Sequenciamento Completo E Caracterização Genética Dos Vírus MIS 0397 E INHRR 17A-10 (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) Isolados No Peru E Na Venezuela

Programa de Pós-Graduação em Virologia Curso de Mestrado

ANDERSON FRANCO DA CRUZ LIMA

Sequenciamento completo e caracterização genética dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a-10 (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) isolados no Peru e na Venezuela

Ananindeua 2015

ANDERSON FRANCO DA CRUZ LIMA

Sequenciamento completo e caracterização genética dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a-10 (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) isolados no Peru e na Venezuela

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Mestre em Virologia, do Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas. Orientador: Dr. Marcio Roberto Teixeira Nunes Co-Orientador: Dr. João Lídio da Silva Gonçalves Vianez Jr.

Ananindeua 2015 ANDERSON FRANCO DA CRUZ LIMA

Sequenciamento completo e caracterização genética dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a-10 (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) isolados no Peru e na Venezuela

Aprovado em: BANCA EXAMIDORA Titulares:

Prof. Dr. Sandro Ptroca da Silva Centro de Inovações Tecnológicas/Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, Instituto Evandro Chagas

Profa. Dra. Daniele Barbosa de Almeida Medeiros Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, Instituto Evandro Chagas

Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves Departamento de Genética, Universidade Federal do Pará

A Deus, meu filho Tiago, minha esposa Alana, pelo apoio incondicional, sem o qual não seria possível realizar esta dissertação.

AGRADECIMENTOS

- A Deus por todos os aprendizados que tem me proporcionado, por ter sido meu porto seguro em todos os momentos da minha vida;

- Aos meus pais, João e Glaci, pelo amor a mim dedicado e por procurarem me proporcionar sempre a melhor educação;

- Ao meu irmão Adriano sua amizade e companheirismo;

- À minha esposa Alana pelo incansável apoio nos momentos em que precisei;

- Ao meu filho Tiago, por entender e me apoiar sempre neste projeto;

- À Marinha do Brasil, na pessoa dos Diretores do Hospital Naval de Belém, neste período, Dr. Ruf (2012) e Dr. Piqueira (2014), pelo encorajamento em iniciar e concluir este Mestrado.

- À coordenação e aos professores do Programa de Pós Graduação em Virologia /IEC pelo apoio e pelos ensinamentos;

- Ao Instituto Evandro Chagas na pessoa do Diretor, Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos, pela contribuição na minha formação acadêmica;

- Ao Dr. Robert B. Tesh (Departamento de Patologia, Universidade do Texas, Galveston, EUA) e Dr. Juan Carlos Navarro (Centro Internacional de Zoonosis, Universidad Central del Ecuador, Quito) por cederem os RNAs referentes as amostras virais utilizadas no estudo

- Ao Dr. Márcio Nunes pela orientação nesta Dissertação de Mestrado, pelo incentivo e por acreditar em meu potencial; por ter me acolhido e me conduzido nos princípios da genética descritiva e da bioinformática;

- Ao Dr. João Vianez, pela co-orientação nesta Dissertação de Mestrado,

- Aos Amigos do CIT: Clayton, Sandro e Jedson pelo grande apoio nas etapas da bioinformática;

- Aos amigos da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas, que contribuíram direta e indiretamente para a execução desta dissertação; - Aos amigos, Aristides, Jairo, Luiz Felipe, Rodrigo e Thadeu, pela parceria nos momentos difíceis, e pela honra de tê-los como amigos.

- A todos os Cavalos-Babuínos!

“Não é o mais forte que sobrevive, nem o mais inteligente, mas o que melhor se adapta às mudanças” ― Charles Darwin RESUMO

Os vírus pertencentes ao gênero Orthobunyavirus, família Bunyaviridae, são agentes virais morfologicamente caracterizados por possuírem partículas esféricas com tamanho entre 80 e 120 nm de diâmetro, envelopadas e por conterem um genoma de RNA trissegmentado, fita simples, polaridade negativa que, em geral codifica seis proteínas, sendo três proteínas estruturais (N, Gn, Gc) e três proteínas não estruturais (NSs, NSm, RpRd). Este estudo teve como objetivo realizar a obtenção do genoma completo de cepas virais isoladas no Peru e Venezuela, os vírus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a-10 (TVP 19255), bem como caracterizar geneticamente os segmentos de RNA (S, M e LRNA), realizar a reconstrução filogenética dos segmentos genômicos e avaliar a possibilidade de rearranjo genético em natureza, para estes vírus. As amostras virais foram isoladas de um caso febril humano ocorrido em um residente de Lima, Peru, e de um primata não humano (Cebus sp) utilizado como sentinela no município de Azoategui, Venezuela, respectivamente. As amostras virais foram submetidas a três etapas, i) extração do ácido nucleico (RNA); ii) obtenção das sequências nucleotídicas por pirosequenciamento e iii) análise computacional. As sequências completas evidenciaram tamanhos, organização genômica e características genéticas (número de resíduos de cisteínas, sítios de glicosilação, motivos conservados, sítios de clivagem, conteúdo A-U e complementariedade entre as regiões 3’-5’ não codificantes) compatíveis com o observado para os membros do gênero Orthobunyavirus. As análises de similaridade e filogenia evidenciaram que os vírus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a – 10 (TVP 19255) são geneticamente mais similares com os membros do grupo Simbu. Análises evolutivas levando em consideração os três segmentos de RNA genômico (S, M, L) possuem origens distintas, sendo os segmentos S e L associados ao VORO e os segmentos MRNA relacionados aos Vírus Iquitos (VIQT) e Vírus Madre de Dios (VMDD). Por fim as análises de troca de segmento genômico (Simplot) evidenciaram claramente a presença de eventos de rearranjo entre os vírus estudados e o VORO confirmando o processo de rearranjo entre dois vírus parentais pertencentes ao grupo Simbu. Por fim, os dados de caracterização do genoma completo e análise de rearranjo contribuirão para melhor entender a contribuição do processo de rearranjo genético envolvendo o VORO, um importante patógeno humano na Amazônia. Palavras-Chave: Arbovírus; Orthobunyavirus; Oropouche; Caracterização Molecular ABSTRACT Viruses belonging to the genus Orthobunyavirus, family Bunyaviridae, are viral agents morphologically characterized as spherical particles with 80 to 120 nm of diameter, enveloped and possess a single stranded, negative sense, tripartide RNA genome which encodes for six viral proteins, three structural proteins (N, Gn and Gc) and usualy three non structural proteins (NSs, NSm and RpRd). This study had as objective obtain the complete genome sequences for the viruses MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a-10 (TVP 19255) isolated in Peru and Venezuela, respectively, as well as genetically characterize the RNA segments and perform phylogenetic reconstruction and evaluate the possibility of genetic reassortment in nature. Viruses were isolated from a human febrile case in Lima, Peru and from a non-human primate (Cebus sp) used as sentinel animal in the municipality of Azoategui, Venezuela, respectively. Both viral isolates were evaluated following three basic steps: i) RNA extraction; ii) nucleotide sequencing; iii) computational analyses. Complete sequences revealed that the size, genome organization and genetic traits (cysteine residues, glycosylation sites, conserved motifs, cleavage sites, A-U content, and 3’-5’ non coding region complementarity) were similar to those observed in other members of the genus Orthobunyavirus. Similarity analysis and phylogeny demonstrated that the viruses MIS 0397 (TVP 19261) and INHRR 17a – 10 (TVP 19255) are genetically close related to members of the Simbu virus group. Evolutionary analyses based on the three RNA segments (S, M, L) demonstrated that both viruses have distinct origins, where the S and L segments were associated to OROV and the M segments related to Iquitos virus (IQTV) and Madre de Dios virus (MDDV). Furthermore, the analyses related to genome segment reassorting (Simplot), clearly demonstrated the reassortment event involving the studied viruses and OROV confirming the natural reassortment process between two distinct parental viruses belonging to the Simbu group. Finally, the data generated for the complete sequences, genetic characterization and evolution will contribute for a better understand regarding the role of the reassortment process involving the OROV, an important human pathogen in the Amazon region. Key-words: Arboviruses; Orthobunyavirus; Simbu group; Oropouche; Molecular characterization.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Representação esquemática do ciclo de transmissão dos arbovírus envolvendo regiões silvestres, peri-urbanas e urbanas ...... 01

Figura 2 – Esquema da organização morfológica dos integrantes da família Bunyaviridae...... 06

Quadro 1 – Sequência nucleotídica dos terminais 5´ e 3´ dos genes S, M e L de representantes da família Bunyaviridae ...... 08

Quadro 2 – Tamanho dos segmentos de RNA genômico segundo os diferentes gêneros pertencentes a família Bunyaviridae ...... 09

Figura 3 – Estratégia de codificação dos segmentos genômicos dos integrantes da família Bunyaviridae...... 10

Figura 4 – Organização genômica de membros representativos da família Bunyaviridae...... 10

Figura 5 – Esquema do ciclo de replicação dos vírus da família Bunyaviridae, gênero Orthobunyavirus ...... 13

Quadro 3 – Principais vírus da família Bunyaviridae associados a doença em humanos, outros vertebrados e plantas segundo o gênero, espécie ou subtipo viral, doença associada, tipo de vetor e distribuição geográfica.22

Quadro 4 – Principais integrantes virais do gênero Orthobunyavirus segundo o sorogrupo, tipo viral, distribuição geográfica e Registro de doença/ isolamento...... 26

Figura 6 – Representação esquemática do ciclo de manutenção e transmissão dos orthobunyavírus ...... 36

Figura 7 – Localização geográfica dos vírus utilizados para caracterização genética42

Figura 8 – Esquema de preparação de biblioteca a partir de DNA complementar (cDNA) ao RNA viral e PCR em emulsão ...... 47

Figura 9 – Esquema da reação de pirosequenciamento ocorrida na plataforma GS FLX 454 (Roche) ...... 48

Quadro 5 – Conjunto de iniciadores específicos usados para obtenção das extreminades 3’ e 5’ dos vírus MIS 0397 (TVP 19255) e INHRR17A-10 (TVP19261) ...... 49

Figura 10 – Representação esquemática do gráfico tipo Box plot evidenciando os valores máximo e mínimo, primeiro quartil, terceiro quartil e mediana .. 52

Quadro 6 – Segmentos genômicos (S, M e LRNA) dos Vírus INHRR-17A-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255) em comparação com outros vírus do grupo Simbu, segundo o tamanho total obtido, produtos gênicos e regiões terminais 5’ NCR e 3’ NCR ...... 56

Figura 11 – Análise das regiões codificadoras de proteínas e determinação dos domínios proteicos associados aos segmentos genômicos ...... 57

Figura 12 – Estrutura secundária do RNA (S, M e LRA) dos vírus MIS 0397 (TVP 19261) (A) e INHRR-17A-10 (TVP 19255) (B) ...... 58

Figura 13 – Tamanho médio dos genomas dos vírus INHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com genomas dos Vírus Oropouche, Jatobal, Akabane e Leanyer pertencentes ao grupo Simbu 60

Figura 14 – Representação das regiões e motivos conservadas da polimerase viral das cepas INHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) ...... 62

Quadro 7 – Regiões de clivagem para a poliproteína codificada pelo segmento MRNA dos vírus INHRR-17a-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255) que determinam as proteímas Gn, NSm e Gc ...... 63

Figura 15 – Região de Zinc Finger ao longo da gliciproteína Gn ...... 63

Figura 16 – Alinhamento dos domínios da Nsm em relação ao BUNV ...... 64

Figura 17 – Domínio de peptídeo de fusão presente na glicoproteína Gc dos vírus INHRR-17a-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255) ...... 65

Figura 18 – Resíduos aminoacídicos envolvidos no processo de empacotamento da ribonucleoproteína dos orthobunyavírus ...... 65

Figura 19 – Resíduos aminoacídicos associados com função de habilidade de ligação com o RNA...... 66

Figura 20 – Representação esquemática das proteínas ...... 67

Figura 21 – Sítios de glicosilação ao longo das proteínas Gn, NSm e Gc codificadas pelo segment MRNA dos vírus INHRR-17a-10 (TVP 19261) (a) e MIS 0397 (TVP 19255) ...... 68

Figura 22 – Análise filogenética do segmento SRNA dos vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes membros do grupo Simbu (grupo V) e outros Orthobunyavírus ...... 71

Figura 23 – Análise filogenética do gene N (693 nt) dos vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes cepas do Vírus Oropouche ...... 73

Figura 24 – Análise filogenética da ORF completa dos vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes Orthobunyavirus ...... 74

Figura 25 – Análise filogenética das sequencias parcias (517 nt) do gene Gn do segmento MRNA dos vírus INHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes Orthobunyavirus pertencentes ao grupo Simbu ...... 75

Figura 26 – Análise filogenética das sequencias completas do gene da polimerase (segmento LRNA) dos vírus INHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes Orthobunyavirus pertencentes ao grupo Bunyamwera (I), Wyeomyia (II), Guaroa (III), California (IV), Simbu (V) e Grupo C (VI) ...... 76

Figura 27 – Análise filogenética das sequencias parcias (517 nt) do gene da polimerase (segmento LRNA) dos vírus INHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes Orthobunyavirus pertencentes ao grupo Simbu ...... 77

Figura 28 – Análise de similaridade genômica realizado pelo método de Simplot .... 78

Figura 29 – Representação esquemática do evento de rearranjo genético para os vírus MIS 0397 (TVP 19255) e INHRR 17a-10 (TVP 19261) ...... 78

Figura 30 – Representação gráfica das distâncias genéticas inter e intragrupo com base no segmento SRNA dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a 10 em comparação a outros membros dos grupos Anopheles A, AnophelesB, Buwamba, Bunyamwera, Califórnia e C ...... 82 Figura 31 – Representação gráfica das distâncias genéticas inter e intragrupo com base no segmento MRNA dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a 10 em comparação a outros membros dos grupos Anopheles A, AnophelesB, Buwamba, Bunyamwera, Califórnia e C ...... 83

Figura 32 – Representação gráfica das distâncias genéticas inter e intragrupo com base no segmento MRNA dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a 10 em comparação a outros membros dos grupos Anopheles A, AnophelesB, Buwamba, Bunyamwera, Califórnia e C ...... 84

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Análise de similaridade do gene N dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) com sequencias de proteínas disponíveis no Genbank empregando o programa BLASTX ...... 59

Tabela 2 – Análise de similaridade do gene da poliproteína M dos vírus INHRR-17A- 10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) com sequencias de proteínas disponíveis no Genbank empregando o programa BLASTX ...... 59

Tabela 3 – Análise de similaridade da polimerase dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) com sequencias de proteínas homólogas disponíveis no Genbank empregando o programa BLASTX ...... 60

Tabela 4 – Percentual de similaridade genetica (nucleotídica e aminoacídica) entre os virus INHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) e outros Orthobunyavirus para os segmentos SRNA (A), MRNA (B) e LRNA (C)69

Tabela 5 – Estimativas de valores de distância Intergrupos para o segmento SRNA dos vírus do grupo Simbu, grupo C, grupo Anopheles A, grupo Anopheles B, grupo Batama, grupo Bwamba, Grupo Califórnia, grupo Bunywamwera em relação aos vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) ...... 79

Tabela 6 – Estimativas de valores de distância Intergrupos para o segmento MRNA dos vírus do grupo Simbu, grupo C, Grupo Califórnia, grupo Bunywamwera em relação aos vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) ...... 80

Tabela 7 – Estimativas de valores de distância Intergrupos para o segmento LRNA dos vírus do grupo Simbu, grupo C, Grupo Califórnia, grupo Bunywamwera em relação aos vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) ...... 80 Tabela 8 – Dados referentes aos resultados obtidos pelo Teste T das distâncias Intragrupo dos membros pertencentes ao grupo Simbu e intergrupo para os vírus MIS 0397 e INHRR17a-10 ...... 85

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ...... 01 1.1 ARBOVIRUS: BREVE HISTÓRICO ...... 01

2 REVISÃO DA LITERATURA ...... 04 2.1 FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE ...... 04 2.2 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS, GENÔMICAS E BIOQUÍMICAS DOS MEMBROS DA FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE ...... 05 2.2.1 Morfologia, propriedades bioquímicas e biofísicas dos bunyavírus ...... 05 2.2.2 Genoma, organização e estratégia de codificação de proteínas ...... 07 2.2.3 Proteína Virais ...... 14 2.2.3.1 Proteína de Estruturais ...... 14 2.2.3.1.1 Proteína do Nucleocapsídeo ...... 14 2.2.3.1.2. Glicoproteínas de Superfície ...... 16 2.2.3.2 Proteínas não Estruturais ...... 17 2.2.3.2.1 Proteína NSs, NSm e L (polimerase viral) ...... 17 2.3 CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DOS MEMBROS DA FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE ...... 20 2.4 DOENÇAS RELACIONADAS AOS BUNYAVÍRUS ...... 21 2.5 GÊNERO ORTHOBUNYAVIRUS ...... 26 2.5.1 Classificação Sorológica ...... 27 2.5.1.1 Grupo Anopheles A ...... 28 2.5.1.2 Grupo Bunyamwera...... 29 2.5.1.3 Grupo C ...... 30 2.5.1.4 Grupo Califórnia ...... 31 2.5.1.5 Grupo Capim ...... 32 2.5.1.6 Grupo Guamá ...... 33 2.5.1.7 Grupo Simbu ...... 34 2.5.1.8 Demais Grupos Antigênicos ...... 34 2.5.2 Ciclo de manutenção dos orthobunyavirus em natureza ...... 35 2.5.3 Epidemiologia molecular dos orthobunyavirus...... 36 2.6 MECANISMO DE EVOLUÇÃO: REARRANJO GENÉTICO ...... 37

3. OBJETIVOS ...... 39 3.1 OBJETIVO GERAL ...... 39 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 39 3.3 JUSTIFICATIVA ...... 39

4 MATERIAL E MÉTODOS ...... 41 4.1 AMOSTRAS VIRAIS ...... 41 4.2 PROPAGAÇÃO VIRAL EM CULTURA DE CÉLULAS VERO E TRATAMENTO DA AMOSTRA COM NUCLEASE ...... 42 4.3 EXTRAÇÃO DE RNA ...... 43 4.4 OBTENÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS ...... 44 4.4.1 Preparação da biblioteca genômica ...... 45 4.4.2 PCR em emulsão (emPCR) ...... 45 4.4.3 emPCR para titulação ...... 45 4.4.4 Pirosequenciamento ...... 47 4.5 MONTAGEM DOS GENOMAS OBTIDOS POR PIROSEQUENCIAMENTO ...... 50 4.6. GENÔMICA DESCRITIVA: ANÁLISES E IDENTIFICAÇÕES ...... 51 4.7 ANÁLISE DE SIMILARIDADE GENÉTICA ...... 51 4.8 ANÁLISE FILOGENÉTICA E EVOLUÇÃO ...... 53 4.9 ANÁLISE DE REARRANJO GENÉTICO EM NATUREZA ...... 53

5 RESULTADOS ...... 54 5.1 OBTENÇÃO DAS SEQUENCIAS NUCLEOTÍDICAS ...... 54 5.2 REGIÕES CONSERVADAS OU MOTIVOS (MOTIFS) ...... 61 5.2.1 Polimerase viral ...... 61 5.2.2 Poliproteína M ...... 62 5.2.3 Proteínas N e NSs...... 65 5.3 CISTEÍNAS E SÍTIOS DE GLICOSILAÇÃO ...... 66 5.4 ANÁLISE DE SIMILARIDADE GENÉTICA (NUCLEOTÍDICA E AMINOACÍDICA) ...... 68 5.5 FILOGENIA E ORIGEM EVOLUTIVA ...... 70 5.6 REARRANJO GENÉTICO ...... 77 5.7 CÁLCULOS DE EXCLUSÃO E INCLUSÃO INTRAGRUPO (BOX PLOT) ...... 79

6 DISCUSSÃO ...... 86

7 CONCLUSÕES ...... 95

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 96

ANEXO AUTORIZAÇÃO PARA UTILIZAÇÃO DA AMOSTRA ...... 118 X

1. INTRODUÇÃO 1.1 ARBOVIRUS: BREVE HISTÓRICO

Os arbovírus são considerados um grande grupo viral ecologicamente bem definidos cujo a origem do nome está relacionada a palavra inglesa “arthropod-borne” acrescida do sufixo vírus. O nome reflete a principal característica desses agentes virais no que se refere ao mecanismo de transmissão em natureza que envolve hospedeiros vertebrados suscetíveis e artrópodes hematófagos como vetores. A manutenção desses vírus entre os artrópodes também dá-se por via sexual ou venérea e, possivelmente pela via transovariana (KARABATSOS, 1985) conforme ilustrado na figura 1.

Figura 1 – Representação esquemática do ciclo de transmissão dos arbovírus envolvendo regiões silvestres, peri-urbanas e urbanas.

Fonte: Adaptada de (CHEN e VASILAKIS, 2011)

Os arbovírus constituem um problema de importância em saúde pública em regiões tropicais e subtropicais do globo, onde se apresentam sob forma endêmica ou epidêmica. A severidade da doença produzida no homem varia, produzindo desde uma síndrome febril autolimitada até quadros mais severos de febre hemorrágica, acompanhados de significativa letalidade (AZEVEDO, 2007).

Em geral, o genoma dos arbovírus é constituído por ácido ribonucléico (RNA). No entanto ocorre uma exceção representada pelo Vírus da febre suína africana (Família Asfaviridae, Gênero Asfivirus), que apresenta seu material genético composto por DNA (DIETZGEN et al., 2011). Para os arbovírus cujo material genético é o RNA, este pode apresentar-se segmentado ou não, polaridade positiva ou negativa, bem como com uma ou duas fitas (KARABATSOS, 1985; DIETZGEN et al., 2011). Na sua maioria, os arbovírus são agentes virais zoonóticos mantidos em ambiente silvestre, sendo que o contato e infecção de humanos ocorre acidentalmente, em especial quando o homem adentra o ambiente silvestre, expondo-se aos nichos ecológicos dos arbovírus. Esses vírus possuem a capacidade de produzir viremia ao se multiplicarem em hospedeiros vertebrados e, ainda, de multiplicarem-se em tecidos de artrópodes, ocorrendo a transmissão a novos vertebrados susceptíveis, após um período de incubação extrínseco, através da picada deste artrópode infectado (TRAVASSOS DA ROSA, 1997; AZEVEDO, 2007) Geograficamente, a distribuição dos arbovirus ocorrem em regiões que certamente por oferecerem condições ecológicas mais favoráveis, tais como temperatura, humidade, diversidade de artrópodes e hospedeiros vertebrados susceptíveis (VASCONCELOS, 2001). Cerca de 537 arbovírus encontram-se registrados no Catálogo Internacional de Arbovírus e outros certos vírus isolados de vertebrados, dos quais 135 foram isolados originalmente na África, 78 na Ásia, 35 na Europa, 229 nas Américas, e 60 na Oceania (DIETZGEN et al., 2011). No contexto de biodiversidade viral, a Amazônia é considerada um dos maiores reservatórios de arbovírus do mundo. Até o momento, dos 226 tipos de arbovírus encontrados nas Américas, cerca de 200 arbovírus e outros vírus de vertebrados foram descritos no Brasil entre os anos de 1954 e 2014 (IEC/MS 2014) Deste total, 176 foram isolados em diferentes localidades do Estado do Pará, dos quais 160 foram descritos pela primeira vez no Brasil, com pelo menos 100 tipos novos para o mundo, (MARTINS, 2007). Trinta e quatro arbovírus têm sido associados com infecções em humanos, alguns inclusive ocasionando quadros graves com possível evolução para óbito (VASCONCELOS,

1992; PINHEIRO, 1996; TRAVASSOS DA ROSA, 1997; VASCONCELOS, 2001; MARTINS, 2007). Embora a região Amazônica, represente a maior fonte de infecção por vários arbovírus endêmicos, as outras regiões do Brasil não são desprovidas desses vírus e epidemias em zonas urbanas, peri-urbanas ou silvestres, especialmente causadas pelo Vírus Dengue (VDEN), Vírus da febre amarela (VFA), Vírus Oropouche (VORO), Vírus Mayaro (VMAY) e Vírus Rocio (VROC), constituem um risco de saúde para uma parcela significante da população brasileira (VASCONCELOS, 2013).

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE

A característica mais distintiva da família Bunyaviridae é o número notável de vírus que são incluídos nesta família (KARABATSOS, 1985; CALISHER, 1988; DIETZGEN et al., 2011). Quase metade (47,4%) dos 537 vírus registrados pelo Catálogo Internacional de Arbovírus e certos outros vírus de vertebrados, foram considerados bunyavírus (DIETZGEN et al., 2011). Historicamente, a família Bunyaviridae foi estabelecida no ano de 1975 para melhor compreender um grupo de agentes virais com propriedades morfológicas e antigênicas similares, sendo hoje reconhecida como uma das maiores famílias de vírus de RNA. Cerca de 300 vírus, distribuídos em cinco gêneros (Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus e Tospovirus), ocorrendo ainda a presença de mais de 40 espécies virais sem classificação. Os gêneros Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus, possuem vírus que, geralmente infectam animais, já os tospovirus são bunyavírus restritos a vegetais e que infectam mais de 650 espécies de plantas. Com essa ampla variedade de espécies virais, é esperado que essa família apresente um grande espectro de características relativas aos processos biológicos, codificação genética e mecanismos de replicação viral (KARABATSOS, 1985; GONZALES-SCARANO, 1996; ELLIOTT, 2008; DIETZGEN et al., 2011). A inclusão de agentes virais à família Bunyaviridae foi inicialmente feita por estudos sorológicos e morfológicas (CASALS, 1657; CASALS, 1963; BERGE, 1975). Com o advento da biologia molecular e obtenção de sequências nucleotídicas, a classificação dos bunyavírus tem sido amplamente associada aos dados genéticos (similaridade genética) obtidos para os três segmentos de RNA desses vírus (DIETZGEN et al., 2011). As características biológicas, epidemiológicas e genéticas desses agentes, apesar de distintas, apresentam aspectos comuns sendo a maioria deles caracterizados como arbovírus, pois mantém seus ciclos de vida envolvendo artrópodes hematófagos e vertebrados como hospedeiros suscetíveis. Para este cenário apontamos como exceção gênero Hantavirus, que apesar de serem considerados bunyavírus, não são classificados como arbovírus por apresentarem mecanismo de transmissão distinto não utilizando

vetores. Neste caso a transmissão dá-se usualmente pelo contato com aerossóis produzidos por excretas dos roedores (fezes e urina) ressecadas contendo partículas de hantavírus (DIETZGEN et al., 2011). Sabe-se que diferentes artrópodes encontram-se associados ao mecanismo de transmissão dos bunyavírus dentre os quais destacam-se os mosquitos, ceratopogonídeos, flebotomíneos e carrapatos (KARABATSOS, 1985; CALISHER, 1988; DIETZGEN et al., 2011). Nesses invertebrados a replicação dos bunyavírus ocorre de forma não letal e sem danos evidentes, mantendo-se provavelmente por toda a existência do artrópode. A manutenção desses vírus na natureza tem a mesma dinâmica padrão dos outros arbovírus, associando ciclos biológicos envolvendo artrópodes silvestres (vetores) e hospedeiros vertebrados (ex: roedores, primatas não humanos, marsupiais e aves). Nos pequenos animais de sangue quente as infecções ocorrem comumente de forma aguda e com um curto período de viremia não letal. Em humanos, a infecção ocorre de maneira acidental, quando indivíduos são expostos acidentalmente ao contato com os insetos transmissores que estão infectados pelos bunyavírus (GONZALES-SCARANO, 1996; NICHOL, 2005).

2.2 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS, GENÔMICAS E BIOQUÍMICAS DOS MEMBROS DA FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE

2.2.1 Morfologia, propriedades bioquímicas e biofísicas dos bunyavírus

As partículas virais tem diâmetro de 80 a 120 nm, e a glicoproteína de superfície (GP) exibe projeções de 5 a 10 nm, as quais são inseridas em uma dupla camada lipídica do envelope com aproximadamente 5 a 7 nm de espessura. Embora geralmente esférico, formas alongadas também podem ser vistos, em especial com os hantavírus. A microscopia eletrônica e estudos bioquímicos do orthobunyavírus, Vírus La Crosse (LACV) sugerem que há 270- 1400 projeções da GP por vírion (OBIJESKI, 1976) Partículas do vírus do supergrupo Bunyamwera são formados por brotamento de Golgi e membranas do retículo endoplasmático; eles se acumulam dentro de cisternas dessas organelas (MURPHY, 1973). Com relação as proteínas, em geral os bunyavírus possuem quatro, sendo duas internas (N e L) e duas externas, essas duas últimas são

glicoproteínas chamadas Gn e Gc, que estão inseridas em um envelope lipídico. As proteínas internas encontram-se relacionadas aos segmentos genômicos de RNA, sendo N (± 2.100 cópias por vírus) e L (25 cópias por vírus), participando da formação do ribonucleocapsídeo (RNC) ou nucleocapsídeo (Figura 2) (GONZALES-SCARANO, 1996; NICHOL, 2005; ELLIOTT, 2008) .

Figura 2 – Esquema da organização morfológica dos integrantes da família Bunyaviridae.

Representação esquemática do vírion orthobunyavírus. (A) Os três segmentos do genoma (SRNA, MRNA e LRNA) envolvidos pela proteína N (nucleocapsídeo) para formar ribonucleoproteínas (RNP), que se associam com a polimerase viral dependente de RNA (RdRp). As RNP são embalados dentro de um envelope lipídico que é derivado a partir do complexo de Golgi da célula hospedeira, que é modificado ela inserção das glicoproteínas virais Gn e Gc. As proteínas Gn e Gc formam um trímero de heterodímeros que criam os picos na partícula de vírus. (B) Um modelo de corte transversal de um víron de vírus Bunyamwera com base em uma reconstrução tomográfica. (C) A arquitetura tripodal da estrutura da glicoproteína pode ser dividido em duas partes principais da proteína: região da base, que é adjacente à membrana; e na região da cabeça-membrana distal. Estes dois contatos de proteínas são separadas umas das outras por uma região peduncular (corpo). Regiões estruturais e as suas dimensões correspondentes são indicados. Fonte: Adaptado de ELLIOTT, 2014.

A interação entre as projeções das glicoproteínas inseridas na membrana e no nucleocapsídeo, se atribui o importante papel na estabilização final da estrutura viral, pois não ocorre a codificação de matriz proteica, estrutura que normalmente tem essa função na estrutura interna das partículas virais (ELLIOTT, 1990; 2008). A composição química global das principais macromoléculas, as quais contribuem para as propriedades bioquímicas dos membros da Família Bunyaviridae, foram quantificadas na seguinte ordem de grandeza, Ácido

Ribonucleico (RNA) 2%, 58% de proteína, 33% de lipídios, e 7% de carboidratos verificados na composição dos vírions (OBIJESKI, 1977). As propriedades biofísicas atribuídas aos bunyavírus podem ser descritas da seguinte forma, coeficiente de sedimentação das partículas virais variando 400- 500 S, suas densidades para flutuação em sacarose tem valores entre 1,16 a 1,18 g/cm3, e em um gradiente em solução de Cloreto de Césio (CsCl) entre 1,20 a 1,21 g/cm3. O tratamento com solventes lipídicos ou detergentes não iônicos remove o envelope viral resultando em perda da capacidade de infecção das partículas virais, para os artrópodes e mamíferos (GONZALES-SCARANO, 1996; SCHMALJOHN, 2007).

2.2.2 Genoma, organização e estratégia de codificação de proteínas

Os membros da Família Bunyaviridae possuem material genético composto por três segmentos de RNA, com cadeia simples do genoma denominados pelas suas dimensões, na língua inglesa, como L (Large), M (Medium), e S (Small). Uma propriedade característica dos bunyavírus, refere- se a complementariedade encontrada nos três segmentos de genes, quer dizer que possuem os mesmos nucleotídeos complementares nos terminais 5´ e 3´. Em indivíduos do mesmo gênero as sequências de nucleotídeos se mostram altamente conservadas, mas ocorre uma diferenciação para vírus de gêneros diferentes (HEWLETT, 1977). Essa possibilidade de emparelhamento das bases terminais gera um fenômeno que forma estruturas tipo “panhandle”, formando estruturas circulares fechadas de forma não covalente de RNA, o fato de não serem ligações tipo covalente, indica uma reversibilidade para esta ligação, as quais foram evidenciadas por análises de microscopias eletrônica, em que três tamanhos de RNAs circulares ficaram evidentes (BISHOP, 1980; NICHOL, 2005; SCHMALJOHN, 2007). As dimensões dos três segmentos de RNA dos bunyavírus são LRNA: 2,7 a 3,1 x 106 (aproximadamente 7000 bases); MRNA: 1,8 a 2,3 x 106 (4450 a 4540 bases); SRNA: 0,28 a 0,50 x 106 (850 a 990 bases); as moléculas de RNA compreendem apenas de 1 a 2% do total da massa da partícula viral, em peso

existem diferenças entre as sequências nucleotídicas terminais de segmentos de vírus de gêneros diferentes na família (Quadro 1) (ELLIOTT, 1997).

Quadro 1 – Sequência nucleotídica dos terminais 5´ e 3´ dos genes S, M e L de representantes da família Bunyaviridae. TAMANHO DO GENE SEQUENCIA Pares de bases - (Acesso #) GÊNERO/VÍRUS NUCLEOTÍDICA Segmento Segmento Segmento S M L Ortobunyavirus/ 3´ UCAUCACAUG- 961 4458 6875 Vírus Bunyamwera 5´ AGUAGUGUGC- (D00353) (M11852) (X14383) Hantavirus/ Vírus 3´ AUCAUCAUCUG- 1696 3616 6533 Hantaan 5´ UAGUAGUAUGC- (M14626) (M14627) (X55901) Nairovirus/ Vírus 3´ AGAGUUUCU- 1712 4888 12255 Dugbe 5´ UCUCAAAGA- (M25150) (M94133) (U15018) Phlebovirus/ Vírus 3´ UGUGUUUC- 1690 3885 6404 Rift Valley 5´ ACACAAAG- (X53771) (M11157) (X56464) Tospovirus/ Vírus 3´ UCUCGUUA- 2916 4821 8897 Tamato spotted wilt 5´ AGAGCAAU- (D00645) (S48091) (D10066) #: código de acesso da sequência nucleotídica no GenBank. Fonte: Adaptado de Schmaljohn & Nichol, 2007

A estratégia para codificação utilizada pelos bunyavírus ocorre no sentido negativo ou nos dois sentidos (ambisenso), conforme o segmento. O segmento L, aqui vamos citar como LRNA, por exemplo em todos os gêneros da família é comum a estratégia de codificação no sentido negativo, codifica uma grande proteína chamada proteína L ou polimerase viral (NICHOL, 2005; SCHMALJOHN, 2007; ELLIOTT, 2008). O tamanho dos genomas de RNA também apresentam variações sendo observados genomas para os segmentos SRNA entre 961 nt (Orthobunyavirus) e 2.916 nt (Tosposvirus); entre 3.916 nt (Phlebovirus) e 4.888 nt (Nairovirus) para o segmento MRNA e entre 6.530 nt (Phlebovirus) a 12.225 nt (Nairovirus) (Quadro 2)

Quadro 2 – Tamanho dos segmentos de RNA genômico segundo os diferentes gêneros pertencentes a família Bunyaviridae. Segmento de RNA Gênero SRNA (nt) MRNA (nt) LRNA (nt) Orthobunyavirus (BUNV) 961 4.458 6.875 Hantavirus (HTNV) 1.696 3.916 6.530 Nairovirus (DUGV) 1.712 4.888 12.225 Phlebovirus (UUKV) 1.720 3.231 6.423 Tospovirus (TSWV) 2.916 4.821 8.897 BUNV: Bunyamwera virus; HTNV: Hantaan virus; DUGV: Dugbe virus; UUKV: Uukuniemi virus; TSWV: Tamato spotted wilt virus; nt: nucleotídeos. Fonte: Adaptado de Elliot 2008.

O segmento de RNA, de tamanho médio, M ou MRNA, tem sua estratégia definida de codificação, utilizando o sentido negativo gerando uma poliproteína precursora que após um processo de clivagem co-traducional origina duas glicoproteínas da superfície do envelope Gc e Gn, e no caso dos orthobunyavírus, phlebovirus de mosquitos e tospovírus, a proteína NSm. Para estes últimos, a estratégia de codificação é ambisenso (WALTER e BARR, 2011). Os orthobunyavírus e nairovírus codificam as proteínas N e NSs (quando codificada) com base no segmento SRNA senso negativo que origina um RNA mensageiro (RNAm) a partir do qual as proteínas são geradas. Os phlebovirus e tosposvirus codificam as proteínas N e NSs em uma estratégia ambisenso usando para a proteína N o RNAm complementar ao RNAviral (RNAv) e para a proteína NSs (no caso dos tosposvírus) um RNA mensageiro (RNAm) complementar ao RNA antigenômico (NICHOL, 2005) (Figura 3). N e NSs são gerados por reconhecimento ribossomal de códons de iniciação em ambas as regiões abertas de leitura, do inglês Open Reading Frame (ORF). A proteína N, também conhecida como proteína do Nucleocápsídeo, tem a função principal de envolver os produtos de RNA oriundos de replicação viral para formar um complexo ribonucleoproteico (RNP). A proteína não-estrutural NSs, tem como papel principal é atuar na modulação da resposta antiviral-célula hospedeira através de diversas vias da imunidade inata (WALTER e BARR, 2011).

Esses produtos gênicos, as proteínas em questão, tem associação com várias propriedades biológicas dos vírus, tais como a atividade da hemaglutinina (hemaglutinação de hemácias de ganso), virulência, tropismo celular, neutralização e fusão celular (ELLIOTT, 2008) (Figura 4).

Figura 3 –Estratégia de codificação dos segmentos genômicos dos integrantes da família Bunyaviridae.

(a) (b) Estratégia de codificação senso-negativa (a) e ambisenso (b) utilizadas pelos membros da família Bunyaviridae.mRNA (+) : RNA mensageiro senso positivo. Fonte: Adaptado de Virus Taxonomy 9th edition. (DIETZGEN et al., 2011)

Figura 4 – Organização genômica de membros representativos da família Bunyaviridae.

Os RNAs genômicos (sentido negativo) estão representados por linhas com pontas em seta e os produtos dos segmentos genômicos por retângulos sólidos N: proteína de Nucleocapsídeo; Gn: glicoproteína aminoterminal; Gc: glicoproteína carboxiterminal; NSs: proteína não estrutural S; NSm: proteína não estrutural M; L: polimerase viral; KDa: peso molecular em kilodaldons; 3’: região terminão aminoterminal não codificante; 5’: região carboxiterminal não codificante. Fonte: Adaptado de Virus Taxonomy 9th edition Dietzgenet al., 2011;

Com a internalização da partícula viral, ocorre o processo de desnudamento e exposição do ácido nucleico viral. Com o material genético livre, o genoma sofre uma transcrição primária, intermediada pela ação da proteína L (polimerase viral), originando o RNAm complementar, a tradução dos RNAm dos segmentos S e L, se dá pelos ribossomos livres no citoplasma celular e o RNAm do segmento M por ribossomos ligados a membranas. A etapa que segue é a replicação do genoma para um RNA complementar sentido positivo, que recebe o nome de RNA antigenômico. O grande diferencial desta molécula, é que não possui a sequência iniciadora no terminal 5´, e o terminal 3´ se estende para o 5´ no RNA molde (SCHMALJOHN, 1996; 2007; ELLIOTT, 2008). Cada segmento do genoma dos bunyavírus atua como um molde para duas vias de síntese de RNA diferentes: a transcrição de RNAm e RNA de replicação (Fig. 03). Produtos de replicação antigenômico e genômico são cópias complementares um do outro, enquanto que os produtos de transcrição são alongados nas suas extremidades 5’ por um ribossomo nativo da célula hospedeira, e são geralmente encurtado nas suas extremidades 3’ em relação ao genoma modelo (Fig. 03) (WALTER e BARR, 2011). Cada cadeia de RNA dos bunyavírus incorpora uma unidade única de transcrição, em contraste com os vírus de RNA não segmentado, os quais possuem unidades de transcrição múltiplas dispostas em uma ordem linear. Estas diferenças fundamentais são prováveis explicações das propriedades das respectivas RNA polimerase dependente de RNA (RdRp); a RdRp só pode iniciar a síntese de RNAm nos terminais do segmento, enquanto que nos vírus com RNA não-segmentados, a iniciação pode ser assinalada por sinais específicos em sítios internos ao longo do genoma. A razão para isto ainda é desconhecida, mas pode demonstrar um requisito para a proximidade de 3’- e 5’- terminal de sequências que em conjunto formam o promotor necessário para a iniciar a transcrição. Uma consequência funcional importante é que a RdRp não pode reiniciar a síntese de RNA após o término em posição anterior. Pode ser que o arranjo de ambisenso das ORFs em segmentos de RNA dos Phlebovirus, Tospovírus e Nairovírus surja como uma forma de aumentar a

capacidade de codificação de cada segmento dentro dos limites funcionais de um RdRp que não pode reiniciar (WALTER e BARR, 2011). A transcrição primária ocorre em segmentos de entrada antes do primeiro ciclo de replicação, a expressão de genes em segmentos em ambos os sentidos seria passível de ser restringido o gene no sentido negativo da orientação. No entanto, no caso do vírus da Febre do Vale do Rift (RVFV), tanto a NSs ambisenso quanto o gene N são transcritas durante os ciclos iniciais de transcrição primária devido à incorporação de cópias complementares dos três segmentos do genoma do RVFV dentro das partículas virais infectantes (IKEGAMI et al., 2005). Logo após o início da transcrição principal, a RdRp é capaz de replicar o modelo inicial. A extremidade 5’ do produto de replicação é fundamentalmente diferente da dos outros mRNAs, implicando em dizer que são produtos de diferentes vias de transcrição, tem um início diferenciado. A razão para esta alteração no modelo da atividade é pouco caracterizado, e pode refletir um controlador na função da RdRp, este controle pode correr através de alguma modificação na polimerase ou possível associação com os componentes da célula hospedeira, ou, ainda alternativamente, pode significar o aumento da estabilidade dos produtos nascentes da replicação através da entrada e permanências destes no capsídeo em formação (WALTER e BARR, 2011). Para o BUNV as regiões promotoras da transcrição e replicação são bem definidas, mostrando o envolvimento de conjuntos distintos, mas com sobreposição de nucleotídeos (KOHL, 2003; BARR, 2007) (BARR, 2003). A replicação depende, da inter-complementaridade terminal com nenhuma sequência específica aparente, enquanto que a transcrição requer a presença de nucleotídeos específicos os quais estão localizados em ambas as extremidades do molde de RNA (BARR, 2003; KOHL, 2003; BARR, 2005; 2007). Embora os segmentos S, M e L de cada bunyavírus possuam partes conservadas de nucleotídeos em comum, eles também exibem sequências de segmentos específicos, estas sequências desempenham papéis importantes na especificação a de cada segmento promotor. Essas evidências sugerem que a síntese de RNA nos bunyavírus, envolvem elementos estruturais da sequência dependentes que são formados por emparelhamento de base inter-

terminais e também a identidade específica dos dois nucleotídeos emparelhados e desemparelhados (WALTER e BARR, 2011) . O complexo de Golgi, fornece as estruturas para que ocorra a glicosilação primária das proteínas, etapa que sucede a tradução destas e replicação dos segmentos de RNA, em seguida ocorre a montagem das partículas virais, as quais são transportadas por vesículas daquele complexo, com posterior liberação por exocitose. Para alguns vírus a montagem das partículas virais ocorre na membrana da célula hospedeira (SCHMALJOHN, 1996; NICHOL, 2005; SCHMALJOHN, 2007; ELLIOTT, 2008). Na Figura 5 está representado um esquema simplificado do ciclo de replicação dos vírus da família Bunyaviridae, neste caso em partículas para os vírus pertencentes ao gênero Orthobunyavirus.

Figura 5 – Esquema do ciclo de replicação dos vírus da família Bunyaviridae, gênero Orthobunyavirus

Números de 1 a 10 representam as diferentes etapas do ciclo de replicação dos Orthobunyavírus. RNAm: Ácido ribonucleico mensageiro; RNAc: ácido ribonucleico complementar; RNAv: ácido ribonucleico viral; ER: retículo endoplasmático. Fonte: Adaptado de Schmaljonh & Nichol, 2007.

2.2.3 Proteínas Virais 2.2.3.1 Proteínas Estruturais 2.2.3.1.1 Proteína de Nucleocapsídeo

O segmento SRNA dos bunyavírus codifica a proteína (N), também denominada de proteína do Nucleocápsideo, cuja função primária é a de encapsular os produtos do RNA virais durante a replicação para formar o complexo ribonucleoproteico (RNP). Tal como acontece com todos os vírus de RNA com cadeia negativa, o genoma dos bunyavírus só é capaz de participar da síntese de seu material genético sob a forma do complexo RNP, e, consequentemente, a interação da proteína N com RNA é crítico para a viabilizar a replicação do vírus. A formação do RNP depende da associação do RNA viral com múltiplas cópias da proteína N dessa forma o RNA fica dentro do capsídeo ao longo de todo o sua síntese, uma atividade que também depende das interações entre os monómeros da proteína N adjacentes. Para o BUNV, cada monómero da proteína N é projetado para ligar 12 nucleotídeos (MOHL e BARR, 2009), e esta estequiometria é distinta da de todos os outros vírus de RNA de cadeia negativa. A proteína N do BUNV surge como resultado de uma polimerização da proteína cujos monômeros são empilhados na posição conformacional de "cabeça-a-cabeça" e "cauda-a-cauda" (LEONARD et al., 2005), resultando numa gama de diferentes estados oligoméricos, consistente com o seu papel no RNP formação (LEONARD et al., 2005; EIFAN e ELLIOTT, 2009). Para os membros dos gêneros Hantavírus e Orthobunyavirus, alguns estudos têm demonstrado que as suas respectivas proteínas N apresentam um certo grau de especificidade na sequência para os RNAs que eles encapsidam e, analisadas em conjunto, indicam que, enquanto não há nenhuma sequência de encapsidação obrigatória, existe evidência de ligação preferencial para sequências ou elementos estruturais representadas dentro do genoma viral (OSBORNE, 2000; MIR, 2005). Este dado tem sido interpretado de forma que a referida proteína teria um papel importante na embalagem exclusiva dos produtos de replicação viral dentro das partículas de virais, mais de tanto mRNAs virais ou RNAs da célula hospedeira em geral. Para além das suas capacidades de ligação a RNA e multimerização, a proteína N hantavírus

também é relatado possuir funções adicionais relacionadas com a expressão dos genes virais e a manipulação da resposta imune inata no interior das células hospedeiras (WALTER e BARR, 2011). Em termos de similaridade para a proteína N, tem sido demonstrado que a sequência nucleotídica para vírus de um mesmo sorogrupo apresenta cerca de 80%, caindo para 40% entre vírus de sorogrupos diferentes (ELLIOTT, 1990). Tendo como base as sequências nucleotídicas e aminoacídicas dos vírus pertencentes aos grupos antigênicos Bunyamwera, Califórnia e Simbu, observou-se a presença de regiões conservadas na proteína N, as quais podem estar associadas com propriedades biológicas fixadoras de complemento o que promove reação cruzada entre os vírus dentro de um mesmo sorogrupo (AKASHI et al., 1984; DUNN, 1994; BOWEN, 1995; SAEED et al., 2001; DIETZGEN et al., 2011). Estudos usando o VBUN evidenciou que a proteína N se liga especificamente a extremidade não codificante 5´ do segmento S, a qual possui o sinal para a proteína N iniciar a encapsidação do genoma viral (OSBORNE, 2000). Mesmo que a sua função fundamental da proteína N seja fornecer uma uniformidade estrutural para o genoma dos bunyavírus, esta também possui funções adicionais, que são igualmente importantes para o ciclo de vida do vírus, incluindo a interação com glicoproteínas de membrana (OVERBY et al., 2007; SHI et al., 2007; RIBEIRO et al., 2009; HEPOJOKI et al., 2010) e interação com a RNA polimerase dependente de RNA (RpRd) viral para permitir o acesso para o RNP durante a síntese de RNA. Uma análise recente da função da proteína N do BUNV permitiu um mapa preliminar funcional, mostrando regiões envolvidas na oligomerização, a ligação da polimerase e montagem do RNP em partículas de vírus (EIFAN e ELLIOTT, 2009). Além disso, a proteína N do BUNV tem a capacidade de alterar a atividade de replicação e transcrição dos RNPs montados diferencialmente, sugerindo que desempenha um papel fundamental para permitir o reconhecimento correto do molde pela RdRp (EIFAN e ELLIOTT, 2009; WALTER e BARR, 2011), embora como isto ocorre ainda não está muito bem definido. A única proteína N a qual tem sua estrutura completa e disponível em alta resolução é a do vírus da Febre do Vale do Rift, tanto na sua forma

monomérica (RAYMOND, 2010) quanto na forma hexamérica (FERRON et al., 2011).

2.2.3.1.2 Glicoproteínas de Superfície

O segmento M RNA dos orthobunyavírus possui em torno de 4.458 a 4.534 nucleotídeos contendo uma única ORF que codifica uma poliproteína com cerca de 1.433 a 1.441 aminoácidos (ESHITA e BISHOP, 1984; LEES et al., 1986; PARDIGON, 1988; CAMPBELL, 1999; YANASE, 2003). As proteínas que compõe a superfície do partícula viral, surgem através da codificação da Poliproteína M (figura 4) que é inserida através de um processo de co-tradução na membrana do retículo endoplasmático, onde ocorre a clivagem, por meio de proteases da célula hospedeira originando três proteínas maduras, sendo duas glicoproteínas de superfície denominadas Gn (29 a 41 kilodalton – kDa) e Gc (108 a 125 kDa), e uma proteína não estrutural NSm (15 – 18 kDa). Os dois primeiros produtos da clivagem forma um heterodímero ligado por pontes dissulfeto, que é transportado e retida no complexo de Golgi. Esse heterodímero Gn-Gc tem funções de alta relevância e especificidade na montagem do vírus, na formação do vírion e infecções de novas células alvo (LEES et al., 1986; ELLIOTT, 1990; NICHOL, 2005; SCHMALJOHN, 2007). Em virtude de um sinal de retenção, o heterodímero Gn-Gc é pesadamente glicosilada e retida no Complexo de Golgi, onde se associa com RNP para mediar a montagem e brotamento das partículas virais maduras. Para a maioria dos heterodímeros Gn-Gc, o sinal para a retenção no Complexo Golgi localiza-se no interior do componente Gn e para o BUNV tem estudos com o mapeamento detalhado e preciso do seu domínio transmembrana (TMD) (SHI et al., 2006). Em contraste, o sinal de retenção no mesmo complexo para o UUKV, um membro do gênero Phlebovirus, reside em sua cauda C-terminal (ANDERSSON e PETTERSSON, 1998). Outra função interessante das glicoproteínas estruturais reside em suas propriedades antigênicas, mostrando em estudos sorológicos a ocorrência de diferenciação entre os sorogrupos quando se avalia as proteínas Gn e Gc codificadas no segmento MRNA dos orthobunyavírus. Em geral, observa-se

uma homologia menor que 40% para membros de sorogrupos distintos e similaridade de 66% para a glicoproteína Gn e 40% para Gc (PRINGLE, 1991; DIETZGEN et al., 2011). A análise de sequências do Segmento MRNA para membros dos sorogrupos Bunyamwera e Califórnia identificou três sítios com potencial para serem glicosilados, locais relativamente ricos em resíduos do aminoácido Cisteína (Cys) e em domínios amino e carboxi terminais. Esses sítios encontram-se conservados nas proteínas Gn e Gc desses vírus (LEES et al., 1986; PARDIGON, 1988; DIETZGEN et al., 2011). Os mesmos procedimentos analíticos foram realizados para o Vírus Oropouche e alguns membros do grupo Simbu, sendo que para estes indivíduos foram obervados apenas dois sítios potenciais para glicosilação, os quais são conservados apenas na proteína Gc (WANG et al., 2001). Os estudos de Cheng e colaboradores realizados no ano 2000 (CHENG et al., 2000), relataram que a glicoproteína Gc possui em sua região conservada, determinantes antigênicos tipo-específicos para anticorpos neutralizantes, hemaglutinantes e protetores, que compõe o mecanismo sorológico usado para classificação dos vírus dentro de seus sorogrupos (WANG et al., 2001). Atribui-se para a proteína Gc as funções de adsorção viral proporcionando a ligação dos bunyavírus as células dos hospedeiros vertebrados e invertebrados (POBJECKY et al., 1986; PEKOSZ et al., 1995; ELLIOTT, 2014).

2.2.3.2 Proteínas Não Estruturais 2.2.3.2.1 Proteína NSs, NSm e L (polimerase viral)

Os segmentos S da maioria dos membros dos gêneros Orthobunyavirus, Tospovirus e Phlebovirus também codificam uma proteína não-estrutural chamado NSs (Fig. 2), cujo papel principal é na modulação da resposta antiviral-célula hospedeira através de diversas vias da imunidade inata (WALTER e BARR, 2011). A proteína não estrutural NSs dos orthobunyavírus possui peso molecular entre 10 a 13 kDa e é traduzida a partir do mesmo RNAm, usando códons iniciadores AUG- alternativos em ORFs sobrepostas (AKASHI et al.,

1984; ELLIOTT, 2008). Vírus de diferentes gêneros possuem sequencias pouco conservadas na NSs, entretanto algumas sequências idênticas foram observadas entre vírus de um mesmo gênero (DUNN, 1994). Apesar de sua função ainda não estar bem definida, acredita-se que a proteína NSs exerça papel importante no processo de replicação viral bem como no mecanismo de virulência (ELLIOTT, R. M., 2009). Alguns estudos atribuem a proteína NSs uma função primordial, principalmente para os membros dos gêneros Orthobunyavirus e Phlebovirus, a de agir como uma potente inibidora da resposta antiviral da célula hospedeira (BOULOY, 2001; BRIDGEN, 2001). Estudos adicionais sugerem essa funcionalidade para as proteínas NSs expressas por hantavírus do Novo Mundo (JAASKELAINEN et al., 2007). Estudos no início da década, feitos por Bridgen e colaboradores (2001) bem como Kohl e colaboradores (2003), atribuíram a esta proteína a capacidade de inibir a síntese das proteínas da célula hospedeira e retardar o estágio inicial de morte celular, inibindo o processo de apoptose mediado por IRF-3. Essa inibição a defesa do organismo, foi demonstrada em alguns estudos posteriores, como uma ação antagonista a resposta mediada por Interferon (IFN) do hospedeiro (ELLIOTT, R. M., 2009). Para o BUNV, verificou- se que a NSs, atua na fase de transcrição do IFN. Esse mecanismo se dá por meio da inibição da fosforilação de serina-2 no heptapéptido (17) presente no domínio C-terminal da RNA polimerase II (II RNAP) em sua subunidade RPB1, a qual efetua uma regulagem negativa na síntese de RNAm da célula hospedeira de forma não específica. A etapa crítica nesta inibição é a interação de um domínio C-terminal da NSs com o componente MED8 do complexo mediador (LEONARD et al., 2005), que desempenha um papel importante na regulação da atividade da RNAP II. Evidências mais recentes sugerem que um domínio adicional na porção N-terminal no interior da NSs exerce relativa importância para sobrepor a resposta antiviral da célula hospedeira, possivelmente usando um mecanismo diferente (VAN KNIPPENBERG, 2010). A proteína de NSs do LACV tem um bloqueio semelhante capaz a resposta de IFN mas que ocorre devido a um direcionamento da RNAP II, de uma forma diferenciada do mecanismo

explicado para o bloqueio da reposta antiviral da NSs do BUNV (VERBRUGGEN et al., 2011). Mohamed e colaboradores em 2009, demonstraram que seis vírus dos sorogrupos Anopheles A, Anopheles B e Tete não codificam a proteína NSs, devido à presença de vários códons de parada ao longo da ORF dessa proteína, assim como os vírus do complexo Wyeomya (BRIESE, 2013), o Vírus Pacui, Rio Preto da Eva e Tapirape, recentemente descritos como membros da família Bunyaviridae e possivelmente pertencentes a um novo gênero geneticamente mais relacionado ao gênero Orthobunyavirus, também não apresentam ORFs codificantes para a proteína NSs (RODRIGUES et al., 2014). Outra proteína não estrutural codificada pelos bunyavírus é a NSm, estudos experimentais envolvendo a referida molécula indicam que esta é uma proteína integral de membrana localizada no complexo de Golgi, fato este que tem levado os pesquisadores a sugerirem que a referida proteína pode estar envolvida no processo de montagem e morfogênese das partículas virais (SHI et al., 2006). Para participar deste processo, pode se admitir que três domínios hidrofóbicos e dois não-hidrofóbicos presentes na proteína NSm, podem ser utilizados. Esses domínios podem ainda atuar como uma sequência de sinal interno para a atuação da glicoproteína Gc (SHI et al., 2006). Outra propriedade da proteína NSm é relativo ao seu domínio N terminal, ser necessário para o crescimento do vírus em culturas de células infectadas (POLLITT, 2006). Todos os bunyavírus possuem sequências nucleotídicas completas para o segmento L em torno de 6,8 a 6,9 kilobases (Kb), esse segmento codifica o componente viral da RdRp, sendo esse o único produto deste segmento. No genoma desses vírus, um único códon de iniciação AUG é identificado, o qual sinaliza a polimerase viral para iniciar a tradução da ORF em uma longa proteína de 2.238 aminoácidos, chamada de proteína L. Até o momento, não se têm evidências de outras regiões codificadoras neste segmento. Ademais, a região codificadora do LRNA compreende cerca de 99% do segmento genômico, sendo que menos de 200 nucleotídeos resultam em informação não codificadoras ao nível das regiões terminais 5’ e 3’ do RNA genômico (ELLIOTT, 1990; SCHMALJOHN, 2007). Como o próprio nome sugere a proteína codificada pelo LRNA é uma molécula grande com mais de 200 kDa que executa diversas funções

complexas que em conjunto resultam na replicação viral e produtos de transcrição de respectivos modelos do genoma viral. A comparação e alinhamento das RdRps a partir de vários grupos de RNA vírus de cadeia negativa demonstra que eles compartilham o módulo bem caracterizado de regiões conservadas as quais são denominadas de I, II, III, IV, sendo evidenciados na região III os domínios pré-A, A, B, C e D. (POCH, 1990; ROBERTS et al., 1995). Pouca homologia, de forma geral, é observada entre as proteínas L dos vírus pertencentes à diferentes gêneros. Contudo, estudos de alinhamento múltiplo comparativo usando sequências de aminoácidos da proteína L de outros membros da família Bunyaviridae indicam que estes motivos são bem conservados, contendo resíduos de ligação de metais e de catalíticos de lisina, e mostra uma grande similaridade nas sequências com motivos putativos de endonucleases e de proteínas G dos outros RNA vírus de cadeia segmentada, como arenavírus, enterovírus e tenuivírus (DIAS et al., 2009). Em adição, estudos complementares sobre as funções da polimerase dos orthobunyavírus, sugere que a proteína L dos vírus do sorogrupo Califórnia (ex. LACV) exercem papel importante no processo de atenuação de neurovirulência e neuroinvasão, porém este mecanismo ainda permanece pouco estudado (ROZHON et al., 1981; ENDRES et al., 1991).

2.3 CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DOS MEMBROS DA FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE

A distribuição entre os grupos dos vírus pertencentes a família Bunyaviridae, geralmente é obtida pela combinação de testes sorológicos clássicos com o objetivo de detectar o relacionamento antigênico entre os indivíduos tais como fixação do complemento (FC), ou inibição de hemaglutinação (IH) e testes de neutralização (TN) (CASALS, 1657; HONIG et al., 2004). Com o advento e padronizações de técnicas de biologia molecular, mais especificamente do sequenciamento nucleotídico, um grande número de registros de genomas parciais e completos têm sido obtidos e têm fortemente auxiliado, juntamente com a determinação de características do genoma, de proteínas virais, propriedades bioquímicas e fisicoquímicas, na classificação mais eficiente desses agentes virais (ELLIOTT, 1990; GONZALES-SCARANO, 1996).

Ainda que os vírus pertencentes a família Bunyaviridae, compartilhem propriedades, são muito diferentes em alguns aspectos, como distribuição geográfica, características patogênicas, e modo de transmissão. Essas diferenciações levaram a classificar essa família em cinco gêneros, já citados anterioermente, essa classificação também leva em conta as relações antigênicas em um grande número de estudos revisados (BEATY e BISHOP, 1988; LABUDA, 1991; BRIESE, 2013). Dentre as peculiaridades de cada gênero pode-se citar por exemplo que dentro do gênero Orthobunyavirus são geralmente transmitida por mosquitos, enquanto que no gênero Nairovirus a transmissão ocorre principalmente por carrapatos e vírus do gênero Phlebovírus tem como vetores principalmente os flebotomíneos (LABUDA, 1991). Casals e Whitman em 1960, sugeriram agrupar esses vírus dentro de um supergrupo chamada Bunyamwera, sugestão está corroborada por Whitman e Shope em 1962. Com o avanço dos estudos, o nome do grupo foi alterado para o gênero Bunyavirus, essa modificação ocorreu devido a descoberta de similaridades moleculares, morfogenéticas, estruturais e modo de replicação dos vírus desse gênero (BISHOP, 1980). Buscando reduzir possíveis problemas na classificação nesse complexo grupo, o Comitê Internacional de Taxonomia Viral decidiu renomear esse gênero para Orthobunyavirus (ELLIOTT, 2008).

2.4 DOENÇAS RELACIONADAS AOS BUNYAVÍRUS Durante seu ciclo de vida os bunyavírus utilizam sua capacidade de replicação em células de vertebrados e invertebrados, gerando nessas células hospedeiras diferentes resultados, em termos de infecção. Quando a replicação ocorre em um mamífero por exemplo, a infecção gera lise e conduz a morte celular, por sua vez a replicação nos artrópodes não gera citopatologia. Nos momentos iniciais da infecção ocorre a liberação de títulos elevados de vírus, das células rompidas, as quais mais tarde tornam-se persistentemente infectadas (SCALLAN e ELLIOTT, 1992). Os Hantavírus são considerados de maior importância entre as bunyaviroses, pois tem capacidade de causar dois tipos de patologias em humanos, febre hemorrágica com síndrome renal (FHSR) e síndrome pulmonar por hantavírus (HPS). Várias são as patologias que podem ser causadas por

Bunyavírus, podemos citar febres hemorrágicas, encefalites e síndromes respiratórias, como verificado no Quadro 3 (EIFAN e ELLIOTT, 2009).

Tipo de doença Principais vetores Localização Vírus Gênero associada associados geográfica

Aedes vexans Akabane Aborto e defeito nipponii, Culicóides África, Ásia, (JaGAr 39) congênito em gado brevitarsis, Culex Austrália tritaeniorhynchus Anomalia Cache congênita em gado América do Valley e ovelha, doença Culeseta inornata Norte (6V633) neuroinvasiva em humanos

Encefalite em La Crosse Aedes triseriatus humanos América do Norte

Oropouche Doença febril em América do Orthobunyavirus (TRVL humanos e Culicóides paraensis Sul e Caribe 9760) meningite (Trinidad) Doença febril em Tahyna (92) Aedes caspius Europa humanos Tacaiuma Doença febril em Anopheles (Ker) América do (Be An 73) humanos cruzii Sul Brasil, Guaroa Doença febril em Anopheles (Ker) Colômbia, (352111) humanos neivai. Panamá Doença febril, Schmallenb diarréia e aborto Culicoides spp Europa erg virus em cabras Culex vomerifer, Brasil, Caraparu Doença febril em Cx.portesi, Trinidad, (BeAn 3994) humanos Wyeomyia sp. Guiana Limatus durhami Francesa,

Tipo de doença Principais vetores Localização Vírus Gênero associada associados geográfica Brasil, Catu (BeH Doença febril em Culex portesi, Trinidad, 151) humanos Anopheles nimbus. Guiana Francesa, Febre hemorrágica severa com Europa Hantaan síndrome renal em Apodemus agrarius Oriental e (76-118) humanos coreae, Ásia (Mortalidade: 5 a 15%) Febre hemorrágica Seoul (80- distribuição com síndrome Rattus novergicus 39) mundial renal em humanos Febre hemorrágica Puumala Clethrionomys Europa com síndrome Hantavirus (Sotkamo) glareolus Ocidental renal em humanos Síndrome Sin Nombre Peromyscus América do cardiopulmonar em (NMH15) maniculatus Norte humanos Síndrome Oligoryzomys América do Andes cardiopulmonar em longicaudatus Sul humanos Síndrome Laguna Calomys laucha, C. América do cardiopulmonar em negra callidus Sul humanos Febre hemorrágica Hyalomma Crimean- Europa em humanos plumbeum Congo Oriental, Nairovirus (Mortalidade: 20 a plumbeum, Hyaloma (Khodza) África, Ásia 80%) asiaticum asiaticum Nairobi Febre, gastrenterite Rhipicephalus Nairovirus sheep e aborto em appendiculatus, África e Ásia disease ovelhas e cabras Culicoides terorensis

Aedes Encefalite e febre (Ochlerotatus) hemorrágica em caballus, Aedes humanos, hepatite (Neomelanoconion) Rift Valley necrótica, circumluteolus, África fever hemorragia e Culex (Culex) aborto em theileri, Culicoides ruminantes sp Phlebovirus domésticos Flebotomíneos

Sandfly Doença febril em Europa e Flebotomíneos fever humanos África

Candiru Doença febril em Amazônia Humano (BeH 22511) humanos Brasileira

Tipo de doença Principais vetores Localização Vírus Gênero associada associados geográfica

Infecção em Tripes (piolho) Asia, Tomato- diferentes espécies também conhecidos America, Tosposvirus spotted wilt de plantas por thunderflies Europa e África.

Abreviaturas no interior dos parênteses correspondem ao número de registro dos protótipos virais. Be: Belém; H: humano; An: animal; Ar: artrópode. Fonte: Adaptado de Chiang, 2012.

Dentro do gênero Orthobunyavírus observa-se múltiplos patógenos humanos e animais em seus 18 sorogrupos, cabe citar o Bunyamwera, Califórnia e Simbu, os quais tem sua transmissão prevalentemente por mosquitos (MOUTAILLER et al., 2008). O Vírus Akabane (AKAV), um membro do sorogrupo Simbu, tem se mostrado uma praga agrícola significativa, causando impactos econômicos pois pode causar abortos, natimortos e deformidades congênitas, como a síndrome de artrogripose-hidroencefálica em ovinos infectados, bovinos e caprinos (INABA et al., 1975; OGAWA et al., 2007). Outro bunyavírus, membro do sorogrupo Califórnia, de importância com relação a doenças é o LACV, onde são relatados entre adultos e crianças em torno de 100 casos por ano desde que foi descoberto em 1960 (GONZALES-SCARANO, 1996). Esse vírus é atualmente a doença transmitida por mosquitos mais comum de crianças nos Estados Unidos, embora os seres humanos são hospedeiros acidentais (JACKSON et al., 2012). Dentro deste gênero podemos ainda citar o Vírus Cache Valley (CVV) membro do sorogrupo Bunyamwera isolado pela primeira vez em Utah em 1956 a partir de mosquitos Culiseta inornata, houve apenas três casos relatados em humanos com sintomatologia que vai desde fotofobia, rigidez de nuca, dor de cabeça e febre evoluindo para encefalite grave e falência múltipla dos órgãos (SEXTON et al., 1997; CAMPBELL et al., 2006; NGUYEN et al., 2013). Na cidade alemã de Schmallenberg, isolou-se a partir de amostras de ruminantes em 2011, um agente viral denominado então de Schmallenberg virus, cujas evidências obtidas pelas análises filogenéticas sugeriram que o mesmo se trata de um rearranjo genético entre o vírus Shamonda e o vírus Sathupalli (YANASE, 2003; BRIESE, 2013; VERONESI et al., 2013). Neste mesmo ano, ocorreu um grande surto na Europa, trazendo prejuízo econômico, devido

ao adoecimento de rebanhos de cordeiros e cabritos. Este evento caracterizou a primeira epidemia relatada por este membro do sorogrupo Simbu no Velho Mundo (REUSKEN et al., 2012; BEER et al., 2013; VERONESI et al., 2013). Uma outra doença importante é a febre hemorrágica Crimeia-Congo (FHCC), que é causada por membro do gênero Nairovírus, que tem como vetor um espécie de carrapato, esse agente tem como característica ser o arbovírus que causa patologia em humanos mais comum depois da dengue (WHITEHOUSE, 2004; BENTE et al., 2013; LASECKA e BARON, 2014). Dentro deste gênero, cabe ainda citar o Vírus Nairobi de doenças em ovelhas, da sua sigla em inglês (NSDV), que está associado a gastroenterite hemorrágica grave em caprinos e ovinos, com uma taxa de mortalidade de cerca de 90% (MARCZINKE e NICHOL, 2002). O gênero Phlebovírus, tem sua transmissão relacionada com mosquitos do gênero Phlebotomus (TESH, 1998). Dentro dos Phlebovirus que causam patologia em humanos ou em animais, O RVFV, isolado pela primeira vez no Vale do Rift, no Quênia, no ano de 1931, mas foi provavelmente responsável por causar doenças na região desde 1910 (FLICK e BOULOY, 2005), infecção aguda em seres humanos tem como características febre, dor de cabeça e dores musculares, manifestações hemorrágicas as quais podem evoluir para uma infecção mais grave apresentando distúrbios neurológicos ou perda de visão (IKEGAMI, 2012). Também ocorre no Velho Mundo o Vírus da Toscana (TOSV) pela primeira vez foi isolado Itália, no ano de 1971, e desde então tem sido detectado em muitos países da Europa Ocidental, incluindo Portugal, Espanha, França, Grécia, Croácia, Chipre e Turquia (DEPAQUIT et al., 2010; CHARREL et al., 2012). O TOSV acaba sendo uma das principais causas de infecções do sistema nervoso central, acarretando em mais da metade das internações de adultos com meningite e meningoencefalite, sua sazonalidade abrange os meses mais quentes do ano na região central da Itália (BRAITO, 1988). Após um levantamento das principais doenças causadas em diversas regiões do planeta, na Amazônia Brasileira temos a circulação de arbovírus do Gênero Orthobunyavirus, dos sorogrupos Anopheles A, Bunyamwera, Grupo C, Califórnia, Gamboa Guamá, Simbu e Turlock. Temos também o hantavírus,

que já foi citado anteriormente (VASCONCELOS, 2013). As principais patologias causadas especificamente por esses agentes serão abordados adiante.

2.5 GÊNERO ORTHOBUNYAVIRUS

O género Orthobunyavirus contém mais de 150 vírus que são distribuídos em diversas regiões geográficas. Quase todos estes vírus são transmitidos por mosquitos e têm ciclos de amplificação em uma variedade de hospedeiros vertebrados. Após seu primeiro isolamento em uma espécie de mosquito em Uganda no ano de 1940, o BUNV, foi encontrado em uma grande parte da África sub-saariana com associação a vários casos de doença febril (SMITHBURN et al., 1946; THEILER, 1973). Neste gênero são encontrados diversos patógenos humanos e animais, incluindo a Bunyamwera, Califórnia, e sorogrupos Simbu, que são transmitidos principalmente por mosquitos (BLITVICH et al., 2012). Os 150 membros são distribuídos em 18 grupos antigênicos, tornando o gênero Orthobunyavirus, um dos principais grupos desta família incluindo diversos patógenos de importância médica e veterinária conforme pode ser visualizado no Quadro 4 (GONZALES-SCARANO, 1996; SCHMALJOHN, 2007; DIETZGEN et al., 2011).

Quadro 4 – Principais integrantes virais do gênero Orthobunyavirus segundo o sorogrupo, tipo viral, distribuição geográfica e Registro de doença/ isolamento.

Grupo Localização Doença ou isolamento Vírus antigênico geográfica viral Anopheles A Tacaiuma América do Sul Humanos Bunyamwera África Humanos Caprinos, bovinos, Cache Valley América do Norte equinos e humanos Fort Sherman América do Sul Humanos Germiston África Humanos Bunyamwera Ilesha África Humanos

Kairi América do Sul Equino Main Drain América do Norte Equino Shokwe África Humanos Wyeomyia América do Sul Humanos Xingu América do Sul Humanos Bwamba África Humanos Bwamba África Humanos Pongola

Grupo Localização Doença ou isolamento Vírus antigênico geográfica viral Apeu América do Sul Humanos

Américas do Sul Caraparu Humanos e Norte Itaqui América do Sul Humanos Madrid América do Norte Humanos C Marituba América do Sul Humanos Murucutu América do Sul Humanos Américas do Sul Nepuyo Humanos e Norte Oriboca América do Sul Humanos Ossa América do Norte Humanos Restan América do Sul Humanos Encefalite América do Norte Humanos California Américas do Sul Guaroa Humanos e Norte Inkoo Europa Humanos Califórnia Jamestown América do Norte Humanos Canyon La crosse América do Norte Humanos Snowshoe hare América do Norte Humanos

Tahyna (Lumbo) Europa (África) Humanos Catu América do Sul Humanos Guama Américas do Sul Guama Humanos e Norte Nyando Nyando África Humanos África, Ásia e Akabane Gado Austrália Ingwavuma África e Ásia Suinos Simbu Iquitos Perú Humanos Madre de Dios Perú Humanos Oropouche América do Sul Humanos Schalemberg Europa Caprinos Fonte: Adaptado de Chiang, 2012.

2.5.1 Classificação Sorológica

A classificação antigênica dos bunyavírus, está em desuso, e tem origem nas pioneiras de diversos pesquisadores, as quais foram reunidas e analisadas, culminando e uma grande obra de interpretação elaborada por Casals em 1957. Para classificar os vírus em seus sorogrupos, eram observados suas reações nos seguintes testes, inibição de hemaglutinação

(IH), fixação de complemente (FC) e neutralização (N), tradicionalmente utilizados, hoje recebem a denominação de testes convencionais ou de primeira geração (Vasconcelos, 2013). Levando em conta esse critério, quando dois ou mais vírus apresentavam um cruzamento sorológico, passam a pertencer ao mesmo grupo antigênico (CASALS, 1657; BEATY e BISHOP, 1988). As técnicas sorológicas clássicas, tem sua função bem definida para classificar os membros da Família Bunyaviridae. Revisão na literatura apresenta os testes de FC com função de informar o gênero dos bunyavírus, por meio da relação antigênica entre as proteínas N desses vírus em análise. A classificação entre sorogrupos é determinada através de testes de IH e TN, cujo o princípio da técnica e estabelecer uma relação antigênica entre as glicoproteínas superficiais Gn e Gc do bunyavírus testados bunyavírus (BEATY e BISHOP, 1988; ELLIOTT, 1990; CALISHER, 1996). A seguir serão descritos os sorogrupos pertencentes ao Gênero Orthobuyavírus.

2.5.1.1 Grupo Anopheles A

Tendo especialmente anofelinos e culicineos, como vetores, os vírus pertencentes a esse sorogrupo circulam tanto na América do Sul quanto América do Norte. Dados obtidos de inquéritos soroepidemiológicos demonstraram que alguns vírus desse grupo antigênico causam infecção natural em animais domésticos e selvagens, tais como gado, porcos, cavalos, aves silvestres, roedores e morcegos (BISHOP, 1996). Este grupo dispões de 15 vírus, sendo o principal representante o Vírus Tacaiuma (VTCM), sendo isolado a partir de infecções em seres humanos e primatas, assim como em estudos com animais sentinela (CALISHER, 1996). O isolamento original do VTCM foi obtido de um macaco sentinela exposto na floresta de Oriboca, próximo a cidade de Belém, em 1955. Caracterização antigênica, morfológica e molecular demonstrou que o VTCM tem essas característica compatíveis com membros do gênero Orthobunyavírus, porém formam um complexo distinto dentro do grupo Anopheles A (ARAÚJO, 1978). O VTCM já foi isolado em mosquitos Haemagogus, Aedes triannulatus e Anopheles cruzii, vetores deste vírus na região Amazônica e em São Paulo. Também já foi isolado de um paciente com quadro febril em São Paulo, além

do mais foram detectados inibidores da hemaglutinação para Tacaiuma em um morador na zona rural de Ribeirão Preto, no estado de São Paulo, e também se visualizou os mesmo inibidores em cavalos da região do Pantanal (IVERSSON et al., 1993). Casos esporádicos e isolados de infecção pelo VTCM em humanos têm sido relatados, sendo a doença caracterizada por uma síndrome febril, acompanhada por cefaleia, calafrios, mialgias e astenia, que dura em torno de três dias de evolução, culminando com a completa recuperação (VASCONCELOS, 1992; TRAVASSOS DA ROSA, 1997; VASCONCELOS et al., 2011). Neste sorogrupo cerca de 6 vírus já foram isolados na Amazônia brasileira (VASCONCELOS, 2013).

2.5.1.2 Grupo Bunyamwera

O vírus protótipo para este grupo também é o pro protótipo da família Bunyaviridae e do gênero Orthobunyavirus, é o vírus BUNV, transmitido por mosquito, foi isolado em 1943 a partir da espécie Aedes coletados em uma floresta tropical em Bunyamwera (Bwamba, Uganda) na África Central (KARABATSOS, 1985). Além de fornecer um nome para a família, o vírus serve como protótipo para o sorogrupo BUNV de cerca de 32 sorotipos do vírus e subtipos descritos (CALISHER, 1996). Tem como sintomatologia, uma doença febril aguda, com dor de cabeça, artralgia e exantema em humanos na região do Sub-Saara africano. Uma grande percentagem (> 82%) de anticorpos para o VBUN foi detectada na população dessa região do continente Africano, demonstrando a ampla circulação desse vírus nesta área (NICHOL, 2001; 2005; SCHMALJOHN, 2007). Na região amazônica, 8 vírus deste sorogrupo já foram isolados, sendo o Tucunduba (VTUC) e o vírus Xingu (VXIN) seus principais representantes. VTUC tem uma relação antigênica com o Vírus Wyeomyia. O único caso em humano conhecido com quadro clínico ocorreu em Belém, Pará, onde uma criança de 1 ano e 6 meses de idade, apresentou febre elevada, diarreia, vômitos, choro frequente, fotofobia, rigidez de nuca, agitação psicomotora, paralisia flácida dos membros superiores, sonolência e posteriormente coma. Já o Vírus Xingu foi isolado de um paciente febril que

desenvolveu uma síndrome íctero-hemorrágica e faleceu. Os exames posteriores mostraram que o paciente também apresentou hepatite B aguda (VASCONCELOS, 1992; 1998).

2.5.1.3 Grupo C

Na década de 50, ocorreu a primeira identificação de um vírus do sorogrupo C, desde então uma série de indivíduos deste grupo foram isolados, foram um dos primeiros grupos de arbovírus isolados na Amazônia Brasileira. Atualmente este grupo dispões de 13 membros relacionados antigenicamente, os quais foram isolados de humanos e animais silvestres como roedores, marsupiais e morcegos, bem como de primatas não humanos (Cebus apella) sentinelas (NUNES et al., 2005). A classificação atual do grupo C é baseada em relações antigênicas determinada usando fixação de complemento (FC), neutralização (N) e inibição da hemaglutinação (IH) testes. Mas estes testes tem o óbice de apresentarem limitações pela disponibilidade de anti-soros específicos e de alta qualidade (HANG et al., 2014). Os vírus do grupo C, encontram-se geograficamente distribuídos em áreas tropicais e subtropicais das Américas, incluindo os Estados Unidos, México, Panamá, Honduras, Guatemala, Trinidad, Brasil, Peru, Equador, Venezuela e Guiana Francesa (KARABATSOS, 1985; SHOPE, 1988; NUNES et al., 2005). Os isolamentos que ocorreram durante os anos 1950 e 1960, forneceram subsídios para a classificação em quatro grandes complexos sorológicos dentro do grupo C, os quais são representados pelas espécies de vírus Caraparu (CARV), o vírus Madrid (MADV), vírus da Marituba (MTBV) e vírus Oriboca (ORIV) (PLYUSNIN, 2012). Dentre os membros desse grupo, pode-se destacar 10 vírus que estão associados com doença em humanos cuja sintomatologia assemelha-se à observada na dengue, sendo eles, (Vírus Caraparu (VCAR), Vírus Oriboca (VORI), Vírus Itaqui (VITQ), Vírus Nepuyo (VNEP), Vírus Apeu (VAPEU), Vírus Marituba (VMTB), Vírus Murutucu (VMUR), Vírus Restan (VRES), Vírus Ossa (VOSSA) e Vírus Madrid (VMAD). Como citado a sintomatologia se assemelha ao Vírus Dengue (VDEN), que se observa com febre, cefaleia, mialgias,

náusea, vômito e fraqueza sendo esses os principais sintomas clínicos (TRAVASSOS DA ROSA, 1997; NUNES et al., 2005). Entre esses vírus, a maior prevalência de anticorpos na Amazônia brasileira tem sido observada para o VCAR, e fora dela, também presente na região do Vale do Ribeira em São Paulo (TRAVASSOS DA ROSA, 1997; AZEVEDO, 2007). Do total de vírus desse grupo, oito foram isolados na Amazônia Brasileira (CAUSEY et al., 1961).

2.5.1.4 Grupo Califórnia

O sorogrupo Califórnia dos bunyavírus é composto por 13 vírus antigenicamente relacionados, a classificação é baseada principalmente nos testes de neutralização (N) e inibição da hemaglutinação (IH) com anti-soros policlonais (SATHER, 1967; HUBALIK e SIMPSON, 1979; BISHOP, 1980; SCHMALJOHN, 2007). Conforme os resultados dos testes sorológicos esse grupo foi subdividido em quatro complexos: Melao (VMEL e VSDN), Encefalite Califórnia, Trivitatus e Guaroa (CALISHER, 1983; KARABATSOS, 1985). Mas quando observadas análises comparativas de segmentos genômicos dos vírus do sorogrupo Califórnia mostraram a formação de apenas três complexos (Melao, encefalite Califórnia e Trivittatus), sugerindo que o vírus Guaroa forme um complexo a parte, fora dos grupos Califórnia e Bunyamwera, permanecendo a sua taxonomia viral ainda não totalmente definida (FAUQUET, 2005; SCHMALJOHN, 2007) O protótipo do grupo é o Vírus da Encefalite Califórnia (VEC), o qual foi isolado em Kern County, Califórnia, no ano de 1943. Desse grupo já foram isolados no Brasil três, Vírus Guaroa (VGRO), vírus Melao (VMEL) e vírus Serra do Navio (VSDN) (FAUQUET, 2005). Vários vírus foram isolados a partir de roedores e outros animais, incluindo animais sentinelas. Pesquisas de anticorpos demonstraram que uma variedade de espécies selvagens podem estar envolvidas na transmissão natural e amplificação destes vírus e que vários deles infectam seres humanos. A transmissão dos vírus desse grupo ocorrem por meio da picada de mosquitos e possuem uma ampla distribuição geográfica, sendo encontrados nas Américas do Sul e do Norte, Ásia, Europa e África (CALISHER, 1983).

Vários vírus desse grupo tem associação com infecções em em humanos causando principalmente casos de encefalites, tais como os Vírus da Encefalite Califórnia (VEC), Vírus Jamestown Canyon (VJC), Vírus Inkoo (VINK) e Vírus La Crosse (VLAC). Juntos, esses vírus são responsáveis por causar aproximadamente 60 a 130 casos de encefalite por ano nos Estados Unidos (SCHMALJOHN, 2007). A infecção em humanos pelo VLAC raramente é fatal (< 1%), embora a doença aguda seja severa e alguns pacientes apresentem ataques epilépticos e cerca de 10% desenvolvem epilepsia ou ataques epilépticos crônicos (ELLIOTT, 1997). O Vírus Tahyna (VTAH) foi isolado de um lote de mosquitos Aedes caspius em 1958 na Checoslováquia e encontra-se amplamente distribuído na Europa central e Ásia. Tem sido associado a uma doença febril indiferenciada com sintomas parecidos com influenza, podendo ainda estar associado à pneumonia e pleurisia, artrite aguda, faringite e ocasionalmente envolvimento do sistema nervoso central. Anticorpos específicos para o VTAH têm sido detectados com alta prevalência em humanos, aves e mamíferos (ELLIOTT, 1997; GRATZ, 2006; LU et al., 2009). No Brasil, observa-se a ocorrência do Vírus Guaroa (VGRO) infectando o homem. Esse vírus causa uma doença febril de evolução autolimitada, com quadro clínico caracterizado por febre elevada (39º a 40ºC), cefaléia, calafrios e mialgias. Todos os casos registrados da doença ocorreram em pessoas que viviam em áreas urbanas com intenso contato com a floresta. A prevalência de anticorpos para o VGRO varia de 8 a 18% na população da Amazônia brasileira, sendo mais elevada principalmente naqueles que vivem às proximidades das florestas (TRAVASSOS DA ROSA, 1997; VASCONCELOS, 1998).

2.5.1.5 Grupo Capim Sorogrupo composto por sete vírus, dos quais Vírus Bush Bush e Vírus Moriche, isolados pela primeira vez em Trinidad, e Vírus Acará, Vírus Benevides, Vírus Benfica, Vírus Capim, Vírus Guajará foram isolados na Amazônia Brasileira, mas nenhum caso isolado em humano (TRAVASSOS DA ROSA, 1997).

O Vírus Moriche foi isolado uma única vez de roedores Proechimys guyannensis. O vírus Bush Bush tem sido isolado de mosquitos Culex sp., Proechimys guyannensis, e camundongos sentinelas. Os Vírus Acará e Benfica foram isolados de roedores Nectomys squamipes, camundongos sentinelas e mosquitos Culex sp. Assim como os demais vírus do Grupo Capim, o Vírus Benevides foi isolado de mosquitos Culex sp e camundongos sentinelas. Ressalte-se que anticorpos para o Vírus Benevides foram detectados em amostras de sangue coletadas de roedores Nectomys squamipes. Por sua vez, o Vírus Guajará foi isolado tanto de Proechimys guyannensis quanto de mosquitos Culex sp e camundongos sentinelas. O vírus Capim, tem sido isolado de diferentes roedores pertencentes as espécies Proechimys guyannensis, Oryzomys goeldi, do marsupial Caluromys philander, bem como de camundongos sentinelas e principalmente de mosquitos Culex sp (KARABATSOS, 1985).

2.5.1.6 Grupo Guamá Como ocorrido com os vírus do Grupo C, os vírus do grupo Guamá também foram uns dos primeiros agentes virais a serem isolados na Amazônia no início dos anos de 1950. Os vírus desse sorogrupo têm sido isolados de aves silvestres, morcegos e uma variedade de animais domésticos (gado, porcos e ovelhas) e animais sentinelas. Os roedores e marsupiais têm sido descritos como hospedeiros para os membros do grupo Guamá, assim como diversos mosquitos atuam como vetores. Encontram-se distribuídos geograficamente nas Américas do Sul e do Norte (KARABATSOS, 1985; BISHOP, 1996). Na Amazônia brasileira, observa-se a ocorrência de sete vírus desse grupo, porém apenas dois estão associados com infecções em humanos, quais sejam: os Vírus Catu (VCATU) e Vírus Guamá (VGMA). Ambos os vírus produzem doença cujo quadro clinico se caracteriza por síndrome febril, acompanhada por cefaléia e calafrios que costumam ser intensos, além de mialgias, fotofobia e anorexia. Os sintomas persistem por até cinco dias, sendo a recuperação completa e a imunidade específica (VASCONCELOS, 1992; 1998; 2001).

2.5.1.7 Grupo Simbu O sorogrupo Simbu possui mais de 20 agentes virais descritos, dos quais alguns estão relacionados com doença em humanos. O VORO é um dos membros desse grupo que assume grante potencial patogênico em humanos e tem sido relacionado a numerosas epidemias de doença febril, conhecida como febre do Oropouche. A febre do Oropouche, nos últimos 40 anos, já acometeu milhares de pessoas principalmente na Amazônia brasileira. O quadro clínico é caracterizado por início abrupto de febre acompanhada por cefaléia, mialgias, artralgias e outras manifestações sistêmicas (PINHEIRO et al., 1981; NUNES, 2007). Ocorrem epidemias fora do Brasil principalmente no Panamá e no Peru (AZEVEDO, 2007). Outros membros do grupo, o Vírus Akabane (VAKA) e o Vírus Aino (VAINO) estão associados com doença em animais. Estes vírus causam aborto e má formação congênita em fetos de bovinos, ovelhas e cabras, encontrando-se amplamente distribuídos no sudeste e oeste da Ásia e Austrália, causando sério impacto econômico na criação desses rebanhos nessas áreas (INABA et al., 1975; SCHMALJOHN, 2007).

2.5.1.8 Demais Grupos Antigênicos Os sorogrupos Bwamba e Nyando apresentam vírus que estão associados com infecções em humanos. Geograficamente esses vírus encontram-se restritos ao continente africano. Diversos isolamentos foram realizados a partir de pacientes febris, sendo que anticorpos fixadores do complemento e neutralizantes têm sido encontrados para vírus de ambos os grupos antigênicos. Ademais, prevalência de anticorpos têm sido observada em humanos e animais domésticos. Especificamente para os vírus do grupo Bwamba, anticorpos também têm sido detectados em aves silvestres (KARABATSOS, 1985; BISHOP, 1996). Para os demais vírus, dos nove sorogrupos restantes (Anopheles B, Bakau, Gamboa, Koongol, Minatitlan, Olifantsvlei, Patois, Tete e Turlock) nenhum isolamento viral a partir de material de humano foi realizado até o momento, não associando, desta forma, esses vírus com infecção em humanos (KARABATSOS, 1985; ELLIOTT, 2008).

2.5.2 Ciclo de manutenção dos orthobunyavirus em natureza

A grande maioria dos membros do gênero Orthobunyavirus, apresentam ciclos naturais de manutenção envolvendo mosquitos, enquanto que uma minoria envolve carrapatos e culicídeas. A transmissão transovariana e a venérea tem sido descritas para alguns orthobunyavírus, tais como o VLAC e Vírus Gamboa (VGAM) (THOMPSON, 1977; BISHOP, 1980; DUTARY, 1989). Esses dois modos de transmissão são importantes e essenciais, uma vez que asseguram a sobrevivência dos vírus, principalmente durante condições climáticas adversas, tais como altas temperaturas e baixa humidade (BEATY e BISHOP, 1988; ELLIOTT, R. M. , 2009). Usualmente, os ciclos e transmissão dos orthobunyavírus, não são muito complexos, apresentando estabilidade em sua manutenção e transmissão, utilizando, geralmente apenas uma espécie de vetor artópode, como pode-se observar para os VLAC, Vírus Snowshoe hare (VSSH) e Vírus Trivittatus (VTVT) que utilizam, respectivamente, como vetores, os mosquitos Aedes triseriatus, Aedes communis e Aedes trivittatus. Na Amazônia, os vírus do Grupo C e Guamá utilizam nichos ecológicos semelhantes sendo mantidos em natureza por uma gama de mosquitos, hospedeiros vertebrados como roedores e marsupiais, como no caso do Vírus Caraparu (grupo C) que tem sido isolado de mosquitos Culex vomerifer, Culex portesi e Wyeomyia e de vertebrados como roedores das especies Oryzomys capito, Oryzomyz laticeps, Nectomys squamipes, Proechymis guyanensis e Zygodontomys longicaudadtus (AZEVEDO, 2007). A Figura 6 ilustra o ciclo de manutenção dos orthobunyavírus de modo simplificado envolvendo mosquitos e ceratopogonídeos

Figura 6 – Representação esquemática do ciclo de manutenção e transmissão dos orthobunyavírus

Fonte: Adaptado de Nunes et al., 2005

2.5.3 Epidemiologia molecular dos orthobunyavírus Nos últimos anos, com o advento da implantação de técnicas moleculares como RT-PCR e sequenciamento nucleotídico, um grande número de membros pertencentes ao gênero Orthobunyavirus tiveram seus genomas parcialmente ou completamente sequenciados. Mais recentemente, o avanço nas metodologias de obtenção de genomas (Next Generation Sequencing) foi de grande importância para a caracterização genética e definição taxonômica de vários orthobunyavírus. Saeed e colaboradores (SAEED et al., 2001) lançaram as bases para o entendimento da epidemiologia molecular do Vírus Oropouche, um dos mais importantes arbovírus em termos de saúde pública na Amazônia Brasileira, sugerindo a existência de pelo menos três linhagens genéticas distintas circulantes nas Américas denominadas de genótipos I, II e III. Estudos adicionais realizados por Vasconcelos e colaboradores (VASCONCELOS et al., 2011) evidenciaram a presença de um quarto genótipo do vírus (genótipo IV) isolado na Amazônia brasileira.

Outros orthobunyavírus, tais como os Vírus do Grupo C, complexo Wyeomyia, Anopheles A, Anopheles B, Akabane e Schmallenberg também tiveram seus genomas parcialmente ou completamente sequenciados o que contribuiu para o melhor entendimento a respeito de suas origens evolutivas e relacionamento genético (NUNES et al., 2005; KOBAYASHI et al., 2007; MOHAMED et al., 2009; VASCONCELOS et al., 2011; CHOWDHARY et al., 2012; DOCEUL et al., 2013). Neste contexto, a análise genética e filogeográfica vêm sendo amplamente usadas para determinar o relacionamento genético de agentes virais, bem como suas origens evolutivas e aspectos de dispersão viral levando em consideração fatores ecoepidemiológicos que favorecem a emergência ou re-emergência viral (NUNES et al., 2005; KOBAYASHI et al., 2007; FARIA et al., 2011; VASCONCELOS et al., 2011; HOLMES, 2013).

2.6 MECANISMO DE EVOLUÇÃO: REARRANJO GENÉTICO Os vírus e RNA podem apresentar diferentes mecanismos evolucionários capazes de gerar biodiversidade viral. Tais mecanismos, basicamente estão relacionados a presença de mutações seletivas, troca de segmentos genéticos ou rearranjo genômico, além da recombinação genética caracterizada pela troca de parte ou porções do material genético (GENTSCH, 1976; GENTSCH e BISHOP, 1978; GENTSCH, 1980; BEATY e BISHOP, 1988; PRINGLE, 1991; SCHMALJOHN, 2001; CHARREL, 2003). Diversos estudos têm demonstrado a presença de mutações, rearranjo e recombinação genética em natureza, no entanto pouco se sabe sobre a real contribuição desses mecanismos para a geração de biodiversidade dos orthobunyavirus. O rearranjo genético, corresponde ao mecanismo de troca de um segmento genômico completo entre agentes virais cujo material genético é semelhante. Dentre os membros da família Bunyaviridae, a troca de segmentos genômicos tem sido experimentalmente demonstrado mediante estudos utilizando culturas celulares e hospedeiros artrópodes co-infectados, bem como pela análise de isolamentos virais ocorridos em natureza (BEATY e BISHOP, 1988; BOWEN et al., 2001; BORUCKI et al., 2002). Com o aprimoramento das técnicas moleculares, tais como o desenvolvimento de protocolos específicos para amplificação de genomas pelo método de reação em cadeia mediada pela polimerase precedida pela reação

de transcrição reversa (RT-PCR), clonagem e seqüenciamento nucleotídico, atualmente já é possível avaliar casos de rearranjo genético ocorridos em natureza previamente sugeridos pela observação de pesquisadores que utilizavam a associação de dados epidemiológicos, ecológicos e antigênicos sobre esses vírus para inferirem suas conclusões. O rearranjo genético tem se mostrado um dos mais importantes mecanismos de geração de biodiversidade viral entre os orthobunyavírus entre os quais, podem ser citados os vírus do grupo C, (SHOPE, 1988; NUNES et al., 2005), o vírus Ngari, que constitui um rearranjo entre o VBUN e o vírus Batai (GERRARD, 2004), eventos de troca de segmentos para o Vírus Akabane (KOBAYASHI et al., 2007) e o vírus Schmallemberg, um rearranjo entre o vírus Shamoda e Sathuperi (GARIGLIANY et al., 2012). Assim, o estudo do relacionamento antigênico dos orthobunyavírus, em suas bases genéticas, pode vir a explicar e contribuir para enriquecer o conhecimento sobre o mecanismo de rearranjo genômico em natureza como mecanismo evolucionário e desses importantes agentes virais.

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL Realizar análise de caracterização molecular e evolutiva de cepas virais isoladas no Peru e Venezuela

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Obter as sequências completas dos segmentos genômicos S, M e LRNA dos vírus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a-10 (TVP 19255); - Caracterizar geneticamente os segmentos de RNA dos vírus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a-10 (TVP 19255); - Realizar a reconstrução filogenética dos segmentos genômicos de RNA dos vírus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a-10 (TVP 19255); - Avaliar a possibilidade de rearranjo genético em natureza.

3.3 JUSTIFICATIVA Os vírus pertencentes ao gênero Orthobunyavirus compreendem um dos maiores grupos virais, a família Bunyaviridae, composta por mais de 300 vírus (DIETZGEN et al., 2011). Dentre os orthobunyavírus, podem ser citados agentes vírais associados a doenças em humanos e em animais, tais como os VORO e Akabane, (VAKA), dois importantes agentes patogênicos à nível de saúde pública e veterinária, respectivamente (PINHEIRO et al., 1981; PINHEIRO, 1996; TRAVASSOS DA ROSA, 1997). Com o advento da biologia molecular e mais recentemente do uso do sequenciamento de última geração pelos métodos de pirosequenciamento, DNA ligase, semicondutor iônico e sequenciamento paralelo (MARGULIES et al., 2005; SHENDURE e JI, 2008; SWERDLOW, 2010; ROTHBERG et al., 2011), diversos genomas completos ou quase que completos foram obtidos, tais como para os vírus pertencentes aos grupos Anopheles A, Grupo C, Vírus Tete, Vírus, Batai, Virus Oya, Virus Akabane, Vírus Schalemberg, Vírus Iquitos, complexo Wyeomyia, dentre outros (DUNN, 1994; AKASHI et al., 1997; KONO et al., 2002; NUNES et al., 2005; YANDOKO et al., 2007; CARVALHO et al., 2009; MOHAMED et al., 2009; AGUILAR et al., 2011; SAVJI et al., 2011; CHOWDHARY et al., 2012; BEER et al., 2013).

Com os dados genéticos completos e parciais para os segmentos genômicos dos Orthobunyavirus, pode-se caracterizar geneticamente um grande número de orthobunyavírus, bem como observar a presença, mais comum do que se imagina, do processo de rearranjo genético em natureza. Esse processo foi claramente evidenciado em vírus como os membros do grupo C (NUNES et al., 2005), Vírus Nigari (GERRARD, 2004) e o Vírus Iquitos (AGUILAR et al., 2011). Apesar da grande quantidade de dados genéticos obtidos para diferentes orthobunyavirus, ainda se torna necessária a caracterização de muitos agentes virais antigenicamente não grupados e que foram taxonomicamente reconhecidos ao nível de gênero. Neste contexto, o presente estudo contribuirá para a identificação, caracterização genética e evolutiva dos virus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a-10 (TVP 19255), isolados no Peru e Venezuela a partir de humanos e primatas não humanos, respectivamente.

4. MATERIAL E MÉTODOS

A caracterização molecular dos vírus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a-10 (TVP 19255) foi processada em basicamente utilizando as seguintes etapas:

i) extração do ácido nucléico (RNA);

ii) obtenção das sequências nucleotídicas por pirosequenciamento e

iii) análise computacional.

4.1 AMOSTRAS VIRAIS

As amostras virais utilizadas neste estudo são denominadas como MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a-10 (TVP 19255), este foi isolado em um primata não humano (Cebus sp) o qual tem função de sentinela, na cidade de Azoategui, Venezuela (8.639431, -63.964214) e aquele teve seu isolamento de um caso humano ocorrido em um residente da cidade de Lima, Peru (- 12.072474, -76.981236), conforme pode ser visualizado na Figura 7. Essas amostras são de vírus liofilizados, após uma única passagem em cultura celular de células VERO. Após uma caracterização prévia com emprego de metodologias sorológicas de Inibição da Hemaglutinação (IH) (SHOPE, 1963) e Fixação de Complemento (FC) (CASALS e WHITMAN, 1960) foram identificados como pertencentes ao sorogrupo Simbu, com uma relação de similaridade maior com o VORO pelo teste de FC e fracamente reativo pelo teste de IH. Tal caracterização foi realizada no departamento de Patologia da Universidade do Texas em Galveston, EUA (A.P.A. Travassos da Rosa, dados não publicados). A amostra que é pertencente à coleção de vírus do Departamento de Patologia da Universidade do Texas, USA, foi gentilmente cedida para a realização do estudo de caracterização molecular conforme documento em anexo (ANEXO 1).

Figura 7 – Localização geográfica dos vírus utilizados para caracterização genética.

Anzoategui (Venezuela) INHRR 17A-10 TVP 19255

Lima (Peru) MIS 0397 TVP 19261

INHRR 17A-10: vírus isolado a partir de amostras de Cebus sp em Azoategui, Venezuela; MIS 0397: vírus isolado de humanos em Lima, Peru. Fonte: Adaptado de www.mapasparacolorirvia12.com

4.2. PROPAGAÇÃO VIRAL EM CULTURA DE CÉLULAS VERO E TRATAMENTO DA AMOSTRA COM NUCLEASE. A propagação viral foi realizada no Departamento de Patologia da Universidade do Texas, Galveston. Para a obtenção do estoque viral foram

tomados inicialmente, frascos de 75 cm3 estéreis utilizados para preparação de monocamada celular. No interior de cada frasco, ocorreu a lavagem previa com solução salina tamponada (PBS) estéril, com concentração final de NaCl 137mM, Fosfato 10 mM, KCL 2.7 mM e pH 7,4 contendo 5% de penicilina (100 mg/mL), adicionou-se 29 mL de meio 199 de crescimento enriquecido com 2 % de L-glutamina a 200 mM (Invitrogen), 1 % de agente estabilizante de pH HEPES (Invitrogen), 10 % de soro bovino fetal- SBF (Invitrogen, USA), penicilina a 100 UI/mL (Invitrogen), estreptomicina a 100 μg/mL (Invitrogen) e 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, ocorrendo a subsequente incubação desses frascos à temperatura de 37 °C durante 2-3 dias. Com a formação da monocamada de células todo o meio de crescimento foi removido completamente de cada frasco, após essa etapa ocorreu a infecção das células com 200 µL de suspensão viral contendo aproximadamente 35 unidades formadoras de placas (UFP). Posteriormente, os frascos foram incubados por 1 hora a 37 ºC. Essa etapa teve como objetivo a adsorção das partículas virais à monocamada celular. Após essa incubação, foram adicionados aos frascos, 10 mL de meio de manutenção enriquecido com 2 % de L-glutamina 200 mM, 1 % de HEPES, 2 % de SBF, penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (100 μg/mL) e 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, sendo então os frascos novamente incubados a 37 °C, durante três a cinco dias, ou até observação do efeito citopático nas células, quando então os sobrenadantes celulares contendo partículas virais foram coletados em tubos plásticos de 15 mL estéreis. Com o objetivo de reduzir quaisquer quantidades de possíveis RNAs contaminantes (ex. Ácidos nucleicos oriundos da célula hospedeira), cada amostra de suspensão de vírus (165,7 µL) foi tratada com 20 U de DNAse Turbo (Ambion, Austin, TX), 36 U de benzonase (Novagen, Damstadt, Germany) e 28 U de RNAse One (Promega, Madson, WI). O ajuste para o volume final de 250 µL ocorreu com tampão DNAse 10X (Ambion, Austin, TX) e incubadas a 37 °C por duas horas. Após este último período de incubação, as amostras foram imediatamente utilizadas para a extração de RNA.

4.3. EXTRAÇÃO DE RNA Cada frasco com suspensão viral, previamente tratada com 250µL

de endonuclease, recebeu a adição de 750 µL de reagente Trizol, após foram acondicionadas em caixas térmicas com gelo seco e enviadas para o laboratório de Genômica do Centro de Inovações Tecnológicas do Instituto Evandro Chagas e usadas para a obtenção do ácido nucléico viral. Para obtenção do RNA viral a partir das amostras previamente tratadas com DNAse/RNAse, utilizou-se o Kit PureLinkTM Viral RNA/DNA Mini Kit (Invitrogen) conforme instruções do fabricante, cujo fundamento baseia-se nas propriedades seletivas de ligação do RNA a membranas de sílica-gel combinadas à centrifugação em alta velocidade (entre 8.000 e 14.000 rpm). No interior de cada microtubo estéril de 1,5 mL, adicionou-se 25 μL de Proteinase K, 200 μL da amostra viral que foi pré tratada com DNAse/RNAse e 200 μL de tampão de lise contendo substância carreadora de RNA. Em seguida, a solução foi misturada por agitação durante quinze segundos e incubada a 56º C em banho seco por quinze minutos, tempo suficiente para que ocorresse a completa lise das partículas virais. Posteriormente, adicionou-se 250 μL de etanol (96-100%) a cada tubo que foram misturados a solução por agitação durante quinze segundos. Na próxima etapa os tubos foram incubados a temperatura ambiente por cinco minutos. O conteúdo de cada tubo foi cuidadosamente transferido para a coluna de sílica, e centrifugado a 9.000 rpm por um minuto. Adicionou-se posteriormente 500 μL do tampão de lavagem fornecido pelo Kit aos tubos, e as amostras foram submetidas a centrifugação a 9.000 rpm por um minuto. O produto do tubo coletor foi desprezado e as etapas de lavagem e centrifugação repetidas. As colunas foram então transferidas para novos tubos coletores, centrifugadas a 14.000 rpm por 1 minuto (para remover resíduos) e transferidas para novos microtubos estéreis de 1,5 ml devidamente identificados. Em seguida, 40 μL de água livre de RNAase foram adicionados às amostras que foram incubadas durante um minuto a temperatura ambiente (25 ºC) e posteriormente centrifugadas a 14.000 rpm para recuperação do RNA aderido à membrana de sílica-gel. O RNA obtido foi usado imediatamente para a reação de pirosequenciamento ou preservado a -70 ºC.

4.4 OBTENÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS A obtenção das sequências nucleotídicas utilizando a plataforma de seqüenciamento GS FLX Genome Sequencer 454TM (Life Science, Roche) incluiu três diferentes etapas: i) Preparação de biblioteca genômica; ii) Amplificação ou amplificação clonal da biblioteca genômica utilizando esferas magnéticas; e iii) sequenciamento conforme descrito no manual do fabricante (http://454.com /products-solutions/454-sequencing-system-portfolio.asp).

4.4.1 Preparação da biblioteca genômica Partindo-se de um genoma de RNA, o primeiro passo foi realizar a preparação de uma biblioteca a partir de DNA complementar (cDNA) ao RNA viral previamente fragmentado. A fragmentação do genoma foi realizada pelo método de fragmentação química por meio da exposição do RNA ao Cloreto de Zinco a 5% durante cinco minutos a temperatura ambiente. A avaliação desta fragmentaçao foi verificada com o equipamento Bioanalyzer 2000 (Agilent) e o chip para RNA (RNA One-a- Ship, Agilent) sendo gerados fragmentos com tamanho médio de 400 pb. Posteriormente, dois diferentes adaptadores universais (A: adaptador para amplificação; B: adaptador para fixação do cDNA à bead ou esfera) foram ligados aos fragmentos de cDNA pela ação enzimática e as bibliotecas foram construídas empregando o kit de preparação de bibliotecas genômicas (fragment cDNA library kit, Roche).

4.4.2 PCR emulsão (emPCR) Por meio do processo de amplificação clonal baseada em emulsão (emPCR), a biblioteca contendo os fragmentos genômicos (cDNAs contendo os adaptadores) foram postas em contato com esferas magnéticas de captura requeridas durante a etapa de seqüenciamento mediante o processo de criação de micro reatores (emulsão). Este processo foi realizado pelo kit emPCR (Roche) levando aproximadamente oito horas de processamento.

4.4.3 emPCR para titulação Antes de realizar o emPCR para sequenciamento propriamente

dito, tornou- se necessário conhecer o melhor número de cópias de cDNA por esfera. Objetivando encontrar o melhor rendimento de enriquecimento do seqüenciador, devendo estar de 5 a 20%. Este processo denomina-se emPCR de titulação. A titulação foi realizada para amplificar as amostras ao redor da bead, pelo método de emPCR emulsão empregando o kit Small Volume (Roche, Applied Science) seguindo a recomendação do protocolo que submete as amostras a quatro diluições distintas que representam 2, 4, 8 e 16 cópias de cDNA por bead. Inicialmente tubos de dois mL contendo o óleo de emulsão foram submetidos à vigorosa agitação no equipamento Tissuelyser (Qiagen) ajustado para 28 Hz durante cinco minutos. Após a homogeneização do óleo de emulsão, as amostras foram adicionadas aos respectivos tubos juntamente com as enzimas, iniciadores complementares aos adaptadores e tampão de emPCR, sendo novamente submetidos à vigorosa agitação 12 Hz durante cinco minutos, objetivando a formação de microrreatores. Em geral, cada microrreator (gotícula de óleo de emulsão), contém um fragmento de cDNA ligado a uma única esfera por um dos adaptadores (microrreator clonal). O fragmento de cDNA contido em cada microrreator foi amplificado isoladamente produzindo milhões de cópias clonais. Ao final da reação de emPCR emulsão, o processo de enriquecimento foi realizado. Esta etapa consistiu na recuperação de esferas que continham fragmentos de DNA e eliminação das que não continham DNA amplificado. A seleção das esferas com amplificação clonal foi realizada pelo processo de ligação de sondas complementares ao DNA amplificado capazes de se hibridizarem a esferas magnéticas de captura (Capture beads). A quantificação e determinação da melhor relação cópias de DNA/beads foi verificada pelo emprego do equipamento CASY DT (Roche Innovatis). Após a obtenção das informações referentes à quantidade de cópias de DNA/beads, realizou-se o emPCR para sequenciamento de forma semelhante ao descrito acima, excetuando-se o kit Small Volume, que foi substituido pelo kit Large Volume (Roche, Applied Science). A Figura 8 ilustra o processo de preparação de biblioteca conforme a metodologia de pirosequenciamento usada pelo GS FLX 454 (Roche Life Science).

Figura 8 - Esquema de preparação de biblioteca a partir de DNA complementar (cDNA) ao RNA viral e PCR em emulsão.

(a) representação do processo de fragmentação do genoma pela ação química do cloreto de zinco; (b) incorporação de adaptadores (A e B); (c) ligação do fragmento de cDNA a esfera magnética com auxílio do adaptador B; (d) amplificaçãoo clonal do cDNA em microreatores; (e) ilustração de uma bead (esfera) após o processo de amplificação clonal pelo PCR em emulsão. Observar que a esfera encontra-se completamente revestida por inúmeras cópias de cDNA (amplificação clonal). Fonte: (MARGULIES et al., 2005).

4.4.4. Pirosequenciamento O sequenciamento das cepas MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a-10 (TVP 19255) foi realizado em sequenciador de última geração GS FLX 454 (Roche Life Science) empregando o método de pirosequenciamento. Após o emPCR para sequenciamento as amostras foram depositadas nas placas do sequenciador sendo esta subdividida em duas regiões, uma para cada amostra. Cada região tem capacidade média para gerar 600 milhões de bases, o que permite uma excelente cobertura de sequenciamento para o genoma das amostras em estudo estimadas em 12kb (cobertura do genoma: 600.000.000 de bases lidas /12.000 bases do genoma = 50.000 vezes). Cabe ressaltar que não há uma etapa de purificação, onde são retirados os RNA interferência do hospedeiro. Observando que esses 600.000.000 de bases lidas não são somente material ribonucleido viral, pois o sequenciador sequência na uma grande maioria de bases do material da célula hospedeira, acarretando em uma cobertura menor, essa diferença tem relação com as variações relativas ao equipamento e a reação.

Após a placa ser completamente preenchida com as esferas de captura contendo o cDNA viral amplificado, a mesma foi inserida no sequenciador GS FLX 454 (Roche Life Science) para a realização do sequenciamento. Os nucleotídeos (A, C, T, G) foram submetidos a um fluxo contínuo de migração (1 nucleotídeo/ segundo) obedecendo a ordem fixada (A- >C->T->G) sobre os orifícios da placa. O fluxo de migração contínuo permitiu o contato com as esferas de captura contendo os DNAs amplificados. A leitura da sequência nesse sistema é realizada a partir de uma combinação de reações enzimáticas que se inicia com a liberação de um pirofosfato, oriundo da adição de um ou mais desoxinucleotídeos complementares ao DNA alvo. Em seguida, esse pirofosfato é convertido em ATP, pela ATP sulfurilase, sendo este utilizado pela luciferase para oxidar a luciferina, produzindo um sinal de luz capturado por uma câmera CCD (charge- coupled device) acoplada ao sistema (Figura 9).

Figura 9 – Esquema da reação de pirosequenciamento ocorrida na plataforma GS FLX 454 (Roche).

(a) Deposição da camada de esferas (beads) contendo os cDNAs clonais; (b) deposição de camadas secundárias contendo enzimas pipiase, luciferase e DNA polimerase; (c) Início da reação de sequenciamento com incorporação nucleotídica e liberação de pirofosfato após a injeção contínua de nucleotídeos A, C, T, G; (d) Gráfico demonstrando a incorporação de nucleotídeos (A, C, T e G) durante o processo de pirosequenciamento; (f) ilustração da emissão de luz durante o processo de incorporação de nucleotídeos pela liberação do pirofosfato e subsequente reação com as enzimas luciferase e pipiase Fonte:(MARGULIES et al., 2005)

As extremidades 3’ e 5’ não codificantes dos genomas foram obtidas empregando os kits RACE 3’ e RACE 5’ (Invitrogen), respectivamente utilizando o conjunto de iniciadores específicos desenhados para cada genoma

viral (RNA viral) conforme descrito no Quadro 5.

Quadro 5 – Conjunto de iniciadores específicos usados para obtenção das extreminades 3’ e 5’ dos vírus MIS 0397 (TVP 19255) e INHRR17A-10 (TVP19261).

Segmento Produto Virus Primer Sequencia 5`->3` TM (oC) genomico esperado (Pb) 5` RACE FPS1 TTGACTGGAATTGTGGGAAA 55 287 5` RACE FPS2 CATCTTTGGCCTTCTTTTGG 55 195 SRNA 5` RACE FPS3 TCTAACAACACCAGCATTGA 55 162 3` RACE RPS1 AAGACTGCTGAACAATGGAT 55 344 3` RACE RPS2 CAAGAGACTTTTTGCGTCAA 55 241 5` RACE FPM1 AGGTACTAGGTGGCCATTAT 55 360 5` RACE FPM2 TCAGCCCACTCCTTAACTAT 55 286 TVP 19261 MRNA 5` RACE FPM3 CCGCGTGGATAAATGATCTA 55 243 3` RACE RPM1 TTTTGTCTTCTCTGGCTTGT 55 275 3` RACE RPM2 TAATAACAGGTTGGGTTGGG 55 93 5` RACE FPM1 TGCTTTGTAACCATCAAGGA 55 246 5` RACE FPM2 CTCAGCAGGAACATCATTTC 55 233 LRNA 5` RACE FPM3 CTCAGCAGGAACATCATTTC 55 209 3` RACE RPM1 CAAAGATTGAACCATGGTCG 55 196 3` RACE RPM2 GACAGAAGCAAGAAAACTGG 55 93 5` RACE FPS1 TACGTAAGACATCTTTGGCC 55 207 5` RACE FPS2 TCTAACAACACCAGCATTGA 55 164 SRNA 5` RACE FPS3 TCTAGCTTCAAATGCCACAT 55 131 3` RACE RPS1 CGTGAAGAGATAGTTGCTGT 55 329 3` RACE RPS2 GAGATTTCTTGCGCCAATTC 55 244 5` RACE FPM1 CTCTTATCAAGTTCCCTCCG 55 138 5` RACE FPM2 AAGCACCTATCACCAATCTG 55 116 TVP 19255 MRNA 5` RACE FPM3 GGATAATGGATGTGATGCCA 55 90 3` RACE RPM1 TGGTACCAATCTTCAGGTTG 55 189 3` RACE RPM2 GGAGTATACCACAGAGCAAA 55 139 5` RACE FPM1 CAAGGACTTCAGCACAGATA 55 234 5` RACE FPM2 TCTGTACTCGAGATTTGCAG 55 194 LRNA 5` RACE FPM3 TCCCGAGAAAAGTAGTTGTG 55 163 3` RACE RPM1 TGAGGATTTCCAAACGAACA 55 192 3` RACE RPM2 AAGCACACAGTGTAGCATTA 55 154 FP: forward primer (senso positivo); RP: reverse primer (senso negativo); pb: pares de bases Fonte: Próprio autor

4.5 MONTAGEM DOS GENOMAS OBTIDOS POR PIROSEQUENCIAMENTO Para montagem das sequências obtidas pelo sistema de pirosequenciamento foi utilizado o pipe-line desenvolvido no núcleo de Bioinformática do Instituto Evandro Chagas, usando o Newbler 2.0 como montador. Inicialmente, os contigs gerados a partir da montagem foram submetidos a um prévio processo de montagem onde os contigs (são sobreposições geradas a partir das leituras do sequentiador) foram confrontados contra um banco de dados do Genbank que contém sequências de hospedeiros (mosquitos, humanos, vertebrados silvestres, etc.). Esta estratégia teve como objetivo a retirada de sequências inespecíficas (sequências do hospedeiro). Ademais, este pré-processo favoreceu a montagem que foi mais rápida e efetiva computacionalmente (GORDON, 2004). Após a etapa de pré-processo, o programa “GS De Novo Assembler” (http://www.454.com/products-solutions/analysis-tools/gs-de-novo assembler) foi usado para a montagem propriamente dita, empregando o programa Newbler versão 2.0 (Roche, Applied Science) como algoritmo de montagem. O “GS De Novo Assembler” tem como função realizar a montagem de genomas baseando-se no tamanho das leituras (reads) e o valor de qualidade de cada uma delas. Para avaliação do valor de qualidade, também foi usado o programa PHRAP (GORDON, 2004) que gerou maior confiabilidade ao processo de checagem. Alternativamente os genomas foram montados utilizando os programas MIRA 3 (http://www.chevreux.org/projects_mira.html), EULER (PEVZNER et al., 2001), AMOS (http://sourceforge.net/apps/mediawiki/amos/index.php) e Geneious versão R-7 (Biomatters) sendo que para estes foi respeitado o mesmo pré- processamento anteriormente citado. A validação do genoma foi feita mediante comparação entre os “contigs” (conjunto de leituras) montados, sendo escolhida como a montagem mais correta aquela que obteve o maior valor de confiabilidade dos programas e com a maior incorporação de leituras (reads) nos contigs. Independente do programa usado para montagem, o genoma final obtido (contigs) foi visualizado pelo programa Geneious versão 5.3.1 e posteriormente confrontado com sequências disponíveis no banco de dados National Center for Biotechnology Information (NCBI)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para identificação empregando o programa BLASTP e BLASTN (http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast).

4.6 GENÔMICA DESCRITIVA: ANÁLISES E IDENTIFICAÇÕES Para obtenção de dados descritivos, inicialmente as sequências nucleotídicas completas obtidas do Segmento S, M e L das cepas MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a – 10 (TVP 19255) foram identificadas pelo programa BLAST (Basic Local Aligning Search Toll) disponível no portal do NCBI (www.nchi.nhi.org) (ALTSCHUL e GISH, 1996). Posteriormente, as sequências nucleotídicas foram comparadas entre si e com outras sequências de orthobunyavírus disponíveis no GenBank utilizando o programa Geneious versão R-7 e Clustal X (THOMPSON et al., 1997). Em seguida, o programa Geneious versão R-7 foi utilizado para avaliar as sequências quanto ao tamanho, predição de ORF, regiões não codificantes (RNC), presença de substituições nucleotídicas (nt) e de aminoácidos (aa). Para efeito de comparações de divergência e homologia nucleotídica e aminoacídica foram usadas as regiões codificantes e o produto protéico associados aos genes respectivamente. As análises de divergência nucleotídica e aminoacídica foram realizadas usando os programas Geneious versão R-7 para alinhamento e Mega 5 (KUMAR, 2000) para construção das matrizes. A determinação de sítios de clivagem foi obtida por comparação com outros orthobunyavírus no banco de dados de família de proteínas PFAM (http://pfam.sanger.ac.uk/) e InterProScan. A previsão de sítios de glicosilação no NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetNGlyc/). Ademais, o programa Geneious v R-7 também foi usado para avaliação de regiões conservadas (motivos) ao longo dos segmentos genômicos S, M e LRNA.

4.7 ANÁLISE DE SIMILARIDADE GENÉTICA Os valores estimados das divergências genômicas (segmentos S, M e LRNA) para os vírus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a – 10 (TVP 19255) foram determinadas a partir dos valores de distância par a par (pairwise distance) obtidos no programa Mega v 6.0 (TAMURA et al., 2013) tendo como base a estimativa das variâncias obtida pelo método de NJ utilizando valores

de bootstrap fixados para 1.000 réplicas e usando o modelo de distância p de substituição aminoacídica. Os valores de distância par a par foram usados para estimar as divergências em relação aos segmentos genômicos entre os vírus em estudo, bem como entre estes e membros representantes de diferentes grupos do gênero Orthobunyavirus da família Bunyaviridae. As estimativas de divergência foram plotadas em um gráfico do tipo boxplot empregando o programa R Core team (2013) (URL http://www.R-project.org) sendo os valores de corte estabelecidos conforme (KENDALL, 1967). Em resumo, considera-se que os valores de primeiro e terceiro quartil fornecem uma estimativa da significância da diferença dos valores analisados, assumindo-se que caso os quartis de dois diagramas não se sobreponham, as medianas são significativamente diferentes num intervalo de 95% de confiança. No gráfico do tipo boxplot, os valores máximos e mínimos são representados pelas linhas tracejadas verticais, externas às caixas; valores do primeiro e terceiro quartil, representados pelas extremidades inferior e superior dos diagramas; e mediana, representada pela linha interna do diagrama (Figura 10)

Figura 10 – Representação esquemática do gráfico tipo Box plot evidenciando os valores máximo e mínimo, primeiro quartil, terceiro quartil e mediana.

Valor máximo

Primeiro quar l

Mediana

Terceiro quar l

Valor mínimo

Fonte: Próprio autor

Para verificar a confiabilidade dos resultados obtidos na análise dos programas MEGA 6.0 e R Core team, estes foram submetidos à análise estatística do tipo Teste-T para variâncias não homogêneas entre os conjuntos de dados, assumindo um intervalo de confiançade 95% e considerando diferentes as relações com valores de P menores que 0,05.

4.8 ANÁLISE FILOGENÉTICA E EVOLUÇÃO A construção das árvores filogenéticas foi realizada através dos métodos de agrupamento de vizinhos (neighbor joining-NJ) (SAITOU e NEI, 1987), máxima verossimilhança (maximum likelihood- ML) (GOLDMAN et al., 2000) e Bayesiano (DRUMMOND et al., 2012), usando o programa MEGA 5.0 e PAUP 4.0 (SWOFFORD, 2003). O programa Modeltest versão 3.6 (POSADA e CRANDALL, 1998), foi usado para determinar o melhor modelo de substituição nucleotidica utilizada para as sequências, segundo o critério de informação Akaike (CIA). Para o método de NJ e Máxima Verossimilhanca, a matriz de distância foi calculada a partir das sequências alinhadas usando o modelo determinado pela análise usando o Modeltest. A análise de Bootstrap (1.000 réplicas) foi usada para dar confiabilidade aos grupamentos filogenéticos (FELSENSTEIN, 1985). Para a análise Bayesiana, empregou-se a cadeia de Markov Monte Carlo (MCMC) utilizando programa MrBayes 3.4 que foi programado para gerar cinco milhões de árvores, fixando uma amostragem a cada 1000 árvores construidas. As probabilidades posteriores Bayesianas (PPB) foram estimadas a partir dos dados obtidos para 50% das árvores consenso geradas (HUELSENBECK e RONQUIST, 2001). O programa TRACER (www.evolve.zoo.ox.ac.uk) foi usado para verificar se as análises feitas pelo MrBayes alcançaram a convergência apropriada. As amostras foram submetidas aos métodos descritos à cima e os melhores modelos foram apresentados nos resultados deste trabalho.

4.9 ANÁLISE DE REARRANJO GENÉTICO EM NATUREZA A evidência de rearranjo genético para os vírus em análise (MIS 0397 - TVP 19261) e INHRR 17a – 10 - TVP 19255) foi investigada utilizando o programa computacional Simplot (http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/simplot/) que avalia o percentual de permutação filogenética de um dado seguimento genômico em relação a outro. O rearranjo genético foi reconhecido como existente, caso os valores de permutação (troca de segmentos) ao longo da sequência genômica do segmento de RNA (S, M ou LRNA) seja acima de 90%.

5 RESULTADOS

5.1 OBTENÇÃO DAS SEQUENCIAS NUCLEOTÍDICAS As cepas MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17A – 10 (TVP 19255) foram completamente sequenciadas e evidenciaram diferentes tamanhos para os segmentos de RNA genômicos que variaram de 943 nt a 6.852 nt. Os segmentos SRNA, MRNA e LRNA do vírus MIS 0397 (TVP 19261) mostraram tamanhos de 943 nt, 4.379 nt e 6.852 nt, respectivamente. Para o vírus INHRR 17A – 10 (TVP 19255), obteve-se para o segmento SRNA o tamanho de 949 nt, para o segmento MRNA o tamanho de 4.395 nt e para LRNA o tamanho de 6.850 nt. Após a análise de predição de ORFs, encontrou-se, independentemente do vírus avaliado seis diferentes regiões codificadoras referentes aos genes N, NSs (segmento SRNA), poliproteína M (segmento MRNA) e a poliproteína L (segmento LRNA) (Quadro 6) A comparação das sequências nucleotídicas das ORFs completas do MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17A – 10 (TVP 19255) com sequencias depositadas no Genbank, usando o programa BLASTX, revelou que não há sequencias com percentual de identidade significativo. Contudo, após a tradução das sequências foi possível encontrar sequências nucleotídicas com percentual de similaridade nesse banco de dados relacionados a família Bunyaviridae, como detalhado adiante. A avaliação do produto gênico realizada pelos programas Interproscan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5/) e ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) evidenciou a presença de seis proteínas, sendo três estruturais (N, Gn e Gc) e três não estruturais (NSs, NSm e L). A figura 12 ilustra as regiões codificadoras para as seis proteínas virais associadas a proteínas codificadas pelos orthobunyavirus.

A análise das regiões 3’ e 5’ não codificantes dos vírus INHRR- 17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) evidenciaram complementariedade entre as regiões terminais dos três segmentos genômicos mostrando alta conservação entre os nove primeiros nucleotídeos dos terminais 5’ NCR (AGTAGTGTAC...>) e onze nucleotídeos da região terminal 3’ NCR (<...AGCACACTACT) em comparação com outros membros do grupo Simbu (Quadro 6).

Quadro 6 - Segmentos genômicos (S, M e LRNA) dos Vírus INHRR-17A-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255) em comparação com outros vírus do grupo Simbu, segundo o tamanho total obtido, produtos gênicos e regiões terminais 5’ NCR e 3’ NCR. Segmento Região genômica(nt/aa) Tamanho DE Vírus Cepa viral Poliptoteína total 5` - NNNNNNNN N NSs Poliproteína L 3`-NNNNNNN RNA M (nt) INHRR-17a-10 TVP 19255 44 AGTAGTGTACT-CCAC… 696 (231aa) 279 (92aa) NA NA 209 ...TGGGAGCACACTACT 949 MIS 0397 TVP 19261 44 AGTAGTGTACT-CCAC… 696 (231aa) 279 (92aa) NA NA 203 ...TGGGAGCACACTACT 943 PDEV BeAn790177 44 AGTAGTGTACT-CCAC… 696 (231aa) 279 (92aa) NA NA 207 ...TGGGAGCACACTACT 947 SRNA OROV BEAN 19991 44 AGTAGTGTACT-CCAC… 696 (231aa) 279 (92aa) NA NA 218 ...TGGGAGCACACTACT 958 JTBV BeAn 423380 44 AGTAGTGTACT-CCAC... 696 (231aa) 279 (92aa) NA NA 200 ...TGGGAGCACACTACT 940 SIMV SA Ar 53 33 AGTAGTGTACT-CCAC… 702 (233 aa) 276 (91aa) NA NA 134 ...TGGGAGCACACTACT 860 AKAV OBE-1 33 AGTAGTGTACT-CCAC… 702 (233 aa) 276 (91aa) NA NA 123 ...TGGGAGCACACTACT 858 Média 922 INHRR-17a-10 TVP 19255 30 AGTAGTGTACTACCA... NA NA 4.272 (1.423aa) NA 108 ...TGGTAGCACACTACT 4.395 MIS 0397 TVP 19261 30 AGTAGTGTACTACCA... NA NA 4.257 (1.418 aa) NA 92 ...TGGTAGCACACTACT 4.379 PDEV BeAn790177 23 AGTAGTGTACTACCA... NA NA 4257 (1.418 aa) NA 138 ...TGGTAGCACACTACT 4.418 MRNA OROV BEAN 19991 31 AGTAGTGTACTACCA... NA NA 4.263 (1.420 aa) NA 91 ...TGGTAGCACACTACT 4.385 JTBV BeAn 423380 23 AGTAGTGTACTCCCA... NA NA 4.266 (1.421 aa) NA 114 ...TGGTAGCACACTACT 4.403 SIMV SA Ar 53 23 AGTAGTGAACTACCA... NA NA 4.230 (1.409 aa) NA 154 ...TGGTAGCACACTACT 4.407 AKAV OBE-1 22 AGTAGTGAACTACCA... NA NA 4.206 (1.401 aa) NA 81 ...TGGTAGAACACTACT 4.309 Média 4.385 INHRR-17a-10 TVP 19255 44 AGTAGTGTACTCCTA… NA NA NA 6.756 (2.251 aa) 50 ...TAGGAGCACACTACT 6.850 MIS 0397 TVP 19261 43 AGTAGTGTACTCCTA… NA NA NA 6.759 (2.252 aa) 50 ...TAGGAGCACACTACT 6.852 PDEV BeAn790177 43 AGTAGTGTACTCCTA… NA NA NA 6.759 (2.252 aa) 50 ...TAGGAGCACACTACT 6.852 LRNA OROV BEAN 19991 43 AGTAGTGTACTCCTA… NA NA NA 6.759 (2.252 aa) 50 ...TAGGAGCACACTACT 6.852 JTBV BeAn 423380 42 AGTAGTGTACTCCTA… NA NA NA 6.759 (2.252 aa) 47 ...TAGGAGCACACTACT 6.848 SIMV SA Ar 53 28 AGTAGTGTACCCCTA... NA NA NA 6.762 (2.253 aa) 71 ...TAGGGGCACACTACT 6.861 AKAV OBE-1 42 AGTAGTGTACTCCTA… NA NA NA 6.759 (2.252 aa) 47 ...TAGGAGCACACTACT 6.848 Média 6.852 S: segmento SRNA; M: segmento MRNA; L: segmento MRNA; nt: nucleotídeo; aa: aminoácido, NCR: região não codificante Fonte: Próprio autor

Figura 11 – Análise das regiões codificadoras de proteínas e determinação dos domínios proteicos associados aos segmentos genômicos

SRNA (a), MRNA (b) e LRNA (c) dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255). RF: Reading frame (cadeia de leitura); +: senso positivo; +1: cadeia positiva 01; +3: cadeia positiva 03 Fonte: Próprio autor

A análise empregando o MFOLD evidenciou complementariedade entre as regiões terminais de todos os segmentos de RNA referentes aos vírus INHRR-17A- 10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) conforme ilustrado na Figura 12.

Figura 12 – Estrutura secundária do RNA (S, M e LRA) dos vírus MIS 0397 (TVP 19261) (A) e INHRR-17A-10 (TVP 19255) (B).

Circulos preenchidos em verde e circundados em azul correspondem ao primeiro nucleotídeo (Adenina) da região terminal 5’; círculos preenchidos em verde e circundados em vermelho correspondem ao primeiro nucleotídeo complementar (Timina) da extremidade 3’. Os valores em Kcal;mol correspondem a energia de ligação para formação da estrutura secundária do RNA viral. Fonte: Próprio Autor

O percentual de A-U obtido para a ORF dos gene N dos vírus vírus INHRR- 17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) foi determinado em 53.1% e 51.3%,

respectivamente. A análise no BLASTX da sequência aminoacídica do gene N revelou maior percentual de identidade dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255) com o Vírus Oropouche (NC_005777) (Tabela 1).

Tabela 1- Análise de similaridade do gene N dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) com sequencias de proteínas disponíveis no Genbank empregando o programa BLASTX.

Vírus Vírus de Maior % de Identidade Cobertura do Valor de e Identidade aminoacídica genoma (%) INHRR-17A- Vírus Oropouche 10 (TVP 100 99 5e-169 (NC_005777) 19255) MIS 0397 Vírus Oropouche 100 99 5e-169 (TVP 19261) (NC_005777) Fonte: Próprio autor.

Em relação ao segmento MRNA, o percentual de A-U obtido para a região codificante (ORF) da poliproteína M para os vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) foi de 54.7% e 55.4%, respectivamente. A análise de similaridade protéica pelo BlastX revelou maior identidade destes com os vírus Madre de Dios e Iquitos, respectivamente (Tabela 2).

Tabela 2- Análise de similaridade do gene da poliproteína M dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) com sequencias de proteínas disponíveis no Genbank empregando o programa BLASTX. % de Cobertura Vírus Vírus de Maior Identidade do genoma Valor de e Identidade aminoacídica (%) INHRR-17A-10 Vírus Madre de Dios 100 99 0.0 (TVP 19255) (KJ866391) MIS 0397 Vírus Iquitos 100 99 0.0 (TVP 19261) (KF697142) Fonte: Próprio autor.

Para o segmento LRNA, a ORF que codifica a polimerase viral dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) mostraram percentuais de U- A estabelecidos em 64.8% e 65.4%, respectivamente. A análise pelo BlastX evidenciou maior similaridade aminoacídica com os virus Madre de Dios e Iquitos (Tabela 3).

Tabela 3- Análise de similaridade da polimerase dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) com sequencias de proteínas homólogas disponíveis no Genbank empregando o programa BLASTX. Cobertura % de Valor de Vírus do genoma Vírus de Maior Identidade e similaridade aminoacídica (%) INHRR-17A-10 Vírus Madre de Dios 100 98 0.0 (TVP 19255) (KJ866391) MIS 0397 Vírus Iquitos 100 98 0.0 (TVP 19261) (KF697142) Fonte: Próprio autor

O tamanho dos segmentos do genoma dos vírus selecionados para esse estudo se assemelha com a média dos tamanhos dos segmentos observada na literatura para os membros do grupo Simbu, os mesmos apresentam semelhança entre si e também com o gênero Orthobunyavirus, com valores de 1 Kb para o SRNA, 4,3 Kb para o MRNA e 6,8 Kb para o LRNA, conforme se visualiza na figura 13.

Figura 13 – Tamanho médio dos genomas dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com genomas dos Vírus Oropouche, Jatobal, Akabane e Leanyer pertencentes ao grupo Simbu.

Fonte: Próprio autor

5.2 REGIÕES CONSERVADAS OU MOTIVOS (MOTIFS) 5.2.1 Polimerase viral O segmento M são extremamente variáveis mostrando poucos aminoácidos conservados, não havendo portanto a formação de regiões extensas e conservadas entre as proteínas geradas por esses segmentos de RNA. Por outro lado, ao nível da polimerase viral, ambos os vírus em estudo mostraram as regiões conservadas denominadas I, II, III e IV ao longo da proteína L (polimerase viral). Em adição os motivos Pré-A (KGQKTAKDREIFLGEFEAKMCLYLVERIAK), A (GLKIEINADMSKWSAQDV), B (TVEIKRNWLQGNLNYTSSYLHSC), C (EALVNSMVHSDDNQT), D (GNQANMKKTYLT) e E (IKEFVSLFNIHGEPFSIYG) observados em outros Orthobunyavirus também mostraram-se conservados nos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261). A figura 14 ilustra as regiões conservadas, bem como os motivos descritos para os vírus pertencentes ao gênero Orthobunyavírus.

Figura 14 – Representação das regiões e motivos conservadas da polimerase viral das cepas INHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261).

Observar a presença das regiões I a IV, bem como o pré domínio A, e domínios A, B, C, D e E descritos na região III da polimerase. Fonte: Próprio autor

5.2.2. Poliproteína M As análises biocomputacionais envolvendo a região codificante para a poliproteína M dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255) evidenciou que as poliproteínas completas possuem 68 resíduos de cisteína e cinco sítios de glicosilação nas posições N65, N567, N731, N857 e N864. Ademais, os sítios de clivagem ou corte para ambos os vírus em estudo foram determinados e encontram-se listados no Quadro 7.

Quadro 7 – Regiões de clivagem para a poliproteína codificada pelo segmento MRNA dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255) que determinam as proteímas Gn, NSm e Gc. Regiões Proteícas Posiçao de Clivagem Regiões de Clivagem 5’/Gn 23 SNH/QI Gn/Nsm 307 KAR/QM Nsm/X 475 TML/TA X/Gc 515 QEL/YQ Gc/3’ 1375 EKE/GI Gn: glicoproteína aminoterminal; Gc: glicoproteína carboxiterminal; NSm: proteína não estrutural M; 5’ região não codificante 5’; 3’: região terminal não codificante 3’; X: indica continuidade na sequencia de aminoácidos e intercalar aos genes. Fonte: Próprio autor

Ademais, o motivo Zinc Finger, com seis resíduos de cisteína altamente conservados, foi detectado ao longo da glicoproteína Gn nas posições C262, C265, C275, C279, C 281, e C300, sendo que nos VORO, MIS 0397 e INHRR17a10 encontrou-se um sétimo resíduo de CIS (C287) exclusivo para esses vírus (Figura 15).

Figura 15- Região de Zinc Finger ao longo da gliciproteína Gn.

O quadro em vermelho indica a região com maior conservação do motivo Zinc Finger entre os vírus selecionados para o estudo. Evidenciadas pelas linhas azuis as cisteínas (Cis) conservadas em relação aos membros do grupo Simbu. A seta vermelha indica o resíduo C287 exclusivo para o VORO, MIS 0397 e INHRR17a10. Fonte: Próprio autor

Em relação a proteína não estrutural Nsm, detectou-se alta conservação do domínio I dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação ao VBUN. Por outro lado, moderada conservação foi encontrada para as regiões dos domínios II, IV e V enquanto que para o domínio III, baixa homologia foi observada. Na região do domínio IV, observou-se conservação parcial do motivo

GDFTNxCNSC que para os vírus vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) correspondeu a sequencia aminoacídica TNKCGTCICGC e TNRCGSCICGC, respectivamente (Figura 16).

Figura 16: Alinhamento dos domínios da Nsm em relação ao BUNV:

DOMÍNIO I DOMÍNIO II

DOMÍNIO III DOMÍNIO IV

DOMÍNIO IV DOMÍNIO V

DI a DV: domínios I a V da NSm; quadro em vermelho: conservação do DI da proteína Nsm. A linha verde indica a conservação parcial do motivo GDFTNxCNSC descrita para o grupos Bunyamwera e Califórnia. Fonte: Próprio autor.

Para a proteína Gc, entre as posições aminoacnoacídicas 1060 e 1086 observou-se nos dois vírus deste estudo conservação da região transmembrana descritas para vírus do grupo Bunyamwera, bem como do peptídeo de fusão WGCEExGCLAxxxGCV(F/Y)GSCQD observado dentre os membros do gênero Orthobunyavírus (Figura 17).

Figura 17 - Domínio de peptídeo de fusão presente na glicoproteína Gc dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255)

Região também conservada entre os integrantes da família Bunyaviridae e dos vírus do grupo Simbu. A seta vermelha indica a degeneração de aminoácidos na sequencia consenso. Fonte: Próprio autor

5.2.3. Proteínas N e NSs Para o gene N, em relação aos resíduos envolvidos no processo de empacotamento da ribonucleoproteína dos orthobunyavírus (P126, G138, Y86 e I232; posição em relação ao BUNV), os aminoácidos P e I foram conservados, porém nas posições P113 e I231 (Figura 18). No que tange os sítios associados a síntese de RNA (F18, F145, L161, Y186, L82, K80, Y186, W194, M195, F226), a maioria mostrou-se conservado nos genomas do gene N das cepas virais apresenta-se conservada no INHRR-17A-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255). Igualmente, observou-se a conservação de resíduos associados com função de habilidade de ligação com o RNA (R41, R95 e K51), sendo que os resíduos conservados são encontrados nas posições: R95 e K51; R95 e K51; e R95 e K51, respectivamente (Figura 19).

Figura 18 - Resíduos aminoacídicos envolvidos no processo de empacotamento da ribonucleoproteína dos orthobunyavírus.

Os aminoácidos envolvidos neste empacotamento estão marcados com o traço vermelho. Fonte: Próprio autor.

Figura 19: Resíduos aminoacídicos associados com função de habilidade de ligação com o RNA.

Os aminoácidos envolvidos na ligação ao RNA estão marcados com o traço vermelho. Fonte: Próprio autor.

5.3 CISTEÍNAS E SÍTIOS DE GLICOSILAÇÃO Os segmentos SRNA, MRNA e LRNA do Vírus MIS 0397 (TVP 19261) evidenciou a presença de um resíduo de cisteína ao nível da proteína N, 68 residuos na poliproteína M (sendo 17 na Gn, 7 na NSm e 40 Gc) e 37 na polimerase. Para o virus INHRR-17A-10 (TVP 19255) detectou-se também um único resíduo de cisteína ao nível da proteina N, 69 na poliproteína M (17 Gn, 8 NSm e 40 Gc), bem como 36 resíduos na polimerase (Figura 20)

Figura 20 – Representação esquemática das proteinas

Proteínas de Nucleocapsídeo (N) e proteína não estrutural S (NSs) codificadas ao nível do segmento SRNA (a), das glicoproteínas de superfície Gn e Gc bem como da proteína não estrutural M (NSm) codificada pelo segmento MRNA (b) e da polimerase viral codificada no segmento LRNA (c). Os traços em amarelo e azul correspondem aos resíduos de cisteínas determinados para cada segmento genômico. Fonte: Próprio autor

Em relação aos sítios potenciais de glicosilação, o segmento MRNA do vírus MIS 0397 (TVP 19255) mostrou o total de três o sítios (Gn=2; NSm=0; Gc=1), enquanto que para o virus INHRR-17A-10 (TVP 19261) detectaram-se dois sítios de glicosilação (Gn = 2; NSm= 0; Gc = 0). A figura 21 representa o posicionamento dos sítios de glicosilação ao longo das proteinas Gn, NSm e Gc dos vírus em estudo.

Figura 21- Sítios de glicosilação ao longo das proteínas Gn, NSm e Gc codificadas pelo segmento MRNA dos vírus INHRR-17A-10.

(a) (TVP 19261) e (b) MIS 0397 (TVP 19255). Barras verticais azuis representam as posições estimadas para os sítios potenciais de glicosilação. A barra vermelha horizontal representa o valor de corte (p=0.5) para determinação dos sítios de glicosilação. aa: aminoácido; números absolutos posicionados ao lado da sigla aa, representam as posições exatas dos sítios de glicosilação. Números no interior de parênteses representam os valores de p para cada sítio de glicosilação determinado. Fonte: Próprio autor.

5.4 ANÁLISE DE SIMILARIDADE GENÉTICA (NUCLEOTÍDICA E AMINOACÍDICA) A análise de similaridade nucleotídica e aminoacídica realizada entre os vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261), bem como entre os mesmos e diferentes membros do gênero Orthobunyavírus, mais precisamente com membros do grupo C (Apeu), Grupo California (La Crosse virus), Bunyamwera (Vírus Bunyamwera), Simbu (Oropouche e Jatobal) mostrou que para o segmento SRNA os vírus em estudo apresentaram maior similaridade nucleotídica (média de 93,4%) e aminoacídica (média de 96,7%) entre si e com os membros do grupo Simbu (similaridade nucleotídica média de 83,9%; similaridade aminoacídica média de 93,5%) (Tabela 4A).

Em relação aos seqmento MRNA, os vírus em estudo mostraram-se mais similares com os membros do grupo Simbu incluídos na análise (percentual médio nucleotídico e aminoacídico = 53,6%) e entre sí de 84,6% (nucleotídeos e aminoácidos) (Tabela 4B). Para o segmento LRNA, a similaridade entre os vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) foi de 83,5% para nucleotídeos e 95,2% para aminoácidos. Já entre os vírus estudados e o vírus Oropouche os percentuais médios foram 86,9% (nucleotídeos) e 96% (aminoácidos). Com o vírus jatobal os percentuais médios foram relativamente menores e determinados em 76% (nucleotídeos) e 86,2% (aminoácidos) (Tabela 4C).

Tabela 4 – Percentual de similaridade genetica (nucleotídica e aminoacídica) entre os virus INHRR- 17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) e outros Orthobunyavirus para os segmentos SRNA (A), MRNA (B) e LRNA (C).

Identidade Nucleotídica (%)

Vírus 1 2 3 4 5 6 7 1 Bunyamwera NC_001926 - 54,6 51,1 55,8 54,4 56,1 54,6 2 LaCrosse NC_004109 42,7 - 54,6 55,6 55,7 55,6 56,0 3 (A) APEU_BEAN848 41,0 43,4 - 52,5 53,0 52,7 53,2 4 MIS0397

KJ866387 41,6 42,7 37,9 - 91,1 95,4 83,2 5 INHRR17a10 KJ866390 41,6 42,7 37,9 100 - 95,3 84,3

6 Oropouche NC_005775 41,6 42,7 37,9 100 100 - 84, 2 7 Jatobal

JQ675602 42,9 43,6 39,7 93,5 93,5 93,5 -

Identidade aminoacídica

Identidade Nucleotídica (%)

Vírus 1 2 3 4 5 6 7 1 Bunyamwera

NC_001926 - 51,7 48,4 50,0 49,3 48,9 48,6 2 LaCrosse

NC_004109 42,2 - 48,0 48,0 48,0 47,0 48,6 (B)3 APEU_BEAN848 33,2 32,4 - 49,2 48,8 47,2 49,0 4 MIS0397

KJ866387 32,5 31,8 32,0 - 76,8 63,2 57,6 5 INHRR17a10

KJ866390 32,7 30,9 31,9 84,6 - 62,9 58,1 6 Oropouche

NC_005775 32,8 30,7 31,3 61,3 60,6 - 57,3

7 Jatobal

JQ675602 32,3 30,5 32,0 49,2 48,3 48,6 -

Identidade aminoacídica

Identidade Nucleotídica (%)

Vírus 1 2 3 4 5 6 7 1 Bunyamwera

NC_001926 - 59,5 56,8 58,5 57,8 58,4 57,2 2 LaCrosse

NC_004109 55,9 - 57,1 59,2 59,1 58,8 58,6 (C)3 APEU_BEAN848 51,0 50,4 - 60,2 59,9 60,0 59,9 4 MIS0397

KJ866387 50,5 51,7 53,4 - 83,5 90,2 75,9 5 INHRR17a10

KJ866390 50,2 52,1 53,4 95,2 - 83,7 75,6 6 Oropouche

NC_005775 50,1 51,4 53,1 97,7 94,4 - 76,0 7 Jatobal

JQ675602 50,4 51,1 53,3 86,5 86,6 86,0 -

Identidade aminoacídica Os números posicionados no triangulo superior correspondem aos percentuais de similaridade nucleotídica enquanto que os números posicionados no triangulo inferior e em negrito representam a similaridade entre sequencias de aminoácidos. Os maiores percentuais de identidade nucleotídica e aminoacídica encontram-se destacados no interior do quadro em cinza. O símbolo (-) corresponde a 100% de similaridade. Fonte: Próprio autor

5.5 FILOGENIA E ORIGEM EVOLUTIVA A análise filogenética dos vírus em estudo foi realizada por três diferentes métodos: Agrupamento de vizinhos, máxima verossimilhança e Bayesiano. Neste caso, a árvore construída pelo método bayesiano foi eleita para representar o relacionamento genético dos vírus em análise em relação a outros orthobunyavírus devido apresentar valores probabilísticos mais confiáveis para os grupamentos filogenéticos (p>0.90 ou 90%). Independente do segmento genômico analisado (S, M ou LRNA), os vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) agruparam-se juntamente com os membros do grupo Simbu (gênero Orthobunyavirus, família Bunyaviridae) (Figura 22, 23 e 24). Para o segmento SRNA, a análise filogenética comparativa mostrou a presença de nove grupos filogenéticos (I a IX) correspondente aos principais grupos antigênicos dos orthobunyavírus. Os vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) foram incluídos no grupo Simbu (V), mais especificamente na subclade

b juntamente com os vírus Jatobal, Oropouche, Buttonwillow e Mermet, sendo mais geneticamente relacionados ao Vírus Oropouche (valor de Probabilidade Posterior Bayesiana; PPB = 100) (Figura 22).

Figura 22 – Análise filogenética pelo método Baiesiano do segmento SRNA dos vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes membros do grupo Simbu (grupo V) e outros Orthobunyavírus.

99 KJ 866386 Iquitos virus MIS 0397 85 KF697144 Iquitos virus IQT9924 97 KP691626 Perdoes virus BeAn 789726 KP026181 Oropouche virus TRVL9760 I-a 99 98 KP052852 Oropouche virus BeAn19991 Group I 92 INHRR-17a-10 100 93 KF697146 Madre de Dios virus FMD1303 JQ675601 Jatobal virus I-b 94 JX983192 Oya virus I-c NC 009896 Akabane virus NC 018477 Simbu virus 80 55 HE795089 Aino virus 99 28 HE800143 Shuni virus HE795095 Peaton virus Group II 23 HE795092 Douglas virus

100 HE795104 Sathuperi virus 91 HE795107 Shamonda virus 99 JX853181 Schmallenberg virus HM627177 Leanyer virus virus NC001927 Bunyamwera virus

0.2

Os vírus em estudo encontram-se escritos no grupo I-a. Letras a, b e c correspondem aos subgrupos observados para o grupo Simbu (V). Os números acima de cada nó principal dos ramos da árvore filogenética correspondem aos valores percentuais de probabilidade posterior bayesiana (PPB) determinada pelo método bayesiano. O valor abaixo da escala,representa o número de substituições nucleotídicas por sítio para o conjunto de sequencias analisadas. Fonte: Próprio autor

A análise comparativa envolvendo 56 cepas do VORO demonstrou que o segmento SRNA do vírus MIS 0397 (TVP 19261) constitui um clado filogenético a parte (grupo V) mais relacionadas ao grupo II que inclui cepas isoladas no estado do Amapá, Rondônia, Pará (Magalhães Barata e Maracanã), enquanto que o vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) formou um clado geneticamente mais distante (VI) mais relacionada as cepas pertencentes ao clado I que incluem amostras dos estados do Pará, Tocantins, Maranhão e Trinidad. Ressalte-se que os vírus os virus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR- 17A-10 (TVP 19255) foram geneticamente mais relacionados às sequencias completas do segmento SRNA dos vírus Iquitos cepa IQT 9924 (Genbank KF697144) e Madre de Dios cepa FMD 1303 (genbank KF697146), respectivamente (Figura 23).

Figura 23 – Análise filogenética do gene N (693 nt) dos vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes cepas do Vírus Oropouche. PA44 PortoDeMoz 2004 RO03 Ariquemes 1991 RO02 OuroPretoDOeste 1991 PA43 PortoDeMoz 2004 PA49 MagalhaesBarata 2006 PA48 Maracana 2006 PE01 Peru 1992 PE04 Peru 1997 PE02 Peru 1993 II PA29 Altamira 1994 RO05 Ariquemes 1991 PE03 Peru 1993 AP05 Magazao 2009 AP03 Magazao 2009 AP04 Magazao 2009 AP01 Magazao 2009 MIS-0397 TVP-19261 Iquitos IQT 9924 KF697144 PN02 Panama 1989 PN03 Panama 1989 PN01 Panama 1989 AC02 XapuriAC 1996 RO01 MachadinhoDOeste 1990 III RO04 Ariquemes 1991 MG01 Arinos 2000 PN04 Panama 1989 MA02 PortoFranco 1988 AM01 Manaus 1980 IV AM03 Manaus 1980 PA05 Braganca 1967 PA03 Belem 1961 PA02 S.MiguelGuamaPA 1960 PA08 Maracana 1971 TR01 Trinidad 1955 PA06 Belem 1968 PA41 Parauapebas 2003 PA42 Parauapebas 2003 AM02 Manaus 1980 MA01 PortoFranco 1988 MA04 Brazil88a 1988 PA23 Tucurui 1988 PA30 VitoriaDoXingu 1996 TO01 Tocantins 2002 I PA15 TomeAcuPA 1978 PA36 Oriximina 1996 PA34 Oriximina 1996 MA06 BarraDoCorda 1993 MA05 PortoFranco 1988 PA31 Altamira 1996 PA33 Xapuri 1996 AC03 Acre 1996 AC01 Xapuri 1996 PA26 SerraPelada 1994 PA20 Portel 1980 MA03 PortoFranco 1988 PA21 Portel 1980 INHRR-17a-10 TVP-19255 V Madre de Dios FMD 1303 KF697146 Jatobal virus JQ675601

0.02

Os vírus presentes na figura foram isolados de distintas regiões geográficas, períodos e hospedeiros. Os quadros em linha preta representam os isolados virais em análise. Os números acima de cada nó principal dos ramos da árvore filogenética correspondem aos valores percentuais de probabilidade posterior bayesiana (PPB) determinada pelo método bayesiano. Algarismos romanos (I a V) correspondem aos grupos filogenéticos observados para o gene N. O valor abaixo da escala, representa o número de substituições nucleotídicas por sítio para o conjunto de sequencias analisadas. Fonte: Próprio autor. Em relação ao segmento MRNA, os virus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR- 17A-10 (TVP 19255), foram também incluídos no mesmo clado dos membros

pertencentes ao grupo Simbu (IV), no entanto ficaram filogeneticamente dispostos no subgrupo Va-1 e mais geneticamente associado ao subgrupo Va-2 (Figura 24).

Figura 24 – Análise filogenética da ORF completa do segmento MRNA dos vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes Orthobunyavirus

100 MIS_0397 I-a 100 KF697143_Iquitos_virus_IQT9924 INHRR_17a-10 100 I-b 100 KF697145_Madre_de_Dios_virus_FMD1303 81 KP026180_Oropouche_virus_TRVL9760 Group I I-c 100 KP052851_Oropouche_virus_BeAn19991 100 JX983193_Oya_virus virus I-d 69 KP691625_Perd›es_virus I-e 100 JQ675602_Jatobal_virus virus I-f HM627176_Leanyer_virus 63 NC_009895_Akabane_virus 100 HE795106_Shamonda_virus HE795094_Peaton_virus virus

94 NC_018478_Simbu_virus virus 100 HE795088_Aino_virus Group II 100 HE800142_Shuni_virus virus 100 JX853180_Schmallenberg_virus

100 HE795091__Douglas_virus 100 HE795103_Sathuperi_virus enomic RNA NC_001926_Bunyamwera virus

0.2 Os números acima de cada nó principal dos ramos da árvore filogenética correspondem aos valores percentuais de probabilidade posterior bayesyana (PPB) determinada pelo método bayesiano. Algarismos romanos (I a II) correspondem aos grupos filogenéticos observados para o segmento MRNA e as letras de a até f, significa subgrupos. O valor abaixo da escala, representa o número de substituições nucleotídicas por sítio para o conjunto de sequencias analisadas. Fonte: Próprio autor.

A análise do segmento MRNA usando sequencias parciais do gene Gn, evidenciou que os vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) são altamente similares aos vírus Iquitos e Madre de Dios, respectivamente. Ademais os vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e Madre de Dios, MIS 0397 (TVP 19261) e Iquitos formaram subgrupos diferentes (I-a e Ib, respectivamente) em relação aos vírus Oropouche (Ic), Jatobal (Id) e Aino (Ie) (Figura 25)

Figura 25 – Análise filogenética das sequencias parcias (517 nt) do gene Gn do segmento MRNA dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes Orthobunyavirus pertencentes ao grupo Simbu.

100 KJ 866388 MIS_0397 100 KF697142_Iquitos_virus_IQT9924 100 KP691624_Perdoes_virus_BeAn_789726 KP026179_Oropouche_virus_TRVL9760 I-a 100 100 KP052850_Oropouche_virus_BeAn19991 Group I 100 KJ 8663391 INHRR_17a-10 100 KF697147_Madre_de_Dios_virus_ 100 JQ675603_Jatobal_virus virus I-b 76 JX983194_Oya_virus virus I-c HM627178_Leanyer_virus

100 HE795087_Aino_virus 100 HE800141_Shuni_virus HE795093_Peaton_virus

100 NC_009894_Akabane_virus NC_018476_Simbu_virus Group II 80 100 HE795090_Douglas_virus 38 HE795102_Sathuperi_virus 100 HE795105_Shamonda_virus 100 JX853179_Schmallenberg_virus NC_001925_Bunyamwera_virus

0.1

As amostras virais em estudo encontram-se no interior dos quadrados associadas aos vírus Iquitos e Madre de Dios. Os números acima de cada nó principal dos ramos da árvore filogenética correspondem aos valores percentuais de probabilidade posterior bayesiana (PPB) determinada pelo método bayesiano. Algarismos romanos (I e II) correspondem aos dois grupos filogenéticos prncipais observados para o segmento MRNA dos vírus do grupo Simbu. Algarismos romanos acrescidos de letras do alfabeto (a-e) representam subgrupos filogenéticos. O valor abaixo da escala, representa o número de substituições nucleotídicas por sítio para o conjunto de sequencias analisadas. Fonte: Próprio autor

Em relação ao segmento LRNA, os vírus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR- 17A-10 (TVP 19255) também agruparam-se com os membros do grupo Simbu no clado V, sendo geneticamente mais relacionado com o segmento completo do Vírus Oropouche (Figura 26). A análise de sequencias parciais do segmento LRNA, evidenciou que os vírus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR-17A-10 (TVP 19255) são similares aos Vírus Iquitos e Madre de Dios, respectivamente (Figura 27).

Figura 26 – Análise filogenética das sequencias completas do gene da polimerase (segmento LRNA) dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes Orthobunyavirus pertencentes ao grupo Bunyamwera (I), Wyeomyia (II), Guaroa (III), California (IV), Simbu (V) e Grupo C (VI).

As amostras virais em estudo encontram-se em vermelho associadas ao vírus Oropouche. Os números acima de cada nó principal dos ramos da árvore filogenética correspondem aos valores percentuais de probabilidade posterior bayesiana (PPB) determinada pelo método bayesiano. Algarismos romanos (I a VI) correspondem aos grupos filogenéticos principais observados para o segmento LRNA dos orthobunyavirus. O valor abaixo da escala, representa o número de substituições nucleotídicas por sítio para o conjunto de sequencias analisadas. Fonte: Próprio Autor

Figura 27 – Análise filogenética das sequencias parcias (517 nt) do gene da polimerase (segmento LRNA) dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) em comparação com sequencias de diferentes Orthobunyavirus pertencentes ao grupo Simbu.

As amostras virais em estudo encontram-se no interior dos quadrados associadas aos vírus Iquitos e Madre de Dios. Os números acima de cada nó principal dos ramos da árvore filogenética correspondem aos valores percentuais de probabilidade posterior bayesiana (PPB) determinada pelo método bayesiano. Algarismos romanos (I e II) correspondem aos dois grupos filogenéticos prncipais observados para o segmento LRNA dos vírus do grupo Simbu. Algarismos romanos acrescidos de letras do alfabeto (a-b) representam subgrupos filogenéticos. O valor abaixo da escala, representa o número de substituições nucleotídicas por sítio para o conjunto de sequencias analisadas. Fonte: Próprio autor.

5.6 REARRANJO GENÉTICO A análise para avaliar a presença de eventos de troca de segmentos genômicos empregando o programa Simplot (Bootscan) evidenciou claramente alto percentual de permutação filogenética para os segmentos SRNA e LRNA (>80%) dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255) com o VORO (genBank SRNA: NC_005776; LRNA: NC_005776), bem como evidenciou diferença significante (valor de permutação filogenética < a 20%) com o VORO e outros membros do grupo Simbu para o segmento MRNA (Figura 28)

Figura 28 – Análise de similaridade genômica realizado pelo método de Simplot

Sequencias concatenadas para as regiões codificantes dos segmentos SRNA, MRNA e LRNA (representados pelas setas amarelas e letras S, M e L, respectivamente) dos vírus MIS 0397, INHRR 17a-10 e outros orthobunyavirus (Bunyamwera, La Crosse, Apeu e Jatobal). Os números no eixo das ordenadas correspondem aos percentuais de similaridade (%) enquanto que os valores numéricos evidenciados no eixo das abississas correspondem a posição do genoma viral. A linha vertical tracejada encontram-se limitando a posição de cada segmento genômico. Fonte: Próprio autor.

Com base no relacionamento filogenético e análise pelo Simplot (Bootscan), sugere-se o padrão de rearranjo S1M2L1 conforme ilustrado na figura 29.

Figura 29 – Representação esquemática do evento de rearranjo genético para os vírus MIS 0397 (TVP 19255) e INHRR 17a-10 (TVP 19261).

Padrão de rearranjo genetico S1M2L1 para os virus NHRR-17a-10 (TVP 19261) e MIS 0397 (TVP 19255), aonde observa-se que ambos conservaram os segmentos SRNA e MRNA do VORO (P1) e herdaram o segmento MRNA de virus parentais distintos (P2 e P3). O símbolo de interrogação sugere que os parentais P2 e P3 correspondem a virus do grup Simbu sem genoma completo para os segmentos M e L RNA. Fonte: Próprio autor.

5.7 CÁLCULOS DE EXCLUSÃO E INCLUSÃO INTRAGRUPO (BOX PLOT) Os cálculos realizados com base nas distâncias nucleotídicas entre os vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) e com os vírus dos gêneros contidos nos alinhamentos que originaram as árvores filogenéticas (distância par a par), distância dentro do grupo Simbu (distância intragrupo) e distância entre o grupo Simbu e cada gênero da família Bunyaviridae (distância intergrupos) para as sequências nucleotídicas dos três segmentos genômicos evidenciaram que as distâncias nucleotídicas para segmentos SRNA (Tabela 5) , MRNA (Tabela 6) e LRNA (Tabela 7) dos vírus INHRR-17A-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) foram menores entre si (intragrupo) do que quando comparados com os demais vírus selecionados para as análises filogenéticas.

Tabela 5 - Estimativas de valores de distância Intergrupos para o segmento SRNA dos vírus do grupo Simbu, grupo C, grupo Anopheles A, grupo Anopheles B, grupo Batama, grupo Bwamba, Grupo Califórnia, grupo Bunywamwera em relação aos vírus NHRR- 17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) Grupo Distância média Distância média Intergrupo Intragrupo Simbu 0,249 0,484 C 0,195 0,488 Anopheles A 0,420 0,526 Anopheles B 0,245 0,553 Batama 0,211 0,534 Bwamba 0,208 0,415 Califórnia 0,227 0,372 Bunywanwera 0,173 0,417 Fonte: Próprio autor.

Da mesma maneira, as estimativas das divergências intragrupo para os vírus do grupo Simbu, para os mesmos segmentos foram menores do que as relações de divergência do grupo Simbu com os demais sorogrupos da família Bunyaviridae (Tabela 6 e Tabela 7).

Tabela 6 - Estimativas de valores de distância Intergrupos para o segmento MRNA dos vírus do grupo Simbu, grupo C, Grupo Califórnia, grupo Bunywamwera em relação aos vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261). Grupos Distância média Intragrupo Distância média Intergrupo

Simbu 0,485 0,537

C 0,300 0,520

Califórnia 0,334 0,493

Bunywanwera 0,353 0,482

Fonte: Próprio autor.

Tabela 7 - Estimativas de valores de distância Intergrupos para o segmento LRNA dos vírus do grupo Simbu, grupo C, Grupo Califórnia, grupo Bunywamwera em relação aos vírus NHRR-17a-10 (TVP 19255) e MIS 0397 (TVP 19261) Grupo Distância média Intergrupo Distância média Intergrupo

Simbu 0,290 0,429

C 0,213 0,423

Califórnia 0,285 0,417

Bunywanwera 0,286 0,415 Fonte: Próprio autor.

Os resultados da estimativa das distâncias par a par, intragrupo e intergrupos em relação a cada um dos gêneros da família Bunyaviridae foram plotados em um gráfico do tipo boxplot, nos quais foram representados os valores: máximos e mínimos de divergência, evidenciados pelas linhas verticais externas às caixas; valores de divergência do primeiro e terceiro quartil do número total de divergências, representados pelas extremidades inferior e superior dos diagramas; e mediana das divergências, demonstrada pela linha interna dos diagramas. Os valores estimados de distância par a par para os segmentos SRNA, MRNA e LRNA, citadas acima. Percebe-se nos gráficos dos segmentos SRNA, MRNA e LRNA, uma definição clara dos grupos de comparação, em função de suas distâncias intragrupo e intergrupos, pois não ocorre sobreposição significativa das respectivas distâncias à área inter-quartil dos diagramas que indicam as estimativas de distância intergrupo dos integrantes do grupo Simbu com os

demais grupos analisados (Figuras 30, 31 e 32) indicando que a maioria dos valores é significativamente diferente com intervalo de confiança de 95%. Entretanto, observou-se, para o SRNA, a sobreposição das medianas dos vírus deste estudo com o primeiro quartil das distâncias intragrupo Simbu. Para o MRNA, ocorre também a sopreposição das medianas dos vírus MIS 0397 e INHRR-17a10 com o primeiro quartil das distâncias intra-grupo Simbu. O segmento LRNA se mostra um pouco menos sobreposto, pois a mediada dos vírus em estudo sobrepões os valores intragrupo Simbu.

Figura 30 - Representação gráfica das distâncias genéticas inter e intragrupo com base no segmento SRNA dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a 10 em comparação a outros membros dos grupos Anopheles A, AnophelesB, Buwamba, Bunyamwera, Califórnia e C.

Fonte: Próprio autor.

Figura 31 - Representação gráfica das distâncias genéticas inter e intragrupo com base no segmento MRNA dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a 10 em comparação a outros membros dos grupos Anopheles A, AnophelesB, Buwamba, Bunyamwera, Califórnia e C.

Fonte: Próprio autor.

Figura 32 - Representação gráfica das distâncias genéticas inter e intragrupo com base no segmento LRNA dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a 10 em comparação a outros membros dos grupos Anopheles A, AnophelesB, Buwamba, Bunyamwera, Califórnia e C.

Fonte: Próprio autor.

A confiabilidade dos dados obtidos foi confirmada pela análise estatística do tipo Teste-T para variâncias não homogêneas, com intervalo de confiança de 95%, a partir dos quais se obteve valores de p maiores que 0,05 na comparação entre as estimativas das divergências intra-grupo e intergrupo para os segmentos genômicos S, M e LRNA dos membros do grupo Simbu em relação aos mesmos segementos dos demais vírus pertencentes aos outros grupos antigênicos analisados, o que indicou que há diferença significativa entre o grupo Simbu e os demais grupos. A tabela 8 evidencia a diferença entre as estimativas de distância intragrupo do grupo Simbu e as distâncias

intergrupo do MIS 0397 e INHRR-17a10 em relação aos demais orthobunyavirus.

Tabela 8 - Dados referentes aos resultados obtidos pelo Teste T das distâncias Intragrupo dos membros pertencentes ao grupo Simbu e intergrupo para os vírus MIS 0397 e INHRR17a-10. Média Intra Simbu Média Inter-Simbu / Valor de p SRNA MIS0397 0,249 0,282 0,3008 Média Inter-Simbu / Valor de p INHRR17a-10 0,281 0,2 Média Intra Simbu Média Inter-Simbu / Valor de p MRNA MIS0397 0,485 0,475 0,4495 Média Inter-Simbu / Valor de p INHRR17a-10 0,472 0,3681 Média Intra Simbu Média Inter-Simbu / Valor de p LRNA MIS0397 0,290 0,201 0,01151 Média Inter-Simbu / Valor de p INHRR17a-10 0,248 0,01274

6. DISCUSSÃO A amazônia Brasileira é considerada um dos ecossistemas mais ricos em termos de biodiversidade aonde co-existem cerca de 5,000 espécies de vertebrados, 50.000 espécies de plantas e 10 a 15 milhões de espécies de plantas e inúmeros microorganismos, dentre agentes virais, bactérias e fungos (TRAVASSOS, 1983; MARES, 1992; ISCKIA, 2009; REGALADO, 2010; MOURA, 2013). Em relação aos arbovírus, os VORO, VDEN (sorotipos 1 a 4), VMAY destacam-se no Brasil por causarem epidemias em humanos (PINHEIRO et al., 1976; GUZMAN e KOURI, 2002; TERZIAN, 2009; VASCONCELOS et al., 2009; GUZMAN et al., 2010) e mais recentemente o Vírus CHIK que foi introduzido no país em 2013 e causou forte epidemia em 2014 (SAÚDE, 2005) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015) Nas últimas quarto décadas, O VORO vem sendo amplamente estudado em termos de epidemiologia incluindo o ciclo de transmissão, modelo animal para estudos em patologia experimental e epidemiologia molecular (DIXON et al., 1981; PINHEIRO et al., 1981; AZEVEDO, 2007; VASCONCELOS et al., 2011). Os estudos moleculares mais recentes incluindo o sequenciamento genômico do segmento SRNA complete e parcial dos segmentos M e LRNA de diferentes cepas Brasileiras e Peruanas (SAEED et al., 2001; AGUILAR et al., 2011; VASCONCELOS et al., 2011) favoreceram o melhor entendimento a respeito da epidemiologia molecular desse importante patógeno humano. No Brasil, desde a década de 1960 o VORO vem causando epidemias no país, mais especificamente na Amazônia Brasileira (ANDERSON et al., 1961; PINHEIRO et al., 1976; DIXON et al., 1981; AZEVEDO, 2007; VASCONCELOS et al., 2009). A última epidemia clinica e laboratorialmente reportada ocorreu em 2009 no Amapá e desde o seu primeiro isolamento até 2009, centenas de milhares de pessoas foram infectadas pelo VORO (VASCONCELOS et al., 2011). As análises dos genomas completos para os isolados MIS 0397 e INHRR17a-10 mostraram que ambos possuem e organização genômica compatível com a observada para membros do gênero Orthobunyavírus evidenciando três segmentos de RNA (S, M e L) com tamanhos compatíveis, presença de quarto ORFs que codificam as proteínas N e NSm (segmento SRNA), poliproteina M (segmento MRNA) e polimerase viral (segmento LRNA) (Quadro 6, Figura 9), além de regiões complementares nas extremidades 3’ e

5’ de cada um dos RNAs virais também observados nos orthobunyavirus (Figura 12). As proteínas Gn, NSm e GC, assim como nos demais orthobunyavírus apresentaram sitios de clivagem similares (conservados), sem alterações marcantes, que originaram as duas glicoproteínas de superfície Gn e Gc, bem como a proteína não estrutural Nsm (Figura 9) (DIETZGEN et al., 2011). Os vírus são agentes causadores de doenças cujo espectro clínico varia deste uma simples gripe até doenças graves como febres hemorrágicas, hepatitis, síindromes neurológicas e imunodeficientes e possuem diferentes proteinas (estruturais e não estruturais) associadas a importantes funções biológicas tais como a ligação virus-célula hospedeira, transcrição, replicação e patogenia viral (DIETZGEN et al., 2011). Mais especificamente, as proteinas de matriz (estruturais) são responsáveis pela ligação do virus a célula infectada, montagem da particular viral e por sua liberação no meio extracelular. As proteínas de matriz de diferentes virus apresentam uma distribuição específica de regiões ricas em carbonos e altamente hidrofóbicas. O conteúdo de adenina-uracila, também conhecido por percentual de A-U, assume importante papel na conservação dos genomas. Como os resíduos de U possuem um papel importante no processo de tradução do RNA mensageiro (RNAm) em proteínas, a quantidade e distribuição de adenina (A) e uracila (U) nos genomas virais (ex: H1N1, Chikungunya, Dengue, Oeste do Nilo, Encefalite japonesa) constitui um fator importante e decisivo para a estabilidade protéica e conservação de propriedades biológicas sob o ponto de vista de hidrofobicidade e saturação de carbono. Estruturas pobres em A-U ou ricas em G-C são estruturalmente mais conservadas e consequentemente mantêm a função biológica (JAYARAJ et al., 2009; PACE et al., 2011; RAJASEKARAN, 2011). No caso dos virus MIS 0397 e INHRR17a-10 os percentuais de A-U encontrados nos segmentos de RNA (S, M e L) foram variados, similares aos observados para outros orthobunyavírus e relativamente menores em regiões associadas a áreas codificantes do genoma, sendo os menores percentuais observados para as regiões gênicas correspondents as proteinas N e L e maiores percentuais para as regioes dos genes associados às glicoproteínas de superfície Gn e Gc.

Os valores percentuais de A-U menores encontrados para os genes N e L provavelmente refletem a necessidade de conservação do genoma e manutenção de uma estrutura rica em conteudo G-C que viabiliza maior estabilidade genômica e consequentemente menor exposição a pressões seletivas que posam modificar a função das proteínas e com isso alterar importantes características biológicas dos virus associadas a replicação e reconhecimento por anticorpos neutralizantes. A análise de similaridade genômica (nucleotídica e aminoacídoca) vem sendo amplamente utilizada para avaliar o quanto um genoma é semelhante a outro auxiliando a classificação de um determinado vírus (DIETZGEN et al., 2011). Percentuais de divergência nucleotidica e principalmente aminoacídica são usados pelos comitês de taxonomia viral organizados pelo ICTV (International Committee on Taxonomy of Virus) para definir a inclusão de um dado agente viral em grupo específico. Para os Orthobunyavírus, estabeleceu- se que para um determinado virus seja incluso em uma espécie, o mesmo deve possuir menos de 7% de percentual aminoacídico em relação aos demais membros que constituem o gênero tendo como base as proteínas de nucleocapsídeo, Gn, Gc e polimerase viral (DIETZGEN et al., 2011). Em relação aos virus MIS 0397 e INHRR17a-10, as analises de similaridade nucleotídica e aminoacídica (Blast n, Blast tx) indicaram alto percentual de similaridade dos segmentos S e L com o VORO e similaridade do segmento M RNA com fragmentos genômicos de aproximadamente 500 nt (166 aa) com os virus Iquitos e Madre de Dios descritos por Avelar et al. 2011 e Ladner et al., 2014 (LADNER et al., 2014). No que tange a avaliação de regiões conservadas ao longo dos genomas dos virus em análise, observou-se que ambos mostraram os motivos conservados ao nível da polimerase viral evidenciados para os demais membros do gênero Orthobunyavirus. Isto sugere que tais conservações (regiões I a IV e domínios A, B, C, D e E da região III) são essenciais para a manutenção da função de polimerase viral exercida pela proteína L codificada no segmento LRNA (SAVJI et al., 2011). O segmento MRNA dos orthobunyavírus codifica uma única poliproteína que após ação de enzimas virais e oriundas do hospedeiro originam as glicoproteínas Gn, Gc e a proteína não estrutural NSm (DIETZGEN et al., 2011).

Os virus MIS 0397 e INHRR17a-10 mostraram regiões de clivagem altamente conservadas quando comparadas com as observadas para os membros do grupo Simbu (ex. VORO, Vírus Akabane, Vírus Tinaroo) confirmando a natureza do RNA viral associado aos membros do grupo Simbu (Quadro 7) As glicoproteínas Gn e Gc apresentam funções associadas a ligação do virus à células hospedeira viabilizando o processo de adsorção viral que culmina na invasão do agente viral ao meio intracelular do hospedeiro infectado. Sabe-se também que ambas as proteinas sofrem grande pressão imunogênica e apresentam características estruturais marcantes que promovem as funções de ligação viral à receptores celulares (GUU et al., 2012). A integridade e estabilidade das estruturas protéicas está diretamente associada ao perfil de resíduos de Cisteína (Cys) presentes em dada sequencia de aminoácidos (MISETA, 2000; LIPTON et al., 2002) uma vez que as Cys promovem a formação de pontes dissulfetos extremamente estáveis. No caso dos virus MIS 0397 e INHRR17a-10, assim como os demais orthobunyavírus, ambos mostraram sete resíduos de Cys ao longo das sequencias aminoacídicas das proteinas Gn e Gc, o que reforça a manutenção estrutural de suas glicoproteínas e consequentemente a função biológica. Ademais, a estrutura Zinc Finger presente na proteína Gn, cuja função biológica está relacionada a ligação RNA-proteína como um co-fator de transcrição mostrou-se conservada com relação aos membros do grupo Simbu (Figura 13), enfatizando mais uma vez, a natureza do segmento M associado a este grupo viral. Em relação a NSm, a real função desta proteina permanece desconhecida apesar de haver hipóteses de que a mesma pode estar relacionada ao processo de replicação viral assim como a proteina NSs (FULLER et al., 1983; GUU et al., 2012). No caso dos MIS 0397 e INHRR17a-10, dentre os domínios descritos para o VBUN, ambos os virus mostraram conservação apenas para o domínio I (Figura 14) sugerindo que as funções biológicas exercidas pela NSm desses virus possam estar associadas mais fortemente a esse domínio. No caso da proteina Gc, sabe-se que esta glicoproteína de alto peso molecular (110 KDa), apresenta uma região extremamente importante e que, em conjunto com as regiões conservadas da prteína Gn (35 KDa), proporciona a ligação do virus a célula hospedeira (SHI et al., 2009; DIETZGEN et al., 2011).

Esta região é denominada de peptideo de fusão e mostrou-se altamente conservada nos virus MIS 0397 e INHRR17a-10 quando comparada aos VBUN, VORO e outros membros do grupo Simbu (Figura 15) demonstrando que a função biológica exercida por esta região foi conservada nos vírus estudados. Outro aspecto observado, referiu-se a conservação no número de resíduos Cys ao longo das proteinas Gn, NSm e Gc quando comparado aos membros do grupo Simbu (Figura 19). Tal conservação também sugere a manutenção estrutural das proteínas e consequentemente manutenção das respectivas funções biológicas para os processos ligação viral (Gn e Gc) e de replicação do virus (NSm) (LIPTON et al., 2002). A presença de sítios de glicosilação em uma proteina associado a presença de um peptideo sinal para glicosilação sugere presença de uma glicoproteína. As glicoproteínas são proteinas extremamente importantes para o processo de ligação do vírus a célula hospedeira. Sabe-se que nos bunyavírus, ambas as glicoproteínas (Gn e Gc) estão associadas a ligação vírus-célula hospedeira e que o número de glicosilações ao longo da proteína pode estar associado ao reconhecimento específico de um receptor e estar relacionado a patogenia exercida por um agente viral (DENG, 1994; MURRELL et al., 2004; PANDA, 2004). No caso dos vírus MIS 0397 e INHRR17a-10, o padrão de glicosilação para as glicoproteínas Gn e Gc foi diferente (Figura 18). Levando em consideração que o vírus MIS 0397 foi isolado de humanos e o vírus INHRR17a-10 foi isolado de primata não humano, e que o primeiro foi obtido de amostra de um paciente febril, é aceitável que exista esta diferença no número de sítios de glicosilação entre os dois vírus o que pode justificar o diferencial patogênico em humanos. As análises relacionadas as proteínas N e NSs codificadas no segmento SRNA dos vírus vírus MIS 0397 e INHRR17a-10 mostraram conservação em sítios aminoacídicos importantes (Figura 16, Figura 17) o que sugere conservação das propriedades biológicas desses vírus tais como atividade antigênica fixadora do complemento, empacotamento da ribonucleoproteína e ligação de RNA a proteínas o que promove a formação dos três ribonucleocapsídeo (DIETZGEN et al., 2011).

O emprego da análise filogenética tem sido de grande valia para a elucidação do relacionamento genético entre diferentes agentes virais pertencentes ao gênero Orthobunyavirus (KONO et al., 2002; YANASE, 2003; LAMBERT e LANCIOTTI, 2008; YADAV et al., 2008; GARIGLIANY et al., 2012; STEUKERS, 2012), bem como para a definição taxonômica de muitos agentes virais ora parcialmente sequenciados (JOHANSSON et al., 2001; SAEED et al., 2001; NUNES et al., 2005; MORES, 2009). Com o advendo do sequenciamento genômico de próxima geração, conhecido com NGS (Next Generation Sequencing), muitos genomas completos para os membros do gênero Orthobunyavírus foram obtidos o que tem facilitado a identificação desses agentes. No caso dos virus MIS 0397 e INHRR17a-10, a filogenia usando as sequencias completas dos segmentos de RNA genômico evidenciou que os RNAs desses virus possuem diferentes origens genéticas, sendo os segmentos S e L associadas ao VORO (Figura 20, Figura 21 e Figura 25) e o MRNA geneticamente mais relacionado ao Vírus Jatobal (Figura 22). A análise filogenética direcionada a diferentes genomas do segmento SRNA do VORO isolados no Brasil, Peru, Panamá e Trinidad evidenciou que apesar de associados ao VORO, os virus MIS 0397 e INHRR17a-10 possuem divergência no que se refere a origem do segmento SRNA, sendo o primeiro relacionado ao Vírus Iquitos, um patógeno humano recentemente descrito no Peru (AGUILAR et al., 2011) associado ao VORO (genótipo II), enquanto que o virus INHRR 17a-10 foi associado ao SRNA de um virus isolado de um primata não humano (Cebus paella) denominado Madre de Dios (LADNER et al., 2014) e até o momento não associado a doença em humanos (Figura 23). Para o segmento M, as analises com genoma completo mostraram que os virus MIS 0397 e INHRR17a-10 formaram um grupo a parte do VORO sendo que seus RNAs, apesar de monofiléticos entre si, devido a divergencia nucleotídica e aminoacídica (Tabela 4) provavelmente pertencem a agentes virais de espécies distintas (Figura 23). Tais resultados foram corroborados com as analises de Simplot (Figura 26) aonde observa-se claramente maior similaridade dos segmentos S e L com o VORO e baixa similaridade com os demais vírius do grupo Simbu. O ecossistema amazônico pela sua grande riqueza em biodiversidade favorece o acontecimento de rearranjo genético. Alguns agentes virais, como

no caso dos virus do grupo C e Guamá coexistem com hospedeiros e em habitats comuns o que facilita o processo de co-infecção e a geração de progenies virais rearranjadas conforme sugerido por Nunes e colaboradores (CALISHER, 1983; NUNES et al., 2005). O contato de diferentes hospedeiros vertebrados e invertebrados que coexistem em um mesmo nicho ecológico associado ao manejo inadequado do meio ambiente pode resultar na emergencia de novos agentes (VASCONCELOS, 2001). Os orthobunyavírus têm demosntrado ser um grupo altamente diverso e, até pouco tempo, quase nada se sabia sobre os mecanismos moleculares e evolutivos relacionados a geração de biodiversidade viral. A obtenção de genomas parcias e completos empregando o sequenciamento de última geração tem proporconado uma visão mais clara a respeito do relacionamento genetico desses vírus contribuindo para o correto posicionamento ou sugestão de inclusão dos agentes virais em um dado grupo, gênero e ou família, mesmo para vírus não cultiváveis cujo genoma foi identificado por análise metagenômica como no caso dos phlebovírus Otter fecal phlebovirus e red fecal Phlebovirus (BODEWES et al., 2014). A reconstrução de genomas por sequenciamento genetico também têm auxiliado na elucidação na origem dos genomas de RNA no que tange o processo de troca de segmentos. Como exemplos podemos citar os Vírus Caraparu, Vírus Itaqui, Vírus Marituba, Vírus Apeu (Grupo C), Vírus Nigari (grupo Bunyamwerar), Vírus Gamboa (dados não publicados), Guamá (dados não publicados) e o próprio VORO apresentam evidências de troca de segmento genômico entre membros do seus respectivos grupos antigênicos (GERRARD, 2004; NUNES et al., 2005). Esta troca de segmentos parece ser mais frequente do que se imagina e sugere o rearranjo genético como sendo o mais provável mecanismo de geração de biodiversidade entre estes agentes virais (GERRARD, 2004). No caso dos virus MIS 0397 e INHRR17a-10, a análise de similaridade (alinhamento múltiplo, Simplot) mostraram a orígem distinta dos segmentos de RNA desses virus. A análise de Boxplot (Figuras 28, 29 e 30) e teste T (Tabela 8) também deram suporte estatístico para a orígem dos RNAs genômicos sugerindo um padrão de rearranjo genetico do tipo S1M2L1, padrão este comumente encontrados entre os orthobunyavirus que demonstra a herança do

segmento MRNA de um virus parental distinto do virus que cedeu os segmentos S e L, neste caso o VORO (Figura 27). O VORO é um importante patógeno humano e parece estar envolvido em diferentes processos de rearranjo genetico servindo como vírus parental e contribuindo para a emergência de novos vírus, patógenos humanos ou vírus que infectam animais. O caso mais recente publicado em literatura, refere-se ao vírus Iquitos isolado no Perú de diferentes pacientes com sintomatologia febril similar a Dengue. Esse vírus foi identificado por sequenciamento genético e testes antigênicos (FC e IH) como um vírus rearranjado entre o VORO e um vírus do grupo Simbu não identificado (AGUILAR et al., 2011). Outro caso de rearranjo envolvendo o VORO associa um Vírus chamado Madre de Dios, isolado também no Peru a partir de amostras de sangue de humanos com sintomatologia febril e de primatas não humanos (LADNER et al., 2014) além de um vírus isolado no estado de Minas Gerais em 2013, denominado de Vírus Perdões, por ter sido isolado na região de Perdões, Minas Gerais e que apresentou os segmentos S e L altamente similares ao VORO e o segmento M similar a algum vírus do grupo Simbu (dados não publicados). Ademais, em 2005, também no estado de Minas Gerais isolou-se o VORO de um primata não humano do gênero Callithrix (NUNES et al., 2005) mesmo gênero do qual o Vírus Perdões foi isolado. Neste contexto, nota-se um grande envolvimento do VORO como parental de outros agentes virais, uns patógenos humanos e outros aparentemente restritos a animais, mostrando o importante papel do VORO no processo de biodiversidade viral dos vírus do Grupo Simbu isolados na Amazônia. A importância da vigilância epidemiológica e virológica é, de fato, fundamental para a avaliação da prevalência de um agente viral em determinada região. O sistema de vigilância epidemiológica do Brasil vem contribuindo ativamente para que novos agentes virais e agentes reemergentes sejam detectados no país e devidamente investigados (Instituto Evandro Chagas, Ministério da Saúde, dados não publicados). No caso do VORO, evidencias de circulação do vírus, seja por detecção de anticorpos, isolamento viral ou detecção de genoma ocorrem periodicamente dentro da área endêmica e esporadicamente em outras regiões oficialmente consideradas indenes (NUNES et al., 2005; TERZIAN, 2009) sugerindo que este vírus circula de maneira

silenciosa e de tempos em tempos causa epidemias e pode co-circular com outros vírus do grupo Simbu ainda não identificados e gerar progênies virais biologicamente distintas (AGUILAR et al., 2011). As evidências de que o VORO está envolvido com o processo de geração de pelo menos três novos vírus tais como os Vírus Iquitos, Madre de Dios e Perdões mostra o grande potencial do micro e macro ambiente natural em que o VORO circula e a importância desse vírus para a epidemiologia viral e saúde pública da região Amazônica. Os dados apresentados neste trabalho foram fundamentais para definir a identificação dos vírus MIS 0397 e INHRR17a-10 isolados na Amazônia Peruana como agentes associados ao processo de rearranjo viral, evidenciando que na região Amazônica Brasileira circulam vírus com potencial patogênico humano, bem como agentes zoonóticos que podem co-circular com outros vírus do mesmo grupo e dar origem a novos vírus. Por fim, é valido ressaltar a importância de se conhecer a fundo a epidemiologia molecular do VORO, bem como dos orthobunyavírus na Amazônia, a fim de ampliar os conhecimentos sobre a biodiversidade viral Amazônica e seus efeitos na saúde humana e animal da região.

7. CONCLUSÕES

a) Os vírus MIS 0397 e INHRR17a-10 apresentaram organização genômica compatível com vírus pertencentes ao grupo Simbu do gênero Orthobunyavirus;

b) Os isolados MIS 0397 e INHRR17a-10 mostraram genomas que codificam no total seis proteínas virais, sendo três estruturais (N, Gn e Gc) e três não estruturais (NSs, NSm e polimerase viral);

c) Os vírus MIS 0397 e INHRR17a-10 possuem características genéticas (tamanho, composição A-U, número de resíduos de Cisteína, sítios de glicosilação e motivos conservados nos genes) semelhantes aos orthobunyavírus;

d) As análises de similaridade genética (nucleotídica e aminoacídica) e filogenia mostraram que os vírus MIS 0397 e INHRR17a-10 são membros do grupo Simbu pertencente ao gênero Orthobunyavírus;

e) A reconstrução de filogenética dos três segmento genômicos de RNA mostrou que os vírus MIS 0397 e INHRR17a-10 possuem RNAs com origem evolutiva distinta;

f) A filogenia molecular associada as analises estatísticas pelo Simplot, Box plot e Teste T mostraram que os vírus MIS 0397 e INHRR17a-10 são vírus que herdaram seus segmentos S e L do VORO e o segmento M de vírus distintos pertencentes ao grupo Simbu;

g) O padrão de rearranjo genético para os vírus MIS 0397 e INHRR17a-10 foi identificado como S1M2L1;

h) Os vírus MIS 0397 e INHRR17a-10 foram identificados por análise do genoma complete do segmento S e parcial dos segmentos M e L como isolados dos vírus Iquitos e Madre de Dios;

i) As sequencias obtidas corespondem aos primeiros dados referentes aos genomas completos (ORF) para os vírus Iquitos e Madre de Dios

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ANEXO AUTORIZAÇÃO PARA UTILIZAÇÃO DA AMOSTRA

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