UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS
ESCUELA DE BIOANÁLISIS
CÁTEDRA: COMPONENTE DE LA INVESTIGACIÓN
ESTUDIO FITOQUÍMICO Y DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y ANTIFÚNGICA DE LA
Coespeletia timotensis Cuatrec.
Tutor: Integrantes:
Dr. Alfredo Usubillaga. Br. Eilyn Pinto.
Dr. Luis Rojas. C.I.: 18.870.141
Br. Karina Toro
C.I.: 18.226.030
Mérida, Febrero 2013 Resumen El presente trabajo describe el estudio fitoquímico y la actividad antibacteriana y antifúngica realizado al extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec, perteneciente a la familia Asteraceae (Compositae), tribu Heliantheae, subtribu Espeletiinae. Planta originaria de los estados Mérida y Táchira conocida popularmente como frailejones. El frailejón es una planta típica de los Andes de Colombia, Ecuador y Venezuela. Recientes hallazgos han llevado el número de especies hasta ahora conocidas a unas 180 que están distribuidas en ocho géneros que conforman la subtribu Espeletiinae. Del material seco y molido se pesaron 250 gramos, que luego se colocó en una columna con aproximadamente 5 L de Hexano- éter dietílico 3:1 v/v, durante 24 horas. Los gramos totales del extracto ya concentrado fue de 23 g. Posteriormente, se realizó una extracción ácido/base para obtener la fracción ácida (6,24 g) y la fracción neutra (3,9 g), de las cuales se tomó una alícuota de la fracción ácida para metilar. Ambas fracciones posteriormente se analizaron por Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM), en un equipo HP 5973 (Hewlett Parckard). Se empleó una columna capilar 5 % fenil, 95% metilpolisiloxano de 30 m de longitud y 0.2 mm de diámetro interno, con un espesor de película de 0.25 µm. Se inyectaron 1.0 µL de solución de aproximadamente 5 mg de cada fracción disuelta en éter dietílico con reparto de 1:50. Los compuestos se identificaron mediante comparación de los tiempos de retención y espectros de masas de la fracción ácida: ácido grandiflorénico [2] (28,88%), ácido kaurénico [1] (7,05%), componente No Identificado N.I. (0,58%), Ácido 15α-acetoxi kaurénico [6] (1,00%), β-amirina [13] (14,79%) y α-amirina [14] (47,70%) que es el más abundante. De la fracción neutra se obtuvo 16-α-hidroxi kaurano [15] (13,62%), Heptacosano [16] (9,13%), N-eicosano [17] (65,83%) resultando el más abundante de esta fracción y Nonadecano [18] (11,42%). La actividad antibacteriana y antifúngica de la mezcla de los componentes [1], [2], [6], [13] y [14] fue evaluada por el método de difusión en agar con discos. Se seleccionaron 9 especies de microorganismos, estos fueron bacterias Gram negativas y Gram positivas: Salmonella typhi (CDC 57), Pseudomona aureginosas (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC 23357), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus aureus (dorado) (ATCC 3568) Enterococcus faecalis (ATCC 29212) y 2 especies de Candida: Candida albicans (CDC B-385) y Candida krusei (ATCC 6258). Los resultados obtenidos revelan que no hubo sensibilidad de los microorganismos estudiados frente al ensayo. AGRADECIMIENTOS.
A DIOS TODOPODEROSO por iluminar y guiar nuestro camino en todo momento y bendecirnos en la realización de este gran proyecto. AL Dr. ALFREDO USUBILLAGA, por aceptar el compromiso de ser nuestro tutor, por compartir sus conocimientos y apoyarnos. AL Dr. LUIS ROJAS por aceptar ser nuestro tutor encargado, por todo el apoyo brindado en el desarrollo de este proyecto. A LA PROFESORA DIOLIMAR BUITRIAGO por sus valiosos consejos y sugerencias durante la realización de este proyecto. AL PROFESOR BERNARDO CHATAING por permitirnos su valioso tiempo y por la colaboración brindada. A LA Dra. ROSA APARICIO le agradecemos la confianza, apoyo y dedicación en la realización de este proyecto, por estar presente en todo momento, por su paciencia y por compartir sus conocimientos y su amistad. A LA PROFESORA JUDITH VELASCO por sus valiosos consejos, por toda la colaboración prestada y por su asesoría. A LA ILUSTRE UNIVERSIDAD DE LOS ANDES, por darnos la oportunidad de crecer profesionalmente. AL INSTITUTO DE INVESTIGACIONES DE LA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS. AL LABORATORIO DE SINDROMES GASTROINTESTINALES Y URINARIOS “LIC. LUISA VIZCAYA”. AL Sr. ALFREDO BOLIVAR por su colaboración en todo momento. A TODAS LAS PERSONAS que de una u otra manera nos atendieron la mano en la realización de este proyecto.
KARINA Y EILYN. DEDICATORIA
A DIOS primeramente, por regalarme salud para lograr los objetivos propuesto, e iluminarme en todo momento.
A MI ABUELA TRINA, que no está entre nosotros, pero siempre está presente en mi corazón y por siempre creer en mí hasta el final.
A MIS PADRES MARÍA Y ASDRUBAL, por ser mi fuente de inspiración, por ser el mejor ejemplo que tenido, por su confianza, por su apoyo incondicional, por creer y estar presente en todo momento. Los amo.
A MIS HERMANOS ASDRUBAL Y ELOY, por estar presente y alegrarme la vida, por sus palabras de apoyo.
A JUAN CARLOS, por su amor incondicional, por sus palabras de aliento y por apoyarme en las buenas y en las malas. Te amo.
A TODA MI FAMILIA, por darme fuerza cuando más lo necesite.
A MIS AMIGAS DULCE, CARMEN, DUBRASCA Y ANLLY, por tantos momentos que compartimos, por el tiempo que pasamos juntas, por regalarme alegrías, tristeza, palabras de motivación y apoyarnos en cada situación que se nos presentara.
KARINA. DEDICATORIA
A Dios todopoderoso por regalarme cada maravilloso día y estar presente en todo momento dándome las fuerzas necesarias para continuar luchando y así cumplir cada una de mis metas. A mis hijos José Gabriel y Ángel Jesús porque me han nutrido para luchar por mis sueños y mi felicidad. No tengo palabras para expresar mi agradecimiento por todas las bendiciones que he tenido junto a ustedes. Gracias por estar conmigo y por compartir los momentos más importantes, por ser valientes y no rendirse, los amo con todo mí ser. A mi esposo Carlos Jesús por todo su amor, apoyo, paciencia, comprensión y por estar en los momentos buenos y malos siempre conmigo. Te amo. A mi mamá Norma Leobarda por todo su apoyo, comprensión y sacrificios, gracias por siempre estar allí. Te adoro. A mi papá José Rafael por los momentos en que me has ayudado y apoyado, por tu amor gracias. Te quiero. A mis hermano José Leonardo gracias por existir y ocupar un lugar muy especial en mi corazón. Te quiero más de lo que te imaginas. A toda mi familia ya que gracias a ellos soy quien soy hoy en día, son a ellos a quien le debo todo, horas de consejos, de regaños, de tristezas y de alegrías de las cuales estoy muy segura que las han hecho con todo el amor del mundo para formarme como un ser integral y de los cuales me siento extremadamente orgullosa. Los amo. A todas las personas que desinteresadamente me ayudaron a culminar esta meta. Gracias.
EILYN. ÍNDICE DE CONTENIDO
I INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….… 1 II MARCO TEÓRICO………………………………………………………….….…. 4 II.1 ANTECEDENTES………………………………………………………….……… 5 II.1.1 Características de la familia Asteraceae……………………………….…...…. 5 II.1.2 Bioformación de los terpenos………………………………………....………. 9 II.1.3 Clasificación química de los terpenos….……………………………….…….. 12 II.1.3.1 Monoterpenos……………………………………………………….………… 13 II.1.3.2 Sesquiterpenos…………………………………………………………….…... 14 II.1.3.3 Diterpenos…………………………………………………………………….. 14 II.1.3.4 Triterpenos…………………………………………………………………….. 15 II.1.3.5 Carotenoides…………………………………………………………………... 16 II.1.4 Taxonomía de la Coespeletia timotensis Cuatrec…………………………...... 17 II.1.4.1 Características macroscópicas de la Coespeletia timotensis Cuatrec…………. 17 II.1.4.2 Características microscópicas de la Coespeletia timotensis Cuatrec…….…… 20 II.1.5 Fitoquímica………………………………………………………………….… 21 II.1.6 Componentes químicos de algunos frailejones……………………………...... 23 II.1.7 Actividades asociadas a los ácidos kaurénicos y sus derivados…………...….. 27 II.1.8 Generalidades de las bacterias y los hongos………………..……………...…. 28 II.1.8.1 Las bacterias…………………………………………………………………... 28 II.1.8.1.1 Las bacterias Gram positivas……………………………………………….... 29 II.1.8.1.2 Las bacterias Gram negativas………………………………………………... 30 II.1.8.2 Los hongos…………………………………………..…………………...…… 30 II.1.9 Actividad antibacteriana y antifúngica……………………………………...... 31 II.1.9.1 Métodos de evaluación de actividad antibacteriana y antifúngica…………… 33 II.1.9.1.1 Método de difusión en agar……………………………………..……...…….. 33 II.1.9.1.2 Método de dilución en caldo………………………………………………….. 34 II.1.9.1.3 Método de dilución en agar………………………………………………..….. 34
i III PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA E HIPÓTESIS…………………… 35 III.1 Planteamiento del problema…………………………………………………... 36 III.2 Hipótesis………………………………………………………………….….... 36 IV OBJETIVOS………………………………………………………………...… 37 IV.1 Objetivo general……………………………………………………………..... 38 IV.2 Objetivos específicos……………………………………………………..…… 38 V MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………….…… 39 V.1 Recolección de la planta y preparación del material……………………..…… 40 V.2 Extracción………………………..…………………………………………… 40 V.3 Separación de la fracción ácida……………..……………………………...…. 40 V.4 Separación y purificación de los componentes…………………………….…. 43 V.4.1 Análisis por cromatografía columna flash…………………………………….. 43 V.5 Análisis de los componentes………………………………………………..… 44 V.5.1 Análisis por cromatografía de capa fina……...……………………………….. 44 V.5.2 Análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas……. 44 V.6 Determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la fracción ácida de la Coespeletia timotensis Cuatrec...………………………………..... 45 V.6.1 Preparación de material para la actividad antibacteriana y antifúngica……..... 46 V.6.2 Preparación de los inóculos bacterianos y fúngicos…………………………... 46 V.6.3 Determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica por el método de difusión en agar……………………………………………………………….. 46 VI RESULTADOS…………………………………………………………...... 48 VII DISCUSIÓN…………………………………………...... 69 VIII CONCLUSIONES………………………………………………………….… 74 IX REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………… 76
ii ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Coespeletia timotensis Cuatrec………………………...... … 6 Figura 2 Estructura orgánica del ácido mevalónico e isopreno……..... 9 Figura 3 Compuestos que dan origen a los terpenos…………….…… 10 Figura 4 Estructuras de algunos Monoterpenos………………….…... 13 Figura 5 Estructuras de algunos Sesquiterpenos.…………………….…. 14 Figura 6 Estructuras de algunos Diterpenos………………………….…. 15 Figura 7 Estructuras de algunos Triterpenos……………………...... 16 Figura 8 Estructuras de algunos Caroteniodes……………………….….. 16 Figura 9 Características macroscópicas de la Coespeletia timotensis Cuatrec………………………………………………………. 18 Figura 10 Especie Coespeletia timotensis Cuatrec...…………………... 19 Figura 11 Estructuras de algunos kaurenos aislados de la fracción ácida de las resinas de diferentes especies de frailejón.…..……...... 26 Figura 12 Estructuras de algunos kaurenos aislados de la fracción neutra de las resinas de diferentes especies de frailejón.…..……...... 27 Figura 13 Estructura de los compuestos identificados en la fracción ácida del extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec…..… 65 Figura 14 Estructura de los compuestos identificados en la fracción neutra del extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec…… 66
iii ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Composición de la fracción ácida de la Coespeletia timotensis Cuatrec……………………………..…………... 52 Tabla 2 Composición de la fracción neutra de la Coespeletia timotensis Cuatrec………………………………………… 53 Tabla 3 Actividad antibacteriana y antifúngica de la fracción ácida de las hojas de Coespeletia timotensis Cuatrec………..… 68
iv ÍNDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1 Bioformación de los terpenos……………………………… 11 Esquema 2 Proceso de obtención de la fracción ácida y neutra de las hojas de Coespeletia timotensis Cuatrec………….……...... 42 Esquema 3 Metilación de la fracción ácida…………………………….. 43
v ÍNDICE DE GRÁFICAS
Grafica 1 Cromatograma general de los componentes de la fracción ácida de la Coespeletia timotensis Cuatrec...... 50 Grafica 2 Cromatograma general de los componentes de la fracción neutra de la Coespeletia timotensis Cuatrec...... 51 Grafica 3 Espectro de masas con ion molecular m/z 314 por metilación del ácido grandiflorénico……………………… 54 Grafica 4 Espectro de masas con ion molecular m/z 316 por metilación del ácido kaurénico……………………………. 55 Grafica 5 Espectro de masas con ion molecular m/z 374 por metilación del ácido 15α-acetoxi kaurénico………………. 56 Grafica 6 Espectro de masas con ion molecular m/z 426 de la β-amirina………………………………………………….. 57 Grafica 7 Espectro de masas con ion molecular m/z 426 de la α-amirina………………………………………………….. 58 Grafica 8 Espectro de masas con ion molecular m/z 491 del 16-α hidroxi –Kaurano……………………………………….. 60 Grafica 9 Espectro de masas con ion molecular m/z 380 del Heptacosano………………………………...... 61 Grafica 10 Espectro de masas con ion molecular m/z 281 del n-eicosano………………………………………………… 62 Grafica 11 Espectro de masas con ion molecular m/z 268 del Nonadecano………………………………...... 63
vi
“Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
El frailejón es una planta típica de los Andes de Colombia, Ecuador y Venezuela. Recientes hallazgos han llevado el número de especies hasta ahora conocidas a unas 180 que están distribuidas en ocho géneros que conforman la subtribu Espeletiinae (Asteraceae). El mayor número de especies de frailejón (105) se encuentra en Colombia. En Venezuela, solamente se han descrito 74 especies, sin embargo, existe una mayor diversidad morfológica, ya que en este país se encuentran 7 de los 8 géneros descritos por Cuatrecasas. En Ecuador, solamente existe una especie, Espeletia pycnophyllas angelensis, que se encuentra en el páramo el Ángel situado en la frontera colombo–ecuatoriana (Rodriguez et al, 2006; Rangel-Ch et al, 2000; Luteyn, 1999; Cuatrecasas, 1976; Ibáñez, 2008).
El género Espeletia fue dedicado por Mutis al Virrey Don José Ezequiel de Espeleta de Nueva Granada. Este género abarcaba todas las especies conocidas como frailejones hasta su revisión taxonómica por Cuatrecasas, lo cual condujo a su división en ocho géneros: Carramboa, Coespeletia, Espeletia, Espeletiopsis, Libanothamnus, Ruilopezia, Tamania y paramiflos. La Coespeletia timotensis Cuatrec., se conocía como Espeletia timotensis hasta 1976 cuando Cuatrecasas creó la subtribu Espeletiinae. El género Coespeletia, descrito por Cuatrecasas en 1976 consta de ocho especies que se desarrollan entre 3000 y los 4400m de altitud (Humboldt et al, 1808; Cuatrecasas, 1996; Cuatrecasas, 1976; Ibáñez, 2008).
El análisis fitoquímico tiene como objetivo determinar los metabólitos secundarios presentes en la especie vegetal a estudiar, por ejemplo en las plantas medicinales, aplicando para ello una serie de técnicas de extracción, de separación, purificación y de determinación de la estructura (Domínguez, 1979).
Históricamente la inmensa mayoría de las investigaciones fitoquímicas desarrolladas hasta hace unas décadas estaban dirigidas a determinar estructuras novedosas. Hoy en día esos estudios se orientan hacia el aislamiento e identificación
2 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” de compuestos biológicamente activos, contra enfermedades como: cáncer, sida, afecciones cardiovasculares, diabetes, y otras enfermedades endémicas: malaria, tripanosomiasis, leishmaniasis y otras (Marcano et al, 2002).
Los estudios fitoquímicos de los frailejones se iniciaron, en el Instituto de Investigaciones de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Los Andes, a principios de 1970; los primeros trabajos fueron realizados en la determinación de tres aceites esenciales presentes en diferentes especies y luego se estudiaron las fracciones menos polares obteniéndose en la mayoría de la especies una alta proporción de diterpenoides, específicamente derivados del ent-kaurano, siendo estos compuestos encontrados en gran proporción en la subtribu Espeletiinae (Romero, 2000; Valero, 2002; Usubillaga et al., 2003)
El presente trabajo describe el estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica realizado al extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec., perteneciente a la familia Asteraceae de la tribu Heliantheae, subtribu Espeletiinae; planta originaria de los estados Mérida y Táchira.
3 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
4 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
II.1 ANTECEDENTES
II.1.1 Características de la familia Asteraceae.
Recientes hallazgos han llevado el número de especies conocidas de frailejón a 180 que están distribuidas en ocho géneros que conforman la subtribu Espeletiinae
(Asteraceae). El mayor número de especies de frailejón aproximadamente 105, se encuentra en Colombia. En Venezuela, solamente se han descrito 74 especies, sin embargo, existe una mayor diversidad morfológica, ya que en este país se encuentran
7 de los 8 géneros descritos por Cuatrecasas. En Ecuador, solamente existe una especie, Espeletia pycnophyllas angelensis, que se encuentra en el páramo el Ángel situado en la frontera colombo-ecuatoriana (Rodriguez et al, 2006; Rangel-Ch et al,
2000; Luteyn, 1999; Cuatrecasas, 1976 Ibáñez, 2008).
El género Espeletia fue dedicado por Mutis al Virrey Don José Ezequiel de
Espeleta de Nueva Granada. Este género abarcaba todas las especies conocidas como frailejones hasta su revisión taxonómica por Cuatrecasas, lo cual condujo a su división en ocho géneros: Carramboa, Coespeletia, Espeletia, Espeletiopsis,
Libanothamnus, Ruilopezia, Tamania y paramiflos. La Coespeletia timotensis
Cuatrec., se conocía como Espeletia timotensis hasta 1976 cuando Cuatrecasas creó la subtribu Espeletiinae. El género Coespeletia, descrito por Cuatrecasas en 1976 consta de ocho especies que se desarrollan entre 3000 y los 4400 m de altitud (Humboldt et al, 1808; Cuatrecasas, 1949; Cuatrecasas, 1996; Cuatrecasas, 1976; Smith et al, 1935;
Ibáñez, 2008).
5 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
La clasificación taxonómica de la Coespeletia timotensis Cuatrec., se basa en que la familia de la Asteraceae, es una de las más abundantes en la flora venezolana.
(Aristiguieta, 1964). Figura 1.
Figura 1. Coespeletia timotensis Cuatrec.
En 1836, De Candolle publica Prodromus, donde describe numerosas
Asteráceas de Venezuela, en el mismo tiempo Blake también estudia varias especies venezolanas. Al final del siglo XIX, en 1877 Ernst, publica una monografía sobre las
Asteráceas venezolanas. H.L. Blake contribuyó mucho en el esclarecimiento de la nomenclatura y sinonimias de muchas Asteráceas en Venezuela, enfocando su estudio a la tribu Heliantheae. En 1915 P.C. Standley publica un estudio monográfico sobre el género Espeletia, y en 1935 Smith y Koch, realizan otra revisión más completa de este género (Aristiguieta, 1964; Ernst, 1877).
Con respecto a la distribución de las Asteráceas en Venezuela, éstas se encuentran desde el nivel del mar como la Cordillera de la Costa donde crece la
Espeletia neriifolia (De Pérez, 1973), hasta los sitios más elevados de los páramos
6 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” andinos. En la Zona Andina y la Alta Guayana existe una alta concentración de especies de Asteraceae, ya que son regiones montañosas y de bajas temperaturas.
En estos territorios pueden considerarse dos regiones según la altitud:
a-. Desde 500 – 2800 m de altitud
b-. Desde 2800 – 4500 m de altitud.
La primera comprende los Andes y la Cordillera de la Costa, y la segunda es solo exclusiva de los Andes.
Las Asteráceas comprenden la tribu Heliantheae, es la tribu más primitiva y diversificada. Es la segunda dentro de ellas por el número de subtribus (Heywood,
1977). Los constituyentes químicos de las Heliantheae no se han investigado mucho, el estudio de 60 géneros, reportó algunos compuestos simples como lactonas sesquiterpénicas del germacrolido, flavonas ó flavonoles, poliacetilenos, alcaloides y constituyentes macromoleculares. Es la única tribu que se le ha determinado la secuencia de aminoácidos en el citocromo C (Heywood, 1977).
En Venezuela la subtribu Espeletiinae es la más representativa de la flora de los páramos andinos. Aún cuando se pueden encontrar frailejones desde el Norte de
Ecuador, Colombia, incluyendo el macizo de Santa Marta y en la Cordillera de la
Costa (Monasterios, 1980).
Dichas especies poseen respuestas a cambios ambientales, algunas modificaciones morfológicas pueden explicarse por mutación, aislamiento y adaptación ecológica, así como a las variaciones del hábitat. Esta y otras variables son discutidas a lo largo de un estudio morfológico de cada taxa, realizado por
Cuatrecasas (1976).
7 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
El género Espeletia que englobaba todas las especies de frailejón hasta 1976, fue creado por Mutis según lo menciona Cuatrecasas en 1976, pero Humboldt y
Bonpland publicaron la descripción de otras tres especies del área de Bogotá
(Humboldt, et al., 1808). En 1814, Humboldt describió un árbol resinífero colectado en la silla de Caracas y lo publicó bajo el nombre de Trixis nerifolia Bonpl. Schultz
Bip posteriormente traspasó esta especie al género Espeletia. Weddell, a su vez dividió el género Espeletia en dos grupos: Uno de arbustos con dos especies (E. neriifolia, E. banksiaefolia) y el otro de plantas herbáceas con nueve especies.
Standley en 1915 describió 17 especies, fue el primero en mencionar y publicar fotografías hechas por el Dr. Janh que mostraban el característico crecimiento en forma de rosetas de muchas especies de Espeletia (Standley, 1915).
A.C. Smith y M. Koch en 1935, basado en la morfología, anatomía floral y palinología estudiada describieron treinta especies, distribuidas entre Colombia y
Venezuela, con una extensión dentro del Ecuador (Smith, et al., 1935). Desde 1935 se han descrito muchas especies nuevas y es en 1965 que Aristiguieta en el vol. 10 de
Compositae de la Flora de Venezuela, menciona 45 especies más que Smith
(Aristiguieta, 1964).
Entre 1969 y 1973, fueron recolectadas y descritas 33 nuevas especies en los páramos y subpáramos de Venezuela. Estas especies fueron descubiertas y recolectadas por el Dr. L. Ruiz Terán y M. López Figueiras de Mérida en colaboración con el Dr. José Cuatrecasas. El principal propósito de las expediciones botánicas liderizadas por el Dr. Cuatrecasas era establecer el desarrollo vegetativo de las Espeletias venezolanas, en base a los descubrimientos realizados en dichas
8 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” expediciones, Cuatrecasas crea la subtribu Espeletiinae y la divide en siete géneros
Carramboa, Coespeletia, Espeletiinae, Espeletiopsis, Libanothamnus, Ruilopezia,
Tamania y posteriormente se creó el género Paramiflos (Cuatrecasas, 1976;
Cuatrecasas, 1996).
II.1.2. Bioformación de los terpenos.
El ácido mevalónico (que contiene seis carbonos), es un derivado de tres moléculas de ácido acético, constituye el precursor de la unidad de isopreno (cinco carbonos) que se origina por su deshidratación y descarboxilación simultánea.
(Figura 2). La condensación de unidades de acetato (C2) tiene lugar a través de la acetilcoenzima A (Marcano, 2002).
Figura 2. Estructura orgánica del ácido mevalónico e isopreno.
O H C CH HO 2 2 C C HO OH H3C H Acido mevalónico Isopreno
Tomado y modificado de Campbell, 2003.
Las unidades de isopreno Isopentenilpirofosfato (IPPF) y
Dimetilalilpirofosfato (DMAPF) constituyen agentes alquilantes tanto para carbono como para oxigeno, nitrógeno o azufre. (Figura 3). La prenilación se considera como una reacción directa de sustitución de un nucleófilo sobre el carbono que contiene el
9 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
éster fosfato, o bien a través de un complejo sustrato-enzima como intermediario
(Dewick, 2002).
Figura 3. Compuestos que dan origen a los terpenos.
H2C CH3 H3C CH3 C C
H C CH 2 O O 2 O O
H2C O P O P H2C O P O P
O- O- O- O-
Isopentenilpirofosfato Dimetilalilpirofosfato
Tomado y modificado de Campbell, 2003.
La habilidad alquilante de la unidad de isopreno es la clave de la biosíntesis de terpenoides. En este caso el nucleófilo es el doble enlace terminal del IPPF y la unión es conocida como cabeza-cola. Considerando que los terpenos se forman a partir de condensaciones sucesivas de C-5, se originan los prenoles (C5n). Al condensarse el
DMAPF y el IPPF en un enlace cabeza-cola se forma el geranilpirofosfato (GPF) que a su vez da origen a los monoterpenos (C10) y al farnesilpirofosfato (FPF) por condensación cabeza-cola con otra unidad de isopreno (Marcano, 2002).
El FPF es el precursor de los sesquiterpenos (C15), el cual tiene dos maneras de condensarse: la primera es de forma cabeza-cola con una unidad C5 para dar origen al geranilgeranilpirofosfato (GGPF) productor de diterpenos (C20), los cuales se pueden engendrar con la condensación de dos unidades de GPF, y la segunda por
10 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” condensación cola-cola con una unidad idéntica para formar un hidrocarburo, el cual es el precursor de los triterpenos (C30), conocido como escualeno (Dewick, 2002).
Los sesterterpenos (C25) pueden formarse a partir de las unidades FPF y GPF o de
GGPF e IPPF, y la cadena es conocida como geranilfarnesilpirofosfato (GFPF).
La condensación de dos unidades GGPF conduce a la formación del precursor de los carotenoides (C40), conocido como fitoeno (Marcano, 2002). [Esquema 1]
Esquema 1. Bioformación de los terpenos.
OPP OPP + cabeza-cola CH3CO-SCoA Prenoles n x C5 (C5n)
DMAPF H IPPF cabeza-cola OPP Monoterpenos (C10) GPF IPPF cabeza-cola GPF cabeza-cola
OPP Sesquiterpenos (C15) FPF IPPF cabeza-cola FPF cola-cola GPF OPP cabeza-cola
11 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Continuación del esquema 1.
IPPF GGPF cabeza-cola OPP Diterpenos (C20)
GFPF GGPF cola-cola
Sesterterpenos (C25)
Fitoeno
Escualeno Carotenoides (C40)
Esteroides Triterpenos (C30)
Tomado y modificado de Marcano, et al. 2002.
II.1.3. Clasificación química de los terpenos.
La variedad de estructuras se debe a la reactividad de los carbocationes presentes en los procesos biosintèticos, los compuestos más frecuentes derivan biológicamente del ácido mevalónico, isopentenilpirofosfato (IPP) y del dimetilalilpirofosfato (DMAPP) los cuales son precursores para la formación de los terpenos: monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos
(C30) y carotenos (C40) (Tyler, et al, 1988).
12 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
II.1.3.1. Monoterpenos:
Son los constituyentes más sencillos de la serie de los terpenos, estos son el resultado del acoplamiento de dos unidades isoprénicas. Se conocen más de mil monoterpenos con estructura regular, que son los constituyentes más frecuentes de los aceites esenciales; con estructura irregular, participan en la formación de las piretrinas y en la composición de algunos aceites esenciales de las Asteraceae; ciclados en metilciclopentanos constituyen los iridoides (Bruneton, 2001). (Figura 4)
Figura 4. Estructuras de algunos monoterpenos.
CH2 CH3
CH2
H3C CH3 H3C CH3
Mirceno Mentano
CH3 CH3 CH3
CH3 CH3
H3C CH3 H3C CH3
Seco-iridano Iridano
Tomado y modificado de Bruneton, 2001.
13 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
II.1.3.2. Sesquiterpenos:
Contienen 15 átomos de carbono y presentan una gran diversidad al aumentar el número de ciclaciones y de modificaciones. Constituyen el grupo principal de isoprenoides de los productos naturales (Bruneton, 2001). (Figura 5)
Figura 5. Estructuras de algunos sesquiterpenos.
CH3 CH3
CH3 CH3 OH
H3C CH3 H3C CH3
Bisaboleno Farnesol
Tomado y modificado de Bruneton, 2001.
II.1.3.3. Diterpenos:
Constituyen un amplio conjunto de compuestos que contiene 20 carbonos procedentes del metabolismo del 2E, 6E, 10E- Geranilgeranilpirofosfato (GGPP). Se encuentran en determinados insectos y en diversos organismos marinos, pero sobre todo están repartidos en los vegetales (Bruneton, 2001).
Especialmente abundantes en las Asteraceae, se han descrito más de 1.200 productos repartidos en un centenar de esqueletos. La estructura de los diterpenos es muy variable, dependiendo estrechamente de su biogénesis por tanto, se clasifican en
14 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” función de la misma: compuestos acíclicos y compuestos ciclados (bicíclicos, tricíclicos y tetracíclicos) (Bruneton, 2001). (Figura 6)
Figura 6. Estructuras de algunos diterpenos.
H H3C CH3
H H
CH3 H3C H H
H
Tigliano CH3
CH3
H CH3 H CH3
OH
CH3
CH 3 Fitol
Tomado y modificado de Bruneton, 2001.
II.1.3.4. Triterpenos:
Son compuestos en C30 procedentes de la ciclación del 3S- 2,3- epóxido- 2,3- dihidroescualeno. Los triterpenos presentan una gran unidad estructural, las principales diferencias se deben a su configuración (Bruneton, 2001). (Figura 7)
15 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Figura 7. Estructuras de algunos triterpenos.
HO HO Eufol β - amirina
Tomado y modificado de Domínguez, 1979.
II.1.3.5. Carotenoides:
Comprenden varios cientos de moléculas tetraterpenicas formadas por el
encadenamiento de ocho unidades isoprenicas. Los carotenos se forman según un
proceso análogo al que conducen al escualeno (Bruneton, 2001). Figura 8.
Figura 8. Estructuras de algunos caroteniodes.
O
O Cantaxantina
16 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Continuación de la figura 8.
δ-caroteno
Tomado y modificado de Bruneton, 2001.
II.1.4. Taxonomía de la Coespeletia timotensis Cuatrec.
La clasificación taxonómica de la Coespeletia timotensis Cuatrec., según
Cuatrecasas, 1996 es:
Familia: Asteraceae.
Clase: Magnoliópsida.
Subclase: Asteridae.
Orden: Asterales.
Tribu: Heliantheae.
Subtribu: Espeletiinae.
Género: Coespeletia.
Especie: Coespeletia timotensis.
II.1.4.1. Características macroscópicas de la Coespeletia timotensis Cuatrec.
Coespeletia timotensis Cuatrec. es una planta arrosetada de hojas lineal- lanceolada, agudas en el ápice, atenuada hacia la base, 28-40 cm de largo 2-3, 5 cm
17 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” de ancho, densamente lanosos-tormentosas por ambas caras, tormento blanco ó blanco-amarillento, suelto, enteres, nervios laterales oculto por el indumento.
Inflorescencias racimos alargados, erectos, sobrepasando el tamaño de las hojas, ramas densamente lanosas, cabezuelas alternas, subtendida por bacterias. Lineales, lanosas, 3,5 a 4 cm diámetro pediceladas, pedicelos 6-2 cm de largo, conteniendo muchas flores (Lasser, 1964).
Involucro de 15-18 mm de largo, 3-4 seriados; brácteas densa y abundantemente lanosa. Receptáculo paleáceo; paleas lineal-lanceoladas, acumuladas en el ápice, de unos 6 mm largo, ligeramente pilosas en el ápice, glabras en el resto.
Cabezuelas haterogamas, variadas flores del radio abundante dispuestas a unas 5 series, femeninas, corolas liguladas, tubo alrededor de 1,5 mm de largo, espaciadamente pilosos, lamina 4-5 mm largo, flores del disco numerosas masculinas, corolas tubulosas, cortas y espaciadamente puberulentas en el tubo, glabras en el resto, 6,5 mm de largo, aquenias glabros y de unos 2,5 mm de largo. Papus ausente.
Esta especie se encuentra en el Páramo Piñango Timotes, a 3600 m.s.n.m. en el estado Mérida-Venezuela (Lasser, 1964). (Figura 9)
Figura 9. Características macroscópicas de la Coespeletia timotensis Cuatrec.
18 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Lasser en 1964 en la Flora de Venezuela continúa su descripción sobre
Coespeletia timotensis Cuatrec., conocida hasta 1976 como Espeletia timotensis.
El género Espeletia presenta las siguientes características: Cabezuela heterógamas, radicadas de muchas flores, flores del radio femeninas numerosas, frecuentemente en dos o más series, fértiles, las del disco masculinas por esterilidad del gineceo. Involucro hemisféricos, y anchamente acampanados, brácteas en 2- 3 series, imbricadas un poco desiguales. Receptáculos planos o débilmente convexos, paleáceo, páleas oblongas, persistentes, abrazando las flores; en algunos casos, además de páleas, el receptáculo esta erizado de pelos. Corolas de las flores femeninas liguladas, tubo corto, cubierto por abundantes pelos ensanchados en el
ápice, lámina aplanada, 2-3 dentada en el ápice (lámina en algunos casos muy reducida ó completamente ausente); corolas de las flores masculinas tubulosas, regulares, 5- partidas en el ápice. Anteras finamente acuminadas-auriculadas en la base. Estilo de las flores masculinas indiviso. Aquenios de flores del radio ovoideos,
3-4 angulados o sub-comprimidos. Papus ausente (Lasser, 1964). (Figura 10)
Figura 10. Especie Coespeletia timotensis Cuatrec.
19 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Cabe destacar que Cuatrecasas en 1976 al seleccionar las diferentes especies recolectadas realizó una nueva clasificación del género Espeletia, creando la Subtribu
Espeletiinae con siete géneros.
II.1.4.2. Características microscópicas de la Coespeletia timotensis Cuatrec.
Coespeletia timotensis Cuatr. Comb. Nov. Hoja de estructura bifacial. La epidermis de la cara adaxial es pluriestrata, con 2 a 3 hileras de células, más pequeñas que la de los estratos más internos, las cuales son de gran turgencia por construir tejido acuífero. La epidermis abaxial es monoestrata, con células isodiamétricas, pequeñas y de paredes finas; en estas caras se forman criptas, algunas de ellas son cerradas y en este caso, solo hay en su interior tejido esponjoso, además de los numerosos pelos y estomas que sobresalen del nivel epidérmico (Acosta, 1985).
El tejido en empalizada es monoestrato, anchas, con cloroplastos dispuestos en capa única tapizando las paredes celulares para una mayor utilización de la luz. El tejido esponjoso es aproximadamente 2/3 partes del espesor total del mesofilo y lo integran células isodiamétricas con algunas lobulaciones y dispuestas laxamente con los cloroplastos también adosados a las paredes celulares. Las haces vasculares de la región laminar están rodeadas de una vaina que puede presentarse simple a triple de acuerdo a la importancia de las haces; sus células son de tamaño irregular, paredes celulósicas y se extienden a ambas epidermis, ensanchándose hacia la cara abaxial
(Acosta, 1985).
Los conductores resiníferos, de tipo esquizógeno se encuentran dispersos en el parénquima de la vena media, así como las extensiones de las vainas en la región
20 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” laminar. La colénquima es de tipo lagunar y se localiza hacia ambas epidermis de la vena media y en el lado abaxial de las extensiones de las vainas que rodean las haces de la región laminar (Acosta, 1985).
II.1.5. Fitoquímica.
La Fitoquímica es una disciplina científica que tiene como objetivo el aislamiento, análisis, purificación, elucidación de la estructura y caracterización de la actividad biológica de diversas sustancias producidas por los vegetales. Las plantas producen una diversidad de sustancias, producto del metabolismo secundario, algunas responsables de la coloración y aromas de flores y frutos, otras vinculadas con interacciones ecológicas como es el caso de la atracción de polinizadores (Luque,
2004).
Actualmente, se ha demostrado que la mayoría de estas sustancias participan en el mecanismo de defensa de las plantas. Entre estos se consideran a las fitoalexinas, los alelopáticos, por mencionar algunos. La razón de ser de estos metabólitos, llamados también compuestos fitoquímicos posee una gama de usos en la agricultura y en la medicina. Adicionalmente, las múltiples funciones que presentan en los vegetales permite la búsqueda de nuevos agroquímicos naturales, como insecticidas, herbicidas, reguladores de crecimiento (Luque, 2004).
En otro concepto cabe mencionar que la fitoquímica comprende el estudio de los metabólitos secundarios de origen vegetal y la metodología que se sigue depende de los objetivos de tales estudios, esto se debe al potencial que representa los metabólitos y las investigaciones no solo se han dirigido a la elucidación de
21 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” estructuras químicas y evaluación de su actividad biológica mediante bioensayos sino que también permite aislar e identificar los principios activos de numerosas plantas con importante actividad biológica (Marcano, et al. 2002).
Existen etapas comunes para el estudio fitoquímico de las especies, estas son:
1.- Selección del material, depende del interés que tenga el estudio:
1.1.- Interés particular, si se tiene información de que una determinada planta es utilizada para cierto tipo de afecciones; se localiza la planta, se comprueba su clasificación botánica, se ubica en la literatura química y así se tiene conocimiento de los posibles constituyentes químicos (Marcano, et al. 2002).
1.2.- Interés a un determinado tipo químico de compuestos, se localiza una familia, un género o una especie que, de acuerdo a la información bibliográfica lo contiene. Se comprueba la presencia del compuesto mediante diversos análisis químicos (Marcano, et al. 2002).
1.3.- Interés en un determinado tipo de actividad biológica, se buscan familias, géneros o especies citadas con esa actividad, se recolectan cantidades pequeñas (10 –
50 g) del material, se hacen extractos alcohólicos, acuosos-alcohólicos o acuosos y se comprueba en ellos esa actividad (Marcano, et al. 2002).
1.4.- Interés en los metabólitos secundarios de una determinada familia o género, se recolectan las especies pertenecientes a ellas y se hacen pruebas químicas preliminares en el campo y pruebas químicas y biológicas en el laboratorio (Marcano, et al. 2002).
22 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
2.- Pruebas de actividad biológica.
La actividad biológica se refiere a cualquier efecto que ejerce la muestra sobre los seres vivos, de modo que existe un gran número de ensayos utilizados para monitorear los estudios fitoquímicos (Marcano, et al. 2002).
Según Grebhardt, los resultados provenientes de pruebas in vivo e in vitro son generalmente diferentes. Sin embargo, los ensayos in vitro son preferentemente utilizados porque son más económicos, requieren mucho menos cantidad de material y las condiciones experimentales son más controlables. Cuando se trata de evaluar un número grande de muestras se utilizan sistemas automatizados, tanto enzimáticos como de líneas celulares, usando generalmente placas de microtítulo de 96 o 394 pozos (Grebhardt, 2000).
3.- Examen químico de las muestras.
3.1.- Pruebas químicas de campo.
Es recomendable llevar un “kit de pruebas” durante la recolección que permite hacer los exámenes más sencillos y frecuentes en muestras recién cosechadas. Ocurre a veces que los resultados en el campo no son reproducidos en el laboratorio, cuando el material vegetal no es fresco, como consecuencia de la descomposición promovida por enzimas presentes en el vegetal (Marcano, et al. 2002).
II.1.6. Componentes químicos de algunos frailejones.
Los kauranos son diterpenos tetracíclicos cuyo nombre proviene del popular
“kauri” el cual se designa a la especie vegetal de Nueva Zelanda Agathis australis
(Araucariaceae). Entre 1928 y 1930 el inglés Hosking aisló de esta planta un
23 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
diterpeno cristalino de formula C20H32 al cual denominó kaureno, nombrando a su isómero isokaurano. Los ent-kauranos tienen una configuración inversa a los esteroides y por esta razón se le identifica como ent-kaurano ó (-)-kauranos (Peña,
2008; Ibañez, 2004; Hanson, 1991)
A principios del siglo XX se realizaron estudios sobre la composición de resinas ácidas, exudados de varias plantas superiores, que presentan un alto contenido de ácidos diterpénicos; entre ellos se encuentra un grupo muy importante que pertenece a los diterpenos tetracíclicos, los ent-kauranos. Un representante de este grupo es el ácido kaurénico [1], ha sido utilizado como punto de partida para la síntesis de nuevos diterpenos; algunos de ellos poseen esqueletos diferentes obtenidos mediante reordenamiento, con miras a la obtención de sustancias con actividad biológica (Romero, 2000; Harborne et al., 1991; Nakano et al., 1973; Nakano et al.,
1995).
En 1968 Piozzi et al., obtienen el ácido (-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oico, conocido como ácido grandiflorénico [2] aislado por primera vez de la Espeletia grandiflora, posteriormente Brieskorn et al., en 1968 aislaron el mismo ácido de la
Espeletia schultzii Wedd, también lo han reportado en diferentes especies de
Espeletiinae (Piozzi et al., 1968; Brieskorn et al., 1969).
Un trabajo realizado en 2003, demostró que el extracto de las especies estudiadas contenían (-)-kaur16-en-19-oico (ácido kaurénico) [1] y (-)-kaur-9(11)16- dien-19-oico (ácido grandiflorénico) [2]; la fracción de ácido de algunas especies como Espeletia semiglobulata (78,6%) y Ruilopezia floccosa (50,9%) mostraron un alto contenido de ácido kaurénico [1], mientras que Coespeletia timotensis Cuatrec.,
24 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
(84,0%) y Espeletia schültzii (61,5%) tenían un alto contenido de ácido grandiflorénico [2] (Usubillaga, et al., 2003).
En un análisis realizado al extracto de las hojas de Espeletiopsis angustifolia se logro identificar para la fracción ácida: ácido ent-kaurénico (18,6%) [1], ácido ent-
15α-O-isovaleroxi-kaur-16-en-19-oico (16,2%) [3], ácido ent-15α-hidroxi-kaur-16- en-19-oico [Ácido grandiflorólico] (9,2%) [4], ácido ent-Kauránico (4,9%) [5], ácido ent-kaur-9(11)16-dien-19-oico [Ácido grandiflorénico] (4,5%) [2], y ácido ent-15α-
O-acetoxi-kaur-16-en-19-oico (3,4%) [6]; en la fracción neutra se encontró ent-kaur-
16-en-19-ol [Kaurenol] (32,7%) [7], y varias ceras formadas por n-alcanos de cadena larga (Meccia, et al. 2010).
A partir de la fracción ácida del extracto de la Espeletia nana Cuatrec., se determinó que las hojas contenían un 34,6% de ácido kaurénico [1], 40,1% de ácido grandiflorénico [2], 8% de ácido ent-15α-acetoxi-kaur-16-eno-19-oico [6] y 13% de
ácido ent-15α-hidroxi-kaur-16-eno-19-oico [4]. La fracción ácida proveniente de las raíces contenía 38% de ácido kaurénico [1], 39,6% de ácido grandiflorénico [2], 8,5% de de ácido ent-15α-acetoxi-kaur-16-eno-19-oico [6] y 13,9% de ácido ent-15α- hidroxi-kaur-16-eno-19-oico [4]. (Figura 11). El análisis cromatográfico de la fracción neutra de las hojas permitió establecer que contenían 43% de kaurenal [8],
3% de kaurenol [7], 13% de ruilopeziol [9], 7% de epi-ruilopeziol [10], 25% de nonacontano [11] y 8% de entriacontano [12]. En cambio, en la resina de las raíces el kaurenal [8] constituye el 88%, hay pequeñas cantidades de kaurenol (7%) [7], ruilopeziol (2,5%) [9], epi-ruilopeziol (1,0%) [10], y solamente 1,5% de ceras (Peña, et al., 2013). (Figura 12).
25 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
De la resina extraída de la Coespeletia timotensis Cuatrec., se ha aislado ácido grandiflorénico [2] (Pérez., 1972)
Figura 11. Estructuras de algunos kaurenos aislados de la fracción acida de las
resinas de diferentes especies de frailejón.
COOH COOH
Ácido kaurénico [1] Ácido grandiflorénico [2]
ISO OH COOH COOH
Á. ent-15α-O-isovaleroxi-kaur-16-en- Á. 15-α-OH-(-)-kaur-16-en-19- 19-oico oico [4] [3]
O
C
O CH3 COOH
COOH Á. 15-α-acetoxi-(-)-kaur-
Á. ent-kauránico [5] 16-en-19-oico [6]
Tomado y modificado de Romero, 2000.
26 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Figura 12. Estructuras de algunos kaurenos aislados de la fracción neutra de las
resinas de diferentes especies de frailejón.
H H
H H CH2OH CHO
Kaurenol [7] Kaurenal [8]
OH OH
Ruilopeziol [9] epi-ruilopeziol [10]
CH3-(CH2)88-CH3 CH3-(CH2)29-CH3
Nonacontano [11] Entriacontano[12]
Tomado y modificado de Romero, 2000.
II.1.7. Actividades asociadas a los ácidos kaurenicos y sus derivados.
Entre otras actividades que se le puede adicionar al ácido grandiflorénico [2] y al ácido kaurénico [1] se ha reportado que el segundo es efectivo in vivo ante el melanoma murino B16-F1 en ratones C57-BL/6 (Sosa et al., 1996). Dosis de 1,0 mg/Kg disminuye el crecimiento del tumor primario, reduce el número de metástasis
27 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” y aumente la supervivencia de los animales de experimentación, tomando en consideración que la LD50 en ratones es 439 mg/Kg, el ácido kaurénico [1] ofrece un alto margen de seguridad. Por lo que recientemente el laboratorio de Productos
Naturales de la Facultad de Farmacia en conjunto con otros laboratorios interdisciplinarios han estudiado diferentes derivados del ácido kaurénico, encontrando excelentes resultados como la efectividad frente a células epiteliales del carcinoma de próstata humano (Ruiz et al., 2007).
El ácido (-)-kaur-9)(11)-16-dien-19-oico (Ácido grandiflorénico) [2] en conjunto con otros derivados del ácido kaurénico se le ha atribuido otras actividades como el efecto inhibitorio en la contracción uterina inducida por acetilcolina, oxitocina y serotonina y actividad inhibitoria sobre la producción de la malonaldehído que se produce en respuesta a la trombina para la formación de plaquetas (Campos-
Bedolla et al., 1997; Kosela et al., 1986). Se puede señalar que entre otras actividades también poseen acción analgésica, antiinflamatoria y antiespasmódica (Pérez et al.,
2004; Sosa et al., 1997). En el 2010, Sosa y cols., en un estudio experimental in vivo realizado al ácido kaurénico [1] demuestran que estos tienen actividades antiinflamatorias y antipiréticas.
II.1.8. Generalidades de las bacterias y los hongos.
II.1.8.1. Las bacterias.
Son microorganismos con célula única (unicelulares) relativamente simple.
Dado que su material genético no está encerrado por una membrana nuclear especial, las células bacterianas se denominan procariontes. Las células bacterianas suelen
28 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” presentar diversas formas; la forma de bastón de los bacilos, la forma esférica u oval de los cocos y la forma de tirabuzón o curva de los espirilos son los más comunes.
Las bacterias individuales pueden formar pares, cadenas racimos u otros agrupamientos, estas formaciones suelen ser características de un género o especie de bacteria particular (Tortora, et al., 2007).
Las bacterias están recubiertas por paredes celulares que en gran parte están constituidas por un complejo de hidratos de carbono y proteínas denominado peptidoglucano. El peptidoglucano o mureína es un copolímero formado por una secuencia alternante de n-acetil-glucosamina y el ácido n-acetilmurámico unidos mediante enlaces β-1,4. La cadena es recta y no ramificada (Tortora, et al., 2007).
II.1.8.1.1. Las bacterias Gram positivas.
La mayoría de las bacterias Gram positivas están compuestas por varias capas de peptidoglucano que conforman una estructura gruesa y rígida. Además, la pared de las bacterias Gram positivas contiene ácidos teicoicos, que están compuestos principalmente por un alcohol y fosfatos. Existen dos clases de ácidos teicoicos; el
ácido lipoteicoico que abarca toda la capa de peptidoglucano y está unida a la membrana plasmática, y el otro es el ácido teicoico mural que está unida a la capa de peptidoglucano (Tortora, et al., 2007).
29 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
II.1.8.1.2. Las bacterias Gram negativas.
La pared de las bacterias Gram negativas está compuesta por una capa de peptidoglucano fina y una membrana externa. El peptidoglucano está unido a la lipoproteína de la membrana externa y se encuentra en el periplasma, una sustancia gelatinosa localizada entre la membrana externa y la membrana plasmática. La pared celular de las bacterias Gram negativas no contiene ácidos teicoicos y el hecho de que contenga una escasa cantidad de peptidoglucano aumenta su susceptibilidad a la ruptura mecánica (Tortora, et al., 2007).
II.1.8.2. Los hongos.
Son organismos eucariontes, cuyas células poseen núcleos diferenciados que contiene el material genético de la célula, encerrado por una membrana nuclear. Los organismos del reino Fungí pueden ser unicelulares o multicelulares. Los hongos multicelulares como las setas pueden asemejarse a las platas, pero no tienen la capacidad de realizar la fotosíntesis. Los hongos verdaderos tienen membranas compuestas sobre todo por una sustancia denominada quitina. Las formas unicelulares de los hongos y las levaduras, son microorganismos ovales más grandes que las bacterias. Los más típicos son los hongos filamentosos (mohos); estos hongos forman una masa visible llamada micelio que está compuesta por filamentos largos
(hifas) que se ramifican y entrelazan. Los hongos tienen la capacidad de reproducirse de forma sexual y asexual (Tortora, et al., 2007).
30 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
II.1.9. Actividad antibacteriana y antifúngica.
La actividad antimicrobiana se utiliza para evaluar la actividad inhibitoria de una planta o sus derivados, la potencia de un compuesto a la susceptibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas (Cruz, et al. 2006). Esta actividad biológica puede variar desde la inhibición completa o parcial del crecimiento microbiano hasta la acción bactericida o fungicida (Maguna, et al. 2006). Para evaluar la actividad es preciso conocer el modelo microbiano perfectamente y tenerlo controlado en las condiciones de laboratorio, ya sea por procedimientos in vitro o in vivo. La medición de esta actividad puede hacerse por métodos de difusión y dilución, entre otros el método de difusión se usa como un procedimiento cualitativo, semicuantitativo y a veces cuantitativo. El método de dilución se usa para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) que se requiere del agente antimicrobiano para inhibir o matar al microorganismo (Cruz, et al. 2006).
El aumento de microorganismos resistentes a los agentes antimicrobianos es el principal problema al que se enfrenta la ciencia médica en el tratamiento de las enfermedades infecciosas: neumonía, tuberculosis, varicela, candidiasis, leishmaniasis, entre otras (Kümmerer. 2004). La creciente demanda de alternativa a los antibióticos, junto a la aparición de algunas enfermedades ligadas a infecciones bacterianas, ha puesto de relieve el potencial de los extractos vegetales y en especial de algunos de sus aceites esenciales como agentes antibióticos (Zekaria, 2007). A las especies que contienen flavonoides se les atribuye varias propiedades farmacológicas.
El uso medicinal extendido de la familia Asteraceae, probablemente se encuentre vinculado a la actividad biológica por la presencia de estos compuestos y otros
31 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” compuestos fenólicos (Abad, et al. 2008). En el 2006, se comprobó que las bacterias
Gram negativas, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa, fueron más sensibles a los terpenoides en comparación con la Gram positiva, Staphylococcus aureus. Esto puede tener su causa en la diferencia que presentan estas bacterias en cuanto a su pared celular, lo cual determinará la penetración o no del terpenoide a la célula bacteriana para que produzca su acción (Maguna, et al. 2006).
Los estudios farmacológicos realizados sobre parte de los componentes químicos, o bien sobre los exudados completos, de algunas plantas de la familia
Asteraceae han demostrado principalmente, actividad antiinflamatoria, antioxidante, antimicrobiana y antifúngica, además de las digestivas, hepáticas y renales más conocidas (Abad, et al. 2008). En la valoración de la actividad antimicrobiana de los extractos etanólico, cetónico y acuoso de la especie vegetal Baccharis nítida perteneciente a la familia Asteraceae, se mostró actividad antibacteriana sólo contra
Staphylococcus aureus aunque se observó que los extractos incrementaron el desarrollo bacteriano de Pseudomona aeruginosa (Rangel, et al. 2001). A través de un estudio realizado a Diplostephium tolimense se encontró que presenta actividad antibacteriana in vitro frente a Staphylococcus aureus (Ávila, et al. 2006).
Se encontró que la fracción obtenida con acetato de etilo de las partes aéreas de Espeletia schultzii Wedd, conteniendo el ácido grandiflorénico [2] y algunos de sus derivados, mostraron actividad frente Bacillus cereus y Staphylococcus aureus
(De los Ríos et al., 1999).
A partir de las hojas de Espeletia barclayana Cuatr., se aislaron dos ácidos kaurenoicos: el ácido (-)-kaur-9)(11)-16-dien-19-oico (Ácido grandiflorénico) [2] y el
32 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
ácido (-)-kaur16-en-19-oico (Ácido kaurénico) [1], los cuales presentaron actividad antibacteriana: el primero frente a Bacillus subtilis y el segundo frente a Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae. La evaluación antibacteriana se llevó a cabo empleando el método de perforación en gel (Gutiérrez et al., 1998)
Sobre la actividad antifúngica se han reportado diversos trabajos en que se afirma que los derivados del ácido kaurénico poseen dicha actividad, como el trabajo realizado por Sartori et al., 2003 donde señala que el ácido ent-kaurénico [1] ha mostrado actividad antifúngica frente a diferentes especies de dermatofitos entre los que están, Epidermophyton floccosum, Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes.
II.1.9.1. Métodos de evaluación de actividad antibacteriana y antifúngica.
II.1.9.1.1. Método de difusión en agar.
Es llamado técnica de Kirby-Bauer, y se basa en la inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor de un disco de papel del filtro impregnado con cantidades conocidas de los agentes antimicrobianos (Ingraham, et al., 1998). Esta técnica consiste en la siembra de la bacteria en la superficie de una placa con un medio de cultivo, sobre él se depositan los discos de papel impregnados, los cuales difunden casi instantáneamente a través del agar, formándose un gradiente de concentración del mismo alrededor del disco. Posteriormente, se lleva a incubar a
37°C durante 18 horas (Prats, 2005).
33 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
El microorganismo se desarrolla en toda la placa excepto alrededor de los disco cuya concentración de antimicrobiano es inhibitoria. El diámetro del halo de inhibición del crecimiento expresa la sensibilidad ó resistencia del microorganismo,
(este halo es medido en milímetro) (Forbes, et al., 2009).
II.1.9.1.2. Método de dilución en caldo.
Esta prueba de sensibilidad en caldo se puede realizar en tubo (macrométodo)
ó en microplaca (micrométodo) (Negroni, 2009). Estudia la susceptibilidad de los microorganismos mediante cultivo en medios líquidos que contiene concentraciones progresivamente más altas de un determinado agente antimicrobiano. Para ello se inoculan una serie de tubos que contienen concentraciones decrecientes de un antimicrobiano en solución con el microorganismo a estudiar, se lleva a incubar para observar el crecimiento ó la inhibición (Ingraham, et al., 1998).
II.1.11.1.3. Método de dilución en agar.
En este método las concentraciones de antimicrobianos y los microorganismos por probar, se reúnen en un medio sólido y no en un caldo, luego son llevadas a incubación. Posteriormente de la incubación, las placas se examinan en busca de crecimiento, y la concentración inhibitoria mínima (CIM) es la concentración más baja de un agente antimicrobiano presente en el agar que inhibe por completo el crecimiento visible (Forbes, et al., 2009).
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35 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
III.1. Planteamiento del problema.
¿Será posible analizar los componentes y determinar la actividad antibacteriana y antifúngica de la fracción ácida y la fracción neutra del extracto obtenido de las hojas de la Coespeletia timotensis Cuatrec.?
III. 2. Hipótesis.
El extracto de las hojas de la Coespeletia timotensis Cuatrec., contiene en la fracción ácida y la fracción neutra diterpenos del tipo Kaureno y que probablemente estos poseen actividad antibacteriana y antifúngica.
36 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
37 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
IV.1. Objetivo general.
Realizar el estudio fitoquímico y determinar la actividad antibacteriana y
antifúngica de las fracciones obtenidas del extracto de las hojas de la
Coespeletia timotensis Cuatrec.
IV.2. Objetivos específicos
Recolectar las hojas de la Coespeletia timotensis Cuatrec., y preparar el
extracto con hexano:éter.
Obtener a partir del extracto de las hojas de la Coespeletia timotensis Cuatrec.,
la fracción ácida y la fracción neutra.
Separar e identificar por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas los componentes de las fracciones ácida y neutra de la Coespeletia
timotensis Cuatrec.
Determinar la actividad antibacteriana y antifúngica del extracto de las hojas
de la Coespeletia timotensis Cuatrec.
38 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
39 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
V.1. Recolección de la planta y preparación del material.
La especie estudiada fue la Coespeletia timotensis Cuatrec. La recolección del material se hizo en el mes de Mayo del 2010, en el Pico el Águila, Estado Mérida, a una altura aproximada de 4.080 m.s.n.m. Un voucher espécimen fue depositado en el herbario MERF bajo el Nº AU35 (Herbario de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los Andes. Mérida- Venezuela).
El material fresco se recortó en pequeños trozos y se secó a temperatura ambiente en bandeja de aluminio, en un lapso aproximadamente de 10 a 15 días.
V.2. Extracción.
Del material ya preparado seco y molido se pesaron 250 gramos, se colocó en una columna con aproximadamente 5 L de Hexano- éter dietílico 3:1 durante 24 horas; al cabo de este tiempo se recuperó el extracto. Del extracto (5 L) se tomó una alícuota de 50 mL, que se colocó en un balón de destilación, previamente pesado y se destiló el solvente a presión reducida en un Rotavapor BÜCHI. Se obtuvo un residuo de color verde oscuro, el cual pesó 0,82 g, y con este dato se calcularon los gramos totales del extracto inicial (23 g).
V.3. Separación de la fracción ácida.
Se disolvió el extracto obtenido en aproximadamente 3 L de Hexano, al cual se le agregó 100 mL de una solución acuosa de hidróxido de sodio (NaOH) al 5% con el objeto de extraer ácidos kaurénicos presentes en el mismo. Se agregó metanol para
40 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” acelerar el proceso de separación de la emulsión que se había formado y así obtener la separación de la fase acuosa que contenía las sales de los ácidos. En la fase orgánica
(hexano) quedó disuelta la fracción neutra. A la fase acuosa se le agregó ácido clorhídrico (HCl) hasta pH 3 para formar cloruro de sodio (NaCl) y así dejar los
ácidos libres. Se extrajo con hexano:éter dietílico (3:1% v/v), formándose dos fases nuevamente: la fase acuosa que se desechó porque ya no contenía ácidos kaurénicos y la fase orgánica que contiene la fracción ácida. Las fracciones ya separadas, se llevaron a destilar obteniéndose el peso de cada una. Una alícuota de la fracción ácida se metiló para su posterior análisis mediante Cromatografía de gases. Los componentes de la fracción neutra no requieren metilación para su análisis cromatográfico. Estos procesos están resumidos en los Esquema 2 y 3.
41 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Esquema 2. Proceso de obtención de la fracción ácida y neutra de las hojas de
Coespeletia timotesis Cuatrec.
MATERIAL SECO Y MOLIDO
EXTRACCIÓN CON HEXANO:ÉTER (3 :1)
CONCENTRACIÓN A LA 1/3 PARTE DEL VOL.
AGITAR CON SOLUCIÓN DE NaOH 5 %
FASE ORGÁNICA Fracción neutra FASE ACUOSA (Sal del ácido + agua)
COMPUESTOS AGREGAR HCl HASTA pH 3 NEUTROS (Kaurenol, kaurenal y ceras)
EXTRACCIÓN CON HEXANO:ÉTER
FASE ORGÁNICA FASE ACUOSA Fracción Ácida
DESECHAR Ácido kaurénico, Ácido grandiflorénico y un triterpeno
42 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
ESQUEMA 3 METILACIÓN DE LA FRACCIÓN ÁCIDA
3 g de nitroso metil urea se
cubren con 150 mL de Et 2O
Se la añade una solución de KOH en agua (50 %p/v)
Mezcla (Se calienta sobre agua tibia)
La mezcla de diazometano -Et2O destila y se
recoge en un balón sobre Et2O
Se enfría en baño de hielo
La solución diazometano-Et2O se agrega a la
Fracción ácida disuelta en ET2O
V.4. Separación y purificación de los componentes:
V.4.1 Análisis por cromatografía columna flash:
Se preparó la cabeza de la columna colocando en un vaso de precipitado 2 g de la fracción acida, se añadieron aproximadamente 20 mL de acetona para disolverlo y se le agregó 4 g de sílica gel. Se colocó fibra de vidrio en una columna de vidrio, se adicionó 100 g de sílica y encima de esta se instaló la cabeza realizada anteriormente, que se eluyó con hexano. Se recolectaron las fracciones, se sembraron en placas de
43 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” sílica gel y se trabajaron con patrones ya existentes en el Laboratorio del Instituto de
Investigaciones de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los
Andes.
V.5 Análisis de los componentes:
V.5.1 Análisis por cromatografía de capa fina (TLC):
Este análisis se realiza mediante 2 fases, la fase estacionaria ó fase fija que se adhiere a una placa rígida que puede prepararse en el laboratorio o comprarse, se utilizó como fase fija placas de Sílica gel 60, marca Alugram Sil G/UV254, con un espesor de 0,20 mm, y la otra fase móvil en la que se emplearon diversos solventes como hexano, acetato de etilo y acetona todos ellos de grado técnico; posteriormente su utilizó el revelador ácido fosfomoblídico.
V.5.2 Análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
(CG-EM):
El análisis de las fracciones se realizó por Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM), en un equipo HP 5973 (Hewlett Parckard). Se empleó una columna capilar 5 % fenil, 95% metilpolisiloxano de 30 m de longitud y
0.2 mm de diámetro interno, con un espesor de película de 0.25 m. Se utilizó una temperatura inicial de 250 °C (1.0 min.), luego se aplicó un calentamiento a razón de
5 °C/min hasta una temperatura final de 300 °C. La temperatura de la interface cromatógrafo-espectrómetro se mantuvo a 280 °C; la temperatura de la cámara de
44 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” ionización a 230 °C y el cuádruplo a 150 °C. Se utilizó helio como gas portador a una velocidad de 34 m/s. El análisis se realizó a 70 eV; a un rango de masas de 40-500 amu a una velocidad de 3.9 espectros/segundos. Se inyectaron 1.0 L de solución de aproximadamente 5 mg de cada fracción disuelta en éter dietílico con reparto de 1:50.
Los compuestos se identificaron mediante comparación de los tiempos de retención y espectros de masas con compuestos patrón existente en el Laboratorio del Instituto de
Investigaciones de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los
Andes.
V.6 Determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la fracción
ácida de la Coespeletia timotensis Cuatrec.:
La actividad antibacteriana y antifúngica se determinó por el método de difusión en agar con discos de papel. Se seleccionaron 9 especies de microorganismos, de las cuales 4 son bacterias Gram negativas (Salmonella typhi
CDC 57, Pseudomona aureginosas ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922 y
Klebsiella pneumoniae ATCC 23357); 3 son bacterias Gram positivas
(Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus (dorado) ATCC 3568 y Enterococcus faecalis ATCC 29212) y 2 especies de Candida (Candida albicans
CDC B-385 y Candida krusei ATCC 6258), cepas de referencia internacional pertenecientes a la Colección de Cultivos Tipo Americano (ATCC) y del Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC)
45 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
V.6.1 Preparación de material para la actividad antibacteriana y antifúngica:
Se prepararon las placas con aproximadamente 20 mL de agar Müeller-
Hinton, y 20 mL de agar Saboraud dextrosa, previamente esterilizado y por último se dejo solidificar para su posterior uso.
V.6.2 Preparación de los inóculos bacterianos y fúngicos:
El ensayo se realizó con un cultivo de 18 horas de cada microorganismo en agar Mueller-Hinton a 37°C. Se preparó el inóculo bacteriano tomando una pequeña cantidad de las colonias de cada microorganismo con la ayuda del asa en aro y se suspendieron en solución salina fisiológica (NaCl al 0.85%) ajustándose al Patrón de
Turbidez de Mac Farland N° 0,5 (106-8 ufc/mL).
V.6.3 Determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica por el método de difusión en agar (Kirby-Bauer):
Los ensayos se realizaron en el Laboratorio de Síndromes Gastrointestinales y
Urinarios “Lic. Luisa Vizcaya”. Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los Andes. Mérida – Venezuela, bajo la asesoría de la Profesora Judith Velasco.
Cada inóculo se sembró en forma confluente con un hisopo sobre la superficie de una placa conteniendo agar Mueller-Hinton, girando sucesivamente la placa en
ángulos de 90°, se utilizaron discos de papel filtro (6 mm) los cuales se esterilizaron con luz ultravioleta (LUV), durante toda la noche.
46 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Se prepararon cuatro (4) diluciones del extracto de la fracción ácida, en un rango de concentración de 250 μg/mL a 1000 μg/mL y se impregnaron los discos de papel filtro con 20 μL de cada dilución, así como también se impregnaron discos de papel filtro con 20 μL del solvente (acetona) como control negativo, luego se colocaron los discos de papel de filtro sobre la superficie del agar ya inoculado.
También se utilizó un control positivo representado por un disco estándar de los antibióticos y el antimicótico de referencia respectivo para cada cepa.
El medio de cultivo inoculado se preincubó durante 18 horas a 4°C y luego se incubó a 37°C durante 24 horas. La lectura de los halos de inhibición se realizó a las
24 y 48 horas. Al cabo de este tiempo, se midió la zona de inhibición alrededor del disco, expresada en mm. Los ensayos se realizaron por duplicado.
47 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
48 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
De acuerdo a los esquemas 2 y 3, descritos en los materiales y métodos se procedió a la purificación de los componentes de la fracción ácida obtenida de las hojas de la Coespeletia timotensis Cuatrec.
Se obtuvo un peso total de la fracción ácida de 6,24 g, la cual se procedió a realizarle una cromatografía en columna flash obteniéndose 46 fracciones de 75 mL de hexano cada una, luego se cambio la polaridad a hexano acetato de etilo al 7%, obteniéndose 20 fracciones de 50 mL cada una. Estas fracciones fueron monitoreadas por cromatografía en capa fina (CCF) con patrones ya establecidos e utilizando como revelador ácido fosfomolibdico.
Análisis de las fracciones ácida y neutra de las hojas de Coespeletia timotensis Cuatrec.
Para el análisis de la fracción ácida y la fracción neutra, además los componentes aislados de fracción ácida, se realizo mediante la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) se obtuvo los siguientes resultados se logro identificar de la fracción ácida cinco (5) componentes y sus tiempos de retención, en la fracción neutra se identifico cuatro (4) componentes y sus tiempos de retención respectivamente. [Gráfica 1 y 2]
49 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” . c e r t 0 a 0 u . C 4 1 s i s n 0 e t 0 . o 3 m 1 i t
a i t 0 e 0 l . e 2 p 1 s e o 0 C 0
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50 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” . c e r t a 0 u 0 . C 4 1 s i s n e 0 t 0 o . 3 m 1 i t
a i t 0 e 0 l . e 2 p 1 s e o 0 C
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5 a m a r 0 g 0 o . t 4 a 5 m 9 o 3 . r 3 C
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 c e i 9 8 7 6 5 4 3 2 4 3 2 1 0 f c 1 1 1 1 1 a n r a > - d - G n e u m b i A T 51 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
En la tabla 1 se muestra el tiempo de retención y los porcentajes de los componentes de la fracción ácida del extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec., de los cuales se identificaron: ácido grandiflorénico [2] (28,88%), ácido kaurénico [1]
(7,05%), componente No Identificado N.I. (0,58%), ácido 15α-acetoxi kaurénico [6]
(1,00%), β-amirina [13] (14,79%) y α-amirina [14] (47,70%). (Figura 13).
Tabla 1. Composición de la fracción ácida de la Coespeletia timotensis Cuatrec.
Nº DEL % T.R (min) COMPONENTE PICO
1 3,41 Ácido grandiflorénico [2] 28,88
2 3,88 Ácido kaurénico [1] 7,05
3 4,15 No Identificado N.I. 0,58
Ácido 15α-acetoxi 4 4,61 1,00 kaurénico [6]
5 8,31 β-amirina [13] 14,79
6 9,31 α-amirina [14] 47,70
En la tabla 2 se muestra los porcentajes de las componentes de la fracción neutra del extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec., con sus respectivos tiempos de retención estas son 16-α-hidroxi–kaurano [15] (13,62%), heptacosano [16]
(9,13%), n-eicosano [17] (65,83%) y nonadecano [18] (11,42%) (Figura 14).
52 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Tabla 2. Composición de la fracción neutra de la Coespeletia timotensis Cuatrec.
Nº DEL PICO T.R (min) COMPONENTE %
1 3,40 16-α-hidroxi kaurano [15] 13,62
2 5,59 Heptacosano [16] 9,13
3 7,34 n-eicosano [17] 65,83
4 9,29 Nonadecano [18] 11,42
Se identificaron según los espectro de masas con ion molecular (m/z) por metilación para el ácido grandiflorénico [2] (m/z 314) [Gráfica 3], ácido kaurénico
[1] (m/z 316) [Gráfica 4], Ácido 15α-acetoxi kaurénico [6] (m/z 374) [Gráfica 5], β- amirina [13] (m/z 426) [Gráfica 6] y α-amirina [14] (m/z 426) [Gráfica 7].
También se identificaron según los espectro de masas con ion molecular (m/z) los componentes de la fracción neutra, se obtuvo 16-α hidroxi –Kaurano [15] (m/z
291) [Gráfica 8], Heptacosano [16] (m/z 380) [Gráfica 9], n-eicosano [17] (m/z 281)
[Gráfica 10] y Nonadecano [18] (m/z 355) [Gráfica 11].
53 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
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Grafica 3. Espectro de masas del éster del ácido grandiflorénico. [2]
54 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
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55 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
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Gráfica 5. Espectro de masas del éster del ácido 15α-acetoxi kaurénico. [6]
56 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
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57 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
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Gráfica 7. Espectro de masas de la α-amirina. [14]
58 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Ácido grandiflorénico [2] Ácido kaurénico [1]
Formula molecular: C20H28O2 Formula molecular: C20H30O2
g g Masa molecular: 300,451 /mol Masa molecular: 302,451 /mol
Punto de fusión: 158-160 ªC Punto de fusión: 175-178 ªC
β-amirina [14] α-amirina [15]
Formula molecular: C30H50O Formula molecular: C30H50O
g g Masa molecular: 426,717 /mol Masa molecular: 426,717 /mol
Punto de fusión: 190-191 ªC Punto de fusión: 190-191 ªC
Ácido 15α-acetoxi kaurénico [7]
Formula molecular: C22H32O4
g Masa molecular: 360,487 /mol
Punto de fusión: 170-173 ªC
59 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Abundance
Scan 30 (3.398 min): 12nov13b1.D\data.ms 42000 94.0 40000 38000 36000 34000 44.0 32000 257.1 OH 30000 28000 26000 135.2 24000 22000 20000 175.2 291.1 18000 16000
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Gráfica 8. Espectro de masas del 16-α hidroxi –Kaurano. [15]
60 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Abundance
Scan 449 (5.613 min): 12nov13b1.D\data.ms 57.0
45000 CH H3C 3
40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000 99.2
206.9
5000 141.2 281.1 239.1 380.4 174.2 323.3 429.1 493.1 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z--> Gráfica 9. Espectro de masas del Heptacosano. [16]
61 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Abundance
Scan 776 (7.342 min): 12nov13b1.D\data.ms 57.1 170000
160000 H3C CH 150000 3
140000
130000
120000
110000
100000
90000
80000
70000
60000
50000 99.2 40000
30000
20000 141.2 207.1 10000 281.1 323.3 173.8 248.8 365.4 408.4 475.6 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z-->
Gráfica 10. Espectro de masas del n-eicosano. [17]
62 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Abundance
Scan 1141 (9.272 min): 12nov13b1.D\data.ms 60000 57.1
55000 H3C CH3
50000
45000
40000
35000
30000
25000
20000 206.9 15000 99.2
10000 281.1 141.2 5000 268 239.2 355.1 175.1 323.3 405.1 436.4 479.1 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z-->
Gráfica 11. Espectro de masas del Nonadecano. [18]
63 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
64 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
16-α-hidroxi kaurano [16] Heptacosano [17]
Formula molecular: C20H34O Formula molecular: C27H56
g g Masa molecular: 290 /mol Masa molecular: 380,733 /mol
n-eicosano [18] Nonadecano [19]
Formula molecular: C20H42 Formula molecular: C19H40
g g Masa molecular: 282,547 /mol Masa molecular: 268,313 /mol
64 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Figura 13: Estructura de los compuestos identificados en la fracción ácida del
extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec.
COOH COOH
Ácido grandiflorénico [2] Ácido kaurénico [1]
OAC
COOH
Ácido 15α-acetoxi kaurénico [6]
HO HO
β-amirina [13] α-amirina. [14]
Tomado y modificado de http://www.chemspider.com/
65 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Figura 14: Estructura de los compuestos identificados en la fracción neutra del
extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec.
OH
16-α hidroxi –Kaurano [15]
CH H3C 3
Heptacosano [16]
H3C CH3
N-eicosano. [17]
H3C CH3
Nonadecano [18]
Tomado y modificado de http://www.chemspider.com/
Actividad antibacteriana y antifúngica de la fracción acida del extracto de la
Coespeletia timotensis Cuatrec.
La actividad antibacteriana y antifúngica fue realizada con cepas de bacterias
Gram positivas y Gram negativas, por lo que son microorganismos morfológicamente y fisiológicamente distintos, de igual manera se realizó la actividad antifúngica con cepas de Candida sp., que poseen algunas diferencias en su morfología.
66 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Los resultados obtenidos en este trabajo sobre la determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la mezcla de los componentes de la fracción ácida de la Coespeletia timotensis Cuatrec., revelan que no hubo sensibilidad de los microorganismos estudiados frente al ensayo, lo que revela que los componentes que se encuentra en la fracción ácida no posee actividad antibacteriana, ni actividad antifúngica. Los ensayos se realizaron por triplicado. (Tabla 5).
En relación de los resultados obtenidos en el laboratorio con la mezcla de componentes de la fracción ácida de la Coespeletia timotensis Cuatrec., y las diluciones antes mencionadas, se puede decir que la mezcla de los componentes de la fracción ácida de la Coespeletia timotensis Cuatrec., no poseen actividad a diferencia a trabajos ya realizados donde sus autores exponen que algunos componentes individualmente y en concentraciones elevadas, poseen actividad antibacteriana y antifúngica sobre distintas bacterias y hongos.
La fracción neutra no se le realizo ninguna de las dos actividades debido a que se obtuvo poca cantidad necesaria para la realización de dichas actividades.
67 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Tabla 3. Actividad antibacteriana y antifúngica de la fracción ácida de las hojas de Coespeletia timotensis Cuatrec.
Zona de Inhibición (mm)* Microorganismos Fracción Controles Positivos Ácidaa SAM VA GM AZT CIP CEF FLU ANF
Staphylococcus aureus NA 41* (ATCC 29923) Enterococcus faecalis NA 21* (ATCC 29212) Escherichia coli NA 21* (ATCC 25922) Klebsiella pneumoniae NA 30* (ATCC 23357) Salmonella Typhi NA 40* (CDC 57) Pseudomonas aeruginosa NA 28* (ATCC 27853) Candida albicans NA 50* (CDC B-385) Candida krusei NA 22* (ATCC 6258) aFracción ácida: diluciones probadas 250, 500, 750 y 1000 mg/mL, SAM: Sulbactam- Ampicilina® (10μg/10μg), VA: Vancomicina® (30 μg), GM: Gentamicina® (10 μg), AZT: Aztreonam® (30μg), CIP: Ciprofloxacina ® (5μg), CEF: Cefoperazona® (75 μg), FLU: Fluconazol® (100 µg), ANF: Anfotericina B® (10 μg), NA: No Activo, NP: No Probado, *Diámetro de la zona de inhibición, discos de 6 mm de diámetro, promedio de dos ensayos consecutivos.
68 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
69 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
De los resultados obtenidos del estudio realizado al extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec., se obtuvieron 6,24 g para la fracción ácida y 3,4 g para la fracción neutra. Estos fueron sometidos al análisis cromatográfico.
Los componentes de la fracción ácida y neutra fueron cuantificados e identificados por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
(CG/EM), entre sus componentes se encuentran: el ácido kaurénico (7,05%), el ácido grandiflorénico (28,88%), la β-amirina (14,79%), la α-amirina (47,70%), el 16-α- hidroxi kaurano (13,62%), el heptacosano (9,13%), el n-eicosano (65,83%) y el nonadecano (11,42%).
Al presente trabajo se le realizó un estudio comparativo con otra especies de frailejones tales como: Coespeletia moritziana, Coespeletia thyrsiformis, Coespeletia spicata, Ruilopezia flocossa, Ruilopezia atropurpurea, Ruilopezia lindenii,
Ruilopezia marcesens y la Espeletia schultzii donde se lograron aislar, cuantificar e identificar el ácido grandiflorénico [2], el ácido kaurénico [1] y ácido 15α-acetoxi kaurénico [6] presente en la especie en este estudio. (Romero, 2000, Peña, 2008 y
Baptista 2005).
En un trabajo previo realizado por Pérez en 1972, la cual analizó la fracción
ácida y neutra de la Coespeletia timotensis Cuatrec, logrando aislar e identificar el
ácido grandiflorénico [2] en un 0,053%, mientras que en este trabajo se logró identificar en un 28,88% por lo tanto se puede decir que la época, año de recolección y otros factores determinan el rendimiento de los componentes. Igualmente Pérez de la fracción ácida logró identificar otro componente ácido 15-α-hidroxi-kaur-16-en-19- oico que en este trabajo no se identificó. Por otra parte en este trabajo se logró
70 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” identificar la presencia de α y -amirina que en el trabajo previo no lo identificaron.
De la fracción neutra Pérez identificó alcoholes alifáticos en un 0,016%, mientras que en este estudio reciente se logró identificar 16-α-hidroxi-kaurano [15] y las ceras.
El espectro de masas obtenido con ión molecular (m/z) por metilación para el
ácido grandiflorénico [2] es de (m/z 314), este se diferencia al obtenido por Pérez en
1972 que fue (m/z 300) debido al éster metílico que se adicionó a la fracción ácida.
Se compararon los espectros de masas obtenidos con ión molecular (m/z) del ácido grandiflorénico [2] y el ácido kaurénico [1] (m/z 314) y (m/z 316) respectivamente, que coincide con el obtenido por Romero (2000) y son diferentes a los espectros de masa obtenidos por Peña en el 2008. Cabe destacar que estas diferencias se deben a la metilación realizada para obtener mejores resultados en la cromatografía. Por otra parte, para el ácido 15α-acetoxi kaurénico [6] el espectro de masas obtenido con ion molecular (m/z) fue de (m/z 374) mientras que Peña en su trabajo obtuvo para el mismo componente (m/z 360), tomando en cuenta que el componente posee el éster metílico que se adicionó para el análisis.
El espectro de masas con ion molecular (m/z) de los componentes de la fracción neutra es para el 16-α hidroxi–Kaurano [15] de (m/z 291), para el
Heptacosano [16] es de (m/z 380), siendo para el n-eicosano [17] de (m/z 281) y para el Nonadecano [18] es de (m/z 355).
La actividad antibacteriana y antifúngica realizada contra bacterias Gram positivas, Gram negativas y algunas cepas de Candida spp., con la mezcla de componentes de la fracción ácida del extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec.,
71 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” reportó resistencia a las diferentes diluciones de concentración en el rango de 250
µg/mL a 1000 µg/mL. En base a lo obtenido se puede decir que la mezcla de componentes no presenta actividad antibacteriana, ni actividad antifúngica.
Del presente trabajo se esperaba que presentara actividad antibacteriana y antifúngica debido a que entre los componentes de la fracción ácida del extracto de las hojas de la Coespeletia timotensis Cuatrec., se encuentran presente el ácido grandiflorénico [2], el ácido kaurénico [1], que han sido reportados de otras especies y han presentado moderada actividad frente a bacterias Gram positivas con un rango de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) de 700 y 1600 µg/mL, frente Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae (Gutiérrez et al., 1998;
Peña, 2008), y el ácido 15α-acetoxi kaurénico [6], ha sido previamente estudiado mostrando débil actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus con una
Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) de 31,25 µg/mL (Peña; 2008).
Resultados anteriores han demostrado que la mezcla de componentes obtenidos de especies de la familia Asteraceae presentan actividad antimicrobiana, tal es el caso de los extractos etanólicos, acetónicos y acuoso analizados de las partes aéreas de Baccharis nítida que mostraron actividad antibacteriana contra
Staphylococcus aureus (Rangel, et al., 2001).
En cuanto a la actividad antifúngica la cepa de Candida albicans y Candida krusei, mostraron resistencia frente a la mezcla de componentes de la fracción ácida del extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec., Trabajos previos han demostrado que el ácido kaurénico [1] y algunos derivados poseen dicha actividad, como el trabajo realizado por Sartori et al., 2003 donde señala que el ácido ent-kaurénico [3]
72 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.” ha mostrado actividad antifúngica frente a diferentes especies de dermatofitos entre los que están, Epidermophyton floccosum, Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes.
Debido a que la fracción ácida de la Coespeletia timotensis Cuatrec, no presentó actividad antibacteriana y antifúngica, esto puede deberse a la presencia de la mezcla de los componentes α y -amirina ya que se encuentran en un porcentaje alto de concentración (62,49%) y puede estar produciendo un antagonismo de dichas actividades.
Se recomienda aislar los componentes de la fracción estudiada y realizarle actividad a cada uno por separado, tomando en cuenta las mismas cepas utilizadas y realizarle actividad antibacteriana y antifúngica a la fracción neutra ya que no se realizó por que se obtuvo muy poco de la mezcla.
73 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
74 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
. Se obtuvo, por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas (CG-EM) de la fracción ácida y la fracción neutra de la
Coespeletia timotensis Cuatrec., la identificación de cinco (5) y cuatro
(4) componentes respectivamente con sus tiempos de retención.
. Los porcentajes de los componentes de la fracción ácida de la
Coespeletia timotensis Cuatre., fueron: ácido grandiflorénico [2]
(28,88%) con un tiempo de retención (T.R.= 3,41 min), ácido kaurénico
[1] (7,05%) (T.R.= 3,88 min), componente No Identificado N.I. (0,58%)
(T.R.= 4,15 min), Ácido 15α-acetoxi kaurénico [7] (1,00%) (T.R.= 4,61
min), β-amirina [14] (14,79%) (T.R.= 8,31 min) y α-amirina [15]
(47,70%) (T.R.= 9,31 min).
. Los porcentajes de las componentes de la fracción neutra de la
Coespeletia timotensis Cuatrec., se identificó 16-α–Kaurano [16]
(13,62%) con un tiempo de retención (T.R.= 3,40 min), Heptacosano [17]
(9,13%) (T.R.= 5,59 min), n-eicosano [18] (65,83%) (T.R.= 7,34 min) y
Nonadecano [19] (11,42%) (T.R.= 9,29 min).
. La fracción ácida de la Coespeletia timotensis Cuatrec., no poseen
actividad antibacteriana, ni actividad antifúngica sobre los
microorganismos estudiados.
75 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
76 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
1.- ABAD, M., BERMEJO P., 2008. Baccharis (Compositae). A review update,
Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, University Complutense.
2.- ACOSTA, R., 1985. Estudio anatomo-foliar del genero Coespeletia cuatrc.
(Compositae) Mérida-Venezuela. Universidad de Los Andes.
3.- ARISTIGUIETA, L., 1964. Compositae en flora de Venezuela., 10 (1), 407-463.
4.- ÁVILA, L., BAQUERO, E., VIÑA, A., MURILLO, E., 2006. Actividad
antibacteriana de Diplostephium tolimense Cuatrec. (ASTERACEAE) frente a
Staphylococcus aureus. Vitae, 13 (1), 55-60.
5.- BAPTISTA, J. 2005. Monografía de tesis de Magíster Scientiae.
6.- BATISTA, R.; BRANDAO, G.; BRAGA, F. and OLIVEIRA, A. 2009.
Cytotoxicity of Wedelia paludosa D.C. extracts and constituents. Rev.bras.
Farmacogn.
7.- BRIESKORN, C., PÖHLMANN, E. 1968. Diterpene vom kaurantyp aus der
Compositae Espeletia chultzii (Wedd). Tetrahedron letters, 54, 5661-5664.
8.- BRUNETON, J., 2001. Farmacognosia. 2a Edición. España. Editorial ACRIBIA,
305-792.
9.- CAMPBELL, M., FARREL, S., 2003. Bioquímica. Internacional Thompson
editores. 4ta Edición. México. 604.
10.- CAMPOS-BEDOLLA, P., CAMPOS, M.G., VALENCIA, A., POMCE, H. 1997.
Effect kauranes from Montanoa spp. on rat uterus. Phytother. Res., 11, 11-16.
11.- CRUZ, S., GÓMEZ, A., GARCÍA, V., ÁLVAREZ, L., CÁCERES, A.,
MORALES, J., 2006. Caracterización de Aceites Esenciales y extractos de ocho
especies Mesoamericanas de Piperáceas y evaluación de la actividad biocida para
77 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
su aprovechamiento como nuevos recursos aromáticos y/o medicinales,
Universidad de San Carlos de Guatemala, 10.
12.- CUATRECASAS, J., 1949. Les Especies de Genere Espeletia. Bull. Inst.
Catalana Hist. Nat., 37, 3-14.
13.- CUATRECASAS, J., 1976. A new subtribe in the Helianthea (compositae):
Espeletiinae. Phytología, 35 (1) 43-61.
14.- CUATRECASAS, J., 1996. Clave provisional de las especies del género
Espeletiopsis Cuatrec. (Espeletiinae, Compositae). Anales del Jardín Botánico
de Madrid, 54, 370-377.
15.- DE LOS RIOS, C., HIDALGO, B., CONTRERAS, Q., CRESCENTE, O.,
CASERTA, A. 1999. Evaluación fitoquímica y actividad antibacteriana de las
inflorescencias de Espeletia schultzii (Asteraceae).Ciencia-Maracaibo, 7, 72-77.
16.- DE PÉREZ, M. 1973. Estudio del contenido en ácido kaurénico en el ciclo
vital de la Espeletia floccosa. Universidadde Los Andes. Mérida-Venezuela.
17.- DEWICK, P. 2002. The biosynthesis of C5–C25 terpenoid compounds. Nat.
Prod. Rep., 19, 181.
18.- DOMÍNGUEZ, X., 1979. Métodos de Investigación Fitoquímica. México,
Editorial Limusa. 67-211.
19.- ERNST, A., 1877. Apoteosis del eminente ciudadano Dr. José Vargas. In:
Adolfo Ernst. Obras Completas (Blas Bruni Celli, comp.). Tomo IX, pp. 481-
482. Ediciones de la Presidencia de la República, Caracas 1988.
78 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
20.- FORBES, B., SAHM, D., WEISSFELD, A., 2009. Balley de Scott:
diagnostico microbiológico. 12ª edición. Buenos Aires. Editorial Médica
Panamericana. 1160.
21.- GREBHARDT, R., 2000. In vitro screening of plant extracts and
phytopharmaceuticals: Novel approaches for the elucidation of active compounds
and their machanisms. Planta medica, 66-99.
22.- GUTIÉRREZ, S., FUENTES, O., TÉLLEZ, A., TORRENEGRA, R. 1998.
Principios activos antibacterianos de Espeletia barclayan. Rev. Latinoamer.
Quím., 26 (3), 71-74.
23.- HANSON, J., DEY, P., HARBORNE, J. 1997. Diterpenoids. Methods in
plant biochemistry, 7, 263-287.
24.- HARBORNE, J.B., TOMAS BARBERAN, F. A. 1991.Ecological Chemistry
and biochemistry of Plant Terpenoides. Clarendon Press. Oxford. 5-17.
25.- HEYWOOD, V.H., 1977. The Biology and Chemistry of the Compositae.
London, New York., Academic Press. 29-693.
26.- HUMBOLDT, A., 1814. Trixism neriifolia. Rel. Hist. 1, 605.
27.- HUMBOLDT, A., BONPLAND, A., 1808. Plantae aequinociales, “En Voyage
Equinoctiales du Nuveau Continent”. Paris.
28.- IBAÑEZ, J. 2004. Estudio de la composición de aceite esencial y de la resina
en el ciclo vital de la Espeletia schultzii, Coespeletia moritziana, Ruilopezia
atropurpurea y de un híbrido precedente de diferentes poblaciones latitudinales.
Universidad de Los Andes, Mérida – Venezuela.
79 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
29.- IBAÑEZ, J., USUBILLAGA, A., 2008. Estudio de la composición del aceite
esencial de un frailejón híbrido entre Espeletia schultzii y Coespeletia moritziana
(Espeletiinae). Revista de la Facultad de Farmacia, 50(1): 16-19.
30.- INGRAHAM, J., INGRAHAM, C., 1998 Introducción a la microbiología.
Editorial Reverté. 2, 802.
31.- KOSELA, S., RASAD, A., ACHMAD, A., WICAKSONON, W., BAIK, S.,
HAN, Y., HAN, B. 1986. Effects of diterpene acids on malondialdehyde
generation during thrombin induced aggregation of rat platelets. Arch. Pharm.
Res., 9, 189-191.
32.- KÜMMERER K., 2004. Resistance in the environment. The Journal of
Antimicrobial Chemotherapy. 54 (2), 311.
33.- LASSER, T., 1964. Flora de Venezuela. Edición especial el Instituto Botánico.
Mérida-Venezuela: 10, 407-445.
34.- LUQUE, R., 2004. Características de la endodermis en la raíz de Coespeletia
(ASTERACEAE). Caldasia, 26 (1), 53-60.
35.- LUTEYN, J., 1999. Paramos, a check list of plant diversity, geographical
distribution, and botanical literatura. Memoirs of the New York Botanical
Garden, 84, 84-98.
36.- MAGUNA F., ROMERO A., GARRO O., OKULIK N. 2006. Actividad
Antimicrobiana de un grupo de Terpenoides. Universidad nacional del nordeste,
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas (Resumen). Disponible en:
http://www.unne.edu.ar/unnevieja/Web/cyt/cyt2006/08-Exactas/2006-E-057.pdf.
80 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
37.- MARCANO, D., MASAHISA, H., 2002. Fitoquímica orgánica. 2ª Edición.
Venezuela. Editorial Torino, 51-480.
38.- MECCIA, G., QUINTERO, P., ROJAS, L., USUBILLAGA, A., CARMONA,
J. 2010. Análisis de los ácidos kaurénicos presentes en Espeletiopsis angustifolia
Cuatrec. de los andes venezolanos. Avances en química. 5(1), 45-49.
39.- MONASTERIO, M., 1980. Los páramos andinos como región natural,
característica generales y afinidades con otras regiones., Ediciones de la
Universidad de Los andes, Mérida-Venezuela.
40.- NAKANO, T., BENERJEE, A. K., USUBILLAGA, A. 1973. Photosensitized
Oxydations of some derivates of kaurenes. J.Org. Chem. 38(21), 3807-3811.
41.- NAKANO, T., MAILLO, M. A., USUBILLAGA, A., CORDERO DE
TROCONIS. 1995. Preferred conformation of a new ring B-homo diterpene,
rearrangement product of methyl-9-alfa-hidroxy-11-alfa-methanesulfonylloxy-(-
)-kauran-19-oate. Natural Product Letter. 6, 63-68.
42.- NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method for
antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; Approved guideline,
2004; M44-A. Wayne, Pa, USA
43.- NEGRONI, M., 2009. Microbiología estomatológica: fundamento y guía
práctica. 2ª Edición. Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana. 656.
44.- PEÑA, A., 2008. Contribución al estudio de los ácidos kaurénicos aislados de
Coespeletia moritziana. Universidad de Los Andes. Mérida-Venezuela.
45.- PEÑA, A., ALARCÓN, L., BAPTISTA, J., APARICIO, R., VILLASMIL, T.,
USUBILLAGA, A. A Phytochemical analysis of Espeletia nana Cuatrec. a midget
81 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
Espeletiinae from paramo Ortiz, Venezuela. Aceptado para su publicación 2013.
Avances en Química.
46.- PERÉZ, M., MATEO, C., MORENO, Y., RABANAL, R. 2004. Studies on the
analgesic and anti-inflamatory effects of Sideritis candicans Ait. Var.
eriocephala Webb aerial part. J. Ethopharmaco., 93, 279-284.
47.- PERÉZ R., 1972. Estudio de los componentes de la Espeletia timotensis.
Revista de la Facultad de Farmacia. Universidad de Los Andes, 9, (13), 64.
48.- PIOZZI, F., PASSANNANTI, S., MARINO, M. L., SPRIO, V. 1072. Canadian
journal of chemistry. 50 (1), 109-112.
49.- PRATS, G., 2005. Microbiología Clínica. Editorial Médica Panamericana. 1ª
Edición. Buenos Aires. 400.
50.- RANGEL-CH, J., FERNÁNDEZ, J., CELIS, M., SARMIENTO, J., 2000.
Espermatofitos. En: Colombia, Diversidad Biótica III. La región de vida
paramuna. Universidad Nacional de Colombia, Editorial Unibiblos, Bogotá,
Colombia, 126-378.
51.- RANGEL, D., GARCÍA, I., VELASCO, J., BUITRAGRO, D., VELAZCO, E.,
2001. Actividad antimicrobiana de los extractos etanólico, acetónico y acuoso de
Baccharis nítida (Ruiz et Pavón) Pers. REVISTA DE LA FACULTAD DE
FARMACIA 42, 44-46.
52.- RODRÍGUEZ, B., COBOS, T., 2006. Nuevas especies de frailejones.
Disponible en: http//www.universia.net.co.
53.- ROMERO, M., 2000. Análisis de los ácidos kaurenicos de varias especies de
Coespeletia y Ruilopezia. Mérida, Venezuela. 6-15.
82 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
54.- RUIZ, Y., RODRIGUEZ, J., ARVELO, F., USUBILLAGA, A., MONSALVE,
M., DIEZ, N., GALINDO, I. 2007. Cytotoxic and apoptosis-inducing effect of
ent-15-oxo-kaur-16-en-19-oic acid, a derivative of grandiflorolicacid from
Espeletia schultzii. Phytochemistry.
55.- SARTORI, M., PRETTO, J., CRUZ, A., BRESCIANI, L., YUNES, R.,
SORTINO, M., ZACCHINO, S., FILHO, V. 2003. Antifugal activity of fractions
and two pure compounds of flowers from Wedelia paludosa (Acmela
brasiliensis) (Asteraceae). Pharmazie, 58(8), 567-569.
56.- SMITH, A.C., KOCH, M.F. 1935. The Genus Espeletia: a study in
Phylogenetic Taxonomy, 1 (7), 479-530.
57.- STANDLEY, P.C., 1915. The Genus Espeletia. Am. J. Bot., 2, 468-485.
58.- SOSA, S.M., GUTIÉRREZ, R., SUÁREZ, O., USUBILLAGA, A. 1997.
Estudio farmacológico del efecto antiinflamatorio de ácido (-)-kaur-16-en-19-
oico en ratas Sprague-Dawley. Acta Científica Venezolana, 48(1), 85.
59.- SOSA, M., SOSA, B., USUBILLAGA, A., ESCALONA, A., SUAREZ, O.,
1996. Antitumorogenic effect of (-)-Kaur-16-en-19-oic Acid n melanoma
B16FL. Study in mice of the line C57BL. VI World Conference Clinical
Pharmacology and Therapeutics. Augusto 4-9. Buenos Aires. Argentina.
60.- SOSA, M., SUÁREZ, O., DALÓ, N., 2010. Kaurenic acid: an in vivo
experimental study of its anti-inflammatory and antipyretic effects. Indian J.
Pharmacol, 42(5), 293-296.
61.- TORTORA G., FUNKE B., CASE C. 2007. Introducción a la microbiología.
Editorial Médica Panamericana. Buenos aires, 959.
83 “Estudio fitoquímico y determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la Coespeletia timotensis Cuatrec.”
62.- TYLER, V., BRADY, L., ROBBERS, J., 1988. Pharmacognosy. Filadelfia.
63.- USUBILLAGA, A., APARICIO, R., ROMERO, M., 2003. Kaurenic acid in
Espeletiinae. Acta de horticultura. 597, ISHS. 129-130.
64.- VALERO, J. 2002. Aislamiento, caracterización y estudio de algunas
reacciones químicas de diterpenos del ent-kaurano, presentes en la Espeletia
schultzii Wedd. Universidad de Los Andes, Mérida- Venezuela.
65.- VELASCO J, CONTRERAS E, BUITRAGO D, VELAZCO E. 2005.Efecto
antibacteriano de Virolasebifera sobre Staphylococcus aureus resistente a
Meticilina. Ciencia 13 (4): 411-415.
66.- ZEKARIA, D., 2007. Los aceites esenciales una alternativa a los
antimicrobianos. Laboratorios Calier.
84