Développement D'une Signature Moléculaire Dans La Maladie

Développement d’une signature moléculaire dans la maladie osseuse de Paget

Thèse

Sabrina Guay-Bélanger

Doctorat en médecine moléculaire Philosophiæ doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

Résumé

La maladie osseuse de Paget (MOP) a changé de visage au cours des dernières années, augmentant le nombre d’individus atteints qui demeurent asymptomatiques. Étant donné le risque élevé de développer un ostéosarcome associé avec la MOP, cette maladie est une contre-indication à la prescription d’agents ostéoformateurs. Avec l’apparition prochaine de nouveaux agents ostéoformateurs pour le traitement de l’ostéoporose, il devient crucial de pouvoir dépister de façon fiable la présence de la MOP. Les objectifs de ce projet étaient (1) de mettre au point un test plus sensible permettant de détecter et d’évaluer la fréquence des mutations post-zygotiques SQSTM1/P392L chez les patients pagétiques, (2) de développer un test génétique de dépistage de la MOP incluant les mutations germinales et post-zygotiques dans SQSTM1, (3) et d’évaluer les performances diagnostiques de ce test intégré avec des marqueurs biochimiques dans une signature moléculaire spécifique à la maladie. Une technique de PCR sensible utilisant un acide nucléique bloqué (LNA) spécifique à la mutation SQSTM1/P392L a été développée, puis la présence de cette mutation a été recherchée dans les cohortes disponibles au laboratoire et dans différents tissus. Ensuite, le développement de la signature moléculaire a utilisé les données génotypiques et biochimiques disponibles dans les cohortes du laboratoire, puis des régressions logistiques ont été effectuées afin de déterminer la combinaison de marqueurs ayant la meilleure capacité à identifier correctement les patients avec la MOP. Des mutations post- zygotiques SQSTM1/P392L étaient présentes chez 4,8% des patients pagétiques, et 1,4% des individus sains dans les populations étudiées, cette mutation post-zygotique étant restreinte à la lignée monocytaire. Deux tests moléculaires sous forme d’algorithme en deux étapes ont ensuite été proposés. D’une part, un algorithme génétique pur pourrait être utilisé : des mutations germinales dans le gène SQSTM1 devraient d’abord être recherchées, et si elles sont absentes, le score génétique basé sur la combinaison de cinq marqueurs génétiques développée dans ce projet devrait être calculé. Cet algorithme génétique avait une sensibilité égale à 83,61% et une spécificité égale à 51,03% dans les cohortes étudiées. D’autre part, un algorithme génétique et biochimique pourrait être proposé: des mutations germinales dans le gène SQSTM1 devraient d’abord être recherchées, et si elles sont absentes, le score combiné basé sur la combinaison des marqueurs génétiques et biochimiques développée dans ce projet devrait être calculé. Dans les populations étudiées, cet algorithme avait une sensibilité égale à 93,88% et une spécificité égale à 54,00%. La découverte des mutations post-zygotiques confirme l’existence d’un spectre mutationnel de SQSTM1 dans la MOP et pourrait expliquer en partie son caractère focal. Ces résultats ont par la suite permis de développer deux tests moléculaires capables de dépister la MOP de façon plus fiable que les biomarqueurs actuellement disponibles en pratique clinique.

iii

Abstract

Paget’s disease of bone (PDB) has changed in recent years, increasing the number of affected individuals who remain asymptomatic. Given the high risk of developing an osteosarcoma associated with PDB, this disease is a contraindication to the prescription of bone anabolic agents. With the incoming introduction of new bone anabolic agents indicated for osteoporosis treatment, it will be crucial to screen accurately for the presence of PDB. The objectives of this project were (1) to develop a more sensitive test to detect and assess the frequency of SQSTM1/P392L post-zygotic mutations in pagetic patients, (2) to develop a genetic test of PDB, including germinal and post-zygotic SQSTM1 mutations, (3) and to assess the diagnostic performance of this test integrated with bone biomarkers in a molecular signature of PDB. A sensitive PCR method using a locked nucleic acid (LNA) specific to the SQSTM1/P392L mutation was developed, and the presence of this mutation was investigated in the cohorts available in the laboratory, and in different tissues. Then, the development of the molecular signature used genotypic and biochemical data available in the laboratory, and logistic regressions were performed to determine the combination of markers with the best ability to correctly identify PDB patients. SQSTM1/P392L post-zygotic mutations were present in 4.8% of pagetic patients, and in 1.4% of healthy individuals in the population studied, this mutation being restricted to the monocytic lineage. Two molecular tests relying on a two steps algorithm were then developed. Firstly, a pure genetic algorithm could be proposed: a screen in the SQSTM1 gene should first be performed to search for disease-causing germinal mutations, and if negative, the genetic score based on a combination of the five SNPs developed in this study should be calculated. In the populations studied, this genetic algorithm had a sensitivity of 83.61% and a specificity of 51.03%. On the other hand, a genetic and biochemical algorithm could be used: a screen in the SQSTM1 gene should first be performed to search for disease-causing germinal mutations, and if negative, the combined score based on a combination integrating both genetic and biochemical markers developed in this study should be calculated. This genetic algorithm had a sensitivity of 83.61% and a specificity of 51.03% in the populations studied. The presence of post-zygotic mutations confirms the existence of a mutational spectrum of SQSTM1 in PDB, and may explain its focal character. These results conducted to the development of two molecular tests which predicted the PDB phenotype better than bone biomarkers already available in clinical practice.

Table des matières

Résumé ...... iii Abstract ...... v Table des matières ...... vii Liste des tableaux ...... xi Liste des figures ...... xiii Liste des abréviations...... xv Remerciements ...... xxi Avant-propos ...... xxiii Introduction ...... 1 1. Épidémiologie de la maladie osseuse de Paget ...... 1 1.1 Incidence actuelle de la maladie osseuse de Paget ...... 2 1.2 Prévalence actuelle de la maladie osseuse de Paget ...... 2 1.3 Rôle des facteurs environnementaux dans la maladie osseuse de Paget ...... 11 2. Aspects cliniques de la maladie osseuse de Paget ...... 13 2.1 Physiopathologie de la maladie osseuse de Paget ...... 13 2.1.1 Tissu osseux normal ...... 13 2.1.2 Tissu osseux pagétique ...... 16 2.2 Présentation clinique de la maladie osseuse de Paget ...... 18 2.2.1 Symptômes ...... 18 2.2.2 Diagnostic ...... 19 2.2.3 Traitement et suivi ...... 21 2.2.4 Complications ...... 23 2.3 Désordres osseux apparentés à la maladie osseuse de Paget ...... 28 2.3.1 Ostéolyse expansive familiale ...... 28 2.3.2 Hyperphosphatasémie expansive du squelette ...... 29 2.3.3 Maladie osseuse de Paget à début précoce ...... 30 2.3.4 Maladie de Paget juvénile ...... 31 2.3.5 Syndrome IBMPFD ...... 32 2.3.6 Dysplasie fibreuse des os ...... 33 3. Génétique de la maladie osseuse de Paget ...... 34 3.1 Mode de transmission ...... 34

vii 3.2 Hétérogénéité génétique ...... 36 3.3 Polymorphismes associés à la maladie osseuse de Paget ...... 37 3.3.1 Variants communs ...... 37 3.3.2 Variants rares ...... 38 4. Importance du gène SQSTM1 et des particules virales dans la physiopathologie de la maladie osseuse de Paget ...... 42 4.1 Mutations dans le gène Sequestosome 1 ...... 42 4.2 Rôle de la protéine SQSTM1/p62 ...... 49 4.3 Conséquences fonctionnelles des mutations dans SQSTM1 ...... 52 4.4 Mutations dans le gène SQSTM1 associées à d’autres maladies ...... 54 4.5 Rôle possible des particules virales ...... 55 4.6 Corrélations phénotype-génotype ...... 57 4.7 Interactions entre gènes et interactions gène-environnement ...... 58 5. Médecine personnalisée dans les maladies osseuses ...... 59 5.1 Biomarqueurs génétiques ...... 61 5.1.1 Structure de l’ADN ...... 61 5.1.2 Variations génétiques ...... 62 5.1.3 Techniques de détection des polymorphismes et/ou des mutations ...... 64 5.2 L’ARN comme biomarqueur...... 70 5.3 Marqueurs protéiques ou biochimiques ...... 71 5.3.1 Techniques de dosage des marqueurs biochimiques ...... 75 5.4 Critères d’évaluation des biomarqueurs ...... 77 5.4.1 Validité analytique ...... 78 5.4.2 Validité clinique ...... 78 5.4.3 Utilité clinique ...... 82 5.4.4 Enjeux éthiques, légaux et sociaux ...... 83 6. Problématique, hypothèses et objectifs...... 84 Chapitre 1 ...... 87 Detection of SQSTM1/P392L post-zygotic mutations in Paget’s disease of bone ...... 87 Résumé ...... 88 Abstract ...... 89 Introduction ...... 90 Materials and methods ...... 91 Individuals ...... 91 Development of the PCR‑clamping method for the GNAS/R201L mutation in FD patients ...... 92

viii

Optimization of the PCR‑clamping method for the SQSTM1/P392L mutation in PDB patients ...... 93 Distribution of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation in blood and saliva tissues of PDB patients .. 94 Distribution of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation in bone tissue of a PDB patient...... 94 Estimation of the copy number of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation ...... 94 Statistical analyses ...... 95 Results ...... 95 Development of the PCR‑clamping method for the GNAS/R201L mutation in FD patients ...... 95 Optimization of the PCR‑clamping method for the SQSTM1/P392L mutation in PDB patients ...... 98 Prevalence of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation in PDB patients ...... 101 Phenotype–genotype associations ...... 104 Somatic mosaicism of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation in PDB patients ...... 106 Estimation of the copy number of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation ...... 109 Discussion ...... 110 Acknowledgments ...... 112 References ...... 113 Chapitre 2 ...... 117 Development of a Molecular Test of Paget’s Disease of Bone ...... 117 Résumé ...... 118 Abstract ...... 119 Introduction ...... 120 Material and methods ...... 121 Individuals...... 121 SNP selection and genotyping ...... 122 Bone biomarkers ...... 123 Statistical analyses ...... 123 Results ...... 125 Combination of genetic markers ...... 126 Frequency of individuals with a genetic score ≥ 0.33 in an independent cohort ...... 140 Genotype-phenotype associations ...... 140 Combination of bone biomarkers ...... 141 Combination of genetic and biochemical markers ...... 145 Development of a molecular test, integrating SQSTM1 mutations screening followed by both genetic and bone biomarkers combinations ...... 145 Discussion ...... 147

ix Acknowledgements ...... 150 Disclosure ...... 151 References ...... 151 Discussion ...... 155 Conclusion ...... 163 Bibliographie...... 165

Liste des tableaux

Tableau 1. Prévalence de la MOP dans les principaux pays du monde...... 5 Tableau 2. Principaux facteurs environnementaux associés à la MOP lors d’études épidémiologiques...... 12 Tableau 3. Principaux polymorphismes et variants génétiques rares associés à la MOP d’après les GWAS et les études de gènes candidats...... 39 Tableau 4. Haplotypes H1 et H2 identifiés dans la population canadienne-française chez les porteurs de la mutation SQSTM1/P392L...... 44 Tableau 5. Fréquence des haplotypes H1 et H2 dans diverses populations...... 45 Tableau 6. Fréquence en pourcentage de patients atteints de la MOP porteurs de mutations dans le gène SQSTM1 dans les principales cohortes caucasiennes publiées, dans les formes familiales (F) et chez les individus atteints non apparentés (NA)...... 46 Tableau 7. Principaux marqueurs biochimiques de la formation et de la résorption osseuse utilisés en recherche et en pratique clinique...... 75 Tableau 8. Tableau de contingence représentant un échantillon de N sujets classés en fonction de leur état de santé et selon le résultat du test étudié...... 82 Tableau 9. Description of the main clinical characteristics of patients (n=10) with fibrous dysplasia (FD)...... 98 Tableau 10. Description of the main clinical characteristics of pagetic patients (n=18) carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation...... 102 Tableau 11. Comparisons of main clinical parameters between PDB patients with SQSTM1/P392L post- zygotic mutations and patients with germinal mutations, or patients without any SQSTM1 mutation...... 105 Tableau 12. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) genotypes available for this study...... 125 Tableau 13. Bivariate analyses of genetic markers in 243 patients with Paget’s disease of bone (PDB) and in 292 healthy controls, all non-carriers of any SQSTM1 gene mutation...... 128 Tableau 14. Intrinsic and extrinsic characteristics for the main molecular tests developed in this study...... 135 Tableau 15. Genotype combinations resulting in a genetic score ≥ 0.33 in men and women separately, all non-carriers of any SQSTM1 gene mutation...... 137 Tableau 16. Comparisons of main clinical characteristics between patients with Paget’s disease of bone (PDB) with a genetic score ≥ 0.33 versus patients with PDB with a genetic score < 0.33; all were not carrier of any SQSTM1 gene mutation...... 141 Tableau 17. Bivariate analyses of biochemical markers in 27 patients with Paget’s disease of bone (PDB) and in 151 healthy controls, all non-carriers of any SQSTM1 gene mutation...... 143

Liste des figures

Figure 1. Prévalence de la MOP dans le monde...... 10 Figure 2. Résultats de la méta-analyse des changements séculaires de prévalence de la MOP...... 10 Figure 3. Cellules osseuses en action lors du remodelage osseux...... 15 Figure 4. Système RANK/RANKL/OPG dans l’ostéoclastogénèse...... 15 Figure 5. Lésions ostéolytiques caractéristiques de la MOP...... 17 Figure 6. Aspect histologique du tissu osseux pagétique...... 17 Figure 7. Aspect histologique des ostéoclastes pagétiques...... 18 Figure 8. Apparence radiographique d’un crâne atteint par la MOP...... 21 Figure 9. Scintigraphie osseuse du corps entier chez un patient pagétique...... 21 Figure 10. Déformations osseuses causées par la MOP...... 27 Figure 11. Agents pharmacologiques disponibles ou en développement pour le traitement de l’ostéoporose. 28 Figure 12. Mode de transmission de la MOP...... 35 Figure 13. Chromatogrammes de la découverte de la première mutation germinale associée avec la MOP. . 43 Figure 14. Conservation du résidu proline au cours de l’évolution...... 43 Figure 15. Récapitulatif des mutations du gène SQSTM1 identifiées chez les individus avec la MOP...... 48 Figure 16. Domaines d’interaction de la protéine SQSTM1...... 50 Figure 17. Rôle de la protéine SQSTM1/p62 dans la voie de signalisation du RANK/NF- κB...... 51 Figure 18. Processus de macroautophagie...... 52 Figure 19. Schéma pathogénique de la MOP...... 59 Figure 20. Structure de l’ADN...... 62 Figure 21. Principales classes de variants génétiques chez l’humain...... 64 Figure 22. Principe du séquençage par la méthode Sanger...... 67 Figure 23. Principe de la méthode TaqMan...... 68 Figure 24. Principe de la plateforme Sequenom MassARRAY iPLEX...... 69 Figure 25. Structure du collagène de type 1...... 75 Figure 26. Principe de la méthode ELISA...... 77 Figure 27. Modèle de l’ACCE pour l’évaluation des tests biologiques...... 78 Figure 28. Représentation graphique d’une courbe ROC...... 82 Figure 29. LNA PCR-clamping method for the GNAS/R201L mutation in patients with fibrous dysplasia (FD)...... 96 Figure 30. Sequencing analysis with and without the use of the LNA PCR-clamping method in patients with fibrous dysplasia (FD)...... 97

xiii Figure 31. Optimization of the LNA PCR-clamping method for the SQSTM1/P392L mutation in patients with Paget's disease of bone (PDB)...... 99 Figure 32. Sequencing analysis with and without the utilisation of the LNA PCR-clamping method in patients with Paget’s disease of bone (PDB)...... 100 Figure 33. Sequencing analysis with and without the use of LNA PCR-clamping method in DNA from monocytes, lymphocytes and saliva in patients with Paget’s disease of bone (PDB)...... 107 Figure 34. X-ray of the pelvis of a patient carrier of the SQSTM1/P392L post-zygotic mutation...... 108 Figure 35. Histology of the transiliac bone biopsy of a patient carrier of the SQSTM1/P392L post-zygotic mutation...... 109 Figure 36. Area under the receiver operating characteristic (ROC) curve (AUC) calculations for the most significant biomarker combinations developed in this study...... 134 Figure 37. Molecular tests proposed for the detection of PDB developed in this study...... 147 Figure 38. Présence d’un spectre mutationnel dans la MOP...... 161

xiv

Liste des abréviations

ACCE: validité analytique, validité clinique, utilité clinique et enjeux éthiques, légaux et sociaux / analytic validity, clinical validity, clinical utility, ethical, legal and social implications ALFY: autophagy-linked FYVE protein ALP: alkaline phosphatase AMPc: adénosine monophosphate cyclique ADN: acide désoxyribonucléique ARN: acide ribonucléique ARNm: acide ribonucléique messager ATP: adénosine triphosphate AUC: aire sous la courbe ROC / area under the ROC curve CASR: récepteur sensible au calcium / calcium sensing receptor CNV: variation du nombre de copies / copy number variation CSF1: colony-stimulating factor 1 CTHRC1: collagen triple helix repeat containing 1 CTX: télopeptide caboxy-terminal du collagène de type 1 / carboxy-terminal collagen crosslinks DC-STAMP: dendritic cell-specific transmembrane protein ddNTP: didésoxyribonucléotide DFO: dysplasie fibreuse des os DKK1: dickkopf-1 dNTP: désoxynucléotide DPD: désoxypyridinoline ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay EPS8L3 : epidermal growth factor receptor kinase substrate 8-like protein 3 ESR1: récepteur de l’estrogène 1 / estrogen receptor 1 FD: fibrous dysplasia FN: faux négatif FP: faux positif GGT: gamma glutamyl-transférase GNAS: guanine nucleotide-binding protein alpha-stimulating activity GSTM4: glutathione S-transferase mu 4 GWAS: étude pangénomique d’association / genome-wide association study HER2: human epidermal growth factor 2

xv HES: hyperphosphatasémie expansive du squelette HRM: méthode de fusion à haute résolution / high resolution melt hsCRP: protéine C-réactive à haute sensibilité / high-sensitivity C-reactive protein IBMPFD: syndrome comportant une MOP à début précoce et/ou une démence fronto-temporale et/ou une myopathie à inclusions / inclusion body myopathy with early-onset Paget’s disease of bone and frontotemporal dementia IκB: inhibiteur de κB IκκB: inhibiteur de la kinase κB β IL-6: interleukine-6 KEAP1: kelch-like ECH-associated protein 1 LNA: acide nucléique bloqué / locked nucleic acid MOP: maladie osseuse de Paget MVNP: protéine de la nucléocapside du virus de la rougeole / measles virus nucleocapsid protein NF-KB: nuclear factor-kappa B NTX: télopeptide amino-terminal du collagène de type 1 / amino-terminal collagen crosslinks NUP205: nucléoporine 205 OEF: ostéolyse expansive familiale OPG: ostéoprotégérine OPTN: optineurine P1CP: propeptide carboxy-terminal du procollagène de type 1 / procollagen type 1 carboxy-terminal propeptide P1NP: propeptide amino-terminal du procollagène de type 1 / procollagen type 1 amino-terminal propeptide PAL: phosphatase alcaline PCR: réaction en chaîne par polymérase / polymerase chain reaction PDB: Paget’s disease of bone PIGN: phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class N PKC: protéine kinase C PML: promyelocytic leukemia protein PNA: acide nucléique peptidique / peptide nucleic acid PTH: parathormone PYD: pyridinoline RANK: receptor activator of nuclear factor kappa-B RANKL: receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand RFLP: polymorphisme de longueur des fragments de restriction / restriction fragment length polymorphism RIN3: ras and rab interactor 3 ROC: receiver operating characteristic

xvi

RPL17P14: ribosomal protein L17 pseudogene 14 RT-PCR: réaction en chaîne par polymérase à transcriptase inverse / reverse transcription polymerase chain reaction SAP: shrimp alkaline phosphatase SLA: sclérose latérale amyotrophique SNP: polymorphisme de nucléotide simple / single nucleotide polymorphism SQSTM1: sequestosome 1 TM7SF4: transmembrane 7 superfamily member 4 TNFα: facteur de nécrose tumorale alpha / tumor necrosis factor alpha TPA: tripropylamine TRACP: phosphatase acide résistante au tartrate TRAF6: TNF receptor-associated factor 6 TRAP: tartrate-resistant acid phosphatase UBA: domaine de liaison à l’ubiquitine / ubiquitin-associated domain UCMA/GRP: upper zone of growth plate and cartilage matrix associated/Gla-rich protein VCP: valosin-containing protein VN: vrai négatif VP: vrai positif VPN: valeur prédictive négative VPP: valeur prédictive positive

xvii

À ma famille, pour votre soutien constant au cours de toutes ces années

xix

Remerciements

En premier lieu, j’aimerais remercier ma directrice de thèse, Dre Laëtitia Michou, pour m’avoir donné l’opportunité de faire un doctorat dans son laboratoire. Ces quatre années passées à travailler sous ta supervision m’ont grandement fait progresser, tant au niveau personnel que professionnel. Les mots me manquent pour décrire toute l’admiration que je te porte. Ta grande écoute, ta disponibilité et ta façon de prioriser à tout prix tes étudiants furent grandement appréciés, et font de toi une superviseure exceptionnelle. J’aimerais également te remercier pour toutes les opportunités que tu m’as offertes, que ce soit lors de la participation à des congrès internationaux ou pour la rédaction de manuscrits, qui ont grandement fait progresser mes connaissances. Je me considère très privilégiée d’avoir travaillé à tes côtés, et je n’aurais pas pu espérer meilleure formation pour faire mon entrée sur le marché du travail.

Je remercie Dr Brown et Dr Morissette, fondateurs du laboratoire, pour les précieux conseils qu’ils m’ont fourni tout au long de la réalisation de mon projet de doctorat. De plus, j’aimerais remercier tous les coauteurs des articles scientifiques auxquels j’ai contribué pendant mes études doctorales. Sans vous, la réalisation de ces travaux n’aurait pu être possible.

Également, je remercie les jurys qui ont accepté de lire cette thèse ainsi que pour leurs précieux commentaires. J’aimerais également remercier le Réseau en santé buccodentaire et osseuse pour le soutien financier au cours de mes études.

J’aimerais remercier Alexandra, Claudia, Davy, Edith, Iris, Julie, Mariejka et Nathalie, sans qui ces dernières années n’auraient sans doute pas été aussi agréables. Je m’estime des plus chanceuse de vous avoir côtoyées et d’avoir développé de si belles amitiés. Merci pour tous ces moments passés, pour ces discussions personnelles et parfois professionnelles! Votre présence va grandement me manquer. J’aimerais adresser un merci spécial à Edith et Julie. Edith, merci mille fois pour toute l’aide que tu m’as apportée au laboratoire, et pour tous les problèmes que tu as si bien su résoudre. Tu es sans doute l’élément clé du laboratoire, sur qui on peut toujours compter. Julie, merci pour toutes ces fois où tu m’as simplifié la vie avec des détails d’ordre administratif. Ta présence au sein de l’équipe est indispensable.

À ma famille et mes amis proches, j’aimerais vous remercier pour votre présence, et pour m’avoir aidée chacun à votre façon dans la réalisation de mes projets. Votre présence dans ma vie est d’une valeur inestimable.

xxi Charles, merci pour ton amour, ta patience, ton support et tes encouragements pendant toutes ces années. Également, je te remercie pour ta grande compréhension, et pour toutes ces fois où tu as su me réconforter et m’apaiser dans les périodes de stress intense, comme toi seul sait si bien le faire.

Finalement, j’aimerais remercier mes parents. Papa, maman, merci pour votre soutien incomparable, et pour tous vos encouragements depuis ma plus tendre enfance. Je m’estime très chanceuse d’avoir d’aussi bons parents à mes côtés, sachant que je peux toujours compter sur votre présence pour m’éclairer et m’encourager à persévérer. Merci pour votre grande écoute, même si la plupart du temps mes études semblaient un peu abstraites à vos yeux. Cependant, sachez que vos efforts de compréhension envers ma passion pour la science ont grandement été appréciés. Je vous remercie également pour l’éducation et les belles valeurs que vous m’avez inculquées. Sans vous, je ne serais certainement pas rendue où je suis aujourd’hui. En fait, mes chers parents, j’aimerais vous dire merci pour tout, tout simplement.

xxii

Avant-propos

Au cours de mon doctorat, j’ai eu la chance de côtoyer des chercheurs et des étudiants hors pairs qui ont donné lieu à la publication de cinq articles scientifiques auxquels j’ai eu la chance de collaborer, et un qui a été récemment soumis dans la revue scientifique Bone. Ainsi, cette thèse est présentée avec insertions de deux articles pour lesquels je suis première auteure.

Le premier article, composant le Chapitre 1 de ma thèse et intitulé « Detection of SQSTM1/P392L post-zygotic mutation in Paget’s disease of bone », a été publié en janvier 2015 dans la revue scientifique Human Genetics. En tant que première auteure, j’ai planifié et réalisé toutes les étapes de ce projet, en plus d’assurer la rédaction du manuscrit. Sylvain Picard était chargé d’effectuer toutes les étapes expérimentales pour préparer la biopsie osseuse, ainsi que pour effectuer la microdissection au laser en vue d’extraire l’ADN des ostéoclastes. Edith Gagnon, en tant que principale assistante de recherche, a contribué à la planification expérimentale du projet. Jean Morissette, en tant que pionnier du laboratoire, a permis de mettre en place la banque d’ADN utilisée pour effectuer ce projet. Ethel S. Siris et Philippe Orcel sont des collaborateurs de longue date du laboratoire, qui nous ont fourni des échantillons d’ADN de patients atteints de MOP provenant de différentes populations (France et États-Unis, respectivement). Jacques P. Brown, en tant que chercheur rhumatologue, a contribué à la caractérisation clinique de chacun des patients inclus dans cette étude. Finalement, Laëtitia Michou, en tant que superviseure de la thèse, a contribué à la planification expérimentale et à la révision du manuscrit.

Le second article, composant le Chapitre 2 de ma thèse et intitulé « Development of a Molecular Test of Paget’s Disease of Bone », a récemment été soumis dans la revue scientifique Bone. En tant que première auteure, j’ai planifié et réalisé toutes les étapes de ce projet, en plus d’assurer la rédaction du manuscrit. David Simonyan et Alexandre Bureau, en tant que biostatisticiens, ont été d’une précieuse aide pour réaliser les analyses statistiques de ce projet. Edith Gagnon a contribué à la planification expérimentale du projet, ainsi qu’au génotypage des différents marqueurs génétiques. Caroline Albert, en tant que collaboratrice, a effectué les dosages sériques de la plupart des marqueurs biochimiques inclus dans l’étude. Jean Morissette, en tant que pionnier du laboratoire, a permis de mettre en place la banque d’ADN utilisée pour effectuer ce projet. Ethel S. Siris et Philippe Orcel sont des collaborateurs de longue date du laboratoire, qui nous ont fourni des échantillons d’ADN de patients atteints de MOP provenant de différentes populations (France et États-Unis, respectivement). Jacques P. Brown, en tant que chercheur rhumatologue, a contribué à la caractérisation clinique de chacun des patients inclus dans cette étude. Finalement, Laëtitia Michou, en tant que superviseure de la thèse, a contribué à la planification expérimentale et à la révision du manuscrit.

xxiii Lors de mon doctorat, j’ai contribué aux publications scientifiques suivantes :

Guay-Bélanger, S. et Michou, L. (2013) «Génétique et physiopathologie de la maladie de Paget.» Réalités en rhumatologie vol 53 Avril/Mai : 1-5.

Beauregard, M., Gagnon, E., Guay-Bélanger, S., Siris E. S., Morissette, J., Brown J. P., Michou, L. (2013) «Genetic association study of Dikkopf-1 and sclerostin genes with paget’s disease of bone.» Calcif Tissue Int 93(5): 405-12.

Beauregard, M., Gagnon, E., Guay-Bélanger, S., Morissette, J., Brown J. P., Michou, L. (2014) «Identification of rare genetic variants in novel loci associated with Paget’s disease of bone.» Hum Genet 133(6): 755-68.

Guay-Bélanger, S., Picard, S., Gagnon, E., Morissette, J., Siris E. S., Orcel, P., Brown J. P., Michou, L. (2015) «Detection of SQSTM1/P392L post-zygotic mutations in Paget’s disease of bone.» Hum Genet 134(1): 53-65.

Guay-Bélanger, S., Cormier, J. G., Michou L. (2015) «La maladie osseuse de Paget, une condition évanescente?» Revue du Rhumatisme 82(4) : 223-29.

xxiv

Introduction

1. Épidémiologie de la maladie osseuse de Paget La maladie osseuse de Paget (MOP) est une affection à révélation tardive qui est rarement diagnostiquée avant la cinquantaine, et qui possède une légère prépondérance masculine. Elle est caractérisée par un remodelage osseux anormal d’un ou plusieurs os, dû à une augmentation de la résorption osseuse, suivie d’une formation osseuse excessive et désorganisée. Elle demeure actuellement la seconde maladie osseuse métabolique la plus fréquente après l’ostéoporose, affectant jusqu’à 3% de la population caucasienne après l’âge de 55 ans (Michou and Brown 2011). Cette prévalence augmente avec l’âge, pour atteindre jusqu’à 10% après 80 ans (Siris, Ottman et al. 1991). La MOP a été décrite pour la première fois par Sir James Paget en 1877, lorsqu’il détailla l’histoire médicale complète d’un patient qu’il suivit pendant plus de 20 ans, chez qui il observa une forme chronique d’inflammation, résultant en des déformations osseuses progressives (Paget 1877). À l’époque, il proposa le nom d’« osteitis deformans » pour ce phénotype, qui fut par la suite appelé Paget’s disease of Bone. Cependant, des analyses de squelettes excavés de sites archéologiques suggèrent que la MOP est apparue il y a environ 2 000 ans en Europe de l’Ouest, la majorité des cas ayant été découverts en Angleterre, et s’est répandue par la suite lors de la migration des européens vers d’autres pays (Mays 2010). Par ailleurs, l’Angleterre a connu par le passé une très forte prévalence de MOP. En effet, des études épidémiologiques effectuées à la fin des années 1970 dans 31 villes britanniques ont montré une prévalence de MOP globale ajustée pour l’âge et le sexe de 5% (Barker, Clough et al. 1977, Barker, Chamberlain et al. 1980). De plus, des prévalences au-delà de 6% ont été observées dans six villes anglaises situées dans la région du Lancashire (Barker, Chamberlain et al. 1980). L’Australie et la Nouvelle-Zélande, deux pays colonisés principalement par des britanniques, sont également connues pour avoir eu vers la fin des années 1970 des prévalences élevées de MOP. En effet, la prévalence ajustée pour l’âge et le sexe en Australie était égale à 3,2%, alors que celle en Nouvelle-Zélande était de 4,4% (Gardner, Guyer et al. 1978, Reasbeck, Goulding et al. 1983). À titre de comparaison, des études épidémiologiques effectuées dans différents pays de l’Europe de l’Ouest ont montré que la prévalence de la MOP variait à cette époque entre 0,4% et 2,7% (Detheridge, Guyer et al. 1982). Ainsi, la MOP a été par le passé une maladie très fréquente dans certaines régions du globe. Au cours des dernières décennies, plusieurs études ont rapporté une diminution de cette prévalence conduisant au portrait épidémiologique actuel de la MOP.

1 1.1 Incidence actuelle de la maladie osseuse de Paget L’incidence actuelle de la MOP est difficile à évaluer de façon fiable puisque la majorité des patients sont asymptomatiques et que ce diagnostic est souvent une découverte fortuite. Néanmoins, certains pays ont évalué cette incidence, ce qui nous donne un aperçu du portrait épidémiologique de la MOP. En Angleterre, on note clairement une diminution de l’incidence de la MOP entre les années 1990 et 1997, celle-ci passant de 1 à 0,6 cas par 10 000 personnes-année (van Staa, Selby et al. 2002). En Espagne, une augmentation progressive de l’incidence de la MOP a été rapportée entre les années 1986 et 2003 dans la commune de Vitigudino, passant de 1,34 à 2,19 cas par 10 000 personnes-année. Cette augmentation a été suivie par une diminution majeure entre les années 2003 et 2009, l’incidence actuelle étant évaluée à 0,887 cas par 10 000 personnes-année. Cependant, on ne note aucun changement dans la ville de Salamanque, distante de seulement 70 km, l’incidence étant évaluée aux alentours de 0,3 cas par 10 000 personnes-année. Cette tendance particulière à la commune de Vitigudino, peuplée de moins de 3 000 habitants, pourrait être expliquée en partie par une augmentation de l’émigration des personnes de moins de 45 ans vers d’autres régions d’Espagne (Corral-Gudino, Garcia-Aparicio et al. 2013). Une augmentation significative de l’incidence de la MOP dans la ville brésilienne de Recife a été décrite entre les années 2006 et 2009, celle-ci étant maintenant évaluée à 50 cas par 10 000 personnes-année. Cette région du Brésil a connu par le passé une immigration massive d’européens, ce qui pourrait expliquer une incidence aussi élevée de la MOP dans un pays d’Amérique du Sud (Reis, Poncell et al. 2012). Malheureusement, l’incidence n’a jamais été étudiée au Canada, ni au Québec. Par ailleurs, il n’existe actuellement aucune donnée d’incidence de la MOP en Amérique du Nord.

1.2 Prévalence actuelle de la maladie osseuse de Paget Plusieurs études de prévalence de la MOP ont été effectuées, démontrant des variations de prévalence considérables selon les régions géographiques (Tableau 1 et Figure 1). En effet, en plus de l’Angleterre, on retrouve une forte prévalence de la MOP en Australie, Nouvelle-Zélande, Amérique du Nord, Afrique du Sud et au Brésil, qui sont tous des endroits peuplés majoritairement par des européens (Bolland and Cundy 2013). De plus, on note des différences marquées de prévalence dans un même pays, avec au moins quatre foyers de haute prévalence décrits dans la littérature; le comté de Lancashire en Angleterre, les régions espagnoles Vitigudino et Cabrera, ainsi que la région de Campanie en Italie (Figure 1) (Barker, Chamberlain et al. 1980, Morales Piga, Lopez-Abente et al. 1990, Miron-Canelo, Del Pino-Montes et al. 1997, Rendina, Gennari et al. 2006). En revanche, la MOP est rare en Scandinavie, en Inde et en Asie du Sud-Est (Ralston 2008). Néanmoins, la publication récente de quelques séries de cas de MOP semble suggérer que ce diagnostic soit en émergence chez les asiatiques, possiblement en raison d'un meilleur accès aux procédures diagnostiques

ou d'une meilleure connaissance de cette maladie par les cliniciens (Lee, Han et al. 2004, H'Ng M and Ho 2005, Wang, Cheng et al. 2005, Hashimoto, Ohno et al. 2006, Maderazo and Li-Yu 2009, Wu, Tseng et al. 2009, Takigami, Ohara et al. 2010, Sankaran, Naot et al. 2012, Li, Long et al. 2013, Nagano, Yokouchi et al. 2013, Wat, Cheung et al. 2013). De même, on observe l’apparition de cas rapportés de MOP dans d’autres populations non caucasiennes, telles que les arabes et les latinos (Rojas-Villarraga, Patarroyo et al. 2006, Alshaikh, Almanea et al. 2011).

On rapporte dans la littérature une diminution de la prévalence de la MOP au cours des dernières décennies. En effet, un déclin de prévalence de la MOP d’environ 40% a été rapporté dans 10 villes d’Angleterre entre les années 1974 et 1994 (Cooper, Schafheutle et al. 1999). Les plus grandes différences ont été observées dans les villes de Lancaster, Preston et Wigan, toutes situées dans le comté de Lancashire, une région bien connue pour avoir eu une prévalence anormalement élevée de la MOP par le passé (Barker, Chamberlain et al. 1980). Ce déclin de prévalence pourrait entre autre être expliqué par l’afflux d’immigrants en provenance de régions ayant une faible prévalence de MOP, telle que l’Asie, ou par la diminution de l’exposition à certains facteurs environnementaux actuellement mal connus (Cooper, Schafheutle et al. 1999, Ralston 2008). Un déclin de prévalence a également été rapporté dans 8 villes d’Europe : Innsbruck, Malmö, Copenhague, Athènes, La Corogne, Valence, Székesfehérvár et Győr (Poor, Donath et al. 2006). Toutefois, ce déclin de prévalence n’a pas été observé dans les pays du sud de l’Europe, notamment l’Italie et l’Espagne, où celle-ci est demeurée stable (Gennari, Di Stefano et al. 2005, Guanabens, Garrido et al. 2008). La Nouvelle-Zélande, quant-à-elle, rapporte un déclin d’environ 50% sur une période de 20 ans (Cundy 2006). Exceptionnellement, la région de Recife au Brésil a connu une augmentation de la prévalence de la MOP dans les dernières années (Reis, Poncell et al. 2012). Au Canada, une seule étude de prévalence de la MOP a été effectuée, celle-ci étant estimée à 0,1% chez les hommes, et 0,2% chez les femmes (Hanley, Brown et al. 2003). Toutefois, il est important de mentionner que ces données ont été auto-rapportées par les participants, ce qui peut engendrer un biais de sous-estimation de la prévalence de la MOP en raison de la fréquence élevée des formes asymptomatiques de la maladie. En ce qui concerne le Québec, une région dans laquelle des formes familiales et des cas isolés de MOP ont été rapportés, il n’existe actuellement aucune donnée de prévalence.

Récemment, une méta-analyse des changements séculaires de prévalence de la MOP a démontré une diminution significative de cette prévalence dans la dernière décennie (0,64 [0,45; 0,91]) (Figure 2) (Corral- Gudino, Borao-Cengotita-Bengoa et al. 2013). Toutefois, il est important de noter que parmi les neuf régions géographiques étudiées dans cette méta-analyse, seules trois ont connu une diminution de prévalence significative, dont l’Angleterre et la Nouvelle-Zélande. Par ailleurs, près de la moitié des individus inclus dans l’étude étaient originaires de l’Angleterre, ce qui influence probablement de façon importante le résultat global de la méta-analyse. Néanmoins, cette étude reflète bien la tendance observée dans plusieurs pays, mais il

3 faut demeurer prudent quant à la généralisation de ces conclusions, puisque celles-ci ne s’appliquent qu’aux régions précédemment connues pour avoir une forte prévalence de MOP. Ainsi, il serait sans doute plus juste de parler d’harmonisation de la prévalence de la MOP, avec la disparition progressive des foyers de haute prévalence (Guay-Bélanger, Cormier et al. 2015).

Tableau 1. Prévalence de la MOP dans les principaux pays du monde.

Nombre Pays (Ville) Méthode de détection Année Prévalence Référence d’individus (Guyer and 1 355 (noirs) 1,3% (noirs) Afrique du Sud (Johannesburg) Radiographies abdominales* 1988 Chamberlain 1 003 (blancs) 2,4% (blancs) 1988) Angleterre (Cooper, (Bath, Cardiff, Carlisle, Lancaster, Preston, Radiographies abdominales 9 828 1993-1995 2,0% Schafheutle et al. Southampton, Newcastle, Portsmouth 1999) Warrington et Wigan) (Gardner, Guyer et Australie Radiographies abdominales 1 203 1978 3,32% al. 1978) (Poor, Donath et Autriche (Innsbruck) Radiographies abdominales 950 2000-2001 0,2% al. 2006) Radiographies abdominales, (Reis, Poncell et Brésil (Recife) phosphatases alcalines et 7 752 2006-2009 6,8% al. 2012) scintigraphie osseuse 2 884 Canada (hommes) 0,1% (hommes) (Hanley, Brown et Questionnaire aux participants 1995-2003 (étude Camos) 6 539 0,2% (femmes) al. 2003) (femmes)

5 Nombre Pays (Ville) Méthode de détection Année Prévalence Référence d’individus (Poor, Donath et Danemark (Copenhague) Radiographies abdominales 950 2000-2001 0,3% al. 2006) (Guanabens, Espagne (Andalousie) Radiographies abdominales 714 2006-2007 0,14% Garrido et al. 2008) (Guanabens, Espagne (Iles Canaries) Radiographies abdominales 433 2006-2007 1,62% Garrido et al. 2008) (Guanabens, Espagne Radiographies abdominales 422 2006-2007 2,37% Garrido et al. (Castille-La Manche/ Castille-Léon) 2008) (Guanabens, Espagne (Catalogne) Radiographies abdominales 855 2006-2007 0,47% Garrido et al. 2008) (Guanabens, Espagne (Communauté valencienne) Radiographies abdominales 721 2006-2007 0,83% Garrido et al. 2008) (Guanabens, Espagne (Galice) Radiographies abdominales 700 2006-2007 1,0% Garrido et al. 2008)

Nombre Pays (Ville) Méthode de détection Année Prévalence Référence d’individus (Guanabens, Espagne (Madrid) Radiographies abdominales 683 2006-2007 1,32% Garrido et al. 2008) (Poor, Donath et Espagne (La Corogne) Radiographies abdominales 715 2000-2001 0,4% al. 2006) (Poor, Donath et Espagne (Valence) Radiographies abdominales 872 2000-2001 0,5% al. 2006) (Guyer and 1 111 (noirs) 1,2% (noirs) États-Unis (Atlanta) Radiographies abdominales 1980 Chamberlain 1 563 (blancs) 0,9% (blancs) 1980) (Guyer and 950 (noirs) 2,6% (noirs) États-Unis (New-York) Radiographies abdominales 1980 Chamberlain 1 082 (blancs) 3,9% (blancs) 1980) (Poor, Donath et Grèce (Athènes) Radiographies abdominales 912 2000-2001 0,3% al. 2006) (Poor, Donath et Hongrie (Gyor) Radiographies abdominales 834 2000-2001 0,5% al. 2006) (Poor, Donath et Hongrie (Székesfehérvar) Radiographies abdominales 812 2000-2001 0,5% al. 2006)

(Detheridge, Irlande (Dublin) Radiographies abdominales 938 1982 1,7% Barker et al. 1983)

7 Nombre Pays (Ville) Méthode de détection Année Prévalence Référence d’individus (Detheridge, Irlande (Galway) Radiographies abdominales 714 1982 0,7% Barker et al. 1983) (Gennari, Di Italie (Sienne) Radiographies abdominales 1 778 1999-2000 0,98-1,48% Stefano et al. 2005) (Gennari, Di Italie (Sienne) Phosphatases alcalines 7 449 2000-2003 1,75% Stefano et al. 2005) (Gennari, Di Italie (Sienne) Scintigraphie osseuse 7 906 2000-2004 2,45% Stefano et al. 2005) 1986-1987, (Gennari, Di Italie (Turin) Radiographies abdominales 6 609 1992-1993 et 0,69-1,03% Stefano et al. 1999-2002 2005) Revue de littérature et (Hashimoto, Ohno Japon (global) questionnaires envoyés dans les 126 008 000 2002-2003 2,8/1 000 000 et al. 2006) hôpitaux (Bastin, Bird et al. Nouvelle-Zélande (Auckland) Radiographies abdominales 3 350 2005-2006 2,6% 2009) Phosphatases alcalines et (Eekhoff, van der Pays-Bas (Rotterdam) 548 1990-1993 3,6% confirmation radiographique Klift et al. 2004)

Nombre Pays (Ville) Méthode de détection Année Prévalence Référence d’individus (Poor, Donath et Suède (Malmö) Radiographies abdominales 890 2000-2001 0,3% al. 2006) * Les radiographies abdominales incluent le bassin, le sacrum, les têtes fémorales et les vertèbres lombaires.

Figure 1. Prévalence de la MOP dans le monde. Il existe des différences considérables dans la prévalence de la MOP entre les différents pays, et parfois au sein d'un même pays, avec l’identification de quatre foyers de haute prévalence de MOP matérialisés par une étoile sur la figure. Figure tirée de (Corral-Gudino, Borao-Cengotita-Bengoa et al. 2013).

Figure 2. Résultats de la méta-analyse des changements séculaires de prévalence de la MOP. Cette méta-analyse inclut les données de prévalence de neuf régions géographiques, et démontre une diminution significative de la prévalence de la MOP au cours de la dernière décennie. Figure tirée de (Corral- Gudino, Borao-Cengotita-Bengoa et al. 2013).

1.3 Rôle des facteurs environnementaux dans la maladie osseuse de Paget La diminution de l’incidence et de la prévalence de la MOP au cours des dernières décennies suggèrent que des facteurs non génétiques pourraient être impliqués dans la physiopathologie de la maladie. En effet, ces observations épidémiologiques pourraient être compatibles avec des changements dans notre mode de vie ou des modifications d’expositions environnementales. Les principaux facteurs environnementaux issus des études épidémiologiques qui ont été associés avec la MOP sont illustrés dans le Tableau 2. Le contact avec des animaux domestiques, tels que le chien et le bétail, est souvent mentionné dans la littérature, mais cela demeure un sujet controversé (Siris, Kelsey et al. 1990, Lopez-Abente, Morales-Piga et al. 1997). Cependant, il est intéressant de constater qu’aucune MOP n’a été diagnostiquée sur les squelettes datant de la période antérieure à la domestication du chien, connu pour avoir initialement transmis à l’homme certaines zoonoses (Roberts and Manchester 2005). De plus, les expositions à la fumée provenant de la cigarette ou de la combustion du bois de chauffage ont été associées avec la MOP (Michou, Collet et al. 2012, Audet, Beaudoin et al. 2013). L’exposition à certains facteurs environnementaux peut également expliquer en partie les différences épidémiologiques majeures observées entre les régions géographiques. Ainsi, la prévalence élevée observée dans la région du Lancashire pourrait être liée à la présence d’usines de traitement du coton qui utilisaient de l’arsenic, pour ensuite le rejeter dans l’eau des rivières approvisionnant les résidents de la région (Lever 2002). De plus, la prévalence élevée de MOP en Campanie a été associée avec un mode de vie rural, plus particulièrement avec la consommation de lait non pasteurisé et de viande n’ayant pas subi de contrôle sanitaire (Rendina, Gennari et al. 2006).

11 Tableau 2. Principaux facteurs environnementaux associés à la MOP lors d’études épidémiologiques.

Nombre Odds ratio Facteur environnemental Population Année Référence d’individus [IC 95%] 3,37 (Michou, Collet et al. Consommation de tabac Française 83 2011 [1,04-11,09] 2012) 2,48 (Audet, Beaudoin et al. Chauffage au bois pendant l’enfance Canadienne-française 361 2013 [1,37-4,49] 2013) 2,22 (Merlotti, Gennari et al. Contact avec des animaux de la ferme Italienne 470 2005 [1,49-3,30] 2005) 1,78 (Merlotti, Gennari et al. Contact avec des lapins Italienne 470 2005 [1,15-2,74] 2005) 2,44 (Merlotti, Gennari et al. Contact avec des cochons Italienne 470 2005 [1,43-4,15] 2005)

1,68 (Merlotti, Gennari et al. Contact avec le bétail Italienne 470 2005 [1,03-2,73] 2005) 2,14 (Lopez-Abente, Morales- Contact avec des vaches Espagnole 299 1996 [1,16-2,94] Piga et al. 1997) 1,77 (Lopez-Abente, Morales- Consommation de cervelle de bovin Espagnole 299 1996 [1,05-2,98] Piga et al. 1997) 1,58 Contact avec des chiens entre l’âge de 40 et 49 ans Américaine (USA) 866 1990 (Siris, Kelsey et al. 1990) [1,09-2,29]

2. Aspects cliniques de la maladie osseuse de Paget

2.1 Physiopathologie de la maladie osseuse de Paget

2.1.1 Tissu osseux normal Les os qui forment le squelette possèdent plusieurs fonctions vitales pour l’être humain; ils fournissent un soutien et un site d’attachement pour les muscles afin de permettre le mouvement du corps, protègent les organes vitaux, fournissent un environnement adéquat pour l’hématopoïèse, servent de réservoir pour divers facteurs de croissance et cytokines, en plus de participer au maintien de l’homéostasie minérale (Clarke 2008). Morphologiquement, il existe deux types d’os, qui diffèrent tant au niveau structurel que métabolique. L’os compact constitue environ 80% de la masse totale osseuse chez l’humain. Il compose la partie externe de l’os, possède un faible taux de remodelage osseux, et est très dense et compact, ce qui lui confère une très grande résistance aux flexions et torsions. Il assume notamment des fonctions de force mécanique et de protection (Hadjidakis and Androulakis 2006). Il est formé de plusieurs lamelles constituées de fibres de collagène parallèles qui sont arrangées de façon concentrique autour d’un canal vasculaire. Ces unités structurales sont nommées ostéons, ou système de Harvers, et permettent aux os d’être un excellent support mécanique (Shea and Miller 2005). L’os trabéculaire participe à la résistance mécanique, mais se charge surtout des fonctions métaboliques. Par ailleurs, il constitue le site majeur du remodelage osseux, et est le site d’initiation de la plupart des maladies osseuses métaboliques (Feng and McDonald 2011). Il est composé d’un réseau de travées osseuses interconnectées avec des espaces occupés par la moelle osseuse, et possède une structure dite lamellaire (Shea and Miller 2005).

Le tissu osseux est un organe dynamique qui est constamment en renouvellement. Le remodelage osseux, un processus par lequel les sites osseux les plus anciens sont résorbés et remplacés par de nouveaux, est d’une importance capitale puisqu’il permet aux os de conserver leur intégrité mécanique, de réparer les fractures et les micro-fractures, en plus de maintenir l’homéostasie minérale dans l’organisme (Compston 2001). Le remodelage osseux s’effectue à l’aide de cellules osseuses spécifiques; les ostéoclastes, les ostéoblastes et les ostéocytes (Figure 3). Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées d’origine hématopoïétique, et proviennent donc de la même lignée cellulaire que les monocytes/macrophages. Leur formation résulte de la fusion cellulaire de plusieurs précurseurs mononucléés (Vaananen and Laitala-Leinonen 2008). La principale fonction des ostéoclastes est d’effectuer la résorption osseuse. En effet, ceux-ci adhèrent à la matrice osseuse et forment un compartiment étanche dans lequel plusieurs ions et enzymes sont sécrétés afin de dégrader la matrice osseuse sous-jacente (Henriksen, Bollerslev et al. 2011). La différenciation et l’activité des ostéoclastes sont principalement régulées par la voie de signalisation du Nucleor Factor kappa B (NF-κB). C’est la liaison entre le Receptor Activator of NF-κB Ligand (RANKL), sécrété par les ostéoblastes et les

13 ostéocytes, et son récepteur, le Receptor Activator of NF-κB (RANK), situé à la surface des précurseurs ostéoclastiques, qui permettra l’activation de cette voie de signalisation. L’ostéoprotégérine (OPG), un récepteur leurre sécrété par les ostéoblastes, est également d’une importance capitale. En effet, celle-ci inhibe l’interaction entre RANKL et RANK, régulant ainsi négativement l’ostéoclastogénèse (Figure 4) (Athanasou 2011). Les ostéoblastes proviennent des cellules souches mésenchymateuses qui ont également la capacité de se différencier en adipocytes, chondrocytes, myoblastes ou en fibroblastes (Neve, Corrado et al. 2011). De plus, la différenciation des ostéoblastes se fait principalement via la voie de signalisation Wnt (Eriksen 2010). La fonction principale de ces cellules est la formation osseuse, via la synthèse de protéines de la matrice osseuse incluant le collagène de type I, et est également responsable de la minéralisation de cette matrice (Katagiri and Takahashi 2002). Les ostéocytes sont des cellules dérivées des ostéoblastes qui sont trappées dans la matrice osseuse minéralisée. Ce sont les cellules osseuses les plus abondantes, représentant environ 90% des cellules osseuses totales (Bellido 2014). Elles ont une morphologie en forme d’étoile et possèdent des prolongements dendritiques qui forment une architecture cellulaire particulière, leur permettant ainsi de communiquer entre elles et avec les cellules localisées à la surface de l’os (Sapir-Koren and Livshits 2014). Les ostéocytes sont actuellement les cellules osseuses les moins bien caractérisées. Néanmoins, plusieurs fonctions leur sont attribuées, telles que la régulation du remodelage osseux et le maintien de l’homéostasie minérale, en plus d’être considérés comme des cellules mécano-sensorielles ayant l’habilité de détecter les contraintes mécaniques apposées sur l’os (Bonewald 2011).

Lors du remodelage osseux, les précurseurs ostéoclastiques sont recrutés à la surface osseuse, puis une fois activés, fusionnent pour former des ostéoclastes matures. Ces derniers effectuent ensuite la résorption de l’os sous-jacent. Puis, les précurseurs des ostéoblastes sont recrutés et activés afin de se différencier en ostéoblastes matures. Ces derniers enclenchent alors le processus de formation et synthétisent une nouvelle matrice osseuse dans les lacunes de résorption. Cette matrice d'os ostéoïde sera ensuite minéralisée (Datta, Ng et al. 2008). Le couplage entre les processus de résorption et de formation osseuse est finement régulé afin de conserver l’intégrité de la masse osseuse. Néanmoins, un découplage entre la résorption et la formation osseuse peut survenir, causant ainsi un remodelage osseux anormal et le développement possible d’une pathologie osseuse (Feng and McDonald 2011).

Figure 3. Cellules osseuses en action lors du remodelage osseux. Le remodelage osseux requiert la présence des ostéoclastes, ostéoblastes et ostéocytes. Les ostéoclastes résorbent l’os, et font place aux ostéoblastes qui forment et minéralisent la nouvelle matrice osseuse. Figure tirée de (Kapinas and Delany 2011).

Figure 4. Système RANK/RANKL/OPG dans l’ostéoclastogénèse. Le RANKL, sécrété par les ostéoblastes et les ostéocytes (non représentés ici), se lie à son récepteur RANK à la surface des précurseurs ostéoclastiques pour activer l’ostéoclastogénèse. L’OPG est un récepteur leurre du RANKL qui, en liant ce dernier, inhibe l’ostéoclastogénèse. Figure adaptée de (Ralston, Langston et al. 2008).

15 2.1.2 Tissu osseux pagétique La MOP se caractérise par un excès de remodelage osseux affectant un ou plusieurs os. La phase initiale de la pathologie est caractérisée par une augmentation de la résorption osseuse, causée par des ostéoclastes plus nombreux et de plus grande taille, créant ainsi des lésions ostéolytiques. Par ailleurs, on peut facilement observer l’évolution de ces lésions sur les radiographies des os atteints (Figure 5) (Cundy and Bolland 2008). La seconde phase de la maladie est caractérisée par une augmentation subséquente de la formation osseuse causée par une activité compensatoire des ostéoblastes (en raison du couplage existant entre les ostéoclastes et les ostéoblastes), présents en grand nombre dans les lésions pagétiques. La matrice osseuse rapidement synthétisée est désorganisée et se présente sous la forme d’un os tissé qui est plus susceptible aux déformations et aux fractures qu’un os lamellaire. La moelle osseuse est par la suite infiltrée par des tissus fibreux et vasculaires, causant une hypertrophie de l’os atteint (Figure 6). Les lésions deviennent alors sclérotiques, sans apparence de remodelage osseux actif (Siris and Roodman 2013).

Histologiquement, les ostéoclastes sont les premières cellules affectées dans la MOP. Ceux-ci ont un phénotype cellulaire pagétique typique qui permet de les distinguer des ostéoclastes normaux. En effet, les ostéoclastes pagétiques sont plus nombreux, de grande taille, peuvent contenir jusqu’à 100 noyaux par cellule, et ont des inclusions nucléaires et cytoplasmiques provenant possiblement de virus de la famille des Paramyxovirus (Figure 7) (Roodman and Windle 2005). De plus, ils sécrètent des niveaux élevés d’interleukine-6 (IL-6), détectables dans la moelle osseuse et le sang périphérique des patients avec la MOP (Roodman, Kurihara et al. 1992). Ils sont également plus résistants à l’apoptose, ces derniers possédant une régulation à la baisse de certains gènes impliqués dans ce processus (Chamoux, Couture et al. 2009, Michou, Chamoux et al. 2010). De plus, leurs précurseurs sont hypersensibles à certains facteurs ostéoclastogéniques tels que le RANKL et la 1,25(OH)2 vitamine D3, formant des ostéoclastes à des concentrations beaucoup moins élevées que celles normalement requises (Kukita, Chenu et al. 1990, Menaa, Reddy et al. 2000).

L’hypersensibilité à la 1,25(OH)2 vitamine D3 est due à une augmentation de l’expression de TAFII-17, maintenant nommé TAF12, une protéine liant les récepteurs de la vitamine D, dans les ostéoclastes pagétiques (Kurihara, Reddy et al. 2004). Les ostéoblastes pagétiques comportent également certaines anomalies. En effet, ceux-ci sur-expriment des gènes codant pour des cytokines ostéoclastogéniques, telles que l’IL-6, IL-1β, Dickkopf-1 (DKK1) et RANKL, ce qui pourrait contribuer au remodelage osseux excessif observé dans la MOP (Menaa, Reddy et al. 2000, Naot, Bava et al. 2007).

Figure 5. Lésions ostéolytiques caractéristiques de la MOP. La progression des lésions ostéolytiques dans la MOP débutante est parfois observable sur des radiographies standards. On remarque en effet le « V de progression » caractéristique de la maladie. Figure adaptée de (Cundy and Bolland 2008).

Figure 6. Aspect histologique du tissu osseux pagétique. Dans les lésions osseuses pagétiques, on note la présence d’ostéoclastes multinucléés et de plus grande taille qui résorbent la matrice osseuse, représentée ici en rose foncé. Les ostéoblastes sont également présents en grand nombre pour effectuer la formation osseuse, qui est désorganisée. La moelle osseuse est également infiltrée par du tissu fibreux, représenté ici par les filaments roses pâles. Figure tirée de (Bullough 2010).

Figure 7. Aspect histologique des ostéoclastes pagétiques. Les ostéoclastes pagétiques sont de plus grande taille que les ostéoclastes normaux, et peuvent contenir jusqu’à 100 noyaux. De plus, des inclusions nucléaires et cytoplasmiques qui proviennent possiblement de virus de la famille des Paramyxovirus ont été observées dans ces cellules. Figure tirée de (Roodman and Windle 2005).

2.2 Présentation clinique de la maladie osseuse de Paget

2.2.1 Symptômes Dans la majorité des cas, la MOP est asymptomatique. En effet, seuls 30 à 40% des patients sont symptomatiques au moment du diagnostic. Cependant, la proportion totale de formes symptomatiques est probablement plus faible étant donné que de nombreux cas de MOP ne seront jamais diagnostiqués (Ralston 2013). Par ailleurs, une étude anglaise récente suggère que seulement 16% des patients atteints de MOP consultent un professionnel de la santé (Tan and Ralston 2014). Le symptôme le plus fréquent est la présence de douleurs osseuses qui, selon une revue systématique, serait présente chez environ 50% des patients pagétiques (Tan and Ralston 2014). Ces douleurs osseuses sont généralement très localisées et permanentes, même quand le patient est au repos, et peuvent être exacerbées la nuit ou lors de l’apposition d’une charge sur l’os atteint. Des douleurs osseuses peuvent également être causées par des complications associées à la MOP, telles que les fractures ou l’arthrose secondaire à la présence d'une lésion pagétique à proximité d'une articulation (Griz, Fontan et al. 2014). De plus, cette maladie peut causer une augmentation de la chaleur cutanée à la surface des os atteints, due à une hypervascularisation des lésions pagétiques, ainsi que des hypertrophies, voire des déformations osseuses (Michou, Collet et al. 2006). Plusieurs autres symptômes sont souvent associés à la MOP, mais ceux-ci résultent davantage des complications qui y sont associées (voir section 2.2.4).

La MOP peut se présenter sous forme monostotique (un seul os atteint), ou polyostotique (plusieurs os atteints), et possède la plupart du temps une distribution asymétrique. De plus, une fois diagnostiquée, la maladie progresse dans les os initialement affectés, sans toutefois s’étendre à d’autres sites adjacents. Les os les plus fréquemment atteints sont le bassin, les fémurs, la colonne vertébrale, le crâne et les tibias. Les humérus, les clavicules, les côtes, les omoplates et les os faciaux sont moins souvent atteints, alors que les os des pieds et des mains sont plus rarement affectés (Siris and Roodman 2013). La maladie se présente sous la forme polyostotique dans environ 60 à 70% des cas (Haddaway, Davie et al. 2007, Wermers, Tiegs et al. 2008, Varenna, Zucchi et al. 2010). Cependant, on rapporte en Nouvelle-Zélande une augmentation de la proportion de patients avec une atteinte monostotique, qui est passée de 24% en 1985-1993 à 36% en 1994- 2002, suggérant une évolution vers une forme moins extensive de la maladie (Cundy, Gamble et al. 2004).

2.2.2 Diagnostic La plupart du temps, le diagnostic de MOP est posé suite à une découverte fortuite. Cela peut être dû à une augmentation des phosphatases alcalines (PAL) totales observées lors d’un bilan de laboratoire de routine, ou à l’observation de changements de la structure osseuse sur un examen d'imagerie médicale réalisé pour d’autres raisons médicales (Ralston, Langston et al. 2008). Lorsqu’une MOP est suspectée, l’évaluation diagnostique devrait inclure l’histoire médicale détaillée du patient, ainsi que son histoire familiale étant donné la forte composante génétique de la MOP. De plus, un examen physique approfondi doit être effectué afin de rechercher la présence possible de symptômes associés à la maladie, ainsi qu’à ses éventuelles complications (Siris and Roodman 2013).

Les tests de laboratoire incluent le dosage de la créatinine, du calcium, de l’albumine, de la 25- hydroxyvitamine D et des PAL totales. La fonction hépatique est également évaluée (gamma glutamyl- transpeptidase (GGT)) afin d’exclure la possibilité que les niveaux élevés de PAL totales soient dus à l’isoforme hépatique des PAL, puisque la mesure spécifique des PAL osseuses demeure difficile à obtenir dans le milieu clinique. En général, les patients pagétiques ont un bilan biochimique normal, à l’exception des PAL totales qui sont souvent élevées. Cependant, les niveaux de PAL peuvent être normaux, notamment chez les patients qui ont une atteinte monostotique ou une maladie métaboliquement peu active, et ne devraient donc pas exclure un diagnostic de MOP (Ralston 2013). Par ailleurs, les PAL totales ont une sensibilité variant entre 69% et 100%, et une spécificité de presque 100% pour le diagnostic de la MOP selon certaines études récentes (Griz, Fontan et al. 2014, Al Nofal, Altayar et al. 2015). Les examens d’imagerie sont les plus fiables pour confirmer le diagnostic de MOP. Le diagnostic positif de la MOP s’effectue sur les radiographies standards des os atteints. En effet, celles-ci démontrent une structure osseuse typique de la MOP, avec la présence de lésions ostéolytiques, sclérotiques, ou un mélange des deux (Lyles, Siris et al. 2001, Selby, Davie et al. 2002). De plus, lorsque le crâne est atteint, ces radiographies montrent parfois un aspect cotonneux

19 typique de la MOP, suggérant une atteinte mixte ostéolytique et sclérotique (Figure 8) (Ferraz-de-Souza and Correa 2013). Bien que les radiographies standards permettent de poser un diagnostic de MOP, elles sont peu utiles pour quantifier l’activité de la maladie puisque l’évolution des lésions pagétiques peut s’avérer très lente. De plus, la scintigraphie osseuse est particulièrement utile pour réaliser le bilan topographique initial de l’extension de la maladie. Il s’agit d’un examen d’imagerie très sensible qui permet de détecter l’augmentation du débit sanguin et de l’activité ostéoblastique caractéristiques de la MOP. En effet, suite à l’injection d’un agent radio-marqué, le plus souvent un bisphosphonate, les zones du squelette qui ont une activité métabolique anormale captent une quantité élevée de radionucléides, l'hyperfixation qui en résulte étant suggestive d'une atteinte pagétique (Figure 9) (Theodorou, Theodorou et al. 2011). Par ailleurs, la scintigraphie osseuse est l’outil de détection de la maladie le plus sensible, identifiant 97-98% des lésions pagétiques, alors que la sensibilité des radiographies se situe aux alentours de 85 à 91% (Laurin, Brown et al. 2001). Néanmoins, des radiographies des os hyperfixants à la scintigraphie osseuse devraient toujours être faites afin de confirmer la présence de lésions pagétiques et surtout de faire le diagnostic différentiel avec d’autres atteintes osseuses telles que des métastases osseuses (Josse, Hanley et al. 2007).

Outre la scintigraphie osseuse, il n’existe que très peu d’outils pour évaluer l’extension de la maladie, attestée par le nombre d’os atteints, chez les patients pagétiques. Cependant, un index anatomique permettant de calculer le pourcentage de tissu osseux atteints par la MOP chez un individu a été développé (Renier, Cronier et al. 1995), et est fréquemment utilisé dans les études de recherche clinique, notamment pour les associations phénotype-génotype. Afin de développer cet index, tous les os du squelette d’un homme de 30 ans en bonne santé ont d’abord été pesés individuellement. Ensuite, des pièces osseuses diverses provenant d’un laboratoire d’anatomie ont été pesées et finalement, une densitométrie minérale osseuse a été effectuée chez plusieurs hommes et femmes. À partir de toutes ces données, des rapports de poids entre les différentes pièces osseuses ont été effectués et le pourcentage de tissu osseux pour chaque os chez les hommes et les femmes a été estimé de façon successive. Par exemple, ces calculs ont permis d’estimer que le pourcentage du crâne chez l’homme est de 9%, alors qu’il est évalué à 11% chez la femme. Ainsi, en additionnant les pourcentages de chaque os atteint chez un individu pagétique, on obtient un score représentatif de l’étendue de la maladie chez cet individu, que l’on nomme Index de Rénier (Renier, Cronier et al. 1995).

Figure 8. Apparence radiographique d’un crâne atteint par la MOP. Lorsque le crâne est atteint depuis plusieurs années, on note la présence de lésions lytiques et sclérotiques diffuses, lui donnant une apparence « cotonneuse ». Figure tirée de la Paget Foundation, www.paget.org.

Figure 9. Scintigraphie osseuse du corps entier chez un patient pagétique. La scintigraphie osseuse est particulièrement utile pour déterminer l’extension de la MOP. L’injection d’un agent radio-marqué permet de visualiser les zones du squelette qui ont une activité métabolique anormale (apparaissant en noir sur la figure), suggérant une atteinte pagétique. Figure tirée de la Paget Foundation, www.paget.org.

2.2.3 Traitement et suivi La première indication pour un traitement dans la MOP est le soulagement des symptômes associés à la maladie. Par ailleurs, la douleur osseuse est le seul symptôme pour lequel il a été démontré qu’un traitement

21 médicamenteux apporte un réel bénéfice clinique au patient (Selby, Davie et al. 2002). Les patients asymptomatiques, mais particulièrement à risque de développer des complications devraient également recevoir un traitement. Ces patients incluent notamment ceux qui ont une MOP dans les os longs, le crâne, la colonne ainsi que dans les os adjacents aux articulations portantes telles que la hanche et le genou. Cependant cela demeure une recommandation controversée, car il n’a pas été prouvé que les médicaments indiqués dans la MOP aient la capacité de prévenir les complications associées avec la maladie (Siris, Lyles et al. 2006). Les patients qui doivent subir une chirurgie à un site pagétique actif peuvent également recevoir un bisphosphonate dans les jours précédant l’intervention pour limiter l'abondance des saignements per- opératoires, dus à l’hypervascularisation de l’os pagétique. Finalement, un traitement médical devrait être considéré chez les patients souffrant d’hypercalcémie, classiquement à la suite d’une immobilisation prolongée (Singer 2009). Les patients qui ont une forme non active de la MOP, qui sont asymptomatiques ou qui ne sont pas à risque de développer des complications ne nécessitent pas d’intervention thérapeutique. Un suivi médical régulier, incluant la mesure des niveaux de PAL totales et des radiographies des os pagétiques, est généralement suffisant (Bolland and Cundy 2013).

Le but principal de la thérapie par bisphosphonates est d’atteindre la rémission, qui se définit par la normalisation des PAL totales. Le traitement vise également à diminuer les douleurs osseuses, normaliser les lésions ostéolytiques et rétablir l’architecture osseuse, en plus de prévenir les récurrences et les complications associées à la maladie (Josse, Hanley et al. 2007). Cependant, il n’existe actuellement aucun traitement pour guérir la maladie. Étant donné que les ostéoclastes sont les premières cellules affectées dans la MOP, la thérapie repose sur l’utilisation d’agents pharmacologiques qui inhibent la résorption osseuse. Le premier agent utilisé était la calcitonine, une hormone peptidique sécrétée par les cellules parafolliculaires de la thyroïde qui, en se liant à son récepteur à la surface des ostéoclastes, inhibe l’activité de ces derniers. Cependant, ce traitement n’est plus utilisé en raison de son efficacité mitigée et ses effets secondaires potentiellement importants (Reid 2012). Actuellement, les bisphosphonates sont les antirésorptifs de choix pour traiter la MOP. Ces agents sont des analogues du pyrophosphate inorganique, et lient les hydroxyapatites qui composent la matrice minérale osseuse, plus particulièrement dans les sites où le remodelage osseux est actif. Lors de la résorption, l’acidification du milieu entraîne la dissociation des bisphosphonates contenus dans la matrice minérale, qui seront par la suite absorbés par les ostéoclastes (Roelofs, Thompson et al. 2006). Il existe deux types de bisphosphonates, qui diffèrent au niveau de leur composition chimique et de leur mécanisme d’action. Les bisphosphonates simples (étidronate, clonodrate et tiludronate) ne contiennent pas de groupement azoté. Lorsqu’ils sont absorbés par les ostéoclastes, ces bisphosphonates sont transformés en analogue toxique de l’adénosine triphosphate (ATP), causant l’apoptose des ostéoclastes et inhibant par le fait même leur activité. Les bisphosphonates qui contiennent un groupement azoté (pamidronate, alendronate, ibandronate, risedronate et acide zolédronique) sont plus

puissants que les précédents. Leur effet antirésorptif provient de leur action directe sur la voie du mévalonate. En effet, ces bisphosphonates inhibent l’enzyme farnésyl-pyrophosphate synthase, empêchant ainsi la prénylation des protéines qui sont cruciales pour la survie et la fonction des ostéoclastes (Rogers, Crockett et al. 2011). Actuellement, il y a quatre bisphosphonates qui sont approuvés pour traiter la MOP au Canada : deux qui s’administrent de façon orale (risedronate et étidronate), et deux de façon intraveineuse (acide zolédronique et pamidronate) (Josse, Hanley et al. 2007). Cependant, l’acide zolédronique représente actuellement le traitement le plus efficace dans la MOP. En effet, une étude a déterminé qu’après 6 mois, une seule perfusion intraveineuse de 5 mg entraîne la normalisation des PAL totales chez 89% des patients, et augmente de façon considérable leur qualité de vie (Reid, Miller et al. 2005). Après un suivi de 6,5 ans, seulement 0,7% de ces patients ont eu une rechute (définie par une ré-augmentation du taux des PAL totales), suggérant une efficacité à long terme pour ce bisphosphonate (Reid, Lyles et al. 2011). De plus, il est généralement très bien toléré, le seul effet secondaire ayant été répertorié est le développement d’une réaction de type Influenza dans les trois jours suivant l’injection chez environ 40% des patients (Pazianas and Abrahamsen 2011). L’autre traitement le plus utilisé au Canada est le risédronate 30 mg die per os pour deux mois consécutifs, pouvant être répété aux six mois si besoin. Ce traitement est parfois source d’effets secondaires gastro-oesophagiens et nécessite souvent d’être répété plusieurs fois lors du suivi. Les autres bisphosphonates ne sont plus régulièrement utilisés dans cette indication.

Le suivi thérapeutique s’effectue en mesurant les niveaux des PAL totales puisqu’elles corrèlent bien avec l’activité de la maladie. Généralement, une diminution de 25% de ces marqueurs biochimiques représente une réponse significative au traitement (Selby 2006). Les PAL totales devraient être mesurées environ tous les 6 mois jusqu’à leur normalisation, et aux 12 mois par la suite (Britton and Walsh 2012). De plus, des radiographies des lésions ostéolytiques devraient être effectuées un an après l’initiation du traitement pour évaluer la progression de la maladie (Singer 2009). Un deuxième traitement peut être offert chez les patients qui ont une rechute, c’est-à-dire lorsque les symptômes de la maladie réapparaissent ou lorsque les PAL totales augmentent à nouveau au-dessus des limites normales ou de plus de 25% par rapport aux taux le plus faible connu pour ce patient, et ce indépendamment des valeurs de référence. Ce deuxième traitement devra cependant être administré au moins six mois après le traitement initial (Selby 2006).

2.2.4 Complications Plusieurs complications sont associées à la MOP, celles-ci variant selon la localisation des sites atteints par la maladie. La présence de déformations osseuses est une complication typique de la MOP, survenant chez environ 20% des patients pagétiques d'après une revue systématique (Tan and Ralston 2014). La courbure des fémurs et des tibias est une caractéristique typique de la maladie (Figure 10). La présence de déformations dans la colonne vertébrale peut mener au développement d’une cyphose, alors qu’une

23 déformation des hanches peut conduire à une protrusion acétabulaire (Theodorou, Theodorou et al. 2011). Le crâne, les mâchoires et les clavicules sont également susceptibles aux déformations osseuses dans la MOP (Lyles, Siris et al. 2001). Les patients pagétiques ayant des déformations osseuses sévères peuvent donc se présenter avec des douleurs réfractaires et des limitations dans leurs mouvements et fonctions (Parvizi, Frankle et al. 2003). Chez ces patients, l’ostéotomie de réalignement semble être un traitement de choix. En effet, il a été démontré que cette intervention permettait de soulager la douleur, d’améliorer les fonctions motrices, ainsi que la satisfaction quant à l’apparence esthétique dans une cohorte de patients (Parvizi, Frankle et al. 2003). Les fractures sont les complications les plus fréquentes associées avec la MOP, survenant chez 10 à 30% des patients (Hadjipavlou, Gaitanis et al. 2002). Celles-ci se produisent le plus souvent dans les fémurs et sont généralement transversales, l’os ressemblant à une craie qui s’est cassée. Les fissures osseuses sont néanmoins plus fréquentes et se produisent généralement à la convexité d’un os courbé (Singer 2009). Cependant, ces dernières sont difficiles à traiter, puisqu’elles ne répondent pas bien au traitement (Ralston, Langston et al. 2008). Des interventions chirurgicales sont donc parfois nécessaires afin de prévenir la progression de ces fissures en fractures complètes (Bone 2006). L’arthrose est également une complication fréquente de la MOP due à la modification de la biomécanique osseuse, l'excès de pression provoquant la dégénérescence de l’os et du cartilage (Griz, Fontan et al. 2014). L’arthrose peut également être secondaire aux expansions et déformations osseuses, qui causent une incongruité du cartilage articulaire (Hadjipavlou, Gaitanis et al. 2002). Les articulations de la hanche et du genou sont les plus souvent atteintes. Les douleurs reliées à l’arthrose ne répondent pas bien au traitement par bisphosphonate, mais peuvent être contrôlées à l’aide d’anti-inflammatoires non stéroïdiens ou d’analgésiques (Griz, Caldas et al. 2006). Néanmoins, une arthroplastie totale de la hanche ou du genou semble être une option thérapeutique efficace chez les patients pagétiques souffrant d’arthrose sévère (Parvizi, Klein et al. 2006). La colonne vertébrale est le deuxième site osseux le plus fréquemment atteint par la MOP, causant souvent des lombalgies et des sténoses spinales secondaires à la présence d’arthrose dans les vertèbres (Hadjipavlou, Gaitanis et al. 2002).

Les complications neurologiques associées avec la MOP résultent de la relation étroite entre le squelette et le système nerveux, et se produisent lorsque le crâne ou la colonne vertébrale sont touchés par la maladie. Ces syndromes neurologiques sont causés par la compression directe des tissus nerveux, ou par une ischémie (Poncelet 1999). Lorsque le crâne est atteint, les patients souffrent fréquemment de maux de tête. Ces derniers sont souvent occipitaux, sévères et aggravés par les éternuements, la toux ou un effort plus prononcé (Gruener and Camacho 2014). La surdité est une complication relativement fréquente associée à la MOP lorsque l’os temporal est atteint (Bone 2006). Selon une revue systématique récente, la surdité serait présente chez environ 9% des patients pagétiques (Tan and Ralston 2014). Plusieurs mécanismes de la perte d’audition dans la MOP ont été suggérés, incluant la compression du nerf auditif, des shunts vasculaires, des écarts aériens osseux causés par la rigidité des tissus de l’oreille moyenne, et plus rarement la prolifération du

tissu fibreux adjacent à l’osselet et des récessus épitympaniques (Monsell 2004). Cette perte auditive peut être stabilisée avec un traitement efficace, mais semble toutefois irréversible (Bone 2006). Lorsque la colonne vertébrale est atteinte, des complications neurologiques peuvent également survenir, telles qu’une compression de la moelle épinière ou des racines nerveuses, ainsi qu’un syndrome de la queue de cheval (Saifuddin and Hassan 2003). Dans la plupart des cas, ces symptômes neurologiques s’améliorent avec la prise de bisphosphonates (Shaker 2009). Cependant, il est possible qu’une décompression chirurgicale soit nécessaire pour les patients dont les symptômes neurologiques progressent ou les douleurs osseuses persistent (Parvizi, Klein et al. 2006).

La MOP est également associée avec des complications cardiovasculaires. Une étude a en effet démontré que les sténoses aortiques, l’athérosclérose et les calcifications des vaisseaux sanguins étaient plus fréquentes chez les patients pagétiques que dans la population générale (Hultgren 1998). De plus, quoi que relativement rare, l’insuffisance cardiaque figure parmi les complications possible de la MOP (Lyles, Siris et al. 2001). Des complications métaboliques peuvent également survenir, telles que l’hypercalcémie, l’hypercalciurie, l’hyperparathyroïdie, l’hyperuricémie et la goutte (Singer 2009).

La complication la plus sévère de la MOP est la dégénérescence de l’os pagétique en ostéosarcome, qui survient chez moins de 1% des patients pagétiques. Récemment, une étude a démontré que l’incidence des ostéosarcomes pagétiques a diminué significativement au cours des dernières années, avec un âge au diagnostic beaucoup plus tardif (Mangham, Davie et al. 2009). Les os les plus souvent touchés sont le bassin, les fémurs, et les humérus, suivi par les tibias et le crâne (Hansen, Seton et al. 2006). Histologiquement, l’aspect général de la tumeur est similaire au remodelage osseux anormal observé dans la MOP, avec plusieurs ostéoblastes atypiques à la surface de l’os nouvellement formé, avec des ostéoclastes géants et multinucléés. Cliniquement, les patients se présentent avec de fortes douleurs osseuses, et parfois avec des niveaux de PAL totales élevés, et éventuellement un syndrome inflammatoire biologique ou une hypercalcémie (Hansen, Seton et al. 2006). Le traitement des ostéosarcomes repose sur la chimiothérapie, la radiothérapie, et la chirurgie. Néanmoins, il s’agit d’un cancer très difficile à traiter, et le développement d’un ostéosarcome chez les patients pagétiques demeure associé à un faible taux de survie, qui se situe aux alentours de 10% à cinq ans (Deyrup, Montag et al. 2007). Le développement de tumeurs à cellules géantes peut également survenir chez les patients pagétiques, avec quelques cas décrits dans la littérature. Généralement bénignes, ces tumeurs sont la plupart du temps localisées dans les os faciaux et le crâne (Rendina, De Filippo et al. 2015).

Malgré le faible pourcentage de patients touchés, il n’en reste pas moins que la MOP est associée avec un risque élevé de développer un ostéosarcome. Ainsi, pour cette raison, cette pathologie est une contre-

25 indication formelle à la prescription d’agents ostéoformateurs, qui stimulent directement l’activité des ostéoblastes et augmentent par le fait même la formation osseuse (Augustine and Horwitz 2013). En effet, cette stimulation excessive augmente le risque théorique de développer un ostéosarcome chez les patients atteints de MOP, chez qui la formation osseuse est déjà augmentée. Dans la population générale, ces agents pharmacologiques sont prescrits pour traiter l’ostéoporose, notamment chez les patients ostéoporotiques sévères, ou qui ne répondent pas aux traitements anti-résorptifs, tels les bisphosphonates et le Denosumab, un anticorps monoclonal dirigé contre le RANKL, prescrits en première ligne (Bernabei, Martone et al. 2014). Malgré leur efficacité démontrée, ces agents ostéoformateurs sont associés avec un risque élevé de développer un ostéosarcome. En effet, des études ont démontré que les rats exposés à long-terme à de fortes doses de Tériparatide (parathormone 1-34), seul agent ostéoformateur actuellement disponible sur le marché, avaient un risque élevé de développer un ostéosarcome (Vahle, Sato et al. 2002, Watanabe, Yoneyama et al. 2012). Pour ces raisons, l’utilisation de cet agent est limitée à 24 mois pour le traitement de l’ostéoporose. Cependant, seuls trois cas d’ostéosarcomes ont été rapportés dans la littérature chez les utilisateurs de Tériparatide, cette incidence étant toutefois similaire à celle observée dans la population générale (Cipriani, Irani et al. 2012). Le faible risque de développer un ostéosarcome associé avec la Tériparatide est probablement dû à son mécanisme d’action. Toutefois, d’autres agents ostéoformateurs sont actuellement en développement pour le traitement de l’ostéoporose, ceux-ci ayant des mécanismes d’action différents, notamment via l’inhibition de la sclérostine, un inhibiteur naturel des ostéoblastes (Figure 11) (Makras, Delaroudis et al. 2015).

Figure 10. Déformations osseuses causées par la MOP. La courbure des fémurs et tibias est une caractéristique typique de la MOP, et peut entraîner plusieurs complications, telles que des fractures ou de la difficulté à effectuer certains mouvements. Figures tirées de la Paget Foundation, www.paget.org.

Figure 11. Agents pharmacologiques disponibles ou en développement pour le traitement de l’ostéoporose. Actuellement, le traitement de l’ostéoporose repose sur l’utilisation des bisphosphonates, du Denosumab ou de la Tériparatide. Cependant, d’autres agents sont actuellement en phase clinique de développement, dont les inhibiteurs de la cathepsine K et les anti-sclérostine. Figure adaptée de (Das and Crockett 2013).

2.3 Désordres osseux apparentés à la maladie osseuse de Paget Plusieurs maladies osseuses rares ont des caractéristiques similaires à la MOP classique de l’adulte, telles qu’une augmentation du remodelage osseux, la présence de déformations osseuses ainsi qu’une augmentation des PAL totales. Cependant, malgré ces similitudes, il existe des différences phénotypiques, notamment au niveau de l’âge d’apparition des symptômes (Ralston 2008). Les prochains paragraphes détaillent chacune de ces maladies osseuses.

2.3.1 Ostéolyse expansive familiale L’ostéolyse expansive familiale (OEF) est une maladie osseuse transmise selon un mode autosomique dominant. Il s’agit d’une maladie très rare, décrite chez seulement cinq familles provenant de différents pays dans le monde (Allemagne, Irlande du Nord, États-Unis, Espagne et Iran), et deux individus américains non apparentés (Enderle and Willert 1979, Osterberg, Wallace et al. 1988, Palenzuela, Vives-Bauza et al. 2002, Whyte and Hughes 2002, Johnson-Pais, Singer et al. 2003, Daneshi, Shafeghati et al. 2005). Cliniquement, la première manifestation de l’OEF est une perte auditive, qui peut survenir à partir de l’âge de 4 ans, suivi d’une perte prématurée de la dentition. Les douleurs osseuses apparaissent dans la vingtaine, et sont parfois si

sévères qu’elles nécessitent l’amputation d’un membre (Osterberg, Wallace et al. 1988). Cette maladie est caractérisée par des augmentations focales du remodelage osseux, et une ostéopénie généralisée. Initialement, les lésions osseuses ressemblent à la phase ostéolytique observée dans la MOP classique de l’adulte. Ces lésions progressent rapidement et entraînent une architecture anormale, causant des déformations et une susceptibilité accrue aux fractures (Crone and Wallace 1990). Contrairement à ce qu’on observe dans la MOP, ces changements architecturaux sont causés par un découplage de l’activité des ostéoclastes et des ostéoblastes. L’os résultant est alors caractérisé par une expansion de la cavité médullaire et un amincissement de la corticale, avec le remplacement quasi complet de la moelle osseuse par des tissus adipeux et vascularisés (Lucas, Daroszewska et al. 2006).

Une analyse de liaison effectuée sur une première famille atteinte d’OEF a permis d’identifier une association avec le locus 18q (Hughes, Shearman et al. 1994). Cette découverte a par la suite mené à l’identification d’une mutation causale chez trois familles atteintes d’OEF, à savoir une duplication des bases 84-101 (84dup18) situées dans l’exon 1 du gène TNFRSFIIA (Hughes, Ralston et al. 2000). Ensuite, cette même mutation a été identifiée chez les deux autres familles atteintes d’OEF (Palenzuela, Vives-Bauza et al. 2002, Elahi, Shafaghati et al. 2007). En ce qui concerne les deux individus avec une forme sporadique de la maladie, une mutation différente a été identifiée, soit une duplication des bases 83-100 (83dup18). Cependant, de façon très intéressante, ces deux mutations mènent à l’insertion de six acides aminés dans le peptide signal de la protéine RANK, suggérant que les mutations causales dans l’OEF sont très spécifiques (Johnson- Pais, Singer et al. 2003). Au niveau fonctionnel, ces insertions se traduisent par une diminution de l’expression de la protéine RANK, un clivage anormal du peptide signal et une augmentation de l’activation du facteur de transcription NF-κB, compatibles avec des mutations activatrices (Hughes, Ralston et al. 2000). Cependant, ces dernières informations n’ont pu être confirmées par une équipe indépendante, suggérant que d’autres mécanismes pourraient être impliqués (Crockett, Mellis et al. 2011).

Le traitement optimal pour l’OEF est actuellement inconnu. L’utilisation d’inhibiteurs de la résorption osseuse s’avère efficace pour diminuer les biomarqueurs du remodelage osseux. Cependant, leur efficacité à réduire la progression des lésions osseuses et à prévenir le développement de complications demeure incertaine (Whyte 2006).

2.3.2 Hyperphosphatasémie expansive du squelette L’hyperphosphatasémie expansive du squelette (HES) est une maladie osseuse transmise selon un mode autosomique dominant qui a été décrite dans une famille australienne, affectant une mère et sa fille (Whyte, Mills et al. 2000). Tout comme l’OEF, la première manifestation de la maladie est la perte auditive en très bas âge, suivie d’une perte de dentition prématurée (Whyte 2006). L’HES résulte d’un désordre du remodelage

29 osseux qui affecte progressivement le squelette en entier, accompagné d’épisodes d’hypercalcémie. Les os atteints subissent un épaississement de la corticale (hyperostose) et une expansion. Les changements les plus visibles surviennent au niveau des phalanges, qui subissent une expansion importante pouvant causer des douleurs considérables (Whyte, Mills et al. 2000).

L’HES est causée par une duplication de 15 paires de bases (84dup15) dans l’exon 1 du gène TNFRSFIIA, créant ainsi une insertion de cinq acides aminés dans le peptide signal du récepteur RANK. L’effet fonctionnel de cette mutation n’a pas été étudié. Cependant, étant donné les similitudes entre cette mutation et celles rapportées dans l’OEF, il est probable que les effets fonctionnels soient similaires, c’est-à-dire une augmentation de l’activité biologique de RANK ainsi que du facteur de transcription NF-κB (Whyte and Hughes 2002).

L’utilisation d’agents qui inhibe la résorption osseuse permet de corriger l’hypercalcémie, mais s’avère inefficace pour traiter les autres symptômes associés à l’HES. Ainsi, la meilleure façon de traiter cette maladie est d’utiliser une approche symptomatique afin de contrôler les différentes complications qui y sont associées (Ralston 2008).

2.3.3 Maladie osseuse de Paget à début précoce La MOP à début précoce est une maladie transmise selon un mode autosomique dominant qui a été diagnostiquée dans deux familles distinctes : une famille japonaise et une famille chinoise (Nakatsuka, Nishizawa et al. 2003, Ke, Yue et al. 2009). Elle est caractérisée par la présence de lésions ostéolytiques et sclérotiques dans les os atteints causant des déformations osseuses similaires à celles observées dans la MOP classique de l’adulte. Dans tous les cas, on note une atteinte du maxillaire et de la mandibule, causant des déformations faciales caractéristiques de cette maladie. La MOP à début précoce diffère cependant de la MOP classique de l’adulte. En effet, les symptômes apparaissent à un plus jeune âge, soit dans la vingtaine ou la trentaine. De plus, on note l’apparition d’une surdité partielle et une perte de dentition vers l’âge de 20 ans (Nakatsuka, Nishizawa et al. 2003). Cependant, une hétérogénéité phénotypique a été observée entre ces deux familles, notamment au niveau des pertes auditives et de dentition qui sont absentes dans la famille chinoise (Ke, Yue et al. 2009).

La MOP à début précoce est également causée par des mutations dans le gène TNFRSFIIA. Une première mutation a été identifiée dans une famille japonaise, soit une duplication des bases 75-101 (75dup27) dans l’exon 1 de ce gène, se traduisant au niveau protéique par l’insertion de neuf acides aminés dans le peptide signal du récepteur RANK. Tout comme pour l’OEF, cette mutation entraîne un clivage anormal du peptide signal de la protéine RANK, ainsi qu’une augmentation de l’activation de NF-κB (Hughes, Ralston et al. 2000). Une seconde mutation a été identifiée dans une famille chinoise, soit une duplication des bases 78-104

(78dup27) dans l’exon 1 du gène TNFRSFIIA, qui cause également l’insertion d’une séquence de neuf acides aminés dans le peptide signal de RANK, mais qui est distincte de celle précédemment identifiée. De plus, les effets fonctionnels de cette mutation sont inconnus jusqu’à présent, mais il est très probable que ceux-ci soient similaires à ceux observés pour la première mutation (Ke, Yue et al. 2009).

À ce jour, seuls les bisphosphonates ont été utilisés pour traiter la MOP à début précoce, et une diminution satisfaisante des marqueurs biochimiques du remodelage osseux a été observée. Cependant, ce traitement s’avère inefficace d’un point de vue clinique. En effet, aucune amélioration des symptômes associés à la maladie n’a été observée. Ainsi, l’efficacité des bisphosphonates pour traiter la MOP à début précoce demeure incertaine (Riches, Imanishi et al. 2008).

2.3.4 Maladie de Paget juvénile La maladie de Paget juvénile, également appelée hyperphosphatasémie idiopathique familiale, est une maladie osseuse très rare, transmise selon un mode autosomique récessif, affectant environ 50 personnes dans le monde (Lucas, Daroszewska et al. 2006). Tout comme la MOP classique de l’adulte, elle est caractérisée par une augmentation du remodelage osseux qui entraîne la formation d’un os tissé ayant une moindre résistance biomécanique et qui est plus susceptible aux fractures. Cependant, dans le cas de la maladie de Paget juvénile, cette anomalie du remodelage osseux est diffuse et non focale comme c'est le cas dans la MOP classique (Helfrich and Hocking 2008). Les symptômes apparaissent généralement dès l’enfance et progressent rapidement. On note entre autre des retards de croissance, des déformations osseuses sévères et l’apparition d'une cyphose. De plus, les enfants atteints par cette maladie sont généralement de petite taille, et ont un élargissement du crâne qui entraîne une surdité précoce (Cundy 2002).

La maladie de Paget juvénile est causée par des mutations homozygotes dans le gène TNFRSFIIB. La première mutation identifiée a été la délétion de trois paires de bases dans l’exon 3 de ce gène, se traduisant au niveau protéique par la perte d’un résidu aspartate en position 182 de la protéine OPG (Cundy, Hegde et al. 2002). À ce jour, plus de 10 mutations causales homozygotes ont été rapportées dans ce gène (Naot, Choi et al. 2014). Au niveau fonctionnel, il a été démontré que ces mutations causent une diminution de la sécrétion d’OPG dans le milieu osseux, en plus de diminuer son affinité pour le RANKL, ce qui entraîne une dérégulation de la voie de signalisation du récepteur RANK, menant ainsi à une augmentation du nombre et de l’activité des ostéoclastes (Middleton-Hardie, Zhu et al. 2006).

Le traitement de la maladie de Paget juvénile repose principalement sur l’utilisation des bisphosphonates, avec des réponses cliniques et biochimiques généralement satisfaisantes (Cundy, Wheadon et al. 2004, Tau, Mautalen et al. 2004). L’OPG recombinante serait un traitement idéal pour cette maladie et s’est montrée très efficace d'après la littérature (Cundy, Davidson et al. 2005). Cependant, cette médication n’est pas utilisée

31 dans la pratique clinique en raison de la faible pharmacocinétique observée dans deux études cliniques de phase I et à des problèmes potentiels d’immunogénicité (Croft, Benedict et al. 2013). Récemment, l’utilisation du Denosumab, un anticorps monoclonal humain dirigé contre le RANKL, s’est avérée très prometteuse pour traiter la maladie de Paget juvénile, offrant ainsi une alternative intéressante à l’utilisation de l’OPG recombinante (Grasemann, Schundeln et al. 2013, Polyzos, Singhellakis et al. 2014).

2.3.5 Syndrome IBMPFD Le syndrome IBMPFD (syndrome comportant une MOP à début précoce et/ou une démence fronto-temporale et/ou une myopathie à inclusions) est une maladie rare, transmise selon un mode autosomique dominant, qui affecte plus de 30 familles dans le monde (Kim, Park et al. 2011). Ce syndrome possède trois caractéristiques phénotypiques distinctes, présentes seules ou en combinaison chez les individus atteints : myopathie à inclusions, MOP et démence fronto-temporale (Nalbandian, Donkervoort et al. 2011). La myopathie à inclusions est présente chez environ 90% des individus atteints, avec l’apparition de faiblesses musculaires vers l’âge moyen de 43 ans. La MOP est présente chez environ 43% des patients, et affecte principalement la colonne vertébrale, le bassin et le crâne. Elle apparaît à un âge précoce, soit vers l’âge moyen de 42 ans. Finalement, la démence fronto-temporale est diagnostiquée chez environ 37% des patients et apparaît vers l’âge moyen de 54 ans (Kovach, Waggoner et al. 2001). Dans la plupart des cas, les individus atteints développent une insuffisance rénale et cardiaque, qui entraîne leur décès entre 40 et 60 ans (Kimonis, Fulchiero et al. 2008).

Le syndrome IBMPFD est causé par des mutations faux-sens dans le gène Valosin-Containing Protein (VCP) (Watts, Wymer et al. 2004). À ce jour, plus de 20 mutations ont été associées à la maladie (Segers, Glibert et al. 2014). La protéine VCP est impliquée dans plusieurs mécanismes cellulaires cruciaux, tels que la régulation du cycle cellulaire, l’apoptose, la dégradation des protéines par le protéasome et l’autophagie (Weihl, Pestronk et al. 2009). La plupart des mutations associées au syndrome IBMPFD sont localisées dans le domaine de liaison à l’ubiquitine. Ainsi, sur le plan fonctionnel, ces mutations entraînent un défaut dans les mécanismes de dégradation par le protéasome et l’autophagie, causant ainsi une accumulation de protéines ubiquitinées dans la cellule (Ju and Weihl 2010).

Il n’existe actuellement aucun traitement pour le syndrome IBMPFD. La façon optimale de contrôler la maladie est de traiter individuellement chaque patient en fonction de la progression de la maladie et des complications qu’il développe. Ainsi, on peut prescrire des bisphosphonates pour traiter la MOP, utiliser la physiothérapie pour limiter l’invalidité associée aux faiblesses musculaires, ou encore assurer un suivi psychiatrique ou neurologique pour contrôler la démence (Mehta, Khare et al. 2013).

2.3.6 Dysplasie fibreuse des os La dysplasie fibreuse des os (DFO) est une maladie osseuse rare et non-héréditaire. Sa fréquence est actuellement inconnue, mais on estime qu’elle pourrait affecter environ un individu sur 30 000 (Chapurlat and Orcel 2008). Elle est caractérisée par le développement de lésions osseuses dans lesquelles la structure osseuse normale est remplacée par du tissu fibreux, causant ainsi une détérioration des fonctions du squelette, des déformations et des douleurs osseuses, en plus d’augmenter la susceptibilité aux fractures. Les symptômes apparaissent généralement avant l’âge de 15 ans (Collins, Riminucci et al. 2013). La maladie peut se présenter sous forme monostotique (75% des cas), ou polyostotique, avec une distribution focale et asymétrique (Riddle and Bui 2013). Dans de rares cas, la DFO polyostotique peut se présenter en combinaison avec une pigmentation anormale de la peau (taches « café-au-lait ») et des anomalies endocriniennes, la puberté précoce étant la plus fréquemment observée. Cette triade caractéristique est connue sous le nom de syndrome de McCune-Albright (Dumitrescu and Collins 2008).

La DFO est causée par des mutations post-zygotiques (ou somatiques survenues dans les stades les plus précoces du développement embryonnaire) dans le gène Guanine Nucleotide-binding protein Alpha- Stimulating activity (GNAS), qui code pour la sous-unité alpha de la protéine Gs. Ces mutations créent alors un mosaïcisme somatique, et la sévérité du phénotype de l’individu atteint dépend du moment d’apparition de la mutation qui détermine elle-même l’étendue et la distribution des cellules mutantes. Ainsi, une mutation qui survient tard dans le développement embryonnaire engendrera un phénotype moins sévère, tel qu’une atteinte monostotique (Weinstein 2006). Il n’existe actuellement aucune forme familiale connue de la maladie. Les mutations qui causent la DFO seraient létales au cours du développement embryonnaire si elles étaient transmises par voie germinale. Les cellules portant la mutation ne pourraient survivre que lorsqu’elles sont à proximité de cellules non mutées (Happle 1986). La plupart du temps, la mutation résulte en la substitution de l’arginine en position 101 par une histidine ou une cystéine, et plus rarement par une glycine ou une leucine (Michou and Brown 2010). Ces mutations sont dites activatrices puisqu’elles causent une activation constitutive de la sous-unité Gs, augmentant ainsi l’activité de l’adénylate cyclase qui produit un excès d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) intracellulaire (Weinstein, Chen et al. 2006). Cette dysfonction cellulaire est responsable des différentes anomalies observées dans la DFO et dans le syndrome de McCune- Albright. Ainsi, la surproduction d’AMPc entraîne une prolifération anormale des cellules stromales de la moelle osseuse qui résulte en la formation d’ostéoblastes peu différentiés, une surproduction de l’enzyme tyrosinase cause l’apparition des taches café-au-lait et finalement, une augmentation de la sécrétion d’hormones mène aux anomalies du système endocrinien (Weinstein 2006). Récemment, un modèle de souris transgéniques exprimant de façon constitutive la mutation GNAS/R201C a été généré. Ces souris exprimaient un phénotype de DFO similaire à ce qui est observé chez l’humain, confirmant que les mutations activatrices

33 dans le gène GNAS sont suffisantes pour causer cette pathologie. Cette étude a également démontré que la DFO pouvait être hérité chez la souris, suggérant que les mutations germinales dans le gène GNAS ne seraient pas létales, à tout le moins dans ce modèle animal (Saggio, Remoli et al. 2014).

Le traitement de la DFO repose généralement sur l’utilisation de bisphosphonates, qui s’avèrent efficaces pour diminuer la progression des lésions et les douleurs osseuses. Dans certains cas, on peut procéder à une chirurgie localisée, afin de corriger une déformation, prévenir une fracture ou tout simplement pour retirer une lésion symptomatique (DiCaprio and Enneking 2005). Récemment, certaines études ont démontré que le Denosumab pourrait aussi être efficace pour traiter la DFO (Boyce, Chong et al. 2012, Ganda and Seibel 2014).

3. Génétique de la maladie osseuse de Paget Suite à la caractérisation clinique initiale de la MOP par Sir James Paget, plusieurs études ont rapporté la présence de personnes malades dans des générations successives, suggérant une agrégation familiale de cette maladie (Galbraith 1954). Environ 12 à 40% des patients avec la MOP auraient en fait une forme familiale de la maladie (Siris, Ottman et al. 1991, Morales-Piga, Rey-Rey et al. 1995, Merlotti, Gennari et al. 2005). Cependant, ce pourcentage est probablement sous-estimé en raison du caractère volontiers asymptomatique de la maladie, y compris chez des apparentés d'une personne atteinte qui pourraient ignorer être atteints par la MOP. Par ailleurs, le risque de développer la maladie chez les apparentés au premier degré d’un individu atteint de MOP est environ 7 à 10 fois plus élevé que pour un individu sans antécédent familial de MOP (Sofaer, Holloway et al. 1983, Siris, Ottman et al. 1991). La MOP en tant que maladie génétique mendélienne transmise selon un mode autosomique dominant a été suggéré pour la première fois en 1956, lors de l’analyse de 37 pedigrees précédemment rapportés dans la littérature (McKusick 1956). Par la suite, plusieurs équipes ont observé des pedigrees compatibles avec un tel mode de transmission, le trait autosomique dominant de la MOP devenant alors de plus en plus évident (Jones and Reed 1967, Sofaer, Holloway et al. 1983, Haslam, Van Hul et al. 1998, Good, Busfield et al. 2001, Hocking, Herbert et al. 2001, Laurin, Brown et al. 2001).

3.1 Mode de transmission Les maladies génétiques mendéliennes résultent classiquement du dysfonctionnement d’un ou plusieurs gènes, et peuvent être transmises aux générations suivantes selon plusieurs modes. Une transmission est dite autosomique lorsque le gène causal est porté par un autosome, et liée à l’X lorsque ce dernier est situé

sur le chromosome X. De plus, la transmission est dite dominante lorsque la présence d’un allèle muté est suffisante pour développer la maladie. Ainsi, pour une personne atteinte, le risque de transmettre cette condition à sa descendance est de 50%, et si la pénétrance est complète, on retrouve des individus atteints à chaque génération. La transmission de la maladie d’un père à son fils est caractéristique d’une hérédité autosomique dominante. La pénétrance se définit comme la probabilité d’être atteint par la maladie lorsqu’un individu est porteur du génotype à risque. On parle de pénétrance complète lorsque tous les individus porteurs de l’allèle muté développent la maladie, et de pénétrance incomplète lorsque les individus porteurs de l’allèle mutés ne développent pas tous la maladie. La transmission récessive, quant-à-elle, nécessite la présence de deux allèles mutés pour le développement de la maladie. Le risque d’une personne atteinte de transmettre la maladie à sa descendance est alors de 25%, et n’implique pas nécessairement la présence de personnes atteintes à chaque génération (Snustad and Simmons 2006).

La composante génétique joue un rôle important dans la physiopathologie de la MOP. Actuellement, environ un tiers des patients ont une forme familiale de la maladie, qui est transmise selon un mode autosomique dominant à pénétrance incomplète (Figure 12) (Michou, Collet et al. 2006). Cette pénétrance est très élevée pour une maladie autosomique dominante, soit aux alentours de 79 à 87%, et semble maximale après l’âge de 60 ans (Morissette, Laurin et al. 2006).

Figure 12. Mode de transmission de la MOP. La MOP est transmise aux générations suivantes selon un mode autosomique dominant. On observe des personnes atteintes à chaque génération, chaque individu atteint a un parent atteint et plusieurs transmissions père-fils sont observées. Figure adaptée de (Good, Busfield et al. 2004).

35 3.2 Hétérogénéité génétique Une hétérogénéité génétique a été démontrée dans les formes familiales, qui ont été liées à sept régions chromosomiques pouvant contenir un gène de susceptibilité à la MOP, nommées respectivement PDB1 à PDB7 (Paget’s Disease of Bone 1 à 7). Une association avec le locus 6p21.3 (PDB1), qui contient le HLA, a d’abord été suggérée (Fotino, Haymovits et al. 1977). Cependant, d’autres études n’ont pas réussi à répliquer cette association (Breanndan Moore and Hoffman 1988, Good, Busfield et al. 2001). Le locus 18q22.1 (PDB2) a été investigué dans la MOP en raison de son association avec l’OEF, une maladie osseuse partageant des caractéristiques similaires à la MOP, et pour laquelle des mutations dans le gène TNFRSFIIA ont été identifiées (Hughes, Shearman et al. 1994, Hughes, Ralston et al. 2000). Plusieurs familles atteintes de MOP ont été liées à ce locus (Cody, Singer et al. 1997, Haslam, Van Hul et al. 1998). Toutefois, aucune mutation causale dans ce gène n’a été rapportée dans la MOP classique de l'adulte (Sparks, Peterson et al. 2001, Wuyts, Van Wesenbeeck et al. 2001). De plus, plusieurs études n’ont pas réussi à répliquer cette association (Hocking, Slee et al. 2000, Nance, Nuttall et al. 2000, Good, Busfield et al. 2001). Le locus 5q35qter (PDB3) a été identifié lors d’un criblage du génome entier effectué sur trois familles canadiennes-françaises (Laurin, Brown et al. 2001). Le clonage positionnel à ce locus a ainsi permis d’identifier la première mutation germinale associée à la maladie, soit la substitution d’une cytosine en thymine en position 1215 du gène Sequestosome 1 (SQSTM1), se traduisant par le changement d’un acide aminé proline en leucine en position 392 (P392L) dans la protéine encodée par ce gène, p62 (Laurin, Brown et al. 2002). Ces résultats ont par la suite été répliqués dans des familles britanniques (Hocking, Herbert et al. 2001, Hocking, Lucas et al. 2002). L’analyse sur les familles canadiennes-française a également permis de lier la MOP au locus 5q31 (PDB4) (Laurin, Brown et al. 2001). Les loci 2q36 (PDB5) et 10p13 (PDB6) ont été associés à la MOP dans 62 familles provenant de différentes populations, soit le Royaume-Uni, l’Australie, la Nouvelle-Zélande, les États-Unis, le Canada et la Hongrie (Hocking, Herbert et al. 2001). L’association avec le locus 10p13 a par la suite été répliquée dans 39 familles de descendance britannique, ce qui ne fut pas le cas pour le locus 2q36, qui correspond probablement à un faux positif des analyses de liaison pangénomique (Lucas, Riches et al. 2008). Finalement, le locus 18q23 (PDB7) a été suggéré suite à l’analyse d’une famille provenant d’Australie (Good, Busfield et al. 2002). Cependant, puisqu’il a par la suite été démontré qu’une partie de cette famille était porteuse d’une mutation dans le gène SQSTM1, la présence d’un gène causal à ce locus demeure peu probable (Good, Busfield et al. 2004). Alors que certains loci associés à la MOP se sont avérés être de faux positifs, un gène causal a été identifié au locus PDB3 et les loci PDB4 et PDB6 restent actuellement les seuls pour lesquels la présence d’un gène causal demeure possible (Chung and Van Hul 2012).

3.3 Polymorphismes associés à la maladie osseuse de Paget Les variants communs sont des polymorphismes dont la fréquence de l’allèle mineur est supérieure à 3 à 5%, alors que les variants rares ont une fréquence de l’allèle mineur qui se situe entre 0,1 à 3%. Par ailleurs, ces derniers seraient plus susceptibles d’avoir un impact fonctionnel et ainsi augmenter le risque de développer une maladie que les variants communs (Bodmer and Bonilla 2008).

3.3.1 Variants communs En plus des régions chromosomiques identifiées lors des analyses de liaison, deux études pangénomiques d’association (GWAS, pour Genome-Wide Association Study), récemment effectuées dans des cohortes européennes, ont permis l’identification de cinq nouveaux loci associés à la MOP (Tableau 3) : 1p13 (près des gènes CSF-1 et EPS8L3), 7q33 (dans le gène NUP205), 8q22 (dans le gène TM7SF4), 14q32 (dans le gène RIN3) et 15q24 (dans les gènes PML et GOLGA6A), en plus de confirmer une association avec des polymorphismes de nucléotides simples (SNPs) aux locus PDB6 (OPTN) et PDB2 (près des gènes PIGN, KIAA1468, RPL17P14 et TNFRSFIIA) (Albagha, Visconti et al. 2010, Albagha, Wani et al. 2011). Au total, ces sept loci expliqueraient environ 86% des cas de MOP parmi les individus non porteurs d’une mutation dans le gène SQSTM1, et le risque de développer la maladie augmenterait proportionnellement avec le nombre d’allèles à risque porté par l’individu (Albagha, Wani et al. 2011). Ces associations ont par la suite été répliquées dans des populations d’origine belge et néerlandaise, ainsi que dans la population canadienne- française (Chung, Beyens et al. 2010, Michou, Conceicao et al. 2012, Beauregard, Gagnon et al. 2014).

De plus, plusieurs gènes candidats ont été investigués en raison de leur implication dans des pathologies osseuses ayant des caractéristiques similaires à la MOP, ou pour leur rôle dans le métabolisme osseux (Tableau 3). Deux variants communs dans le gène TNFRSFIIA, qui code pour le récepteur membranaire ostéoclastique RANK, ont été associés à la MOP, et ce spécifiquement chez les femmes (Chung, Beyens et al. 2010). De plus, un polymorphisme de ce même gène a été associé aux formes sévères de MOP (Gianfrancesco, Rendina et al. 2012). Quelques polymorphismes dans le gène TNFRSFIIB, qui code pour l’OPG, ont été associés à la MOP (Wuyts, Van Wesenbeeck et al. 2001, Daroszewska, Hocking et al. 2004). De façon intéressante, les associations avec les polymorphismes de ce gène étaient là aussi restreintes aux femmes (Beyens, Daroszewska et al. 2007). Une première étude d’association a exclu la présence de polymorphismes du gène VCP associés avec la MOP classique de l'adulte (Lucas, Mehta et al. 2006). Cependant, une seconde étude indépendante a rapporté une association d’un polymorphisme de ce gène avec la MOP (Chung, Beyens et al. 2011). Ainsi, à ce jour, l’association des polymorphismes du gène VCP avec la MOP classique de l’adulte demeure incertaine. Un polymorphisme du gène Gla-Rich Protein (UCMA/GRP) a été associé à un effet protecteur contre la MOP, tout comme l’association protectrice de deux variants communs dans le gène OPTN (Michou, Conceicao et al. 2012). De plus, les gènes DKK1 et SOST,

37 qui codent pour les protéines DKK1 et Sclérostine, dont les taux sériques sont augmentés dans la MOP, ont été investigués dans la population canadienne-française. Une association protectrice avec un polymorphisme du gène DKK1 a été rapportée, ce qui ne fut pas le cas pour le gène SOST (Beauregard, Gagnon et al. 2013). Les gènes CASR et ESR1 ont également été investigués, et une association génétique avec la MOP a été publiée (Tableau 3) (Donath, Speer et al. 2004). Enfin, plusieurs études d’association ont été effectuées avec des gènes codant pour des cytokines impliquées dans la pathogénie de la MOP ou dans le métabolisme osseux, sans toutefois mener à des associations statistiquement significatives (Corral-Gudino, del Pino- Montes et al. 2010, Chung, Beyens et al. 2011, Gallone, Di Stefano et al. 2011).

3.3.2 Variants rares En raison de son effet fondateur, la population canadienne-française est susceptible d’être enrichie en variants génétiques rares, ce qui lui confère une plus grande puissance statistique pour la détection de tels variants (Casals, Hodgkinson et al. 2013). Ainsi, plusieurs variants rares ont été détectés dans cette population, notamment dans les gènes UCMA/GRP, OPTN, DKK1 et GSTM4 sans toutefois être associés à la MOP (Michou, Conceicao et al. 2012, Beauregard, Gagnon et al. 2013, Beauregard, Gagnon et al. 2014). Des variants génétiques rares dans les gènes TM7SF4 et CTHRC1 ont quant-à-eux été associés avec la MOP chez les patients pagétiques non porteurs d’une mutation dans le gène SQSTM1 (Tableau 3) (Beauregard, Gagnon et al. 2014). L’effet fonctionnel de ces variants génétiques rares n’est pas connu à ce jour.

Tableau 3. Principaux polymorphismes et variants génétiques rares associés à la MOP d’après les GWAS et les études de gènes candidats.

Locus Gène Protéine correspondante Association avec la MOP M-CSF (Macrophage Colony-Stimulating Factor); cytokine responsable de la prolifération et de la survie des CSF-1 Identifié dans les GWAS* précurseurs ostéoclastiques 1p13

EPS8L3 (Epidermal growth factor receptor kinase Substrate EPS8L3 Identifié dans les GWAS 8-Like protein 3); enzyme de fonction inconnue Récepteur du calcium; impliqué dans le métabolisme Étude gène-candidat, variants 3q21 CASR calcique communs associés avec la MOP Récepteur des estrogènes; impliqué dans la régulation Étude gène-candidat, variants 6q25 ESR1 hormonale communs associés avec la MOP Nucléoporine 205 kDa; composante des pores nucléaires 7q33 NUP205 impliquée dans le transport de substances entre le Identifié dans les GWAS cytoplasme et le noyau DC-STAMP (Dendritic-Cell Specific Transmembrane Identifié dans les GWAS, variants TM7SF4 Protein); impliquée dans la fusion des précurseurs rares associés avec la MOP 8q22 ostéoclastiques CTHRC1 (Collagen Triple Helix Repeat Containing 1); CTHRC1 Variants rares associés avec la MOP impliquée dans la voie de signalisation Wnt

39 Locus Gène Protéine correspondante Association avec la MOP OPG (Ostéoprotégérine); récepteur leurre du RANKL, Association de variants communs 8q24 TNFRSFIIB inhibiteur de l’ostéoclastogénèse, mutations causales avec la MOP, restreinte aux femmes associées avec la maladie de Paget juvénile VCP (Valosin-Containing Protein); impliquée dans la Association incertaine avec la MOP, régulation du cycle cellulaire, l’apoptose, la dégradation des 9p13 VCP résultats contradictoires dans la protéines par le protéasome et l’autophagie. Mutations littérature associées avec le syndrome IBMPFD** Identifié dans les GWAS, association OPTN (optineurine); impliquée dans la régulation de NF-κB OPTN protectrice de variants communs avec et de l’autophagie la MOP UCMA/GRP (Upper zone of growth plate and Cartilage 10p13 Matrix Associated/Gla-Rich Protein); protéine dépendante Identifié dans les études d’association de la vitamine K et impliquée dans la modulation du calcium UCMA/GRP (PDB6), association protectrice d’un dans l’environnement extracellulaire, le contrôle négatif de la variant commun avec la MOP différenciation ostéogénique, la modulation de la formation minérale et l’autophagie Étude gène-candidat, association DKK1 (Dikkopf-1); inhibiteur de la voie de signalisation WNT 10q11 DKK1 protectrice d’un variant commun avec impliquée dans la différenciation des ostéoblastes la MOP RIN3 (Ras and Rab Interactor 3); impliquée dans le 14q32 RIN3 Identifié dans les GWAS transport vésiculaire

Locus Gène Protéine correspondante Association avec la MOP PML (Promyelocytic Leukemia Protein); impliquée dans la PML Identifié dans les GWAS croissance cellulaire, l’apoptose et la sénescence 15q24 Membre de la famille des golgines; associé à l’appareil de GOLGA6A Identifié dans les GWAS Golgi

PIGN (Phosphatidylinositol Glycan Anchor biosynthesis

class N); impliquée dans la biosynthèse du Identifié dans les GWAS PIGN glycosylphosphatidylinositol (GPI) KIAA1468 KIAA1468; fonction inconnue Identifié dans les GWAS 18q21 RPL17P14 (Ribosomal Protein L17 Pseudogene 14); RPL17P14 Identifié dans les GWAS fonction inconnue RANK (Receptor Activator of Nucleor Factor kappa-B); Variants communs associés avec la 18q22 TNFRSFIIA activateur de l’ostéoclastogénèse, mutations causales MOP, aucune mutation causale associées avec l’ostéolyse expansive familiale associée avec la MOP *GWAS : Genome-wide association studies (études pangénomiques d’association); **IBMPFD : Inclusion body myopathy with early onset Paget’s disease of bone and frontotemporal dementia (syndrome comportant une MOP à début précoce et/ou une démence fronto-temporale et/ou une myopathie à inclusions).

41 4. Importance du gène SQSTM1 et des particules virales dans la physiopathologie de la maladie osseuse de Paget

4.1 Mutations dans le gène Sequestosome 1 La première mutation germinale liée à la maladie a été identifiée par notre laboratoire lors d’un clonage positionnel au locus PDB3 situé en 5q35-qter chez une grande famille canadienne-française. Il s’agit d’une substitution d’une cytosine en thymine en position 1215 (exon 8) du gène SQSTM1 (Figure 13). Cette mutation est localisée dans un ilot CpG, soit un point chaud favorisant la survenue de mutations, et pourrait être issue d’une désamination d’une cytosine méthylée. Au niveau protéique, cette mutation se traduit par le changement d’un acide aminé proline en leucine en position 392 (P392L) dans la protéine SQSTM1, aussi appelée p62 (Figure 13). Ce résidu proline a été très conservé pendant l’évolution, lui conférant probablement un rôle important pour la fonction de la protéine (Figure 14) (Laurin, Brown et al. 2002). De plus, dans la population canadienne-française, cette mutation est portée par deux haplotypes distincts (H1 et H2), ce qui suggère que cette mutation pourrait être issue de deux effets fondateurs indépendants dans cette population (Tableau 4) (Laurin, Brown et al. 2002). Par ailleurs, dans cette population, ces deux haplotypes sont présents dans des fréquences similaires chez les individus avec une forme familiale de la maladie et porteurs de la mutation SQSTM1/P392L, alors que l’haplotype H2 est plus fréquent dans les formes familiales issues d’autres populations, principalement européennes (Tableau 5). La mutation SQSTM1/P392L est la seule mutation identifiée dans la population canadienne-française, présente chez 37,7% des individus atteints ayant une forme familiale de la MOP, et 9,0% des individus atteints non apparentés (Morissette, Laurin et al. 2006). Dans notre population, la majorité des individus atteints porteurs de cette mutation sont hétérozygotes, à l’exception de deux individus homozygotes sans impact significatif sur le phénotype clinique observé, confirmant ainsi son caractère dominant (la présence d’un seul allèle muté est suffisante pour engendrer le phénotype clinique pagétique). La pénétrance de cette mutation est incomplète, mais semble maximale après l’âge de 60 ans avec des valeurs aux alentours de 79 à 87% (Morissette, Laurin et al. 2006). À ce jour, près de 30 mutations faux-sens ou stop ont été identifiées dans le gène SQSTM1. Toutefois, la mutation SQSTM1/P392L demeure la plus fréquemment associée avec la maladie, présente chez environ 20,7% des formes familiales, et 4,7% des atteints non apparentés (Tableau 6). Les mutations dans le gène SQSTM1 sont pour la plupart localisées dans l’exon 8, à l’exception de quelques-unes que l’on retrouve entre autres dans l’exon 7 (Figure 15). Globalement, ces mutations dans le gène SQSTM1 expliquent environ 34,5% des formes familiales de la maladie, et 5,9% des individus atteints non apparentés (Tableau 6).

Figure 13. Chromatogrammes de la découverte de la première mutation germinale associée avec la MOP. La première mutation germinale liée à la MOP est la substitution d’une cytosine en thymine en position 1215 du gène SQSTM1, se traduisant au niveau protéique par le changement d’un acide aminé proline en leucine en position 392 (P392L) de la protéine SQSTM1, aussi appelée p62. Cette mutation a été observée majoritairement à l’état hétérozygote chez les individus atteints. Figure tirée de (Laurin, Brown et al. 2002).

Figure 14. Conservation du résidu proline au cours de l’évolution. Le résidu proline en position 392 de la protéine SQSTM1/p62 a été conservé pendant l’évolution, lui suggérant un rôle important pour la fonction de la protéine. Figure crée à partir du programme HomoloGene, NCBI.

43 Tableau 4. Haplotypes H1 et H2 identifiés dans la population canadienne-française chez les porteurs de la mutation SQSTM1/P392L.

Marqueurs haplotypiques Haplotype H1 Haplotype H2 D5S2073-83 kb 12 2 IVS1 + 633 A A IVS5-23 A G Exon 6-916 T C Exon 6-976 A G C1215T (P392L) T T 3’UTR + 2503 C T 3’UTR + 2687 T G NL9 + 96 kb 2 3 NL27 + 285 kb 10 8

Tableau 5. Fréquence des haplotypes H1 et H2 dans diverses populations.

Québec* Australie† Belgique‡ Espagne‡ États-Unis¶ Italieδ Pays-Bas‡

H1 H2 H1 H2 H1 H2 H1 H2 H1 H2 H1 H2 H1 H2 Familles 10/18 8/18 1/13 12/13 - - - - 1/6 5/6 0/2 2/2 0/2 2/2 avec P392L 55,6% 44,4% 7,7% 92,3% - - - - 16,7% 83,3% 0,0% 100,0% 0,0% 100,0% Non 6/12 6/12 3/36 33/36 0/17 17/17 0/10 10/10 0/3 3/3 1/16 15/16 0/3 3/3 apparentés 50,0% 50,0% 8,3% 91,7% 0,0% 100,0% 0,0% 100,0% 0,0% 100,0% 6,3% 93,7% 0,0% 100,0% avec P392L *(Morissette, Laurin et al. 2006); †(Lucas, Hocking et al. 2005, Rea, Walsh et al. 2009); ‡(Chung, Beyens et al. 2008); ¶(Rhodes, Johnson-Pais et al. 2008, Michou, Morissette et al. 2010); δ(Morissette, Laurin et al. 2006, Falchetti, Di Stefano et al. 2009).

45 Tableau 6. Fréquence en pourcentage de patients atteints de la MOP porteurs de mutations dans le gène SQSTM1 dans les principales cohortes caucasiennes publiées, dans les formes familiales (F) et chez les individus atteints non apparentés (NA).

Mutations Québec R.-Uni Hollande Belgique France Italie Australie N.-Zélande États-Unis Total F NA F NA F NA F NA F NA F NA F NA F NA F NA F NA (domaine) 53 177 70 175 18 83 - 111 18 76 14 413 59 194 47 19 59 129 338 1 377 D335E (LIR) 0,2 0,07

S349T 1,7 0,3

P364S 1,7 0,3

K378X 1,7 0,3

A381V 1,3 14,3 0,6 0,07

Y383X 7,1 0,5 0,3 0,1

P387L (UBA) 0,5 3,4 0,6 0,1

G1205C (UBA) 1,7 0,3

A390X (UBA) 1,4 11,1 1,3 7,1 1,5 0,07

A390V (UBA) 1,7 0,3

P392L (UBA) 37,7 9,0 18,6 8,6 22,2 2,4 5,4 22,2 5,3 14,3 2,4 16,9 4,6 21,3 11,9 2,3 20,7 4,7

L394X ∆T (UBA) 1,4 3,4 0,9

L394X ∆C (UBA) 1,7 3,4 0,9

S397A (UBA) 0,2 0,07

S399P (UBA) 5,6 0,3

M401V (UBA) 7,1 0,3

M404V (UBA) 5,7 0,6 1,3 21,4 0,7 2,1 2,4 0,4

M404T (UBA) 5,6 0,3

G411S (UBA) 4,3 0,9

L413F (UBA) 5,6 0,3

L417Q (UBA) 0,8 0,07

D423X (UBA) 0,2 0,07

G425E (UBA) 0,2 0,07

G425R (UBA) 1,4 0,6 5,6 14,3 0,2 1,2 0,1

Total 37,7 10,2 37,1 9,8 39,0 2,4 - 5,4 38,9 9,2 92,7 5,1 22,0 4,6 27,7 10,5 27,2 3,1 34,5 5,9

Tableau tirée de (Guay-Bélanger, Cormier et al. 2015).

Figure 15. Récapitulatif des mutations du gène SQSTM1 identifiées chez les individus avec la MOP. La plupart des mutations associées avec la MOP sont situées dans l’exon 8 du gène SQSTM1, qui code pour le domaine de liaison à l’ubiquitine. Les mutations identifiées dans la partie supérieure de la figure sont celles rapportées dans les formes familiales de MOP, alors que celles présentées dans la partie inférieure ont été rapportées chez les individus atteints non apparentés. Figure tirée de (Guay-Belanger 2013).

4.2 Rôle de la protéine SQSTM1/p62 SQSTM1, également appelée p62, est une protéine de 440 acides aminés, avec un poids moléculaire de 62 kDa, qui contient neuf domaines d’interaction protéique (Figure 16). Ces différents domaines lui permettent d’interagir avec de multiples protéines, ce qui lui confère plusieurs rôles au sein de la cellule (Chung and Van Hul 2012). Entre autre, SQSTM1 est une protéine adaptatrice impliquée dans la voie de signalisation RANK/NF-κB. En effet, la liaison du RANKL à son récepteur membranaire RANK à la surface des ostéoclastes permet le recrutement de la protéine TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6), qui se lie à son tour à la protéine SQSTM1. Ensuite, via son domaine PB1, SQSTM1 interagit avec la protéine kinase C (PKC), ce qui entraîne la phosphorylation de l’inhibiteur de la kinase κB β (IKKβ) par la PKC. Une fois activé, l’IKKβ phosphoryle l’inhibiteur de κB (IκB), qui est ensuite dégradé par le protéasome, libérant ainsi le facteur de transcription NFκB. Ce dernier peut alors transloquer au noyau pour ainsi activer la transcription des gènes essentiels pour la différenciation et l’activité des ostéoclastes (Figure 17) (McManus and Roux 2012).

La protéine SQSTM1 est également impliquée dans les mécanismes de dégradation des protéines. Le système de dégradation par le protéasome permet de dégrader des protéines mal repliées ou endommagées et contrôle ainsi plusieurs mécanismes cellulaires, tels que l’apoptose, la réponse immunitaire, la transduction de signaux et le cycle cellulaire (Lippai and Low 2014). Brièvement, des molécules d’ubiquitine s’attachent aux protéines qui doivent être éliminées, formant ainsi une chaîne d’ubiquitine. Cette chaîne est ensuite reconnue par des protéines adaptatrices qui ont pour fonction de transporter ces protéines endommagées au protéasome afin que celles-ci soient dégradées (Kerscher, Felberbaum et al. 2006). La protéine SQSTM1 est l’une de ces protéines adaptatrices. En effet, via son domaine de liaison à l’ubiquitine (UBA), elle a la capacité de reconnaître les protéines ubiquitinées, et les transporte ensuite vers le protéasome (Seibenhener, Babu et al. 2004). SQSTM1 joue aussi un rôle dans l’autophagie. La macro-autophagie, ici appelée autophagie, est un mécanisme permettant à la cellule de digérer une partie de son contenu, pour ainsi éliminer des protéines ou des organites altérés. (Puyal, Ginet et al. 2008). La première étape du processus implique la formation d’une double membrane, nommée autophagosome, qui encercle une partie du cytoplasme de la cellule. Ensuite, cet autophagosome fusionne avec le lysosome, qui devient alors l’autolysosome, dans lequel des enzymes sont relâchées afin de dégrader son contenu (Figure 18) (Ichimura and Komatsu 2010). En plus de maintenir l’homéostasie cellulaire, l’autophagie participe à la différenciation cellulaire, au remodelage des tissus, au contrôle de la croissance cellulaire, à la défense cellulaire et à l’adaptation à un environnement défavorable (Cuervo 2004). La protéine SQSTM1 est impliquée dans la formation d’agrégats avec les protéines ubiquitinées. Par ailleurs, un défaut d’autophagie mène à l’accumulation de protéines non dégradées, que l’on observe souvent dans les maladies neurodégénératives (Wooten, Hu et al. 2006). La protéine SQSTM1 possède un domaine LC3-interacting region (LIR), lui permettant d’interagir avec la protéine Atg8/LC3, une

49 protéine cruciale pour la formation d’autophagosomes. Il a par ailleurs été démontré que l’interaction directe entre ces deux protéines est nécessaire pour la dégradation de ces agrégats via le mécanisme d’autophagie (Pankiv, Clausen et al. 2007). De plus, SQSTM1 possède un domaine Keap1-interacting region (KIR), lui permettant d’interagir avec la protéine Keap1, impliquée dans le stress oxydatif (Lau, Wang et al. 2010). Finalement, la protéine SQSTM1 est impliquée dans l’apoptose, un processus de mort programmée des cellules qui se veulent inutiles, endommagées ou infectées. En effet, celle-ci favorise l’agrégation des molécules caspase-8 ubiquitinées, une enzyme cruciale pour l’initiation de la voie extrinsèque du mécanisme d’apoptose, ce qui permet d’activer une cascade de signalisation menant au processus apoptotique (Jin, Li et al. 2009).

Figure 16. Domaines d’interaction de la protéine SQSTM1. La protéine SQSTM1 possède neuf domaines d’interactions, ce qui lui permet d’interagir avec une multitude de protéines, lui donnant ainsi plusieurs rôles importants au sein de la cellule. Figure adaptée de (Rea, Walsh et al. 2013).

Figure 17. Rôle de la protéine SQSTM1/p62 dans la voie de signalisation du RANK/NF- κB. La liaison du RANKL à son récepteur membranaire RANK à la surface des ostéoclastes permet le recrutement de la protéine TRAF6, qui lie à son tour la protéine SQSTM1/p62. SQSTM1 interagit ensuite avec la protéine kinase C (PKC) pour activer une cascade de signalisation qui permet au facteur de transcription NFκB de transloquer du cytoplasme au noyau et activer les gènes de l’ostéoclastogénèse. Figure tirée de (Guay- Belanger 2013).

Figure 18. Processus de macroautophagie. La première étape du processus implique la formation d’une double membrane qui encercle une partie du cytoplasme de la cellule. Cet autophagosome fusionne ensuite avec le lysosome, qui devient l’autolysosome, dans lequel des enzymes sont relâchées afin de dégrader son contenu. Figure tirée de (Klionsky, Abeliovich et al. 2008).

4.3 Conséquences fonctionnelles des mutations dans SQSTM1 Les mutations décrites dans le gène SQSTM1 sont pour la plupart situées dans la région codant pour le domaine de liaison à l’ubiquitine, suggérant qu’une altération de la liaison des chaînes d’ubiquitine pourrait jouer un rôle dans le développement de la MOP. Par ailleurs, ces mutations réduiraient la capacité de la protéine SQSTM1 à lier l’ubiquitine in vitro (Cavey, Ralston et al. 2005, Cavey, Ralston et al. 2006, Garner, Long et al. 2011). Ce défaut de liaison pourrait entraîner une accumulation de protéines p62 non dégradées, causant une activation aberrante de la voie de signalisation RANK/NF-κB et augmentant ainsi la différenciation et l’activité des ostéoclastes (Goode and Layfield 2010). D’ailleurs, les mutations stop (E396X, Y383X et K378X), qui causent la formation d’une protéine ayant un domaine UBA tronqué, ont été associées avec une plus forte activation de la voie du NF-κB, engendrant un phénotype clinique plus sévère (Rea, Walsh et al. 2006, Goode, Long et al. 2014). Cependant, l’identification des mutations SQSTM1/P364S et SQSTM1/A381V localisées dans l’exon 7 du gène SQSTM1, soit en dehors de la région codant pour le domaine de liaison à l'ubiquitine, sont tout de même associées avec une activité élevée de NF-κB et contribueraient à la différenciation et l’activité des ostéoclastes pagétiques (Najat, Garner et al. 2009, Rea, Walsh et al. 2009).

L’hypothèse d’un défaut de régulation de l’autophagie dans les ostéoclastes a également été suggérée dans la MOP. Dans les ostéoclastes pagétiques, la protéine SQSTM1 est surexprimée, et ce peu importe le statut mutationnel (Chamoux, Couture et al. 2009). Étant donné que la protéine SQSTM1 est dégradée via le processus d’autophagie, des niveaux élevés de cette protéine pourraient indiquer une réduction du flux autophagique dans les ostéoclastes pagétiques (Ralston and Layfield 2012). Par ailleurs, les mutations dans le gène SQSTM1 altèrent le flux autophagique (Hocking, Whitehouse et al. 2012). De plus, la protéine SQSTM1 interagit avec la protéine Autophagy-Linked FYVE-containing protein (ALFY) dans les ostéoclastes. Dans des conditions de dénutrition, puissant inducteur d’autophagie in vitro, on observe la formation d’agrégats cytoplasmiques contenant les protéines SQSTM1 et ALFY, et des résultats similaires sont observés lorsque la protéine SQSTM1 est surexprimée. Ces résultats suggèrent un rôle pour l’autophagie dans la régulation de la formation et la fonction des ostéoclastes, et pourraient expliquer les effets spécifiques des mutations du gène SQSTM1 sur les ostéoclastes (Hocking, Mellis et al. 2010). D’ailleurs, selon certains auteurs, cette accumulation de protéines non dégradées pourrait correspondre aux inclusions nucléaires et cytoplasmiques observées par microscopie électronique dans les ostéoclastes pagétiques (Azzam, Scott et al. 2009). Finalement, l’identification de mutations du gène SQSTM1 dans le domaine LIR (SQSTM1/D335E) interagissant avec la protéine LC3, et dans le domaine KIR (SQSTM1/S349T) interagissant avec Keap1 supporte davantage le rôle de l’autophagie et du stress oxydatif dans la MOP (Falchetti, Di Stefano et al. 2009, Wright, Rea et al. 2013).

Plusieurs études ont été réalisées afin de déterminer la contribution exacte des mutations dans le gène SQSTM1 dans le développement de la MOP. Une première étude a montré que les ostéoclastes des patients pagétiques étaient plus nombreux, contenaient un nombre plus élevé de noyaux, avaient une meilleure capacité de résorption osseuse et étaient plus résistants à l’apoptose. Cependant, ces caractéristiques étaient peu influencées par la mutation SQSTM1/P392L, à l’exception des individus sains porteurs de cette mutation pour lesquels un phénotype ostéoclastique intermédiaire a été observé, suggérant que cette mutation pourrait prédisposer à la MOP en contribuant au statut hyperactif des ostéoclastes (Chamoux, Couture et al. 2009). Dans une autre étude, les précurseurs ostéoclastiques porteurs de la mutation SQSTM1/P392L étaient hypersensibles au RANKL et au TNFα, mais pas à la 1,25(OH)2 vitamine D3 et par conséquent, n’exprimaient pas des niveaux élevés de TAFII-17 (Kurihara, Hiruma et al. 2007). Des modèles in vivo ont également été générés. D’abord, un modèle murin pour lequel le gène SQSTM1 a été inactivé (SQSTM1-/-) a été développé. Une altération de l’ostéoclastogénèse, accompagnée d’une inactivation de la voie du NF-κB chez ces souris, a permis de mettre en évidence l’importance de la protéine SQSTM1/p62 dans le métabolisme osseux (Duran, Serrano et al. 2004). Le promoteur tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) a été utilisé afin d’exprimer la mutation SQSTM1/P392L dans la lignée des ostéoclastes chez un modèle de souris transgénique (TRAP- p62P392L). Ces souris avaient un nombre plus élevé d’ostéoclastes, mais n’ont toutefois pas développé des

53 lésions osseuses comme celles observées dans la MOP chez l’humain. De plus, les précurseurs ostéoclastiques provenant de ces souris transgéniques étaient hypersensibles au RANKL et au TNFα, mais n’étaient pas hypersensibles à la 1,25(OH)2 vitamine D3 et les ostéoclastes ne possédaient pas un nombre plus élevé de noyaux. Ces résultats suggèrent donc que la présence de la mutation SQSTM1/P392L contribue à l’augmentation de l’ostéoclastogénèse, sans toutefois permettre de reproduire le phénotype pagétique complet (Kurihara, Hiruma et al. 2007). Ensuite, cette même équipe a généré un modèle de souris arborant la mutation SQSTM1/P394L, qui est l’équivalent de la mutation SQSTM1/P392L observée chez l’humain. Des résultats similaires ont été obtenus et encore une fois, ce modèle murin n’a pas permis de reproduire l’ensemble des caractéristiques phénotypiques de la MOP. Il a donc été suggéré que la mutation SQSTM1/P392L pourrait prédisposer à la MOP en augmentant la sensibilité des précurseurs ostéoclastiques aux cytokines ostéoclastogéniques et/ou le potentiel ostéoclastogénique du microenvironnement osseux (Hiruma, Kurihara et al. 2008). Finalement, une équipe indépendante a généré un modèle de souris avec la mutation SQSTM1/P394L, et concluait que la présence de cette mutation était suffisante pour développer la MOP. En effet, ces souris ont développé des lésions osseuses qui présentaient des similitudes à celles observées chez l’humain, caractérisées par une augmentation focale du remodelage osseux et par la présence d’un os tissé. De plus, les ostéoclastes dans ces lésions étaient plus nombreux et contenaient un nombre élevé de noyaux par rapport au contrôle, mais toutefois assez faible par rapport à ce qu’on observe habituellement dans un ostéoclaste pagétique (Daroszewska, van 't Hof et al. 2011). Ces résultats confirment donc que la mutation P394L chez la souris permet de reproduire certaines caractéristiques du phénotype pagétique aux niveaux clinique et cellulaire, quoique ce phénotype pagétique soit incomplet dans les deux études. De plus, ces deux études ont étudié différemment les lésions osseuses, soit uniquement les vertèbres dans le premier cas, et les os longs dans l’autre. De façon intéressante, le rôle de l’autophagie dans la MOP a encore une fois été mis en évidence. En effet, une augmentation de l’expression génique de SQSTM1, LC3 et Atg5 dans les précurseurs ostéoclastiques de ces souris, ainsi qu’une augmentation de l’expression de la protéine LC3-II dans les ostéoclastes ont été observées, suggérant une dérégulation de l’autophagie et une augmentation de la formation d’autophagosomes (Daroszewska, van 't Hof et al. 2011). Finalement, le rôle exact des mutations dans le gène SQSTM1 dans le développement de la MOP demeure incertain. Néanmoins, la plupart des études suggèrent que d’autres facteurs, soit génétiques ou environnementaux, sont nécessaires afin de développer le phénotype complet de la maladie.

4.4 Mutations dans le gène SQSTM1 associées à d’autres maladies Étant donné son rôle central dans plusieurs mécanismes cellulaires, la protéine SQSTM1 est impliquée dans plusieurs autres maladies. La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie caractérisée par la

dégénération des neurones moteurs du cerveau et de la moelle épinière. Des agrégats protéiques ont été observés dans les neurones moteurs affectés par la maladie, et il a été démontré que leur formation est causée par une accumulation de la protéine SQSTM1 (Gal, Strom et al. 2007). Par ailleurs, des mutations dans le gène SQSTM1 ont été rapportées dans les formes familiales et sporadiques de la SLA (Fecto, Yan et al. 2011, Chen, Zheng et al. 2014). De façon intéressante, la mutation SQSTM1/P392L est la mutation la plus fréquemment associée avec la SLA, tout comme dans la MOP. Par ailleurs, on rapporte un individu porteur de cette mutation qui a développé à la fois la SLA et la MOP, suggérant des mécanismes communs pour le développement de ces maladies (Kwok, Morris et al. 2014). Des mutations dans ce gène ont également été identifiées chez des individus atteints de démence fronto-temporale, ou de SLA associée avec une démence fronto-temporale (Le Ber, Camuzat et al. 2013). À ce jour, plus de 30 mutations ont été rapportées dans la SLA et/ou la démence fronto-temporale, et contrairement à ce qui est observé dans la MOP, ces mutations sont localisées dans différentes régions du gène SQSTM1. Les conséquences fonctionnelles de ces mutations sont encore inconnues, mais pourraient impliquer une dérégulation de la voie du NF-κB et du processus d’autophagie, tout comme dans la MOP (Rea, Majcher et al. 2014). Étant donné son rôle dans la dégradation par le protéasome, la protéine SQSTM1 est impliquée dans certaines maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer. En effet, la protéine SQSTM1 prévient l’accumulation de la protéine Tau, empêchant ainsi la formation des agrégats responsables de la neurodégénération (Ramesh Babu, Lamar Seibenhener et al. 2008). Finalement, plusieurs études ont démontré des corrélations entre l’expression de la protéine SQSTM1 et le cancer, notamment dans le cancer du sein où une surexpression fut observée (Thompson, Harris et al. 2003, Geetha, Vishwaprakash et al. 2012).

4.5 Rôle possible des particules virales Le rôle possible des particules virales a été suggéré suite à l'identification d’inclusions nucléaires et cytoplasmiques provenant de virus de la famille des paramyxovirus dans les ostéoclastes pagétiques (Rebel, Malkani et al. 1976). Le virus de la rougeole a été détecté par plusieurs équipes de recherche dans les cellules osseuses des patients pagétiques à l’aide de plusieurs techniques différentes, telles que l’hybridation in situ, l’immunohistochimie, et la RT-PCR (Basle, Fournier et al. 1986, Mills, Frausto et al. 1994, Reddy, Singer et al. 1995, Reddy, Singer et al. 1996, Friedrichs, Reddy et al. 2002). Certaines études ont également identifié la présence du virus de la maladie de Carré du chien, un autre virus de la famille des paramyxovirus, chez les patients atteints de MOP (Gordon, Anderson et al. 1991, Mee, Dixon et al. 1998). Cependant, plusieurs équipes ont échoué à détecter la présence de tels virus chez les patients pagétiques, créant ainsi une controverse dans la littérature concernant un rôle possible des particules virales dans la MOP (Ralston, Digiovine et al. 1991, Helfrich, Hobson et al. 2000, Ooi, Walsh et al. 2000, Matthews, Afzal et al. 2008).

55 Néanmoins, plusieurs études ont permis d’établir un rôle fonctionnel des particules virales dans le développement de la MOP. Le virus de la maladie de Carré pourrait induire l’ostéoclastogénèse par les précurseurs ostéoclastiques en culture, via l’augmentation de l’expression de la protéine SQSTM1 et l’activation de la voie du NF-κB, suggérant un rôle pour ce virus dans la MOP (Selby, Davies et al. 2006). La transduction des précurseurs ostéoclastiques humains avec le gène codant pour la nucléocapside du virus de la rougeole (MVNP) résulte en la formation d’ostéoclastes plus nombreux, de plus grande taille, multinucléés, avec des capacités de résorption supérieures et produisant des quantités élevées de la cytokine IL-6. De plus, ces précurseurs ostéoclastiques sont hypersensibles à la 1,25(OH)2 vitamine D3. Ces résultats démontrent que l’expression du gène MVNP stimule la formation d’ostéoclastes qui expriment un phénotype pagétique complet similaire à celui observé dans la MOP (Kurihara, Reddy et al. 2000). À la lumière de ces résultats, un modèle de souris transgénique exprimant le gène MVNP dans les cellules de la lignée des ostéoclastes a été généré, et l’analyse des ostéoclastes chez ces souris a confirmé les résultats précédemment observés in vitro. De façon plus importante, 30% de ces souris ont développé des lésions pagétiques similaires à celles observées chez l’humain. La présence du gène MVNP semble donc permettre la reproduction du phénotype pagétique, à l’exception de l’hypersensibilité des précurseurs ostéoclastiques au RANKL, suggérant l’implication d’autres facteurs dans le développement de la maladie (Kurihara, Zhou et al. 2006). Finalement, afin de déterminer les rôles potentiels de MVNP et de la mutation SQSTM1/P392L dans la pathogénèse de la MOP, les cellules de la moelle provenant de patients pagétiques mutés et de contrôles sains ont été testées pour la présence du gène MVNP, démontrant que les ostéoclastes d’environ 70% des patients atteints de la MOP exprimaient ce gène. Les précurseurs ostéoclastiques provenant de patients mutés dans SQSTM1 et négatifs pour le MVNP étaient hypersensibles au RANKL et formaient plus d’ostéoclastes, alors que les ostéoclastes des patients mutés dans SQSTM1 et exprimant également MVNP avaient un phénotype pagétique complet. Un modèle de souris P394L exprimant le gène MVNP dans la lignée des ostéoclastes a alors été généré. Ce modèle murin a développé des lésions pagétiques contenant des ostéoclastes qui avaient le phénotype pagétique cellulaire complet. Ainsi, ces résultats ont permis de démontrer que la présence de la mutation SQSTM1/P392L est responsable de l’hypersensibilité des précurseurs ostéoclastiques au RANKL et de l’augmentation de l’ostéoclastogénèse, alors que la présence du gène MVNP est responsable de la multinucléation des ostéoclastes, de la sécrétion de niveaux élevés d’IL6, en plus de l’hypersensibilité des précurseurs ostéoclastiques à la 1,25(OH)2 vitamine D3 (Kurihara, Hiruma et al. 2011). Ces résultats supportent donc un rôle pour une infection virale dans la pathogénèse de la MOP. Néanmoins, étant donné que l’absence du gène MVNP chez un bon nombre de patients, il ne fait aucun doute que d’autres facteurs génétiques ou environnementaux sont impliqués dans le développement de la MOP.

4.6 Corrélations phénotype-génotype D’après les différentes études de corrélations phénotype-génotype publiées, les individus pagétiques porteurs d’une mutation dans le gène SQSTM1 sont diagnostiqués environ cinq ans plus tôt que les individus atteints non porteurs de cette mutation (59,4 ± 11,5 vs 65,0 ± 10,4 ans, p < 0,0001) (Visconti, Langston et al. 2010). Les individus porteurs d’une mutation dans le gène SQSTM1 ont également un nombre d’os atteints plus élevé que les individus non mutés (6,46 ± 6,03 vs 2,47 ± 2,47 os, p < 0,0001), suggérant la présence d’un phénotype plus sévère chez les individus mutés (Rea, Walsh et al. 2009). Ces observations ont par ailleurs été répliquées dans d’autres populations (Collet, Michou et al. 2007, Gennari, Gianfrancesco et al. 2010). De plus, les individus porteurs d’une mutation stop dans le gène SQSTM1, telle que A390X, L394X et E396X, pouvant entraîner la production d’une protéine tronquée, ont un nombre d’os atteints plus élevé que les individus porteurs d’une mutation faux-sens (6,0 ± 2,7 vs 3,4 ± 2,4 os, p < 0,0001), suggérant un phénotype plus sévère chez les porteurs d’une mutation stop (Hocking, Lucas et al. 2004). Certaines études ont également permis d’observer que les individus mutés dans SQSTM1 requéraient plus souvent un traitement par bisphosphonates et avaient une qualité de vie moindre que les patients pagétiques non porteurs d’une mutation (Collet, Michou et al. 2007, Visconti, Langston et al. 2010).

Dans la littérature, quelques individus porteurs de deux mutations dans le gène SQSTM1 ont été rapportés. Un individu porteur des mutations SQSTM1/P392L et SQSTM1/S399P sur le même allèle a été identifié, et semble avoir un phénotype clinique très sévère. En effet, presque la totalité de son squelette est affecté par la MOP, causant des déformations aux membres inférieurs et supérieurs, mais également dans la colonne et le crâne (Eekhoff, Karperien et al. 2004). Également, quatre individus porteurs de deux mutations situées sur des allèles différents dans le gène SQSTM1 ont été identifiés : trois individus porteurs de la mutation SQSTM1/P392L accompagnée des mutations SQSTM1/A390X, SQSTM1/A381V et SQSTM1/G411S, ainsi qu’un individu porteur des mutations SQSTM1/G425R et SQSTM1/I424S. Cependant, on observe chez ces individus un phénotype clinique similaire aux individus porteurs d’une seule mutation, suggérant un phénotype clinique particulièrement sévère uniquement chez les porteurs de deux mutations situées sur le même allèle (Collet, Michou et al. 2007, Gennari, Gianfrancesco et al. 2010, Visconti, Langston et al. 2010). De plus, trois individus homozygotes pour la mutation SQSTM1/P392L ont été rapportés dans la littérature, incluant un cas provenant d’une forme familiale de MOP et deux cas atteints non apparentés. Cependant, ces trois individus homozygotes ont un phénotype similaire aux individus hétérozygotes, sans évidence d’une sévérité excessive du phénotype clinique, confirmant ainsi le vrai caractère dominant de la mutation SQSTM1/P392L (Morissette, Laurin et al. 2006, Chung, Beyens et al. 2008).

Finalement, de nombreux apparentés porteurs d’une mutation dans le gène SQSTM1 ne semblent pas développer la MOP. En effet, une étude a démontré que seulement 23,5% des enfants qui ont hérité d’une

57 mutation dans le gène SQSTM1 développent la maladie. De plus, ces individus semblent avoir une maladie moins sévère que leurs parents, basé sur le nombre d’os atteints (1 [1; 6] vs 12 [1; 43] os, p = 0,002), et l’atteinte squelettique (3,8% [0,2; 10,5] vs 36,8% [5,0, 63,5] os, p = 0,003). Ces résultats supportent donc l’expressivité variable de cette maladie dans les formes familiales et aussi le rôle possible de facteurs environnementaux modificateurs, probablement protecteurs, dans la MOP (Bolland, Tong et al. 2007, Cundy, Rutland et al. 2015).

4.7 Interactions entre gènes et interactions gène-environnement Deux études ont récemment suggéré l’existence d’interactions entre gènes dans la MOP. Une première étude a mis en évidence un effet synergique pour la mutation SQSTM1/P392L et un polymorphisme dans le gène TNFRSFIIA, qui mène à une augmentation de l’activité basale de NF-κB (Gianfrancesco, Rendina et al. 2012). De plus, une seconde étude a démontré que les mutations dans le gène SQSTM1 combinées aux allèles associés avec la MOP dans les GWAS pourraient agir de manière additive pour prédire l’étendue et la sévérité de la maladie, bien que la taille d’effet des mutations dans SQSTM1 s’avère environ trois fois plus élevé que celle des polymorphismes (Albagha, Visconti et al. 2013). Afin d’arriver à ces conclusions, les auteurs ont développé un score de sévérité qui n’a toutefois pas encore été validé. Brièvement, ce score s’appuie sur quelques caractéristiques cliniques et complications associées à la MOP. Ainsi, plus le patient a des complications secondaires à la maladie, plus son score de sévérité sera élevé. De plus, afin d’étudier les effets des allèles associés avec la MOP dans les GWAS, un score de risque allélique a été développé. Ainsi, pour chaque allèle sélectionné, un score a été établi dépendamment de la taille de l'effet du génotype de l’individu, puis a été ajusté en fonction de l’association de chaque allèle avec la MOP. Le score pour chaque allèle étudié a été additionné, donnant ainsi un score de risque allélique cumulatif. Une association positive entre ce score et la sévérité de la maladie a par ailleurs été démontrée (Albagha, Visconti et al. 2013). Finalement, un score de risque génétique tenant compte du score de risque allélique et de la présence d’une mutation dans le gène SQSTM1 a été généré. Cette classification a permis de démontrer que les individus porteurs d’une mutation dans le gène SQSTM1 combinée aux allèles associés dans les GWAS avaient un phénotype clinique plus sévère, avec une sensibilité de 70%, mais une spécificité de seulement 55% (Albagha, Visconti et al. 2013).

La diminution de l’incidence et de la sévérité de la MOP dans certaines régions géographiques laisse présager l’implication de facteurs environnementaux qui pourraient modifier l’expressivité du phénotype de la MOP. L’interaction entre les particules de la rougeole (MVNP) et la protéine p62 est sans doute l’interaction gène- environnement la mieux caractérisée dans la MOP. En effet, les souris qui expriment la mutation SQSTM1/P394L et le gène MVNP développent un phénotype complet de la MOP, suggérant une interaction

entre ces deux facteurs (Kurihara, Hiruma et al. 2011). Le tabagisme a précédemment été associé avec la MOP (Michou, Collet et al. 2012). Or, l’exposition à la fumée de tabac ou à des concentrés de fumée de tabac mène à l’augmentation de l’expression génique de SQSTM1 in vitro (Jorgensen, Dozmorov et al. 2004). De plus, les condensés de fumée de cigarette peuvent induire l’autophagie in vitro (Shi, Yin et al. 2012). On observe également une augmentation de l’expression de la protéine SQSTM1 dans des conditions de dénutrition, qui peuvent éventuellement mener à l’activation du mécanisme d’autophagie (Lehnert, Byrne et al. 2006). Tel que précédemment mentionné, la prévalence élevée de la MOP observée dans la région anglaise du Lancashire pourrait être liée à la présence d’arsenic dans l’eau approvisionnant les habitants de cette région (Lever 2002). Par ailleurs, il a été démontré que l’exposition à l’arsenic dérégule l’autophagie en bloquant le flux autophagique via l’activation de la voie Nrf2/Keap1, impliquée dans le stress oxydatif, menant ainsi à l’augmentation de l’expression de la protéine SQSTM1 (Lau, Zheng et al. 2013). Donc, ces facteurs environnementaux pourraient moduler l’expression de la protéine p62, notamment via le stress oxydatif et l’autophagie, et par le fait même moduler l’expressivité de la MOP (Figure 19).

Figure 19. Schéma pathogénique de la MOP. L’incidence et l’expressivité de la maladie osseuse de Paget peuvent être modulées par la présence de facteurs génétiques et environnementaux. Figure tirée de (Guay-Bélanger, Cormier et al. 2015).

5. Médecine personnalisée dans les maladies osseuses La médecine personnalisée est un concept qui vise à administrer le bon traitement, au bon patient, et au bon moment, dans le but d’optimiser l’effet thérapeutique individuel et de diminuer l’apparition d’effets indésirables (Dieudé and Garchon 2011). Afin d’appliquer ce concept, il est impératif de caractériser des biomarqueurs fiables pour développer des tests biologiques qui permettront d’augmenter l’efficacité diagnostique et

59 thérapeutique, en plus d’aider de façon considérable à la compréhension des mécanismes physiopathologiques des maladies étudiées (Gaudin 2011). Un biomarqueur est une caractéristique qui est mesurée et évaluée objectivement comme indicateur d’un processus biologique normal, un processus pathologique, ou pour une réponse pharmacologique à une intervention thérapeutique. Selon leur application pour la détection des maladies, il existe trois classes distinctes de biomarqueurs : les biomarqueurs de dépistage, de diagnostic et de pronostic. Les biomarqueurs de dépistage sont utilisés pour prédire la présence potentielle d’une maladie chez un individu asymptomatique. Les biomarqueurs utilisés pour le diagnostic permettent d’établir la présence de la maladie chez un individu, alors que les biomarqueurs pronostiques permettent d’évaluer la progression de la maladie. Les biomarqueurs peuvent également être utilisés dans le but d’évaluer l’efficacité d’un traitement, ou de prévenir le développement de complications associées à la pathologie d’intérêt. De plus, ils peuvent parfois s’avérer être des cibles thérapeutiques pertinentes, notamment lorsque leur rôle causal dans la pathogénèse de la maladie est démontré (Azuaje 2010). Les biomarqueurs peuvent être étudiés seuls, mais dans la plupart des cas, c’est la combinaison de plusieurs biomarqueurs qui s’avère être le plus pertinent, notamment dans le cas des maladies complexes (Vittecoq and Lequerré 2011).

L’utilisation de biomarqueurs est de plus en plus présente dans la pratique clinique, notamment pour le traitement de certains cancers. En effet, on note l’apparition de tests compagnons, soit des outils développés spécifiquement dans le but de sélectionner les patients qui sont les plus susceptibles de bien répondre et de bien tolérer un traitement ciblé (Olsen and Jorgensen 2014). Par exemple, le gène human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) est surexprimé dans environ un quart des individus atteints d’un cancer du sein, menant au développement d’une forme très agressive de cancer. Des anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine HER2 ont donc été développés (Trastuzumab et Pertuzumab), augmentant considérablement le pronostic pour ce type de cancer (Reynolds, Sarangi et al. 2014). Également, des mutations dans le gène B- Raf proto-oncogene (BRAF), qui code pour une protéine kinase, sont présentes chez environ 50% des individus atteints d’un mélanome. Ainsi, le développement d’un inhibiteur qui cible spécifiquement ces protéines kinases mutées a été développé (Verumafenib), améliorant ainsi la réponse clinique et la survie des patients atteints (Mancini, Pinzani et al. 2015). Ainsi, ces exemples confirment l’importance de rechercher des biomarqueurs fiables, qui contribuent de façon importante à améliorer le traitement des patients dans la pratique clinique. Les biomarqueurs peuvent provenir de sources très variables, les plus fréquemment étudiées étant l’ADN, l’ARN et les protéines. On parle alors de biomarqueurs génétiques et de marqueurs protéiques ou biochimiques, respectivement.

5.1 Biomarqueurs génétiques De nombreuses maladies sont influencées par des facteurs génétiques. Ainsi, les variations génétiques constituent une source inestimable pour la caractérisation de nouveaux biomarqueurs.

5.1.1 Structure de l’ADN L’acide désoxyribonucléique (ADN), que l’on retrouve dans le noyau des cellules, contient le matériel héréditaire et constitue le génome chez les êtres vivants. L’ADN est formé de l’enchaînement de nucléotides. Ces nucléotides sont composés d’un groupement phosphate, d’un sucre, et d’une base azotée (adénine (A), guanine (G), cytosine (C) ou thymine (T)). Il existe donc quatre nucléotides distincts, nommés selon leur base azotée correspondante (A, G, C ou T) (Griffiths and National Center for Biotechnology Information (États-Unis) 2000). La séquence de ces nucléotides est spécifique et est nécessaire au bon fonctionnement de l’organisme. Le génome humain est constitué d’environ 3 milliards de nucléotides, et environ 99,9% de ces nucléotides sont identiques entre les individus (Marian 2012). L’ADN possède une structure en double hélice. En effet, il est composé de deux brins complémentaires, formés d’une chaîne de nucléotides maintenus ensemble par des liens phosphodiester. Ces deux brins sont maintenus ensemble par des liaisons hydrogènes entre les bases azotées, l’adénine s’associant toujours avec la thymine, et la guanine avec la cytosine (Figure 20) (Snustad and Simmons 2006). Les gènes sont faits d’ADN et sont considérés comme étant l’unité fondamentale physique et fonctionnelle de l’hérédité. En effet, ceux-ci contiennent les informations nécessaires pour produire les protéines. On estime qu’il existe entre 20 000 et 25 000 gènes chez l’humain (Handbook - Genetics Home Reference, National Institutes of Health, 2014). Ces gènes sont composés de régions régulatrices, d’introns et d’exons. Les gènes représentent environ 5% du génome et les exons, soit les parties du gène qui codent pour les protéines, représentent environ 1% du génome. Ainsi, la fonction de la majeure partie du génome demeure inconnue à ce jour (Marian 2012).

Figure 20. Structure de l’ADN. L’ADN possède une structure en double hélice composée de deux brins complémentaires formés de nucléotides, et maintenus ensemble par des liaisons hydrogènes entre les bases azotées. Figure tirée du Handbook - Genetics Home Reference, National Institutes of Health, 2014.

5.1.2 Variations génétiques Il existe deux types de variations génétiques: les mutations et les polymorphismes. Les mutations sont des altérations permanentes dans la séquence de l’ADN, et ont la plupart du temps un effet fonctionnel délétère (Wright 2001). Ce sont des événements très rares, qui se produisent dans moins de 1% des cas. Dépendamment de leur nature et de leur localisation dans le génome, les conséquences des mutations peuvent varier. Par exemple, lorsqu’une mutation dans l’ADN cause un changement dans la séquence d’acides aminés de la protéine, la protéine résultante peut fonctionner anormalement ou être complètement éliminée. Ainsi, si cette protéine joue un rôle crucial dans l’organisme, son altération peut entraîner le développement d’une maladie (Handbook - Genetics Home Reference, National Institutes of Health, 2014). Les mutations peuvent être de nature germinale, somatique ou post-zygotique. Les mutations germinales sont présentes dans les cellules germinales et sont transmises par un parent lors de la fécondation. Ainsi, lorsque la mutation est germinale, celle-ci est présente dans toutes les cellules de l’individu porteur. Les mutations somatiques sont des mutations qui surviennent de façon spontanée au cours de la vie d’un individu. La mutation se produit initialement dans une cellule, et sera ensuite transmise à toutes ses cellules

descendantes. Ainsi, contrairement aux mutations germinales, les mutations somatiques sont présentes uniquement dans certaines sous-populations cellulaires (Griffiths and National Center for Biotechnology Information (États-Unis) 2000). Les mutations post-zygotiques, quant-à-elles, sont des mutations somatiques qui surviennent dans les stades les plus précoces du développement embryonnaire, causant ainsi une distribution en mosaïque des cellules normales et mutées dans les tissus ou les organes des individus porteurs de ce type de mutation (Weinstein 2006). Dans certaines maladies, l’existence d’un spectre mutationnel a été rapportée, avec l’identification de mutations causales à différents niveaux cellulaires. C’est notamment le cas dans la neurofibromatose de type 1, une maladie généralement causée par des mutations germinales dans le gène neurofibromin 1 (NF1), pour laquelle des individus atteints porteurs de mutations post-zygotiques dans ce gène ont été identifiés. Le phénotype clinique résultant est alors proportionnel au nombre de cellules mutées, les individus mutés au niveau germinal ayant généralement une maladie plus sévère (Kaplan, Foster et al. 2010, Biesecker and Spinner 2013). Les polymorphismes sont des altérations de l’ADN ayant une fréquence de plus de 1% dans la population. Contrairement aux mutations, les polymorphismes ont la plupart du temps des effets fonctionnels mineurs ou nuls. Ce sont par ailleurs ces polymorphismes qui déterminent notre apparence et notre comportement, mais ils peuvent également augmenter notre prédisposition à certaines maladies (Frazer, Murray et al. 2009). Selon la fréquence de leur allèle mineur, les polymorphismes se divisent en deux catégories : les variants communs et les variants rares. Les variants communs sont des polymorphismes dont la fréquence de l’allèle mineur est supérieure à 3 à 5%, alors que les variants rares ont une fréquence de l’allèle mineur entre 0,1% et 3%. Par ailleurs, ces derniers seraient plus susceptibles d’avoir un impact fonctionnel et ainsi augmenter le risque de développer une maladie que les variants communs (Bodmer and Bonilla 2008).

Les polymorphismes de nucléotides simples (SNPs) sont des variations de la séquence d’ADN dans laquelle un seul nucléotide (A, T, G ou C) est modifié. Il existe également des variants dits structuraux, qui incluent les insertions/délétions, substitutions, inversions et les variations du nombre de copies (CNV) (Figure 21). Cependant, les variations les plus fréquentes sont les SNPs (Frazer, Murray et al. 2009). La plupart des SNPs ont des effets fonctionnels mineurs ou nuls, mais leur combinaison peut permettre de prédire la susceptibilité de développer une pathologie, notamment pour les maladies complexes. En effet, contrairement aux maladies monogéniques qui sont habituellement causées par des altérations d’un seul gène, les maladies complexes sont causées par une combinaison de plusieurs facteurs génétiques et de facteurs non génétiques, tels que les facteurs environnementaux. Par ailleurs, le profil génétique de ces maladies complexe est probablement déterminé par une combinaison de variants génétiques qui sont fréquents dans la population, et qui ont individuellement un faible effet fonctionnel sur la maladie. Les études pangénomiques d’association sont d’ailleurs basées sur cette hypothèse, permettant de découvrir des milliers de SNPs associés à différentes pathologies multifactorielles (Sebastiani, Timofeev et al. 2009). Ainsi, étant donné leur fréquence élevée, leur

63 caractère binaire et leurs possibles conséquences fonctionnelles, les SNPs sont les marqueurs génétiques les plus utilisés en recherche (Garchon and Dieudé 2011).

Figure 21. Principales classes de variants génétiques chez l’humain. Les variations les plus fréquentes sont les SNPs, dans lesquelles un seul nucléotide est altéré. Il existe cependant des variations structurales, qui incluent les insertions/délétions, substitutions, inversions et les variations du nombre de copies (CNV). Figure tirée de (Frazer, Murray et al. 2009).

5.1.3 Techniques de détection des polymorphismes et/ou des mutations Plusieurs techniques de séquençage et de génotypage ont été développées afin d’identifier des polymorphismes associés à différentes maladies. Les techniques de séquençage peuvent être utilisées pour déterminer la séquence d’ADN contenant des polymorphismes préalablement connus, mais sont également très utiles pour l’identification de nouveaux polymorphismes. Parmi les techniques de séquençage, on note entre autre le séquençage avec la méthode Sanger, et le séquençage de seconde génération. Le séquençage avec la méthode Sanger, également nommé méthode de terminaison de chaîne, débute par l’appariement d’une amorce à la matrice d’ADN simple brin qui a été préalablement amplifiée et dénaturée. Ensuite, des didésoxynucléotides (ddNTP) fluorescents sont ajoutés à la réaction. L’absence d’un groupement hydroxyle dans la structure des ddNTPs empêche l’attachement du désoxyribonucléotide (dNTP) suivant, bloquant ainsi la polymérisation. À la fin de la réaction de séquençage, l’ADN est à nouveau dénaturé et les fragments d’ADN, qui sont de tailles différentes, sont séparés par électrophorèse. Finalement, à leur sortie du gel, chaque base fluorescente est identifiée automatiquement par l’ordinateur, ce qui permet de recréer la séquence d’ADN étudiée (Figure 22) (Gibson, Muse et al. 2004).

Le séquençage de seconde génération, ou séquençage à haut débit, permet de générer un grand nombre de séquences en une seule réaction et ce, à un prix très avantageux. Pour ces raisons, le séquençage de

seconde génération est maintenant l’outil privilégié pour les analyses de l’exome ainsi que du génome entier. Plusieurs plateformes développées par des compagnies sont actuellement disponibles sur le marché, ces dernières utilisant des technologies différentes. De façon générale, pour chacune de ces plateformes, la première étape consiste à fragmenter de façon aléatoire l’ADN génomique. Ensuite, une librairie de fragments d’ADN simple brin doit être préparée, et ceux-ci sont amplifiés par PCR afin de permettre la réaction de séquençage (Metzker 2010). Il existe plusieurs technologies de séquençage dites de seconde génération, les principales étant le pyroséquençage, le séquençage avec des terminateurs réversibles et le séquençage par ligation. Le pyroséquençage est utilisé par la plateforme Roche 454. Le principe de cette méthode repose sur l’ajout des dNTPs un à un. Le dNTP complémentaire à la séquence est incorporé dans le brin en cours de synthèse qui est alors momentanément arrêtée. L’ajout de ce dNTP libère un pyrophosphate et une suite de réactions enzymatiques se produit, créant un signal lumineux qui est capté par une caméra, révélant ainsi la séquence du fragment analysé. Ensuite, la réaction de synthèse reprend, avec l’ajout d’un nouveau dNTP à la séquence, et la réaction de pyroséquençage se poursuit jusqu’à ce que tous les fragments aient été séquencés (Metzker 2010). Le séquençage à l’aide de terminateurs réversibles est utilisé entre autres par la plateforme HiSeq2000 d’Illumina. Le séquençage est effectué à l’aide de quatre dNTP associés à un fluorochrome différent, et possédant un terminateur à leur extrémité qui permet d’arrêter la polymérisation. Après l’ajout d’un dNTP, un laser détecte le fluorochrome associé à cette base. Le terminateur du dNTP incorporé est ensuite enlevé, de même que son fluorochrome, et on peut alors procéder à l’ajout de la base suivante. Ainsi, chaque position du fragment séquencé est lue l’une après l’autre (Ilie, Long et al. 2014). La méthode de séquençage par ligation est utilisée par la plateforme SOLiD de Life Technologies. Cette méthode utilise des amorces universelles et des sondes formées de deux nucléotides, qui sont marquées avec quatre fluorochromes distincts. Ainsi, chaque fluorochrome représente quatre séquences de di-nucléotides sur une possibilité de 16. D’abord, une amorce universelle s’hybride au fragment d’ADN à séquencer. Ensuite, les sondes formées de deux nucléotides s’hybrident aux matrices d’ADN complémentaires, et sont liguées avec la ligase. La fluorescence émise est mesurée, et le clivage du fluorochrome permet à une autre sonde de s’hybrider. Un nouveau cycle pourra ainsi débuter cinq bases en amont de l’amorce. Ce processus sera répété pendant sept cycles. Le brin d’ADN synthétisé est par la suite retiré, une seconde amorce universelle s’hybride à la matrice d’ADN en décalant d’une base, et le processus de ligation se répète. Globalement, cinq amorces universelles sont utilisées pour la réaction de séquençage, permettant ainsi à chaque base d’être mesurée deux fois (Rodríguez-Ezpeleta, Hackenberg et al. 2012). Peu importe la technique utilisée, les réactions de séquençage de seconde génération produisent un grand nombre de séquences d’ADN. Ces séquences doivent donc être alignées à une séquence de référence ou assemblées de novo à l’aide d’outils bio- informatiques pour pouvoir être analysées (Metzker 2010).

65 Les méthodes de génotypage sont particulièrement utiles pour génotyper des polymorphismes d’intérêt préalablement identifiés, mais elles ne donnent des informations que sur la position étudiée, et ne permettent donc pas d’étudier la séquence adjacente aux variants analysés. La méthode des polymorphismes de taille de fragments de restriction (RFLP) est une ancienne méthode qui n’est plus utilisée de nos jours. Brièvement, l’ADN des individus était digéré par une enzyme de restriction, et les différents fragments étaient séparés par électrophorèse, puis transférés sur une membrane. Cette membrane était par la suite hybridée avec une sonde RFLP marquée. Cette sonde était un fragment d’ADN génomique cloné qui détectait les fragments d’ADN avec lesquels elle présentait une homologie. L’hybridation révélait alors des tailles de fragments différentes, chacune étant spécifique à un allèle, ce qui permettait d’identifier le génotype chez l’individu analysé (Bernot and Périlleux 1996).

La technologie TaqMan est une méthode de génotypage à émission de fluorescence. Une PCR est effectuée avec quatre amorces : deux oligonucléotides ordinaires encadrant le SNP d’intérêt afin de permettre l’amplification du fragment, et deux sondes s’hybridant spécifiquement à chacun des allèles sauvage et muté. Chaque sonde possède un fluorochrome rapporteur attaché à son extrémité 5' et un chromophore suppresseur non fluorescent à son extrémité 3' (Gibson, Muse et al. 2004). Il est à noter que les fluorochromes doivent être de couleurs différentes pour chacun des allèles afin de bien pouvoir les discriminer. Au début de l’étape d’élongation de la PCR, les sondes s’hybrident spécifiquement aux fragments d’ADN. À cette étape, la proximité du fluorochrome et du chromophore suppresseur empêche la détection de la fluorescence. Par la suite, lorsque la Taq polymérase dégrade la sonde hybridée dans le sens 5' vers 3', cela entraîne une libération du fluorochrome rapporteur, produisant ainsi une émission de fluorescence (Figure 23). Un programme informatique mesure les niveaux de fluorescence à chaque cycle de PCR et permet ainsi la discrimination des deux allèles afin de déterminer le génotype (Le Morvan, Formento et al. 2005).

La méthode de fusion à haute résolution (HRM pour high resolution melt) est une technique de génotypage simple, rapide et peu coûteuse. Elle permet de génotyper plusieurs individus simultanément pour une mutation ou un polymorphisme donné. La première étape consiste à amplifier par PCR un court fragment d’ADN contenant le polymorphisme ou la mutation d’intérêt. Ensuite, un agent intercalant fluorescent saturant se lie spécifiquement aux fragments d’ADN double brin. La température est alors augmentée progressivement, ce qui entraîne une dénaturation de certains fragments d’ADN, éliminant le fluorochrome, et provoquant une baisse de fluorescence. Des courbes de fusion, qui mettent en relation la fluorescence en fonction du temps, sont ensuite créées. Un changement mineur dans la séquence d’ADN est suffisant pour créer une variation dans la courbe de fusion. Ainsi, on peut facilement déterminer le génotype d’un individu en observant la courbe de fusion correspondante. Par exemple, l’ADN hétérozygote double brin se sépare en fragments simple brin à des températures inférieures à l’ADN homozygote. De plus, les deux génotypes homozygotes

auront des courbes de fusion différentes, en fonction de leur séquence d’ADN respective (Chomarat and Breysse 2011).

La plateforme Sequenom MassARRAY iPLEX est une technique de génotypage à haut débit qui permet d’analyser plusieurs polymorphismes simultanément chez un nombre élevé d’individus. La première étape consiste à effectuer une amplification par PCR à l’aide d’amorces spécifiques, suivie d’un traitement avec l’enzyme shrimp alkaline phosphatase (SAP) afin de neutraliser les dNTPs non incorporés dans la réaction. Ensuite, des amorces spécifiques à chaque allèle s’hybrident à la séquence d’ADN en amont du polymorphisme à génotyper. La réaction d’extension iPLEX est alors effectuée. À cette étape, les fragments d’ADN sont incubés avec des ddNTPs terminateurs dont la masse a été modifiée. Un nucléotide sera alors incorporé au site du polymorphisme, dépendamment de la séquence complémentaire. Ensuite, les fragments d’ADN sont analysés à l’aide de la spectrométrie de masse. En fonction de la masse du fragment et à l’aide d’un programme bio-informatique, il est possible de déterminer le génotype de l’individu, puisque chaque ddNTP possède une masse différente (Figure 24) (Gabriel, Ziaugra et al. 2009).

Figure 22. Principe du séquençage par la méthode Sanger. Cette méthode débute avec l’appariement d’une amorce spécifique à l’ADN préalablement dénaturé. Ensuite, des ddNTPs fluorescents sont ajoutés à la séquence complémentaire d’ADN, bloquant ainsi la polymérisation. Des fragments d’ADN de tailles différentes sont alors synthétisés. Ces derniers sont ensuite séparés généralement par le processus d’électrophorèse. Finalement, chaque base fluorescente est identifiée automatiquement par l’ordinateur, permettant de recréer la séquence complète du fragment étudié. Figure tirée de (Lamoril, Ameziane et al. 2008).

Figure 23. Principe de la méthode TaqMan. La méthode TaqMan utilise deux sondes qui possèdent un fluorochrome rapporteur à son extrémité 5' et un chromophore suppresseur à son extrémité 3', qui s’hybrident spécifiquement aux allèles sauvage et muté. Lorsque la Taq polymérase dégrade la sonde hybridée durant la réaction de PCR, cela entraîne la libération du fluorochrome rapporteur, produisant ainsi une émission de fluorescence qui pourra être analysé à l’aide d’outils bio-informatiques. Dépendamment de la fluorescence émise, le génotype de l’individu pourra être déterminé. Figure tirée de (Bass, Nikou et al. 2010).

Figure 24. Principe de la plateforme Sequenom MassARRAY iPLEX. Une amplification par PCR du fragment d’ADN contenant le polymorphisme d’intérêt est effectuée, suivie d’un traitement avec l’enzyme shrimp alkaline phosphatase (SAP). Ensuite, des amorces spécifiques à chaque allèle s’hybrident à la séquence d’ADN en amont du polymorphisme à génotyper. Un ddNTP terminateur dont la masse a été modifiée sera incorporé au site du polymorphisme, dépendamment de la séquence complémentaire. La masse des fragments d’ADN est finalement mesurée à l’aide de la spectrométrie de masse, permettant de déterminer le génotype de l’individu analysé. Figure adaptée de (Gabriel, Ziaugra et al. 2009).

69 5.2 L’ARN comme biomarqueur Tout comme le génome, le transcriptome, qui correspond à l’ensemble des acides ribonucléiques messagers (ARNm) produits lors de la transcription du génome, est une bonne source de biomarqueurs. En effet, la quantification de l’ARNm permet d’obtenir des informations sur le taux de transcription de différents gènes. De plus, la quantité d’ARNm est souvent corrélée avec l’activité des protéines codées (Chiocchia and Lequerré 2011). Ainsi, des mesures d’expression génique effectuées à l’aide de puces à ADN peuvent permettre d’identifier des gènes exprimés différemment chez des individus atteints d’une maladie donnée en comparaison avec des individus sains. Ces gènes différemment exprimés peuvent jouer un rôle dans la pathogénie de la maladie, ou encore prédire sa progression et sa sévérité, et peuvent donc devenir des biomarqueurs ayant une utilité clinique (Rao 2008). Par exemple, des études d’expression génique ont permis d’identifier une signature incluant 70 gènes qui a la capacité de prédire le pronostic chez des femmes atteintes d’un cancer du sein (van de Vijver, He et al. 2002, Bueno-de-Mesquita, Sonke et al. 2011).

Outre l’ARNm, d’autres classes d’ARN sont de bonnes sources de biomarqueurs. Les microARNs sont de petits ARN d’environ 22 nucléotides qui ont la capacité de réguler l’expression des gènes à l’aide de mécanismes de régulation post-transcriptionnelle (Baulande, Criqui et al. 2014). Cette particularité leur confère donc un rôle important dans divers processus, tels que la différenciation cellulaire, la prolifération et l’apoptose (Pimentel, Bonilla et al. 2014). Les microARNs jouent également un rôle important dans le métabolisme osseux, incluant les processus de formation et de résorption osseuse, en régulant l’expression de certaines cytokines et facteurs de transcription. Ces découvertes suggèrent donc que les microARNs pourraient devenir des cibles thérapeutiques intéressantes pour les maladies osseuses (Papaioannou, Mirzamohammadi et al. 2014, Zhao, Xu et al. 2014). La recherche intensive dans ce domaine pendant les dernières années a permis de constater que plusieurs pathologies étaient associées à une modification importante de l’expression des microARNs circulants. Ainsi, la quantification des microARNs dans les liquides biologiques a permis d’identifier plusieurs biomarqueurs d’intérêt crucial, notamment dans le cancer. Le microARN-34 (miR-34) est un suppresseur de tumeur régulé à la baisse dans plusieurs cancers. Par conséquent, une molécule mimant le microARN-34 (MRX34) a été développée, et est présentement en étude clinique de phase 1 chez les patients atteints d’un cancer hépatique (Bader 2012, Bouchie 2013). Ces données confirment donc le potentiel thérapeutique des microARNs, qui contribueront sans doute à améliorer la pratique clinique.

5.3 Marqueurs protéiques ou biochimiques Les marqueurs biochimiques sont couramment utilisés en pratique clinique et en recherche pour diagnostiquer des maladies, établir un pronostic ou encore pour évaluer l’efficacité d’un traitement. C’est notamment le cas pour les maladies osseuses. Les marqueurs du remodelage osseux sont des produits biochimiques mesurés dans le sérum ou l’urine qui reflètent l’activité métabolique de l’os, mais qui n’ont toutefois aucune fonction directe dans le contrôle du métabolisme osseux (Vasikaran, Eastell et al. 2011). Ces marqueurs sont divisés en deux catégories, soit les marqueurs de la formation et de la résorption osseuse.

Les marqueurs de la formation osseuse sont des molécules produites par les ostéoblastes, ou qui proviennent du métabolisme du procollagène (Tableau 7). Le collagène de type 1, qui compose la matrice osseuse, est formé à partir du procollagène. Les molécules de procollagène possèdent des extensions peptidiques aux extrémités amino-terminale (N-terminale) et carboxy-terminale (C-terminale) qui sont clivées par des enzymes pendant la formation osseuse, formant ainsi le collagène de type 1. Ce clivage mène ensuite à la libération du propeptide N-terminal du procollagène de type 1 (P1NP), ainsi que du propeptide C-terminal du procollagène de type 1 (P1CP) dans la circulation, permettant donc leur détection dans le sérum des individus (Seibel 2005). La PAL est une enzyme sécrétée par les ostéoblastes et possède un rôle important pour la formation et la minéralisation de la matrice osseuse. Celle-ci peut être mesurée dans le sérum, mais la prudence est de mise lors de l’interprétation, car elle provient de plusieurs tissus. En effet, environ la moitié des PAL détectées dans le sérum d’individus sains proviennent de l’os, l’autre moitié étant principalement d’origine hépatique. Ainsi, la plupart du temps, ce sont les PAL sériques totales qui sont mesurées, qui sont ensuite corrigées en mesurant la GGT pour s’assurer de la bonne fonction hépatique chez l’individu. Cependant, plusieurs techniques ont été développées pour séparer les différents isoformes, et il est possible de détecter spécifiquement les PAL osseuses, ce qui peut s’avérer parfois très utile en clinique (Delmas 2000). L’ostéocalcine est une protéine non collagénique de la matrice osseuse, également sécrétée par les ostéoblastes lors de la formation osseuse. Plusieurs formes de l’ostéocalcine peuvent être mesurées, l’ostéocalcine N-mid s’avérant être la plus fiable (Garnero, Grimaux et al. 1994). De plus, l’ostéocalcine peut être mesurée dans le sérum, mais comme elle est excrétée par les reins, il est également possible de la mesurer dans l’urine (Vasikaran, Eastell et al. 2011). Toutefois, en raison de la variabilité des techniques, l’instabilité des échantillons et sa grande variabilité biologique, l’ostéocalcine constitue un marqueur biochimique peu spécifique, limitant ainsi son utilisation dans la pratique clinique (Hlaing and Compston 2014). Parmi ces marqueurs biochimiques de la formation osseuse, le P1NP s’avère être le plus sensible, le plus stable, et est souvent considéré comme le marqueur de référence reflétant la formation osseuse (Biver 2012, Burch, Rice et al. 2014). Cependant le coût de ce test ne permet pas son utilisation en pratique clinique actuellement.

71 Les marqueurs de la résorption osseuse sont des molécules produites par les ostéoclastes, ou qui proviennent de la dégradation du collagène (Tableau 7). La phosphatase acide résistante au tartrate (TRACP) est une enzyme lysosomale sécrétée par les ostéoclastes lors de la résorption osseuse. En effet, ces enzymes génèrent des espèces réactives d’oxygène qui contribuent à la dégradation de la matrice osseuse. Il existe deux isoformes, soit la TRACP5a et TRACP5b. L’isoforme TRACP5b est spécifique aux ostéoclastes, et la plupart des techniques permettent de détecter spécifiquement cet isoforme dans le sérum des individus (Hlaing and Compston 2014). Le collagène de type 1 a une structure en triple hélice et possède, aux extrémités C-terminale et N-terminale, deux télopeptides que l’on nomme respectivement les télopeptides C- terminal et N-terminal du collagène de type 1 (CTX et NTX). De plus, les différents peptides de collagène de type 1 sont maintenus ensemble par des molécules que l’on nomme pyridinoline (PYD) et désoxypyridinoline (DPD), permettant ainsi leur stabilisation (Figure 25) (Watts 1999). Plusieurs marqueurs de la résorption osseuse sont des produits de dégradation du collagène pendant la résorption osseuse. En effet, lors de ce processus, les molécules de collagène sont dégradées par des enzymes libérant les molécules de PYD et de DPD dans la circulation, et sont ensuite excrétées dans l’urine. C’est d’ailleurs dans l’urine que ces deux molécules sont dosées (Seibel 2005). La dégradation du collagène entraîne également la libération du CTX et du NTX. Il existe deux formes de CTX, soit le αCTX et le βCTX, et c’est le ratio α/βCTX qui permet de fournir de l’information sur l’activité du remodelage osseux (Seibel 2005). Le CTX et le NTX peuvent être détectés dans les échantillons d’urine ou de sérum. Le CTX est le marqueur de résorption osseuse le plus utilisé, considéré comme étant la référence. Cependant, puisque celui-ci est fortement influencé par la prise alimentaire et le cycle diurne, il est préférable de récolter les échantillons le matin avant 10h00 AM et après un jeune de 12 heures, pour de meilleurs résultats. De plus, d’un point de vue technique, il est préférable d’analyser les échantillons sériques puisque ces derniers ne nécessitent pas de doser la créatinine (Biver 2012).

Les marqueurs biochimiques du remodelage osseux possèdent toutefois une certaine variabilité. En effet, leurs valeurs peuvent être influencées par plusieurs facteurs, causant ainsi une variabilité entre les échantillons, ce qui peut diminuer la reproductibilité des résultats, tant au niveau interindividuel que pour un même individu. Parmi ces facteurs, on note des aspects techniques, tels que la façon de récolter et de conserver les échantillons, ainsi que les différences entre les méthodes utilisées. De plus, au niveau biologique, les biomarqueurs du remodelage osseux peuvent être influencés par le cycle diurne, menstruel ou saisonnier, mais aussi par la diète, l’âge, le sexe ou encore l’ethnicité. Les comorbidités ainsi que la médication concomitante sont d’autres facteurs pouvant influencer les valeurs des biomarqueurs du remodelage osseux (Burch, Rice et al. 2014). Néanmoins, ces marqueurs sont couramment utilisés dans la pratique clinique. Par exemple, en ostéoporose, les biomarqueurs du remodelage osseux sont utilisés pour monitorer la réponse au traitement anti-ostéoporotique, notamment l’observance ou une éventuelle difficulté

d’absorption des bisphosphonates oraux (Vasikaran, Eastell et al. 2011). En ce qui concerne la MOP, les marqueurs biochimiques du remodelage osseux sont utiles pour le diagnostic, mais surtout pour l’évaluation de l’activité de la maladie, ainsi que la réponse au traitement. Tel que précédemment mentionné (voir sections 2.2.2 et 2.2.3), les PAL totales sont les plus utilisées pour la prise en charge clinique de la MOP. Les PAL osseuses et le P1NP sont également de bons marqueurs pour prédire l’activité de la maladie. Par ailleurs, ces deux biomarqueurs sont recommandés par les dernières lignes directrices américaines dans les atteintes pagétiques monostotiques, où les PAL totales sont habituellement normales et ne permettent donc pas le suivi thérapeutique (Singer, Bone et al. 2014). Également, des ratios α/βCTX très élevés sont généralement présents chez des patients pagétiques non traités, suggérant une augmentation de la résorption osseuse. Toutefois le dosage du αCTX n’étant pas disponible en pratique clinique, cela limite considérablement l’utilisation du dosage du CTX dans la MOP. Finalement, l’ostéocalcine n’est pas recommandée pour le suivi de la MOP étant donné son manque de sensibilité (Shankar and Hosking 2006).

Outre les marqueurs biochimiques du remodelage osseux, d’autres biomarqueurs protéiques peuvent être mesurés pour évaluer le métabolisme osseux. Entre autres, les molécules impliquées dans le maintien de l’équilibre phosphocalcique sont d’une importance capitale pour le métabolisme osseux. Le calcium est impliqué dans de multiples processus, notamment la contraction musculaire, la conduction nerveuse, les signaux intracellulaires et la minéralisation osseuse, sa disponibilité étant donc d’une importance capitale pour le bon fonctionnement de l’organisme. Environ 99% du calcium est emmagasiné dans les cristaux d’hydroxyapatite de la matrice osseuse (Courbebaisse and Souberbielle 2011). Lorsque les niveaux de calcium baissent dans l’organisme, la glande parathyroïde sécrète la parathormone (PTH), qui stimule à son tour la transformation de la vitamine D en son métabolite actif, la 1,25(OH)2 vitamine D3. La 1,25(OH)2 vitamine

D3 et la PTH agissent ainsi simultanément pour mobiliser le calcium dans le tissu osseux en stimulant la résorption osseuse. De plus, la PTH augmente la réabsorption intestinale et rénale du calcium. Ainsi, la vitamine D et la PTH permettent de réguler l’homéostasie minérale (Wranicz and Szostak-Wegierek 2014). De façon intéressante, l’action de la PTH sur le squelette dépend fortement de sa concentration, et de son mode d’administration. En effet, des niveaux élevés de PTH dans l’organisme, observés suite à une administration continue de PTH ou secondaires à un dérèglement métabolique, ont pour effet de stimuler la résorption osseuse. Cependant, une administration de courte durée et intermittente, telle que celle observée suite à une injection sous-cutanée de Tériparatide (PTH 1-34), stimule de façon prédominante la formation osseuse (Augustine and Horwitz 2013). C’est par ailleurs cette dernière propriété de la PTH qui explique l’efficacité de la Tériparatide pour le traitement de l’ostéoporose.

Une altération de cet équilibre phosphocalcique peut avoir des répercussions sévères sur la masse osseuse. Il est donc important de faire un bilan phosphocalcique chez les individus atteints d’une maladie osseuse, afin

73 de s’assurer qu’il n’y a aucune anomalie dans ce système. Lorsque la vitamine D est synthétisée par la peau ou absorbée via l’alimentation, elle est transportée jusqu’au foie où elle est hydroxylée en 25OH vitamine D. La 25OH vitamine D est ensuite libérée dans le sang, et transportée jusqu’aux reins où elle est à nouveau hydroxylée, permettant de former la 1,25(OH)2 vitamine D3, soit la forme active de la vitamine D. Le dosage de la 1,25(OH)2 vitamine D3 est très ardu et couteux et il n’est habituellement pas recommandé en pratique clinique. Ainsi, c’est la 25OH vitamine D, qui agit comme substrat pour la 1,25(OH)2 vitamine D3, qui est dosée afin d’évaluer le statut de la vitamine D (Heaney 2011). Le dosage de la PTH doit en tout temps être interprété en fonction de la calcémie. Ainsi, la PTH et le calcium doivent toujours être dosés simultanément. Dans le plasma, le calcium est présent sous différentes formes : 40 à 45% est lié à des protéines, principalement l’albumine, 5 à 10% est lié à des anions, et près de 50% se trouve sous la forme de calcium ionisé. Le calcium ionisé est la forme active du calcium, la concentration de calcium ionisé étant donc la plus intéressante à mesurer. Cependant, le calcium ionisé est très difficile à doser de façon adéquate. Ainsi, la plupart du temps, un dosage du calcium total est effectué, et est ensuite corrigé pour l’albumine puisque la fraction de calcium ionisé dans l’organisme dépend grandement du taux de cette protéine (Courbebaisse and Souberbielle 2011).

Dans la MOP, d’autres marqueurs protéiques peuvent être intéressants à doser pour monitorer l’activité de la maladie, ou tout simplement pour découvrir de nouveaux biomarqueurs fiables associés à la maladie. Notamment, le dosage de l’IL-6 chez les patients pagétiques pourrait s’avérer intéressant. En effet, les ostéoclastes pagétiques sécrètent des niveaux élevés d’IL-6, détectables dans la moelle osseuse et le sang périphérique des patients avec la MOP, suggérant un rôle pour cette cytokine dans la pathogénie de la maladie (Roodman, Kurihara et al. 1992). La protéine C-réactive à haute sensibilité (hsCRP) est un marqueur de l’inflammation. Elle est sécrétée par le foie et les tissus adipeux en réponse à un stress inflammatoire, et est régulée majoritairement par l’IL-6 (Genest 2010). Ainsi, étant donné le rôle de l’IL-6 dans la MOP, il peut être utile de mesurer les niveaux de hsCRP dans le sérum des patients pagétiques. De plus, des concentrations sériques élevées de hsCRP sont associées à une augmentation du remodelage osseux et de la densité minérale osseuse, suggérant un lien entre l’inflammation et le métabolisme osseux (Koh, Khang et al. 2005). Étant donné leur rôle déterminant dans l’activité et la différenciation des ostéoclastes, il peut être intéressant de mesurer les niveaux sériques de RANKL et OPG pour évaluer le remodelage osseux. Par ailleurs, les concentrations sériques d’OPG sont plus élevées chez les patients pagétiques que chez des individus sains, suggérant un rôle pour ce facteur ostéoclastogénique dans la MOP. En ce qui concerne le RANKL, aucune différence n’a été observée (Alvarez, Peris et al. 2003). Cependant, il est bien connu que les ostéoclastes pagétiques sont hypersensibles au RANKL, formant des ostéoclastes à des concentrations beaucoup moins élevées que celles normalement requises (Menaa, Reddy et al. 2000). Ces résultats suggèrent donc un rôle pour le RANKL dans la MOP, principalement dans la formation des ostéoclastes pagétiques. Finalement, un rôle pathologique dans la MOP a été suggéré pour les protéines DKK1 et

sclérostine, soient des inhibiteurs de la voie Wnt impliquée dans la formation des ostéoblastes. En effet, les concentrations sériques de DKK1 et sclérostine sont plus élevées chez les patients pagétiques que chez les contrôles sains, ce qui suggère que ces molécules pourraient être de bons biomarqueurs associés à la MOP (Marshall, Evans et al. 2009, Yavropoulou, van Lierop et al. 2012).

Tableau 7. Principaux marqueurs biochimiques de la formation et de la résorption osseuse utilisés en recherche et en pratique clinique.

Marqueurs de la formation osseuse Marqueurs de la résorption osseuse Propeptide N-terminal du procollagène de type 1 (P1NP) Phosphatase acide résistante au tartrate (TRACP) Phosphatases alcalines totales Pyridinoline (PYD) Phosphatases alcalines osseuses Désoxypyridinoline (DPD) Ostéocalcine Télopeptide C-terminal du collagène de type 1 (CTX) Télopeptide N-terminal du collagène de type 1 (NTX)

Figure 25. Structure du collagène de type 1. Le collagène de type 1 a une structure en triple hélice et possède deux télopeptides aux extrémités C- terminale et N-terminale. De plus, les différents peptides de collagène de type 1 sont maintenus ensemble par les pyridinolines. Figure tirée de (Hlaing and Compston 2014).

5.3.1 Techniques de dosage des marqueurs biochimiques Dans la pratique clinique, il existe deux méthodes principales pour doser des biomarqueurs protéiques dans les liquides biologiques. La méthode enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) est sans doute la méthode la plus utilisée. D’abord, l’anticorps spécifique à la protéine, ou l’antigène, que l’on souhaite doser est adsorbé sur la surface des puits d’une plaque de micro-titrage. Ensuite, l’échantillon biologique de l’individu, le plus souvent du sérum ou de l’urine, est ajouté dans les puits. Si la protéine d’intérêt est présente, elle se liera

75 spécifiquement à l’anticorps adsorbé sur la surface des puits, alors que les autres protéines seront éliminées lors des lavages. On ajoute un second anticorps spécifique à l’antigène, cet anticorps étant conjugué à une enzyme. L’antigène se retrouve alors coincé en sandwich entre les deux anticorps. Finalement, on ajoute le substrat de l’enzyme, et la réaction enzymatique produit un changement de couleur observable. On peut donc ensuite mesurer cette activité enzymatique à l’aide d’un lecteur de plaque afin de déterminer la concentration de la protéine d’intérêt dans l’échantillon analysé (Figure 26) (Tortora, Case et al. 2003).

Le système Elecsys de Roche est une technique immunologique automatisée qui utilise le principe d’électro- chimiluminescence. Le principe de base est le même que pour la technique ELISA. L’échantillon de l’individu est d’abord incubé en présence de deux anticorps spécifiques à la protéine d’intérêt : un anticorps monoclonal biotinylé et un anticorps polyclonal ruthénylé. Lorsque ces deux anticorps lient l’antigène, celui-ci se retrouve coincé en sandwich. Ensuite, des microbilles recouvertes de streptavidine sont ajoutées à la solution. La streptavidine forme ainsi un lien solide avec la biotine, permettant de créer un complexe très stable. La solution est alors aspirée dans une cellule contenant un aimant, où un champ magnétique est appliqué, ce qui permet aux microbilles de lier la surface de cette cellule de mesure. Un lavage est ensuite effectué avec une solution contenant de la tripropylamine (TPA), qui est essentielle pour la réaction de chimiluminescence. Un voltage est appliqué, déclenchant une réaction de chimiluminescence entre la TPA et le ruthénium. Cette réaction se poursuit tant que le voltage est appliqué. Finalement, la lumière est détectée par un photomultiplicateur. Cette réaction, très stable et contrôlée, confère plusieurs avantages à cette technologie; elle est très rapide, précise, sensible, et utilise très peu de volume d’échantillon (Roche, www.cobas.com).

Tout comme les marqueurs génétiques, il est possible d’étudier les marqueurs biochimiques à plus grande échelle. Le protéome est l’ensemble des protéines codées par un génome à un moment donné, et dans un environnement donné. L’analyse protéomique consiste donc à caractériser toutes les protéines qui sont présentes dans un milieu biologique donné dans le but d’identifier des marqueurs associés à certaines pathologies. Généralement, les méthodes d’analyses protéomiques se basent sur deux étapes : la séparation des protéines, et l’identification de celles-ci par spectrométrie de masse. Plusieurs méthodes sont actuellement disponibles sur le marché, faisant intervenir différentes technologies de séparation et de spectrométrie. Tout comme pour la génomique, il existe des puces qui permettent d’analyser plusieurs protéines en une seule expérience. Cependant, étant donné la diversité et l’hétérogénéité des protéines, ces puces permettent la plupart du temps d’analyser un groupe spécifique ou une famille particulière de protéines (Trocmé, Baillet et al. 2011).

Figure 26. Principe de la méthode ELISA. Description des principales étapes de la méthode ELISA. Figure tirée de (Tortora, Case et al. 2003).

5.4 Critères d’évaluation des biomarqueurs L’avancement de la technologie au cours des dernières années permet dorénavant de découvrir un grand nombre de marqueurs génétiques et biochimiques associés à plusieurs pathologies, créant ainsi de nouvelles opportunités pour développer des tests biologiques. Cependant, avant d’être commercialisés, ces tests doivent subir une évaluation rigoureuse afin de confirmer les bénéfices de leur utilisation dans la pratique clinique. Pour ce faire, le modèle ACCE (pour Analytical validity, Clinical validity, Clinical utility et Ethical, legal and social implications) a été développé. Le modèle ACCE contient 44 questions, qui permettent d’évaluer quatre composantes principales : la validité analytique, la validité clinique, l’utilité clinique et les implications éthiques, légales et sociales (Figure 27) (Haddow and Palomaki 2004). Toutefois, avant d’évaluer chacune de ces composantes, il est primordial de bien définir le phénotype clinique, ainsi que la population cible (Sanderson, Zimmern et al. 2005). De plus, le but du test biologique à évaluer doit être clairement défini. En effet, les tests biologiques peuvent avoir différentes utilités, notamment le diagnostic, la prédiction, le dépistage, ou encore l’évaluation de la réponse à un traitement spécifique (Zimmern and Kroese 2007).

Figure 27. Modèle de l’ACCE pour l’évaluation des tests biologiques. Le modèle de l’ACCE permet d’évaluer la performance des tests biologiques avant leur utilisation dans la pratique clinique. Il se divise en quatre composantes principales, soit la validité analytique, la validité clinique, l’utilité clinique et les implications éthiques, sociales et légales. Figure tirée du site internet du Centre pour le contrôle des maladies et de la prévention, www.cdc.gov/genomics/gtesting/ACCE/.

5.4.1 Validité analytique La validité analytique se définit comme étant la capacité d’un test à mesurer de façon fiable et précise la variable d’intérêt. Cette étape porte une attention particulière aux techniques utilisées en laboratoire. Selon le modèle ACCE, la validité analytique se divise en quatre éléments principaux : la sensibilité analytique, la spécificité analytique, le contrôle qualité en laboratoire et la robustesse de la technique utilisée (Haddow and Palomaki 2004). La sensibilité analytique se définit comme étant l’efficacité du test à détecter la variable d’intérêt, alors que la spécificité analytique calcule la capacité du test à bien discriminer les échantillons selon la présence ou l’absence de la variable d’intérêt. Globalement, l’étape de la validité analytique a pour but de s’assurer que le test développé en laboratoire est fiable et reproductible (Becker, van El et al. 2011).

5.4.2 Validité clinique La validité clinique est la capacité d’un test à détecter ou prédire le phénotype d’intérêt. Selon le modèle ACCE, la validité clinique tient compte des éléments suivants : la sensibilité clinique, la spécificité clinique, la prévalence de la pathologie d’intérêt, les valeurs prédictives positive et négative, ainsi que la pénétrance

lorsque le test inclut des données génétiques (Haddow and Palomaki 2004). Afin d’évaluer la validité clinique d’un test biologique, sa performance doit être évaluée, c’est-à-dire sa capacité à discriminer un individu sain d’un individu malade. Ainsi, les performances du test sont étudiées dans deux populations, soit les individus malades et les individus sains. Il existe deux scénarios possible pour l’évaluation des tests biologiques; les performances du test peuvent être comparées à celles d’un test de référence, ou elles peuvent être analysées dans une population dans laquelle les individus sains et malades sont préalablement connus (Chrétien 2011). Le Tableau 8 est un tableau de contingence représentant un échantillon de N sujets classés en fonction de leur état de santé, et selon le test étudié. Dans ce tableau, les vrais positifs (VP) correspondent aux patients malades ayant un test positif, alors que les faux positifs (FP) sont des individus sains qui ont un test positif. Dans la même logique, les vrais négatifs (VN) sont les individus sains qui ont un test négatif, et les faux négatifs (FN) sont les individus malades qui ont un test négatif. À partir de ces données, il est possible de calculer les caractéristiques intrinsèques du test, qui incluent la sensibilité et la spécificité. La sensibilité d’un test correspond à la probabilité d’avoir un test positif chez un individu malade. Elle mesure donc la capacité du test à identifier correctement les individus malades. Elle se calcule de la façon suivante :

푉푃 푆푒푛푠푖푏푖푙푖푡é = 푉푃 + 퐹푁

La spécificité correspond à la probabilité d’avoir un test négatif chez un individu sain, et mesure donc la capacité du test à identifier correctement les individus sains. Elle se calcule de la façon suivante :

푉푁 푆푝é푐푖푓푖푐푖푡é = 푉푁 + 퐹푃

Une sensibilité égale à 1 signifie que le test permet d’identifier 100% des individus malades, et à l’inverse, une spécificité de 1 signifie que le test permet d’identifier 100% des individus sains. Cependant, l’obtention de tels résultats est peu probable. Ainsi, on priorise une bonne sensibilité lorsqu’il est dangereux de ne pas diagnostiquer la pathologie d’intérêt. À l’inverse, on priorisera une bonne spécificité s’il est dangereux de diagnostiquer à tort une maladie (Delacour, Servonnet et al. 2009). Les valeurs prédictives positive (VPP) et négatives (VPN) peuvent également apporter de l’information supplémentaire, et sont particulièrement utiles dans la pratique clinique. La VPP correspond à la probabilité qu’un individu soit malade si le test est positif, et se calcule de la façon suivante :

푉푃 푉푃푃 = 푉푃 + 퐹푃

79 À l’inverse, la VPN correspond à la probabilité qu’un individu soit sain si le test est négatif, et se calcule de la façon suivante :

푉푁 푉푃푁 = 푉푁 + 퐹푁

Ainsi, plus la valeur de la VPP est proche de 1, plus le patient risque d’être malade si le test est positif. À l’inverse, plus la VPN est proche de 1, plus le patient risque d’être indemne de la maladie si le test est négatif (Emmanuel 1997). Cependant, les VPP et VPN dépendent à la fois des caractéristiques intrinsèques du test (sensibilité et spécificité), et de la prévalence de la maladie dans la population à tester. Ainsi, il est primordial d’estimer la prévalence de la maladie dans la population étudiée avant de calculer ces valeurs. Les formules de la VPP et de la VPN peuvent donc être exprimées en fonction de ces paramètres :

푆푒 푥 푝 푉푃푃 = (푆푒 푥 푝) + (1 − 푆푝)푥 (1 − 푝)

푆푝 푥 (1 − 푝) 푉푃푁 = 푆푝 푥 (1 − 푝) + (1 − 푆푒) 푥 푝

Où Se désigne la sensibilité, Sp la spécificité, et p la prévalence.

Ces valeurs varient donc en fonction de la prévalence, et par le fait même, ne sont pas transposables à d’autres populations. Ainsi, si la prévalence augmente dans la population étudiée, on observera une augmentation de la VPP, et une diminution de la VPN. À l’inverse, plus la prévalence est faible, plus la VPP tend vers 0, et la VPN vers 1 (Delacour, Servonnet et al. 2009).

Les rapports de vraisemblance sont une autre façon d’exprimer les caractéristiques intrinsèques d’un test biologique. Ils dépendent de la sensibilité et de la spécificité du test, mais sont toutefois indépendants de la prévalence. Le rapport de vraisemblance positif permet de calculer le rapport entre la probabilité d’avoir un test positif chez un individu malade et la probabilité d’avoir un test positif chez un individu sain, et se calcule de la façon suivante :

푆푒 퐿 = 1 − 푆푝

Le rapport de vraisemblance positif quantifie le gain diagnostique d’un test positif. Ainsi, un individu malade a L fois plus de chance d’avoir un test positif qu’un individu sain. Le rapport de vraisemblance négatif permet de calculer le rapport entre la probabilité d’avoir un test négatif chez un individu malade et la probabilité d’avoir un test négatif chez un individu sain, et se calcule de la façon suivante :

1 − 푆푒 휆 = 푆푝

Le rapport de vraisemblance négatif quantifie le gain diagnostique d’un test négatif. Ainsi, un individu malade a λ fois plus de chance d’avoir un test négatif qu’un individu sain. Il est donc avantageux d’avoir un rapport de vraisemblance positif élevé, et un rapport de ressemblance négatif faible, afin d’avoir le meilleur gain diagnostique possible pour le test biologique étudié (Delacour, François et al. 2009).

Lorsqu’un test est composé de variables quantitatives, il est crucial de choisir une valeur seuil optimale, qui influencera les caractéristiques intrinsèques du test. En effet, pour un test parfait qui possèderait une sensibilité et une spécificité égale à 1, il serait facile de déterminer la valeur seuil qui permettrait de discriminer parfaitement les individus malades et les individus sains. Cependant, étant donné que la majorité des tests ne sont pas parfaitement discriminants, le choix d’une valeur seuil conduit inexorablement à des erreurs de classification des individus. Ainsi, si on souhaite prioriser une bonne sensibilité, on diminuera la valeur seuil du test. À l’inverse, si la spécificité est plus importante, cette valeur seuil sera augmentée (Delacour, Servonnet et al. 2009). Il existe plusieurs méthodes pour déterminer cette valeur seuil, les courbes Receiver Operating Characteristics (ROC) étant les plus fréquemment utilisées. Les courbes ROC permettent de mettre en relation la sensibilité et la spécificité pour toutes les valeurs seuils possibles d’un test. Graphiquement, l’axe des Y correspond à la sensibilité, alors que l’axe des X est l’inverse de la spécificité (1-Spécificité) (Figure 28). Les coordonnées (0,1) correspondent donc à une sensibilité et une spécificité égales à 1. Ainsi, plus la courbe ROC se rapproche du coin supérieur gauche plus la capacité discriminante du test est importante. À l’inverse, plus la courbe ROC se rapproche de la diagonale du graphique reliant les extrémités inférieure gauche et supérieure droite, moins la capacité discriminante du test est importante. La génération de courbes ROC permet également de calculer l’aire sous la courbe (AUC), qui représente la probabilité que les individus sains et malades soient adéquatement classifiés. Or, plus l’aire sous la courbe est élevée, plus les capacités discriminantes du test sont bonnes, une aire sous la courbe égale à 1 correspondant à un test parfait (Azuaje 2010).

81 Tableau 8. Tableau de contingence représentant un échantillon de N sujets classés en fonction de leur état de santé et selon le résultat du test étudié.

Individus malades Individus sains Total Test positif Vrais positifs (VP) Faux positifs (FP) VP+FP Test négatif Faux négatifs (FN) Vrais négatifs (VN) FN+VN Total VP+FN FP+VN

Figure 28. Représentation graphique d’une courbe ROC. La courbe ROC met en relation la sensibilité et la spécificité pour toutes les valeurs seuils possibles d’un test biologique. Graphiquement, l’axe des Y correspond à la sensibilité, alors que l’axe des X est l’inverse de la spécificité (1-Spécificité). Ainsi, plus la courbe tend vers l’extrémité supérieure gauche du graphique, plus le test étudié est bon. À l’inverse, plus la courbe tend vers la diagonale reliant les extrémités inférieure gauche et supérieure droite, plus le test étudié est médiocre. Figure tirée du site internet AD Science, Scientific & Statistical Software, Paris France, http://www.adscience.fr/uploads/ckfiles/files/html_files/StatEL/statel_courbe_ROC.htm.

5.4.3 Utilité clinique L’utilité clinique correspond aux risques et bénéfices associés à l’introduction du test biologique dans la pratique clinique. Cette étape est sans doute la plus importante puisqu’elle permet de déterminer si l’utilisation du test améliore la prise en charge des patients (Sanderson, Zimmern et al. 2005). Pour évaluer l’utilité clinique d’un test, plusieurs éléments sont considérés (Figure 27). D’abord, il est primordial de connaître

l’histoire naturelle de la maladie, incluant l’âge d’apparition et la sévérité du phénotype clinique. En effet, il peut être utile de connaître l’âge d’apparition des premiers symptômes afin de déterminer le moment optimal pour l’utilisation du test biologique. D’un autre côté, si la maladie n’entraîne pas de conséquences sérieuses sur la santé, l’utilisation d’un test biologique n’est peut-être pas justifiée (Haddow and Palomaki 2004). L’utilisation du test doit apporter un réel bénéfice pour les individus testés. Pour justifier l’utilisation d’un test biologique dans la pratique clinique, des interventions efficaces doivent être posées chez les individus ayant un test positif. Par exemple, si la maladie d’intérêt ne peut être traitée ou évitée, le patient retirera peu de bénéfices suite à l’utilisation du test biologique (Haddow and Palomaki 2004). De plus, l’utilisation du test doit améliorer la prise en charge des patients. Ainsi, il faut évaluer les bénéfices de l’utilisation du test chez les individus, comparativement aux standards déjà établis dans la pratique clinique. Dans le cas des tests compagnons, les bénéfices du traitement associé avec le test biologique devront être évalués (Matsui 2013). Également, les risques encourus par l’utilisation du test biologique, que le résultat soit positif ou négatif, doivent être pris en compte. Ces derniers peuvent être d’ordre physique ou psychologique (Haddow and Palomaki 2004). La mise en place d’études cliniques, qui permettent d’évaluer la performance du test dans un contexte clinique, est primordiale pour évaluer l’utilité clinique. C’est par ailleurs les résultats de ces études qui permettront de déterminer les bénéfices associés à l’utilisation du test biologique développé (Matsui 2013). Aussi, il faut vérifier que des procédures d’assurance qualité sont en place afin de s’assurer que le test est effectué selon les lignes directrices préétablies en laboratoire. Le personnel ainsi que les aménagements nécessaires pour mettre en place le test biologique développé doivent être évalués. D’autres facteurs seront également pris en compte pour évaluer l’utilité clinique, notamment l’évaluation économique, le développement et la validation de matériel éducationnel pour les individus testés, ainsi que la mise en place d’un programme de suivi à long terme pour s’assurer de l’efficacité du test étudié (Becker, van El et al. 2011).

5.4.4 Enjeux éthiques, légaux et sociaux Bien que cela constitue une tâche souvent ardue, il est important de déterminer les enjeux éthiques, légaux et sociaux que l’utilisation d’un test biologique dans la pratique clinique pourrait engendrer. Étant donné qu’il existe une multitude d’enjeux à considérer, cette section décrit uniquement quelques exemples rapportés dans la littérature. L’un des principaux enjeux à considérer est sans doute la discrimination génétique. En effet, l’apparition des tests biologiques fait craindre un traitement différent des individus basé sur leur patrimoine génétique, notamment par les compagnies d’assurances, où l’information génétique pourrait être utilisée afin d’établir la prime d’assurance vie (Joly, Ngueng Feze et al. 2013). Malgré l’application de lois par certains pays, quelques cas de discrimination génétique dans le domaine des assurances ont été rapportés, notamment chez les individus à risque de développer la maladie d’Huntington (Bombard, Veenstra et al. 2009). L’apparition de tests biologiques peut également entraîner des issues de stigmatisation. En effet,

83 plusieurs conditions génétiques peuvent être plus fréquentes dans certains groupes ethniques. Ainsi, certains tests génétiques de dépistage peuvent être offerts préférentiellement à ces groupes, ce qui peut causer un sentiment de stigmatisation sociale ou de vulnérabilité dans cette population. C’est notamment le cas des juifs hassidiques, qui ont un risque particulièrement élevé de développer la maladie de Tay-Sachs, une maladie fatale (Lew, Burnett et al. 2015). Par ailleurs, un test de dépistage réservé à cette population a été mis au point, permettant de diminuer l’incidence de cette maladie chez les juifs hassidiques de plus de 90% (Kaback 2001). Dans le même ordre d’idée, certains traitements pharmacologiques peuvent s’avérer plus ou moins efficaces dans certains groupes ethniques en raison de la prévalence de polymorphismes ou de mutations qui peuvent différer au sein de ces populations. Ainsi, l’absence d’avenue thérapeutique pour ces populations est une issue éthique très importante, et peut encore une fois causer un sentiment de stigmatisation sociale chez ces individus (Botkin, Teutsch et al. 2010). Les tests génétiques peuvent également avoir un impact familial important. En effet, l’une des principales caractéristiques d’un test biologique est de fournir des informations génétiques sur l’individu testé, mais également sur les membres de la famille. Par exemple, si une femme est porteuse d’une mutation dans le gène breast cancer 1 (BRCA1), qui augmente considérablement le risque de développer un cancer du sein, cela signifie que non seulement l’un de ses parents est porteur de la même mutation, mais également qu’elle a 50% de risque de la transmettre à sa descendance. Ainsi, cela peut faire naître un sentiment de culpabilité lié à la transmission d’une maladie grave à la génération suivante. De plus, l’individu à haut risque communique généralement l’information dans la famille, ce qui peut être source de conflit, notamment lorsque les apparentés ne désirent pas connaître cette information (Botkin, Teutsch et al. 2010). Des signes de détresse psychologique peuvent être présents chez les patients diagnostiqués avec une maladie sévère ou ayant un risque élevé de la développer dans le futur. Cependant, cette détresse se produit généralement à court terme suite à l’obtention du résultat du test, et diminue suite aux séances de conseil génétique, notamment chez les femmes ayant un test positif pour le cancer du sein (Schlich-Bakker, ten Kroode et al. 2006). Finalement, il est important de porter une attention particulière à l’interprétation des résultats d’un test biologique. En effet, une mauvaise interprétation peut mener à des préoccupations inutiles, voire même à l’instauration d’un traitement pharmacologique inapproprié, ce qui peut entraîner de sévères conséquences chez le patient (Botkin, Teutsch et al. 2010).

6. Problématique, hypothèses et objectifs Même si les connaissances sur la physiopathologie de la MOP ont grandement progressé dans les dernières années, il n’en reste pas moins que plusieurs questions demeurent sans réponse. Actuellement, dans plusieurs pays connus pour avoir une prévalence élevée de la MOP, on observe un déclin de la prévalence et de la sévérité de la maladie, attestée notamment par un nombre d’os atteints moindre (Cundy, Gamble et al.

2004, Cooper, Harvey et al. 2006). Ceci peut faire craindre une augmentation de la proportion d'individus atteints ou prédisposés génétiquement mais qui demeurent totalement asymptomatiques, notamment dans les formes familiales. Tel que précédemment mentionné, la MOP est une contre-indication formelle à la prescription d’agents ostéoformateurs, qui vont stimuler l’activité des ostéoblastes, en raison du risque élevé de transformation en ostéosarcome associé avec cette maladie. Cette stimulation excessive chez des individus atteints ou prédisposés à la MOP augmente le risque théorique de développer un ostéosarcome, un cancer primitif de l'os actuellement incurable, ou de causer l’apparition d’une MOP symptomatique, représentant tous les deux des effets secondaires graves de ces agents pharmacologiques. Au cours des dernières décennies, l’utilisation des bisphosphonates à long terme pour le traitement de l’ostéoporose a mis en évidence l’apparition d’effets secondaires rares, mais potentiellement graves (Pazianas and Abrahamsen 2011). On peut donc supposer une plus large utilisation des agents ostéoformateurs dans les prochaines années. Ainsi, avec l’apparition prochaine de nouveaux médicaments ostéoformateurs pour le traitement de l’ostéoporose, il devient crucial de pouvoir exclure de façon certaine, et si possible peu invasive et peu coûteuse, la présence d'une MOP, y compris asymptomatique.

L’une des caractéristiques les plus surprenantes de la MOP est son caractère focal et sa distribution asymétrique. De plus, une fois diagnostiquée, elle progresse dans les os initialement atteints, sans toutefois s’étendre à d’autres sites adjacents (Roodman and Windle 2005). Afin d’expliquer l’aspect focal de la maladie, des auteurs ont suggéré, et ensuite démontré, que certaines mutations somatiques dans le gène SQSTM1 peuvent se produire focalement dans les lésions pagétiques. Le séquençage de l’ADN des tissus osseux affectés a effectivement permis l’identification d’une mutation SQSTM1/P392L chez deux patients atteints d’une forme sporadique de la MOP et qui n’avait pas été détectée dans l’ADN extrait de leurs échantillons de sang, suggérant une origine somatique pour ces mutations (Merchant, Smielewska et al. 2009). Toutefois, une seconde étude indépendante n’a pas permis de révéler la présence de mutations somatiques dans les ostéoblastes et les cellules de la moelle osseuse provenant de patients pagétiques (Matthews, Naot et al. 2009). Ces résultats suggèrent que des mutations somatiques SQSTM1/P392L peuvent être détectées dans les lésions pagétiques, mais pas dans les cellules de la moelle osseuse ou dans les cellules du sang périphérique chez les patients atteints de la MOP. Ainsi, une recherche de mutation dans le gène SQSTM1 à partir d'une prise de sang et un séquençage selon les standards actuels pourraient méconnaître la présence éventuelle de la mutation chez certains patients véritablement atteints par la MOP.

La dysplasie fibreuse des os (DFO) est une maladie métabolique osseuse rare, de distribution focale et asymétrique, comme dans la MOP. Elle est causée par des mutations post-zygotiques (ou somatiques survenant dans les stades les plus précoces du développement embryonnaire) dans le gène GNAS (Weinstein 2006). La nature post-zygotique de ces mutations rend leur identification difficile sans la biopsie de l'os atteint.

85 Une méthode de PCR très sensible a donc été développée. Cette technique utilise un acide nucléique peptidique (PNA pour peptide nucleic acid) qui permet de bloquer l’amplification de l’allèle sauvage afin d’améliorer la sensibilité à détecter la présence de l’allèle muté, même s'il est présent en faible quantité dans l’ADN provenant des cellules du sang périphérique (Lietman, Ding et al. 2005).

Étant donné les similitudes entre la DFO et la MOP, et la présence possible de mutations somatiques du gène SQSTM1 dans les os pagétiques, l’optimisation de la méthode PCR sensible développée pour détecter des mutations chez les patients atteints de DFO pourrait être adaptée à la détection d'éventuelles mutations post- zygotiques SQSTM1/P392L, dans le sang périphérique des patients atteints de la MOP chez lesquels aucune mutation germinale de SQSTM1 n'était détectable. Ensuite, la détection de ces mutations post-zygotiques, en combinaison avec d’autres marqueurs génétiques et biochimiques connus, pourrait permettre le développement d’une signature moléculaire spécifique à la MOP afin d’améliorer son dépistage dans la pratique clinique.

Ainsi, les objectifs principaux de mon projet sont :

(1) de mettre au point un test plus sensible permettant d’évaluer la fréquence des mutations post-zygotiques SQSTM1/P392L chez les patients atteints de la MOP;

(2) de développer un test génétique de dépistage de la MOP incluant les mutations germinales et post- zygotiques de SQSTM1;

(3) et d'évaluer les performances diagnostiques de ce test intégré avec des marqueurs biochimiques dans une signature moléculaire spécifique à la maladie.

Chapitre 1

Detection of SQSTM1/P392L post-zygotic mutations in Paget’s disease of bone

Sabrina Guay-Bélanger1,2, Sylvain Picard3, Edith Gagnon1, Jean Morissette1, Ethel S. Siris4, Philippe Orcel5, Jacques P. Brown1,2,6 and Laëtitia Michou1,2,6.

1Department of Endocrinology and Nephrology, CHU de Québec Research Centre, Québec, QC, Canada 2Division of Rheumatology, Department of Medicine, Université Laval, Québec, QC, Canada 3Department of Pathology, CHU de Québec, Québec, QC, Canada 4Department of Medicine, Columbia University Medical Centre, New York City, NY, USA 5Pôle appareil locomoteur, service de rhumatologie B, hôpital Lariboisière, AP-HP, Paris, France 6Department of Rheumatology, CHU de Québec, Québec, QC, Canada

Ce chapitre est présenté sous forme d’article scientifique et a été publié dans la revue : Human Genetics. 2015 Jan; 134(1) : 53-65.

87 Résumé La maladie osseuse de Paget (MOP) est transmise, dans un tiers des cas, selon un mode autosomique dominant à pénétrance incomplète. La mutation germinale SQSTM1/P392L est la mutation la plus fréquente associée avec la maladie. Étant donné la nature focale de la MOP, une équipe d’investigateurs a montré que des mutations somatiques SQSTM1/P392L pouvaient se produire dans les lésions pagétiques en absence de mutations germinales détectables dans le sang périphérique. Les objectifs de cette étude étaient de développer une méthode fiable pour détecter des mutations post-zygotiques SQSTM1/P392L, en optimisant une méthode de réaction en chaîne par polymérase (PCR) sensible rapportée comme étant efficace pour la détection de mutations post-zygotiques dans le sang périphérique de patients atteints de la dysplasie fibreuse des os, et d’évaluer la fréquence de cette mutation post-zygotique chez les patients atteints de MOP. Nous avons utilisé un acide nucléique bloqué (LNA) conçu spécifiquement pour la mutation SQSTM1/P392L, qui bloque l’amplification de l’allèle sauvage pendant la PCR. Nous avons analysé l’ADN de 376 patients pagétiques et 297 contrôles sains, tous non porteurs d’une mutation germinale SQSTM1/P392L. Nous avons détecté cette mutation post-zygotique chez 4,8% des patients pagétiques, et 1,4% des contrôles sains [p = 0,013; OR 3,68 (1,23; 11,00)]. Les patients pagétiques porteurs d’une mutation post-zygotique avaient un nombre d’os atteints et un index de Rénier moins élevés que les patients porteurs d’une mutation germinale, suggérant une sévérité moindre de la maladie. Nous avons également démontré que cette mutation post- zygotique était restreinte à la lignée des monocytes. Ces résultats ont confirmé que la méthode de PCR sensible utilisant un LNA est efficace pour détecter des mutations post-zygotiques SQSTM1/P392L, qui peuvent se produire chez les patients atteints de MOP.

Abstract Paget’s disease of bone (PDB) is transmitted, in one-third of cases, in an autosomal dominant mode of inheritance with incomplete penetrance. The SQSTM1/P392L germinal mutation is the most common mutation associated with PDB. Given the focal nature of PDB, one team of investigators showed that SQSTM1/P392L somatic mutations could occur in pagetic bone lesions in the absence of germinal mutations detectable in the peripheral blood. The objectives of this study were to develop a reliable method to detect SQSTM1/P392L post-zygotic mutations, by optimizing a polymerase chain reaction (PCR)-clamping method reported to be effective in detecting post-zygotic mutations in peripheral blood from patients with fibrous dysplasia; and to evaluate the frequency of this post-zygotic mutation in PDB patients. We used a locked nucleic acid (LNA) specifically designed for the SQSTM1/P392L mutation, which blocks the wild-type allele amplification during the PCR. DNA from 376 pagetic patients and 297 controls, all without any SQSTM1/P392L germinal mutation, was analyzed. We found that 4.8% of PDB patients and 1.4% of controls were carriers of this post-zygotic mutation [p = 0.013, OR 3.68 (1.23; 11.00)]. PDB patient carriers of a post-zygotic mutation had a lower number of affected bones and Renier’s index than patients carrying a germinal mutation, suggesting a lower disease extension. We also demonstrated that this post-zygotic mutation was restricted to the monocytic lineage. These results confirmed that LNA PCR clamping is effective for the detection of SQSTM1/P392L post- zygotic mutations, which may occur in patients with PDB.

89 Introduction Paget’s disease of bone (PDB) is the second most frequent metabolic bone disorder after osteoporosis, affecting up to 3% of adults over 55 years of age (Collet, Michou et al. 2007). PDB is characterized by focal increases in bone turnover, affecting one or several bones, and resulting in abnormal bone architecture and weakened bone strength (Michou, Collet et al. 2006). Although the exact etiology of the disease is still unknown, the genetic component plays an important role in its pathophysiology. In fact, one-third of patients have a familial form of this disease, which is transmitted in an autosomal dominant mode of inheritance with incomplete penetrance (Michou and Brown 2011). Several chromosomal regions have been linked to PDB, confirming its genetic heterogeneity. The 5q35-qter locus was first reported in the French-Canadian population, and led to the identification of the first germinal mutation associated with PDB. This substitution of a cytosine to a thymine at position 1,215 in the Sequestosome 1 (SQSTM1) gene results in the substitution of the proline at position 392 to a leucine (p.Pro392Leu, called here P392L) in the p62 protein (Laurin, Brown et al. 2001, Laurin, Brown et al. 2002). As of now, more than 20 mutations in the SQSTM1 gene have been described (Chung and Van Hul 2001, Hocking, Lucas et al. 2002, Morissette, Laurin et al. 2006). SQSTM1 mutations are reported in similar frequencies across countries: SQSTM1 mutations are present in 24.5% of patients with a familial history of PDB and 10.5% of unrelated PDB patients in Australia (Rea, Walsh et al. 2009). In Italy, 36.9% and 9.7% of patients with or without a familial history of PDB, respectively, were carriers of a SQSTM1 mutation (Gennari, Gianfrancesco et al. 2010), and similar frequencies were also observed in United Kingdom and New Zealand (Cundy, Naot et al. 2011, Hocking, Lucas et al. 2004). In United-States, SQSTM1 mutations are present in 20.5% of patients with a familial history of PDB, while none were reported in sporadic patients (Rhodes, Johnson-Pais et al. 2008). However, the SQSTM1/P392L mutation remains the most frequent mutation linked to PDB, with an overall frequency of 23.6% in familial cases, and 7.1% in unrelated patients (Morissette, Laurin et al. 2006). In the French-Canadian population, only the SQSTM1/P392L mutation is present, with frequencies of 46% in familial cases, and 16% in unrelated patients (Morissette, Laurin et al. 2006). Environmental factors also play an important role in PDB pathogenesis, in particular viral infections, as pagetic osteoclasts frequently express the measles virus nucleocapsid protein (MVNP) (Teramachi, Zhou et al. 2014).

PDB has an asymmetrical distribution and remains highly localized to affected bones, patients rarely developing new lesions after diagnosis (Roodman and Windle 2005). To explain this focal nature, some authors suggested, and then showed, that somatic mutations in the SQSTM1 gene could occur in pagetic bone lesions. Indeed, one team has reported a SQSTM1/P392L mutation in affected bone of two unrelated patients with PDB, but not in their peripheral blood, suggesting a somatic origin for these mutations (Merchant, Smielewska et al. 2009). Another independent study failed to detect any somatic mutations of the SQSTM1

gene in osteoblasts and bone marrow cells culture of PDB-affected patients (Matthews, Naot et al. 2009). Thus, these results may suggest that SQSTM1/P392L somatic mutations can be detected in pagetic bone lesions, but not in bone marrow of PDB patients.

Fibrous dysplasia (FD) is a focal bone disorder with an asymmetrical mono- or polyostotic distribution, like PDB. FD is caused by post-zygotic mutations in the Guanine Nucleotide-binding Protein Alpha-Stimulating activity (GNAS) gene, encoding for the α-subunit of the Gs protein. Post-zygotic mutations are somatic mutations occurring during the early development of the zygote, resulting in a mosaic distribution of normal and mutant cells in tissues or organs of affected individuals (Weinstein 2006). Most of the time, the mutation reported in FD is a substitution of the arginine at position 201 of the Gs protein to a histidine or a cysteine, and, rarely, to a glycine or a leucine (Michou and Brown 2010). Since the detection of these post-zygotic mutations is difficult without practicing a bone biopsy, a sensible polymerase chain reaction (PCR)-clamping method has been developed. This technique used a peptide nucleic acid (PNA), a primer that specifically blocks the amplification of the wild-type allele; thereby, improving the sensitivity to detect the mutant allele, even if this one was present in low copy number in DNA from peripheral blood of affected individuals (Lietman, Ding et al. 2005).

Given the similarities in the skeletal distribution between FD and PDB and the possible presence of SQSTM1/P392L somatic mutations in pagetic bone lesions, we hypothesized that the optimization of the PCR method, developed to detect GNAS post-zygotic mutations in FD, would allow us to detect SQSTM1/P392L post-zygotic mutations in the peripheral blood of patients with PDB. Thus, the objectives of this study were to develop a reliable method to detect SQSTM1/P392L post-zygotic mutations and to evaluate the frequency of this post-zygotic mutation in PDB.

Materials and methods

Individuals This study was approved by the CHU de Québec Ethics Committee, and all participants, affected or not, signed a consent form before entering the study. A complete bone evaluation, including total serum alkaline phosphatase (sALP) measurement, skull and pelvis X-rays and a wholebody bone scan was performed for each patient. The criteria used to diagnose PDB were: (1) an increase in total sALP level and/or (2) a typical aspect of PDB on the bone X-rays and/or (3) an abnormal whole-body bone scan, as previously reported (Laurin, Brown et al. 2001). Patients with FD were diagnosed on a typical bone aspect by the use of imaging. All patients with FD studied here were French-Canadians. The mean age was 43.5 ± 14.6 years, 50.0% of

91 them had only one bone affected, and 60.0% were male. Patients with PDB originated from three different countries: Canada (French-Canadians from the province of Quebec), France and United States (New York city area). Either they suffered from a familial form of PDB or they were considered as unrelated affected individuals. All participants studied were screened for germinal mutations in exons 7 and 8 of the SQSTM1 gene, and none of them were carrier of a SQSTM1 gene mutation. In the French-Canadian patients, the mean age at the time of the study was 80.3•± 10.9 years, 57.9% were male and 45.2% had a monostotic disease (Laurin, Brown et al. 2002, Morissette, Laurin et al. 2006). In the French population, the mean age of PDB patients was 70.7 ± 14.0 years, 56.3% were male and 31.3% had a monostotic disease. Finally, in the New York city area population, 44.4% were male and 60.3% had a monostotic bone involvement (the mean age was not available for this population) (Michou, Morissette et al. 2010, Michou, Collet et al. 2011). Clinical characteristics of pagetic patients, including total sALP (expressed as the number of times the midpoint of normal range to normalize results between patients), the age at PDB diagnosis, the number of bone sites affected by PDB and the skeletal extension calculated by the Rénier’s index, were collected (Renier, Cronier et al. 1995). Controls were healthy individuals from the French-Canadian population without any personal or familial history of PDB based on a questionnaire, and with normal total sALP levels at inclusion. For three of them, a bone scan was performed (see results section). The mean age of these healthy individuals at the time of the study was 76.7 ± 10.9 years, and 28.4% were male. For each participant, DNA from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was extracted according to standard procedures.

Development of the PCR‑clamping method for the GNAS/R201L mutation in FD patients Despite good results have been obtained in detecting somatic mutations in FD using a PNA in the literature (Lietman, Ding et al. 2005), the LNA has many advantages: the LNA has a higher stability when bonded to DNA, a higher affinity for complementary DNA sequences than PNA or than DNA itself, and a better sensitivity to the presence of mismatched bases (Braasch and Corey 2001). For all these reasons, we preferred, in our study, optimizing the PCR-clamping method by the use of an LNA instead of a PNA. We optimized this PCR- clamping technique in 10 patients with FD, in accordance with the literature (Lietman, Ding et al. 2005). The LNA was specifically designed for the GNAS/ R201L mutation and synthesized by Exiqon (Woburn, MA, USA) (5′-TTCGCTGCCGTGTCCTGAC-3′). A portion of exon 8 of the GNAS gene was amplified by PCR using the following primers: forward 5′-CACCCCACGTGTCTTTCTTT-3′ and reverse 5′-CACAGCATCCTACCGTTGAA- 3′. Each 20 μL PCR contained 40 ng of DNA, 1× PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 0.4 μM of each primer, 0.2 mM of dNTPs, 1 M of betaine, 0.4 U of JumpStart Taq DNA Polymerase and 5 μM of the specific LNA. PCR conditions were an initial denaturation at 95°C for 5 min, followed by 38 cycles at 95°C for 30 s (denaturation

step), 74°C for 30 s (LNA hybridization step), 55°C for 30 s (primer annealing step) and 72°C for 30 s (extension step), and an additional extension step was performed at 72°C for 8 min. Amplification products were purified and sequenced with Big Dye Deoxy Terminator v 3.1 Cycle (Applied Biosystems) on an ABI 3730xl sequencer at the Plateforme de séquençage et de génotypage des génomes du Centre de recherche du CHU de Québec. The DNA sequences obtained were analyzed with Staden package version 1.6 (Staden 1996). All chromatograms were independently analyzed by two readers (SGB, LM). In case of discordant interpretation, the PCR-clamping followed by the sequencing analysis was repeated. All sequences showing a post-zygotic mutation were done at least twice to confirm the results.

Optimization of the PCR‑clamping method for the SQSTM1/P392L mutation in PDB patients In this study, we only investigated the SQSTM1/P392L mutation, the most common mutation associated with PDB so far, since this mutation occurs at a hypermutable CpG dinucleotide sequence, a mutational hotspot (Laurin, Brown et al. 2002, Morissette, Laurin et al. 2006). We used an LNA specifically designed for this SQSTM1/P392L mutation, which was synthesized by Exiqon (Woburn, MA, USA) (5′-CAGCCGCGGGTCAGC- 3′). To confirm the LNA’s ability to block the wild-type allele amplification, we analyzed DNA from three types of control individuals: one healthy individual non-carrier of a SQSTM1/P392L germinal mutation, one pagetic patient heterozygous for the SQSTM1/ P392L germinal mutation, and one patient homozygous for this germinal mutation. A portion of exon 8 of the SQSTM1 gene was amplified using the following primers: forward 5′-TGGCTAACTGGCCTGTTCTT-3′ and reverse 5′-AATGGCTTCTTGCACCCTAA-3′. PCR mix and conditions were the same as those used for the detection of the GNAS/R201L post-zygotic mutation. Given the small amount of amplified fragments in the presence of LNA, we performed a nested PCR using the following primers: forward 5′-TACAGGGAAAGCAGGTCCAC-3′ and reverse 5′-TCCTGGAAGAAGGCAGAGAA-3′, and standard PCR conditions. Amplification products were purified, sequenced, and analyzed as previously mentioned. Once the LNA PCR-clamping technique was accurate, we analyzed DNA from 297 French- Canadian PDB patients, of whom 75 had a familial form of the disease, 16 PDB patients from the French population, of whom five suffered from a familial form of the disease, 63 unrelated PDB patients from the New York city area population, and 297 French-Canadian healthy controls, all non-carriers of a SQSTM1/P392L germinal mutation. Finally, to ensure that the post-zygotic mutations detected were not false positives due to the PCR method’s limits, we analyzed DNA from 19 individuals diagnosed with a rare bone disease and who are not likely to carry a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation.

93 Distribution of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation in blood and saliva tissues of PDB patients Blood samples (50 mL) were collected from three PDB patient carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation, one PDB patient heterozygous for the SQSTM1/P392L germinal mutation and one PDB patient non- carrier of any mutation within the SQSTM1 gene. PBMCs were isolated by Ficoll density gradient and dextran sedimentation. The isolated PBMCs were then centrifuged and incubated 20 min in PBS/0.2% BSA with the following antibodies: PercpCy5.5-conjugated anti-human CD45, PE-conjugated anti-human CD14, FITC- conjugated anti-human CD3, APC-conjugated anti-human CD19 and V450-conjugated anti-human CD56, according to the manufacturer’s protocol. Monocytes and lymphocytes were further sorted using the BD SORP FACSAria II cytometer at the Plateforme d’imagerie et cytométrie du Centre de recherche du CHU de Québec. Cells considered as monocytes were CD45+CD14+ cells, and those considered as lymphocytes were CD45+CD3+ (T lymphocytes), CD45+CD19+ (B lymphocytes) and CD45+CD56+ (natural killers) cells. Saliva samples (2 mL) were collected from two PDB patient carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation using the Oragene-DNA kit, provided by DNA Genotek (Ottawa, ON, Canada). DNA was extracted from monocytes, lymphocytes, and saliva separately using standard procedures, and the LNA PCR-clamping method was performed as previously described to detect SQSTM1/P392L post-zygotic mutations in these cell populations.

Distribution of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation in bone tissue of a PDB patient A transiliac bone biopsy was performed on the only patient carrier of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation who had a pelvic site involved with PDB, using a Rochester trephine (inner diameter 7–8 mm). Bone biopsy was bi-sectioned with low ISOMET speed saw (Buehler, Canada) and one section was frozen at −80 °C for laser microdissection of osteoclasts, before DNA extraction and sequencing. The other part of the biopsy was fixed in Phosphate buffered 10% formaldehyde prior to being decalcified in 14% EDTA for 3 days. Then, this bone sample was embedded in paraffin. A 5-μm-thick section was sectioned with a Leica RM2245 microtome and H&E stained to confirm that the bone biopsy was indeed in a pagetic area.

Estimation of the copy number of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation A fluorescent-based Realtime PCR quantification was performed on 10 ng of genomic DNA from 18 PDB patients carrier of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation, two PDB patient carriers of a homozygous SQSTM1/P392L germinal mutation, two PDB patients heterozygous for this same mutation, and 15 individuals

non-carrier of any mutation. We used the LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, DE), and reagent LightCycler 480 SYBRGreen I Master (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) as described by the manufacturer, with 2% DMSO. A portion of exon eight of the SQSTM1 gene was amplified using two specific forward LNA-enhanced qPCR primers synthetized by Exiqon (Woburn, MA, USA): 5′- TGTTTCGGCAGAGGCTGACC + C-3′ for the wild-type allele, and 5′-TGTTTCGGCAGAGGCTGACC + T-3′ for the mutant allele. The reverse primer was the same for both reactions and was synthesized without LNA (5′- TCCGATGTCATAGTTCTTGGTCTGC-3′). PCR conditions were 40 cycles at 90°C for 10 s (denaturation), 65°C for 10 s (annealing), 72°C for 14 s (elongation) and 80°C for 5 s (reading). A melting curve was performed to assess non-specific signal, and a standard curve was established using known amount of purified PCR products. Calculation of the number of copies of each mRNA was performed using second derivative method and a standard curve of Cp versus logarithm of the quantity, using the LightCycler 480 v1.5 program provided by the manufacturer (Roche Diagnostics, Mannheim, DE). Finally, the percentage of the mutant allele T versus wild-type allele C was calculated for each sample. All manipulations and analyses were performed at the Plateforme d’expression génique du Centre de recherche du CHU de Québec.

Statistical analyses Frequencies of the SQSTM1/P392L post-zygotic mutation between cases and controls were compared using a Chi-square test, with odds ratio (OR) and 95% confidence interval (95%CI) calculations. For the phenotype– genotype associations, we compared PDB patients with post-zygotic mutations to patients with germinal mutations and without any mutation within the SQSTM1 gene, for the following items: total sALP levels, age at diagnosis, number of affected bones, and Renier’s index. Analyses relied on Student t test for continuous variables, and Chi-square or Fisher exact tests when appropriate for nominal values. All analyses were performed using IBM SPSS Statistics 21 and a p value of < 0.05 was considered statistically significant.

Results

Development of the PCR‑clamping method for the GNAS/R201L mutation in FD patients The LNA PCR-clamping method was developed with DNA from PBMCs of ten patients with FD and two healthy controls. Figure 29 shows that the LNA specifically designed for the GNAS/R201L mutation was effective to block the wild-type allele amplification. Direct sequencing of the PCR products in presence of the LNA showed that one individual was carrier of a GNAS/R201L post-zygotic mutation, which was not detected

95 in the absence of the LNA (Figure 30). The FD patient carrier of the GNAS/R201L post-zygotic mutation, who was the only one to have a McCune-Albright syndrome, also seemed to have a more extensive disease than non-mutated FD patients (see FD-02, Tableau 9). In fact, he had 11 FD-affected bones, while the mean number in this cohort was 3.2•± 3.4 affected bones. These results suggested that the GNAS/R201L post- zygotic mutation can be detected with this PCR-clamping technique in FD.

Figure 29. LNA PCR-clamping method for the GNAS/R201L mutation in patients with fibrous dysplasia (FD). PCR was performed in the absence (-) or in the presence (+) of the LNA. DNA from FD patients (lanes labeled 1 to 4) and healthy controls (lanes labeled C) was used. A band of 460 bp was present when PCR was performed in absence of the LNA, and the intensity was reduced by the addition of the LNA in the PCR mix, as expected. PCR fragments were loaded on a 1% agarose gel. The water lane represented a control without DNA, and the absence of a PCR band indicated that there was no contamination in this experience.

Figure 30. Sequencing analysis with and without the use of the LNA PCR-clamping method in patients with fibrous dysplasia (FD). Forward and reverse short nucleotide sequence analysis of the region covering the GNAS/R201L mutation is presented. Left panel shows the sequences in absence of the LNA, and right panel shows the DNA sequence in presence of the LNA. a DNA sequence of a FD patient non carrier of a GNAS/R201L post-zygotic mutation. Regardless of the presence of the LNA, only the wild-type G allele was amplified. b DNA sequence of the patient FD-02, who is carrier of a GNAS/R201L post-zygotic mutation. In absence of the LNA, only the wild- type G allele was amplified, while in presence of the LNA, both wild-type G and mutant A allele were amplified.

97 Tableau 9. Description of the main clinical characteristics of patients (n=10) with fibrous dysplasia (FD).

Age at Extraosseous involvements or Patient ID Sex diagnosis Affected bones complications of FD (years) FD-01 M 40 Sphenoid None Skull, right maxillary, mandible, rib McCune Albright syndrome, back cage, both humeri, right radius, left and neck café au lait skin aFD-02 M 15 ulna, right pelvis, right femur, right lesions, hypophosphatemia, tibia erectile dysfunction Stenosis of the right external FD-03 M 26 Right temporal region auditory canal Bacterial meningitis, complete Left mastoid and occipital regions, FD-04 M 24 deafness on the left side, sphenoid, left mandible infertility Mazabraud’s syndrome (left calf FD-05 M 45 Both tibias and right thigh myxoma in addition to FD) FD-06 F 28 Left mastoid and occipital regions None Skull, D9 and L2 vertebrae, left FD-07 F 43 ischion, left sacroiliac region, both None femurs FD-08 M 24 Sphenoid None Right frontal region, ethmoid, FD-09 F 57 nasal bone, malar region, right None mandible FD-10 F 26 Skull None aFD-02 was found to be carrier of a GNAS/R201L post-zygotic mutation in our study.

Optimization of the PCR‑clamping method for the SQSTM1/P392L mutation in PDB patients The PCR performed on DNA from PBMCs of three control individuals confirmed that the LNA specifically designed for the SQSTM1/P392L mutation was very effective to block the wild-type allele amplification (Figure

31). Then, the PCR-clamping method was performed on DNA from PBMCs of a subset of patient non-carriers of a germinal mutation to search for SQSTM1/P392L post-zygotic mutations. Direct sequencing of PCR products showed that one patient in this subset was carrier of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation (Figure 32). These results suggested that this LNA PCR-clamping method was effective to detect SQSTM1/P392L post-zygotic mutations in peripheral blood of pagetic patients.

Figure 31. Optimization of the LNA PCR-clamping method for the SQSTM1/P392L mutation in patients with Paget's disease of bone (PDB). PCR was performed in absence (-) or in the presence (+) of the LNA. DNA from PBMCs of a non-mutated healthy individual (lane labeled 1), a patient with a heterozygous genotype for the SQSTM1/P392L germinal mutation (lane labeled 2), and a patient with an homozygous genotype for the SQSTM1/P392L germinal mutation (lane labeled 3) was used. A band of 600 bp was present when PCR was performed in absence of the LNA. For the mutated individuals, this band was still present when the LNA was added in the PCR mix, while completely absent for the non-mutated healthy individual. PCR fragments were loaded on a 1% agarose gel. The water lane represented a control without DNA, and the absence of a PCR band indicated that there was no contamination in this experience.

Figure 32. Sequencing analysis with and without the utilisation of the LNA PCR-clamping method in patients with Paget’s disease of bone (PDB). Forward and reverse short nucleotide sequence analysis of the region covering the SQSTM1/P392L mutation is presented. Left panel shows the sequences in absence of the LNA, and right panel shows the DNA sequence in presence of the LNA. a DNA sequence of a PDB patient carrier of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation. In absence of the LNA, only the wild-type C allele was amplified, while in presence of the LNA, both wild-type C and mutant T allele were amplified. b DNA sequence of a non-mutated healthy individual. Regardless of the presence of the LNA, only the wild-type C allele was amplified. c DNA sequence of a PDB patient carrier of a heterozygous SQSTM1/P392L germinal mutation. In absence of the LNA, both wild-type C and mutant T allele were amplified, while in presence of the LNA, only the mutant T allele was amplified. d DNA sequence of a PDB patient carrier of a homozygous SQSTM1/P392L germinal mutation. Regardless of the presence of the LNA, only the mutant T allele was amplified, as expected.

100

Prevalence of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation in PDB patients After verifying the accuracy and precision of the PCR-clamping method, we evaluated the prevalence of the SQSTM1/P392L post-zygotic mutation in 376 PDB-affected patients from three distinct populations (Quebec, France and New York city area) and 297 French-Canadian healthy individuals, all non-carriers of a SQSTM1/P392L germinal mutation. In the French-Canadian population, we detected a SQSTM1/P392L post- zygotic mutation in 17 (5.7%) patients with PDB (Tableau 10). Among them, five unrelated patients had a familial autosomal dominant form of the disease, but with absence of germinal or post-zygotic SQSTM1/P392L mutation in their relatives. In the French population, one (6.3%) patient with an autosomal dominant familial form of PDB was also carrier of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation (Tableau 10). We did not detect this post-zygotic mutation in patients with PDB from the New York city area population. Also, this post-zygotic mutation was not present in non-pagetic patients with a rare bone disease, further supporting that the post- zygotic mutations observed in PDB patients were not false positives due to the limits of the PCR method. Overall, in the three cohorts, we found 18 (4.8%) PDB patients carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation, the difference with healthy controls being statistically significant [p = 0.013, OR 3.68 (1.23; 11.00)]. Surprisingly, we found four (1.4%) carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation in a priori healthy French-Canadian individuals, based on questionnaire and total sALP measurements at inclusion. We were able to perform clinical examinations and whole-body bone scan in three of these healthy individuals to search if they had asymptomatic PDB. The clinical exam of the first one, an 81-year-old woman, demonstrated a frank hypertrophy of the internal extremity of the right clavicle, consistent with a diagnosis of PDB, but the bone scan only demonstrated degenerative lumbar and knee fixations, and no X-rays were available. The second healthy control was a 70-year-old man, without any clinical evidence of PDB. His bone scan did not show any fixation suggestive of PDB. The third control carrier of a post-zygotic mutation was a 54-year-old woman who reported permanent pain of the right parietal bone, but her bone scan and skull X-rays did not show any evidence of PDB.

101 Tableau 10. Description of the main clinical characteristics of pagetic patients (n=18) carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation.

Age at Number of Family Total sALP Renier’s index Patient ID Population Sex diagnosis affected Affected bones history levelsa (%) (years) bones Right femur, right clavicle, right PDB-01 French-Canadian No M 53 1.95 3 4.82 frontal region PDB-02 French-Canadian No F 68 11.99 2 Skull, sacrum 13.00 Left pelvis, left femur, lumbar PDB-03 French-Canadian No M 65 7.73 3 8.35 vertebra PDB-04 French-Canadian No F 30 1.48 1 Left tibia 5.00 PDB-05 French-Canadian No M 42 11.07 1 Sacrum 2.00 PDB-06 French-Canadian No M 49 2.32 2 Right femur, right scapula 7.80 PDB-07 French-Canadian No F 57 2.19 1 Right femur 9.00 PDB-08 French-Canadian No F 63 2.59 3 Skull, right pelvis, right femur 20.00 PDB-09 French-Canadian No M 64 1.28 2 Sacrum, lumbar vertebra 2.65 PDB-10 French-Canadian No M 79 1.55 1 Right humerus 1.17 PDB-11 French-Canadian Yes M 75 1.68 2 Right pelvis, left femur 7.70 PDB-12 French-Canadian No M 66 0.98 3 Right femur, both radius 4.70 PDB-13 French-Canadian No F 64 1.39 1 Left femur 6.00 Both occipital and parietal PDB-14 French-Canadian Yes F 66 0.84 1 3.67 regions

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Age at Number of Family Total sALP Renier’s index Patient ID Population Sex diagnosis affected Affected bones history levelsa (%) (years) bones Left pelvis, sacrum, right femur, PDB-15 French-Canadian Yes F 67 1.73 5 17.00 left fibula, right humerus Left pelvis, sacrum, L1 vertebra, PDB-16 French-Canadian Yes M 58 3.19 6 19.22 left scapula, right tibia, skull PDB-17 French-Canadian Yes F 78 1.79 1 Skull 11.00 PDB-18 French Yes M 58 1.22 2 Right pelvis, D7 vertebra 4.8 aThe normal range was 30-120 U/L; sALP = serum phosphatase alkaline, expressed as the number of times the midpoint of normal range.

103 Phenotype–genotype associations PDB patients carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation had a statistically significant lower number of affected bones than patients carrying a germinal mutation (2.2 ± 1.4 vs. 5.2 ± 4.3 affected bones, respectively, p = 0.002). These patient carriers of a post-zygotic mutation also had a lower Renier’s index than patients carrying a germinal mutation (8.2 ± 5.7 vs. 15.7 ± 13.4, p = 0.043), suggesting a lower disease extent (Tableau 11). Within the group of PDB patient carriers of a post-zygotic mutation, those with a familial form of the disease had 3.0 ± 2.35 affected bones, compared to 1.92 ± 0.86 for unrelated PDB patients, suggesting that familial cases had a more extensive disease. However, these results are only descriptive considering the small sample size. Although not statistically significant, PDB patients with post-zygotic mutations tended to have a lower age at diagnosis than patients without any mutations, and a higher age than patients carrying a germinal mutation. Moreover, patient carriers of a post-zygotic mutation tended to have a higher total sALP level than non-mutated patients, but lower than patients with a germinal mutation. These results suggested that patients with a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation have an intermediate clinical phenotype, between patient carriers of a SQSTM1/P392L germinal mutation and patients with PDB non-carrier of any SQSTM1 mutation.

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Tableau 11. Comparisons of main clinical parameters between PDB patients with SQSTM1/P392L post-zygotic mutations and patients with germinal mutations, or patients without any SQSTM1 mutation.

Comparison of post- Comparison of post- zygotic mutation zygotic mutation Categories of patients carriers to germinal carriers to non- mutation carriers mutated patients

Post-zygotic Germinal mutation Non-mutated patients mutation carriers carriers p value p value (n=356) (n=18) (n=116)

Age at diagnosis (years), 61.2 ± 12.2 58.4 ± 11.1 62.3 ± 11.1 0.324 0.716 mean ± SD

Total sALP levelsa 3.2 ± 3.4 4.5 ± 8.2 2.9 ± 3.1 0.629 0.977

Number of affected 2.2 ± 1.4 5.2 ± 4.3 2.5 ± 2.3 0.002 0.884 bones, mean ± SD

Renier’s index (%), 8.2 ± 5.7 15.7 ± 13.4 10.2 ± 8.7 0.043 0.606 mean ± SD asALP = serum phosphatase alkaline expressed as the number of times the midpoint of normal range.

105 Somatic mosaicism of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation in PDB patients Direct sequencing of PCR products from PDB patient carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation showed that this mutation was present in the monocytes population, but absent in lymphocytes and saliva (Figure 33). Similar results have been observed for the three patients, carrier of a post-zygotic mutation. The LNA PCR-clamping method performed on DNA from monocytes, lymphocytes and saliva suggested that the post-zygotic mutation was restricted to the monocytic lineage.

Among the 18 PDB patient carriers of the SQSTM1/P392L post-zygotic mutation, only one patient with a pagetic involvement of the pelvis was eligible for a transiliac bone biopsy. This patient was treated with an infusion of zoledronic acid 5 mg in 2008. He had normal levels of sALP and creatinine at the time of the biopsy. The X-ray of his pelvis demonstrated a typical pagetic aspect of the right pelvis with prominence of bone sclerosis, cortico-trabecular dedifferentiation and bone hypertrophy (Figure 34). Unfortunately, the one effort to secure active pagetic bone for laser micro-dissection proved ineffective, as the biopsy yielded tissue with insignificant cellular activity (Figure 35). Indeed, the osteoclastic activity appeared largely decreased in number, and slight fibrosis process has been observed in some Howship’s lacunae. An absence of osteoblast cells was also observed. Increased cortical thicknesses, architectural disorganization with heavily trabeculated bone were observed, suggesting a final ‘burn out’ phase of pagetic bone, although we cannot definitely rule out that this absence of bone cells may result from a technical problem during the fixation of the bone sample.

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Figure 33. Sequencing analysis with and without the use of LNA PCR-clamping method in DNA from monocytes, lymphocytes and saliva in patients with Paget’s disease of bone (PDB). Forward short nucleotide sequence analysis of the region covering the SQSTM1/P392L mutation is presented. Left panel shows the sequences in absence of the LNA, and right panel shows the DNA sequences in presence of the LNA. a DNA sequences of the monocytes population. (1) For the PDB patient carrier of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation, only the wild-type C allele was amplified in absence of the LNA, while in presence of the LNA, both wild-type C and mutant T allele were amplified. (2) For the PDB patient carrier of a SQSTM1/P392L germinal mutation, both wild-type C and mutant T alleles were amplified in absence of the LNA, while only the mutant T allele was amplified after the addition of the LNA in the PCR mix. (3) For the non- mutated PDB patient, only the wild-type C allele was amplified, regardless of the presence of the LNA. b DNA sequences of the lymphocytes population from a PDB patient carrier of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation. Only the wild-type allele C was amplified, regardless of the presence of the LNA. c DNA sequence of the saliva cells population from a PDB patient carrier of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation. Only the wild-type C allele was amplified, regardless of the presence of the LNA.

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Figure 34. X-ray of the pelvis of a patient carrier of the SQSTM1/P392L post-zygotic mutation. This figure shows a typical pagetic aspect of the right pelvis with prominence of bone sclerosis, cortico- trabecular dedifferentiation and bone hypertrophy.

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Figure 35. Histology of the transiliac bone biopsy of a patient carrier of the SQSTM1/P392L post-zygotic mutation. The bone biopsy was fixed in Phosphate buffered 10% formaldehyde, decalcified in 14% EDTA for three days, and embedded in paraffin. A 5μm thick section was sectioned with a Leica RM2245 microtome and was H&E stained. a This figure shows the heavily trabeculated bone, one of the main characteristics of PDB (magnification x 400). b This figure shows a typical aspect of PDB, with non-lamellar architecture, presence of woven bone, and a mosaic pattern. Also, we can observe the absence of osteoclasts in Howship’s lacunae and of osteoblasts (magnification x 20).

Estimation of the copy number of the SQSTM1/P392L post‑zygotic mutation For PDB-affected patient carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation, the percentage of the mutant T allele versus the wild-type C allele was ≤ 10% for each DNA sample tested. For the PDB patients carrier of a heterozygous SQSTM1/P392L germinal mutation, this percentage was > 97%, suggesting that the mutant T allele and the wild-type C allele were present in a similar copy number, as expected. For non-mutated

109 individuals and patients homozygous for the germinal SQSTM1/P392L mutation, we found about 3% of contamination.

Discussion In this study, we developed an LNA PCR-clamping method reliable to detect a GNAS/R201L post-zygotic mutation in peripheral blood of one patient with McCune Albright syndrome, but none of FD patients, which represents a mutation rate similar to the one reported in the literature (Lietman, Ding et al. 2005). We then optimized this PCR technique to detect SQSTM1/P92L post-zygotic mutations in peripheral blood of patients with PDB. We found that 4.8% of PDB patients and 1.4% of healthy controls were carrier of this post-zygotic mutation. Among the PDB patient carriers of a post-zygotic mutation, five of them had an autosomal dominant form of the disease, but none of the relatives were carrier of a germinal or post-zygotic SQSTM1 mutation. Since the disease-causing gene is still unknown in these families, we cannot rule out that these post-zygotic mutations can act as a modifier. Genotype–phenotype associations showed that PDB patient carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation had a lower number of affected bones and a lower Renier’s index than patients carrying a germinal mutation, suggesting a less important disease extension. We did not find any statistically significant difference in the sALP levels between the different mutations groups, which is not surprising since most of patients have already been treated for PDB. Thereafter, we observed that the somatic mosaicism of SQSTM1/P392L mutation was restricted to the monocytic lineage. Indeed, the post-zygotic mutation was present in DNA from peripheral blood monocytes, but absent from DNA of lymphocytes and saliva. Our results, in addition to the presence of SQSTM1/P392L somatic mutations reported in pagetic bones (Merchant, Smielewska et al. 2009), confirm that SQSTM1/P392L post-zygotic mutations may occur in patients with PDB. The detection of SQSTM1/P392L post-zygotic mutations in four healthy individuals, although unexpected, may suggest that this post-zygotic mutation has an incomplete penetrance. Indeed, incomplete penetrance has also been reported for the SQSTM1/P392L germinal mutation, this penetrance being about 80% by the seventh decade (Ralston and Albagha 2011). Healthy individual carriers of the SQSTM1/P392L germinal mutation, even after the age of 55 years and without any clinical symptoms of PDB, have also been reported in the literature (Bolland Tong et al. 2007).

Although we were unable to confirm the presence of the SQSTM1/P392L post-zygotic mutation in an affected bone, we observed that the presence of this mutation was restricted to monocytes, the osteoclasts precursors. Since osteoclasts are the primary cells affected by PDB, we may hypothesize that a subset of cells originating from the monocytic lineage and carrying this mutation could contribute focally to the development of PDB. However, we cannot rule out the possibility that osteoclasts or their precursors may have recirculated from an

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affected bone in the peripheral blood. It will be interesting to determine if these monocytes are expressing MVNP to investigate the relation between post-zygotic mutations and viral infection, as it was done for the SQSTM1 germinal mutation (Kurihara, Hiruma et al. 2011). In the future, the generation of animal model carriers of this SQSTM1/P392L post-zygotic mutation would be of paramount importance to better assess the functional role of post-zygotic mutations in PDB pathogenesis.

Our study has some limitations. First, we used an LNA blocking the mutation site in the forward sense only. We also decided to focus our study only on the SQSTM1/P392L mutation since it is the most frequent mutation associated with PDB and the only one present in the French-Canadian population, and it is located on a mutational hotspot. More than 20 mutations in the SQSTM1 gene have been associated with PDB, and it is likely that they can occur as well in a post-zygotic form. Then, the LNA PCR-clamping method should be adapted to other SQSTM1 mutations reported in PDB to have a better idea of the prevalence of post-zygotic mutations in PDB. Alternatively, to facilitate the detection of post-zygotic mutations, other sensitive and more high throughput genotyping methods, such as single-nucleotide polymorphisms arrays and/or next-generation sequencing, should be considered (Omoyinmi, Melo Gomes et al. 2014). On the other hand, this study has several strengths. First, the recruitment of this large cohort of patients with the systematic collection of clinical data is a valuable tool to study the genetic factors of PDB. Second, we developed and validated a successful PCR-clamping method, which ensures its accuracy and reproducibility in the detection of low-frequency mutations.

In the literature, post-zygotic mutations are defined as mutations that arise in development during organogenesis, at the zygote stage. These mutations are classically unilateral, as evidenced by the topographically limited and tissue or organ-restricted clinical manifestations. They usually cause the development of sporadic disease in individuals with unaffected parents (Biesecker and Spinner 2013). In this study, our data do not allow us to determine at which time the mutation arose during organogenesis, but its presence in a blood lineage may suggest an early occurrence in the development of the zygote. It is important to note that there are different classes of mosaic disorders. FD is a disorder that manifests only as a mosaicism, since there is no familial form of the disease. In fact, this disease is caused by mutations that are lethal in the embryonic development, which means that they cannot be transmitted through the germ line. Cells bearing the mutation can only survive when they are in close proximity to wild-type cells (Happle 1986). Some disorders, usually transmitted in an autosomal dominant pattern of inheritance, have also been reported in mosaic forms. Patients with such mosaicism can have affected children since the post-zygotic mutation, if present in the germ line, would be transmitted to the offspring. For example, in neurofibromatosis type 1, even if most of the affected individuals are carriers of a germinal mutation in the NF1 gene and develop a complete disease phenotype, some individuals were reported to have clinical manifestations limited to a tissue or an

111 organ due to the presence of post-zygotic mutations in the NF1 gene (Biesecker and Spinner 2013, Kaplan, Foster et al. 2010). Somatic mosaicism due to post-zygotic mutations can result in a milder, borderline clinical phenotype which may vary with the proportion, usually low, of cells carrying the mutation (Forsberg, Absher et al. 2013). Thus, our results suggest that, like in neurofibromatosis type 1, pagetic patient carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic mutation would develop a less extensive bone involvement than patients harboring the germ line mutation. Indeed, it is possible that the PDB extent could be somewhat correlated to the proportion of cells carrying the SQSTM1/P392L post-zygotic mutation. However, we did not find any particular trend in the laterality of affected bones in patients carrying the post-zygotic mutation, since both sides were affected in most of them. In this study, all patients carrying the SQSTM1/P392L post-zygotic mutation had a percentage of mutant T allele ≤ 10%. These results could explain why we were not able to detect this post-zygotic mutation without the addition of the LNA in the PCR mix, and suggest that our technique increases the sensibility to detect SQSTM1/P392L mutations in our populations. In fact, the diagnostic performance of the PNA to detect GNAS post-zygotic mutations in fibrous dysplasia is about 1%, and about 0.03% for the next-generation sequencing technique (Narumi, Matsuo et al. 2013). Our results are in accordance with a possible mutational spectrum at germinal, post-zygotic and somatic levels for the SQSTM1/P392L mutation. This mutational spectrum, including post-zygotic mutations, could explain the focal nature with the asymmetric bone distribution observed in PDB, and contribute to the variable expressivity observed in familial forms of PDB with autosomal dominant pattern of inheritance.

In conclusion, we developed a reliable LNA PCR-clamping method to detect SQSTM1/P392L post-zygotic mutations in peripheral blood of patients with PDB. Further studies in other populations are warranted to determine more accurately the frequency of the SQSTM1/P392L mutations at a germinal, post-zygotic and somatic level, respectively, and to determine how post-zygotic mutations, within the SQSTM1/P392L mutational spectrum, may contribute to the focal nature of pagetic bone involvement.

Acknowledgments

Sabrina Guay-Bélanger was supported in part by a Ph.D. student award from the Network for Oral and Bone Health Research (Fonds de Recherche en Santé du Québec). Dr. Michou is supported by a career award from the Fonds de Recherche en Santé du Québec. This study was funded by the Canadian Institute of Health Research (MOP 115151 and IMH 112316), the Fondation du CHUQ, the Canadian Foundation for Innovation, the Fonds de Recherche en Santé du Québec, the Laval University and the CHU de Québec Research Centre. We thank Lynda Brown, the research nurse who collected blood samples and helped for the bone biopsy preparation, and Suzanne Côté who assisted Dr. Brown to perform the bone biopsy.

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Chapitre 2

Development of a Molecular Test of Paget’s Disease of Bone

Sabrina Guay-Bélanger1,2, David Simonyan1, Alexandre Bureau3,4, Edith Gagnon1, Caroline Albert5, Jean Morissette1, Ethel S. Siris6, Philippe Orcel7, Jacques P. Brown1,2,8 and Laëtitia Michou1,2,8.

1CHU de Québec Research Centre, Québec, QC, Canada 2Division of Rheumatology, Department of Medicine, Université Laval, Québec, QC, Canada 3Département de médecine sociale et préventive, Université Laval, Québec, QC, Canada 4Centre de recherche du Centre intégré universitaire de santé et de services sociaux de la Capitale-Nationale, Québec, QC, Canada 5Department of Biochemistry, CHUM, Montreal, QC, Canada 6Columbia University Medical Centre, New-York City, NY, USA 7Pôle appareil locomoteur, service de rhumatologie B, hôpital Lariboisière, AP-HP, Paris, France 8Department of Rheumatology, CHU de Québec, Québec, QC, Canada

Ce chapitre est présenté sous forme d’article scientifique et a récemment été soumis dans la revue : Bone

117 Résumé La maladie osseuse de Paget (MOP) est transmise selon un mode autosomique dominant à pénétrance incomplète dans un tiers des cas. Jusqu’à maintenant, seules des mutations dans le gène SQSTM1 ont été associées avec la maladie. Plusieurs polymorphismes de nucléotide simple (SNPs) ont été associés à la MOP chez les patients non porteurs d’une mutation dans le gène SQSTM1, avec des tailles d’effet individuel mineures. Actuellement, les lignes directrices recommandent de mesurer les niveaux de phosphatases alcalines (PAL) totales dans le sérum pour le dépistage de la MOP. Cependant, les marqueurs génétiques ou biochimiques pris individuellement peuvent manquer de sensibilité pour le dépistage de la maladie. Ainsi, l’objectif de cette étude était de développer un test moléculaire spécifique à la MOP, en combinant les marqueurs génétiques et biochimiques afin de dépister la maladie, qui est fréquemment asymptomatique. Nous avons génotypé 35 SNPs précédemment associés avec la MOP chez 305 patients et 292 contrôles sains. De plus, les niveaux sériques de 14 biomarqueurs du remodelage osseux ont été mesurés chez 51 patients et 151 contrôles sains. Des modèles de régression logistique bivariés et multivariés, ajustés pour l’âge et le sexe, ont été générés pour rechercher une combinaison de SNPs et/ou de marqueurs biochimiques qui pourraient dépister la MOP chez les patients non porteurs d’une mutation dans le gène SQSTM1. D’abord, une combinaison de cinq marqueurs génétiques avait une aire sous la courbe ROC (AUC) avec un intervalle de confiance à 95% de 0,731 [0,688; 0,773], permettant la détection de 81,5% des patients pagétiques. Ensuite, une combinaison de deux marqueurs du remodelage osseux avait une AUC égale à 0,822 [0,726; 0,918], et était présente chez 81,5% des patients atteints de MOP. La combinaison des cinq marqueurs génétiques et des deux marqueurs biochimiques a augmenté l’AUC à 0,892 [0,833; 0,951], permettant la détection de 88,5% des patients pagétiques. Ces résultats suggèrent qu’un algorithme intégrant d’abord un dépistage pour les mutations dans SQSTM1, suivi par une combinaison de marqueurs génétiques ou une combinaison de marqueurs génétiques et biochimiques chez les patients non porteurs d’une mutation dans le gène SQSTM1, pourrait détecter le phénotype pagétique de façon plus fiable que les biomarqueurs actuellement disponibles dans la pratique clinique.

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Abstract Paget’s disease of bone (PDB) is transmitted in an autosomal-dominant mode of inheritance with incomplete penetrance in one third of cases. To date, only SQSTM1 gene mutations have been linked to the disease. Several single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been associated with PDB in patient non-carriers of a SQSTM1 mutation, but they have minor size effects. The current clinical practice guidelines still recommend to measure total serum alkaline phosphatase (sALP) for PDB screening. However, genetic or bone biomarkers alone may lack sensitivity to detect PDB. Thus, the objective of this study was to develop a molecular test of PDB, combining genetic and bone biomarkers, in order to detect PDB, which is frequently asymptomatic. We genotyped 35 SNPs previously associated with PDB in 305 patients, and 292 healthy controls. In addition, serum levels of 14 bone biomarkers were assayed in 51 patients and 151 healthy controls. Bivariate and multivariate logistic regression models with adjustment for age and sex were fitted to search for a combination of SNPs and/or bone biomarkers that could best detect PDB in patient non-carriers of a SQSTM1 mutation. First, a combination of five genetic markers gave rise to the highest area under the ROC curve (AUC) with 95% confidence interval [95% CI] of 0.731 [0.688; 0.773], which allowed us to detect 81.5% of patients with PDB. Second, a combination of two bone biomarkers had an AUC of 0.822 [0.726; 0.918], and was present in 81.5% of patients with PDB. Then, the combination of the five genetic markers and the two bone biomarkers increased the AUC up to 0.892 [0.833; 0.951], and detected 88.5% of patients with PDB. These results suggested that an algorithm integrating first a screen for SQSTM1 gene mutations, followed by either a genetic markers combination or a combined genetic and biochemical markers test in patients non-carrier of any SQSTM1 mutation, may detect the PDB phenotype better than biomarkers already available in the clinical practice.

119 Introduction Paget’s disease of bone (PDB) is characterized by focal abnormal bone remodeling, with increased bone resorption coupled with an increased and disorganized new bone formation, resulting in abnormal bone architecture and weakened bone strength. This disease affects up to 3% of Caucasians over 55 years of age, which makes it the second most frequent metabolic bone disorder after osteoporosis (Michou and Brown 2011). In most cases, patients with PDB are asymptomatic. However, 10 to 30% of patients will develop symptoms and complications, such as bone pain, bone deformities, fractures, deafness, or nerve root compression. The development of an osteosarcoma is the most severe complication, and occurs in less than 1% of patients with PDB (Roodman and Windle 2005).

PDB has a strong genetic component, the disease being transmitted in an autosomal dominant mode of inheritance with incomplete penetrance in about one third of cases (Michou and Brown 2010). Although genetic heterogeneity has been demonstrated in familial forms of PDB, only the Sequestosome 1 (SQSTM1) gene at the 5q35 locus has been linked to PDB, with nearly 30 disease-causing mutations identified so far (Laurin, Brown et al. 2002, Rea, Walsh et al. 2013). Overall, these mutations in SQSTM1 gene are present in about 35% of familial forms of PDB, and 7% of unrelated patients (Guay-Bélanger, Cormier et al. 2015). Two genome wide association studies (GWAS) performed in PDB-affected patients without SQSTM1 mutations identified seven loci associated with PDB (Albagha, Visconti et al. 2010, Albagha, Wani et al. 2011). These associations were then replicated in other populations, including the French-Canadian population (Chung, Beyens et al. 2010, Michou, Conceicao et al. 2012, Beauregard, Gagnon et al. 2014). In this population, some rare variants were also associated with PDB in patient non-carriers of SQSTM1 mutations (Beauregard, Gagnon et al. 2013, Beauregard, Gagnon et al. 2014). Environmental factors were reported to play an important role in PDB pathogenesis. Although controversial in the literature, viral infection would contribute to the development of the disease, as osteoclasts expressing the gene encoding for the measles virus nucleocapsid protein (MVNP) develop a complete pagetic phenotype, both in cellular and animal models (Kurihara, Hiruma et al. 2011).

Currently, a decline in the prevalence and severity of PDB is observed in many countries previously known to have a high prevalence of PDB (Cooper, Harvey et al. 2006, Corral-Gudino, Borao-Cengotita-Bengoa et al. 2013). This may increase the proportion of affected individuals who remain asymptomatic, especially in familial forms. Given the high risk of developing an osteosarcoma on pagetic bone, this disease is a formal contraindication to the prescription of bone anabolic agents, such as Teriparatide. Indeed, the excessive stimulation of osteoblasts in individuals affected but asymptomatic or predisposed to PDB may increase the risk of developing an osteosarcoma or more likely give rise to the occurrence of a symptomatic PDB, representing serious adverse events of these drugs. With the incoming introduction of anabolic agents

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targeting natural inhibitors of osteoblasts indicated for osteoporosis treatment, it will be crucial to exclude accurately the presence of PDB, including in asymptomatic individuals. The current clinical practice guidelines still recommend to measure total serum alkaline phosphatase (sALP) for PDB screening (Singer, Bone et al. 2014). However, total sALP levels may be within the normal range, especially in patients with monostotic or metabolically inactive disease, and this should not exclude a diagnosis of PDB (Ralston 2013). Since genetic or bone biomarkers alone may lack sensitivity to predict the clinical diagnosis of PDB, we hypothesized that the combination of both kind of markers would be better. Thus, the objective of this study was to develop a molecular test of PDB, including a combination of genetic and bone biomarkers, in order to detect PDB.

Material and methods

Individuals The present study was approved by the CHU de Québec Ethics Committee and all participants, affected or not, signed a consent form before entering the study. A complete bone evaluation, including total sALP measurement, skull and pelvis X-rays and a whole-body bone scan, was performed for each patient. The criteria used to diagnose PDB were: 1) an increase in total sALP level and/or 2) a typical aspect of PDB on the bone X-rays and/or 3) an abnormal whole-body bone scan, as previously reported (Laurin, Brown et al. 2001). Patients with PDB originated from two different countries: Canada (French-Canadian from a 120km area around Quebec City) and France (Angers, Paris, Saint-Etienne areas). They had either a familial form of PDB, with only one affected per family being included in this study, or they were unrelated affected individuals. In the French-Canadian patients, the mean age at inclusion was 69.2 ± 9.6 years, 57.1% were male, and 42.7% had a monostotic disease (Laurin, Brown et al. 2002, Morissette, Laurin et al. 2006). In the French population, the mean age of PDB patients at inclusion was 62.7 ± 13.9 years, 50.0% were male, and 22.2% had a monostotic disease (Michou, Collet et al. 2012). An affected-only cohort of validation included PDB patients from United- States (New-York city area). In this population, 44.3% were male, and 54.3% had a monostotic disease (Michou, Morissette et al. 2010). Clinical characteristics, including sex, family history of PDB, total sALP levels (expressed as the number of times the midpoint of normal range in order to normalize results between patients), the age at PDB diagnosis, the number of bone sites affected by PDB and the skeletal extension calculated by the Rénier’s index, were collected for each patient (Renier, Cronier et al. 1995). Controls were healthy individuals from the French-Canadian population living in an area of 120km around Quebec City without any personal or familial history of PDB based on a questionnaire, and with normal total sALP levels at inclusion. Bone scans were not done in this population. The mean age of these healthy individuals at inclusion

121 was 64.8 ± 10.9 years, and 28.8% were male. For each participant, DNA from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was extracted according to standard procedures.

SNP selection and genotyping All study participants were previously screened for germinal mutations in exons 7 and 8 of the SQSTM1 gene, and 47 patients with PDB were carriers of a germinal SQSTM1 mutation: all patients with a mutation were carriers of a SQSTM1/P392L germinal mutation, except for two French individuals; one was carrier of a SQSTM1/A390X mutation, and the other of both SQSTM1/P392L and SQSTM1/A390X mutations. In addition, 15 participants were carriers of a SQSTM1/P392L post-zygotic but not germinal mutation (Guay-Bélanger, Picard et al. 2015). 35 SNPs previously shown to be associated with PDB in the literature were genotyped (Tableau 12) (Beyens, Daroszewska et al. 2007, Albagha, Visconti et al. 2010, Chung, Beyens et al. 2010, Albagha, Wani et al. 2011, Chung, Beyens et al. 2011, Michou, Conceicao et al. 2012, Beauregard, Gagnon et al. 2013, Beauregard, Gagnon et al. 2014). Genotyping of SNPs relied on two different methods: Sanger sequencing or Sequenom MassARRAY SNP Multiplex Technology. The SNPs genotyped by the Sanger sequencing method were first amplified using a polymerase chain reaction (PCR). Amplification products were purified and sequenced with Big Dye Deoxy Terminator v 3.1 Cycle (Applied Biosystems) on an ABI 3730xl sequencer, and the DNA sequences obtained were analyzed with Staden package version 1.6 (Staden 1996). For the Sequenom MassARRAY SNP Multiplex Technology, the purified DNA solution containing multiplexed primer-based extension reaction (iPLEX reaction) products was dispensed from the 384-wells microplate onto a 384-pad silicon microchip, using the MassARRAY nanodispenser. The mass of each SNP allele was detected on the MassARRAY Compact MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time Of Flight) mass spectrometer. The results were analyzed with MassARRAY Typer 4 software. In order to verify the allele calls, 3.7% of samples were randomly duplicated in the plate, and yielded to a consistency of 100%. All genotyping procedures were performed at the Plateforme de séquençage et de génotypage des génomes du Centre de recherche du CHU de Québec. Each SNP was genotyped in 287 French-Canadian patients with PDB, 18 French patients with PDB, and 292 healthy controls from the French-Canadian population. Finally, five selected SNPs (see results section) were genotyped in 70 unrelated patients with PDB, from the New-York city area population.

122

Bone biomarkers Ten biomarkers associated with bone metabolism were assayed in serum using commercial Roche Diagnostics immunoassay kits (Hoffman’s division LaRoche Ltée; Laval, Canada), according to the manufacturer’s protocol: procollagen type 1 amino-terminal propeptide (P1NP), 25-OH vitamin D, interleukin-6 (IL-6), parathyroid hormon (PTH), C-telopeptide, N-mid osteocalcin, calcium, albumin, total ALP and high- sensitivity C-reactive protein (hsCRP). All these immunoassays were performed using the Cobas E170 or the Cobas c311 system at the Laboratoire de biochimie de l’hôpital St-Luc du Centre hospitalier de l’Université de Montréal. In addition, receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand and osteoprotegerin (OPG) serum levels were measured using commercially available ELISA kits from Neobiolab (Cambridge, MA, USA), and serum levels of anti-measles virus IgG were measured using the ELISA kit from IBL International (Hamburg, Germany), according to the manufacturer’s protocols. Finally, sclerostin serum levels were measured using a homemade ELISA protocol. Briefly, the plates were coated with 4 µg/mL of human sclerostin monoclonal antibody (R&D, Minneapolis, USA) overnight at 4°C. Then, all wells were blocked for two hours with a 0.1 M Tris solution containing 8% of milk. After washing three times with a Tris-buffered saline solution containing 0.05% of Tween20 (TTBS), samples and standards were incubated overnight at 4°C. The plate was washed again, and samples were incubated one hour at 4°C with 2µg/mL of biotinylated antihuman sclerostin immunoglobulin (R&D, Minneapolis, USA) for the detection of the antigen. Then, samples were washed three times and incubated for one hour at 4°C with Streptavidin-HRP (R&D, Minneapolis, USA). After a final wash, the substrate (R&D, Minneapolis, USA) was added and samples were incubated 20 minutes at room temperature. Finally, the stop solution (R&D, Minneapolis, USA) was added, and the absorbance, determined as the optical density at 450 nm, was measured. The intra-assay coefficient of variation (CV) was 10.1%, and the inter-assay CV was 7.3%. Each of these biomarkers were measured in serum samples from 36 French- Canadian patients with PDB, 15 French patients with PDB and 151 healthy controls from the French-Canadian population. Serum samples were collected at the inclusion visit, aliquoted, and frozen immediately at -80 until analyses. Serum samples were not available in the New York city area population.

Statistical analyses Hardy-Weinberg equilibrium was checked by a conformity chi-square test in controls. Linkage disequilibrium was calculated by the use of Haploview software. Since there was one to five missing genotypes in 10 SNPs, and one SNP (rs3829923) had 14 (2.35%) missings, these genotypic data were imputed using the expectation-maximization algorithm of multiple imputation procedure, which includes all genetic markers. Genetic markers were dichotomized according to the presence or absence of the at risk allele within the genotype, and patients carrying a germinal or a post-zygotic SQSTM1 mutation were removed from these

123 analyses. To describe non-linear interactions among all SNPs, we applied the multiple dimensionality reduction (MDR) method, using 10-folds cross-validation. The subjects were considered at high risk when they exceeded the threshold ratio (1.0). The maximum cross-validation consistency and maximum testing balanced accuracy were used for gene-gene interaction selection. Bivariate analyses were performed to compare the frequencies of each SNP between cases and controls, using Chi-square or Fisher’s exact tests, with odds ratio (OR) and 95% confidence interval (95%CI) calculations. Then, bivariate and multivariate logistic regression models with adjustment for age and sex were fitted to search for a unique SNP, or a combination of SNPs, that could predict the PDB phenotype. The goodness of fit for the last models was verified using the Hosmer- Lemeshow test. A classification table was generated in order to establish a cut-off point for the predicted probability of PDB based on estimated sensitivity and specificity. Then, using the logistic regression estimates of each parameter, the predicted probability of PDB was calculated for each individual, and if this predicted probability was equal or greater than the established cut-off point, the individual was considered as having a positive test. In order to facilitate the results interpretation, this predicted probability was referred as a genetic score. The area under the receiving operating characteristics (ROC) curve and 95% CI were estimated for all of these models using DeLong et al.’s approach available in SAS (DeLong, DeLong et al. 1988). Intrinsic characteristics, including sensitivity, specificity, positive and negative likelihood ratios, as well as extrinsic characteristics, including positive and negative predicting values (PPV and NPV) with 95%CI were also calculated. Then, analyses were performed with 243 patients with PDB, of whom 231 were French-Canadians and 12 were French, and 292 healthy controls.

Serum calcium was corrected for albumin, using the standard formula (corrected calcium (mmol/L) = total calcium (mmol/L) + 0.02 x [40 - albumin (g/L)]), and a scale change of this variable in µmol/L was applied. Bivariate analyses were performed to compare the mean of each bone biomarker between cases and controls. Student t or Wilcoxon tests were used, depending on the variable distribution. Then, logistic regression models with adjustment for age and sex were fitted to search for a combination of biomarkers that could detect the PDB phenotype. The area under the ROC curve (AUC) and 95%CI were also calculated for each bone biomarker separately, and then in combination. Intrinsic and extrinsic characteristics were also calculated for the bone biomarkers combinations. In order to establish a cut-off point for continuous variables, a classification table was generated. Then, the estimates of each parameter given by the logistic regression analysis were used to calculate the predicted probability of PDB for each individual. In this model, the predicted probability was referred as a biochemical score. Analyses were then performed with 27 PDB-affected patients (16 French-Canadians and 11 French), and 151 healthy controls. We further combined the genetic and biochemical markers in the same logistic model to test if it increased the diagnostic detection. The predicted probability of a positive score for PDB detection for this model was calculated as previously described, and was referred as a combined score in this study. These analyses included 26 patients with PDB (16 French-

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Canadians and 10 French), and 151 healthy controls. For the genotype-phenotype associations, we compared PDB patients with a genetic score equal or greater than the established cut-off point to PDB patients with a genetic score inferior than this cut-off point, for the following items: familial history of PDB, age at diagnosis, total sALP levels, number of affected bones, and Renier’s index. Analyses relied on Student t test for continuous variables, and Chi-square of Fisher’s exact tests when appropriate for nominal values. Genotype- phenotype association analyses included patients with PDB from the three populations available to this study. Statistical analyses were performed using SAS 9.4, MDR v 3.0.2, and IBM SPSS Statistics 21. Intrinsic and extrinsic characteristics for each molecular test were calculated using SAS and the online platform https://www.medcalc.net/tests/diagnostic_test.php. For all analyses, a p value of <0.05 was considered statistically significant.

Results Three SNPs departing from Hardy-Weinberg equilibrium (rs11742646, rs10498635 and rs35211496) were excluded from the analyses. In addition two SNPs were in complete linkage disequilibrium with other SNPs studied, rs10494112 with rs499345 as well as rs484959, and rs1485286 with rs2073617. Then, a total of 30 SNPs were included in the analyses (Tableau 12). We searched for gene-gene interactions between SNPs using a MDR approach. However, no combination was found to be significantly associated with PDB (data not shown).

Tableau 12. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) genotypes available for this study.

Loci Physical position SNP number Gene 110201580 Rs650985 GSTM4 110352477 Rs10494112† EPS8L3/CSF-1 1p13 110361682 Rs499345 EPS8L3/CSF-1 110366083 Rs484959 EPS8L3/CSF-1 3q24 18160060 Rs4688903 LOC339862 5q31 141019830 Rs11742646* RELL2 7q33 135293128 Rs4294134 NUP205 104388446 Rs35500845 CTHRC1 8q22 105359432 Rs2458413 TM7SF4 105367264 Rs62620995 TM7F4 8q24 119950668 Rs1485286† TNFRSFIIB

125 Loci Physical position SNP number Gene 119952765 Rs11573871 TNFRSFIIB 119953158 Rs11573869 TNFRSFIIB 119955111 Rs6415470 TNFRSFIIB 119964283 Rs2073617 TNFRSFIIB 9p13 35054586 Rs565070 VCP 13141144 Rs3829923 OPTN 13151224 Rs2234968 OPTN 13155726 Rs1561570 OPTN 10p13 13169374 Rs825411 OPTN 13184045 Rs2095388 OPTN 13276751 Rs17152980 UCMA 54074757 Rs2241529 DKK1 10q11 54076271 Rs1569198 DKK1 54086453 Rs11001604 DKK1 10q23q24 100322658 Rs477950 HPSE2 14q32 93103309 Rs10498635* RIN3 15q24 74336633 Rs5742915 PML 17q11 41829296 Rs851062 SOST 59751331 Rs4941107 PIGN 18q21 59979135 Rs2980996 KIAA1468 60082093 Rs3018362 RPL17P14 60021761 Rs35211496* TNFRSFIIA 18q22 60027241 Rs1805034 TNFRSFIIA 60060735 Rs2957128 TNFRSFIIA *SNPs departing from Hardy-Weinberg equilibrium in the control group; †SNPs removed from further analyses because of complete linkage disequilibrium (D’=1) with other SNPs studied.

Combination of genetic markers In bivariate analyses, nine of the 30 SNPs were associated with PDB in our population (Tableau 13). All these SNPs had an AUC varying between 0.500 and 0.585, suggesting that individually, these SNPs are not good markers to detect PDB in patient non-carriers of SQSTM1 mutations. Logistic regression analysis, adjusted for age and sex, showed that a combination of six genetic markers, consisting in rs499345 (EPS8L3/CSF-1),

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rs5742915 (PML), rs2458413 (TM7SF4), rs3018362 (RPL17P14), rs2234968 (OPTN) and rs62620995 (TM7SF4), yielded to most significant results. The AUC for this combination was 0.767 [0.727; 0.807] (p < 0.0001), but the at risk genetic marker rs62620995 was a rare variant, present in a very small number of individuals (3.9%), which may limit the use of this marker in other populations. While removing this SNP from the combination, and adjusting the model for sex only, we noticed that the AUC for the combination of the five remaining genetic markers was still at 0.731 [0.688; 0.773] (p < 0.0001) (Figure 36A). The logistic regression estimates of each parameter in this model were as follow:

Odds of disease = Exp [-2.8535 + (sex*1.2590) + (rs499345*0.5316) + (rs5742915*0.6064) + (rs2458413*0.7487) + (rs3018362*0.7037) + (rs2234968*0.5751)]

Predicted probability (genetic score) = Odds of disease / (1 + Odds of disease)

Where sex = 1 for a man, and 0 for a woman; and genetic marker values = 1 when the at risk allele was present in the genotype, and 0 when the at risk allele was absent in the genotype (see Tableau 13 for detailed genotype information)

Using a cut-off point of 0.33 for the genetic score, this five genetic marker combination, adjusted for sex, had a sensitivity of 81.5%, a specificity of 51.0%, and positive and negative likelihood ratios of 1.7 and 0.4, respectively. PPV and NPV were at 58.1% and 76.8%, respectively (Tableau 14). The cut-off was exceeded in 198 (81.5%) patients with PDB (including 9 French patients), and 143 (49.0%) healthy controls (p < 0.0001, OR = 4.6 [3.1; 6.8]). Among these patients, 29 different genotype combinations resulting in a genetic score ≥ 0.33 were observed, including 24 combinations in men and 5 in women, respectively (Tableau 15).

127 Tableau 13. Bivariate analyses of genetic markers in 243 patients with Paget’s disease of bone (PDB) and in 292 healthy controls, all non-carriers of any SQSTM1 gene mutation.

At risk genotypes At risk genotypes frequency SNPs ID frequency in patients in healthy controls p value OR [95%CI] AUC [95%CI] Genotypes with PDB n (%) n (%) Rs650985 GG/GA 24 (9.9) 32 (11.0) 0.684 0.890 [0.509; 1.557] 0.505 [0.479; 0.531] AA 219 (90.1) 260 (89.0) Rs499345 AA/AC 173 (71.2) 165 (56.5) 0.001 1.902 [1.325; 2.730] 0.573 [0.533; 0.614] CC 70 (28.8) 127 (43.5) Rs484959 GG/GA 224 (92.2) 244 (83.6) 0.003 2.319 [1.323; 4.066] 0.543 [0.516; 0.570] AA 19 (7.8) 48 (16.4) Rs4688903 TT/TC 35 (14.4) 46 (15.8) 0.664 0.900 [0.559; 1.450] 0.507 [0.476; 0.537] CC 208 (85.6) 246 (84.2) Rs4294134 GG/GA 241 (99.2) 281 (96.2) 11 (3.8) 0.028 4.716 [1.035; 21.482] 0.515 [0.502; 0.527] AA 2 (0.8)

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At risk genotypes At risk genotypes frequency SNPs ID frequency in patients in healthy controls p value OR [95%CI] AUC [95%CI] Genotypes with PDB n (%) n (%) Rs35500845 AA/AG 243 (100.0) 289 (98.9) 0.255 1.841 [1.703; 1.990] 0.505 [0.499; 0.511] GG 0 (0.0) 3 (1.1) Rs2458413 AA/AG 217 (89.3) 235 (80.5) 0.005 2.024 [1.229; 3.334] 0.544 [0.514; 0.574] GG 26 (10.7) 57 (19.5) Rs62620995 TT/TC 14 (5.8) 8 (2.7) 0.080 2.170 [0.895; 5.263] 0.515 [0.498; 0.533] CC 229 (94.2) 284 (97.3) Rs11573871 AA/AG 20 (8.2) 28 (9.6) 0.584 0.846 [0.464; 1.542] 0.507 [0.483; 0.531] GG 223 (91.8) 264 (90.4) Rs11573869 TT/TC 241 (99.2) 290 (99.3) 1.000 0.830 [0.116; 5.937] 0.501 [0.493; 0.508] CC 2 (0.8) 2 (0.7) Rs6415470 AA/AG 202 (83.1) 229 (78.4) 0.171 1.355 [0.876; 2.097] 0.524 [0.490; 0.557] GG 41 (16.9) 63 (21.6)

129 At risk genotypes At risk genotypes frequency SNPs ID frequency in patients in healthy controls p value OR [95%CI] AUC [95%CI] Genotypes with PDB n (%) n (%) Rs2073617 TT/TC 181 (74.5) 214 (73.3) 0.754 1.064 [0.722; 1.568] 0.506 [0.469; 0.543] CC 62 (25.5) 78 (26.7)

Rs565070 AA/AG 193 (79.4) 232 (79.5) 0.994 0.998 [0.655; 1.521] 0.500 [0.465; 0.534] GG 50 (20.6) 60 (20.5) Rs3829923 TT/TC 136 (56.0) 160 (54.8) 0.786 1.049 [0.745; 1.477] 0.506 [0.464; 0.548] CC 107 (44.0) 132 (45.2) Rs2234968 AA/AG 139 (57.2) 125 (42.8) 0.001 1.786 [1.266; 2.519] 0.572 [0.530; 0.614] GG 104 (42.8) 167 (57.2) Rs1561570 TT/TC 205 (84.4) 215 (73.6) 0.003 1.932 [1.253; 2.979] 0.554 [0.520; 0.588] CC 38 (15.6) 77 (26.4) Rs825411 CC/CT 202 (83.1) 235 (80.5) 0.431 1.195 [0.767; 1.862] 0.513 [0.481; 0.546] TT 41 (16.9) 57 (19.5)

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At risk genotypes At risk genotypes frequency SNPs ID frequency in patients in healthy controls p value OR [95%CI] AUC [95%CI] Genotypes with PDB n (%) n (%) Rs2095388 AA/AG 226 (93.0) 265 (90.8) 0.345 1.354 [0.720; 2.549] 0.511 [0.488; 0.534] GG 17 (7.0) 27 (9.2) Rs17152980 GG/GC 242 (99.6) 286 (97.9) 0.134 5.074 [0.607; 42.426] 0.508 [0.499; 0.517] CC 1 (0.4) 6 (2.1)

Rs2241529 AA/AG 175 (72.0) 202 (69.2) 0.474 1.147 [0.789; 1.667] 0.514 [0.475; 0.553] GG 68 (28.0) 90 (30.8) Rs1569198 AA/AG 195 (80.2) 224 (76.7) 0.323 1.233 [0.813; 1.870] 0.518 [0.483; 0.553] GG 48 (19.8) 68 (23.3) Rs11001604 TT/TC 59 (24.3) 55 (18.8) 0.126 1.382 [0.913; 2.092] 0.527 [0.492; 0.562] CC 184 (75.7) 237 (81.2) Rs477950 TT/TC 28 (11.5) 40 (13.7) 0.452 0.820 [0.490; 1.375] 0.511 [0.483; 0.539] CC 215 (88.5) 252 (86.3)

131 At risk genotypes At risk genotypes frequency SNPs ID frequency in patients in healthy controls p value OR [95%CI] AUC [95%CI] Genotypes with PDB n (%) n (%) Rs5742915 CC/CT 189 (77.8) 197 (67.5) 0.008 1.688 [1.144; 2.491] 0.552 [0.514; 0.589] TT 54 (22.2) 95 (32.5) Rs851062 GG/GA 202 (83.1) 240 (82.2) 0.776 1.067 [0.680; 1.674] 0.505 [0.472; 0.537] AA 41 (16.9) 52 (17.8) Rs4941107 GG/AG 207 (85.2) 249 (85.3) 0.977 0.993 [0.615; 1.604] 0.500 [0.469; 0.530] AA 36 (14.8) 43(14.7) Rs2980996 CC/CT 112 (46.1) 131 (44.9) 0.777 1.051 [0.747; 1.479] 0.506 [0.464; 0.549] TT 131 (53.9) 161 (55.1) Rs3018362 AA/AG 167 (68.7) 151 (51.7) < 0.0001 2.052 [1.438; 2.927] 0.585 [0.544; 0.626] GG 76 (31.3) 141 (48.3) Rs1805034 CC/CT 183 (75.3) 198 (67.8) 0.056 1.448 [0.989; 2.120] 0.538 [0.499; 0.576] TT 60 (24.7) 94 (32.2)

132

At risk genotypes At risk genotypes frequency SNPs ID frequency in patients in healthy controls p value OR [95%CI] AUC [95%CI] Genotypes with PDB n (%) n (%) Rs2957128 AA/AG 183 (75.3) 185 (63.4) 0.003 1.764 [1.211; 2.570] 0.560 [0.521; 0.599] GG 60 (24.7) 107 (36.6) SNPs= single nucleotide polymorphisms; OR= odds ratio; 95%CI= 95% confidence interval; AUC= area under the receiver operating characteristic (ROC) curve.

133

Figure 36. Area under the receiver operating characteristic (ROC) curve (AUC) calculations for the most significant biomarker combinations developed in this study. The description of each marker included in the combinations and AUC graphs are presented for each combination: A The genetic markers combination B The biochemical markers combination C The combination including the genetic and biochemical markers.

134

Tableau 14. Intrinsic and extrinsic characteristics for the main molecular tests developed in this study.

Genetic and P1NP* Total alkaline Germinal Five genetic Genetic Two bone Genetic and biochemical phosphatases** markers algorithmδ biomarkers biochemical SQSTM1 markers combination‡ combination¶ algorithm° mutations combination† n = 177 n = 178 n = 535 n = 597 n = 177 n = 199 n = 597 n = 176 True positive, n 19 21 47 198 255 22 23 46 True negative, n 102 77 292 149 149 73 81 81 False positive, n 48 74 0 143 143 77 69 69 False negative, n 8 6 258 45 50 5 3 3 Sensitivity 70.37 77.78 15.41 81.48 83.61 81.48 88.46 93.88 [95%CI], % [49.82; 86.25] [57.74; 91.38] [11.55; 19.96] [76.02; 86.16] [78.96; 87.58] [61.92; 93.70] [69.85; 97.55] [83.13; 98.72] Specificity 68.00 50.99 100.00 51.03 51.03 48.67 54.00 54.00 [95%CI], % [59.90; 75.37] [42.74; 59.21] [98.74; 100.00] [45.14; 56.90] [45.14; 56.90] [40.43; 56.95] [45.68; 62.16] [45.68; 62.16] Positive predictive 28.36 22.11 100.00 58.06 64.07 22.22 25.00 40.00 value [95%CI], % [18.01; 40.69] [14.23; 31.78] [92.45; 100.00] [52.63; 63.36] [59.14; 68.79] [14.48; 31.69] [16.55; 35.11] [30.98; 49.55] Negative predictive 92.73 92.77 53.09 76.80 74.87 93.59 96.43 96.43 value [95%CI], % [86.17; 96.81] [84.93; 97.30] [48.82; 57.33] [70.22; 82.55] [68.25; 80.74] [85.67; 97.89] [89.92; 99.26] [89.92; 99.26] Positive likelihood 2.20 1.59 1.66 1.71 1.59 1.92 2.04 - ratio [95%CI] [1.57; 3.08] [1.22; 2.06] [1.46; 1.90] [1.50; 1.94] [1.25; 2.01] [1.54; 2.40] [1.69; 2.46]

135 Genetic and P1NP* Total alkaline Germinal Five genetic Genetic Two bone Genetic and biochemical phosphatases** markers algorithmδ biomarkers biochemical SQSTM1 markers combination‡ combination¶ algorithm° mutations combination† n = 177 n = 178 n = 535 n = 597 n = 177 n = 199 n = 597 n = 176 Negative likelihood 0.44 0.44 0.85 0.36 0.32 0.38 0.21 0.11 ratio [95%CI] [0.24; 0.79] [0.21; 0.90] [0.81; 0.89] [0.27; 0.48] [0.24; 0.42] [0.17; 0.85] [0.07; 0.63] [0.04; 0.34] 95%CI = 95% confidence interval; *calculated using a cut-off point of 46.89 ng/mL; **calculated using a cut-off point of 68.90 U/L; ‡The probability level for a positive genetic score for Paget's disease of bone was ≥ 0.33; δThe genetic algorithm consists in germinal SQSTM1 mutations test followed by the genetic combination; ¶The probability level for a positive biochemical score for Paget's disease of bone was ≥ 0.07; †The probability level for a positive combined score for Paget's disease of bone was ≥ 0.05; °The genetic and biochemical algorithm consists in germinal SQSTM1 mutations test followed by the combination integrating both genetic and biochemical markers

136

Tableau 15. Genotype combinations resulting in a genetic score ≥ 0.33 in men and women separately, all non-carriers of any SQSTM1 gene mutation.

Predicted probability of genetic score Number of carriers of rs499345 rs5742915 rs2458413 rs3018362 rs2234968 ≥0.33 this combination (%)

Men

0.828 AA/AC CC/CT AA/AG AA/AG AA/AG 33 (6.17)

0.730 AA/AC CC/CT AA/AG AA/AG GG 31 (5.79)

0.704 AA/AC CC/CT AA/AG GG AA/AG 16 (2.99)

0.440 CC CC/CT AA/AG GG GG 14 (2.62)

0.724 AA/AC TT AA/AG AA/AG AA/AG 14 (2.62)

0.596 AA/AC TT AA/AG AA/AG GG 12 (2.24)

0.573 AA/AC CC/CT AA/AG GG GG 11 (2.06)

0.583 CC CC/CT AA/AG GG AA/AG 10 (1.87)

0.739 CC CC/CT AA/AG AA/AG AA/AG 9 (1.68)

0.614 CC CC/CT AA/AG AA/AG GG 8 (1.50)

0.422 AA/AC TT AA/AG GG GG 7 (1.31)

0.695 AA/AC CC/CT GG AA/AG AA/AG 7 (1.31)

0.565 AA/AC TT AA/AG GG AA/AG 6 (1.12)

137 Predicted probability of genetic score Number of carriers of rs499345 rs5742915 rs2458413 rs3018362 rs2234968 ≥0.33 this combination (%)

0.607 CC TT AA/AG AA/AG AA/AG 6 (1.12)

0.388 AA/AC CC/CT GG GG GG 5 (0.93)

0.465 CC TT AA/AG AA/AG GG 5 (0.93)

0.530 AA/AC CC/CT GG GG AA/AG 5 (0.93)

0.562 AA/AC CC/CT GG AA/AG GG 4 (0.75)

0.429 CC CC/CT GG AA/AG GG 3 (0.56)

0.433 CC TT AA/AG GG AA/AG 3 (0.56)

0.398 CC CC/CT GG GG AA/AG 2 (0.37)

0.411 AA/AC TT GG AA/AG GG 1 (0.19)

0.554 AA/AC TT GG AA/AG AA/AG 1 (0.19)

0.572 CC CC/CT GG AA/AG AA/AG 1 (0.19)

Women

0.577 AA/AC CC/CT AA/AG AA/AG AA/AG 39 (7.29)

0.435 AA/AC CC/CT AA/AG AA/AG GG 32 (5.98)

0.445 CC CC/CT AA/AG AA/AG AA/AG 27 (5.05)

138

Predicted probability of genetic score Number of carriers of rs499345 rs5742915 rs2458413 rs3018362 rs2234968 ≥0.33 this combination (%)

0.403 AA/AC CC/CT AA/AG GG AA/AG 21 (3.93)

0.427 AA/AC TT AA/AG AA/AG AA/AG 8 (1.50)

139 Frequency of individuals with a genetic score ≥ 0.33 in an independent cohort We estimated the frequency of individuals with a genetic score ≥ 0.33 in an independent cohort of unrelated patients with PDB from United-States (New-York city area). All individuals carrier of a SQSTM1 mutation were removed from this analysis. 49 out of 63 patients with PDB (77.8%) had a genetic score greater than 0.33, and were then correctly classified as PDB-affected individuals. These patients had various ethnic ancestries: 15 were Italian Americans, 19 were Jewish (originating from Hungary, Belarus or Ukraine), and the others originating from different European countries or from Africa or the Caribbean. These results suggested that the genetic combination was not restricted to the French-Canadian population, and can be found with a similar frequency in a multiethnic population.

Genotype-phenotype associations PDB patients with a genetic score ≥ 0.33 had significant higher sALP levels than PDB patients with a genetic score < 0.33 (3.25 ± 3.35 versus 2.03 ± 1.42, p < 0.0001) (Tableau 16). We did not find any other genotype- phenotype association. These results suggest that PDB patients with a genetic score ≥ 0.33 may have a more active disease, based on the sALP levels measurement.

140

Tableau 16. Comparisons of main clinical characteristics between patients with Paget’s disease of bone (PDB) with a genetic score ≥ 0.33 versus patients with PDB with a genetic score < 0.33; all were not carrier of any SQSTM1 gene mutation.

Comparison of patients with a genetic score ≥ 0.33 Categories of patients with PDB to patients with PDB with a genetic score < 0.33 PDB patients with a PDB patients with a genetic score ≥ 0.33 genetic score < 0.33 p value (n = 247) (n = 59) Positive family history 47 (19.34) 11 (18.64) 0.903 of PDB Age at diagnosis 61.70 ± 11.94 64.89 ± 11.69 0.106 (years), mean ± SD Total sALP levels* 3.25 ± 3.35 2.03 ± 1.42 < 0.0001 Number of affected 2.57 ± 2.22 2.15 ± 2.28 0.204 bones, mean ± SD Reniers’ index (%), 10.57 ± 9.01 8.58 ± 8.15 0.123 mean ± SD *For total sALP levels, values are expressed as the number of times the midpoint of normal range; SD= standard deviation; sALP= serum alkaline phosphatase.

Combination of bone biomarkers The bivariate analyses showed that PDB patients had a statistically significant higher serum levels of P1NP, C- telopeptide, calcium, total ALP and OPG, and a lower serum level of sclerostin compared to healthy controls (Tableau 17). The bone biomarkers with the greatest AUC were calcium, total ALP, and P1NP: 0.747, 0.739 and 0.721, respectively. P1NP and total ALP were considered as gold standards in this study. With the use of the cut-off point 46.89 ng/mL for P1NP, this biomarker alone had a sensitivity of 70.4%, a specificity of 68.0%, and a positive and negative likelihood ratios of 2.2 and 0.4. PPV and NPV were at 28.4% and 92.7%, respectively. Regarding the total ALP, with the use of the cut-off point 68.90 U/L, this biomarker had a sensitivity of 77.8%, a specificity of 51.0%, a positive and a negative likelihood ratios of 1.6 and 0.4, and a PPV and NPV of 22.1% and 92.8%, respectively (Tableau 14). Logistic regression analysis, adjusted for age and sex, showed that a combination of five bone biomarkers, including calcium, P1NP, N-mid osteocalcin,

141 OPG and sclerostin, had the highest AUC: 0.887 [0.821; 0.953] (p < 0.0001). However, since N-mid osteocalcin had a negative coefficient estimate and age was not significantly associated to PDB in the multivariate logistic regression model, we decided to remove these parameters from the combination. Also, we noticed that the AUC for a two bone markers combination, consisting in calcium and P1NP, most likely to be used in the clinical practice, had similar results : AUC = 0.822 [0.726; 0.918], p < 0.0001 (Figure 36B). The logistic regression estimates of each parameter in this model were as follow:

Odds of disease = Exp [-27.6491 + (sex*0.6241) + (Calcium*0.0106) + (P1NP*0.0184)]

Predicted probability (biochemical score) = Odds of disease / (1 + Odds of disease)

Where sex = 1 for a man, and 0 for a woman; calcium and P1NP values were in µmol/L and ng/mL respectively

Using a cut-off point of 0.07 for the biochemical score, this two bone biomarker combination, adjusted for sex, had a sensitivity of 81.5%, a specificity of 48.7%, and positive and negative likelihood ratios of 1.6 and 0.4, respectively. PPV and NPV were at 22.2% and 93.6%, respectively (Tableau 14). The cut-off was exceeded in 22 (81.5%) patients with PDB (including 9 French patients), and 77 (51.3%) healthy controls (p = 0.004, OR = 4.2 [1.5; 11.6]).

142

Tableau 17. Bivariate analyses of biochemical markers in 27 patients with Paget’s disease of bone (PDB) and in 151 healthy controls, all non-carriers of any SQSTM1 gene mutation.

Mean ± SD in Mean ± SD in patients with PDB healthy controls p value OR [95%CI] AUC [95%CI] n = 27 n = 151 P1NP (ng/mL) 141.23 ± 172.66 42.54 ± 26.77 0.004 1.022 [1.011; 1.033] 0.721 [0.580; 0.863] 25-OH vitamin D 68.75 ± 27.97 64.80 ± 24.77 0.456 1.006 [0.990; 1.023] 0.544 [0.418; 0.670] (nmol/L) Interleukin-6 (pg/mL) 9.18 ± 29.15 2.80 ± 5.07 0.258 1.033 [0.987; 1.080] 0.664 [0.553; 0.775] Parathyroid hormone 6.95 ± 18.84 4.12 ± 1.77 0.435 1.033 [0.983; 1.085] 0.389 [0.242; 0.535] (pmol/L) C-telopeptide (ng/mL) 0.44 ± 0.43 0.26 ± 0.14 0.028 21.876 [3.143; 152.251] 0.570 [0.413; 0.726] N-mid osteocalcin 35.75 ± 54.54 19.74 ± 8.03 0.130 1.054 [1.015; 1.095] 0.591 [0.432; 0.750] (ng/mL)

Serum calcium* 2.38 ± 0.16 2.28 ± 0.09 < 0.0001 1.010 [1.005; 1.016] 0.747 [0.649; 0.845] (mmol/L)

Total ALP (U/L) 161.31 ± 172.22 72.37 ± 33.05 0.008 1.020 [1.010; 1.030] 0.739 [0.605; 0.873] hsCRP (mg/L) 5.08 ± 6.55 3.53 ± 4.87 0.151 1.048 [0.981; 1.120] 0.551 [0.424; 0.678] Sclerostin (ng/mL) 0.57 ± 0.29 0.80 ± 0.53 0.028 0.259 [0.081; 0.832] 0.640 [0.540; 0.740] RANKL (ng/mL) 1.41 ± 1.26 1.57 ± 3.30 0.810 0.978 [0.811; 1.178] 0.533 [0.387; 0.678]

143 Mean ± SD in Mean ± SD in patients with PDB healthy controls p value OR [95%CI] AUC [95%CI] n = 27 n = 151 Osteoprotegerin 1.78 ± 1.66 1.35 ± 0.77 0.037 1.404 [0.977; 2.017] 0.608 [0.500; 0.717] (ng/mL) Anti-measles virus IgG 3190.93 ± 966.57 3544.19 ± 871.71 0.058 1.000 [0.999; 1.000] 0.606 [0.497; 0.715] (mIU/mL) *Calcium was corrected for albumin. SD= standard deviation; OR= odds ratio; 95%CI= 95% confidence interval; AUC= area under the receiver operating characteristic (ROC) curve; P1NP= procollagen type 1 amino-terminal propeptide; ALP= alkaline phosphatase; hsCRP= high-sensitivity C-reactive protein; RANKL= receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand.

144

Combination of genetic and biochemical markers We then integrated both genetic and biochemical markers into the same logistic model, adjusted for age and sex. The combination with the highest AUC to predict the PDB phenotype consisted in the five at risk genetic markers cited above, and calcium, P1NP, osteocalcin, OPG and sclerostin (AUC = 0.928 [0.885; 0.972], p < 0.0001). Again the combination integrating calcium and P1NP, adjusted for sex only, and more likely to be widely used in the clinical practice, had similar results with an AUC of 0.892 [0.833; 0.951] (p < 0.0001) (Figure 36C). The logistic regression estimates of each parameter in this model were as follow:

Odds of disease = Exp [-30.9036 + (sex*0.5957) + (rs499345*0.4824) + (rs5742915*1.3519) + (rs2458413*0.3675) + (rs3018362*1.6467) + (rs2234968*0.4279) + (calcium*0.0106) + (P1NP*0.0202)]

Predicted probability (combined score) = Odds of disease / (1 + Odds of disease)

Where sex = 1 for a man, and 0 for a woman; genetic marker values = 1 when the at risk allele was present in the genotype, and 0 when the at risk allele was absent in the genotype; calcium and P1NP values were in µmol/L and ng/mL respectively

Using a cut-off point of 0.05 for the combined score, this combination, adjusted for sex, had a sensitivity of 88.5%, a specificity of 54.0%, a positive likelihood ratio of 1.9, a negative likelihood ratio of 0.2, and a PPV and NPV of 25.0% and 96.4%, respectively. The cut-off was exceeded in 23 (88.5%) patients with PDB (including 10 French patients), and 69 (46.0%) healthy individuals (p < 0.0001, OR = 9.0 [2.6; 31.3]).

Development of a molecular test, integrating SQSTM1 mutations screening followed by both genetic and bone biomarkers combinations In our French-Canadian and French populations, 62 (20.3%) of patients with PDB were carriers of a SQSTM1 mutation, and none of healthy controls were carrier of any SQSTM1 mutation. Among them, 15 were carriers of a post-zygotic SQSTM1/P392L mutation. However, since the detection of such mutations may be tedious, we decided to restrain the SQSTM1 screening to germinal mutations in the molecular test in order to facilitate its development. Also, 10 out of 15 (66.7%) of the PDB patients carriers of this post-zygotic mutation had a genetic score ≥ 0.33, suggesting that the majority will be detected when screened by the molecular test in a subsequent step. In this sample, the screening for germinal SQSTM1 mutations had a sensitivity of 15.4%, a specificity of 100%, a PPV of 100%, a NPV of 53.1%, and a negative likelihood ratio of 0.9 (Tableau 14). Depending on the nature of the samples available, two distinct molecular tests to detect PDB could be proposed. First, if only DNA samples are available, a pure genetic molecular test, relying on a two steps

145 algorithm could be used: first a screen in the SQSTM1 gene should be performed to search for disease- causing germinal mutations, and if negative, the genetic score based on the combination of the five SNPs developed in this study should be calculated (Figure 37A). In our populations, this pure genetic molecular test was positive in 255 (83.6) patients with PDB, and 143 (49.0%) of healthy controls (p < 0.0001, OR = 5.3 [3.6; 7.8]), using the same cut-off point than above cited. This genetic algorithm had a sensitivity of 83.6%, a specificity of 51.0%, a PPV of 64.1% and a NPV of 74.9%. Positive and negative likelihood ratios were at 1.7 and 0.3, respectively (Tableau 14). Second, if DNA and serum samples are available, a molecular test integrating both genetic and biochemical markers and relying on a two steps algorithm could be used: first a screen in the SQSTM1 gene should be performed to search for disease-causing germinal mutations, and if negative, the combined score based on the logistic model integrating both genetic and biochemical markers should be calculated (Figure 37B). In the subgroup of individuals for which both DNA and serum samples were available in our populations (49 patients with PDB and 150 healthy controls), this genetic and biochemical algorithm was present in 46 (93.9%) patients with PDB and 69 (46.0%) healthy individuals (p < 0.0001, OR = 18.0 [5.4; 60.4]), using the same cut-off point than above cited. In this subgroup, this genetic and biochemical algorithm had a sensitivity of 93.9%, a specificity of 54.0%, positive and negative likelihood ratios of 2.0 and 0.1, and a PPV and NPV of 40.0% and 96.4%, respectively (Tableau 14).

146

Figure 37. Molecular tests proposed for the detection of PDB developed in this study. A The genetic algorithm relies first on a screen in the SQSTM1 gene to search for disease-causing germinal mutations. If negative, the genetic combination developed in this study should be tested. B The genetic and biochemical algorithm relies first on a screen in the SQSTM1 gene to search for disease-causing germinal mutations. If negative, the combination integrating both genetic and biochemical markers developed in this study should be tested.

Discussion In patients with PDB non-carrier of a SQSTM1 mutation, a combination of five genetic markers, consisting in rs499345 (EPS8L3/CSF-1), rs5742915 (PML), rs2458413 (TM7SF4), rs3018362 (RPL17P14) and rs2234968 (OPTN), adjusted for sex, gave rise to an AUC of 0.731 [0.688; 0.773], and yielding to a sensitivity of 81.5% and a specificity of 51.0%, using a cut-off point of 0.33 for the genetic score. This genetic combination relying on SNPs identified in GWAS and replicated in the French-Canadian population (Albagha, Visconti et al. 2010, Albagha, Wani et al. 2011, Michou, Conceicao et al. 2012), allowed the correct classification of 81.5% of patients with PDB in our cohorts, non-carriers of any SQSTM1 mutation, and in 77.8% of patients with PDB

147 coming from the multiethnic population of New York city area, using a cut-off point of 0.33 for the genetic score. In addition, a combination of bone biomarkers, including calcium and P1NP, and adjusted for sex, had an AUC of 0.822 [0.726; 0.918], and a sensitivity and a specificity of 81.5% and 48.7%, respectively. This bone biomarker combination identified correctly 81.5% of patients with PDB in our French and French-Canadian populations, all non-carriers of a SQSTM1 mutation and using a cut-off point of 0.07 for the biochemical score. Then, the combination of both genetic and biochemical markers adjusted for sex increased the AUC to 0.892 [0.833; 0.951] and, using a cut-off point of 0.05 for the combined score, this combination identified correctly 23 patients (88.5%) with PDB. In order to cover the monogenic component of PDB (with the presence of germinal SQSTM1 mutations) and the multifactorial aspect of the disease, we proposed two molecular tests relying on a two steps algorithm. The genetic algorithm identified 255 (83.6%) of patients with PDB, and had a sensitivity of 83.6% and a specificity of 51.0%. The algorithm integrating both genetic and biochemical markers identified correctly 46 (93.9%) patients with PDB, and had a sensitivity of 93.9% and a specificity of 54.0%.

Currently, the only genetic test available in PDB in some countries is the screening for germinal SQSTM1 mutations in exons 7 and 8. However, only 15.4% of patients with PDB were carriers of a germinal SQSTM1 mutation in our population. Using a cut-off point of 0.33, the five genetic markers combination developed in this study had a greater sensitivity than the SQSTM1 screen for germinal mutations, suggesting that a combination of genetic markers, even with a small effect size, may be useful for the detection of PDB. The AUC of the bone biomarkers combination was higher than for the genetic markers combination. However, bone biomarkers may have a much greater inter-individual variability, in particular in the general population. But, combining calcium and P1NP resulted in a greater AUC (0.822) than total ALP alone (0.739), which is the most sensitive bone biomarker currently available to assess PDB activity in the clinical practice. This bone biomarkers combination also had a higher AUC than P1NP alone (0.721), which is the gold standard to asses bone remodeling activity in PDB, but not yet available in the clinical practice.

In the literature, total sALP was reported to have a sensitivity varying between 69% and 100% for the detection of PDB in some studies (Al Nofal, Altayar et al. 2015). However, total sALP levels may be within the normal range, especially in patients with a monostotic or a metabolically inactive disease, and this should not exclude a diagnosis of PDB (Ralston 2013). Whole-body bone scan is the most sensitive tool to detect the disease, identifying 97-98% of pagetic lesions, and bone X-rays have a sensitivity around 85-91% (Laurin, Brown et al. 2001). Imaging tests are currently the best tools for the positive diagnosis of PDB, but remain expensive and more invasive for patients, although they are definitely required for the positive clinical diagnosis of PDB, according to the recent guidelines (Singer, Bone et al. 2014). Considering the invasiveness and the cost of imaging methods, a molecular test relying on genetic and bone biomarkers through a single peripheral blood sample might represent a valuable clinical option for PDB screening. One of the two bone biomarkers is

148

already available in the clinical practice, at a relatively low cost. P1NP will probably be available for clinicians in the future, as it is the most sensitive marker for bone formation, already cited in the American recommendations from Endocrine Society for PDB management (Singer, Bone et al. 2014). Although genotyping of genetic markers may seem somehow expensive, the molecular tests proposed in this study could represent an interesting approach from an economic point of view to screen individuals who need to be investigated with bone scan or not. Then, these molecular tests may avoid systematic bone scans in all patients likely to receive a bone anabolic agent prescription, which may be a cost-effective approach in a medium to long-term period.

To the best of our knowledge, there is no other study in PDB that combine genetic and bone biomarkers to detect PDB. Recently, Albagha et al. reported that mutations in the SQSTM1 gene, combined with seven SNPs associated with PDB in the GWAS, could act in an additive manner to predict the extent and severity of the disease, based on a severity score developed by the authors and not yet validated. This combination had a sensitivity of 70% and a specificity of 55% to predict the severity of PDB (Albagha, Visconti et al. 2013).

The molecular test integrating the screening for germinal SQSTM1 mutation, followed by the test for the genetic and biochemical markers combination, had the greatest intrinsic and extrinsic characteristics in our populations, identifying correctly 93.9% of PDB-affected patients. However, given the small sample of individuals available to test this algorithm, the genetic algorithm seemed more appropriate for the detection of PDB in our population, with a more representative number of individuals available for genetic analysis. But, these results suggest that the screening of genetic and biochemical markers should be a valuable tool to improve the positive diagnosis of PDB, considering the lack of sensitivity of total sALP and the clinical necessity to accurately rule out PDB before using bone anabolic agents. The presence of the genetic combination with a similar frequency in a multiethnic population from New York City, as well as in the French and French-Canadian populations, may suggest that it could be used in different countries, where PDB is observed. Regarding bone resorption biomarkers, although C-telopeptide serum levels were significantly higher in patients than in controls in univariate analyses, this biomarker wasn’t retained in multivariate analyses. A recent meta-analysis demonstrated that the urinary N-terminal telopeptide (uNTX) is the bone resorption biomarker with the highest sensitivity to detect PDB (Al Nofal, Altayar et al. 2015), but this biomarker requires an urinary sample either second AM urine or 24-hours urine collection which limits its feasibility in the clinical practice.

Our study has some limitations. First, the small number of samples available for bone biomarkers measurement may have biased the intrinsic and extrinsic characteristics of the genetic and biochemical combined algorithm in our study. It should also be of paramount importance to replicate the molecular tests

149 developed in this study in a much larger cohort with genetic and biochemical samples available for patients with PDB and healthy controls. Second, the genetic combination was detected in 49.0% of healthy controls and the genetic and bone biomarkers combination was detected in 46.0% of healthy controls, which may represent a high number of false positive for whom whole body bone scan followed by centered X-rays would be required to confirm or infirm the PDB diagnosis. Another validation study should be represented by the trial of these molecular tests in a large cohort of healthy individuals aged 60 years old or more, likely to receive a prescription of a bone anabolic agent for osteoporosis treatment, to validate their accuracy and reliability to identify individuals with asymptomatic PDB. Of note, some of the patients with PDB from our cohorts have received bisphosphonates before serum sampling which may has decreased the sensitivity of some bone biomarkers, but may be more close to the clinical reality, where patients usually receive bisphosphonate therapy before bone anabolic agents. If replicated and validated with the ACCE (analytic validity; clinical validity; clinical utility; ethical, legal and social implications) criteria (Haddow and Palomaki 2004), these molecular tests might become a companion test before initiating bone anabolic agents to improve safety.

In conclusion, we have developed two molecular tests: a pure genetic molecular test, integrating first a screen for SQSTM1 germinal mutations, followed in non-carriers, by a genetic markers combination, and a genetic and biochemical molecular test, integrating a screen for SQSTM1 germinal mutations, followed in non-carriers, by a genetic and biochemical markers combination. These two molecular tests predicted the PDB phenotype better than total ALP or P1NP alone, considered as gold standards, in our populations. Further studies are now warranted in other populations to improve these molecular tests for a possible future use in the clinical practice.

Acknowledgements Sabrina Guay-Bélanger was supported in part by a Ph.D. student award from the Network for Oral and Bone Health Research (Fonds de Recherche en Santé du Québec). Dr. Michou is supported by a career award from the Fonds de Recherche en Santé du Québec. This study was funded by the Canadian Institute of Health Research (MOP 115151 and IMH 112316), the Fondation du CHUQ, the Canadian Foundation for Innovation, the Fonds de Recherche en Santé du Québec, the Laval University and the CHU de Québec Research Centre.

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Disclosure Commercial Roche Diagnostics immunoassay kits for the measurement of the procollagen type 1 amino- terminal propeptide (P1NP), 25-OH vitamin D, interleukin-6 (IL-6), parathyroid hormon (PTH), C-telopeptide, osteocalcin, calcium, albumine, total alkaline phosphatase (ALP) and high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP) were given in kind from Hoffman’s division LaRoche Ltée; Laval, Canada.

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151 Chung, P. Y., G. Beyens, P. L. Riches, L. Van Wesenbeeck, F. de Freitas, K. Jennes, A. Daroszewska, E. Fransen, S. Boonen, P. Geusens, F. Vanhoenacker, L. Verbruggen, J. Van Offel, S. Goemaere, H. G. Zmierczak, R. Westhovens, M. Karperien, S. Papapoulos, S. H. Ralston, J. P. Devogelaer and W. Van Hul (2010). "Genetic variation in the TNFRSF11A gene encoding RANK is associated with susceptibility to Paget's disease of bone." J Bone Miner Res 25(12): 2592-2605. Cooper, C., N. C. Harvey, E. M. Dennison and T. P. van Staa (2006). "Update on the epidemiology of Paget's disease of bone." J Bone Miner Res 21 Suppl 2: P3-8. Corral-Gudino, L., M. Borao-Cengotita-Bengoa, J. Del Pino-Montes and S. Ralston (2013). "Epidemiology of Paget's disease of bone: a systematic review and meta-analysis of secular changes." Bone 55(2): 347-352. DeLong, E. R., D. M. DeLong and D. L. Clarke-Pearson (1988). "Comparing the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: a nonparametric approach." Biometrics 44(3): 837-845. Guay-Belanger, S., J.-G. Cormier and L. Michou (2015). "La maladie osseuse de Paget, une condition évanescente?" Revue du Rhumatisme 82(4) : 223-229. Guay-Belanger, S., S. Picard, E. Gagnon, J. Morissette, E. S. Siris, P. Orcel, J.P. Brown and L. Michou (2015). "Detection of SQSTM1/P392L post-zygotic mutations in Paget’s disease of bone." Hum Genet 134(1): 53-65. Haddow, J. E. and G. E. Palomaki (2004). "ACCE: a model process for evaluating data on emerging genetic tests." Human genome epidemiology: A scientific foundation for using genetic information to improve health and prevent disease: 217-233. Kurihara, N., Y. Hiruma, K. Yamana, L. Michou, C. Rousseau, J. Morissette, D. L. Galson, J. Teramachi, H. Zhou, D. W. Dempster, J. J. Windle, J. P. Brown and G. D. Roodman (2011). "Contributions of the measles virus nucleocapsid gene and the SQSTM1/p62(P392L) mutation to Paget's disease." Cell Metab 13(1): 23-34. Laurin, N., J. P. Brown, A. Lemainque, A. Duchesne, D. Huot, Y. Lacourciere, G. Drapeau, J. Verreault, V. Raymond and J. Morissette (2001). "Paget disease of bone: mapping of two loci at 5q35-qter and 5q31." Am J Hum Genet 69(3): 528-543. Laurin, N., J. P. Brown, J. Morissette and V. Raymond (2002). "Recurrent mutation of the gene encoding sequestosome 1 (SQSTM1/p62) in Paget disease of bone." Am J Hum Genet 70(6): 1582-1588. Michou, L. and J. P. Brown (2010). "Genetics of bone diseases: Paget's disease, fibrous dysplasia, osteopetrosis, and osteogenesis imperfecta." Joint Bone Spine 78(3): 252-258. Michou, L. and J. P. Brown (2011). "Emerging strategies and therapies for treatment of Paget's disease of bone." Drug Des Devel Ther 5: 225-239. Michou, L., C. Collet, J. Morissette, M. Audran, T. Thomas, E. Gagnon, J. M. Launay, J. L. Laplanche, J. P. Brown and P. Orcel (2012). "Epidemiogenetic study of French families with Paget's disease of bone." Joint Bone Spine 79(4): 393-398. Michou, L., N. Conceicao, J. Morissette, E. Gagnon, G. Miltenberger-Miltenyi, E. S. Siris, J. P. Brown and M. L. Cancela (2012). "Genetic association study of UCMA/GRP and OPTN genes (PDB6 locus) with Paget's disease of bone." Bone 51(4): 720-728. Michou, L., J. Morissette, E. R. Gagnon, A. Marquis, M. Dellabadia, J. P. Brown and E. S. Siris (2010). "Novel SQSTM1 mutations in patients with Paget's disease of bone in an unrelated multiethnic American population." Bone 48(3): 456-460. Morissette, J., N. Laurin and J. P. Brown (2006). "Sequestosome 1: mutation frequencies, haplotypes, and phenotypes in familial Paget's disease of bone." J Bone Miner Res 21 Suppl 2: P38-44. Ralston, S. H. (2013). "Clinical practice. Paget's disease of bone." N Engl J Med 368(7): 644-650.

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153

Discussion

La MOP a changé de visage au cours des dernières années. En effet, on observe une diminution de la prévalence et de la sévérité de la maladie, particulièrement dans les régions précédemment connues pour avoir une forte prévalence de MOP (Cundy, Gamble et al. 2004, Mangham, Davie et al. 2009, Corral-Gudino, Borao-Cengotita-Bengoa et al. 2013). Ces facteurs contribuent probablement à l’augmentation relative du nombre d’individus atteints qui demeurent asymptomatiques. Pour ces raisons, la MOP devient plus difficile à diagnostiquer, ce diagnostic étant la plupart du temps posé suite à une découverte fortuite. De plus, étant donné l’augmentation de l’incidence de l’ostéoporose, et considérant la survenue d’effets secondaires rares mais graves étant associée à la prise de bisphosphonates à long terme, il est fort possible que les agents ostéoformateurs connaissent une plus large utilisation dans les prochaines années. Cependant, étant donné le risque de développer un ostéosarcome, la MOP est une contre-indication formelle à la prescription d’agents ostéoformateurs, qui vont stimuler l’activité des ostéoblastes. Il devient donc crucial de pouvoir dépister de façon certaine et fiable la présence de la MOP, y compris chez les individus asymptomatiques. Ainsi, l’objectif global de cette thèse était de développer une signature moléculaire spécifique à la MOP afin d’améliorer le dépistage fiable de cette maladie dans la pratique clinique.

Le premier chapitre de cette thèse a évalué la fréquence des mutations post-zygotiques SQSTM1/P392L chez les patients atteints de MOP, ainsi que leur distribution tissulaire. Pour ce faire, une méthode de clampage de la PCR sensible et fiable qui permettait de détecter des mutations post-zygotiques SQSTM1/P392L dans le sang périphérique des individus pagétiques a été développée. Avec cette technique, cette mutation a été identifiée chez 4,8% des patients pagétiques et 1,4% des individus à priori sains dans les cohortes disponibles au laboratoire. De façon intéressante, ces mutations post-zygotiques étaient restreintes à la lignée des monocytes, précurseurs des ostéoclastes.

Ces résultats ont d’abord permis de démontrer l’existence d’un spectre mutationnel dans la MOP (Figure 38). La présence de mutations aux niveaux germinal et somatique avait déjà été décrite dans la littérature (Laurin, Brown et al. 2001, Merchant, Smielewska et al. 2009). Maintenant, ces résultats démontrent que des mutations dans le gène SQSTM1 peuvent aussi survenir à une étape précoce du développement embryonnaire, mais postérieur à la formation du zygote. Actuellement, une seule étude a démontré la présence de mutations somatiques SQSTM1/P392L dans le tissu osseux pagétique, qui n’avaient pas été détectées dans le sang périphérique chez ces individus (Merchant, Smielewska et al. 2009). Il serait intéressant de vérifier si la méthode de PCR sensible développée dans cette thèse pourrait permettre de

155 détecter ces mutations dans les monocytes circulants chez ces individus, devenant ainsi une procédure beaucoup moins invasive que la biopsie osseuse. La détection de cette mutation post-zygotique SQSTM1/P392L chez des individus à priori sains pourrait suggérer une pénétrance incomplète, comme ce qui est observé pour la mutation germinale. Malgré le fait qu’un diagnostic de MOP n’a pu être confirmé par scintigraphie osseuse, ces individus mériteraient un suivi à plus long terme. En effet, malgré l’absence apparente de la maladie, il n’en reste pas moins que ces individus ont une prédisposition génétique à la MOP, qui devrait être prise en compte notamment avant la prescription d’agents ostéoformateurs. Ainsi, cette nouvelle donnée implique qu’il faudrait rechercher ces différents types de mutations pour faire un dépistage fiable de la MOP.

Actuellement, les conséquences fonctionnelles des mutations post-zygotiques SQSTM1/P392L demeurent inconnues. En ce qui concerne les mutations germinales, il a été suggéré que cette mutation prédispose à la MOP en augmentant la sensibilité des précurseurs ostéoclastiques aux cytokines ostéoclastogéniques et/ou le potentiel ostéoclastogénique du microenvironnement osseux (Hiruma, Kurihara et al. 2008). Il pourrait donc être intéressant dans le futur d’étudier les précurseurs ostéoclastiques chez les patients pagétiques porteurs de ces mutations post-zygotiques, afin d’observer si cette mutation entraîne l’hypersensibilité des précurseurs aux cytokines ostéoclastogéniques, et si les ostéoclastes résultant de leur différenciation possèdent le phénotype cellulaire caractéristique de la maladie. Également, la génération d’un modèle animal porteur de cette mutation post-zygotique SQSTM1/P392L pourrait être d’une grande importance afin d’élucider le rôle fonctionnel de ces mutations dans la MOP. Actuellement, il existe un modèle murin transgénique dans lequel cette mutation est exprimée uniquement dans la lignée des ostéoclastes (Kurihara, Hiruma et al. 2007). Cependant, étant donné que moins de 10% des monocytes étaient porteurs de cette mutation post-zygotique chez les patients pagétiques dans notre cohorte, un modèle réellement post-zygotique, avec l’introduction de la mutation à une étape précoce dans le développement du zygote, serait sans doute plus approprié pour en étudier les conséquences fonctionnelles.

Les mutations post-zygotiques SQSTM1/P392L, restreintes à la lignée des monocytes, pourraient en partie expliquer le caractère focal de la MOP. En effet, une fois diagnostiquée, la MOP progresse dans les os initialement atteints, sans toutefois s’étendre dans les sites osseux adjacents (Roodman and Windle 2005). Cette caractéristique surprenante de la maladie pourrait être expliquée de la façon suivante : lorsqu’ils sont attirés à la surface d’un os qui doit être résorbé, les monocytes porteurs d’une mutation SQSTM1/P392L se différencient en ostéoclastes matures en présence des cytokines nécessaires à la différenciation dans le microenvironnement osseux. Ces ostéoclastes matures et probablement hyperactifs pourraient ensuite déclencher, ou à tout le moins prédisposer, au développement de la maladie en résorbant de façon excessive l’os sous-jacent, sans toutefois affecter les os adjacents. Cependant, il demeure difficile d’expliquer les raisons

156

pour lesquelles un os en particulier est atteint par la maladie. La plupart des os atteints par la MOP sont hyper- vascularisés, ce qui suggère que le facteur causal de la MOP pourrait arriver par voir sanguine, pour se greffer dans ces os. Ainsi, les monocytes mutés au niveau post-zygotique pourraient arriver par voie sanguine et s’installer dans un os hyper-vascularisé avec un microenvironnement osseux favorable à la formation d’un clone de cellules mutées. Néanmoins, il serait très intéressant de valider la présence de cette mutation post- zygotique SQSTM1/P392L dans les ostéoclastes à la surface d’un os atteint par la MOP. Toutefois, la biopsie osseuse effectuée sur un patient porteur d’une mutation post-zygotique n’a pas permis d’extraire l’ADN des ostéoclastes, ni d’en vérifier le phénotype cellulaire. Cette biopsie a démontré un os pagétique en phase finale de la maladie, avec absence de cellules osseuses. Si l’occasion se présente, il serait intéressant d’effectuer une biopsie osseuse chez un autre patient porteur d’une mutation post-zygotique afin de déterminer si les ostéoclastes pagétiques in situ sont effectivement porteurs de cette mutation. L’idéal serait cependant d’effectuer des biopsies osseuses d’un os pagétique et d’un os sain chez un même patient porteur d’une mutation post-zygotique, afin de déterminer si les ostéoclastes mutés sont restreints à l’os pagétique. Cette procédure étant très invasive, l’utilisation d’un modèle animal porteur d’une mutation post-zygotique pour effectuer cette même procédure pourrait constituer une alternative intéressante.

Évidemment, la méthode de clampage de la PCR développée dans cette thèse pour détecter les mutations post-zygotiques peut sembler fastidieuse. Ainsi, d’autres méthodes sensibles et à haut-débit, comme par exemple le séquençage de seconde génération, auraient pu être utilisées. Or, au moment de débuter cette thèse, de telles méthodes étaient difficilement accessibles, ce qui a justifié le choix de la méthode de clampage de la PCR. Néanmoins, cette méthode de PCR sensible a permis de confirmer la présence de mutations post-zygotiques dans la MOP, ouvrant ainsi la porte à la détection de telles mutations. Cette étape était par ailleurs cruciale pour la suite de ce projet, puisqu’elle a permis de reclasser correctement 18 patients atteints de MOP, que l’on croyait non porteurs d’une mutation dans le gène SQSTM1. Ainsi, ces résultats étaient préalables à la deuxième section de cette thèse, afin de développer une signature moléculaire spécifique à la maladie, incluant à la fois les mutations germinales et post-zygotiques du gène SQSTM1.

L’objectif du deuxième chapitre de cette thèse était de développer un test génétique de dépistage de la MOP, incluant les mutations germinales et post-zygotiques de SQSTM1, et d’évaluer les performances de dépistage de ce test intégré avec des marqueurs biochimiques dans une signature moléculaire spécifique à la maladie. Étant donné qu’il n’existe pas d’autres gènes pour lesquels une mutation causale a été identifiée dans la MOP, les SNPs associés à la MOP d'après les GWAS ont été utilisés afin de développer un test génétique de dépistage. Étant donné qu’un test génétique pourrait manquer de sensibilité pour détecter le phénotype clinique pagétique dans notre cohorte, des marqueurs biochimiques ont été intégrés afin d’améliorer les capacités de dépistage de ce test. Ainsi, une combinaison de cinq marqueurs génétiques a été développée,

157 incluant les marqueurs rs499345 (EPS8L3/CSF-1), rs5742915 (PML), rs2458413 (TM7SF4), rs3018362 (RPL17P14) et rs2234968 (OPTN), qui a permis d’identifier 81,5% des patients atteints de MOP, excluant les porteurs de mutations germinales et post-zygotiques dans SQSTM1. Ensuite, une combinaison de deux marqueurs biochimiques a été développée, incluant le calcium et le P1NP, et a identifié 81,5% des patients pagétiques. Lorsque ces cinq marqueurs génétiques et deux marqueurs biochimiques étaient combinés dans un même modèle, 88,5% des patients atteints de MOP dans les cohortes disponibles au laboratoire étaient détectés. Afin de couvrir les composantes monogénique et multifactorielle de la MOP, deux tests moléculaires reposant sur un algorithme en deux étapes ont été proposés, dépendamment de la nature des échantillons disponibles. D’abord, si seuls des échantillons d’ADN sont disponibles, un test moléculaire génétique pur pourrait être utilisé : premièrement, des mutations germinales devraient être recherchées dans le gène SQSTM1, et si elles sont absentes, le score génétique basé sur la combinaison des cinq marqueurs génétiques développée dans ce projet de doctorat devrait être calculé. Cet algorithme génétique pur a permis de détecter 83,6% des patients pagétiques dans les populations étudiées. Ensuite, si des échantillons d’ADN et de sérum sont disponibles, un test intégrant à la fois les marqueurs génétiques et biochimiques pourrait être utilisé : d’abord, des mutations germinales devraient être recherchées dans le gène SQSTM1, et si elles sont absentes, le score combiné basé sur la combinaison intégrant les marqueurs génétiques et biochimiques développée dans ce projet de doctorat devrait être calculé. Cet algorithme génétique et biochimique a permis de détecter 93,9% des patients atteints de MOP dans les cohortes disponibles au laboratoire.

De façon intéressante, la plupart des SNPs qui sont inclus dans la combinaison de marqueurs génétiques proviennent des études pangénomiques d’association et sont situés dans des gènes, ou à proximité de gènes, qui codent pour des protéines ayant un rôle connu dans le remodelage osseux. En effet, les SNP rs499345 et rs3018362 sont situés près des gènes CSF-1 et TNFRSFIIA, qui codent pour le M-CSF et le récepteur RANK, respectivement. Par ailleurs, il est bien connu que ces deux molécules sont cruciales pour la formation et la survie des ostéoclastes (Crockett, Mellis et al. 2011). De plus, le SNP rs2458413 est situé dans un intron du gène TM7SF4, qui code pour la protéine DC-STAMP, une protéine essentielle dans le processus de fusion des précurseurs ostéoclastiques afin de former des ostéoclastes matures multinucléés capables d’effectuer la résorption osseuse (Zhang, Dou et al. 2014). Le SNP rs2234968, quant à lui, est situé dans un exon du gène OPTN, qui code pour la protéine optineurine. L’optineurine est une protéine ubiquitaire impliquée dans l’autophagie ainsi que dans la régulation du facteur de transcription NF-κB, tout comme la protéine SQSTM1 (Kachaner, Genin et al. 2012). Par ailleurs, le gène OPTN est le principal candidat actuellement investigué dans le locus PDB6. Finalement, le SNP rs5742915 est situé dans un exon du gène PML. Cependant, la protéine PML ne possède actuellement aucun rôle connu dans le remodelage osseux (Albagha, Wani et al. 2011). Néanmoins, étant donné leur implication dans la survie et la différenciation des ostéoclastes, premières

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cellules affectées dans la MOP, ces SNPs pourraient avoir un impact fonctionnel sur la pathogénèse de la MOP.

En ce qui concerne les associations génotype-phénotype, seule une association entre le score génétique et les niveaux de PAL sériques totales a été observé. En effet, les patients avec un score génétique supérieur à 0,33 avaient des niveaux de PAL sériques totales significativement plus élevés que les patients pagétiques ayant un score génétique inférieur à 0,33, suggérant la présence d’une maladie plus active chez les patients avec un score génétique élevé. Par ailleurs, il pourrait être intéressant d’étudier les monocytes chez les individus ayant un score génétique supérieur à 0,33, afin d’étudier l’effet de ces polymorphismes sur le phénotype cellulaire des ostéoclastes.

Malgré le rôle probable des protéines de la nucléocapside du virus de la rougeole (MVNP) dans la physiopathologie de la MOP, aucune association avec les immunoglobulines sériques de type G (IgG) dirigées contre le virus de la rougeole n'a été identifiée dans cette étude. Or, la majorité des individus âgés de plus de 50 ans dans les populations étudiées ont été en contact avec ce virus au cours de leur vie. Ainsi, cette sérologie était positive chez tous les individus étudiés, y compris les patients pagétiques et les individus sains. Les résultats auraient sans doute été différents si l’expression du MVNP avait été mesurée par qPCR, comme il a précédemment été démontré dans la littérature (Kurihara, Hiruma et al. 2011). Il pourrait donc être intéressant de reproduire cette méthode dans les cohortes disponibles au laboratoire.

Évidemment, la prochaine étape serait de répliquer ces tests moléculaires dans une cohorte de MOP indépendante, afin de vérifier si les algorithmes développés dans cette thèse peuvent s’appliquer à une autre population. Puis, ces algorithmes devront être validés dans une population susceptible de recevoir des agents ostéoformateurs, afin de s’assurer qu’ils possèdent une bonne capacité de dépistage et que leur utilisation offre des avantages dans la pratique clinique. De plus, l’accès à une grande cohorte pourrait permettre d’évaluer si ces tests moléculaires sont corrélés avec la sévérité du phénotype pagétique. Une fois ces étapes effectuées, le test moléculaire offrant les meilleures capacités discriminantes pour le dépistage de la MOP pourrait devenir un test compagnon avant la prescription d’un agent ostéoformateur. Par exemple, un laboratoire centralisé pourrait être en charge d’effectuer toutes les analyses, à partir d’une seule prise de sang. Le génotypage des marqueurs génétiques et le dosage des marqueurs biochimiques pourraient être effectués à l’aide des méthodes proposées dans cette thèse (séquençage Sanger et système Elecsys). Les résultats du test moléculaire pourraient ensuite être acheminés au clinicien sous la forme d’une échelle de risque d’être atteint ou prédisposé à la MOP, en tenant compte de la présence ou l’absence de chaque partie de l’algorithme proposé. Si un individu a la présence de l’une des étapes du test proposé (mutation germinale dans SQSTM1, suivi de la combinaison de marqueurs génétiques ou de la combinaison de marqueurs

159 génétiques et biochimiques), des explorations complémentaires avant de prescrire un agent ostéoformateur seraient souhaitables. À première vue, la réalisation de toutes ces étapes semble fastidieuse et coûteuse comparativement à la scintigraphie osseuse du corps entier, seule méthode fiable actuellement disponible en pratique clinique. Cependant, la mise en place d’un laboratoire centralisé constitue une plateforme intéressante pour effectuer de façon fiable ces différentes analyses. De plus, le génotypage des marqueurs génétiques peut effectivement s’avérer dispendieux. Néanmoins, d’un point de vue économique, cette signature moléculaire pourrait représenter une approche intéressante à moyen ou long-terme afin de dépister les individus qui auraient besoin d’être investigués avec des examens d’imagerie. Ainsi, cette signature moléculaire pourrait éviter de pratiquer d’emblée des scintigraphies osseuses chez tous les patients ostéoporotiques candidats à la prescription d’agents ostéoformateurs.

À ce jour, seuls trois cas d’ostéosarcomes ont été rapportés chez les utilisateurs de Tériparatide, seul agent ostéoformateur actuellement disponible sur le marché, cette incidence étant toutefois similaire à celle observée dans la population générale (Cipriani, Irani et al. 2012). En ce qui concerne la MOP, il n’y a actuellement aucun cas d’ostéosarcome rapporté chez les patients pagétiques qui auraient reçu une prescription d’agents ostéoformateurs par mégarde. Cependant, il a été confirmé par des collègues qu’un individu ostéoporotique à priori exempt de MOP a développé une MOP symptomatique suite à l’utilisation du Tériparatide, le diagnostic ayant été confirmé par scintigraphie osseuse. De plus, on ne dispose actuellement d’aucune donnée sur la sécurité d’utilisation d’agents ostéoformateurs chez des individus qui seraient porteurs d’une mutation causale dans le gène SQSTM1, mais dont la scintigraphie osseuse serait négative. Par ailleurs, plusieurs individus dans notre cohorte sont porteurs de ces mutations, sans toutefois développer le phénotype clinique de la MOP, et ce même après 60 ans. Il serait sans doute plus sage de s’abstenir de prescrire des agents ostéoformateurs chez ces patients, au risque de causer l’apparition d’effets secondaires graves. Cependant, certains patients qui ont une ostéoporose très sévère, avec présence de multiples fractures, pourraient être privés d’une thérapie très efficace en raison de leur profil génétique défavorable. Ainsi, il est difficile de déterminer l’approche idéale pour ces patients : est-il préférable de se priver d’un traitement ostéoformateur, et prendre le risque de faire une énième fracture ostéoporotique, qui pourrait s’avérer mortelle? Devrait-on prendre le risque de donner un agent ostéoformateur chez un patient porteur d’une mutation dans SQSTM1, et ainsi prédisposé à la MOP, sachant les risques associés avec le développement d’un ostéosarcome? Il n’est malheureusement pas rare que les cliniciens se retrouvent à court de traitement dans la pratique clinique, en raison de la faible réponse thérapeutique chez certains patients souffrant d’ostéoporose sévère. Les conséquences psychologiques pour un patient se retrouvant face à cette situation difficile sont également non négligeables, et devraient être considérées avant l’introduction d’un tel test. À ma connaissance, il y a au moins un individu atteint de MOP qui a reçu une prescription de Tériparatide pour traiter une ostéoporose sévère, après bien sûr avoir été informé des risques par son clinicien. Or, aucun

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effet néfaste de l’utilisation d’un agent ostéoformateur n’a été rapporté jusqu’à maintenant chez ce patient pagétique. La Tériparatide est certes un agent ostéoformateur, mais le risque de développer un ostéosarcome dans un contexte de MOP demeure faible, en raison du mécanisme d’action de ce médicament. Néanmoins, ce traitement pourrait engendrer l’apparition d’une MOP symptomatique, qui s’avère tout de même être un effet secondaire grave. L’introduction de nouveaux médicaments ostéoformateurs dont le mécanisme d’action consiste à inhiber un inhibiteur naturel des ostéoblastes, par exemple des anticorps contre sclérostine actuellement en phase III, pourrait comporter un plus grand risque de développer un ostéosarcome. Ainsi, le dépistage précoce et fiable de la MOP demeure d’une importance cruciale pour éviter l’apparition d’effets secondaires graves associés avec les agents ostéoformateurs dans la pratique clinique.

Figure 38. Présence d’un spectre mutationnel dans la MOP. Les mutations du gène SQSTM1 sont présentes à la fois au niveau germinal, post-zygotique et somatique chez les patients atteints de MOP.

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Conclusion

La réalisation de cette thèse a permis de développer une signature moléculaire, sous la forme de deux algorithmes, capable de dépister la MOP de façon plus fiable que les biomarqueurs actuellement disponibles en pratique clinique. Ces algorithmes couvrent à la fois le volet monogénique de la MOP, en intégrant les mutations germinales dans le gène SQSTM1, et le volet multifactoriel, en incluant des marqueurs génétiques et des biomarqueurs du remodelage osseux. Évidemment, les algorithmes proposés constituent un résultat préliminaire, qui demandera d’être répliqué dans des cohortes indépendantes afin de s’assurer qu’ils peuvent dépister la MOP de façon fiable dans la population générale, et que leur utilisation contribue à améliorer la pratique clinique actuelle. Néanmoins, s’ils sont validés, le meilleur de ces algorithmes pourrait agir à titre de test compagnon pour la prescription d’agents ostéoformateurs, ces derniers étant indiqué pour le traitement de l’ostéoporose sévère.

Outre l’augmentation de la sécurité d’utilisation des agents ostéoformateurs, cette signature moléculaire pourrait être appliquée dans des contextes différents. En effet, plusieurs individus sont atteints d’une forme familiale de la maladie, sans toutefois être porteurs d’une mutation dans le gène SQSTM1. Il devient donc difficile de déterminer quels sont les apparentés à risque de développer la maladie, puisque le gène causal demeure inconnu à ce jour. Or, l’application de la signature moléculaire proposée pourrait permettre de détecter ces apparentés à risque, avant même l’identification du gène causal. De plus, si cette signature s’avère capable de prédire la sévérité du phénotype clinique, cela pourrait permettre aux cliniciens de traiter les patients de façon personnalisée.

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