Análises Proteômicas, Anti-Venômicas E Isolamento De Novas Proteínas Com Atividade Citotóxicas De Venenos Elapídicos
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA Análises Proteômicas, Anti-venômicas e Isolamento de Novas Proteínas com Atividade Citotóxicas de Venenos Elapídicos Orientador: Dr. Adriano Monteiro de Castro Pimenta Paula Henriques Cruz Ciscotto Agosto/2011 PAULA HENRIQUES CRUZ CISCOTTO Análises Proteômicas, Anti-venômicas e Isolamento de Novas Proteínas com Atividade Citotóxicas de Venenos Elapídicos Tese submetida ao Curso de Pós- graduação em Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do título de doutor em Bioquímica. Belo Horizonte Minas Gerais/Brasil 2011 II Apaixone-se por um sonho, acredite que tudo dará certo, pois somente a sua fé trará seu sonho para perto de você.... No final, poderá contemplar a magia de tudo aquilo que teve fé.....Tudo que aconteceu é merecimento, por seus sinceros desejos.... (Fabiana Thais Oliveira) III Agradecimentos: Aos meus pais por sempre estarem ao meu lado, incentivando meu crescimento pessoal e profissional e apoiando minhas decisões. Apoiando as mudanças de vida. Ao Prof. Adriano M. C. Pimenta por dar continuidade à minha trajetória científica pelo caminho da especialização profissional e por depositar em mim sua confiança para realização deste trabalho. Pelas conversas e desabafos. Ao Dr. Michael Richardson pela ajuda na determinação da seqüência de aminoácidos, das proteínas purificadas. Ao Msc. Breno Rates pela ajuda no sequenciamento de novo. Ao Dr. Carlos Bloch pela colaboração feita entre os laboratórios. Ao Dr. Luciano pela paciência, pelos ensinamentos e colaboração na determinação das sequências das proteínas. Ao Dr. Eduardo Ferraz Coelho e ao Msc. Diogo Valadares pela colaboração nos experimentos de atividade anti-Leishmania e citoxicidade em macrófago. À Élida Monteiro Andrade pela colaboração e ensinamentos nos ensaios de 2D- immunobloting. Ao Dr. Eládio Sanchez pela doação do veneno peruano da espécie M. spixii. Á Wany Slena Maria pela colaboração, ao ceder os soros anti-Elapídicos específicos. Ao Dr. Prof. Carlos Chavez pelas palavras de incentivo, desta forma, deu continuidade à orientação do mestrado. Como diz o ditado: O bom filho a casa torna. À Dra. Profa. Maria Elena pelo carinho demonstrado em todos os dias de convivência. Aos conselhos no final desse caminho e a indicação para início de um próximo. Á todos colegas e ex-colegas de laboratório que durante estes anos ou parte dele, fizeram parte do meu dia-dia, contribuindo com suas experiências e incentivos. Agradeço a todos vocês pelos dias de alegria e também de dificuldade que passamos IV juntos, o que sempre nos leva a um crescimento pessoal. Na vida, além do conhecimento adquirido, o mais interessante é a relação interpessoal, no qual conhecemos pessoas que permanecerão em nosso coração ou em nossa lembrança. Vocês sempre estarão comigo. Em especial, vai um agradecimento para Alexandre Dutra, Vitor Minelli, Juliana Cassoli, Ricardo Andrez, Cristina Monerat, Breno Rates, Rodrigo Novaz, Melissa Assef, Micheline Donato, Daniele Nascimento, Thiago Braga, Marcela Nunes, Beatriz Adaime, Rosângela Romeo, Karla Ferraz, Daniel Santos, pela amizade e amadurecimento de vida. Aos grandes amigos que de alguma forma sempre me deram força: Thais Ciscotto, Fabiano Straposkovisk, Lele, Xande, André Roberto, Bruninho, Luiz, Marcelo Bulhões, Cris e Cadinho. Amigos são os que sorriem na sua alegria, e não simplesmente, os que lhe aconselham na tristeza. Ao, Pedro, que apesar de surgir no final dessa etapa de vida, foi quem me deu força e coragem para continuar, para acabar e para iniciar uma nova etapa... Pessoas aparecem na nossa vida e sempre tem um por quê, um pra que. Quando menos esperamos, parece que algo está reservado. São situações que parecem coincidências. Situações que remetem ao destino. Espero que você continue fazendo parte da minha vida. Esp.F12! Deus... uma força maior que não fazia tanto parte dos meus pensamentos. Hoje, uma fé interior e um sentimento superior, que me dá brilho, força, coragem, atitude pra ir atrás de metas, objetivos e sonhos. Que me tira o medo do novo. Me tira o medo de viver a vida. Que me dá uma sensação plena de que tudo vai dar certo. Pois agora é a hora, porque esse é o momento reservado para a minha felicidade. Me dá um claro sentimento de que agora é a hora de uma grande realização profissional, de vida e de emoção. Agradeço a todos citados acima. Nessa vida não viemos só, não vamos só. Sempre levarei todos no meu coração e na minha mente. Amadurecimento, é vivência, é aprendizado, e foi com vocês que hoje me tornei esse ser lindo, seja profissional ou pessoalmente falando. V ÍNDICE Páginas LISTA DE AMINOÁCIDOS....................................................................... VIII LISTA DE ABREVIATURAS..................................................................... IX LISTA DE FIGURAS................................................................................... XI LISTA DE TABELAS.................................................................................. XIII RESUMO....................................................................................................... XVI ABSTRACT................................................................................................... XVIII 1.INTRODUÇÃO.......................................................................................... 1 1.1 Aspectos gerais e dados epidemiológicos do ofidismo......................... 2 1.2 As serpentes........................................................................................... 7 1.2.1 Características morfológicas gerais e seus venenos....................... 7 1.2.2 Venenos Elapídicos........................................................................ 10 1.3 Principais famílias de toxinas dos venenos elapídicos: 3FTxs e PLA2......................................................................................................... 13 1.3.1Three-fingers–3FTxs (α-neurotoxinas e cardiotoxinas- citotoxinas)............................................................................................ 13 1.3.2 Fosfolipases (PLA2)....................................................................... 18 1.4 Gênero Micrurus................................................................................... 23 1.4.1 Características das serpentes.......................................................... 23 1.4.2 O veneno de Micrurus e suas toxinas........................................... 29 1.4.2.1 Atividade neurotóxica............................................................. 30 1.4.2.2 Atividade miotóxica................................................................ 31 1.4.2.3 Atividades proteolítica, hemolítica, hemorrágica e cardiovascular...................................................................................... 32 1.4.2.4 Toxinas dos venenos de Micrurus........................................... 33 1.5 Proteômica e os venenos ofídicos......................................................... 37 1.6 Sorologia e estudos anti-venômicos..................................................... 41 1.7 Venenos de serpentes e sua atividade antiparasitária........................... 46 2.OBJETIVOS............................................................................................... 50 2.1 Objetivos Geral..................................................................................... 51 2.2 Objetivos Específicos........................................................................... 51 3.METODOLOGIA...................................................................................... 53 3.1 Obtenção dos venenos.......................................................................... 54 3.2 Obtenção dos antivenenos.................................................................... 54 3.3 Dosagem de proteína............................................................................ 55 3.4 Cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas (LC/MS)...................................................................................................... 55 3.5 Cromatografia Líquida Bidimensional (2D-LC).................................. 56 3.6 Análises por Espectrometria de Massa................................................. 57 3.7 Determinação da seqüência N-terminal de proteínas isoladas............. 57 3.8 Pesquisa de Similaridade...................................................................... 58 3.9 Eletroforese bidimensional (Gel-2D).................................................... 58 3.10 Digestão tríptica (in gel)..................................................................... 59 VI 3.11 Imunoensaio – reação cruzada............................................................ 60 3.12 Fracionamento do veneno de M. lemniscatus...................................... 60 3.13 Análises estruturais das proteínas purificadas do veneno de M. lemniscatus...................................................................................................... 62 3.14 Atividade anti-Leishmania................................................................... 62 3.14.1 Cultivo dos parasitas...................................................................... 62 3.14.2 Ensaio de citotoxicidade em L.(L). amazonensis......................... 63 3.15 Ensaio de citotoxicidade em macrófago.............................................. 65 4.RESULTADOS.........................................................................................