Universidad De Guayaquil Facultad De Ciencias Quimicas Modalidad: Investigación Tema: Autores: Tutor: Co-Tutor

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS MODALIDAD: INVESTIGACIÓN

TEMA: CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL ACEITE OBTENIDO DE LAS SEMILLAS DEL FRUTO DEL MATE (Crescentia cujete L.).

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO

AUTORES: LOURIDO SALAZAR LUIGGI RAFAEL PALADINES SANTACRUZ GEOVANNA LISSETTE

TUTOR: PHD. ADONIS BELLO ALARCÓN CO-TUTOR: Q.F ZORAIDA BURBANO GOMEZ Msc. GUAYAQUIL-ECUADOR 2017 i

APROBACIÓN DEL TUTOR

En calidad de tutor /a del Trabajo de Titulación, Certifico: Que he asesorado, guiado y revisado el trabajo de titulación en la modalidad de investigación, cuyo título es “Caracterización físico-química y actividad antioxidante del aceite obtenido de las semillas del fruto del mate (Crescentia cujete L.)”, presentado por LUIGGI RAFAEL LOURIDO SALAZAR, con cédula de ciudadanía N° 0920028396 y GEOVANNA LISSETTE PALADINES SANTACRUZ, con cédula de ciudadanía N° 0925641797, previo a la obtención del título de Químico y Farmacéutico.

Este trabajo ha sido aprobado en su totalidad y se adjunta el informe de Antiplagio del programa URKUND. Lo Certifico. -

Guayaquil, 21 de Marzo del 2017

FIRMA TUTOR DE TESIS

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CERTIFICADO DEL TRIBUNAL

El Tribunal de Sustentación del Trabajo de Titulación del Sr. Luiggi Rafael Lourido Salazar y la Srta. Geovanna Lissette Paladines Santacruz, después de ser examinados en su presentación, memoria científica y defensa oral, da por aprobado el Trabajo de Titulación.

DR. JULIO RODRIGUEZ ZURITA MsC PRESIDENTE - MIEMBRO DEL TRIBUNAL

Q.F. FERNANDA VÉLEZ LEÓN MsC DRA. AMALIA SUAREZ MsC DOCENTE–MIEMBRO DEL TRIBUNAL DOCENTE–MIEMBRO DEL TRIBUNAL

ING. NANCY VIVAR CÁCERES SECRETARIA ENCARGADA

CARTA DE AUTORIA DE TITULACIÓN Fecha

Guayaquil, 21 de Marzo del 2017

Nosotros, LUIGGI RAFAEL LOURIDO SALAZAR Y GEOVANNA LISSETTE PALADINES SANTACRUZ, autores de este trabajo declaro ante las autoridades de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil, que la responsabilidad del contenido de este TRABAJO DE TITULACIÓN, nos corresponde a nosotros exclusivamente; y el patrimonio intelectual de la misma a la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil.

Declaro también es de nuestra autoría, que todo el material escrito, salvo el que está debidamente referenciado en el texto. Además, ratifico que este trabajo no ha sido parcial ni totalmente presentado para la obtención de un título, ni en una Universidad Nacional, ni una Extranjera.

LUIGGI RAFAEL LOURIDO SALAZAR

NOMBRES DEL AUTOR C.I. 0920028396

GEOVANNA LISSETTE PALADINES SANTACRUZ NOMBRES DEL AUTOR C.I. 0925641797

AGRADECIMIENTO

En primer lugar agradezco a Dios por haberme dado sabiduría y salud para poder culminar esta etapa en mi vida y sobre todo a mis padres por brindarme su apoyo incondicional y aconsejándome en cada paso en esta etapa de mi vida.

Agradezco al apoyo incondicional de mi familia, tanto a mi padre como a mi madre por haberme sabido guiar en toda mi vida, me ayudaron a formarme con buenos sentimientos, hábitos y valores, lo cual me ha ayudado a salir adelante en los momentos más difíciles.

Agradezco a mi compañera, amiga y más, Geovanna Paladines para poder culminar este trabajo, ya que gracias a su curiosidad se pudo salir adelante con esta investigación y estoy muy orgulloso de ti, Dios permitió poder realizar este trabajo junto y nos ayudó a forjarnos como profesionales.

Agradezco a mi tutor de tesis el Lcdo. Adonis Bellos Alarcón PhD. y Co-Tutora Q.F. Zoraida Burbano Gómez Msc. Por haberme brindado la oportunidad de recurrir a su capacidad y conocimiento científico y a su vez poder guiarme en este largo camino durante el desarrollo de mi tesis.

Mi agradecimiento también va dirigido al Gerente Propietario de la Empresa GUSTAFF S.A., el Ing. Gustavo Argüello por haberme permitido poder dar mis primeros pasos en su prestigiosa empresa y formarme como profesional.

Para finalizar, agradezco de igual manera a todas las personas que fueron mis compañeros y amigos más cercanos de clase durante todos los niveles de Universidad, que siempre estuvieron apoyando y aconsejando formando así un gran vinculo duradero, ya que gracias al compañerismo, amistad y apoyo han aportado a mis ganas de seguir adelante en mi carrera profesional.

Luiggi Rafael Lourido Salazar

AGRADECIMIENTO

Gracias Dios por todo lo que me has dado, gracias por no soltar mi mano y mantenerme a tu lado contra vientos y mareas. Gracias Dios por haber caminado junto a nosotros , dándonos tu ayuda ,fortaleza, sabiduría y paz , para permitirnos alcanzar una más de nuestras metas de vida.

Agradezco a mi hermosa familia, que me ha dado su total apoyo incondicional, desde mis primeros pasos, ya que con su amor, cariño y valores me han dado la motivación para escalar en mi vida y no desfallecer en el camino .Han sido y serán siempre mi pilar fundamental, gracias a ellos he podido forjarme como persona, y ser la persona que ahora soy con sus virtudes y defectos de noble corazón. Cada uno que aporto de una forma maravillosa para que logre conseguir mi meta, ya sea con ayuda, regaño, consejo, sonrisa o un abrazo, me hicieron saber que siempre van a estar ahí y aunque los tiempos estén difíciles, harán que el día sea alegre. Por eso y más siempre les estaré eternamente agradecida.

Agradezco a nuestro tutor el Dr. Adonis Bello Alarcón y Co-Tutora Q.F. Zoraida Burbano Gómez Msc, que con su paciencia y sabiduría nos guiaron con excelencia y disposición durante toda la etapa de desarrollo de la tesis.

Agradezco a las personas que conocí durante mi etapa Universitaria, que de alguna manera aportaron en mí de forma positiva en mi camino hacia la meta. Agradezco a mis compañeros, con los cuáles pasamos muchos obstáculos y vivimos muchas aventuras y a los que hoy puedo llamar amigos. A su vez a mis amigos más cercanos, que siempre estuvieron ahí, alentando y apoyando en toda esta etapa. Agradezco a los docentes que me formaron como profesional e inculcaron en mí la curiosidad de investigar.

Agradezco de manera especial a mi compañero de tesis, por haberme dado su apoyo, soporte y entusiasmo, para seguir adelante, y estoy muy orgullosa y feliz de decir que lo logramos y que esta meta lograda, es un paso más que nos acerca a la meta final de lograr el éxito profesional, personal y de vida.

Geovanna Paladines Santacruz

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INDICE GENERAL Pág. INTRODUCCIÓN 1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 3 HIPÓTESIS 3 VARIABLE VARIABLE DEPENDIENTE 4 VARIABLE INDEPENDIENTE 4 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL 4 OBJETIVO ESPECÍFICOS 4 CAPITULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA I.1. Antecedentes del trabajo 5 I.2. Mate, jícaro o totumo 5 I.2.1. Origen y distribución 5 I.2.2. División taxonómica 6 I.2.3. Denominaciones o sinonimias 6 I.2.4. Sinonimia botánica 6 I.2.5. Descripción botánica 7 I.3. Composición química 7 I.3.1. Ácidos grasos 8 I.3.2. Análisis fisicoquímico para aceites vegetales 11 I.4. Actividad biológica 11 I.4.1. Uso medicinal 11 I.4.2. Actividad antioxidante 12 I.4.3. Determinación de la actividad antioxidante in vitro por el método DPPH 13

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I.5. Caracterización fisicoquímica para aceites comestibles 15 I.5.1. Densidad relativa 15 I.5.2. Perdida por calentamiento 15 I.5.3. Índice de Yodo 15 I.5.4. Índice de Peróxido 16 I.5.5. Acidez 16 I.5.6. Índice de acidez 17 I.5.7. Índice de saponificación 17 I.6. Cromatógrafo de gases acoplada a espectrómetro de masas 17 CAPITULO II. MATERIALES Y MÉTODOS II.1. Metodología 19 II.2. Extracción de aceite 19 II.3. Análisis fisicoquímicos 20 II.3.1. Densidad relativa 20 II.3.2. Pérdida por calentamiento 20 II.3.3. Índice de Yodo 21 II.3.4. Índice de peróxido 21 II.3.5. Acidez 22 II.3.6. Índice de refracción 22 II.3.7. Índice de saponificación 22 II.3.8. Contenido de ácidos grasos 23 II.4. Determinación de la actividad antioxidante in vitro por el método del DPPH 24

Capítulo III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN III.1. Extracción de aceite 25 III.2. Análisis Fisicoquímicos de los aceites 25 III.2.1. Densidad relativa 25 III.2.2. Pérdida por calentamiento 25 III.2.3. Índice de refracción 25

III.2.4. Índice de saponificación 26 III.2.5. Acidez 26 III.2.6. Índice de peróxido 26 III.2.7. índice de Yodo 27 III.2.8. Contenido de ácidos grasos 27 III.3. Ensayo DPPH 29 CONCLUSIONES 32 RECOMENDACIONES 33 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 34 ANEXOS 40

ÍNDICE DE TABLAS

TABLA N° Pág. TABLA N° I. Compuestos obtenidos en la hoja 8

TABLA N° II. Ácidos grasos saturados 9

TABLA N° III. Ácidos grasos monoinsaturados 10

TABLA N° IV. Ácidos grasos poliinsaturados 10

TABLA N° V. Composición de ácidos grasos del aceite 28

TABLA N° VI. Relación entre la conc. del blanco estandarizado Trolox y la absorbancia 29

TABLA N° VII. Datos de la absorbancia del blanco y la muestra 30

ÍNDICE DE GRÁFICAS

FIGURA N° Pág. FIGURA N° 1. Estructura del DPPH antes y después de reacción antioxidante 14

FIGURA N° 2. Curva de regresión lineal obtenida del Trolox 29

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO Nº Pág.

ANEXO Nº 1. Herbario guay, descripción taxonómica del mate 40

ANEXO Nº 2. Fotografías de la fase experimental 41

ANEXO Nº 3. Gráficas del GC-MS 47

ANEXO Nº 4. Decoloración de solución DPPH 48

ANEXO Nº 5. Certificado de presentación de tema en II Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología 49

ANEXO N° 6 Certificado de análisis del Laboratorio PROGECA 50

RESUMEN

El interés científico por el empleo de los aceites vegetales muestra una tendencia ascendente. La necesidad de desarrollar nuevos alimentos funcionales y la creciente demanda de la industria de los nutracéuticos hacen que estos compuestos constituyan diana de investigación de muchos grupos fitoquímico del mundo. El presente trabajo tiene como objetivo caracterizar desde el punto de vista físico-químico el aceite obtenido de las semillas del fruto Crescentia cujete L. Los procedimientos para el análisis de las características fisicoquímicas se llevaron a cabo en PROGECA; Laboratorio de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil.

La metodología empleada en esta investigación fue de tipo experimental, donde se emplearon alrededor de 30 frutos de mate con un rendimiento de 250 a 500 semillas. La obtención del aceite se realizó por Soxhlet utilizando hexano como solvente. La caracterización físico-química se realizó por triplicado siguiendo la Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN para grasas y aceites comestibles. La extracción por Soxhlet permitió obtener un rendimiento promedio de 36,57%. Los análisis fisicoquímicos del aceite obtenido están dentro de la norma ecuatoriana: densidad relativa (0,9045 g/ml), pérdida por calentamiento (1.38%), índices de refracción (1,464), índice de saponificación (191,39 mgKOH/g), índices de acidez (1,32 % como ácido oleico), índice de peróxidos (3,997 %) e índice de yodo (120,97 mg/100g aceite). El análisis de CG-EM muestra más de un 80% de ácidos grasos insaturados, siendo el ácido oleico el componente mayoritario con un 63,9 %, el cuál cumple numerosas funciones favorables a nivel fisiológico y metabólico en nuestro organismo. Además, se realizó el ensayo del DPPH de este aceite.

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ABSTRACT

The scientific interest in the use of vegetable oils shows an upward trend. The need to develop new functional foods and the growing demand of nutraceutical industries, made that these compounds constitute a target for many phytochemical research groups. The present study aims to characterize from the physical- chemical point of view the oil obtained from the seeds of the fruit of Crescentia cujete L. Procedures for the analysis of physicochemical characteristics were carried out in PROGECA; Faculty of Sciences Chemical laboratory of the Guayaquil University.

The methodology employed in this research was of experimental type, where were use around 30 fruits of Crescentia cujete L. which had around 250 to 500 seeds. The oil was obtained by the method of Soxhlet using hexane as solvent. The physical and chemical characterization was performed in triplicate according to the standard technique Ecuadorian NTE INEN for fats and edible oils. The Soxhlet extraction allowed to obtain an average yield of 36, 57%. The physico-chemical analysis of the oil obtained are within the Ecuadorian standard: relative density (0, 9045 g/ml), loss on heating (1.38%), refractive index (1,464), saponification value (mg KOH/g 191, 39), rates of acidity (1.32% as oleic acid), peroxides (3,997%) and rate of iodine (120, 97 mg / 100 g oil). The analysis of CG-EM shows more than 80% of unsaturated fatty acids, being the oleic acid the majority component with 63.9%, which is known for its favorable physiological and metabolic functions in our organism. In addition, the DPPH assay of this oil was carried out.

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LISTA DE SÍMBOLOS

μg microgramos μL microlitros mL mililitros mg miligramos μm micrómetros μM micromolar mm milímetros nm nanómetros ºC grado centígrado cm centímetro m metro ppm partes por millón N normalidad I Índice meq miliequivalentes KOH Hidróxido de Potasio NaOH Hidróxido de Sodio ClH Ácido Clorhídrico ATP Trifosfato de adenosina ADN Ácido Desoxirribonucleico AOCS American Oils Chemist´s Society VLDL Lipoproteína de muy baja densidad (Español) DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl OPS Organización Panamericana de la Salud OMS Organización Mundial de la Salud IEPI Instituto Ecuatoriano de Propiedad Intelectual INVIMA Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamento INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización ERO Especie Reactivas del Oxígeno

INTRODUCCIÓN

Los productos naturales han sido de preferencia en las personas, desde la antigüedad, pero en el mercado existe una gran competencia de productos sintéticos que a pesar de su gran acogida no han logrado reemplazar, en varios casos, los beneficios que un producto natural puede ofrecer. Pero a pesar de ello, todavía se desconoce en qué medida puede ser utilizado un producto natural, siendo este muchas veces abandonado en el transcurso de su estudio y a su vez no investigado debido a la falta de interés o por el desconocimiento y simplemente creyendo que solo se lo puede utilizar para un solo fin (Pomilio, 2012; Jimenez, 2013).

Los aceites fijos están constituidos por mezclas de ácidos grasos unidos mediante enlace covalente a moléculas de glicerol. En general se trata de compuestos insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos, cuya composición no se ve alterada al ser expuestos al calor o la destilación. En los vegetales los aceites se encuentran principalmente en las semillas de los frutos; de los cuales pueden ser extraídos por dos métodos: expresión en frío o en caliente en prensas hidráulicas o extracción con el empleo de disolventes orgánicos (Etong et al., 2014).

Los árboles del género Crescentia de la familia Bignoniaceae, son muy abundantes en los hábitats secos tropicales. En toda América se les conoce con diferentes nombres como mate, jícaro o totumo, siendo un árbol originario de México y Centroamérica, que puede alcanzar entre 5 a 10 m de altura. Su vida oscila entre los 100 y 200 años, presentan una forma irregular con copa ligera y muchos intersticios entre las ramas (Hernandez-Rivas & Campos-Sosa, 2007).

Estudios químicos y nutricionales demuestran que la semilla del mate es una fuente potencial de proteínas y aceite carente de toxicidad, con un olor y sabor muy parecido al aceite de olivo (Figueroa, 2000). Según Figueroa (2000) las semillas poseen un 33.4% de grasa, 16.8% de fibra cruda y 25.1 % de proteína, sin especificar la composición química de la fracción lipídica, a diferencia del

reporte de Luna (2007) que señala un 37% de aceite con un 59.4% de ácido oleico como componente mayoritario. Finalmente Espitia-Baena (2011) indica que las semillas contienen un 20% de aceite.

En la región costera del Ecuador, éste fruto es comercializado de forma artesanal, donde se utiliza su cáscara, fuerte y resistente, como base para elaborar utensilios de cocina, joyerías e instrumentos musicales como las maracas (Bravo et al., 2016).

La determinación de propiedades fisicoquímicas de un aceite vegetal no conocido puede dar como resultado una nueva fuente de ácidos grasos, cuyo contenido en ácidos saturados e insaturados determina su capacidad para intervenir en el funcionamiento fisiológico y cumplir un papel importante en el funcionamiento del organismo. Los ácidos grasos insaturados desempeñan roles en la prevención de enfermedades cardiovasculares, mediante la reducción de acumulación de lípidos en las paredes arteriales y reducción de la presión arterial (Moreno, 2010).

Tomando como base todo lo anteriormente expuesto, la presente investigación tiene como objetivo evaluar las características fisicoquímicas y antioxidantes del aceite que se obtiene a partir de las semillas de los frutos de Crescentia cujete L., mediante una extracción por Soxhlet utilizando n-hexano como disolvente.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El interés científico de la presente investigación, se basa en la obtención y la caracterización fisicoquímica del aceite de las semillas de los frutos de C. cujete L. y evaluar la capacidad antioxidante in vitro de los componentes presentes. Basándose en experiencias anteriores, con estudios del fruto Espitia et al. (2011) un tamizaje preliminar fitoquímico muestra la presencia de alcaloides cuaternarios, altos contenidos de lípidos, compuestos polifenoles, saponinas y naftoquinonas. Además se detectaron y aislaron ácidos orgánicos como el ácido cianhídrico, ácido tánico y ácido crescéntico.

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

El interés científico de la presente investigación, se basa en la obtención y caracterización del aceite de las semillas de Crescentia cujete L. Por todo lo anterior, este trabajo plantea la siguiente problemática: ¿Podrá obtenerse mediante extracción por método de Soxhlet, el aceite de la semilla del fruto del mate con capacidad antioxidante?

HIPÓTESIS

Las semillas del Mate (Crescentia cujete L) presentan aceites fijos con capacidad antioxidante al ser evaluados por un modelo farmacodinámico in vitro: DPPH.

VARIABLES

 VARIABLES DEPENDIENTES

 Rendimiento de aceite fijo  Características del aceite fijo  Capacidad antioxidante in vitro del aceite fijo

 VARIABLE INDEPENDIENTE

 Condiciones de extracción  Propiedades fisicoquímicas del aceite  Condiciones experimentales del método de DDPH

OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL

 Evaluar las propiedades fisicoquímicas y antioxidante in vitro del aceite obtenido de las semillas del fruto de Crescentia cujete L,

OBJETIVOS ESPECÌFICOS

 Determinar el rendimiento de aceite obtenido por método de Soxhlet de la semilla del fruto de C. cujete L.

 Determinar las propiedades fisicoquímicas del aceite obtenido.

 Evaluar la actividad antioxidante in vitro del aceite de las semillas por captura de radicales libres de DPPH.

CAPÍTULO I

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

I.1. ANTECEDENTES DEL TRABAJO

El árbol del mate está distribuido en toda la América intertropical, desde la Florida hasta Brasil, en África y Asia tropical. Es utilizado como medicina y fuente de alimento de animales, e igualmente, de utilería de cocina (Botero et al., 2015).

En Nicaragua se han creado técnicas Industriales para obtener productos a partir de este fruto como alcohol a partir de la pulpa; aceite comestible de uso industrial, torta y harina de las semillas y carbón de las cáscaras. En la medicina natural se emplea la pulpa de Mate como laxante, emoliente y expectorante (Recalde, 2015).

Por otro lado, estudios químicos y nutricionales demuestran que las semillas tienen un alto porcentaje de aceites. En la región caribeña de Colombia se utiliza el totumo desde tiempos ancestrales en la alimentación de bovinos, cerdos y gallinas con buenos resultados nutricionales (Botero et al., 2011). La semilla del mate seca contiene 33,4% de grasa, 16,8% de fibra cruda y 25,1 % de proteína (Figueroa et al, 2000).

I.2. MATE, JÍCARO O TOTUMO

I.2.1. ORIGEN Y DISTRIBUCIÓN

El totumo se adapta a diferentes ecosistemas y siendo probablemente nativa de las sabanas del sur de México, América Central y zona norte de Sudamérica, donde es cultivado o aparece por regeneración natural. Su distribución latitudinal varía de 0 a 1000 metros sobre el nivel del mar y temperaturas de 16 a 33ºC (Salazar, 2001). Su amplia diversidad se expresa, por ejemplo, en la variedad de formas y tamaños de las hojas, frutos y de los árboles mismos. Se desarrolla mejor en suelos profundos, aunque también crece en suelos arcillosos, pesados y con drenaje típicos de las sabanas sujetas a inundaciones frecuentes. Tolera suelos

bajos en nutrientes, es resistente y estimulada en su germinación por el fuego (Botero et al., 2012; Lim, 2012).

I.2.2. DIVISIÓN TAXONÓMICA

CLASE: Equisetiopsida C. Agardh SUBCLASE: Magnoliidae Nóvak ex. Takht SUPERORDEN: Asteranae Takht ORDEN: Lamiales Bromhead FAMILIA: Bignoniaceae Juss GÉNERO: Crescentia L. NOMBRE CIENTÍFICO: Crescentia cujete L (Herbario GUAY, 2016)

I.2.3. DENOMINACIONES O SINONIMIAS

En el continente americano, se reconoce con diferentes nombres vulgares entre los que están: Calabash, Calabash tree en Estados Unidos; Cujete, Cirián, Tecomate, Guaje en México; Jícaro, Morro, Guacal, Calabacero totumo en América Central, Higuero en Puerto Rico, Calabasa en Cuba, Taparo en Venezuela, Mate, Pilche en Ecuador, Huingo en Perú, Cuite en Brasil (Salazar, 2001; Lim, 2012).

I.2.4. SINONIMIA BOTÁNICA

Crescentia acuminata Kunth; Crescentia angustifolia Willd. ex Seem; Crescentia arborea Raf; Crescentia cujete var. puberula Bureau & K. Schum; Crescentia cuneifolia Gardner; Crescentia ovata Burm.f; Crescentia cuneifolia Gardner; Crescentia spathulata Miers; Crescentia fasciculata Miers (Lim, 2012).

I.2.5. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

Es un árbol que alcanza una altura que oscila entre los 5 a 12 m y diámetros de hasta 30cm. Su vida oscila entre los 100 y 200 años, presentan una forma irregular, copa amplia y muchos intersticios entre las ramas, estas siguen un patrón dicotómico en su tronco y a medida que crecen se dividen a su vez en dos. Hojas simples, fasciculadas, de varios tamaños en cada fascículo, láminas espatuladas a oblanceoladas de 5-20*3-6cm, base cuneada, ápice usualmente obtuso hasta redondeado y corto-acuminado, cartáceas, 5-14 pares de venas laterales, glabras. Inflorescencia caulinar, una flor solitaria, o en pares, pedicelos lepídotos. Cáliz bajo bilabiado, verde. Corola gamopétala verde claro, 4-7*3- 4.5cm. Estambres 4, insertos. Ovario superior, ovoide, lepídoto, 1-locular (Jarquin , 2012). Frutos globosos, indehiscentes, de 15 a 40cm de diámetro con un pericarpio duro y abundante pulpa cuyo interior rodea numerosas semillas (Salazar, 2001).

I.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA

Según estudios de Espitia et al., (2011), revelan la presencia de lapachona, ácido gentísico, saponinas y 1,4-naftoquinonas, esta última con actividad citotóxica. La pulpa del fruto con la semilla triturada contiene un 14% de proteína y un 60% de carbohidratos (Botero et al., 2012). Recalde (2015) menciona que la pulpa cruda del fruto de C.cujete L. contiene ácidos orgánicos como el cianhídrico, clorogénico, cítrico, crescéntico, tánico, tartárico y alcaloides cuaternarios, polifenoles y cromóforos lipófilos.

El tamizaje fitoquímico de las hojas y tallo demuestra alcaloides cuaternarios, esteroles insaturados y polifenoles. Las hojas contienen ácido caféico. La madera contiene naftoquinonas (Recalde, 2015). El estudio fitoquímico preliminar mostró la presencia en el fruto de alcaloides cuaternarios y polifenoles. Como se indica en la tabla Nº I, realizado en la hoja, se demostró que contiene diversos grupos de compuestos cuya relación varía dependiendo del extracto utilizado (TRAMIL, 2005).

Tabla Nº I. Compuestos obtenidos en la hoja Esteroide Cumarina Heterósido Compuesto Extracto triterpeniode flavónica flavónico fenólico Éter de + - - - petróleo Cloroformo + - - - Etanol 90% + - ++++ ++ Infusión ++ (TRAMIL, 2005)

Existe también la presencia de terpenos: α y ß-amirina, ß-sitosterol, estigmasterol, asperulósido, aucubina, plumierida; bencenoides: ácido gentísico- 3-hidroxi metil-diona; alcanos: triacontanol (TRAMIL, 2005).

En cuanto a las semillas, (Espitia-Baena et al., 2011; Recalde, 2015) señalan que éstas contienen un 37% de aceite fijo parecido al aceite de oliva, que está constituido por ácidos oleico 59.4%, linoléico 19.3% y saturados 19.7%. Luna (2007) menciona que aproximadamente en el aceite de mate, el 52 % corresponde a ácido oleico, 17 % a ácido linoléico, 16 % a ácido palmítico y 10,6 % es ácido esteárico; otros constituyentes de la semilla son azúcares, ácido crescéntico, b- sitosterol, estigmasterol, glucósidos iridoides como la asperulosida y la plumierida.

I.3.1. ÁCIDOS GRASOS

Los ácidos orgánicos monocarboxílicos con estructura de cadena lineal, forman parte de otros lípidos unidos casi siempre por medio de enlaces éster, y rara vez amida (Luna, 2007). Tiene estructura de cadena lineal anfipática con un extremo polar carboxilo y una cadena apolar que finaliza con un grupo metilo (Argüeso et al., 2011). Según la naturaleza de la cadena carbonada, los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados, lineales, ramificados o alicíclicos, y pueden contener como sustituyentes grupos hidroxilo u oxo (Luna, 2007).

Por razones de biosíntesis, en los organismos superiores sólo existen ácidos grasos con un número par de átomos de carbono y en función de ese número se clasifican como indican las Tabla Nº II, III y IV ácidos grasos de cadena corta (≤ 10 átomos de carbono), de cadena media (12 o 14) y de cadena larga (≥16). Según la presencia o no de dobles enlaces en su cadena, se habla de ácidos grasos saturados cuando carecen de ellos, monoinsaturados cuando tienen un doble enlace, y poliinsaturados cuando tienen al menos 2 dobles enlaces (Argüeso et al, 2011).

Los más abundantes son por lo general, los ácidos grasos lineales, con número par de átomos de carbono, generalmente superior a 12 e inferior a 24. Son frecuentes las cadenas insaturadas con enlaces dobles en cis, como el oleico, 9- octadecenoico, o el linoléico, 9,12-octadecadienoico (Luna, 2007). Según la posición del último doble enlace respecto al último átomo de carbono como indican las Tablas Nº II y III, los ácidos grasos insaturados se clasifican en w3, w6, w7 y w9. Por reacciones multienzimáticas los ácidos grasos insaturados pueden transformarse entre sí, aunque los mamíferos carecen de enzimas desaturasa que permitan incluir dobles enlaces en las posiciones w3 y w6 ,por lo que los ácidos grasos de esas dos series no son interconvertibles entre sí en el hombre y sus precursores, siendo así incorporados en la dieta (Argüeso et al, 2011).

Tabla Nº II Ácidos grasos monoinsaturados

Nombre Símbolo y estructura Características y procedencia Líquido, más

CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH) cis; w9 abundante en el ser Oleico humano; presente en oliva, aguacate Semilíquido.

Cadena Larga Cadena CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH) trans; w9 Hidrogenación del Elaídico ác. oleico, presente en margarinas

(Argüeso et al, 2011) 9

Tabla Nº III Ácidos grasos saturados Nombre Símbolo y estructura Características y procedencia

CH3(CH2)4COOH Líquido, incoloro y Capróico viscoso. Grasas y aceites vegetales. CH (CH ) COOH 3 2 6 Leche de mamíferos, Caprílico aceite de coco y palma.

Cadena corta Cadena

CH3(CH2)10COOH Sólido, aceite de semilla Laúrico de palma y coco, leche humana, vaca y cabra. Líquido, incoloro, CH3(CH2)12COOH manteca de nuez Mirístico moscada, aceite de palma Cadena media Cadena y ballena.

CH3(CH2)14COOH Sólido, blanco, presente Palmítico en carnes, lácteos y aceites de coco y palma. Sólido de aspecto céreo, CH3(CH2)16COOH presente en grasas y Esteárico

Cadena larga Cadena aceites vegetales y animales. (Argüeso et al, 2011)

Tabla Nº IV Ácidos grasos poliinsaturados Nombre Símbolo y estructura Características y

procedencia Ác. Graso esencial, HOOC(CH ) CH=CH–CH CH=CH(CH ) CH 2 7 2 2 4 3 presente en semillas de Linoléico girasol, soja, huevos,

aves de corral.

HOOC(CH2)5CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2- Docosapent CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH3 Leche de mamíferos, aenoico aceite de coco y palma. (DPA) Eicosapenta HOOC(CH2)3CH=CH-CH2CH=CH-CH2-CH=CH-CH2- CH=CH-CH CH=CH-CH CH enoico 2 2 3 Aceite de pescado Cadena larga Cadena (EPA) HOOC(CH2)7CH=CH-CH2CH=CH-CH2CH=CH-CH2- Ác. Graso esencial, CH3 presente en pescado, α-Linolénico semillas de lino y grasa animal (Argüeso et al, 2011)

I.3.2 ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS PARA ACEITES VEGETALES

El análisis de las propiedades fisicoquímicas de los alimentos es uno de los aspectos principales en el aseguramiento de su calidad. Este análisis cumple un papel muy importante en la determinación del valor nutricional de los alimentos, en el control del cumplimiento de los parámetros exigidos por los organismos de salud y también para el estudio de las posibles irregularidades como adulteraciones, falsificaciones, etcétera. Tanto en alimentos terminados como en sus materias primas (Uriel, 2012).

Las grasas y los aceites son triglicéridos con diferentes composiciones de las cadenas de alquilo en función de su origen (Salimon et al., 2012). La identificación de las características fisicoquímicas del aceite tiene una importancia práctica y proporciona las bases para la calidad e idoneidad de los aceites (Barkatullah et al., 2012), en particular las cualidades físicas y el valor nutricional (Angaye et al., 2015).

La composición química proporciona información sobre el contenido total de ácidos grasos saturados e insaturados, que a menudo se utilizan como indicadores de calidad para determinar la estabilidad y la oxidación de grasa y aceite (Ogungbenle, 2014). Los aceites que contienen ácidos grasos insaturados, son más deseables como alimentos y sirven para reducir niveles de colesterol en suero sanguíneo. (Ogungbenle et al., 2015).

I.4. ACTIVIDAD BIOLÓGICA

1.4.1. USO MEDICINAL

El totumo en la medicina se emplea para diferentes infusiones: el extracto hidroalcohólico (95%) de hoja (5 mg/mL) presentó una actividad antimicrobiana in vitro contra Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus. La maceración hidroalcohólica de hoja inhibió el crecimiento in vitro de Salmonella typhi. El

extracto etanólico de hoja y tallo mostró acción antibacteriana in vitro contra Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Escherichia coli (TRAMIL, 2005). Las hojas se usan para tratar problemas de hipertensión (Botero et al., 2011),

La pulpa cruda se consume como un antiparasitario y cocida se utiliza para quitar la sarna a los perros y caballos (Álvarez Henao, 2010), y se ingiere para tratar la diarrea, dolor de estómago, resfriados, bronquitis, tos, asma y uretritis (Botero et al., 2011). En 2008, en Colombia se publicó el listado de plantas medicinales aprobadas con fines terapéuticos por el INVIMA, donde se permite el uso del jarabe con extracto de pulpa del fruto fresco como coadyuvante en el tratamiento de trastornos respiratorios leves (Espitia-Baena et al.,2011).

Según un estudio realizado en el noroeste de Colombia por Otero et al., (2000) sobre la capacidad neutralizante de extractos de plantas contra el efecto hemorragico del veneno de Bothrops atrox, indica que el extracto del fruto inmaduro de C.cujete L, presenta una moderada actividad antihemorrágica en dosis de 4mg/ratón. La pulpa de fruto inhibió el crecimiento de cepas de Streptococcus pneumoniae (TRAMIL, 2005).

En la ganadería se lo ha estado implementando como suplemento y fitofármaco para tratar la mastitis, los golpes de los animales y la retención placentaria debido a su efecto abortivo (Botero et al., 2012).

I.4.2. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

El estudio de la capacidad antioxidante de las plantas medicinales y alimenticias ha crecido en las últimas décadas ya que un número importante de productos obtenidos de éstas, como los aceites, alcaloides y los polifenoles, poseen efectos antioxidantes, los cuales son evidenciados mediante diferentes ensayos in vitro e in vivo (Rivas et al., 2016).

Los antioxidantes son compuestos que pueden inhibir o retardar la oxidación de otras moleculas como lípidos ,proteínas y ácidos nucleicos (Angulo, 2014), inhabilitando la iniciación y/o propagación de las reacciones en cadena de los radicales libres (Rivas et al., 2016).

Pueden actuar de las siguientes formas:

 Previniendo la formación de especies reactivas de oxígeno (ERO).

 Interceptando ataque de ERO.

 Secuestrando los metabolitos reactivos y convirtiéndose en moléculas menos

reactivas.

 Amplificando la resistencia de las dianas biológicas sensibles al ataque de

ERO.

 Facilitando la reparación del daño causado por ERO.

 Manteniéndose un ambiente favorable para la actuación de otros antioxidantes. (Martinez, 2011).

I.4.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO POR EL MÉTODO DEL DPPH

El ensayo consiste en determinar la capacidad capturadora del radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) del aceite siguiendo el procedimiento propuesto por Brand-Williams y col., (1995).

DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo), es un radical libre estable, el cual disuelto en un alcohol como etanol o metanol tiene una coloración azul-violeta. En presencia de un antioxidante el DPPH es convertido a 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo con un color amarillo (Cervato y col, 2000).

En su forma de radical libre, el DPPH• absorbe a 515 nm - 517 nm y cuando sufre reducción por un antioxidante, esta absorción desaparece. En consecuencia, la desaparición del DPPH• proporciona un índice para estimar la capacidad del compuesto de prueba para atrapar radicales. El modelo que explica la actividad de un compuesto como antirradical se ejemplifica con la siguiente ecuación:

Figura 1. Estructura del DPPH antes y después de la reacción antioxidante (Tovar, 2013).

Donde AH es un antioxidante que actúa como antirradical donando átomos de hidrógeno, dando como resultado radicales con estructuras moleculares neutras que detendrán la reacción en cadena, tal es el caso de los fenoles. El nuevo radical formado (A∙) puede interactuar con otro radical para formar moléculas neutras (DPPHA, A-A). La reacción entre el DPPH• y un compuesto depende de la conformación estructural del mismo, por lo que las comparaciones cuantitativas no siempre son apropiadas (Martínez, 2011).

Los resultados de este método son expresados en IC50, el cual se define como la concentración necesaria de muestra para reducir el 50% de la cantidad inicial de DPPH y se expresa como la relación molar de cada componente por radical. Los niveles bajos de IC50 indican alta eficacia en la donación de hidrógeno (Silva y col., 2000).

Desde el punto de vista metodológico, el DPPH es un método fácil y exacto para la medición de actividad antioxidante en frutas y verduras por lo que es recomendado para medir la actividad antioxidante en este tipo de muestras (Gil y col., 2000).

Este método presenta también la ventaja de ser una prueba no enzimática y es utilizado para proveer información básica en la reactividad de compuestos para el secuestro de radicales (Silva y col., 2000).

I.5. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA PARA ACEITES COMESTIBLES

1.5.1. DENSIDAD RELATIVA A 25/25°C, (D25)

Es la relación entre la masa de un volumen dado de una sustancia y la masa de un volumen igual de agua en las mismas condiciones de presión y temperatura a 25°C para aceites. La densidad relativa es un número abstracto. (Norma INEN 035, 1973-08).

1.5.2. DETERMINACIÓN DE PÉRDIDA POR CALENTAMIENTO

La determinación exacta de humedad es difícil, pero en los alimentos es de gran importancia, el porcentaje de humedad en alimentos es menor en relación al de las frutas y verduras; Incluso en los aceites existe una pequeña cantidad de agua. Es muy importante determinar la humedad ya que sirve para conocer en qué proporción se encuentran los nutrientes, además indica la estabilidad de los alimentos (Recalde, 2015).

Ayuda a determinar el contenido de humedad y otras sustancias volátiles. Se calienta el producto a 103 °C hasta eliminar completamente la humedad y las materias volátiles (Norma INEN 039, 1973-08).

1.5.3. ÍNDICE DE YODO

En condiciones normalizadas, los glicéridos de los ácidos grasos insaturados presentes en el aceite, se unen con una cantidad definida de halógeno, contenida en la solución de Wijs, de monocloruro de Yodo. El índice de Yodo esta correlacionado con el índice de refracción y densidad. El grado de absorción se estima valorando el yodo en exceso con sustancias halogenadas (Rodriguez, 2013).

Es una medida del grado medio de insaturación de ciertas sustancias orgánicas, expresada como centigramos de yodo absorbidos, bajo condiciones determinadas, por cada gramo de sustancia (Norma INEN 037, 1973-08).

1.5.4. ÍNDICE DE PERÓXIDO

Con la medida de este parámetro, se estima el grado de oxidación inicial del aceite, indica igualmente el deterioro que se puede haber dado en compuestos antioxidantes, como polifenoles y tocoferoles, se expresa en miliequivalentes de oxígeno activo por kilogramo de grasa (Norma INEN .0277, 1978-02).

Es la medida de peróxidos contenidos en el aceite. Durante el almacenaje la formación de peróxidos es baja durante el periodo inicial. Pero puede variar en unas pocas semanas o algunos meses, de acuerdo al aceite o grasa en particular, la temperatura, etcétera y esto debe tomarse en cuenta, cuando se interpretan los resultados cuantitativos (Velez de Aviles, 1998).

1.5.5. ACIDEZ

La acidez de los aceites, determina el porcentaje expresado en ácido oleico de ácidos grasos libres de un aceite, expresado convencionalmente como gramos de ácido oleico, laúrico o erúcico por cada 100 g de sustancia (Norma INEN 038, 1973-08).

La presencia de ácidos libres en una grasa, es la consecuencia de fermentaciones, frutos en mal estado sanitario, frutos caídos al suelo, frutos

atrojados, etc., de procesos de transformación de fruto incorrectos (Jiménez, 2011).

1.5.6. ÍNDICE DE ACIDEZ

Es el número de miligramos de hidróxido de potasio requeridos para neutralizar los ácidos grasos libres contenidos en 1 gramo de grasa o aceite (Norma INEN 038, 1973-08).

1.5.7. ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN

Es el número de miligramos de hidróxido de potasio (KOH) requeridos para saponificar 1 gramo de grasa o aceite (Norma INEN 040, 1973-08).

I.6. CROMATOGRAFO DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRO DE MASAS (GCMS)

La cromatografía de gases es una técnica separativa que tiene la cualidad de conseguir la separación de mezclas muy complejas. Pero una vez separados, detectados, e incluso cuantificados todos los componentes individuales de una muestra problema, el único dato del que se dispone para la identificación de cada uno de ellos es el tiempo de retención de los correspondientes picos cromatográficos. Este dato no es suficiente para una identificación inequívoca, sobre todo cuando se analizan muestras con un número elevado de componentes, como es frecuente en cromatografía de gases (Gutiérrez et al., 2002).

Por otra parte, la espectrometría de masas puede identificar de manera casi inequívoca cualquier sustancia pura, pero normalmente no es capaz de identificar los componentes individuales de una mezcla sin separar previamente sus componentes, debido a la extrema complejidad del espectro obtenido por superposición de los picos de cada componente (Gutiérrez et al., 2002).

La unión GC-MS es sumamente propicia, sinérgica, ya que los compuestos aptos para el análisis tanto por GC como por MS con impacto de electrones (EI, técnica de ionización de las moléculas más usada en GC-MS), son moléculas con temperaturas de ebullición, pesos moleculares o polaridades bajos o medianos, presentes en mezclas en el rango de concentraciones (ppb– ppm) similar para ambas técnicas. Además su análisis transcurre en el mismo estado de agregación (fase vapor) (Stashenko & Martínez , 2010).

En principio, se trata de dos técnicas que trabajan en fase gaseosa y necesitan una muy pequeña cantidad de muestra para su análisis, por lo que son muy compatibles (Gutiérrez et al., 2002).

CAPÍTULO II

MATERIALES Y MÉTODOS

II.1. METODOLOGÍA

En el presente trabajo de titulación, se emplearon alrededor de 30 frutos de mate o totumo con un rendimiento de 250–500 semillas por fruto, proveniente de la ciudadela: La Kennedy en la Avenida San Jorge de la ciudad de Guayaquil, provincia del Guayas. Estas semillas obtenidas se secaron y se procedió a la extracción de aceite de las semillas por el método de Soxhlet con el empleo de n- hexano como disolvente. La especie fue identificada en la facultad de Ciencias Naturales, en el Herbario Guay y el número de herbolización asignado fue: 015 (ver Anexo 1).

Para determinar las características fisicoquímicas del aceite, se realizaron los respectivos análisis, en los Laboratorios de Productos Naturales y PROGECA de la Facultad de Ciencias Químicas. Para este estudio el material vegetal se subdividió en 12 grupos de 40 g cada uno y fueron extraídos por Soxhlet por un tiempo aproximado de 3 a 4 horas. Se realizó una investigación de tipo experimental.

II.2. EXTRACCIÓN DE ACEITE

Las semillas colectadas fueron lavadas y secadas en estufa MEMMERT a 40°C antes de ser empleadas. Una vez secadas fueron molidas con el empleó de un molino manual para grano Toolcraft Tc2541 con un tamaño de tamiz de 500 mm. Para la extracción se empleó un equipo Soxhlet en el cual se colocó un dedal con el polvo de las semillas (40 g) pesado en balanza de precisión marca BOECO (Alemania). En cada proceso de extracción se utilizaron 250 mL de n-hexano, que después de trascurrido entre tres o cuatro horas fue concentrado en rotaevaporador Heidolph. Se realizó 12 veces el experimento.

FÓRMULA  R: Rendimiento expresado el porcentaje 푉표푙푢푚푒푛 (푚퐿)  V: Volumen del aceite fijo obtenido en mL %푅 = ∗ 100 푃푒푠표 (푔)  P: Peso de semillas empleado

II.3. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO

Los métodos empleados en esta fase experimental fueron basados bajo la norma técnica ecuatoriana INEN para Grasas y aceites comestibles.

II.3.1. DENSIDAD RELATIVA A 25/25°C, (D25)

El ensayo se realizó por triplicado.Pesa el picnómetro limpio y seco con tapa en balanza Analítica BOECO, el picnómetro con agua al ras con tapa . pesó la muestra en el picnometro previamente seco y con tapa,calcular.

FÓRMULA  m1: picnómetro con agua 푚2 − 푚  m2 : picnómetro con muestra 푑 = 푚1 − 푚  m: picnómetro vacío

II.3.2. DETERMINACIÓN DE PÉRDIDA POR CALENTAMIENTO

Se pesó la cápsula de vidrio vacía en la balanza analítica, luego se pesó de 2- 3 g de muestra en la cápsula de vidrio en la balanza analítica KERN. Se llevó a la estufa MEMMERT a temperatura de 105ºC por 2 horas, luego se sacó de la estufa la cápsula, se dejó enfriar y se pesó la cápsula con la muestra. Este ensayo se realizó por triplicado pero reduciendo el período de calentamiento a 30 min, hasta que la diferencia entre los resultados de dos operaciones de pesaje sucesivas no exceda de 0,002 g.

FÓRMULA  p: pérdida por calentamiento, en porcentaje de masa  m: masa del cristalizador, en gramos (g) m1 − m2  m1: masa del cristalizador, con muestra, antes del P = ∗ 100 m1 − m calentamiento, en (g)  m2: masa del cristalizador, con muestra, después del calentamiento, en (g)

II.3.3. ÍNDICE DE YODO

En una fiola de 125 mL se pesó de 0.5-1 g de muestra en balanza analítica KERN, se disuelve en 10 mL de cloroformo y se añade con pipeta volumétrica 25 mL de reactivo de Wijs, se deja en una gaveta para proteger de la luz por 30 minutos, agitando de vez en cuando; en la misma forma, se procedió con un blanco. Transcurrido el tiempo indicado, se lo sacó de la gaveta y se añadió 10 mL de solución de yoduro de potasio a 15% y 100 mL de agua destilada. Se tituló inmódicamente con la solución de tiosulfato de sodio 0.1N, utilizando solución reactiva de almidón, como indicador final de la titulación. Se agitó el líquido del frasco enérgicamente mientras se tituló. Con el objeto de que reaccione el yodo que pueda hallarse disuelto en el cloroformo. Simultáneamente, se procedió a titular el blanco.

FÓRMULA

0.127∗(V−V1)∗N I1 = *100 Peso de la Muestra

II.3.4. ÍNDICE DE PERÓXIDO

En una fiola de 125 mL con un tapón de vidrio se pesó 5.00 ± 0.05 g de muestra de aceite en balanza analítica KERN. Se agregó 30 mL de solución de ácido acético–cloroformo, luego se agitó para disolver la muestra. Se Agregó 0.5 mL de solución saturada de ioduro de potasio KI y se dejó que la solución repose, agitando ocasionalmente 1 minuto exacto y luego se agregó inmediatamente 30 mL de agua destilada. Se realizó la titulación con tiosulfato de sodio 0.1N, acondicionándolo gradualmente, agitando constantemente hasta que el color amarillo casi desaparezca. Se agregó 0.5 mL de la solución de almidón, y se continuo la titulación con agitación. Cerca del punto final se agregó el tiosulfato en gotas hasta que desaparezca el color azul. Finalmente se hizo una determinación con un blanco. La titulación no debe exceder 0.1 mL de la solución de tiosulfato de sodio 0.1N.

FÓRMULA

Consumo TioSulfato ∗ N Tiosulfato I = ∗ 1000 Peso de la Muestra

II.3.5. ACIDEZ

En una fiola se pesó la fiola en balanza analítica KERN, tarar y luego pesar 5g de muestra. Añadir 20 mL de alcohol neutro y 20 mL de Dietil éter. Agitar y añadir 2-3 gotas de solución indicadora Fenolftaleína. Proceder a titular con Hidróxido de Sodio 0.1N hasta aparición de color rosado.

FÓRMULA

Consumo Na(OH) ∗ N Na(OH) ∗ Peso Molecular en mLeq Ác. Graso A = ∗ 100 Peso de la Muestra

II.3.6. ÍNDICE DE REFRACCIÓN

En el refractómetro THERMO Electron Corporation, se limpió con alcohol la superficie donde se agrega la muestra, luego se agregó una gota de muestra en el Refractómetro a 25 ˚C y anotar la medida. Realizar prueba por triplicado.

II.3.7. ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN

Se pesó alrededor de 3g en balanza analítica BOECO GERMANY, dentro de un frasco Erlenmeyer de 250 mL de capacidad. Agregue cuidadosamente por medio de una pipeta volumétrica, 25 mL de una solución alcohólica de 0.5 N de KOH. Calentar en baño María por 30 minutos o hasta que la muestra esté totalmente homogenizada que indica que está totalmente saponificada, dejar enfriar. Agregar 1mL de solución indicadora de fenolftaleína y se titula el exceso de álcali con solución 0.5 N de HCl. Realizar determinación en blanco y muestra por triplicado.

FÓRMULA  SAP: índice de saponificación del producto, en mg/g

 V2: volumen de solución de ClH o H2SO4 empleado en la titulación de la muestra, en mL 56.1 (V1 − V2) ∗ N  V1: volumen de solución de ácido clorhídrico o SAP = m sulfúrico empleado en la titulación del ensayo en blanco, en mL  N: normalidad de la solución de ácido clorhídrico o sulfúrico.  m: peso de la muestra, en g

II.3.8. CONTENIDO DE ÁCIDOS GRASOS

Se pesó 30 mg muestra en una balanza analítica BOECO (Alemania), se agregaron 3 mL de cloruro de acetilo al 10 % en metanol (disolución metilante). Se cerró herméticamente y se calentó a 85 °C por 2 h con agitación vigorosa ocasional. Al cabo de ese tiempo se llevó a temperatura ambiente, se adicionaron 4 mL de n˗hexano y 4 mL de agua destilada. Agitar en una zaranda por 15 min y dejar reposar. De la fase orgánica (superior) se extrajeron 3 mL hacia otro tubo de ensayo, se le adicionaron 4 mL de n˗hexano y 4 mL de NaOH a 1 mol/L en metanol, se cerró y se agitó en zaranda durante 15 min. Se dejó reposar y extrajeron 2 mL de la fase orgánica, de la cual se tomó 1 µL para el análisis por cromatógrafo de gases (Shimadzu, Japón) GCMS-QP2010 Plus, equipado con un detector selectivo de masas, serie QP2010. La inyección de la muestra se realizó manualmente por el modo “split” con una relación de 1:20, siendo la temperatura del inyector 250 °C. La separación se realizó en una columna capilar Crossbond de 30 m × 0,25 mm DI y 0,25 µm de espesor de película. La temperatura del horno se programó a 100 °C (3 min), 250 °C (10 min) y 280 °C hasta completar los 30 min. Como gas portador se utilizó helio a un flujo de 1 mL/min. El espectrómetro de masas fue operado en el modo de ionización electrónica (IE) a 70 eV y con una temperatura de la fuente iónica e interfase de 280 °C. La detección se realizó en el modo de barrido total desde 30-500uma. Las estructuras de los ácidos grasos fueron propuestas sobre la base del proceso de fragmentación general así como por la base de datos NIST 21, con más un 93 % de confiabilidad en todos los

casos. La cuantificación de los compuestos fue realizada por normalización interna del área bajo la curva de cada pico cromatográfico (Indarti et al., 2005).

II.4. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO POR EL MÉTODO DEL DPPH

El ensayo consistió en determinar la capacidad capturadora del radical libre estable 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) del aceite siguiendo el procedimiento propuesto por Brand-Williams y col., (1995).

Para la preparación del estándar Trolox se emplea metanol a partir de una solución madre de 2 mM y posteriores disoluciones, de 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 y 0,9 mM en metanol, para preparar la curva patrón. La absorbancia se mide con cubetas de vidrio estándar de 10 mm a 515 nm en Espectrofotómetro UV-VIS modelo 4001/4. La absorbancia característica de este radical que posee un color violeta intenso, disminuye en presencia de un antioxidante (que sea capaz de capturar un electrón libre) u otro radical, lo que permite cuantificar la capacidad capturadora de radicales libres que poseen ciertos compuestos mediante la determinación del grado de decoloración que provoca a una solución metanólica de DPPH (Brand- Williams y col., 1995).

Muestra:

El aceite (2 mL) se mezcló en metanol en proporción 1:1 V/V, se agitó durante una hora y se centrifuga a 2500-3000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. Del extracto obtenido se tomó 100 µL y se diluyeron en proporciones con metanol de 1:1, 1:2 y 1:3 hasta lograr una absorbancia dentro del rango de linealidad. Las lecturas del Trolox y los aceites se realizaron por triplicado de manera cinética hasta 30 minutos (cada 10 minutos) para comparar las velocidades de reacción.

CAPÍTULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

III. 1. EXTRACCIÓN DE ACEITE

El rendimiento del aceite fijo en la extracción por Soxhlet fue de 36,57 ± 1,21 %. El valor obtenido en la fase experimental fue superior a otros reportes de la literatura como por ejemplo 19,31 %, Luna (2007) y 28,12 % López et al. (2015). Este resultado sugiere que la extracción por Soxhlet es un método eficiente de extracción de aceites vegetales, con la ventaja de que los mismos pueden ser obtenidos en cortos períodos de tiempo. El tiempo promedio de extracción fue de 3 horas.

III.2. ANÁLISIS FISICOQUÍMICO

III. 2.1. DENSIDAD RELATIVA

El valor obtenido fue de 0.9045 g/mL, valor mayor a los obtenidos por Luna (2007), siendo estos resultados de 0.8874 g/mL y 0.8876 g/mL. También es comparable a otros de usos alimenticios e industriales como el aceite de soya (Glycine max L.) con una densidad de 0.919g/mL, el aceite de maní (Arachis hypogaea L.) con 0.914g/mL y el aceite de oliva (Olea europea L.) refinado con 0.910g/mL.(Stevenson et al., 2007; Sakouhi et al. 2008; Russo et al., 2012).

III.2.2. PÉRDIDA POR CALENTAMIENTO

El ensayo dio como resultado un valor de 1.38 %, dicho valor resulta de la pérdida de agua y materias volátiles presentes en la muestra.

III. 2.3. ÍNDICE DE REFRACCIÓN

El índice de refracción dio un valor de 1.46 a 25ºC, valores similares a los obtenidos por Luna (2007) del aceite de mate obtenidos de dos regiones Estanzuela y San Agustín, Guatemala, dando 1.46 a 25°C en ambos casos. En relación con otros tipo de aceites, como el aceite de oliva cuya especificación dada en la NTE INEN 29:2012 es de 1,466 -1,4685 a 25 ºC y los resultados dados por Navas, (2010), del aceite de uva de 1.453 a 25°C.

III.2.4. ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN

El valor promedio obtenido en el ensayo fue de 191.39 mg KOH/g, en comparación a los valores obtenidos por Luna, (2007) que fueron de 174.78 mg KOH/g muestra y 179.90 mg KOH/g muestra respectivamente. Según el Codex Alimentarius para el aceite de oliva, el índice de aceptabilidad oscila de 184 mg KOH/g -196 mg KOH/g.

III. 2.5. ACIDEZ

El valor promedio obtenido en este ensayo de ácido graso libre fue de 1.314 expresado como g de ácido oleico por cada 100 g de aceite fijo, debido a que éste ácido graso predomina en la muestra. Siendo éste un valor mayor a los datos obtenidos por Luna, (2007) de 0.065 % y 0.090 % en aceite de semilla de mate.

En comparación con el aceite de oliva el Codex Alimentarius, especifica un valor máximo de 2,0 % para aceite de oliva virgen y 3,3 % para aceite de oliva común.

III.2.6. ÍNDICE DE PERÓXIDO

- El valor promedio obtenido en este ensayo fue de 3,997 meq O2/Kg ± 2.081*10 3%, siendo un resultado superior en comparación a los valores obtenidos por Luna

(2007) de 0.43 y 0.80 meq O2/Kg ,encontrándose dentro de las especificaciones establecidas por el Codex Alimentarius para aceites comestibles siendo aceptable hasta 15 meq O2/Kg de aceite.

Comparada con otro tipo de aceite como el de sacha inchi, Martinez, (2011) obtuvo 11,5313 meq O2/Kg, siendo un valor mayor al obtenido del aceite de mate.

La NTE INEN 29:2012 para aceite de oliva indica que debe tener un valor máximo de10 y 20 meq O2/1Kg, dependiendo de la clase de aceite de oliva.

III.2.7. INDICE DE YODO

El valor promedio obtenido en este ensayo fue de 120,97 mg/100g aceite. Resultado superior a los valores obtenidos por Luna (2007) de 90.95 mg/100g aceite y 89.32 mg/100g aceite. En comparación con otro tipo de aceite como el de girasol el Codex Alimentario establece un rango de 118-141mg/100g, encontrándose dentro de este rango.

El valor obtenido es superior a los permitidos por la NTE INEN 29:2012 para aceites de oliva siendo estos de 79 mg/100g aceite – 89 mg/100g aceite.

III.2.8. CONTENIDO DE ÁCIDOS GRASOS

Como se muestra en la Tabla N° V, los ácidos insaturados son los principales componentes del aceite, siendo el éster metílico del ácido oleico (63,9%) el componente mayoritario, seguido del éster metílico del ácido palmitoleico (16,7%).

En general, el contenido de ácidos grasos insaturados sobrepasa el 80%, de los cuales 77,97% corresponde a ácido oleico. Los ácidos grasos saturados en conjunto constituyen el 17,61% del total y el éster del ácido esteárico constituye el 74,38%.

Los aceites que contienen más cantidad de ácidos grasos insaturados, son más deseables como alimento y pueden ser utilizados en la reducción de colesterol (Ogungbenle & Afolayan, 2015). Espitia-Baena et al., (2011) informan un contenido de un 20% de aceite en las semillas y como componente mayoritario al ácido oleico con un 52%. En este reporte no se establece las condiciones de extracción, ni la forma en que fue evaluada la composición química.

Tabla N° V Composición de ácidos grasos (%) del aceite de C. cujete.

TIEMPO DE PICO NOMBRE % RETENCIÓN 1 3.857 Estireno 0,02 2 20.773 n-Pentadecanoato de metilo 0,03 3 21.371 Éster metílico del ácido Palmitoleico (C16:1) 16,74 4 21.556 Éster metílico del ácido palmítico (C16:0) 0,26 5 21.791 Ácido palmítico (C16:0) 0,04 6 22.148 Éster metílico del ácido margárico (C17:0) 0,25 7 22.720 Éster metílico del ácido oleico (C18:1) 63,92 8 22.835 Éster metílico del ácido esteárico (C18:0) 13,31 9 22.905 Ácido oleico (C18:1) 0,72 10 23.045 Ácido esteárico (C18:0) 0,33 11 23.229 Ácido linoléico (C18:2) 0,10 12 23.299 Ácido behénico (C22:0) 0,10 13 23.496 Éster metílico del ácido nonadecanoico (C20:0) 0,10 14 24.107 Ácido Cis-13-eicosenoico (C20:1) 0,44 15 24.336 Ácido araquídico (C20:0) 1,91 16 25.055 Ácido lignocérico (C24:1) 0,05 17 25.360 Éster metílico del ácido heneicosanoico (C21:0) 0,10 18 26.270 Ácido pentacosanoico (C25:0) 0,22 19 26.665 Éster metílico del ácido behénico (C22:0) 0,66 20 27.810 Ácido cerótico (C26:0) 0,06 21 28.325 Éster metílico del ácido tricosanoico (C23:0) 0,06 22 29.801 Ácido montánico (C28:0) 0,07 23 30.494 Éster metílico del ácido tetracosanoico (C24:0) 0,38

III.3. ENSAYO DPPH

En la literatura consultada no se encontró información sobre capacidad antioxidante in vitro para aceites obtenidos a partir de especies de C. cujete L. Para poder establecer una comparación de estos resultados se consideró el procedimiento de extracción empleado en esta investigación.

La selección del Trolox como sustancia de referencia en este estudio se debió en primer lugar a su uso reiterado en estos ensayos, a la estabilidad química de la molécula y la disponibilidad en el laboratorio. En la tabla N° VI se presentan los resultados obtenidos para el análisis de linealidad por el método de Lambert-Beer a una longitud de onda de 515 nm.

TABLA N° VI. Relación entre la concentración del blanco estandarizado Trolox y la absorbancia (Tabla Patrón) Conc (Trolox) A(515nm) A(515nm) A(515nm) Promedio 0,1 0,146 0,143 0,147 0,145 0,3 0,302 0,298 0,304 0,301 0,5 0,458 0,453 0,460 0,457 0,7 0,613 0,607 0,617 0,613 0,9 0,769 0,762 0,773 0,768

El análisis estadístico de la recta de absorbancia contra concentración se presenta en la figura 2.

1,000 y = 0,8923x + 0,0262 0,800 R² = 0,9863

0,600

0,400

ABSORBANCIA 0,200

0,000 0 0 , 1 0 , 2 0 , 3 0 , 4 0 , 5 0 , 6 0 , 7 0 , 8 0 , 9 1 CONCENTRACIÓN

Figura 2. Curva de regresión lineal obtenida del Trolox

La significación del modelo dio una p˂ 0,05 y un R2 de 0,9863. Este valor de R2 demostró que la recta tuvo un buen ajuste en el rango de concentración de Trolox (0,1 a 0,9 µM). Valores semejantes han sido reportados en otros estudios con esta sustancia de referencia: R2= 0,919, (Upadhya et al., 2015) y R2= 0,992, (Parikh et al., 2017).

El aceite se procesó según se indicó en el acápite II.4, por lo tanto se obtuvo el comportamiento de la capacidad de captar radicales libres en tres valores de concentración como se muestra en la Tabla Nº VII.

TABLA N° VII. Datos de la Absorbancia del Blanco y de la Muestra Dilución Absorbancia Media: A(515) m Dif. Blanco 0,526 1:1 0,521 0,526 0,450 0,531 0,401 1:2 0,412 0,408 0,332 0,411 0,207 1:3 0,211 0,21 0,134 0,212 BLANCO 0,0768

A partir de los valores de absorbancia obtenido se calculó el porcentaje de inhibición según la siguiente ecuación:

D. O. m − D. O. b %DPPH: ∗ 100 D. O. DPPH

0.526−0.076 1) %DPPH: ∗ 100 ∶ ퟓퟖ. ퟓퟗퟒ% 0.768 0.408−0.076 2) %DPPH: ∗ 100 ∶ ퟒퟑ. ퟐퟐퟗ% (Valor más cercano al 50%) 0.768 0.21−0.076 3) %DPPH: ∗ 100 ∶ ퟏퟕ. ퟒퟒퟖ% 0.768

Como se puede deducir de los resultados en el aceite fijo extraído de las semillas del mate hay capacidad de capturar radicales libres, lo cual le da a este aceite vegetal un valor agregado. Como se pudiera esperar de una sustancia con capacidad antioxidante en la medida que disminuye la concentración disminuye la capacidad de inhibición de la recaptura de radicales.

En la dilución 1:2 se obtuvo el valor más cercano al 50 % de inhibición por lo que fue utilizada para calcular el valor del IC50. La absorbancia promedio a esta dilución fue de 0,408 lo que equivale a 0,428 µM de Trolox según la ecuación de la recta: 퐀퐛퐬 = 0,8923 x Concentración (trolox) + 0,0262

Considerando que el valor de densidad relativa del aceite es 0,9045 g/mL entonces 2 mL pesan 1,809 g. Es decir, que la capacidad antioxidante del aceite, según la metodología realizada, corresponde a 0,236 µM Trolox/g de aceite o como más comúnmente se expresa 236,5 µM Trolox/Kg de aceite. Este resultado sugiere una buena capacidad antioxidante comparable con otros aceites de uso humano. Por ejemplo el aceite de oliva en condiciones de procesamiento similares presenta en este ensayo de DPPH un valor de 409.78 µmol Trolox/ Kg de aceite y hasta un valor de 779.14 µmol Trolox/ Kg de aceite oliva extra virgen (Samaniego, 2006).

La capacidad antioxidante por este ensayo del DPPH por sí solo no da un resultado que garantice la capacidad antioxidante in vivo del aceite, pero en muchos reportes científicos es un parámetro de referencia. Los estudios de composición química realizados no identifican los posibles compuestos responsables de esta capacidad de atrapar radicales de DPPH por lo que sería muy interesante continuar el análisis del aceite del mate para caracterizar la fracción de insaponificables. La identificación de estos compuestos conjuntamente con la abundancia de ácidos grasos insaturados permite establecer el valor comercial de los aceites vegetales.

CONCLUSIONES

El presente trabajo de Tesis permitió realizar la caracterización fisicoquímica del aceite fijo de mate (Crescentia cujete L.) y con base a los resultados obtenidos, se puede arribar a las siguientes conclusiones:

 Mediante extracción por Soxhlet se logró obtener un rendimiento promedio de 36.57% de aceite fijo de las semillas de la especie.

 Las propiedades fisicoquímicas del aceite obtenido de las semillas son similares a otros aceites vegetales de uso humano como el aceite de oliva, de soya o maíz.

 El perfil lipídico obtenido por CG-EM reveló un contenido de ácidos grasos insaturados totales de alrededor del 80%, siendo el ácido oleico el mayor porcentaje con 63.92%.

 El aceite obtenido mostró capacidad antioxidante mediante el método DPPH,

siendo el CI50 igual a 236,5 µmol Trolox/kg de aceite.

RECOMENDACIONES

 Realizar estudios toxicológicos del aceite de la semilla del Mate, con el fin de garantizar su uso como productos alimenticio y/o cosmético.

 Realizar los mismos análisis en otras especies del género Crescentia tomando en cuenta su ubicación geográfica, tiempo de cosecha o madurez, para comparar el rendimiento de aceite y los resultados obtenidos con la especie estudiada.

 Identificar los compuestos antioxidantes presentes en la fracción insaponificable del aceite obtenido.

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ANEXOS

ANEXO 1: HERBARIO GUAY, DESCRIPCIÓN TAXONOMICA DEL MATE

ANEXO 2: FOTOGRAFÍAS DE LA FASE EXPERIMENTAL

 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

 EXTRACCIÓN DE LAS SEMILLAS

 SECADO DE LAS SEMILLAS

 MOLIENDA DE LAS SEMILLAS

 EXTRACCIÓN DE ACEITE

a) Peso de la Muestra

b) Preparación del equipo

c) Rotaevaporador: Separación de Solvente y Aceite

d) Aceite obtenido

 ANALISIS FISICO-QUÍMICO a) Índice de refracción

b) Densidad Relativa

c) Índice de Acidez

d) Índice de Saponificación

e) Índice de Yodo

f) Humedad

g) Índice de Peróxido

ANEXO 3: GRÁFICAS DEL GC-MS

3 0 . 4 9 7

3 0 . 0 0

2 9 . 8 0 0

2 9 . 2 0 7 2 9 . 0 8 3

2 8 . 7 3 8

2 8 . 3 2 7

2 8 . 0 0 2 7 . 8 1 0

2 7 . 0 4 3

2 6 . 6 6 5

2 6 . 2 6 8

2 6 . 0 0

2 6 . 1 4 9

2 5 . 9 5 3

2 5 . 3 6 1 2 5 . 1 9 8

2 5 . 0 5 5

2 4 . 3 3 7

2 4 . 0 0

2 4 . 1 1 0

2 3 . 9 5 9

2 3 . 7 1 5

2 3 . 5 7 0

2 3 . 4 9 7

2 3 . 3 9 7 2 3 . 3 0 0

2 3 . 2 2 7

2 3 . 0 4 3

2 2 . 9 0 4

2 2 . 8 3 0

2 2 . 7 1 2

2 2 . 2 6 2

2 2 . 0 0

2 2 . 1 5 0

2 2 . 0 0 7

2 1 . 7 9 0

2 1 . 5 5 2 2 1 . 4 4 0

2 1 . 3 7 3

2 1 . 1 3 5

2 1 . 1 0 4

2 1 . 0 4 0

2 1 . 0 0 3

2 0 . 8 9 4

2 0 . 7 7 5

2 0 . 5 4 9 2 0 . 0 0

1 9 . 8 5 4 1 8 . 3 4 1 1 8 . 0 0

1 6 . 0 0 TIC: EST00-1.D \data.ms

1 4 . 0 0

1 2 . 0 0

1 0 . 0 0

1 0 . 0 7 8

9 . 6 7 4 9 . 3 9 2

8 . 0 0 8 . 0 1 4

6 . 0 0

4 . 0 0 3 . 8 5 4

1 e + 0 7

2 e + 0 7

3 e + 0 7

2 0 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0

1 . 2 e + 0 7

1 . 4 e + 0 7

1 . 6 e + 0 7

1 . 8 e + 0 7

2 . 2 e + 0 7

2 . 4 e + 0 7 2 . 6 e + 0 7

2 . 8 e + 0 7

T im e - - > A b u n d a n c e

ANEXO 4. DECOLORACIÓN DE SOLUCIÓN DPPH

ANEXO 5. Certificado de presentación de tema en II Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología

ANEXO Nº 6 Certificado de análisis de Laboratorio PROGECA