1.2. Structure Du Virion Et Génome Viral

VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2020 - Thèse n°027

MÉCANISMES MOLÉCULAIRES IMPLIQUÉS DANS LA PATHOGENÈSE DU VIRUS DE LA FIÈVRE HÉMORRAGIQUE DE CRIMÉE-CONGO

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 25 septembre 2020 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

LEROLLE Solène Née le 6 mars 1997 à Angers (49)

VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2020 - Thèse n°027

MÉCANISMES MOLÉCULAIRES IMPLIQUÉS DANS LA PATHOGENÈSE DU VIRUS DE LA FIÈVRE HÉMORRAGIQUE DE CRIMÉE-CONGO

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 25 septembre 2020 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

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LEROLLE Solène Née le 6 mars 1997 à Angers (49)

Liste des Enseignants du Campus Vétérinaire de Lyon (01-09-2019)

ABITBOL Marie DEPT - BASIC- SCIENCES Professeur ALVES-DE-OLIVEIRA Laurent DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences ARCANGIOLI Marie-Anne DEPT - ELEVAGE- SPV Professeur AYRAL Florence DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences BECKER Claire DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences BELLUCO Sara DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences BENAMOU- SMIT H Agnès DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences BENOIT Etienne DEPT - BASIC- SCIENCES Professeur BERNY Philippe DEPT - BASIC- SCIENCES Professeur BONNET - GARIN Jeanne-Marie DEPT - BASIC- SCIENCES Professeur BOULOCHER Caroline DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences BOURDOISEAU Gilles DEPT - ELEVAGE- SPV Professeur BOURGOIN Gilles DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences BRUY ERE Pierre DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences BUFF Samuel DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences BURONFOSSE Thierry DEPT - BASIC- SCIENCES Professeur CACHON Thibaut DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences CADORÉ Jean-Luc DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur CALLAIT-CARDINAL Marie-Pierre DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences CAROZZO Claude DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences CHABANNE Luc DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur CHALVET-MONFRAY Karine DEPT - BASIC- SCIENCES Professeur DE BOY ER DES ROCHES Alice DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences DELIGNET T E- MULLER Marie-Laure DEPT - BASIC- SCIENCES Professeur DJELOUADJI Zorée DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences ESCRIOU Catherine DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences FRIKHA Mohamed-Ridha DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences GALIA Wessam DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences GILOT - FROMONT Emmanuelle DEPT - ELEVAGE- SPV Professeur GONT HIER Alain DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences GRANCHER Denis DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences GREZEL Delphine DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences HUGONNARD Marine DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences JANKOWIAK Bernard DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences JOSSON-SCHRAMME Anne DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences JUNOT Stéphane DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences KODJO Angeli DEPT - ELEVAGE- SPV Professeur KRAFFT Emilie DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences LAABERKI Maria-Halima DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences LAMBERT Véronique DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences LE GRAND Dominique DEPT - ELEVAGE- SPV Professeur LEBLOND Agnès DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur LEDOUX Dorot hée DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences LEFEBVRE Sébastien DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences LEFRANC-POHL Anne-Cécile DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences LEGROS Vincent DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences LEPAGE Olivier DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur LOUZIER Vanessa DEPT - BASIC- SCIENCES Professeur MARCHAL Thierry DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur MOISSONNIER Pierre DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur MOUNIER Luc DEPT - ELEVAGE- SPV Professeur PEPIN Michel DEPT - BASIC- SCIENCES Professeur PIN Didier DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur PONCE Frédérique DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur PORTIER Karine DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur POUZOT-NEVORET Céline DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences PROUILLAC Caroline DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences REMY Denise DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur RENE MART ELLET Magalie DEPT - ELEVAGE- SPV Maître de conférences ROGER Thierry DEPT - BASIC- SCIENCES Professeur SABATIER Philippe DEPT - ELEVAGE- SPV Professeur SAWAYA Serge DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences SCHRAMME Michael DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur SERGENTET Delphine DEPT - ELEVAGE- SPV Professeur THIEBAULT Jean-Jacques DEPT - BASIC- SCIENCES Maître de conférences THOMAS-CANCIAN Aurélie DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences TORTEREAU Antonin DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences VIGUIER Eric DEPT - AC- LOISIR- SPORT Professeur VIRIEUX-WATRELOT Dorot hée DEPT - AC- LOISIR- SPORT Maître de conférences ZENNER Lionel DEPT - ELEVAGE- SPV Professeur 3

Remerciements

A Monsieur le Professeur Mohamed SAOUD

De l’Université Claude Bernard Lyon 1, Faculté de médecine de Lyon, Pour m’avoir fait l’honneur d’accepter la présidence de mon jury de thèse, Hommage respectueux.

A Monsieur le Docteur Vincent LEGROS,

De VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon, Pour m’avoir fait l’honneur d’accepter l’encadrement de ce travail, Pour ses précieux conseils tout au long de notre projet Qu’il trouve ici l’expression de ma gratitude.

A Monsieur le Professeur Michel PEPIN.

De VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon, Pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de siéger à mon jury de thèse, Sincères remerciements.

Remerciements

A ma mère et à mon père, A mes frères et sœur, A mes amis, A Antoine.

Table des matières

Table des figures ...... 11 Liste des abréviations ...... 13 Introduction ...... 15 PARTIE I – Généralités sur le VFHCC ...... 19 1. Données épidémiologiques du VFHCC ...... 19 1.1. Épidémiologie descriptive du VFHCC ...... 19 1.2. Épidémiologie analytique du VFHCC ...... 22 1.2.1. Maintenance et transmission du virus : rôle des tiques ...... 22 1.2.2. Maintenance et transmission du virus : rôle des vertébrés ...... 23 1.2.3. Autres modes de transmission ...... 23 2. Symptômes, lésions et diagnostic de la maladie ...... 24 2.1. Symptômes ...... 24 2.2. Diagnostic ...... 25 2.2.1. Éléments épidémio-cliniques ...... 25 2.2.2. Diagnostic expérimental ...... 25 3. Systèmes d’étude du virus ...... 27 3.1. Modèle viral : le virus Hazara (VHAZ) et le virus Tofla (VTFL) ...... 27 3.2. Génie biologique et systèmes de génétique inverse ...... 28 3.2.1. Système de minigénome ...... 29 3.2.2. Système de pseudoparticules virales ...... 31 3.2.3. Systèmes de réplicons particulaires viraux ...... 32 3.2.4. Système de clones infectieux ...... 33 3.3. Modèles animaux ...... 35 3.3.1. Rongeurs immunodéficients ...... 35 3.3.2. Modèles primates non-humains ...... 35 4. Traitement et prévention de la maladie ...... 36 4.1. Traitement ...... 36 4.1.1. Traitement symptomatique ...... 36 4.1.2. Traitement étiologique ...... 36 4.2. Prévention ...... 37 4.2.1. Lutte contre les tiques dans l’environnement et mesures de protection pour l’Homme ...... 37 4.2.2. Prophylaxie médicale ...... 38 PARTIE II – Biologie du VFHCC ...... 41 1. Aspects taxonomiques et moléculaires ...... 41 1.1. Taxonomie : le genre Orthonairovirus ...... 41 1.2. Structure du virion et génome viral ...... 42 1.3. Cycle viral ...... 43 1.3.1. Entrée cellulaire ...... 45 1.3.2. Transcription, traduction et réplication ...... 45 1.3.3. Maturation des glycoprotéines ...... 46 1.3.4. Assemblage viral et sortie ...... 49 2. Structure et rôle des protéines virales ...... 49 2.1. Protéines codées par le segment S ...... 49 2.1.1. Structure et fonction primaire de la NP ...... 49 2.1.2. NP et traduction des ARNm viraux ...... 52 2.1.3. NP et acteurs cellulaires de la réponse immunitaire innée ...... 52 2.1.4. NP, NSs et apoptose ...... 53 2.1.5. NP et activité endonucléase ...... 55 2.2. Protéines codées par le segment M ...... 55 2.2.1. Glycoprotéines d’enveloppe ...... 56 9

2.2.2. Protéine NSm ...... 56 2.2.3. Domaine mucine-like et protéines GP38, GP85 et GP160 ...... 57 2.3. Protéine codée par le segment L ...... 59 2.3.1. Structure de la protéine L ...... 59 2.3.2. Domaine à doigt de zinc et formation de RNP virales ...... 60 2.3.3. Protéine L et activité endonucléase ...... 60 2.3.4. Domaine OTU et échappement à la réponse immunitaire innée ...... 60 PARTIE III – Pathogenèse du VFHCC ...... 63 1. Pathophysiologie du VFHCC ...... 63 1.1. Tropisme cellulaire ...... 63 1.2. Anomalies biochimiques et sanguines ...... 64 1.3. Études anatomo-pathologiques ...... 65 2. Mécanismes moléculaires impliqués dans la pathogenèse du VFHCC ...... 69 2.1. Perturbation de l’intégrité de l’endothélium ...... 69 2.1.1. Bases cellulaires et moléculaires de la structure de l’endothélium ...... 69 2.1.2. Perturbation des jonctions intercellulaires des cellules endothéliales ...... 71 2.2. Perturbation de l’hémostase primaire ou secondaire ...... 72 2.2.1. Hémostase primaire et secondaire ...... 72 2.2.2. Perturbation de l’hémostase primaire ...... 73 2.2.3. Perturbation de l’hémostase secondaire ...... 74 2.3. Pathogenèse immuno-induite ...... 75 3. Étude de l’implication des protéines GP38, GP85 et GP160 dans la pathogenèse du VFHCC ...... 76 3.1. Matériel et méthodes ...... 77 3.2. Résultats ...... 81 3.2.1. Production des protéines GP38, GP85 et GP160 ...... 81 3.2.2. Effet de GP38, GP85 et GP160 sur l’hémostase ...... 85 3.2.3. Effet de GP38, GP85 et GP160 sur différents types cellulaires ...... 89 3.3. Discussion ...... 97 3.3.1. Production et purification de GP38 ...... 97 3.3.2. Protéines virales sécrétées et coagulation ...... 98 3.3.3. Protéines virales sécrétées et leur effet sur certains types cellulaires ...... 100 Conclusion ...... 105 Bibliographie ...... 107

Table des figures

Figure 1 : Distribution géographique des cas de FHCC en Turquie en 2002 et en 2008 (Leblebicioglu et al., 2016)...... 20 Figure 2 : Pays ayant rapporté des cas de FHCC (en rouge) et pays avec circulation virale sérologique ou virologique (en orange) (Tipih et Burt, 2020) ...... 21 Figure 3 : Cycle des tiques du genre Hyalomma et son implication dans le cycle épidémiologique du VFHCC (Bente et al., 2013)...... 24 Figure 4 : Tests diagnostiques disponibles en fonction de la virémie ou de la présence d’anticorps lors d’infection par le VFHCC (D'après Raabe, 2020)...... 27 Figure 5 : Système de minigénome (Zivcec et al., 2016) ...... 30 Figure 6 : Système de pseudoparticules virales (Zivcec et al., 2016) ...... 32 Figure 7 : Système de clone infectieux (Zivcec et al., 2016)...... 34 Figure 8 : Structure du virion du VFHCC (Bente et al., 2013) ...... 42 Figure 9 : Génome du VFHCC (Zivcec et al., 2016) ...... 43 Figure 10 : Cycle du VFHCC (Bente et al., 2013)...... 44 Figure 11 : Maturation du GPC (Sanchez et al., 2006)...... 48 Figure 12 : Domaines et motifs de la NP (Zivcec et al., 2016) ...... 49 Figure 13: Structure de la NP (Guo et al., 2012) ...... 50 Figure 14 : Structure des oligomères de NP (Wang et al., 2012) ...... 51 Figure 15: Interaction entre deux protéines NP au niveau du site de clivage par la caspase 3 (Wang et al., 2012)...... 54 Figure 16 : Domaines et motifs du GPC (Zivcec et al., 2016) ...... 55 Figure 17: Structure de GP38 (Mishra et al., 2020)...... 58 Figure 18 : Domaines et motifs de la protéine L (Zivcec et al., 2016) ...... 59 Figure 19 : Visualisation du rVFHCC fluorescent dans les organes reproducteurs femelles (Welch et al., 2019a)...... 64 Figure 20 : Phases de FHCC (Ergönül, 2008) ...... 65 Figure 21 : Lésions hépatiques induites par le VFHCC (Zivcec et al., 2013) ...... 67 Figure 22 : Lésions spléniques induites par le VFHCC (Zivcec et al., 2013) ...... 68 Figure 23 : Jonctions intercellulaires endothéliales (Timmerman et al., 2016) ...... 70 Figure 24 : Relocalisation de la cadhérine vasculaire endothéliale induite par le VFHCC (Connolly-Andersen et al., 2011) ...... 71 Figure 25 : Hémostase (Anatomy and Physiology Volume 2, Chapitre 18, p759, 2014). .... 73 Figure 26 : Constructions plasmidiques codant les segments M, MLD-GP38, GP38, M- ΔMLD-ΔGP38-ΔSKI-1, MLD-GP38-HA-KDEL et GP38-HA-6His ...... 82 Figure 27 : Production de surnageant contenant GP38, GP85 ou GP160 ...... 83 Figure 28 : Purification de la protéine GP38 ...... 85 Figure 29 : Principe du ROTEM (D’après Görlinger et al., 2016) ...... 86 Figure 30 : Effet des protéines GP38, GP85 et GP160 sur les voies extrinsèque et intrinsèque de la coagulation...... 87 Figure 31 : Effet de GP38, GP85 et GP160 sur la voie extrinsèque de la coagulation. ... 89 Figure 32 : Liaison de GP38, GP85 et GP160 aux cellules Huh7 ...... 90 Figure 33 : Cytotoxicité hépatique de GP38, GP85 et GP160 ...... 92 Figure 34 : Cytotoxicité de GP38, GP85 et GP160 sur les PBMCs ...... 93 11

Figure 35 : Effet de GP38, GP85 et GP160 sur les pourcentages de populations cellulaires des PBMCs ...... 94 Figure 36 : Effet de GP38, GP85 et GP160 sur l’activation des LT ...... 95 Figure 37 : Caractérisation des HUVECs ...... 96 Figure 38 : Liaison de GP38, GP85 et GP160 aux cellules HUVECs ...... 97

Liste des abréviations

A10 : Amplitude du caillot 10 minutes après l’initiation de la coagulation ACD : Acide citrate dextrose AdV-5 : Adénovirus de type 5 ALAT : Alanine aminotransférase ASAT : Aspartate aminotransférase BoHV-4 : Herpèsvirus bovin de type 4 CD : Cluster de différentiation CIVD : Coagulation intravasculaire disséminée CFT : Temps de formation du caillot CT : Temps de coagulation DAPI : 4',6-diamidino-2-phénylindole eIF4G : Facteur d’initiation de la traduction eucaryote 4G ELISA : Dosage immuno-enzymatique sur support solide ESCRT : Composants du complexe de tri endosomique FHCC : Fièvre hémorragique de Crimée Congo FHV : Fièvre hémorragique virale GFP : Protéine fluorescente verte GPC : Précurseur des glycoprotéines HA : Hémagglutinine HCL : Hospices Civils de Lyon H&E : Marquage hématoxyline et éosine HEK293T : Cellule humaine embryonnaire de rein 293T hpi : Heures post-incubation HUVEC : Cellule endothéliale humaine issue de la veine endothéliale IFN : Interféron IFNAR : Récepteur aux interférons de type I IHC : Marquage immunohistochimique IL-x : Interleukine-x JAK/STAT : Janus kinase / signal transducer and activator of transcription JAM : Molécule de jonction adhésive LB : Lymphocyte B LDH : Lactate déshydrogénase LT : Lymphocyte T MCF: Fermeté maximale du caillot MIF : Facteur inhibiteur de la migration des macrophages MLD : Domaine mucine-like MVA : Virus modifié Vaccinia Ankara NCR : Régions non-codantes NP : Nucléoprotéine OMS : Organisation Mondiale de la Santé PAMPs : Motifs moléculaires associés aux pathogènes PBMC : Cellule mononuclée sanguine périphérique PBS : Tampon phosphate salin 13

PreGc : Précurseur de Gc PreGn : Précurseur de Gn PRR : Récepteur de reconnaissance de motifs moléculaires PT : Temps de prothrombine RE : Réticulum endoplasmique RIG-I : Retinoic acid-inducible gene I ROTEM : Thromboélastométrie rotative RLR : Récepteurs RIG-I-like RNP : Ribonucléoprotéine rVFHCC : Virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo recombinant rVSV : Virus de la stomatite vésiculeuse recombinant SDS : Dodécylsulfate de sodium shed GP : Glycoprotéines tronquées du virus Ebola SKI-1/S1P : subtilisin kexin isozyme-1/site-1 protease SP : Signal peptidases SRAS-CoV-2 : Coronavirus du syndrome respiratoire sévère aigu 2 STAT-x : Transducteur de signal et activateur de la transcription x SVF : Sérum de veau fœtal TBST : Tampon tris salin Tween TCA : Temps de céphaline activée TEER : Résistance électrique trans-endothéliale TGN : Réseau trans-golgien TLR-4 : Récepteur toll-like 4 TM : Domaine transmembranaire TNF-α : Facteur de nécrose tumorale α VE-cadhérine : Cadhérine vasculaire endothéliale VDEN : Virus de la dengue VEBO : Virus Ebola VFHCC : Virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo VHAZ : Virus Hazara VTFL : Virus Tofla ZO : Zonula occludens 6His : Séquence hexa-histidine

Introduction

Les maladies infectieuses, bactériennes ou virales, sont une véritable menace pour l’humanité comme pour les règnes animal et végétal. Certaines ont été éradiquées notamment par la mise en place de campagnes de vaccination efficaces, comme la variole, maladie causée par le virus variolique de la famille Poxviridae, ou la peste bovine, causée par le virus Rinderpest de la famille Paramyxoviridae. Cependant, dans son essai scientifique Destin des maladies infectieuses publié en 1939, Charles Nicolle affirme : « Il y aura des maladies nouvelles. C’est un fait fatal. ». En effet, la récente pandémie due au coronavirus du syndrome respiratoire sévère aigu 2 (SRAS-CoV-2) ayant débuté en décembre 2019 est un nouvel exemple de l’émergence de nouvelles maladies infectieuses et de leur impact sanitaire, économique et social. Plus que jamais, les maladies virales émergentes représentent donc un enjeu de santé publique majeur.

Une grande partie des maladies virales émergentes sont des arboviroses, c’est-à-dire qu’elles sont transmises via un arthropode, le plus souvent hématophage, comme les moustiques, les phlébotomes ou les tiques. Ces arthropodes capables d’être infectés par un pathogène et de le transmettre sont appelés « compétents ». L’émergence de nouvelles arboviroses dans des zones où elles n’étaient pas présentes auparavant peut s’expliquer notamment par l’expansion géographique du vecteur arthropode émergent. Cette dernière peut s’expliquer par le phénomène de mondialisation, associant une intensification des déplacements, du commerce et de l’urbanisation, mais également par le réchauffement climatique, qui conduit à l’apparition de nouvelles zones propices au développement du vecteur.

Il existe plus de 500 arbovirus connus à ce jour, dont une centaine sont pathogènes pour l’Homme. Les tiques, et notamment celles de la famille Ixodidae, sont responsables de la transmission de nombreuses maladies d’importance médicale. En particulier, les tiques du genre Hyalomma sont les vecteurs du virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (VFHCC), un virus de l’ordre Bunyavirales, de la famille Nairoviridae et du genre Orthonairovirus, dont l’infection chez l’homme provoque une maladie se manifestant, pour les formes les plus graves, par des fièvres hémorragiques pouvant être fatales. Le taux de mortalité de cette maladie, pour lequel il n’existe à ce jour ni traitement spécifique ni vaccin, varie de 5 à 30%.

Actuellement, le VFHCC est endémique en Asie, en Afrique, au Moyen-Orient et en Europe de l’Est. Cependant, la répartition géographique de son principal vecteur, la tique Hyalomma marginatum, augmente et progresse vers le Nord, cette dernière ayant récemment été identifiée en Suède (Grandi et al., 2020). Ainsi, le risque que des cas de fièvre hémorragique de Crimée- 15

Congo (FHCC) apparaissent dans ces nouvelles zones géographiques est indéniable. Notamment, en 2010, la détection du génome du VFHCC chez des tiques en Espagne (Estrada- Peña et al., 2012) a précédé la survenue de deux cas locaux d’infection dans ce même pays en 2016 (Negredo et al., 2017). Si l’un de ces cas était dû à une morsure de tique infectée, l’autre était dû à une transmission nosocomiale du virus. En effet, les morsures de tiques ne sont pas le seul mode d’infection : un contact avec les fluides corporels d’animaux ou de personnes infectés permet également la transmission du virus (Bente et al., 2013). Ainsi, de par son potentiel émergent, la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (FHCC) fait partie de la liste des dix maladies infectieuses prioritaires pour lesquelles l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) priorise les efforts de recherche (WHO BluePrint R&D, “https://www.who.int/activities/prioritizing-diseases-for-research-and-development-in- emergency-contexts,”).

Le VFHCC est un virus classé en tant que pathogène de catégorie 4. Le décret n°94-352 du 4 mai 1994 définit ces pathogènes comme provoquant « des maladies graves chez l’Homme et constituant un danger sérieux pour les travailleurs ; le risque de propagation dans la collectivité est élevé ; il n’existe généralement ni prophylaxie ni traitement efficace. » (Décret no 94-352 du 4 mai 1994, 1994). Ainsi, pendant longtemps, la recherche concernant ce virus et sa pathogenèse a été ralentie par l’obligation de l’étudier en laboratoire de niveau de biosécurité 4, dont l’accessibilité est limitée, mais également par l’absence de modèles animaux dont l’infection reproduit les symptômes de la maladie humaine. Récemment, l’instauration de plusieurs systèmes d’étude in vitro, permettant l’étude du virus en conditions de biosécurité de niveau moindre, ainsi que de modèles animaux d’infection ont permis une meilleure compréhension du VFHCC, de sa structure, de son cycle cellulaire ainsi que de ses interactions avec l’hôte infecté et de sa pathogenèse.

Le VFHCC est un virus enveloppé de 90 à 100 nm de diamètre, dont l’enveloppe est caractérisée par la présence de deux glycoprotéines d’enveloppe, Gn et Gc. A l’intérieur de cette enveloppe se trouve le génome viral, qui est un ARN divisé en trois segments, nommés S, M et L. Le segment S code notamment la nucléoprotéine (NP), protéine impliquée dans la formation de ribonucléoprotéines (RNP) virales de par son interaction avec l’ARN viral. Le segment M code une polyprotéine, le précurseur des glycoprotéines (GPC), qui est maturé tout au long de la voie sécrétoire pour donner, d’une part, les glycoprotéines d’enveloppe Gn et Gc, et d’autre part des protéines non-structurales, les protéines NSm, GP38, GP85 et GP160. Enfin, le segment L code une unique protéine, la protéine L, ayant un rôle de polymérase à ARN dépendante de l’ARN et étant un élément structural des RNP virales (Zivcec et al., 2016). 16

Dans cette thèse sont décrits les mécanismes moléculaires connus impliqués dans la pathogenèse du VFHCC, et la potentielle implication des protéines GP38, GP85 et GP160 dans cette dernière est explorée.

PARTIE I – Généralités sur le VFHCC

1. Données épidémiologiques du VFHCC

1.1. Épidémiologie descriptive du VFHCC

La FHCC fut identifiée pour la première fois en 1944, lors d’une épidémie de fièvres hémorragiques chez des militaires russes en Crimée. L’étiologie de l’épidémie fut rapidement suspectée comme étant arbovirale. Cette hypothèse fut confirmée après que l’injection de filtrats de tiques du genre Hyalomma marginatum reproduisit en 1965 les mêmes symptômes chez des volontaires et le virus fut ainsi nommé « virus de Crimée » (Bente et al., 2013; Hoogstraal, 1979; Whitehouse, 2004). En 1969, il fut découvert que le virus de Crimée était antigéniquement identique à un virus isolé en République Démocratique de Congo en 1956, appelé virus de Congo et responsable de maladie similaire à celle causée par le virus de Crimée. Ainsi, le virus a été renommé « virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo » (Bente et al., 2013; Hoogstraal, 1979; Whitehouse, 2004).

Depuis lors, la distribution géographique du VFHCC ne cesse de croître. Actuellement, il est endémique dans de nombreux pays d’Asie, d’Afrique, de Moyen-Orient et d’Europe de l’Est (“Outbreak Distribution Map | Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) | CDC,” 2019). Nonobstant, les cas sont seulement sporadiques dans ces régions d’endémicité, à l’exception de la Turquie où plus d’une cinquantaine de cas sont reportés chaque année (WHO, Crimean- Congo Hemorrhagic Fever, https://www.who.int/health-topics/crimean-congo-haemorrhagic- fever/#tab=tab_1). Le phénomène d’émergence du VFHCC en Turquie est particulièrement identifiable des années 2002 à 2008 (Figure 1). En effet, le nombre de cas passa de 150 en 2002 à 1315 en 2008 (Leblebicioglu et al., 2016).

Figure 1 : Distribution géographique des cas de FHCC en Turquie en 2002 et en 2008 (Leblebicioglu et al., 2016). L’incidence des cas en légende est donnée pour 100 000 personnes.

En Afrique, des cas de FHCC ont été détectés au Burkina Faso, en République d’Afrique Centrale, en République Démocratique du Congo, en Égypte, au Kenya, en Mauritanie, en Namibie, en Nigeria, en Afrique du Sud, au Sénégal, au Soudan, en Tanzanie et en Ouganda (Aradaib et al., 2011, 2010; Bower et al., 2019; Bukbuk et al., 2016; Dunster et al., 2002; Gear et al., 1982; Nabeth et al., 2004a, 2004b; Saluzzo et al., 1985, 1984; Tipih and Burt, 2020; Zivcec et al., 2017). De plus, en Algérie, au Bénin, au Cameroun, en Guinée Équatoriale, en Éthiopie, au Ghana, en Guinée, au Mali, au Madagascar, au Maroc, au Mozambique, au Niger, en Somalie, en Tunisie et au Zimbabwe, où aucun cas n’a pour l’instant été déclaré, une circulation virale est reportée, que ce soit par détection du génome viral chez des tiques ou par détection sérologique, que ce soit chez les humains, les animaux domestiques de bétail ou les 20

animaux sauvages (Akuffo et al., 2016; Butenko, 1996; Gonzalez et al., 1989; Kamissoko et al., 2017; Kautman et al., 2016; Ksiazek et al., 1995; Mathiot et al., 1989; Muianga et al., 2017; Palomar et al., 2013, p. 1; Sadeuh-Mba et al., 2018; Shepherd et al., 1987; Tipih and Burt, 2020; Wasfi et al., 2016; Wilson et al., 1990). En Asie, des cas ont été décrits en Afghanistan, au Kazakhstan, au Pakistan, en Chine, en Inde, au Tadjikistan et en Ouzbékistan (Burney et al., 1980; Mustafa et al., 2011; Nurmakhanov et al., 2015; Paragas et al., 2007; Tipih and Burt, 2020; Tishkova et al., 2012; Verma, 2011; Yen et al., 1985) . Au Moyen-Orient, les pays dans lesquels des cas ont été déclarés sont l’Iran, l’Iraq, l’Arabie Saoudite, l’Oman et les Émirats Arabes Unis (El-Azazy and Scrimgeour, 1997; Sadegh Chinikar et al., 2005; Schwarz et al., 1995; Shurie et al., 1997; Tantawi et al., 1980), tandis qu’en Europe de l’Est, l’Albanie, la Bulgarie, la Grèce, le Kosovo, la Turquie, la Géorgie et la Russie ont rapporté des cas (Ajazaj- Berisha et al., 2013; Drosten et al., 2002; Karti et al., 2004; Leblebicioglu et al., 2016; Maltezou et al., 2009; Papa et al., 2004, 2002; Zakhashvili et al., 2010). Enfin, en Europe de l’Ouest, des cas ont été rapportés en Espagne (Negredo et al., 2017), et les pays comme le Portugal, la France, la Hongrie et la Roumanie présentent des indices sérologiques de circulation virale (Ceianu et al., 2012; Filipe et al., 1985; Grech-Angelini S et al., 2020; Horváth, 1976). Ces informations sont résumées sur la Figure 2.

Figure 2 : Pays ayant rapporté des cas de FHCC (en rouge) et pays avec circulation virale sérologique ou virologique (en orange) (Tipih et Burt, 2020)

1.2. Épidémiologie analytique du VFHCC 1.2.1. Maintenance et transmission du virus : rôle des tiques

Le cycle épidémiologique du VFHCC implique la présence de tiques de la famille Ixodidae (tiques dures) et de nombreux mammifères. Un des enjeux importants fut d’identifier les vecteurs principaux de la maladie. La compétence d’un vecteur arthropode se définit comme sa capacité à acquérir, maintenir et transmettre un pathogène. Ainsi, le simple isolement du virus chez un arthropode ne permet pas de conclure sur sa compétence à transmettre le virus. Par exemple, des études ont permis de déterminer que le virus n’est pas capable de persister trans- stadialement chez des tiques molles infectées expérimentalement par le VFHCC (Durden et al., 1993; Shepherd et al., 1989a). Or, les tiques ne se nourrissant qu’une seule fois par stade, il est nécessaire pour qu’elles soient compétentes que le virus persiste trans-stadialement. De même, la présence du virus chez des arthropodes de la famille Culicoides n’est que le reflet d’un repas sanguin chez un mammifère transitoirement virémique et non de sa compétence à transmettre le virus (Causey et al., 1970).

Le VFHCC a été détecté chez de nombreux genres de tiques dures, dont les genres Hyalomma, Amblyomma, Rhipicephalus, Dermacentor, et Ixodes (Gargili et al., 2017; Hoogstraal, 1979; Shepherd et al., 1989a; Spengler et al., 2016b), mais la contribution de chacune dans le cycle épidémiologique du VFHCC reste peu clair. Cependant, les tiques du genre Hyalomma sont considérées comme les principales vectrices du virus. Ces tiques restent infectées à vie et transmettent le virus de manière trans-stadiale, trans-ovarienne et vénérienne (Gonzalez et al., 1992; Xia et al., 2016). De plus, des études expérimentales identifient ces tiques comme vecteurs compétents (Gargili et al., 2017) et la répartition géographique du VFHCC se superpose à celle de ces tiques (Mild et al., 2010). Enfin, les hôtes vertébrés sur lesquels ces tiques se nourrissent préférentiellement sont ceux chez lesquels le VFHCC est détecté (Spengler et Estrada-Peña, 2018). Ces données corroborent l’hypothèse selon laquelle les tiques du genre Hyalomma sont les principales vectrices du VFHCC.

Les tiques de la famille Ixodidae se développent selon plusieurs stades : œuf, larve, nymphe et adulte (Shayan et al., 2015). Elles nécessitent un repas sanguin par stade. Le cycle des tiques du genre Hyalomma est représenté en Figure 3 (Bente et al., 2013), ainsi que son implication pour la transmission du VFHCC. Après éclosion de l’œuf, la larve se nourrit sur un premier hôte vertébré, préférentiellement des espèces de l’ordre Rodentia, Lagomorpha, et de la classe Aves (Spengler et Estrada-Peña, 2018). Après avoir effectué son repas sanguin, la larve mue en nymphe tout en restant attachée au même hôte, sur lequel la nymphe effectuera son repas 22

sanguin. Ensuite, la nymphe se détache de l’hôte et retourne au sol pour muer en adulte. L’adulte cherche alors un nouvel hôte, généralement un vertébré de la famille Bovidae (Spengler et Estrada-Peña, 2018), sur lequel il effectuera son repas sanguin et se reproduira. Les femelles retournent alors au sol, où elles pondent leurs œufs.

1.2.2. Maintenance et transmission du virus : rôle des vertébrés

Des infections asymptomatiques par le VFHCC de nombreuses espèces vertébrées ont été rapportées, qu’elles soient domestiques ou sauvages (Ergönül et Whitehouse, 2007). Cependant, les vertébrés ne sont pas considérés comme le réservoir du VFHCC, la virémie étant chez eux seulement transitoire (Spengler et al., 2016a). Malgré cela, ils constituent des hôtes amplificateurs et permettent la transmission horizontale du virus d’une tique à une autre lorsqu’ils sont virémiques (Figure 3). Cependant, un vertébré non virémique peut également permettre la transmission horizontale du virus si une tique naïve effectue son repas à proximité d’une tique infectée, par un mécanisme de « co-feeding » (Figure 3).

De nombreux mammifères sont sensibles à l’infection par le VFHCC (Spengler et al., 2016a, 2016b). Une étude rétrospective séro-épidémiologique réalisée à partir de prélèvements d’animaux domestiques et sauvages a été réalisée (Spengler et al., 2016a). Parmi les espèces domestiques, les vaches, les buffles domestiques, les chameaux, les chèvres, les moutons, les chevaux, les ânes, les mulets, les cochons, les poulets, les canards et les chiens présentent des traces de circulation virale, tandis que parmi les espèces sauvages, les lièvres, buffles et rhinocéros représentent les mammifères dont la séroprévalence est la plus élevée. La plupart des études sérologiques effectuées chez les espèces aviaires n’indiquent aucune preuve sérologique d’infection par le VFHCC des oiseaux, malgré le fait que certaines espèces d’oiseaux représentent un hôte pour les tiques vectrices de VFHCC.

1.2.3. Autres modes de transmission

Outre la transmission via les arthropodes, le VFHCC peut également être transmis par contact avec des fluides corporels provenant de patients infectés pendant la phase aiguë de la maladie, ou par contact avec du sang ou des tissus d’animaux virémiques (Bente et al., 2013; Gargili et al., 2017) (Figure 3). De plus, des infections nosocomiales peuvent se produire à cause d’une stérilisation insuffisante du matériel médical ou encore de la réutilisation d’aiguilles usagées.

Figure 3 : Cycle des tiques du genre Hyalomma et son implication dans le cycle épidémiologique du VFHCC (Bente et al., 2013). Les flèches bleues indiquent le cycle des tiques du genre Hyalomma, avec les différents hôtes selon le stade de la tique. Les larves et nymphes se nourrissent sur des petits mammifères et des oiseaux, tandis que les adultes se nourrissent sur des ongulés ou des humains. Les flèches rouges pleines indiquent les opportunités de transmission du VFHCC des tiques aux mammifères, ou des mammifères aux tiques. L’épaisseur de la flèche indique l’efficacité de transmission. Les flèches rouges en pointillés indiquent les opportunités de transmission du VFHCC entre tiques par « co-feeding » et/ou, pour les adultes, par transmission vénérienne. L’infection des humains peut survenir par morsure de tique ou par exposition à des tissus ou sang d’animaux ou de patients infectés.

2. Symptômes, lésions et diagnostic de la maladie

2.1. Symptômes

Les humains sont les seuls vertébrés connus développant des symptômes lors d’infection par le VFHCC. Ces derniers sont généralement bénins et non-spécifiques, caractérisés par une maladie fébrile. Cependant, environ 12 % des patients infectés par le VFHCC développent des fièvres hémorragiques classiquement séparées en quatre phases (Hoogstraal, 1979). La première phase est la phase d’incubation. Elle varie de un à cinq jours après la morsure par une tique infectée, contre sept à dix jours lors d’infection par contact avec des tissus ou du sang infectés (Ergönül, 2006; Ergönül et al., 2006c). A cette phase d’incubation succède une phase pré-hémorragique caractérisée par des symptômes non spécifiques comme de la fièvre et de l’apathie. La phase hémorragique apparaît 3 à 5 jours après le début de symptômes (Ergönül, 2006). Elle se manifeste par des pétéchies sur la peau, les conjonctives et les muqueuses, puis par la formation de larges ecchymoses cutanées, ainsi que par des saignements gastro- intestinaux et urinaires (Swanepoel et al., 1989). Des manifestations pulmonaires peuvent avoir lieu, avec le développement d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë incluant une infiltration parenchymale et alvéolaire, des effusions pleurales, de la toux, de l’hémoptysie, de 24

la dyspnée, des hémorragies et de l’hypertension pulmonaires (Bilgin et al., 2014; Dogan et al., 2011; Engin et al., 2009). Plus rarement, la FHCC peut se manifester par des troubles neuropsychiatriques, incluant des troubles de l’humeur, un état confusionnel, de la désorientation et de l’agressivité (Ergönül, 2006; Kleib et al., 2016; Whitehouse, 2004). Lors des cas mortels, la mort survient entre 5 et 14 jours après le début des symptômes, à la suite d’hémorragies, de défaillances multi-viscérales et de choc hémorragique. Lors des cas non- mortels, la rémission totale peut durer jusqu’à un an (Ergönül, 2006). Actuellement, aucune rechute d’infection n’a été décrite, suggérant que l’infection est aiguë.

2.2. Diagnostic 2.2.1. Éléments épidémio-cliniques

Le diagnostic clinique de l’infection par le VFHCC est difficile en raison du caractère non spécifique de certains symptômes. Le diagnostic différentiel de la FHCC inclut notamment les autres fièvres hémorragiques virales. Plusieurs autres virus répartis dans différentes familles virales, Arenaviridae, Filoviridae, Flaviviridae, Hantaviridae, Phenuiviridae et Reoviridae sont responsables de fièvres hémorragiques virales chez les humains. La FHCC est également à distinguer d’autres infections virales, comme les hépatites virales, mais aussi d’infections bactériennes ou parasitaires, comme le paludisme, la leptospirose, la fièvre typhoïde ou un sepsis (Chinikar et al., 2012). Ainsi, le diagnostic de la FHCC associe des éléments cliniques et épidémiologiques. Epidémiologiquement, une FHCC doit être suspectée si le patient habite ou a voyagé dans une zone endémique, s’il a été mordu par une tique récemment ou a été exposé à des fluides corporels d’animaux ou d’humains potentiellement virémiques (Ergönül, 2006). Cliniquement, une suspicion de FHCC peut être établie lors de fièvres, de fuites vasculaires et de défauts de coagulation. Cependant, le diagnostic expérimental est nécessaire afin de confirmer une infection par le VFHCC.

2.2.2. Diagnostic expérimental 2.2.2.1. Détection directe du VFHCC

Une des méthodes de diagnostic du VFHCC consiste en la culture du virus sur lignées cellulaires sensibles à l’infection (Figure 4). Cependant, cette méthode nécessite des conditions de biosécurité de niveau 4, souvent absentes des régions où le virus circule, et est donc rarement réalisée en pratique (Raabe, 2020).

La principale méthode de diagnostic de FHCC, rapide et sensible, repose sur la détection et la quantification du génome du VFHCC par transcription inverse couplée à l’amplification 25

génique (RT-qPCR) à partir de sérums de patients suspectés de FHCC (Figure 4). Le premier test a été développé en 1996 (Schwarz et al., 1996) et reste largement utilisé, même si de nombreux autres tests ont vu le jour depuis (Papa, 2019; Raabe, 2020). Ces tests sont utilisables pendant la première semaine de la maladie, lorsque les patients infectés sont virémiques. De plus, de nombreux rapports indiquent que la sévérité de la maladie est associée à une charge virale élevée (Çevik et al., 2008; Duh et al., 2007; Hasanoglu et al., 2018; Papa et al., 2007; Saksida et al., 2010; Wölfel et al., 2007), les cas mortels étant généralement associés à des charges virales supérieures à 109 copies de génome viral par mL. Ainsi, en plus du diagnostic de la maladie, la RT-qPCR permet également d’établir un pronostic. Cependant, l’existence de souches divergentes de VFHCC peut entraîner la présence de faux-négatifs par absence de reconnaissance de la séquence du VFHCC, comme cela a été le cas pour la souche AP92 du virus, non reconnue par les tests initiaux de RT-qPCR (Raabe, 2020). Afin de remédier à cela, un test ciblant la région 5’ non-codante du segment S du génome viral, hautement conservée chez toutes les souches du VFHCC, a été mis au point et permet de détecter 18 souches différentes de VFHCC, dont la souche AP92 (Atkinson et al., 2012).

Par ailleurs, des techniques de dosage immuno-enzymatique sur support solide (ELISA) permettent de détecter les antigènes du VFHCC dans le sérum de patients suspectés de FHCC ont été développées (Saijo et al., 2005a; Shepherd et al., 1988).

2.2.2.2. Détection indirecte du VFHCC : tests sérologiques

La disparition du virus dans le sang est généralement associée à la détection d’anticorps dirigés contre le VFHCC (Raabe, 2020). Ainsi, après la première semaine de maladie, les tests sérologiques sont plus appropriés pour le diagnostic de la FHCC (Figure 4), même si dans certains cas mortels de FHCC, les taux d’anticorps anti-VFHCC ne sont pas détectables (Kaya et al., 2014; Swanepoel et al., 1989). Actuellement, ces anticorps sont détectés par des méthodes d’ELISA ou d’immunofluorescence basées sur l’expression d’une protéine virale recombinante, la NP (Álvarez-Rodríguez et al., 2020; Bukbuk et al., 2014; S.D. Dowall et al., 2012; Emmerich et al., 2018, 2010; Garcia et al., 2006; Marriott et al., 1994; Rangunwala et al., 2014; Saijo et al., 2005b, 2002; Shrivastava et al., 2019).

Figure 4 : Tests diagnostiques disponibles en fonction de la virémie ou de la présence d’anticorps lors d’infection par le VFHCC (D'après Raabe, 2020). En orange est indiquée la période optimale de test pour chacune des techniques. Les durées typiques des quatre phases de FHCC sont représentées en gris, et leurs variations sont indiquées en pointillés noirs.

3. Systèmes d’étude du virus

Afin de déterminer un traitement et une prévention médicale efficaces contre le VFHCC, il est nécessaire d’étudier sa biologie, son cycle, ainsi que les interactions hôte-pathogène. Cependant, comme expliqué en introduction, le VFHCC est un virus nécessitant des mesures de biosécurité de niveau 4, impliquant de nombreuses contraintes et ne facilitant pas l’étude du virus. Ainsi, de nombreux systèmes d’études in vitro comme in vivo, décrits dans cette partie, ont été instaurés, et ont permis de nombreuses avancées, que ce soit en recherche fondamentale ou translationnelle.

3.1. Modèle viral : le virus Hazara (VHAZ) et le virus Tofla (VTFL)

Des virus phylogénétiquement proches partagent de nombreux points communs, que ce soit au niveau de leur structure, de leur cycle ou de leur biologie. Ainsi, l’étude de ces virus peut apporter de nombreuses informations sur le virus initialement étudié. Un virus phylogénétiquement proche du VFHCC, le VHAZ, est souvent utilisé comme modèle d’étude du VFHCC (Flusin et al., 2011; Matsumoto et al., 2018; Molinas et al., 2016; Surtees et al., 27

2016). Comme le VFHCC, ce virus fait partie de la famille Nairoviridae et du genre Orthonairovirus, mais il appartient à l’espèce Hazara orthonairovirus, contrairement au VFHCC, qui fait partie de l’espèce Crimean-Congo fever orthonairovirus (Abudurexiti et al., 2019). Dans une classification définie en 2016, le VHAZ et le VFHCC appartiennent au même sérogroupe (Walker et al., 2016). A la différence du VFHCC, le VHAZ n’est pas associé à des maladies humaines et requiert seulement des conditions de biosécurité de niveau 2. De plus, l’infection d’un modèle de souris immunodéficientes par ce virus induit une mortalité de 50 % des souris infectées, avec l’apparition de lésions hépatiques et spléniques, similairement à l’infection de ce même modèle par le VFHCC (Stuart D. Dowall et al., 2012). Ainsi, le VHAZ est un substitut intéressant au VFHCC, qui peut être utilisé dans des conditions de biosécurité moindres. Il est cependant nécessaire de confirmer les observations réalisées avec le VHAZ avec le VFHCC, comme des différences fonctionnelles existent entre ces deux virus (Fuller et al., 2019).

En 2016, un nouveau virus phylogénétiquement proche des VFHCC et VHAZ, le virus Tofla (VTFL), fut découvert. Comme VHAZ, il n’est pas associé à des maladies humaines, et l’infection d’un modèle de souris immunodéficientes par ce virus induit une maladie sévère à létale, comme lors d’infection par le VFHCC (Shimada et al., 2016).

3.2. Génie biologique et systèmes de génétique inverse

La génétique inverse est un outil puissant permettant d’étudier les mécanismes moléculaires précis impliqués dans le cycle viral et les interactions hôte-pathogène. A l’aide de mutants créés par le biais du génie biologique, cette approche permet de comprendre la fonction de certains gènes, à l’inverse de la génétique classique, qui cherche à identifier les mutations de gènes responsables de phénotypes donnés. En virologie, la génétique inverse permet notamment la génération de virus rapporteurs, ou encore de virus présentant des mutations, permettant par exemple l’identification de résidus d’acides aminés importants pour la fonction de différentes protéines virales et de mieux comprendre les interactions hôte-pathogène.

Afin de comprendre les systèmes développés, il est nécessaire de connaître la structure du VFHCC. Elle est décrite ici sommairement, et sera décrite plus en détail dans la Partie II de cette thèse. Le VFHCC est un virus enveloppé, dont l’enveloppe est caractérisée par la présence de deux glycoprotéines d’enveloppe, Gn et Gc. A l’intérieur de cette enveloppe se trouve le génome viral, qui est un ARN divisé en trois segments, nommés S, M et L. Le segment S code notamment la NP, protéine impliquée dans la formation de RNP virales de par son interaction

avec l’ARN viral. Le segment M code une polyprotéine, le GPC, qui est maturé tout au long de la voie sécrétoire pour donner, entre autres protéines, les glycoprotéines d’enveloppe Gn et Gc. Enfin, le segment L code une unique protéine, la protéine L, ayant un rôle de polymérase à ARN dépendante de l’ARN et étant un élément structural des RNP virales (Zivcec et al., 2016).

3.2.1. Système de minigénome

Le système de minigénome est un système utile pour étudier la transcription et la réplication virales. En effet, un minigénome est composé d’un ARN contenant les éléments structuraux du génome viral, parmi lesquels les régions non-codantes 5’ et 3’ de l’ARN viral génomique, mais dont la région codant normalement les gènes viraux a été remplacée par une région codant un gène rapporteur, codant par exemple la nanoluciférase (Bergeron et al., 2015, 2010; Devignot et al., 2015). Ainsi, ce système n’est pas infectieux et permet l’étude du virus hors des conditions de biosécurité de niveau 4.

Dans ce système, des copies d’ADN du minigénome sont clonées dans un vecteur plasmidique d’expression, sous le contrôle d’un promoteur T7. Ainsi, la co-transfection de cellules avec ce vecteur ainsi qu’un vecteur codant la polymérase T7 sous contrôle d’un promoteur de classe II (c’est-à-dire un promoteur d’ARN polymérase II cellulaire) induit la transcription du minigénome. Les protéines L et NP nécessaires à la formation des RNP virales sont également apportées par transfection de vecteurs plasmidiques exprimant leur séquence, sous contrôle d’un promoteur de classe II. Ainsi, le minigénome d’ARN est encapsidé et sert de matrice pour la réplication comme pour la transcription, générant alors in fine un signal rapporteur, permettant de mesurer de manière quantitative la réplication génomique, la transcription et la traduction (Figure 5). Ce système est cependant limité par l’incapacité d’étudier des étapes cruciales du cycle viral, comme l’entrée virale, l’assemblage viral et la sortie.

Figure 5 : Système de minigénome (Zivcec et al., 2016) Le système de minigénome est composé d’un plasmide codant le minigénome et trois plasmides codant la NP, la protéine L et la polymérase T7. Le minigénome est sous le contrôle d’un promoteur T7. Il contient les régions non-codantes 5’ et 3’ des segments génomiques du VFHCC qui flanquent un gène codant une protéine rapportrice (la nanoluciférase) en sens négatif. La transfection des plasmides codant la NP, la protéine L et la polymérase T7 permet la production de protéines, qui permettent la transcription du plasmide du minigénome en ARN viral. Cet ARN est encapsidé et forme des RNP virales, qui sont alors transcrites en ARNm et traduites en protéine rapportrice, ou répliquées en ARN viral. Un signal luminescent est obtenu par ajout de substrat.

3.2.2. Système de pseudoparticules virales

Pour remédier aux limitations du système de minigénome, un système de pseudoparticules a été développé. Les pseudoparticules sont générées en transfectant cinq plasmides, codant respectivement la NP, le GPC, la protéine L, la polymérase T7 (sous le contrôle d’un promoteur de classe II) et le minigénome. Ce dernier est sous le contrôle d’un promoteur T7. Ainsi, le minigénome est encapsidé sous forme de RNP virales, et ces dernières sont incorporées dans une pseudoparticule virale. Les pseudoparticules ainsi générées sont capables d’entrer dans une cellule cible, où le minigénome alors transcrit et traduit génère un signal. Le génome ne contenant pas les gènes viraux, mais un gène rapporteur, les pseudoparticules sont incapables d’exprimer les protéines virales. Ainsi, elles miment un cycle unique d’infection et peuvent être utilisées en condition de biosécurité de niveau 2.

Il existe actuellement plusieurs systèmes de pseudoparticules. Dans le premier système, les pseudoparticules produites expriment un rapporteur Renilla (Devignot et al., 2015). Afin d’obtenir un signal conséquent, il est nécessaire de transfecter les cellules cibles de l’infection avec des plasmides codant la NP et la protéine L au préalable. Le deuxième système est basé sur des pseudoparticules qui ont été générées avec des plasmides exprimant le GPC et la protéine L codons-optimisés, et le minigénome exprime la nanoluciférase. Avec ce système, il n’est pas nécessaire de transfecter au préalable les cellules à infecter avec les plasmides codant la NP et la protéine L (Bergeron et al., 2015) (Figure 6). Un dernier système est basé sur une protéine rapportrice fluorescente verte (GFP) (Freitas et al., 2020).

Figure 6 : Système de pseudoparticules virales (Zivcec et al., 2016) Ce système est composé d’un plasmide codant un minigénome et de quatre plasmides codant pour la polymérase T7, la NP, la protéine L, et le GPC. Le minigénome est sous le contrôle d’un promoteur T7. Il contient les régions non-codantes 5’ et 3’ des segments génomiques du VFHCC qui flanquent un gène codant une protéine rapportrice (la nanoluciférase) en sens négatif. La transfection des plasmides codant la NP, la protéine L et la polymérase T7 permet la production de protéines, qui permettent la transcription du plasmide du minigénome en ARN viral. Cet ARN est encapsidé et forme des RNP virales, qui sont alors transcrites en ARNm et traduites en protéine rapportrice, ou répliquées en ARN viral. Un signal luminescent est obtenu par ajout de substrat. Des pseudoparticules sont alors formées de par l’expression du GPC, et peuvent infecter d’autres cellules. Dans ces dernières, l’ARN génomique des pseudoparticules virales est amplifié et transcrit en ARNm, résultant en l’expression de la protéine rapportrice. Un signal luminescent est obtenu par ajout de substrat.

3.2.3. Systèmes de réplicons particulaires viraux

Un système de réplicons particulaires viraux a été récemment généré. Afin de produire de telles particules, les cellules productrices sont transfectées avec des plasmides exprimant les segments génomiques S et L sous contrôle d’un promoteur T7, et avec des plasmides exprimant le GPC et la polymérase T7 sous le contrôle d’un promoteur de classe II. Des réplicons particulaires viraux sont alors produits, mais ne contiennent que les ARN génomiques des segments S et L. Ainsi, ces particules permettent une infection en cycle unique. De plus, des réplicons particulaires fluorescents ont été obtenus en transfectant un variant du segment S qui exprime

en plus de la nucléoprotéine une protéine fluorescente, ZsGreen (Scholte et al., 2019b; Spengler et al., 2019).

3.2.4. Système de clones infectieux

Un dernier système permet la production de virus recombinant infectieux (rVFHCC) à partir d’ADN plasmidique contenant la séquence complète du génome sous le contrôle d’un promoteur T7. Les cellules productrices sont transfectées avec les plasmides exprimant les trois segments génomiques, ainsi qu’avec des plasmides exprimant la polymérase T7, la protéine L et la NP sous le contrôle d’un promoteur d’ARN polymérase II cellulaire, ce qui permet la génération d’ARN génomiques viraux. Ces ARN sont alors utilisés pour la transcription, la production des protéines virales et la réplication virale. In fine, les protéines virales ainsi que les RNP produites s’assemblent et produisent des particules infectieuses, capables d’infecter d’autres cellules pendant de multiples cycles (Figure 7). Ainsi, des conditions de biosécurité de niveau 4 sont nécessaires pour l’utilisation de ce système.

Grâce à ce système, un virus rapporteur fluorescent a pu être généré, permettant entre autres l’étude précise du tropisme cellulaire du VFHCC ainsi que l’identification d’un potentiel inhibiteur de la polymérase du VFHCC (Welch et al., 2020, 2019b, 2017).

Figure 7 : Système de clone infectieux (Zivcec et al., 2016). Des plasmides codant les séquences génomiques du VFHCC ainsi que des plasmides codant les protéines L, NP et la polymérase T7 sont transfectées dans des cellules productrices. Les plasmides génomiques contiennent les séquences de chacun des trois segments (S, M et L) en polarité positive, sous le contrôle d’un promoteur T7, tandis que les plasmides codant les protéines L, NP et T7 sont sous le contrôle d’un promoteur d’ARN polymérase II cellulaire. Des RNP antigénomiques sont formés après transcription par la polymérase T7 des plasmides codant les séquences génomiques du VFHCC, qui sont alors répliquées en ARN génomique qui forme des RNP génomiques. Ces derniers sont transcrits, traduits en protéines virales. Le GPC subit une maturation pour produire les glycoprotéines d’enveloppe Gn et Gc. Après accumulation de protéines virales et d’ARN génomiques matures, des particules infectieuses sont assemblées et relarguées dans le milieu extracellulaire.

3.3. Modèles animaux 3.3.1. Rongeurs immunodéficients

Comme abordé précédemment, les animaux ne développent pas de symptômes lors d’infection par le VFHCC. C’est le cas pour les animaux de laboratoire couramment utilisés, comme les souris, les rats, les cochons d’Inde ou les hamsters immunocompétents (Shepherd et al., 1989b; Smirnova, 1979). Ainsi, pendant longtemps, des souris ou rats nouveaux-nés (chez qui le système immunitaire n’est pas totalement fonctionnel) ont été utilisés (Hoogstraal, 1979). Cependant, il fut récemment observé que des souris immunodéficientes, soit déficientes pour le récepteur aux interférons de type I (IFNAR) (Ifnar-/-), pour les récepteurs aux interférons de type I et II (Ifnagr-/-) ou pour le transducteur de signal et activateur de la transcription (STAT) 1 (Stat-1-/-), développent une maladie sévère, le plus souvent létale, pour le VFHCC (Aligholipour Farzani et al., 2019b; Bente et al., 2010; Bereczky et al., 2010; Zivcec et al., 2013). De même, des souris à qui l’on injecte des anticorps dirigés contre la sous-unité IFNAR1 sont transitoirement immunodéficientes et développent elles aussi une maladie sévère à létale (Garrison et al., 2017; Lindquist et al., 2018). Très récemment, un modèle de hamster déficient pour le facteur cellulaire STAT-2 (Stat-2-/-) a été développé (Ranadheera et al., 2020). Enfin, un dernier modèle utilisant des souris sévèrement immunodéficientes et humanisées par un transfert de cellules souches humaines CD34+, reproduit lors d’infection par le VFHCC une maladie neurologique (Spengler et al., 2017).

Les maladies sévères à létales sont obtenues chez ces modèles murins par inoculation intranasale, sous-cutanée, intramusculaire et intrapéritonéale, la voie intrapéritonéale étant celle induisant le plus de létalité (Garrison et al., 2019). Notamment, l’injection sous-cutanée du VFHCC dans un modèle de souris Ifnar-/- induit le développement d’une maladie sévère, mais non létale, représentant alors un modèle de convalescence intéressant (Hawman et al., 2019).

3.3.2. Modèles primates non-humains

Des études d’infection par le VFHCC de primates non-humains incluant les grivets (Chlorocebus aethiops), de babouins (Papio) ou de patas (Erythrocebus patas) révèlent que ces derniers ne développent pas de symptômes (Hoogstraal, 1979; Smirnova, 1979). Cependant, le macaque crabier (Macaca fascicularis) est sensible à l’infection par le VFHCC et développe alors une maladie sévère, représentative de celle observée chez l’humain. Ainsi, il représente le premier modèle animal immunocompétent développant une forme de la maladie (Haddock et al., 2018), et a été utilisé afin d’étudier l’efficacité de certaines molécules antivirales (Hawman

et al., 2020). Cependant, ce modèle reste controversé : dans une autre étude, l’infection de macaques crabiers par le VFHCC n’induit qu’une maladie bénigne (Cross et al., 2020).

4. Traitement et prévention de la maladie 4.1. Traitement 4.1.1. Traitement symptomatique

Les infections asymptomatiques ou se manifestant par un syndrome fébrile non-spécifique ne requièrent généralement pas d’hospitalisation ni de traitement. En revanche, les infections se manifestant par des symptômes plus graves sont traitées par des traitements symptomatiques de support (Ergönül, 2008). Ainsi, afin de prévenir l’augmentation de la perméabilité vasculaire, des perfusions intraveineuses sont réalisées ; les anormalités de coagulation sont traitées par administration de plasma et de plaquettes, et les hémorragies par transfusion sanguine.

4.1.2. Traitement étiologique In vitro comme in vivo, il a été observé que la ribavirine, un analogue de la guanosine ciblant la polymérase virale par inhibition compétitrice, inhibe la réplication du VFHCC dans un système de minigénome (Bergeron et al., 2010), dans des cellules infectées (Paragas et al., 2004; Watts et al., 1989) et dans des modèles animaux (Bente et al., 2010; Tignor et Hanham, 1993). Cette molécule antivirale non-spécifique a été employée pendant plus de 20 ans pour traiter les patients atteints de FHCC, et de nombreuses études indiquent un effet bénéfique de la drogue malgré l’absence de bras contrôle lors des essais cliniques (Jabbari et al., 2006; Smego et al., 2004). Cependant, un essai clinique randomisé n’a pas permis de confirmer l’effet bénéfique de la ribavirine (Koksal et al., 2010). D’autres essais cliniques sont nécessaires afin de déterminer l’efficacité de la ribavirine dans le traitement de la FHCC (Johnson et al., 2018). Récemment, une étude réalisée en modèle murin a permis d’observer que le traitement par la ribavirine induisait une réduction de la charge virale aux temps précoces de l’infection, mais qu’elle n’empêchait cependant pas la maladie de se développer (Hawman et al., 2018; Oestereich et al., 2014). Par contraste, le favipiravir, un autre analogue nucléosidique inhibant également la polymérase virale par inhibition compétitrice, a montré une efficacité thérapeutique dans des modèles murins d’infection par le VFHCC (Hawman et al., 2018; Oestereich et al., 2014) et permet une réduction de la virémie et de l’excrétion virale dans le modèle de macaque crabier (Hawman et al., 2020). Des essais cliniques sont nécessaires afin d’évaluer l’efficacité de cette molécule prometteuse.

Outre les analogues nucléosidiques, l’immunothérapie passive a également été utilisée (Vassilev et al., 1991). Cependant, aucun essai clinique randomisé impliquant ce traitement n’a été réalisé, empêchant de conclure quant à l’efficacité du traitement.

L’observation selon laquelle les souris déficientes pour les récepteurs aux interférons (IFN) développent une maladie sévère à létale laisse supposer que les IFN ont un rôle important dans le contrôle de l’infection. Il a été confirmé in vitro que l’IFN de type I inhibe la réplication du VFHCC (Andersson et al., 2006; I. Andersson et al., 2004). Ainsi, il fut supposé qu’administrer de l’IFN aux patients infectés par le VFHCC pouvait être bénéfique, mais un essai clinique impliquant un traitement avec de l’IFN n’en montre aucun effet bénéfique (van Eeden et al., 1985).

4.2. Prévention

En l’absence de traitement étiologique approuvé, il est nécessaire de prévenir la maladie. Ceci passe par la lutte contre les tiques dans l’environnement, et par le développement de vaccins.

4.2.1. Lutte contre les tiques dans l’environnement et mesures de protection pour l’Homme

La cinétique de transmission du virus de la tique vers l’hôte est inconnue dans le cas du VFHCC (Gargili et al., 2017). Pour certains virus transmis par des tiques comme le virus de Powassan, un virus de la famille des Flaviviridae, il a été montré que seules 15 minutes sont nécessaires pour que la transmission virale se fasse (Ebel et Kramer, 2004). Ainsi, par mesure de précaution, il est recommandé de retirer le plus rapidement possible toute tique présente sur le corps.

De nombreuses mesures peuvent être prises pour diminuer l’exposition au virus, passant notamment par l’information du grand public. Afin de réduire le risque de transmission du VFHCC de la tique à l’Homme, l’OMS recommande le port des vêtements protecteurs, l’utilisation d’acaricides et l’évitement des zones de présence des tiques. Afin de réduire le risque de transmission du virus de l’animal à l’Homme, il est nécessaire de manipuler les animaux ou leurs tissus avec des gants et des vêtements de protection. Enfin, pour réduire le risque de transmission interhumaine, et notamment les infections nosocomiales, il est recommandé d’éviter tout contact physique rapproché avec une personne infectée par le VFHCC, de porter des équipements de protection lors des soins, et de respecter les bonnes pratiques d’hygiène. (WHO, Aide-mémoire sur la fièvre hémorragique de Crimée-Congo, “https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/204157/Fact_Sheet_WHD_2014_FR_15258 37

.pdf?sequence=1&isAllowed=y,”). En effet, il a été montré que les méthodes standards barrières sont suffisantes pour empêcher la transmission virale (Celikbas et al., 2014).

4.2.2. Prophylaxie médicale

Actuellement, il n’existe aucun vaccin cliniquement approuvé contre le VFHCC. Cependant, depuis 1974, un vaccin obtenu à partir de virus cultivés sur tissus cérébraux de souriceaux infectés et inactivés par traitement au chloroforme et par la chaleur a été utilisé en Bulgarie jusqu’en 1996 (Papa et al., 2011). Malgré une baisse du nombre de cas en Bulgarie pendant ce laps de temps, l’absence d’essais cliniques et les problèmes de sûreté qu’implique ce vaccin n’en font pas une solution viable.

De nombreuses avancées ont été réalisées au cours des dernières années, notamment par le développement de modèles animaux d’infection. Ainsi, différentes stratégies sont mises en place pour la mise au point d’un vaccin contre le VFHCC. La plupart ciblent la NP ou les glycoprotéines d’enveloppe (Gn et Gc), ayant un fort potentiel immunogénique. D’une part, la NP contient de nombreux épitopes cellulaires B et T (Burt et al., 2013; Liu et al., 2014; Moming et al., 2018; Shrivastava et al., 2020; Wei et al., 2010) , et sa séquence n’est que peu variable (Hewson et al., 2004). De manière surprenante, la NP est une protéine virale interne, qui n’est pas censée être exposée. Il est donc étonnant qu’elle induise la production d’anticorps neutralisants. Cependant, dans un système d’étude de pseudoparticules virales, la NP est sécrétée dans le milieu extracellulaire (Zhou et al., 2011). D’autre part, les glycoprotéines d’enveloppes Gn et Gc sont des protéines localisées à l’enveloppe virale et impliquées dans l’étape d’entrée virale, pouvant constituer des cibles pour des anticorps neutralisants. Ces protéines sont maturées à partir d’une polyprotéine, appelée précurseur des glycoprotéines (GPC), avec d’autres protéines, GP38, GP85, GP160 et NSm (Altamura et al., 2007; Sanchez et al., 2006, 2002). De nombreux anticorps monoclonaux dirigés contre Gc neutralisants in vitro ont été décrits (Bertolotti-Ciarlet et al., 2005). Nonobstant, ces anticorps ne sont étonnamment pas protecteurs dans un modèle murin d’infection par le VFHCC (Golden et al., 2019). A notre connaissance, il n’existe aucun anticorps monoclonal neutralisant dirigé contre la glycoprotéine Gn. En revanche, il existe des anticorps monoclonaux neutralisants comme non-neutralisants dirigés contre la protéine sécrétée GP38. 13G8, un anticorps non-neutralisant dirigé contre GP38, s’est révélé être protecteur dans un modèle murin d’infection par le VFHCC (Golden et al., 2019).

Différentes approches vaccinales ont été développées au cours des dernières années. Elles comprennent les vaccins à base d’ADN ou d’ARN messagers (ARNm), les vecteurs viraux, les vaccins sous-unitaires, les pseudoparticules virales ou les particules virales entières inactivées.

4.2.2.1. Vaccins à base d’ADN

Un premier vaccin à ADN a été proposé en 2006, délivrant le GPC de la souche IbAr 10200. A la suite de l’administration de ce vaccin, 50% des souris utilisées pour l’étude ont développé des anticorps neutralisants in vitro, mais les études d’exposition post-vaccinale au virus n’ont pas été réalisées, empêchant de conclure sur l’efficacité de ce vaccin (Spik et al., 2006). Depuis, l’efficacité partielle d’un autre vaccin à base d’ADN exprimant les glycoprotéines d’enveloppe matures et la NP de la souche IbAr 10200 a été montrée (Hinkula et al., 2017). De même, un vaccin à base d’ADN codant le GPC entier de la souche IbAr 10200 a permis la protection partielle contre l’infection dans deux modèles murins (Garrison et al., 2017).

Basé sur l’expression de la NP, un vaccin à ADN exprimant la NP de la souche Turkey- Kelkit06, co-exprimé ou non avec le cluster de différenciation 24 (CD24) protège un modèle murin contre l’infection létale (Aligholipour Farzani et al., 2019c, 2019b). Si la vaccination s’est révélée protectrice, la réponse anticorps induite n’est pas neutralisante in vitro.

4.2.2.2. Vaccins à base d’ARNm

Un vaccin exprimant la NP de la souche de VFHCC Ank-2 administré intra-musculairement dans un modèle murin d’infection a permis la protection de 100% des souris infectées lors de la mise en place d’une stratégie de primo-vaccination suivie de rappel, tandis qu’une administration unique permettait la protection de 50% des souris (Aligholipour Farzani et al., 2019a).

4.2.2.3. Vecteurs viraux vaccinaux

Plusieurs vecteurs viraux ont été développés dans le but de créer un vaccin contre le VFHCC. A cette fin, le virus modifié Vaccinia Ankara (MVA) (Buttigieg et al., 2014; Dowall et al., 2016), le virus recombinant de la stomatite vésiculeuse (rVSV) (Rodriguez et al., 2019), l’adénovirus de type 5 recombinant (AdV-5) (Aligholipour Farzani et al., 2019b; Zivcec et al., 2018) et l’herpèsvirus bovin de type 4 (BoHV-4) (Aligholipour Farzani et al., 2019b) ont été utilisés pour délivrer respectivement le GPC et la NP de la souche IbAr 10200, le GPC de la souche IbAr 20100, la NP de la souche IbAr 10200 ou de la souche Turkey-Kelkit06, et la NP de la souche Turkey-Kelkit06. Le vaccin MVA ne s’est pas révélé protecteur malgré l’induction

d’une réponse humorale et cellulaire chez les souris vaccinées. Le vaccin rVSV administré intrapéritonéalement induit une protection de 100% des animaux dans un modèle murin d’infection. La protection induite par les vaccins AdV-5 n’est que partielle, comme celle induite par le vaccin basé sur le BoHV-4.

4.2.2.4. Vaccins sous-unitaires

Les ectodomaines des glycoprotéines d’enveloppes Gn et Gc de la souche IbAr 10200 ont été exprimés dans des cellules Schneider 2 de Drosophila puis purifiées. L’injection intrapéritonéale de ces protéines associées à un adjuvant permet la production d’anticorps neutralisants, mais n’offre pas de protection à la suite d’une infection sous-cutanée par le VFHCC (Kortekaas et al., 2015).

4.2.2.5. Pseudoparticules virales

Une injection intrapéritonéale des pseudoparticules virales décrites plus haut a permis la forte production d’anticorps neutralisants in vitro. De plus, dans une épreuve d’exposition post- vaccinale au VFHCC chez un modèle murin, ces anticorps ont protégé 40% des souris infectées (Hinkula et al., 2017). Un autre système de réplicons particulaires viraux a permis une protection de 100% des animaux infectés par différentes souches de VFHCC (Scholte et al., 2019b; Spengler et al., 2019).

4.2.2.6. Vaccins inactivés

En 2015, la souche Turkey-Kelkit06 a été propagée en culture cellulaire puis inactivée par le formaldéhyde. Cette stratégie induit la protection de 80% des souris infectées (Canakoglu et al., 2015).

PARTIE II – Biologie du VFHCC

1. Aspects taxonomiques et moléculaires 1.1. Taxonomie : le genre Orthonairovirus

L’ordre Bunyavirales comprend plus de 500 virus agents d’infections et de maladies chez de nombreux hôtes comprenant les plantes, les animaux et les humains. Actuellement, cet ordre est divisé en 12 familles, dont cinq sont associées à des maladies humaines : Arenaviridae, Hantaviridae, Nairoviridae, Peribunyaviridae et Phenuiviridae. Notamment, la famille Nairoviridae comprend des virus à ARN tri-segmentés, enveloppés et transmis par des tiques. Elle est divisée en trois genres, dont le genre Orthonairovirus, qui contient plus de 40 virus répartis en 15 espèces (Abudurexiti et al., 2019). La nomenclature de ce genre est fréquemment modifiée. Récemment, de nouveaux virus ont été ajoutés à ce genre, qu’ils soient nouvellement identifiés, comme le virus Meram (Ergünay et al., 2020), ou auparavant classés dans d’autres familles virales, comme le virus d’Estero Real, un virus précédemment classé dans la famille Peribunyaviridae (Nunes et al., 2018).

Les virus du genre Orthonairovirus infectent un large spectre d’hôtes, y compris les humains. Notamment, le VFHCC est l’orthonairovirus le plus pathogène pour l’homme connu à ce jour. De par la gravité de la maladie qu’il engendre chez l’humain, il est le virus le plus étudié du genre. Cependant, il n’est pas le seul à induire des maladies chez les humains : en effet, le virus de la maladie du mouton de Nairobi (d’où la famille Nairoviridae tire son nom), le virus de Ganjam, le virus de Dugbe, le virus d’Erve, le virus de Kasokero, le virus d’Issyk-kul et le virus de Soldado sont les agents étiologiques suspectés de maladies fébriles, maux de tête, prurits et diarrhées (Burt et al., 1996; Chastel, 1998; Dandawate et al., 1969; Kalunda et al., 1986; L’vov et al., 1984; Moussa et al., 1975; Rao et al., 1981; Treib et al., 1998). De plus, de nombreuses autres espèces de vertébrés sont également susceptibles aux infections par les orthonairovirus, qu’elles soient asymptomatiques (comme pour le VFHCC) ou responsables de maladies aux impacts économiques importants. En particulier, le virus de la maladie du mouton de Nairobi et le virus de Ganjam sont responsables de gastroentérites hémorragiques chez les moutons et les chèvres en Afrique et en Asie respectivement, avec un taux de mortalité dépassant 90% (Davies, 1997), faisant de ces virus une menace économique importante dans les pays en voie de développement. Des symptômes similaires de gastroentérite hémorragique sont retrouvés chez des souris de laboratoire immunocompétentes infectées avec le virus de Leopard Hill, un autre orthonairovirus infectant des chauve-souris (Ishii et al., 2014). 41

1.2. Structure du virion et génome viral

Le VFHCC est un virus enveloppé. Des études de microscopie électronique révèlent que les particules virales de VFHCC sont sphériques, de 80 à 100 nm de diamètre, possédant de petites projections en pointes d’une taille inférieure à 10 nm partant de la surface de la particule (Korolev et al., 1976; Zivcec et al., 2016), correspondant aux glycoprotéines d’enveloppe (Figure 8).

En tant que membre de la famille Nairoviridae, le génome du VFHCC est un ARN divisé en trois segments, nommés segment S, M et L. Ces ARN sont de polarité négative pour les segments M et L, tandis que le segment S adopte une polarité ambisens. Ces trois segments possèdent à leurs extrémités 5’ et 3’ des régions non-codantes complémentaires permettant la pseudo-circularisation du génome, et flanquant les régions codant les protéines virales.

Figure 8 : Structure du virion du VFHCC (Bente et al., 2013) Le virion est sphérique et fait entre 80 et 100 nm de diamètre. Son enveloppe lipidique est composée de spicules correspondant aux glycoprotéines Gn et Gc. Le virion contient trois segments d’ARN monocaténaires (S, L et M), encapsidés par la NP et la protéine L.

Le VFHCC code sept protéines virales (Figure 9). Avec une taille d’environ 1,6 kb, le segment S est le plus petit des trois segments du génome viral. Il code en polarité négative une protéine appelée nucléoprotéine (NP), dont la fonction principale est la formation de RNP virales en encapsidant le génome viral, par une liaison de la NP avec l’ARN viral. De plus, en polarité positive, sur un cadre ouvert de lecture chevauchant celui de la NP, le segment S code également une protéine non-structurale appelée NSs (Barnwal et al., 2016). Le segment M, d’une taille intermédiaire d’en moyenne 5,4 kb, code une seule polyprotéine, le GPC, dont la maturation complexe, décrite plus loin, donne naissance aux protéines d’enveloppe Gn et Gc, ainsi qu’aux protéines non-structurales GP38, GP85, GP160 et NSm (Altamura et al., 2007; Sanchez et al., 2006, 2002). Enfin, le plus grand des segments avec une taille d’environ 12,1 kb, le segment L, code une seule protéine, la protéine L, ayant notamment le rôle d’ARN polymérase dépendante de l’ARN (Honig et al., 2004a; Kinsella et al., 2004).

Figure 9 : Génome du VFHCC (Zivcec et al., 2016) Le VFHCC possède un génome d’ARN monocaténaire tri-segmenté, de polarité négative. Le segment S (en vert, d’environ 1,6 kb) code la NP ; le segment M (en violet, d’environ 5,4 kb) code le GPC, et le segment L (en gris, d’environ 12,1 kb) code la protéine L. Le segment S code également en sens positif une protéine non-structurale, NSs. Les régions codantes sont flanquées de régions non-codantes (NCR).

1.3. Cycle viral En Figure 10 est représenté schématiquement le cycle intracellulaire du VFHCC. Les différentes étapes du cycle sont décrites ci-dessous.

Figure 10 : Cycle du VFHCC (Bente et al., 2013). (A) Attachement du virion au récepteur cellulaire. (B) Internalisation dépendante de la clathrine. (C) Fusion des membranes virale et endosomale permettant le relargage des RNP dans le cytosol. (D) Réplication des RNP et génération d’ARNm. (E) Traduction des ARNm en protéines virales. (F) Traduction du GPC au niveau du réticulum endoplasmique et maturation des glycoprotéines. (G) Transport des glycoprotéines dans l’appareil de Golgi. (H) Maturation des glycoprotéines. (I) Assemblage de nouveaux virions. (J) Exocytose et relargage des nouveaux virions. Le cycle est décrit plus en détail dans le texte.

1.3.1. Entrée cellulaire

Les glycoprotéines d’enveloppe Gn et Gc sont vraisemblablement impliquées dans l’attachement du virus aux cellules, son internalisation et sa fusion à la membrane endosomale. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués ne sont pas encore précisément connus. Gc est la glycoprotéine d’enveloppe vraisemblablement impliquée dans l’attachement cellulaire, de par l’existence d’anticorps monoclonaux dirigés contre cette protéine et neutralisant l’infection (Bertolotti-Ciarlet et al., 2005). Le récepteur cellulaire du VFHCC n’est pas encore identifié, même si des études d’interactomique ont révélé une interaction de Gc avec la nucléoline (Xiao et al., 2011), une protéine cellulaire connue pour être le récepteur du virus syncitial respiratoire (Tayyari et al., 2011) ou encore un facteur d’entrée pour le virus de l’encéphalite japonaise (Thongtan et al., 2012). Ainsi, l’implication de cette protéine dans l’entrée du VFHCC reste à être étudiée dans un contexte d’infection. De plus, la forte homologie entre la boucle de fusion de la glycoprotéine Gc du virus de la fièvre de la vallée du Rift (Dessau et Modis, 2013) et celle de Gc du VFHCC (Garry et Garry, 2004) laisse supposer que Gc est impliquée dans la fusion des membranes virale et cellulaire, mais des études supplémentaires sont nécessaires pour confirmer ceci.

Après attachement à la membrane cellulaire, le VFHCC est internalisé par endocytose dépendante de la clathrine (Garrison et al., 2013; Simon et al., 2009). Ce mécanisme est également dépendant du cholestérol (Simon et al., 2009). De plus, la protéine cellulaire Rab5 est nécessaire pour le transport du VFHCC aux endosomes précoces puis aux corps multi- vésiculaires (Garrison et al., 2013; Shtanko et al., 2014), tandis que l’inactivation de la protéine Rab7, impliquée dans le trafic des endosomes précoces aux endosomes tardifs, n’induit aucun changement d’infectivité ou d’association du VFHCC aux corps multi-vésiculaires, témoignant de la non-implication des endosomes tardifs dans le cycle du VFHCC (Garrison et al., 2013; Shtanko et al., 2014). En revanche, des composants du complexe de tri endosomique (ESCRT) sont essentiels pour l’infectivité du VFHCC (Shtanko et al., 2014). Dans l’ensemble, ces données suggèrent que les corps multi-vésiculaires sont les organelles où les membranes virale et cellulaire fusionnent, libérant alors le génome viral dans le cytosol, mais ceci reste à être confirmé et précisé.

1.3.2. Transcription, traduction et réplication

Le génome viral de polarité négative sert de matrice pour la protéine L, qui synthétise grâce à son activité polymérase un ARN complémentaire de polarité positive ayant le rôle d’ARNm.

Des études réalisées sur un virus phylogénétiquement proche du VFHCC, le virus de Dugbe, ont permis d’identifier la présence de séquences non-virales à l’extrémité 5’ de ces ARNm (Jin et Elliott, 1993). Ainsi, le VFHCC est suspecté d’initier la traduction de ces ARNm par un mécanisme de vol de coiffe, impliquant jusqu’à 6 à 16 nucléotides des ARNm cellulaires en aval de leur coiffe. Ce mécanisme serait assuré par la protéine L, qui contient un domaine endonucléase (Devignot et al., 2015; Honig et al., 2004a). In silico, il avait été prédit que ce domaine était situé en aval de l’extrémité amino-terminale de la protéine L (Morin et al., 2010); et un système de pseudo-particules virales a confirmé cette localisation et a précisé notamment l’importance du résidu asparagine 693 de la protéine L pour cette fonction (Devignot et al., 2015). La traduction des ARNm viraux permet alors la synthèse des protéines virales. La traduction des ARNm viraux se fait au détriment de celle des ARNm cellulaires, par un mécanisme encore non complètement élucidé, mais impliquant la liaison de la NP aux régions 5’ non-codantes des ARNm viraux ainsi que la présence du facteur d’initiation de la traduction eucaryote 4G (eIF4G) (Jeeva et al., 2017a).

La réplication du génome viral est également assurée par l’activité ARN-polymérase de la protéine L. Le génome viral est de polarité négative et sert de matrice pour la synthèse d’un ARN complémentaire de polarité positive, appelé ARN antigénomique. Ce dernier est encapsidé par la NP pour former des RNP antigénomiques, qui servent alors elles-mêmes de matrice pour la synthèse de nouveaux ARN génomiques, de polarité négative. Une particularité des ARN viraux génomiques est que leur extrémité est monophosphorylée (Habjan et al., 2008; Spengler et al., 2015). Cette monophosphorylation est sans doute obtenue par un mécanisme appelé « prime and realign », durant lequel une endonucléase virale, probablement celle de la protéine L, génère une extrémité 5’-monophosphate en clivant le premier nucléotide de l’extrémité 5’, comme observé pour le virus Hantaan (Garcin et al., 1995), un virus du même ordre Bunyavirales que le VFHCC. Le rôle de cette monophosphorylation serait l’échappement à la réponse immunitaire innée, un des senseurs cellulaires cytoplasmiques, RIG-I, reconnaissant notamment les extrémités di- ou tri-phophosphorylées des ARN (Hornung et al., 2006; Kato et al., 2008),. Cependant, malgré la stratégie de monophosphorylation de l’extrémité 5’ des ARN viraux, le VFHCC induit tout de même une réponse immunitaire induite par RIG- I (Spengler et al., 2015).

1.3.3. Maturation des glycoprotéines

La traduction des ARNm viraux permet la synthèse de protéines virales, dont le GPC, codé par le segment M du VFHCC. Cette polyprotéine est maturée de manière complexe tout au long de

la voie sécrétoire en six protéines : les deux glycoprotéines d’enveloppe Gn et Gc (Sanchez et al., 2002), mais également des protéines non-structurales, GP38, GP85, GP160 (Sanchez et al., 2006) et NSm (Altamura et al., 2007) (Figure 11).

Le GPC est une protéine contenant six domaines transmembranaires (notés TM0 à TM5), ayant un rôle soit de peptide signal de sécrétion ou d’ancre membranaire (Lasecka et Baron, 2014).

Le TM0 permet notamment de conduire la synthèse totale du GPC au niveau du réticulum endoplasmique (RE). De manière concomitante à la traduction et à l’élongation, un premier clivage a lieu après TM0, et le GPC acquiert des N-glycosylations et des ponts disulfures. De plus, des clivages du GPC ont lieu, libérant le précurseur de Gn (PreGn), le précurseur de Gc (PreGc) et une protéine non-structurale, NSm (Altamura et al., 2007; Sanchez et al., 2002). Ces clivages auraient lieu par des signal peptidases (SP). Après un trafic jusqu’à l’appareil de Golgi de ces protéines, ont lieu plusieurs O-glycosylations du domaine mucine-like (MLD) de PreGn situé à son extrémité amino-terminale, ainsi qu’un clivage au niveau d’un motif RRLL par une proprotéine convertase, la subtilisin kexin isozyme-1/site-1 protease (SKI-1/S1P) (Vincent et al., 2003). Ce clivage conduit à la formation de deux protéines, GP160 et GP85. GP160 et GP85 sont ensuite partiellement clivées dans le réseau trans-golgien (TGN) par une furine au niveau d’un motif RSKR, conservé chez toutes les souches du VFHCC (Bergeron et al., 2015; Walker et al., 2016), libérant ainsi la protéine GP38 (Sanchez et al., 2006). La protéase cellulaire nécessaire pour la conversion de PreGc en Gc n’est actuellement pas identifiée, mais le motif impliqué (RKPL) étant le même que celui du virus de Guanarito, un virus de la famille des Arenaviridae, pour lequel le GPC est clivé au niveau de ce motif par une SKI-1/S1P (Rojek et al., 2008), il est supposé que la même protéase ou une protéase similaire soit impliquée dans le clivage de PreGc en Gc.

Figure 11 : Maturation du GPC (Sanchez et al., 2006). La maturation du GPC codé par le segment M (clivages, N- et O-glycosylations) a lieu tout au long de la voie sécrétoire, permettant in fine la production des glycoprotéines d’enveloppe Gn et Gc, mais aussi la sécrétion de GP38, GP85 et GP160. Les N-glycosylations sont marquées en rouge, les O-glycosylations en bleu.

1.3.4. Assemblage viral et sortie

Actuellement, peu de choses sont connues quant à l’assemblage des composants du VFHCC et sa sortie. Cependant, la localisation subcellulaire des glycoprotéines virales Gn et Gc dans l’appareil de Golgi et le TGN (Bertolotti-Ciarlet et al., 2005), de même que la localisation périnucléaire de la NP (Ida Andersson et al., 2004), proche de l’appareil de Golgi, laissent supposer que l’appareil de Golgi ou le TGN constituent le lieu d’assemblage des virions, qui seraient alors relargués par exocytose. Dans des cellules épithéliales polarisées, la sortie des virions a lieu à la membrane baso-latérale (Connolly-Andersen et al., 2007).

2. Structure et rôle des protéines virales 2.1. Protéines codées par le segment S 2.1.1. Structure et fonction primaire de la NP

Figure 12 : Domaines et motifs de la NP (Zivcec et al., 2016) En vert foncé est représenté le domaine globulaire de la NP, et en vert clair le domaine « tige ». Un domaine de clivage par la caspase-3 est indiqué en violet foncé. Les différents domaines impliqués dans la liaison de la NP à l’ARN sont en rose. Les domaines impliqués dans la fonction endonucléase de la NP sont en bleu. Enfin, en gris est représentée la région de liaison de la NP à l’actine, et en pointillés la région de liaison de la NP aux autres NP.

Comme abordé précédemment, la principale fonction de la NP est la formation de RNP virales en encapsidant le génome viral. Afin de mieux comprendre comment cette protéine interagit avec l’ARN viral, sa structure a été déterminée par cristallographie suivie de diffractions aux rayons X (S. D. Carter et al., 2012; Stephen D. Carter et al., 2012; Guo et al., 2012; Wang et al., 2015, 2012) (Figure 13). Elle est composée d’un domaine globulaire (head) et d’un domaine « tige » (arm ou stalk) (Figure 12, Figure 13). Les extrémités carboxy-terminale comme amino-terminale sont impliquées dans la formation du domaine globulaire, tandis qu’un faisceau d’hélices α compose le domaine « tige ». Une forte ressemblance de cette protéine avec la protéine NP du virus Lassa, un membre de la famille Arenaviridae, du même ordre

Bunyavirales, est à noter, malgré leur faible similarité de séquence primaire (Stephen D. Carter et al., 2012; Guo et al., 2012; Wang et al., 2012).

Figure 13: Structure de la NP (Guo et al., 2012) En vert est représenté le domaine globulaire, et en violet le domaine « tige ». (A) Représentation schématique des différents domaines de la NP. (B) Structure de la NP.

In vitro, la NP est présente sous forme monomérique dans les cellules infectées (Wang et al., 2016), mais sous cette conformation, elle ne se lie que faiblement à l’ARN (Guo et al., 2012). La NP existe également sous forme d’oligomères, formés par l’interaction du domaine globulaire d’une protéine avec le domaine « tige » d’une autre protéine adjacente (Figure 14). La présence d’une superhélice dans la structure de la protéine NP a été déterminée comme essentielle pour permettre cette interaction homotypique (Macleod et al., 2015).

Figure 14 : Structure des oligomères de NP (Wang et al., 2012) Les polymères de NP forment une double superhélice antiparallèle.

Il a été déterminé que la NP se lie à l’ARN viral selon deux modes différents : la liaison à de l’ARN bicaténaire a lieu via l’interaction du domaine « tige » avec les extrémités complémentaires 5’ et 3’ du génome viral, tandis que la liaison à l’ARN monocaténaire, qu’il soit cellulaire ou viral, se fait au niveau du domaine globulaire de la NP (Jeeva et al., 2017b). Dans les deux cas, lors de sa liaison avec l’ARN, la NP subit un changement de conformation (Jeeva et al., 2017b). De plus, la protéine NP interagit également avec les extrémités amino- et carboxy-terminales de la protéine virale L (Macleod et al., 2015), complétant ainsi la formation des RNP. Lors d’infection, la NP est localisée dans une région périnucléaire, et cette localisation est notamment dépendante des filaments d’actine cellulaires (Ida Andersson et al., 2004), pour laquelle la NP possède un domaine de liaison (Macleod et al., 2015).

Ces études poussées concernant cette protéine ont permis le développement d’une molécule antivirale potentielle, appelée Affimer-NP, de forte affinité pour le domaine globulaire de la protéine NP. Elle interfère ainsi avec la fonction de liaison à l’ARN et à l’oligomérisation des monomères (Álvarez-Rodríguez et al., 2020).

Cependant, la protéine NP comporte également d’autres fonctions, décrites ci-dessous.

2.1.2. NP et traduction des ARNm viraux

La NP permet d’augmenter la traduction des ARN messagers (ARNm) viraux au détriment des ARNm cellulaires, de par sa liaison à la région 5’ non-codante des ARNm viraux (Jeeva et al., 2017a). Ce mécanisme moléculaire est notamment dépendant du facteur d’élongation 4G (eIF4G). La présence d’une coiffe n’est pas nécessaire pour cette stratégie de traduction facilitée par la NP, et ceci corrobore le fait que la NP ne se lie avec les analogues de coiffe qu’avec une faible affinité in vitro (Guo et al., 2012). Cette dernière observation laisse de plus supposer que NP n’est pas impliquée dans le processus de vol de coiffe, malgré la haute similarité structurale du domaine globulaire de la protéine NP avec celui de la protéine NP du virus Lassa, qui est, lui, impliqué dans cette fonction (Qi et al., 2010).

2.1.3. NP et acteurs cellulaires de la réponse immunitaire innée

La NP est une protéine ciblée par le système immunitaire. Cette réponse est déclenchée après reconnaissance de motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) par des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRR) et conduit à l’établissement d’un état antiviral. Les interférons (IFN) sont des facteurs clés de cette réponse immunitaire, et leur sécrétion promeut l’expression de gènes stimulés par l’IFN (ISG), dont plus de 300 ont été décrits. Ces ISG ont des activités antivirales, antiprolifératives et immunomodulatoires.

Le fait que des souris déficientes pour la voie IFN (Ifnar-/-, Stat-/-) soient hautement susceptibles à l’infection par le VFHCC (Bente et al., 2010; Bereczky et al., 2010; Garrison et al., 2017; Hawman et al., 2019, 2019; Lindquist et al., 2018; Zivcec et al., 2013) suggère qu’il existe une résistance de l’hôte induite par les IFN contre le VFHCC. En effet, des études in vitro ont montré que l’IFN-α inhibe la réplication du VFHCC (Andersson et al., 2006), et que MxA, un ISG bien décrit, représente un facteur clé de cet effet antiviral de l’IFN-α contre le VFHCC (Andersson et al., 2006; I. Andersson et al., 2004). Le mécanisme de l’activité inhibitrice de MxA reste à être complètement élucidé. Cependant, il a été montré que la NP et MxA interagissent l’une avec l’autre, induisant une localisation périnucléaire de MxA, où la NP est localisée (I. Andersson et al., 2004). Ceci suggère soit que MxA séquestre la NP dans des complexes périnucléaires, la rendant indisponible pour la réplication du génome viral et la formation de RNP, comme observé pour le virus de La Crosse (Kochs et al., 2002), un virus de la famille des Peribunyaviridae et de l’ordre Bunyavirales, ou alors que la liaison directe de MxA à la NP empêche les fonctions de cette dernière.

2.1.4. NP, NSs et apoptose

L’apoptose est une voie de mort cellulaire programmée, induite par le déclenchement d’un signal extra- ou intracellulaire. Les voies intrinsèque ou extrinsèque de l’apoptose sont alors activées. Les interactions entre l’apoptose et les infections virales sont complexes : de nombreux virus sont connus pour déclencher l’apoptose lors d’infection, tandis que d’autres l’inhibent ou la retardent.

Aux stades tardifs d’infection, le VFHCC induit l’apoptose, présumément par l’induction d’une réponse inflammatoire importante (Karlberg et al., 2015, 2011). En effet, l’infection par le VFHCC induit le clivage, et donc l’activation, du facteur pro-apoptotique Bid, membre de la famille BCL-2. En particulier, le facteur de nécrose tumorale (TNF-α) qui est sécrété dans le surnageant de cellules infectées aux stades tardifs d’infection aurait un rôle dans l’activation de la voie de mort induite par le récepteur au TNF-α (Karlberg et al., 2015). Il a également été suggéré que l’apoptose des hépatocytes était induite par le VFHCC à cause d’une surcharge du RE, conduisant à un stress de RE déclenchant donc l’apoptose (Rodrigues et al., 2012). De plus, récemment, le rôle d’une protéine non-structurale codée par le segment S en sens positif, NSs, dans l’induction de l’apoptose a été déterminé dans un système de surexpression de NSs (Barnwal et al., 2016). Dans ces conditions, NSs active la voie intrinsèque de l’apoptose en dérégulant le potentiel membranaire mitochondrial, mais la voie extrinsèque de l’apoptose est également induite. Cependant, le rôle de cette protéine en conditions d’infection reste à être déterminé, car elle subit une dégradation active par le protéasome dans les cellules infectées (Barnwal et al., 2016). NSs est conservée chez toutes les souches du VFHCC, exceptée la souche AP92 (Hewson et al., 2004). Ainsi, des études plus poussées du mécanisme d’apoptose lors d’infection par cette souche pourraient être intéressantes.

Si le VFHCC active l’apoptose aux stades tardifs d’infection, ce n’est pas le cas aux stades précoces d’infection. En effet, dans un modèle de cellules épithéliales, les activations de la caspase-3 comme de la caspase-9 sont inhibées lors d’infection par le VFHCC aux stades précoces. Dans un modèle de surexpression de la protéine NP, il fut démontré que la NP est responsable de la suppression du processus apoptotique coordonné par Bax, membre pro- apoptotique de la famille des protéines BCL-2, ou par un de ces effecteurs en aval (Karlberg et al., 2015).

De manière concomitante à l’activation des caspases aux stades tardifs d’infection, la protéine NP est clivée par un mécanisme dépendant de la caspase-3 (Karlberg et al., 2011). Des analyses

structurales révèlent la présence d’un motif de clivage par la caspase-3, DEVD, présent à l’apex du domaine « stalk » (Stephen D. Carter et al., 2012; Guo et al., 2012), conservé chez toutes les souches du VFHCC (Karlberg et al., 2011). Cependant, comme ce site est impliqué dans l’oligomérisation de NP, le clivage par la caspase-3 n’aurait lieu seulement que sur la forme monomérique de NP (Wang et al., 2012) (Figure 15). Des mutations de ce domaine de clivage résultent en l’incapacité pour la caspase-3 de cliver la NP, et, de manière intrigante, en une augmentation de l’activité de la polymérase virale dans un système de mini-réplicons (Wang et al., 2012). Ainsi, le clivage de la protéine NP par la caspase-3 pourrait être un mécanisme de défense de l’hôte contre l’infection par le VFHCC, mais une autre explication serait que la NP agirait comme un leurre pour la caspase-3 pour inhiber l’induction de l’apoptose pendant l’infection, comme observé pour le virus de Junín, un virus de la famille des Arenaviridae et de l’ordre Bunyavirales (Wolff et al., 2013). Ceci pourrait alors expliquer l’induction retardée de l’apoptose expliquée précédemment.

A B

Figure 15: Interaction entre deux protéines NP au niveau du site de clivage par la caspase 3 (Wang et al., 2012). (A) Une molécule de NP est représentée en blanc, l’autre en jaune. En violet sont représentés les résidus impliqués dans l’interaction entre les deux protéines. (B) Le domaine de clivage par la caspase 3 n’est pas exposé dans la double-superhélice antiparallèle des polymères de NP. L’hétérodimère de caspase-3 est représenté en cyan et bleu.

Jusqu’à récemment, le clivage de la protéine NP n’avait été étudié qu’en cellules de mammifères. Dans ces cellules, le clivage de la NP par la caspase-3 est non seulement non requis pour la réplication virale, mais il l’inhibe même (Wang et al., 2012). Cependant, des études récentes réalisées sur des cellules de tiques ont révélé d’une part que dans ces cellules, la NP n’est pas clivée, et d’autre part que le site de clivage par la caspase-3 est essentiel pour la réplication virale en cellules de tiques (Salata et al., 2018). Ces cellules restent infectées de manière permanente et aucune mort cellulaire n’est observée. Ces observations pourraient expliquer la conservation de ce motif de clivage apparemment défavorable pour le virus dans

des cellules de mammifères : il le serait dans des cellules de tiques, qui constituent le réservoir du virus.

2.1.5. NP et activité endonucléase

Il a été déterminé in vitro que la NP possède une activité endonucléase dépendante des cations divalents sur l’ADN mono- comme bicaténaire (Guo et al., 2012; Wang et al., 2015). Cette activité n’est pas spécifique d’une séquence particulière et est portée par une poche chargée positivement située sur le domaine globulaire de la protéine NP. Cependant, l’activité endonucléase de la NP semble être abrogée par sa liaison avec de l’ARN (Wang et al., 2016). Des études complémentaires sont donc nécessaires afin de déterminer les conséquences fonctionnelles de cette activité endonucléase.

2.2. Protéines codées par le segment M

Comme présenté précédemment, le segment M code une polyprotéine maturée en plusieurs protéines : les glycoprotéines d’enveloppe Gn et Gc, NSm, GP38, GP85 et GP160 (Figure 16). Le rôle de chacune de ces protéines est décrit ci-dessous.

Figure 16 : Domaines et motifs du GPC (Zivcec et al., 2016)

En vert est représenté le TM0. Les autres domaines transmembranaires sont représentés en jaune. Les différents domaines correspondant aux futures protéines maturées (le domaine MLD, GP38, Gn, NSm et Gc) sont indiqués. La région de liaison de Gn à l’ARN est indiquée en gris, la potentielle boucle de fusion de Gc est représentée en bleu, et la région de liaison à la nucléoline de Gc est représentée en pointillés.

2.2.1. Glycoprotéines d’enveloppe

Les glycoprotéines d’enveloppe sont Gn et Gc. Le rôle potentiel de Gc dans l’entrée virale, en tant qu’interacteur éventuel avec un potentiel récepteur cellulaire du VFHCC, a déjà été évoqué plus haut dans cette thèse.

En tant que glycoprotéine d’enveloppe, Gn est une protéine transmembranaire. De manière intéressante, la partie cytoplasmique de Gn possède un domaine en doigt de zinc qui, in vitro, se lie à l’ARN. Ainsi, Gn pourrait être impliquée dans la formation de nouveaux virions, en interagissant avec l’ARN viral, comme une protéine de matrice (Estrada et De Guzman, 2011) Cependant, comme l’ARN viral est incorporé dans les RNP, ce mécanisme potentiel reste à être élucidé.

2.2.2. Protéine NSm

Lors de la maturation du GPC, des premiers clivages libèrent PreGn, PreGc, mais également une protéine non-structurale, NSm (Altamura et al., 2007). Cette protéine possède trois domaines transmembranaires, de TM2 à TM4.

Dans un système de pseudoparticules virales, la délétion de NSm induit une production retardée des particules virales ainsi qu’une maturation moindre de la glycoprotéine d’enveloppe Gc. Ainsi, NSm induirait une subversion du système sécrétoire de l’hôte, accélérant le trafic des protéines au sein de ce système et promouvant alors la sécrétion de nouvelles particules virales (Freitas et al., 2020).

D’autres virus de l’ordre Bunyavirales, comme le virus Maguari, le virus Oropouche, le virus de la fièvre de la vallée du Rift ou le virus de Schmallenberg, codent une protéine NSm. Cependant, pour chacun de ces virus, elle n’est pas essentielle pour la réplication virale (Bird et al., 2007; Gerrard et al., 2007; Pollitt et al., 2006; Tilston-Lunel et al., 2016; Won et al., 2006). De manière similaire, pour le VFHCC, un virus recombinant fluorescent, pour lequel le domaine de NSm a été retiré, a pu être généré, confirmant la non-implication de NSm dans la réplication virale. Parmi le genre Orthonairovirus, seuls certains virus phylogénétiquement proches du VFHCC, les virus de la maladie du mouton de Nairobi, le virus de Kupe, le virus de Dugbe, et le virus Hazara, codent un homologue de NSm (Walker et al., 2016, 2015).

La pathogénicité du VFHCC recombinant fluorescent ne possédant pas NSm a été évaluée dans un modèle de souris immunodéficientes. Comme un virus fluorescent contenant NSm,

l’infection par le virus fluorescent ne contenant pas NSm induit, lui aussi, une maladie sévère à létale, malgré un retard dans l’apparition des symptômes. Ainsi, NSm ne serait pas impliquée dans la pathogenèse du VFHCC dans ce modèle (Welch et al., 2020).

2.2.3. Domaine mucine-like et protéines GP38, GP85 et GP160

La protéine PreGn est un précurseur de Gn. Sa maturation implique un premier clivage par la SKI-1/S1P au niveau du site RRLL, qui libère tout d’abord Gn de GP160 et GP85 (Vincent et al., 2003). Ce clivage est essentiel pour la libération de virus infectieux, comme le montre l’absence de production de virus infectieux par des cellules déficientes en SKI-1/S1P infectées (Bergeron et al., 2007).

La différence de taille (85 kDa et 160 kDa) entre GP85 et GP160 reste encore mal comprise. En effet, ni une dénaturation avec de l’urée et des agents réducteurs, ni différents traitements de déglycosylation n’altèrent le profil différentiel de migration électrophorétique de ces deux protéines (Sanchez et al., 2006). Ainsi, GP160 ne serait pas un dimère de GP85, et leur différence ne réside pas non plus dans des profils différents de glycosylation. De futures études sont nécessaires afin d’éclaircir ce point.

Puis, GP160 et GP85 sont partiellement clivées dans le TGN par une furine au niveau d’un motif RSKR, libérant ainsi la protéine GP38 (Sanchez et al., 2006) du domaine mucine-like présent à l’extrémité amino-terminale du GPC. Si ce motif RSKR est conservé chez toutes les souches du VFHCC, il ne l’est chez aucun autre virus du genre Orthonairovirus. GP38 est donc une protéine spécifique du VFHCC (Bergeron et al., 2015; Walker et al., 2016).

Le domaine MLD est un domaine hautement glycosylé, présent chez le GPC, GP160 et GP85. D’autres virus, comme le virus Ebola ou le virus de Marburg, membres de la famille des Filoviridae, possèdent également un domaine MLD et un motif de clivage par les furines (Volchkov et al., 2000, 1998). De manière intéressante, le domaine MLD du VFHCC peut être remplacé par le domaine MLD du virus Ebola sans altérer les fonctions des protéines virales (Fusco et al., 2015). Cependant, contrairement au domaine MLD des filovirus, le domaine MLD du VFHCC n'est pas incorporé dans les virions (Sanchez et al., 2002). De fait, le devenir du MLD après sa séparation de GP38 reste inconnu. Enfin, la délétion du domaine MLD n’impacte pas le trafic du GPC le long de la voie sécrétoire, témoignant de sa non-implication dans la maturation du GPC. Par contraste, la délétion du domaine GP38 induit une rétention de Gn dans le réticulum endoplasmique (Bertolotti-Ciarlet et al., 2005). De plus, l’inhibition du clivage par la furine au niveau du site RSKR dans un système de clone infectieux induit une baisse de 57

conversion de PreGn en Gn, ainsi qu’en un retard de production virale (Bergeron et al., 2015) Ainsi, GP38 ou le clivage par la furine seraient impliqués dans la maturation du GPC. Des données récentes sont venues éclaircir l’implication de GP38 dans la réplication virale. En effet, dans un système de pseudoparticules virales, la délétion du domaine de GP38 induit une absence de production de particules virales, par absence de maturation de la protéine PreGc en Gc (Freitas et al., 2020).

Additionnellement, il fut observé que GP38, GP85 et GP160 sont sécrétées dans le milieu extracellulaire de cellules infectées in vitro par le VFHCC (Sanchez et al., 2006). Le rôle extracellulaire de ces trois protéines reste encore à être élucidé. La structure de la forme extracellulaire de la protéine GP38 a été récemment déterminée par cristallographie suivie de diffraction aux rayons X (Mishra et al., 2020) (Figure 17), mais elle ne montre d’homologie avec aucune protéine connue virale ou cellulaire. C’est un monomère composé de trois faisceaux d’hélices α à son extrémité amino-terminale, suivie d’un noyau composé de deux β- sandwichs. Cette structure est renforcée par quatre ponts disulfures, et contient deux sites de N- glycosylations.

Figure 17: Structure de GP38 (Mishra et al., 2020). (A) Structure de GP38 colorée en arc-en-ciel de l’extrémité amino- à carboxy-terminale (de bleu à rouge). (B) Diagramme topologique indiquant la structure secondaire de GP38. Les hélices α sont représentées par des cylindres tandis que les feuillets β le sont par des flèches. Les sites de N-glycosylation sont représentés par des carrés bleus, et les ponts disulfures par des pointillés.

Par microscopie électronique et microscopie confocale, la forme extracellulaire de GP38 est observée à la membrane des cellules comme à la surface des virions (Golden et al., 2019). Cependant, la présence de GP38 à la surface des virions reste controversée (Freitas et al., 2020).

De manière intéressante, des anticorps dirigés contre GP38 se révèlent être protecteurs dans un modèle murin immunodéficient (Golden et al., 2019). Cependant, ces anticorps ne sont pas neutralisants in vitro. Ceci suggère une éventuelle implication des formes sécrétées de GP38, GP85 et GP160 dans la pathogenèse du VFHCC, explorée plus loin dans cette thèse.

2.3. Protéine codée par le segment L

2.3.1. Structure de la protéine L

Le segment L est le plus grand des trois segments du VFHCC. Avec environ 12 000 nucléotides, il est plus grand que les segments L des autres virus à ARN tri-segmentés de l’ordre Bunyavirales. Il code une unique protéine, la protéine L, qui contient plusieurs domaines (Figure 18). Un de ces domaines, très conservé, est responsable de l’activité de polymérase à ARN dépendante de l’ARN, nécessaire pour la transcription et la réplication virales (Honig et al., 2004b). Les autres domaines de la protéine L sont un domaine de tumeur ovarienne (OTU), un domaine topoisomérase, un domaine à doigt de zinc, un motif de glissière à leucine et un domaine endonucléase. Si les rôles de certains de ces domaines, comme le domaine topoisomérase ou le motif de glissière à leucine, ne sont actuellement pas élucidés, des études récentes ont fourni des indices sur les rôles des autres domaines, décrits ci-dessous.

Figure 18 : Domaines et motifs de la protéine L (Zivcec et al., 2016) Les domaines OTU, topoisomérase, à doigt de zinc, de glissière à leucine, endonucléase et d’ARN polymérase dépendante de l’ARN sont représentés respectivement en bleu, jaune, vert, orange, rose et noir. Les domaines de liaison à la NP sont représentés en pointillés.

2.3.2. Domaine à doigt de zinc et formation de RNP virales

Le domaine à doigt de zinc est nécessaire pour l’interaction de la protéine L avec la NP, complétant la formation de RNP virales (Macleod et al., 2015).

2.3.3. Protéine L et activité endonucléase

La protéine L contient un domaine à activité endonucléase. L’implication de ce domaine dans le vol de coiffe nécessaire à la traduction des ARNm viraux a été évoqué plus haut dans cette thèse.

Classiquement, les endonucléases des virus à ARN négatif sont triées en deux classes : les endonucléases His+ possèdent une histidine au niveau de leur site actif, tandis que les endonucléases His- n’en possèdent pas (Reguera et al., 2016). Comme le site actif du domaine endonucléase du VFHCC ne possède pas d’histidine, il fut d’abord pensé qu’il appartenait aux endonucléases His- ; cependant, la nécessité d’un métal ionique pour l’activité endonucléase du domaine, similairement aux endonucléases His+, le rapproche de la classe de ces dernières (Holm et al., 2018). Ainsi, possédant simultanément des caractéristiques des deux classes, le domaine endonucléase du VFHCC ne fait partie ni des endonucléases His-, ni His+.

2.3.4. Domaine OTU et échappement à la réponse immunitaire innée

Les PAMPs sont reconnus par une combinaison sophistiquée de PRR, qu’ils soient cytosoliques ou membranaires. Notamment, les virus de l’ordre Bunyavirales sont majoritairement reconnus par une classe de ces récepteurs, les récepteurs RIG-I-like (RLR) (Elliott et Weber, 2009), parmi lesquels le retinoic acid-inducible gene I (RIG-I). La reconnaissance du VFHCC par RIG-I (Spengler et al., 2015) induit l’activation d’une cascade de signalisation complexe conduisant à l’expression d’IFN de type I et de cytokines pro-inflammatoires. Les IFN de type I induisent alors l’expression de gènes stimulés par l’IFN (ISG) par la voie des IFNAR et janus kinase / signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) (Schindler et al., 2007). Ces ISG ont un rôle antiviral.

La réponse des IFN de type I est hautement régulée. Notamment, elle repose sur de nombreuses modifications post-traductionnelles de certains acteurs clés de la réponse IFN, comme l’ubiquitinylation. Par exemple, une polyubiquitinylation liée par les arginines 63 est essentielle pour l’activation de RIG-I (Gack et al., 2007). Le niveau global d’ubiquitinylation est régulé 60

par des désubiquitinases cellulaires, parmi lesquelles les protéines de la famille des tumeurs ovariennes (OTU), comme A20 ou DUBA (Kayagaki et al., 2007; Wertz et al., 2004). De plus, la réponse IFN de type I induit l’expression d’une protéine de 15 kDa, ISG15, qui est un membre de la famille des ubiquitines (Haas et al., 1987). Cette protéine est retrouvée chez de nombreuses espèces de mammifères, mais avec un haut degré de diversité structurale (Perng et Lenschow, 2018). Cette protéine peut être conjuguée de manière covalente à des protéines cibles via une cascade enzymatique appelée ISGylation (Loeb et Haas, 1992). Cette protéine, qu’elle soit conjuguée ou libre dans sa forme intra- ou extracellulaire, est connue pour antagoniser la réplication de certains virus, même si son activité diverse, dépendante du pathogène comme de l’espèce d’hôte infecté (Perng et Lenschow, 2018), n’est pas totalement comprise.

Il a été observé que la protéine L du VFHCC contient un domaine OTU à son extrémité amino- terminale (Honig et al., 2004b; Kinsella et al., 2004; Walker et al., 2016). Ceci suggère que, comme les protéines A20 ou DUBA cellulaires, elle pourrait être impliquée dans la déubiquitinylation. De nombreuses études basées sur un système de surexpression du domaine OTU corroborent cette hypothèse (Bakshi et al., 2013; Frias-Staheli et al., 2007; Holzer et al., 2011; Kocabas et Aslan, 2015). De plus, dans deux systèmes différents, l’un impliquant la protéine L purifiée et l’autre un minigénome, il a été montré que ce domaine n’est pas nécessaire à l’activité polymérase de la protéine L (Bergeron et al., 2010; Tchesnokov et al., 2020). Ainsi, dans un système de génétique inverse, un virus recombinant a pu être obtenu, pour lequel le domaine OTU n’a plus d’activité de déubiquitinylation. Une infection par ce virus conduit à l’instauration d’un état antiviral dans les cellules infectées, caractérisé par une activation des facteurs cellulaires clés de la réponse immunitaire innée, tandis qu’un virus pour lequel le domaine OTU est fonctionnel conduit à une activation réduite de ces facteurs, dont RIG-I (Scholte et al., 2017). De nombreuses études structurales et biochimiques ont été réalisées sur les domaines OTU des virus du genre Orthonairovirus (Akutsu et al., 2011; Capodagli et al., 2013, 2011; Deaton et al., 2016; Dzimianski et al., 2019b, 2019a; James et al., 2011; van Kasteren et al., 2012).

Les études biochimiques révèlent que le VFHCC possède une forte activité désubiquitinase comparé à d’autres virus du même genre. Une activité accrue de cette activité désubiquitinase envers les ubiquitines liées par les arginines 6, 11, 48 et 63 a été observée (Dzimianski et al., 2019a), témoignant du potentiel rôle de l’OTU virale dans l’atténuation de la réponse immunitaire innée. Ainsi, dans une visée thérapeutique, il pourrait être intéressant de cibler ce domaine. Par exemple, il fut observé que la liaison stable d’un variant d’ubiquitine au domaine OTU, l’ubiquitine CC4., empêchant alors l’activité de désubiquitinylation du domaine OTU par 61

compétition inhibitrice avec l’ubiquitine cellulaire, inhibe l’infection virale à l’étape de transcription ou de réplication (Scholte et al., 2019a). Ceci peut sembler contradictoire avec le fait que l’activité de désubiquitinylation est indépendante de l’activité polymérase de la protéine L. Pour expliquer ceci, il fut proposé que la liaison stable du domaine OTU avec le variant d’ubiquitine puisse affecter la formation des RNP virales, ou encore qu’elle rende la polymérase inactive.

De manière intéressante, l’étude du domaine OTU de la protéine L du VFHCC a également mis en évidence une activité additionnelle de ce domaine comparé aux protéines cellulaires à domaine OTU : une activité de déISGylation (Akutsu et al., 2011; Capodagli et al., 2013; Dzimianski et al., 2019b; Frias-Staheli et al., 2007; James et al., 2011). Le VFHCC possède une forte activité déISGylase envers les ISG15 des espèces humaines, bovines et caprines (Dzimianski et al., 2019b), qui représentent des hôtes importants du VFHCC, témoignant potentiellement de l’implication de cette activité de déISGylation dans l’adaptation du virus à son hôte.

PARTIE III – Pathogenèse du VFHCC

Comprendre la pathogenèse d’un virus est primordial afin de prévenir et traiter les lésions et maladies qu’il induit. Cependant, la pathogenèse du VFHCC reste pour l’instant encore non complètement élucidée. Dans cette partie sont décrits la pathophysiologie et les mécanismes moléculaires actuellement connus impliqués dans la pathogenèse du VFHCC. Enfin, l’éventuel rôle des protéines GP38, GP85 et GP160 dans l’induction d’hémorragies est étudiée.

1. Pathophysiologie du VFHCC 1.1. Tropisme cellulaire Plusieurs types cellulaires ont été décrits comme infectés par le VFHCC, in vitro comme in vivo. Des données d’immunohistochimie et d’hybridation in situ effectuées lors d’autopsies de patients révèlent que les hépatocytes, les cellules phagocytaires mononucléées et les cellules endothéliales sont les principales cibles de l’infection (Burt et al., 1997). Ces données ont été confirmées in vitro (Connolly-Andersen et al., 2011, 2009; Lindquist et al., 2018; Peyrefitte et al., 2010) comme in vivo (Welch et al., 2019b; Zivcec et al., 2013) dans des modèles murins d’infection. Récemment, l’utilisation d’un virus rapporteur fluorescent dans un modèle murin a permis l’identification de nouveaux organes cibles de l’infection par le VFHCC, comme notamment l’appareil reproducteur femelle, plus précisément les ovaires et l’utérus (Welch et al., 2019b) (Figure 19). De même, dans un modèle de macaques crabiers, de l’ARN viral a également été détecté dans les organes génitaux mâles (Smith et al., 2019). Des études supplémentaires sont nécessaires afin de déterminer plus précisément le type cellulaire impliqué. De plus, des études d’immunohistochimie et d’hybridation in situ effectuées dans un modèle de souris humanisées par un transfert de cellules humaines CD34+ ont permis d’identifier les cellules gliales comme cellules cibles d’infection neurologique (Spengler et al., 2017).

Figure 19 : Visualisation du rVFHCC fluorescent dans les organes reproducteurs femelles (Welch et al., 2019a). Des souris immunodéficientes ont été infectées avec un virus rVFHCC fluorescent. La fluorescence a été observée aux stades tardifs d’infection. La flèche blanche représente les ovaires ; la flèche noire représente l’utérus ; et l’étoile représente les nœuds lymphatiques iliaques.

1.2. Anomalies biochimiques et sanguines

L’infection par le VFHCC de ces cellules cibles induit de nombreux signes cliniques chez l’Homme, évoqués plus tôt dans cette thèse. Ces signes cliniques sont accompagnés d’anomalies biochimiques et sanguines, associées à la sévérité des cas de FHCC (Bente et al., 2013). Ces anomalies incluent une leucopénie précoce ainsi qu’une thrombocytopénie. Des anomalies de la coagulation se développent, avec une prolongation du temps de prothrombine (PT) et du temps de céphaline activée (TCA), et la détection de produits de dégradation de la fibrine, caractéristiques d’une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). De plus, une élévation du taux sérique des enzymes aspartate et alanine aminotransférases (ASAT et ALAT respectivement) est indicatrice de lésions organiques. Enfin, des taux sériques élevés de cytokines pro-inflammatoires, notamment du TNF-α et d’interleukine 6 (IL-6), sont associés aux cas fatals d’infection par le VFHCC, suggérant une composante inflammatoire dans la pathogenèse du VFHCC (Ergönül et al., 2006a, 2006b; Kaya et al., 2014; Onguru et al., 2010; Papa et al., 2006; Yesilyurt et al., 2011; Yilmaz et al., 2010).

En Figure 20 sont représentées les variations du taux de plaquettes, d’ASAT, d’ALAT, la virémie ainsi que la CIVD en fonction des quatre phases de FHCC (incubation, phase pré- hémorragique, phase hémorragique et convalescence).

Figure 20 : Phases de FHCC (Ergönül, 2008) Les évolutions de la virémie (viremia), du taux de plaquettes (PLTs), du taux d’ASAT et d’ALAT (AST and ALT) et des marqueurs de CIVD (Disseminated Intravascular Coagulation) sont indiquées.

1.3. Études anatomo-pathologiques

En raison du haut niveau de biosécurité nécessaire à l’étude du VFHCC, peu d’autopsies de patients infectés par ce virus ont été réalisées. Une étude réalisée en 1997 a permis d’observer que les principales lésions chez l’Homme se situent dans le foie et sont caractérisées par de l’hyperplasie des cellules de Kupffer et de la nécrose hépatocellulaire (Burt et al., 1997). Dans les cas rares de symptômes neurologiques, un œdème cérébral et cérébelleux, une encéphalopathie et un hématome sous-dural ont été décrits (Kleib et al., 2016).

A partir de 2010, la mise en place de nouveaux modèles animaux développant une maladie lors d’infection par le VFHCC a permis une étude plus poussée des lésions induites par l’infection. L’étude des lésions induites lors d’infection par le VFHCC chez ces modèles animaux ont révélé la présence de lésions majoritairement au niveau du foie, et minoritairement au niveau de la rate. Des antigènes viraux ont pu être détectés dans le foie (plus précisément, dans les hépatocytes et les cellules de Kupffer) et dans la rate, mais également au niveau du cerveau, du cœur, des poumons, du pancréas et des reins, même si dans ces derniers organes, aucune lésion n’a été observée (Bente et al., 2010; Lindquist et al., 2018; Zivcec et al., 2013). Les lésions hépatiques incluent une hypertrophie des cellules de Kupffer et une nécrose hépatique (Figure 21) tandis que les lésions spléniques observées correspondent à une lymphocytolyse et une infiltration neutrophilique diffuse (Figure 22).

De plus, le modèle animal de souris humanisées par un transfert de cellules CD34+ développant une maladie neurologique a permis d’identifier les lésions cérébrales comme de la méningoencéphalite, de la gliose astrocytaire, un œdème et de la congestion vasculaire (Spengler et al., 2017). Ceci est à mettre en lien avec un cas humain de FHCC avec des symptômes neurologiques en 2016 : le patient présentait un hématome sous-dural (Kleib et al., 2016).

Figure 21 : Lésions hépatiques induites par le VFHCC (Zivcec et al., 2013) Analyses histologique (marquage hématoxyline et éosine (H&E)) et immunohistochimique (IHC) de foie de souris Ifnar -/- infectées par le VFHCC par voie sous-cutanée. Les tissus ont été marqués avec de l’hématoxyline et de l’éosine pour l’analyse histologique ou par un sérum de lapin polyclonal dirigé contre la NP pour l’immunohistochimie. Les flèches noires représentent de la nécrose hépatocellulaire avec une infiltration de polynucléaires neutrophiles viables comme dégénérés. La flèche blanche représente de la nécrose coalescente avec une perte de la structure hépatique.

Figure 22 : Lésions spléniques induites par le VFHCC (Zivcec et al., 2013) Analyses histologique (marquage hématoxyline et éosine (H&E)) et immunohistochimique (IHC) de rate de souris Ifnar-/- infectées par le VFHCC par voie sous-cutanée. Les tissus ont été marqués avec de l’hématoxyline et de l’éosine pour l’analyse histologique ou par un sérum de lapin polyclonal dirigé contre la NP pour l’immunohistochimie. Les flèches noires représentent une lymphocytolyse diffuse dans la pulpe blanche et les flèches noires représentent une infiltration diffuse de polynucléaires neutrophiles.

2. Mécanismes moléculaires impliqués dans la pathogenèse du VFHCC

Les moyens d’étude viraux décrits précédemment ont permis de nombreuses avancées dans l’étude du VFHCC. Cependant, la pathogenèse de ce virus reste tout de même encore mal comprise. Cette partie décrit les éléments de connaissances actuels concernant la pathogenèse de ce virus, par comparaison avec d’autres virus induisant des fièvres hémorragiques. Les virus à l’origine de fièvres hémorragiques virales sont classés dans plusieurs familles virales, dont les familles Arenaviridae, Asfarviridae, Filoviridae, Flaviviridae, Hantaviridae, Arenaviridae, Phenuiviridae, Reoviridae, et Nairoviridae (Paessler et Walker, 2013). Les mécanismes moléculaires à l’origine de ces fièvres hémorragiques varient selon leur étiologie, et peuvent inclure une perturbation de l’intégrité de l’endothélium, une perturbation de l’hémostase primaire ou secondaire, ou encore l’induction incontrôlée de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (Paessler et Walker, 2013). Cependant, une combinaison de tous ces mécanismes est souvent à l’origine des symptômes hémorragiques, et il n’est pas simple d’identifier le mécanisme primaire.

2.1. Perturbation de l’intégrité de l’endothélium

2.1.1. Bases cellulaires et moléculaires de la structure de l’endothélium

L’endothélium vasculaire tapisse la face interne des vaisseaux sanguins et est constitué de cellules endothéliales reposant sur une lame basale. Sa fonction primaire est de compartimenter le sang dans les vaisseaux. Pour cela, des jonctions intercellulaires adhérentes et serrées unissant les cellules endothéliales entre elles jouent le rôle structural de barrière et de maintien de la polarité cellulaire. Elles régulent également la croissance des cellules par inhibition de contact ainsi que la perméabilité transcellulaire (Bazzoni et Dejana, 2004).

Les composants des jonctions adhérentes sont les complexes cadhérines/caténine (Figure 23). En particulier, les cellules endothéliales expriment un type spécifique de cadhérine, la cadhérine vasculaire endothéliale (VE-cadhérine). Les VE-cadhérines d’une cellule interagissent avec les VE-cadhérines d’une autre cellule proche, promouvant l’adhésion cellulaire. Les caténines sont des protéines intracellulaires faisant le lien entre la partie cytoplasmique des VE-cadhérines et le cytosquelette de la cellule. Les caténines impliquées dans les complexes VE-

cadhérine/caténine des jonctions adhérentes sont la β-caténine, la γ-caténine (aussi appelée plakoglobine) et la protéine p120. Les jonctions serrées sont également composées de molécules transmembranaires, comme l’occludine, les protéines de la famille des claudines ou les molécules de jonction adhésives (JAM), et de molécules intracellulaires, comme la protéine zonula occludens (ZO), interagissant à la fois avec les molécules transmembranaires des jonctions serrées et les éléments du cytosquelette (Bazzoni et Dejana, 2004) (Figure 23).

Jonctions serrées

Jonctions ` adhérentes

Figure 23 : Jonctions intercellulaires endothéliales (Timmerman et al., 2016) Les jonctions serrées impliquent les claudines, occludines et JAM, tandis que les jonctions adhérentes impliquent les VE-cadhérines comme molécules transmembranaires. Les jonctions serrées impliquent notamment les protéines ZO, tandis que les jonctions adhérentes impliquent les protéines p120, β-caténine et γ-caténine comme molécules intracellulaires interagissant avec les éléments du cytosquelette, notamment l’actine.

Un autre élément important de la structure de l’endothélium est le glycocalyx, qui est une couche riche en carbohydrates à la surface luminale des cellules endothéliales. Il est notamment composé de protéoglycanes, glycosaminoglycanes et glycoprotéines. Ces molécules forment ainsi un réseau complexe, limitant l’accès de composés solubles aux cellules endothéliales, et ayant donc un rôle important dans l’imperméabilité de l’endothélium (Reitsma et al., 2007; Weinbaum et al., 2007).

La structure et l’intégrité de l’endothélium peuvent être mises à mal lors d’infection par des virus induisant des fièvres hémorragiques, par des mécanismes décrits ci-dessous.

2.1.2. Perturbation des jonctions intercellulaires des cellules endothéliales

Certains virus induisant des fièvres hémorragiques sont à l’origine de perturbations de la structure des jonctions intercellulaires. Désorganisées, ces dernières ne peuvent plus assurer leur fonction de barrière. Notamment, le virus de Junín, de la famille Arenaviridae, induit lors d’infection de cellules endothéliales une diminution de l’expression de la VE-cadhérine et de la protéine p120 (Grant et al., 2014). De même, une baisse d’expression surfacique de la VE- cadhérine est observée lors d’infection de cellules endothéliales par le virus Andes, de la famille Hantaviridae (Shrivastava-Ranjan et al., 2010), qui s’explique par une augmentation de l’internalisation de cette protéine (Gorbunova et al., 2010).

Le VFHCC, quant à lui, n’induit pas de baisse d’expression de la VE-cadhérine, ni d’augmentation de sa dégradation. Cependant, il induit un changement dans sa distribution cellulaire (Connolly-Andersen et al., 2011) (Figure 24). Des études de perméabilité sur les cellules endothéliales sont nécessaires afin de déterminer l’impact de la relocalisation de la VE- cadhérine induite par le VFHCC.

Figure 24 : Relocalisation de la cadhérine vasculaire endothéliale induite par le VFHCC (Connolly-Andersen et al., 2011) Des cellules endothéliales ont été infectées ou non par le VFHCC. 48 heures post-infection, les cellules ont été fixées et marquées. La NP est représentée en rouge, la VE-cadhérine en vert et les noyaux en bleu. Dans les cellules non-infectées, la VE-cadhérine est localisée au niveau des jonctions cellulaires, tandis que dans les cellules infectées, la localisation semble plus diffuse.

2.2. Perturbation de l’hémostase primaire ou secondaire

2.2.1. Hémostase primaire et secondaire

L’hémostase est un phénomène physiologique hautement régulé, assurant la prévention des saignements spontanés et l’arrêt des hémorragies en cas de rupture de la continuité de la paroi vasculaire. Elle peut être divisée en deux phases, l’hémostase primaire et l’hémostase secondaire (Figure 25). La présence d’une brèche dans le continuum endothélial conduit à l’activation des plaquettes sanguines, qui s’agrègent alors en un « thrombus plaquettaire », amas de plaquettes regroupées entre elles par la présence de fibrinogène. Ce phénomène correspond à l’hémostase primaire. De manière concomitante à l’hémostase primaire a lieu l’hémostase secondaire, aussi appelée « cascade de coagulation » et impliquant de nombreux facteurs de coagulation, permettant in fine la consolidation du thrombus plaquettaire via la protéolyse du fibrinogène en fibrine, plus stable. La cascade de coagulation peut être activée par une voie extrinsèque, par l’exposition du facteur tissulaire normalement contenu dans la paroi des vaisseaux sanguins. Une voie intrinsèque permet également l’activation de la cascade de coagulation. In vitro, cette voie est initiée par l’activation du facteur XII par un activateur particulaire, tel que la silice, le kaolin ou l’acide ellagique. La coagulation est également régulée par la présence de facteurs fibrinolytiques permettant la dissolution du clou plaquettaire.

A B

Figure 25 : Hémostase (Anatomy and Physiology Volume 2, Chapitre 18, p759, 2014). (A) Schéma de l’hémostase. A la suite d’une blessure, laissant le sang s’échapper du vaisseau sanguin, un spasme vasculaire réduit tout d’abord le flux sanguin. Ensuite, le thrombus plaquettaire se forme. Enfin, la coagulation consolide ce thrombus. (B) Schéma de la cascade de coagulation, permettant à terme la conversion du fibrinogène en fibrine.

2.2.2. Perturbation de l’hémostase primaire

Les plaquettes jouent un rôle primordial dans la régulation de l’homéostasie vasculaire. Elles sont les principales actrices de l’hémostase primaire, qui aboutit, lors d’une brèche vasculaire, à son comblement par formation d’un clou plaquettaire. De nombreuses maladies

hémorragiques virales sont liées à une thrombocytopénie, pouvant expliquer les symptômes hémorragiques observés. Cette thrombocytopénie peut être induite de différentes manières : par réduction de la production des plaquettes (thrombocytopénie centrale) ou par une surconsommation rapide des plaquettes, la production de nouvelles plaquettes n’étant pas assez efficace pour contrer cet épuisement rapide (thrombocytopénie périphérique).

La thrombocytopénie est une caractéristique des anomalies sanguines observées chez les patients atteints de FHCC, accompagnée d’une CIVD. Ces observations suggèrent l’induction d’une thrombocytopénie périphérique lors d’infection par le VFHCC : en effet, lors d’une CIVD, de la coagulation a lieu de manière disséminée, épuisant alors les plaquettes. Cependant, des études sont nécessaires afin de comprendre les mécanismes moléculaires précis impliqués dans cette thrombocytopénie.

2.2.3. Perturbation de l’hémostase secondaire

Les plaquettes ne sont cependant pas les seules actrices de l’hémostase. L’hémostase secondaire, qui consiste en la consolidation du clou plaquettaire en transformant le fibrinogène en fibrine, repose sur de nombreux facteurs de coagulation. Certains des facteurs de coagulation, comme les facteurs I, II, V, VII, IX, X, XI ou XII, sont synthétisés par le foie, de même que des facteurs anti-coagulants comme la protéine C, la protéine S ou l’antithrombine. Un dysfonctionnement du foie peut donc être à l’origine de troubles de l’hémostase secondaire, induisant des hémorragies. Par exemple, une infection par le virus de la fièvre jaune, de la famille Flaviviridae et induisant des fièvres hémorragiques, induit directement l’apoptose des hépatocytes (Quaresma et al., 2006). Cela empêche en amont la production suffisante des facteurs de coagulation produits par le foie et perturbe par conséquent l’hémostase secondaire.

Quant au VFHCC, des rapports d’autopsie ainsi que l’étude des lésions organiques chez des modèles murins d’infection rapportent des lésions du foie (Burt et al., 1997; Lindquist et al., 2018). In vitro, l’infection par le VFHCC de cellules hépatiques induit des effets cytopathiques. Une étude plus poussée montre que dans ces cellules, le VFHCC induit l’apoptose par activation de la voie intrinsèque comme extrinsèque de l’apoptose, ainsi qu’un stress du réticulum endoplasmique (Rodrigues et al., 2012). Ainsi, le VFHCC induit des lésions hépatiques pouvant expliquer en grande partie la pathogenèse hépatique de la FHCC. Cependant, les conséquences de ces lésions hépatiques sur l’hémostase n’ont pas été explorées à ce jour.

2.3. Pathogenèse immuno-induite

De nombreuses maladies hémorragiques sont associées à un taux de cytokines élevé : on parle de « tempête cytokinique ». Le degré de sévérité de la maladie est souvent lié à cette augmentation de la sécrétion de cytokines, comme c’est le cas pour la fièvre jaune (ter Meulen et al., 2004). Ces cytokines, comme l’IL-6 ou le TNF-α notamment, peuvent être à l’origine d’une augmentation de la perméabilité vasculaire (Marcus et al., 1996).

Un taux élevé de cytokines pro-inflammatoires est retrouvé notamment lors d’infection par les virus de la famille Filoviridae, les virus Ebola et Marburg. Cela peut s’expliquer par le tropisme de ces virus pour les monocytes, qui s’activent et sécrètent des cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-1β, le TNF-α, l’IL-6 ou l’IL-8 (Feldmann et al., 1996; Gupta et al., 2001; Stroher et al., 2001). L’expression de certaines de ces cytokines par les lymphocytes T est également induite par la liaison du virus Ebola aux lymphocytes T par le biais du récepteur Tim-1 (Younan et al., 2017). En revanche, les cellules dendritiques infectées par les virus Ebola ou Marburg ne voient pas leur production de cytokines pro-inflammatoires accrue (Bosio et al., 2003), tout comme les macrophages ou les cellules dendritiques infectés par le virus de Lassa (Baize et al., 2004), un virus de la famille des Arenaviridae.

Ces profils différentiels d’expression de cytokines induits par l’infection sont également retrouvés lors d’infection par le VFHCC. Une étude montre que l’infection des macrophages induit l’expression d’IFN de type 1 et des cytokines IL-6, IL-8 et TNF-α, tandis que les cellules dendritiques infectées sécrètent de l’IL-6 et de l’IL-8, mais pas de TNF-α (Peyrefitte et al., 2010). Ces résultats sont controversés : une autre étude montre en effet que les cellules dendritiques infectées sécrètent de l’IL-6 et du TNF-α, mais pas d’IL-8 (Connolly-Andersen et al., 2009). Etonnamment, le virus de Dugbe, un virus phylogénétiquement proche du VFHCC, mais non pathogène, infecte les macrophages et induit une sécrétion de 30 à 50 fois plus élevée de certaines cytokines (dont l’IL-6) que lors d’infection par le VFHCC (Peyrefitte et al., 2010). Enfin, cultiver des cellules endothéliales dans du surnageant provenant de cellules dendritiques infectées par VFHCC induit leur activation (Connolly-Andersen et al., 2011). Cette activation est abrogée lors d’ajout d’anticorps dirigés contre le TNF-α, faisant de ce facteur la cytokine responsable de l’activation des cellules endothéliales. L’infection directe des cellules endothéliales induit elle-même la production d’IL-6 et d’IL-8 par ces cellules, mais la culture de cellules endothéliales dans du surnageant provenant d’autres cellules endothéliales infectées n’induit pas leur activation (Connolly-Andersen et al., 2011).

3. Étude de l’implication des protéines GP38, GP85 et GP160 dans la pathogenèse du VFHCC

Comme présenté plus tôt dans cette thèse, les formes solubles de GP38, GP85 ou GP160 sont la cible d’anticorps conférant une protection contre l’infection dans un modèle de souris néonatales et un modèle de souris adultes déficientes dans la voie de réponse à l’IFN de type I (Bertolotti-Ciarlet et al., 2005; Golden et al., 2019), même si ces anticorps se révèlent être non- neutralisants in vitro. Ainsi, cela suggère que les formes sécrétées de GP38, GP85 ou GP160 possèdent un rôle dans la pathogenèse induite par le VFHCC. Les mécanismes moléculaires sous-jacents n’ont cependant pour le moment pas été explorés.

Il est possible qu’une protéine virale sécrétée soit impliquée dans la genèse de syndromes hémorragiques. Dans le cas du virus de la dengue (VDEN), un virus de la famille Flaviviridae, le rôle de NS1, une protéine virale non-structurale sécrétée en quantité importante dans le milieu extracellulaire (Flamand et al., 1999), dans l’induction des hémorragies est relativement bien connu. Dans un modèle murin, l’inoculation de NS1 induit des fuites vasculaires au niveau des poumons, du foie et de l’intestin grêle, ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, dont le TNF-α et l’IL-6 (Beatty et al., 2015). Ces données ont été confirmées in vitro : NS1 induit une hyperperméabilité d’une barrière formée de cellules endothéliales (Beatty et al., 2015; Modhiran et al., 2015), et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires est liée à une activation des cellules mononucléées sanguines périphériques (PBMCs) d’une manière dépendante du récepteur toll-like 4 (TLR-4) (Modhiran et al., 2015). De plus, NS1 active également les plaquettes via TLR-4, ce qui conduit à une surconsommation des plaquettes, à une CIVD et à une thrombocytopénie périphérique (Chao et al., 2019; Quirino-Teixeira et al., 2020). Cependant, des mécanismes indépendants de la sécrétion de cytokines induite par NS1 sont également impliqués dans la pathogenèse de dengue sévère. En effet, NS1 induit la sécrétion de facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF), protéine impliquée dans la dégradation des jonctions intercellulaires des cellules endothéliales par autophagie des composants moléculaires de ces jonctions, notamment de la VE-cadhérine (Chen et al., 2018, 2016). De surcroît, elle induit la destruction du glycocalyx endothélial via l’héparanase-1 et des métalloprotéases matricielles (Glasner et al., 2017; Puerta-Guardo et al., 2016). Ces mécanismes sont à l’origine d’une perturbation de l’intégrité de l’endothélium et de sa fonction de barrière.

De façon intéressante, des anticorps dirigés contre NS1 confèrent une protection contre l’infection par le virus de la dengue dans un modèle murin (Beatty et al., 2015; Henchal et al., 1988; Wan et al., 2014), comme observé pour les anticorps dirigés contre GP38 dans le cas du VFHCC (Golden et al., 2019). Ainsi, il est fort probable qu’une étude approfondie du rôle extracellulaire de GP38, GP85 et GP160 apporte de nouvelles connaissances sur la pathogenèse encore mal comprise du VFHCC. Plusieurs hypothèses peuvent être émises. Premièrement, GP38, GP85 et GP160 pourraient être responsables de troubles directs de la coagulation en agissant directement sur les acteurs de l’hémostase primaire ou secondaire. Cette hypothèse a été explorée dans cette étude. Alternativement, ces protéines pourraient être toxiques pour certains types cellulaires impliqués dans la coagulation et la perméabilité endothéliale. Ainsi, nous avons étudié la cytotoxicité de ces protéines pour les trois types cellulaires cibles de l’infection par le VFHCC, dans le but d’étudier ensuite les éventuels mécanismes moléculaires sous-jacents : (i) les hépatocytes, responsables de la synthèse de nombreux facteurs de coagulation, (ii) les PBMCs, qui, une fois activées, peuvent être à l’origine d’une sécrétion accrue de cytokines pro-inflammatoires, vasodilatatrices et inductrices d’augmentation de perméabilité, et (iii) les cellules endothéliales, composantes principales de la barrière endothéliale.

3.1. Matériel et méthodes

Lignées cellulaires. Des cellules issues d’hépatocarcinome cellulaire (Huh7) et des cellules humaines embryonnaires de rein (HEK293T) ont été cultivées dans du milieu Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, gibco, ThermoFisher) supplémenté de 10 % de sérum de veau fœtal (SVF), 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. 200 µg/mL de généticine ont été ajoutés au milieu des HEK293T. Toutes les cellules ont été maintenues à

37°C dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO2.

Cellules primaires. Cellules endothéliales humaines issues de la veine ombilicale (HUVECs). Des cordons ombilicaux ont été obtenus des Hospices Civils de Lyon (HCL). Pour chaque cordon, l’intérieur de la veine ombilicale a été rincé avec du tampon phosphate salin (PBS). De la collagénase (0,2 %) a été injectée à l’intérieur de la veine ombilicale. Après clampage des extrémités de la veine, le cordon a été incubé pendant 10 minutes dans du PBS préalablement chauffé à 37°C au bain-marie. Ensuite, après avoir exercé une légère pression sur l’ensemble du cordon afin de faciliter le détachement des HUVECs, les clamps ont été retirés des extrémités du cordon. Les cellules endothéliales ont été collectées par injection de PBS dans la veine. Après centrifugation à 750 g pendant 10 min à température ambiante, les cellules ont été 77

ensemencées dans un flacon de culture cellulaire préalablement recouvert de collagène de rat (2 %) dans du milieu de croissance de cellules endothéliales 2 (EGM-2, Lonza). Elles ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO2.

PBMCs. Du sang veineux périphérique de donneurs sains a été obtenu des HCL. Le sang dilué deux fois dans du PBS et de l’acide citrate dextrose (ACD) a été ajouté à du Ficoll avant d’être centrifugé 20 min à 850 g à 20°C. L’anneau de cellules immunitaires a été récupéré et rincé une première fois avec du PBS supplémenté de 0,5 % de SVF et d’ACD grâce à une centrifugation de 10 min à 850 g à 4°C, puis plusieurs autres fois grâce à une série de centrifugations de 10 min à 300 g à 4°C. Les expériences ont été conduites avec des PBMCs cultivées dans du milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640, gibco, ThermoFisher) supplémenté de 10 % de SVF, 20 ng/mL d’IL-2 et 50 ng/mL d’IL-7, à 37°C dans une atmosphère humide contenant 5

% de CO2.

Production de surnageant. 2,3.106 cellules HEK293T ont été transfectées avec 12 µg des plasmides pCAGGS-M, pCAGGS-MLD-GP38, pCAGGS-GP38, pCAGGS-M-ΔMLD- ΔGP38-ΔSKI-1, pCAGGS-MLD-GP38-HA-KDEL ou pUC19 à l’aide de chlorure de calcium

(CaCl2) et de tampon HEPES Buffer saline (HBS). 6 h après transfection, le milieu a été remplacé par du milieu Opti-MEM (gibco, ThermoFisher). 48 h après transfection, les surnageants ont été collectés, centrifugés pendant 5 min à 750 g puis filtrés à l’aide d’un filtre de seringue de 0,45 µm (STARLAB). Dans le cas où les surnageants ont été concentrés, ils l’ont été sur colonne Vivaspin 10 kDa (Sartorius) par une centrifugation à 3000 g jusqu’à ce qu’ils soient concentrés 20 fois ou 100 fois, puis ont été stockés à -80°C.

Purification de protéines. Du surnageant a été produit comme décrit ci-dessus avec le plasmide pCAGGS-GP38-HA-6His. Le surnageant a été concentré 100 fois puis mélangé dans une colonne avec une résine de nickel et d’acide nitrilotriacétique (Protino Ni-NTA Agarose, MACHEREY-NAGEL) préalablement équilibrée avec une solution de 50 mM de dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4), 10 mM d’imidazole et 300 mM de chlorure de sodium (NaCl) pendant 1 h à température ambiante sous agitation. La colonne a ensuite été rincée deux fois avec une solution de 50 mM de NaH2PO4, 20 mM d’imidazole et 300 mM de NaCl. Enfin, 5 élutions consécutives (notées E1 à E5) ont été réalisées avec une solution de 50 mM de NaH2PO4, 250 mM d’imidazole et 300 mM de NaCl, suivies de 5 élutions consécutives

(notées E6 à E10) avec une solution de 50 mM de NaH2PO4, 500 mM d’imidazole et 300 mM de NaCl. Chaque élution a été ultrafiltrée sur colonne Vivaspin 10 kDa (Sartorius) par une centrifugation à 3000 g. Les échantillons ont été stockés à -80°C.

Western Blot et marquage au bleu de Coomassie. Afin de révéler GP38, GP85 et GP160, les échantillons ont été dénaturés à 95°C pendant 5 min dans du tampon réducteur (5X Blue Loading Buffer, 200 mM Tris HCl pH 6,8, 10 % dodécylsulfate de sodium (SDS), 500 mM β- mercaptoéthanol et 50 % glycérol). Une électrophorèse a été réalisée en gel de polyacrylamide 10 ou 12 % dénaturant. L’échelle de protéines utilisée est une échelle de protéines précolorées (NEB). Pour le marquage au bleu de Coomassie, le gel a été incubé avec une solution contenant

0,1 % de Coomassie Blue R-250, 10 % d’acide acétique, 50 % de méthanol et 40 % d’H2O pendant 2 h sous agitation à température ambiante, puis rincé plusieurs fois avec une solution contenant 10 % d’acide acétique, 50 % de méthanol et 40 % d’H2O. Pour le Western Blot, les protéines ont été transférées sur des membranes de nitrocellulose (Bio-Rad). Après 30 min de saturation des membranes dans du tampon tris salin Tween (TBST, 20 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM NaCl et 0,05 % Tween-20) supplémenté de 5 % de lait, les membranes ont été incubées pendant 1 h à température ambiante avec l’anticorps primaire de souris anti-GP38 (13G8, BEI Resources) dilué au 1:500 dans le tampon de saturation (TBST + 5 % lait). Après trois lavages des membranes dans du TBST, les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire IRDye 800CW (LI-COR Biosciences) dilués au 1:20000 pendant 1 h à température ambiante à l’abri de la lumière. Les membranes ont été révélées par imagerie avec le système d’imagerie infrarouge CLx Odyssey (LI-COR Biosciences) et analysées grâce au logiciel ImageStudio Lite.

Quantification de protéines par la méthode de Bradford. Le kit Bio-Rad Protein Assay (Bio- Rad) a été utilisé selon les instructions du fabricant.

Thromboélastrométrie rotative (ROTEM). Afin d’analyser les paramètres de coagulation, du sang périphérique veineux a été incubé avec des surnageants provenant de cellules HEK293T transfectées avec pCAGGS-MLD-GP38 ou pUC19 concentrés 20 fois, dilués au 1:10, 1:50 ou 1:250 dans le sang. La coagulation a été analysée avec les kits EXTEM et INTEM (Medilon) sur une machine ROTEM selon les instructions du fabricant.

Mesure de l’activité de la lactate déshydrogénase (LDH) extracellulaire. Afin de mesurer l’activité de la LDH extracellulaire, le kit CytoTox-One Homogeneous Membrane Integrity Assay (Promega) a été utilisé selon les instructions du fabricant. Des cellules Huh7 ont été incubées avec du surnageant concentré 100 fois provenant de cellules HEK293T transfectées avec différents plasmides et dilué au 1:10 dans le milieu de culture, ou avec du milieu Opti- MEM dilué au 1:10 dans le milieu de culture. Alternativement, l’expérience a été réalisée sur du surnageant concentré 100 fois provenant de cellules HEK293T transfectées avec différents

plasmides, dilué au 1:10 dans le milieu de culture, ou sur du milieu Opti-MEM dilué au 1:10 dans le milieu de culture. A différents temps post-incubation, les surnageants ont été transférés dans une plaque 96 puits noire et incubés avec le substrat (Reagent Solution) pendant 10 min à température ambiante. Puis la réaction a été arrêtée par ajout de Stop Solution et la fluorescence a été lue avec une longueur d’onde excitatrice de 560 nm et une longueur d’onde d’émission de 610 nm sur un Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader (Berthold).

Cytométrie en flux. 1.105 HUVECs ont été incubées avec les anticorps anti-CD144-FITC, anti- CD146-PE, anti-CD45-VioGreen dilués au 1:50 pendant 30 min à 4°C à l’abri de la lumière, rincées pendant 10 min à 300 g à 10°C puis elles ont été analysées par cytométrie en flux à l’aide du MACSQuant (Miltenyi Biotec). Des PBMCs ont été incubées avec du surnageant concentré 20 fois provenant de cellules HEK293T transfectées avec pCAGGS-MLD-GP38 ou pUC19 et dilué au 1:10 dans le milieu de culture. A différents temps post-incubation, 1.105 PBMCs ont été incubées avec les anticorps anti-CD3-APC, anti-CD14-PE-Cy7, anti-CD19- Pacific Blue et anti-CD69-PE ou avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilués au 1:50 pendant 30 min à 4°C à l’abri de la lumière, rincées pendant 10 min à 300 g à 10°C puis elles ont été analysées par cytométrie en flux à l’aide du BD FACSCanto II (BD Biosciences). Enfin, 5.105 Huh7 ou HUVECs préalablement incubées avec différents surnageants pendant 1 h à 37°C puis rincées deux fois pendant 10 min à 300 g ont été premièrement marquées avec un anticorps primaire (l’anticorps de souris 13G8 dilué au 1:200 et l’anticorps de souris anti-RGS- 6His dilué au 1:500 respectivement) pendant 1 h à 4°C. Après un rinçage pendant 10 min à 300 g, elles ont été secondement marquées avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris lié à l’APC dilué au 1:100 pendant 1 h à 4°C et à l’abri de la lumière. Après un dernier rinçage pendant 10 min à 300 g, les cellules ont été analysées par cytométrie en flux à l’aide du MACSQuant (Miltenyi Biotec). Les anticorps et le DAPI proviennent de Miltenyi Biotec. Les analyses ont été effectuées avec le logiciel FlowJo.

3.2. Résultats

3.2.1. Production des protéines GP38, GP85 et GP160

La première étape nécessaire à l’étude de l’implication des protéines GP38, GP85 et GP160 dans la pathogenèse du VFHCC a été de les produire. Pour cela, un système d’expression de protéines recombinantes en cellules HEK293T a été utilisé. En effet, ces protéines sont hautement O- et N-glycosylées. La glycosylation est une modification post-traductionnelle qui affecte l’activité biologique, la fonction, et de manière importante, l’antigénicité de nombreuses protéines. De nombreux systèmes d’expression de protéines recombinantes, qu’ils soient procaryotes (bactériens) ou eucaryotes (en levures, en cellules d’insecte ou en cellules de mammifères), ont été mis au point afin de permettre l’expression de protéines recombinantes. Cependant, tous n’impliquent pas le même type de modifications post-traductionnelles. Le système d’expression en cellules humaines présente l’avantage de produire des protéines dont les structures sont proches des structures natives des protéines, grâce à sa capacité à effectuer les mêmes modifications post-traductionnelles (notamment, les O- et N-glycosylations). Après avoir transfecté les cellules avec des plasmides contenant les séquences d’intérêt, les protéines sécrétées ont été collectées dans le surnageant de milieu de culture, comme présenté ci-dessous (en 3.2.1.1.). Ce surnageant contient à la fois les protéines d’intérêt (selon les plasmides utilisés), mais également d’autres protéines sécrétées par les cellules transfectées, pouvant éventuellement rendre difficile quant à la spécificité des effets observés l’interprétation des résultats des expériences réalisées. Afin de contrecarrer ceci, une solution est de purifier les protéines d’intérêt. Ceci est présenté ci-dessous en 3.2.1.2..

3.2.1.1.Production de surnageant contenant GP38, GP85 et GP160

Des cellules HEK293T ont été transfectées avec un plasmide contenant soit la séquence du segment M (pCAGGS-M) ; soit le domaine MLD fusionné à la séquence de GP38 (pCAGGS- MLD-GP38) ; soit la séquence de GP38 (pCAGGS-GP38). De plus, afin de produire du surnageant ne contenant pas les protéines GP38, GP85 et GP160, plusieurs plasmides ont été utilisés : un plasmide contenant la séquence du segment M dans laquelle les domaines MLD et GP38 ainsi que le signal de clivage SKI-1/S1P ont été supprimés (pCAGGS-M-ΔMLD-ΔGP38- ΔSKI-1) ; un plasmide codant la protéine MLD-GP38 fusionnée à un motif KDEL à son extrémité C-terminale (pCAAGS-MLD-GP38-HA-KDEL), empêchant ainsi sa sécrétion du RE ou de l’appareil de Golgi par transport rétrograde (Gomez-Navarro et Miller, 2016) ; et un

plasmide contrôle, pUC19. Les différents plasmides utilisés sont représentés schématiquement en Figure 26.

Figure 26 : Constructions plasmidiques codant les segments M, MLD-GP38, GP38, M-ΔMLD-ΔGP38- ΔSKI-1, MLD-GP38-HA-KDEL et GP38-HA-6His Sont montrées l’organisation des différents domaines (MLD, GP38, Gn, NSm, Gc) ainsi que la position des premiers acides aminés après clivage par des protéases délimitant les différents domaines. Les domaines transmembranaires (TM) putatifs sont désignés par les rectangles gris. Les sites de clivages par des signal peptidases, par une furine, par SKI-1/S1P et par une protéase SKI-1-like sont respectivement indiqués par des flèches noires, rouges, oranges ou vertes.

48 h après transfection, les surnageants ont été récupérés, filtrés et concentrés 20 fois. La présence des différentes protéines a été évaluée par Western Blot grâce à l’anticorps 13G8 ciblant GP38, GP85 et GP160 (Golden et al., 2019) (Figure 27). L’absence de bandes dans le surnageant des cellules transfectées avec pCAGGS-M-ΔMLD-ΔGP38-ΔSKI-1, pCAGGS- MLD-GP38-HA-KDEL ou pUC19 indique comme attendu que, lors de ces transfections, ni GP160, ni GP85, ni GP38 ne sont sécrétées. On observe la présence de bandes aux alentours de 38 kDa dans le surnageant des cellules ayant été transfectées avec pCAGGS-M, pCAGGS- MLD-GP38 ou pCAGGS-GP38. De plus, 2 bandes supplémentaires d’intensité moindre aux alentours de 85 kDa et 160 kDa sont présentes dans le surnageant des cellules transfectées avec pCAGGS-M et pCAGGS-MLD-GP38. Ainsi, la transfection avec pCAGGS-M, pCAGGS- MLD-GP38 et pCAGGS-GP38 permet l’expression et la sécrétion dans le surnageant de GP38, et dans une moindre mesure, dans le cas de transfection avec pCAGGS-M et pCAGGS-MLD- GP38, de GP160 et GP85, conformément aux données de la littérature (Sanchez et al., 2006). Une bande aux alentours de 48 kDa est également présente dans le surnageant des cellules transfectées avec pCAGGS-GP38, révélant la présence d’un précurseur putatif de GP38 sécrété.

Figure 27 : Production de surnageant contenant GP38, GP85 ou GP160 Des cellules HEK293T ont été transfectées avec 12 µg de différents plasmides exprimant le segment M, MLD- GP38, GP38, M-ΔMLD-ΔGP38-ΔSKI-1, MLD-GP38-HA-KDEL ou pUC19. 48 heures après transfection, les surnageants ont été collectés, filtrés et concentrés 20 fois. La présence de GP38, GP85 et GP160 dans les surnageants a été évaluée par Western Blot grâce à l’anticorps 13G8.

3.2.1.2.Purification de la protéine recombinante GP38

Dans l’optique de purifier la protéine GP38 sécrétée, des cellules HEK293T ont été transfectées avec un plasmide codant GP38 fusionnée à une étiquette hémagglutinine (HA) et une séquence hexa-histidine (6His) à son extrémité C-terminale, pCAGGS-GP38-HA-6His (Figure 26). 48 h après transfection, les surnageants ont été collectés, filtrés et concentrés 100 fois. La protéine étiquetée a ensuite été purifiée par chromatographie d’affinité sur colonne de nickel suivie d’une élution en 10 fractions (notées E1 à E10). Chaque fraction a été ultrafiltrée afin de retirer l’imidazole. Le rendement de la purification a été évalué par Western Blot (Figure 28A). La révélation du Western Blot grâce à l’anticorps primaire 13G8 indique la présence d’une bande aux alentours de 38 kDa dans les fractions E1 à E6 après purification et ultrafiltration. La présence d’une bande aux alentours de 60 kDa indique la présence d’une protéine de nature inconnue. Afin de mesurer plus précisément la quantité de protéines présentes dans chaque fraction, un marquage au bleu de Coomassie (Figure 28B) ainsi qu’un dosage colorimétrique par la méthode de Bradford (Figure 28C) de chacune des fractions ont été réalisés. On observe pour le marquage au bleu de Coomassie la présence de bandes aux alentours de 38 kDa dans les fractions E1 à E6. La présence d’une bande autour de 40 kDa, présente également dans les fractions issues de lavages, indique la nécessité de réaliser des lavages supplémentaires. Enfin,

le dosage par la méthode de Bradford donne des concentrations variant de 0,015 à 0,115 µg/µL pour les fractions E1 à E6.

C Echantillon Concentration (µg/µL) E1 0,054 E2 0,115 E3 0,044 E4 0,045 E5 0,023 E6 0,015 E7 0,003 E8 0,003 E9 0,002 E10 0,001

Figure 28 : Purification de la protéine GP38 Des cellules HEK293T ont été transfectées avec un plasmide exprimant GP38-HA-6His. 48 h après transfection, les surnageants ont été collectés, filtrés et concentrés 100 fois puis la protéine taguée 6His a été purifiée au moyen d’une résine Ni-NTA. (A) Western Blot grâce à l’anticorps 13G8 révélant la présence de la protéine GP38. (B) Marquage au bleu de Coomassie. (C) Concentrations obtenues par dosage par la méthode de Bradford. E1 à E10 représentent les différentes fractions récoltées après purification et ultrafiltration.

Les expériences présentées par la suite ont été réalisées en parallèle du processus d’optimisation de la purification de la protéine GP38. Ainsi, elles ont été réalisées avec du surnageant non purifié provenant de cellules HEK293T transfectées avec différents plasmides, codant ou non GP38, GP85 et GP160. Les surnageants provenant des cellules HEK293T transfectées avec pCAGGS-M, pCAGGS-MLD-GP38, pCAGGS-GP38, pCAGGS-M-ΔMLDΔGP38ΔSKI-1, pCAGGS-MLD-GP38-HA-KDEL ou pUC19 sont par la suite respectivement dénommés M segment, MLD-GP38, GP38, M-ΔMLDΔGP38ΔSKI-1, MLD-GP38-HA-KDEL ou pUC19.

3.2.2. Effet de GP38, GP85 et GP160 sur l’hémostase

La thromboélastométrie rotative (ROTEM) est une méthode permettant de mesurer l’efficacité de coagulation d’un échantillon sanguin citraté en évaluant les propriétés élastiques du sang au cours de la coagulation (Görlinger et al., 2016). Le ROTEM est constitué de quatre canaux indépendants de mesure de visco-élasticité (Figure 29A). Chaque canal est composé d’une cuvette jetable, contenant l’échantillon sanguin à tester, fixée dans une coupelle immobile métallique dont la température est réglée à 37°C. Une broche oscillante plonge dans l’échantillon sanguin et applique une force oscillatoire, tournant de 4,75° douze fois par minute. La coagulation est initiée en recalcifiant tout d’abord l’échantillon sanguin citraté. En effet, le

citrate forme des complexes avec le calcium sanguin, rendant ce dernier indisponible pour l’activation de nombreux facteurs de coagulation. De plus, la coagulation est initiée soit par l’ajout d’acide ellagique et de phospholipides, mimant ainsi l’activation de la cascade de coagulation par la voie intrinsèque (test INTEM), ou par l’ajout de facteur tissulaire recombinant et de phospholipides, imitant la voie extrinsèque de la cascade de coagulation (test EXTEM). Au fur et à mesure de la formation du caillot sanguin, les mouvements oscillatoires de la broche sont inhibés par l’augmentation de la viscosité du sang. Cette diminution d’ampleur d’oscillation est évaluée par mesure de l’angle de déviation d’un faisceau de lumière dirigé vers la broche. Le signal subséquent est traité et transformé par l’appareil en une courbe thromboélastométrique (temogramme) évaluant de nombreux paramètres (Figure 25B). Parmi eux, le temps de coagulation (CT) correspond au temps nécessaire pour que l’amplitude du caillot atteigne 2 mm. Ce temps dépend principalement de l’activité enzymatique des facteurs de coagulation de la voie intrinsèque ou extrinsèque, selon le test utilisé. Le temps de formation du caillot (CFT) indique le temps nécessaire pour que l’amplitude du caillot passe de 2 à 20 mm et dépend principalement du nombre de plaquettes, de leur activité et de la génération de thrombine, le facteur permettant la transformation du fibrinogène en fibrine. L’angle α reflète la cinétique de la formation du clou plaquettaire. La fermeté maximale du caillot (MCF) est définie quant à elle comme l’amplitude maximale du caillot atteinte durant le test. De manière similaire, l’amplitude à 10 minutes (A10) est définie comme l’amplitude du caillot 10 minutes après l’initiation de la coagulation. A B

Figure 29 : Principe du ROTEM (D’après Görlinger et al., 2016) (A) Principe de mesure de thromboélastométrie rotative. (B) « Temogramme » indiquant les paramètres cliniquement importants. CT, temps de coagulation ; CFT, temps de formation du caillot ; A10, amplitude du caillot à 10 min ; MCF, fermeté maximale du caillot.

Afin d’étudier l’hypothèse selon laquelle GP38, GP85 ou GP160 ont un rôle direct dans la coagulopathie observée chez les patients atteints de fièvre hémorragique de Crimée-Congo, les surnageants M segment, MLD-GP38, GP38 ou pUC19 concentrés 20 fois ont été dilués à différents ratios (1:10, 1:50 ou 1:250) dans du sang humain périphérique veineux citraté. Ensuite, les échantillons ont été analysés par un test EXTEM ou INTEM, directement après mise en contact du sang avec le surnageant. Les paramètres CT, CFT, angle α, MCF et A10 ont été mesurés (Figure 30). Les résultats présentés correspondent à une expérience réalisée une fois, sans réplicats techniques (liés à la présence de seulement quatre canaux de mesure de visco-élasticité sanguine et au grand nombre de conditions testées initialement). Des précautions sont donc à prendre quant à l’interprétation des résultats.

EXTEM INTEM

CT (s) CT (s) 120 CT (s) 100120 200 80100 150 Angle α 6080 A10 100 pUC19 Angle α 4060 A10 Angle α A10 (°) 2040 (mm) (°) 50 (mm) M segment 1/10 (°) 020 (mm) 0 0 M segment 1/50 MCF M segment 1/250 MCFMCF CFT (s) CFTCFT (s) (s) (mm) (mm)(mm) CT (s) CT (s) 250 120 200 100 150 pUC19 80 Angle α 100 A10 Angle α 60 A10 (°) 50 (mm) MLD-GP38 1/10 40 0 (°) 20 (mm) MLD-GP38 1/50 0 MLD-GP38 1/250 MCF CFT (s) MCF (mm) CFT (s) (mm)

CT (s) CT (s) 200 120 150 pUC19 100 100 80 Angle α (°) A10 (mm) GP38 1/10 Angle α 60 A10 50 40 0 (°) 20 (mm) GP38 1/50 0 GP38 1/250 MCF (mm) CFT (s)

MCF CFT (s) (mm)

Figure 30 : Effet des protéines GP38, GP85 et GP160 sur les voies extrinsèque et intrinsèque de la coagulation. Du sang citraté humain provenant de donneurs sains a été incubé avec les surnageants M segment, MLD-GP38, GP38 ou pUC19 concentrés 20 fois et dilués à différents ratios (1:10, 1:50 et 1:250) dans le sang. La coagulation a été analysée par tests EXTEM et INTEM. CT, temps de coagulation ; CFT, temps de formation du caillot ; MCF, fermeté maximale du caillot ; A10, amplitude du caillot 10 minutes après initiation de la coagulation.

Les résultats d’incubation du sang avec du surnageant M segment à différentes ratios (1:10, 1:50 et 1:250) n’indiquent aucune variation des paramètres observés comparés à l’incubation avec le surnageant contrôle pUC19 pour le test EXTEM. Pour le test INTEM, des variations du CFT peuvent être observées. Cependant, l’absence de corrélation entre les variations et la dose de surnageant utilisée indiquerait que ces variations sont dues aux variations du ROTEM et non à un effet des protéines contenues dans le surnageant sur la coagulation intrinsèque. L’incubation avec le surnageant GP38, quel que soit le ratio, n’induit aucune variation des paramètres observés, que ce soit pour le test EXTEM ou INTEM. Quant à l’incubation avec le surnageant MLD-GP38, le test INTEM ne révèle aucune variation des paramètres observés.

Cependant, le test EXTEM révèle un CFT augmenté lors d’incubation avec MLD-GP38 à un ratio de 1:10 par rapport à l’incubation avec le surnageant contrôle pUC19. Cet effet n’est pas retrouvé pour des concentrations plus faibles de MLD-GP38 (1:50 et 1:250).

Afin d’explorer plus précisément l’éventuelle augmentation du CFT extrinsèque lors d’incubation de sang citraté avec le surnageant MLD-GP38 dilué au 1:10, l’expérience a été répétée pour ce surnageant. Les résultats présentés en Figure 31 représentent donc les résultats de deux expériences indépendantes, avec plusieurs réplicats techniques. On n’observe aucune différence significative entre l’incubation avec le surnageant pUC19 ou le surnageant MLD- GP38 dilué au 1:10 dans le sang, quel que soit le paramètre observé.

A B C

D E

Figure 31 : Effet de GP38, GP85 et GP160 sur la voie extrinsèque de la coagulation. Les surnageants MLD-GP38 ou pUC19 concentrés 20 fois ont été dilués au 1:10 dans du sang citraté humain provenant de donneurs sains. La coagulation extrinsèque a été analysée par test EXTEM. (A) Temps de coagulation (CT) normalisé par rapport à pUC19. (B) Temps de formation du caillot (CFT) normalisé par rapport à pUC19. (C) Angle α normalisé par rapport à pUC19. (D) Fermeté maximale du caillot (MCF) normalisée par rapport à pUC19. (E) Amplitude du caillot à 10 min (A10) normalisée par rapport à pUC19. Les barres d’erreur représentent les médianes et interquartiles. La significativité statistique a été déterminée par un test U de Mann-Whitney. ns = non significatif (valeur p > 0,05).

Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent l’absence d’effet des protéines GP38, GP85 et GP160 sur les voies extrinsèque et intrinsèque de la coagulation.

3.2.3. Effet de GP38, GP85 et GP160 sur différents types cellulaires

3.2.3.1.Effet de GP38, GP85 et GP160 sur des cellules hépatiques

3.2.3.1.1. Liaison de GP38, GP85 et GP160 aux cellules hépatiques

Les hépatocytes sont une des cibles primaires d’infection par le VFHCC (Burt et al., 1997). De plus, des études sur des souris traitées avec un anticorps dirigé contre l’IFN de type I indiquent la présence de dommages hépatiques sévères lors d’infection par le VFHCC, caractérisés à la

fois par la nécrose et l’apoptose des hépatocytes (Lindquist et al., 2018). Or, de nombreux facteurs de coagulation sont synthétisés par les hépatocytes. C’est le cas de la prothrombine, du facteur V, VII, IX, X, XI et XII. Ainsi, une atteinte hépatique peut être à l’origine d’une baisse de production de ces facteurs, expliquant la survenue d’hémorragies par déficit de coagulation.

Afin d’étudier si GP38, GP85 et GP160 ont un effet sur les cellules hépatiques, nous nous sommes tout d’abord intéressés à leur éventuelle liaison à ces cellules. Ainsi, des cellules Huh7 ont été incubées pendant 1 h à 37°C avec du surnageant non concentré pUC19 ou MLD-GP38- HA-6His (Figure 26), ou encore avec de l’Opti-MEM. Ensuite, la liaison surfacique des protéines GP38, GP85 et GP160 a été évaluée par cytométrie en flux grâce à un anticorps dirigé contre GP38, 13G8. Un anticorps secondaire lié à l’APC a été utilisé pour la révélation (Figure 32). Lorsque les cellules sont incubées avec MLD-GP38-HA-6His, on observe une augmentation de la liaison surfacique de l’anticorps secondaire, qu’on n’observe pas lors d’incubation des cellules avec de l’Opti-MEM ou pUC19. Ceci témoigne d’une liaison de GP38, GP85 ou GP160 aux cellules Huh7.

Figure 32 : Liaison de GP38, GP85 et GP160 aux cellules Huh7 Des cellules Huh7 ont été incubées avec de l’Opti-MEM, pUC19 ou MLD-GP38-HA-6His pendant 1 h à 37°C. Puis elles ont subi un marquage avec un anticorps primaire 13G8 suivi d’un marquage avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris lié à l’APC avant d’être analysées par cytométrie en flux.

3.2.3.1.2. Cytotoxicité induite par GP38, GP85 et GP160 sur des cellules hépatiques

Afin de déterminer si les formes sécrétées de GP38, GP85 ou GP160 sont cytotoxiques pour les cellules hépatiques, des cellules Huh7 ont été incubées avec les surnageants M segment, MLD-GP38, GP38, M-ΔMLD-ΔGP38-ΔSKI-1, MLD-GP38-HA-KDEL et pUC19 concentrés 100 fois, ou du milieu Opti-MEM, dilués au 1:10 dans le milieu de culture des cellules Huh7.

L’activité de la LDH relarguée par les cellules Huh7 a été mesurée à différents temps post- incubation par un test fluorométrique (Figure 33). La LDH est une enzyme intracellulaire qui est relarguée dans le milieu extracellulaire en cas de dommages membranaires cellulaires. La mesure de l’activité de la LDH extracellulaire après incubation de cellules avec une molécule représente donc un marqueur de la cytotoxicité de la molécule. Un contrôle positif (Max Lysis) fourni par le fabricant induisant la lyse de 100 % des cellules a été utilisé. L’expérience a été réalisée une fois en triplicatas techniques. Ainsi, des précautions sont à prendre quant à l’interprétation des résultats. Ces derniers ont été normalisés par rapport à l’activité de la LDH mesurée après 30 minutes d’incubation des cellules avec du surnageant contrôle pUC19.

Le processus de transfection des cellules HEK293T peut engendrer des dommages cellulaires et le relargage subséquent de LDH active dans le surnageant. De plus, les surnageants utilisés dans cette étude n’ont pas été purifiés. Ainsi, il est probable que de la LDH active, provenant des cellules HEK293T, soit déjà présente dans les surnageants avec lesquels sont incubées les cellules Huh7. Afin d’évaluer la part de l’éventuelle activité de la LDH extracellulaire relarguée dans les différents surnageants par les cellules HEK293T transfectées, une mesure de l’activité de la LDH extracellulaire a été réalisée dans les différents surnageants (Figure 29, barre

LDHHEK293T). On observe que l’activité de la LDH contenue dans les différents surnageants est supérieure à l’activité mesurée dans de l’Opti-MEM, indiquant que le processus de production de surnageant est à l’origine du relargage dans le milieu extracellulaire de LDH active.

Pour tous les surnageants testés, l’activité de la LDH est moindre que celle de la LDH relarguée après lyse totale des cellules, comme le montrent les activités relatives de la LDH libérée après lyse totale des cellules (Max Lysis) à 0,5, 24 et 48 heures post-incubation (hpi). Cela indique que moins de 100 % des cellules subissent des dommages cellulaires après incubation avec les différents surnageants. Le fait que l’activité de la LDH augmente au fur et à mesure du temps après lyse totale des cellules peut s’expliquer par l’augmentation du nombre de cellules au cours du temps.

Pour chaque surnageant testé, l’activité de la LDH mesurée après incubation des cellules Huh7 est équivalente ou inférieure à l’activité de la LDH déjà présente dans le surnageant

(LDHHEK293T), suggérant que c’est en réalité l’activité de la LDH provenant des cellules transfectées qui est mesurée. Les activités de la LDH mesurées dans le cas d’incubation pendant 30 minutes des cellules Huh7 avec les surnageants M segment, MLD-GP38 et GP38 sont respectivement 1,55, 1,32 et 1,88 fois supérieures à celle du surnageant contrôle pUC19, tandis que celles des surnageants M-ΔMLD-ΔGP38-ΔSKI-1 ou MLD-GP38-HA-KDEL, ne contenant

pas les protéines d’intérêt, sont respectivement inférieures (0,74 fois) ou égales (1,05 fois) à celle du surnageant contrôle. On observe de plus une diminution au cours du temps de l’activité de la LDH pour tous les surnageants testés, sauf dans le cas du surnageant M-ΔMLD-ΔGP38- ΔSKI-1 dont l’activité de la LDH semble stable au cours du temps.

- -

-1 GP38 -ΔMLD - M -ΔSKI -KDEL MLDHA ΔGP38

Figure 33 : Cytotoxicité hépatique de GP38, GP85 et GP160 Des cellules Huh7 ont été incubées avec un dixième de surnageants M segment, MLD-GP38, GP38, M-ΔMLD- ΔGP38-ΔSKI-1, MLD-GP38-HA-KDEL, pUC19 concentrés 100 fois ou avec de l’Opti-MEM. L’activité de la LDH a été mesurée 0,5, 24 et 48 heures post-incubation (hpi) puis normalisée par rapport à l’activité de la LDH mesurée 0,5 hpi avec pUC19. L’activité de la LDH mesurée directement dans les surnageants M segment, MLD- GP38, GP38, M-ΔMLD-ΔGP38-ΔSKI-1, MLD-GP38-HA-KDEL, pUC19 concentrés 100 fois est représentée par les barres noires (LDHHEK293T). Les barres d’erreur représentent les moyennes et écarts-types.

Ainsi, les résultats suggèrent que dans ces conditions expérimentales, les protéines GP38, GP85 et GP160 n’induisent que peu de dommages cellulaires sur les cellules hépatiques.

3.2.3.2. Effet de GP38, GP85 et GP160 sur des PBMCs

3.2.3.2.1. Cytotoxicité de GP38, GP85 et GP160 sur des PBMCs

Une des anomalies sanguines observées lors d’infection par le VFHCC est une leucopénie précoce (Bente et al., 2013). Afin d’évaluer le rôle de GP38, GP85 et GP160 dans l’induction de la mort de PBMCs, des PBMCs ont été purifiées à partir de sang veineux périphérique humain provenant de donneurs sains. Après incubation de ces PBMCs avec du surnageant contrôle (pUC19) ou MLD-GP38 concentrés 20 fois, dilués au 1:10 dans le milieu de culture, elles ont été marquées au DAPI, un marqueur fluorescent se liant fortement à l’ADN et ne diffusant pas au travers des membranes cellulaires intactes. Ainsi, le DAPI est couramment utilisé pour marquer les cellules mortes. L’analyse a été réalisée par cytométrie en flux (Figure 92

34). L’expérience n’a pu être réalisée qu’une fois en duplicatas techniques, ainsi, des précautions sont à prendre quant à l’interprétation des résultats. On observe que l’incubation de PBMCs avec du surnageant contrôle pUC19 induit une mortalité progressive des cellules, le maximum de mortalité observée (54,1 %) étant atteint pour 72 hpi. Comparativement, l’incubation de PBMCs avec du surnageant contenant GP38, GP85 et GP160 induit une mortalité plus rapide que lors de l’incubation avec du surnageant contrôle, le maximum de mortalité observée (56,9 %) étant atteint dès 48 hpi.

A B 24 hpi 48 hpi 72 hpi

pUC19 pUC19 pUC19 MLD- GP38 MLD- GP38 MLD- GP38

Figure 34 : Cytotoxicité de GP38, GP85 et GP160 sur les PBMCs Des PBMCs provenant de donneurs sains ont été incubées avec MLD-GP38 ou pUC19 concentrés 20 fois, dilués au 1:10 dans le milieu de culture. La mortalité cellulaire a été évaluée par cytométrie en flux par marquage au DAPI. (A) Graphes de cytométrie en flux représentatifs de deux expériences à 24, 48 et 72 hpi. (B) Pourcentage de cellules DAPI positives (DAPI+) à 24, 48 et 72 hpi. Les barres d’erreur représentent les moyennes et écarts- types.

Ainsi, ces résultats suggèrent que dans ces conditions expérimentales, GP38, GP85 et GP160 sont toxiques pour les PBMCs de manière précoce.

Afin de déterminer si GP38, GP85 et GP160 induisent la mort d’une population particulière de cellules parmi les cellules immunitaires sanguines, des PBMCs ont été incubées avec du surnageant contrôle (pUC19) ou MLD-GP38 concentrés 20 fois, dilués au 1:10 dans le milieu de culture. Ensuite, différentes populations ont été marquées grâce à des anticorps spécifiques. Les lymphocytes B (LB) ont été marqués par l’anticorps anti-CD19 ; les lymphocytes T (LT) par l’anticorps anti-CD3 ; et les monocytes par l’anticorps anti-CD14. Nous considérons que les cellules non marquées représentent d’autres cellules immunitaires mononucléées, comme les cellules dendritiques ou les lymphocytes cytotoxiques (lymphocytes NK). La variation du pourcentage respectif de chacune de ces populations a été analysée par cytométrie en flux au cours du temps (Figure 35). Ainsi, des variations de pourcentages de populations indiqueraient que certaines populations prendraient le pas au détriment d’autres, suggérant une mortalité moindre pour ces populations. L’expérience a été réalisée une seule fois, en duplicatas techniques ; l’interprétation subséquente des résultats doit donc être précautionneuse. Lors 93

d’incubation des PBMCs avec du surnageant contrôle pUC19 (Figure 35A), on n’observe que peu de variations dans les pourcentages des populations au cours du temps, notamment à 72 hpi, où le taux de mortalité est maximal (Figure 34). De même, lors d’incubation des PBMCs avec du surnageant MLD-GP38 (Figure 35B), peu de variations dans les pourcentages des populations sont observées, notamment à 48 hpi, où le maximum de mortalité des PBMCs est atteint (Figure 34).

A B

Figure 35 : Effet de GP38, GP85 et GP160 sur les pourcentages de populations cellulaires des PBMCs Des PBMCs provenant de donneurs sains ont été incubées avec (A) pUC19 ou (B) MLD-GP38 concentrés 20 fois, dilués au 1:10 dans le milieu de culture. Les pourcentages des différents types cellulaires ont été évalués au cours du temps par cytométrie en flux par marquage grâce à des anticorps anti-CD3, anti-CD14 et anti-CD19. Les barres d’erreur représentent les moyennes et écarts-types.

Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que dans ces conditions expérimentales, GP38, GP85 et GP160 sont toxiques pour les PBMCs. Il faudrait répéter l’expérience afin de déterminer plus précisément si elles ciblent préférentiellement un type cellulaire particulier.

3.2.3.2.2. Effet de GP38, GP85 et GP160 sur l’activation des PBMCs

De nombreuses maladies hémorragiques sont associées à un taux de cytokines élevé : on parle de « tempête » ou « orage cytokinique ». Le degré de sévérité de la maladie est souvent lié à cette augmentation de sécrétion de cytokines, comme c’est le cas pour la FHCC (Bente et al., 2013; Zivcec et al., 2016). De plus, l’infection de macrophages et de cellules dendritiques par le VFHCC induit l’expression de TNF-α et IL-6 (Connolly-Andersen et al., 2009; Peyrefitte et al., 2010) par ces mêmes cellules.

Ainsi, nous avons souhaité étudier le rôle de GP38, GP85 et GP160 dans l’activation des PBMCs, plus précisément des LT. En effet, l’activation de ces cellules peut être facilement suivie par l’induction rapide de l’expression du marqueur membranaire CD69. Pour ce faire, des PBMCs purifiées de sang humain provenant de donneurs sains ont été incubées avec MLD- GP38 ou pUC19 concentrés 20 fois et l’expression surfacique du marqueur CD69 chez les LT 94

(exprimant CD3) a été évaluée par cytométrie en flux (Figure 36). L’expérience n’a été réalisée qu’une fois en duplicatas techniques ; l’interprétation des résultats doit en tenir compte. L’incubation des PBMCs avec du surnageant contrôle induit dès 24 hpi une légère activation des LT (2,09 %), qui double à 48 hpi (4,09 %) puis se stabilise (3,84 %). Incubés avec MLD- GP38, les LT sont 1,3 fois plus activés à 24 hpi que lors de l’incubation avec pUC19, mais l’augmentation d’activation au cours du temps (1,6 fois à 48 hpi) est moindre que celle observée lors de l’incubation avec pUC19.

Figure 36 : Effet de GP38, GP85 et GP160 sur l’activation des LT Des PBMCs provenant de donneurs sains ont été incubées avec MLD-GP38 ou pUC19. Le pourcentage de LT activés (cellules CD3 positive (CD3+) et CD69 positives (CD69+)) a été déterminé à 24, 48 et 72 hpi. Les barres d’erreur représentent les moyennes et les écarts-types.

Ainsi, ces résultats suggèrent que GP38, GP85 et GP160 induisent une activation précoce des LT. 3.2.3.3.Effet de GP38, GP85 et GP160 sur des cellules endothéliales

3.2.3.3.1. Isolement de cellules endothéliales primaires

Les cellules endothéliales sont les actrices constitutives de l’endothélium et représentent une cible d’infection pour le VFHCC (Connolly-Andersen et al., 2011). La mort ou la désorganisation structurelle de ces cellules peuvent induire des fuites vasculaires à l’origine d’hémorragies.

Afin d’étudier l’effet de GP38, GP85 et GP160 sur les cellules endothéliales, nous avons tout d’abord récupéré un cordon ombilical humain et procédé à l’isolement des cellules endothéliales humaines issues de la veine ombilicale (HUVECs). La caractérisation de ces HUVECs a été réalisée par cytométrie en flux, en analysant la présence des marqueurs CD144, CD146 et l’absence du marqueur CD45 (Figure 37). En effet, CD144, CD146 sont

respectivement des marqueurs de la cadhérine endothéliale vasculaire (VE-cadhérine) et du mélanome de la molécule d'adhésion cellulaire (MCAM), tous deux exprimés par les cellules endothéliales, tandis que CD45 est exprimé par les leucocytes. Les cellules isolées ont été comparées à des cellules HUVECs commerciales caractérisées (Lonza). L’analyse révèle que près de 100 % des cellules isolées co-expriment CD144 et CD146 (Figures 38A), et près de 0% d’entre elles ne co-expriment les marqueurs CD144 et CD146 avec celui de la lignée leucocytaire (Figure 37B et 38C). Ainsi, ces cellules ont pu être ultérieurement utilisées dans des expériences mettant en jeu des cellules endothéliales primaires.

A B C

Figure 37 : Caractérisation des HUVECs Des HUVECs ont été isolées puis caractérisées par cytométrie en flux par analyse de l’expression surfacique des marqueurs CD144, CD146 et CD45. Les co-marquages des anticorps (A) anti-CD144-FITC et anti-CD146-PE, (B) anti-CD144-FITC et anti-CD45-VioGreen, et (C) anti-CD146-PE et anti-CD45-VioGreen ont été évalués par cytométrie en flux. En rouge sont représentées les HUVECs non marquées.

3.2.3.3.2. Liaison de GP38, GP85 et GP160 aux cellules endothéliales

Nous nous sommes tout d’abord intéressés à l’éventuelle liaison de GP38, GP85 et GP160 à ces cellules. Ainsi, des cellules HUVECs préalablement caractérisées ont été incubées pendant 1 h à 37°C avec du surnageant non concentré pUC19 ou MLD-GP38-HA-6His (Figure 26), ou encore avec de l’Opti-MEM. Ensuite, la liaison surfacique de GP38, GP85 et GP160 a été évaluée par cytométrie en flux grâce à un anticorps dirigé contre l’étiquette 6His. Un anticorps secondaire lié à l’APC a été utilisé pour la révélation (Figure 38). Lorsque les cellules sont incubées avec MLD-GP38-HA-6His, on observe une augmentation de la liaison surfacique de

l’anticorps secondaire, qu’on n’observe pas lors d’incubation des cellules avec de l’Opti-MEM ou pUC19. Ceci témoigne d’une liaison de GP38, GP85 ou GP160 aux cellules HUVECs.

Figure 38 : Liaison de GP38, GP85 et GP160 aux cellules HUVECs Des cellules HUVECs préalablement caractérisées ont été incubées avec de l’Opti-MEM, pUC19 ou MLD-GP38- HA-6His pendant 1 h à 37°C. Puis elles ont subi un marquage avec un anticorps primaire dirigé contre l’étiquette 6His suivi d’un marquage avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris lié à l’APC avant d’être analysées par cytométrie en flux.

3.3. Discussion

3.3.1. Production et purification de GP38

Dans cette étude, nous avons purifié la protéine GP38, obtenant des concentrations allant jusqu’à 0,115 mg/mL (Figure 24C). Au cours de l’année 2020, d’autres auteurs ont produit et purifié avec succès GP38, l’obtenant à une concentration de l’ordre de 10 mg/mL et leur permettant ainsi d’analyser sa structure (Mishra et al., 2020). Les différences à la fois de constructions plasmidiques, de protocole de transfection, de production comme de purification peuvent être à l’origine de ces différences de concentration. Notamment, le protocole de transfection utilisé dans cette étude se base sur des cellules HEK293T. Cependant, lors de transfection de ces cellules adhérentes, le rendement de production est moindre que lors de transfection de cellules non adhérentes en suspension, comme par exemple des cellules FreeStyle 293, récemment obtenues par notre laboratoire.

Afin de confirmer et préciser les résultats obtenus lors de cette étude avec du surnageant non purifié contenant les protéines GP38, GP85 et GP160, il est nécessaire de purifier en quantité suffisante ces protéines afin de s’affranchir des effets d’éventuels contaminants présents dans les surnageants collectés des HEK293T transfectées. Une autre possibilité intéressante serait de transduire les cellules d’intérêt (PBMCs, HUVECs...) avec des vecteurs lentiviraux codant soit M segment, soit MLD-GP38, soit GP38. Ainsi, les effets autocrine comme paracrine des 97

protéines GP38, GP85 et GP160 sur les cellules transduites pourront être évalués, tout en s’affranchissant des obstacles évoqués ci-dessus.

Une autre donnée intéressante, qu’il n’a pas été possible d’obtenir au cours de cette étude, est la quantité de GP38, GP85 et GP160 extracellulaires présentes chez les patients. De nombreuses études révèlent que les niveaux circulant de NS1 du VDEN varient de 0,1 à 50 µg/mL chez les patients infectés par le VDEN, et que sa concentration est corrélée à la sévérité des signes cliniques (Glasner et al., 2018). Connaître précisément les niveaux circulants de GP38, GP85 et GP160 chez les patients infectés par le CCFHV permettrait d’adapter les études in vitro pour travailler avec des concentrations proches de celles observées lors d’infections naturelles. Cependant, en l’état actuel de nos connaissances, aucune étude ne révèle pour l’instant si GP38, GP85 et GP160 sont détectables dans le sang des patients infectés par le VFHCC, et à quelle quantité. Pour remédier à cela, il serait intéressant d’obtenir des échantillons de sang de patients infectés et de rechercher grâce à une technique ELISA la présence de GP38, GP85 et GP160 dans le sang, puis d’évaluer leurs quantités. Cependant, l’obligation de travailler en conditions de biosécurité de niveau 4 ainsi que la difficulté de se procurer du sang de patient infecté par le VFHCC rend cette démarche difficile.

3.3.2. Protéines virales sécrétées et coagulation

Dans cette étude, nous avons souhaité étudier l’hypothèse selon laquelle GP38, GP85 ou GP160 auraient un effet sur la coagulation. En effet, la perturbation de la coagulation est à l’origine de nombreux troubles hématologiques. L’incapacité de réparer une brèche de l’endothélium lorsque le processus de coagulation est décru est à l’origine de fuites vasculaires continuelles, tandis qu’un état d’hypercoagulabilité à l’origine de CIVD induit un épuisement des facteurs de coagulation et des plaquettes. Traditionnellement, la capacité hémostatique était mesurée par des tests conventionnels tels que le nombre de plaquettes, le TCA, le PT, le taux de fibrinogène ou de produits de dégradation de la fibrine. Cependant, ces tests sont statiques et isolés. La thromboélastométrie rotative est une méthode fournissant une évaluation globale de la fonction hémostatique, surmontant les limitations évoquées des tests conventionnels et de plus en plus utilisée au chevet des patients, notamment grâce à sa rapidité et à la diversité des tests fonctionnels disponibles (Görlinger et al., 2016). Ainsi, nous avons étudié l’effet de l’incubation de sang humain avec du surnageant contenant GP38, GP85 et GP160. Ne connaissant la concentration de ces protéines ni dans le sang des patients infectés, ni dans les surnageants utilisés pour l’expérience, nous avons testé plusieurs concentrations. Les

surnageants concentrés 20 fois ont été dilués au 1:10, 1:50 et 1:250 dans le sang, mais aucune variation n’a été observée quels que soient le surnageant ou le paramètre observé (CT, CFT, angle α, MCF et A10 des tests EXTEM et INTEM) (Figure 30 et 32). Cette absence de différence pourrait être expliquée par l’absence de réplicats pour certains surnageants testés (surnageants M segment et GP38 pour le test EXTEM ; surnageants M segment, MLD-GP38 et GP38 pour le test INTEM), mais également par la possibilité que la concentration des protéines dans les surnageants soit trop faible. Pour remédier à cela, il est nécessaire de produire et de purifier GP38 ainsi que de connaître sa quantité dans le sang des patients infectés par le VFHCC afin de reproduire au mieux son éventuel effet sur la coagulation.

De nombreux virus à l’origine de FHVs interfèrent avec le processus de coagulation. L’infection de monocytes et macrophages par le virus Ebola (VEBO) induit la surexpression du facteur tissulaire par ces mêmes cellules, déclenchant le processus de coagulation en activant la voie extrinsèque de l’hémostase secondaire (Geisbert et al., 2003). D’une autre manière, les cellules endothéliales infectées par des virus de la famille des Hantaviridae lient et facilitent l’auto-activation du facteur XII, déclenchant ainsi la voie intrinsèque de l’hémostase secondaire (Taylor et al., 2013). Ces processus sont à l’origine d’une suractivation et surconsommation des facteurs de coagulation, et nécessitent l’infection par le virus. Cependant, de manière intéressante, NS1 du VDEN est seule capable de se lier à la fois à la prothrombine et sa forme activée, la thrombine. Si la liaison de NS1 avec la thrombine n’interfère étonnamment pas avec son activité, la liaison de NS1 avec la prothrombine inhibe son activation en thrombine. Ceci expliquerait l’allongement subséquent du TCA (Lin et al., 2012). De plus, NS1 interfère également avec l’hémostase primaire en induisant une thrombocytopénie périphérique par activation accrue des plaquettes (Chao et al., 2019). Si la thromboélastométrie rotative donne une idée globale du processus de coagulation, il serait tout de même pertinent de s’intéresser plus précisément aux éventuelles interactions de GP38, GP85 et GP150 avec différents facteurs clés du processus de coagulation, comme par exemple la prothrombine, la thrombine ou les plaquettes, par des expériences de co-immunoprécipitation et cytométrie en flux.

3.3.3. Protéines virales sécrétées et leur effet sur certains types cellulaires

3.3.3.1. Protéines virales sécrétées et cellules hépatiques

Les hépatocytes sont des cellules clés de l’hémostase. En effet, elles sont à l’origine de la production de nombreux facteurs de coagulation. Certains virus sont responsables de dommages hépatiques sévères, comme le virus de la fièvre jaune (Paessler et Walker, 2013), de la famille des Flaviviridae. De manière intéressante, la nécrose et l’apoptose des hépatocytes sont observées dans un modèle murin d’infection par le VFHCC (Lindquist et al., 2018).

Une première étude nous a permis d’identifier une liaison des protéines GP38, GP85 ou GP160 aux cellules hépatiques (Figure 32). Des études réalisées avec des surnageants contenant GP38 seulement ou GP85 et GP160 seulement permettront de déterminer plus précisément les protéines virales impliquées dans cette liaison. Nous avons ensuite souhaité étudier l’éventuelle contribution de GP38, GP85 et GP160 dans la genèse des lésions hépatiques observées lors de FHCC. Pour cela, une mesure de l’activité de la LDH extracellulaire a été effectuée après incubation de Huh7 avec du surnageant contenant les protéines virales d’intérêt (Figure 33). Cependant, dans ces conditions expérimentales, GP38, GP85 et GP160 ne semblent pas être responsables de dommages hépatiques. Comme déjà évoqué, nous ne connaissions pas la quantité de protéines présentes dans le surnageant, ni dans les patients infectés. Ainsi, si nous avions observé des différences significatives, il aurait été difficile de les relier à ce qu’il se passe dans le cas d’infections naturelles. Il serait donc pertinent d’effectuer la même expérience avec des quantités précises et pertinentes de protéines virales purifiées pour s’affranchir de ces obstacles. De surcroît, les cellules Huh7 sont une lignée cellulaire dérivée d’hépatocarcinome humain. Il serait judicieux de réaliser cette expérience sur un modèle plus physiologique de cellules primaires, comme des hépatocytes primaires humains (PHH), ainsi que d’étudier la capacité de GP38, GP85 et GP160 à se lier à ces cellules. Il est également important de corroborer les résultats observés par mesure d’activité de la LDH avec d’autres méthodes permettant d’étudier la mort cellulaire, comme par exemple de la cytométrie en flux après marquage avec de l’iodure de propidium (un agent intercalant de l’ADN) et de l’annexine V (se liant à la phosphatidylsérine, molécule exposée à la surface des cellules précocement apoptotiques). Cette méthode a l’avantage de pouvoir discriminer deux processus de mort cellulaire, l’apoptose et la nécrose. Dans l’hypothèse où GP38, GP85 et GP160 seraient à l’origine de mort cellulaire hépatique, il faudrait se pencher plus précisément sur l’étude de la voie impliquée.

100

3.3.3.2. Protéines virales sécrétées et PBMCs

Dans cette étude, nous suggérons que l’incubation de PBMCs avec du surnageant contenant GP38, GP85 et GP160 est à l’origine d’une mort plus rapide des PBMCs comparé à l’incubation de ces cellules avec du surnageant contrôle (Figure 34). Il est cependant étonnant que l’incubation avec du surnageant contrôle induise une mort des PBMCs au bout de 72 h seulement. Cela pourrait s’expliquer par la présence dans le surnageant non purifié et concentré de facteurs induisant la mort des PBMCs, renforçant la nécessité de purifier les protéines pour de futures expériences afin de s’assurer de la spécificité de leur effet. Incuber des PBMCs avec du milieu de culture contenant 1:10 d’Opti-MEM aurait pu servir de contrôle négatif pour cette expérience afin d’évaluer si l’incubation avec le surnageant contrôle pUC19 induit une mortalité plus rapide des PBMCs. De plus, la mortalité des PBMCs induite par GP38, GP85 et GP160 ou par le surnageant contrôle n’est pas spécifique d’un type de PBMCs particulier (Figure 35). De surcroît, une activation plus rapide des LT après incubation avec MLD-GP38 a été suggérée, bien que faible (Figure 36). Il aurait été judicieux d’utiliser un contrôle positif d’activation des LT, comme un anticorps anti-TCR associé avec un anticorps anti-CD28, ou encore du phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-ionomycine lors de notre expérience, afin de quantifier au mieux cette activation. De plus, les mêmes limitations évoquées précédemment quant à la quantité et la pureté de protéines présentes dans le surnageant s’appliquent ici.

De nombreuses FHVs sont associées à des taux de cytokines élevés chez les patients infectés. Ces cytokines sont majoritairement sécrétées par les PBMCs. L’infection des PBMCs par de nombreux virus, dont le VFHCC (Connolly-Andersen et al., 2009), le VEBO ou le VDEN (Paessler et Walker, 2013), est à l’origine de la sécrétion accrue de cytokines, dont TNF-α ou IL-6. De plus, dans le cas de VEBO et du VDEN, des protéines virales sécrétées (des glycoprotéines tronquées (shed GP) et NS1 respectivement) activent directement les cellules immunitaires pour produire des cytokines pro-inflammatoires (Escudero-Pérez et al., 2014; Modhiran et al., 2015). De manière similaire, GP38, GP85 et GP160 pourraient avoir un rôle dans l’induction de sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par des cellules immunitaires activées lors d’infection par le VFHCC. Il serait intéressant d’étudier par réaction en chaîne par polymérase quantitative après transcription inverse (RT-qPCR) la quantité d’ARNm intracellulaire de gènes codant des cytokines pro-inflammatoires dans les PBMCs à la suite de leur incubation avec ces protéines virales, et de confirmer ces résultats par ELISA pour étudier la quantité de cytokines sécrétées dans le surnageant. De plus, la voie de signalisation via le TLR-4 est impliquée dans ce mécanisme à la fois pour shed GP de VEBO et pour NS1 du VDEN (Escudero-Pérez et al., 2014; Modhiran et al., 2015). Ainsi, l’ajout d’anticorps anti- 101

TLR-4 ou un test de compétition par du lipopolysaccharide pourraient tous deux avoir un intérêt dans l’étude de la voie de signalisation impliquée dans l’effet de GP38, GP85 et GP160 sur les cellules immunitaires. De surcroît, la glycosylation des shed GP, qui comprennent un domaine MLD, possède un rôle également important dans ce mécanisme (Escudero-Pérez et al., 2014). Ainsi, nous pourrions traiter GP38, GP85 et GP160, qui sont des protéines hautement glycosylées, avec des enzymes de déglycosylation afin d’étudier l’importance des N- et O- glycosylations sur le rôle de ces protéines. Enfin, nous pourrions déterminer par cytométrie en flux le(s) sous-type(s) cellulaire(s) des PBMCs impliqué(s) dans la sécrétion accrue de cytokines pro-inflammatoires. En effet, si seules les cellules dendritiques dérivées de monocytes sont infectées productivement par le VFHCC (Connolly-Andersen et al., 2009), cela n’exclut pas la potentielle implication d’autres types de cellules immunitaires, comme les macrophages ou les lymphocytes, dans la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires.

3.3.3.3.Protéines virales sécrétées et cellules endothéliales

L’endothélium a un rôle clé de barrière, permettant la compartimentation du sang dans les vaisseaux sanguins. Plusieurs facteurs indispensables contrôlent cette homéostasie vasculaire, dont (i) les cellules endothéliales en elles-mêmes ; (ii) les jonctions intercellulaires adhérentes et serrées ; et (iii) le glycocalyx. Ainsi, des lésions cellulaires, la perturbation et désintégration des jonctions intercellulaires endothéliales ainsi que la dégradation du glycocalyx peuvent perturber l’homéostasie vasculaire, à l’origine d’hémorragies. NS1 du VDEN a été largement étudiée dans son rôle direct de perturbation du rôle de barrière de l’endothélium. En effet, de nombreuses expériences de résistance électrique trans-endothéliale (TEER) ont montré son rôle dans l’induction d’une hyperperméabilité endothéliale (Beatty et al., 2015; Glasner et al., 2018; Modhiran et al., 2015). Les mécanismes impliqués comprennent la stimulation par NS1 de production de MIF, molécule induisant une hyperperméabilité endothéliale par autophagie des protéines de jonctions intercellulaires, ainsi que l’induction par NS1 d’expression de protéines telles que la cathepsine L, l’héparanase ou des sialidases, qui dégradent les composants du glycocalyx (Chen et al., 2018, 2016; Glasner et al., 2017; Puerta-Guardo et al., 2016). De manière similaire, shed GP de VEBO induit également directement une augmentation de perméabilité de l’endothélium (Escudero-Pérez et al., 2014).

Dans cette étude, nous avons voulu étudier l’effet de l’incubation de GP38, GP85 et GP160 sur un modèle de cellules endothéliales primaires humaines que nous avons isolées et caractérisées (Figure 37). Les expériences réalisées sur les HUVECs devront ensuite être réalisées sur des HUVECs provenant de différents donneurs afin de s’affranchir d’une éventuelle variabilité

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interindividuelle. Tout d’abord, nous avons montré une liaison des protéines GP38, GP85 et GP160 aux cellules endothéliales (Figure 38). Des études réalisées avec des surnageants contenant GP38 seulement ou GP85 et GP160 seulement permettront de déterminer plus précisément les protéines virales impliquées dans cette liaison. Ensuite, une mesure de TEER ainsi que l’étude d’un flux d’albumine marquée au travers d’une monocouche d’HUVECs disposées dans un Transwell et incubées avec les protéines virales d’intérêt pourrait permettre d’évaluer leur rôle dans l’induction d’une hyperperméabilité endothéliale. Dans le cas où une hyperperméabilité est mise en évidence, nous pourrions étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu. L’intégrité et la distribution des protéines de jonctions intercellulaires, en particulier la VE-cadhérine, pourraient être évaluées par microscopie confocale, après incubation des HUVECs avec GP38, GP85 et GP160. En effet, lors d’infection par le VFHCC de cellules endothéliales, la distribution de la VE-cadhérine est modifiée, malgré l’absence de dégradation ou de baisse d’expression de la VE-cadhérine (Connolly-Andersen et al., 2011). De plus, toujours par microscopie confocale, nous pourrions évaluer l’intégrité du glycocalyx de cellules endothéliales mises en contact avec GP38, GP85 et GP160. Nous pourrions de surcroît étudier l’éventuelle implication de molécules impliquées dans la dégradation du glycocalyx dans l’éventuelle hyperperméabilité induite par GP38, GP85 et GP160 en utilisant des inhibiteurs spécifiques de ces molécules. Pour toutes ces expériences, NS1 du VDEN que nous aurions préalablement produite et purifiée de la même manière que GP38, GP85 et GP160 pourrait constituer un contrôle positif adéquat. Enfin, nous ne pouvons exclure l’éventualité selon laquelle GP38, GP85 et GP160 induisent une mort des cellules endothéliales, que nous pourrions évaluer par mesure de l’activité de la LDH et par cytométrie en flux.

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LEROLLE Solène

MÉCANISMES MOLÉCULAIRES IMPLIQUÉS DANS LA PATHOGENÈSE DU VIRUS DE LA FIÈVRE HÉMORRAGIQUE DE CRIMÉE-CONGO

Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, le 25 septembre 2020

RESUME : Le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (VFHCC) est un virus de la famille Nairoviridae représentant une menace sanitaire sérieuse pour l’Homme. Cette arbovirose émergente est transmise par des tiques du genre Hyalomma, dont la distribution géographique augmente rapidement. Il n’existe actuellement aucun vaccin ni traitement spécifique dirigé contre ce virus responsable de fièvres hémorragiques pouvant être mortelles. Afin de développer ces derniers, il est primordial d’étudier et de comprendre la biologie et les mécanismes moléculaires impliqués dans la pathogenèse du VFHCC.

Dans cette thèse ont été décrites les connaissances actuelles sur la pathogenèse du VFHCC. Les lésions hépatiques, les troubles de la coagulation ainsi que la tempête cytokinique que l’infection par le VFHCC induit sont à l’origine des symptômes observés lors de fièvre hémorragique de Crimée-Congo. Cependant, les mécanismes moléculaires à l’origine de ces lésions et troubles restent encore aujourd’hui non élucidés. De plus, le rôle extracellulaire de certaines protéines virales non-structurales sécrétées, les protéines GP38, GP85 et GP160, est largement inconnu. Dans cette thèse, nous avons étudié l’éventuelle contribution de ces protéines sécrétées dans la pathogenèse du VFHCC, en particulier dans l’induction du syndrome hémorragique. Les résultats obtenus suggèrent que ces protéines ne perturbent pas directement le mécanisme de coagulation, mais qu’elles sont cytotoxiques pour les cellules immunitaires. Des études supplémentaires sont nécessaires afin de préciser les mécanismes moléculaires impliqués dans cette cytotoxicité ainsi que ses conséquences fonctionnelles.

MOTS CLES : - Virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo - Étiologie - Hémorragie - Protéines virales

JURY : Président : Monsieur le Professeur Mohamed Saoud

1er Assesseur : Monsieur le Docteur Vincent Legros 2ème Assesseur : Monsieur le Professeur Michel Pépin

DATE DE SOUTENANCE : 25 septembre 2020

ADRESSE DE L’AUTEUR : 2 square Mongazon 49000 Angers