UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS ESCUELA DE BIOANÁLISIS CÁTEDRA: COMPONENTE DE LA INVESTIGACIÓN ESTUDIO FITOQUÍMICO Y DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y ANTIFÚNGICA DE LA Coespeletia timotensis Cuatrec. Tutor: Integrantes: Dr. Alfredo Usubillaga. Br. Eilyn Pinto. Dr. Luis Rojas. C.I.: 18.870.141 Br. Karina Toro C.I.: 18.226.030 Mérida, Febrero 2013 Resumen El presente trabajo describe el estudio fitoquímico y la actividad antibacteriana y antifúngica realizado al extracto de la Coespeletia timotensis Cuatrec, perteneciente a la familia Asteraceae (Compositae), tribu Heliantheae, subtribu Espeletiinae. Planta originaria de los estados Mérida y Táchira conocida popularmente como frailejones. El frailejón es una planta típica de los Andes de Colombia, Ecuador y Venezuela. Recientes hallazgos han llevado el número de especies hasta ahora conocidas a unas 180 que están distribuidas en ocho géneros que conforman la subtribu Espeletiinae. Del material seco y molido se pesaron 250 gramos, que luego se colocó en una columna con aproximadamente 5 L de Hexano- éter dietílico 3:1 v/v, durante 24 horas. Los gramos totales del extracto ya concentrado fue de 23 g. Posteriormente, se realizó una extracción ácido/base para obtener la fracción ácida (6,24 g) y la fracción neutra (3,9 g), de las cuales se tomó una alícuota de la fracción ácida para metilar. Ambas fracciones posteriormente se analizaron por Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM), en un equipo HP 5973 (Hewlett Parckard). Se empleó una columna capilar 5 % fenil, 95% metilpolisiloxano de 30 m de longitud y 0.2 mm de diámetro interno, con un espesor de película de 0.25 µm. Se inyectaron 1.0 µL de solución de aproximadamente 5 mg de cada fracción disuelta en éter dietílico con reparto de 1:50. Los compuestos se identificaron mediante comparación de los tiempos de retención y espectros de masas de la fracción ácida: ácido grandiflorénico [2] (28,88%), ácido kaurénico [1] (7,05%), componente No Identificado N.I. (0,58%), Ácido 15α-acetoxi kaurénico [6] (1,00%), β-amirina [13] (14,79%) y α-amirina [14] (47,70%) que es el más abundante. De la fracción neutra se obtuvo 16-α-hidroxi kaurano [15] (13,62%), Heptacosano [16] (9,13%), N-eicosano [17] (65,83%) resultando el más abundante de esta fracción y Nonadecano [18] (11,42%). La actividad antibacteriana y antifúngica de la mezcla de los componentes [1], [2], [6], [13] y [14] fue evaluada por el método de difusión en agar con discos. Se seleccionaron 9 especies de microorganismos, estos fueron bacterias Gram negativas y Gram positivas: Salmonella typhi (CDC 57), Pseudomona aureginosas (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC 23357), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus aureus (dorado) (ATCC 3568) Enterococcus faecalis (ATCC 29212) y 2 especies de Candida: Candida albicans (CDC B-385) y Candida krusei (ATCC 6258). Los resultados obtenidos revelan que no hubo sensibilidad de los microorganismos estudiados frente al ensayo. AGRADECIMIENTOS. A DIOS TODOPODEROSO por iluminar y guiar nuestro camino en todo momento y bendecirnos en la realización de este gran proyecto. AL Dr. ALFREDO USUBILLAGA, por aceptar el compromiso de ser nuestro tutor, por compartir sus conocimientos y apoyarnos. AL Dr. LUIS ROJAS por aceptar ser nuestro tutor encargado, por todo el apoyo brindado en el desarrollo de este proyecto. A LA PROFESORA DIOLIMAR BUITRIAGO por sus valiosos consejos y sugerencias durante la realización de este proyecto. AL PROFESOR BERNARDO CHATAING por permitirnos su valioso tiempo y por la colaboración brindada. A LA Dra. ROSA APARICIO le agradecemos la confianza, apoyo y dedicación en la realización de este proyecto, por estar presente en todo momento, por su paciencia y por compartir sus conocimientos y su amistad. A LA PROFESORA JUDITH VELASCO por sus valiosos consejos, por toda la colaboración prestada y por su asesoría. A LA ILUSTRE UNIVERSIDAD DE LOS ANDES, por darnos la oportunidad de crecer profesionalmente. AL INSTITUTO DE INVESTIGACIONES DE LA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS. AL LABORATORIO DE SINDROMES GASTROINTESTINALES Y URINARIOS “LIC. LUISA VIZCAYA”. AL Sr. ALFREDO BOLIVAR por su colaboración en todo momento. A TODAS LAS PERSONAS que de una u otra manera nos atendieron la mano en la realización de este proyecto. KARINA Y EILYN. DEDICATORIA A DIOS primeramente, por regalarme salud para lograr los objetivos propuesto, e iluminarme en todo momento. A MI ABUELA TRINA, que no está entre nosotros, pero siempre está presente en mi corazón y por siempre creer en mí hasta el final. A MIS PADRES MARÍA Y ASDRUBAL, por ser mi fuente de inspiración, por ser el mejor ejemplo que tenido, por su confianza, por su apoyo incondicional, por creer y estar presente en todo momento. Los amo. A MIS HERMANOS ASDRUBAL Y ELOY, por estar presente y alegrarme la vida, por sus palabras de apoyo. A JUAN CARLOS, por su amor incondicional, por sus palabras de aliento y por apoyarme en las buenas y en las malas. Te amo. A TODA MI FAMILIA, por darme fuerza cuando más lo necesite. A MIS AMIGAS DULCE, CARMEN, DUBRASCA Y ANLLY, por tantos momentos que compartimos, por el tiempo que pasamos juntas, por regalarme alegrías, tristeza, palabras de motivación y apoyarnos en cada situación que se nos presentara. KARINA. DEDICATORIA A Dios todopoderoso por regalarme cada maravilloso día y estar presente en todo momento dándome las fuerzas necesarias para continuar luchando y así cumplir cada una de mis metas. A mis hijos José Gabriel y Ángel Jesús porque me han nutrido para luchar por mis sueños y mi felicidad. No tengo palabras para expresar mi agradecimiento por todas las bendiciones que he tenido junto a ustedes. Gracias por estar conmigo y por compartir los momentos más importantes, por ser valientes y no rendirse, los amo con todo mí ser. A mi esposo Carlos Jesús por todo su amor, apoyo, paciencia, comprensión y por estar en los momentos buenos y malos siempre conmigo. Te amo. A mi mamá Norma Leobarda por todo su apoyo, comprensión y sacrificios, gracias por siempre estar allí. Te adoro. A mi papá José Rafael por los momentos en que me has ayudado y apoyado, por tu amor gracias. Te quiero. A mis hermano José Leonardo gracias por existir y ocupar un lugar muy especial en mi corazón. Te quiero más de lo que te imaginas. A toda mi familia ya que gracias a ellos soy quien soy hoy en día, son a ellos a quien le debo todo, horas de consejos, de regaños, de tristezas y de alegrías de las cuales estoy muy segura que las han hecho con todo el amor del mundo para formarme como un ser integral y de los cuales me siento extremadamente orgullosa. Los amo. A todas las personas que desinteresadamente me ayudaron a culminar esta meta. Gracias. EILYN. ÍNDICE DE CONTENIDO I INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….… 1 II MARCO TEÓRICO………………………………………………………….….…. 4 II.1 ANTECEDENTES………………………………………………………….……… 5 II.1.1 Características de la familia Asteraceae……………………………….…...…. 5 II.1.2 Bioformación de los terpenos………………………………………....………. 9 II.1.3 Clasificación química de los terpenos….……………………………….…….. 12 II.1.3.1 Monoterpenos……………………………………………………….………… 13 II.1.3.2 Sesquiterpenos…………………………………………………………….…... 14 II.1.3.3 Diterpenos…………………………………………………………………….. 14 II.1.3.4 Triterpenos…………………………………………………………………….. 15 II.1.3.5 Carotenoides…………………………………………………………………... 16 II.1.4 Taxonomía de la Coespeletia timotensis Cuatrec…………………………....... 17 II.1.4.1 Características macroscópicas de la Coespeletia timotensis Cuatrec…………. 17 II.1.4.2 Características microscópicas de la Coespeletia timotensis Cuatrec…….…… 20 II.1.5 Fitoquímica………………………………………………………………….… 21 II.1.6 Componentes químicos de algunos frailejones……………………………...... 23 II.1.7 Actividades asociadas a los ácidos kaurénicos y sus derivados…………...….. 27 II.1.8 Generalidades de las bacterias y los hongos………………..……………...…. 28 II.1.8.1 Las bacterias…………………………………………………………………... 28 II.1.8.1.1 Las bacterias Gram positivas……………………………………………….... 29 II.1.8.1.2 Las bacterias Gram negativas………………………………………………... 30 II.1.8.2 Los hongos…………………………………………..…………………...…… 30 II.1.9 Actividad antibacteriana y antifúngica……………………………………...... 31 II.1.9.1 Métodos de evaluación de actividad antibacteriana y antifúngica…………… 33 II.1.9.1.1 Método de difusión en agar……………………………………..……...…….. 33 II.1.9.1.2 Método de dilución en caldo………………………………………………….. 34 II.1.9.1.3 Método de dilución en agar………………………………………………..….. 34 i III PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA E HIPÓTESIS…………………… 35 III.1 Planteamiento del problema…………………………………………………... 36 III.2 Hipótesis………………………………………………………………….….... 36 IV OBJETIVOS………………………………………………………………...… 37 IV.1 Objetivo general……………………………………………………………..... 38 IV.2 Objetivos específicos……………………………………………………..…… 38 V MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………….…… 39 V.1 Recolección de la planta y preparación del material……………………..…… 40 V.2 Extracción………………………..…………………………………………… 40 V.3 Separación de la fracción ácida……………..……………………………...…. 40 V.4 Separación y purificación de los componentes…………………………….…. 43 V.4.1 Análisis por cromatografía columna flash…………………………………….. 43 V.5 Análisis de los componentes………………………………………………..… 44 V.5.1 Análisis por cromatografía de capa fina……...……………………………….. 44 V.5.2 Análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas……. 44 V.6 Determinación de la actividad antibacteriana y antifúngica de la fracción ácida de la Coespeletia timotensis Cuatrec...………………………………..... 45 V.6.1 Preparación de material