T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ

FERMENTE SUCUKTAN İZOLE EDİLEN BAZI LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN STARTER KÜLTÜR OLARAK KULLANIM POTANSİYELİNİN BELİRLENMESİ

Proje No: FBY-11-3515

YÜKSEK LİSANS TEZ PROJESİ SONUÇ RAPORU

Proje Yürütücüsü Prof. Dr. Hasan YETİM Gıda Mühendisliği Bölümü

Araştırmacı Yük. Lis.Öğr. Yasemin ÇELEBİ SEZER 10/2012 KAYSERİ

FERMENTE SUCUKTAN İZOLE EDİLEN BAZI LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN STARTER KÜLTÜR OLARAK KULLANIM POTANSİYELİNİN BELİRLENMESİ Yasemin ÇELEBİ SEZER

Erciyes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü

Yüksek Lisans Tezi, Ağustos 2012

Danışman: Prof. Dr. Hasan YETİM

ÖZET

Geleneksel fermente sucuklarda üretim süresince gelişen mikroflora ile ürünün kalitesi, teknolojik özellikleri ve güvenilirliği arasında kuvvetli bir ilişki bulunmaktadır. Bu nedenle geleneksel Türk tipi sucuklarda spontan olarak gelişen, sucuk kalitesi üzerinde olumlu etkileri bulunan doğal floranın starter kültür olarak kullanılma potansiyelinin belirlenmesi gerekmektedir. İşte bu çalışmada da geleneksel yöntemlerle üretilen sucuklardan izole edilen bazı bakteri kültürlerinin starter kültür olarak kullanılma potansiyeli araştırılmıştır. Araştırmada, starter kültürsüz hazırlanan kontrol grubuna ilave olarak laktik asit bakterilerinin (Lactobacillus sakei, Lb. curvatus, Lb. plantarum) ve Staphlococcus cinsi bakterilerin (S. xylosus ve S. carnosus) 9 farklı kombinasyonu oluşturularak toplam 10 farklı grup sucuk üretilmiştir. Fermantasyon süresince (0., 4., 8 ve 12. günler) sucuk örneklerinde nem, pH, su aktivitesi analizleri ile laktik asit bakteri sayımları yapılmıştır. Ayrıca sucuğun bakteriyel florasınındaki değişim fermentasyon süresince (0., 4., 8. ve 12. günler) PCR-DGGE yöntemi ile izlenmiştir. PCR-DGGE analizi sonuçlarına göre tüm sucuk örneklerinde, fermantasyonun 4. gününden itibaren şiddetli bir Lb. sakei bandı gözlenmiştir. Kontrol grubu örneklerde Brochothrix thermosphacta, Leuconostoc gasicomitatum, Carnobacterium divergens ve Lactococcus piscium bakterileri fermentasyonun ilk günlerinden itibaren gözlenmiştir. Lb. plantarum, Lb. sakei ve Lb. curvatus bakterilerine ait bantlar sucuk örneklerinde ayırt edilebilmelerine rağmen, S. carnosus ve S. xylosus bakterilerine ait bantlar ayırt edilememiştir.

Ayrıca, fermantasyon sonrası, sucuk örneklerinde bazı fiziksel, kimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal analizler ile uçucu bileşiklerin analizi yapılmıştır. Üretilen sucuklarda olgunlaşmanın son gününde pH değerleri; 4.96-5.45, aw değerleri; 0.89-0.92, kuru madde değerleri; %58.08-59.48 ve titrasyon asitliği değerleri; %1.25-1.80 aralıklarında bulunurken, ortalama LAB sayısının 8.65 log kob/g, TMAB sayısının 8.83 log kob/g, Enterobacteriaceae sayısının 3.70 log kob/g ve maya-küf sayısının ise 4.5 log kob/g civarında olduğu tespit edilmiştir. Duyusal açıdan en çok Lb. curvatus+Lb. sakei bakteri kültürlerini içeren (CS) sucuk grubu örnekleri beğenilmiştir. Üretilen tüm sucuklarda uçucu bileşik fraksiyonun önemli bir kısmını, baharat kaynaklı terpenlerin oluşturduğu tespit edilmiştir. Elde edilen bulgulara göre, ilave edilen bakteri kültürlerinin sucukların kalite ve teknolojik özellikleri üzerine istatiksel olarak önemli bir etkisi gözlenememiş konuyla ilgili daha çok sayıda ve daha detaylı araştırmaların yapılması gerektiği sonucuna varılmıştır.

Anahtar Kelimeler: Türk tipi sucuk, yerel flora, doğal starter kültür, moleküler teknikler

DETERMINATION OF STARTER CULTURE POTENTIAL OF SOME LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM TURKISH SUCUK Yasemin ÇELEBİ SEZER

Erciyes University, Graduate School of Natural and Applied Sciences

M. Sc. Thesis, August 2012

Supervisor: Prof. Dr. Hasan YETİM

ABSTRACT

In general, there is a strong relationship between the growing microflora during the Turkish sucuk production and the quality, technological characteristics and safety of the product. Hence, the determination of potantial use of natural flora as a starter culture is important since they grow spontaneously and have positive effects on quality of the sucuks. In this research, the potantial use of bacterial cultures used as starter culture and obtained from the Turkish sucuks produced by traditional methods was investigated. In research, ten different groups of sucuk were produced, thereby creating nine different combination of lactic acid bacterias (Lactobacillus sakei, Lb. curvatus, Lb. plantarum) and Staphlococcus type bacteria (S. xylosus ve S. carnosus) beside a control group produced without starter culture. Sample groups were fermented in a special cabin (15- 24 ºC, %75-95 relative humidity) for 12 days. Percent (%) moisture, pH, water activity and lactic acid bacteria count determined in the sucuk samples during the fermentation (0., 4., 8. and 12. days). PCR-DGGE analysis was also performed in order to determine the bacterial flora of sucuk during the fermentation. After the fermentation, some physical, chemical, microbiological, sensory and volatile compound analysis were conducted in sucuk samples. At the last day of fermentation in sucuk samples, pH values were between 4.96-5.45, water activity values were between 0.89-0.92, dry matter values were between 58.08-59.48%, titration acidity values between 1.25-1.80% and the number of average LAB was 8.65 log cfu/g, TMAB was 8.83 log cfu/g, number of Enterobacteriaceae was 3.70 log cfu/g and number of yeast and mold was 4.5 log cfu/g. From the sensory points of view, the most favoured sample group amoung the sucuks was Lb. curvatus+Lb. sakei bacterial cultures (CS) containing samples. In all samples, the terpenes originated from the spices were the important portion of volatile compound fraction. In terms of PCR-DGGE analysis results, in all sucuk samples, several Lb. sakei band was observed. At the beginning of fermentation in control group, Leuconostoc mesenteroides, Carnobacterium divergens, Brochothrix thermosphacta, Leuconostoc gasicomitatum bacteria were observed. Although Lb. plantarum, Lb. sakei and Lb. curvatus bacteria bands were distinguished in the all sucuk samples, S. carnosus and S. xylosus bacteria bands could not. In terms of the data obtained, added bacterial culture in the production of fermented sucuk did not have statiscally significant effect on the quality and technological characteristics of the sucuk samples. In conclusion, it might be suggested that more detailed research should be conducted on the quality of sucuk produced with added starter culture or isolated bacterial cultures.

Keywords: Turkish sucuk, house flora, indigenous starters, molecular techniques

KISALTMA ve SİMGELER

Sembol Anlamı LAB Lactic acid Bacteria; Laktik Asit Bakterisi TMAB Toplam Mezofilik Aerobik Bakteri MRS De Man Rogosa and Sharpe Agar PCA Plate Count Agar VRB Violet Red Bile Agar DRBC Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar Kob Koloni Oluşturan Birim KM Kuru madde aw Water activity; Su Aktivitesi TBA Tiyobarbütirik Asit ABS Absorbans SFS Serum Fizyolojik Su A Adenin T Timin G Guanin C Sitozin g Gram V Volt vb. ve benzeri MS Mass spectrometry; Kütle spektrometrisi SPME Solid Phase Microexraction; Katı faz mikroekstraksiyon μmol Mikromol

TABLOLAR LİSTESİ

Tablo 2.1. Sucuk üretiminde kullanılan bakteri kültürlerinin kombinasyonları ...... 20 Tablo 2.2. Fermente sucukların olgunlaştırma koşulları ...... 21 Tablo 2.3. V1 ve V3 bölgesinin amplifikasyonu için kullanılan primerlerin baz dizilimi ...... 26 Tablo 3. 1. Fermentasyon süresince sucuk örneklerine ait LAB sayısının değişimi (log kob/g) 34 Tablo 3. 2. Sucuk örneklerine ait mikrobiyolojik sayım sonuçları (log kob/g) ...... 34 Tablo 3. 3. Sucuk örneklerinin fermentasyon süresince fizikokimyasal analiz sonuçları ...... 40 Tablo 3. 4. Sucuk örneklerine ait fermentasyon sonundaki fizikokimyasal analiz sonuçları ..... 43 Tablo 3. 5. Sucuk örneklerine ait renk ölçüm değerleri ...... 43 Tablo 3. 6. Çiğ Sucuk Örneklerine Ait Duyusal Analiz Sonuçları ...... 47 Tablo 3. 7. Pişmiş Sucuk Örneklerine Ait Duyusal Analiz Sonuçları ...... 47 Tablo 3. 8. Kontrol grubu ile bakteri kültürü ilave edilen sucuklarda olgunlaşma süresince belirlenen uçucu bileşiklerin alanlarına ait ortalamalar ...... 55

ŞEKİLLER LİSTESİ

Şekil 2. 1. Araştırmada hazırlanan sucuk üretim aşamaları ...... 22 Şekil 3.1. Sucuk örneklerinin LAB sayılarının fermentasyon süresince değişimi ...... 32 Şekil 3. 2. Sucuk Örneklerinin Fermentasyon Süresince pH Değerlerinin Değişimi ...... 36 Şekil 3.3. Sucuk öneklerinin fermentasyon süresince su aktivitesi değerlerinin değişimi..... 37 Şekil 3.4.Sucuk örneklerinin fermentasyon süresince kuru madde değerlerinin değişimi .... 39 Şekil 3.5. Laboratuarda üretilen çiğ ve pişirilmiş sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda kesit yüzey rengi değerlerinin örnekler arasındaki değişimi ...... 45 Şekil 3.6. Laboratuarda üretilen çiğ ve pişirilmiş sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda dış yüzey rengi değerlerinin örnekler arasındaki değişimi ...... 46 Şekil 3.7. Laboratuarda üretilen çiğ sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda kesit yüzey görünüş değerlerinin örnekler arasındaki değişimi ...... 48 Şekil 3.8. Laboratuarda üretilen çiğ sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda kabuk oluşum değerlerinin örnekler arasındaki değişimi ...... 49 Şekil 3.9. Laboratuarda üretilen çiğ ve pişirilmiş sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda tekstür değerlerinin örnekler arasındaki değişimi ...... 50 Şekil 3.10. Laboratuarda üretilen çiğ ve pişirilmiş sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda tat- aroma değerlerinin örnekler arasındaki değişimi ...... 51 Şekil 3.11. Laboratuarda üretilen çiğ ve pişirilmiş sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda genel beğeni değerlerinin örnekler arasındaki değişimi ...... 52 Şekil 3.12. Kontrol grubu sucuk örneğinin V1 bölgesine göre PCR-DGGE analizi sonucu tanımlanan bakterilere ait bantlar ...... 58 Şekil 3.13. Sucuk örneklerinin V1 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi ...... 59 Şekil 3.14. Sucuk örneklerinin V1 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi ...... 59 Şekil 3.15. Sucuk örneklerinin V1 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi ...... 60 Şekil 3.16. Kontrol grubu sucuk örneğininV3 bölgesine göre PCR-DGGE analizi sonucu tanımlanan bakterilere ait bantlar ...... 61 Şekil 3.17. Sucuk örneklerinin V3 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi ...... 62 Şekil 3.18. Sucuk örneklerinin V3 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi...... 63 Şekil 3.19. Sucuk örneklerinin V3 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi ...... 64

İÇİNDEKİLER

FERMENTE SUCUKTAN İZOLE EDİLEN BAZI LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN STARTER KÜLTÜR OLARAK KULLANIM POTANSİYELİNİN BELİRLENMESİ

BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK SAYFASI ...... i YÖNERGEYE UYGUNLUK SAYFASI ...... ii KABUL VE ONAY SAYFASI ...... iii TEŞEKKÜR ...... iv ÖZET...... v ABSTRACT ...... vii KISALTMA ve SİMGELER ...... ix TABLOLAR LİSTESİ ...... x ŞEKİLLER LİSTESİ ...... xi İÇİNDEKİLER ...... xii

GİRİŞ ...... 1

1. BÖLÜM GENEL BİLGİLER

1.1. Sucuk ve Özellikleri ...... 5 1.2. Sucuk Mikroflorası ...... 6 1.3. Sucuklarda Starter Kültür Kullanımı ...... 7 1.4. Et ve et ürünlerinde kullanılan starter kültürler; ...... 8 1.5. Sucukların Mikroflorasının Belirlenmesi ...... 12 1.6. Sucuklarda Uçucu Bileşikler ...... 15

2. BÖLÜM MATERYAL VE YÖNTEM

2.1. Materyal ...... 18 2.1.1. Hammadde ve katkı maddeleri ...... 18 2.1.2. Sucuk üretimi ...... 19 2.2. Yöntem ...... 21 ...... 21 2.2.1. Mikrobiyolojik analizler...... 21 2.2.2. Fizikokimyasal analizler...... 23 2.2.3. Duyusal analizler...... 24 2. 2. 4. Uçucu Bileşiklerin Analizi ...... 25 2.2.5. Sucuk Örneklerinin Bakteriyel Florasının Fermentasyon Süresince Belirlenmesi ...... 25 2.2.6. İstatistiksel analiz ...... 30

3. BÖLÜM BULGULAR

3.1. Mikrobiyolojik Analizlere Ait Bulgular ...... 31 3. 1. 1. Laktik asit Bakterilerinin (LAB) Sayısı ...... 31 3. 1. 2. Toplam Mezofilik Aerobik Bakteri (TMAB) Sayısı ...... 32 3. 1. 3. Toplam Enterobacteriaceae Sayısı ...... 33 3. 1. 4. Maya Küf Sayısı ...... 33 3.2. Fizikokimyasal Analizlere Ait Bulgular ...... 35 3. 2. 1. pH Değeri ...... 35

3. 2. 2. Su Aktivitesi(aw) değeri ...... 36 3. 2. 3. Kurumadde miktarı ...... 38 3. 2. 4. Titrasyon Asitliği değeri ...... 41 3. 2. 5. Kalıntı nitrit miktarı ...... 41 3. 2. 6. Renk değerleri ...... 42 3. 2. 7. Duyusal analizlere ait bulgular ...... 44 3. 2. 8. Uçucu Bileşikler ...... 52 3. 2. 9. Sucuk Örneklerinin PCR-DGGE Analiz Sonuçları ...... 57

4. BÖLÜM TARTIŞMA, SONUÇ ve ÖNERİLER

4.1. Laboratuvarda Üretilen Sucuk Örnekleri ...... 64 4.1.1. Mikrobiyolojik analizlere ait bulgular ...... 64 4.1.1.1.Laktik asit Bakterilerinin (LAB) Sayısı ...... 64 4.1.2. Fizikokimyasal analizlere ait bulgular ...... 67 4. 1. 3. Duyusal analizlere ait bulgular ...... 72 4. 1. 4. Uçucu Bileşikler ...... 75 4. 1. 5. Sucuk Örneklerinin PCR-DGGE Analiz Bulguları ...... 79 4.2. Araştırma Sonucunda Elde Edilen Bazı Önemli Bulgular ...... 80 4.3. Araştırma Sonucunda Yapılabilecek Öneriler ...... 84 KAYNAKLAR…………………………………………...…………………………93 EKLER ...... 96 Sucuk duyusal panel formu ...... 96

ÖZGEÇMİŞ ...... 98

GİRİŞ

İnsanların beslenmesinde et ve et ürünleri, mineral maddeleri, vitaminleri ve özellikle esansiyel aminoasitleri ve yağ asitlerini yapısında bulundurması sebebiyle önemli bir yere sahiptir. Et ürünleri içerisinde yaygın olarak sevilerek tüketilen sucuk geleneksel olarak üretilen fermente bir üründür. Sucuk, kırmızı et ve hayvansal yağlardan oluşmuş, şekil olarak halka, parmak veya at nalına benzer bir yapıda ve doğal yollarla kurutulmak süretiyle fermente edilen bir et ürünüdür. Zaman içerisinde sucuk üretiminde koyun, keçi, manda ve diğer hayvan etleri ile birlikte sarımsak, şeker, nitrat, nitrit, bitkisel yağ ve farklı baharatlar ile kullanıla gelmiştir [1].

Ülkemizde üretilen et ürünlerinin en eskilerinden birisi olan sucuk, işleme teknolojisi açısından Avrupa ve Amerika’da üretilen fermente kuru salam ve sosislere benzemekle birlikte tamamen Türklere özgü bir et ürünüdür [2]. Bununla birlikte sucuk, Orta Asya, Orta doğu, Kafkaslar, Balkanlar, Güneydoğu Avrupa ve Kuzey Afrika’da bilinen uluslararası bir et ürünü haline gelmiştir. Sucuk, karakteristik aroması ve lezzeti nedeniyle tüketiciler tarafından beğeniyle tüketilmekte olup et sektöründe büyük bir pazar hacmi oluşturmaktadır [3]. Ayrıca, sucuğun kalitesinin yükseltilmesi ve spontan floradan kaynaklanabilecek risklerin en aza indirilmesi için kontrollü fermentasyon şartları uygulanmasına ve starter kültür kullanımına gerek duyulmaktadır [4].

Fermente sucuklarda aroma, renk, lezzet ve kıvamın oluşumu çeşitli mikroorganizmaların fermentleriyle oluşturdukları biyokimyasal reaksiyonlar sonucu oluşmaktadır. Biyokimyasal reaksiyonların gelişebilmesi için arzu edilen bir mikrofloranın varlığı gerekmektedir. Bu amaçla yapılan çalışmalarda sucuğun olgunlaşması ve fermentasyonunda laktik asit bakterilerinin ve katalaz pozitif kokların teknolojik olarak önemli iki temel grup olduğu belirtilmiştir. Et teknolojisinde starter kültür olarak kullanılan laktik asit bakterileri Lactobacillus plantarum, Lb. curvatus, Lb. pentosus, Lb. sakei, Pediococcus pentosaceus, P. acidilactici bakterileridir. 2

Katalaz pozitif koklar ise Staphylococcus carnosus, S. xylosus’dır. Küflerden Penicillum nalgiovense ve mayalardan ise Debaryomyces hansenii yaygın olarak kullanılmaktadır [5].

Fermente et ürünlerinde de lezzet ve aroma bileşenlerinin analiz edilmesi önemlidir. Fermente kuru sosislerde; uygulanan reçeteye, starter kültürlere ve olgunlaştırma koşullarına bağlı olarak değişen çok sayıda uçucu bileşik oluşmaktadır. Uçucu bileşiklerin oluşumunda proteolitik, lipolitik ve enzimatik reaksiyonlar ile lipit oksidasyonu, aminoasit degradasyonu gibi kimyasal reaksiyonlar önemli rol oynamaktadır. Uçucu bileşik olarak bu tip et ürünlerinde hidrokarbonlar, aldehitler, asitler, ketonlar, alkoller, esterler ve sülfürlü bileşikler yaygın olarak bulunmaktadır. Yapılan araştırmalarda fermente sucuk üretiminde kullanılan özellikle katalaz pozitif koklar ile laktik asit bakterilerinin uçucu bileşikler üzerinde önemli etkilerinin olduğu görülmüştür [6, 7]. Özellikle katalaz pozitif koklar karakteristik tat, aroma gelişiminde etkili proteolisiz, lipolisiz ve renk stabilitesi gibi istenilen reaksiyonlarda rol almaktadırlar [8, 9, 10].

Sucukta spontan olarak gelişen bakteriler, üretim prosesine ve formülasyonuna iyi adapte olamamış, ticari starterlerin aksine daha kolay adapte olabilen metabolik aktivitesi daha yüksek ve patojen bakterilerle daha iyi rekabet eden bakterilerdir. Bu yüzden sucuk üretiminde starter kültür olarak doğal floranın kullanılması önem arz etmektedir [11].

Ülkemizde sucuk üretiminde ürün kalitesinin artırılması ve korunması amacıyla starter kültür kullanımı tavsiye edilmekte ve giderek yaygınlaşmaktadır. Ancak starter kültür üretilmediğinden sucuk üretiminde batı ülkelerinde değişik fermente et ürünlerinin üretiminde kullanılan starter kültürler kullanmaktadırlar. Dolayısıyla bu kültürlerden hangilerinin Türk sucuğuna uygun olduğu belli değildir ve kullanımı daha çok yabancı ülkelerdeki starter kültür üreten firmaların önerileri doğrultusunda olmaktadır. Bu nedenle, ürünler ne kadar hijyenik, kaliteli ve standart olursa olsun, tat-aroma özellikleri açısından Türk sucuğu özelliklerine uymayan ürün üretimine neden olacağı bildirilmektedir [12]. Oysa son yıllarda kendine özgü duyusal özellikler taşıyan geleneksel fermente sosislere olan tüketici talebi giderek artmakta ve dünyada bu konuda yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Geleneksel ürünler ile endüstriyel ürünler 3

arasında belirgin farklılıklar olup bu durum genellikle ürüne ilave edilen ticari starter kültürler ile doğal olarak ürüne kontamine olan florada bulunan fermentatif bakterilerin farklı olmasından kaynaklanmaktadır. Geleneksel ürünlerdeki yerel flora ürüne daha iyi adapte olduğundan daha yüksek metabolik aktivite gösterdiği dolayısıyla daha kaliteli fermente sosis üretiminin mümkün olduğu bildirilmektedir [11]. Bu nedenle son yıllarda geleneksel fermente et ürünlerine özgü nitelikler kazandıran mikroorganizmaların tanımlanması ve starter kültür olarak kullanım potansiyellerinin belirlenmesi amacıyla yapılan çok sayıda çalışma bulunmaktadır [6, 13, 14].

Son yıllarda geleneksel fermente ürünlere özgü nitelikler kazandıran mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla PCR’a (Polimeraz zincir reaksiyon) dayalı yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu amaçla yapılan çalışmalar özellikle canlı fakat kültüre alınamayan floranın belirlenmesine imkan sağladığı için kültürel olmayan yöntemler daha çok tercih edilmektedir. Kültürel olmayan yöntemlerden özellikle PCR- DGGE yönteminin, birçok fermente üründe laktik mikrofloranın belirlenmesi ve fermentasyon süresince izlenmesi amacıyla son yıllarda yaygın olarak kullanıldığı bilinmektedir [13, 15]. PCR tabanlı bu teknik, amplifiye edilmiş DNA parçalarından oluşmuş karışımın, denatüre edici bileşenler içeren poliakrilamit jel içinde ayrılmasını sağlamaktadır [13, 16].

İşte bu nedenlerle geleneksel et ürünümüz olan sucukta spontan olarak gelişen fermentatif bakterilerin starter kültür olarak kullanılabilme potansiyelinin belirlenmesi gerekmektedir. Bu amaçla yapılan çalışmada ülkemizde geleneksel yöntemle starter kültür kullanılmadan üretilen sucuklardan izole edilen bazı bakteri türlerinin (Lb. sakei, Lb. curvatus, Lb. plantarum) sucuğun bazı kalite ve teknolojik özellikleri üzerine etkileri belirlenmiştir. Diğer taraftan fermentasyon süresince doğal mikroflora ile rekabet ettiği bilinen starter kültürlerin ortamda gelişerek faaliyetlerine devam edip etmediği bilinmemektedir. Sucuklarda gözlenen olumlu veya olumsuz değişiklikler net bir şekilde mikrobiyal flora ile ilişkilendirilemediği için sucuğun kalite parametreleri ile ortamdaki mikrobiyal değişimin birlikte takip edilmesi gerekmektedir. Bu amaçla yapılan çalışmalarda özellikle PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) tekniği öne çıkmaktadır. Dolayısıyla yapılan bu araştırmada üretilen sucukların bir taraftan bazı kalite ve teknolojik özellikleri analiz edilirken diğer taraftan fermentasyon süresince bakteriyel profillerindeki değişim de PCR-DGGE yöntemiyle izlenmiştir. 4

Böylece bakteriyel profil ile bazı kalite parametreleri arasındaki ilişki belirlenmeye çalışılmıştır.

Sonuç olarak; yapılan bu çalışmada Türk sucuğuna özgü geleneksel özelliklerin korunduğu, duyusal ve mikrobiyolojik kalitesi yüksek, teknolojik yönden daha güçlü starter kültür kombinasyonlarının belirlenmesi ve bu starter kültürlerin kullanıldığı üretim proseslerinin standardize edilerek endüstriyel fermentasyonlara aktarılması hedeflenmiştir.

1. BÖLÜM

GENEL BİLGİLER

1.1. Sucuk ve Özellikleri

Sucuk, kuter veya kıyma makinesinde kıyılarak hamur haline getirilen et ve yağın, üzerine tuz, şeker, çeşitli baharatlar ve az miktarda diğer katkı maddeleri ilave edilerek, doğal veya yapay kılıflara doldurulduktan sonra uygun bir sıcaklık derecesi, nisbi nem, ve hava akımında belirli bir süre olgunlaştırılması ile elde edilen fermente bir et ürünüdür [2, 17]. TSE 1070’de ise “resmi veya özel kombina veya mezbahalarda kesilen, sağlıklı kasaplık büyükbaş hayvan gövde etleri ve/veya manda etlerinden hazırlanan sucuk hamurunun, doğal veya yapay kılıflara doldurulması ve bir süre bekletilerek olgunlaştırılmasıyla elde edilen et ürünü” olarak tanımlanmaktadır [17].

Sucuk, işleme teknolojisi açısından Avrupa ve Amerika'da üretilen fermente kuru salam ve sosislere benzemekle birlikte Türk'lere özgü bir et ürünüdür [2]. Üretimde genelde sığır, koyun, manda ve kanatlı hayvan etleri de kullanılabilmektedir [18]. Sucuk üretiminde et/yağ karışımına diğer ürün bileşenleri ilave edildikten sonra homojenliği sağlamak amacıyla uygun bir şekilde karıştırma işlemi yapılır. Karıştırma esnasında tuz ve diğer maddelerin düzgün bir şekilde dağılması ve yayılmasına dikkat edilmelidir. Hamur haline getirilen karışım, yoğurma makinasına aktarılır. Hazırlanan karışım daha sonra doğal kılıflar veya benzer çaptaki yapay kılıflara dolum makinası kullanılarak doldurulur [2].

Sucuk üretiminde kılıf olarak doğal ve suni (fibroz kollajen özellikte) kılıflar kullanılabilir. Dolum basınçla yapılmalı, kesinlikle gevşek olmamalı ve hava boşluğu bırakılmamalıdır. Eğer üründe hava boşluğu bırakılırsa, oluşan boşluklarda mikrobiyal 6

üreme olabilir ve sonuçta ekşime, kokuşma, rengin bozulması gibi sorunlar ortaya çıkabilir. Gevşek dolumda ise iç kısım kurur ve dış kısımda boşluklar oluşarak yapı bozulur [2].

Fermentasyon sucuk üretiminde en kritik ve en önemli aşamalardan biridir. Fermentasyon aşamasında düşen pH değeri ile su kaybı ve kuruma hızlanır, arzu edilen tekstür, tat, aroma ve renk oluşur, mikrobiyal bozulma önlenir [19].

Sucuk üretiminde fermentasyon aşaması etin yapısında doğal olarak bulunan ve üretim ortamında doğal olarak bulunan floranın gelişmesiyle gerçekleşmesinin yanında starter kültür kullanılarak da gerçekleşmektedir. Bu yöntemlere ilave olarak bazen işletme tarafından geliştirilen başarılı bir ürün maya olarak kullanılarak da fermentasyon gerçekleştirilebilir [20].

Fermente et ürünlerinde lezzet, fermentasyon aşamasında gerçekleşen mikroorganizma faaliyetleri sonucu oluşmaktadır [21]. Sucuk üretiminde fermentasyon teknolojisi ile son ürünün farklı bir tekstür ve lezzet kazanması nedeniyle, fermente sosisler diğer sosis tiplerinden farklılık göstermektedirler [22, 23].

1.2. Sucuk Mikroflorası

Sucuk hamurunun başlangıçtaki mikroorganizma yükü genellikle 105-107 kob/g olmaktadır [24]. Üründe istenen renk değişimini sağlamak, arzu edilen aromayı kazandırmak, pH seviyesini düşürmek, sucuğu bozan ve istenmeyen bakterilerin üremelerini önlemek gibi faaliyetler, sucuklardaki yararlı mikroorganizmalar olarak görülen laktik asit bakterileri ile katalaz pozitif kokların gelişmeleri sonucu oluşmaktadır [25].

Genellikle 25°C’nin altında olgunlaştırılan sucuklarda, Lb. sakei ve Lb. curvatus baskın florayı oluştururken, olgunlaşma sıcaklığı 25 °C’nin üzerinde olanlarda Lb. plantarum’un yoğun olarak bulunduğu belirtilmiştir [24].

Yapılan bir çalışmada, sucuklarda tanımlanan laktobasil suşlarından 131 tanesinin Lb. sakei, 51 tanesinin Lb. curvatus, 7 tanesinin Lb. plantarum olduğu bildirilmiştir [26]. Yapılan diğer bir araştırmada ise, 51 adet sucuk örneği üzerinde çalışılmış ve doğal 7

mikroflorada Lb. plantarum, Lb. curvatus, Lb. pentosus, Lb. rhamnosus, Lb. delbrueckii, Pediococcus acidilactici ve P. pentosaceus bakterileri bulunduğu tespit edilmiştir [27].

Rantsiou et al. [28] tarafından Yunanistan, Macaristan ve İtalya’da üretilen doğal fermente sosislerde gelişen Lactobacillus türlerinin tanımlanması amacıyla yapılan bir araştırmada, fermentasyon aşamasında izole edilen toplam 358 suş 16S rRNA dizi analizi ile tanımlanmıştır. Yunan sosislerinde izolatların %48.2’sinin Lb. curvatus, Macar sosislerinde %70.8’sinin Lb. sakei, İtalyan sosislerinde ise % 48.8’nin Lb. sakei ve %29.8’sinin de Lb. curvatus olduğu belirlenmiştir.

Aymerich et al. [5] tarafından Arjantin’de üretilen fermente sosislerde (fuet ve chorizo) gelişen laktik asit bakterileri ve Gram pozitif katalaz pozitif koklar PCR metodu ile tanımlanmıştır. Tüm sosis tiplerinde Lb. sakei ve S. xylosus’un dominant tür olduğu, Lb. curvatus, Lb. plantarum, S. epidermidis ve S. carnosus’un ise ürüne göre değişiklik gösterdiği tespit edilmiştir.

Özdemir [20] sucuk florasındaki dominant laktobasillus türlerinin, sucukların organoleptik nitelikleri ile ilişkisini belirlemek amacıyla yürüttüğü araştırmada, izole edilen 252 suşun %82.1’ini Lb. sakei, %7.9’u Lb. curvatus ve %2.8’ini Lb. plantarum olarak identifiye etmiştir.

1.3. Sucuklarda Starter Kültür Kullanımı

Fermente, kuru, yarı kuru et ürünleri üretiminde, gelişmiş ülkelerin çoğunda; starter kültürler kullanılmaktadır [30]. Geleneksel sucukların kendine özgü lezzeti, fermentasyon süresince ortamda doğal olarak bulunan mikrofloranın veya ilave edilen starter kültürlerin enzimatik aktivitesi sonucu oluşan bileşiklerden ve katkı maddelerinden kaynaklanmaktadır [31].

Türkiye’de, birçok işletmede starter kültür kullanılmadan sucuk üretimi yapılmaktadır. Bu durumun, olgunlaşma sürecini olumsuz yönde etkilediği dolayısıyla arzu edilen sucuk tat ve aromasının elde edilemediği bildirilmiştir [12]. Birçok araştırmacı tarafından kaliteli ve güvenilir sucuk üretebilmek için starter kültür kullanılması gerektiği düşünülmektedir [32]. 8

Fermente sosis üretiminde starter kültürler; güvenli gıda üretimini sağlamak, bozulmaya neden olan mikroorganizmaları inhibe etmek ve arzu edilmeyen değişimleri engellemek, istenen tekstür ve renge sahip, sağlıklı ürün üretimini sağlamak amacıyla kullanılmaktadır [33]. Sucuk üretiminde kullanılan starter kültürler ürünün pH’sını düşürerek bir taraftan patojen mikroorganizmaların gelişimini önlerken, diğer taraftan sucuk hamurunun su tutma kapasitesini düşürerek ürünün kuruma süresini hızlandırmaktadır [34, 35].

Genel olarak fermente gıdaların üretiminde kullanılan starter kültürlerde aranan ortak özellikler şunlardır [36];

Mikrobiyal Güvenlik: -Patojenik ve toksik etkiye sahip olmamalıdır, -Tehlikeli enfeksiyonlara neden olmamalıdır.

Teknolojik etkinlik: -Spontan mikrofloradan baskın olmalıdır, -İstenilen metabolik aktiviteye sahip olmalıdır, -Ürünün kalitesine olumsuz yönde etkileri olmamalıdır.

Kullanım kolaylığı: -Kolay çoğalabilir olmalıdır, -Donmuş veya donmuş-kurutulmuş olarak muhafaza edilebilir olmalıdır, -Belirtilen koşullarda uzun süreli depolamada önemli özellikleri stabil kalmalıdır, -Temin edilmesi ve taşınması kolay olmalıdır.

1.4. Et ve Et ürünlerinde Kullanılan Starter Kültürler;

1-Laktik Asit Bakterileri (LAB): Laktik asit bakterileri, düzgün veya kıvrımlı uzun çubuk şeklinde, spor oluşturmayan, Gram (+) ve katalaz (-) bakterilerdir. Genellikle hareketsiz, çoğu mikroaerofilik, anaerobik veya fakültatif anaerobik bakterilerdir. Çoğunlukla mezofiliktirler. Büyük bir kısmı pH 4.0-4.5’da iyi gelişim gösterirler [37]. Sucuk ve benzeri et ürünlerinde yaygın olarak kullanılan laktik asit bakterileri arasında Lb. plantarum, Lb. sakei, Lb. curvatus, Lb. pentosus, P. acidilactici ve P. pentosaceus 9

bulunmaktadır [2]. Starter kültür olarak laktik asit bakterileri (LAB) kullanılıyorsa, uygulanacak olgunlaştırma sıcaklığına göre mikroorganizma türleri de farklılık göstermektedir. Örneğin, 30-35°C’de olgunlaştırılan sucuklarda P. pentosaceus, P. acidilactici ve Lb. plantarum; 18-22°C sıcaklık aralığında olgunlaştırılan sucuklarda ise Lb. sakei ve Lb. curvatus kullanılması tavsiye edilmektedir [38].

Laktik asit bakterilerinin fermentasyonda kullanımı ile üretim etkin ve başarılı bir şekilde gerçekleştirilmektedir [39]. Laktik asit bakterileri, şekerleri metabolize etmelerine göre homofermentatif ve heterofermentatif olarak iki gruba ayrılırlar [40]. Üretimde genelde homofermantatif laktik asit bakterileri tercih edilmesine rağmen ticari üretimde kullanılan laktobasiller fakültatif heterofermantatif grupta bulunmaktadır. Fermente sosis üretiminde starter kültür olarak kullanılan laktobasiller; Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. sakei, Lb. acidophilus, Lb. alimentarus, Lb. casei, ve Lb. lactis’tir. Bu amaçla en çok tercih edilenler ise, Lb. plantarum, Lb. sakei ve Lb. curvatus türleridir [41]. Diğer bir laktik asit bakteri grubundan olan pediokokların, fermente sosis üretiminde kullanılmasının nedeni ise, homofermantatif olarak laktat üretmeleridir. Ancak keskin tat oluşumu üzerine laktobasillere göre ürüne daha az etki ederler [42].

2-Mikrokoklar: Micrococcus ve Staphylococcus cinsi bakteriler Gram (+), aerobik veya fakültatif anaerobik olup hareketsizdirler. Sucuk üretiminde yaygın olarak kullanılan Micrococcaceae familyasına ait türler; Staphylococcus carnosus, S. xylosus, Micrococcus varians ve M. auranticus’tur. Belirtilen türlerin hepsi % 10 NaCI içeren besiyerinde gelişmekte, katalaz oluşturmakta, nitratı indirgemektedir. M. varians özellikle oksijene ihtiyaç duymakta ve dolayısıyla sucuk hamurunda S. carnosus’a göre daha az rekabet gücüne sahip olmaktadır. Starter kültür olarak kullanılan mikrokoklar ve stafilokoklar olgunlaşma sırasında çok az çoğalmakta veya hiç çoğalmamaktadır. Ancak metabolik aktivite gösterebilmektedir. Bazı araştırıcılar Micrococcaceae familyası üyeleri ile olgunlaşmada arzu edilen etkinin sağlandığını belirtmişlerdir. Bu familyaya ait bakterilerin, ürün üzerine olan etkisinin arttırılması için yüksek konsantrasyonlarda (106-107) ilave edilmesi gerektiği bildirilmektedir [37].

3-Mayalar: Fermente sosislerde starter kültür olarak kullanılan en yaygın maya Debaryomyces hansenii’dir. Aerobik veya fakültatif anaerobik olan bu maya tuz ve 10

nitrata karşı toleranslıdır. D. hansenii, yüzeyde ya da sucuğun dışına yakın kısımlarında gelişebilir [37].

4-Küfler: Yaygın olarak kullanılan küfler arasında P.nalgiovense, P. chrysogenum ve P. camemberti bulunmaktadır [37]. Küf sporu içeren sıvıya, ürünün daldırılması şeklinde inokülasyon işlemi gerçekleştirilebildiği gibi küf sporları ürün yüzeyine püskürtülerek de inokülasyon işlemi yapılabilmektedir [2].

Fermente sosislerde starter kültür kullanımıyla ilgili olarak çok sayıda araştırma yapılmıştır. Bunlardan bazıları aşağıda özetlenmiştir:

Cantoni et al. [43] lipidlerin parçalanmasından sorumlu mikrokokların sucukların olgunlaşması sırasında ürün aromasını etkileyen mikroorganizmalar olduklarını belirtmişlerdir.

Uğur [24] sucuklarda mikrokokların; renk gelişiminde, aromanın oluşumunda ve olgunlaşmanın hızlanmasında etkili bir starter kültür olarak kullanılabileceğini bildirmiştir.

Yapılan bir çalışmada, çabuk olgunlaştırılan sucuklarda; S. carnosus + Lb. plantarum, S. carnosus + P. acidilactici, S. carnosus + Lb. plantarum+ P. pentosaceus kültürleri önerilirken; açık havada (doğal koşullarda) kurutulan sucuklarda ise, S. carnosus + Lb. plantarum+ P. acidilactici, Lb. plantarum+ S. carnosus + P. pentosaceus'un değişik oranlardaki kombinasyonları starter kültür olarak önerilmiştir [44].

Gönülalan vd. [25] fermente sucuk üretiminde çeşitli starter kültür kombinasyonlarının (S. xylosus DD-34 + P. pentosaceus PC-1, Lb. plantarum L74 + S. carnosus MIII, S. carnosus MIII + Lb. pentosus LP-1, S. xylosus DD-34 + P. pentosaceus PCFF-1, P. acidilactici PA-2, S. carnosus MC-1 + P. pentosaceus PC-1, S. xylosus DD-34 + Lb. alimentarus BJ-33) kullanımının, sucuğun kalite özellikleri üzerinde olumlu etkilerinin olduğunu belirlemişlerdir.

Dalmış ve Soyer [26] yaptıkları bir çalışmada starter kültür kullanmadan geleneksel yöntemle ve P. pentosaceus ile S. xylosus starterlerini kullanarak ürettikleri sucukları 11

karşılaştırmışlardır. Sonuçta starter kültür ilaveli grupta pH ve nem içeriğinin daha düşük olduğunu belirlemişlerdir.

Diğer taraftan, Ceylan and Fung [45], yaptıkları çalışmada sucuk üretiminde kullanılan Lb. sakei ve P. acidilactici starter kültür kombinasyonunun, sucuğa inokule edilen Yersinia enterocolitica’yı tamamen inhibe ettiği sonucuna varmışlardır.

Kaban ve Kaya [46] ise sucuk üretiminde kullandıkları starter kültür kombinasyonlarının (P. acidilactici + Lb. curvatus + S. xylosus, Lb. sakei + S. carnosus) ve Enterobacteriaceae sayılarında azalmaya neden olduklarını belirtmişlerdir.

Diğer taraftan et ve et ürünlerinde starter kültür kullanımının biyojen aminlerin oluşumunu azalttığı bildirilmiştir [47]. Yapılan bir çalışmada, doğal koşullarda fermentasyon sonucu oluşan biyojen amin miktarlarının, starter kültürlerle gerçekleşen fermentasyonda oluşan miktarlardan çok daha fazla olduğu bildirilmiştir. Starter kültürden Lb. sakei, S. carnosus ve S. xylosus bakterileri ilave edilerek yapılan sucuklarda, kontrol grubuna göre biyojen amin miktarının %80-90 oranında azaldığı saptanmıştır [48].

Sucukta Spontan Olarak Gelişen Fermentatif Bakterilerin Starter Kültür Olarak Kullanılması

Son yıllarda kendine özgü duyusal özellikler taşıyan geleneksel fermente sosislere olan tüketici talebi giderek artmakta ve dünyada bu konuda yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Geleneksel ürünler ile endüstriyel ürünler arasında belirgin farklılıklar olup bu durum özellikle ürüne ilave edilen ticari starter kültürler ile doğal olarak ürüne kontamine olan florada bulunan fermentatif bakterilerin farklı olmasından kaynaklanmaktadır. Geleneksel ürünlerdeki yerel flora ürüne daha iyi adapte olduğundan daha yüksek metabolik aktivite göstermekte dolayısıyla daha kaliteli sosis üretimi mümkün olmaktadır [11]. Bu nedenle son yıllarda geleneksel fermente et ürünlerine özgü nitelikler kazandıran mikroorganizmaların tanımlanması ve starter kültür olarak kullanım potansiyellerinin belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmalar bulunmaktadır [6, 13, 14, 49].

Sucukta spontan olarak gelişen bakteriler, üretim prosesine ve formülasyonuna iyi adapte olamamış, ticari starterlerin aksine daha kolay adapte olabilen metabolik 12

aktivitesi daha yüksek ve patojen bakterilerle daha iyi rekabet eden bakterilerdir. Bu yüzden sucuk üretiminde starter kültür olarak doğal floranın kullanılması önem arz etmektedir. Bu konuda ülkemizde yapılan araştırmalar bulunmakla birlikte araştırmaların sayıları oldukça kısıtlıdır.

Nazlı et al. [50] sucuklardan izole ettiği S. carnosus ve Lb. plantarum bakterilerini sucukların üretiminde starter kültür olarak kullanmış ve bu starter kültürleri kullanıldığı grubun, duyusal değerlendirmede diğer gruplara göre daha yüksek puan aldığı sonucuna varılmıştır.

Geleneksel yöntemlerle üretilen sucuklardan izole edilen bakteriler, katıldıkları fermente et ürününün hijyenik kalitesinin ve duyusal kalitesinin arttırılmasını sağlamaktadır. Bu düşünce, Avrupa Birliği desteği ile hazırlanan proje (Tradisausage, QLK1 CT-2002) tarafından da dikkate alınmıştır. Talon et al. [49] yapmış olduğu çalışmada, geleneksel yöntemlerle üretilen sucuklardan izole edilen L. sakei, S. equorum ve S. succinus bakterilerini starter kültür olarak kullanılmıştır. Starter kültür eklenen örneklerde yapılan analizler sonucunda kontrol grubu örneklere (starter kültür içermeyen) enterekok ve L. monocytogenes sayılarında düşüş görülmüştür. Ayrıca starter kültürlü örnek gruplarında biyojen amin miktarının ve lipit oksidasyon oranının azaldığı sonucuna varılmıştır. Duyusal analiz sonuçlarına bakıldığında ise starter kültürler, eklendikleri örneklerde, tat ve aroma bakımından belirgin bir değişiklik yapamazken, tekstürü iyileştirdiği gözlenmiştir.

1.5. Sucukların Mikroflorasının Belirlenmesi

Olgunlaşma süresince gelişen mikrofloranın türü, çoğunlukla kullanılan olgunlaşma tekniği ile yakından ilişkilidir. Olgunlaşma süresi kısa olan sucuklarda, fermentasyonun erken aşamalarında laktobasiller hakim florayı oluştururken, olgunlaşma süresi uzun olan sucuklarda fermentasyonun erken aşamalarında mikrokoklar hakim florayı oluşturmaktadır [13].

Fermentasyonda aktif rol alan starter kültürlerin sucuk hamuruna ilave edildikten sonra ortam koşullarına daha iyi adapte olmuş mevcut mikroflora ile fermentasyon süresince rekabet ettiği bilinmektedir. Dolayısıyla starter kültürlerden beklenen faydanın 13

sağlanabilmesi için fermentasyon süresince bu kültürlerin canlı kalmaları ve hatta baskın florayı oluşturmaları gerekmektedir [51].

Gıdalarda bulunan fermantatif bakterilerin tanımlanmasında geleneksel kültürel yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu amaçla, uygun besiyerlerine ekim yapıldıktan sonra farklı morfolojik özelliklerine göre seçilen tipik koloniler izole edilip, saflaştırılarak biyokimyasal testler ile tanımlanmaktadır [28]. Ancak uygulanan biyokimyasal testler uzun zaman alıcı ve iş yükünün fazla olmasının yanında fenotipik özelliklerin ortaya çıkmasındaki yetersizlikler ve kültüre alınamamış canlı hücrelerin belirlenmesini imkansız oluşu gibi ciddi dezavantajlara sahiptirler. Diğer taraftan, mikroorganizmalar değişen çevre koşullarına bağlı olarak fenotipik özelliklerini değiştirebildikleri gibi tek bir nükleotitte meydana gelen bir değişiklik fenotipten sorumlu olan herhangi bir genin fonksiyonunu bozabilmektedir. Böylece fenotipik olarak aynı fakat genotipik olarak farklı izolatlar meydana gelebilmektedir [52]. Geleneksel yöntemlerde karşılaşılan bu tür zorluklarından dolayı genotipik yöntemlere olan ilgi giderek artmaktadır [15].

Son zamanlarda dünyada fermente et ürünlerine özgü nitelikler kazandıran mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Bu amaçla son yıllarda moleküler biyoloji alanındaki gelişmeler yakından takip edilmekte ve genotipik tiplendirme yöntemleri fermentasyonda rol alan bakterilerin tanımlanmasında kullanılmaktadır [15].

Özellikle 1990‟lardan sonra DNA’ya dayalı pekçok tabanlı tanımlama metodu geliştirilmiştir. Özellikle polimeraz zincir reaksiyonuna (polymerase chain reaction, PCR) dayanan yöntemler mikroorganizmaları tanımlamak için hızlı, güvenilir ve basit yöntemler olarak öne çıkmıştır. Bu metot mikrobiyal genom yapısının tamamını veya bir kısmını tarama yeteneğine sahiptir [53]. Akrabalık ilişkileri yüksek oranda korunmuş bölgelerin çoğaltılması ile tanımlanabilir. Değişken DNA segmentlerinin çoğaltılması ise, yakın ilişkili türler arasındaki farklılıkları belirlemede kullanılmaktadır [13].

Mikroorganizmaların tespit edilmesi ve tanımlaması için, 16S rRNA, ya da onu kodlayan gen gibi bazı moleküler markırların (işaretleyicilerin) kullanıldığı moleküler 14

biyolojik teknikler, mikrobiyel çeşitliliği araştırmak ve mikrobiyal toplulukların yapılarını analiz etmek için artık daha sıklıkla kullanılmaktadır. Bu amaçla bir gıda matriksindeki bakteriyel izolatların cins seviyesinin ötesinde, tür seviyesinde tanımlanması için, 16S rRNA üzerinde türe özgü primerler dizayn edilebilmektedir [54].

Diğer taraftan mikroorganizmaların tür seviyesinde tanımlanması ve filogenetik sınıflandırmalarının yapılmasında 16S rRNA’nın değişken V1-V3 bölgelerinin dizi analizi de yapılmaktadır [55]. Ancak Lb. plantarum, Lb. paraplantarum, Lb pentosus gibi yakın ilişkili türlerin ayrılması için 16S rRNA tam sekans analizi yeterli olmamaktadır. Bundan dolayı bu türlerin ayrımında arasında tRNA genlerininde bulunduğu 16S-23S rRNA bölgesi dizi analizi de kullanılmaktadır [13, 56].

Hızla gelişen bir bilim dalı olan moleküler biyoloji alanında mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla yeni metotların geliştirilmesi için yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Bu amaçla genellikle kültürel olmayan metotların kullanımına yönelik bir eğilim vardır.. Birçok bakterinin geliştiği ortamla ilgili bilginin yetersiz olması ve bu ortamlara benzer şartların sağlanma zorluğundan dolayı kültürel olmayan yöntemler tercih edilmektedir. Bu tür olumsuz etkilerin ortadan kaldırılması amacıyla kültürel olmayan teknikler geliştirilmiştir. Bu tekniklerden en yaygın kullanılanı Denaturant gradient jel elektroforez tekniği (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)’dir. PCR tekniğinin DGGE ile kombinasyonu aynı boyuttaki fakat farklı dizilimdeki DNA parçaları arasındaki farklılıkların bulunmasına imkan sağlamaktadır [57].

PCR tabanlı DGGE tekniği amplifiye edilmiş DNA parçalarından oluşmuş karışımın, denatüre edici bileşenler içeren poliakrilamit jel içinde ayrılmasını sağlar. Normalde agaroz ya da akrilamid jel elektroforezinde her bir DNA parçasının elektronik mobilitesi onun boyutu ile orantılıdır. DGGE’de aynı boyuttaki DNA parçaları denaturasyon profillerine göre jel üzerinde ayrılır. Çift zincirli DNA (dsDNA) artan denatürasyon şartlarına maruz kalınca tek zincirli DNA (ssDNA) haline dönüşür. dsDNA’nın denatürasyonunda fragmentler erime bölgeleri denen yerlerde kademe kademe denatüre olurlar ve sonuçta dsDNA, ssDNA’ya dönüşür. Erime bölgeleri, aynı sıcaklıkta eriyen baz dizilerinin oluşturduğu alanlardır. Denature edici gradiyent jelin belli bir 15

noktasındaki erime sıcaklığı çift zincirli DNA’nın erime sıcaklığına ulaştığı zaman sarmallar kısmi olarak açılır ve molekülün ilerleyişi pratik olarak durur. Sekans varyasyonu erime sıcaklıklarının farklı olmasına neden olur ve farklı dizilime sahip moleküllerin ilerleyişi jelin değişik noktalarında sonlanır ve böylelikle farklı jel görüntüleri oluşmuştur [15, 57].

Pek çok ülkede geleneksel olarak üretilen fermente sosislerin mikrobiyal populasyonunu tanımlamak amacıyla PCR-DGGE’e dayalı birçok çalışma yapılmıştır. Örneğin; Fontanaa et al., [58], PCR-DGGE tekniği kullanılarak fermente Arjantin sosislerinin mikrobiyal yükünü tanımlamışlardır. Yine birçok araştırmacı tarafından İtalyan sosislerinin fermentasyon sırasındaki mikrobiyal kompozisyonu PCR-DGGE tekniği ile izlenmiştir [13, 15, 57, 59]. Ülkemizde ise Kesmen et al. [14], yapmış oldukları bir çalışmada, olgunlaşmasını tamamlamış sucuk örneklerinde bulunan laktik asit bakterilerini, 16S rDNA’nın V1 ve V3 bölgelerini PCR-DGGE tekniğiyle analiz ederek tanımlamışlardır. Çalışma sonucunda sucuk örnekleri içerisinde toplam 8 farklı laktik asit bakterisi tespit edilmiş olup, Lb. sakei, Lb. curvatus ve Weissella viridescens bakterilerinin sucuk mikroflorasındaki en baskın bakteriler olduğu rapor edilmiştir.

1.6. Sucuklarda Uçucu Bileşikler

Olgunlaşma süresince fermente sosislerde tespit edilen uçucu bileşikler; karbonhidratlar, proteinler ve yağların mikrobiyal metabolizmasından kaynaklanmaktadır [60]. Fermente sosislerde uçucu bileşik olarak, alkoller, asitler, aldehitler, ketonlar, esterler, hidrokarbonlar, furanlar, sülfitler, nitriller gibi birçok bileşiğin bulunduğu tespit edilmiştir [61].

Fermente et ürünlerinin mikrobiyal florasının, oluşan uçucu bileşikler üzerinde etkili olduğu ve ürünlerde tanımlanmış bileşiklerin %60’ının lipit oksidasyonu, %27’sinin fermentasyon, %6’sının proteolisizden kaynaklandığı belirtilmektedir [9, 18].

Sucuklarda ekşi tadın oluşumu üzerine karbonhidratların fermentasyonu sonucu oluşan laktik asit ve asetik asit gibi organik asitlerin büyük etkisi bulunmaktadır. Fermentasyon sırasında oluşan laktik asit miktarı üzerinde kullanılan baharatlar, şeker miktarı, starter kültürler gibi birçok faktör etkilidir [63]. 16

Proteoliz sonucu oluşan küçük molekül ağırlıklı proteinler, peptitler ve serbest aminoasitlerin sucukların tat ve aromasının oluşumu üzerinde önemli etkileri olduğu bilinmektedir [64, 65, 66].

Aminoasit metabolizmasında enzimatik reaksiyonlar da önemli yer tutmaktadır. Tirozin ve triptofan tirozin-fenol-liyaz enzimlerince fenol ve indole dönüştürülmektedir. 2- metil propiyonik ve 3-metil bütanoik asitler fermente sosislerde peynirimsi aromadan sorumludur. Diğer taraftan ise, 2- veya 3-metilbütanol, 2- veya 3-metilbütanal fermente sosislerin tipik aromatik bileşiklerindendir [67].

Fermente sosislerde oluşan uçucu bileşiklerin tespiti üzerine yapılan birçok çalışma mevcuttur. Meynier et al. [68] tarafından yapılmış bir çalışmada tat ve aroma oluşumu üzerine laktik asit bakterilerinin (Lactobacillus sakei L110, Pediococcus acidilactici 725, P. pentosaceus 716) ve Staphylococcus türlerinin (S. carnosus 833, S. saprophyticus M31) etkileri araştırılmış ve 80 farklı bileşik tespit edildiği belirtilmiştir.

İspanyol tipi fermente bir sosis olan Chorizo üzerine yapılan bir çalışmada, 115 uçucu bileşik tanımlamış, bu bileşiklerin asit, alkol, aldehit, keton, ester, eter, fenolik bileşik alkan, sülfürlü bileşik, aromatik hidrokarbon, lakton, , kloroform, benzofuran, terpen ve nitrojenli bileşik olduğu belirtilmiştir [69].

Fermente edilmiş sosis örneklerinde çeşitli stafilokok ve mikrokok türlerinin; metional, fenilasetaldehit, feniletanol, 2-metilpropanal, 2-metilpropanoik asit, 2- ve 3- metilbütanal, 2- ve 3-metilbütanoik asit, 2- ve 3-metilbütanol, etil-2-ve 3-metil bütanoat gibi aroma bileşiklerini oluşturduğu belirtilmiştir [70, 71].

Stahnke’nin 1999 yılında [61] yaptığı bir çalışmada fermente sosis üretiminde starter kültür olarak S. xylosus ve S. carnosus’u kullanmıştır. S. carnosus’un oluşturduğu aromatik bileşikler arasında kısa zincirli aldehitler ve asitler bulunmasına rağmen, S. xylosus’un oluşturduğu aromatik bileşikler içinde ketonlar, aseton, 3- ve 4-metil-2- peptanon, sülfidler, dimetilsülfid ve dimetiltrisülfid gibi bileşiklerin olduğu belirtilmiştir. Berger et al., [72], İtalyan tipi fermente sosislerde yaptıkları bir çalışmada ise, uçucu bileşiklerin önemli bir kısmının lipit hidroliz ürünleri ve baharatlardan (biber) kaynaklandığı belirtmiştir. 17

Görüldüğü gibi, son yıllarda fermente sosislerin, geleneksel özelliklerinin korunarak kalite özelliklerinin arttırılması yönünde birçok çalışma yapılmaktadır. Bu amaçla fermente sosislerin duyusal ve teknolojik özellikleri üzerinde etkili faktörlerden olan sucuğun mikrobiyal florasının tespiti üzerine çalışmalar yapılmaktadır. Yapılan çalışmalar içerisinde DNA’ya dayalı moleküler yöntemler hızlı ve güvenilir sonuçlar vermesi nedeniyle son yıllarda diğer yöntemlere göre daha çok tercih edilmektedir. Bu yöntemlerden özellikle PCR-DGGE metodu sucuklarda mikrobiyal floranın tespitinde kullanılabilmektedir. Birçok araştırmacı sucuk ve benzeri fermente sosislerden izole edilen bakteri kültürlerinin (doğal) ortama daha iyi adapte olması ve geleneksel tat aromayı oluşturması yönleriyle bu kültürlerin sucuk üretiminde kullanılmasının daha avantajlı olduğunu düşünmektedir [49]. Ancak bu olumlu etkiler fermente et ürünlerine katılan starter bakteri kültürleri için söylense de bakteri kültürü katılmış ve katılmamış sucuk ve benzeri fermente ürünlerin fermentasyon süresince bakteri florasındaki değişim tam olarak bilinmemektedir. Dolayısıyla, sucuk üretiminde kullanılan bakteri kültürlerinin fermentasyon süresince takip edilmesi ve sucuğun diğer kalite özellikleri ile bakteriyel floradaki değişimin ilişkilendirilmesi gerekmektedir. Bu amaçla yapılan çalışmada geleneksel yöntemle starter kültür kullanılmadan üretilen sucuklardan izole edilen değişik bakteri kültürleri kullanılarak fermentasyon süresince bir taraftan sucukların bakteriyel florasındaki değişim izlenirken, diğer taraftan sucuğun kalite özellikleri belirlenmiştir. Böylece, sucuk üretiminde birçok araştırmacı tarafından tavsiye edilen starter kültür kullanımının sucuk üretimindeki etkileri detaylıca incelenmeye çalışılmıştır. 18

2. BÖLÜM

MATERYAL VE YÖNTEM

2.1. Materyal

2.1.1. Hammadde ve katkı maddeleri

Sucuk üretiminde kullanılan et ve kuyruk yağı, Saray Tarım ve Hayvancılık A.Ş. Et Ürünleri İşletmesi’nden (Kayseri) temin edilmiştir. Et ve yağ seçiminde, materyalin sucuk üretimine uygunluğu esas alınmıştır. Bu amaçla kesimden sonra bir gece dinlendirilmiş, sığır karkaslarının sırt bölgesine ait etler kullanılmıştır. Kullanılan kuyruk yağı ise kesim sonrası koyun karkaslardan alınmış, hızlı bir şekilde soğutulduktan sonra küçük parçalar halinde doğranarak -18°C’de muhafaza edilmiştir. Üretimde kullanılan tuz, sarımsak, sakkaroz ve çeşitli baharatlar gibi katkı maddeleri Kayseri piyasasından temin edilmiştir. Sucuk hamurunun dolumunda Pabay A.Ş. firmasından temin edilen kollajen kılıflar (çap 38 mm) kullanılmıştır.

2.1.1.1. Sucuk Üretiminde Kullanılan Bakteri Kültürleri

Üretimde starter kültür olarak, laboratuvarımızda daha önce yapılan bir çalışma kapsamında, Kayseri piyasasından toplanan geleneksel yöntemle starter kültür kullanılmadan üretilen sucuklardan izole edilerek moleküler yöntemlerle (16S rDNA ve 23S rDNA sekans analizi) tanımlanmış laktik asit bakterileri (Lb. sakei, Lb. curvatus, Lb. plantarum) kullanılmıştır. Bu amaçla % 20 gliserol içeren MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) broth besiyerinde -80 oC’de muhafaza edilen laktik asit bakterileri, MRS broth besiyerine ekim yapıldıktan sonra 37oC’de 24-48 saat inkübe edilerek aktive edilmiştir.

19

Üretimde kullanılan diğer kültürlerden Staphlococcus carnosus B-14760 Amerika Tarım Bakanlığı Kültür Kolleksiyonu’ndan (Agricultural Research Service Culture Collection) ve Staphlococcus xylosus ATTC 29971 ise Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi Başkanlığı’ndan liyofilize olarak temin edilmiştir. S. carnosus ve S. xylosus suşları ise TSA (Tryptic Soy Agar) besiyerine ekim yapılarak 37°C’de 24 saat inkübe edilmiştir. Sucuk hamurlarına laktik asit bakterileri yaklaşık 107 kob/g, S. xylosus ve S. carnosus suşları ise 106 kob/g seviyesinde Tablo 2.1’de bildirilen kombinasyonlar halinde inoküle edilmiştir.

2.1.2. Sucuk üretimi

Araştırmada kullanılan sucuk örneklerinin üretimi, Erciyes Üniversitesi Gıda Mühendisliği laboratuvarlarında gerçekleştirilmiştir. Sucuk örneklerinin olgunlaştırılması ise Erciyes Üniversitesi Safiye Çıkrıkçıoğlu Meslek Yüksek Okulu Gıda Teknolojisi Pilot İşleme Tesisi’nde gerçekleştirilmiştir. Sucuk üretimi farklı zamanlarda iki tekerrür şeklinde gerçekleştirilmiştir.

Sucuk hamuru %80 yağsız sığır eti ve %20 kuyruk yağı kullanılarak hazırlanmıştır. Formülasyonda yer alan baharat ve katkı maddelerinin kullanımında Gökalp vd. (2004)’ın belirttiği reçete esas alınmıştır. Buna göre; her bir kg et–yağ karışımı için 25 g tuz, 10 g sarımsak, 4 g sakkaroz, 7 g kırmızı biber, 5 g karabiber, 9 g kimyon ve 2.5 g yenibahar, 0.005 g NaNO2ve 0.033 kg NaNO3 kullanılmıştır.

Araştırmada, starter kültür kullanılmadan üretilen kontrol grubuna ilave olarak laktik asit bakterilerinin (Lb. sakei, Lb. curvatus, Lb. plantarum) ve Staphlococcus cinsi bakterilerin (S. xylosus ve S. carnosus) 9 farklı kombinasyonu oluşturularak toplam 10 farklı grup sucuk üretilmiştir (Tablo 2.1)

Sucuk üretiminde, laboratuvar tipi kıyma makinasıyla kıyma haline getirilen kırmızı ete, önceden dondurulmuş kuyruk yağı, baharatlar ve nitritli kürleme tuzu ilave edilerek homojen bir karışım elde edilinceye kadar yoğurma işlemi uygulanmıştır. Karışım 4°C’de bir gün (24 saat) bekletilmiştir (Şekil 2.1.).

20

Tablo 2.1. Sucuk üretiminde kullanılan bakteri kültürlerinin kombinasyonları

Örnek Adı Uygulama Kontrol (K) İlave edilen bakteri grubu yok PC Lb. plantarum (107kob/g) + Lb. curvatus (107kob/g) PS Lb. plantarum(107kob/g) + Lb. sakei (107kob/g) CS Lb. curvatus (107kob/g) + Lb. sakei (107kob/g) PS1 Lb. plantarum(107kob/g) + Lb. sakei (107kob/g) + S. carnosus (106kob/g) PC1 Lb. plantarum(107kob/g)+ Lb. curvatus (107kob/g) + S. carnosus (106kob/g) CS1 Lb. curvatus (107kob/g) + Lb. sakei (107kob/g) + S. carnosus (106kob/g) PS2 Lb. plantarum(107kob/g) + Lb. sakei (107kob/g)+S. xylosus (106kob/g) PC2 Lb. plantarum(107kob/g) + Lb. curvatus(107kob/g)+ S. xylosus (106kob/g) CS2 Lb. curvatus (107kob/g) + Lb. sakei (107kob/g)+ S. xylosus (106kob/g)

2.1.2.1. İnokulasyon

Farklı örnek gruplarına ait sucuk hamurları 4oC’de bir gün dinlendirildikten sonra, Tablo 2.1’de belirtilen seviyelerde bakteri karışımları ilave edilmiş ve homojen bir dağılım olacak şekilde yoğrulmuştur. Sucuk karışımları laboratuar tipi pistonlu dolum makinası (Coşdu, Kayseri) kullanılarak kollajen kılıflara dolumu gerçekleştirilmiştir. Kontrol grubu sucuk örneklerine, kültür ilavesi yapılmamış yalnızca aynı oranda steril fizyolojik tuzlu su konulmuştur.

2.1.2.2. Fermentasyon (Olgunlaştırma)

Araştırma kapsamında üretilen sucuk örnekleri inokulasyon ve dolumdan sonra 4 saat oda şartlarında dengelendikten sonra Tablo 2.2.’de verilen şartlarda 12 gün süreyle fermentasyona tabi tutularak olgunlaştırılmıştır. Fermentasyonun 0. günü, üretilen sucukların inokulasyonun ve dolumunun yapıldığı gün; fermentasyonun sona erdiği gün ise 12. gün olarak kabul edilmiştir. 21

Tablo 2.2. Fermente sucukların olgunlaştırma koşulları [2].

Süre Sıcaklık (°C) Bağıl nem (%) Hava akımı (m/sn)

72 saat 24 ±1ºC 90 ±2ºC 1.5-2

72 saat 21 ±1ºC 85 ±2ºC 1.5-2 48 saat 20 ±1ºC 80±2ºC 1.5-2 48 saat 18 ±1ºC 80 ±2ºC 1.5-2 48 saat 17 ±1ºC 75 ±2ºC 1.5-2

Soğutulmuş ve 1 gece dinlendirilmiş parça et ve kuyruk yağı

Baharat, Sarımsak, Sakkaroz, Tuz, Kıyma makinası NaNO2, NaNO3

0-4°C’de 24 saat bekletme

Yoğurma

Starter Kültür

Dolum İlavesi

Dinlendirme

Oda

Fermentasyon .

Şekil 2.1. Araştırmada takip edilen sucuk üretim aşamaları [2] 22

2.2.Yöntem

Fermentasyon süresince (0., 4., 8. ve 12. günler) sucuk örneklerinde % nem, pH, su aktivitesi analizleri ile bazı mikrobiyolojik analizler yapılmıştır. Ayrıca sucuğun bakteriyel florasını belirlemek amacıyla fermentasyon süresince (0., 4., 8. ve 12. günler) PCR-DGGE analizi ve laktik asit bakteri sayımı yapılmıştır. Olgunlaşma tamamlandıktan sonra sucuk örneklerinde bazı fiziksel, kimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal analizler yapılarak elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirilmiştir.

2.2.1.Mikrobiyolojik analizler

Sucuklardan aseptik koşullarda 25 g örnek alınarak 225 ml ringer solüsyonu ile stomacher (Masticator IUL Instruments/Spain) yardımıyla homojenize edilmiştir. Bu homojenizattan (10-1’ lik dilüsyon) 1 ml alınarak uygun dilüsyonlar hazırlanmıs ve maya ve küf sayımında kullanılmıştır. Daha sonra ilk homojenata (10-1’ lik dilüsyon) maya ve küf gelişimini önlemek amacı ile 200 ppm cycloheximide (Sigma 18079) ilave edilerek Maxiumum recovery diluent (Merck) kullanılarak 10-1’den 10-8’ ye kadar seri dilüsyon hazırlanmış ve bakteriyolojik analizlerde kullanılmıştır.

2.2.1.1. Toplam mezofilik aerobik bakteri (TMAB) sayısı

Sucuk örneklerinin TMAB sayısı, Plate Count Agar (PCA, Merck) besiyerine dökme plak yöntemiyle ekim yapılarak belirlenmiştir. Ekim yapılan petriler 35±1°C sıcaklıkta 48 saat süreyle inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda oluşan koloniler sayılmıştır [73].

2.2.1.2. Laktik asit bakterilerinin (LAB) sayısı

Sucuk örneklerinde LAB sayımı için MRS agar (Merck) besiyeri kullanılmıştır. Numunelerin farklı dilüsyonlarından MRS agar bulunan petrilere yüzeye dökme yöntemiyle ekim yapılmış ve 35±1°C’de 72 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda petrilerde sayım yapılarak laktik asit bakterilerinin sayısı bulunmuştur [74].

2.2.1.3. Maya ve küf sayısı

Sucuk örneklerinin maya ve küf sayısı, Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol besiyerine (DRBC, Merck) dökme plak yöntemiyle ekim yapılarak analiz edilmiş ve 23

ekim yapılan petriler 25±1ºC’de 3-5 gün süre ile inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda oluşan maya ve küf kolonileri sayılmıştır [75].

2.2.1.4. Toplam Enterobacteriaceae

Toplam Enterobacteriaceae sayımı için dökme plak yöntemi ile Violet Red bile Dextrose (VRBD) Agara ekim yapılmıştır. Ekim yapılan petriler 35ºC’de 48 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda oluşan koloniler sayılmıştır [75].

2.2.2. Fizikokimyasal analizler

2.2.2.1. Kurumadde miktarı

Homojen hale getirilmiş örneklerden 10 g tartılarak 125±2°C’de sabit tartıma ulaşıncaya kadar kurutulduktan sonra kurumadde miktarı belirlenmiştir [76].

2.2.2.2. pH değeri

Sucuk örneklerinden 10 g tartılarak üzerine 100mL saf su ilave edilmiştir. Ultra turrax (Ika, T25) kullanılarak homojenize edilen örneklerin pH değerleri uygun tamponlarla kalibre edilmiş pH-metre (WMW-70, ABD) ile ölçülmüştür [77].

2.2.2.3. Su aktivitesi (aw) değeri

Sucuk örneklerinin su aktivitesi (aw) değerlerinin ölçümünde, kalibrasyonu yapılmış su aktivitesi tayin cihazı (AquaLab 2.0, ABD) kullanılmıştır. Bu amaçla cihaza ait özel numune kaplarına yaklaşık 2 g homojenize edilmiş örneklerden tartılarak oda sıcaklığında ölçüm yapılmıştır [78].

2.2.2.4. Titrasyon asitliği değeri

Yaklaşık 10 g örnek 200 ml saf su ile homojen hale getirilerek filtre kağıdından (Whatman No 54) süzülmüştür. Süzüntü 250 ml’ye saf su ile tamamlandıktan sonra bu karışımdan 25 ml alınmış ve üzerine 75 ml distile su ilave edilerek fenolftalein eşliğinde 0.01 N NaOH ile titre edilmiştir. Harcanan hacim üzerinden % asitlik değeri hesaplanmıştır [79].

24

2.2.2.5. Kalıntı nitrit miktarı

Doymuş boraks çözeltisi ve sıcak saf su ile birlikte homojenize edilen sucuk örnekleri, 15 dakika kaynar su banyosunda tutulduktan sonra oda sıcaklığına kadar soğutulmuştur. Hazırlanan örnek çözeltileri üzerine sırasıyla Carez 1 (Merck) ve Carez 2 (Merck) çözeltisi ilave edilmiş ve her ilaveden sonra iyice çalkalanmıştır. 200 mL hacme kadar saf su ile seyreltilen örnek çözeltileri iyice karıştırılıp oda sıcaklığında 30 dakika süreyle bekletildikten sonra bir filtre kağıdı (Whatman 42) kullanılarak iki kez süzülmüştür. Elde edilen süzüntüye, 1/1 oranında Griess (Merck) çözeltisi ilave edilmiş ve 30 dakika normal oda sıcaklığında ve karanlıkta bekletildikten sonra köre karşı 540 nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Okunan absorbans değerleri, seyreltme faktörü (20) ve standart eğriden tespit edilen katsayı, örnek miktarına oranlanarak, örnekteki nitrit miktarı ppm olarak hesaplanmıştır [80].

2.2.2.6. Renk değerleri

Renk tayin cihazı (Minolta) kalibre edildikten sonra sucuk örneklerinin kesit ve iç yüzeylerinde renk ölçümü yapılmıştır. Ölçümü yapılan L*, a* ve b* değerleri Aydınlatma Komisyonu CIELAB (Comission Internationale de I’E Clairage) tarafından aşağıdaki gibi ifade edilmektedir [81]:

L*=0 siyah L* =100 beyaz (koyuluk / açıklık) a*: + kırmızı a*: - yeşil b*: + sarı b*: - mavi

2.2.3. Duyusal analizler

Sucuk örnekleri, kılıfları soyulduktan sonra 0.5 cm kalınlığında dilimlenerek panelistlere çiğ ve pişmiş olarak sunulmuştur. Pişirme işlemi elektrikli ızgarada (Tefal/ FIT’N Clean) gerçekleştirilmiştir. Sucuk örneklerinin tat, renk, koku, aroma, tekstür ve görünüş gibi özellikleri 6 panelistden oluşan bir duyusal panelde hedonik skala (1-9) ile değerlendirilmiştir [82, 83]. Duyusal analizde kullanılan form Ek. 1.’de verilmiştir.

2.2.4. Uçucu Bileşiklerin Analizi

25

Sucuk örneklerinin uçucu bileşikleri, 85 μm carboxen/polydimethylsiloxane Stable Flex fiber (CAR/PDMS SF Supelco USA) kullanılarak katı faz mikroekstraksiyon SPME (Solid Phase Microextraction) tekniği ile analiz edilmiştir. Bu amaçla her bir örnekten 50 ml’lik vialler içerisine 10 g tartılarak PTFE-kaplı silikon septum ile vialler kapatılmıştır. 40oC sabit sıcaklıkta 1 saat süre ile bekletilerek aroma bileşenlerinin fibere adsorbe olması sağlandıktan sonra aroma bileşiklerinin DB-624 (J&W Scientific, 30m, 0.25mm i.d., 1.4μm film) kapiler kolonun kullanıldığı GC/MS (GC, Agilent Technologies 6890N, MS, Agilent Technologies 5973) sisteminde kalitatif ve kantitatif analizi yapılmıştır. Başlangıçta fırın sıcaklığı 40°C’de 5 dk. tutulduktan sonra, 3°C/dk. hızla 110°C’ye, 4°C/dk. hızla 150°C’ye, 10°C/dk hızla 210°C’ye kadar çıkarılarak 12 dk. bekletilmiştir (toplam işlem süresi 56.33 dk.). Helyum gazı 1ml/dk. akış hızıyla taşıyıcı gaz olarak kullanılmıştır. Değerlendirme işlemlerinde; Flavor ve TBAM Uçucu Yağ Bileşenleri Kütüphanesi yanısıra Wiley kütüphane tarama yazılımları da kullanılmıştır [84].

2.2.5. Sucuk Örneklerinin Bakteriyel Florasının Belirlenmesi

Bu çalışma kapsamında üretilen kontrol grubu ve farklı bakteri kültürlerinin ilave edildiği sucuk örneklerinin bakteriyel florası, fermentasyonun 0., 4., 8 ve 12. günlerinde PCR-DGGE yöntemi ile belirlenmiştir. Bu amaçla öncelikle sucuk örneklerinden DNA izolasyonu yapıldıktan sonra PCR reaksiyonu ve denatürant gradient jel elektroforezi (DGGE) gerçekleştirilmiştir.

2.2.5.1. Sucuk örneklerinden DNA İzolasyonu

DNA izolasyonu için ticari izolasyon kiti (Qiagen) kullanılmıştır. Buna göre; sucuk örneklerinden 25 g tartılarak stomacher torbası içerisinde 225 ml ringer çözeltisi ile birlikte homojenize edildikten sonra homojenattan 2 ml’lik tüplere aktarılmıştır. Tüpler 10000xg’de 10 dk. santrifüj edildikten sonra süpernatant dökülmüştür. Pellet üzerine 180 μl lizozimli izolasyon solüsyonu (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8, 0.3mM lizozim) ilave edilerek süspanse edilmiştir. Süspansiyon 37°C de 45 dk inkübe edildikten sonra 20 μl Proteinaz K ve 200 μl AL Buffer (Qiagen) eklenerek kısa süreli bir karıştırma işlemi uygulanmıştır. Tüpler önce 56°C de 30 dk sonra 95°C de 15 dk inkübe edilmiş ve daha sonra oda sıcaklığına soğutulmuştur. Tüplere 200 μl etanol 26

eklenip kısa bir süre karıştırıldıktan sonra tüp içerikleri spin kolonlara aktarılmıştır. Spin klonlar 6000xg de 1 dk. santrifüj edilerek DNA’nın silika membranda tutulması sağlanmıştır. Spin klonlar önce 500 μl AW1 Buffer (Qiagen) daha sonra ise yine 500 μl AW2 Buffer (Qiagen) ile yıkanmıştır. 20000xg de 3 dak. santrifüj edilen tüpler oda sıcaklığında 30 dk. kurumaya bırakılmıştır. Kurutma işleminin sonunda spin kolonlara 50 μl elüsyon tamponu (Qiagen) eklenip 6000xg de 3 dk. santrifüj işlemi uygulanmıştır. Elüe edilen DNA’ların konsantrasyonları nanodropta ölçülerek belirlenmiştir [14].

2.2.5.2. PCR-DGGE Analizi

a. PCR Amplifikasyonu

DNA izolasyonunun ardından DGGE analizi için pek çok bakteriye spesifik bölgeler içeren 16SrRNA üzerindeki V1 bölgesi, V1GCf ve V1r primerleri ile V3 bölgesi ise V3GCf ve V3r primerleri kullanılarak amplifiye edilmiştir (Tablo 2.3.).

Bakteriyel DNA’yı amplifiye etmek amacıyla 25 μl ticari PCR master mix (Qiagen), 500 ng kalıp DNA ve 0.8 μM ileri ve 0.4 μM geri primerden oluşan toplam 50 μl’lik reaksiyon karışımı hazırlanmıştır.

Tablo 2.3. V1 ve V3 bölgesinin amplifikasyonu için kullanılan primerlerin baz dizilimi

Amplikon Bölge Oligonükleotid Dizi (5’→3’) Literatür Uzunluğu

İleri primer (V1f) GCGGCGTGCCTAATACATGC

V1 Geri primer (V1r) TTCCCCACGCGTTACTCACC 100 bç

GC clamp CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC [54]

İleri primer (V3f) CCTACGGGAGGCAGCAG

V3 Geri primer (V3r) ATTACCGCGGCTGCTGG 193 bç

GC clamp CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC

V1 bölgesi için termal döngü şartları, thouchdown prosedürüne göre; 95 °C’de 10 dk. ilk denatürasyon ve 95 °C’de 1 dk. denaturasyondan sonra ilk döngüde 60 °C olan yapışma sıcaklığı 0.5°C/döngü hızla 50 °C’ye düşürülmüş ve 50 °C’de 20 döngü daha 27

gerçekleştirilmiştir. Her döngüde 72 °C’de 2.5 dk. uzama aşaması uygulanmıştır. Son uzama ise 72 °C’de 30 dk. olarak uygulanmıştır [85].

V3 bölgesi için ise termal döngü şartları yine thouchdown prosedürüne göre; 95 °C’de 10 dk. ilk denatürasyon ve 95 °C’de 1 dk, denaturasyondan sonra yapışma sıcaklığı 61 °C’den 51 °C’ye 0.5°C/döngü hızla düşürülmüş, 51 °C’de 10 döngü daha gerçekleştirilmiştir, her döngüde 72 °C’de 3dk. uzama aşaması uygulanmıştır. Son uzama ise 72 °C’de 30 dk. olarak uygulanmıştır [85]. b. DGGE Analizi Sucuk örneklerinden direkt DNA izolasyonunun ardından amplifiye edilen V1 ve V3 bölgesine ait PCR ürünlerinin DGGE analizi Kesmen et al. [14] göre yapılmıştır.

Çözeltilerin Hazırlanması

% 40 lık akrilamid/bis (37.5:1) hazırlanması: 38.93 g akrilamid (Sigma/A9099) ve

1.07 g bis-akrilamid (Sigma/M7279) tartılmıştır ve dH2O ile 100 ml’ye tamamlanmıştır. 0.45μl’lik filtreden geçirilerek 4 oC’de muhafaza edilmiştir.

50 x TAE tamponunun hazırlanması: 242 g Tris base (Sigma/ T6066), 57.1 ml glacial asetik asit (SigmaA 9977), 100 ml 0.5 M EDTA (Sigma/ E5134) (pH 8.0), dH2O ile 1000 ml’ye tamamlanmıştır. Karışım 120 oC’de 15 dakika otoklavda steril edildikten sonra oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir.

1 x TAE yürütme tamponunun hazırlanması: 140 ml 50 x TAE tamponuna 6860 ml dH2O ilave edilerek toplam hacim 7.000 ml tamamlanmıştır.

% 10 luk amonyum persulfat hazırlanması: 1 g amonyum persulfat (Sigma/ A9164) o tartılıp dH2O ile 10 ml’ye tamamlanmıştır, -20 C’de muhafaza edilmiş ve bir hafta boyunca kullanılmıştır.

Dcode Boyama Solüsyonunun hazırlanması: 0.1 g bromfenol blue xylenecyanol (Sigma/ B3269), 1xTAE tamponu ile 10 ml’ye tamamlanmış ve oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir.

28

Dcode 2x Jel Yükleme Boyası Solüsyonu hazırlanması: 0.50 ml %2lik bromfenolblue-xylenecyanol (Sigma/ B3269), 7 ml gliserol (Sigma /G5516), 2.5 ml dH2O ile 10 ml’ ye tamamlanmıştır.

V1 Bölgesi İçin Yüksek ve Düşük Denaturant Konsantrasyonlu Jelleri

% 8 lik % 30 denaturant içeren jelin (yüksek konsantrasyonlu jel) hazırlanması: 20 ml % 40 akrilamid / bis (37.5:1), 12 ml deiyonize formamid (Sigma/ F9036), 12.6 g

üre (Sigma/ U5378) ve 2 ml 50 x TAE tamponu dH2O ile 100 ml’ye tamamlanmıştır. Hazırlanan solüsyon ultrasonik su banyosunda 20 dakika degaz edilmiş ve koyu renkli cam şişelerde muhafaza edilmiştir.

% 8 lik % 50 denaturant içeren jelin (yüksek konsantrasyonlu jel) hazırlanması: 20 ml % 40 akrilamid / bis (37.5:1), 22 ml deiyonize formamid (Sigma/ F9036), 22.8 g

üre (Sigma/ U5378) ve 2 ml 50 x TAE tamponu dH2O ile 100 ml’ye tamamlanmıştır. Hazırlanan solüsyon ultrasonik su banyosunda 20 dk degaz edilmiş ve koyu renkli cam şişelerde muhafaza edilmiştir.

V3 Bölgesi İçin Yüksek ve Düşük Denaturant Konsantrasyonlu Jelleri

% 8 lik % 15 denatürant içeren jelin (düşük konsantrasyonlu jel) hazırlanması: 20 ml % 40 akrilamid / bis (37.5:1), 6 ml deiyonize formamid, 6.3 g üre ve 2 ml 50 x TAE tamponu, dH2O ile 100 ml’ye tamamlanmıştır. Hazırlanan solüsyon ultrasonik su banyosunda 20 dakika degaz edilmiş ve koyu renkli cam şişelerde muhafaza edilmiştir.

% 8 lik % 55 denaturant içeren jelin (yüksek konsantrasyonlu jel) hazırlanması: 20 ml % 40 akrilamid / bis (37.5:1), 22 ml deiyonize formamid (Sigma/ F9036), 23.1 g

üre (Sigma/U5378) ve 2 ml 50xTAE tamponu dH2O ile 100 ml’ye tamamlanmıştır. Hazırlanan solüsyon ultrasonik su banyosunda 20 dakika degaz edilmiş ve koyu renkli cam şişelerde muhafaza edilmiştir.

Poliakrilamid jelin hazırlanması

Yüksek ve düşük konsantrasyonlu jellerin her birinden 20 ml kullanılmıştır. Yüksek konsantrasyonlu jeli renklendirerek görünürlüğünü sağlamak amacı ile 400 μl boyama solüsyonu ilave edilmiştir. Her iki solüsyona da jelleşmeyi sağlamak amacı ile 14 μl 29

tetrametilen diamin (TEMED/Sigma) ve 140 μl %10’luk amonyum persülfat (APS/ Sigma) eklenmiştir.

Gradient jel oluturmak için DGGE (Dcode Universal Mutation Detection System /BioRad) sisteminin özel jel dökme aparatından faydalanılmıştır. Farklı konsantrasyonlarda denaturant içeren jeller enjektörlerle çekilmiş ve gradiyent jel oluşturacak aparata yerleştirilmiştir. Denaturant konsantrasyonu jelin altından üstüne doğru azalacak şekilde cam plakalar arasına yaklaşık 10 ml/dk hızla dökülmüş ve ardından kuyucukları oluşturacak olan tarak yerleştirilmiştir. Jelin polimerleşmesi için minimum 2 saat beklenmiştir. Jel polimerleştikten sonra üzerindeki tarak çıkarılarak tanka yerleştirilmiş ve oluşan kuyucuklar önce 1xTAE tamponla yıkanmıştır. Daha sonra 40 μl PCR ürünleri ve 10μl jel yükleme boyası karışımı kuyucuklara sırası ile yüklenmiştir. Tampon sıcaklığı 60 ºC’ye ayarlanmış ve sistemin pompası çalıştırılmıştır. V1 bölgesine göre amplifiye edilen örneklerin DGGE analizinde 150 V’da 4 saat elektrik akımı uygulanırken, V3 bölgesine göre amplifiye edilen örneklerin DGGE analizinde önce 10 dakika 50 V’da ardından 3.5 saat 200 V’da elektrik akımı uygulanmıştır. Elektroforez sonunda tanktan çıkarılan jel 50 μg/ml etidyum bromide (Sigma/E1510) içeren 1xTAE tampon içerisinde 20 dakika bekletilmiş ve saf ile yıkandıktan sonra oluşan bantlar jel görüntüleme sisteminde (GelDoc XR/BioRad) görüntülenmiştir.

2. 2. 5. 3. DGGE bantlarının jelden alınması, amplifikasyonu, saflaştırılması ve analizi

Her bir sucuk örneğinden izole edilen bakteriyel DNA’ların V1 ve V3 bölgesine ait DGGE bant profilleri görüntülendikten sonra bantlar tek tek steril bir pipet ucu ile kesilerek içerisinde 50 μl steril su bulunan tüplere aktarılmıştır. Bantlar su içerisinde 4oC’de 1 gece bekletilerek DNA’nın suya geçmesi sağlanmıştır. Su içerisine elüe olan DNA solüsyonundan 2 μl kullanılarak tekrar PCR yapılmış ve tekrar DGGE sisteminde yürütülmüştür. Oluşan tek bantlar alınarak 50 μl steril su içerisinde 4oC’de 1 gece bekletilmiş ve DNA’nın elüe olması sağlanmıştır. Bu işlem bir kez daha tekrar edilerek bantların saflaşması sağlanmıştır. Son aşamada GC clamp bulunmayan V3f, V3r ile V1f, V1r primerleri (Tablo 2.3.) kullanılarak tekrar PCR yapılmış (Tablo 2.4. ve Tablo 2.5.) ve PCR ürünleri dizi analizi için Genoks (Ankara)’a gönderilmiştir. Dizi analiz 30

sonuçları Gen Bankası’nın verileri ile karşılaştırılarak her bir bandı oluşturan bakteri tanımlanmıştır.

2.2.6. İstatistiksel analiz

Sucuk örneklerinin kalite ve teknolojik özellikleri üzerine, bakteri kültürü ilavesinin etkisini belirlemek amacıyla, elde edilen veriler SPSS 18.0 (SPSS Inc, USA) paket programı kullanılarak değerlendirilmiştir. Araştırmada farklı bakteri kültürleri (Lb. sakei, Lb. curvatus, Lb. plantarum, S. carnosus ve S. xylosus) ve olgunlaşma süresi (0, 4, 8, 12. günler) faktör olarak seçilmiştir. Elde edilen veriler SPSS 18 paket programı kullanılarak varyans analizine tabii tutulmuştur. Tek ve iki faktör varyans analizine tabi tutulan veri ortalamaları arasındaki fark α=0.05 önem düzeyinde Duncan çoklu karşılaştırma testi kullanılarak belirlenmiştir. 31

3. BÖLÜM

BULGULAR

3.1. Mikrobiyolojik Analizlere Ait Bulgular

Kontrol grubu ve bakteri kültürü ilave edilerek üretilen sucuk örneklerinde olgunlaşmanın 0., 4., 8. ve 12. günlerinde toplam laktik asit bakteri sayımı yapılmıştır. Olgunlaşmanın son gününde (12. gün) ise, toplam laktik asit bakteri sayımına ilave olarak, toplam mezofilik aerobik bakteri, toplam küf-maya ve toplam Enterobacteriaceae sayısı da belirlenmiştir. Alınan sonuçların ortalama ve standart sapma değerleri Tablo 3.1. ve Tablo 3.2.’de verilmiştir.

3.1.1. Laktik asit Bakterilerinin (LAB) Sayısı

Sucuk örneklerinde tespit edilen LAB sayısının fermentasyon süresince değişimi Şekil 3.1.’de gösterilmiştir. Fermentasyonun 0. gününde tüm örneklerde LAB sayısının 6.30- 6.98 arasında değiştiği tespit edilmiştir. Lb. plantarum+Lb. curvatus+ S. xylosus bakterilerini içeren PC2 örnek grubu, Lb. plantarum+Lb. sakei+ S. xylosus bakterilerini içeren PS2 örnek grubu ile Lb. plantarum+Lb. curvatus+ S. carnosus bakterilerini içeren PC1 örnek gruplarında tespit edilen LAB sayısı kontrol grubu örneklerden önemli derecede (p<0.05) düşük bulunmuş olmasına rağmen PS (Lb. plantarum+Lb. sakei), PC (Lb. plantarum+Lb. curvatus), CS1 (Lb. curvatus+Lb. sakei+S. carnosus) ve CS2 (Lb. curvatus+Lb. sakei+S. xylosus) grubu örneklerinin LAB sayısı kontrol grubu örneklerden önemli derecede (p<0.05) yüksek olduğu belirlenmiştir (Tablo 3.1.). Fermentasyonun 4. gününde tüm sucuk örneklerinde LAB sayısının 8.33-8.84 log kob/g arasında değişen değerlere yükseldiği tespit edilmiştir. PS ve PS2 grubu örneklerin LAB sayılarının diğer örnek gruplarına kıyasla önemli derecede (p<0.05) yüksek, CS ve PC grubu örneklerinin ise diğer örnek gruplarına göre önemli derecede düşük (p<0.05) olduğu gözlenmiştir. Kontrol grubu örnekler ile CS1, PC2 ve CS2 grubu örnekler arasında farklılığın ise önemli olmadığı (p>0.05) tespit edilmiştir (Tablo 3.1.).

Fermentasyonun 8. gününde tüm sucuk örneklerinde LAB sayısının 8.38-8.68 log kob/g arasında değiştiği belirlenmiştir. Yine kontrol grubu örnekler ile bakteri kültürü ilave 32

edilmiş örnekler arasındaki farklılığın da istatistiki olarak önemli olmadığı (p>0.05) belirlenmiştir (Tablo 3.1.).

Fermentasyonun 12. gününde LAB sayısını tüm örnek gruplarında 8.38-8.79 log kob/g arasında değiştiği gözlenmiştir. Fermentasyonun son gününde en düşük LAB sayısı kontrol grubu örneklerde (6.38 log kob/g) tespit edilmiş ve PS, PC, PS1, PC1, CS1, PS2 ve PC2 grubu örneklerden önemli derecede (p<0.05) düşük olduğu gözlenmiştir (Tablo 3.1.)

Şekil 3.1. Sucuk örneklerinin LAB sayılarının fermentasyon süresince değişimi. PS: Lb.plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei+ S. carnosus; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus.

33

3.1.2. Toplam Mezofilik Aerobik Bakteri (TMAB) Sayısı

TMAB sayısının, sucuk örneklerinde belirlenen değerleri Tablo 3.2.’ de verilmiştir. Fermentasyonun sonunda TMAB sayısının tüm örnek gruplarında 8.59-9.16 log kob/g arasında değiştiği gözlenmiştir. Fermentasyonun son gününde en düşük TMAB sayısı kontrol grubu örneklerde (8.59 log kob/g) tespit edilmiş ve bu sayının PS, PC, PS1, PC1, PS2 ve PC2 grubu örneklerden önemli derecede (p<0.01) düşük olduğu gözlenmiştir. En yüksek TMAB sayısı ise PC2 grubu örneklerde (9.16 log kob/g) belirlenmiş ve K, PC, CS, PS1, PC1, CS1 ve CS2 örnek gruplarından önemli derecede (P<0.01) yüksek olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.2.).

3. 1. 3. Toplam Enterobacteriaceae Sayısı

Kontrol grubu ve bakteri kültürü ilave edilen sucukların olgunlaşma sonunda belirlenen Enterobacteriaceae sayıları Tablo 3.2.’de verilmiştir. Fermentasyonun sonunda tüm sucuk örneklerinde Enterobacteriaceae sayısının 3.15-4.29 log kob/g arasında değiştiği belirlenmiştir. Tüm örnek grupları içerisinde en yüksek Enterobacteriaceae sayısı (4.24 log kob/g) kontrol grubu örneklerde tespit edilmiştir. Bakteri kültürü ilave edilmiş örnek gruplarında ise CS grubu örneklerin Enterobacteriaceae sayılarının (4.30 log kob/g), diğer örnek gruplarına kıyasla önemli derecede (p<0.01) yüksek olduğu, PS2 grubu örneklerin Enterobacteriaceae sayısının (3.05 log kob/g) ise diğer örnek gruplarından önemli derecede düşük (p<0.01) olduğu gözlenmiştir. Ayrıca, kontrol grubu örnekler ile CS1, PC2 ve CS2 grubu örnekler arasındaki farklılığın önemli olmadığı (p>0.01) gözlemlenmiştir (Tablo 3.2.).

3.1. 4. Maya Küf Sayısı

Tüm sucuk örneklerinde toplam maya küf sayısının 4.10-5.38 log kob/g arasında değiştiği tespit edilmiştir. PC2 grubu örneklerin (5.38 log kob/g) maya küf sayılarının diğer örnek gruplarına göre önemli derecede yüksek olduğu belirlenirken, CS, CS1 ve PS1 (4.10 log kob/g) örnek gruplarının maya küf sayılarının diğer örnek gruplarına göre önemli derecede düşük olduğu tespit edilmiştir. Diğer taraftan kontrol, PS, PC örnek grupları arasındaki farklılığın önemli olmadığı (p>0.01) tespit edilmiştir. 34

Tablo 3.1. Fermentasyon süresince sucuk örneklerine ait LAB sayısının değişimi (log kob/g)

Süre Ortalama (gün) KONTROL PS PC CS PS 1 PC 1 CS 1 PS 2 PC 2 CS 2 Değer Önem Düzeyi

0. 6.74 d ±0.05 6.90 c ±0.04 6.92 c±0.02 6.74 d±0.06 6.78d±0.0 6.30f ±0.08 6.98c±0.03 6.54e±0.08 6.30f±0.06 6.95a±0.06 6.71 *

4. 8.52 d ±0.06 8.84 a ±0.03 8.68 bc±0.03 8.35 ef ±0.01 8.49d±0.07 8.33f±0.01 8.58cd±0.1 8.74ab±0.04 8.51d±0.02 8.47de±0.06 8.55 * 8. 8.51 abcd ±0.05 8.61 ab ±0.09 8.5 abcd ±0.07 8.58 ab ±0.04 8.56abc±0.08 8.38d ±0.11 8.39cd±0.03 8.57ab±0.15 8.68a±0.05 8.48bcd±0.02 8.53 ** 12. 8.38 e ±0.08 8.79 a ±0.05 8.68abc±0.04 8.54 d ±0.01 8.68abc ±0.03 8.74ab ±0.06 8.61cd±0.01 8.72ab±0.18 8.73ab±0.04 8.62cd±0.01 8.65 *

PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; PS: Lb. plantarum + Lb. sakei ; CS: Lb. curvatus + Lb. sakei ; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei +S. carnosus ; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus . Aynı satırdaki farklı harfler. veriler arasında istatistiksel bir fark olduğunu göstermektedir (*:p<0.05 seviyesinde önemli; **: p<0.01 seviyesinde önemli).

Tablo 3. 2. Fermentasyon sonunda sucuk örneklerine ait mikrobiyolojik sayım sonuçları (log kob/g)

Mikrobiyolojik Ortalama Analizler K PS PC CS PS 1 PC 1 CS 1 PS 2 PC 2 CS 2 Değer Önem Düzeyi

TMAB 8.59c±0.15 9.02a±0.02 8.81b±0.04 8.81b±0.04 8.81b±0.04 8.81b±0.04 8.60c±0.08 9.08a±0.12 9.16a±0.12 8.60c±0.12 8.83 **

Küf-Maya 4.70c±0.12 4.38cde±0.12 4.54cd±0.33 4.10f±0.03 4.15f±0.03 5.06b±0.02 4.10f±0.05 4.30de±0.05 5.38a±0.12 4.22e±0.10 4.50 **

Enterobacteriaceae 4.24ab±0.01 3.65d±0.06 3.15e±0.21 4.29a±0.06 3.59d±0.15 3.30e±0.15 3.70d±0.07 3.05f±0.00 3.97c±0.09 4.02bc±0.02 3.70 **

PS:Lb.plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus ; CS: Lb. curvatus+ Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei+ S. carnosus; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus . Aynı satırdaki farklı harfler, veriler arasında istatistiksel bir fark olduğunu göstermektedir (*:p<0.05 seviyesinde önemli; **:p<0.01 seviyesinde önemli). 35

3.2. Fizikokimyasal Analizlere Ait Bulgular

Bütün örnek gruplarında olgunlaşmanın 0., 4., 8. ve 12. günlerinde pH, su aktivitesi ve % kuru madde analizleri, olgunlaşmanın son günü olan 12. gününde ise asitlik, kalıntı nitrit miktarı, renk ölçümü, duyusal analizler ile uçucu bileşiklerin analizleri gerçekleştirilmiş elde edilen sonuçların ortalamaları, standart sapma değerleriyle birlikte Tablo 3.3’de verilmiştir.

3. 2. 1. pH Değeri

Fermente edilmiş sucuk örneklerinde fermentasyon süresince gözlenen pH değeri, Şekil 3.2.’deki gibi bir değişim göstermiştir. Fermentasyonun 0. gününde tüm örneklerin pH değerleri 5.84-5.95 aralığında değişmiştir. Tüm örnek grupları içerisinde CS1 grubu örneğin pH değerinin (5.97) önemli derecede (p<0.01) yüksek olduğu, kontrol, PS1, PC1 ve PS grubu örneklerde ölçülen pH değerlerinin ise diğer tüm örnek gruplarından önemli derecede (p<0.01) düşük olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.3.).

Fermentasyonun 4. gününde ise örneklerin sahip olduğu pH değerleri 4.81-5.04 arasında yer almıştır. PC grubu örneğin pH değerinin (4.81) diğer tüm örnek grupları ile kıyaslandığında önemli derecede düşük olduğu görülmüştür. Kontrol grubunun pH değerinin (5.04) ise diğer örnek gruplarına kıyasla önemli derecede yüksek (p<0.01) olduğu tespit edilmiştir. Diğer taraftan PS, CS ve CS1 grubu örneklerde istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık gözlenmemiştir (Tablo 3.3.).

Fermentasyonun 8. günü pH değerleri incelendiğinde tüm örneklerin pH değerinin 4.85-5.39 arasında değiştiği, PS örnek grubunun (4.85), diğer tüm örnek gruplarına kıyasla önemli derecede düşük olduğu sonucuna varılmıştır. Tüm örnek grupları içerisinde en yüksek pH değeri PC2 örnek grubunda belirlenmiştir. PC, CS, PS1, CS1 ve PS2 grubu örneklerde ise istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık gözlenmemiştir (Tablo 3.3.).

Fermentasyonun son gününde tüm örneklerin pH değerinin 4.96-5.45 arasında değiştiği gözlenmiştir. PS grubu örneğin pH değerinin (4.96) kontrol grubuna kıyasla önemli derecede (p<0.01) düşük olduğu sonucuna varılmıştır. Kontrol grubu ise 36

(5.45) CS2 grubu hariç diğer tüm örnek gruplarına kıyasla önemli derecede yüksek (p<0.01) pH değeri vermiştir. Diğer taraftan PS, PC, CS, PS1, PC1 CS1, PS2 ve PC2 grubu örneklerde istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık gözlenmemiştir (Tablo 3.3.).

Şekil 3.2. Sucuk Örneklerinin Fermentasyon Süresince pH Değerlerinin Değişimi PS: Lb.plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei+ S. carnosus; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus.

3. 2. 2. Su Aktivitesi(aw) değeri

Gıdalarda mikrobiyal güvenliğin göstergelerinden biri olan su aktivitesi değeri, kontrol ve bakteri katılmış sucuk örneklerinde Şekil 3.3’deki gibi bir değişim göstermiştir.

Fermentasyonun 0. gününde örneklerin (aw) değeri, 0.95-0.96 aralığında değiştiği belirlenmiştir. Fermentasyonun 0. günü en düşük su aktivitesi değeri PS, CS ve PS1 (0.95) örnek gruplarında belirlenirken, bu değerin diğer tüm örnek gruplarında tespit edilen su aktivitesi değerlerine kıyasla önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu bulunmuştur (Tablo 3.3.).

Fermentasyonun 4. gününde örneklerin (aw) değeri, 0.93-0.96 aralığında bulunmuştur. En düşük su aktivitesi değeri (0.93) kontrol grubu örneklerde gözlenmiş ve bu değerin 37

diğer tüm örnek gruplarına göre önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu sonucuna ulaşılmıştır. En yüksek su aktivitesi değeri (0.96) PS1, PC1, CS1, PS2 ve PC2 örnek gruplarında belirlenmiş ve bu değerin diğer tüm örnek gruplarının sahip olduğu su aktivitesi değerlerine kıyasla önemli derecede yüksek (P<0.01) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.3.).

Fermentasyonun 8. gününde (aw) değerlerinin 0.92-0.94 aralığında değiştiği gözlenmiştir. En düşük su aktivitesi değeri (0.92) kontrol, PC, PC1 ve PS grubu örneklerinde gözlenmiş, bu değerin diğer tüm örnek gruplarına kıyasla önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu tespit edilmiştir. PS1, PS2, PC2 ve CS2 grubu örneklerde belirlenen en yüksek (0.94) su aktivitesi değerinin diğer tüm örnek gruplarına kıyasla önemli derecede yüksek (P<0.01) olduğu bulunmuştur

Fermentasyonun 12. gününde örneklerin su aktivitesi (aw) değeri, 0.89-0.92 aralığında değişmiştir. En düşük su aktivitesi değeri (0.89) PS grubu örneklerinde gözlenirken, bu değerin diğer tüm örnek gruplarına kıyasla önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu tespit edilmiştir. PS2 ve CS2 grubu örneklerde ise diğer tüm örnek gruplarına kıyasla

önemli derecede yüksek (P<0.01) aw değeri tespit edilmiştir (Tablo 3.3.).

Şekil 3.3. Sucuk örneklerinin fermentasyon süresince su aktivitesi değerlerinin değişimi PS: Lb.plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei+ S. carnosus; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus.

38

3. 2. 3. Kurumadde miktarı

Fermente edilmiş sucuk örneklerinde gözlenen kuru madde miktarı Şekil 3.4’ de gösterilmiştir. Bu şekildeki verilere göre fermentasyonun 0. günü örneklerin kuru madde miktarı, %33.86-39.96 aralığında değiştiği, en düşük kuru madde değerinin (%33.86) PC örnek gruplarında belirlendiği ve bu değerin PS, CS, PS1, CS1 ve CS2 örnek gruplarına kıyasla önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu sonucuna ulaşılmıştır. En yüksek kuru madde değerinin Kontrol (%39.96) ise, PC, CS1, PS2 ve PC2 örnek gruplarında belirlendiği, PS, CS, PS1, PC1, CS1 ve CS2 örnek gruplarında istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık olmadığı gözlenmiştir (Tablo 3.3.). Ayrıca fermentasyon süresi boyunca kuru madde değerlerinde artış gözlenmiştir.

Fermentasyonun süregeldiği 4. günde örneklerdeki kuru madde miktarı, %39.88-43.58 aralığında değişmektedir. En düşük kuru madde değerinin (%39.88) PC2 grubu örneklerde belirlenirken, en yüksek (%43.58) kuru madde değerinin kontrol gruplarında belirlenmiştir. Örnek gruplarında istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık gözlenmemiştir (Tablo 3.3.).

Fermentasyonun 8. günü örneklerin kuru madde miktarı, %46.36-58.46 aralığında değiştiği gözlenmiştir. Gözlenen değerlere bakıldığında en düşük kuru madde değerinin (%46.36) PC2 örnek gruplarında belirlenirken, bu değerin diğer örnek gruplarında bulunan kurumadde değerlerine kıyasla önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu tespit edilmiştir. En yüksek (%58.46) kuru madde değerinin ise PC örnek gruplarında belirlenirken, bu değerin diğer örnek gruplarıyla kıyaslandığında istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık gözlenmemiştir (Tablo 3.3.). Ayrıca Kontrol, CS, PS1, PC1, CS1 ve PS2 örnek gruplarında istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık olmadığı gözlenmiştir (Tablo 3.3.).

Fermentasyonun son günü olan 12. gününde örneklerde tespit edilen kuru madde miktarı, %58.08-59.96 aralığında değiştiği, en düşük kuru madde değerinin (%58.08) PC2 örnek gruplarında belirlenirken, en yüksek (%59.96) kuru madde değerinin PC1 örnek gruplarında belirlendiği bulunmuştur. Örnek gruplarından elde edilen veriler 39

değerlendirildiğinde istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık bulunmamıştır (Tablo 3.3.).

Şekil 3.4. Sucuk örneklerinin fermentasyon süresince kuru madde değerlerinin değişimi PS: Lb.plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei+ S. carnosus; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus. 40

Tablo 3.3. Sucuk örneklerinin fermentasyon süresince fizikokimyasal analiz sonuçları

Fizikokimyasal Süre Ortalama Ö. D Özellikler (gün) Kontrol PS PC CS PS 1 PC 1 CS 1 PS 2 PC 2 CS 2 Değer

0. 5.84e±0.00 5.85e±0.01 5.89c±0.00 5.88cd±0.01 5.84e±0.01 5.84e±0.01 5.97a±0.01 5.88d±0.01 5.95b±0.00 5.89cd±0.01 5.88 **

pH 4. 5.04 a ±0.01 4.85f±0.01 4.81 g ±0.01 4.85 f ±0.01 4.84 f±0.01 4.97 c ±0.01 4.97c±0.01 4.91d ±0.01 5.02 b ±0.01 4.86 e±0.01 4.91 **

8. 5.18 c ±0.03 4.85 g ±0.01 5.03 e ±0.02 5.01 e f±0.01 5.03 e ±0.01 5.24b±0.01 4.98f±0.03 5.04 e ±0.01 5.39 a ±0.02 5.09d±0.01 5.08 ** 12. 5.45a±0.01 4.96d±0.01 5.21bc±0.04 5.09cd±0.01 5.13 bcd±0.02 5.26bc±0.01 5.09cd±0.01 5.15bcd±0.07 5.45a±0.21 5.3ab±0.09 5.19 **

0 0.96a±0.00 0.95d±0.00 0.96ab±0.00 0.95c±0.00 0.95d±0.00 0.96a±0.00 0.96 ab ±0.00 0.96ab±0.00 0.96bc±0.00 0.96ab±0.00 0.95 **

Su 4 0.93d ±0.00 0.94 c ±0.00 0.95b±0.00 0.95b±0.00 0.96 a ±0.00 0.96 a ±0.00 0.96 a ±0.00 0.96 a ±0.00 0.96 a ±0.00 0.95 a ±0.00 0.95 ** aktivitesi 8 0.92f±0.00 0.92g±0.00 0.92f±0.00 0.93d±0.00 0.94ab±0.00 0.92e±0.00 0.93c±0.00 0.94b±0.00 0.94 a ±0.00 0.94 ab±0.00 0.93 ** 12 0.91de±0.00 0.89g±0.00 0.91cd±0.00 0.91cd±0.00 0.91c±0.00 0.9f±0.00 0.90f±0.00 0.92b±0.00 0.90e±0.00 0.92a±0.00 0.90 **

0 36.66bc±0.57 38.38ab±0.26 33.86c±0.26 39.96a±2.57 38.45ab±0.01 36.75abc±0.07 38.77ab±0.27 35.11c±0.16 34.74c±0.01 38.79ab±0.45 37.14 *

Kuru Madde 4 43.58a±0.23 43.11 a±0.78 43.07 a ±0.45 42.41ab±0.96 41.96ab±0.04 41.85 ab±1.03 43.44 a±0.41 42.26ab±2.32 39.88b±1.85 42.94 a±0.06 42.45 Ö.d. (%) 8 51.01cd±2.01 55.99b±0.18 58.46 a ±0.18 52.08 c±1.18 48.87 d±0.01 49.67 cd±1.64 51.49 c±1.20 51.85 c±0.27 46.36e±0.58 54.92b±0.48 52.07 **

12 58.5 a ±0.81 59.48 a±0.03 58.85 a ±0.57 58.88 a±0.76 58.82 a±0.87 59.13 a±1.64 59.96 a±2.08 58.89 a±0.39 58.08 a±1.49 58.48 a±0.64 58.90 Ö.d. PS:Lb.plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei+ S. carnosus; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus. Aynı satırdaki farklı harfler, veriler arasında istatistiksel bir fark olduğunu göstermektedir (*:p<0.05 seviyesinde önemli; **:p<0.01 seviyesinde önemli; Ö.d.:önemli değil). 41

3. 2. 4. Titrasyon Asitliği değeri

Araştırmada fermente sucuklarda gözlenen titrasyon asitliği değerleri Tablo 3.4’de verilmiştir. Olgunlaşmanın son gününde elde edilen titrasyon asitliği değerleri incelendiğinde, değerlerin 1.25-1.80 asit aralığında değiştiği görülmektedir. En düşük titrasyon asitliği değerinin (1.25) PC1 örnek gruplarında olduğu, bu değerin PS1 grubu hariç diğer örnek gruplarının sahip olduğu değerlere kıyasla önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu sonucuna ulaşılmıştır. En yüksek titrasyon asitliği (1.80) değeri ise PC2 örnek gruplarında bulunduğu ve bu değerin CS, PS1, PC1 ve CS1 örnek gruplarının titrasyon asitliği değerleri ile kıyaslandığında istatiksel açıdan önemli (P<0.01) bir farklılık gözlendiği tespit edilmiştir (Tablo 3.4.). Kontrol, PS, PC, CS, CS1, PS2 ve CS2 örnek gruplarında istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık olmadığı gözlemlenmemiştir (Tablo 3.4.).

3. 2. 5. Kalıntı nitrit miktarı

Gıda güvenliğinde bir ölçüt olarak kabul edilen kalıntı nitrit miktarı, fermente edilmiş sucuk örneklerinde olgunlaşma süresince Tablo 3.4’de görüldüğü gibi bir değişim göstermiştir. Olgunlaşmanın son gününde kalıntı nitrit miktarı değerleri incelendiğinde değerlerin 6.31-14.65 ppm aralığında değiştiği görülebilir. En düşük kalıntı nitrit miktarı değerinin (6.31 ppm) PC örnek gruplarında belirlenirken, bu değerin diğer örnek gruplarına göre kıyaslandığında önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu sonucuna ulaşılmıştır. En yüksek kalıntı nitrit miktarı (14.65 ppm) ise CS1 örnek gruplarında belirlenirken, bu değerin CS2 grubu hariç diğer örnek gruplarına göre kıyasla önemli derecede yüksek (P<0.01) olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Kontrol, PS ve CS örnek gruplarında istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık gözlenmediği ve PS1, PC1, PS2 ve PC2 örnek gruplarında da istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık gözlenmediği belirlenmiştir (Tablo 3.4). 42

3. 2. 6. Renk değerleri

Gıda endüstrisinde üründe kalitesinin bir ölçütü olarak kabul edilen CIE L*, a* ve b* renk ölçüm değerleri, çalışmada sucuk örneklerinin olgunlaşması sonunda incelenerek elde edilen sonuçların ortalamaları standart sapma değerleriyle birlikte Tablo 3.5.’de verilmiştir.

Olgunlaşmanın son gününde L* değeri açısından, en açık renkli örneğin CS 2 (37.33 L*), en koyu renkli örneğin ise kontrol grubu örnekte (34.23 L*) olduğu tespit edilmiştir. CS2 grubu örneğin Kontrol ve CS grubu örnekler ile kıyaslandığında önemli derecede yüksek olduğu (P<0.01) sonucuna ulaşılmıştır. Kontrol grubu örneğin L* değeri CS ve PC2 grubu örnekler hariç diğer örnek gruplarının L* değerlerine göre kıyaslandığında önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.5.).

Örnekler arasında en düşük a* değerini PC (14.31 a*) örneği alırken, en yüksek a* değerini ise PS (15.89 a*) grubu örnek almıştır. PC örnek grubunun a* değeri, Kontrol, PS, PS1, PS2 ve CS2 grubu örneklerin a* değeri ile kıyaslandığında önemli derecede düşük olduğu (P<0.01), Kontrol grubu örneğin a* değeri ise PS, PS1, PS2 ve CS2 grubu örneklerin a* değerleri hariç diğer örnek gruplarına kıyasla önemli derecede yüksek (P<0.01) olduğu gözlenmiştir (Tablo 3.5.).

En düşük b* değerlerine sahip sucuk örneği PC (1,23 b*); en yüksek b* değerlerine sahip sucuk örneği ise CS 2 (1.99 b*) olarak tespit edilmiştir. PC grubu örneğin b* değeri CS1 örnek grubunun sahip olduğu b* değeri ile kıyaslandığında önemli derecede yüksek olduğu (P<0.01) gözlenirken, CS2 grubu örneğin b* değeri ise diğer örnek gruplarının sahip olduğu b* değerlerine kıyasla önemli derecede farklılık (P>0.05) olmadığı gözlenmiştir (Tablo 3.5.).

43

Tablo 3. 4. Sucuk örneklerine ait fermentasyon sonundaki fizikokimyasal analiz sonuçları

Fizikokimyasal KONTROL PS PC CS PS 1 PC 1 CS 1 PS 2 PC 2 CS 2 Ortalama Önem Özellikler Değer Düzeyi Yüzde Asitliği 1.59abc±0.15 1.67ab±0.06 1.62abc±0.22 1.52bc±0.14 1.43cd±0.04 1.25d±0.07 1.55bc±0.06 1.73ab±0.06 1.80a±0.01 1.73ab±0.02 1.58 **

Kalıntı nitrit 8.39d±0.34 8.65d±0.14 6.31e±0.81 7.92d±1.33 12.17bc±0.39 10.68c±0.62 14.65a±1.02 10.61c±0.53 11.31c±1.06 13.24ab±0.08 10.40 ** (ppm)

PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus ; CS: Lb. curvatus+ + Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. carnosus;PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus . Aynı satırdaki farklı harfler, veriler arasında istatistiksel bir fark olduğunu göstermektedir (*:p<0.05 seviyesinde önemli; **:p<0.01 seviyesinde önemli; Ö.d.: Önemli değil).

Tablo 3.5. Fermentasyonun son gününde sucuk örneklerine ait renk ölçüm değerleri

Kontrol PS PC CS PS 1 PC 1 CS 1 PS 2 PC 2 CS 2 Ortalama Önem Düzeyi Değer L* 34.23c±0.46 36.05ab±0.33 36.22ab±1.56 35.42bc±0.79 36.02ab±0.70 36.87ab±0.08 37.33a±0.27 37.01ab±0.78 35.78abc±0.24 37.33a±0.35 36.22 ** a* 15.38abc±0.42 15.89a±0.30 14.31e±0.09 14.89cde±0.18 15.50ab±0.18 14.77de±0.28 14.53e±0.09 15.23bcd±0.03 14.70de±0.21 15.68ab±0.32 15.08 ** b* 1.82b±0.02 1.58 b ±0.02 1.23 b ±0.26 1.96 b ±0.95 1.69ab±0.17 1.37 b ±0.37 1.38a±0.09 1.72 b ±0.08 1.65 b ±0.85 1.99±0.01ab 1.63 * PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus ; CS: Lb. curvatus+ Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei+ S. carnosus; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus . Aynı satırdaki farklı harfler, veriler arasında istatistiksel bir fark olduğunu göstermektedir (*:p<0.05 seviyesinde önemli; **:p<0.01 seviyesinde önemli; Ö.d.:önemli değil).

44

3. 2. 7. Duyusal analizlere ait bulgular

Gıda ürünlerinin kabul edilebilirliğinin bir göstergesi olan duyusal özelliklerden; dış yüzey rengi, kesit yüzey rengi, tekstür, kesit yüzey görünüşü, kabuk oluşumu, tat, koku, aroma ve genel beğeni düzeyleri açısından örnekler, olgunlaşmanın son günü (12. Gün) panelistler tarafından değerlendirmeye tabi tutulmuştur. Duyusal analiz, standart kalınlıkta dilimlenen hem pişirilmemiş ve hem de elektrikli ızgarada 2 dakika süre ile pişirilmiş 10 farklı sucuk örneklerinde tekrarlanmıştır. Elde edilen sonuçlar ortalama ve standart sapma değerleriyle birlikte Tablo 3.6.’da verilmiştir.

3. 2. 7. 1 Kesit yüzey rengi

Pişirilmiş ve pişirilmemiş sucuk örneklerinde belirlenen kesit yüzey rengi değerleri Tablo 3.6. ve Tablo 3.7.’de verilmiştir. Olgunlaşmanın son gününde pişirilmemiş sucuk örneklerine bakıldığında en düşük kesit yüzey rengi değerinin PC 2 (6.68) örneğinde, en yüksek değerin ise CS (7.87) örneklerinde olduğu tespit edilmiştir. İstatistiksel açıdan veriler değerlendirildiğinde ise örnekler arasındaki farkın önemsiz (P>0.05) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.6.). Sucuk örneklerine ait kesit yüzey rengi değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS, PS ve CS 2 örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir (Şekil 3.5.) .

Pişirilmiş sucuk örneklerinde olgunlaşmanın son gününde test edilen kesit yüzey rengi değerleri incelendiğinde de en düşük kesit yüzey rengi değerinin CS 1 (7.42) örneğinde, en yüksek değerin ise CS (8,66) örneklerinde olduğu tespit edilmiştir. CS grubu örneğin PC1, CS1, PS2, PC2 ve CS2 grubu örneklere göre önemli derecede (P<0.01) yüksek olduğu belirlenirken; CS1 grubu örneğin kontrol, PS, PC, PS1 örnek gruplarıyla kıyaslandığında önemli derecede düşük olduğu sonucuna varılmıştır (Tablo 3.7.). Pişirilmiş sucuk örneklerine ait kesit yüzey rengi değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde örnekler arasında sırasıyla CS ve PC örneklerinin en yüksek değerleri aldığı görülmüştür (Şekil 3.5.).

45

Şekil 3. 5. Laboratuarda üretilen çiğ ve pişirilmiş sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda kesit yüzey rengi değerlerinin örnekler arasındaki değişimi PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ + Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus.

3. 2. 7. 2. Dış yüzey rengi

Olgunlaşmanın son gününde hem pişirilmiş ve hem de pişirilmemiş sucuk örneklerinde belirlenen dış yüzey rengi değerleri Tablo 3.6. ve Tablo 3.7.’de verilmiştir. Pişirilmemiş sucuklara ait dış yüzey rengi değerleri incelendiğinde, en düşük dış yüzey rengi değerinin PC (7.25) örneğinde, en yüksek değerin ise CS 2 (8.00) örneklerinde olduğu tespit edilmiştir. Örnekler arasında istatistiki olarak önemli (P>0.05) derecede fark olmadığı tespit edilmiştir (Tablo 3.6.). Sucuk örneklerine ait dış yüzey rengi değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde de örnekler arasında sırasıyla CS 2 ve PC1 örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir (Şekil 3.6.) .

Pişirilmiş sucuk örneklerinde test edilen dış yüzey rengi değerleri incelendiğinde de en düşük dış yüzey rengi değerinin CS 1 (7.42) örneğinde, en yüksek değerin ise CS (8,66) örneklerinde olduğu tespit edilmiştir. CS grubu örneklerin, CS1, PS2 ve PC2 grubu örneklere göre önemli (P<0.01) derecede yüksek bulunmuştur (Tablo 3.7.). Kontrol grubu örnek ile PS, PC, CS, PS1 ve PC1 grup örneklere kıyasla önemli derecede farklılıkolmadığı görülmüştür. Pişirilmiş sucuk örneklerine ait dış yüzey rengi değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde örnekler arasında sırasıyla CS ve PS örneklerinin en yüksek değerleri aldığı tespit edilmiştir (Tablo 3.7.).

46

Şekil 3.6. Laboratuarda üretilen çiğ ve pişirilmiş sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda dış yüzey rengi değerlerinin örnekler arasındaki değişimi PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ + Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus.

3. 2. 7. 3. Kesit yüzey görünüşü

Pişirilmemiş sucuk örneklerinde test edilen kesit yüzey görünüşü değerleri Tablo 3.6.’de verilmiştir. Olgunlaşmanın son gününde en düşük kesit yüzey görünüşü değerlerini PS 2 (6.92), en yüksek değeri ise CS (8,16) örneğinin aldığı belirlenmiştir. Elde edilen veriler istatistiksel açıdan değerlendirildiğinde ise örnekler arasındaki farkın önemli (P<0.01) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.6.). Sucuk örneklerine ait kesit yüzey görünüşü değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS ve CS 2 örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir (Şekil 3.7.).

47

Tablo 3.6. Fermentasyon süresi sonunda çiğ sucuk örneklerine ait duyusal analiz istatistik sonuçları

Ortalama ÇİĞ SUCUK KONTROL PS PC CS PS 1 PC 1 CS 1 PS 2 PC 2 CS 2 Önem Değer Düzeyi Kesit yüzey rengi 7.50ab±0.52 7.66ab±0.49 7.58b±0.79 8.00ab±0.42 7.58ab±0.51 7.33ab±0.77 7.50ab±0.79 7.33ab±0.88 7.16b±0.93 7.66ab±0.77 7.53 ö.d. Dış yüzey rengi 7.66ab±0.65 7.58ab±0.51 7.25ab±0.45 7.58a±0.66 7.50ab±0.89 7.66ab±0.98 7.50ab±0.79 7.50b±1.00 7.58ab±0.90 8.00ab±0.42 7.58 ö.d. Kesit Yüzey görünüşü 7.58cd±0.51 7.66e±0.49 8.00abcd±0.42 8.16ab±0.57 7.75de±0.45 7.50bcd±0.68 7.25abcd±0.45 6.92abc±0.67 7.66a±0.49 8.08abcd±0.79 7.65 ** Kabuk oluşumu 7.66a±0.65 7.50a±0.90 7.42a±1.37 7.83a±0.93 7.42a±1.16 7.58a±0.90 7.00a±0.73 7.33a±0.98 7.33a±1.15 7.50a±1.31 7.45 ö.d. Tekstür 7.66ab±0.49 7.83c±0.90 7.92abc±0.66 8.00ab±0.60 7.83bc±0.71 7.83ab±0.71 7.25ab±0.75 7.00ab±1.04 7.50a±0.52 7.66ab±0.98 7.65 * Sucuk tat ve aroması 7.58c±0.51 7.75bc±0.75 7.92bc±0.79 8.00abc±0.42 7.58bc±0.51 7.00ab±1.04 7.25ab±0.62 7.11a±0.79 7.16a±0.71 7.58abc±0.79 7.49 **

Genel Beğeni 7.58cd±0.51 7.66e±0.49 7.83cde±0.38 8.16bc±0.39 7.50de±0.52 7.33bc±0.49 7.08bc±0.51 6.83ab±0.57 7.25a±0.62 7.66bcd±0.77 7.49 ** PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus ; CS: Lb. curvatus+ + Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei +S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus . Aynı satırdaki farklı harfler, veriler arasında istatistiksel bir fark olduğunu göstermektedir (*:p<0.05 seviyesinde önemli; **:p<0.01 seviyesinde önemli; ö.d.: önemli değil).

Tablo 3.7. Fermentasyon süresi sonunda pişmiş sucuk örneklerine ait duyusal analiz sonuçları

PİŞMİŞ SUCUK KONTROL PS PC CS PS 1 PC1 CS1 PS 2 PC 2 CS 2 Ortalama Değer Önem Düzeyi Kesit yüzey rengi 8.25cd±0.86 8.16bcd±0.93 8.25cd±0.96 8.66bcd±0.49 8.50d±0.79 7.66abc±0.49 7.42ab±0.66 7.92ab±0.99 7.58a±0.99 7.83ab±0.71 8.02 ** Dış yüzey rengi 8.25abc±0.86 8.42bc±0.66 8.33c±0.77 8.67abc±0.49 8.50c±0.79 7.92ab±0.79 7.42ab±0.66 7.83ab±1.02 7.50a±1.17 7.92ab±0.66 8.07 ** Tekstür 7.66a±0.77 7.41a±0.51 8.16a±0.71 8.00a±0.73 7.91a±0.90 8.16a±0.71 8.00a±0.42 7.66a±0.98 7.58a±1.37 7.83a±0.93 7.84 ö.d. Sucuk tat ve aroması 7.41abc±0.51 7.25bc±0.75 8.00abc±0.85 8.25c±0.86 7.83bc±0.83 7.50abc±1.78 7.33bc±0.49 7.16ab±1.71 7.72a±1.10 7.08abc±0.79 7.55 * Genel Beğeni 7.75abc±0.75 7.25c±0.62 8.16abc±0.71 8.08bc±0.90 7.91bc±0.90 7.75abc±1.41 7.33c±0.49 7.25a±0.75 7.80ab±1.13 7.33abc±0.65 7.66 *

PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus ; CS: Lb. curvatus+ + Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei +S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus . Aynı satırdaki farklı harfler, veriler arasında istatistiksel bir fark olduğunu göstermektedir (*:p<0.05 seviyesinde önemli; **:p<0.01 seviyesinde önemli; ö.d.: önemli değil). 48

Şekil 3.7. Laboratuarda üretilen çiğ sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda kesit yüzey görünüş değerlerinin örnekler arasındaki değişimi PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ + Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus.

3. 2. 7. 4. Kabuk oluşumu

Pişirilmemiş sucuk örneklerinde test edilen kabuk oluşumu parametresine ait değerleri Tablo 3.6.’de verilmiştir. Olgunlaşmanın son gününde en düşük kabuk oluşumu değerinin CS 1 (7) örneklerinde, en yüksek değerin ise CS (7.83) örneklerinde olduğu tespit edilmiştir. İstatistiksel açıdan veriler değerlendirildiğinde ise örnekler arasındaki farkın önemsiz (P>0.05) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.6.). Sucuk örneklerine ait kabuk oluşumu değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde örnekler arasında sırasıyla CS ve Kontrol örneklerinin en yüksek değerleri aldığı gözlenmiştir (Şekil 3.8.). 49

Şekil 3. 8. Laboratuarda üretilen çiğ sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda kabuk oluşum değerlerinin örnekler arasındaki değişimi PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ + Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus.

3. 2. 7. 5. Tekstür

Hem pişirilmiş ve hem de pişirilmemiş sucuk örneklerinde belirlenen tekstür özelliğine ait değerler Tablo 3.6. ve Tablo 3.7.’de verilmiştir. Pişirilmemiş sucuklarda test edilen tekstür puanları incelendiğinde, olgunlaşmanın son gününde en düşük tekstür değerinin 7.00 ile PS 2 örneğinde en yüksek değerin ise CS (8.00) örneklerinde olduğu tespit edilmiştir. Kontrol grubu örnek, PS2 grubu örneğe kıyasla önemli derecede (P<0.05) yüksek bulunmuştur (Tablo 3.6.). Sucuk örneklerine ait tekstür değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS ve PC örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir (Şekil 3.9.).

Pişirilmiş sucuk örneklerinin tekstür özelliğine ait değerlere bakıldığında da en düşük tekstür değerinin PS (7.41) örneğinde, en yüksek değerin ise PC (8.16) örneklerinde olduğu belirlenmiştir. İstatistiksel açıdan veriler değerlendirildiğinde ise örnekler arasındaki farkın önemsiz (P>0,05) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.7.). Sucuk örneklerine ait tekstür değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla PC ve CS örneklerinin en yüksek değerleri aldığı gözlenmiştir (Şekil 3.9.). 50

Şekil 3.9. Laboratuarda üretilen çiğ ve pişirilmiş sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda tekstür değerlerinin örnekler arasındaki değişimi PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ + Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus.

3. 2. 7. 6. Tipik sucuk tat ve aroması

Hem pişirilmiş ve hem de pişirilmemiş sucuk örneklerinde tespit edilen tipik sucuk tat ve aroma özelliğine ait değerler Tablo 3.6. ve Tablo 3.7’de verilmiştir. Pişirilmemiş sucuklarda belirlenen tipik sucuk tat ve aroma puanları incelendiğinde, en düşük değerlerin olgunlaşmanın son gününde en düşük tipik sucuk tat ve aroma değerinin PC 1 (7.00) örneğinde, yüksek değerin ise CS (8.00) örneklerinde olduğu tespit edilmiştir. Örneklerin tipik sucuk tat ve aroma değerlerindeki farkın istatistiki olarak önemli (P<0.01) olduğu belirlenmiştir (Tablo 3.6.). Sucuk örneklerine ait tipik sucuk tat ve aroma değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS ve PC örneklerinin en yüksek değerleri aldığı gözlenmiştir (Şekil 3.10.).

Pişirilmiş sucuk örneklerinin tipik sucuk tat ve aroma özelliğine ait değerlere bakıldığında da olgunlaşmanın son gününde en düşük tipik sucuk tat ve aroma değerinin CS 2 (7.08) örneklerinde, en yüksek değerin ise 8.25 ile CS örneğinde elde edildiği tespit edilmiştir. Örneklerin tipik sucuk tat ve aroma değerlerindeki farkın istatistiki olarak önemli (P<0.05) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.7.). Sucuk örneklerine ait tipik sucuk tat ve aroma değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde 51

olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS ve PC örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir (Şekil 3.10.).

Şekil 3.10. Laboratuarda üretilen çiğ ve pişirilmiş sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda tat- aroma değerlerinin örnekler arasındaki değişimi PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ + Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus.

3. 2. 7. 7. Genel Beğeni

Genel beğeni olarak pişirilmiş ve pişirilmemiş sucuk örneklerinde test edilen genel beğeni özelliğine ait değerler Tablo 3.6. ve Tablo 3.7.’de verilmiştir. Pişirilmemiş sucuk örneklerinde en düşük genel beğeni değerini PS2 (6.83) örneği, en yüksek değeri ise CS (8.16) örneklerinin aldığı tespit edilmiştir. Pişirilmiş sucuklara ait değerler incelendiğinde de çiğ sucuklarda bulunan değerlere paralellik gösterdiği sonucuna varılmıştır. Pişirilmiş sucuklarda en düşük değerin PS2 (7.25) örneği, en yüksek değerin ise CS (8.08) örneklerinin aldığı gözlemlenmiştir. Hem çiğ hem de pişirilmiş sucuklara ait genel beğeni değerlerindeki farkın istatistiki olarak önemli (P<0.05) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.6. ve 3.7.). 52

Şekil 3.11. Laboratuarda üretilen çiğ ve pişirilmiş sucuk örneklerinin fermentasyon sonunda genel beğeni değerlerinin örnekler arasındaki değişimi PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ + Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei)+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus.

3.2.8. Uçucu Bileşikler

Kontrol grubu ile bakteri kültürlerinin farklı kombinasyonları ilave edilerek üretilen sucuklardan olgunlaşmanın son gününde alınan örneklerin uçucu bileşikleri SPME – GC/MS tekniği kullanılarak analiz edilmiştir. Belirlenen bileşiklerin ortalama pik alanlarına ait veriler Tablo 3.8’de verilmiştir. Uçucu bileşik olarak olgunlaşma sonunda n-alkanlar, aromatik hidrokarbonlar, aldehitler, asitler, ketonlar, alkoller, esterler ve terpenler gibi birçok bileşik grubundan toplam 48 adet bileşik tanımlanmıştır.

Aldehit grubunda bulunan benzen asetaldehit, tüm örnek gruplarında tespit edilmesine rağmen, S. xylosus bakterileri katılan PS2, PC2 ve CS2 grubu örneklerde daha yüksek konsantrasyonlarda gözlemlenmiştir. Kuminaldehit ise kontrol dahil tüm örnek gruplarında gözlemlenmiştir. Kimyon kaynaklı bir uçucu bileşik olan kuminaldehit kontrol, CS, CS 1 ve CS 2 grubu örneklerde 14.62-22.54 arasında değişen değerlerde tespit edilmesine rağmen Lb. plantarum içeren diğer tüm örnek gruplarında (PS, PS1, PS2, PC, PC1, PC2) ise 1.45-1.61aralığında değişen değerler aldığı belirlenmiştir. Bu durumun bu örnek gruplarının içerdiği Lb. plantarum ile ilgili olduğu düşünülmektedir. Çünkü yapılan çalışmalarda kuminaldehitin Lb. plantarum üzerinde antimikrobiyal etki göstererek Lb. plantarum’un gelişimi üzerinde inhibe edici etkisinin olduğu 53

bildirilmiştir (Ceylan and Fung, 2004). Dolayısıyla kuminaldehitin, Lb. plantarum’u inhibe ederken kendisinin de indirgendiği düşünülmektedir. Doymamış yağ asitlerinin oksidasyonu sonucu oluşan nonanal ise kontrol ve bakteri katılan tüm sucuk gruplarında çok düşük düzeylerde (0.2-0.8 ) gözlemlenmiştir (Tablo 3.8).

Alkan grubu içerisinde yer alan siklohekzasiloksan dodekametil (cyclohexasiloxane dodecametil) siklopentasiloksan dekametil (cyclopentasiloxane decametil), siklotetrasiloksan oktametil (cyclotetrasiloxane octametil), siklotrisiloksan hekzametil (cyclotrisiloxane hexametil) kontrol dahil tüm sucuk örneklerinde belirlenmiştir. Ancak, siklotrisiloksan hekzametil uçucu bileşiği Lb. plantarum bakterisi içeren örnek gruplarında (PS, PS1, PS2, PC, PC1, PC2) diğer örnek guplarına kıyasla daha yüksek konsantrasyonlarda (0.52-0.75) bulunmuştur (Tablo 3.8.).

Alkol grubu içersinde yer alan kumin alkol ve fenil etil alkol tüm örnek gruplarında tespit edilmiştir. Kumin alkol özellikle PS, PS1 ve PS2 grubu örnekler ile PC, PC1 ve PC2 örnek gruplarında diğer tüm örnek gruplarına göre önemli derecede yüksek bulunmuştur (Tablo 3.8.).

Aroma bileşenlerinden karboksilik asit ve alkollerin esterifikasyonuyla oluşan esterler grubunda yer alan etil dekanoat tüm örnek gruplarında düşük konsantrasyonlarda tespit edilmiştir. Ayrıca, sucukların aroması üzerine etkili olan asitlerden mikrobiyal katabolizmanın bir ürünü olan hekzanoik asit, tüm örneklerde düşük seviyelerde tespit edilmiştir (Tablo 3.8).

Benzothiazol, metil öjenol (methyl eugenol), anethol (anetol), öjenol (eugenol), metil kavikol (estragole) bileşikleri tüm örneklerde belirlenen aromatik hidrokarbonlardır. Öjenol CS, CS1 ve CS2 örnek gruplarında diğer örnek gruplarına göre daha yüksek oranlarda tespit edilmiştir. Metil öjenol tüm örnek gruplarında tespit edilmesine rağmen PS, PS1 ve PS2 örneklerinde diğer gruplara göre önemli derecede yüksek olduğu gözlenmiştir. Alkol grubunda bulunan metil kavikol, anetol, benzotiazol (benzothiazole) karvakrol, sineol (cineol), oksim fenoksi metil (oxime metoksi fenil) tüm örnek gruplarında düşük düzeylerde tespit edilmiştir.

54

Sucuk örneklerinde 34 adet terpenik bileşik saptanmıştır. Toplam uçucu bileşikler bakımından sucuk grupları değerlendirildiğinde, terpenlerin konsantrasyonlarının diğer bileşiklere kıyasla daha büyük olduğu görülmektedir. Özellikle terpinen, karyofillen ve simen bileşiklerinin konsantrasyonlarının diğer uçucu bileşiklere göre oldukça yüksek olduğu (18.8-18.05) görülmektedir (Tablo 3.8.).

Çalışma sonucunda bulunan terpenik bileşikler:

α-humulen ve α-bergamoten tüm örnek gruplarında düşük seviyelerde tespit edilmiştir D-karen tüm örnek gruplarında tespit edilmiş olmasına rağmen PS, PS1 ve PS2 örnek gruplarında diğer gruplara göre önemli derecede yüksek olduğu gözlenmiştir. Karyofillen E tüm örnek gruplarında tespit edilmiştir. Bu aroma bileşiği özellikle PS, PS1 ve PS2 örnek grupları ile PC, PC1 ve PC2 örnek gruplarında diğer örnek gruplarına kıyasla daha yüksek oranlarda gözlenmiştir. Ayrıca Karyofillen E tüm örnek gruplarında diğer uçucu bileşiklere göre belirgin bir şekilde yüksek oranda gözlenmiştir. Kamfen (Camphene), tridekan, α-guaien, mirsen (myrcene), α- fellendren, β-pinen, α- selinen, terpinen-4-ol, kadinen delta, α-kopaen, simen, β-elemen, limonen, α-pinen, sabinen, β selinen, γ terpinen ve α terpinen gibi terpenik bileşikler tüm örnek gruplarında tespit edilmiştir. Mirsen (myrcene) bakteri kültürü ilave edilen örneklerde kontrol grubuna göre önemli derecede yüksek olduğu gözlenmiştir. Simenin (cymene) PC, PC1 ve PC2 örnek gruplarında diğer örnek gruplarına kıyasla belirgin bir şekilde yüksek oranda gözlenmiştir. Limonen ve γ- terpinen tüm örnek gruplarında tespit edilmiş olmasına rağmen PC, PC1 ve PC2 örnek gruplarında diğer gruplara göre önemli derecede yüksek (P<0.001) olduğu gözlenmiştir. α terpinen ise CS, CS1 ve CS2 örneklerinde yüksek konsantrasyonlarda tespit edilmesine rağmen diğer örnek gruplarında çok düşük seviyelerde tespit edilmiştir. Monoterpenlerden olan linalol tüm sucuk örneklerinde tespit edilmiştir. Ancak bu uçucu bileşik özellikle PS, PS1 ve PS2 örnek grupları ile PC, PC1 ve PC2 örnek gruplarında diğer gruplara kıyasla daha yüksek oranlarda gözlenmiştir. Diğer taraftan α-tujenal, kamfor, farnesen, karotol, terpinolen tüm örnek gruplarında düşük düzeylerde tespit edilmiştir (Tablo 3.8.). 55

Tablo 3.8. Kontrol grubu ile bakteri kültürü ilave edilen sucuklarda olgunlaşma süresince belirlenen uçucu bileşiklerin alanlarına ait ortalamalar

BİLEŞİKLER KONTROL PS PS 1 PS 2 PC PC 1 PC 2 CS CS 1 CS 2 Önem Düzeyi BENZEN ASETALDEHİT 0.20±0.09 0.18±0.07 0.17±0.05 0.33±0.01 0.24±0.06 0.31±0.06 0.54±0.01 0.22±0.05 0.20±0.03 0.65±0.03 *

KUMINALDEHİT 17.66±1.17 1.48±0.05 1.61±0.07 1.45±0.04 2.95±0.01 1.71±0.77 1.53±0.02 22.54±0.63 14.62±0.53 17.29±1.43 * NONANAL 0.08±0,02 0.05±0.00 0.02±0.00 0.04±0,03 0.07±0,01 0.08±0.01 0.04±0,02 0.06±0,01 0.05±0,02 0.08±0,03 * KUMİN ALKOL 2.15±0.97 5.59±0.9 1 4.37±0.77 4.54±0.72 4.50±0.89 3.75±0.99 4.15±1.98 1.43±0.12 1.23±0.1 1.51±0.08 * FENİL ETİL ALKOL 0.38±0.14 0.53±0.00 0.47±0.14 0.48±0.02 0.35±0.07 0.31±0.07 0.6±0.00 0.24±0.07 0.28±0,05 0.38±0.03 * β-AKORADIEN 0.22±0.00 0.45±0.04 0.35±0.02 0.35±0.04 0.34±0,15 0.3±0.07 0.35±0.02 0.35±0.07 0.22±0.03 0.25±0,09 * SİKLOHEKZASİLOKSAN 0.14±0.07 0.22±0.03 0.35±0.14 0.25±0,17 0.17±0.01 0.28±0.07 0.30±0,16 0.17±0,09 0.15±0.05 0.15±0.08 * DODEKAMETİL SİKLOPENTASİLOKSAN 0.37±0.12 0.4±0.07 0.26±0.1 0.37±0.01 0.38±0.02 0.32±0,13 0.45±0.07 0.32±0.07 0.18±0.01 0.27±0,10 * DEKAMETİL SİKLOTETRASİLOKSAN 0.12±0.02 0.25±0.00 0.2±0.00 0.23±0.02 0.43±0.07 0.42±0.00 0.45±0,02 0.23±0.07 0.24±0.00 0.15±0.00 * OKTAMETİL SİKLOTRİSİLOKSAN 0.28±0.01 0.52±0.00 0.64±0.07 0.52±0.19 0.63±0.07 0.56 ±0.27 0.75±0.21 0.24±0.09 0.22±0.07 0.16±0.02 * HEKZAMETİL ETİL DEKANOAT 0.23±0.03 0.48±0.08 0.77±0.14 0.42±±0.07 0.19±0.01 0.14±0,07 0.18±0.09 0.16±0,09 0.22±0,11 0.21±0.01 * HEKZANOİK ASİT 0.21±0.12 0.21±0.09 0.2±0.05 0.32±0.08 0.13±0.01 0.31±0.07 0.17±0.01 0.16±0.00 0.2±0.07 0.12±0.01 * KARVAKROL 0.21±0,02 0.17±0.05 0.23±0.04 0.16±0.02 0.13±0.00 0.08±0,04 0.12±0,05 0.17±0.01 0.07±0,01 0.08±0.01 * CINEOL 0.14±0,07 0.07±0,01 0.02±0.01 0.05±0,01 0.09±0,01 0.07±0,02 0.08±0,01 0.09±0,01 0.14±0,07 0.12±0.01 * ÖJENOL 1.01±0,08 2.09±1,05 1.89±0.09 1.63±0,08 1.55±0.07 1.45±0.08 1.38±0,45 3.88±0.11 3.85±0.2 4.03±0.91 * METİL KAVİKOL 0.21±0.03 0.25±0.04 0.26±0.00 0.23±0.02 0.24±0,05 0.28±0,05 0.25±0.01 0.30±0.07 0.27±0,08 0.23±0,05 * BENZOTHİAZOLE 0.27±0.01 0.33±0,17 0.25±0.09 0.15±0,05 0.19±0.01 0.23±0.07 0.13±0,05 0.24±0.03 0.20±0.03 0.14±0.06 * METİL ÖJENOL 2.93±0.07 5.1±0.00 4.15±0.07 4.13±0.02 3.51±0.02 2.85±0.07 2.36±0.02 3.88±0.16 1.67±0.00 3.05±1.09 *

ANETHOL 0.20±0.00 0.11±0.00 0.2±0.14 0.01±0.01 0.34±0.01 0.36±0.07 0.56±0.02 0.14±0.07 0.12±0.02 0.07±0.03 *

OKSİM METOKSİ FENİL 0.65±0,09 0.66±0,27 0.79±0.48 0.49±0.29 0.59±0.09 0.39±0.09 0.43±0.20 0.33±0.13 0.43±0.27 0.31±0.11 * KAMFEN 0.08±0.02 0.05±0.01 0.06±0,03 0.07±0,01 0.07±0,02 0.05±0,01 0.08±0,02 0.08±0,01 0.05±0,02 0.01±0,00 * α-HUMULEN 0.47±0.00 0.82±0.03 0.71±0.07 0.83±0.07 0.63±0.07 0.55±0.02 0.64±0.01 0.64±0.07 0.56±0.07 0.57±0.08 * TRIDEKAN 0.03±0,01 0.04±0,01 0.05±0,01 0.04±0.00 0.02±0,01 0.02±0,00 0.02±0,00 0.02±0,00 0.07±0.01 0.08±0.01 * α-BERGAMOTEN 0.15±0,05 0.08±0.01 0.06±0,03 0.22±0,17 0.25± 0.07 0.16±0,08 0.20±0.04 0.17±0.01 0.14±0,04 0.16±0,09 * D-KAREN 0.3±0.08 2.55±0.09 2.74±0.01 2.45±0.04 0.43±0.07 0.57±0.01 0.26±0.01 0.39±0.07 0.34±0.02 0.28±0.06 * 56

KARYOFİLLEN E 8.85±0.07 17.92±1.34 16.76±1.02 17.94±1.48 12.44±0.01 11.52±0.03 12.49±0.07 9.84±0.21 7.13±0.01 8.38±0.53 * α-GUAIEN 0.15±0.05 0.18±0.01 0.18±0.01 0.24±0.02 0.13±0.02 0.13±0.02 0.15±0,05 0.2±0.11 0.15±0,05 0.1±0.00 * MİRSEN 0.35±0.01 0.85±0.08 0.79±0.01 1.03±0.02 1.28±0.01 1.36±0.02 1.29±0.01 0.76±0.05 0.87±0.02 0.74±0.00 * α-FELLANDREN 0.9±0.07 0.62±0.17 0.99±0.34 0.47±0.01 1.06±0.02 1.35±0.04 1.21±0.14 0.76±0.05 0.79±0.07 0.76±0.06 * β- PINEN 2.84±0.65 2.94±0.71 3.79±1.00 1.75±0.81 3.33±0.62 4.03±0.44 2.5±0.88 2.43±0,97 3.19±1.07 2.91±1.05 * α-SELINEN 0.33±0.12 0.53±0.09 0.44±0.31 0.47±0.21 0.57±0.27 0.35±0.15 0.4±0.27 0.4±0.15 0.35±0,22 0.31±0.12 * TERPINEN-4-OL 0.42±0,21 0.5±0.15 0.46±0.22 0.48±0.11 0.54±0.13 0.46±0.12 0.53±0.37 0.42±0.25 0.34±0.12 0.41±0.20 * KADİNEN DELTA 0.12±0.01 0.21±0.01 0.23±0.00 0.24±0,15 0.14±0.07 0.22±0.07 0.16±0.01 0.12±0,07 0.2±0.09 0.16±0.11 * α-KOPAEN 1.05±0.07 1.55±0.11 1.36±1.00 1.52±0.82 1.33±0.22 1.16±0.80 1.24±0.22 0.90±0,09 0.76±0.21 1.14±0,77 * SİMEN 7.25±1,07 6.89±1.09 5.69±1,67 8.34±2.14 10.15±1.07 10.41±2.02 9.79±1.97 5.94±0,67 8.67±±0,97 7.58±0.92 * Β-ELEMEN 0.44±0.21 0.7±0.33 0.4±0.20 0.58±0.25 0.63±0.17 0.61±0.07 0.63±0.07 0.33±0,09 0.22±0.00 0.33±0.15 * LIMONEN 1.43±0.77 1.91±0.90 1.43±0.45 1.82±0.43 2.35±0.77 2.43±0.52 2.35±0,97 1.42±0.86 1.8±0.78 1.5±0.64 * α-PINEN 1.07±0.43 0.43±0.20 0.32±0.12 0.33±0.07 0.72±0.31 1.5±0.07 0.82±0.12 2.44±0.49 0.85±0.23 0.83±0.31 * SABINEN 0.42±0.07 0.16±0.00 1.74±0.00 0.38±0.02 0.73±0.01 0.83±0.02 0.12±0.00 0.13±0.02 0.45±0.07 0.09±0.01 * β SELINEN 0.47±0.09 0.72±0.00 0.5±0.07 0.66±0.02 0.52±0.05 0.46±0.02 0.49±0.00 0.6±0.14 0.4±0.07 0.46±0.01 * γ TERPINEN 18.8±0.06 18.67±0.02 16.06±0.91 20.92±0.04 22.63±0.21 28.05±0.04 25.01±0.70 17.29±0.70 19.81±1.14 18.81±0.15 * α TERPINEN 0.12±0.06 0.35±0.03 0.22±0.04 0.54±0.06 0.58±0.05 0.36±0.06 0.23±0.08 11.12±1.06 6.5±1.96 8.32±1.06 * LINALOOL 2.74±0.03 3.06±0.08 3.16±0.05 3.35±1,07 3.3±0.09 3.44±0.08 3.43±0.02 2.84±0.7 2.08±0,17 2.83±0.11 * α-THUJENAL 0.37±0.01 0.48±0.07 0.37±0,19 0.40±0,15 0.34±0,05 0.53±0,05 0.70±0,27 0.25±0,07 0.26±0.01 0.31±0.01 * KAMFOR 0.05±0.00 0.03±0.01 0.05±0.00 0.04±0.01 0.06±0.00 0.05±0.01 0.07±0.00 0.04±0.01 0.06±0.01 0.05±0.01 * FARNESEN 0.24±0.01 0.46±0.00 0.43±0.00 0.45±0.04 0.45±0,17 0.35±0.05 0.37±0.04 0.36±0,11 0.40±0.01 0.42±0.01 * KAROTOL 0.13±0.03 0.22±0.03 0.15±0.01 0.19±0,09 0.14±0,08 0.11±0,07 0.14±0,05 0.16±0.01 0.15±0.01 0.1±0.02 * TERPINOLEN 0.06±0,01 0.32±0.07 0.18±0.00 0.08±0.01 0.08±0.01 0.45±0.07 0.4±0.00 0.24±0,05 0.23±0.04 0.20±0,03 * PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus ; CS: Lb. curvatus+ Lb. sakei; PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. carnosus; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus; PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus . a: Ortalama Tablo 3.8.’in devamı pik alanı ; b: standart sapma (*:p<0.001 seviyesinde önemli; ö.d.: önemli değil).

57

3. 2. 9. Sucuk Örneklerinin PCR-DGGE Analiz Sonuçları

Kontrol ve bakteri kültürleri ilave edilerek üretilen sucuk örneklerinin bakteri profili fermentasyon süresince (0., 4., 8. ve 12. gün) PCR-DGGE yöntemiyle izlenmiştir. Bu amaçla sucuk örneklerinden direkt DNA izolasyonu yapıldıktan sonra 16S rRNA üzerindeki değişken V1 ve V3 bölgelerine ait amplifikasyon ürünleri DGGE jelinde yürütülerek jel görüntüleri alınmıştır.

3. 2. 9. 1. Sucuk Örneklerinin V1 Bölgesine Göre PCR-DGGE Analiz Sonuçları

16S rRNA üzerinde yaklaşık 100 bç uzunluğundaki değişken V1 bölgesi universal V1GCf ve V1r primerleri ile amplifiye edildikten sonra amplifikasyon ürünleri %30-50’lik DGGE jelinde yürütülerek jel görüntüleri analiz edilmiştir.

Kontrol grubu sucuk örneğinin fermentasyon süresince V1 bölgesine göre PCR-DGGE analizi sonucu tanımlanan bakteriler Şekil 3.12’de görülmektedir. Buna göre, fermentasyonun 0. gününde tespit edilen Lactoccocus piscium’un fermentasyonun ilerleyen günlerinde bant şiddeti giderek azalmıştır. Lb. sakei’ye ait bant ise fermentasyonun 4. gününden itibaren tespit edilmiş olup fermentasyonun ilerleyen günlerinde bant şiddetinde değişiklik görülmemiştir. Fermentasyonun 0. gününde Brochothrix thermosphacta ve Carnobacterium divergens türlerine ait bantların fermentasyon süresince asitliğin artmasıyla birlikte bant şiddetlerinin de azaldığı gözlenmiştir.

Kontrol, PS, PC ve CS grubu örneklerde fermentasyon süresince V1 bölgesinin analizi sonucu tespit edilen bakteri profili Şekil 3.13.’de görülmektedir. Buna göre olgunlaşmanın 4. gününden itibaren tüm örneklerde şiddetli bir Lb. sakei bandı izlenmiştir. Olgunlaşmanın 4. gününden itibaren Lb. curvatus bakterisine ait bantlar yalnızca PC ve CS grubu örneklerde, Lb. plantarum bakterisine ait bantlar ise, yalnızca PC ve PS grubu örneklerde tespit edilmiştir. Tüm örneklerde olgunlaşmanın 0. 58

gününde Lb. sakei, Lb. curvatus, Lb. plantarum bantları gözlenmemiştir. 4. günden itibaren hem laktik asit bakteri sayısı, hem de kuru madde miktarının artmasıyla birlikte bu bakterilere ait bant şiddetleri artmıştır. Fermentasyonun 4., 8. ve 12. günlerde bant şiddetlerinde değişiklik bulunmamaktadır.

K0 K4 K8 K12

Şekil 3.12. Kontrol grubu sucuk örneğinin V1 bölgesine göre PCR-DGGE analizi sonucu tanımlanan bakterilere ait bantlar (1: Brochothrix thermosphacta; 2:Lc. piscium; 3: Carnobacterium divergens; 4: Lb. sakei) K0:Kontrol 0. gün, K4:Kontrol 4. gün, K8:Kontrol 8. gün, K12:Kontrol 12. gün

PS1, PC1 ve CS1 grubu örneklerde fermentasyon süresince V1 bölgesinin analizi sonucu tespit edilen bakteri profilleri Şekil 3.14.’de görülmektedir. PS1 ve PC1 grubu sucuk örneklerinde olgunlaşmanın 4. gününden itibaren parlak Lb. sakei bandı ve nispeten parlak Lb. plantarum bandı, CS 1 örneğinde ise parlak Lb. sakei bandı ve nispeten parlak Lb. curvatus bandı gözlenmiştir. V1 bölgesine göre yapılan PCR-DGGE analizinde S. carnosus bakterisine ait bant tespit edilmemiştir.

PS2, PC2 ve CS2 grubu örneklerde fermentasyon süresince V1 bölgesinin analizi sonucu tespit edilen bakteri profilleri Şekil 3.15.’de görülmektedir. 59

PS2 ve PC2 grubu sucuk örneklerinde olgunlaşmanın 4. gününden itibaren parlak Lb. sakei bandı ve nispeten parlak Lb. plantarum bandı gözlenmiştir. CS2 örneğinde ise, parlak Lb. sakei bandı ve nispeten parlak Lb. curvatus bandı tespit edilmiştir. V1 bölgesine göre yapılan PCR-DGGE analizinde S. xylosus bakterisine ait bant gözlenmemiştir.

CS C C C PS P P P P P K4 K1 P P K 0 S4 0 C 2 S8 S1 S4 S8 S1 C C C K0 8 12 2 2 0 4 8 4

Şekil 3. 13. Sucuk örneklerinin V1 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi K0: Kontrol 0. Günü, K4: Kontrol 4. Gün, K8: Kontrol 8. Gün, K12: Kontrol 12. Gün, CS0: CS 0. Gün, CS4: CS 4. Gün, CS8: CS 8. Gün, CS12: CS 12. Gün, PS0: PS 0. Gün, PS4: PS 4. Gün, PS8: PS 8. Gün, PS12: PS 12. Gün, PC0: PC 0. Gün, PC4: PC 4. Gün, PC8: PC 8. Gün, PC12: PC 12. Gün, PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS:Lb. curvatus+ Lb. sakei. K0-1: Lc. piscium; K0-3: Brochothrix thermosphacta; K0-2: Carnobacterium divergens; K4- 1, CS4-1, PS4-1, PC4-1: Lb. sakei; CS4-2, PC4-2: Lb. curvatus; PC4-3, PS4-2: Lb. plantarum

60

PS PS PS PC PC CS CS1 CS PS PC PC1 CS 1- 1-4 1- 1-8 1- 1-0 -8 1- 1-8 1-0 -4 1-4 0 12 12 00 12 00

Şekil 3. 14.Sucuk örneklerinin V1 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi CS1-0: CS1 0. gün, CS1-4: CS1 4. gün, CS1-8: CS1 8. gün, CS1-12: CS1 12. gün, PS1-0: PS1 0. Gün, PS1-4:PS1 4. gün, PS1-8:PS1 8. Gün, PS1-12: PS1 12. gün, PC1-0: PC1 0. gün, PC1-4: PC1 4. gün, PC1-8: PC1 8. gün, PC1-12:PC1 12. gün, PS1: Lb.plantarum + Lb. sakei+S. carnosus; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus. PS1, PC1, CS1-0-1: Carnobacterium divergens; PS1, PC1, CS1-0-2: Lc. piscium; PS1, PC1, CS1-0-3: Carnobacterium divergens; PS1, PC1, CS1-4-1: Lb. sakei; PS1, PC1-4-2: Lb. plantarum; CS1-4-2: Lb. curvatus

C PC PC P PC C PS PS PS CS S PS 2-0 2-4 C 2- CS S2 2-0 2-4 2- 2-4 2- 2-8 2- 12 2- - 12 8 8 0 12

Şekil 3. 15. Sucuk örneklerinin V1 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi CS2-0:CS2 0. Gün, CS2-4:CS2 4. Günü, CS2-8:CS2 8. Günü, CS2-12:CS 212. Günü, PS2-0:PS2 0. Günü, PS2-4:PS2 4. Gün, PS2-8: PS 2 8. Gün, PS2-12:PS2 12. Gün, PC2-0:PC2 0. Gün, PC2-4:PC2 4. Gün, PC2-8:PC2 8. Gün, PC2-12:PC2 12. Gün, PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus; PS2, PC2, CS2-0-1: Carnobacterium divergens; PS2, PC2, CS2-0-2: Lc. piscium; PS2, PC2, CS2-4-1: Lb. sakei; PS2, PC2-4-2: Lb. plantarum; CS2-4-2: Lb. curvatus 61

3.2.9.2. Sucuk Örneklerinin V3 Bölgesine Göre PCR-DGGE Analiz Sonuçları

16S rRNA üzerinde yaklaşık 200 bç uzunluğundaki değişken V3 bölgesi universal V3GCf ve V3r primerleri ile amplifiye edildikten sonra amplifikasyon ürünleri %15-55’lik DGGE jelinde yürütülerek jel görüntüleri analiz edilmiştir.

Kontrol grubu sucuk örneğinin fermentasyon süresince V3 bölgesine göre yapılan PCR-DGGE analizi sonucu tanımlanan bakteriler Şekil 3.16’da görülmektedir. Fermentasyonun 0. gününde tespit edilen B. thermosphacta ve Leu. gasicomitatum türlerine ait bantların fermentasyon süresince asitliğin artmasıyla birlikte bant şiddetlerinin azaldığı gözlenmiştir. Fermentasyonun 0. gününde gözlenen Lc. piscium ve C. divergens türlerine ait bantlar ise fermentasyonun 4. gününden itibaren tespit edilmemiştir. Lb. sakei ve Weissella koreensis bakterilerine ait bantlar ise fermentasyonun 4. gününden itibaren görülmüş olup fermentasyonun ilerleyen günlerinde bant şiddetlerinde değişiklik gözlenmemiştir.

K0 K K K1 4 8 2

Şekil 3.16. Kontrol grubu sucuk örneğininV3 bölgesine göre PCR-DGGE analizi sonucu tanımlanan bakterilere ait bantlar K0-1: Brochothrix thermosphacta; K0-2: Leuconostoc gasicomitatum; K0-3: Carnobacterium divergens; K0-4: Lactococcus piscium; K12-5:Tanımlanamayan bakteri; K12-6: Lb. sakei, K12-7:Weissella koreensis K0:Kontrol 0. Gün, K4:Kontrol 4. Gün, K8:Kontrol 8. Gün, K12:Kontrol 12. Gün 62

Kontrol, PS, PC ve CS grubu örneklerin fermentasyon süresince V3 bölgesine göre yapılan PCR-DGGE analizi sonucu tespit edilen bakteri profilleri Şekil 3.17.’de görülmektedir. Buna göre Lb. curvatus ve Lb. sakei bakteri bantları birbirinden ayırt edilememiştir. Beklenildiği gibi PS ve PC grubu sucuk örneklerinde Lb. plantarum bandı gözlenmesine rağmen, CS sucuk örneğinde Lb. plantarum bandı gözlenmemiştir.

PS PC CS PS 0 PS 4 PS PC PC PC CS CS CS K1 8 4 8 K4 K8 12 0 8 12 0 4 12 K0 2

Şekil 3.17. Sucuk örneklerinin V3 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi K0:Kontrol 0. Günü, K4:Kontrol 4. Günü, K8:Kontrol 8. Günü, K12:Kontrol 12. Günü, CS0:CS 0. Günü, CS4: CS 4. Günü, CS8:CS 8. Günü, CS12:CS 12. Günü, PS0:PS 0. Gün, PS4:PS 4. Gün, PS8:PS 8. Gün, PS12: PS12. Gün, PC0: PC 0. Gün, PC4: PC 4. Gün, PC8: PC 8. Gün, PC12: PC 12. Gün. PS: Lb. plantarum+ Lb. sakei; PC: Lb. plantarum + Lb. curvatus; CS: Lb. curvatus+ Lb. sakei

PS1, PC1 ve CS1 grubu örneklerde fermentasyon süresince V3 bölgesinin analizi sonucu tespit edilen bakteri profilleri Şekil 3.18.’de görülmektedir. Lb. sakei ve Lb. curvatus bantları ayrılmadığından tek bant olarak gözlenmiştir. PS1 ve PC1 örneklerinde belirgin Lb. plantarum bandı görülmesine rağmen; CS1 sucuk örneğinde Lb. plantarum bandı 63

gözlenmemiştir. S. carnosus bakterisine ait bant örneklerin hiçbirisinde tespit edilmemiştir.

PS2, PC2 ve CS2 grubu örneklerde fermentasyon süresince V3 bölgesinin analizi sonucu tespit edilen bakteri profili Şekil 3.19.’da görülmektedir. Lb sakei, Lb. curvatus ve S. xylosus bakterilerine ait bantlar DGGE jelinde eşit mesafede göç ettikleri için birbirlerinden ayırt edilememiştir. Diğer taraftan PS2 ve PC2 grubu örneklerde belirgin Lb. plantarum bandı gözlenmesine rağmen; CS2 grubu sucuk örneğinde Lb. plantarum bandı tespit edilmemiştir.

S. Lb. Lb. Lb. plan car sake curv PS PS PS PC PS PC PC P CS CS CS CS taru nos i atus 1-0 1-4 1- 1-0 1-8 1-4 1-8 C 1-0 1-4 1-8 1- us 12 m 1- 12 1 2

Şekil 3. 18.Sucuk örneklerinin V3 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi. CS1-0: CS1 0. Günü, CS1-4: CS1 4. Günü, CS1-8: CS1 8. Günü, CS1-12: CS1 12. Günü, PS1-0: PS1 0. Gün, PS1-4: PS1 4. Gün, PS1-8: PS1 8. Gün, PS1-12: PS1 12. Gün, PC1-0: PC1 0. Gün, PC1-4: PC1 4. Gün, PC1-8: PC1 8. Gün, PC1-12: PC1 12. Gün, PS1: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. carnosus; PC1: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. carnosus; CS1: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. carnosus

64

S. Lb Lb Lb. xylo . . plan PS PS PS PS PC PC PC PC CS CS CS CS sus sa cu taru 2-0 2-4 2-8 2- 2-0 2-4 2-8 2- 2-0 2-4 2-8 2- ke rv m 12 12 12 i at us

Şekil 3. 19. Sucuk örneklerinin V3 bölgesine göre PCR-DGGE Analizi CS2-0:CS2 0. Gün, CS2-4:CS2 4. Günü, CS2-8:CS2 8. Günü, CS2-12:CS 212. Günü, PS2-0:PS2 0. Gün, PS2-4:PS2 4. Gün, PS2-8:PS 2 8. Gün, PS2-12:PS2 12. Gün, PC2-0:PC2 0. Gün, PC2-4:PC2 4. Gün, PC2-8:PC2 8. Gün, PC2-12:PC 2 12. Gün, PS2: Lb. plantarum + Lb. sakei+S. xylosus; PC2: Lb. plantarum + Lb. curvatus+ S. xylosus; CS2: Lb. curvatus + Lb. sakei + S. xylosus . 65

4. BÖLÜM

TARTIŞMA, SONUÇ ve ÖNERİLER

4.1. Laboratuvarda Üretilen Sucuk Örnekleri

Araştırmada, kontrol grubu ve bakteri kültürü ilave edilerek üretilen sucuk örneklerinin fermentasyon süresince, bir taraftan bakteriyel florasındaki değişim PCR-DGGE yöntemiyle izlenirken, diğer taraftan tüm örneklerin fiziksel, kimyasal, mikrobiyolojik özellikleri ile uçucu aroma bileşenleri analiz edilerek elde edilen sonuçlar aşağıda kısaca değerlendirilmiştir.

4.1.1. Mikrobiyolojik analizlere ait bulgular

Bütün örnek gruplarında fermentasyonun 0., 4., 8. ve 12. günlerinde yapılan laktik asit bakteri sayımı ile fermentasyonun 12. gününde tespit edilen toplam mezofilik aerobik bakteri, toplam Enterobacteriaceae ve maya-küf sayıları aşağıda değerlendirilmiştir.

4.1.1.1.Laktik asit Bakterilerinin (LAB) Sayısı

Sucuk örneklerinde fermentasyonun başlangıcında 6-7 log kob/g arasında değişen laktik asit bakteri sayısı, fermentasyonun 4. gününde hızlı bir yükseliş göstererek 8.35-8.84 log kob/g düzeyine ulaşmıştır. Olgunlaşmanın 8. ve 12. günlerinde ise LAB sayısında az bir değişim gözlenmiştir. Olgunlaşma süresince sucuk örneklerinde tespit edilen ortalama LAB sayıları dikkate alındığında bakteri kültür ilavesinin toplam LAB sayısı üzerine istatistiki bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. Diğer taraftan olgunlaşmanın 8. ve 12. günlerinde tespit edilen LAB sayıları incelendiğinde, kontrol grubu örneklerde düşük seviyede bir azalma gözlenirken, bakteri kültürü ilave edilmiş diğer tüm örneklerde çok az bir artış olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca sucuk üretiminde kullanılan 66

farklı bakteri kültürlerinin toplam LAB sayısı üzerine etkisi incelendiğinde, ilave edilen bakteri kültürü ile LAB sayısı arasında anlamlı bir ilişki bulunmamıştır.

Konuyla ilgili benzer bir çalışmada Erçoşkun [86], starter kültür ilave edilmeyen sucuk örneklerinde toplam LAB sayısını 6 log/cfu g olarak tespit ederken, starter kültür ilave edilerek üretilen sucuklarda toplam LAB sayısını 6.5 log/cfu g olarak rapor etmiştir. Kaban [87] yapmış olduğu araştırmada olgunlaşma sonunda starter kültür ilave edilmeyen sucuk örneklerinde toplam LAB sayısını 7.38 log kob/g olarak tespit ederken, starter kültür ilave edilerek üretilen sucuklarda toplam LAB sayısını 7.84 log kob/g olarak tespit etmiştir.

Dinçer vd. [88] yapmış oldukları çalışmada sucuktan izole edilen Lb. sakei ilave edilerek üretilen sucuklarda LAB sayısı olgunlaşmanın 0. gününde 2x107-4x107 kob/g olan LAB sayısını olgunlaşmanın 3. gününde 1.4x109-4x107 kob/g aralığında bulmuştur. Kaban ve Kaya [90] ticari Lb. sakei kültürünün fermentasyon sırasında 109 kob/g düzeyine kadar gelişebileceğini belirtmişlerdir. Ayrıca, yapılan başka bir çalışmada da Gençcelep [47] farklı nitrit seviyeleri ve farklı ticari starter kültür kullanarak üretilen sucuklarda, fermentasyonun 9. gününde LAB sayısını 7.84-8.81 log kob/g aralığında bulmuştur.

Dolayısıyla yapılan araştırmalar bizim bulgularımıza benzer olarak kontrol ile bakteri kültürü ilave edilmiş sucuk örneklerinin LAB sayıları arasındaki farkın <1 log kob/g’dan düşük olduğunu göstermiştir.

4.1.1.1. Toplam mezofilik aerobik bakteri (TMAB) sayısı

Tüm sucuk örneklerinde fementasyonun son gününde (12. gün) analiz edilen TMAB sayısının 8.59-9.16 log kob/g arasında değiştiği gözlenmiştir. Kontrol grubu örneklerde TMAB sayısının LAB sayısına benzer bir değişim gösterdiği tespit edilmiştir. Olgunlaşmanın son gününde en düşük TMAB sayısı kontrol grubu örneklerde (8.59 log kob/g) belirlenirken en yüksek TMAB değeri PC2 grubu örneklerde (9.16 log kob/g) tespit edilmiştir (Tablo 3.2.). Olgunlaşma sonunda sucuk örneklerinde tespit edilen ortalama TMAB sayıları dikkate alındığında bakteri kültür ilavesinin TMAB sayısı üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir.

67

İnal [76] yaptığı araştırmada olgunlaşmasını tamamlamış geleneksel fermente sucuklarda TMAB sayısı için kabul edilebilir miktarın 106 kob/g olduğu sonucuna varmıştır. Yapılan başka bir çalışmada ise geleneksel fermente sucukların TMAB sayılarının 1.60x107-7.00x106 kob/g aralığında olduğu sonucuna varılmıştır [50]. Diğer bir çalışmada ise sucuk üretiminde fermentasyon başlangıcında 5.5-6.2 log kob/g olan toplam canlı sayısının olgunlaşma sonunda artarak 8.0 log kob/g’ın üzerine çıktığı sonucuna varmışlardır [83]. Comi et al. [91] yapmış oldukları araştırmada yavaş olgunlaştırılan İtalyan tipi fermente sosislerde fermentasyonun 14. gününde toplam canlı bakteri sayılarının 5.0 log kob/g olduğunu ve olgunlaşma sonunda ise 7.0-8.0 log kob/g seviyesine ulaştığını belirtmişlerdir. Dolayısıyla belirtilen araştırma sonuçlarının bu çalışmada elde edilen TMAB sonuçları ile benzerlik gösterdiği görülmüştür.

4. 1. 1. 4. Toplam Enterobacteriaceae Sayısı

Kontrol grubu ve bakteri kültürü ilave edilen sucuklarda fermentasyonun son gününde toplam Enterobacteriaceae sayısının 3.15-4.29 log kob/g arasında değiştiği tespit edilmiştir. CS grubu örneklerin (4.30 log kob/gr) Enterobacteriaceae sayılarının kontrol hariç diğer örnek gruplarına kıyasla önemli derecede (p<0.01) yüksek olduğu belirlenmiştir. PS2 grubu örneklerin (3.05 log kob/gr) ise diğer örnek gruplarına göre önemli derecede düşük (p<0.01) olduğu gözlenmiştir. Olgunlaşma sonunda sucuk örneklerinde tespit edilen ortalama Enterobacteriaceae sayıları dikkate alındığında bakteri kültür ilavesinin toplam Enterobacteriaceae sayısı üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir.

Kaban [87] olgunlaşmanın 0. gününde 103 kob/g düzeyinde tespit edilen Enterobacteriaceae sayısının olgunlaşmanın sonunda hem kontrol hem de starter kültür ilave edilmiş sucuklarda tespit edilebilir sınırın (<102 kob/g) altına düştüğünü bildirmiştir. Bu çalışmada elde edilen değerlerin Kaban [87] bulduğu değerlerden yüksek olduğu tespit edilmiştir. Diğer taraftan Aksu and Kaya [98] tarafından yapılan bir çalışmada, sucuk örneklerinde olgunlaşmanın 1. gününde 3.92 log cfu/g olarak tespit edilen Enterobacteriaceae sayısının, 7. günde 4.89 log cfu/g yükseldiğini, 14. günde ise <2 log cfu/g’a düştüğünü belirlemişlerdir. Castano et al. [57] fermente İspanyol tipi sosislerde olgunlaşmanın başlangıcında Enterobacteriaceae sayısında küçük bir artış 68

tespit edilmesine rağmen, olgunlaşma süresince azalan aw ile birlikte asidik pH ve yüksek tuz/nem oranına bağlı olarak Enterobacteriaceae sayısının düştüğünü bildirmişlerdir.

4. 1. 1. 4. Maya Küf Sayısı

Tüm sucuk örneklerinde toplam maya küf sayısının 4.10-5.38 log kob/g arasında değiştiği tespit edilmiştir. Maya ve küf sayıları değerlendirildiğinde, CS ve CS1 grubu örneklerde (4.10 log kob/g) PS1 örnek grubu hariç diğer tüm örnek gruplarından önemli derecede (p<0.01) düşük olduğu tespit edilmiştir. PC2 örnek grubunun ise (5.38 log kob/g) diğer tüm örnek gruplarına kıyasla önemli derecede yüksek olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.2.). Olgunlaşma sonunda sucuk örneklerinde tespit edilen ortalama küf-maya sayıları dikkate alındığında bakteri kültür ilavesinin toplam küf – maya sayısı üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir.

Sucukların kalite kriteri açısından önem taşıyan maya-küfler, düşük su aktivitesi ve pH değerlerinde bile çoğalabilirler. Piyasadan toplanan sucuklar üzerinde yapılan çalışmaların sonucunda toplam maya ve küf sayısının 3.50-5.53 log kob/g arasında değiştiği tespit edilmiştir [94]. Teixeira et al. [95] yapmış olduğu çalışmada starter kültür katarak ürettikleri geleneksel fermente sucuklarda maya ve küf sayısını 5.1 log kob/g seviyesinde bulmuşlardır.

Dolayısıyla belirtilen araştırma sonuçlarının bu çalışmada elde edilen maya küf sonuçları ile benzerlik gösterdiği görülmüştür. Ancak, çalışmamızda bulduğumuz maya küf sonuçlarının Türk Gıda Kodeksi et ürünleri tebliğinde belirtilen limitin (102 kob/g) üstünde olduğu belirlenmiştir [96].

4.1.2. Fizikokimyasal analizlere ait bulgular

4.1.2.1. pH değeri

Kontrol ve bakteri kültürü ilave edilmiş sucuk örneklerinde fermentasyonun 0. gününde, 5.84-5.95 arasında değişen pH değerleri olgunlaşmanın 4. gününde 4.81-5.04 arasında bulunmuştur. 8. günde 5.01-5.24 arasında değişen değerlere düşmüştür. 12. günde ise 4.96-5.45 aralığında pH değerlerinin değiştiği gözlenmiştir. Olgunlaşmanın 4. gününde 69

tüm örneklerde en düşük pH değerine ulaşılmış daha sonra yükseldiği gözlenmiştir (Şekil 3.2.). Olgunlaşmanın son gününde ise en düşük pH değerinin PS (4.96) sucuk örneğinde, en yüksek pH değerinin ise kontrol ve PC2 (5.45) örneklerinde tespit edilmiş ve örnekler arasındaki farkın (p<0.01) istatistiki olarak önemli olduğu belirlenmiştir (Tablo 3.3.). Sonuç olarak bakteri kültürü ilavesinin sucuk örneklerinin pH değeri üzerine istatistiki olarak önemli derecede bir etkisinin olduğu belirlenmiştir.

Gök [99] ürettiği geleneksel fermente sucuklarda olgunlaşmanın 7. gününde pH değerlerinin 4.72-4.78’e kadar düştüğünü tespit etmiştir. Ayrıca yapılan diğer bir çalımada, P. pentasoceus, Lb. rhamnasus, Lb. plantarum ve Lb. sakei bakterileri kullanılarak üretilen sucuk örneklerinde fermentasyonun sonunda pH değerlerini 4.7-5.1 arasında olduğunu bildirmişlerdir [100]. Erkmen and Bozkurt [94] piyasadan toplanan 50 adet sucukta, pH değerlerini 4.53-5.77 aralığında bulmuşlardır.

4.1.2.2. Su Aktivitesi(aw) değeri

Fermentasyonun 0. günü örneklerin (aw) değeri, 0.94-0.96 aralığında değişmekteyken, fermentasyon süresi boyunca ise su aktivitesi değerlerinde düşüş gözlenmiştir.

Olgunlaşmanın son gününde en düşük aw değerinin PS (0.89) sucuk örneğinde, en yüksek aw değerinin ise CS 2 (0.92) sucuk örneğinde olduğu tespit edilmiş ve örnekler arasındaki farkın istatistiki olarak önemli (p<0.01) olduğu belirlenmiştir (Tablo 3.3).

Starter kültür bulunmayan kontrol örneğinin ise olgunlaşma sonunda aw değeri 0.91 tespit edilmiştir. Bu sonuç kontrol ve bakteri kültürü ilave edilen gruplar arasında kuruma açısından önemli bir farklılığın olmadığını göstermektedir.

Sucuk üretiminde fermentasyon aşamasında pH’nın çok hızlı bir şekilde düşmesi et proteinlerinin su tutma kapasitesinin yükselmesine ve kurumanın gecikmesine neden olmaktadır [2]. Nazlı [50] geleneksel fermente sucuklardan izole edilen S. carnosus ve Lb. plantarum laktik asit bakterilerini ilave ederek fermente edilen sucuklarda, olgunlaşmanın 9. gününde örneklerin aw değerlerinin 0.79’a kadar düştüğünü tespit etmişlerdir. Yapmış olduğumuz çalışmada da olgunlaşması tamamlanan sucukların aw değerlerinin de 0.8-0.9 civarında olduğu belirlenmiş olup, sonuçların yapılan araştırmalarla benzerlik gösterdiği görülmektedir.

70

4.1.2.3. Kurumadde miktarı

Örnek gruplarına ait kurumadde (KM) değerleri fermentasyon boyunca yükseliş göstermiştir. Fermentasyonun 0. günü örneklerin kurumadde miktarı, %33-38 aralığında değişmekteyken, fermentasyon süresi boyunca ise kurumadde değerlerinde artış gözlenmiştir. Olgunlaşma sonunda kuru madde miktarları %55-60 arasında değişmektedir. Örnekler arasındaki farkın istatistiki olarak önemli (p<0.01) olduğu belirlenmiştir (Tablo 3.3.).

Türk Gıda Kodeksi’nin Et Ürünleri Tebliği [105]’ne göre tüketime sunulmuş bir sucukta nem miktarının en fazla %40 (%60 kuru madde) olması gerektiği belirtilmektedir. Yapılan araştırmada 12 günlük olgunlaşma süresi sonunda, sucukların nem oranlarının istenen değerlerde olduğu tespit edilmiştir. Farklı ticari starter kültür kullanarak ve farklı nitrit seviyeleri katılarak üretilen sucuklar 12 gün süreyle olgunlaştırılmış, fermentasyonun 9. gününde nem miktarları % 37.65-40.83 (kurumadde miktarları % 62.35-59.17) aralığında bulunmuştur [47].

Çeşitli araştırmalar sonucunda, starter kültür kullanımının nem üzerinde önemli etkisinin olduğu tespit edilmiştir [47, 90]. Bu farklılıkların spontan floranın içeriğinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Diğer taraftan yaptığımız araştırmada kullanılan etin pH değerinin 5.8 civarında olması, laktik asit bakterilerinin daha iyi gelişmelerine ve rekabet edebilmelerine imkan vermiştir.

4.1.2.4. Titrasyon Asitliği değeri

Olgunlaşmanın son gününde titrasyon asitliği değerleri incelendiğinde değerler 1.25- 1.80 aralığında değişmektedir. En düşük titrasyon asitliği değerinin (1.25) PC1 örnek gruplarında belirlenirken, bu değerin PS1 grubu hariç diğer örnek gruplarının sahip olduğu değerlere kıyasla önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu sonucuna ulaşılmıştır. En yüksek titrasyon asitliği (1.80) PC2 örnek gruplarında belirlenirken, bu değerin CS, PS1, PC1 ve CS1 örnek gruplarının değerleri ile kıyaslandığında istatiksel açıdan önemli (P<0.01) bir farklılık gözlemlenmiştir. Kontrol, PS, PC, CS, CS1, PS2 ve CS2 örnek gruplarında istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık gözlemlenmemiştir (Tablo 3.4.). 71

Sucuklara katılan starter kültürlerin üretmiş oldukları laktik asit, olgunlaşma süresince titrasyon asitliği değerini arttırdığı tespit edilmiştir [106].

Gök [99] ürettiği geleneksel fermente sucuklara ait titrasyon asitliği değerlerinin olgunlaşmanın başlangıcından depolamanın sonuna doğru %0.14-1.44 aralığında değiştiğini belirtmiştir. Hindi etinden yapılan sucuklarla yapılan bir çalışmada olgunlaştırma sonunda örneklerin titrasyon asitliği değerlerinin % 1.55-% 1.59 arasında değiştiğini belirtmiştir [18].

4.1.2.5. Kalıntı nitrit miktarı

Olgunlaşmanın son gününde kalıntı nitrit miktarı değerleri incelendiğinde değerler 6.31- 14.65 aralığında değişmektedir. En düşük kalıntı nitrit miktarı değerinin (6.31) PC örnek gruplarında belirlenirken, bu değerin diğer örnek gruplarına kıyasla önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu sonucuna ulaşılmıştır. En yüksek (14.65) kalıntı nitrit miktarı CS1 örnek gruplarında belirlenirken, bu değerin CS2 grubu hariç diğer örnek gruplarına göre kıyasla önemli derecede yüksek (P<0.01) olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Kontrol, PS ve CS örnek gruplarında istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık gözlemlenmemiştir. PS1, PC1, PS2 ve PC2 örnek gruplarında da istatiksel açıdan önemli (P>0.01) bir farklılık gözlemlenmemiştir (Tablo 3.4.).

Benzer olarak yapılan bir çalışmada da S. carnosus ve S. xylosus ilave edilerek üretilen sucuklarda kalıntı nitrit miktarı bakteri ilave edilmeyen kontrol grubu sucuk örneklerine göre daha yüksek olduğu tespit edilmiştir [104].

Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine göre son üründe bulunabilecek kalıntı nitrit miktarı (sodyum nitrit) için 50 ppm ile sınırlandırılmıştır [105]. Yapılan çalışmanın sonuçlarına bakıldığında, sucuklara ait kalıntı nitrit miktarlarının bu limiti aşmadığı görülmektedir.

Yapılan diğer bir araştırmada 100 ppm nitrit ilave edilerek üretilen sucuklarda kalıntı nitrit miktarının fermentasyon sonunda 40 ppm;150 ppm ilave edilerek üretilen sucuklarda ise 56 ppm olarak tespit etmişlerdir [97]. Belirtilen sonuçların araştırma bulgularıyla uyum gösterdiği gözlenmektedir.

72

4.1.2.6. Renk değerleri

Üründe kalitenin bir ölçütü olan CIE L*, a* ve b* renk ölçüm değerleri, sucuk örneklerinde olgunlaşma sonunda tespit edilmiş ve sonuçların ortalamaları standart sapma değerleriyle birlikte Tablo 3.5.’de verilmiştir. Olgunlaşmanın son gününde, en açık renkli örneğin CS 2 (37.33), en koyu renkli örneğin ise kontrol (34.23) olduğu tespit edilmiştir. CS2 örnek grubunun kontrol ve CS örnek grupları ile kıyaslandığında önemli derecede yüksek olduğu (P<0.01) sonucuna ulaşılmıştır. Kontrol örnek grubunu ise CS ve PC2 örnek grupları hariç diğer örnek gruplarına göre kıyasla önemli derecede düşük (P<0.01) olduğu sonucuna ulaşılmıştır (Tablo 3.5). Kaban ve Kaya [6] yapmış oldukları çalışmada geleneksel yöntemle üretim yapan sucuk işletmelerinden temin edilerek izole edilen, Staphylococcus xylosus GM92 ve Lactobacillus plantarum GM77 suşlarının, sucuğun renk değerleri üzerine etkisini incelemişlerdir. L* değeri, kontrol grubunda 38.98±2.02, starter kültürlü örneklerde 42.25±1.44 olarak belirlenmiş ve bu iki ortalama değer arasındaki fark istatistiki olarak önemli bulunmuştur.

Olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında en düşük a* değerini PC (14.31) örneği alırken, en yüksek a* değerini ise PS (15.89) örnekleri almıştır. PC örnek grubu, kontrol, PS, PS1, PS2 ve CS2 örnek grupları ile kıyaslandığında önemli derecede düşük olduğu (P<0.01) sonucuna ulaşılmıştır. Kontrol örnek grubunu ise PS, PS1, PS2 ve CS2 örnek grupları hariç diğer örnek gruplarına göre kıyasla önemli derecede yüksek (P<0.01) olduğu sonucuna ulaşılmıştır (Tablo 3.5.). Bu sonuç PS grubu örnekte toplam renk pigmentleri içerisinde nitrosomyoglobin oranının fazla olduğunu göstermektedir [107]. Renk oluşumu mikrobiyal asitleşme ile nitritin parçalanması sonucu hızlanmaktadır [2]. Üren ve Babayiğit [108] ürettikleri sucukların a* değerlerinin fermentasyon süresince düştüğünü rapor etmişlerdir. Aynı şekilde, yapılan diğer bir çalışmada ise geleneksel fermente sucuklarda fermentasyon başlangıcında 14.35 olarak bulduğu a* değerinin, fermentasyon sırasında 17.27’lere kadar çıktığını ve kurutma aşamasında düştüğünü bildirmiştir [18].

Olgunlaşmanın son gününde en düşük b* değerlerine sahip örnek grubu, PC (1,23); en yüksek b* değerlerine sahip sucuk örneği ise CS 2 (1.99) tespit edilmiştir. PC örnek grubu CS1 örnek grupları ile kıyaslandığında önemli derecede yüksek olduğu (P<0.01) sonucuna ulaşılmıştır. CS2 örnek grubunun ise diğer örnek gruplarına kıyasla önemli 73

derecede farklılık (P>0.05) gözlenmemiştir (Tablo 3.5.). Gimeno et al. [109] sucukların b* değerlerindeki farklılığın, biberde bulunan sarı karotenoidlerden kaynaklandığını belirtmiştir.

4.1. 3. Duyusal analizlere ait bulgular

Bütün örnek gruplarında belirlenen dış yüzey rengi, kesit yüzey rengi, tekstür, kesit yüzey görünüşü, kabuk oluşumu, tat, koku, aroma ve genel beğeni özelliklerine ait bulgular aşağıda kısaca değerlendirilmiştir.

4.1.3.1. Kesit yüzey rengi

Hem pişirilmiş ve hem de pişirilmemiş sucuk örneklerinde belirlenen kesit yüzey rengi değerleri Tablo 3.6. ve Tablo 3.7.’de verilmiştir. Olgunlaşmanın son gününde pişirilmemiş sucuk örneklerinde kesit yüzey rengi değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde örnekler arasında sırasıyla CS, PS ve CS 2 örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir. Aynı şekilde pişirilmiş sucuk örneklerine ait kesit yüzey rengi değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS ve PC örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir (Şekil 3.5.).

Tüm örnek gruplarına ait kesit yüzey rengi değerleri incelendiğinde bakteri kültürü ilavesinin kesit yüzey rengi üzerinde belirleyici bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir.

4.1.3.2. Dış yüzey rengi

Hem pişirilmiş ve hem de pişirilmemiş sucuk örneklerinde belirlenen dış yüzey rengi değerleri Tablo 3.6. ve 3.7.’de verilmiştir. Pişirilmemiş sucuklara ait dış yüzey rengi değerleri incelendiğinde, olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS 2 ve PC1 örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir (Şekil 3. 10.) Örnekler arasında istatistiki olarak önemli derecede fark olmadığı tespit edilmiştir (Tablo 3.6.). Pişirilmemiş örneklerde sucuklarda ortama ilave edilen bakterilerin dış yüzey renk üzerine belirgin bir etkisi görülmemiştir.

74

Pişirilmiş sucuk örneklerine ait dış yüzey rengi değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS ve PS örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir (Şekil 3.6.). Pişirilmiş örneklerde sucuklarda ortama ilave edilen bakterilerin renk üzerine belirgin bir etkisi görülmemiştir.

4.1.3.3. Kabuk oluşumu

Pişirilmemiş sucuk örneklerinde test edilen sucuk örneklerine ait kabuk oluşumu değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS ve kontrol örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir (Şekil 3.7.). İstatistiksel açıdan veriler değerlendirildiğinde ise örnekler arasındaki farkın önemsiz (P>0.05) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.6.). Sonuçlar incelendiğinde, sucuklara bakteri kültürü ilavesinin kabuk oluşumu üzerinde herhangi olumlu bir etkisinin olmadığı anlaşılmaktadır.

4.1.3.4. Kesit yüzey görünüşü

Pişirilmemiş sucuk örneklerinde test edilen kesit yüzey görünüşü değerlerinin sucuk örnekleri arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS ve CS 2 örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir. İstatistiksel açıdan veriler değerlendirildiğinde ise örnekler arasındaki farkın önemli (P<0.05) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.6.). Sucuklara bakteri kültürü ilavesinin kesit yüzey görünüşü üzerinde herhangi olumlu bir etkisinin olmadığı anlaşılmaktadır.

4.1.3.5. Tekstür

Hem pişirilmiş ve hem de pişirilmemiş sucuk örneklerinde belirlenen tekstür özelliğine ait değerler Tablo 3.6. ve Tablo 3.7.’de verilmiştir. Pişirilmemiş sucuk örneklerine ait tekstür değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS ve PC örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir. Sucuklara bakteri kültür ilavesinin pişirilmemiş sucuk örneklerinin tekstürü üzerinde belirgin bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir.

75

Pişirilmiş sucuk örneklerine ait tekstür değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla PC ve CS örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir (Şekil 3.9.). İstatistiksel açıdan veriler değerlendirildiğinde ise örnekler arasındaki farkın önemsiz (P<0.05) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.7.). Sucuklara bakteri kültür ilavesinin pişirilmiş sucuk örneklerinin tekstürü üzerinde belirgin bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir.

4.1.3.6. Tipik sucuk tat ve aroması

Hem pişirilmiş ve hem de pişirilmemiş sucuk örneklerinde tespit edilen tipik sucuk tat ve aroma özelliğine ait değerler Tablo 3.6. ve Tablo 3.7.’de verilmiştir. Hem pişirilmiş ve hem de pişirilmemiş sucuk örneklerine ait tipik sucuk tat ve aroma değerlerinin örnekler arasındaki değişimi incelendiğinde olgunlaşmanın son gününde örnekler arasında sırasıyla CS ve PC örneklerinin en yüksek değerleri aldığı belirlenmiştir (Şekil 3.10.). Hem pişirilmiş ve hem de pişirilmemiş sucuk örneklerinde tipik sucuk tat ve aroma değerlerindeki farkın istatistiki olarak önemli (P<0.05) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.6.).

Genel olarak tipik sucuk tat ve aroması bakımından hem pişirilmemiş ve hem de pişirilmiş örnekler arasından sadece laktik asit bakterilerini içeren (CS ve PC) dolayısıyla laktik asit bakterinin sucukta oluşturduğu ekşimsi tadın, ticari sucuk örneklerinin içerdiği katkı maddeleri tarafından dengelendiği ve sonuçta arzu edilen bir tat ve aromanın oluştuğu anlaşılmaktadır.

4.1.3.7. Genel beğeni

Hem pişirilmiş ve hem de pişirilmemiş sucuk örneklerinde test edilen genel beğeni özelliğine ait değerler Tablo 3.6. ve Tablo 3.7.’de verilmiştir. Pişirilmemiş sucuk örneklerinde en düşük genel beğeni değerini PS2 (6.83) örneği, en yüksek değeri ise CS (8.16) örneklerinin aldığı tespit edilmiştir. Pişirilmiş sucuklara ait değerler incelendiğinde de çiğ sucuklarda bulunan değerlere paralellik gösterdiği sonucuna varılmıştır. Pişirilmiş sucuklarda en düşük değerin PS2 (7.25) örneği, en yüksek değerin ise CS (8.08) örneklerinin aldığı gözlemlenmiştir. Hem çiğ hem de pişirilmiş 76

sucuklara ait genel beğeni değerlerindeki farkın istatistiki olarak önemli (P<0.05) olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3.6. ve 3.7.).

4. 1. 4. Uçucu Bileşikler

Olgunlaşma sonunda uçucu bileşik olarak n-alkanlar, aromatik hidrokarbonlar, aldehitler, asitler, ketonlar, alkoller, esterler ve terpenler gibi birçok bileşik grubundan toplam 48 adet bileşik tanımlanmıştır (Tablo 3.8). Fermente et ürünlerinde tespit edilen uçucu bileşiklerin lipit oksidasyonu, amino asit oksidasyonu, amino asit şeker reaksiyonları, hayvan yemleri ve baharattan ileri geldiği bilinmektedir [19, 62]. Çeşitli araştırmalarda fermente et ürünlerinde; alkanlar, alkenler, aldehitler, ketonlar, alkoller, aromatik hidrokarbonlar, karboksilik asitler, esterler, terpenler, kükürtlü bileşikler, furanlar, pirazinler, aminler gibi birçok bileşik tespit edilmiştir [61, 110].

Olgunlaşma sonunda oluşan uçucu bileşikler grubunda yer alan aldehitler genellikle lipit oksidasyonu sonucu oluşan bileşikler olarak bilinmektedir [111]. Ancak formaldehit, asetaldehit, propanal gibi kısa zincirli aldehitler karbonhidrat metabolizması ürünleridir [101]. Yapılan araştırmada aldehit grubunda bulunan benzen asetaldehit, tüm örnek gruplarında düşük konsantrasyonlarda gözlemlenmiştir. İtalyan tipi kuru sosislerde benzen asetaldehitin olgunlaşma sırasında belirgin bir şekilde artış gösterdiğini ve bu tip fermente sosisler için önemli bir bileşik olduğunu belirtmişlerdir [60]. Sucukta belirlenen diğer önemli bir bileşik kimyondan kaynaklanan kuminaldehittir [86]. Kuminaldehit ise kontrol dahil tüm örnek gruplarında gözlemlenmiştir. Ancak kuminaldehit, kontrol, CS, CS 1 ve CS 2 grubu örneklerde 14.62-22.54 arasında değişen değerlerde tespit edilmesine rağmen Lb. plantarum içeren diğer tüm örnek gruplarında (PS, PS1, PS2, PC, PC1, PC2) ise 1.45-1.61aralığında değişen değerler aldığı belirlenmiştir. Bu durumun bu örnek gruplarının içerdiği Lb. plantarum ile ilgili olduğu düşünülmektedir. Çünkü yapılan çalışmalarda kuminaldehitin Lb plantarum üzerinde antimikrobiyal etki göstererek Lb. plantarum’un gelişimini ve asit üretimini engellediği bildirilmiştir [112]. Dolayısıyla kuminaldehitin, Lb. plantarum’u inhibe ederken kendisinin de indirgendiği düşünülmektedir.

Doymamış yağ asitlerinin oksidasyonu sonucu oluşan nonanal ise tüm sucuk gruplarında çok düşük düzeylerde gözlemlenmiştir (Tablo 3.8). Meynier et al. [68] 77

milano salamlarında aldehitlerin % 12,8 oranında olduğunu, Anserona et al. [113] fermente sosislerden chorizo de Pamplona’da aldehitlerin % 13,8 oranında olduğunu tespit etmişlerdir.

Aminoasitlerin enzimatik olmayan strecker degradasyonu ile oluşan 2-metil bütanal ve 3-metil bütanal sucukların arzu edilen tipik aromasını meydana getirmektedir [8]. Fermente et ürünlerinde ekşi ve peynirimsi aroma veren 3-metilbütanal ve 2- metilbütanal sırasıyla lösin ve izolösinin degradasyonu sonucu oluşmaktadır [70]. Gök [99] yaptığı çalışmada headspace yöntemi kullanarak 2-metil bütanal ve 3-metil bütanal uçucu bileşiklerini tespit etmiş olmasına rağmen, Kaban [87] yaptığı çalışmada belirtilen bileşikleri SPME-GC-MS yöntemi ile tespit edememiştir. Ancak çalışmamızda gerek kontrol grubunda gerekse diğer örneklerde 2 veya 3-metilbütanal ve 2-metil propanal gibi aroma bileşenleri tespit edilememiştir.

Fermente kuru sosislerde alkollerin en önemli kaynakları lipit oksidasyonu, karbonhidrat metabolizması ve amino asit katabolizmasıdır [69]. Alkol grubu içerisinde yer alan kumin alkol ve fenil-etil alkol tüm örnek gruplarında tespit edilmiştir. Kumin alkol, kuminaldehitin aksine PS, PS1 ve PS2 grubu örnekler ile PC, PC1 ve PC2 örnek gruplarında diğer tüm örnek gruplarına göre önemli derecede yüksek bulunmuştur. Dolayısıyla bu örneklerde kuminaldehitin kısmen kumin alkole indirgendiği düşünülmektedir. β-akoradien tüm örnek gruplarında düşük düzeylerde tespit edilmiştir (Tablo 3.8.). Kuru fermente sosislerde pekçok alkol birçok araştırmada tespit edilmiştir [8, 60, 69, 114, 115].

Karbonhidratların ve aminoasitlerin parçalanması sonucu oluşan asitler sucuklara genellikle peynirimsi bir aroma vermektedir [62]. Bu çalışmada sucuk aroması üzerine etkili olan asitlerden yalnızca hekzanoik asit, tüm örneklerde tespit edilmiştir. Hekzanoik asit, fermente sosislerde yapılan benzer çalışmalarda da tespit edilmiştir [72, 84].

Sucukların aromasında etkili olan diğer bileşiklerde terpenlerdir. Terpenik bileşikler daha çok hamura katılan baharattan kaynaklanmaktadır [116]. Bu çalışmada sucuklarda 34 tane terpenik bileşik saptanmıştır. Toplam uçucu aroma bileşikleri bakımından sucuk grupları değerlendirildiğinde, oransal olarak terpenlerin diğer belirlenen bileşiklere 78

kıyasla daha büyük olduğu görülmektedir. Özellikle terpinen, karyofillen ve simen bileşiklerinin konsantrasyonlarının diğer kimyasal bileşiklerin konsantrasyonlarına göre oldukça yüksek olduğu görülmektedir. α-humulen ve α-bergamoten tüm örnek gruplarında düşük seviyelerde tespit edilmiştir D-karen tüm örnek gruplarında tespit edilmiş olmasına rağmen PS, PS1 ve PS2 örnek gruplarında diğer gruplara göre önemli derecede yüksek olduğu gözlenmiştir. γ-terpinen tüm örnek gruplarında tespit edilmiş olmasına rağmen PC, PC1 ve PC2 örnek gruplarında diğer gruplara göre önemli derecede yüksek (P<0.001) olduğu gözlenmiştir. α-terpinen ise diğer örnek gruplarına kıyasla CS, CS1 ve CS2 örneklerinde daha yüksek konsantrasyonlarda tespit edilmiştir Karyofillen E ve linalol tüm sucuk örneklerinde tespit edilmiştir. Ancak bu uçucu bileşikler özellikle Lb. plantarum içeren PS, PS1, PS2, PC, PC1 ve PC2 örnek gruplarında diğer gruplara kıyasla daha yüksek oranlarda gözlenmiştir (Tablo 3.8. ).

Çalışmamızda diğer terpenik bileşiklere göre yüksek konsantrasyonlarda bulunan simen olgunlaşmış, karabiber, kimyon ve yenibahar kaynaklı bir uçucu bileşiktir. Simen özellikle Lb. plantarum ve Lb. curvatus içeren PC, PC1 ve PC2 örnek gruplarında diğer örnek gruplarına kıyasla belirgin bir şekilde yüksek oranda gözlenmiştir. Et ve et ürünlerine tipik baharat kokusu veren α-thujenal karabiber ve biberiye ekstraktında bulunmaktadır [117, 118]. α-thujenal, tüm örnek gruplarında düşük düzeylerde tespit edilmiştir. Benzer olarak kamfen, tridekan, α-guaien, mirsen, α- fellendren, β-pinen, α- selinen, terpinen-4-ol, kadinen delta, α-kopaen, simen, β-elemene, limonen, α-pinen, sabinen, β selinen, γ terpinen ve α terpinen gibi terpenik bileşikler de tüm örnek gruplarında düşük düzeylerde tespit edilmiştir.

Diğer bir monoterpen olan limonen nanemsi ve turunçgil aromasına sahip bileşiklerden olup karabiberde ve biberiyede önemli miktarda bulunmaktadır [117]. Limonen tüm örnek gruplarında tespit edilmiş olmasına rağmen PC, PC1 ve PC2 örnek gruplarında diğer gruplara göre önemli derecede yüksek olduğu gözlenmiştir.

Terpenlerin miktarının genellikle olgunlaşma süresi ilerledikçe arttığı pek çok araştırıcı tarafından bildirilmiştir [68, 117, 118]. Meynier et al. [68] milano salami olarak adlandırılan kuru kür edilmiş sosis örneklerinde çok sayıda terpen belirlemişler ve bu bileşiklerin baharat kaynaklı olduklarını belirtmişlerdir.

79

Yapılan çaılşmada kontrol ve bakteri kültürü ilave edilen sucukların uçucu bileşik profilini ağırlıklı olarak baharat kaynaklı terpenler oluşturmaktadır. Tüm sucuk örneklerinde lipit oksidasyonu ve amino asit katabolizması sonucu oluşan bileşik sayısı oldukça düşüktür. Dolayısıyla bakteri kültür ilavesinin uçucu aroma bileşikleri üzerine önemli bir etkisinin olmadığı sonucuna varılmıştır.

4.1. 5. Sucuk Örneklerinin PCR-DGGE Analiz Bulguları

Kontrol grubu sucuk örneğinin fermentasyon süresince V1 bölgesinin PCR-DGGE analizi sonucuna göre, fermentasyonun 0. gününde tespit edilen Lactoccocus piscium’un fermentasyonun ilerleyen günlerinde bant şiddeti giderek azalmıştır. Lb. sakei’ye ait bant ise fermentasyonun 4. gününden itibaren tespit edilmiş olup fermentasyonun ilerleyen günlerinde bant şiddetinde değişiklik görülmemiştir. Fermentasyonun 0. gününde Brochothrix thermosphacta ve Carnobacterium divergens türlerine ait bantların fermentasyon süresince asitliğin artmasıyla birlikte bant şiddetlerinin de azaldığı gözlenmiştir.

Fermentasyon süresince V1 bölgesinin analiz sonucuna göre tüm örneklerde olgunlaşmanın 0. gününde Lb. sakei, Lb. curvatus, Lb. plantarum bantları gözlenmemiştir. 4. günden itibaren hem laktik asit bakteri sayısı, hem de kuru madde miktarının artmasıyla birlikte bant şiddetleri artmıştır. 4, 8 ve 12. günlerde bant şiddetlerinde değişiklik bulunmamaktadır. Olgunlaşmanın 4. gününden itibaren tüm örneklerde parlak bir Lb. sakei bandı tespit edilmiştir. Lb. plantarum bakterisine ait bant, olgunlaşmanın 4. gününden itibaren yalnızca PC, PC1, PC2, PS, PS1 ve PS2 grubu örneklerde tespit edilirken, Lb. curvatus bakterisine ait bant ise PC, PC1, PC2, CS, CS1 ve CS2 grubu örneklerde gözlenmiştir. V1 bölgesine göre PCR-DGGE analizinde S. carnosus ve S. xylosus bakterilerine ait bant tespit edilmemiştir.

V3 bölgesinin PCR-DGGE analiz sonucuna göre kontrol grubunda fermentasyonun 0. gününde tespit edilen B. thermosphacta ve Leu. gasicomitatum türlerine ait bantların fermentasyon süresince asitliğin artmasıyla birlikte bant şiddetlerinin azaldığı gözlenmiştir. Fermentasyonun 0. gününde gözlenen Lc. piscium ve C. divergens türlerine ait bantlar ise fermentasyonun 4. gününden itibaren tespit edilmemiştir. Lb. sakei ve Weissella koreensis bakterilerine ait bantlar ise fermentasyonun 4. gününden 80

itibaren görülmüş olup fermentasyonun ilerleyen günlerinde bant şiddetlerinde değişiklik gözlenmemiştir.

Fermentasyon süresince V3 bölgesinin analiz sonucuna göre tüm örneklerde Lb. curvatus ve Lb. sakei bakteri bantları birbirinden ayırt edilememiştir PC, PC1, PC2, PS, PS1 ve PS2 grubu sucuk örneklerinde Lb. plantarum bandı gözlenmesine rağmen, CS, CS1 ve CS2 grubu sucuk örneklerinde Lb. plantarum bandı gözlenmemiştir. S. carnosus bakterisine ait bant profili örneklerin hiçbirisinde tespit edilememiştir. S. xylosus ise Lb. sakei ve Lb. curvatus bakterilerine ait bantlar ile DGGE jelinde eşit mesafede göç ettikleri için birbirlerinden ayırt edilememiştir.

Cocolin et al. [13] fermente sosislerde olgunlaşma sırasında mikrobiyal popülasyonun belirlenmesi amacıyla PCR-DGGE analiz yöntemini kullanmışlardır. Bu amaçla fermentasyonun belirli günlerinde sucuklardan örnek alınıp, PCR-DGGE analizi yapmışlardır. Sonuç olarak fermentasyonun ilk 10 günü Lb. sakei baskın bakteri olarak tespit edilmişken, sonraki 10 gün Lb. curvatus baskın bakteri olarak belirlenmiştir.

Yapılan diğer bir çalışmada ise Fontanaa et al. [58], PCR-DGGE tekniği kullanılarak fermente Arjantin sosislerinin mikrobiyal yükünün tanımlamışlardır. Albano et al. [120] Portekiz sucuklarının mikrobiyal tanımlamasını yapabilmek için, PCR-DGGE analiz yöntemini kullanmışlardır. Sonuç olarak sucuklarda LAB baskın bakteriler olarak tespit edilmiştir. Yine birçok araştırmacı tarafından İtalyan sosislerinin fermentasyon sırasındaki mikrobiyal kompozisyonu PCR-DGGE tekniği ile izlenmiştir [13, 59].

Kesmen et al. [14] yapmış oldukları çalışmada sucuk içerisinde bulunan laktik asit bakterilerini, 16S DNA üzerinde bulunan bakterilere spesifik V1 ve V3 bölgelerini kullanarak PCR- DGGE tekniğiyle tanımlama yapmışlardır. Çalışma sonucunda sucuk örnekleri içerisinde toplam 8 farklı laktik asit bakterisi tespit edilmiş olup, Lb sakei, Lb curvatus ve Weissella viridescens bakterilerinin mikrofloradaki en baskın bakteriler olduğu rapor edilmiştir.

81

4.2. Araştırma Sonucunda Elde Edilen Bazı Önemli Bulgular

Bu çalışmada geleneksel yöntemle starter kültür kullanılmadan üretilen sucuklardan izole edilen fermentatif bakterilerin starter kültür olarak kullanılabilme potansiyelini belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, geleneksel yöntemle starter kültür kullanılmadan üretilen sucuklardan izole edilen farklı bakteri kültürleri kullanılarak fermentasyon süresince bir taraftan sucukların bakteriyel florasındaki değişim izlenirken, diğer taraftan sucuğun bazı kalite özellikleri belirlenmiştir.

Araştırmada, starter kültür kullanılmadan hazırlanan kontrol grubuna ilave olarak laktik asit bakterilerinin (Lactobacillus sakei, Lb. curvatus, Lb. plantarum) ve Staphlococcus cinsi bakterilerinin (S. xylosus ve S. carnosus) 9 farklı kombinasyonu oluşturularak toplam 10 farklı grup sucuk üretilmiştir. Fermentasyon süresince (0., 4., 8 ve 12. günler) sucuk örneklerinde nem, pH, su aktivitesi analizleri ile mikrobiyolojik analizler yapılmıştır. Ayrıca sucuğun bakteriyel florasını belirlemek amacıyla fermentasyon süresince (0., 4., 8. ve 12. günler) PCR-DGGE analizi yapılmıştır. Olgunlaşma tamamlandıktan sonra sucuk örneklerinde fiziksel, kimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal analizleri yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar istatistiksel analizlere (SPSS Version 18.0 kullanılarak) tabi tutularak değerlendirilmiştir.

Bu çalışma kapsamında elde edilen bulgular aşağıda sıralanmıştır:

1. Bakteri kültürü ilave edilen sucuk örnekleri, LAB sayısı bakımından kontrol grubu ile arasında önemli bir farklılık bulunmamıştır. Olgunlaşmanın son gününde tespit edilen, LAB sayısı, kontrol grubu örneklerde, bakteri kültürü ilave edilen örneklerden <1 log kob/g daha düşük olduğu görülmüştür. Bu sonuç literatürdeki çalışmalarla benzerlik göstermektedir. Ancak bu çalışmada bakteri kültürü ilave edilerek toplam sayının arttırılmasından ziyade istenilen LAB kompozisyonunun oluşturulması hedeflenmiştir.

2. Bu çalışmada sucuklara ilave edilen bakteri kültürlerinin toplam Enterobacteriaceae ve maya-küf sayısının düşürülmesinde etkili olmadığı 82

sonucuna varılmıştır. Bu durum ilave edilen bakteri kültürlerinin maya-küf ve Enterobacteriaceae açısından herhangi bir inhibe edici etkisinin olmadığını göstermektedir.

3. Tüm örneklerin pH değerleri, olgunlaşmanın başlangıcında hızla düşerek, olgunlaşmanın 4. günü en düşük değerlere ulaşmış ve daha sonraki günlerde az bir yükselme göstermiştir. Kontrol grubu örneklerde pH değeri, diğer sucuk örneklerine göre daha yüksek bulunmuştur. Dolayısıyla bakteri kültürü ilavesinin az da olsa pH’ı düşürücü etkisinin olduğu gözlenmiştir. Bu durumun örneklerde tespit edilen LAB sayısı ile ilişkili olduğu düşünülmektedir Diğer taraftan, ilave edilen bakteri türü ile örneklerin pH değerleri arasında anlamlı bir ilişki gözlenmemiştir.

4. Olgunlaşma süresince tüm örneklerde su aktivitesi değerleri hızlı bir düşüş göstermiştir. Olgunlaşmanın son

gününde tüm örneklerde tespit edilen aw değerleri hızlı olgunlaştırılan sucuklar

için önerilen aw değerleri; 0.89-0.92 aralığında bulunmuştur. Bununla birlikte

bakteri kültür ilavesinin aw üzerine etkisinin olmadığı sonucuna varılmıştır.

5. Olgunlaşma süresince tüm örneklerde % kurumadde değerleri hızlı bir yükseliş göstermiştir. Diğer taraftan bakteri kültürü ilavesinin sucuklarda % kurumadde miktarı üzerine etkisinin olmadığı tespit edilmiştir.

6. Tüm örneklerde tespit edilen kalıntı nitrit miktarı 6.31-14.65 ppm arasında değişim göstermiştir. Ancak, S. carnosus (PS1, PC1 ve CS1) ve S. xylosus içeren (PS2, PC2 ve CS2) örneklerde tespit edilen kalıntı nitrit miktarı, diğer örnekler göre daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Bu durumda S. carnosus ve S. xylosus suşlarının nitratı nitrite indirgediği ve kalıntı nitrit miktarını arttırdığı anlaşılmaktadır.

7. Bakteri kültür ilavesinin sucuk örneklerinin renk değerlerinde belirgin bir etkisinin olmadığı sonucuna varılmıştır. S. carnosus ve S. xylosus bakterileri ilave edilen örneklerde nitratın nitrite daha sonra da oluşan nitrit oksidin miyoglobin ile birleşerek daha fazla 83

oranda nitrosomiyoglobin oluşturması beklendiği halde özellikle L* ve a* değerleri üzerinde beklenilen farklılık gözlenememiştir.

8. Genel olarak tipik sucuk tat ve aroması bakımından hem çiğ hem de pişirilmiş örnekler arasından sadece laktik asit bakterilerini içeren (CS ve PC) örneklerin duyusal olarak daha çok beğenildiği belirlenmiştir. Dolayısıyla laktik asit bakterinin sucukta oluşturduğu ekşimsi tadın, ticari sucuk örneklerinin içerdiği katkı maddeleri tarafından dengelendiği ve sonuçta arzu edilen bir tat ve aromanın oluştuğu anlaşılmaktadır.

9. Tüm sucuk örneklerinde baharat kaynaklı terpenlerin fazlaca olduğu ancak sucuklarda arzu edilen ve tipik sucuk aromasını meydana getiren 2-metil bütanal ve 3-metil bütanal bileşiklerine ise çalışmamızda rastlanmamıştır. Bu durumun, moleküler ağırlıkları düşük bu bileşiklerin tespitinde headspace örnekleyici yerine katı faz mikroekstraksiyon (SPME) sistemi kullanılmasından ileri geldiği düşünülmektedir.

10. Kuminaldehit, kontrol, CS, CS1 ve CS2 grubu örneklerde 14.62-22.54 arasında değişen değerlerde tespit edilmesine rağmen Lb. plantarum içeren diğer tüm örnek gruplarında (PS, PS1, PS2, PC, PC1, PC2) ise 1.45-1.61 aralığında değişmiştir. Bu durumun bu örnek gruplarının içerdiği Lb. plantarum ile ilgili olduğu düşünülmektedir. Çünkü yapılan çalışmalarda kuminaldehitin Lb. plantarum üzerinde antimikrobiyal etki göstererek Lb. plantarum’un gelişimini ve asit üretimini engellediği bildirilmiştir. Ayrıca, Lb. plantarum içeren tüm örnek gruplarında kuminaldehit oransal olarak azaldığı için diğer uçucu bileşiklerin oransal olarak arttığı belirlenmiştir.

11. PCR-DGGE sonuçları ise aşağıda kısaca özetlenmiştir:

 Sucuk hamuruna ilave edilen bakterilere ait bantların fermentasyonun 4. gününden itibaren oluştuğu ve bunların fermentasyon süresince kaybolmadığı dolayısıyla mikrobiyal floranın canlı kaldığı anlaşılmaktadır.

84

 Kontrol grubu örnekler de dahil tüm sucuk örneklerinde Lb. sakei’ye ait spesifik bantlar tespit edilmiştir. Dolayısıyla bu bakterinin ortama daha iyi adapte olarak hamurda doğal florayı oluşturduğu anlaşılmaktadır.

 Kontrol grubu ve Lb. sakei ilave edilmemiş örnek grupları dahil tüm örneklerde en şiddetli bandın Lb. sakei’ye ait olduğu belirlenmiştir. Dolayısıyla ortama iyi adapte olmuş Lb. sakei’nin ilave edilen laktik kültürlere rağmen dominant özelliğini koruduğu anlaşılmaktadır.

 Buna karşılık Lb. plantarum’a ait spesifik bantlar yalnızca bu bakterilerin ilave edildiği örneklerde gözlenmiştir. Dolayısıyla bu bakterinin ortamdaki baskın floraya rağmen gelişebildiği anlaşılmaktadır. Lb. plantarum bandının Lb. sakei bandından daha az şiddette olması, Lb. plantarum’un fermentasyon sırasında baskın flora ile rekabetinden ve/veya kimyon kaynaklı kuminaldehitin bu bakteri üzerindeki inhibitör etkisinden ileri gelebileceği düşünülmektedir.

 Sucuk hamuru hazırlanırken örneklere 106 kob/g seviyesinde S. carnosus ve S. xylosus bakterileri, 107 kob/g seviyesinde ise laktik asit bakterileri inoküle edilmiştir. Buna rağmen, olgunlaşma süresince yapılan PCR-DGGE analizlerinde örneklerde S. carnosus ve S. xylosus bakterileri tespit edilememiştir. Dolayısıyla bu bakterilerin sayısının PCR-DGGE yönteminin deteksiyon limitinin altında olduğu düşünülmektedir.

4.3. Araştırma Sonucunda Yapılabilecek Öneriler

Bu araştırmanın sonuçları dikkate alındığında aşağıdaki önerilerin yapılabileceği düşünülmektedir;

1. Bu çalışmada sucuk örneklerinin fermentasyon süresince laktik asit bakteri kompozisyonundaki 85

değişim PCR-DGGE kullanılarak izlenebilmiş, ancak, S. carnosus ve S. xylosus bakterileri tespit edilememiştir. Dolayısıyla laktik floranın fermentasyon süresince izlenmesinde bu yöntem önerilebilir.

2. Sucuğun yerel florasının ilave edilen bakteri kültürleri ile değişmediği tespit edilmiştir. Her ne kadar kullanılan bakteri kültürleri, starter kültür kullanılmadan geleneksel yöntemle üretilen sucuklardan izole edilmiş izolatlar olsa da, bu bakterilerin sucuk hamuruna katıldığında ortama adapte olması gerektiği anlaşılmıştır. Ticari starter kültürler ile ilgili olarak geleneksel tat ve aroma bakımından istenilen özellikleri taşımadığı bildirilse de, son yıllarda starter kültürlerde aranan özellikler rekombinant DNA teknolojisi ile arttırılabilmektedir. Sonuç olarak, çalışmamızda kullandığımız bakteri kültürlerinin rekombinant DNA teknolojisi ile üretilen starter kültürlere teknolojik yönden alternatif olamayacağı görülmektedir.

3. Bu çalışmada fermente et ürünlerinin tipik aroma bileşiklerinden olan 2-metil bütanal ve 3-metil bütanal tespit edilememiştir. Bu durumda düşük molekül ağırlıklı bu uçucu bileşiklerin tespiti için SPME yerine headspace örnekleyici kullanılması önerilebilir.

4. Literatürdeki bilgiler ve elde edilen sonuçlar dikkate alındığında sucuk üretiminde fermentasyon süresince Lb. plantarum’un daha iyi gelişebilmesi için üretimde kullanılan kimyon miktarını standardize etmek gerektiği anlaşılmıştır.

5. Geleneksel yöntemlerle üretilen sucuklardan izole edilen laktik asit bakteri kültürlerinin sucuğun teknolojik, mikrobiyolojik ve duyusal kalitesi üzerine belirgin derecede bir etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Dolayısıyla sucuktan izole edildikten sonra kültür ortamında geliştirilen ve muhafaza edilen bu bakterilerin sucuk hamuruna ilave edildikten sonra yerel flora kadar ortama iyi adapte olamadığı anlaşılmaktadır. Bu tip izolatların starter kültür olarak kullanılması durumunda, bu bakteriler sucuk hamuruna benzer bir fermentasyon ortamında geliştirildikten sonra bu hamurdan alınan bir porsiyonun yeni fermentasyon ortamına eklenerek prosesin başlatılması (back slopping) yöntemi önerilebilir. 86

KAYNAKLAR

1. Bozkurt, H., Erkmen, O., 2002. Effects starter cultures and additives on the quality of Turkish style sausage. Meat Science, 61: 149-156. 2. Gökalp, H. Y., Kaya, M. ve Zorba, Ö., 2004. Et Ürünleri İşleme Mühendisliği. Atatürk Üniv. Yayın No:786, Ziraat Fak. Yayın No: 320, Ders Kitapları serisi No:70, Atatürk Üniv. Ziraat Fak. Ofset Tesisi, Erzurum. 3. Ercoşkun H., Taği Ş., Ertaş A. H., 2010. The effect of different fermentation intervals on the quality characteristics of heat-treated and traditional sucuks. Meat Science, 85: 174-181. 4. Erdogrul, Ö. T., 1998. Et ve süt ürünlerinde kullanılan starter kültürler. Celal Bayar Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Dergisi. ISSN 1301-2428 s.127- 130. 5. Aymerich, T., Martin, B., Garriga, M. and Hugas, M., 2003. Microbial Quality and Direct PCR Identification of Lactic Acid Bacteria and Nonpathogenic Staphylococci from Artisanal Low-Acid Sausages. Applied and Enviromental Microbiology, 69: 4583-4594. 6. Kaban, G., Kaya, M., 2007. Fermente Sosislerde Uçucu Bileşikler. Atatürk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 38: 225-230. 7. Garcia-Varona, M., Santos, E. M., Jaime, I. and Rovira, J., 2000. Characterisation of Micrococcaceae Isolated from Different Varienties of Chorizo. International Journal of Food Microbiology, 54: 189–195 8. Berdagué, J. L., Monteil, P., Montel, M. C. and Talon, R., 1993. Effects of Starter Cultures on the Formation of Flavour Compounds in Dry Sausage. Meat Science, 35: 275-287. 9. Montel, M. C., Talon, J. R., Berdague, J. L. and Rousset-Akrim, S., 1996. Biochemical Activities of Micrococcoceae and Their Effects on the Aromatic Profiles and Odours of a Dry Sausage Model. Food Microbiology, 13: 489-499. 10. Olesen, P. T., Meyer A. S. and Stahnke, L. H., 2004. Generation of Flavour Compounds in Fermented Sausage the Influence of Curing Ingredients, Staphylococcus starter Culture and Ripening Time. Meat Science, 66: 675–687. 87

11. Campbel-Plat, G., 1995. Fermented meats- a world perspective, pp. 39-52. In “Fermented Meats” (Eds. G. Campbel-Plat and P. E., Cook). Chapman and Hall, New york, NY. 12. Vural, H. 1992. Türk fermente sucuk üretiminde starter kültür kullanımı üzerine araştırmalar. Hacettepe Üniversitesi, Doktora Tezi. 13. Cocolin, L., Manzano, M., Aggio, D., Cantoni, C., Comi, G., 2001. A novel polymerase chain reaction (PCR) – denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) for the identification of Micrococcaceaes trains involved in meat fermentations. Meat Science, 58: 59-64. 14. Kesmen, Z., Yetiman, A.E., Gulluce, A., Kacmaz, N., Sagdic, O., Cetin, B., Adiguzel, A., Sahin, F., Yetim, H., 2011. Combination of culture-dependent and culture-independent molecular methods for the determination of lactic microbiota in sucuk. International Journal of Food Microbiology, 153: 428– 435 15. Temmerman, R., Huys, G., Swings, J., 2004. Identification of lactic acid bacteria:culture-dependent and culture independent methods. Trends in Food Science and Technology, 15: 348-359. 16. Muyzer, G., Smalla, K., 1995. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoek, 73: 127–141. 17. Anonim, 2002. Türk Standartları Enstitüsü Türk Sucuğu, TS 1070. Türk Standartları Enstitüsü, Ankara. 18. Ensoy, Ü. ve Kolsarıcı, N., 2004. Fermente et ürünlerinde flavor oluşumu. Standard, 43: 81-93. 19. Blom, H., Hagen, B. F., Pedersen, B. O., Holck, A. L., Axelsson, L. and Naes, H., 1996. Accelerated production of dry fermented sausage. Meat Science, 43: 229- 242. 20. Özdemir, H., 1999. Türk fermente sucuğunun florasındaki dominant Lactobacillus türlerinin sucuğun organoleptik nitelikleri ile ilişkisi. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 46: 189-198. 21. Dainty, R. H. and Blom, H., 1995. Flavor chemistry of fermented sausages, pp. 176-193. In: Fermented Meats (Eds. G. Campbell-Plat, and P.E. Cook). Chapman and Hall, New York, NY. 88

22. Korel, F., 1996. Analyses of fermented sausages and the use of starer cultures and carbohydrate substrates in fermented turkey sausage. Clemson University, Thesis of Master of Science Animal and Food Industries. Clemson, USA. 23. Törnük, F., Yılmaz, M..T., Yetim, H., 2010. Geleneksel Et Ürünlerimizden Türk Sucuğunun Serüveni. I. Et Ürünleri Sucuk Çalıştayı, s. 85-95, Kuşadası, Aydın. 24. Uğur, M., 1984. Starter kültür kullanılarak Türk sucuklarında kalitenin geliştirilmesi üzerine araştırmalar. İstanbul Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi Dergisi, 10: 41-52. 25. Gönülalan, Z., Arslan, A., Köse, A., 2004. Farklı starter kültür kombinasyonlarının fermente sucuklardaki etkileri. Turkish Journal Veterinary and Animal Science, 28: 7-16. 26. Dalmış, Ü., Soyer, A., 2008. Effect of processing methods and starter culture (Staphylococcus xylosus and Pediococcus pentosaceus) on proteolytic changes in Turkish sausages (sucuk) during ripening and storage. Meat Science, 80: 345- 354. 27. Gökalp, H. Y., Çon, A. H., 2000. Türk sucuklarından izole edilen bakteriyosin benzeri metabolitler üreten Laktik Asit Bakterilerinin gıdaları bozucu ve gıda kaynaklı patojen bazı bakteriler üzerine antagonistik etkileri. Et ve Ürünleri Sempozyumu '96, Bildiri Kitabı, ss. 55-64. İstanbul Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi Yayınları, İstanbul. 28. Rantsiou, K., Cocolin, L., 2006. New developments in the study of the microbiota of naturally fermented sausages as determined by molecular methods: a review. International Journal of Food Microbiology, 108: 255–267. 29. Seager, M. S., Banks, J. G., Blackburn, C. D. W., Board, R. G., 1986. A taxonomic study of Staphylococcus spp. isolated from fermented sausages. Journal of Food Science, 51: 295-297. 30. Öztan, A., 1993. Et Bilimleri ve Teknolojisi. Hacettepe Üniversitesi Mühendislik. Fakültesi Yayınları. Hacettepe Üniversitesi Basımevi, Ankara. 31. Verplaetse, F., 1994. Influence of Raw Meat Properties And Processing Technology on Aroma Quality of Raw Fermented Meat Products. Proceeding International Congress Meat Science Tecnology, 65.Yayınları, Ankara, 40-45 s. 32. Everson, C., Danner, W. E., Hammes, P. A., 1970. Bacterial starter cultures in sausage products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 18: 570-571. 89

33. Lücke, F. K., 2000. Utilization of microbes to process and preserve meat. Meat Science, 56: 105-115. 34. Filiz, N., 1996. Yüksek Isı ile Üretilen Türk Sucuklarında Starter Kültür Kullanımı Üzerine Araştırmalar. Uludağ üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Bursa, 65 s. 35. Lücke, F. K., Hechelmann, H., 1987. Starter cultures for dry sausages and raw ham composition and effect. Fleischwirtschaft, 67: 307-314. 36. Buchenhüskes, J. H. 1993. Selection Criteria for Lactic Acid Bacteria to be used as Starter Cultures for Various Food Commodities. FEMS Microbiology Reviews, 12: 253-272. 37. Dönderici, S. Z., 2005. Penicillium Cinsine Ait Bazı Küflerin Türk Tipi Fermente Sucuk Üretiminde Koruyucu Kültür Olarak Kullanım Olanaklarının Araştırılması. Çukurova Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Adana, 112 s. 38. Lucke, F. K., 1986. Microbiological processes in the manufacture of dry sausage and raw ham. Fleischwirtschaft, 66: 1505-1509. 39. Candoğan, K., 2000. Bacterial starter cultures, aging and fermentation effects on some characteristics of fermented beef sausages. Clemson University, Thesis of Doctor of Philosophy of Food Tecnology, Clemson, USA. 40. Caplice, E. and Fitzgerald, G.F., 1999. Food fermentations: role of microorganisms in food production and preservation. International Journal of Food Microbiology, 50: 131-149. 41. Girard, J. P. and Bucharles, C., 1992. Acid fermentation, pp. 138-164. In: Technology of Meat and Meat Products (Ed. Girard, J.P.A.). Ellis Horwood, London, England. 42. Jessen, B., 1995. Starter Cultures for meat fermentations, pp. 134-140. In: Fermented Meats. (Eds. G. Campbell-Platt and P. E. Cook). Blackıe Academic & Professional. Glasgow G64 2NZ, UK. 43. Cantoni, C., Molnar, M. R., Renon, P., Giolitti, G., 1967. Lipolytic Micrococci in porkfat. Journal of Applied Bacteriology, 30: 190-196. 44. Alperden, İ., Özay, G., 1993. Fermentation technologies in food production. Nato- Tu-Fermentech. Final project report, TUBİTAK, Food and Refrigeration Department. 90

45. Ceylan, E., Fung, D. Y. C., 2000. Destruction of Yersinia enterocolitica by Lactobacillus sake and Pediococcus acidilactici during low-temperature fermentation of Turkish dry sausage (sucuk). Journal of Food Science, 65: 876- 879. 46. Kaban, G., Kaya, M., 2006. Effect of starter culture on growth of Staphlococcus aureus in sucuk. Food Control, 17: 797-801 47. Gençcelep, H., 2006. Sucuk Üretiminde Değişik Starter Kültürler ve Farklı Nitrit Seviyelerinin Biyojen Amin Oluşumu Üzerine Etkileri. Ankara Üniversitesi, Doktora Tezi, Ankara, 130 s 48. Santos, M. H. S., 1996. Biogenic amines: their importance in foods. International Journal of Food Microbiology, 29: 213-231. 49. Talon, R., Leroy, S., Lebert, I., 2007. Microbial ecosystems of traditional fermented meat products: the importance of indigenous starters. Meat Science 77: 55–62. 50. Nazlı, B., 1998. Research on the ripening of Turkish fermented sausage using a local starter culture combination. Turkish Journal Veterinary Animal Science, 22: 393-397. 51. Schillinger, U. and Lücke, F. K. 1989. Antibacterial Aktivity of Lactobacillus sake Isolated from Meat. Applied Environmental Microbiology, 55: 1901–1906 52. Aygün, G., 2008. Hastane Enfeksiyonlarının Kontrolünde Mikrobiyoloji Laboratuarının Rolü. Cerrahpaşa Üniversitesi Tıp Fakültesi Sürekli Tıp Etkinlikleri. Hastane Enfeksiyonları. Koruma ve Kontrol, Sempozyum Dizisi No:60, 207-212. 53. Tekeli A., 2006. PCR amplifikasyon temelli mikrobiyal tiplendirme, s: 197-222. In: Moleküler Mikrobiyoloji Tanı Prensipleri ve Uygulamalar (Eds. A. Tekeli, Ş. Ustaçelebi). Palme Yayıncılık, Ankara, 54. Mannu, L., Riu, G., Comunian, R., Fozzi, M. C., Scintu, M. F., 2002. A preliminary study of lactic acid bacteria in whey starter cultureand industrial Pecorino Sardo ewes‟ milk cheese: PCR identification and evolution during ripening. International Dairy Journal, 12: 17–26. 55. Aman, RI., Ludwig, W., Schleifer, KH., 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiology Reviews, 59: 143–169 91

56. Gurtler, V., Stanisich, V. A., 1996. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S–23S rDNA spacer region. Microbiology Reviews, 142: 3–16. 57. Ercolini, D., 2004. PCR-DGGE Fingerprinting: Novel Strategies For Detection of Microbes In Food. Journal Microbiology Methods 56: 297–314. 58. Fontanaa, C., Vignoloa, G., Cocconcelli, P. S., 2005. PCR–DGGE analysis for the identification of microbial populations from Argentinean dry fermented sausages. Journal of Microbiological Methods 63: 254-263. 59. Aquilanti, L., Santarelli, S., Silvestri G., Osimani, A., Petruzzelli, A., Clementi F., 2007. The microbial ecology of a typical Italian salami during its natural fermentation. International Journal of Food Microbiology, 120: 136-145. 60. Sunesen, O. L., Dorigoni, V., Zanardi, E. and Stahnke, L., 2001. Volatile Compounds Released During Ripening in Italian Dried Sausage. Meat Science, 58: 93–97. 61. Stahnke, L. H., 1999. Volatiles Produced by Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus during Growth in Sausage Minces. Part I. Collection and Identification. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie, 32: 357-364. 62. Montel, M. C., Mason, F. and Talon, R., 1998. Bacterial role in flavour development. Meat Science, 49: 111 – 123. 63. Toldra, F., Sanz, Y. and Lores, M., 2001. Meat Fermentation Technology, In Hui, Y.H.Ed.. Meat Science Applications. Marcel Dekker Incorporated New York, USA 64. Serdaroğlu, M. ve Tömek, S., 1995. Fermente et ürünlerinde proteolitik enzimlerin önemi. Pamukkale Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Mühendislik Bilimleri Dergisi, 1: 89-94. 65. Waade, C. and Stahnke, L. H., 1997. Dried sausages fermented with Staphylococcus xylosus at different temperatures and with different ingredient levels. Part IV. Amino acid profile. Meat Science, 46: 101-114. 66. Diaz O., Fernandez, M., Garcia, G. G., Hoz, L. and Ordonez, J. A., 1997. Proteolysis in dry fermented sausages: the effect of selected exogenous proteases. Meat Science, 46: 115-128. 92

67. Molimard, P. and Spinnler, H. E., 1996. Review: Compounds involved in the flavor of surface mold-ripened cheeses: origins and properties. Journal Dairy Science, 79: 169–184. 68. Meynier, A., Novelli, E., Chizzolini, R., Zanardi, E. and Gandemer, G., 1999. Volatile compounds of commercial Milano salami. Meat Science, 51: 175 – 183. 69. Mateo, J. and Zumalacarregui, J. M. 1996. Volatile compounds in chorizo and their changes during ripening. Meat Science, 44: 255– 273. 70. Mason, F., Hinrichsen, L., Talon, R. and Montel, M. C. 1999. Factors influencing leucine catabolism by a strain of Staphylococcus carnosus. International Journal Food Microbiology, 49: 173–178. 71. Demeyer, D. and Stahnke, L. 2002. Quality control of fermented meat products. In: Meat Processing (Eds. Joseph Kerry, John Kerry and David Ledward). Edition, CRC Press LLC and Woodhead Publishing Ltd. England. 72. Berger, R. G., Macku, C., Bruce German, J. and Shibamoto, T., 1990. Isolation and Identification of Dry Salami Volatiles. Journal of Food Science, 55: 1239- 1242. 73. Anonymous, 2001. Aerobic Plate Count. FDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 3. AOAC International, Gaithersburg, MD., USA. 74. De Man, J. C., Rogosa, M., Sharpe, M. E., 1960. A medium for the cultivation of Lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology, 23: 130-135. 75. Anonymous, 2001a. Yeasts, Molds and Mycotoxins. FDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 18. AOAC International, Gaithersburg, MD., USA. 76. İnal, T., 1973. Türk fermente sucuğunun bakteriyolojik kalitesi ve mikrobiyolojik standardizasyonu. Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Dergisi, 14: 95-103. 77. Şimşek, Ö., 2003. Uşak ve Yöresi Ekşi Hamurlarından İzole Edilen Antimikrobiyal Aktiviteye Sahip Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlanması ve Bazı Metabolik Özelliklerinin Belirlenmesi. Pamukkale Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, Denizli, 90 s 78. Dokuzlu, C., 2004. Gıda Analizleri. Marmara Kitabevi Yayınları, Bursa, 346 s 93

79. Gökalp, H. Y., Kaya, M., Tülek, Y., Zorba, Ö., 2001. Et ve Et Ürünlerinde Kalite Kontrolü ve Laboratuar Uygulama Kılavuzu. Atatürk Üniversitesi Ziraat Fakültesi yayınları No: 318. Atatürk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Ofset Tesisi, Erzurum, 320 s 80. Yetim, H. und Kesmen, Z, 2005. Sucuk ? Türkische Rohwurst ? Wirkung von Hydratisiertem, Fettfreiem Sojamehl (FFSM) auf die Reifung. Fleischwirtsch, 85: 94-96. 81. Mitsumoto, M., O’Grady, M. N., Kerry, J. P., Buckley, J., 2005. Addition of tea cathechins and vitamin C in sensory evaluation, colour and lipid stability during chilled storage in cooked or raw beef and chicken patties. Meat Science, 69: 773-779. 82. Altuğ, T. 1993. Duyusal test teknikleri. E.Ü.Mühendislik Fakültesi Ders Kitapları Yayın No.28, 56 s., İzmir. 83. Soyer, A.1995. Dondurulmuş kolyoz (Scomber japonicus) balıklarında lipid oksidasyonu üzerine bazı antioksidanların ve vakum paketlemenin etkisi. Doktora Tezi. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara, 90s. 84. Marco, A., Navarro, J. L. and Flores, M., 2004. Volatile Compounds of Dry- Fermented Sausages as Affected by Solid-phase Microextraction (SPME). Food Chemistry, 84: 633-641. 85. Silvestri, G., Santarelli, S., Aquilanti, L., Beccaceci, A., Osimani, A., Tonucci, F., 2007. Investigation of the microbial ecology of Ciauscolo, a traditional Italian salami, by culture-depende nt techniques and PCR-DGGE. Meat Science 77: 413–423. 86. Ercoşkun, H., 1999. Farklı Starter Kültürler kullanılarak Üretilen Sucukların Bazı Özellikler ve Uçucu Aroma Bileşikleri. Pamukkale Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 100s. 87. Kaban, G., 2007. Geleneksel Olarak Üretilen Sucuklardan Laktik asit Bakterileri ile Katalaz Pozitif Kokların izolasyonu-identifikasyonu, Üretimde Kullanılabilme İmkanları ve Uçucu Bileşikler Üzerine Etkileri. Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Erzurum, 101 s. 88. Dinçer, B. 1980. Yerli sucuklarda fermentasyon ve kurumada bileşimsel, lipolitik ve organoleptik değişiklikler üzerinde araştırmalar. Doçentlik Tezi, Ankara Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi, 123 s. 94

89. Geisen, R., Lücke, F. K. and Kröckel, I. O., 1992. Starter and Protective Culture for Meat and Meat Products. Fleischwirtschaft, 72: 894-898. 90. Kaya, M. and Gökalp, H. Y., 2004b. The Effects of Starter Cultures and Different Nitrite Doses on the Growth of Listeria monocytogenes in sucuk production. Turkish Journal of Veterinary & Animal Science, 28: 1121-1127 . 91. Comi, G., Citterio, B., Manzano, M., Cantoni, C. and Bertoldi, M., 1992. Evaluation and Characterization of Micrococcaceae Strains in Italian Dry Fermented Sausages. Fleischwirtschaft, 72: 1679-1683. 92. Kaya, M. and Gökalp H. Y., 2004a. The Behavior of Listeria monocytogenes in Sucuks Produced with Different Lactic Starter Cultures. Turkish Journal of Veterinary & Animal Science, 28: 1113-1120. 93. Gençcelep, H., Kaban, G. and Kaya, M., 2007. Effects of Starter Cultures and Nitrite Levels on Formation of Biogenic Amines in Sucuk. Meat Science, 77: 424-430. 94. Erkmen, O., Bozkurt, H., 2004. Quality characteristics of retailed sucuk (Turkish dry-fermented sausage). Food Technology and Biotechnology, 42 : 63-69. 95. Teixeira, P., Ferreira, V., Barbosa, J. V., Silva, J., Gibbs, P., Hog, T., 2009. Microbiological profile of Salpicão de Vinhais and Chouriça de Vinhais from raw materials to final products: Traditional dry sausages produced in the North of Portugal. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 10: 279- 283. 96. Anonim, 2000. Türk Gıda Kodeksi Et Ürünleri Tebliği. Resmi Gazete 23960, Tebliğ No:2000/4, Başbakanlık Basımevi, Ankara. 97. Vural, H. ve Öztan, A., 1992. Türk Sucuklarında Ticari Starter Kültür Kullanımı Üzerine Araştırmalar. Gıda, 17: 53-60. 98. Kaban, G., Aksu, M. İ. and Kaya, M., 2007b. Behavior of Staphylococcus aureus in Sucuk with Nettle (Urtica dioica L.). Journal of Food Safety, 24: 400-410 99. Gök, R., 2006. Antioksidan Kullanımının Fermente Sucukların Bazı Kalite Özellikleri Üzerine Etkileri. Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Kayseri, 135 s. 100. Erkkila, S., Petäjä, E., Eerola, S., Lilleberg, L., Mattila-Sandholm, T., Suihko, M. L., 2001. Flavour profiles of dry sausages fermented by selected novel meat starter cultures. Meat Science, 58: 111-116. 95

101. Ordonez J. A., Hierro E. M., Bruna J. M. and Hoz, L. 1999. Changes in the components of dry-fermented sausages during ripening . Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 39: 329–367. 102. Hechelmann, H., 1985. Mikrobiell verursachte Fehlfabrikate bei Rohwurst und Rohschinken In:Mikrobiologie und Qualitat von Rohwurst und Rohschinken. Bundensanstalt für Fleischforschung, Kulmbach, pp.103-127. 103. Heperkan, D. ve Sözen, M., 1988. Fermente Et Ürünleri Üretimi ve Mikrobiyal Proseslerin Kaliteye Etkisi. Gıda Dergisi, 15: 371-378. 104. Guo, H. L., Liu, D.C., Chen, M. T. 2003. Color Stability of Chinese-Style Sausage Inoculated with Staphylococcus Carnosus and Staphylococcus Xylosus. Asian- Australia Journal Animal Science, 16: 570-574 105. Anonim, 2001. Et ve et ürünleri sanayi alt komisyon raporu. Sekizinci Beş Yıllık Kalkınma Planı, Devlet Planlanma Teşkilatı, Ankara 106. Bouton, P. E., Harris, P. V., 1972. The effects of cooking temperature and time on some mechanical properties of meat. Journal of Food Science, 37: 140–144. 107. Potthast, K., 1986. Fleischfarbe, Farbstabilitat und Umrötung.In:Chemisch- physikalische Merkmale der Fleischqualitat, Bundensanstalt für Fleischforschung, Kulmbach S 89-110. 108. Üren, A., Babayigit, D., 1997. Colour parameters of Turkish type fermented sausage during fermentation and ripening. Meat Science, 45: 539-549. 109. Gimeno, O., Ansorena, D., Astiasaran, I., Bello, J., 2000. Characterization of chorizo de Pamplona: instrumental measurements of colour and texture. Food Chemistry, 69: 195-200. 110. Tjener, K., Stahnke, L. H., Andersen, L. and Martinussen, J.,2003. A Fermented Meat Model System for Studies of Microbial Aroma Formation. Meat Science, 66: 211-218. 111. Stahnke, L. H., 1994. Aroma Components from Dried Sausages Fermented with Staphylococcus xylosus. Meat Science: 38: 39-53. 112. Ceylan, E., Fung, D. Y. C., 2004. Antimicrobial Activity Of Spices. Food Science Institute. Kansas State University, Manhattan, Kansas, 55pp. 113. Ansorena, D., Gimeno, O., Astiasaran I. and Bello, J., 2001. Analysis of Volatile Compounds by GC-MS of A Dry Fermented Sausage: Chorizo De Pamplona. Food Research International, 34: 67-75. 96

114. Misharina, T. A., Andreenkov, V. A. and Vashchuk, E. A., 2001. Changes in the Composition of Volatile Compounds During Aging of Dry-Cured Sausages. Applied Biochemistry and Microbiology, 37: 480-486. 115. Bianchi, F., Cantoni, C., Careri, M., Chiesa, L., Musci, M. and Pinna, A., 2007. Characterization of the Aromatic Profile for the Authentication and Differentiation of Typical Italian Dry-Sausages. Talanta, 72: 1552-1563. 116. Estevez, M., and Cava, R., 2006. Effectiveness of rosemary essential oil as an inhibitor of lipid and protein oxidation. Meat Science, 72: 348-355. 117. Ravindran, P. N. and Kallupurackal, J. A. 2001. Black pepper. In: Handbook of herbs and Spices. (Edt. Peter, K.V.). CRC Pres, Woodhead Publishing Ltd., England 118. Sasikumar, B. 2004. Rosemary. In: Handbook of Herbs and Spices. (Edt. Peter, K.V.). CRC Pres, Woodhead Publishing Ltd., England. 119. Viallon, C., Berdague, J. L., Montel, M. C., Talon, R., Martin, J. F., Kondjoyan, N. and Denoyer, C.,1996. The Effect of Stage of Ripening and Packaging on Volatile Content and Flavour of Dry Sausage. Food Research International, 29 (7), 667–674. 120. Albano, H., Henriques, I., Correia, A., Hogg, T. and Teixeira P., 2008. Characterization of microbial population of ‘Alheira’(a traditional Portuguese fermented sausage) by PCR-DGGE and traditional cultural microbiological methods. Journal of Applied Microbiology, 105: 2187–2194.

97

EKLER

Sucuk duyusal panel formu

Adı Soyadı: Tarih: Örnek No:

SUCUK PANEL DEĞERLENDİRME FORMU

Özellik

Pembemsi Kırmızı Arzu edilmeyen renk

Kesit Yüzey Rengi 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Kırmızımsı Kahverengi Arzu edilmeyen renk

Dış Yüzey Rengi 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Düzgün Mozaik Görünüm Karışık Görünüm

Kesit Yüzey Görünüşü 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Yok Var

Kabuk oluşumu 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Düzgün Kaba Tekstür 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Var Yok

Tipik SucukTat 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ve Aroması

Çok İyi Çok Kötü

Genel Beğeni 9 8 7 6 5 4 3 2 1 98

TÜKETİM İÇİN PİŞİRİLMİŞ SUCUK PANEL DEĞERLENDİRME FORMU

Özellik

Kırmızımsı Kahverengi Arzu edilmeyen renk

Kesit Yüzey Rengi 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Kırmızımsı Kahverengi Arzu edilmeyen renk

Dış Yüzey Rengi 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Düzgün Kaba Tekstür 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Var Yok

Tipik Sucuk Tat 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ve Aroması

Çok İyi Çok Kötü

Genel 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Beğeni

Belirtmek İstediğiniz Hususlar:

…

…………………………………………………………...... 99

ÖZGEÇMİŞ

KİŞİSEL BİLGİLER

Adı- Soyadı : Yasemin ÇELEBİ SEZER

Doğum tarihi : 02.01.1988

Medeni hali : Evli

E-mail : [email protected], [email protected]

EĞİTİM DURUMU

Derece Kurum Mezuniyet Tarihi Lisans Ege Üniversitesi 2009 Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü

İŞ DENEYİMLERİ

Yıl Kurum Görev

2009- Halen Osmaniye Korkut Ata Üniversitesi, Araştırma Görevlisi

Mühendislik Fakültesi,

Gıda Mühendisliği Bölümü,

YABANCI DİL

İngilizce

YAYINLAR

A) Uluslar arası sempozyumlarda sunulan bildiriler

2011, Kesmen Z, Celebi Y, Yetim H, Detection of seagull meat in meat mixtures using real-time PCR assay. 57th ICoMST International Congress of Meat Science and Technology, 7-12 August, pp:249, Ghent, Belgium 100

B)Ulusal sempozyumlarda sunulan bildiriler

2011, Çelebi Y, Törnük F, Şimşek H, Yetim H., Din ve inançların dünyada et ve et ürünleri tüketimindeki rolü ve gelecekte yaşanabilecek gelişmeler, 7. Gıda Mühendisliği Kongresi, 24-26 Kasım, Ankara

Sezer Y.Ç., Süfer Ö., Yetim H., “Tüm Yörelerin Sahiplendiği Ortak Lezzet: Tirit”, Geleneksel Gıdalar Sempozyumu, 10&12 Mayıs 2012, Konya.

Sezer Y.Ç., Kesmen, Z., Yetiman A. E., Yetim H., “Sucuğun Laktik Mikroflorasının Belirlenmesinde Polimeraz Zincir Reaksiyonu – Denatüre Gradient Jel Elektroforez (Pcr-Dgge) Yönteminin Propidium Monoazide (Pma) İle Birlikte Kullanımı”, Geleneksel Gıdalar Sempozyumu, 10&12 Mayıs 2012, Konya.