DIAGNÓSTICO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS ASOCIADOS
AL CULTIVO DE LA PAPA EN COLOMBIA, CON ENFASIS EN EL VIRUS MOP-
TOP (PMTV, POMOVIRUS).
JOSÉ FERNANDO GIL RAMÍREZ
Tesis de Grado presentada para optar al Título de
Magíster en Ciencias - Biotecnología
DIRECTOR
MAURICIO ALEJANDRO MARÍN MONTOYA I.A., M.Sc., PhD.
ASESOR ESTADÍSTICO
JOSÉ MIGUEL COTES TORRES I.A., M.Sc., PhD
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MEDELLÍN
FACULTAD DE CIENCIAS
2010
1
CONTENIDO
RESUMEN 16
2. OBJETIVOS 23
2.1. Objetivo general 23
2.2. Objetivos específicos 23
3. MARCO TEÓRICO 24
3.1. Virus asociados al cultivo de la papa 24
3.2 Virus asociados al cultivo de la papa en Colombia 27
3.3. Generalidades de algunos virus asociados al cultivo de la papa 30
3.3.1. Familia Virgaviridae 30
Género Pomovirus 32
Potato mop-top virus (PMTV) 33
3.3.2. Familia Potyviridae 36
Género Potyvirus 37
Potato virus Y (PVY) 39
3.3.3. Familia Alphaflexiviridae 42
Género Potexvirus 43
Potato virus X (PVX) 44
3.3.4. Familia Betaflexiviridae 46
Género Carlavirus 47
Potato virus S (PVS) 48
3.3.5. Familia Luteoviridae 50
2
Género Polerovirus 50
Potato leafroll virus (PLRV) 52
3.3.6. Familia Closteroviridae 55
Género Crinivirus 56
Potato yellow vein virus (PYVV) 57
3.4. Métodos de diagnóstico en virología vegetal 60
3.4.1 Métodos Biológicos 61
Inoculación mecánica 63
Inoculación por vectores 63
Injertos 64
3.4.2. Métodos serológicos 64
ELISA (Enzyme-linked immuno-sorbent assay) 65
Otros métodos de inmunodiagnóstico 67
Microscopía electrónica 68
3.4.3. Métodos basados en el uso de ácidos nucleicos 69
Hibridización molecular 69
Técnicas basadas en PCR 71
PCR en tiempo real 72
4.1. Localización 74
4.2. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa 75
4.3. Detección del PMTV en cultivos afectados por S. subterranea 77
4.4. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa mediante RT-PCR y secuenciación 78
4.5 Secuencias parciales de los genomas virales 82
4.6. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real 84
3
5. RESULTADOS 89
5.1. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa 89
Evaluación de incidencia de síntomas en cultivos de papa 89
5.2 Detección serológica de virus en muestras de papa sintomáticas 93
5.3 Niveles de incidencia de virus en cultivos de papa de 12 zonas productoras de Colombia 94
5.4 Detección serológica de PMTV en cultivos de papa de Colombia 99
5.5. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa mediante RT-PCR y secuenciación 102
5.5.1. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PVY 106
5.5.2. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PYVV 111
5.5.3. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVS 115
5.5.4. Afinidades filogenéticas de aislamientos PLRV 120
5.5.5. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVX 124
5.5.6. Afinidades filogenéticas de aislamientos PMTV 128
5.6. Secuencias parciales de los genomas virales 136
5.6.1. Secuencias parciales del genoma de PMTV 136
5.6.2. Secuencias parciales del genoma de PVY 148
5.6.3. Secuencias parciales del genoma de PVX 159
5.6.4. Secuencias parciales del genoma de PVS 166
5.6.5. Secuencias parciales del genoma de PLRV 169
5.6.6. Secuencias parciales del genoma de PYVV 171
5.7. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real 176
5.7.1. Pruebas de detección de PVY 176
5.7.2. Pruebas de detección de PMTV 179
4
6. DISCUSIÓN 185
CONCLUSIONES 200
AGRADECIMIENTOS 203
BIBLIOGRAFÍA 204
ANEXOS 227
5
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Procedencia de las muestras de papa utilizadas para la detección de virus. 74
Tabla 2. Cebadores específicos utilizados en la detección por RT-PCR de cada uno de los virus bajo estudio. 80
Tabla 3. Cebadores específicos utilizados en la detección por RT-PCR de cada uno de los virus bajo estudio. 83
Tabla 4. Cebadores específicos y sondas a utilizar en la detección por qRT-PCR de los virus PVY y PMTV. 86
Tabla 5. Muestras empleadas para la detección del virus PVY. 86
Tabla 6. Muestras empleadas para la detección del virus PMTV. 87
Tabla 7. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces y tubérculos de plantas de papa afectadas por S. subterranea. 100
Tabla 8. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces de plantas de Nicotiana benthamiana cultivadas en sustratos infestados con S. subterranea. 101
Tabla 9. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVY. 103
Tabla 10. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PLRV. 104
Tabla 11. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVX. 105
Tabla 12. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVS. 105
Tabla 13. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PYVV. 106
Tabla 14. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP y TGB2 del virus PMTV. 106
Tabla 15 Matriz de identidad para cepas del virus PVY de cultivos de papa de Colombia y otros países del mundo. 108
6
Tabla 16 Matriz de identidad para cepas del virus PYVV de cultivos de papa de Colombia y Perú. 112
Tabla 17. Matriz de identidad para cepas del virus PVS en cultivos de papa de Colombia y el Mundo. 118
Tabla 18. Matriz de identidad para cepas del virus PLRV de Colombia y el Mundo 122
Tabla 19. Mariz de identidad para cepas del virus PVX de Colombia y el Mundo 126
Tabla 20. Matriz de identidad para cepas del virus PMTV (TGB) de Colombia y el Mundo. 130
Tabla 21. Matriz de identidad para cepas del virus PMTV (CP) de Colombia y el Mundo. 133
Tabla 22. Aislamientos de los virus en estudio y secuencias parciales de sus genomas. 136
Tabla 23. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del primer fragmento de la región CP secuenciada para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo. 140
Tabla 24. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del segundo fragmento de la región CP secuenciado para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo. 140
Tabla 25. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento secuenciado de la región TGB para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo. 142
Tabla 26. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del primer fragmento de la región CP secuenciado para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo. 144
Tabla 27. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento de la región CPRT secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo. 144
Tabla 28. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región TGB secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo. 145
Tabla 29. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región P1 secuenciada para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo. 150 7
Tabla 30. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo. 151
Tabla 31. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo 151
Tabla 32. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo. 155
Tabla 33. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo. 156
Tabla 34. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región P1 secuenciada para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo. 156
Tabla 35. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región RdRp secuenciada para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo. 160
Tabla 36. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo. 161
Tabla 37. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 5‟NTR-RdRp secuenciada para la cepa Carmen de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo. 163
Tabla 38. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟ RdRp secuenciada para la cepa Carmen de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo. 164
Tabla 39. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟TGB3-CP- 3‟NTR secuenciada para la cepa ¨Carmen¨ de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo. 164
Tabla 40. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada para las cepas Carmen y Santuario de PVS y su comparación con otros aislamientos del mundo. 167
8
Tabla 41. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP-3‟NTR secuenciada para las cepas Carmen y Santurio de PVS y su comparación con otros aislamientos del mundo. 167
Tabla 42. Matriz de identidad para nucleótidos y aminácidos de la región parcial de CP secuenciada para las cepas Siguineque y Suras de PLRV y su comparación con otros aislamientos del mundo. 169
Tabla 43. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región parcial del extremo 5‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos cepas de PYVV del Perú. 172
Tabla 44. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región parcial del extremo 3‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos aislamientos de PYVV del Perú. 172
Tabla 45. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada para las cepas Obonuco y Saguarán y dos aislamientos de PYVV del Perú. 173
Tabla 46. Detección del virus PMTV en muestras de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana sembradas en turba inoculada con S. subterranea, empleando tres metodologías (ELISA, RT-PCR, qRT-PCR). 180
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama representativo de los seis géneros que conforman la familia Virgaviridae. 31
Figura 2. Representación del genoma de PMTV. 36
Figura 3. Organización del genoma de un potyvirus. 39
Figura 4. Representación del genoma de un Potexvirus. 44
Figura 5. Representación del genoma de los Carlavirus. 48
Figura 6. Representación del genoma de los Polerovirus. 52
Figura 7. Representación del genoma de un Crinivirus. 57
Figura 8. Representación esquemática de la organización del genoma del PYVV. 60
Figura 9. Promedio de cuatro síntomas visuales posiblemente asociados a enfermedades virales en cultivos de papa ubicados en cuatro departamentos de Colombia. 89
Figura 10. Síntomas observados en campo sobre tejido foliar de plantas de papa en cuatro departamentos de Colombia. 90
Figura 11. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente asociados a enfermedades virales en cultivos de papa para los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. 91
Figura 12. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente asociados a enfermedades virales en cultivos de papa ubicados en 12 zonas de muestreo dentro de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. 93
Figura 13. Niveles de detección serológica de los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX con respecto a los cuatro síntomas evaluados visualmente en la investigación (AV, EN, EF y MR) en cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia. 94
10
Figura 14. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX en cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia. 96
Figura 15. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. 97
Figura 16. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX en cultivos de papa de 12 zonas productoras de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. 98
Figura 17. Plantas señuelo y fotos de microscopía de sus raíces infectadas con S. subterranea. 102
Figura 18. Amplicones obtenidos con los cebadores PVY F y PVYR (480 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 107
Figura 19. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVY obtenidos de cultivos de papa de Colombia y otros países del mundo. 110
Figura 20. Amplicones obtenidos con los cebadores PYVVCPF y PYVVCPR (758 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de tres departamentos de Colombia. 111
Figura 21. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PYVV obtenidos de cultivos de papa de Colombia y Perú. 114
Figura 22. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF y PVSR (629 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 116
Figura 23. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVS obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. 119
Figura 24. Amplicones obtenidos con los cebadores PLRVF y PLRVR (330 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 120
11
Figura 25. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PLRV obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. 123
Figura 26. Amplicones obtenidos con los cebadores PVXF y PVXR (562 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 125
Figura 27. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVX obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. 127
Figura 28. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana de dos departamentos de Colombia. 129
Figura 29. Árbol filogenético basado en secuencias parciales del TGB2 viral para aislamientos de PMTV obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo. 131
Figura 30. Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (460 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana de tres departamentos de Colombia. 132
Figura 31. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PMTV obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo. 135
Figura 32. Amplicón obtenido con los cebadores H360 y PMTV2017R (2000 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana de dos departamentos de Colombia. 138
Figura 33. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 – 123end (1067 pb) y PMTV759 – PMTV1552R (817 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado en suelo infestado con S. subterranea. 138
Figura 34. Amplicónes obtenidos con los cebadores Furo-Hel – 123end (2722 pb) y PMTV1948F – 123end (448 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado en sustrato infestado con S. subterranea. 139
|Figura 35. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV5 USA RNA3 y PMTV7 USA RNA3 (647 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrada en suelo infestado con S. subterranea. 139
12
Figura 36. Contextualización de las secuencias obtenidas para laa región CP de la cepa R25 de PMTV respecto a la secuencia de referencia NC 003724. 141
Figura 37. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa R25de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003725. 143
Figura 38. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de la cepa RValle de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003724. 146
Figura 39. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa RValle de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003725. 147
Figura 40. Amplicones obtenidos a partir de tejido foliar de papa de dos cepas de PVY del departamento de Antioquia, con los cebadores PVYc – PVYd (967 pb), PVYCPF – PVYCPR (827 pb); PVYF – 3ntr (1061 pb); PVYF – 3ntrC (1061 pb) 148
Figura 41. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYCPF – 3ntr (1219 pb), PVYCPF – 3ntrC (1219 pb), a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia. 149
Figura 42. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región P1 de PVY de la cepa Ceja respecto a la secuencia de referencia AJ584851.1. 152
Figura 43. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Ceja respecto a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867. 153
Figura 44. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Ceja respecto a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867. 154
Figura 45. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Carmen respecto a la secuencia de referencia AJ585342. 157
Figura 46. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones CP y P1 de PVY de la cepa Carmen respecto a las secuencias de referencia AY884983 y 166867. 158
13
Figura 47. Amplicones obtenidos con los cebadores PVX5476F-PVXR (749 pb), PVX1F- PVX1651R (1651 pb), PVX3130-PVX4495 (1365 pb), PVX5476F-PVX6415R (939 pb), a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia. 159
Figura 48. Contextualización de las secuencias obtenidas para una región parcial de RdRp y CP de la cepa Ceja de PVX, respecto a la secuencia de referencia EU021215. 162
Figura 49. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones 5‟NTR-5‟ RdRp parcial, 3‟RdRp parcial y TGB3 parcial-CP-3‟NTR de la cepa Carmen de PVX, respecto a la secuencia de referencia EU021215. 165
Figura 50. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF-PVSCPR (1288 pb) carriles 12 a 20, a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia. 166
Figura 51. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP-3‟NTR de cepas Carmen y Santuario de PVS, respecto a las secuencias de referencia AJ863510 y AJ863509. 168
Figura 52. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región parcial CP de las cepas de PLRV Siguineque y Suras, respecto a la secuencia de referencia AF453388. 170
Figura 53. Amplicones obtenidos con los cebadores CPm1-CPm2 (2025 pb), a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Nariño. 171
Figura 54. Contextualización de las secuencias obtenidas para CPm parcial de las cepas de PYVV Obonuco y Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y AJ557129.1. 174
Figura 55. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de cepas de PYVV Obonuco y Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y AJ557129.1. 175
Figura 56. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYF y PVYUnivR (227 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de dos departamentos de Colombia. 177
14
Figura 57. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PVYUnivF, PVYUnivR y la sonda PVYUniv a partir de tejido foliar de plantas de papa de dos departamentos de Colombia. 178
Figura 58. Porcentajes de detección del virus PVY empleando ELISA, RT-PCR y qRT- PCR en muestras de tejido foliar de papa de los departamentos de Antioquia y Nariño. 178
Figura 59. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV759F y PMTV1552R (816 pb) a partir de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana cultivadas en suelos infestados con S. subterranea de cuatro departamentos de Colombia 182
Figura 60. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PMTV1948F, PMTV2017R y la sonda PMTV1970 a partir de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana cultivadas en suelos infestados con S. subterranea de cuatro departamentos de Colombia 183
Figura 61. Porcentajes de detección del virus PMTV empleando ELISA, RT-PCR y qRT- PCR en muestras de tejido de raíz de N. benthamiana cultivadas en suelos procedentes de cuatro departamentos de Colombia. 184
15
RESUMEN
El cultivo de la papa representa uno de los renglones agrícolas de mayor importancia en
Colombia, alcanzando cerca de 162.000 ha y una producción que supera 2.721.396 ton.
Este cultivo es afectado por diversas plagas y enfermedades, entre las que se destacan las polillas de los tubérculos, el tizón tardío y los problemas virales. Diferentes trabajos indican que los problemas virales reducen los rendimientos y la calidad del tubérculo semilla en cultivos de papa de todo el mundo, razón por la cual su manejo debe hacer parte fundamental de los programas de manejo fitosanitario en este cultivo. Esta investigación se planteó con el fin de evaluar la presencia y características genotípicas de los virus Potyvirus
(PVY), PVX, PLRV, PVS, PYVV y PMTV en los cultivos de papa de los departamentos de
Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño, determinándose además los niveles de incidencia de cuatro de ellos (Potyvirus, PLRV, PVS y PVX) en diez regiones de dichos departamentos. Adicionalmente, se evaluó la utilidad de la técnica de qRT-PCR para la detección de los virus PVY y PMTV, seleccionados por su importancia económica y carácter cuarentenario, respectivamente. Los resultados confirmaron la presencia de los seis virus bajo estudio en los cultivos de papa de Colombia, siendo los Potyvirus y PVS los de mayor incidencia con 72 y 40%, respectivamente, mientras que el PLRV y PVX se encontraron en el 20 y 8% de las muestras evaluadas. Los análisis moleculares de los seis virus analizados, permitieron inferir las afinidades filogenéticas de los genotipos virales, encontrándose que los virus PLRV y PYVV presentan bajos niveles de variación y diferenciación con respecto a cepas de referencia de otros lugares del mundo, mientras que los virus PVY y PVS resultaron con niveles apreciables de variación. De gran interes resultó el hecho que un alto número de cepas colombianas de PVY estuvieron asociadas
16
con la raza PVY-NTN, responsable de la enfermedad conocida como PTNRD. Los virus
PVX y PMTV presentaron un alto número de cepas con bajos niveles de variabilidad, aunque algunos aislamientos compartieron bajos niveles de identidad con los genotipos de referencia mundial. El uso de la técnica de qRT-PCR permitió detectar el virus PVY en el
100% de las muestras analizadas y el PMTV en el 45% de raíces de plantas de Nicotiana benthamiana utilizadas como plantas señuelo para S. subterranea. Estas proporciones de detección mediante qRT-PCR fueron superiores en 34% y 20% para PVY y PMTV con respecto a la técnica de ELISA, y en 9% (PVY) y 17% (PMTV) cuando se comparó con
RT-PCR convencional. Se espera que la información generada en esta investigación sea incorporada para el diseño de metodologías de diagnóstico viral que apoyen los programas de certificación de tubérculo semilla y los programas de manejo integrado de enfermedades virales en los cultivos de papa de Colombia.
17
1. INTRODUCCIÓN
El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L.) ocupa un lugar importante en la economía mundial, debido a su uso como fuente de almidón para consumo fresco y para la industria de alimentos, de concentrados para animales y de bebidas alcohólicas (Horton, 1992). En el año 2007, la producción mundial de papa alcanzó 325,30 millones de ton con un rendimiento promedio de 16,8 ton/ha, siendo la región Andina la de mayor crecimiento en la producción del tubérculo, pasando de 30 millones de ton/año en el decenio de 1960 a
165,41 millones de ton para el 2007. En el año 2005 los países en desarrollo presentaron un incremento en la producción del tubérculo, a tal punto que alcanzaron a superar la producción de los países desarrollados. China, Rusia e India, son en su orden los mayores productores del tubérculo en el mundo, con 72, 36 y 26 millones de ton de papa en el año
2007, respectivamente (FAO, 2008).
Para el mismo año, América Latina tuvo un área cosechada de papa de 963.766 ha, con un rendimiento promedio de 16,3 ton/ha, un valor cercano al promedio mundial y similar al
Europeo, cuyo rendimiento fue de 17,4 ton/ha. Sin embargo, América Latina presenta una reducción en el consumo de papa (20,7 kg/persona), lo que contrasta con los altos consumos que se presentan en regiones como Europa, que alcanzan promedios de 87,8 kg/persona (FAO, 2008).
En Colombia, el cultivo de la papa genera una producción de 2.721.396 ton en aproximadamente 162.000 ha cosechadas. El rendimiento promedio del cultivo para el
2006 fue de 16,8 ton/ha, valor similar al promedio de rendimiento mundial. La producción nacional está distribuida en su orden en los departamentos de Cundinamarca, Boyacá,
Nariño y Antioquia con 398.926, 297.492, 266.112 y 119.854 ton, respectivamente.
18
Alrededor de 25.000 ton/año, son exportadas como papa fresca o refrigerada y el 7% del total de dichas exportaciones, son representadas por productos procesados. Con respecto a importaciones del tubérculo, para el año 2006 éstas ascendieron a 84.791 ton, con cerca del
62% correspondiente a papas procesadas, congeladas y féculas (MADR, 2006).
Los principales problemas en la producción de papa en Latinoamérica se pueden definir en su orden en: problemas de comercialización y poscosecha (variación en precios, costos de almacenamiento y demanda), las plagas y enfermedades y la reducida calidad del tubérculo semilla. Esta última está estrechamente relacionada con el segundo aspecto y con la capacidad técnico-científica de los países productores (Herrera y Scott, 1993). Los efectos adversos de diferentes factores climáticos también limitan la producción de papa en gran medida (MADR, 2006), especialmente bajo las condiciones actuales del cambio climático global.
Desde tiempo atrás se han venido reportando los efectos que tienen los virus en el cultivo de la papa y principalmente en su rendimiento. Aunque el promedio del rendimiento nacional para el año 2006 es semejante al promedio mundial obtenido en el año 2007, no es el óptimo, debido principalmente a la degeneración del tubérculo semilla ocasionado en gran medida por los patógenos virales (Howard, 1978; Sánchez de Luque et al., 1991). Lo anterior se evidencia mejor, si se compara el rendimiento promedio de 45 ton/ha en una región como Inglaterra, donde se cuenta con un estricto sistema de certificación de semilla
(Defra, 2005). Datos similares se han registrado en Latinoamérica en la provincia de
Buenos Aires (Argentina), donde se han reportado rendimientos promedios de 30-50 ton/ha
(Cantos de Ruiz et al., 1989) y en la localidad de Colpac, Huancayo (Perú), donde se obtuvieron registros de rendimiento que alcanzaron 74 ton/ha (Benza, 2008), cuando se
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aplicaron medidas para reducir la presencia de virus en el tubérculo semilla y se realizaron todas las prácticas agronómicas necesarias para el correcto manejo del cultivo.
En el mundo los principales virus que afectan la papa son: PLRV (Potato leafroll virus,
Polerovirus), PVY (Potato virus Y, Potyvirus), PVA (Potato virus A, Potyvirus) y PVX
(Potato virus X, Potexvirus) (Salazar, 1997a), sumándose a éstos PVS (Potato virus S,
Carlavirus) y PYVV (Potato yellow vein virus, Crinivirus) en Colombia (Salazar, 1997a;
Arciniegas, 2003). El efecto del PLRV en variedades susceptibles puede llegar a ocasionar pérdidas de hasta el 90%, mientras que PVY y PYVV, pueden reducir los rendimientos hasta en 80% y 60%, respectivamente. Sin embargo los estudios en virología han demostrado que el efecto sobre la producción en papa es especialmente crítico cuando los virus se presentan en conjunto; así por ejemplo, la infección simultánea de PVA y PVX pueden llegar a destruir completamente el cultivo (Arciniegas, 2003; Zapata 2004). Debido a estos graves efectos sobre la producción de papa, el Instituto Colombiano Agropecuario
(ICA), dirige un Programa Nacional de Certificación de Semilla de Papa cuyas tolerancias mínimas para virus en cultivos destinados a semilla son los siguientes: para PLRV, PVY,
PVX y PVS no se permite presencia de virus en semilla Super Élite y Élite, 1% de presencia de virus en semilla básica, 2% en semilla registrada y 5% en semilla certificada.
Para el caso de PYVV no se permite presencia de virus en semilla Super Élite, Élite y
Básica, 1% en semilla registrada y 1% en semilla certificada (Zapata, 2004). Sin embargo, la utilización sucesiva de tubérculo semilla por parte de los agricultores conduce al aumento de los niveles de incidencia y severidad de estos virus y de otros no incluidos en el programa de certificación, generando reducciones importantes en la producción de este cultivo en el país. Entre los virus no incluidos se destacan el PMTV (Potato mop-top virus,
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Pomovirus), que según Salazar (2006), está distribuido en todos los Andes suramericanos, desde Venezuela hasta Bolivia, pero no induce la sintomatología clásica reportada en la zona templada y por tanto tiende a ser confundido con otros problemas virales o incluso con problemas abióticos. Este virus fue recientemente detectado por Vélez (2007) en cultivos de Zipaquirá y Subachoque, mediante RT-PCR con cebadores específicos y a partir de un ensayo de inoculación en plantas de tabaco mediada por Spongospora subterranea
(Plasmodiophoridae), el agente causal de la sarna polvosa de la papa y que actúa como su vector en el suelo.
Ya que el problema de la sarna polvosa de la papa causado por S. subterranea se ha expandido dramáticamente en los últimos años en las principales regiones cultivadores del tubérculo del país (Jaramillo y Botero, 2007), es posible que paralelamente la infección por el virus Mop-top también se encuentre en franco aumento, razón por la cual se planteó la presente investigación, con el objetivo principal de evaluar la presencia de PMTV en las principales regiones cultivadoras de papa de los departamentos de Antioquia,
Cundinamarca, Boyacá y Nariño, determinado el nivel de variabilidad de las cepas detectadas mediante análisis de secuencias de la región que codifica para la cápside viral y implementando una prueba diagnóstico basada en RT-PCR en tiempo real que permita la detección del PMTV. Dichas evaluaciones fueron acompañadas por el estudio de los niveles de incidencia de los virus PVY, PVX, PLRV, PVS y PYVV mediante pruebas de
ELISA y análisis de secuencias diagnósticas para determinar su identidad y afinidades filogenéticas con cepas de dichos virus cuyas secuencias están reportadas en las bases de datos moleculares. De esta manera el desarrollo de esta investigación ha generado un cuerpo actualizado de información sobre el estado de la sanidad viral de los cultivos de
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papa en Colombia y sobre las características genéticas de sus agentes causales, bases para el diseño de las estrategias de manejo de estas enfermedades en los cultivos de papa de nuestro país.
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2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Detectar y caracterizar los principales virus que afectan la sanidad de los cultivos de papa de las regiones productoras de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño, con
énfasis en el estudio del virus PMTV.
2.2. Objetivos específicos
Determinar los niveles de incidencia de los virus PVS, PVX, PLRV, PVY y PMTV mediante pruebas de ELISA, en las principales regiones cultivadoras de papa de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño.
Evaluar la presencia del virus PMTV en quistosoros de S. subterranea presentes en agallas de raíces y/o tubérculos y muestras de suelos de lotes afectados por sarna polvosa mediante pruebas de ELISA y RT-PCR.
Definir las afinidades filogenéticas entre las variantes de los virus PVS, PVX, PLRV, PVY,
PYVV y PMTV identificadas mediante RT-PCR convencional y secuenciación en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño, y aquellas cuyas secuencias se encuentran depositadas en las bases de datos moleculares.
Implementar una metodología basada en RT-PCR en tiempo real para el diagnóstico de los virus PVY y PMTV, seleccionados para este análisis por su importancia económica y condición cuarentenaria, respectivamente.
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3. MARCO TEÓRICO
3.1. Virus asociados al cultivo de la papa
El cultivo de la papa es uno de los más afectados por los problemas virales en la agricultura mundial, siendo reportados al menos 25 virus y viroides (Salazar, 1995; Salazar, 2006) que se pueden agrupar con base en la dependencia de la papa para su supervivencia y diseminación. Dentro del grupo de los dependientes se destacan: PVX, PVY, PVS, PVM
(Potato virus M, Carlavirus), PAMV (Potato aucuba mosaic virus, Potexvirus), PMTV,
PLRV, PVT (Potato virus T, Betaflexiviridae sin género asignado), APMV (Andean potato mottle virus, Comovirus), PBRV (Potato black ringspot virus, Nepovirus), WPMV (Wild potato mosaic virus, Potyvirus), PSTVd (Potato spindle tuber viroid, Pospiviroid) y APLV
(Andean potato latent virus, Tymovirus). En el segundo grupo, es decir, los que no dependen de la papa para su supervivencia se encuentran: AMV (Alfalfa mosaic virus,
Alfamovirus), BCTV (Beet curly top virus, Curtovirus), CMV (Cucumber mosaic virus,
Cucumovirus), PYDV (Potato yellow dwarf virus, Nucleorhabdovirus), TRV (Tobacco rattle virus, Tobravirus), TMV (Tobacco mosaic virus, Tobamovirus), TRSV (Tobacco ringspot virus, Nepovirus), ToBRV (Tomato black ring virus, Nepovirus), ToSWV
(Tomato spotted wilt virus, Tospovirus) y TSV (Tobacco streak virus, Ilarvirus). Los virus del primer grupo generalmente presentan un rango de hospederos más restringido o moderado que los del segundo (Salazar, 1995), mientras que PLRV, PVY, PVA, PVX y
PVS, son considerados los de mayor importancia económica y con la más amplia distribución mundial (Solomon-Blackburn y Barker, 2001).
Los problemas virales en el cultivo de la papa afectan la producción de tubérculos al reducir el área fotosintética, la movilización de nutrientes y por tanto la acumulación de
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carbohidratos para la formación adecuada de los tubérculos, lo cual está asociado directamente a reducciones del rendimiento y además imposibilita al agricultor para obtener tubérculo semilla a partir de su propio cultivo (Salazar, 1995). En sistemas agrícolas tradicionales como los que predominan en las zonas alto-andinas de Suramérica, esta situación es frecuente y conduce a la pérdida de vigor de la semilla, y a un efecto acumulativo de diferentes virus que termina por reducir dramáticamente los rendimientos, al cabo de varios ciclos de siembra-cosecha. En explotaciones tecnificadas, dicha situación se remedia mediante el empleo de semilla certificada, la cual es monitoreada por los organismos de sanidad de los estados. Así por ejemplo, en Colombia se permite hasta un
5% de presencia de virus para semilla certificada y de 0 a 1% para semilla básica dependiendo de los virus (Zapata, 2004), mientras que en Inglaterra los límites permitidos no superan el 0.01% de plantas con síntomas virales para semilla pre-básica; 4% para semilla básica y 10% para semilla certificada (Defra, 2006). La siembra de semilla certificada es sin duda un factor fundamental para el aumento de los rendimientos en este cultivo.
La degeneración del tubérculo semilla se ha debido entre otras causas, a los virus que inciden en el cultivo de la papa (Guerrero y Martínez, 1980; Santos Rojas, 1985) y dicha incidencia se debe principalmente al desconocimiento de los patógenos virales que posee el tubérculo semilla empleado para la siembra y a la dificultad para su detección prematura, lo que hace más difícil controlar la diseminación de los virus y mantener rendimientos
óptimos en los cultivos (Howard, 1978; Salazar, 1982). La relación de los patógenos del tubérculo semilla es bastante estrecha, encontrándose en ocasiones incidencias debidas a la sucesiva propagación del mismo material hasta del 100% (Secor y Rivera-Varas, 2004).
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Una ilustración de la degeneración del tubérculo semilla debida a la afección viral, es la situación del rendimiento en Perú para la década de los 80, en la cual se reportaba una producción promedio de 8 ton/ha (Salazar, 1986; FAO, 1987), que luego de un proceso de implementación de programas de saneamiento de semilla y estudios sobre la influencia de los virus y el tipo de partículas virales relacionadas con la degeneración de las variedades locales (Ezeta y Scheidegger, 1985) logró aumentarse a 12,1 ton/ha a nivel nacional y a 17 ton/ha en la región costera del país (Nuñez, 2009). Lo anterior indica que la disminución en el rendimiento productivo del cultivo de la papa puede llegar a niveles críticos en la región
Andina, llegándose a estimar hasta en un 50% (Guerrero y Martínez, 1980).
Además de los virus tradicionalmente encontrados en los cultivos de papa, frecuentemente se reporta la aparición de nuevas especies o variantes virales y/o ocurre la re-emergencia de otros virus que habían perdido importancia económica. Dichas situaciones están muy asociadas a la globalización de los mercados, que facilitan el movimiento de productos de origen agrícola entre continentes y países, en donde los virus pueden encontrar nuevas variedades susceptibles y condiciones agroambientales o antropogénicas que favorezcan su proceso infectivo y dispersión. Algunos ejemplos que ilustran estas situaciones incluyen la emergencia de la raza PVY-NTN que causa necrosis de tubérculo y los virus codificados como SB26/29 y SB41, que causan mosaicos severos y enanismos en cultivos de papa del
Perú, con reducciones en el rendimiento de hasta el 80% para SB26/29 (transmitido por el
Psyllidae, Russelliana solanicola) (Rojas et al., 1993; Tenorio, 2000; Salazar, 2006). De otra parte el virus PMTV ha sido reportado en diferentes regiones del continente americano, representa una gran preocupación para los productores en Norte América, donde fue reportado en 1991-1992 (Xu et al., 2004; Johnson, 2009) y en Costa Rica se ha detectado
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mediante serología en el 50% de las muestras evaluadas, principalmente en las zonas con altitudes comprendidas entre 1800 y 2500 msnm (Vásquez et al., 2006). En Colombia
PMTV fue recientemente reportado en cultivos de papa de Cundinamarca y Boyacá (Vélez,
2007). Como anota Salazar (2006), esta variación en re-emergencia de algunos virus y la aparición de otros nuevos, puede estar influenciada fuertemente por los cambios climáticos que además de afectar la fisiología del cultivo, influyen sobre las poblaciones de los vectores de los virus, razones por las que es necesario mantener una vigilacia fitosanitaria permanente que conduzca a evitar su diseminación y efecto económico en la producción de los cultivos.
3.2 Virus asociados al cultivo de la papa en Colombia.
En estudios realizados desde años atrás en el país, se ha evidenciado la presencia e interacción de diversos virus afectando el cultivo de la papa. Tal es el caso de los virus
PVX, PVY y PLRV, para los cuales se reportaron pérdidas del orden del 61% en rendimiento (Guerrero, 1978). Además de estos virus, en las últimas décadas ha cobrado importancia el PYVV (Guzman et al., 2004a; Zapata, 2004), gracias a su eficiente diseminación por parte de Trialeurodes vaporariorum, un insecto que es además comúnmente encontrado en otros cultivos de la región Andina como frijol (Phaseolus vulgaris), zanahoria (Daucus carota) y diversas plantas arvenses (especialmente solanáceas silvestres y poáceas) (Salazar, 1997b). Más recientemente, se ha reportado en el país el virus PMTV o Mop-top de la papa (Vélez, 2007); dicho virus puede causar pérdidas estimadas de hasta 25% en rendimiento en la región templada, lo que sumándose al efecto del daño ocasionado por su vector S. subterranea, pudiera ascender a valores de 50 - 80%
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(Jones y Harrison, 1972; Guerrero, 1997; Guerrero, 2000). Según Salazar (2006), el PMTV es uno de los virus que ha sido prevalente en el cultivo de la papa en los andes sudamericanos, pero su efecto sobre el rendimiento del cultivo no se ha establecido claramente en esta zona. La enfermedad inducida por PMTV presenta una amplia gama de síntomas dependiendo de la variedad del cultivar, que incluyen amarillamiento foliar, anillos necróticos y cuarteamiento de tubérculos y moteados tipo ¨Aucuba¨ (Salazar, 1995;
Sokmen et al., 1998; Xu et al., 2004). En Colombia, no es posible identificar con exactitud la sintomatología que induce PMTV en los cultivos de papa, pudiéndose confundir con desordenes fisiológicos o afecciones de otros patógenos, incluyendo algunas razas de PVY y PVS.
Con respecto a la importancia económica de estos virus en Colombia, se han realizado diferentes estudios tendientes a estimar los porcentajes de reducción atribuibles a los principales virus que afectan el cultivo de papa. Así, para PYVV se estimó que bajo las condiciones del centro experimental La Selva de CORPOICA (Rionegro, Antioquia), este virus ocasiona una disminución del 28% en la variedad Diacol Capiro (Zapata, 2004). En los casos de PVX, PVY y PLRV, estudios realizados en la variedad ICA-Puracé, encontraron que las inoculaciones individuales de los virus PVX y PVY en plantas sanas no ocasionaron una disminución significativa en el desarrollo y rendimiento del cultivo; sin embargo, su inoculación conjunta, condujo a pérdidas del orden del 61%. Las inoculaciones individuales de PLRV ocasionaron pérdidas de 47% respecto al testigo, mientras que el asocio de PVY y PLRV redujo la producción en un 55%. Finalmente, cuando se inocularon conjuntamente PVX-PVY y PVX-PLRV, estos valores fueron del 39% y 24%, respectivamente (Guerrero y Martínez, 1980).
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Por otra parte, en un estudio en el que se evaluaron la incidencia y los efectos en los rendimientos de los virus PVX, PVS, PVY y PLRV en tres regiones altitudinales (páramo-
3200 msnm, media-2600 msnm y baja-2150 msnm) sobre las variedades Parda Pastusa,
ICA Puracé, Diacol Capiro e ICA Tequendama, a lo largo de tres años consecutivos empleando los tubérculos semilla del mismo experimento, se encontró que la zona baja fue la que presentó mayor incidencia viral, con valores de 68 y 87% para el primer y segundo semestre del año y disminuciones en el rendimiento del 50 y 40%, respectivamente. La zona media tuvo incidencias del 34 y 46% y disminución en el rendimiento del 14 y 30%.
En la zona del páramo, la incidencia fue tan sólo del 18% y no se presentó una disminución evidente en la producción durante el primer semestre; sin embargo, para el segundo semestre las incidencias fueron del 30% reduciéndose el rendimiento en un 3%. Los resultados confirmaron la relación estrecha entre el incremento de las poblaciones de áfidos y otros insectos vectores con la incidencia de los virus que afectan papa (Sánchez de Luque et al., 1991).
Para Solanum phureja, en un estudio con 800 muestras de los municipios de Nariño y
Cundinamarca y que estimó la incidencia de virus mediante Inmuno-impresión, se encontraron valores de 86%, 72%, 39% y 91%, para los virus PVS, PVY, PVX y PLRV, respectivamente. Esta misma evaluación se realizó al material del banco de germoplasma de la Colección Central Colombiana de S. phureja y en este caso los valores de incidencia fueron de 20%, 19%, 5.7% y 6,6%, respectivamente (Guzman et al., 2004a).
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3.3. Generalidades de algunos virus asociados al cultivo de la papa.
3.3.1. Familia Virgaviridae.
La familia taxonómica Virgaviridae fue recientemente descrita y agrupa virus cuya partícula viral posee forma de bastón (Latín Virga). Incluye los géneros Furovirus (5 especies), Hordeivirus (4 especies), Pecluvirus (2 especies), Pomovirus (4 especies),
Tobamovirus (25 especies) y Tobravirus (3 especies) y un total de 43 especies descritas.
Las características del grupo son entre otras, proteínas de replicación de tipo alfa, genoma de ARN de sentido positivo con un motivo de ARN de transferencia asociado a su extremo
3‟ terminal, forma de bastón de sus viriones y un canal central de 20 a 25 nm de diámetro.
Por último, las proteínas de cápside poseen tamaños que oscilan entre 19 a 24 kDa (Adams et al., 2009; ICTV, 2010).
Los virus de esta familia se caracterizan también por poseer al menos una proteína de movimiento “30K”, como es el caso de Furovirus, Tobamovirus y Tobravirus. Por su parte,
Hordeivirus, Pecluvirus y Pomovirus, tienen un grupo de tres proteínas relacionado con su movimiento sistémico en la planta denominado “TGB” (Bloque triple de genes). Existen algunas diferencias en la organización de sus genomas y el número de ARN que los componen varía desde 1 a 3 dependiendo del género. Hordeivirus y Pomovirus poseen tres
ARN genómicos (ARNg), pero el primer grupo tiene su motivo de ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) en un ARN diferente al de los motivos Helicasa y Metil- transferasa, los cuales están juntos en los demás géneros de la familia. Tobamovirus es el
único género cuyos integrantes poseen un solo ARN como genoma y no es transmitido por un patógeno del suelo; el resto de miembros de la familia poseen dos ARNg (Adams et al.,
2009). 30
Mediante el análisis filogenético de la RdRp de los virus de la familia con aquellos agrupados como Benyvirus (viriones con forma de bastón), miembros de las familias
Closteroviridae y Bromoviridae, el género Idaeovirus y miembros del orden Tymovirales, se encontró que los géneros que agrupa la familia Virgaviridie están fuertemente soportados por la alta relación filogenética de sus secuencias y que los virus del género Benyvirus son realmente distantes de la familia en cuestión (Adams et al., 2009). En la figura 1 se pueden visualizar las diferencias en los genomas de los virus pertenecientes a la familia
Virgaviridae.
Figura 1. Diagrama representativo de los seis géneros que conforman la familia Virgaviridae. (M) Motivo
Metil-transferasa, (H) Motivo Helicasa, (R) Motivo RdRp, el Bloque triple de genes (TGB) esta representado por los cuadros en tramas, (MP) Proteínas de movimento de la superfamília “30K”, (C) Proteína rica en cisteína o “CRP”. Los triángulos representan sitios de supresión del codón de finalización. (t) representa motivos de ARN de transferencia con los aminoácidos que acepta. Los corchetes representan ORF que no están presentes en algunas razas. Tomado de Adams et al, (2009).
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Género Pomovirus
El género Pomovirus deriva su nombre de la especie tipo Potato mop-top virus (PMTV). El género está compuesto por tres especies además de PMTV: Beet soil-borne virus (BSBV),
Beet virus Q (BVQ) y Broad bean necrosis virus (BBNV). BSBV y BVQ son transmitidos por Polymyxa betae (Meunier et al., 2003), mientras que BBNV es transmitido por P. graminis y PMTV por S. subterranea (Deacon, 2010). Los virus de este género poseen viriones con simetría helicoidal cuyas longitudes varían de 60 a 310 nm, dependiendo del virus (Büchen-Osmond, 2010) y el ARN. PMTV posee 3 moléculas de ARN con tamaños de 6,4 kb, 3 kb y 2,5 kb, con caperuzas hacia el extremo 5‟ y una estructura tipo ARNt hacia el extremo 3‟. El coeficiente de sedimentación de las partículas formadas es de 230,
170 y 125S. El ARN 1 codifica para una proteína que tiene motivos de metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteína generada por supresión del codón de finalización del ORF
1 con motivos de RdRp. Cerca del extremo 3´del ARN 2 se presenta una proteína asociada a la transmisión por vector y generada a partir de la supresión del codón de terminación del
ORF que codifica para CP. Esta proteína parece ser la responsable de la pérdida de la estructura helicoidal en los extremos del ARN durante el proceso de desensamblaje. El
ARN 3 codifica para cuatro polipéptidos de 51, 21, 13 y 8 kDa, respectivamente. Los primeros tres presentan secuencias similares a proteínas de TGB de otros virus, involucradas en el movimiento célula a célula. La función de la cuarta proteína, una proteína rica en cisteína (CRP), parece ser la de actuar en el incremento de la virulencia; sin embargo, no es indispensable para el proceso infectivo (Reavy et al., 1998; Savenkov et al.,
2003).
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Las secuencias de los virus de este género comparten menos del 80% de identidad cuando se comparan sus genomas completos y menos del 90% cuando se comparan las secuencias de aminoácidos de la proteína de cápside. También difieren en su rango de hospederos, especies vectores, morfología de los cuerpos de inclusión en tejidos, relaciones serológicas y componentes del genoma, particularmente presencia o ausencia de CRP (Büchen-
Osmond, 2010).
La especie PMTV es transmitida por zoosporas de S. subterranea y BSBV es transmitido por P. betae, ambos plasmodiofóridos que afectan los sistemas radiculares de sus hospedantes. Estos virus también pueden ser transmitidos por semilla asexual. Los virus pueden permanecer en las estructuras de resistencia de sus vectores por varios años en el suelo (Astier et al., 2007; Dijkstra y Khan, 2006).
Potato mop-top virus (PMTV)
PMTV es transmitido de forma persistente y muy específica por S. subterranea f. sp. subterranea, agente causal de la sarna polvosa de la papa. S. subterranea posee unas estructuras de resistencia denominadas quistosoros (conglomerado de esporas de resistencia características del patógeno) que pueden sobrevivir en el suelo durante largos periodos de tiempo. El patógeno inicia su infección cuando lo quistosoros liberan las zoosporas primarias, las cuales se adhieren a los pelos radicales de la planta y comienza la fase de penetración, empleando para ello un “estilete” que se genera posterior a la formación del
“tubo” por el quiste infectivo. Este tubo, junto con el estilete, son los que permiten que el protoplasto del patógeno ingrese al interior de la célula del hospedero. Una vez dentro de
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las raíces de la planta, el patógeno forma un plasmodio primario multinucleado con una delgada membrana que posteriormente se convierte en un zooesporangio, el cual será liberado a la fase líquida del suelo como zoosporas secundarias (Dijkstra y Khan, 2002;
Merz y Fallon, 2009).
En los ensayos de transmisión del virus se ha observado que éste es transmitido eficientemente a plantas indicadoras (ej. N. tabacum y N. benthamiana) a partir de muestras de suelo infestadas con quistes del patógeno (Campbell, 1996; Vélez, 2007).
El virus posee tamaños de 6043 nt (ARN 1), 3134 nt (ARN 2) y 2964 nt (ARN 3) (PMTV accesiones de GenBank N° NC_003723.1, NC_003724.1 y NC_003725.1, respectivamente). Su virión consiste en una partícula elongada con simetría helicoidal en forma de bastón con longitudes de 100 a 150 nm y 250 a 300 nm, y un diámetro de 18 a 20 nm. El coeficiente de sedimentación corresponde a 236S, TIP de 75 a 80°C, LIV mayor a
200 días y el DEX alrededor de 3 (Büchen-Osmond, 2010).
El ARN 1 tiene dos ORF, el primero codifica para la proteína de 149 kDa y el segundo produce la proteína RdRp mediante la estrategia de supresión del codón de parada. En las proteínas de dicho ARN se han detectado además dominios de metiltransferasa y helicasa
(Savenkov et al., 1999). El ARN 2 tienen una estrategia similar, con dos ORFs los cuales codifican para la CP y para una proteína generada por supresión del codón de parada denominada CP2 (Figura 2). El ARN 3 codifica para TGB y para CRP, como se enunció en las generalidades de los Pomovirus (Savenkov et al., 2003).
El PMTV constituye un pequeño grupo de virus que para su movimiento sistémico en la planta hospedante no requiere de la expresión de CP, ni de la formación del virión
(McGeachy y Barker, 2000), debido a que el TGB le ofrece la posibilidad de mover el ARN
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infeccioso a través de largas distancias en la planta (Melander et al., 2001). Dicho ARN desnudo se puede encontrar en tubérculos asintomáticos y causar una infección secundaria para la siguiente temporada de siembra (McGeachy y Barker, 2000). La manifestación de los síntomas característicos de la enfermedad depende de la presencia de los tres ARN en el tejido (Savenkov et al., 2003).
Los principales síntomas que causa PMTV en cultivos de regiones templadas corresponden a mosaicos tipo “aucuba” en las hojas y anillos necróticos y agrietamientos en los tubérculos. En las variedades cultivadas en los Andes estos síntomas no son evidentes, y en su lugar se presentan amarillamientos foliares, enanismos y acortamiento de entrenudos
(Salazar, 1995; Dijkstra y Khan, 2006; Büchen-Osmond, 2010). En condiciones experimentales el virus puede infectar plantas de las familias Chenopodiaceae, Solanaceae y Tetragoniaceae. Dentro de estas se encuentran las plantas que se usan para su diagnóstico, las cuales corresponden a Nicotiana debneyi y Chenopodium amaranticolor, en las que se produce necrosis sistémica y lesiones locales concéntricas cafés, respectivamente. Nicotiana benthamiana, N. debneyi y N. clevelandii, son las especies más apropiadas para el mantenimiento y propagación del virus bajo condiciones experimentales
(Büchen-Osmond, 2010).
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Figura 2. Representación del genoma de PMTV. a. En las cajas se observan las proteínas para las que codifica el genoma. Las flechas indican las proteínas originadas y los ARN subgenómicos (ARNsg). b.
Representación de la encapsidación independiente de los tres ARN de PMTV. Fuente: http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/643.html.
3.3.2. Familia Potyviridae
La familia Potyviridae debe su nombre al género Potyvirus. Dentro de la familia se encuentran los géneros, Brambyvirus (1 especie), Bymovirus (6 especies), Ipomovirus (4 especies), Macluravirus (6 espcies), Potyvirus (143 especies), Rymovirus (3 especies),
Tritimovirus (4 especies) y 3 especies sin género asignado: Spartina mottle virus (SpMoV),
Sugarcane streak mosaic virus (SCSMV) y Tomato mild mottle virus (TomMMoV). Es la familia taxonómica con mayor número de especies de virus de plantas, con 170 especies formalmente reconocidas por el ICTV (ICTV, 2010), los que se caracterizan por su morfología filamentosa y flexuosas de 11 a 15 nm de diámetro con simetría helicoidal y longitudes de 650 a 900 nm para los virus monopartita (Brambyvirus, Ipomovirus,
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Macluravirus, Potyvirus, Rymovirus, Tritimovirus) y de 200-300, 500-600 nm para los virus bipartita del género Bymovirus (Dijkstra y Khan, 2006; Astier et al., 2007) (Figura 3).
Su ARN es de cadena sencilla con sentido positivo y lleva una proteína VPg (Proteína viral asociada al genoma) de alrededor de 24 kDa unida covalentemente al extremo 5‟ y una poly-A de longitudes variables hacia el extremo 3‟. Cada ARN comprende un solo ORF que traduce una poliproteína de 340-370 kDa que es clivada por las proteasas virales para generar las proteínas funcionales del virus. Su genoma es de 10 kb rodeado por cerca de
2000 copias de la proteína de cápside (CP) (Urcuqui-Inchima et al., 2001). La familia
Potyviridae también se caracteriza por inducir inclusiones cilíndricas citoplasmáticas (CI), como ruedas de carreta (pinwheels) o agregados laminares. Estas CI contienen proteínas codificadas por el genoma viral que poseen actividad Adenosín trifosfatasa (ATPasa) y
Helicasa. Otra proteína viral, HC-Pro (Helper component protease) provoca inclusiones amorfas (AI) en las que generalmente se encuentran asociadas organelas degradadas de la célula con partículas virales. Esta proteína, también posee funciones de proteinasa y se asocia a la transmisión por el vector (Dijkstra y Khan, 2006; Urcuqui-Inchima et al., 2001).
Género Potyvirus
El nombre del género Potyvirus se deriva de la especie “Potato virus Y” (Dijkstra y Khan,
2006). El género posee 143 especies aprobadas, lo que le convierte en el más numeroso de los siete géneros de la familia (ICTV, 2010). Las partículas virales tienen una longitud de
680 a 900 nm, cuyos viriones poseen un coeficiente de sedimentación de 150 a 160S, una densidad de flotación de 1,31 g/cm3 en CsCl y un genoma de ARN con alrededor 9700 nt
(Dijkstra y Khan, 2006). 37
Como ya se había indicado, el genoma contiene solo un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para una poliproteína de 340-370 kDa (Riechmann, et al., 1992; Riechmann et al.,
1995) que es procesada posteriormente, por acción de tres proteasas en siete proteínas pequeñas: P1, componente asistente (Helper Component); P3, de inclusión cilíndrica (CI); inclusión nuclear A (NIa); inclusión nuclear B (NIb); proteína de cápside (CP) y dos proteínas putativas denominadas 6K1 y 6K2 (Riechmann et al., 1992) (Figura 3). Las proteasas corresponden a la proteinasa P1 y del componente asistente (HC-pro), que catalizan solo reacciones autoproteolíticas en los extremos C-terminales (Carrington et al.,
1989; Verchot, et al., 1991), mientras que los clivajes restantes son catalizados mediante mecanismos trans y autoproteolíticos mediados por la proteína de inclusión nuclear (NIa-
Pro), un homólogo de la proteinasa del Picornavirus 3C (Langenberg y Zhang, 1997). El procesamiento y función de todas estas proteínas es aún controversial pero se cree que muchas de ellas son multifuncionales (Riechmann et al., 1992; Verchot y Carrington 1995;
Mahajan et al., 1996).
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Figura 3. Organización del genoma de un potyvirus. a. Se observa el ARN genómico asociado a VPg hacia el extremo 5‟ y la poly-A en el extemo 3‟. Dentro de lo demarcado como una caja se detalla la poliproteína con las proteínas maduras luego del clivaje. Se indican con flechas las proteínas que realizan el clivaje y los lugares donde ocurre el mismo. b. Representación del virión de un Potyvirus. Fuente: http://ca.expasy.org/viralzone/all_by_species/50.html
Potato virus Y (PVY)
El virus PVY posee un genoma de 9704 nt (PVY raza N, accesión del GenBank No.
X12456.1), una proteína VPg hacia su extremo 5‟ y poliadenilación (poly-A) hacia el extremo 3‟ (Shukla et al., 1994). La morfología del virus consiste en una cápside no envuelta, elongada con simetría helicoidal monopartita y flexuosa, una longitud de 684 nm a 730 nm, diametro de 11 nm y un canal axial de 2-3 nm (Ogawa et al., 2008). La proteína de la cápside (CP) es el principal componente del virión con aproximadamente 2000 unidades monoméricas (Urcuqui-Inchima et al., 2001). La densidad de los viriones en CsCl es de 1.323 g/cm3 para cepas tipo PVY-O y de 1.326 g/cm3 para cepas PVY-N. El punto de inactivación térmico (TIP) es de 50-62 °C, su longevidad in vitro (LIV) de 7 a 50 días y el
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exponente decimal (DEX) de la dilución esta usualmente entre 2 a 6. La infectividad de las partículas no cambia por tratamientos con éter y es inactivado con fenol o diferentes detergentes (Gibbs y Mackenzie, 1997; Van Regenmortel et al., 2000; Hsu et al., 2005).
La especie PVY esta formada por un complejo de diferentes aislamientos (Smith, 1931), siendo la primera variante identificada del virus la denominada PVC (Potato virus C), que luego pasó a ser llamada PVY-C (Bawden, 1943). Históricamente los aislamientos del virus se han dividido en tres razas principales: PVY-O, PVY-N, y PVY-C, de acuerdo a los síntomas inducidos en Nicotiana tabacum cv. Samsun y Solanum tuberosum ssp. tuberosum (Delgado-Sánchez y Grogan, 1970). Hay que tener en cuenta además que no todas las variantes del virus son transmitidas por áfidos, como ocurre con algunos aislamientos de la raza PVY-C (Blanco-Urgoiti et al., 1998). Más recientemente se ha incorporado en la clasificación de sus variantes el criterio del tipo de antigenicidad de su proteína de cápside y los genes de resistencia que vence en el hospedante; tal es el caso del aislamiento denominado PVY-Z, el cual esta serológicamente clasificado como PVY-O, pero que sobrepasa los genes Nytbr y Nc (Jones, 1990) y elicita el gen Nz en las plantas
(Singh et al., 2008). Otro grupo es denominado PVY-N-Wilga (PVY N-Wi), el cual tiene propiedades biológicas de los aislamientos PVY-N, pero está serológicamente clasificado como PVY-O, lo que permite deducir que presenta un genoma recombinante entre las secuencias de los dos tipos de aislamientos (Glais et al., 2002a). En los últimos años se ha detectado una variante adicional denominada PVY-NTN, serológicamente relacionada con
PVY-N, pero que causa anillos necróticos en tubérculos de papa, enfermedad conocida como PTNRD (Potato tuber necrotic ringspot disease) y que puede ocasionar pérdidas hasta del 100% en este cultivo (Kogovsek et al., 2008).
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Dentro de las regiones que determinan la variabilidad del virus o mejor, del complejo viral, se ha determinado que las regiones 5´NTR (Región no traducible del 5‟) y de la proteína
P1, corresponden a las secuencias más variables en el género Potyvirus, siendo responsable hasta de un 28% de la variabilidad total existente entre los grupos O y N (Marie-Jeanne-
Tordo et al., 1995; Ward et al., 1995). Hacia el interior de la región CP (Glais et al., 2002a;
Ohshima et al., 2000) ó dentro de la región del gen HC-Pro (Schubert et al., 2007), es posible que se encuentre la secuencia responsable de los síntomas PTNRD. De otra parte, las regiones NIb y 3‟-NTR, constituyen puntos de variación y recombinación, y pueden servir para diferenciar las razas o patotipos del virus a partir del estudio de sus secuencias
(Kogovsek et al., 2008).
El PVY es transmitido de forma mecánica, por injerto y por áfidos de manera no persistente, principalmente por la especie Myzus persicae, aunque también se han reportado
Aphis fabae, Macrosiphum euphorbiae, Myzus (Nectarosiphon) certus, Myzus (Phorodon) humuli y Rhopalosiphum insertum. No requiere de un virus auxiliar; sin embargo, si puede facilitar la transmisión de otros virus como el Potato aucuba mosaic virus.
Experimentalmente, se pueden emplear especies de las familias Solanaceae,
Commelinaceae y Chenopodiaceae para las pruebas biológicas de transmisión y expresión de síntomas, así como también para obtener fuente de inóculo. Dentro de dichas familias, se destacan las especies Capsicum annuum, Capsicum frutescens, Chenopodium amaranticolor, Chenopodium quinoa, Solanum lycopersicum, Nicotiana glutinosa,
Nicotiana tabacum, Physalis floridana, Solanum chacoense, Solanum demissum, Solanum demissum x S. tuberosum, Solanum tuberosum, Tinantia erecta. Luego de las inoculaciones, en N. glutinosa y N. tabacum, se pueden desarrollar síntomas tales como
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moteado sistémico suave o severo y aclaramiento sistémico de venas. En papa, dependiendo de la variedad y la raza viral, se pueden desarrollar síntomas que van desde moteados y clorosis en las venas hasta necrosis de tubérculo (Büchen-Osmond, 2010).
3.3.3. Familia Alphaflexiviridae
La familia Alphaflexiviridae pertenece al orden Tymovirales y está compuesta por seis géneros: Allexivirus (8 especies), Botrexvirus (1 especie, Micovirus), Lolavirus (1 especie),
Mandarivirus (1 especie), Potexvirus (35 especies) y Sclerodarnavirus (1 especie,
Micovirus) que suman un total de 57 especies. Los virus de este grupo taxonómico se caracterizan por poseer viriones filamentosos flexuosos entre 470 a 800 nm y 12-13 nm de diámetro, constituidos por subunidades de una sola CP. Son virus monopartita con ARN de sentido positivo con tamaños de 5.4 a 9 kb, su primer ORF codifica para una RdRp tipo potex y poseen TGB que se expresan a partir de ARNsg (ARN subgenómico). El extemo 5‟ posee una caperuza de Metilguanosin y su extremo 3‟ tiene una cola poly-A. Su genoma varía entre 6.400 a 9.300 nt (Huang et al., 2004; Dijkstra y Khan, 2006; Astier et al., 2007;
ViralZone, 2010; DPVweb, 2010). Hacia el extremo 5‟ se encuentra una proteína replicasa tipo alfa constituida por motivos metiltransferasa, helicasa y RdRp y hacia el extremo 3‟ se ubica el gen CP, que codifica para proteínas de 22 a 44 kDa (Dijkstra y Khan, 2006). En esta familia recientemente se incluyó el género Sclerodarnavirus, que carece de cápside e infecta al hongo Sclerotinia sclerotiorum; de allí deriva su nombre Sclerotinia sclerotiorum debilitation-associated RNA virus (SsDRV). El virus solo posee un ORF que codifica para la replicasa tipo alfa, altamente relacionada filogenéticamente con los géneros Allexivirus,
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Potexvirus y Mandarivirus, siendo la carencia de cápside razón suficiente para ser considerado un género diferente (Adams y Kreuze, 2008a).
Género Potexvirus
Este nombre se deriva de la especie tipo Potato virus X (PVX). El género se caracteriza por poseer viriones filamentosos flexuosos con simetría helicoidal y longitudes de 470 a 580 nm (Huang et al., 2004) y un diámetro de 13 nm. Los viriones poseen un coeficiente de sedimentación que se encuentra entre los rangos 115 a 130S y un coeficiente de densidad de flotación de 1,31 g/cm3 en CsCl (Dijkstra y Khan, 2006).
La molécula de ARN contiene cinco ORF (Figura 4) y su tamaño es de 6,4 kb. El ARNg, lleva a la expresión del ORF 1, el cual contiene los motivos metiltransferasa, helicasa y polimerasa. Desde el ORF 2 al 5, el virus emplea la estrategia de ARNsg. Los ORF 2, 3 y 4 son traslapados y constituyen el TGB, que codifica para proteínas de 25, 12 y 8 kDa, respectivamente, involucradas en el movimiento del virus célula a célula. El ORF 2 también contiene un segundo motivo helicasa, mientras que el ORF 5 codifica para la proteína CP (Dijkstra y Khan, 2006; Verchot-Lubicz et al., 2007). Los NTR de los virus de este género, juegan un papel importante en la regulación y el movimiento del virus a través de las células de su hospedero. El 5‟NTR está implicado en la regulación de la síntesis del
ARNg, ARNsg, la encapsidación del virus y el transporte del virus por los plasmodesmos.
Por su parte, el 3‟NTR está involucrado en la síntesis, tanto de la cadena positiva del ARN como de la negativa (Verchot-Lubicz et al., 2007).
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Dentro del género Potexvirus se han descrito 35 especies (ICTV, 2010). Estos virus se transmiten fundamentalmente de forma mecánica, aunque algunas especies se transmiten por semilla, como es el caso de WClMV (White clover mosaic virus) (Astier et al., 2007).
Figura 4. Representación del genoma de un Potexvirus. a. En las cajas se indican los ORF. En la parte inferior se ilustra la formación de los ARNsg, que dan origen a las proteínas de movimiento (TGB) y CP. b.
Representación del virión de un Potexvirus. Fuente: http://www.expasy.org/viralzone/all_by_species/272.html
Potato virus X (PVX)
El virus PVX se caracteriza por tener una longitud de 470 a 580 nm y un diámetro de 13 nm con simetría helicoidal (ICTV, 2000), un genoma de 6,435 kb de ARN con sentido positivo (PVX raza Tula, accesión del GenBank N° EU021215.1) contenidos en una varilla flexuosa (monopartita) (Huisman et al., 1988); posee una caperuza hacia el extremo 5‟ al igual que una región 5‟NTR compuesta por 84 nt, cinco ORF y una secuencia 3‟NTR de 72
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nucleotidos (nt) (Skryabin et al., 1988). El virión tiene un canal axial central de cerca de 3 nm de diámetro. La densidad en gradiente de CsCl es de 1,31 g/cm3. La cápside del virus está compuesta por alrededor 1.000 a 1.500 subunidades de la proteína CP, que en algunos aislamientos de PVX es glicosilada (ICTV, 2000). Su PI corresponde a un pH de 4,4, con un TIP de 68-76°C, LIV de 40-60 días y un DEX de 5 a 6. Las proteínas constituyen un
94% del peso de la partícula y su virión sólo tienen una proteína estructural (CP) (Büchen-
Osmond, 2010).
En la región 5‟NTR, el virus posee un motivo repetitivo de ACCA muy conservado entre aislamientos de PVX, pero no siempre presente en todas las especies del género Potexvirus; por ejemplo Potato aucuba mosaic virus no cuenta con dicho motivo. Esta región 5‟NTR, interactúa con regiones complementarias a lo largo del genoma que funcionan como promotores de la transcripción de los ARNsg y presentan estructuras secundarias del tipo tallo-asa (SL) que participan en la regulación de la síntesis del ARN (Vechot-Lubicz et al.,
2007). Mutaciones dirigidas a esta secuencia repetida (ACCA), han mostrado que las repeticiones localizadas entre los nt 9 a 13 son indispensables para la acumulación del
ARNg y además afectan la replicación viral (Morozov et al., 1991; Verchot et al., 1998;
Park et al., 2008).
El virus se puede transmitir por inoculación mecánica y de manera natural por contacto entre plantas, pero no por polen o semilla. Las especies susceptibles al virus se encuentran en las familias Amaranthaceae, Cruciferaceae y Solanaceae, siendo Brassica campestris ssp. rapa, Datura stramonium, Gomphrena globosa, Nicotiana tabacum y Solanum tuberosum, especies comúnmente utilizadas para su estudio. Los síntomas en papa varían dependiendo de su interacción con otros virus, pudiendo originar mosaicos, moteados,
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manchas anulares y necrosis, mientras que en Datura stramonium y N. tabacum, corresponden a anillos cloróticos sistémicos seguidos de moteados y anillos cloróticos o moteados, respectivamente (Büchen-Osmond, 2010).
3.3.4. Familia Betaflexiviridae
La familia Betaflexivirida al igual que Alphaflexiviridae, pertenecen al orden Tymovirales.
La familia está integrada por los géneros Capillovirus (2 especies), Carlavirus (43 especies), Citrivirus (1 especie), Foveavirus (4 especies), Trichovirus (5 especies), Vitivirus
(6 especies), además de seis especies sin un género asignado: African oil palm ringspot virus (AOPRV), Banana mild mosaic virus (BanMMV), Cherry green ring mottle virus
(CGRMV), Cherry necrotic rusty mottle virus (CNRMV), Potato virus T (PVT) y
Sugarcane striate mosaic-associated virus (SCSMaV), sumando un total de 67 especies en la familia. Los virus de este grupo se caracterizan por poseer viriones filamentosos flexuosos de 600 a 1000 nm de longitud y de 12 a 13 nm de ancho. Poseen genomas de tamaños que oscilan entre 6.5 a 9 kb de ARN de sentido positivo, cuyo extremo 5‟ posee una caperuza de Metilguanosin y su extremo 3‟ tiene una cola poly-A. Otra característica determinante de la familia, es que su RdRp es de tipo carlavirus y con tamaños que varían de 150 a 250 kDa, posee una o varias proteínas de movimiento (TGB en Carlavirus y
Foveavirus y 30K en los demás géneros), la CP posee tamaños variables, de acuerdo al género, de 22 a 44 kDa. Se denominó Beta, debido a que es la segunda familia creada de la división de la antigua familia Flexiviridae (Adams y Kreuze, 2008b; ICTV, 2010,
ViralZone, 2010; DPVweb, 2010)
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Género Carlavirus
El virus tipo del género es el Carnation latent virus (CLV). Los 43 virus del género poseen partículas flexuosas de 470 a 1000 nm, con diámetros de 12 a 15 nm con simetría helicoidal. Los viriones tienen coeficientes de sedimentación entre 147 a 176S y densidades de flotación de 1,31 a 1,33 g/cm3 en CsCl (Dijkstra y Khan, 2006, ViralZone, 2010). Sus genomas son de ARN de cadena sencilla de sentido positivo con tamaños de 5.8 a 9 kb; hacia el extremo 5‟ presentan una caperuza y hacia el extremo 3‟ tienen una cola poly-A
(ViralZone, 2010). La TIP se encuentra entre 55 a 85°C, dependiendo de la especie del virus. Poseen 6 ORF: El ORF 1, representa alrededor del 70% del genoma y su proteína presenta tres dominios: hacia el N-terminal de metil-transferasa, un dominio con motivos de helicasa en la parte central y el motivo de polimerasa hacia el extremo C-terminal. Esta proteína es autocatalítica. Los ORF 2, 3 y 4 forman el TGB involucrado en el movimiento de la partícula viral, además la proteína 2 posee un motivo helicasa y las proteínas 3 y 4 poseen regiones posiblemente transmembranales muy hidrofóbicas. Estas proteínas se expresan mediante ARNsg (Figura 5). El ARNsg que se genera de los ORF 5 y 6 da origen a las proteínas CP y CRP; ésta última permite la unión del ARN a la cápside. Cabe destacar que la polimerasa de estos virus guarda homología con la polimerasa de los Potexvirus,
Closterovirus y Tymovirus (Foster, 1992; Zavriev et al., 1991).
La transmisión de los virus se da por inoculación mecánica ó por áfidos de forma no persistente. Algunas especies son transmitidas por Bemisia tabaci (Cowpea mild mottle virus, CPMMV) o a través de semilla. Los síntomas característicos de los carlavirus se enmarcan entre infecciones latentes (CLV), mosaicos (Poplar mosaic virus, PopMV),
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necrosis (Pea streak virus, PeSV) y ocasionalmente causan pérdidas significativas en los cultivos (Potato virus M, PVM y Potato virus S, PVS) (Astier et al., 2007).
Figura 5. Representación del genoma de los Carlavirus. a. En los cuadros se muestran las proteínas originadas a partir de cada región del genoma. Se observan los dos ARNsg producidos y las proteínas que estos codifican. b. Representación del virión de un Carlavirus. Fuente: http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/268.html
Potato virus S (PVS)
El virus PVS se caracteriza por poseer un genoma de 8464 nt (PVS aisalmiento Vltava, accesión del Genbank N° AJ863510). Sus partículas poseen una longitud de 650 nm y un diámetro de 12 nm (Mackenzie et al., 1989). El ORF 1 característico del género codifica para la proteína de replicación, con motivos de metiltransferasa (MTR), helicasa (Hel) y
RdRp hacia el extremo 5‟. Produce dos ARNsg hacia el extremo 3‟ del genoma, con
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tamaños de 2,5 y 1,5 kb, los cuales están incluidos en los filamentos flexuosos de las partículas del virus. El más pequeño de estos ARNsg codifica para la CP y el segundo para la proteína de 11 kDa. Se ha encontrado una variabilidad moderada en el virus, que se basa principalmente en diferencias en las secuencias de los genes CP y CRP. La transmisión del virus se da mediante áfidos de forma no persistente, e infecta plantas de las familias
Solanaceae y Chenopodiaceae, principalmente (Matousek et al., 2000; Matousek et al.,
2004).
Con base en la infección sistémica y no sistémica en Chenopodium spp., se pueden reconocer dos razas del virus: PVSA (PVS Andino) y PVSO (PVS Ordinario), respectivamente. Las homologías entre ambas razas para las secuencias que codifican CP y la proteína de 11 kDa son de 93% y 79%, respectivamente. En estas proteínas también se encuentra el mayor número de aminoácidos que difiere entre ambas razas, diferencias que sugieren los diferentes tipos de transmisión y sintomatologías que inducen (Foster y Mills,
1992). Así por ejemplo, PVSO no causa sintomatología en la mayoría de cultivares de papa de Europa, pero ocasionalmente produce leves rugosidades en las hojas; mientras que PVSA induce fuertes síntomas, que incluyen senescencia prematura y pérdida de hojas especialmente en plantas con infección secundaria, ocasionando pérdidas superiores al 20% cuando se encuentra asociado a PVX (Jeffries, 1998). La transmisión de PVSO se da principalmente por contacto más que por áfidos, mientras que PVSA se concentra más en el tejido y es eficientemente transmitido por áfidos como M. persicae. El virus también puede ser transmitido a partir de tubérculos infectados e incluso por plantas in vitro (EPPO,
2009).
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3.3.5. Familia Luteoviridae.
La familia Luteoviridae se deriva del género Luteovirus y se divide de acuerdo al origen filogenético del gen de la polimerasa y a las propiedades biológicas, en tres géneros:
Enamovirus (1 especie), Luteovirus (6 especies) y Polerovirus (13 especies), además de ocho especies sin género asignado: Barley yellow dwarf virus-GPV (BYDV-GPV), Barley yellow dwarf virus-RMV (BYDV-RMV), Barley yellow dwarf virus-SGV (BYDV-SGV),
Chickpea stunt disease associated virus (CpSDaV), Groundnut rosette assistor virus
(GRAV), Indonesian soybean dwarf virus (ISDV), Sweet potato leaf speckling virus
(SPLSV) y Tobacco necrotic dwarf virus (TNDV), lo que suma 28 especies en la familia.
Los viriones son partículas isométricas de 25 a 30 nm de diámetro, los cuales están compuestos por dos proteínas de cápside con alrededor de 180 copias. Poseen un genoma de ARN de cadena sencilla con sentido positivo de un tamaño de 5,6 a 6 kb. Los ORF están agrupados en bloques separados por regiones no codificantes de 100 a 200 nt. La expresión de los genes comprende las estrategias supresión de codón de parada (readthrough), cambio en el marco de lectura (frameshift), ARNsg y transactivación de traducción localizada en el extremo 3‟ (Taliansky et al., 2003; Astier et al., 2007; Dijkstra y Khan, 2006; ViralZone,
2010).
Género Polerovirus.
Los polerovirus se caracterizan por presentar cápside no envuelta con simetría icosahédrica con diámetro de alrededor de 23 nm (ViralZone, 2010). Los viriones poseen coeficientes de
3 3 flotación en CsCl de 1,38 a 1,42 g/cm , con densidades de 1.34 g/cm en Cs2SO4. El
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coeficiente de sedimentación es de 115S, el TIP es de 70 a 80°C y el DEX se encuentra alrededor de 4, aunque éste depende del hospedero. Los genomas comprenden tamaños de
5880 a 5990 nt de longitud.
Los virus de este género son transmitidos por vectores generalmente del orden Hemiptera y la familia Aphididae, así como mediante injertos, pero no por semilla, por inoculación mecánica, ni a través del polen (Büchen-Osmond, 2010).
El género Polerovirus, presenta al menos siete ORF (Figura 6). El ORF 0 codifica para una proteína de 29 kDa, que es indispensable para la acumulación del virus. El ORF 1 tiene un motivo de proteinasa y se cree que de éste se deriva la proteína VPg. El ORF 2 codifica para la polimerasa a partir de un mecanismo de cambio en el marco de lectura -1
(Ribosomal frameshift). El ORF 3 codifica para la proteína de la cápside viral, y se fusiona con el ORF 5 mediante supresión del codón de finalización (Ribosomal readthrough), dando origen a una proteína que parece estar involucrada en la transmisión por áfidos, al conferir estabilidad a la partícula viral en la hemolinfa del insecto. El ORF 4 está involucrado con el movimiento del virus en la planta, y se deriva del ORF 3 (Astier et al.,
2007; Dijkstra y Khan, 2006). Las únicas proteínas traducidas directamente del ARNg, son
ORF0 que genera a P0, la poliproteína del ORF1 (P1) y la polimerasa (ORF1-2) que se origina, cómo se indicó anteriormente, como una fusión por cambio en el marco de lectura cerca del final del ORF1. La proteína Rap1 se produce por la omisión del primer codón de inicio (Leaky Scanning) por parte del ribosoma e inicia ésta en un inusual IRES (sitio interno de entrada del ribosoma) (Figura 6). El resto de los ORF de los polerovirus se traducen a partir de ARNsg (ViralZone, 2010).
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Figura 6. Representación del genoma de los Polerovirus. a. Las cajas indican los ORF y debajo de ellas se muestran las diferentes estrategias para la expresión de las proteínas. b. Representación del virion de un
Polerovirus. Fuente: http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/610.html.
Potato leafroll virus (PLRV)
El PLRV corresponde a una partícula isométrica que posee un genoma completo de 5865 nt de ARN de sentido positivo (PLRV raza Zim13, accesión del GenBank N° AF453388), en
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cuyo extremo 5‟ se encuentra asociado a una VPg (Taliansky et al., 2003). Su cápside tiene una simetría icosahédrica con diámetro de 24 nm (Peters, 1967; Takanami y Kubo, 1979).
El virión posee una densidad de flotación en CsCl de 1,39 g/cm3, el TIP es de 70.8°C, la
LIV es de 5-10 días y el DEX es de alrededor de 4. Las proteínas representan el 70% del peso del virión (Büchen-Osmond, 2010).
El virus tiene divido su genoma en ocho ORF densamente empaquetados, con el ORF 1 solapando el ORF 0 y el ORF3 traslapado con el ORF 4 (Mayo y Miller, 1999). El virus emplea diferentes estrategias para la modulación de su ARN; así los tres primeros ORF proximales a 5‟ (0 al 2), son expresados a partir del ARNg, y los ORF proximales al extremo 3‟ (3 al 7), son expresados a partir de ARNsg, lo que hace que el virus sea muy versátil y económico en el uso de secuencias codificadoras (Taliansky et al., 2003). El ORF
0 esta involucrado en el desarrollo de la sintomatología y se cree que es un supresor del silenciamiento de genes en sus hospedantes, P1 tiene funciones de proteinasas y contiene la secuencia que codifica para VPg y posiblemente para una helicasa; el ORF 2 codifica para
RdRP mientras que el ORF 3 lo hace para la CP de 23 kDa. El ORF 4 codifica para una proteína de movimiento y la fusión de los ORF 3 y 5 genera una proteína estructural menor de 80 kDa, que se cree participa en la transmisión del virus por áfidos. Los ORF 6 y 7 han sido descritos recientemente y aunque sus funciones son desconocidas, se especula que P7 tiene propiedades de unión a ácidos nucleicos (Taliansky et al., 2003).
Los aislamientos difieren muy poco unos de otros en sus secuencias. Esto se demostró en un estudio en el que se usaron 12 secuencias completas de aislamientos del virus y las identidades fueron del 94 al 98% sobre todos los ORF. Sin embargo, en el mismo estudio con 19 aislamientos de PLRV que representaban cepas de diferentes continentes, se
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encontró que comparando las secuencias de los ORF 0 y 5 y parte del 1, era posible dividir a la especie en tres grupos: aislamientos Australianos, aislamientos Peruanos e Ingleses y un tercer grupo con aislamientos de Australia, Cuba y algunos europeos. Lo anterior conduce a plantear dos hipótesis sobre el origen de esta especie: que divergió recientemente de un ancestro viral como resultado de su adaptación a papa o que es una especie con fuertes restricciones de selección. En cualquier caso, la estrecha base genética de los cultivares de papa, puede ser un factor que restrinja la variación de este virus (Guyader y
Ducray, 2002). El virus más relacionado con PLRV en la secuencia de CP es el virus suramericano SPLSV (Sweet potato leaf speckling virus), el cual guarda una identidad del
70%, mientras que con otros Polerovirus, este valor no supera el 65% de identidad (Fuentes et al., 1996).
PLRV es transmitido por áfidos de manera persistente no propagativa, multiplicándose en el floema del huésped (Taliansky et al., 2003). El insecto más eficiente para su transmisión es M. persicae; sin embargo, Macrosiphum euphorbiae se constituye en un buen vector del virus, aunque menos eficiente, sobre todo para aislamientos australianos. Las familias taxonómicas Amaranthaceae, Cruciferaceae, Portulacaceae y Solanaceae, contienen las especies que bajo condiciones experimentales presentan mayor susceptibilidad al virus, destacándose Amaranthus caudatus, Capsella bursa-pastoris, Celosia argentea, Datura stramonium, Gomphrena globosa, Lycopersicon esculentum, Montia perfoliata, Nicotiana clevelandii, Physalis floridana, Solanum tuberosum, Solanum tuberosum ssp. andigena,
Solanum tuberosum ssp. tuberosum.
Los síntomas principales que ocasiona este virus en papa corresponden a enanismos y enrollamiento de hojas, acompañados de una grave reducción en el rendimiento. En plantas
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indicadoras como Datura stramonium, se pueden observar amarillamientos sistémicos entre venas y en Physalis floridiana se presenta clorosis sistémica entre venas y enrollamiento de hojas (Büchen-Osmond, 2010).
3.3.6. Familia Closteroviridae
La familia Closteroviridae deriva su nombre del género Closterovirus (9 especies) y se compone, además del ya mencionado, de los géneros Ampelovirus (8 especies), Crinivirus
(12 especies) y la especie sin género asignado Mint vein banding-associated virus
(MVBV), sumando así 30 especies para la familia. Esta clasificación es basada principalmente en el modo de transmisión y en las características del ARNg. Los miembros de la familia poseen viriones flexuosos con una longitud de 650 a 900 nm, ó 1200 a 2200 nm y un diámetro de 10-13 nm. Su genoma posee un rango de tamaños entre 15 y 20 kb
(Karasev, 2000; Martelli et al., 2002). Hacia el extremo 3‟, posee una terminación en estructura de horquilla (hairpin) y hacia el extremo 5‟ probablemente posee una caperuza de nucleótidos metilada. Los viriones poseen un coeficiente de sedimentación entre 96 y
140S y densidades de flotación en CsCl de 1,30 a 1,34 g/cm3. Otra característica particular de la familia es la presencia de genes que codifican para proteínas homólogas a las proteínas celulares de choque térmico 70 (HSP: heat shock proteins) y para una CP análoga o adicional, la cual conforma la cola del virión (Dijkstra y Khan, 2006; Astier et al., 2007;
Büchen-Osmond, 2010; ViralZone, 2010).
Los virus de esta familia son generalmente transmitidos por vectores Homópteros de forma no persistente (Karasev, 2000; Martelli et al., 2002). Ampelovirus y Closterovirus poseen
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genomas monopartitas, mientras que en el caso de los Crinivirus, se pueden presentar genomas bipartitas ó tripartitas (Livieratos et al., 2004).
Género Crinivirus
Los virus de este género poseen partículas de 650 a 850 nm y 700 a 900 nm de longitud, con un diámetro de 12 nm. Su genoma esta segmentado en dos ARN generalmente (Figura
7) (caso especial PYVV con 3 ARN), con tamaños de 8,1 y 7,2 kb, respectivamente. Sus
ARNg son encapsidados independientemente. El ARN 1 lleva el módulo de replicación, con los ORF 1a, 1b y 2. Los dos primeros están involucrados en la codificación para proteínas de replicación, incluyendo la RdRp y el tercero (ORF 2), codifica para una proteína de 31 kDa con función desconocida. El ORF 1b se produce por un cambio en el marco de lectura +1, que contiene el motivo RdRp (Hull, 2002). El ARN 2, tiene siete
ORFs, correspondiendo el ORF 6 a la proteína CPm (Cápside menor) y el ORF 5 a CP. El
ORF 2 codifica para una proteína HSP70h, esencial para el ensamblaje del virión y su movimiento entre células (Figura 7) (Aguilar et al., 2003; Hartono et al., 2003).
Los virus se pueden encontrar en células del floema y su transmisión ocurre por insectos de la familia Alleyrodidae de forma no persistente; no pudiendo ser transmitidos de manera mecánica. Los síntomas ocasionados por los virus del género corresponden a amarillamientos de nervaduras en hojas viejas generalmente, y algunas veces pueden inducir necrosis. Estos virus pueden causar epidemias severas en los cultivos susceptibles relacionadas con el incremento de su vector en el campo (Astier et al., 2007).
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Figura 7. Representación del genoma de un Crinivirus. a. Las cajas indican lo ORF y en la parte inferior de
éstas, las estrategias de traducción. b. Representación del virión de un Crinivirus. Fuente: http://www.expasy.org/viralzone/all_by_species/287.html.
Potato yellow vein virus (PYVV)
La enfermedad causada por el virus PYVV se reportó por primera vez en cultivos de papa en Antioquia (Colombia) en el año de 1943 (Alba, 1950). El virus se caracteriza por poseer un genoma tripartita y al menos cinco especies de ARNdc (ARN de doble cadena), denominados ARNdc 1, ARNdc 2, ARNdc 3, x y y. Presenta en su extremo 5‟ una caperuza y una estructura de pseudo-nudo hacia el extremo 3‟. El ARN 1 (8035 nt, accesión del
GenBank N° AJ557128.1) posee 3 ORF: ORF 1a y 1b los cuales contienen los dominios conservados L-Pro, MTR, Hel y RdRp (Figura 8) y la pequeña proteína hidrofóbica p7
(Livieratos et al., 2004). RdRp se produce por el cambio en el marco de lectura +1, como
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ha sido demostrado para el género Closterovirus (Agranovsky et al., 1994). El ORF 2 produce una pequeña proteína hidrofóbica que contiene putativamente una hélice transmembranal. Esta proteína varia en su ubicación en los crinivirus (Livieratos et al.,
2004).
El ARN 2 (5339 nt, accesión del GenBank N° AJ557129) tiene cinco ORF potenciales:
Hsp70h, p7, p60, p10 y CP. En su orden, la primera proteína es homóloga a la familia de chaperonas Hsp70 y está estrechamente relacionada con las Hsp70 de otros closterovirus y crinivirus. La proteína se asocia a las partículas virales y es indispensable para el correcto ensamblaje del virión y del movimiento del virus, como se ha visto en Beet yellow virus
(BYV, Closterovirus) (Alzhanova et al., 2001) y Citrus tristeza virus (CTV, Closterovirus)
(Satyanarayana et al., 2000). La proteína del ORF 2 es muy conservada entre los virus de la familia Closteroviridae, aunque en posiciones diferentes del genoma; sin embargo, aún no se conoce su función (Livieratos et al., 2004). El ORF 3 codifica para una proteína p60 homóloga para otros Closterovirus y Crinivirus (Karasev, 2000), que en el virus BYV corresponde a la proteína p64, cuarto componente integral del virión, junto con CP, CPm y
Hsp70h (Napuli et al., 2003). El ORF 4 (proteína p10) codifica para una proteína que no posee similitud con ninguna otra en las bases de datos, ni siquiera estableciendo alineamientos de la secuencias con otros Crinivirus en ubicaciones similares del genoma
(Karasev, 2000). Por último el ORF 5 codifica para la proteína putativa CP, que en homología y tamaño es muy similar a las de otros Crinivirus; además posee una región consenso de aminoácidos conservados que se encuentra en las CP de muchos virus flexuosos (Alzhanova et al., 2001).
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El ARN 3 (3892 nt, accesión del GenBank N° AJ508757) posee tres ORF potenciales: p4,
CPm y p26. La primera proteína no posee su contraparte en los otros genomas descritos de la familia Closteroviridae, ni homología con ninguna otra secuencia en las bases de datos.
El ORF 2 codifica para una proteína putativa denominada CPm por su homología con la CP menor de otros closterovirus (Livieratos et al., 2002). El ORF 3 codifica para una proteína con posición similar y tamaño a la descrita para el ARN 2 de Lettuce infectious yellows virus (LIYV, Crinivirus) (Klaassen et al., 1995; Büchen-Osmond, 2010), el ARN 2 de
Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV, Crinivirus) (Aguilar et al., 2003), el
ARN 2 de Sweet potato clorotic stunt virus (SPCSV, Crinivirus) (Kreuze et al., 2002) y el
ARN 1 de CuYV (Hartono et al., 2003). Parece ser única para el género Crinivirus; sin embargo, p26 guarda una limitada identidad con sus contrapartes del género (máximo de
36% con p26 de CuYV) y no presenta homología con otras secuencias en las bases de datos. Es de destacar que los tres ARN presentes en el virus poseen UTRs (regiones que no se traducen) con secuencias diferentes cada uno (Livieratos et al., 2004).
El virus presenta una baja variación genética entre los aislamientos de Perú y Colombia, siendo éstas las regiones de referencia debido a que sus cultivos son los más afectadas por la enfermedad (Offei et al., 2004). Igualmente, se ha reportado que puede ocasionar pérdidas de hasta el 50% en los cultivos de papa de dichos países (Salazar et al., 2000). Sus síntomas característicos corresponden a amarillamientos de las venas secundarias acompañados de un color amarillo intenso en la lámina foliar. Sin embargo, las nervaduras pueden recuperar el color verde hasta que la planta muere. Mediante infecciones dirigidas en diferentes solanáceas, se ha encontrado que además de papa, puede infectar el tomate y
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algunas plantas arvenses como Polygonum sp., Tagetes sp. y Catharanthus roseus (Salazar et al., 2000; Arciniegas, 2003; Morales et al., 2004).
Figura 8. Representación esquemática de la organización del genoma del PYVV. Las líneas oscuras representan el ARNg, las cajas representan las proteínas originadas con su respectivo nombre y los ORFs de cada proteína se indican en la parte superior o inferior. La flecha indica el sitio de corte de una proteína autocatalítica. Fuente: Livieratos et al, (2004).
3.4. Métodos de diagnóstico en virología vegetal
En la mayoría de los estudios de virus de plantas, es esencial poder establecer un diagnóstico acertado, esto implica tener las herramientas para reconocer la enfermedad e identificar de manera precisa el (los) virus que la causa(n). Por tal razón, es necesario establecer técnicas de diagnóstico altamente eficientes, rápidas y económicas para el estudio de la epidemiología de la enfermedad viral, evaluar la eficiencia de los métodos de manejo ó para garantizar que las plantas y las semillas están libres de virus (Astier et al.,
2007). A continuación se describen brevemente los principales métodos empleados para el diagnóstico de virus en plantas.
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3.4.1 Métodos Biológicos
Cuando los virus infectan las plantas, pueden o no inducir síntomas. Si los síntomas son producidos en las plantas infectadas, éstos pueden tener un valor en el diagnóstico (Salazar,
1995). Los síntomas principales asociados a enfermedades virales incluyen cambios en la pigmentación normal de las plantas (mosaicos, amarillamientos, grabados), cambios en el crecimiento (enanismos), necrosis de tejidos (para algunos virus), deformaciones y reducción en el rendimiento. Las observaciones de la planta en su conjunto y el contexto en que ocurren dicho cambios y su análisis, constituyen los primeros pasos para el diagnóstico de virus (Astier et al., 2007).
La sintomatología es la fuente primaria en la descripción de las enfermedades virales. El nombre de la especie de virus es principalmente tomado sobre la base del síntoma que causa en la planta en la cual fue identificado por primera vez (Astier et al., 2007). Sin embargo, la sintomatología se constituye en el método más insensible de diagnóstico, por cuanto solo la experiencia puede indicar cuándo es conveniente usarla (Salazar, 1995).
Entre los síntomas más comunes se presentan:
Mosaicos: Es una distribución anormal de los pigmentos de clorofila en las hojas, frecuentemente asociada con la estructura de los cloroplastos. Resulta en la yuxtaposición de varios tonos de color en la superficie de la hoja.
Variegación: Típico en flores, donde hay una ausencia de antocianinas vacuolares que generan visos blancos o una acumulación de estos pigmentos que originan tonos rojizos oscuros.
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Amarillamientos: Es característico de infecciones virales en las cuales la partícula se multiplica en los tejidos vasculares. La acumulación de virus en el floema impide el flujo normal de savia, lo que crea un estado de deficiencia que causa atrofia de raíces y enanismo.
Necrosis: Los puntos necróticos y la coloración café ocurren por la muerte de las células infectadas. Algunas necrosis pueden inducir a la muerte de la planta. La necrosis también se puede observar en frutos o tubérculos como es el caso de PVY-NTN.
Reducción en el crecimiento y deformación: La multiplicación del virus está acompañada de alteraciones metabólicas que producen generalmente reducción en el vigor de las plantas infectadas y reducción en su desarrollo. El enanismo es un síntoma característico de enfermedades virales que se acompaña de hojas pequeñas y acortamiento de entrenudos, así como también de la reducción en cantidad y tamaño de flores, frutos y semillas (Astier et al., 2007).
Los síntomas anteriormente descritos, van acompañados a su vez de disminuciones en los rendimientos de los cultivos.
Algunos virus no llevan a la expresión de síntomas en su planta hospedera, no parecen causar detrimento de ésta o pasan desapercibidos en el material de propagación. En ocasiones estos virus tienen un fuerte sinergismo con otros, intensificando su efecto como es el caso de Lily symptomless virus (LSLV, Carlavirus), el cual, en infecciones conjuntas con CMV causan la enfermedad de las manchas necróticas en Liliáceas.
A nivel celular también se pueden determinar síntomas, siendo en algunos casos útiles para identificar un género taxonómico particular (ej: Potyvirus, Carlavirus, Comovirus,
Tobamovirus). Esta técnica, sin embargo, requiere cierto nivel de experiencia pero no 62
equipo muy sofisticado. El tipo de tinción empleado para diferenciar los síntomas también es determinante en la identificación del grupo viral.
Inoculación mecánica.
Se basa en el uso de plantas herbáceas que reaccionan frente a un alto número de virus diferentes y se constituyen en plantas indicadoras de la presencia de infecciones virales a partir de inoculaciones mecánicas. Algunas de éstas plantas son: N. benthamiana, N. clevelandii, Chenopodium quinoa, C. amaranticolor, entre otras.
Las pruebas de inoculación mecánica deben realizarse en plantas jóvenes mantenidas en ambientes controlados para asegurar la sensibilidad y reproducibilidad de los síntomas.
Usualmente se emplea una solución tampón a base de fosfato para acompañar el extracto macerado de la planta infectada, que se aplicará en la superficie de las hojas de las plantas sanas. La inoculación mecánica se da cuando se frota con la savia infectada el tejido sano con ayuda de algún material, usualmente carborundum® ó celita, que permiten causar micro-heridas en éste. Las hojas deben lavarse luego de la inoculación con agua y asegurar que las plantas permanezcan en un ambiente controlado que favorezca la multiplicación del virus y la expresión de los síntomas en la planta.
Inoculación por vectores.
Algunos virus no pueden ser transmitidos de forma mecánica, como por ejemplo algunos de los que están restringidos al floema de las plantas como los Luteovirus, Polerovirus,
Nanovirus, entre otros. En este caso, las plantas indicadoras son inoculadas con sus vectores específicos, previa alimentación de éstos en plantas sintomáticas.
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Injertos.
Otro tipo de indexación ampliamente usada para la detección de virus o agentes infecciosos de etiología poco/no conocida, es la injertación. Esta se da principalmente en especies frutales y se eligen especies leñosas que manifiesten rápidamente los síntomas de la enfermedad, lo que generalmente ocurre varios meses después.
Hay que destacar que los síntomas expresados en la planta son de dos tipos, localizados o restringidos a la hoja inoculada y sistémicos. Los primeros hacen referencia a la reacción fisiológica de la planta al ingreso del virus y en ocasiones al daño ocasionado por la inoculación, los cuales se presentan pocos días después de esta. En el segundo caso, son síntomas que se presentan luego que la partícula viral comienza a desplazarse en la planta y se expresan en tejido diferente al de la inoculación.
El diagnóstico basado únicamente en expresión de síntomas es insuficiente, debido a que los síntomas no sólo dependen del virus y sus variantes, sino también del genotipo del hospedero y de las condiciones bióticas y abióticas prevalecientes durante la prueba (Astier et al., 2007).
3.4.2. Métodos serológicos.
Estos métodos se basan en la interacción de dos tipos de proteínas: antígenos (proteínas de origen viral) y anticuerpos (proteínas del tipo inmunoglobulinas que reconocen dichos antígenos y se produce a partir del sistema inmune de los animales). Por mucho tiempo se han empleado las partículas virales en sí mismas como antígenos, porque son relativamente fáciles de obtener y purificar.
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Los anticuerpos son Inmunoglobulinas (Ig), de las cuales las más usadas son IgG, que representan a su vez las tres cuartas partes de las inmunoglobulinas producidas en los mamíferos. Existen dos tipos de anticuerpos para el diagnóstico de virus: los anticuerpos policlonales (pABs) y los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos policlonales son producidos generalmente en animales como conejos y cabras, mediante la inyección de proteínas purificadas del virus que inducen la producción por los linfocitos B de un complejo de anticuerpos que son colectados en el suero sanguíneo del animal. Por su parte, los anticuerpos monoclonales (mABs), son obtenidos a partir de células cancerosas que se obtienen por una fusión del mieloma de ratones y células limfocitarias y se multiplican in vivo en un medio selectivo. A este cultivo se aplica el antígeno, generándose un sobrenadante con los anticuerpos que reconocen un epítope particular de la proteína viral, por lo que este tipo de anticuerpos es mucho más específico que los policlonales (Astier et al., 2007; Shcherbakova, 2007).
ELISA (Enzyme-linked immuno-sorbent assay)
Esta técnica se basa en la unión o marcaje de las inmunoglobulinas con enzimas que generan una reacción de color al degradar un sustrato. El conjugado con fosfatasa alcalina es el más comúnmente empleado. La prueba de ELISA puede ser directa o indirecta, dependiendo de que tipo de anticuerpo esté asociado a la enzima. En la directa, el antígeno objetivo es detectado por una enzima conjugada de anticuerpos homólogos (antígeno específica). En la prueba indirecta, un anticuerpo homólogo al antígeno, pero sin marcar
(ABs1), es el que captura el antígeno objetivo y luego un conjugado de enzima es el que
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detecta el complejo antígeno-anticuerpo, a partir de un segundo anticuerpo contra ABs1
(Shcherbakova, 2007).
Hay diversidad de protocolos en los que se usan platos de poliestireno como soporte para la aplicación de las pruebas de ELISA, pero el más común es el formato DAS (double antibody sandwich), que se basa en poner el antígeno en medio de dos anticuerpos específicos. La IgG se une fuertemente al poliestireno e interactúa con el antígeno. Para revelar la reacción se hace uso de la misma IgG pero marcada con la enzima (conjugado), la cual se fija al antígeno y posteriormente se adiciona el sustrato para que ocurra la reacción de color. La intensidad del color es medida a una longitud de onda de 405 nm. La absorbancia puede en ciertos rangos de concentración, ser proporcional al logaritmo de la concentración (Salazar, 1995; Astier et al., 2007; Shcherbakova, 2007).
Otras variantes de ELISA corresponden al sandwich de ELISA indirecto o TAS-ELISA
(Triple antibody sandwich), que involucra anticuerpos provenientes de dos especies animales, siendo los anticuerpos que detectan el antígeno objetivo, producidos en una de estas especies y el anticuerpo del conjugado, producido en la otra especie animal. Una ventaja de este método es la universalidad del conjugado, ya que puede se empleado para el análisis de varios antígenos. Otro formato de ELISA es DAC (recubrimiento directo de antígenos) ó PTA (antígenos atrapados en placa). En este procedimiento, los antígenos son inmovilizados en una placa, contrario a lo que pasa en el DAS-ELISA. Se usa preferiblemente para evaluar la respuesta inmune a un antígeno y no tanto para realizar diagnóstico (Shcherbakova, 2007). Una técnica similar pero realizada en membranas de nitrocelulosa, es la denominada NCM-ELISA (ELISA en membranas de nitrocelulosa). Se basa principalmente en fijar el antígeno a la membrana y posteriormente unir los
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anticuerpos específicos y el conjugado, como en la prueba DAC-ELISA, pero requiere un paso adicional y es el bloqueo de la membrana luego de fijado el antígeno (Salazar, 1995).
Otros autores describen la técnica como DBIA (dot blot immuno assay) ó dot-ELISA, pudiéndose emplear además de membranas de nitrocelulosa, aquellas de
Polivinilidenofluoruro (PVDF). La técnica de flujo lateral (LFA), es empleada in situ y consiste en una barra que contiene en su orden superficies con: la región de aplicación de la muestra, una membrana de nitrocelulosa con pequeñas láminas con los anticuerpos específicos inmovilizados y la almohadilla absorbente. A medida que el antígeno es adsorbido por la membrana, éste sube por la barra y se une a los anticuerpos, los cuales se concentran en las laminillas donde se da la reacción de color. Dos líneas indican una prueba positiva y una sola línea en la barra indica una prueba negativa o que el antígeno no se encuentra en la muestra analizada (Shcherbakova, 2007).
Otros métodos de inmunodiagnóstico.
Inmuno-fluorescencia (IFA): actualmente se usan para la prueba anticuerpos monoclonales, los cuales son marcados con colorantes fluorescentes para producir los conjugados con moléculas como fluorosceína isotiocianato o rhodamina isotiocianato. En el ensayo directo, se emplean conjugados con anticuerpos específicos para el antígeno objetivo, en el caso del ensayo indirecto, como en el TAS-ELISA, el segundo anticuerpo es el que se encuentra marcado con el colorante fluorescente. El resultado se observa en un microscopio de fluorescencia, lo que se puede potenciar si se utiliza un software apropiado que cuantifique las unidades fluorescentes presentes en la placa (Shcherbakova, 2007).
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Immunobloting: Es denominado también Western bloting. Es un método muy sensible para la identificación de proteínas y se basa en la combinación de geles de electroforesis y la interacción antígeno-anticuerpo. El método consta de tres etapas: separación de las proteínas a analizar en un gel de poliacrilamida desnaturalizante con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), donde pueden ser visualizadas luego de una tinción y comparadas con las muestras de referencia. La segunda etapa se basa en la transferencia y fijación de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa mediante electroforesis (blotted). Por último, los pABs o mABs son aplicados a la membrana para realizar la detección mediante reacción enzimática similar a la descrita en las pruebas de ELISA (Shcherbakova, 2007).
Microscopía electrónica.
La microscopía electrónica permite obtener resultados de diagnóstico a partir de una evidencia visual mediante la tinción negativa con metales pesados de los tejidos/savia vegetales (Salazar, 1995). Es frecuente su combinación con métodos inmunológicos
(inmuno-electromicroscopía-IEM) que se constituye en uno de los medios directos más precisos de identificación de virus. La técnica es simple y rápida y consiste en examinar un extracto crudo de planta, de manera que los anticuerpos se fijan a los motivos antigénicos de la cápside viral formando un tipo recubrimiento alrededor de la partícula, que es fácilmente observable al microscopio electrónico (Salazar, 1995; Astier et al., 2007).
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3.4.3. Métodos basados en el uso de ácidos nucleicos.
Las técnicas basadas en el uso de ácidos nucleicos han permitido a los investigadores sobrepasar las desventajas que presentan las técnicas dependientes de la interacción antígeno-anticuerpo, en particular los problemas asociados a su posible inespecificidad.
Una ventaja de los métodos basados en el uso de ácidos nucleicos es por tanto, la alta precisión que ofrecen para la detección viral así como su uso simultáneo para la caracterización genética de los virus bajo estudio e incluso de su interacción con el hospedero. Estos métodos se dividen básicamente en dos grupos: hibridización con secuencias de ADN/ARN y aquellos que emplean la metodología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Shcherbakova, 2007).
Hibridización molecular.
El principio de estas técnicas se basa en la fijación de pequeñas cantidades de extractos de plantas (Tissue-printing) ó de ácidos nucleicos totales (Dot-blot) en membranas de nylon o nitrocelulosa, que son reconocidos por sondas marcadas radioactivamente ó por sondas no isotópicas. El resultado se monitorea por el cambio de coloración que se observa en la membrana (detección colorimétrica) ó sobre una película de detección (métodos radioactivos ó quimioluminiscentes) (Astier et al., 2007).
Hibridización Dot-blot: En esta metodología, se parte de una pequeña cantidad de savia de la muestra a evaluar, a la cual se realiza extracción de ácidos nucleicos procediendo a su denaturalización a altas temperaturas o por tratamiento con álcali; luego una pequeña muestra es fijada en la membrana con la ayuda de UV. Los sitios no específicos de
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reconocimiento en la membrana son bloqueados por incubación en la etapa de prehibridización, utilizando una solución que contiene una proteína (generalmente albúmina de suero bovino). Posteriormente, se realiza el proceso de hibridización en la membrana con una sonda marcada, para luego proceder a lavar y realizar el revelado que depende del tipo de sonda utilizada (Hull, 2004). Se ha reportado que la técnica puede detectar hasta 0,5 pg de titulo viral (Khan y Dijkstra, 2006). Considerando que la prueba es fiable, rápida y fácil de desarrollar, se presenta como una alternativa al uso de la técnica de
ELISA convencional, cuando no se cuentan con anticuerpos específicos para un virus de interés o cuando los costos de éstos son muy altos (Astier et al., 2007).
Tissue-printing: En este caso, se utiliza una aplicación directa de secciones frescas de tejido infectado (tallo, hojas o bulbos) en una membrana para visualizar in situ la distribución en los tejidos de los virus (Makkouk et al., 1993). El procedimiento es rápido, sensible y simple (no utiliza extracción de virus), es económico por que no requiere de equipo especializado, además es apropiado para evaluar un alto número de muestras por día
(Webster et al., 2004). Esta técnica permite estudiar aspectos relacionados con la localización de las partículas virales en los tejidos de las plantas y evaluar su movimiento entre células y através de los haces vasculares (Más y Pallas, 1995).
Las hibridizaciones son reveladas mediante el marcaje de la prueba con un isotopo radioactivo (fósforo 32) o un reportero no radioactivo como biotina, acetilaminofluorene
(AAF), fluorovitosina o digoxigenina (Astier et al., 2007).
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Técnicas basadas en PCR.
Se fundamentan en la amplificación exponencial de una secuencia de ácidos nucleicos que es flanqueada por un par de cebadores, los cuales son usados por una polimerasa termo estable de ADN para la formación de las nuevas cadenas. La técnica consta de múltiples ciclos (usualmente 35 a 40) en los cuales hay desnaturalización de ADN de doble cadena, anillamiento de los cebadores (oligonucleotidos de 16 a 35 bases), extensión
(polimerización) y nuevamente desnaturalización. Esto permite la detección precisa de una secuencia viral y posterior secuenciación para caracterizarla con exactitud (Astier et al.,
2007; Shcherbakova, 2007).
En el caso de los virus de ARN es necesario un paso anterior a la PCR, en el cual se pasa el
ARN a su homólogo de ADN, denominado ADN copia (ADNc). Este proceso es realizado por una enzima transcriptasa reversa de orígen viral.
Los métodos basados en PCR permiten una mayor sensibilidad que las pruebas mencionadas anteriormente, debido a que una pequeña secuencia es amplificada millones de veces, posibilitándose su visualización como bandas a través de electroforesis en geles
(Shcherbakova, 2007). Entre las diferentes variaciones que tiene esta técnica se incluyen:
PCR anidada: se fundamenta en el empleo de dos pares de cebadores, los externos que dan origen a un fragmento que sirve de molde para el segundo par (internos), generando amplicones altamente específicos. Un ejemplo del uso exitoso de esta técnica en virología, corresponde a la detección de especies de virus de los géneros Vitivirus y Foveavirus en plantas de vid (Shcherbakova, 2007; Webster et al., 2004).
PCR-RFLP: En esta técnica se hace uso en conjunto de la metodología RFLP (Restriction fragment length polymorphism) y PCR, para estudiar las diferencias entre los virus con
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base en la ausencia/presencia de sitios de restricción en la secuencia de sus genomas. Luego de la amplificación por PCR, los fragmentos obtenidos son digeridos con una enzima de restricción y se analiza el patrón de bandas mediante electroforesis. Es un método que permite diferenciar aislamientos sin los costos que consumen la clonación y la secuenciación (Webster et al., 2004).
RT-PCR múltiple: Múltiples especies o razas pueden ser detectadas en una sola reacción de
PCR, que combina cebadores específicos para los diferentes virus. La técnica requiere que los productos de la amplificación posean tamaños diferentes para cada virus y que entre los cebadores no haya reacciones cruzadas (Webster et al., 2004).
PCR-Inmunocaptura (IC-PCR): Esta metodología combina el reconocimiento del virus con el uso de anticuerpos específicos y la amplificación por PCR. La reacción antígeno- anticuerpo, constituye la primera fase, en la cual se reducen el riesgo de contaminación con inhibidores presentes en el tejido de la planta, al obtenerse el virus fijado a las placas de poliestireno. Luego, en condiciones alcalinas y en presencia de un detergente se libera el
ARN ó ADN viral para ser amplificado posteriormente mediante RT-PCR o PCR convencional (Webseter et al., 2004; Shcherbakova, 2007).
PCR en tiempo real.
Esta metodología permite monitorear la acumulación en tiempo real de los productos de
PCR para cada ciclo durante toda la reacción. La técnica no requiere correr las muestras en gel de electroforesis ya que la información requerida se obtiene en las gráficas del monitoreo de la reacción. Es más rápida, específica y sensible que una PCR convencional,
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además de ser un método cuantitativo al suministrar información de la cantidad de producto amplificado, previa generación de una curva de calibración (Shcherbakova, 2007).
El equipo para este procedimiento posee instrumentación para la medición de la fluorescencia generada por la liberación de fluorocromos liberados o incorporados en los diferentes ciclos de la reacción. Se pueden emplear colorantes como SYBRgreen®, que es un compuesto que se intercala en el ADN de doble cadena y es la forma de detección más simple de la técnica; aunque tiene como desventaja el hecho que el colorante se puede intercalar en amplicones inespecíficos generados durante la reacción (Shcherbakova, 2007).
Otra metodología que evita los problemas de detección inespecífica, consiste en el uso de sondas Taqman® (25-30 nt), las cuales se unen al interior de la secuencia demarcada por los cebadores. Posee un marcaje en su extremo 5‟ de un derivado de Fluorosceína
(generalmente 6-FAM) y en el extremo 3‟ un compuesto que absorbe la fluorescencia del primero, denominado atenuador (quencher) (generalmente TAMRA). La detección se da cuando la sonda hibridiza en la secuencia de interés (al igual que los cebadores específicos) y al comenzar la extensión, la acción 5‟-3‟ exonucleasa de la polimerasa degrada la sonda, liberando el flurocromo que se encuentra hacia el extremo 5‟, siendo posible su detección por parte del equipo. Otros formatos de la técnica incluyen las denominadas sondas
Scorpion™ ó del tipo Molecular Beacons, en los cuales las sondas forman estructuras plegadas en forma de asa, que una vez se eleva la temperatura en la reacción son separadas, produciéndose la fluorescencia y por tanto la detección respectiva (Shcherbakova, 2007).
El uso de PCR en tiempo real viene extendiéndose ampliamente en el campo de la fitopatología, permitiendo identificar virus y otros patógenos que afectan las plantas. Es un método de diagnóstico e identificación evaluado en patógenos cuarentenarios como el
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viroide de la papa (PSTVd) y en virus de gran importancia económica como Tomato spotted wilt virus (TSWV) y PVY-NTN (Webster et al., 2004; Shcherbakova, 2007).
4. METODOLOGÍA
4.1. Localización
Esta investigación se desarrolló en el Laboratorio de Biología celular y molecular de la
Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Las muestras de plantas de papa fueron obtenidas en los principales municipios cultivadores de los Departamentos de Antioquia,
Boyacá, Cundinamarca y Nariño (Tabla 1). Las plantas utilizadas para la detección de
PMTV a partir de muestras de suelo infestadas con quistosoros de S. subterranea, fueron mantenidas en casas malla en el Centro Experimental Paysandú, ubicado en el corregimiento Santa Elena, municipio de Medellín (bh-MB, 2.550 msnm., temperatura media 14°C y precipitación promedio anual de 2.000 mm).
Tabla 1. Procedencia de las muestras de papa utilizadas para la detección de virus.
Departamento Zona Municipio Vereda N°Lotes
Buena Vista 1 El Vergel 1 La Unión San Juan 1 Oriente El Cardal 1 Tasajo 3 Sonsón Antioquia La Honda 1 Santuario El Carmelo 3 La Ramada 1 Oriente Cercano Marinilla Alto de Mercado 1 Barbacoa 1 Carmen de Viboral 2
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Continuación Tabla 1
Norte El Roble 5 Sta Rosa de Osos Santana 3 Chasques 3 1 Villapinzón Villapinzón Quincha 3 Bosabita 1 San Jorge 3 Alto del Águila 2 Cundinamarca Zipaquirá Zipaquirá Páramo de Guerrero 2 Venta Larga 1 Parcelas 1 Cota La Variante 2 Occidente Madrid Los Árboles 3 Facatativá 2 Joyagua 1 Siguineque 1 Turmequé Chiratá 1 TV Juratá 1 Boyacá Rosales 1 Sota 1 Ventaquemada Capellanía 2 Cormechoque 3 Siachoque Tunja Jurubita 3 Soracá Quebrada Vieja 2 Santa Bárbara 1 La Victoria 3 Catambuco 1 Pasto Pasto Cruz Loma 1 Jongovito 1 Nariño Obonuco 1 Saguarán 1 El Placer Bajo 1 Ipiales Ipiales Suras 2 El Chita 1 Giro San Antonio 3
4.2. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa
Para esta evaluación se realizaron muestreos aleatorios en ocho cultivos de papa de
diferentes variedades ubicados en tres zonas productoras del Departamento de Antioquia
(zona 1: Oriente, zona 2: Oriente cercano, zona 3: Norte Antioqueño), tres zonas en
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Cundinamarca (zona 4: Zipaquirá, zona 5: Villa Pinzón, zona 6: Occidente), dos zonas en
Boyacá (zona 7: Turmeque-Ventaquemada, zona 8: Tunja) y dos zonas en Nariño (zona 9:
Pasto, zona 10: Ipiales) (Tabla 1). En cada cultivo se realizó un recorrido aleatorio evaluándose 100 plantas por sintomatología general presumiblemente asociada a virus (AV: amarillamiento de venas, En: enanismo, EF: enrollamiento foliar, MR: mosaico rugoso, O: sin síntomas visibles). Estas 100 plantas se dividieron en cuatro grupos de 25, tomándose dos hojas de las plantas correspondientes a las lecturas 5, 10, 15, 20 y 25 de cada grupo, para generar una muestra compuesta (bulk) para el análisis serológico. Adicionalmente y con fines comparativos, de cada zona se tomó una muestra de plantas con cada uno de los síntomas indicados anteriormente (AV, En, EF, MR), con el fin evaluar la asociación de dichos síntomas con la presencia de alguno(s) de los virus bajo análisis.
Una vez en el laboratorio, las muestras obtenidas de cada cultivo se evaluaron mediante pruebas de ELISA con anticuerpos específicos de la compañía Agdia (Indiana, EEUU) para los virus PVX, Potyvirus, PLRV y PVS. Para la detección del virus PMTV se utilizaron anticuerpos de la compañía Bioreba (Reinach, Suiza). Las siguientes son las características de cada uno de las pruebas de ELISA empleadas para esta detección viral:
PLRV: Prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos policlonales y detección con anticuerpos policlonales conjugados a la enzima Fosfatasa alkalina.
Grupo de Potyvirus: Prueba de ACP-ELISA utilizando anticuerpos monoclonales desarrollados por USDA Florist and Nursery Crops Laboratory (Beltsville, Maryland,
USA) y detección con anticuerpo monoclonal conjugado a la enzima Fosfatasa alkalina.
PVX: Prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos policlonales y detección con anticuerpos policlonales conjugados a la enzima Fosfatasa alkalina.
76
PMTV: prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos monoclonales desarrollados por
Scottish Agricultural Science Agency (SASA) y su detección con anticuerpo monoclonal conjugado a la enzima Fosfatasa alkalina.
PVS: Prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos policlonales y detección con anticuerpos policlonales conjugados a la enzima Fosfatasa alkalina.
Para las pruebas de ELISA, se tomaron fracciones de tejido foliar de cada muestra y se pesaron 100 mg, procediéndose a macerar con el buffer de extracción recomendado para cada virus en concentración 1X y siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados colorimétricos fueron cuantificados en un equipo Multiscan (Labsystem, Finlandia), incluyendo en cada prueba un control positivo (suministrado por el fabricante en forma liofilizada) y un control negativo (buffer de extracción). Los pozos fueron considerados con reacción positiva cuando la lectura de absorbancia a 405 nm presentó un valor mínimo del doble de la lectura obtenida en el control negativo (Matthews, 1993).
Los resultados de niveles de incidencia fueron analizados a través de un modelo lineal generalizado aleatorio considerando una distribución binomial para la variable incidencia y utilizando una función de ligamiento logit. Los efectos aleatorios fueron: zona y cultivos de dentro de zona. Para el análisis estadístico de utilizó el procedimiento GLIMMIX del programa estadístico SAS versión 9.1.3.
4.3. Detección del PMTV en cultivos afectados por S. subterranea
En cada una de las diez zonas bajo estudio, se ubicó al menos un cultivo afectado por sarna polvosa, tomándose una muestra de raíces y/o tubérculos sintomáticos, además de una
77
muestra de suelo de 1 kg. Las muestras de tejidos sintomáticos fueron utilizadas para la detección de PMTV directamente a partir de los quistosoros del patógeno, mediante ELISA y RT-PCR, como se describe en los otros apartados de la metodología; mientras que la muestra de suelos fue tamizada para la extracción de quistosoros siguiendo la metodología de Jaramillo y Botero (2007), en la cual se utiliza un juego de tamices de 250 y 90 μm. Una vez realizado este procedimiento, se tomaron 5 g del material retenido en el tamiz de 25 μm
(suelo y quistosoros) para realizar su inoculación en macetas con turba de 250 g de capacidad, en las cuales se transplantaron plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) con
2-3 pares de hojas verdaderas, siguiendo la metodología de Vélez (2007). La concentración de quistosoros de cada una de las muestras tamizadas fue cuantificada a partir de una dilución de 100 mg/10 ml de agua mediante un hematocitometro. Tres meses despues de la siembra se tomaran muestras de hojas y raíces para el diagnóstico de PMTV mediante pruebas de ELISA y RT-PCR.
4.4. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa mediante RT-PCR y secuenciación
Para el análisis filogenético de los virus PVY, PLRV, PVS, PVX y PYVV se utilizaron secuencias parciales de la región del genoma que codifica para la cápside viral; mientras que para PMTV además de esta región, también se realizó el análisis con base en una porción del gen TGB2.
El ARN molde necesario para la técnica de RT-PCR se obtuvo a partir de extracciones de
ARN total de plantas de papa con los diferentes síntomas virales mediante el kit RNeasy
78
plant mini kit (QIAGEN Inc., California, USA). Para el caso de PMTV, además del análisis de plantas de papa, también se evaluó tejido foliar de plantas de N. benthamiana mantenidas en suelos infestados con quistosoros de S. subterranea y directamente de agallas de raíces y tubérculos con sarna polvosa. Para este procedimiento se maceraron 100 mg de tejido foliar, utilizando 450 μL de buffer RLT (para tejido foliar) o RLC (para raíces y tubérculos) y 4,5 μl de β-mercaptoetanol, siguiendo las instrucciones del fabricante, pero con dos centrifugaciones simultáneas en la etapa de lavado del ARN. Al finalizar el procedimiento, el ARN obtenido fue resuspendido en 40 μl de agua destilada ésteril tratada con DEPC.
Adicionalmente, ante la dificultad de obtener los amplicones esperados en algunas zonas de muestreo mediante el procedimiento de extracción de ARN total, se realizó la transcripción reversa a partir de liberación post-ELISA, siguiendo el procedimiento de inmunocaptura propuesto por Harju et al. (2005). Brevemente, una vez concluída la prueba de ELISA, se remueve el sustrato mediante tres lavados de 1 min con PBS-T (PBS suplementado con
0.05% Tween 20) y las partículas virales fueron liberadas con buffer-R (10mM Tris–HCl, pH 8.0 with 1.0% Triton X-100) bajo incubación a 70°C por 10 min. La solución resultante se almacenaba a -20°C hasta su uso directo en la RT.
Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos (Two-Steps RT-PCR). Para esto se utilizaron cebadores específicos (Tabla 2) y/o oligo-dT (para los virus que presentan colas de poly-A en sus regiones 3‟) en las reacciones de retrotranscripción de un volumen de 20
µl, incluyendo 1,9 µl de agua, 4 µl de buffer RT 5X, 4 µl de MgCl2 25 mM, 2 µl de dNTPs
10 mM, 1 µl de cebador reverso 10 µM, 0,1 µl de inhibidor de RNasa (40U/µl), 2 µl de enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 U/µl )(Fermentas, Lituania) y 5 µl de ARN o
79
alternativamente una dilución 1:5. El programa consistió en 37°C por 60 min, 75°C por 15
min y finalmente las muestras fueron mantenidas a 4°C hasta su uso en el PCR posterior.
Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 µl con 16,2 µl de agua, 2,5 de
buffer de enzima 10X, 1,8 µl de MgCl2 (25 mM), 0,5 µl de dNTPs (10 mM), 0,5 µl de cada
cebador (10 µM) (Tabla 2), 0,2 µl de Taq ADN polimerasa (5 U/µl) (Fermentas) y 2,5 µl de
ADNc, aunque en algunas ocasiones fue necesario preparar diluciones de 1:5 y 1:10 de
ADNc. El programa de PCR consistió en 95°C por 30 s, seguido de 40 ciclos de 95°C por
30s, 52-60°C (Tabla 2) por 45 s, 72°C por 1 min (1 min por cada 1000 pb esperados) y una
extensión final a 72°C por 5 min.
Tabla 2. Cebadores específicos utilizados en la detección por RT-PCR de cada uno de los
virus bajo estudio.
Tamaño T° Virus Cebador Secuencia Referencia amplicón annealing
PVYF 5'-ACG TCC AAA ATG AGA ATG CC-3' PVY 480 pb 53°C Nie y Singh, 2001 PVYR 5'-TGG TGT TCG TGA TGT GAC CT-3' PVXF 5'-TAG CAC AAC ACA GGC CAC AG-3' PVX 562 pb 57ºC Nie y Singh, 2001 PVXR 5'-GGC AGC ATT CAT TTC AGC TTC-3' 5´-ATG GAA ATC CGA TCG TGG AAC PYVVCPF Livieratos et al., PYVV CT-3´ 758 pb 55°C 2002 PYVVCPR 5´-CTA CTC AAT AGA TCC TGC TA-3´ Chikh Ali et al., PVSCPF 5'-CTA GRC AAT TGC GAG CTC AC-3' 2008 PVS 1288 pb 53°C 5'-ATG ATC GAG TCC AAG GGC ACT G - PVSR Nie y Singh,2001 3' PLRVF 5' -CGC GCT AAC AGA GTT CAG CC-3' PLRV 336 pb 54ºC Singh et al., 1995 PLRVR 5'-GCA ATG GGG GTC CAA CTC AT-3'
5‟-CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA C819 CC-3‟ PMTV 460 pb 56°C MacKenzie, 1996 5‟–CAT GAA GGC TGC CGT GAG GAA H360 GT-3‟
80
PMTVF4 5‟ CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG-3‟ 417 pb 56°C Xu et al., 2004 PMTVR4 5‟ AGC CAC TAA CAA AAC ATACTGC-3‟
Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% suplementado con 4 μL de bromuro de etidio (10 mg/ml), visualizados utilizando un transiluminador UV (Biometra, Göttingen, Alemania) y su tamaño verificado por comparación con el marcador de peso molecular Generuler 100 pb DNA ladder
(Fermentas). Los amplicones del tamaño esperado para cada uno de los virus bajo análisis, fueron purificados directamente del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen), para proceder a su secuenciación en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores del
RT-PCR en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied Biosystems) de la compañía
Macrogen (Corea del Sur).
Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit
6.0.6 y Chromas 1.45, construyéndose secuencias consenso y confirmándose su identidad con genes virales por comparación con las bases de datos moleculares, mediante el programa nucleotide BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi). Esta información sirvió de base para realizar el análisis de las relaciones filogenéticas de las cepas virales encontradas y aquellas de otras regiones del mundo, cuyas secuencias están reportadas en las bases de datos moleculares. Para esto se alinearon las secuencias mediante el software Clustal W y la matriz generada fue utilizada para obtener un árbol filogenético basado en Máxima Parsimonia utilizando la opción Heuristic search del programa PAUP
4.0b, asumiendo los espacios (gaps) como nucleótidos eliminados (missing value) y la orden tree-bisection reconnection (TBR) (Swofford, 1998). El soporte de la topología
81
interna de los dendrogramas fue determinado por análisis de bootstrap con 1000 remuestreos (Felsenstein, 1985).
4.5 Secuencias parciales de los genomas virales
Con el fin de obtener un mayor nivel de información sobre las características de los genomas de los virus bajo estudio, adicionalmente se evaluaron múltiples cebadores dirigidos a otras regiones del genoma, diferentes a las utilizadas en el análisis filogenético
(Tabla 3). Para esto se siguieron los procedimientos de extracción de ARN, RT-PCR y secuenciación descritos anteriormente, pero utilizando un menor número de aislamientos.
Para realizar el ensamblaje de los genomas parciales, las secuencias se editaron mediante
Chromas, generándose los consensos con ambos cebadores usando Bioedit. Posteriormente, se verificaba el marco de lectura correcto utilizando el servidor de Expasy (Expasy
Proteomic Server, http://www.expasy.ch/tools/dna.html) y se procedía a su alineamiento con respecto a los genomas completos para cada virus, disponibles en el GenBank. Las regiones alineadas eran seleccionadas para evaluar sus niveles de identidad en nucleótidos y aminoácidos con la herramienta de matriz de identidad del programa Bioedit. Con las secuencias disponibles para cada aislamiento viral, se generaba un ensamble en contigs mediante la herramienta ContigExpress del software vector NTI (versión 11.0 Invitrogen
Corporation 2008). Finalmente, aquellos genomas que presentaban mayores niveles de identidad con respecto a las secuencias ensambladas de las cepas nativas, fueron utilizados como base de referencia para realizar diagramas de su ubicación en el contexto genómico, mediante el software Vector NTI.
82
Tabla 3. Cebadores específicos utilizados en la detección por RT-PCR de cada uno de los
virus bajo estudio.
Posición en T° Virus Cebador Secuencia el genoma Referencia annealing (nt)
PVYc 5'-AAT TAA AAC AAC TCA ATA CA- 3' 2 a 21
PVYd 5'-TGY GAH CCA CGC ACT ATG AA-3' 955 a 974
PVYHC- 5'-CGM ARG GGY GAT AGT GGA GT-3' 880 a 899 ProF Glais et al., PVYHC- 2002a 5'-GTT TCT GCY GCT GAC ACT CG-3' 2704 a 2723 ProR
PVYCPF 5'-ACC ATC AAG SAA ATG ACA CA-3' 8564 a 8583 PVY 53°C PVYCPR 5'-CGG AGA GAC ACT ACA TCA CA-3' 9371 a 9390
5'-AAC CAT TCT TCA AGA AGC CAA CAC HF 4034 a 4063 TGC GTA-3' 5'-TAC GCA GTG TTG GCT TCT TGA AGA ATG HR 4034 a 4063 GTT-3' Glais et al., 5'-GTC TCC TGA TTG AAG TTT ACA GTC ACT 1998 3ntr 9670 a 9703 GYT ATG A-3'
3ntrC 5'-GTC TCC TGA TTG AAG TTT AC-3' 9684 a 9703
5'-GAA AAC TAA ACC ATA CAC CAA CAA C- PVX1F 1 a 25 3'
PVX1651R 5'-CGC GTT TRG CTT TCT TTR CRG-3' 1651 a 1672 PVX3130F 5'-GTS GAG AAT GAG GAG TC-3' 3130 a 3146 Rain et al., PVX 5'-CCT AAA CTT TTC AAA CTA NTG ATG AG- PVX4495R 4495 a 4520 2007 3'
PVX5476F 5'-CAA TCA TAG CAG TMA TTA G-3' 5476 a 5494
PVX6415R 5'-ATT TAT ATT CAT ACA ATC-3' 6415 a 6435
PVSCPF 5'-CTA GRC AAT TGC GAG CTC AC-3' 7098 a 7117 Chikh Ali et PVS 53°C al., 2008 PVSCPR 5'-TGG TAT CAC CTC AGT TAC TCC-3' 8366 a 8386
CPm1 5'-ATG GAT AAG TCT GTT TTA GAT G-3' 916 a 937 Livieratos et PYVV 52° al., 2002 CPm2 5'-TCA AAA GTT TTG ATT CAC ATT C-3' 2919 a 2940 5'-GAT GGT GTA CCC GGA TGT GGA AAG TC- Savenkov et PMTV FURO-Hel 3151 a 3176 58°C 3' al., 1999
83
Continuación Tabla 3
123 end 5'-GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC- 5847 a 5872 3'
PMTV759F 5'-ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG-3' 1072 a 1094 Presente Trabajo PMTV1552R 5'-GCC AAT TGT CTC AAT CAT ACA CTG-3' 1865 a 1888
C819 5‟-CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA CC-3‟ 822 a 844 MacKenzie, 1996 H360 5‟–CAT GAA GGC TGC CGT GAG GAA GT-3‟ 385 a 407
PMTVF4 5‟ CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG-3‟ 1726 a 1746 Xu et al., 56°C 2004 PMTVR4 5‟ AGC CAC TAA CAA AAC ATA CTG C-3‟ 2120 a 2141 PMTV5 5'-GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT-3' USA RNA3 1417 a 1436 Lambert et PMTV7 al., 2003 5'-AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC-3' USA RNA3 2044 a 2063
4.6. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real
Con el fin de generar una prueba de diagnóstico que permita la detección rápida y sensible
de los virus, se evaluó una metodología de RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) utilizando
sondas Taqman® y cebadores específicos para los virus PVY y PMTV. Estos virus fueron
seleccionados en la investigación debido a su importancia económica y amplia distribución
en las regiones cultivadoras de papa (PVY) y a su condición de patógeno cuarentenario
(PMTV) asociado a S. subterranea. Se utilizaron 40 muestras de tejido foliar de papa (para
PVY) obtenidas de cultivos de los departamentos de Antioquia y Nariño (Tabla 5) y 40 de
raíces de plantas de N. benthamiana obtenidas de suelos infestados con quistosoros de S.
subterranea de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño (Tabla 6). Todas las muestras
fueron evaluadas mediante ELISA, RT-PCR convencional y qRT-PCR. Las pruebas de
ELISA se realizaron con anticuerpos comerciales para PVY (Agdia) y para PMTV
84
(Bioreba), mientras que los RT-PCR convencional se desarrollaron con cebadores específicos para PVY: PVYF y PVYUnivR (Tablas 3 y 4); para PMTV se utilizaron los cebadores diseñados a partir de las secuencias obtenidas en el proyecto PMTV759F y
PMTV1552R (Tabla 3). Las reacciones de qRT-PCR se realizaron en un sólo paso, utilizando el kit QuantiTect Probe RT-PCR (Qiagen, Alemania) en 20 μl de reacción conteniendo 10 μl de 2X QuantiTect Probe Master Mix (HotStarTaq DNA Polymerase,
QuantiTect Probe RT-PCR Buffer, dNTPs incluyendo dUTP, ROX buffer), 0,2 μl
QuantiTect RT Mix (Reverso transcriptasas Omniscript y Sensiscript), 6,9 μl de agua libre de ARNasas, 0,8 μl de cada cebador (10 μM), 0,3 μl de sonda Taqman® (10 μM) (Tabla 4) y 1 μl de ARN. Las reacciones fueron realizadas en un equipo Rotor-Gene Q 5plex
Platform (Qiagen) y consistieron de 50°C por 30 min, seguido por la activación de la Taq polimerasa Hotstart a 95°C por 15 min; y el PCR en 40 ciclos de 15 s 94°C y 1 min a 60°C.
Para cada muestra se calcularon los valores Ct utilizando el software del equipo. Los resultados obtenidos para cada prueba fueron comparados mediante análisis de los niveles de significancia corregidos por el método de Bonferroni y utilizando el programa SAS
System 9.1.3.
85
Tabla 4. Cebadores específicos y sondas a utilizar en la detección por qRT-PCR de los virus PVY y PMTV.
Cebadores Tamaño T° Virus Secuencia Referencia sondas amplicón Annealing
5'- CAT AGG AGA AAC TGA UnivF GAT GCC AAC T -3´
5'- TGG CGA GGT TCC ATT TTC UnivR Kogovsek et PVY A -3' 73 pb 60ºC al., 2008
Sonda FAM-TGA TGA ATG GGC TTA
UnivPVY TGG TTT GGT GCA-BHQ-1
5'-GTG ATC AGA TCC GCG TCC 1948F TT-3'
5'-CCA CTG CAA AAG AAC 2017R CGA TTT-C 3' Mumford et PMTV 70 pb 60°C al., 2000
Sonda FAM ACC AGA ACT ACG GTG
CCG CGT CG BHQ-1 PMTV- 1970
Tabla 5. Muestras empleadas para la detección del virus PVY.
Muestra Localidad Vereda Variedad
P3 6-10 Pasto La Victoria Parda pastusa P3 EN Pasto La Victoria Parda pastusa P4 1-5 Pasto La Victoria Nevada P4 AV Pasto La Victoria Nevada P4 11-15 Pasto La Victoria Nevada P5 11-15 Pasto Catambuco Capiro P6 11-15 Pasto Cruz Loma Capiro P7 MR Pasto Jongovito Criolla P8 AV Pasto Obonuco Criolla P8 16-20 Pasto Obonuco Criolla
86
Continuación Tabla 5
IP EF Ipiales Saguarán Capiro IP ESP Ipiales Saguarán Capio IP EN Ipiales Saguarán Capiro IP MR Ipiales Saguarán Capiro IP1 AV Ipiales Saguarán Capiro IP2 MR Ipiales El placer Bajo Capiro IP3 EF Ipiales Suras Capiro IP3 1-5 Ipiales Suras Capiro IP4 AV Ipiales Suras Criolla IP4 11-15 Ipiales Suras Criolla U1 La Unión Las Llamas Capiro U2 La Unión Sta Inés Capiro U3 La Unión Sn juan Capiro U4 La Unión Sn Juan Capiro U5 La Unión Madera Puracé U6 La Unión Las Acacias Puracé U7 La Unión Sn Miguel abajo Capiro U8 La Unión El Guarango Capirol SR1 Sta Rosa de Osos Aragón Capiro SR2 Sta Rosa de Osos Aragón Capiro SR3 Sta Rosa de Osos Aragón Capiro SR4 Sta Rosa de Osos Betania Capiro SR5 Sta Rosa de Osos Betania Capiro SR6 Sta Rosa de Osos Aragón Capiro SR7 Sta Rosa de Osos El Roble Capiro SR8 Sta Rosa de Osos Quitasol Capiro SR9 Sta Rosa de Osos Quitasol Capiro B1 Belmira la Salazar Capiro B2 Belmira la Salazar Capiro B3 Belmira la Salazar Capiro
Tabla 6. Muestras empleadas para la detección del virus PMTV.
Muestra Localidad Vereda Variedad
C+ KIT ELISA C+ 1/5 KIT ELISA C+ 1/10 KIT ELISA C+ 1/50 KIT ELISA 7 Ipiales Rosario Unica 10 Pasto El Campanero Parda Pastusa
87
Continuación Tabla 6
10(1) Pasto El Campanero Parda Pastusa Páramo 23 Zipaquirá Guerrero Pastos Páramo 23(1) Zipaquirá Guerrero Pastos 25 La unión La Cabaña Criolla 25(1) La unión La Cabaña Criolla 35 La unión Madera Criolla 36 La unión Vallejuelito Criolla Vallejuelito La unión Vallejuelito Capiro Villapinzón Villapinzón Chasques Capiro Villapinzón(1) Villapinzón Chasques Capiro Villapinzón(2) Villapinzón Chasques Capiro Madrid Madrid Los Árboles Capiro Madrid(1) Madrid Los Árboles Capiro Madrid(2) Madrid Los Árboles Capiro Páramo Zipaquirá Zipaquirá Guerrero Parda Pastusa Páramo Zipaquirá(1) Zipaquirá Guerrero Parda Pastusa Páramo Zipaquirá(2) Zipaquirá Guerrero Parda Pastusa Páramo Zipaquirá(3) Zipaquirá Guerrero Parda Pastusa Páramo Zipaquirá(4) Zipaquirá Guerrero Parda Pastusa Tunja Tunja Siachoque Capiro Tunja(1) Tunja Siachoque Capiro Tunja(2) Tunja Siachoque Capiro Tunja(3) Tunja Siachoque Capiro Ventaquemada Ventaquemada Capellanía Capiro ventaquemada (1) Ventaquemada Capellanía Capiro Ventaqumada(2) Ventaquemada Capellanía Capiro Ventaquemada(3) Ventaquemada Capellanía Capiro SRO L2 Sta Rosa de Osos Aragón Capiro SRO L4 Sta Rosa de Osos Aragón Capiro SRO L5 Sta Rosa de Osos Aragón Capiro SRO L5(2) Sta Rosa de Osos Aragón Capiro SRO L6 Sta Rosa de Osos Aragón Capiro SRO L7 Sta Rosa de Osos El Tres Capiro TZ1Z1 Turmeqé Siguineque Criolla
88
5. RESULTADOS
5.1. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa
Evaluación de incidencia de síntomas en cultivos de papa
El análisis de la sintomatología visual presumiblemente asociada a posibles infecciones virales indicó que el mosaico rugoso se presenta como el síntoma con mayores niveles de incidencia en los cultivos de papa de los cuatro departamentos bajo estudio, con un promedio del 16%, seguido por el enrollamiento foliar (10%) y el amarillamiento de venas
(7%). El síntoma enanismo fue el menos evidente, alcanzando un promedio del 2% (Figura
9).
Figura 9. Promedio de cuatro síntomas visuales posiblemente asociados a enfermedades virales en cultivos de papa ubicados en cuatro departamentos de Colombia. AV: amarillamiento de venas, EF: Enrollamiento foliar,
EN: enanismo y MR: mosaico rugoso. Sint: representa las observaciones en las que se presentó al menos uno de los síntomas evaluados. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
89
Figura 10. Síntomas observados en campo sobre tejido foliar de plantas de papa en cuatro departamentos de
Colombia. A: Amarillamiento de Venas (AV); B, D: Mosaico Rugoso (MR); C: Otros síntomas
(verdeamiento de nervaduras). E: Enrollamiento Foliar (EF); F: Enanismo (EN).
Las observaciones de síntomas visuales entre cultivos de papa de diferentes departamentos, demostraron mayor niveles de incidencia en los cultivos de Antioquia para los cuatro síntomas evaluados, alcanzando promedios del 34% para el MR, 20% para AV, 18% para
EF y 7% para EN, mientras que los niveles de incidencia de los cuatro síntomas observados
90
en los Departamentos de Boyacá y Cundinamarca fueron muy similares, no superando valores de 15% para ninguno de ellos, e incluso presentando niveles marginales para el síntoma EN (< 2%). La situación encontrada en el Departamento de Nariño, indicó bajos niveles de incidencia para los cuatro síntomas evaluados, con ninguno de ellos superando el
10% (Figura 11).
Figura 11. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente asociados a enfermedades virales en cultivos de papa para los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y
Nariño. AV: Amarillamiento de venas, EF: Enrollamiento foliar, EN: Enanismo y MR: Mosaico rugoso. Sint: representa las observaciones en las que se presentó al menos uno de los síntomas evaluados. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
91
Al evaluar los niveles de incidencia de los cuatro síntomas bajo estudio en las zonas muestreadas dentro de cada departamento, se evidenció que la región Oriente cercano (Ant) presentó los promedios más altos respecto al síntoma AV, siendo éste de 37% y significativamente superior al del resto de las zonas, con excepción de Ipiales (Nar), cuyo promedio fue de 20%. Las dos zonas con mayores promedios para EF, fueron Santa Rosa de Osos (Ant) y Occidente (Cund), cuyos valores fueron 22% y 17%, respectivamente. EN fue el síntoma con los menores promedios de incidencia en todas las zonas, encontrándose en rangos de 1% a 5%. Por último, MR fue más frecuente en la zona de Santa Rosa de Osos
(Ant), con promedios del 30%, seguido por Zipaquirá (Cund) con el 27% (Figura 12).
92
Figura 12. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente asociados a enfermedades virales en cultivos de papa ubicados en 10 zonas de muestreo dentro de los departamentos de
Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. AV: amarillamiento de venas, EF: enrollamiento foliar, EN: enanismo y MR: mosaico rugoso. Sint: representa las observaciones en las que se presentó al menos uno de los síntomas evaluados. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
5.2 Detección serológica de virus en muestras de papa sintomáticas
Con el fin de evaluar la asociación de la presencia de los virus Potyvirus, PVS, PLRV y
PVX con alguno (s) de los cuatro síntomas evaluados visualmente en la investigación, se realizó un análisis serológico sobre grupos de plantas que compartían los mismos síntomas, no encontrándose ninguna correlación significativa para las combinaciones virus/síntomas evaluados. Por el contrario, esta evaluación detectó la ocurrencia de potyvirus en promedios superiores al 68% para los cuatro síntomas, alcanzándose valores tan altos como 90% en plantas con EF y EN. Así mismo, las pruebas de ELISA detectaron en una alta proporción de plantas sintomáticas la presencia de PVS (>30% para los cuatro síntomas), mientras que
PLRV se detectó en un rango del 13 al 25% de las muestras con diferentes síntomas. Por
último, PVX fue el virus con menores niveles de detección en este ensayo en plantas con síntomas de MR y EF (< 6%), aunque su presencia en plantas con AV y EN superó el 20%
(Figura 13). En síntesis este ensayo conduce a reevaluar la creencia generalizada en técnicos y agricultores de papa de que plantas presentando síntomas particulares estarían afectadas por una especie viral determinada, como es el caso evidente con los resultados de
AV, donde se detectaron los cuatro virus en promedios superiores al 15%, no siendo
93
entonces el PYVV el único virus presente en dichas muestras. Para éste último no hay disponibles anticuerpos comerciales para su detección.
Figura 13. Niveles de detección serológica de los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX con respecto a los cuatro síntomas evaluados visualmente en la investigación (AV, EN, EF y MR) en cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
5.3 Niveles de incidencia de virus en cultivos de papa de 10 zonas productoras de
Colombia
Los resultados de la detección serológica de los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX indican su presencia generalizada en las zonas productoras de papa del país, siendo los
94
Potyvirus y el PVS los que arrojaron mayores niveles de incidencia con promedios nacionales de 72% y 40%, respectivamente; mientras que el virus PLRV se detectó con un promedio del 20%. Por otra parte, PVX fue el virus evaluado con menor nivel de incidencia, alcanzando un valor del 8%. En promedio, el 90% de las muestras colectadas en la investigación fueron positivas a alguno de los virus estudiados (Figura 14). Al analizar dichos resultados en cada uno de los cuatro departamentos evaluados, no se encontraron diferencias significativas para la incidencia de los cuatro virus entre departamentos, aunque resalta el hecho que algunos virus se presentaron en proporciones muy altas, como el caso de los Potyvirus en el 76% de las muestras de Boyacá y PVS en el 58% de las muestras analizadas de Cundinamarca. Contrariamente, PVX presentó valores relativamente bajos con respecto a los otros virus, siendo las muestras de Nariño donde su proporción promedia fue mayor (14%), mientras que para Cundinamarca y Boyacá alcanzó el 5%. En promedio, el 91% de las muestras fueron positivas a alguno de los virus evaluados en Antioquia, 90% en Boyacá y Cundinamarca y 85% en Nariño (Figura 15).
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Figura 14. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus Potyvirus, PLRV,
PVS y PVX en cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia. Sint: representa las muestras que resultaron positivas para al menos uno de los virus en las evaluaciones serológicas. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
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Figura 15. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus Potyvirus, PLRV,
PVS y PVX en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. Sint: representa las muestras que resultaron positivas para al menos uno de los virus en las evaluaciones serológicas. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
El análisis de la incidencia viral al interior de cada una de las diez zonas cultivadoras de papa evaluadas indicó que Potyvirus es el grupo predominante, presentando promedios de hasta el 80% para Santa Rosa de Osos (Ant), seguido por Tunja (Boy) y Oriente Cercano
(Ant) con 77% y 75%, respectivamente, mientras que las demás zonas presentaron valores superiores al 56%. El segundo virus más incidente dentro de las zonas fue PVS, siendo
Oriente Cercano (Ant) y Pasto (Nar) las zonas donde se obtuvieron mayores promedios
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(49% y 47% respectivamente). PLRV se ubicó entre valores del 30% (Villapinzón) y 14%
(Zipaquirá), siendo Turmequé-Ventaquemda (Boy) la segunda zona con mayor incidencia del virus (27%). Pasto (Nar) y Oriente cercano (Ant), reportaron los promedios más altos para PVX, ubicándose en el orden de 28% y 25%, respectivamente. Las demás zonas tuvieron promedios por debajo del 9%. En general, la zona Oriente Cercano (Ant) fue la que presentó mayores niveles de incidencia viral, con un promedio de 94% de las muestras positivas para al menos uno de los virus (Figura 16).
Figura 16. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus Potyvirus, PLRV,
PVS y PVX en cultivos de papa de 10 zonas productoras de los departamentos de Antioquia, Boyacá,
Cundinamarca y Nariño. Sint: Al menos una de las muestras fue positiva en la prueba serológica Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
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5.4 Detección serológica de PMTV en cultivos de papa de Colombia
La detección del virus PMTV a partir de muestras foliares de papa no arrojó resultados positivos para ninguna de las muestras evaluadas procedentes de las 10 zonas bajo estudio, razón por lo cual se realizó una evaluación piloto en 12 muestras de raíces de plantas con síntomas de sarna polvosa y tubérculos con pústulas de la enfermedad, de diferentes departamentos (Tabla 7). Nuevamente, en los resultados de las pruebas de ELISA no se detectó ninguna muestra con PMTV, aunque si en los controles positivos del kit de
Bioreba, lo cual validaba el funcionamiento de la prueba. Por esta razón se decidió evaluar la presencia del virus PMTV a partir de plantas de N. benthamiana cultivadas en macetas con turba e inoculadas con quistosoros de S. subterranea, tal como se describió en la metodología. En total se evaluaron las raíces de plantas procedentes de sustratos infestados con 18 muestras diferentes de S. subterranea (Figura 17), encontrándose que cinco muestras de Antioquia, y una de Boyacá, Cundinamarca y Nariño arrojaron resultados positivos en las pruebas de ELISA (Tabla 8).
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Tabla 7. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces y tubérculos de plantas de papa afectadas por S. subterranea.
Muestra Tejido evaluado Departamento Municipio Absorbancia Resultado
Control + 2,421 Positivo Control - 0,112 Negativo
PC tubérculo cáscara Boyacá Siguineque 0,119 Negativo
PP tubérculo pulpa Boyacá Siguineque 0,121 Negativo
Tunja C tubérculo cáscara Boyacá Siachoque 0,116 Negativo
Tunja P tubérculo pulpa Boyacá Siachoque 0,12 Negativo
Ventaquemada C tubérculo cáscara Boyacá Ventaquemada 0,124 Negativo
Ventaquemada P tubérculo pulpa Boyacá Ventaquemada 0,141 Negativo
Solanas C tubérculo cáscara Cundinamarca Villapinzón 0,127 Negativo
Solanas P tubérculo pulpa Cundinamarca Villapinzón 0,12 Negativo
Villapinzón C tubérculo cáscara Cundinamarca Villapinzón 0,124 Negativo
Villapinzón P tubérculo pulpa Cundinamarca Villapinzón 0,122 Negativo RZ1 Raíz Cundinamarca Zipaquirá 0,205 Negativo RZ5 Raíz Cundinamarca Zipaquirá 0,2 Negativo RZ6 Raíz Cundinamarca Zipaquirá 0,222 Negativo RV2 Raíz Cundinamarca Villapinzón 0,221 Negativo RO6 Raíz Cundinamarca Madrid 0,214 Negativo RTunja1 Raíz Boyacá Siachoque 0,209 Negativo RTV2 Raíz Boyacá Siguineque 0,205 Negativo
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Tabla 8. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces de plantas de
Nicotiana benthamiana cultivadas en sustratos infestados con S. subterranea.
Procedencia del Suelo tamizado Muestra Absorbancia Resultado Departamento Municipio Variedad
Control + 2,47 Positivo Control - 0,12 Negativo 7 Nariño Ipiales Única 0,137 Negativo 10 Nariño Pasto Parda Pastusa 0,131 Negativo 25 Antioquia La Unión Criolla 1,215 Positivo 35 Antioquia La Unión Criolla 0,14 Negativo 36 Antioquia La Unión Criolla 0,148 Negativo SRO L2 Antioquia Sta Rosas Osos Capiro 0,139 Negativo SRO L4 Antioquia Sta Rosas Osos Capiro 0,13 Negativo SRO L5 Antioquia Sta Rosas Osos Capiro 0,142 Negativo SRO L6 Antioquia Sta Rosas Osos Capiro 1,015 Positivo SRO L7 Antioquia Sta Rosas Osos Capiro 1,442 Positivo Vallejuelito Antioquia La Unión Capiro 0,13 Negativo 23 Cundinamarca Zipaquirá Pastos 0,154 Negativo Villapinzón Cundinamarca Villapinzón Capiro 0,146 Negativo Madrid Cundinamarca Madrid Capiro 0,791 Positivo Zipaquirá6 Cundinamarca Zipaquirá Parda Pastusa 0,124 Negativo Tunja1 Boyacá Siachoque Capiro 0,121 Negativo TZ1Z1 Boyacá Siguineque Criolla 0,172 Negativo TV2 Boyacá Siguineque Criolla 0,487 Positivo
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Figura 17. Plantas señuelo y fotos de microscopía de sus raíces infectadas con S. subterranea. a. Plantas de
N. benthamiana sembradas en sustratos infestados con S. subterranea. b. Microscopía de raíces de N. benthamiana sembradas en sustratos infestados con S. subterranea, donde se observan estructuras del patógeno (40X y 100X).
5.5. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa mediante RT-PCR y secuenciación
Debido al alto número de muestras que resultaron positivas en las pruebas de ELISA para los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX, se optó por realizar las evaluaciones de RT-PCR y
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las secuenciaciones correspondientes en al menos una muestra representativa de cada departamento, obteniéndose un total de 33 secuencias consenso para PVY (seleccionado por ser el potyvirus de mayor importancia económica en este cultivo en el mundo) (Tabla
9), 18 para PLRV (Tabla 10), 14 para PVX (Tabla 11), 15 para PVS (Tabla 12) y 10 para
PYVV (Tabla 13). Para este último virus, ante la no disponibilidad de anticuerpos específicos, se tomaron como base de selección las muestras con sintomatología característica de AV. Para el caso de PMTV, el bajo número de muestras detectadas como positivas, condujo a la obtención de tres secuencias consenso para la región TGB2 y cuatro secuencias para una gran porción del gen CP (Tabla 14).
Tabla 9. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVY.
Código Departamento Municipio Vereda Variedad
5MED Antioquia Sta Rosa Osos El Roble Capiro 6MED Antioquia Sta Rosa Osos El Roble Capiro 7MED Antioquia Sta Rosa Osos Santana Capiro 8MED Antioquia Sta Rosa Osos Santana Capiro 11BM Cundinamarca Villapinzón Capiro 12BM Cundinamarca Villapinzón Chasques Criolla 12COL Antioquia Unión Buena Vista Capiro Alto del 13BM Cundinamarca Zipaquirá Águila Suprema 13COL Antioquia Sonsón Tasajo Capiro 13FB Cundinamarca Madrid Los Árboles Capiro Alto del 14BM Cundinamarca Zipaquirá Águila Única 14COL Antioquia Sonsón Tasajo Capiro 14FB Antioquia Carmen de Viboral Capiro 15BM Cundinamarca Cota Parcela Capiro 15COL Nariño Pasto Cubijan Parda Pastusa 16BM Cundinamarca Villapinzón Chasques Capiro 17BM Boyacá Siachoque Cormechoque Capiro
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Continuación Tabla 9
17COL Antioquia Unión Buena Vista Capiro Quebrada 18BM Boyacá Soracá Vieja Única 18COL Antioquia Unión Buena Vista Capiro 19BM Boyacá Turmequé Rosales Única 19COL Antioquia Unión Buena Vista Capiro 20BM Boyacá Ventaquemada Capellanía Capiro 20COL Antioquia Sonsón Tasajo Capiro 21BM Antioquia Unión Capiro 21COL Antioquia Sonsón Tasajo Capiro 34MY Nariño Pasto Cruz Loma Capiro 35MY Nariño Ipiales Saguarán Capiro 36MY Nariño Ipiales El Placer Bajo Capiro 37MR Antioquia Santuario Valle de María Nevada 37MY Nariño Ipiales Saguarán Capiro 38MR Antioquia La Ceja Capiro 39MR Antioquia Carmen de Viboral Aldana abajo Nevada
Tabla 10. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PLRV.
Código Departamento Municipio Vereda Variedad
1BM Cundinamarca Villapinzón Capiro 1C Boyacá Turmequé Siguineque Suprema 2BM Cundinamarca Villapinzón Chasques Suprema 2C Cundinamarca Facatativá Criolla 3BM Cundinamarca Villapinzón Bosabita Esmeralda 4BM Cundinamarca Zipaquirá San Jorge Suprema 4C Antioquia La unión El Vergel Capiro 5BM Cundinamarca Madrid Los árboles Capiro 5C Antioquia Sonsón Tasajo Capiro 6BM Cundinamarca Madrid Los árboles Capiro 6C Antioquia La unión Buena vista Capiro 7BM Boyacá Turmequé Siguineque Crolla 7C Nariño Pasto El Campanero ICA Nariño 8C Nariño Pasto El Campanero Criolla 9BM Boyacá Siachoque Jurubita Parda Pastusa 14MED Antioquia Sta Rosa de Osos Santana Capiro 20FB Boyacá Turmequé Siguineque Criolla 87MY Nariño Ipiales Suras Criolla
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Tabla 11. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVX.
Código Departamento Municipio Vereda Variedad
17FB Antioquia Santuario El Carmelo Capiro 18FB Antioquia Carmen de Viboral Capiro 19FB Antioquia Carmen de Viboral Capiro 22COL Antioquia La Unión El Vergel Capiro 23COL Nariño Pasto Cubijan Parda pastusa 27BM Cundinamarca Zipaquirá Venta larga Criolla 28BM Cundinamarca Zipaquirá Venta larga Criolla 29BM Boyacá Soracá Quebrada vieja Unica 50MY Nariño Pasto La Victoria Parda pastusa 51MY Nariño Pasto La Victoria Nevada 52MY Nariño Pasto Cruzloma Capiro 53MY Nariño Ipiales Suras Criolla 54MY Nariño Ipiales Saguarán Capiro
58MR Antioquia Carmen de Viboral Aldana abajo Nevada
Tabla 12. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVS.
Código Departamento Municipio Vereda Variedad
24FB Antioquia Santuario El Carmelo Capiro 26FB Antioquia Sonsón Tasajo Criolla 55MY Antioquia La Unión Vallejuelito Criolla 56MY Antioquia Sta Rosa de Osos El Roble Capiro 57MY Cundinamarca Villapinzón Quincha Esmeralda 58MY Cundinamarca Villapinzón Chasques Criolla 59MY Cundinamarca Villapinzón Bosabita Esmeralda 61MY Nariño Pasto La Victoria Nevada 62MY Nariño Pasto La Victoria Nevada 63MY Nariño Ipiales Saguarán Capiro 64MY Nariño Ipiales Suras Criolla 65MY Boyacá Siachoque Jurubita Suprema 66MY Antioquia Sta Rosa de Osos El Roble Criolla 67MY Antioquia Carmen de Viboral Aldana Abajo Nevada 68MY Antioquia Santuario Valle de María Capiro
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Tabla 13. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PYVV.
Código Departamento Municipio Vereda Variedad
13MED Antioquia Sonsón Tasajo Capiro 22FB Antioquia Santuario El Carmelo Capiro 23FB Antioquia Carmend de Viboral Capiro 27UN Cundinamarca Facatativá Criolla 28UN Antioquia La Unión El Vergel Capiro Buena 54MR Antioquia La Unión Vista Capiro 90MY Nariño Pasto La Victoria Nevada 91MY Nariño Pasto Obonuco Criolla 92MY Nariño Ipiales Saguarán Capiro 93MY Nariño Ipiales Suras Criolla
Tabla 14. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP y TGB2 del virus
PMTV.
Región del Código Departamento Municipio Vereda Variedad genoma 11MED Control positivo ELISA CP 70MR Antioquia La Unión La Cabaña Criolla CP 71MR Antioquia La Unión Vallejuelito Capiro CP 71MY Cundinamarca Madrid Los Árboles Capiro CP 72MY Boyacá Ventaquemada Capellanía Capiro CP 9MED Control positivo ELISA TGB2 66MR Antioquia La Unión La Cabaña Criolla TGB3 67MR Antioquia La Unión Vallejuelito Capiro TGB4 70MY Boyacá Ventaquemada Capellanía Capiro TGB5
5.5.1. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PVY
Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PVYF y PVYR arrojaron los amplicones del tamaño esperado de ~480 pb (Figura 18). El análisis utilizando 33 secuencias de este virus
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y de 20 secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PVY representando diferentes razas de este virus (PVY-O, PVY-C, PVY-N, PVY-NTN y PVY-NWilga) y orígenes geográficos diferentes, indicaron niveles de identidad para la región estudiada superiores al 89%; siendo evidente la relación entre las mayoría de cepas obtenidas en este estudio y aquellas clasificadas como N y NTN, con las cuales compartieron niveles de identidad superiores al 96%. Por otra parte las identidades entre cepas Colombianas de
PVY fueron superiores al 95% en todos los casos, con una gran proporción de cepas compartiendo niveles superiores al 98%. Las cepas de referencia con menores niveles de identidad (89 al 92%) con respeto a las cepas Colombianas fueron aquellas representantes de las razas PVY-O y PVY-C, aunque tambien esto ocurrió con algunas PVY-NWilga y
PVY-N (Tabla 15).
Figura 18. Amplicones obtenidos con los cebadores PVY F y PVYR (480 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: Q El Roble, 3: U El Roble, 4: V
Santana, 5: W Santana, 6: Control negativo.
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CzR 1: N- DQ000989.1; China:HM036202.1; USA 1: NTN- FJ204166.1; S.Afr 1: O/N- GQ853619.1; S.Afr 2: NTN-GQ853629.1; UK: NTN- EF027897.1; Jordan 1: EU073855.1; CzR: NTN -DQ000988.1; Jordan 2: EU073858.1; USA: H- X68223.1; Jap: NTN- AB295479.1; S.Afr 3: N-Wi- GQ853667.1; Hu:AJ619750.1; Iran 1: C- EF192312.1; Iran 2: C-EF192314.1; S.Afr 4: N-Wi- GQ853653.1; Egypt: N- AF522296.1; Iran 3: O- O- 3: Iran AF522296.1; N- Egypt: GQ853653.1; N-Wi- 4: S.Afr C-EF192314.1; 2: Iran EF192312.1; C- 1: Iran Hu:AJ619750.1; GQ853667.1; N-Wi- 3: S.Afr AB295479.1; NTN- Jap: USA:X68223.1; H- EU073858.1; 2: Jordan -DQ000988.1; CzR: NTN EU073855.1; EU586136.1 1: Jordan Korea: South PepMV EF027897.1; GQ853631.1; NTN- N-Wi- UK: : 5 S.Afr NTN-GQ853629.1; AY061994.1; 2: S.AfrO- India: GQ853619.1; O/N- 1: S.AfrEF192319.1; FJ204166.1; USANTN- 1: China:HM036202.1; DQ000989.1; N- CzR1: PepMV PepMV L 21CO L 20CO L 19CO L 18CO L 17CO L 15CO L 14CO L 13CO L 12CO S.Afr 5 S.Afr 4 S.Afr 3 S.Afr Jordan Jordan 2 S.Afr 1 S.Afr China Korea 3 Iran 2 Iran 1 Iran 2 USA 2 CzR 1 USA 1 CzR 39MR 38MR 37MY 37MR 36MY 35MY 34MY 21BM 20BM 19BM 18BM 17BM 16BM 15BM 14BM 13BM 12BM 11BM 8MED 7MED 6MED 5MED India Egypt 14FB 13FB
Tabla Tabla PVY Jap Hu UK S. S. 2 1 5MED 0,704 0,907 0,892 0,909 0,903 0,907 0,911 0,918 0,971 0,966 0,975 0,973 0,973 0,969 0,975 0,977 0,973 0,973 0,975 0,975 0,969 0,973 0,975 0,975 0,975 0,975 0,966 0,969 0,975 0,975 0,982 0,975 0,975 0,975 0,975 0,973 0,975 0,973 0,975 0,975 0,975 0,973 0,973 0,975 0,969 0,973 0,973 0,975 0,973 0,973 0,975 0,975 0,973 ID 6MED
15 0,711 0,918 0,914 0,918 0,918 0,927 0,962 0,962 0,966 0,964 0,964 0,964 0,966 0,969 0,964 0,964 0,966 0,966 0,971 0,964 0,995 0,997 0,997 0,997 0,988 0,991 0,997 0,997 0,986 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,964 0,964 0,997 0,988 0,964 0,997 0,997 0,997 0,973 0,92 0,9 ID 1 1 1 1
Matriz de identidad para cepas del virus PVY de cultivos de papa de Colombia y otros países del mundo. del países y otros Colombia de papa de cultivos de PVY del virus cepas identidad para de Matriz 7MED 0,709 0,916 0,898 0,918 0,911 0,916 0,916 0,925 0,964 0,962 0,962 0,962 0,964 0,966 0,962 0,962 0,964 0,964 0,969 0,962 0,997 0,991 0,993 0,988 0,997 0,997 0,962 0,962 0,991 0,962 0,997 0,997 0,997 0,997 0,975 0,96 0,96 ID 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8MED 0,709 0,916 0,898 0,918 0,911 0,916 0,916 0,925 0,964 0,962 0,962 0,962 0,964 0,966 0,962 0,962 0,964 0,964 0,969 0,962 0,997 0,991 0,993 0,988 0,997 0,997 0,962 0,962 0,991 0,962 0,997 0,997 0,997 0,997 0,975 0,96 0,96 ID 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11BM 0,711 0,918 0,914 0,918 0,918 0,927 0,962 0,962 0,966 0,964 0,964 0,964 0,966 0,969 0,964 0,964 0,966 0,966 0,971 0,964 0,995 0,997 0,997 0,997 0,988 0,991 0,997 0,997 0,986 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,964 0,964 0,997 0,988 0,964 0,997 0,997 0,997 0,973 0,92 0,9 ID 1 1 1 1 12BM 0,711 0,918 0,914 0,918 0,918 0,927 0,962 0,962 0,966 0,964 0,964 0,964 0,966 0,969 0,964 0,964 0,966 0,966 0,971 0,964 0,995 0,997 0,997 0,997 0,988 0,991 0,997 0,997 0,986 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,964 0,964 0,997 0,988 0,964 0,997 0,997 0,997 0,973 0,92 0,9 ID 1 1 1 1 2OL 12CO 0,709 0,916 0,898 0,918 0,911 0,916 0,916 0,925 0,964 0,962 0,962 0,962 0,964 0,966 0,962 0,962 0,964 0,964 0,969 0,962 0,997 0,991 0,993 0,988 0,997 0,997 0,962 0,962 0,991 0,962 0,997 0,997 0,997 0,997 0,975 0,96 0,96 ID 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 13BM 0,711 0,918 0,914 0,918 0,918 0,927 0,962 0,962 0,966 0,964 0,964 0,964 0,966 0,969 0,964 0,964 0,966 0,966 0,971 0,964 0,995 0,997 0,997 0,997 0,988 0,991 0,997 0,997 0,986 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,964 0,964 0,997 0,988 0,964 0,997 0,997 0,997 0,973 0,92 0,9 ID 1 1 1 1 3OL 13CO 0,704 0,907 0,892 0,907 0,905 0,909 0,914 0,991 0,986 0,995 0,993 0,993 0,988 0,995 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0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 ID 1
Iran 0,71 0,99 0,94 0,99 0,99 0,94 0,94 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,92 0,92 0,92 0,92 0,91 0,91 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,91 0,91 0,92 0,91 0,91 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,91 ID 3 108 India 0,72 0,94 0,94 0,94 0,94 0,94 0,93 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 ID
S.Afr 0,72 0,94 0,99 0,98 0,99 0,93 0,93 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,92 0,92 0,92 0,91 0,91 0,92 0,92 0,91 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,91 0,91 0,92 0,91 0,91 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,91 ID 5 PepMV PepMV Korea 0,718 0,713 0,713 0,711 0,722 0,715 0,713 0,709 0,709 0,707 0,711 0,709 0,709 0,707 0,709 0,709 0,709 0,709 0,715 0,707 0,711 0,709 0,709 0,709 0,704 0,707 0,709 0,709 0,711 0,709 0,709 0,709 0,709 0,711 0,709 0,709 0,709 0,709 0,709 0,707 0,707 0,709 0,711 0,704 0,711 0,709 0,711 0,711 0,709 0,709 0,711 0,704 0,72 ID S. S. El análisis filogenético utilizó 454 posiciones, 291 de las cuales resultaron constantes, 92 variables pero no informativas y 71 informativas para el método de máxima parsimonia. El dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,78, Índice de Retención (RI) de
0,89 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,22 y separó las cepas de PVY bajo análisis en tres cluster (I, II, III) fuertemente soportados por valores de bootstrap superiores al 89%; además de un cuarto clado conteniendo dos cepas de Irán, pero con un bajo soporte de
Bootstrap (59%). El grupo I incluyó 29 cepas de PVY obtenidas en este estudio de cultivos de papa de los cuatro departamentos evaluados, presentando un muy bajo número de cambios entre sus integrantes (<9); mientras que el clado II agrupó a cuatro cepas de PVY obtenidas en cultivos del oriente de Antioquia con el conjunto principal de cepas de referencia de las razas PVY-NTN y PVY-N, además de un aislamiento del tipo H procedente de EEUU. El tercer grupo no incluyó ninguna cepa secuenciada en este estudio, y estuvo conformado por cepas de referencia de las razas PVY-O, PVY-C, PVY-N y
PVYN-Wilga, pero no PVY-NTN. Finalmente, la secuencia del Potyvirus Pepper mottle virus (PepMV) presentó valores de identidad cercanos al 70% con respecto a las secuencias de los aislamientos de PVY, ubicándose por fuera de los grupos detallados (Figura 19), lo cual confirmó su utilidad como grupo externo para el análisis.
109
Figura 19. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVY obtenidos de cultivos de papa de Colombia y otros países del mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
110
5.5.2. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PYVV
Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PYVVCPF y PYVVCPR produjeron amplicones del tamaño esperado de ~758 pb (Figura 20). El análisis utilizando 10 secuencias de este virus obtenidas en el presente estudio y 10 secuencias referencia previamente depositadas en el GenBank de cepas de PYVV procedentes de cultivos de papa de Colombia y Perú, indicó niveles de identidad para la región de la cápside viral estudiada superiores al 99 % en todos los casos. Por otra parte las identidades entre cepas de PYVV y aquella utilizada como grupo externo del Lettuce infectious yellows virus
(LIYV), especie tipo del género Crinivirus, alcanzó niveles de identidad inferiores al 45%
(Tabla 16).
Figura 20. Amplicones obtenidos con los cebadores PYVVCPF y PYVVCPR (758 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de tres departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: AVUni Unión, 3: AVF4
Facatativá, 4: Control negativo.
111
AJ560291.1; ColAJ560291.1; 7: 37665095; Col 8: LIYV- GQ397977.1; USA: 20153353:4964-6322 Peru 1: Col AJ557129.1; 1: Col AJ586117.1; 2: Col AJ586114.1; 3: Col AJ586116.1; 4: Col GQ397986.1; 5: Peru 2: GQ397982.1; 50428964:4284-5051; Col 6: USA LIYV- 8 Col 7 Col 6 Col 2 Peru 5 Col 4 Col 3 Col 2 Col 1 Col 1 Peru 93MY 92MY 91MY 90MY 54MR 28UN 27UN 23FB 22FB 13MED PYVV
Tabla Tabla
16 0,444 0,988 0,994 0,992 0,991 0,992 0,997 0,992 0,991 0,994 0,992 0,991 0,997 0,994 0,997 0,995 0,995 MED 0,99 0,99 0,99 ID 13
Matriz de identidad paraPYVV decepas cultivos de y Perú. de virus papa Colombia del 0,445 0,995 0,991 0,997 0,994 0,992 0,991 0,994 0,998 0,997 0,991 0,994 0,992 0,991 0,998 0,995 0,998 0,995 22FB 0,99 ID 1 0,445 0,995 0,991 0,997 0,994 0,992 0,991 0,994 0,998 0,997 0,991 0,994 0,992 0,991 0,998 0,995 0,998 0,995 23FB 0,99 ID 1 27UN 0,444 0,991 0,997 0,992 0,995 0,992 0,994 0,992 0,995 0,995 0,992 0,995 0,994 0,992 0,997 0,998 0,998 0,997 ID 1 1 28UN 0,443 0,992 0,991 0,992 0,998 0,997 0,992 0,992 0,991 0,997 0,997 0,995 0,995 0,994 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 54MR 0,444 0,991 0,997 0,992 0,995 0,992 0,994 0,992 0,995 0,995 0,992 0,995 0,994 0,992 0,997 0,998 0,998 0,997 ID 1 1 90MY 0,443 0,988 0,988 0,985 0,987 0,988 0,988 0,992 0,988 0,997 0,997 0,997 0,992 0,992 0,991 0,991 0,991 0,99 0,99 0,99 ID 91MY 0,443 0,991 0,991 0,987 0,988 0,994 0,995 0,998 0,997 0,994 0,991 0,994 0,992 0,992 0,992 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 92MY 0,444 0,992 0,992 0,991 0,991 0,988 0,991 0,991 0,995 0,991 0,997 0,998 0,997 0,995 0,992 0,995 0,994 0,994 0,994 0,99 ID 93MY 0,445 0,988 0,988 0,985 0,987 0,988 0,988 0,992 0,988 0,997 0,995 0,997 0,992 0,992 0,991 0,991 0,991 0,99 0,99 0,99 ID Peru 1 Peru 0,445 0,988 0,992 0,988 0,992 0,991 0,988 0,991 0,995 0,988 0,991 0,988 0,995 0,992 0,995 0,997 0,997 0,992 0,99 ID 1 Col 1 Col 0,444 0,991 0,997 0,992 0,995 0,992 0,994 0,992 0,995 0,995 0,992 0,995 0,994 0,992 0,997 0,998 0,998 0,997 ID 1 1 Col 2 Col 0,443 0,988 0,998 0,988 0,991 0,991 0,988 0,995 0,991 0,988 0,991 0,988 0,995 0,998 0,995 0,994 0,994 0,992 0,99 0,99 ID Col 3 Col 0,441 0,988 0,988 0,988 0,992 0,988 0,988 0,991 0,988 0,992 0,992 0,991 0,991 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 Col 4 Col 0,443 0,997 0,992 0,991 0,998 0,991 0,994 0,991 0,987 0,988 0,987 0,994 0,992 0,994 0,992 0,992 0,991 0,99 0,99 0,99 ID
Col 5 Col 0,444 0,995 0,991 0,988 0,992 0,998 0,988 0,992 0,992 0,985 0,988 0,987 0,985 0,992 0,991 0,992 0,994 0,994 0,99 0,99 ID 0,445 0,988 0,992 0,988 0,992 0,991 0,988 0,991 0,995 0,988 0,991 0,988 0,995 0,992 0,995 0,997 0,997 0,992 Peru Peru 0,99 ID 1 2 Col 6 Col 0,441 0,988 0,988 0,988 0,992 0,988 0,988 0,991 0,988 0,992 0,992 0,991 0,991 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 Col 7 Col 0,443 0,992 0,991 0,992 0,998 0,997 0,992 0,992 0,991 0,997 0,997 0,995 0,995 0,994 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 Col 8 Col 0,443 0,988 0,995 0,997 0,988 0,991 0,988 0,992 0,991 0,991 0,991 0,988 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID LIYV- 0,443 0,443 0,441 0,445 0,444 0,443 0,441 0,443 0,444 0,445 0,445 0,444 0,443 0,443 0,444 0,443 0,444 0,445 0,445 0,444 USA ID
El112
El análisis filogenético utilizó 749 posiciones, 328 de las cuales resultaron constantes, 407 variables pero no informativas y 14 informativas para el método de máxima parsimonia. El dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,99, Índice de Retención (RI) de
0,90 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,0 y agrupó las cepas de PYVV bajo análisis en un gran clado soportado por un 100% de valor de bootstrap. Este clado incluyó indistintamente cepas de referencia previamente secuenciadas de Colombia y Perú y los 10 aislamientos evaluados en este trabajo. La secuencia del crinivirus LIYV se ubicó externamente al clado de PYVV con un alto número de cambios con respecto al clado principal (Figura 21).
113
Figura 21. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PYVV obtenidos de cultivos de papa de Colombia y Perú. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
114
5.5.3. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVS
Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PVSCPF y PVSR generaron los amplicones del tamaño esperado de ~629 pb (Figura 22). El análisis utilizando 15 secuencias de este virus y 12 secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PVS de diferentes orígenes geográficos, indicaron niveles de identidad para la región estudiada superiores al
76%. Los porcentajes de identidad encontrados entre algunas cepas Colombianas de PVS presentan un alto nivel de identidad (99%) (ej. 24FBPVS y 26FBPVS), mientras que en otros casos este valor tan sólo alcanzó el 77%. Los aislamientos 57MYPVS, 58MYPVS y
65MYPVS fueron los que compartieron mayores niveles de identidad (>94%) con respecto a las secuencias de referencia de diferentes países (EEUU, Escocia, China, Siria,
Alemania), mientras que el aislamiento de referencia más distante correspondió al obtenido de Vltava (República Checa) (AJ863510), que en ningún caso compartió niveles superiores al 87%. El virus Carnation latent virus (CLV), virus tipo del género Carlavirus utilizado como grupo externo en el análisis, tan sólo presentó niveles de identidad cercanos al 46% con respecto a las cepas de PVS (Tabla 17).
115
Figura 22. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF y PVSR (629 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: P3 Pasto-La Victoria, 3:P4
Pasto-La Victoria, 4: P4 2 Pasto-La Victoria, 5: PEF Sta Bárbara, 6: IPesp Ipiales-Saguarán, 7: IP4 Ipiales-
Suras, 8: Control negativo.
El análisis filogenético utilizó 492 posiciones, 147 de las cuales resultaron constantes, 176 variables pero no informativas y 169 informativas para el método de máxima parsimonia.
El dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,74, Índice de Retención (RI) de 0,86 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,26 y separó las cepas de PVS en dos clados principales (I, II) fuertemente soportados por valores de bootstrap (98 y 99%). El grupo I incluyó 12 cepas de PVS obtenidas en este estudio de cultivos de papa de Antioquia,
Cundinamarca y Nariño, además de una cepa de referencia de Vltava (PVS raza A). Sin embargo, al interior de este clado, se presentaron dos subgrupos fuertemente soportados por valores de Bootstrap superiores al 99% y con un alto número de cambios entre ellos, que se manifiestan en porcentajes de identidad inferiores al 80% entre las secuencias de sus integrantes. En el clado II, se agruparon las secuencias de tres aislamientos de PVS procedentes de la sabana Cundiboyacense (57MY, 58MY y 65MY) con 11 aislamientos de
116
referencia obtenidos del GenBank, siendo evidente un menor nivel de variabilidad al interior de este grupo, pues todos los integrantes compartieron porcentajes de identidad en la secuencia estudiada superiores al 93% (Figura 23).
117
Sco 1:Sco GU144327.1; 2:Sco GU144325.1; Ch 1: AJ889246.1; Ger 1: Y15625.1;Ireland 3:Sco GU144330.1; USA: FJ813512.1; Syria: AB364946.1;CLV- USA 1: S45593.1; USA 3: FJ813514.1; USA 4: FJ813513.1; 2 Ch Ger 2: AJ863510.1; Ch 2: AY687337.1; CLV-Ger 2 Ireland: X52627.1 USA 4 USA 3 USA 2 Syria USA 1 Sco3 Ger 1 1 Ch 2 Sco 1 Sco 68MY 67MY 66MY 65MY 64MY 63MY 62MY 61MY 59MY 58MY 57MY 56MY 55MY 26FB 24FB PVS
Tabla Tabla 0,433 0,778 0,757 0,773 0,771 0,769 0,775 0,778 0,778 0,782 0,786 0,788 0,788 0,771 0,769 0,784 0,771 0,977 0,964 0,946 0,788 0,794 0,941 0,931 0,989 24FB 0,79 0,84 ID
17
.
Matriz de identidad para en PVS cultivos de y el virus de papa cepas Colombia Mundo. del 0,431 0,757 0,775 0,773 0,771 0,778 0,784 0,784 0,786 0,786 0,773 0,771 0,782 0,792 0,769 0,834 0,958 0,939 0,796 0,939 0,929 0,989 26FB 0,78 0,78 0,78 0,97 0,79 ID 55MY 0,425 0,786 0,773 0,778 0,775 0,782 0,782 0,782 0,786 0,792 0,796 0,796 0,792 0,792 0,794 0,794 0,788 0,857 0,938 0,942 0,792 0,798 0,939 0,929 0,931 0,78 0,95 ID 56MY 0,439 0,792 0,763 0,788 0,786 0,784 0,792 0,792 0,798 0,798 0,807 0,807 0,784 0,782 0,786 0,804 0,786 0,842 0,931 0,802 0,809 0,939 0,939 0,941 0,79 0,96 0,95 ID 57MY 0,462 0,933 0,778 0,952 0,952 0,954 0,958 0,939 0,943 0,968 0,968 0,775 0,773 0,769 0,993 0,757 0,757 0,815 0,805 0,795 0,993 0,809 0,798 0,796 0,794 0,96 0,96 ID 58MY 0,935 0,773 0,954 0,954 0,956 0,962 0,962 0,941 0,946 0,773 0,771 0,767 0,995 0,755 0,751 0,809 0,799 0,788 0,993 0,802 0,792 0,788 0,46 0,96 0,97 0,97 0,79 ID 59MY 0,427 0,766 0,782 0,772 0,784 0,786 0,786 0,788 0,795 0,795 0,788 0,786 0,795 0,853 0,962 0,788 0,795 0,931 0,942 0,939 0,946 0,79 0,78 0,79 0,79 0,79 0,95 ID 61MY 0,429 0,785 0,762 0,785 0,783 0,787 0,789 0,787 0,791 0,795 0,799 0,799 0,778 0,787 0,801 0,778 0,847 0,987 0,799 0,805 0,938 0,958 0,964 0,78 0,78 0,95 0,95 ID 62MY 0,435 0,796 0,773 0,794 0,792 0,796 0,798 0,798 0,804 0,809 0,809 0,792 0,798 0,811 0,859 0,987 0,962 0,809 0,815 0,977 0,79 0,79 0,79 0,96 0,95 0,97 0,8 ID 63MY 0,763 0,782 0,751 0,753 0,745 0,753 0,753 0,763 0,757 0,766 0,766 0,766 0,848 0,859 0,753 0,865 0,859 0,847 0,853 0,751 0,757 0,842 0,857 0,834 0,41 0,85 0,84 ID 64MY 0,417 0,765 0,834 0,753 0,755 0,751 0,755 0,755 0,767 0,767 0,765 0,767 0,767 0,939 0,935 0,937 0,755 0,865 0,778 0,755 0,757 0,786 0,788 0,769 0,771 0,79 0,79 ID 65MY 0,935 0,778 0,956 0,956 0,958 0,964 0,964 0,943 0,946 0,973 0,973 0,773 0,771 0,767 0,755 0,753 0,811 0,801 0,995 0,993 0,804 0,794 0,792 0,46 0,96 0,79 0,79 ID 66MY 0,421 0,782 0,852 0,765 0,767 0,763 0,767 0,767 0,778 0,782 0,775 0,775 0,775 0,962 0,958 0,767 0,937 0,859 0,798 0,787 0,795 0,767 0,769 0,786 0,794 0,782 0,784 ID 67MY 0,421 0,786 0,865 0,769 0,771 0,767 0,771 0,771 0,782 0,995 0,958 0,771 0,935 0,848 0,778 0,786 0,771 0,773 0,782 0,792 0,771 0,769 0,78 0,78 0,78 0,78 0,79 ID 68MY 0,425 0,788 0,867 0,771 0,773 0,769 0,773 0,773 0,782 0,784 0,782 0,782 0,782 0,995 0,962 0,773 0,939 0,792 0,788 0,773 0,775 0,784 0,792 0,773 0,771 0,85 0,78 ID Sco 1 Sco 0,458 0,788 0,964 0,964 0,958 0,973 0,973 0,964 0,962 0,956 0,782 0,775 0,973 0,767 0,766 0,809 0,799 0,795 0,968 0,807 0,796 0,786 0,788 0,95 0,78 0,97 ID 1 Sco 2 Sco 0,458 0,788 0,964 0,964 0,958 0,973 0,973 0,964 0,962 0,956 0,782 0,775 0,973 0,767 0,766 0,809 0,799 0,795 0,968 0,807 0,796 0,786 0,788 0,95 0,78 0,97 ID 1 0,445 0,935 0,798 0,943 0,948 0,935 0,952 0,948 0,952 0,943 0,956 0,956 0,782 0,775 0,946 0,765 0,766 0,804 0,795 0,946 0,943 0,798 0,792 0,784 0,786 1 Ch 0,78 0,79 ID Ger 1 0,445 0,941 0,788 0,943 0,943 0,931 0,952 0,948 0,943 0,943 0,962 0,962 0,784 0,782 0,782 0,943 0,767 0,757 0,791 0,788 0,941 0,939 0,798 0,786 0,784 0,782 0,8 ID
Sco 3 Sco 0,445 0,937 0,786 0,941 0,958 0,958 0,943 0,952 0,964 0,964 0,782 0,778 0,767 0,763 0,798 0,787 0,786 0,958 0,792 0,782 0,778 0,95 0,95 0,78 0,96 0,96 0,78 ID USA 1 0,451 0,941 0,775 0,991 0,987 0,995 0,958 0,948 0,948 0,973 0,973 0,773 0,771 0,767 0,964 0,755 0,753 0,798 0,789 0,786 0,962 0,792 0,782 0,778 0,95 0,96 0,78 ID Syria 0,456 0,946 0,991 0,991 0,995 0,958 0,952 0,952 0,973 0,973 0,773 0,771 0,767 0,964 0,755 0,753 0,796 0,787 0,784 0,962 0,782 0,778 0,775 0,78 0,95 0,96 0,79 ID USA 2 0,456 0,921 0,773 0,946 0,946 0,941 0,931 0,935 0,958 0,958 0,769 0,767 0,763 0,958 0,751 0,745 0,772 0,956 0,954 0,784 0,775 0,771 0,769 0,95 0,95 0,79 0,78 ID USA 3 0,453 0,937 0,991 0,946 0,991 0,987 0,943 0,948 0,964 0,964 0,773 0,771 0,767 0,956 0,755 0,753 0,792 0,783 0,954 0,952 0,786 0,773 0,771 0,78 0,95 0,78 0,78 ID USA 4 0,456 0,937 0,778 0,991 0,946 0,991 0,991 0,943 0,943 0,964 0,964 0,771 0,769 0,765 0,956 0,753 0,751 0,794 0,785 0,782 0,954 0,952 0,788 0,778 0,775 0,773 0,95 ID Ger 2 0,435 0,782 0,778 0,773 0,775 0,786 0,788 0,798 0,788 0,788 0,867 0,865 0,852 0,778 0,834 0,782 0,773 0,762 0,766 0,773 0,778 0,763 0,773 0,757 0,757 0,78 0,78 ID 0,782 0,937 0,937 0,921 0,946 0,941 0,937 0,941 0,935 0,788 0,786 0,782 0,935 0,765 0,763 0,796 0,785 0,935 0,933 0,792 0,786 0,778 2 Ch 0,46 0,95 0,95 0,79 0,78 ID 118 Ireland CLV- 0,435 0,456 0,453 0,456 0,456 0,451 0,445 0,445 0,445 0,458 0,458 0,425 0,421 0,421 0,417 0,435 0,429 0,427 0,462 0,439 0,425 0,431 0,433 0,46 0,46 0,41 0,46 ID
Figura 23. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVS obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
119
5.5.4. Afinidades filogenéticas de aislamientos PLRV
Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PLRVF y PLRVR generaron los amplicones del tamaño esperado de ~330 pb (Figura 24). El análisis utilizando 18 secuencias de este virus y 14 secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PLRV de diferentes orígenes geográficos, indicó niveles de identidad para la región estudiada superiores al
97%. Estos valores se presentaron tanto entre cepas obtenidas de cultivos de papa de los cuatro departamentos colombianos evaluados, como con respecto a las cepas de referencia utilizadas. El virus Cereal yelow dwarf virus (CYDV), un polerovirus utilizado como grupo externo en el análisis, presentó niveles de identidad cercanos al 77% con respecto a las cepas de PLRV incluidas en el estudio (Tabla 18).
Figura 24. Amplicones obtenidos con los cebadores PLRVF y PLRVR (330 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: V2 Villapinzón, 3:V7
Villapinzón, 4: V8 Villapinzón, 5: Z3 Zipaquirá, 6: O4 Madrid, 7: O6 Madrid, 8: Control negativo.
120
El análisis filogenético utilizó 328 posiciones, 241 de las cuales resultaron constantes, 72 variables pero no informativas y 15 informativas para el método de máxima parsimonia. El dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,87, Índice de Retención (RI) de
0,83 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,12 y agrupó en un sólo clado (100% bootstrap) todas las cepas de PLRV, incluyendo las obtenidas en este estudio y aquellas de referencia, no presentándose ningún subgrupo interno soportado con altos valores de bootstrap (Figura
25).
121
Fran 6: NOIR- AF453390.1; CYDV- AF453390.1; Fran 6: NOIR- USA: DQ115534.1 India: Can: AF539791.1; D13954.1; S.Kor: EU313202.2; U73777.1; CzcheRep: Fran 1: X77322.1; Ch 1: Neth: AF453394.1; Ch 2: FJ859021.1; Ch 3: FJ859015.1; EF063711.1; Fran 3: AF453389.1; Fran 2: Zim13-Fran 4: Fran AF453388.1; 5: AF453393.1; OP- AF453391.1; CU87- FR1- USA CYDV- Fran 6 Fran 5 Fran 4 Fran 3 Fran 2 3 Ch 2 Ch 1 Ch Neth Fran 1 CzR S.Kor Can India 87MY 20FB 14MED 9BM 8C 7C 7BM 6C 6BM 5C 5BM 4C 4BM 3BM 2C 2BM 1C 1BM PLRV
Tabla Tabla 0,771 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,987 0,987 0,993 0,993 0,993 0,996 0,987 0,987 0,987 0,987 0,987 0,993 0,984 0,984 0,996 0,993 0,987 1BM 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1
18 0,777 0,984 0,978 0,984 0,981 0,981 0,984 0,981 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,981 0,984 0,993 0,987 0,981 0,996 0,996 0,996 0,984 0,987 0,981 0,987 0,99 0,99
. 1C ID 1 1 1
Matriz de identidad para de y el PLRV virus Colombia Mundo cepas del 0,765 0,978 0,978 0,978 0,981 0,981 0,984 0,981 0,981 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,987 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,981 0,987 0,978 0,984 0,978 0,984 0,996 0,993 0,981 0,993 2BM 0,99 ID 0,771 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,987 0,987 0,993 0,993 0,993 0,996 0,987 0,987 0,987 0,987 0,987 0,993 0,984 0,984 0,996 0,993 0,987 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 2C ID 1 0,768 0,981 0,981 0,981 0,984 0,984 0,987 0,984 0,984 0,987 0,987 0,987 0,987 0,993 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,984 0,981 0,987 0,981 0,987 0,996 0,996 0,984 0,996 3BM 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 0,774 0,981 0,975 0,981 0,978 0,978 0,981 0,978 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,984 0,984 0,987 0,993 0,996 0,996 0,996 0,996 0,984 0,993 0,993 0,993 0,987 0,984 0,996 4BM 0,99 0,99 0,99 ID 0,774 0,981 0,975 0,981 0,978 0,978 0,981 0,978 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,984 0,978 0,981 0,987 0,996 0,996 0,984 0,996 0,978 0,987 0,993 0,981 0,984 0,978 0,996 0,984 0,99 4C ID 1 0,768 0,981 0,975 0,981 0,978 0,978 0,981 0,978 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,984 0,984 0,987 0,996 0,984 0,987 0,987 0,993 0,987 0,984 5BM 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 0,774 0,981 0,975 0,981 0,978 0,978 0,981 0,978 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,984 0,978 0,981 0,987 0,996 0,996 0,984 0,996 0,978 0,987 0,993 0,981 0,984 0,978 0,996 0,984 0,99 5C ID 1 0,771 0,978 0,978 0,978 0,981 0,981 0,984 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,987 0,984 0,981 0,981 0,981 0,987 0,981 0,978 0,984 0,978 0,984 0,993 0,987 0,981 0,993 6BM 0,99 0,99 ID 0,777 0,984 0,978 0,984 0,981 0,981 0,984 0,981 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,981 0,984 0,993 0,987 0,981 0,996 0,996 0,996 0,984 0,987 0,981 0,987 0,99 0,99 6C ID 1 1 1 0,771 0,978 0,972 0,978 0,975 0,975 0,978 0,975 0,981 0,978 0,978 0,978 0,978 0,981 0,981 0,981 0,984 0,996 0,987 0,987 0,987 0,987 0,987 0,984 0,996 0,984 0,984 0,987 0,981 0,987 0,987 7BM 0,99 ID 0,777 0,984 0,978 0,984 0,981 0,981 0,984 0,981 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,981 0,984 0,993 0,987 0,981 0,996 0,996 0,996 0,984 0,987 0,981 0,987 0,99 0,99 7C ID 1 1 1 0,777 0,984 0,978 0,984 0,981 0,981 0,984 0,981 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,981 0,984 0,993 0,987 0,981 0,996 0,996 0,996 0,984 0,987 0,981 0,987 0,99 0,99 8C ID 1 1 1 0,771 0,978 0,972 0,978 0,975 0,975 0,984 0,975 0,981 0,978 0,978 0,978 0,978 0,981 0,981 0,981 0,984 0,993 0,993 0,987 0,993 0,981 0,996 0,984 0,987 0,981 0,993 0,987 9BM 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 14MED 0,768 0,981 0,975 0,981 0,978 0,978 0,981 0,978 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,984 0,984 0,987 0,996 0,984 0,987 0,987 0,993 0,987 0,984 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 0,768 0,987 0,987 0,987 0,987 0,984 0,993 0,993 0,993 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,984 0,981 0,987 0,981 0,987 0,993 0,996 0,984 0,996 20FB 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 87MY 0,765 0,984 0,978 0,984 0,981 0,981 0,984 0,981 0,981 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,981 0,987 0,978 0,984 0,978 0,984 0,993 0,987 0,981 0,993 0,99 0,99 ID India 0,777 0,993 0,993 0,996 0,993 0,993 0,996 0,996 0,996 0,996 0,987 0,984 0,981 0,987 0,987 0,981 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,993 0,987 0,987 0,993 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 0,777 0,993 0,993 0,996 0,993 0,993 0,996 0,996 0,996 0,996 0,987 0,984 0,981 0,987 0,987 0,981 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,993 0,987 0,987 0,993 Can 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 S.Kor 0,774 0,987 0,987 0,987 0,993 0,993 0,993 0,993 0,996 0,996 0,984 0,987 0,981 0,978 0,984 0,984 0,978 0,984 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,987 0,984 0,984 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID
0,774 0,993 0,993 0,993 0,996 0,996 0,993 0,996 0,993 0,996 0,996 0,984 0,993 0,981 0,978 0,984 0,984 0,978 0,984 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,987 0,984 0,984 CzR 0,99 0,99 0,99 ID 1 1 Fran 1 0,774 0,993 0,993 0,993 0,996 0,996 0,993 0,996 0,993 0,996 0,996 0,984 0,993 0,981 0,978 0,984 0,984 0,978 0,984 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,987 0,984 0,984 0,99 0,99 0,99 ID 1 1 0,774 0,993 0,993 0,993 0,996 0,996 0,993 0,996 0,993 0,996 0,996 0,984 0,993 0,981 0,978 0,984 0,984 0,978 0,984 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,987 0,984 0,984 Neth 0,99 0,99 0,99 ID 1 1 0,771 0,984 0,987 0,987 0,993 0,993 0,993 0,981 0,984 0,984 0,981 0,987 0,987 0,981 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,981 0,987 0,987 1 Ch 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 0,771 0,993 0,993 0,993 0,996 0,996 0,996 0,993 0,993 0,981 0,978 0,975 0,981 0,981 0,975 0,981 0,987 0,978 0,978 0,978 0,978 0,984 0,987 0,981 0,981 0,987 2 Ch 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 0,774 0,987 0,987 0,987 0,993 0,993 0,993 0,993 0,996 0,996 0,984 0,987 0,981 0,984 0,984 0,984 0,978 0,984 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,987 0,984 0,984 3 Ch 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID Fran 2 0,774 0,993 0,993 0,987 0,996 0,996 0,996 0,993 0,993 0,981 0,978 0,975 0,981 0,981 0,975 0,981 0,981 0,978 0,978 0,978 0,978 0,984 0,987 0,981 0,981 0,987 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID Fran 3 0,771 0,996 0,993 0,993 0,987 0,996 0,996 0,996 0,993 0,993 0,981 0,978 0,975 0,981 0,981 0,975 0,981 0,981 0,978 0,978 0,978 0,978 0,984 0,987 0,981 0,981 0,987 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID Fran 4 0,768 0,987 0,987 0,993 0,993 0,993 0,987 0,984 0,987 0,981 0,978 0,984 0,984 0,978 0,984 0,978 0,981 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,978 0,984 0,984 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 Fran 5 0,774 0,987 0,987 0,996 0,987 0,984 0,993 0,993 0,993 0,987 0,978 0,987 0,975 0,972 0,978 0,978 0,972 0,978 0,978 0,975 0,975 0,975 0,975 0,981 0,984 0,978 0,978 0,984 0,99 0,99 0,99 0,99 ID Fran 6 0,768 0,987 0,987 0,993 0,993 0,993 0,987 0,984 0,987 0,981 0,978 0,984 0,984 0,978 0,984 0,978 0,981 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,978 0,984 0,984 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 CYDV- 0,768 0,774 0,768 0,771 0,774 0,774 0,771 0,771 0,774 0,774 0,774 0,774 0,777 0,777 0,765 0,768 0,768 0,771 0,777 0,777 0,771 0,777 0,771 0,774 0,768 0,774 0,774 0,768 0,771 0,765 0,777 0,771 USA ID
122
Figura 25. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PLRV obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
123
5.5.5. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVX.
Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PVXF y PVXR produjeron los amplicones del tamaño esperado de ~562 pb (Figura 26). El análisis utilizando 14 secuencias de este virus procedentes de cultivos de papa de Colombia y 20 secuencias de referencia obtenidas del
GenBank de cepas de PVX representando diferentes razas de este virus y orígenes geográficos diferentes, indicó niveles de identidad para la región estudiada superiores al
76%; presentándose un grupo de 11 cepas que compartieron niveles de identidad superiores a 94% entre ellas y con el conjunto principal de las cepas de referencia utilizadas en el análisis. Las otras cepas colombianas (29BM, 23Col, 53MY), presentaron identidades menores con respecto al grupo principal, variando desde 86% al 77%, destacándose que las cepas 23Col y 53MY no compartieron niveles superiores al 80% con ninguno de los otros aislamientos analizados. El nivel de identidad de la secuencia de referencia utilizada como grupo externo (Cymbidium mosaic virus, CyMV) con relación a las cepas de PVX fue inferior al 48% (Tabla 19).
El análisis filogenético utilizó 542 posiciones, 188 de las cuales resultaron constantes, 173 variables pero no informativas y 181 informativas para el método de máxima parsimonia.
El dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,73, Índice de Retención (RI) de 0,72 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,27 y separó las cepas de PVX bajo análisis en tres clados (I, II, III) fuertemente soportados por valores de bootstrap superiores al 92%, siendo el grupo I mayoritario al contener 11 cepas de Colombia y 18 de referencia, mientras que el clado II tan sólo contiene dos cepas (23Col y 53MY), al igual que el clado III, que
124
incluye dos cepas de referencia del Reino Unido. Adicionalmente, dentro del clado I, se presentó el aislamiento 29BM como un cluster individual, pero no soportado por el análisis de bootstrap (Figura 27).
Figura 26. Amplicones obtenidos con los cebadores PVXF y PVXR (562 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 9: AVOP Carmen de Viboral, 10:
MRijk Santuario, 11: P Carmen de Viboral, 12: Control negativo.
125
U19790.1; 1: Japan BS- AB056719.1; Korea 2: AF373782.1; Korea 3: KO1-UK AF260640.1;1: DY- Ch X88781.1;6: Taiwan- AF272736.2; UK2: 2: Japan X88782.1;AB056718.1; Ch CyMV-1: EF063709.1; Korea: AB541573.1Korea Ch 2: EU095494.1; Korea 1: KO2- AF260641.1;CyMV- 1: Scotland GU144353.1; Spain: AJ505748.1; Ch 4: GU373815.1;Japan 2 2: Scotland GU144360.1; UK 3: X88783.1; Ch 4: HM036197.1; 6 Ch UK 4: NI- X88784.1; India: GU256064.1; Iran:Korea 3 FJ461343.1; Ch 5: Korea 2 Japan 1 5 Ch Iran India UK 4 4 Ch UK 3 2 Scot 3 Ch Spain 1 Sco Korea 1 2 Ch 1 Ch UK 2 UK 1 58MR 54MY 53MY 52MY 51MY 50MY 29BM 28BM 27BM 23COL 22COL 19FB 18FB 17FB PVX
Tabla Tabla 0,481 0,961 0,959 0,949 0,955 0,959 0,942 0,955 0,964 0,975 0,975 0,977 0,975 0,979 0,946 0,951 0,964 0,769 0,773 0,987 0,962 0,784 0,964 0,964 0,964 0,858 0,962 0,962 0,786 0,974 0,946 0,946 17FB 0,94 0,97 ID
19 0,479 0,955 0,957 0,938 0,957 0,946 0,953 0,953 0,948 0,957 0,962 0,959 0,949 0,957 0,955 0,959 0,935 0,946 0,951 0,773 0,779 0,946 0,959 0,788 0,959 0,968 0,964 0,866 0,962 0,959 0,957 0,998 0,946 18FB 0,79 ID
.
Mariz de identida 0,479 0,955 0,957 0,938 0,957 0,946 0,953 0,953 0,949 0,957 0,962 0,959 0,949 0,957 0,955 0,959 0,935 0,946 0,951 0,775 0,781 0,946 0,959 0,788 0,959 0,968 0,964 0,866 0,962 0,959 0,957 0,998 0,946 19FB 0,79 ID 22COL 0,481 0,953 0,959 0,951 0,959 0,948 0,992 0,959 0,944 0,959 0,972 0,994 0,974 0,981 0,979 0,987 0,948 0,966 0,968 0,777 0,777 0,974 0,962 0,962 0,972 0,968 0,864 0,966 0,959 0,792 0,957 0,957 0,974 0,79 ID 23COL 0,463 0,782 0,786 0,792 0,792 0,782 0,788 0,781 0,795 0,792 0,795 0,794 0,797 0,794 0,788 0,792 0,794 0,797 0,799 0,794 0,998 0,792 0,795 0,795 0,799 0,795 0,794 0,792 0,786 0,79 0,79 0,79 0,79 0,79 ID 27BM 0,468 0,962 0,968 0,955 0,957 0,955 0,961 0,974 0,964 0,962 0,968 0,968 0,955 0,957 0,959 0,771 0,773 0,959 0,985 0,792 0,988 0,987 0,987 0,862 0,981 0,794 0,959 0,959 0,959 0,962 0,97 0,97 0,97 0,97 ID
d para cepas del virus PVX y el ded paracepas Colombia Mundo virus del 28BM 0,975 0,964 0,975 0,961 0,962 0,975 0,961 0,979 0,979 0,972 0,977 0,975 0,975 0,961 0,962 0,968 0,766 0,768 0,966 0,985 0,794 0,985 0,987 0,987 0,868 0,981 0,795 0,966 0,962 0,962 0,962 0,47 0,97 0,97 ID 29BM 0,479 0,866 0,864 0,855 0,864 0,866 0,868 0,864 0,858 0,868 0,868 0,851 0,864 0,864 0,782 0,781 0,862 0,866 0,797 0,866 0,868 0,868 0,868 0,862 0,799 0,864 0,866 0,866 0,858 0,87 0,86 0,87 0,87 0,87 ID 50MY 0,476 0,968 0,974 0,961 0,975 0,962 0,964 0,974 0,962 0,979 0,979 0,974 0,968 0,975 0,974 0,974 0,957 0,959 0,964 0,771 0,773 0,964 0,794 0,988 0,996 0,868 0,987 0,987 0,795 0,968 0,964 0,964 0,964 0,99 ID 51MY 0,474 0,968 0,974 0,961 0,975 0,962 0,968 0,974 0,962 0,979 0,983 0,977 0,968 0,975 0,974 0,974 0,957 0,959 0,964 0,771 0,773 0,964 0,794 0,988 0,996 0,868 0,987 0,987 0,795 0,972 0,968 0,968 0,964 0,99 ID 52MY 0,476 0,966 0,972 0,959 0,974 0,961 0,959 0,972 0,961 0,977 0,974 0,968 0,966 0,974 0,972 0,972 0,955 0,957 0,962 0,771 0,773 0,962 0,987 0,988 0,988 0,866 0,985 0,988 0,792 0,962 0,959 0,959 0,964 0,79 ID 53MY 0,463 0,781 0,784 0,781 0,786 0,788 0,779 0,794 0,788 0,794 0,792 0,795 0,792 0,786 0,792 0,795 0,797 0,788 0,792 0,794 0,794 0,797 0,794 0,792 0,998 0,788 0,788 0,784 0,79 0,79 0,79 0,79 0,79 0,79 ID 54MY 0,474 0,972 0,959 0,974 0,961 0,959 0,975 0,961 0,977 0,974 0,968 0,966 0,974 0,972 0,972 0,955 0,957 0,962 0,766 0,768 0,966 0,792 0,987 0,866 0,985 0,985 0,794 0,962 0,959 0,959 0,962 0,97 0,99 0,99 ID 58MR 0,481 0,961 0,962 0,955 0,959 0,944 0,962 0,948 0,961 0,964 0,975 0,981 0,981 0,979 0,983 0,951 0,955 0,972 0,768 0,769 0,966 0,788 0,962 0,964 0,964 0,862 0,966 0,959 0,974 0,946 0,946 0,987 0,97 0,79 ID 0,468 0,771 0,766 0,768 0,769 0,777 0,769 0,773 0,773 0,771 0,775 0,766 0,775 0,779 0,773 0,766 0,775 0,773 0,957 0,769 0,768 0,797 0,773 0,773 0,773 0,781 0,768 0,773 0,799 0,777 0,781 0,779 0,773 UK 1 0,76 ID 0,477 0,756 0,766 0,771 0,766 0,768 0,777 0,766 0,779 0,771 0,773 0,775 0,768 0,773 0,777 0,773 0,771 0,777 0,768 0,957 0,768 0,766 0,795 0,771 0,771 0,771 0,782 0,766 0,771 0,797 0,777 0,775 0,773 0,769 UK 2 ID 0,959 0,964 0,953 0,961 0,946 0,964 0,961 0,949 0,962 0,968 0,968 0,983 0,974 0,977 0,949 0,961 0,768 0,773 0,972 0,962 0,792 0,962 0,964 0,964 0,864 0,968 0,959 0,794 0,968 0,951 0,951 0,964 Ch 1 Ch 0,47 0,97 ID 0,474 0,949 0,959 0,959 0,955 0,944 0,959 0,955 0,955 0,959 0,961 0,968 0,955 0,961 0,968 0,955 0,961 0,777 0,775 0,955 0,957 0,957 0,959 0,959 0,864 0,962 0,957 0,792 0,966 0,946 0,946 0,951 Ch 2 Ch 0,97 0,79 ID Korea 0,481 0,948 0,955 0,996 0,951 0,948 0,944 0,955 0,955 0,951 0,957 0,953 0,953 0,959 0,953 0,957 0,955 0,949 0,771 0,766 0,951 0,955 0,786 0,955 0,957 0,957 0,851 0,961 0,955 0,788 0,948 0,935 0,935 0,946 ID 1
Sco 1 Sco 0,477 0,962 0,968 0,961 0,968 0,953 0,983 0,968 0,953 0,968 0,974 0,988 0,983 0,988 0,957 0,968 0,977 0,773 0,773 0,983 0,972 0,792 0,972 0,974 0,974 0,868 0,975 0,968 0,794 0,987 0,959 0,959 0,979 0,99 ID Spain 0,476 0,959 0,964 0,957 0,964 0,949 0,975 0,964 0,949 0,968 0,981 0,983 0,987 0,988 0,953 0,961 0,974 0,777 0,779 0,979 0,972 0,795 0,972 0,974 0,974 0,868 0,975 0,968 0,797 0,979 0,955 0,955 0,975 0,97 ID 0,477 0,964 0,962 0,955 0,977 0,955 0,975 0,983 0,981 0,987 0,959 0,983 0,773 0,775 0,981 0,974 0,792 0,974 0,975 0,975 0,977 0,794 0,981 0,957 0,957 0,977 Ch 3 Ch 0,97 0,97 0,97 0,97 0,99 0,97 0,87 0,97 ID Sco 2 Sco 0,477 0,957 0,959 0,957 0,959 0,944 0,959 0,948 0,962 0,968 0,975 0,981 0,983 0,983 0,953 0,955 0,968 0,768 0,766 0,981 0,966 0,794 0,966 0,968 0,968 0,858 0,962 0,795 0,974 0,949 0,949 0,975 0,97 0,97 ID 0,477 0,959 0,964 0,957 0,964 0,949 0,964 0,949 0,964 0,977 0,975 0,983 0,981 0,988 0,953 0,968 0,775 0,775 0,975 0,968 0,788 0,968 0,977 0,974 0,864 0,972 0,964 0,994 0,959 0,959 0,975 UK 3 0,99 0,97 0,79 ID 0,966 0,972 0,961 0,972 0,957 0,968 0,972 0,957 0,972 0,977 0,968 0,975 0,974 0,957 0,961 0,968 0,773 0,771 0,964 0,974 0,974 0,983 0,979 0,868 0,979 0,792 0,972 0,962 0,962 0,964 Ch 4 Ch 0,47 0,97 0,79 0,97 ID 0,468 0,964 0,974 0,955 0,977 0,957 0,955 0,957 0,972 0,964 0,962 0,968 0,968 0,951 0,959 0,962 0,771 0,773 0,961 0,977 0,794 0,977 0,979 0,979 0,979 0,974 0,795 0,959 0,957 0,957 0,955 UK 4 0,97 0,97 0,87 ID 0,477 0,955 0,962 0,959 0,957 0,955 0,961 0,957 0,957 0,949 0,948 0,955 0,949 0,953 0,955 0,955 0,949 0,779 0,773 0,948 0,961 0,779 0,961 0,962 0,962 0,961 0,961 0,781 0,944 0,949 0,948 0,942 India 0,94 0,87 ID 0,972 0,974 0,959 0,955 0,955 0,961 0,972 0,964 0,959 0,964 0,968 0,955 0,955 0,961 0,766 0,769 0,962 0,975 0,788 0,972 0,974 0,974 0,866 0,975 0,959 0,953 0,953 0,959 Iran 0,47 0,97 0,97 0,97 0,97 0,79 ID 0,481 0,949 0,955 0,948 0,955 0,944 0,955 0,955 0,968 0,977 0,975 0,983 0,944 0,959 0,964 0,777 0,777 0,959 0,786 0,959 0,968 0,964 0,864 0,962 0,955 0,788 0,992 0,953 0,953 Ch 5 Ch 0,94 0,99 0,97 0,97 0,97 ID Japan 0,474 0,957 0,966 0,951 0,957 0,944 0,955 0,955 0,957 0,957 0,949 0,944 0,955 0,949 0,953 0,948 0,944 0,946 0,768 0,769 0,944 0,961 0,781 0,961 0,962 0,962 0,961 0,957 0,782 0,948 0,946 0,946 0,86 0,94 ID 1 Korea 0,479 0,968 0,977 0,955 0,957 0,955 0,957 0,977 0,972 0,964 0,959 0,964 0,968 0,951 0,955 0,961 0,766 0,768 0,959 0,974 0,974 0,975 0,975 0,975 0,792 0,959 0,957 0,957 0,955 0,97 0,97 0,79 0,87 0,97 ID 2 Korea 0,483 0,951 0,959 0,955 0,951 0,948 0,959 0,959 0,955 0,961 0,957 0,957 0,962 0,957 0,961 0,996 0,959 0,953 0,771 0,766 0,955 0,959 0,959 0,961 0,961 0,855 0,964 0,955 0,792 0,951 0,938 0,938 0,949 0,79 ID 3 0,474 0,975 0,959 0,977 0,966 0,955 0,974 0,962 0,974 0,972 0,964 0,959 0,964 0,968 0,955 0,959 0,964 0,766 0,771 0,962 0,972 0,784 0,972 0,974 0,974 0,864 0,975 0,968 0,786 0,959 0,957 0,957 0,959 Ch 6 Ch 0,97 ID Japan 0,474 0,975 0,951 0,968 0,957 0,949 0,972 0,955 0,964 0,966 0,959 0,957 0,964 0,959 0,962 0,948 0,949 0,959 0,756 0,961 0,781 0,966 0,968 0,968 0,866 0,962 0,782 0,953 0,955 0,955 0,961 0,76 0,97 0,97 ID 2 CyMV- Korea 0,474 0,474 0,483 0,479 0,474 0,481 0,477 0,468 0,477 0,477 0,477 0,476 0,477 0,481 0,474 0,477 0,468 0,481 0,474 0,463 0,476 0,474 0,476 0,479 0,468 0,463 0,481 0,479 0,479 0,481 0,47 0,47 0,47 0,47 ID 126
Figura 27. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVX obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
127
5.5.6. Afinidades filogenéticas de aislamientos PMTV
Las pruebas de RT-PCR para el virus PMTV se realizaron con dos pares de cebadores:
PMTVF4 y PMTVR4 que produjeron los amplicones del tamaño esperado de ~417 pb
(Figura 28) y H360 y C819 que a su vez produjeron los amplicones del tamaño esperado de
~460 pb (Figura 30). El análisis para el primer par de cebadores se hizo empleando tres secuencias de este virus procedentes de cultivos de papa de Colombia, junto con una secuencia obtenida por inmuno-captura post-ELISA del control positivo del kit de Bioreba y siete secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PMTV representando diferentes orígenes geográficos. Los resultados indicaron niveles de identidad para la región
TGB2 superiores al 97% entre los aislamientos colombianos; siendo la excepción la cepa
70MY, que presentó niveles superiores al 86% con respecto a las cepas Colombianas y a las de referencia. El nivel de identidad de la secuencia de referencia utilizada como grupo externo Beet soil-borne virus (BSBV) con relación a las demás cepas fue inferior al 67%
(Tabla 20).
El análisis filogenético utilizó 424 posiciones, 256 de las cuales resultaron constantes, 148 variables pero no informativas y 20 informativas para el método de máxima parsimonia. El dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,97, Índice de Retención (RI) de
0,82 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,03 y agrupó las cepas de PMTV en estudio con las de referencia en un clado fuertemente soportado por un bootstrap de 100%. Dentro de este clado se ubicaron dos cluster soportados por valores de boostrap superiores al 70%, donde el primero agrupó el aislamiento correspondiente al post-ELISA del kit Bioreba con cepas de Suecia y Reino Unido, mientras que el segundo agrupó dos de las cepas
128
Colombianas (66MR y 67MR) con cepas de Dinamarca y República Checa. Por otro lado, la cepa 70MY se localizó por fuera del clado como un cluster individual, no soportado por el análisis bootstrap (Figura 29).
Figura 28. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana de dos departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión, 3: R36 La
Unión, 4: RValle La Unión, 5: R25 dilución 1/10, 6: R36 dilución 1/10, 7: RValle dilución 1/10, 8: Control negativo.
129
AY353719.2; 2: Sweden NC_003725.1; BSBV- China: EF545142.1 1:Sweden AJ277556.1; CzechRepublic 1: AY187010.1; Denmark: AY426745.1;China CzechRepublic 2: DQ144451.1; UK: D30753.1; Denmark 2:BSBV- Sweden 2 2 Denmark UK CzRep 2 1 Denmark CzRep 1 Sweden 1 70MY 67MR 66MR 9MED PMTV
Tabla Tabla
20
.
Matriz de identidad para (TGB) PMTV virus cepas y el de del Colombia Mundo. 9MED 0,672 0,988 0,978 0,983 0,983 0,988 0,98 0,98 0,86 0,98 0,98 ID 66MR 0,667 0,985 0,973 0,988 0,867 0,98 0,99 0,99 0,98 0,98 ID 1 67MR 0,667 0,985 0,973 0,988 0,867 0,98 0,99 0,99 0,98 0,98 ID 1 70MY 0,646 0,865 0,865 0,865 0,867 0,867 0,86 0,86 0,86 0,86 0,86 ID Sweden 0,674 0,985 0,988 0,988 0,988 0,99 0,99 0,86 0,98 0,98 ID 1 1 CzRep 1 0,674 0,995 0,983 0,997 0,865 0,983 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 Denmark 0,674 0,995 0,983 0,997 0,865 0,983 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 1 1 CzRep 2 0,677 0,988 0,992 0,997 0,997 0,988 0,865 0,988 0,988 0,98 0,98 ID 0,679 0,988 0,978 0,983 0,983 0,988 0,973 0,973 0,98 0,86 0,98 UK ID
Denmark 0,669 0,985 0,978 0,992 0,995 0,995 0,985 0,985 0,985 0,978 0,86 ID 2 Sweden 0,674 0,985 0,988 0,988 0,988 0,99 0,99 0,86 0,98 0,98 ID 2 1 BSBV- BSBV- China 0,674 0,669 0,679 0,677 0,674 0,674 0,674 0,646 0,667 0,667 0,672 ID
130
Figura 29. Árbol filogenético basado en secuencias parciales del TGB2 viral para aislamientos de PMTV obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
131
Para el segundo par de cebadores, el análisis se realizó empleando cuatro secuencias de éste virus procedentes de cultivos de papa de Colombia, junto con una secuencia obtenida por inmuno-captura post-ELISA del control positivo del kit de Bioreba y 15 secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PMTV representando diferentes orígenes geográficos. Dicho análisis indicó niveles de identidad para la región CP superiores al 98%; con excepción de los aislamientos 71MY y 72MY, los cuales presentaron niveles superiores al 76% respecto a las otras cepas Colombianas y a las de referencia. El nivel de identidad de la secuencia de referencia utilizada como grupo externo Beet soil-borne virus
(BSBV) con relación a las demás cepas, fue inferior al 59% (Tabla 21).
Figura 30. Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (460 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana de tres departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión, 3: R36 La Unión, 4:
RValle La Unión, 5: R25 dilución 1/10, 6: R36 dilución 1/10, 7: RValle dilución 1/10, 8: Control negativo.
132
Den Den 1: AF487407.4; Thai: EU016676.1; Den 2: AY196094.2; Jap: FinD16193.1; 1: AM503617.2; Pol: Fin GQ503252.1; 2: AM503631.1; Fin 3: CzR: AM503632.1; AF393507.1; Fin 4: AM503626.1; Den 3: AF487408.2; Finlad 5: AM503623.1; BSBV-China Can: AY327117.1; China: EF545141.1 CzR 1: DQ102381.1; Sw: AJ243719.1; BSBV- Den 3 CzR 2 Pol Jap Den 2 Thai Den 1 Sw CzR 1 Can Fin 5 Fin 4 Fin 3 Fin 2 Fin 1 72MY 71MY 71MR 70MR 11MED PMTV
Tabla Tabla
21 MED 0,591 0,995 0,997 0,995 0,997 0,992 0,995 0,995 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,766 0,763 0,985 0,99 11 ID
. 1 1
Matriz de identidad para (CP) de PMTV virus cepas Colomb del 70MR 0,596 0,985 0,987 0,985 0,982 0,982 0,985 0,987 0,987 0,987 0,987 0,987 0,987 0,985 0,985 0,758 0,756 0,995 0,985 0,98 ID 71MR 0,596 0,992 0,987 0,987 0,985 0,992 0,992 0,992 0,992 0,992 0,992 0,763 0,761 0,995 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 71MY 0,591 0,761 0,763 0,761 0,763 0,761 0,758 0,761 0,763 0,763 0,763 0,763 0,763 0,763 0,763 0,763 0,992 0,761 0,756 0,763 ID 72MY 0,591 0,763 0,766 0,763 0,766 0,763 0,761 0,763 0,766 0,766 0,766 0,766 0,766 0,766 0,766 0,766 0,992 0,763 0,758 0,766 ID Fin 1 0,591 0,995 0,997 0,995 0,997 0,992 0,995 0,995 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,766 0,763 0,985 0,99 ID 1 1 Fin 2 0,591 0,995 0,997 0,995 0,997 0,992 0,995 0,995 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,766 0,763 0,985 0,99 ID 1 1 Fin 3 0,591 0,997 0,997 0,995 0,995 0,992 0,997 0,997 0,997 0,766 0,763 0,992 0,987 0,997 ID 1 1 1 1 1 1 Fin 4 0,591 0,997 0,997 0,995 0,995 0,992 0,997 0,997 0,997 0,766 0,763 0,992 0,987 0,997 ID 1 1 1 1 1 1 Fin 5 0,591 0,997 0,997 0,995 0,995 0,992 0,997 0,997 0,997 0,766 0,763 0,992 0,987 0,997 ID 1 1 1 1 1 1 0,591 0,997 0,997 0,995 0,995 0,992 0,997 0,997 0,997 0,766 0,763 0,992 0,987 0,997 Can
ia y el Mundo. ID 1 1 1 1 1 1 0,591 0,997 0,997 0,995 0,995 0,992 0,997 0,997 0,997 0,766 0,763 0,992 0,987 0,997 CzR ID 1 1 1 1 1 1 1 0,591 0,997 0,997 0,995 0,995 0,992 0,997 0,997 0,997 0,766 0,763 0,992 0,987 0,997 Sw ID 1 1 1 1 1 1
Den 0,59 0,99 0,99 0,99 0,76 0,76 0,99 0,99 ID 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Thai 0,59 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,76 0,76 0,99 0,98 ID 1 1 1 0,591 0,992 0,995 0,992 0,987 0,992 0,995 0,995 0,995 0,995 0,995 0,995 0,992 0,992 0,763 0,761 0,987 0,982 0,992 Den 0,99 ID 2 0,59 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,77 0,76 0,99 0,98 Jap ID 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,588 0,995 0,997 0,992 0,992 0,995 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,995 0,995 0,763 0,761 0,985 0,995 0,99 0,99 Pol ID 0,591 0,997 0,997 0,995 0,995 0,992 0,997 0,997 0,997 0,766 0,763 0,992 0,987 0,997 CzR ID 1 1 1 1 1 1 2 Den 0,59 0,99 0,99 0,99 0,76 0,76 0,99 0,99 ID 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BSBV- BSBV- China 0,588 0,591 0,588 0,591 0,591 0,586 0,593 0,591 0,591 0,591 0,591 0,591 0,591 0,591 0,591 0,591 0,591 0,596 0,596 0,591 ID
133
El análisis filogenético utilizó 406 posiciones, 200 de las cuales resultaron constantes, 109 variables pero no informativas y 97 informativas para el método de máxima parsimonia. El dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,99, Índice de Retención (RI) de
0,98 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,01 y agrupó las cepas de PMTV en estudio en dos clados (I y II) furtemente soportados por valores de bootstrap del 100%. En el primer clado (I) se agruparon las cepas 70MR y 71MR junto con todas las cepas de referencia, mientras que en el segundo clado (II) se agruparon las cepas Colombianas 71MY y 72MY procedentes del altiplando Cundiboyacense (Figura 31).
134
Figura 31. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PMTV obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
135
5.6. Secuencias parciales de los genomas virales
En la tabla 22 se describen los aislamientos y las regiones secuenciadas para la
caracterización parcial de los genomas de los virus estudiados en este trabajo.
Tabla 22. Aislamientos de los virus en estudio y secuencias parciales de sus genomas.
Codigos Región Muestra Vereda Municipio Departamento Virus secuencias secuenciada 38MY, 40MY, 5' UTR, P1, CP, 3' Ceja 42MY, 44MY, La Lomita La Ceja Antioquia PVY UTR 46MY, 48 MY 39MY, 41MY, Carmen de 5' UTR, P1, CP, 3' Carmen 45MY, 47MY, Aldana Abajo Antioquia PVY Viboral UTR 49MY, RdRp parcial al 3', 59MR, 62MR, Ceja La Lomita La Ceja Antioquia PVX TGB1 parcial 5', 64MR TGB3 parcial 3', CP 5' UTR, RdRp 58MR, 60MR, Carmen de parcial al 5' y 3', CP, Carmen 61MR, 63MR, Aldana Abajo Antioquia PVX Viboral TGB 1 parcial al 5', 65MR TGB3 parcial al 3' Carmen de Carmen 67MY Aldana Abajo Antioquia PVS CP, 3' UTR Viboral Santuario 68MY Valle de María Santuario Antioquia PVS CP, 3' UTR Ip4 11-15 87MY Suras Ipiales Nariño PLRV CP parcial TV2 11-15 20FB Siguineque Turmequé Boyacá PLRV CP parcial P4AV 90MY, 94MY Obonuco Pasto Nariño PYVV CP, CPm Ip1AV 92MY, 96MY Saguarán Ipiales Nariño PYVV CP, CPm 70MR, 78MR, CP, CPRT, TGB1 84MR, 81MY, R25 La Cabaña La Unión Antioquia PMTV parcial, TGB2, 66MR, 68MR, TGB3, CRP 82MY CP parcial, CPRT 71MR, 85MY, parcial, TGB1 Rvalle 67MR, 69MR, Vallejuelito La Unión Antioquia PMTV parcial, TGB2, 83MY TGB3 parcial, CRP
5.6.1. Secuencias parciales del genoma de PMTV
Para la amplificación de algunas regiones del genoma del virus PMTV, se tomaron dos
aislamientos del municipio de La Unión, (Antioquia) (Tabla 22) y se realizaron las
136
reacciones de RT-PCR como se indicó en la metodología, empleándose para ello los cebadores dirigidos al ARN2 (CP) C810 - H360 (Figura 30), H360 – PMTV2017R (Figura
32), PMTV759F – PMTV1552R (Figura 33), PMTV1948F – 123end (Figura 34) y los cebadores dirigidos al ARN3 (TGB) PMTVF4 – PMTVR4 (Figura 28), PMTV5 USA
RNA3 – PMTV7 USA RNA3 (Figura 35) y PMTVF4 – 123end (Figura 33). Los cebadores dirigidos al ARN 1 (RdRP) FURO-Hel – 123end, no fueron exitosos para las cepas evaluadas en este estudio, ya que las secuencias de los amplicones obtenidos de ~2800 pb y de ~350 pb, no estuvieron relacionadas con el genoma de PMTV o correspondian a una región ya secuenciada de TGB, respectivamente (Figura 34). Cabe resaltar que a partir de la secuencia obtenida con la combinación de cebadores H360 – PMTV2017R se realizó el diseño de los cebadores PMTV759F – PMTV1552R, utilizados en las pruebas de qRT-
PCR.
137
Figura 32. Amplicón obtenido con los cebadores H360 y PMTV2017R (2000 pb) a partir de tejido de raíz de
N. benthamiana de dos departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 5: Control negativo, 6: RValle La
Unión, 7: R36 La Unión, 8: R25 dilución.
Figura 33. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 – 123end (1067 pb) (carriles 2 a 4) y
PMTV759 – PMTV1552R (817 pb) (carriles 5 a 7), a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado en sustrato infestado con S. subterranea. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión Ant, 3: RValle La Unión Ant, 4:
Control negativo, 5: R25 La Unión Ant, 6: RValle La Unión Ant, 7: Control negativo.
138
Figura 34. Amplicónes obtenidos con los cebadores Furo-Hel – 123end (2722 pb) (carriles 2 a 4) y
PMTV1948F – 123end (448 pb) (carriles 5 a 7), a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado en sustrato infestado con S. subterranea. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión Ant, 3: RValle La Unión Ant, 4:
Control negativo, 5: R25 La Unión Ant, 6: RValle La Unión Ant, 7: Control negativo.
Figura 35. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV5 USA RNA3 y PMTV7 USA RNA3 (647 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrada en sustrato infestado con S. subterranea. 1: Marcador
100pb, 2: R25 La Unión, 3: R36 La Unión, 4: RValle La Unión, 5: R25 dilución 1/10, 6: R36 dilución 1/10,
7: RValle dilución 1/10, 8: Control negativo.
139
El ensamblaje de las secuencias para cada ARN obtenido, se realizó con relación a los
genomas completos de PMTV de diferentes orígenes geográficos. Así, para el aislamiento
R25 se encontraron identidades superiores al 98% en la secuencia de nucleótidos para el
fragmento de CP (ARN2) hacia el extremo 5‟ (Figura 36), e identidades del 99% cuando se
empleó la secuencia de aminoácidos (Tabla 23). Para el fragmento de CP hacia el extremo
3‟ y con respecto al genoma de referencia (NC 003724), se encontraron identidades
superiores al 97% para nucleótidos y de 95% cuando se usaron aminoácidos en las
comparaciones (Tabla 24).
Tabla 23. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del primer fragmento de la
región CP secuenciada para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos AJ243719.1 PMTVCP Sw SwedenNC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R R25 PMTVCP AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden ID NC_003724.1 PMTV Sweden 1,00 ID AM503633.1 PMTVCP Finland 0,99 0,99 ID DQ102381.1 PMTVCP Czech R 1,00 1,00 0,99 ID 0,99 R25 PMTVCP 0,99 0,99 0,98 0,99 ID
Aminoácidos AJ243719.1 PMTVCP Sw SwedenNC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R R25 PMTVCP AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden ID NC_003724.1 PMTV Sweden 1,00 ID AM503633.1 PMTVCP Finland 0,99 0,99 ID DQ102381.1 PMTVCP Czech R 1,00 1,00 0,99 ID R25 PMTVCP 0,99 0,99 0,99 0,99 ID
Tabla 24. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del segundo fragmento de la
región CP secuenciado para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos AJ243719.1 PMTVCP Sw SwedenNC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R R25 PMTVCP AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden ID NC_003724.1 PMTV Sweden 1,00 ID AM503633.1 PMTVCP Finland 0,97 0,97 ID DQ102381.1 PMTVCP Czech R 0,99 0,99 0,98 ID R25 PMTVCP 0,98 0,98 0,97 0,98 ID
Aminoácidos AJ243719.1 PMTVCP Sw SwedenNC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R R25 PMTVCP AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden ID NC_003724.1 PMTV Sweden 1,00 ID AM503633.1 PMTVCP Finland 0,96 0,96 ID DQ102381.1 PMTVCP Czech R 0,99 0,99 0,98 ID R25 PMTVCP 0,97 0,97 0,95 0,97 ID
140
1 NC_003724.1Potatomop-topvirusRNA3: 1 » 3138 707884MRPMTVCP: 384 » 1836 500 CP gi 20373119 ref NCref 003724.1 gi 20373119 1000 CPRT 1500 3134 bp 78MR81MYPMTVCP: 1853 » 2959 2000 2500 3000
Figura 36. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de la cepa R25 de PMTV respecto a la secuencia de referencia NC 003724. Se observan dos fragmentos de CP para R25, uno cercano al extremo 5‟ (707884MRPMTVCP 384-1836) y el segundo cercano al extremo 3‟ (78MR81MYPMTVCP
1853-2959).
141
Para la misma cepa, las secuencias obtenidas para la región TGB (ARN3) se compararon
con cinco secuencias completas del GenBank, presentándose indentidades superiores al
97% con respecto a los genomas de referencia en nucleótidos y del 94% para aminoácidos
(Tabla 25). La secuencia comparada corresponde a un fragmento parcial de TGB1, TGB2,
TGB3 y CRP (Figura 37).
Tabla 25. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento secuenciado
de la región TGB para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleótidos NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzRp AJ277556.1 PMTVTGB Sw R25 PMTVTGB NC_003725.1 PMTVTGB Sweden ID AY187010.1 PMTVTGB Denmark 0,97 ID D30753.1 PMTVTGB UK 0,98 0,97 ID DQ144451.1 PMTVTGB CzechRepublic 0,97 1,00 0,97 ID AJ277556.1 PMTVTGB Sweden 1,00 0,97 0,98 0,97 ID R25 PMTVTGB 0,98 0,98 0,97 0,98 0,98 ID
Aminoácidos NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzRp AJ277556.1 PMTVTGB Sw R25 PMTVTGB NC_003725.1 PMTVTGB Sweden ID AY187010.1 PMTVTGB Denmark 0,94 ID D30753.1 PMTVTGB UK 0,96 0,93 ID DQ144451.1 PMTVTGB CzechRepublic 0,94 1,00 0,93 ID AJ277556.1 PMTVTGB Sweden 1,00 0,94 0,96 0,94 ID R25 PMTVTGB 0,95 0,95 0,94 0,95 0,95 ID
Para el caso de la región CP de la cepa RValle de PMTV, se obtuvieron dos fragmentos de
tamaños menores a los alcanzados para la cepa R25, que abarcaron además la región CPRT
hacia el centro del genoma (Figura 38). El análisis se hizó utilizando las mismas secuencias
genómicas de referencia que se emplearon para R25, e indicó para el primer fragmento
(CP), identidades del 99% en las secuencias de nucleótidos y 100% para aminoácidos
(Tabla 26). Para el segundo fragmento (CPRT) las identidades para las secuencias de
nucleótidos fueron del 98%, mientras que para aminoácidos estuvieron por encima del 97%
(Tabla 27).
142
1 NC_003725.1PMTVTGB: 1 » 2966 500 gi 20373121 ref NC 003725.1 003725.1 NC ref 20373121 gi TGBp1 1000 2964 bp 6668MR82MYPMTVTGB: 1426 » 2747 1500 TGBp2 2000 TGBp3 CRP 2500
Figura 37. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa R25de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003725.
143
Tabla 26. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del primer fragmento de la
región CP secuenciado para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R RValle PMTVCP AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden ID NC_003724.1 PMTV Sweden 1,00 ID AM503633.1 PMTVCP Finland 1,00 1,00 ID DQ102381.1 PMTVCP Czech R 1,00 1,00 1,00 ID RValle PMTVCP 0,99 0,99 0,99 0,99 ID
Aminoácidos AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R RValle PMTVCP AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden ID NC_003724.1 PMTV Sweden 1,00 ID AM503633.1 PMTVCP Finland 1,00 1,00 ID DQ102381.1 PMTVCP Czech R 1,00 1,00 1,00 ID RValle PMTVCP 1,00 1,00 1,00 1,00 ID
Tabla 27. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento de la región
CPRT secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R RValle PMTVCP AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden ID NC_003724.1 PMTV Sweden 1,00 ID AM503633.1 PMTVCP Finland 0,99 0,99 ID DQ102381.1 PMTVCP Czech R 1,00 1,00 0,99 ID RValle PMTVCP 0,98 0,98 0,98 0,98 ID
Aminoácidos AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R RValle PMTVCP AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden ID NC_003724.1 PMTV Sweden 1,00 ID AM503633.1 PMTVCP Finland 0,99 0,99 ID DQ102381.1 PMTVCP Czech R 1,00 1,00 0,99 ID RValle PMTVCP 0,98 0,98 0,97 0,98 ID
Para el análisis de la región TGB de la cepa RValle, se evaluaron además cinco cepas de
referencia que contenian la porción del genoma comprendida entre TGB1 parcial a CRP
(Figura 39). El análisis de dichas secuencias demostró identidades superiores al 97% para
nucleótidos y del 94% para aminoácidos (Tabla 28).
144
Tabla 28. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región TGB
secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleótidos NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzR AJ277556.1 PMTVTGB Sw RValle PMTVTGB NC_003725.1 PMTVTGB Sweden ID AY187010.1 PMTVTGB Denmark 0,97 ID D30753.1 PMTVTGB UK 0,98 0,97 ID DQ144451.1 PMTVTGB Czech R 0,97 1,00 0,97 ID AJ277556.1 PMTVTGB Sweden 1,00 0,97 0,98 0,97 ID RValle PMTVTGB 0,98 0,97 0,97 0,97 0,98 ID
Aminoácidos NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzR AJ277556.1 PMTVTGB Sw RValle PMTVTGB NC_003725.1 PMTVTGB Sweden ID AY187010.1 PMTVTGB Denmark 0,96 ID D30753.1 PMTVTGB UK 0,96 0,93 ID DQ144451.1 PMTVTGB Czech R 0,96 1,00 0,93 ID AJ277556.1 PMTVTGB Sweden 1,00 0,96 0,96 0,96 ID RValle PMTVTGB 0,96 0,95 0,94 0,95 0,96 ID
145
1 NC_003724.1Potatomop-topvirusRNA3: 1 » 3134 71MR-H360-C819RVALLE: 384 » 843 500 CP gi 20373119 ref NCref 003724.1 gi 20373119 1000 85MYPMTVRVALLE: 1081 » 1838 CPRT 3134 bp 1500 2000 2500 3000
Figura 38. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de la cepa RValle de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003724. Se observan dos fragmentos de CP para RValle, uno cercano al extremo 5‟ (71MR 384-843) y el segundo cercano al extremo 3‟ (85MY 1081-1838).
146
1 NC_003725.1PMTVTGB: 1 » 2968 500 gi 20373121 ref NC 003725.1 003725.1 NC ref 20373121 gi TGBp1 1000 6769MR83MYPMTVTGBRVALLE: 1416 » 2749 2964 bp 1500 TGBp2 2000 TGBp3 CRP 2500
Figura 39. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa RValle de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003725.
147
5.6.2. Secuencias parciales del genoma de PVY
Para el estudio de las secuencias parciales del genoma de PVY se utilizaron dos aislamientos del departamento de Antioquia (Tabla 22), encontrándose secuencias de
óptima calidad para los amplicones obtenidos con las combinaciones de cebadores PVYc –
PVYd, PVYCPF – PVYCPR, PVYF – 3ntr, PVYF – 3ntrC (Figura 40), PVYCPF – 3ntr,
PVYCPF – 3 ntrC (Figura 41).
Figura 40. Amplicones obtenidos a partir de tejido foliar de papa de dos cepas de PVY del departamento de
Antioquia, con los cebadores PVYc – PVYd (967 pb) carriles 7 a 9; PVYCPF – PVYCPR (827 pb) carriles 10 a 12; PVYF – 3ntr (1061 pb) carriles 13 a 15; PVYF – 3ntrC (1061 pb) carriles 16 a 18. 1: Marcador 100pb,
7: Ceja, 8: Carmen, 9: Control negativo, 10: Ceja, 11: Carmen, 12: Control negativo, 13: Ceja, 14: Carmen,
15: Control negativo, 16: Ceja, 17: Carmen, 18: Control negativo.
148
Figura 41. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYCPF – 3ntr (1219 pb) carriles 5 a 7, PVYCPF –
3ntrC (1219 pb) carriles 8 a 10, a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia.
1: Marcador 1Kb, 5: Ceja, 6: Carmen, 7: Control negativo, 8: Ceja, 9: Carmen, 10: Control negativo.
El análisis de las secuencias ensambladas se realizó con cada una de las cepas individualmente y con 11 genomas completos de PVY depositados en el GenBank. Así, para la región P1 y parte del 5‟NTR de la cepa Ceja (Figura 42), se encontraron identidades del 99% en nucleótidos con cepas de las razas PVY-N y PVY-NTN y superiores al 99% para aminoácidos (Tabla 29). Para el mismo aislamiento se obtuvieron dos secuencias diferentes de la región CP. En la primera secuencia se obtuvo además de la región CP, una porción del extremo 3‟NTR (Figura 43), que compartió identidades superiores al 95% en nucleótidos con cepas de las razas PVY-NTN y PVY-N de Europa, USA y Canada y superiores al 97% en aminoácidos (Tabla 30). La otra secuencia de CP obtenida para dicho aislamiento (Figura 44), compartió identidades superiores al 97% con cepas de las razas
PVY-N y PVY-NTN para nucleótidos y del 98% para aminoácidos (Tabla 31).
149
Tabla 29. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región P1 secuenciada
para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACeja PVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,88 ID AJ585195.1 PVY UK 0,89 0,95 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,70 0,71 0,71 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,90 0,96 0,95 0,72 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,70 0,71 0,71 0,99 0,71 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,82 0,83 0,84 0,86 0,83 0,86 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,82 0,83 0,85 0,86 0,83 0,86 0,98 ID U09509.1 PVYC Canada 0,89 0,97 0,95 0,71 0,96 0,71 0,82 0,82 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,71 0,71 0,71 0,91 0,72 0,91 0,83 0,83 0,71 ID AY884983.1 PVYN USA 0,70 0,71 0,71 0,99 0,72 0,99 0,86 0,86 0,71 0,91 ID Ceja PVY 0,70 0,71 0,71 0,99 0,72 0,99 0,86 0,86 0,71 0,91 0,99 ID
Aminoácidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSA38MYPVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,86 ID AJ585195.1 PVY UK 0,88 0,94 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,68 0,68 0,69 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,88 0,94 0,95 0,69 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,68 0,68 0,69 0,99 0,68 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,83 0,82 0,84 0,84 0,82 0,83 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,83 0,82 0,84 0,84 0,82 0,84 0,98 ID U09509.1 PVYC Canada 0,87 0,95 0,93 0,68 0,93 0,68 0,81 0,81 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,67 0,67 0,67 0,89 0,67 0,88 0,79 0,79 0,66 ID AY884983.1 PVYN USA 0,69 0,68 0,70 1,00 0,69 0,99 0,84 0,85 0,68 0,89 ID Ceja PVY 0,68 0,68 0,69 1,00 0,69 0,99 0,84 0,84 0,68 0,89 1,00 ID
150
Tabla 30. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACeja PVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,92 ID AJ585195.1 PVY UK 0,92 0,98 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,93 0,99 0,98 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,93 0,99 0,98 0,99 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,90 0,92 0,92 0,93 0,92 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,91 0,92 0,92 0,93 0,92 0,99 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,93 0,99 0,98 0,99 0,99 0,93 0,93 ID U09509.1 PVYC Canada 0,93 0,98 0,97 0,98 0,98 0,92 0,92 0,98 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,90 0,90 0,89 0,91 0,90 0,96 0,96 0,91 0,90 ID AY884983.1 PVYN USA 0,91 0,90 0,90 0,91 0,90 0,97 0,97 0,91 0,90 0,98 ID Ceja PVY 0,90 0,91 0,91 0,91 0,91 0,95 0,95 0,91 0,91 0,96 0,96 ID
Aminoácidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACeja PVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,95 ID AJ585195.1 PVY UK 0,94 0,98 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,95 0,99 0,98 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,95 0,99 0,98 0,99 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 0,99 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,95 0,99 0,98 0,99 0,99 0,96 0,96 ID U09509.1 PVYC Canada 0,96 0,98 0,97 0,98 0,98 0,94 0,94 0,98 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,94 0,94 0,93 0,95 0,94 0,98 0,98 0,94 0,93 ID AY884983.1 PVYN USA 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 0,99 0,99 0,96 0,94 0,99 ID Ceja PVY 0,94 0,95 0,94 0,95 0,95 0,97 0,97 0,95 0,94 0,97 0,98 ID
Tabla 31. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo
Nucleotidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACeja PVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,91 ID AJ585195.1 PVY UK 0,90 0,97 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,91 0,98 0,98 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,91 0,98 0,98 0,99 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,89 0,91 0,91 0,91 0,91 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,89 0,91 0,90 0,91 0,91 0,99 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,91 0,98 0,98 0,99 0,99 0,91 0,91 ID U09509.1 PVYC Canada 0,91 0,97 0,96 0,97 0,98 0,91 0,90 0,97 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,88 0,89 0,88 0,89 0,89 0,96 0,96 0,89 0,89 ID AY884983.1 PVYN USA 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,97 0,97 0,90 0,89 0,98 ID Ceja PVY 0,89 0,91 0,90 0,91 0,91 0,99 0,99 0,91 0,90 0,96 0,97 ID
Aminoácidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACeja PVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,94 ID AJ585195.1 PVY UK 0,93 0,97 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,94 0,98 0,98 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,93 0,98 0,98 0,99 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,93 0,94 0,93 0,94 0,93 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,92 0,94 0,93 0,94 0,93 0,99 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,94 0,98 0,98 0,99 0,99 0,94 0,93 ID U09509.1 PVYC Canada 0,95 0,98 0,96 0,97 0,97 0,93 0,92 0,97 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,91 0,93 0,92 0,93 0,92 0,98 0,98 0,93 0,91 ID AY884983.1 PVYN USA 0,93 0,94 0,93 0,94 0,93 0,99 0,99 0,94 0,93 0,99 ID Ceja PVY 0,92 0,94 0,93 0,94 0,93 0,99 0,98 0,94 0,92 0,98 1511,00 ID
1 AJ584851.1PVYstrainNUK: 1 » 9651 38MYPVY: 23 » 892 P1 500 1000 HC-Pro 1500 2000 2500 P3 gi 209395183 gb gi FJ214726.1 209395183 3000 6K1 3500 4000 CI 4500 9773 bp 5000 6K2 5500 NIa-VPg 6000 NIa-Pro 6500 7000 7500 NIb 8000 8500 CP 9000 9500
Figura 42. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región P1 de PVY de la cepa Ceja respecto a la secuencia de referencia AJ584851.1.
152
1 AY166867.1PVYNCanada: 1 » 9703 AY884983.1PVYNUSA: 1 » 9703 P1 500 1000 HC-Pro 1500 2000 2500 P3 gi 209395183 gb gi FJ214726.1 209395183 3000 6K1 3500 4000 CI 4500 9773 bp 5000 6K2 5500 NIa-VPg 6000 NIa-Pro 6500 7000 NIb 7500 8000 8500 42444648MYPVY: 8610 » 9658 » 8610 42444648MYPVY: CP 9000 9500
Figura 43. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Ceja respecto a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867.
153
1 AJ585342.1PVYNTNUK: 1 » 9647 P1 500 1000 HC-Pro 1500 2000 2500 P3 gi 209395183 gb gi FJ214726.1 209395183 3000 6K1 3500 4000 CI 4500 9773 bp 5000 6K2 5500 NIa-VPg 6000 NIa-Pro 6500 7000 NIb 7500 8000 8500 40MYPVYCP: 8575 » 9310 CP 9000 9500
Figura 44. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Ceja respecto a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867.
154
El análisis de los ensambles para la cepa Carmen, mostró dos tipos de asociación con
secuencias de referencia para la región CP. La primera (CP y 3‟NTR) se dió con secuencias
de las razas PVY-NTN (Figura 45), presentando identidades del 99% para nucleótidos y del
98% en aminoácidos (Tabla 32). El segundo fragmento de CP al igual que el fragmento
correspondiente a la región P1 y 5‟NTR (Figura 46), se asoció con secuencias de referencia
de la raza PVY-N de USA y Canadá, con identidades para CP del 96% para nucleótidos y
del 97% cuando se evaluaron aminoácidos (Tabla 33). En el caso de la región genómica P1,
se encontraron identidades del 94% para nucleótidos con respecto a una cepa Canadiense
de PVY-N y del 93% para aminácidos (Tabla 34).
Tabla 32. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACarmen PVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,93 ID AJ585195.1 PVY UK 0,93 0,98 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,93 0,99 0,98 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,94 0,99 0,98 0,99 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,92 0,94 0,93 0,94 0,94 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,92 0,94 0,93 0,94 0,94 0,99 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,93 0,99 0,98 0,99 0,99 0,94 0,94 ID U09509.1 PVYC Canada 0,94 0,99 0,98 0,99 0,99 0,94 0,94 0,99 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,91 0,91 0,90 0,92 0,91 0,96 0,96 0,92 0,91 ID AY884983.1 PVYN USA 0,92 0,91 0,91 0,92 0,91 0,97 0,97 0,92 0,92 0,98 ID Carmen PVY 0,92 0,94 0,93 0,94 0,94 0,99 0,99 0,94 0,94 0,96 0,97 ID
Aminoácidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACarmen PVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,96 ID AJ585195.1 PVY UK 0,95 0,99 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,96 0,99 0,99 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,96 0,99 0,99 0,99 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,96 0,96 0,95 0,97 0,96 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,96 0,96 0,95 0,97 0,96 0,99 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,96 0,99 0,99 0,99 0,99 0,96 0,96 ID U09509.1 PVYC Canada 0,97 1,00 0,98 0,99 0,99 0,96 0,96 0,99 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,94 0,95 0,94 0,95 0,94 0,98 0,98 0,95 0,94 ID AY884983.1 PVYN USA 0,96 0,96 0,95 0,97 0,96 0,99 0,99 0,96 0,96 0,99 ID Carmen PVY 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 0,98 0,98 0,95 0,95 0,98 0,99 ID
155
Tabla 33. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACarmen PVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,92 ID AJ585195.1 PVY UK 0,91 0,97 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,92 0,99 0,98 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,93 0,99 0,98 0,99 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,89 0,91 0,90 0,92 0,91 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,89 0,91 0,90 0,92 0,91 0,99 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,92 0,98 0,98 0,99 0,99 0,91 0,92 ID U09509.1 PVYC Canada 0,92 0,98 0,96 0,97 0,98 0,91 0,91 0,97 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,89 0,89 0,89 0,90 0,89 0,96 0,96 0,90 0,90 ID AY884983.1 PVYN USA 0,90 0,89 0,89 0,90 0,90 0,97 0,98 0,90 0,89 0,97 ID Carmen PVY 0,90 0,90 0,90 0,91 0,91 0,96 0,96 0,91 0,91 0,96 0,96 ID
Aminoácidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACarmen PVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,95 ID AJ585195.1 PVY UK 0,94 0,97 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,95 0,98 0,98 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,95 0,98 0,98 0,99 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 0,99 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,95 0,98 0,98 0,99 0,99 0,96 0,96 ID U09509.1 PVYC Canada 0,96 0,98 0,97 0,98 0,98 0,95 0,95 0,98 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,93 0,94 0,93 0,95 0,94 0,97 0,97 0,94 0,93 ID AY884983.1 PVYN USA 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 0,99 0,99 0,96 0,95 0,98 ID Carmen PVY 0,94 0,95 0,94 0,95 0,95 0,97 0,97 0,95 0,94 0,97 0,98 ID
Tabla 34. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región P1 secuenciada
para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACarmen PVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,89 ID AJ585195.1 PVY UK 0,90 0,95 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,70 0,72 0,71 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,90 0,95 0,95 0,72 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,70 0,72 0,71 0,99 0,72 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,82 0,83 0,84 0,86 0,83 0,85 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,82 0,83 0,85 0,86 0,83 0,86 0,98 ID U09509.1 PVYC Canada 0,90 0,97 0,95 0,71 0,96 0,71 0,83 0,83 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,71 0,71 0,71 0,91 0,72 0,91 0,82 0,83 0,71 ID AY884983.1 PVYN USA 0,70 0,71 0,71 0,99 0,72 0,99 0,86 0,86 0,71 0,91 ID Carmen PVY 0,72 0,72 0,71 0,92 0,73 0,91 0,82 0,82 0,72 0,94 0,91 ID
Aminoácidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACarmen PVY AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID AF522296.1 PVYN Egypt 0,86 ID AJ585195.1 PVY UK 0,88 0,94 ID AJ584851.1 PVYN UK 0,69 0,69 0,70 ID AJ585196.1 PVYO UK 0,88 0,94 0,94 0,69 ID AJ585342.1 PVYNTN UK 0,69 0,69 0,69 1,00 0,69 ID AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,84 0,83 0,85 0,83 0,83 0,83 ID AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,84 0,83 0,84 0,84 0,83 0,84 0,98 ID U09509.1 PVYC Canada 0,87 0,94 0,93 0,69 0,93 0,68 0,82 0,82 ID AY166867.1 PVYN Canada 0,68 0,67 0,68 0,89 0,68 0,88 0,78 0,78 0,67 ID AY884983.1 PVYN USA 0,69 0,69 0,70 1,00 0,69 0,99 0,84 0,84 0,69 0,88 ID Carmen PVY 0,69 0,67 0,68 0,90 0,68 0,90 0,78 0,79 0,67 0,93 0,90 ID 156
1 AJ585342.1PVYNTNUK: 1 » 9647 P1 500 1000 HC-Pro 1500 2000 2500 P3 gi 209395183 gb gi FJ214726.1 209395183 3000 6K1 3500 4000 CI 4500 9773 bp 5000 6K2 5500 NIa-VPg 6000 NIa-Pro 6500 7000 7500 NIb 8000 8500 454749MYPVY: 8738 » 9617 CP 9000 9500
Figura 45. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Carmen respecto a la secuencia de referencia AJ585342.
157
1 AY166867.1PVYNCanada: 1 » 9704 AY884983.1PVYNUSA: 1 » 9704 39MYPVY: 55 » 922 P1 500 1000 HC-Pro 1500 2000 2500 P3 gi 209395183 gb gi FJ214726.1 209395183 3000 6K1 3500 4000 CI 4500 9773 bp 5000 6K2 5500 NIa-VPg 6000 NIa-Pro 6500 7000 NIb 7500 8000 8500 41MYPVY: 8617 » 9272 CP 9000 9500
Figura 46. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones CP y P1 de PVY de la cepa
Carmen respecto a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867.
158
5.6.3. Secuencias parciales del genoma de PVX
Para el estudio de las secuencias parciales del genoma de PVX se utilizaron dos cepas del departamento de Antioquia (Tabla 22), realizándose las reacciones de RT-PCR con las combinaciones de cebadores PVX1F – PVX1651R, PVX3130F – PVX4495R, PVX5476F -
PVX6415R y PVX5476F – PVXR (Figura 47).
Figura 47. Amplicones obtenidos con los cebadores PVX5476F-PVXR (749 pb) carriles 5 a 7, PVX1F-
PVX1651R (1651 pb) carriles 8 a 10, PVX3130-PVX4495 (1365 pb) carriles 11 a 13, PVX5476F-PVX6415R
(939 pb) carriles 14 a 16, a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia. 1:
Marcador 100pb, 5: Carmen, 6: Ceja, 7: Control negativo, 8: Ceja, 9: Carmen, 10: Control negaativo, 11:
Ceja, 12: Carmen, 13: Control negativo, 14: Ceja, 15: Carmen, 16: Control negativo.
Las secuencias ensambladas se contextualizaron respecto a la secuencia de referencia
EU021215. De la cepa Ceja se obtuvieron dos fragmentos, los cuales correspondieron al extremo 3‟ de la región que codifica para RdRp y TGB3-CP parcial hacia el extremo 5‟
(Figura 48). El análisis de las secuencias, que empleó siete genomas de referencia, indicó identidades superiores al 95% para nucleótidos y al 98% para aminoácidos para la región
159
RdRp (Tabla 35). El fragmento TGB3-CP, presentó identidades igualmente superiores al
95% para nucleótidos y del 100% para aminoácidos con respecto a cepas de PVX de China
y Taiwan (Tabla 36).
Tabla 35. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región RdRp secuenciada
para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCeja PVX EF423572.1 PVX China ID M72416.1 PVX Russia 0,95 ID M38480.1 PVX Russia 0,95 1,00 ID FJ461343.1 PVX Iran 0,96 0,96 0,96 ID AF272736.2 PVX Taiwan 0,96 0,96 0,96 0,97 ID AB056718.1 PVX os Japan 0,96 0,95 0,95 0,97 0,99 ID AB056719.1 PVXbs Japan 0,95 0,95 0,95 0,97 0,97 0,97 ID Ceja PVX 0,95 0,95 0,95 0,96 0,95 0,95 0,95 ID
Aminoácidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCeja PVX EF423572.1 PVX China ID M72416.1 PVX Russia 0,99 ID M38480.1 PVX Russia 0,99 1,00 ID FJ461343.1 PVX Iran 0,99 0,99 0,99 ID AF272736.2 PVX Taiwan 0,99 0,99 0,99 0,99 ID AB056718.1 PVX os Japan 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID AB056719.1 PVXbs Japan 0,98 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID Ceja PVX 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,98 ID
160
Tabla 36. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCeja PVX EF423572.1 PVX China ID M72416.1 PVX Russia 0,96 ID M38480.1 PVX Russia 0,96 1,00 ID FJ461343.1 PVX Iran 0,97 0,96 0,96 ID AF272736.2 PVX Taiwan 0,97 0,96 0,96 0,98 ID AB056718.1 PVX os Japan 0,97 0,96 0,96 0,97 0,98 ID AB056719.1 PVXbs Japan 0,95 0,95 0,95 0,96 0,97 0,96 ID Ceja PVX 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,95 ID
Aminoácidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCeja PVX EF423572.1 PVX China ID M72416.1 PVX Russia 0,98 ID M38480.1 PVX Russia 0,98 1,00 ID FJ461343.1 PVX Iran 0,99 0,97 0,97 ID AF272736.2 PVX Taiwan 1,00 0,98 0,98 0,99 ID AB056718.1 PVX os Japan 0,99 0,97 0,97 0,98 0,99 ID AB056719.1 PVXbs Japan 0,98 0,96 0,96 0,97 0,98 0,97 ID Ceja PVX 1,00 0,98 0,98 0,99 1,00 0,99 0,98 ID
161
1 EU021215.1PVX: 1 » 6436 500 1000 1500 2000 gi 154816334 gb EU021215.1 EU021215.1 gb 154816334 gi RdRp 2500 3000 6435 bp 6435 6264MR-PVX: 3185 » 4472 3500 4000 4500 GB1 TG GB2 TG 5000 GB3 TG 59MR-PVX5476F-PVXR: 5485 » 6226 5500 CP 6000
Figura 48. Contextualización de las secuencias obtenidas para una región parcial de RdRp y CP de la cepa
Ceja de PVX, respecto a la secuencia de referencia EU021215.
162
De la cepa Carmen de PVX, se obtuvieron tres fragmentos correspondientes al 5‟NTR-
RdRp parcial, RdRp parcial hacia el 3‟ y TGB3 parcial al 3‟-CP-3‟NTR (Figura 49). Para el
primer framento se encontraron identidades del 97% para nucleótidos con secuencias de
cepas de China y con una cepa de la raza PVX-bs de Japón, mientras que para la secuencia
de aminoácidos las identidades fueron superiores al 98% en todos los casos (Tabla 37).
Para el segundo fragmento de RdRp, las identidades correspondieron al 95% para
nucleótidos con excepción de las razas PVX-os y PVX-bs, las cuales fueron del 94%. Para
aminoácidos fue muy similar, siendo las identidades de 99% y 98%, respectivamente
(Tabla 38). Por último, el fragmento que correspondió al extremo 3‟ del genoma de PVX,
mostró identidades del 97% para nucleótidos con cepas de Rusia e Iran y del 100% para
aminoácidos (Tabla 39).
Tabla 37. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 5‟NTR-RdRp
secuenciada para la cepa Carmen de PVX y su comparación con otros aislamientos del
mundo.
Nucleotidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCarmen PVX EF423572.1 PVX China ID M72416.1 PVX Russia 0,97 ID M38480.1 PVX Russia 0,97 1,00 ID FJ461343.1 PVX Iran 0,96 0,96 0,96 ID AF272736.2 PVX Taiwan 0,97 0,97 0,97 0,96 ID AB056718.1 PVX os Japan 0,96 0,96 0,96 0,95 0,99 ID AB056719.1 PVX bs Japan 0,97 0,97 0,97 0,97 0,98 0,98 ID Carmen PVX 0,97 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,97 ID
Aminoácidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCarmen PVX EF423572.1 PVX China ID M72416.1 PVX Russia 0,99 ID M38480.1 PVX Russia 0,99 1,00 ID FJ461343.1 PVX Iran 0,99 0,99 0,99 ID AF272736.2 PVX Taiwan 0,99 0,99 0,99 0,99 ID AB056718.1 PVX os Japan 0,99 0,99 0,98 0,99 1,00 ID AB056719.1 PVX bs Japan 1,00 1,00 0,99 1,00 1,00 0,99 ID Carmen PVX 0,99 0,99 0,98 0,99 0,99 0,98 0,99 ID
163
Tabla 38. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟ RdRp
secuenciada para la cepa Carmen de PVX y su comparación con otros aislamientos del
mundo.
Nucleotidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCarmen PVX EF423572.1 PVX China ID M72416.1 PVX Russia 0,95 ID M38480.1 PVX Russia 0,95 1,00 ID FJ461343.1 PVX Iran 0,96 0,96 0,96 ID AF272736.2 PVX Taiwan 0,96 0,96 0,96 0,97 ID AB056718.1 PVX os Japan 0,96 0,95 0,95 0,97 0,99 ID AB056719.1 PVX bs Japan 0,95 0,95 0,95 0,97 0,97 0,97 ID Carmen PVX 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,94 0,94 ID
Aminoácidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCarmen PVX EF423572.1 PVX China ID M72416.1 PVX Russia 0,99 ID M38480.1 PVX Russia 0,99 1,00 ID FJ461343.1 PVX Iran 0,99 0,99 0,99 ID AF272736.2 PVX Taiwan 0,99 0,99 0,99 0,99 ID AB056718.1 PVX os Japan 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID AB056719.1 PVX bs Japan 0,98 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID Carmen PVX 0,99 0,99 0,99 0,99 0,98 0,98 0,98 ID
Tabla 39. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟TGB3-CP-
3‟NTR secuenciada para la cepa ¨Carmen¨ de PVX y su comparación con otros
aislamientos del mundo.
Nucleotidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCarmen PVX EF423572.1 PVX China ID M72416.1 PVX Russia 0,96 ID M38480.1 PVX Russia 0,96 1,00 ID FJ461343.1 PVX Iran 0,97 0,96 0,96 ID AF272736.2 PVX Taiwan 0,97 0,96 0,96 0,98 ID AB056718.1 PVX os Japan 0,96 0,96 0,96 0,97 0,98 ID AB056719.1 PVX bs Japan 0,95 0,95 0,95 0,96 0,97 0,96 ID Carmen PVX 0,96 0,97 0,97 0,97 0,96 0,96 0,95 ID
Aminoácidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCarmen PVX EF423572.1 PVX China ID M72416.1 PVX Russia 0,98 ID M38480.1 PVX Russia 0,98 1,00 ID FJ461343.1 PVX Iran 0,99 0,98 0,98 ID AF272736.2 PVX Taiwan 1,00 0,98 0,98 0,99 ID AB056718.1 PVX os Japan 0,99 0,98 0,98 0,99 0,99 ID AB056719.1 PVX bs Japan 0,98 0,97 0,97 0,98 0,98 0,98 ID Carmen PVX 1,00 0,98 0,98 0,99 1,00 0,99 0,98 ID
164
1 EU021215.1PVX: 1 » 6438 61MR-PVX1F: 71 » 728 500 1000 1500 gi 154816334 gb EU021215.1 EU021215.1 gb 154816334 gi 2000 RdRp 2500 3000 6435 bp 6435 63MR-PVX3130F-PVX4495R: 3184 » 4480 3500 4000 4500 GB1 TG GB2 TG 5000 GB3 TG 58-60-65MR: 5491 » 6391 5500 CP 6000
Figura 49. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones 5‟NTR-5‟ RdRp parcial, 3‟RdRp parcial y TGB3 parcial-CP-3‟NTR de la cepa ¨Carmen¨ de PVX, respecto a la secuencia de referencia
EU021215.
165
5.6.4. Secuencias parciales del genoma de PVS
Para el estudio de secuencias parciales del genoma de PVS, se emplearon cebadores dirigidos a la región CP PVSCPF-PVSCPR (Figura 50), para dos cepas del departamento de Antioquia (Tabla 22) realizándose las reacciones de RT-PCR como se describió en la metodología.
Figura 50. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF-PVSCPR (1288 pb) carriles 12 a 20, a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia. 1: Marcador 1 Kb, 12: Control negativo, 13:
Vergel Sta Rosa de Osos, 14: Estación Berrio Sta Rosa de Osos, 15: El Roble Sta Rosa de Osos, 16: Sta Ana
Sta Rosa de Osos, 17: Buena Vista La Unión, 18: Vía Sonsón La Unión, 19: Valle de María Santuario, 20:
Valle de María Santuario2.
De las dos cepas estudiadas, se obtuvieron dos fragmentos de CP (Figura 51), cuyo análisis indicó identidades para el primer fragmento de 86% y 87% para nucleótidos, en las cepas de Carmen y Santuario, respectivamente. Para el caso de aminoácidos, ambas cepas tuvieron identidades del 92% con respecto a un aislamiento del virus obtenido en Alemania
(Tabla 40). Para el segundo fragmento, que comprendió a CP-3‟NTR, las identidades
166
fueron del 90% para nucleótidos y de 97% para aminoácidos con la cepa de referencia
(Tabla 41).
Tabla 40. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada para las cepas Carmen y Santuario de PVS y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos AJ863509.1PVSLeonaGermanyAJ863510.1PVSVltavaGermanyFJ813512.1PVSWaDefUSFJ813513.1PVSId4106USCarmen PVSCPSantuario PVSCP AJ863509.1 PVS Germany ID AJ863510.1 PVS Germany 0,79 ID FJ813512.1 PVS USA 0,96 0,79 ID FJ813513.1 PVS USA 0,96 0,79 0,99 ID Carmen PVSCP 0,78 0,86 0,78 0,78 ID Santuario PVSCP 0,78 0,87 0,78 0,78 1,00 ID
Aminoácidos AJ863509.1PVSLeonaGermanyAJ863510.1PVSVltavaGermanyFJ813512.1PVSWaDefUSFJ813513.1PVSId4106USCarmen PVSCPSantuario PVSCP AJ863509.1 PVS Germany ID AJ863510.1 PVS Germany 0,83 ID FJ813512.1 PVS USA 0,96 0,85 ID FJ813513.1 PVS USA 0,96 0,85 0,99 ID Carmen PVSCP 0,87 0,92 0,88 0,88 ID Santuario PVSCP 0,87 0,92 0,88 0,88 0,99 ID
Tabla 41. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP-3‟NTR secuenciada para las cepas Carmen y Santurio de PVS y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos AJ863509.1PVSLeonaGermanyAJ863510.1PVSVltavaGermanyFJ813512.1PVSWaDefUSFJ813513.1PVSId4106USCarmen PVSCPSantuario PVSCP AJ863509.1 PVS Germany ID AJ863510.1 PVS Germany 0,85 ID FJ813512.1 PVS USA 0,95 0,86 ID FJ813513.1 PVS USA 0,96 0,86 0,98 ID Carmen PVSCP 0,82 0,90 0,84 0,83 ID Santuario PVSCP 0,81 0,90 0,84 0,83 1,00 ID
Aminoácidos AJ863509.1PVSLeonaGermanyAJ863510.1PVSVltavaGermanyFJ813512.1PVSWaDefUSFJ813513.1PVSId4106USCarmen PVSCPSantuario PVSCP AJ863509.1 PVS Germany ID AJ863510.1 PVS Germany 0,99 ID FJ813512.1 PVS USA 0,98 0,99 ID FJ813513.1 PVS USA 0,99 1,00 0,99 ID Carmen PVSCP 0,96 0,97 0,96 0,97 ID Santuario PVSCP 0,96 0,97 0,96 0,97 1,00 ID 167
1 AJ863509.1PVSLeonaGermany: 1 » 8480 AJ863510.1PVSVltavaGermany: 1 » 8480 500 1000 1500 2000 gi 226359395 gb FJ813513.1 2500 RdRp 3000 3500 8485 bp 4000 4500 5000 5500 5kDa k 25 6000 2kDa k 12 6500 7 kDa 7 7000 68MY-PVSCPF: 7162 » 7712 67MY-PVSCPF: 7162 » 7754 1kDa k 11 CP 7500 67MY-PVSCPR: 7801 » 8335 68MY-PVSCPR: 7828 » 8335 8000
Figura 51. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP-3‟NTR de cepas Carmen y
Santuario de PVS, respecto a las secuencias de referencia AJ863510 y AJ863509.
168
5.6.5. Secuencias parciales del genoma de PLRV
Para PLRV no se contó con cebadores que flanquearan otras regiones del genoma diferentes a la usada para el análisis filogenético. Es por ello que sólo se contextualizaron con respecto a un genoma de referencia (AF453388) dos de las secuencias obtenidas para la región que codifica CP (Tabla 22) (Figura 52). Se emplearon siete genomas completos de diferentes orígenes geográficos y razas del virus para el análisis de las secuencias, mostrando identidades superiores al 98% para nucleótidos con las secuencias obtenidas. En el caso de las identidades para aminoácidos, la cepa ¨Siguineque¨ tuvo identidades del 99% con aislamientos de las razas PLRV-Noir, PLRV-CU87 y una cepa de Egipto, mientras que la cepa ¨Suras¨ presentó identidades del 98% con respecto a dichos aislamientos (Tabla 42).
Tabla 42. Matriz de identidad para nucleótidos y aminácidos de la región parcial de CP secuenciada para las cepas Siguineque y Suras de PLRV y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleótidos AF453388.1 AF453389.1PLRV Zim13 AF453390.1PLRV Francia OP Spain AF453391.1PLRV Noir France AF453392.1PLRV Fr1 France AF453393.1PLRV CIP01 AY138970.1PLRV France CU87 Siguineque PLRVCuba Egypt PLRV Suras PLRV AF453388.1 PLRV Zim13 Francia ID AF453389.1 PLRV OP Spain 0,99 ID AF453390.1 PLRV Noir France 0,99 0,99 ID AF453391.1 PLRV Fr1 France 1,00 0,99 0,99 ID AF453392.1 PLRV CIP01 France 0,99 0,99 0,99 0,98 ID AF453393.1 PLRV CU87 Cuba 0,99 0,99 1,00 0,99 0,99 ID AY138970.1 PLRV Egypt 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID Siguineque PLRV 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID Suras PLRV 0,98 0,98 0,99 0,98 0,98 0,99 0,98 0,99 ID
Aminoácidos AF453388.1 AF453389.1PLRV Zim13 AF453390.1PLRV Francia OP Spain AF453391.1PLRV Noir France AF453392.1PLRV Fr1 France AF453393.1PLRV CIP01 AY138970.1PLRV France CU87 Siguineque PLRVCuba Egypt PLRV Suras PLRV AF453388.1 PLRV Zim13 Francia ID AF453389.1 PLRV OP Spain 0,98 ID AF453390.1 PLRV Noir France 0,99 0,99 ID AF453391.1 PLRV Fr1 France 0,99 0,97 0,98 ID AF453392.1 PLRV CIP01 France 0,99 0,98 0,99 0,98 ID AF453393.1 PLRV CU87 Cuba 0,99 0,99 1,00 0,98 0,99 ID AY138970.1 PLRV Egypt 0,99 0,99 1,00 0,98 0,99 1,00 ID Siguineque PLRV 0,98 0,98 0,99 0,97 0,98 0,99 0,99 ID Suras PLRV 0,97 0,97 0,98 0,96 0,97 0,98 0,98 0,99 ID
169
1 AF453388.1PLRVstrainZim13France: 1 » 5865 500 1000 P1 1500 AF453388.1PLRVstrainZim13France 2000 P2 2500 5865 bp 3000 P4 3500 P3-CP 20FB-PLRV: 3652 » 3978 87MY-PLRV: 3653 » 3978 4000 P5 4500 P6 5000 P7 5500
Figura 52. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región parcial CP de las cepas de PLRV
Siguineque y Suras, respecto a la secuencia de referencia AF453388.
170
5.6.6. Secuencias parciales del genoma de PYVV
Del virus PYVV se eligieron dos cepas (Tabla 22) para estudiar otra región del genoma diferente a la región de CP que se empleó en el análisis filogenético (Figura 54). Dicha región correspondió a la codificante para CPm en el ARN3 y se emplearon para su amplificación mediante RT-PCR los cebadores CPm1-CPm2, obteniendo los amplicones del tamaño esperado (Figura 53).
Figura 53. Amplicones obtenidos con los cebadores CPm1-CPm2 (2025 pb), a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Nariño. 1: Marcador 100, 2: Obonuco, 3: Saguarán, 4: Control negativo.
El análisis de las secuencias se realizó comparándolas con dos genomas completos del virus obtenidos del Perú y depositados en el GenBank (NC_006063.1 y AJ557129.1), tanto para la región CPm (Figura 54), como para CP (Figura 55). Dicho análisis mostró identidades del 99% para la región de nucleótidos correspondiente al 5‟ de CPm de ambas secuencias
(Obonuco y Saguarán), mientras que para aminoácidos fue del 98% (Tabla 43). El segundo
171
segmento de CPm hacia el extremo 3‟, presentó identidades para nucleótidos y aminoácidos superiores al 98% (Tabla 44).
Tabla 43. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región parcial del extremo 5‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos cepas de PYVV del Perú.
Nucleotidos AJ508757.2PYVVCPmPeruNC_006061.1PYVVCPmPeruObonuco Saguarán AJ508757.2 PYVV CPm Peru ID NC_006061.1 PYVV CPm Peru 1,00 ID Obonuco PYVV 0,99 0,99 ID Saguarán PYVV 0,99 0,99 0,99 ID
Aminoácidos AJ508757.2PYVVCPmPeruNC_006061.1PYVVCPmPeruObonuco Saguarán AJ508757.2 PYVV CPm Peru ID NC_006061.1 PYVV CPm Peru 1,00 ID Obonuco PYVV 0,98 0,98 ID Saguarán PYVV 0,98 0,98 0,99 ID
Tabla 44. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región parcial del extremo 3‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos aislamientos de
PYVV del Perú.
Nucleotidos AJ508757.2PYVVCPmPeruNC_006061.1PYVVCPmPeruObonuco Saguarán AJ508757.2 PYVV CPm Peru ID NC_006061.1 PYVV CPm Peru 1,00 ID Obonuco PYVV 0,99 0,99 ID Saguarán PYVV 0,99 0,99 0,99 ID
Aminoácidos AJ508757.2PYVVCPmPeruNC_006061.1PYVVCPmPeruObonuco Saguarán AJ508757.2 PYVV CPm Peru ID NC_006061.1 PYVV CPm Peru 1,00 ID Obonuco PYVV 0,99 0,99 ID Saguarán PYVV 0,98 0,98 1,00 ID
172
El análisis de la región CP mostró identidades para nucleótidos respecto a las dos secuencias de referencia del 99% y para aminoácidos igualmente del 99% (Tabla 45).
Tabla 45. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada para las cepas Obonuco y Saguarán y dos aislamientos de PYVV del Perú.
Nucleotidos NC_006063.1PYVVCPPeruAJ557129.1PYVVCPUKObonuco Saguarán NC_006063.1 PYVVCP Peru ID AJ557129.1 PYVVCP Perú 1,00 ID Obonuco 0,99 0,99 ID Saguarán 0,99 0,99 1,00 ID
Aminoácidos NC_006063.1PYVVCPPeruAJ557129.1PYVVCPUKObonuco Saguarán NC_006063.1 PYVVCP Peru ID AJ557129.1 PYVVCP Perú 1,00 ID Obonuco 0,99 0,99 ID Saguarán 0,99 0,99 1,00 ID
173
1 AJ508757.2PYVVCPmPeru: 1 » 3892 NC_006061.1PYVVCPmPeru: 1 » 3892 500 P4 96MYCPm1: 967 » 1706 94MYCPm1: 978 » 1737 1000 gi 30172189 embgi 30172189 AJ508757.2 1500 CPm 3892 bp 2000 94MYCPm2: 2112 » 2899 96MYCPm2: 2133 » 2889 2500 3000 P26 3500
Figura 54. Contextualización de las secuencias obtenidas para CPm parcial de las cepas de PYVV Obonuco y
Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y AJ557129.1.
174
1 NC_006063.1PYVVCPPeru: 1 » 5339 AJ557129.1PYVVCPUK: 1 » 5339 500 1000 Hsp70 1500 gi 46518016 emb AJ557129.1 AJ557129.1 emb 46518016 gi 2000 P7 2500 5339 bp 3000 P60 3500 P10 4000 92MY-PYVV: 92MY-PYVV: 4302 » 5038 90MY-PYVV: 90MY-PYVV: 4311 » 5023 4500 CP 5000
Figura 55. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de cepas de PYVV Obonuco y
Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y AJ557129.1.
175
5.7. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real.
5.7.1. Pruebas de detección de PVY.
Las reacciones de RT-PCR (Figura 56) y qRT-PCR (Figura 57) resultaron en amplificaciones exitosas del genoma de PVY cuando se emplearon los cebadores descritos en la metodología (Tablas 3 y 4), obteniéndose los fragmentos de ~227pb y las curvas de amplificación del reporte de emisión de fluorescencia esperados, respectivamente.
Al comparar los niveles de detección en tejido foliar de papa del virus PVY mediante RT-
PCR en tiempo real (qRT-PCR) con relación a RT-PCR y ELISA, se encontró que esta metodología detectó la presencia del virus en la totalidad de las muestras evaluadas (con excepción del control negativo), mientras que la RT-PCR convencional y la prueba de
ELISA detectaron el virus en el 88% y 63% de las muestras. El análisis estadístico arrojó diferencias significativas al nivel del 95% entre la prueba de ELISA y qRT-PCR, pero no entre ELISA y PCR convencional (Figura 58).
176
Figura 56. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYF y PVYUnivR (227 pb) a partir de tejido foliar de plantas de papa de dos departamentos de Colombia (Tabla 5). 1: Marcador 100pb, 2: P3 6-10, 3: P3 EN, 4: P4
1-5, 5: P4 AV, 6: P4 11-15, 7: P5 11-15, 8: P6 11-15, 9: P7 MR, 10: P8 AV, 11: P8 16-20, 12: Ip EF, 13: Ip
Esp, 14: Ip EN, 15: Ip MR, 16: Ip1 AV, 17: Ip2 MR, 18: Ip3 1-5, 19: Ip8 EF, 20: Ip4 AV, 21: Marcador
100pb, 22: Ip4 11-15, 23: U1, 24: U2, 25: U3, 26: U4, 27: U5, 28: U6, 29: U7, 30: U8, 31: SR1, 32: SR2, 33:
SR3, 34: SR4, 35: SR5, 36: SR6, 37: SR7, 38: SR8, 39: SR9, 40: B1. (Vease Figura 58b: muestras B2, B3 y
Control negativo).
177
Figura 57. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PVYUnivF, PVYUnivR y la sonda
PVYUniv a partir de tejido foliar de plantas de papa de dos departamentos de Colombia.
Figura 58. Porcentajes de detección del virus PVY empleando ELISA, RT-PCR y qRT-PCR en muestras de tejido foliar de papa de los departamentos de Antioquia y Nariño.
178
5.7.2. Pruebas de detección de PMTV
Las reacciones de RT-PCR (Figura 59) y qRT-PCR (Figura 60) resultaron en amplificaciones exitosas de PMTV empleándose los cebadores descritos en la metodología
(Tablas 3 y 4), obteniéndose los amplicones de ~816 pb y curvas de reporte de la emisión de fluorescencia esperados, respectivamente.
Al analizar los niveles de detección en raíces de N. benthamiana sembradas en turba inoculada con el suelo tamizado con quistosoros de S. subterranea, se encontró que la prueba de qRT-PCR determinó la presencia del virus en el 45% de las muestras analizadas, mientras que mediante ELISA y RT-PCR convencional se diagnosticaron 25 y 28% de las muestras como positivas para este virus. Sin embargo, el análisis estadístico no indicó diferencias significativas al nivel del 95% entre las tres pruebas analizadas (Figura 61). Al observar individualmente la capacidad de las pruebas para detectar el PMTV, resultó llamativo el hecho que algunas muestras fueran positivas para dos de las tres pruebas, e incluso se presentaron casos en los que la prueba de ELISA detecto el virus pero no las pruebas basadas en RT-PCR, lo cual sugiere problemas con la inhibición de las reacciones enzimáticas o con los cebadores empleados (Tabla 46).
179
Tabla 46. Detección del virus PMTV en muestras de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana sembradas en turba inoculada con S. subterranea, empleando tres metodologías (ELISA, RT-PCR, qRT-PCR).
Muestra Localidad Vereda Variedad ELISA RT-PCR qRT-PCR
C+ KIT ELISA + - + C+ 1/5 KIT ELISA + - + C+ 1/10- KIT ELISA + - + C+ 1/5- KIT ELISA + - + 7 Ipiales Rosario Unica - - - Parda 10 Pasto El Campanero Pastusa - - - Parda 10(1) Pasto El Campanero Pastusa - + + Páramo 23 Zipaquirá Guerrero Pastos - - + Páramo 23(1) Zipaquirá Guerrero Pastos - + + 25 La unión La Cabaña Criolla + + + 25(1) La unión La Cabaña Criolla + + + 35 La unión - + + 36 La unión - - - Vallejuelito La unión Vallejuelito Capiro - + + Villapinzón Villapinzón Chasques Capiro - - - Villapinzón(1) Villapinzón Chasques Capiro - - - Villapinzón(2) Villapinzón Chasques Capiro - - - Madrid Madrid Los Árboles Capiro + - + Madrid(1) Madrid Los Árboles Capiro - - - Madrid(2) Madrid Los Árboles Capiro - - - Páramo Parda Zipaquirá Zipaquirá Guerrero Pastusa - - + Páramo Parda Zipaquirá(1) Zipaquirá Guerrero Pastusa - - - Páramo Parda Zipaquirá(2) Zipaquirá Guerrero Pastusa - - - Páramo Parda Zipaquirá(3) Zipaquirá Guerrero Pastusa - - - Páramo Parda Zipaquirá(4) Zipaquirá Guerrero Pastusa - + + Tunja Tunja Siachoque Capiro - - + Tunja(1) Tunja Siachoque Capiro - - - Tunja(2) Tunja Siachoque Capiro - - - Tunja(3) Tunja Siachoque Capiro - - - Ventaquemada Ventaquemada Capellanía Capiro + - - ventaquemada (1) Ventaquemada Capellanía Capiro - - - Ventaqumada(2) Ventaquemada Capellanía Capiro - - - Ventaquemada(3) Ventaquemada Capellanía Capiro - - - 180
Continuación Tabla 46
SRO L2 Sta Rosa de Osos Aragón Capiro - - - Sta Rosa de SRO L4 Osos Aragón Capiro - - + Sta Rosa de SRO L5 Osos Aragón Capiro - + - Sta Rosa de SRO L5(2) Osos Aragón Capiro - + - Sta Rosa de SRO L6 Osos Aragón Capiro + + + Sta Rosa de SRO L7 Osos El Tres Capiro + + + TZ+Z+ Turmeqé Siguineque Criolla - - -
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Figura 59. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV759F y PMTV1552R (816 pb) a partir de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana cultivadas en suelos infestados con S. subterranea de cuatro departamentos de Colombia (Tabla 6). a. 1: Marcador 100pb, 2: C+, 3: C+ 1/5, 4: C+1/10, 5: C+ 1/50, 6: 7, 7:
10, 8: 10 (1), 9:23, 10: 23 (1), 11: 25, 12: 25 (1), 13: 35, 14: 36, 15: Valle, 16: Villapinzón, 17: Villapinzón
(1), 18: Villapinzón (2), 19: Madrid, 20: Madrid (1), 21: Marcador 100pb, 22: Madrid (2), 23: Zipaquirá, 24:
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Zipaquirá (1), 25: Zipaquirá (2), 26: Zipaquirá (3), 27: Zipaquirá (4), 28: Tunja, 29: Tunja (1), 30: Tunja (2),
31: Tunja (3), 32: Ventaquemada, 33: Ventaquemada (1), 34: Ventaquemada (2), 35: Ventaquemada (3). b. 1:
Marcador 100pb, 2: SRO L2, 3: SRO L4, 4: SRO L5, 5: SRO L5 (1), 6: SRO L6, 7: SRO L7, 8: TZ1Z1, 9:
Marcador 100pb, 10: Control negativo para PMTV, 11: B2, 12: B3, 13: Control negativo para PVY.
Figura 60. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PMTV1948F, PMTV2017R y la sonda
PMTV1970 a partir de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana cultivadas en suelos infestados con S. subterranea de cuatro departamentos de Colombia
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Figura 61. Porcentajes de detección del virus PMTV empleando ELISA, RT-PCR y qRT-PCR en muestras de tejido de raíz de N. benthamiana cultivadas en suelos procedentes de cuatro departamentos de Colombia.
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6. DISCUSIÓN
La papa es el cuarto cultivo de producción mundial luego del arroz, maíz y trigo, que provee la subsistencia básica a personas de diferentes continentes y es considerado por algunas sociedades como el segundo pan (Secor y Rivera-Varas, 2004). Sin embargo, este cultivo es afectado por un sinnúmero de patógenos, dentro de los cuales se destacan los virus. Dichos patógenos, se han venido reportando regularmente en los cultivos de papa del país, incluyendo PVY, PLRV; PVX, PVS y PYVV; este último ha aumentado su importancia en las últimas décadas por su rápida diseminación y efectos sobre el cultivo
(Guerrero, 1978; Guzman et al., 2004a; Zapata, 2004). Para los virus mencionados se han realizado diversos estudios en el país, con el fin de evaluar su incidencia en algunas regiones productoras o en variedades cultivadas, así como también su efecto sobre la producción y rendimiento (Guerrero y Martinez, 1980; Sánchez de Luque et al., 1991;
Zapata, 2004; Guzmán et al., 2004a). Recientemente, como avance de este trabajo (Gil et al., 2009), se reportaron altas incidencias para Potyvirus en los cultivos de tres regiones de
Antioquia (41 a 75%), mientras que el virus PLRV presentó niveles de 9 al 16% y PVX sólo se encontró en la región de Marinilla-Rionegro en una proporción del 22%. Esto enfatiza la importancia de reforzar los programas de certificación de semilla, debido a que el agricultor emplea en la mayoría de los casos, semilla de repetición infectada por virus y como resultado hay una degeneración continua del material de siembra y de los rendimientos esperados del cultivo.
Por otro lado, la reciente documentación de la presencia del virus PMTV en el país (Vélez,
2007) conduce a pensar que adicional a los virus tradicionalmente estudiados y contemplados en los programas de certificación de semilla, existen otros que son
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prevalentes y de importancia cuarentenaria, pero que aún no se reportan debido a que no se ha realizado una evaluación de su presencia en el país, como podría ser el caso de los virus
PVM, PAMV, AMV, APMV, PVT, APLV, entre otros y cuyo reporte se ha dado previamente en otros países andinos y de Centro América (Salazar, 1995; Vásquez et al.,
2006).
Al realizar las evaluaciones visuales de los síntomas presentes en los cultivos de papa del país, se trató de simular la actividad realizada por los técnicos de campo y agricultores para determinar la presencia o no de afecciones virales. Como resultado se evidenció que no siempre se presentan síntomas individuales, sino que éstos generalmente pueden estar combinados y que como es bien sabido, no siempre corresponden a enfermedades virales, por lo que son referidos en este trabajo como presumiblemente asociados a virus. Es por esto que algunos amarillamientos y rugosidades foliares, fácilmente se pueden confundir con síntomas virales, aunque pueden ser debidos a desórdenes fisiológicos ocasionados por exceso en las aplicaciones de biocidas (fitotoxicidad), cambios drásticos en las condiciones ambientales y de nutrición de los cultivos, así como corresponder a químeras genéticas.
Los cultivos en Antioquia presentaron los mayores niveles de incidencia visual para los cuatro síntomas evaluados (AV, EF, EN, MR), lo cual estuvo acompañado por la detección en este departamento de los mayores niveles de incidencia de los virus estudiados mediante pruebas de ELISA. Por otro lado, los resultados obtenidos de las muestras síntomáticas evaluadas mediante las pruebas serológicas específicas para los virus Potyvirus, PVX,
PLRV, PVS, indican que no necesariamente los síntomas observables son atribuibles a determinados virus y que la ausencia de síntomas no representa ausencia de virus en los cultivos. Los resultados visuales de Boyacá, Cundinamarca y Nariño fueron muy similares 186
entre ellos, al igual que las incidencias evaluadas mediante ELISA, pero con promedios inferiores a lo encontrado en Antioquia. Sin embargo, al evaluar estos resultados es necesario contemplar la posible ocurrencia de otros virus no determinados en este trabajo, así como las diferencias en las variedades y épocas de muestreo para cada una de las zonas estudiadas, ya que es es bien sabido que la temperatura, precipitación, poblaciones de insectos vectores y estado fenológico del cultivo, entre otros factores, influyen dramáticamente en la manisfestación de los síntomas inducidos por virus.
Un antecedente que demuestra la necesidad de realizar monitoreos regulares sobre los cultivos de papa del país con el fin de evaluar su incidencia y de realizar estudios tendientes a identificar nuevos virus asociados al cultivo, es el del trabajo llevado a cabo en Costa
Rica para identificar los virus de papa presentes en este país y fortalecer su programa de certificación de semilla. Dicho estudio, contempló, la evaluación de siete virus no incluidos en su programa de certificación de semilla y la determinación de la incidencia de seis virus contenidos en este programa, empleando para ello pruebas de ELISA. Como resultado se encontró que virus como PAMV y TRSV presentaron incidencias muy altas y superiores a las de virus comúnmente estudiados (Vásquez et al., 2006). El caso de PAMV llama la atención, debido a que no se había reportado en dicho país a pesar de ser un virus con amplia dispersión en Centro y Suramérica, de fácil transmisión por áfidos y común asocio con PVY (Baulcombe et al., 1993; Brunt et al., 1996; Salazar, 1995). Así mismo, se encontró una incidencia de PMTV del 50% en muestras tomadas entre las altitudes 1800 a
2500 msnm, alturas similares a las regiones donde se siembra papa en nuestro país. Además de estos resultados, se reportó las presencia de seis de los siete virus que aún no habían sido documentados en Costa Rica (Vásquez et al., 2006).
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Para el caso particular de PMTV, la literatura describe que su sintomatología en papa incluye moteados amarillos y mosaicos en las hojas nuevas, al igual que zonas cloróticas en forma de V y acortamiento de entrenudos hacia los brotes (síntoma del que proviene el nombre de Mop-Top). Los síntomas en las hojas parecen estar presentes solo en climas muy fríos y cuando el tubérculo semilla ha sido infectado con anterioridad. En algunas variedades los tubérculos desarrollan anillos necróticos concéntricos en la superficie, síntoma conocido como “Spraing” (Rydén et al., 1986; Rydén et al., 1989; Harrison y
Reavy 2002). Partiendo de este precedente, los muestreos en campo de nuestra investigación, estuvieron dirijidos a la observación de dichos síntomas, especialmente en los sitios más altos de las zonas evaluadas. Desafortunadamente, no fue posible detectar
PMTV mediante ELISA o RT-PCR a partir de tejido de papa con síntomas similares a los descritos anteriormente, ni en raíces y tubérculos de papa afectados por S. subterranea, hecho por el cual se decidió evaluar la presencia del virus a partir de plantas señuelo, principalmente N. benthamiana, siguiendo los reportes planteados por Sjöberg (2006) y
Vélez (2007). De esta forma, se diagnosticó la ocurrencia del virus en al menos una muestra de los cuatro departamentos evaluados. No obstante, persiste la pregunta sobre los niveles de incidencia de PMTV en las diferentes regiones cultivadoras de papa del país y sobre su efecto en la degeneración del tubérculo semilla y/o en la producción; lo cual de resultar significativo, sería muy grave al adicionar este problema al causado por S. subterranea, su agente vector, que puede ocasionar reducciones en rendimiento hasta del
40% (Gilchrist et al., 2009).
Para complementar el análisis de incidencia de los virus bajo estudio y obtener mayor información sobre aquellos de los cuales no se pudo hacer análisis de incidencia, se
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realizaron los análisis filogenéticos de los seis virus bajo estudio (PVY, PYVV, PVS, PVX,
PLRV y PMTV). En todos los casos la región del genoma utilizada para dicho análisis correspondió a aquella que codifica para CP; aunque para el caso de PMTV se empleó adicionalmente una fracción de la región que codifica para la proteína TGB2.
El virus PVY fue el virus del cual se obtuvo un mayor número de aislamientos para el análisis filogenético. Dicho análisis presentó para este virus, identidades superiores al 89% de las cepas Colombianas con respecto a las de referencia de diferentes países, lo que demuestra que todas son variantes de la misma especie, según los criterios taxonómicos definidos para el género Potyvirus (Glais et al., 2002b; Adams et al., 2005). De dichas comparaciones, resultó destacado el hecho que todas las cepas secuenciadas se ubicaron en un clado filogenético compartiendo identidades superiores al 95% con aislamientos que representan las razas del virus PVY-N y PVY-NTN. Con respecto a las secuencias parciales del genoma de PVY de los aislamientos del departamento de Antioquia, se encontraron igualmente altas identidades con las razas PVY-N y PVY-NTN para la región que codifica la proteína P1, CP y los UTR 5‟ y 3‟. Lo anterior, sugiere la posible presencia de la enfermedad PTNRD en el país. Dicha enfermedad se caracteriza por la presencia de anillos necróticos en los tubérculos, que pueden aparecer cuando estos se cosechan, pero más comúnmente cuando se almacenan (Glais et al., 2002a). Debido a que en Colombia no es una práctica usual el almacenamiento de tubérculos, los síntomas de la presencia de la enfermedad PTNRD pueden ser confundidos o verse enmascarados por otros factores, como los climáticos y los agrietamientos ocasionados por la herramienta de labranza e incluso por otros patógenos en el tubérculo. Al parecer los síntomas foliares de la raza
PVY-NTN son más severos que los producidos por PVY-N, produciendo también anillos
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en la lámina foliar (Kogovsek et al., 2008). Sin embargo, es necesario disponer de mayor información relacionada con las secuencias de los aislamientos generadas en este estudio para conocer con certeza las identidades taxonómicas de éstos, así como los eventos recombinatorios que presentan y de esta forma, direccionar los estudios tendientes a identificar la sintomatología, daño asociado a cada una de las variantes de PVY y su efecto en los programas de certificación de semilla y mejoramiento genético que se realizan en el país. Lo anterior permitirá conocer además, sí existe una relación entre las características del genoma viral y la habilidad de dichas variantes para romper la resistencia a los materiales mejorados y/o naturalamente tolerantes a este virus (Schubert et al., 2007).
El análisis filogenético del virus PYVV, mostró identidades superiores al 99% con las secuencias de referencia de Perú y Colombia. Esto también sucedió cuando se analizó la región que codifica para la proteína CPm del virus. Desafortunadamente, no existe mucha información disponible de las secuencias de este virus, dificultándose la realización de análisis de variabilidad genética. PYVV, se puede considerar un virus “exótico” y restringido al subcontinente Suramericano, ya que aún no se ha reportado en otros lugares del mundo, lo que a su vez lo constituye en un virus de gran importancia cuarentenaria para los países europeos, principalmente (Lopez et al., 2006). La importancia de su infección radica en que puede ocasionar pérdidas en el rendimiento de hasta el 50% en el cultivo de la papa y a que, en algunos cultivares, el virus puede permanecer como una enfermedad latente, no necesariamente causando su sintomatología típica de amarillamiento de las nervaduras secundarias (Salazar et al., 2000). En el árbol filogenético obtenido, se aprecia claramente que todas secuencias se agrupan en un clado y que los cambios de nucleótidos son mínimos. Este resultado es muy similar al encontrado por Offei et al, (2004), cuando
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compararon aislamientos de PYVV colombianos con peruanos, obteniendo 99% de identidad de nucleótidos en todas las secuencias evaluadas. Sin embargo, un estudio más reciente realizado por Guzmán et al, (2006), basado en RT-PCR RFLP, se encontraron tres diferentes patrones de restricción (A, B y C) con la enzima HinfI para 18 aislamientos de los departamentos de Antioquia, Cundinamarca y Nariño, predominando en un 80% el patrón A. Adicionalmente, se observó que hubo combinación de patrones de restricción A con B ó con C, indicando posibles infecciones combinadas de al menos dos diferentes genotipos de PYVV. El patrón de restricción A sólo se observó en Nariño, mientras que los tres patrones estuvieron presentes en las muestras de Antioquia y Cundinamarca. Estudios independientes sugieren que PYVV se diseminó a partir de Colombia y Ecuador hacia otros países vecinos como Perú y Venezuela (Salazar et al., 2000; Offei et al., 2004), por lo que es posible que el nivel de variación hasta ahora encontrado, esté subestimado o mejor representado en otras regiones del genoma diferentes a la cápside viral. En este sentido, en un estudio realizado sobre 50 aislamientos de PYVV en S. phureja en Colombia, se reportaron cuatro perfiles electroforéticos mediante la metodología de polimorfismo conformacional de la cadena sencilla (SSCP) (Guzmán et al., 2009). Como se puede inferir de estos resultados, se requiere de un estudio más profundo del virus PYVV en nuestro país, para determinar con mayor precisión sus posibles variantes, las implicaciones epidemiológicas de éstas y su efecto en los rendimientos de las variedades cultivadas en
Colombia.
Con respecto al análisis de secuencias del virus PVS, se presentaron valores de identidad superiores al 76% entre las cepas Colombianas y aquellas de referencia, lo que indica un alto grado de variabilidad en este virus. Matousek et al. (2000), describen alta variabilidad
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entre aslamientos andinos y ordinarios de PVS (PVSA y PVSo, respectivamente), siendo mayor cuando se comparan las regiones localizadas hacia el extremo N-terminal de la CP.
En el presente estudio, dicha variabilidad se evidencia en el árbol filogenético, en el cual las diferentes cepas del país se agrupan con las cepas de referencia en dos clados, con altos soportes de bootstrap. El clado I aparentemente esta relacionado con la raza PVSA, al ubicarse allí una de las cepas características de esta raza (Vltava). Sin embargo, dentro del mismo clado existe una gran variación entre las cepas colombianas, las que incluso se dividen en dos subclados bien definidos. El clado II, estuvo representado por cepas pertenecientes a PVSo junto con tres cepas del altiplano Cundiboyacense (Chikh et al.,
2008; Cox & Jones, 2010a). Cox & Jones (2010a), obtuvieron resultados muy similares a los aquí reportados, aunque las identidades encontradas para la región CP en el presente trabajo, resultaron aún más bajas que las indicadas por dichos autores. Respecto a la secuenciación parcial del genoma de PVS, se obtuvo un fragmento de mayor tamaño de la región CP para dos aislamientos del departamento de Antioquia. Uno de ellos fue obtenido del mismo material de papa del que se obtuvo PVY (identificado como Carmen) para la secuenciación parcial de su genoma. Los datos indicaron identidades superiores al 78% en esta región con respecto a cepas de referencia de USA y Alemania, confirmándose así los resultados de variación encontrados en el análisis filogenético.
En esta investigación se encontró una alta incidencia de PVY y PVS infectando papa en
Colombia, a partir de cepas con niveles importantes de variación, para ambos virus. Es por esto, que se deben fortalecer las medidas de diagnóstico y control para estos virus, principalmente en los programas de certificación de semilla, y especialmente considerar el manejo de sus vectores en regiones que favorezcan su diseminación.
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PLRV ha sido uno de los virus más estudiados y prevalentes en el cultivo de la papa a nivel mundial, así como uno de los que probablemente causan mayores daños en el cultivo
(Solomon-Blackburn y Barker, 2001). Sin embargo, reiteradamente no se ha encontrado una notable diferencia entre las secuencias de sus aislamientos alrededor del mundo, hecho que se repitió en este trabajo al analizar las secuencias obtenidas de la región que codifica para CP. El análisis filogenético mostró diferencias de máximo un 3% con respecto a las secuencias de referencia y agrupó a todas las cepas en un solo clado. Cuando se realizó el análisis de la contextualización de las secuencias obtenidas de PLRV respecto a los genomas de referencia, se encontraron igualmente identidades del orden del 99% y 98% para nucleótidos y aminoácidos respectivamente, para la cepa Siguineque, mientras que la cepa Suras, presentó identidades del 98% y 97% para nucleótidos y aminoácidos. Según la literatura, la varibilidad estudiada y reportada para el virus, se centra principalmente en la región codificante para P0. Dicha región permite la discriminación entre diferentes aislamientos del virus y la distinción en tres grupos de aislamientos, con valores de identidad que fluctúan entre 94,7% y 98,5% (Plchova et al., 2009). Se ha planteado que los bajos niveles de variación encontrados en este virus son posiblemente resultado de su reciente divergencia a partir de otro virus que se especializó en la afección a papa y/o a las fuertes presión de selección que ejerce la estrecha base genética de las variedades de S. tuberosum cultivadas en el mundo (Guyader y Ducray, 2002; Taliansky et al., 2003). Es necesario entonces, para conocer la verdadera variabilidad de las cepas de PLRV presentes en el país, analizar las secuencias de las regiones hacia el extremo 5‟ del genoma del virus, como lo es P0.
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Para el caso del virus PVX, el análisis de las secuencias obtenidas junto con las de referencia mostró diferentes grupos y una variabilidad relativamente baja de los aislamientos colombianos, aunque algunos de ellos presentaron diferencias importantes con respecto a las secuencias de referencia (86% al 77%). El árbol filogenético separó las cepas colombianas en dos clados, siendo mayoritario el número de éstas ubicado en el clado I; mientras que el clado II sólo estuvo conformado por dos cepas del departamento de Nariño.
En cuanto a la secuenciación parcial del genoma de PVX, los dos aislamientos utilizados provinieron del departamento de Antioquia. La cepa Carmen, se obtuvo del mismo material en el cual se detectaron los virus PVS y PVY utilizados en el análisis de secuencias y denominados bajo este mismo nombre. El análisis mostró que en los dos casos las secuencias obtenidas no presentaron un alto grado de variabilidad respecto a las secuencias de los genomas de referencia, fluctuándo éstos valores entre 94 y 98% para nucleótidos y
98 a 100% para aminoácidos. Basados en los resultados de Yu et al, (2010), que separan las cepas de PVX con base en secuencias de CP en dos diferentes orígenes geográficos
(Eurasia y America), y en los resultados obtenidos en este trabajo, donde se obtuvo una separación de las cepas de referencia en los mismos grupos, se podría decir que el clado I contiene cepas asociadas al grupo ¨Eurasia¨ y el clado III posee cepas asociadas al grupo
¨America¨. A partir de lo anterior, se puede inferir que el clado II es evidentemente un grupo no asociado a los descritos por Yu et al, (2010), y que podría coincidir con un clado recientemente descrito por Cox y Jones (2010b), que incluye seis aislamientos de los Andes suramericanos. Cabe preguntarse entonces, cuales serían las implicaciones biológicas de este grupo aparentemente diferente con respecto a la epidemiología y efecto del virus PVX en los cultivos de papa de Colombia. Es necesario entonces, secuenciar y analizar un mayor
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número de aislamientos del país y evaluar su grado de virulencia frente a diferentes materiales de papa, de manera que se genere una mejor perspectiva sobre la estructura poblacional de PVX en nuestro país.
Del virus PMTV se realizó el análisis filogenético para dos regiones del genoma amplificadas con los cebadores H360-C819 y PMTVF4-R4, utilizados previamente por
Vélez (2007) en un estudio que incluyó muestras de diferentes regiones del país. La primera región codifica para CP (ARN2) y la segunda para la proteína TGB2 (ARN3). En el primer caso, dos de las cuatro secuencias de cepas colombianas (70MR y 71MR), se agruparon en el mismo clado con las secuencias de referencia de PMTV de otros países y compartiendo identidades superiores al 98%, mientras que las otras dos cepas (71MY y
72MY) se ubicaron en un clado independiente y con bajos niveles de identidad con respecto al clado I (~76%). Esta situación ya había sido reportada por Vélez (2007), al encontrar que algunos aislamientos Colombianos de PMTV presentaban identidades cercanas al 80% en la secuencia de nucleótidos que codifica para la región de CP con relación a las cepas cuyas secuencias se encontraban disponibles en el GenBank. Lo anterior muestra que el grado de variación que presenta el virus, al menos en esa región del genoma, es alto para algunas cepas de Colombia e incluso permite plantear la posibilidad de que correspondan a diferentes especies virales del género Pomovirus. Esta situación requiere de un análisis completo del genoma y de estudios epidemiológicos que evaluen el efecto de estas variantes sobre la transmisión del virus, su nivel de virulencia en diferentes materiales de papa y su distribución en la planta. Nielsen y Nicolaisen (2003), reportaron la presencia en
Dinamarca de dos grupos de PMTV basado en análisis de las secuencias de CP, encontrando que éstos comparten 98% de identidad, pero con diferencias notables en la
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reproducción de síntomas en plantas indicadoras. Una situación similar fue encontrada por
Mayo et al. (1996) al comparar las secuencias de CP de ocho aislamientos de PMTV obtenidos en los Andes Peruanos y tres procedentes de Escocia. Xu et al (2004), reportaron la presencia del virus en USA y Canadá, y altos niveles de identidad con los aislamientos reportados hasta ese momento en Perú y Europa. Adicionalmente, en dicho trabajo se confirmó la distribución errática del virus en la planta, recomendándose la necesidad de tomar muestras de distintas partes de un mismo tubérculo para detectar el virus. Para el caso de las secuencias obtenidas de la región TGB2, se obtuvieron niveles de identidad para nucleótidos superiores al 97% para dos de las tres cepas locales, mientras que la restante
(70MY) presentó identidades cercanas al 86%. Como es de notar, las dos cepas que mostraron marcada diferencia respecto a las demás para la región CP y esta última descrita para la región TGB2 son de de la sabana Cundiboyacense, lo que permite suponer que en dicha zona, es posible que se encuentren genotipos diferentes a los mundialmente reportados para este virus. Dichas diferencias pueden estar muy relacionadas con la variabilidad encontrada en S. subterranea en el país, la cual separa al patógeno en dos grupos de acuerdo al tejido de donde éste se ha aislado (tubérculo o raíz). En este sentido, recientemente Carreño (2009) evaluó la variabilidad de S. subterranea en Colombia mediante la técnica SSCP a partir de amplicones de la región ITS, confirmando la presencia de al menos dos grupos de aislamientos. La relación entre las diferencias encontradas entre las poblaciones de ambos patógenos son de interés debido a que es CP y más específicamente CPRT, la proteína relacionada con la transmisión del virus por dicho plasmodioforido, tal como se demuestra del trabajo de Reavy et al. (1998), quienes reportaron que el aislamiento PMTV-T, que carece de un fragmento representativo de
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secuencia en el ARN2, no puede ser transmitido por S. subterranea, pero sí mediante inoculación mecánica. Esta situación aparentemente se debe a la deleción de una porción de la región CPRT del ARN2 del virus (Sandgren et al., 2001).
La contextualización en el genoma viral de las dos secuencias obtenidas en cepas de PMTV del departamento de Antioquia, indicó que se tratan de aislamientos representativos del genoma ordinario de PMTV y no de las variantes encontradas en el análisis filogenético.
Sus identidades para las porciones del ARN2 y ARN3 secuenciadas fueron altas (>97%) con respecto a los genomas reportados en trabajos anteriores (Cerovska et al., 2007;
Sandgren et al., 2001), por lo que se plantea la necesidad de secuenciar dichas regiones en al menos un aislamiento de las variantes referidas. Los resultados encontrados en esta investigación permiten plantear que el caso de PMTV en Colombia es aparentemente singular, dada la presencia de dos variantes genéticas, de los altos niveles de afección que genera S. subterranea en cultivos de papa de diferentes departamentos y de las diferencias notables en la manisfestación de síntomas de la sarna polvosa entre variedades locales
(Carreño, 2009; Gilchrist et al., 2009), situación que amerita continuar con los estudios de dichos patosistemas.
Además del análisis de incidencia de cuatro virus de importancia económica en cultivos de papa de Colombia y la caracterización molecular de porciones del genoma de seis virus; en esta investigación se evaluó la posibilidad de incorporar la metología de RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) como una herramienta adicional para la detección de los virus que efectan este cultivo en nuestro país. Diversos estudios registran el aumento en los niveles de sensibilidad para la detección virus fitopatógenos que ofrece esta técnica (Mumford et al.,
2000; Olmos et al., 2005; López et al., 2006; Kogovsek et al., 2008; Davey, 2009). Así por 197
ejemplo, Olmos et al, (2005), al evaluar la presencia de PPV directamente en áfidos, encontraron que la qRT-PCR podría detectar niveles tan bajos como 4 copias del genoma viral y a partir de este límite inferior su rango de acción alcanzó 4 x 108 copias. Los autores, al comparar la sensibilidad de esta técnica con respecto a RT-PCR convencional, anidado y
ELISA, encontraron que qRT-PCR podría aún generar curvas de amplificación en diluciones de transcritos del genoma viral tan bajas como 1:65,536,000; mientras que RT-
PCR anidado y RT-PCR convencional/ELISA lo hacían en niveles de 1:32,768,000 y
1:256,000, respectivamente. Esta situación corresponde en términos prácticos a aumentos de sensibilidad de 100 y 1000 veces, un valor similar al encontrado por Fabre et al. (2003), evaluando la detección de Barley yellow dwarf virus (BYDV).
El uso de la técnica de qRT-PCR en esta investigación, permitió efectivamente detectar tanto el virus PVY como PMTV en el 100% de las muestras analizadas para el primer virus y en el 45% para PMTV. Estas proporciones de detección fueron superiores en ambos casos con respecto a las técnicas de ELISA y RT-PCR convencional, siendo diagnósticado el virus PVY en un 34% más de las muestras que lo encontrado mediante ELISA y en un 9% más con respecto a RT-PCR convencional. Similarmente, el virus PMTV fue detectado por el qRT-PCR en una proporción superior en 20 y 17% más con respecto a ELISA y RT-PCR convencional, respectivamente. Estudios realizados para evaluar la utilidad de la técnica de qRT-PCR en el diagnóstico de PVY, han encontrado no sólo aumentos en los niveles de sensibilidad de la detección, sino la posibilidad de utilizar esta metodología para la diferenciación de las razas del virus, lo cual posibilita por ejemplo, la determinación rápida de la proporción de cepas asociadas al PTNRD en un cultivo o región particular (Kogovsek et al., 2008). Esta situación requiere ser evaluada en los cultivos de nuestro país, pues los
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análisis de secuencias de este trabajo, sugieren la presencia de cepas asociadas a esta grave enfermedad en Colombia.
En forma similar, diversos trabajos se han realizado con el fin de evaluar el potencial de qRT-PCR para su uso en programas de certificación de tubérculo semilla de papa y la detección de PMTV y de su vector S. subterranea en lotes de cultivo (Mumford et al.,
2000; van de Graaf et al., 2003). Davey (2009) indica que mediante qRT-PCR es posible la detección del PMTV en bioensayos basados en tomate luego de un periodo tan corto como dos semanas, lo cual al compararse con la metodología convencional, representa un ahorro de tiempo cercano a dos meses. Por otra parte, Mumford et al, (2000), diseñaron cebadores y una sonda bajo el sistema de qRT-PCR Taqman para la detección de PMTV en tejido foliar y tubérculos de papa, encontrando que esta metodología aumenta el nivel de sensibilidad del diagnóstico de dicho virus en 10000 veces con respecto al procedimiento de ELISA comúnmente utilizado. De gran interés resultará ampliar la base de análisis de la metodología planteada en esta investigación, de manera que se evalue el efecto de inhibidores, variabilidad genética de los virus y su distribución (especialmente de PMTV), en las plantas afectadas, con miras a incorporar estas metodologías en el programa de certificación de semilla que regula el ICA en nuestro país. Finalmente, este experimento de comparación de metodologías, conduce a inferir que sí la técnica ELISA presenta niveles de sensibilidad inferiores en 100 a 10000 veces con respecto a qRT-PCR, y particularmente en nuestro estudio de entre 20 y 34% menos, es posible que los niveles de incidencia de los virus detectados en cultivos de papa de Colombia sean aún mayores a los encontrados en esta investigación, lo cual resulta de gran preocupación para la agroindustria de producción de papa en Colombia.
199
CONCLUSIONES
En esta investigación se determinó la presencia e identificación molecular de los genotipos de los virus PLRV, PMTV, Potyvirus (PVY), PVS, PVX y PYVV en cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia. Los análisis de incidencia realizados mediante ELISA para cuatro de ellos (PLRV, PVS, PVX, Potyvirus) arrojaron resultados que indican altos niveles infección viral en los cultivos de papa, siendo las incidencias de los potyvirus y
PVS las más altas con 72 y 40%, respectivamente, mientras que el PLRV y PVX se encontraron en el 20 y 8% de las muestras evaluadas. Estos niveles variaron entre las zonas evaluadas en cada Departamento, pero notablemente fueron muy superiores a las evaluaciones de síntomas visuales realizadas, lo que sugiere la necesidad de incorporar con mayor intensidad métodos de diagnóstico serológico y/o molecular en las evaluaciones fitosanitarias que realizan los técnicos, gremios y entes gubernamentales de sanidad vegetal.
Los estudios moleculares utilizando cebadores específicos para los seis virus bajo análisis, permitieron su detección en diversos cultivos de papa de Colombia, confirmándose la presencia del virus PMTV en al menos una de las muestras procedentes de cada departamento incluido en la investigación. El aumento en la distribución e importancia económica de S. subterranea, agente vector del PMTV, conduce a plantear la necesidad de estudiar con más detalle las características propias de estos patosistemas en los agroecosistemas paperos de los Andes Colombianos y evaluar su efecto sobre la producción y calidad del tubérculo semilla en forma independiente y conjunta.
200
Los análisis de secuencias de la región de la cápside de los seis virus analizados, permitieron inferir las afinidades filogenéticas de los genotipos virales afectando los cultivos de papa en Colombia. En términos generales, se encontraron bajos niveles de variación y diferenciación con respecto a cepas de referencia de otros lugares del mundo en los virus PLRV y PYVV; mientras que los virus PVY y PVS resultaron con niveles apreciables de variación, detectándose la asociación entre un alto número de cepas colombianas de PVY con las raza PVY-NTN, responsable en el mundo de la enfermedad conocida como PTNRD. Los virus PVX y PMTV presentaron una estructura poblacional basada en un alto número de cepas con bajos niveles de variabilidad, pero con algunas variantes divergentes con respecto a los genotipos de referencia mundial.
Un aporte importante de esta investigación correspondió al aumento de la información disponible sobre las secuencias de diferentes regiones de los genomas de virus de papa en
Colombia. Dicha información se presentaba en forma marginal o no estaba disponible para la gran mayoría virus analizados y podrá ser utilizada como base para análisis de estructura poblacional en el ámbito científico y en forma más práctica para el diseño de técnicas de diagnóstico ajustadas a las realidades genotípicas de estos patógenos en los cultivos de papa del país; metodologías necesarias para el apoyo de los programas de certificación de tubérculo semilla y para la formulación de programas de manejo integrado de las enfermedades virales.
Los análisis de las secuencias parciales de los virus de papa estudiados en esta investigación indican de la presencia de diferencias importantes entre cepas de una misma especie viral; e incluso la contextualización realizada con respecto a genomas previamente secuenciados, demostró que las diferentes regiones evaluadas para cada cepa, no 201
necesariamente estaban asociadas a un genoma de referencia en particular, lo cual sugiere que fenómenos como la recombinación y el rearreglo interno de genes son importantes en la definición de la estructura genética de las poblaciones de algunos de los virus. Estos hallazgos deben ser considerados en los estudios epidemiológicos de dichos virus que se realicen en el país.
En este trabajo se presentó y validó una metodología de qRT-PCR para la detección de los virus PVY y PMTV en cultivos de papa de Colombia con miras a su utilización en los programas de certificación de semilla que se adelantan en el país. La ventajas que ofrece el establecimiento de cultivos de papa libres de patógenos virales se han demostrado en múltiples estudios y es por esto que los principales países productores de este tubérculo han implementado sistemas robustos de certificación de semilla, en los que se emplean diversos métodos de diagnóstico viral que incluyen observaciones visuales de síntomas, detección serológica y qRT-PCR. Esta última metodología viene tomando gran fuerza, gracias a que ofrece mayores niveles de sensibilidad, agilidad en la obtención de resultados e información sobre las características genotípicas de las variantes virales encontradas en una región o país.
202
AGRADECIMIENTOS
El autor desea expresar su gratitud a la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín,
Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Universidad de Nariño, Fedepapa, Fritolay y al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08, Bases para la implementación de prácticas de exclusión de Spongospora subterranea y el virus asociado Mop-top (PMTV) en cultivos de papa mediante el desarrollo de herramientas de diagnóstico in situ y en laboratorio) que aportaron los recursos físicos, humanos, técnicos y financieros para adelantar este trabajo. La investigación se realizó en las instalaciones de los Laboratorios de Biología Celular y Molecular de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medellín y en el Laboratorio de Sanidad Vegetal del
Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid.
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ANEXOS
Anexo 1. Síntomas diferentes a AV, EF, EN y MR observados en los cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia.
Anexo 2. Planta de papa infectada con S. subterranea. Se observan agallas generadas por la infección.
227
Anexo 3. Concentración de quistosoros de S. subterranea encontrados en los suelos empleados para la detección del virus PMTV mediante plantas señuelo.
Localidad qistosoros/ml 7 17200 10 16000 25 8200 35 89000 36 111800 SRO L2 13600 SRLO L3 21800 SRO L4 9800 SRO L5 29600 Vallejuelito 18800 23 12800 Villapinzón 24400 Madrid 44066 Zipaquirá6 10600 Tunja1 11200 TZ1Z1 20400 Ventaquemada 35400
228