Programa de Pós-Graduação em Virologia Curso de Mestrado ANDERSON FRANCO DA CRUZ LIMA Sequenciamento completo e caracterização genética dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a-10 (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) isolados no Peru e na Venezuela Ananindeua 2015 ANDERSON FRANCO DA CRUZ LIMA Sequenciamento completo e caracterização genética dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a-10 (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) isolados no Peru e na Venezuela Dissertação apresentada para obtenção do grau de Mestre em Virologia, do Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas. Orientador: Dr. Marcio Roberto Teixeira Nunes Co-Orientador: Dr. João Lídio da Silva Gonçalves Vianez Jr. Ananindeua 2015 ANDERSON FRANCO DA CRUZ LIMA Sequenciamento completo e caracterização genética dos vírus MIS 0397 e INHRR 17a-10 (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) isolados no Peru e na Venezuela Dissertação apresentada para obtenção do grau de Mestre em Virologia, do Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas. Orientador: Dr. Marcio Roberto Teixeira Nunes Co-Orientador: Dr. João Lídio da Silva Gonçalves Vianez Jr. Aprovado em: BANCA EXAMIDORA Titulares: Prof. Dr. Sandro Ptroca da Silva Centro de Inovações Tecnológicas/Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, Instituto Evandro Chagas Profa. Dra. Daniele Barbosa de Almeida Medeiros Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, Instituto Evandro Chagas Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves Departamento de Genética, Universidade Federal do Pará A Deus, meu filho Tiago, minha esposa Alana, pelo apoio incondicional, sem o qual não seria possível realizar esta dissertação. AGRADECIMENTOS - A Deus por todos os aprendizados que tem me proporcionado, por ter sido meu porto seguro em todos os momentos da minha vida; - Aos meus pais, João e Glaci, pelo amor a mim dedicado e por procurarem me proporcionar sempre a melhor educação; - Ao meu irmão Adriano sua amizade e companheirismo; - À minha esposa Alana pelo incansável apoio nos momentos em que precisei; - Ao meu filho Tiago, por entender e me apoiar sempre neste projeto; - À Marinha do Brasil, na pessoa dos Diretores do Hospital Naval de Belém, neste período, Dr. Ruf (2012) e Dr. Piqueira (2014), pelo encorajamento em iniciar e concluir este Mestrado. - À coordenação e aos professores do Programa de Pós Graduação em Virologia /IEC pelo apoio e pelos ensinamentos; - Ao Instituto Evandro Chagas na pessoa do Diretor, Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos, pela contribuição na minha formação acadêmica; - Ao Dr. Robert B. Tesh (Departamento de Patologia, Universidade do Texas, Galveston, EUA) e Dr. Juan Carlos Navarro (Centro Internacional de Zoonosis, Universidad Central del Ecuador, Quito) por cederem os RNAs referentes as amostras virais utilizadas no estudo - Ao Dr. Márcio Nunes pela orientação nesta Dissertação de Mestrado, pelo incentivo e por acreditar em meu potencial; por ter me acolhido e me conduzido nos princípios da genética descritiva e da bioinformática; - Ao Dr. João Vianez, pela co-orientação nesta Dissertação de Mestrado, - Aos Amigos do CIT: Clayton, Sandro e Jedson pelo grande apoio nas etapas da bioinformática; - Aos amigos da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas, que contribuíram direta e indiretamente para a execução desta dissertação; - Aos amigos, Aristides, Jairo, Luiz Felipe, Rodrigo e Thadeu, pela parceria nos momentos difíceis, e pela honra de tê-los como amigos. - A todos os Cavalos-Babuínos! “Não é o mais forte que sobrevive, nem o mais inteligente, mas o que melhor se adapta às mudanças” ― Charles Darwin RESUMO Os vírus pertencentes ao gênero Orthobunyavirus, família Bunyaviridae, são agentes virais morfologicamente caracterizados por possuírem partículas esféricas com tamanho entre 80 e 120 nm de diâmetro, envelopadas e por conterem um genoma de RNA trissegmentado, fita simples, polaridade negativa que, em geral codifica seis proteínas, sendo três proteínas estruturais (N, Gn, Gc) e três proteínas não estruturais (NSs, NSm, RpRd). Este estudo teve como objetivo realizar a obtenção do genoma completo de cepas virais isoladas no Peru e Venezuela, os vírus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a-10 (TVP 19255), bem como caracterizar geneticamente os segmentos de RNA (S, M e LRNA), realizar a reconstrução filogenética dos segmentos genômicos e avaliar a possibilidade de rearranjo genético em natureza, para estes vírus. As amostras virais foram isoladas de um caso febril humano ocorrido em um residente de Lima, Peru, e de um primata não humano (Cebus sp) utilizado como sentinela no município de Azoategui, Venezuela, respectivamente. As amostras virais foram submetidas a três etapas, i) extração do ácido nucleico (RNA); ii) obtenção das sequências nucleotídicas por pirosequenciamento e iii) análise computacional. As sequências completas evidenciaram tamanhos, organização genômica e características genéticas (número de resíduos de cisteínas, sítios de glicosilação, motivos conservados, sítios de clivagem, conteúdo A-U e complementariedade entre as regiões 3’-5’ não codificantes) compatíveis com o observado para os membros do gênero Orthobunyavirus. As análises de similaridade e filogenia evidenciaram que os vírus MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a – 10 (TVP 19255) são geneticamente mais similares com os membros do grupo Simbu. Análises evolutivas levando em consideração os três segmentos de RNA genômico (S, M, L) possuem origens distintas, sendo os segmentos S e L associados ao VORO e os segmentos MRNA relacionados aos Vírus Iquitos (VIQT) e Vírus Madre de Dios (VMDD). Por fim as análises de troca de segmento genômico (Simplot) evidenciaram claramente a presença de eventos de rearranjo entre os vírus estudados e o VORO confirmando o processo de rearranjo entre dois vírus parentais pertencentes ao grupo Simbu. Por fim, os dados de caracterização do genoma completo e análise de rearranjo contribuirão para melhor entender a contribuição do processo de rearranjo genético envolvendo o VORO, um importante patógeno humano na Amazônia. Palavras-Chave: Arbovírus; Orthobunyavirus; Oropouche; Caracterização Molecular ABSTRACT Viruses belonging to the genus Orthobunyavirus, family Bunyaviridae, are viral agents morphologically characterized as spherical particles with 80 to 120 nm of diameter, enveloped and possess a single stranded, negative sense, tripartide RNA genome which encodes for six viral proteins, three structural proteins (N, Gn and Gc) and usualy three non structural proteins (NSs, NSm and RpRd). This study had as objective obtain the complete genome sequences for the viruses MIS 0397 (TVP 19261) e INHRR 17a-10 (TVP 19255) isolated in Peru and Venezuela, respectively, as well as genetically characterize the RNA segments and perform phylogenetic reconstruction and evaluate the possibility of genetic reassortment in nature. Viruses were isolated from a human febrile case in Lima, Peru and from a non-human primate (Cebus sp) used as sentinel animal in the municipality of Azoategui, Venezuela, respectively. Both viral isolates were evaluated following three basic steps: i) RNA extraction; ii) nucleotide sequencing; iii) computational analyses. Complete sequences revealed that the size, genome organization and genetic traits (cysteine residues, glycosylation sites, conserved motifs, cleavage sites, A-U content, and 3’-5’ non coding region complementarity) were similar to those observed in other members of the genus Orthobunyavirus. Similarity analysis and phylogeny demonstrated that the viruses MIS 0397 (TVP 19261) and INHRR 17a – 10 (TVP 19255) are genetically close related to members of the Simbu virus group. Evolutionary analyses based on the three RNA segments (S, M, L) demonstrated that both viruses have distinct origins, where the S and L segments were associated to OROV and the M segments related to Iquitos virus (IQTV) and Madre de Dios virus (MDDV). Furthermore, the analyses related to genome segment reassorting (Simplot), clearly demonstrated the reassortment event involving the studied viruses and OROV confirming the natural reassortment process between two distinct parental viruses belonging to the Simbu group. Finally, the data generated for the complete sequences, genetic characterization and evolution will contribute for a better understand regarding the role of the reassortment process involving the OROV, an important human pathogen in the Amazon region. Key-words: Arboviruses; Orthobunyavirus; Simbu group; Oropouche; Molecular characterization. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Representação esquemática do ciclo de transmissão dos arbovírus envolvendo regiões silvestres, peri-urbanas e urbanas ........................... 01 Figura 2 – Esquema da organização morfológica dos integrantes da família Bunyaviridae. ......................................................................................... 06 Quadro 1 – Sequência nucleotídica dos terminais 5´ e 3´ dos genes S, M e L de representantes da família Bunyaviridae ................................................. 08 Quadro 2 – Tamanho dos segmentos de RNA genômico segundo os diferentes gêneros pertencentes a família Bunyaviridae ........................................ 09 Figura 3 – Estratégia de codificação dos segmentos genômicos dos integrantes da família Bunyaviridae. ................................................................................ 10 Figura 4 – Organização genômica de membros representativos da família Bunyaviridae. ......................................................................................