Tłumaczenie Patentu Europejskiego (19) Pl (11) Pl/Ep 2986615 Polska

RZECZPOSPOLITA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2986615 POLSKA

(13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (51) Int.Cl. 17.04.2014 14784998.8 C07D 493/14 (2006.01) A61K 31/336 (2006.01) A61K 31/122 (2006.01) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 12.12.2018 Europejski Biuletyn Patentowy 2018/50 Urząd Patentowy EP 2986615 B1 Rzeczypospolitej Polskiej

(54) Tytuł wynalazku: Sposoby i kompozycje do leczenia ran

(30) Pierwszeństwo: 18.04.2013 AU 2013901359

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

24.02.2016 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2016/08

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

28.06.2019 Wiadomości Urzędu Patentowego 2019/06

(73) Uprawniony z patentu:

QBiotics Limited, Yungaburra, AU

(72) Twórca(y) wynalazku:

PAUL WARREN REDDELL, Yungaburra, AU VICTORIA ANNE GORDON, Yungaburra, AU RYAN MOSELEY, Coity, GB ROBERT STEADMAN, Hengoed, GB

RACHAEL LOUISE MOSES, Milton Keynes, GB

T3 GLEN MATHEW BOYLE, Taringa, AU PETER GORDON PARSONS, St Lucia, AU

(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Tadeusz Rejman 2986615 KANCELARIA PATENTOWA REJMAN S.C. ul. Ciepła 15 lok. 41 50-524 Wrocław

PL/EP

Uwaga:

W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

EP 2986615B1

Opis Dziedzina Wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy związków epoksy-tiglianowych i ich zastosowania w pobudzaniu gojenia ran. W szczególnych przykładach wykonania, związkami epoksy-tiglianowymi są związki epoksy-tiglian-3-onu. Opisane są sposoby indukowania pobudzenia gojenia ran jak również sposoby zmniejszenia powstawania blizn i polepszenia efektów kosmetycznych po zagojeniu rany przez zmniejszenie zmian w pigmentacji skóry i/lub polepszenia ponownego wzrostu włosów i sposoby zapobiegania powstawaniu rozległych blizn. Także opisane są związki i kompozycje do zastosowania w gojeniu ran. Tło Wynalazku [0002] Gojenie ran jest złożonym procesem, w którym skóra lub inny narząd lub tkanka sama się naprawia po zranieniu. W prawidłowej skórze, naskórek (najbardziej zewnętrzna warstwa) i skóra właściwa (wewnętrzna lub głębsza warstwa) występują w stałym stanie równowagi, tworząc barierę zabezpieczającą przeciwko środowisku zewnętrznemu. Gdy warstwa zabezpieczająca zostanie uszkodzona, normalny fizjologiczny proces gojenia rany jest natychmiast uruchamiany. Klasyczny model gojenia rany jest podzielony na trzy kolejne, zachodzące na siebie fazy, mianowicie: zapalną, proliferacyjną i ostatecznie przebudowy. [0003] Podczas fazy zapalnej gojenia rany występuje aktywna rekrutacja neutrofilii a następnie monocytów z otaczających naczyń do rany. Neutrofile są niezbędne do początkowej kontroli i zniszczenia bakteryjnych i grzybiczych zakażeń w ranie. Monocyty dojrzewają w makrofagi, gdy dotrą do rany gdzie pełnią liczne role w czasie rozkładu rany obejmującego początkową fagocytozę i oczyszczenie z macierzy i resztek komórek. Uwolnienie enzymów, cytokin i czynników wzrostu zarówno przez neutrofile jak i makrofagi w ranie może wówczas wywrzeć głęboki wpływ na inne komórki w ranie i otaczających tkankach. Na przykład, makrofagi wydzielają kolagenazy, które oczyszczają ranę; interleukiny i czynnik martwicy nowotworu (TNF), które pobudzają fibroblasty i sprzyjają angiogenezie; i transformujący czynnik wzrostu (TGF), który pobudza keratynocyty. Także wydzielają one płytkowy czynnik wzrostu i czynnik wzrostu śródbłonka naczyń, który inicjuje tworzenie ziarniny a tym

1 EP 2986615B1 samym inicjuje przejście do faz proliferacyjnej i przebudowy. Szybka i zdecydowana, ale krótkotrwała faza proliferacyjna często wiąże się z dobrymi efektami gojenia rany. [0004] Drugi etap gojenia rany obejmuje proliferację i migrację komórek oraz zmniejszenie rany. Obejmuje to działania podjęte przez komórki w ranie w celu osiągnięcia zamknięcia przerwy rany i uzupełnienia utraty tkanki. Migracja i proliferacja keratynocytów jest fundamentalna do osiągnięcia ponownej epitelializacji rany, podczas gdy przebudowa leżącej poniżej skóry właściwej wynika z migracji, proliferacji i różnicowania fibroblastów, które pomagają otrzymać zamkniętą ranę i prowadzą do syntezy, zwinięcia i wyrównania włókien kolagenowych. [0005] W końcowym etapie przebudowy, migrujące i proliferujące keratynocyty przy krawędzi rany ponownie rozwarstwiają się aby uszczelnić ranę i utworzyć ciągły naskórek. Podczas tego etapu może pojawić się wiele zmian w skórze właściwej w tym przebudowa wewnątrzkomórkowej macierzy aby odbudować normalną architekturę i unaczynienie skóry właściwej. [0006] W pewnych przypadkach, gojenie ran może być powolne lub może w ogóle nie wystąpić. Wiele czynników wpływa na gojenie rany, na przykład ogólny stan zdrowia zranionego osobnika, wiek zranionego osobnika, choroby takie jak cukrzyca lub inne choroby, które mogą wpłynąć na krążenie, występowanie zakażenia, ciał obcych lub martwej tkanki lub w pewnych przypadkach lek może wpłynąć na szybkość gojenia rany. [0007] Ponadto w pewnych ranach, niedostateczna regulacja przebudowy rany może skutkować włóknieniem i nadmiernym tworzeniem blizn do pozostającej tkanki bliznowatej, która jest funkcjonalnie i kosmetycznie gorsza niż prawidłowa tkanka. [0008] Istnieje dużo badań nad polepszeniem gojenia ran i zmniejszenia tworzenia tkanki bliznowatej. Jednak istnieje potrzeba znalezienia środków, które są zdolne do pobudzania gojenia ran na przykład zwiększając szybkość gojenia rany, szczególnie przewlekłych ran. Istnieje także potrzeba środków, które pozwalają na gojenie rany ze zmniejszonym bliznowaceniem w porównaniu do tego, które występuje naturalnie.

2 EP 2986615B1

Streszczenie Wynalazku [0009] Niniejszy wynalazek opiera się, przynajmniej częściowo, na odkryciu, że ekstrakty z roślin, które zawierają związki epoksy-tiglianowe są zdolne do pobudzenia gojenia ran a także zmniejszenia tkanki bliznowatej tworzącej się po zagojeniu rany. [0010]W pierwszym aspekcie wynalazku dostarczony jest związek 5,6- lub 6,7- epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w pobudzaniu gojenia rany gdzie związek 5,6- lub 6,7-epoksy-tiglianowy jest związkiem o wzorze (I):

gdzie

R1 oznacza wodór i R2 oznacza -OR17; lub R1 i R2 razem tworzą grupę karbonylową (=O);

R3 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R4 i R5 oznaczają niezależnie wodór lub -OR17; lub R4 i R5 razem tworzą wiązanie podwójne lub epoksydowe (-O-);

R5 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R7 oznacza -OH lub -OR18;

R8 oznacza -OH lub-OR18; pod warunkiem, że R7 i R8 nie oznaczają oba OH;

R9 i R10 są niezależnie wybrane z wodoru i C1-6alkilu;

R11 i R12 lub R12 i R13 razem tworzą epoksyd a pozostała grupa R11 i R13 oznacza wodór, -OH lub -OR17

R14 oznacza wodór lub -R17;

3 EP 2986615B1

R15 oznacza wodór lub -R17;

R16 oznacza wodór lub -R17;

R17 oznacza wodór, -C1-6alkil, -C2-6alkenyl, -C2-6alkinyl, -C(O)C1-6alkil, -

C(O)C2-6alkenyl lub -C(O)Cz-salkinyl;

R18 oznacza C1-20alkil, -C2-20alkenyl, -C2-20alkinyl, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-

20alkenyl, -C(O)C2-20alkinyl, -C(O)cykloalkil, -C(O)C1-10alkilocykloalkil; -C(O)C2-

10alkenylocykloalkil, -C(O)C2-10alkinylocykloalkil, -C(O)aryl, -C(O)C1-

10alkiloaryl, -C(O)C2-10alkenyloaryl, -C(O)C2-10alkinyloaryl, -C(O)C1-

10alkiloC(O)R19, -C(O)C2-10alkenyloC(O)R19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)R19, -

C(O)C1-10alkiloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkenyloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-

10alkinyloCH(OR19)(OR19), -C(O)C1-10alkiloSR19, -C(O)C2-10alkenyloSR19, -

C(O)C2-10alkinyloSR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)OR19, -C(O)C2-

10alkenyloC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)OR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)SR19, -

C(O)C2-10alkenyloC

(O)SR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)SR19,

lub

4 EP 2986615B1 tiglianowy jest syntetyczną lub półsyntetyczną pochodną wyizolowanego związku tiglianowego. [0012] W pewnych przykładach wykonania, pobudzenie gojenia rany obejmuje zwiększenie szybkości gojenia rany. W pewnych przykładach wykonania, pobudzenie gojenia rany obejmuje zmniejszenie bliznowacenia w tkance rany. W pewnych przykładach wykonania, pobudzenie gojenia rany obejmuje zarówno zwiększenie szybkości gojenia rany jak i zmniejszenia bliznowacenia w tkance rany. W pewnych przykładach wykonania rana jest raną przewlekła, ostrą raną lub raną istniejącą. [0013] W jeszcze innym aspekcie wynalazku dostarczony jest związek 5,6- lub 6,7-epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w zapobieganiu nadmiernemu bliznowaceniu zwłaszcza gdy nadmierne bliznowacenie stanowi keloid lub blizna hipertroficzna; gdzie związek 5,6- lub 6,7-epoksytiglianowy jest wybrany z: 12-tigloilo-13-butanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- onu (Związek 21); 12-(3-butenoilo)-13-nonanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 22); 12-benzoilo-13-(2-metylobutanoilo-6, 7-epoksy-4,5,9, 12, 13,20-heksahydroksy- 1-tiglien-3-onu (Związek 23); 12,13-dibutanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 27) 12-benzoilo-13-butanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- onu (Związek 28); 12,13-di-nonoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 41); 12,13-di-heksanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 42); 12,13-di-pentanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 43); 12,13-di-tigloilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 44) 5,20-di-acetylo-12-tigloilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-

5 EP 2986615B1 heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 45); 12,13-di-(2E,4E)-heks-2,4-enoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 46); 12-heksanoilo-13-[2-(N-metyloantraniloilo)]-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1 -tiglien-3-onu (Związek 47) 12-acetylo-13-[2-(N-metyloantraniloilo)]-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 48); 12,13-di-heptanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 49); 12-mirystoilo-13-acetylo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- onu (Związek 50); 12-mirystoilo-13(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy- 1-tiglien-3-onu (Związek 51); 12-(2-metylobutanoilo)-13-acetylo-6,7-epoksy-4,5,9, 12, 13,20-heksahydroksy- 1-tiglien-3-onu (Związek 52); i 12-hydroksy-13-heksanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien- 3-onu (Związek 53); 12,13-di-(3-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 60) lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli. [0014] W jeszcze innym aspekcie dostarczony jest związek 5,6- lub 6,7-epoksy- tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w zmniejszeniu bliznowacenia spowodowanego przez gojenie rany przez zmniejszenie zmian w pigmentacji skóry i/lub polepszenie ponownego wzrostu włosów; gdzie związek 5,6- lub 6,7-epoksy-tiglianowy jest związkiem o wzorze (I):

6 EP 2986615B1

gdzie

R1 oznacza wodór i R2 oznacza -OR17; lub R1 i R2 razem tworzą grupę karbonylową (=O);

R3 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R4 i R5 niezależnie oznaczają wodór lub -OR17; lub R4 i R5 razem tworzą podwójne wiązanie lub epoksydowe (-O-);

R5 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R7 oznacza -OH lub -OR18;

R8 oznacza -OH lub -OR18; pod warunkiem, że R7 i R8 nie oznaczają oba OH;

R9 i R10 są niezależnie wybrane z wodoru i C1-6alkilu;

R11 i R12 lub R12 i R13 razem tworzą epoksyd i pozostała grupa R11 i R13 oznacza wodór, -OH lub -OR17

R14 oznacza wodór lub -R17;

R15 oznacza wodór lub -R17;

R16 oznacza wodór lub -R17;

R17 oznacza wodór, -C1-6alkil, -C2-6alkenyl, -C2-6alkinyl, -C(O)C1-6alkil, -

C(O)C2-6alkenyl lub -C(O)C2-6alkinyl;

R18 oznacza C1-20alkil, -C2-20alkenyl, -C2-20alkinyl, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-

20alkenyl, -C(O)C2-20alkinyl, -C(O)cykloalkil, -C(O)C1-10alkilocykloalkil; -C(O)C2-

10alkenylocykloalkil, -C(O)C2-10alkinylocykloalkil, -C(O)aryl, -C(O)C1-

7 EP 2986615B1

10alkiloaryl, -C(O)C2-10alkenyloaryl,-C(O)C2-10alkinyloaryl, -C(O)C1-

10alkiloC(O)R19, -C(O)C2-10alkenyloC(O)R19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)R19, -

C(O)C1-10alkiloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkenyloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-

10alkinyloCH(OR19)(OR19),-C(O)C1-10alkiloSR19,-C(O)C2-10alkenyloSR19, -

C(O)C2-10alkinyloSR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)OR19, -C(O)C2-

10alkenyloC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)OR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)SR19, -

C(O)C2-10alkenylo(O)SR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)SR19,

lub

R19 oznacza wodór, -C1-10alkil, -C2-10alkenyl, -C2-10alkinyl, cykloalkil lub aryl; gdzie każda grupa alkilowa, alkenylowa, alkinylowa, cykloalkilowa lub arylowa jest opcjonalnie podstawiona; lub jego geometrycznym izomerem lub stereoizomerem lub farmaceutycznie dopuszczalną solą. Opis Wynalazku Definicje [0015] Jeśli nie zdefiniowano inaczej, wszystkie techniczne i naukowe terminy stosowane w niniejszym zgłoszeniu mają to samo znaczenie co powszechnie rozumiane przez znawców z dziedziny, do której wynalazek należy. Mimo że jakiekolwiek sposoby i materiały podobne lub równoważne tym opisanym w niniejszym zgłoszeniu mogą być stosowane w wykonaniu lub badaniu niniejszego wynalazku, opisane są preferowane sposoby i materiały. Do celów niniejszego wynalazku następujące terminy są zdefiniowane poniżej. [0016] Przedimki nieokreślone są stosowane w niniejszym zgłoszeniu aby odnieść się do jednego lub więcej niż jednego (tj. do co najmniej jednego) gramatycznego obiektu przedmiotu. Przykładowo “element” oznacza jeden element lub więcej niż jeden element. [0017] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin “około” dotyczy wielkości, poziomu, wartości, rozmiaru, wielkości lub ilości, która różni się o 30%, 25%,

8 EP 2986615B1

20%, 15% lub 10% w odniesieniu do referencyjnej wielkości, poziomu, wartości, rozmiaru, wielkości lub ilości. [0018] W tej specyfikacji, chyba, że kontekst wymaga inaczej, słowa “obejmują”, “obejmuje” i “obejmujący” będą rozumiane jako oznaczające zawarcie określonego etapu lub elementu lub grupy etapów lub elementów ale bez wyłączenia jakiegokolwiek innego etapu lub elementu lub grupy etapów lub elementów. [0019] Termin "alkil" dotyczy opcjonalnie podstawionych liniowych i rozgałęzionych grup węglowodorowych mających 1 do 20 atomów węgla. Tam gdzie jest to odpowiednie, grupa alkilowa może mieć określoną liczbę atomów węgla, na przykład -C1-C6, alkil, który obejmuje grupy alkilowe mające 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 atomów węgla w liniowych lub rozgałęzionych ułożeniach. Nieograniczające przykłady grup alkilowych obejmują metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, s- i t-butyl, pentyl, 2-metylobutyl, 3-metylobutyl, heksyl, 2- metylopentyl, 3-metylopentyl, 4-metylopentyl, 2-etylobutyl, 3-etylobutyl, heptyl, oktyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl i pentadecyl. [0020] Termin "alkenyl" dotyczy opcjonalnie podstawionych, nienasyconych liniowych lub rozgałęzionych węglowodorów, mających 2 do 20 atomów węgla i mających co najmniej jedno podwójne wiązanie. Tam, gdzie jest to odpowiednie grupa alkenylowa ma określoną liczbę atomów węgla, na przykład C2-C6 alkenyl, który obejmuje grupy alkenylowe mające 2, 3, 4, 5 lub 6 atomów węgla w liniowych lub rozgałęzionych ułożeniach. Nieograniczające przykłady grupy alkenylowych obejmują etenyl, propenyl, izopropenyl, butenyl, s- i t-butenyl, pentenyl, heksenyl, hept-1,3-dien, heks-1,3-dien, non-1,3,5-trien i podobne. [0021] Termin "alkinyl" dotyczy opcjonalnie podstawionych nienasyconych liniowych lub rozgałęzionych węglowodorów mających 2 do 20 atomów węgla, mających co najmniej jedno potrójne wiązanie. Tam gdzie jest to odpowiednie, grupa alkinylowa ma określoną liczbę atomów węgla, na przykład C2-C6 alkinyl, który obejmuje grupy alkinylowe mające 2, 3, 4, 5 lub 6 atomów węgla w liniowych lub rozgałęzionych ułożeniach. Nieograniczające przykłady obejmują etynyl, propynyl, butynyl, pentynyl i heksynyl. [0022] Terminy "cykloalkil" i "karbocykliczny" dotyczy opcjonalnie

9 EP 2986615B1 podstawionych nasyconych lub nienasyconych monocyklicznych, bicyklicznych lub tricyklicznych grup węglowodorowych. Tam gdzie jest to odpowiednie grupa alkilowa może mieć określoną liczbę atomów węgla, na przykład C3-C6 cykloalkil oznacza grupę karbocykliczną mającą 3, 4, 5 lub 6 atomów węgla. Nieograniczające przykłady mogą obejmować cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklopentenyl, cykloheksyl, cykloheksenyl, cykloheksadienyl i podobne.

[0023] "Aryl" oznacza C6-C14 członowy monocykliczny, bicykliczny lub tricykliczny pierścieniowy układ karbocykliczny mający do 7 atomów w każdym pierścieniu, gdzie co najmniej jeden pierścień jest aromatyczny. Przykłady grup arylowych obejmują, ale nie wyłącznie, fenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, indanyl i bifenyl. Aryl może zawierać 1-3 pierścienie benzenowe. Jeśli obecne są dwa lub więcej pierścieni aromatycznych, wówczas pierścienie mogą być połączone razem, tak że przylegające pierścienie dzielą wspólne wiązanie. [0024] Każdy alkil, alkenyl, alkinyl, cykloalkil i aryl, czy to jako poszczególna jednostka czy jako część większej jednostki może opcjonalnie być podstawiony jednym lub więcej opcjonalnymi podstawnikami wybranymi z grupy składającej się z C1-6alkilu, C2-6alkenylu, C3-6cykloalkilu, okso (=O), -OH, -SH, C1-6alkiloO-,

C2-6,alkenyloO-, C3-6cykloalkiloO-, C1-6alkiloS-, C2-6alkenyloS-, C3-

6cykloalkiloS-, -CO2H, -CO2C16alkilu, -NH2, -NH(C1-6alkilu), -N(C1-6alkilu)2, -

NH(fenylu). -N(fenylu)2, -CN, -NO2, -halogenu, -CF3, -OCF3, -SCF3, -CHF2, -

OCHF2, -SCHF2, -fenylu, -Ofenylu, -C(O)fenylu,-C(O)C1-6alkilu. Przykłady odpowiednich podstawników obejmują, ale nie wyłącznie, metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, -winyl, metoksy, etoksy, propoksy, izopropoksy, butoksy, metylotio, etylotio, propylotio, izopropylotio, butylotio, hydroksy, hydroksymetyl, hydroksyetyl, hydroksypropyl, hydroksybutyl, fluoro, chloro, bromo, jodo, cyjano, nitro, -CO2H, -CO2CH3, trifluorometyl, trifluorometoksy, trifluorometylotio, difluorometyl, difluorometoksy, difluorometylotio, morfolino, amino, metyloamino, dimetyloamino; fenyl, fenoksy, fenylokarbonyl, benzyl i acetyl. [0025] Związki według wynalazku mogą być w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Jednak będzie docenione, że farmaceutycznie

10 EP 2986615B1 niedopuszczalne sole także wpadają w zakres wynalazku gdyż mogą one być użyteczne jako produkty pośrednie w przygotowaniu farmaceutycznie dopuszczalnych soli lub mogą być użyteczne w czasie przechowywania lub transportu. Odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują, ale nie wyłącznie, sole farmaceutycznie dopuszczalnych kwasów nieorganicznych takich jak kwasy chlorowodorowy, siarkowy, fosforowy, azotowy, węglowy, borowy, sulfaminowy i bromowodorowy lub sole farmaceutycznie dopuszczalnych kwasów organicznych takich jak kwasy octowy, propionowy, butanowy, winowy, maleinowy, hydroksymaleinowy, fumarowy, maleinowy, cytrynowy, mlekowy, śluzowy, glukonowy, benozesowy, bursztynowy, szczawiowy, fenylooctowy, metanosulfonowy, toluenosulfonowy, benzenosulfonowy, salicylowy, sulfanilowy, asparaginowy, glutaminowy, etylenodiaminotetraoctowy, stearynowy, palmitynowy, oleinowy, laurylowy, pantotenowy, taninowy, askorbinowy i walerianowy. [0026] Sole zasadowe obejmują, ale nie wyłącznie, te utworzone z farmaceutycznie dopuszczalnymi kationami takimi jak sód, potas, lit, wapń, magnez, amon i alkiloamon. [0027] Zasadowe zawierające azot grupy mogą być kwaternizowane za pomocą takich środków jak halogenki niższych alkili takich jak chlorki, bromki i jodki metylu, etylu, propylu i butylu; siarczany dialkilu jak siarczan dimetylu i dialkilu; i innych. [0028] Zostanie także rozpoznane, że związki według wynalazku mogą posiadać asymetryczne centra i dlatego też jest możliwe aby występowały w więcej niż jednej postaci stereoizomerycznej. Zatem wynalazek dotyczy także związków w zasadniczo czystej postaci izomerycznej w jednym lub więcej centrum asymetrycznym, np. większej niż około 90% ee, tak jak około 95% lub 97% ee lub większej niż 99% ee, jak również mieszaninach w tym ich mieszaninach racemicznych. Takie izomery można otrzymać przez wyizolowanie z naturalnych źródeł, za pomocą asymetrycznej syntezy na przykład wykorzystując chiralne produkty pośrednie lub przez chiralną rezolucję. Związek według wynalazku może istnieć w postaci izomerów geometrycznych. Wynalazek także dotyczy związków w zasadniczo czystych postaciach cis (Z) lub trans (E) lub ich mieszaninach.

11 EP 2986615B1

[0029] Związki według niniejszego wynalazku mogą być otrzymane przez wyizolowanie z rośliny lub części rośliny lub przez derywatyzację wyizolowanego związku lub przez derywatyzację powiązanego związku. [0030] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin “rana” dotyczy fizycznego przerwania ciągłości lub integralności struktury tkankowej. Rany mogą być ostre lub przewlekłe i obejmują rany cięte i skaleczenia, chirurgiczne nacięcia lub rany, nakłucia, obtarcia, zadrapania, rany uciskowe, abrazje, zatarcia, odleżynowe owrzodzenia (np. rany ciśnieniowe lub łóżkowe); rany termiczne (oparzenia ze źródeł zimna i ciepła), rany chemiczne (np. oparzenia kwasem lub zasadą) lub zakażenia patogenami (np. wirusowe, bakteryjne lub grzybicze) w tym otwarte i nienaruszone wrzody, wysypki skórne, plamy i trądzik, owrzodzenia, przewlekłe rany (w tym rany związane z cukrzycą takie jak owrzodzenia dolnej części nóg i owrzodzenia stóp, owrzodzenia żyły nogi i rany ciśnieniowe), miejsca przeszczepu skóry u dawcy i biorcy, schorzenia odpowiedzi immunologicznej, np. łuszczyca i egzema, owrzodzenia żołądka lub jelit, rany w jamie ustnej, w tym owrzodzenia ust, uszkodzona chrząstka lub kość, rany amputacyjne i zmiany rogówkowe. [0031] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin “przewlekła rana” dotyczy rany, która nie zagoiła się w normalnym okresie czasu gojenia się u innego zdrowego osobnika. Przewlekłe rany mogą być takimi, które nie goją się z powodu stanu zdrowia osobnika, na przykład, gdy u osobnika występuje słabe krążenie lub choroba taka jak cukrzyca lub gdy osobnik otrzymuje lek, który hamuje prawidłowy proces gojenia. Gojenie może być też zakłócone przez obecność zakażenia, takiego jak zakażenie bakteryjne, grzybicze lub pasożytnicze. W pewnych przypadkach przewlekła rana może pozostawać niezagojona przez tygodnie, miesiące lub nawet lata. Przykłady przewlekłych ran obejmują, ale nie wyłącznie, cukrzycowe owrzodzenia, rany ciśnieniowe i owrzodzenia tropikalne. [0032] Termin "pobudzenie gojenia rany” stosowany w niniejszym zgłoszeniu dotyczy poprawy gojenia rany w porównaniu do gojenia rany, które można zaobserwować w nieleczonej ranie. Pobudzenie gojenia rany obejmuje zwiększenie szybkości gojenia rany, na przykład, rana może się zagoić z szybkością to jest godziny, dni lub tygodnie szybciej niż wówczas, gdy rana

12 EP 2986615B1 pozostaje nieleczona. Pobudzenie gojenia rany może także obejmować zmniejszenie tkanki bliznowatej w gojeniu lub zagojonej ranie w porównaniu do tej, której spodziewa się gdy rana pozostaje nieleczona. [0033] Termin “gojenie rany” dotyczy odbudowy integralności tkankowej, albo częściowo albo w całości. [0034] Termin "zmniejszenie bliznowacenia” lub “zmniejszenie tkanki bliznowatej” do których odnosi się w niniejszym zgłoszeniu dotyczą polepszonego efektu kosmetycznego i/lub zmniejszonej nieprawidłowej tkanki spowodowanej przez gojenie rany w porównaniu do tego, gdy rana pozostaje nieleczona. W pewnych przykładach wykonania zmniejszenie tkanki bliznowatej obejmuje zmniejszenie lub zminimalizowanie nieprawidłowej tkanki, zmniejszenia lub zminimalizowanie zmian w pigmentacji skóry i/lub polepszenie ponownego wzrostu włosów w porównaniu do sytuacji gdy rana pozostaje nieleczona. [0035] Termin"związek epoksy-tiglianowy” dotyczy związku mającego jedną z następujących podstawowych węglowych struktur cyklicznych:

[0036] Związki mają układ tricyklo[9.3.0.0]tetradekanowy z połączonym pierścieniem cyklopropanowym przyłączonym do sześcioczłonowego pierścienia. Epoksyd jest przyłączony do siedmioczłonowego pierścienia w pozycji 5,6- lub 6,7. [0037] Termin "związek epoksy-tiglien-3-onu" dotyczy związku mającego strukturę epoksy-tiglianu zdefiniowaną powyżej gdzie pięcioczłonowy pierścień ma strukturę 1,2-en-3-onu:

13 EP 2986615B1

Sposoby gojenia ran [0038] W pierwszym aspekcie wynalazku dostarczony jest związek 5,6- lub 6,7- epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w pobudzaniu gojenia rany gdzie związek 5,6- lub 6,7-epoksy-tiglianu jest związkiem o wzorze (I):

gdzie

R1 oznacza wodór i R2 oznacza -OR17; lub R1 i R2 razem tworzą grupę karbonylową (=O);

R3 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R4 i R5 oznaczają niezależnie wodór lub -OR17; lub R4 i R5 razem tworzą wiązanie podwójne lub epoksydowe (-O-);

R6 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R7 oznacza -OH lub -OR-18;

R8 oznacza -OH lub -OR18; pod warunkiem, że R7 i R8 nie oznaczają oba OH;

14 EP 2986615B1

R9 i R10 są niezależnie wybrane z wodoru i C1-6alkilu;

R11 i R12 lub R12 i R13 razem tworzą epoksyd i pozostała grupa R11 i R13 oznacza wodór, -OH lub -OR17

R14 oznacza wodór lub -R17;

R15 oznacza wodór lub -R17;

R16 oznacza wodór lub -R17;

R17 oznacza wodór, -C1-6alkil, -C2-6alkenyl, -C2-6alkinyl, -C(O)C1-6alkil, -

C(O)C2-6alkenyl lub -C(O)C2-6alkinyl;

R18 oznacza C1-20alkil, -C2-20alkenyl, -C2-20alkinyl, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-

20alkenyl, -C(O)C2-20alkinyl, -C(O)cykloalkil, -C(O)C1-10alkilocykloalkil; -C(O)C2-

10alkenylocykloalkil, -C(O)C2-10alkinylocykloalkil, -C(O)aryl, -C(O)C1-

10alkiloaryl, -C(O)C2-10alkenyloaryl, -C(O)C2-10alkinyloaryl, -C(O)C1-

10alkiloC(O)R19, -C(O)C2-10alkenyloC(O)R19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)R19, -

C(O)C1-10alkiloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkenyloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-

10alkinyloCH(OR19)(OR19), -C(O)C1-10alkiloSR19, -C(O)C2-10alkenyloSR19, -

C(O)C2-10alkinyloSR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)OR19, -C(O)C2-

10alkenyloC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)OR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)SR19, -

C(O)C2-10alkenyloC(O)SR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)SR19,

lub

15 EP 2986615B1 zewnętrznych tkankach takich jak skóra. Rana może być wynikiem skaleczenia, ugryzienia lub oparzenia. Narządem lub tkanką może być jeden lub więcej spośród skóry, mięśnia, wątroby, nerek, płuc, serca, trzustki, śledziony, żołądka, jelit, pęcherza moczowego, jajników, jąder, macicy, chrząstki, ścięgna, więzadła, kości i podobnych. W szczególnych przykładach wykonania rana jest w skórze i/lub mięśniu. [0040] W pewnych przykładach wykonania związek epoksy-tiglianowy o wzorze (I) jest podawany wkrótce po tym jak pojawi się rana. W innych przykładach wykonania, raną jest przewlekła rana, która nie zagoiła się w ciągu dni, tygodni, miesięcy lub lat. W jeszcze innych przykładach wykonania raną jest istniejącą rana, która nie zagoiła się z prawidłową szybkością lub nie zagoiła się w związku z brakiem odpowiedzi na inne terapie. [0041] Związki o wzorze (I) mogą także być stosowane na ranę, która się goi lub zagoiła się z nadmiernym bliznowaceniem. Przykładami takich ran są te, które wytwarzają lub wytworzyły blizny keloidowe lub blizny hipertroficzne. [0042] W pewnych przykładach wykonania, rana jest zakażona bakteriami. Bakteryjne zakażenie może być spowodowane przez bakterie Gram dodatnie lub Gram ujemne, zwłaszcza bakterie Gram dodatnie. Nieograniczające przykłady bakterii, które są kontrolowane przez związki według wynalazku obejmują bakterie Rodzaju Pałeczki, takie jak B, subtilis. B. anthracis, B. cereus, B. firmis, B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus, B. coagulans, B. pantothenticus, B. alvei, B. brevis, B. circubins, B. laterosporus, B. macerans, B. polymyxa, B. stearothermophilus, B. thuringiensis i B. sphaericus; Gronkowce takie jak S. aureus, S. epidemlidis. S. haemolyticus, S. suprophyticus; Paciorkowce na przykład, S. pyrogenes. S. pneumoniae, S. alagactiae, S. dysgalactiae, S. equisimilis, S. equi, S. zooepidemicus, S. anginosus, S. salwarius, S. milleri, S. sanguis, S. mitior, S. mutans, S. faccalis, S. faecium, S. bovis, S. equinus, S. uberus i S. avium; Aerococcus spp.,Gemella spp., Corynehacterium spp., Listeria spp., Kurthia spp., Lactobacillus spp.. Erysipdothrix spp., Arachnia spp., Actinomyces spp., Propionibacterium spp., Rothia spp., Bifidobacterium spp., Clostridium spp., Eubacterium spp., Serratia spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Enterococcus spp., Pseudomonas spp., Nocardia spp. i Mycobacterium spp.

16 EP 2986615B1

[0043] W pewnych przykładach wykonania rana jest zakażona grzybami. Zakażenie grzybicze może być spowodowane przez grzyby nitkowate lub drożdże. Nieograniczające przykłady grzybów, które są kontrolowane przez związki według wynalazku obejmują grzyby Rodzaju takiego jak Aspergillus spp., Mucor spp., Trichiophylon spp., Cladosporium spp., Ulocladium spp., Curvularia spp., Aureobasidium spp., Candida albicans, Candida spp., Cryptococcus spp., Malessezia pachydermatis, Malessezia spp. i Trichosporon spp. [0044] W pewnych przykładach wykonania rana jest zakażona zarówno przez bakterie jak i grzyby, w tym w biofilmach. [0045] Osobnikiem mającym ranę, która ma zostać zagojona, może być jakikolwiek osobnik w tym ssaki, ptaki, ryby i gady. W pewnych przykładach wykonania osobnikiem jest człowiek, zwierzę domowe, zwierzę laboratoryjne, zwierzę rolne lub pracujące, ptak hodowlany, zwierzę wyścigowe lub uwięzione dzikie zwierzę takie jak te przechowywane w zoo. Przykłady odpowiednich osobników obejmują, ale nie wyłącznie, ludzi, psy, koty, króliki, chomiki, świnki morskie, myszy, szczury, konie, bydło, owce, kozy, jelenie, świnie, małpy, torbacze, kurczaki, gęsi, kanarki, papużki faliste, krokodyle, węże, jaszczurki i podobne. W szczególnych przykładach wykonania, osobnikiem jest ssak taki jak człowiek, pies, kot, koń, bydło, owca, koza, świnia, jeleń, szczur, świnka morska, kangur, królik lub mysz. [0046] W pewnych przykładach wykonania, podanie związku epoksy- tiglianowego o wzorze (I) pobudza gojenie rany przez zwiększenie szybkości gojenia rany. W pewnych przykładach wykonania podanie związku epoksy- tiglianowego o wzorze (I) pobudza gojenie przez zmniejszenie bliznowacenia lub ilości tkanki bliznowatej, która powstałaby przy braku leczenia. W pewnych przykładach wykonania, leczenie polepsza kosmetyczny wynik lub efekt lub wygląd rany gdy jest zagojona w tym poprawiając pigmentację skóry i polepszając ponowny wzrost włosów w porównaniu do rany, która nie była leczona. [0047] W szczególnych przykładach wykonania pobudzenia gojenia rany, leczenie korzystnie jest miejscowe lub dookoła miejsca lub stosowane wewnątrz zmiany aby zapewnić zlokalizowany efekt.

17 EP 2986615B1

[0048] “Skuteczna ilość” oznacza ilość potrzebną przynajmniej częściowo do uzyskania pożądanej odpowiedzi, na przykład inicjacji gojenia się rany albo zwiększenia szybkości gojenia się rany. Ilość różni się w zależności od zdrowia i stanu fizycznego osobnika, który ma być leczony, grupy taksonomicznej osobnika, który ma być leczony, preparatu kompozycji, oceny sytuacji medycznej i innych odpowiednich czynników. Oczekuje się, że ilość będzie we względnie szerokim zakresie, który może być wyznaczony za pomocą rutynowych badań. Skuteczna ilość w odniesieniu do człowieka może na przykład być w zakresie około 0.1 ng na kg masy ciała do 1 g na kg masy ciała na dawkę. Dawka korzystnie jest w zakresie 1µg do 1 g na kg masy ciała na dawkę, tak jak w zakresie 0.5 mg do 1 g na kg masy ciała na dawkę. W jednym przykładzie wykonania, dawka jest w zakresie 1 mg do 500 mg na dawkę. W innym przykładzie wykonania dawka jest w zakresie 1 mg do 250 mg na dawkę. W jeszcze innym przykładzie wykonania dawka jest w zakresie 1 mg do 100 mg na dawkę, tak jak do 50 mg na dawkę. W jeszcze innym przykładzie wykonania dawka jest w zakresie1 µg do 1 mg na kg masy ciała na dawkę. Schematy dawkowania mogą być wyregulowane tak aby dostarczyć optymalną terapeutyczną odpowiedź. Na przykład, kilka podzielonych dawek może być podawanych codziennie, co tydzień, co miesiąc lub w innych odpowiednich odstępach czasowych lub dawka może być proporcjonalnie zmniejszona jak wskazano przez pilną potrzebę sytuacji. [0049] W pewnych przykładach wykonania, związek epoksy-tiglianowy o wzorze (I) lub ekstrakt roślinny zawierający co najmniej jeden związek epoksy- tiglianowy o wzorze (I) może być podawany oddzielnie, albo jednocześnie albo po kolei, albo w tej samej kompozycji jako inny farmaceutycznie aktywny środek, który jest użyteczny do gojenia ran. Na przykład, związki epoksy- tiglianowe o wzorze (I) mogą być podawane w połączeniu z antybiotykiem i/lub środkiem przeciwzapalnym. Odpowiednie antybiotyki obejmują antybiotyki beta- laktamowe takie jak penicylina, ampicylina, amoksycylina, flukloksacylina, dikloksacylina, metacylina, karbenicylina i norocylina; cefalosporyny takie jak cefaleksyna, cefacetryl, cefadroksyl, cefaloglicyna, cefalonium, cefalorydyna, cefatryzyna, cefaklor, cefproksyl, cefunozam, cefmetazol, lorakarbef, cefminoks, cefdynir, cefpodoksym i cefpirom; karbapenemy takie jak imipenem,

18 EP 2986615B1 meropenem, ertapenem, daripenem, panipenem i biapenem; aminoglikozydy takie jak gentamycyna, streptomycyna, neomycyna, kanamycyna, wankomycyna, erytromycyna i azytromycyna; oksazolidynony takie jak linezolid i posizolid, linkozamidy takie jak klindamycyna, chinoliny takie jak kwas oksolinowy, ciprofloksacyna, enoksacyna, ofloksacyna, lomefloksacyna, lewofloksacyna i difloksacyna; i sulfonamidy takie jak sulfametoksazol, sulfoadiazyna i sulfacetamid lub mieszaniny takie jak amoksiklav (amoksycylina i kwas klawulonowy). Odpowiednie środki przeciwzapalne obejmuję niesteroidowe leki przeciwzapalne takie jak meloksykam, piroksykam, oksykam, aspiryna, difunizal, ibuprofen, deksibuprofen, naproksen, ketoprofen, indometacyna, tolmetyna, kwas mefenamowy, nimesulid i podobne i kortykosteroidy takie jak hydrokortyzon, prednizolon, metyloprednizolon, prednizon, budezonid, betametazon i deksametazon. [0050] Związki epoksy-tiglianowe o wzorze (I) mogą być stosowane w połączeniu z innymi leczniczymi sposobami gojenia ran takimi jak opatrunki i maści, balsamy i żele. Na przykład związki epoksy-tiglianowe mogą być stosowane w połączeniu z opatrunkami ze srebrem oraz opatrunkami, maśćmi, balsamami i żelami zawierającymi środki terapeutyczne takie jak jod, aloes, melonowiec lub medycznie aktywnymi miodami takimi jak miód manuka lub inne biologicznie lub fizjologicznie aktywne środki takie jak środki przeciwwirusowe, środki przeciwbakteryjne, środki przeciwgrzybicze i witaminy takie jak witamina A, C, D i E oraz ich estry. Związki epoksy-tiglianowe o wzorze (I) mogą być także stosowane w połączeniu z opatrunkami, które dostarczają ranie cząsteczkową strukturę. Takie opatrunki mogą obejmować polimerowe filmy i sieciowane filmy polimerowe takie jak kwas hialuronowy i powiązane struktury w tym sieciowany kwas hialuronowy. [0051] Związek epoksy-tiglianowy jest związkiem o wzorze (I):

19 EP 2986615B1

gdzie

R1 oznacza wodór i R2 oznacza -OR17; lub R1 i R2 razem tworzą grupę karbonylową (=O);

R3 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R4 i R5 oznaczają niezależnie wodór lub -OR17; lub R4 i R5 razem tworzą wiązanie podwójne lub epoksydowe (-O-);

R6 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R7 oznacza -OH lub -OR18;

R8 oznacza -OH lub -OR18; pod warunkiem, że R7 i R8 nie oznaczają oba -OH;

R9 i R10 są niezależnie wybrane z wodoru i C1-6alkilu;

R11 i R12 lub R12 i R13 razem tworzą epoksyd i pozostająca grupa R11 i R13 oznacza wodór, -OH lub -OR17;

R14 oznacza wodór lub -R17;

R15 oznacza wodór lub -R17;

R16 oznacza wodór lub -R17;

R17 oznacza wodór, -C1-6alkil, -C2-6alkenyl, -C2-6alkinyl, -C(O)C1-6alkil, -

C(O)C2-6alkenyl lub-C(O)C2-6alkinyl;

R18 oznacza C1-20alkil, -C2-20alkenyl, -C2-20alkinyl, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-

20alkenyl, -C(O)C2-20alkinyl, -C(O)cykloalkil, -C(O)C1-10alkilocykloalkil; -C(O)C2-

10alkenylocykloalkil -C(O)C2-10alkinylocykloalkil, -C(O)aryl, -C(O)C1-10alkiloaryl,

-C(O)C2-10alkenyloaryl, -C(O)C2-10alkinyloaryl, -C(O)C1-10alkiloC(O)R19, -

20 EP 2986615B1

C(O)C2-10alkenyloC(O)R19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)R19, -C(O)C1-

10alkiloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkenyloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-

10alkinyloCH(OR19)(OR19), -C(O)C1-10alkiloSR19, -C(O)C2-10alkenyloSR19, -

C(O)C2-10alkinyloSR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)OR19, -C(O)C2-

10alkenyloC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)OR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)SR19, -

C(O)C2-10alkenyloC(O)SR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)SR19,

lub

R19 oznacza wodór, -C1-10alkil, -C2-10alkenyl, -C2-10alkinyl, cykloalkil lub aryl; Gdzie każda grupa alkilowa, alkenylowa, alkinylowa, cykloalkilowa lub arylowa jest opcjonalnie podstawiona; lub jego geometrycznym izomerem lub stereoizomerem lub farmaceutycznie dopuszczalną solą. [0052] W pewnych przykładach wykonania, związkiem o wzorze (I) jest związek epoksy-tiglien-3-onu o wzorze (II):

gdzie R3, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 i R15 są jak zdefiniowano dla wzoru (I). [0053] W pewnych przykładach wykonania, związkiem o wzorze (I) lub (II) jest związek o wzorze (III):

21 EP 2986615B1

gdzie R7, R8, R11, R12, R13 i R15 są jak zdefiniowano dla wzoru (I). [0054] W określonych przykładach wykonania o wzorze (I), wzorze (II) lub wzorze (III) jeden lub więcej następujących ma zastosowanie:

R1 oznacza wodór i R2 oznacza OH lub -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenyl lub

-OC(O)C2-6alkinyl, lub R1 i R2 razem tworzą grupę karbonylową; zwłaszcza gdzie R1 i R2 razem tworzą grupę karbonylową;

R3 oznacza wodór lub -C1-3alkil, zwłaszcza -C1-3alkil, bardziej szczególnie metyl;

R4 oznacza wodór lub -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenyl lub -OC(O)C2-

6alkinyl i R5 oznacza wodór lub -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenyl lub -

OC(O)C2-6alkinyl; lub R4 i R5 razem tworzą wiązanie podwójne lub epoksydowe; zwłaszcza gdzie R4 i R5 razem tworzą wiązanie podwójne;

R6 oznacza wodór lub -C1-3alkil, zwłaszcza -C1-3alkil, bardziej szczególnie metyl;

R7 oznacza -OH, -OC(O)C1-15alkil -OC(O)C2-15alkenyl, -OC(O)C2-15alkinyl, -

OC(O)aryl gdzie grupa arylowa jest opcjonalnie podstawiona, -OC(O)C1-

15alkiloaryl, -OC(O)C1-10alkiloC(O)H, -OC(O)C2-10alkenylC(O)H, -OC(O)C1-

10alkiloC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-10alkenyloC(O)C1-6alkil, -OC(O)C1-

10alkiloCH(OC1-3alkilo)(OC1-3alkil), -OC(O)C2-10alkenyloCH(OC1-3alkilo)(OC1-

3alkil),-OC(O)C1-10alkiloSC1-6alkil, -OC(O)2-10alkenyloSC1-6alkil, -OC(O)C1-

10alkiloC(O)OC1-6alkil lub -OC(O)C2-10alkiloC(O)OC1-6alkil; zwłaszcza -OH, -

22 EP 2986615B1

OC(O)C1-15alkil, -OC(O)C2-12alkenyl,-OC(O)C2-12alkinyl, -OC(O)aryl gdzie grupa arylowa jest opcjonalnie podstawiona, -OC(O)C1-12alkiloaryl, -OC(O)C1-

6alkiloC(O)H, -OC(O)C2-6alkenyloC(O)H, -OC(O)C1-6alkiloC(O)C1-6alkil, -

OC(O)C2-6alkenyloC(O)C1-6alkil, -OC(O)C1-6alkiloCH(OC1-3alkilo)(OC1-3alkil), -

OC(O)C2-6alkenyloCH(OC1-3alkilo)(OC1-3alkil), -OC(O)C1-6alkiloSC1-3alkil, -

OC(O)C2-6alkenyloSC1-3alkil, -OC(O)C1-6alkiloC(O)OC1-3alkil lub -OC(O)C2-

6alkiloC(O)OC1-3alkil;

R8 oznacza -OC(O)C1-15alkil, -OC(O)C2-15alkenyl, -OC(O)C2-15alkinyl, lub - OC(O)aryl gdzie grupa arylowa jest opcjonalnie podstawiona, zwłaszcza -

OC(O)C1-10alkil, -OC(O)C2-10alkenyl, -OC(O)C2-10alkinyl lub -OC(O)aryl gdzie grupa arylowa jest opcjonalnie podstawiona; bardziej szczególnie -OC(O)C1-

10alkil, -C(O)C2-10alkenyl i -OC(O)aryl gdzie grupa arylowa jest opcjonalnie podstawiona;

R9 i R10 oznaczają niezależnie-C1-3alkil, zwłaszcza gdzie R9 i R10 oba oznaczają metyl;

R11 i R12 razem tworzą epoksyd i R13 oznacza -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-

6alkenyl lub-OC(O)C2-6alkinyl, zwłaszcza -OH lub -C(O)C1-3alkil; lub

R12 i R13 razem tworzą epoksyd i R11 oznacza -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-

6alkenyl lub-OC(O)C2-6alkinyl, zwłaszcza -OH; i

R14 oznacza wodór, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenyl lub -C(O)C2-6alkinyl, zwłaszcza wodór;

R15 oznacza wodór, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenyl lub-C(O)C2-6alkinyl, zwłaszcza wodór lub-C(O)C1-3alkil; i

R16 oznacza wodór, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenyl lub -C(O)C2-6alkinyl, zwłaszcza wodór. [0055] W szczególnych przykładach wykonania, związek epoksydowy jest wybrany z jednego z następujących związków w Tabelach 1 do 6:

23 EP 2986615B1

Tabela 1

Związek R1 R2 R3 R4 1 H H

2 H H

3 H H

4 H H

5 H H

6 H H

7 H H

8 H H

9 H H

24 EP 2986615B1

10 H H

11 H H

12 H H

13 H H

14 H H

15 H H

16 H H

17 H H

18 H H

19 -H H H

20 H H

25 EP 2986615B1

21 H H

22 H H

23 H H

25 H H

26 H H

27 H H

28 H H

41 H H

42 H H

43 H H

44 H H

26 EP 2986615B1

46 H H

47 H H

48 H H

49 H H

50 -CH3 H H

51 H H

52 -CH3 H H

53 -H H H

60 H H

27 EP 2986615B1

Tabela 2:

Związek R1 R2 24

Tabela 3:

Związek R1 R2 54

28 EP 2986615B1

Tabela 4:

Związek R1 R2 29

30 -H

29 EP 2986615B1

Tabela 5:

Związek R1 R2 37

30 EP 2986615B1

Tabela 6:

Związek R1 R2 38

[0056] Związki według niniejszego wynalazku mogą być w postaci czystego związku lub w postaci ekstraktu roślinnego. [0057] Gdy związki są oznaczone jako posiadające stereochemię, oznaczona stereochemia jest względną stereochemią i opiera się na znajomości szlaków biosyntetycznych i analizy chemicznej. [0058] W pewnych przykładach wykonania, ekstrakt roślinny jest z rośliny rodzaju Fontainea lub Hylandia, zwłaszcza gatunkiem jest Fontainea pancheri, Fontainea australis, Fontainea borealis, Fontainea fugax, Fontainea oraria, Fontainea picrosperma, Fontainea rostrata, Fontainea subpapuana, Fontainea venosa lub Hylandia dockrillii, zwłaszcza Fontainea picrosperma, Fontainea australis, Fontainea rostrata lub Hylandia dockrillii. [0059] Części rośliny mogą obejmować owoc, nasiono, korę, łodygę, liść, kwiat, korzenie, bielmo, owocnię i drewno, zwłaszcza gdy ekstrakt jest uzyskiwany z

31 EP 2986615B1 nasiona. [0060] Ekstrakty roślin mogą być otrzymane za pomocą standardowych sposobów, na przykład biomasa otrzymana z nasion, liści, owoców, bielma, owocni, łodygi lub kory rośliny jest poddawana początkowej ekstrakci rozpuszczalnikiem, takim jak polarny rozpuszczalnik, na przykład etanol. Początkowy ekstrakt jest następnie zatężany i rozcieńczany wodą i poddawany ekstrakcji drugim rozpuszczalnikiem na przykład octanem etylu. Próbki rozpuszczalnika z drugiej ekstrakcji są zbierane i poddawane rozdziałowi za pomocą preparatywnego frakcjonowania HPLC. Frakcje są analizowane za pomocą analitycznej HPLC i zbierane zgodnie z czasem retencji związków znajdujących się w próbkach. Zebrane frakcje są ważone, poddawane bioanalizie i analizowane za pomocą analitycznej HPLC. Dalsze frakcjonowanie przy zastosowaniu jednego lub więcej preparatywnych HPLC jest przeprowadzone aby wyizolować określone związki. Każdy związek jest poddawany bioanalizie i jego struktura jest identyfikowana za pomocą technik UV, NMR i spektrometrii masowej. [0061] Inne związki według wynalazku mogą być otrzymane przez derywatyzację związków izolowanych z roślin lub części roślin, zwłaszcza z rodzaju Fontainea, zwłaszcza z gatunków Fontainea picrosperma, zwłaszcza nasion Fontainea picrosperma. [0062] Pochodne naturalnych związków można otrzymać za pomocą technik znanych w dziedzinie. Na przykład grupy hydroksylowe mogą być utlenione do ketonów, aldehydów lub kwasów karboksylowych przez ekspozycję na środki utleniające takie jak kwas chromowy, odczynnik Jonesa, KMnO4, nadkwasy takie jak mCPBA (kwas metachloronadbenzoesowy) lub dioksyrany takie jak dimetylodioksyran (DMDO) i metylo(trifluorometylo)dioksyran (TFDO). Środki utleniające mogą być wybrane tak, że inne funkcjonalne grupy w cząsteczce są lub nie są także utleniane. Na przykład alkohol pierwszorzędowy może być wybiórczo utleniony do aldehydu do kwasu karboksylowego w obecności drugorzędowych alkoholi przy zastosowaniu odczynników takich jak

RuCl2(PPh3)3-benzen. Drugorzędowe alkohole mogą być wybiórczo utlenione do ketonów w obecności alkoholu pierwszorzędowego przy zastosowaniu Cl2-

32 EP 2986615B1 pirydyny lub NaBrO3-azotanu amonowo-cerowego. Alkohole mogą być utlenione w obecności podwójnych i potrójnych wiązań i bez epimeryzacji w przylegających stereocentrum przy zastosowaniu odczynnika Jonesa z lub bez Celitu (lub chlorku amonu). Alternatywnie, wybrane odczynniki mogą być mniej wybiórcze skutkując utlenieniem w więcej niż jednej grupie funkcyjnej. [0063] Grupy hydroksylowe mogą być także derywatyzowane przez eteryfikację lub acylację. Na przykład, etery mogą być przygotowane przez tworzenie jonu alkoholanowego w obecności zasady i poddania reakcji alkoholanu z odpowiednim halogenkiem alkilu, halogenkiem alkenylu, halogenkiem alkinylu lub halogenkiem arylu. Podobnie acylacja może być osiągnięta przez tworzenie jonu alkoholanu i reakcję z odpowiednim kwasem karboksylowym lub aktywowanym kwasem karboksylowym (takim jak bezwodnik lub chlorek acylowy). [0064] Grupy acylowe mogą być hydrolizowane aby dostarczyć alkohole za pomocą kwaśnej lub zasadowej hydrolizy znanej w dziedzinie i te alkohole mogą być dalej derywatyzowane jak powyżej. [0065] Ketony mogą być zredukowane do drugorzędowych alkoholi przez środki redukujące takie jak wodorek litowo-glinowy i inne wodorki metali bez redukowania wiązań podwójnych, w tym α-nienasyconych ketonów. [0066] Wiązania podwójne i wiązania potrójne mogą być zredukowane do wiązań pojedynczych przy zastosowaniu redukcji katalitycznej, na przykład

H2/Pd. Wiązania podwójne mogą także być utlenione do epoksydów przy zastosowaniu środków utleniających takich jak nadkwasy, na przykład mCPBA lub dioksyrany, takie jak DMDO i TFDO. Wiązania podwójne mogą także być poddane reakcjom addycji aby wprowadzić podstawniki takie jak grupy halo, hydroksy lub alkoksy. [0067] Znawca z dziedziny będzie w stanie wyznaczyć odpowiednie warunki do otrzymania pochodnych wyizolowanych związków, na przykład przez odniesienie do tekstów dotyczących syntetycznej metodologii, przykładów, którymi są Smith M.B. and March J., March's Advanced Organic Chemistry, Piąte Wydanie, John Wiley & Sons Inc., 2001 and Larock R.C., Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Ltd., 1989. Ponadto wybiórcze

33 EP 2986615B1 manipulacje grup funkcyjnych mogą wymagać zabezpieczenia innych grup funkcyjnych. Odpowiednie grupy zabezpieczające aby zapobiec niepożądanym reakcjom ubocznym są dostarczone w Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons Inc., 3-cie Wydanie, 1999. Związki według Wynalazku [0068] W innym aspekcie wynalazku, dostarczone są nowe związki obejmujące: 12-heksanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 5); 12-acetylo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-on (Związek 6); 12-propanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 7); 12-butanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy- 1-tiglien-3-on (Związek 8); 12-[(2E,4E)-(6,6-dimetoksyheksa-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 9); 12-[(2E,4E)-6-oksoheksa-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 10); 12-[(2E,4E)-6,7-dihydroksydodeka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 11); 12-[(2E)-4,5-dihydroksy-deka-2-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 12); 12-tigloilo-13-(2-metylopropanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-on (Związek 13); 12-[(2E)-3-metylotioprop-2-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 14); 12-(2-metyloprop-2-enoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 15); 12-[(2E,4E)-heksa-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 16); 12-[(2E,4E)-8-oksododeka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 17); 12-[(2Z,4E)-deka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-

34 EP 2986615B1

4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 18); 13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 19); 12-[(2E)-but-1-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 20); 12-tigloilo-13-butanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 21); 12-(3-butenoilo)-13-nonanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-on (Związek 22); 12-benzoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy- 1-tiglien-3-on (Związek 23); 12-[(2Z,4E)-deka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylopropanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 25); 12-[(2E,4E)-6,7-(anty)-epoksy-dodeka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 26); 12,13-dibutanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 27); 12-benzoilo-13-butanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- on (Związek 28); 12-tigloilo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-on (Związek 29); 13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 30); 12-acetylo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-on (Związek 31); 12,13-di-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- on (Związek 32); 12-propanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 33); 12-heksanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 34); 12-tigloilo-13-(2-metylopropanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-on (Związek 35);

35 EP 2986615B1

12-[(2E)-3-metylotioprop-2-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy- 4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 36); 12-{[2-(metylosulfanylo)karbonylo]-acetoilo}-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy- 4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 39); 12-[(2-metoksykarbonylo)-acetoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy- 4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 40); 12,13-di-nonoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 41); 12,13-di-heksanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 42); 12,13-di-pentanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 43); 12,13-di-tigloilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 44) 5,20-diacetylo-12-tigloilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 45); 12,13-di-(2E,4E)-heks-2,4-enoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-on (Związek 46); 12-heksanoilo-13-[2-(N-metyloantraniloilo)]-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 47) 12-acetylo-1,3-[2-(N-metyloantraniloilo)]-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 48); 12,13-di-heptanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 49); 12-mirystoilo-13-acetylo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- on (Związek 50); 12-mirystoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy- 1-tiglien-3-on (Związek 51); 12-(2-metylobutanoilo)-13-acetylo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-on (Związek 52); i 13-heksanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on (Związek 53); 12,13-di-(3-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,1-tiglien-3-on (Związek 60)

36 EP 2986615B1

Lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól. [0069] W jeszcze innym aspekcie wynalazku którykolwiek ze związków 5 do 53 lub 60 lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól może występować w postaci farmaceutycznej kompozycji z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozpuszczalnikiem i/lub substancją pomocniczą. Kompozycje [0070] Podczas gdy związki epoksy-tiglianowe o wzorze (I) lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole mogą być podawane czyste, bardziej dogodne może być podanie związków epoksy-tiglianowych w postaci farmaceutycznej kompozycji razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem i/lub substancją pomocniczą. [0071] Postać i szybkość dawkowania do zastosowania farmaceutycznego i kompozycje mogą być z łatwością możliwe do wyznaczenia przez znawcę z dziedziny. [0072] Postacie dawkowania obejmują tabletki, rozproszenia, zawiesiny, wstrzyknięcia, roztwory, syropy, pastylki, kapsułki, czopki, aerozole, plastry przezskórne, impregnowane (okluzyjne) opatrunki, kremy, żele i podobne. Te postacie dawkowania mogą także obejmować urządzenia do wstrzyknięć lub implantacji zaprojektowane specjalnie do lub zmodyfikowane do kontrolowanego uwalniania farmaceutycznej kompozycji. Kontrolowane uwalnianie środka terapeutycznego może być osiągnięte przez jego powlekanie, na przykład hydrofobowymi polimerami obejmującymi akrylowe żywice, woski, wyższe alkohole alifatyczne, kwasy polimlekowy i poliglikolowy i określone pochodne celulozowe takie jak hydroksypropylometyloceluloza. Dodatkowo kontrolowane uwalnianie może być osiągnięte przez zastosowanie innych matryc polimerowych, liposomów i/lub mikrosfer. [0073] Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i dopuszczalne nośniki do podania ogólnego mogą także być wprowadzone do kompozycji według tego wynalazku. [0074] Odpowiednio, farmaceutyczna kompozycja zawiera farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą lub dopuszczalną substancję pomocniczą. Przez “farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą” rozumie się stały lub ciekły wypełniacz, rozcieńczalnik lub substancje

37 EP 2986615B1 kapsułkującą, które mogą być bezpiecznie stosowane. W zależności od określonej drogi podania mogą być stosowane różne nośniki dobrze znane w dziedzinie. Te nośniki lub substancje pomocnicze mogą być wybrane z grupy obejmującej cukry, skrobie, celulozę i jej pochodne, słód, żelatynę i inne środki żelujące, talk, siarczan wapnia, oleje roślinne, oleje syntetyczne, alkohole i/lub poliole, kwas alginowy, roztwory buforowane fosforanem, emulgatory, izotoniczny roztwór soli fizjologicznej i wodę wolną od pirogenów. [0075] Może być zastosowana jakakolwiek odpowiednia droga podania dla dostarczenia człowiekowi lub pacjentowi niebędącemu człowiekiem farmaceutycznej kompozycji według wynalazku. Na przykład mogą być zastosowane drogi doustna, miejscowa, doodbytnicza, pozajelitowa, podjęzykowa, podpoliczkowa, dożylna, dostawowa, domięśniowa, śródskórna, podskórna, przez inhalację, do gałki ocznej, dootrzewnowa, dokomorowa, przezskórna i podobne. [0076] Farmaceutyczne kompozycje według niniejszego wynalazku odpowiednie do podania mogą występować w oddzielnych jednostkach takich jak strzykawki, fiolki, rurki, kapsułki, saszetki lub tabletki każda zawierająca wcześniej określoną ilość jednego lub więcej farmaceutycznie aktywnych związków lub ekstraktów według wynalazku, w postaci proszku lub granulek lub w postaci roztworu lub zawiesiny w wodnej cieczy, roztworze cyklodekstryn, niewodnej cieczy, emulsji olej w wodzie lub emulsji woda w oleju lub w postaci roztworu lub zawiesiny w kremie lub żelu lub w postaci zawiesiny mikro- lub nanocząstek wprowadzających związek według wynalazku, w tym, ale nie wyłącznie, mikro- lub nanocząstek krzemionki lub polilaktydu. Takie kompozycje mogą być przygotowane za pomocą jakiegokolwiek sposobu z dziedziny farmacji ale wszystkie sposoby obejmują etap połączenia jednego lub więcej farmaceutycznie aktywnych związków według wynalazku z nośnikiem, który stanowi jeden lub więcej potrzebnych składników. Ogólnie, kompozycje są przygotowywane przez równomierne i dokładne zmieszanie środków według wynalazku z ciekłymi nośnikami lub drobno podzielonymi stałymi nośnikami lub oboma a następnie, jeśli jest to konieczne, ukształtowanie produktu do pożądanego wyglądu. [0077] W proszkach, nośnik jest drobno podzielonym ciałem stałym, który jest w

38 EP 2986615B1 połączeniu z drobno podzielonym aktywnym składnikiem. [0078] W tabletkach, aktywny składnik jest zmieszany z nośnikiem mającym wymaganą zdolność wiązania w odpowiednich proporcjach i zbite w pożądany kształt i wielkość. [0079] Odpowiednie nośniki dla proszków i tabletek obejmują węglan magnezu, stearynian magnezu, talk, cukier, laktozę, pektynę, dekstrynę, skrobię, żelatynę, tragakantę, metylocelulozę, karboksymetylocelulozę sodową, woski o niskiej temperaturze topnienia, masło kakaowe, i podobne. Termin “preparat” ma obejmować formulację aktywnego związku z materiałem kapsułkującym jako nośnikiem dostarczającym kapsułkę, w której aktywny składnik, z lub bez nośników, jest otoczony przez nośnik, który w ten sposób występuje w połączeniu z nim. Podobnie zawarte są kachetki i pastylki. Tabletki, proszki, kapsułki, pigułki, kachetki i pastylki mogą być stosowane jako stałe postacie odpowiednie do podania doustnego. [0080] Do przygotowania czopków, wosk o niskiej temperaturze topnienia, taki jak mieszanina glicerydów kwasów tłuszczowych lub masło kakaowe, jest najpierw topiony i aktywny składnik jest w nim homogenicznie rozpraszany na przykład przez mieszanie. Stopiona homogeniczna mieszanina jest następnie wylewana do form o dogodnym kształcie, pozostawiona do schłodzenia i przez to do zestalenia. [0081] Preparaty odpowiednie do podania dopochwowego mogą występować jako krążki, tampony, kremy, żele, pasty, pianki lub spreje zawierające oprócz aktywnego składnika takie nośniki, które są znane w dziedzinie jako odpowiednie. [0082] Ciekłe postacie preparatów obejmują roztwory, zawiesiny i emulsje na przykład wodę lub roztwory woda-glikol propylenowy. Na przykład pozajelitowe ciekłe preparaty do wstrzyknięć mogą być wytworzone jako roztwory w wodnym 1,2-propanodiolu, dimetylosulfotlenku (DMSO), wodne roztwory gamma cyklodekstryny lub 2-hydroksypropylo-beta-cyklodekstryny, roztwór soli fizjologicznej lub roztwór glikolu polietylenowego, z lub bez buforu. Preferowanym zakresem pH jest 3.5-4.5. Odpowiednie bufory buforują preparat przy pH 3.5-4.5 i obejmują, ale nie wyłącznie, bufor octanowy i bufor cytrynianowy.

39 EP 2986615B1

[0083] Związki o wzorze (I) mogą dzięki temu być utworzone do podania pozajelitowego (np. przez wstrzyknięcie, na przykład bolus lub ciągły wlew) i mogą występować w postaci dawki jednostkowej w ampułkach, wcześniej wypełnionych strzykawkach, wlewach o małej objętości lub w wielodawkowych pojemnikach, do których dodano środek konserwujący. Kompozycje mogą przyjąć takie postacie jak zawiesiny, roztwory lub emulsje w olejowych lub wodnych nośnikach i mogą zawierać środki formułujące takie jak zawieszające, stabilizujące i/lub rozpraszające. Alternatywnie, aktywny składnik może być w postaci proszków, otrzymanych przez aseptyczną izolację jałowego ciała stałego lub przez liofilizację z roztworu dla odtworzenia z odpowiednim nośnikiem, np. jałową, wolną od pirogenów wodą, przed zastosowaniem. [0084] Wodne roztwory odpowiednie do stosowania doustnego mogą być przygotowane przez rozpuszczenie aktywnego składnika w wodzie i dodanie barwników, aromatów, środków stabilizujących i zagęszczających, jeśli jest to pożądane. [0085] Wodne zawiesiny odpowiednie do stosowania doustnego mogą być wytworzone przez rozproszenie drobno podzielonego aktywnego składnika w wodzie z lepkim materiałem takim jak naturalne lub syntetyczne gumy, żywice, metyloceluloza, karboksymetyloceluloza sodowa lub inne dobrze znane środki zawieszające. [0086] Także zawarte są stałe postacie preparatów, które mają być przekształcone na krótko przed zastosowaniem w ciekłe postacie preparatów do podania doustnego. Takie ciekłe postacie obejmują roztwory, zawiesiny i emulsje. Te preparaty mogą zawierać oprócz aktywnego składnika, barwniki, aromaty, stabilizatory, bufory, sztuczne i naturalne słodziki, substancje rozpraszające, zagęszczające, solubilizujące i podobne. [0087] Do podania miejscowego na skórę lub inny narząd, związki zgodnie z wynalazkiem mogą być wytworzone w postaci żeli, maści, emulsji, past, kremów lub balsamów lub w postaci plastra przezskórnego. Żele mogą być wytworzone przy zastosowaniu odpowiednich środków zagęszczających a następnie dodanie ich do wodnych/alkoholowych kompozycji związku. Odpowiednie środki zagęszczające lub żelujące są znane w dziedzinie, takie jak poliwinylokarboksypolimer, Karbomer 940. Maści i kremy mogą na przykład być

40 EP 2986615B1 wytworzone z wodną lub olejową bazą z dodatkiem odpowiednich środków zagęszczających i/lub żelujących. Balsamy mogą być wytworzone z wodną lub olejową bazą i na ogół będą także zawierały jeden lub więcej emulgatorów, środków stabilizujących, środków rozpraszających, środków zawieszających, środków zagęszczających lub środków barwiących. [0088] Preparaty odpowiednie do podania miejscowego także obejmują roztwory lub zawiesiny, które mogą być podawane miejscowe w postaci roztworów do kąpieli lub namoczenia lub spreju. Te preparaty mogą być odpowiednio stosowane do zwalczania podrażnień skórnych, ukąszeń owadów i ran na stopach. [0089] Preparaty odpowiednie do podania miejscowego do ust obejmują pastylki zawierające aktywny środek w aromatyzowanym podłożu, zazwyczaj sacharozie i akacji lub tragakancie; pastylki zawierające aktywny składnik w obojętnym podłożu takim jak żelatyna i gliceryna lub sacharoza i akacja; i płyny do ust zawierające aktywny składnik w odpowiednim ciekłym nośniku. [0090] Roztwory lub zawiesiny są podawane bezpośrednio do jamy nosowej za pomocą konwencjonalnych sposobów, na przykład za pomocą zakraplacza, pipety lub spreju. Preparaty mogą być dostarczone w postaci pojedynczej dawki lub wielu dawek. W ostatnim przypadku zakraplacza lub pipety, może to być osiągnięte przez podanie pacjentowi odpowiedniej, wcześniej określonej objętości roztworu lub zawiesiny. W przypadku spreju, może to zostać osiągnięte na przykład przez pompę z odmierzającym rozpylaczem atomizerowym. Aby polepszyć dostarczanie donosowe i retencję związki zgodnie z wynalazkiem mogą być zamknięte w kapsułkach z cyklodekstrynami lub wytworzone z ich środkami, które przewiduje się, że wzmocnią dostarczanie i retencję w śluzówce nosa. [0091] Podanie do przewodu oddechowego może być także osiągnięte za pomocą preparatu aerozolu, w którym aktywny składnik jest dostarczany w opakowaniu pod ciśnieniem z odpowiednim propelentem takim jak chlorofluorowęgiel (CFC) na przykład dichlorodifluorometan, trichlorofluorometan, lub dichlorotetrafluoroetan, dwutlenek węgla lub inny odpowiedni gaz. Aerozol może dogodnie także zawierać środek powierzchniowo czynny taki jak lecytyna. Dawka leku może być kontrolowana

41 EP 2986615B1 przez dostarczenie zaworu odmierzającego. [0092] Alternatywnie, aktywny składnik może być dostarczony w postaci suchego proszku, na przykład proszkowej mieszaniny związku o wzorze (I) w odpowiednim proszkowym podłożu takim jak laktoza, skrobia, pochodne skrobii takie jak hydroksypropylometyloceluloza i poliwinylopirolidon (PVP). [0093] Dogodnie, nośnik proszkowy utworzy żel w jamie nosowej. Proszkowa kompozycja może występować w postaci dawki jednostkowej na przykład w kapsułkach lub wkładach np. żelatynowych lub blistrach, z których proszek może być podawany za pomocą inhalatora. [0094] W preparatach przeznaczonych do podania do przewodu oddechowego, w tym w preparatach donosowych, związek na ogół będzie miał cząstki o małej wielkości na przykład rzędu 1 do 10 mikronów lub mniej. Taka wielkość cząstki może być otrzymana za pomocą sposobów znanych w dziedzinie na przykład przez mikronizację. [0095] Wynalazek zostanie teraz opisany w odniesieniu do następujących Przykładów, które ilustrują pewne korzystne aspekty niniejszego wynalazku. Jednak będzie zrozumiałe, że szczegółowość następującego opisu wynalazku nie ma zastępować powszechności powyższego opisu wynalazku. Krótki Opis Figur [0096] Figura 1 jest fotograficznym przedstawieniem zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie w ludzkich noworodkowych fibroblastach traktowanych kontrolą tylko nośnikiem, 24 godziny po zadrapaniu. Figura 2 jest fotograficznym przedstawieniem zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie w ludzkich noworodkowych fibroblastach traktowanych 30 ng/mL Związkiem 1, 24 godziny po zadrapaniu. Figura 3 jest graficznym przedstawieniem analizy inwazji na podłożu Matrigel ludzkich noworodkowych fibroblastów traktowanych 10 ng/mL lub 30 ng/mL Związkiem 1 w porównaniu do traktowanych kontrolą tylko nośnikiem. Komórki zliczono po 24 godzinach inkubacji * p < 0.05; *** p < 0.001. Figura 4 jest analizą Western blot ludzkich noworodkowych fibroblastów traktowanych Związkiem 1 i przedstawia aktywację a następnie zmniejszenie aktywności kluczowych cząsteczek sygnałowych biorących udział w naprawie i

42 EP 2986615B1 gojeniu rany. Figura 5 jest fotograficznym przedstawieniem wpływów ekspozycji fibroblastów (hodowanych w obecności TGF-β1) na zakres stężeń Związku 1 na różnicowanie miofibroblastów, charakteryzujących się zwiększoną ekspresją α- aktyny mięśni gładkich i tworzeniem włókien naprężeniowych. Figura 6 jest fotograficznym przedstawieniem wpływów ekspozycji fibroblastów (hodowanych w obecności TCF-β1) na zakres stężeń Związku 37 na różnicowanie miofibroblastów, charakteryzujących się zwiększoną ekspresją α- aktyny mięśni gładkich i tworzeniem włókien naprężeniowych. PRZYKŁADY Przykład 1: Ekstrakty roślinne [0097] Wszystkie ekstrakty roślinne przygotowano przez posiekanie materiału roślinnego i ekstrakcję etanolem w stosunku około 1 część materiału roślinnego na 2 do 5 części etanolu (wag./wag.). Ekstrakt pozostawiono do odstania na całą noc w 4°C a następnie supernatant zlano i przechowywano w 4°C aż do zastosowania. [0098] Obecność związków epoksy-tiglianowych w roślinnych ekstraktach potwierdzono za pomocą LCMSMS wykorzystując Shimadzu HPLC sprzężoną z ABI3200 spektrometrem masowym z potrójnym kwadrupolem. Kolumnę C18 z haloamidem zastosowano do rozdzielenia związków w mieszaninie, wykorzystując mieszaniny acetonitryl/woda jako układ rozpuszczalników. [0099] Większość próbek była poddana sposobowi KinC18Gen przy zastosowaniu kolumny C18 Kinetix 4.6 mm x 100 mm 2.6 mikrona: Acetonitryl 55% 60% 75% 100% 100% 55%

Minuty: 0 2.5 15 15.1 17.5 17.6

[0100] Niektóre z próbek zostały poddane sposobowi Amide Long przy zastosowaniu kolumny z haloamidem RP 4.6 mm x 150 mm, 2.7 mikrona, od Advanced Materials Technology: Acetonitryl: 45% 58% 95% 95% 45% 45%

Minuty: 0 13 20 24 24.1 27

43 EP 2986615B1

Przykład 2: Izolacja i wyjaśnienie związków epoksy-tiglianowych. [0101] Związki oczyszczono z nasion Fontainea picrosperma za pomocą ekstrakcji i chromatografii na żelu krzemionkowym a następnie preparatywnej HPLC ( Kolumna C18, kombinacje rozpuszczalników metanol/woda) przy zastosowaniu ogólnych sposobów opisanych poniżej. [0102] Około 1-2 kg materiału roślinnego (liście, owoce, nasiona, łodygi, korzenie roślin, kora lub drewno) jest drobno siekane, ekstrahowane 2 częściami etanolu (wag./obj.) trzy razy, ekstrakty są łączone, odparowywane a pozostałość rozdzielana między wodę i niemieszalny organiczny rozpuszczalnik (zwykle spirytus naftowy bp 40-60 (PE) lub octan etylu EtOAc). Pozostałość z odparowania organicznego rozpuszczalnika jest poddana chromatografii na żelu krzemionkowym w mieszaninie rozpuszczalników o wzrastającej polarności, rozpoczynając od PE lub heptanu i przechodząc do EtOAc a następnie metanolu. Frakcje z żelu krzemionkowego są następnie oczyszczane za pomocą preparatywnej HPLC na kolumnach C18 zwykle przy zastosowaniu gradientów metanol-woda. Ostatnie frakcje są analizowane pod katem bioaktywności, zbierane zgodnie z czasem retencji związków stwierdzonych za pomocą analitycznej HPLC i poddane dalszej preparatywnej HPLC aby uzyskać czyste związki. Każdy związek jest poddany analizie biologicznej i jego struktura jest potwierdzana za pomocą technik UV, NMR i spektrometrii masowej. Związek 1: 12-tigloilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0103]

44 EP 2986615B1

1 [0104] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.3 Hz), 1.11 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.21 (3H (16), s), 1.24 (3H (17), s), 1.26 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.43 (1H (3"), m, J=14.1, 7.3, 7.2 Hz), 1.69 (1H (3"). m), 1.73 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 1.77 (3H (4'), dd, J=7.1, 1.2 Hz), 1.8 (3H (5'), d, J=1.5 Hz), 1.94 (1H (11), m), 2.37 (1H (2"), qt, J=7.0, 6.8 Hz), 3.17 (1H (8), d), 3.26 (1H (7), s), 3.69 (1H, OH, br.s), 3.80. (1H (20), d. J=12.7 Hz), 3.83 (1H (20), d, J=12.2.Hz), 4.06 (1H (10), t, J=2,7 Hz), 4.22 (1H (5), s), 5.42 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 6.02 (1H, OH, br.s). 6.79 (1H (3'), m, J=7.2, 7.0, 1.2 Hz), 7.71 (1H, (1), dd). 13 [0105] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 12.2 (5'), 14.4 (4'), 15.1 (18), 16.1 (5"), 17.2 (16), 23.6 (17), 26.1 (3"), 26.6 (15), 36.0 (8), 36.1 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 48.9 (10,) 61.8 (6), 64.6 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.3 (5), 72.4 (4), 76.7 (12), 77.2 (9), 128.4 (2'), 133.4 (2), 137.6 (3'), 164.7 (1), 167.4 (1'), 178.9 (1"), 209.9 (3). Związek 2: 12,13-di-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5.9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0106]

45 EP 2986615B1

1 [0107] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.89 (3H (4"), J=73Hz), 0.91 (3H (4'), t. J=7.8 Hz), 1.11 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.12 (3H (5'), d, J=6.8 Hz), 1.21 (3H (17), s), 1.22 (3H (16), s), 1.26 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.44 (1H (3'), td, J=13.9, 7.3 Hz), 1.44 (1H (3"), td, J=13.9, 7.3 Hz), 1.63 (1H (3') dd, J=7.8, 5.9 Hz), 1.69 (1H (3"), dd, J=13.9, 7.1 Hz), 1.74 (3H (19), dd, J=2.7, 1.2 Hz), 1.90(1H (11), dd, J=10.0, 6.6 Hz), 2.36 (1H (2'), q, J=7.0 Hz), 2.36 (1H (2"), q, J=7.0 Hz). 3.16 (1H (8), d. J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.61 (1H (OH). m), 3.78 (1H (20), m, J=12.7 Hz), 3.85 (1H (20), d, J=12.2 Hz), 4.06 (1H (10), t, J=2.7 Hz), 4.22 (1H (5), s), 5.40 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 5.98 (1H (9- OH), m), 7.71 (1H (1). dd, J=2.4, 1.5 Hz), 13 [0108] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4'), 11.6 (4"), 15.0 (18). 16.1 (5"), 170 (5'), 17.2 (17), 23.7 (16), 26.2 (3"), 26.5 (15), 26.7 (3'), 36.0 (8), 36.0 (14), 41.2 (2"), 41.8 (2'), 45.5 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.2 (12), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.7 (1), 175.9 (1'), 178.8 (1"), 209.9 (3), Związek 3: 12-[(2E,4E,6E)-dodeka-2,4,6-trienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)- 6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0109]

46 EP 2986615B1

1 [0110] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d, J=7.0 Hz), 0.87 (3H (12'), m. J=7.0 Hz). 0.92 (3H (4"), t. J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.24 (3H (16), s), 1.26 (2H (10'), m), 1.27 (1H (14), m), 1.29 (2H (11'), m), 1.39 (2H (9'), m), 1.45 (1H (3"), dd, J=14.1, 7.0 Hz), 1.71 (1H (3"), m), 1.74 (3H (19), dd, J=2.8, 1.2 Hz), 1.95 (1H (11), dq), 2.12 (2H (8'), q), 2.38 (1H (2"), sxt, J=7.0 Hz), 3.17 (1H (8), d, J=6.7 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.57 (1H, (4- OH), s), (3.78 (1H (20), m), 3.86 (1H (20), m), 4.06 (1H (10), d, J=2.7 Hz), 4.22 (1H (5), s), 5.41 (1H (12), d), 5.79 (1H (2'), d, J=15.2 Hz), 5.92 (1H (7'), dt, J=15.2, 7.2 Hz), 6.04 (1H (OH), m), 6.11 (1H (6'), dd, J=15.1, 10.7 Hz), 6.19 (1H (4'), dd, J=14.8, 11.2 Hz). 6.51 (1H (5'), dd, J=14.9, 1.0.7 Hz), 7.23 (1H (3'), dd, J=15.5, 1.0.9 Hz), 7.72 (1H (1), dd, J=2.4. 1.3 Hz). 13 [0111] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (12'), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16), 22.5 (11'), 23.6 (17), 26.2 (3"), 26.7 (15), 28.6 (9'), 31.4 (10'), 33.0 (8'), 36.0 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 48.9 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.6 (5), 72.4 (4), 76.7 (9), 77.1 (12), 119.5 (2'), 127.5 (4'), 129.7 (6'), 133.5 (2), 141.1 (7'), 141.7 (5'), 145.3 (3'), 164.8 (1), 166.6 (1'), 170.0 (1"), 210.0 (3). Związek 4: 12-[(2E,4Z)-deka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0112]

47 EP 2986615B1

1 [0113] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.87 (3H (10'), s), 0.93 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.13 (3H (5"), d. J=7.1 Hz), 1.23 (3H (16), s), 1.25 (3H (17), s), 1.27 (1H (14), d, J=1.6 Hz), 1.27 (2H (9'), m), 1.30 (2H (8'), m), 1.40 (2H (7'), m), 1.46 (1H (3"), dd, J=14.2, 6.9 Hz), 1.71 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.95 (1H (11), d, J=3.3 Hz), 2.11 (1H (20-OH), m), 2.26 (2H (6'), m), 2.38 (1H (2"), q, J=7.0 Hz), 3.18 (1H (8), d, J=6.6 Hz), 3.28 (1H (7), s), 3.53 (1H (4-OH), d, J=0,9 Hz), 3.77 (1H (20), m), 3.81 (1H (5-OH), d, J=2.9 Hz), 3.87 (1H (20), dd, J=12.4, 7.6 Hz), 4.06 (1H (10), d, J=2.7 Hz), 4.22 (1H (5), d, J=1.7 Hz), 5.43 (IH (12), d, J=9.9 Hz), 5.83 (1H (2'), d, J=15.2 Hz), 5.86 (1H (5'), ddd, J=10.8, 7.9, 7.8 Hz), 6.03 (1H (9-OH), m), 6.10(1H (4'), td, J=11.2, 0.7 Hz), 7.56 (1H (3'), ddd, J=15.3, 11.7, 1.1 Hz), 7.72 (1H (1), dd. J=2.5, 1.4 Hz). 13 [0114] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (10'), 15.2 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 22.5 (9'), 23.7 (16), 26.2. (3"), 26.7 (15), 28.3 (6'), 29.0 (7'), 31.4 (8'), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 76.8 (12), 77.1 (9), 120.8 (2), 126.4 (4'), 133.5 (2), 140.0 (3'), 142.2 (5'), 164.8 (1), 166.6 (1'), 179.0 (1"), 210.0 (3). Związek 5: 12-heksanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on

48 EP 2986615B1

[0115]

1 [0116] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.5 Hz), 0.87 (3H (6'),t, J=7.0 Hz), 0.91 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.11 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.21, (3H (16), s), 1.21, (3H (17), s), 1.25 (1H (14), d, J=6.6 Hz), 1.43 (1H (3"), m, J=14.1, 7.4, 7.1 Hz), 1.60 (2H (3'), quin, J=7.4 Hz), 1.70 (1H (3"), ddd, J=13.9, 7.3, 7.1 Hz), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.9 (1H (11), dq, J=10.0, 6.5 Hz), 2.27 (2H (2'), dt, J=7.4, 3.7 Hz), 1.29 (2H (4'), m, J=7.5, 7.2, 3.9 Hz), 1.29 (2H (5'), m, J=7.5, 7.2, 3.9 Hz), 2.36 (1H (2"), sxt, J=7.0 Hz), 3.14 (1H (8), d, J=6.6 Hz), 3.25 (1H (7), s), 3.64 (1H, (OH), s), 3.83 (1H (OH), dd, J=12.5, 7.9 Hz), 3.79 (2H (20), dd, J=12.5, 5.7 Hz), 3.94, (1H (OH), d, J=2.5 Hz), 4.06 (1H (10), t, J=2.6 Hz), 4.22 (1H (5), s), 5.37 (1H (12), d, J=10.0 Hz), 5.95 (1H (OH), br. s.) 7.7 (1H (1), dd, J=2.4, 1.3 Hz). 13 [0117] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 13.9 (6'), 15.0 (18), 16.1 (5"), 17.1 (16), 22.3 (5'), 23.6 (17), 24.9 (3'), 26.2 (3"), 26.6 (15), 31.1 (4'), 34.5 (2'), 35.96 (8), 36.04 (14), 41.2 (2"), 45.6 (11), 48.9 (10), 61.8 (6), 64.6 (20), 65.2 (7). 65.5 (13), 71.4 (5), 72.4 (4), 76.5 (12), 77.1 (9), 133.4 (2), 164.6 (1), 173.3 (1'), 178.8 (1"), 209.9 (3), Związek 6: 12-acetylo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-

49 EP 2986615B1 heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0118]

1 [0119] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.6 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.21 (3H (16), s). 1.23 (3H (17), s), 1.25 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.44 (1H (3"), m, J=14.1, 7.3, 7.2 Hz), 1.71 (1H (3"), dd), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.0 Hz), 1.91 (1H (11), m), 2.04 (3H (2'), s), 2.36 (1H (2"), m, J=7.0, 6.8 Hz), 3.14 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.78 (1H (20), d, J=12.7 Hz), 3.85 (1H (20), d, J=12.7 Hz), 4.04 (1H (10), t, J=2.7 Hz), 4.21 (1H (5), s), 5.33 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 7.7 (1H (1), s). 13 [0120] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.1 (16), 21.0 (2'), 23.7 (17), 26.2 (3"), 26.7 (15), 36.0 (8), 36.1 (14), 41.2 (2"), 45.7 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7). 65.4 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.8 (9), 77.1 (12), 133.5 (2), 164.6 (1), 170.6 (1'), 178.9 (1"), 209.9 (3). Związek 7: 12-propanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0121]

50 EP 2986615B1

1 [0122] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d. J=6.8 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.6 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.3 Hz), 1.13 (3H (3'), t), 1.21 (3H (16), s), 1.22 (3H (17), s), 1.25 (1H (14), dd, J=10.3, 6.8 Hz), 1.44 (1H (3"), m J=14.0, 7.0, 6.6 Hz), 1.70 (1H (3"), dd, J=14.2, 6,8 Hz), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 1.91 (1H (11), m), 2.31 (2H (2'), m), 2.37 (1H (2"), dd, J=13.7, 6.8 Hz), 3.15 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.78 (1H (20), d, J=12.2 Hz), 3.84 (1H (20), d, J=12.7 Hz), 4.05 (1H (10), m), 4.21 (1H (5), s), 5.35 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 5.92 (1H (OH), br.s.), 7.71 (1H (1), m). 13 [0123] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.3 (3'), 9.7 (19), 11.6 (4"). 15.1 (18), 16.1 (5"), 17.1 (16), 23.7 (17), 26.2 (3"), 26.7 (15), 27.8 (2'), 36.0 (8), 36.1 (14), 41.2 (2"), 45.7 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.6 (20), 65.2 (7), 65.4 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.8 (12), 77.1 (9), 133.5 (2), 164.6 (1), 173.9 (1'), 178.9 (1"), 209.9 (3). Związek 8: 12-butanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0124]

51 EP 2986615B1

1 [0125] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.6 Hz), 0.94 (3H (4'), t, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d), 1.22 (3H (16), s), 1.23 (3H (17), s), 1.26 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.45 (1H (3"), dq, J=14.0, 7.1 Hz) 1.64 (2H (3'), m, J=14.6, 7.2, 7.1 Hz), 1.71 (1H (3"), dd, J=13.7, 6.8 Hz), 1.75 (3H (19), d, J=2.9 Hz), 1.90 (1H (11), dd, J=10.0, 6.6 Hz), 2.27 (2H (2'), m), 2.37 (1H (2"), qt, J=7.0, 6.8 Hz), 3.15 (1H (8), d, J=6.4 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.77 (1H (20), m, J=12.2 Hz), 3.86 (1H (20), m, J=12.7 Hz), 4.05 (1H (10), d, J=2.4 Hz), 4.21 (1H (5), s), 7.71 (1H (1), dd, J=2.4, 1.0 Hz). 13 [0126] C NMR (125 MHz. CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"). 13.5 (4'), 15.1 (18), 16.1 (5"). 17.1 (16), 18.7 (3"), 23.7 (17), 26.2 (3"), 26.6 (15), 36.0 (8), 36.1 (14), 36.4 (2'),41.2 (2"), 45.6 (11), 48.9 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 76.6 (12). 77.1 (9), 133.5 (2), 164.7 (1), 173.1 (1'), 178.8 (1"), 209.9 (3). Związek 9: 12-[(2E,4E)-(6,6-dimetoksyheksa-2.4-dienoilo]-13-(2- metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13.20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0127]

52 EP 2986615B1

1 [0128] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.24 (3H (16), s), 1.27 (1H (14), dd, J=11.2, 6.8 Hz), 1.44 (1H. (3"), m), 1.72 (1H (3"). m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 1.96 (1H (11), dd, J=10.0, 6.6 Hz), 2.37 (1H (2"). m), 3.17 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.31 (3H (7'), s), 3.31 (3H (8'), s), 3.79, (1H (20), m, J=12.2 Hz), 3.86 (1H (20), m), 4.06 (1H (10), br. s.), 4.22 (1H (5), d, J=2.4 Hz), 4.89 (1H (6'), dd, J=4.4, 1.0 Hz), 5.42 (1H. (12), d, J=9.8 Hz), 5.91 (1H (2'), d, J=15.7 Hz), 5.98 (1H (5'), dd, J=15.7, 4.4 Hz), 6.47 (1H (4'), dd, 15.6, 11.2 Hz), 7.21 (1H (3'), dd, J=15.6, 11.2 Hz), 7.71 (1H (1), s). 13 [0129] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 23.6 (16), 26.2 (3"), 26.8 (15), 36.0 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.8 (11), 48.9 (10), 52.7 (7'), 52.7 (8'). 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.4 (13), 71.6 (5), 72.4 (4), 77.1 (9), 77.1 (12), 101.3 (6'), 122.8 (2'), 131.0 (4'), 133.5 (2), 137.9 (5'), 143.4 (3'), 164.7 (1), 166.1 (1'), 178.9 (1"), 209.9 (3). Związek 10: 12-[(2E-,4E)-6-oksoheksa-2.4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)- 6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0130]

53 EP 2986615B1

1 [0131] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0.93 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.13 (3H (5"), d, J=7.1 Hz), 1.24 (3H (17), s), 1.25 (3H (16), s), 1.28 (1H (14), m), 1.46 (1H (3"), td, J=14.1, 7.3 Hz), 1.70 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.2 Hz), 1.99 (1H (11), dddd, J=9.8, 6.5, 6.4, 6.1 Hz), 2.38 (1H (2"), d, J=6.8 Hz), 3.19 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.28 (1H (7), s), 3.77 (1H (20), m, J=12.5 Hz), 3.87 (1H (20), d, J=13.0 Hz), 4.06 (1H (10), d, J=2.7 Hz), 4.22 (1H (5), s), 5.46 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 6.28 (1H (2'), d, J=15.4 Hz), 6.40 (1H (5'), dd, J=15.4, 7.8 Hz), 7.14 (1H (4'), dd, J=14.9, 11.2 Hz), 7.36 (1H (3'), dd, J=15.4, 11.2 Hz), 7.71 (1H (1), dd, J=2.6, 1.3 Hz), 9.66 (1H (6'), d, J=7.6 Hz). 13 [0132] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 15.2 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16), 23.6 (17), 26.2 (3"), 26.9 (15), 36.0 (8), 36.3 (14), 41.2 (2"), 45.8 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.1 (7), 65.3 (13), 71.6 (5), 72.3 (4), 77.1 (9), 78.2 (12), 129.4 (2'). 133.6 (2), 137.2 (5'), 140.8 (3'), 146.9 (4'), 164.4 (1), 165.0 (1'), 178.9 (1"), 192.8 (6;), 209.8 (3). Związek 11: 12-[(2E,4E)-6,7-dihydroksydodeksa-2,4-dienoilo]-13-(2- metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,3,9.12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0133]

54 EP 2986615B1

1 [0134] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=2.0 Hz), 0.87 (3H (12'), d, J=2.0 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.24 (3H (16), s), 1.28 (1H (14), d, J=6.4 Hz), 1,28 (2H (11'), d, J=6.4 Hz), 1.44 (2H (8'), d, J=6.8 Hz), 1.46 (1H (3"), d, J=6.8 Hz), 1.47 (2H (9'), d, J=2.9 Hz), 1.69 (1H (3"), m), 1.76 (3H (19), m), 1.95 (1H (11), dd, J=9.5, 6.6 Hz), 2.38 (1H (2"), dq, J=13.7. 6.8 Hz). 3.17 (1H (8), d, J=6.4 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.49 (1H (7'), br. s.), 3.60 (1H (OH), s), 3.82 (2H (20),), 4.03 (1H (6'), m), 4.06 (1H (10), br. s.), 4.22 (1H (5), d, J=2.9 Hz), 5.42 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 5.88 (1H (2'), d, J=15.2 Hz), 6.08 (1H (OH), t, J=6.1 Hz), 6.11 (1H (5'), t, J=6.1 Hz), 6.43 (1H (OH), m), 6.47 (1H (4'), m), 7.21 (1H (OH), dd, J=13.2, 2.0 Hz), 7.24 (1H (3'), s), 7.71 (1H (1), s), 13 [0135] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm; 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (12'), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16), 22.6 (11'), 23.6 (17), 25.3 (9'), 26.2 (3"), 26.8 (15), 31.7 (10'), 33.1 (8'), 36.0 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.8 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.4 (13), 71.6 (5), 72.4 (4), 74.5 (7'), 75.1 (6'), 77.1 (9), 77.1 (12), 133.5 (2), 121.8 (2'), 129.7 (4'), 141.6 (5'), 143.8 (3'), 164.6 (1), 166.2 (1'), 178.9 (1"), 209.9 (3). Związek 12: 12-[(2E)-4,5-dihydroksy-deka-2-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)- 6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on

55 EP 2986615B1

[0136]

1 [0137] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d), 0.87 (3H (10'), t), 0.93 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.23 (3H (16), s), 1.26 (2H (9'). m), 1.27 (1H (14), m), 1.28 (2H (8'), m), 1.30 (1H (7'), m), 1.42 (2H (6'), m), 1.44 (1H (3"), m), 1.46 (1H (7'). m), 1.70 (1H (3"), m), 1.74 (3H (19), d, J=1.6 Hz), 1.95 (1H (11), m), 2.37 (1H (2"), m), 3.16 (1H (8), d, J=6.5 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.75 (1H (5'), m), 3.77 (1H (20), m), 3.85 (1H (20), d, J=19.3 Hz), 4.05 (1H (10), br. s.), 4.21 (1H (5), s), 4.32 (1H (4'), m), 5.41 (1H (12), d, J=9.5 Hz), 6.11 (1H (2'), dd, J=8.8, 1.8 Hz), 6.92 (1H (3'), dd, J=4.9, 1.6 Hz), 7.71 (1H (1), dd), 13 [0138] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19). 11.6 (4"), 14 (10'), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16), 22.5 (9'), 23.7 (17), 25.5 (7'), 26.2 (3"), 26.8 (15), 31.7 (8'), 32.0 (6'), 36.0 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.8 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.4 (13), 71.6 (5), 72.3 (4), 73.9 (4'), 74.1 (5'), 77.1 (12), 77.3 (9), 122.5 (2'), 133.6 (2), 145.9 (3'), 164.6 (1), 165.5 (1'), 179 (1"), 209.9 (3). Związek 13: 12-tigloilo-13-(2-metylopropanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,1,3,20- heksahydroksy-4-tiglien-3-on [0139]

56 EP 2986615B1

1 [0140] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 1.14 (3H (4") d, J=7.3 Hz, 1.17 (3H (3"), d, J=6.8 Hz), 1.22 (3H (16), s), 1.24 (3H (17), s), 1.28 (1H (8), m), 1.74 (3H (19), s), 1.77 (3H (4'), d, J=7.3 Hz), 1.95 (1H (11), dd, J=10.0, 6.6 Hz), 2.56 (1H, (2"), m, J=7.3, 7.1, 7.0 Hz), 3.16 (1H (14), d, J=6.4 Hz), 3.26 (1H (7). s), 3.82 (2H (20), m), 4.06 (1H (10), br. s.), 4.22 (1H (5), d, J=2.4 Hz), 5.41 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 6.80 (1H (3'), m), 7.71 (1H (1), s),

13 [0141] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 12.2 (5'), 14.4 (4'), 15.1 (18), 17.2 (17), 18.5 (3"), 18.6 (4"), 23.7 (16), 26.5 (15), 34.1 (2"), 36.0 (8), 36.1 (14), 45.8 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.6 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.4 (5), 72.4 (4), 76.6 (12), 77.2 (9), 128.4 (2'), 133.4 (2), 137.6 (3'), 164.7 (1), 167.5 (1'), 179.3 (1"), 209.9 (3). Związek 14: 12-[(2E)-3-metylotioprop-2-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0142]

57 EP 2986615B1

1 [0143] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 0,92 (3H (4"), 1, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.23 (3H (17), s), 1.24 (3H (16), s), 1.27 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.44 (1H (3"), m), 1.71 (1H (3"), m). 1.75 (3H (19), s), 1.94 (1H (11), m), 2.14 (1H (OH), t, J=5.9 Hz), 2.32 (3H (4'), s), 2.38 (1H (2"), m), 3.16 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.55 (1H (4-OH), s), 3.78 (1H (20), dd, J=12.7, 5.9 Hz), 3.84 (1H (5-OH), s), 3.85 (1H (20), s), 4.05 (1H (10), m), 4.21 (1H (5), d, J=2.4 Hz), 5.41 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 5.61 (1H (2'), d, J=14.7 Hz), 6.02 (1H (9-OH), m), 7.69 (1H (3'), d, J=14.7 Hz), 7.71 (1H (1), s), 13 [0144] C NMR (125 MHz. CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"). 14.3 (4'), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16). 23.7 (17), 26.2 (3"), 26.7 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.4 (4), 76.8 (12), 77.1 (9), 112.8 (2'), 133.5 (2), 147.5 (3'), 164.5 (1'), 164.8 (1), 178.9 (1"), 210.0 (3). Związek 15: 12-(2-metyloprop-2-enoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12.13.20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0145]

58 EP 2986615B1

1 [0146] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d), 0.92 (3H (4"), t, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.23 (3H (17), br. s.), 1.25 (3H (16), s), 1.27 (1H (14), dd, J=11.2, 6.4 Hz), 1.45 (1H (3"), m), 1.72 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.0 Hz), 192 (3H (4'), s), 1.95 (1H (11), m), 2.38 (1H (2"), m), 3.18 (1H (8), d), 3.28 (1H (7), s), 3.54 (1H (OH), d, J=1,0 Hz), 3.78 (1H (20), m), 3.87 (1H (20), dd), 4.06 (1H (10), m), 4.22 (1H (5), d, J=2.0 Hz), 5.42 (1H (12), s), 5.56 (1H (3'), dt, J=2.9, 1.5 Hz), 6.05 (1H (3'), m), 7.72 (1H (1), dd, J=2.4, 1.5 Hz). 13 [0147] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm; 9.7 (19), 11.6 (4"), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 18.5 (4'), 23.7 (16), 26.2 (3"), 26.7 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 77.1 (9), 77.3 (12), 125.8 (3'), 133.5 (2),136.2 (2'), 164.7 (1), 166.8 (1'), 178.9 (1"), 209.9 (3), Związek 16: 12-[(2E,4E)-heksa-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0148]

59 EP 2986615B1

1 [0149] H NMR (500 MHz. CDCl3,) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=6.5 Hz), 0.93 (3H (4"), t), 1.13 (3H (5"), m. J=6.8 Hz), 1.23 (3H (16), br. s.), 1.26 (3H (17), s), 1.27 (1H (14), m), 1.45 (1H (3"), s), 1.70 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.8, 1.2 Hz), 1.86 (3H (6'), dd, J=7.3, 1.7 Hz), 1.96 (1H (11), dd, J=9.8, 6.2 Hz), 2.37 (1H (2"), m), 3.18 (1H (8), d, J=6.7 Hz), 3.28 (1H (7), s), 3.78 (1H (20), m), 3.87 (1H (20), m), 4.06 (1H (10), br. s.), 4.21 (1H (5), br. s.), 5.44 (1H (12), d, J=10.1 Hz), 5.83 (1H (2'), d, J=15. 0 Hz), 5.94 (1H (5'), m), 6.14 (1H (4'), m), 7.59 (1H (3'), ddd, J=15.3, 11.7, 1.2 Hz), 7.72 (1H (1), dd, J=2.2, 1.3 Hz). 13 [0150] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.1 (6'), 15.2 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 23.7 (16), 26.2 (3"), 26.7 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.4 (4), 76.8 (12), 77.1 (9), 120.7 (2'), 127.3 (4'), 133.5 (2), 136.2 (5'), 139.6 (3'), 164.8 (1), 166.6 (1'), 179.0 (1"), 210.0 (3). Związek 17: 12-[(2E,4E)-8-oksododeka-2,4-dienoilo]-13-(2- metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0151]

60 EP 2986615B1

1 [0152] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=5.3 Hz), 0.88 (3H (12'), t, J=7.3 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.4 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.22 (3H (16), br. s.), 1.23 (3H (17), s), 1.26 (1H (14), d, J=5.4 Hz), 1.28 (2H (11'), d, J=2,8 Hz), 1.43 (1H (3"), br. s.), 1.53 (2H (10'), m), 1.71 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1,3 Hz), 1.95 (1H (11), m), 2.37 (1H (2"), m), 2.38 (2H (9'), d, J=7.2 Hz), 2.42 (2H (6'), m), 2.52 (2H (7'), s), 3.17 (1H (8), d, J=6.6 Hz), 3.27 (1H (7). s), 3.53 (1H (OH), s), 3.81 (1H (20), br. s.), 3.86 (1H (20), m), 4.05 (1H (10), m), 4.22 (1H (5), d, J=2.4 Hz), 5.41 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 5.76 (1H (2'), d, J=15.4 Hz), 6.09 (1H (5'), t, J=6.8 Hz), 6.15, (1H (4'), d, J=10.6 Hz), 7.16 (1H (3'), dd, J=15.4, 10.6 Hz), 7.71 (1H (1), dd, J=2.6, 1.3 Hz). 13 [0153] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 13.8 (12'), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 22.3 (11'). 23.7 (16), 25.9 (10'), 26.2 (3"), 26.7 (15), 26.9 (6'), 36.1 (8), 36.1 (14), 41.2 (2"), 41.3 (7'), 42.7 (9'), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 77.1 (12), 77.2 (9), 119.6 (2'), 129.1 (4'), 133.5 (2), 142.8 (5'), 145.0 (3'), 164.8 (1), 166.6 (1'), 179.0 (1)", 209.7 (8'), 210.1 (3). Związek 18: 12-[(2Z,4E)-deka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0154]

61 EP 2986615B1

1 [0155] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (10'), t, J=6.9 Hz), 0.87 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 0.94 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.14 (3H (5"). d, J=7.1 Hz), 1.22 (3H (16), s), 1.23 (3H (17), s), 1.25 (1H (14), br. s.), 1.27 (2H (8'), br. s.), 1.28 (2H, (9'), br. s.), 1.41 (2H (7'), m), 1.46 (1H (3"), m), 1.71 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.94 (1H (11), dd, J=10.0, 6.4 Hz), 2.16 (2H (6'), s), 2.39 (1H (2"), m, J=7.2, 7.0 Hz), 3.16 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.53 (1H (4-OH), d, J=0.6 Hz), 3.77 (1H (20), dd, J=12.7, 5.7 Hz), 3.83 (1H (5- OH), d, J=3.1 Hz), 3.86 (1H (20), m, J=12.6, 7.7 Hz), 4.05 (1H (10), t, J=2.7 Hz), 4.21 (1H (5), d, J=2.9 Hz), 5.43 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.51 (1H (2'), d, J=11.4 Hz), 6.06 (1H (5'), ddd, J=15.1, 7.2, 6.8 Hz), 6.55 (1H (3"). t, J=11.6 Hz). 7.29 (1H (4'), ddd, J=15.1, 7.2. 6.8 Hz). 7.72 (1H (1), dd, J=2.3, 1.3 Hz). 13 [0156] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (10'), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.1 (16), 22.5 (9'), 23.7 (17), 26.2 (3"), 26.6 (15), 28.3 (7'), 31.4 (8'), 33.0 (6'), 36.0 (14), 36.1 (8), 41.2 (2"), 45.8 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 76.1 (12), 77.1 (9), 115.0 (2'), 126.9 (4'), 145.9 (3'), 146.1 (5'), 133.5 (2), 164.8 (1), 165.9 (1'), 178.9 (1"), 210.0 (3). Związek 19: 13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0157]

62 EP 2986615B1

1 [0158] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.92 (3H (4'), t, J=7.6 Hz), 1.07 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 1.16 (3H (5'), d, J=6.8 Hz), 1.20 (3H (16), s), 1.24 (1H (14), m), 1.26 (3H (17), s), 1.45 (1H (3'),ddd, J=13.8, 7.1, 7.0 Hz), 1.71 (1H (3'), dt, J=13.7, 7.3 Hz), 1.76 (1H (11), d, J=15.7 Hz), 1.77 (3H (19), dd, J=2.7, 1.2 Hz), 2.41 (1H (2'), m, J=7.0, 6.8 Hz), 3.08 (1H (8), d, J=7.3 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.79 (1H (10), d, J=2.9 Hz), 3.81 (2H (20), m), 3.90 (1H (12), d, J=9.8 Hz), 4.20 (1H (5), s), 7.70 (1H (1), dd, J=2.4, 1.5 Hz). 13 [0159] C NMR (125 MHz. CDCl3) δ ppm: 9.8 (19), 11.7 (4'). 16.6 (5'), 16.2 (18), 17.2 (17), 23.4 (16). 26.5 (3'), 27.9 (15), 34.8 (14), 36.5 (8), 41.0 (2'), 47.3 (11), 50.7 (10), 62.4 (6), 65.0 (20), 66.0 (7), 68.4 (13), 71.5 (5), 72.1 (4), 77.6 (9), 78.3 (12), 133.9 (2), 163.8 (1), 180.1 (1'), 209.7 (3). Związek 20: 12-[(2E)-but-2-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0160]

63 EP 2986615B1

1 [0161] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H. (18), d, J=6.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.1 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.24 (3H (16), s), 1.26 (1H (14), d, J=6.7 Hz), 1.45 (1H (3"), dd, J=14.5, 6.4 Hz), 1.72 (1H (3"). dd, J=14.1. 6.8 Hz), 1.75 (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 1.87 (3H (4'), dd, J=6.9, 1.7 Hz), 1.94 (1H (11), dd, J=9.8, 6.4 Hz), 2.37 (1H (2"), dd, J=13.8, 6.8 Hz), 3.16 (1H (8), d, J=6.5 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.78 (1H (20), d, J=12.2 Hz), 3.87 (1H (20), m), 4.05 (1H (10), m), 4.21 (1H (5). s), 5.40 (1H (12), d. J=9.9 Hz), 5,81 (1H (2'), dddd, J=155, 1.6, 1.5, 1.2 Hz), 6.92 (1H (3'), dd, J=15,5,7.0 Hz), 7.71 (1H (1), m). 13 [0162] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 18.1 (4'), 23.7 (16), 26.2 (3"), 26.7 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 76.7 (12), 77.1 (9), 122.6 (2'), 133.6 (2), 145.0 (3'), 164.8 (1), 166.1 (1'), 178.9 (1"), 210.2 (3). Związek 24: 12-(2E,4E)-deka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12.13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0163]

64 EP 2986615B1

1 [0164] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d, J=5.6 Hz), 0.87 (3H (10'), d J=11.7 Hz), 0,93 (3H (4"), t, J=7,5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.22 (3H (16), s), 1.24 (3H (17), s), 1.26 (1H (14), m), 1.26 (2H (8'), br. s.), 1.29 (2H (9'), m), 1.45 (1H (3"), m), 1.41 (2H (7'), m), 1.73 (1H (3"), m), 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.95 (1H (11), dd, J=9.7, 6.4 Hz), 2.15 (2H (6'), m), 2.38 (1H (2"), m), 3.17 (1H (8), d, J=6,6 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.55 (1H (OH), m), 3.78 (1H (20), dd, J=12.0, 4.6 Hz), 3.87 (1H (20), m), 4.05 (1H (10), m), 4.22 (1H (5), m), 5.41 (1H (12), d, J=9,9 Hz), 5.75 (1H (2'), d, J=15.4 Hz), 6.13 (1H (5'), dd, J=6.7, 6.2 Hz), 6.16 (1H (4'), s), 7.20 (1H (3'), dd, J=1-5.5, 9.9 Hz), 7.72 (1H (1), dt, J=2,5, 1.3 Hz). 13 [0165] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (10'), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (17), 22.4 (9'), 23.6 (16), 26.2 (3"), 26.7 (15), 28.4 (7'), 31.3 (8'), 33.0 (6'), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13),71.7 (5), 72.3 (4), 76.7 (12), 77.1 (9), 118.8 (2'), 128.3 (4'), 133.5 (2), 145.3 (5'), 145.6 (3'), 164.8 (1), 166.6 {1'), 178.9 (1"), 210.0 (3). Związek 25: 12-[(2Z,AE)-deka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylopropanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0166]

65 EP 2986615B1

1 [0167] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d), 0.86 (3H (10'), t), 1.16 (3H (4"), d), 1.19 (3H (3"), d, J=7.0 Hz), 1.22 (3H (16), s), 1.22 (3H (17), s), 1.25 (2H (8'), m), 1.27 (1H (14), (d, J=3.1 Hz), 1.29 (2H (9'), m), 1.4] (2H (7'), br. s.), 1.75 (3H (19), s), 1.94 (1H (11), dd, J=10.0, 6.4 Hz), 2.16 (2H (6'), s), 2.58 (1H (2"), dt, J=1,4.0, 7.0 Hz), 3.16 (1H (8), d, J=6.7 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.55 (1H (OH), br. s), 3.78 (1H (20), d, J=12.5 Hz), 3.86 (1H (20), d, J=13.1 Hz), 4.05 (1H (10), d, J=5.4 Hz), 4.21 (1H (5), s), 5.41 (1H (12), d. J=9.9 Hz), 5.51 (1H (2'), d, J=11.2 Hz), 6.06 (1H (5'), dd, J=15.3, 7.0 Hz), 6.55 (1H (3'), t, J=11.4 Hz), 7.29 (1H (4'), dd, J=15.3, 7.0 Hz), 7.71 (1H (1), s), 13 [0168] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 14,7 (10'), 15.1 (18), 17.1 (16), 18.6 (3"), 18.6 (4"), 22.5 (9'), 23.7 (17), 26.6 (15), 28.4 (7'), 31.4 (8'), 33.0 (6'), 34.2 (2"), 36.0 (14), 36.1 (8), 45.7 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.5 (13), 71.7 (5). 72.3 (4), 76.0 (12), 77.2 (9), 115.0 (2'), 126.9 (4'), 133.5 (2), 145.9 (3'), 146.2 (5'), 164.8 (1), 165.9 (1'), 179.3 (1"), 210.0 (3). Związek 26: 12-[(2E,4E)-6,7-(anty)-epoksy-dodeka-2,4-dienoilo]-13-(2- metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,3,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0169]

66 EP 2986615B1

1 [0170] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=4.4 Hz), 0.86 (3H (12'), br. s.), 0.92 (3H (4"). t, J=7.3 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz). 1.22 (3H (17). br. s.). 1.24 (3H (16), s). 1.27 (1H (14), d, J=7.3 Hz), 1.28 (2H (11'), m), 1.29 (2H (10'), m), 1.44 (2H (9'), m), 1.57 (2H (8'), m), 1.72 (2H (3"), dd, J=13.9, 7.1 Hz), 1.75 (3H (19), d, J=1.5 Hz), 1.95 (1H (11), m), 2.37 (1H (2"), m), 2.85 (1H (7'), tt, J=5.6, 2.0 Hz), 3.15 (1H (6'), d, J=7.8 Hz), 3.17 (1H (8), s), 3.28 (1H (7), s), 3.52 (1H (OH), d, J=2.9 Hz), 3.76 (1H (OH), m), 3.79 (1H (20), d, J=2.9 Hz), 3.87 (1H (20), m), 4.05 (1H (10), d, J=2.0 Hz), 4.22 (1H (5). d). 5.42 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 5.83 (1H (5'), d, J=15.2, 7.8 Hz), 5.87 (1H (2'), d, J=15.7 Hz), 6.00 (1H (OH), m), 6.47 (1H (4'), dd, J=14.7, 11.2 Hz), 7.20 (1H (3'), dd, J=15.2, 11.2 Hz), 7.71 (1H (1), br. s.). 13 [0171] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"), 14.0 (12'), 15.1 (18), 16.2 (5"), 17.2 (16), 22.5 (11'), 23.7 (17), 25.5 (9'), 26.2 (3"), 26.8 (15), 31.5 (10'). 31.9 (8'), 36.1 (8), 36.2 (14), 41.2 (2"), 45.9 (11), 49.0 (10), 57.5 (6'), 61.6 (7'), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.4 (13), 71.7 (5), 72.3 (4), 77.1 (9), 77.1 (12), 121,6 (2'), 130.9 (4'), 133.5 (2), 139.7 (5'), 143.3 (3'), 164.7 (1), 166.2 (1'), 179.0 (1"), 210.1 (3).

67 EP 2986615B1

Związek 29: 12-tigloilo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0172]

1 [0173] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.83 (3H (18), d, J=6.8 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.6 Hz), 1.13 (3H (5"), d, J=6.8 Hz). 1.20 (1H (14), d, J=5.9 Hz), 1.22 (3H (17), s), 1.23 (3H (16), s), 1.45 (1H (3"), tt, J=14.2, 7.3 Hz), 1.72 (1H (3"),dd), 1.77 (3H (5'), dd, J=7.1, 1.2 Hz), 1.80 (3H (4'), d, J=1.5 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 2.11 (1H (11), dq), 2.29 (1H (8), d, J=5.4 Hz), 2.38 (1H (2"), m, J=7.0, 6.8 Hz), 2.47 (1H (20-OH), t, J=6.8 Hz), 2.98 (1H (4-OH), s), 3.53 (1H (10), m), 3.73 (1H (5), d, J=1.0 Hz), 3.81 (1H (20), dd, J=12.7, 6.8 Hz), 3.92 (1H (2.0), m, J=12.7, 6.8 Hz), 4.46 (1H (7), d, J=5.4 Hz), 5.10 (1H (7-OH), d, J=5.4 Hz), 5.39 (1H (12), d, J=10,3 Hz), 6.55 (1H (9-OH), m), 6.80 (1H (3'), m, J=7.1, 6.8, 1.5 Hz), 7.58 (1H (1), s), 13 [0174] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19). 11.6 (4"), 12.2 (4'), 14.0 (18), 14.4 (5'), 16.2 (5"), 17.0 (17), 23.5 (16), 26.2 (15), 26.2 (3"), 34.7 (14), 35.,2 (8), 41.3 (2"), 43.7 (11). 57.3 (10), 62.6 (5), 64.2 (20), 67.0 (6), 67.0 (13), 71.3 (4), 75.8 (12), 77.3 (7), 79.1 (9), 128.3 (2'), 134.7 (2), 137.8 (3'), 159.7 (1), 167.4 (1'), 179.7 (1"), 205.7 (3). Związek 30: 13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13.20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0175]

68 EP 2986615B1

1 [0176] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.91 (3H (4'), t, J=7.6 Hz), 1.02 (3H (18), d, J=6.4 Hz), 1.15 (1H (14), d, J=5.9 Hz), 1.15 (3H(5'), d, J=7,3 Hz), 1.19 (3H (16), s), 1.22 (3H (17), s), 1.46 (1H (3'), ddd, J=14.1, 7.0, 6.8 Hz), 1.70 (1H (3'), dt, J=13.7, 7.3 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 1.93 (1H (11), dq, J=9.8, 6.6, 6.5 Hz), 2.24 (1H (8), d, J=5.9 Hz), 2.40 (1H (2'), m, J=7.0, 6.8 Hz), 2.84 (1H (20-OH), br. s.), 3.44 (1H (4-OH), s), 3.50 (1H (10), t, J=2.4 Hz), 3.76 (1H (5), s), 3.84 (1H (20), dd, J=12.2, 3.9 Hz), 3.88 (1H (12), dd, J=10.0, 3.7 Hz), 3.92 (1H (20), d, J=12.2, 5.9 Hz), 4.46 (1H (7), d, J=4.4 Hz), 4.57 (1H (OH), m), 5.20 (1H (OH), m), 7.60 (1H (1), s). 13 [0177] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.7 (4'), 14.6 (18), 16.5 (5'), 16.7 (16), 23.6 (17), 26.4 (15), 26.5 (3'), 33.8 (14), 35.5 (8), 41.1 (2'), 45.5 (11), 57.8 (10), 62.6 (5), 64.1 (20), 66.9 (6), 68.0 (13), 71.3 (4), 76.8 (12), 77.3 (7), 78.8 (9), 134.4 (2), 160.2 (1), 180.0 (1'), 206.2 (3). Związek 31: 12-acetylo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0178]

69 EP 2986615B1

1 [0179] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.17 (3H (16), s), 1.18 (1H (14), s), 1.22 (3H (1.7), s), 1.44 (1H (3"), m, J=14.1, 7.3, 7.1 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.8, 1.2 Hz), 2.04 (3H (2'), s). 2.09 (1H (11), dq, J=10.2, 6.5 Hz), 2.31 (1H (8), d, J=5.6 Hz), 2.37 (1H (2"), sxt, J=7.0 Hz), 2.88 (1H (20-OH), m), 3.52 (1H (10), d, J=2.6 Hz), 3.59 (1H (4-OH). s), 3.81 (1H (5), d, J=0.9 Hz), 3.83 (1H (20), d, J=12.4 Hz), 3.96 (1H (20), d), 4.39 (1H (7), d, J=5.1 Hz), 5.04 (1H (7-OH), d, J=5.5 Hz), 5.3 (1H (12), d, J=10.1 Hz), 6.48 (1H (9-OH), br. s.), 7.58 (1H (1), s). 13 [0180] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"). 14.0 (18), 16,2 (5"), 16.7 (16), 20.9 (2'), 23.3 (17), 26.1 (3"), 26.2 (15), 34.6 (14), 35.1 (8), 41.3 (2"), 43.4 (11), 57.3 (10), 62.4 (5), 63.7 (20), 65.6 (13% 67.3 (6), 71.3 (4), 76.1 (12), 77.2 (7), 79.0 (9), 134.6 (2), 159.8 (1), 170.6 (1'), 179.7 (1"), 206.1 (3). Związek 32: 12.13-di-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0181]

70 EP 2986615B1

1 [0182] H NMR (500 MHz. CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 0.89 (3H (4'), m, J=7.6 Hz), 0.91 (3H (4"), d, J=7.5 Hz), 1.11 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.12 (3H (5'), d, J=7.0 Hz), 1.17 (3H (16), s), 1.18 (1H (14), d, J=5.7 Hz), 1.19 (3H (17), s), 1.42 (1H (3'), m), 1.46 (1H (3"), dt, J=6.8, 3.3 Hz), 1.62 (1H (3'), dt, J=8.2, 6.9 Hz), 1.68 (1H (3"), d, J=7.1 Hz), 1.80 (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 2.10 (1H (11), dd, J=10.2, 6. Hz). 2,33 (1H (8), d, J=5.4 Hz), 2.35 (1H (2'), m), 2.38 (1H (2"), d, J=4.3 Hz), 3.14 (1H (20-OH), br. s.), 3.54 (1H (10), dd, J=2.4, 2.2 Hz), 3.83 (1H (20), d, J=13.0 Hz), 3.85 (1H (5), d, J=1.0 Hz), 3.96 (1H (4- OH), s), 3.98 (1H (20), m, J=12.8 Hz), 4.37 (1H (7), d, J=5.3 Hz), 5.03 (1H (7- OH), d, J=5.5 Hz), 5.36 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 6.46 (1H (9-OH), s), 7.59 (1H (1) s). 13 [0183] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 11.6 (4'), 13.9 (18), 16.1 (5"), 16.8 (5'), 16.9 (16), 23.5 (17), 26.0 (15), 26.2 (3"), 26.7 (3'), 34.6 (14), 35.1 (8), 41.3 (2"), 41.7 (2'), 43.3 (11), 57.2 (10), 62.2 (5), 63.2 (20), 65.6 (13), 67.6 (6), 71.3 (4), 75.4 (12), 77.2 (7), 79.1 (9), 134.6 (2), 160.0 (1), 175.9 (1'), 179.6 (1"), 206.3 (3). Związek 33: 12-propanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy- 4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0184]

71 EP 2986615B1

1 [0185] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.83 (3H (18), d), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.13 (3H (3'), t. J=7.6 Hz), 1.18 (3H (16), s), 1.19 (1H (14), s), 1.22 (3H (17), s), 1.44 (1H (3"), m, J=14.1, 7.5, 7.1 Hz), 1.71 (1H (3"), ddd, J=13.9, 7.3, 7.1 Hz), 1.81, (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 2.08 (1H (1), dd, J=10.2,6.5 Hz), 2.29 (1H (8), m), 2.31 (2H(2'), m), 2.37 (1H (2"), d, J=7.0 Hz), 2.72 (1H (20-OH), t, J=6.7 Hz), 3.34 (1H (4-OH), s), 3.53 (1H (10), d, J=2.4 Hz), 3.78 (1H (5), d), 3.82 (1H (20), dd, J=12.7, 5.9 Hz), 3.94 (1H (20), dd, J=12.7, 5.9 Hz), 4.42 (1H (7), d, J=5.6 Hz), 5.06 (1H (7-OH), d, J=5.6 Hz), 5.32 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 6.49 (1H (9-OH), s), 7.58 (1H (1), d, J=1,3 Hz). 13 [0186] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.3 (3'), 10.3 (19), 11.6 (4"). 14.0(18), 16.2 (5"), 16.8 (16), 23.5 (17), 26.1 (3"), 26.2 (15), 27.8 (2'), 34.6 (14), 35.1 (8), 41.3 (2"), 43.4 (11), 57.3 (10), 62,5 (5), 63.8 (20), 65.6 (13), 67.2 (6), 71.3 (4), 75.9 (12), 77.3 (7), 79.1 (9), 134.6 (2), 159.8 (1), 173.9 (1'), 179.7 (1"), 206.0(3). Związek 34: 12-heksanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy- 4,7,9,12.13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0187]

72 EP 2986615B1

1 [0188] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.83 (3H (18), d), 0.88 (3H (6'), t. J=6.9 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.1 Hz), 1.18 (3H (16), s), 1.19 (1H (14), s). 1.21 (3H (17), s), 1.29 (2H (4'), m), 1.30 (2H (5'), m, J=7.6, 7.3, 3.6 Hz), 1.44 (1H, (3"), dt, J=14.1, 7.0 Hz), 1.61 (2H (3'), m), 1.70 (1H (3"), m, J=14.1, 7.3, 7.1 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 2.08 (1H (11), dq, J=10.3, 6.5 Hz), 2.3 (1H (8), d, J=3.8 Hz), 2.28 (2H (2'), m), 2.37 (1H (2"), q, J=7.0 Hz), 2.73 (1H (20-OH), m), 3.35 (1H (4-OH), br. s.), 3.53 (1H (10), t, J=2.5 Hz), 3.78 (1H (5), d, J=1.1 Hz), 3.82 (1H (20), d, J=12.6 Hz), 3.94 (1H (20), d, J=12.5 Hz), 4.42 (1H (7), d, J=3.9 Hz), 5.06 (1H (7-OH), d, J=5.4 Hz), 5.34 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 6.48 (1H (9-OH), s), 7.58 (1H (1), d, J=1.5 Hz). 13 [0189] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 13.9 (18), 13.9 (6'), 16.1 (5"), 16.8 (16), 22.3 (5'), 23.5 (17), 24.9 (3'), 26.1 (15), 26.2 (3"), 31.1 (4'), 34.5 (2'), 34.6 (14), 35.2 (8), 41.3 (2"), 43.3 (11), 57.3 (10), 62.5 (5), 64.0 (20), 65.6 (13), 67.1 (6), 71.3 (4), 75.6 (12), 77.2 (7), 79.1 (9), 134.6 (2), 159.8 (1), 173.3 (1'), 179.6 (1"), 206.0 (3). Związek 35: 12-tigloilo-13-(2-metylopropanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20- heksahydroksy-1 - tiglien-3-on [0190]

73 EP 2986615B1

1 [0191] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d), 1.15 (3H (3"), d, J=7.0 Hz), 1.17 (3H (4"), d, J=7.0 Hz), 1.21 (1H (14), m), 1.21 (3H (16), s), 1.21 (3H (17), s), 1.77 (3H (4'), dd, J=7.1, 1.1 Hz), 1.80 (3H (5'), d, J=1.3 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.9, 1.4 Hz), 2.13 (1H (11), dd. J=9.6, 6.3 Hz), 2.32 (1H (8), d,J=6.1 Hz), 2.58 (1H (2"), spt, J=7.0 Hz), 3.46 (1H (4-OH), s), 3.54 (1H (10), d, J=2.5 Hz). 3.81 (1H (5), d, J=1.2 Hz). 3.82 (1H (20), m), 3.96 (1H (20), d, J=13.0 Hz), 4.42 (1H (7), d, J=4.9 Hz), 5.07 (1H (7-OH), d, J=5.5 Hz), 5.37 (1H (12), d, J=10.2 Hz), 6.52 (1H (9-OH), s), 6.80 (1H (3'), dq, J=7.0, 1.4 Hz), 7.58 (1H (1), dd, J=2.0, 1.4 Hz). 13 [0192] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 12.2 (5'), 14.0 (18), 14.4 (4'), 16.9 (16), 18.5 (3"), 18.6 (4"), 23.5 (17), 26.0 (15), 34.2 (2"), 34.6 (14), 35.2 (8), 43.6 (11), 57.3 (10), 62.4 (5), 63.7 (20), 65.7 (13), 67.3 (6), 71.3 (4), 75.7 (12), 77.2 (7), 79.1 (9), 128.3 (2'), 134.6 (2), 137.8 (3'), 159.9 (1), 167.5 (1'), 180.1 (1"), 206.0 (3). Związek 36: 12-[(2E)-3-metylotioprop-2-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-5,6- epoksy-4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0193]

74 EP 2986615B1

1 [0194] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.92 (3H (4"), t, J=7.0 Hz), 0.84 (3H (18), d, J=6.5 Hz), 1.13 (3H (5") d, J=7.0 Hz), 1.18 (1H (14), s), 1.20 (3H (16), s), 1.22 (3H (17), s), 1.44 (1H (3"), dt, J=13.9, 7.0 Hz), 1.72 (1H (3"), d, J=13.8 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.7, 1.2 Hz), 2.12 (1H (11), dd, J=9.4, 5.6 Hz), 2.31 (1H (8), d, J=6.0 Hz), 2.32 (3H (5'), s), 2.38 (1H (2"), q, J=7.0 Hz), 3.36 (1H (4- OH), s), 3.53 (1H (10), d, J=2.3 Hz), 3.78 (1H (5), d, J=0.9 Hz), 3.82 (1H (20), d, J=12.6 Hz), 3.94 (1H (20), d), 4.43 (1H (7). d, J=4.6 Hz), 5.08 (1H (7-OH), d), 5.37 (1H (12), d. J=10.2 Hz), 5.61 (1H (2'), d, J=14.9 Hz), 6.53 (1H (9-OH), s), 7.58 (1H (1), d, J=1.9 Hz), 7.68 (1H (3'), d, J=14.9 Hz). 13 [0195] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 14.0 (18), 14.3 (5'), 16.2 (5"), 16.9 (16), 23.5 (17), 26.2 (15), 26.2 (3"), 34.7 (14), 35.2 (8), 41.3 (2"), 43.6 (11), 57.3 (10), 62.5 (5), 64.0 (20), 65.6 (13), 67.1 (6), 71.3 (4), 75.8 (12), 77.3 (7), 79.1 (9), 112.7 (2'), 134.6 (2), 147.7 (3'), 159.8 (1), 164.5 (1'), 179.8 (1"), 206.0(3). Związek 37: 12-tigloilo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0196]

75 EP 2986615B1

1 [0197] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (2H (18), d, J=6.6 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6,9 Hz), 1.19 (1H (14), s), 1.20 (1H (16), s), 1.21 (1H (17), s), 1.44 (1H (3"), dt, J=14.1, 7.0 Hz), 1.72 (1H (3"), dq), 1.77 (3H (4'), dd, J=7.1, 1.1 Hz), 1.8 (3H (5'), t, J=1.3 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.9, 1.5 Hz), 2.13 (1H (11), q, J=2.9 Hz), 2.33 (1H (8), d, J=5.7 Hz), 2.38 (1H (2"), q, J=7.0 Hz), 2.99 (1H (20-OH), br. s.), 3.55 (1H (10), t, J=2.6 Hz), 3.70 (1H (4- OH), br. s.), 3.83 (1H (20), dd, J=12.8, 4.9 Hz), 3.84 (1H (5),d, J=1.1 Hz), 3.98 (1H (20), dd, J=12.8, 7.3 Hz), 4.39 (1H (7), d, J=5.5 Hz), 5.06 (1H (7-OH), d, J=5.5 Hz), 5.39 (1H (12), d, J=10.2 Hz), 6.53 (1H (9-OH), br. s.), 6.8 (1H (3'), dd, J=7.1, 1.5 Hz), 7.59 (1H (1). dd, J=2.0, 1.5 Hz). 13 [0198] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 12.2 (5'), 14.0 (1.8), 14.4 (4'), 16.2 (5"), 17.0 (16), 23.5 (17), 26.1 (15), 26.1 (3"), 34.7 (14), 35.2 (8), 41.2 (2"), 43.7 (11), 57.2 (10), 62.3 (5), 63.5 (20), 65.7 (13). 67.5 (6), 71.3 (4), 75.9 (12), 77.2 (7), 79.1 (9), 128.3 (2'), 134.6 (2). 137.7 (3'), 159.9 (1), 167.4 (1'), 179.7 (1"), 206.1 (3). Związek 38: 12.]3-di-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9.13,20- heksahydroksy-l-tiglien-3-on [0199]

76 EP 2986615B1

1 [0200] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 0.89 (3H (4'), t, J=7.4 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5'), d, J=7.0 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.19 (1H (14), d, J=1.5 Hz), 1.20 (3H (16) s), 1.21 (3H (17), s), 1.45 (1H (3'), dd, J=14.1, 6.8 Hz), 1.45 (1H (3"), dd, J=14.1, 6.8 Hz), 1.62 (1H (3'), dd, J=8.3, 7.5 Hz), 1.68 (1H (3"), dd, J=14.1, 6.9 Hz), 1.81 (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 2.08 (1H (11), dd, J=10.3, 6.5 Hz), 2.30 (1H (8), d, J=5.5 Hz), 2.36 (1H (2'), m), 2.36 (1H (2"), m), 2.62 (1H (10-OH), t, J=6.8 Hz), 3.22 (1H (4-OH), s), 3.53 (1H (10), br. s.), 3.76 (1H (5), d, J=1.1 Hz), 3.82 (1H (20), dd, J=12.5, 6.3 Hz), 3.93 (1H (20), dd, J=12.6, 7.0 Hz), 4.44 (1H (7), d, J=5.5 Hz), 5.06 (1H (7-OH), d, J=5.6 Hz), 5.36 (1H (12), d, J=10.3 Hz). 6.48 (1H (9-OH), s), 7.58 (1H (1), d, J=2.0 Hz). 13 [0201] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4'), 11.6 (4"), 13.9 (18), 16.1 (5"), 16.9 (5'), 17.0 (16), 23.5 (17), 26.0 (15), 26.2 (3"), 26.7 (3'), 34.6 (14), 35.2 (8). 41.3 (2'), 41.8 (2"), 43.3 (11), 57.3 (10), 62.5 (5), 63.9 (20), 65.6 (13), 67.2 (6), 71.3 (4), 75.4 (12), 77.3 (7), 79.1 (9), 134.7 (2), 159.8 (1), 175.9 (1'), 179.6 (1"), 205.9 (3). Związek 39: 12-{[2-(metylosulfanylo)karbonylo]-acetoilo)-13-(2- metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0202]

77 EP 2986615B1

1 [0203] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=6.6 Hz, 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.13 (3H (5"), d, J=7.0 Hz), 1.16 (3H (16), s), 1.20 (1H (14), d, J=5.9 Hz), 1.23 (17). br. s.), 1.45 (1H (3"), td, J=14.1, 7.2 Hz), 1.70 (1H (3"), td, J=14.0, 7.2 Hz), 1.82 (3H (19), dd, J=2.8, 1.3 Hz), 2.05 (1H (OH), d, J=3.40 Hz), 2.09 (1H (11), dd. J=10.3, 6.5 Hz), 2.27 (1H (8), d, J=5.9 Hz), 2.34 (3H (4'), s), 2.38 (1H (2"), t, J=7.0 Hz), 2.85 (1H (4-OH), s), 3.52 (1H (10), dd, J=2.6, 2.3 Hz), 3.57 (2H (2'), d, J=4.5 Hz), 3.70 (1H (5), d, J=1.1 Hz), 3.81 (1H (20), dd, J=12.2, 6.2 Hz), 3.89 (1H (20), m), 4.46 (1H (7), d, J=5.7 Hz), 5.02 (1H (7-OH), d, J=5.9 Hz), 5.35 (1H (12), d, J=10.3 Hz), 6.47 (1H (9-OH), m), 7.56 (1H (1), dd, J=2.0, 1.3 Hz). 13 [0204] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 12.1 (4'), 14.0 (18), 16.2 (5"), 16.6 (16), 23.5 (17), 26.2 (3"), 26.5 (15), 34.8 (14), 35.2 (8), 41.3 (2"), 43.3 (11), 49.5 (2'), 57.4 (10), 62.7 (5), 64.4 (20), 65.3 (13), 66.8 (6), 71.3 (4), 77.2 (7), 77.9 (12). 79.1 (9), 134.7 (2), 159.5 (1), 165.7 (1'), 179.8 (1"), 190.9 (3'), 205.6 (3). Związek 40: 12-[(2-metoksykarbonylo)-acetoilo]-13-(2-metylobutanoilo)- 5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-on [0205]

78 EP 2986615B1

1 [0206] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (3H (18), d), 0.92 (3H (4"), t, J=7.6 Hz). 1.13 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.17 (3H (16), s), 1.21 (1H (14), d, J=5.9 Hz), 1.23 (3H (17), s), 1.45 (1H (3"), dt, J=14.2, 6.8 Hz), 1.70 (1H (3"), dd, J=14.2, 6.8 Hz), 1.82 (3H (19), dd, J=2.7, 1.2 Hz), 2.09 (1H (11), dd, J=10.3, 6.4 Hz), 2.27 (1H (8), d, J=4.9 Hz), 2.38 (1H (2"), m, J=14.1, 7.0, 6.8 Hz), 2.72 (1H (4-OH), s), 3.37 (2H (2'), s), 3.53 (1H (10), d, J=2.4 Hz), 3.70 (1H (5), d. J=1.0 Hz), 3.72 (3H (4'), s), 3.80 (1H (20), m), 3.90 (1H (20), m), 4.46 (1H (7), d, J=2.4 Hz), 5.02 (1H (7-OH), d, J=5.9 Hz), 6.49 (1H (9-OH), s), 7.56 (1H (1), d, J=2.0 Hz). 13 [0207] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.3 (19), 11.6 (4"), 13.9 (18), 16.2 (5"), 16.7 (16), 23.5 (17), 26.2 (3"), 26.5 (15), 34.8 (14), 35.2 (8), 41.3 (2"), 41.4 (2'), 43.3 (11), 52.5 (4'), 57.4 (10), 62.7 (5), 64.7 (20), 65.3 (13), 66.6 (6), 71.3 (4), 77.2 (7), 77.7 (12), 79.1 (9), 134.8 (2), 159.4 (1). 166.1 (1'), 166.1 (3'), 179.8 (1"), 205.5 (3). Przykład 3: Przygotowanie pochodnych Tiglianowych [0208] Liczne związki przygotowano półsyntetycznie za pomocą hydrolizy estrów C-12 i C-13 mieszaniny 5,20-acetonidów związków tiglianowych takich jak Związek 1 i powiązane związki, następnie ponownej estryfikacji przy C-12 i C-13 ze standardowymi odczynnikami przy zastosowaniu następujących

79 EP 2986615B1 sposobów. [0209] Surową mieszaninę estrów tiglianowych do syntezy analogów tiglianowych przygotowano przez sproszkowanie na grubo 150 g nasion Fontainea picrosperma które następnie ekstrahowano przez mieszanie z acetonem w 1L kolbie. Po 4 godzinach, tę zawiesinę przesączono próżniowo i placek filtracyjny przemywano acetonem aż do momentu gdy TLC (PE:EtOAc : 4:6) wykazało nieobecność estrów tiglianowych. Zebrane przesącze odparowano, uzyskując surową mieszaninę estrów. Następnie usunięto tłuszcze przez szybką chromatografię na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (eter naftowy/octan etylu; PE/EtOAc 8:2→4:6 jako eluent) uzyskując 8.2 g (5.5%) surowej mieszaniny estrów. [0210] Mieszaninę estrów następnie zabezpieczone, deestryfikowano i ponownie estryfikowano w pozycjach C-12 i C-13 jak zilustrowano w następujących reakcjach wykorzystując różne grupy acylowe dostarczając Związki 21, 22, 23, 27, 28, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 i 60.

[0211] 10 mL roztworu mieszaniny estrów A w dimetyloformamidzie (DMF) dodano do 50 mL roztworu p-toluenosulfonianu pirydyny (PPTS, 4.1 g, nadmiar) w DMF (10 mL) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Następnie dodano 120 mL 2,2-dimetoksypropanu (DMP) i roztwór mieszano przez 24 godziny. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono roztworem NaCl (150 mL) i przemyto octanem etylu (EtOAc, 50 mL). Fazę organiczną przemyto roztworem NaCl, wysuszono (Na2SO4), przesączono i odparowano. Pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 8:2→6:4 jako eluent) uzyskując 5.2 g (3.5%) mieszaniny B estrów 5,20-acetonidu. Nieprzereagowany

80 EP 2986615B1 materiał ponownie poddano reakcji w tych samych warunkach uzyskując dodatkową mieszaninę B estrów.

[0212] 0.21N roztwór NaOMe przygotowano na świeżo przez powolne dodawanie małych kawałków sodu (9.7 g) do zmieszanego metanolu (stopniowa HPLC, 2 L). Przy energicznym mieszaniu dodano następnie szybko 128 mL tego roztworu do 6.4 g mieszaniny B estrów 5,20-acetonidu. pH otrzymanego roztworu musi być utrzymywane w zakresie 11.5-12.0 przez rozsądne dodawanie 0.21 M NaOMe, uważając aby nie przekroczyć pH 12.5. Po mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, mieszaninę reakcyjną zobojętniono za pomocą kwasu octowego, przesączono i odparowano do około 1/20 początkowej objętości. Dodano EtOAc (20 mL) i roztwór przemyto 2N H2SO4 (100 mL). Kwaśny płyn z przemycia ekstrahowano EtOAc i zebrane roztwory EtOAc przemyto roztworem NaCl (2 x 300 mL). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 6:4→4:6 jako eluent) uzyskując 1.4 g białego proszku. Synteza analogów tiglianowych z symetrycznym wzorem estryfikacji; Przykładowe Sposoby Zmodyfikowana estryfikacja Steglicha [0213] 1.

81 EP 2986615B1

[0214] Do roztworu acetonidu deacylo-tiglianowego (100 mg; 0,23 mMol) w THF (5 mL), dodano 4-dimetyloaminopirydynę (DMAP) (15 mg; 0,12 mMol) i roztwór ogrzewano do 60°C (temperatura łaźni olejowej). Oddzielnie do roztworu estryfikującego kwasu karboksylowego (10 Eq) w THF (10 mL/g), dodano N,N'- dicykloheksylokarbodiimid (DCC, 10 Eq); po mieszaniu przez około 15 minut zawiesinę przesączono przez zwitek waty i kroplami dodano do roztworu THF acetonidu deacylo-tiglianowego. Po mieszaniu przez 24 godziny w 60°C, reakcję rozwinięto przez rozcieńczenie za pomocą EtOAc (≈200 mL) i przemycie 2N H2SO4 (≈50 mL), solanką (2 x ≈50 mL), a następnie nasyconym

NaHCO3 (≈50 mL) i solanką (2 x≈50 mL). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 9:1→6:4 jako eluent) uzyskując 111 mg (80%) białego proszku. 3.2. Odbezpieczenie [0215]

SPOSÓB A (TFA w CH2Cl2) [0216] Diester acetonidu (100 mg) dodano do świeżo przygotowanego roztworu

82 EP 2986615B1 kwasu trifluorooctowego (TFA) w CH2Cl2 (2% Obj./Obj,; 200 µL, 2 µL/mg). Po mieszaniu 6-12 godzin w temperaturze pokojowej, reakcję rozwinięto przez przemycie mieszaniną nasyconego NaHCO3 (≈10 mL) i solanki (≈40 mL), a następnie samą solanką (2x ≈40 mL). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 8:2→2:8 jako eluent) uzyskując analogi tiglianowe (wydajność około: 60-70%),

SPOSÓB B (HClO4 w MeOH) [0217] Diester acetonidu (100 mg) dodano do świeżo przygotowanego roztworu

HClO4 w MeOH [zakres pH: 1.5-2.0]. Po mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 6-24 godzin, reakcję rozwinięto przez zneutralizowanie octanem sodu, przesączenie i odparowanie do około 1/20 początkowej objętości, następnie dodano EtOAc (10 mL) i roztwór przemyto 2N H2SO4 (30 mL) a następnie solanką (30 mL). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc - →4;6 jako eluent) uzyskując diester z wydajnością około 60-70%. [0218] Ten sposób wykorzystano do wytworzenia Związków 27, 41, 42, 43, 44, 46, 49 i 60. Synteza niesymetrycznych diestrów, Przykładowe Sposoby: [0219] 1.

Do roztworu 12,13-deacylo-5,20-acetonidu (C) (1.4 g; 3,4 mMol) w 10 mL tetrahydrofuranie (THF), dodano 740 mL 34 mMol metyloaminy (TEA) i roztwór ogrzewano do 60°C, Oddzielnie do roztworu kwasu (S)-(+)-2- metylobutanowego (3,702 mL; 34 mMol) w THF (20 mL), dodano N,N'-

83 EP 2986615B1 dicykloheksylokarbodiimid (DCC, 7,015 g; 34 mMol). Po mieszaniu przez około 15 minut, zawiesinę przesączono i dodano do ciepłego roztworu wyjściowego diolu (C). Po mieszaniu 24 godziny w 60°C, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono EtOAc (≈200 mL) i przemyto 2N H2SO4 (≈50 mL), roztworem

NaCl (2 x ≈50 mL), a następnie roztworem NaHCO3 (≈50 mL) i roztworem NaCl

(2 x≈50 mL). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 9:1→6:4 jako eluent) uzyskując 12-deacylo-5,20-acetonido-13-[(S)-(+)-2-metylobutanian (D) w postaci białego proszku. 2.

Do roztworu 12,13-deacylo-5,20-acetonidu C (100 mg; 0,25 mMol) w THF (5 mL), dodano kwas (S)-(+)-2-metylobutanowy (109 µL; 1,00 mMol) i N,N'- dicykloheksylokarbodiimid (DCC, 206,33 mg; 1,00 mMol). Roztwór mieszano w 60°C (temperatura łaźni olejowej) przez 24 godziny a następnie rozwinięto przez rozcieńczenie EtOAc (≈20 mL) i przemycie 2N H2SO4 (≈50 mL), solanką

(2 x ≈50 mL), nas. NaHCO3 (≈50 mL), i solanką (2 x≈50 mL). Po wysuszeniu

(Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 9.1→6:4 jako eluent) uzyskując 106.2 mg (60%.) 12- deacylo-5,20-acetonido-13-((S)-2-metylobutanianu) D w postaci białego proszku. 3.

84 EP 2986615B1

Do roztworu 12,13-deacylo-5,20-acetonidu C (100 mg; 0,25 mMol) w THF (5 mL) dodano diizopropyloetyloaminę (DIPEA) (131 µL; 0,75 mMol) i bezwodnik octowy (94 µL; 0,75 mMol). Po mieszaniu przez 72 godziny w temperaturze pokojowej dodano EtOAc (10 mL) i roztwór przemyto 2N H2SO4 (2 x 20 mL) i solanką (20 mL). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc - →4:6 jako eluent) uzyskując 104 mg (87%) 12-deacylo-13-acetylo-5,20-acetonidu w postaci białego proszku. 4.

[0220] Do roztworu deacylo-5,20-acetonidu (100 mg; 0,25 mMol) w toluenie (5 mL) / dimetyloformamidzie (2 mL), dodano bezwodnik N-metyloizatowy (266 mg; 1,50 mMol) i dimetyloaminopirydynę (DMAP) (31 mg; 0.25 mMol). Po mieszaniu 24 godziny w 80°C, reakcję rozwinięto przez rozcieńczenie EtOAc

(≈10 mL) i kolejne przemycia [2N H2SO4 (≈20 mL) + solanka (≈60 mL)] (x2), i

[nas. NaHCO3 (≈20 mL) + solanka (≈60 mL)] (x2). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 9:1→7:3 jako eluent) uzyskując 114 mg (80%) 12- deacylo-13-[(N-metylo)-antranilano-5,20-acetonidu w postaci białego proszku.

85 EP 2986615B1

Acylacja 13-monoesterów: Przykładowe sposoby [0221] 1.

Do roztworu 12-deacylo-5,20-acetonido-13-[(S)-(+)-2-metylobutanianu (D) (1062 mg; 2,04 mMol) w toluenie (10 mL), dodano dimetyloaminopirydynę (DMAP) (249 mg; 2.04 mMol). Oddzielnie do roztworu kwasu benzoesowego 1224 mg; 10.02 mMol) w toluenie (20 mL), dodano trietyloaminę (1.397 mL; 10.02 mMol) i roztwór mieszano przez około 2 minuty do całkowitego rozpuszczenia; następnie dodano chlorek 2,4,6-trichlorobenzoilu (1.566 mL; 10.02 mMol) (Roztwór 1). Po zmieszaniu kompozycji zawierającej związek D przez 6 godzin, zawiesinę przesączono i wylano do Roztworu 1. Po zmieszaniu przez 24 do 48 godzin w 60°C, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono EtOAc (≈10 mL) i przemyto roztworem MH2SO4 (≈40 mL), roztworem NaCl (2 x ≈40 mL), a następnie roztworem NaHCO3 (≈40 mL) i roztworem NaCl (2 x≈40 mL). Po zmieszaniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 9:1→7:3 jako eluent) uzyskując 5,20- acetonido-12-benzoesano-13-[(S)-(+)-2-metylobutanian E w postaci białego proszku. 2.

86 EP 2986615B1

Do roztworu deacylo-13-(N-metyloantranoilo)-5,20-acetonidu (100 mg; 0,18 mMol) w tetrahydrofuranie (THF, 5 mL), kolejno dodano bezwodnik octowy (51 mg; 0,54 mMol) i dimetyloaminopirydynę (DMAP) (2,2 mg; 0,018 mMol). Po zmieszaniu 6 godzin w 50°C, reakcję rozwinięto przez rozcieńczenie EtOAc (ok.

10 mL) i kolejne przemycia 2N H3SO4 (2x ok. 40 mL), nas. NaHCO3 (2x ok. 40 mL), i solanką (2x ok. 40 mL). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 95:05→7:3 jako eluent) uzyskując 105 mg (95%) 12-acetylo-13-(N-metylo)antranilano-5,20- acetonidu w postaci białego proszku. 3.

Do roztworu12-deacylo-5,20-acetonido-13-[(S)-2-metylobutanianu] (100 mg; 0,19 mMol) w toluenie (5 mL), dodano dimetyloaminopirydynę (DMAP) (23 mg; 0,19 mMol). Oddzielnie do roztworu kwasu tyglowego (95 mg; 0,95 mMol) w toluenie (5 mL), dodano trietyloaminę (132 µL; 0,95 mMol) i roztwór mieszano przez około 2 minuty do całkowitego rozpuszczenia; następnie dodano roztwór chlorku 2,4,6-trichlorobenzoilu (148 µL; 0,95 mMol) i po mieszaniu przez 6 godzin w temperaturze pokojowej, zawiesinę przesączono (zwitek waty) i kroplami dodano do roztworu monoestru diterpenoidu w toluenie. Po mieszaniu 24-48 h w 60°C, mieszaninę reakcyjną rozwinięto przez rozcieńczenie EtOAc

87 EP 2986615B1

(ok. 10 mL) i przemycie 2N H2SO4 (ok. 40 mL), solanką (2 x ≈40 mL), a następnie NaHCO3 (ok. 40 mL) i solanką (2 x≈40 mL). Po wysuszeniu

(Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 9:1→7:3 jako eluent) uzyskując 59 mg (50%) 12- tigloilo-13-metylobutyrylo-5,20-acetonidu w postaci białego proszku. 4.

Roztwór 12-deacylo-5,20-acetonido-13-(S)-2-metylobutanianu (100 mg; 0,19 mMol) w toluenie (10 mL) ogrzano do 60°C, i kolejno dodano kwas mirystynowy (217 mg; 0,95 mMol), N,N'-dicykloheksylokarbodiimid (DCC) (196 mg; 0,95 mMol) i dimetyloaminopirydynę (DMAP) (23 mg; 0,19 mMol). Po mieszaniu 12 godzin w 60°C, reakcję rozwinięto przez rozcieńczenie EtOAc (≈10 mL) i przemycie 2N H2SO4 (2x ≈40 mL), nas. NaHCO3 (2x ≈40 mL), i solanką (2x ≈40 mL). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 9:1→7:3 jako eluent) uzyskując 121 mg (70%) 12-mirystoilo-13-(2-metylobutanoilo)-5,20-acetonidu w postaci białego proszku. 5.

Roztwór 12-deacylo-5,20-acetouido-13-octanu (100 mg; 0,25 mMol) w toluenie

88 EP 2986615B1

(10 mL) ogrzewano do 60°C (temperatura łaźni olejowej), a następnie dodano kwas mirystynowy (286 mg; 1,00 mMol), N,N'-dicykloheksylokarbodiimid (DCC) (206 mg; 1,00 mMol) i dimetyloaminopirydynę (DMAP) (31 mg; 0,25 mMol). Po mieszaniu 12 godzin w 60°C, reakcję rozwinięto przez rozcieńczenie EtOAc (ok.

10 mL) i przemycie 2N H2SO4 (2x ok. 40 mL), nas. NaHCO3 (2x ok.40 mL), i solanką (2x ok. 40 mL). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 9:1→7:3 jako eluent) uzyskując 121 mg (70%) 12-mirystylo-13-acetylo-5,20-acetonidu w postaci białego proszku. 6.

[0222] Do ogrzanego (60 °C, temperatura łaźni olejowej) roztworu deacylo-13- (N-metyloantranoilo)-5,20-acetonidu (100 mg; 0,18 mMol) w toluenie (10 mL) kolejno dodano kwas heksanowy (84 mg; 0,72 mMol), dicykloheksylokarbodiimid (DCC, 149 mg; 0,72 mMol), i dimetyloaminopirydynę (DMAP 22 mg; 0,18 mMol). Po mieszaniu 12 h w 60°C, reakcję rozwinięto przez rozcieńczenie EtOAc (ok. 10 mL) i przemycie kolejno 2N H2SO4 (2x ok. 40 mL), nas. NaHCO3 (2x ok. 40 mL), i solanką (2x ok, 40 mL). Po wysuszeniu

(Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc 9:1→7:3 jako eluent) uzyskując 108 mg (90%) 12- heksanoilo-13-(N-metyloantranoilo)-5,20-acetonidu w postaci białego proszku. Odbezpieczenie [0223] 1.

89 EP 2986615B1

5,20-acetonido-12-benzoesan-13-[(S)-(+)-2-metylobutanian E (637 mg; 1.02 mMol) dodano do świeżo przygotowanego roztworu HClO4 w MeOH [1.5 < pH < 2.0]. Po mieszaniu przez 6-24 godziny, mieszaninę reakcyjną zobojętniono octanem sodu, przesączono i odparowano do około 1/20 wyjściowej objętości.

Dodano EtOAc (10 mL) i roztwór przemyto 2N H2SO4 (30 mL) a następnie roztworem NaCl (30 mL). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym metodą grawitacyjną (PE/EtOAc - →4:6 jako eluent) uzyskując 12-benzoesano-13-[(S)-(+)-2-metylobutanian F (Związek 23) w postaci białego proszku. 2.

[0224] Reakcja z 12-acetylo-13-N-metyloantranoilo-5,20-acetonidem wygląda następująco: Do roztworu 12-acetylo-13-N-metyloantranoilo-5,20-acetonidu

(100 mg; 0,16 mMol) w CH2Cl2 (10 mL), dodano kwas trifluorooctowy (TFA) (300 µL; 3% Obj./Obj.). Po mieszaniu około 12 godzin, reakcję rozwinięto przez przemycie [NaHCO3 (≈10 mL) + solanką (≈40 mL)] a następnie i solanką (2x

≈40 mL). Po wysuszeniu (Na2SO4), przesączeniu i odparowaniu, pozostałość

90 EP 2986615B1 oczyszczono za pomocą grawitacyjnej chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (PE/EtOAc 8:2→2:8 jako eluent) uzyskując 12-acetylo-13-(N- metyloantranoilo)-tiglian, 69 mg (75%) w postaci białego proszku. [0225] Związki 21,22, 23, 28, 45, 47, 48, 50, 51, 52 i 53 przygotowano za pomocą tych sposobów. Związek 21 1 [0226] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H, d, J=6.6 Hz), 0.93 (3 H, t, J=7.4 Hz), 1.21 (3 H. s), 1.23 (3 H, s), 1.29 (1 H, d, J=6.7 Hz), 1.64 (2 H, sxt, J=7.6 Hz), 1.73 (3 H, dd. J=2.9, 1.3 Hz), 1.77 (3 H, dq, J=7.2, 1.2 Hz), 1.79-1.81 (3 H, m), 1.95 (1 H, dd, J=9.9, 6.5 Hz), 2.24-2.38 (2 H, m), 3.16 (1 H, d, J=6.7 Hz), 3.26 (1 H, d, J=0.5 Hz), 3.65 (1 H, s), 3.83 (2H, dd, J=13.3, 12.5 Hz), 3.94 (1 H, d, J=3.1 Hz, OH), 4.06 (1 H, t, J=1.6 Hz), 4.22 (1 H, s), 5.41 (1 H, d, J=9.9 Hz), 5.82-6.00 (1 H, br. s., OH), 6.80 (1 H, qq, J=7.1, 1.4 Hz), 7.71 (1 H, dd, J=2.6, 1.3 Hz). 13 [0227] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.72, 12.20, 13.62, 14.43, 15.07, 17.12, 18.03, 23.66, 26.35, 35.98, 36.03, 36.13, 45.76, 48.92, 61.77, 64.56, 65.23, 65.65, 71.36, 72.41, 76.74, 77.20, 128.38, 133.46, 137.73, 164.63, 167.62, 176,12, 209.88. Związek 22 1 [0228] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3 H. d, J=7.3 Hz), 0.86 (3 H, t, J=7.2 Hz), 1.20 (3 H, s), 1,21 (3 H, s), 1.20-1.40 (10 H, m), 1.29 (1 H, d, J=6.8 Hz), 1.67 (2 H, d, J=13.7 Hz), 1.75 (3 H, dd, J=2.9, 1.0Hz), 1.88-1.92 (2H, m) 1.89-1.95 (1H, m), 3.07 (2H, dd, J=6.8, 1.5 Hz), 3.15 (1 H, d. J=6.4 Hz), 3.26 (1 H, s), 3.85 (2 H, dd, J=12.7,4.4 Hz), 4.04 (1 H, d, J=2.9 Hz). 4.21 (1 H. s), 5.13- 5.15 (1 H, m), 5.16-5.18 (1 H, m), 5.35 (1 H, d, J=9.8 Hz), 5.82-5.92 (1 H, m), 7.70 (1. H, dd, J=2.4, 1.0 Hz). [0229] 13C NMR (125 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm: 9.74, 14.08, 15.12, 17.03, 22.63, 23.69, 24.48, 26.51, 29.07, 29.08, 29.19, 31.81, 34.25, 36.01, 36.04, 39.29, 45.50, 48.94, 61.69, 64.54, 65.21, 65.49, 71.58, 72.35, 77.17, 77.41, 118.62, 130.03, 133.55, 164.54, 171.11, 176.25, 209.86, Związek 23 1 [0230] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.90 (3 H, d, J=6.5 Hz), 0.94 (3 H, t,

91 EP 2986615B1

J=7.5 Hz), 1.14 (3 H, d, J=7.1 Hz), 1.22 (3 H, s), 1.32 (1 H, d, J=6.6 Hz), 1.35 (3 H, s), 1.41-1.51 (1 H, m, J=14.1, 7.5, 7.0 Hz), 1.69-1.79 (1 H, m), 1.73 (3 H, dd, J=2.9, 1.3 Hz), 2.08 (1 H, dq, J=9.9, 6.5 Hz), 2.39 (1 H, sxt, J=7.0 Hz). 3.24 (1 H, d, J=6.6 Hz), 3.29 (1 H, s), 3.84 (2 H, dd, J=12.8. 1.3 Hz), 4.10 (1 H, t, J=2.5 Hz), 4.24 (1 H, d, J=0.7 Hz), 5.62 (1 H, d, J=9.9 Hz), 6.07 (1 H, br. s., OH), 7.43 (2 H, t, J=7.7 Hz), 7.55 (1 H, tt, J=7.5. 1.3 Hz), 7.72 (1 H, dd. J=2.6, 1.3 Hz), 7.99 (2 H, dm, J=8.4, 1.3 Hz) 13 [0231] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.73, 11.61, 15.14, 16.14, 17.32, 23.63, 26.18, 26.82, 36.03, 36.34, 41.22, 45.92, 48.92, 61.86, 64.59, 65.20, 65.48, 71.27, 72.46, 77.23, 77.60, 128.44 (2 C), 129.70 (2 C), 130.02, 133.07, 133.52, 164.54, 165.94, 179.00, 209.84. Związek 27 1 [0232] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3 H, d, J=6.5 Hz), 0.93 (6 H. t, J=7.4 Hz), 1.20 (6 H, s), 1.28 (1 H, d, J=6.6 Hz), 1.58-1.68 (4 H, m), 1.74 (3 H, d, J=1.8 Hz), 1.91 (1 H, dq, J=10.0, 6.4 Hz). 2.20-2.36 (4 H, m). 3.14 (1 H, d, J=6.6 Hz). 3.25 (1 H, s), 3.63 (1 H, s, OH), 3.76-3.86 (1 H, m), 3.93 (1 H, d, J=3.1 Hz, OH), 4.05 (1 H, d, J=2.4 Hz), 4.21 (1 H, d, J=2.4 Hz), 5.36 (1 H, d, J=10.0 Hz), 5.84 (1 H, br. s., OH), 7.70 (1 H, s).

[0233] 13C NMR (125 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm: 9.72, 13.46, 13.62, 15.04, 17.02, 18.01. 18.61, 23.66, 26.34, 35.90, 35.95, 36.14, 36.38, 45.42, 48.90, 61.79, 64.58, 65.21, 65.60, 71.34, 72.40, 76.59, 77.18, 133.49, 164.54, 173.30, 176.05, 209.85. Związek 28 1 [0234] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.91 (3 H, d, J=6.6 Hz), 0.96 (3 H, t, J=7.4 Hz), 1.21 (3 H, s), 1.34 (3 H, s), 1.36 (1 H, d, J=3.4 Hz), 1.60 - 1.72 (2 H, m), 1.74 (3 H, d, J=2.1 Hz), 2.09 (1 H, dd, J=9.8, 6.5 Hz), 2.31 (1 H, t, J=15.9, 7.6 Hz), 2.38 (1 H, t, J=15.9, 7.6 Hz), 3.24 (1 H, d, J=6.7 Hz), 3.29 (1 H, s), 3.80 (1 H, d, J=12.4 Hz), 3.87 (1 H, d, J=12.4 Hz), 4.09 (1 H, d, J=2.7 Hz), 4.24 (1 H, s), 5.62 (1 H, d, J=9.9 Hz), 7.43 (2 H, t, J=7.7 Hz), 7.56 (1 H, t, J=7.4 Hz), 7.73 (1 H, s), 7.99 (2 H, d, J=7.3 Hz) 13 [0235] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.73, 13.65, 15.16, 17.25, 18.07, 23.66, 26.59, 36.07, 36.18, 36.23, 45.80, 48.95, 61.74, 64.55, 65.23, 65.62,

92 EP 2986615B1

71.54, 72.40, 77.21, 77.63, 128.46 (2 C), 129.72 (2 C), 129.98, 133.12, 133.56, 164.57, 166.15, 176.19, 209.88. Związek 41 1 [0236] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=7.3 Hz), 0.85 (3H (9'), t, J=7.3 Hz), 0.86 (3H (9"), t, J=6.8 Hz), 1.20 (3H (16), s), 1.20 (3H (17), s), 1.22-1.30 (10H (4', 5', 6', 7', 8'), m), 1.22-1.30 (10H, 4'', 5'', 6'', 7'', 8''), m), 1.28 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.53-1.62 (2H (3"), m), 1.56-1.63 (2H (3'), m), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.90 (1H (11), dq, J=10.1. 6.5 Hz), 2.19 (1H (20-OH), t, J=6.8 Hz), 2.24-2.32(2H (2'), m), 2.29-2.37 (2H (2''), m), 3.14 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.59 (1H (4-OH), s), 3.78 (1H (20), dd, J=12.5, 5.2 Hz), 3.82-3.87 (1H (20), m, J=12,5. 7.3 Hz), 3.89 (1H (5-OH), d, J=3.1 Hz), 4.05 (1H (10), dq), 4.21 (1H (5), d, J=2.6 Hz), 5.36 (1H (12), d, J=.10.4 Hz), 5.86 (1H 9- OH), br. s.), 7.70 (1H (1), dd, J=2.6, 1.6 Hz). 13 [0237] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 14.1 (9''), 14.1 (9'), 15.1 (18), 17.0 (16), 22.6 (8''), 22.6 (8'), 23.7 (17), 24.5 (3''), 25.2 (3'), 26.3 (15), 28.99 (4''), 29.07 (6'), 29.07 (6''). 29.15 (4'), 29.18 (5''), 29.2 (4'), 29.22 (5'), 31.78 (7''), 31.80 (7'), 34.3 (2''), 34.5 (2'), 35.9 (14), 36.0 (8), 45.4 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.6 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.5 (12), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.6 (1), 173.5 (1'), 176.2 (1''), 209.9 (3). Związek 42 1 [0238] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.2 Hz), 0.87 (3H (6'), t, J=7.0 Hz), 0.88 (3H (6''), t, J=7.0 Hz), 1.20 (3H (17), s), 1.21 (3H (16), s), 1.25-1.31 (2H (4'), m), 1.25-1.31 (2H (4''), m), 1.26-1.32 (2H (5''), m), 1.26-1.32 (2H (5'), m), 1.27-1.29 (1H (14), m, J=6.8 Hz), 1.57-1.62 (2H (3''), m), 1.58-1.63 (2H (3'), m), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.91 (1H (11), dq, J=10.1, 6.5 Hz), 2.20 (1H (20-OH), t, J=6.8 Hz), 2.26-2,30 (2'), m), 2.29-2.34 (2H (2''), m), 3.14 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.59 (1H (4-OH), d, J=1.0 Hz), 3.78 (1H (20), dd, J=12.5, 5.2 Hz), 3.82-3.87 (1H, (20), m), 3.88 (1H (5-OH), d, J=3.1 Hz), 4.05 (1H (10), t, J=2.6 Hz), 4.21 (1H (5), d, J=3.6 Hz). 5.36 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.86 (1H, (9-OH), br.s.),7.70 (1H (1), dd, J=2.3, 1.3 Hz), 13 [0239] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 13.8 (6''), 13.9 (6'), 15.1 (18), 17.0 (16), 22.26 (5''), 22.3 (5'), 23.7 (17), 24.1 (3''), 24.8 (3'), 26.3 (15),

93 EP 2986615B1

31.1 (4''), 31.2 (4'), 34.2 (2''), 34.5 (2'), 35.9 (14), 36.0 (8), 45.4 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.6 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.5 (12), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.6 (1), 173.5 (1'), 176.2 (1''), 210.0 (3). Związek 43 1 [0240] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=6.5 Hz), 0.89 (3H (5'), t, J=7.2 Hz), 0.90, (3H (5''), t, J=7.3 Hz), 1.21 (3H (16), s), 1.21 (3H (17), s), 1.28 (1H (14), d, J=6.6 Hz), 1.29-1.37 (2H (4''), m), 1.29-1.38 (2H (4'), m), 1.55- 1.59 (2H (3''), m), 1.56-1.62 (2H (3'), m). 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.2 Hz), 1.91 (1H (11), dq, J=10.1, 6.5 Hz), 2.19 (1H (20-OH), t, J=6.6 Hz), 2.24-2.32 (2H (2'), m), 2.30-2.38 (2H (2''), m), 3.15 (1H (8). d, J=6.6 Hz), 3.25 (1H (7), s), 3.59 (1H (4-OH), s), 3.78 (1H (20), dd, J=12.6, 5.2 Hz), 3.85 (1H (20), dd, J=12.6, 7.4 Hz), 3.88 (1H (20-OH), d, J=3.1 Hz), 4.05 (1H (10), t. J=2.6 Hz), 4.21 (1H (5), d, J=2.3 Hz), 5.36 (1H (12), d, J=10.0 Hz), 5.85 (1H (9-OH), br. s.), 7.70 (1H (1), dd, J=2.3, 1.4 Hz). 13 [0241] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 13.65 (5''), 13.68 (5'), 15.1 (18), 17.0 (16), 22.1 (4''), 22.2 (4'), 23.7 (17), 26.4 (15), 26.5 (3''), 27.2 (3'), 34.0 (2''), 34.2 (2'), 35.9 (14), 36.0 (8), 45.5 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.6 (20), 65.2 (7), 65.6 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.6 (12), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.6 (1). 173.5 (1'), 176.2 (1''), 209.9 (3). Związek 44 1 [0242] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.86 (3H (18), d, J=6.2 Hz), 1.24 (3H (16). s), 1.26 (3H (17), s), 1.33 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz). 1.76-1.78 (2H (4'), m). 1.77-1.79 (2H (4''), m), 1.78-1.79 (3H (5"), m), 1.80-1.81 (3H (5'), m), 1.97 (1H (11). dq, J=9.9, 6.4 Hz), 2.19 (1H (20-OH), br.s.), 3.18 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.27 (1H (7), s), 3.60 (1H (4-OH), s), 3.74-3.81 (1H (20), m), 3.86 (1H (20),br. s.), 3.89 (1H (5-OH), br. s.), 4.04-4.11 (1H (10), m). 4.22 (1H (5), s), 5.45 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 6.28 (1H (9-OH), br. s.), 6.75- 6.83 (1H (3'), m), 6.85-6.94(1H (3''), m), 7.72(1H (1). dd, J=2.6, 1.6 Hz). 13 [0243] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.8 (5''), 12.2 (5'), 14.4 (4'), 14.7 (4''), 15.2 (18), 17.3 (16), 23.7 (17), 26.8 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.5 (20), 65.3 (7), 65.6 (13), 71.7 (5), 72.4 (4), 77.0 (12), 77.2 (9), 128.2 (2'), 128.5 (2"), 133.4 (2), 137.6 (3'), 139.8(3''), 164.9 (1),

94 EP 2986615B1

167.5 (1'), 169.7 (1''), 210.0 (3).. Związek 45 1 [0244] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.79 (3H (18), d, J=6.6 Hz). 0.93 (3H (4'''), t, J=7.5 Hz), 1.13 (3H (5'''), d, J=7.0 Hz), 1.24 (3H (17), s), 1.28 (3H (16), s), 1.28 (1H (14), d, J=6.7 Hz), 1.45 (1H (3'''), dq, J=14.1, 7.3 Hz), 1.69-1.76 (1H (3'''), m), 1.71 (3H (19), dd, J=2.8, 1.4), 1.77 (3H (4"), dq, J=7.1, 1-1 Hz), 1.79- 1.81 (3H (5''), m), 1.90 (1H (11), dq, J=9.8, 6.5 Hz), 2.01 (3H (2''''), s), 2.18 (3H (2'), s). 2.38 (1H (2'''), sxt, J=7.0 Hz). 2.99 (1H (4-OH), s), 3.15 (1H (7). s), 3.26 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.54 (1H (20), d, J=12.1 Hz), 4.14-4.17, (1H (10), m), 4.69 (1H (20), d, J=12.1 Hz), 5.42 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.52 (1H (5), s), 5.98 (1H (9-OH), br.s,), 6.80 (1H (3''), qq, J=7.1, 1.3 Hz), 7.62 (1H (1), dd, J=2.3, 1.2 Hz). 13 [0245] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.8 (19), 11.6 (4'''), 12.2 (5''), 14.4 (4''), 15.0 (18). 16.2 (5'''), 17.3 (16), 20.7 (2''''), 20.8 (2'), 23.7 (17), 26.2 (3'''), 26.7 (15), 36.0 (14), 36.1 (8), 41.2 (2'''), 45.8 (11), 49.4 (10), 60.4 (6), 65.4 (7), 65.6 (13), 66.3 (20), 68.1 (5), 71.8 (4), 76.7 (12), 76.9 (9), 128.5 (2"), 133.8 (2), 137.6 (3''), 162.5 (1), 167.4 (1''), 168.8 (1'), 170.6 (1''''), 178.9 (1'''), 206.3 (2). Związek 46 1 [0246] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.87 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 1.23 (3H (16), s), 1.25 (3H (17), s), 1.34 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.75 (3H (19), dd, J=2.6, 1.0 Hz), 1.82-1.85 (3H (6'), m), 1.82-1.85 (3H (6''), m), 1.93-1.99 (1H (11), m), 3.17 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.27 (1H (7), br.s.), 3.78 (1H (20), d, J=12.6 Hz), 3.85 (1H (20), d, J=12.2 Hz), 4.05-4.08 (1H (10), m), 4.22 (1H (5), d, J=1.6 Hz), 5.47 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.73 (1H (2'), d, J=15.2 Hz), 5.75 (1H (2''), d, J=15.1 Hz), 6.08-6.19 (1H (4'), m), 6.08-6.19 (1H (4''), m), 6.14-6.19 (1H (5'), m), 6.15-6.18 (1H (5''), m), 7.16-7.23 (1H (3'), m), 7.26-7.33 (1H (3''), m), 7.71- 7.73, (1H (1), m). 13 [0247] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 15.2 (18), 17.2 (16), 18.7 (6'), 18.7 (6''), 23.6 (17), 26.7 (15), 36.1 (8), 36.2 (14), 45.9 (11), 49.0 (10), 61.6 (6), 64.6 (20), 65.3 (7), 65.6 (13), 71.7 (5), 72.4 (4), 77.0 (12), 77.1 (9), 117.7 (2''), 118.7 (2'), 129.7 (4'), 129.7 (4''), 133.4 (2), 139.7 (5'), 141.0 (5''), 145.5 (3'), 147.3 (3''), 164.8 (1), 166.8 (1'), 169.2 (1''), 210.0 (3), Związek 47

95 EP 2986615B1

1 [0248] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.89 (3H (18), d, J=6.7 Hz), 0.90 (3H (6'), t, J=6.7 Hz), 1.28 (3H (16), s), 1.29-1.34 (2H (4'), m), 1.30-1.35 (2H (5'), m), 1.31 (3H (17), s), 1.40 (1H (14), d, J=6.6 Hz). 1.60-1.65 (2H (3'), m), 1.77 (3H (19), dd, J=2.7, 1.2 Hz), 1.97 (1H (11), dq, J=9.9, 6.5 Hz), 2.14 (1H (20-OH), dd, J=7.4, 6.4 Hz), 2.30 (2H, (2'), td, J=7.4, 7.3 Hz), 2.87 (3H (MeNH), d, J=4.8 Hz), 3.22 (1H (8), d, J=6.6 Hz), 3.29 (1H (7), s), 3.80 (1H (20), dd, J=12.5, 5.7 Hz), 3.86 (1H (20), dd, J=12.9, 7.8 Hz), 4.08-4.11 (1H (10), m), 4.24 (1H (5), d, J=2.5 Hz), 5.53 (1H (12). d, J=9.9 Hz), 6.30-6.37 (1H (9-OH), m). 6.52 (1H (6"), ddd. J=7.9, 7.0, 0.9 Hz), 6.64 (1H (4"), d, J=8.4 Hz), 7.36 (1H (5"), ddd, J=8.4, 7.1, 1.4 Hz), 7.56 (1H (3"NH), g, J=4.8 Hz), 7.75 (1H, 7"), dd,J=8.2, 1.6 Hz), 7.72- 7.76 (1H (1), m). 13 [0249] C NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 9.8 (19), 14.0 (6'), 15.2 (18), 17.2 (16), 22,4 (5'), 23.9 (17), 24.9 (3'), 27.0 (15), 29.5 (MeNH). 31.2 (4'), 34.5 (2'), 36.1 (8), 36.2 (14), 45.7 (11), 49.0 (10), 61.8 (6), 64.6 (20), 65.4 (7), 65.5 (13), 71.6 (5), 72.4 (4), 76.8 (12), 77.4 (9), 108.6 (2") 111-0 (4"), 114.5 (6"), 131.8 (7"), 133.6 (2), 135.6 (5"), 152.7 (3"), 164.4 (1), 170.2 (1"), 173.2 (1'), 209.9 (3). Związek 48 1 [0250] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.9 (3H (18), d, J=6.6 Hz), 1.27 (3H (16), s), 1.32 (3H (17), s), 1.4 (1H (14), d, J=6.6 Hz), 1,77 (3H (19), dd, J=2.7, 1.0 Hz), 1.98 (1H (11), dq, J=9,9, 6.5 Hz), 2.05 (3H (2'), s), 2.88 (3H (MeNH), d, J=5.1 Hz), 3.22 (1H (8), d, J=6.6 Hz), 3.29 (1H (7), s), 3.80 (1H (20), dd, J=12.2, 5.2 Hz), 3.83∼3.88 (1H (20), m), 4.09 (1H (10), br.s.), 4.24 (1H (5), d, J=2.9 Hz), 5.49 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 6.53 (1H (6"), t, J=7.6 Hz), 6.64 (1H (4"), d, J=8.6 Hz), 7.36 (1H (5"), ddd, J=8.4, 7.0, 1.6 Hz), 7.55 (1H (3"-NH), q, J=4.6 Hz), 7.73 (1H (1), s), 7.78 (1H (7"), dd, J=8.0, 1.6 Hz). 13 [0251] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.8 (19), 15.3 (18), 17.2 (16), 21.0 (2'), 23.9 (17), 27.1 (15), 29.5 (MeNH), 36.1 (8), 36.3 (14), 45.8 (11), 49.0 (10), 61.8 (6). 64.6 (20), 65.3 (7), 65.4 (13), 71.6 (5), 72.4 (4). 77.3 (9), 77,4 (12), 108.6 (2"), 111.0 (4"), 114.5 (6"), 131.9 (7"), 133.6 (2), 135.6 (5"), 152.7 (3"), 164.4 (1), 170.3 (1"), 170.4 (1'), 209.9 (3). Związek 49

96 EP 2986615B1

1 [0252] H NMR (500MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.8 Hz), 0.86 (3H (7'), t, J=6.7 Hz), 0.86 (3H (7"), t, J=6.7 Hz), 1.20 (3H (16), s), 1.20 (3H (17), s), 1.22-1.32 (12 H, (4', 5', 6', 4", 5", 6"), m), 1.28 (1H (14), d, J=6,7 Hz), 1.55-1.63 (4H (3', 3"), m), 1.74 (3H (19), dd, J=2.6, 1.0 Hz), 1.90 (1H (11), m), 2.28 (2H (2"), m), 2.32 (2H (2'), m), 3.14 (1H (8), d, J=6.7 Hz), 3.25 (1H (7), s), 3.65 (1H (4-OH), s), 3.81 (2H (20), br.s.), 3.97 (1H (5-OH), br.s.), 4.05 (1H (10). t, J=2.6 Hz), 4.21 (1H (5), s), 5.35 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.85 (1H (9-OH), br.s.). 7.70 (1H (1), dd, J=2.6, 1.6 Hz), 13 [0253] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 14.0 (7'), 14,0 (7"), 15.0 (18), 17.0 (16), 22.4 (6"), 22.5 (6'), 23.7 (17), 24.4 (3'), 25.1 (3"), 26.3 (15), 28.7 (4'), 28.7 (4"), 31.4 (5'), 31.4 (5"), 34.3 (2'), 34.5 (2"), 35.9 (8), 35.9 (14), 45.4 (11). 48.9 (10), 61.8 (6), 64.6 (20), 65.2 (7), 65.6 (13), 71.3 (5), 72.4 (4), 76.5 (9), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.5 (1), 173.5 (1'), 176.2 (1"), 209.8 (2). Związek 50 1 [0254] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.8 Hz), 0.85 (3H (14'), t, J=6.8 Hz), 1.20 (3H (16), s), 1.20 (3H (17), s), 1.21-1.28 (20H (4', 5', 6', 7', 8', 9', 10', 11', 12', 13'), m), 1.30 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.60 (2H (3'), quin, J=7.3 Hz), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz). 1.91 (1H (11), dq, J=10.1, 6.5 Hz), 2.07 (3H, (2"), s), 2.23-2.34 (2H (2'), m), 3.14 (1H (8), d, J=6.8 Hz), 3.24 (1H (7), s), 3.46 (1H (5-OH), s), 3.65 (1H (4-OH), s), 3.77-3.83 (2H (20), m, J=3.1 Hz), 3.97 (1H (20-OH), d, J=3.1 Hz), 4.04 (1H (10), t, J=2.6 Hz), 4.21 (1H (5), d, J=2.1 Hz), 5.36 (1H (12), d, J=10.4 Hz), 5.70 (1H (9-OH), br.s.), 7.69 (1H (1), dd, J=2.6, 1.6 Hz). 13 [0255] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 14.1 (14'), 15.0 (18), 17.0 (16), 21.0 (2"), 22.7 (13'), 23.6 (17), 25.1 (3'), 26.2 (15), 29.0 (4'), 29.2 (5'), 29.3 (6'), 29.5 (7'), 29.6 (8'), 29.6 (8'), 29.6 (9'), 29.6 (10'). 29.6(11'), 31.9 (12'), 34.5 (2'), 35.8 (14), 35.9 (8), 45.3 (11), 48.9 (10), 61.8 (6), 64.6 (20). 65.2 (7), 65.8 (13), 71.2 (5), 72.4 (4), 76.5 (12), 77.2 (9), 133.5 (2), 164.4 (1). 173.6 (1'), 173.6 (1"), 209.8 (3). Związek 51 1 [0256] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.84 (3H (18), d, J=6.8 Hz), 0.86 (3H

97 EP 2986615B1

(14'), t, J=7.0 Hz), 0.92 (3H (4"), t, J=7.5 Hz), 1.12 (3H (5"), d, J=6.8 Hz), 1.21 (3H (16), s), 1.22 (3H (17), s), 1.21-1.31 (20H (4', 5', 6', 7', 8', 9', 10', 11', 12', 13'), m), 1.25 (1H (14), d, J=6.2 Hz), 1.44 (1H (3"), ddq, J=14.0, 7.1, 7.1 Hz), 1.60 (2H (3'), m), 1.71 (1H (3"), ddq, J=14.0, 7.5, 7.5 Hz). 1.75 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.90 (3H (11), dq, J=10.1, 6.5 Hz), 2.18 (1H (20-OH), m, J=6.8, 4.7 Hz), 2.28 (2H (2'), m, J=11.4, 7.4 Hz). 2.36 (2H (2"), sxt, J=7.3 Hz), 3.15 (1H (8), d. J=6.8 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.57 (1H (4-OH), d, J=1.0 Hz), 3.78 (1H (20), dd, J=12.5, 4.2 Hz), 3.86 (1H (20), dd, J=12.5, 6.8 Hz), 3.87 (1H (5-OH), d, J=3.1 Hz), 4.05 (1H (10), m, J=2.6 Hz), 4.21 (1H (5), d, J=2.6 Hz), 5.37 (1H (12), d, J=9.9 Hz), 5.98 (1H (9-OH), br.s.), 7.71 (1H (1), dd, J=2.6, 1.6 Hz). 13 [0257] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.6 (4"). 14.1 (14'), 15.1 (18). 16.1 (5"). 17.2 (16), 22.7 (13'), 23.7 (17), 25.2 (2'), 26.2 (3"), 26.6 (15), 29.0 (5'), 29.3 (4'), 29.3 (4"), 29.5 (6'), 29.6 (8'), 29.6 (9'), 29.6 (10'), 29.7 (11'), 31.9 (12'), 34.6 (2'), 36.0 (8), 36.1 (14), 41.2 (2"), 45.6 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.5 (13), 71.6 (5), 72.4 (4), 76.5 (12), 77.2 (9), 133.5 (2). 164.7 (1), 173.3 (1'), 178.8 (1"), 209.9 (3). Związek 52 1 [0258] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.85 (3H (18), d, J=6.8 Hz), 0.90 (3H (4'), t, J=7.5 Hz), 1.11 (3H (5'), d, J=7.3 Hz), 1.19 (3H (16), s), 1.21 (3H(17),s), 1.31 (1H (14), d, J=6.8 Hz), 1.44-1.56 (1H (3'),m), 1.58-1.67 (1H (3'), m), 1.74 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 1.88-1.96 (1H (11), m), 2.08 (3H (2"), s), 2.33-2.43 (2H (2'), m), 3.15 (1H (8), d, J=6.2 Hz), 3.25 (1H (7), s), 3.59 (1H (4-OH), br.s.), 3.78 (1H (20), d, J=13.0 Hz), 3.85 (1H (20), d, J=12.5 Hz), 4.05 (1H (10), t, J=2.9 Hz), 4.21 (1H (5), s), 5.38 (1H (12), d, J=10.4 Hz), 5.74 (1H (9-OH), br.s.), 7.71 (1H (1), dd, J=2.3, 1.3 Hz). 13 [0259] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.7 (19), 11.3 (4'), 15.0 (18), 16.5 (5'), 17.0 (16), 21.0 (2"), 23.6 (17), 26.1 (15), 26.9 (3'), 35.7 (14), 35.9 (8), 41.2 (2'), 45.3 (11), 48.9 (10), 61.7 (6), 64.5 (20), 65.2 (7), 65.8 (13), 71.5 (5), 72.4 (4), 76.2 (12), 76.9 (9), 133.5 (2), 164.6 (1), 173.6 (1"), 176.4 (1'), 209.9 (3). Związek 53 1 [0260] H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (3H (6'), m, J=7.3 Hz), 1.06 (3H (18), d, J=6.2 Hz), 1.18 (3H (16), s), 1.25 (3H (17), s), 1.25 (1H (14), d, J=7.3

98 EP 2986615B1

Hz), 1.27-1.33 (4H (4', 5'), m), 1.59-1.65 (2H (3'), m), 1.74-1.80 (1H (11), m), 1.76 (3H (19), dd, J=2.9, 1.3 Hz), 2.23 (1H (20-OH), t, J=6.2), 2.35 (2H (2'), td, J=7.5, 1.6 Hz), 3.06 (1H (8), d, J=7.3 Hz), 3.26 (1H (7), s), 3.57 (1H (4-OH), s), 3.77 (1H (10), t, J=2.6 Hz), 3.81 (2H (20), dd, J=7.3, 4.7 Hz), 3.94 (1H (12), dd, J=9.1, 1.3 Hz), 4.2 (1H (5), s), 7.69, (1H (1), dd, J=2.3, 1.3 Hz). 13 [0261] C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.8 (19), 13.9 (6'), 16.3 (18), 17.2 (16), 22.3 (5'), 23.3 (17), 24.5 (3'), 28.0 (15), 31.3 (4'), 34.0 (2'), 34.8 (14), 36.5 (8), 47.2 (11), 50.8 (10), 62.5 (6), 65.0 (20), 66.0 (7), 68.6 (13), 71.4 (5), 72.1 (4), 77.7 (9), 78.2 (12), 134.0 (2), 163.7 (1), 177.3 (1'), 209.6 (3). Związek 60 [0262] HPLC: kolumna C18 Kinetex C18 4.6 mm, 0.8 mL/min, metanol-woda (70:30). Czas retencji: 10.9 minut. Przykłady wpływów in vitro na rodzaje komórek zaangażowane w gojenie rany Przykład 4: Gojenie zadrapania i migracja fibroblastów in vitro [0263] Zdolność wczesnego pasażu noworodkowych fibroblastów napletka (NFF) hodowanych w RPMI 1640- 10% cielęcej surowicy płodowej do migracji przez ranę stanowiącą zadrapanie utworzonej w zrastającej się monowarstwie po traktowaniu oczyszczonymi związkami lub ekstraktami roślinnymi wyznaczono przy zastosowaniu jednego lub więcej z poniższych trzech sposobów. Sposób 1 [0264] Komórki wysiano do dołków o średnicy 16-mm (płytki 24-dołkowe), pozostawiono do zrośnięcia się i wykonano dwa zadrapania w każdym dołku wykorzystując czubek jałowej plastikowej pipety. Podłoże usunięto, dołki przemyto solą fizjologiczną buforowaną fosforanem o pH 7.2 (PBS) aby pozbyć się usuniętych komórek, dodano świeże podłoże a następnie wykonano 10- krotne rozcieńczenia czystego związku lub ekstraktu roślinnego (2µL). Inkubację kontynuowano przez 16 do 30 godzin. Doświadczenie zakończono gdy brzegi zadrapania nietraktowanych hodowli zamknęły około 25% początkowej przerwy. Monowarstwy przemyto PBS, utrwalono etanolem i wybarwiono 0.05% fioletem krystalicznym. Fotomikrografie każdego dołka

99 EP 2986615B1

(mikroskop EVOS) wydrukowano i każde zadrapanie zmierzono w 3 miejscach aby wyznaczyć średnią szerokość. Uważa się, że przyśpieszone gojenie rany jest istotne jeśli pozostająca przerwa stanowiła <40% przerwy nietraktowanych kontroli. Sposób 2 [0265] Komórki wysiano do 6 mm dołków (płytki 96-dołkowe) lub 16 mm (płytki 24-dołkowe), z 2 do 6 kopiami dołków/rozcieńczeniem i traktowano tak jak w Sposobie 1. Natychmiast po traktowaniu, brzegi zadrapania obrysowano na spodniej powierzchni dołka za pomocą cienkiego mazaka. Po utrwaleniu i wybarwieniu, migrację oceniono pod mikroskopem z pomocą siatki kartograficznej, punktując migrację jako 0, 25, 50, 75 lub 100% (całkowite zamknięcie) początkowej szerokości. Uważa się, że przyśpieszone zamknięcie rany jest istotne jeśli średni kwartyl kopii był mniejszy niż ten nietraktowanej kontroli (p<0.05, t-test). Dodatkowo powierzchnie “rany” stworzono przez wysianie komórek w obecności 3 mm kołków ze stali nierdzewnej (96-dołkowa płytka) lub przez wprowadzenie równo-obramowanych pierścieni teflonowych. Te urządzenia usunięto po całonocnej inkubacji komórek NFF. Sposób 3 [0266] Komórki wysiano i traktowano w 96-dołkowych płytkach jak w Sposobie 2 (5 kopii dołków na rozcieńczenie) za wyjątkiem tego, że zadrapania wykonano jednym ruchem za pomocą narzędzia mającego 96, 1 mm cienkich pokrytych teflonem kołków (Essen Bioscience Woundmaker). Następnie płytkę umieszczono w 37°C, 5% CO2 wilgotnej atmosferze w urządzeniu IncuCyte FLR zaprogramowanym do fotografowania każdego dołka w fazie kontrastu w 3 godzinnych odstępach przez 42 godziny. Oprogramowanie wyznaczyło początkowe granice zadrapania i szybkość jego zamknięcia. Uważa się, że przyśpieszone zamknięcie rany jest istotne jeśli początkowa szybkość zamknięcia była >10% nietraktowanych kontroli. [0267] Wyniki są przedstawione w Tabelach 7 do 9. Tabela 7: Szybkości zamykania rany stanowiącej zadrapanie w ludzkich noworodkowych fibroblastach po traktowaniu czystymi związkami.

Związek SposóbZwiązek 1 Sposób 1Sposób Związek 2 Sposób Sposób 2 1S posóbZwiązek 3 SSposóbposób Sposób 32 1 SSposóbposób 3 2

100 EP 2986615B1

Testowy %zamknięcia Testowy %zamknięcia Testowy %zamknię Stęż. w Stęż. w Stęż. cia w (ng/mL) porównaniu (ng/mL) porównaniu (ng/mL) porównani do kontroli do kontroli u do kontroli

1 30 166 200 180 30 150 1 100 146 100 1 60 2 30 130 30 147 2 100 129 3 200 270 5 30 209 5 200 300 8 200 190 11 200 270 18 200 220 27 1000 158 2000 130 28 200 140 21 200 200 22 200 400 23 200 130

[0268] Szare zacienienie z wytłuszczeniem wskazuje, że szybkość zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie jest istotnie wyższa niż w przypadku traktowania kontroli. [0269] Wszystkie czyste związki wykazały, że mają istotnie zwiększone szybkości gojenia rany w porównaniu do kontroli traktowanych tylko nośnikiem. Tabela 8: Szybkości Zamknięcia Rany stanowiącej Zadrapanie w Ludzkich noworodkowych fibroblastach po traktowaniu niefrakcjonowanymi etanolowymi ekstraktami różnych roślinnych części Fontainea picrosperma

Część Sposób 1 Sposób 2 Sposób 3 Rośliny Rozcień %zamknięci Rozcieńcz %zamknięci Rozcieńcz %zamknięci czenie a w enie a w enie a w ekstraktu porównaniu ekstraktu porównaniu ekstraktu porównaniu do kontroli do kontroli do kontroli

Liść 5000 268 5000 300 5000 220

101 EP 2986615B1

Łodyga 5000 367

Kora 500 397 500 200

Bielmo 500 128 500 270

Egzokarp 500 167 Niedojrzały 5 x 104 300 owoc

[0270] Szare zacienienie i wytłuszczenie wskazuje, że szybkość zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie jest istotnie wyższa niż w przypadku traktowania kontroli. [0271] Etanolowe surowe ekstrakty wszystkich roślinnych części Fontainea picrosperma które zbadano miały istotnie zwiększone szybkości zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie w porównaniu do kontroli traktowanej tylko nośnikiem. Tabela 9: Szybkości Zamknięcia Rany stanowiącej Zadrapanie w ludzkich fibroblastach noworodkowych po traktowaniu niefrakcjonowanymi ekstraktami etanolowymi różnych części roślin trzech różnych gatunków roślin.

Część Sposób 1 Sposób 2 Sposób 3 rośliny

Rozcieńczenie %zamknięcia Rozcieńczenie %zamknięcia w Rozcieńczenie %zamknięcia ekstraktu w ekstraktu porównaniu do ekstraktu w porównaniu kontroli porównaniu do kontroli do kontroli

Fontainea australis

Liść 500 163

Łodyga 5000 203

Fontainea rostrata Liść 500 101 500 141 Hylandia dockrillii

102 EP 2986615B1

Hylandia dockrillii Liść 5000 187 Łodyga 500 390 500 129

Kora 500 192 5000 121

Owoc 500 385

[0272] Szare zacienienie i wytłuszczenie wskazuje, że szybkość zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie jest istotnie wyższa niż w przypadku traktowania kontroli. [0273] Ekstrakty z części roślin dwóch innych gatunków Fontainea, F. australis i F. rostrata, i blisko spokrewnionego gatunku Hylandia dockrillii wykazały istotnie zwiększone szybkości zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie w porównaniu do kontroli traktowanej tylko nośnikiem. [0274] Dodatkowo, obserwacje płytek testowych pod mikroskopem (Sposób 1) sugerowały, że fibroblasty wykazały rażącą różnicę we wzorze barwienia po traktowaniu Związkiem 1. Bliższe badanie ujawniło, że było to ze względu na to, że komórki wyraźnie rosły w sposób wielowarstwowy, potencjalnie wskazując na brak zahamowania kontaktu, wzrost proliferacji lub zdolność przebudowy. Przykłady zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie w traktowaniu kontroli i Związku 1 w 24 godziny po zadrapaniu są zilustrowane odpowiednio na Figurach 1 i 2. Przykład 5: Analiza inwazji na podłożu Matrigelu pod kątem zdolności do migracji ludzkich noworodkowych fibroblastów [0275] Komory do badania inwazji na podłożu Matrigel dostarczają komórki w warunkach, które pozwalają na ocenę ich właściwości inwazyjnej in vitro. Komory do badania inwazji na podłożu Matrigel składają się z płytki towarzyszącej z hodowlą komórkową z wkładkami hodowli komórkowej zawierającymi błonę PET o wielkości porów 8 mikronów z cienką warstwą macierzy błony podstawnej Matrigel. Macierz Matrigel służy jako odtworzona błona podstawna in vitro. Warstwa zamyka pory błony blokując migrację nieinwazyjnych komórek przez błonę. W przeciwieństwie komórki inwazyjne są zdolne do odłączenia się od i inwazji przez macierz Matrigel i pory błony o wielkości 8 mikronów. Błona może być przetworzona dla mikroskopii świetlnej i

103 EP 2986615B1 elektronowej i może być z łatwością usunięta po barwieniu. [0276] Komory zastosowano zgodnie z instrukcjami producenta, jak opisano w dwóch badaniach, aby ocenić wpływy Związków 1, 2, 5 i 42 na migrację ludzkich noworodkowych fibroblastów. Pierwsze badanie oceniło wpływy trzech stężeń (0. 10 i 30 ng/mL) Związku 1 na noworodkowe fibroblasty w dołkach zawierających podłoże z 10% cielęcej surowicy płodowej. Drugie badanie wykorzystało dwa stężenia (0 i 30ng/mL) dla każdego ze Związków 1, 2, 5 i 42 aby zbadać wpływy na migrację noworodkowych fibroblastów głodzonych przez 2 dni przed traktowaniem a następnie przeniesiono je do podłoża z 1% cielęcą surowicą płodową. Rehydratacja [0277] Opakowanie zawierające komory usunięto z przechowywania w -20°C i pozostawiono do osiągnięcia temperatury pokojowej. Ciepłe podłoże hodowlane oparte na biwęglanie (37°C) dodano do wnętrza wkładek (500 µL) i na dno dołków (750 µL). Komory zawierające podłoże Matrigel pozostawiono do rehydratacji na 2 godziny w inkubatorze z hodowlą tkankową 37°C, w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Po rehydratacji podłoże ostrożnie usunięto przez aspirację bez naruszenia warstwy macierzy Matrigel™ na błonie. Badania Inwazji [0278] Komórki zebrano i ponownie zawieszono z gęstością 20,000 komórek na mL.W sumie 250 µL zawiesiny komórek umieszczono we wnętrzu wkładki (5,000 komórek). Dodatkowe 250 µL podłoża zawierającego odpowiednie Związki następnie dodano do wnętrza wkładki uzyskując pożądane końcowe stężenia dla każdego z dwóch badań. W sumie 750 µL podłoża zawierającego odpowiednie stężenia każdego związku w każdym traktowaniu umieszczono w dołku pod odpowiednią wkładką. Komory z Matrigel inkubowano przez 24 godziny w nawilżonym inkubatorze z hodowlą tkankową w 37°C, atmosferze 5%

CO2. Pomiar inwazji komórkowej [0279] Nie-inwazyjne komórki usunięto z górnej powierzchni błony przez “ścieranie”. Bawełniany tampon zanurzono we wkładce po usunięciu podłoża i zastosowano silne ciśnienie gdy koniuszek tamponu posuwał się po

104 EP 2986615B1 powierzchni błony. Ścieranie powtórzono z drugim tamponem zwilżonym PBS. Komórki, które zaatakowały zewnętrzną powierzchnię wkładki następnie utrwalono przez umieszczenie ich w 500 µL 100% metanolu na co najmniej 5 minut. Wkładki następnie przeniesiono do towarzyszącej płytki zawierającej 500 µL 0.1% fioletu krystalicznego w metanolu, i barwiono przez co najmniej 15 minut. Wkładki odbarwiono przez pasaż przez 3 płytki towarzyszące zawierające 500 µL wody, zanim wysuszono je na powietrzu. [0280] Następnego dnia, błonę usunięto z obudowy wkładki przez odwrócenie wkładki i wprowadzenie czubka ostrego ostrza skalpela przez błonę przy krawędzi przylegającej do ściany obudowy. Obudowę wkładki obrócono naprzeciw nieruchomego ostrza i błonę uwolniono. Błonę wychwycono z obudowy za pomocą pincety i umieszczono prawą stroną do dołu na 10 µL roztworu glicerolu Kaisera i przykryto szkiełkiem podstawowym. Szkiełka pozostawiono na całą noc do wyschnięcia, przed zliczeniem komórek atakujących. Wyniki [0281]W pierwszym badaniu fibroblasty traktowane albo 10 albo 30 ng/mL Związku 1 wykazały zwiększoną zdolność do migracji w układzie komór do badania inwazji na podłożu Matrigel w porównaniu do komórek traktowanych tylko nośnikiem (Figura 3). Drugie badanie potwierdziło wyniki pierwszego badania ze Związkiem 1 i wykazało podobne poziomy zwiększonej zdolności do migracji dla Związków 2, 5 i 42 (Tabela 10). Tabela 10: Analiza inwazji na podłożu Matrigel ludzkich noworodkowych fibroblastów traktowanych 30 ng/mL każdego związku. Dane są wyrażone jako % wzrost inwazji błony w porównaniu do kontroli traktowanej tylko nośnikiem, z lub bez odchyleń standardowych z dwóch powielonych doświadczeń. Komórki zliczono po 24 godzinach inkubacji.

Związek Zliczenie komórek jako % kontroli (Kontrola = brak dodanych komórek)

1 356 ± 141 2 366 ± 122 5 218 ± 21 42 350 ± 101

105 EP 2986615B1

Przykład 6: Repopulacja i zamknięcie rany stanowiącej zadrapanie przez unieśmiertelnione ludzkie keratynocyty (HaCaT) in vitro [0282] Zdolność unieśmiertelnionych ludzkich keratynocytów (HaCaT) do migracji wzdłuż rany stanowiącej zadrapanie utworzonej w zrośniętej monowarstwie po traktowaniu albo Związkiem 1 albo Związkiem 2 wyznaczono za pomocą następującego sposobu. [0283] Trypsynizowane komórki HaCaT wysiano z gęstością 7.4x104 komórek/mL w 24-dołkowej płaskodennej Falkonówce BD, płytkach do hodowli tkankowych (VWR International, UK) w 1 mL podłożu Eagle’a zmodyfikowanym przez Dulbecco (DMEM), wzbogaconym w L-glutaminę (2 mM), antybiotyki (100 U/mL penicyliny G sodowej, 100 µg/mL siarczanu streptomycyny i 0.25 µg/mL amfoterycyny B); i 10% cielęcej surowicy płodowej (wszystkie od Invitrogen Ltd., UK) uzyskując gęstość komórek 7.4x104 komórek wysianych w każdym dołku. Komórki następnie utrzymywano w 37°C w atmosferze 5% CO2/95% powietrza przez całą noc. Następnego ranka, DMEM zawierające 10% cielęcej surowicy płodowej zastąpiono DMEM bez surowicy a następnie komórki HaCaT utrzymywano bez surowicy w DMEM przez 48 godzin. [0284] Po 48 godzinach DMEM bez surowicy usunięto i wykonano pojedynczą “ranę” stanowiącą zadrapanie jałową pipetą wzdłuż każdej warstwy komórkowej. Po dwukrotnym przemyciu w 1 mL PBS do każdego dołka dodano podłoże (1mL) zawierające Związek 1 lub Związek 37. To podłoże składało się z DMEM wzbogacone w L-glutaminę (2mM), antybiotyki (jak powyżej) i 1% bydlęcą surowicę płodową, oprócz Związku 1 lub Związku 37 o końcowych stężeniach 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10 lub 100µg/mL. Były trzy powielone dołki na stężenie dla każdego związku.

[0285] Hodowle HaCaT utrzymywano w 37°C w atmosferze 5% CO2/95% powietrza i repopulacja powierzchni obnażonej “rany” monitorowano za pomocą Mikroskopii Konfokalnej typu Time-Lapse (Mikroskop Konfokalny Leica TCS SP5, Leica Microsystems UK Ltd., UK) przy 100x powiększeniu z cyfrowymi obrazami uchwyconymi w stałych pozycjach co 20 minut przez okres 48 h. Sekwencje cyfrowych obrazów eksportowano i przygotowano pliki filmów w formacie avi przy zastosowaniu oprogramowania LAS AF (Leica Microsystems).

106 EP 2986615B1

Szybkości zamknięcia rany HaCaT in vitro określono ilościowo przy zastosowaniu Oprogramowania (ImageJ 1.37v; http://rsb.info.nih.gov/ij/). Dane analizowano za pomocą Jednokierunkowej Analizy Wariancji z testem post-hoc Tukeya. Każde doświadczenie przeprowadzono na 3 oddzielnych przypadkach. [0286] W 48 godzinie po aplikacji, Związek 1 istotnie zwiększył szybkość zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie (p<0.01) w porównaniu do traktowania kontroli w stężeniach 0.001, 0.01 i 0.1 ng/ml (Tabela 11). W 48 godzinie Związek 37 także zwiększył szybkość zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie (p<0.01) w porównaniu do traktowania kontroli w stężeniach 0.001, 0.01, 0. 1 i 1.0 µg/ml (Tabela 11). Tabela 11: Rozmiar repopulacji i zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie przez unieśmiertelnione ludzkie keratynocyty w 48 godzin po traktowaniu szeregiem stężeń Związku 1 i Związku 37. Dane są dla % powierzchni rany zadrapania pozostającej otwartą po traktowaniu ( ± błędy standardowe).

Związek Stężenie związku (µg związku/ml podłoże wzrostowe)

0 0.001 0.01 0.1 1.0 10 1 43.8+3.6 8.6±9.4 19.7±9.3 21.4±5.8 35.4±7.9 45.5+7.3 37 49.5±5.4 4.3±4.1 0.9±1.5 2.2±3.4 30.0±5.3 37.1±7.1

[0287] Aby wyznaczyć czy efekty Związku 1 i Związku 37 we wzmacnianiu repopulacji i zamknięcia rany stanowiącej zadrapanie jak przedstawiono w Tabeli 11 były pośredniczone przez proliferację lub migrację komórek przeprowadzono dwa dodatkowe doświadczenia. Pierwsze z tych doświadczeń było skierowane na aspekty migracji i powtórzono badanie repopulacji w miejscu zadrapania ale z dodatkiem 1µg/mL Mitomycyny C do podłoża w tym samym czasie, w którym podawane są związki. Wiadomo, że Mitomycyna C hamuje proliferację komórkową, w tym tą komórek HaCaT; i wyznaczono, że nie jest cytotoksyczna w układzie hodowlanym przy stężeniu 1µg/mL. Wyniki tego badania migracji odkryły (p<0.05) nasiloną repopulację i zamknięcie rany stanowiącej zadrapanie przy stężeniach między 0.001 i 1.0 µg/mL dla obu Związku 1 i Związku 37. [0288] Doświadczenie proliferacji oceniło wpływy dwóch związków na proliferację HaCaT (co zmierzono za pomocą MTT) w układzie hodowlanym w 4

107 EP 2986615B1 okresach czasu (24, 48, 120 i 168 godzin). Oba Związki 1 i 37 wykazały istotny wpływ (p<0.01) w zwiększaniu proliferacji komórek HaCaT przez zakres stężeń pomiędzy 0.001 i 10µg/mL w porównaniu do traktowania kontroli bez dodanego związku. [0289] Te wyniki przedstawiają, że zarówno proliferacja jak i nasilona migracja komórek biorą udział w procesach repopulacji w miejscu zadrapania i gojenia ze Związkami 1 i 37. Przykład 7: Różnicowanie monocytów w makrofagi za pomocą związków [0290] Makrofagi odgrywają liczne role w gojeniu rany, w tym w oczyszczaniu z komórkowych szczątków i tkanki martwiczej na wczesnym etapie zapalenia a następnie wsparciu proliferacji komórkowej i odbudowy tkanki w czasie późniejszych etapów gojenia. Fenotyp M1 uważa się, że jest związany z wczesnym etapem zapalenia a fenotyp M2 z etapem gojenia. [0291] Aby wyznaczyć potencjalne wpływy Związku 1 i piętnastu innych związków epoksy-tiglianowych kolejno/w szeregu na różnicowanie monocytów wyizolowano ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) za pomocą sedymentacji Ficolla-Paquea heparynizowanej krwi od 72-letniego dawcy ludzkiego płci męskiej i umieszczono na płytkach w ilości 100,000 komórek/dołek w RPMI-1640 10% FCS. Zdublowane dołki traktowano 10- krotnymi rozcieńczeniami związków i inkubowano w 37°C przez 4 dni. Dołki wizualnie punktowano pod kątem przyłączenia i morfologii, następnie przemyto dwukrotnie PBS, barwiono sulforodaminą i wprowadzone zabarwienie określono ilościowo w czytniku ELISA. Płytki następnie przemyto wodą i barwiono 1% fioletem krystalicznym w metanolu dla sfotografowania i punktowania morfologii adherentnej komórki. [0292] Wyniki z doświadczenia dawka-odpowiedź z ludzkimi PBMC (Tabela 12) wykazały, że wszystkie szesnaście związków epoksy-tiglianowych przebadało zróżnicowane monocyty krwi obwodowej w makrofagi w stężeniach w ng, co osądzono przez adherencję i morfologię, które stanowiło mieszaninę komórek dendrytycznych typowych dla fenotypu M2 i zaokrąglonych komórek typowych dla fenotypu M1. Tabela 12: Końcowe stężenia w serii rozcieńczeń do indukcji fenotypu makrofagów w ludzkich monocytach krwi obwodowej przez związki epoksy-

108 EP 2986615B1 tiglianowe kolejno/w szeregu.

Związek Punkt końcowy różnicowania (ng/mL)

1 1 2 1 3 10 5 1 8 10 21 10 22 100 23 1 24 1 41 0.1 42 1 49 1 50 1 51 1 52 10 53 100

Przykład 8: Wpływy związków 1 i 37 na różnicowanie się dorosłych skórnych fibroblastów w miofibroblasty [0293] Fibroblasty odgrywają centralną rolę w procesie gojenia rany i gdy są zaktywowane, różnicują się do fenotypu miofibroblastycznego, który charakteryzuje się ekspresją α-aktyny mięśni gładkich (α-SMA). Podczas gdy miofibroblasty prowadzą do naprawy tkanki i gojenia ran, ich nadekspresja jest związana z pogorszonym gojeniem i nadmiernym bliznowaceniem. [0294] Wpływy Związków 1 i 37 na różnicowanie skórnych fibroblastów w miofibroblasty zbadano przez oszacowanie ekspresji α-SMA przez stymulowane

TGF-β1-skórne fibroblasty. Sposoby [0295] Po trypsynizacji fibroblasty wysiano w 8-dołkowych systemach szkiełek komorowych Permanox (VWR international) w podłożu DMEM, zawierającym antybiotyki, 2 mM L-glutaminę i 10% cielęcą surowicę płodową (250 µL, wszystkie nabyte z Invitrogen); przy gęstości komórek 2,5x104komórek/dołek i utrzymywano w 37°C w 5% CO2/95% powietrzu przez 48h.

109 EP 2986615B1

[0296] W 48 godzinie zatrzymano wzrost fibroblastów w DMEM bez surowicy na 48 godzin a następnie zastąpiono je DMEM bez surowicy (250 µL), zawierającym Związki 1 lub 37 w stężeniach 0. 0.001, 0.01, 0.1, 1.0 i 10.0

µg/mL (3 dołki/stężenie/ związek) i TGF-β1 (10ng/ml, Peprotech). Fibroblasty utrzymywano w 37°C w 5% CO2/95% powietrzu przez 72 godziny. [0297] W 72 godzinie, dołki szkiełek komorowych przemyto PBS (x1, 250 µL) i utrwalono w 4% paraformaldehydzie (100 µL/dołek) przez 10min. Dołki szkiełek komorowych następnie przemyto ponownie PBS (x1. 250 µl), potraktowano 0.1% Triton X-100 w PBS (100 µL, Sigma) przez 5min i ponownie przemyto PBS (x1, 250 µL). Dołki zablokowano 1% BSA w PBS (250 µL, Sigma) przez 1h i przemyto (x3) w 0.1% BSA/PBS. [0298] Dołki inkubowano z monoklonalnym mysim anty-ludzkim α-SMA, klon 1A4 (1:100., 150ul, Sigma) w 4°C przez całą noc, przemyto (x6) w 0.1% BSA/PBS i inkubowano z kozim anty-mysim przeciwciałem IgG Alexa Fluor 488 (1:1000, 250 µL, Invitrogen), w temperaturze pokojowej przez 1 h w ciemności. Szkiełka komorowe przemyto (x6) w 0.1% BSA/PBS i barwiono kontrastowo roztworem Hoescht 33258 przez 30 min w ciemności (1:2000, 250 µL, Sigma). Komorę następnie usunięto dla szkiełek i traktowano barwnikiem Fluorsave (Santa Cruz) przez 10min w ciemności. Szkiełka oglądano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Leica Microsystem), z obrazami cyfrowymi uchwyconymi przy powiększeniu x200. Obrazy cyfrowe przetworzono przy zastosowaniu oprogramowania Image J. Wyniki

[0299] W traktowaniu kontrolnym za pomocą TGF-β1 ale bez dodanych Związków, dorosłe fibroblasty skórne zróżnicowały się w miofibroblasty, zwykle charakteryzujące się zwiększoną ekspresją α-SMA, zebraniem włókien naprężeniowych α-SMA i całościowym rozwojem powiększonej, poligonalnej morfologii komórkowej. W przeciwieństwie do tego, ekspozycja dorosłych skórnych fibroblastów traktowanych TGF-β1 na Związek 1 i Związek 37 wpłynęła na różnicowanie w miofibroblasty w sposób zależny od stężenia. W przypadku Związku 1 o stężeniu 0.1 µg/mL, w hodowlach fibroblastów nie występuje tworzenie włókien naprężeniowych α-SMA i typowej poligonalnej

110 EP 2986615B1 morfologii komórkowej, reprezentacyjnych dla różnicowania miofibroblastów (Figura 5). Ze związkiem 37 wystąpiło działanie destrukcyjne na tworzenie włókien naprężeniowych α-SMA i rozwój poligonalnej morfologii przy stężeniu 10 µg/mL (Figura 6). [0300] Ponadto, wydają się, że są inne nieznaczne zmiany w morfologii miofibroblastów w zakresie stężeń między 1 a 10 µg/mL Związku 1 i między 0.1 do 1.0 µg/mL dla Związku 37 (Figury 5 i 6). [0301] Szczególne wpływy związków na różnicowanie fibroblastów/miofibroblastów mogą odnosić się do minimalnego tworzenia blizn obserwowanego w ranach leczonych in vivo Związkiem 1 (Przykłady 16 i 17). Przykład 9: Indukcja wyrzutu reaktywnych form tlenu przez neutrofile w odpowiedzi na Związek 1 [0302] Neutrofile są wyspecjalizowanymi komórkami fagocytowymi wrodzonego układu odpornościowego i ich napływ i aktywacja jest niezbędna do oczyszczania z bakterii, grzybów i skórnych pozostałości podczas wczesnych etapów gojenia rany. Szeroka aktywność przeciwdrobnoustrojowa neutrofilii opiera się na kilku strategiach w tym wyrzucie reaktywnych form tlenu (ROS). [0303] Badanie podjęto aby ocenić potencjalne działania Związku 1 w indukcji wyrzutu reaktywnych form tlenu przez neutrofile. [0304] Neutrofile wyizolowano ze świeżej krwi zdrowego ludzkiego dawcy przez lizę granulek krwinek czerwonych, które otrzymano przez sedymentację Ficolla- Paquea. Neutrofile (∼ 4 x 106 komórek/ml) inkubowano z 10 µg/ml dihydroetydyną (DHE) (Sigma-Aldrich) w kompletnym podłożu hodowlanym w 37°C przez 15 min razem z porcją niebarwionych komórek które mają być zbadane jako niebarwiona kontrola. Po tej inkubacji nastąpiło traktowanie Związkiem 1 w zakresie stężeń (0, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml) przez 15 min. Wytworzenie reaktywnych form tlenu po inkubacji wyznaczono przy zastosowaniu cytometru przepływowego FACS Canto aby zmierzyć fluorescencję w związku z utlenieniem DHE do jonu etydynowego. [0305] To badanie stwierdziło brak wytwarzania ROS w traktowaniu kontroli bez obecności Związku 1. W przeciwieństwie Związek 1 indukował istotne

111 EP 2986615B1 wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) w sposób zależny od dawki, z wytwarzaniem ROS wzrastającym ze stężeniami Związku 1. Przykłady wpływów związków na białka, geny i cytokiny w odniesieniu do lepszych rezultatów gojenia rany Przykład 10: Cząsteczkowa analiza ludzkich fibroblastów noworodkowych traktowanych Związkami 1 i 42 [0306] Metodę Western Blot zastosowano do zidentyfikowania wpływów Związków 1 i 42 na białka w odniesieniu do naprawy i gojenia w ludzkich fibroblastach noworodkowych (NFF). Przeprowadzono dwa badania. W pierwszym badaniu NFF traktowano albo 10 albo 30 ng Związku 1/mL przez 6 lub 24 godzin, przed zebraniem i ekstrakcją białka. W drugim badaniu NFF traktowano osobno stężeniami 30 ng/mL Związków 1 i 2 odpowiednio przez 6 godzin. Powstałe lizaty z obu badań poddano analizie western blot i badano za pomocą przeciwciał specyficznych dla cząsteczek sygnalizacyjnych zaangażowanych w naprawę i gojenie rany. Przygotowanie próbek białkowych do analizy Western blot. [0307] Podłoże z adherencyjnych ludzkich noworodkowych fibroblastów rosnących w 75 cm2 płytkach usunięto i komórki przemyto dwukrotnie w lodowatym PBS. Przyłączone komórki zebrano w 10 mL lodowatym PBS przy zastosowaniu skrobaczki komórkowej (Costar®, Corning), granulowano przez odwirowanie przez 5 minut (1,500 rpm, Temp.pokojowa), ponownie zawieszono w 1 mL lodowatego PBS i przeniesiono do 1.5 mL mikroprobówki. Komórki zebrano przez odwirowanie (13,200 rpm, Temp.Pokojowa, 2 s), PBS usunięto i peletki przechowywano w -20°C aż do momentu gdy będą potrzebne. [0308] Zamrożone peletki rozmrożono na lodzie i ponownie zawieszono w objętości buforu do lizy komórek będącej 3-4 krotnością objętości peletek przez pipetowanie w górę i w dół. Zawiesinę komórkową sonifikowano 60 s w 4°C i odwirowywano przez 20 minut (13,200 rpm, 4°C) i interfazę zawierającą białko przeniesiono do świeżej 1.5 ml mikroprobówki. Białko przechowywano w -20°C. Wyznaczenie stężenia białka [0309] Stężenia białka wyznaczono przy zastosowaniu zestawu do analizy Białka BCA (Pierce). Ten sposób opiera się na redukcji Cu2+ do Cu1+ przez

112 EP 2986615B1 białko w zasadowym roztworze. Utworzony Cu1+ jest następnie chelatowany za pomocą kwasu bicynchoninowego (BCA) tworząc fioletowy produkt reakcji. [0310] Próbki białka rozcieńczono 1/10 i 1 /20 (obj./obj.) w wodzie MilliQ i 10 µL wyciągnięto z płytek w dwóch kopiach w 96-dołkowej płaskodennej płytce (Costar®, Corning). Roztwory podstawowe bydlęcej albuminy osoczowej (BSA) przygotowano w 100, 200, 400, 600, 1,000, i 1,200 µg/mL i 10 µL/dołek pobranych z płytek w dwóch kopiach i analizowano razem z próbkami. Odczynnik roboczy BCA przygotowano przez zmieszanie 50 części odczynnika A z 1 częścią odczynnika B i podzielono po 100 µL do każdego dołka. Płytkę inkubowano w 37°C przez 30-45 min umożliwiając wystąpienie reakcji. Nieprzetworzone absorbancje odczytano przy A590 nm na czytniku mikropłytek (VERSAmax, Molecular Devices) i sporządzono krzywą wzorcową przy zastosowaniu oprogramowania SOFT max PRO (Molecular Devices). Stężenia nieznanych próbek oszacowano z krzywej. Elektroforeza na żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE). [0311] Próbki białek przygotowano przez zmieszanie z odpowiednią objętością 2 x SDS buforu ładującego i denaturowano przez ogrzewanie przez 10 minut w 70°C. SDS-PAGE żelową przeprowadzono przy zastosowaniu urządzenia Mini- Protean II dual slab gel (Bio-Rad Laboratories) opisanego przez Laemmli (6). Żel rozwijający składał się z 0.275 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% (wag./obj.) SDS, 0.05% (wag./obj.) świeżo przygotowanego nadsiarczanu amonu, 1% (obj./obj.) TEMED i między 7.5-12% (wag./obj.) akryloamidu/bisakryloamidu (29:1). Roztwór dopełniono do 5 mL w MilliQ H2O, i pozostawiono do ustalenia na co najmniej 30 minut (Temp.pokojowa) podczas gdy pokryto go warstwą nasyconego wodą butanolu. Przed wylaniem żelu zagęszczającego, nasycony wodą butanol wylano. Żel zagęszczający składał się z 0.125 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.1% (wag./obj.) SDS, 0.05% (wag./obj.) świeżo przygotowanego nadsiarczanu amonu, 0.1% (obj./obj.) TEMED i 4% (wag./obj.) akryloamidu/bisakryloamidu (29:1). Roztwór uzupełniono do 2.5 mL na żel w

MilliQ H2O, wylano na wierzch żelu rozwijającego i pozostawiono do ustalenia za pomocą 10-zębowego grzebienia (Bio-Rad Laboratories) na co najmniej 30 min. Elektroforezę przeprowadzano przez około 1 h lub do momentu gdy

113 EP 2986615B1 barwnik wycieknie z dna żelu (200 V, Temp.pokojowa) w 1× SDS buforze do elektroforezy. Transfer Western [0312] Po elektroforezie SDS-PAGE płytki żelowe ostrożnie rozdzielono, żel zagęszczający odcięto i przeniesiono do Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad Laboratories). “Transfer kanapkowy” złożono w następujący sposób: porowatą gąbkę, dwa arkusze papieru do blottingu (Whatmann), błonę nitrocelulozową, żel, dwa dodatkowe arkusze papieru do blottingu i kolejną porowatą gąbkę wprowadzono do urządzenia do transferu. Gąbki, błonę i papier do blottingu wstępnie zwilżono w zimnym buforze do elektroblottingu i zabezpieczono przed powstaniem jakichkolwiek pęcherzyków powietrza co by skutkowało nieprawidłowym przeniesieniem białek. Białka przenoszono pod napięciem 100 V przez 1 h (stałe napięcie) w lodowatym buforze w 4°C z błoną nitrocelulozową (Hybond™-C, Amersham Biosciences) bliżej strony anionowej i dodano paczkę lodu i mieszadło magnetyczne. Próbkowanie błon białkowych [0313] Po przeniesieniu, błonę inkubowano w 5% (wag./obj.) Blotto w 0.1% (obj./obj.) Tween 20/TBS w Temp.pokojowej przez co najmniej 30 minut z delikatnym orbitalnym wytrząsaniem aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Pierwszorzędowe przeciwciało rozcieńczono w 5% (wag./obj.) BSA jak zaleca producent (patrz Tabela 13 poniżej) do końcowej objętości 2 mL. Utworzono plastikową kopertę zawierającą błonę i przeciwciało i zamknięto szczelnie termicznie, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Koperty wirowano na wytworzonym na zamówienie rotorze (w przybliżeniu 16 h) w 4°C. [0314] Błonę usunięto z worka, umieszczono w plastikowym zasobniku z 0.1% (obj./obj.) Tween 20/TBS i przemyto cztery razy w temperaturze pokojowej z energicznym orbitalnym wytrząsaniem przez 15 minut na przemycie. Odpowiednie drugorzędowe przeciwciało sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) próbkowano na błonę przez rozcieńczenie go 1/1,000 w 5% (wag./obj.) Blotto w 0.1% (obj./obj.) Tween 20/TBS i umieszczeniu go w świeżej plastikowej kopercie, którą obracano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Immunodetekcja białek [0315] Aby usunąć jakiekolwiek niezwiązane lub niespecyficzne związane

114 EP 2986615B1 przeciwciało, błonę przemyto w 0.1%) (obj./obj.) Tween 20/TBS/ w temperaturze pokojowej cztery razy, każdy przez 15 minut. Zastosowano Odczynnik Western Lighting™ Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences) aby wytworzyć wykrywalny sygnał z drugorzędowych przeciwciał znakowanych HRP. Odczynnik opiera się na oksydacyjnej degradacji luminolu katalizowanej przez HRP, co skutkuje emisją światła, które jest wykrywalne przy 420 nm i może być uchwycone na filmie. Równe objętości z butelki 1 i butelki 2 zmieszano tuż przed detekcją. Całkowitą objętość 2 mL w przeliczeniu na błonę nałożono i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Zadbano o to aby zapewnić, że cała błona była równo eksponowana. Błonę usunięto, wysuszono szybko na papierze do blottingu, wprowadzono między dwa zabezpieczające arkusze polipropylenowe w kasecie filmowej (Hypercassette™, Amersham Biosciences) i eksponowano na część filmu (SuperRX, Fujifilm). Początkową ekspozycję 2 min zastosowano do oceny optymalnego czasu do detekcji. Film wywołano w Kodak Image Station (Kodak). Tabela 13: Przeciwciałami stosowanymi w tym badaniu były: Zastosowane Przeciwciało Gospodarz Producent rozcieńczenie

Anty-pan fosfo PKC Królik 1:1,000 Cell Signalling

Anty-Fosfo-ERK (Thr202/Tyr204) Królik 1:1,000 Cell Signalling

Anty-ERK Królik 1:1,000 Cell Signalling

Anty-Fosfo-MEK 1/2 (Ser217/221) Królik 1:1,000 Cell Signalling

Anty-MEK1/2 Królik 1:1,000 Cell Signalling

Anty -MM P9 Królik 1:1,000 Cell Signalling

Anty-królicze Ig sprzężone z HRP Owca 1:1,000 Cell Signalling

[0316] W pierwszym badaniu ze Związkiem 1, Western blot bada przejściową aktywację obu MEK1/2 i ERK1/2 po 6 godzinach traktowania albo 10 albo 30 ng/mL Związku 1 a następnie zmniejszenie aktywacji po 24 godzinach traktowania. Wiadome jest, że aktywacja MEK/ERK odgałęzienia szlaku kinazy MAP wpływa na fenotyp migracji wielu rodzajów komórkowych, w tym

115 EP 2986615B1 fibroblastów. Nie wykryto żadnych różnic w poziomach MMP9. [0317] Podobne wzory fosforylacji fosfo-ERK stwierdzono przeprowadzając Western Blot w drugim badaniu z 30 ng/mL stężeniami Związków I i 42 na NFF. Przykład 11: Wpływ Związku 1 na ekspresję genów zaangażowanych w gojenie rany [0318] Wpływy Związku 1 na ekspresję genów związanych z gojeniem rany zbadano w dwóch sytuacjach (a) ludzkich PBMC i (b) mysich komórkach zrębowych ludzkich nowotworowych przeszczepów ksenogenicznych. Materiały i Sposoby [0319] Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) wyizolowano za pomocą sedymentacji Ficolla-Paquea heparynizowanej krwi od 68-letniego ludzkiego dawcy płci męskiej i hodowano w RPMI-1640 10% FCS. Po traktowaniu Związkiem 1 o stężeniu 30 ng/mL, monowarstwę przemyto raz roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i komórki zebrano za pomocą jałowych skrobaczek i przechowywano w postaci peletek w -80° C. [0320] Mysie komórki zrębowe ludzkich nowotworowych przeszczepów ksenogenicznych otrzymano od myszy, u których linia ludzkich komórek czerniakowych Sk-Mel-28 została wstrzyknięta podskórnie w 2 miejsca po bokach każdej z myszy BALB/c Foxnlnu (2 x 106komórek/miejsce) i pozostawionych do wzrostu do około 7 mm średnicy. Następnie do każdego nowotworu wstrzyknięto 50 µL 20% glikolu propylenowego zawierającego 30 µg Związku 1 lub 50 µL 20% glikolu propylenowego. W różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu mysz poddano eutanazji i nowotwory zebrano, usunięto pokrywającą skórę i nienaruszone nowotwory przechowywano w ∼80°C. [0321] RNA ekstrahowano z 30 mg zamrożonego nowotworu lub 1 x 107 komórek przy zastosowaniu mini zestawu QiagenRNeasyPlus zgodnie z instrukcjami producenta, następnie obliczono za pomocą urządzenia NanoDrop i potwierdzono integralność na denaturujących żelach agarozowych noszących 1 kb marker DNA i wybarwiono za pomocą bromku etydyny. Amplifikacja RNA i znakowanie. [0322] Około 500 ng całkowitego nieznakowanego RNA doprowadzono do

116 EP 2986615B1 końcowej objętości 11 µL za pomocą wody bez nukleazy. RNA inkubowano z 9 µL mieszaniną master mix odwrotnej transkryptazy (1 µL T7 Oligo (dT) Primer, 2 µL 10X buforu pierwszej nici, 4 µL mieszaniny dNTP, 1 µL inhibitora RNazy i 1 µL ArrayScript) w 42 °C przez 2 godziny. Po tym nastąpił etap syntezy drugiej nici cDNA, która objęła dalszą inkubację w 16 °C przez 2 godziny z 80 µL mieszaniny drugiej nici (63 µL wody bez nukleazy, 10 µL 10X buforu drugiej nici, 4 µL mieszaniny dNTP, 2 µL polimerazy DNA i 1 µL RNazy H). cDNA oczyszczono przez przesączenie przez wkład filtrujący cDNA za pomocą 250 µL buforu wiążącego cDNA i przemycie 500 µL buforu do przemycia dostarczonego w zestawie. Oczyszczone cDNA eluowano 20 µL 55 °C wody bez nukleazy. Każdą próbkę cDNA inkubowano z 7.5 µL mieszaniny IVT master mix (2.5 µL T7 10X buforu do reakcji, 2.5 µL mieszaniny enzymu T7 i 2.5 µL mieszaniny biotyna-NTP) w 37 °C przez 16 godzin. Reakcję zatrzymano przez dodanie do każdej próbki cRNA 75 µL wody bez nukleazy. Biotynylowane, amplifikowane RNA oczyszczono przez przesączenie próbek cRNA przez wkłady filtrujące cRNA za pomocą 350 µL buforu wiążącego cRNA 250 µL 100 % etanolu zmieszanych razem przed załadowaniem na filtry. Wkłady filtrujące cRNA z przyłączonym RNA następnie przemyto 650 µL buforu do przemycia zanim eluowano oczyszczony cRNA za pomocą 200 µL 55 °C wody bez nukleazy. [0323] Hybrydyzacja z wykorzystaniem macierzy ekspresyjnej BeadChip firmy Illumina. Próbki cRNA ogrzewano w 65°C przez 5 min i zebrano przez wirowanie pulsacyjne. Po ogrzewaniu w 65 stopniach przez 5 minut, około 750 ng próbki cRNA odmierzono do oddzielnych probówek, do których dodano ∼ 5 µL wody bez Rnazy i 10 µL mieszaniny hybrydyzacyjnej. Około 15 µL przygotowanej mieszaniny cRNA załadowano na macierze ekspresyjne BeadChip firmy Illumina. Kolejne etapy hybrydyzacji i mycia przeprowadzono zgodnie z Whole- Genome Gene Expression Direct Hybridization Assay Guide dostarczonymi przez Illumina. [0324] Ludzkie HT-12 v4 macierze ekspresyjne BeadChip obejmują więcej niż 47,000 transkryptów i znanych odmian składania przez ludzki transkryptom. Mysie Ref-8 v2.0 macierze ekspresyjne BeadChips obejmują około 25,600

117 EP 2986615B1 dobrze objaśnionych RefSeq (Sekwencja referencyjna) transkryptów, zawierających ponad 19,000 unikatowych genów. [0325] Analiza danych. Macierze BeadChip odczytano za pomocą Systemu iScan i przeniesiono poprzez GenomeStudio do GeneSpring GX v12.5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Wartości ekspresji normalizowano przy zastosowaniu normalizacji kwantylowej z ustawieniami błędu. Jednostki przefiltrowano w oparciu o punktację detekcji obliczony przez GenomeStudio gdzie p ≤ 0.05 uważane było za istotne. Zmiany ekspresji genów związanej z gojeniem rany indukowane w ludzkich PBMC przez Związek 1. [0326] Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) są bogate w limfocyty i prekursory makrofagów (monocyty) zaangażowane w wytwarzanie cytokin i przebudowę enzymów związanych z procesem gojenia rany. Tabela 14 wymienia zmiany ekspresji genów indukowane przez 30 ng/mL Związku, 1 które były >2 razy wyższe >2 razy niższe niż kontrola, nietraktowane PBMC i miały wiadomy związek z gojeniem rany. Gojenie rany jest złożoną, wieloetapową sekwencją, w której procesy takie jak zapalenie następnie muszą być zmniejszone. Dlatego też należy zauważyć, że geny przedstawione w Tabeli 14 ilustrują zakres istotnych cząsteczek regulowanych przez Związek 1 w zmieszanej populacji limfoidów in vitro, bez określenia kolejności ekspresji specyficznej tkankowo in vivo. [0327] Geny obejmowały prozapalne cytokiny (IL-1α, IL-1β i IL-6) zaangażowane w ochronę przed zakażeniem, cytokiny do osłabienia odpowiedzi zapalnej (IL-10 i IL-24), czynniki wzrostu (GMCSF, CSF1 i HBEGF), i zakres chemokin i metalopeptydaz macierzy do przebudowy tkanki (ostatnie ułatwione przez zmniejszenie ekspresji TIMP2). Zmniejszenie ekspresji THBS1, które hamuje tworzenie ziarniny jest także korzystnym czynnikiem w gojeniu rany. Zwiększenie ekspresji KLF10 powinno ułatwić angiogenezę i jest wskaźnikiem indukcji TGF-β. Transglutaminazy (TGM) stabilizują białka przez ich krzyżowe sieciowanie i mają inne korzystne działania w gojeniu rany. Tabela 14. Zmiany w ekspresji genów związane z lepszymi skutkami gojenia rany, które są indukowane w ludzkich PBMC przez Związek 1

118 EP 2986615B1

Kierunek Nazwa Genu (Homo Krotność zmian Gen Czas (h) regulacji sapiens) w ekspresji ekspresji Interleukina 1. alfa (IL1α), IL1α 24 14.6 Zwiększenie mRNA.

Interleukina 1. beta (IL1β), IL1β 24 15.4 Zwiększenie mRNA.

Interleukina 6 (Interferon 1L6 24 33.1 Zwiększenie 2, beta) (IL6), mRNA.

Interleukina 10 (IL10), IL10 24 2.1 Zwiększenie mRNA.

Interleukina 24 (IL24), IL24 odmiana transkryptu 1, 24 4.6 Zwiększenie mRNA.

Czynnik stymulujący GM-CSF kolonię GM (GM-CSF), 4 4.3 Zwiększenie mRNA

24 34.6 Zwiększenie 96 6 Zwiększenie Czynnik stymulujący CSF1 kolonię, odmiana 24 5.1 Zwiększenie transkryptu 4, mRNA.

Czynnik wzrostu wiążący HBEGF heparynę podobny do 4 2.7 Zwiększenie EGF (HBEGF), mRNA.

24 5.1 Zwiększenie Ligand Chemokiny 1 CXCL1 (wzór C-X-C) (CXCL1), 24 15.5 Zwiększenie mRNA.

Ligand Chemokiny 2 CXCL2 (wzór C-X-C) (CXCL2), 4 3.5 Zwiększenie mRNA.

119 EP 2986615B1

Kierunek Nazwa Genu (Homo Krotność zmian Gen Czas (h) regulacji sapiens) w ekspresji ekspresji

24 73.5 Zwiększenie Ligand chemokiny 5 (wzór CXCL5 24 8.1 Zwiększenie C-X-C) (CXCL5), mRNA.

96 15.1 Zwiększenie Ligand chemokiny 7 (wzór CXCL7 24 17.5 Zwiększenie C-X-C) (CXCL7), mRNA.

96 37.4 Zwiększenie Ligand Chemokiny 13 CXCL13 (wzór C-X-C) (CXCL13), 24 2.2 Zwiększenie mRNA.

96 23.5 Zwiększenie Ligand Chemokiny 1 CCL1 (wzór C-C ) (CCL1), 24 39.8 Zwiększenie mRNA.

96 42.6 Zwiększenie Ligand Chemokiny 3 CCL3 (wzór C-C) (CCL3). 24 56.9 Zwiększenie mRNA.

Ligand Chemokiny 7 CCL7 (wzór C-C) (CCL7), 4 9.4 Zwiększenie mRNA.

24 54.5 Zwiększenie 96 4.8 Zwiększenie Ligand Chemokiny 1 CCL3L1 podobny do 3 (wzór C-C) 4 5.3 Zwiększenie (CCL3L1), mRNA.

24 72.3 Zwiększenie 96 4.2 Zwiększenie

120 EP 2986615B1

Kierunek Nazwa Genu (Homo Krotność zmian Gen Czas (h) regulacji sapiens) w ekspresji ekspresji

Metalopeptydaza MMP1 Macierzy 1 (MMP1), 4 3.1 Zwiększenie mRNA.

24 4.2 Zwiększenie Metalopeptydaza MMP7 Macierzy 7 (MMP7), 4 3.5 Zwiększenie mRNA.

24 7.4 Zwiększenie 96 117.3 Zwiększenie Metalopeptydaza MMP9 Macierzy 9 (MMP9), 24 -229 Zmniejszenie mRNA.

Metalopeptydaza MMP10 Macierzy 10 (stromelizyna 4 3.2 Zwiększenie 2) (MMP10), mRNA.

24 52 Zwiększenie Metalopeptydaza MMP1 9 Macierzy 19 odmiana 4 11.6 Zwiększenie transkryptu. 1, mRNA. A.

24 2.6 Zwiększenie Inhibitor metalopeptydazy TIMP2 24 -10.9 Zmniejszenie 2 TIMP (TIMP2), mRNA.

Trombospondyna 1 THBS1 4 47.8 Zmniejszenie (THBS1), mRNA.

24 -101.5 Zmniejszenie Czynnik 10 podobny do Kruppel 10 (KLF10), KLF10 4 5.9 Zwiększenie odmiana transkryptu 1, mRNA.

121 EP 2986615B1

Kierunek Nazwa Genu (Homo Krotność zmian Gen Czas (h) regulacji sapiens) w ekspresji ekspresji

24 9.3 Zwiększenie Transglutaminazy TGM3 4 2.3 Zwiększenie (TGM3), mRNA.

24 28.4 Zwiększenie Transglutaminaza 2 TGM2 (TGM2), odmiana 24 12.2 Zwiększenie transkryptu 1, mRNA.

96 4.4 Zwiększenie Transglutaminaza 5 TGM5 (TGM5), odmiana 24 -3.3 Zmniejszenie transkryptu 2. mRNA.

Zmiany ekspresji genów związanej z gojeniem rany indukowane w mysich komórkach zrębowych ludzkich przeszczepów ksenogenicznych nowotworu przez Związek 1 [0328] Doskonałe gojenie miejsc nowotworowych u myszy i zwierząt domowych, udowodnione przez przywrócenie owłosienia i koloru włosów jak również minimalne bliznowacenie, jest zauważalną cechą traktowania Związkiem 1 poprzez wstrzyknięcie do wnętrza nowotworu (Przykłady 16 i 17). Zmiany w ekspresji genów związanej z gojeniem rany były dlatego też analizowane w mysich komórkach zrębowych ludzkich ksenogenicznych przeszczepów nowotworów we wczesnych punktach czasowych po wstrzyknięciu podczas gdy nowotwór pozostawał wciąż nienaruszony. [0329] Dane ekspresji wykorzystujące mikromacierze specyficzne genowo przedstawiono dla 2-3 pojedynczych ludzkich przeszczepów ksenogenicznych SK-Mel-28 traktowanych przez wstrzyknięcie do wnętrza nowotworu 30 µg Związku 1, razem z 3 miejscami traktowanymi tylko nośnikiem, dane połączono. Tylko te mysie geny, dla których ekspresja w miejscu traktowanym Związkiem 1 była >2 razy wyższa lub >2 razy niższa niż w miejscu, gdzie wstrzyknięto tylko

122 EP 2986615B1 nośnik badano pod kątem istotności dla gojenia rany. [0330] Tabela 15 wymienia geny wybrane przez powyższe kryteria i o znanych związkach z gojeniem rany. [0331] Liczne geny o znanych korzystnych skutkach w odniesieniu do gojenia rany miały zwiększoną ekspresję co najmniej 2-krotnie przez Związek 1. Były to geny zaangażowane w skurcz mięśni (ACTA1), wzrost (EGR1), modulację zapalenia (CXCL1), keratyny do odnowy keratynocytów (krt5, 10, 14, 15, 17, 71. krtdap), migrację keratynocytów (Col17a1), różnicowanie komórek naskórka i komunikację komórkową (lor, Tgm2, Itga7). [0332] Jeden gen związany z gojeniem rany Trombospondyna 2 (Thbs2) miał zmniejszoną ekspresję. Zmniejszenie ekspresji tego genu jest związane ze zwiększoną gęstością naczyniową i wzrostem fibronektyny we wczesnych etapach gojenia rany. Tabela 15. Zmiany w ekspresji genów związanej z lepszymi skutkami gojenia rany, które są indukowane w mysich komórkach zrębowych ludzkich ksenogenicznych przeszczepów nowotworów przez Związek 1.

Krotność Kierunek Kod Nazwa genu Czas (h) zmian w regulacji genu (Musmusculus) ekspresji ekspresji aktyna, alfa 1, mięsień Acta1 0.5 9.3 Zwiększenie szkieletowy (Acta1), mRNA.

4 30.3 Zwiększenie 8 8.5 Zwiększenie Wczesna odpowiedź wzrostu Egr1 4 4.7 Zwiększenie 1 (Egr1), mRNA.

8 5.34 Zwiększenie Ligand chemokiny 1 (wzór C- CXCL1 4 12.1 Zwiększenie X-C) (Cxcl1), mRNA. krt14 keratyna 14 (Krt14), mRNA 1 9.4 Zwiększenie 2 5.6 Zwiększenie 4 9.7 Zwiększenie

123 EP 2986615B1

Krotność Kierunek Kod Nazwa genu Czas (h) zmian w regulacji genu (Musmusculus) ekspresji ekspresji

Krt10 keratyna 10 (Krt10), mRNA. 1 7 Zwiększenie 2 2.4 Zwiększenie 4 8.6 Zwiększenie 8 2.1 Zmniejszenie Krt17 keratyna 17 (Krt17), mRNA. 1 2.9 Zwiększenie 4 10 Zwiększenie 8 2 Zmniejszenie Krt15 keratyna 15 (Krt15), mRNA. 1 2.3 Zwiększenie Krt5 keratyna 5 (Krt5), mRNA. 1 2.8 Zwiększenie Krt71 keratyna 71 (Krt71), mRNA. 4 3.2 Zwiększenie kolagen, rodzaj XVII, alfa 1 Col17a1 1 2.7 Zwiększenie (Col17a1), mRNA.

2 2 Zwiększenie 4 3.2 Zwiększenie Związany z różnicowaniem Krtdap keratynocytów (Krtdap), 1 7 Zwiększenie mRNA.

4 3.8 Zwiększenie Zrogowaciała koperta 1M Lce1m 1 4.9 Zwiększenie (Lce 1m), mRNA.

Zrogowaciała koperta 1B Lce1b 1 4,8 Zwiększenie (Lce1b), mRNA.

Zrogowaciała koperta 1D Lce1d 1 3.3 Zwiększenie (Lce1d), mRNA.

Zrogowaciała koperta 1A1 LCe1a1 1 2.7 Zwiększenie (Lce1a1), mRNA.

4 2.8 Zwiększenie

124 EP 2986615B1

Krotność Kierunek Kod Nazwa genu Czas (h) zmian w regulacji genu (Musmusculus) ekspresji ekspresji Zrogowaciała koperta 1A2 Lce1a2 1 3 Zwiększenie (Lce1a2), mRNA.

Lor lorykryna (Lor), mRNA. 1 11.6 Zwiększenie 2 2.8 Zwiększenie transglutaminaza 2, C Tgm2 0.5 2.67 Zwiększenie polipeptyd (Tgm2), mRNA.

4 2 Zmniejszenie trombospondyna 2 (Thbs2), Thbs2 0.5 3.98 Zmniejszenie mRNA.

integryna alfa 7 (Itga7), Itga7 1 2.1 Zwiększenie mRNA.

Przykład 12: Wpływ związków na wytwarzanie cytokiny [0333] Specyficzne cytokiny odgrywają istotne role w procesach gojenia rany i środki, które modulują te substancje mogą być użyteczne w leczeniu ran i/lub polepszeniu kosmetycznych efektów gojenia (np. zmniejszenie bliznowacenia). Wpływy Związków 1, 2, 5 i 42 na regulację czterech cytokin (IL-1β, IL-6, IL-8 i TNFα) znanych z tego, że są istotne we wczesnych etapach procesu gojenia rany zbadano w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). [0334] PBMC wyizolowano przez sedymentację Ficolla-Paquea heparynizowanej krwi pobranej od ludzkich dawców 72-letniego płci męskiej (Dawca 1) i 34-letniego płci męskiej (Dawca 2). Wszystkie komórki hodowano w 10% FCS, RPMI jak uprzednio wyszczególniono. [0335] PBMC wysiano z gęstością 1.5x105 komórek na dołek w 10% FCS, RPMI. Pobudzenie tych komórek czterema związkami przeprowadzano przy czterech stężeniach (0 ng/mL, 3 ng/mL. 30 ng/mL, 300 ng/mL) w dwóch kopiach przez 24h w inkubatorze w 37°C, w wilgotnej atmosferze 5% CO2. Próbki podłoża pobrano z każdego wymaganego dołka i mrożono w -80°C aż do zastosowania.

125 EP 2986615B1

[0336] Analizy metodą Cytometric Bead Array (CBA) zastosowano do zmierzenia wyników. Analizy CBA dostarczają sposób uchwycenia rozpuszczalnego analitu lub zestawu analitów przy zastosowaniu kulek powlekanych przeciwciałem o znanych rozmiarach i fluorescencji. Następnie przeprowadzana jest detekcja przy zastosowaniu innego fluorescencyjnie znakowanego drugorzędowego przeciwciała aby wytworzyć kompleks kanapkowy. Każdą próbkę podłoża analizowano pod kątem obecności rozpuszczalnych IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70 i TNFα przy zastosowaniu Zestawu CBA do Wykrywania Ludzkiej Zapalnej Cytokiny BD (Becton Dickinson) zgodnie z instrukcjami producenta. Wartości średniej gęstości fluorescencji z każdej próbki porównywano w odniesieniu do krzywej wzorcowej aby wyznaczyć stężenia cytokin (pg/mL). [0337] Wyniki analizy CBA dla każdego związku są przedstawione w Tabeli 16. [0338] Wszystkie cztery związki istotnie zwiększyły poziomy czterech cytokin (TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8), które wykryto w supernatantach analizowanych z traktowanych PBMC, z tendencjami stałymi między PBMC od dwóch dawców. Najwyższe poziomy cytokin zwykle występowały przy dwóch najwyższych stężeniach (30 i 300 ng/mL) związków. Tabela 16. Wytwarzanie cytokin z PBMC po inkubacji przez 24 godziny przy stężeniach 0, 3, 30 i 300 ng związku/ml dla Związków 1, 2, 5 i 42. Poziomy cytokin są wyrażane w pg/ml ± odchylenie standardowe i są przedstawione dla każdego z dwóch dawców.

[Związek 1] ng/mL Cytokina 0 3 30 300 0 3 30 300 24.3+1. 324.4±0. 592.2±24 TNFα 3.7±1.1 355.0±4.3 5.3±0.5 11.2±0.3 209.6±7.5 4 0 .7 121.6±5. IL-1β 0.8±0.1 1.2±0.2 11.9±0.8 39±0.2 1.3±0.9 3.1±0.9 43.9±1.7 6 IL-6 4.5±0.8 9.7±1.2 34.2±1.1 89.5± 13.8 10.5±1.1 8.3±0.4 12.6±0.9 38.8±9.0 1720±1 16920±1 24078±81 32021±1 IL-8 425±41 16419±40 855±83 1493±2 57 198 5 156 Dawca 1 Dawca 2

126 EP 2986615B1

[Związek 2] ng/mL Cytokina 0 3 30 300 0 3 30 300 TNFα 3.8±0.7 31.15± 314.07± 330.0±28.7 26.2±23.9 27.3±8.3 211.5±12. 618.1±63 6.9 37.9 4 .7 IL-1β 0.9±0.1 1.4±1.2 12.1±0.4 37.7±4.6 5.5±3.2 6.7±1.3 52.6±5.0 123.9±1. 0 IL-6 3.8±0.3 9.1±0.2 38±3.9 84.1±3.6 13.7±4.9 14.9±1.1 14.5±3.3 41.4±2.3

IL-8 430±66 2099±5 18229±2 16634±b25 4073±388 2608±30 26401±27 34117±6 85 592 1 9 1 30 Dawca 1 Dawca 2 [Związek 5] ng/mL Cytokina 0 3 30 300 0 3 30 300 620.9±66 85.8±8. 289.9±18 TNFα 4.3±0.6 306.4+9.0 15.4.±4.2 53.9±9.0 223±11.2 4 .6 .5

IL-1β 0.6±0.1 2.1±0.1 15.7±0.9 44±1.6 4.6±0.1 8.1±2.8 43.6±6.1 114.9±2.4 12.4±0. IL-6 3.7±1.0 33.6±0.6 77.5±9.1 9.5±2.1 14.9±1.1 L2.5±1.2 51.9±1.3 2 33876±2 4924±3 4.765±99 IL-8 360±22 1790±55 17275±40 2026±206 26288±260 66 9 532 Dawca 1 Dawca 2 [Związek 42] ng/mL Cytokina 0 3 30 300 0 3 30 300 631.6±16. 45.8±55 271.9±22 109.5±29 TNFα 5.0±1.0 267.5±11.9 12.6±7.7 354.2±6.3 .2 .4 .3 9 137.8+10. IL-1β 2.7±0.4 2.6±0.6 16.8±1.2 41.3±1.2 1.9±1.3 21.7±7.5 71.2±6.0 9

IL-6 5.1±2.5 8.1±6.4 32.1±0.7 71±4.6 10.1±1.7 30.4±11.8 23.6±0.8 69.3±1.8 32925±55 3013±3 16389±8 7885±25 IL-8 403±80 17425±680 1224±887 28176±37 77 84 16 2 Dawca 1 Dawca 2

Przykłady aktywności in vivo Przykład 13: Ostra odpowiedź zapalna w mysiej skórze [0339] Ostra odpowiedź zapalna jest ważną początkową fazą procesu gojenia rany. Komórki prozapalne, głównie neutrofile i makrofagi; migrują do miejsca i zabezpieczają go przed zakażeniem i uwalniają cytokiny i chemokiny

127 EP 2986615B1 zaangażowane w inicjację i regulację późniejszej naprawy tkanki. [0340] Myszom nude płci męskiej wstrzyknięto podskórnie po każdej stronie 50 µL roztworów 100 µg/mL odpowiednio Związków 1, 2, 5 i 42 w 20% glikolu propylenowym. Każda strona zaczerwieniła się w ciągu 4 godzin i po 24 godzinach naruszona powierzchnia obejmowała około 1 cm średnicy skóry. Stwardnienie utworzyło się w ciągu następnych 6 dni i po 14 dniach miejsce całkowicie się zagoiło z minimalnym bliznowaceniem. [0341] Ostra odpowiedź zapalana zainicjowana przez związki w skórze, następnie szybko rozłożone, jest zgodna z obserwowanymi bezpośrednimi wpływami związków na prozapalne komórki (Przykłady 7 i 9) oraz na ekspresję genów i profile cytokin w PBMC (Przykłady 11 i 12). Taka silna ale przejściowa odpowiedź prozapalna jest często związana z dobrymi efektami gojenia rany in vivo. Przykład 14 : Preparat Żelowy Związku 1 [0342] Albo 30 mg albo 50 mg Związku 1(>97% czystość wyznaczona przez HPLC) rozpuszczono w 99.5% alkoholu izopropylowego (Biotech Pharmaceuticals) i pozostawiono do odstania na całą noc. Przygotowano jako środek żelujący roztwór 0.6% Karbomeru 940 (Snowdrift Farms) w 5mL jałowej wody. Związek 1 zatężono a następnie dodano razem roztwór 0.6% Karbomeru 940 w 20 mL strzykawce i dokładnie zmieszano. Następnie dodano 20 µL 100% trietanoloaminy (Sigma-Aldrich) i szybko zmieszano. Otrzymany żelowy Związek 1 następnie odmierzono do pojedynczych 1 mL insulinówek aby wytworzyć dawki 3 mg Związku 1/mL i 5mg Związku 1/mL. Przykład 15: Wstrzykiwalny preparat Związku 1 [0343] 20mg Związku 1 (>97% czystość wyznaczona przez HPLC) rozpuszczono w 8 mL 1.2 propanodiolu (Sigma-Aldrich) w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 mL i pozostawiono do odstania na całą noc w temperaturze pokojowej. 12 mL albo 30 mM buforu octanowego o pH 4.2 albo soli fizjologicznej (chlorek sodu do wstrzyknięć BP 0.9% - AstraZeneca) dodano następnie do roztworu i dokładnie zmieszano. Roztwór następnie wyjałowiono przez sączenie i odmierzono do 1 mL dawki 1 mg/mL stężenia Związku 1. Przykład 16: Weterynaryjne kliniczne leczenie niegojących się ran i ran, które nie reagują na obecne standardy opieki

128 EP 2986615B1

[0344] Związek 1 zastosowano do leczenia trudno gojących się ran u 10 zwierząt domowych (tj. posiadanych prywatnie i będących pod opieką) mając na celu polepszenie powtórnego zamiaru wygojenia rany. [0345] Siedem psów (Canis lupus familiaris) i jednego kangura drzewnego (Dendrolagus lumholtzii) z przewlekłymi, niegojącymi się ranami, które nie reagowały na obecne weterynaryjne standardy opieki dla tych wskazań traktowano Związkiem 1 przez niezależnych weterynarzy. Drugiego drzewnego kangura i spectacled flying fox (Pteropus conspicillatus) z ranami nieodpowiednimi do początkowego leczenia za pomocą obecnej standardowej opieki także traktowano Związkiem 1. Wszystkie przypadki traktowano jako otwarte rany bez zastosowania opatrunków lub innych bandaży w czasie przebiegu leczenia Związkiem 1 i późniejszym okresem rozkładu rany. Jeśli nie określono w badaniach poszczególnych przypadków nie zastosowano żadnych równoczesnych leków w czasie leczenia Związkiem 1. [0346] Uwagi dotyczące przypadku i leczenia dla każdego z pacjentów są podsumowane poniżej. Należy zauważyć, że ponowne okazanie tych zwierząt leczącym weterynarzom było często nieregularne i efekty gojenia ran mogą okazać się dobre przed ponownymi wizytami oceniającymi. [0347] Leczenie Związkiem 1 zaskutkowało skutecznym rozkładem rany z minimalnym bliznowaceniem w ośmiu zakończonych przypadkach. Rozkład rany przebiegał dobrze w badaniach dwóch bieżących przypadków, które były ostatnio leczone (Badania przypadku 8 i 10). Badania Przypadku 1 do 8: Niegojące się rany Badanie Przypadku 1: Niegojąca się głęboka obumierająca rana twarzy, 3 letni berneński pies górski [0348] Uwagi dotyczące przypadku: • Duża, owalna rana twarzy 7cm długość x 4 cm szerokość x do 2 cm głębokość po lewej stronie nosa pacjenta • Rana pokryła się strupem ze skrawkami nekrotycznej wydzieliny ropy • Histopatologia: głębokie obumierające uszkodzenie prawdopodobnie związane z ukąszeniem przez pająka i charakteryzujące się obecnością bakterii ziarniniakowych i ropnym zapaleniem

129 EP 2986615B1

• Rana nie odpowiadała na standardowe protokoły leczenia ran obejmujące antybiotyki (cefaleksynę, amoksiklaw, gentamycynę) i leki przeciwzapalne (makrolon) przez okres 3 miesięcy • Rana stopniowo powiększała swój rozmiar, powodując zamknięcie oka i istotnie naruszając wzrok pacjenta oraz ogólne zachowanie. Żuchwowe węzły chłonne pacjenta powiększyły się. • Opcja pozostałej standardowej opieki była dla radykalnej operacji chirurgicznej twarzy i rekonstrukcji. • Początkowe leczenie obejmowało 5 podań (w sumie 5.3mL) żelowego Związku 1 (3 mg/mL) przez początkowy 14 dniowy okres (Związek 1 podawany w dniach 1, 2, 6, 10 i 14). • Po częściowym rozkładzie rany w 28 dniu, pacjentowi podano pojedynczą 1 mL dawkę Związku 1 (0.5 mg/mL) przez wstrzyknięcie jej pod powierzchnię wielu miejsc w obrębie powierzchni rany. • 35 dnia po wstrzyknięciu Związku 1 rana wypełniła się zdrową różnicującą się ziarniną i nie było żadnej oznaki zakażenia. • Jednocześnie podawanymi lekami w czasie przebiegu leczenia Związkiem 1 był temgesic i lignokaina w czasie pierwszego podawania preparatu żelowego, temgesic i tramadol w czasie i w dniu natychmiast po wstrzyknięciu (tj. dni 28 i 29) i następnie wspomagająco niska dawka doustnego kortykosteroidu (makrolon) codziennie od dnia 42. • W dniu 76 po końcowym leczeniu rana zagoiła się i wypełniła prawidłową tkanką z minimalnym bliznowaceniem a także ponownym wzrostem włosów obejmującym ponad 95% początkowej powierzchni rany. Badanie Przypadku 2: Rozerwana, zakażona torbiel na brzuchu, 13 letni Bokser [0349] Uwagi dotyczące przypadku: • Słaby pacjent z ostrym zapaleniem stawów i kości, obarczony wysokim ryzykiem związanym ze znieczuleniem w odniesieniu do jakiejkolwiek chirurgicznej interwencji • U pacjenta występowała trwała zakażona torbiel na plecach proksymalnie do ogona, która nie reagowała na regularny drenaż i wstrzykiwanie do torbieli

130 EP 2986615B1

antybiotyków (gentamycyny, enrofloksacyny, norocyliny) przez okres 5 miesięcy. • U pacjenta wystąpiło rozerwanie torbieli i podwyższona temperatura. Torbiel oczyszczono w celu usunięcia martwej skóry a następnie przepłukano solą fizjologiczną i chlorheksydyną. Pacjenta leczono antybiotykami (klindamycyna i norocylina) oraz lekami przeciwzapalnymi (metacam). • Po 5 dniach rana związana z rozerwaną torbielą nie wykazała żadnych oznak rozkładu i była otoczona znacznym miejscowym stanem zapalnym. Następnie eksponowaną powierzchnię rany (około 5 cm długość x 3 cm szerokość x do 2.5 cm głębokość) przepłukano solą fizjologiczną i 0.5 mL żelowego Związku 1 (3 mg/mL) naniesiono równo na powierzchnię rany. • Po 5 dniach po leczeniu żelowym Związkiem 1 rana istotnie zmniejszyła się do mniej niż 30% powierzchni początkowej rany (przybliżone wymiary 3cm długość x 1.5cm szerokość x 1cm głębokość) i składała się ze zdrowej ziarniny. • W 30 dniu rana rozłożyła się i pojawiła się prawidłowa tkanka oraz ponad 70% włosów ponownie wzrosło w porównaniu do początkowej powierzchni rany. • Jednocześnie podawanymi temu pacjentowi lekami w czasie przebiegu leczenia Związkiem 1 był wstrzykiwalny niesteroidowy lek przeciwzapalny (metacam) w czasie leczenia. Badanie przypadku 3: Niegojące się zakażone punkcyjne rany, 11 letni Chow Chow [0350] Uwagi dotyczące przypadku: • U pacjenta wystąpiły dwie duże rany po ugryzieniu (każda około 4 cm długa x 1.5 cm szeroka x 2 cm głęboka) na zadzie po walce psów. • Rany przemyto i pacjenta leczono antybiotykami (tabletki amoksiklav i wstrzykiwalna norocylina) • Po 8 dniach rany były trwałe, nie zamykające się i zakażone. • Rany wyczyszczono i do każdej rany równo podano 0.4 mL żelowego Związku 1 (3 mg/mL). • W 15 dniu po leczeniu Związkiem 1 rany były istotnie zmniejszone do mniej

131 EP 2986615B1

niż 40% ich początkowej wielkości, powstały strupy i nie było oznak zakażenia. • W 46 dniu po leczeniu Związkiem 1 rany całkowicie się rozłożyły i pojawiła się prawidłowa tkanka, bez bliznowacenia i nastąpił całkowity ponowny wzrost włosów na powierzchni rany. • Nie podawano równocześnie żadnych leków pacjentowi w czasie leczenia Związkiem 1. Badanie Przypadku 4: Niegojące się zakażone rany na twarzy i śródstopiu psa (11 letni Bokser) [0351] Uwagi dotyczące przypadku: • U pacjenta występowały dwie powierzchnie niegojących się zakażonych i objętych stanem zapalnym ran, jedna na lewej stronie twarzy i jedna na lewej stronie śródstopia, które nie reagowały na wydłużone 8 tygodniowe podawanie antybiotyków (cefaleksyna, doksycyklina) i kortykosteroidów (makrolon). • Pojedyncze leczenie 5 mg/mL preparatem żelowym Związku 1 zastosowano na ranę na twarzy (0.4 mL) i na ranę nogi (0.6 mL). • Rana na twarzy szybko zareagowała na leczenie Związkiem 1 z wystąpieniem małego strupa w 7 dniu i całkowitym zamknięciu rany, w tym znaczący ponowny wzrost włosów widoczny 14 dnia po leczeniu. Powierzchnia rany zagoiła się całkowicie w 63 dniu po leczeniu. • Rana na nodze również zareagowała szybko z wystąpieniem strupa na zlokalizowanych powierzchniach. W dniu 14 strup w dużym stopniu odczepił się i zaobserwowano leżącą poniżej ziarninę. Powierzchnia rany zamknęła się całkowicie i była pokryta więcej niż w 95% włosami w 63 dniu po leczeniu. • Jednocześnie podawanymi temu pacjentowi lekami w czasie leczenia Związkiem 1 były podawane codziennie niskie dawki kortykosteroidów (makrolon) w czasie bieżącego leczenia zespołu atopowego zapalenia skóry u psów. Badanie Przypadku 5: Niegojąca się zakażona rana na uchu psa (4 letni Bull Arab)

132 EP 2986615B1

[0352] Uwagi dotyczące przypadku: • U pacjenta występowało niegojące się skaleczenie związane z wypadkiem przy polowaniu, które utrzymywało się na lewym uchu przez więcej niż 6 tygodni. • Trzy leczenia, każde składające się z 0.1 mL 5 mg/mL żelowego preparatu Związku 1, zastosowano na uszkodzoną powierzchnię w 8 dniowych odstępach. Nie zastosowano równocześnie żadnych leków w czasie przebiegu leczenia pacjenta Związkiem 1. • 41 dni po pierwszym leczeniu Związkiem 1 rana całkowicie się zamknęła. Dalsza ocena 152 dni po początkowym leczeniu wykazała całkowity rozkład rany, minimalne bliznowacenie z ponad 80% pokryciem włosami w porównaniu do początkowego miejsca rany. Badanie Przypadku 6: Niegojąca się zakażona rana na uchu psa (11 letni Bokser) [0353] Uwagi dotyczące przypadku: • U pacjenta występowała niegojąca się rana (zakażona i objęta stanem zapalnym) na górnej części lewego ucha i była leczona przez 10 tygodni za pomocą protokołów standardowej opieki obejmującej regularne podanie (i) miejscowego dermatologicznego preparatu (Neotopic) łączącego środki przeciwbakteryjny (siarczan neomycyny), przeciwzapalny (hydrokortyzon) i przeciwświądowy (lignokaina) oraz (b) dostępnej w sprzedaży zawiesiny (Auracol) ze składnikami przeciwzapalnym (prednizolon), przeciwgrzybiczym (azotan mikonazolu) i przeciwbakteryjnym (siarczan polimyksyny B). Przed tymi podaniami pacjentowi podawano doustnie niskie dawki kortykosteroidów (makrolon) w ramach bieżącej terapii do leczenia przewlekłego zespołu atopowego zapalenia skóry u psów. • Po 10 tygodniach protokołu standardowej opieki nie było żadnych oznak rozkładu rany. • Pojedyncze leczenie 3 mL 5 mg/mL żelowym preparatem Związku 1 zastosowano na uszkodzoną powierzchnię i w ciągu 15 minut podawania Związku 1 wystąpiło dostrzegalne zaczerwienienie leczonej powierzchni. • Od 4 dnia leczenia Związkiem 1 wznowiono u pacjenta podawanie

133 EP 2986615B1

codziennie niskich dawek kortykosteroidów (makrolon) do leczenia ostego atopowego zapalenia skóry. To leczenie kontynuowano przez cały okres gojenia i rozkładu rany. • W 17 dniu po leczeniu Związkiem 1 nie było żadnych oznak zakażenia ani zapalenia i w miejscu leczenia rozwinęła się dobrze zziarninowana warstwa rany. • W 83 dniu leczenia nastąpiło całkowite zamknięcie rany i ponowny wzrost włosów wystąpił na więcej niż 90% początkowej powierzchni rany. • 139 dni po leczeniu nie było możliwe rozpoznanie miejsca początkowej rany, nie było oznak bliznowacenia i ani różnic w pigmentacji skóry ani wyraźnego zgrubienia w i dookoła leczonej powierzchni. Badanie Przypadku 7: Niegojące się zakażone rany na uszach i twarzy psa (8 letni terier Jack Russell) [0354] Uwagi dotyczące przypadku: • U pacjenta wystąpiły dwie niegojące się rany na czubku i spodzie prawego ucha i niegojąca się rana na pysku, które właściciel zaobserwował, że występują przez ponad 4 tygodnie. Możliwą przyczyną było ukąszenie przez zakażonego pająka lub innego owada. • Dwa leczenia, każde 0.1 mL 5 mg/mL żelowym preparatem Związku 1, zastosowano na obie uszkodzone powierzchnie na uszach w 5 dniowym odstępie. Pojedyncze leczenie 0.1 Ml 5mg/mL żelowym preparatem Związku 1 zastosowano do zmian na twarzy. • 13 dnia po pierwszym leczeniu Związkiem 1 obie rany na uchu znacząco zmniejszyły się i utworzyły się strupy. 29 dnia rana zamknęła się w pełni i całkowicie pokryła się włosami. • W 16 dniu leczenia, rana na pysku całkowicie się rozłożyła. • Temu pacjentowi podawano równocześnie przez 5 dni doustnie antybiotyki amoksycylinę i kwas klawulonowy (amoksiklav) w czasie początkowego leczenia. Badanie przypadku 8: Zakażona rana kości na nodze kangura drzewnego (Marsupialia, Dendrolagus lumholtzi) [0355] Uwagi dotyczące przypadku:

134 EP 2986615B1

• Pacjentem był dziki kangur drzewny zraniony w wyniku zaatakowania przez psa co zaskutkowało zwichnięciem kości krzyżowej i zapaleniem kości i szpiku kostnego. Pacjenta leczono przez 1 miesiąc wstrzykiwalnymi antybiotykami ceftazydymem (Fortum) i sulfametoksazolem trimetoprimu (TMS). Podczas gdy zapalenie zmniejszyło się wymaz bakteriologiczny wykazał, że bakterie Gram ujemne i Serratiamarcesens były wciąż obecne. Uszkodzona kończyna nie była obciążona. • Leczenie ceftazydymem przez kolejne 2 tygodnie nie zaskutkowało żadnym polepszeniem stanu i weterynarz powiadomił o słabej prognozie oczyszczenia z zakażenia z kości i możliwym istotnym mechanicznym rozerwaniu struktury kości, która wpłynie na przyszłe chodzenie. Nowy bakteriologiczny wymaz pobrany z zatok z wypływającą wydzieliną na stawie skokowym i podeszwie w tym samym czasie ujawniło obecność mieszanych gatunków beztlenowców i Gram dodatnich gatunków Actinomyces więc podano pojedynczy powolny dożylny wlew jodku sodu (Sodide). • W związku z brakiem odpowiedzi na inne leczenia i ogólną słabą prognozę przy leczeniu za pomocą standardów opieki, rozpoczęto 2 tygodnie później leczenie ratujące obejmujące 4 podania 5 mg/mL żelowego preparatu Związku 1. • Dla pierwszego podania 0.1 mL żelowego Związku 1 zastosowano na każdą z trzech zmian na prawym stawie skokowym ( jeden nad stawem łydki, jeden na spodzie podeszwy stopy i małą zmianę u podstawy pięty) i rozpoczęto powolny wlew dożylny jodku sodu. W ciągu 10 minut podawania żelowego Związku 1 pojawiła się ropna wydzielina z leczonej powierzchni. • Po okazaniu 8 dni po pierwszym leczeniu ropna wydzielina wyciekała z 2 spośród 3 ran na nodze. Inna rana (najmniejsza zmiana na pięcie) zmniejszyła się i zaczęła się goić. Dalsze leczenie 0.15 mL 5 mg/mL żelowym preparatem Związku 1 zastosowano do leczenia każdej z dwóch otwartych ran (jedna nad stawem łydki, druga na spodzie podeszwy stopy). Podano także powolny dożylny wlew jodku sodu. • Kolejne 15 dni później (23 dni po początkowym leczeniu) kilka mL gęstej

135 EP 2986615B1

ropy zostało wyciśnięte z rany na podeszwie stopy zanim wtłoczono 0.15 mL 5 mg/mL żelowego preparatu Związku 1 do osuszonej zatoki rany. • Tydzień później wystąpiła istotna poprawa zakażenia. Mały kawałek kości usunięto z dziury w podeszwie stopy. Nie było widocznej żadnej ropy ale wystąpiło wydzielanie surowicy. Kolejne 0.2 mL żelowego Związku 1 naniesiono na każdą z tych zmian, jedną na kostkę, drugą na spód stopy. Podano także powolny dożylny wlew jodku sodu. Kończyna jest obecnie obciążona, ale pięta i podeszwa stopy jest wciąż bardzo twarda z zapaleniem i chód zwierzęcia jest bardzo nierówny i ciężar przerzucony jest na nieuszkodzoną lewą nogę. • Kolejne 15 dni później rana nad stawem kostki całkowicie zamknęła się i ponownie wyrosły włosy. Rana na pięcie podeszwy stopy zmniejszyła się do mniej niż 50% swojego rozmiaru z poprzedniej wizyty i otaczająca skóra i tkanka są miękkie, sprężyste i prawidłowe. Kończyna została całkowicie obciążona i nie występuje żadna nierówność w chodzie zwierzęcia. • Oprócz wstrzykiwalnego jodku sodu nie podawano pacjentowi żadnych innych leków w czasie leczenia Związkiem 1. Badanie Przypadku 9: Infekcyjne zapalenie naczyń w uchu kangura drzewnego (Marsupialia, Dendrolagus lumholtzi) [0356] Uwagi dotyczące przypadku: • Pacjentem było młode zranione zwierzę znalezione dziko • Pacjent był bardzo słaby, odwodniony i anemiczny. Próbka moczu wykazała obecność krwi i zakażenie bakteryjne, prawdopodobnie sepsę. Pacjenta poddano leczeniu płynami i podawano lek przeciw mdłościom cytrynian maropitantu (cerenia) i dwa preparaty do wstrzyknięć Tribacteral (trimetoprim, sulfadiazyna) i ceftazydym (fortum). • Po 9 dniach podawania kroplówek stan pacjenta poprawił się ale wciąż występowało obrażenie prawego ucha i prawdopodobnie zakażenie naczyń i gangrena. Niemożliwa była operacja chirurgiczna z powodu znaczącego ryzyka związanego ze znieczuleniem ze względu na wysoce upośledzony stan pacjenta. Zamiast tego rozpoczęto leczenie żelowym preparatem Związku 1.

136 EP 2986615B1

• Trzy leczenia 0.1 mL 5 mg/mL stężeniem żelowego Związku 1 zastosowano na uszkodzoną powierzchnię w 7 dniowych odstępach. Jedynym lekiem podawanym jednocześnie w tym czasie był antybiotyk z grupy cefalosporyn ceftazydym (fortum). • 7 dnia po pierwszym leczeniu żelowym Związkiem 1, mocno przylegający strup pokrył powierzchnię rany. Ten strup zniknął 10 dnia ujawniając dobrze rozwiniętą różową warstwę ziarniny. • Przed rozpoczęciem trzeciego i ostatniego podania 14 dnia po początkowym leczeniu powierzchnia rany zmniejszyła się o około 50% i w 25 dniu zdrowa tkanka była obecna na całej powierzchni rany. • 67 dnia zmiana uległa całkowitemu rozłożeniu i ucho pokryte było w pełni włosami. Badanie Przypadku 10: Ostra szarpana rana na głowie spectacled flying fox (Mammalia, Pteropus conspicillaltus) [0357] Uwagi dotyczące przypadku: • Pacjentem był 4 miesięczny flying fox z głęboką penetrującą raną na głowie 4-miesięcznego flying fox spowodowaną zaplątaniem w drut kolczasty. • W opinii leczącego weterynarza, który miał duże doświadczenie w ranach u zwierząt dzikich (w tym flying fox) normalna standardowa opieka prawdopodobnie były by wysoce problematyczne powodując utratę kształtu prawego oka i spowodowanie, że nie będzie mogło się zamykać albo z powodu nadmiernego tworzenia tkanki bliznowatej związanych z operacją chirurgiczną lub rozmiarem wymaganego ziarninowania jeśli stosowane były opatrunki na ranę. • Związek 1 nanoszono na ranę w 3 podaniach 0.1 mL 5 mg/mL żelowego preparatu przez 28 dniowy okres (Dni 1, 10 i 28). Podczas przebiegu leczenia nie podawano jednocześnie żadnych innych leków ani nie przeprowadzano żadnych interwencji. • 14 dnia po początkowym leczeniu wystąpiło znaczne wypełnienie tkanką i przebudowa i 28 dnia oko było w stanie całkowicie się zamknąć. W 38 dniu strup pokrył całą powierzchnię rany i zaczął schodzić ujawniając w 49 dniu warstwę prawidłowej ziarniny.

137 EP 2986615B1

• 55 dnia po początkowym leczeniu na całej powierzchni początkowej rany wystąpiło wypełnienie prawidłową tkanką i prawe oko wróciło do swojej wyjściowej pozycji. Obecna była bardzo zdrowa warstwa ziarniny. Przykład 17: Rozkład i wywołany efekt kosmetyczny ran po nekrozie i obumarciu samoistnych nowotworów u zwierząt domowych leczonych Związkiem 1.

[0358] Weterynaryjne dane kliniczne dotyczące prędkości rozkładu ran, które wytworzyły się po nekrozie i obumarciu samoistnych nowotworów, które leczono przez wstrzyknięcie do wnętrza nowotworu Związku 1 (30% preparat 1,2 propanodiolu w stężeniu albo 0.5 albo 1.0 mg/mL) u dwudziestu czterech zwierząt domowych są podsumowane w Tabeli 17. [0359] Należy zauważyć, że wszystkie rany były traktowane jako otwarte rany i w żadnym z tych przypadków nie były stosowane żadne bandaże, opatrunki, balsamy ani jednocześnie podawane leki. Tabela 17: Wielkość rany i szybkość rozkładu (czas do zamknięcia) u zwierząt domowych po obumarciu samoistnych nowotworów, które leczono za pomocą wstrzykiwalnego preparatu Związku 1. Psy

Klasa Liczba Średnia Średnia Średnia liczba dni wielkości rany Przypadków powierzchnia głębokość od obumarcia rany (cm2) rany (mm) nowotworu do zamknięcia rany

0.25 do 9 cm2 7 3.6 ± 2.7 6.7 ± 2.8 24 ± 16

9 do 50 cm2 5 30.4 ± 16.1 14.0 ± 5.5 40 ± 15

>50 do 130 3 95.3 ± 35.0 13.3 ± 5.8 62 ± 18 cm2 Konie Klasa wielkości Liczba Średnia Średnia Średnia liczba dni od rany Przypadków powierzchnia głębokość rany obumarcia

138 EP 2986615B1

Psy

Klasa Liczba Średnia Średnia Średnia liczba dni wielkości rany Przypadków powierzchnia głębokość od obumarcia rany (cm2) rany (mm) nowotworu do zamknięcia rany

0.25 do 9 cm2 7 3.6 ± 2.7 6.7 ± 2.8 24 ± 16

9 do 50 cm2 5 30.4 ± 16.1 14.0 ± 5.5 40 ± 15

>50 do 130 3 95.3 ± 35.0 13.3 ± 5.8 62 ± 18 cm2 Konie

rany (cm2) (mm) nowotworu do zamknięcia rany

0.25 do 9 cm2 4 2.9 ± 1.4 7.5 ± 2.9 20 ± 12 9 do 50 cm2 2 19.5 ± 14.5 10.0 ± 0 53 ± 22 Koty

Klasa Liczba Średnia Średnia Średnia liczba dni wielkości rany Przypadków powierzchnia głębokość od obumarcia rany (cm2) rany (mm) nowotworu do zamknięcia rany

3 4.8 ± 6.3 5.0 ± 4.3 17 ± 10 17 ± 10

[0360] Dane z tych przypadków także przedstawiają dobre efekty kosmetyczne rozkładu rany z minimalnym bliznowaceniem i prawidłowym odrostem włosów u większości pacjentów (Tabela 18). W kilku przypadkach, gdzie nie wystąpiło bliznowacenie, zazwyczaj zbiegły się z powierzchniami o prawidłowej cienkiej skórze (np. na kończynach koni i psów). Tabela 18: Cechy tkanki, skóry i owłosienia miejsc z wygojoną raną u zwierząt

139 EP 2986615B1 domowych po obumarciu samoistnych nowotworów, które leczono za pomocą wstrzykiwalnego preparatu Związku 1.

Cechy tkanki, skóry i owłosienia miejsca rany po rozkładzie

Cechy miejsca rany i rodzaj efektu Liczba psów Liczba koni Liczba kotów

Deficyt tkanki w Brak lub minimalny 15 6 3 miejscu rany1 Niewielki 0 0 0

Znaczny 0 0 0

Biznowacenie & Brak lub minimalne 13 4 3 zgrubienie skóry2 Niewielkie 1 1 0

Znaczne 1 1 0

Odrośnięcie włosów w Całkowite 12 5 2 miejscu rany3 Częściowe 1 1 1

Skąpe 2 0 0

Zmiana w kolorze Brak 15 3 2 włosów Obecna 0 3 1

Pigmentacja skóry Normalna 11 3 3

Niejednolita 1 1 0

Hipopigmentacja 3 1 0

Hiperpigmentacja 0 1 0

1Rodzaje deficytu tkanki Brak lub minimalny: <5% deficytu tkanki wzdłuż początkowej powierzchni rany Niewielki: 5 do 10% deficytu tkanki wzdłuż początkowej powierzchni rany Znaczny: >10% deficytu tkanki wzdłuż początkowej powierzchni rany

2.Rodzaje bliznowacenia i zgrubienia skóry: Brak lub minimalny: Bliznowacenie niewyraźne wizualnie lub przed dotyk. Niewielkie: Zlokalizowana blizna pokrywająca < 10% początkowej powierzchni rany Znaczne: Bliznowacenie pokrywające >10% początkowej powierzchni rany

3.Rodzaje odrośnięcia włosów na powierzchni rany: Całkowite: Włosy pokrywają >95% początkowej powierzchni rany Częściowe: Włosy pokrywają >50% początkowej powierzchni rany

140 EP 2986615B1

Cechy tkanki, skóry i owłosienia miejsca rany po rozkładzie

Cechy miejsca rany i rodzaj efektu Liczba psów Liczba koni Liczba kotów

Skąpe: Włosy pokrywają <50% początkowej powierzchni rany

141 EP 2986615B1

Zastrzeżenia 1. Związek 5,6- lub 6,7-epoksy-tiglianu lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w pobudzaniu gojenia rany; gdzie związek 5,6- lub 6,7-epoksy-tiglianu jest związkiem o wzorze (I):

gdzie

R1 oznacza wodór R2 oznacza -OR17; lub R1 i R2 razem tworzą grupę karbonylową (=O);

R3 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R4 i R5 niezależnie oznaczają wodór lub -OR17; lub R4 i R5 razem tworzą wiązanie podwójne lub epoksydowe (-O-);

R6 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R7 oznacza -OH lub -OR18;

R8 oznacza -OH lub -OR18; pod warunkiem, że R7 i R8 nie oznaczają oba OH;

R9 i R10 są niezależnie wybrane z wodoru i C1-6alkilu;

R11 i R12 lub R12 i R13 razem tworzą epoksyd i pozostała grupa R11 i R13 oznacza wodór, -OH lub -OR17

R14 oznacza wodór lub -R17;

R15 oznacza wodór lub -R17;

R16 oznacza wodór lub -R17;

R17 oznacza wodór, -C1-6alkil, -C2-6alkenyl, -C2-6alkinyl, -C(O)C1-6alkil, -

142 EP 2986615B1

C(O)C2-6alkenyl lub -C(O)C2-6alkinyl;

R18 oznacza C1-20alkil, -C2-20alkenyl, -C2-20alkinyl, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-

20alkenyl, -C(O)C2-20alkinyl, -C(O)cykloalkil, -C(O)C1-10alkilocykloalkil; -C(O)C2-

10alkenylocykloalkil, -C(O)C2-10alkinylocykloalkil, -C(O)aryl, -C(O)C1-

10alkiloaryl, -C(O)C2-10alkenyloaryl, -C(O)C2-10alkinyloaryl, -C(O)C1-

10alkiloC(O)R19, -C(O)C2-10alkenyloC(O)R19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)R19, -

C(O)C1-10alkiloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkenyloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-

10alkinyloCH(OR19)(OR19), -C(O)C1-10alkiloSR19, -C(O)C2-10alkenyloSR19, -

C(O)C2-10alkinyloSR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)OR19, -C(O)C2-

10alkenyloC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)OR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)SR19, -

C(O)C2-10alkenyloC(O)SR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)SR19,

lub

143 EP 2986615B1

4. Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z zastrzeżeniami 1 do 3 gdzie rana jest przewlekłą raną, ostrą raną lub istniejącą raną. 5. Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z zastrzeżeniami 1 do 4 gdzie związek epoksy-tiglianowy występuje w postaci ekstraktu roślinnego zwłaszcza gdzie ekstrakt roślinny jest możliwy do otrzymania z rośliny, którą jest gatunek Fontainea lub gatunek Hylandia. 6. Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 5 gdzie związkiem epoksy-tiglianowym o wzorze (I) jest związek o wzorze (II):

gdzie R3, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 i R15 są jak zdefiniowano dla wzoru (I), zwłaszcza gdzie związkiem o wzorze (I) lub (II) jest związek o wzorze (III):

144 EP 2986615B1

gdzie R7, R8, R11, R12, R13 i R15 są jak zdefiniowano dla wzoru (I). 7. Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 6 gdzie R1 oznacza wodór i R2 oznacza OH lub -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenyl lub -OC(O)C2-

6alkinyl, lub R1 i R2 razem tworzą grupę karbonylową. 8.Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 7 gdzie R3 oznacza wodór lub -C1-3alkil. 9. Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z którymkolwiek z zastrzeżeń1 do 8 gdzie R4 i R5 niezależnie oznaczają wodór lub -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenyl lub -

OC(O)C2-6alkinyl lub R4 i R5 razem tworzą wiązanie podwójne lub epoksydowe. 10. Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 9 gdzie R6 oznacza wodór lub -C1-3alkil. 11. Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 10 gdzie R7 oznacza -

OH, -OC(O)C1-15alkil, -OC(O)C2-15alkenyl, -OC(O)C2-15alkinyl, -OC(O)aryl gdzie grupa arylowa jest opcjonalnie podstawiona, -OC(O)C1-15alkiloaryl, -

OC(O)C1-10alkiloC(O)H, -OC(O)C2-10alkenyloC(O)H, -OC(O)C1-10alkiloC(O)C1-

6alkil, -OC(O)C2-10alkenyloC(O)C1-6alkil, -OC(O)C1-10alkiloCH(OC1-

145 EP 2986615B1

3alkilo)(OC1-3alkil), -OC(O)C2-10alkenyloCH(OC1-3alkilo)(OC1-3alkil), -OC(O)C1-

10alkiloSC1-6alkil, -OC(O)C2-10alkenyloSC1-6alkil, -OC(O)C1-10alkiloC(O)OC1-

6alkil lub -OC(O)C2-10alkiloC(O)OC1-6alkil. 12. Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 11 gdzie R8 oznacza -

OC(O)C1-15alkil, -OC(O)C2-15alkenyl, -OC(O)C2-15alkinyl lub -C(O)aryl gdzie grupa arylowa jest opcjonalnie podstawiona. 13. Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 12 gdzie R9 i R10 oznaczają niezależnie -C1-3alkil. 14. Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 13 gdzie R11 i R12 tworzą epoksyd i R13 oznacza -OH, -OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenyl lub -

OC(O)C2-6alkinyl lub gdzie R12 i R13 tworzą epoksyd i R11 oznacza -OH, -

OC(O)C1-6alkil, -OC(O)C2-6alkenyl lub -OC(O)C2-6alkinyl. 15. Związek epoksy-tiglianowy lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania zgodnie z którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 14 gdzie R15 oznacza wodór, -C(O)C1-6alkil, -C(O)C2-6alkenyl lub -C(O)C2-6alkinyl. 16. Związek 5,6- lub 6,7-epoksy-tiglianu lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w zapobieganiu nadmiernemu bliznowaceniu, zwłaszcza gdzie nadmierne bliznowacenie stanowi keloid lub bliznę hipertroficzną; gdzie związek 5,6- lub 6,7-epoksytiglianu jest wybrany z: 12-tigloilo-13-butanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- onu (Związek 21); 12-(3-butenoilo)-13-nonanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 22); 12-benzoilo-13-(2-metylobutanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 23); 12,13-dibutanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 27) 12-benzoilo-13-butanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-

146 EP 2986615B1 onu (Związek 28); 12,13-di-nonoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 41); 12,13-di-heksanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 42); 12,13-di-pentanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 43); 12,13-di-tigloilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 44) 5,20-di-acetylo-12-tigloilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 45); 12,13-di-(2E,4E)-heks-2,4-enoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 46); 12-heksanoilo-13-[2-(N-metyloantraniloilo)]-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 47) 12-acetylo-13-[2-(N-metyloantraniloilo)]-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 48); 12,13-di-heptanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 49); 12-mirystoilo-13-acetylo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- onu (Związek 50); 12-mirystoilo-13(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy- 1-tiglien-3-onu (Związek 51); 12-(2-metylobutanoilo)-13-acetylo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 52); i 12-hydroksy-13-heksanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien- 3-onu (Związek 53); 12, 13-di-(3-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 60) lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli. 17. Związek 5,6- lub 6,7-epoksy-tiglianu lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w sposobie leczenia, gdzie sposób leczenia obejmuje zmniejszenie bliznowacenia spowodowanego przez gojenie rany przez

147 EP 2986615B1 zmniejszenie zmian w pigmentacji skóry i/lub poprawę odrośnięcia włosów; gdzie związek 5,6- lub 6,7-epoksy-tiglianu jest związkiem o wzorze (I):

gdzie

R1 oznacza wodór i R2 oznacza -OR17; lub R1 i R2 razem tworzą grupę karbonylową (=O);

R3 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R4 i R5 oznaczają niezależnie wodór lub -OR17; lub R4 i R5 razem tworzą wiązanie podwójne lub epoksydowe (-O-);

R6 oznacza wodór lub C1-6alkil;

R7 oznacza -OH lub -OR18;

R8 oznacza -OH lub -OR18; pod warunkiem, że R7 i R8 nie oznaczają oba OH;

R9 i R10 są niezależnie wybrane z wodoru i C1-6alkilu;

R11 i R12 lub R12 i R13 razem tworzą epoksyd i pozostała grupa R11 i R13 oznacza wodór, -OH lub -OR17

R14 oznacza wodór lub -R17;

R15 oznacza wodór lub -R17;

R16 oznacza wodór lub -R17;

R17 oznacza wodór, -C1-6alkil, -C2-6alkenyl, -C2-6alkinyl, -C(O)C1-6alkil, -

C(O)C2-6alkenyl lub -C(O)C2-6alkinyl;

R18 oznacza C1-20alkil, -C2-20alkenyl, -C2-20alkinyl, -C(O)C1-20alkil, -C(O)C2-

20alkenyl, -C(O)C2-20alkinyl, -C(O)cykloalkil, -C(O)C1-10alkilocykloalkil; -C(O)C2-

148 EP 2986615B1

10alkenylocykloalkil, -C(O)C2-10alkinylocykloalkil, -C(O)aryl, -C(O)C1-

10alkiloaryl, -C(O)C2-10alkenyloaryl, -C(O)C2-10alkinyloaryl, -C(O)C1-

10alkiloC(O)R19, -C(O)C2-10alkenyloC(O)R19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)R19, -

C(O)C1-10alkiloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-10alkenyloCH(OR19)(OR19), -C(O)C2-

10alkinyloCH(OR19)(OR19), -C(O)C1-10alkiloSR19, -C(O)C2-10alkenyloSR19, -

C(O)C2-10alkinyloSR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)OR19, -C(O)C2-

10alkenyloC(O)OR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)OR19, -C(O)C1-10alkiloC(O)SR19, -

C(O)C2-10alkenyloC(O)SR19, -C(O)C2-10alkinyloC(O)SR19,

lub

R19 oznacza wodór, -C1-10alkil, -C2-10alkenyl, -C2-10alkinyl, cykloalkil lub aryl; gdzie każda grupa alkilowa, alkenylowa, alkinylowa, cykloalkilowa lub arylowa jest opcjonalnie podstawiona; lub jego geometrycznym izomerem lub stereoizomerem lub jego farmaceutycznie dopuszczalną solą. 18. Związek wybrany z grupy składającej się z: 12-heksanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 5); 12-acetylo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 6); 12-propanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 7); 12-butanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy- 1-tiglien-3-onu (Związek 8); 12-[(2E,4E)-(6,6-dimetoksyheksa-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 9); 12-[(2E,4E)-6-oksoheksa-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 10);

149 EP 2986615B1

12-[(2E,4E)-6,7-dihydroksydodeka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 11); 12-[(2E)-4,5-dihydroksy-deka-2-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 12); 12-tigloilo-13-(2-metylopropanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 13); 12-[(2E)-3-metylotioprop-2-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 14); 12-(2-metyloprop-2-enoilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 15); 12-[(2E,4E)-heksa-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 16); 12-[(2E,4E)-8-oksododeka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek l7); 12-[(2Z,4E)-deka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 18); 13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- onu (Związek 19); 12-[(2E)-but-2-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 20); 12-[(2Z,4E)-deka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylopropanoilo)-6,7-epoksy- 4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 25); 12-[(2E,4E)-6,7-(anty)-epoksy-dodeka-2,4-dienoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-6,7- epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 26); 12-tigloilo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 29); 13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- onu (Związek 30); 12-acetylo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 31); 12,13-di-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- onu (Związek 32); 12-propanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20-

150 EP 2986615B1 heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 33); 12-heksanoilo-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 34); 12-tigloilo-13-(2-metylopropanoilo)-5,6-epoksy-4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 35); 12-[(2E)-3-metylotioprop-2-enoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy- 4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 36); 12-{[2-(metylosulfanylo)karbonylo]-acetoilo}-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy- 4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 39); i 12-[(2-metoksykarbonylo)-acetoilo]-13-(2-metylobutanoilo)-5,6-epoksy- 4,7,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 40); lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli. 19. Związek wybrany z grupy składającej się z: 12-tigloilo-13-butanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- onu (Związek 21); 12-(3-butenoilo)-13-nonanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 22); 12-benzoilo-13-(2-metylobutanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 23); 12,13-dibutanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 27) 12-benzoilo-13-butanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- onu (Związek 28); 12,13-di-nonoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 41); 12,13-di-heksanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 42); 12,13-di-pentanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 43); 12,13-di-tigloilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 44) 5,20-di-acetylo-12-tigloilo-13-(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 45);

151 EP 2986615B1

12,13-di-(2E,4E)-heks-2,4-enoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 46); 12-heksanoilo-13-[2-(N-metyloantraniloilo)]-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 47) 12-acetylo-13-[2-(N-metyloantraniloilo)]-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20- heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 48); 12,13-di-heptanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3-onu (Związek 49); 12-mirystoilo-13-acetylo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien-3- onu (Związek 50); 12-mirystoilo-13(2-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy- 1-tiglien-3-onu (Związek 51); 12-(2-metylobutanoilo)-13-acetylo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 52); 12-hydroksy-13-heksanoilo-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1-tiglien- 3-onu (Związek 53); i 12,13-di-(3-metylobutanoilo)-6,7-epoksy-4,5,9,12,13,20-heksahydroksy-1- tiglien-3-onu (Związek 60); lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli. 20. Farmaceutyczna kompozycja zawierająca związek według zastrzeżenia 18 lub zastrzeżenia 19 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub substancję pomocniczą.

152 EP 2986615B1

1 EP 2986615B1

2 EP 2986615B1