Université De Pau Et Des Pays De L'adour Pour M’Avoir Confié Ce Travail De Recherche Et Pour Ses Précieux Conseils Au Cours De Ces Trois Années

THÈSE

Présentée à

UNIVERSITÉ DE PAU ET DES PAYS DE L’ADOUR

École Doctorale des Sciences Exactes et de leurs Applications

Par

Yannick COLIN

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR

Spécialité : Microbiologie

______

DEVELOPPEMENT METHODOLOGIQUE POUR L'ETUDE DE LA

DIVERSITE DES MICRO-ORGANISMES SULFATO-REDUCTEURS

ET LEUR ROLE DANS LA METHYLATION DU MERCURE

______

Soutenue publiquement le 19 décembre 2012

Après avis de :

M. Rutger DE WIT DR CNRS, Université de Montpelier 2 Rapporteur Mme Agnès HIRSCHLER-REA MC-HDR, Université de la Méditerranée Rapporteur

Devant la comission d’examen formée de :

Mme Karine ALAIN CR CNRS, Université de Bretagne Occidentale Examinateur M. Robert DURAN Pr, Université de Pau et des Pays de l’Adour Examinateur M. Rémy GUYONEAUD Pr, Université de Pau et des Pays de l’Adour Co-directeur de thèse M. Pierre CAUMETTE Pr, Université de Pau et des Pays de l’Adour Directeur de Thèse

REMERCIEMENTS

Je tiens dans un premier temps à remercier Monsieur Pierre Caumette, Professeur à l'Université de Pau et des Pays de l'Adour pour m’avoir confié ce travail de recherche et pour ses précieux conseils au cours de ces trois années. Je remercie également et Monsieur Rémy Guyoneaud, Professeur à l'Université de Pau et des Pays de l'Adour, co-encadrant de ce travail de thèse, pour sa sympathie, sa disponibilité, ses idées et ses conseils. Enfin, merci à Monsieur Robert Duran, Directeur de l'Equipe Environement et Microbiologie, qui m’a ouvert les portes du laboratoire.

Je tiens à remercier Monsieur Rutger DE WIT, Directeur de Recherche à l'Université de Montpelier 2, et Madame Agnès HIRSCHLER-REA, Maître de Conférences à l'Université d’Aix-Marseille, d’avoir accepté d’être les rapporteurs de ce travail.

Je remercie également Madame Karine Alain, Chargée de Recherche au laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes de Brest, d’avoir accepté de participer à ce jury, ainsi que pour sa disponibilité et son soutien durant mon Master à l’Univeristé de Bretagne Occidentale.

Ce travail est le résultat d’étroites collaborations avec le Laboratoire de Chimie Analytique Bio-inorganique et Environnement (CNRS UMR 5254). Je remercie David amouroux, Mathilde Monperrus, Emmanuel Tessier et Abu Sharif pour leurs collaborations.

J’aimerai adresser un remerciement particulier à Monsieur Phillipe Goulas pour m’avoir permis d’effectuer mon enseignement de monitorat à l'Univeristé de Pau et des Pays de l'Adour. et pour sa confiance dès mon entrée en fonction. Je remercie les autres enseignants avec qui j’ai eu le plaisir de travailler (Beatrice Lauga, Christine Cagnon, Pierre Sivadon et Jérome Gury)

Ce travail n’aurait pu aboutir sans l’aide de nombreuses personnes. J’adresse une pensée particulière à Marisol Goni, Jerome Gury, Claire Gassie, FLorence Hakil et Sophie Gentès.

Je tiens à remercier mes amis qui m’ont soutenu, m’ont fait décompresser, et avec qui j'ai passé de supers moments. Nombreux parmi eux ont fortement contribué à la création du CUB 2,

on peut dire que c'est une belle réussite. Un grand merci à vous: Saussicon, Mich, Mitch, Maité, Karine & Seb, Mu & Ben, Maxou; Vévert, Ludo, Evan, Gaetan, Rich, JB, Jerome, Matthieu, Vince, …

Une dédicace particulière à Jean-Phi & Judith: En souvenir des nombreuses soirées jeux (7 wonders, les aventuriers du rail, King of Tokyo, …) et autres moments très sympathiques… et ce n'est pas terminé!

Finalement, je garde une place toute particulière pour mes parents et à ma sœur, Célia. Je les remercie pour leur soutien et les encouragements qui m’ont été très précieux durant les années de ma thèse. C’est l’éducation que vous m’avez offert qui m’a permis d’arriver là où je suis aujourd’hui, merci. Ma vie personnelle a beaucoup compté pendant mon doctorat. On ne peut travailler bien que si l’on se sent bien, merci à toi Hélène pour ta patience, ton aide et la joie que tu m'as apporté.

SOMMAIRE

REMERCIEMENTS ...... I SOMMAIRE ...... III LISTE DES FIGURES ...... VI LISTE DES TABLES ...... X LISTE DES ABBREVIATIONS ...... XI

INTRODUCTION GENERALE ...... 1

CHAPITRE I - SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ...... 5 1. LES MICRO -ORGANISMES SULFATO -REDUCTEURS ...... 6 1.1 Taxonomie des BSR ...... 6 1.2 Ecologie des BSR...... 8 i. Réduction dissimilatrice du sulfate ...... 8 ii. Autres accepteurs terminaux d’électrons ...... 9 iii. Donneurs d’électrons et source de carbone ...... 10 1.3 Marqueurs moléculaires des BSR...... 11 i. ADNr 16S...... 12 ii. Gènes dsrAB ...... 12 1.4 Distribution des BSR dans l’écosystème côtier...... 14 i. Les sédiments ...... 14 ii. La colonne d’eau ...... 15 2. METHYLATION DU MERCURE DANS LES ECOSYSTEMES AQUATIQUES ...... 16 2.1 Le mercure dans l'environnement ...... 16 2.2 Spéciation du mercure dans les sédiments anoxiques ...... 17 i. Méthylation du mercure...... 18 ii. Déméthylation du mercure ...... 19 iii. Facteurs environnementaux influençant la méthylation du mercure ...... 19 2.3 Métabolisme des BSR et méthylation du mercure ...... 22 2.4 Taxonomie des BSR et méthylation du mercure ...... 23 3. MISE EN CULTURE DES MICRO -ORGANISMES ...... 26 3.1 Composition d'un milieu de culture...... 26 3.2 Limites de l'approche culturale ...... 26 3.3 Amélioration des méthodes de culture ...... 27 i. Concentration des substrats ...... 27 ii. Maintien de la communication cellulaire in vitro...... 28 iii. Temps d'incubation et taille de l'inoculum ...... 29 iv. Procédures d'enrichissement...... 31 v. Techniques de culture haut débit ...... 31 3.4 Microbiologie en conditions d'anaérobiose...... 32 i. Création et maintien de l'anaérobiose des milieux de culture...... 32 ii. Techniques traditionnelles d'isolements des micro-organismes sulfato-réducteurs...... 34

CHAPITRE II - PROCEDURES EXPERIMENTALES ...... 37 1. SITE D 'ETUDE ...... 38 1.1 Description de l'estuaire de l'Adour...... 38 1.2. Stratégies d’échantillonnage ...... 39 i. Station B20...... 39 ii. Campagne METADOUR III ...... 40 2. APPROCHE CULTURALE DES BSR...... 42 2.1 Milieux de culture pour l'isolement de BSR ...... 42 2.2 Enrichissements des sédiments de la station B20...... 43 2.3 Isolement haut- débit des BSR...... 44 2.4 Identification des souches ...... 46 2.5 Conservation des souches ...... 46 3. APPROCHE MOLECULAIRE ...... 46 3.1 Extraction des acides nucléiques ...... 46

III

3.2 Réactions de polymérisation en chaîne (PCR)...... 46 3.3 Purification des amplicons et dosage de l’ADN amplifié...... 47 3.4 Analyses moléculaires de la diversité...... 47 i La T-RFLP (Terminal-Restrictive Fragments Length Polymorphism) ...... 47 ii. Amplification des gènes dsrAB par PCR...... 48 iii. Digestion enzymatique ...... 48 iv. Electrophorèse capillaire ...... 48 v. Analyses des données T-RFLP ...... 49 3.5 Clonage...... 49 i. Principe du clonage ...... 49 ii. Séquençage des gènes ...... 50 3.6 Analyses phylogénétiques...... 50 4. ESTIMATION DU POTENTIELS DE METHYLATION DU MERCURE ...... 52 4.1 Biosenseur ...... 52 4.2 Estimation de la production de méthylmercure par le biosenseur ...... 53 4.3 Dosage chimique du méthylmercure par GC-ICP-MS ...... 54

CHAPITRE III : ISOLEMENT HAUT DEBIT DES BSR DES SEDIMENTS DE L 'ESTUAIRE DE L 'A DOUR ...... 55 1. PREAMBULE ...... 56 2. ISOLEMENT HAUT DEBIT DES BSR EN MICROPLAQUES 384 PUITS ...... 58 2.1 Abstract ...... 58 2.2 Introduction...... 59 2.3 Experimental procedures...... 60 i. Study site and sample collection ...... 60 ii. Enrichments conditions...... 60 iii. dsrAB genes T-RFLP Analyses ...... 61 iv. Isolation procedure for sulfate reducing bacteria ...... 63 v. Genetic diversity analysis of isolates...... 63 2.4 Results ...... 64 i. Extensive SRB isolation in original sediments (IS.2)...... 64 ii. Contribution of the enrichments procedure on the cultivable diversity ...... 64 iii. Contribution of resampling sediments on the cultivable diversity...... 67 2.5 Discussion...... 68 2.6 Conclusion...... 70 2.7 References...... 71 3. COMBINAISON DE LA CULTURE HAUT DEBIT ET DU CLONAGE DU GENE DSR A POUR L 'ETUDE DE LA DIVERSITE DES BSR DANS LES SEDIMENTS ...... 74 3.1 Abstract ...... 74 3.2 Introduction...... 75 3.3 Materials and methods...... 76 i. Study site and sediment sample collection...... 76 ii. dsrA gene : clone library and sequencing ...... 76 iii. Isolation and identification procedure for SRB in 384-well microplates...... 77 iv. Sequences analysis...... 79 3.4 Results ...... 80 i. SRB diversity by dsrA cloning ...... 80 ii. SRB diversity by high throughput isolations in 384-well microplates...... 83 3.5 Discussion...... 86 3.6 References...... 94 4. CONCLUSION DU CHAPITRE ...... 98

CHAPITRE IV: DIVERSITE BACTERIENNE TOTALE ET SULFATO -REDUCTRICE DANS LE PANACHE DE L ’ESTUAIRE DE L ’A DOUR ...... 101 1. PREAMBULE ...... 102 2. DIVERSITE BACTERIENNE TOTALE ET SULFATO -REDUCTRICE DANS LE PANACHE DE L'ESTUAIRE DE L 'A DOUR ...... 103 2.1 Abstract ...... 103

2.2 Introduction...... 104 2.3 Materials and Methods ...... 105 i Area of investigation and auxiliary data...... 105 ii. Total bacterial community structures...... 106 iii. Sulfate-reducing community structures ...... 107 2.4 Results ...... 108 i. Main physical and chemical parameters ...... 110 ii. Structure of total microbial communities...... 110 iii. Structure of sulfate-reducing communities ...... 114 2.5 Discussion...... 119 2.6 Conclusion...... 122 2.7 References...... 124 3. CONCLUSION DU CHAPITRE ...... 128

CHAPITRE V: ETUDE DE LA METHYLATION DU MERCURE CHEZ LES BSR VIA L ’UTILISATION D’UN BIOSENSEUR ...... 130 1. PREAMBULE ...... 131 2. ETUDE DE LA METHYLATION DU MERCURE CHEZ LES BSR VIA L ’UTILISATION D ’UN BIOSENSEUR ...... 133 2.1 Abstract ...... 133 2.2 Introduction...... 134 2.3 Materials and methods...... 135 i. Growth conditions of BerOc1 and G200 strains ...... 135 ii. Biosensor ...... 136 iii. Screening of MeHg production in 96-well microplates...... 137 iv. Screening of MeHg production in Bellco tubes...... 137 v. Simultaneous analysis of MeHg production by GC-ICPMS and the biosensor...... 138 vi. Phylogenetic analysis of isolates and Hg methylation determination...... 138 2.4 Results and Discussion ...... 140 i. Screening of iHg methylation in microplate...... 140 ii. Screening of MeHg production in Bellco tubes...... 141 iii. Simultaneous determination of MeHg production by GC-ICPMS and the biosensor...... 142 iv. Mercury methylation determination among isolates ...... 144 2.5 References...... 148 3. CONCLUSION DU CHAPITRE ...... 151

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ...... 153

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 161

LISTE DES FIGURES

Chapitre I Figure I.1 Phylogénie des micro-organismes sulfato-réducteurs ------7 Figure I.2 : Etapes de la réduction dissimilatrice du sulfate ------8 Figure I.3 : Représentation schématique de la dégradation de la matière organique en condition anoxique ------11 Figure I.4 : Comparaison deux à deux des degrés de similarité de séquences pour les gènes codant pour l’ARNr 16S et la réductase dissimilatrice du sulfite ( dsr AB) chez 119 souches sulfito et/ou sulfato-réductrices. ------13 Figure I.5 : Représentation schématique de la dégradation de la matière organique par les communautés microbiennes présentes dans un sédiment estuarien. ------14 Figure I.6 : Cycle du mercure dans un habitat côtier ------17 Figure I.7 : Méthylation et déméthylation biotique du mercure dans les sédiments------18 Figure I.8 : Biodisponibilité du mercure inorganique en fonction des concentrations en matière organique dissoute et en sulfures in situ ------21 Figure I.9 : Phylogénie des micro-organismes affiliés au genre Desulfovibrio basée sur les séquences codant pour l’ARNr 16S------25 Figure I.10 : Variation du nombre de colonies dénombrées sur boîte de Petri------30 Figure I.11 : Fiole de Widdel------33 Figure I.12 : Systèmes de type Hungate ou Balch------34 Figure I.13 : Technique "roll tube" développée par Hungate------35

Chapitre II Figure II.1 : Photographies de l’estuaire de l’Adour------38 Figure II.2 : Localisation de la station de prélèvement B20 ------39 Figure II.3 : Localisation des 4 stations de prélèvement (ES, PC, PD et MA) dans le panache de l’estuaire de l’Adour------40 Figure II.4 : Représentation schématique du gradient échantillonné le long du panache de l’estuaire de l’Adour ------41 Figure II.5 : Procédure d’isolement et d’identification des micro-organismes sulfato- réducteurs en microplaques 384 puits ------45

Figure II.6 : Plasmide pmerR BS BPmerlux porté par la souche E.coli MC1061 ------52

Figure II.7 : Procédure de détection de la production de méthylmercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur luminescent. ------53 Figure II.8 : Détermination chimique de la production de méthylmercure via l’utilisation d’isotopes stables du mercure------54

Chapitre III Figure III.1 : Flow chart summarizing the overall procedure carried out for the sediments enrichment procedure and subsequently the SRB microplate isolation.------62 Figure III.2 : Representation of the different OTUs isolated from the estuarine sediments ----65 Figure III.3 : Principal component analysis (PCA) of T-RFLP of dsr AB genes from enriched and initial sediments ------66 Figure III.4 : Rarefaction curves of sulfate-reducing diversity assessed by the isolation procedure in 384 well microplates ------68 Figure III.5 : Flow chart summarizing the overall procedure carried out for the high- throughput SRB isolation and identification------78 Figure III.6 : Phylogenetic tree based on the translated ( α subunit) amino acid sequences of PCR-amplified dsr AB genes from the Adour estuary, showing clones related to the Desulfobacteraceae (N=96 clones; 180aa ).------81 Figure III.7 : Phylogenetic tree based on the translated ( α subunit) amino acid sequences of PCR-amplified dsr AB genes from the Adour estuary, showing clones related to the Desulfobulbaceae (N=58 clones; 180aa ) and unaffiliated with any cultured SRB.------82 Figure III.8 : Rarefaction curves of sulfate-reducing diversity estimated by both molecular cloning and SRB cultivation ------84 Figure III.9 : Phylogenetic tree based on the PCR amplified 16S rRNA gene (500 bp) of isolates related to the Desulfobulbaceae ------87 Figure III.10 : Phylogenetic tree based on the PCR amplified 16S rRNA gene (500 bp) of isolates related to the Desulfovibrionaceae , Desulfomicrobiaceae , Desulfobacteraceae and the Peptococcaceae ------88 Figure III.11 : Comparative analysis of the SRB diversity assessed concurrently by 384-well microplates cultivation and DsrA clone library ------90 Figure III.S1 : dsr A nucleic sequences and DsrA amino acid sequences pairwise identity plot for pure cultures and dsr A clones present in Figures III.6 and III.7. ------93

VII

Figure III.S2 : Comparaison de la diversité sulfato-réductrice isolée en microplaques 384 puits à partir des sédiments de l'estuaire de l'Adour avec celle obtenue à partir de la même station d'échantillonnage et d'autres sédiments côtiers ------98

Chapitre IV Figure IV.1 : CCA ordination plots for the ﬁrst two dimensions to represent the relationship of sulfate-reducing diversity with environmental factors analyzed using 16S rRNA gene digested with HaeIII as restriction enzyme ------111 Figure IV.2 : Relative abundance of microbial populations represented by the terminal restriction fragments (T-RFs) by Hae III and having a specific distribution along the studied gradient------113 Figure IV.3 : CCA ordination plots for the ﬁrst two dimensions to represent the relationship of sulfate reducing diversity with environmental factors analyzed using the dsr A gene ------114 Figure IV.4 : Relative abundance of sulfate-reducing populations represented by the terminal restriction fragments (T-RFs) provided by Taq aI and having a specific distribution along the studied gradient ------115 Figure IV.5 : Phylogenetic tree based on the translated ( α subunit) amino acid sequences of PCR-amplified dsrAB genes from the PC1, PD1 and MA240 samples ------117 Figure IV.6 : Spatial distribution of sampling points (ES, PC, PD and MA) along the Adour River gradient ------120

Chapitre V Figure V.1 : Plasmide pmerRBSBPmerlux porté par la souche E.coli MC1061 ------136 Figure V.2 : Detection of methylmercury production by Desulfovibrio strain BerOc1 and Desulfovibrio strain G200, incubated 48H at 37°C in 96-well microplates with different inorganic mercury concentrations------140 Figure V.3 : Detection of methylmercury production by Desulfovibrio strain BerOc1 cultivated in Bellco tubes over the time and according different inorganic mercury concentrations ------142 Figure V.4 : Detection of methylmercury production by Desulfovibrio strain BerOc1 over the time and in Bellco tubes. ------143

VIII

Figure V.5 : Phylogenetic trees based on the dsrAB genes sequences (1100 bp) (A) and 16S rRNA gene sequences (1000 bp) (B) from sulfate-reducing isolates recovered from the Adour estuary sediments and tested for their mercury methylation capabilities------144 Figure V.6 : Detection of methylmercury production among the 21 sulfate-reducing strains affiliated to the Desulfobulbaceae family using the E. coli MC1061 pmerR BS BPmerlux sensor.-146

LISTE DES TABLES

Chapitre I

Table I-1: Description des familles affiliées aux micro-organismes sulfato-réducteurs capables de réduire les molécules carbonées jusqu'au CO 2 (Groupe 1) ou seulement jusqu'à l'acétate (Groupe 2)..... 10 Table I-2: Potentiels d’oxydo-réduction des couples rédox utilisés en microbiologie...... 33

Chapitre II

Table II-1: Volumes d'eaux collectés à différentes profondeurs sur les 4 stations d'échantillonnage et filtrés jusqu’à saturation de la membrane de porosité 0,2 m...... 41

Table II-2: Enrichissements des sédiments de la station B20 menés sous différentes conditions physicochimiques...... 44

Chapitre III

Table III.1 : Sediments collected on November 2009 were placed under different conditions of substrate, temperature, and light regime, until sulfidogenic growth was observed...... 61

Table III.2 : Representative strains isolated from Adour sediments and representing newly-cultured sulfate-reducing members ...... 85

Chapitre IV

Table IV.1 : Locations and characteristics of sampling points and samples collected along the Adour River plume gradient...... 106

Table IV.2 : Physico-chemical parameters of the Adour plume estuary along the 4 sampling stations (ES, PC, PD and MA) ...... 109

Table IV.3 : Total number of T-Rfs detected for each samples along the estuarine plume gradient, using both the Hae III and Hinf I restriction enzymes ...... 111

Table IV.4 : Sulfate-reducing strains isolated from the plume estuary with their closest relatives cultivated ...... 118

LISTE DES ABBREVIATIONS

ADN/DNA: Acide désoxyribonucléique/Desoxyribonucleic acid APS: Adénosine phopho-sulfate ATP: Adénosine triphosphate BEt: Bromure d’éthidium BSA: Bovin serum albumine BSR/SRB: Bactérie sulfato-réductrice/Sulfate-reducing bacteria dNTP: Désoxyribonucléotide triphosphate dsr: dissimilatory sulfite reductase DO/OD: Densité optique/Optical density EDTA: Ethylène diamine tétraacétate e-: électron GC-ICPMS: Gaz chromatography induced coupled plasma mass spectrometry (Chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse à plasma induit) NCBI: National Center for Biotechnology Information ND: non déterminé OTU: Operational taxonomic unit pb/bp: paire de bases/base pair PCR: Polymerase chain reaction (réaction de polymérisation en chaîne) PCB: polychlorobiphényles aussi appelés biphényles polychlorés

XI Introduction Générale

INTRODUCTION GENERALE

1 Introduction Générale

L’écosystème côtier représente une zone de transition entre le Continent et l’Océan. Il reçoit des apports d’eaux douces riches en matière organique d’origines anthropiques ou naturelles. De plus, divers polluants (sels nutritifs, pesticides, métaux, PCB, …) issus du bassin versant s'y accumulent. Ces enrichissements continuels en font un habitat très actif d'un point de vue biogéochimique, où les composés organiques et inorganiques subissent des transformations contrôlées par de nombreux processus physiques, chimiques, et biologiques. Malgré sa faible superficie, la zone côtière est considérée comme un composant essentiel du budget global du carbone dans l’Océan (Gatusso et al., 1998 ; Duarte et al., 2005) . Près de la moitié de la production primaire océanique y serait produite par les micro-organismes phytoplanctoniques, les micro-algues benthiques et les macro-algues (Paerl, 1997) , tandis que la moitié de la matière organique y serait dégradée et minéralisée par les communautés microbiennes présentes dans la colonne d'eau et le compartiment sédimentaire (Whitman et al. 1998 ; Middelburg et al. 2005 ; Keller et Zengler, 2004) . Les transfomations microbiennes des composés minéraux ou organiques ont un énorme impact sur la biodisponibilité et le devenir des nutriments et des polluants dans l´environnement. Les conséquences sur la qualité des écosystèmes sont importantes et méritent une attention toute particulière.

Les estuaires abritent une grande variété de métabolismes microbiens. L’utilisation de marqueurs moléculaires universels a fournit une représentation globale de la diversité procaryotique présente et active in situ . Les micro-organismes affiliés aux δ-Proteobacteria , γ- Proteobacteria , Bacteroidetes , et Planctomycetes sont considérés comme les plus abondants et importants en terme écologique (Llobet-Brossa et al., 1998 ; Ravenschlag et al., 2001). Dès lors que l'habitat est dépourvu en oxygène, le sulfate, forme la plus oxydée du soufre, constitue l’accepteur terminal d'électrons privilégié pour l’oxydation des composés organiques, avec production concomitante d'hydrogène sulfuré (H 2S) (Muyzer et al., 2008). Ainsi dans les sédiments anoxiques, les micro-organismes sulfato-réducteurs constituent une large fraction de la biomasse microbienne totale et sont très largement impliqués dans la minéralisation de la matière organique (Jorgensen, 1977 ; Jorgensen, 1982) . Bien que certains micro-organismes capables de mener la réduction dissimilatrice du sulfate soient affiliés au domaine des Archaea , les micro- organismes sulfato-réducteurs étudiés dans ce travail appartiennent au domaine des Bacteria et sont majoritairement affiliés aux δ-Proteobacteria. Ainsi, ce groupe fonctionnel sera désigné sous le terme BSR (Bactéries Sulfato-Réductrices) tout au long de ce manuscrit.

2 Introduction Générale

Outre leur implication dans les cycles du carbone et du soufre, une partie des BSR participe activement dans les processus de méthylation et déméthylation du mercure (Compeau et Bartha, 1985; Gilmour et al., 1992 ; Gilmour et Henry, 1992) . Le méthylmercure est un composé neurotoxique capable d'être bioaccumulé dans les tissus des organismes vivants et de se bioamplifier le long des différents maillons de la chaîne alimentaire (Bloom, 1992 ; Southworth et al., 1995 ; Guimarães et al., 1998; Roulet et al., 2000 ; Mergler et al., 2007) . Une contamination chronique en mercure inorganique, même à de faibles concentrations, combinée à des BSR abondantes et actives in situ , peuvent expliquer que les concentrations en méthylmercure dans les organismes des maillons trophiques supérieurs soient 10 7 fois plus concentrées que dans l’eau dans laquelle ils évoluent (Munthe et al., 2007) .

A ce jour, il est impossible de modéliser le risque lié à la production de méthylmercure par les BSR grâce à la seule connaissance de leur existence dans les sédiments estuariens. En raison du peu de souches isolées et analysées, aucune relation entre la diversité phylogénétique des BSR et les potentiels de méthylation du mercure ne peut être actuellement établie. Les mécanismes moléculaires mis en jeu dans les processus de méthylation et déméthylation du mercure restent encore méconnus, et des souches proches phylogénétiquement présentent parfois des potentiels de méthylation très différents (Gilmour et al., 2011 ; Dias et al., 2008) . La mise en culture reste alors une étape clef pour explorer la distribution des potentiels de méthylation au sein des différents genres sulfato-réducteurs et pour élucider le rôle de ce groupe fonctionnel dans la spéciation du mercure in situ .

L’implication des BSR dans le cycle du mercure fait l'objet d'une thématique de recherche menée par l’Equipe d’Environnement et Microbiologie (EEM) et le Laboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique de l’Environnement (LCABIE), associés depuis 2007 au sein de l’Institut des Sciences Analytiques et de Physico-chimie pour l'Environnement et les Matériaux (IPREM). En Aquitaine, l'estuaire de l'Adour est soumis aux rejets domestiques des agglomérations du bassin versant, ainsi qu'à un ensemble d’activités portuaires, industrielles et agricoles, et constitue donc un modèle d'étude privilégié. Les premiers travaux portant sur les espèces mercurielles ont souligné des pics de production saisonnière de méthylmercure pouvant être liés à une activité microbienne (Stoichev et al., 2004) . Dans la famille des Desulfomicrobiaceae , deux souches capables de méthyler le mercure , ont été isolées des sédiments et caractérisées (Dias et al., 2008). Cependant de nombreuses BSR détectées par leurs signatures moléculaires dans l'estuaire restent encore à être cultivées et étudiées.

3 Introduction Générale

Dans ce contexte scientifique, le travail mené au cours de cette thèse avait pour objectif d’améliorer l’efficacité des techniques d'isolement des BSR puis d’évaluer le potentiel de méthylation du mercure des souches par une approche haut-débit. L’accroissement significatif du nombre d’isolats requiert de s’affranchir impérativement du matériel classiquement utilisé en microbiologie traditionnelle et de s'orienter vers une miniaturisation des volumes de culture. Ainsi, une procédure rapide d’isolement et d’identification des BSR a été mise au point en microplaques 384 puits et appliquée aux sédiments et au panache de l'estuaire de l'Adour. Les données culturales obtenues, combinées aux analyses moléculaires, ont offert une bonne représentation de ce groupe fonctionnel dans l’estuaire. Dans un deuxième temps, un biosenseur initialement développé pour la détection du méthylmercure in situ (Ivask et al., 2001 ; Rantala et al., 2011) a été testé pour l'analyse des potentiels de méthylation du mercure des BSR cultivées. Cet outil constitue une alternative rapide au dosage du mercure par méthode chimique, trop fastidieuse à mettre en place dans un concept de caractérisation haut-débit des souches.

L’ensemble de ce travail est présenté dans ce mémoire et s'articule autour de 5 chapitres. La synthèse bibliographique de ce manuscrit est présentée dans le Chapitre I . Elle offre un état de l’art sur l’écologie des BSR dans l’écosystème côtier, puis se concentre sur leur rôle dans la transformation des composés mercuriels et sur l’intérêt et les limites des approches culturales en microbiologie. Le Chapitre II couvre les procédures expérimentales mises en œuvre et développées au cours de ce travail, tandis que les autres chapitres présentent les résultats obtenus sous forme d’articles scientifiques. Le Chapitre III présente le développement de la méthode d'isolement haut-débit des BSR et évalue l'apport d’une étape d'enrichissement et d'un deuxième échantillonnage pour accroitre la diversité sulfato-réductrice cultivée dès lors qu'une technique culturale haut-débit est appliquée. L'analyse conjointe de la diversité culturale et moléculaire des BSR présentes dans les sédiments de l'estuaire de l'Adour est ensuite présentée. L'étude de la diversité microbienne totale et sulfato-réductrice du panache de l'estuaire est traitée dans le Chapitre IV , tandis que l'optimisation et l'utilisation d'un biosenseur luminescent pour estimer les potentiels de méthylation du mercure des BSR isolées dans ce travail fait l'objet du Chapitre V. Enfin, l’ensemble des résultats obtenus et les perspectives qui en découlent seront commentés dans le chapitre Conclusion et Perspectives .

CHAPITRE I - SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

5 I. Synthèse Bibliographique

1. LES MICRO-ORGANISMES SULFATO-REDUCTEURS

1.1 Taxonomie des BSR

La réduction dissimilatrice du sulfate constitue un métabolisme énergétique ancien qui serait apparu sur Terre il y a environ 3,5 milliards d'années (Shen et al., 2001) . Malgré cette longue histoire évolutive, l’utilisation des composés minéraux du soufre comme accepteurs terminaux d'électrons pour l’oxydation des composés carbonés, semble être partagée par un nombre restreint de micro-organismes. A l'image de la réduction des composés oxydés de l'azote, le terme "sulfato-réducteur" n’a pas de réelle valeur taxonomique et englobe des genres bactériens très éloignés phylogénétiquement les uns des autres. Ces micro-organismes sont répartis dans 5 phyla bactériens et 2 phyla archéens présentés dans l’arbre phylogénétique ci-contre (Figure I.1) .

Les bactéries à Gram négatif sont les principaux micro-organismes sulfato-réducteurs isolés des sédiments anoxiques côtiers. Elles appartiennent à la subdivision δ des Proteobacteria et sont classées dans 6 familles et 24 genres. Ces micro-organismes sont généralement mésophiles, la seule exception étant Thermodesuforhabdus norvegicus , Desulfacinum infernum , et Desulfacinum hydrothermale capables de se développer à 60°C (Mori et al., 2003 ; Beeder et al., 1995 ; Rees et al., 1995 ; Sievert et Kuever, 2000) . À ce jour, la majorité des souches sulfato- réductrices isolées sont affiliées au genre Desulfovibrio qui contient près de 50 espèces décrites (Figure I.1) . Les autres genres contiennent nettement moins de souches isolées et caractérisées. D’autres micro-organismes sulfato-réducteurs sont affiliés à la division des Firmicutes. Ces bactéries à Gram positif possèdent un faible GC% et sont mésophiles ou thermophiles modérées avec la capacité de former des endospores (Mori et al. , 2003 ; Stackebrandt et al., 1997 ; Hattori et al., 2000) . Elles sont soit isolées de sources chaudes terrestres et affiliées au genre Desulfotomaculum (Liu et al., 1997 ; Goorissen et al., 2003) , soit isolées du sol, du pergélisol ou des eaux souterraines et affiliées au genre Desulfosporosinus (Stackebrandt et al., 1997 ; Robertson et al., 2001 ; Lee et al., 2009 ; Ramamoorthy et al., 2006 ; Vatsurina et al., 2008) . Enfin, une seule espèce, D. polytropa constitue le genre Desulfosporomusa (Sass et al., 2004) .

Les trois autres phyla bacteriens contenant des BSR sont les Nitrospirae (Genre Thermodesulfovibrio ) (Henry et al. , 1994) , les Thermodesulfobacteria (Genre Thermodesulfobacterium ) isolées de sources chaudes terrestres (Haouari et al., 2008 ; Zeikus et al., 1983 ; Sonne-Hansen et Ahring, 1999) , et les Thermodesulfobiaceae (genre Thermodesulfobium ) (Figure I.1) . La réduction dissimilatrice du sulfate est également réalisée

6 I. Synthèse Bibliographique

par des procaryotes du domaine des Archaea , retrouvés au niveau des réservoirs pétroliers, des sources chaudes acides (Mori et al., 2003 ; Itoh et al., 1999) et des sources hydrothermales marines (Stetter et al., 1987; Burggraf et al., 1990; Huber et al., 1997) . Ces micro-organismes, affiliés aux genres Archaeoglobus , Caldivirga et Thermocladium , sont actuellement les seuls représentants sulfato-réducteurs chez les Archaea .

Figure I.1 Phylogénie des micro-organismes sulfato-réducteurs basée sur les séquences d’ARNr 16S complètes de Bacteria et Archaea décrites. Les séquences ont été obtenues à partir de la banque de données « SILVA SSU rRNA » (version 03 08 22) et l’arbre construit avec le logiciel ARB. L’échelle indique 10 % de différence entre séquences (Muyzer et Stams, 2008)

7 I. Synthèse Bibliographique

1.2 Ecologie des BSR

i. Réduction dissimilatrice du sulfate

Les BSR interviennent activement dans l'oxydation de la matière organique en réduisant le sulfate avec la production concomitante d'hydrogène sulfuré (H 2S). Ce métabolisme est constitué de différentes réactions enzymatiques mettant en jeu un total de 8 électrons (Figure II.2) . L'enzyme ATP sulfurylase catalyse l'attachement d'un ion sulfate à un phosphate d'une molécule d’ATP pour former de l'APS (adénosine-5'-phosphosulfate). La réaction catalysée par l' ATP sulfurylase étant thermodynamiquement défavorable ( Go' = + 46 kJ/mol), l’intervention d’une pyrophosphatase hydrolysant le pyrophosphate en phosphate inorganique favoriserait la réaction 2- (Go' = - 21,9 kJ/mol). La conversion de l'APS en sulfites (S0 3 ) et AMP est ensuite réalisée par l'APS réductase , l'hydrogène étant utilisé ici comme donneur d'électrons ( Go' = - 68,6 kJ/mol). Enfin, la réduction des sulfites en sulfures serait assurée par trois enzymes: une sulfite réductase (ou trithionate synthase ), une trithionate réductase et une thiosulfate réductase , mettant en jeu six électrons (Madigan et Martinko, 2007) .

ATP PPi2e- AMP 6e- 2- 2- SO 4 APS SO 3 H2S (Sulfate) ATP sulfurylase APS reductase (Sulfite) sulfite reductase (sulfures)

Etape 1 Etape 2 Etape 3 Figure I.2: Etapes de la réduction dissimilatrice du sulfate (D’après Deplancke et al. , 2000) .

Etape 1 : Réaction endergonique couplée à l’hydrolyse d’une liaison pyrophosphate et à l'intervention d'une ATP sulfurylase .

2- Etape 2 : L’APS produit est dans un second temps réduit en sulfite (SO 3 ) par une APS réductase , l’hydrogène étant utilisé comme donneur d’électrons. Etape 3 : Réduction du sulfite en sulfure.

Il est important de noter que la réduction dissimilatrice du sulfate n’est pas le seul métabolisme produisant des composés soufrés réduits dans les sédiments anoxiques. Des micro- organismes qualifiés de sulfo-réducteurs ( Desulfuromonas sp. et Desulfurella sp.) et thiosulfato- réducteurs sont capables d'oxyder la matière organique via la réduction du soufre élémentaire ou du thiosulfate. Enfin des micro-organismes sulfo ou thiosulfato-réducteurs ou fermentaires utilisent les molécules soufrées comme piège à électrons assurant des produits de fermentation organique plus oxydés et stimulant ainsi la production d'énergie.

8 I. Synthèse Bibliographique

ii. Autres accepteurs terminaux d’électrons

Outre la capacité de réduire le sulfate, certains micro-organismes sulfato-réducteurs sont 2- 2− capables d’utiliser les sulfites (SO 3 ), le thiosulfate (S2O3 ) ou d’autres composés non soufrés en tant qu'accepteurs terminaux d'électrons et en conditions limitantes de sulfate. A titre d'exemple des micro-organismes appartenant au genre Desulfovibrio ( D. desulfuricans et D. − − + oxamicus ) réduisent les nitrates (NO 3 ) et les nitrites (NO 2 ) en ammonium (NH 4 ) (Dalsgaard et Bak, 1994 ; López-Cortés et al. , 2006). La réduction de composés plus atypiques peut être également observée, et concerne le chromate (Lovley et Phillips, 1994) , l'arsenate (Newman et al., 1997) , le Fe(III) (Coleman et al. , 1993 ; Lovley et al., 1993) , l'uranium (IV) (Lovley et al. , 1993) , le manganèse (IV) (Tebo et Obraztsova, 1998) , ou des composés organiques (fumarate, sulfonates, dimethylsulfoxide, chlorobenzoate) et halogénés.

En présence de fortes concentrations en matière organique et en condition limitante de sulfate, certaines souches affiliées aux genres Desulfovibrio, Desulfosarcina-Desulfococcus ou Desulfobulbaceae seraient capables d’établir des relations syntrophiques avec des micro- organismes méthanogènes ou homoacétogènes qui agissent comme un puits alternatif de protons (Orphan et al., 2001) . Le transfert inter-espèces de protons créerait des conditions thermodynamiquement favorables pour l’oxydation des composés carbonés par les BSR, qui fourniraient à leur tour les substrats nécessaires au développement des micro-organismes consommateurs d'hydrogène (Bryant et al., 1977 ; Stolyar et al., 2007) . Ainsi, Bryant et collaborateurs (1977) ont démontré la croissance de micro-organismes appartenant au genre Desulfovibrio en présence de lactate et d'Archaea méthanogènes qui agissent comme un puits alternatif de protons en absence de sulfate. Enfin, des souches affiliées aux genres Desulfomicrobium et Desulfovibrio sont capables de fermenter le pyruvate avec comme produits finaux de fermentation l'acétate, le CO 2 et l'hydrogène. Ces multiples capacités métaboliques expliquent en partie le caractère ubiquiste des BSR colonisant les sédiments marins et lacustres, mais aussi les sources hydrothermales, les suintements froids, les boues volcaniques, les rhizosphères et les tapis microbiens.

9 I. Synthèse Bibliographique

iii. Donneurs d’électrons et source de carbone

Les micro-organismes impliqués dans la réduction dissimilatrice du sulfate sont métaboliquement très versatiles. Ainsi le choix des sources d'énergie et de carbone va fortement influencer la diversité cultivable en laboratoire. En présence de sulfate, les BSR ont la capacité de dégrader de nombreuses substances carbonées telles que des alcools (éthanol, propanol, butanol), l'hydrogène (avec une source de carbone, CO 2 ou d'acétate), des acides gras (propionate, palmitate, formate), des acides organiques (benzoate, malate, fumarate), des sucres (glucose, fructose, cellobiose, lactose), des acides aminés (alanine, sérine), des hydrocarbures aliphatiques et aromatiques dont des alcanes à longues chaines (Figure I.3) (Muyzer et Stams, 2008) . Sur la base du métabolisme du carbone, deux principaux groupes sont décris (Table I.1) .

Table I-1 : Exemples de genres sulfato-réducteurs capables de réduire les molécules carbonées jusqu'au CO 2 (Groupe 1) ou seulement jusqu'à l'acétate (Groupe 2).

Groupe 1 Groupe 2 (oxydateurs complets) (oxydateurs incomplets)

Desulfobacter sp. Desulfovibrio sp. Desulfobacterium sp. Desulfobotulus sp. Desulfotomaculum sp. Desulfotomaculum sp. Desulfococcus sp. Desulfomicrobium sp. DesulfoarculuDesulfoarculuss sp. Desulfomonile sp. Desulfobacca sp. Desulfohalobium sp. Desulfocapsa sp. Desulfobulbus sp. Desulfonema sp. Desulfonatronovibrio sp. Desulfosarcina sp. Thermodesulfobacterium sp. Desulfobacula sp. Thermodesulfovibrio sp. Desulfacinum sp. Desulfosporisinus sp. Desulforhabdus sp. Desulfocella sp. Desulforhopalus sp. Thermodesulforhabdus sp. Arch aeoglobus sp.

Le groupe 1 regroupe les oxydateurs complets, capables d'oxyder complètement la matière organique jusqu'au CO 2 (Figure I.3). Ce groupe contient les genres Desulfomonas , Desulfococcus , Desulfobacter , Desulfosarcina et Desulfotomaculum (Table I.1) . A l'inverse, les genres Desulfovibrio et Desulfobulbus sont qualifiés d'oxydateurs incomplets. Ces derniers dégradent leurs substrats jusqu'à l'acétate (Figure I.3) et sont classés dans le groupe 2 (Table I.1) . Ainsi les études menées sur la diversité des BSR in situ peuvent permettre de faire certaines

10 I. Synthèse Bibliographique prédictions sur le rôle joué par ces micro-organismes dans la minéralisation de la matière organique.

Macromolécules (protéines, lipides et polysaccharides)

Hydrolyse

Monomères (AA, AG et sucres)

Fermentation Groupe 2 2- SO 4

Composés réduits Groupe 1 H2S (lactate, butyrate et propionate)

2- SO 4 SO 2- 4 H S H2 2 H S 2 Acétate

2- SO 4

H2S

CO 2

Figure I.3: Représentation schématique de la dégradation de la matière organique en condition anoxique. Les macromolécules (protéines, polysaccharides et lipides) sont hydrolysées en monomères (acides aminés, sucres, acide gras) à leur tour dégradés par fermentation en acétate, propionate, butyrate, lactate et hydrogène. En présence de sulfate, les BSR oxydent

ces produits de fermentation jusqu’au CO 2. ( Groupe 1 ), ou jusqu'à l'acétate ( Groupe 2 ). (D’après Muyzer et Stams, 2008 ).

1.3 Marqueurs moléculaires des BSR

Ces dernières années ont fait l’objet de nombreuses avancées en écologie microbienne. L'utilisation d'outils moléculaires innovants et en constante évolution a considérablement amélioré notre vision de la diversité phylogénétique des micro-organismes sulfato-réducteurs, autrefois cantonnée aux techniques culturales traditionnelles. L'approche moléculaire s'affranchit de l'isolement des micro-organismes et est réduite à l'étude des acides nucléiques extraits directement de l'environnement (McHardy et Rigoutsos, 2007) . Ainsi, le séquençage des ADNs et ARNs, les techniques d'empreintes moléculaires (DGGE, T-RFLP) ou les observations microscopiques couplées à des marqueurs moléculaires spécifiques (FISH, CARD-FISH) ont permis de caractériser une diversité microbienne jusqu’alors non cultivée et de nouveaux groupes phylogénétiques ont été décrits (Risatti et al. , 1994 ; Boetius et al. , 2000) .

11 I. Synthèse Bibliographique

i. ADNr 16S

Des amorces ciblant spécifiquement le gène codant l'ARNr 16S des BSR ont été mises au point et utilisées pour analyser la diversité de ce groupe fonctionnel dans l'environnement via des techniques de FISH, slot blot ou puces à ADN (Loy et al., 2002 ; Sahm et al., 1999 ; Ramsing et al., 1996 ; Devereux et al. , 1996 ; Amann et al., 1995) . Cependant, la nature polyphylétique des BSR limite l'identification de nouveaux phyla lorsque des marqueurs moléculaires universels tels que le gène codant l'ARNr 16S sont utilisés. De plus, l'utilisation de gènes de ménage s'avère inefficace pour attribuer une capacité métabolique ou physiologique à des organismes qui sont non-cultivés. Il parait alors plus judicieux de cibler des marqueurs moléculaires spécifiquement impliqués dans la réduction dissimilatrice du sulfate.

ii. Gènes dsrAB

L'enzyme la plus souvent utilisée comme marqueur fonctionnel des micro-organismes sulfato- réducteurs est la réductase dissimilatrice du (bi)sulfite, qui catalyse la réduction du sulfite en sulfure d’hydrogène (Dissimilatory Sulfite Reductase, DSR) (Figure I.2). En effet, cette enzyme est détectée chez tous les micro-organismes sulfato-réducteurs étudiés jusqu'ici et chez quelques organismes ne réduisant pas le sulfate mais respirant le sulfite (Klein et al., 2001) . La réductase dissimilatrice du sulfite est composée d'au moins deux polypeptides structurés en α2 et β2. Les gènes codants pour ces deux sous-unités sont dsr A et dsr B (appelés dsr AB), adjacents dans le génome des BSR et possédant un haut degré de conservation. Une paire d’amorces spécifiques (DSR1F/DSR4R), proposée par Wagner et al. (1998) et leur variantes (Loy et al., 2004 ; Moreau et al., 2010) permettent de cibler la majorité des gènes dsr AB (environ 1,9 kbp). Plus récemment, Giloteaux et al., (2010) et Pester et al., (2010) ont développé de nouvelles amorces pour étudier les micro-organismes sulfato-réducteurs dans les environnements à faible biomasse microbienne.

Les topologies des arbres phylogénétiques basés sur les gènes codant l'ARNr 16S et dsr AB sont congruentes (Zverlov et al., 2005) . Un seuil de similarité de séquences de 90% pour les gènes dsr AB a été défini comme correspondant au traditionnel seuil de 97% utilisé pour la définition de l'espèce lors de l'analyse des gènes codant l'ARNr 16S ( Kjeldsen et al., 2007) (Figure I.4). Cette relation permet de définir des phylotypes sur la base des gènes dsr AB et d'estimer la richesse sulfato-réductrice in situ . Quelques discordances sont tout de même rencontrées chez certains micro-organismes affiliés au genre Desulfotomaculum et sont expliquées par des transferts génétiques horizontaux (Klein et al., 2001) . Ce phénomène

12 I. Synthèse Bibliographique concerne uniquement une partie de ces bactéries à Gram positif. Ces gènes dsr AB proviendraient initialement de Desulfobacterium anilini et sont alors qualifiés de xénologues.

Figure I.4: Comparaison deux à deux des degrés de similarité de séquences pour les gènes

codant pour l’ARNr 16S et la réductase dissimilatrice du sulfite ( dsr AB) chez 119 souches

sulfito et/ou sulfato-réductrices . Les lignes en pointillés indiquent le seuil de 97% de

similarité de séquences pour les gènes codant l’ARNr 16S communément utilisé pour la

définition des espèces. Ce seuil est équivalent à une similarité de séquences de 90 % pour les

gènes dsr AB. Le cluster de points dans le coin gauche représente les compara isons entre les

micro-organismes du genre Archaeoglobus et les micro-organismes du domaine des Bacteria .

(Kjeldsen et al. , 2007).

Outre, la réductase dissimilatrice du sulfite, deux autres enzymes interviennent dans la réduction dissimilatrice du sulfate. l'ATP sulfurylase assure l'activation de l'ATP (Figure I.2) . Cependant cette enzyme est également impliquée dans la réduction assimilatrice du sulfate et ne peut donc pas être utilisé comme marqueur fonctionnel. Enfin, l'APS reductase est codée par les gènes apr AB et intervient dans la conversion de l'APS en sulfites et AMP (Figure I.2) . Ces gènes sont présents chez l'ensemble des micro-organismes sulfato-réducteurs, mais ont toutefois été détectés chez certains micro-organismes sulfo-oxydants ( Chromatiaceae sp. , Thiobacillus sp., Thiothrix sp.) (Meyer et Kuever, 2007) . De plus, ces gènes seraient particulièrement sujets aux transferts horizontaux de gènes et les bases de données sont peu exhaustives (Friedrich, 2002) .

13 I. Synthèse Bibliographique

1.4 Distribution des BSR dans l’écosystème côtier

i. Les sédiments

L’écosystème côtier est riche en matière organique et il s’y succède des communautés microbiennes de la surface vers la profondeur en fonction des gradients des paramètres physico- chimiques. Les premiers millimètres des sédiments sont propices au développement de producteurs primaires (eucaryotes photosynthétiques et cyanobactéries) qui synthétisent la matière organique par conversion de l'énergie lumineuse en énergie chimique (Underwood et Kromkamp, 1999). Dans cette partie superficielle du sédiment, les micro-organismes chimio- organo-hétérotrophes aérobies et anaérobies facultatifs vont rapidement oxyder la matière organique produite en utilisant l'oxygène comme accepteur terminal d'électrons, limitant ainsi la diffusion de l'oxygène en profondeur (Figure I.5). Sans bioturbation, le sédiment devient anoxique dès quelques millimètres de profondeur (Altenbach et al. , 2011) et la minéralisation de la matière organique y est donc assurée par des micro-organismes opérant la respiration d'autres composés (nitrates, fer, manganèse, sulfates,…) et la fermentation (Figure I.5).

Lumière Colonne d’eau

- NO 3 Phototrophes N2 MO Sédiments oxiques O H 0 2 2 Chimio-organotrophes

aérobies CO 2 Intermédiaires

Dénitrifiantes Fermentatives Sédiments anoxiques

Intermédaires Profondeur N 2- 2 CO SO 4 2 Phototrophes anaérobies Acétate BSR H S 2 sulfo-oxydants + Intermédaires + CO2 Acétate Méthanogènes

CO 2 CH 4

Figure I.5: Représentation schématique de la dégradation de la matière organique par les communautés microbiennes présentes dans un sédiment estuarien.

14 I. Synthèse Bibliographique

Avec une concentration d'environ 28 mM dans l'eau de mer, le sulfate constitue l'un des principaux accepteurs terminaux d'électrons pour l'oxydation des molécules carbonées, et va donc largement contribuer à la minéralisation de la matière organique dans la partie anoxique des sédiments (Jorgensen, 1982) . Les sulfures produits par les BSR sont majoritairement piégés dans les sédiments sous forme de pyrite (FeS 2) par complexation avec le fer présent in situ . Une partie 0 2- des sulfures produits sera tout de même réoxydé en soufre élémentaire (S ) ou sulfate (SO 4 ) par des micro-organismes photosynthétiques anoxygéniques et chimiotrophes sulfo-oxydants (Chlorobium sp. et Beggiatoa sp.) (Figure I.5) .

ii. La colonne d’eau

Bien qu’étant définies comme anaérobies strictes, les BSR peuvent être détectées aux interfaces oxie-anoxie des sédiments, dans des tapis microbiens oxiques, voire dans le panache des estuaires et dans l’Océan (Sass et al., 1997 ; Teske et al., 1998 ; Canfield et al., 2010) . Les genres Desulfovibrio, Desulfonema et Desulfomicrobium sont ceux principalement détectés dans ces écosystèmes oxiques. En présence d’oxygène, les sulfures potentiellement produits lors de la réduction du sulfate sont directement réoxydés et l’activité des BSR devient alors difficilement détectable. La sensibilité des micro-organismes anaérobies à l'oxygène vient probablement de l’effet toxique des espèces réactives de l’oxygène (ERO) sur les protéines intervenant dans le métabolisme énergétique des cellules, l'oxydation des substrats ou la synthèse des protéines et des acides nucléiques (Cypionka, 2000) . Afin de faire face au stress oxydatif, diverses stratégies sont utilisées par les BSR :

- L’ agrégation cellulaire : elle favorise la création de micro-niches anoxiques dans la colonne d'eau (Cypionka, 2000) .

- Le Chimiotactisme : déplacement physique des cellules dans un gradient d'oxygène grâce à leur flagelle (Fisher et Cypionka, 2006 ; Eschemann et al. , 1999).

- La respiration de l'oxygène (Dannenberg et al. , 1992 ; Dilling et Cypionka, 1990).

- La production de superoxides dismutases (SOD) et superoxides reductases (SOR) (Jenney et al. , 1999 ; Dos Santos et al. , 2000 ; Hatchikian et Henry, 1977).

15 I. Synthèse Bibliographique

Dans les estuaires, le débit des rivières et les périodes de crues s'accompagnent souvent d'une remise en suspension des particules sédimentaires et des micro-organismes qui y sont associés. Selon l’amplitude des marées et le débit des rivières, la dynamique des masses d’eau va plus ou moins perturber l’interface eau/sédiment et conditionner l'exposition des BSR à l’oxygène mais aussi, dans le cas d’activités anthropiques, aux polluants. En fonction du transit, de la sédimentation et de la remobilisation des polluants piégés dans les couches sédimentaires, les sédiments vont devenir un puits plus ou moins définitif pour l’accumulation des éléments toxiques comme les métaux. Une partie des micro-organismes impliqués dans la réduction dissimilatrice du sulfate participe activement à la biotransformation des métaux et intervient notamment dans les processus de méthylation et déméthylation du mercure (Compeau et Bartha, 1985; Gilmour et al., 1992) .

2. METHYLATION DU MERCURE DANS LES ECOSYSTEMES AQUATIQUES

2.1 Le mercure dans l'environnement

Les sources de mercure dans l'environnement sont à la fois naturelles (activité volcanique, érosion des sols) et anthropiques. Malgré une utilisation plus restreinte depuis les années 70, le mercure et ses dérivés sont encore couramment employés dans plusieurs domaines tels que la métallurgie, l'industrie électronique, l'industrie chimique, la santé, l'agriculture et l'orpaillage. Le mercure libéré sous forme Hg 0 (volatile) ou Hg 2+ est retrouvé dans l'air, l'eau et le sol, et peut être transporté d'un milieu à l'autre avant de se concentrer dans les sédiments. Si toutes les formes du mercure sont dangereuses pour la santé, leur toxicité varie considérablement selon la spéciation du métal. Du fait de sa capacité à se fixer au groupement thiol des protéines, ainsi qu'à se bioaccumuler et se bioamplifier tout au long de la chaine trophique, le méthylmercure + (CH 3Hg ) est considéré comme la forme la plus toxique (Loseto et al., 2008 ; Lebel et al., 1997 ; et Legrand et al., 2007) . Les plus fortes concentrations en méthylmercure sont détectées dans les milieux aquatiques dans les maillons trophiques supérieurs (poissons, crustacés, coquillages et oiseaux) (Boening, 2000) . Dans les années 1950, l'accident de Minamata (Japon) a mis en évidence des troubles du système nerveux, oculaire, auditif et des atteintes fœtales graves chez des populations humaines pour qui poissons et coquillages représentent des aliments de base (Ullrich et al., 2001 ; Clarkson, 1993) . La valeur seuil de méthylmercure recommandée par l'Organisation Mondiale de la Santé est de 0.5 mg.kg − 1.

16 I. Synthèse Bibliographique

Figure I.6: Cycle du mercure dans un habitat côtier. Les sédiments sont oxiques dans les premiers millimètres et l'oxygène est ensuite rapidement consommé . Le mercure associé à des ronds noirs représente la complexation du mercure inorganique avec la matière organique. Les flèches orientées v ers le bas représentent la sédimentation et les processus de dépôt du mercure. Les flèches orientées vers le haut représentent les processus de diffusion du mercure. MiR ( mer - interdependant Réduction), OD (Déméthylation Oxydative ), RD (Déméthylation Réductive ),

SRB (Bactéries Sulfato-Réductrices). (Merrit et Amirbahman, 2009) .

2.2 Spéciation du mercure dans les sédiments anoxiques

Les processus de méthylation du mercure dans les sédiments peuvent avoir une origine biotique ou abiotique. De nombreux paramètres physico-chimiques tels que la teneur en matière organique, le pH, le potentiel redox, la température, ainsi que la diversité et l'activité microbienne présente in situ (Clarkson, 1993 ; Compeau et Bartha, 1985 ; Lambertsson et Nilsson, 2006) peuvent intervenir directement ou indirectement sur la spéciation de ce métal et doivent donc être identifiés pour évaluer les risques associés aux contaminations métalliques in situ .

17 I. Synthèse Bibliographique

i. Méthylation du mercure

Dans les écosystèmes côtiers ou lacustres, les sédiments anoxiques constituent des sites majeurs de production de méthylmercure (Pak and Bartha, 1998 ; Covelli et al., 1999 ; Hintelmann et al., 2000 ; Hines et al., 2004 ; Goulet et al., 2007) . Bien que la spéciation de ce métal puisse résulter de processus chimiques ou photochimiques, la méthylation du mercure y est majoritairement assurée par des processus biologiques (Berman et Bartha, 1986 ; Coelho-Souza et al., 2006) . L'intervention de micro-organismes sulfato-réducteurs fut pour la première fois mise en évidence dans les années 80 (Compeau et Bartha, 1985). L'inhibition des micro- organismes méthanogènes en compétition pour le substrat, a pu être corrélée avec une augmentation de la production de méthylmercure. A l'inverse, l'ajout de molybdate, un inhibiteur de la réduction dissimilatrice du sulfate, a induit une chute significative de la méthylation du mercure. Cependant, dans certains compartiments, le molybdate n'inhibe pas totalement la production de méthylmercure, suggérant ainsi que la méthylation du mercure n'est pas totalement spécifique aux BSR. Récemment, Fleming et al. (2006) ; Kerin et al. (2006) ; Hamelin et al. (2011) ; Yu et al. (2012) ont démontré l’implication de bactéries ferri-réductrices ( Geobacter sp. et Desulfuromonas sp. ) ainsi que d’ Archaea méthanogènes (Methanobacteriales, Methanococcales, et Methanosarcinales) dans ces biotransformations.

Hg 0

2- Méthylation 2- SO 4 S

BSR

2+ BFR Hg CH 3Hg Fe 3+ Fe 2+

Déméthylation oxydative

Figure I.7 : Méthylation et déméthylation biotique du mercure dans les sédiments. Les bactéries sulfato-réductrices (BSR) et ferri-réductrices (BFR) assurent la méthylation du mercure et sa déméthylation oxydative. (D’après Yu et al. , 2012).

18 I. Synthèse Bibliographique

ii. Déméthylation du mercure

De manière générale, les micro-organismes identifiés comme méthylant le mercure inorganique sont également capables de réaliser sa déméthylation. La déméthylation oxydative, menée par les micro-organismes sulfato-réducteurs, ferri-réducteurs et les Archaea méthanogènes (Marvin DiPasquale et Oremland, 1998 ; Oremland et al., 1995 ; Oremland et al., 1991), produit du mercure inorganique susceptible d’être à nouveau reméthylé (Figures I.6 et I.7) . Ce processus semble important pour de faibles concentrations en mercure et en conditions préférentiellement anoxiques (Marvin DiPasquale et al., 2000) . A l'inverse, en condition oxique et pour de fortes concentrations en mercure, la déméthylation intervient par une seconde voie, appelée déméthylation réductive, et fait intervenir les gènes mer présents sous forme d'opéron et régulés par la protéine MerR (Barkay et al., 2003 ; Nascimento et al. , 2003) (Figures I.6 et I.7) . Les gènes mer A et mer B codent respectivement pour deux enzymes, la réductase mercurique 2+ 0 + cytosolique (réduction du Hg en Hg ) et la lyase organomercurielle (réduction du CH 3Hg en Hg 2+ et Hg 0). Ces gènes ont été identifiés chez plusieurs micro-organismes Gram négatifs (Pseudomonas sp. , Xanthomonas sp. , Shewanella sp. , Streptomyces sp. ...) mais l'ensemble de l'opéron mer n'a pas été retrouvé chez les BSR.

iii. Facteurs environnementaux influençant la méthylation du mercure

Les BSR représentent une fraction importante de la biomasse microbienne totale dans les sédiments côtiers anoxiques. Ainsi, une contamination au mercure faible mais chronique peut avoir des répercussions majeures sur les niveaux trophiques supérieurs. Les principaux facteurs biotiques ou abiotiques régulant la spéciation du mercure restent, à ce jour, incertains. La production de méthylmercure peut être soit (1) limitée par la biodisponibilité du mercure inorganique in situ , soit (2) être fonction de la diversité microbienne présente dans les sédiments. De nombreuses variables environnementales, tels que l'hydrodynamisme de la colonne d'eau (Merritt et Amirbahman, 2008) , le potentiel redox (Eh), le pH, les apports et l'accumulation en matière organique dissoute (Lambertsson et Nilsson, 2006), la concentration en soufre réduit (S 2- ) ou la présence de ligands (Gilmour et al., 1992 ; Schaefer et al., 2011) , peuvent moduler la biodisponibilité chimique du mercure (Ullrich et al., 2001) et ainsi contrôler les taux de méthylmercure dans les sédiments. Ces facteurs peuvent agir également sur l'activité des communautés microbiennes et les micro-organismes méthylants.

19 I. Synthèse Bibliographique

Le cycle du soufre Les sulfures produits au cours de la sulfato-réduction sont capables de se complexer avec le 0 0 + 2- - mercure sous forme de HgS , Hg(SH) 2 , Hg(SH) , HgS 2 et HgHS 2 . Ces complexes chargés auraient tendance à se former plus les concentrations en sulfures augmentent et à rendre le 0 0 mercure indisponible. A l'inverse les formes non chargées HgS , Hg(SH) 2 auraient tendance à se former à de faibles concentrations de sulfures. Ces dernières, posséderaient un coefficient de partition octanol/eau (Kow) élevé, traduisant une meilleure biodisponibilité et donc une meilleure diffusion aux travers des membranes cellulaires (Benoit et al., 1999) . Gilmour et collaborateurs (1992) ont déterminés une activité optimale de méthylation pour des concentrations en sulfate comprises entre 2 et 100 µM. Au-dessus de 100 µM, la méthylation est inversement corrélée à la concentration en sulfures. De plus, la méthylation du mercure inorganique diminue avec une salinité croissante (Barkay et al., 1997 ). Du fait de l’association de celui-ci avec des chlorures et des sulfures, dissous la disponibilité du mercure est réduite (King et al., 2000) .

La matière organique La capacité de méthylation des communautés sulfato-réductrices est généralement corrélée positivement avec la charge en matière organique dissoute (DOM) (Figure I.8) ( Macalady et al., 2000 ; Covelli et al., 2009 ; Feyte et al., 2010) . Le mercure et le méthylmercure ont tendance à former des complexes avec les molécules organiques. Golding et al. (2002) ont montré une augmentation du taux de méthylation en présence de molécules de faible poids moléculaire incluant des acides aminées. Ce résultat suggère un transport passif du mercure aux travers des membranes cellulaires via d'autres molécules. La complexation du mercure se déroulerait plus particulièrement au niveau des groupements soufrés de la fraction hydrophobe et acide de la matière organique (Karlsson et Skyllberg, 2003 ; Ravichandran, 2004 ; Khwaja et al., 2006). En utilisant Geobacter sulfurreducens et Desulfovibrio desulfuricans ND132, Schaefer et Morel (2011) ont suggéré un transport du mercure inorganique dans la cellule par complexation du mercure avec des thiols (composés organiques comportant un groupement -SH) ou des sulfures.

20 I. Synthèse Bibliographique

Sans MOD Avec MOD

La MOD réduit Formation de la formation de complexes HgS complexes HgS

Faible Biodisponibilité biodisponibilité Ligands de la paroi accrue cellulaire

Hg-L

MeHg

Effet limité de la MOD Hg-CYS Figure I.8: Biodisponibilité du mercure inorganique en fonction des concentrations en matière organique dissoute (MOD) et en sulfures in situ . En absence de matière organique dissoute, les sulfures ont tendance à complexer le mercure inorganique, le rendant indisponible pour les BSR. En présence de matière organique dissoute, les interactions du mercure avec les molécules soufrées sont réduites et la complexation du mercure avec des molécules carbonées de faible poids moléculaire améliorerait la disponibilité du mercure pour les BSR et donc favoriserait la méthylation biotique du mercure (Graham et al. , 2012).

Le potentiel redox L'impact du potentiel redox (Eh) sur la spéciation et la biodisponibilité du mercure, associé aux variations de carbone organique dissous, fer, chlorure et sulfate, peuvent largement influencer la méthylation du mercure. La modification du potentiel redox lors des transitions oxie/anoxie dans les sédiments peut avoir un impact significatif sur la production de méthylmercure. Des travaux récents ont montré une corrélation positive entre la concentration en méthylmercure et un abaissement du potentiel rédox (DeLaune et al., 2004 ; Sunderland et al., 2006). Ullrich et collaborateurs (2001) ont suggéré qu'en condition oxique, la réduction du mercure inorganique limiterait la biodisponibilité du mercure et donc sa méthylation.

21 I. Synthèse Bibliographique

En 2012, Frohne et collaborateurs ont mené une étude en microcosme pour étudier l'influence de ces différents facteurs sur la mobilité et la méthylation du mercure. L'expérience était basée sur la transition d'une condition réduite (-350 mV, pH5) vers une condition oxique (600 mV, pH5). Les résultats de ce travail suggèrent que le ratio (Carbone Organique Dissous / Mercure total) semblerait être plus important que le COD seul. Les variations du potentiel rédox sembleraient affecter le comportement du mercure inorganique dissous et celui du méthylmercure indirectement via des modifications du COD, du cycle du soufre et la structure de la communauté microbienne. A moindre échelle, le potentiel redox et le pH et la concentration en fer et chlorures influenceraient la spéciation du mercure.

2.3 Métabolisme des BSR et méthylation du mercure

Bien que le processus de méthylation soit à priori lié aux cycles du soufre et du fer, la capacité à produire du méthylmercure n'est pas un caractère commun à tous les micro-organismes sulfato- réducteurs et ferri-réducteurs. La production de méthylmercure peut être fonction du métabolisme énergétique des micro-organismes et être liée à (1) une voie spécifique de méthyltransferases, (2) une voie spécifique à l'assimilation du mercure inorganique, et (3) la capacité du mercure à se combiner à d'autres molécules et à traverser passivement les membranes cellulaires.

Malgré plusieurs études portant sur des d'enzymes potentiellement impliquées dans la spéciation du mercure inorganique en méthylmercure (Choi et al., 1994 ; Wood et al., 1968) , les mécanismes de transport du mercure et les enzymes contrôlant sa méthylation et sa déméthylation restent encore aujourd'hui peu connus chez les BSR. Les premiers travaux sur la méthylation chez les BSR ont été initiés sur Desulfovibrio desulfuricans LS. Richard Bartha et ses collaborateurs ont proposé que la méthylation du mercure serait à l'origine d'un "accident enzymatique" au cours du quel le mercure inorganique recevrait un groupement méthyle de la méthylcobalamine (MeB12) (Choi et al. , 1994) . Le groupement méthyle proviendrait du C3 de la sérine ou du formate via la voie de l'acétylCoA. La voie de l'acétylCoA est impliquée dans le métabolisme du carbone chez certains acétogènes, méthanogènes et sulfato-réducteurs capables de convertir l'acétate en CO 2. Ces micro-organismes, qualifiés d'oxydateurs complets, possèdent des enzymes à coronoïdes intervenant dans cette voie biochimique. Cependant, Ekstrom et al., (2003) ont identifié d'autres sulfato-réducteurs sans la voie de l'acétylCoA et capables de produire du méthylmercure, suspectant ainsi l'existence de plusieurs voies de méthylation chez les BSR. Ekstrom et Morel (2008) ont confirmé ces résultats en inhibant la méthylation du

22 I. Synthèse Bibliographique mercure en condition limitante de cobalt chez Desulfococcus multivorans , un oxydateur complet qui utilise la voie de l'acétylCoA. A l'inverse le taux de méthylation de Desulfovibrio africanus , un oxydateur incomplet qui n'utilise pas cette de voie de transformation, n'était pas affecté par cette limitation. D'autres composés jouant un rôle clef dans la méthylation du mercure chez les oxydateurs incomplets restent donc à être élucidés.

En 2003, Batten et Scow envisagent la méthylation du mercure comme un mécanisme de détoxification du mercure inorganique, du fait que le méthylmercure est bien plus volatile. Enfin, en 2012, Moberly et collaborateurs ont noté une corrélation positive entre méthylation et la surexpression de gènes impliqués dans le transport du fer et d'autres gènes codant pour des domaines de fixation des métaux (CxxC). Le mercure pourrait ainsi interférer avec le transport du fer chez Desulfovibrio desulfuricans .

2.4 Taxonomie des BSR et méthylation du mercure

Plus de la moitié des micro-organismes sulfato-réducteurs testés à ce jour pour leur capacité à méthyler le mercure sont affiliés au genre Desulfovibrio , et la moitié des souches testées sont capables de produire du méthylmercure. Sur la base du gène codant l'ARNr 16S, Gilmour et collaborateurs (2011) ont répertorié dans un arbre phylogénétique toutes les souches affiliées au genre Desulfovibrio et testées pour leurs potentiels de méthylation (Figure I.9) . Les souches représentées en bleu sont capables de méthyler le mercure, tandis que les souches représentées en rouge ont été testées pour la production de méthylmercure mais n'ont pas présenté de production significative.

Les 4 souches D. desulfuricans spp. ainsi que D. vulgaris appartiennent au groupe desulfuricans . Toutes ces souches semblent ne pas être en mesure de méthyler le mercure. L'exception concerne D. desulfuricans LS. Les souches ND132 et BerOc1 sont définies comme méthylantes et se classent parmi les micro-organismes principalement rencontrés en milieux marins ou halophiles. Une nouvelle fois ce groupe contient également un micro-organisme incapable de méthyler le mercure, D. salexigens . Phylogénétiquement plus éloignés, D. africanus sp. et la souche T2 isolée de la baie de Chesapeake sont également méthylants. Enfin, la souche méthylante X2, isolée de la baie de Chesapeake, se regroupe avec des micro-organismes ayant la propriété d'utiliser des substrats inhabituels pour le genre Desulfovibrio . Du fait de la grande diversité phylogénétique dans le genre Desulfovibrio et du faible nombre de souches testées pour

23 I. Synthèse Bibliographique la méthylation du mercure, toute suggestion sur la distribution phylogénétique reste encore hypothétique.

Les taux de méthylation du mercure estimés par King et collaborateurs (2000) et Ekstrom et Morel (2008) ont suggéré que les BSR des genres Desulfobacterium et Desulfococcus , oxydateurs complets du carbone, méthylent le mercure à plus haut taux que les espèces affiliées aux genres Desulfovibrio et Desulfobulbus . Ces micro-organismes représentent une part importante des sulfato-réducteurs dans les habitats côtiers et leurs taux de méthylation seraient 3 fois supérieurs à ceux des oxydateurs incomplets. Ces différences de taux de méthylation pourraient s'expliquer par la présence de méthyltransferases constitutives ou induites pendant l'oxydation complète de l'acétate en CO 2. Des sédiments enrichis avec de l'acétate ou du lactate et du mercure inorganique ont montré des taux de méthylation plus importants que les sédiments non enrichis. Cependant, les sédiments enrichis avec de l'acétate ont produit un tiers de méthylmercure en plus que les sédiments enrichis avec du lactate. (King et al., 2000).

Bien que la méthylation du mercure soit un caractère partagé par plusieurs micro-organismes impliqués dans le cycle du soufre et du fer, cette capacité métabolique n'est pas retrouvée chez tous les micro-organismes sulfato-réducteurs et ferri-réducteurs. De plus, une production nette de méthylmercure peut être facilement obtenu chez Desulfovibrio sp. , Desulfomicrobium sp. , en condition de respiration du fumarate ou en fermentation, démontrant ainsi que la méthylation du mercure n'est pas directement couplée à la réduction du sulfate ou du fer. Cette biotransformation du mercure résulterait de plusieurs voies métaboliques et serait influencée conjointement par plusieurs facteurs environnementaux tels que la productivité de l'écosystème, la température, les conditions rédox, le pH, le sulfate, et par l'activité des micro-organismes sulfato-réducteurs. Ces biotransformations sont d'autant plus complexes que certains micro-organismes affiliés phylogénétiquement à des groupes méthylants ne produisent pas de méthylmercure lorsqu'ils sont cultivés in vitro (Munthe et al., 2007) .

Bien qu'un micro-organisme puisse se comporter très différemment en culture pure et dans son habitat naturel, l'accès aux souches pures constitue une manière efficace d'obtenir des informations cruciales en écologie microbienne. Une fois isolés, les potentiels métaboliques des micro-organismes peuvent être facilement déterminés et l'accès à l'ensemble des gènes permet de tester de nombreuses hypothèses et d'identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le fonctionnement des écosystèmes (Giovannoni et al., 2007) .

24 I. Synthèse Bibliographique

Figure I.9: Phylogénie des micro-organismes affiliés au genre Desulfovibrio basée sur les séquences codant pour l’ARNr 16S. Les souches en noir représentent les micro-organismes non testés pour leur potentiel de méthylation du mercure. Les souches identifiées en bleu sont capables de produire du méthylmercure tandis que les souches identifiées en rouge ont été caractérisées comme non-méthylantes (Gilmour et al. , 2011).

25 I. Synthèse Bibliographique

3. MISE EN CULTURE DES MICRO-ORGANISMES

3.1 Composition d'un milieu de culture

L’isolement des micro-organismes en laboratoire requiert de connaitre les conditions spécifiques et essentielles pour le développement des micro-organismes (sources de carbone, sources énergétiques, vitamines, potentiel redox, pH, ...). Les éléments indispensables à leur croissance peuvent être déterminés en calculant la composition de la biomasse microbienne. Les éléments requis à de fortes concentrations sont qualifiés de macroéléments (carbone, oxygène, hydrogène, azote, soufre, phosphore, potassium, calcium, fer, magnésium, chlore, et sodium). Ils constituent approximativement 95% de la composition de la matière sèche des micro-organismes et leur présence est donc impérative dans les milieux de culture synthétiques (Plugge, 2005) . D'autres éléments sont essentiels à de bien plus faibles concentrations et sont regroupés sous le terme micro-éléments ou oligo-éléments. Même s'il est plus difficile de prouver leur importance, ces oligo-éléments peuvent être impliqués dans des réactions enzymatiques essentielles. Ils comprennent le fluor, le zinc, le strontium, le cuivre, le vanadium, le sélénium, le lithium, le manganèse, l'iode, le tungstène, le molybdène, le nickel, le chrome, le cobalt et le silicium. Toutefois, l'utilisation de ces micro-éléments peut inhiber certains processus biochimiques. Par exemple, la fixation de l'azote chez les spirochètes est inhibée en présence de tungstène dans le milieu de culture (Plugge, 2005 ; Leadbetter, 2003) .

3.2 Limites de l'approche culturale

Les micro-organismes identifiés par les outils moléculaires comme dominants ou métaboliquement actifs dans un écosystème sont rarement, pour ne pas dire jamais, isolés in vitro . La suppression de la communication cellulaire, la dormance cellulaire due aux substrats limitants ou d'autres stress, les fortes concentrations de nutriments, les temps d'incubation trop courts, la sélection du milieu de culture et notre compréhension incomplète des conditions physiques, chimiques et nutritionnelles indispensables à la croissance microbienne expliqueraient en grande partie la faible efficacité de culture, définie par Staley et Konopka (1985) comme “ The great plate count anomaly ”.

26 I. Synthèse Bibliographique

3.3 Amélioration des méthodes de culture

Certains microbiologistes considèrent que les micro-organismes qualifiés de "non-cultivés" ou "non-cultivables" possèdent des propriétés biologiques inconnues et pourraient en réalité être cultivés grâce à de simples modifications des conditions de mise en culture (Janssen et al., 2002 ; Joseph et al., 2003 ; Sait et al., 2002 ; Bruns et al., 2003a ; Giovannoni et al., 2007 ; Alain et Querellou , 2009) . Au cours de ces dernières années, des efforts ont ainsi été menés pour limiter les biais inhérents à la culture traditionnelle (Nichols, 2007) et ont permis d'accroitre l'efficacité de culture et notamment d'isoler des micro-organismes auparavant non-cultivés (Giovanonni et al., 2007) .

i. Concentration des substrats

Traditionnellement, la concentration des substrats dans les milieux de culture synthétiques est plusieurs fois supérieure aux concentrations mesurées dans l'environnement. La transition d'un écosystème naturel à un milieu de culture artificiel peut donc représenter un stress pour les micro-organismes (Bruns et al., 2003 ; Hahn et al., 2004). Les micro-organismes oligotrophes sont adaptés à de faibles concentrations en substrats et peuvent représenter une part importante des procaryotes récalcitrants à la culture in vitro (Ferrari et al., 2005 ; Watve et al., 2000) . Le transfert d' Escherichia coli , de Vibrio vulnificus ou de Micrococcus luteus dans un milieu riche à température optimale pour l'activité enzymatique induit la production instantanée de superoxides et d'autres radicaux (Bloomfield et al. , 1998 ). Si ce stress lié au substrat est évité, alors le stress oxydatif peut être limité (Bussmann et al. , 2001) . De plus, de fortes teneurs en nutriments peuvent promouvoir le développement d'organismes qualifiés d'opportunistes, capables de former des colonies visibles, des biofilms ou une turbidité (Ferrari et al. , 2005), au détriment d'espèces qualifiées d'oligotrophes. Afin de limiter le stress lié à une exposition massive au substrat, le milieu de culture initial peut être dilué ( Janssen et al., 2002) . Cette technique a permis d'isoler de nouveaux micro-organismes, mais l'incubation des cellules avec de faibles concentrations en nutriments présente le désavantage de générer une faible biomasse microbienne. Une alternative consiste à incuber les cellules avec des molécules complexes. Ces polymères sont progressivement hydrolysés au cours du temps et fournissent de façon continue de faible quantité de substrats (Sait et al., 2002 ; Davis et al., 2005). En 2004 , Hahn et collaborateurs ont développé une méthode de filtration/acclimatation des cellules. Les micro- organismes ont été placés à des concentrations croissantes en substrats au cours du temps et 56% des isolats ont représentés de nouveaux phyla cultivés.

27 I. Synthèse Bibliographique

Afin d'éviter un choc lié à une exposition massive au substrat, certains auteurs ont tenté de mimer l'environnement naturel aux travers de techniques innovantes (Ferrari et al., 2005 ; Kaeberlein et al., 2002 ; Yasumoto-Hirose et al. , 2006) . En 2002, Kaeberlein et al. ont dilué les sédiments pour séparer les micro-organismes des particules sédimentaires. Les cellules ont ensuite été incluses dans de l'agar placé entre 2 membranes dans une chambre de diffusion. Enfin, la chambre a été placée sur du sédiment et a permis d'isoler de nombreuses micro-colonies invisibles à l'œil nu.

ii. Maintien de la communication cellulaire in vitro

Reproduire au mieux les conditions physico-chimiques rencontrées in situ peut, dans certains cas, être insuffisant. La séparation des cellules microbiennes les unes des autres implique la suppression des communications intercellulaires. Ces interactions complexes prennent place dans les habitats naturels et font intervenir des populations microbiennes inter-dépendantes les unes des autres (Giovannoni et al., 2007) . La combinaison de deux organismes ou plus peut assurer une réaction biologique inexistante chez un micro-organisme en culture pure (symbiose, co- métabolisme ...). Des molécules signal sont produites et actives à de très faibles concentrations de l'ordre du picomolaire. Bien souvent, les populations microbiennes possèdent un seuil de sensibilité pour la molécule signal en dessous duquel les cellules ne se développent pas. Au sein des bactéries Gram positives, les molécules signal produites sont des protéines et des polypeptides. La protéine Rpf sécrétée par Micrococcus luteus augmente le taux de viabilité des cellules par 100 et peut aussi stimuler la croissance des cellules (Mukamolova et al. , 1998). Chez les micro-organismes Gram négatif, les molécules signal semblent être des molécules de faible poids moléculaire et plus particulièrement des dérivés des N-acyl homoserine lactones.

L'absence de communication intercellulaire dans un milieu de culture artificiel peut être contrebalancée par l'ajout de molécules signal. Batchelor et al. (1997) ont montré que le N-(3- oxohexanoyl) homoserine lactone (OHHL) réduit de façon significative la phase de latence d'une culture de Nitrosomonas europea préalablement carencée en substrats. De plus, lorsque la molécule signal n'a pas pu être identifiée, le surnageant d'une culture microbienne peut être utilisée. En 1999, Sun et Zhang ont pu stimuler la croissance et la viabilité de culture de M tuberculosis agées en ajoutant le surnageant d'une culture en fin de croissance dans le milieu de culture. L'ajout de surnageant a permis de réduire la phase de latence et d'augmenter la croissance de Micrococcus luteus (Kaprelyants et al., 1993) . L'ajout d'Acyl homoserine lactone (N-butyryl-HL et N-oxohexanoyl-DL-HL) à une concentration finale de 10 µM a amélioré

28 I. Synthèse Bibliographique significativement l’isolement de bactéries marines (Bruns et al., 2002) . Le N-oxohexanoyl-DL- HL représente l'homoserine lactone utilisée par la majorité des bactéries à Gram négatif capables de quorum sensing, tandis que le N-butyryl-HL possède une courte chaine acyl et diffuse donc plus facilement que les autres N-acyl homoserine lactone.

L'AMPc est retrouvé dans l'environnement à hauteur de 1 à 35 pM et a montré l'impact le plus significatif sur la croissance des micro-organismes (Ammerman et Azam, 1981) . A raison de 10 µM dans le milieu de culture, l'AMPc a augmenté l'efficacité de culture jusqu'à 100% des bactéries totales dans la mer Baltique (Bruns et al., 2002) et jusqu'à 10% dans un lac eutrophe (Bruns et al., 2003) . Cette molécule est connue pour être impliquée dans la régulation des enzymes cataboliques, dans la réplication de l'ADN, des gènes impliqués en situation de carence nutritive, et la répression des transcrits de l'ARN polymérase (Bruns et al., 2003b) . L'AMPc est retrouvé à hauteur de 0.2-1.2 nM dans l'eau de mer (Bruns et al., 2003b) . Des analyses de microautoradiographie ont révélé que l'AMPc a été utilisé par 18% des cellules. Même si l'effet est moins significatif que pour l'AMPc, l'ATP a également permis d'induire la croissance de nouvelles espèces. Dans l'optique d'isoler physiquement les cellules les unes des autres tout en maintenant une communication intercellulaire, Zengler et al. (2002) ont développé une technique haut-débit d'encapsulation des micro-organismes dans des microbilles d'agarose. Toutes les billes ont été placées dans une colonne où sont fournis les nutriments et où les molécules signales produites peuvent être échangées.

iii. Temps d'incubation et taille de l'inoculum

L'incubation des cultures peut être également un point critique pour l'isolement des micro- organismes. Les temps d'incubation sont généralement compris entre 1 semaine et 1 mois. Cependant, des études ont montré que les micro-organismes rarement cultivés sont souvent isolés lorsque les temps d'incubation sont supérieurs à 1 mois. Une longue période d'incubation permet le développement de micro-organismes à faible taux de croissance ou présentant une longue phase de latence due à un milieu de culture non-optimal. En 2002, Janssen et al. ont obtenu la meilleure efficacité d'isolement de micro-organismes en combinant de faibles concentrations de substrats et un temps d'incubation de 10 semaines. Des micro-organismes rarement cultivés ont été isolés et affiliés aux Acidobacteria et Verrucomicrobia .

Un échantillon de sédiment peut fournir un grand nombre de colonies, mais les micro- organismes à croissance rapide peuvent rapidement se propager dans un milieu de culture et

29 I. Synthèse Bibliographique inhiber la croissance cellulaire de micro-organismes plus lents à se développer. Retirer les colonies microbiennes qui apparaissent la première semaine d'incubation peut permettre l'isolement d'une plus grande diversité microbienne. Une autre alternative consiste à réduire la taille de l'inoculum. La réduction de l'inoculum n'est pas proportionnelle à la réduction du nombre d'isolats. En effet Davis et al. (2005) ont montré que pour la réduction d'un inoculum par 10, on observe une augmentation du nombre d'isolats par un facteur 2 (Figure I.10) . Le développement des colonies est probablement inhibé lorsque les colonies sont trop proches les unes de autres ou peut être lié à une carence nutritive. Cependant, le nombre de micro- organismes rarement isolés n'était pas significativement différent selon la taille de l'inoculum.

Figure I.10: Variation du nombre de colonies dénombrées sur boîte de Petri. Le graphique représente le nombre de colonies obtenues sur gélose avec une suspension sédimentaire (axe des abscisses) et une suspension sédimentaire 10 fois inférieure (axe des ordonnées) (Davis et al., 2005) .

30 I. Synthèse Bibliographique

iv. Procédures d'enrichissement

La culture traditionnelle est sélective et une fraction inconnue de la diversité microbienne totale est directement sous-estimée (Keller et Zengler, 2004) . Un milieu de culture ne peut pas assurer le développement de tous les micro-organismes présents in situ . Afin d'accroitre la fraction microbienne cultivée, des procédures d'enrichissement sont souvent menées sur l'échantillon initial . L'étape d'enrichissement a pour vocation de multiplier les conditions de croissance ou de favoriser la croissance d'un groupe fonctionnel particulier sous-représenté, ou des micro-organismes présentant des caractéristiques bien spécifiques (température, pH, potentiel redox, concentration en sels, carbone, énergie, accepteur d'électron, facteur de croissance, inhibiteur…). Le succès de la culture dépend de la capacité du microbiologiste a composer un milieu de culture qui va favoriser la croissance du groupe microbien d'intérêt et défavoriser la croissance de compétiteurs.

v. Techniques de culture haut débit

De nouvelles techniques de culture ont récemment été développées et ont contribué à isoler de nouveaux taxons microbiens jusqu'alors non cultivés. Ces techniques innovantes permettent d'isoler et cultiver les micro-organismes à haut débit (micromanipulation au laser, système microdrop® (Bruns et al., 2003a) , cytométrie de flux (Porter et al., 1993) , FACS (Park et al., 2005). Le système MicroDrop® développé par Bruns et al. (2003a) produit de façon très reproductible des gouttes de 150-200 pL afin d'inoculer des microplaques dans un milieu de culture défini. Cette technique haut débit assure l'ensemencement d'une microplaque 96 puits en moins d'une minute tout en évitant une dilution initiale des échantillons ( Bruns et al., 2003a). De plus, la technique s'avère être statistiquement plus reproductible que les méthodes du type MPN. Plus récemment, Ingham et al. (2007) ont développé une boîte de Petri subdivisée en millions de compartiments dans laquelle les nutriments sont fournis au travers d'une membrane poreuse. Cette technique assure la croissance et le criblage de millions de souches et constitue une manière efficace de supprimer les effets de compétitions intercellulaires. Elle permet ainsi la croissance de micro-organismes bien souvent inhibés par d'autres micro-organismes opportunistes.

Cependant, ces méthodes de culture haut-débit requièrent des matériaux et des logiciels couteux difficilement implémentables dans chaque laboratoire. En 2002, Connon et Giovannoni ont opté pour une procédure d'isolement en microplaques 48 puits pour le bacterioplancton, où la croissance était détectée par coloration des cellules au DAPI. Ce travail alliant de faibles

31 I. Synthèse Bibliographique concentrations en nutriments et une dilution basique des cellules en microplaques a permis la culture de nouveaux micro-organismes SAR11, OM43, SAR92, et OM60/OM241 considérés comme dominants dans les banques de clones.

3.4 Microbiologie en conditions d'anaérobiose

En plus des limitations précédemment évoquées, les conditions requises pour la croissance des micro-organismes sulfato-réducteurs et plus généralement des micro-organismes anaérobies compliquent drastiquement les procédures d'isolement, de culture et de conservation des souches. L’anaérobiose représente le mode de développement biologique dans un milieu anoxique. La croissance des micro-organismes qualifiés d'anaérobies stricts est directement inhibée en présence d'oxygène même à de faibles concentrations. Suite à la réduction de l'oxygène, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) se forment dans les cellules et peuvent être la conséquence de dysfonctionnements cellulaires (Cypionka et al. , 1985) . Cependant, la notion d’anoxie n'est pas uniquement associée à l’oxygène mais à un potentiel redox (Eh) équivalent ou inférieur à - 110 mV. Eh exprime le flux d’électrons des agents réducteurs vers les agents oxydants. Il est contrôlé par l’activité des électrons en solution (Sposito, 1983) . La formule de Nernst permet de calculer la valeur du potentiel rédox d’un couple dans des conditions données dès lors que le potentiel de réduction standart (E0’) est connu. E0’, exprimé en mV, indique la tendance de l’agent réducteur à perdre des électrons.pour des concentrations de solutés égales 1 mol.L -1, une température de 25°C et un pH 7.

Formule de Nernst : Eh = E° + (ln 10.RT/nF) x log {[Oxydant]/[Réducteur]}

R : Constante des gaz parfaits (8,314J.K-1.mol-1) T : Température en Kelvin (25°C = 298,15 K) F : Constante de Faraday (96 485 C.mol-1 = 1 F) n : Nombre d’électrons transférés dans la demi-réaction

i. Création et maintien de l'anaérobiose des milieux de culture

Des procédures bien spécifiques sont requises pour créer et maintenir les milieux de culture en conditions anoxiques. La fiole de Widdel (Widdel et Bak, 1992) est fréquemment utilisée pour préparer et distribuer les milieux de culture stérilement sous atmosphère contrôlée (Figure I.11) . Ce dispositif spécifique permet de dégazer le milieu autoclavé sous un flux de gaz neutre (argon ou azote). Cependant, une anaérobiose parfaite ne peut pas être obtenue par simple dégazage, et

32 I. Synthèse Bibliographique des agents chimiques sont requis pour réduire complètement les milieux de culture. Du fait de leur effet inhibiteur sur la croissance microbienne, ces agents réducteurs sont ajoutés à de faibles concentrations dans le milieu (<0.05%, w/v). L’efficacité réductrice varie selon le E0’ du couple redox correspondant (Table I.2). Les plus utilisés en laboratoire sont le thioglycolate de sodium, la cystéine HCl, le Na 2S,9H 20, les sulfures de fer, le dithiothreitol et la dithionite de sodium.

Figure I.11: Fiole de Widdel

Table I-2 : Potentiels d’oxydo-réduction des couples rédox utilisés en microbiologie (Plugge, 2005) .

33 I. Synthèse Bibliographique ii. Techniques traditionnelles d'isolements des micro-organismes sulfato-réducteurs

L'isolement des micro-organismes sulfato-réducteurs est basé sur des techniques développées dans les années 60/70 par Hungate (1969) et Wolfe (1971), les pionniers de l'anaérobiose. Ces méthodes n'ont que très peu évolué et sont encore largement utilisées dans les laboratoires de microbiologie. Les micro-organismes anaérobies stricts sont isolés et cultivés dans des contenants rendus hermétiques par un bouchon en butyle et un système de type Hungate (écrasement d’un bouchon grâce à un pas de vis) ou Balch (écrasement du bouchon par un anneau de sertissage en aluminium) (Figures I.12A et I.12B ). Afin de préserver les conditions anoxiques, chaque addition ou prélèvement dans les tubes de culture se fait au travers du bouchon butyl grâce à une seringue et une aiguille préalablement dégazée sous un flux d'azote.

Figure I.12: Systèmes de type (A) Balch (écrasement du bouchon par un anneau de sertissage en aluminium) ou (B) Hungate (écrasement d’un bouchon grâce à un pas de vis)

34 I. Synthèse Bibliographique

La technique "roll tube" développée par Hungate (1969) constitue l'équivalent de la boîte de Petri pour la culture en anaérobiose (Figure I.13) . Elle permet le dénombrement et l'isolement de colonies dans un tube fermé hermétiquement. Une fine couche de milieu gélosé contenant une suspension cellulaire diluée est répartie uniformément sur la paroi interne du tube et permettra le développement de colonies bien isolées. Grâce au développement des hottes et jarres anoxiques, l'isolement de micro-organismes anaérobies peut à présent être mené sur boîte de Petri. Bien que fastidieuse, la technique "roll tube" reste une technique moins sensible aux phénomènes de ré- oxydation des milieux de culture et est donc indispensable pour l'isolement de certains micro- organismes qui requiert des conditions anoxiques stringentes (potentiel rédox inférieur à - 300mV).

Figure I.13: Technique "roll tube" développée par Hungate (1969). Elle constitue l'équivalent de la boîte de Petri pour la culture en anaérobiose.

35 I. Synthèse Bibliographique

L'isolement de micro-organismes sulfato-réducteurs peut également être mené via des séries de dilution en tubes, en gélose profonde ou en milieu liquide (Pfennig & Trüper, 1992). Le milieu gélosé est maintenu en surfusion pour réaliser les dilutions successives de l'échantillon. Contrairement aux milieux de culture liquides, la gélose possède l'avantage de conduire à l'obtention de colonies distinctes qui peuvent par la suite être prélevées à l'aide d'une pipette Pasteur. La plupart des micro-organismes sulfato-réducteurs décris à ce jour ont été isolés grâce aux techniques décrites ci-dessus. Cependant, la complexité des procédures d'isolement en anaérobiose et les limites associées à la culture in vitro conduisent bien souvent à une faible diversité culturale. L'application des méthodes innovantes développées ces dernières années peuvent dans certains cas s'appliquer à l'anaérobiose sous réserves de certaines adaptations. Par exemple, la technique d'encapsulation des cellules en cytométrie en flux (Zengler et al. , 2002) peut être envisagée pour la culture en anaérobiose des micro-organismes sulfato-réducteurs.

36 II. Procédures expérimentales

CHAPITRE II - PROCEDURES EXPERIMENTALES

37 II. Procédures expérimentales

1. SITE D'ETUDE

1.1 Description de l'estuaire de l'Adour

L’estuaire de l’Adour prend sa source entre le Pic du Midi de Bigorre (2872 m) et le Pic des Quatre Termes (2542 m). Il parcourt le bassin Aquitain sur plus de 300km et se jette au niveau du Golfe de Gasconne après Bayonne. Ses principaux affluents sont le Gave de Pau, le Gave d’Oloron, la Nive et le Luy. Cet écosystème fait l’objet d’une forte pression anthropique reposant sur un ensemble d’activités portuaires, industrielles, et agricoles associées aux rejets domestiques des agglomérations situées tout au long du bassin versant (Pau, Tarbes, Orthez, Bayonne et Tarnos). Au niveau de l’embouchure, la largeur de l’estuaire n’excède pas 150 m avec des fonds de 12 m en moyenne (Figure II.1). Le débit moyen annuel mesuré à l'embouchure est de l’ordre de 350 m 3.s -1 et la charge en matières en suspension avoisine les 10 mg.L -1. Cependant, lors des périodes de crue, le débit peut atteindre plus de 1800 m 3.s -1 avec une charge de matière en suspension pouvant atteindre les 600 mg.L -1. La quantité de matière exportée dans le Golfe de Gascogne a été estimée entre 0,25 et 0,30 Mt par an (Maneux et al., 1999 ; Snoussi et al., 1990). Le temps de résidence de la matière en suspension dans le panache est relativement faible et n'excède pas plusieurs jours. L’influence marine, par rapport au volume total de l’estuaire varie de 15 à 37% selon les conditions de débit et les coefficients de marée, mais la moyenne annuelle est estimée à 20-25%.

Figure II.1: Photographies de l’estuaire de l’Adour. Les agglomérations de Tarnos, Anglet, Boucau et Bayonne sont situées à proximité de l’embouchure de l’estuaire.

38 II. Procédures expérimentales

1.2. Stratégies d’échantillonnage

i. Station B20

La station B20 est localisée à moins de 10 kilomètres de l'embouchure de l'estuaire de l'Adour, entre le point kilométrique 125 (en amont) et le point kilométrique 130 (en aval) (Figure II.2). Cette station est une zone de mélange de l'eau douce et l'eau de mer qui est fonction des coefficients de marée. Les premiers centimètres de sédiments ont été collectés le 27 Octobre 2009 pour une optimisation de la procédure d’isolement haut débit des BSR et l’échantillonnage principal a été mené le 18 Novembre 2009. Pour chaque échantillonnage, les sédiments ont été stockés à 4°C dans des tubes hermétiques sans phase gazeuse de façon à conserver les conditions d’anoxie. La salinité de la colonne d’eau a été évaluée à 1% (réfractomètre Atago S10) et la température était de 13°C. En fonction, des coefficients de marée, la concentration en sulfate de la station B20 varie entre 0.3mM (eau douce en amont) et 7.1mM (eau de mer diluée en aval).

Figure II.2: Localisation de la station de prélèvement B20 dont les sédiments ont servis à

l’étude moléculaire et culturale haut-débit des BSR.

39 II. Procédures expérimentales

ii. Campagne METADOUR III

Le panache de l'estuaire de l'Adour a été échantillonné au cours de la campagne METADOUR III, menée sur la période du 15 au 18 mai 2010, en collaboration avec le Laboratoire de Chimie Analytique Bio-inorganique et Environnement (LCABIE - UMR IPREM 5254). Le gradient étudié comprend une station intra-estuarienne (ES), une station dans le panache concentré (PC), une station dans le panache dilué (PD) et une station marine (MA) (Figure II.3) . Pour chacune des 4 stations, des prélèvements ont été réalisés à différentes profondeurs à l'aide de bouteilles Niskin et GoFlow (Figure II.4) . Chaque échantillonnage a fait l'objet de plusieurs dosages: nitrate, nitrite, oxygène, phosphate et d’un profil hydrologique des paramètres physiques de la colonne d’eau (température, salinité, turbidité, pH,…). Pour les analyses de biologie moléculaire, chaque échantillon d'eau a été filtré sur 0,22 m jusqu’à saturation du filtre. Les points de prélèvement et les volumes d’eau filtrés sont résumés dans la Table II.1 . Les filtres ont été directement stockés dans l’azote liquide puis conservés à -80°C jusqu’à analyse. Enfin, des échantillons d’eau ont été immédiatement utilisés pour l’isolement de BSR en microplaques 384 puits.

Figure II.3: Localisation des 4 stations de prélèvement (ES, PC, PD et MA) dans le panache

de l’estuaire de l’Adour. Des échantillons d’eau ont été collectés à différentes profondeurs et

ont servis à l’étude moléculaire et culturale haut-débit des BSR.

40 II. Procédures expérimentales

Figure II.4: Représentation schématique du gradient échantillonné le long du panache de l’estuaire de l’Adour. Pour chacune des 4 stations échantillonnées (ES, PC, PD et MA), l’eau a été récoltée a différentes profondeurs.

Table II-1 : Volumes d'eaux collectés à différentes profondeurs sur les 4 stations d'échantillonnage et filtrés jusqu’à saturation de la membrane de porosité 0,2 m

Profondeur Volume d’eau filtrée Stations d’échantillonnage (m) (mL) Station intra-estuarienne (ES) 1 - (15.05.2010) 6 - 1 600 Station panache concentré (PC) 5 1100 (17.05.2010) 24 1500 1 900 Station panache dilué (PD) (17.05.2010) 13 1200 55 1500

5 1200 Station marine (MA) 22 1500 (18.05.2010) 240 2100 800 2100

41 II. Procédures expérimentales

2. APPROCHE CULTURALE DES BSR

2.1 Milieux de culture pour l'isolement de BSR

Les BSR des sédiments de la station B20 et du panache de l'estuaire de l'Adour ont été isolées dans un milieu de culture à base d'eau collectée dans la station B20. L'eau récoltée sur site a été filtré (0,45 m), puis enrichie en Na 2SO 4, 4 g ; Na 2S2O3, 0,79 g ; KH 2PO 4, 0,20 g ; NH 4Cl, 0,24 g. et tampon HEPES, 10 mM. Les donneurs d’électrons utilisés sont le lactate-Na, 5 mM ; l’acétate-Na, 5 mM ; le pyruvate-Na, 5 mM ; et le glycérol, 5 mM. Les solutions de sélénite- tungstate, 1 mL ; d’éléments traces SL12 , 1 mL ; et de résazurine, 1 mL, ont été rajoutées et sont présentées ci dessous. Pour les isolements menés dans les stations PC, PD et MA du panache, la salinité du milieu de culture a été ajustée à hauteur de 20 g.L -1. Les milieux de culture ont été préparés en fioles pénicillines de 100 mL, fermées hermétiquement par un bouchon butyl et serties avec une capsule en aluminium. Après stérilisation à l’autoclave 20 min à 121°C, sous une pression de 1 bar, le milieu a été refroidi sous flux d'azote. Enfin, 0,25 mL de solution de vitamines V7 diluée au 1/10 ème , 200 M de dithionite et 1mM d'une solution de FeSO4 ont été ajoutés avant utilisation.

Solution d’éléments traces SL12 (Overmann et al. 1992)

Contient pour 1 L d’eau distillée : EDTA, 3,0 g ; FeSO 4.7H 2O, 1,1 g ; CoCl 2.6H 2O, 190 mg ;

MnCl 2.2H 2O, 50 mg, ZnCl 2, 42 mg ; NiCl 2.6H 2O, 24 mg ; Na 2MoO 4.2H 2O, 18 mg ; H 3BO 3, 300 mg ; CuCl 2.2H 2O, 2 mg. La solution est stérilisée à l’autoclave à 121°C pendant 20 minutes, puis stockée à l’obscurité.

Solution de résazurine (Widdel and Bak, 1992) La résazurine, un indicateur d'oxydo-réduction, a été utilisée dans les milieux de culture à raison de 1 mg L -1. Au cours de la stérilisation du milieu, ce composé est irréversiblement réduit en résofurine, de couleur rose à pH neutre. Lors de la réduction du milieu, la seconde réaction réversible, consiste en la production de hydrorésofurine. En dessous d'un potentiel rédox de - 110mV pour le couple rédox résofurine/hydrorésofurine, le milieu de culture devient transparent et redevient rose si le potentiel rédox redevient supérieur à -51mV. Cependant, un virage du milieu de culture au rose ne signifie pas forcément que le milieu s'est oxydé. Certains micro- organismes opérant la réduction du nitrate produisent des nitrites qui peuvent agir comme oxydants potentiels et augmenter le potentiel redox. De la même façon, un milieu de culture

42 II. Procédures expérimentales transparent ne signifie pas que les conditions réduites sont atteintes puisque certains micro- organismes requièrent un potentiel redox bien inférieur à -110mV pour leur croissance.

Solution de vitamines V7 (Pfennig et Trüper, 1992) Contient pour 1L d’eau distillée : biotine, 2 mg ; p-aminobenzoate, 10 mg, thiamine, 10 mg ; pantothénate, 5 mg ; pyrodoxamine, 50 mg, vitamine B12, 20 mg ; nicotinate, 20 mg. La solution est stérilisée par filtration (porosité 0,2 m) et stockée à l’obscurité.

Solution de dithionite (Na 2S2O4) 0.1M

0,17g de Na 2S2O4 sont dilués dans de l’eau distillée, dégazée sous flux d’azote. La solution est stockée à 4°C dans un flacon fermé hermétiquement par un bouchon en butyle en condition anoxique et stérilisée par filtration (membrane filtrante de porosité 0,2 m).

Solution de Fer (FeSO 4, 7H 2O) 0.5M

1.4g de FeSO 4, 7H 2O sont dilués dans de l’eau distillée, dégazée sous flux d’azote. La solution est stockée à 4°C dans un flacon fermé hermétiquement par un bouchon en butyle en condition anoxique et stérilisée par filtration (membrane filtrante de porosité 0,2 m).

2.2 Enrichissements des sédiments de la station B20

Les sédiments collectés sur la station B20 ont été dilués au 1/10 avec de l’eau collectée sur site. Les suspensions sédimentaires ont été réparties dans 90 tubes Bellco à raison de 20 mL par tube. 2 tubes (sédiment initial) ont été immédiatement homogénéisés. 18ml ont été centrifugés 15min à 5000 g à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et le sédiment a été conservé à -80°C pour les analyses moléculaires. Du glycérol (Cf: 30%) a été ajouté aux 2 mL restants pour cryoprotéger les cellules à -80°C en vue d’une procédure d'isolement. Les 88 tubes restants ont été incubés sous différentes conditions physicochimiques (substrat, température et éclairage) (Table II.2). Les substrats testés sont l’acétate (1 et 20 mM), le lactate (1 et 20 mM), l’éthanol (20 mM), le glycérol (20 mM), le pyruvate (20 mM), la cellulose (3g), l’hydrogène (phase gazeuse), et une suspension dense de microphytobentos récolté sur le site de prélèvement. Ces dix essais ont été réalisés en duplicata et incubés à 10°C et 30°C, avec et sans éclairage (lampe à incandescence avec régime continu). Une fois la croissance des micro-organismes sulfato-réducteurs détectée par la formation de précipités de sulfures de fer, les enrichissements ont été traités comme les échantillons initiaux.

43 II. Procédures expérimentales

Table II-2 : Enrichissements des sédiments de la station B20 menés sous différentes

conditions physico-chimiques (substrat, température et éclairage). Les sédiments ont

été incubés jusqu'à la détection de précipités de sulfures de fer.

10°C 30°C Substrats Lumière Obscurité Lumière Obscurité Acétate 1 mM 62 jours 18 j. 62 j. 10 j. Acétate 20 mM 18 j. 18 j. 9 j. 9 j.

microphytobentos 62 j. 62 j. 62 j. 62 j.

Cellulose 14 j. 14 j. 4 j. 4 j. Ethanol 20 mM 10 j. 18 j. 4 j. 4 j. Glycérol 20 mM 18 j. 18 j. 4 j. 4 j. Hydrogène 10 j. 10 j. 3 j. 3 j. Lactate 1 mM 62 j. 18 j. 62 j. 10 j.

Lactate 20 mM 10 j. 10 j. 4 j. 4 j. Pyruvate 20 mM 14 j. 18 j. 4 j. 4 j. Contrôle final 62 j. 62. j.d 62 j. 62 j.

IS.2 0 j.

2.3 Isolement haut- débit des BSR

Une méthode de dilution jusqu’à extinction des BSR a été optimisée en microplaque 384 puits et appliquée aux sédiments de la station B20 et au panache de l'estuaire de l'Adour durant la campagne METADOUR III. La miniaturisation des volumes de culture (100 µL) a permis d'accroitre significativement le nombre d'isolats traités. La croissance des micro-organismes sulfidogènes a pu être mise en évidence par la formation d'un précipité noir (FeS), résultant de la réaction de l'hydrogène sulfuré (H 2S) produit lors de la sulfato-réduction avec le fer présent dans le milieu de culture (Figure II.5) .

Réduction dissimilatrice des sulfates

2- + 4H 2 + SO 4 + 2H H2S + 4H 2O

Précipitation des sulfures

2+ + H2S + Fe FeS (précipité noir) + 2H

44 II. Procédures expérimentales

En amont de l’isolement, des séries de dilutions des échantillons ont été menées pour déterminer la dilution optimale, pour laquelle la moitié des puits de la microplaque contient une croissance positive, et théoriquement une seule cellule (Figure II.5.1) . Les isolements ont ensuite été réalisés en répartissant la dilution optimale dans plusieurs microplaques 384 puits. Les cultures ont été placées à 18°C pendant 2 à 3 semaines afin d’assurer la croissance d’un maximum d’isolats (Figure II.5.2) . Pour assurer des conditions anoxiques et éviter les phénomènes de réoxidation, toute la procédure d'isolement a été menée en chambre anoxique (Bactron III) et les microplaques ont été scellées dès que possible avec un film Alumaseal CS TM et incubées en sachets Gazpack® (BD GasPakTM EZ Gas Generating Pouch Systems).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415 16 17 18 19 20 21 22 23 24 A A B B C C D D E E F F G Détermination de G H Dilution Dilution H I la dilution I J J K K L optimale L M M N N O O P P

1.Dilutions en série (1/10) 2. Procédure d’isolement

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 A B Amplification du C gène codant D E pour l’ARNr 16S F G H

3. Repiquage en

4. Affiliation phylogénétiques microplaques 96 puits des souches

Figure II.5: Procédure d’isolement et d’identification des micro-organismes sulfato-

réducteurs en microplaques 384 puits. 1 : Des séries de dilutions des échantillons ont été

menées pour déterminer la dilution qui offre une croissance positive dans la moitié des

puits. 2 : La dilution optimale a été répartie dans plusieurs microplaques 384 puits. 3 : Les

puits positifs sont recultivés en microplaque 96 puits. 4 : Les souches sont identifiées par

amplification et séquençage du gène codant l’ARNr 16S.

45 II. Procédures expérimentales

2.4 Identification des souches

Une fois la croissance de micro-organismes sulfidogènes détectée, les isolats ont été repiqués en microplaques 96 puits dans un volume de 200 µL (Figure II.5.3) . Les microplaques ont été incubées à 18°C pendant 1 semaine et 1 µL de culture a été utilisé pour une amplification directe du gène codant pour l’ARNr 16S (Figure II.5.4) . Les amplifications ont été réalisées dans un volume final de 50 µL avec les amorces 63F/1387R (0.2 M), 0,4 mM de dNTPs, 2mM de MgCl2, 1.25U de Taq polymérase (Eurobio) et son tampon. Les réactions d’amplification sont menées selon le programme suivant : 1 cycle de 15 min à 95°C pour lyser les cellules et dénaturer les acides nucléiques, 34 cycles de 3 étapes : dénaturation 45 sec à 95°C, hybridation 45 sec à 58°C et élongation 1 min à 72°C, puis un cycle d’élongation final de 10 min. Un séquençage avec l’amorce 63F des amplicons obtenus a été effectué (GATC Biotech - Konstanz, Germany) .

2.5 Conservation des souches

Une fois identifiées, les souches sulfato-réductrices d'intérêt ont été recultivées dans des volumes de culture de 7 mL. La pureté des souches a été vérifiée par observations microscopiques et repiquages successifs. Les souches en pleine phase de croissance exponentielle ont enfin été cryoprotégées avec du glycérol (10% vol/vol) et conservées à -80°C.

3. APPROCHE MOLECULAIRE

3.1 Extraction des acides nucléiques

Toutes les extractions d’ADNs génomiques, à partir des différents échantillons issus des sédiments ou de cultures pures, ont été réalisées à l’aide d’un kit (UltraCleanTM Soil DNA isolation kit, MoBio Laboratories) selon les recommandations du fournisseur. Toutefois, l’addition d’EDTA (10 mM) est nécessaire lors de la première étape de lyse cellulaire, permettant ainsi d’inactiver les nucléases présentes au cours de l’extraction. Ce kit combine deux types différents de lyses cellulaires, une lyse mécanique par broyage et une lyse enzymatique.

3.2 Réactions de polymérisation en chaîne (PCR)

La PCR est une méthode permettant d’obtenir rapidement une quantité importante d’un segment précis d’ADN contenu dans une matrice complexe d’ADN génomique (10 ng) grâce à l’utilisation de deux amorces de polarité opposée encadrant le fragment à amplifier (Mullis et al.,

46 II. Procédures expérimentales

1986 ; Saiki et al., 1985) . Un thermocycleur automatisé répète des cycles de trois étapes : la dénaturation de l’ADN par élévation de température, l’hybridation des amorces (température d’hybridation évaluée par Tm= 2AT+4GC) et la synthèse du brin complémentaire grâce à une ADN polymérase thermostable. L’amplification du fragment d’ADN cible est exponentielle. Il est parfois nécessaire de réaliser des PCR dites nichées. Dans ce cas, l’amplicon obtenu après une première PCR est amplifié à l’aide d’un couple d’amorces (internes aux premières) qui s’hybride à une partie interne de la séquence amplifiée (gain en sensibilité et spécificité). La réaction de PCR est préparée dans un volume réactionnel de 50 L contenant environ 10 ng d’ADN matriciel, 0,4 M de chacune des deux amorces utilisées, 0,2 mM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1,25 U de Taq polymerase (Eurobio) avec son tampon réactionnel 1X final.

3.3 Purification des amplicons et dosage de l’ADN amplifié

Les produits PCR sont purifiés à l’aide du kit commercial GFX TM DNA Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech) . Cette purification a pour but de séparer le fragment d’ADN amplifié du reste des composants du milieu de réaction (protéines, sels) et notamment des autres acides nucléiques (amorces non utilisées, amplification de séquences non désirées inférieures à 100 paires de bases, …). Afin d’évaluer les quantités d’ADN amplifié, une méthode d’estimation des quantités d’ADN amplifié a été utilisée. Elle est basée sur l’utilisation d’un marqueur de taille (Smartladder Eurogentec, USA) lors de l’électrophorèse. En suivant les recommandations du fournisseur, à chaque bande est associée une quantité d’ADN. L’intensité de fluorescence de ces dernières peut ainsi être comparée à celle des produits PCR et une estimation de la quantité d’ADN peut alors être donnée.

3.4 Analyses moléculaires de la diversité par T-RFLP

i La T-RFLP (Terminal-Restrictive Fragments Length Polymorphism)

La méthode de la T-RFLP a été développée par Liu et al. (1997) . Après extraction des ADNs génomiques de chaque échantillon et amplification par PCR avec des amorces fluorescentes spécifiques, les communautés bactériennes ne sont plus représentées que par un mélange de gènes d’intérêts amplifiés (les gènes dsr AB par exemple). La T-RFLP permet de mettre en évidence le polymorphisme de taille des fragments terminaux de restriction (T-RFs: terminal restriction fragments), obtenus après hydrolyse par des endonucléases de restriction des produits PCR marqués. La longueur de ces T-RFs peut varier d’une espèce à l’autre selon la position de la

47 II. Procédures expérimentales séquence nucléotidique reconnue par l’enzyme. Les populations bactériennes sont ainsi représentées par la taille en paires de base (pb) de leurs fragments de restriction terminaux respectifs.

ii. Amplification des gènes dsrAB par PCR

Afin de caractériser la composition microbienne totale sulfato-réductrices des communautés bactériennes, un couple d’oligonucléotides fluorescents portant en 5’ un fluorochrome (FAM ou carboxyfluoresceine) ont été utilisés. Ce couple d’amorces ciblant le gène codant pour le gène métabolique de la bisulfite réductase (dsrAB) a été sélectionnés dans le but de caractériser la population bactérienne des sulfato-réducteurs.

iii. Digestion enzymatique

La digestion enzymatique est ici utilisée afin d’étudier le polymorphisme de longueur au sein de différents échantillons. L’enzyme de restriction utilisée reconnait des sites spécifiques de clivages à 4 paires de bases et présentent ainsi une fréquence de coupure importante. Environ 700 ng des différents produits PCR purifiés sont soumis à une digestion enzymatique selon les recommandations du fournisseur (New England BioLabs) . L’hydrolyse a été réalisée dans le tampon réactionnel préconisé par le fournisseur avec 10 unités d’enzyme pour digérer environ 1 g d’ADN amplifié. Une incubation de 3 heures est réalisée à 37°C, température optimum d’activité de l’enzyme utilisée.

iv. Electrophorèse capillaire

Uniquement 100 ng de chaque digestion subissent une dénaturation physique pendant 2 min à 95°C, en présence de 20 L de formamide (dénaturant chimique) ainsi que de 0,5 l de marqueur de taille moléculaire (TAMRA 500, Applied Biosystems) . Après une injection électrocinétique de l’échantillon pendant 30 secondes dans un capillaire contenant un gel polymère adapté (gel de polyacrylamide Pop-4, Applied Biosystems), la migration est effectuée sous une tension de 15 kV pendant 30 minutes à 60°C. Cette migration entraîne alors la séparation des différents fragments de restriction selon leur taille. Seuls les fragments de restriction en position terminale (T-RFs) sontdétectés, car ils contiennent l’amorce fluorescente. Une analyse préliminaire des électrophorégrammes est réalisée grâce au logiciel GeneScan v3.0 (Applied Biosystems) permettant de déterminer les tailles des différents fragments détectés.

48 II. Procédures expérimentales

v. Analyses des données T-RFLP

L’analyse des données de manière statistique vise à répartir, en un certain nombre de groupes, les différents profils T-RFLP en fonction de leurs caractéristiques respectives mesurées (T RFs définis par la taille en paires de bases [pb], hauteur de l’intensité de fluorescence). Les diverses techniques statistiques de classification visent toutes à répartir n échantillons sur chacun desquels on a mesuré p caractéristiques (nombre de T-RFs, présence ou absence de T-RFs) en un certain nombre m de sous groupes aussi homogènes que possible, où le choix (subjectif) de m résultera d’un compromis à trouver entre une description qui soit à la fois suffisamment simple (m pas trop grand) et suffisamment détaillée (m pas trop petit). Le logiciel utilisé pour les analyses est MVSP version 3.12.d (http://www.kovcomp.com) .

3.5 Clonage

i. Principe du clonage

Le clonage a pour but de séparer et d’obtenir des copies identiques d’un gène ou d’un fragment de gène en l’intégrant dans un plasmide (vecteur). Les produits PCR sont clonés chez Escherichia coli JM109 selon le kit de clonage pGEM® - T Easy Vector System (Promega). Les cellules transformées par le plasmide recombinant sont sélectionnées sur milieu sélectif solide composé de LB (Tryptone, 10 g.L -1 ; Extrait de levure, 5 g.L -1 ; NaCl, 5 g.L -1) avec de l’ampicilline à 100 g.ml-1, de l'IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactoside) à 40 g.mL-1 et du Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indole-β-D-galactoside) à 40 mg.mL-1. Les colonies contenant l'insert sont alors repiquées sur une nouvelle boîte de Petri contenant le même milieu LB sélectif. Enfin, l’insert de 96 clones blancs pris au hasard est réamplifié. La réaction de PCR est réalisée directement sur les cellules bactériennes pour chaque clone, dans les mêmes conditions que précédemment avec les amorces M13F et M13R situées sur le plasmide (M13F 5'- CTGGCCGTCGTTTTAC-3' et M13R 5'-GGTCATAGCTGTTTCCTG-3'). Le programme utilisé est le suivant : 5 min à 94°C, 35 cycles de 3 étapes (45 sec à 94 °C, 45 sec à 54 °C, 1 min à 72 °C) suivis de 10 min à 72 °C.

49 II. Procédures expérimentales

ii. Séquençage des gènes

D’après Sanger et al. (1992), la réaction de séquençage est basée sur l’interruption de l’étape d’élongation au cours du processus polymérisation de l’ADN. Le fragment à séquencer est utilisé comme matrice lors de la synthèse nucléotidique réalisée par une ADN polymérase. Le brin complémentaire de l’ADN matrice est synthétisé à partir de l’extrémité 3’OH de l’amorce appariée, en présence de désoxyribonucléotides triphosphates (dNTPs) et de didésoxyribonucléotides tri-phosphates (ddNTPs) portant quatre fluorochromes différents. Les ddNTPs, analogues structuraux des dNTPs et deshydroxylés en 3’, sont des terminateurs de chaîne. Ainsi, l’incorporation d’un ddNTP dans la chaîne nucléotidique lors de l’élongation entraîne l’arrêt de l’extension de la séquence. Le pool d’oligonucléotides néo-synthétisé est ensuite séparé en fonction de la taille par électrophorèse capillaire. Il devient alors possible de déterminer pour chacun des quatre fluorochromes utilisés la taille des fragments obtenus et d’en déduire la séquence nucléotidique du fragment analysé.

3.6 Analyses phylogénétiques

Les séquences obtenues sont alignées à l’aide du logiciel ClustalX 1.81 (ftp://ftpigbmc.u- strasbg.fr/pub/ClustalX/) avec celles de référence présentes dans les banques de données (NCBI pubmed) . Cette opération consiste à disposer les unes en dessous des autres des portions de séquences similaires en minimisant leurs différences. Toutes les séquences sont ajustées à la taille de la séquence nucléotidique la plus courte (http://helios.bto.ed.ac. uk/evolgen/filatov/proseq.htmL) . L’ensemble des séquences est alors analysé par le logiciel MEGA4 (www.megasoftware.net) qui génère un arbre phylogénétique. Les arbres phylogénétiques sont élaborés par comparaison des séquences d’ADN (ADN codant pour l’ARN 16S ou pour un gène métabolique) selon une méthode dite de distances: le neighbor joining. A la différence de l’autre méthode des distances, UPGMA, celle du neighbor joining n’est pas ultramétrique. Elle n’implique pas que les séquences évoluent à une vitesse constante (hypothèse d’horloge moléculaire rarement confirmée). La méthode du neighbor joining permet de déterminer le nombre de nucléotides qui varient entre deux séquences. C’est une méthode agglomérative qui utilise un algorithme de «clusterisation». Les séquences sont rassemblées d’après leur similarité. Les séquences les plus similaires sont regroupées entre elles, puis comparées aux autres pour former un groupe plus vaste dans lequel le degré de similarité est moindre (Sneath et Sokal, 1973) . Des méthodes statistiques permettent de vérifier la robustesse des arbres tels que le « bootstrap » (Felsentein, 1985) . Les arbres phylogénétiques sont construits à partir d’une matrice de données initiale dans laquelle des tirages aléatoires avec remise sont

50 II. Procédures expérimentales réalisés. Cette opération est reproduite 1000 fois. L’ensemble des topologies obtenues est comparé et un pourcentage de robustesse est attribué à chaque nœud de branche. Le pourcentage est d’autant plus élevé que le nœud de branche est retrouvé dans les différentes topologies. Plus ce pourcentage est élevé plus le nœud est robuste. Les pourcentages inférieurs à 50 % ne sont généralement pas pris en considération. La topologie de l’arbre sera particulièrement sensible à la qualité des séquences extérieures ou «outgroup» choisies pour la reconstruction et servant à enraciner l’arbre (Daveli et al., 2001) . L’«outgroup» doit être suffisamment distant des autres séquences pour permettre la discrimination et le positionnement des unes par rapport aux autres.

Les séquences ont été regroupées entre elles en unités taxonomiques opérationnelles (OTUs) grâce au logiciel DOTUR (Schloss and Handelsman, 2005) . Une séquence représentative a ensuite été utilisée pour assigner les OTUs à un taxon. Afin de définir les différents phylotypes et établir les courbes de raréfaction, les séquences ont été alignées par ClustalW et une matrice de distances nucléotidiques a été calculée avec la suite de logiciels Phylip (Felsentein, 1989) . Le logiciel DOTUR a ensuite permi d'identifier les différents OTUs en fonction du seuil de coupure choisie pour la similarité des séquences.

51 II. Procédures expérimentales

4. ESTIMATION DU POTENTIELS DE METHYLATION DU MERCURE

4.1 Biosenseur

Un biosenseur, la souche E.coli MC1061, a été utilisé pour estimer la production de méthylmercure chez les souches sulfato-réductrices isolées. Cette souche, génétiquement modifiée, héberge le plasmide pmerR BS BPmerlux qui contient l’opéron de la luciférase luxCDABE issu de Photorhabdus luminescens (Frackman et al. , 1990) , fusionné avec les gènes mer impliqués dans la résistance au mercure. L’enzyme clef du système rapporteur est une organomercurielle lyase, produit du gène mer B. Cette enzyme produite constitutivement par la souche MC1061 catalyse le clivage de la liaison carbone-méthyle du méthylmercure. Le Hg 2+ produit va induire l’expression du gène rapporteur mer R et celle de l’opéron luxCDABE (Rantala et al. , 2011) (Figure II.6) . L’expression de l’opéron luxCDABE produit des cellules luminescentes. La souche MC1061 porte également sur le plasmide le gène de résistance à l’ampicilline facilitant ainsi la manipulation de biosenseur. Afin d’obtenir un biosenseur spécifiquement sensible au méthylmercure, Rantala et collaborateurs conseillent de chélater le mercure inorganique en utilisant une concentration optimale d’EDTA (Rantala et al. , 2011) .

MeHg Hg 2+ + Product of merR gene: Product of merB gene: + P regulatory protein of the Organomercurial Lyase me mer R r R mer operon

B Pm r e e r m

c a l P

Plasmide A B

pmerR BPmerlux E

R BS

p p

m Bacterial luciferase

A A reporter operon (luxCDABE) from Ampicillin Resistance Photorhabdus luminescens

Figure II.6: Plasmide pmerR BS BPmerlux porté par la souche E.coli MC1061 ( D’après Rantala et al. , 2011 ; Ivask et al. , 2009 )

52 II. Procédures expérimentales

4.2 Estimation de la production de méthylmercure par le biosenseur

Les sulfures produits par les BSR au cours de la sulfato-réduction pouvant interférer avec le méthylmercure, l’optimisation de la méthode a été réalisée en cultivant les micro-organismes en respiration fumarate. Pour les souches qui ont par la suite été cultivées en sulfato-réduction, les sulfures produits ont été complexés en partie par ajout de FeSO 4 (1 mM) avant l’incubation avec le mercure inorganique (Figure II.7) . Après incubation, 100 µL de culture ont été prélevés en triplicat à l'aide d'une seringue stérile et préalablement dégazée à l'azote. Le volume prélevé a ensuite été transféré dans une microplaque spéciale pour la mesure de luminescence, à raison de 100 µL par puits, et stocké à -20°C avant analyse (Figure II.7) .

En parallèle, la souche E.coli MC1061, hébergeant le plasmide pmerR BS BPmerlux, a été cultivée dans un milieu LB à 37°C contenant de l’ampicilline à raison de 100 µg.mL -1. Une fois la souche en phase exponentielle de croissance (DO600nm : 0.8-0.9), les cellules ont été centrifugées à 6000g pendant 10 min à température ambiante, et resuspendues dans du milieu LB 2X de façon à obtenir une DO600nm de valeur 1. 100 µL du biosenseur ont ensuite été rajoutés par puits et la microplaque a été incubée 1H à 37° sous agitation de 250 rpm. Enfin, la bioluminescence produite en présence de méthylmercure a été mesurée à 482 nm sur un luminomètre à microplaques (Series 4000 Perspective Biosystem).

Respiration FeSO 4 du sulfate (1mM)

BSR iHg Respiration T (T 0-T3H ) du fumarate Δ 100 µl

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 A Incubation B Bioluminescence C Biosensor D 1H à 37 °C E (482 nm) F 100 µl à 250 rpm G H

Figure II.7: Procédure de détection de la production de méthylmercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur luminescent.

53 II. Procédures expérimentales

4.3 Dosage chimique du méthylmercure par GC-ICP-MS

Cette technique fait intervenir l’utilisation d’isotopes stables. Elle permet de suivre la transformation du 199 Hg 2+ ajouté dans la culture microbienne en CH3 199 Hg+ et donc d'évaluer le processus de méthylation du mercure inorganique. Les composés du mercure sont extraits sous champ micro-ondes en système ouvert (Figure II.8) . L’utilisation de ce système permet une extraction douce à pression atmosphérique, limitant ainsi les problèmes de transformation et de conversion des différentes espèces. Le magnétron produit les micro-ondes puis le guide d’ondes permet de les focaliser. 4 mL d’extrait et 2 mL de HNO 3 6N sont placés dans un matras pour pouvoir atteindre les espèces intracellulaires ou complexées. Celui-ci est directement introduit dans le guide d’ondes, afin d’augmenter leur efficacité, 2 minutes à 45 W. Il est important de placer la tête de condensation afin d’éviter les vapeurs et les pertes éventuelles.

Une étape d’éthylation permet de rendre les espèces de mercure étudiées volatiles, permettant ainsi leur analyse par chromatographie gazeuse. En pratique, 1 mL d’extrait est mélangé à 5 mL de tampon acétate 0,1 M puis le pH est ajusté à 4 (pH optimum pour la dérivation des formes du mercure). Puis sont introduits au mélange 1 mL d’isooctane et 1 mL de tetraéthylborate de sodium (NaBEt 4) 1%. Le mélange est agité vigoureusement pendant 5 minutes. Enfin, la phase organique est prélevée pour l’analyse GC-ICP-MS.

Figure II.8: Détermination chimique de la production de méthylmercure via l’utilisation d’isotopes stables du mercure. La procédure comprend une étape d’extraction du mercure, suivie d’une étape de dérivation et d’analyse.

CHAPITRE III : ISOLEMENT HAUT DEBIT DES BSR DES SEDIMENTS DE L'ESTUAIRE DE L'ADOUR.

55 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

1. PREAMBULE

Au cours des 20 dernières années, les techniques de biologie moléculaire ont largement contribué à accroitre nos connaissances en écologie microbienne. Les travaux de diversité basés sur l'étude des acides nucléiques ont dévoilé une richesse microbienne insoupçonnée, jusqu’alors récalcitrante aux procédures de mise en culture (Head et al. 1998 ; Hugenholtz et al. , 1998 ; Donachie et al. 2007) . En effet, les techniques traditionnelles de culture présentent de nombreuses limites, et la plupart des micro-organismes identifiés in situ restent encore aujourd'hui en grande partie à être cultivés et caractérisés (Nichols et al., 2007 ; Alain et Querellou 2009) . Ce constat est d'autant plus vrai pour les micro-organismes anaérobies tels que les BSR, pour lesquelles les conditions de mise en culture sont fastidieuses et limitent encore plus l'efficacité d'isolement.

Cependant, bien que la biologie moléculaire s’affranchisse des biais inhérents à la culture des micro-organismes, une analyse exclusivement basée sur des marqueurs moléculaires peut conduire à une image partielle et biaisée de la diversité microbienne. Des biais expérimentaux liés aux étapes d'extraction des acides nucléiques et à la spécificité des amorces utilisées pour l'amplification des marqueurs génétiques existent (Fortin et al., 2004) . De plus, l'amplification des gènes se fait indifféremment de l’état physiologique des cellules dans l’environnement ( Ellis et al., 2003), tandis que la plupart de nos connaissances physiologiques sur les microorganismes reposent sur des études menées sur souches pures. L'application concomitante d'une approche moléculaire et culturale s'avère donc être une stratégie judicieuse pour accéder à une vision plus complète de la diversité microbienne présente in situ (Donachie et al., 2007) , accroitre nos connaissances sur les potentiels métaboliques des communautés microbiennes et identifier les gènes d’intérêt.

Récemment, l'approche culturale a été revisitée via le développement de méthodes d’isolement haut-débit des micro-organismes. Ces outils tendent à accroitre significativement le nombre de souches isolées tout en tenant compte de certaines limites liées à la culture traditionnelle et ont significativement amélioré la fraction de la diversité microbienne cultivable (Connon et Giovannoni, 2002 ; Bruns et al. , 2003) . Dans ce contexte, le travail présenté dans ce manuscrit décrit l’optimisation et l’application d’une stratégie d'isolement haut-débit des BSR en microplaques 384 puits. La réduction des volumes de culture (100 L) a pour objectif d’accroitre considérablement le nombre de souches isolées tout en facilitant leur identification

56 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour phylogénétique. Ce travail d'isolement haut-débit des BSR a été optimisé et appliqué aux sédiments de surface de la station B20 de l’estuaire de l’Adour (France).

La première partie de ce chapitre (p.58) traite de la diversité des souches sulfato- réductrices isolées en microplaques 384 puits à partir des sédiments initiaux et enrichis de l’estuaire de l’Adour. L’analyse T-RFLP des gènes dsrAB a permis de sélectionner les enrichissements pour lesquels la structure de la communauté sulfato-réductrice a été significativement modifiée. Afin d’accroitre la diversité cultivable, deux des enrichissements divergeant le plus des sédiments initiaux ont été utilisés pour l’isolement des BSR en microplaque. Ainsi, la contribution de la procédure d’enrichissement et d'un second échantillonnage pour améliorer la diversité sulfato-réductrice cultivable a été évaluée dans ce travail. Enfin, la diversité sulfato-réductrice totale obtenue a été comparée à celles obtenues lors des études antérieures basées sur des méthodes de culture traditionnelles et a permis d’apprécier l’efficacité de la méthode développée. Les résultats obtenus sont présentés sous forme d’un article qui sera prochainement soumis dans la revue « Journal of Microbiological Methods ».

Dans la deuxième partie de ce chapitre (p.74) la diversité culturale obtenue en microplaques 384 puits a été complétée par une approche moléculaire basée sur l’analyse du gène dsr A. Ainsi, l’analyse phylogénétique des isolats et des clones a permis une étude approfondie des communautés sulfato-réductrices présentes dans les sédiments de l'estuaire de l'Adour. Les résultats obtenus sont présentés sous forme d’un article accepté en 2012 dans la revue « FEMS Microbiology Ecology » sous le titre « Combination of high-throughput cultivation and dsrA cloning for assessment of sulfate reducing bacteria in sediments »

57 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

2. ISOLEMENT HAUT DEBIT DES BSR EN MICROPLAQUES 384 PUITS

Ce travail sera prochainement soumis dans la revue « Journal of microbiological methods » sous le titre de : contribution of enrichments and resampling for sulfate reducing bacteria diversity assessement by high throughput cultivation

COLIN Yannick, GOÑI-URRIZA Marisol, CAUMETTE Pierre et GUYONEAUD Rémy

Equipe Environnement et Microbiologie, IPREM UMR CNRS 5254, Université de Pau et des Pays de l'Adour, IBEAS, BP 1155, 64013 Pau Cedex, France.

2.1 Abstract

Advanced cultivation techniques increased significantly the microbial culturability leading to cultivate new phylotypes. Among them, high throughput methods permitted to obtain and handle large numbers of isolates. This constitutes a considerable advantage for anaerobes as compared to the time-consuming traditional culturing that include, most of the time, enrichment procedures. In the current study, we investigated the contribution of both enrichment procedures and resampling on sulfate reducing bacteria cultivable diversity when applying an intensive isolation in 384-well microplates. Initial sediments originated from the Adour estuary and allowed the recovery of 99 sulfate-reducing strains representing 13 OTUs. Beside, sediments were enriched under 44 different physicochemical conditions and shifts in the sulfate-reducing community were detected by comparing the dsr AB genes T-RFLP profiles. Two representatives of the most divergent samples were subsequently investigated using the same isolation procedure and allowed the achievement of 5 new OTUs out of 17 and 33 isolates respectively. As comparison, an higher increase in species richness (5 new OTUs out of 28 isolates) could be assessed by resampling original sediments one month apart at the same study site. In the present study, results suggest that performing isolations at different sampling times is more effective and rapid for cultivable diversity studies than operating enrichment incubations when using high- throughput cultivation techniques. However enrichments remain essential for the recovery of microorganisms with specific metabolic capabilities that are under-represented in natural microbial communities.

58 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

2.2 Introduction

Technically, anaerobes can be grown in liquid or agar media. Anoxic and reduced conditions, are achieved by cooling down autoclaved media under an oxygen -free gas ﬂow and the addition of reducing agents at low concentration (<0.05%, w/v) (Plugge, 2005) . Concerning sulfate reducing bacteria, special glassware closed with crimped or screw-capped stoppers are frequently used to dispense anoxic media and ensure airtight dishes. The most commonly employed techniques for their isolation are based on slight modifications of the pioneering roll tube’s technique ( Hungate, 1950, Macy et al., 1972; Hungate & Macy, 1973; Miller and Wollin, 1974; Balch and Wolfe, 1976) . Most of the sulfate reducing bacteria, even recently isolated from various ecosystems, were recovered from this method (Ben Ali Gam et al. 2009, Suzuki et al. 2009, van Houten et al. 2009, Alazard et al. 2010), or by using the deep agar dilution series (ADS) technique (Pfennig & Trüper, 1992) . Alternatively, isolations and incubations may be carried out by plating on Petri dishes and liquid dilution series (Gittel et al. 2008, Zhang et al. 2009, Finster et al. 2010) under controlled atmosphere (glovebox, anaerobic jars, and Gaspak® system). Nevertheless, due to technical procedures, anaerobic culturing is time consuming and handling isolates at larger scale is not conceivable.

Although anoxic conditions make cultivation more complex, shortcomings that relied on culture-dependent methods concern more broadly the whole prokaryotes, and are probably involved in the statement that 99% of bacteria observed under a microscope are not cultivated on the lab bench (Trevors and al. 1998) . The transition from environmental conditions to an artificial medium that mimic as much as possible the natural habitat is a major challenge for microbiologists (Alain and Querellou, 2009) . The design of a culturing medium that fulfil all required conditions for the microbial growth is a crucial step and will probably not sustain the development of all the microorganisms. Due to the large panel of physico-chemical parameters fluctuating in situ (temperature, pH, pO2, light ...), bacteria may change from a culturable state to a temporal or permanent viable but non-culturable state (Olivier et al. , 2005 ; Shigematsu et al., 2007 ) . In addition, modification of the nutrients content or physical conditions could permit to selectively grow desired organisms that are poorly represented in the sample. Enrichment procedures may help to solve a part of the missing fraction.

59 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

During the last decades, continuous efforts were conducted to improve efficiency in microbial cultivation and High Throughput Culturing (HTC) practices were designed (Giovanonni et al. 2007) . These techniques aimed to reduce the culturing devices, to isolate a large amount of microbial strains and successfully contributed to grow new phylotypes. In this context, a dilution-to-extinction procedure in 384-well microplates was used to isolate sulfate reducing bacteria under anoxic conditions. Initial sediment collected in the Adour estuary was used as original sample for the isolation. In addition we assess the contribution of enrichment procedures as compared to resampling when applying a high throughput cultivation technique. Phylogenetic analysis of isolates permitted to evaluate the effectiveness of culture enrichments or resampling on the microbial diversity recovery.

2.3 Experimental procedures

i. Study site and sample collection

Sulfate-reducing diversity was investigated within the upper part of intertidal sediments in the Adour estuary (French South Atlantic Coast). B20 station constituted the study site approximately 10 km upstream the mouth estuary (Duran et al. 2008) . Initial sediments (IS.1) was first sampled in October 2009 and used for a direct isolation procedure. Moreover, the main sampling took place in November 2009. Sediments were used for direct SRB isolation (IS.2) and for SRB isolation after enrichment procedures ( AC.1 and GL.20 ) (Figure III.1) . For both dates, surface sediments (0-5cm depth horizon) were collected and stored less than 48h at 4°C in a closed vial before analysis.

ii. Enrichments conditions

All enrichment cultures were set up as a 10% (vol/vol) sediment slurry in water collected at the study site. Sediment slurry was dispensed in 90 Bellco tubes (20 mL) and duplicate enrichments were started. Two tubes were immediately homogenized by vortexing and 18 mL were centrifuged at 5000g 15 min at room temperature. Supernatants were discarded and sediments were stored at -80°C for molecular analysis. The remaining 2 mL were supplemented with 1 mL of glycerol, homogenized and placed at -80°C for future microbial isolation (IS.2) . Other sediment slurries were incubated in duplicates under 44 different physico-chemical conditions listed in Table III.1 . Once sulfidogenic growth was detected by black ferrous sulfide precipitates, enrichments were removed and processed like IS.2 sample.

60 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

Table III.1: Sediments collected on November 2009 were placed under different conditions of substrate, temperature, and light regime, until sulfidogenic growth was observed (3 to 60 days). Substrates tested were acetate (1 and 20 mM), lactate (1 and 20 mM), ethanol (20 mM), glycerol (20 mM), pyruvate (20 mM), cellulose (3g), hydrogen (headspace flushed with H 2, 1 bar), and a dense microphytobentos suspension haversted on the study site. All these ten substrates conditions were incubated in duplicates, at 10°C and 30°C, with or without light regime. Bowed samples were used for the SRB isolation in 384-well

iii. dsrAB genes T-RFLP Analyses

Total DNA from the 90 sediment slurries was extracted from 0.25 g of wet weight sediment using the Powersoil DNA Isolation kit according to the manufacturer’s instructions (MoBio laboratories, Solana Beach, CA, U.S.A) . dsr AB genes fragments were amplified using the FAM-labelled DSRB1F and the DRS4R primers (Wagner et al. 1998) , in a final volume of 50 L. PCR conditions were optimized for the amplification of all samples under the same conditions as follow: 0.2 M of each primer, 0.4 mM of dNTPs, 2 mM of MgCl 2, 1.25 U of Taq DNA polymerase (Eurobio) in its buffer. PCR was carried out as follow: 5 min at 94°C for

61 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour the initial denaturation, 34 cycles of 45 s at 94°C, 45 s at 58°C, 1 min at 72°C; and a final extension for 10 min at 72°C. PCR products were digested with Sau 3AI and Taq αI (New England Biolabs) and were processed as described in Goñi-Urriza et al. (2007). Electrophoregrams were analyzed using GeneScan software (Applied Biosystems) . For each T- RFLP fingerprint generated, all the size peaks exceeding 25 units above the background fluorescence were aligned with the internal size standard using the GeneScan software. T-RFs below 35bp and above 500bp were excluded from the analysis in order to minimize sizing errors. In order to facilitate comparisons of fingerprints between different enrichments, the peak height for individual T-RFs was normalized to percent of the total fingerprint height. This data were used to calculate pairwise similarity values for all samples. A Principal Correspondence Analysis (PCA) was performed to evaluate the influence of the enrichments on the structure of the sulfate-reducing bacterial community using MVSP software (Multi-Variate Statistical Package 3.12d, Kovach Computing Services, 1985-2001, UK) . The Bray-Curtis quantitative similarity indexes were also calculated.

IS.2 Enrichments (November 2009) dsr AB genes fingerprint (T-RFLP)

IS.1 IS.2 AC.1 GL.20 (October 2009)

28 SRB 99 SRB 50 SRB

Figure III.1: Flow chart summarizing the overall procedure carried out for the sediments enrichment procedure and subsequently the SRB microplate isolation. IS1: Initial Sediments 1; IS2: Initial Sediments 2, AC.1: Acetate enrichment (1mM); GL.20: Glycerol enrichment (20mM)

62 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

iv. Isolation procedure for sulfate reducing bacteria

DNA fingerprint data demonstrated that IS.2 sample as well as sediments enriched with acetate 1mM (AC.1, cluster II) and glycerol 20mM (GL.20, cluster III) exhibited the highest divergence of dsr AB genes. IS.2 , AC.1 , GL.20 and IS.1 samples were thus used as original samples for intensive isolation (Figure III.1) . Culture medium was prepared with water collected on the study site amended per liter with: Na 2SO 4, 4 g ; Na 2S2O3.5H 2O, 0.79 g ;

KH 2PO 4, 0.20 g ; NH 4Cl, 0.24 g ; selenite-tungstate solution (Widdel and Bak, 1992) , 1 mL ; trace element SL12 solution (Overmann et al. 1998) , 1 mL ; vitamins V7 solution (Pfennig and Trüper, 1992) , 1 mL ; yeast extract, 0.01% ; sulfurs solution (Widdel and Bak, 1992) , 1 mL ; HEPES buffer, 10 mM ; Rezasurine solution (Widdel and Bak, 1992) , 1 mL ; lactate-Na, 5 mM ; acetate-Na, 5 mM ; pyruvate-Na, 5 mM ; and glycerol, 5 mM. Medium was sterilized 20 min at 121°C in 100 mL penicillin flasks closed with butyl stoppers and immediately flushed under nitrogen gas flow for 3 min. Prior to use, FeSO 4.7H 20, 1 mM and Na 2S2O4, 200 µM were added from stock solutions. The pH was adjusted to 7 with NaOH 5N.

SRB isolation was achieved in 384-well microplates with culture volumes down to 100 l. SRB’s growth was determined by iron sulfide precipitation during incubation. Prior to isolation, tenfold dilution series were performed in microplates in order to determine the dilution for which half of wells give positive results. To ensure anoxic conditions and to prevent reoxidation, all the procedure was carried out in an anoxic chamber (Bactron III) with

N2/H 2 (95%/5%) as oxygen-free gas. 384-well microplates were sealed as soon as possible with an aluminium foil and incubated one week at 18°C in anaerobic bags (BD GasPakTM EZ Gas Generating Pouch Systems) . The suitable dilution, containing theoretically a single cell per positive well was subsequently used for isolation by dispensing in 384-well microplates. Isolation microplates were incubated for 3 weeks at 18°C to ensure development of low growth rate isolates.

v. Genetic diversity analysis of isolates

When sulfidogenic growth was detected, 1L of culture was directly used for 16S rRNA genes amplification using the 63F/1387R primer set (Marchesi et al. 1998) . Amplifications were made in a final volume of 50 L, with 0.2 M of each primer, 0.4 mM of dNTPs, 2 mM of MgCl2, 1.25U of Taq DNA polymerase (Eurobio) in its buffer. PCR was carried out as follow: 15 min at 94°C for the initial denaturation and cell lysing, 34 cycles of 45 s at 94°C, 45

63 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour s at 58°C, 1 min at 72°C; and a final extension for 10 min at 72°C. PCR products were sequenced at GATC Biotech (Konstanz, Germany). Isolates of interest were recultivated in Venoject® tubes (7 mL) and stored at -80°C with 30% glycerol.

Rarefaction analysis was performed on sulfate-reducing isolates recovered from initial and enriched B20 sediments to determine the OTU richness. Sequences with similarities greater than 97% for partial SSU rRNA genes were thus used to assign sequences to a distinct OTU (Stackebrandt and Goebel., 1994) . Rarefaction curves (Heck et al. 1975) were produced using the DOTUR software program (Schloss & Handelsman, 2005) applying the default sequence assignment algorithm. Rarefaction diagrams were made by plotting the number of OTUs as a function of the number of individual isolates. Coverage (C) was calculated using the following formula: C=1−(n1/N), where n1 is the number of OTUs occurring only once among the isolates and N is the total number of isolates examined (Mullins et al. 1995) .

2.4 Results

i. Extensive SRB isolation in original sediments (IS.2)

A high throughput SRB isolation procedure was achieved in 384-well microplates. Axenic cultures were achieved by a dilution to extinction procedure of sediments in culture volumes down to 100 L. Based on a 97% sequence similarity cutoff, 99 sulfate-reducing strains were recovered from IS.2 sample and grouped into 13 phylotypes. 5 OTUs (J; I; A; H and G) were repeatedly isolated and represented more than 80% of total isolates (Figure III.2) . Most of these phylotypes were identified as members of the Desulfobulbaceae family and shared high 16S rDNA sequence similarity with Desulfopila sp. and Desulfotalea sp members. In addition, OTU A was found to be phylogenetically closed to Desulfomicrobium baculatum (99% of sequence similarity). The remaining phylotypes isolated from IS.2 sample clustered into 8 OTUs that were poorly represented (Figure III.2) .

ii. Contribution of the enrichments procedure on the cultivable diversity

Different carbon sources were applied on IS.2 sample in order to modify the sulfate- reducing community structure . Sediments slurries were placed at 10 or 30°C, and under obscurity or a light regime. Depending on the physico-chemical conditions, enrichments were incubated from 3 to 60 days until that dissimilatory sulfate reduction was evidenced by iron sulfide precipitation (Table III.1) . As expected, sulfides production was quickly detected

64 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour among sediments slurries incubated at 30°C and with low molecular weight carbon sources. In contrast, sediments slurries with complex carbon sources or with lower substrate concentrations were incubated 60 days before iron sulfide precipitates were detected.

IS.2 sample 80% IS.1 sample

AC.1 & GL.20 sp. Desulfopila 60%

40% Desulfovibrio sp. Desulfovibrio Desulfocurvus sp. Desulfocurvus Desulfocapsa sp. Desulfobulbus sp. Desulfobulbus Desulfofrigus sp. Desulfofrigus Desulfovibrio sp. Desulfovibrio Desulfomicrobium sp. Desulfomicrobium

sp. Desulfobulbus Desulfotaleasp. Desulfopila sp. Desulfopila

20% sp. Desulfosporosinus

sp. Desulfovibrio isolates total of Percent

0% JIAHBDCFMKGLERPNOQSTUV OTUs (97% sequences similarity cut-off)

Figure III.2: Representation of the different OTUs isolated from the estuarine sediments.

Isolates originated from the initials sediments (IS.1 and IS.2) as well as from the enriched

sediments GL.20 and AC.1. The OTUs were defined according to a 16S rRNA gene

sequences similarity cut-off of 97%.

T-RFLP analysis based on the dsr AB genes was performed to appreciate changes in the sulfate reducing community composition in enriched sediments as compare to the IS.2 sample. The restriction enzymes Taq αI and Sau 3AI were used to create different fingerprints profiles for each of the samples. Taking into consideration T-RFs representing more than 1% of the total fluorescence, the sulfate reducing richness ranged between 23 and 19 T-RFs in initial sediments (average values from duplicates). Based on the Bray-Curtis dissimilarity index, most of the electrophoregrams were fairly similar to those obtained with IS.2 sample (Bray-Curtis dissimilarity index < 0.3) and grouped into the Cluster I on the Principal Component Analysis

65 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

(PCA) (Figure III.3) . Notwithstanding, two groups ( Clusters II and III ) differentiated from IS.2 sample when using both restriction enzymes. Cluster II contained all enrichment cultures made with lactate, pyruvate or glycerol (20mM), incubated at 10°C under light and dark conditions (Figure III.3) . The Bray-Curtis dissimilarity index indicated a significant community dissimilarity between cluster II and the IS.2 sample (BC = 0.42) . The electrophoregrams obtained for these enrichments with the restriction enzyme Taq αI were characterized by the presence of a specific T-RF (121bp) representing about 25% of the total fluorescence. As already observed in initial sediments, T-RFs 87bp and 140bp constituted a large part of the total fluorescence (27%). Cluster III grouped sediment slurries without substrate addition, and those incubated with lower nutrients concentrations or complex molecules at 30°C and under light conditions. This group exhibited the strongest dissimilarity value with IS.2 sample (BC =0.44). T-RFLP profiles constituting the Cluster III did not exhibit the major T-RFs observed in the other profiles. The two most dominant T-RFs were identified as 61bp and 65bp and were estimated to represent only 19% of the total fluorescence.

Figure III.3: Principal component analysis (PCA) of T-RFLP of dsr AB genes from enriched sediments incubated at 10°C and 30°C, with or without light regime and from initial sediments ( IS.2 ). IS.2 samples as well as representatives of clusters II and III were chosen for SRB isolation in microplate and are represented by large symbols.

66 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

According to the dissimilarity calculation of the sulfate-reducing communities, sediments enriched with glycerol (20mM) at 10°C and under dark regime (cluster II) , as well as, sediments enriched with acetate (1mM) at 30°C under light regime (cluster III) were selected for the SRB isolation procedure and led to isolate 17 and 33 sulfate-reducing strains respectively. Strains clustered into 9 OTUs among the Desulfobulbaceae , Desulfovibrionaceae and Desulfomicrobiaceae families (Figure III.2) . Enrichment with glycerol mainly promoted the isolation of microorganisms that are not true sulfate-reducing bacteria, but microorganisms known to reduce thiosulfate and sulfurs ( Klebsiella sp. , Ilyobacter sp. , Shewanella sp. ). For both enrichments, most of the sulfate reducing isolates grouped with OTUs previously described as prevalent in IS.2 sample . Nevertheless, OTUs Q, S; T; U and V represented new cultivated phylotypes among the Desulfovibrionaceae and the Desulfobulbaceae families (Figure III.2) .

iii. Contribution of resampling sediments on the cultivable diversity

IS.1 sample was collected a month earlier the main sampling at the same study site. 28 sulfate-reducing strains were isolated and grouped into 11 OTUs. 6 out of the 11 OTUs were common with the IS.2 sample and included the major phylotypes reported in IS.2 sample and in enriched sediments. OTUs J; I; A; H and G represented here half of total isolates (Figure III.2) . The remaining OTUs represented new phylotypes ( OTUs R; P; N; O and Q ) and clustered among the Desulfobacteraceae , the Desulfobulbaceae and the Desulfovibrionaceae families (Figure III.2) . As compare to sample IS.2 , a more efficient rarefaction curve was obtained with IS.1 (Figure III.4) . Based on the 28 strains isolated, the number of phylotypes detected was 25% higher with IS.1 than with IS.2 sample .

67 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

IS.2 2 IS.1

Number of OTUs detected (97% similarity cutoff) similarity (97% detected OTUs of Number Enrichments 0 0 20 40 60 80 100 Number of isolates

Figure III.4: Rarefaction curves of sulfate-reducing diversity assessed by the isolation

procedure in 384 well microplates. Estimation of phylotypes was achieved according to a 3% cut-off for 16S rRNA gene sequences. The diversity cultivated from the IS1 sample (dotted curve), the IS2 sample (black curved) as well as from the enriched sediments ( GL.20 and AC.1 ) (grey curve) are presented. Vertical bars constitute the 95% confidence intervals.

2.5 Discussion

The so-called “Great Plate Count Anomaly” has been relatively well stated during the last decades (Staley and Konopka, 1985) . As commonly admitted with DNA-based approaches, traditional culturing methods underestimated the whole microbial diversity. A single culturing medium will not fulfill all required conditions ensuring the growth of all living prokaryotes. Enrichment culture procedures make use of this knowledge and aim to multiply physico- chemical conditions of microbial culture in order to assess the highest cultivable diversity. However, to achieve enrichments and to detect parameters modifying the microbial diversity take considerable time and tend to modify our vision of the microbial diversity occurring in situ . As a result, few microbes are generally grown and molecular biology is often favored to explore the microbial diversity (Marzorati et al. , 2008) .

68 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

In the current study, we carried out a SRB high-throughput isolation in microplates traditionally used for gene amplification and sequencing. The opimized procedure permitted to reduce drastically the culture volumes and thus the number of isolates handled was significantly increased as compare to similar studies that used traditional culturing techniques (Gittel et al. 2008, Suzuki et al. 2007, Mussmann et al. 2005, Dias et al. 2008; Knoblauch et al. 1999, and Sass et al. 1998) . In total, 177 sulfate reducing strains were recovered from the Adour estuarine sediments using both enriched and initial sediments. Based on their percent similarity of 16S rRNA gene sequence (600bp) with sequences deposited in GeneBank, sulfate- reducing strains were identified and clustered into 22 OTUs. The number of estimated species using the Chao1 estimator of species richness was 25 phylotypes, suggesting the occurrence of a large number of SRB co-existing in B20 station sediments. The coverage value of the rarefaction was calculated to be 96%, indicating that the sulfate-reducing isolates accessed from B20 sediments could well cover the cultivable diversity.

SRB related to the Desulfopila , Desulfotalea and Desulfomicrobium genera were repeatedly grown from IS.2 sample. As the highest dilutions were used as inocula, these phylotypes should constitute prevalent cultivable sulfate-reducing populations in the studied sediments. In contrast, 8 phylotypes constituted a slight fraction of the total isolates. Poorly represented phylotypes were affiliated to the Desulfovibrio , Desulfosporosinus , Desulfobulbus and Desulfotalea genera and may correspond to: (1) minor sulfate-reducing populations occurring in the studied sediments, (2) microorganisms recalcitrant to in vitro cultivation or to (3) microbes usually outcompeted by fast growing bacteria. Taking into account, that SRB isolation permitted to increase the number strains handled, the probability to cultivate them using traditional culturing practices would be near zero.

Based on the cultural dataset, we investigated the contribution of an enrichment procedure on the sulfate-reducing culturability. According to the molecular fingerprint, enrichments poorly contributed to modify the sulfate-reducing community, excepted for slurries that grouped in clusters II and III . The stability of the sulfate-reducing community to the modification of the physico-chemical condition testifies the high nutritional versatility and the adaptation potential of this functional group to the fluctuation of environmental conditions (Milleto et al. , 2010) . According to the T-RFLP profile similarities; samples GL.20 and AC.1 exhibited the highest shift in the sulfate-reducing communities and were thus used for the SRB isolation procedure, as the representatives of clusters II and III . As a result, enrichments

69 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour tended to reduce the whole sulfate-reducing diversity by favouring the growth of the OTU J (61% of isolates). This phylotype was presviously identified as dominant in initial sediments and was related to the Desulfopila genus (Figure III.2) . However, 5 new phylotypes were recovered from enriched sediments. They were poorly represented and had as the closest relative members Desulfocapsa sulfoexigens , Desulfocapsa thiozymogenes, Desulfobulbus elongatus , Desulfovibrio psychrotolerans and Desulfocurvus vexinensis (Colin et al., 2012) .

Resampling Adour sediments led to significantly increase the SRB richness (Figures III.4) . Newly cultivated OTUs shared high 16S rRNA gene sequence similarities with Desulfovibrio psychrotolerans , Desulfovibrio pr1.2 and Desulfovibrio sulfodismutans and Desulfofrigus fragile . These phylotypes may correspond to transient microbial populations in Adour sediments or may had their abundance reduced when IS.2 sample were collected. Maintaining the isolation effort on IS.2 sample would eventually permit to recover them. With the exception of OTU Q, the newly cultivated phylotypes recovered from IS.1 sample were different from those recovered from the enriched sediments. Regarding the number of isolates processed, IS.1 sample led to a higher increase in the SRB richness. This result suggests that performing different samples would be more efficient that operating enrichment incubations when using high-throughput cultivation techniques. Nevertheless, enrichments led to isolate microbes with low sequence silmilarities with the SRB previously cultivated. Thus, these microorganisms constitued probably new cultivated sulfate-reducing species. Moreover, an enrichment procedure may be helpful, when investigating microbes with specific potentials or metabolisms.

2.6 Conclusion

Even if the sulfate-reducing diversity was certainly not entirely recovered, the application of an isolation procedure in 384 well microplates led to significantly expand the number of strains handled and thus to increase the cultivable diversity. Within Adour estuary sediments a large number of phylotypes could be quickly cultivated and were related to different genera within the δ proteobacteria and the Firmicutes. In this study, we wanted to assess the highest cultivable sulfate-reducing diversity from B20 sediments. Enriched sediments were thus processed but poorly contribute to modify the original sulfate reducing communities in sediments and did not permit to significantly increase the sulfate reducing diversity. In contrast, a higher increase could be reported by resampling the studied station.

70 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

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73 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

3. COMBINAISON DE LA CULTURE HAUT DEBIT ET DU CLONAGE DU GENE DSR A POUR L'ETUDE DE LA DIVERSITE DES BSR DANS LES SEDIMENTS

Ce travail a été publié en 2012 dans la revue « FEMS microbiology Ecology » sous le titre de: Combination of high-throughput cultivation and dsrA cloning for assessment of sulfate reducing bacteria in sediments

DOI: 10.1111/j.1574-6941.2012.01452.x.

COLIN Yannick, GOÑI-URRIZA Marisol, CAUMETTE Pierre et GUYONEAUD Rémy

Equipe Environnement et Microbiologie, IPREM UMR CNRS 5254, Université de Pau et des Pays de l'Adour, IBEAS, BP 1155, 64013 Pau Cedex, France.

3.1 Abstract

Improving the knowledge on sulfate-reducing bacteria diversity and ecophysiology will permit a better understanding on their key roles in aquatic ecosystems. Therefore, their diversity was evaluated in estuarine sediments by a polyphasic approach including dsr A genes cloning and sequencing (156 clones) and high-throughput isolations in 384-well microplates (177 strains). Using the related thresholds of 95% (DsrA amino-acid sequences) and 97% (16S rRNA gene sequences) for sequence similarity, sulfate-reducing bacteria were grouped into 60 and 22 operational taxonomic units respectively. Both approaches poorly overlapped and rather complemented each other. The clone library was dominated by sequences related to the Desulfobacteraceae , while only one isolate belonged to this family. Most of the strains were affiliated to the genera Desulfopila and Desulfotalea within the Desulfobulbaceae. Desulfopila - related strains exhibited a high phylogenetic microdiversity and represented numerically significant populations. In contrast, Desulfovibrio isolates were less abundant but displayed a high phylogenetic diversity. 384-well microplate isolations enhanced significantly the number of isolates handled. As a consequence, 15 new taxa sharing less than 98% sequence similarity (16S rRNA gene) with their closest relatives were obtained. This polyphasic approach allowed obtaining a high phylogenetic diversity and thus a better view of sulfate-reducing communities in intertidal sediments.

74 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

3.2 Introduction

Sulfate-Reducing Bacteria (SRB) represent a significant part of the standing microbial communities living in coastal sediments. Clone libraries based on 16S rRNA genes estimated them to account for 20-30% of total microbial sequences (de Wit 2008, Cifuentes et al. 2000, Jiang et al. 2009) . This functional group is involved in the decomposition and the mineralization of the organic matter (Jørgensen 1982) as well as in the sulfur cycle. SRB can oxidize a large range of substrates, grow as fermentatives, or even use other external electron acceptors when sulfate is depleted (Muyzer and Stams 2008) . Their occurrence is thus not restricted to marine-influenced coastal environments but more broadly to habitats where settled organic matter accumulates and oxygen comes down to nearby zero.

The diversity of SRB has been extensively investigated, mainly using molecular approaches. They own the bisulfite reductase involved in the dissimilatory reduction of oxidized sulfur species. This enzyme is encoded by the dsr AB genes that constitute a highly specific target to investigate SRB diversity in coastal sediments (Wagner et al. 1998, Bahr et al. 2005, Leloup et al. 2005, Leloup et al. 2007, Jiang et al. 2009, Giloteaux et al. 2010, Pester et al. 2010, Steger et al. 2011) . Most of the commonly mesophilic SRB found in coastal habitats belonged to the δ proteobacteria . Members of the Desulfobacteraceae and Desulfobulbaceae were often reported as the dominant SRB and thus highly suspected to be largely involved in the biogeochemical transformations of carbon and sulfur (Mussmann et al. 2005, Leloup et al. 2005, Leloup et al. 2007, Gittel et al. 2008, Jiang et al. 2009) . Beside, the Peptococcaceae members were also encountered in the upper part of estuaries where the salinity and the sulfate concentration are low. Those Gram-positive bacteria are related to the Desulfotomaculum and Desulfosporosinus genera (Leloup et al. 2005).

The use of DNA-based approaches for diversity studies led to significantly expand our knowledge in microbial ecology and confirmed that a large fraction of microorganisms were not-yet-cultivated. Molecular techniques are easy and fast to perform, and lead to a deep description of the diversity when good molecular targets exist. Nevertheless, molecular tools do not capture the whole microbial diversity. Biases linked with DNA extraction, PCR conditions, and primers specificity were reported in literature and affect the composition of clone libraries (Donachie et al. 2007) . Moreover, the phylogenetic affiliation of clone sequences is sometimes rough since databases for functional genes are limited as compared to 16S rRNA gene. As an

75 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour alternative to assess the microbial diversity, high throughput cultivation (HTC) techniques were developed during the last decades (Janssen et al. 2002, Sait et al. 2002, Bruns et al. 2003, Ferrari et al. 2005, Stingl et al. 2007). These methods aimed to overcome limits that relied on traditional culturing by increasing the number of isolates. HTC techniques successfully contributed to enhance the bacterial recovery and could partially help to explore bacterial diversity.

In the present study, the SRB community in surface sediments of the Adour estuary was investigated simultaneously by cloning and sequencing the dsr A gene and by intensive isolation. We applied a simple dilution-to-extinction method combined with cultivation in 384- well microplates. A large number of SRB isolates were grown, screened and identified in culture volumes down to 100 µL, under anoxic conditions. Compilation of molecular signatures and exhaustive cultural dataset allowed to gain a more comprehensive view on this functional group in surface estuarine sediments.

3.3 Materials and methods

i. Study site and sediment sample collection

SRB diversity was investigated in surface intertidal sediments collected in the Adour estuary (French South Atlantic Coast). B20 station constituted the study site, approximately 8 km upstream the mouth estuary (Duran et al. 2008) . A first sampling was performed the 10/27/2009 for the optimization of the microplate isolation procedure. The main sampling took place the 11/18/2009 and was used for an intensive SRB isolation. Both sampling were achieved at low tide and surface sediments (0-5cm depth horizon) were collected and stored in completely filled tubes without head-space. During the main sampling, the water salinity was estimated to 1 ‰ (Atago S10 refractometer) and temperature was 13°C.

ii. dsrA gene : clone library and sequencing

Initial sediments were used for the construction of a dsr AB clone library. Total DNA was extracted from 0.25 g of wet weight sediments using the Powersoil DNA Isolation kit according to the manufacturer’s instructions (MoBio laboratories, Solana Beach, CA, U.S.A) . Extracted DNAs from two samples were pooled together and dsr AB genes were amplified using the DSR1F/4R primers pair (Wagner et al. 1998) . The reaction mixture contained 1X -1 PCR buffer, 400 µM of dNTPs, 2 mM of MgCl 2, 200 pM of primers, 2 µg.mL of bovine

76 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour serum albumin (BSA) and 1.25 U of Taq DNA polymerase (Eurobio) . The amplification parameters were as follow: 5 min at 95°C, 34 cycles of 30 sec at 95°C, 30 sec at 54°C, and 1 min 30 sec at 72°C, and finally 10 min at 72 °C. Triplicate PCR products were mixed together and gel purified using the GFX DNA and Gel Band Purification kit (GE Healthcare). Expected size amplicons were cloned using the TOPO XL PCR Cloning Kit (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA). Recombinant clones were screened for unique inserts by PCR using DSR1F/4R primers and purified PCR products were sequenced at GATC Biotech (Konstanz, Germany) using the DSR1F primer. The dsr A sequences obtained with this single sequencing were subsequently analyzed.

iii. Isolation and identification procedure for SRB in 384-well microplates

Culture conditions were optimized for carbon sources, electrons acceptors, incubation conditions, reductants and growth factors (data not shown) . The final culture medium was prepared with filtered water (0.45 µm pore size) collected on the study site and amended per liter with: Na 2SO 4, 4 g ; Na 2S2O3, 0.79 g ; KH 2PO 4, 0.20 g ; NH 4Cl, 0.24 g ; selenite-tungstate solution (Widdel and Bak, 1992) , 1 mL ; trace element SL12 solution (Overmann et al. 1992) , 1 mL ; vitamins V7 solution (Pfennig and Trüper, 1992) , 1 mL ; yeast extract, 0.01% ; sulfurs solution (Widdel and Bak, 1992), 1 mL ; HEPES buffer, 10 mM ; rezasurine solution (Widdel and Bak, 1992) , 1 mL ; lactate-Na, 5 mM ; acetate-Na, 5 mM ; pyruvate-Na, 5 mM ; and glycerol, 5 mM. Medium was sterilized 20 min at 121°C in 100ml penicillin flasks closed with butyl stoppers and immediately flushed under nitrogen gas flow. Prior to use, FeSO 4.7H 2, 0.1 mM was added and permitted to monitor sulfidogenic growth by iron sulfide precipitation during incubations. Na 2S2O4, 200 µM was finally added to provide reduced conditions and pH was adjusted to 7 with NaOH 1N.

SRB were isolated at 18°C through a simple dilution-to-extinction technique using initial sediments from the two samples. In order to increase the cultivated diversity, enrichment procedures with different carbon sources and temperatures were carried out on sediments slurries collected on November 2009. SRB growth in all enrichments was check according to iron sulfide precipitation and shifts in SRB community were monitored by T-RFLP molecular fingerprint based on dsr AB genes (data not shown). Two of the most divergent SRB communities, enriched with acetate (1 mM) at 30°C and glycerol (20 mM) at 10°C, were selected for two additional SRB isolations.

77 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

Ten-fold dilution series (Most probable numbers) were first performed in microplates in order to determine the dilution for which half of wells would display a positive growth and, theoretically, one single cell per well. Afterwards, this optimal dilution was dispensed in several 384-well microplates (Figure III.5). To prevent reoxidation issues, all the procedure was carried out in an anoxic chamber (Bactron III) with H 2/N 2 (5/95, v/v) as oxygen-free gas. Microplates were sealed with an aluminium foil and incubated three weeks at 18°C in anaerobic bags (BD GasPakTM EZ Gas Generating Pouch Systems) . Once sulfidogenic growth was detected, isolates were first recultivated in 96 well microplates. After growth, 1 L of culture was directly used for 16S rRNA gene amplification using the 63F/1387R primer set (Marchesi et al. 1998) without DNA extraction step. PCR products were sequenced at GATC Biotech (Konstanz, Germany). Purity of cultures was checked by microscopic observations and isolates of interest were recultivated in larger volumes and stored at -80°C with 30% glycerol (Figure III.5) .

Estuarine Sediments

MPN procedure for SRB

Optimal dilution selection

SRB isolation in 384-well microplates

Positives wells

Growth of isolates in 96-well microplate

Growth of SRB of interest PCR amplification of the in larger volume 16S rRNA gene PCR

Figure III.5: Flow chart summarizing the overall procedure carried out for the high- throughput SRB isolation and identification.

78 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

iv. Sequences analysis

Both partial 16S rDNA and dsrA sequences were assembled using the software Sequencher v4.1.4 and compared to those present in databank using the BLAST program at NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov ). 16S rRNA chimeric sequences were checked using the web tool DECIPHER (Wright et al. 2011). dsr A sequences were translated in amino acids sequences using Expasy web tool ( web.expasy.org/translate/) . Alignments were achieved by using ClustalX v1.83 (Thompson et al., 1997) and phylogenetic trees were constructed using the Neighbor Joining algorithm (Saitou and Nei, 1987) with MEGA software version 4 (Tamura et al., 2007). Bootstrap trials were set as 1,000 replicates. Sequences were grouped into operational taxonomic units using the DOTUR software package (Schloss and Handelsman, 2005). The coverage of the dsr A clone library was calculated using the equation Cx = 1 - (Nx/n), where Nx is the number of unique sequences and n is the total number of sequences. 16S rRNA and dsr A genes sequences have been submitted to the database and assigned respectively Accession Nos. HE600725-HE600902 and HE651931-HE652086.

79 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

3.4 Results

i. SRB diversity by dsrA cloning

dsr A gene was used as a molecular marker for SRB community in surface sediments of the Adour estuary. 156 positive clones were processed and partially sequenced using the DSR1F primer (Wagner et al. 1998) . A threshold value of 95% for DsrA amino acid sequences, consistent with the 90% threshold for dsr A nucleic sequences (see Figure III.S1) , was chosen for the OTU delineation. According to Kjeldsen et al. 2007 these threshold correspond to a 97% cut-off value for the 16S rRNA gene. Dsr A clones grouped into 60 distinct Operational Taxonomic Units (OTUs) (Figures III.6 and III.7) . The rarefaction curve failed to reach saturation level but the coverage value was calculated to be 73% (Figure III.8) . Sequence analysis showed that Desulfobacteraceae and Desulfobulbaceae members were dominant in surface sediments. Both families accounted respectively for 61% and 29% of the total clone sequences. Among the Desulfobacteraceae , 19 sequences were closely related to previously cultured members identified as Desulfobacter sp, Desulfococcus sp, Desulfobacterium sp. and clustered into 12 phylotypes (OTUs 14-21 and 32-35 ) ( Figures III.6) . Additionally, 79 sequences were more distantly affiliated to known SRB and grouped into 23 phylotypes (OTUs 01-13 and 22-31 ) (Figures III.6) . Among them, OTUs 04 ; 10; 13 and 31 were dominant and accounted for nearly 25% of the total sequences. Beside, 46 sequences were related to the Desulfobulbaceae and clustered into 15 phylotypes (OTUs 36-50 ) (Figures III.7) . OTU 36 constituted 9% of the total clone sequences and displayed as closest relative Desulforhopalus singaporensis (82%). The remaining clones (OTUs 51-60 ) had very low similarities with known SRB and formed separated lineages in the phylogenetic tree (Figure 3). No representative of the Desulfovibrionaceae and Desulfomicrobiaceae families were detected.

80 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

60 N=14 OTU 01 clone 25H-0D-46 (ACJ11298) 73 clone UBM1D80.23 (AFH41544) PR12 C09 OTU 02 PR12 C07 OTU 03 N=11 OTU 04 59 clone LGWG17 (ABK90695) 98 N=2 OTU 05 75 PR12 G12 OTU 06 PR11 E01 OTU 07 PR12 H05 OTU 08 PR1198 H01 OTU 09 92 N=10 OTU 10 51 clone PuertoRico.mCR004 (AAS87076) 96 PR11 B11 50 PR11 E05 OTU 11 PR11 H12 OTU 12 PR11 G11 clone UBM1D80.06 (AFH41534) N=10 OTU 13 Desulfobacterium oleovorans DSM6200 T(AF418201) clone 40H-0D-7 (ACJ11334) PR11 B03 OTU 14 Desulfofaba gelida DSM12344 T (AAK83201) PR11 B12 OTU 15 71 PR12 F05 OTU 16 T 98 Desulfococcus multivorans DSM2059 (AAC24101) 96 N=2 OTU 17 72 N=2 95 PR11 A06 OTU 18 Desulfosarcina variabilis DSM2060 T(AAK58134) 80 Desulfosarcina cetonica DSM7267T(AAN31398) clone EBext-22 (CAR81735) DSB clone VHS058 (AAZ15784 Desulfonema limicola DSM2076 T (AAC24099) N=5 100 OTU 19 87 PR12 A02 OTU 20 Olavius algarvensis sulfate-reducing endosymbiont (AAK28360) 74 Desulfocella halophila DSM11763 T(AAL57473) T 64 Desulfobotulus sapovorans DSM2055 (AAC24109) Desulfobacterium vacuolatum DSM3385(AAL57479) Desulfobacterium autotrophicum DSM3382 T(AAL57437) 92 70 Desulfobacter curvatus DSM3379 (AAL57471) 67 Desulfobacter latus DSM3391 T (AAC24097) PR11 F02 OTU 21 Desulfobacula toluolica DSM7467 T(CAD29754) Desulfotignum balticum DSM7044 T(AAN31402) 96 PR12 E12 OTU 22 PR12 H08 OTU 23 98 N=3 OTU 24 PR11 F10 OTU 25 PR11 A10 OTU 26 PR11 H08 OTU 27 PR12 B05 OTU 28 58 clone 40H-0D-12 (ACJ11339) clone LGWN10 (ABK90795) N=3 OTU 29 PR11 C12 PR11 H07 OTU 30 N=8 OTU 31 Sulfate-reducing bacterium mXyS1 (AAQ05941) Desulfobacterium anilinii DSM4660 T(AAQ05939) 98 PR12 C03 OTU 32 PR11 A09 OTU 33 DSB PR12 E09 OTU 34 PR11 B08 OTU 35 Desulfotomaculum nigrificans DSM574T(ZP08114262) 0.05

Figure III.6: Phylogenetic tree based on the translated ( α subunit) amino acid sequences of PCR- amplified dsrAB genes from the Adour estuary, showing clones related to the Desulfobacteraceae (N=96 clones; 180aa ). The tree was constructed using the Neighbor- joining method. Sequences determined in this study are in bold. Bootstrap values (in %) are based on 1000 replicates each and are shown at the nodes >50% bootstrap support. Clones that shared less than 95% of amino acids similarity were clustered in the same OTU. The scale bar represents 5% sequence divergence. DSB: Desulfobacteraceae .

81 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

79 N=14 OTU 36 63 clone LGWG13 (ABK90703) PR11 B04 OTU 37 PR12 E06 OTU 38 clone PIMO1D07 (AAV68644) PR12 C11 OTU 39 75 N=2 99 Sulfate reducing isolate PR7D06 PR12 G06 OTU 40 Desulforhopalus vacuolatus DSM9700 T(AAK83203) N=2 OTU 41 99 T 99 Desulforhopalus singaporensis DSM12130 (AAL57465) N=3 OTU 42 clone PIMO2B08 (AAV68658) clone EBext-38 (CAR81767) DBB N=5 OTU 43 91 84 Desulfopila inferna DSM19738 T (ACU00018) Desulfofustis glycolicus DSM9705 T(AAL57455) 56 PR11 G08 OTU 44 clone PIMO8H06 (AAV68687) 54 N=3 OTU 45 92 T 69 99 Desulfotalea psychrophila DSM12343 (YP064533) 61 N=4 OTU 46 54 clone dsrA1 AEA35367 N=2 OTU 47 80 86 Desulfobulbus rhabdoformis DSM8777 T(CAB95038) Desulfobulbus propionicus DSM2032 T(AF218452) 61 clone DSR-J (AAQ56666) clone DSR-H (AAQ56653) 99 OTU 48 56 N=2 PR11 A07 OTU 49 83 OTU 50 63 99 N=3 PR11 G02 OTU 51 clone DSRI-4 (CAL64116) clone VN5 (AAY27761) 99 PR11 B07 OTU 52 PR11 C04 OTU 53 99 Desulfomicrobium spp. (N=3) DSM 99 86 66 clone NKeSA2 (ACH73208) 74 PR12 F09 OTU 54 81 Desulfovibrio spp. (N=5) DSV 94 99 N=2 OTU 55 99 PR12 C06 63 clone S17 (BAF42708) PR12 E10 OTU 56 99 PR11 G01 OTU 57 clone (B04P034) PR11 D02 OTU 58 82 clone VO5 (AAY27783) 99 PR11 C07 OTU 59 clone 25H-0D-61 (ACJ11313) 99 PR12 D12 OTU 60 Desulfotomaculum nigrificans DSM574 T(ZP08114262)

0.05 Figure III.7: Phylogenetic tree based on the translated ( α subunit) amino acid sequences of PCR- amplified dsrAB genes from the Adour estuary, showing clones related to the Desulfobulbaceae (N=58 clones; 180aa ) and unaffiliated with any cultured SRB. The tree was constructed using the Neighbor-joining method. Sequences determined in this study are in bold. Bootstrap values (in %) are based on 1000 replicates each and are shown at the nodes >50% bootstrap support. Clones that shared less than 95% of amino acids similarity were clustered in the same OTU. The scale bar represents 5% sequence divergence. DBB: Desulfobulbaceae , DSV: Desulfovibrionaceae and DSM: Desulfomicrobiaceae .

82 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

ii. SRB diversity by high throughput isolations in 384-well microplates

384-well microplates were inoculated with the highest dilutions yielding positive sulfidogenic growth. The presence of both thiosulfate and glycerol in the culture medium, may generate false positives (non-sulfate reducers sulfidogens) but increased overall the SRB culture efficiency. Positive wells were first recultivated and then identified by 16S rRNA gene sequencing (Figure III.5) . More than 70% of positive wells provided optimal sequences. The remaining 30% (unreadable sequences) constituted poor signal-to-noise ratio in sequence data or multiple overlying traces, probably due to low culture biomass or mixed cultures respectively. As a result, 127 isolates were identified from the two sediments samples and 50 isolates arose from the two enrichments. Based on 3% sequence divergence, s ulfate-reducing strains clustered into 22 OTUs (Figure III.8) and were related to the δ proteobacteria and the Clostridia classes. Phylotypes were mostly related to the Desulfobulbaceae (9 OTUs) and the Desulfovibrionaceae (10 OTUs) families, and 4 of them (OTUs S; T; U and V) were exclusively recovered from the enrichments (Figures III.9 and III.10) . The remaining isolates were related to the Desulfobacteraceae , Desulfomicrobiaceae and Peptococcaceae families. Increasing the sequence similarity threshold to 98, 99 or 100% for species delineation (Stackebrandt and Ebers, 2006) significantly raised the number of taxa to respectively 29, 34 and 41 OTUs (Figure III.8). This increase concerned mainly some of the Desulfobulbaceae isolates that exhibited high phylogenetic diversity at the species level (Figure III.9). Based on 98% similarity for species delineation, 15 out of 29 phylotypes constituted new taxa among the Desulfobulbaceae , the Desulfovibrionaceae and the Desulfobacteraceae (Table III.2) .

Desulfobulbaceae isolates Most of the strains within the Desulfobulbaceae were related to the Desulfopila , Desulfotalea and Desulfobulbus genera. According to an identity criterion of 97%, isolates were gathered into 9 phylotypes (OTUs G; H; I; J; K; L; Q; S and T) (Figure III.9) . OTUs H; I; G and J shared high sequence similarities and were related to the validly described Desulfopila aestuarii MSL86. With a total of 109 strains identified, OTUs I and J were recovered either from initial or enriched sediments and constituted the prevalent cultured phylotypes. OTU G was also repeatedly grown from initial sediments and was related to Desulfotalea members. OTU Q was related to the Desulfobulbus genus and displayed as closest relative Desulfobulbus propionicus (95%). Finally OTUs K; S and T were more distantly

83 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour related to described sulfate-reducing members. Based on a 98% cut-off, 7 phylotypes represented new cultured members within the Desulfobulbaceae family (Table 1) .

Number of OTUs 20

10 DsrA clones (95%) 16S isolates (97%) 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Number of sequences

Figure III.8: Rarefaction curves of sulfate-reducing diversity estimated by both molecular cloning and SRB cultivation. The black line represents the DsrA clone library for which sequences that shared more than 95% of amino acids similarity were assigned to the same OTU. Grey line represents the diversity assessed by microplate cultivation based on a 3% cut-off consistent with the 90% cut-off for dsrAB genes. Dashed lines display the cultural diversity when threshold value for OTU assignment is raised to 98, 99 and 100% identity. Vertical bars constitute 95% confidence intervals.

Desulfovibrionaceae isolates Desulfovibrionaceae represented only 10% of the sulfate-reducing isolates. Strains were phylogenetically distant with identities scores ranging from 80 to 100%. According to a 97% cut off, they clustered into 10 OTUs (Figure III.10) . 5 of them (OTUs V; C; F; U; and P) shared ≤97% of sequence identity with their closest relatives. OTUs B; D and R shared high sequence similarities with Desulfovibrio ferrophilus , Desulfovibrio portus and Desulfovibrio psychrotolerans , while OTUs E and N were only distantly related to the closest validly described strains. OTU U was recovered from the acetate enrichment and was related to Desulfocurvus vexinensis (94% sequence identity) within the Desulfovibrionaceae . Based on 98% similarity with cultured SRB, 7 new taxa were obtained within the Desulfovibrionaceae family (Table III.2) .

84 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

Table III.2: Representative strains isolated from Adour sediments and representing newly-

cultured sulfate-reducing members, based on the partial 16S rRNA gene sequences (600bp).

(a) DSB: Desulfobacteraceae, DBB: Desulfobulbaceae, DSV: Desulfovibrionaceae. (b)

Number of strains belonging to the same OTU, representative strain number and EMBL

accession number for 16S rRNA gene are indicated

Family a OTU Isolates b Closest cultured relative Closest type strain N=2 Desulfofrigus sp. HRS-La3x (EF442987, Desulfofrigus fragile strain LSv21 DSB OTU O PR2_C01 (HE600891) 95%) (AF099065, 94%) N=2 Sulfate-reducing bacterium R-PropA1 Desulfobulbus elongatus strain FP DBB OTU Q PR8_A05 (HE600836) (AJ012591, 96%) (X95180, 95%) N=1 Desulfopila aestuarii strain MSL86 DBB OTU G Desulfotalea sp. SFA4 (AJ318381, 97%) PR2_D11 (HE600886) (AB110542, 97%) N=1 Desulfobacterium catecholicum strain DBB OTU I Desulfotalea sp. SFA4 (AJ318381, 97%) PR6_E07 (HE600828) NZva20 (NR_028895, 96%) N=6 Desulfobacterium catecholicum strain Desulfobacterium catecholicum strain DBB OTU H PR5_F12 (HE600808) NZva20 (NR_028895, 97%) NZva20 (NR_028895, 97%) N=28 Desulfopila aestuarii strain MSL86 Desulfopila aestuarii strain MSL86 DBB OTU I PR6_B04 (HE600775) (AB110542, 96%) (AB110542, 96%) N=1 Bacterium ROMEm4sh241 (AY998129, Desulforhopalus singaporensis strain DBB OTU S PR8_E06 (HE600839) 97%) S'pore T1 (AF118453, 94%) N=1 Delta proteobacterium LacK10 (AY771932, Desulfotalea psychrophila strain LSv54 DBB OTU T PR8_E09 (HE600840) 97%) (AF099062, 95%) N=1 Desulfocurvus vexinensis strain VNs36 Desulfocurvus vexinensis strain VNs36 DSV OTU U PR8_B08 (HE600853) (DQ841177, 95%) (DQ841177, 95%) N=1 Desulfovibrio indonesiensis (AB546254, DSV OTU C Desulfovibrio cavernae (AJ621885, 91%) PR7_F05 (HE600851) 90%) N=2 Desulfovibrio aespoeensis strain Aspo-2 Desulfovibrio aespoeensis strain Aspo-2 DSV OTU P PR2_E11 (HE600901) (CP002431, 96%) (CP002431, 96%) N=2 DSV OTU E Desulfovibrio sp. Pr1.2 (AF228128, 97%) Desulfovibrio portus (AB110541, 96%) PR7_H10 (HE600861) N=1 Desulfovibrio gracilis strain SEBR DSV OTU F Desulfovibrio sp. LVform6 (AJ548465, 93%) PR6_E11 (HE600852) (NR_044785, 92%) N=4 Desulfovibrio psychrotolerans strain Desulfovibrio psychrotolerans strain DSV OTU R PR2_D10 (HE600896) JS1(NR_042581, 97%) JS1(NR_042581, 97%) N=1 Delta proteobacterium K2-52 (AY371186, Desulfovibrio psychrotolerans strain DSV OTU V PR3_G02 (HE600850) 96%) JS1(NR_042581, 95%)

Other sulfate-reducing bacteria The remaining strains ( i.e. 9% of total isolates) were related to the Desulfomicrobiaceae , Desulfobacteraceae and Peptococcaceae families (Figure III.10). Desulfomicrobiaceae strains accounted for around 4% of total isolates. They clustered in OTU A and were phylogenetically close to Desulfomicrobium baculatum (99% sequence similarities). Within the Desulfobacteraceae family, only 2 strains were identified (OTU O). They were related to the δ proteobacterium Lack5 (95% sequence similarities) and constituted a novel cultured taxon. Finally, a single strain (OTU M) was related to the Desulfosporosinus lacus (98%) among the Gram-positive bacteria.

85 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

3.5 Discussion

In this study, the diversity of sulfate-reducing bacteria in surface sediments of the Adour estuary was investigated through dsr A cloning/sequencing and high throughput cultivation. Based on this polyphasic approach, all the representatives of the mesophilic sulfate-reducing families classically encountered in coastal environment were detected. Despite the molecular analysis failed to describe the whole SRB community, the 60 identified OTUs revealed a high phylogenetic diversity. Most of the sequences had low similarity with dsr A sequences from cultured sulfate-reducing bacteria as already reported in other studies (Jiang et al. 2009) . The dominance of the Desulfobacteraceae and the Desulfobulbaceae is in good agreement with previous molecular studies applied on intertidal sediments (Purdy et al. 1997; Purdy et al. 2002; Joulian et al. 2001; Bahr et al. 2005, Mussmann et al. 2005) . Microplate isolations showed that cultured strains poorly overlapped the dsr A clones diversity. Although the abundance of strains identified as Desulfobulbaceae confirmed molecular data, only one cultured phylotype (OTU O) was related to the Desulfobacteraceae whereas Desulfovibrionaceae and Desulfomicrobiaceae members were only retrieved from cultivation. Both approaches rather complemented each other and provided a more consistent and detailed description of the sulfate-reducing community (Figure III.11) .

86 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

73 Strain PR6C06 55 Strain PR8B06 (N=6) 80 Strain PR5E01 (N=2) 53 Strain PR6A02 (N=2) Strain PR5F09 (N=3) Strain PR2D09 Strain PR5B05 (N=9) OTU J 50 Strain PR6B12 Strain PR7D06 (N=41) Strain PR6H10 (N=3 ) 62 Strain PR5F08 (N=5) 85 Strain PR4H04 (N=6) 94 Desulfopila aestuarii MSL86 T(AB110542) Strain PR7H05 (N=6) OTU H Strain PR5A08 (N=27) 61 OTU I 69 Strain PR7D01 Strain PR6E07 Strain PR2D11 87 Strain PR7B06 (N=12) OTU G 99 61 Strain PR5E10 Strain PR6A11 63 Desulfotalea psychrophila LSv54 T (NC006138) 97 Desulfotalea arctica LSv514 T (AF099061) 52 Strain PR6F05 Delta proteobacterium JS_SRB400Ace (AM774323) 99 Desulfobacterium catecholicum DSM3882 T (AJ237602) 93 Desulfobacterium catecholicum Kette (EF442982) OTU L 62 Strain PR2H05 97 Strain PR2D04 (N=2) ‘Desulfobacterium corrodens ’ IS4 (AY274450) Delta proteobacterium JS_SRB100Ace (AM774322) 97 97 Desulfopila inferna JS_SRB250Lac T (AM774321) 100 Delta proteobacterium JS_SRB100Hy (AM774315) Delta proteobacterium JS_SRB400Hy (AM774318) 50 Desulforhopalus vacuolatus ltk10 T (L42613) 56 Desulforhopalus singaporensis S’pore T1 T (AF118453) Desulfofustis glycolicus PerGlyS T (X99707) Strain PR8B10 (N=6) OTU K 87 T 53 Desulfocapsa sulfoexigens SB164P1 (Y13672) Strain PR8E09 OTU T 58 Strain PR8E06 OTU S Desulfocapsa thiozymogenes Bra2 T(X95181) 94 Desulfobulbus japonicus Pro1 T (AB110549) Desulfobulbus mediterraneus 86F1 T (AF354663) 99 Strain PR8A05 OTU Q 100 Strain PR2D12 T 80 Desulfobulbus rhabdoformis M16 (U12253) T 59 Desulfobulbus propionicus DSM2032 (AY548789) 57 Desulfobulbus elongatus DSM2809 T (X95180) Desulfovibrio vulgaris DSM644 T(AB294142)

0.02

Figure III.9: Phylogenetic tree based on the PCR amplified 16S rRNA gene (500 bp) of isolates related to the Desulfobulbaceae . The tree was constructed using the Neighbor-joining method. Sequences determined in this study are in bold. Bootstrap values (in %) are based on 1000 replicates each and are shown at the nodes >50% bootstrap support. OTU with 16s rRNA gene identities >97% were used to form phylogenetic clusters. The scale bar represents 2% sequence divergence.

87 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

99 Strain PR3A06 96 Strain PR3G02 OTU V 100 Strain PR2D10 (N=4) OTU R 84 78 Desulfovibrio psychrotolerans DSM19430 T(AM418397) Desulfovibrio acrylicus DSM10141 T(U32578) Desulfovibrio alaskensis DSM16109 T(Y11984) 70 Strain PR2C04 OTU N 83 T 59 Desulfovibrio sulfodismutans DSM3696 (Y17764) Desulfovibrio magneticus DSM13731 T(D43944) Desulfovibrio africanus DSM2603 T(X99236) Desulfovibrio inopinatus DSM10711 T(AF177276) 80 Strain PR7 F05 OTU C Desulfovibrio gabonensis DSM10636 T(U31080) Desulfovibrio senezii DSM8436 T(AF050100) 97 Desulfocurvus vexinensis DSM17965 T(DQ841177) 82 Strain PR8 B08 OTU U 98 Strain PR7 B02 Desulfovibrionaceae T 100 Desulfovibrio ferrophilus DSM15579 (AY274449) OTU B 100 Strain PR6C08 77 Strain PR6E11 OTU F Desulfovibrio longus DSM6739 T(AY359867) 99 T 77 63 Desulfovibrio frigidus DSM17176 (DQ148943) 98 Desulfovibrio lacusfryxellense (DQ767883) 51 Desulfovibrio zosterae DSM11974 T(Y18049) Desulfovibrio bastinii DSM16055 T(AY35986) Desulfovibrio aespoeensis DSM10631 T(CP002431) 79 Desulfovibrio sp.Pr1.2 (AF228128) 69 Strain PR7G06 (N=2) 100 Strain PR2C05 (N=2) OTU P 82 75 Strain PR5D02 74 100 Strain PR7G02 OTU D Desulfovibrio portus DSM19338 T (AB110541) Strain PR2E09 OTU E 99 Strain PR7E12 Desulfovibrio sp.Ac5.2 (AF228127) Desulfovibrio vulgaris DSM644 T (AF418179) 79 Desulfovibrio desulfuricans DSM642 T(M34113) 61 Desulfomicrobium orale DSM12838 T(AJ251623) 92 Desulfomicrobium sp. ADR21 (AM419441) 100 Desulfomicrobium sp. ADR26 (AM419442) Desulfomicrobiaceae 99 Strain PR5A12 (N=10) OTU A 99 Desulfomicrobium baculatum DSM4028 T(AJ277895) Desulfocella halophila DSM11763 T(AF022936) 100 Desulfobacter postgatei DSM2034 T(AF418180) 98 Desulfobacter curvatus DSM3379 T(AF418175) Desulfobacterium phenolica DSM3384 T(AJ237606) 97 T 99 100 Desulfobacula toluolica DSM7467T DSM7467 (AJ441316) Desulfobacterium vacuolatum DSM3385 T(AF418178) Desulfobacterium autotrophicum DSM3382 T(AF418177) 98 T 58 100 Desulfobacterium cetonicum DSM7267 (AJ237603) Desulfobacteraceae Desulfosarcina variabilis DSM2060 T(M34407) Sulfate-reducing bacterium Hxd3 (AF141881) Desulfofaba gelida DSM12344 T (AF099063) Strain PR2 C01 (N=2) OTU O Desulfofrigus fragile DSM12345 T(AF099065) 100 Deltaproteobacterium LacK5 (AY771930) 70 Desulfoluna butyratoxydans DSM19427 T(AB110540) 97 T 96 Desulfoluna spongiiphila DSM17682 (EF187256) Desulfosporosinus acidophilus DSM22704 T(FJ951625) Desulfosporosinus orientis DSM765 T(Y11570) Peptococcaceae 100 Strain PR7 D03 OTU M 79 T 90 Desulfosporosinus lacus DSM15449 (AJ582757) Thermodesulfovibrio yellowstonii DSM11347 T(AB231858)

0.05

Figure III.10: Phylogenetic tree based on the PCR amplified 16S rRNA gene (500 bp) of isolates related to the Desulfovibrionaceae , Desulfomicrobiaceae , Desulfobacteraceae and the Peptococcaceae . The tree was constructed using the Neighbor-joining method. Sequences determined in this study are in bold. Bootstrap values (in %) are based on 1000 replicates each and are shown at the nodes >50% bootstrap support. OTU with 16s rRNA gene similarity >97% were used to form phylogenetic clusters. The scale bar represents 5% sequence divergence. DSB: Desulfobacteraceae , DSV: Desulfovibrionaceae , DSM: Desulfomicrobiaceae , and PEP: Peptococcaceae.

88 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

Desulfobulbaceae representatives are widespread in numerous environments probably due to their physiological flexibility for growth (Purdy et al. 2002, de Wit et al. 2008, Rees et al. 2010). One remarkable finding was the prevalence of Desulfopila and Desulfotalea -related strains in initial sediments. More than 100 isolates (OTU G; H; I; J; K and L ) displayed high sequence similarities and were related to Desulfopila aestuarii and Desulfotalea spp. (Figure III.9). Desulfotalea representatives were originally isolated from permanently cold arctic marine sediments (Knoblauch et al., 1999) and displayed low optimal temperature (10-18°C). All isolates retrieved in the Adour estuary were isolated and cultivated at 18°C, a parameter consistent with the recovery of strains with high sequence similarity with psychrophilic anaerobes. D. aestuarii MSL86 is a strictly anaerobic and mesophilic sulfate reducer isolated from estuarine sediments in the Sea of Japan (Suzuki et al. 2007) . Based on the specific probe Sva1428 for Desulfotalea members and relatives (SVA group) or on isolation procedures, Desulfotalea and Desulfopila members were reported to be active and present at rather high proportions in coastal sediments (Sahm et al. 1999; Asami et al. 2005, Suzuki et al. 2007) . Catalyzed Reporter Deposition Fluorescence In Situ Hybridization (CARD-FISH) estimated the SVA group to be a predominant bacterial lineage in Wadden sediments, with concentration ranging from 3.84 to 7.63x10 +6 cells per cm 3 in the top 5 cm of sediments (Gittel et al. 2008) . Here, according to the microplate enumerations, this phylogenetic lineage accounted for 1.3 x10 +6 cells per cm 3 of sediment in Adour estuary and thus represented an ecologically important group. The most abundant phylotype (OTU J) shared a high sequence similarity (99%) with D. aestuarii but was not identified in the clone library as revealed by the dsr AB sequencing of one representative (strain PR7_D06; HE655457) (Figure III.7) .

The low abundance of the Desulfobacteraceae among isolates contrasted drastically with molecular signatures (Figure III.11). This might be explained by some technical limits of the in vitro cultivation (medium specificity, substrates, incubation time, recalcitrant microbes …) that may favor some organisms. The physiological state of Desulfobacteraceae members in situ can also explain these differences. Competition experiments showed that Desulfobulbus strains were the better competitor for limiting amounts of sulfate, whereas Desulfobacter representatives were better adapted and active in saline and sulfate-rich habitats ( Laanbroek et al. 1981, Laanbroek et al. 1984) . B20 station is located 8 km upstream the mouth of the river and important salinity variations occur. Depending on tide and coefficient conditions, sulfate concentration ranges from 0.3 (upstream freshwater) to 7.1 mM (diluted seawater) in B20 station (Bouchet, personal communication and “Agence de l'eau” web page) . During the sampling period, the water

89 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour collected for the preparation of the culture medium corresponded to low tide conditions (salinity 1‰). Further samplings (high tide) would permit to determine if more Desulfobacteraceae - related organisms can be isolated from the sampling site. In these sediments, organic matter degradation by sulfate-reducing bacteria might be ensured by differential populations depending on environmental conditions.

40 clones isolates Clones/Isolates(%) 20

DBB DSB DSV DSM PEP N.A.

Figure III.11: Comparative analysis of the SRB diversity assessed concurrently by 384-

well microplates cultivation and DsrA clone library. The number of OTUs detected in each

family is specified in parentheses. DBB: Desulfobulbaceae , DSB: Desulfobacteraceae ,

DSV: Desulfovibrionaceae , DSM: Desulfomicrobiaceae , PEP: Peptococcaceae and N.A:

non-affiliated.

Low abundance or even absence of Desulfovibrio -related species was often noticed when sulfate-reducing diversity was examined with molecular tools in the Seine estuary (Leloup et al., 2005) , Adour estuary ( Dias et al., unpublished) , Bassin d’Arcachon ( de Wit, 2008) , Tama River (Purdy et al., 1997) , or pristine aquifer (Detmers et al., 2004) . Their apparent ubiquity in enrichments and subsequent isolations may reflect that these populations are opportunists and dominate selective isolations (Purdy et al. 1997) . In the present study, no clone sequence could be related to this family. These observations would encourage the conclusion that Desulfovibrio species may not play a significant role in the studied sediment, or would be present in low abundance. However, Desulfovibrionaceae represented 10% of the isolates and 45% of the OTUs was attached to this family. Only 2 OTUs ( U and V) were exclusively recovered from the

90 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour enriched sediments while other phylotypes were detected in the initial samples. OTU R and V were related to Desulfovibrio psychrotolerans isolated from Lake Pangong, a salt-water lake located in the Himalayas (Sasi Jyothsna et al. 2008) . These isolates exhibited a low sequence similarity with their other relatives and thus occupied a particular place within the large Desulfovibrio genus. In the same way, OTUs C; F; P and U showed low sequence similarities with cultured sulfate-reducing bacteria (Figure III.10) . Strain PR8_B08 (OTU U) was related to Desulfocurvus vexinensis, the only representative of the genus Desulfocurvus. D. vexinensis was isolated from a deep artesian well in France and has been assigned to a novel genus among the Desulfovibrionaceae , due to a high G+C content and the absence of desulfoviridin (Klouche et al., 2009) . The dilution-to-extinction technique in microplates applied here permitted to state that Desulfovibrionaceae are common in the B20 station, and would account for around 1.3 10 +5 cell.cm 3 of sediment. This family displayed a high phylogenetic diversity, and should not be neglected as important functional sulfate-reducing group in sediments, even if molecular methods did not detect it. The same conclusion may be drawn for the Desulfomicrobiaceae members that represent 6% of the total isolates but without dsr A sequence detected (Figure III.11) . Members of the Desulfomicrobium genus were already reported to occur in aquatic environment, as well as in the studied station with two species previously described as Desulfomicrobium salsuginis and Desulfomicrobium aestuarii (Dias et al. 2008) . New specific primers targeting the dsr AB genes were recently described (Giloteaux et al. 2010, Pester et al. 2010, Steger et al. 2011) and could potentially overcome the missing molecular fraction.

348-well microplates turned out to be well suited for miniaturized cultures and allowed the handling of a high number of isolates. As far as we know, with 177 strains and 156 clones analyzed, this study constitute one of the most all-accomplished polyphasic approach on sulfate- reducing bacteria in an intertidal sediment. The microplate approach contributed to assess a significant part of the SRB community and provided complementary results to the molecular approach. The significant increase in SRB isolates enhanced 2 to 6 folds the microbial richness relying on traditional cultivation techniques (Gittel et al. 2008, Suzuki et al. 2007, Mussmann et al. 2005, Knoblauch et al. 1999, and Sass et al. 1998) . High-throughput isolation permitted a rapid access to numerous but also original strains. 15 OTUs shared less than 98% sequence similarity with cultured SR and were related to the Desulfobulbaceae , the Desulfovibrionaceae and the Desulfobacteraceae (Table III.2) . Numerous Desulfopila and Desulfotalea members were isolated and a remarkable microdiversity relied to this group. All the isolated strains are at present available for more detailed physiological and taxonomic studies. The statement that less

91 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour than 1% of microorganisms are cultivable need to be reconsidered and should not be applied systematically when considering specific functional groups. Implementation of two different approaches suggested that each technique has its own limits and provides a distinctive picture of the microbial diversity.

Acknowledgements Y.C. was granted by the French Ministry of Education and Investigation. This work was partially funded through the French National Agency for Research (ANR) through Minameta Project (grant JCJC-2006-044) and the INSU through EC2CO project (DIRECT).

92 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

A A dsr A A amino-acid dsr

airwise airwise identity plot for pure cultures and ines ines indicate 90% 16S dsrA nucleic sequence and 95%

A A nucleic sequences and DsrA amino acid sequences p dsr sequence identitysequence thresholds. clones clones present in Figures III.6 and III.7. Dotted l Figure III.S1:

93 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

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97 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

4. CONCLUSION DU CHAPITRE

Les BSR constituent un groupe fonctionnel important dans les sédiments anoxiques estuariens. Elles sont très abondantes et interviennent activement dans le cycle du soufre et dans les processus de minéralisation de la matière organique (Jorgensen, 1982) . Au cours de ce travail, nous avons mis au point une méthode d’isolement haut débit assurant la culture et l’identification des BSR présentes dans les sédiments de la station B20 de l’estuaire de l’Adour. Au total, 177 BSR ont ainsi été cultivées et identifiées sur la base du gène codant pour l’ARNr 16S. Considérant un seuil de similarité de séquences de 97% pour la définition de l’espèce, 22 OTUs ont été identifiés. La comparaison de la diversité sulfato-réductrice cultivée dans ce travail avec celle obtenue dans de précédentes études basées sur des techniques traditionnelles d'isolement, a révélé que la procédure d'isolement en microplaques 384 puits a permis d’améliorer la diversité cultivable de 2 à 6 fois (Figure III.S2) . L’isolement d’un grand nombre de micro-organismes et leur identification a donné accès à des phylotypes très peu représentés qui n’auraient probablement pas été cultivés avec des méthodes d’isolement plus classiques.

Sass et al. 1998

Knoblauch et al. 1999

Mussmann et al. 2005

Suzuki et al. 2007

Gittel et al. 2008

Dias et al. 2008

Colin et al. 2012

0 5 10 15 20 25 Nombre de phylotypes sulfato-réducteurs isolés (seuil de 97% de similarité de séquence)

Figure III.S2: Comparaison de la diversité sulfato-réductrice isolée en microplaques 384

puits à partir des sédiments de l'estuaire de l'Adour (Colin et al. , 2012) avec celle obtenue à

partir de la même station d'échantillonnage (Dias et al. , 2008) , et d'autres sédiments

côtiers (Gittel et al. , 2008; Suzuki et al. , 2007; Mussmann et al. , 2005; Knoblauch et al. ,

1999; et Sass et al. , 1998) via l'utilisation de techniques traditionnelles d'isolement.

98 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour

13 des 22 phylotypes détectés ont été directement isolés à partir des sédiments initiaux et affiliés aux familles des Desulfobulbaceae , Desulfovibrionaceae , Desulfomicrobiaceae et Peptococcaceae . Afin d’améliorer la diversité cultivable une procédure d’enrichissement des sédiments a été mise en place mais s’est révélée peu efficace. Avec 50 souches isolées, seulement 5 nouveaux OTUs ont été cultivés et l’abondance des phylotypes identifiés comme majoritaires dans les sédiments initiaux a été augmentée de 20%. En revanche, un deuxième échantillonnage sur site s’est révélé plus efficace en permettant l’isolement de 5 nouveaux phylotypes pour seulement 28 souches cultivées. Les variations physico-chimiques de l’environnement influencent la structure et la composition des communautés microbiennes au cours du temps, et l'abondance des phylotypes peut alors augmenter ou diminuer au sein des communautés microbiennes (Thiyagarajan et al. , 2010) . Ainsi, les fluctuations de la diversité des BSR in situ constituent un enrichissement naturel des sédiments. Dans une optique d’accéder à la plus grande diversité microbienne cultivable, un échantillonnage régulier dans le temps peut servir à accroitre significativement l’efficacité d’isolement notamment dans des écosystèmes soumis à de larges variations physico-chimiques comme les estuaires. Cependant, la procédure d'enrichissement a donné accès à 5 nouveaux phylotypes qui n'avaient jamais été cultivés auparavant et peut être très utile lorsqu'une capacité métabolique particulière est recherchée.

En parallèle de la procédure d’isolement des BSR, une analyse moléculaire basée sur le gène dsr A a été menée sur les sédiments initiaux. Cette technique est couramment employée pour l’étude des communautés sulfato-réductrices présentes dans l'environnement (Leloup et al., 2009 ; Leloup et al. , 2006 ; Kjeldsen et al. , 2007) . Dans ce travail, les approches moléculaires et culturales se sont révélées très complémentaires et la compilation des données a conduit à identifier les principales familles sulfato-réductrices généralement rencontrées dans l’écosystème estuarien. Les micro-organismes appartenant aux Desulfobacteraceae ont constitué plus de la moitié des clones tandis qu’un seul phylotype cultivé a pu y être affilié. A l’inverse, les isolats appartenant aux familles des Desulfomicrobiaceae et Desulfovibrionaceae ont représenté plus de 15% des souches mais aucune signature moléculaire appartenant à ces deux familles n’a pu être détectée. Ces résultats suggèrent que chacune des deux approches possède des limites qui leur sont propres et tendent à donner une image biaisée de la diversité réellement présente in situ . L’étude des acides nucléiques directement extraits des sédiments a permis d’identifier des BSR potentiellement récalcitrantes à la culture in vitro ou aux conditions particulières de mise en cultures choisies dans cette étude. De même l’approche culturale a donné accès à des BSR dont les gènes dsr AB n’ont pas été extraits ou amplifiés de manière optimale. 15 taxons ont partagé

99 Chapitre III. Isolement haut-débit des BSR des sédiments de l’estuaire de l’Adour des similarités de séquences inférieures ou égales à 98% pour les gènes codant l'ARNr 16S et ont donc constitué de nouvelles SRB cultivées qui restent à être caractérisées.

Suite à l’isolement haut-débit des BSR en microplaque, près de 100 souches ont été affiliées à la famille des Desulfobulbaceae et plus précisément aux genres Desulfopila/Desulfotalea , pour lesquels peu d’espèces ont à ce jour été décrites et caractérisées (Knoblauch et al. , 1999 ; Suzuki et al. , 2007 ; Gittel et al. , 2010). Avec une estimation de 1.3 x10 6 bactéries par cm 3 de sédiments, ces micro-organismes constitueraient une fraction importante de la communauté sulfato- réductrice dans les sédiments de la station B20 et présentent une importante microdiversité in situ . En effet, l’analyse des gènes 16S a révélé que ce groupe phylogénétique contient de nombreux micro-organismes très proches phylogénétiquement les uns des autres. Cette microdiversité peut s’apparenter à différents écotypes correspondant à une adaptation aux variations environnementales rencontrées dans les sédiments de l'estuaire de l'Adour.

100 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

CHAPITRE IV: DIVERSITE BACTERIENNE TOTALE ET SULFATO-REDUCTRICE DANS LE PANACHE DE L’ESTUAIRE DE L’ADOUR

101 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

1. PREAMBULE

Situés à l’interface entre le domaine continental et le domaine marin, les estuaires sont des zones de mélange des eaux continentales et océaniques. La confrontation des masses d’eaux se traduit par une accumulation plus ou moins temporaire du matériel sédimentaire, ce qui en fait des lieux de production biologique intense (Hobbie, 2000) . L’abondance et la diversité microbienne y est tributaire des apports terrigènes (sels nutritifs, matières particulaires et polluants) et des eaux marines plus oligotrophes. La forte variabilité des paramètres physico- chimiques à l'échelle spatiale et temporelle influence et modifie profondément les communautés microbiennes ( Lozupone and Knight, 2007 ). Certains facteurs abiotiques tels que la salinité, la température ou encore la profondeur sont considérés comme les facteurs structurant les plus importants dans les écosystèmes estuariens (Goni et al., 2007) .

Du fait de l’hydrodynamisme des courants de la marée et des rivières, les particules sédimentaires sont remises en suspension et contribuent à la formation du panache estuarien. Les BSR constituent une fraction importante de la biomasse bactérienne des sédiments anoxiques et sont susceptibles de se retrouver associées aux particules sédimentaires présentes dans la colonne d’eau. Malgré un impact négatif évident de l'oxygène sur ces micro-organismes qualifiés d’anaérobies stricts, certaines BSR sont capables de résister à des périodes d'oxie plus ou moins longues (Dolla et al. , 2006). A titre d'exemple des BSR affiliées aux genres Desulfovibrio , Desulfococcus , et Desulfonema ont été abondamment détectées dans des tapis de cyanobactéries oxiques et des boues activées (Mogensen et al. , 2005 ; Risatti et al. , 1994 ; Minz et al. , 1999) . La formation d'agrégats cellulaires, le chimiotactisme, la respiration de l’oxygène et la production d'enzymes contre les espèces réactives de l'oxygène sont autant de stratégies défensives utilisées par ce groupe fonctionnel pour faire face à une exposition chronique ou permanente à l'oxygène (Dolla et al. 2006, Cypionka, 2000) .

L'article présenté dans ce chapitre concerne l'étude de la structure des communautés microbiennes le long du panache de l'estuaire de l'Adour par une approche d’empreinte moléculaire (T-RFLP) et en fonction des conditions environnementales. Un intérêt tout particulier a été porté sur les communautés sulfato-réductrices présentes dans le panache de l'estuaire. En parallèle de l'analyse moléculaire basée sur les gènes 16S et dsr AB, la diversité des BSR a été analysée via une approche culturale en microplaques 384-puits. Ce travail a été réalisé au cours de la campagne METADOUR III menée du 15 au 18 mai 2010.

102 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

2. DIVERSITE BACTERIENNE TOTALE ET SULFATO-REDUCTRICE DANS LE PANACHE DE L'ESTUAIRE DE L'ADOUR.

Ce travail sera prochainement soumis dans la revue "Aquatic Microbial Ecology " sous le titre de: «Total bacterial and sulfate-reducing richness along an estuarine plume gradient (Adour estuary, France )»

COLIN Yannick 1, GOÑI-URRIZA Marisol 1, GASSIE Claire 1, MONPERRUS Mathilde 2, CAUMETTE Pierre 1 and GUYONEAUD Rémy 1

1 Equipe Environnement et Microbiologie, IPREM UMR CNRS 5254, Université de Pau et des Pays de l'Adour, IBEAS, BP 1155, 64013 Pau Cedex, France. 2 Laboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et Environnement (LCABIE) UMR CNRS 5034 – Université de Pau et des Pays de l'Adour

2.1 Abstract

Microbial diversity in bacterioplankton assemblages was examined in three locations along the coastal plume discharge of the Adour Estuary (France). Using terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) of 16S rRNA and dsr AB genes, the composition of total microbial diversity, as well as, sulfate-reducing communities were simultaneously investigated and combined with the in situ physicochemical parameters. The total microbial communities were principally influenced by the water depth and a decrease in nutrient concentrations along the plume diffusion. Even if no oxygen minimum zone was reported in the water column, molecular signatures of sulfate reducing bacteria were successfully retrieved in most of the sampling points along the plume gradient. Cloning and sequencing of dsr A gene combined to an isolation procedure of sulfidogenic microorganisms permitted to investigate further this functional group and led to the identification of microorganisms related to the Desulfobacteraceae , Desulfobulbaceae , Desulfomicrobiaceae and Desulfovibrionaceae families. Sulfate-reducing isolates recovered from the mouth estuary were closely affiliated to strains previously isolated from anoxic sediments upstream the river. In contrast, strains related to Desulfovibrio oceani sp. were cultivated when moving toward the open Ocean. Results suggest that these microorganisms are specific to marine waters and may occur as dormant state waiting for more favourable conditions for growth and activities. Finally, the composition of

103 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour microbial communities occurring in deep waters was significantly different from other samples and some specific phylotypes were detected.

2.2 Introduction

Estuaries and adjacent waters are among the most productive marine ecosystems on Earth. Bacteria and photosynthetic microorganisms are abundant and constitute a productive component of plankton (Hobbie, 2000; Bianchi, 2006) . Major physical and chemical environmental shifts occur in coastal environments, such as fluxes caused by currents and tides, the mixing of marine water with freshwater and terrestrial inputs by rivers and groundwater. Periodic mixing of fresh and marine waters results in a high physico-chemical variability both in space and time (temperature, nutrients, salinity, pH ...). As a general trend, an increase of α- Proteobacteria and γ-Proteobacteria , and a decrease of β-Proteobacteria , with increasing salinity are reported in estuarine gradients (Cottrell and Kirchman, 2003, Bouvier and del Giorgio, 2002) . Among the abiotic factors, salinity has been often reported as a major determinant of microbial community composition (Ysebaert et al., 2003; Wu et al., 2006; Telesh and Khlebovich, 2010). Lozupone and Knight (2007) suggested that at large scale, salinity exceed the influence of other environmental parameters . Temperature and depth were considered as the other most important factors, probably due to the fact that, they are linked to parameters such as light, hydrostatic pressure, and nutrients concentration (Furhman et al. 2008, Fortunato and Crump, 2011) . Likewise, shifts in bacterial composition were linked to inorganic nutrients content (Pinhassi and Hagström, 2000) or to the nature of the particular and dissolved organic matter pool (Cottrell and Kirchman, 2000).

Within estuarine sediments, sulfate reducing bacteria (SRB) constitute one of the major microbial populations and are largely involved in organic matter mineralization (Jorgensen 1982) . They are considered as strict anaerobes since they require reduced conditions for growth. Nevertheless, currents of the tides and the river discharges mix materials along the estuary and contribute to resuspend settled sediments and their associated microorganisms. According to their size, sediments are lifted up off the bottom by currents and tend to remain in suspension for several hours, days, or even much longer (Lorthiois et al. , 2012) . SRB affiliated to the Desulfovibrio genus were already reported to occur in oxic habitats. They were found to survive under ﬂuctuating oxygen regimes and to resume their sulfate-reducing activity with concomitant growth immediately upon anaerobic conditions (Cypionka 2000; Finster et al. 2010) . To cope with oxygen exposure, diverse strategies were reported such as cells aggregation, chemotaxis, or

104 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour the reduction of molecular oxygen and reactive oxygen species (ROS). Some Desulfovibrio species sustain metabolic activity with oxygen by energy coupled respiration. So far, even if the production of ATP was detected, no growth could be observed under oxic conditions. In addition,, Canfield and coworkers (2010) reported that dissimilatory reduction occurs in water columns oxygen miminum zones and would account for up to 33% of the organic matter degradation.

The aim of this study was to determine patterns of bacterioplankton diversity along the Adour estuary plume (France). A particular interest was given to the sulfate reducing community occurring in the water column. Molecular fingerprint analysis of 16S rRNA and dsr AB genes fragments were carried out and combined to shifts of environmental parameters. In addition, sulfate reducers isolations were performed in 384-well microplates from all sampling points. The overall results are discussed in the view of the characterization of sulfate- reducing communities according to the distance from the estuarine mouth and the water depth.

2.3 Materials and Methods

i Area of investigation and auxiliary data

The Adour estuary is located on the south French coast and is flowing into the Atlantic Ocean. Water samples were collected along a gradient from the estuarine mouth to the open Ocean. The concentrated plume ( PC station ), the diluted plume ( PD station ) and a marine location ( MA station ) were sampled at different water depth. Thus, a total of 10 samples were investigated from the 16th to the 18th of May 2010. Water was collected using a rosette sampler equipped with GoFlow and Niskin bottles, and a CTD unit (sea-Bird) for monitoring the salinity, temperature, oxygen, and turbidity. In view of molecular characterization of microbial communities, water was filtered through 0.22 µm pore size filter (cellulose nitrate) until complete saturation. Sample volumes collected for each sampling site are summarized in Table IV.1 . Filters were instantaneously transferred to a cryotube and frozen in liquid nitrogen until analyze. In addition, a fourth station located within the Adour estuary (ES station ) was sampled and exclusively used for the SRB microplate isolation.

105 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

Table IV.1: Locations and characteristics of sampling points and samples collected along the

Adour River plume gradient

Longitude / Samples ID Depth (m) Water volume (mL) Latitude

1 600 Concentrated Plume 5 1100 -1,57182 / 43,51832 (PC) 24 1500 1 900 Diluted Plume 13 1200 -1,63814 / 43,57254 (PD) 55 1500

5 1200

Marine station 22 1500 -1,79732 / 43,60200 (MA) 240 2100 800 2100

ii. Total bacterial community structures

Total DNA extractions were performed in triplicates using the kit fast RNA prosoil direct kit (MP Biomedical) combined to the kit AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen), according to the manufacturer's guideline. The concentration and quality of DNA was checked on 0.8% agarose gels stained with ethidium bromide. 16S rRNA genes were amplified by PCR with the primer set 63F/1387R (Marchesi et al., 1998) . The forward primer was fluorescently labeled with FAM fluorochrome (6-carboxyfluorescein acetoxymethyl-ester). Amplifications were achieved in 50 µL volumes containing 200 nM of each primer, 1X PCR buffer, 200 µM of dNTPs, 1.5 mM MgCl2, and 2.5 U of Taq DNA polymerase (Eurobio) . The temperature program started with 5 min denaturation step at 95°C, followed by 28 cycles of 5 min at 95°C, 45 sec. at 58°C and 1 min at 72°C. The amplified fragments were checked on 0.8% agarose gel. T-RFLP analyses were performed as previously described elsewhere ( Goni et al., 2007 ), using 3U of Hinf I and Hae III (New England Biolabs) as restriction enzymes for 16S amplicons. T-RFLP profiles were aligned using the T-align software (Smith et al., 2005, http://inismor.ucd.ie/~talign/) and the confidence interval was set to 0.5. Relative abundances were calculated and T-RFs that displayed less than 1% of the total fluorescence were removed before recalculation of relative abundances.

106 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

iii. Sulfate-reducing community structures

Fingerprint profiles Triplicate nested PCRs were performed with the DSR1F/4R and subsequently the 619AF/1905BR primers pair (Wagner et al., 1998 ; Giloteaux et al., 2010) . Amplifications with the first set of primers were achieved in 50 µL volumes containing, 200 nM of each primer, 1X

PCR buffer, 400 µM of dNTPs, 1.5 mM MgCl 2 and 1.25 U of Taq DNA polymerase (Eurobio) . The temperature program started with 5 min denaturation step at 95°C, followed by 35 cycles of 45 sec at 95°C, 45 sec at 55°C and 1 min at 72°C, and finally 10 min at 72 °C. For the second run, the forward primer was fluorescently labeled with FAM fluorochrome (6-carboxyfluorescein acetoxymethyl-ester) and PCR reactions were as follow: 200 nM of each primer, 1X PCR buffer,

400 µM of dNTPs, 1.5 mM MgCl 2, and 1.25 U of Taq DNA polymerase (Eurobio) . The temperature program started with 5 min denaturation step at 95°C, followed by 35 cycles of 45 sec at 95°C, 45 sec at 54°C, 1 min at 72°C, and finally 10 min at 72 °C. The amplified genes fragments were checked on 0.8% agarose gel, concentrated and gel purified using the GFX DNA and Gel Band Purification kit (GE Healthcare). T-RFLP analyses were performed as previously described elsewhere (Goni et al. 2007) . The restriction enzymes Taq α1, Bsp 1286I and Hpy CH4V (New England Biolabs) were used to generate the fingerprint profiles.

dsrAB Clone library and sequence analysis To identify the major sulfate reducing phylotypes occurring in the water column, samples PC1, PD1 and MA240 were subjected to dsr AB genes cloning. Nested-PCR amplicons were ligated into the PCRTOPO 2.1 TA cloning vector (Invitrogen, The Netherlands) and transformed into competent Escherichia coli TOP 10F’ cells (Invitrogen, The Netherlands) according to the manufacturer’s instructions. dsr AB sequences were assembled by using the software Sequencher v4.1.4 , translated in amico acid sequences and compared to those present in databank using the BLAST program at NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) . Alignments were achieved by using ClustalX v1.83 (Thompson et al., 1997) and phylogenetic tree was constructed using the Neighbor-Joining method (Saitou and Nei, 1987) with MEGA software version 4 (Tamura et al., 2007) . Bootstrap trials were set as 1,000 replicates and shown on nodes of the phylogenetic tree.

Canonical Component Analysis The relationships between microbial community composition and water characteristics were analyzed by canonical correspondence analysis (CCA). CCA permits direct analysis of microbial

107 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour community composition in relation to variables such as depth, salinity, temperature, dissolved oxygen, ammonium, nitrate, nitrite, silicate, phosphate, particles in suspension, particulate organic carbon and the chlorophyll a. The resulting ordination biplot approximated the structural diversity of each sampling point ------& with respect to environmental variables, which were represented as arrows. The length of these arrows indicated the relative importance of that environmental factor in explaining variation in bacterial profiles, while the angle between the arrows indicated the degree to which they were correlated.

vi. Cultivation strategy for sulfate-reducing bacteria Sulfidogenic microorganisms were isolated from all the sampling points by applying a dilution-to-extinction procedure in 384-well microplates described elsewhere in Colin et al. (2012) . The sampling station ES station, located in the intra-estuarine zone, was also investigated. For each sample, 10 and 100 fold water dilutions were performed in a culture medium made with environmental water collected upstream the ES station in the Adour estuary.

The culture medium contained per liter: Na 2SO 4, 4 g ; Na 2S2O3, 0.79 g ; KH 2PO 4, 0.20 g ;

NH 4Cl, 0.24 g ; selenite-tungstate solution (Widdel and Bak, 1992) , 1 mL ; trace element SL12 solution (Overmann et al. 1992) , 1 mL ; vitamins V7 solution (Pfennig and Trüper, 1992) , 1 mL ; yeast extract, 0.01% ; sulfurs solution (Widdel and Bak, 1992), 1 mL ; HEPES buffer, 10 mM ; rezasurine solution (Widdel and Bak, 1992) , 1 mL ; lactate-Na, 5 mM ; acetate-Na, 5 mM ; pyruvate-Na, 5 mM ; and glycerol, 5 mM. Medium was sterilized 20 min at 121°C in 100 mL penicillin flasks closed with butyl stoppers and immediately flushed under nitrogen gas flow.

Prior to use, FeSO 4.7H 2O, 0.1 mM and Na 2S2O4, 200 µM were finally added, and pH was adjusted to 7 with NaOH 1N. The salinity of the culture medium was adjusted to 20 g.L -1 for samples collected in the PC, PD and MA stations. Water dilutions were dispensed in microplates and incubated at 20°C under anoxic conditions for 2 weeks. Sulfidogenic growth was evidenced by black precipitate of iron sulfide. Thus, positives wells were identified by a direct PCR amplification and sequencing of the 16S rRNA genes without extraction step as described elsewhere in Colin et al. (2012) . Sequences were assembled by using the software Sequencher v4.1.4 and compared to those present in databank using the BLAST program at NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

108 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

3 26 ) ) ; 3- 0.47 (µg/L) Chla 4 5 0.54 5 ND (µg/L) POC

SPM (mg/L) ) ) ; phosphate (PO - 3 C, PD and MA). Given are 2

O (µmol/L)

4 ) ) ; nitrate (NO - 2 NH (µmol/L)

3- 4 anic anic carbon (POC), and chlorophyll a (Chla). (

PO (µmol/L)

- 3 NO (µmol/L) -

2 NO

(µmol/L)

plume estuary along the 4 sampling stations (ES, P Sil.

ty (Turb.) ; silicate (Sil.) ; nitrite (NO (µmol/L)

(NTU) Turb.

) ) ; particles in suspension (SPM) ; particulate org 2 (PSU) salinity (m) Depth ) ) ; oxygen (O + 4 T (°C) 14.10 2211.99 24010.67 35.38 800 35.66 0.23 0.35 35.67

109 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

2.4 Results

i. Main physical and chemical parameters

Physicochemical characteristics were determined in the different samples throughout the plume gradient and are summarized in Table IV.2 . The water column depth varied from 6 m at the ES station to 800 m at the MA station and was linked to a decrease of temperature from 15°C at surface waters to 10.6°C for deeper samples. The ES station was characterized by low salinity and high turbidity values. In the estuarine mouth, low-density estuarine freshwater outflowed seawater in PC and PD stations. Both PC1 and PD1 samples exhibited the highest turbidity (4.85 and 2.13 NTU) and the lowest salinity values (27 and 31 g.L -1). Salinity values in other samples were homogeneous (35 g.L -1).

ii. Structure of total microbial communities

T-RFLP analysis of prokaryotic 16S rRNA genes present in the Adour plume revealed a total diversity of 206 and 122 different T-RFs over the three sampling stations, using respectively Hae III and Hinf I as restriction enzyme. Based on Hae III digestion, the number of T-RFs reported per sample ranged from 33 to 62 T-RFs, while diversity assessed with Hinf I varied from 22 to 32 T-RFs ( Table IV.3) . Despite that Hae III provided more resolution, both restriction enzymes offered similar patterns along the studied gradient. Canonical Component Analysis (CCA) showed a good discrimination of the bacterial communities. Using T-RFLP profiles provided by Hae III, the first 2 axes explained 50% of the total variance for the bacterial communities (Figure IV.1). The Bray Curtis index calculation showed that microbial communities in PC1 and PC5 samples shared 80% of similarity. They were positively linked to the turbidity and silica values and negatively impacted by salinity. Deep water samples (MA240 and MA800) clearly stand out from other samples (30% of similarity) and were positively related with the water depth column and the phosphate content. As compare to the MA800 sample, microbial communities occurring in the MA240 sample were positively influenced by the ammonium concentration (Figure IV.1) .

110 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

Table IV.3: Total number of T-Rfs detected for each samples along the estuarine plume gradient, using both the Hae III and Hinf I restriction enzymes

Number of T-RFs Number of T-RFs Samples (HaeIII) (HinfI)

PC1 45 32

PC5 42 29

PC24 39 29

PD1 52 24 PD13 50 22 PD55 62 24 MA5 40 24

MA22 33 25

MA240 50 29

MA800 57 32

2.8 PC station

PD station pc5a 2.2 MA station pc5b pc5c pc1a 1.7 pc1c pc1b Silica 1.1 - Turbidity NO 3

Axe (11%)2 0.6 ma800a ma800b pd1c ma800c pd1a pd1b 3- Depth PO 4 ma22a NO - -2.8 T°C -2.2 -1.7 pc24c-1.1 -0.6 2 0.6 1.1 1.7 2.2 2.8 pc24a pc24b + ma22c -0.6 NH 4 pd13b pd55c ma240a ma5c pd55a pd13a ma5b pd55b-1.1 ma240c pd13c ma5a ma22b Salinity -1.7

-2.2 -2.8 Axe 1 (39%) 16S-HaeIII Figure IV.1: CCA ordination plots for the ﬁrst two dimensions to represent the relationship of sulfate-reducing diversity with environmental factors analyzed using 16S rRNA gene digested with Hae III as restriction enzyme. The impact of the environmental variables on the CCA axes is represented by the length and angle of arrows.

111 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

Major phylotypes detected from the PC station to the MA station were compatible with those traditionally found in coastal waters. Based on the Hae III digestion, the major T-RFs (78bp, 151bp, 155bp, 192bp and 247bp) accounted for 40-63% of the total fluorescence in all samples, excepted for MA240 and MA800 samples (10 and 23%) where other specific OTUs were reported as dominant (Figures IV.2A and IV.2B) . In PC station, T-RFs 151bp, 192bp and 247bp were dominant and constituted more than one third of the total bacterioplankton (Figure IV.2A) . Both, T-RFs 192bp and 247bp were respectively related to the Alphaproteobacteria and the Bacteroidetes and their fluorescence decreased subsequently when moving away from the estuarine mouth. No putative identification could be achieved from the database for T-RF 151 bp. However, a negative correlation could be demonstrated with its abundance and the column water depth in PD and MA stations. Transition from PC to PD station was accompanied by a significant increase in the relative abundance of T-RFs 78bp and 151bp. Both T-RFs represented the major phylotypes in PD station as well as in MA5 and MA22 samples (28-39% of the total fluorescence) (Figure IV.2A) . T-RF 78bp could be related to the SAR11 clade within the Pelagibacteraceae family. MA240 and MA800 samples constituted deep sampling points and microbial communities were clearly different from all other samples when comparing T-RFLP profiles (Figure IV.1) . Relative abundance of most the phylotypes encountered along the studied gradient were found to decrease in deeper waters (Figure IV.2A) . On the contrary, T-RFs 159bp, 182bp, 184bp, and 369bp were absents or poorly detected in PC and PD stations and their relative abundance increased in 240MA and 800MA samples (Figure IV.2B) . Moreover, T-RFs 257bp and 287bp had their abundance increased in PC24 PD55 and MA22, MA240 and MA800 samples, and were thus specific to deep waters along the gradient. These 6 phylotypes were estimated to constitute 26-37% of the total fluorescence in 240MA and 800MA samples and putative identification affiliated them to the Gammaproteobacteria .

112 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

A Relative Abundance 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20

MA5 PC1 PD1

MA22

PC5 PD13

MA240

PC24 PD55 MA800

PC station PD station MA station

78bp 247bp 155bp B 151bp 192bp 345bp 0,00 0,03 0,05 0,08 0,10 0,00 0,03 0,05 0,08 0,10 0,00 0,03 0,05 0,08 0,10

MA5 PC1 PD1

MA22

PC5 PD13

MA240

PC24 PD55 MA800

PC station PD station MA station

287bp 159bp 184pb 257bp 369bp 182bp

Figure IV.2: Relative abundance of the major microbial populations represented by the

terminal restriction fragments (T-RFs) provided by Hae III and having a specific

distribution along the studied gradient. (A) Major T-RFs detected in surface waters. (B)

Specific T-RFs occurring in deep water. Numbers in keys refer to T-RFs length in base pairs (bp). The values represented are the average of triplicates.

113 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

iii. Structure of sulfate-reducing communities

T-RFLP analysis of dsrAB encoding genes dsr AB genes were successfully amplified by nested PCR from all sampling points, with the exception of PD13, MA5 and MA22 samples. Examination of T-RFLP profiles revealed that sulfate-reducing communities varied along the gradient. The first axis of the Canonical Correspondence Analysis (CCA) explained 21% of the total variance of this functional group. Structure community samples were distributed along the depth axis, excepted for the MA240 sample. The PC1 and PD1 samples were found to be negatively impacted by the salinity values, while PC1 and MA240 samples were positively related with the ammonium content (Figure IV.3) .

2.8 PC station PD station pc1b 2.2 - MA station pc1a NO 2 Turbidity Silica 1.7 pd55c

T°C 1.1 pd55a NO - pc1c pc24a 3 pc24c Axe 2 (13%) pd1c 0.6 pd1a pd55b ma800b -2.2 -1.7 -1.1 -0.6 0.6 1.1 1.7 2.2 2.8 pc5b PO 3- pd1b -0.6 4 pc24b Depth pc5c -1.1 ma800a ma240b + pc5a NH 4 ma240a -1.7 Salinity

-2.2

Axe 1 (21%) dsr A-taqa1

Figure IV.3: CCA ordination plots for the ﬁrst two dimensions to represent the relationship of sulfate reducing diversity with environmental factors analyzed using the dsr A gene. The impact of the environmental variables on the CCA axes is represented by the length and angle of arrows.

114 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

Molecular fingerprint assessed with the restriction enzyme Taq α1 provided between 7 and 10 T-RFs per sample. T-RFs 58bp, 107bp, 115bp and 116bp represented the main phylotypes detected in all samples. They accounted for 50-79% of the total fluorescence in PC and PD stations, and for 37-45% of the total fluorescence in MA station (Figure IV.4) . T-RF 115bp dominates sulfate reducing communities in both PD and PC stations, and accounted for up to 50% of total fluorescence in PD55 sample. For the 3 sampling stations, the abundance of T-RF 58bp was found to increase with depth, while the occurrence of T-RF 107bp was mostly constant along the different samples (Figure IV.4) . In contrast, T-RF 116bp was specifically detected as abundant in PC5 and MA240 samples (30% and 16% of total fluorescence). Using Taq α1 for in silico restriction of dsr A gene, T-RFs 115bp and 116bp were identified as Desulfomicrobiaceae Desulfovibrionaceae or Desulfobulbaceae members, while T-RFs 58bp and 107bp did not have a match in the database. As already observed for the 16S rRNA gene; T-RFs occurring in specific samples were reported. T-RF 222bp was exclusively recovered in deep samples (PC24, PD55 and MA800). In addition, T-RFs 255bp and 273bp were specific to MA240 sample (32% of the total fluorescence). Finally, T-RFs 201bp and 188bp were exclusively recovered in MA800 sample and constituted 48% of total fluorescence (data not shown) .

Relative abundance

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

MA5 PC1 PD1 No amplification MA22 No PC5 PD13 amplification

MA240

PC24 PD55 MA800

PC station PD station MA station 115bp 58bp 107bp 116bp

Figure IV.4: Relative abundance of sulfate-reducing populations represented by the terminal restriction fragments (T-RFs) provided by Taq aI and having a specific distribution along the studied gradient. Numbers in keys refer to T-RFs length in base pairs (bp). The values represented are the average of triplicates

115 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

dsrAB clone libraries In order to refine the putative identification among this functional group, dsr AB genes amplified from the PC1, PD1 and MA240 samples were cloned and sequenced. As a result, 18 out of the 50 clones sequenced could not be related to known SRB. Other sequences were related to the Desulfobulbaceae , Desulfobacteraceae , Desulfovibrionaceae and Desulfomicrobiaceae families (Figure IV.5) . Desulfomicrobiaceae members were only encountered in PC1 and PD1 samples. Moreover, the abundance of Desulfovibrionaceae members appeared to decrease gradually from the estuarine mouth to the marine station. Finally, the Desulfobacteraceae members were prevalent in MA240 sample and represented around half of clones sequenced.

Isolation procedure An isolation procedure for sulfidogenic microorganisms was carried out on each water samples, using a dilution-to-extinction technique in 384-well microplates. In addition, a fourth sampling station, identified as ES station and located upstream the PC station within the Adour estuary, was investigated by the culturing approach. Similarly to dsr AB genes amplification, positive sulfidogenic growths were obtained for all samples, except for PD13, MA5 and MA22 samples. According to the number of positive wells, results suggested sulfidogenic microorganisms to occur at a concentration of 2 to 16 cells.mL -1 of water in PC1, PC5, PC24, PD1, PD55 and MA800 samples, while higher bacterial concentrations were obtained in the ES station and the MA240 sample (60 cells.mL -1) (Figure IV.6) .

A total of 152 sulfidogenic strains were isolated and identified based on their partial 16S rRNA gene sequence. For each sampling station, 4 to 40% of the sulfidogenic isolates were represented by SRB while other microorganisms were related to Citrobacter sp., Shewanella sp., Klebsiella sp., Vibrio sp. and Sulfurospirillum sp (Figure IV.6) . In the ES station; 17% of sulfidogenic microorganisms affiliated the Desulfomicrobiaceae and the Desulfovibrio naceae families (Figure IV.6 and Table IV.4) . Strains PR4C11 , PR4H11 , PR4F11 and PR4H09 were isolated from the ES1 sample and displayed as closest cultivated relatives Desulfomicrobium baculatum (100% of sequence similarity), Desulfovibrio desulfuricans (98%) and Desulfovibrio aespoensis (98%). A single sulfate-reducing isolate, PR7E12 , was recovered from the ES6 sample and related to Desulfovibrio strain Ac5.2 (98%) (Table IV.4).

116 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

Thermodesulfovibrio yellowstonii DSM11347T(AAC24111) clone PIMO3D08 (AAV68674) clone PC1-27-1 clone MA240 -73-1 93 clone MA240 -78-1 clone TopDsr8 (ACN81666) clone EBint-53 (CAR81893) PD1 clones (N=2) Non-affiliated 99 58 100 98 PD1 clones N=7 clone PD1-51-2 100 clone SURF-GC205-dsr52 (ABG29327) clone EBext -38 (CAR81767) 100 clone dsrSbII -15 (AAO61108) clone PC1-23-2 92 Desulfotomaculum alkaliphilum DSM12257T(AAL57463) Peptococcaceae Desulfotomaculum nigrificans DSM574T(AY015499) 82 PC1 clones (N=2) 100 clone NTUA-5A-DSR21 (ABR45809) 62 clone LGWN03 (ABK90793) 73 clone PC1-04-1 90 Desulfobulbus propionicus DSM2032T(AF218452) 100 Desulfobulbus elongatus DSM2908T(CAC36142) Desulfobulbus rhabdoformis DSM8777T(CAB95038) Desulfotalea psychrophila DSM12343T(YP064533) clone PC1 -01-1 Desulfobulbaceae clone MA240 -85-2 Desulforhopalus singaporensis DSM12130T(AAL57465) Desulfofustis glycolicus DSM9705T(AAL57455) clone MA240 -65-2 51 51 Desulfopila inferna DSM19738T (ACU00018) 71 100 PD1 clones (N=2) 91 Desulforhopalus vacuolatus DSM9700T(AAK83203) 98 clone PD1-45-1 99 clone CARN -B4 CAR72820 clone LGWN07 ABK90811 clone PD1 -36-2 98 clone MA240 -91-2 Non-affiliated clone MA240 -93-2 clone VHS033 AAZ15792 92 clone VN8 AAY27767 95 89 PC1 clones (N=2) 100 100 clone PC1 -21-1 98 Desulfatiferula olefinivorans DSM18843T(DQ826724) 100 Bilophila wadsworthia (ZP07944760) 80 clone PD1 -65-1 Desulfovibrio desulfuricans (CAC09930) 100 Desulfovibrio africanus (BAB55563) Desulfovibrio termitidis (AAL57443) Desulfovibrio vulgaris (ABH06951) Desulfovibrionaceae 81 Desulfovibrio cuneatus DSM11391T (BAB55567) 77 PD1 clones (N=3) 59 78 100 Desulfovibrio oceani subsp. galateae (ACN54203) 100 Desulfovibrio oceani subsp. oceani (ACN54201) clone MA240 -70-2 100 Desulfovibrio aespoeensis DSM10631T(CP002431) 61 Desulfotignum balticum DSM7044T(AAN31402) 81 Desulfobacula toluolica DSM7467T(CAD29754) 77 clone PC1-26-2 82 Desulfobacter latus DSM3391T (AAC24097) 93 55 Desulfobacter curvatus DSM3379 (AAL57471) 67 Desulfobacterium autotrophicum DSM3382T(AAL57437) Desulfobacterium vacuolatum DSM3385(AAL57479) Desulfofaba gelida DSM12344T (AAK83201) 100 96 MA240 clones (N=2) Desulfocella halophila DSM11763T(AAL57473) 62 Desulfobotulus sapovorans DSM2055T(AAC24109) 96 Desulfobacterium anilini DSM4660T(AAQ05939) Desulfobacteraceae 99 clone PD1-52-1 sulfate-reducing bacterium mXyS1 (AAQ05941) 89 96 PC1 clones (N=2) clone EBext -47 CAR81785 Desulfosarcina variabilis DSM2060T(AAK58134) Olavius algarvensis sulfate -reducing endosymbiont(AAK28360) clone MA240 -87-2 99 clone NTd-I18 BAE96447 Desulfococcus multivorans DSM2059T(AAC24101) Desulfosarcina cetonica DSM7267T(AAN31398) 68 Desulfonema ishimotonii DSM9680T(AY626030) clone NTd-I23 BAE96457 99 MA240 clones (N=3) 53100 Desulfomicrobium escambiense (BAB55555) clone PC1-10-2 7995 PD1 clones (N=2) 100 Desulfomicrobium baculatum (BAB55553) clone PD1 44 2 F Desulfomicrobiaceae Desulfomicrobium apsheronum DSM5918T(AAL57483) Desulfomicrobium norvegicum (BAB55557) 74 77 Desulfomicrobium macestii DSM4194T(BAB55559)

0.05

Figure IV.5: Phylogenetic tree based on the translated ( α subunit) amino acid sequences of PCR-amplified dsr AB genes from the PC1, PD1 and MA240 samples. There were a total of 200 positions in the final dataset. The scale bar corresponds to 0.05 substitutions per site. Bootstrap values are shown for branches with more than 50% bootstrap support. Filled symbols refer to the 3 samples: PC1 (square), PD1 (round) and MA240 (triangle).

117 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

In PC station, sulfate-reducing microorganisms were only isolated from surface water. Strains PR8E11 and PR8G11 were respectively affiliated to Desulfopila aestuarii (96%) and Desulfotalea SFA4 (99%) (Table IV.4) . In addition strains related to Citrobacter sp . (Enterobacteriaceae ) were found to represent respectively 20% and 7 % of total sulfidogenic isolates in the ES and PC stations. These microorganisms were recently found to carry the dsr AB genes. In PD1 and MA240 samples, the microplate isolation led to grow 7 strains related to Desulfovibrio oceani . Strains PR9B12 , PR9H11 , PR9D08 and strains PR10D10 , PR9A08 shared 100% of 16S rRNA sequence similarity with respectively Desulfovibrio oceani subsp . oceani and Desulfovibrio oceani subsp . galateae (Figure IV.6 and Table IV.3) . In addition, a third phylotypes (strains PR4G05 and PR4F05 ) shared 98% of sequence similarity with D. oceani subsp. galateae . Finally, a single microorganism was recovered from the MA800 sample and was phylogenetically close to Desulfobacula phenolica (96%).

Table IV.4: Sulfate-reducing strains isolated from the estuarine plume gradient with their closest relatives cultivated. Water depth, salinity, temperature and oxygen concentration measured in situ are summarized for each isolate identified.

depth Salinity T (°C) O (µM) strain ID Closest cultivated relatives References (m) (g.L -1) 2 Intra-Estuarine Station (ES) Desulfomicrobium baculatum 1 0.16 12.34 259.36 PR4C11 Rozanova et al. ,1994 (100%) Desulfovibrio aespoensis Aspo3 1 0.16 12.34 259.36 PR4H11 Pedersen et al., unpublished (98%) 1 0.16 12.34 259.36 PR4F11 Desulfovibrio desulfuricans (98%) Oyaizu and Woese, 1985 1 0.16 12.34 259.36 PR4H09 Desulfovibrio desulfuricans (98%) Oyaizu and Woese, 1985 6 0.16 12.32 264.23 PR7E12 Desulfovibrio sp. Ac5.2 (98%) Wieringa et al., unpublished Concentrated Plume Station (PC) 1 27.12 14.7 ND PR8E11 Desulfopila aestuarii (96%) Suzuki et al. , 2007 1 27.12 14.7 ND PR8G11 Desulfotalea sp. SFA4 (99%) Ruetters et al., unpublished Diluted Plume Station (PD) PR4G05 Desulfovibrio oceani subsp. 1 31.51 15.27 249.09 Finster et al. , 2010 PR4F05 galateae (98%) Marine Station (MA) Desulfovibrio oceani subsp. 240 35.66 11.99 245.81 PR10D10 ; PR9A08 Finster et al. , 2010 galateae (100%) PR9B12 ; PR9H11 Desulfovibrio oceani subsp. 240 35.66 11.99 245.81 Finster et al. , 2010 PR9D08 oceani (100%) Desulfobacula phenolica strain Bak and Widdel, 1988 800 35.67 10.67 172.48 PR4D08 PhO1 (96%) (Kuever et al. , 2001)

118 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

2.5 Discussion

By analyzing the dynamic of the microbial communities in the estuarine plume together with physicochemical parameters, we were interested to assess a better knowledge on SRB occurring in the plume estuary. Our results showed that abundance of major T-RFs varied significantly along the studied gradient, according to the distance from the estuarine mouth and the water depth. Even if salinity was often reported as a major factor regulating the distribution of microbial communities (Ysebaert et al., 2003 ; Goni et al., 2007 ; Telesh and Khlebovich, 2010) , this parameter was mostly homogeneous in PC, PD and MA stations, and thus, was not found to influence drastically the structure of microbial communities. Inflow of freshwater from the Adour estuary in the Ocean was mostly detected in surface waters of the PC and PD stations. A higher impact of salinity on the microbial communities could be probably assessed by investigating the 16S rRNA genes amplified from the ES station.

In silico identification suggested that the Alphaproteobacteria and the Bacteroidetes related members constituted the most abundant bacterial populations in PC station. Bacteroidetes were reported as one of the most abundant bacterial phyla in various marine environments probably because of their ability to degrade complex organic molecules (Glöckner et al., 1999 ; Abell and Bowman, 2005) .When moving away from the estuarine mouth a bacterial population affiliated to the clade SAR11 increased in abundance considerably. This phylotype might be responding to a decrease in nutrient content or in toxic substances in the estuarine mouth. Giovannoni et al. (2005) defined this phylogenetic group as obligate oligotrophs and similar results were formerly observed (Nogales et al., 2007) . SAR11 populations were found ubiquitously distributed in marine environments. Rappé and Giovannoni (2003) estimated this phylogenetic group to represent around one quarter of all rRNA genes identified in Ocean. In addition the T-RF 151 bp was reported as dominant but could not be identified. Due to the variation of its abundance in the water column, we suggested it might correspond to a photosynthetic bacterium or to a microorganism depending on primary production. The most drastic changes in total bacterial diversity were reported for water samples collected at deeper sampling sites. Both MA240 and MA800 samples displayed close to 70% of T-RFLP profiles dissimilarities with other samples. These results are not surprising, since several environmental factors vary from the surface to the deep ocean. The vertical structuring of bacterioplankton communities in the ocean has been demonstrated in many studies (Lee and Fuhrman, 1991 ; Blumel et al., 2007 ; Carlson et al., 2009). The spatial distribution of bacteria within the water column is mainly impacted by the increasing hydrostatic pressure and light limitation (Blumel et al., 2007) .

119 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

(100%) x2 (100%) x3 (100%) (96%) Desulfobacula Desulfobacula phenolica PhO1 Desulfovibrio Desulfovibrio subsp.oceani oceani Desulfovibrio subsp.oceani galateae 6% 94% 100 isolates 100 …) (97%) x2 Klebsiella 40% ., Desulfovibrio oceani subsp. oceani Desulfovibrio galateae Sulfurospirillum sp. . ., 5 5 isolates Schewanella sp 60% (96%) sulfidogenic isolates vibriosp (99%) ., Phylogenetic affiliation of Known Known sulfate reducers Citrobacter sp Others ( sp -1 -1 7% Desulfopila aestuarii Desulfopila SFA4Desulfotalea (99%) freundii Citrobacter 60mL 16 16 – 2mL ≈ ≈ 14% PC stationPC station PD station MA n n microplates s s occurring in the (98%) 17 17 isolates 79% (99%) 98%) x2 20% 17% ES station ES Desulfovibrio aespoeensis Aspo3 Desulfovibrio desulfuricans ( Desulfomicrobium baculatum -(100 freundii Citrobacter x6 96%) Desulfovibrio sp. Ac5.2 sp.Desulfovibrio (98%) 30 30 isolates 63% Cultivable Sulfidogenic MicroorganismsCultivable Concentratio No Sulfidogenic No Sulfidogenic Microorganisms isolated Cultivable Sulfidogenic Cultivable Sulfidogenic Microorganisms Concentratio water column MPNthrough determination in 384-well D. oceani subsp. galateae oceani D. subsp. galateae Estimation of the numbersulfidogenic microorganism 0 -50 -25 -250 -100 -800

Figure IV.6: Spatial distribution of sampling points (ES, PC, PD and MA) along the Adour River gradient. Sulfidogenic microorganisms were estimated by MPN technique in 384 well microplates. Dilution of 10 -1 and 10 -2 were performed in culturing medium and used for SRB isolations. Proportions of sulfate reducers identified among isolates are summarized in pie charts for each sampling station.

120 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

An expected sulfate-reducing diversity was detected all along the Adour estuarine plume. All sampling points, for which the dsr AB genes were successfully amplified, gave positive sulfidogenic cultures in 384 well microplates. Based on the polyphasic approach, SRB related to the Desulfomicrobiaceae, Desulfovibrionaceae and the Desulfobulbaceae families were found to dominate the intra-estuarine waters and the concentrated plume. Sulfate-reducing isolates recovered shared high sequence similarity with SRB previously cultivated from the Adour estuary sediments upstream the ES station (Colin et al., 2012) . These microorganisms were probably transported from sediments that were lifted up off the bottom during tides and/or by river discharges and thus drained to the Ocean. Isolations were incubated less than 2 weeks, suggesting that these SRB can support periodic oxic phases and recover quickly their growth potential when environmental conditions are more favourable. In addition, isolates sharing high 16S gene sequence similarity (96-100%) with Citrobacter freundii were grown and constitute a significant part of sulfidogenic microorganisms in the coastal zone. Recent studies on gas pipeline and acid mine drainage suggested that the Citrobacter genus was able to perform dissimilatory sulfate reduction under anoxic condition (Angeles-ch et al., 2002 ; Qiu et al., 2009) . The strain Citrobacter DBM isolated from sediments of a mining area was found to grow in oxic and anoxic conditions and thus stated as a facultative anaerobe (Qiu et al., 2009). According to these results, this phylogenetic group would be able to colonize habitats where oxygen levels fluctuate. Changes in oxygen concentrations in the Adour estuarine plume would probably not impact Citrobacter ’s growth, and these microorganisms would be able to constitute a significant fraction of the sulfate-reducing community when oxygen is depleted.

dsr AB clones from the diluted plume and the marine station permitted to detect a high sulfate- reducing diversity in the water column. Clones were affiliated to the Desulfobacteraceae , Desulfobulbaceae and Desulfovibrionaceae families. However, most of these microorganisms were not recovered by the cultivation approach. They could be considered in bad physiological state due to oxygen exposure, since closely relatives were formerly recovered from Adour sediments using the same cultivation procedure (Colin et al., 2012) . Most of the sulfate-reducing isolates from PD and MA stations were affiliated to Desulfovibrio oceani subsp . oceani and Desulfovibrio oceani subsp . galateae , two strains isolated from the water column of the Oxygen Minimum Zone (OMZ) off the coast of Peru at 400m depth (Finster et al., 2010) . These SRB were previously shown as highly resistant to oxygen exposure for at least 24 days without reduced growth potential. No growth could be demonstrated during the oxic phase but strains

121 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour were able to recover their growth without any increase in lag phase was observed (Finster et al., 2010) . This phylotype was not previously detected in the anoxic sediments of the B20 station and it remains to be investigated if they are part of an active sulfate-reducing community within the water column, or if they were transported from the sediments. Molecular signatures of clones phylogenetically closed to D. oceani were previously detected in the water column of the Western English Channel and in an Arenicola marina bioturbated mesocosms (Ashforth, E.J, unpublished, Finster et al., 2010 ). These microorganisms would be expected to constitute adapted SRB to oxic habitat and seem to be widespread in the Ocean.

Water collected at depth of 240m in the marine station constituted a particular sample where high turbidity and high concentrations of silica were reported. The increase of these environmental parameters was presumed to be due to dead phytoplankton sinking throughout the water column aftermath of a massive bloom (Gooday et al., 1990). A high ammonium concentration was measured and suggested an advanced decomposition of organic matter throughout. As previously observed with the 16S rRNA gene, some T-RFs were specifically reported at the MA240 sample when investigating the dsr AB genes. Using the cultural approach, an increase in the number of sulfidogenic bacterial cells (60 cells.mL -1) was also reported, consistent with a higher heterotrophic microbial activity and potential organic matter degradation in deep waters. Nevertheless most of these suldifogenic microorganisms were related to the genus Shewanella . Canfield and coworkers (2010) reported sulfate-reduction and sulfur oxydation activies in oxygen minimum zones. Similarly, oxygen free waters may be expected during the decomposition of phytoplankton biomass in deep waters and provide favorable conditions for anaerobic growth.

2.6 Conclusion

Our results suggest that shifts in bacterioplankton along the Adour plume estuary are mainly driven by the water column depth and the distance from the estuarine mouth. Since salinity values were rather homogeneous from the concentrated plume to the marine station, we can assume that this parameter was not a main driver of bacterioplankton compositional shifts in our study. Nevertheless, salinity would probably influence microbial communities if taking into account inner station such as the ES station (Goni et al., 2007) . Using both cultivation-dependent and molecular methods, SRB were detected all along the studied gradient. Even if their physiological state and their activity were not assessed, several isolates could be grown when anoxic conditions were provided in vitro . SRB recovered from the intra-estuarine station and

122 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour concentrated plume were previously cultivated from anoxic sediments upstream the river. They were probably associated to sediments particles, while other sulfate reducers isolated from the marine station and affiliated to Desulfovibrio oceani would seem to be specific to marine waters.

123 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

2.7 References

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127 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour

3. CONCLUSION DU CHAPITRE

Au cours de ce travail, la structure des communautés microbiennes totales et sulfato- réductrices ont été évaluées le long du panache de l'estuaire de l'Adour. L'analyse des profils T- RFLP des gènes codant pour l'ARNr 16S en fonction des paramètres physicochimiques a révélé l'influence majeure du panache turbide et de la profondeur de la colonne d’eau sur la composition et la structure du bacterioplancton. La comparaison des communautés microbiennes totales du panache concentré de l'estuaire avec celles du panache dilué a révélé une modification significative de l'abondance des phylotypes majoritaires. Les microorganismes affiliés aux α- proteobacteria et Bacteroidetes ont été détectés comme dominants dans le panache concentré, tandis que l’abondance de micro-organismes appartenant à la famille des Pelagibacteraceae , caractéristique des eaux marines, a augmenté en s’éloignant de l’embouchure de l’estuaire. De plus, l'abondance des phylotypes majoritaires identifiés dans les eaux de surface a décliné dans les échantillons d’eaux collectées à 240 m et 800 m de profondeur et d'autres populations microbiennes spécifiques ont été détectées et affiliées au γ-proteobacteria .

Comme pour l'étude de la diversité microbienne totale, la présence des BSR dans le panache de l'estuaire a été étudiée par analyse T-RFLP des gènes codant pour la réductase dissimilatrice du sulfite ( dsr AB). La colonne d'eau de l'estuaire de l'Adour est peu turbide et présente une saturation de l'oxygène dissout de l'ordre de 70 à 80%. Les BSR sont définies comme anaérobies strictes et représentent une large fraction des communautés microbiennes des sédiments estuariens. Cependant le caractère dynamique de l'estuaire tend à remettre en suspension les particules sédimentaires et par conséquent la flore microbienne qui y est associée. Ainsi, ce groupe fonctionnel a été détecté tout au long du panache, à l’exception de 3 échantillons localisés dans le panache dilué et la station marine. En moyenne, 7 à 10 T-RFs ont pu être détectés par échantillon et les BSR ont pu être affiliées aux familles des Desulfovibrionaceae , Desulfomicrobiaceae , Desulfobulbaceae et Desulfobacteraceae .

En parallèle; la mise en culture des BSR en microplaques 384-puits a été menée sur l’ensemble des échantillons du gradient. L’analyse phylogénétique des souches isolées dans la zone intra-estuarienne et le panache concentré, a permis d’identifier des BSR proches phylogénétiquement des souches isolées des sédiments de surface de la station B20 ( Chapitre III ). Sur la base du facteur de dilution utilisé pour l'isolement, les BSR cultivées à partir du panache de l’estuaire sont plus d'1 million de fois moins concentrées que dans les sédiments. Ces

128 Chapitre IV : Diversité bactérienne totale et sulfato-réductrice dans le panache de l’estuaire de l’Adour micro-organismes appartiennent aux genres Desulfovibrio , Desulfomicrobium , Desulfopila , et Desulfotalea et sont donc susceptibles de provenir des sédiments remis en suspension en amont et transportés jusqu’à l’embouchure de l’estuaire. À ce jour, aucune étude n'a pu être en mesure de déterminer si ces BSR sont actives dans la colonne d'eau. Cependant lorsque les conditions optimales de croissance sont atteintes en laboratoire, ces micro-organismes sont capables de retrouver rapidement leur activité métabolique. Après avoir été transportées par le courant pendant plusieurs heures ou plusieurs jours, ces BSR peuvent potentiellement retrouver une activité sulfato-réductrice après sédimentation du matériel particulaire ou lors de la création de microniches anoxiques dans le panache turbide (Simon et al., 2002 ; Schramm et al., 1999) .

Bien que l'analyse moléculaire menée sur le panache dilué et la station marine ait révélé une large diversité sulfato-réductrice, l'isolement haut-débit des BSR a principalement permis d'isoler des micro-organismes affiliés à Desulfovibrio oceani . Ce phylotype a déjà été isolé d'une zone de minimum d'oxygène au large des côtes Péruviennes et a montré une grande tolérance à l'oxygène moléculaire (Finster et al., 2010) . Des clones proches phylogénétiquement de Desulfovibrio oceani ont également été détectés dans des environnements oxiques (Ashforth, E.J, unpublished ; Finster et al., 2010) . A l'inverse des BSR isolées à proximité de l'embouchure de l'estuaire, D. oceani pourrait constituer une population sulfato-réductrice adaptée à la vie marine ou plus généralement adaptée aux habitats oxiques. Une approche basée sur la quantification des transcrits des gènes dsr AB pourrait permettre de statuer sur l’activité de ces micro-organismes dans la colonne d’eau. Les autres genres sulfato-réducteurs detectés en biologie moléculaire dans le panache dilué et la station marine n’ont pas pu être cultivés en microplaques bien que certains de ces micro-organismes aient été préalablement isolés à partir des sédiments de l’estuaire (Colin et al., 2012) . La récalcitrance de ces BSR à l'approche culturale peut être expliquée par une exposition à l'oxygène trop importante et donc une incapacité des micro-organismes à retrouver une activité sulfato-réductrice.

Enfin, comme quelques phylotypes affiliés aux γ-proteobacteria , certaines BSR ont été spécifiquement détectées dans les eaux profondes. Ces microorganismes peuvent provenir des sédiments benthiques et être remis en suspension à l’interface eau/sédiment. Une seule BSR a été cultivée de la station MA800 et a été affiliée au genre Desulfobacula .

129 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

CHAPITRE V: ETUDE DE LA METHYLATION DU MERCURE CHEZ LES BSR VIA L’UTILISATION D’UN BIOSENSEUR

130 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

1. PREAMBULE

Les sources de mercure dans l’environnement peuvent être d’origines naturelles et anthropiques. Son cycle biogéochimique comprend diverses formes physicochimiques caractérisées par différents états de matière (liquide, solide ou gazeux). En raison de sa forme élémentaire gazeuse (Hg 0) très réactive, le mercure est facilement dispersé dans l’atmosphère, et les écosystèmes aquatiques sont particulièrement affectés (Ulrich et al., 2001) . Il s’y concentre par les précipitations et le lessivage des sols et des roches et sa dynamique est modulée par les interactions physiques, chimiques et biologiques. L’écosystème côtier est considéré comme l’un des principaux sites de production du méthylmercure. Le potentiel de bioconcentration et de bioamplification de ce composé neurotoxique dans les réseaux trophiques supérieurs en font la forme la plus toxique du mercure. Bien que présent à très faibles concentrations dans l’eau, le méthylmercure peut se concentrer jusqu’à 10 millions de fois dans les poissons carnivores de fin de chaîne alimentaire (Munthe et al., 2007 ; Bowles et al., 2001) .

Certains micro-organismes sulfato-réducteurs, ferri-réducteurs et méthanogènes ont été identifiés comme capables de méthyler le mercure inorganique (Compeau et Bartha, 1985 ; Gilmour et al., 1992 ; Gilmour et Henri, 1992 ; Benoit et al., 1999 ; King et al., 2000) . Les BSR constituent une large fraction de la biomasse microbienne totale dans les sédiments anoxiques et une partie de ce groupe fonctionnel est susceptible d'intervenir sur le cycle du mercure de manière significative. Cependant, plus de 25 ans après avoir été identifiés comme les acteurs principaux dans la méthylation du mercure dans les sédiments côtiers, moins de 60 souches ont été testées pour leur capacité à produire du méthylmercure. Avec près de 40 souches analysées; le genre Desulfovibrio représente le genre le plus étudié (Gilmour et al., 2011) . Sur la totalité des souches testées, près de la moitié ont été identifiées comme méthylantes, suggérant que la méthylation du mercure n’est pas une caractéristique commune dans ce groupe fonctionnel. Le déterminisme génétique de la méthylation du mercure reste encore aujourd’hui incertain, et plusieurs voies métaboliques sont envisagées en fonction du métabolisme des micro-organismes vis-à-vis du carbone. Les données de méthylation sur les autres genres sulfato-réducteurs sont largement plus limitées. Le faible nombre de souches testées est notamment expliqué par la complexité des procédures d’isolement des micro-organismes anaérobies et les méthodes chimiques fastidieuses pour l'étude des potentiels de méthylation. Cependant, ces informations écologiques sont cruciales pour évaluer les risques liés à une contamination en milieu côtier. Les micro-organismes affiliés au genre Desulfovibrio ont rarement été identifiés comme majoritaires

131 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur et l'analyse des gènes 16S ou dsr AB a souvent démontré que les communautés sulfato- réductrices étaient dominées par des micro-organismes affiliés aux familles des Desulfobacteraceae et Desulfobulbaceae (Leloup et al., 2009 ; Gittel et al., 2008 ; Leloup et al., 2007 ; Purdy et al., 2003) .

Dans ce contexte, ce chapitre traite de l’application d’un biosenseur luminescent pour estimer les potentiels de méthylation chez les BSR en microplaque 96 puits. Ce senseur représente une alternative rapide et moins complexe que l’analyse chimique et permet de traiter simultanément un nombre important de micro-organismes sur de faibles volumes de cultures (100 µL). La mise au point du biosenseur a été menée sur deux souches modèles au laboratoire pour la méthylation du mercure: Desulfovibrio BerOc1 et Desulfovibrio G200. Ces micro-organismes ont servi de témoins positif et négatif pour la methylation du mercure. De plus, 21 souches sulfato- réductrices isolées des sédiments de la station B20 de l'estuaire de l'Adour ont été analysées. Ces souches sont affiliées à la famille des Desulfobulbaceae et ont présenté la particularité d'être phylogénétiquement très proches les unes des autres.

132 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

2. ETUDE DE LA METHYLATION DU MERCURE CHEZ LES BSR VIA L’UTILISATION D’UN BIOSENSEUR

Ce travail sera prochainement soumis sous le titre de: « Bacterial sensor for direct determination of mercury methylation capabilities among sulfate-reducing microorganisms »

COLIN Yannick 1, GOÑI-URRIZA Marisol 1, MONPERRUS Mathilde 2, GENTES Sophie 1, CAUMETTE Pierre 1 and GUYONEAUD Rémy 1

2.1 Abstract

Here, we describe the development of a biological procedure to investigate mercury methylation capacities among sulfate-reducing bacteria. This technique is based on a bacterial sensor that contains the luxCDABE operon as a reporter under the control of a mercury- inducible promoter. The bacterial sensor was set up and successfully incubated with Desulfovibrio sp. strain BerOc1, a sulfate-reducing bacterium formerly identified as a mercury methylator. Methylmercury production was determined over the time and according to different initial mercury concentrations. In addition, the bacterial sensor was used as a rapid and inexpensive test to investigate methylmercury production by sulfate-reducing isolates recently recovered from the Adour estuarine sediments (France). The 21 isolates tested were related to the Desulfobulbaceae family and, based on 16S rRNA and dsrAB gene sequences, shared identical or high sequences similarities. As a result, 7 out of the 21 SRB were reported as methylmercury producers. As already observed for SRB related to the Desulfovibrionaceae and the Desulfomicrobiaceae families, SRB tested in this work were found to display large differences in mercury methylation potential even for closely related strains.

133 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

2.2 Introduction

Environmental methylation of inorganic mercury (iHg) constitutes a human health issue due to its neurotoxic effect and its biomagnification in the aquatic food webs (Merrit and Amirbahman , 2009 ; Legrand et al., 2007) . Production of methylmercury (MeHg) was shown to be mainly driven by dissimilatory sulfate-reducing bacteria (SRB) (Compeau et Bartha, 1985 ; Gilmour et al., 1992 ; Benoit et al., 1999 ; King et al., 2000). In addition, microorganisms involved in the iron cycle (Fleming et al., 2006 ; Kerin et al., 2006) as well as methanogens (Hamelin et al., 2011) were reported as iHg methylators in anoxic sediments.

To date, SRB investigated for their Hg methylation capabilities are mainly affiliated the Desulfovibrionaceae (Gilmour et al., 2011) , while few members related to the Desulfobulbaceae (King et al., 2000), the Desulfomicrobiaceae families (Ranchou-Peyruse et al., 2009) , or other functional groups ( Geobacter sp. or Desulfuromonas sp. ) were reported to produce MeHg (Kerin et al., 2006 ; Yu et al., 2012) . Up to date, no more than 60 bacterial strains have been examined. The ability to produce MeHg is not ubiquitous among SRB, and only half of the investigated strains were reported as Hg methylators (Gilmour et al., 2011) . Strains phylogenetically close from each others, related to the Desulfovibrio and Desulfomicrobium genera, displayed large differences in mercury methylation capabilities. (Gilmour et al. 2011 ; Dias et al., 2008) . These results suggested that Hg methylation capabilities would seems to be strain-dependent rather than species, genus or metabolic group dependent. Thus, molecular surveys of microbial communities at the genus or even species level do not permit to predict risk linked to MeHg formation in aquatic ecosystems and further experiments based on isolated strains are needed.

Despite the fact that a considerable work was addressed on Hg-methylators, their phylogenetic distribution and the biochemical mechanisms involved in Hg methylation are still poorly understood. An exclusive reliance on bacteria involved in the iron or sulfur cycles for iHg methylation do not have to be stated but rather derives from technical limitations and the weak number of organisms tested. Traditional anaerobic culturing is complex and do not allowed to isolate and to handle microbial cultures at a large scale. Moreover, bacterial Hg transformations are commonly studied by determining the fate of species-speciﬁc isotopic tracers for iHg and MeHg (Graham et al., 2012 ; Gilmour et al., 2011 ; Bridou et al., 2011) . In

134 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur spite of accuracy and sensitivity, the chemical determination is sophisticated, highly time- consuming, and thus limits considerably the number of strains investigated.

In this context, we optimized a technical procedure that aims to screen at large scale phylogenetically diverse groups of anaerobic bacteria for their Hg-methylating capabilities. A bacterial sensor for MeHg (Ivask et al., 2009) was successfully tested on SRB strains exhibiting different potential for Hg methylation, and was further used to assess mercury methylation potential among 21 new representatives of the Desulfobulbaceae family. This procedure should permit to develop insights into in situ biological methylation control and to further investigate the phylogenetic distribution of Hg-methylating bacteria.

2.3 Materials and methods

i. Growth conditions of BerOc1 and G200 strains

Hg methylation potentials of Desulfovibrio strain BerOc1 and Desulfovibrio strain G200 were previously evaluated using stable isotopes (Bridou et al., 2011; Ranchou-Peyrusse et al., 2009). BerOc1 strain was isolated from the Berre Lagoon on the French Mediterranean coast and was found to methylate iHg at a high rate (25% of the initial iHg added). On the contrary, Desulfovibrio strain G200 was not able to methylate iHg, even if a demethylation activity was reported. Thus both strains were used as positive and negative controls to set up the biosensor for the determination of iHg methylation among SRB.

During the optimization stage, growth based on the dissimilative reduction of sulfate was ruled out, due to the potential toxic effect of sulfides on the biosensor. Furthermore, we wanted to limit the potential ligands for iHg. Thus, fumarate and pyruvate were respectively used as electron acceptor and electron donor and Desulfovibrio strains were cultivated at 37°C.

Culturing medium contained per liter: NaCl (5g); MgCl 2.6H 20 (0.4g); CaCl 2.2H 20 (0.1g);

KH 2PO 4 (0.2g); NH 4Cl (0.25g); KCl (0.5g); HEPES buffer (10mM); selenite tungstate (1mL); trace element (1mL); V7 solution (1mL); and resazurin (0.001%) as a redox dye. Anoxic conditions were achieved under a nitrogen gas-flow immediately after autoclaving and the addition of dithionite (200 M). pH was adjust to 7.2.

135 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

ii. Biosensor

The strain Escherichia coli MC1061 containing the plasmid pmerR BS BPmerlux is a recombinant luminescent sensor strain expressing luxCDABE genes in response to MeHg (Ivask et al., 2009) . This biological tool was first developed to detect MeHg in environmental samples . The bacterial sensor produces constitutively an organomercurial lyase that mediates the cleavage of the carbon–mercury bond of MeHg. iHg ions subsequently yielded induce the luciferase reporter operon (luxCDABE) and produce a self-luminescent cell (Rantala et al., 2011) (Figure V.1) .

MeHg Hg 2+

+ Product of merR gene: Product of merB gene: + P regulatory protein of the Organomercurial Lyase me mer R r R mer operon

B Pm r e e r m

c a l P

Plasmide A

pmerR BPmerlux E

R BS

p p

m Bacterial luciferase A

A reporter operon (luxCDABE) from Ampicillin Resistance Photorhabdus luminescens

Figure V.1: pmerR BS BPmerlux plasmid carried out by the strain E.coli MC1061. (From Rantala et al. , 2011 ; Ivask et al. , 2009)

136 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

iii. Screening of MeHg production in 96-well microplates

In view of a high throughput iHg methylation potentials characterization, Desulfovibrio sp. strain BerOc1 and Desulfovibrio strain G200 were grown in a 96-well polystyrene microplate. Culture medium was directly spiked with different concentrations in iHg (0; 10; 25; 50; 75; 100; 150 and 200 µg.L-1). Strains were incubated 48H at 37°C in culture volumes of 200 µL and placed under anoxic conditions. Standard errors were derived from the means of triplicate data points. At the end of the incubation period, 100 µL of microbial cultures were dispensed in a black 96-well microplate for luminescence measurements. Samples were immediately stored at - 20°C.

Beside, the biosensor was cultivated on a LB medium (Sambrook et al., 1989) supplemented -1 with ampicillin (l00 µg.mL ) at 37°C. Once at the exponential phase (OD 600nm = 0.8-1), E. coli cells were harvested by centrifugation at 6000 rpm 10 min at room temperature and then resuspended in fresh LB 2X medium to reach a OD 600nm = 1. Then, a volume of the biosensor suspension (100 µL) was added to samples, and the black 96-well microplate was incubated for 1h at 37 °C under shaking (250 rpm). Bioluminescence was measured at 482 nm using a Multi- well Plate Reader (Series 4000 Perspective Biosystem).

iv. Screening of MeHg production in Bellco tubes

Due to a high detection threshold for MeHg production using 96-well polystyrene microplates, Desulfovibrio strain BerOc1 and Desulfovibrio strain G200 were grown in acid pre- cleaned Bellco tubes. Glassware was closed with butyl stopper and flushed with N 2 gas. All additions and withdrawn of cultures were achieved with flushed syringes to ensure anoxic conditions. In order to measure the detection threshold for methylmercury production; iHg methylation was monitored over the time and according to 4 different initial concentrations in iHg (0.5, 5, 10 and 50 µg.L-1). Briefly, growth was monitored photometrically by following changes in optical density (600nm) of microbial cultures. Once in the late exponential phase, microbial cultures were split and dispensed into four tubes (4 x 4mL) previously flushed under a

N2 gas-flow. Cultures were spiked with different iHg concentration and were maintained at 37°C. Culture volumes of 100 µL were subsequently uptaken in triplicates at 0, 15, 60, 120, 240 and 360 min and MeHg production was determined with the biosensor as described previously.

137 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

v. Simultaneous analysis of MeHg production by GC-ICPMS and the biosensor

In order to assess the specificity of the luminescent signal with the iHg methylation by Desulfovibrio strain BerOc1, MeHg production was simultaneously determined by gas chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry (GC-ICPMS) and the bacterial sensor. Desulfovibrio strain BerOc1 was grown in acid pre-cleaned Bellco tubes. In the late -1 exponential growth phase (D0 600nm = 0.160), the bacterial culture was spiked with 10 µg.L of iHg and culture volumes were sampled at different times during the incubation (0, 15, 60, 120, 240 and 360 min). Biosensor measurements were carried at 482 nm out as described above.

For the GC-ICPMS analysis, 3ml of bacterial culture were collected at the different sampling times and amended with 30 µL of pure HCl to stabilize mercury species at 4°C. Bacterial culture were digested with 3 mL of nitric acid 6N under a microwave field (Prolabo A301, 40 W, 3 min.) , allowing the solubilization of the cells and the refractory organic compounds (Rodriguez Martin-Doimeadios et al., 2004). The extract was then submitted to derivatization using ethylation (Tseng et al., 1997) . Briefly 5 mL of acetic acid/sodium acetate buffer (0.1 M) were added to set the pH at 4. Then 0.2 mL of iso-octane and 1 mL of 0.5% (w/v) sodium tetraethylborate were added for derivatization. After 5 minutes of vigorous agitation by hand, the organic phase was transferred to an injection vial and stored at –18°C until GC-ICPMS detection. The amount of formed and recovered mercury species deriving from the enriched isotope 199 were calculated by using the equation described previously (Hintelmann et al., 1997) .

vi. Phylogenetic analysis of isolates and Hg methylation determination

21 sulfate-reducing isolates were assayed for their iHg methylation potentials. These sulfate- reducing strains were identified as major populations in anoxic sediments of the Adour estuary on the French Atlantic Coast (Colin et al., 2012) . They were related to the Desulfopila , Desulfotalea and Desulfobulbus genera and shared high sequences similarities for the 16S rRNA gene. In this study, this microbial diversity was further analyzed by sequencing the dsr AB genes using the primer set 619/1905BR (Giloteaux et al., 2010). Amplifications were made in a final volume of 50 L, with 0.2 M of each primer, 0.4 mM of dNTPs, 2 mM of

MgCl 2, 1.25U of Taq DNA polymerase (Eurobio) in its buffer. PCR was carried out as follows: 5 min at 94°C for the initial denaturation and cell lysing, 34 cycles of 30 s at 94°C, 30 s at 54°C, 1 min 30 at 72°C; and a final extension for 10 min at 72°C. Then, the purified PCR products were sequenced at GATC Biotech (Konstanz, Germany) using both the 619AF and

138 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

1905BR primers. Both partial 16S rRNA and dsr AB genes sequences were assembled using the software Sequencher v4.1.4 and compared to those present in databank using the BLAST program at NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov ). 16S rRNA chimeric sequences were checked using the web tool DECIPHER (Wright et al. 2011). Alignments were achieved by using ClustalX v1.83 (Thompson et al., 1997) and phylogenetic trees were constructed using the Neighbor Joining algorithm (Saitou and Nei, 1987) with MEGA software version 4 (Tamura et al., 2007). Bootstrap trials were set as 1,000 replicates.

MeHg production was tested on the 21 SRB. For all strains, the culture medium was prepared with water collected on the sampling site and amended with KH 2PO 4, 0.20 g ; NH 4Cl, 0.24 g ; selenite-tungstate solution (Widdel and Bak, 1992) , 1 mL ; trace element SL12 solution (Overmann et al. 1992) , 1 mL ; vitamins V7 solution (Pfennig and Trüper, 1992) , 1 mL ; 1 mL ; HEPES buffer, 10 mM ; rezasurine solution (Widdel and Bak, 1992) , 1 mL. Electron donors and acceptors were lactate, acetate, pyruvate and glycerol (5 mM each) and sulfate (20 mM). All strains were grown under sulfate-reducing conditions at 25°C until their exponential growth phase. In addition, both Desulfovibrio strain BerOc1 and Desulfovibrio strain G200 were used as positive and negative controls for the iHg methylation. Once in the exponential growth phase, bacterial cultures were amended with 1 mM of FeSO 4.7H 20 to complex sulfides produced during the dissimilatory sulfate reduction and then were incubated with 50 µg.L -1of iHg during 3h at 25°C. For each strain, 3x100 µL of the supernatants of microbial cultures were uptaken after 0 and 3h of incubation. Samples were subsequently used to determine MeHg production using the biosensor. The luminescence measured at the beginning of the incubation

(L0H ) was removed to the luminescence measured after 3H of incubation at 25°C ( L3H ), and the value was normalized according the optical density ( OD 600nm )of the microbial cultures using the following formula: (L 3h -L0h) / OD 600nm .

139 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

2.4 Results and Discussion

i. Screening of iHg methylation in microplate

In view of a high throughput cultivation and iHg methylation determination, Desulfovibrio strain BerOc1 and Desulfovibrio strain G200 were cultivated in 96-well microplates and the MeHg production was assayed for different initial iHg concentration. Due to technical limitations that relied on anaerobic cultivation in microplates, iHg was spiked at the beginning of the experiment and microbial culture were then incubated 48H at 37°C before analysis. For each iHg concentration tested on Desulfovibrio strain G200, no bioluminescence could be measured. The absence of bioluminescent signal testified that the working iHg concentrations did not induced the sensor. In contrast, a positive signal was reported from 50 to 200 µg.L -1 of initial iHg for Desulfovibrio strain BerOc1 (Figure V.2) . MeHg produced with initial iHg concentrations below 50 µg.L -1 could not be detected. This poor sensitivity is probably due to the adsorption of the iHg on the polystyrene microplate, limiting its bioavailability for SRB, or to adsorption of MeHg produced. Thus, specific acid cleaned glassware was used for the SRB cultivation and for the iHg methylation determination in the following experiments.

25,00

20,00

15,00

BeroC1 10,00 G200

Luminescence

5,00

0,00 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 iHg concentration (µg.L -1)

Figure V.2: Detection of methylmercury production by Desulfovibrio strain BerOc1 and

Desulfovibrio strain G200, incubated 48H at 37°C in 96-well microplates with different -1 inorganic mercury concentrations (0 to 200 µg.L ). Bioluminescence produced by E. coli

MC1061 pmerR BS BPmerlux was measured at 482 nm.

140 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

ii. Screening of MeHg production in Bellco tubes

MeHg production by Desulfovibrio strain BerOc1 was tested in Bellco tubes over the time and according to different iHg concentrations (Figure V.3). Incubations with iHg were performed from the late exponential growth phase culture (OD 600nm = 0.170) to the beginning of the -1 stationary phase (OD 600nm = 0.220). A spike of 0.5 µg.L of iHg did not permitted to highlight iHg methylation in the bacterial culture for which the MeHg produced was probably below the detection limit. However, microbial culture incubated with 5, 10 and 50 µg.L -1 of iHg provided a luminescent signal from 15 min of incubation, while no signal could be reported at 0 min. These results support the fact that iHg spiked did not induced a signal by the bacterial sensor and suggest that the biological mechanism for iHg methylation is relatively fast. The time to reach maximum signal intensity was estimated to be 2-3H. This plateau could correspond to a balance between the methylation and demethylation activities as already reported in Bridou et al., 2011 . In addition, the luminescent signal was found to increase proportionally when measuring MeHg production in microbial culture spiked with 5 and 10 µg.L -1 of iHg, suggesting a relationship between the amount of MeHg produced and the intensity of the signal. The culture incubated with 50 µg.L -1of iHg provided the highest luminescence, but only twice higher than the culture spiked with 10 µg.L -1of iHg, supporting the idea of a saturation of the signal produced by the sensor.

Assuming an iHg methylation rate of 25% for Desulfovibrio strain BerOc1 (Ranchou et al., 2009) , and taking into account the dilution with the biosensor, the detection threshold for MeHg ranged between 62.5 and less than 625 ng.L -1. This result is consistent with the limit of detection of 75 ng.L -1 reported by Rantala and coworkers (2011). Nevertheless we can expect a slight increase of the MeHg detection limit for our experiments due to the interaction of mercury with living organic matter affecting the transport, the transformation and the bioavailability of the metal (Graham et al. , 2012) . The high sensitivity of the biosensor for the MeHg offer the possibility to investigate MeHg production among the SRB with low iHg levels that may come close to environmental concentrations. Finally, incubation of Desulfovibrio strain G200 with 10 and 50 µg.L-1 of iHg did not induce the production of luminescence by the biosensor (data not shown) .

141 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

50 µg.L-1

10 µg.L-1 80 0,25 5 µg.L-1 0,5 µg.L-1 70 OD 600nm 0,23 60

50 0,21 40 30 0,19

600nm OD

Luminescence 20 0,17

0 0,15 0 100 200 300 400 500 Time (min)

Figure V.3: Detection of methylmercury production by Desulfovibrio strain BerOc1 cultivated in Bellco tubes over the time and according different inorganic mercury concentrations (0.5 to 50 µg.L-1). Bioluminescence produced by E. coli MC1061 pmerR BS BPmerlux was measured at 482 nm.

iii. Simultaneous determination of MeHg production by GC-ICPMS and the biosensor

In the late exponential growth, Desulfovibrio strain BerOc1 was incubated with 10 µg.L-1 of iHg. MeHg production was simultaneously monitored by the bacterial sensor (Figure V.4.A) and by GC-ICPMS in order to confirm the sensitivity of the biosensor to MeHg. Values generated by both techniques were plotted to generate a regression curve (Figure V.4.B) . The linear regression analysis data showed a good relationship between both the chemical and the biological techniques, with a coefficient of regression value r2 = 0.99. This result confirmed that the bioluminescence measured at 482nm is well linked to the MeHg production by Desulfovibrio strain BerOc1.

142 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

A 30 0,25

25 0,23

20 0,21

0,19 OD (600nm) OD Luminescence 10

0,17 5

0 0,15 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Time (min) MeHg OD 600nm

B 30

2 r = 0,9968

Luminescence 10

0 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50

MeHg (µg.L -1)

Figure V.4: (A) Detection of methylmercury production by Desulfovibrio strain BerOc1 over the time and in Bellco tubes. Spike concentration was 10 µg.L -1 and cultures were incubated for 6H at 37°C. (B) Relationship between MeHg production estimated by GC-

ICPMS and luminescence of the biosensor MC1061 pmerR BS BPmerlux. Line represents the best fit determined by linear regression of the data.

143 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

OTU Q OTU B OTU G OTU from from sulfate- OTU I OTU OTU H OTU (B) (B) 0.02 on 1000 replicates 98 87 85 OTU J OTU 71 77 71 57 71 82 71 75 54 98 98 97 100 83 95 95 100 100 tion was detected are in bold and Strain PR2D11 Strain PR2A11 Strain PR8B06 Strain PR7H05 Strain PR6A05 (AF118453) Strain PR6A02 Strain PR5A03 Strain PR2A10 Strain PR5F08 Strain PR7B05 Strain PR4H04 Strain PR2A12 T Strain PR4C04 StrainPR5G01 Strain PR5B01 StrainPR7D06 StrainPR8E02 Strain PR6H10 Strain PR8H07 (AF099061) (X95180) (X99707) T capabilities. capabilities. The 21 strains were related to T T (L42613) Strain PR8A05 T StrainD12 PR2 and bold. and (AF418179) T DSM12130 DSM2908 DSM12342 DSM9705 DSM9700 DSM644 and 16S rRNA gene sequences (1000 bp) Desulfotalea arctica A) Desulfofustis glycolicus Desulfobulbuselongatus Desulfovibriovulgaris Desulforhopalus singaporensis Desulforhopalus vacuolatus r-joining method. Bootstrap values (in %) are based (AY626032) (U16723) (AF418196) T T T ort. ort. Sulfate-reducing strains for which MeHg produc (AF334594) T DSM644 (AF418191) DSM12342 T DSM12130 (AF418202) sediments and tested for their mercury methylation T on potential but unable to produce MeHgon potential to inare but produce grey unable AB genes sequences (1100 bp) ( DSM9700 DSM9705 dsr DSM2908 Desulfotaleaarctica Desulfovibriovulgaris Strain PR6A02 Desulforhopalus singaporensis Strain PR6H10 StrainPR8E02 StrainPR5G01 StrainPR4C04 Strain PR5B01 Strain PR8H07 Strain PR7D06 Strain PR8B06 Strain PR2A11 Strain PR7B05 Strain Strain PR2A12 Strain PR5F08 Strain PR6A05 Strain PR5A03 Desulfofustis glycolicus Strain PR4H04 Strain PR2A10 Strain PR2D11 77 Desulforhopalus vacuolatus 100 100 80 97 Strain PR7H05 100 100 100 Strain PR8A05 Desulfobulbuselongatus 100 56 99 Strain PR2D12 90 99 95 family. The tree was constructed using the Neighbo 100 82 75 81 86 78 81 0.05 Desulfobulbaceae A the the each each and are shown at the nodes >50% bootstrap supp strains Other black. tested iHg methylati their for reducing reducing isolates recovered from the Adour estuary Figure V.5: Phylogenetic trees based on the 144 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur iv. Mercury methylation determination among isolates

The iHg methylation potentials of 21 sulfate reducing strains were determined using the bacterial sensor. All strains were related to the Desulfobulbaceae family and were isolated from anoxic sediments of the Adour estuary (Colin et al., 2012) . They were phylogenetically close from each others. Based on the 16S rRNA gene, Desulfopila and Desulfotalea related strains shared between 96.2% and 100% of sequence similarity. By sequencing partially the dsr AB genes, we confirmed the occurrence of minor but consistent genotypic variations among these microorganisms (Figure V.5) . This bacterial microdiversity may rely on diverse parameters such as spatial separation in sediments, physico-chemical variations or specific bacterial interactions (Schloter et al. , 2000) . Despite the general use of the 16S rRNA gene as molecular marker, this gene may present limited variations for the discrimination of closely related taxa or strains (Nubel et al., 1996 ). Thus, protein-coding genes that exhibit higher genetic variations may be used for the classiﬁcation of closely related species ( Bavykin et al., 2004) . dsr AB genes sequences demonstrated a range of similarity between 74 and 100%, thus permitting a more accurate discrimination of the sulfate-reducing isolates, and could be used to distinguish closely related strains which showed over 99% of sequence similarity for the 16S rRNA gene such as strains PR7B05 ; PR2A12 ; PR5F08 (Figure V.5) .

The 21 sulfate-reducing affiliated to the Desulfobulbaceae family were tested for their methylation capacities. In addition, Desulfovibrio strain BerOc1 and Desulfovibrio strain G200 were used as positive and negative controls respectively (Figure V.6). Sulfate-reducing strains were cultivated under sulfate reduction and were spiked with 50 µg.L-1 of iHg at their exponential growth phase. Among the SRB tested in this study, the capacity for mercury methylation varied a lot (Figure V.6) . Based on the phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences, strains PR7B05 ; PR2A12 ; PR5F08 ; PR5A03 ; PR4H04 ; PR5B01 ; PR8H07 and PR7D06 shared more than 99% sequences similarities and displayed different potential capabilities for iHg methylation. Among SRB belonging to the δ-Proteobacteria , Ekstrom et al. (2003) already demonstrated that mercury methylation was not metabolic group-dependent. In this study we demonstrate that iHg methylation capacities are strain-dependent rather than genus or metabolic group dependent among the Desulfobulbaceae family. The remaining strains in OTU J were PR6H10 ; PR8E02 ; PR2A10 ; PR6A02 ; PR2A11 ; PR6A05 and PR8B06 . and did not exhibit iHg methylation capacities or the MeHg produced was below the detection limit (Figures V.5 and V.6) . Finally strains that clustered within the OTUs I and H were identified as

145 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur non merthylating bacteria, while strains that clustered OTU G and Q were found to produce MeHg but at lower rate than methylating strains affiliated to OTU J (Figure V.6)

Desulfovibrio strain g200 Desulfovibrio strain BerOc1 Strain PR7B05 Strain PR2A12 Strain PR5F08 Strain PR5A03 Strain PR4H04 Strain PR5B01 Strain PR8H07 Strain PR7D06 Strain PR2A11 Strain PR6A05 Strain PR8B06 Strain PR5G01 Strain PR4C04 Strain PR6A02 Strain PR6H10 Strain PR8E02 Strain PR2D11 Strain PR2A10 Strain PR7H05 Strain PR8A05 Strain PR2D12

0,0 50,0 100,0 150,0 200,0

Normalized MeHg production

Figure V.6: Detection of methylmercury production among the 21 sulfate-reducing strains

affiliated to the Desulfobulbaceae family using the E. coli MC1061 pmerR BS BPmerlux sensor. Bioluminescence measured was normalized according optical density of the bacterial culture estimated at 600nm. Error bars represent standard errors from triplicates

Up to date the Desulfobulbaceae members contained only 2 strains that were investigated for their iHg methylation activity (Rodriguez-Gonzales et al., 2009 ; King et al., 2000) . In the present study 21 strains related to this family were investigated and 7 were found to produce MeHg. DNA/DNA reassociation methods are needed to investigate the whole bacterial genomes of isolates sharing high sequence similarities but having different potential for iHg methylation (OTU J) , in order to define if those bacteria belong to the same species. Based on a cultural approach in 384-well microplate, members related to the Desulfopila and Desulfotalea genera were found to account for 1.3 x10 +6 cells per cm3 of anoxic sediments in Adour estuary (Colin et al., 2012) . Strains PR2A12 ; PR4H04 ; PR5B01 ; and PR8H07 clustered in OTU J and were found to methylate iHg at a rate equivalent to that of Desulfovibrio strain BerOc1 or even higher.

146 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

According to these results and their abundance in anoxic sediments, this phylogenetic group has to be taken into consideration when evaluating the risk linked to MeHg production in coastal ecosystems.

As shown in this work, the biosensor may be used as a tool to investigate metabolic capabilites of SRB for iHg methylation, or to determine at large scale the distribution of methylating bacteria among the SRB. Moreover, since the molecular determinism of the iHg methylation still unknown the sensor may be applied directly on complex samples (sediments, or bacterial associations) in order to analyse global methylation rate using low iHg concentrations. Finally this tool may be used on other functionals groups that were not tested for this biotranformations so far.

147 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

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150 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur

3. CONCLUSION DU CHAPITRE

Un biosenseur permettant la détection du méthylmercure dans l'environnement a été utilisé dans ce travail pour estimer les potentiels de méthylation du mercure chez les BSR. Dans un premier temps le biosenseur a été incubé avec deux souches modèles du laboratoire, affiliées au genre Desulfovibrio . La souche Desulfovibrio BerOc1 est capable de méthyler le mercure inorganique tandis que la souche Desulfovibrio G200 est incapable de produire du méthylmercure (Bridou et al., 2011; Ranchou-Peyrusse et al., 2009) . L’analyse de la production de méthylmercure par la souche Desulfovibrio BerOc1 a été menée en parallèle par dosage chimique des isotopes du mercure et par le biosenseur. La comparaison des deux méthodes de dosage a montré une bonne corrélation, validant ainsi l’application du biosenseur sur les BSR. L'utilisation de cet outil biologique pour la détermination des potentiels de méthylation du mercure chez les micro-organismes sulfato-réducteurs constitue une alternative simple, rapide et économique au dosage chimique des isotopes stables du mercure. Bien que la méthode chimique reste bien plus précise, l'utilisation d'un biosenseur permet de traiter un grand nombre de souches à la fois et offre également la possibilité de mener des études cinétiques approfondies des processus de méthylation dans le temps et selon différentes conditions de culture.

Le potentiel de méthylation du mercure de la souche Desulfovibrio BerOc1 a pu être évalué au cours du temps pour différentes concentrations initiales en mercure inorganique. La concentration minimale de mercure inorganique pour laquelle le méthylmercure produit a été détecté par le biosenseur a été estimée à 5 µg.L-1 soit une concentration de 625 ng.L -1 de méthylmercure. Ce résultat suggére une bonne sensibilité du biosenseur pour de faibles concentrations en méthylmercure équivalent à celles qui peuvent être recontrées in situ . Pour chaque concentration en mercure inorganique testée, la production de méthylmercure a pu être mise en évidence dès les premières minutes d'incubation (<15min) démontrant que la méthylation du mercure constitue un mécanisme rapide. De plus, un équilibre entre les processus de méthylation et déméthylation du mercure semble se mettre en place dès 2-3H d'incubation à 37°C.

Enfin les potentiels de méthylation de 21 souches affiliées aux genres Desulfopila , Desulfotalea et Desulfobulbus ont été testés avec le biosenseur. Ces micro-organismes ont été isolés des sédiments de surface de la station B20 (Chapitre III ) et ont montré une forte abondance in situ . L'analyse moléculaire des séquences pour le gène codant pour la sous-unité

151 Chapitre V : Etude de la méthylation du mercure chez les BSR via l’utilisation d’un biosenseur ribosomique 16S a montré que ces souches sont très proches phylogénétiquement, avec des similarités de séquences supérieures à 96%. Le séquençage et l'analyse des gènes codant pour la réductase dissimilatrice du sulfite ( dsr AB) ont confirmé et complété notre vision de cette microdiversité au sein des souches. L'analyse de la méthylation du mercure des 21 BSR avec le biosenseur a montré des potentiels très différents selon la souche. Comme précédemment décris pour les genres Desulfovibrio ou Desulfomicrobium , la méthylation du mercure semblerait être souche dépendante plutôt que genre ou espèce dépendante. Cependant, l'étude de ces isolats sulfato-réducteurs a dévoilé certains clusters homogènes.

15 2

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

153 Conclusion et Perspectives

Les zones estuariennes sont le siège d’interactions et de mélanges entre les eaux continentales et marines. Au cours de son cheminement dans le bassin versant, la rivière Adour se charge en matière organique, sels nutritifs et divers polluants par le lessivage des sols, et les rejets des activités agricoles, industrielles et urbaines localisées en aval de l'estuaire. Du fait des caractéristiques hydrologiques et géomorphologiques, le temps de résidence des particules en suspension dans l'estuaire de l'Adour est relativement faible comparé aux autres grands estuaires Français. Cette faible turbidité limite la formation d'un bouchon vaseux et l'apport de matière en suspension dans le Golfe de Gascogne est estimé entre 0,25 et 0,30 Mt par an (Maneux et al., 1999 ; Snoussi et al., 1990). Les apports des différents gaves puis de la rivière Adour et de la Nive, combinés à une faible profondeur de colonne d'eau et une température élevée dans l'estuaire, favorisent le développement des producteurs primaires photosynthétiques. La matière organique produite en zone côtière est en grande partie dégradée dans les sédiments par les micro-organismes hétérotrophes, mais également exportée vers le large et influence les réseaux trophiques bien au delà de l'estuaire. Dans les sédiments de l'estuaire, l'oxygène est totalement consommé dès les premiers millimètres de profondeur et les communautés microbiennes utilisant d'autres composés en tant qu'accepteurs terminaux d'électrons sont détectées. Les microorganismes sulfato-réducteurs sont très largement impliqués dans la minéralisation de la matière organique (Jorgensen, 1982) et constistuent une large fraction de la biomasse microbienne. Les gènes dsr AB amplifiés des sédiments de surface de l'estuaire de l'Adour ont été estimé à raison de 1.5 10 8 copies par gramme de sédiment (Colin, non publié)

La première partie de ce travail s'est attachée à décrire la structure des communautés sulfato- réductrices dans les sédiments de surface de la station B20, ainsi que le long du panache de l'estuaire de l'Adour. La mise en place d'une procédure d'isolement haut-débit des BSR en microplaque 384 puits a réduit significativement les volumes de culture à raison de 100 µL, permettant ainsi de traiter un grand nombre d'isolats à la fois. Au total, près de 200 BSR ont été isolées et identifiées à partir des sédiments et du panache de l'estuaire. Sur la base du gène codant pour l'ARN ribosomal 16S, 15 phylotypes issus des sédiments ont montré des similarités de séquences inférieures ou égales à 98% avec les micro-organismes précédemment cultivés et ont donc été considérés comme de nouveaux taxons cultivés. Par comparaison aux études menées avec des techniques traditionnelles d'isolement en anaérobiose, la diversité des BSR isolées en microplaque a été améliorée de 2 à 6 fois. Plusieurs phylotypes ont été isolés une ou deux fois seulement et n'auraient probablement pas été cultivés avec des techniques d'isolement plus classiques.

154 Conclusion et Perspectives

L'approche culturale menée à la fois sur les sédiments et sur le panache de l'estuaire a été complétée par une approche moléculaire. Dans les deux cas, l'isolement des BSR et l'analyse des gènes dsr AB directement amplifiés de l'environnement ont fournit des résultats très différents et donc complémentaires. Chacune des deux approches présentent des limites qui leur sont propres et par conséquent fournissent une image biaisée de la diversité microbienne réellement présente in situ . La compilation des données moléculaires et culturales a donc offert une représentation globale et plus juste de la diversité sulfato-réductrice présente dans l'estuaire de l'Adour. Cette approche polyphasique a permis d'identifier toutes les familles sulfato-réductrices mésophiles généralement rencontrées dans un écosystème côtier.

Dans les sédiments de surface de la station B20, le facteur de dilution utilisé pour la procédure d'isolement a permis d'estimer la concentration des BSR cultivables à 1.10 6 bactéries par cm 3 de sédiments. Les BSR affiliés à la famille des Desulfobulbaceae ont été détectées comme abondantes par l'approche moléculaire et culturale. Près de 100 isolats ont été affiliées aux genres Desulfopila et Desulfotalea contenant à ce jour pas plus de 4 espèces cultivées et caractérisées (Knoblauch et al., 1999 ; Suzuki et al., 2007 ; Gittel et al., 2010) . Avec plus de 60% des clones affiliés, les micro-organismes appartenant à la famille des Desulfobacteraceae constituent la seconde famille sulfato-réductrice majoritaire des sédiments. Cependant un seul phylotype appartenant à cette famille a été cultivé dans ce travail. Ces résultats contradictoires peuvent être liés à des conditions d'isolement inadaptées aux micro-organismes affiliés aux Desulfobacteraceae , ou bien au mauvais état physiologique des cellules in situ . A l'inverse, les BSR appartenant aux familles des Desulfovibrionaceae et des Desulfomicrobiaceae ont constitué 15% des souches isolées mais n'ont pas été détectées par l'approche moléculaire, suggérant des biais dans l'extraction des acides nucléiques ou dans l'amplification des gènes dsr AB.

155 Conclusion et Perspectives

Le gradient étudié du panache de l'estuaire de l'Adour s'étend d'une zone intra-estuarienne jusqu'à une zone marine. Pour les 4 stations analysées, des échantillons d'eau ont été collectés à différentes profondeurs. Bien que les BSR soient qualifiées d'anaérobies strictes, la confrontation des courants de la marée et des eaux douces résulte en la remise en suspension des particules sédimentaires et des micro-organismes qui y sont associés. Selon l'hydrodynamisme de l'estuaire, les communautés sulfato-réductrices peuvent être confrontées à des expositions chroniques à l'oxygène plus ou moins longues dans le temps et être transportées le long du gradient estuarien. L'approche culturale menée sur la colonne d'eau a montré que les BSR étaient bien moins représentées que dans les sédiments. La concentration des micro-organismes sulfidogènes cultivables a été estimée entre 0 et 60 cellules.mL-1, et 4 à 40% de ces micro-organismes ont été affiliés aux BSR. Les micro-organismes sulfato-réducteurs ont principalement été isolés à partir des échantillons d'eau de surface, influencée par les apports d'eaux douces de l'estuaire moins denses que l'eau de mer. Malgré la faible concentration de matrice dans la colonne d'eau, les gènes codant pour la réductase dissimilatrice du sulfite ( dsr AB) ont pu être amplifiés par PCR nichée tout au long du gradient étudié, à l'exception de certains échantillons dans le panache dilué et la station marine, pour lesquels aucune souche sulfidogène n'a pu être également cultivée.

Les micro-organismes affiliés aux genres Desulfovibrio , Desulfopila , Desulfotalea , et Desulfomicrobium , préalablement isolés des sédiments anoxiques de la station B20, ont également été cultivés à partir des échantillons d’eau de la station intra-estuarienne et du panache concentré de l'estuaire. Au vue des fortes similarités de séquences des gènes codant pour l'ARNr16S entre les souches issues des sédiments de la station B20 et celles isolées dans le panache de l'estuaire, ces micro-organismes ont fort probablement été remis en suspension dans la colonne d'eau par l'action des courants et transportés jusqu'à l'embouchure estuarienne. Bien que l'oxygène dissous dans la colonne ait été estimé entre 70 et 80% de saturation, les souches isolées du panache de l'estuaire n'ont pas montré de phase de latence plus importante que celles isolées de la station B20. Ce résultat suggère que ces micro-organismes sont capables de résister à une exposition à l'oxygène et de retrouver leur capacité à réduire les sulfates dès lors qu'ils sont replacés en anaérobiose. Ces conditions peuvent être retrouvées lorsque les particules sédimentaires auxquelles sont associés ces microorganismes se redéposent à l'interface eau/sédiment, ou bien lorsque la turbidité de l'estuaire permet la création de microniches anoxiques dans la colonne d'eau (Simon et al., 2002) .

156 Conclusion et Perspectives

Cependant, en s'éloignant de l'embouchure estuarienne, la résistance des BSR à l'oxygène semble être limitée pour certains microorganismes. Bien que l'approche moléculaire ait permis d'identifier des BSR appartenant aux familles des Desulfobacteraceae , Desulfobulbaceae et Desulfovibrionaceae dans le panache dilué et la station marine, ces micro-organismes n'ont pas pu être isolés comme ils l'ont été précédémment dans la zone intra-estuarienne et le panache concentré. Ce résultat peut être lié à la dégradation progressive de l'état physiologique des cellules au cours de leur transport le long du gradient. La majorité des BSR isolées à partir du panache dilué et de la station marine ont été affiliées à Desulfovibrio oceani . Ces micro- organismes sembleraient constituer une population sulfato-réductrice adaptée à la vie marine. Desulfovibrio oceani subsp. oceani et Desulfovibrio oceani subsp. galateae sont deux souches récémment isolées d'une zone de minimum d'oxygène aux larges des Côtes Péruviennes et ont montré une résistance accrue à l'oxygène. Ces souches sont capables de retrouver une activité sulfato-réductrice après une exposition de 27 jours à l'oxygène et sans qu'aucune phase de latence ne puisse être constatée (Finster et al., 2010) .

La resuspension du matériel sédimentaire par l'action des courants et l'occurrence des BSR dans le panache de l'estuaire de l'Adour peuvent avoir des répercussions majeures sur les cycles biogéochimiques des polluants et notamment du mercure. Des études menées dès les années 1980, ont démontré l'implication des BSR dans la méthylation du mercure inorganique dans les sédiments côtiers (Compeau et Bartha, 1985) . Leur présence dans le panache ainsi que la remobilisation du mercure présent à l'interface eau/sédiment peuvent faciliter ses biotransformations et favoriser le transfert du mercure dans les réseaux trophiques supérieurs. L'existence d'une activité sulfato-réductrice dans un habitat oxique telle que la colonne d'un estuaire n'est pas facilement identifiable car les sulfures potentiellement produits sont rapidement réoxydés. Cependant, la capacité des BSR à utiliser des voies métaboliques alternatives à la réduction dissimilatrice du sulfate ne doit pas être sous-estimée. Bridou et al. (2011) ont mis en évidence la méthylation du mercure chez des BSR cultivées dans différentes conditions de croissance (respiration du fumarate, fermentation,…). De plus, des micro-organismes affiliés au genre Citrobacter ont constitué une fraction significative des isolats dans la station intra- estuarienne et le panache concentré de l'estuaire. Ces micro-organismes qualifiés d'anaérobies facultatifs sont capables de se développer en condition oxique mais également de réaliser la réduction dissimilatrice du sulfate en anaérobiose (Angeles-ch et al., 2002 ; Qiu et al., 2009) . Aucune information sur la méthylation du mercure n'est actuellement disponible pour ce genre phylogénétique qui devra être testé pour son potentiel.

157 Conclusion et Perspectives

A ce jour, moins de 60 souches sulfato-réductrices ont été testées pour leur potentiels de méthylation du mercure et la majorité des souches analysées sont affiliées au genre Desulfovibrio . Ces micro-organismes sont facilement isolés en laboratoire à de fortes concentrations cellulaires et sont donc souvent utilisés comme modèles d'étude. Néanmoins ce groupe phylogénétique constitue une faible fraction des communautés sulfato-réductrices de l'estuaire de l'Adour et est rarement identifié comme abondant dans les écosystèmes estuariens. Une vision plus globale des potentiels de méthylation au sein des différents genres sulfato- réducteurs est donc nécessaire pour appréhender ces transformations à l'échelle de l'écosystème. Le manque de données sur la méthylation du mercure par les BSR est lié aux limites rencontrées dans l'isolement des micro-organismes anaérobies ainsi qu'aux techniques de dosage chimiques du mercure qui nécessitent des compétences spécifiques et un matériel de pointe.

Dans ce contexte, le travail présenté dans le chapitre V décrit le développement et l’application d’une méthode alternative aux techniques de dosage traditionnelles des isotopes stables du mercure. Un biosenseur initialement développé pour détecter la présence de méthylmercure dans l'environnement (Ivask et al., 2001 ; Ivask et al., 2009) a été appliqué aux BSR pour estimer leurs potentiels de méthylation. L'objectif de ce travail est de disposer d'une méthode simple, sensible et rapide pour évaluer la capacité des micro-organismes à méthyler le mercure. Le couplage de la méthode d'isolement haut-débit en microplaque 384 puits présentée précédemment avec le biosenseur permettrait d'évaluer à terme la distribution des potentiels de méthylation du mercure à large échelle. La phylogénie et l'évolution des micro-organismes méthylants pourraient ainsi être étudiées au sein des communautés microbiennes.

Dans un premier temps, cet outil biologique a été validé sur deux souches modèles du laboratoire. Une bonne corrélation a pu être observée entre le dosage chimique du méthylmercure par GC-ICPMS et le biosenseur. La méthylation du mercure par la souche Desulfovibrio BerOc1 a été évaluée pour différentes concentrations initiales en mercure inorganique. Le seuil minimal de détection a été obtenu pour une concentration initiale en mercure de 5 µg.L -1, soit approximativement 1.25 µg.L -1 de méthylmercure produit, démontrant ainsi la bonne sensibilité de cet outil biologique pour des concentrations proches des conditions environnementales. De plus, quelque soit la concentration testée, la méthylation chez BerOc1 a pu être mise évidence dès 15 minutes d'incubation avec le mercure inorganique suggérant une réponse rapide de ces micro-organismes en présence du polluant.

158 Conclusion et Perspectives

Dans un deuxième temps, des souches sulfato-réductrices isolées des sédiments de la station B20 et affiliées aux genres Desulfopila, Desulfotalea et Desulfobulbus ont été sélectionnées et testées pour leurs potentiels de méthylation du mercure avec le biosenseur. Jusqu'à présent uniquement 2 souches appartenant à la famille des Desulfobulbaceae avaient été analysées et identifiées comme méthylantes (Rodriguez-Gonzales et al., 2009 ; King et al., 2000) . A partir des données culturales obtenues dans ce travail, les genres Desulfopila et Desulfotalea ont été détectés comme abondants dans les sédiments de la station B20, et également présents dans le panache concentré de l'estuaire de l'Adour. Le séquençage et l'analyse des séquences des gènes codant pour l'ARN ribosomal 16S et la réductase dissimilatrice du sulfite a révélé que ces micro- organismes étaient tous étroitement apparentés les uns aux autres d'un point de vue phylogénétique. De plus, une bonne congruence entre la phylogénie des deux marqueurs moléculaires a été observée en dessous du seuil de similarité de séquence utilisé pour la définition de l'espèce. Des variations de l'ordre de 0 à 3,8% et de 0 à 18,7% pour les séquences des gènes 16S et dsr AB ont été respectivement observées. Cette microdiversité peut s’apparenter à différents écotypes correspondant à une adaptation aux variations environnementales rencontrées dans les sédiments de l'estuaire de l'Adour (Achtman et Wagner, 2008) et des comportements différents vis-à-vis de la méthylation du mercure sont envisageables.

21 souches affiliées aux genres Desulfopila, Desulfotalea et Desulfobulbus ont donc été choisies et testées pour leur potentiel de méthylation du mercure avec le biosenseur. Ainsi 7 des 21 isolats ont été identifiés comme méthylants. Certaines souches ont montré des potentiels de méthylation du mercure équivalents, voire supérieurs à celui de la souche Desulfovibrio BerOc1 pour qui la production de methylmercure a été estimée à environ 25% du mercure incubé (Ranchou et al., 2009) . Ainsi, ces micro-organismes affiliés à la famille des Desulfobulbaceae sont en partie capables de méthyler le mercure et doivent donc être considérés avec intérêt dans l'estuaire de l'Adour. L'estimation des potentiels de méthylation du mercure chez des micro- organismes très proches phylogénétiquement a déjà été menée ( Ranchou-Peyruse et al., 2009, Gilmour et al., 2011 ). Cependant le nombre de souches était beaucoup plus restreint et les micro- organismes ont très rarement été isolés d'un même échantillon environnemental comme c'est le cas dans ce travail.

Suite aux résultats obtenus dans ce manuscrit pour la famille des Desulfobulbaceae , et aux travaux antérieurs portant sur les micro-organismes appartenant aux Desulfovibrionaceae et Desulfomicrobiaceae , la détection de certaines familles ou certains genres bactériens in situ ne

159 Conclusion et Perspectives permet pas de conclure sur les risques liés à une contamination au mercure dans l'habitat côtier. Dans ces trois familles, des souches phylogénétiquement proches possèdent des potentiels de méthylation du mercure très différents. A ce jour, l'approche moléculaire des BSR n'est donc pas envisageable et aucune conclusion sur la production de méthylmercure ne peut être avancée quant à la présence de certains micro-organismes dans l'écosystème côtier. Afin d'évaluer les risques de santé publiques liés à la contamination des sédiments estuariens, il parait actuellement plus judicieux d'évaluer le potentiel de méthylation du mercure d'un sédiment d'un point de vue global et non pas les potentiels de méthylation des micro-organismes qui le composent. Cette approche est facilement envisageable avec le biosenseur. Cependant l'approche culturale reste à ce jour essentielle pour tenter d'identifier les mécanismes moléculaires mis en jeu et les facteurs de contrôle de la méthylation du mercure chez les BSR. L'identification des gènes impliqués dans la méthylation du mercure et le suivi de leur transcription pourraient être envisagés à l'avenir pour prévenir les risques environnementaux. Les travaux présentés dans ce manuscrit offrent des outils et des perspectives intéressantes pour étudier la structure des communautés sulfato-réductrices dans l'écosystème estuarien et leur implication dans la méthylation du mercure. De plus, ces potentiels de méthylation pourront être plus aisément appréciés au sein des nombreux autres genres sulfato-réducteurs qui restent encore aujourd’hui non caractérisés. L'application du biosenseur sensible au méthylmercure ne s'arrête pas aux BSR et son application peut être envisagée pour rechercher la production de méthylmercure parmi d'autres taxons bactériens.

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RESUME

Les Bactéries Sulfato-Réductrices (BSR) représentent un groupe fonctionnel majeur dans les habitats aquatiques en intervenant dans les processus de minéralisation de la matière organique. En plus de leur implication dans le cycle du carbone et du soufre, les BSR sont considérées comme les principaux producteurs de méthylmercure en milieu côtier, un composé neurotoxique extrêmement bioaccumulable dans les réseaux trophiques. Dans ce contexte, la diversité des BSR dans les sédiments et le panache de l'estuaire de l’Adour (France) a été évaluée par une approche polyphasique incluant le clonage des gènes dsr AB et une méthode de culture haut-débit en microplaques 384 puits. Ces deux techniques ont fourni des données très complémentaires et donc, une meilleure représentation de la diversité sulfato-réductrice réellement présente dans l’estuaire. La réduction des volumes de culture à raison de 100 µL a permis d’améliorer significativement l’efficacité d’isolement des BSR. Près de 200 souches ont été isolées et identifiées à partir des sédiments et du panache de l’estuaire, et plusieurs d'entre elles ont constitué de nouveaux taxons cultivés. En parallèle, un biosenseur luminescent sensible spécifiquement au méthylmercure a été appliqué pour l’étude de la méthylation du mercure par les BSR. Cet outil simple et rapide constitue une bonne alternative aux méthodes de détection chimique traditionnellement utilisées pour évaluer les potentiels de méthylation du mercure des micro-organismes. L’analyse de la production de méthylmercure chez 21 BSR affiliées à la famille des Desulfobulbaceae a permis d’identifier des souches méthylantes, dont certaines ont été identifiées comme abondantes dans les sédiments de l’estuaire. À long terme, l’utilisation du biosenseur pour l’analyse des capacités de méthylation du mercure chez les BSR ou d’autres groupes fonctionnels permettra de mieux connaître la distribution phylogénétique des micro- organismes méthylants et d'appréhender le déterminisme génétique de ces transformations.

Mot clés : bactéries sulfato-réductrices, isolement haut-débit, dsrAB, estuaire, méthylmercure

ABSTRACT

Sulfate-Reducing Bacteria (SRB) represent a significant part of the standing microbial communities living in coastal sediments. This functional group is involved in the decomposition and the mineralization of organic matter as well as in the sulfur cycle. In addition, production of methylmercury was shown to be mainly driven by SRB in aquatic ecosystems. Environmental methylation of inorganic mercury constitutes a human health issue due to its neurotoxic effect and its biomagnification in aquatic food webs. In this context, sulfate-reducing diversity was evaluated in anoxic sediments, as well as in the water plume of the Adour estuary. SRB were characterized through a polyphasic approach including dsr AB genes analysis and high throughput isolations in 384-well microplates. As a result, the microplate approach contributed to assess a significant part of the sulfate- reducing community and provided complementary results to the molecular approach. High-throughput SRB isolation permitted a rapid access to numerous but also original strains and around 200 SRB were isolated and identified from the estuarine sediments and the estuarine plume. Beside, the mercury methylation potentials of 21 sulfate reducing strains were determined using a bacterial sensor. All strains were related to the Desulfobulbaceae family and the capacity to produce methylmercury varied a lot. This work permit to identify some methylating strains identified as abundant in the Adour estuarine sediments. On the long view, the use of the biosensor to assess the mercury methylation potential will offer a better knowledge on the distribution of methylating bacteria among the SRB and other functional groups and could help to identify the molecular determinism beside these transformations. key words: sulfate-reducing bacteria, high-throughput cultivation, dsrAB, estuary, methylmercury