Vii. Referencias Bibliográficas

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

“ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y CUANTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES TOTALES DE LAS HOJAS DE Sambucus peruviana H.B.K. (SAUCO) PROVENIENTE DE LA CIUDAD BIOQUIMICADE HUAMACHUCO” Y

TESIS I

PARA OPTAR EL GRADO ACADEMICO FARMACIA DE DE BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA

AUTORES : Horna Acevedo Lissette Gioanna

BIBLIOTECA López Cenizario Carlos Wilfredo

ASESOR : Dr. Ruiz Reyes Segundo Guillermo

CO-ASESOR : Mg. Venegas Casanova Edmundo

TRUJILLO – PERU 2012

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

PRESENTACION

SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO:

En cumplimiento de las normas dispuestas en el reglamento interno de la Facultad

de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, sometemos a

su consideración el Informe de Trabajo de Investigación I intitulado:

“ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y CUANTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES TOTALES DE LAS HOJAS DE Sambucus peruviana H.B.K. (SAUCO) PROVENIENTE DE LA CIUDADBIOQUIMICA DE HUAMACHUCO” Y

Con el Propósito de optar el Grado Académico de Bachiller en Farmacia y

Bioquímica. FARMACIA Dejamos a vuestra consideración señores miembros del jurado la calificación del DE siguiente trabajo.

Trujillo, enero del 2012 BIBLIOTECA

…………………………………. ……………………………… Lissette Gioanna Carlos Wilfredo Horna Acevedo López Cenizario

JURADO CALIFICADOR

…………………………………………….

Mg. Gilmer Zari Gil

PRESIDENTE BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE

……………………………………… …..……….…………………………

Dr Segundo G. Ruiz Reyes Mg.Marilú R. Soto Vásquez

BIBLIOTECAMIEMBRO MIEMBRO

DEDICATORIA

A Dios.

Por haberme permitido llegar hasta

este punto y haberme dado salud para

lograr mis objetivos, además de su

infinita bondad y amor.

A mis padres

Ana y Angel BIOQUIMICA YPor haberme educado y soportar mis errores. Gracias por sus consejos, por el amor,

el cariño, la comprensión, la paciencia

y el apoyo que me brindaron FARMACIA para culminar mi carrera profesional. DE

A mis hermanas

Porque siempre he contado con BIBLIOTECA ellas para todo, gracias a la confianza

que siempre nos hemos tenido; por el apoyo y amistad.

LISSETTE

iii

A Dios

Gracias por darme la vida, por poner en mi camino a personas maravillosas y por las bendiciones y los regalos que recibo día tras día.

A Mis Padres Efigenia y Humberto, gracias por ser los guías que me han ayudadoBIOQUIMICA a crecer, por la paciencia que han tenido paraY enseñarme. Gracias por haber estado al pendiente de mí durante toda esta etapa.

FARMACIA

A mis hermanos Que con su amor me han enseñado a salir adelante.

Gracias por su paciencia gracias por preocuparse por su hermanoBIBLIOTECA mayor, gracias por compartir sus vidas, pero sobre todo gracias por estar en otro

momento tan importante en mi vida .

CARLOS

AGRADECIMIENTO

Agradecemos a Dios Todopoderoso por estar con nosotros en cada paso

que dimos, por fortalecer nuestros corazones e iluminar nuestras mentes, y por

haber puesto en nuestro camino a personas que han sido de soporte y compañía,

así como habernos ayudado a culminar nuestros estudios.

Un agradecimiento especial a nuestro asesorBIOQUIMICA Dr. Segundo Guillermo Ruiz Y Reyes, por su apoyo constante y desinteresado, por su amistad, por sus

enseñanzas y disposición en la conducción del desarrollo de este trabajo de

investigación. FARMACIA

Agradecemos también a nuestro Co-asesor Mg. Edmundo Venegas

Casanova y a la Dra Edita Araujo Castillo por su desinteresado apoyo y

colaboración en la realización de este trabajo, así como a los señores miembros BIBLIOTECA del jurado por el interés y sugerencias para la realización de este trabajo.

LISSETTE Y CARLOS

ÍNDICE

Pág.

PRESENTACIÓN……………………………………………………………….... i

JURADO CALIFICADOR …………………………………………………..….. ii

DEDICATORIA………………………………………………………….……... iii BIOQUIMICA AGRADECIMIENTO………………………………………………………Y ...….. v RESUMEN……………………………………………………………..…….….. vi

SUMMARY…………………………………………………………....…….…. vii

I. INTRODUCCIÓN ...... 1 FARMACIA II. MATERIAL Y MÉTODO ...... 10 2.1. MATERIALDE ...... 10 2.2. METODOLOGÍA ...... 12 2.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE DATOS ...... 18 III. RESULTADOS ...... 19 IV. DISCUSIÓN ...... 288 V. CONCLUSIONESBIBLIOTECA ...... 36 VI. RECOMENDACIONES ...... 37

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 388

VIII.ANEXOS ...... 42

RESUMEN

Se realizó el estudio farmacognóstico de las hojas de Sambucus peruviana H.B.K. Se determinó las características macromorfológicas de la hoja, se observó que tiene el limbo oblongo-aovadas, borde acerrado, ápice acuminada, base redonda, peciolo corto, inervación imparipinnadas, sus hojas con mediciones promedio de 6.5 cm de ancho y 16.5 cm de largo, color verde, superficie lustrosa. También se observó las características micromorfológicas para determinar la estructura y elementos celulares, se realizaron secciones histológicas superficiales y transversales. Los parámetros de calidad realizados fueron: determinación de materias extrañas (1.09 ± 0.14%), porcentaje de humedad residual (8.35 ± 0.34%), cenizas totales (9.30 ± 0.23%), cenizas solubles enBIOQUIMICA agua (7.02 ± 0.72%), cenizas Y insolubles en ácido (0.26 ± 0.06%), sustancias solubles en agua (6.82 ± 0.33%), en alcohol a 50° GL (10.71 ± 0.30%) y en alcohol a 70° GL (12.5 ± 0.21%), los métodos utilizados son los que describen la Norma Ramal para drogas crudas del MINSAP y los resultados se encuentran dentro de los rangos permisibles de ésta. Se preparó el extracto fluido de FARMACIAlas hojas, al cual se le determinó: sólidos totales (11.43 ± 0.06%), huella dactilar y la marcha fitoquímica propuesta por Olga DE Loock y Migdalia Miranda (alcaloides, aminoácidos, lactonas, triterpernos y esteroides, antocianidinas, flavonoides, saponinas, taninos.), así mismo se cuantificó los flavonoides totales expresados como quercetina mediante espectrofotometría UV visible a 248 nm, encontrándose en un porcentaje de 0.4775%. BIBLIOTECA Los resultados obtenidos fueron evaluados en el programa Microsoft Excel 2007 de Microsoft Office para la realización del análisis estadístico correspondiente (media Aritmética y desviación estándar).

Palabras claves: Sambucus peruviana, estudio farmacognóstico, extracto fluido, flavonoides totales, tamizaje fitoquimico, Huella dactilar, cuantificación de flavonoides totales

vii

SUMMARY

Pharmacognostic study was performed on the leaves of Sambucus peruviana HBK Was determined the micromorphological characteristics of the leaf, it was observed that the limbo is oblong-ovate, acerra edge, apex acuminate, base rounded, petiole short, innervation imparipinnate leaves, their measurements were: 6.5 cm wide and 16.5 cm long, green, glossy surface. It was also observed micromorphological characteristics to determine the structure and cellular elements were carried out surface and transverse histological sections. The quality parameters were performed: determination of foreign matter (1.09 ± 0.14%), residual moisture content (8.35 ± 0.34%), total ash (9.30 ± 0.23%), ash soluble in water (7.02 ± 0.72%), ash acid insoluble (0.26 ± 0.06%), water-soluble substances (6.82 ± 0.33%), alcohol 50 ° GL (10.71 ± 0.30%)BIOQUIMICA and 70 ° GL alcohol (12.5 ± Y 0.21%), the methods used are those that describe the Standard Branch for crude drugs MINSAP and the results are within the allowable ranges of the latter. Fluid extract was prepared from the leaves, which were determined: total solids (11.43 ± 0.06%), fingerprinting and phytochemical up proposed by Olga Miranda Loock and Migdalia (alkaloids, aminoFARMACIA acids, lactone s, and steroids triterpernos, anthocyanidins, flavonoids,DE saponins, tannins.), so it was quantified total flavonoids expressed as quercetin by UV visible spectrophotometry at 248 nm, being at a rate of 0.4775%. The results were evaluated in the Microsoft Excel 2007 Microsoft Office to carry out the corresponding statistical analysis (mean and standard deviation). BIBLIOTECA Keywords: Sambucus peruviana, pharmacognostic study, fluid extract, total flavonoids, phytochemical screening, Fingerprint, quantification of total flavonoids

viii

I. INTRODUCCIÓN

Las plantas con propiedades medicinales fueron las primeras medicinas

utilizadas en forma empírica para la cura de enfermedades que padecía el hombre;

así diferenciaron las que curaban de las que mataban, eran conocimientos

transmitidos oralmente por la carencia de escritura. Al desarrollarse la escritura, y

con la aparición del papiro como soporte de la misma, se comenzó a recoger

información, convirtiéndose las mismas en patrimonio de unos pocos dentro de las

sociedades por las cuales ha atravesado la humanidad hasta nuestros días. Esto

hizo que se profundizara en el conocimiento de lasBIOQUIMICA especies vegetales que poseen propiedades medicinales y ampliar su experienciaY en el empleo de los productos

que de ellas se extraen1,2,3,4,5.

Si bien las plantas han constituidoFARMACIA la base de los sistemas de Medicina Tradicional para mantener laDE salud e incrementar la calidad de vida del hombre; la

incidencia que los productos de origen vegetal han tenido en los procedimientos

terapéuticos ha variado a lo largo del tiempo, en buena parte, en relación con los

avances del conocimiento científico. Las drogas secas y los extractos pasaron de

tener un papelBIBLIOTECA hegemónico en el arsenal terapéutico a un discreto segundo plano,

para volver a alcanzar, en las últimas décadas, una presencia cada vez mayor en el

tratamiento médico tradicional6,7.

En la actualidad existe un reconocimiento del empleo de fuentes naturales

de medicamentos y en especial de la Fitoterapia, como la ciencia que estudia la

utilización de los productos de origen vegetal con una finalidad terapéutica, ya sea

para prevenir, atenuar o curar un estado patológico; justificado en muchos casos

por razones económicas, el descubrimiento de efectos adversos en fármacos

sintéticos, el mejor conocimiento químico, farmacológico y clínico de las drogas

vegetales y sus productos derivados, el desarrollo de métodos analíticos que

facilitan el control de la calidad, el desarrollo de nuevas formas de preparación y

administración de los medicamentos fitoterapéuticos. Con una tendencia en los

países desarrollados al retorno del empleo de productos naturales en el tratamiento

de diversas afecciones; en lo que se destaca el importante papel de la

Organización Mundial de la Salud (OMS), en cuanto a la utilización de la BIOQUIMICA fitoterapia dentro de los programas de salud de Ylos distintos países, a través de la

validación de efectos etnobotánicos adjudicados a las plantas durante la existencia

de la humanidad8,9,10,11.

FARMACIA Desde el punto de vista científico experimental las plantas curativas están DE en estrecha relación con la tierra y el medio ecológico, contienen sustancias

químicas terapéuticas funcionales y nutritivas capaces de complementar la

alimentación con efecto purificador, regenerador y vivificador que requiere ser

validado yBIBLIOTECA demostrado como virtudes de plantas funcionales y medicinales que

deben ser clasificados en base al contenido de sus principios activos como:

alcaloides, saponinas, hormonas, ácidos orgánicos, componentes nitrogenados,

vitaminas, sales, minerales etc., localizados obviamente en diferentes partes

anatómicas y específicas de la planta como ocurre con la quinina que

prioritariamente se concentra en la corteza de la Quina como factor que

contribuye con efectos terapéuticos12.

La farmacognosia desempeña un papel muy importante en la actualidad,

determinando los principios activos contenidos en las plantas, separándolas de

estas, determinando sus estructuras químicas, procurando su síntesis,

estableciendo los parámetros de calidad de las drogas vegetales para

estandarizarlas teniendo un control de calidad previo a la extracción, para así de

este modo llegar a su validación; propone también modificaciones estructurales en

la busca de una mayor actividad y finalmente den a conocer a la humanidad los BIOQUIMICA resultados de los estudios. La determinación delY principio activo presente en la

planta que es responsable del efecto fisiológico, da el valor medicinal a la

planta13,14,15.

FARMACIA Para el análisis de drogas vegetales se emplean diversas marchas DE fitoquímicas, las cuales utilizan diversas partes de la planta ya que los principios

activos no se distribuyen uniformemente en toda la planta. Además también

utilizan diferentes solventes que permiten el aislamiento de los principios activos

o constituyentesBIBLIOTECA de las drogas, identificándolos por medio de reacciones químicas

cualitativas. Un gran porcentaje de los principios activos de las plantas están

comprendidos dentro de los llamados metabolitos secundarios que son

compuestos químicos de estructura relativamente compleja y distribución más

restringida y más característica de fuentes botánicas específicas que los llamados

metabolitos primarios, universalmente distribuidos y que participan en la

actividad celular de todo ser viviente16,17.

Las plantas medicinales son definidas por la Organización Mundial de la

Salud (OMS) como toda especie vegetal en la que el todo o una parte está dotada

de actividad farmacológica. Esta última corresponde a compuestos químicos

propios de la planta, que están sometidos a variables físicas, tales como la

humedad del suelo, condiciones de luz, temperatura y otros18,19.

Nuestro país, es mundialmente reconocido por la variedad de especies BIOQUIMICA vegetales que posee y que son utilizadas desdeY tiempos inmemoriales con fines

terapéuticos, alimenticios, ornamentales, entre otros; tal es así, que es considerado

el tercer país más mega-diverso del planeta. El Perú ha efectuado importantes

aportes de especies y variedades para el mundo gracias a los diversos pisos FARMACIA ecológicos y microclimas que presenta, donde habría 50 mil especies vegetales DE (20% de las existentes en la Tierra) de las que 2,000 han sido utilizadas con fines

curativos17,20.

ActualmenteBIBLIOTECA la medicina tradicional peruana, sigue siendo la primera

instancia de consulta y tratamiento en gran parte de nuestro país. Sin embargo,

hasta el día de hoy se viene utilizando las plantas medicinales en base al

conocimiento popular y esto hace que no se aproveche la gran mayoría de las

propiedades que contiene dicha planta, o sean utilizados de forma inadecuada;

como es el caso del Sambucus peruviana (sauco), una especie arbórea que se

cultiva en las partes altas de los Andes (Perú, Bolivia y Norte de Argentina)20,21.

El sauco es un árbol de unos 12 m. de alto, con ramas glabras y flores

blancas perfumadas, ornamental por sus flores y frutos y que crece entre los 450 –

3900 m.s.n.m. prefiere suelos profundos, e textura variable; tolera peligrosidad

baja a media y requiere buen nivel de humedad21.

El cocimiento de las flores se emplea como sudorífico y contra la viruela,

así como también en las inflamaciones de la vejiga y la próstata. El cocimiento de BIOQUIMICA las hojas se emplea como galactógeno y antisépticoY bucal y el de las flores es

usado como antirreumático, antiséptico, depurativo y sudorífico. La infusión de la

raíz en hidropesía, el cocimiento de los frutos como colutorios, en las afecciones

de la boca y el cocimiento de las ramas floridas contra el alcoholismo21,22,23. FARMACIA

DE Los frutos son bayas esféricas o globosas, negras, de 5 – 6 mm. De

diámetro; semillas pequeñas, en número de 3 – 6 por fruto. Los frutos son

jugosos, de sabor agradable y sabor agridulce; se consumen al estado fresco;

sirviendo tambiénBIBLIOTECA para hacer mermeladas. Sus flores en infusión se utilizan contra

la tos asma. Se propaga vegetativamente. Estudios fitoquímicos revelan la

presencia de flavonoides que tienen propiedades antiinflamatorias21,22.

Los flavonoides pertenecen a un grupo de compuestos naturales arreglados

bajo un sistema C6-C3-C6, en el cual dos anillos aromáticos llamados A y B están

unidos por una unidad de tres carbonos que pueden o no formar un tercer anillo,

que en caso de existir es llamado anillo C. Se conoce como 10 clases de

flavonoides (Chalconas, flavonas, flavonoles, flavanonas, flavanonoles,

antocianidinas, catequinas, epicatequinas, auronas, isoflavonoides, pterocarpanos,

rotenoides, etc) los cuales pueden encontrarse como aglicona o bajo la forma de

glicósidos con una o tres unidades de azúcar, generalmente en los carbonos 3 y/o

7, siendo los azucares más comunes la glucosa, galactosa, ramnosa, xilosa y

arabinosa3,4,17.

Está comprobado que los flavonoides son importantes para el desarrollo y BIOQUIMICA buen funcionamiento de las plantas al protegerlasY contra agentes agresores

externos, como la radiación UV, microorganismos, animales herbívoros y del

medio ambiente. Pueden actuar como señalizadores químicos, indicando a los

insectos que planta es apropiada para su alimentación, oviposición o simplemente FARMACIA guiándolos y facilitando así la polinización24,25. DE En su relación con el hombre, los flavonoides actúan como antioxidantes

naturales, es decir, tienen la capacidad de secuestrar y neutralizar los radicales

libres, especies químicas muy reactivas que fácilmente conducen a reacciones

incontroladas,BIBLIOTECA resultando en diversas formas de daños oxidativos sobre las

moléculas, organelas y diversas células y tejidos; causando su degeneración,

envejecimiento, pérdida de su función y otras formas importantes de daño celular.

Por lo tanto los flavonoides juegan un papel importante en la prevención de varios

procesos fisiopatológicos asociados con el estrés oxidativo y a la presencia de

radicales libres, tales como el cáncer y diversas enfermedades neurodegenerativas

y cardiovasculares24,25,26.

Otra de las propiedades de los flavonoides es su capacidad para contribuir

a las propiedades de los alimentos, como el sabor o la dulzura. Además son

utilizados en la industria de los cosméticos por su actividad desodorante y

reductora de la hiperpigmentación causada por la vejez25,26.

Existen trabajos realizados en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la

Universidad Nacional de Trujillo que comprueban la presencia de flavonoides en BIOQUIMICA las hojas de Sambucus peruviana, Castro MilagrosY y Dávila Silvia realizaron un

estudio Fitoquímico de las hojas y el fruto de Sambucus peruviana en 1994, por

otra parte Castro Flor y Abanto Jessica identificaron los flavonoides presentes en

la hoja mediante espectrofotometría U-V y espectroscopia IR en el año 2000, FARMACIA además la cátedra de Farmacognosia de esta universidad viene realizando estudios DE con diferentes especies de plantas con la finalidad de fomentar la investigación y

aumentar el conocimiento sobre estos, dentro de los trabajos publicados

recientemente tenemos: Determinación de la técnica de extracción de flavonoides

totales de BIBLIOTECAlas hojas de Mangifera indica L. realizado por el Dr. Segundo Ruiz;

Identificación preliminar de los metabolitos secundarios de los extractos acuosos

y etanólicos del fruto y hojas de Morinda citrifolia L. noni y cuantificación

espectrofotométrica de los flavonoides totales realizado por Chávez M y

Eustaquio C.; Cuantificación de flavonoides totales y taninos presentes en el

decocto e infuso de hojas de Thea sinensis L. te verde y negro, realizado por

Acevedo E y De la Cruz R.

Teniendo en cuenta los estudios mencionados y que no se han realizado

trabajos sobre cuantificación de flavonoides totales en Sambucus peruviana, así

como el conocimiento de los beneficios aportados por estos metabolitos, nos

motiva a la investigación aquí descrita, en la que se evaluará las características

farmacognósticas y el contenido de flavonoides totales de las hojas de Sambucus

peruviana proveniente de la ciudad de Huamachuco.

BIOQUIMICA Y Para el presente trabajo se planteó el siguiente problema:

¿Qué características farmacognósticasFARMACIA presenta la hoja de Sambucus peruviana H.B.K (sauco) proveniente deDE la ciudad de Huamachuco? ¿Cuál es la concentración de los flavonoides totales de las hojas de Sambucus

peruviana H.B.K (sauco) proveniente de la ciudad de Huamachuco?

BIBLIOTECA

Objetivos

Objetivo General:

- Contribuir al estudio farmacognóstico y cuantificar los flavonoides

totales de la hoja de Sambucus peruviana H.B.K (sauco).

Objetivos Específicos:

- Determinar las características farmacognósticas de la hoja de

Sambucus peruviana H.B.K (sauco).

- Cuantificar los flavonoides totales presentes en la hoja de Sambucus BIOQUIMICA peruviana H.B.K (sauco). Y

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

II. MATERIAL Y METODO

2.1. MATERIAL DE ESTUDIO

Hojas de Sambucus Peruviana H.B.K (sauco) proveniente del distrito de

Huamachuco de la provincia de Sánchez Carrión. Departamento de la

Libertad.

2.2. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

2.2.1. Materiales de Laboratorio BIOQUIMICA Y De uso común en el laboratorio de Farmacognosia

2.2.2. Equipos

- Equipo de Lixiviación FARMACIA - Balanza Triple Brazo 700/800 series OHAUS US PAT. Nº 2, DE 729,439.

- Balanza Analítica OHAUS GA 200 (precisión 0.0001 g)

- Estufa THELCO H.W. Kessel Model 17.

BIBLIOTECA- Estereoscopio Karl Zeiss Stemi DV4 - Espectrofotómetro Heweltt Packard de arreglo de diodos modelo

8452A.

- Horno Mufla Furnace 1300

- Microscopio Karl Zeiss Primo Star 176 065

- Tamiz Retsh

2.2.3. Reactivos

- Ácido acético glacial 99.8% de pureza, calidad Sigma

- Ácido clorhídrico 37% de pureza, calidad Sigma

- Ácido nítrico 65% de pureza, calidad Sigma

- Ácido sulfúrico 98% de pureza, calidad Sigma

- Anhídrido acético 98% de pureza, calidad Sigma

- Cloruro férrico hexahidratado 97% de pureza, calidad Sigma

- Cloruro de mercurio (II) 99.5% de pureza, calidad Sigma

- Cloruro de sodio 99.5% de pureza, calidad Sigma BIOQUIMICA - Hidróxido de sodio 98% de pureza,Y calidad Sigma

- Magnesio metálico

- Nitrato de bismuto 98% de pureza, calidad Sigma

- Gelatina from porcin skin, calidad Sigma FARMACIA - Tolueno 99.5% de pureza, calidad Sigma DE - Yodo 99.8% de pureza, calidad Sigma

- Yoduro de potasio 99% de pureza, calidad Sigma

BIBLIOTECA

2.3. METODOLOGIA

2.3.1. Recolección

La especie objeto de estudio Sambucus Peruviana H.B.K (sauco) fue recolectada en el mes de agosto, período de floración, de la ciudad de Huamachuco. Provincia de Sánchez Carrión. Departamento de la Libertad (7.8° sur latitud, 78.07° Oeste longitud y 3072 m.s.n.m.).

De una misma población se recolectó hojas maduras de la parte aérea de la planta con el fin de preservar la especie. BIOQUIMICA Y

2.3.2. Selección

Una vez realizada la recolección de la muestra se procedió a hacer la FARMACIA selección de la materia vegetal con el objetivo de realizar una separación de DE las partes deterioradas y evitar la mezcla con otra especie.

2.3.3. Identificación taxonómica BIBLIOTECA

La planta medicinal seleccionada, se llevó al Herbario Truxillensis

de la Universidad Nacional de Trujillo para su identificación

Taxonómica. Codigo Nº 52790 (HUT).

2.3.4. Clasificación Taxonómica

La especie Sambucus peruviana, nativa de nuestro país, de acuerdo al sistema de clasificación filogenética de Adolph Engler publicada en la XII Edición del Syllabus DER PFLANZENFAMILIEN del año 1954 – 1964, es de la siguiente manera:

DIVISIÓN……………………..MAGNOLIOPHYTA CLASE…………………………MAGNOLIOPSIDA SUBCLASE……………………METACHLAMYDEAE ORDEN………………………..DIPSACALES FAMILIA……………………...Caprifoliaceae GENERO………………………SambucusBIOQUIMICA ESPECIE………………………SambucusY peruviana H.B.K.

2.3.5. Desecación

- DESECACIÓN FARMACIA Para evitar cualquier tipo de alteración que pudiera afectar a la composición deDE la planta, la droga fue convenientemente desecada.

Las hojas seleccionadas se colocaron sobre papel kraft en un lugar fresco y seco durante 24 horas. Luego se pasaron a bolsas hechas de papel kraft y se llevaron a estufa a una temperatura de 40 ºC, durante

BIBLIOTECA48 horas.

2.3.6. Molienda y Tamización

Una vez desecado el material vegetal, se procedió a su molienda en

mortero de acero hasta tamaño de partícula adecuado. El material así

pulverizado, se procedió a tamizar (tamaño partícula 2 mm), se

almacenó adecuadamente en frascos ámbar en un lugar sin humedad

y luz directa, hasta su posterior utilización.

2.3.7. Caracterización macromorfológica 3,24

Se llevó a cabo analizando los siguientes caracteres: Forma, textura,

superficie, peculiaridades, color, olor, condición y dimensiones; los

cuales fueron contrastados con las bibliografías correspondientes. BIOQUIMICA Y

2.3.8. Caracterización Micromorfológica 22,24,27,28

FARMACIA El método se basa en la observación al microscopio de los tejidos de DE la hoja fresca para determinar estructura y elementos celulares que

nos ayuden a la identificación de la planta.

BIBLIOTECA Al material vegetal se le realizaron secciones histológicas

superficiales y transversales lo más fino posible a diferentes alturas

de los mismos empleando para ello navaja, se procedió a su análisis,

descripción o ilustración con la ayuda de un microscopio compuesto.

2.3.9. Determinación de materias extrañas24,29,30

Procedimiento:

Pesar 1 g de droga, colocar en una placa petri y con la ayuda del

estereoscopio proceder a separar la materia extraña manualmente.

Pesar el material separado y determinar su porcentaje en base al

peso de la muestra ensayo.

Los límites para las materias extrañas, se establecen en las

monografías o especificaciones de calidad de cada droga en BIOQUIMICA particular. Y

El porciento de materia extraña (푀푒) se calcula mediante la fórmula

siguiente: FARMACIA 푚 푀 = 푥100(%) DE 푒 푀

Donde:

BIBLIOTECA 푀 = Masa inicial de la muestra de ensayo (g).

푚 = Masa de materia extraña (g).

100 = Factor matemático para los cálculos.

2.3.10. Determinación de humedad 24,29,30

Método Gravimétrico:

Este análisis se realiza por triplicado.

Procedimiento:

Colocar la cápsula durante 1 hora en la estufa a la temperatura de

secado del producto. Empleando pinzas, se traslada la cápsula al

desecador y se deja enfriar durante 30min. Luego pesar la cápsula en

balanza analítica con aproximación de 0,1mg. BIOQUIMICA Pesar 0.5 g de muestra previamenteY homogeneizada, colocar la muestra con la cápsula en la estufa a la temperatura y tiempo

recomendado, 105ºC x 3 horas.

Con una pinza se sacaFARMACIA la capsula con la muestra de la estufa y se

lleva a enfriar enDE desecador durante 30min.

Se repite el procedimiento de secado por una hora adicional,

volviéndose a pesar, hasta obtener peso constante.

BIBLIOTECA Método gravimétrico.

푀 −푀 퐻 = 2 1 푥100(%)m/m 푔 푀

Donde:

Hg = Pérdida de masa por desecación (%)

푀2 = Masa de la cápsula con la muestra de ensayo (g).

푀1 = Masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g).

푀 = Masa de la capsula vacía (g).

100 = Factor matemático para los cálculos.

2.3.11. Determinación de cenizas totales24,30,31,32BIOQUIMICA Y Procedimiento:

Pesar de 0.5 g de la droga pulverizada y tamizada con una desviación

permisible de 0,5mg en un crisol de porcelana previamente tarado. FARMACIA Se calienta suavemente la porción de ensayo aumentando la DE temperatura hasta carbonizar y posteriormente se incinera en un

horno mufla a temperatura de 700 a 750°C durante 2h.

BIBLIOTECA Se enfría el crisol en una desecadora a temperatura ambiente y se

pesa, repitiéndose el proceso hasta que dos pesadas sucesivas no

difieran en más de 0,5mg por gramo (peso constante).

Para obtener el peso constante los intervalos entre calentamiento y

pesada son de 30 min. Si el residuo presenta trazas de carbón, se le

añade unas gotas de solución de peróxido de hidrógeno concentrado,

p ácido nítrico o solución de nitrato de amonio al 10% /v y se calienta

hasta evaporar los solventes. Al enfriar el crisol el residuo debe ser

de color blanco o casi blanco.

Cuando los valores obtenidos para las cenizas totales son elevadas

(>5%), es necesario conocer si las mismas están compuestas por

metales pesados, lo cual se determina mediante los ensayos de

cenizas insolubles, y si este residuo es elevado, hay que someter a la

droga a otros análisis antes de aprobar su uso.

La cantidad de cenizas totales (퐶푡) enBIOQUIMICA base anhidra se calcula por la Y fórmula siguiente:

푀2−푀 퐶푙푥100 퐶푙 = FARMACIA푥100(%) 퐶푡 = 푀1−푀 100−퐻 DE Donde:

퐶푙 = Cenizas totales en base hidratada.

푀 = Masa del crisol vacío (g). BIBLIOTECA

푀1 = Masa del crisol con la muestra de ensayo (g).

푀2 = Masa del crisol con la ceniza (g).

100 = Factor matemático para los cálculos.

퐻 = % humedad.

2.3.12. Determinación de cenizas solubles en agua24,30, 31,32

Es la diferencia de peso entre las cenizas totales y el residuo

remanente después del tratamiento de las cenizas totales con agua.

Los valores no deben de ser mayores de 8 – 10%.

Procedimiento:

A las cenizas totales obtenidas, añadir de 5 – 10 ml de agua

destilada, tapar el crisol y dejar herví suavemente a la llama del

mechero durante 5 minutos. BIOQUIMICA Y Filtrar a través de un papel filtro libre de cenizas. Lavar el residuo

con agua caliente hasta obtener aproximadamente un volumen de

filtrado de 60mL. Luego, colocar el papel de filtro y su contenido en FARMACIA un crisol previamente tarado y posteriormente incinerar en un horno DE mufla de 700 a 750 ºC durante 2 horas. Finalmente, se deja en

desecador hasta alcanzar temperatura ambiente para luego pesar.

Repetir el proceso hasta alcanzar peso constante.

BIBLIOTECA

La cantidad de cenizas solubles en agua (퐶퐴) en base anhidra se

calcula por las fórmulas siguientes:

푀2 − 푀4 퐶푙푥100 퐶푙 = 푥100(%)퐶퐴 = 푀1 − 푀 100 − 퐻

Donde:

퐶푙 = % de cenizas solubles en agua en base hidratada.

푀 = Masa del crisol vacío (g).

푀1 = Masa del crisol con la muestra de ensayo (g).

푀2 = Masa del crisol con la ceniza (g).

푀4 = Masa del crisol con las cenizas insolubles en agua (g)

100= Factor matemático para los cálculos.

퐻 = % humedad. BIOQUIMICA Y

2.3.13. Determinación de cenizas insolubles en ácido 24,30,31,32:

FARMACIA

Procedimiento:DE

A las cenizas totales obtenidas agregar 5mL de solución

de HCl al 10 %, tapar el crisol con un vidrio reloj y calentar sobre

BIBLIOTECAbaño de agua hirviendo durante 10 minutos. Lavar el vidrio de reloj con 5 ml de agua caliente, vertiéndose posteriormente al contenido

del crisol. Filtrar la solución a través de papel filtro libre de cenizas,

lavar el residuo con agua caliente hasta que el filtrado acidulado con

ácido nítrico, al cual se le ha de añadir I o II gotas de solución de

nitrato de plata 0.1 M, la cual no debe mostrar presencia de cloruros.

Desecar el papel filtro con el residuo de 100 a 105ºC se transfiere al

crisol inicial y se incinera en una mufla de 700-750ºC durante 2

horas. Colocar en un desecador hasta alcanzar temperatura ambiente

para luego pesar. Repetir el procedimiento hasta obtener peso

constante.

La cantidad de cenizas insolubles en ácido clorhídrico (퐶푖)

en base anhidra se calcularán por las fórmulas siguientes:

푀2−푀 퐶푙푥100 퐶푙 = 푥100(%) 퐶푖 = 푀1−푀 100−퐻

BIOQUIMICA Y

Donde:

퐶푙 = % de cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base

hidratada. FARMACIA DE 푀 = Masa del crisol vacío (g).

푀1 = Masa del crisol con la muestra de ensayo (g).

푀2 = Masa del crisol con la ceniza (g).

100 = Factor matemático para los cálculos. BIBLIOTECA 퐻 = % humedad.

2.3.14. Determinación de sustancias solubles24,30,31,32

Se basa en la extracción de las sustancias en agua, alcohol o una

mezcla hidroalcohólica, mediante maceración y evaporación hasta

sequedad de una alícuota del extracto.

Procedimiento:

Pesar 3 muestras de 5g de la droga previamente pulverizada y

tamizada, luego transferir a un frasco cónico con tapa de 250mL,

añadir 100mL de alcohol de 50º GL,BIOQUIMICA 70º GL y agua a temperatura Y ambiente, respectivamente, agitar durante 6h y dejar en reposo hasta

el día siguiente; posteriormente agitar 30min, dejar reposar

alrededor de 30min; después filtrar por papel. Finalmente, medir FARMACIA una alícuota de 2 mL, evaporar sobre Baño María, desecar a 105 °C DE en una estufa durante 3h, dejar enfriar y posteriormente pesar.

El porcentaje de sustancias solubles en base anhidra (SS) se calcula

mediante la fórmula siguiente:

BIBLIOTECA

푅 푥 500 푥 100 푆푠 = (%) 푀(100 − 퐻)

Donde:

H = Humedad de la muestra (%).

R = Residuo de la muestra (g).

M = Masa de la muestra (g).

500 y 100 = Factores matemáticos para los cálculos.

El ensayo se realiza por duplicado. Se informa el promedio de las

dos determinaciones del porciento de sustancias solubles. BIOQUIMICA Y

2.3.15. Preparación del extracto fluido de sauco 24

Se pesó 250 g de drogaFARMACIA y se procedió a humectar, Luego separamos

porciones equivalentesDE a 125g, 75g y 50g de droga. Se colocó la

porción de 125 g previamente humectada en el percolador y se

maceró con alcohol de 70°GL por 48 horas. Se prosiguió a percolar y

recoger 50 ml de extracto fluido, los cuales se separaron y BIBLIOTECA guardaron en un frasco ámbar. Se siguió recibiendo 5 porciones

sucesivas de percolado de 75 ml. cada una enumerándola según el

orden que se recibió. Colocamos la porción equivalente a 75 g de

extracto fluido en un percolador y maceramos con las porciones de

75 ml del lote anterior por 48 horas. Se percoló hasta obtener 75 ml y

se guardó en el frasco ambar. Se prosiguió percolando 5 porciones

de 50 ml de extracto fluido, cada uno enumerado. Se colocó la

tercera porción equivalente a 50 g. y se macero por 48 horas con las

porciones de extracto del lote anterior. Luego se procedió a percolar

hasta obtener 125 ml de extracto, los cuales se pasaron al frasco

ámbar. La cantidad final de extracto fluido fue de 250 ml.

2.3.16. Determinación de sólidos totales del extracto fluido24

Se midio 5 ml del extracto fluido a una cápsula de porcelana

limpia, seca y previamente tarada; laBIOQUIMICA cápsula se colocó en un baño Y de agua y evaporamos hasta que el residuo esté siruposo;

posteriormente se llevó a estufa a una temperatura de 105 ± 2 °C

durante 3h. FARMACIA Retiramos la cápsula de la estufa, colocamos en una desecadora DE hasta que alcance la temperatura ambiente y pesamos. Repetimos el

proceso anterior, pero empleando sólo 60 min. de secado, hasta

obtener peso constante.

BIBLIOTECA

Los sólidos totales 푆푡 se calcularon mediante la fórmula siguiente:

푃 − 푃 푆 = 푟 푥 100 푡 푉

Donde:

푃푟 = Masa de la cápsula más el residuo (g)

푃 = Masa de la cápsula vacía (g)

푉 = Volumen de la porción de ensayo (mL)

100 = Factor matemático

El ensayo se realizó por duplicado y se informó la BIOQUIMICA cantidad de sólidos totalesY g/100mL.

FARMACIA 2.3.17. Huella dactilar del extracto fluido24 DE

Procedimiento:

Verter 20mL de la muestra ensayo en una probeta de 1000mL de BIBLIOTECA aproximadamente 5cm de diámetro y 70cm de altura simulando ser

una cámara cromatografica.

Colocar una tira de papel de filtro (Whatman #1) de 4cm de ancho

por 15cm de longitud verticalmente de manera que su borde superior

esté fijado a una varilla metálica que permita la suspensión de la tira

de papel y su extremo inferior esté sumergido dentro de la muestra

de ensayo pero sin tocar el fondo ni las paredes del recipiente. Cerrar

la cámara hermeticamente y dejar transcurrir 2h; finalizada ésta,

retirar el papel filtro y dejar secar. Una vez seco, proceder a su

inspección visual y caracterización.

Examen e Interpretación de la imagen: Se tienen en cuenta los

aspectos siguientes:

- Color.

- Altura. BIOQUIMICA Y - Descripción de las diferentes partes.

- Cambios de coloración con vapores de amoniaco.

- Examen bajo la luz ultravioleta. FARMACIA

DE Color: El color de la imagen se define en su conjunto inicialmente

como:

- Vivamente coloreada

BIBLIOTECA- Poco coloreada - Muy poco coloreada

En dependencia de la tonalidad que predomine en toda la imagen y

posteriormente se detallen los colores característicos de cada una de

las 4 zonas si son fácilmente detectables.

Altura: La altura de una imagen capilar se determina midiendo con

una regla graduada en cm, del borde inferior del papel a la franja,

siendo esta inversamente proporcional al grado alcohólico de la

muestra.

La altura promedio de una imagen capilar es de 8cm

aproximadamente, de ahí que se pueden clasificar las imágenes en:

- Altas: De 8,0cm en adelante

- Medianas: Entre 5,0-8,0cm

- Pequeñas: Menos de 5,0cm BIOQUIMICA Y - En el análisis de la imagen es posible distinguir 4 zonas:

- Franja: límite superior de ascensión del líquido.

- Sub-franja: región generalmente poco coloreada, comprendida

entre la franja y laFARMACIA zona superior de la banda.

- Banda: zona DE generalmente pigmentada debido a la presencia de

sustancias coloreadas.

- Sub-banda: situada debajo de la banda hasta el límite de inmersión.

BIBLIOTECA Descripción de las diferentes partes: Una de las zonas de mayor

interés es la franja, que esta puede ser o no traslucida, lo que

denotará la presencia de resinas o aceites esenciales y grasas.

En la franja, también puede describirse la forma que esta adopta,

dentro de ella.

- Lineal

- Festonada

- Dentada (regular o irregular)

- Profundamente dentada

Cambios de coloración con vapores de amoníaco: Se expone la

imagen capilar a los vapores de amoniaco y se observan e informan

los cambios de coloración. El efecto de la coloración debe

desaparecer al retirar la tira de papel de los vapores amoniacales.

Examen bajo la Luz Ultravioleta: DespuésBIOQUIMICA de la corrida, la tira de Y papel bien seca se expone a la Luz ultravioleta de 366nm. Se observa

e informa la fluorescencia de las diferentes zonas de la imagen.

FARMACIA 2.3.18. Tamizaje FitoquímicoDE de la droga y del extracto fluido: “Prueba

de la Gota”17,30,31

Procedimiento: BIBLIOTECA Pesar 1g de droga almacenada, agregar 30mL del solvente (para

obtener los extractos: Diclorometánico, Etanólico, agua acida y

Acuoso). Mantener a reflujo controlado por 10 minutos en Baño

María. Luego se dejar enfriar y posteriormente filtrar. Finalmente

realizar los ensayos correspondientes para cada extracto.

En el caso de la tintura evaporar el solvente, y el residuo redisolver

en los solventes necesarios (diclorometano, etanol, agua, agua ácida)

para la realización de los ensayos.

1. Extracto diclorometánico: Se identificara compuestos de muy

baja polaridad como: Esteroles, Quinonas.

a. Ensayo de Liebermann-Burchard: Medir X gotas del extracto y

agregar X gotas de Anhídrido acético, XX gotas de Ácido

Acético y I gota de ácido sulfúricoBIOQUIMICA concentrado y mezclar Y suavemente. La reacción será positiva si aparece coloración

azul, verde o naranja.

FARMACIA b. Ensayo de Bornträger: Medir X gotas del extracto y llevar a DE sequedad, luego agregar XX gotas de tolueno y XX gotas de

NaOH 10%. Se agita mezclando las fases y se deja en reposo

hasta su ulterior separación. Si la fase acuosa alcalina

(superior) se colorea de rosado o rojo, el ensayo se considera BIBLIOTECA positivo.

2. Extracto etanólico: Se identificara compuestos de polaridad muy

variada, como: Esteroides, Alcaloides, Flavonoides y Taninos.

a. Ensayo de Liebermann-Burchard: medir X gotas del extracto y

llevar a sequedad en baño de agua. Luego agregar X gotas de

Anhídrido acético, XX gotas de Ácido Acético y I gota de

ácido sulfúrico concentrado. La reacción será positiva si

aparece coloración azul, verde o naranja.

b. Ensayo de Shinoda: Medir X gotas del extracto, agregar

limadura de magnesio seguido por gotas de HClcc., las

coloraciones roja (flavonas), roja a crimson (flavonoles),

crimson a magenta (flavanonas) y algunas veces azul o verde, BIOQUIMICA son consideradas positivas. Y

c. Ensayo de Tricloruro férrico: Medir X gotas del extracto y

luego añadir II gotas de Cloruro Férrico, la aparición de un FARMACIA color azul-negro, nos indica la presencia de Tanino derivados DE del Ácido Gálico y la aparición de un color verde indica la

presencia de Taninos derivados del Catecol.

BIBLIOTECAd. Ensayo de Gelatina: Medir XX gotas del extracto y llevar a

sequedad en baño de agua y el residuo redisolver en XX gotas

de agua; luego añadir I gota de solución reactiva de gelatina

1%. Se debe de observar un precipitado blanco, que nos indica

la presencia de Taninos.

e. Ensayo de Dragendorff: Medir XX gotas del extracto y llevar a

sequedad en baño de agua y el residuo redisolver con XX gotas

de solución de ácido clorhídrico al 1%. Luego agregar II – III

gotas de reactivo. Este reactivo (yoduro de bismuto y potasio)

da, con los alcaloides en solución débilmente acidulada,

precipitados de color rojo o anaranjado.

f. Ensayo de Mayer: Medir XX gotas del extracto y llevar a

sequedad en baño de agua y el residuo redisolver en XX gotas

de solución de ácido clorhídrico al 1%. Luego agregar III – IV BIOQUIMICA gotas de reactivo. Este reactivoY da con casi todas las soluciones

de alcaloides, precipitados de color blanco, blanco amarillento

o amarillo limón claro.

g. Ensayo de Baljet:FARMACIA Medir XX gotas del extracto y llevar a

sequedadDE en baño de agua y el residuo redisolver en X gotas

del reactivo. Este reactivo da positivo en presencia de

compuestos con agrupamiento lactónico, en particular

Coumarinas, coloración o precipitado rojo claro a oscuro. BIBLIOTECA

h. Ensayo de Kedde: Medir XX gotas del extracto y llevar a

sequedad en baño de agua y el residuo redisolver en X gotas

del reactivo. Este reactivo da positivo en presencia de

glicósidos cardiotónicos, con coloración purpura o violáceo.

i. Ensayo de Ninhidrina: Medir papel de filtro, 2.5x5 cm.

Agregar III gotas de extracto, secar en estufa, agregar II gotas

de solución de ninhidrina, secar en estufa. La aparición de

color morado nos indica preliminarmente presencia de

aminoácidos.

3. Extracto acuoso - ácido: Se identificara compuestos básicos,

como: Alcaloides.

a. Ensayo de Dragendorff: Medir XXBIOQUIMICA gotas del extracto y agregar Y II a III gotas de reactivo. Este reactivo (yoduro de bismuto y

potasio) da, con los alcaloides en solución débilmente

acidulada, precipitados de color rojo o anaranjado.

FARMACIA

b. Ensayo deDE Mayer: Medir XX gotas del extracto y agregar III –

IV gotas de reactivo. Este reactivo da con casi todas las

soluciones de alcaloides, precipitados de color blanco, blanco

amarillento o amarillo limón claro. BIBLIOTECA

c. Ensayo de Wagner: Medir XX gotas del extracto y agregar II –

III gotas de reactivo. Este reactivo es muy sensible y da con los

alcaloides, precipitados floculentos que varían del color café

claro al rojo o pardo oscuro.

4. Extracto acuoso: Se identificara compuestos de alta polaridad,

como: Flavonoides, Leucoantocianidinas, Saponinas, Taninos.

a. Ensayo de Shinoda: medir XX gotas del extracto y llevar a

sequedad en baño de agua y el residuo redisolver en XX gotas

de solución de etanol, luego agregar unos trocitos de cinta de

magnesio seguido por gotas de HClcc; las coloraciones roja

(flavonas), roja a crimson (flavonoles), crimson a magenta

(flavanonas) y algunas veces azul o verde, son consideradas

positiva. BIOQUIMICA Y

b. Ensayo de Rosenhein: Medir XX gotas del extracto y llevar a

sequedad; luego agregar XX gotas de solución de ácido

clorhídrico 2N/1-propanol llevar a baño maría de 15 – 30 FARMACIA minutos. La aparición de una coloración roja, marrón en la fase DE acuosa, nos indica la presencia de leucoantocianidinas y

catequinas respectivamente.

BIBLIOTECA c. Ensayo de Espuma: Medir XX gotas del extracto. Agitar

vigorosamente por 30 segundos, esperar 15 minutos en reposo.

La persistencia de la espuma nos indica la presencia de

saponinas.

d. Ensayo de Gelatina: Medir XX gotas del extracto y añadir I-II

gota de solución reactiva de gelatina 1%. Se debe de observar

un precipitado blanco, que nos indica la presencia de Taninos.

2.3.19. Cuantificación de flavonoides totales del extracto fluido de

Sambucus peruviana H.B.K. mediante espectrofotometría UV-

visible.33,34

Procedimiento: BIOQUIMICA Y Preparación de la Solución Patrón:

- Pesar 80 mg de quercetina patrón y disolver con c.s.p.100 mL de

etanol a 96 ° GL;FARMACIA para obtener una concentración de 800 p.p.m. DE

1000 푚푙 80 mg quercetina x = 100 ml 800 푚푔

BIBLIOTECAPreparación de soluciones diluidas de la muestra patrón para la

curva de calibración

- Medir volúmenes de 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0; 1.2 y 1.4 ml de la

solución patrón y aforar a 100 con alcohol de 96ºGL, para

obtener concentraciones de 1.6; 3.2; 4.8; 6.4; 8.0; 9.6 y 11.2 ppm

respectivamente.

- Primero se realizó un espectro con la disolución de 8.0 ppm en

el espectrofotómetro para conocer el pico más alto

correspondiente a la λ máx a la que absorbe la quercetina, a la

cual se leyeron todas las muestras.

- A continuación hacer 3 lecturas de absorbancias de las

concentraciones conocidas, en el espectrofotómetro UV-Visible

Hewlett Packard (8452A–Diode Array Spectrofotometer) para

obtener la ecuación de la recta. BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE

BIBLIOTECAPreparación de la Solución Blanco:

Se utilizó etanol a 96 °GL como solución blanco, tomar una alícuota

de 3mL aproximadamente para la calibración del espectrofotómetro

UV-Visible Hewlett Packard (8452A–Diode Array

Spectrofotometer).

Preparación de la muestra:

Hidrólisis de Flavonoides

Se midio 20 ml del extracto fluido a un balón y se llevó a reflujo con

20 ml de ácido sulfúrico al 10 % durante dos horas.

Purificación de flavonoides totales:

- Se llevó el extracto a baño maría hasta disminuir

aproximadamente a 50% del volumen, enfriamos y llevamos a

refrigeración durante 1 hora.

- El extracto refrigerado se filtró alBIOQUIMICA vacío sobre embudo büchner Y previamente acondicionado a una temperatura menor a 15ºC,

luego lavamos el residuo con 3 volúmenes sucesivos de 400mL

de agua destilada helada.

- Llevamos el papelFARMACIA filtro que contiene los flavonoides totales, en

forma de cristales,DE a la estufa a 40ºC durante 2 horas.

- Solubilizamos los cristales obtenidos con 100 ml de etanol de 96

ºGL y 100 ml de agua destilada y se llevó a baño maría hasta

disminuir a 50% del volumen y repetimos los pasos anteriores BIBLIOTECA por 3 veces hasta obtener los cristales purificados.

Preparación de la solución problema

- Se pesó los cristales purificados equivalentes a 0.2g de droga y

se aforó a 100 mL con etanol al 96°GL; de éste aforo tomamos

dos alícuotas de 3 mL aproximadamente, y de cada alícuota se

obtuvo 3 lecturas de absorbancias a 248 nm en el

espectrofotómetro UV-Visible Hewlett Packard (8452A – Diode

Array Spectrofotometer).

2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE DATOS

Se empleó el programa Microsoft Excel 2007 de Microsoft Office para la realización del análisis estadístico correspondiente: Media Aritmética y Desviación Estándar. BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

III. RESULTADOS

Tabla. Nº 1: Estudio macromorfológico externo de las hojas de Sambucus peruviana H.B.K.

Limbo Oblongo-Aovadas Borde Acerrado Ápice Acuminada FORMA Base Redonda Peciolo Corto Inervación Imparipinnadas BIOQUIMICA Y COLOR Verde

SUPERFICIE Lustrosa

OLOR FARMACIA Sui Géneris DE CONDICIONES Fresca

MEDICIONES 6.5 cm de ancho PROMEDIO DE LA 16.5 cm de largo HOJA BIBLIOTECA

Tabla N° 2: Caracterización Micromorfológica. Sección Superficial de la hoja de Sambucus Peruviana H.B.K.

SECCIÓN SUPERFICIAL DE LA HOJA Observación Descripción

Las células epidérmicas

propiamente dichas BIOQUIMICA Y presentan forma alargada de paredes sinuosas delgadas.

No presenta estomas ni

tricomas, estas células son FARMACIA más gruesas que las células DE del envés (abaxial), sin

ningún contenido

citoplasmático.

BIBLIOTECA Figura N° 1: Sección superficial Adaxial (haz)

Se observan tres tipos de células epidérmicas: Las células propiamente dichas son más pequeñas que las de las cara adaxial, son de forma irregular de paredes más sinuosas que las de la cara adaxial.

Los estomas están rodeados por Figura N° 2: Sección superficial Abaxial (envés) 4 células irregulares de paredes BIOQUIMICA Y sinuosas de las cuales una es más pequeña, característica que lo presentan los estomas anomocíticos. Los estomas son numerosos presentándose de 24 FARMACIA a 30 por campo microscópico a DE 100 aumentos También se observan tricomas unicelulares muy desarrollados

BIBLIOTECA Figura N° 3: Sección superficial Abaxial (envés)

Tabla N° 3: Caracterización Micromorfológica. Sección Transversal de la hoja de Sambucus Peruviana H.B.K.

SECCIÓN TRANSVERSAL DE LA HOJA

MESÓFILO

Presenta una estructura dorsiventral (Bifacial). Las células epidérmicas del haz (adaxial) son BIOQUIMICA mas gruesas que las células del Y envés sin ningún contenido citoplasmático. Ambos protegidos por una cutícula delgada. El parénquima empalizado Figura N° 4: Sección transversal del mesófilo FARMACIA clorofiliano esta formado por DE células cortas ligeramente alargadas, dispuestos en una sola hilera. El parénquima esponjoso esta formado por células irregulares y BIBLIOTECA amplios espacios intercelulares. En el Haz se observa tricomas pluricelulares y unicelulares

Figura N° 5: Sección transversal del mesófilo

RAQUIS

En el raquis se observa pelos unicelulares bien desarrollados dispuestos radialmente, también se disponen a lo largo de ambas epidermis de forma aislada. A si mismo se observan pelos glandulosos con cabeza pluricelular en la cual se observan aceites esenciales. En la nervadura BIOQUIMICA Y principal se observa debajo de amboas epidermis tejido

Figura N° 6: El raquis Sección transversal colenquimático de tipo angular

como tejido de resistencia (tejido mecánico) FARMACIA En las células del parénquima del DE raquis que son bien desarrollados se encuentran espacios intercelulares bien desarrollados (esquizógenos) que cuando envejecen se llenan de arenilla BIBLIOTECA cristalina (color marrón oscuro). Estas células al ser tratados con acido clorhídrico disuelve a las arenillas que son cristales de Figura N° 7: El raquis Sección transversal oxalato de calcio.

Tabla N° 4: Caracterización de las hojas de Sambucus peruviana H.B.K.

NOMBRE DEL ENSAYO RESULTADO

Materias extrañas 1.09 ± 0.14%

Humedad 8.35 ± 0.34%

Cenizas totales 9.30 ± 0.23%

Cenizas solubles en agua 7.02 ± 0.72% BIOQUIMICA Cenizas insolubles en acido Y 0.26 ± 0.06%

Agua 6.82 ± 0.33%

Sustancias solubles Alcohol 50°GL 10.71 ± 0.30% FARMACIA IV. Alcohol 70°GL 12.5± 0.21% DE

Sólidos Totales del Extracto Fluido 11.43 ± 0.06%

BIBLIOTECA

Tabla N°5: Análisis capilar del extracto fluido de la hoja de Sambucus peruviana H.B.K.

Característica Descripción

Imagen vivamente coloreada, irregularmente Color dentada sin aparición de bandas

altura Imagen alta BIOQUIMICA Y Cambios de coloración con La imagen se torna ligeramente amarillenta vapores de amoniaco

Se observó una fluorescencia naranja en la Examen bajo la luz ultravioleta FARMACIAfranja

BIBLIOTECA

Tabla N° 6: Tamizaje fitoquímico de la droga (hoja seca) y del extracto fluido de Sambucus peruviana H.B.K.

ENSAYOS METABOLITOS MUESTRA RESULTADO

Droga + Dragendorf Alcaloides E.F. - Droga + Mayer Alcaloides E.F. - Droga + Wagner Alcaloides E.F. - Droga + Ninhidrina Aminoácidos E.F. + Droga + Baljet Lactonas E.F. + DrogaBIOQUIMICA - Bornträger Quinonas Y E.F. - Liebermann- Droga + Triterpenos/esteroles Burchard E.F. + Droga + Rosenhein Antocianidinas E.F. + FARMACIA Droga + Shinoda Flavonoides E.F. + DE Glicósidos Droga - Kedde cardiotónico E.F. - Droga + Espuma Saponinas E.F. + Droga + Cloruro férrico Taninos E.F. + BIBLIOTECA Droga - Gelatina Taninos E.F. -

Leyenda: E.F.: Extracto fluido

+ : Positivo

- : Negativo

Tabla N° 7: Cuantificación de flavonoides totales expresados como quercetina de las hojas de Sambucus peruviana H.B.K. mediante espectrofotometría UV- visible.

CONTENIDO DE GRAMOS DE HOJA FLAVONOIDES TOTALES

0.4775 g 100 g expresados como quercetina BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

V. DISCUSIÓN

Para asegurarnos que se está trabajando con la muestra correcta, el

material vegetal objeto de estudio fue identificado como Sambucus peruviana

H.B.K en el Herbario Truxillensis de la Universidad Nacional de Trujillo con

número de herbario 52790 (HUT).

El estudio farmacognóstico abarca un conjunto de parámetros de calidad

de la droga que son muy importantes para la identificación de la especie, la

determinación de su calidad y pureza. Se debe BIOQUIMICA tomar en cuenta la época de Y recolección, el lugar y la forma de conservarla hasta que se encuentre seca3,4.5, 17.

El siguiente estudio empezó con el reconocimiento macroscópico y

microscópico de las hojas de SambucusFARMACIA peruviana H.B.K.

Como se observa en la Tabla N° 1, desde el punto de vista

macromorfolólgico las hojas son opuestas, compuestas, imparipinnadas, con 7 –

9 folíolos ovados, oblongos o lanceolados, ápice acuminado, base redondeada, a BIBLIOTECA veces obtusa, de 6 – 10 cm de longitud.

La determinación de las características macromorfologicas, puede

proporcionar un medio simple y rápido para establecer la identidad, la pureza y,

posiblemente, la calidad de la droga21.

En las Tablas Nº 2 y 3, apreciamos los resultados del estudio histológico

de la planta estudiada, útiles para establecer, junto con las características

macroscópicas, la variedad de la planta.

Respecto a los cortes histológicos de la hoja de sauco estudiada, se observa

en la Tabla N° 2, la sección superficial de la hoja. En la Figura N° 1, las células

epidérmicas propiamente dichas presentan forma alargada de paredes sinuosas

delgadas. No presenta estomas ni tricomas, estas células son más gruesas que las

células del envés (abaxial), sin ningún contenido citoplasmático. En la figura N° 2

y 3, se observan tres tipos de células epidérmicas: LasBIOQUIMICA células propiamente dichas Y son irregulares, más pequeñas y sinuosas que las de la cara adaxial. Los estomas

están rodeados por 4 células irregulares de paredes sinuosas de las cuales una es

más pequeña, característica que lo presentan los estomas anomocíticos. Los FARMACIA estomas son numerosos presentándose de 24 a 30 por campo microscópico a 100 DE aumentos, en la Figura N° 3, se observan tricomas unicelulares muy desarrollados

en el envés 21,22.

BIBLIOTECA En la Tabla N° 3, tenemos la sección transversal de la hoja. En la Figura

N°4 observamos al mesófilo, que contiene una estructura dorsiventral (bifacial).

Las células epidérmicas del haz (adaxial) son mas gruesas que las células del

envés sin ningún contenido citoplasmático. Ambos protegidos por una cutícula

delgada. El parénquima empalizado clorofiliano esta formado por células cortas

ligeramente alargadas, dispuestos en una sola hilera. El parénquima esponjoso

esta formado por células irregulares y amplios espacios intercelulares. Se observa

también tricomas pluricelulares y unicelulares (Figura N° 4) 21, 22.

En la figura N° 6 y 7, observamos el raquis, hay presencia de pelos

unicelulares bien desarrollados dispuestos radialmente, también se disponen a lo

largo de ambas epidermis de forma aislada. A si mismo se observan pelos

glandulosos con cabeza pluricelular en la cual se observan aceites esenciales. En

la nervadura principal se observa debajo de ambos epidermis tejido

colenquimático de tipo angular como tejido de resistencia (tejido mecánico) 21,22. BIOQUIMICA Y

El material biológico, debe estar enteramente libre de la contaminación

inorgánica como polvo, la excreta de los animales; y de la contaminación orgánica

como insectos, etc. Además es difícilFARMACIA preparar una muestra con materia extraña

puesto que la mayor parte deDE ésta se adhiere a las partes intrínsecas de la planta

medicinal. El problema es especialmente difícil cuando las muestras de los

materiales de la planta medicinal seleccionados son pequeñas; deben ser

suficientemente grandes, ser representativos, de ahí la importancia de realizar un BIBLIOTECA control de materia extraña orgánica e inorgánica. Se entiende por materias

extrañas aquellas partes de la droga que no corresponde a las exigencias que

señala la monografía en cuanto a color, tamaño, estado y grado de pulverización,

mezclas de otras partes de la planta o de otras plantas, polvo, arena, piedra y otras

sustancias minerales. En nuestro caso como se muestra en la Tabla N° 4, la

materia extraña es de 1.09 ± 0.14 encontrándose dentro de los rangos permisibles

que de acuerdo al Farmacopea Europea no debe ser mayor al 2 % 17, 24.

Una forma de conservación de la droga cruda es eliminar el exceso de

humedad para evitar reacciones de hidrólisis de sus fitoconstituyentes y la

proliferación de microorganismos. El porcentaje de humedad encontrado fue de

8.3% , valor que se encuentra dentro de los niveles aceptados que oscilan entre 8 y

14 % en la mayoría de las monografías encontradas en las farmacopeas3,4,5,17,24 .

BIOQUIMICA Y Las cenizas totales permiten determinar la cantidad de materia remanente

después de la ignición: cenizas fisiológicas, derivados de los tejidos de la planta y

cenizas no fisiológicas, que son el residuo después de la ignición de la materia

extraña adherida a la superficie FARMACIAde la droga. El porcentaje de cenizas totales, fue

de 9.30 ± 0.23% el cual es elevadoDE según la Norma Ramal Cubana.

Cuando los valores obtenidos para cenizas totales son elevados (> 5%), es

necesario conocer si las mismas están compuestas por metales pesados, lo cual se

determina BIBLIOTECA mediante los ensayos de cenizas insolubles, y si este resultado es elevado hay que someter la droga a otros análisis si es necesario.

Por lo que fue necesario determinar el porcentaje de cenizas solubles en

agua e insolubles en ácido cuyos resultados fueron de 7.02 ± 0.72% y 0.26 ±

0.06% respectivamente, los cuales son menores a los valores máximos permisibles

establecidos en las Normas Ramales Cubanas 17,22.32.

Al encontrarse una cantidad mayor de cenizas solubles en agua, podemos

afirmar que la mayor cantidad de cenizas corresponderían a concentraciones

elevadas de algunos iones como calcio, magnesio, hierro, sodio, potasio, etc. Pues

estos son solubles en agua, y el bajo valor para las cenizas insolubles en ácido nos

indica que la especie vegetal no está contaminada con metales pesados 17,22.

BIOQUIMICA Y Se determinaron las sustancias solubles en agua, en alcohol a 50°GL y en

70°GL, los cuales se muestran en la Tabla N° 4 obteniéndose concentraciones de

6.82 ± 0.33%; 10.71 ± 0.30% y 12.5 ± 0.21% respectivamente. Este método

determina la cantidad de principiosFARMACIA activos en una cantidad de droga, extraíble con

un solvente. Se emplea paraDE drogas en las cuales no se dispone de un método de

ensayo químico o biológico aprobado, para determinar su composición química

cuantitativa, como nuestra droga 17,22,26.

BIBLIOTECA

Según los resultados tenemos que la cantidad de sustancias extraíbles con

alcohol de 70 °GL es mayor que con los otros solventes utilizados; lo que sirvió

como dato para preparación del Extracto Fluido.

Los extractos fluidos son extractos líquidos de materias vegetales, de tal

manera preparados, que la cantidad de extracto final en volumen es equivalente a

la de la droga desecada al aire en peso, o sea, la relación peso de droga/volumen

final de extracto 1 es a 1 17.

Al extracto fluido de la hoja de sauco se le determino la cantidad de

sólidos totales y se le realizó el análisis capilar.

El porcentaje de sólidos totales que se observanBIOQUIMICA en la Tabla N° 4 del Y extracto fluido fue de 11.43 ± 0.06%, que a pesar de no referirse exclusivamente

a la cantidad de principios activos puede dar una medida de que a mayor valor de

éste, mayor es la probabilidad de existencia de metabolitos activos presentes 17.24.

FARMACIA

Los resultados obtenidos del análisis capilar del extracto fluido están

relacionados con la Tabla N°5 y Anexo N° 9.5, los cuales muestran una imagen

alta, irregularmente dentada, de color pardo oscuro, el resto de la imagen es más BIBLIOTECA claro; no se observan otras zonas. Al ser expuesta a los vapores de amoniaco la

imagen se torna ligeramente amarillenta y posteriormente, a la luz ultravioleta se

observó una fluorescencia naranja en la franja, característico de la presencia de

flavonoides17,30,32.

Se realizó el Tamizaje Fitoquímico de la hoja y del extracto fluido y se

observó la presencia de flavonoides en ambos mediante la reacción de Shinoda

(Tabla N° 6).

En la reacción de Shinoda, el magnesio metálico es oxidado por el HCl

concentrado, dando como productos al H2, que es eliminado en forma de gas y el

MgCl2, que es el que forma complejos con los flavonoides dando coloraciones

características. El magnesio divalente intensifica la coloración por estar

doblemente coordinado 17,24.

BIOQUIMICA Y Así mismo se identificó la presencia de otros metabolitos como esteroides,

aminoácidos, flavonoides, antocianidinas, saponinas y alcaloides tanto en la hoja

como en el extracto fluido a excepción de los alcaloides que solo dieron positivo

en el extracto fluido. FARMACIA DE

El hecho de que las reacciones para alcaloides dieran positivo en el

extracto fluido puede deberse a que en la lixiviación intervienen fuerzas físicas

importantesBIBLIOTECA como la gravedad, viscosidad, adherencia, fricción, osmosis,

capilaridad y solución17,22,32.

En la Tabla N° 7 se observa que 100 g de hojas de Sambucus peruviana

H.B.K contienen 0.4775g de flavonoides totales expresados como quercetina. La

cuantificación se llevó acabo mediante espectrofotometría UV/Visible a 248 nm

(longitud de onda de máxima absorción) la cual fue determinada con la solución

patrón de 8 ppm.

Como características generales de estos compuestos debemos señalar su

solubilidad en agua y etanol, su carácter fenólico y su intensa absorción en la

región ultravioleta y visible del espectro debido a la presencia de sistemas

aromáticos conjugados; de allí el fundamento por el cual se identificó en el

extracto acuoso y etanólico al 96°GL y no en el extracto diclorometánico

La especie que se estudia no existe reporte bibliográficoBIOQUIMICA científico del cual Y regirse para llegar a certeras conclusiones.

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

VI. CONCLUSIONES

1. Se realizó la estandarización macromorfológica y micromorfológica de las

hojas de Sambucus peruviana H.B.K.

2. Los parámetros de calidad estudiados se encuentran dentro del rango de

valores que se reportan para las drogas vegetales.

3. Los resultados obtenidos nos permiten proponer los parámetros de calidad de BIOQUIMICA la planta. Y

4. Se demostró con el análisis fitoquímico preliminar la presencia de metabolitos

activos tales como alcaloides, aminoácidos, lactonas, triterpernos y esteroides, FARMACIA antocianidinas, flavonoides, saponinas, taninos. DE

5. En las hojas secas de la especie estudiada se encuentran flavonoides en un

porcentaje de 0.4775%. BIBLIOTECA

VII. RECOMENDACIONES

 Se recomienda seguir con los estudios de las hojas de Sambucus peruviana,

hasta separar los fitoconstituyentes importantes que se encuentran en las hojas

y en el extracto fluido.

 Realizar estudios del mismo tipo en las diferentes estaciones del año, para una

comparación de las concentraciones y los fitoconstituyentes.

 Realizar estudios de las hojas de Sambucus peruviana de diferentes lugares

de nuestra región.

 Realizar estudios que demuestren la acciónBIOQUIMICA farmacológica de los Y fitoconstituyentes de las hojas de Sambucus peruviana.

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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BIBLIOTECA

IX. ANEXOS

9.1. Estudio macromorfológico externo de las hojas de Sambucus peruviana H.B.K.

Hoja compuesta de Sambucus peruviana H.B.K.

BIOQUIMICA Y

FARMACIA

Forma de la hoja de Sambucus peruviana H.B.K.

BIBLIOTECA

Medición del largo de las Medición del ancho de las hojas de Sambucus peruviana hojas de Sambucus peruviana

9.2. Estudio Fitoquímico Preliminar

Tamizaje FitoquímicoBIOQUIMICA del extracto fluido de SambucusY peruviana

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

Tamizaje Fitoquímico de la hoja de Sambucus peruviana

9.3. Preparación del extracto fluido de Sambucus peruviana

Recolección de la muestra Selección de la muestra

BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE Estabilización de la muestra

BIBLIOTECA

Molienda y Tamizado

Droga homogeneamente Construcción Humidificada del equipo de Lixiviación

BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE

BIBLIOTECA

Extracción del principio Extracto fluido

de Sambucus peruviana de Sambucus peruviana

9.4. Análisis capilar del extracto Fluido

BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE

Capilarograma del extracto fluido de hojas de Sambucus peruviana

BIBLIOTECA

9.5. Caracterización de las hojas de Sambucus peruviana H.B.K.

CENIZAS MUESTRA HUMEDAD TOTALES 1 8.26% 9% 2 8.19% 9% 3 8.60% 9% 4 7.78% 10% 5 8.47% 9% 6 8.18% 9% 7 8.33% 9% 8 9.04% 9% 9 8.27% 9% PROMEDIO 8.35% 9.30% DESVEST 0.34% 0.23%

CENIZAS SOLUBLES EN AGUABIOQUIMICA 1 Y7% 2 6% 3 7% 4 8% PROMEDIO 7.02% DESVEST FARMACIA 0.72%

CENIZASDE INSOLUBLES EN ACIDO 1 0.17 2 0.30 3 0.30 4 0.24 PROMEDIO 0.26 BIBLIOTECADESVEST 0.06 SOLIDOS TOTALES MACERADO 1 5% 2 4% 3 4% 4 4% PROMEDIO 4.49% DESVEST 0.04%

SOLIDOS TOTALES EXTRACTO FLUIDO 1 11% 2 11% 3 11% 4 12% PROMEDIO 11.43% DESVEST 0.06%

SUSTANCIAS SOLUBLES extracto 13% 70ºGL extracto 12% 70ºGL extracto 12% 70ºGL extracto 12% BIOQUIMICA 70ºGL Y PROMEDIO 12.50% DESVEST 0.21%

extracto 50ºGL 11% extracto 50ºGL 11% extracto 50ºGL FARMACIA 10% extracto 50ºGL 11% DE PROMEDIO 10.71% DESVEST 0.30%

agua 6% BIBLIOTECAagua 7% agua 7% agua 7% PROMEDIO 6.82% DESVEST 0.33%

9.6. Cuantificación de Flavonoides Totales del extracto fluido de Sambucus peruviana H.B.K. mediante espectrofotometría UV- visible.

Curva de Calibración. Patron Quercetina 0.9000 y = 68.684x + 0.0412 0.8000 R² = 0.9889 0.7000

0.6000

0.5000 Curva de Calibración 0.4000

Absorbancia Lineal (Curva de 0.3000 Calibración) 0.2000 BIOQUIMICA 0.1000 Y 0.0000 0 0.005 0.01 0.015 Concentración (mg/mL)

FARMACIA

EXTRACTO NÚMERO DE DE LECTURA DE ABSORBANCIA (nm) FLUIDO LECTURAS

1 2.2164 2 2.2207

3 2.2048 1 4 2.2121 BIBLIOTECA 5 2.2129 6 2.2098 1 1.9705 2 1.9648 3 1.9766 2 4 1.9749 5 1.9667 6 1.9779

BIOQUIMICA Y

FARMACIA DE

BIBLIOTECA