Die Bedeutung Peripher Wirkender Neurotoxine Zur Erforschung Neurophysiologischer Prozesse Carlo G

Vierteljahrsschrift der Naturforschenden Gesellschaft in Zürich (1987) 132/4: 191-258 Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiologischer Prozesse Carlo G. CaratsCh, Universität Zürich

Die vorliegende Arbeit ist in zwei Teile gegliedert. Im ersten Teil wird eine Übersicht über die peripher wirkenden Neurotoxine (NT) und eine Charakterisierung dieser Wirkung gegeben. Je nach Typ ihrer spezifischen toxlschen Aktivität werden die NT in drei Gruppen eingeteilt: (I) präsynaptisch wirkende NT, (II) postsynaptisch wirkende NT – zwei Gruppen, die hauptsächllch an den neuromuskulären Synapsen wirken – und (HI) NT mit Wirkung auf Ionen-Kanäle, besonders auf die Natrium-Kanäle erregbarer Membranen. Im zweiten Teil wird über eigene Arbeiten berichtet, die eine Analyse des Wirkungsmechanls- mus von [3-Bungarotoxin (13-BuTx), einem präsynaptisch wirksamen Schlangen-NT, zum Ziel hatten. Die komplexe triphasische Wirkung von (3-BuTx wurde mit immunologischen und haupt- sächlich elektrophysiologischen Methoden in detail analysiert.

The importance of peripherally acting neurotoxins for the investigation of neurophysiological pro- cesses This essay is divided into two parts. The first part contains a survey of the peripherally acting neurotoxins (NT) and a characterization of their effects. According to their specific activity the NT are classified in three groups: (I) presynaptically acting NT, (H) postsynaptically acting NT – two groups which take effect mainly on neuromuscular junctions – and (HI) NT with an effect on ionlc channels, especially on the sodium channel of excitable membranes. The second part is a report on studies of my own in order to analyze the mechanism of action of p-Bungarotoxin ((3-BuTx), a presynaptically acting snake neurotoxin. The complex action of p- BuTx was studied in detail with immunological and particularly electrophysiological techniques.

1 Übersicht über peripher wirkende Neurotoxine

l.1 Definition des Begriffes «peripher wirkende Neurotoxine» Wenn von Neurotoxinen gesprochen wird, so können verschiedene Personen, je nach Muttersprache, Ausbildung und Arbeits- oder Forschungs-Richtung, darunter etwas VersChiedenes verstehen. Weil das Gebiet der Substanzen, die eine toxische Wirkung auf das Nervensystem haben, enorm gross ist (man denke nur an die Neurotoxizität von Elementen wie Blei, von Phosphorsäure- Estern als Schädlingsbekämpfungsmittel oder gewisser Antibiotica), muss der Begriff des Neurotoxins genau definiert werden. Unter Neurotoxinen – in Anlehnung an die Definition von E. Russel (1976), einem der Gründer der «International Society an Toxinology» – ver- 192 Carlo G. Caratsch stehen wir Substanzen, die toxisch auf das Nervensystem wirken und von Lebewesen, d. h. von Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen, produziert wurden. Bei der vorliegenden Arbeit ist das Gebiet zusätzlich eingeschränkt, in dem nur solche Neurotoxine berüCksichtigt wurden, die «in vivo» entweder ausschliesslich oder hauptsächlich auf das periphere Nervensystem einwirken. Entsprechend dieser Definition werden typische zentral wirkende Neuro- toxine, wie z. B. das Apamin, ein interessantes Octapeptid, gewonnen aus dem Giftstoff der Biene (Apis mellifera) (E. Habermann 1972, 1977 ; E. Habermann und K. Fischer, 1979), niCht berücksichtigt. Jedoch besitzen sehr viele peripher wirkende Neurotoxine, bei experimenteller Applikation am Zentral-Ner- vensystem (ZNS) ebenfalls dort eine Wirkung. Das Fehlen einer zentralen Wirkung «in vivo» beruht entweder auf der Unfähigkeit der toxischen Mole- küle, die Blut-Gehirn-Schranke zu durChdringen und ins ZNS zu gelangen, oder auf ihrer hohen Spezifizität für gewisse periphere Rezeptoren, die z. B. an der neuromuskulären Synapse lokalisiert sind. Allerdings werden in der vorliegenden Arbeit gewisse Ausnahmen gemacht. So wird in der schemati- sChen Übersicht und Charakterisierung der Neurotoxine unter den präsynap- tisCh wirksamen z. B. auch das Tetanus-Toxin wegen seiner Verwandtschaft mit dem Botulinum-Toxin kurz besprochen. Weiterhin werden in dieser Übersicht keine Neurotoxine pflanzlichen Ur- sprungs berücksichtigt, ebenfalls mit einer Ausnahme, nämliCh der Gruppe von Grayanotoxin, Veratridin und Aconitin wegen ihres dem Batrachotoxin ähnlichen Wirkungsmechanismus. So bleiben viele Wirkstoffe unerwähnt, vor allem die wichtige Gruppe der natürlichen Curare-Stoffe. Diese und später ihre synthetischen und halbsynthetischen Derivate haben in der experimentellen Physiologie, Pharmakologie und Toxikologie eine besonders grosse Rolle gespielt und sind heute aus der Therapie (Anästhesie) nicht wegzudenken. Trotzdem, weil ihre Wirkung gut bekannt ist, wurde zur Abgrenzung des Ge- bietes die ganze Gruppe der pflanzlichen Neurotoxine niCht berücksichtigt. Als letzte Einschränkung ist noch zu erwähnen, dass das SChema der auf- geführten Neurotoxine nicht vollständig ist, es nicht sein kann: Das Gebiet der Neurotoxinologie (Lehre der Neurotoxine) ist in voller Entwicklung, und es vergeht kein Monat, ohne dass neue Neurotoxine entdeckt, chemisch analysiert und in ihrer Wirkung beschrieben werden. Es wurde versucht, in der vorliegenden Aufzählung und Charakterisierung diejenigen Neurotoxine zu berücksichtigen, die unseres Wissens bis zum Frühjahr 1985 mit einiger Si- cherheit beschrieben wurden. l.2 Einteilung der peripher wirkenden Neurotoxine Die peripher wirkenden Neurotoxine bakteriellen oder tierischen Ursprungs können nach ihrem Wirkungsmechanismus in drei Gruppen und mehrere Klassen eingeteilt werden. Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 193

1.2.1 Gruppe I: Präsynaptisch wirkende Neurotoxine Die Neurotoxine dieser Gruppe wirken an der präsynaptischen Seite der Synapse, d. h. sie beeinflussen den Prozess der Neurotransmittor-Freisetzung. Diese Beeinflussung kann mannigfaltig sein: Sie geht von der einfaChen Hem- mung dieser Funktion (z. B. die Wirkung des Botulinum-Toxins) über einen diphasischen Effekt mit anfänglicher Verstärkung, die später von einer Blok- kierung gefolgt ist (z. B. die Wirkung des a-Latrotoxins) bis zur komplexen Wirkung gewisser Schlangen-Neurotoxine mit einem triphasischen Effekt: an- fängliche Hemmung, sekundäre Verstärkung und tertiärer Block. Die grösste Anzahl der bis heute bekannten Toxine dieser Gruppe wirkt an den motorischen Nervenendigungen der neuromuskulären Synapse und speziell an den Cholinergischen Nervenendigungen der Vertebraten. Nach Herkunft der einzelnen Neurotoxine kann diese Gruppe in vier verschiedene Klassen eingeteilt werden. Klasse 1: Bakterien-Neurotoxine (Tabelle l). Es sind dies Proteine mit einem hohen MolekulargewiCht (ca. 150000 daltons), die die Freisetzung von Neurotransmittoren hemmen. Diese Hemmung betrifft die durch Nervenreiz evozierte und die spontane, sowohl quantale als auch niCht-quantale Freiset- zung. Klasse 2: Spinnen-Neurotoxine (Tabelle 2). Es sind ebenfalls Proteine mit einem hohen Molekulargewicht (ca. 130 000 daltons). Sie bewirken anfänglich eine sehr starke Erhöhung der spontanen quantalen Freisetzung des Neuro- transmittors, der später eine Hemmung derselben und eine Blockierung der synaptischen Übertragung folgen. Klasse 3: Schlangen-Neurotoxine (Tabelle 3). Diese Proteine bestehen aus 1-3 Polypeptidketten. Die meisten dieser Neurotoxine besitzen eine markante Phospholipase A2 (PhLp A2)-Aktivität. Mit wenigen Ausnahmen weisen sie eine charakteristische triphasische Wirkung auf. Zuerst kommt es zu einer kurzen Hemmung der evozierten und spontanen Neurotransmittor-Freiset- zung, die wahrscheinlich durch die Bindung des Neurotoxins an die Mem- bran der Nervenendigung bedingt ist. Danach folgt eine sekundäre Erhöhung dieser Freisetzung und zuletzt eine durch die Entleerung der Nervenendigun- gen bedingte tertiäre Verminderung bis zur Blockierung. Die Phasen 2 und 3 werden durch die PhLp A2-Aktivität verursacht. Klasse 4: Eine «Sammelklasse» (Tabelle 4). Es werden hier präsynaptisch wirksame Neurotoxine zusammengefasst, die von anderen Tierarten (z. B. von Fischen) stammen. Ihre Wirkungen sind ebenfalls nicht direkt mit denen der Toxine der vorher besprochenen Klassen zu vergleichen.

l.2.2 Gruppe II: Postsynaptisch wirkende Neurotoxine Die Neurotoxine dieser Gruppe sind an der postsynaptischen Seite der neuro- muskulären Synapse wirksam, die meisten von ihnen spezifisch an den cholinergen motorischen Endplatten der Vertebraten. Daneben wurden in letzter 194 Carlo G. Caratsch

Zeit auch solche Neurotoxine entdeckt, die spezifisch auf die neuromuskulä- ren Synapsen der Crustacea oder der Insekten wirken. Diese Gruppe kann je naCh Wirkungsort in zwei Klassen unterteilt werden: Klasse 1: Neurotoxine mit Wirkung auf den nikotinischen Acetylcholin-Re- zeptor (nAChR). Diese ist ein komplexes Molekül, bei dem funktionell zwei Teile unterschieden werden können: a) der AChR «sensu stricto», d. h. der Diskriminator oder Erkennungs- und Bindungsstelle für Agonisten. Diese befinden sich in den a-Untereinhei- ten des Rezeptors. b) der damit gekoppelte Ionen-Kanal-Modulator (Ionic channel modulator, ICM), der nach Bindung des Agonisten mit dem Diskriminator durch Konformationsänderungen einen Ionen-Kanal eröffnet. Dadurch können vor allem Natrium-Ionen in die Muskelzelle einströmen, und es entsteht eine postsynaptische Depolarisation (Endplatten-Potential, e.p.p., oder ein Minia- tur-Endplatten-Potential, m. e. p. p.). Neurotoxine können zwischen diesen zwei funktionellen Teilen untersChei- den. Es gibt demnach: Klasse la (Tabellen 5, 6 und 7): Toxine, die spezifisch mit dem Diskrimina- tor interagieren und reversibel oder irreversibel die Bindung von Agonisten hemmen und dadurch eine «curaromimetische» Wirkung haben, und Klasse lb (Tabelle 8): Toxine, die spezifisch mit dem ICM interagieren. Sie verhindern nicht die Bindung von Agonisten, hemmen aber die Öffnung der Kanäle, und dadurch blockieren sie ebenfalls die Funktion des AChR. Klasse 2 (Tabelle 9): Neurotoxine mit Wirkung auf die neuromuskuläre Synapse von Crustacea oder Insekten. Diese interagieren spezifisch mit postsynaptischen glutaminergen und GABAergen Rezeptoren der Muskelzellen dieser Tiere und blockieren hier die neuromuskuläre Übertragung, ähnlich der Wirkung der Neurotoxine der Klasse 1 auf den nAChR.

1.2.3 Gruppe III: Neurotoxine mit Wirkung auf Natrium-Kanäle Diese Neurotoxine beeinflussen die Funktion der spannungssensiblen Na- Kanäle (voltage-sensitive Na-channels) in der Membran erregbarer Zellen. Diese Kanäle, die beim Ruhepotential geschlossen sind, öffnen sich beim Er- reichen eines bestimmten Depolarisationsgrades der Membran. Die einzelnen Wirksubstanzen sind sehr verschieden bezüglich ihres Ursprungs, der chemischen Struktur und der Wirkungsstärke. Je nach ihren Bindungsstellen am Na-Kanal-Protein und nach ihren Wirkungen können sie in Anlehnung an Caterall (1980) in drei Klassen eingeteilt werden. Klasse 1 (Tabelle 10): Diese Neurotoxine binden siCh an einen ersten To- xin-Rezeptor, der sich wahrscheinlich an der Aussenseite der Na-Kanal-Pore befindet. Hauptvertreter dieser Klasse sind Tetrodotoxin (TTX) und Saxito- xin (STX). Ihr Wirkungsmechanismus beruht auf einer Hemmung des Na- triumtransportes durch den Kanal. Der Kanal bleibt «geschlossen». Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 195

Klasse 2 (Tabelle 11): Diese Neurotoxine binden sich an einen zweiten Typ von Toxinrezeptor, der siCh wahrscheinlich innerhalb des Na-Kanals befindet. Durch Bindung an dieser Stelle können sie sowohl die Aktivierung als die Inaktivierung des Kanals beeinflussen. Zu dieser Klasse gehören als Haupt- vertreter Batrachotoxin (BTX) und die Pflanzen-Neurotoxine Grayanotoxin, Veratridin und Aconitin. Ihr Wirkungsmechanismus beruht darauf, dass die Aktivierung (Öffnung) der Kanäle bei einem Membranpotential erfolgt, das dem Ruhepotential näher liegt. Daneben bewirken sie eine partielle Hem- mung der Inaktivierung (Schliessen der Kanäle). Die Summe beider Effekte führt zu einer Daueraktivierung einer Fraktion der Kanäle und deswegen zu einer Depolarisation der Membran. Klasse 3 (Tabelle 12): Diese Neurotoxine binden sich an einen dritten Typ von Toxin-Rezeptor, der sich ebenfalls wahrscheinlich innerhalb des Kanals befindet. Die Bindung dürfte von der spannungsbedingten Konformationsän- derung des Kanals abhängig sein. In diese Klasse gehören die Skorpion-Neu- rotoxine und die Seeanemone-Neurotoxine. Ihr Wirkungsmechanismus beruht auf einer Hemmung der Inaktivierung der Kanäle durch Bindung an den Rezeptor, wenn der Kanal sich in einem aktivierten Zustand befindet. Die Neurotoxine dieser Klasse verstärken die Wirkung derjenigen der Klasse 2. Innerhalb der Neurotoxine derselben Klasse besteht eine gegenseitige kompetitive Bindungshemmung. Die Bindung der Neurotoxine der Klasse 1 an ihre Rezeptoren ist vollständig unabhängig von der der anderen beiden Klassen. Hingegen besteht zwischen Klasse 2 und 3 eine Interaktion, in dem Sinne, dass Bindung eines Toxins einer Klasse an seinen Rezeptor die Bin- dung eines Toxins der anderen Klasse an seinen Rezeptor begünstigt. Die Wirkung der Neurotoxine der Klasse 2 und 3 wird von derjenigen der Klasse 1 antagonisiert, denn durch den überwiegenden Kanal-Schliess-Effekt der Neurotoxine der Klasse 1 wird die Erregbarkeit der Membran blockiert. Tabelle 1 Gruppe I: PIäsynaptisch wirkende Neurotoxine Klasse 1: Bakterien-Neurotoxine

Table 1 Group I: Presynaptic neuIotoxins Class l: Bacterial neurotoxins

Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. WirkungsoIt Wirkungs-Mechanismus/-Stärke

Botulinustoxin Produziert vom anae- Protein. Es gibt minde- Cholinergische Nerven Hemmung deI ACh-Freisetzung, (BoTx) roben Bakterium stens 8 immunologisch neu-endigungen an den sowohl der evozierten (e.p.p.) als [53, 93, 177, «Clostridium versch. Typen. -romuskulären Synapsen der spontanen Freisetzung 189, 190, 197, botulinum» MG: 135 000-170 000 der Vertebraten. (m.e.p.p. und molekulare Freiset- 207, 2081' 2 Polypeptidketten In vivo nur peripher zung). durch 1 S-S Brücke ver- In vitro auch zentral Genauer Wirkungsmechanismus bunden. nicht bekannt. BoTx wiId in die Nervenendigungen aufgenommen und wirkt von der Innenseite. Evtl. Verminderung der Empfindlich- keit des Freisetzungsapparates für Ca. Effekt partiell kompensie rt duIch AminopyIidine (4-AP, 3,4-DAP) Giftigstes aller bekannten Toxine LD5o Maus: 5-50 ng/kg Körper- gew. je nach Typ.

BoTx A idem MG = 150000 idem Der wirksamste alleI Typen. [191, 196, 214] (99 000+55 000) LDso Maus: 5 ng/kg Körpergew.

BoTx B idem MG: 152000 idem Weniger toxisch als Typ A, [61, 191] (104 000+51 000) kürzere Wirkungsdauer

BoTx C, idem MG = 155 000 idem Blockiert neuromuskuläre Über- [198] (100 000+55 000) tragung. Wird nicht von BoTx C2 antagonisiert

BoTx Cz idem MG = 160000 Noch nicht genau be- Bewirkt Hypotonie, Hämorrha- 1198] (105 000+55 000) kannt gien und Ansammlungen von Flüssigkeiten in den Lungen und Trachea. Hemmt nicht die neuromusk. BoTx CI antagonisiert. Evtl. WiIkung durch VerändeIun- gen von Membran-Permeabilität der Zellen und/oder von zell. Se- kretion.

BoTx D idem MG = (170000) Cholinergische Nerven- WiIkungsmechanismus ähnlich [165] (110 000+60 000) endigungen wie beim BoTx A. Weniger toxisch

BoTx E idem MG = 147 000 idem idem [60, 199] (102 000+50 000)

BoTx F idem MG = 128 000-155 000 idem idem [61, 165] (105 000+56 000)

BoTx G idem MG = noch nicht be- Wahrscheinlich idem Wahrscheinlich idem [165] kannt

Tetanustoxin Produziert vom anae- Protein bestehend aus 2 In vivo im Zentralner- Hemmung der Freisetzung von (TeTx) roben Bakterium Polypeptidketten, die vensystem (Rücken- Glycin, GABA und andeIen puta- [87, 137, 185] «Clostridium durch 2 S-S Brücken mark). tiven AminosäuIe-Neurotransmit- tetani» verbunden sind. In vitro auch peripher toren in Gehirn und Rückenmark. MG = 140 000 an der Muskel-End- In vitro auch von ACh (Muskel- Heavy chain (H-ch) platte Endplatten). 87 000 LD5o Maus: 5 ng/kg Körper- Light chain (L-ch) gewicht 48 000

' Die Zahlen in den eckigen Klammern beziehen sich auf die LiteIatur. Tabelle 2 Gruppe I: Präsynaptisch wirkende Neurotoxine Klasse 2: Spinnen-Neurotoxine 00 Table 2 Group I: PIesynaptic neurotoxins Class 2: Spider neurotoxins

Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-Stärke a-Latrotoxin Im Giftstoff deI Spinne Protein, bestehend aus Nervenendigungen von Massive Freisetzung von Neuro- (a-LaTx) «Latrodectus mactans einer Polypeptidkette neuromuskulären transmittoren aller Art. Am Bsp. [67, 79, 81, tredecimguttatus» MG = 130000 Synapsen sowohl der der Muskel-Endplatte: Starke Er- 108, 159] = Schwarze Witwe Vertebraten als der In- höhung der Frequenz der m.e.p.p., (Black Widow Spider) vertebraten. Daneben dann Verminderung bis auf 0. Zu auch Zellkulturen diesem Zeitpunkt Hemmung von evozierten e.p.p., wegen Entlee- rung der Vesikeln. Wirkungsmechanismus nicht sicher. Möglicherweise wirkt a-LaTx selber, nach Einbettung in der Membran, als Ionophor für Na und Ca. Ohne divalente Katio- nen keine Wirkung. LD5o Maus = 10 µg/kg Körperge- wicht

Black Widow Rohgiftstoff der Spinne Enthält als Toxin das a- idem idem. Schwächer als das gereinigte Spider Venom «Latrodectus m. LaTx, daneben noch an- Toxin. Enthält neben a-LaTx auch (BWSV) tredecimguttatus» deIe tox. Fraktionen noch andere toxische Substanzen, [78, 164, 179] = Black Widow Spider z. B. die Fraktion E, die ähnliche Wirkungen an der neuromuskulä- ren Synapse des Hummers hat.

Brown Widow Rohgiftstoff der Spinne idem idem. Schwächer als BWSV Spider Venom «Latrodectus m. (BrWSV) geometricus» [108] = Brown Widow Spider

Red Back Rohgiftstoff der Spinne idem idem. Schwächer als BWSV Spider Venom «Lactrodectus m. (RBSV) hasselti» [179] = Red Back SpideI Tabelle 3 Gruppe I: Präsynaptisch wirkende Neurotoxine Klasse 3: Schlangen-Neurotoxine Table 3 Group I: Presynaptic neurotoxins Class 3: Snake-neuIotoxines

Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-Stärke

ß-Bungarotoxin Im Gift der Schlange PIotein, bestehend aus Nervenendigungen an Komplexe Wirkung auf die Ner- ((3-BuTx) «Bungarus multicinctus» 2 Polypeptidketten, die der neuro-muskulären venendigungen [1-3, 6, 28, 29, 31, (Formosan banded durch eine S-S Brücke Synapse der Vertebra- Triphasischer Effekt: initiale 40, 42, 126, 128, krait). verbunden sind. ten. Hemmung sekundärer Verstär- 130, 131, 204] Familie der Elapidae, MG = 20000 ß-BuTx geht in vivo kung, tertiärer Block der ACh- UnteIfamilie der Kette A: MG = 13 500 nicht ins ZNS. Wenn in- Freisetzung. Elapinae mit 120 AS traventrikulär appli- Wirkungsmechanismus: Kette B: MG = 7000 ziert, auch im ZNS sehr a) rasche Blockierung der Freiset- mit 70 AS toxisch. zung von ACh, vermutlich Phospholipase A2-Akti- durch Bindung an die Mem- vität, lokalisiert in der bran deI Nervenendigungen längeren Kette b) sekundäre Verstärkung durch (AS-Sequenz weitge- Freisetzung von ACh und dann hend mit der von ande- graduelle Verminderung bis ren PhLp. homolog) zum totalen Block durch die PhLp-Aktivität des Toxins LDso Maus: 25 ug/kg Körper- gewicht EDso von a) in vitro (Frosch): 10-7M Trennung beider Ketten bringt den Verlust der speziflschen Neu- rotoxizität mit sich. N Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-Stärke 0

Crotoxin Im Gift der Schlange Protein, bestehend aus Cholinerge Nerven Hemmung der FIeisetzung von [21, 43, 188] «Crotalus durissus 2 Polypeptidketten, die -endigungen an deI. ACh. TriphasischeI Effekt. terr/icus» durch eine S-S Brücke neuromuskulären Die Toxizität des ganzen Toxins (Südamerikanische verbunden sind. Synapse. ist bedeutend grösser als diejenige Klapperschlange). Crotoxin A = Crotapo- deI beiden einzelnen Komponen- Familie deI Viperidae, tin, ein saures Polypep- ten. Unterfamilie der tid, Nach Rekombination beider Teile Crotalinae MG = 8000 mit 88 AS; wird die ursprüngliche Toxizität Crotoxin B, eine basi- wiedeI hergestellt. sche PhLp A2 Wirkungsmechanismus: vermut- MG = 14000 mit 140 AS lich ebenfalls einerseits «Spezifl- tät» für die Membran der Nerven- endigungen (Crotoxin B) und andererseits die PhLp-Aktivität (Cro- toxin A)

Taipoxin Im Gift der Schlange Protein, bestehend aus idem Hemmung der Freisetzung von [53, 145, «Oxyuranus scutellatus 3 Polypeptidketten, von In vivo keine Wirkung ACh. Triphasischer Effekt. 146, 147] scutellatus» denen 2 (a+ß) PhLp- im ZNS bewiesen Wirkungsmechanismus: wie bei (Australische Aktivität haben und die ß-BuTx «taipan snake»). dritte (y) ein saures Eines der stärksten Toxine dieser Familie der Elapidae, Glykoprotein ist. Klasse Unterfamilie der MG = 46 000: LD5o Maus: 2 ttg/kg Körper- Elapinae a = 18 000 mit 119 AS gewicht ß= 14000 mit 118 AS — 13 000 mit ? AS

Notexin Im Gift der Schlange Für beide Toxine: idem Hemmung der Freisetzung von Notechis II-5 «Notechis scutatus eine einzelne Polypep- ACh. TIiphasischer Effekt. [53, 90, 91, 94, scutatus» tidkette mit 119 AS und Wirkungsmechanismus: idem. 114, 140, 152, 192] (Australische 7 S-S Brücken Notexin ist toxischer als Notechis «tiger snake»). H-5 Familie deI Elapidae, Relativ schwache PhLp- LD5o Maus: 17 µg/kg Körper- Unterfamilie der Aktivität gewicht für Notexin Elapinae LDso Maus: 45 µg/kg Körper- gewicht für Notechis H-5 AusseI der neurotoxischen auch Ceruleotoxin Im Gift der Schlange Leicht basisches Protein Cholinerge Nerven Hemmung der Freisetzung von [22, 101, 133] «Bungarus fasciatus» mit einem isoelektri- -endigungen an der ACh. TriphasischeI Effekt. (früher irrtümlicherwei- schen Punkt von 7.4 neuromuskuläIen Wirkungsmechanismus: ähnlich se im Gift deI Schlange MG = ca. 26000 Synapse wie bei anderen bekannten prä- «B. caeruleus» Dimer, bestehend aus 2 synaptischen Toxinen, wie ß- vermutet). identischen UnteIein- BuTx, Taipoxin usw. Familie der Elapidae, heiten, die ein MG von LDso Maus: 30-70 ug/kg Körper- Unterfamilie der 13 000 haben. gewicht. Elapinae Markante PhLp-Aktivi- Daneben bei höheren Konzentra- tät tionen auch postsynaptische Ef- fekte, speziell bei postsynaptischen Membranen des ToIpedo, z. B. bei den cholinergischen lono- phoren. Myonecrotoxische Wirkungen

Textilotoxin Im Gift deI Schlange Protein, das in 4 Unter- idem Hemmung der Freisetzung von [92, 206] «Pseudonaja textilis» einheiten getrennt wer- ACh. Triphasischer Effekt. (Australian den kann. PhLp A2- Aktivität = ca. 1/4 derjeni- brown snake). MG des ganzen Toxin gen von ß-BuTx. Familie der Elapidae, ca. 8 000 Eines der toxischsten Neuro- Unterfamilie der PhLp A2-Aktivität toxine: Elapinae LDso Maus: 1 µg/kg Körper- gewicht

PhLp A2 Im Gift der Schlange Basische PhLp A2 mit idem, aber auch an an- Neurotoxische Effekte präsynap- (N. nigricollis) «Naja nigricollis» 119 AS und 7 S-S Brük- deren Phospholipid- tisch, daneben aber auch post- [51, 140] (black necked cobra). ken Membranen synaptisch, sowie cardiotoxische Familie der Elapidae, und myonecrotoxische Effekte. Unterfamilie der LDso Maus: 630 ug/kg KörpeI- Elapinae gewicht

PhLp A2 Im Gift der Schlange Saures Protein. idem Präsynaptische neurotoxische (N. naja atra) «Naja naja atra» Polypeptidkette mit 120 Effekte. [51, 213, 220] (Taiwan cobra or AS und 7 S-S Brücken WenigeI toxisch als die PhLp A2 Chinese cobra). aus dem Gift der N. nigricollis Familie der Elapidae, Unterfamilie der Elapinae N Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-Stärke N

PhLp A2 Im Gift deI Schlange Basische PhLp A2 Cholinerge Nerven Präsynaptische neurotoxische (Trim. mucr.) «Trimeresurus -endigungen an der Effekte. [102] mucrosquamatus» neuromuskulären Bei höheren Konzentrationen (Formosan habu). Synapse auch myonecrotoxische Effekte Familie der Viperidae, Unterfamilie deI Crotalidae

Fraction Cb Im Gift der Schlange Basische PIotein-Frak- idem Hemmung der Freisetzung von (Fr. Cb) «Pseudocerastes fieldi» tion, die in 2 Proteine ACh. TIiphasischer Effekt. [17, 212] (Field's horned getrennt werden kann: Cb I ist wenig toxisch, viper). Cb I und Cb II. Cb H mit PhLp Az-Aktivität ist Familie der Viperidae, MG für beide: ca. 16000 stärker toxisch als Cb I. Unterfamilie der Cb H hat PhLp Az-Akti- Eine bedeutend grössere Toxizität Viperinae vität zeigt sich bei Rekombination beider Fraktionen, die synergistisch (superadditiv ?) wirken. Keine postsynaptischen Effekte

Caudoxin Im Gift der Schlange Protein idem Hemmung der FIeisetzung von [142, 215] «Bitis caudalis» Einzel-Kette mit PhLp ACh. Triphasischer Effekt. (African horned Az-Aktivität LDso Maus: 180 (150-220) Kg/kg puff adder). MG = 13 322 Körpergewicht. Familie der Viperidae, Ausser der neurotoxischen auch Unterfamilie der myonecrotoxische Effekte Viperinae

Fraktion j Im Gift der Schlange Basische Proteine mit idem Triphasischer Effekt. Fraktion kt «Vipera ammodytes» PhLp Az-Aktivität. Hemmung der Freisetzung von Fraktion kz (long-nosed viper). Enzymatische Wirkung ACh. [210] Familie der Viperidae, in der Reihenfolge: Reihenfolge der Wirkungsstärke UnteIfamilie der ki>j=k2 an der neuro- muskulären Viperinae Synapse: j>kz>ki LDso Maus: 21 sg/kg KöIper- gewicht k^ 360 sg/kg Körper -gewichtj 580 µg/kg Körper- Mojave Toxin Im Gift der Schlange Protein, bestehend aus idem Hemmung der Freisetzung von [33, 100] «Crotalus scutulatus» 2 Polypeptidketten: eine ACh. Triphasischer Effekt. (North American Moja- basische PhLp Az und Wirkungsmechanismus: wie bei ve Iattle snake). ein saures Peptid anderen präsynaptisch wirkenden Familie der Viperidae, Neurotoxinen. Unterfamilie der Hemmeffekt von ß-BuTx poten- Crotalinae ziert, aber anscheinend nicht von Crotoxin. Möglicherweise gleiche Bindungs- stelle wie für Crotoxin, aber verschieden von der des ß-BuTx

Agkistrodotoxin Im Gift der Schlange Protein mit 121 AS und idem Effekte ähnlich denen des 13-BuTx. [221-222 ] «Agkistrodon halys 7 S-S Brücken Neben prä- auch gewisse post- (Pallas)» synaptische Effekte diskutiert. (Asiatische TIiphasischer Effekt. Schlange). Minimale Letaldosis Maus: Familie der Viperidae, 55-110 µg/kg Körpergewicht UnteIfamilie der Crotalinae

Fr. HI-3 Im Gift der Schlange Protein mit PhLp Az- idem Präsynaptisch toxische Effekte. PhLp A2 «Vipera Russelli» Aktivität Kein triphasischer Effekt nachge- (Vipera R.) (Russel's viper). MG = 15 000 wiesen. [106] Familie der Viperidae, Neuromuskulärer Hemmeffekt bei Unterfamilie der einer Konzentration von 3 µg/ml Viperinae LDso Maus: 2,l mg/kg Körper- gewicht. Neben neurotoxischen auch hä- matotoxische und myonecrotoxische Effekte

Crotamine-like Im Gift der Schlange Protein mit 43 Amino- idem Stimulierender Effekt auf ACh- Toxin «Crotalus horridus» säuren und wahrschein- Freisetzung sowohl bei Hühnern [143] (NoIth American lich 3 S-S Brücken (M. biventeI) als bei der Maus rattle snake). (Diaphragma). Familie deI Viperidae, Wirkungsmechanismus: noch Unterfamilie der nicht geklärt. Crotalinae Beim Huhn wahrscheinlich prä- synaptisc. Bei der Maus auch myonecrotoxischer Effekt Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-Stärke

Fraction IV Im Gift der Schlange PIoteine Cholinerge Nervenendi- Hemmung der FIeisetzung von Fraction III «Tropidechis carinatus» FI. IV: gungen an der neuro- ACh, sowohl der spontanen als (TIopidechis c.) (Australian MG = 10000 muskulären Synapse der evozierten. [168] rough-scaled snake). Fr. III: Neben präsynaptischen auch post- Familie der Elapidae, MG = 14 000-18 000 synaptische Effekte diskutiert. Unterfamilie der LD5o Maus Fr. IV: 20 jig/kg Kör- Elapinae pergewicht LD5o Maus Fr. HI: l,7 mg/kg Kör- pergewicht

Dendrotoxin Im Gift der Schlange Basisches Polypeptid idem; in vitro auch Verstärkung der Freisetzung von (DTx) «Dendroaspis mit 59 AS und 3 S-S Wirkungen im ZNS ACh an deI neuromuskuläIen [62, 95-97] angusticeps» Brücken. Synapse nach Reiz des Ne rvs. (Eastern gIeen mamba). MG = 6500 Wirkungsmechanismus: noch Familie der Elapidae, Strukturell verwandt nicht genau bekannt. Keine post- Unterfamilie der mit PIotease-Hemmer synaptische WiIkung. Elapinae Interaktion mit blockierenden prä- synaptischen Neurotoxinen wie I3-BuTx, Notexin und Crotoxin. Bindung an Stellen, die evtl. mit den Bindungsstellen dieser Toxine zu tun haben. Möglicherweise handelt es sich um eine neue Klasse von prä- synaptischen Toxinen

Toxin I Im Gift der Schlange Chemisch verwandt mit idem Verstärkung der Muskelzuckun- Toxin K «Dendroaspis polylepis DTx gen nach Nervenreizung. Keine [97] polylepis» postsynaptische Wirkung nachge- (black mamba). wiesen. Familie der Elapidae, Wirkungsmechanismus: wahr- Unterfamilie der scheinlich ähnlich dem des DTx Elapinae Tabelle 4 Gruppe I: Präsynaptisch wirkende Neurotoxine Klasse 4: Neurotoxine aus anderen TieIarten stammend Table 4: Group I: Presynaptic neurotoxins Class 4: Neurotoxins from other animal species

Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-StäIke

Pardaxin I Im Rohsekret des Lipophile Proteine mit Cholinerge Nerven Erhöhung deI Freisetzung von (PX I) Fisches einem MG von -endigungenneu an der Transmitter Quanta: sowohl der Pardaxin H «Pardachirus ca. 16 000-17 000 -romuskulären Synapse spontanen (Frequenz deI m.e.p.p.) (PX II) marmoratus» als auch der evozierten (quantal (Red Sea flatfish) content der e.p.p.) Pardachirus m. Ordnung der Pleuronec- PX I: einzelne Polypep- Daneben wahIschein- Später Entleerung deI Nerven- cIude venom tiformes, Familie der tidkette mit 162 AS. lich auch auf Membra- endigungen und Blockierung der (PMS) Soleidae (ca. 10-20% des PMS) nen der Muskelzellen Synapse. [166, 178, 201] PX H: einzelne Poly- Daneben myonecrotoxische peptidkette mit etwa Effekte. gleichem MG. Wirkungsmechanismus: wahr- (ca.8-10% scheinlich eine porenbildende des PMS) Eigenschaft der Toxine. PMS = RohsekIet, ent- Die neurotoxische Wirkung von hält ausser PX I und PX den SteIoidglykosiden noch nicht II auch andere toxische bekannt. Faktoren, z. B. Steroid- LD5o für Fische (Fundulus heteIo- glykoside. clitus) in Meerwasser: 30 ug/ml und g Körpergewicht EDso Frosch für PX I: 0,8 µg/m1 EDso Frosch für PX II: 10 sg/ml Toxin - Ursprung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-Stärke

Glycerotoxin Im Rohsekret der Gift- GIykoprotein mit einem Cholinerge Nerven Stimulierender Effekt auf die FIei- (GlTx) drüse des Ringelwurms MG von ca. 300000. -endigungen an der setzung des Neurotransmittors, so- Glycera convoluta «Glycera convoluta». Wahrscheinlich eine neuromuskulären wohl an der neuromuskulären venom Stamm der Annelida, einzelne Polypeptid- Synapse Synapse als an Synaptosomen. (GCV) Klasse der Plychaeta. kette Wirkungsmechanismus: noch [151, 167] 1 Giftdrüse enthält nicht genau geklärt, einige Ähn- ca. 10" Moleküle des lichkeiten mit der Wirkung von Neurotoxins a-LaTx sind vorhanden. GITx wird wahrscheinlich nicht in die Nervenendigung aufgenommen, sondern wiIkt direkt an der Membran. Vorbehandlung mit Concanavalin A hemmt die Bindung von GCV

Toxin fraction a Isoliert aus dem Noch unbekannt ideal fa: erhöht sehr stark die Frequenz (fa) Schwamm der spontanen m.e.p.p., veI- Toxin fraction 13 «Tedania ignis» mindert die Amplitude der (fß) Tedania ex- Stamm der Porifera evozierten e.p.p. tract [194] Daneben gibt es noch f3: hat keinen Effekt auf die Fre- viele andere nicht-neu- quenz der spontanen m.e.p.p., rotoxische Fraktionen vermindert die Amplitude der evozierten e.p.p. f13 antagonisiert den Effekt von a-LaTx

Midgut extract Gewonnen aus dem Noch unbekannt idem Stimulierender Effekt auf die evo- [59] Darm von Larven der zierte ACh- Freisetzung, Erhöhung «Vespa orientalis» der Amplitude von e.p.p. um (Oriental hornet). ca. 20-60%; anschliessend Ver- Ordnung der Hymenop- minderung der Amplitude. tera, Unterordnung der Schwache Toxizität: Aculeata, Familie der LD50 Maus: 300 mg/kg Kôrper- Vespidae gewicht Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 207

Gruppe H: Postsynaptisch wirkende Neurotoxine

Die Neurotoxine dieser Gruppe wirken an der postsynaptischen Seite der neuromuskulären Synapse. Sie werden eingeteilt in solche, die spezifisch auf den nAChR wirken (Klasse l) – entweder auf den Diskriminator oder auf den ICM – und solche, die auf die neuromuskuläre Synapse von Crustacea und Insekten wirken (Klasse 2). Klasse la, Neurotoxine mit spezifischer Wirkung auf den Diskriminator des nAChR. Diese Klasse enthält Neurotoxine, die eine stabilisierende neuromuskuläre Blockierung bewirken, indem sie sich spezifisch an den nAChR «sensu stricto» binden. Es handelt sich also um einen curaromimetischen Wirkungsmechanismus. Die wichtigsten Neurotoxine dieser Klasse sind im Giftstoff von Land- und Wasserschlangen der Familie der Elapidae, Unterfamilie der Elapinae, Hydrophiinae und Laticaudinae (A. Phelps, 1981) enthalten. Man kennt heute mehr als 60 solcher postsynaptisch wirkender Schlangen-Neu- rotoxine, und von mehr als 50 unter ihnen ist auch die Aminosäure-Sequenz weitgehend bekannt. Entsprechend ihrer chemischen Struktur werden diese Neurotoxine wie folgt unterteilt (C. Y. Lee, 1979; G. Habermehl, 1983): – «kurze» Neurotoxine, die 60-62 Aminosäurereste und 4 Disulfid-Brücken haben, mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 (Tabelle 5) – «lange» Neurotoxine, die 71-74 Aminosäurereste und 5 Disulfid-Brücken haben, mit einem Molekulargewicht von etwa 8000 (Tabelle 6) Die Bindung aller dieser Neurotoxine ist nicht kovalent, sondern basiert auf multiplen elek- trostatischen und hydrophobischen Interaktionen (C. Y. Lee, 1979). Die Bindung der «kurzen» Neurotoxine ist schwach reversibel, während die «langen» sich beinah irreversibel an den nAChR binden. Die Dissoziationskonstante für den nAChR-Neurotoxin-Komplex liegt je nach Toxin zwischen 1 nM und 20 pM (C. Y. Lee, 1979). Das a-Bungarotoxin (a-BuTx), ein «langes» Neurotoxin, wurde unter den Toxinen dieser Klasse zuerst entdeckt, am intensivsten untersucht und es ist dasjenige, das sich am stärksten «irreversibel» mit dem nAChR bindet. Mit Hilfe dieses Neurotoxins wurde die Dichte der nAChR an der Muskel-Endplatte bestimmt, und Untersuchungen zur Isolierung des Rezeptors durchgeführt. Das a-BuTx sei in der vorliegenden Arbeit als Beispiel für die ganze Gruppe aus- führlich besprochen (siehe Tabelle 7), während für alle anderen, die chemisch weitgehend ähn- lich sind und grundsätzlich den gleichen Wirkungsmechanismus haben, nur eine Aufzählung erfolgt. 208 Carlo G. Caratsch

Tabelle 5 «Kurze» Schlangen-Neurotoxine mit Wirkung auf den Diskriminator-Teil der postsynaptischen nAChR mit 60-62 Aminosäureresten und 4 Disulfidbrücken. MG = ca. 7000. Table 5 "Short" s nake neurotoxins acting on the discriminator-part of the postsynaptic nAChR, with 60-62 amino acids and 4 disulphide bridges. Mol. wt. = ca. 7000.

Familie der Elapidae:

Unterfamilie Schlange Neurotoxin

Elapinae Dendroaspis jamesonii kaimosae Toxin V;, 1 Dendroaspis polylepis polylepis Toxin-a, FS 2 Dendroaspis viridis Toxin 4.11.3 Hemachatus haemachatus Toxin-II Toxin-IV Naja haje annulifera a-toxin CM-14 CM-10 CM-12 Naja haje haje CM-2 CM-6 CM-10a Naja melanoleuca Toxin-d Naja mossambica in. Neurotoxin I Neurotoxin HI Naja naja atra Cobrotoxin oder a-atratoxin Naja naja oxiana a-toxin Naja nigricollis a-toxin Naja nivea a-toxin (3-toxin Hydrophiinae Enhydrina schistosa Toxin 4 Toxin 5 Hydrophis cyanocinctus Hydrophitoxin a Hydrophitoxin b Lapemis hardwickü Neurotoxin Pelamis platurus Pelamitoxin a Laticaudae Aipysurars laevis Toxin a Toxin b Toxin c Laticauda colubrina Laticotoxin a Laticauda laticaudata Laticotoxin a Laticotoxin b Laticauda senrifasciata Erabutoxin a Erabutoxin b Erabutoxin c Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 209

Tabelle 6 «Lange» Schlangen-Neurotoxine mit Wirkung auf den Diskriminator-Teil der postsynaptischen nAChR mit 71-74 Aminosäureresten und 5 Disulfidbrücken. MG = ca. 8000. Table 6 "Long" snake neurotoxins acting on the discriminator-part of the postsynaptic nAChR, with 71-74 amino acids and 5 disulphide bridges. Mol. wt. = ca. 8000.

Familie der Elapidae: Unterfamilie Schlange Neurotoxin

Elapinae Bungarus multicinctus a-bungarotoxin Dendroaspis jamesonii kaimosae Toxin VIN 1 Dendroaspis polylepis polylepis Toxin-y Toxin 8 Toxin VN2 Dendroaspis viridis Toxin I Toxin V Toxin 4.7.3. Toxin 4.9.3. Naja haje Toxin III Naja haje haje Toxin CM-5 Naja melanolauca Toxin b Toxin 3.9.4. Naja naja Toxin-A Toxin-B Toxin-C Naja naja naja Toxin 3 (Indien) Toxin 3 (Pakistan) Toxin 4 Naja naja oxiana Neurotoxin I Naja naja siamensis Toxin 3 Naja nivea Toxin a Notechis scutatus scutatus Toxin 1H-4 Ophiophagus hannah Toxin a Toxin b Laticaudae Laticauda semifasciata 1 Toxin Ls HI

' Eine Sonderstellung in dleser Gruppe nimmt das Toxin Ls III der Schlange Laticauda semifasciata ein, das, obwohl zu den «langen» Neurotoxinen gezählt, nur 66 Aminosäurereste hat. Tabelle 7 Gruppe II: Postsynaptisch wirkende Neurotoxine Klasse la: NeuIotoxine mit Wirkung auf den DiskriminatoI -Teil des postsynaptischen nAChR Table 7 Group II: Postsynaptic neurotoxins Class la: Neurotoxin acting on the discriminator-part of the postsynaptic nAChR

Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. WirkungsoIt Wirkungs-Mechanismus/-Stärke a-Bungarotoxin Im Gift der Schlange Basisches Polypeptid Periphere nikotinisch- Irreversible Bindung am Diskrimi- (a-BuTx) «Bungarus multicinctus» mit 74 AS und 5 S-S cholinerge neuIo- natoI des nAChR (d.h. am nAChR [42, 48, 139, (Formosan banded BIücken muskuläre Synapse: «sensu stricto») deI postsynapti- 140, 158] krait). MG = 8000 Muskelendplatten und schen Membran. Familie der Elapidae, – in vitro – Synapsen Wirkungsmechanismus: durch die Unterfamilie der der elektrischen Organe sehr spezifische Blockierung des Elapinae von elektrischen nAChR wird die Wirkung des phy- Fischen (Torpedo und siologischen Agonisten ACh oder Electrophorus) von anderen Agonisten vollständig gehemmt und die neuIomuskuläre Übertragung unterbrochen. Kompetitive Bindungseigenschaf- ten mit reversiblen Blockern des Curare-Typs und mit anderen Neurotoxinen dieser Klasse. LD5o Maus: 300 sg/kg Körper- gewicht

Andere Neurotoxine dieser Klasse, die nicht von Schlangen stammen:

Conotoxine Im Gift der Meeres- Peptide: AS MG Periphere nikotinisch- Alle drei sind Blocker des nAChR. (GI, GIA, GH) Schnecke GI: 13 1700 cholinerge neuro- Für alle dIei Toxine: [82, 200] «Conus geographus» GIA: 15 1900 muskuläre Synapse 8 µg/ml: reduzie rt die e. p. p. und (Geography cone, flsh- GH: 13 1600 hebt m. e. p. p. auf. hunting marine snail Alle drei Toxine haben 25 µg/ml: hebt m. e. p. p. und from the central Indo- 2 S-S Brücken e. p. p. auf. Paciflc). Ordnung der Kein Effekt auf neuronale und Monotocardia, Unter- Muskel-a. p. ordnung der Toxoglos- Conotoxine hemmen reversibel sa, Familie der Conidae die Bindung von 125I-a-BuTx Nereistoxin Im Gift des Glieder- 4-N,N-dimethylamino- Periphere nikotinisch- Neurotoxischer Effekt am (NTX) [68] wurms l,2-dithiolane cholinerge neuro- nAChR. «Lumbriconereis hetero C5H5NS2 muskuläre Synapse NTX ist ein reversibler partieller -poda» MG = 149,3 Agonist. (marine segmented Zu Beginn leichte Depolarisation, worm). dann Blockierung des AChR-Dis- Stamm der Annelida, kriminators. NTX hemmt die Bin- Klasse der Polycheta, dung von 3 H-ACh und 125 I-a- Ordnung der Errantia BuTx, nicht aber die des 3 H-Per- hydrohistrionicotoxin, ein AChR- ICM-BlockeI

Lophotoxin im Gift des Koralls Cyclisches DiteIpen idem Blocker des nikotinischen AChR. (LTX) «Lophogorgia rigida» C22H24O8 LTX in einer Konzentration von [13, 55, 56 und MG = 416,4 2-25 µM hemmt irreversibel 73, 200] «Lophogorgia chelen- m. e. p. p. und e. p. p. sis». Bindungsstelle des LTX wahr- Stamm der Cnidaria, scheinlich getrennt von der des Klasse der Anthozoa ACh. LDso Maus: 8 mg/kg Körper- gewicht. Blockierung der e. p. p. und m. e. p. p.: 2-25 µM Tabelle 8 Gruppe II: Postsynaptisch wirkende NeuIotoxine Klasse lb: Neurotoxine mit WiIkung auf den Ionen-Kanal- Modulator des nAChR Table 8 Group H: Postsynaptic neurotoxins Class lb: Neurotoxins acting on the ionic channel modulator (ICM) of the nAChR

Toxin UrspIung Chemie/Mol.-G. WiIkungsort Wirkungs-Mechanismus/-Stärke

Histrionicotoxin Gewonnen aus den Spiropiperidin-Alkaloid Periphere nikotinische Reversible Blockierung der Ionen- (HTx) Hautdrüsen des C19H25NO cholineIge Synapse: Kanäle, die mit dem nAChR ver- [8, 169, 202] Frosches MG = 283 Muskelendplatte und – bunden sind. Dadurch werden die «Dendrobates in vitro – Synapse deI Endplatten und die Synapsen der histrionicus» elektrischen Organe von elektrischen Organe blockiert : Familie der Ranidae, elektrischen Fischen «curaromimetische» Wirkung. Gattung der Dendro- (Torpedo und Electro- Daneben auch partielle Hemmung batidae phorus) deI spannungssensiblen Na- Kanäle und der K-Kanäle. Wirkungsmechanismus: Vermin- derung der e. p. c. bis zum Block, ohne Verhinderung der Bindung von cholinergen Agonisten oder Antagonisten. Andere I. C. M.- Liganden dagegen hemmen die Bindung von HTx. Dissoziationskonstante für Elec- troplaques: 100-400 nM. EDso e. p. c. Frosch Sartorius: 10 uM

PerhydIo- Semisynthetisches Ci9H37NO idem idem Histrionicotoxin Derivat MG = 295 (H12-HTx) [7, 69]

Pumiliotoxin-C Gewonnen aus den 5-pIopyl-2-propyl-cis- idem Reversible Hemmung der Ionen- (PTX-C11) Hautdrüsen des decahydro-quinolin Kanäle, die mit dem nAChR [218] FIosches C15H29N verbunden sind, ähnlich wie «Dendrobates pumilio». MG = 283 beim HTx. Schwächer in der Familie der Ranidae, Wirkung. Gattung der Dendro- Verhindert kompetitiv die Bin- batidae dung von HTx. Minimal Letaldosis Maus: 20 mQ/ku Knmeruewicht Tabelle 9 Gruppe II: Postsynaptisch wirkende Neurotoxine Klasse 2: Neurotoxine mit Wirkung auf die neuromuskuläre Synapse von Crustacea und Insekten Table 9 GIoup II: Postsynaptic neurotoxins Class 2: Neurotoxins acting on the neuromuscular junction of crustaceans and insects

Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-StäIke

JoIo spider Im Gift der Spinne Chemische Natur noch Neuromuskuläre JSTX vermindert spezifisch die toxin (JSTX) «Nephila clavata» unklar. Synapse des HummeIs e. p. s. p. deI neuromuskulären [4, 124] (Joro spider). MG = _-1000 (experimentell unter- Synapse des Hummers. Stamm deI Arthropoda, (ca. 500) sucht an Palinurus Kein Effekt auf die i. p. s. p. Klasse deI AIachnida, japonicus) Somit scheint es ein speziflscheI Ordnung der Araneae Antagonist des glutaminergischen Rezeptors zu sein. Hohe Spezifizität: ED5o füI die Verminderung deI glutamineIgi- schen e. p. s. p.: 10-9 bis 10-8 M. Bei hohen Konzentrationen Effekt irreversibel. Kein Effekt auf cholinergische Synapsen

ExtIact from the Im Gift der Spinne Chemische NatuI noch idem Dieser Giftextrakt hat eine ähn- venom of Ara- «Araneus ventricosus» unklar liche Wirkung wie das JSTX. neus ventr. idem Effekt irreversibel [125]

5-Philantho- Im Gift der Wespe Chemische Natur noch Neuromuskuläre 8-PTX, wie auch ] -PTX und y- toxin «Philanthus triangulum» unklar Synapse von Insekten PTX, hat hemmende postsynapti- (S-PTX) (bee wolf solitary wasp). sche Wirkungen an der neuromus- [49, 154] Ordnung der Hymen- kulären Synapse. optera, Unterordnung Wirkungsmechanismus: S-PTX der Aculeata, Familie hemmt postsynaptisch den Gluta- der Vespidae mat-Rezeptor. 6-PTX hemmt auch die Aufnahme von Glutamat in den präsynapti- schen Nervenendigungen t) Toxin UrspIung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-Stärke

Fraction E Im Gift der Hornisse Chemische Natur und Neuromuskuläre VTX-E hemmt reversibel sowohl toxin «Vespa MG noch unklar Synapse des Hummers die e. p. s. p. wie die i. p. s. p. (VTX-E) mandariana» (experimentell unter- Daneben kommt es zur Hyper- [123] Ordnung der Hymen- sucht an Palinurus polarisation der postsynaptischen optera, Unterordnung japonicus) Membran und zu einer Erhöhung der Aculeata, Familie der Membran-Leitfähigkeit, wahr- deI Vespidae scheinlich wegen einer Erhöhung der Permeabilität für Cl-Ionen. Der Effekt von VTX-E hat Ähn- lichkeit mit dem der GABA an der neuro-muskulären Synapse von Crustacea

Tabelle 10 Gruppe IH: Neurotoxine mit Wirkung auf Natrium-Kanäle Klasse l: Neurotoxine, die Natrium-Kanäle blockieren. Wasserlösliche heterozyklische Substanzen mit .Guanidinium-Teilen Table 10 Group HI: NeuIotoxins acting on the sodium channel Class l: Neurotoxins blocking the sodium channel. Hydrophilic heterocyclic substances with guanidine rests

Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-Stärke

TetIodotoxin In den Gonaden, Leber SummenfoImel: Ubiquitär an der Mem- Hemmung der Erregbarkeit der (TTX) und Eingeweiden von CI1H17N3O8 bran erregbarer Zellen Membran. [11, 36, 99, 115, Fischen der Familie der Strukturformel bekannt (vor allem an Nerven Wirkungsmechanismus: Blockie- 171, 184, 193] «Tetraodontidae» MG = 319,28 und Muskelzellen) rung der Aktivierung der span- (Pufferfische, Kugel- nungssensiblen Na-Kanäle. Na- fische), trium kann nicht mehr in die Zelle «Diodontidae» einströmen, und dadurch kann die (Igelfische), und Membran nicht mehr depolarisiert «Molidae» (Sonnen- werden. fische). TTX bindet sich reveIsibel an Speziell im japanischen einem spezifischen Rezeptor, der Kugelfisch sich von dem der Lokalanästhetica «Spheroides rubripes» unterscheidet. (= fugu fish) Hochtoxisch: LD5o Maus: 10 ug/kg Körper- gewicht. Saxitoxin produziert von Dinofla- Summenformel: idem Hemmung der Erregbarkeit der (STX) gellaten der Gattungen CIOH17N7O4 Membran. [36, 99, 115, «Gonyaulax Strukturformel bekannt Wirkungsmechanismus: wie bei 116,184] catenella» und MG = 229,30 TTX. «Gonyaulax STX bindet sich an den gleichen tamarensis». Rezeptor wie TTX. Diese werden von ver- Hochtoxisch: schiedenen Muscheln, LDso Maus: 10 µg/kg Körper- z. B. von gewicht «Saxidomus giganteus» (= butter clam) oder von «Mytilus edulis» (blue mussel = Mies- muschel) als Nahrung verwendet

Gonyautoxin PIoduzieIt von Dinofla- Summenformel: Wie bei TTX und STX Hemmung der Erregbarkeit deI (GoTx) gellaten der Gattungen CioHi8N7Os Membran. [89, 117, 118] «Protogonyaulax spp.». Strukturformel bekannt Wirkungsmechanismus: wie bei Diese werden von ver- MG = 316,2 TTX und STX. schiedenen Muscheln Toxizität: wahrscheinlich auch als Nahrung verwendet sehI toxisch

TTX-like Gewonnen aus der Xan- Chemische Struktur idem «TTX-like substance» ist im Gift- substance thid-Krabbe noch nicht genau ge- stoff neben grösseren Mengen von [172] «Altergatis floridus». klärt STX und GTX enthalten. UrspIung wahrschein- Wirkungsmechanismus: wie bei lich auch aus der Nah- TTX und STX rungskette

TTX-like com- In den Giftdrüsen und Chemische Struktur idem Wirkungsmechanismus: wie bei pound Eiern von dem Kraken noch nicht genau TTX und STX. [195] «Hapalochlaena gekläIt. Evtl. identisch Toxizität: etwas kleiner als bei maculosa» mit TTX? TTX (blue-ringed octopus) Tabelle 11 Gruppe III: Neurotoxine mit Wirkung auf Natrium -Kanäle Klasse 2: Neurotoxine, die die Aktivierung und die Inaktivierung der NatIium-Kanäle beeinflussen Table 11 Group III: NeuIotoxins acting on the sodium channel Class 2: Neurotoxins affecting both the activation and inactivation of the sodium channel

Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-Stärke

Batrachotoxin Gewonnen aus den SteIoid-Alkaloid Ubiquitär an der Mem- Erhöhung, dann Hemmung der (BTX) Hautdrüsen der Farb- Summenformel: bran eIregbaIer Zellen Erregbarkeit der Membran. [37, 39, 58, frösche C31 H42N206 (vor allem an Nerven- Wirkungsmechanismus: Verschie- 132, 169, 211] «Phyllobates Strukturformel bekannt und Muskelzellen) bung der Spannungsabhängigkeit aurotaenia» und MG = 538,69 der AktivieIung und Hemmung «Phyllobates der Inaktivierung der spannungs- terribilis». sensiblen Na-Kanäle. Dadurch Familie der Ranidae, kommt es zu einer Erhöhung der Gattung der Dendroba- Permeabilität der Membran für tidae Na-Ionen und zu einer Depolari- sation. IIreversible Bindung an einer anderen Bindungsstelle als die der Toxine der Klasse l. Diese WiIkung wird von TTX und STX aufgehoben. LDso Maus: 2 ug/kg Körper- gewicht. EDso in vitro: 0,7 uM

Batrachotoxinin idem ähnliche Formel idem idem. Etwas wenigeI toxisch. A (BTX-A) [39] Homobatrocho- idem ähnliche Formel idem idem. Etwas weniger toxisch. toxin (Homo-BTX) [169]

Grayanotoxin Gewonnen aus den Heterocyclische Diter- idem Erhöhung, dann Hemmung der (GTX) Blättern verschiedener penoide. Erregbarkeit der Membran. Mehrere Typen Pflanzen der Familie Als Beispiel das GTX I: Wirkungsmechanismus: GTX I, GTX IH, ein Teil der Kanäle aktiviert wird. a-2H-GTX H [35, 37, 170]

Veratridin Gewonnen aus dem Steroid-Alkaloid idem Erhöhung, dann Hemmung der [34-37, 183] Rhizom des Summenformel: ErIegbarkeit der Membran. «Veratrum album L.» C36H51 NO51 Wirkungsmechanismus: wie bei und vom Samen des Strukturformel bekannt BTX. «Schoenocaulon offici- MG = 673,81 Weniger toxisch als BTX. nale» LD5O Maus: l,35 mg/kg Körper- Familie der Liliaceae gewicht ED50 in vitro: 2,9 xl0- 5 M, wobei nur ein Teil der Kanäle aktiviert wird.

Aconitin Gewonnen aus Alkaloid idem Erhöhung, dann Hemmung der [34-37] «Aconitum napellus L.» Summenformel: Erregbarkeit der Membran. und anderen Aconiten. C34H47NO11 Wirkungsmechanismus: Familie der Ranuncula- Strukturformel bekannt wei bei BTX. ceae MG = 645,72 Weniger toxisch als BTX. LD5o Maus: 0,33 mg/kg Kôrper- gewicht. ED5o in vitro: 3,6xl0-6 M, wobei nur ein Teil der Kanäle aktivie rt wird.

Brevetoxin Gewonnen aus dem Summenformel idem (?) EIhöhung, dann Hemmung der (Tl7, T34) Dinoflagellat C50H76O14 Erregbarkeit der Membran. [14, 15] «Ptychodiscus brevis» Strukurformel bekannt Wirkungsmechanismus: EIhöhung (Florida red tide MG = 895,l der PeImeabilität der Membran organism) für Na-Ionen. Dadurch Depolari -sation der Membran. Genauer Mechanismus noch nicht gesichert, evtl. ähnlich dem des BTX. Wirkung der Toxine von TTX antagonisiert. 117 ist toxischer als T34. ED5o in vitro (neuromuskulärer Block): ca. 5 nM (0,l-7 nM) Tabelle 12 Gruppe IH: Neurotoxine mit Wirkung auf Natrium-Kanäle Klasse 3: Neurotoxine, die die Inaktivierung der Natrium-Kanäle hemmen Table 12 Group III: Neurotoxins acting on the sodium channel Class 3: Neurotoxins inhibiting the inactivation of the sodium channel

Toxin Ursprung Chemie/Mol.-G. WirkungsoIt Wirkungs-Mechanismus/-StäIke

Skorpiontoxine Im Gift folgendeI Alle diese Toxine sind Ubiquitär an deI Mem- Beeinflussung der Erregbarkeit [Ubersicht: Skorpione der Familien einzelne Polypeptidket- bran erregbarer Zellen dieser Zellen. An der neuromusku- 38, 186] der Buthidae, Scorpio- ten mit je 4 Disulfid- (voI allem an Nerven- lären Synapse anfänglich Induk- nidae und Tityinae: brücken. und Muskelzellen) tion von repetitiven ap. An isolier- AaH-toxin I «Androctonus MG für alle ca. = 7000 ten Axonen bewiIken sie eine Aah-toxin I' australis Hector» DepolaIisation. AaH-toxin I" Wirkungsmechanismus: Hem- AaH-toxin II mung deI Inaktivierung der Na- AaH-toxin IH Kanäle. Diese Toxine binden sich [156] an einen anderen Rezeptor als die Toxine der Klasse 2. Sie verstär- ken wesentlich die Wirkung der Amm-toxin HI «Androctonus Toxine dieser Klasse. Amm-toxin V mauretanicus Ihre Wirkung wird von TTX auf- Amm-toxin VI mauretanicus» gehoben. Bop-toxin I «Buthus Von allen diesen Toxinen ist AaH- Bop-toxin HI occitanus paris» toxin H das am stärksten toxische: Bot-toxin I «Buthus LDso Maus: 10 ug/kg Körper- Bot-toxin H occitanus gewicht Bot-toxin IH tutenatus» Bot-toxin VIII Bot-toxin IX [83, 155] CsE-toxin I «Centruroides sculpturatus Ewing» Css-toxin I «Centruroides Css-toxin II suffusus [111, 112] suffusus» Lqq-toxin IH «Leiurus Lqq-toxin IV quinquestriatus Lqq-toxin V quinquestriatus» Ts-toxin «Tityus (Tityustoxin) serrulatus» Skorpiontoxine mit spezifischer Wirkung auf Insekten Skorpiontoxine: Im Gift folgender Chemische Struktur Wahrscheinlich an der Paralytischer Effekt auf Insekten. [Ubersicht: 186] SkoIpione deI Familie noch bei vielen nicht ge- Membran erIegbarer Wirkungsmechanismus: noch deI Buthidae und nau geklärt Zellen nicht genau geklärt. Wahrschein- ScoIpionidae: lich ein ähnlicher wie bei den To- AaH-toxin IT «Androctonus xinen, die für Säugetiere spezifisch australis Hector sind. Amm-toxin P2 «Androctonus Depolarisierende Wirkung auf mauretanicus motorische Nerven, die zu musku- mauretanicus» lären Erregungen und evtl. zu sek. Be-toxin IT «Buthus epeus» Lähmung führen. CsE-toxin vl «Centruroides CsE-toxin v2 sculpturatus CsE-toxin v3 Ewing» Bj-toxin IT-I «Buthotus judaicus» Proteine IT-H ca. 36x toxischer als IT-I Bj-toxin IT-H IT-I [223] MG: 7532, 67 AS IT-H MG: 7894, 69 AS Smp-toxin ITl «Scorpio maurus Polypeptide Beim Scorpio maurus palmatus Smp-toxin IT2 palmatus» IT1: MG: 3232 wurden auch Toxine mit spez. [136, 138] IT2: MG: 3963 Wirkung auf Crustacea gefunden.

Seeanemonen-Toxine Seeanemonen- Im Gift, das in den Einzelne basische Ubiquitär an der Mem- Wirkung an neuronalen Membra- Toxine Nematocysten (spe- Polypeptidketten bran erregbarer Zellen nen, voI allem an der von Crusta- [Ubersicht: ziellen Stechorga- MG für alle ca. cea. Die Wirkung ist p rinzipiell 38, 76, 180] nellen) verschie- = 4000-6000 ähnlich der von Skorpiontoxinen. dener Seeanemonen Wirkungsmechanismus: Hem- (Coelenterata) mung der Inaktivierung der Na- enthalten ist. Kanäle. Stamm deI Cnidaria, Die Seeanemonen-Toxine binden Klasse der Athozoa: sich an den gleichen Rezeptor wie ATX I «Anemonia sulcata» MG = 4802, 46 AS die Skorpiontoxine. Die Bindung ATX H «Anemonia sulcata» MG = 4935, 47 AS ist irreversibel, in Abwesenheit ATX HI «Anemonia sulcata» MG = 2932, 27 AS von TTX. [19, 41, 71, Die Wirkung wird von TTX anta- 181] gonisiert.

_,.x.-. Ursprung Chemie/Mol.-G. Wirkungsort Wirkungs-Mechanismus/-Stärke

«Anthopleura MG=5183,49AS Die Toxizität ist allgemein stärker xanthogrammatica» MG = 4590 für Crustacea als füI Vertebraten. «Anthopleura MG = 4875 ED5o von ATX II für Froschnerv elegantissima» (RanvieI'sche Schnürringe): CflX L «Condylactis 5-10 u.M. CTX aurantiaca» ED5o von ATX H füI : 10-100 nM CTX aurantiaca» ED5o von CTX für : 250 nM gigantea» LD>o von CTX für Crustacea: ca. 5 ug/kg Körpergewicht

Schlangen-Toxine Crotami... Im Gift der Schlange Basisches Polypeptid Wirkung an der Mem- Partielle Depolarisation der ]47, 103, 175] «Crotalus durissus mit 42 AS und 3 S-S bran erregbarer Zellen, Muskelzellen mit spontanen terrif cus» Brücken speziflsch für Säugetier- repetitiven a.p. (South American rattle- MG = ca. 5000 Skelettmuskeln, kaum Wirkungsmechanismus: Hem- snake) aber an Nerven, Herz mung der Inaktivierung der Na- Familie der Viperidae, oder glatten Muskeln Kanäle. Dadurch kommt es zu Unterfamilie der Crota- einer Erhöhung der Permeabilität linae der Membran für Na-Ionen und zu einer schwachen Depolarisa- tion (ca. um 35%). Die Bindung des Crotamins ist irreversibel. Crotamin verstäIkt ebenfalls die Wirkung von Neurotoxinen der Klasse 2 und hat einen von diesen sich unteIscheidenden RezeptoI. Möglicherweise bindet es sich an den gleichen Rezeptor wie die anderen Neurotoxine der Klasse 3. ED5o Ratten-Diaphragma: 0,2-0,5 ug/m1 fine besondere Stellung unter den NeuIotoxinen mit Wirkung auf Ionen-Kanäle nimmt das Pumiliotoxin-B ein. Trotz einer gewissen Wir- kung auf Calcium-Bewegungen in den Nervenzellen ist es kein eigentliches Neurotoxin. Es sei hieI trotzdem wegen seines einzigaItigen Effekts auf die Calcium-Kanäle erwähnt uxin-B Gewonnen aus den Indolizidin-Alkaloid Sarkoplasmatisches Reversible Potenzierung von Hautdrüsen des Fro- Summenformel: Reticulum von Muskel- direkt und indirekt ausgelösten ]6.9] sches C19H33NO3 fasern Kontraktionen an HeIz- und «Dendrobates pumilio» MG = 323,26 Muskelfasern. Familie der Ranidae, Wirkungsmechanismus: Beeinflus- Gattung der Dendroba- sung der Calcium-Kanäle und tidae Calcium-Pumpen an der Mem- bran des sarkoplasmatischen Reti- culums. Die Calcium-Freisetzung aus dem Ret. wird eIleichtert und die Zurückbeförderung durch die Pumpen verzögert. Daneben auch Beeinflussung der Calcium-Bewegung in Nerven- zellen. LD5o Maus: ca. 1 kg/kg Körper- gewicht 222 Carlo G. Caratsch

2 Untersuchungen über den Wirkungsmechanismus von 13-Bungarotoxin

2.1 Präsynaptisch wirkende Neurotoxine als Forschungsinstrumente Präsynaptisch wirkende Neurotoxine sind sehr nützliche Instrumente für die Untersuchung der Phänomene, die zur Freisetzung von Neurotransmittoren führen. Sie rufen unterschiedliche, zum Teil sehr starke Wirkungen hervor. So bewirkt z. B. der Giftstoff der Spinne «Schwarze Witwe» (Black Widow Spi- der Venom) oder sein gereinigtes Toxin a-Latrotoxin eine massive Erhöhung der Frequenz der spontan auftretenden m.e.p.p., auf die später eine BloCkie- rung der synaptischen Übertragung folgt (A. Gorio und A. Mauro, 1979; S. Misler und W. P. Hurlbut, 1979; A. Grasso, S. Alemä, S. Rufini und M.I. Senni, 1980; L. G. Magazanik, T. I. Slavnona, S.I. Salikhov und A. S. Sadyk- hov, 1982). Dieses Phänomen basiert hauptsächlich auf der Eigenschaft des Toxins, nach spezifischer «Erkennung» der Nervenendigung und Einbettung in deren Membran als Ionophor zu wirken. Dadurch wird der Einstrom verschiedener Ionen, u. a. der von Calcium-Ionen, in die präsynaptische Nerven- endigung deutlich erhöht. Als Folge dieser Erhöhung von [Ca++] nimmt die Frequenz der m.e.p.p. stark zu. Unter den Neurotoxinen, die in erster Linie die Freisetzung von Neuro- transmittoren hemmen, bieten sich die Bakterien-Toxine Botulinum-Toxin und Tetanus-Toxin an. Der Wirkungsmechanismus beider Toxine dürfte verwandt sein. Von speziellem Interesse für die Erforschung der Freisetzungsme- chanismen ist hier das Botulinum-Toxin, das zu den giftigsten Substanzen überhaupt gehört und spezifisch auf die periphere cholinerge neuromuskuläre Synapse wirkt (L. L. Simpson, 1973 ; C. Lamanna, 1976; H. Lundh, 1978; L. C. Sellin, 1981, 1985; V. Dolezal, F. Vyskocil und S. Tucek, 1983). Der genaue Wirkungsmechanismus dieses Toxins ist noch nicht aufgeklärt, beruht aber wahrscheinlich auf einer verminderten Empfindlichkeit des Freisetzungsme- chanismus für Calcium-Ionen innerhalb der Nervenendigungen, ohne dass der Einstrom von Calcium gehemmt wäre. Eine andere Gruppe von präsynaptisch wirkenden Neurotoxinen, die für die Untersuchungen zum Freisetzungsmechanismus wertvoll ist, ist die der Schlangen-Toxine. Unter ihnen wirkt eine ganze Reihe (siehe 5.199-206) sehr spezifisCh auf die nikotinisch-cholinerge neuromuskuläre Synapse. Einige davon zeichnen siCh durch eine hohe Toxizität aus. So hat z. B. Taipoxin, ein Toxin gewonnen aus dem Giftstoff der australischen Schlange Oxyuranus scutellatus scutellatus (taipan), für die Maus eine LDso von 2µg/kg Körperge- wiCht (J. Fohlmann, D. Eaker, E. Karlsson und S. Thesleff, 1976). Sie ist um einen Faktor von 10-100mal kleiner als diejenige anderer bekannter präsynap- tisch wirkender Schlangen-Neurotoxine, wie z. B. Crotoxin, Notexin, 3-Bun- garotoxin, Dendrotoxin. Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 223

2.2 ß-Bungarotoxin als spezifisches Instrument Unter allen diesen Schlangen-Neurotoxinen nimmt ß-Bungarotoxin (ß-BuTx) eine besondere Stellung ein, da es zuerst entdeckt und analysiert wurde (C. C. Chang und C. Y. Lee, 1963) und wohl heute am besten bekannt ist. ß-BuTx ist im Giftstoff der Schlange Bungarus multicinctus (Formosan many-banded krait) enthalten, die zu der Familie der Elapidae gehört und im südlichen China und in Taiwan beheimatet ist. Schon die ersten Untersuchungen haben gezeigt, dass der Giftstoff dieser Schlange mehr als eine Fraktion mit neurotoxischen Effekten enthält. C.C. Chang und C. Y. Lee (1963) konnten nachwei- sen, dass neben einer starken curaromimetischen Wirkung durch das bekannte a-Bungarotoxin – den Prototyp der Klasse postsynaptisch wirkender Neurotoxine – auch präsynaptisch wirkende Komponenten vorhanden sein müssen. Durch bioChemische Trennung des Giftstoffes in einzelne Fraktionen konnte das für die präsynaptische Wirkung verantwortliche Toxin, das ß BuTx, isoliert und seine spezifischen Wirkungen an der motorischen End- platte studiert werden (C.C. Chang, T. F. Chen und C.Y. Lee, 1973; R.B. Kelly und F. R. Brown, 1974). Wie auch bei anderen präsynaptisch wirkenden Schlangen-Neurotoxinen wurde früh erkannt, dass die neuromuskulär blok- kierende Wirkung des ß-BuTx mit seiner enzymatischen Phospholipase-Akti- vität assoziiert ist (T. Abe, A. R. LimbriCk und R. Miledi, 1976; P.N. Strong, J. Goerke, S. G. Oberg und R. B. Kelly, 1976).

2.2.1 Analyse der Wirkung von ß-BuTx an der Muskel-Endplatte Eine genauere Untersuchung des Einflusses von ß-BuTx auf die Muskel-End- platte zeigte, dass es sich um eine komplexe Wirkung handelt. Einerseits hängt diese Wirkung von der enzymatischen Aktivität der Phospholipase (PhLp) A2 ab, die ein Bestandteil des Toxins ist (T. Abe, S. Alemä und R. Mi- ledi, 1977 b; C.C. Chang, M.J. Su, C.Y. Lee und D. Eaker, 1977 a; B.D. Ho- ward und R. Truog, 1977; B. D. Howard und C. B. Gundersen, 1980). Durch diese Aktivität kann ß-BuTx den Abbau der Phospholipide der Membran der Nervenendigungen bewirken. Diese partielle Zerstörung der Membran führt zu einer stark erhöhten Freisetzung von ACh, die sich in einer erhöhten Fre- quenz der spontan auftretenden m.e.p.p., charakterisiert durch anfallsweise Ausschüttungen von Quanten (bursts), ausdrückt. Anschliessend nimmt die Frequenz langsam ab, bis die spontane AussChüttung von ACh zuletzt ganz unterbleibt. Die evozierte ACh-Freisetzung nimmt ebenfalls ab, und die neu- romuskuläre Übertragung ist «blockiert». Dieser «Angriff» auf die Membran der Nervenendigungen kann mikro- anatomisch nachgewiesen werden. Ist die gewählte Konzentration des Toxins genügend hoch (100 sg/ml) und die Wirkungszeit genügend lang (eine bis mehrere Stunden), so kann eine echte «Denervierung» der Muskel-Endplatte erfolgen. Die elektronen-mikroskopischen Bilder zeigen dann, dass die Ner- venendigungen, als Folge der Wirkung dieser hohen Konzentration von ß- 224 Carlo G. Caratsch

BuTx, stark reduziert und desintegriert sind und teilweise von den Schwann'schen Zellen phagozytiert werden (T. Abe et al., 1976). Unter Um- ständen verschwindet die Nervenendigung sogar vollständig, und die Schwann'sche Zelle nimmt direkten Kontakt mit der postsynaptischen Mem- bran der Muskelzelle auf. Ausser diesem Effekt wurde aber auch schon frühzeitig die Existenz eines zweiten Effektes erkannt, der unabhängig von der relativ unspezifischen PhLp Az-Aktivität des Toxins ist. Wird diese enzymatisChe Aktivität unterbunden, so bewirkt 11-BuTx trotzdem eine Hemmung der ACh-Freisetzung (T. Abe et al., 1977 a; C.C. Chang, C.Y. Lee, D. Eaker und J. Fohlmann, 1977 b; T. Abe und R. Miledi, 1978; C. G. Caratsch, B. Maranda, R. Miledi und P. N. Strong, 1979 a). Dieser Effekt tritt sehr frühzeitig und rasch ein, ist PhLp-unabhängig und hat wahrscheinlich mit der Affinität des Toxins zu der Membran der Ner- venendigungen zu tun. Diese hohe Affinität ist letzten Endes für die Spezifizi- tät der Gesamtwirkung verantwortlich.

2.2.2 Chemische Struktur von ß-Bungarotoxin Aus dem Rohgift der Schlange Bungarus multicinctus können vier präsynap- tisch wirksame neurotoxisChe Fraktionen gewonnen werden: 3i-, 32-, ß3- und 34-BuTx (T. Abe et al., 1977 b). Das Isotoxin 33 ist unter ihnen das wiChtigste, besitzt die grösste PhLp-Aktivität, ist wahrsCheinlich mit dem 13-BuTx, das von C. C. Chang und C. Y. Lee (1963) beschrieben wurde, identisch und wird im folgenden kurz «(3-BuTx» genannt. ß-BuTx ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 21000 daltons (R. B. Kelly und F. R. Brown, 1974; T. Abe et al., 1977 b; K. Kondo, K. Narita und C. Y. Lee, 1978 a). Es besteht aus zwei Polypeptidketten mit Molekularge- wichten von 13 000 und 7000 daltons, die durch eine, eventuell auch mehrere Disulfid-Brücken verbunden sind. Die Aminosäure-Sequenz der beiden Ket- ten wurde ebenfalls von K. Kondo et al. (1978 b) aufgeklärt. Die Aktivität der Phospholipase (Phosphatide 2-acyl-hydrolase, EC 3.l.1.4) des Toxins ist mit der längeren der beiden Ketten (A-Kette) verbunden. Diese Kette hat 120 Aminosäurereste, und ihre Sequenz weist eine bemerkenswerte Homologie mit der anderer Schlangen-Phospholipase Az-Enzyme (sowohl neurotoxische als auch nicht-neurotoxische) und mit der Phospholipase A2 aus dem Schweine-Pankreas (K. Kondo et al., 1978 b) auf. Die zweite Polypeptidkette (B-Kette) hat 70 Aminosäurereste und unterscheidet sich in ihrer Sequenz von allen anderen Schlangengift-Proteinen. Eine mögliche Funktion dieser Kette dürfte in ihrer Fähigkeit zur Erkennung und irreversiblen Bindung des Toxins an spezifische «Rezeptor-Proteine» in der Membran der motorischen Nerven- endigungen bestehen (K. Kondo et al., 1978 b; C. G. Caratsch et al., 1981). Diese Hypothese erscheint zwar verlockend, muss jedoch mit Vorbehalt be- trachtet werden, weil Notexin, ein anderes präsynaptisCh wirksames Neuroto- xin gewonnen aus dem Giftstoff der Schlange Notechis scutatus scutatus (Au- Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 225 stralian tiger snake), nur aus einer einzigen Polypeptidkette besteht. In diesem Falle müssen die Stelle mit enzymatischer Aktivität und die für die Erkennung der präsynaptischen Membran verantwortliche in der gleichen Kette liegen. Eine klare Antwort auf die Frage nach der Lokalisation der Effekte könnte die Spaltung von ß-BuTx in seine beiden Ketten und die Untersuchung von deren individuellen Effekten an der Muskel-Endplatte geben. Zwar ist eine Trennung des Toxins in seine beiden Polypeptidketten biochemisCh möglich (R. B. Kelly und F. R. Brown, 1974; K. Kondo et al., 1978 a, b); jedoch fehlt den einzelnen Ketten im physiologischen Experiment ihre toxische Aktivität.

2.3 Experimentelle Trennung der zwei Effekte von ß-BuTx Der erste Schritt zur Untersuchung des genauen Wirkungsmechanismus von ß-BuTx auf die motorischen Nervenendigungen war der Versuch einer klaren Unterscheidung zwischen dem bekannten PhLp-abhängigen Effekt und der postulierten, teilweise schon bekannten ersten, raschen Hemmung der Neuro- transmittor-Freisetzung, die von der PhLp A2-Aktivität unabhängig ist. Zur Untersuchung des spezifischen, deswegen auch interessanten ersten Effektes von ß-BuTx war es notwendig, die PhLp-Aktivität des Toxins zu un- terdrücken (C. G. Caratsch et al., 1979 b). In einer ersten Gruppe von Experi- menten wurde die Aktivität der Calcium-abhängigen PhLp A2 durch Elimina- tion dieses Kations aus der Badflüssigkeit gehemmt. In einer zweiten Gruppe wurde die enzymatische Aktivität durch Herabsetzung der Temperatur gehemmt. Zur Klärung dieser Frage wurde die Wirkung von (3-BuTx an einzelnen neuromuskulären Synapsen mit Hilfe elektrophysiologischer Untersuchungs- methoden analysiert.

2.3.1 Elektrophysiologische Methoden Alle nachfolgend beschriebenen Experimente wurden an dem Nerv-Muskel- Präparat (M. sartorius) des Frosches (Rana temporaria) mit elektrophysiologischen Standard-Methoden (B. Katz und R. Miledi, 1965 a) durchgeführt. Der Muskel wurde in normaler oder modifizierter Frosch-Ringer-Lösung equilibriert (C. G. Caratsch et al., 1981). Oberflächlich liegende Muskel-Endplatten wurden intrazellulär abgeleitet, um die postsynaptische Antwort auf das freigesetzte ACh, d. h. die spontan auftretenden Miniatur-Endplattenpotentiale (m.e.p.p.) oder die evozierten Endplattenpotentiale (e.p.p.), zu messen. Zur Evozierung von e.p.p. wurde der Nerv alle 20 oder 30 Sekunden stimuliert. (+)-TuboCurarin (Endkonzentration 0,5-l,5 µM) wurde der Badflüssigkeit zugesetzt, um die Höhe des evozierten e.p.p. soweit zu vermindern, dass es un- terschwellig wurde, deswegen kein Aktionspotential (a.p.) entstehen konnte und die Kontraktion des Muskels verhindert wurde. 13-BuTx wurde dem Bad in verschiedenen Dosierungen zugegeben. Die folgend angegebenen Konzen- 226 Carlo G. Caratsch trationen beziehen sich auf Endkonzentrationen im Bad. Die Amplitude der e.p.p. von ein oder zwei Endplatten wurde jeweils während des ganzen Versu- ches gemessen. Von anderen Endplatten wurde sie vor der Zugabe von 13- BuTx und nachdem sich dessen Effekt voll entwickelt hatte, bestimmt.

2.3.2 Experimente in Calcium-freier Strontium- Frosch-Ringer- Lösung Einerseits ist Calcium ein essentieller Cofactor für die Aktivität der Phospho- lipase A2 (P. N. Strong et al., 1976; T. Abe et al., 1977 b), und Strontium wirkt als dessen kompetitiver Hemmer. Andererseits kann Strontium an der neuro- muskulären Synapse im physiologischen Experiment Calcium zumindest soweit ersetzen, dass eine evozierte ACh-Freisetzung möglich wird (R. Miledi, 1966; F.A. Dodge, R. Miledi und R. Rahamimoff, 1969). Somit erlaubt die Substitution von Calcium durch Strontium (6 mM) in Anwesenheit von EGTA, um mögliche Calciumfreisetzung aus dem Muskel zu verhindern (R. Miledi und R. E. Thies, 1971), die Messung des PhLp-unabhängigen Effektes von 13-BuTx an der Muskel-Endplatte.

Bild I Zeitverlauf der Wirkung von ß-BuTx (250 nM) auf die Amplitude der e.p.p. in Strontium-Ringer-Lösung. Der Muskel wurde bei Zimmertemperatur in Strontium (6 mM)-Ringer-Lösung mit EGTA (l mM) equilibriert. E. p. p. wurden alle 30 sec. ausgelöst und aus einer Endplatte registriert, die während 0 100 — des ganzen Experimentes abgeleitet wurde. Der Pfeil deutet auf die Zugabe von ß-BuTx. 60 - Fig. I Time course of the effect of ß-BuTx 60 - (250 nM) on the amplitude of e. p. p. s in strontium-Ringer solution. The muscle was equili- 40 brated at room temperature in strontium (6 mM)-Ringer ln the presence of EGTA (I mM). 20 - al E. p. p. s were elicited once every 30 sec, and recorded from an end-plate monitored 0 0 30 60 throughout the experlment. At the arrow ß- Time (min) BuTx was added to the bath.

Unter diesen experimentellen Bedingungen bewirkte ß-BuTx eine relativ langsame Hemmung der ACh-Freisetzung. Bild 1 zeigt die Abnahme der Am- plitude des e.p.p. nach Zugabe von 250 nM 13-BuTx ohne Zeichen einer sekun- dären Erhöhung, wie sie bei erhaltener PhLp 2-Aktivität zu erwarten wäre. Diese Verminderung der e.p.p. war konzentrationsabhängig, und eine Dosis- Wirkungs-Kurve für diesen Effekt konnte erstellt werden (Bild 2A). Bei nied- rigen Konzentrationen des Toxins ergaben die experimentellen Daten auch eine klassische sigmoidale Kurve. Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 227

A Bild 2 A. Dosis-Wirkungskurve der durch (3-BuTx bewirkten Abnahme der e. p. p.-Ampli- tude in Strontium-Ringer- Lösung. Abszisse: log der Konzentration von 13-BuTx. Ordinate: Amplitude der e. p. p. in Prozent der Kontroll- amplitude. B. Hill-Diagramm der durch (3-BuTx bewirkten Abnahme der e.p.p.-Amplitude in Strontium- Ringer- Lösung. Abszisse: log der Konzentra- tion von ß-BuTx. Ordinate: log (p/l-p), wobei p die bruchteilige Abnahme der e.p.p.-Ampli- tude bedeutet. Für beide Bilder 0 = Experi- mente bei Raumtemperatur (ca. 21° C); 0 = Experimente bei T = 5° C; Punkte und Verti- kalstriche bedeuten Mittelwerte ± Standard- abweichung. Fig. 2 A. Dose-response curve of the 13- BuTx-induced decrease of e.p.p. amplitude in strontium-Ringer solution. Abscissa: log of the concentration of (3-BuTx used. Ordinate: e. p. p. amplitude expressed as percentage of control amplitude. B. Hill-plot of the ß-BuTx-induced decrease of e.p.p. amplitude in strontium-Ringer solution. Abscissa: log of the concentration of 3-BuTx used. Ordinate: log (p/l-p), where p is the frac- tional decrease in e.p.p. amplitude. For both A and B = experiments performed at room temperature (ca. 21° C); 0 = experiments performed at 5° C; points and bars represent mean ± S.D.

Dagegen wich sie bei höheren Konzentrationen (>. 250 nM) von dem er- warteten Verlauf ab. Dies wird besonders deutlich, wenn die Daten nach der Methode von Hill (W. E. L. Brown und A. V. Hill, 1923) analysiert werden (Bild 2B). Mit einer hohen Konzentration (z. B. 3 µM) fiel die Amplitude der e.p.p. zwar bedeutend schneller auf tiefere Werte, zeigte aber wieder eine se- kundäre Zunahme und einen langsamen tertiären Abfall bis zum Verschwin- den der Antwort. Ein triphasischer Effekt (Bild 3), ähnlich wie es bei viel tieferen Konzentrationen von 13-BuTx in normaler Calcium-Ringer-Lösung vor- kommt (T. Abe et al., 1977 a; C.C. Chang et al., 1977 a), wurde sichtbar.

160 Bild 3 Zeitlicher Verlauf der Wirkung von p-BuTx (3 µM) auf die Amplitude der e.p.p. in • 80 Strontium-Ringer- Lösung. Für weitere Einzel-

▪ 60 heiten siehe Bild l.

40 Fig. 3 Time course of the effect of ß-BuTx (3 µM) on the amplitude of e.p.p.s in 20 strontium-Ringer solution. For other details see Fig. l. —10 0 30 60 Time (min) 228 Carlo G. Caratsch

In der Annahme, dass diese sekundäre Erhöhung von einer Restaktivität der PhLp verursacht ist, wurden einige Experimente bei tieferen Temperatu- ren durchgeführt (5° C). Unter diesen experimentellen Bedingungen entspra- chen die Resultate sowohl der sigmoidalen klassischen Dosis-Wirkungs- Kurve als auch der Geraden des Hill-plots. Sekundäre Zunahme und tertiärer Abfall wurden hierbei'nicht mehr beobachtet. Es wurden auch Kontrollversu- che mit kleineren Toxin-Konzentrationen (<_ 100 nM) durchgefüh rt. Sie ergaben ähnliche Hemmungswerte wie diejenigen bei Raumtemperatur (ca. 21° C) und lassen vermuten, dass dieser erste PhLp A2-unabhängige Hemmeffekt relativ Temperatur-unempfindlich ist. Diese Resultate bestätigen, dass mit hoher Konzentration von ß-BuTx einige PhLp-Aktivität auCh in einem Calcium- freien Medium immer noCh vorhanden ist. Frühere Untersuchungen (P. N. Strong et al., 1976; T. Abe et al., 1977 b; C.C. Chang et al., 1977 b) mit ver- sChiedenen Phospholipid-Substraten in Anwesenheit anderer divalenter Kat- ionen haben ebenfalls Restaktivitäten gezeigt. Eigene Untersuchungen zur Phospholipase-Aktivität von 13-BuTx in An- wesenheit von Calcium- oder von Strontium-Ionen mit der pH-stat-Methode und mit Eigelb-Phospholipiden als Substrat ergaben messbare Enzymaktivitä- ten bei Toxin-Konzentrationen zwischen 0,l und 5,5 tM (Bild 4). Diese Kurve zeigt, dass 3 µM ß-BuTx im Calcium-freien Medium die gleiche enzymatische Aktivität hat wie etwa 200 nM in einem normalen Calcium-haltigen Medium. Die dadurch bewiesene Restaktivität der PhLp A2 erklärt den späten und langsamen triphasischen Verlauf von Bild 3.

Bild 4 Vergleich der Phospholipase-Aktivi- tät von (3-BuTx in Calcium- und in Strontium- Ringer- Lösnngen. Abszisse: ß-BuTx Konzen- tration (µM). Ordinate: enzymatische Aktivität (µequiv. freigesetzte Fettsäuren /min.). Lyo- phylisiertes, in destilliertem Wasser gelôstes (3-BuTx wurde in ein Homogenat von Eigelb injiziert. In Anwesenheit des En--Lipoproteine zyms freigesetzte Fettsäuren wurden automatisch titriert und die Enzymaktivität aus der Anfangsneigung berechnet. ®–® Aktivität gemessen in Calcium- Lösung. 0-0 Aktivität gemessen in Strontium- Lôsung (Calcium-frei, mit EGTA). Fig. 4 Comparison of phsopholipase activity in calcium and in strontium solutions. Ab- scissa: concentration of 3-BuTx (µM). Ordi- nate: enzymatic activity (µequiv. fatty acid liberated/min). Lyophilized toxin, diluted in distilled water, was injected into an egg yolk lipoprotein homogenate. Fatty acids liberated in the presence of the. toxin were titrated automa- tically. Enzyme activity was calculated from the initial slope.0-0 activity measured in Cat+ solutions. 0-0, activity measured in Sr2+ solutions (Ca2+-free, containing EGTA). Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 229

2.3.3 Experimente in Calcium-Frosch-Ringer-Lösung bei verschiedenen Tem- peraturen Ein Absenken der Temperatur bewirkt bei enzymatischen Vorgängen eine Verminderung der Aktivität. Diese Wirkung wurde bereits bei Experimenten in Strontium-Ringer-Lösung mit hohen Konzentrationen von ß-BuTx ausge- nutzt, um die restliche PhLp-A2-Aktivität zu unterdrücken. In einer zweiten Gruppe von Experimenten wurde nun versucht, die beiden Effekte des 13-BuTx (125 nM) besser voneinander zu trennen, indem in normaler Calcium-Ringer die PhLp-A2-Aktivität durch Absenken der Tempe- ratur zunehmend gehemmt wurde. Bei Raumtemperatur bewirkt das Toxin den Charakteristischen triphasischen Verlauf, der schon früher beschrieben wurde (T. Abe et al., 1977 a; C. C. Chang et al., 1977b). Allerdings tritt unter diesen experimentellen Bedin- gungen die PhLp-abhängige zweite Phase so schnell ein, dass die erste rasche Hemmung der Amplitude der e. p. p. leiCht übersehen werden kann (R. Mi- ledi, persönliche Mitteilung). Die postulierte Möglichkeit zur Trennung dieser beiden Effekte (C. G. Caratsch et al., 1979a) in der triphasischen Sequenz wird nachweisbar, wenn die Temperatur auf 10 ± 1° C reduziert wird. Bei gleich- zeitiger Messung an zwei oberflächigen Muskel-Endplatten weist diese triphasische Sequenz einen praktisch identischen Verlauf auf (Bild 5). Mit weiterem

Bild 5 Zeitlicher Verlauf der Wirkung von ß-BuTx (125 nM) auf die Amplitude der e. p. p. in normaler Calcium-Ringer-Lösung. Der Muskel wurde bei 10 ± l° C equilibriert. Alle 30 sec. ausgelöste e. p. p. wurden gleichzeitig von zwei Endplatten abgeleitet. Der Pfeil deu- 100 — tet auf die Zugabe von ß-BuTx ins Bad. 00 — Fig. 5 Time course of the effect of ß-BuTx

66 (125 nM) on the amplitude of e. p. p. s in normal calcium-Ringer solution. The muscle was 40 E equilibrated at 10 ± l° C. E. p. p. s evoked one every 30 sec were recorded simultaneously 20 from two end-plates. At the arrow ß-BuTx was 0 added to the bath. —10 30 66 Time lminl

Absenken der Temperatur bis auf 5 ± 1° C wird die enzymatisch bedingte se- kundäre Erhöhung der Amplitude der e. p. p. derart verzögert und vermindert, dass die e. p. p. nach einer vollständigen Hemmung sich nur noch bis zu durchschnittlich 10 % des ursprünglichen Kontrollwertes vorübergehend er- holen. Diese Resultate sind in Bild 6 zusammengefasst. Die Temperaturabhängigkeit der neurotoxischen PhLp-A2-Aktivität von 3- BuTx wurde auch biochemisch mit der auf Seite 228 beschriebenen Methode untersucht. Diese Experimente bestätigen die elektrophysiologisChen Resul- 230 Carlo G. Caratsch

Bild 6 Einfluss der Temperatur auf den 100 zeitlichen Verlauf der Hemmung der Amplitu- de der e. p. p. durch ß-BuTx (125 nM) in nor- 80 maler Calcium-Ringer- Lôsung. Das Präparat

60 — wurde bei Raumtemperatur ( ), bei 10° C (— — —) und bei 5° C (— • —) equilibriert. Jede 40 I Kurve ist der Mittelwert aus vier oder mehre- ren Experimenten. In allen Experimenten 20 — I wurden die e. p. p. wie im Bild 1 beschrieben ausge- _ . . 0 1 I \ , , , — -7 - löst und abgeleitet. Der Pfeil deutet auf die Zu- -10 0 30 60 Time 1minl gabe von (3-BuTx ins Bad. Fig. 6 Influence of temperature on the time course of e. p. p. amplitude inhibition by 13- BuTx (125 nM) in calcium-Ringer. The muscles were equilibrated in normal calcium-Ringer solution at room temperature ( ), at 10° C (— — —) and at 5° C (— • —). Each curve repre- sents the mean of four or more end-plates followed throughout the experiments. In all experiments the e. p. p. s were elicited and recorded as described in Fig. l. At the arrow (3-BuTx was added to the bath.

Bild 7 Temperaturabhängigkeit der PhLp • Az-Aktivität von (3-BuTx. Abszisse: Tempera- 100 — tur in °C. Ordinate: spezifische Enzymaktivität • (µequiv. freigesetzte Fettsäuren •min-'•mg Pro- = • • tein -'). Lyophylisiertes Toxin wurde in das w Standard-Calcium-Inkubationsmedium, das • Eigelb-Lipoproteine als Enzymsubstrat ent- a 80 — E • hielt, injiziert. Das Reaktionsgefäss war von ei- - • nem thermostatisierten Wassermantel (± 0,5° C) umschlossen, und die Temperatur wurde E während der einzelnen Experimente konstant 60 — gehalten. Die freigesetzten Fettsäuren wurden • automatisch titriert bei verschiedenen Tempe- , ° Fig. 7 Temperature dependence of the • ä 40 — phospholipase activity of (3-BuTx. Abscissa: temperature in ° C. Ordinate: specific enzymatic activity (µequiv. fatty acid liberated. min-'•mg protein- I). Lyophilized toxin was injected into the standard calcium incubation 20 — • mixture, using egg yolk lipoprotein as enzyme • substrate. The reaction vessel was enclosed in a thermostated water jacket (± 0.5° C) and the temperature in the vessel continuously moni- 0 I I I I I I I tored during each essay with a digital ther- 10 20 30 mistor. Released fatty acids were titrated auto- Temperature 1°C) matically at temperatures between l.5 and 30.5° C. Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 231 tate. Bei Messung der spezifischen enzymatisChen Aktivität des Toxins im Be- reiCh zwischen l,5° und 32 ° C in einem Medium mit normaler Calcium-lo- nen-Konzentration kann eine stetige Aktivitätszunahme mit steigender Tem- peratur gesehen werden (Bild 7). Im unteren Temperaturbereich (5°-20 ° C) beträgt der Temperatur-Koeffizient (Qio) ungefähr 2,3 (2,2-2,5). Wie aus diesem Bild ersichtlich ist, verursacht eine Verminderung der Raumtemperatur (ca. 21 ° C) auf 5 ° C eine 5fache Reduktion der enzymatischen Aktivität. Diese Werte erklären die Verzögerung und Verminderung der sekundären Erhöhung der e. p. p., die wir in Experimenten bei tiefer Temperatur beobachtet haben.

2.4 UntersuChung der Wirkung des PhLp-abhängigen Effektes mit Antikör- pern Als weitere Möglichkeit zur Abklärung der komplexen neurotoxischen Wir- kung von ß-BuTx und speziell der Rolle der enzymatischen Aktivität innerhalb dieser Wirkung bietet sich der immunologische Weg. Für diese Unter- suchungen wurden Antisera sowohl gegen das natürliche als gegen ein enzymatisch-inaktiviertes Derivat hergestellt.

2.4.1 Erzeugung der Antikörper Die A-Kette von 13-BuTx, die Träger der PhLp-A2-Aktivität ist, wurde am Hi- stidin-Rest 48 (His-48) mit p-Bromophenacylbromid modifiziert (T. Abe et al., 1977b), in Anlehnung an die Methode zur Inaktivierung der Schweine-Pan- kreas-PhLp-A2 (J. J. Volwerk, W. A. Pieterson und G. H. de Haas, 1974). Die- ses modifizierte Toxin (PBP-(3-BuTx) besitzt eine enzymatische Aktivität, die auf ca. 3 % des ursprünglichen Wertes vermindert ist. In Experimenten «in vivo» mit Mäusen zeigte sich das PBP-13-BuTx ebenfalls bedeutend weniger toxisch, mit einer Letalität von ca. 1% im Vergleich zu der des ursprünglichen ß-BuTx (T. Abe et al., 1977b). Zur Erzeugung von Antikörpern wurde PBP-13-BuTx (100 j,g in complete Freund's adjuvant) intradermal im Rücken von weissen New Zealand Kanin- cheninjiziert. Dieser Applikation folgten zwei Booster-Injektionen (100 µg in incomplete Freund's adjuvant) im Abstand von drei Wochen. Für das natür- liche 3-BuTx wurde wegen seiner hohen Toxizität ein ähnliches Verfahren mit kleineren Dosierungen verwendet (1 µg initial, 2x2,5 µg als Booster). Zehn Tage nach der letzten Injektion wurde den Tieren Blut zur Gewinnung von Serum entnommen. Für die elektrophysiologischen Versuche wurden die Sera während 30 Minuten auf 56 °C erhitzt, um einen Faktor zu inaktivieren, der im Kaninchenserum vorhanden ist und an der Muskelendplatte eine Er- höhung der spontanen Transmittor-Freisetzung bewirkt (Y. Ito, R. Miledi und A. Vincent, 1974). Zur Equilibrierung der Ionen-Konzentrationen wurden die Sera über Nacht gegen Frosch-Ringer-Lösung dialysiert. 232 Carlo G. Caratsch

2.4.2 Immunologische und enzymatische Wirkung der Antikörper Sowohl mit 13-BuTx als mit PBP-(3-BuTx konnte eine gute Antikörper-Bildung beobachtet werden. Für PBP-13-BuTx genügte schon eine einmalige intrader- male Injektion (100 µg) zur nachweisbaren Bildung von Antikörpern, während für das natürliche 13-BuTx wegen der sehr kleinen maximal injizierbaren Men- ge auch die beiden Booster-Injektionen notwendig waren. In dem Doppel-Immunodiffusionstest nach Ouchterlony, mit dem die Stärke der Antigen-Antikörper-Reaktion untersucht werden kann, zeigte das Antiserum, das mittels PBP- 3-BuTx hergestellt wurde, eine einzige Präzipita- tionslinie sowohl mit dem natürlichen als mit dem modifizierten Toxin (Bild 8) (C. G. Caratsch et al., 1979c). Die vollständige Fusion dieser Präzipitations- linie deutet auf die Bildung von Antikörpern, die gegen ein gemeinsames An- tigen im natürlichen und im PBP-modifizierten PhLp-inaktiven, ß-BuTx reagieren. Dies bedeutet, dass die gebildeten Antikörper nicht oder nur in sehr kleiner Konzentration gegen Antigene der katalytischen, also enzymatisch wirksamen Stelle des Toxins reagieren. Die mit der gleichen Methode durch- geführte Untersuchung der Kreuz-Reaktivität des Anti-PBP-3-BuTx-Anti- serums gegenüber anderen präsynaptisch wirkenden Neurotoxinen führte zu folgenden Resultaten (Tabelle 13): Die Reaktivität ist sehr hoch mit dem natürlichen und dem modifizierten 13-BuTx (ß3-Isotoxin) sowie mit dem Roh- gift des Bungarus multicinctus, aus dem sie gewonnen wurden; die Reaktivi- tät ist schwächer mit den anderen 3-Isotoxinen (3 ' , 32, (34), mit Taipoxin und Notexin, zwei anderen stark wirksamen präsynaptisch wirkenden Neurotoxi- nen mit PhLp-Aktivität und mit dem Rohgift des Bungarus coeruleus. Dage- gen zeigten die Schweine-Pankreas-PhLp A2, der bovine Pankreas Trypsin-In- hibitor, dessen Aminosäuren-Sequenz an einigen Stellen eine Homologie zur B-Kette des ß-BuTx aufweist (C. Y. Lee, 1979), und das a-BuTx als Prototyp der postsynaptisch wirkenden Neurotoxine, überhaupt keine Reaktivität.

Bild 8 Ouchterlony- Doppel -Immunodiffu- sionstest eines Anti-PBP-(3-BuTx-Antiserums vom Kaninchen. Inhalt der Vertiefungen: Zen- trum = Antiserum (10 µl); 1 = (3-BuTx (l µg); 2 = PBP-ß-BuTx (l µg). Fig. 8 Ouchterlony double immunodiffusion analysis of an anti-Rabbit PBP-13-BuTx antiserum. Contents of wells: centre, antiserum (10 µl); l, (3-BuTx (l µg); 2, PBP-I3-BuTx (l µg)• Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 233

Tabelle 13 Ouchterlony- Doppel-Immundiffusionstest von Anti-PBP-ß-BuTx-Antiserum. Die Wirkung von Antiserum (10 µl) wurde untersucht mit Serien -Verdünnungen von potentiell kreuzreagierenden Polypeptid-Neurotoxinen und Phospholipasen, mit 0,03-100 µg pro Vertie- fung. Der Grad der Kreuzreaktion relativ zu der mit PBP13-BuTx wurde qualitativ visuell beur- teilt (+++++ sehr stark kreuzreagierend; — keine Kreuzreaktion bei 100 µg). Table 13 Ouchterlony double immunodiffusion analysis of anti-(3-BuTx antiserum. Antiserum (10 µl) was tested against serial dilutions of potential cross-reacting polypeptide neurotoxins and phospholipases, 0.03-100 µg per well. The degree of cross-reactivity was qualitatively related to PBP-(3-BuTx on a visual basis (+++++ most highly cross-reactive; — no cross-reactivity at 100 µg).

Fällung

PBP-13-BuTx +++++ p-BuTx 4i3-isotoxin) +++++ ß-i-isotoxin + (3-2-isotoxin ++ [3-4-isotoxin +++ Bungarus-multicinctus- Rohgift +++++ Bungarus-caeruleus-Rohgift +++ Taipoxin ++ Notexin + a-Bungarotoxin — Schweine-Pankreas PhLp A2 Rinder-Pankreas -Trypsin-Inhibitor —

Sowohl Anti-ß-Bu-Tx- als Anti-PBP-ß-BuTx-Antiserum hemmten die PhLp-Aktivität des natürlichen 13-BuTx in biochemisChen Experimenten, bei denen Modell-PhosphatidyCholin-Membranen als Substrat verwendet wurden (C. G. Caratsch et al., 1982). Das Präimmun-Serum zeigte bei einer Tempera- tur von 20 ° C eine Aktivität von 75 IE (Internationale Einheit: l.tmol freigesetzte Fettsäuren • min.-' • mg Protein-'), was mit den Werten von 70 IE der Ex- perimente mit Eigelb-Lipoproteinen als Substrat übereinstimmt (C.G. Ca- ratsch et al., 1981). Dagegen ist in Experimenten mit dem spezifischen Immun- serum die enzymatische Aktivität im Dosis-Bereich von 0,05 bis 0,4 µg ß-BuTx auf 15 % des Kontrollwertes reduziert (Bild 9). Die Hemmung der PhLp-Akti- vität ist von der Konzentration des Anti-ß-BuTx-Antiserums abhängig, und eine Dosis-Wirkungs-Kurve dieser Hemmung konnte erstellt werden. Aller- dings war es auch mit sehr hohen Antiserum-Konzentrationen nicht möglich, die Aktivität der PhLp zu mehr als 90% zu hemmen (Bild 10).

2.4.3 Wirkung der Antikörper in elektrophysiologischen Versuchen ElektrophysiologisChe Untersuchungen über den Einfluss des spezifisChen Anti-ß-BuTx-Antiserum auf die charakteristische triphasische Wirkung des Neurotoxins an der Muskelendplatte zeigten, dass diese vollständig blockiert 234 Carlo G. Caratsch

30 Bild 9 Phospholipase A2- Aktivität von 3- BuTx und ihre Hemmung durch spezifische Antikôrper. Immun- oder Prä -immun-Serum (20 µI) wurde mit steigenden Konzentrationen von ß-BuTx während 15 Minuten bei 20° C präinkubiert und dem Substrat (radioaktiv markiertes Phosphatidylcholin) zugegeben. Die resultierende enzymatische Aktivität mit Immun- (0) oder Präimmun-Serum ( ) wurde bestimmt durch Messung der freigesetzten Fettsäuren mittels Dünnschicht- Chromatogra- phie. 0 0 0 Fig. 9 Phospholipase A2 activity of (3-BuTx 9 I 1 I I I I and its inhibition by specific antibody. Im- 0.1 0.2 0.3 0.4 ß-BuTx/µg mune or preimmune serum (20 µl) was preincubated with increasing concentrations of 13- BuTx for 15 min at 20° C and added to the substrate (radioactive labelled phosphatidylcholine). The resultant enzyme activity in the presence of either immune (0) or preimmune (C) serum was determined with measurement of liberated fatty acids through thin-layer chromatography.

100 Bild 10 Hemmung der Phospholipase-A2 i—• Aktivität durch spezifische Antikörper. 0,4 tg 80 0, von 3-BuTx wurden mit zunehmenden Men- gen von Anti-13-BuTx-Antiserum a ^ während 15 p 60 Minuten bei 20° C präinkubiert und dann dem 3 2 Substrat (markiertes Phosphatidylcholin) zugegeben. Die resultierende enzymatische Aktivi- ö g 40 • tät wurde bestimmt durch Messung der freigesetzten Fettsäuren mittels Dünnschicht 20 -Chro- matographie.

/• I I I I 11 Fig. 10 Titration of the inhibition of phos- 0 4 8 12 16 " 100 anti-fl•RuTx antiserum/Ill pholipase A activity by specific antibody; 0.4 µg of ß-BuTx was preincubated with increasing amounts of anti-(3-BuTx antiserum for 15 min at 20° C and then added to the substrate (radioactive labelled phosphatidylcholine). The resulting enzyme activity was assayed through thinlayer chromatography. Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 235 wurde (Bild 11). In Kontroll-Experimenten, bei denen ß-BuTx (125 nM) wäh- rend 15 min mit Präimmun-Serum inkubiert und anschliessend dem Nerv- Muskel-Präparat bei einer Temperatur von 10 °C zugegeben wurde, zeigte sich der klassische triphasische Verlauf. Wurde statt dessen die Inkubation mit Im- mun-Serum, d. h. mit spezifischen Anti-Toxin-Antikörpern durchgeführt, so wurden sämtliche Phasen des 13-BuTx-Effektes gehemmt. Die Möglichkeit, dass diese Hemmung durch Präzipitation des Toxins als Folge der Bildung unlösliCher Antigen-Antikörper-Komplexe stattfand, ist unwahrscheinlich, da die Inkubationszeit sehr kurz war (15 min) und Kontrollexperimente mit 125I- markierten (3-BuTx zur Kontrolle der Sedimentation nach dieser Inkubations- zeit nur eine solche von etwa 5 % ergaben.

Bild 11 Zeitlicher Verlauf der Wirkung von 100 13-BuTx (125 nM) auf die Inkubation mit Im- e immune munserum (immune) oder Präimmunserum • 75 (preimmune) für 15 Minuten bei 20° C. Der v q Pfeil deutet auf die Zugabe der Toxin-Antikör- A o „ U per lns Bad. ° 50 Fig. 11 Time course of the effect of 125 nM 0. ® So preimmune (3-BuTx on e. p. p. amplitude after preincuba- U 2 25 0•5 0 tion of f3-BuTx with either immune or preim- ä •®® B 0 ee. mune serum for 15 min at 20° C. At the arrow, 0 i enzyme-antibody mixture was added. —10 6 10 20 20 time/min

Zur Erklärung der Selektivität des Effektes von 13-BuTx an der neuromus- kulären Synapse wurde eine spezifische Stelle für die Erkennung der Mem- bran der Nervenendigung postuliert (T. Abe et al., 1976; C.Y. Lee, 1979; J. W. Spokes und J.O. Dolly, 1980; C.G. Caratsch et al., 1981), die in der B-Kette liegen könnte. Die protektive Wirkung des Anti-13-BuTx-Antiserum in elektrophysiologischen Experimenten, bei denen auch der erste, PhLp-unab- hängige Effekt gehemmt wurde, suggeriert die Möglichkeit, dass eine weitere Fraktion von Antikörpern mit der Erkennungsstelle des Toxins reagiert. Die Antikörper in dem von uns verwendeten Anti-(3-BuTx-Antiserum sind polyclonal, und eine Koexistenz mehrerer Populationen von Antikörpern, die verschiedene Effekte des 3-BuTx hemmen, ist durchaus möglich. Weiterhin ist nicht auszuschliessen, dass ein Teil ihrer protektiven Wirkung durch Veränderung der sterischen Struktur des Toxins an der aktiven Stelle bedingt ist. Die Herstellung von monoclonalen Anti-PBP-ß-BuTx-Antikörpern, die eine einzige immundominante Stelle des natürlichen ß-BuTx – sehr wahr- scheinliCh in der A-Kette lokalisiert – erkennen, wurde kürzlich beschrieben (P. N. Strong, J. N. Wood und J. Ivanyi, 1984). Mit Hilfe dieser monoClonalen Antikörper können weitere noch ungeklärte Probleme des PhLp-abhängigen Effektes von ß-BuTx untersucht werden. 236 Carlo G. Caratsch

2.5 Untersuchung über die Bedingung des ersten, PhLp-unabhängigen Effek- tes von 13-BuTx Um den Wirkungsmechanismus des ersten, PhLp-unabhängigen Effektes von 13-BuTx an der neuromuskulären Synapse besser zu verstehen, war es notwendig, die selektive Bindung des Toxins an die Membran der Nervenendigungen zu analysieren. Bei früheren Untersuchungen mit evozie rter Freisetzung von ACh zur Un- terscheidung der zwei verschiedenen Effekte von [3-BuTx fiel auf, dass nach Ausschalten der PhLp-Aktivität die erste Verminderung der e. p. p.-Amplitude je nach experimentellen Bedingungen variierte. Die Freisetzung des Neuro- transmittors nahm in normaler Frosch-Ringer-Lösung merklich schneller ab als in einer solchen, bei der Calcium durch Strontium ersetzt wurde. Auf Grund dieser Beobachtungen wurde postuliert, dass Calcium-Ionen den Be- ginn und die Geschwindigkeit der ersten raschen Hemmung beein flussen, möglicherweise dadurch, dass die Bindung des Neurotoxins an die Membran der Nervenendigung begünstigt wird (C. G. Caratsch et al., 1981). Auch andere Autoren haben einen Ein fluss von divalenten Kationen auf die Wirkung des [3-BuTx beschrieben. So haben z. B. C.C. Chang und M.J. Su (1982) gefunden, dass in Nerv-Muskel-Präparaten des Mausdiaphragmas der erste Effekt des Toxins von dem divalenten Kationen-Milieu abhängig ist. Weiterhin haben H. Rehm und H. Betz (1982) beschrieben, dass gewisse divalente Kationen – aber nicht alle – fähig sind, Calcium im Bindungsschritt von us l_ß_BuTx an Membranen von Gehirnsynaptosomen zu ersetzen. Um diesen SaChverhalt zu klären, wurde in einer weiteren Serie von Expe- rimenten der Einfluss mehrerer divalenten Kationen auf den ersten PhLp-un- abhängigen Effekt von 13-BuTx untersuCht.

2.5.l Methodik Strontium ist das einzige divalente Kation, das Calcium im Prozess der evozierten Neurotransmittor- Freisetzung effizient ersetzen kann (R. Miledi, 1966; F.A. Dodge et al., 1969). Deswegen konnte die Messung der Amplitude von e. p. p. für die Analyse der Wirkung anderer divalenter Kationen auf den Ef- fekt von 13-BuTx nicht angewendet werden. Der Toxin- Effekt auf die Neuro- transmittor- Freisetzung an der Muskel-Endplatte kann aber auch durch Mes- sung der Frequenz der m. e. p. p. analysiert werden (C.C. Chang et al., 1973 ; R. B. Kelly, S. G. Oberg, P. N. Strong und G. M. Wagner, 1976; T. Abe et al., 1976, 1977b). Die spontan auftretenden m. e. p. p. sind nämlich nicht von der Anwesenheit von Calcium oder Strontium in der extrazellulären Flüssigkeit abhängig (B. Katz und R. Miledi, 1965b; R. Miledi und R. E. Thies, 1967, 1971) und können beobachtet werden, auch wenn andere divalente Kationen, die die evozierten e. p. p. blockieren, Calcium im Medium ersetzen. Somit war es möglich, die Wirkung von Calcium, Strontium, Magnesium, Cobalt und Man- Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 237

gan auf den ersten, PhLp-unabhängigen Effekt von ß-BuTx zu studieren und dadurch einige Informationen über die Bindungsbedingungen des Toxins an die Membran zu gewinnen. Diese Versuchsserien wurden ebenfalls an dem Nerv-Muskel-Präparat (M. Sartorius) der Rana temporaria mit elektrophysiologischer Standard- Technik durchgeführt (B. Katz und R. Miledi, 1965 a). Die normale Frosch- Ringer-Lösung enthielt 1,8 mM Calcium. In anderen Lösungen wurde dieses Kation durCh Strontium, Magnesium, Cobalt oder Mangan (jeweils 5 mM) in Anwesenheit von EGTA (l mM) (R. Miledi und R. E. Thies, 1971) ersetzt. Alle Versuche wurden in Anwesenheit von Neostigmin (4,5 µM) – einem reversiblen Hemmer der AChE – durchgeführt, um die Amplitude der m. e. p. p. zu erhöhen und so deren Messung zu erleichtern. Ausserdem wurde dem Medium in allen Versuchen Tetrodotoxin (l µM) zugesetzt, das die spannungssensiblen Natrium-Kanäle blockiert und dadurch eine Muskelkontrak- tion verhindert (T. Abe et al., 1976). Die Experimente wurden entweder bei Raumtemperatur (21 0 -22 ° C) oder bei 10 ° C durchgeführt. Am Ende jedes Experimentes wurde Lanthan (End- konzentration im Bad 1 mM) zugegeben, um zu untersuchen, ob die Nerven- endigung nach der Behandlung mit dem präsynaptisch wirksamen Toxin immer noch Transmittor-Quanta freisetzen konnte (J. Heuser und R. Miledi, 1971). Die m. e. p. p. wurden während jeweils 30 sec automatisCh gezählt über die gesamte Versuchsdauer, d. h. über eine Zeit von 40 bis 100 Minuten (C. G. Ca- ratsch et al., 1985). Die erhaltenen Werte wurden dann semilogarithmisch als Prozente der Kontrollfrequenz aufgetragen und die extrapolierte Abnahme- rate mit der Linear-Regressions-Methode errechnet.

2.5.2 Experimente in Calcium-haltiger Ringer-Lösung Die Mehrheit dieser Experimente wurde bei 10°C zur Verminderung und Ver- zögerung des zweiten, PhLp-abhängigen Effektes von 13-BuTx durchgeführt (C. G. Caratsch et al., 1981). Bild 12A zeigt den typischen Verlauf eines solchen Experimentes. Nach Zugabe von ß-BuTx (250 nM) fällt die Frequenz der m. e. p. p. sehr rasch auf tiefe Werte, hier sogar bis auf 0. Anschliessend steigt sie wieder auf hohe Werte – bis zu mehr als der zehnfachen Kontrollfre- quenz – mit häufigen «bursts» von m. e. p. p., d. h. kurzen Ausbrüchen von m. e. p. p. mit extrem hohen Frequenzen. Dieses Muster von Entladungen konnte in manchen Experimenten über eine Stunde dauern, während in anderen die Frequenz nach 20 bis 60 Minuten langsam wieder auf tiefere Werte fiel. Zugabe von Lanthan (l mM) bewirkte immer eine sehr kurze Periode von Entladungen mit ausserordentlich hoher Frequenz (bis zu mehr als der hun- dertfachen Kontrollfrequenz), gefolgt von einer endgültigen Abnahme auf 0 (weniger als 1 m. e. p. p./2 min).

238 Carlo G. Caratsch

. ;; h 11 i1 ;1 i .1 .1, 1111 II .11 1 f111. II V. al[

ß -BuTx

-10 0 10 20 30 40 0 2 3 4 5 time (min) time (min)

Bild 12 Wirkung von (3-BuTx auf die Frequenz von m. e. p. p. einer Endplatte in Calcium-Rin- ger-Lösung. Die horizontal gestrichelten Linien entsprechen der Standardabweichung der Kon- trollfrequenz vor Zugabe des Toxins. A. Frequenz der m. e. p. p. während des Versuches. Zur Zeit 0 wurden 13-BuTx und bei La Lanthan (Endkonzentration 1 mM) dem Bad zugegeben. Abszisse: Zeit in Minuten. Ordinate: Frequenz der m. e. p. p./Sekunde. B. Semilogarithmisches Diagramm der ersten Phase des gleichen Experimentes. Abszisse: Zeit in Minuten. Ordinate: log. der Frequenz als Prozent der Kontrollfrequenz. Fig. 12 Effect of 13-BuTx on the frequency of m. e. p. p. s in calcium-Ringer solution at an end- plate. The horizontal dash-lines stand for the standard deviations of the control frequency before adding the toxin. A. M. e. p. p. s frequency during the experiment. At time 0 13-BuTx (final concentration 250 nM) and at La lanthanum (final concentration 1 mM) were added to the bath. Abscissa: time in minutes. Ordinate : m. e. p. p. s frequency/s. B. Semilogarithmic plot of the first stage of toxin action in the same experiment. Abscissa: time in minutes. Ordinate: log of the frequency expressed as percentage of control frequency. Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 239

Kontroll-Experimente bei Raumtemperatur zeigten wieder, ähnlich wie bei der Messung von e. p. p.-Amplituden, dass die sekundäre, PhLp-abhängige Er- höhung der Frequenz mit einer viel kürzeren Latenz auftritt und damit die erste Frequenzverminderung partiell oder vollständig verdeCkte. Wurde die Frequenz der m. e. p. p., berechnet als Prozent der Kontrollfre- quenz, semilogarithmisch aufgetragen, so entsprach der ß-BuTx-bedingte Ab- fall in der Mehrheit der Fälle einer Geraden, d. h. sie schien einem Mechanis- mus «Pseudo-erster»-Ordnung zu folgen (Bild 12B). In einzelnen Experimen- ten, die bei 10 ° C durchgeführt wurden, verhinderte die wegen der tiefen Tem- peratur schwaChe Basis-Frequenz eine klare Analyse des Abfalls. Nach Halbierung der 13-BuTx-Konzentration auf 125 nM erfolgte die Fre- quenzabnahme viel langsamer, was beweist, dass dieser Hemmeffekt des To- xins konzentrationsabhängig ist (vgl. Tabelle 14).

2.5.3 Experimente mit anderen divalenten Kationen Da in in diesen Experimenten die Calcium-abhängige PhLp-Aktivität durch Fehlen dieses Kations gehemmt war, wurden sie bei Raumtemperatur durch- geführt. Zu Vergleichszwecken wurden auCh für jedes Kation zwei Versuche bei reduzierter Temperatur (10 ° C) gemacht. Herabsetzung der Temperatur verminderte klar die Grundfrequenz der m. e. p. p. bei allen untersuchten Mus- kel-Endplatten, wie schon von anderen Autoren beschrieben (P. Fatt und B. Katz, 1952; B. Katz und R. Miledi, 1965). Dagegen hatte sie nur einen ver- nachlässigbaren Einfluss auf die Toxin-bedingte Frequenzabnahme der m. e. p. p. (C. G. Caratsch, R. Miledi und P. N. Strong, 1983). Die untersuchten divalenten Kationen besitzen zum Teil selber einen Ein- fluss auf die Frequenz der m. e. p. p. an der Muskel-Endplatte des Frosches. In Calcium-Ringer-Lösung bei Raumtemperatur liegt die normale Frequenz zwischen 1 und 3/seC (P. Fatt und B. Katz, 1952; R. Miledi und R. E. Thies, 1967). Ersatz von Calcium durch Magnesium hat eine leichte Abnahme der Fre- quenz zur Folge (J. del Castillo und B. Katz, 1954; J.I. Hubbard, S.E. Jones und E. M. Landau, 1968; R. Miledi und R. E. Thies, 1971), während Strontium praktisch keine Veränderung bewirkt (D. Elmquist und D. S. Feldmann, 1965 ; F. A. Dodge et al., 1969; R. Amwyl, T. Kelly und F. Sweeney, 1982; L.M. Ma- sukawa und D. R. Livengood, 1982). Von den anderen beiden Ionen (Cobalt und Mangan) dagegen ist bekannt, dass sie die Grundfrequenz deutliCh erhö- hen. So verdoppelte Cobalt in unseren Versuchen die m. e. p. p.-Frequenz im Vergleich zu den Messungen in Calcium, was mit früheren Arbeiten überein- stimmt (J. N. Weakly, 1973 ; H. Kita, K. Narita und W. van der Kloot, 1981), während Mangan eine Frequenzerhöhung um das 4- bis 5fache bewirkte – wiederum in Übereinstimmung mit anderen Autoren (R. J. Balnave und P. W. Gage, 1973 ; H. Kita et al., 1981; L. M. Masukawa und D. R. Livengood, 1982). Alle diese Frequenzänderungen nach Wechsel von normaler Calcium-Rin- ger-Lösung zu einer mit anderen divalenten Kationen waren aber nach einer

240 Carlo G. Caratsch

Equilibrierungszeit genügend stabil, um eine neue Basis-Frequenzlinie zu bil- den, die den rascheren Effekt von 3-BuTx auf die Transmitterfreisetzung messbar werden liess (C. G. Caratsch et al., 1985). Der erste, PhLp-unabhängige Effekt von 13-BuTx auf die Frequenz der m. e. p. p. ist eindeutig davon abhängig, welches divalente Kation im extrazel- lulären Milieu anwesend ist. Bild 13A zeigt den Effekt von ß-BuTx (25 nM) in Magnesium-Ringer-Lösung. Die Frequenzabnahme ist wesentlich langsamer als in der Anwesenheit von Calcium-Ionen. Innerhalb von ca. 25 min fällt sie von 3,3/sec auf ein Plateau von etwa l,5/sec ab. Mit Magnesium wurde im Durchschnitt eine Plateau-Frequenz erreicht, die sich zwischen 25 und 45% der eigenen Kontrollfrequenz bewegte. Die Analyse des Frequenzabfalls auf semilogarithmisCher Skala ergab hier in 5 von 7 Experimenten wieder eine Gerade (Bild 13 B).

- BuTx 1

30- v

20- nN n

E 10 1 T 1 1 1 1 1 1 1 1 0 10 20 30 40 50

time (min)

Bild 13 Wirkung von [1-BuTx auf die Frequenz von m. e. p. p. einer Muskel-Endplatte gemessen in einer Ringer-Lösung, in der in Anwesenheit von EGTA (1 mM) Calcium durch Magnesium (5 mM) ersetzt wurde. Für weitere Einzelheiten siehe Bild 12. Fig. 13 Effect of ß-BuTx on the frequency of m. e. p. p. s in a Ringer solution where calcium has been substituted by magnesium (5 mM) in the presence of EGTA (l mM) at one end-plate. For other details see Fig. 12. Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 241

Wurde Calcium durch Strontium oder Cobalt ersetzt, so verzögerte sich die Frequenzabnahme nach Zugabe von 13-BuTx noch mehr als in Gegenwart von Magnesium-Ionen. Bild 14A zeigt ein Beispiel für den Effekt des Toxins in Cobalt-Ringer-Lösung. Die Cobalt-bedingte relativ hohe Frequenz von 5,7/sec fiel auf etwa l/4 in 35 min. Zugabe von Lanthan, bevor ein Plateau erreicht wurde, ergab die übliche extrem hochfrequente Entladung von Quanta, der nach einigen Minuten eine vollständige Inaktivität folgte. Die semiloga- rithmische Darstellung zeigte wieder einen geraden Verlauf der Frequenzab- nahme, d. h. sie folgte einem Mechanismus pseudo-erster Ordnung (Bild 14B). Mit Magnesium- und Strontium-Ringer-Lösung wurden, wie mit CalCium, ebenfalls eine kleinere Anzahl Experimente mit halber ß-BuTx-Konzentration (125 nM) durchgeführt. Diese ergaben wesentlich flachere Kurven für die Fre- quenz-Abnahme, bzw. kleinere Konstanten der Abfallrate, die aber in der gleichen Reihenfolge wie bei den grösseren Konzentrationen auftraten.

p-BuTx

5- u 4-

C -BuTx m I F.

100 a a 0

E2- 50-

A U 30- v ü 20- ss

E 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I I I 10 I I I 1 I I I 0 10 20 30 40 50 -10 0 10 20 30 40 time (min) time (min)

Bild 14 Wirkung von (3-BuTx auf die Frequenz von m. e. p. p. einer Muskel-Endplatte gemessen in einer Ringer- Lösung, in der in Anwesenheit von EGTA (l mM) Calcium durch Kobalt (5 mM) ersetzt wurde. Für weitere Einzelheiten siehe Bild 12. Fig. 14 Effect of (3-BuTx on the frequency of m. e. p. p. s in a Ringer solution where calcium has been substituted by cobalt (5 mM) in the presence of EGTA (l mM) at one end-plate. For other details see Fig. 12. 242 Carlo G. Caratsch

In Mangan-Ringer-Lösung war der Frequenzabfall wiederum bedeutend langsamer. Tabelle 14 und Bild 15 fassen alle diese Resultate zusammen. Aus der Tabelle kann für jedes untersuchte divalente Kation die berechnete Kon- stante der Abfallrate (Verminderung der Frequenz in % • min-') und die Zeit der Frequenzabnahme auf 50% des Ausgangswertes (t5o) bei den zwei untersuchten Konzentrationen von ß-BuTx entnommen werden. Die Wirksamkeit dieser untersuchten divalenten Kationen in der Förderung des Hemmeffektes von ß-BuTx auf die Frequenz der m.e.p.p. ist: Calcium > Magnesium > Strontium . Cobalt > Mangan. Die berechneten Werte unterscheiden sich alle statistisch signifikant voneinander mit Ausnahme derjenigen von Strontium und Cobalt, deren Wir- kungsstärke etwa gleich ist.

Tabelle 14 Wirkung von fünf divalenten Kationen auf die initiale Frequenzabnahme von m.e.p.p. an Muskel-Endplatten, die durch die Zugabe von (3-BuTx verursacht wurde. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ± S.F. (für n >_ 5) oder nur Mittelwerte (für n < 5). Table 14 Influence of five divalent cations on the first decrease in frequency of m. e. p. p. s. at muscle end-plates caused by addition of 13-BuTx. Values are given as means ± S.E. of mean (for n >_ 5) or just as mean (for n < 5).

Calcium Magnesium Strontium Cobalt Mangan

Konz. von (3-BuTx 250 nM 125 nM 250 nM 125 nM 250 nM 125 nM 250 nM 250 nM

Konstante der Abfallrate 27.8 7.3 6.5 4.3 4.2 2.5 4.l 2.6 (% Abfall • Min-1) ± 4.8 ± 0.5 ± 0.2 ± 0.4 ± 0.5

Intervall zwischen Beginn 2.1 9.2 10.3 15.8 16.l 27.1 16.7 26.8 der Abnahme und Errei- ± 0.4 ± 0.8 ± 0.9 ± l.5 ± 5.5 chen von 50% der Aus- gangsfrequenz (Min)

Zahl der Versuche 7 2 7 1 6 2 5 5

Bild 15 Wirkung von fünf divalenten Katio- nen auf die initiale Verminderung der Fre- quenz von m. e. p. p. an Muskel-Endplatten, die durch Zugabe von (3-BuTx (250 nM) ins Bad verursacht wurde. Jede Gerade ist der Mittelwert von fünf bis sieben Experimenten. Abszisse: Zeit in Minuten. Ordinate: log. der Frequenz als Prozent der Kontrollfrequenz. Fig. 15 Influence of five divalent cations on the initial decrease in frequency of m. e. p. p. s at frog neuromuscular junctions, caused by addition of 13-BuTx (250 nM) to the bath. Each line is the mean of five to seven experiments. Abscissa: time in minutes. Ordinate: log of the frequency expressed as percentage of control frequency. Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 243

2.5.4 Experimente in Ringerlösung ohne divalente Kationen Es blieb die Frage offen, ob der erste Hemmeffekt von 3-BuTx auf die Freiset- zung von Transmittor-Quanta überhaupt auf die Anwesenheit von divalenten Kationen im extrazellulären Medium angewiesen sei. Um dies abzuklären, wurden einige VersuChe in einer Ringer-Lösung ohne divalente Kationen und mit EGTA (1 mM) durchgeführt. Unter diesen Bedingungen treten m. e. p. p. immer noch auf, aber mit kleinerer Frequenz, wahrscheinlich weil die durCh das Fehlen divalenter Kationen bedingte Verminderung ihrer Amplitude das Auffinden und Zählen der kleineren m. e. p. p. erschwert (R. Miledi und R. E. Thies, 1967, 1971). In diesen Untersuchungen bewirkte die Zugabe von ß-BuTx in der übli- chen Konzentration (250 nM) entweder keine Abnahme der m. e. p. p.-Fre- quenz (in drei Experimenten) oder nur eine sehr langsame (in zwei Experi- menten, siehe als Beispiel Bild 16). Diese Resultate bestätigen frühere Beob- achtungen (T. Abe und R. Miledi, persönliChe Mitteilung).

-BuTx La 1 1

Bild 16 Wirkung von 13-BuTx auf die Fre- quenz von m. e. p. p. einer Muskel-Endplatte, gemessen in einer Ringer- Lösung ohne divalente Kationen in Anwesenheit von EGTA (l mM). Für weitere Einzelheiten siehe Bild 12. Fig. 16 Effect of (3-BuTx on the frequency of m. e. p. p. s in a divalent cation-free Ringer solution during one single experiment. At time 0 13-BuTx (final concentration 250 nM) and at La lanthanum (final concentration 1 mM) were added to the bath. For other details see Fig. 12. i i i i i i I I I I i 0 10 20 30 40 50 time (min)

2.5.5 Schlussfolgerungen Die Analyse des ersten PhLp-unabhängigen Hemmeffekts von (3-BuTx zeigt, dass mit allen untersuchten divalenten Kationen dieses Neurotoxin eine expo- nentielle Frequenzabnahme der spontanen Freisetzung von Transmittor- Quanta verursacht. Somit deuten unsere Resultate darauf hin, dass diese Hemmung ein Phänomen ist, dessen Kinetik siCh einer solchen erster Ord- nung annähert. 244 Carlo G. Caratsch

Dieser Hemmeffekt wird wenig von der Temperatur beeinflusst, hängt aber eindeutig ab von der Art der divalenten Kationen, die im extrazellulären Mi- lieu anwesend sind. Die ermittelte Reihenfolge der Wirksamkeit in diesem Prozess ist aber verschieden von der ihrer Wirksamkeit bei der Unterstützung der PhLp-Aktivität. Hier ist Calcium notwendig für die enzymatische Aktivi- tät, während von den übrigen Kationen Strontium, Magnesium, Mangan nur einen kleinen Resteffekt besitzen (T. Abe et al., 1977b). Divalente Kationen scheinen ein gemeinsamer Faktor im Wirkungsmecha- nismus von verschiedenen präsynaptisch wirkenden Schlangen-Neurotoxinen zu sein. So wird eine Fraktion aus dem Giftstoff der SChlange Dendroaspis angusticeps in ihrer Wirkung von divalenten Kationen beeinflusst (A. L. Harvey und P. W. Gage, 1981). Weiterhin wurde gezeigt, dass am Histidin-Rest modifi- ziertes, PhLp-inaktiviertes Crotoxin und Notexin in ihrer Hemmwirkung ebenfalls von divalenten Kationen abhängig sind (C. C. Chang und M. S. Su, 1982). In letzter Zeit wurden verschiedene Studien über den BindungssChritt des ß-BuTx an präsynaptischen Membranen und seine Abhängigkeit von divalenten Kationen publiziert. Die Resultate sind allerdings etwas widersprüchlich. B. Othmann, J.W. Spokes und J.O. Dolly (1981) haben beschrieben, dass die Bindung von titriertem ß-BuTx an Synaptosomen aus dem cerebralen Cortex der Ratte unabhängig von Calcium ist. Weiterhin haben M. Donlon, W. Shain, G. S. Tobias und G. W. Marinette (1982) gezeigt, dass die Bindung einer iodierten ß-BuTx-Variante mit einem Molekulargewicht von 11 000 an synaptischen Membranen von Rattenhirn, von gewissen divalenten Kationen gehemmt wird. Nach dieser Arbeit ist Magnesium ein schlechterer Hemmer (und deswegen ein besserer Promotor) als Strontium. Unsere Resultate sind in besserer Übereinstimmung mit denjenigen von H. Rehm und H. Betz (1982). Diese Autoren haben mit biochemisChen Methoden die Bindung von iodierten ß-BuTx an synaptische Membranen aus Hühnerhirn studiert. Sie fanden, dass die Bindung stark von der Präsenz divalenter Kationen abhängt, und dass in ihrer Abwesenheit sie auf ca. 7 % reduziert wird. Die Reihenfolge der Kationen naCh ihrer Wirksamkeit unterscheidet siCh allerdings etwas von der bei uns gefundenen. Während bei ihnen Ringer-Lösungen mit Calcium, Ma- gnesium oder ohne divalente Kationen mit unseren vergleichbare Resultate zeigten, besassen in ihren Untersuchungen Cobalt und Strontium eine ähnli- che Wirkungsstärke wie Calcium. Diese Unterschiede können in den verschiedenen Substraten – intakte Froschmuskel-Nervenendigungen und Synaptoso- men gewonnen aus Hühnergehirn – oder in den möglicherweise verschiedenen Strukturen des unbehandelten, bzw. iodierten 13-BuTx begründet sein. In jedem Fall spielt Calcium eine wesentliche Rolle im Wirkungsmechanis- mus des ß-BuTx. Einerseits ist Calcium ein notwendiger Co-Faktor für die Aktivität der PhLp A2, die einen wiChtigen, wenn auch etwas unspezifischen Teil seiner Toxizität ausmacht. Hier kann Calcium nicht ersetzt werden, ohne einen radikalen Verlust dieser enzymatischen Eigenschaft zu bewirken. Aus- Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 245 serdem aber hat Calcium auch einen Einfluss auf die erste Phase der Wirkung von ß-BuTx, und hier können gewisse divalente Kationen Calcium mit unter- schiedlichem Erfolg ersetzen. Diese Resultate können zum Verständnis des spezifischen Wirkungsmecha- nismus präsynaptisch wirkender Neurotoxine beitragen, mit deren Hilfe das Phänomen der Steuerung der Neurotransmittor-Freisetzung weiter erforscht werden kann.

3 Zusammenfassung/Summary

Die vorliegende Arbeit ist in zwei Teile gegliedert. Im ersten Teil wird eine Übersicht über die peripher wirkenden Neuro- toxine und eine Charakterisierung dieser Wirkung gegeben. Das Interesse der neurobiologischen Forschung an Neurotoxinen ist in der hohen Spezifität ihrer Wirkung begründet. Da die meisten dieser Toxine äusserst gezielt einzelne Funktionen im Ablauf einer synaptisChen Übertragung oder in der Erregungs- leitung längs erregbarer Membranen beeinflussen, sind sie geeignete Werk- zeuge für das Studium dieser Ereignisse. Mit ihrer Hilfe können die neuro- physiologisChen Kenntnisse vertieft werden. Neurotoxine sind Substanzen, die toxisch auf das Nervensystem wirken und von Lebewesen produziert werden. In dieser Arbeit wird dieses grosse Gebiet eingeschränkt, in dem nur Toxine, die spezifisch auf das periphere Nervensystem wirken, und ausserdem nur solche, die von Mikroorganismen oder von Tieren produziert werden, berücksichtigt sind. Je nach Typ ihrer spezifischen toxischen Aktivität werden die Neurotoxine in drei Gruppen eingeteilt: (I) präsynaptisch wirkende Neurotoxine, (II) postsynaptisch wirkende Neurotoxine — zwei Gruppen, die hauptsächlich (aber niCht ausschliesslich) an der neuromuskulären Synapse wirken — und (III) Neurotoxine mit Wirkung auf Ionen-Kanäle, ganz besonders auf die Na- trium-Kanäle der erregbaren Membranen. Um die Übersicht zu erleichtern, werden einzelne Gruppen nach Ursprung der Toxine oder nach ihren spezifischen toxischen Effekten weiter unterteilt. Bei der Charakterisierung werden für jedes einzelne Toxin folgende Daten (soweit vorhanden) angegeben: Ur- sprung des Neurotoxins; chemische Angaben; Wirkungsort; Beschreibung des Effektes mit Wirkungsmechanismus, Wirkungsstärke, Toxizität und Bin- dungseigenschaften. Im zweiten Teil wird über eigene Arbeiten berichtet, die eine Analyse des Wirkungsmechanismus von (3-Bungarotoxin (3-BuTx), einem präsynaptisch wirksamen Schlangen-Neurotoxin, zum Ziel hatten. Daraus gewonnene Kenntnisse sollen ein Hilfsmittel zum Verständnis von Mechanismen sein, die zur Freisetzung von Neurotransmittoren führen. Die komplexe Wirkung von ß-BuTx auf die Freisetzung von Acetylcholin 246 Carlo G. Caratsch

(ACh) an der motorischen Endplatte hat einen charakteristischen triphasischen Verlauf: initiale Hemmung, sekundäre Verstärkung und tertiärer Block. Dieser Verlauf wird auf das Zusammenwirken zweier Mechanismen zurück- geführt. Einerseits verursacht eine bekannte Phospholipase (PhLp) A2-Aktivi- tät des Toxins die sekundäre und tertiäre Phase der Wirkung durCh enzymatischen Abbau von Phospholipiden aus Nervenendigungs-Membranen. Ande- rerseits bedingt ein postulierter PhLp-unabhängiger Effekt die initiale rasche Hemmung der ACh-Freisetzung. Der erste Schritt zur Analyse des Wirkungs- meChanismus von ß-BuTx war der Versuch, eine klare Trennung dieser zwei Effekte zu erreichen. Zu diesem Zweck wurde die Wirkung von ß-BuTx an einzelnen motorischen Endplatten des Frosches mit Hilfe elektrophysiologischer Methoden untersucht. Unter verschiedenen experimentellen Bedingun- gen, bei denen die enzymatische Aktivität unterdrückt war, wurde der erste PhLp-unabhängige Effekt des Toxins allein analysiert. Dadurch konnte bewiesen werden, dass dieser Effekt selbständig zu einer Hemmung der synaptischen Übertragung genügt. Ausserdem wurde eine Dosis-Wirkungs-Kurve dieses Effektes aufgestellt und seine Kinetik studiert. Der immunologische Weg bietet eine andere Möglichkeit zur Unter- suchung der komplexen Wirkung von 13-BuTx und speziell der Rolle seiner endogenen PhLp-Aktivität. Es wurden Antisera gegen das natürliche (3-BuTx und gegen ein enzymatisch inaktives Derivat gewonnen und ihr Ein fluss auf die Wirkung dieser Toxine studiert. In bioChemischen Experimenten hemmten beide Antisera die PhLp-Aktivität des natürlichen ß-BuTx, was auf ge- meinsame Antigene hinweist. Der Einfluss des spezifischen Anti-ß-BuTx-An- tiserums auf die triphasische Wirkung des natürliChen Toxins wurde elektro- physiologisCh untersuCht und zeigte, dass beide Effekte des ß-BuTx gehemmt werden. Dies lässt die Annahme zu, dass eine weitere Fraktion der polyclona- len Antikörper mit der «Erkennungsstelle» des Toxins interagiert. Um die Hemmung der ACh-Freisetzung durch ß-BuTx besser abzuklären, wurden die ionischen Bedingungen (Ein fluss divalenter Kationen) für den PhLp-unabhängigen Effekt untersucht. Diese Experimente wurden an einzelnen motorischen Endplatten durch Messung der spontanen Freisetzung von ACh-Quanten durchgeführt. Die Resultate ergaben, dass die untersuchten Kationen den Hemmeffekt von 13-BuTx unterschiedliCh stark forderten: Cal- cium > Magnesium > Strontium Cobalt > Mangan. In Abwesenheit aller divalenten Kationen zeigte ß-BuTx praktisch keine Wirkung mehr. Bei allen Experimenten in Anwesenheit von divalenten Kationen folgten die Hemm- kurven annähernd einer Kinetik erster Ordnung, was darauf hindeutet, dass die Hemmung der Freisetzung von ACh hauptsächlich von der Konzentration des Toxins abhängig ist. Diese Resultate lassen erkennen, dass ß-BuTx divalente Kationen benötigt, um an die Membran der Nervenendigung gebunden zu werden und gleichzeitig die ACh-Freisetzung initial zu hemmen. Calcium besitzt hier – zusätzlich zu seiner Rolle als essentieller Cofaktor für die PhLp- Aktivität – eine entsCheidende Funktion. Die Bedeutung perlpher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 247

This essay is divided into two parts.

The first part contains a survey of the peripherally acting neurotoxins and a characterization of their effects. The reason for the interest of neurobiologi- cal research in neurotoxins lies in the high specificity of their effect. Since most of these toxins are able to influence in a decisive way single functions in the phenomenon of a synaptiC transmission, they represent valuable tools for the research of these mechanisms. With their help it is possible to raise the level of our neurophysiological knowledge. Neurotoxins are substances toxic to the nervous system and produced by organisms. In this survey this large field has been reduced by restricting the attention to toxins which act specifically on the peripheral nervous system and are produced by microorganisms or by animals. According to their speCific toxic activity the neurotoxins are classified in three groups: (I) presynaptically acting neurotoxins, (II) postsynaptically acting neurotoxins – two groups which take effect mainly (but not exclusively) on neuromuscular junctions – and (III) neurotoxins with an effeCt on ionic channels, especially on the sodium channel of excitable membranes. In order to faCilitate a survey the single groups have been further subdivided according to the origin of the toxins and their specific effects. The characterization of each single neurotoxin will include the following data (if available): origin of the neurotoxins; chemical data; site of their effect; description of their effect with the mechanism of aCtion, intensity of their effeCt, toxicity and binding characteristics. The second part is a report on studies of my own in order to analyze the mechanism of action of ß-Bungarotoxin (3-BuTx), a presynaptically acting snake neurotoxin. The knowledge gained from these studies may help in the understanding of the mechanisms which regulate the release of neurotrans- mitters. The complex action of ß-BuTx on the release of acetylcholine (ACh) at the neuromuscular junction has a characteristic triphasiC effeCt: initial inhibition, secondary increase and tertiary bloCk. This course of the effect is asCribed to the interaction of two mechanisms of action. On the one hand a well known phospholipase (PhLp) A2 activity of the toxin induces the secondary and tertiary phases of the observed effect through enzymatical hydrolysis of phos- pholipids in the membrane of the nerve endings. On the other hand a postu- lated phospholipase-independent effect may cause the initial, early inhibition of transmitter release. The first step in analyzing the complex mechanism of action of 3-BuTx was therefore the attempt to obtain a clear separation of these two effects. For this purpose its effect at the frog neuromuscular junction was studied with the help of electrophysiological techniques. The initial, early phase of the effect of ß-BuTx was studied under conditions where the enzymatic activity was blocked in various ways. Thereby it was possible to prove that this early inhibition phase in itself can block neuromuscular trans- 248 Carlo G. Caratsch mission. The dose-response curve of this effect was calculated and its kinetic qualities were analyzed. Another approach to study the complex effect of ß-BuTx, and more specifically the importance of its endogenous PhLp-activity, was the immunological one. Anti-toxin antisera against both the native toxin and an enzymatically- inactive derivative were raised, and their influence on the effeCt of ß-BuTx studied. In biochemical experiments both antisera inhibited the PhLp-aCtivity of the native 3-BuTx, evidenCe for their sharing common antigenes. In electro- physiologiCal experiments, the influence of the specific anti-(3-BuTx antiserum on the triphasic effect of the native toxin proved both typical actions to be blocked, suggesting that another fraction of the polyclonal antibodies may possibly interact with the "recognition site" of the toxin for the membrane of the nerve-endings. In order to analyze more exactly the initial early inhibition of the neuro- transmitter release, the ionic Conditions (ie. the influence of the presence of. divalent cations) for the phospholipase-independent action have been analyzed. These experiments were performed by measuring the frequenCy of the spontaneous release of ACh-quanta at individual end-plates. The results ob- tained prove that the potency of these cations in promoting the initial phase of the 13-BuTx effect was different depending on the cation used: calcium > magnesium > strontium a cobalt > manganese. In the absence of any divalent cations f3-BuTx showed practically no effeCt. With all experiments in the presence of divalent cations the inhibition curves followed approximately first-order kinetics, suggesting that this effect depends mainly on toxin concentration. These results indicate that ß-BuTx requires divalent Cations in order to bind to the membrane of nerve terminals and exert its initial inhibitory effect on ACh-release. CalCium, in addition to its role as an essential cofactor in phospholipase-activity, has an essential function here, too.

4 Liste der Abkürzungen

ACh Acetylcholin AChR Acetylcholin- Rezeptor a. p. Aktions-Potential AS Aminosäure 13-BuTx 13-Bungarotoxin EDso Dosis, welChe bei 50% der Individuen eines Kollektivs eine bestimmte Wirkung hervorruft EGTA AethylenglyCol-bis-(ß-aminoethylether)-N,N-tetraessigsäure e. p. c. Endplatten-Strom e. p. p. Endplatten-Potential e. p. s. p. Exzitatorisches postsynaptisches Potential ICM Ionic channel modulator (Ionen-Kanal-Modulator) Die Bedeutung peripher wirkender Neurotoxine zur Erforschung neurophysiol. Prozesse 249 i. p. s. p. Inhibitorisches postsynaptisches Potential LDso Dosis, bei welcher 50% der Individuen eines Kollektivs ster- ben m. e. p. c. Miniatur-Endplatten-Strom m. e. p. p. Miniatur-Endplatten-Potential nAChR Nikotinischer AcetylCholin-Rezeptor NT Neurotoxin PBP-13-BuTx Para-Bromo-Phenacyl-ß-Bungarotoxin PhLp Phospholipase S-S Disulfid-Bindung ZNS Zentral-Nerven-System

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Mein Dank gebührt Herrn Prof. Dr. P.G. Waser für seine Unterstützung und das Interesse, das er für diese Arbeit bekundet hat. Für die Durchsicht des Textes möchte lch Frau Dr. N. Heer und Frau Dr. C. Steinbach sowie für die sorgfältige HeIstellung des Manuskripts Frau R. Steiger meinen herzlichen Dank ausspre- chen. Herrn S. Schumacher danke ich für seine technische Mltarbeit. Die finanzielle Unterstützung des Nationalfonds (Projekt Nr. 3.293-0.85) sei dankbar aner- kannt.

PD Dr. med. Carlo G. Caratsch, Institut für Pharmakologie der Universität Zürich, Gloriastrasse 32, 8006 Zürich.