetty erilaisten tekijöiden vaikutusta itämerensimpukan biomarkkerivasteisiin. Laboratoriokokeissa on tutkittu vähähappisten olosuhteiden ja kahden ympäristömyrkyn, kuparin ja tributyylitinan (TBT), sekä näiden myrkkyjen ja vähähappisten olosuhteiden yhteisvaikutuksen merkitystä valittuihin biomarkkerivasteisiin. Laboratoriokokei- den aikana kerätyt kudosnäytteet tuhoutuivat kuitenkin Merentutkimuslaitoksen pakastimen sulaessa elokuussa 2003 ennen kuin biomarkkerianalyysejä ehdittiin tehdä. Lokakuussa 2003 tehtiin kenttätutkimus Vuosaaren sataman alueella, missä oli havaittu korkeita TBT-pitoisuuksia keväällä 2003 ruoppausten yhteydessä. Alueelta kerättiin itämerensimpukoita ja sedi-

menttinäytteitä, ja biomarkkerianalyysien lisäksi Vuosaaren sedimentti- ja simpukkanäytteistä analysoitiin ympäristömyrkkypitoisuuksia.

1.3.1. Laboratoriokokeet

Itämeressä esiintyy laajoja hapettomia pohja-alueita ja ihmisen aiheuttama rehevöityminen lisää näiden alueiden määrää (Diaz & Rosenberg 1995, Sandberg 1996). Vähähappiset eli hypoksiset olosuhteet ovat stressitekijä pohjaeläimille, kuten itämerensimpukalle. Nämä olosuhteet voivat vaikuttaa simpukoiden fysiologiaan ja biomarkkerivasteisiin siten, että havaitut vasteet eivät olekaan yhteydessä ympäristömyrkkyihin vaan hapettomuuteen. Laboratorio- kokeiden avulla oli tarkoitus selvittää, miten hypoksia vaikuttaa neljän biomarkkeriin: GST-, CAT- ja AChE-aktiivisuuteen sekä metallotioneiinien määrään. Tämä tehtiin altistamalla simpukoita koeyksiköissä ensin pelkälle hypoksialle (hypoksiakoe) ja tämän jälkeen valitun ympäristömyrkyn ja hypoksian yhteisvaikutusta tutkittiin altistamalla simpukoita kuparille ja hypoksialle (kuparialtistuskoe) sekä TBT:lle ja hypoksialle (TBT-altistuskoe).

Hypoksia

Happea (O2) on vedessä huomattavasti vähemmän kuin ilmassa, mikä johtuu hapen suhteellisen huonosta liukenemisesta veteen (Horne & Goldman 1994). Hapen liukenemisaste veteen on riippuvainen lämpötilasta siten, että kylmempään veteen liukenee enemmän happea. Hapen määrään vedessä vaikuttavat lämpötilan lisäksi mm. veden kerrostuneisuus sekä perustuotannon ja hengityksen suhde (eli hapen tuotanto ja kulutus). Pohjan läheisyydessä ei matalimpia alueita lukuun ottamatta tapahdu perustuotantoa, vaan pohjien ravintoverkko saa pääosan energiasta materiaalista, jota sataa pohjalle valoisasta kerroksesta. Koska happea kuluu pohjalla eliöiden hengityksen lisäksi myös hajotustoimintaan ja veden kerrostuminen voi estää hapekkaan veden pääsyn pohjalle, saattaa happi kulua loppuun pohjan tuntumassa. Hypoksiaa eli veden vähähappisuutta esiintyy luonnollisesti matalilla ja suljetuilla vesialueilla, ja lisäksi rehevöityminen lisää hypoksialle altistuvien alueiden määrää (Diaz & Rosenberg 1995). Hapen kyllästysaste eli saturaatio voi vaihdella vedessä 0 %:sta yli 100 %:iin, jolloin kyseessä on vilkkaan perustuotannon aikaansaama hapen supersaturaatio. Hapen eri satu- raatioasteista erotetaan normoksia (hapen osapaine eli PO2 = 100 %), lievä hypoksia (20–40 %), hypoksia (<20 %) ja anoksia (<2–0 %) (Sandberg 1996).

Eliöiden fysiologiset vasteet hypoksialle riippuvat mm. altistumisajasta, hypoksian asteesta, elinkierron vaiheesta ja altistuneiden yksilöiden iästä (Sandberg 1996). Yleensä hypoksialle altistunut eliö kasvattaa hengitystiheyttä, mikä kuluttaa energiaa, ja olojen vallitessa pidempään hypoksia vaikuttaa eliön ravitsemustilaan. Pohjan päällä elävät lajit siirtyvät pois vähähappisilta alueilta ja sedimentissä elävät lajit siirtyvät sedimentissä ylöspäin lähemmäs hapekkaampaa elinympäristöä. Itämerensimpukka kestää monien muiden arktisten simpukkalajien tavoin pitkäaikaistakin altistumista hypoksialle (Diaz & Rosenberg 1995). Monet eläimet, mm. simpukat, pystyvät muuntamaan metaboliaansa siten, että ne kestävät ajoittaista anoksiaa ja hypoksiaa (Hochachka 1983, Greenway & Storey 1999, English & Storey 2003). Tällöin metabolia hidastuu ja metaboliareaktiot muuttuvat anaerobisiksi, esimerkiksi anaerobiseksi glykolyysiksi ja reaktioksi, jossa laktaatti hajoaa etanoliksi ja hiilidioksidiksi.

Kuparin ja TBT:n myrkyllisyysvaikutukset Laboratoriokokeissa käytettiin ympäristömyrkkyjen malliyhdisteinä kuparia ja TBT:a, jotka edustavat metallien ja orgaanisten myrkkyjen ryhmää. Molempia yhdisteitä on käytetty myrkkymaaleissa, joiden avulla estetään päällyskasvuston muodostumista alusten pohjaan (IMO 1999). Kuparia on käytetty jo pitkään myrkkymaalien ainesosana ja TBT:a sisältäviä maaleja on aluksissa käytetty 1960-luvulta lähtien. Eliöt tarvitsevat kuparia, koska se on osa monia erilaisia entsyymejä, jotka ovat elintärkeitä solujen toiminnan kannalta (Gaetke & Chow 2003, Isani ym. 2003). Kupari toimii lisäksi monien entsyymien kofaktorina ja katalyyttinä monissa reaktioissa. Toisaalta kupari on hyvin myrkyllistä soluille silloin, kun se esiintyy soluissa vapaana metalli-ionina (Cu2+ tai Cu+) ja muodostaa hapen reaktiivisia muotoja, jotka aiheuttavat oksidatiivista stressiä (Gaetke & Chow 2003). Kupari voi ionimuodossa lisäksi kiinnittyä proteiinien kysteiiniosiin ja muuttaa niiden rakenteen toimintakyvyttömäksi. Soluissa toimii kuparin myrkyllisyyden vuoksi mekanismeja, mm. metallotioneiinit, jotka pitävät vapaan kuparin pitoisuuden soluissa alhaisena. Kaloilla akuutin kuparialtistuksen on todettu vaikuttavan kidusten pintasoluissa, jossa kupari-ionit häiritsevät ionisäätelyä ja aiheuttavat soluja kudosvaurioita ja lopulta veren- kiertoelimistön pettämisen (Handy 2003). Lievän hypoksian aiheuttamien kidusvaurioiden on todettu kaloilla nopeuttavan kuparin akuutteja myrkyllisyysvaikutuksia (Sellers 1975). Ruuan kautta saadun kuparin akuutit vaikutukset ruuansulatuskanavassa ovat samankaltaiset kuin kiduksissa (Handy 2003). Kuparin vaikutukset kroonisessa altistuksessa, jossa pitoisuudet ovat

lähempänä ympäristössä esiintyviä tasoja (muutamia mikrogrammoja litrassa vettä), ovat monimutkaisempia. Kroonisessa altistuksessa kuparin eritykseen, sijoitukseen ja varastointiin on enemmän aikaa. Kroonisia vaikutuksia ovat ionitasapainon muutosten lisäksi hapetus-pel- kistyspotentiaalin, immuniteetin ja lisääntymisstrategian muutokset (Handy 2003). Kuparin krooniset vaikutukset saattavat olla merkki endokriinisysteemin häiriöistä (Handy 2003). Tässä työssä käytetty kuparikonsentraatio (0,2 mg l-1) on huomattavasti korkeampi kuin ympäristössä mitatut konsentraatiot. Tätä pitoisuutta on aiemmin käytetty laboratoriokokeissa, joissa itäme- rensimpukoita altistettiin kuparille ja tuholaismyrkky malationille (Lehtonen & Leiniö 2003). TBT kuuluu orgaanisiin tinayhdisteisiin, ja tarkemmin butyylitinoihin. Orgaaniset tinayhdisteet ovat pääosin ihmisen valmistamia, ja näin myös butyylitinat. TBT:a käytetään mm. laivojen pohjamaaleissa estämään vesieliöiden kiinnittymistä pintoihin (Hoch 2001, Rüdel 2003). Maaleista TBT:a vapautuu veteen, ja yhdisteen myrkyllisyys estää pinnoilla kasvavien eliöiden kiinnittymisen maalatulle alustalle. Muita butyylitinayhdisteitä, di- ja mono- butyylitinaa (DBT ja MBT), käytetään mm. PVC-muovien pehmentimenä. Butyylitinoja voi päätyä ympäristöön myös teollisuuden jätevesien mukana (Rüdel 2003). Butyylitinoista TBT on myrkyllisin DBT:n ja MBT:n ollessa vähemmän myrkyllisiä ja vesiliukoisempia. Butyylitinat hajoavat ympäristössä joko abioottisesti (mm. valon vaikutuksesta) tai bioottisesti eliöissä (Rüdel 2003). Bioottisissa reaktioissa TBT hajoaa vierasainemetabolian entsyymien vaikutuksesta (Morcillo ym. 1998). TBT mineralisoituu hajoamisketjussa ensin dibutyylitinaksi ja edelleen monobutyylitinaksi, joka hajoaa viimein neliarvoiseksi tina-ioniksi (eli TBT+ → DBT2+ → MBT3+ → Sn4+). Abioottisista reaktioista fotolyysillä on suurin merkitys TBT:n hajoamisessa. Tämä reaktio on kuitenkin hyvin hidas, ja TBT:n puoliintumisaika on fotolyysissä noin 3 kuukautta (Rüdel 2003). Bioottinen hajotus on nopeampaa kuin abioottinen, ja TBT:n puoliintumisajat vaihtelevat biologisissa reaktioissa kuudesta vuoro- kaudesta useisiin viikkoihin. Sedimentissä TBT:n hajoamisen on arvioitu kestävän 50–75 vuorokautta hapellisissa olosuhteissa, mutta hapettomissa olosuhteissa hajoaminen voi kestää jopa vuosikymmeniä (Rüdel 2003). TBT on hyvin myrkyllistä vesieliöille (Alzieu 2000, Albalat ym. 2002) ja erityisesti nilviäisille (Lee 1991b, Morcillo ym. 1998, Walker ym. 2001). TBT:n on todettu aiheuttavan mm. kotilonaaraiden maskulinisaatiota (imposex), jossa naaraat kehittävät asteittain koiras- puolisia sekundaarisia sukupuoliominaisuuksia. Esimerkiksi Iso-Britanniassa on Nucella lapillus- ja Pohjanmerellä Buccinum undatum -kotilopopulaatioita paikallisesti tuhoutunut TBT:n aiheuttamien lisääntymishäiriöiden vuoksi (Bryan ym. 1986, Cadée ym. 1995, Birchenough ym. 2002). TBT:n on havaittu aiheuttavan nilviäisillä lisäksi mm. kuoren epä-

muodostumista, neurotoksisia vaikutuksia ja DNA-vaurioita, jotka johtavat vakavimmillaan solujen kuolemaan (Alzieu 2000, Mičić ym. 2002). TBT:n myrkyllisyyden mekanismia ei kuitenkaan tunneta vielä tarkasti (Morcillo ym. 1998). Kotiloiden testosteronitasojen on havaittu kohonneen vasteena TBT-altistukselle, ja tämä ilmiö on yhdistetty imposex-ilmiön syntyyn. Testosteronitasoihin TBT vaikuttaa mahdollisesti sytokromi P450-entsyymien kautta (Morcillo 1998). Nämä entsyymit toimivat vierasainemetabolian lisäksi myös hormonien aineenvaihdunnassa. Nilviäisissä TBT:n metabolia- nopeuden on kuitenkin oletettu olevan melko alhainen johtuen vierasainemetabolian ensim- mäisen vaiheen entsyymien vähyydestä (Lee 1991a). Nilviäisiin kertyy enemmän TBT:a kuin esimerkiksi kaloihin nilviäisten metabolian hitaudesta johtuen. TBT:n käyttöä on rajoitettu viime vuosikymmeninä sen epätoivottujen myrkyllisyysvaikutusten vuoksi (IMO 1999). Suomessa on orgaanisia tinayhdisteitä sisältävien maalien käyttö ollut kiellettyä alle 25 metriä pitkissä aluksissa vuodesta 1991 (Valtion ympä- ristöhallinto 2005). Kansainvälisen merenkulkujärjestön IMO:n sopimuksen mukaan, jonka EU on hyväksynyt, orgaanisia tinayhdisteitä ei käytetä enää vuoden 1.1.2003 jälkeen, ja orgaanisia tinayhdisteitä ei tulisi olla missään käytössä enää vuonna 2008 (IMO 2005). Tässä työssä itämerensimpukat altistettiin hypoksian lisäksi kahdelle eri TBT-konsen- traatiolle, jotka olivat 0,2 µg TBT-Cl l-1 ja 2 µg TBT-Cl l-1. Näiden konsentraatioiden arveltiin aiheuttavan itämerensimpukassa fysiologisia vaikutuksia, vaikka tälle lajille ei löytynyt tutkittuja TBT-Cl-myrkyllisyysarvoja. Guolan & Yong (1995) ovat käyttäneet pitoisuutta 0,50 µg TBT-Cl l-1 60 vuorokauden altistuskokeessa aikuisille sinisimpukoille. Tämä pitoisuus aiheutti kasvun hidastumista ja vaurioita soluorganelleissa, mm. mitokondrioissa. Valkirsin ym. (1987) mukaan aikuisilla sinisimpukkayksilöillä on havaittu kuolleisuutta 96 tunnin akuuttitoksisuustesteissä vasta 38 µg TBT l-1 konsentraatiossa, ja aikuisilla katkoilla viiden päivän kokeessa kuolleisuutta on havaittu konsentraatioissa 6–15 µg TBT l-1. Tämän kokeen pitoisuudet valittiin tarpeeksi alhaisiksi vastaamaan kokeen kestoa (12 vuorokautta), mutta kuitenkin siten, että myrkyllisyysvaikutuksia ehtisi ilmetä kokeen aikana.

Hypoksian, kuparin ja TBT:n vaikutukset biomarkkereihin Hypoksian vaikutuksia tässä työssä käytettyihin biomarkkerivasteisiin on tutkittu varsin vähän. Metabolian muuttuminen aerobisesta anaerobiseksi voi vaikuttaa mitattaviin biomarkkerivasteisiin. Hypoksian aikana soluissa tapahtuu metabolian ohella muitakin biokemiallisia muutoksia, ja mm. hapen reaktiivisten muotojen määrä vähenee, jolloin oksidatiivinen stressi vähenee (Lushchak ym. 2001). Kun happipitoisuus jälleen nousee, oksidatiivinen stressi

lisääntyy. Esimerkiksi karpilla on todettu maksan katalaasiaktiivisuuden nousevan hapet- tomuuden aikana, ilmeisesti happipitoisuuden nousun ennakoimiseksi (Lushchak ym. 2001). Tässä työssä tehdyistä laboratoriokokeista pelkässä hypoksia-altistuksessa ja TBT-altistuksessa happipitoisuus nostettiin viimeisten koepäivien ajaksi hypoksia-akvaarioissa 100 %:iin palautumisen tutkimiseksi. Kuparin tiedetään vaikuttavan metallotioneiinitasoihin mm. simpukoilla (Viarengo ym. 1999). Metallotioneiinin rooli on kaksitahoinen: se säätelee kuparin määrää soluissa ja lisäksi metallotioneiinilla voi olla merkittävä osa kuparin aiheuttaman oksidatiivisen stressin lie- ventäjänä simpukoissa (Wright ym. 2000). Wrightin ym. (2000) mukaan myös antioksi- danttisten entsyymien aktiivisuudet ovat herkkiä kuparialtistuksen indikaattoreita akvaattisissa eliöissä. TBT-altistuksen indikaattorina on perinteisesti käytetty kotiloilla havaittavaa imposex- ilmiötä, mutta myös muita biomarkkereita on tutkittu. TBT:n on havaittu vaikuttavan troop- pisilla kalalajeilla GST-aktiivisuuteen (Al-Ghais & Ali 1999) ja toimivan simpukoilla TBT:n aineenvaihdunnassa (Fitzpatrick ym. 1997), joten TBT voi vaikuttaa GST:n aktiivisuustasoon itämerensimpukalla. TBT:n on todettu rotilla aiheuttavan hermovaurioita (Mizuhashi ym. 2000), jotka vaikuttavat mahdollisesti AChE:n aktiivisuustasoon. Mizuhashin ym. (2000) mukaan TBT:n aiheuttamat hermovauriot voivat johtua joko suoraan TBT:n myrkkyvaiku- tuksesta tai ne voivat olla hapen reaktiivisten muotojen välittämiä, koska katalaasin on todettu vähentävän vaurioita.

1.3.1. Kenttänäytteenotto Vuosaaren sataman alueella

Helsingin Vuosaareen on rakenteilla satama, joka tulee korvaamaan nykyisin käytössä olevat satamat eli Länsisataman ja Sörnäisten sataman (Vuosaaren satamahankkeen verkkopalvelu). Vuosaaren satamahanke on Suomen valtion ja Helsingin kaupungin yhteishanke, jonka toteuttavat Helsingin Satama, Tiehallinto, Merenkulkulaitos ja Ratahallintokeskus yhteis- työssä. Sataman otetaan käyttöön vuonna 2008. Vuosaaren sataman rakennustöiden yhteydessä löydettiin sedimenteistä korkeita TBT-pitoisuuksia, jotka ovat peräisin alueella toimineesta telakasta. Tältä alueelta kerättiin simpukka- ja sedimenttinäytteitä syksyllä 2003 yhteistyössä Helsingin kaupungin ympäristökeskuksen kanssa. Simpukkanäytteistä analysoitiin biomarkkerivasteet (GST, CAT, AChE ja MT) ja sekä simpukka- että sedimenttinäytteistä ympäristö- myrkkypitoisuuksia. Kenttätutkimuksessa kartoitettiin itämerensimpukan biomarkkerivasteita

TBT-saastuneella alueella ja arvioitiin, soveltuvatko tutkimuksessa käytetyt biomarkkerit TBT-altistuksen indikaattoreiksi. Lisäksi haluttiin selvittää TBT:n kertymän suuruutta ja meta- boliatasoa itämerensimpukassa. Vuosaaren sataman alueella aiemmin olleen telakan toiminnan vuoksi sedimentteihin on paikallisesti kertynyt erilaisia käytössä olleita aineita, mm. myrkkymaaleissa käytettyjä yhdisteitä. Vuosaaren telakka on ollut laivanrakennuskäytössä vuodesta 1974, ja vuosina 1974–1987 siellä rakennettiin noin 30 laivaa (Liisa Autio, suullinen tiedonanto 3.11.2004). Lisäksi telakka osallistui noin sadan muun laivan rakentamiseen. Vuodesta 1987 telakka- allasta ja uivia telakoita vuokrattiin laivojen korjausta varten. Telakan toiminta päättyi vuonna 2004. Toukokuussa 2003 löytyi sataman ja meriväylän ruoppausmassojen tutkimuksissa korkeita TBT-pitoisuuksia sedimentistä telakka-altaan läheisyydestä, ja Uudenmaan ympä- ristökeskus keskeytti ruoppaukset lisätutkimusten ajaksi. Sataman alueelta löytynyt TBT on peräisin telakkatoiminnasta, ja ilmeisesti suurin osa TBT:sta on peräisin uivista telakoista (Liisa Autio, suullinen tiedonanto 3.11.2004). Pahiten TBT-saastuneen alueen ympärille on suunnitteilla suojarakenne, joka koostuu penkereestä ja verhorakenteesta. Suojarakenteen sisä- puolella pilaantuneet maamassat voidaan puhdistusruopata, sillä rakenteen tulisi estää TBT- pitoisen sedimentin leviäminen laajemmalle alueelle. Lisäksi myöhemmin tarkoituksena on kiinteyttää betonilla pahiten TBT-saastuneet sedimentit satamakentän pohjaan siten, että TBT- saastuneet sedimentit eivät pääse enää yhteyteen ympäristön kanssa (Vuosaaren satamahankkeen verkkopalvelu). Vuosaaren alueen TBT-kuormituksen vuoksi alue on erityisen mielenkiintoinen biomarkkerivasteiden kannalta, sillä muutkin biomarkkerit kuin perinteisesti kotiloilla käytetty imposex-ilmiö voi toimia TBT-altistuksen ilmentäjänä. Itämerensimpukan biomarkkerivasteita on toistaiseksi tutkittu kenttäolosuhteissa hyvin vähän, vaikka se on yleinen pohjaeläin Itä- merellä. Lehtonen ym. (2004) ja Leiniö & Lehtonen (käsikirjoitus) ovat kartoittaneet itämeren- simpukan biomarkkerivasteita Saaristomerellä ja vasteiden vuodenaikaista vaihtelua Hanko- niemellä. Näiden tutkimusten perusteella GST, CAT, AChE ja MT ovat potentiaalisen käyttö- kelpoisia biomarkkereita itämerensimpukassa. TBT:n mahdollisia vaikutuksia näihin biomarkkereihin on selostettu laboratoriokokeiden taustaosiossa. TBT:n metaboliittien DBT:n ja MBT:n mittausten avulla selvitettiin TBT:n hajoamisen vilkkautta itämerensimpukoissa. TBT:n tiedetään jossain määrin metaboloituvan sinisimpukoissa, perustuen mm. mitattuihin TBT/MBT-suhteisiin, mutta vastaavaa tietoa itämerensimpukan metaboliatasosta ei ole ollut. TBT:stä riippumattomien biomarkkerivasteiden selittämiseksi Vuosaaren alueelta mitattiin

TBT:n ja sen metaboliittien lisäksi myös muita ympäristömyrkkypitoisuuksia simpukoista ja sedimenttinäytteistä: näytteistä analysoitiin kymmenen eri metallin pitoisuudet [arseeni (As), kadmium (Cd), koboltti (Co), kromi (Cr), kupari (Cu), lyijy (Pb), mangaani (Mn), nikkeli (Ni), sinkki (Zn) ja vanadiini (V)] ja PCB-yhdisteiden pitoisuudet sekä DDT:n (eli p,p-dikloro- difenyylitrikloroetaaanin) ja sen metaboliittien p,p-diklorodifenyylidikloroetaanin (DDD) ja p,p-diklorodifenyylitrikloroetyleenin (DDE) pitoisuudet.

1. Aineisto ja menetelmät

2.1. Laboratoriokokeet

Laboratoriokokeet tehtiin Tvärminnen eläintieteellisellä asemalla keväällä ja kesällä 2003. Kokeissa selvitettiin hypoksian eli vähähappisten olosuhteiden vaikutusta itämerensimpukan biomarkkereihin. Kokeissa käytettiin kuparia ja TBT:a malliyhdisteinä ympäristömyrkkyjen ja hypoksian yhteisvaikutusten tutkimiseksi. Laboratoriokokeita tehtiin kolme erillistä. Hypoksiakokeessa itämerensimpukoita altistettiin kuuden vuorokauden ajan hypoksialle ja seurattiin kahden vuorokauden ajan toipumista nostamalla veden happikyllästys 100 %:iin. Kuparialtistuskokeessa itämerensimpukoita altistettiin kuparille (0,2 mg l-1) sekä normoksiassa että hypoksiassa yhdeksän vuorokauden ajan. TBT-altistuskokeessa itämerensimpukoita altistettiin kahdelle eri TBT-pitoisuudelle (0,2 µg TBT-Cl l-1 ja 2 µg TBT-Cl l-1) kymmenen vuorokauden ajan ja lisäksi seurattiin simpukoiden toipumista hapettomuudesta nostamalla happikyllästys 100 %:iin kahden vuorokauden ajaksi.

2.1.1. Hypoksialaitteisto

Kokeissa veden happikyllästystä alennettiin erityisen laitteiston avulla (kuva 5.). Laitteisto on muunneltu versio Dr. Bent Vismannin kehittämästä hapen, pH:n ja vetysulfidin yhtäaikaisesta säätelylaitteistosta laboratorio-olosuhteita varten (Vismann 1996). Laitteisto koostuu happi- mittarista (Strathkelvin Instruments Oxygen Meter, model 781), regulaattorista (Power supply ja Signal controller, PR Electronics), magneettiventtiilistä (Danfoss), akvaariopumpusta sekä typpikaasupullosta.

2. HAPPIMITTARI 3. REGULAATTORI

O2 N2

Ilma- pumppu

Happielektrodi N2 Magn.- venttiili

1. AKVAARIO

Kuva 5. Hypoksialaitteisto.

Laitteisto säätelee happipitoisuutta siten, että happimittari mittaa elektrodin (platina- hopeaelektrodi) avulla jatkuvasti veden happipitoisuutta. Happimittari on yhdistetty regulaat- toriin, johon voidaan ohjelmoida haluttu happikyllästys, esim. 10 %, ja sallittu poikkeama-alue tästä arvosta, esim. 4 prosenttiyksikköä. Kun happimittarin mittaama arvo siirtyy sallitun arvo- alueen ylä- tai alapuolelle, kytkee regulaattori virran joko magneettiventtiiliin tai akvaario- pumppuun, jolloin akvaariossa kuplitetaan joko typpikaasua (N2) tai ilmaa, ja veden happipitoisuus palautuu sallitulle arvo-alueelle.

2.1.2. Hypoksiakoe

Kokeessa käytetyt itämerensimpukat kerättiin Tvärminnen eläintieteellisen aseman läheisyydestä Sundholmenista (7–8 m syvyydestä) ja Storfjärdeniltä (20–25 m syvyydestä) 24.4.2003 Ekman-pohjanoutimella (kuva 6). Sedimenttinäytteet siivilöitiin 5 mm siivilällä, ja noin 200 kappaletta yli 10 mm kokoista itämerensimpukkaa kerättiin talteen. Simpukat sijoitettiin akklimoitumaan saaviin, jonka pohjalle laskeutettiin noin 7 cm:n kerros hapekasta pintasedimenttiä. Simpukoita akklimoitiin kuusi vuorokautta. Saavissa oli läpivirtaus (noin 0,5 l min-1) sekä ilmastus, ja veden lämpötila oli + 10 ˚C.

HANKONIEMI

Sundholmen Storfjärden

TVÄRMINNE

Kuva 6. Tvärminnen alueen kartta. Kuva: Kari Lehtonen, Merentutkimuslaitos.

Kokeessa käytettiin kahta koeakvaariota (20*30*20 cm), joista toisessa oli koko kokeen ajan ilmastus (100 % happikyllästys) ja toisessa alennettu happikyllästys (10 %). Akklimoituneista simpukoista valikoitiin 100 kappaletta 10–19 mm pituista yksilöä kum- paankin koeakvaarioon kokeen alkamista edeltävänä päivänä 29.4., ja niiden annettiin sopeu- tua koeoloihin vuorokauden ajan hapekkaassa vedessä.

Koe kesti 8 vuorokautta, 30.4.–9.5.2003 (liite 1). Koeakvaarioissa oli koko kokeen ajan 5 l suodatettua merivettä (0,2 µm), ja veden lämpötila oli + 9–10 ˚C. Kokeen aikana happimittari kalibroitiin joka päivä ja akvaarioiden vesi vaihdettiin joka toinen päivä. Vesi vaihdettiin imemällä letkulla mahdollisimman paljon vettä pois akvaarioista ja poistamalla samalla akvaarion pohjalle kertyneet simpukoiden jätökset. Uusi vesi kaadettiin varovasti simpukoiden päälle. Hypoksia-akvaarioon vaihdettavasta vedestä laskettiin happisaturaatio lähelle 10 %:a kuplittamalla siinä typpikaasua ennen veden vaihtoa.

Akvaariot peitettiin kokeen ajaksi mustalla muovilla, jotta simpukat häiriintyisivät mahdollisimman vähän akvaarion ulkopuolisista ärsykkeistä. Veden pinta peitettiin lisäksi kummassakin akvaariossa pakkausstyroksilla, jotta hapen liukeneminen ilmasta veteen estyisi.

Kuudentena koevuorokautena hypoksialaitteisto kytkettiin pois päältä ja hypoksia-akvaarion happisaturaatio nostettiin normaalille tasolle (100 %) kuplittamalla ilmaa. Kolme viimeistä koevuorokautta molemmissa akvaarioissa pidettiin 100 % happikyllästys ja simpukat saivat palautua hypoksiasta.

Simpukoiden aktiivisuutta seurattiin kokeen aikana noin kerran vuorokaudessa. Ak- tiivisuus määritettiin silmämääräisesti laskemalla ne simpukat, joiden hengitys- ja poistoputket (sifot) olivat esillä. Muistiin kirjattiin myös putkien suhteellinen pituus, eli olivatko ne vain vähän esillä vai ojennettuna pitkiksi. Mahdolliset kuolleet yksilöt poistettiin joka päivä. Yksilö todettiin kuolleeksi, kun sen kuori oli auki, eikä se sulkenut kuorta ärsytyksestä (haavilla töniminen) huolimatta.

Kummastakin koeakvaarioista otettiin 20 simpukan näyte viisi kertaa kokeen aikana: nollahetkenä, 2., 4., 6., ja 9. koevuorokautena. Simpukoiden määrä siis väheni koeakvaarioissa kokeen aikana siten, että nollahetkellä simpukoita oli kummassakin akvaariossa 100 yksilöä ja 6.-9. koevuorokautena simpukoita oli jäljellä 20 yksilöä kummassakin akvaariossa. Näytteen- oton yhteydessä 20 simpukkaa siirrettiin koeakvaarioista puhtaaseen suodatettuun (0,2 µm) meriveteen ja niitä pidettiin jäissä. Simpukat preparoitiin tunnin kuluessa koeakvaarioista oton jälkeen, ja niistä erotettiin ruuansulatusrauhaset kukin omaan Eppendorf-putkeen GST- ja CAT-aktiivisuusmäärityksiä varten ja jalat viiden yksilön ryhminä yhteen Eppendorf-putkeen AChE-aktiivisuusmäärityksiä varten. Kudosnäytteet jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä, minkä jälkeen näytteet varastoitiin – 80 ˚C. Simpukoiden kuorten pituus mitattiin työntömitalla.

2.1.3. Kuparialtistuskoe

Kokeessa käytetyt itämerensimpukat kerättiin 28.5.2003 Storfjärdeniltä (30–35 m syvyydestä) pohjatroolilla. Simpukat sijoitettiin välittömästi Storfjärdeniltä kerättyä merivettä sisältävään saaviin. Kerätyistä simpukoista noukittiin noin 450 yksilöä, jotka olivat yli 10 mm pituisia. Akklimatisaatio tapahtui samoin kuin hypoksiakokeessa, tosin akklimatisaatioaika oli tässä kokeessa pidempi, 12 vuorokautta. Kokeessa itämerensimpukat altistettiin hypoksian lisäksi kuparille (kuvat 7 ja 8). Hypoksialaitteistoja toimi kokeen aikana kaksi rinnakkaista eli molemmissa hypoksia-akvaa-

rioissa oli omansa. Haluttu kuparikonsentraatio 0,2 mg l-1 saatiin aikaan lisäämällä koeakvaarioihin milli-Q -veteen liuotettua kuparisulfaattia (CuSO4). -1 Kuparisulfaattikantaliuoksessa oli tuhatkertainen konsentraatio (785,8 mg CuSO4 l ) haluttuun konsentraatioon verrattuna, joten koeakvaarioihin lisättiin kantaliuosta 1 ml litraa kohden. Kontrolli- ja hypoksia-akvaarioihin lisättiin vastaava määrä pelkkää milli-Q -vettä. Tässä kokeessa veden määrää yhtä simpukkaa kohden pidettiin vakiona, jotta saatavilla olevan kuparin määrä pysyisi samana kokeen ajan. Veden määrää siis vähennettiin koeakvaarioissa sitä mukaa kun simpukoiden määrä väheni näytteenottojen yhteydessä (taulukko 2). Koe- akvaarioiden maksimitilavuus oli 10 l. Koe kesti yhdeksän vuorokautta, 10.6.–19.6.2003 (liite 1). Koejärjestelyt olivat mainit- tuja poikkeuksia lukuun ottamatta samat kuin hypoksiakokeessa. Kokeen aikana happimittarit kalibroitiin ja vesi vaihdettiin joka päivä. Vedenvaihdon yhteydessä tehtiin kupari- ja mQ- lisäykset. Simpukoiden aktiivisuus mitattiin kaksi kertaa vuorokaudessa, aamulla ja illalla. Kaikista koeakvaarioista otettiin 20 simpukkayksilön näyte viisi kertaa kokeen aikana: nolla- hetkenä, 2., 4., 6. ja 9. koevuorokautena. Näytteet käsiteltiin samoin kuin hypoksiakokeessa.

Kontrolli Hypoksia

100 % O2 10 % O2

Cu Cu + hypoksia

100 % O2 10 % O2 0,2 mg l-1 Cu 0,2 mg l-1 Cu

Kuva 7. Kuparialtistuskokeen koejärjestely.

Taulukko 2. Kuparialtistuskokeen akvaarioiden vesitilavuudet, myrkkylisäykset ja yksilömäärät koe- vuorokausittain.

Koevuoro- Tilavuus (l) CuSO4- Simpukoiden kausi lisäys (ml) määrä 0 9,6 100 0-2 9,6 9,6 80 2-4 7,2 7,2 60 4-6 4,8 4,8 40 6-9 2,4 2,4 20

Kuva 8. Kuparialtistuskokeen koejärjestely. Vasemmalla akvaariot, perällä kaksi happimittaria ja ylhäällä regulaattorit.

2.1.4. TBT-altistuskoe

Kokeessa käytetyt itämerensimpukat kerättiin 2.7.2003 Storfjärdeniltä (30–35 m syvyydestä) pohjatroolilla. Simpukat sijoitettiin välittömästi Storfjärdeniltä kerättyä merivettä sisältäviin saaveihin, joihin kytkettiin ilmastus, ja simpukoita pidettiin yön yli + 10 ˚C:ssa. Simpukat sijoitettiin akklimatisaatioastiaan seuraavana päivänä. Akklimatisaatio tapahtui samoissa olosuhteissa kuin hypoksiakokeessa, ja se kesti 8 vuorokautta. Kokeessa itämerensimpukat altistettiin hypoksian lisäksi kahdelle eri TBT-konsen- traatiolle, jotka olivat 0,2 µg TBT-Cl l-1 ja 2 µg TBT-Cl l-1 (kuva 9). TBT-konsentraatiot saatiin aikaan lisäämällä koeakvaarioihin tributyylitinakloridia (TBT-Cl). TBT-Cl liukenee huonosti veteen, joten kantaliuokset valmistettiin liuottamalla TBT-Cl:a asetoniin. Kanta- liuosten valmistamisessa käytetty TBT-Cl (Merck, tuote no. 808390) oli tiheydeltään 1,20 g cm-3 eli 1,20 g ml-1. Laimeampi kantaliuos valmistettiin liuottamalla 16,7 µl TBT-Cl:a 10 ml:aan asetonia, jolloin saatiin 2 µg TBT-Cl ml-1 asetonia. Vahvempi kantaliuos valmistettiin liuottamalla 167 µl TBT-Cl:a 10 ml:aan asetonia, jolloin saatiin 20 µg TBT-Cl ml-1 asetonia. Tässä kokeessa koeakvaarioiden vesimäärä pidettiin samana koko kokeen ajan, 7 litrassa. Haluttu TBT-konsentraatio saatiin aikaan lisäämällä laimeampaa ja vahvempaa kantaliuosta 700 µl koeakvaarioihin, jolloin loppukonsentraatioiksi muodostui 0,2 µg TBT-Cl l-1 ja 2 µg TBT-Cl l-1. Kontrolli- ja hypoksia-akvaarioihin lisättiin vastaava määrä puhdasta asetonia, tosin vasta toisesta vedenvaihdosta eteenpäin. Ohji ym. (2002) on tutkinut asetonin myrkyllisyyttä Caprella-katkoille akvaariokokeissa, ja todennut sen olevan myrkytöntä alle 125 µl l-1 pitoisuuksissa. Tässä kokeessa asetonia oli akvaarioissa enintään 100 µl l-1.

Kontrolli Hypoksia

100 % O2 10 % O2

TBT 1 Hypoksia + TBT 1

100 % O2 10 % O2 0,2 µg TBT- Cl l-1 0,2 µg TBT- Cl l-1

TBT 2 Hypoksia + TBT 2

100 % O2 100 % O2 2 µg TBT- Cl l-1 2 µg TBT- Cl l-1

Kuva 9. TBT-altistuskokeen koejärjestely.

Koe kesti 12 vuorokautta, ja se suoritettiin 12.7.–25.7.2003 (liite 1). Hypoksialait- teistoja toimi kokeen aikana kolme rinnakkaista (kuva 9). Kokeen aikana happimittarit kalibroitiin joka päivä ja vedet vaihdettiin joka toinen päivä. Vedenvaihtojen yhteydessä tehtiin TBT- ja asetonilisäykset. Akvaarioiden pH-tasoa arvioitiin kokeen aikana kolmeen otteeseen indikaattoripaperin avulla, ja mittausten mukaan pH pysyi samana kaikissa koe- yksiköissä kokeen ajan, noin kahdeksassa. Kahden viimeisen koevuorokauden aikana tutkittiin palautumista sekä altistumisesta myrkylle sekä hypoksialle. Kaikkien hypoksia-akvaarioiden happipitoisuus nostettiin 100 %:iin ja TBT-akvaarioiden simpukat siirrettiin puhtaisiin akvaarioihin (ei myrkkylisäyksiä). Koejärjestelyt olivat muutoin samat kuin hypoksiakokeessa. Kokeen aikana simpukoiden aktiivisuus merkittiin muistiin kaksi kertaa vuorokaudessa. Kaikista koeyksiköistä otettiin 20 yksilön näyte viisi kertaa kokeen aikana: nolla- hetkenä, 2., 4., 8., ja 13. koevuorokautena. Näytteet käsiteltiin samoin kuin hypoksiakokeessa.

2.2. Kenttänäytteenotto

Näytteenotto toteutettiin Helsingin Vuosaaressa 1.–2.10.2003 yhteistyössä Helsingin kaupungin ympäristökeskuksen kanssa. Itämerensimpukoita kerättiin kuudelta asemalta ja sedi- menttinäytteitä viideltä asemalta Vuosaaren sataman edustalta (kuva 10, taulukko 3). Sim- pukka- ja sedimenttinäytteet otettiin samasta paikasta, jos se oli mahdollista. Simpukoita löytyi parhaiten hiekansekaisesta sedimentistä, joka ei kuitenkaan sovellu sedimenttianalyyseihin, joten sopivan hienojakoiset sedimenttinäytteet otettiin lähimmästä mahdollisesta paikasta. Pikku-Niinisaaren aseman läheisyydestä ei löydetty sopivaa sedimenttiä lainkaan. Kaikki näytteet otettiin van Veen-pohjanoutimella. Sedimenttinäytteitä varten kaavit- tiin pohjanoutimella nostetusta sedimenttipaakusta päällimmäinen hapettunut kerros (noin 2 cm). TBT-määrityksiin käytetyt sedimenttinäytteet säilöttiin happopestyihin (10 % HCl) lasiastioihin epäpuhtauksien välttämiseksi. Kaikki sedimenttinäytteet pakastettiin säilytyksen ajaksi (– 20 °C).

Taulukko 3. Simpukoiden näytteenottopisteiden ominaisuuksia.

Asema Matalakari Uutela Satama-allas Lehdessaari Mölandet Pikku-Niinisaari Syvyys 20–22 m 11 m 7 m 9 m 7 m 10 m Kuvaus Karkeata Vaihteleva Vain Hiekansekaista Runsaasti Vaihteleva sedimenttiä, tiheys muutamia sedimenttiä, simpukoita, pohja ja paljon simpukoita. simpukoita, vaihteleva hiekansekainen simpukkatiheys. eläimiä. harmaa ja tiheys sedimentti. haiseva simpukoita. sedimentti.

Kuva 10. Näytteenottopisteet Vuosaaren sataman alueella. □ = sedimenttinäyte, ● = simpukkanäyte. MAT = Matalakari, UUT = Uutela, PIN = Pikku-Niinisaari, SAT = satama-allas, LEH = Lehdessaari ja MÖL = Mölandet. Harmaa soikio = Mustakuvun läjitysalue. Kartta: Liisa Autio, Helsingin Kaupungin Ympäristökeskus.

Sipoo

Suomi

SAT MÖL Helsinki 100 km LEH

UUT UUT

Helsinki

1 km MAT MAT © Helsingin kaupunki, Kaupunkimittausosasto 035/2004

Simpukat kerättiin siivilöimällä sedimenttiä 5 mm seulalla. Jokaiselta asemalta kerättiin noin 150 simpukkaa, mikä tarkoitti pohjan karkeudesta ja simpukkatiheydestä riippuen 15–30 nostoa van Veen-pohjanoutimella. Veden lämpötila pohjan läheisyydessä oli näytteenottohetkellä Uutelassa + 8,7 °C ja satama-altaassa + 8,9 °C.

2.2.1. Näytteiden käsittely

Simpukat preparoitiin näytteenottoa seuraavana päivänä. Yön yli simpukat säilytettiin + 4 °C ilmastetussa merivedessä 10 l astioissa. Säilytyksessä käytetty merivesi kerättiin jokaiselta asemalta erikseen, ja simpukat pidettiin omalta asemalta kerätyssä vedessä. Biomarkkeri- analyysejä varten preparoitiin jokaiselta asemalta 40 yli 10 mm kokoista simpukkaa. Sim- pukoiden ruuansulatusrauhaset erotettiin kukin omaan Eppendorf-putkeen GST-, CAT- ja MT- määrityksiä varten ja jalat viiden yksilön ryhminä yhteen Eppendorf-putkeen AChE-mää- rityksiä varten. Kudosnäytteet jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja varastoitiin lopuksi – 80 °C:een. Myrkkymäärityksiä varten preparoitiin jokaiselta asemalta 90 simpukkaa, joista 30 yksilöä käytettiin kokonaisina TBT-määrityksiin, 50 yksilöä orgaanisten klooriyhdisteiden määrityksiin ja 13–10 yksilöä metallipitoisuuksien määrityksiin. TBT-määrityksissä käytet- tävät simpukat säilöttiin happopestyihin (10 % HCl) lasiastioihin epäpuhtauksien välttämi- seksi. Kaikki simpukkanäytteet pakastettiin välittömästi (– 20 °C).

2.2.2. Metallit, organoklooriyhdisteet sekä TBT, DBT ja MBT

Laboratoriohygieenikko Seija Kalso (Helsingin kaupungin ympäristökeskus) analysoi sedimentti- ja simpukkanäytteistä metallipitoisuudet (As, Cd, Co, Cr, Cu, Pb, Mn, Ni, Zn ja V) sekä orgaanisten klooriyhdisteiden pitoisuudet (PCB-yhdisteet, DDT , DDD ja DDE). PCB- yhdisteet ja DDT sekä sen metaboliitit uutettiin kuivaamattomasta näytteestä ja analysoitiin kaasukromatografisesti, ja lisäksi määritettiin kuiva-aineen määrä osanäytteestä. Menetelmän laajennettu mittausepävarmuus on 30 %. Kuivatut sedimenttinäytteet ja tuoreet simpukka- näytteet poltettiin typpihapon ja vetyperoksidin seoksessa mikroaaltouunissa, ja saadusta liuoksesta analysoitiin metallipitoisuudet plasma-massaspektrometrillä. Dr. Ingela Dahllöf (National Environmental Research Institute, Tanska) analysoi sedimentti- ja simpukkanäytteiden TBT-, DBT- ja MBT-pitoisuudet. Orgaaniset tinayhdisteet etyloitiin näytteistä alhaisessa pH:ssa (pH 5) käyttäen triprotyylitinaa standardina ja erotettiin vesifaasista pentaaniin. Butyylitinapitoisuudet analysoitiin kaasukromatografilla (GC-PFPD).

2.3. Biomarkkerianalyysit

Biomarkkerianalyysit tehtiin Merentutkimuslaitoksen biokemian laboratoriossa. Kaikki ana- lyyseissä tarvittavat kemikaalit ovat Sigma-Aldrichin valmistamia, ellei toisin mainita. Labora- toriokokeiden aikana kerätyistä kudosnäytteistä oli tarkoitus mitata GST-, CAT- ja AChE- aktiivisuudet. Suurin osa näytteistä tuhoutui kuitenkin Merentutkimuslaitoksen superpakas- timen sulaessa elokuussa 2003. Vain hypoksiakokeen näytteistä ehdittiin analysoida GST- ja CAT-aktiivisuudet. Vuosaaren näytteistä analysoitiin GST-, CAT- ja AChE-aktiivisuudet sekä MT-pitoisuus.

GST- ja CAT-aktiivisuusmittaukset GST- ja CAT-aktiivisuudet mitattiin samasta kudoshomogenaatista. Hypoksiakokeen näyt- teistä määritettiin 10 yksilön aktiivisuudet jokaista näytteenottoa ja koeyksikköä kohden. Vuo- saaren simpukoista aktiivisuudet mitattiin jokaiselta asemalta 12 yksilön ruuansulatus- rauhasesta käyttäen kahta rinnakkaista mittausta näytettä kohden. Poikkeuksena oli satama- allas, josta löytyi vain kolme mittauskelpoista simpukkaa. Näytteiden kudosmäärät punnittiin (yli 15 mg tarpeellinen määrä analyysiin) ja niihin lisättiin suhteessa 1:3 kylmää 100 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 7), minkä jälkeen näytteet homogenisoitiin käsin sauvan avulla jäähauteessa. Homogenisoinnin tarkoituksena on rikkoa kudoksen rakenne ja vapauttaa solulimassa liukoisena olevat yhdisteet lisättyyn puskuriin. Näytteitä sentrifugoitiin 20 minuuttia (10 000 * g, + 4 °C). Sentrifugoinnissa raskaammat kappaleet painuvat pohjalle, ja nesteeseen jäävät jäljelle vain solulimassa liukoisena olevat yhdisteet. Sentrifugoinnin aikana erottunut kirkas supernatantti pipetoitiin erilleen, ja se laimennettiin kylmällä 100 mM kalium- fosfaattipuskurilla (pH 7). Laimennuskerroin oli GST-analyysissä 40 ja CAT-analyysissä 25. Laimennetut näytteet säilytettiin jäähauteessa aina mittaushetkeen asti, ja mittaukset tehtiin 1,5 tunnin kuluessa sentrifugoinnista. CAT-aktiivisuudet mitattiin seuraamalla Claibornen (1985) kehittämää menetelmää.

CAT-aktiivisuusmittauksessa määritettiin näytteeseen lisätyn vetyperoksidin (H2O2) hajoamis- nopeus spektrofotometrisesti (Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 2). Laimennettua näytettä, huoneenlämpöistä kaliumfosfaattipuskuria ja vetyperoksidisubstraattia lisättiin kvartsikyvettiin, josta mitattiin absorbanssin muutosta 240 nm alueella 5 sekunnin välein yhden minuutin ajan. Jokaisesta näytteestä tehtiin kolme rinnakkaista mittausta, ja vetyperoksidin spontaani hajoaminen määritettiin nollanäytteillä. 240 nm on vetyperoksidille ominainen absorbaatioaallonpituus, ja mittauksen aikana absorbanssin määrä vähenee, kun näyt-

teessä oleva katalaasi hajottaa vetyperoksidia. Hajoaminen on sitä nopeampaa, mitä enemmän katalaasia näytteessä on. Mittauksissa käytettiin apuna tietokoneohjelmaa (Perkin Elmer UVKinLab Version 2.80.02), joka laskee absorbanssin muutosnopeuden (dA min-1). GST-aktiivisuudet määritettiin käyttämällä Habigin ym. (1974) kehittämää menetel- mää. GST-mittauksessa määritettiin GST:n katalysoiman konjugaatioreaktion nopeutta spektrofotometrisesti. Kyvettiin lisättiin laimennettua näytettä, huoneenlämpöistä kaliumfosfaattipuskuria, 1-kloori-2,4-dinitrobentseeniä (CDNB) ja glutationia (GSH). Jokaisesta näytteestä tehtiin kolme rinnakkaista mittausta ja lisäksi määritettiin spontaanin kompleksin- muodostuksen nopeus nollanäytteiden avulla. Reaktiossa GSH muodostaa kompleksin CDNB:n kanssa GST:n katalysoimana, ja reaktion nopeus on verrannollinen GST:n määrään näytteessä. Kompleksinmuodostusnopeutta mitattiin 340 nm alueella 5 sekunnin välein yhden minuutin ajan. 340 nm on CNDB:n ja GSH:n muodostaman kompleksin ominainen absor- banssiaallonpituus, ja absobanssi kasvaa mittauksen aikana. CAT- ja GST-aktiivisuudet laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti:

-1 ∆O.D. min * Vtot * lk = µmol min-1 mg-1 proteiinia -1 ε * kyvetin läpimitta * Vn * [prot] mg ml

Jossa ∆O.D. min-1 = optisen tiheyden muutos eli absorbanssin muutos

Vtot = kokonaisnestetilavuus mittauksessa (ml)

Vn = näytteen määrä mittauksessa (ml) ε = moolinen absorptiokerroin [prot] mg ml-1 = proteiinipitoisuus laimennetussa näytteessä lk = laimennoskerroin

Absorbanssin muutoksesta vähennettiin nollanäytteiden absorbanssin muutos, ja tätä lukua käytettiin kaavassa. Kokonaisnestetilavuus oli mittauksissa 1,5 ml ja näytteen määrä 0,075 ml. Moolinen absorptiokerroin CAT-mittauksissa käytetylle vetyperoksidille on 0,040 mM-1 cm-1 ja GST-mittauksissa syntyvälle kompleksille 9,6 mM-1 cm-1, ja laimennoskerroin oli CAT-analyysissä 25 ja GST-analyysissä 40. CAT-aktiivisuudet kerrottiin -1:llä posi- tiivisten loppuarvojen saamiseksi. Laimennettujen näytteiden (supernatantti ja puskuri) proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin (1976) menetelmällä. Menetelmä perustuu proteiiniin sitoutuvan värin intensiteetin mittaamiseen spektrofotometrisesti. Mittaukset tehtiin kuoppalukulaitteella (Bio-Rad Micro-

plate Reader Benchmark), joka lukee 96-paikkaisen kuoppalevyn absorbanssit. Jokaista mittausta varten valmistettiin 6–8 standardia BSA-kantalioksesta (Bovine Serum Albumin), jota laimennettiin mQ-vedellä haluttuun pitoisuuteen. Näytteitä laimennettiin edelleen suhteessa 1:400 mQ-vedellä. Standardeja ja näytteitä pipetoitiin kuoppalevylle kaikkia kolme rinnakkaista. Lopuksi kuoppalevylle lisättiin mQ-vedellä laimennettua (1:4) väriainetta (Bio- Rad Protein Assay Dye Reagent, Bio-Rad), ja levyä inkuboitiin huoneen lämmössä vähintään 3 minuuttia. Mittaus suoritettiin 595 nm alueella, ja tulokset laskettiin Benchmark Microplate Reader -ohjelman (versio 5.0.1., Bio-Rad) avulla. Absorbanssit mitattiin enintään 30 minuutin kuluttua värin lisäämisestä.

AChE-aktiivisuusmittaukset AChE-aktiivisuusmittaukset tehtiin käyttäen Ellmanin ym. (1961) ja Bocquenén & Galganin (1998) kehittämää analyysitekniikkaa, jonka Sari Leiniö (Merentutkimuslaitos) on soveltanut sopivaksi itämerensimpukalle. Aktiivisuusmittaukset tehtiin simpukoiden jalasta, ja mittauksia varten yhdistettiin preparoinnin yhteydessä viiden yksilön kudosnäytteet yhdeksi tarvittavan näytemäärän saavuttamiseksi, joka on vähintään 0,2 g. Kudosnäytteet homogenisoitiin käsin Eppendorf-putkessa sauvan avulla, ja putkeen lisättiin ennen homogenisointia kylmää fosfaattipuskuria (0,02 M, pH 7) suhteessa 1:2 kudosta ja puskuria. Näytteitä sentrifugoitiin homogenisoinnin jälkeen 20 minuuttia (10 000 * g, + 4 °C). Supernatantit pipetoitiin erikseen. Mittaukset tehtiin kuoppalukulaitteella (Bio-Rad Microplate Reader Benchmark), joka lukee 96-paikkaiselta kuoppalevyltä absorbanssit. Mittaus perustuu reaktioihin, joissa näyt- teessä oleva asetyylikoliiniesteraasi ensin hajottaa substraatiksi lisätyn asetyylitiokoliinin (ACTC) tiokoliiniksi ja etikkahapoksi, ja tiokoliini reagoi edelleen ditiobentsoaatin kanssa (DTNB eli Ellmanin reagenssi) muodostaen tiobentsoaattia (TNB). TNB:n spesifinen absorbanssi on 412 nm, ja tämä mitataan kuoppalukulaitteella. Kuoppalevylle pipetoitiin näyte, huoneenlämpöistä fosfaattipuskuria (0,02 M, pH 7), ditiobentsoaattia (DTNB) fosfaattipuskurissa (0,01 M, pH 8) ja ACTC:a liuotettuna mQ- veteen. Mittaukset tehtiin käyttäen 3–4 rinnakkaista näytettä riippuen näyte-erän määrästä. AChE-aktiivisuus lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti:

-1 ∆O.D. min * Vtot*1000 = µmol ACTC min-1 mg-1 proteiinia -1 ε * kuopan syvyys * Vn * [prot] mg ml

Jossa ∆O.D. min-1 = optisen tiheyden muutos eli absrobanssin muutos

Vtot = kokonaisnestetilavuus mittauksessa (ml)

Vn = näytteen määrä mittauksessa (ml) ε = moolinen absorptiokerroin TNB:lle 1,36*104 M-1 cm-1 [prot] mg ml-1 = proteiinipitoisuus laimennetussa näytteessä

Mittaustulokset suhteutettiin näytteiden proteiinikonsentraatioon, joka määritettiin Bradfordin (1976) menetelmällä.

Metallotioneiinimittaukset Laboratoriomestari Susanna Hyvärinen (Merentutkimuslaitos) analysoi simpukoiden kudos- näytteistä MT-pitoisuudet käyttäen Viarengon ym. (1997) kehittämää tekniikkaa. MT-mittaukset tehtiin simpukoiden ruuansulatusrauhasista. Kudosta punnittiin vähintään 0,5 g mittausta kohden (kudosta noin viidestä yksilöstä), ja ne homogenisoitiin Potter-homogenisaattorilla (Braun) 0,5 M sakkaroosipuskurissa (20 mM TRIS, pH 8,6). Näytteitä sentrifugoitiin 20 minuutin ajan (30 000 * g, + 0–4 °C), jonka jälkeen niistä pipetoitiin 1 ml puhtaisiin koe- putkiin ja niihin lisättiin etanolia ja kloroformia. Näytteitä sentrifugoitiin uudelleen 10 minuutin ajan (6000 * g, + 0–4 °C). Supernatantti pipetoitiin erilleen ja siihen lisättiin suola- happoa (HCl), RNA:ta ja etanolia, jolloin näytteessä olevat proteiinit sakkautuvat. Tunnin pakastuksen jälkeen näytteitä sentrifugoitiin kaksi kertaa, ja välissä putken pohjalle jäänyt pelletti pestiin etanolilla, kloroformilla ja sakkaroosi-TRIS-puskurilla ja resuspendoitiin natriumkloridiliuoksella ja suolahapolla, johon oli lisätty EDTA:ta. Spektrofotometristä mittausta varten näytteitä laimennettiin 0,25 M natriumkloridiliuoksella ja niihin lisättiin DTNB:ä Na-fosfaattipuskurissa. Näytteet sentrifugoitiin viimeisen kerran huoneenlämmössä (3000 * g, 5 min), jonka jälkeen niistä mitattiin absorbanssi (412 nm) spektrofotometrillä (Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 2). Ellmanin reagenssi sitoutuu proteiinien kysteiiniosiin muodostaen keltaisen värin, joka mitataan absorbanssina. Simpukoiden metallotioneiinien kysteiinipitoisuus on 29 %, jonka perusteella voidaan laskea näytteen metallotioneiinipitoisuus (Viarengo ym. 1997).

2.4. Aineiston tilastollinen käsittely

Laboratoriokokeista hypoksiakokeen biomarkkeriaineiston eroa käsittelyiden välillä on tutkittu parittaisilla t-testeillä ja eroa koepäivien välillä Kruskal-Wallisin testillä. Levenen varianssi- testillä on testattu varianssien yhtäläisyyttä t-testien yhteydessä, ja t-testin arvo on ilmoitettu joko siten, että varianssit ovat oletetusti yhtä suuret, tai jos Levenen testi on antanut merkitsevän arvon, ei t-testissä ole variansseja oletettu yhtä suuriksi. Kruskal-Wallisin testi on yksisuuntaista varianssianalyysia vastaava ei-parametrinen testi. Varianssianalyysiä ei ole käy- tetty, koska testin vaatimukset, mm. aineiston normaalisuus, eivät ole täyttyneet pienen otoskoon vuoksi. Aktiivisuusmittausten eroja tutkittiin t-testillä hypoksiakokeessa ja Kruskal- Wallisin testillä kupari- ja TBT-altistuskokeissa. Eroja biomarkkeriaineistossa Vuosaaren asemien välillä on tutkittu Kruskal-Wallisin testin avulla. Metallotioneiinin ja yksittäisten metallien pitoisuuden välistä korrelaatiota on tutkittu laskemalla ei-parametrinen korrelaatiokerroin Spearmanin rho (ρ). Kaikki tilastolliset testit on tehty käyttämällä SPSS-tilasto-ohjelmaa (versiot 11.5.0. ja 12.0.1.). Vuosaaren biomarkkerimittaukset ja metallipitoisuudet on standardoitu seuraavasti. Jokaiselle biomarkkerille on laskettu keskiarvo (ka) ja keskihajonta eli varianssi (σ) jokaista asemaa kohti. Näin saatu aineisto on standardisoitu käyttämällä kaavaa xi' = (xi - ka) / σ, jolloin aineiston varianssiksi tulee 1 ja keskiarvoksi 0. Standardisoituihin arvoihin on tämän jälkeen lisätty aineiston pienimmän arvon itseisarvo kaavalla B = xi' + |xmin|, jolloin aineiston pienin arvo siirtyy nollaan. Asemakohtaiset keskiarvot (B) ovat tämän käsittelyn jälkeen vertailukelpoisia keskenään. Standardoidut biomarkkerivasteet on yhdistetty integroiduksi biomarkkerivasteeksi (IBR) Beliaeffin & Burgeotin (2002) kuvaaman menetelmän avulla. Standardoitujen biomarkkerivasteiden ja integroidun biomarkkerivasteen esittämiseen on käytetty star plot - kuvaajia, joiden pinta-alat (A) on laskettu siten, että jokaisen aseman standardoidut biomarkkeriarvot on kerrottu pareittain ja jaettu kahdella (kolmion pinta-alan kaavan mukaisesti) erilaisten yhdistelmien muodostamissa sarjoissa Ai = (BiBi+1)/2 eli esimerkisi AChE*MT/2, MT*GST/2, GST*CAT/2 ja CAT*AChE/2. Neljällä biomarkkerilla erilaisia sarjoja, eli joissa asemakohtaiset keskiarvot (B) ovat eri järjestyksessä, muodostui kaksi. IBR on Ai-arvojen summa. Eri tavalla järjestettyjen sarjojen summista on laskettu keskiarvo, joka on esitetty star plot-kuvaajissa.

2. Tulokset

3.1. Laboratoriokokeiden tulokset

3.1.1. Hypoksiakoe

Biomarkkerien aktiivisuudet on esitetty box plot -kuvaajien avulla, ja tämän kuvaajatyypin osat on selitetty esimerkissä (liite 2). GST-aktiivisuuksien keskiarvo oli kontrollikäsittelyssä 2,24 ± 0,11 µmol min-1 mg-1 ja hypoksiakäsittelyssä 2,39 ± 0,14 µmol min-1 mg-1 (kuva 11). Kaikki ilmoitetut biomarkkeriarvot ovat tekstissä muodossa arvo ± se eli keskivirhe. GST-aktiivisuuksissa ei ole tilastollisesti merkitsevää eroa käsittelyiden eikä päivien välillä (liite 3). GST-aktiivisuudet olivat koeyksiköissä samalla tasolla kokeen alkaessa, ja toisena koevuorokautena hypoksia- käsittelyssä havaittiin kokeen korkeimmat GST-arvot, tosin myös kontrollikäsittelyn arvot olivat korkeammat kuin nollahetkenä. Kolmen viimeisen vuorokauden palautumisjakso ei näkynyt hypoksia-akvaarion GST-aktiivisuuksissa. CAT-aktiivisuuksien keskiarvo oli kontrollikäsittelyssä 220 ± 13,5 µmol min-1 mg-1 ja hypoksiakäsittelyssä 253 ± 19,6 µmol min-1 mg-1 (kuva 12). CAT-aktiivisuuksissa ei ole tilastollisesti merkitsevää eroa käsittelyiden välillä (liite 3). Päivien välillä on kuitenkin merkitsevä ero hypoksiakäsittelyssä (liite 3). CAT-aktiivisuudet nousivat ensin 2. vuorokauden kohdalla, laskivat 4. vuorokauden kohdalla, nousivat jälleen 6. vuorokauden kohdalla ja laskivat palautumisjakson aikana.

3 mol/min/mg µ 2

1 Kontrolli

0 Hypoksia N = 10 10 10 10 5 5 9 10 10 10 d 0 d 2 d 4 d 6 P 3

Kuva 11. Hypoksiakokeen GST-aktiivisuudet. Kuvaajassa koevuorokaudet (d) 0–6 ja 3. palautumisvuorokausi (P 3). N = analyysissä käytettyjen yksilöiden määrä. Boxplot-kuvaajan tulkinta: ks. liite 2.

Aktiivisuusmittaukset kontrolli- ja hypoksia-akvaarioissa erosivat merkitsevästi toisistaan (liite 3, kuva 13). Vähähappisissa olosuhteissa simpukat kurottivat sifonsa pitkiksi (n. 5 cm) ja suurin osa simpukoista piti sifojaan ulkona. Normaaleissa happioloissa suurin osa simpukoista ei pitänyt sifojaan ulkona, ja näkyvät sifot kurottuivat ulos vain vähän (n. 0,5 cm). Aktiivisuus, eli prosenttiosuus sifojaan näyttävistä simpukoista, pysyi hypoksian aikana 60–70 %:ssa ja kontrollikäsittelyssä 20–40 %:ssa. Kun hypoksia-akvaarion happipitoisuus nostettiin 100 %:iin viidentenä koepäivänä, palautuivat aktiivisuustasot vuorokauden kuluessa hypoksia- akvaariossa kontrollin tasolle. Kaikkien kokeessa käytetyiden simpukoiden kuoren pituuden keskiarvo oli 1,41 ± 0,18 cm (arvo ± keskihajonta).

800

700

600

500

400 mol/min/mg

µ 300

200

100 Kontrolli

0 Hypoksia N = 10 10 10 10 5 5 9 10 10 10 d 0 d 2 d 4 d 6 P 3

Kuva 12. Hypoksiakokeen CAT-aktiivisuudet. Koevuorokaudet (d) 0–6 ja 3. palautumisvuorokausi (P 3). N = analyysissä käytettyjen yksilöiden määrä.

80 Kontrolli Hypoksia ) 60 ä (% ss i v

y 40 k ä t n fo i 20 S

0 012456P1P2P3 Koevuorokausi

Kuva 13. Simpukoiden aktiivisuudet hypoksiakokeessa. Koevuorokaudet 0–6 sekä palautumisvuorokaudet (P) 1–3. Ei mittauksia 3. koevuorokaudelta.

3.1.2. Kuparialtistuskoe

Kuparialtistuskokeen biomarkkerianalyysejä ei tehty aineiston tuhoutumisen vuoksi. Aktiivi- suuksissa oli suuria eroja käsittelyiden välillä (liite 3, kuva 14). Kaikki käsittelyt erosivat merkitsevästi toisistaan paitsi Cu- ja H-Cu-käsittelyt. Molemmissa kuparia sisältävissä käsit- telyissä simpukoiden aktiivisuus oli lähes koko kokeen ajan hyvin alhainen, eli simpukat pitivät kuorensa kiinni suurimman osa ajasta. H-Cu-käsittelyssä oli havaittavissa pientä nousua aktiivisuuksissa kahden viimeisen koevuorokauden aikana verrattuna pelkkään kupari- altistukseen. Kontrolli- ja hypoksia-akvaarioissa aktiivisuudet olivat pääosin samankaltaiset kuin hypoksiakokeessa, eli hypoksiassa aktiivisuudet olivat korkeammalla. Hypoksiassa aktiivisuudet olivat pääosin 50–75 % ja kontrollissa 20–60 %. Viimeisessä mittauksessa hypoksiakäsittelyn aktiivisuus laski kontrollikäsittelyn tasolle, vaikka tässä kokeessa ei ollut palautumisjaksoa kokeen lopussa. Kaikkien kokeessa käytettyjen simpukoiden kuoren pituuden keskiarvo oli 1,37 ± 0,12 cm (arvo ± keskihajonta). H-Cu-käsittelyssä kuoli kaksi simpukkaa kokeen aikana: ensim- mäinen yksilö kuoli heti ensimmäisen koevuorokauden aikana ja toinen seitsemännen koevuorokauden kohdalla. Muissa koeyksiköissä ei ollut kuolleisuutta kokeen aikana.

80 Kontrolli Hypoksia

) 60 Cu H-Cu sä (% s

yvi 40 k ä n t o f i

S 20

0 -10123456789 Koevuorokausi

Kuva 14. Simpukoiden aktiivisuus kuparialtistuskokeessa. Käsittelyt ovat kontrolli, hypoksia, Cu = kuparialtistus 0,2 mg l-1 ja H-Cu = hypoksia + kuparialtistus 0,2 mg l-1.

3.1.3. TBT-altistuskoe

TBT-altistuskokeen biomarkkerianalyysejä ei tehty aineiston tuhoutumisen vuoksi. Sim- pukoiden aktiivisuudet poikkesivat toisistaan kokeen aikana (liite 3, kuva 15). Kontrol- likäsittelyn aktiivisuudet erosivat merkitsevästi kaikista muista käsittelyistä ja hypoksia- käsittelyn aktiivisuudet erosivat merkitsevästi myrkky+hypoksia-käsittelyistä. Hypoksiassa aktiivisuudet olivat 40–70 % välillä ja kontrollissa 10–40 % välillä. Kaikissa TBT:a sisältävis- sä käsittelyissä aktiivisuudet olivat samankaltaisia, eli hyvin alhaisia koko kokeen ajan. Valtaosa TBT:lle altistetuista simpukoista ei pitänyt sifojaan ulkona hypoksiassakaan. Palau- tumisjakson aikana alhaisemmalle TBT-pitoisuudelle altistetut simpukat lisäsivät aktiivi- suuttaan.

80 Kontrolli H TBT1 60 H-TBT1

) TBT2 H-TBT2 sä (% s

yvi 40 k ä n t o f i S

0 -1012345678910P1P2 Koevuorokausi

Kuva 15. Simpukoiden aktiivisuus TBT-altistuskokeessa. Kontrolli, H = hypoksia, TBT1 = 0,2 µg TBT-Cl l-1, H-TBT1 = TBT1 + hypoksia, TBT2 = 2 µg TBT-Cl l-1 ja H-TBT2 = TBT2 + hypoksia. Koevuorokaudet -1–10 sekä palautumisvuorokaudet 1 ja 2.

Korkeammassa TBT-pitoisuudessa, eli 2 µg TBT-Cl l-1, akvaarion pohjalle ilmestyi heti ensimmäisen koevuorokauden aikana sifojen palasia. Lisäksi ne sifot, jotka olivat kiinni simpukoissa ja näkyvissä, näyttivät katkonaisilta. Korkeammassa TBT-pitoisuudessa simpu-

koita myös kuoli kokeen aikana, ja myrkyn vaikutus oli nopeampi hypoksiassa (liite 3). H- TBT2-käsittelyssä kuoli kolmen ensimmäisen koevuorokauden aikana 64 yksilöä. Toisen ja kolmannen koevuorokauden välisenä yönä hypoksialaitteiston ilmapumppu ei toiminut TBT2- H-käsittelyssä, minkä vuoksi happipitoisuus oli 3. koevuorokauden aamulla vain 2,5 %. Vain viisi yksilöä oli eläviä 4. koevuorokauden näytteenottohetkellä. TBT2-käsittelyssä kuoli seitse- män koevuorokauden aikana yhteensä 39 yksilöä, ja vain neljä simpukkaa oli eläviä 8. koevuorokauden näytteenotossa. Simpukoita kuoli myös alhaisemmassa TBT-pitoisuudessa (0,2 µg TBT-Cl l-1) kokeen aikana. TBT1-H ja TBT1-käsittelyissä kuolleisuutta esiintyi kokeen puolivälistä eteenpäin. TBT1-H-käsittelyssä kuoli kokeen aikana yhteensä 26 yksilöä ja TBT1-käsittelyssä 20 yksilöä. Viimeisessä näytteenotossa oli TBT1-H-akvaariossa kolme ja TBT1-akvaariossa kaksi elävää simpukkaa. Kontrolli- ja hypoksia-käsittelyissä ei ollut kuolleisuutta kokeen aikana. Kaikkien kokeessa käytettyjen simpukoiden kuoren pituuden keskiarvo oli 1,55 ± 0,32 cm (arvo ± keskihajonta).

3.2. Kenttätutkimus

3.2.1. Butyylitinapitoisuudet

Korkeimmat TBT-pitoisuudet simpukoissa mitattiin Lehdessaaren asemalta, jossa pitoisuus oli 545 µg TBT:a tuorepainokiloa kohden (kuva 16, liite 4). Neljällä muulla asemalla pitoisuudet olivat 204–286 µg TBT:a tuorepainokiloa kohden, eli noin puolet alhaisempia kuin Lehdessaaren asemalla. Referenssiaseman, eli Matalakarin, pitoisuudet olivat samalla tasolla kuin Uutelan, Pikku-Niinisaaren ja Mölandetin asemilla. Satama-altaasta ei löydetty tarpeeksi simpukoita TBT-pitoisuusmääritystä varten. Sedimentin TBT-pitoisuudet olivat korkeimmillaan satama-altaassa, jossa pitoisuus oli 6039 µg TBT:a kuivapainokiloa kohden, ja toiseksi korkeimmat Lehdessaaren asemalla, 1164 µg TBT:a kuivapainokiloa kohden (kuva 17, liite 4). Muilla asemilla sedimentin TBT-pitoisuudet olivat hyvin alhaisia verrattuna satama-altaaseen ja Lehdessaaren asemaan, 54–88 TBT kg-1.

600

500 TBT DBT 400 MBT

300 tuorrepainoa -1 200

µg kg 100

0 MAT UUT PIN SAT LEH MÖL

Kuva 16. Butyylitinapitoisuudet itämerensimpukoissa. Ei mittausta satama-altaasta (SAT).

6000

5000 TBT DBT 4000 MBT

3000 kuivapainoa -1 2000 µg kg 1000

0 MAT UUT PIN SAT LEH MÖL

Kuva 17. Butyylitinapitoisuudet sedimentissä. Ei mittausta Pikku-Niinisaaren asemalta (PIN).

3.2.2. PCB-yhdisteet

PCB-yhdisteistä määritettiin seitsemän eri muodon (PCB:t 28, 52, 101, 118, 138, 153 ja 180; numerot viittaavat IUPAC:in nimeämiskäytäntöön) pitoisuudet sekä PCB-yhdisteiden koko- naismäärä. Kaikkien PCB-yhdisteiden pitoisuudet olivat sedimentissä ja simpukoissa lähellä mittaustarkkuuden alarajaa 0,001 mg kg-1, ja vain PCB-yhdisteiden kokonaismäärä on ilmoi-

tettu kuvassa 18. Pitoisuudet ovat simpukoilla tuorepaino- ja sedimentissä kuivapainokiloa kohden. Simpukoiden PCB-pitoisuuksissa ei ollut suuria eroja asemien välillä, ja arvot olivat välillä 0,02–0,03 mg kg-1. Sedimenttinäytteistä Lehdessaari erottuu muita asemia korkeampien PCB-pitoisuuksien vuoksi (kuva 18). Lehdessaaren asemalla PCB-yhdisteiden yhteen laskettu pitoisuus oli sedimentissä 0,18 mg kg-1 ja muiden asemien pitoisuudet <0,015–0,02 mg kg-1.

0,2 Simpukat Sedimentti 0,15

-1 g

k 0,1 mg

0,05

0 ** * MAT UUT PIN SAT LEH MÖL

Kuva 18. PCB-yhdisteiden kokonaispitoisuudet itämerensimpukoissa tuorepainokiloa kohden ja sedimentissä kuivapainokiloa kohden. * = ei mittausta.

3.2.3. DDT, DDE ja DDD

DDT:n ja sen metaboliittien DDE:n ja DDD:n pitoisuudet mitattiin vain simpukoista. Pitoi- suudet olivat lähellä mittaustarkkuuden alarajaa (0,001 mg tuorepainokiloa kohden) tai sen alapuolella, eli hyvin alhaisia. Asemien välillä ei havaittu eroja DDT:n ja sen metaboliittien pitoisuuksissa.

3.2.4. Metallit

Simpukoista mitatut metallipitoisuudet olivat lähes kaikkien metallien osalta korkeammat tai yhtä korkeat referenssiaseman eli Matalakarin simpukoissa kuin lähempänä satamaa, poikkeuksena on kromi. Satama-altaasta ja Lehdessaaren asemalta ei löytynyt tarpeeksi simpukoita metallimäärityksiä varten. Simpukoiden metallipitoisuudet on ilmoitettu milli- grammoin kilossa tuorepainoa (liite 4). Satama-altaan sedimentti erottuu muista asemista selkeästi korkeampien pitoisuuksien vuoksi useiden metallien kohdalla (koboltti, kromi, kupari, mangaani ja nikkeli). Monien metallien pitoisuudet olivat matalimmat Matalakarin ja Uutelan asemilla ja korkeammat lähempänä satamaa, poikkeuksena on Uutelan korkea arsenikkipitoisuus. Sedimentin metallipitoisuudet on ilmoitettu milligrammoina kilossa kuivattua sedimenttiä (liite 4). Simpukoiden kaikkien metallien standardoiduissa pitoisuuksissa ei ollut suuria eroja niillä neljällä asemalla, joista pitoisuudet on mitattu (kuva 19). Standardoitujen arvojen avulla kuvataan suhteellisia eroja metallikuormituksessa, ja standardointimetodi on kuvattu osiossa 2.4. Metallotioneiinin vahvimpien tässä työssä mitattujen indusoijien (kadmiumin, kuparin ja sinkin) pitoisuudet simpukoissa on standardoitu erikseen (kuva 20). Matalakarilla, eli tutki- muspisteistä uloimmalla asemalla, oli korkein kuormitus näiden metallien osalta. Uutelan simpukoissa oli korkea sinkkipitoisuus, mutta alhainen kadmiumpitoisuus muihin asemiin verrattuna. Pikku-Niinisaaressa oli kaikkien metallien kuormitus kohtalainen verrattuna muihin asemiin, ja Mölandetissa vain kadmiumpitoisuus oli korkea.

0 * * MA T UUT SA T LEH PIN MÖL

Kuva 19. Kaikkien analysoitujen metallien standardoidut pitoisuudet simpukoissa. * = ei mittausta.

3 Cd

2 Cu Zn

0 * * MA T UUT SA T LEH PIN MÖL

Kuva 20. Kadmiumin (Cd), kuparin (Cu) ja sinkin (Zn) standardoidut pitoisuudet simpukoissa. * = ei mittausta.

3.2.5. GST

Kaikki ilmoitetut biomarkkeriarvot ovat tekstissä muodossa arvo ± keskivirhe eli se. Vuosaaren asemien GST-aktiivisuuksien keskiarvo oli 1,67 ± 0,06 µmol min-1 mg proteiinia-1. GST-aktiivisuuksissa, jotka on suhteutettu näytteiden proteiinikonsentraatioon, ei ole tilastollisesti merkitsevää eroa asemien välillä (p = 0,951) (kuva 21, liite 5). Kaikkiin biomarkkeri- analyyseihin käytettyjen simpukoiden kuoren pituuden keskiarvo oli 1,50 cm. Pienin simpukka oli 1,05 cm:n ja suurin 1,90 cm:n pituinen.

3.2.6. CAT

CAT-aktiivisuuksissa ei ole tilastollisesti merkitsevää eroa asemien välillä (p = 0,705; kuva 22). Asemien CAT-aktiivisuuksien keskiarvo oli 190 ± 9,87 µmol min-1 mg proteiinia-1. Simpukoiden ruuansulatusrauhasen proteiinipitoisuus, johon GST- ja CAT-aktiivisuudet on suhteutettu, ei vaihdellut merkitsevästi asemien välillä (p = 0,454; kuva 23).

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5 mol/min/mg µ

1,0

0,0 N = 10 12 12 3 12 12 MAT UUT PIN SAT LEH MÖL

Kuva 21. GST-aktiivisuudet itämerensimpukassa. N = analyysiin käytettyjen yksilöiden määrä.

500

400

300

mol/min/mg 200 µ

100

0 N = 11 12 12 3 12 12 MAT UUT PIN SAT LEH MÖL

Kuva 22. CAT-aktiivisuudet itämerensimpukassa. N = analyysiin käytettyjen yksilöiden määrä.

8 Proteiinia mg/ml 6

2 0 N = 11 12 12 3 12 12 MAT UUT PIN SAT LEH MÖL

Kuva 23. Ruuansulatusrauhasen proteiinipitoisuus itämerensimpukassa. N = analyysiin käytettyjen yksilöiden määrä.

3.2.7. AChE

AChE-aktiivisuusmittauksissa ei ollut merkitsevää eroa asemien välillä (p = 0,112; kuva 24, liite 5). Asemien AChE-aktiivisuuksien keskiarvo oli korkeimmillaan Uutelan asemalla (31,3 ± 3,29 nmol ACTC min-1 mg proteiinia-1) ja matalimmillaan Mölandetin asemalla (17,7 ± 2,73 nmol ACTC min-1 mg proteiinia -1). Pikku-Niinisaaren kahdeksasta AChE-aktiivisuusmittauksesta onnistui teknisten vaikeuksien vuoksi vain neljä. Proteiinipitoisuuden määritys epäonnistui yhteensä kuudesta näytteestä, johtuen näytteiden haihtumisesta pitkittyneen säilytyksen (– 20 °C) aikana. Proteiinipitoisuusmittauksista Lehdessaaren seitsemän näytettä ja Mölandetin neljä näytettä antoivat korkeampia tuloksia kuin muiden asemien kohdalla johtuen myös pitkittyneestä säilytyksestä. Näiden näytteiden proteiinipitoisuudet on korjattu jakamalla ne kertoimella 1,46, joka on saatu kaikkien onnistuneiden proteiinipitoisuusmittausten ja osittain haihtuneiden näytteiden proteiinipitoisuuksien keskiarvojen suhteesta. Korjatut simpukan jalan proteiinipitoisuudet, joihin AChE-aktiivisuus on suhteutettu, eivät vaihdelleet asemien välillä merkit- sevästi (p = 0,424; liite 5).

20 ACTC/min/mg proteiinia

0 MAT UUT PIN SAT LEH MÖL

Kuva 24. AChE-aktiivisuudet itämerensimpukoissa. Ei mittauksia satama-altaasta (SAT).

3.2.8. MT

Korkeimmat MT-pitoisuudet mitattiin Pikku-Niinisaaren simpukoista (504 ± 4,53 µg g tuorepainoa-1) ja alhaisimmat Matalakarin simpukoista (317 ± 24,1 µg g-1; kuva 25). Asemien välillä ei ollut kuitenkaan tilastollisesti merkitsevää eroa (p = 0,71; liite 5). Metallotioneiinin ja yksittäisten metallien pitoisuuden välillä oli positiivinen korrelaatio vain kromin osalta (Spearmanin korrelaatiokerroin 1,00; p < 0,01).

600

500

400

300 g/g tuorepainoa µ 200

100

0 MAT UUT PIN SAT LEH MÖL

Kuva 25. Metallotioneiinipitoisuudet itämerensimpukoissa. Ei mittausta satama-altaasta (SAT).

3.2.9. Standardoidut biomarkkerivasteet ja IBR

Simpukoiden standardoidut biomarkkerivasteet on kuvattu star-plot -kuvaajien avulla kaikista markkereista erikseen sekä yhdistettynä integroiduksi biomarkkerivasteeksi (kuva 26). Standardoitujen arvojen laskentamenetelmä on kuvattu osiossa 2.2.4. Yksittäisistä biomarkkereista AChE-aktiivisuuden osalta asemista erottuu Mölandet ja metallotioneiinien osalta Pikku-Niinisaari. Nämä kaksi asemaa erottuvat myös kaikista biomarkkereista lasketussa integroidussa biomarkkerivasteessa. Lehdessaaren aseman simpukoiden standardoidut biomarkkerivasteet ovat pienemmät kuin Mölandetin ja Pikku-Niinisaaren asemilla.

A. GST B. CAT

MAT MAT 2,00 2,00

1,00 1,00 MÖL UUT MÖL UUT

0,00 0,00

LEH PIN LEH PIN

C. AChE D. MT

MAT MAT 2,00 3,00

2,00 1,00 MÖL UUT MÖL 1,00 UUT

0,00 0,00

LEH PIN LEH PIN

E. IBR

MAT 2,00

1,00 MÖL UUT

0,00

LEH PIN

Kuva 26. Biomarkkerien standardoidut arvot (A – D) ja näistä laskettu integroitu biomarkkerivaste (E).

4. Tulosten tulkinta

4.1. Laboratoriokokeet

Laboratoriokokeiden hypoksiaosion biomarkkeritulosten perusteella lyhytaikainen hypoksia ei vaikuta itämerensimpukan GST- ja CAT-aktiivisuuksiin merkittävästi. Katalaasi suojaa soluja oksidatiiviselta stressiltä (Winston & Di Giulio 1991). Antarktisella Adamussium colbecki –simpukkalajilla on havaittu CAT-tasojen olevan luon- nossa kertaluokkaa korkeammat kuin lauhkean vyöhykkeen simpukoilla (Regoli ym. 1997). Tämän oletetaan johtuvan korkeasta happipitoisuudesta arktisissa vesissä, ja hapen reaktiivisten muotojen yleisyydestä (Regoli ym. 1997). Hypoksisissa oloissa oksidatiivisen stressin on puolestaan havaittu olevan alhaisella tasolla (Lushchak ym. 2001), ja CAT-aktiivisuuksien on todettu laskevan mm. Biomphalaria tenagophila –kotilolla anoksisissa olosuhteissa (Ferreira ym. 2003). Toisaalta hypoksian vaikutuksesta CAT-aktiivisuuksiin on myös päinvastaisia tuloksia: Corbicula fluminea –simpukalla CAT-aktiivisuudet nousivat vasteena hypoksialle (Vidal ym. 2002). Aktiivisuuksien nousu johtuu mahdollisesti siitä, että Corbicula fluminea ei kestä hyvin vähähappisia olosuhteita (Vidal ym. 2002). Tämän kokeen CAT- aktiivisuudet eivät laskeneet hypoksiassa, vaikka itämerensimpukka on hypoksiaa hyvin kes- tävä laji. Palautumisjakso ei vaikuttanut CAT-aktiivisuuksiin hypoksia-akvaariossa, vaikka happipitoisuuden palautumisen on havaittu laskevan CAT-aktiivisuutta kotiloilla (Ferreira ym. 2003). GST:t toimivat osana antioksidanttista puolustusjärjestelmää neutralisoimalla hapen reaktiivisia muotoja (Wright ym. 2000). GST-aktiivisuudet eivät kuitenkaan eronneet kontrolli- ja hypoksiakäsittelyiden välillä. Biomphalaria tenagophila –kotilolla tehdyssä kokeessa GST-aktiivisuudet eivät muuttuneet anoksiassa, mutta laskivat, kun happipitoisuus palautettiin normaaliksi (Ferreira ym. 2003). Palautumisjakso ei tässä kokeessa vaikuttanut GST-aktiivisuuksiin. Hypoksiakäsittelyn korkeimmat aktiivisuusarvot niin GST:n kuin CAT:n osalta mitattiin toisen koevuorokauden näytteistä. Vaste voi johtua satunnaisesta vaihtelusta tai hypoksian aiheuttamasta stressistä heti kokeen alussa. Hypoksialle altistettujen yksilöiden GST- ja CAT-vasteissa oli suurempaa vaihtelua kuin kontrolliolojen yksilöissä, ja yksilöiden välillä oli suuria eroja. Vaihtelu oli molempien biomarkkerien osalta suurinta kokeen alussa, ja se tasaantui kokeen edetessä. Syynä voi olla simpukoiden tottuminen hapettomiin olosuhteisiin.

Vaikka GST- ja CAT-aktiivisuuksissa ei havaittu muutoksia tässä kokeessa, on itämerensimpukan hyvän hypoksiansietokyvyn (Diaz & Rosenberg 1995) vuoksi lajilla luultavasti tehokas antioksidattinen puolustusjärjestelmä happipitoisuuden muutoksia vastaan, kuten yleensä hypoksiaa kestävillä lajeilla (Ferreira ym. 2003). Kokeessa käytetty happipitoisuus (10 %) ei välttämättä ollut tarpeeksi alhainen vaikuttaakseen itämerensimpukan GST-ja CAT-aktiivisuuksiin, vaikka simpukoiden käyttäytymisessä olikin huomattavia eroja käsit- telyiden välillä. Aktiivisuusmittausten tulokset erosivat selvästi kontrolli- ja hypoksiakäsittelyiden välillä kaikissa kokeissa. Hypoksiassa simpukat yrittivät löytää hapekkaampaa vettä venyt- tämällä hengitysputkensa mahdollisimman pitkiksi, ja tällä toiminnolla on luultavasti vaikutusta simpukoiden energiankäyttöön. Kun simpukoita altistettiin myrkylle, joko kuparille tai TBT:lle, pitivät simpukat kuorensa mahdollisimman paljon kiinni estääkseen altistumisen haitalliselle yhdisteelle, myös hypoksisissa olosuhteissa. Vastaava käyttäytyminen luonnon- oloissa voi suojata simpukkaa suhteellisen lyhytaikaiselta myrkkykuormitukselta, mutta se estää samalla tehokkaan ruuanhankinnan sekä hengitysputken kurottamisen mahdollisesti hapekkaampaan vesikerrokseen, mikä heikentää simpukan selviytymismahdollisuuksia. TBT-kokeessa havaittu hengitysputkien katkeileminen voi johtua TBT:n aiheuttamasta solukuolemasta. TBT:n on todettu aiheuttavan simpukoilla soluvaurioita, jotka johtuvat DNA:ta vaurioittavasta myrkyllisyysvaikutuksesta (Mičić ym. 2002). Kokeessa käytetyt TBT- Cl-pitoisuudet ovat huomattavasti korkeampia kuin ympäristössä esiintyvät pitoisuudet, mutta kroonisen TBT-altistuksen itämerensimpukassa aiheuttamat DNA-vauriot ovat mahdollisia myös luonnonolosuhteissa.

4.2. Kenttätutkimus

4.2.1. TBT-pitoisuudet simpukoissa ja sedimentissä

TBT-pitoisuus itämerensimpukassa oli korkeimmillaan Lehdessaaren asemalla, jossa pitoisuus oli 545 µg TBT:a tuorepainokiloa kohden ja matalimmillaan Matalakarilla ja Uutelassa 204– 205 µg kg-1. Vuosaaren satamahankkeen teetättämät tutkimuksissa on havaittu hieman alhaisempia TBT-pitoisuuksia samalta alueelta kuukautta aiemmin (Niinimäki ym. 2004). Kohonen ym. (käsikirjoitus) ovat analysoineet korkeita TBT-pitoisuuksia itämerensimpukassa

Turun Aurajoen suulta (236–353 µg TBT:a tuorepainokilossa) ja Naantalista (161–414 µg kg-1). Itämerensimpukalle ei löydy julkaistuja vertailuarvoja muualta maailmasta. Sinisim- pukan (M. edulis) TBT-pitoisuuksia on mitattu mm. Puolan rannikolla, jossa korkeimmat pitoisuudet (39 ng Sn g-1 eli 94 µg TBT kg-1; muunnoskerroin 2,42), löytyivät Gdanskin lahdelta (Albalat ym. 2002). Itämeren- ja sinisimpukan eri puolilla maailmaa havaittuja TBT-pitoisuuksia on esitelty taulukossa 5. TBT-pitoisuudet kuvaavat hetkellistä tilannetta, sillä pitoisuuksien on havaittu vaih- televan simpukoissa mm. vuodenaikaisista tekijöistä johtuen (Sheehan & Power 1999). TBT:n kulkeutuminen vesistöissä ja biosaatavuus voi vaihdella paikallisesti mm. sademäärästä riippuen, ja simpukoiden ravinnonhankintanopeus ja siten simpukkaan päätyvän TBT:n määrä voi vaihdella. Ympäristötekijöiden lisäksi myös simpukoiden kudosten hiilihydraatti- ja rasva- pitoisuus vaihtelevat vuodenaikojen mukaan, ja näillä muutoksilla on merkitystä rasvaliu- koisten yhdisteiden määrän kannalta (Sheehan & Power 1999). TBT-pitoisuudet ovat tutkimusten mukaan vaihdelleet sinisimpukassa jopa kymmenkertaisesti eri vuodenaikoina (Sheehan & Power 1999), ja Islannissa tehdyssä tutkimuksessa on puolestaan havaittu, että sinisimpukan TBT-pitoisuus on korkeimmillaan talvella ja matalimmillaan keväällä (Skarphédinsdóttir ym. 1996). Vuosaaren itämerensimpukoiden TBT-pitoisuudet ovat korkeita verrattuna sinisimpukasta mitattuihin pitoisuuksiin, ja korkeampia pitoisuuksia on mitattu sinisimpukoista vain hyvin saastuneilla alueilla. Itämeressä mitatut sinisimpukan TBT-pitoisuudet ovat merkittävästi alhaisempia kuin Suomen rannikolla itämerensimpukassa mitatut pitoisuudet. Suomen rannikolla tuskin on kuitenkaan samassa suhteessa enemmän TBT-kuormitusta, joten erot selittynevät osittain myös TBT:n erilaisesta kertymisestä tai aineenvaihdunnasta näissä simpukkalajeissa. Vuosaaren simpukoissa oli moninkertaisesti enemmän TBT:a kuin sen metaboliitteja DBT:a ja MBT:a, mikä johtuu joko TBT:n hyvin alhaisesta aineenvaihdunnasta itämerensim- pukoissa tai siitä, että TBT-kuormitusta on tapahtunut lähiaikoina (Kohonen ym. käsikirjoitus). Vuosaaren asemilla TBT/DBT-suhde vaihtelee 10,9 ja 12,9 välillä (liite 4). Sinisimpukalla TBT/MBT-suhteen on havaittu olevan alhaisempi: 1,2–4,7 Puolan rannikolla (Albalat ym. 2002); 0,42–6,21 Korean rannikolla (Hyae-Kyung ym. 2002) ja 1,5–10,2 Grönlannin länsirannikolla (Strand & Asmund 2003).

Taulukko 5. TBT-pitoisuuksia itämerensimpukassa (Macoma balthica) ja sinisimpukassa (Mytilus edulis). * = lähteeseen viitattu Hyae-Kyungin ym. (2002) artikkelissa.

Laji Paikka TBT-pitoisuus µg kg-1 märkäpainoa Lähde

Macoma balthica Vuosaari, Helsinki, 10/2003 204–545 Tämä tutkimus Vuosaari, Helsinki, 9/2003 151–272 Niinimäki ym. 2004 Aurajoen suu, Turku 236–353 Kohonen ym.

Naantali 161–414 Kohonen ym.

Mytilus edulis Puolan rannikko, 1998 5–94 Albalat ym. 2002 List, Saksa (Itämeri), 1999 6 Rüdel ym. 2003 Eckwarderhörne, Saksa 17 Rüdel ym. 2003 (Pohjanmeri), 1999 Korea, 1997–1999 17–1 200 Hyae-Kyung ym. 2002 Brittiläinen Kolumbia, Kanada, 25–153 Stewart & 1990 Thompson, 1994 * Tokionlahti, Japani, 1989 20–240 Higashiyama ym, 1991 * Tyynenmeren rannikko, USA, <5–1 080 Short & Sharp 1989 1986–1987 *

Vierasainemetabolia on simpukoissa huomattavasti hitaampaa kuin esimerkiksi nisäk- käissä (Lee 1991b, Fitzpatrick ym. 1997). Simpukoiden välillä voi lisäksi olla lajikohtaisia eroja vierasainemetabolian nopeudessa ja tehokkuudessa (Livingstone 1998). On mahdollista, että itämerensimpukkaan kertyy enemmän TBT:a kuin sinisimpukkaan, koska TBT:n aineen- vaihdunta toimii paremmin sinisimpukassa kuin itämerensimpukassa. Lisäksi TBT:n biosaatavuus voi olla erilainen lajien välillä: itämerensimpukka elää sedimentissä ja käyttää enimmäkseen ravinnokseen sedimentoitunutta ainesta kun taas sinisimpukka elää kiinnit- tyneenä kovaan alustaan ja hankkii ravintonsa suodattamalla. Tästä syystä sinisimpukasta mitatut TBT-pitoisuudet eivät ole verrannollisia itämerensimpukasta mitattuihin pitoisuuksiin, eikä suoria vertailuja simpukoiden elinympäristön TBT-kuormituksen suuruudesta tai ajankohdasta voida tehdä. Itämerensimpukka vaikuttaa keräävän TBT:a enemmän kudoksiinsa kuin sinisimpukka, minkä vuoksi itämerensimpukka voi olla sinisimpukkaa herkempi laji TBT-kuormituksen seurannassa. Sedimentin TBT-pitoisuuksien vaihteluväli oli Vuosaaressa 54–6039 µg TBT:a kuivapainokiloa kohden. Vuosaaren satamahankkeen samalla alueella teettämissä mittauksissa pitoisuudet ovat olleet huomattavasti alhaisempia (taulukko 6, Niinimäki ym. 2004), mutta tasoero voi johtua erilaisesta määritysmenetelmästä. Itämeren rannikolta Saksasta ja Puolasta on viime vuosina mitattu vielä huomattavasti korkeampia sedimentin TBT-pitoisuuksia kuin

tässä tutkimuksessa Vuosaaresta (Biselli ym. 2000, Senthilkumar ym. 1999). Korkeita TBT- pitoisuuksia on löydetty lähiaikoina niinkin kaukaa kuin Antarktikselta (Negri ym. 2004).

Taulukko 6. Sedimentin TBT-pitoisuuksia Vuosaaressa ja muilla merialueilla. * = lähteeseen viitattu Arambarrin ym. (2003) artikkelissa.

Paikka TBT pitoisuus µg kg-1 kuivapainoa Lähde

Vuosaari, Helsinki, 10/2003 54–6 039 Tämä tutkimus Vuosaari, Helsinki, 9/2003 2–64 Niinimäki ym. 2004 Vuosaari, Helsinki, 3/2003 6–64 Niinimäki ym. 2004

Gipuzkoa, Espanja, 2000 121–13 260 Arambarri ym. 2003 Saksa, Itämeri, 1997–98 570–17 000 Biselli ym. 2000 Saksa, Pohjanmeri, 1997–98 80–720 Biselli ym. 2000 Gdanskin lahti, Puola 260–40 000 Senthilkumar ym. 1999 * Rossinmeri, Antarktis 63–4 726 Negri ym. 2004

Vuosaaressa sedimentin korkeat TBT-pitoisuudet olivat selkeästi keskittyneet satama- altaan lähelle, mutta simpukoiden TBT-pitoisuuksissa oli pienempiä eroja asemien välillä. Näytteenottopisteiden uloimmalla asemalla, Matalakarilla, simpukoiden TBT-pitoisuudet eivät olleet merkittävästi alhaisempia kuin muilla asemilla, vaikka aseman oli tarkoitus toimia ver- tailupisteenä muille asemille. Syynä voi olla ruoppausmassojen läjityspisteen läheisyys (ks. kuva 10), jonka vuoksi satamasta peräisin olevaa sedimenttiä ja näin ollen myös TBT:a on saattanut kulkeutunut Matalakarin alueelle. Sataman pahimmin saastuneita sedimenttejä ei läjitetä, vaan ne stabiloidaan sataman alle, joten TBT:a ei pitäisi kulkeutua satama-alueelta pois (Vuosaaren satamahankkeen verkkopalvelu).

4.2.2. Biomarkkerivasteet simpukoissa

Vuosaaren simpukoiden GST-aktiivisuuden kaikkien asemien keskiarvoksi mitattiin 1,67 ± 0,06 µmol min-1 mg proteiinia-1. Tämä keskiarvo on samaa tasoa kuin itämerensimpukan GST- aktiivisuudet samaan aikaan vuodesta Tvärminnen alueella Hankoniemellä, jossa keskimääräi- nen GST-aktiivisuus on lokakuussa Storfjärdenillä 0,80 ± 0,19 µmol min-1 mg proteiinia-1 ja Långskärissä 1,81 ± 0,51 µmol min-1 mg proteiinia-1 (Leiniö & Lehtonen käsikirjoitus). Tutkimuspisteistä Storfjärdenin asema sijaitsee lähellä Koverharin terästehdasta ja Långskär ulompana merellä.

Vuosaaressa mitatut GST-arvot eivät vaihdelleet eri asemien välillä. Luonnonoloista kerätyistä simpukoista mitatut GST-aktiivisuudet ovat joskus vaikeasti tulkittavia (Solé 2000). Solén (2000) mukaan GST-vasteet ovat tutkimuksissa yleisesti ottaen tuottaneet kahdenlaisia vasteita: ne ovat saastuneella alueella joko kohonneet tai niissä ei ole ollut muutoksia vertailualueisiin verrattuna. Kalojen GST-aktiivisuudet ovat antaneet samankaltaisia tuloksia kuin simpukoissa. Van der Oost ym. (2003) mukaan GST-aktiivisuudet ovat nousseet tilastollisesti merkitsevästi 33 %:ssa 82 tutkimuksesta, jossa tätä biomarkkeria on käytetty. Lisäksi GST-aktiivisuuksien oli havaittu muutamassa tapauksessa myös laskeneen. Ilmeisesti jotkut yhdisteet, kuten polyklooratut dibentso-p-furaanit (PCDD-yhdisteet) ja PAH-yhdisteet, voivat sekä nostaa että laskea GST-aktiivisuuksia kaloissa. Fitzpatrick ym. (1997) mukaan GST-aktiivisuudet ilmentävät simpukoissa altistumista orgaanisille yhdisteille, eikä erilaisten metallien ole havaittu vaikuttavan GST-aktiivisuuksiin (Regoli & Principato 1995). Fitzpatrick ym. (1997) havaitsivat Iso-Britanniassa tehdyissä kenttäkokeissa, että sinisimpukan GST-aktiivisuudet nousivat simpukoissa, jotka oli siirretty referenssialueelta saastuneemmalle alueelle. Syynä ei kuitenkaan ollut haitallisten yhdisteiden aiheuttama oksidatiivinen stressi eikä alueiden välisestä suolapitoisuuden vaihtelusta aiheutunut stressi. Havaittu vaste voi Fitzpatrickin ym. (1997) mukaan johtua lindaanin, dieldriinin, PAH- tai PCB-yhdisteiden vaikutuksesta. Myös TBT voisi olla mahdollinen GST- aktiivisuuksien indusoija, koska GST:n on havaittu toimivan TBT:n aineenvaihdunnassa simpukoilla (Lee 1991b). Vuosaaren asemista Lehdessaaren aseman korkea simpukoiden TBT-pitoisuus ei kuitenkaan näkynyt GST-aktiivisuuksissa. Solén (2000) mukaan joissakin transplantaatiokokeissa havaitut muutokset simpukoiden GST-aktiivisuuksissa eivät ole johtuneet eroista haitallisten yhdisteiden määrässä, vaan syvyyden muutoksesta aiheutuneesta stressistä. Tässä tutkimuksessa asemien syvyyserot (7–22 m) eivät vaikuttaneet havaittavasti GST-tasoihin. Lehtonen ym. (2004) ovat löytäneet yli kaksinkertaisia eroja itämerensimpukan GST- aktiivisuuksissa Turussa saastuneemman alueen ja puhtaamman referenssialueen välillä (1,42 ± 0, µmol min-1 mg proteiinia-1 ja 3,08 ± 0,54 µmol min-1 mg proteiinia-1), ja erot olivat simpukan kudoksista mitattujen PCB- ja DDT-gradienttien mukaisia. Vuosaaren alueelta ei löytynyt korkeita PCB- eikä DDT-pitoisuuksia, mikä voi selittää asemien GST-aktiivisuuksien samankaltaisuuden asemien välillä. Vuosaaren simpukoiden CAT-aktiivisuudet ovat itämerensimpukalla samaa luokkaa kuin Tvärminnen alueella samaan aikaan vuodesta. Vuosaaren asemien CAT-aktiivisuuksien keskiarvoksi mitattiin 190 ± 9,87 µmol min-1 mg proteiinia-1 ja Tvärminnen alueella CAT-

aktiivisuudet ovat lokakuussa Storfjärdenillä 133 ± 39,9 µmol min-1 mg proteiinia-1 ja Långskärissä 181 ± 28,6 µmol min-1 mg proteiinia-1 (Leiniö & Lehtonen käsikirjoitus). CAT-aktiivisuuksien nousua pidetään oksidatiivisen stressin ilmentäjänä (van der Oost 2003, Solé 2000). Oksidatiivista stressiä aiheuttavat monien solujen normaalien prosessien lisäksi myös erilaiset vierasaineet. Katalaasi toimii vetyperoksidin hajotuksen lisäksi mm. solujen peroksisomeissa tapahtuvassa rasvahappojen metaboliassa. Katalaasin monimuotoiset tehtävät soluissa vaikeuttavat CAT-aktiivisuuden muutosten tulkintaa (van der Oost 2003). Akvaattisessa ympäristössä on havaittu lämpötilan ja happiolosuhteiden vaikuttavan oksida- tiivisiin prosesseihin ja siten oksidatiivisen stressin tasoon, mikä edelleen mutkistaa tulkintaa (Sheehan & Power 1999, van der Oost 2003). Esimerkiksi Israelin rannikolla Donax trunculus –simpukoilla tehdyssä tutkimuksessa, jossa verrattiin saastuneita ja puhtaita alueita, eivät CAT-aktiivisuudet eronneet saastuneemman alueen ja puhtaamman vertailualueen välillä (Angel ym. 1999). Kaloilla tehdyissä tutkimuksissa CAT-aktiivisuuksien nousua on havaittu muutamissa laboratoriokokeissa, mutta monissa kokeissa aktiivisuudessa ei tapahtunut muutosta altistuksen aikana (van der Oost 2003). CAT-aktiivisuudet ovat lisäksi laskeneet, kun kaloja on altistettu tietyille yhdisteille, mm. PAH-yhdisteille ja kadmiumille. Van der Oostin (2003) mukaan 20 laboratoriokokeesta 20 %:ssa oli havaittu CAT-aktiivisuuksien nousu vasteena altistukselle ja 11 kenttäaineistosta 55 %:ssa CAT-aktiivisuudet olivat saastuneella alueella korkeammat kuin puhtaalla vertailualueella. CAT-aktiivisuudet eivät vaihdelleet merkittävästi asemien välillä Vuosaaren alueella. Ranskassa tehdyssä tutkimuksessa on havaittu joissa elävien Unio tumidus –simpukoiden antioksidanttipuolustusjärjestelmän reagoivan ympäristön PAH- ja PCB-yhdisteiden pitoisuuksien lisäksi myös metallikuormaan (Cossu ym. 2000). Antarktisella Adamussium colbecki –simpukkalajilla on todettu laboratoriotutkimuksissa CAT- ja GST-tasojen laskevan vasteena kupari- ja elohopea-altistukselle (Regoli ym. 1997). Lasku näiden biomarkkerien aktiivisuuksissa saattaa liittyä kuitenkin vain akuuttiin altistumiseen, eikä efektiä ole havaittu kroonisessa altistuksessa luonnonolosuhteissa (Regoli ym. 1997). Metallipitoisuudet eivät vaikuttaneet tässä tutkimuksessa GST- ja CAT-aktiivisuuksiin. Lehtonen ym. (2004) ovat havainneet eroja CAT-aktiivisuuksissa Turun alueella saastuneemman alueen ja puhtaamman referenssialueen välillä. Vuosaaren asemilta löytyi vain hyvin alhaisia PCB- ja DDT-pitoisuuksia, mikä voi selittää GST-aktiivisuuksien tavoin myös CAT-aktiivisuuksien vähäisen vaihtelun asemien välillä. CAT-aktiivisuudet eivät nousseet

vasteena Vuosaaressa mitattuihin korkeisiin TBT-pitoisuuksiin, vaikka katalaasilla on epäilty olevan rooli TBT:n myrkyllisyysvaikutusten ilmentymisessä (Mizuhashi ym. 2000). Vuosaaren näytepisteiden AChE-aktiivisuuksien keskiarvo oli 27,0 nmol ACTC min-1 mg proteiinia-1. Aktiivisuus on hieman korkeampi kuin samaan aikaan vuodesta Tvär- minnessä, jossa aktiivisuus on Storfjärdenillä 17 ± 1,6 nmol ACTC min-1 mg proteiinia-1 ja Långskärillä 20 ± 0,9 nmol ACTC min-1 mg proteiinia-1 (Leiniö & Lehtonen käsikirjoitus). Asemien välillä ei ollut suuria eroja Mölandetia lukuun ottamatta, jossa oli hieman alhaisempi AChE-aktiivisuus kuin muilla asemilla. AChE-aktiivisuus on paljon käytetty biomarkkeri, jota on käytetty erityisesti arvioi- maan, ovatko merieliöt altistuneet maataloudessa ja metsänhoidossa käytetyille tuholais- myrkyille (van der Oost 2003). Monissa tutkimuksissa on havaittu AChE-aktiivisuuden laskevan, mutta ei ole ollut varmuutta siitä, ovatko syynä olleet tuholaismyrkyt, jotkin muut tekijät tai kenties molemmat. On mahdollista, että vesiympäristössä AChE:a voivat inhiboida tuholaismyrkkyjen lisäksi myös muista yhdisteistä koostuvat monimutkaiset seokset (Payne ym. 1996, Guilhermino ym. 1998). AChE-aktiivisuutta on käytetty biomarkkerina mm. Ruditapes decussatus- ja Mytilus galloprovincialis –simpukoilla, joissa hyönteismyrkkyjen lisäksi aktiivisuuksiin vaikuttivat kotitalouksien jätevedet, levämyrkyt sekä raskasmetallit (Dellali ym. 2001). Alhaisimmat AChE-aktiivisuudet mitattiin tässä tutkimuksessa läheltä kaupunkia, jonka jätevedet päästettiin mereen puhdistamattomina. Jäteveden arveltiin sisältävän enemmän raskasmetalleja kuin orgaanisia yhdisteitä. Metallien on todettu vaikuttavan AChE-aktiivisuuteen (Hamza-Chaffai ym. 1998), mutta Vuosaaren asemien välinen metallikuormituksen erot ovat olleet mahdollisesti liian pieniä vaikuttaakseen havaittavasti itämerensimpukoiden AChE-aktiivisuuteen. Simpukoiden AChE-aktiivisuuden on todettu olevan riippuvainen lämpötilasta siten, että aktiivisuus laskee alhaisissa lämpötiloissa (esim. Leiniö & Lehtonen käsikirjoitus). Vuosaaren asemista lämpötilat mitattiin vain kahdelta asemalta (Uutela 11 m ja + 8,7 °C; satama-allas 7 m ja + 8,9 °C), mutta luultavasti alhaisin lämpötila on ollut syvimmällä asemalla, Matalakarilla. Lämpötilaerot eivät selitä Mölandetin alhaista arvoa, silla aseman syvyys oli vain 7 metriä, jolloin lämpötila ei ole voinut olla ratkaisevasti alhaisempi kuin esimerkiksi satama-altaassa ja Lehdessaaren asemalla. Widdowsin & Pagen (1993) mukaan TBT aiheuttaa neurotoksisia vaikutuksia sinisimpukalla, mm. kidusten värekarvojen liikkeen hidastumista, mikä vaikuttaa simpukan ruuan- hankintatehokkuuteen. Neurotoksisten vaikutusten ilmeneminen viittaa siihen, että myös AChE-aktiivisuuden muutokset voivat olla yksi mahdollinen TBT:n myrkkyvaikutus. TBT:n

vaikutusta AChE-aktiivisuuteen on tutkittu mm. Ribeiron ym. (2002) tutkimuksessa troop- pisella makeanveden kalalajilla, jolla AChE-aktiivisuus nousi vasteena TBT-altistukselle, mutta selkeätä syy-seuraussuhdetta ei voitu todentaa. Vuosaaressa Lehdessaaren asemalta mitattu muita asemia korkeampi TBT-pitoisuus ei kuitenkaan vaikuttanut itämerensimpukan AChE-aktiivisuuksiin. Vuosaaren simpukoista korkeimmat MT-pitoisuudet löytyivät Pikku-Niinisaaren simpukoista läheltä satamaa ja matalimmat pitoisuudet uloimmalta asemalta, Matalakarilta. Simpukoista mitatut metallipitoisuudet eivät kuitenkaan olleet useimpien mitattujen metallien osalta merkittävästi alhaisempia Matalakarin asemalla verrattuna Pikku-Niinisaaren asemaan. Kromi oli ainoa metalli, jonka pitoisuudet olivat selkeästi alhaisemmat Matalakarilla (81 µg g-1 märkäpainoa) verrattuna Pikku-Niinisaareen (260 µg g-1). Kromin pitoisuus ja metallotioneiinien pitoisuus korreloivat lisäksi tilastollisesti merkitsevällä tasolla. Kromia ei kuitenkaan mainita voimakkaana metallotioneiinin indusoijana (Viarengo ym. 1999). Metallo- tioneiinin tärkeimpien indusoijien, kadmiumin, kuparin ja sinkin, standardisoidut pitoisuudet olivat Pikku-Niinisaaren asemalla keskimääräiset verrattuna muihin asemiin. Korkeimmat suh- teelliset pitoisuudet näiden metallien osalta löytyvät Matalakarilta, jossa oli kuitenkin alhaisin MT-taso. Metallotioneiinien induktiota on perinteisesti pidetty spesifisenä biomarkkerina, joka ilmentää metallikuormituksen määrää (Ringwood ym. 1999). Nisäkkäillä, hyönteisillä ja äyriäisillä on kuitenkin havaittu metallotioneiinien indusoituvan myös muista syistä kuin metallien kertymisestä soluun (van der Oost 2003). Hormoneista glukokortikoidit ja peptidit indusoivat metallotioneiinien synteesiä, ja lämpötila sekä ravitsemustaso vaikuttavat metallien sitoutumiseen metallotioneiiniin. Lisäksi korkeat orgaanisten yhdisteiden pitoisuudet voivat estää metallotioneiinin synteesiä. Vuosaaren asemilta mitatut erilaisten yhdisteiden ja metallien pitoisuudet kromia lukuun ottamatta eivät selitä havaittuja metallotioneiinipitoisuuksia.

5. Yhteenveto ja johtopäätökset

Hypoksia ei vaikuttanut merkittävästi itämerensimpukoiden GST-ja CAT-vasteisiin, mutta simpukoiden aktiivisuudessa oli huomattavia eroja kontrolli- ja hypoksiakäsittelyissä. Samoin kupari- ja TBT-altistuskokeissa simpukoiden aktiivisuudet poikkesivat kontrolli- olosuhteista niin hypoksiassa, myrkkyaltistuksessa kuin molempien yhteisvaikutuksen aika- nakin. Laboratoriokokeissa käytetty hypoksialaitteisto toimi kiitettävästi kokeiden ajan, ja sen käyttömahdollisuudet hypoksian vaikutusten tutkimisessa ovat tulevaisuudessa hyvät. Happioloja koeyksiköissä tallentava laitteisto parantaisi mahdollisuuksia koeolosuhteiden tarkkailuun. Vuosaaren simpukoista mitatut TBT-pitoisuudet eivät vaikuttaneet mitattujen biomarkkereiden tasoon havaittavasti. Syynä voi olla tutkimuksessa käytettyjen biomarkkereiden sopimattomuus TBT-altistuksen ilmentäjiksi tai se seikka, että tutkimuksessa ei ollut kunnollista vertailuasemaa. Matalakarin, joka sijaitsee noin kahdeksan kilometrin päässä Vuosaaren satamasta, oli tarkoitus toimia puhtaana vertailualueena, ja esimerkiksi sedimentin TBT-pitoisuuksien kohdalla näin olikin. Sedimentin TBT-pitoisuudet olivat koholla vain aivan sataman läheisyydessä, eikä TBT vaikuta kulkeutuneen sedimentissä kovinkaan kauas sataman läheisyydestä. Simpukoista mitatut TBT-pitoisuudet olivat kuitenkin samalla tasolla Matalakarin asemalla kuin lähempänä satamaa olevilla asemilla, jolloin selkeää vertailu- aineistoa ei TBT-pitoisuuksien osalta muodostunut. Mustakuvun läjitysalue (ks. kuva 10) sijaitsee lähellä Matalakarin simpukoiden näytteenottopistettä, minkä vuoksi alueen simpukoi- hin on voinut kertyä sataman ruoppausmassoista peräisin olevaa TBT:a. Matalakarin sedimenttipiste oli hieman kauempana läjitysalueelta kuin simpukoiden näytteenottopiste, joten TBT ei ehkä ole levinnyt sedimentissä kovinkaan kauas läjitysalueelta. GST- ja CAT-aktiivisuudet toimivat itämerensimpukassa ainakin PCB-yhdisteiden ja DDT:n sekä sen metaboliittien vaikutusten ilmentäjinä (Lehtonen ym. 2004), mutta Vuosaaressa näiden yhdisteiden pitoisuudet olivat kaikilla asemilla hyvin alhaisia. AChE- aktiivisuudet olivat Vuosaaressa alhaisempia vain yhdellä asemalla, mutta mitään yksittäistä selkeätä syytä tälle aktiivisuuden laskulle ei aineiston perusteella ole. MT-pitoisuus korreloi mitatuista metalleista vain kromin pitoisuuden kanssa. Havaittu korrelaatio ei kuitenkaan välttämättä tarkoita syy-seuraussuhdetta kromin ja metallotioneiinien induktion välillä. Tässä tutkimuksessa ei mitattu elohopean pitoisuutta, jota pidetään yhtenä metallotioneniinin vahvimmista indusoijista. Metallien pitoisuudet olivat simpukoissa melko samankaltaisia eri asemien välillä, eikä tässäkään tapauksessa ollut selvää vertailuasemaa. Integroitu bio-

markkerivaste osoittaa Mölandetin ja Pikku-Niinisaaren simpukoiden olevan stressaan- tuneimpia, tosin erot kaikkien asemien välillä ovat melko pieniä. Yllättävää on, ettei Lehdessaaren biomarkkerivaste ole korkeampi, vaikka tämä asema sijaitsi lähimpänä satama- allasta ja tällä asemalla oli mm. simpukoissa korkeat TBT-pitoisuudet. Tässä tutkimuksessa käytetyt biomarkkerit eivät selkeästi ilmentäneet TBT:n haittavaikutuksia, mutta esimerkiksi DNA-vauriot voisivat toimia TBT:n myrkyllisyysvaikutusten biomarkkerina (Mičić ym. 2002). DNA-vaurioiden on todettu olevan lupaava biomarkkeri mm. sinisimpukalla (Livingstone ym. 2000). Itämerensimpukan korkeat TBT-pitoisuudet kertovat osaltaan Vuosaaren alueen suhteellisen korkeasta TBT-kuormituksesta, mutta myös TBT:n ilmeisen heikosta aineenvaihdunnasta itämerensimpukassa verrattuna esimerkiksi sinisimpukkaan. Itämerensimpukka voi siten toimia hyvänä TBT-altistuksen ilmentäjänä, jos TBT:n leviämistä halutaan tutkia laajemmin esimerkiksi Suomen rannikolla. Itämerensimpukoiden korkeat TBT-pitoisuudet voivat mahdollisesti vaikuttaa simpukkaa ravintonaan käyttäviin lajeihin, joita ovat mm. kampela (Platichthys flesus), kivinilkka (Zoarces viviparus) ja haahka (Somateria mollissima). Selkärankaisilla on huomattavasti tehokkaampi vierasainemetabolia kuin selkärangattomilla (Hoch 2001), mutta vaikka TBT hajoaisi nopeasti näiden lajien kudoksissa, on lisääntyneellä aineenvaihdunnalla energeettisiä kustannuksia ja siten myös mahdollisia vaikutuksia yksilöi- den terveydentilaan.

6. Kiitokset

Suurkiitos Kari Lehtoselle kaikesta avusta, materiaalista, ideoista ja työn ohjauksesta. Kiitos Eva Sandberg-Kilvelle avusta happilaitteiston rakentamisessa ja käytännön järjestelyjen kanssa Tvärminnessä. Kiitos Lallulle, Bebbelle, Totille ja muulle Tvärminnen henkilökunnalle suuresta määrästä aikaa, hyviä neuvoja ja apua. Kiitos Ulla Karlströmille ja Susanna Hyväri- selle laboratoriotöiden jouduttamisesta. Kiitos Roope Flinkmanille simpukkakuvasta. Kiitos Liisa Autiolle ja Ingela Dahllöfille innostuneesta ja asiantuntevasta yhteistyöstä Vuosaaren materiaalin kanssa. Kiitos Helsingin kaupungin ympäristökeskuksen tutkimusmestareille Jyrki Muuriselle ja Hannu Saloselle sekä laborantti Seija Kalsolle avusta Vuosaaren näytteiden keruussa ja analysoinnissa. Kiitos Walter ja Andreé de Nottbeckin säätiölle sekä Onni Talaan säätiölle tutkimuksen rahoituksesta. Kiitos Saaralle, Silvalle ja muille ystäville avusta, huvista ja jonkun rodin ylläpitämi- sestä. Kiitos Lilille ja Niilolle näppiksellä hyppelystä.

7. Kirjallisuus

Adams, S.M. 2001: Biomarker/bioindicator response profiles of organisms can help differentiate between sources of anthropogenic stressors in aquatic ecosystems. — Biomarkers 6: 33–44. Adams, S.M., Giesy, J.P., Tremblay, L.A. ja Eason, C.T. 2001: The use of biomarkers in ecological risk assessment: recommendations from the Christchurch conference on Biomarkers in Ecotoxicology. — Biomarkers 6: 1–6. Adams, S.M. 2003: Establishing causality between environmental stressors and effects on aquatic ecosystems. — Human and Ecological Risk Assessment 9: 17–35. Albalat, A., Potrykus, J., Pempkowiak, J. ja Potre, C. 2002: Assessment of organotin pollution along the Polish coast (Baltic Sea) by using mussels and fish as sentinel organisms. — Chemosphere 47: 165–171. Al-Ghais, S.M. & Ali, B. 1999: Inhibition of glutathione S-transferase catalyzed xenobiotic detoxication by organotin compounds in tropical marine fish tissues. — Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 62: 207–213. Alzieu, C. 2000: Impact of tributyltin on marine invertebrates. — Ecotoxicology 9: 71–76. Angel, D.L., Fiedler, U., Eden, N., Kress, N., Adelung, D. ja Herut, B. 1999: Catalase acitivity in macro- and microorganisms as indicator of biotic stres in coastal waters of the eastern Mediterranean Sea. — Helgoland Marine Research 53: 209–218. Arambarri, I., Garcia, R. ja Millán, E. 2003: Assessment of tin and butyltin species in estuarine superficial sediments from Gipuzkoa, Spain. — Chemosphere 51: 643–649. BEEP-hanke. — beep.lptc.u-bordeaux.fr. Sivuilla käyty 17.11.2004. Beliaeff, B. & Burgeot, T. 2002: Integrated biomarker response (IBR): a useful graphical tool for ecological risk assessment. — Environmental Toxicology and Chemistry 21: 1316–1322. Birchenough, A.C., Evans, S.M., Moss, C. ja Welch, R. 2002: Re-colonisation and recovery of populations of dogwhelks Nucella lapillus (L.) on shores formerly subject to severe TBT contamination. — Marine Pollution Bulletin 44: 652–659. Biselli, S., Bester, K., Hühnerfuss, H. ja Fent, K. 2000: Concentrations of the antifouling compound Irgarol 1051 and of organotins in water and sediments of German North and Baltic Sea marinas. — Marine Pollution Bulletin 40:233–243. Bocquené, G. & Galgani, F. 1998: Biological effects of contaminants: Cholinesterase inhibition by organophosphate and carbamate compounds. — ICES Techniques in Marine Environmental Sciences No.22. 12 s. Bradford, M.M. 1976: Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding. — Analytical Biochemistry 72: 248–254. Bryan, G.W, Gibbs, P.E., Burt, G.R. ja Hummerstone, L.G. 1986: The decline of the gastropod Nucella lapillus around south-west England: evidence for the effect of tributyltin from anti-fouling paints. — Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 66: 611–640. Cadée, G.C., Boon, J.P., Fischer, C.V., Mensink, B.P. ja Ten Hallers-Tjabbes, C.C. 1995: Why the whelk (Buccinum undatum) has become extinct in the Dutch Wadden Sea. — Netherland Journal of Sea Research 34: 337–339. Chapman, P.M. 1995: Ecotoxicology and pollution – key issues. — Marine Pollution Bulletin 31: 4–12. Claiborne, A. 1985: Catalase activity. Teoksessa Greenwald, R.A. (toim.) Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. — C.R.C. Press, Boca Raton, Florida. s. 283–284. Cossu, C., Doyotte, A., Babut, M., Exinger, A. ja Vasseur, P. 2000: Antioxidant biomarkers in freshwater bivalves, Unio tumidus, in response to different contamination profiles of aquatic sediments. — Ecotoxicology and Environmental Safety, section B 45: 106–121. Dellali, M., Gnassia Barelli, M., Romeo, M. ja Aissa, P. 2001: The use of acetylcholinesterase activity in Ruditapes decussatus and Mytilus galloprovincialis in the biomonitoring of Bizerta lagoon. — Comparative Biochemistry and Physiology Part C 130: 227–235. Diaz, R.J. & Rosenberg, R. 1995: Marine benthic hypoxia: A review of its ecological effects and the behavioural responses of benthic macrofauna. — Oceanography and Marine Biology: an Annual Review 33: 245– 303. Domouhtsidou, G.P., Dailianis, S., Kaloyianni, M. ja Dimitriadis, V.K. 2004: Lysosomal membrane stability and metallothionein content in Mytilus galloprovincialis (L.), as biomarkers – combination with trace metal concentrations. — Marine Pollution Bulletin 48: 572–586. Ebadu, M., Leuschen, M.P., El Refaey, H., Hamada, F.M. ja Rojas, P. 1996: The antioxidant properties of zinc and metallothionein. — Neurochemistry International 29: 156–166. Ellman, G.L., Courtney, K.O., Andres, V. ja Featherstone, R.M. 1961: A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. — Biochemical Pharmacology 7: 88–95.

English, T.E & Storey, K.B. 2003: Freezing and anoxia stresses induce expression of metallothionein in the foot muscle and hepatopancreas of the marine gastropod Littorina littorea. — The Journal of Experimental Biology 206: 2517–2524. Escartín, E. & Porte, C. 1997: The use of cholinesterase and carboxylesterase activities from Mytilus galloprovincialis in pollution monitoring. — Environmental Toxicology and Chemistry 16: 2090– 2095. European Chemicals Bureau: Existing chemicals. — ecb.jrc.it/existing-chemicals/. Sivuilla käyty 20.3.2004. Ferreira, M.V.R., Alencastro, A.C.R. ja Hermes-Lima, M. 2003: Role of antioxidant defenses during estivation and anoxia exposure in the freshwater snail Biomaphalaria tenagophila (Orbigny, 1835). — Canadian Journal of Zoology 81: 1239–1248. Fitzpatrick, P.J., O’Halloran, D. S., Sheehan, D. ja Walsh, A. R. 1997: Assessment of a glutathione S-transferase and related proteins in the gill and digestive gland of Mytilus edulis (L.), as potential organic pollution biomarker. — Biomarkers 2: 51–56. Gaetke, L.M. ja Chow, C.K. 2003: Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. — Toxicology 189: 147–163. Galloway, T.S., Millward, N., Browne, M.A. ja Depledge, M.H. 2002: Rapid assessment of organophosphorous/carbamate exposure in the bivalve mollusc Mytilus edulis using combined esterase activities as biomarkers. — Aquatic Toxicology 61: 169–180. Géret, F., Jouan, A., Turpin, V., Bebianno, M.J. ja Cosson, R.P. 2002: Influence of metal exposure on metallothionein synthesis and lipid peroxidation in two bivalve mollusks: the oyster (Crassostrea gigas) and the mussel (Mytilus edulis). — Aquatic Living Resources 15: 61–66. Gilbert, M.A. 1977: The behaviour and functional morphology of deposit feeding in Macoma balthica (Linne, 1758), in New England. — Journal of Molluscan Studies 43: 18–27. Giuère, A., Couillard, Y., Campbell, P.G.C., Perceval, O., Hare, L., Pinel-Alloul, B. ja Pellerin, J. 2000: Steady- state distribution of metals among metallothionein and other cytosolic ligands and links to cytotoxicity in bivalves living along a polymetallic gradient. — Aquatic Toxicology 64: 185–200. Goldberg, E.D, Bowen, V.T., Farrington, J.W, Harvey, G., Martin, J.H., Parker, P.L., Risebrough, R.W, Robertson, W., Schneider, E. ja Gamble, E. 1978: The Mussel Watch. — Environmental Conservation 5: 101–125. Greenway, S.C. & Storey, K.B. 1999: The effect of prolonged anoxia on enzyme activities in oysters (Crassostrea virginica) at different seasons. — Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 242: 259–272. Guilhermino, L., Barros, B., Silva, M.C. ja Soares, A.M.V.M. 1998: Should the use of inhibition of cholinesterases as a specific biomarker for organophosphate and carbamate pesticides be questioned? — Biomarkers 3, 157–163. Guolan, H. & Yong, W. 1995: Effects of tributyltin chloride on marine bivalve mussels. — Water Research 29: 1877–1884. Habig, W.H., Pabst, M.J. ja Jakoby, B. 1974: Glutathione-S-transferase. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. — Journal of Biological Chemistry 249: 7130–7139. Hamza-Chaffai, A., Roméo, M., Gnassia-Barelli, M. ja El Abed, A. 1998: Effect of copper and lindane on some biomarkers measured in the clam Ruditapes decussatus. — Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 61: 397–404. Handy, R.D. 2003: Review – chronic effects of copper exposure versus endocrine toxicity: two sides of the same toxicological process? — Comparative Biochemistry and Physiology Part A 135: 25–38. Handy, R.D., Galloway, T.S. ja Depledge, M.H. 2003: A proposal for the use of biomarkers for the assessment of chronic pollution in regulatory toxicology. — Ecotoxicology 12: 331–343. Higashiyama, T., Shiraishi, H., Otsuki, A. ja Hashimoto, S. 1991: Concentrations of organotin compounds in blue mussels from the Wharves of Tokyo Bay. — Marine Pollution Bulletin 22: 585–587. Hoch, M. 2001: Organotin compounds in the environment – an overview. — Applied Geochemistry 16: 719–743. Hochachka, P.W. (toim.) 1983: Metabolic biochemistry and molecular biomechanics. — The Mollusca 1. 510 s. Horne, A.J. & Goldman, C.R. 1994: Limnology. Luku 7, s. 115–132. — McGraw-Hill Book Co., Singapore. 2. painos. 576 s. Hyae-Kyung, H., Shin, T., Byung-Yoon, M., Shinsuke, T. 2002: Butyltin residues in blue mussels (Mytilus edulis) and arkshells (Scapharca broughtonii) collected from Korean coastal waters. — Environmental Pollution 117: 475–486. ICES 2004: Report of the working group on biological effects of contaminants. — ICES Marine Habitat Committee. Kööpenhamina. 86 s. IMO 1999: Anti-fouling systems. International Maritime Organization. www.imo.org/environment. Sivuilla käyty 15.12.2004. IMO 2005: International convention on the control of harmful anti-fouling systems on ships. www.imo.org/home.asp?topic_id=161. Sivuilla käyty 15.2.2005.

Isani, G., Monari, M., Andreani, G., Fabbri, M. ja Carpene, E. 2003: Effect of copper exposure to the antioxidant enzymes in bivalve mollusc Scapharca inequivalvis. — Veterinary Research Communications 27: 691–693. Kohonen, T., Virtasalo, J., Vahteri, P. ja Salmi, M.: Organotin compounds in coastal sediments and in the Baltic clam (Macoma balthica) in the Archipelago Sea, SW Finland. Käsikirjoitus. Kägi, J.H.R. & Schäffer, A. 1988: Biochemistry of metallothionein. — Biochemistry 27: 8509–8515. Lee, R.F. 1991a: Glutathione S-transferase in marine invertebrates from Langesundfjord. — Marine Ecology Progress Series 46: 33–36. Lee, R.F. 1991b: Metabolism of tributyltin by marine animals and possible linkages to effects. — Marine Environmental Research 32: 29–35. Lehtonen, K.K., Kankaanpää, H., Leiniö, S., Sipiä, V.O., Pflugmacher, S. ja Sandberg-Kilpi, E. 2003: Accumulation of nodularin-like compounds from the cyanobacterium Nodularia spumigena and changes in acetylcholinesterase activity in the clam Macoma balthica during short-term laboratory exposure. — Aquatic Toxicology 64: 461–476. Lehtonen, K.K. & Leiniö, S. 2003: Effects of exposure to copper and malathion on metallothionein levels and acetylcholinesterase activity of the mussel Mytilus edulis and the clam Macoma balthica from the northern Baltic Sea. — Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 71: 489–496. Lehtonen, K.K., Leiniö, S., Schneider, R., Leivuori, M. 2004: Biomarkers of pollution effects in the bivalves Mytilus edulis and Macoma balthica collected from two areas in the southern coast of Finland (Baltic Sea). Käsikirjoitus. Leiniö, S. & Lehtonen K.K.: Seasonal variability in biomarkers in the bivalves Mytilus edulis and Macoma balthica in the Northern Baltic Sea. — Käsikirjoitus. Livingstone, D.R. 1998: The fate of organic xenobiotics in aquatic ecosystems: quantitative and qualitative differences in biotransformation by invertebrates and fish. — Comparative Biochemistry and Physiology Part A 120: 43–49. Livingstone, D.R., Chipman, J.K., Lowe, D.M., Minier, C., Mitchelmore, C.L., Moore, M.N., Peters, L.D. ja Pipe, R.K. 2000: Development of biomarkers to detect the effects of organic pollution on aquatic invertebrates: recent molecular, genotoxic, cellular and immunological studies on the common mussel (Mytilus edulis L.) and other mytilids. — International Journal of Environment and Pollution 13: 56– 91. Luoma, S.N. 1996: The developing framework of marine ecotoxicology: Pollutants as a variable in marine ecosystems? — Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 200: 29–55. Lushchak, V.I., Lushchak, L.P., Mota, A.A. ja Hermes-Lima, M. 2001: Oxidative stress and antioxidant defences in goldfish Carassius auratus during anoxia and reoxygenation. — American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology 280: 100–107. McNaught, A.D. & Wilkinson, A. 1997: IUPAC Compendium of Chemical Technology. — Blackwell Publishing, Oxford. 2. painos. 450s. Mičić, M., Bihari, N., Labura, Ž., Müller, W.E.G. ja Batel, R. 2002: Induction of apoptosis in the blue mussel Mytilus galloprovincialis by tri-n-butyltin chloride. — Aquatic Toxicology 55: 61–73. Mizuhashi, S., Ikegaya, Y. ja Matsuki, N. 2000: Cytotoxicity of tributyltin in rat hippocampal slice cultures. — Neuroscience Research 38: 35–42. Montserrat, J.M., Geracitano, L.A ja Bianchini, A. 2003: Current and future perspectives using biomarkers to assess pollution in aquatic ecosystems. — Comments on Toxicology 9: 255–269. Moore, M.N., Livingstone, D.R., Donkin, P., Bayne, B.L., Widdows, J. ja Lowe, D.M. 1980: Mixed function oxygenases and xenobiotic detoxication/toxication systems in bivalve molluscs. — Helgoländer Meeresuntersuchungen 33: 278–291. Mora, P., Fournier, D. ja Narbonne, J.F. 1999: Cholinesterases from marine mussels Mytilus galloprovincialis and M. edulis and from the freshwater bivalve Corbicula fluminea. — Comparative Biochemistry and Physiology Part C 122: 353–361. Morcillo, Y., Ronis, M.J.J. ja Porte C. 1998: Effects of tributyltin on the Phase I testosterone metabolism and steroid titres of the clam Ruditapes decussata. — Aquatic Toxicology 42: 1–13. Narbonne, J.F, Daubèze, M., Clérandeau, C. ja Garrigues, P. 1999: Scale of classification based on biochemical markers in mussels: application to pollution monitoring in European coasts. — Biomarkers 4: 415– 424. Negri, A.P., Hales, L.T., Battershill, C., Wolff, C. ja Webster, N.S. 2004: TBT contamination identified in Antarctic marine sediments. — Marine Pollution Bulletin 48: 1142–1144. Niinimäki, J., Paasivirta, L., Heitto, A., Oulasvirta, P. ja Vatanen, S. 2004: Vuosaaren satamahankkeen vesistö- ja kalatalousseuranta 2003. — Vuosaaren satamahankkeen julkaisuja 1/2004.

Ohji, M., Takeuchi, I., Takahashi, S, Tanabe, S. ja Miyazaki, N. 2002: Differences in the acute toxicities of tributyltin between the Caprellidea and the Gammaridea (Crustacea: Amphipoda). — Marine Pollution Bulletin 44: 16–24. OSPAR. Oslo and Paris Commission. The convention for the protection of the marine environment of the North- east Atlantic. — www.ospar.org. Sivuilla käyty 17.11.2004. Payne, J., Mathieu, A., Melvin, W. ja Fancey L.L. 1996: Acetylcholinesterase, an old biomarker with new future? Field trials in association with two urban rivers and a paper mill in Newfoundland. — Marine Pollution Bulletin 32: 225–231. Regoli, F. & Principato, G. 1995: Glutahtione, glutathione-dependent and antioxidant enzymes in mussel, Mytilus galloprovincialis, exposed to metals under field and laboratory conditions: implications for the use of biochemical biomarkers. — Aquatic Toxicology 31:143–164. Regoli, F., Nigro, M., Bertoli, E., Principato, G. ja Orlando, E. 1997: Defences against oxidative stress in the Antarctic scallop Adamussium colbecki and effects of acute exposure to metals. — Hydrobiologia 355: 139–144. Ribeiro, C.A.O, Schatzmann, M., Silva de Assis, H.C, Silva, P.H., Pelletier, E. ja Akaishi F.M. 2002: Evaluation of tributyltin subchronic effects in tropical freshwater fish (Astyanax bimaculatus, Linnaeus, 1758). — Ecotoxicology and Environmental Safety 51: 161–167. Ringwood, A.H., Hameedi, M.J., Lee, R.F., Brouwer, M., Peters, E.C., Scott, G.I., Luoma, S.N. ja Di Giulio, R.T. 1999: Bivalve Biomarker Workshop: overview and discussion group summaries. — Biomarkers 6: 391–399. Rüdel, H. 2003: Case study: Bioavalability of tin and tin compounds. — Ecotoxicology and Environmental Safety 56: 180–189. Rüdel, H., Lepper, P. ja Steinhanses, J. 2003: Retrospective monitoring of organotin compounds in marine biota from 1985 to 1999: results from the German Environmental Specimen Bank. — Environmental Science and Technology 37: 1731–1738. Sandberg, E. 1996: Benthic predator-prey relationships and abiotic stress - the effects of physical disturbance and oxygen deficiency. — Väitöskirja. Department of Biology & Husö Biological Station, Åbo Akademi University. Turku 1996. 41 s + liitteet. Segerstråle, S.G. 1939: Piirteitä Itämeren murtovesibiologiasta. — Eripainos Luonnon Ystävästä 1: 1–10. Sellers, C.M., Heath, A.G. ja Bass, M.L. 1975: The effect of sublethal concentrations of copper and zinc on ventilatory activity, blood oxygen and pH in rainbow trout (Salmo gairdneri). — Water Research 9: 401–408. Senthilkumar, K., Duda, C.A., Villeneuve. D.L., Kannan, K., Falandysz, J. ja Giesy, J.P. 1999: Butyltin compounds in sediment and fish from the Polish coast of the Baltic Sea. — Environmental Science and Pollutant Research 6: 200–206. Sheehan, D. & Power, A. 1999: Effect of seasonality on xenobiotic and antioxidant defence mechanisms of bivalve molluscs. — Comparative Biochemistry and Physiology Part C 123: 193–199. Short, J.W. & Sharp, J.L. 1989: Tributyltin in bay mussels (Mytilus edulis) of the Pasific coast of the United States. — Environmental Science and Technology 23: 740–743. Skarphédinsdóttir, H., Ólafsdóttir, K., Svavarsson, J. ja Jóhannesson, T. 1996: Seasonal fluctuations of tributyltin (TBT) and dibutyltin (DBT) in the dogwhelk, Nucella lapillus (L.), and the blue mussel, Mytilus edulis L., in Icelandic waters. — Marine Pollution Bulletin 32: 358–361. Solé M. 2000: Assessment of the results of chemical analyses combined with the biological effects of organic pollution on mussels. — Trends in Analytical Chemistry 19: 1–9. Stewart, C. & Thompson, J.A.J. 1994: Extensive butyltin contamination in Southwestern Coastal British Columbia, Canada. — Marine Pollution Bulletin 28: 601–606. Strand, J. & Asmund, G. 2003: Tributyltina accumulation and effects in marine molluscs from West Greenland. — Environmental Pollution 123:31–37. Stryer, L. 1995: Membrane channels and pumps. Teoksessa Biochemistry. — Freeman, New York. 2. painos, s. 291–298. UNEP MAP. United Nations Environment Programme Mediterranean Action Plan. — www.unepmap.gr. Sivuilla käyty 17.11.2004. Valkirs, A.O., Davidson, B.M. ja Seligman, P.F. 1987: Sublethal growth effects and mortality to marine bivalves from long-term exposure to tributyltin. — Chemosphere 16: 201–220. Valtion ympäristöhallinto 2005. Luettelo sallituista antifouling-valmisteista. www.ymparisto.fi/default.asp?node=3506&lan=fi. Sivuilla käyty 15.2.2005. van der Oost, R., Beyer, J. ja Vermeulen N.P.E. 2003: Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review. — Environmental Toxicology and Pharmacology 13: 57–149. Viarengo, A., Burlando, B., Dondero, F., Marro, A. ja Fabbri, R. 1999: Metallothionein as a tool in biomonitoring programmes. — Biomarkers 4: 455–466.

Viarengo, A., Ponzano, E., Dondero, F. ja Fabbri, R. 1997: A simple spectrophotometric method for metallothionein evaluation in marine organisms: an application to Mediterranean and Antarctic molluscs. — Marine Environmental Research 44: 69–84. Vidal, M-L., Bassères, A. ja Narbonne, J-F. 2002: Influence of temperature, pH, oxygenation, water-type and substrate on biomarker responses in the freshwater clam Corbicula fluminea (Müller). — Comparative Biochemistry and Physiology Part C 132: 93–104. Vismann, B. 1996: The sulfide exposure experiments: The sulfide electrode and a set-up automatically controlling sulfide, oxygen and pH. — Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 204: 131–140. Vuosaaren satamahankkeen verkkopalvelu. — www.vuosaarensatama.fi/fi/. Sivuilla käyty 14.12.2004. Walker, C.H., Hopkins, S.P., Sibly, R.M. ja Peakall, D.B. 2001: Principles of ecotoxicology. — Taylor & Francis, New York. 2. painos. 309 s. WHO International Programme on Chemical Safety 1993: Biomarkers and risk assessment: concepts and principles. — Environmental Health Criteria 155. World Health Organization, Geneve. www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc155.htm Widdows, J. & Page, D.S. 1993: Effects of tributyltin and dibutyltin on the physiological energetics of the mussel, Mytilus edulis. — Marine Environmental Research 35: 233–249. Winston, G.W. & Di Giulio, R.T. 1991: Prooxidant and antioxidant mechanisms in aquatic organisms. — Aquatic Toxicology 19: 137–161. Wright, J., George, S., Martinez-Lara, E., Carpene, E. ja Kindt, M. 2000: Levels of glutathione and metallothionein affect the toxicity of oxidative stressors in an established carp cell line. — Marine Environmental Research 50: 503–508.

63 Liite 1 1/2

Pvm Hypoksiakoe Ti 22.4. Suunnittelu Ke 23.4. Happimittarin kalibrointi To 24.4. Systeemin rakennusta / Näytteenotto /Akklimatisaation aloitus Pe 25.4. Akklimatisaatio La 26.4. Akklimatisaatio Su 27.4. Akklimatisaatio Ma 28.4. Akklimatisaatio / Preparoinnin opettelu / Koeakvaarioiden valmistelu Ti 29.4. Akklimatisaatio / Koeakvaarioiden valmistelu / Akklimatisaatio koe-olosuhteisiin Ke 30.4. Kokeen käynnistys – näyte d 0 To 1.5. Koepäivä 1 Pe 2.5. Koepäivä 2 – näyte d 2, veden vaihto La 3.5. Koepäivä 3 Su 4.5. Koepäivä 4 – näyte d 4, veden vaihto Ma 5.5. Koepäivä 5 Ti 6.5. Koepäivä 6 – näyte d 6, veden vaihto, hypoksia pois Ke 7.5. Palautumispäivä 1 To 8.5. Palautumispäivä 2 – veden vaihto Pe 9.5. Palautumispäivä 3 – näyte P 3

Pvm Kuparialtistuskoe Ke 28.5. Simpukoiden haku, sijoitus akklimatisointisaaviin To 29.5. Akklimatisaatio 1 Pe 30.5. Akklimatisaatio 2 La 31.5. Akklimatisaatio 3 Su 1.6. Akklimatisaatio 4 Ma 2.6. Akklimatisaatio 5 Ti 3.6. Akklimatisaatio 6 Ke 4.6. Akklimatisaatio 7 To 5.6. Akklimatisaatio 8 Pe 6.6. Akklimatisaatio 9 La 7.6. Akklimatisaatio 10 Su 8.6. Akklimatisaatio 11 Ma 9.6. Kokeen valmistelu, simpukat koeakvaarioihin Ti 10.6. Kokeen käynnistys – d 0, veden vaihto Ke 11.6. Koepäivä 1 – veden vaihto To 12.6. Koepäivä 2 – d 2, veden vaihto Pe 13.6. Koepäivä 3 – veden vaihto La 14.6. Koepäivä 4 – d 4, veden vaihto Su 15.6. Koepäivä 5 – veden vaihto Ma 16.6. Koepäivä 6 – d 6, veden vaihto Ti 17.6. Koepäivä 7 – veden vaihto Ke 18.6. Koepäivä 8 – veden vaihto To 19.6. Koepäivä 9 – d 9

Liite 1 2/2

Pvm TBT-altistuskoe Ke 2.7. Simpukoiden haku, sijoitus akklimatisointisaaviin To 3.7. Akklimatisaatio 1 Pe 4.7. Akklimatisaatio 2 La 5.7. Akklimatisaatio 3 Su 6.7. Akklimatisaatio 4 Ma 7.7. Akklimatisaatio 5 Ti 8.7. Akklimatisaatio 6 Ke 9.7. Akklimatisaatio 7 To 10.7. Akklimatisaatio 8 Pe 11.7. Simpukat koeakvaarioihin, La 12.7. Kokeen käynnistys, d 0 Su 13.7. Koepäivä 1, veden vaihto Ma 14.7. Koepäivä 2 d 2 Ti 15.7. Koepäivä 3, veden vaihto Ke 16.7. Koepäivä 4 d 4 To 17.7. Koepäivä 5, veden vaihto Pe 18.7. Koepäivä 6, La 19.7. Koepäivä 7, veden vaihto Su 20.7. Koepäivä 8 d 8 Ma 21.7. Koepäivä 9, veden vaihto Ti 22.7. Koepäivä 10, hypoksia pois, veden vaihto Ke 23.7. Palautumispäivä 1 To 24.7. Palautumispäivä 2, veden vaihto Pe 25.7. Palautumispäivä 3 P 3

Liite 2 1/1

Liite 3 1/3 Hypoksiakokeen GST-aktiivisuuksien vertailu hypoksia- ja kontrollikäsittelyiden välillä.

Levenen t- testi varianssitesti Koevrk F p df p d 0 3.06 0.097 18 0.541 d 2 0.83 0.373 18 0.373 d 4 13.31 0.007 5.2 0.476 d 6 0.22 0.642 17 0.611 Rec 3 2.08 0.166 18 0.701 kaikki 3.22 0.076 87 0.405

Hypoksiakokeen CAT-aktiivisuuksien vertailu hypoksia- ja kontrollikäsittelyiden välillä.

Levenen t- testi varianssitesti Koevrk F p df p d 0 1.43 0.247 18 0.176 d 2 9.30 0.007 12 0.930 d 4 5.66 0.045 5 0.514 d 6 0.57 0.461 17 0.386 Rec 3 1.72 0.206 18 0.141 kaikki 3.06 0.097 18 0.541

Hypoksiakokeen GST-aktiivisuuksien vertailu päivien välillä.

Kruskal-Wallis

Käsittely Χ2 df p Kontrolli 2.13 3 0.547 Hypoksia 5.04 3 0.169

Hypoksiakokeen GST-aktiivisuuksien vertailu päivien välillä.

Levenen t- testi varianssitesti Koevrk käsittely F p df p d 0 vs. d 2 kontrolli 0.78 0.39 18 0.413 hypoksia 0.08 0.788 18 0.350 d 2 vs. d 4 kontrolli 3.53 0.083 13 0.832 hypoksia 2.11 0.17 13 0.224 d 4 vs. d 6 kontrolli 3.68 0.079 12 0.703 hypoksia 0.86 0.371 13 0.538 d 6 vs. d 9 kontrolli 0.01 0.943 17 0.508 hypoksia 1.68 0.211 18 0.136 d 0 vs. d 9 kontrolli 1.09 0.309 18 0.549 hypoksia 3.97 0.062 18 0.175

Liite 3 2/3

Hypoksiakokeen CAT-aktiivisuuksien vertailu päivien välillä.

Kruskal-Wallis

Käsittely Χ2 df p Kontrolli 0.37 3 0.946 Hypoksia 12.33 3 0.006

Hypoksiakokeen CAT-aktiivisuuksien vertailu päivien välillä.

Levenen t- testi varianssitesti Koevrk käsittely F p df p d 0 vs. d 2 kontrolli 0.31 0.586 18 0.035 hypoksia 8.12 0.11 18 0.040 d 2 vs. d 4 kontrolli 0.27 0.871 13 0.435 hypoksia 11.09 0.005 10 0.014 d 4 vs. d 6 kontrolli 0.20 0.661 12 0.532 hypoksia 3.94 0.069 13 0.014 d 6 vs. d 9 kontrolli 0.30 0.589 17 0.802 hypoksia 1.48 0.24 18 0.004 d 0 vs. d 9 kontrolli 0.74 0.402 18 0.071 hypoksia 2.72 0.116 18 0.319

Hypoksiakokeen aktiivisuuksien vertailu käsittelyiden välillä.

Levenen t- testi varianssitesti Käsittelyt F p df p Kontrolli vs. hypoksia 7.92 0.014 9.8 0.016

Kuparialtistuskokeen aktiivisuuksien vertailu käsittelyiden välillä.

Levenen t- testi varianssitesti Käsittelyt F p df p Kontrolli vs. Cu 0.63 0.436 20 0.000 Kontrolli vs. hypoksia 3.51 0.76 20 0.000 Kontrolli vs. H-Cu 0.95 0.341 20 0.000 Hypoksia vs. H-Cu 7.86 0.011 13.3 0.000 Cu vs. H-Cu 0.00 0.986 20 0.496

Liite 3 3/3

TBT-altistuskokeen aktiivisuuksien vertailu käsittelyiden välillä.

Levenen t- testi varianssitesti Käsittelyt F p df p Kontrolli vs. hypoksia 6.19 0.02 18.4 0.000 Kontrolli vs. TBT1 1.65 0.211 26 0.000 Kontrolli vs. H-TBT1 0.04 0.853 26 0.000 Kontrolli vs. TBT2 0.05 0.825 21 0.000 Kontrolli vs. TBT2-H 0.76 0.396 17 0.001 Hypoksia vs. H-TBT1 4.69 0.04 20.3 0.000 Hypoksia vs. H-TBT2 1.01 0.329 17 0.000 TBT1 vs. H-TBT1 0.88 0.357 26 0.570 TBT2 vs. H-TBT2 0.72 0.412 12 0.328 TBT1 vs. TBT2 1.51 0.233 21 0.590 H-TBT1 vs. H-TBT2 0.33 0.573 17 0.875

Yksilömäärät koeyksiöissä TBT-altistuskokeen aikana. Katkoviivalla merkitty näytteenotot (20 yksilöä).

CT H T1 T1H T2 T2H 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 60 60 60 60 59 58 60 60 60 60 59 58 60 60 59 60 57 21 60 60 59 60 57 21 40 40 39 40 35 0 40 40 39 40 35 0 40 40 39 40 27 0 40 40 39 40 27 0 40 40 39 40 27 0 40 40 39 40 17 0 40 40 39 36 17 0 40 40 39 36 17 0 20 20 14 16 0 0 20 20 14 16 0 0 20 20 10 11 0 0 20 20 7 6 0 0 20 20 7 6 0 0 20 20 6 5 0 0 Palautuminen 20 20 6 5 0 0 Palautuminen 20 20 5 5 0 0 Palautuminen 20 20 5 5 0 0 Palautuminen

Liite 4 1/1

Butyylitinapitoisuudet itämerensimpukoissa.

µg kg -1 tuorepainoa

Asema TBT DBT MBT TBT/BTtot TBT/DBT MAT 275 21.3 6.99 0.91 12.9 UUT 204 18.1 8.47 0.88 11.3 PIN 286 24.2 8.12 0.90 11.8 SAT LEH 545 45.0 21.60 0.89 12.1 MÖL 205 18.9 7.43 0.89 10.9

Butyylitinapitoisuudet sedimentissä.

µg kg -1 kuivapainoa

Asema TBT DBT MBT Kuivapaino LOI % MAT 54 2.98 1.3 47.7 3.8 UUT 55 28.93 4.0 32.7 6.0 PIN SAT 6039 703.98 274.2 42.8 3.2 LEH 1164 359.49 141.9 35.5 4.7 MÖL 88 41.02 33.9 24.0 8.2

Metallipitoisuudet itämerensimpukoissa. mg kg-1

AsemaAsCdCoCr CuPbMnNi ZnV MAT 0.79 0.095 0.51 0.081 21 0.41 8 0.38 130 0.057 UUT 0.82 0.004 0.42 0.15 13 0.45 10 0.6 140 0.13 SAT LEH PIN 0.79 0.043 0.51 0.26 15 0.35 6.5 0.47 120 0.12 MÖL 0.6 < 0,05 0.3 0.21 8.5 0.4 14 0.46 89 0.23

Metallipitoisuudet sedimentissä. mg kg-1

AsemaAsCdCoCr CuPbMnNi ZnV MAT 2.4 0.22 5.5 16 9.1 6 180 8 36 18 UUT 5.4 0.49 7.8 30 21 13 220 16 72 31 PIN SAT 5 0.18 47 67 67 14 430 38 100 45 LEH 3.9 0.27 14 52 36 18 300 25 100 43 MÖL 6.1 0.65 12 56 36 21 310 28 130 55

Liite 5 1/1

CAT-aktiivisuudet vs. asemat

Kruskal-Wallis

Χ2 df p 2.79 5 0.732

GST-aktiivisuudet vs. asemat

Kruskal-Wallis

Χ2 df p 1.39 5 0.925

Simpukoiden ruuansulatusrauhasen proteiinipitoisuudet vs. asemat

Kruskal-Wallis

Χ2 df p 4.70 5 0.454

AChE-aktiivisudets vs. asemat

Kruskal-Wallis

Χ2 df p 7.50 4 0.112

Simpukoiden jalan proteiinipitoisuudet vs. asemat

Kruskall-Wallis

Χ2 df p 3.87 4 0.424

MT-pitoisuudet vs. asemat

Kruskall-Wallis

Χ2 df p 8.63 4 0.071