UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA COORDINACIÓN GENERAL ACADÉMICA Coordinación de Bibliotecas Biblioteca Digital

La presente tesis es publicada a texto completo en virtud de que el autor ha dado su autorización por escrito para la incorporación del documento a la Biblioteca Digital y al Repositorio Institucional de la Universidad de Guadalajara, esto sin sufrir menoscabo sobre sus derechos como autor de la obra y los usos que posteriormente quiera darle a la misma.

Av. Hidalgo 935, Colonia Centro, C.P. 44100, Guadalajara, Jalisco, México [email protected] - Tel. 31 34 22 77 ext. 11959 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA Centro Universitario de los Lagos

Maestría en Ciencia y Tecnología

“Evaluación del efecto ansiolítico del extracto metanólico de hojas de Justicia spicigera (Schltdl.) y sus fracciones en ratas hembra en las fases de proestro- estro”. TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA CON ORIENTACIÓN EN BIOMÉDICA

PRESENTA: IBQ. ANA RAQUEL RAMOS MOLINA

Director de tesis: Dr. en C. Cesar Soria Fregozo

Codirector de tesis: Dr. en C. Armando Mora Pérez

Lagos de Moreno, Jal., junio de 2019.

II

El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Ciencias Biomédicas (Área Histología y Psicobiología) y Síntesis de Química Orgánica del Centro Universitario de los Lagos de la Universidad de Guadalajara, bajo la Dirección del Dr. Cesar Soria Fregozo y la Co-Dirección del Dr. Armando Mora Pérez. El proyecto recibió apoyo financiero parcial del PROGRAMA DE APOYO A LA MEJORA EN LAS CONDICIONES DE PRODUCCIÓN DE LOS MIEMBROS DEL SNI Y SNCA (PRO-SNI) convocatoria 2017 y 2018. Durante la realización del presente trabajo Ana Raquel Ramos Molina recibió una beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) para estudios de posgrado con número de registro CVU 855016.

III

COMITÉ DE EVALUACIÓN

Dr. Cesar Soria Fregozo Laboratorio de Ciencias Biomédicas/Área Histología y Psicobiología Universidad de Guadalajara/Centro Universitario de los Lagos Lagos de Moreno, Jalisco, México

Dr. Armando Mora Pérez Laboratorio de Ciencias Biomédicas/Área Histología y Psicobiología Universidad de Guadalajara/Centro Universitario de los Lagos Lagos de Moreno, Jalisco, México

Dra. Rosa Isela García Ríos Laboratorio de Ciencias Biomédicas/Área Histología y Psicobiología Universidad de Guadalajara/Centro Universitario de los Lagos Lagos de Moreno, Jalisco, México

Dr. Virginia F. Marañón Ruiz Laboratorio de Síntesis Química Orgánica Universidad de Guadalajara/Centro Universitario de los Lagos Lagos de Moreno, Jalisco, México

Dr. Mario E. Flores Soto Laboratorio de Neurobiología Centro de Investigación Biomédica de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social. Guadalajara, Jalisco, México

IV

ÍNDICE GENERAL ÍNDICE DE FIGURAS VIII ÍNDICE DE TABLAS IX LISTA DE ABREVIATURAS X RESUMEN XII 1. INTRODUCCIÓN 1 2. ANTECEDENTES 3 2.1 Generalidades de los trastornos de ansiedad 3 2.2 Clasificación y prevalencia de los trastornos de ansiedad 4 2.3 Generalidades de la ansiedad de tipo pánico 5

2.3.1 Participación del receptor GABAa en los trastornos de ansiedad. 7 2.4 Neurobiología de la ansiedad 8 2.4.1 Esteroides neuroactivos y ansiedad 11 2.5 Tratamientos farmacológicos de la ansiedad 15 2.6 Tratamientos fitofarmacológicos de la ansiedad (estudios clínicos) 15 2.7 Modelos animales de la ansiedad 16 2.8 Ciclo menstrual, hormonas y su relación con el trastorno de ansiedad 19 2.9 Ciclo estral, hormonas y su relación con el trastorno de ansiedad 21 2.10 Generalidades de Justicia spicigera Schltdl 23 2.10.1 Fitoquímica de Justicia spicigera Schltdl 24 2.11 Efecto de Justicia spicigera Schltdl en los trastornos afectivos 25 2.12 Plantas medicinales con efecto ansiolítico 26 2.13 Estudios preclínicos de metabolitos secundarios con efecto ansiolítico 28 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 31 4. JUSTIFICACIÓN 32 5. HIPÓTESIS 33 6. OBJETIVOS 33

V

6.1 Objetivo general 33 6.2 Objetivos particulares 33 7. MATERIALES Y MÉTODOS 34 7.1 Sujetos experimentales 34 7.2 Material vegetal 34 7.2.1 Obtención del extracto metanólico de Justicia spicigera Schltdl 34 7.2.2 Pruebas fitoquímicas preliminares 35 7.2.3 Pruebas de solubilidad 35 7.2.4 Obtención de las fracciones del extracto metanólico de Justicia 35 spicigera Schltdl. 7.3 Citología vaginal 36 7.4 Diseño de grupos experimentales 36 7.5 Pruebas conductuales 38 7.5.1 Prueba de actividad locomotriz 40 7.6 Análisis estadístico 41 8. RESULTADOS 42 8.1. PRIMERA FASE EXPERIMENTAL 42 8.2. LABERINTO DE BRAZOS ELEVADOS 42 8.2.1 Tiempo de permanencia en brazos abiertos 42 8.2.2 Porcentaje de entradas a brazos abiertos 42 8.2.3 Entradas totales a ambos brazos 43 8.2.4 Índice de ansiedad 44 8.2.5 Latencia al intento de exploración 45 8.2.6 Frecuencia al intento de exploración 45 8.2.7 Tiempo total del intento de exploración 46 8.2.8 Latencia a la evaluación de riesgo 47 8.2.9 Frecuencia de la evaluación de riesgo 47 8.2.10 Tiempo total de evaluación de riesgo 48 8.3 PRUEBA DE ACTIVIDAD LOCOMOTRIZ 48 8.3.1 Número de cuadros cruzados 48

VI

8.3.2 Latencia a la conducta vertical 49 8.2.3 Frecuencia de la conducta vertical 50 8.3.4 Tiempo total de conducta vertical 50 8.3.5 Latencia al acicalamiento 51 8.2.6. Frecuencia y tiempo de acicalamiento 51 9. FASE EXPERIMENTAL 2 53 9.1 Pruebas de solubilidad de las fracciones del extracto metanólico de las 53 hojas de justicia spicigera 9.2 Análisis fitoquímico preliminar del extracto metanólico y de las 54 fracciones de las hojas de Justicia spicigera 9.3 Cromatografía en capa delgada de las fracciones del extracto 55 metanólico de las hojas de justicia spicigera 9.4 LABERINTO DE BRAZOS ELEVADOS 57 9.4.1 Tiempo de permanencia en brazos abiertos 57 9.4.2 Porcentaje de entradas a brazos abiertos 57 9.4.3 Entradas totales a ambos brazos 58 9.4.4 Índice de ansiedad 59 9.4.5 Intento de exploración (Latencia, frecuencia y tiempo total) 60 9.4.6 Latencia a la evaluación de riesgo 62 9.4.7 Tiempo total de evaluación de riesgo 64 9.5 PRUEBA DE ACTIVIDAD LOCOMOTRIZ 65 9.5.1 Número de cuadros cruzados 65 9.5.2 Frecuencia de la conducta vertical 65 9.5.3 Tiempo total de la conducta vertical 66 9.5.4 Frecuencia del acicalamiento 67 9.5.5 Tiempo total del acicalamiento 68 X. DISCUSIÓN 70 XI. CONCLUSIÓN 79 XII. BIBLIOGRAFÍA 80 XIII. ANEXOS 93

VII

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA NOMBRE PÁGINA

1 Comparación de los desórdenes de ansiedad por año de los 5 principales países en el mundo

2 Estructura del receptor GABAA, y los sitios de unión a 7 benzodiacepinas, neuroesteroides, etanol y barbitúricos. 3 Principales regiones cerebrales implicadas en los trastornos 9 de ansiedad 4 Representación esquemática de la producción de cortisol 10 5 Representación esquemática de la regulación del eje 12 hipotálamo-hipófisis-gonadal 6 Comparación estadística del porcentaje de días de 20 discapacidad anuales entre hombres y mujeres en México 7 Niveles hormonales a lo largo del ciclo estral de roedores 21 8 Fotografía representativa de Justicia spicigera y su 24 identificación taxonómica 9 Estructuras representativas de terpenos, flavonoides, 28 esteroles y alcaloides 10 Diseño experimental 1ra. Fase experimental 37 11 Diseño experimental 2da. Fase experimental 38 12 Laberinto de brazos elevados 39 13 Actividad locomotriz 40

14 Placas de cromatografía de las diferentes fracciones del 56 extracto metanólico de Justicia spicigera

VIII

ÍNDICE DE TABLAS

TABLA NOMBRE PÁGINA 1 Clasificación de trastornos de ansiedad según el DSM-V y la 4 CIE-10: equivalencias 2 Criterios establecidos por el DSM-V para el diagnóstico de los 6 trastornos de ansiedad 3 Descripción de algunos modelos animales para medir ansiedad 18 4 Etapas del ciclo estral de la rata. 22 5 Metabolitos secundarios y su efecto ansiolítico. 29 6 Pruebas de solubilidad a las diferentes fracciones del extracto 53 metanólico 7 Análisis fitoquímico preliminar del extracto metanólico de las 54 hojas de Justicia spicigera 8 Análisis fitoquímico preliminar de las fracciones del extracto metanólico.

IX

LISTA DE ABREVIATURAS

°C Grados celsius μg Microgramos 5HT 5-hidroxitriptamina/serotonina ACTH Adrenocorticotropina AE Acetato de etilo ANOVA Analysis of Variance (por sus siglas en inglés BA Brazos abiertos BZD Benzodiacepinas 2- C2O4 Oxalato

C4H6O4Ca Acetato de calcio ccd Cromatografía en capa delgada

CHCl3 Cloroformo

CH3OH Metanol CIE Clasificación internacional de enfermedades 10a edición Cl- Ión cloro

Coa Cosolvente a

Cob Cosolvente b

CoCl2 Cloruro de cobalto cm Centímetros CRH Hormona liberadora de corticotropina DHEA Dehidroepiandrosterona DMSO Dimetilsulfóxido DSM-V Manual de diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales DZP Diazepam EMHM Extracto metanólico de las hojas de muicle ERE Elementos de respuesta ER Receptores a estrógenos FSH Hormona folículo estimulante

X

FXAE Fracción de acetato de etilo

FXCa Fracción cloroformo a

FXCb Fracción cloroformo b FXM Fracción metanólica g Gramos GABA Ácido gamma aminobutírico GnRH Hormona liberadora de gonadotropina

H2SO4 Ácido sulfúrico Hx Hexano HHG Hipotálamo-hipófisis-gonadal HPA Hipotálamo-hipófisis-adrenal i.p Intraperitoneal K Potasio kg Kilogramos LH Hormona luteinizante m Metros M-D Metaestro-diestro mg Miligramos ml Mililitros

NaCl2 Cloruro de sodio NS No significante OMS Organización mundial de la salud P-E Proestro-estro PCPA P-clorofenilalanina s Segundos SNC Sistema nervioso central UV Ultravioleta v.o Vía oral V:V Volumen-volumen

XI

RESUMEN

Introducción: La ansiedad es una respuesta emocional normal y de sobrevivencia ante situaciones de peligro. Sin embargo, cuando dicha respuesta sobrepasa su intensidad o se presenta sin motivo alguno se torna patológica; presentándose con mayor frecuencia en mujeres, debido a las fluctuaciones hormonales. Debido a que los fármacos ansiolíticos presentan efectos secundarios, el uso de la medicina tradicional ha ido en aumento. En este sentido, la planta conocida como Muicle (Justicia spicigera) ha sido empleada para tratar “los nervios”, así como en la regulación del ciclo menstrual, entre otros usos. Se ha reportado que el extracto acuoso de las hojas de Justicia spicigera en ratas hembra en las fases proestro-estro (P-E) tiene mayor efecto ansiolítico en comparación con las fases de metaestro-diestro (M-D) a una dosis de 12 mg/kg. Sin embargo, no existe ningún estudio científico que avale si el extracto metanólico y/o sus fracciones posean efecto ansiolítico. Objetivo: Evaluar el efecto ansiolítico del extracto metanólico y sus fracciones de las hojas de Justicia spicigera o muicle en ratas hembra en las fases P-E (fases caracterizadas por altas concentraciones de hormonas ováricas) sometidas a las pruebas de laberinto de brazos elevados y actividad locomotriz, las cuales fueron distribuidas en dos fases experimentales. La primera se utilizó para la curva dosis-respuesta del extracto metanólico de las hojas de muicle (EMHM). En tanto que, la segunda fase se evaluó la actividad ansiolítica de las fracciones metanólica (FXM), clorofórmica (FXC) y acetato de etilo (FXAE) del EMHM. Materiales y Método: Para la primera fase experimental se conformaron los grupos de la siguiente manera; el primer grupo recibió agua purificada 1.8ml/kg (VEH), el segundo, tercero y cuarto grupo recibieron 3, 6 y 12mg/kg del EMHM respectivamente; y un último grupo recibió 2mg/kg de diazepam como control positivo. Mientras que, en la segunda fase experimental, el primer grupo recibió 1.8ml/kg de agua purificada (VEH); el segundo y tercer grupo recibieron

1.8ml/kg de Cosa y Cosb respectivamente utilizado. Un cuarto grupo se le administró 12mg/kg de la FXM, al quinto grupo 12mg/kg de la FXAE, al sexto grupo 12mg/kg de la FXCa, al séptimo grupo 12mg/kg de la FXCb y un último grupo recibió 2mg/kg de

XII diazepam como control positivo. Del mismo modo, se realizaron pruebas fitoquímicas preliminares cualitativas a cada de las fracciones evaluadas. Resultados: Respecto a la primera fase experimental, la dosis 12 mg/kg EMHM incrementó significativamente el tiempo de permanencia en los brazos abiertos (p=0.027) de manera semejante al diazepam y en comparación con el vehículo. En la prueba de actividad locomotriz, los tratamientos no modificaron significativamente el número de cuadros cruzados en ninguno de los grupos (p=0.050). Mientras que, en la segunda fase experimental, se observó una pérdida del efecto ansiolítico; ya qué hubo una disminución del tiempo de permanencia en los brazos abiertos en las fracciones evaluadas, mientras que el Cosa mostró actividad ansiogénica (p= 0.001), sin modificar significativamente el número de cuadros cruzados en la prueba de actividad locomotriz (p= 0.969). Conclusión: El EMHM posee efecto ansiolítico en la dosis de 12mg/kg al aumentar el tiempo de permanencia en los brazos abiertos, dicho efecto se deba probablemente al sinergismo de los metabolitos del EMHM con hormonas ováricas. Por otro lado, el fraccionamiento del extracto metanólico perdió el efecto ansiolítico presentado por el extracto completo, se sugiere que los metabolitos responsables de dicho efecto, deben mantenerse en las proporciones contenidas en el extracto metanólico.

XIII

1. INTRODUCCIÓN

Se define a la ansiedad como una emoción de sobrevivencia, ya que está ligada a las reacciones de peligro inminente, de tal manera que es la responsable de las respuestas de valoración ante algún riesgo (Blanchard y col., 1988; Baxter y col., 2013). Por otro lado, cuando estas reacciones se presentan de forma exagerada y sin la identificación de algún estímulo desencadenante, se considera una ansiedad patológica. En este sentido, la ansiedad se ha convertido, a nivel mundial en un importante problema de salud, ya que los síntomas de esta patología repercuten en las actividades cotidianas del individuo que la padece. Se sabe que las mujeres en etapa reproductiva, son más propensas que los hombres a desarrollar algún tipo de ansiedad, debido a los cambios hormonales presentes a lo largo de su vida (Arenas y Puigcerver., 2009). Por tal motivo, se han relacionado las fluctuaciones hormonales con cambios a nivel conductual, así como su estrecha participación a nivel cerebral y la aplicación de tratamientos hormonales para contrarrestar dichos problemas (McEwen y Alves., 1999). Los fármacos utilizados para contrarrestar los síntomas de la ansiedad como las benzodiacepinas, los barbitúricos, entre otros, bajo tratamientos crónicos pueden tener efectos secundarios, como síndrome de abstinencia, dependencia, alteraciones cognitivas o motoras (Pita y Manzanares., 1994). Por tal razón, el uso de la medicina tradicional para el tratamiento de éstas y otras patologías relacionadas con los trastornos afectivos ha incrementado en los últimos años (Gorn y col., 2009). En este sentido, la medicina tradicional reporta diversas plantas utilizadas para el tratamiento de los “nervios”. Tal es el caso de la planta conocida como Muicle o Muitle (Justicia spicigera), la cual es reportada por la medina tradicional como “tónico nervioso”, sangrado uterino, alteraciones en los periodos de la menstruación, entre otros padecimientos (Peña y col., 2010). Se ha reportado que la kaempferitrina, un metabolito aislado de Justicia spicigera posee efecto de tipo antidepresivo en ratones macho a dosis de 10 y 20 mg. Sin

- 1 - embargo, el rendimiento para la obtención de kaempferitrina es bajo, ya que a partir de 5 kg de Justicia spicigera se obtuvo 1 g de kaempferitrina (Cassani y col., 2014). Mientras que, dosis de 12 mg/kg del extracto acuoso de las hojas de muicle a nivel experimental produce un efecto de tipo ansiolítico en la rata durante las fases de proestro-estro (P-E) del ciclo estral (García-Ríos y col., 2018). También, se ha demostrado el efecto de tipo antidepresivo a dosis de 24 y 48 mg/kg a los 21 días de tratamiento en hembras en las fases de metaestro-diestro evaluadas en la prueba de nado forzado (Carpio-Reyes, R.J., 2018). En este sentido, los efectos ansiolíticos y antidepresivos identificados en el extracto acuoso de hojas de Justicia spicigera, podría deberse a otros metabolitos contenidos en el extracto, ya que la concentración de kaempferitrina contenida en el extracto acuoso estaría muy por debajo de la dosis mínima efectiva identificada por Cassani y col., (2014). Sin embargo, a la fecha no se ha evaluado el efecto de tipo ansiolítico del extracto metanólico, así como de las fracciones del mismo en ratas hembra en las fases de P-E, en donde las concentraciones hormonales de progesterona y estradiol son altas (Mora y col., 1996), mismas fases donde se encontró un efecto ansiolítico con el extracto acuoso de las hojas de Justicia spicigera (García-Ríos y col., 2018). Por lo que, en el presente trabajo se evaluó si la administración aguda del extracto metanólico y/o de las fracciones de las hojas de Justicia spicigera poseen efecto de tipo ansiolítico, en la prueba de laberinto de brazos elevados en la rata hembra en las fases de P-E.

- 2 -

2. ANTECEDENTES

2.1 GENERALIDADES DE LOS TRASTORNOS DE ANSIEDAD

Ciertas emociones como el pánico, el miedo y la ansiedad son consideradas estados o sensaciones de sobrevivencia, en las que el individuo responde a un estímulo externo relacionado con un factor estresante, amenazante o algún peligro inminente (Graeff, F., 2007), dicha respuesta es acompañada de un sentimiento de desagrado, preocupación y tensión que permiten al sujeto adoptar las medidas pertinentes para afrontar dicha amenaza (Ministerio de Sanidad y Consumo, 2008). Un estudio realizado por Robert y Caroline Blanchard en 1988, hace una diferenciación entre la ansiedad y el miedo; concluyendo que, la ansiedad es una emoción ligada al comportamiento en respuesta a la valoración de riesgos en situaciones en las que el peligro es incierto y considerándola una emoción de supervivencia, mientras que el miedo está ligado a estrategias de defensa en respuesta al peligro real (Blanchard y col., 1988; Savage y col., 2017), de ésta manera, dicha respuesta es denominada umbral emocional, y éste parámetro hasta cierto punto es adaptativo, pero cuando el umbral emocional tiende a tornarse perjudicial en el nivel de respuesta, surgen los trastornos patológicos (Rodriguez-Landa y Contreras, 1998). El Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales (DSM-V) (2014) define a la ansiedad como una emoción que comparte características de miedo y ansiedad excesivos, desencadenando alteraciones en la conducta asociadas a dicha respuesta. Los trastornos de ansiedad a nivel patológico, son considerados como un cúmulo de síntomas debido a la presencia de preocupación, miedo o un temor excesivo, tensión, o activación que provoca un malestar notable o un deterioro clínicamente significativo de la actividad del individuo, aunque las causas que desencadenan este tipo de trastornos no han sido claras debido a que, según la literatura, están involucrados factores desencadenantes de tipo psicosocial, ambiental, biológicos, trastornos en el estado de ánimo y estrés (Pascual, P., 2012).

- 3 -

Para poder diagnosticar esta emoción como un trastorno de ansiedad, hay ciertos criterios establecidos y validados clínicamente, siendo la expectación ansiosa y el estado de hipervigilancia los síntomas claves para su diagnóstico. Lo anterior, debe ser realizado por un psicólogo y un psiquiatra, quienes se basan en las descripciones que se realizan en el DSM-V.

2.2 CLASIFICACIÓN Y PREVALENCIA DE LOS TRASTORNOS DE ANSIEDAD De acuerdo al DSM-V en conjunto con la Clasificación Internacional de Enfermedades décima versión (CIE-10), publicada por la Organización Mundial de la Salud (OMS), han descrito varios criterios generales para clasificar y diagnosticar los trastornos de ansiedad, tabla 1 (DSM-V., 2014).

Tabla 1. Clasificación de trastornos de ansiedad según el DSM-V y la CIE-10: equivalencias

DSM-V CIE-1O

Trastorno de ansiedad fóbica Fobia social Fobias sociales Fobia simple Fobias específicas Trastorno de ansiedad generalizada Trastorno de ansiedad generalizada Trastorno mixto ansioso-depresivo Otro trastorno mixto de ansiedad Otros trastornos de ansiedad Trastorno obsesivo-compulsivo Trastorno obsesivo-compulsivo Agorafobia sin crisis de angustia Agorafobia Otros trastornos de ansiedad Trastorno de angustia con agorafobia Trastorno de angustia Trastorno de angustia sin agorafobia

A nivel mundial, los desórdenes de ansiedad causan cerca del 2.02% del total de días perdidos por discapacidad al año (1.55%-2.52%) en edades laborales (15-49 años), según estadísticas presentadas por Institute for Health Metrics and Evaluation. Por otro lado, en México desde el año 2000, representa el 1.91% del total de días de discapacidad anual en hombres y mujeres. En la última década en países desarrollados como Japón y Australia, así como en países en conflicto social como Argentina y Cuba, ha incrementado el porcentaje de

- 4 - días perdidos por discapacidad (GBD, 2017). Por lo que, factores socioeconómicos parecen ser determinantes en el incremento de la prevalencia de los días perdidos por discapacidad asociados a los trastornos de ansiedad (Figura 1).

Figura 1. Comparación de los desórdenes de ansiedad por año de los principales países en el mundo. Tomado de healthdata.org

De esta manera, los trastornos de ansiedad son considerados, a nivel mundial, la sexta causa de discapacidad (Baxter y col., 2013).

2.3 GENERALIDADES DE LA ANSIEDAD DE TIPO PÁNICO La ansiedad de tipo pánico se caracteriza principalmente por la presencia de crisis de pánico de manera periódica y repentina seguida de eventos de constante intranquilidad y de preocupación sobre las implicaciones de sufrir otro episodio o cambios de conducta relacionados con las crisis, estos eventos pueden presentarse con episodios de agorafobia y acrofobia (Eizaguirre y col., 2013), mientras que en

- 5 - roedores se presenta el miedo a espacios abiertos y elevados (Walf y Frye, 2007). Para diagnosticar y caracterizar una crisis de pánico en humanos, se han referido y descrito los siguientes criterios clínicos, de los cuales, si se presentan cuatro de los aquí descritos, se puede considerar una crisis de ansiedad tipo pánico (Tabla 2).

Tabla 2. Criterios establecidos por el DSM-V para el diagnóstico de los trastornos de ansiedad

Por otro lado, se han estudiado los cambios a nivel neurológico de los trastornos de ansiedad, y se ha inferido que estas alteraciones probablemente se debe a aumento del nivel de catecolaminas en el sistema nervioso central (SNC), alteraciones en estructuras cerebrales involucradas en la respuesta al estrés y pánico (por ejemplo, amígdala y locus coerúleus); así como fallas en la neurotransmisión mediada por GABA (ácido gammaaminobutírico), principal neurotransmisor inhibitorio del SNC (Martin y Ressler, 2009).

- 6 -

2.3.1 PARTICIPACION DEL RECEPTOR GABAA EN LOS TRASTORNOS DE ANSIEDAD. Como se mencionó anteriormente, una de las principales hipótesis sobre las alteraciones que a nivel cerebral desencadenan los trastornos de ansiedad, es la participación de la falla de la neurotransmisión mediada por GABA considerado el principal neurotransmisor inhibitorio del SNC. Se ha reportado que la excitabilidad neuronal está mediada principalmente por dicho neurotransmisor. Considerando que el equilibrio en la actividad neuronal está regulado por la entrada excitatoria principalmente glutamatérgica y la actividad inhibitoria GABAérgica (Nemeroff C., 2003), de tal modo, este neurotransmisor ejerce su efecto mediante la activación de los receptores GABAA, GABAC y GABAB, siendo los dos primeros de tipo ionotrópicos, mientras que GABAB, es de tipo metabotrópico acoplados a proteínas G y sistemas de segundos mensajeros, los cuales activan canales de Ca2+ y K+. Los receptores de tipo GABAA son los más abundantes en el SNC, los cuales atraviesan la membrana neuronal, y se encuentran constituidos por cinco subunidades protéicas

(heteropentamérico), 1-6, β1-3, γ1-3, , ϴ y Ƥ1-3, al ensamblarse forman un canal iónico

- selectivo para el ión cloro (Cl ) (Bormann J., 2000) (Figura 2).

Figura 2. Estructura del receptor GABAA, y los sitios de unión a benzodiacepinas, neuroesteroides, etanol y barbitúricos. Tomado y modificado de psicomag.com

- 7 -

Bajo condiciones fisiológicas normales, el neurotransmisor GABA activa a su receptor

GABAA, al unirse a su sitio de reconocimiento permite la apertura del canal permeable al ión Cl-, provocando de esta manera la entrada del ión e hiperpolarización la neurona y como consecuencia la inhibición neuronal (Mody y Pearce 2004). La mayoría de los receptores GABAA se conforman por por dos subunidades α, dos subunidades β y una subunidad γ, las cuales presentan afinidad a diversas sustancias, que pueden tener un efecto de tipo agonista o antagonista de GABA sobre el receptor (Sieghart y Sperk 2002). En la patología de la ansiedad dicho neurotransmisor se encuentra en concentraciones bajas promoviendo una hiperexcitabilidad neuronal, de esta manera, el receptor

GABAA ha sido el blanco de diversas sustancias con potenciales efectos terapéuticos como los benzodiacepinas, neuroesteroides y alcohol, que tienen como finalidad la modificación del tiempo y frecuencia de apertura del canal iónico (Möhler y col., 1996). Por otro lado, dicho receptor muestra afinidad a diversas sustancias que bloquean la acción del neurotransmisor Gabaérgico, como lo son el alcaloide bicuculina, la picrotoxina (fármaco convulsivante) que tienen como finalidad bloquear el canal iónico - del receptor GABAA, impidiendo la entrada del ión Cl (Sieghart y Ernst., 2005).

2.4 NEUROBIOLOGÍA DE LA ANSIEDAD Diversos estudios preclínicos reportan que existe una estrecha relación entre las respuestas de ansiedad y estructuras cerebrales tales como: la corteza prefrontal, la cual está encargada de interpretar la información sensorial debido a la inervación recíproca con estructuras del sistema emocional, como la amígdala; estructura que coordina las reacciones de alarma, regula respuestas viscerales y conductuales usando como mediadores receptores serotonérgicos tipo 5HT-1A, noradrénérgicos y benzodiacepínicos (Goddard y Charney, 1997). También, el hipotálamo, región cerebral encargada de la regulación de hormonas mediante la estimulación de la hipófisis y la activación simpática, el hipocampo que se ha relacionado con el sistema de memoria y aprendizaje, generación y recuperación

- 8 - de recuerdos (Gómez B., 2007) y el locus coeruleus principal estructura cerebral que contiene los cuerpos neuronales que sintetizan noradrenalina, y se encuentra regulada por neurotransmisores inhibitorios como GABA y serotonina, con comunicación reciproca con el hipocampo, hipotálamo, amígdala y corteza prefrontal (figura 3). Los neurotransmisores implicados en la modulación de la ansiedad, se han clasificado de la siguiente manera; como inhibidores, la dopamina, serotonina, GABA, acetilcolina y encefalina, mientras que, a la noradrenalina, colecistoquinina y ácido glutámico son de tipo excitatorio (Gray, J.A., 1978; Pérez de la Mora, M., 2003; Klumpp y col., 2018).

Tálamo

Corteza prefrontal

Hipotálamo Amígdala Hipocampo Locus coeruleus

Figura 3. Principales regiones cerebrales implicadas en los trastornos de ansiedad. Tomado y modificado de psicomag.com

Tanto estructuras cerebrales como neurotransmisores y hormonas, responden a estímulos que desencadenan mecanismos en respuesta propios de la ansiedad ante situaciones de estrés. El eje hipotálamo-hipófisis-adrenal (HPA) se encarga de la secreción de cortisol, hormona de tipo glucocorticoide producida por la corteza suprarrenal (Smith y col.,2003) (figura 4), dicha secreción sigue un ritmo circadiano aumentando por la mañana y disminuyendo de manera progresiva durante el día, regresando a su nivel basal por la noche (Maidana y col., 2013). Un incremento en la síntesis y liberación del cortisol, se da ante un evento amenazante y bajo estrés agudo.

- 9 -

Al verse alterado el HPA en la retroalimentación negativa, se inhibe el hipotálamo y la hipófisis para de esta forma reducir la secreción de la hormona liberadora de corticotropina (CRH) y disminuir la liberación de cortisol. Si no se presenta la inhibición de la secreción de CRH y consecuentemente hay una sobreproducción de cortisol y de esta manera puede desencadenar desordenes tales como el trastorno de ansiedad, el trastorno bipolar, el síndrome por estrés postraumático, depresión, entre otros (Redolar y col., 2012).

Figura 4. Representación esquemática de la producción de cortisol

- 10 -

2.4.1 ESTEROIDES NEUROACTIVOS Y ANSIEDAD En el SNC se puede dar la síntesis a partir del colesterol de una subclase de esteroides, llamados neuroesteroides (Do Rego y col., 2009). Estás moléculas son sintetizadas en el SNC por las células de la glía con efectos en el tejido neural; los principales neuroesteroides incluyen a la pregnenolona, la dehidroepiandrosterona (DHEA), la progesterona, o la alopregnanolona (Baulieu E., 1981; Pluchino y col., 2013).

Se ha demostrado que los neuroesteroides derivados de la progesterona, específicamente la alopregnanolona, poseen propiedades ansiolíticas, sedantes e hipnóticas cuyos mecanismos se han correlacionado con la neurotransmisión GABAérgica, dado que por lo menos alopregnanolona, ejerce sus efectos antidepresivos, mediante el sitio de unión a GABA, dentro del receptor GABAA (Balada y col., 2012). De manera natural, en las mujeres se han encontrado mayores concentraciones de progesterona en estructuras cerebrales como; amígdala, cerebelo e hipotálamo (Bixo y col, 1997). Mientras que, quienes cursan por patologías como parkinson, alzheimer, depresión, ansiedad y esquizofrenia se ha encontrado que los niveles de neuroesteroides se encuentran reducidos (Bernardi y col., 2000; Dubrovsky B., 2005). Por otro lado, los esteroides neuroactivos son aquellos que se producen de manera sintética endógena al organismo e independientemente de su origen son capaces de modificar interacciones y estructuras neurales (Paul y Purdy, 1992; Dubrovsky, B., 2005). Por ello, se ha planteado la hipótesis de la alteración del eje hipótalamo- hipófisis-gonadal (HHG), el cual bajo condiciones normales regula la producción de esteroides gonadales (figura 5) (Murray y col., 2008). Estudios preclínicos han demostrado que la administración de hormonas como la progesterona y la pregnanolona tienen un efecto ansiolítico evaluado en un modelo de laberinto de brazos elevados al aumentar el tiempo de permanencia en los brazos abiertos (Bitran y col., 1993; Reddy y col., 2005); tal es el caso de Gangitano y col. (2009), en el cual evaluaron la influencia de la progesterona sobre la conducta de tipo

- 11 - ansiolítica dependiente de fase ovárica en el ratón. Se encontró que las hembras en la fase de estro aumentaron el tiempo de permanencia en los brazos abiertos respecto a hembras en fase diestro (Gangitano y col.,2009). Por otro lado, se ha demostrado que los receptores a estrógenos (RE), ER, ER, juegan un papel importante en los trastornos de ansiedad; por ejemplo en ratas hembras Wistar, Le Moëne y col. (2019) demostraron que la inhibición del receptor ER en el núcleo del hipotálamo, provoca el despliegue de conductas de tipo ansiolítico en situaciones aversivas; mientras que la inhibición del ER en amígdala incrementó la evaluación de riesgo evaluada en el laberinto de brazos elevados (Le Moëne y col., 2019).

Figura 5. Representación esquemática de la regulación del eje hipotálamo-hipófisis-gonadal

- 12 -

Por otro lado, hormonas esteroideas como los estrógenos (17β-estradiol, estriol y estrona) liberados por los ovarios son los responsables de los caracteres sexuales primarios y secundarios femeninos. Se producen diariamente 700 μg de 17-β- estradiol (E2); E2 tiene una vida media corta ya que se oxida irreversiblemente a estrona y estriol. La regulación de su producción y sus niveles de concentración se hallan sujetos a un ciclo complejo: los mensajeros del hipotálamo y de la hipófisis regulan la producción hormonal de los ovarios por otro lado, estos compuestos actúan sobre estructuras encefálicas. En los tejidos cerebrales los estrógenos ejercen un efecto neuroprotector, en el que podría tal vez tener un papel importante el tipo de receptor. Influyen en el estado de ánimo y la capacidad cognoscitiva, la plasticidad sináptica y la sinaptogenesis (Kumar y col., 2010; Österlund, M.K., 2010).

La secreción cerebral de estrógenos también afecta al ciclo menstrual, dado que no sólo responde a las hormonas ováricas en respuesta a las gonadotropinas hipofisarias, sino que también requiere la presencia de neuroesteroides. Se sabe, que para que se produzca el pico preovulatorio de la hormona luteinizante (LH), además del estradiol, es esencial la progesterona; lo que sugiere que la progesterona requerida para la ovulación es de origen cerebral. La liberación de progesterona pre-pico de LH se induce por el propio estradiol (Micevych y Sinchk, 2008). La progesterona promueve la meiosis para generar células germinales (Channing y col., 1978), e induce la reentrada de las células en el ciclo celular (Hammes y Levin, 2007). A su vez, los astrocitos son mediadores de las acciones neuroendocrinas de las hormonas sexuales. En concreto, el estradiol y la progesterona modulan la síntesis, la acumulación y liberación por los astrocitos del hipotálamo de factores implicados en la liberación de hormona liberadora de gonadotropinas (GRH), y otros factores (García- Segura y col., 2008).

La acción de las hormonas esteroideas en las neuronas se ejerce mediante la unión a dos tipos de receptores; su unión a un receptor de la membrana o del citoplasma con

- 13 - una acción rápida y su unión a un receptor nuclear con la consecuente activación de la transcripción de proteínas, una acción lenta. La unión de los estrógenos a su receptor citoplásmico no requiere síntesis de proteínas, sino que activa las vías de señalización de quinasas y Ca2+ y la respuesta se genera en unos pocos minutos, con expresión de genes uniendo al promotor factores de trascripción. Por el contrario, la unión al receptor nuclear regula la actividad de los genes que poseen elementos de respuesta (ERE) en su promotor.

Los receptores a progesterona son 3 isoformas , , . Los cuales difieren en su localización, siendo los  los que se localizan en cerebro, en estructuras como córtex, cerebelo, núcleo caudado, tálamo, hipófisis y médula espinal (Zhu y col., 2003). Mientras que los receptores a estrógenos son de dos tipos, unos acoplados a proteínas G (GPR30) y los nucleares que se dividen en dímeros ER, ER, ER, siendo los ER localizados en cerebro, principalmente en amígdala e hipocampo (Heldring y col., 2007; Jia y col., 2015). Los cambios en los niveles de estrógeno circulante a lo largo de la vida reproductiva, se han asociado con cambios en la incidencia de la ansiedad en las mujeres, principalmente en periodos de bajas concentraciones plasmáticas como la etapa menstrual, postparto, climaterio y postmenopausia (Boivin y col., 2017). El estudio de los mecanismos neurobiológicos de los trastornos de ansiedad, incluye el uso de ansiolíticos clínicamente efectivos, de los cuales ya se conoce por lo menos un mecanismo de acción. Sin embargo, a nivel preclínico puede existir más de un mecanismo farmacológico involucrado en el establecimiento del efecto ansiolítico. Hormonas esteroideas como la progesterona y el estradiol, tienen efecto sobre receptores cerebrales GABAérgicos (Baulieu y col., 1996); a nivel preclínico, se ha reportado que la progesterona tiene efectos ansiolíticos, aunque su metabolito reducido, la alopregnanolona incrementa dicho efecto (Bitran y col., 1995). El estradiol endógeno, reduce los niveles de miedo (Graham y Daher., 2016), en ratas Sprague Dawley, en fase de estro del ciclo estral, a las cuales se les administró vía

- 14 - subcutánea, β-estradiol en una dosis de 15 μg/kg y 100 μg/kg, 30 minutos antes de la prueba de miedo condicionado, se observó un efecto potenciado con el estradiol endógeno dado que su respuesta a la extinción del miedo incrementó (Graham y Scott, 2018).

2.5 TRATAMIENTOS FARMACOLÓGICOS DE LA ANSIEDAD Generalmente, los fármacos utilizados para tratar la ansiedad tienen efecto en el SNC, específicamente en estructuras del sistema emocional (McCann y col., 1995). Estos actúan como agonistas del sistema GABAérgico, favoreciendo indirectamente la neurotransmisión serotoninérgica, dopaminérgica o noradrenérgica; al ser fármacos liposolubles tienen la capacidad de penetrar de manera fácil y rápida al SNC. Algunos de estos grupos de fármacos son; barbitúricos como el mebaral, el luminal, el pentotal, surital; las benzodiacepinas como clobazam, diazepam, clorazepato, lorazepam y alprazolam; están también las azapironas como la buspirona y por último los bloqueadores de los receptores β1 y β2 adrenérgicos como el alprenolol, pindolol, carteolol. Siendo los dos primeros los más utilizados a nivel clínico (Pita y Manzanares, 1994). La mayoría de estos fármacos tienen como efecto secundario alteraciones cognitivas y motoras, somnolencia, fatiga, vértigo, taquicardia, cefalea u otros, que dependen del fármaco en específico, aunque todos al ser de administración crónica, causan dependencia (Pita y Manzanares, 1994). Debido a ello se han propuesto tratamientos alternativos con plantas medicinales de manera conjunta con las terapias psicológicas (Saeed y col., 2007).

2.6 TRATAMIENTOS FITOFARMACOLÓGICOS DE LA ANSIEDAD (ESTUDIOS CLINICOS) Debido a los efectos secundarios causados por los fármacos empleados para tratar los trastornos afectivos (Ballenger J. 1998), se ha incrementado la búsqueda y el desarrollo de nuevos tratamientos para disminuir los síntomas de dichos trastornos, y con ello las investigaciones al ámbito de la fitoterapia han ido en aumento. Se sabe del

- 15 - uso de la medicina tradicional alternativa como la herbolaria en personas con trastornos afectivos, principalmente ansiedad y depresión (Druss y Rosenheck 2005). Un estudio realizado en población anglosajona, identificó que el uso de la herbolaria, como tratamiento complementario ha aumentado 4 veces más los últimos cinco años (12.7% vs 3.4%) (Ravven y col., 2011). En este sentido, Kava Piper methysticum es una planta usada en Estados Unidos de Norteamérica, en pacientes diagnosticados con ansiedad moderada o leve (Kennedy., 2005), aunque se recomienda su uso a corto plazo debido a sus efectos hepatotóxicos (Pittler y Ernst., 2003). Por otro lado, un estudio realizado en 198 personas a las cuales se les administró extracto de Passiflora incarnata, no mostró diferencias estadísticamente significativas en cuanto a la disminución de los síntomas en comparación con la administración de benzodiacepinas (Miyasaka y col., 2007; Asher y col., 2017). Dicho estudio no se discriminó género, edad, tiempo de tratamiento o si se encontraba asociado a alguna otra enfermedad, factores que podrían ser determinantes en el éxito terapéutico. Ya que por lo menos las diferencias de respuesta farmacológica entre hombres y mujeres son más marcadas en mujeres asociada a la presencia de hormonas ováricas, como el estradiol y la progesterona, ya que estas modulan el estado de ánimo (Arenas y Puigcerver, 2009). Debido a estos hallazgos es necesaria la investigación científica del efecto de los extractos medicinales, tal como se recomienda en la medicina tradicional y con ello identificar si poseen las propiedades que se les atribuyen, así como explorar la posible interacción de los metabolitos de las plantas con hormonas gonadales sobre la modulación de los estados de ánimo.

1.7 MODELOS ANIMALES DE LA ANSIEDAD Si bien, los trastornos de ansiedad no pueden ser como tal medidos por un modelo animal, ya que no alcanzan a presentar la sintomatología completa propia de dicha patología, se ha propuesto, considerar circunstancias a las cuales son sometidos los animales, para asemejar situaciones que se le puede presentar a un sujeto en la vida cotidiana, ya que por lo general los trastornos de ansiedad son detonados por situaciones externas (Contreras y col., 2003). En este sentido, y con el fin de estudiar

- 16 - los trastornos de ansiedad, así como el potencial desarrollo de fármacos que contrarresten los síntomas propios, se han desarrollado modelos animales que permitan replicar algunas de las características propias de dicha patología, dichos modelos deben cumplir una serie de criterios: 1. El modelo debe de contar con validez, es decir, se debe basar en una característica de la patología. 2. Similitud conductual, las características conductuales propias de la patología del humano deben ser reproducidas en el modelo animal. 3. Similitudes bioquímicas, esto es, entre las estructuras fisiológicas implicadas, la farmacología y bioquímica propias de la patología. 4. Especificidad de los criterios del trastorno que se está estudiando, en el caso de la ansiedad, se deben presentar los mismos síntomas. (Cruz y col., 2003).

Diversos estudios reportan que en animales la ansiedad es caracterizada por alteraciones conductuales, que si bien tienden a ir hacia los extremos de su conducta habitual, por ejemplo, su actividad locomotriz puede ir en aumento o de lado contrario observar una inmovilidad, se puede llegar a observar también, la disminución de la interacción social, así como la supresión de la actividad sexual (Contreras y col., 2003). En animales de laboratorio, se ha observado que los parámetros utilizados para medir la ansiedad en pruebas conductuales, se ven positivamente disminuidos, al utilizar agonistas GABAérgicos que ayudan a restaurar la función de la neurotransmisión GABAérgica (Petty F.,1995). Dos de los modelos ampliamente utilizados son: enterramiento defensivo, en el cual, el animal cubre con aserrín un electrodo que representa un estímulo, debido a que cuando lo tocan, reciben un choque eléctrico de baja intensidad, en este modo se evalúa el tiempo en que las ratas tardan en presentar esta conducta (latencia) y el tiempo que se toman en cubrir dicha fuente. Otro modelo es el laberinto del brazos elevados, el cual consiste de un par de brazos cerrados, con paredes, y un par de brazos abiertos, en éste modelo, la rata puede elegir permanecer en el brazo cerrado,

- 17 - o explorar los brazos abiertos, dicho modelo permite medir ansiedad con agorafobia o acrofobia (Contreras y col., 2003). Otros modelos de ansiedad valoran respuestas conductuales naturales del animal o bien de su exposición a estímulos estresantes, algunos de ellos se describen en la siguiente tabla 3.

Tabla 3. Descripción de algunos modelos animales para evaluar ansiedad Modelo de Descripción Referencia ansiedad Transición luz- El animal se coloca en el lado iluminado de una (Crawley y oscuridad cámara de dos compartimentos, las variables Goodwin. 1980) contabilizadas son: número total de transiciones entre los compartimentos y el tiempo total de actividad. Fármacos como los benzodiacepinas aumentan el número de transiciones en el compartimento iluminado, lo cual se considera como efecto ansiolítico. Interacción social En pares de ratas, se mide el tiempo en el que (Treit D., 1985) pasan interaccionando por medio de conductas como; seguir al compañero, olfateo, manejando variables como: luz baja/ambiente familiar-no familiar; luz alta/ambiente familiar-no familiar, concluyendo que la interacción social se presenta en ambientes con luz baja y ambiente familiar. Condicionamiento Los animales son entrenados para asociar cierto (Brown y col., al miedo estimulo por lo general, luz, a un estímulo 1951) aversivo, choque eléctrico en patas, midiendo la respuesta de sobresalto a dicho estimulo, se ha reportado que algunos ansiolíticos, reducen la amplitud del sobresalto dosis-dependiente.

- 18 -

2.8 CICLO MENSTRUAL, HORMONAS Y SU RELACIÓN CON EL TRASTORNO DE ANSIEDAD Al entrar a la pubertad, las mujeres comienzan a experimentar cambios fisiológicos derivados a su vez de variaciones hormonales. Las hormonas gonadotropina (GnRH), folículo estimulante (FSH) y luteinizante (LH) comienzan a incrementar sus niveles desencadenando una serie de cambios físicos y fisiológicos, entre ellos, la aparición del ciclo menstrual. Dicho ciclo inicia con la menarca (aparición de la primera menstruación), hasta la menopausia (desaparición de la menstruación), y tiene una duración aproximada de 28 a 40 días en el 75% de las mujeres y en un 15% es irregular o variable (Escobar y col., 2010).

A lo largo del ciclo, las mujeres experimentan síntomas emocionales y físicos relacionados principalmente con etapas perimenstruales, y con un cambio recurrente de los niveles hormonales como esteroides sexuales (estrógenos y progesterona) y gonadotrofinas hipofisarias (FSH y LH). Estas variaciones hormonales se han relacionado con la susceptibilidad a presentar cambios en el estado de ánimo, principalmente cuando los niveles hormonales se encuentran a la baja (Rodríguez- Landa y col., 2015). El ciclo menstrual se acompaña con la producción hormonal ovárica regulada por el hipotálamo y la glándula hipófisis, además de recibir información de la corteza cerebral y del sistema límbico (Zanin y col., 2012). A menudo las alteraciones a lo largo del ciclo menstrual son motivo de consultas médicas, debido a las variaciones tan abruptas del estado de ánimo, libido y apetito derivado de los cambios cíclicos hormonales (López-Mato y col., 2000; Zanin y col., 2012). Se ha reportado que hay una relación entre la alta prevalencia de los cambios del estado de ánimo y el ciclo reproductivo femenino, asociado a las variaciones en los niveles hormonales que se presentan a lo largo del mismo, por ejemplo, en el síndrome premenstrual, en etapa postparto y en el climaterio (Freeman., 2003). Estos cambios hormonales se han asociado al desarrollo de trastornos de ansiedad y depresión (Yang y col., 2013).

- 19 -

En México, se ha reportado que, en mujeres los desórdenes de ansiedad causan el 3.16% del total de días perdidos por discapacidad al año, mientras que en hombres representa solo el 1.07% (figura 6) (GBD., 2017).

Figura 6. Comparación estadística del porcentaje de días de discapacidad anuales entre hombres, mujeres y ambos en México (GBD. 2017).

Por otro lado, en otras especies de mamíferos como la rata hembra, se presenta algo similar al ciclo reproductivo femenino. En la rata hembra se conoce como ciclo estral, y se caracteriza por la diferencia de concentraciones en las hormonas gonadotrofinas y la presencia de diferentes tipos celulares en cada fase de ciclo (Miller y Takahashi 2014) (figura 7).

- 20 -

Figura 7. Niveles hormonales a lo largo del ciclo estral de roedores (Tomado de Miller y Takahashi, 2013).

2.9 CICLO ESTRAL, HORMONAS Y SU RELACIÓN CON EL TRASTORNO DE ANSIEDAD El ciclo estral de la rata se caracteriza por presentar cuatro fases; proestro, estro, metaestro y diestro (Freeman M., 1988), en dichas fases, las variaciones de las concentraciones hormonales son similares al ciclo reproductivo femenino, las hormonas FSH y LH están presentes a bajas concentraciones e incrementan en fase de proestro; por su parte el estradiol disminuye en fase metaestro manteniéndose hasta alcanzar niveles máximos en proestro, regresando a su estado basal en estro. Por su parte, la progesterona incrementa en fase metaestro y diestro, y disminuye en proestro y al final de estro incrementa nuevamente (Smith y col., 1975; Sportnitz y col., 1999). Cada fase se caracteriza por la presencia de células con características morfológicas particulares, así como una conducta reproductiva específica en la rata (Tabla 4).

- 21 -

Tabla 4. Etapas del ciclo estral de la rata. Tomado y modificado de (Frías y Ortega 2013) Fase de Duración Hormonas Histología Descripción Conducta ciclo (horas) Estro 9-15 FSH Presencia de Celo, Estrógenos células epiteliales Nerviosismo LH cornificadas o Receptiva a escamosas la cópula

Metaestro 21 progesterona Neutrófilos, Poca leucocitos y actividad y algunas células ovulación epiteliales. Diestro 56 progesterona Abundantes No leucocitos y receptiva pocas células (no acepta epiteliales cópula) Proestro 12 FSH Células Receptiva a Estradiol nucleadas, pocos copula a leucocitos final de

fase.

A medida que avanza el ciclo reproductivo de las hembras, se presenta una variación hormonal notable, que implica la disminución y el aumento en la concentración de las diversas hormonas gonadales que participan en dicho ciclo. Diferentes estudios preclínicos, han reportado los cambios observables que se presentan debido a estas transiciones (Miller y Takahashi, 2014).

Los estrógenos y las hormonas sexuales a nivel SNC juegan un papel neuromodulador, modificando la concentración de neurotransmisores por diversos mecanismos (Zanin y col., 2012). Por ejemplo, algunos estrógenos incrementan la

- 22 - concentración sanguínea de triptófano, aminoácido encargado de la síntesis de serotonina, y relacionado con los trastornos depresivos (Vieitez y col., 2000; Zanin y col., 2012). Por otro lado, la progesterona, a concentraciones altas en sangre produce somnolencia, efectos sedantes y disminuye la excitabilidad neuronal. En tanto que a concentraciones plasmáticas bajas se ha asociado con fatiga, apatía, anhedonia y estados depresivos (Vieitez y col., 2000). Evidencias experimentales y clínicas también han reportado que la progesterona modula los sistemas GABAérgico, noradrenérgico, serotonérgico, dopaminérgico, neurotransmisores implicados en las acciones de los fármacos con acción antidepresiva y ansiolítica (Gutiérrez-García y col., 2000).

Estudios experimentales en ratas hembra, a las cuales se les administró alopregnanolona y progesterona a dosis 10 µg vía intracerebroventricular, se pudo observar un efecto ansiolítico-sedante, el cual fue bloqueado al administrar picotroxina, un antagonista de los receptores GABAA (Bitran y col., 1991). Por otro lado, Fernández y Picazo (1992) demostraron que ratas hembra en la fase de proestro, del ciclo estral de la rata, presentan menor ansiedad que las hembras ovariectomizadas, en un modelo de ansiedad experimental como el enterramiento defensivo, efecto que es revertido con la administración de estrógenos, siendo éste el tratamiento más eficaz en cuanto a la reducción del tiempo dedicado al enterramiento (Fernández y Picazo., 1992). Por su parte, diversos estudios han reportado el uso de compuestos de origen vegetal reportados por la medicina tradicional, que en sinergismo con las hormonas ováricas contribuyen a aminorar los síntomas del estado de ánimo, como la ansiedad (López- Rubalcava y Estrada-Camarena., 2016).

2.10 GENERALIDADES DE JUSTICIA SPICIGERA SCHLTDL. (ACANTACEE) Justicia spicigera es un arbusto que crece de 1 a 1.5 m de altura, densamente ramificado. Tiene las hojas más largas que anchas. Las flores se encuentran agrupadas en la unión del tallo, la hoja y en la parte terminal de la planta, comúnmente de color anaranjado, algunas veces rojo pálido en forma de tubos. Planta endémica de

- 23 -

México, Belice, Costa Rica, El Salvador, Guatemala, Honduras y Nicaragua, se encuentra presente en climas cálido, semicálido, semiseco, seco y templado desde el nivel del mar hasta los 3000 m. Cultivada en huertos, crece también a orillas de caminos, asociada a vegetación silvestre en bosques tropicales caducifolio, subcaducifolio subperennifolio y perennifolio, matorral xerófilo, bosque espinoso, bosque mesófilo de montaña, bosques de encino, de pino y mixto de encino-pino (Peña y col.,2010). En la figura 8 se describe su clasificación taxonómica.

Reino Plantae Subreino Tracheobionta Filo Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Subclase Asteridae Orden Scrophulariales Familia Acanthaceae Genero Justicia Especie Justicia Spicigera Nombre común Muicle

Figura 8. Fotografía representativa de Justicia spicigera y su identificación taxonómica.

2.10.1 FITOQUÍMICA DE JUSTICIA SPICIGERA Justicia spicigera, mejor conocido como “muicle”, es una planta medicinal de la cual se han identificado compuestos como carbohidratos simples, mucílagos, pectinas, 2 glucósidos, pigmentos, resinas, aceites esenciales y minerales (K, C4H6O4Ca y C2O4 -2 SO4 y NaCl), se han aislado de las hojas compuestos fenólicos, flavonoides como kaempferitrina y kaempferol trirhamnoside y taninos de las flores (Osuna y col., 2005). Por otro lado, pruebas fitoquímicas realizadas a las hojas secas de Justicia spicigera revelan algunos de sus componentes como; antocianinas, fitoesteroles y flavonoides (Baqueiro-Peña y Guerrero-Beltrán, 2017).

- 24 -

Un estudio realizado para evaluar la actividad antibacteriana y antifúngica del extracto etanólico de Justicia Spicigera en una fracción hexánica, se pudieron identificar compuestos como; 4-metil-3-pentanal, 2-hidroxi-2-metil-butanoato de metilo, 3,4- epoxi-2-hexanona, 4-(1-metiletoxi)-1-butanol, ácido 2-hidroxi-2-metil-butanoico, 1,2- diol-(2-furanil)-3-buteno, 2-hexenoato de etilo, ácido 3-tiofen-acético, ácido ftálico-2- etil-butil éster y 4-fenil-1,2-di-(4-metoxifenil)-eteno (Vega-Avila y col., 2012).

2.11 EFECTO DE JUSTICIA SPICIGERA EN LOS TRASTORNOS AFECTIVOS Se ha probado el extracto acuoso de la planta de Justicia spicigera, así como de metabolitos para tratar de conocer el mecanismo de acción. Uno de ellos es el estudio realizado por Cassani y col. en 2014, en el cual se aisló la kaempferitrina del extracto etanólico de Justicia spicigera, utilizando 5 kg de la planta cuyo rendimiento fue de 1025 mg. El compuesto se utilizó para evaluar el efecto antidepresivo en ratones en la prueba de suspensión de cola, nado forzado y campo abierto. Se demostró el efecto antidepresivo de kaempferitrina a dosis de 5, 10 y 20 mg/kg. Además, se evaluó un sinergismo de 1 mg/kg de kaempferitrina e imipramina a dosis de 6.25 mg/kg, fluoxetina 10 mg/kg y desipramina a dosis de 3.12 mg/kg, se reportó el efecto de tipo antidepresivo de kaempferitrina con estas combinaciones a excepción de la desipramina. Este mismo estudio se evaluó el posible mecanismo de acción de la kaempferitrina con los receptores 5-HT1A y su interacción con el sistema de neurotransmisión serotonérgico, ya que se ha reportado en la literatura que dicho sistema está relacionado con el estado de ánimo y por ende con la ansiedad. En este estudió se inhibió la síntesis de 5-HT mediante el inhibidor de la enzima triptófano hidroxilasa, el p-clorofenilalanina (PCPA) antes del tratamiento con kaempferitrina. PCPA redujo aproximadamente el 80% de la serotonina endógena en el cerebro de los roedores, por lo tanto se sugiere la participación del sistema serotoninérgico en las acciones antidepresivas de kaempferitrina, aunque no se descarta la participación de otros sistemas de neurotransmisores en dicho efecto (Cassani y col., 2014).

- 25 -

Por otra parte, se han demostrado el efecto anti-desesperanza del extracto acuoso de las hojas de Justicia spicigera en ratas hembra ciclantes, a las que se les administró de forma aguda vía oral en la fase P-E y metaestro-diestro (M-D), diferentes dosis del extracto acuoso de las hojas de muicle (infusión), 12, 24, 48 y 96 mg/kg y fluoxetina 4 mg/kg, y se evaluó su efecto en la prueba de nado forzado y actividad locomotriz. Se demostró que la dosis aguda de 12 y 48 mg/kg, así como dosis crónicas de 24 y 48 mg/kg del extracto acuoso de las hojas de Justicia spicigera producen un efecto anti- desesperanza en las fases de M-D del ciclo estral, fase caracterizada por la baja concentración de hormonas (Carpio-Reyes, R.J., 2018). Además, con las mismas dosis de muicle y utilizando al diazepam (2 mg/kg) como fármaco de referencia, se realizó una curva dosis respuesta del extracto acuoso para evaluar la influencia de las hormonas ováricas en las fases de P-E y M-D. El efecto se evaluó en el laberinto de brazos elevados y se encontró que la dosis de 12 mg/kg del extracto produce un efecto ansiolítico en las fases de P-E de manera semejante al diazepam, aumentando la variable de tiempo de permanencia en brazos abiertos y reduciendo el índice de ansiedad. De manera conjunta, se realizó un análisis fitoquímico cualitativo y se pudo identificar la presencia de terpenos, flavonoides y esteroles en el extracto de Justicia spicigera. Cuyo efecto ansiolítico podría deberse a la presencia de dichos compuestos en sinergismo con hormonas ováricas (García- Ríos y col., 2018).

2.12 PLANTAS MEDICINALES CON EFECTO ANSIOLÍTICO Estudios preclinicos han demostrado que la administración de 10 ml/kg del extracto acuoso de Agastache, mexicana y xolocotziana, en ratones macho Swiss Webster, produjo una disminución de la ansiedad de manera semejante al diazepam, en la prueba de comportamiento exploratorio de evitación. Mientras que, la administración oral del extracto metanólico y del principal flavonoide presente en el extracto, el tilianin, mostró una reducción de la ansiedad en la prueba de laberinto de brazos elevados, sin modificar la actividad locomotriz (Estrada-Reyes y col., 2004; Estrada-Reyes y col., 2014).Thakur y Rana en 2013, evaluaron la actividad ansiolítica

- 26 - del extracto hidroalcohólico de Cissampelos pareira en un modelo animal utilizando el laberinto de brazos elevados, observando que dicho extracto aumenta el tiempo de permanencia en brazos abiertos de manera semejante al diazepam (DZP) (Thakur y Rana 2013). Por otro lado, se ha demostrado que la administración oral del extracto acuoso de tila (Tilia americana L.) a dosis de 10, 30, 100 y 300 mg / kg en ratones macho produce un efecto ansiolítico en la prueba de laberinto de brazos elevados, respuesta semejante al diazepam. Las pruebas de cromatografía líquida de alta resolución demostraron la presencia de flavonoides como quercetina y kaempferol, probables responsables de la actividad ansiolítica del extracto acuoso de tila (Pérez-Ortega y col., 2007). Otro estudio, demostró que el extracto hexánico de Annona cherimola administrado en ratones Swiss Webster, a una dosis de 3.12 mg/kg produjo efectos ansiolíticos en la prueba de laberinto de brazos elevados. Dicho efecto, potenció su actividad en combinación con 0.5 mg/kg de muscimol (agonista de los receptores GABA) (Estrada- Reyes y col., 2006). La manzanilla (Matricaria recutita L) es usada en la medicina tradicional para reducir los nervios, el dolor menstrual, fiebre y “susto” (Argueta y col., 1994). Un estudio demostró que el aceite esencial de la manzanilla administrado en ratones adultos de la cepa Balb-C a dosis de 50 y 100 mg/kg, produce un efecto ansiolítico mejor que la cafeína a dosis de 25 mg/kg en la prueba de laberinto de brazos elevados, sin cambios en la actividad locomotriz (Devrim y col., 2012).

Por otro lado, Razavi y col. (2017) demostraron el efecto del extracto alcohólico y acuoso de Lippia citriodora y su componente principal, un flavonoide conocido como verbascosido en un modelo de ratón, evaluado en laberinto de brazos elevados y se pudo observar que la dosis de 200 mg/kg del extracto acuoso y etanólico, así como 100 mg/kg del flavonoide, aumentaron significativamente el tiempo de permanencia en brazos abiertos (Razavi y col., 2017).

- 27 -

2.13 ESTUDIOS PRECLÍNICOS DE METABOLITOS SECUNDARIOS CON EFECTO ANSIOLÍTICO Para conocer el efecto de diversos metabolitos contenidos en las plantas es necesario realizar la identificación química de los mismos. Y posteriormente evaluar sus propiedades ansiolíticas o de algún otro tipo. Por ello, se ha hecho la extracción de algunos metabolitos secundarios (Tabla 5) como; terpenos, flavonoides, esteroles y alcaloides, (figura 9), de plantas reportadas en la medicina tradicional, como ansiolíticas para posteriormente evaluarlos en diferentes modelos animales de ansiedad.

Chalcona; flavonoide base

Figura 9: Estructuras representativas de terpenos, flavonoides, esteroles y alcaloides.

De tal modo y con el fin de desarrollar fitofármacos eficaces y confiables para el tratamiento de los trastornos afectivos como la ansiedad, se emplean técnicas apropiadas como la separación mediante cromatografía en columna, cromatografía en capa delgada, cromatografía líquida de alta resolución, espectrofotometría en masas para la identificación y cuantificación de dichas moléculas.

- 28 -

Tabla 5. Metabolitos secundarios y su efecto ansiolítico Planta Metabolitos con posible Metodología Referencia actividad ansiolítica Agastache Tilianina Dosis de 30 mg / kg, ip, el González- efecto ansiolítico se vio Trujano y col., mexicana disminuido por la 2015 administración de flumazenil (un antagonista de GABAA / BZD, 5 mg / kg i.p), ratones, laberinto de brazos elevados Cissampelos Alcaloides, flavonoides, La actividad ansiolítica se (Thakur y pareira esteroles, terpenos evaluó en la prueba de Rana, 2013) laberinto elevado, dosis 100, 200, 400 mg/kg vs DZP, el extracto aumentó significativamente el número de entradas, cruces y tiempo de permanencia en brazos abiertos. Agastache diosmetin, acacia, Se utilizaron las pruebas de mexicana flavonoides y terpenos enterramiento defensivo y (Estrada- ssp. holeboard locomoción Reyes y col., xolocotziana dispositivo rota-rod. 2014) Observando en dosis de 1 mg/kg vs DZP un efecto ansiolítico, en un modelo de ratón.

Por otro lado, se ha reportado que algunos flavonoides, crisina, apigenina, aislados de plantas como Passifora coerulea y matricaria rucutita, poseen efectos ansiolíticos mediante su afinidad por el receptor a benzodiacepinas (Paladini y col., 1999). En el caso particular de las especies de Justicia, se ha evaluado la actividad de diversos extractos para la extracción de compuestos con actividad biológica encontrando cumarina, lignanos, flavonoides, alcaloides y triterpenos, todos ellos con múltiples propiedades farmacológicas, entre ellas, antiinflamatorias, analgésicos, digestivos, contra desórdenes mentales, antiepilépticos y antitumorales (Corrêa y col., 2012). En este sentido y de manera particular, se han aislado metabolitos como los flavonoides; apigenina con efecto antiinflamatorio en Justicia gendarussa, kaempferitrin en Justicia spicigera, alcaloides como; vasicina con efecto uterotónico, y

- 29 - diversos triterpenos con efectos sobre la disminución de la fertilidad, elenosidos y justicinol con efecto sobre SNC (Subbaraju y col., 2004; Susplugas y col., 2005).

- 30 -

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

En la actualidad, los problemas afectivos como la ansiedad, repercuten de manera significativa en la calidad de vida de los sujetos que lo padecen, aunado a que algunos tratamientos farmacológicos poseen efectos secundarios y ocasionan dependencia. En este sentido, y en la búsqueda de alternativas farmacológicas el uso de la medicina tradicional ha incrementado. Se ha reportado el efecto ansiolítico de diferentes plantas; y de manera particular, el extracto acuoso de Justicia spicigera ha mostrado efectos de tipo ansiolíticos en las fases de P-E, caracterizadas principalmente por las altas concentraciones de hormonas. Sin embargo, se desconocen los metabolitos responsables de dicho efecto. Por lo que, el presente trabajo se evaluará el efecto ansiolítico del extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera, así como la identificación de las fracciones con la misma actividad en ratas hembra Wistar durante las fases P-E.

- 31 -

4. JUSTIFICACIÓN.

En la actualidad, la ansiedad afecta a gran parte en la población a nivel mundial. Es un problema emocional que impacta de manera significativa a las mujeres debido a los cambios hormonales sufridos a lo largo del ciclo menstrual, aunado a esto, los efectos colaterales de tratamientos farmacológicos como los benzodiacepinas, se ha incrementado el uso de plantas medicinales para su tratamiento. Por lo cual, se requiere explorar de manera científica si los efectos terapéuticos atribuidos a las mismas existen. Una planta empleada en diferentes estados de la república mexicana como tónico nervioso para el tratamiento de la ansiedad es la Justicia spicigera. Efecto ansiolítico que ya ha sido demostrado en el grupo de trabajo. Sin embargo, es importante comprobar si el extracto metanólico y/o las fracciones obtenidas de Justicia spicigera conservan la actividad ansiolítica.

- 32 -

5. HIPÓTESIS 1.- El extracto metanólico de hojas de Justicia spicigera Schltdl producen un efecto ansiolítico de manera dosis dependiente, durante las fases de proestro-estro en ratas hembra Wistar.

2.- Las fracciones obtenidas a partir del extracto metanólico de hojas de Justicia spicigera Schltdl presentan un efecto ansiolítico durante las fases de proestro-estro de ratas Wistar.

6. OBJETIVOS 6.1 Objetivo General Determinar el efecto ansiolítico del extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera Schltdl en ratas hembra Wistar en las fases de proestro-estro, así como identificar las fracciones del extracto con actividad ansiolítica.

6.2 Objetivos Particulares 6.2.1. Obtener el extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera Schltdl. 6.2.2. Realizar pruebas de solubilidad de los extractos obtenidos de Justicia spicigera Schltdl. 6.2.3. Realizar una curva dosis-respuesta de la administración aguda del extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera (Schltdl.), en ratas hembra en las fases proestro-estro sometidas a las pruebas de laberinto de brazos elevados y actividad locomotriz. 6.2.4. Obtener las fracciones del extracto metanólico de hojas de Justicia spicigera (Schltdl.), mediante el uso de la cromatografía en columna. 6.2.5. Realizar pruebas fitoquímicas preliminares del extracto metanólico y las fracciones para la identificación cualitativa de la presencia de compuestos como flavonoides, esteroles, alcaloides y terpenos. 6.2.6. Determinar la actividad ansiolítica de la administración aguda de las fracciones obtenidas del extracto metanólico de hojas de Justicia spicigera

- 33 -

(Schltdl.), en ratas hembra en las fases de proestro-estro sometidas a las pruebas de laberinto de brazos elevados y actividad locomotriz

7. MATERIALES Y MÉTODOS 7.1 Sujetos experimentales Se utilizaron 106 ratas hembra de la cepa Wistar, las cuales fueron mantenidas bajo condiciones de bioterio estándar, con libre acceso al agua y alimento. El ciclo luz- oscuridad será de 12x12 horas a temperatura ambiente de 23° a 25 °C. Todas las manipulaciones experimentales y el manejo de los animales se realizaron con estricto apego a las normas éticas para el uso de animales de laboratorio, tomando como referencia la NOM-062 y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales del National Research Council (NOM., 1999).

7.2 Material vegetal La recolección de la planta se realizó en la localidad de “La Libertad” con las coordenadas: 21° 44´43.68” N, 102° 03´48.51” O, municipio de Lagos de Moreno, Jalisco, México, a una altitud de 1996 msnm. El espécimen vegetal fue llevado al Herbario del Centro de Investigaciones Biológicas de la Universidad Veracruzana (CIB- UV), donde se le asignó un número de catálogo (García-Ríos y col., 2018).

7.2.1 Obtención del extracto metanólico de Justicia spicigera Schltdl. Las hojas frescas de Justicia spicigera (Schltdl.), (Acanthaceae) se pesaron y se sometieron a un proceso de secado a la sombra a 22 °C un periodo de 4-7 días; posteriormente se determinó el rendimiento en seco. Una vez deshidratada la planta se pesaron 200 g y se agregaron 4 L de metanol para la maceración, transcurrido 7 días de reposo se procedió a la concentración del extracto mediante el uso de un rotavapor a 65°C aproximadamente, con el fin de recuperar el disolvente y continuar con la maceración del material vegetal. Este proceso se repitió hasta obtener el agotamiento del material vegetal tomando como

- 34 - indicador la coloración inicial del macerado. Posteriormente se realizaron las pruebas de solubilidad.

7.2.2 Pruebas fitoquímicas preliminares El extracto de las hojas de Justicia spicigera y de las fracciones obtenidas del extracto metanólico, fueron sometidos a estudios preliminares con las siguientes técnicas estandarizadas, para la determinación de la presencia de metabolitos secundarios como; alcaloides, esteroles, terpenos y flavonoides (Aiyelaagbe y Osamudiamen, 2009; Lalitha y Jayanthi, 2012; Mora-Pérez y Hernández-Medel, 2016). Las técnicas de identificación de los metabolitos secundarios están basadas en la modificación de un grupo funcional, la apertura de un sistema anular, formación de un complejo originando con esto el cambio de coloración, formación de algún precipitado o gas (Mora y col., 2012) VER ANEXO I.

7.2.3 Pruebas de solubilidad Del extracto metanólico se obtuvieron tanto sustancias apolares como polares, por lo que fue necesario buscar el vehículo adecuado para disolver el extracto. Se utilizaron diversos disolventes como agua, solución salina fisiológica y dimetilsulfóxido (DMSO). El cosolvente es una sustancia integrada por dos o más compuestos con la capacidad de disolver mezclas, que presentan propiedades polares y apolares. El primer cosolvente fue preparado con 4:1:5 (propilenglicol, tween 80 y solución salina 0.9%, respectivamente (Llavarasan y col., 2003), mientras que el segundo cosolvente se preparó 98% solución salina, 2% tween 80 (Oliveira y col., 2017). El extracto con los diferentes cosolventes se puso en agitación durante 5, 10 y 20 minutos.

7.2.4 Obtención de las fracciones del extracto metanólico de Justicia spicigera Schltdl. Para la obtención de las fracciones a partir del extracto metanólico de Justicia spicigera Schltdl., se utilizó la cromatografía de columna (columna de cristal de 50 cm de largo y 3 cm de diámetro), la cual tiene como principio la afinidad de los metabolitos

- 35 - por el solvente utilizado. Como fase estacionaria se empleará gel de sílice 60 (número de malla 70-230), empacándose con hexano (Hx). La cromatografía en columna se desarrollará con Hx y se aumentará la polaridad de forma gradual con (acetato de etilo) AE, para finalmente obtenerse fracciones de diferentes polaridades. Los eluyentes a emplear serán hexano (C6H14), acetato de etilo (AE), cloroformo (CHCl3) y metanol

(CH3OH). Cada una de las fracciones obtenidas, fueron evaluadas en el laberinto de brazos elevados y actividad locomotriz.

7.3 Citología vaginal Durante 18 días, antes de iniciar las pruebas conductuales y la administración del extracto o las fracciones, diariamente se realizaron frotis vaginales de las ratas, y sólo las hembras con tres ciclos regulares continuos (4-5 días) se incluyeron en el estudio. Las muestras vaginales se recolectaron insertando la punta de la pipeta pasteur (aproximadamente 2 mm) en la vagina (cuidadosamente para no dañar los labios y en canal vaginal), el lavado se realizó con solución salina fisiológica (0.9%), y se colocó en un portaobjetos para ser observado al microscopio. La etapa del ciclo estral se determinó inmediatamente por microscopía óptica (aumento de 40x). Los frotis se clasificaron mediante la estimación de las proporciones relativas de los leucocitos, células epiteliales nucleadas y células epiteliales cornificadas (Cora y col., 2015).

7.4 Diseño de grupos experimentales FASE EXPERIMENTAL 1: Curva dosis-respuesta de la administración aguda del extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera (Schltdl.), en ratas hembra sometidas a la prueba de laberinto de brazos elevados y actividad locomotriz. Se realizó un estudio transversal con cinco grupos experimentales: un grupo vehículo (agua purificada, 1.8 ml/kg, v.o.), tres grupos recibieron diferentes dosis del extracto metanólico de Justicia spicigera Schltdl., (3, 6 y 12 mg/kg/1.8 ml, v.o.) y el quinto grupo recibió diazepam, como fármaco de referencia (2 mg/kg, i.p.). Una hora después de la administración de los tratamientos, se sometió a las ratas

- 36 -

hembras en las fases P-E a las pruebas de laberinto de brazos elevados y actividad locomotriz.

Figura 10. Diseño experimental 1ra. Fase

FASE EXPERIMENTAL 2: Determinar la actividad ansiolítica de las fracciones obtenidas del extracto de las hojas de Justicia spicigera Schltdl., en ratas hembra sometidas a la prueba de laberinto de brazos elevados y actividad locomotriz.

Se probaron las fracciones del extracto obtenidas; acetato de etilo (FXAE), cloroformo (FXC) y metanol (FXM) en los grupos de animales correspondientes, se realizó una administración aguda de la fracción en ratas hembra en las fases de P-E y posteriormente se evaluará la actividad ansiolítica en el laberinto de brazos elevados y actividad locomotriz.

- 37 -

Figura 11. Diseño experimental 2da. Fase experimental

7.5 Pruebas conductuales. El laberinto de brazos elevado es un aparato que consiste en una cruz de dos brazos abiertos y dos brazos cerrados, pintados de blanco y negro, respectivamente (figura 12). Los brazos abiertos serán de 50  10 cm (longitud  ancho), y los brazos cerrados 50  10 x 40 cm (longitud  ancho x altura). El laberinto será elevado a 50 cm del suelo. Las ratas fueron colocadas en el centro del laberinto, mirando hacia un brazo abierto. La prueba tuvo una duración de 5 min y se evaluaron las siguientes variables: a) tiempo de permanencia en los brazos abiertos (s), b) número de entradas a los brazos abiertos (n), c) la conducta de intento de exploración (attempt) que de acuerdo con Griebel y col., (1996): se define como el intento de entrada en los brazos abiertos, seguido por

- 38 - respuestas de evitación, es decir, incluye el estiramiento del cuerpo hacia adelante en posición horizontal al piso y la inmediata retracción a su posición original y d) la evaluación de riesgo (head-dipping), conducta identificada cuando la rata asoma la cabeza hacia el suelo desde el filo de un brazo abierto, esta respuesta puede ocurrir mientras el cuerpo del animal se encuentra en los brazos cerrados, en la plaza central, o los brazos abiertos (Walf y Frye, 2007); y e) índice de ansiedad el cual se calcula de la siguiente manera: Índice de ansiedad = 1- [([Tiempo de permanencia en brazos abiertos/ duración de la prueba] + [ Entradas a los brazos abiertos/ entradas totales])/2] (Cohen y col., 2013).

Figura 12. Laberinto de brazos elevados

Para las conductas de intento de exploración y evaluación de riesgo se evaluará la latencia al despliegue de la conducta (s), frecuencia (n) y tiempo empleado en dicha conducta (s). Las ratas que cayeron al suelo fueron descartadas del posterior análisis de datos.

- 39 -

7.5.1 Prueba de actividad locomotriz. La prueba consistió en colocar individualmente a la rata durante 5 minutos en una caja de acrílico opaca (44 x 33 x 20 cm), cuya base está dividida en 12 cuadros de 11 x 11 cm (figura 13). Los registros fueron videograbados para su revisión posterior. En esta prueba se evaluará: (I) el número de cuadrados cruzados por la rata (es decir, cuando un animal pasa de un cuadro a otro con sus patas traseras), (II) la conducta vertical (es decir, cuando la rata adquiera una postura vertical con respecto al piso de la jaula), (III) el acicalamiento (es decir, cuando la rata lama sus patas ,así como el aseo de la nariz / la cara (golpes a lo largo del hocico), lavado de cabeza (movimientos semicirculares sobre la parte superior de la cabeza y detrás de las orejas), el aseo del cuerpo (lamer la piel del cuerpo y rascarse el cuerpo con las patas traseras), lamer la pierna, y el aseo de la cola y genitales (lamer del área genital y la cola) (Kalueff y Tuohimaa, 2004, 2005). Para la conducta vertical y el acicalamiento se evaluará su latencia, frecuencia y tiempo.

Figura 13. Actividad locomotriz

- 40 -

Esta prueba se utiliza para descartar que los datos obtenidos en la prueba de laberinto de brazos elevados estén influenciados por alteraciones motoras generalizadas (por ej. hiperactividad o hipoactividad motriz), producidas por la manipulación o los tratamientos administrados. Cabe señalar que la prueba de actividad locomotriz será aplicada posteriormente a la prueba de laberinto en brazos elevados.

Después de cada sesión de pruebas la caja de actividad locomotriz se limpia cuidadosamente con una solución de etanol al 10% para eliminar los olores de los animales evaluados previamente.

7.6 El análisis estadístico Todos los datos fueron analizados mediante el ANOVA de una vía para evaluar si existe una diferencia significativa entre los grupos de ratas. Cuando p<0.05 se empleará la prueba post hoc de Dunnett. Los resultados fueron expresados como la media ± el error estándar.

- 41 -

8. RESULTADOS

8.1. FASE EXPERIMENTAL 1: Curva dosis-respuesta de la administración aguda del extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera (Schltdl.), en ratas hembra sometidas a la prueba de laberinto de brazos elevados y actividad locomotriz.

8.2. LABERINTO DE BRAZOS ELEVADOS 8.2.1. Tiempo de permanencia en brazos abiertos. El tratamiento de 12 mg/kg EMHM y DZP 2 mg/kg incrementan de manera estadísticamente significativa el tiempo de permanencia en los brazos abiertos (BA) [F(4,25) =3.278, p=0.027], en comparación con el VEH. (Gráfica 1).

Gráfica 1: Dosis 12mg/kg del EMHM y DZP 2mg/kg incrementan la permanencia del tiempo en los brazos abiertos de manera significativa [F(4,25)= 3.278, p=0.027]. * vs VEH.

8.2.2 Porcentaje de entradas a brazos abiertos En cuanto al porcentaje de entradas a los BA, no se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(4,25) = 1.003, p=0.425, NS], entre ninguno de los tratamientos, es decir, el porcentaje de entradas a los BA fue similar en los cinco tratamientos. Gráfica 2.

- 42 -

Gráfica 2. No se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)=1.003, p=0.425, NS], en el porcentaje de entradas al BA en la prueba de laberinto de brazos elevados.

8.2.3 Entradas totales a ambos brazos En cuanto al número total de entradas a ambos brazos, no se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)=1.382, p=0.269, NS], entre ninguno de los tratamientos. Gráfica 3.

Gráfica 3. No se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)=1.382, p=0.269, NS], en el número total de entradas a ambos brazos en la prueba de laberinto de brazos elevados.

- 43 -

8.2.4 Índice de ansiedad El análisis estadístico del índice de ansiedad, mostró una disminución significativa en el grupo DZP 2 mg/kg [F(4,25)= 3.313, p=0.032] , respecto al VEH, sin diferencias en los tratamientos del EMHM. Gráfica 4.

Gráfica 4. DZP 2mg/kg disminuyó significativamente [F(4,25)=3.133, p=0.032] su índice de ansiedad, respecto al VEH. * vs VEH.

8.2.5 Intento de exploración Otra variable analizada fue el intento de exploración, en su latencia (s), frecuencia (n) y tiempo total empleado (s). En cuanto a la primera variable analizada, la latencia del intento de exploración, no mostró diferencias significativas [F(4,25)=2.026, p=0.121, NS], con ninguno de los tratamientos evaluados respecto al VEH (gráfica 5).

- 44 -

Gráfica 5. No se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)=2.026,p=0.121, NS] en la latencia de la conducta de intento de exploración en la prueba de laberinto de brazos elevados, entre los diferentes grupos experimentales.

8.2.6 Frecuencia del intento de exploración Por otra parte en la frecuencia del intento de exploración, se pudo ver un aumento significativo [F(4,25)=4.938, p=0.005], en el tratamiento 3 mg/kg EMHM respecto al VEH. (gráfica 6).

Gráfica 6. La frecuencia en la conducta de intento de exploración, aumentó de manera significativa [F(4,25)=4.938,p=0.005] con dosis 3mg/kg respecto al VEH. *vs VEH.

- 45 -

8.2.7 Tiempo total del intento de exploración Por último, se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)=4.669, p=0.006], en el tiempo total empleado en el tratamiento DZP, disminuyendo el tiempo empleado en el intento de exploración con respecto al VEH, sin mostrar diferencias los demás tratamientos (gráfica 7).

Gráfica 7. Se observó una disminución significativa [F(4,25)=4.669, p=0.006] en el tiempo total empleado en la conducta del intento de exploración en DZP 2 mg/kg. *vs VEH.

8.2.8 Evaluación de riesgo En análisis de la conducta de evaluación de riesgo, en la latencia al despliegue de la conducta no se muestran diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)= 1.324, p=0.288, NS], en ninguno de los tratamientos respecto al VEH (gráfica 8).

- 46 -

Gráfica 8. No se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)=1.324, p=0.288, NS] en la latencia a la conducta de evaluación de riesgo en la prueba de laberinto de brazos elevados

8.2.9 Frecuencia de la evaluación de riesgo Hubo un aumento significativo [F(4,25)= 5.393, p=0.003], en la frecuencia de la conducta en los tratamientos 3 mg/kg, 12 mg/kg y DZP respecto al VEH (gráfica 9).

Gráfica 9. Dosis de 3mg/kg, 12mg/kg del EMHM y DZP 2mg/kg incrementan la frecuencia de la conducta de evaluación de riesgo en la prueba de laberinto de brazos elevados. Observando diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)=5.393 p=0.003] respecto al VEH. * vs VEH.

- 47 -

8.2.10 Tiempo total de la evaluación de riesgo El tiempo total empleado en la conducta (s) en los tratamientos de 3 mg/kg y 12 mg/kg EMHM se observó un aumento [F(4,25)= 4.821, p=0.005], con respecto al VEH (gráfica 10).

Gráfica 10. Las dosis de 3mg/kg y 12mg/kg del EMHM incrementan de manera significativa [F(4,25)=4.821, p=0.005] el tiempo total en la conducta de evaluación de riesgo. * vs VEH.

8.3 PRUEBA DE ACTIVIDAD LOCOMOTRIZ 8.3.1 Número de cuadros cruzados El análisis de los cuadros cruzados en la actividad locomotriz, no mostró diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)= 2.755, p=0.050, NS], en ninguno de los tratamientos en comparación con el VEH (gráfica 11).

- 48 -

Gráfica 11. No se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)=2.755, p=0.050, NS] entre el número de cuadros cruzados en la prueba de locomoción.

8.3.2 Latencia a la conducta vertical Otra de las variables evaluadas en la prueba de actividad locomotriz fue la conducta vertical. El análisis estadístico no mostró diferencias estadísticas [F(4,25)= 1,819, p=0.157, NS] en la latencia a realizar la conducta vertical (Gráfica 12), por ninguno de los tratamientos en comparación con el VEH.

Gráfica 12. En la latencia a la conducta vertical, no se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)=1.819, p=0.157, NS] entre los grupos experimentales.

- 49 -

8.3.3 Frecuencia de la conducta vertical Por otro lado, se pudo observar un aumento significativo [F(4,25)= 3.758, p=0.016], de la frecuencia a la conducta vertical con el tratamiento de 12 mg/kg del EMHM con respecto al VEH (gráfica 13).

Gráfica 13. La frecuencia de la conducta vertical aumentó significativamente [F(4,25)=3.758, p=0.016] en el grupo dosis 12mg/kg del EMHM con respecto al VEH. * vs VEH

8.3.4 Tiempo total de la conducta vertical En cuanto al tiempo total empleado en la conducta vertical, se puede observar un aumento [F(4,25)= 4,783, p=0.005] con el tratamiento de 6 mg/kg del EMHM en comparación al VEH (gráfica 14).

Gráfica 14. Dosis 6mg/kg del EMHM mostró un aumento [F(4,25)=4.783, p=0.005] en el tiempo total de la conducta vertical respecto al VEH. * vs VEH

- 50 -

8.3.5. Latencia al acicalamiento Por último, se evaluó la conducta de acicalamiento. En cuanto a la latencia a realizar el acicalamiento, hubo una disminución [F(4,25)= 5.719, p=0.002], en los tratamientos 3,6,12 mg/kg y DZP 2 mg/kg respecto al VEH (gráfica 15).

Gráfica 15: Dosis 12mg/kg, 6mg/kg, 3mg/kg del EMHM y DZP 2mg/kg disminuyeron significativamente [F(4,25)= 5.719, p=0.002] la latencia en el acicalamiento con respecto al VEH. * vs VEH.

8.3.6. Frecuencia y tiempo de Acicalamiento Mientras que el análisis estadístico no mostró diferencias significativas en los dos últimos parámetros evaluados, frecuencia del acicalamiento(n) [F(4,25)= 1.297, p=0.298, NS] (Gráfica 16) y tiempo total empleado en el acicalamiento (s), [F(4,25)= 0.996, p=0.428, NS] (Gráfica 17).

- 51 -

Gráfica 16. No se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(4,25)=1.297, p=0.298, NS] en la frecuencia en que se hizo la conducta de acicalamiento.

Gráfica 17. La estadística no reflejó diferencias significativas [F(4,25)=0.996, p=0.428, NS] en el tiempo total empleado al acicalamiento en los diferentes grupos experimentales.

- 52 -

9. FASE EXPERIMENTAL 2: Fraccionamiento y determinación de la actividad ansiolítica de las fracciones obtenidas del extracto de las hojas de Justicia spicigera Schltdl., en ratas hembra sometidas a la prueba de laberinto de brazos elevados y actividad locomotriz.

9.1 PRUEBAS DE SOLUBILIDAD DE LAS FRACCIONES DEL EXTRACTO METANÓLICO DE LAS HOJAS DE JUSTICIA SPICIGERA

Tabla 6. Pruebas de solubilidad a las diferentes fracciones del extracto metanólico VEHÍCULO FXM FXAE FXC Solución salina ++++ ++++ ---- Cosolvente a ------++++ 50% Salina 40% propilenglicol 10% tween 80 DMSO (0.1%) ------Cosolvente b ------++++ 1% tween 80 99% salina Cosolvente c ------96% propilenglicol 4% etanol

Insoluble: -----, Soluble: ++++

- 53 -

9.2 ANÁLISIS FITOQUÍMICO PRELIMINAR DEL EXTRACTO METANOLICO Y DE LAS FRACCIONES DE LAS HOJAS DE JUSTICIA SPICIGERA. Con la finalidad de determinar los componentes químicos presentes en el extracto metanólico, así como en las fracciones obtenidas del extracto metanólico de Justicia spicigera, se realizaron pruebas fitoquímicas preliminares para su identificación, Dragendroff y Wagner para alcaloides, Liebermann–Burchard y Salkowski para esteroles y terpenos y finalmente Shinoda para Flavonoides, obteniendo los siguientes resultados: En cuanto al análisis fitoquímico del extracto metanólico, se observó la presencia de terpenos, flavonoides y esteroles (tabla 7), mientras que, en las fracciones del extracto se observó la presencia escaza de terpenos y flavonoides en la fracción de hexano, las fracciones de cloroformo y acetato de etilo mostraron similitudes en la presencia abundante de terpenos y esteroles, mientras que una presencia escaza de flavonoides y finalmente en la fracción de metanol se observó una presencia abundante de alcaloides y relativamente abundante de terpenos y esteroles (tabla 8).

Tabla 7. Análisis fitoquímico preliminar del extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera

Tabla 8. Análisis fitoquímico preliminar de las fracciones del extracto metanólico METABOLITOS TERPENOS FLAVONOIDES ESTEROLES ALCALOIDES

FRACCIÓN HEXANO + + ------CLOROFORMO ++++ + ++++ ----- ACETATO DE ++++ + ++++ ----- ETILO METANOL ++ ----- ++ +++ Presencia escaza +, Presencia relativamente abundante ++, Presencia abundante: ++++, Ausencia: -----,

- 54 -

9.3. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA DE LAS FRACCIONES DEL EXTRACTO METANÓLICO DE LAS HOJAS DE JUSTICIA SPICIGERA. Con la finalidad de determinar si las fracciones del extracto metanólico conservan la actividad, se procedió a realizar el fraccionamiento del extracto mediante cromatografía en columna, con lo que se obtuvieron 4 fracciones, que corresponden a la fracción de hexano, cloroformo, acetato de etilo y metanol. El monitorio de metabolitos presentes en las fracciones mediante cromatografía en capa delgada observados con luz UV de longitud de onda larga (365 nm) y corta (254 nm), fueron revelados con cloruro de cobalto (CoCl2) al 2% en ácido sulfúrico (H2SO4) al 10% en agua y se observó que, la fracción de hexano presenta una tenue concentración de terpenos y flavonoides, mientras que las fracciones de cloroformo y acetato de etilo tienen mucha similitud con respecto a la presencia de metabolitos según lo observado en luz uv y con CoCl2, identificando la presencia de terpenos y esteroles con gran intensidad, mientras que la presencia de flavonoides fue escasa. Por otra parte, con los agentes reveladores en la fracción de metanol se pudo observar la presencia de terpenos y esteroles, debido a la polaridad que presenta esta fracción y la fase móvil empleada en la cromatografía en capa fina (cloroformo:metanol 8:2; v:v), podemos inferir que los terpenos y esteroles observados en esta fracción corresponden a compuestos glicosilados; además en dicha fracción se observó la presencia de alcaloides.

- 55 -

Figura 14. Placas de cromatografía de las diferentes fracciones del extracto metanólico de Justicia spicigera: A) Fracción Hexano; B) Fracción Cloroformo; C) Fracción acetato de etilo; D)

Fracción metanólico. Placas 1) Fase móvil Acetato de etilo; revelado con CoCl2 al 2% en H2SO4 al 10%, se observa la presencia de esteroles (Rf=0.44, correspondiente al β-sitosterol, Rf=0.37) en fracciones B,C. 2) Fase móvil cloroformo/metanol 8:2 (v/v), se observa la presencia de flavonoides (Rf=0.55, posiblemente rutina). 3) Fase móvil cloroformo/metanol 8:2 (v/v) con luz UV 254 nm, presencia de metabolitos polares no identificados (Rf=0.04), 4) Fase móvil cloroformo/metanol 8:2 revelada con CoCl2 al 2% en H2SO4 al 10% (Revelando presencia de esteroles glicosilados Rf= 0.66)

- 56 -

9.4. LABERINTO DE BRAZOS ELEVADOS 9.4.1. Tiempo de permanencia en brazos abiertos. La variable correspondiente al tiempo de permanencia en los BA, aumentó significativamente F(7,48)=25.93, p=0.001] en DZP respecto al VEH, sin observar modificaciones significativas en los demás tratamientos respecto al VEH. (Gráfica 18).

Gráfica 18: El tiempo de permanencia en los BA aumentó significativamente [F(7,48)= 8.134, p= 0.001] en DZP. * vs VEH. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

9.4.2 Porcentaje de entradas a brazos abiertos En cuanto al porcentaje de entradas a los BA, no se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(7,48)= 3.474, p= 0.154, NS]. (Gráfica 19).

- 57 -

Gráfica 19: No se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(7,48)= 3.47, p= 0.154, NS] en el porcentaje de entradas al BA, en la prueba de laberinto de brazos elevados. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

9.4.3 Entradas totales a ambos brazos En cuanto al número total de entradas a ambos brazos, se observó una disminución estadísticamente significativas [F(7,48)= 4.054, p=0.001], en el grupo Cosa respecto a DZP. (Gráfica 20).

- 58 -

Gráfica 20. Gráfica 20. El grupo experimental Cosa, presentó diferencias estadísticamente significativas [F(7,48)= 4.054, p=0.001], al disminuir el número total de entradas a ambos brazos en la prueba de laberinto de brazos elevados. * vs DZP VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

9.4.4 Índice de ansiedad El análisis estadístico del índice de ansiedad, mostró una disminución significativa

[F(7,48)=6.362, p=0.001] en DZP respecto al VEH. (Gráfica 21).

- 59 -

Gráfica 21. Los grupos Cosa, Cosb, FXAE, FXCa, FXCb presentaron un aumento significativo [F(7,48)=6.362, p=0.001] en el índice de ansiedad respecto al VEH .* vs VEH; ** vs DZP. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

9.4.5 Intento de exploración Otra variable analizada fue el intento de exploración, en su latencia (s), frecuencia (n) y tiempo total empleado (s). La primer variable a considerar fue la latencia del intento de exploración y no mostró diferencias significativas [F(7,48)= 1.269, p= 0.285, NS], (gráfica 22), de igual manera, en cuanto a la frecuencia (n) no hubo diferencias estadísticas [F(7,48)= 1.828, p= 0.103, NS], (gráfica 23), así como en el tiempo total empleado en la conducta (s) [F(7,48)= 2.376, p=0.80, NS] (gráfica 24) con ninguno de los tratamientos evaluados respecto al VEH.

- 60 -

Gráfica 22. No se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(7,48)= 1.269, p= 0.285, NS], en la latencia al intento de exploración. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

Gráfica 23. La frecuencia al intento de exploración no mostró diferencias estadísticamente significativas [F(7,48)= 1.828, p= 0.103, NS], en ninguno de los grupos experimentales. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

- 61 -

Gráfica 24. En el tiempo total empleado en la conducta del intento de exploración, no hubo una diferencia estadísticamente significativa [F(7,48)= 2.376, p=0.80, NS]. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

9.4.6 Evaluación de riesgo En análisis de la conducta de evaluación de riesgo, se analizaron las variables latencia de la conducta (s), frecuencia (n) y tiempo total empleado en la conducta. El análisis estadístico no mostró diferencias estadísticas significativas en la latencia al despliegue de la conducta (s) [F(7,48)= 1.189, p= 0.327, NS] (gráfica 25), así como en la frecuencia (n) en la que se realizó la conducta no se encontraron diferencias significativas [F(7,48)= 1.613, p= 0.155, NS] (gráfica 26) respecto al VEH.

- 62 -

Gráfica 25. No se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(7,48)= 1.189, p= 0.327, NS] en la latencia de la conducta de evaluación de riesgo en la prueba de laberinto de brazos elevados. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

Gráfica 26. No se observaron diferencias estadísticamente significativas [F(7,48)= 1.613, p= 0.155, NS] en la frecuencia de la conducta de evaluación de riesgo en la prueba de laberinto de laberinto de brazos elevados. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

- 63 -

9.4.7 Tiempo total de evaluación de riesgo

El tiempo total empleado en la conducta (s) en DZP se observó un aumento significativo de dicha variable [F(7,48)= 3.797, p= 0.002] con respecto al VEH (gráfica 27).

Gráfica 27. Gráfica 27. El tiempo total empleado en la evaluación de riesgo, aumentó de manera significativa [F(7,48)= 3.797, p= 0.002] en DZP respecto al VEH y FXM. * vs VEH; VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

- 64 -

9.5 PRUEBA DE ACTIVIDAD LOCOMOTRIZ 9.5.1 Número de cuadros cruzados El análisis de los cuadros cruzados en la actividad locomotriz, no mostró diferencias estadísticamente significativas [F(7,48)= 1.097, p= 0.380, NS] en ninguno de los tratamientos en comparación con el VEH (gráfica 28).

Gráfica 28. No se observaron diferencias estadísticamente [F(7,48)= 1.097, p= 0.380, NS] entre el número de cuadros cruzados en la prueba de locomoción. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

9.5.2 Frecuencia de la conducta vertical Por otro lado, se observaron cambios estadísticamente significativos [F(7,48)=0.467, p=0.854], en la frecuencia a la conducta vertical con el tratamiento con respecto al VEH (gráfica 29).

- 65 -

35

30

25

20

15

10

Conducta Conducta (n) vertical 5

0 VEH FXM FXAE Cosa FXCa Cosb FXCb DZP

Tratamientos Gráfica 29. No se observaron diferencias significativas [F(7,48)=0.467, p=0.854] en la frecuencia de la conducta vertical. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

9.5.3 Tiempo total de la conducta vertical Otra variable analizada fue el tiempo total empleado en la conducta vertical, en el que pudimos observar un aumento significativo [F(7,48)= 3.507, p= 0.004], en la FXM respecto al VEH (gráfica 30).

- 66 -

100 90 * 80 70 60 50 40 30

Conducta (s) Conducta vertical 20 10 0 VEH FXM FXAE Cosa FXCa Cosb FXCb DZP

Tratamientos Gráfica 30. La FXM presentó un aumento significativo [F(7,48)= 3.507, p= 0.004] en el tiempo total en la conducta vertical respecto al VEH. * vs VEH. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

9.5.4 Frecuencia del acicalamiento

En cuanto a la frecuencia del acicalamiento, la FXCb presentó un aumento significativo [F(7,48)= 3.248, p= 0.007] respecto a DZP. (Gráfica 31)

- 67 -

12 * 10

8

6

4 Acicalamiento (n) Acicalamiento 2

0 VEH FXM FXAE Cosa FXCa Cosb FXCb DZP

Tratamientos

Gráfica 31. La FXCb presentó un aumento significativo [F(7,48)= 3.248, p= 0.007] en la frecuencia en el acicalamiento respecto a DZP. * vs DZP. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

9.5.5 Tiempo total del acicalamiento Por último, el tiempo total empleado en el acicalamiento, las FXM y FXAE presentaron un aumento significativo [F(7,48)= 3.003, p= 0.011] respecto a DZP. (Gráfica 32).

- 68 -

100 * 90 * 80 70 60 50 40 30 Acicalamiento Acicalamiento (s) 20 10 0 VEH FXM FXAE Cosa FXCa Cosb FXCb DZP

Tratamientos Gráfica 32. Las FXM y FXAE presentaron un aumento significativo [F(7,48)= 3.003, p= 0.011] en el tiempo total en el acicalamiento respecto a DZP. * vs DZP. VEH=vehículo; Cosa=cosolvente a; Cosb=cosolvente b; FXM= fracción metanólica; FXAE= Fracción acetato de etilo; FXCa =Fracción cloroformo a; FXCb =Fracción cloroformo b; DZP=diazepam

- 69 -

X. DISCUSIÓN

En el presente estudio, la primera fase experimental correspondiente a la curva dosis-respuesta se encontró que la dosis de 12 mg/kg del EMHM produjo un efecto ansiolítico en la prueba de laberinto de brazos elevados aumentando el tiempo de permanencia en los brazos abiertos, así como la frecuencia y tiempo de evaluación de riesgo, de manera semejante al control positivo DZP. Ninguno de los tratamientos modificó de manera significativa la actividad locomotriz. Además, se detectó que todas las dosis del extracto, así como DZP redujeron la latencia al acicalamiento. En estudios previos del grupo de trabajo, se confirmó el efecto ansiolítico atribuido por la medicina tradicional a Justicia spicigera, evaluado en el modelo de laberinto de brazos elevados en ratas durante las fases de P-E y M-D del ciclo estral de la rata, encontrando que la dosis de 12 mg/kg del extracto acuoso de las hojas de muicle produce un incremento en el tiempo de permanencia y en el porcentaje de entradas en los brazos abiertos, así como una reducción del índice de ansiedad de manera semejante al DZP, en ambas fases, pero con mayor eficacia en las fases de P-E. Esto asociado a la interacción entre hormonas ováricas y los metabolitos contenidos en Justicia spicigera (García-Ríos y col., 2018). Tomando como base la dosis mínima efectiva de 12 mg/kg, (García-Ríos y col., 2018), en el presente trabajo, se utilizaron dos dosis aritméticas menores de la mínima efectiva, empleando 3, 6 y 12 mg/kg del EMHM para evaluar si dichas dosis presentaban efectos ansiolíticos, encontrando que el EMHM en dosis de 12 mg/kg conserva el mismo efecto ansiolítico que el extracto acuoso de las hojas de muicle en ratas en las fases P-E, incrementando el tiempo de permanencia en brazos abiertos. Lo que sugiere que, los metabolitos con acción ansiolítica son de naturaleza polar, debido a que se comparte el efecto en el extracto acuoso y metanólico (Marcano y Hasegawa, 2002), hallazgo que facilitará la búsqueda de los metabolitos responsables del efecto en la segunda fase experimental del presente estudio. Al respecto Razavi y col., (2017) evaluaron el efecto ansiolítico de los extractos acuoso y etanólico de Lippia citriodora, dicha investigación demostró, que ambos extractos en una dosis de 200

- 70 - mg/kg en un modelo de ratón incrementan el tiempo de permanencia en los brazos abiertos de manera semejante al DZP (Razavi y col., 2017).

Un factor importante a considerar en nuestro modelo experimental, es la presencia de altas concentraciones de hormonas ováricas. Se ha reportado que los esteroides neuroactivos, (hormonas como progesterona y estradiol que se producen en un sitio diferente del SNC, pero ejercen sus efectos sobre él), tienen un sitio de interacción específico en el receptor GABAA modulando la neurotransmisión GABAérgica (Paul y Purdy. 1992; Baulieu y col., 1996; Dubrovsky B., 2005), esto podría inferir que bajo las condiciones experimentales del presente trabajo los componentes del EMHM en dosis de 12 mg/kg en sinergismo con los esteroides neuroactivos, en concentraciones altas en las fases P-E mejoran el efecto de tipo ansiolítico encontrado.

Para la exploración de la actividad ansiolítica de distintas sustancias, en roedores se utiliza la prueba de laberinto de brazos elevados, en la validación de dicho modelo se ha tomado como base la biología de los roedores, ya que de manera natural los espacios abiertos y elevados les resultan hostiles, de tal manera que la ansiedad se ve reflejada en una reducción en el tiempo de permanencia en los brazos abiertos y por lo tanto una sustancia ansiolítica como es el caso del fármaco, DZP, aumentaría el tiempo de permanencia en dichos brazos (Pellow y col., 1985; Walf y Frye, 2007). En este sentido, la dosis de 12 mg/kg del EMHM presenta un efecto de tipo ansiolítico, ya que el tiempo de permanencia en los brazos abiertos aumenta en dicho grupo experimental, de manera similar al DZP. Por otra parte, el índice de ansiedad, bajo las condiciones experimentales del presente trabajo disminuyó con DZP respecto al VEH, evento esperado debido a que el DZP es un fármaco ansiolítico (Pellow y col., 1985; Walf y Frye, 2007), mientras que las dosis del EMHM solamente muestran una tendencia a disminuirlo, esto podría deberse a la variedad en los rangos en las entradas totales en los diferentes tratamientos.

- 71 -

Otras conductas evaluadas en el laberinto de brazos elevados fueron el intento de exploración, la cual consiste en que el animal intenta entrar a los brazos abiertos, acompañada de respuestas de evitación, conducta moduladas principalmente por el sistema serotonérgico (Griebel y col., 1996), de este modo, se observó un incremento en la frecuencia en esta conducta con el tratamiento de 3 mg/kg EMHM, lo que podría significar que se necesita proporciones bajas de metabolitos contenidos en el extracto para estimular este sistema probablemente por activación de los receptores 5HT-1A. Favoreciendo el establecimiento del sinergismo con las altas concentraciones de hormonas ováricas y de este modo establecer el efecto. Por otro lado, DZP redujo el tiempo empleado en el intento de exploración, pero no la frecuencia en la que se realizó esta conducta; probablemente, el mecanismo de acción del extracto en la modulación del intento de exploración podría ser serotónergico y las proporciones de los metabolitos presentes en 3 mg/kg son suficientes para estimularlos, dado que dicho efecto no se observa con la dosis de 6 y 12 mg/kg probablemente por alguna saturación de los receptores. Mientras que en la evaluación de riesgo, mecanismo sensible a sistema serotonérgico, se pudo observar que la dosis de 3 mg/kg aumenta la frecuencia y el tiempo empleado a realizar dicha conducta, lo que puede sugerir que en dosis de 3 y 12 mg/kg el EMHM puede actuar se manera semejante a un agonista parcial de receptores 5HT-1A , como la buspirona, la cual se ha reportado que en dosis bajas (0.1 y 0.3 mg/kg) aumentan la frecuencia y el tiempo de la evaluación de riesgo (Rodgers y col.,1999). También se observó que DZP aumenta la frecuencia de la evaluación de riesgo respecto al VEH. En este sentido, existen reportes en donde se observa que BDZ tienden a aumentar la evaluación de riesgo y disminuir el intento de exploración (Griebel y col., 1997), como se observó en el presente estudio. Con base en lo encontrado en la prueba de laberinto de brazos elevados se puede sugerir que el extracto metanólico a parte de producir el incremento de permanencia en brazos abiertos, también logra incrementar la frecuencia y el tiempo de la evaluación de riesgo, variables que no se modificaron con lo reportado del extracto acuoso (García-Ríos y col.,2018). Al respecto, probablemente los cambios químicos

- 72 - producidos por el extracto metanólico favorecen el afrontamiento emocional del animal en la evaluación de riesgo (Griebel y col., 1997). De manera adicional se pudo identificar que la dosis 3 mg/kg del extracto fue suficiente para aumentar frecuencia del intento de exploración, así como la frecuencia y tiempo de la evaluación de riesgo. Lo que sugiere que los metabolitos presentes en la dosis de 3 mg/kg son suficientes para estimular los receptores 5HT1A. Con respecto a la prueba de actividad locomotriz se descartó que algún componente motriz fuese el responsable del efecto ansiolítico observado en la prueba de laberinto de brazos elevados, ya que no se observaron diferencias estadísticas en el número de cuadros cruzados en ninguno de los tratamientos evaluados (Griebel y col., 1996). Otra de las conductas evaluadas en la prueba de actividad locomotriz fue la conducta vertical, que es una conducta de exploración, y se pudo observar un aumento en la frecuencia a realizarla con el tratamiento de 12 mg/kg del EMHM respecto al VEH, del mismo modo hubo un aumento en el tiempo total en el tratamiento de 6 mg/kg del EMHM, mostrando también una tendencia a incrementar de la dosis de 12mg/kg, esto semejando a lo reportado que fármacos ansiolíticos como el DZP aumentan el tiempo y frecuencia de la conducta vertical (Griebel y col., 1996).

Adicionalmente, se evaluó la conducta de acicalamiento, reportada como una respuesta innata de higiene y motivación con una secuencia cefalocaudal, que se encuentra relacionada con mecanismos de control motor y modulada por el circuito límbico y el sistema GABAérgico (Kalueff y Tuohimaa, 2005; Kalueff y col., 2015), encontrando que la latencia al acicalamiento disminuyó en los tratamientos del EMHM, así como de DZP respecto al VEH; lo que podría sugerir que los animales se encuentran motivados para comenzar a realizar está conducta en un menor tiempo. Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en el número y tiempo empleado en el acicalamiento con ninguno de los tratamientos evaluados. De acuerdo con lo reportado por Song y col. (2016) estresores ligeros no causan una modificación en el acicalamiento, por lo tanto, bajo estas condiciones experimentales no se modifica la conducta de autoaseo o asociada a motivación.

- 73 -

Referente a los resultados encontrados en el experimento 2, correspondiente al fraccionamiento del extracto metanólico, las fracciones, metanólica (FXM), acetato de etilo (FXAE) y clorofórmica (FXCa y FXCb), no mostraron efecto ansiolítico en la prueba de laberinto de brazos elevados. Se sugiere que las concentraciones o tipos de metabolitos responsables del establecimiento del efecto ansiolítico observado en el extracto metanólico completo, requieren de estar juntas y en esas concentraciones para ejercer su efecto. Datos que concuerdan con lo lo reportado por otros autores con diferentes plantas con efecto ansiolítico, al fraccionar el extracto (Nogueira y col., 1998) o bien al realizar una curva dosis respuesta de las fracciones, dosis bajas no tienen efecto, sin embargo, dosis medias a altas sí presentan un efecto ansiolítico (Jiménez- Ferrer y col., 2017).

Con respecto al tiempo de permanencia en los brazos abiertos, las fracciones evaluadas correspondientes a FXM, FXAE, FXCa y FXCb no modificaron de manera significativa dicha variable y se observó una tendencia a reducirla en las FXAE, FXCa y FXCb, mientras que la FXM presentó una tendencia a aumentar esta variable, respecto al VEH. Se presentó también, una disminución significativa en uno de los cosolventes (Cosa) utilizado como VEH, en una de las fracciones clorofórmicas, sugiriendo un marcado efecto ansiogénico por parte de este, cabe mencionar que las proporciones usadas en el cosolvente fueron muy altas (Mora y Hernández, 2016) en comparación con las empleadas en otros estudios (Martínez y col., 2006; Sawantdesai y col., 2016), del mismo modo, se ha reportado que el propilenglicol (componente utilizado en mayores proporciones en el Cosa), presenta una disminución en el tiempo de permanencia en BA, así como una disminución en el total de entradas al BA respecto al VEH (Dong y col., 2017). Respecto del índice de ansiedad, dismunuyó en el tratamiento de DZP , mientras que la FXM presentó una tendencia a disminuirlo, aunque no significativa, y aunque con el extracto metanólico completo tampoco se encontraron diferencias significativas, sí se observaba una tendencia a reducirlo con las dosis de 3, 6 y 12 mg/kg. Lo que indica que la separación de los metabolitos, también influye en el efecto sobre esta variable.

- 74 -

Otra variable analizada fue el intento de exploración, se observó una tendencia de la FXM a incrementar la frecuencia y el tiempo empleado en dicha conducta en comparación con el VEH. En este sentido la dosis de 3 mg/kg del extracto metanólico incrementó significativamente dicha variable. Con base en el análisis fitoquímico preliminar realizado a las fracciones, se identificó la presencia de terpenos y esteroles, en las fracciones evaluadas, aunque dando una coloración más tenue que la observada con el extracto metanólico. De manera adicional, en la FXM se identificó la presencia de alcaloides. Sin embargo, podríamos descartar que las concentraciones presentes de alcaloides contenidas en la FXM, única fracción en la que fueron identificados, puedan ejercer algún efecto ansiolítico modificando considerablemente alguna de las variables, ya que hay reportes que demuestran que este grupo de metabolitos incrementan el tiempo de permanencia en brazos abiertos y la evaluación de riesgo, mismas variables que en el presente estudio no fueron modificadas de manera significativa (Ngo y col., 2009), aunque por otro lado, reportes in vitro señalan que los alcaloides presentes en Boophone disticha, presentan afinidad por el transportador de serotonina (Nielsen y col.,2004).

Respecto al efecto de la FXCa sobre el intento de exploración, cabe mencionar que si bien el cosolvente, tiende a disminuir la frecuencia y el tiempo empleado en el intento de exploración, los metabolitos contenidos en esta fracción como lo son los terpenos y esteroles, parecen prevenir dicho efecto, ya que se comporta de manera semejante al VEH, en comparación con el segundo cosolvente utilizado ( Cosb), se observa que esta fracción FXCb, aumenta de manera semejante al VEH el tiempo (s) y frecuencia (n) en la que se realiza el intento de exploración. Por lo que, siguen siendo los terpenos y esteroles los candidatos a ser los posibles responsables del efecto observado anteriormente con el extracto metanólico. En relación a la evaluación de riesgo, el extracto metanólico incrementa la frecuencia y en el tiempo empleado en la conducta con las dosis de 3 y 12 mg/kg. Dicho efecto se perdió al fraccionar el extracto, ya ninguna de las fracciones evaluadas (FXM,

FXAE, FXCa y FXCb) replicó el efecto, sino por el contrario a excepción de la FXAE, las fracciones restantes mostraron una tendencia a disminuir la frecuencia en la que

- 75 - se realizó la conducta, mientras que el tiempo total en el que se realizó la conducta fue disminuido significativamente por las FXAE, FXCa y los respectivos cosolventes, pudiendo observar una tendencia a aumentar este parámetro por la FXM. En el caso del Cosa, se observó una marcada reducción tanto de la frecuencia como el tiempo total empleado, pudiendo revertir un poco el efecto ansiogénico con la FXCa. En este caso nuevamente observamos que los terpenos y esteroles contenidos en esta fracción (detectados en una mayor coloración, que en el extracto metanólico), previenen el efecto que per se presenta el cosolvente, ya que al utilizar un segundo cosolvente (Cosb), se pudo observar una tendencia a aumentar la frecuencia y el tiempo total de la evaluación de riesgo. Respecto a la prueba de actividad locomotriz, en el análisis del número de cuadros cruzados, no se detectaron cambios significativos con ninguno de los tratamientos evaluados, incluyendo los cosolventes. Lo que parece confirmar un perfil ansiogénico

(Cosa)y no un efecto de hipoactividad o sedación; descartando que los efectos observados con las FXM, FXAE, FXCa y FXCb estén asociados a un componente motriz igual que el efecto ansiolítico del diazepam. Por otro lado, se observó, en la conducta vertical únicamente un aumento por parte de la FXM, efecto que se observó con anterioridad en la dosis de 12 mg/kg del EMHM, más no modificaciones en otras de las conductas, lo que sugiere que las concentraciones de los metabolitos presentes en cada fracción son en conjunto los responsables del efecto sumado que se observó en el EMHM completo.

En las pruebas fitoquímicas preliminares realizados a las fracciones obtenidas del extracto metanólico, se identificó de manera adicional a lo ya encontrado, es decir la presencia de terpenos, esteroles y flavonoides; sin embargo, se detecta la presencia de alcaloides en la fracción de metanólica. En este sentido, la cromatografía en columna permitió separar a los diversos metabolitos y dejar libres a los alcaloides permitiendo así su observación mediante pruebas fitoquímicas preliminares. Por ello, se considera a la cromatografía en columna, así como a la cromatografía de contracorriente de refinación de zona de pH como métodos para enriquecer

- 76 - metabolitos, pero en realidad son métodos que te permite separar metabolitos, que muchas veces por impedimentos estéricos no pueden reaccionar a los agentes reveladores como pasa con diferentes metabolitos. Por ejemplo, diversos alcaloides de la planta Uncaria macrophylla Wall (Zhang y col., 2013). Por otra parte, se ha reportado que la separación de metabolitos mediante técnicas como la cromatografía en columna con la idea de aislar el metabolito activo, no siempre resulta en un incremento en la potencia del efecto farmacológico (Mora y Hernández, 2016). En diversos trabajos se ha observado un decline en el efecto farmacológico de las fracciones con respecto al extracto original (De Lima y col., 1998). Lo que, sugiere que algunos extractos no pueden ser separados y deben ser estandarizados para poder ejercer el efecto como el caso del Ginseng G115 (Scaglione y col., 2005) o el Ginkgo biloba (EGb 761) (Clostre, F., 1999). En algunos casos pueden ser parcialmente purificados mediante cromatografía en columna, permitiendo excluir aquellos metabolitos que no tienen efecto y solo incluir aquellos que participan en él. En tales casos, se reporta como extractos semi-purificados, por ejemplo, PEA (Extracto purificado A) de las semillas de Paullinia cupana (guaraná), que produce un efecto ansiolítico en el modelo de laberinto de brazos elevados, efecto que puede ser modulado por mecanismos dopaminérgicos y serotoninérgicos (Roncon y col., 2011).

Finalmente, con los datos encontrados, se sugiere que el fraccionamiento del extracto metanólico elimina su efecto ansiolítico. Diversos estudios han demostrado la presencia en Justicia spicigera de metabolitos como narigenina, hesperidina, kaempferitrina y kaempferol, compuestos de tipo flavonoides (Euler y Alam., 1982; Esquivel-Gutiérrez y col., 2013), fitoestrógenos como el elenosido (Alonso y col., 1997) y los esteroles β-sitosterol, 3β-glucosil-O-sitosterol así como los alcaloides; alantoína, vasicina (Dominguez y col., 1990), de manera particular el flavonoide kaempferitrina, mostró efecto de tipo antidepresivo relacionado a un mecanismo serotonérgico (Cassani y col., 2014), mientras que Oviedo y col (2009) reportaron que la fracción alcaloidal de A. muricata aumentan la frecuencia y el tiempo de permanencia en BA, relacionado esto al sistema GABAérgico (Oviedo y col., 2009). Con las pruebas

- 77 - fitoquímicas preliminares se identifica la presencia de terpenos y esteroles en mayor proporción en las fracciones cloroformo y acetato de etilo, mientras que poseen muy pocas proporciones de flavonoides. En tanto que la fracción metanólica, reveló la presencia de alcaloides en alta proporción y no se identificaron flavonoides, pero si esteroles y terpenos en menor proporción que en las fracciones cloroformo y acetato de etilo. En la fracción hexánica se identificó una muy baja proporción de terpenos y flavonoides en comparación con las fracciones restantes. Lo anterior, viene a reafirmar la hipótesis que los probables metabolitos responsables del efecto ansiolítico son los terpenos y esteroles, los cuales requieren de estar en las proporciones que contenía el extracto metanólico para ejercer su efecto, por otra parte, surge la hipótesis de la participación de los alcaloides en el efecto ansiolítico, no ejerciendo el efecto de manera independiente, dado que la fracción metanólica en la que están presentes no produjo el efecto ansiolítico. Sin embargo, sí podrían participar en conjunto con los terpenos y esteroles en el efecto encontrado.

- 78 -

XI. CONCLUSIÓN

Los resultados obtenidos sugieren que el extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera ejerce efecto ansiolítico en la dosis de 12 mg/kg, semejante al DZP aumentando el tiempo de permanencia en los brazos abiertos. Además de incrementar la evaluación de riesgo, sin modificaciones en la actividad locomotriz. El efecto observado con la dosis de 3 y 12 mg/kg sobre el intento de exploración y la evaluación de riesgo, sugiere que los metabolitos responsables de dicho efecto pueden estar actuando por vía GABAérgica y/o serotonérgica en sinergismo con hormonas ováricas. El fraccionamiento del extracto metanólico produjo una pérdida del efecto ansiolítico, lo que pone en evidencia que los metabolitos responsables del efecto, deben mantenerse en las proporciones contenidas en el extracto metanólico. Siendo las proporciones de cada uno de estos (terpenos, esteroles, alcaloides y flavonoides), así como el sinergismo con altas concentraciones hormonales, los causantes del efecto observado en el EMHM.

- 79 -

XII. BIBLIOGRAFÍA

Aiyelaagbe O.O., Osamudiamen P.M. (2009). Phytochemical screening for active compounds in Mangifera indica Plant Sci. Res.(2): 11-13 Asher Gary N, Gerkin J. y Gaynes Bradley N. (2017). Complementary Therapies for Mental health disorders. https://doi.org/10.1016/j.mcna.2017.04.004. Arenas M. C., Puigcerver A. (2009). Diferencias entre hombres y mujeres en los trastornos de ansiedad: una aproximación psicobiológica. Escritos de Psicología, 3(1), 20-29. Balada Nicolau F., Márquez Vega C., Nadal Alemany R., Redolar Ripoll D., Silvestre Soto J. (2012). Tratamiento psicofarmacológico de los trastornos de ansiedad. En Farmacología y endocrinología del comportamiento. Ed. UOC, Barcelona España: 300-304. Baqueiro-Peña I. y Guerrero-Beltrán, J.Á. (2017). Physicochemical and antioxidant characterization of Justicia spicigera. Food Chem; 218: 305–12. Baulieu E.E. (1981). Steroid hormones in the brain: several mechanisms?. In Fuxe K, Gustafsson JA, Weterberg L, eds. Steroid hormone regulation of the brain. Oxford: Pergamon Press; 3-14. Baulieu E., Schumacher M., Koening H., Jung- Testas I., Akwa Y. (1996). Progesterone as a neurosteroid: actions within the nervous system. Cell Mol Neurobiol, 16(2):143-154. Ballenger J. (1998). Comorbidity of panic and depression: implications for clinical management. Intern. Clinic. Psychopharmacol 13(4): S13-S17 Baxter A.J., Scott K.M., Vos T., Whiteford H.A. (2013). Global prevalence of anxiety disorders: disorders: a systematic review and meta-regression. Psychol. Med. (43):897–910. Bernardi F., Lanzone A., Cento R.M. (2000). Allopregnanolone and dehydroepiandrosterone response to corticotropin-releasing factor in patients suffering from Alzheimer’s disease and vascular dementia. Eur J Endocrinol;142: 466–471.

- 80 -

Biblioteca digital de la medicina tradicional mexicana. (2009). Atlas de las Plantas de la Medicina Tradicional Mexicana // Muicle. México. Recuperado de http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=Muicle &id=7981 . Bitran D, Hilvers R.J, Kellogg C.K. (1991). Anxiolytic effects of 3 alpha-hydroxy-5 alpha[beta]- pregnan-20-one: endogenous metabolites of progesterone that are active at the GABAA receptor. Brain Res; (561): 157-61. Bitran D, Purdy R.H, Kellogg C.K. (1993). Anxiolytic effect of progesterone is associated with increases in cortical allopregnanolone and GABAA receptor function. Pharmacol Biochem Behav; 45: 423-8. Bitran D., Shiekh M, McLeod M. (1995) .Anxiolytic effect of progesterone is mediated by the neurosteroid allopregnanolone at brain GABAA receptors. J Neuroendocrinol (7):171–177. Bixo M., Andersson A., Windlad B., Purdy RH, Backstrom T. (1997). Progesterone, 5 alpha-pregnane-3,20- dione and 3apha-hydroxy-5 alpha-pregnane-20-one in specific regions of the human female brain in different endocrine states. Brain Res; 764:173-178. Blanchard D.C, Blanchard R.J. (1988). Ethoexperimental approaches to the biology of emotion. Ann Rev of Psychol, 39(1):43-68. Bormann J. (2000). The ABC of GABA receptors. Trends Pharmacol (21): 9-16. Boivin J.R., Piekarski D.J., Wahlberg J.K., Wilbrecht L. (2017). Age, sex, and gonadal hormones differently influence anxiety- and depression-related behavior during puberty in mice. Psychoneuroendocrinol, (85): 78-87. Brown J.S., Kalish H.I., Farber I.E. (1951). Conditioned fear as revealed by magnitude of startle response to an auditory stimulus. J. Exp. Psychol. (41), 317–328. Cassani J., Dorantes-Barrón A. M., Novales L. M., Real G. A., Estrada-Reyes R. (2014). Anti-depressant-like effect of kaempferitrin isolated from Justicia spicigera Schltdl (Acanthaceae) in two behavior models in mice: evidence for the involvement of the serotonergic system. Mol, 19(12), 21442-21461.

- 81 -

Channing C.P., Hillensjo T., Schaerf F.W. (1978). Hormonal control of oocyte meiosis, ovulation and luteinization in mammals. Clin Endocrinol Metab. 7; 601-24. 26. Clostre F. (1999). Ginkgo biloba extract (EGb 761). State of knowledge in the dawn of the year 2000. Ann Pharm Fr. Suppl 1:1S8-88. Review. Cohen H., Matar M.A., Joseph Z. (2013). Animal models of post-traumatic stress disorder. Curr Prot Neurosci, 64, unit 9.45.. Contreras C. M., Rodríguez-landa J.F., Gutiérrez-García A. G., Bernal Morales B., y Saavedra M. (2003). “El estudio experimental de la ansiedad y la depresión,” 29– 39. Cora M.C., Kooistra, L., Travlos G. (2015). Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse: Review and Criteria for the Staging of the Estrous Cycle Using Stained Vaginal Smears. Toxicol Pathol. 43, 776-793. Corrêa G. M. y Alcântara A. F. de C. (2012). Chemical constituents and biological activities of species of Justicia: a review. Rev Brasi de Farmacog. 22(1), 220-238. Crawley J.N. y Goodwin F.K. (1980). Preliminary report of a simple animal model for anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacol Bioche and Behav; (13), 167-170. Cruz-Morales S.E., González-Reyes M.R., Gómez-Romero J., y Arriaga J.C. (2003). Modelos de Ansiedad. Rev Mex de An de la conducta, 28(1), 93-105. De, Actualización, La Codificación, Del Dsm-, and ® Suplemento. (2014). “DSM-5 ® asociación Americana de Psiquiatría Actualización de La Codificación Del DSM-5 De Lima T. C. M., Klu¨eger P. A., Pereira P. A, Macedo-Neto W. P., Morato G. S., Farias M. R. (1998). Behavioural Effects of Crude and Semi-purified Extracts of Syzygium cuminii Linn. Skeels. Phytother Res 12, 488–493 Devrim Ö., Ümide D., Hülya T., y Demirci B. (2012). “Phytomedicine Psychopharmacological Profile of Chamomile ( Matricaria Recutita L .) Essential Oil in Mice.” Europ J of Integrative Med 19 (3–4). Do Rego, J.L., Seong, J.Y., Burel, D., Le- Do Rego, J.L., Seong, J.Y., Burel, D., Leprince, J., Luu-The, V., Tsutsui, K., Tonon, M.C., Pelletier, G,. Vaudry, H. (2009). Neurosteroid biosynthesis: enzymatic pathways and neuroendocrine regulation by neurotransmitters and neuropeptides. Front. Neuroendocrinol. 30; 259-301.

- 82 -

Dong L., Wang S., Li Y., Zhao Z., Shen Y., Liu L. (2017). RU486 reverses emotional disorders by influencing astrocytes and endoplasmic reticulum stress in chronic restraint stress challenged rats. Cell Physiol. Biochem (42): 1098–1108. Domínguez, X; Achenbach, H; González, C y Ferré - D’Amare, A. (1990). Estudio químico del muitle (Justicia spicigera). Rev. Latinoamer. Quím 21, 142-143. Druss BG, Rosenheck RA. (2005). Use of practioner-based complementary the-rapies by persons reporting mental consitions in the United States. Arch Gen Psychiatry (57):708-714. Dubrovsky BO. (2005). Steroids, neuroactive steroids and neurosteroids in psychopathology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry; 29:169-92. Eizaguirre N O., Chavez R., González-Torres M A. y Gaviria M. (2013). “Trastorno de pánico y fibrilación auricular.” Semergen 39 (7):370–75. Escobar M., Pipman V., Arcari A., Boulgourdjian E., Keselma A., Pascualini, T., Alonso, G., y Blanco, M. (2010). Trastornos del ciclo menstrual en la adolescencia. Archivos Argentinos de Pediatría, 108 (4). Estrada-Reyes R, Heinze G., Marti M., y Lo C. (2006). “Anxiolytic-like Actions of the Hexane Extract from Leaves of Annona Cherimolia in Two Anxiety Paradigms : Possible Involvement of the GABA / Benzodiazepine Receptor Complex” 78:730– 37. Estrada-Reyes R., López-rubalcava C, Ferreyra-Cruz O. A., Dorantes-Barrón A.M., Heinze G., y Moreno J. (2014). “Central Nervous System Effects and Chemical Composition of Two Subspecies of Agastache Mexicana ; an Ethnomedicine of Mexico.” J of Ethnopharmacol 153 (1):98–110. Euler, K.L. y Alam, M. (1982). Isolation of Kaempferitrin from Justicia spicigera. J Nat Products 45, 220 - 221, doi:10.1021/Np50020a020. Fernandez-Guasti A, Picazo O. (1992). Changes in burying behavior during the estrous cycle: effect of estrogen and progesterone. Psychoneuroendocrinol, (17):681-689. Freeman EW. (2003). Premenstrual syndrome and premenstrual dysphoric disorder: definitions and diagnosis. Psychoneuroendocrinol; (28) 3:25-37.

- 83 -

Freeman ME. (1988). The ovarian cycle of the rat. The Physiology of Reproduction. Raven Press 1893-1912. Frías Domínguez M.C. y Ortega Villalobos M. (2013). Manual de prácticas de fisiología veterinaria. Facultad de Medicina Veterinaria y zootecnia, Universidad Autónima de México: 71-74. Gangitano, D., Salas, R., Teng, Y., Perez, E., y De Biasi, M. (2009). Progesterone modulation of alpha5 nAChR subunits influences anxiety-related behavior during estrus cycle. Genes, brain, and beh, 8(4), 398–406. García-Ríos R. I., Mora-Pérez A., González-Torres D., Carpio-Reyes R.J. y Soria- Fregozo C. (2018). Anxiolytic-like effect of the aqueous extract of Justicia spicigera leaves on female rats: a comparison to diazepam. Phitochem. García-Segura LM, Lorenz B, Don Carlos LL. (2008). The role of glia in the hypothalamus: implications for gonadal steroid feedback and reproductive neuroendocrine output. Reprod 135:419–429. Global Burden of Disease (GBD). (2018). GBD compare https://vizhub.healthdata.org/gbd-compare/ Goddard A, y Charney D. (1997). Toward an integrated neurobiology of panic disorder. J Clin Psychiatry; 58: 4-11. Gómez B. G. (2007). Neurofisiología de la ansiedad, versus la angustia como afecto que se siente en el cuerpo, Inf Psicol, 9: 101 – 119. González-Trujano M.E., Ponce-Muñoz H., Hidalgo-Figueroa, S., Navarrete- Vázquez, G., Estrada-Soto, S., (2015). Depressant effects of Agastache mexicana methanol extract and one of major metabolites tilianin. Asian Pac. J. Trop. Med. (8), 185-190. Gorn Shoshana B., Navarro Alanís S., y Saavedra Solano N. (2009). “El uso de las terapias alternativas y complementarias en población mexicana con trastornos depresivos y de ansiedad : Resultados de una encuesta en la ciudad de México” 32 (2):107–15. Graeff Frederico G. (2007). Anxiety, Panic and the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis. Rev Bras de Psiquiat 29 (1):3–6.

- 84 -

Graham Bronwyn M., Daher, M., (2016). Estradiol and progesterone have opposing roles in the regulation of fear extinction in female rats. Neuropsychopharmacol (41): 774–780. Graham Bronwyn M., y Scott E. (2018). Effects of Systemic estradiol on fear extinction in female rats are dependent on interactions between dose, estrous phase, and endogenous estradiol levels. Horm and Behav (97); 67–74. Gray J. A. (1978). The neuropsychology of anxiety. British J of Psychol, 69(4), 417– 434. Griebel D. J., Sanger, Perrault, G. (1996). The use of the rat elevated plus-maze to discriminate between non-selective and BZ-1 (휔) selective, benzodiazepine receptor ligands. Psychopharmacol, 124(3),245-254. Griebel G., Rodgers R. J., Perrault G. y Sanger D. J. (1997). Risk Assessment Behaviour: evaluation of utility in the study of 5-HT-Related drugs in the rat elevated plus-maze test. Pharmacol Biochem and Behav: 57(4), 817-827 Gutiérrez-García A. G., Contreras C. M., y Díaz-Meza J L. (2000). Cómo Actúa la Progesterona Sobre El Sistema Nervioso Central.” Salud Mental 23 (2). Hammes S.R., Levin, E.R. (2007). Extranuclear steroid receptors: nature and actions. Endocr Rev. 28; 726-41. Heldring N, Pike A, Andersson S, Matthews J, Cheng G, Hartman J, Tujague M, Ström A, Treuter E, Warner M, Gustafsson JA. (2007). Estrogen receptors: how do they signal and what are their targets. Physiol Rev. 87(3):905-31. Jia M., Dahlman-Wright K., Gustafsson JÅ. (2015). Estrogen receptor alpha and beta in health and disease. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. (4):557-568. Jiménez-Ferrer E, Santillán-Urquiza MA, Alegría-Herrera E, Zamilpa A, Noguerón- Merino C, Tortoriello J, Navarro-García V, Avilés-Flores M, Fuentes-Mata M, Herrera-Ruiz M. (2017), Anxiolytic effect of fatty acids and terpenes fraction from Aloysia triphylla: Serotoninergic, GABAergic and glutamatergic implications. Biomed Pharmacother. (96):320-327. Kalueff A.V., Tuohimaa, P. (2004). Grooming analysis algorithm for neurobehavioural stress research. Bra Res Protocols, 13(3):151-158. 68

- 85 -

Kalueff A. V., Tuohimaa, P. (2005). Contrasting grooming phenotypes in three mouse strains markedly different in anxiety and activity (129S1, BALB/c and NMRI). Behav Brain Res 160(1):1-10. Kalueff A. V., Tuohimaa, P. (2005). Mouse grooming microstructure is a reliable anxiety marker bidirectionally sensitive to GABAergic drugs. European J Pharmacol 508; 147–153. Kalueff A. V., Stewart A. M., Song C., Berridge K. C., Graybiel A.M, Fentress J.C. (2015). Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nat Rev Neurosci. 17: 45–59 Kennedy J. (2005). Herb and supplement use in the US adult population. Ann Clin Psychi 27(11):1847–58. Klumpp H., Kinney KL., Kennedy AE., Shankman SA., Langenecker SA., Kumar A., Phan KL. (2018). Trait attentional control modulates neurofunctional response to threat distractors in anxiety and depression. J Psychiatric Res 102; 87-95. Kumar S., Lata, K., Mukhopadhyay, S., Mukherjee, T.K. (2010). Role of estrogen receptors in prooxidative and anti-oxidative actions of estrogens: A perspective. Biochim. Biophys. Acta 1800; 1127-1135. Llavarasan R., Vasudevan M., Anbazhagan S. Venkataraman S. (2003). Antioxidant activity of Thespesia populnea bark extracts against carbon tetrachloride-induced liver injury in rats. J of Ethnopharmacol (87):227–230. Lalitha T., Umarani R. (2012). Energy efficient cluster based key management technique for wireless sensor network Int. J. Adv. Eng. Technol: (3) (2) :186-190. Le Moëne O, Stavarache M, Ogawa S, Musatov S, Ågmo A. (2019). Estrogen receptors α and β in the central amygdala and the ventromedial nucleus of the hypothalamus: Sociosexual behaviors, fear and arousal in female rats during emotionally challenging events. Brain Res (367): 128-142 López-Mato A., Illa, G., Boullosa, O., Márquez, C. y Vieitez, A. (2000). Trastorno Disforico Premenstrual. Rev Chil de Neuropsiq. 38.

- 86 -

López-Rubalcava C. y Estrada-Camarena E. (2016). Mexican medicinal plants with anxiolytic or antidepressant activity: Focus on preclinical research. J Ethnopharmacol. (186) :377-391. Marcano D., M. Hasegawa. (2002). Fitoquímica orgánica. Universidad Central de Venezuela. 588. Martínez AL., Domínguez F., Orozco S., Chávez M, Salgado H., González M., González-Trujano ME. (2006). Neuropharmacological effects of an ethanol extract of the Magnolia dealbata Zucc. leaves in mice. J Ethnopharmacol 106(2):250-255. Maidana P, Bruno OD, Mesh V. (2013). Medición del cortisol y sus fracciones: una puesta al día. Medicina (Buenos Aires); 73:579-584. Martin, E. I. y Ressler K. (2009). The Neurobiology of Anxiet Y Disorders : Brain I Maging , Genetics , and Psychoneuroendocrinology. Psychiatr Clin N Am (32):549–75. McCann UD., Thorne D., Hall M. (1995). The effects of L- Dihydroxyphenylalanine on alertness and mood á-Methyl- para-tyrosine-treated healthy humans: Further evidence for the role of catecholamines in arousal and anxiety. Neuropsycopharmacol (13):41-52. McEwen B, Alves S. (1999). Estrogen actions in the central nervous system. Endocrine Rev 20:279–307. Micevych, P., Sinchk, K. (2008). Synthesis and Function of Hypothalamic Neuroprogesterone in Reproduction. Endocrinol 149; 2739-2742. Miller Brooke H., y. Takahashi J. S. (2014). “Central Circadian Control of Female Reproductive Function.” Front in Endocrinol (5):1–8. Ministerio de Sanidad y Consumo. (2008). Guía de práctica clínica para el manejo de pacientes con trastornos de ansiedad. Guías de Práctica Clínica en el SNS: UETS Nº 2006/10. Miyasaka, L.S., Atallah, A.N., Soares, B.G., (2007). Passiflora for anxiety disorder. Cochrane Database Syst Rev CD004518. Mody I., Pearce RA. (2004). Diversity of inhibitory neurotransmission through GABA(A) receptors. Trends Neurosci.;27(9):569–575.

- 87 -

Mora S., Dussaubat N., y Díaz-Véliz G. (1996). “Effects of the estrous cycle and ovarian hormones on behavioral indices of anxiety in female rats.” Psychoneuroendocrinol, 21(7): 609–20 Mora-Pérez A., Hernández-Medel M.R. (2016). Anticonvulsant activity of methanolic extract from Kalanchoe pinnata (Lam.) stems and roots in mice: A comparison to diazepam. Neuro, (31): 161-168. Möhler H., Benke D., Benson J., Lüscher B., Rudolph U., Fristchy JM. (1996). Diversity in structure, pharmacology and regulation of GABAA receptor. In the GABA receptor. 1ª. Ed. Humana Press Inc. Totawa. New Jersey . Murray F., Smith D. W., Hutson P. H. (2008). Chronic low dose corticosterone exposure decreased hippocampal cell proliferation, volume and induced anxiety and depression like behaviours in mice. European J Pharmacol (583): 115-127. Ngo Bum E, Taiwe GS, Moto FC. (2009). Anticonvulsant, anxiolytic, and sedative properties of the roots of Nauclea latifolia Smith in mice. Epilepsy Behav. 15(4):434–40. Nemeroff C.B. (2003). “The role of GABA in the pathophysiology and treatment of anxiety disorders”. Psychopharmacol Bulletin; 37(4):133-146. Nielsen, N.D., Sandager, M., Stafford, G.I., Jaeger, A.K., van Staden, J. (2004). Screening of indigenous plants from South Africa for affinity to the serotonin reuptake transport protein. J. Ethnopharmacol. 94, 159–163. NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones Técnicas para la Producción, Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio, Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación. Oviedo M., García M., Díaz C., Marder M. Costa M., Rincón J., Sánchez C., Guerrero M. (2009). Extracto y fracción alcaloidal de Annona muricata con actividad de tipo ansiolítica en ratones. Rev. Colomb. Cienc. Quím. Farm: 38 (1), 105-120. Oliveira, T.L.S., Morais, S.R., Sá, S., Oliveira, M.G., Florentino, I.F., Silva, D.M.D., Carvalho, V.V., Silva, V.B.D., Vaz, B.G., Sabino, J.R. (2017). Antinociceptive, anti- inflammatory and anxiolytic-like effects of the ethanolic extract, fractions and

- 88 -

Hibalactone isolated from Hydrocotyle umbellata L. (Acaricoba)—Araliaceae. Biomed. Pharmacother. 95, 837–846. Österlund, M.K. (2010). Underlying mechanisms mediating the antidepressant effects of estrogens. Biochim. Biophys. Acta 1800; 1136-1144. Osuna-Torres L, Tapia-Pérez ME, Aguilar-Contreras A. (2005). Justicia spicigera Schldl. (Acanthaceae). Plantas medicinales de la medicina tradicional mexicana para tratar afecciones gastrointestinales. Barcelona, España: Publicacions Edicions de la Universitat de Barcelona. Paladini A., Marder M., Medina J., Viola H. (1999). Flavonoids and the Central Nervous System: from forgotten factors to potent anxiolytic compounds. J Pharm 51, 519- 526. Pascual Pascual P.,Villena Ferrer A., Morena Rayo S.,Téllez Lapeira J. M. (2012) El paciente ansioso. [Internet]. Fisterra.com. Paul SM, Purdy RH. (1992). Neuroactive steroids. FASEB; 6: 2311-22. Pellow, S., Chopin, P., File, S.E., Briley, M. (1985). Validation of open: closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci. Methods. 14, 149-167. Pérez de la Mora M. (2003). Dónde y cómo se produce la ansiedad: sus bases biológicas. Rev. Ciencia: 13-28. Pérez-Ortega G., Guevara-Fefer P.,Chávez M., Herrera J., Martínez A., Martínez A.L., González-Trujano M.E. (2007). Sedative and anxiolytic efficacy of Tilia americana var. mexicana inflorescences used traditionally by communities of State of Michoacan, Mexico. J Ethnopharmacol (116): 461–468. Petty, F., (1995). GABA and mood disorders: a brief review and hypothesis. J Affective Disor 34 (4), 275–281. Peña Agüero B., Andres Gutiérrez G., Rojas Alba M. (2010). “El Muicle.” Usos medicinales del muicle (Justicia spicigera Schlect and Schdl). Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Pita Calandre, E, and J Manzanares Iribas. (1994). “Fármacos ansiolíticos e hipnóticos en psicología clínica.” Ansiedad y estrés 0:121–26.

- 89 -

Pittler MH, Ernst E. (2003). Kava extract versus placebo for treating anxiety. Cochrane Database Syst Rev ;1. Art. No.: CD003383. Pluchino N, Santoro A, Genazzani A. (2013). Advances in Neurosteroids: Role in Clinical Practice. Climacteric 16(1): 8-17. Ravven SE, Zimmerman MB, Schultz SK. (2011). 12-month herbal medicine use for mental health from the national Comorbidity Survey Replication (NCS-R). Ann Clin Psychiatry 23(2):83–94. Razavi BM, Zargarani N, Hosseinzadeh H. (2017). Anti-anxiety and hypnotic effects of ethanolic and aqueous extracts of Lippia citriodora leaves and verbascoside in mice. Avicenna J Phytomed ; 7 (4): 353-365. Redolar R.D., Ferran Balada N.F., Silvestre S.J. (2012). Tratamiento psicofarmacológico de los trastornos de ansiedad. En. Farmacología y endocrinología del comportamiento. (247-290). Editorial UOC, S.L. Barcelona, España. Reddy DS, O’Malley BW, Rogawski MA. (2005). Anxiolytic activity of progesterone in progesterone receptor knockout mice. Neuropharmacol; 48: 14-24. Rodríguez-Landa J. F., Contreras, C. M., (1998). Algunos datos recientes sobre la fisiopatología de los trastornos por ansiedad. Rev Bioméd, (9):181-191. Rodríguez-Landa J. F., Puga-Olguín, A., Germán-Ponciano, J. L., García-Ríos, R. I., Soria-Fregozo, C. (2015). Anxiety in Natural and Surgical Menopause-Physiologic and Therapeutic Bases. En: Federico Durbano (Ed.), A Fresh Look at Anxiety Disorders. Edit. InTech. 173-198. Roncon C.M, Biesdorf de Almeida C., Klein T., de Mello J.C., Audi EA. (2010). Anxiolytic effects of a semipurified constituent of guaraná seeds on rats in the elevated T-maze test. Planta Med. (3):236-41. Saeed SA., Bloch RM., Antonacci DJ. (2007) Herbal and dietary supplements for treatment of anxiety disorders. American Family Physician. 76(4):549-56. Savage K., Firth J., Stough C., y Sarris J. (2017). “GABA-Modulating Phytomedicines for Anxiety: A Systematic review of preclinical and clinical evidence.” Phytother Res:1–16.

- 90 -

Sawantdesai NS1, Kale PP1, Savai J. (2016). Evaluation of anxiolytic effects of aripiprazole and hydroxyzine as a combination in mice. J Basic Clin Pharm. 7(4):97-104. Scaglione F., Pannacci M., Petrini O. (2005). The Standardised G115® Panax ginseng C.A. Meyer Extract. Evid Based Integrative Med; 2 (4): 195-206. Sieghart W., Sperk G. (2002). Subunit composition, distribution, and function of GABA(A) receptor subtypes. Curr Top Med Chem.;2(8):795–816. Sieghart W, Ernst M. (2005). Heterogeneity of GABAA receptors: revived interest in the development of subtype-selective drugs. Curr Med Chem Cent Nerv Syst; 5: 217- 42. Smith M. S., Freman, M. E. y Neil, J. D. (1975). The control of progesterone secretion during the estrous cycle pseudopregnancy in the rat: prolactin, and early gonadotropin and steroid levels associated with rescue of the corpus luteum of pseudopregnancy. Endocrinol (96): 219-226. Smith J, Toussaint, Heuser, (2003). Stress and aging: theoretical and empirical challenges for interdisciplinary research. Neurobiol Aging; 24(1):S77–S82 Song C., Berridge K. C., Kalueff A. (2016). ‘Stressing’ rodent self-grooming for neuroscience research. Nat Rev Neurosci. 17(9): 591. doi:10.1038/nrn.2016.103. Spornitz U. M., Socin C. D. y David, A. A., (1999). Estrous stage determination in rats by means of scanning electron microscopic images of uterine surface epithelium. The Anat. Rec., (254): 116-126. Subbaraju GV, Kavitha JDR, Rajasekhar D, Jimenez JI. (2004). Jusbetonin, the first indolo [3,2-b] quinoline alkaloid glycoside, from Justicia betonica. J Nat Prod 67: 461-462. Susplugas S, Van Hung N, Bignon J, Thoison O, Kruczynski A, Sévenet T, Guéritte F. (2005). Cytotoxic arylnaphthalene lignans from a Vietnamese acanthaceae, Justicia patentiflora. J Nat Prod 68: 734-738. Thakur P., Rana A.C. (2013). Effect of Cissampelos pareira leaves on anxiety-like behavior in experimental animals. Trad. Complement. Med. (3),188–193. Tortella-Feliu, M. (2014). Los Trastornos de ansiedad en el DSM-5. Cuadernos de

- 91 -

medicina psicosomática, 110,62-69. Treit D. (1985). Animal models for the study of anti-anxiety agents: a review. Neuros and Biobehevi Rev (9), 203-222. Vieitez, A., Lopez Mato, A., Boullosa, O., Marquez, C. y Perez, S. (2000). Depresión Climatérica. Rev Argentina de Clínic Neuropsicol, 9 (2). Vega-Avila E., Tapia-Aguilar R., Reyes-Chilpa R., Guzmán-Gutiérrez S.L., Pérez- Flores J., y Velasco-Lezama R. (2012). “Actividad Antibacteriana Y Antifúngica de Justicia Spicigera.” Rev Latinoamericana de Quim. Walf, A. A., Frye, C. A., (2007). The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature protocols. 2(2):322-328. Yang SG, Mlcek M, Kittnar O. (2013). Estrogen can modulate menopausal women´s heart rate variability. Physiol Res (62): 165–171. Zanin L., Paez, A., Correa C., De Bortoli M. (2012). Ciclo menstrual: sintomatología y regularidad del estilo de vida diario. Fundamentos en Humanidades 12(24):103- 123. Zhang Q., Lin C., Duan W., Wang X., Luo A. (2013). Preparative Separation of Six Rhynchophylla Alkaloids from Uncaria macrophylla Wall by pH-Zone Refining Counter-Current Chromatography. Molecules, 12; 15490-15500: Zhu, Y., Bond, J., Thomas, P. (2003). Identification, classification, and partial characterization of genes in humans and other vertebrates homologous to a fish membrane progestin receptor. Proc Natl Acad Sci USA 100; 2237-42.

- 92 -

ANEXOS Anexo I. Pruebas fítoquímicas preliminares

Alcaloides Compuestos orgánicos cuya característica es ser solubles en agua, contener al menos en la molécula un átomo de nitrógeno y ejercer actividad, generalmente tienen un sabor amargo y son tóxicos, razón por la cual, en la planta se consideran como protección contra herbívoros y agentes patógenos (Harborne, 1998). Para la determinación de estos compuestos se destacan diversas técnicas, entre ellas podremos encontrar las técnicas de Dragendroff y la técnica de Wagner.

Técnica de Dragendroff Se tomaron 5 mg del extracto de la planta y se realizó una cromatografía en capa delgada (ccd) utilizando como fase móvil la mezcla CHCl3:AE (8:2; v:v). Una vez obtenida la ccd se procedió a rociar con el reactivo de Dragendroff la placa. La coloración anaranjada sobre fondo amarillo es indicativa de la presencia de alcaloides. Para la preparación del reactivo de Dragendroff modificado: Se mezclaron 5 ml de la solución A y 5 ml de la solución B en 20 m de ácido acético y aforarlo a 100 ml con agua destilada. Solución A): 8 g de nitrato de bismuto en una mezcla de 10 ml de ácido acético y 40 ml de agua destilada.

Solución B): 8 g de yoduro de potasio disueltos en 20 ml de agua destilada.

Técnica de Wagner

Se tomó 1 ml del extracto de las hojas de muicle disuelto en etanol, posteriormente se agregaron 8 gotas del reactivo de Wagner. El precipitado marrón indica presencia de alcaloides (Obadoni y Ochuko, 2001; Lalitha y Jayanthi, 2012).

- 93 -

Preparación del reactivo de Wagner: Se disuelve en 20 ml de agua 1.2 g de yodo y 2 g de yoduro de potasio.

Esteroles y terpenos Compuestos derivados del ciclopentanoperhidrofenantreno, un sistema de cuatro ciclos que se forma a partir del hidrocarburo escualeno. Los principales grupos en que se clasifican los esteroides son: I. Esteroles o alcoholes esteroideos II. Calciferoles o vitaminas D III. Esteroides hormonales IV. Ácidos biliares

Generalmente a los esteroles sintetizados de las plantas se les denomina esteroles vegetales o fitoesteroles, presentan estructuras similares y funciones análogas al colesterol de los vertebrados. El colesterol, el principal esterol en animales desempeña importantes funciones en el organismo: siendo precursor de la síntesis de diversas hormonas esteroideas. Para la identificación de esteroides se empleados la reacción de Liebermann Burchard y la reacción de Salkowski. Se disolvieron por separado: 10 mg de extracto disuelto en 2 ml de cloroformo y se les realizó la técnica de Lieberman Burchard y la técnica de Salkowski.

Liebermann Burchard

Se añadió a 1 ml del extracto de las hojas de muicle, 5 gotas de anhídrido acético y 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La presencia de un color verde esmeralda indica presencia de esteroides o esteroles (Lalitha y Jayanthi, 2012)

Salkowski A 1 ml del extracto de las hojas de muicle se le agrega 1 ml de ácido sulfúrico concentrado. El desarrollo de dos capas y la emisión de florescencia indica positiva la presencia de esteroides o esteroles (Aiyelaagbe y Osamudiamen, 2009).

- 94 -

Flavonoides Se sintetizan a partir de una molécula de fenilalanina y 3 de malonil-CoA, son moléculas que presentan dos anillos bencénicos unidos a través de una cadena de tres átomos de carbono (Hollman y Katan, 1999). La identificación de los flavonoides se realiza mediante técnicas como el ensayo de Shinoda (Vinod y col., 2010; Kiranmai y col., 2011).

Ensayo de Shinoda: A 1 ml del extracto de las hojas de muicle disuelto en etanol, se añadió 0.5 g de magnesio y posteriormente 5 gotas de ácido clorhídrico concentrado. Coloración rojiza indica presencia de flavonoides

- 95 -

ANEXO 2. Divulgación científica

Trabajo en extenso con registro ISBN

Ana Raquel Ramos-Molina, Daniel González-Torres, Armando Mora-Pérez, Rosa Isela García-Ríos y Cesar Soria-Fregozo. (2019). “EFECTO ANSIOLÍTICO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE LAS HOJAS DE JUSTICIA SPICIGERA EN RATAS HEMBRA EN LA FASE DE PROESTRO-ESTRO”. En DESARROLLO CIENTÍFICO EN MÉXICO: Cap 8: 3760-3766. Online. ISBN 978-607-95228-9-6

ASISTENCIA Y PARTICIPACIÓN EN CONGRESOS NACIONALES

➢ Ponente con el trabajo denominado “EFECTO ANSIOLÍTICO DEL EXTRACTO METANÓLICO Y ACUOSO DE LAS HOJAS DE JUSTICIA SPICIGERA EN RATAS HEMBRA EN LA FASE DE PROESTRO-ESTRO”. En la modalidad de cartel durante la XV° reunión participación de la mujer en la ciencia. 23 de mayo del 2018.

➢ Ponente con el trabajo denominado “EFECTO ANSIOLÍTICO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE LAS HOJAS DE JUSTICIA SPICIGERA EN RATAS HEMBRA EN LA FASE DE PROESTRO-ESTRO”. En la modalidad de cartel durante la 16° Curso-Reunión del grupo de bioseñales de la actividad neuronal a la conducta. 4 al 6 de Julio del 2018.

➢ Ponente con el trabajo denominado. “GENDER COMPARATION OF THE ANXIOLYTIC LIKE EFFECT OF THE ADMINISTRATION THE INFUSION OF JUSTICIA SPICIGERA LEAVES IN WISTAR RATS”. En la modalidad de

- 96 -

cartel durante el XXXII Congreso Nacional de Bioquímica. 4 al 9 de noviembre del 2018.

➢ Ponente, charlas divulgativas en el aula. “PLASTICEREBRO: CAMBIOS DEL CEREBRO EN EL APRENDIZAJE Y MEMORIA”. En la modalidad ponente durante la semana del cerebro. 11 al 20 de marzo del 2019.

➢ Ponente con el trabajo denominado. “ACTIVIDAD ANSIOLÍTICA DE LAS FRACCIONES DEL EXTRACTO METANÓLICO DE HOJAS DE JUSTICIA SPICIGERA SCHLTDL. EN RATAS HEMBRA EN LAS FASES PROESTRO- ESTRO”. En la modalidad de cartel durante la XVI reunión participación de la mujer en la ciencia. 31 de mayo del 2019.

ASISTENCIA A CURSOS

➢ Asistente en el curso-taller de “Bases metodológicas y estadísticas para la investigación”. 23 al 27 de octubre de 2017 ➢ Asistente en el curso de “El pez cebra como modelo de investigación en la neurociencia de la conducta”. 25, 26 y 28 de mayo del 2018 ➢ Asistente en el curso de “Estadística aplicada en modelos experimentales”. 09 al 11 de Julio del 2018 ➢ Asistente en el ciclo de conferencias “VI coloquio de investigación en ciencia y tecnología”. 3 al 5 de octubre del 2018.

- 97 -

- 98 -

- 99 -

- 100 -

- 101 -

- 102 -

- 103 -

- 104 -

- 105 -

- 106 -

- 107 -

PERSPECTIVAS

1.- Caracterización química del extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera con técnicas especializadas.

2.- -Evaluación del efecto antidesesperanza de la administración crónica del extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera en ratas ovarectomizadas y en las fases de metaestro-diestro.

3.- -Evaluación del efecto ansiolítico de la administración crónica del extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera en ratas ovarectomizadas y en las fases de metaestro-diestro.

4-. Evaluación del efecto ansiolítico de la combinación de las fracciones obtenidas del extracto metanólico de las hojas de Justicia spicigera en las fases de proestro-estro de la rata.

- 108 -