MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

NAIRA BORGES AMARO

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE EXTRATOS VEGETAIS DE Trichilia pallida (Swartz, 1788) (Sapindales: Meliaceae) e Sesamum indicum (Linnaeus, 1753) (Lamiales: Pedaliaceae) NA PROSPECÇÃO DE ACARICIDAS BOTÂNICOS PARA CONTROLE DE Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari: Ixodidae).

Orientador:

Prof. Dr. FERNANDO DE FREITAS FERNANDES

Dissertação de Mestrado

Goiânia Goiás 2007

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

NAIRA BORGES AMARO

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE EXTRATOS VEGETAIS DE Trichilia pallida (Swartz, 1788) (Sapindales: Meliaceae) e Sesamum indicum (L. Linnaeus, 1753) (Lamiales: Pedaliaceae) NA PROSPECÇÃO DE ACARICIDAS BOTÂNICOS PARA CONTROLE DE Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari: Ixodidae).

Orientador: Prof. Dr. FERNANDO DE FREITAS FERNANDES

Dissertação submetida ao Programa de Pós- graduação em Medicina Tropical, Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Medicina Tropical na área de concentração em Parasitologia.

Goiânia –GO, 2007 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (GPT/BC/UFG)

Amaro, Naira Borges. A485a Avaliação do potencial de extratos vegetais de Trichilia pallida (Swartz, 1788) (Sapindales: Meliaceae) e Sesamum indicum (Lin- naeus, 1753) ( Lamiales: Pedaliaceae) na prospecção de acarici- das botânicos para controle de Rhipicephalus sanguineus ( Latreil- le, 1806) (Acari: Ixodidae) [manuscrito] / Naira Borges Amaro. – 2007. xvi,105f : figs., tabs.

Orientador: Prof. Dr. Fernando de Freitas Fernandes.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2007.

Bibliografia: f.73-105. Inclui listas de figuras, tabelas e de abreviaturas. Anexos.

1. Rhipicephalus sanguineus 2. Acaricidas botânicos 3. Carra- pato – Controle 4. Trichilia pallida 5. Sesamum indicum I. Fer- nandes, Fernando de Freitas. II. Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública III. Título.

CDU:595.42 iii

Dedico este trabalho aos meus pais, Nilma Helena e Aparecido da Paz pelo amor, incentivo, pelos conselhos nos momentos difíceis e por serem a razão da minha vida, amo vocês. iv

AGRADECIMENTOS

A Deus pela orientação maior da vida e por ter permitido que eu continuasse minha caminhada.

Ao Prof. Dr. Fernando de Freitas Fernandes, pelo estímulo, empenho, paciência, atenção e incentivo no processo de amadurecimento científico, além de total dedicação a este projeto, sempre dedicado a me orientar e ajudar no meu crescimento profissional.

Ao CNPq pelo auxílio financeiro que me foi concedido, sendo primeiramente uma bolsa de Desenvolvimento Tecnológico e Industrial (DTI), vinculada a um outro projeto coordenado pelo meu orientador Prof. Fernando (Edital CNPq 014/2004 - Fomento Tecnológico), pelo período de 2005 a 2006 e posteriormente pela bolsa de Formador de Pesquisador de Mestrado, no PPGMT a partir de 11/2006.

À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, na pessoa da coordenadora Profª. Drª Maria de Fátima.

A todos os colegas e amigos do Laboratório de Artropodologia Médica e Veterinária, Laurindo Camilo, Edméia de Paula e Souza Freitas, Ly de Freitas Fernandes, Letícia Camilo, Renan Nunes, Walmirton D’Alessandro e Paula Roberta, pela ajuda nos testes e amizade.

Em especial aos meus amigos, Marcella Brettas e Walfredo, pelo incentivo diário, carinho e principalmente pela amizade e companheirismo.

A minha amiga Christiany pelos momentos de descontração e lazer.

À minha mãe Nilma Helena e minha cunhada Eline Bertonsin, pela ajuda nas coletas de campo, por sempre me incentivarem a lutar quando me faltava coragem. Obrigado por acreditarem e me mostrarem o quanto sou capaz de conquistar meus objetivos.

A todos os meus tios, tias, primos, avós e amigos que sempre estiveram ao meu lado me apoiando, dando coragem para lutar contra meus desânimos e por entenderem meu distanciamento. Saibam que se hoje estou aqui é porque vocês tiveram um papel muito importante durante toda a minha jornada neste projeto.

Aos funcionários da Pós-Graduação do IPTSP, Zezinho e Kariny.

A todos que de forma anônima contribuíram no apoio ao Projeto.

Aos meus irmãos, Marizano Borges e Amarildo Borges e, a meu pai, Aparecido da Paz, que mesmo não entendendo o que eu estava fazendo respeitaram minha decisão, pois viram que era importante para mim. v

Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, eu não teria saído do lugar... as facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo as críticas nos auxiliam muito.”

Chico Xavier vi

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS...... viii

LISTA DE TABELAS ...... ix

LISTA DE ABREVIATURAS...... x

LISTA DE NOMENCLATURAS DE NOMES CIENTÍFICOS...... xi

RESUMO...... xiii

ABSTRACT ...... xv

1- INTRODUÇÃO...... 17

1.1- Origem, distribuição e importância de Rhipicephalus sanguineus...... 18 1.2- Ciclo biológico de R. sanguineus...... 19 1.3- Morfologia de R. sanguineus...... 21 1.4- Dificuldades no controle de R. sanguineus...... 23 1.5- Acaricidas botânicos como nova perspectiva para o controle de R.sanguineus em outros artrópodes ...... 24 1.6- Trichila pallida...... 27 1.7- Sesamum indicum...... 28

3- OBJETIVOS...... 31

3.1- Objetivo geral...... 32 3.2- Objetivos específicos...... 32

4- MATERIAL E MÉTODOS...... 33

4.1- Obtenção do extrato em hexano de T. pallida...... 34 4.2- Obtenção do óleo essencial de S. indicum...... 34 4.3- Preparo das soluções botânicas para os bioensaios...... 35 4.4- Escolha dos solventes...... 36 4.5- Obtenção dos espécimes de R. sanguineus...... 36 4.6- Metodologia para verificação da bioatividade das substâncias vegetais sobre larvas de R. sanguineus...... 37

5- ARTIGO: Potentiality of plants Trichilia pallida (Swartz, 1788) (Sapindales: Meliaceae) and Sesamum indicum (Linnaeus, 1753) (Lamiales: Pedaliaceae) in the prospection of botanical acaricides to control of Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari: Ixodidae)...... 40

6- CONCLUSÕES ...... 71 7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 73 vii

8- ANEXOS...... 83 8.1 – Roteiro para preparação de Dissertação de Mestrado e Tese de Doutorado no PPGMT...... 84 8.2 – Normas adotadas pelo Periódico Memórias do Instituto Oswaldo Cruz...... 86 8.3 - Normas para publicação no periódico científico internacional Journal of Medical Entomology...... 90 viii

LISTA DE FIGURAS

FIGURAS DA DISSERTAÇÃO

Figura 1. Ciclo biológico do Rhipicephalus sanguineus. Fonte: de autoria do Prof. Dr. Fernando de Freitas Fernandes, Prodap/ICB/UFMG. Acesso em: 25 de março de 2007...... 20

Figura 2. Rhipicephalus sanguineus. Ventre (A) e Dorso (B) do macho. Observar base do capítulo hexagonal, peritrema em forma de vírgula, presença de um par de placas adanais, rostro e palpos curtos, coxa I bífida e escudo não ornamentado com 11 festões (Fonte: adaptado de Agriculture Handbook, 1965)...... 22

Figura 3. Rhipicephalus sanguineus. Dorso (A) e Ventre (B) da fêmea. Observar base do capítulo hexagonal, peritrema em forma de vírgula, rostro e palpos curtos, coxa I bífida e escudo não ornamentado com 11 festões (Fonte: adaptado de Agriculture Handbook, 1965)...... 23

Figura 4. Árvore (A) e folhas com frutos de T. pallida (B). Fonte: Adaptado do site: de autoria de Atrium. Acesso em 23 de março de 2007...... 28

Figura 5. Estruturas químicas do sesamol, sesamina e sesamolina do óleo essencial de Sesamum indicum...... 29

Figura 6. Sesamum indicum: Arbusto com flores (A) Sementes (B) Frutos do tipo deiscente (B). Fonte: adaptado do site: Acesso em: 23 de março de 2007...... 29

Figura 7. Face interna do pavilhão auditivo de um cachorro infestada por Rhipicephalus sanguineus (A) fêmea ingurgitada de R. sanguineus (B)...... 37

FIGURAS DO ARTIGO

Figure. 1. Mortality of larvae of Rhipicephalus sanguineus for action of different concentrations of the extract in hexane of leaves of Trichilia pallida, observed at the 24th and 48th hour of exposure. The trend line is derived from logarithmic regression (Probit analysis). Y = Equation of the straight line. R2 = determination Coefficient…………………………...68

Figure. 2. Susceptibility of larvae of Rhipicephalus sanguineus to different concentrations of the essential oil of seeds of Sesamum indicum, observed after 24 and 48 hours of exposure. Concentrations values (x 1000). The trend line is derived from logarithmic regression (Probit analysis). Y = Equation of the straight line. R2 = determination Coefficient………………...69 ix

LISTA DE TABELAS

Table. 1. Susceptibility of larvae of Rhipicephalus sanguineus to the extract in hexane of leaves of Trichilia pallida and to the essential oil of the seeds of Sesamum indicum, observed after 48th hour of exposure by the method of larval packet test (lpt)...... 70 x

LISTA DE ABREVIATURAS

B.O.D ...... BIOLOGICAL OXYGEN DEMAND

CL ...... CONCENTRAÇÃO LETAL e.h...... EXTRATO HEXÂNICO e.b...... EXTRATO BRUTO

FIOCRUZ ...... FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

IPTSP ...... INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

LAMV ...... LABORATÓRIO DE ARTROPODOLOGIA MÉDICA E VETERINÁRIA mg ...... MILIGRAMA mL ...... MILILITRO

P.A...... PUREZA ANALÍTICA ppm ...... PARTES POR MILHÃO

PPGMT ...... PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

UFG ...... UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

UFSCAR ...... UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS xi

LISTA DE NOMENCLATURA DE NOMES CIENTÍFICOS

Acalymma vittatum (Fabricius, 1775) (Coleoptera: Chrysomelidae) Aedes albopictus (Skuse, 1894) (Diptera: Culicinae) Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicinae) Agathis australis (D. Don) Loudon, 1829) (Pinales: Araucariaceae) Anacardium occidentale (Linnaeus, 1753) (Rutales: Anacardiaceae) Anthonomus grandis (Boheman, 1843) (Coleoptera: Curculionidae) Artemia salina Leach (Crustacea: Anostraca) Atta sexdens rubropilosa (Forel, 1908) (Hymenoptera: Formicidae) Azadirachta indica (A. Juss, 1830) (Sapindales: Meliaceae) Babesia caballi (Piroplasmidae: Babesiidae) Babesia canis (Piroplasmidae: Babesiidae) Babesia gibsoni (Piroplasmidae: Babesiidae) Bemisia tabaci (Gennadius, 1889) (Hemiptera: Aleyrodidae) Chenopodium ambrosioides (L., 1753) (Caryophyllales: Chenopodiaceae) Chrysanthemum cinerariifolium (Trevis.Vis.,1847) (Asterales: Asteraceae) Chrysomya albiceps (Wiedemann, 1819) (Diptera: Calliphoridae) Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794) (Diptera: Calliphoridae) Candida sp (Saccharomycetales: Saccharomycetaceae) Copaifera reticulata (Ducke, 1915) (Fabales: Fabaceae) Culex quinquefasciatus (Say, 1823) (Diptera: Culicinae) Curcuma longa (L., 1753) (Zingiberales: Zingiberaceae) Dacrycarpus dacrydioides (A. Rich.de Laub. 1969) (Pinales: Podocarpaceae) Dermanyssus gallinae (Degeer, 1778) (Acari: Dermanyssidae) Derris spp. (Lour, 1790) (Fabales: Fabaceae) Ehrlichia canis (Moshkovski 1945) (Rickettsiales: Rickettsiaceae) Eucalyptus citriodora (Hook, 1848) (Myrtales: Myrtaceae) Eucalyptus globulus (Labill, 1799) (Myrtales: Myrtaceae) Eucalyptus staigeriana (F.Muell. ex F.M.Bailey) (Myrtales: Myrtaceae) Eupatorium adenophorum (Spreng, 1826) (Asterales: Asteraceae) Haemobartonella canis (Kikuth, 1928) (Rickettsiales: Bartonellacea) Halocarpus biformis (Hook. Quinn, 1982) (Lepidoptera: Noctuidae) Heliothis virescens (Fabricius, 1777) (Lepidoptera: Noctuidae) Helicoverpa armigera (Hübner, 1808) (Lepidoptera: Noctuidae) Hepatozoon canis (Eucoccidiida: Haemogregarinidae) Holocarpus bidwillii (Hook. f.) Quinn, 1982) (Asterales: Asteraceae) Holocarpus kirkii (F. Muell. Quinn,1982) (Asterales: Asteraceae) Lagarostrobos colensoi (W. Hooker Quinn, 1982) (Pinales: Podocarpaceae) Lathyrus laxifolius (L., 1753) (Fabales: Fabaceae) Lepidothamnus intermedius (T. Kirk Quinn, 1982) (Pinales: Podocarpaceae) Leucoagaricus gongylophorus (Singer Möller) (Agaricales: Basidiomycota) Lipaphis erysimi (Kaltenbach, 1843) (Hemiptera: Aphididae) Melia azedarach (L., 1753) (Sapindales: Meliaceae) Melinis minutiflora (P. Beauv, 1812) (Poales: Poaceae) Musca domestica (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) Nicotiana spp. (L., 1753) (Solanales: Solanaceae) Papilio glaucus (Linneaus, 1758) (Lepidoptera: Papilionidae) Peridroma saucia (Hubner, 1808) (Lepidoptera: Noctuidae) Phaseolus acuteafolius (A. Gray, 1852) (Fabales: Fabaceae) xii

Phyllocladus trichomanoides (D. Don, 1832) (Pinales: Podocarpaceae) Plutella xylostella (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Plutellidae). Piper nigrum (Linn. 1753) (Piperales: Piperaceae) Podocarpus acutifolius (Kirk, 1883) (Pinales: Podocarpaceae) Podocarpus totara (G. Benn. ex D. Don in Lamb, 1828) (Pinales: Podocarpaceae) Quassia amara (L., 1762) (Sapindales: Simaroubaceae) Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1829) (Acari: Ixodidae) Rickettsia conorii (Rickettsiales: Rickettsiaceae) Rickettsia rickettsii (Piza, 1929) (Rickettsiales: Rickettsiaceae) Ricinus communis (L., 1753) (Malpighiales: Euphorbiaceae) Sapindus saponaria (L., 1753) (Sapindales: Sapindaceae) Sesamum indicum (Linneaus,1753) (Lamiales: Pedaliaceae) Spodoptera exigua (Hueb, 1818) (Lepdoptera: Noctuidae) Spodoptera frugiperda (JE Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) Spodoptera littoralis (Boisduval, 1833) (Lepdoptera: Noctuidae) Spodoptera litura (Fabricius, 1775) (Lepidoptera: Noctuidae) Theileria equi (Laveran 1901) (Piroplasmida: Babesiidae) Trichilia catigua (A. Juss, 1829) (Sapindales: Meliaceae) Trichilia connaroides (Wight & Arn. Bentv, 1982) (Sapindales: Meliaceae) Trichilia hirta (L., 1759) (Sapindales: Meliaceae) Trichilia pallida (Swartz, 1788) (Sapindales: Meliaceae) Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepidoptera: Gelechiidae)

xiii

RESUMO

Rhipicephalus sanguineus é um ectoparasita cosmopolita, de importância médica e veterinária, por ser transmissor de patógenos ao cão doméstico, seu principal hospedeiro, mas também ao homem e outros animais domésticos e silvestres. Dentre os agentes transmitidos por diferentes cepas deste vetor estão a Ehrlichia canis, Babesia canis, B. caballi, B. gibsoni,

Hepatozoon canis, Haemobartonella canis, Theileria equi, Rickettsia conorii e R. rickettsii do grupo etiológico de febre maculosa, em diversas partes do mundo. Além disto, este ixodídeo pode ocasionar anemias severas, espoliação e desconforto em seus hospedeiros. O uso contínuo e muitas vezes inadequado de inseticidas e acaricidas químicos sintéticos, principais produtos utilizados no controle deste artrópode, tem favorecido o desenvolvimento de resistência deste ixodídeo aos mesmos, ineficiência nas medidas de controle, prejuízos sanitários e econômicos, além dos prejuízos ambientais ocasionados pelo acúmulo destas drogas no ambiente. O crescente número de relatos de resistência de R. sanguineus a estes produtos suscitam a realização de estudos para desenvolvimento de novas estratégias de controle para este vetor. Neste sentido, o presente estudo objetivou verificar a potencialidade de duas plantas encontradas no Brasil, Trichilia pallida e Sesamum indicum, para prospecção de acaricidas organonaturais, a serem utilizados como nova alternativa para controle de R. sanguineus. Folhas de T. pallida foram coletadas em áreas de Mata Atlântica do Estado de

São Paulo, enquanto sementes de S. indicum foram coletadas em fazendas de cultivo do

Estado de Goiás. As amostras vegetais foram transportadas a laboratórios de fitoquímica para obtenção do extrato hexânico (e.h.) de folhas de T. pallida e do óleo essencial de S. indicum.

O primeiro foi obtido por extração em hexano de folhas de T. pallida, previamente dessecadas, trituradas, maceradas e percoladas a frio. O óleo essencial foi obtido por destilação (arraste a vapor) do óleo de sementes de S. indicum, previamente obtido através da prensagem de sementes e saturação destas em hexano. Fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus xiv

foram coletadas em ambientes freqüentados por cães naturalmente infestados, em diversos bairros da cidade de Goiânia, Goiás. Estas foram identificadas, limpas e mantidas em incubadoras do tipo B.O.D., climatizadas a 27 ± 1ºC, UR ≥ 80% e fotoperíodo de 12 horas, para a oviposição e conseqüente obtenção de larvas para a realização dos bioensaios com as substâncias botânicas. Estes foram realizados em quadruplicata, em uma câmara climatizada a

27 ± 1ºC, UR ≥ 80% e fotofase natural de 12 horas. Para cada bioensaio uma nova solução estoque do extrato vegetal foi preparada, diluindo-se o extrato em solvente e água destilada.

Cerca de 50 larvas com 14 a 21 dias de idade eram acondicionadas em envelopes de papel filtro, impregnados com diferentes concentrações das substâncias vegetais, obtidas a partir de diluições da solução estoque com água destilada. Em cada bioensaio, para cada concentração testada, utilizaram-se quatro envelopes. Para o grupo controle utilizaram-se o mesmo número de larvas por envelope, submetidas a: 1. envelopes secos (sem tratamento); 2. envelopes apenas com água destilada e, 3. envelopes impregnados com os solventes utilizados, nas mesmas concentrações utilizadas para o grupo teste. Por ação do (e.h.) das folhas de T. pallida e do óleo essencial de S. indicum, obtiveram-se na 24ª hora de exposição, respectivamente, as concentrações letais (CL) CL50 de 4.660 ppm e 107.729 ppm e as CL99 de

14.217 ppm e 279.912 ppm. Para as mesmas substâncias vegetais, na 48ª hora, constataram-se respectivamente as CL50 de 1.555 ppm e 78.880 ppm e CL99 de 3.431 ppm (Intervalo de confiança a 95% (IC) de 3.085 a 4.006 ppm e 221.255 ppm (IC = 189.837-289.657).

Mortalidade significativa não foi observada no grupo controle (p < 0,05). Os resultados suscitam investimentos para a preservação e cultivo destas plantas em nosso país, bemo como para a continuidade de estudos como o fracionamento dos extratos vegetais testados, com simultâneo monitoramento das frações bioativas para R. sanguineus, objetivando o desenvolvimento de acaricidas organonaturais para serem utilizados como medida de controle alternativa e de menor impacto ambiental. xv

ABSTRACT

Rhipicephalus sanguineus is a cosmopolitan ectoparasite, of veterinary and medical importance, for transmitting pathogens to domestic dogs, its principal host, but also to men and other wild and domestic animals. Among the agents transmitted by different vector strains we find Ehrlichia canis, Babesia canis, B. caballi, B. gibsoni, Hepatozoon canis,

Haemobartonella canis, Theileria equi, Rickettsia conorii e R. rickettsii of the ethiological group of spotted fever, in several parts of the world. Furthermore, these ticks can cause severe anaemia, espoliation and uneasiness in the hosts. The continuous use and often improper of synthetic chemical insecticide and acaricide, main products used in the control of this arthropod, has favored the developing of tick resistance to them, inefficiency in the control measures, sanitary and economic harms, besides environmental harm caused by the accumulation of such chemicals in the environment. The increasing number of reports about

R. sanguineus resistance to these products suggests that further studies should be carried out in order to develop new strategies to control this vector. Thus, the aim of the present study was to investigate the potentials of two plants found in Brazil, Trichilia pallida and Sesamum indicum, for organic natural acaricide prospection to be used as a new alternative to control R. sanguineus. T. pallida leaves were collected in areas of “Mata Atlântica” in the State of São

Paulo, while S. indicum seeds were collected from farms in Goiás state, Brazil. The vegetable samples were transported to phytochemistry laboratories for the obtaining of hexane extract

(h.e.) of leaves of T. pallida and of the essential oil of S. indicum. The first was obtained by extraction in hexane of leaves of T. pallida, previously desiccated, triturated, softened and percolated to cold. The essential oil was obtained by distillation (steam drag’s method) of the oil of S. indicum seeds, previously obtained through the pressing of seeds and saturation of these in hexane. R. sanguineus engorged females were collected in environs with dogs xvi

naturally infested, in several districts in the city of Goiânia, Goiás state. These were identified, cleaned and conditioned in a incubator of type B.O.D., acclimatized to 27 ± 1ºC,

RH ≥ 80% and photoperiod of 12 hours, for oviposition and consequent obtainance larvae to bioassays to be performed with botanic substances. These were carried out in quadruplicate, in an acclimatized camera at 27 ± 1ºC, RH ≥ 80% and photoperiod of 12 hours. For each bioassay a new storing solution of the vegetable extract was prepared, diluting the extract in solvent and distilled water. About 50 larvae from 14 to 21 days of age were conditioned in filter paper envelopes, impregnated with different concentrations of vegetable substances, obtained from dilution of stock solution with distilled water. In each bioassay, to each tested concentration, four envelopes were used. For control group it was used the same amount of larvae in each envelope, submitted to: 1. dry envelopes (with no treatment); 2. envelopes with only distilled water and, 3. envelopes impregnated with solvents used, in the same concentrations used for the test group. For the action of h.e. leaves of T. pallida and essential oil of S. indicum, after 24th hour of exposure, it was obtained, respectively the lethal concentrations (CL) of CL50 of 4,660 ppm and 107,729 ppm and CL99 of 14,217 ppm and

279,912 ppm. For the same botanical substances, after 48th hour, it was obtained, respectively

CL50 of 1,555 ppm and 78,880 ppm and CL99 of 3,431 ppm (Confidence Interval (IC) of 95% de 3,085 a 4,006 ppm and 221,255 ppm (IC = 189,837-289,657). There was no significant mortality rate within the control group (p < 0.05). The results suggest investments to be made in order to preserve and grow these plants in our country, as well as to the to the continuity of studies as the fractioning of the vegetable extract being tested, with simultaneous monitoring of bioactive fractions to R. sanguineus, aiming at developing organic natural acaricide to be used as an alternative measure of control and as a form of causing less environmental impact. Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 04/2007 17

1- INTRODUÇÃO 18

1.1- Origem, distribuição e importância de Rhipicephalus sanguineus

R. sanguineus (LATREILLE, 1806) (Acari: Ixodidae) conhecido como “carrapato vermelho do cão” no Brasil e “Brown dog tick” em países de língua inglesa, é uma espécie originária do continente Africano e, que encontra-se distribuída em todos os continentes do planeta parasitando primariamente o cão doméstico (Flechtmann, 1973; Walker et al., 2000;

Lord, 2005). Acredita-se que sua introdução nas Américas deve ter sido advinda da colonização européia a partir do final do século 15 ou anteriormente, já que há relatos de fósseis de cães domésticos no Peru, Bolívia e México datados para antes do século 15

(Leonard et al., 2002).

Somando-se a isto, as intensas atividades agropecuárias no Brasil, o convívio do homem com animais domésticos e a valorização de atividades ao ar livre favorecem a disseminação de agentes infecciosos transmitidos por carrapatos, propicia o surgimento e ressurgimento de diferentes agentes etiológicos (Massard & Fonseca, 2004). Conforme verificado por Harrison et al. (1997), no Brasil, Dantas-Torres et al. (2005, 2006), nos Estados Unidos e Carpenter et al. (1990), na Carolina do Norte, através dos ataques causados pelas formas imaturas deste ixodídeo em humanos, supondo-se, assim, uma provável tendência das cepas do R. sanguineus em aumentarem sua adaptação ao homem como hospedeiro.

Este carrapato pode ocasionar anemias severas, espoliação e desconforto em seus hospedeiros e participar como vetor biológico e reservatório da Ehrlichia canis (Hoogstraal,

1967; Andereg & Passos, 1999), podendo também transmitir Babesia canis, B. caballi e B. equi (Hoogstraal, 1967). Além destes, Rickettsia do grupo etiológico da febre maculosa foi diagnosticada em 18,8% dos espécimes deste carrapato, coletados em cães domésticos do centro e norte do Mississipi e de Chicago, EUA (Burgdorfer et al., 1975; Lemos et al., 1997). 19

1.2 - Ciclo biológico de R. sanguineus

R. sanguineus (LATREILLE, 1806) (Acari: Ixodidae) é um carrapato cosmopolita, trioxeno, que parasita principalmente o cão doméstico em áreas urbanizadas, mas que também pode parasitar outros mamíferos, aves e répteis (Flechtmann, 1973; Lord, 2005).

Seu ciclo de vida compreende três estádios: larva, ninfa e adulto. Durante o seu desenvolvimento, os adultos iniciam a cópula 4 dias após a fixação no hospedeiro, onde as fêmeas ingurgitam-se em cerca de 46 dias (Sartor, 1996). Posteriormente, as mesmas, abandonam o hospedeiro, iniciam a postura no ambiente e em 21 a 29 dias cada fêmea deposita aproximadamente de 4000 a 5000 ovos segundo Flechtmann (1990) ou de 1000 a

3000 ovos, segundo Labruna (2004). Estes são pequenos, esféricos e de coloração castanha

(Neves, 2005). Em cerca de 19 dias ocorre a eclosão das larvas. Estas se fixam no hospedeiro e se engurgitam em cerca de 3 dias. No ambiente, após cerca de 6 dias as larvas sofrem uma ecdise originando as ninfas. Estas se fixam no hospedeiro e se tornam ingurgitadas em torno de 4 dias. Em mais 12 dias sofrem outra ecdise no ambiente, originando adultos, machos ou fêmeas, reiniciando o ciclo (Flechtmann, 1990). Seu ciclo biológico encontra-se ilustrado demonstrado na Figura 1.

Em estudo realizado por Bellato & Daemon (1997), verificou-se que a longevidade de ninfas e adultos de R. sanguineus em diferentes temperaturas (18, 27, 32ºC), diminuia à medida que a temperatura aumentava. Semelhantemente, observaram que a duração da pré- postura e postura foi menor com o aumento da temperatura. Somando-se a isto, Bachara et al.

(1995) verificaram que o ciclo desse carrapato se completava em aproximadamente 90 dias sob condições laboratoriais, prolongando-se em condições ambientais, quando expostos a inimigos naturais, alterações ambientais e ao comportamento da espécie no ambiente. Diante disto, Sartor et al. (1996) verificaram que a longevidade das larvas ao jejum variou de 57 a 61 dias, para as ninfas de 14 a 74 dias e para os adultos ficou entre 58 a 116 dias. 20

Figura 1. Ciclo biológico do Rhipicephalus sanguineus. Fonte: de autoria do Prof. Dr. Fernando de Freitas

Fernandes, Prodap/ICB/UFMG. Acesso em: 25 de março de 2007.

1.3- Morfologia de R. sanguineus

Este ixodídeo possue rostro curto, palpos cônicos, base do capítulo hexagonal e com

ângulos projetando-se lateralmente. São providos de olhos e de festões. Os estigmas têm forma de vírgula. Os machos apresentam placas adanais em número par (Rey, 2002), medem

3,5 por 1,5 mm, possuem escudo marrom-avermelhado. As fêmeas apresentam o corpo elíptico, atingindo 11 mm de comprimento por 7 mm de largura, possuem coloração marrom- avermelhada a amarelada. Os peritremas são em forma de vírgula (Flechtmann, 1990). Nas figuras 2 e 3 observa-se que as larvas apresentam seis pernas, enquanto os adultos apresentam 21 oito (Lord, 2005). Sendo que os adultos podem viver aproximadamente um ano prolongando- se nas regiões de clima frio (Rey, 2002).

Após o quarto par de patas o R. sanguineus apresenta um par de estigmas respiratórios, abrindo-se em peritremas. O capítulo ou falsa cabeça, encaixa-se numa chanfradura do idiosoma chamada cameróstomo. As peças bucais implantadas no capítulo são constituídas por quelíceras, hipóstomo e palpos. Na face dorsal do idiosoma do carrapato encontra-se o escudo que nos machos cobre todo o corpo e nas larvas, ninfas e fêmeas cobre apenas uma pequena região anterior do dorso. O escudo pode apresentar-se ornamentado por manchas. Na linha mediana da face ventral encontram-se, respectivamente, nos terços anterior e posterior, os orifícios genital e anal (Figuras 2 e 3) (Neves, 2005).

O sistema digestivo é seguido de uma faringe muscular, que funciona como órgão de sucção, um esôfago em S e glândulas salivares. O intestino médio é representado pelo estômago provido de numerosos divertículos, que vão aumentando de volume durante a sucção sanguínea. O intestino posterior é formado pelo reto e vesícula. O sistema excretor é constituído por um par de tubos de Malpighi. O sistema reprodutor masculino é constituído por dois testículos que partem de canais deferentes que se unem para formar a vesícula seminal. Não há órgão copulador. O macho, com auxílio do rostro, introduz o espermatóforo contendo os espermatozóides, no orifício genital feminino. O sistema reprodutor feminino é constituído de um ovário com um par de ovidutos que se unem formando um útero. O sistema circulatório é responsável pela manutenção e circulação da hemolinfa deste artrópode (Neves,

2005). 22

Hipóstomo

Base do capítulo Palpo

Pata I Abertura genital

Peritrema Pata II

Ânus Pata III

Placas adenais Festões Pata IV (A) (B)

Figura 2. Rhipicephalus sanguineus. Ventre (A) e Dorso (B) do macho. Observar base do capítulo hexagonal, peritrema em forma de vírgula, presença de um par de placas adanais, rostro e palpos curtos, coxa I bífida e escudo não ornamentado com 11 festões (Fonte: adaptado de Agriculture Handbook, 1965).

Área porosa Olho Coxa 1 Abertura genital Escudo

Coxa 3

Ânus

(A) (B) Sulco anal

Figura 3. Rhipicephalus sanguineus. Dorso (A) e Ventre (B) da fêmea. Observar base do capítulo hexagonal, peritrema em forma de vírgula, rostro e palpos curtos, coxa I bífida e escudo não ornamentado com 11 festões (Fonte: adaptado de Agriculture Handbook, 1965). 23

1.4- Dificuldades no controle de R. sanguineus

Durante muitas décadas no Brasil, a principal forma de controle do R. sanguineus era feito através da utilização de acaricidas ou inseticidas químicos desenvolvidos para uso em bovinos ou domissanitários, em dosagens e formas de aplicação das mais variadas (Fernandes,

2000). Este histórico possibilitou o desenvolvimento de resistência deste ixodídeo aos acaricidas comerciais e químicos sintéticos, no Brasil, incluindo à piretróides (Fernandes et al., 1997; Fernandes et al., 1998; Fernandes, 2000; Fernandes & Freitas, 2001). Em outros países como Panamá (Miller et al., 2001) e Espanha (Estrada-Pena, 2005) R. sanguineus também vêm demonstrando resistência, suscitando a realização de estudos para o desenvolvimento de estratégias de controle para este carrrapato.

Na atualidade, é importante que o uso de acaricidas e inseticidas químicos sintéticos se restrinja ao mínimo necessário, visando reduzir o impacto ambiental causado pelo acúmulo destas drogas no meio ambiente e nas cadeias alimentares.

1.5- Acaricidas botânicos como nova perspectiva para o controle de Rhipicephalus sanguineus e outros artrópodes.

Segundo Matos (1988) para a escolha da espécie da planta a ser estudada é necessário o conhecimento da flora da região, as informações populares sobre o uso das plantas, bem como uma avaliação prévia da composição química e estrutural e, a forma de isolamento e purificação de seus constituintes.

Diante das dificuldades existentes no controle de R. sanguineus, substâncias botânicas ativas contra ácaros e insetos têm se apresentado como uma promissora alternativa a ser estudada para o controle deste carrrapato, com base nos resultados promissores obtidos por

Prates et al. (1993), que avaliaram a atividade larvicida de componentes do capim Melinis minutiflora (Poaceae) sobre o carrapato do boi, R. (Boophilus) microplus (CANESTRINI, 24

1887), e por Chagas et al. (2002), que testou a atividade larvicida sobre o mesmo carrapato de

óleos de Eucalyptus staigeriana e E. citriodora e E. globulus (Myrtaceae).

Resultados animadores foram também obtidos no controle de outros ácaros como

Dermanyssus gallinae (Tucci et al., 1998), de insetos culicíneos como Aedes albopictus

(Guimarães et al., 2001), Culex quinquefasciatus (Silva et al., 2003) e A. aegypti (Silva et al.,

2004), de triatomíneos (Laurent et al., 1997) e de insetos de importância agrícola (Grainge et al., 1985; Kulat et al., 1999; Sinha et al., 2003).

Xie et al. (1994), constataram que a atividade inseticida do extrato em etanol da

Trichilia hirta inibiu significativamente o crescimento da Peridroma saucia, lagarta do nabo

(HÜBNER) e que o extrato das folhas não demonstrou tal atividade, com exceção da casca. O extrato da T. connaroides em bioensaio nutricional reduziu significativamente o crescimento, consumo e eficiência de conversão do alimento ingerido e digerido, em Peridroma saucia e

Spodoptera litura FABRICIUS Confirmando, assim, que os liminóides encontrados neste gênero apresentam maior ou menor efeito dependendo de suas estruturas e das espécies a serem estudadas. Conforme verificado por Rocha et al. (2004), que avaliaram a atividade de limonóides isolados de frutos de T. pallida sobre lagartas de Spodoptera frugiperda em dieta artificial.

Somando-se a estes, promissores resultados foram também obtidos por Fernandes &

Freitas (2007), estudando a atividade larvicida do óleo-resina de Copaifera reticulata

(Leguminosae, Caesalpinioideae) sobre R. (Boophilus) microplus. Filho & Dorval (2003), ao avaliarem o efeito de iscas à base de folhas e de sementes do gergelim (S. indicum) no controle de saúva limão, Atta sexdens rubropilosa, em diferentes concentrações, verificaram que nas iscas à base de farinha de folhas de gergelim (15%) e sementes de gergelim (30%), as mortalidades foram superiores aos de alguns produtos comercializados, como clorpirifós

(“Pikapau” e “Landrin”). 25

Roth et al. (1998), ao isolarem componentes ativos de Curcuma longa, constataram, a atividade anti-fúngica de frações do e.h. de suas folhas sobre Candida sp, além de ação larvicida sobre A. aegypti. Além disto, atividade repelente sobre mosquitos de três espécies de

Curcuma foi constatada por Pitassawat et al. (2003).

Espécies da meliácea Trichilia têm demonstrado atividade inseticida em insetos de importância agrícola, como a lagarta-do-cartucho do milho, Spodoptera frugiperda

(Lepidoptera: Noctuidae) (Roel et al., 2000) e a mosca-branca, Bemisia tabaci (Hemiptera:

Aleyrodidae) (Souza & Vendramim, 2001). Atividade inseticida sobre S. frugiperda também foi observada por extratos aquosos de Anacardium occidentale (Brito et al., 2004).

Simmonds et al. (2001), isolaram e avaliaram a deterrência alimentar de três tetranortriterpenos de raízes de T. pallida, dissolvidos em acetona e avaliaram a 100 ppm, sobre o último ínstar de S. littoralis, Spodoptera exigua (HUEB), Heliothis virescens e

Helicoverpa armigera (HUBNER). Constatando que apenas um dos tetranortriterpenos

(methyl 6,11β-dihydroxy-12 α-(2-methylpropanoyloxy)-3,7-dioxo- 14β, 15β epoxy-1,5- meliacadien-29-oate) avaliados inibiu a alimentação da larva das quatro espécies analisadas.

Em S. littoralis, a inibição alimentar pelo extrato bruto em acetona de T. pallida a 100 ppm foi maior que pelos tetranortriterpenóides isolados do referido extrato. Tal fato, pode ter sido ocasionado por uma possível ação sinérgica entre os compostos, que quando isolados, apresentam atividade deterrente reduzida.

Sukontason et al. (2004, 2004a) e Dey et al. (2005) avaliaram a ação do óleo de

Eucalyptus sobre estádios larvais dos ciclorrafos Musca domestica (Diptera: Muscidae) e

Chrysomya megacephala e o efeito do extrato de folhas de Eupatorium adenophorum

(Asteraceae) sobre adultos de Lipaphis erysimi (Hemiptera: Aphididae). Outros estudos demonstraram a bioatividade de substâncias extraídas de plantas, tais como Azadirachta indica (Meurant et al., 1994) e extratos das gimnospermas Podocarpus totara; P. 26 acuteafolius; Dacrycarpus dacrydioides; Halocarpus bidwillii; H. biformis; H. kirkii;

Lagarostrobos colensoi; Lepidothamnus intermedius; Lathyrus laxifolius; Phyllocladus trichomanoides; Popilio glaucus, e Agathis australis (Gerard & Ruf, 1997).

Outros estudos também obtiveram excelentes resultados como os de Coêlho (2006), usando plantas nativas do cerrado em triatomíneos e larvas de Aedes aegypti. Cabral et al.

(2004), com C. megacephala e C. albiceps, Zanon (2001), com Culex quinquefasciatus e

Guimarães et al. (2001), em A. albopictus. Pagnocca et al. (1990), observaram ação inibidora no desenvolvimento do fungo simbionte da formiga, Atta sexdens rubropilosa, que se encontra em estruturas do S. indicum provávelmente pela ocorrência de compostos com propriedades fungistáticas nesta planta.

Qualquer que seja a estratégia adotada no controle dos carrapatos ou dos seus patógenos, ela deve-se basear nos conhecimentos sobre a biologia, ecologia, bioquímica, fisiologia e imunologia tanto do parasito quanto do hospedeiro e de suas interações (Pereira et al., 2000).

1.6- Trichilia pallida

O gênero Trichilia, da família Meliaceae, foi descrito por BROWNE em 1756, compreende 70 espécies distribuídas na América Tropical, África e região Indo–Malaia, das quais aproximadamente 43 espécies ocorrem no Brasil (Pennington et al., 1981). A T. pallida, conhecida por Baga-de-morcego, é uma planta clímax ombrófila, com ocorrência na Mata

Atlântica, mas que se encontra amplamente distribuída desde a Amazônia ao Estado de Santa

Catarina, não ocorrendo no nordeste brasileiro e no Rio Grande do Sul (Zimback et al., 2004;

Patrício & Cervi, 2005). 27

Seu porte varia de 3 a 8 m de altura. Seus ramos jovens são acinzentados até marrom

escuros e, suas folhas imparipinadas ou raro trifolioladas (Figuras 4A, B). Com floração de

janeiro a junho e frutos maduros a partir de maio.

A B

Figura 4. Árvore (A) folhas e frutos de Trichilia pallida (B). Fonte: adaptado de: de autoria da empresa Atrium. Acesso em

23 de março de 2007.

1.7 - Sesamum indicum

O Sesamum indicum, (Linneaus, 1753) (Pedaliaceae), é uma planta oleaginosa de

ampla adaptabilidade, seu cultivo se estende de 25º S e 25º N, porém pode ser encontrado

também até 40º N na China, Rússia e USA a 30º S na Austrália e a 35º S na América do Sul

(Arriel et al., 1999). Cresce como pequeno arbusto alcançando altura de 1,8m; tem hábito de

crescimento ramificado ou não, as folhas da parte alta tem forma de ponta de lança, as mais

baixas crescem mais largas, arredondadas ou dentadas. As flores podem ter cor rósea, branca

ou violeta (Figura 6A) e o fruto (Figura 6B) é uma baga alongada com pelugem contendo

sementes (Figura 6C) pequenas com cor variando do branco ao preto. 28

Sesamol O

Sesamina Sesamolina

Figura 5. Estruturas químicas do sesamol, sesamina e sesamolina do óleo de Sesamum indicum.

O óleo de gergelim tem teores altos de ácidos graxos insaturados, de proteína digestível, e de sesamol (2%); além do mais o óleo possui grande resistência à rancificação por oxidação (propriedade atribuída ao sesamol) (Bahia, 2006).

A B C 29

Figura 6. Sesamum indicum: Arbusto com flores (A). Frutos do tipo deiscente (B).

Sementes (C). Fonte: adaptado de: Acesso em 23 de março de 2007.

A família Pedaliaceae possui 16 gêneros e 60 espécies mencionando-se 49 espécies do gênero Sesamum indicum (L.) e as cultivares podem ser diferenciadas por vários atributos da planta como altura, ciclo, coloração do caule, das folhas e das sementes, tipo de ramificação e resistência às pragas. O principal produto do gergelim é o grão (Figura 6C). Seu uso vai da culinária à medicina e à indústria farmacêutica e de cosméticos à porções afrodisíacas. Os grãos são comestíveis, fornecem óleo e farinha, contem vitaminas A, B, C, e possuem bom teor de cálcio, fósforo e ferro (grãos pretos são mais ricos em cálcio e vitamina A). Plantado em consórcio com o algodoeiro o gergelim ajuda a controlar o bicudo (Bahia, 2006). 30

Entre os constituintes menores do óleo de gergelim, encontram-se o sesamol, a sesamina e a sesamolina (Figura 5). O sesamol com suas propriedades antioxidantes dá ao

óleo uma elevada estabilidade química evitando a rancificação, sendo entre os demais óleos de origem vegetal, o que apresenta a maior resistência à oxidação (Beltrão, 1994). 31

3 - OBJETIVOS Objetivo geral:

Verificar o potencial de substâncias extraídas das plantas T. pallida e S. indicum na prospecção de acaricidas botânicos para controle do carrapato R. sanguineus.

Objetivos específicos: 32

- Analisar a ação larvicida do extrato hexânico de folhas de T. pallida sobre R. sanguineus;

- Verificar a ação larvicida do óleo essencial da semente do S. indicum sobre larvas de

R. sanguineus; 33

4 - MATERIAL E MÉTODOS 34

4.1 - Obtenção do extrato hexânico de T. pallida

Extrato em hexano (e.h.) de folhas de T. pallida foi obtido segundo os métodos de

Roel et al. (2000), Souza & Vendramim (2001), Rocha et al. (2004) e Vieira & Gallo (2004).

Folhas de T. pallida obtidas foram dessecadas em estufa de ventilação forçada à temperatura de 40°C, trituradas em moinho elétrico de facas até atingir baixa granulometria, pesadas e percoladas a frio. Cerca de 800 g do pó de cada planta coletada foram colocados num béquer com capacidade para 2000 ml, no qual foi adicionado 1 litro do solvente hexano, misturando- se com agitador mecânico até completa homogeneização, deixando em repouso por 72 h, protegido da luz. Logo após foi filtrado em papel filtro qualitativo. Feito isto, em cada filtragem o volume do béquer foi completado com álcool metanólico para a seguinte percolação, e repetido por 4 vezes. O filtrado foi concentrado em evaporador rotativo e o extrato bruto (e.b.), colocado em placas de petri para secagem, numa capela de exaustão, em temperatura ambiente. Posteriormente o (e.b.) foi acondicionado em frascos de vidro âmbar e armazenados em dessecador até sua utilização.

4.2 - Obtenção do óleo essencial de Sesamum indicum

O óleo da semente do S. indicum foi obtido pela extração com hexano em um aparelho extrator Soxhlet por 6 horas. Estas foram inicialmente prensadas a frio. Em seguida a polpa oleosa obtida foi saturada com hexano, que dissolveu todo o óleo presente, permanecendo em repouso por 6 horas. A massa resultante foi então filtrada a vácuo e, o solvente evaporado do

óleo por aquecimento sob refluxo durante 2,5 horas. Este período deve ser controlado em função da pressão do vapor sob biomassa. Em seguida este foi submetido a um processo de destilação (arraste a vapor) para extração do óleo essencial. Após a condensação do vapor, a mistura de água com o óleo essencial foi armazenada em coletores de decantação, acoplado à 35 saída da serpentina. O tempo de decantação foi de cerca de 12 horas, ficando o óleo na fase inferior e a água na fase superior do coletor. Posteriormente, o óleo foi filtrado para eliminar impurezas (Pimentel & Silva, 2000; Cunha, 2005).

4.3 - Preparo dos extratos botânicos para os bioensaios

Frascos de vidro de cor âmbar com extratos e óleos, foram armazenados em dessecador no LAMV até serem utilizados para os bioensaios com artrópodes. Para a preparação das soluções estoques dos extratos vegetais, estes foram pesados em balança analítica, com precisão de 0,0001 g. Em cada bioensaio uma solução estoque com e.h. das folhas de T. pallida foi preparada na concentração de 5.000 ppm, diluindo 0,75 g deste extrato em água destilada, 19,5 ml do solvente álcool metanólico P.A. e 4,5 ml do tensoativo Tween®

80. Esta permanecia em repouso por cerca de 24 h para facilitar a dissolução, era homogeneizada em agitador magnético por aproximadamente 15 minutos e, tinha seu volume ajustado com água destilada para 150 ml. Soluções estoques do óleo das sementes de S. indicum foram preparadas a 250.000 ppm, diluindo 37,5 g do óleo de forma similar, porém utilizando como solvente o álcool etílico P.A. (30 ml), adicionando-se 60 ml do tensoativo

Tween® 80 e completando seu volume para 150 ml.

As soluções foram preparadas 24 horas antes da realização dos testes (Arruda et al.,

2003). A partir das soluções estoque foram obtidas soluções em concentrações menores desejadas, por uma série de diluições em água destilada. Espécimes de carrapatos foram expostos às diferentes concentrações dos extratos botânicos testados. Os dados obtidos da mortalidade proporcionada por cada concentração (ppm) dos extratos botânicos foram interpolados através de análise de Probit objetivando determinar as Concentrações Letais CL50

(concentração capaz de matar 50% das larvas) e CL99 (concentração capaz de matar 99% das 36 larvas) e respectivos Intervalos de Confiança (IC), através de análise de Probit, utilizando o software Sistema para Análises Estatísticas (SAEG, 1990)®, versão 9.0©.

4.4 - Escolha dos solventes

Diversos tipos de solventes foram testados quanto à solubilização dos extratos botânicos e à tolerância das larvas de carrapatos. Os carrapatos foram submetidos aos solventes pelo “método de papéis impregnados”, adaptado de metodologias anteriores (Leite,

1988; FAO, 2004; Fernandes, 2000).

4.5 - Obtenção de espécimes de Rhipicephalus sanguineus

Teleóginas de R. sanguineus (Figura 7A, B) foram coletadas nas superfícies do piso, paredes e teto de canis e em outros ambientes habitados por cães infestados, de diversos bairros de Goiânia. Estas foram acondicionadas em recipientes descartáveis e encaminhadas ao LAMV. No laboratório foram lavadas com água destilada e secas em papel toalha. Logo após, foram dorsalmente fixadas com fita dupla-face em placas de vidro sobre placas de petri e, colocadas em incubadoras B.O.D. climatizadas a 27 ± 1ºC e UR ≥ 80%, para realizarem a oviposição (Fernandes, 2000; FAO, 2004).

Para obtenção de larvas com idade uniforme, diariamente foi recolhido a oviposição das teleóginas em um único tubo de polietileno, com tampa enroscável. Após a eclosão, o tubo foi vedado com fita adesiva do tipo crepe (Fernandes, 2000; FAO, 2004). 37

A B

Figura 7. Face interna do pavilhão auditivo de um cão doméstico infestado por (seta)

Rhipicephalus sanguineus (A) Fêmea ingurgitada de R. sanguineus (B).

4.6 - Metodologia para verificação da bioatividade das substâncias vegetais sobre larvas de R. sanguineus

Os bioensaios foram realizados em uma câmara biológica, climatizada a 27 ± 1ºC e

UR ≥ 80%, fotoperíodo de 12 h e, em quadruplicata. Para a contenção e exposição das larvas

às soluções testadas foi utilizado envelopes de papel filtro. Cada envelope recebeu 2 ml de solução, distribuída uniformemente em suas superfícies internas, com auxílio de uma pipeta.

Este volume foi calculado com base na área do papel filtro, equivalendo proporcionalmente ao utilizado por Leite (1988). Foram utilizadas nos testes apenas larvas com 14 a 21 dias de idade. Uma alíquota destas larvas foram colocada no centro de uma folha de papel branco, fixada sobre a bancada com fita dupla-face. Destas, pelo menos 50 larvas com boa motilidade foram içadas com um pincel n° 4 de pêlos claros, umedecido na solução testada, e colocadas em cada envelope. As demais larvas foram eliminadas com fita crepe. Os envelopes foram fisicamente vedados, dobrando-se a sua abertura (borda com 1 a 2 cm) e prendendo-se a mesma com auxílio de prendedores metálicos. Estes foram pendurados em suportes de forma a deixar suspensos ao ar os envelopes, sem contato com nenhuma superfície, a fim de evitar 38 perdas da solução ou contaminação. Sob os envelopes, nas bancadas, foram colocados umidificadores para manter a umidade adequada aos bioensaios (Fernandes et al., 2004).

Todos os experimentos foram acompanhados por uma série controle, contendo o mesmo número de larvas no solvente utilizado e água destilada. Em seguida, os envelopes foram inspecionados com auxílio de um estereoscópio, para o registro das larvas vivas, mortalidade e efeitos toxicológicos observados. Para uma análise mais precisa da bioatividade de cada solução testada, os efeitos toxicológicos das plantas sobre os carrapatos, nos horários de observação (24 e 48 horas) foram anotadas em separado, as quantidades de larvas: 1. vivas com capacidade locomotora, 2. vivas, porém sem locomoção e 3. realmente mortas. Além disto, quaisquer fenômenos ou efeitos toxicológicos observados nas larvas nestes horários foram anotados, tais como; movimentação repetitiva, desprendimento de membros, crescimento de bolhas de gás ou líquido no idiosoma, presença de fungos, etc. Entretanto, para possibilitar a comparação dos resultados com os de outros autores (Leite, 1988; FAO,

2004), os percentuais médios de mortalidade foram calculados considerando mortas também as larvas sem capacidade locomotora, da seguinte forma:

Mortalidade (%) = larvas mortas x 100 total de larvas

Mortalidade média (%) = mortalidade da repetição 1 + mortalidade da repetição 2

2

Não foram feitas correções quando a mortalidade do controle esteve entre 0 e 5% e a mortalidade do teste foi de 0 ou 100%. Em testes com mortalidade no grupo controle entre 5 e

10% cada mortalidade média foi corrigida pela fórmula de Abbott (1925). Resultados de testes que produzirem mortalidade no grupo controle superior a 5% foram descartados (FAO, 39

2004). As CL50 e CL99 e respectivos IC foram calculadas por análise de Probit (Silva et al.,

2003, 2004). 40

5- ARTIGO 41

Journal of Medical Entomology Fernando de Freitas Fernandes Section: Address: Laboratory of Medical Artropodology Research articles and Veterinary (LAMV) - Setor de Medical entomology Entomology- DMIPP, Institute of Tropical Vector Control, Pest Management, Patology and Public Health, Federal University Resistance, Repellents of Goiás

Running head: CEP: 74.605-050, Caixa Postal: 131 Fernandes et al. – Acaricidal activity of Goiânia, Goiás, Brasil T. pallida and S. indicum on R. sanguineus Telephone/Fax number: 55 (62) 3521-1839. e-mail: [email protected]

Potentiality of plants Trichilia pallida (Swartz, 1788) (Sapindales: Meliaceae) and Sesamum indicum (Linnaeus, 1753) (Lamiales: Pedaliaceae) in the prospection of botanical acaricides to control of Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari: Ixodidae).

NAIRA BORGES AMARO1

Laboratory of Medical Artropodology and Veterinary (LAMV), Division of Entomology, Department of Microbiology, Immunology, Parasitology, and Pathology, Institute of Tropical Patology and Public Health, Federal University of Goiás, 74.605-050, Caixa Postal 131, Goiânia, Goiás, Brasil.

1 Bolsista do CNPq, de Desenvolvimento Tecnológico e Industrial (DTI), Edital CNPq 014/2004 - Fomento Tecnológico, Bolsista de Mestrado no Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical (PPGMT) do IPTSP- UFG Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar). CNPq Research Fellow. Bolsista da UFG no Mestrado do PPGMT, LAMV. Bolsista do CNPq, Iniciação Tecnológica Industrial (ITI), LAMV Laboratório de Artropodologia Médica e Veterinária (LAMV), Setor de Entomologia do Departmento de Microbiologia, Imunologia, Parasitologia e Patologia, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, 74.605-050, Caixa Postal 131, Goiânia, Goiás, Brasil. E-mail: [email protected] 42

ABSTRACT

This paper aims at verifying the potentials of Trichilia pallida Swartz and Sesamum indicum Linnaeus in the prospection of botanical acaricide, to be used as a new alternative to R. sanguineus Latreille control. Hexane extract (h.e.) of T. pallida leaves and S. indicum seeds oil were obtained in laboratory, from samples collected, respectively, in areas of “Mata Atlântica” in the State of São Paulo and in farms in Goiás, in Brazil. R. sanguineus larvae were obtained from engorged females collected in naturally infested environs of several districts in the city of Goiânia, Goiás. Bioassays were carried out in quadruplicate, at 27±1ºC, RH≥80% and photoperiod of 12 hours. About 50 larvae, from 14 to 21 days of age, were conditioned in filter paper envelopes, impregnated with different concentrations of vegetable substances, obtained from dilution of stock solution. In each bioassay, four envelopes impregnated with each tested concentration were used. The control group used the same amount of larvae, submitted to: 1. envelopes with no treatment; 2. envelopes with distilled water and, 3. envelopes having solvents used in the preparation of vegetable solutions. For the action of h.e. leaves of T. pallida and S. indicum oil, after 24h of exposure, it was obtained, respectively, CL50 of 4,660 ppm and 107,729 ppm and CL99 of 14,217 ppm and 279,912 ppm.

After 48h, it was obtained, respectively, CL50 of 1,555 ppm and 78,880 ppm and CL99 of 3,431 ppm and 221,255 ppm. There was no significant mortality rate within the control group (P< 0.05).

KEYS WORDS Rhipicephalus sanguineus, botanical acaricides, tick control, Trichilia pallida, Sesamum indicum. 43

Introduction

Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari: Ixodidae) is a tick that sponges mainly the domestic dog in urbanized areas and secondarily other mammals, birds and reptiles. By having as dispersion epicenter the Afrotropical area, this cosmopolitan tick, which is the species that presents the widest geographical distribution (between parallel 50° N and 35° S) was dispersed sponging the dogs that accompanied people in their migrations). R. sanguineus is responsible for causing severe anemia (in solid infestations that happen in the domestic dog, that seems not to develop resistance to the tick), discomfort because of the bites, and for transmitting from several pathogens to their hosts, during its habit (Hoogstraal

1985, Barker and Murrel 2002, Guglielmone et al. 2004).

Among the transmitted pathogenic agents, in several places of the world, by several stumps of R. sanguineus to their hosts, including the man, there are mainly Ehrlichia canis and Babesia canis, but also B. caballi, B. gibsoni, Hepatozoon canis, Haemobartonella canis,

Theileria equi, Rickettsia conorii, agent of the "fever exanthematic of Mediterranean", and R. rickettsii from the etiological group of the " spotted fever ". As a matter of fact, in some areas of Mexico, for instance, it is believed that R. sanguineus is a more important vector of this illness, known at that country as “fiebre manchada”, than Amblyomma cajennense (Fabricius,

1787) (Acari: Ixodidae), main vector in the Neotropical area (Hoogstraal et al. 1967,

Burgdorfer et al. 1975, 1988; Sexton et al. 1976, Woldehiwet and Ristic 1993, Perez et al.

1996, Lemos et al. 1997, Kjemtrup et al. 2000, Paludo et al. 2003, Calic et al. 2004). Besides, recent studies demonstrated that R. sanguineus also acts as reservoir of Leishmania chagasi, etiological agent of visceral Leishmaniose (Coutinho et al. 2005, Dantas-Torres et al. 2005).

Due to the growth of the number of accidental parasitism reports in humans, mainly for their immature forms, in the USA, Spain, Uruguay, Mexico, (Hoogstraal 1967, Clark et al.

1996, Felz et al. 1996, Harrison et al. 1997, Venzal et al. 2003, Nebreda-Mayoral et al. 2004) 44 and recently in Brazil (Dantas-Torres et al. 2005, 2006), it is believed that R. sanguineus is becoming more anthropophilic, thus, it can come to cause the increase in the erliquiose incidence, babesiose and spotted fever, such as emerging antropozoonose (Fernandes 2000).

Reinforcing the fact that due to the absence of pathognomic clinic signs, these illnesses in humans a lot of times are confused with other diseases with similar clinic profile, leading to a late clinical diagnosis of the patient which may result in his death (Hoogstraal 1967, Smith

1984, Telford et al. 1993, Harrison et al. 1997, Lemos et al. 1997, Kjemtrup et al. 2000, Calic et al. 2004).

In infestations for R. sanguineus, which is a trioxeno, about 95% of their stadiums are in the environment, where they accomplish all their ecdises and, only 5% in the dogs. Their stadiums present nidicola´s habit (habit of staying close to nests of dogs, therefore, places where they sleep) secluding in holes of the floor, walls and roofs of their hosts´ shelters. They also present the habit of climbing screens, after engorged, like walls of kennels and of other environment frequented by infested dogs, making possible this way, that their engorged females infest the neighboring houses, climbing the dividing walls. In favorable conditions its biological cycle can be completed in up to 51 days, with occurrence of more than 2,5 generations a year, which varies depending on the climatic conditions (Guglielmone et al.

2004).

The continuous and a lot of times inadequate use of insecticides and synthetic chemical, main products used in the control of this vector, has been favoring the resistance development to these products, inefficiency in the control measures, sanitary and economical damages, besides environmental damages caused by the accumulation of these drugs in the environment.

For decades in Brazil, the combat to this tick R. sanguineus was just made through baths or pulverization of the dogs infested with acaricide and insecticides, in dosages of the 45 most varied, mainly developed for use in catlles or for environmental disinfestations

(Fernandes 2000, Fernandes et al. 2001). This history of incorrect use has probably led to significant reduction in sensibility of the target site of these acaricides, i.e., sodium channels of the nervous system, producing Knockdown resistance (Kdr) (Hervé 1983, Wang et al.

2002). This was first noted among R. sanguineus by Fernandes (2000), in the municipally of

Goiânia, Goiás State, Brazil. It is believed that the populations of existent R. sanguineus in this municipally have developed two mechanisms different from resistance, because these manifested loss of the efficiency of Cipermetrina, resistance to Deltametrina, but not to

Permetrina, all pyrethroid (Fernandes 2000). A similar situation was observed in Panama for this tick, whose resistance was characterized by an increase in the esterase levels as well as

Kdr (Miller et al. 2001). However, other explanation for this phenomenon would be that the specific tick formulations for use in dogs, using permetrina base and other chemical groups, were introduced at the Brazilian commercial market, and adopted by the creators, only many years after the release of the acaricide using deltametrina and cipermetrina base.

Later, resistance of R. sanguineus to synthetic chemical acaricide was also diagnosed at other countries as Panama, to DDT, amitraz and permetrina (Miller et al. 2001) and in

Spain, to the deltametrina (Estrada-Pena 2005).

These factors, combined to the notable biotic potential of the species and the complexity of the environments infested by the same, come to propose the accomplishment of studies for development of new control strategies for R. sanguineus. The use of vegetable substances with acaricide properties has been proved a promising alternative for control of ticks (Prates et al. 1993, Chagas et al. 2002, Fernandes et al. 2005b, 2007a, b; Fernandes and

Freitas 2007). In this sense, the present study aimed to evaluate the potential of two plants found in Brazil, being Trichilia pallida (Swartz,1788) and Sesamum indicum (Linnaeus,

1753), for the search of botanical acaricide, to be used as alternative measure of control for R. 46 sanguineus. These plants were chosen for the study mainly with base in the previous verification of their harmful activity on insects of agricultural importance (Hebling-Beraldo et al. 1991, Xie et al. 1994, Pagnocca et al. 1990, Morini 1999, Wheeler and Isman 2001, Cunha

2005).

Materials and Methods

Obtaining vegetable solutions - leaves of T. pallida were collected in areas of

Atlantic forest of the State of São Paulo and sent to the Laboratory of chemistry for processing of its extract according to the method of Ambrozin et al. (2004). These were dry in forced ventilation greenhouse to 40 ºC with reduction of the pressure for the achievement of a fine powder. The extraction was made by maceration in hexane with three repetitions, leaving it in rest for 72 h. Soon afterwards, the filtrate was put in a rotate evaporator for the achievement of the hexane extract (e.h.). Seeds of S. indicum were collected in farms of cultivation of the State of Goiás. These were initially cold pressed. Soon afterwards the obtained oily pulp was saturated with hexane, that dissolved the whole present essential oil, staying in rest for 6 hours. The resulting mass was then filtered through vacuous and, the evaporated solvent of the essential oil for heating about reflow for 2,5 hours. After the extraction, the solvent was evaporated through a rotavapor and the fraction of lipid determined gravimetrically. Soon afterwards this was submitted to a distillation process for extraction of the essential oil, according to Pimentel and Silva (2000) and Cunha (2005).

After the condensation of the steam, the mixture of water with the essential oil was stored in decantation collectors, coupled to the exit of the coil. The time of decantation was about 12 hours, being the oil in the inferior face and the water in the superior face of the collector.

Later, the oil was filtered to eliminate impurities. 47

For the preparation of the solutions stock of the vegetable extracts, these were weighted in analytical scale, accurately 0.0001 g. In each bioassay a solution stocks with e.h. of the leaves of T. pallida was prepared in the concentration of 5,000 ppm, diluting 0.75 g of this extract in distilled water, 19,5 ml of the solvent alcohol methanolic P.A. and 4,5 ml of the tense active Tween® 80. This period in rest for about 24 h to facilitate the dissolution, was homogenized in magnetic agitator for approximately 15 minutes and it had its adjusted volume with water distilled for 150 ml. Solutions stock of the essential oil of the seeds of S. indicum was prepared to 250,000 ppm, diluting 37,5 g of the essential oil in a similar way, however, using as solvent the alcohol ethanol P.A. (30 ml), being added 6,0 ml of Tween® 80 and being completed its volume to 150 ml. The choice of the solvents and tense active was made with base in the efficiency of the dilution of the studied vegetable substances, and after the accomplishment of previous rehearsals of larval tolerance to different types and concentrations of solvents and tense actives (Fernandes et al. 2005a).

With the objective of making possible the verification of the activity biocide of different concentrations of the vegetable extracts, it was obtained by dilution of the solutions stocks with distilled water other solutions, at concentrations of 4,000, 3,000, 2,500, 2,000 and

1,500 ppm of e.h. of T. pallida and 230,000, 200,000, 180,000, 150,000 and 100,000 ppm of the essential oil of S. indicum.

Obtaining of ixodidae larva - Engorged females of R. sanguineus were collected in environments frequented by dogs naturally infested, in several neighborhoods of the city of

Goiânia. These were stored in glass flasks with proper cover and then sent to the laboratory, where they were washed in distilled water, dried on paper towels. With aid of a stereoscope it was identified taxonomically and selected engorged female in perfect anatomical conditions

(Fernandes 2000). For the accomplishment of the oviposition, the engorged female were 48 adhered dorsally with doubledsided tape on slides, inversely disposed on the base of a dish

Petri. Soon afterwards they were conditioned in a incubator of the type B.O.D., acclimatized to 27±1ºC, RH=80% and photoperiod of 12 hours (Fernandes et al. 2005b, 2007b). The daily oviposition were collected and gathered in a single tube of polyethylene (3 x 9 cm) with proper cover, constituting a pool of eggs. After the appearance, each tube of polyethylene was sealed then with adhesive ribbon to avoid the escape of larva (Fernandes 2000, 2001).

Methodology for verification of larval sensibility to vegetable extracts - the evaluation of the sensibility of R. sanguineus to the vegetable extracts accomplished in the present work was adapted of the methodology of larval packet test (lpt), previously described by Fernandes et al. (2007b). This was obtained starting from the improvement of previous methodologies (Leite 1988, Fernandes 2000, 2001; FAO 2004, Fernandes et al. 2005b), seeking to reduce costs, to increase their practical use, however, without loss of the efficiency.

The bioassays were accomplished in a biological camera, acclimatized 27±1ºC and

RH=80%, photoperiod of 12 h and, especially built for studies with botanical acaricide. For the contention and exhibition of the larva to the tested solutions in filter paper envelopes (≈

327 cm2) containing micropores to provide ventilation in their interior. The internal surfaces of each envelope were impregnated with 2 ml of each tested solution, distributed evenly with aid of a pipette. It was used in the bioassays just larva with 14 to 21 days of age, aiming at to make possible the comparison of the results with other authors' studies. A bracket of this larva was put in the center of a sheet of white paper, fastened on the bench with doubledsided tape.

Of these, at least 50 larvae with good motility were hoisted with a brush n° 4 of clear hair, previously moistened in the tested solution, and put in each envelope. The remaining larvae were eliminated with ribbon crape. The envelopes were physically sealed, by bending its opening (border with 1 to 2 cm) and tightening the same with aid of metallic fasteners. These 49 were hung in form supports in order to be suspended in the air, without contact with any surface, in order to avoid losses of the solution or contamination. Under the envelopes, in the benches, humidifiers were used to maintain appropriate the acclimatization of the biological camera.

The bioassays were made in quadruplicate. For each bioassay a new solution stock of the vegetable extract was prepared. In each bioassay, for each tested concentration, four envelopes were used. All of the experiments were accompanied by a group control, containing the same number of larva in each envelope and, prepared in the following way: 1. dry envelopes (without treatment); 2. envelopes with distilled water and, 3. envelopes impregnated with the solvents and used tense active, in the same concentrations used for the group test.

The envelopes were open and inspected by the stereoscope after 24 and 48 hours of exhibition, for the registration of alive and dead larva and possible observed toxicological effects. To make possible the comparison of the results with other authors studies, the percentile ones medium of mortality were calculated considering also killed the larva without capacity of locomotion. In case of an eventual bioassay with mortality of the group control larger than 5%, it would be discarded and repeated.

Aiming the determination of the Lethal Concentrations (CL), especially CL50 and

CL99, and their respective Confidence interval (IC) of 95%, it was interpolated the percentile medium mortality rate obtained by the action of the different tested concentrations, through regression analysis Probit, using the software System for Statistical Analyses (SAEG, 1990)® version 9.0 the qui-square test was Applied (X2) at the level of 5% of significance to verify the influence of the concentration in the larvicide efficiency. 50

Results

The e.h. from leaves of T. pallida and the essential oil of S. indicum presented larvicide activity for R. sanguineus. The medium indexes of mortality obtained by the extract of T. pallida at concentrations of 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000 and 5,000 ppm, were respectively of 0, 6.66, 9.7 , 17.4, 31.3 and 60.6% of the larva, after 24 hours of exhibition. At the 48th hour, for the same concentrations, the mortality of 50%, was verified in 0, 72, 89.28,

99.9, 100 and 100% of the larva. The mortality results observed after 24 and 48 hours of exhibition to the different concentrations of the extract of T. pallida were demonstrated in the

Figure 1.

The essential oil of S. indicum at concentrations of 100,000, 150,000, 180,000,

200,000, 230,000, 250,000 ppm, caused the mortality of 50%, respectively 68.1, 88, 93, 99.7 and 100% of the larva, after 24 hours of exhibition. At the 48th hour the mortality of 75, 84,

98, 99.8, 99.9 and 100% of the larva were observed, respectively, for the same concentrations.

The larval susceptibility of R. sanguineus to the different concentrations of the essential oil of

S. indicum is demonstrated in the Figure 2. There was not significant mortality (larger than

5%) in the control group, in none of their treatments (P < 0.05).

After 24 hours of exposition to the extract of T. pallida, it was obtained the lethal concentrations CL50 and CL99 of 4,660 ppm and 14,217 ppm, respectively. By the action of the essential oil of S. indicum it was obtained on this same schedule of observation CL50 of

107,729 ppm and CL99 of 279,912 ppm. The lethal concentrations obtained after 48 hours of

2 2 exhibition to e.h of T. pallida (X = 5.92 > X .05 (1) = 3,84) and to the essential oil of S.

2 2 2 indicum (X = 14.09 > X .05 (1) = 3,84) are in the Table 1. The values of X obtained allow rejects the hypothesis that the mortality of the larva does not depend on the concentration of the vegetable solutions. 51

Discussion

The insecticide and acaricide potential of several vegetable species has become an increasing objective of studies by different researchers, who wish, in the great diversity of existent species in the Brazilian flora and of other countries, to find substances for development of organonatural insecticides and acaricide, with smaller environmental impact than synthetic chemist, given the harmful accumulation of these products in the nature and alimentary chain.

Fernandes and Freitas (2007) observed larvicide action of the oil-resin of an

Amazonian species of Copaíba, Copaifera reticulata (Leguminosae: Caesalpinioideae), on the

“cattle tick”, R. (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae). Larvicide activity of the extract rude ethanol from the peel of the stem of Magonia pubescens St.Hil

(Sapindaceae) was evidenced by Fernandes et al. (2007a, b) on R. (B.) microplus and R. sanguineus. As well as of e.b.e. from the peel of the stem of another soapberry, Sapindus saponaria L., on the bovine tick and also on R. sanguineus, previously verified by Fernandes et al. (2005b, 2007c). These authors observed 99% of mortality of larva of R. (B.) microplus and of R. sanguineus submitted respectively to the concentrations of 6,360 ppm (≈ 0.64%) and of 3,922 ppm (≈ 0.39%) of this e.b.e. Chagas et al. (2002) testing the oil essential three species of Eucalyptus on larva of the bovine tick, obtained 100% of larval mortality by the action of the concentrations of 10% (≈ 100,000 ppm) of the essential oil of E. staigeriana and of E. citriodora, and of 20% (≈ 200,000 ppm) of the oil of E. globulus. The lethal concentrations of the vegetable substances observed by the foregoing authors, opposed to the results obtained in the present work, ratify the potentiality of T. pallida for investigation of botanical acaricide, once this determined the mortality of 99% of the larva (CL99) of R. sanguineus by the action of a smaller concentration (3,431ppm ≈ 0.34%). 52

A harmful action on insects was previously also observed in extracted substances of other vegetable species, such as acid crisantemico (insecticide action); rotenona (action fagoinibitora and deterrente); nicotine (insecticide action and growth inhibitor); quassina

(insecticide action) and azadiractina (insecticide action, of inhibition of feeding and growth of the insect), extracted respectively from flowers of the "píretro", Chrysanthemum cinerariafolium (Asteraceae); from roots of the "timbó", Derris spp. (Fabaceae); of the leaves of the "tobacco", Nicotina spp. (Solanaceae), of the stem of the "corner", Quassia amara

(Simaroubaceae) (Vieira et al. 1999) and of the Indian "neem", Azadirachta indica

(Meliaceae), also known as "neem" or "amargosa". This one stands out as one of the most well known, because of their insecticide properties (Vendramim, 2000), having been registered its action on more than 400 species of insects and acaridae, besides action against mushrooms, bacteria and nematode (Martinez, 2002). The high potential of this plant was one of the reasons that motivated the choice for the present study of another species from

Meliacea family, Trichilia pallida Swartz, known popularly as "Berry bat", "Catigua",

"Catigua-great", "Tauvá" or "Amesca". Besides the selection for taxonomic similarity, T. pallida was chosen for the study because it has a molecular structure economically viable

(simple and with viable extraction methods) and, mainly for having demonstrated previously also to possess insecticide and repellent properties, against several insects of agricultural importance, such as “variegated cutworm” Peridroma saucia Hübner (Lepidoptera:

Noctuidae) (Xie et al. 1994), the “tobacco cutworm” Spodoptera litura Fabricius

(Lepidoptera: Noctuidae) (Xie et al. 1994, Wheeler and Isman 2001), the “fall armyworm” S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), and “striped cucumber beetle” Acalymma vittatum F.

(Coleoptera: Chrysomelidae) and the "tomato pinworm" Tuta absoluta Meyrick (Lepidoptera:

Gelechiidae) (Cunha 2005). It has also been verified toxicological effects on the micro 53 crustacean of salt water, the Anemia saline Leach (Crustacea: Anostraca) (Mikolajcazak and

Reed 1987).

In the present study, it was observed that the extract of T. pallida presents a larger toxicity to the larva than the essential oil of S. indicum. However, it is believed that in the analysis of the potentiality for development of organo-natural acaricide, it should also be considered the largest viability and smaller cost of the last in relation to the first, given the domain of the techniques of cultivation of S. indicum in wide scale, quite spread in the agriculture.

Sesamum indicum, a plant of the Pedaliacaea family, was chosen for this study by having presented, in previous studies, harmful action on anthills, altering the breathing metabolism of Atta sexdens rubropilosa (Formicidae) (Hebling-Beraldo et al. 1991) and exercising inhibitory action on its fungi symbiotic Leucoagaricus gongilophorus (Singer)

Möller (Agaricales: Basidiomycota). Morini et al. (1999) demonstrated that isolated lignin from essential oil of S. indicum are poisonous for labor ants Atta sextens L. Other factor that has influenced this choice was the previous verification that composts of this plant, sesamina and sesamolina, act as synergist of used insecticides in the control of Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera: Formicidae) (Pagnocca et al. 1990).

In spite of FAO (2004), in studies for verification of the susceptibility and/or resistance of arthropods to the insecticides or acaricide, authorize the correction of the medium indexes of mortality of the group tests, for the formula of Abbott (1925), in case there is mortality of the group controls between 5 and 10%, in the present study it was opted to use a more rigid criterion of evaluation, discarding and repeating any bioassays in that there was mortality above 5% in the group control. This care was taken aiming to eliminate any possibility of interference of the solvents or of any unexpected factors in the observed larval 54 mortality, propitiating a pure verification of larvicide activity of the vegetable substances tested.

The results of the present study allow the recommendation of the tested solvents and tenseactive, for the preparation of substances acaricide organonatural, especially for control of

R. sanguineus, because in the tested concentrations they didn't cause larval mortality. It is worth to remind that the choice of these products was based on previous rehearsals of larval tolerance accomplished previously with several types of solvents and tense-active (Fernandes et al. 2005a). Nevertheless, preceding the beginning of the present study, new rehearsals of larval tolerance with these products were repeated, confirming that, through the methodology of larval packet test (lpt), the Tween® 80, in concentrations of until 5%, and the ethanol and methanol in concentrations of up to 25%, can be used with safety in the preparation of the solutions stocks, once they did not have caused any mortality to the larva, after 48 hours of exposition.

The absence of mortality of larva contained in the dry envelopes demonstrate the absence of toxicity of the paper used filter. The absence of significant mortality in none of the three treatments of the group controls allow the recommendation of the methodology used in this work for studies of evaluation of the susceptibility of larva from ticks to acaricide.

Studies accomplished by Rosales (2001) demonstrated that extracts of plants of the family Meliaceae produce adult's toxicological effect of big or smaller intensity, depending on the species of the plant, but also of the vegetable organs used for the processing of the same ones. Boiça et al. (2005), observed larger toxicity of the extracts of the branches and T. catigua and T. pallida than of the leaves, on Plutella xylostella (Linnaeus, 1758)

(Lepidoptera: Plutellidae). According to the same author, extracts of fruits of S. saponaria were also shown more poisonous than the leaves for this Lepidoptera. Torrecillas and

Vendramim (2001), observed larger toxicity of the aqueous extract of branches of T. pallida 55 of the extract of their leaves on Spodoptera frugiperda (JE Smith, 1797) (Lepidoptera:

Noctuidae) and the "white fly" Bemisia tabaci (Gennadius, 1889) (Hemiptera: Aleyrodidae)

Genn biótipo B. On the other hand, Boiça et al. (2005) observed larger toxicity of the leaves

T. pallida and T. catigua, in relation to the fruits, on larva of Plutella xylostella L.

(Lepidoptera: Plutellidae). Likely, Thomazini et al. (2000) verified larger toxicity of the aqueous extract of the leaves of T. pallida on T. absoluta than the aqueous extract of their branches. These data may suggest the accomplishment of new studies, aiming at to investigate the larvicide efficiency on R. sanguineus, of extracts produced with other vegetable organs from T. pallida and S. indicum plants

The results of the present work raise investments for the preservation of the studied plants, mainly T. pallida in the areas of Atlantic Forest, its natural environment. As well as for the accomplishment of new researches, aiming at the isolation of compositions (fractions and sub-fractions) bioactive of the extract and essential oil tested, with monitoring of the sensibility of R. sanguineus to them, endeavoring the development of botanical acaricide of smaller environmental impact than commercial acaricide and synthetic chemical. 56

Acknowledgements

The authors thank the partial financial support granted by Conselho Nacional de

Desenvolovimento Científico e Tecnológico - CNPq (National Council for Scientific and

Technological Development) and by the Fundação de Apoio à Pesquisa da UFG (FUNAPE) for the accomplishment of the present study, especially for the scholarship of ITI, DTI, and of

Master's degree granted by CNPq. 57

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Footnotes

* Grant holder from CNPq - Technological and Industrial Development (DTI),

CNPq Publication 014/2004 – Technological Foment, Grant holder of Master's degree in the

Program of Masters degree in Tropical Medicine (PPGMT) of IPTSP-UFG

Department of Chemistry of the Federal University of São Carlos (UFSCar). CNPq Research

Fellow.

Grant holder of UFG in the Master's degree of PPGMT, LAMV.

Grant holder of CNPq, Technological Initiation Scholarship (ITI), LAMV.

Laboratory of ´Artropodologia Médica´ and Veterinary (LAMV), Section of Entomology of

Department of Microbiology, Immunology, Parasitological and Pathology, Institute of

Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goiás, 74.605-050, Post office box 131, Goiânia, Goiás, Brazil. E-mail: [email protected] 65

Figure Legends

Figure. 1. Mortality of larvae of Rhipicephalus sanguineus for action of different concentrations of the extract in hexane of leaves of Trichilia pallida, observed at the 24th and

48th hour of exposure. The trend line is derived from logarithmic regression (Probit analysis).

Y = Equation of the straight line. R2 = determination Coefficient.

Figure. 2. Susceptibility of larvae of Rhipicephalus sanguineus to different concentrations of the essential oil of seeds of Sesamum indicum, observed after 24 and 48 hours of exposure.

Concentrations values (x 1000). The trend line is derived from logarithmic regression (Probit analysis). Y = Equation of the straight line. R2 = determination Coefficient. 66

Table Legend

Table. 1. Susceptibility of larvae of Rhipicephalus sanguineus to the extract in hexane of leaves of Trichilia pallida and to the essential oil of the seeds of Sesamum indicum, observed after 48th hour of exposure by the method of larval packet test (lpt). 67

Figure 1

100 24h 48h Log. (24h) 80 Log. (48h) ) 2

(% Y = 41,529Ln(x) - 243,96 R = 0,81 60 ty i l ta r

o 40 M

2 20 Y = 46,269Ln(x) - 345,85 R = 0,86

0 1500 2500 3500 4500 Concentrations (ppm)

Figure. 1. Mortality of larvae of Rhipicephalus sanguineus for action of different concentrations of the extract in hexane of leaves of Trichilia pallida, observed at the 24th and

48th hour of exposure. The trend line is derived from logarithmic regression (Probit analysis).

Y = Equation of the straight line. R2 = determination Coefficient. 68

Figure 2

y = 30,387Ln(x) - 64,551 R2 = 0,90 100

80 Y = 59,048Ln(x) - 222,6 R2 = 0,96 ) (%

60 ty i l a

t 24h r

o 40 48h M Log. (24h) Log. (48h) 20

0 100 150 200 250 Concentrations (ppm)

Figure. 2. Susceptibility of larvae of Rhipicephalus sanguineus to different concentrations of the essential oil of seeds of Sesamum indicum, observed after 24 and 48 hours of exposure.

Concentrations values (x 1000). The trend line is derived from logarithmic regression (Probit analysis). Y = Equation of the straight line. R2 = determination Coefficient. 69

Table 1

Table. 1. Susceptibility of larvae of Rhipicephalus sanguineus to the extract in hexane of leaves of Trichilia pallida and to the essential oil of the seeds of Sesamum indicum, observed after 48th hour of exposure by the method of larval packet test (lpt).

Extratos Lethal Concentrations (ppm) vegetais (Intervalo de Confiança a 95%) X2 R2

CL25 CL50 CL75 CL99

Trichilia 1239 ppm 1555ppm 1953 ppm 3431 ppm 6,0 0.81 pallida (1087-1357) (1433-1656) (1851-2059) (3085-4006)

Sesamum 58636 ppm 78880 ppm 106113 ppm 221255 ppm indicum 15,0 0.90 (41381-71124) (62830-90075) (93767-116059) (189837-289657)

2 R : Coefficient of determination values; CL25: Concentration capable to kill 25% of the larva;

CL50: Concentration capable to kill 50% of the larva; CL75: Concentration capable to kill 75% of the larva; CL99: Concentration capable to kill 99% of the larva. IC: Confidence Interval

(IC) of 95% significance; X2: Qui-square values; (P < 0.05). Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 70

6 – CONCLUSÕES Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 71

CONCLUSÕES

1. O extrato hexânico de T. pallida e o óleo essencial de S. indicum demonstraram atividade larvicida para R. sanguineus. Constatou-se, portanto, o potencial destas plantas na prospecção de acaricidas botânicos a serem utilizados como nova alternativa para controle de R. sanguineus, de baixo impacto ambiental

2. O extrato de T. pallida demonstrou uma maior toxicidade às larvas que o óleo essencial de S. indicum. Contudo, no julgamento da potencialidade para desenvolvimento de acaricidas orgânicos devem ser considerados também a maior praticidade e menor custo na obtenção do último em relação ao primeiro, pelo domínio de suas técnicas de cultivo.

3. Os solventes etanol e metanol e o tensoativo Tween 80 P.A. mostraram-se eficientes na diluição dos extrato e óleo essencial testados, e atóxicos para larvas de R. sanguineus, nas concentrações utilizadas, possibilitando a recomendação do uso desses no preparo de acaricidas organonaturais para controle desse carrapato.

4. Os resultados do presente trabalho suscitam investimentos para cultivo das plantas estudadas, sobretudo para a preservação de T. pallida em áreas de Mata Atlântica, seu bioma natural, bem como para a continuidade das pesquisas, objetivando o isolamento de compostos (frações e sub-frações) bioativos do extrato e óleo essencial testados, com monitoramento da sensibilidade de R. sanguineus aos mesmos, objetivando o desenvolvimento de acaricidas botânicos. Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 72

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 73

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8 - ANEXOS Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 84

8.1 – Roteiro para preparação de Dissertação de Mestrado e Tese de Doutorado no PPGMT

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS UFG INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL Rua Delenda Rezende Melo, S/N- Setor Universitário - 74605-050 - Goiânia-GO Fone (062)521.1837 - 209.61.02 - FAX (062)521.1839 – E-mail: [email protected]

ROTEIRO PARA PREPARAÇÃO DE DISSERTAÇÃO DE MESTRADO E TESE DE DOUTORADO

COMENTÁRIOS GERAIS:

O Colegiado do Curso recomenda que todas as teses e dissertações sejam apresentadas segundo as especificações a seguir: 1. As teses ou dissertações, qualquer que seja a modalidade escolhida: clássica ou baseada em manuscritos, devem ser redigidas em português. Para a modalidade baseada em manuscrito(s) estes devem ser incluídos no idioma em que foram publicados/ submetidos a publicação e as demais partes da tese devem ser redigidas em português. 2. Teses à nível de Doutorado devem conter contribuições originais e/ou importantes para área de conhecimento. 3. A dissertação para obtenção do grau de mestre deve mostrar a familiaridade com trabalhos prévios na área e habilidade para desenvolver, organizar e discutir os resultados da investigação. Não há exigência de originalidade na investigação/ resultados apresentados. 4. Qualquer que seja a modalidade escolhida, esta deverá ser apresentada com: capa, contracapa no verso da qual deverá ser inserida a ficha catalográfica (segundo modelo da Biblioteca Central da UFG), página de aprovação (para o exemplar final), agradecimentos, dedicatória, lista de abreviaturas.

COMPONENTES DA TESE DE MESTRADO OU DOUTORADO 1. OPÇÃO CLÁSSICA

A tese deve incluir na seguinte ordem: a) Sumário do conteúdo; b) Resumo em português e em inglês; c) Introdução/ revisão da literatura nos moldes tradicionais; d) Objetivos do estudo; e) Material e métodos: descrição da população e métodos utilizados; f) Resultados: descrição dos principais resultados e apresentação de tabelas/ gráfica/ fotografias, etc; g) Discussão dos resultados nos moldes tradicionais. h) Conclusões/ recomendações finais; i) Referências bibliográficas de acordo com as normas adotas pelo periódico: Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. j) Anexos opcionais: Aprovação do Comitê de Ética, fichas/questionários utilizados.

2. OPÇÃO BASEADA EM MANUSCRITO

Como alternativa para formato de tese clássica ou tradicional a tese pode consistir em apresentação de um ou mais artigos nos quais o candidato é autor ou co-autor. Os artigos devem ter um eixo comum caracterizando-os como componentes de uma única linha de investigação. 1. Os candidatos tem a opção de incluir como parte integrante da tese o texto de um ou mais manuscritos submetidos, ou a serem submetidos para publicação ou artigos já publicados. 2. A tese deve ser mais do que uma coletânea de manuscrito(s). Todos os componentes da tese devem ser integrados com uma progressão lógica de um capítulo para o próximo. Para assegurar que a tese tenha Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 85

continuidade de conteúdo, textos de conexão que possibilitem vínculos entre os diferentes artigos são recomendados. A estrutura da tese com inserção de manuscrito(s) deve conter na seguinte ordem: a) Sumário do conteúdo; b) Resumo geral da tese/ dissertação em português e em inglês; c) Introdução/ revisão da literatura, nos moldes tradicionais. d) Manuscrito(s) tais como publicados/redigidos/submetidos com texto de ligação; e) Conclusões/ recomendações finais; k) Referências bibliográficas citadas na introdução e textos de conexão de acordo com as normas adotadas pelo periódico Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. www.fiocruz.br l) Anexos opcionais: Aprovação do Comitê de Ética, fichas/questionários utilizados. Adendo: Nos casos de inserção de artigos já publicados, recomenda-se que só sejam incluídos na tese artigos sob co-autoria de pós graduandos quando estes tenham tido participação substancial nos trabalhos. Nestes casos, sugerimos uma declaração explícita de todos os co-autores e colaboradores do(s) trabalho(s) apresentado(s) especificando qual tipo de participação. Esta declaração poderia ser incluída em uma parte inicial da tese denominada: Contribuição dos autores. Consideramos que seja interesse dos candidatos e orientadores especificar claramente as responsabilidades de todos os autores e co-autores nos artigos apresentados. Quando houver a inclusão de manuscritos a serem submetidos, relacionar apenas o nome do pós graduando na autoria. Modificações substanciais no conteúdo da tese devem ser autorizados previamente pela comissão de pós graduação. Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 86

8.2 – Normas adotadas pelo Periódico Memórias do Instituto Oswaldo Cruz Memórias do Instituto Oswaldo Cruz

As Memórias do Instituto Oswaldo Cruz são uma revista multidisciplinar que publica pesquisas originais relativas aos campos da medicina tropical (incluindo patologia, epidemiologia de campo e estudos clínicos), parasitologia médica e veterinária (protozoologia, helmintologia, entomologia e malacologia) e microbiologia médica (virologia, bacteriologia e micologia). A revista aceita, especialmente, pesquisas básicas e aplicadas em bioquímica, imunologia, biologia molecular e celular, fisiologia, farmacologia e genética relacionada a essas áreas. Comunicações breves são também consideradas. Artigos de revisão só quando solicitados. Ocasionalmente, trabalhos apresentados em simpósios ou congressos são aparecem como suplementos.

Os artigos apresentados devem ser escritos preferencialmente em inglês. Quando neste idioma, devem ser checados por alguém que tenha o inglês como primeira língua e que, preferencialmente, seja um cientista da área.

A submissão de um manuscrito às Memórias requer que este não tenha sido publicado anteriormente (exceto na forma de resumo) e que não esteja sendo considerado para publicação por outra revista. A veracidade das informações e das citações bibliográficas é de responsabilidade exclusiva dos autores.

Os manuscritos serão analisados por pelo menos dois pareceristas; a aprovação dos trabalhos será baseada no conteúdo científico e na apresentação.

Todo o material deve ser enviado para a Produção Editorial, Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Av. Brasil 4365, Pavilhão Mourisco, sala 308, 21045-900 Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

Os manuscritos que não estiverem de acordo com estas instruções serão imediatamente devolvidos.

Ao encaminhar um manuscrito para a revista, os autores devem estar cientes de que, se aprovado para publicação, o copyright do artigo, incluindo os direitos de reprodução em todas as mídias e formatos, deverá ser concedido exclusivamente para as Memórias. A revista não recusará as solicitações legítimas dos autores para reproduzir seus trabalhos.

Favor providenciar e checar cada item abaixo antes de submeter seu manuscrito para as Memórias do Instituto Oswaldo Cruz:

• Carta de submissão do trabalho, assinada por todos os autores, especificando o autor de contato, bem como endereço, telefone, fax e e-mail. Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 87

• Três cópias completas do artigo, incluindo as ilustrações e um disquete contendo o texto, tabelas, gráficos e fotografias digitalizadas. • O manuscrito (incluindo tabelas e referências) deve ser preparado em um software para edição de textos, em espaço duplo, fonte 12, impresso em papel padrão e paginado. As margens devem ser de pelo menos 3 cm. • A seqüência do artigo deve ser: título resumido (com até 40 caracteres - letras e espaços), título (com até 250 caracteres), autores (sem títulos ou graduação), afiliação institucional (endereço completo somente do autor correspondente), resumo, palavras-chave, notas de rodapé indicando a fonte de financiamento ou mudanças de endereço, introdução, material e métodos, resultados, discussão, agradecimentos (os mínimos necessários), referências, tabelas (fora do texto e com título), e figuras (com legendas em folha separada). • Só as referências citadas no texto devem aparecer nas lista e devem seguir o estilo do Index Medicus. Se a referência for de artigo ainda não publicado, mas já aceito, deverá ser apresentada carta da revista que publicará o manuscrito ou de outros autores autorizando a referida citação.

Para maiores informações sobre o formato e o estilo da revista, favor consultar um número recente da Revista ou entrar em contato com a Editoria Científica pelo telefone (+55-21-2598.4335), fax (+55-21-2561.1442 / 2280-5048), ou e-mail ([email protected] / [email protected]) Instruções ao autor

The manuscript should be prepared using standard word processing software and should be printed (font size 12) double-spaced throughout the text, figure captions, and references, with margins of at least 3 cm.The manuscript should be arranged in the following order: running title, title, authors' names, institutional affiliations, summary, key words, introduction, materials and methods, results, discussion, acknowledgements, and references. Sponsorships and corresponding author (mentioning fax number and e- mail address) should be as a footnote on the first page. Summary: up to 200 words (100 words in case of short communications). It should emphasize new and important aspects of the study or observations. Key words: 3-6 items must be provided. Terms from the Medical Subject Headings (Mesh) list of Index Medicus should be used. Introduction: should set the purpose of the study, give a brief summary (not a review) of previous relevant works, and state what new advance has been made in the investigation. It should not include data or conclusions from the work being reported. Materials and Methods: should briefly give clear and sufficient information to permit the study to be repeated by others. Standard techniques need only be referenced. Ethics: when reporting experiments on human subjects, indicate whether the procedures followed were in accordance with the ethical standards of the responsible committee on human experimentation (institutional or regional) and with the Helsinki Declaration of 1975, as revised in 1983. When reporting experiments on animals, indicate whether the institution's or a national research council's guide for, or any national law on the care and use of laboratory animals was followed. Results: should be a concise account of the new information discovered, with the least personal judgement. Do not repeat in text all the data in the tables and illustrations. Discussion: should be limited to the significance Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 88

of the new information and relate the new findings to existing knowledge. Only unavoidable citations should be included. Acknowledgements: should be short and concise, and restricted to those absolutely necessary. References: must be accurate. Only citations that appear in the text should be referenced. Unpublished papers, unless accepted for publication, should not be cited. Work accepted for publication should be referred to as "in press" and a letter of acceptance of the journal must be provided. Unpublished data should only be cited in the text as "unpublished observations", and a letter of permission from the author must be provided. The references at the end of the paper should be arranged in alphabetic order according to the surname of the first author. The titles of journals should be abbreviated according to the style used in the Index Medicus. Consult www.nlm.nih.gov/serials/lii.html. - In the text use authors' surname and date: Lutz (1910) or (Lutz 1910). With two authors it is (Lutz & Neiva 1912) or Lutz and Neiva (1912). When there are more than two authors, only the first is mentioned: Lutz et al. (1910) or (Lutz et al. 1910). - At the end of the paper use the following styles: Journal article Chagas C, Villela E 1922. Forma cardiaca da tripanosomiase americana. Mem Inst Oswaldo Cruz 14: 15-61. Book or Thesis Morel CM 1983. Genes and Antigens of Parasites. A Laboratory Manual, 2nd ed., Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, xxii + 580 pp. Chapter in book Cruz OG 1911. The prophylaxis of malaria in central and southern Brasil. In R Ross, The Prevention of Malaria, John Murray, London, p. 390-398.

Illustrations: Figures and tables must be understandable without reference to the text. - Figures should be mounted on a manuscript-size sheet. Photographs must be sharply focused, well contrasted, black and white glossy prints. Photographs and line drawings must be marked on the back with the author's name, the figure number and an arrow pointing to the top. If mounted onto a plate, the figures should be numbered consecutively with Arabic numbers. Magnification must be indicated by a line or bar in the figure, and referenced, if necessary in the caption (e.g., bar = 1 mm). Plates and line figures should either fit one column (8 cm) or the full width (16.5 cm) of the page and should be shorter than the page length to allow inclusion of the legend. Legends must be provided on a separate sheet. Letters and numbers on figures should be of a legible size upon reduction or printing. Collour illustrations can only be accepted if the authors defray the cost. However, a colour photograph illustrates the cover of each issue of the Journal and authors are invited to submit illustrations with legends from their manuscript for consideration for the cover at no charge. - Tables should supplement, not duplicate, the text and should be numbered with Roman numerals. A short descriptive title should appear above each table, with any explanations or footnotes (identified with a, b, c, etc.) below.

Short communications should communicate rapidly single results or techniques. They should occupy no more than three printed pages including figures and/or tables. They should not contain excessive references. References should be cited at the end of the paper using the same format as in full papers. A brief summary and three key words must be provided.

Alternative format: manuscripts may be submitted following the "Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals" produced by the Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 89

International Committee of Medical Journal Editors also known as the Vancouver Style. In this case, authors should follow the guidelines in the fifth edition (Annals of Internal Medicine 1997; 126: 36-47, or at the website http://www.acponline.org/journals/resource/unifreqr/htm) and will be responsible for modifying the manuscript where it differs from the instructions given here, if the manuscript is accepted for publication. Authors should also follow the Uniform Requirements for any guidelines that are omitted in these Instructions.

Once a paper is accepted for publication, the authors must provide:

• a diskette containing the text of the final approved version of the manuscript (including tables and graphics) in Word or Word Perfect for Windows format (Macintosh formats should be converted); • an affidavit, provided by the Editorial Office, signed by all authors. Authors from different countries or institutions may sign in different sheets containing the same basic statement; • a copyright assignment form, provided by the Editorial Office, signed by the corresponding author.

Page charges: there will be no page charges. Proofs: one set of page proofs will be supplied for the author to check for typesetting accuracy, to be returned by the stipulated date. No changes to the original manuscript will be allowed at this stage. Offprints: authors will receive 30 free offprints. An order form will be sent to the author enabling further offprints to be ordered at prices listed on the form. Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 90

8.3 - Normas para publicação no periódico científico internacional Journal of Medical Entomology Journal of Medical Entomology

About this Journal Online Edition (1999-Current) Contents and PDF Reprints (1997-2000) Publish with ESA (Information for Contributors) A dvertise in this publication Subscription Information Buy Back Issues

About this Journal Journal of Medical Entomology is published bimonthly in January, March, May, July, September, and November. The journal publishes reports on all phases of medical entomology and medical acarology, including the systematics and biology of insects, acarines, and other arthropods of public health and veterinary significance. The journal is divided into the following sections: Morphology, Systematics, Evolution; Sampling, Distribution, Dispersal; Development, Life History; Population and Community Ecology; Behavior, Chemical Ecology; Population Biology/Genetics; Molecular Biology/Genomics; Neurobiology, Physiology, Biochemistry; Vector Control, Pest Management, Resistance, Repellents; Arthropod/Host Interaction, Immunity; Vector/Pathogen/Host Interaction, Transmission; Vector-Borne Diseases, Surveillance, Prevention; Direct Injury, Myiasis, Forensics; Modeling/GIS, Risk Assessment, Economic Impact. In addition to full-length research articles, the journal publishes interpretive articles in a Forum section, Book Reviews, Short Communications and Rapid Communications. Short Communications should be prepared similarly to articles; however, the "Materials and Methods" and "Discussion" should be briefer. Total length should be 2,000 words or less. Rapid Communications should address late-breaking news and extremely time-sensitive material. Submissions are limited to 2,000 words and are assessed higher editorial review charges to cover costs for rapid review and typesetting. Click here for additional information and criteria for submitting a Rapid Communication. The journal has an Editor-in-Chief and Subject Editors who are volunteers from among the ESA membership. The Editor-in-Chief applies for the position and is appointed by the ESA Governing Board based on a recommendation from the journal's editorial board. Subject Editors are recommended by the Editor-in-Chief and approved by the journal's editorial board. The usual term for editors is five years with an option for renewal. Editors are responsible for the review and acceptance or rejection of Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 91

manuscripts submitted for publication and can recommend changes in editorial style and policies. The editorial board comprises one representative each from Sections A, B, C, E, and F and five representatives from Section D.

Editor-in-Chief: Walter J. Tabachnick Florida Medical Entomology Lab, Vero Beach, FL [email protected] Subject Editors: Thomas R. Burkot CDC-NCID, Atlanta, GA [email protected] Gary G. Clark USDA, Gainesville, FL [email protected] John Marshall Clark University of Massachusetts, Amherst, MA [email protected] Jonathan F. Day University of Florida, Vero Beach, FL [email protected] Ann M. Fallon University of Minnesota, St. Paul, MN [email protected] Lane D. Foil Louisiana State University, Baton Rouge, LA [email protected] Howard S. Ginsberg USGS Patuxent Wildlife Research Center, Kingston, RI [email protected] Laura C. Harrington Cornell University, Ithaca, NY [email protected] Uriel Kitron University of Illinois, Urbana, IL [email protected] Phillip G. Lawyer USUHS, Bethesda, MD [email protected] Leon P. Lounibos Florida Medical Entomology Lab, Vero Beach, FL [email protected] Timothy J. Lysyk Agriculture & Agri-Food Canada, Lethbridge Research Center, Lethbridge, AB, Canada [email protected] Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 92

Richard W. Merritt Michigan State University, East Lansing, MI [email protected] Roger D. Moon University of Minnesota, St. Paul, MN [email protected] Douglas E. Norris Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, Baltimore, MD [email protected] William K. Reisen Arbovirus Field Station, Bakersfield, CA [email protected] Richard C. Russell University of Sydney, Sydney, Australia [email protected] Christopher J. Schofield LSHTM, London, United Kingdom [email protected] [email protected] Daniel E. Sonenshine Old Dominion University, Norfolk, VA [email protected] Daniel A. Strickman USDA-ARS, Beltsville, MD [email protected] Guiyun Yan University of California, Irvine, CA [email protected] Book Review Editor: Jonathan G. Lundgren USDA-ARS, Northern Grain Insects Research Laboratory, Brookings, SD [email protected] Editorial Board: Please click here for the current Editorial Board of the Journal of Medical Entomology. Please click here for the current terms of office for the Editorial Board. Managing Editor: Alan Kahan Entomological Society of America 10001 Derekwood Lane, Suite 300 Lanham, MD 20706-4876 Phone: 301-731-4535, ext. 3020 Fax: 301-731-4538 [email protected] Issue Manager: Lathifah M. Ibrahim Cadmus Professional Communications 940 Elkridge Landing Road Linthicum, MD 21090-2908 Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 93

Phone: 800-257-5529 or 410-691-6998 Fax: 410-691-6929 [email protected] Submit a Manuscript

To submit a manuscript for publication in one of the four ESA journals, Annals of the Entomological Society of America, Environmental Entomology, Journal of Economic Entomology, or Journal of Medical Entomology, please see below. To submit manuscript for publication in American Entomologist, Arthropod Management Tests, or the Thomas Say books, please refer to the specific submission requirements noted on each publication's home page.

Journal Submissions The four journals published by ESA primarily contain research articles, all of which are peer reviewed before being accepted for publication. The manuscript review process is described in the "Publishing Policies and Procedures" section. In addition to scientific research articles, all four journals publish letters to the editor, interpretive or evaluative articles that appear in a Forum section, and book and media reviews. Manuscripts that describe entomological techniques and computer software programs generally are not considered for publication in the journals, although software programs can be covered in the book and media reviews section. Papers that are published in the Forum section are authored by acknowledged leaders in the field. Forum articles are reviews of a research area that include a stimulating, thought-provoking discussion and that focus on important, and sometimes controversial, issues. They should provide an innovative approach to current thought and speculate about future research directions. Forum articles may also be written by invitation of the journal editor-in-chief.

Where to Submit All articles should be submitted electronically using the ESA web-based Rapid Review system. Go to http://www.rapidreview.com and select the "Author Log On" button next to the ESA journal titles. All authors using Rapid Review are required to set up an account by filling in their contact information and determining their user name and password. Once a paper is submitted through the system, the author can log on subsequently and see the status of his or her manuscript.

General Submission Instructions All manuscripts submitted to the Entomological Society of America should be written with clarity and readability in mind. Manuscripts are subject to editing to ensure conformity to editorial standards and journal style. Consult the Council of Biology Editors' style manual, Scientific Style and Format Manual for Authors, Editors, and Publishers, 6th ed., along with recent issues of the journal for style and format. Follow the requirements shown below when preparing manuscripts and refer to specific ESA editorial standards as noted in the ESA Style Guide. Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 94

• Submit manuscript as an MS Word, WordPerfect, or RTF file with a page size of Letter, 8.5 x 11". • Use continuous line numbers on all text and reference pages. For instructions on how to insert line numbers, click here. • Type all as double-spaced, with 1-inch margins, and do not right justify text. • Use the font Times (New) Roman with a size of 12 point. • Left-justify the title, author line, affiliation lines, subheadings, text, and References Cited. • Insert tabs, not spaces, for paragraph indents. • Use italicization only to indicate scientific names (including viruses), symbols or variables, and words that are defined. • Use quotation marks for quoted material only. • Use American English spelling throughout and follow Merriam-Webster's New Collegiate Dictionary, 10th ed., for guidance on spelling. • Number pages consecutively, beginning with the title page. • Begin each of the following on a separate page and arrange in the following order: title page, abstract and key words (three to six words), text, acknowledgments, references cited, footnotes, tables, figure legends, and figures. • Type all captions on a separate page and put each figure and table on a separate page. Refer to the Figures section of the ESA Style Guide for information on how to submit figures. Refer to the ESA Style Guide for additional information.

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Voucher Specimens

Abbreviations Use standard abbreviations as listed in the Council of Biology Editors’ Scientific Style and Format, The CBE Manual for Authors, Editors, and Publishers, 6th ed., or those listed in this guide. Avoid nonstandard abbreviations. Abbreviations for Time Use the following abbreviations for time: h (hour), min (minute), s (second), yr (year), mo (month), wk (week), d (day). Do not add "s" to create plurals (e.g., wks). Fig./Figs. Use "Fig." if singular and "Figs." if plural (e.g., Fig. 1; Figs. 2 and 3). Dates Present dates in this format: day month year (e.g., 23 January 1997). Do not abbreviate names of months in text. Metric Units Use metric units. English units may follow within parentheses only if they are of direct practical purpose. Liter Do not abbreviate "liter" by itself or when accompanied by a numeral. % versus percentage Use "%" only with numerals and in tables and figures. Close up space to numerals (e.g., 50%). Otherwise, use the word percentage (e.g., percentage of defoliation). Per versus slash Use "per" rather than a slash unless reporting measurements in unit to unit (e.g., insects per branch, not insects/branch; but g/cm2, not g per cm2

Abstract and Key Words On a separate page, provide an abstract of fewer than 250 words. Give scientific name and authority at first mention of the subject organism. Do not cite references, figures, tables, probability levels, or results. Refer to results only in the general sense. Place three to five key words on a line below the abstract. Optional foreign language abstract: All articles will have an English abstract. However, to encourage international communication, authors may include a second abstract in a Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 96

language other than English. (Spanish, French, German, Russian, Portuguese, Chinese, or Japanese are accepted.) It is the author's responsibility to provide an accurate, and grammatically correct non-English version. Do not repeat the keywords.

Acknowledgment Place the acknowledgments after the text. Organize acknowledgments in paragraph form in the following order: persons (omit all professional titles and degrees), groups, granting institutions, grant numbers, and serial publication number.

Common Names Use only those common names cited in the current ESA Common Names of Insects & Related Organisms online database, or those names approved by the ESA Common Names Committee. Do not use any other common name. Do not abbreviate common names (e.g., CPB for Colorado potato beetle). Give scientific name and authority at first mention of each organism (including plants) in the abstract and again in the text.

Figures Figures may be embedded in the manuscript text file for the initial Version 1 submission, but for accepted manuscripts of Version 2 or higher, figures must be attached as separate TIFF, EPS, or PowerPoint files. For more information on preparing digital figures see the section on Digital Art Preparation. For review purposes, it is acceptable to include figures, whether in black and white or color, as part of the manuscript file, with each figure on a separate page. Figures should be inserted in the manuscript file in one of the following formats: TIFF, EPS, WMF, or JPEG. GIF formats, such as from websites, are not acceptable and produce poor quality printouts because of low resolution, even for peer review purposes. Charts from Excel and SigmaPlot should not be inserted unless they are in one of the above formats. Figure Preparation Although figures of any size can be submitted, figures that fit exactly the width of 1 column (72 mm) or 2 columns (148 mm) expedite the publication process. Figures should be no longer than 195 mm from top to bottom. Separate parts of the same figure must be grouped together and arranged to use space efficiently. Wherever possible, it is best to avoid using a full page for a set of illustrations. That is, authors should attempt to have each figure appear separately from the others and should consider numbering illustrations as separate figures rather than as multiple parts of the same figure. When choosing a font size, remember that it should be large enough so that reduction to fit the journal page will not make lettering difficult to read. Final lettering size should be 8 or 9 point using the fonts Arial or Helvetica or Times New Roman or Times Roman. Letter locants on figures composed of more than one element should match those in the text (either upper- or lowercase). Use a scale bar in lieu of magnification, Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 97

and define scale in the figure caption. Figures will not be relettered nor will flaws be corrected. Authors are urged to refer to our Digital Art Preparation section for detailed information and specifications for on preparing digital art. Or, contact the publications office at 301- 731-4535, ext. 3020 or [email protected] with questions concerning the preparation of artwork. Photographs See the Digital Art Preparation section on how to submit photographs. Remember to scan black and white photos as grayscale and not color. For color photos, use the CMYK color mode, not RGB. Save photos in the TIFF format. Abbreviations and Symbols Abbreviations and symbols in figures should match those in the text or be defined in legends. Figure Captions Type all captions double-spaced on a separate page. All captions should be in paragraph form as shown by the example below. Fig. 1. Relationship between percentage of defoliation of oak trees and gypsy moth population density. (A) Defoliation and egg mass density. (B) Defoliation of egg density. Letter locants on figures composed of more than one element should match those in the text (either upper- or lowercase). Do not use equal signs to define abbreviations; use commas (e.g., Ap, barometric pressure).

Footnotes to the Text Avoid footnotes in the text. Use unnumbered footnotes only for disclaimers and animal use information. Use numbered footnotes (superscripted) only for addresses of authors. Place all footnotes on a separate page after References Cited. Unnumbered footnotes precede numbered footnotes. Examples of footnotes are: Unnumbered Footnotes This article reports the results of research only. Mention of a proprietary product does not constitute an endorsement or a recommendation by the USDA for its use. In conducting the research described in this report, the investigators adhered to the "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals," as promulgated by the Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council. The facilities are fully accredited by the American Association of Laboratory Animal Care. Numbered Footnotes 1Department of Entomology, University of Colorado, 345 East 7th Street, Denver, CO 78095.

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Gene Sequencing Inclusion of a GenBank/EMBL accession number for primary nucleotide and amino acid sequence data is a criterion for the acceptance of a manuscript for publication. Sequences from new species and new genes must indicate the proportion of the gene sequenced and should include data from both strands. The accession number may be included in the original manuscript or the sequence may be provided for review and an accession number provided when the manuscript is revised. A manuscript will not be accepted for publication until the accession number is provided. GenBank may be contacted at their website at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/submit.html. The EMBL Data Library may be contacted at their website at http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/index.html. Model Analysis At the beginning of the manuscript, authors should state clearly the goals of their model construction and analysis. Evaluation by reviewers depends upon these goals and the type of model. Authors should attempt to describe the main conclusions, limitations, and sensitivity of results to assumptions. For stochastic models, describe the variability in the results. Modeling Guidelines The following guidelines pertain to any mathematical model calculated for purposes other than statistical analysis. Authors must adequately describe both model structure and model analysis. Authors must explain and justify original equations and computer programs or justify the selection of a published software package used in the computation of models. Model structure and steps in the analysis must be described in the Materials and Methods section. Without presenting extensive computer code, the text must permit an understanding of the model that would allow most mathematically inclined scientists to duplicate the work. Present all equations that represent the biology of the system being modeled. Unless their derivation is self-evident, show how the equations were derived and mention the underlying assumptions. Express how the equations are solved over time and space. Provide references for standard techniques (e.g., matrix manipulation, integration). Define all variables and parameters in each equation and describe their units (e.g., time, space, and mass). In the Materials and Methods or Results section, present the range of parameter values included in the model, and describe the uncertainty in or range of validity of these values.

Numbers Spell out numbers at the beginning of a sentence. Spell out the numbers one through nine (10 and up are always used as numerals), unless they are used as units of measure (e.g., eight children, three dogs, 8 g, 3 ft, 0600 hours; NOT 8 children, 3 dogs, eight grams, three feet, or six o'clock am). This includes spelling out the ordinals first through ninth, along with twofold, one-way ANOVA, and one-half. Ordinals from 10 and higher are numerals, such as 10th or 51st. In some cases, such as where there is a long list of items (e.g., 8 flies, 6 mosquitoes, 4 butterflies, and 10 bees), exceptions can be made if the editor concurs. The editorial staff will have flexibility in interpreting the rule. Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 99

Zeros with P values All numbers <1 must be preceded by a zero (e.g., P < 0.05). Commas When a number is >1,000, use a comma to separate hundreds from thousands. Semicolon Use a semicolon to separate different types of citations (Fig. 4; Table 2). Repeating symbols It is not necessary to repeat symbols or units of measure in a series (e.g., 30, 40, and 60%, respectively).

Order of Elements Order of elements are as follows: title page; Abstract and key words; introduction (no heading); Materials and Methods; Results; and Discussion (or Results and Discussion); Acknowledgments; References Cited; footnotes; tables; figure legends; and figures.

References Cited Cite only those articles published or formally accepted for publication (in press). Include all references mentioned in text. Include enough information to allow reader to obtain cited material (e.g., book and proceedings citations must include name and location [city and state or country] of publisher). Abbreviate journal titles according to the most recent issue of BIOSIS Serial Sources. Citations and References should not be numbered. References Cited: Chronological order Single Author (Smith 1993) Two Authors (Smith and Jones 1993) Multiple Citations (Smith 1996, Smith et al. 1997, Jones 1998) Multiple Publications by Same Author(s) (Smith et al. 1995a, 1995b, 1997; Jones 1996) Personal Communications (Jones 1988; L. J. Smith, personal communication). Obtain and forward (at submission) a letter of permission to use citations to personal communications (from those other than authors). Unpublished Data (L.J.S., unpublished data) for one author or (unpublished data) for all authors. Obtain and forward (at submission) a letter of permission to use citations to unpublished data (from those other than authors). Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 100

In Press (Smith 1997) for in press, cite projected year of publication. Software (PROC GLM, SAS Institute 1999) for software user's manual References Cited: Alphabetical order (chronological for one author or more than two authors, and alphabetical order [by surname of second author] for two authors) Journal Articles Evans, M. A. 2000. Article title: subtitle (begin with lowercase after colon or dash unless first word is a proper noun). J. Abbr. 00:000–000. Evans, M. A. 2001a. Title. J. Abbr. 00: 000–000. Evans, M. A. 2001b. Title. J. Abbr. 00: 000–000. Evans, M. A., and R. Burns. 2001. Title. J. Abbr. 00: 000–000. Evans, M. A., and A. Tyler. 2001. Title. J. Abbr. 00: 000–000. Evans, M. A., A Tyler, and H. H. Munro. 2000. Title. J. Abbr. 00: 000–000. Evans, M. A., R. Burns, and A. A. Dunn. 2001. Title. J. Abbr. 00: 000–000. In Press Evans, M. A. 2002. Title. J. Econ. Entomol. (in press). Books Burns, R. 2001. title: subtitle. Publisher, City, State. Evans, M. A. 2001. Colorado potato beetle, 2nd ed. Publisher, City, State or Country. Tyler, A. 2001. Western corn rootworm, vol. 2. Publisher, City, State or Country. Article/Chapter in Book Tyler, A. 2001. Article or chapter title, pp. 000–000. In T.A.J. Royer and R. B. Burns (eds.), Book title. Publisher, City, State or Country. Tyler, A., R.S.T. Smith, and H. Brown. 2001. Onion thrips control, pp. 178–195. In R. S. Green and P. W. White (eds.), Book title, vol. 13. Entomological Society of America, Lanham, MD. No Author Given (USDA) U.S. Department of Agriculture. 2001. Title. USDA, Beltsville, MD. (IRRI) International Rice Research Institute. 2001. Title. IRRI, City, State or Country. Proceedings Martin, P. D., J. Kuhlman, and S. Moore. 2001. Yield effects of European corn borer (Lepidoptera: Pyralidae) feeding, pp. 345–356. In Proceedings, 19th Illinois Cooperative Extension Service Spray School, 24–27 June 1985, Chicago, IL. Publisher, City, State. Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 101

Rossignol, P. A. 2001. Parasite modification of mosquito probing behavior, pp. 25– 28. In T. W. Scott and J. Grumstrup-Scott (eds.), Proceedings, Symposium: the Role of Vector-Host Interactions in Disease Transmission. National Conference of the Entomological Society of America, 10 December 1985, Hollywood, FL. Miscellaneous Publication 68. Entomological Society of America, Lanham, MD. Theses/Dissertations James, H. 2001. Thesis or dissertation title. M.S. thesis or Ph.D. dissertation, University of Pennsylvania, Philadelphia. Software SAS Institute. 2001. PROC user's manual, version 6th ed. SAS Institute, Cary, NC. URL Citations Reisen, W. 2001. Title. Complete URL (protocol://host.name/path/file.name).

Reporting Requirements for Statistical Tests All data reported (except for descriptive biology) must be subjected to statistical analysis. Descriptive biology should include information such as sample sizes and number of replications. Authors are responsible for the statistical method selected and for the accuracy of their data. Authors should be able to justify the use of a particular statistical test when requested by an editor. Results of statistical tests may be presented in the text, in tables, and in figures. Statistical methods should be described in Materials and Methods with appropriate references. Experimental designs should also be described fully in Materials and Methods. Descriptions should include information such as sample sizes and number of replications. See specific section in this style guide for suggestions on formatting statistical results. Only t-tests and analyses of variance require no citation. Cite the computer program user's manual in the References Cited. Probit/logit When presenting results of probit/logit analysis, these columns should be included in tables (in this order, left to right); n, slope + SE, LD (or LC) (95% CL), and chi-square. When a ratio of one LD versus another is given, it should be given with its 95% CI. Statistical tests to show what model best fits data intended to estimate the 99.9986% level of effectiveness should be presented to justify use of any model, including the probit model. Thus, we do not recommend use of the Probit 9 without tests to show that the probit model fits the data. Analysis of Variance or t-test When presenting the results of analysis of variance or a t-test, specify F (or t) values, degrees of freedom, and P values. This information may be placed in parentheses in the text. Example: (F = 9.26; df = 4, 26; P < 0.001). If readability of the text is affected by the presence of repeated parenthetical statistical statements, place them in a table. Regression In regressions, specify the model, define all variables, and provide estimates of variances for parameters and the residual mean-square error. Italicize variables in equations and text. Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 102

Variance and sample size Include an estimate of the variance and sample size for each mean regardless of the method chosen for unplanned multiple comparisons.

Structure of Computer Code For models solved or simulated by computers, mention the programming language and computer used. Describe the important numerical methods used in calculating the model (e.g., integration and random number generation). Mention how the program's logic and algorithms were tested and verified. When published software is computed, provide a reference and state which procedures were used. Discuss in any section of the manuscript the limitations of the published software. Original computer programs should be made available at the request of reviewers and readers.

Tables Place tables after the References Cited section. Double-space and number all tables. Boldface table title. Do not repeat data already presented in text. If a table continues on more than one page, repeat column headings on subsequent page(s). Click here to see a sample table Title Title should be short and descriptive. Boldface table number and title only. Include "means + SEM" in title if applicable. Do not footnote title; use the unlettered first footnote to include general information necessary to understand the table (e.g., define terms, abbreviations, and statistical tests). Lines Use horizontal lines to separate title from column headings, column headings from data field, and data field from footnotes. Do not use vertical lines to separate columns. All columns must have headings. Abbreviations Use approved abbreviations. Use abbreviations already defined in the text and define others in the general footnote. Use the following abbreviations in tables only: amt (amount), avg (average), concn (concentration), diam (diameter), exp (experiment), ht (height), max (maximum), min. (minimum), no. (number), pop (population), prepn (preparation), temp (temperature), vs (versus), vol (volume), wt (weight). Use the following abbreviations for months: Jan., Feb., Mar., April, May, June, July, Aug., Sept., Oct., Nov., and Dec. Operational Signs Repeat operational signs throughout data field. Insert a space on either side of sign (1.42 ± 1.36). Spacing Leave no space between lowercase letters and their preceding values (e.g., 731.2ab). Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 103

Footnotes to Tables Use footnotes to define or clarify column headings or specific datum within the data field. Do not footnote the title; use the unlettered first footnote to include general information necessary to understand the table (e.g., define terms, abbreviations, and statistical tests). The use of asterisks is reserved for statistical significance only. Example: Means within a column followed by the same letter are not significantly different (P < 0.05; Student t-test [Abbott 1925]). *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; NS, not significant). Use lowercase italicized superscripted letters to indicate footnotes. Footnote letters should appear in the table in consecutive order, from left to right across the table then down the page.

Taxonomy Follow the International Code of Zoological Nomenclature, 4th ed., for taxonomic style. Center the heading that indicates the name of the taxon in bold type. Center figure numbers in parentheses under the main heading; do not use bold type. Start all synonomies at the left margin with runovers indented. Include authors and date. References must appear in References Cited section. Use telegraphic style throughout descriptions. For Journal of Medical Entomology Authors only: Please refer to the journal's Policy on Names of Aedine Mosquito Genera and Subgenera if writing about these insects. Taxonomy Headings Use only acceptable 3rd-level subheadings such as: • Male • Female • Material Examined • Type Material • Distribution • Etymology • Biology • Discussion Avoid using Description as a subheading. Dates Use Roman numerals I through XII to designate month of collection. Use arabic numerals 00 through 99 to designate collection years in the 20th century. Do not abbreviate other years, including the 21st century. Express data in this format: day- month (use a Roman numeral)-year. Example: 2-V-97. Locality Other than Principal Types Start with the largest area followed by successively smaller areas separated by colons. Capitalize countries. Arrange data for each locality in the following order: count of specimens and sex or stage (as applicable), city or vicinity, date, collector, and Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 104

depository. Example: MEXICO: Tamaulipas: 1 male, 1 female, Ciudad Mante, 15-III- 97, K. Haack; 5 females, Ciudad Victoria, 3-VII-99, C. Hughes, MCZ. Arrange localities alphabetically. Use a semicolon to separate data for different localities. Define depositories in the Materials and Methods. Type Material Start description with the principal type in capital letters. Follow this immediately with count and sex of specimens (use male and female symbols if possible), then place additional data in the order of locality, date, additional data, and collector. Separate these items with commas. Example: HOLOTYPE: 1 male, Locust Grove, VA, 22-X-98, on Cercis canadensis, R. H. Foote. PARATYPES: 2 males, same data.

Text The introduction should clearly state the basis of your study along with the background of the problem and a statement of purpose. The Materials and Methods section should include a clear and concise description of the study design, experimental execution, materials, and method of statistical analysis. Results should be clearly differentiated from the interpretation of your findings in the Results section or within the Results and Discussion. Cite tables and figures in numerical order as they should appear in the text. Include suggestions for direction of future studies, if appropriate. Scientific Names Scientific names and authorities must be spelled out (except for Fabricius and Linnaeus, which are abbreviated as F. and L., respectively) the first time a species is mentioned in the abstract and again in the main body of text. Use of "Stadium," "Stage," and "Instar" Manuscripts received for publication in ESA periodicals refer to arthropods and the periods of time in their development in various ways. These designations should be used consistently. Stadium (Plural: Stadia): The period of time between two successive molts. Stage: One of the successive principal divisions in the life cycle of an arthropod (e.g., egg, nymph, larva, prepupa, pupa, subimago, and adult). Instar: The arthropod itself between two successive molts. For the purposes of the definition, hatching is considered a molt. Examples of Usage: Nymphs feed on the underside of leaves during the first stadium. Larvae of some dermestids go through an indefinite number of stadia (or have an indefinite number of instars). The nymphs were reared through the fifth stadium. Immature stages (e.g., eggs, larvae, and pupae; eggs and nymphs) are illustrated. First instar of cerambycids make galleries in wood. Some 200 first-instar spiderlings were collected. The predators fed readily on early instars of the face fly. Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 105

Heading Levels First-level headings are centered and boldfaced on their own line. Initial capital letters. Used to divide the manuscript into major sections (e.g., Materials and Methods, Results). Second-level headings are flush left, boldface, and are also on their own line with initial capital letters. Second-level headings are rarely used except in taxonomic articles where multilevels of headings may be necessary.) Third-level headings are boldfaced, paragraph indented, have initial capital letters, and are followed by a period. Third-level headings are used to divide first-level sections into smaller sections. Fourth-level headings are italicized (but not boldfaced), paragraph indented, have initial capital letters, follow immediately after a third-level heading or start a new paragraph, and are followed by a period. Fourth-level headings are used to divide third-level sections into smaller sections. Capitalization Do not capitalize the following words in subheadings: a, an, and, as, at, be, by, for, from, in, into, near, of, on, per, to, the, through, upon, with, without, within. Manufacturers In parentheses, provide manufacturer's name and location (city, state) and model number of relevant materials and equipment. Example: (Model 3000, LI-COR, Lincoln, NE). Use generic names when possible (e.g., self-sealing plastic bags). Software Cite user's manuals in the text (e.g., SAS Institute 1998) and in References Cited section (e.g., SAS Institute. 1998. User's manual, version 7.0. SAS Institute, Cary, NC). Equations Consult Mathematics into Type for correct formatting of equations and mathematical variables. Italicize all mathematical variables. Center more complex equations on a separate line.

R = A barrtype + Blog 10 (f) (2)

Title Page The title page should include the name, complete address, phone number, fax number, and e-mail address of corresponding author. Include a running head of <65 characters, including author names. Example: Smith and Jones: Biological Control of C. capitata (no period). For more than two authors, use the senior author's name followed by et al. Example: Smith et al.: Biological Control of C. capitata (no period). Include the section of the journal. Amaro NB – Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - Parasitologia – IPTSP / UFG – 03/2007 106

The title should be concise and informative. Include either the ESA approved common name or the scientific name, but not both of the subject. Common names used in the title must be listed in the ESA Common Names of Insects & Related Organisms. Do not include authors of scientific names in the title. Do not capitalize the following words in the title or subheadings: a, an, and, as at, by, for, from, in, into, near, of, on, to, the, through, upon, without, within. Insert (Order: Family) immediately after the name of the organism. Include all authors’ names below the title. Affiliation line includes a complete address. If appropriate, designate current addresses for all authors by numbered footnotes (superscripted numbers) placed at the bottom of the title page. Numbers are placed outside commas in multi-authored articles. Click here to see a sample title page

Validation or the Testing of Model Results Authors must state why the model did not require testing (e.g., theoretical study), why it cannot be tested (e.g., lack of data), or how it was tested. Data used for testing must be independent of data used to build or calibrate the model. Describe the data and procedures in Materials and Methods. Authors should be aware that the testing of models is an important step that should be a part of most studies.

Voucher Specimens Voucher specimens of arthropods serve as future reference for published names used in scientific publications. Although the deposition of voucher specimens is not required as a condition for publication, authors are encouraged to deposit specimens in an established, permanent collection and to note in the published article that the expected deposition has been made and its location. Authors should contact the curator of a voucher repository before deposition concerning the procedures required for curation to ensure that the collection will accept the voucher materials. The designation and proper labeling of voucher specimens is the author's responsibility. When available, at least three specimens should be deposited. Each specimen should have the following information provided at the time of deposition: • Standard label data that are required for the specimens collection (i.e., locality, date of collection, collector, host, ecological data, whether the specimen is from a laboratory collection, etc.). • An identification label that includes the identifier and date of identification. • A label that designates the specimen as "voucher."