Avaliação Da Toxicidade Do Cloridrato Polihexametileno Biguanida (PHMB) Em Biomphalaria Glabrata (Say 1818)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DA RELAÇÃO PARASITO-HOSPEDEIRO

Amanda de Oliveira Melo

Avaliação da toxicidade do cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) em Biomphalaria glabrata (Say 1818)

Goiânia 2018

Amanda de Oliveira Melo

Avaliação da toxicidade do cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) em Biomphalaria glabrata (Say 1818)

Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre

Orientador: Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra Coorientador: Prof. Dr. Thiago Lopes Rocha

Goiânia 2018

Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluna: Amanda de Oliveira Melo

Orientador: Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra

Coorientador: Prof. Dr. Thiago Lopes Rocha

Membros:

1. Prof. Dr. José Clecildo Barreto - UFG

2. Dra. Daniella de Sousa Mendes Moreira Alves - UFG

3. Profa. Dra. Luciana Damacena Silva - UEG

Data: 14/09/2018

A minha amada família, em especial aos meus pais, minha irmã e meu namorado.

AGRADECIMENTOS

Agradeço, primeiramente, a Deus por todas as conquistas concedidas a mim e a toda minha família para o desenvolvimento deste trabalho ao qual eu me propus realizar.

Agradeço aos meus pais, Wilmar e Luciana, pelo carinho e amor. Vocês foram meus exemplos de persistência, coragem, força e determinação, sempre me incentivando a continuar e a buscar melhores resultados. A vocês todo o meu amor.

Agradeço a minha irmã Natália, uma pessoa iluminada que sempre me mostrou que eu posso ir além.

Agradeço ao meu namorado Luiz Claudio, que me incentivou e me apoiou em todas as minhas decisões, sempre me fazendo sorrir com sua alegria.

Agradeço a todos os meus familiares, em especial aos meus avós que me motivaram com seus ensinamentos.

Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. José Clecildo, pela confiança depositada em meu trabalho, e por abrir as portas do seu laboratório a mim. Seus ensinamentos colaboraram para minha formação durante o mestrado e eu os levarei para a vida toda.

Meus agradecimentos também se direcionam ao meu coorientador Prof. Dr. Thiago, por ter me recebido tão bem, sempre disposto a me ajudar e a colaborar com a minha pesquisa. Suas correções e instruções para o desenvolvimento deste trabalho foram de grande valia. Obrigada pela dedicação!

Agradeço imensamente aos colaboradores deste trabalho, Profa. Dra. Luciana Damacena Silva, Profa. Dra. Daniela Melo, Dra. Juliana Avelar, Ms. Fabrício Moreira e Me. Daniela Braz por toda a ajuda para o desenvolvimento deste trabalho e pelos ricos ensinamentos que recebi.

Agradeço também aos amigos do Laboratório de Estudos da Relação Parasito Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás, Ms. Guaraciara, Ms. Nayana, Geisa, Dra. Daniella Sousa, Me. Thaynara, Ms. Heloísa, Pedro Eugênio, Paulo, Ms. Francesca, Ms. Jaqueline, Dra. Caroline, Dr. Hanstter, Jade, Antônio, Daiane, Guiliane e Ms. Jéssica pelos momentos de aprendizado.

Agradeço aos amigos e colegas do Laboratório de Biotecnologia Ambiental e Ecotoxicologia da Universidade Federal de Goiás.

Agradeço aos pesquisadores e estudantes do Laboratório de Mutagênese da Universidade Federal de Goiás, por me receberam tão bem, Dra. Fernanda Godoy, Dra Wanessa Carvalho, Dr. Hugo Freire, Ms. Jhennefer Ramos, Ms. Thaís Alves e Ms. Alice Tâmara.

Agradeço aos meus amigos da graduação Cárita Ribeiro, Leonardo Martins, Déborah Carolina, Caroline Gusmão e Pedro Porto pelo apoio e incentivo durante o mestrado.

Agradeço a secretaria e a coordenação do Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito Hospedeiro.

Agradeço a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pela concessão da bolsa, ao Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública e a Universidade Federal de Goiás, por possibilitarem a realização deste trabalho.

SUMÁRIO

TABELAS E FIGURAS ...... 12 SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ...... 14 RESUMO ...... 16 CAPÍTULO I ...... 1 1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DE LITERATURA ...... 1 1.1 Histórico da esquistossomose ...... 1 1.1 Ciclo biológico de Schistosoma mansoni ...... 4 1.2 Moluscos do gênero Biomphalaria ...... 7 1.3 Características biológicas de Biomphalaria glabrata ...... 9 1.4 Distribuição geográfica de Biomphalaria glabrata no Brasil ...... 14 1.5 Controle da esquistossomose ...... 15 1.6 Utilização de moluscicidas no controle da esquistossomose ...... 16 1.7 Niclosamida ...... 18 1.8 Cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) ...... 20 1.8.1 Estrutura ...... 20 1.8.2 Aplicações e benefícios ...... 21 1.9 Testes genotóxicos ...... 22 1.9.1 O Ensaio cometa na avaliação de danos do DNA ...... 23 1.9.2 Fundamentos do ensaio cometa ...... 24 1.9.3 Ensaio cometa em Biomphalaria glabrata ...... 25 1.10 Teste do micronúcleo ...... 26 2. JUSTIFICATIVA ...... 28 3. OBJETIVOS ...... 30 3.1 Objetivo Geral ...... 30 3.2 Objetivo Específico ...... 30 CAPÍTULO II – ARTIGO I ...... 32 1. Introduction ...... 35 2. Materials and methods ...... 36 2.1 Test substance ...... 36 2.2. Snails ...... 37 2.3. Snail embryotoxicity test ...... 37 2.4. Acute toxicity tests with new-borns and adult snails ...... 38

2.5. Behavioural assessment ...... 38 2.6 Statistical analysis ...... 39 3. Results and discussion ...... 39 3.1 Embryotoxicity ...... 39 3.2 Toxicity to new-borns and adult snails ...... 44 4. Conclusion ...... 48 References ...... 50 CAPÍTULO III – ARTIGO II ...... 58 1. Introduction ...... 61 2. Materials and Methods ...... 62 2.1 Snails ...... 62 2.2 Substance test ...... 63 2.3 Exposure ...... 63 2.4 Genotoxicity ...... 63 2.5 Mutagenicity ...... 64 2.6 Statistical analysis ...... 65 3. Results and discussion ...... 65 3.1 Comet assay ...... 65 3.2 Micronucleus Test ...... 69 4. Conclusion ...... 72 References ...... 74 CAPÍTULO IV – CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 82 ANEXOS ...... 84 REFERÊNCIAS ...... 85

TABELAS E FIGURAS

Capítulo I

Figura 1 - Países e áreas de risco da esquistossomose no mundo ...... 2

Figura 2 - Vermes adultos de Schistosoma mansoni ...... 5

Figura 3 - Ciclo biológico das espécies de Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum e Schitosoma haematobium ...... 6

Figura 4 - Exemplar da espécie de Biomphalaria glabrata ...... 9

Figura 5 - Esquema geral do corpo de Biomphalaria glabrata ...... 10

Figura 6 - Massa ovígera de Biomphalaria glabrata com 12 horas de desenvolvimento embrionário ...... 12

Figura 7 - Distribuição de Biomphalaria glabrata no Brasil ...... 14

Figura 8 - Países que utilizaram o controle de hospedeiros intermediários de Schistosoma spp ...... 17

Figura 9 - Fórmula molecular do composto 5-cloro-N-(2-cloro-4-nitrofenil)- 2hidroxibenzamida, Niclosamida, comercialmente chamada de Bayslucida® ...... 18

Figura 10 - Fórmula molecular do composto cloridrato polihexametileno biguanida ...... 20

Figura 11 - Imagem de nucleóide formando cometa com dano ao DNA ...... 24

Capitulo II

Figura 1 - Estádios iniciais de desenvolvimento de Biomphalaria glabrata ...... 38

Figura 2 - Frequência (%) dos estádios iniciais de desenvolvimento de Biomphalaria glabrata após exposição ao cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) por 144 h ...... 40

Figura 3 - Taxa de eclosão (%) de Biomphalaria glabrata após exposição a cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) por 144 h ...... 41

Figura 4 - Alterações morfológicas em embriões de Biomphalaria glabrata após exposição ao cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) por 144 h ...... 42

Figura 5 - Taxa de mortalidade (%) de embriões (A) de recém-nascidos (B) e adultos (C) de Biomphalaria glabrata após exposição ao cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) por 144 horas para embriões e 96 horas para recém-nascidos e adultos ...... 45

Figura 6 - Proporção de alterações no comportamento de Biomphalaria glabrata após a exposição ao cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) por 96 horas ...... 47

Tabela 1 - Frequência (%) de alterações morfológicas nos estádios iniciais de desenvolvimento de Biomphalaria glabrata após exposição ao cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) por 144 h ...... 43

Tabela 2 - Efeitos tóxicos do cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) nos estádios iniciais de desenvolvimento, embriões, recém-nascidos e adultos de Biomphalaria glabrata. Os resultados são apresentados como médias (limite inferior - limites superiores) ...... 44

Capítulo III

Figura 1 - Danos no DNA expressos como % de DNA da cauda (média ± DP) em Biomphalaria glabrata do controle e expostos ao cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) durante 48 horas ...... 66

Figura 2 - Imagem de ensaio cometa representativo em hemócitos de Biomphalaria glabrata do controle e expostos ao cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB), grupo controle (A), 0,5 mg L-1 (B), 1,0 mg L-1 (C), 1,5 mg L-1 (D) ...... 67

Figura 3 - Alterações nucleares de hemócitos de Biomphalaria glabrata do controle e exposto ao cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) por 48 horas ...... 70

Figura 4 - Alterações nucleares de hemócitos observadas em Biomphalaria glabrata após exposição ao PHMB ...... 71

Tabela 1 - Frequência de hemócitos (%) distribuídos pelo grau de dano ao DNA em Biomphalaria glabrata do controle e expostos ao cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) por 48 horas ...... 68

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

ANOVA - Análise de Variância Multidirecional

AU - Unidade Arbitrária

BB - Núcleo Blebbed

BE - Núcleo Broken-eggs

BN - Binucleado

CL50 - Concentração Letal Mediana

DNA - Ácido Desoxirribonucleico

HNA - Alterações Nucleares Hemocitárias

IDH - Índice de Desenvolvimento Humano

IL - Interleucina

KN - Núcleo Kidney-shaped

LN - Núcleo Lobado

LOEC - Concentração do Menor Efeito Observado

MDA - Malondialdeído

MN - Micronúcleo

MOA - Mecanismo de Ação

NFKβ - Fator de Transcrição Nuclear β

NOEC - Concentração de Efeito Não Observado

NTD - Doenças Tropicais Negligenciadas

OCDE - Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico

OMS - Organização Mundial da Saúde

OTM - Moment Olive Tail

PHMB - Cloridrato Polihexametileno Biguanida

RNA - Ácido Ribonucleico

TL - Comprimento da Cauda

TNFα - Fator de Necrose Tumoral

WHO - World Health Organization

RESUMO

Os caramujos do gênero Biomphalaria atuam como primeiro hospedeiro no ciclo do parasito Schistosoma mansoni, causador da esquistossomose no Brasil. O controle dessa parasitose pode ser feito através do controle químico dos caramujos hospedeiros. A Organização Mundial da Saúde (OMS), recomenda a niclosamida como agente moluscicida. Entretanto este composto químico apresenta toxicidade à fauna e a flora aquática, baixa solubilidade e alto custo, os quais demonstram a necessidade do surgimento de novos compostos moluscicidas. O presente estudo propõe avaliar a atividade moluscicida do cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) para o caramujo B. glabrata. Os bioensaios foram realizados em três fases distintas do caramujo, sendo elas embriões, recém-eclodidos e adultos, com as mesmas concentrações de PHMB avaliadas: 0,6; 1,0; 1,6; 2,0; 2,6; 3,0 e 3,6 mg L-1, durante 144 e 96 horas respectivamente. A avaliação da genotoxicidade e da mutagenicidade do PHMB foi realizada em hemócitos de caramujos adultos através do ensaio cometa e do teste de micronúcleo e HNA respectivamente, com as concentrações de 0,5; 1,0; 1,5 mg L-1 durante 48 horas de exposição. O PHMB não impediu o desenvolvimento embrionário, mas impediu a eclosão -1 dos caramujos em concentrações acima de 1,6 mg L , resultando em mortalidade. A CL50 do PHMB para os embriões foi 0,98 mg L-1. Em caramujos recém-eclodidos e adultos, o -1 PHMB se demonstrou bastante tóxico, com CL50 de 1,43 e 1,49 mg L , respectivamente. Os resultados apresentados pela avaliação da genotoxicidade e da mutagenicidade do PHMB demonstraram que apenas as concentrações de 1,0 e 1,5 mg L-1 causaram efeito genotóxico. E o PHMB na concentração de 1,0 mg L-1 durante 48 horas induziu a formação de micronúcleos e alterações nucleares no hemócitos de B. glabrata. Este é o primeiro estudo que avalia a atividade moluscicida do PHMB em B. glabrata. A toxicidade do PHMB foi confirmada em todas as fases de B. glabrata analisadas, sendo os embriões a fase mais sensível. Além disso o PHMB induziu genotoxicidade no caramujo de forma não dependente da concentração, e apenas nas concentrações mais altas este composto se mostrou mutagênico.

Palavras chave: esquistossomose, caramujo, moluscicida, ensaio cometa, teste do micronúcleo, embriotoxicidade, biomarcadores.

ABSTRACT

The snails of the genus Biomphalaria act as the first host in the cycle of the parasite Schistosoma mansoni, which causes schistosomiasis in Brazil. The control of this parasitosis can be done through the chemical control of host snails. The World Health Organization (WHO) recommends niclosamide as a molluscicidal agent. However, this chemical presents toxicity to aquatic fauna and flora, low solubility and high cost, which demonstrate the need for the appearance of new molluscicidal compounds. The present study proposes to evaluate the molluscicidal activity of the polyhexamethylene biguanide hydrochloride (PHMB) for the B. glabrata snail. The bioassays were performed in three distinct stages of the snail, being embryos, new hatchlings and adults, with the same PHMB concentrations evaluated: 0.6; 1.0; 1.6; 2.0; 2.6; 3.0 and 3.6 mg L-1, for 144 and 96 hours respectively. The genomic and mutagenicity evaluation of PHMB was performed on adult sperm hemocytes through the comet assay and the micronucleus and HNA test respectively, with concentrations of 0.5; 1.0; 1.5 mg L-1 for 48 hours of exposure. PHMB did not prevent embryonic development, but prevented hatching of -1 snails at concentrations above 1.6 mg L , resulting in mortality. The LC50 of the PHMB for the embryos was 0.98 mg L-1. In newly hatched snails and adults, PHMB was shown -1 to be quite toxic, with LC50 of 1.43 and 1.49 mg L , respectively. The results presented by the PHMB genotoxicity and mutagenicity evaluation showed that only concentrations of 1.0 and 1.5 mg L-1 caused genotoxic effect. The PHMB at the concentration of 1.0 mg L-1 for 48 hours induced the formation of micronuclei and nuclear alterations in B. glabrata hemocytes. This is the first study evaluating the molluscicidal activity of PHMB in B. glabrata. The toxicity of PHMB was confirmed in all phases of B. glabrata analyzed, the embryos being the most sensitive phase. In addition, PHMB induced genotoxicity in the snail in a non-concentration-dependent manner, and only at the highest concentrations did this compound prove to be mutagenic.

Key-words: schistosomiasis, snail, molluscicide, comet assay, micronucleus test, embryotoxicity, biomarkers.

Capítulo I Revisão de Literatura

CAPÍTULO I

1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DE LITERATURA

1.1 Histórico da esquistossomose

As esquistossomoses, popularmente conhecidas como bilharzíases ou barriga d’água, são doenças parasitárias causadas por trematódeos do gênero Schistosoma que, para o homem, tem como principais agentes etiológicos as espécies Schistosoma haematobium, S. japonicum, S. mansoni. Na esquistossomose haematóbica, também conhecida como esquistossomose urinária, ou geniturinária, o parasito S. haematobium localiza-se de preferência no plexo vesical. Sua distribuição é predominante africana, estendendo-se também a outras áreas da bacia do mediterrâneo. Os moluscos vetores são espécies do gênero Bulinus. Já a S. japonicum é responsável pela esquistossomose intestinal que ocorre ao Extremo Oriente e Pacífico Ocidental, onde se encontram os hospedeiros intermediários do gênero Oncomelania. A espécie S. mansoni ocorre na África, nas Antilhas e na América do Sul, onde determina uma infecção denominada esquistossomose mansônica ou intestinal, pela localização dos parasitos nas vênulas da parede do intestino grosso, sigmoide e reto. Sua distribuição geográfica está condicionada pela distribuição de algumas espécies de moluscos de água doce, do gênero Biomphalaria, hospedeiros intermediários de S. mansoni (Rey, 2008; Colley et al. 2014).

As primeiras observações sobre o agente etiológico da esquistossomose, foram feitas em 1851 no Egito, pelo médico patologista alemão Theodor Bilharz. No Brasil a história da esquistossomose teve início em 1866, quando em Berlim, o pesquisador Griesinger enviou uma carta a Otto Wucherer, sugerindo-lhe verificar ovos de Schistosoma haematobium, em pacientes com hematúria na urina (Paraense 2008). Em 1902, Manson encontrou ovos de bilharzia, com espícula lateral por toda massa fecal de alguns pacientes, e acreditou que havia duas espécies de bilharzia. No ano de 1907 Sambon propôs a criação de uma nova espécie do parasito no homem, e denominou-a de Schistosoma mansoni (Paraense 2008).

No ano de 1908, no Brasil, o cientista baiano Pirajá da Silva, encontrou um ovo muito semelhante ao de S. mansoni, no sangue fresco de um adolescente nativo de Salvador. Mas pouco se sabia sobre o ciclo do parasito e o hospedeiro intermediário ainda era desconhecido. Porém Pirajá da Silva avançou em seus estudos, e concordou com Manson e Sambon, que os ovos com espinho lateral indicavam uma terceira espécie de S. mansoni. Em 1916 Lutz, confirmou todos os resultados a que chegou Leiper, no Egito, sobre o ciclo da esquistossomose, ou seja, confirmou a caracterização dos vermes adultos, além disso reconheceu como hospedeiros intermediários a Biomphalaria glabrata (então denominada de Planorbis divaceus e P. guadalculpensis) e a B. straminea (então P. centimetralis), descrevendo as lesões principais nelas produzidas pelo parasito. Descreveu a cercária, observando as condições de sua libertação do corpo do caramujo e sua penetração em animais de laboratório. Confirmou a caracterização dos vermes adultos feita por Pirajá da Silva e Leiper. E ocupou-se finalmente da infecção humana e experimental sob aspectos sintomatológicos, patogênico, anatomopatológico, terapêutico e profilática. (Paraense 2008).

Schistosoma mansoni foi introduzido as África para o hemisfério ocidental, durante o tráfico de escravos. Quanto aos caramujos hospedeiros intermediários, investigações sistemáticas moleculares têm indicado origem americana do gênero Biomphalaria. Sobre a doença, a esquistossomose afeta cerca de 200 milhões de pessoas, e mais de 600 milhões vivem em áreas sob o rico de contrair a doença (Figura 1). Além disso cerca de 120 milhões de pessoas apresentam os sintomas da doença e 20 milhões de pessoas apresentam a forma grave da doença. Atualmente a esquistossomose é endêmica em 74 países, com destaque para África, América Latina e Ásia (WHO 2018). Estima-se que pelo menos 91,4 % das pessoas que necessitam de tratamento para a doença vivem na África (Tlamçani & Er-Rami 2014). Estudos recentes mostraram que que mais de 200.000 mortes por ano são devidas à esquistossomose neste continente. Em países como a Nigéria, a Tanzânia, Gana e Moçambique cerca de 76 milhões de pessoas estão infectadas pela doença, sendo que 70 % dos casos apresentam as formas graves da doença, com fibrose periportal, hepatomegalia e esplenomegalia (Adenowo et al. 2015).

Figura 1 – Países e áreas de risco da esquistossomose no mundo. Fonte World Health Organization 2014.

A esquistossomose se estabeleceu no Brasil através do tráfico de escravos vindos do continente africano pela região litoral, mas expandiu-se amplamente dada as condições climáticas favoráveis ao estabelecimento e reprodução do hospedeiro intermediário, bem como as condições precárias de saneamento básico (Neves 2005). Abrange 19 Unidades Federadas, com áreas endêmicas na região nordeste. Estima-se que, aproximadamente, 25 milhões de pessoas estejam expostas ao risco de contrair a doença, e que 2,5 a 6 milhões encontrem-se infectadas (Brasil 2010). A esquistossomose ocorre de forma endêmica nos Estados: Alagoas, Bahia, Espirito Santo, Maranhão, Minas Gerais, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte e Sergipe. No Ceará, Distrito Federal, Goiás, Pará, Paraná, Piauí, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e São Paulo a transmissão é focal (Brasil 2010; Domingues 2013). Vários estudos demonstraram que a distribuição da esquistossomose não se faz de forma homogênea no Brasil, e nas regiões consideradas endêmicas prevalece condições precárias e até mesmo inexistentes de saneamento básico, pobreza e baixos níveis de escolaridade (Nascimento & Oliveira 2013).

A Organização Mundial da Saúde (OMS) caracteriza a esquistossomose com uma Doença Tropical Negligenciada (NTD), uma classe de doenças que são consideradas endêmicas em populações de baixa renda. Sua incidência está diretamente relacionada

com a fragilidade social e econômica da população, sendo associada com o baixo nível de saneamento básico e acesso à educação sanitária desta população, comprovando a estreita relação desta doença com o índice de desenvolvimento humano (IDH) (Lindoso & Lindoso 2009; Abou-El-Naga 2015; Madinga et al. 2015).

Estudos demonstram que o financiamento mundial de inovação em doenças negligenciadas não chega a 5 %, ainda que estas doenças estejam presentes em 149 países. Isto porque a pesquisa desenvolvida em grandes indústrias farmacêuticas do setor privado é sempre direcionada para a obtenção de lucro, e sendo esta categoria de doenças endêmica em países subdesenvolvidos, o baixo poder aquisitivo dos pacientes não é capaz de proporcionar um retorno financeiro exigido pelas grandes empresas (Brasil 2010; Virmond 2010).

A esquistossomose é uma doença crônica e debilitante, pois compromete diversos órgãos do corpo. Esta doença pode incapacitar os indivíduos que a manifestam e assim como outras NTD, ela carrega um estigma social, fator este que dificulta ainda mais o tratamento e a recuperação dos pacientes. A endemicidade da esquistossomose em uma determinada região causa diversos impactos na população, já que esta doença compromete a capacidade cognitiva, pode causar anemia, nanismo e atrapalha o desenvolvimento social, em crianças e adultos jovens (Brasil 2010; Kealey 2010).

1.1 Ciclo biológico de Schistosoma mansoni

Os trematódeos do gênero Schistosoma são platelmintos, da classe Digenea e da família Schistosomatidae. Algumas características tornam os representantes desse gênero diferentes quando são comparados com os demais trematódeos. Primeiramente eles apresentam sexos separados e bem definidos (dióicos), diferentemente dos outros helmintos da classe que são hermafroditas. O macho adulto possui o corpo achatado e largo, que é revestido por projeções em forma de espinhos, e apresenta uma fenda na região anterior denominada um canal ginecóforo, onde a fêmea adulta se aloja. A fêmea possui o corpo delgado e quase cilíndrico e de comprimento maior do que o macho (Figura 2). Outra característica que os diferenciam, é que as fases larvais desse parasito, completam parte do seu desenvolvimento em moluscos de água doce. Os ovos que possuem formato elíptico, são liberados pelo ambiente externo embrionados (miracídios), não são operculados e possuem um espículo lateral (Coley et al. 2014; Sah et al. 2015). 4

Figura 2 - Vermes adultos de Schistosoma mansoni. Fonte: Carvalho et al. 2008. Adaptado.

O ciclo biológico de S. mansoni é heteróxeno, composto por uma fase assexuada que ocorre no hospedeiro intermediário, e outra sexuada que ocorre no hospedeiro definitivo (Figura 3). O ciclo se inicia quando os ovos contendo miracídios são eliminados pelo hospedeiro definitivo juntamente com as fezes. Esses ovos, ao entrarem em contato com a água e em condições ambientais favoráveis de temperatura, luminosidade, oxigenação e hipotonicidade, promovem a eclosão dos miracídios (fase livre nadante do parasito), que por quimiotaxia, encontram caramujos do gênero Biomphalaria e penetram pelos tecidos moles. Após 48 horas no interior do caramujo, os miracídios se transformam em esporocistos primários, que através da poliembrionia se tornam esporocistos secundários e depois cercárias. As cercárias (forma infectante para o hospedeiro definitivo) possuem a cauda bifurcada e saem do caramujo através de estímulos de luz e calor. As cercárias nadam e penetram ativamente na pele ou por qualquer região da pele da conjuntiva ou da mucosa orofaringiana (regiões adequadas como porta de entrada) do hospedeiro definitivo (homem, ou qualquer vertebrado que esteja na água). A infecção via mucosas, pode ocorrer através dá ingestão de água que contém cercárias; estas não

chegam ao estômago, penetrando pelo esôfago (Barsoum et al. 2013; Colley et al. 2014; Siqueira et al. 2017).

Figura 3 - Ciclo biológico de Schistosoma mansoni. Os vermes adultos que vivem nas vênulas de um hospedeiro humano depositam os ovos (1), alguns dos quais ficam presos nos tecidos enquanto outros são eliminados pelas fezes. Em contato com a água doce, eclodem os miracídios (2) presentes nos ovos livres que infectam os caramujos do gênero Biomphalaria (3). Dentro do caramujo, os miracídios diferenciam-se em esporocistos primários (4), posteriormente em esporocistos secundários (5). Cada esporocisto secundário finalmente diferencia-se em cercárias (6) (forma infectante). As cercárias perdem suas caudas durante a penetração da pele do hospedeiro definitivo (7) e tornam-se esquistossômulos (8). Estes migram através da circulação sanguínea para as veias portais do fígado, onde se diferenciam e amadurecem em vermes adultos (9). Os vermes machos e fêmeas adultos acasalam-se para completar o ciclo de vida. Fonte: Pila et al. 2017, adaptado.

A penetração das cercárias é resultado da atividade lítica de suas glândulas de penetração e pela ação mecânica promovida pelos seus movimentos vibratórios intensos (Neves 2005; Caldas et al. 2008). Simultaneamente ao processo de penetração, ocorre a perda da cauda bifurcada, e as larvas resultantes (esquistossômulos), migram através dos tecidos subcutâneos, penetram em vasos sanguíneos e são levadas pela circulação para o coração lado direito, depois pulmões, seguem pelas arteríolas pulmonares, pelos capilares alveolares, chegando as veias pulmonares, e em seguida chegam ao lado esquerdo do coração (Wynn & Cheever 1995; Barsoum et al. 2013). Seguindo o fluxo sanguíneo, os esquistossômulos que chegam até o sistema porta intra-hepático onde podem completar 6

o seu desenvolvimento em aproximadamente 25-28 dias após a infecção, se diferenciando em vermes adultos, machos e fêmeas. Há se então, o amadurecimento sexual dos machos e o acasalamento, que é indispensável para que as fêmeas completem rapidamente eu próprio desenvolvimento. A manutenção da fêmea no canal ginecóforo do macho, auxilia na digestão do sangue e no transporte para os sítios de postura dos ovos. No entanto, como observado em infecções unissexuais, o amadurecimento sexual do macho – com a produção de espermatozoides – ocorre na ausência da fêmea (Lenzi et al. 2008).

Os vermes adultos migram, acasalados, para a veia mesentérica inferior e seus ramos, alcançando muitos dos casais o plexo hemorroidário superior e áreas vizinhas onde as fêmeas realizam a postura de, aproximadamente, 400 ovos por dia. Os ovos depositados demoram cerca de 8 dias para se tornarem maduros, e aparecem nas fezes após passarem pelos tecidos da mucosa intestinal. Os casais que mantém na circulação, podem migrar para os espaços porta, levando à formação de granulomas, que são caracterizados pela reação inflamatória aos antígenos do ovo, seguida da produção de colágeno, podendo evoluir para um quadro de fibrose periportal hepática. A espícula dorsal nos ovos de S. mansoni, provavelmente ajudam em sua retenção nos vasos. Uma enzima produzida pelo miracídio difunde-se através da casca do ovo e ajuda a digerir o tecido subjacente. A ação desta enzima, juntamente com necrose do tecido causado por pressão e pelo efeito do espinho, ajuda a liberar o ovo dos tecidos p/ a luz do intestino (Baptista & Andrade 2005; Wynn 2008; Andrade 2009; Colley et al. 2014; Souza 2015).

Os primeiros sintomas apresentados pela esquistossomose na fase aguda incluem febre, distúrbios gastrointestinais e complicações pulmonares. Na fase crônica a doença é caracterizada principalmente por inflamações hepáticas e esplênicas, com distensão abdominal (Ross et al. 2007; Cantanhede et al. 2010).

1.2 Moluscos do gênero Biomphalaria No Brasil, somente três, das onze espécies do gênero Biomphalaria são encontradas naturalmente infectadas por S. mansoni, sendo elas Biomphalaria glabrata (Say 1818), Biomphalaria straminea (Dunker 1848), Biomphalaria tenagophila (D’orbigny 1835). Os moluscos do gênero Biomphalaria encontram-se no filo Mollusca, classe Gastropoda, subclasse Pulmonata, Ordem Basommatophora e família Planorbidae. Os

caramujos desse gênero possuem uma concha discoidal enrolada em espiral plana, a qual apresenta um aprofundamento do giro central de ambos os lados, com coloração castanha escuro, que pode variar dependendo de condições ambientais (Paraense 2008; Sanogo et al. 2018).

O habitat desses moluscos são geralmente margens dos rios, lagos, lagoas, açudes, pântanos, bueiros, brejos, canais de irrigação ou corpos d’água parados ou com baixa correnteza e de pequena profundidade sobre temperatura de 20 º a 26 °C e pH de 7 a 8. Com o passar dos anos observou-se uma ocorrência frequente deste hospedeiro intermediário em áreas urbanas, que sofreram alguma alteração ambiental para satisfazer as necessidades de consumo e lazer do ser humano. Em muitas regiões, principalmente em cidades que possuem alguns bairros periféricos, encontra-se uma grande quantidade de criadouros de caramujos em valas de hortas destinadas ao cultivo e provenientes de drenagens fluviais (Tibiriça et al. 2011; Monteiro 2017). A alimentação desses gastrópodes pode variar de acordo com o local onde se encontram e com a disponibilidade deste alimento, apesar de serem considerados herbívoros, filtradores de plâncton, predadores e até carnívoros em alguns casos, sua alimentação é quase que exclusivamente vegetal (Barbosa 1995; Guimarães et al. 2009; Monteiro 2017).

Mesmo sendo hermafroditas, os caramujos desse gênero preferem a reprodução por fecundação cruzada. A maturidade sexual é atingida em aproximadamente 35 a 50 dias. Os ovos são protegidos por uma substância gelatinosa e glicoproteica e depositados em uma superfície, geralmente folhas de plantas, pedras ou até na concha de outros caramujos. A eclosão embrionária ocorre em aproximadamente 7 – 9 dias (Paraense 1955; Vianey-Liaud & Dussart 2002; Palasio et al. 2015). Dentre as três espécies do gênero Biomphalaria, a espécie B. glabrata (Figura 4) é a principal espécie transmissora da esquistossomose no Brasil, devido à sua ampla distribuição, altos índices de infecção, maior susceptibilidade à infecção por S. mansoni (Boffi 1979). Este fato pode ser comprovado ao analisar a distribuição de B. glabrata com as ocorrências da esquistossomose, que coincidem sempre nas mesmas áreas (Giovanelli et al. 2001; Grault 2013; Filho 2016; Monteiro 2017).

Figura 4 - Biomphalaria glabrata. (ch) – concha; (gi) – giro interno ou apical; (pe) – pé; (te) – tentáculo. Fonte: Laboratório de Estudos da Relação Parasito Hospedeiro – LAERPH/IPTSP/UFG.

1.3 Características biológicas de Biomphalaria glabrata

O caramujo B. glabrata adulto pode apresentar conchas com até 40 mm de diâmetro, 11 mm de largura e com seis a sete giros, sinistrógiras aumentando gradativamente o seu tamanho, enrolados em espiral plana sem opérculo (Souza & Andrade 2006). A concha desses gastrópodes, que pode atingir o maior diâmetro e largura dentre os representantes da família Planorbidae, em sua maioria das vezes possui coloração marrom escuro, e é formada por várias camadas. A camada mais externa, denominada de perióstraco, é constituída de material orgânico proteico, associado à quinonas. As camadas internas são constituídas de cristais de carbonato de cálcio (Barnes & Ruppert 1996; Bezerra 2005). Este órgão serve de proteção para as por partes moles, divididas anatomicamente em: massa cefalopediosa e a massa visceral (Figura 4). Na parte superior da massa cefalopediosa existem dois tentáculos longos e filiformes com os olhos situados junto à base, que desenvolvem funções tátil. Abaixo dos tentáculos e acima da boca encontra-se a mufla, que possui dois palpos labiais em forma de “T” quando vista pela frente, sendo contornada pela mandíbula. Na parte inferior estão localizados os pés alongados que são responsáveis pela locomoção, com o auxílio das glândulas podais que secretam muco sobre o qual o caramujo prende-se ao substrato. É sobre essa estrutura que ocorre o dobramento da epiderme, conhecida como manto, estrutura responsável pela

secreção de carbonato de cálcio, contribuindo assim para a formação da concha (Souza & Andrade 2006; Paraense et al. 2008).

O sistema digestivo dos caramujos da espécie B. glabrata é formado pela boca, cavidade bucal, esôfago, estômago, intestino, reto e ânus (Figura 5). A boca possui espessamentos cuticulares denominados mandíbula e rádula. A rádula é uma fita alongada e revestida de numerosos dentículos quitinosos em forma de gancho, direcionados para o interior da cavidade bucal. A rádula sendo um órgão para alimentação, possui função primordial de raspagem e maceração dos alimentos. A digestão é extracelular ocorre no estômago, como resultado da ação de enzimas provenientes das bolsas esofágicas e do ceco digestivo. O intestino estende-se desde a extremidade anterior do estômago atravessando a massa visceral, para se abrir via ânus, do lado direito do manto. O sistema digestório se finaliza no reto, que tem por função a formação, compactação e armazenamento das fezes (Barnes & Ruppert 1996; Moore 2003; Brasil 2014).

Figura 5 - Esquema geral do corpo de B. glabrata. (ms) Massa cefalopediosa; (p) pé; (mf) mufla; (te) tentáculo; (om) abertura genital mascula; (cm) colar do manto; (ps) pseudobrânquias, (an) ânus; (pn) pneumóstoma; (mc) músculo columelar; (cl) crista lateral (cl), (ct) crista retal; (rt) reto; (tr) tubo renal; (cp) cavidade pulmonar; (ga) glándula do albumen; (ia) intestino anterior; (et) estômago; (im) intestino médio; (ip) intestino posterior; (gd) glándula digestiva (ot) ovoteste. Fonte: Paraense 2008.

O sistema genital desses moluscos hermafroditas é formado pelo ovoteste, órgão em forma de cachos que produz os gametas masculinos e femininos. Depois de formados, os gametas saem dessa estrutura e são transportados através do ovispermiduto passando pelas vesículas seminais onde ocorre a maturação de espermatozóides e posteriormente para a glândula do álbumem que tem a função de envolver os ovos produzidos. A partir desta glândula, o ovispermiduto se bifurca, diferenciando-se em partes masculina e feminina, até desembocar em uma pequena bolsa denominada de carrefour, que recebe secreção da glândula de albume, destinada a envolver o ovo (Brasil 2007; Amaral et al. 2008; Paraense 2008; Cantinha 2008).

Os ovos são envoltos por uma substância gelatinosa, rica em proteínas, glicoproteínas, galactogênio, glicogênio e lipídeos que são produzidos pela glândula de albúmen e são agrupados por uma membrana protetora que é denominada massa ovígera (Figura 6) (Ribeiro-Paes et al. 1994; Rosa 2008; Baron et al. 2013).

O desenvolvimento embrionário do caramujo B. glabrata ocorre através de sucessivas clivagens espirais (Camey & Verdonk 1970; Carvalho 2008). Um ovo maduro de B. glabrata tem 100 µm de comprimento. O primeiro estádio do desenvolvimento é conhecido como blástula, que ocorre aproximadamente entre a 10a e 23a hora após a primeira clivagem. Neste estádio ocorrem apenas mitoses sem aumento de volume celular (Kawano 1983; Kawano et al. 2008).

Cerca de 24 a 39 horas após a primeira clivagem do ovo, inicia a gastrulação, que pode ser caracteriza pelo fim da clivagem e início do crescimento, diferenciação e movimentação celular, dando origem ao segundo estádio do desenvolvimento conhecido como gástrula. O tipo de gastrulação no B. glabrata ocorre por invaginação ou endobolia. Na região onde se encontram os corpúsculos polares está localizado o polo animal e vegetal, que começam a se transformar e o embrião modifica sua forma de arredondada para achatada, quando observado em perfil (Kawano et al. 1992; Kawano et al. 2008).

O estádio trocófora ocorre entre 40a e 89a após a 1a clivagem é identificada como a primeira fase larval de B. glabrata, que se caracteriza pela formação do prototroco (região do corpo que separa em duas partes: a região pré-trocal e pós-trocal), que é formado de duas fileiras de células situadas acima da boca, com cílios recobrindo toda sua superfície. É nesta fase que ocorre o início da movimentação larval, que de início é

muito lenta e com o passar do tempo vai se tornando mais rápida (Camey & Verdonk 1970; Kawano et al. 2008).

Os estádios de véliger (120 horas) e hipoestádio (144 horas de idade) em B. glabrata ocorrem ainda dentro da cápsula do ovo. O estádio de véliger se apresenta caracterizado pela formação da concha, que começa a cobrir uma parte do corpo. O prototroco evolui para o velum, que é um órgão responsável pela movimentação intensa da larva no interior da cápsula. Há um desenvolvimento maior do pé, formação dos olhos, aumento do tamanho dos tentáculos e início do enrolamento da concha sobre o corpo. O hipoestádio caracteriza-se pela formação completa do embrião e início da eclosão (Tallarico et al. 2004; Kawano et al. 2008)

Figura 6 – Massa ovígera de Biomphalaria glabrata com aproximadamente 12 horas após a postura. (me) – membrana externa; (ov) – ovo; (em) – embrião; (sc) – substância coloidal; (sp) – substância perivitelínica. Fonte: Laboratório de Estudos da Relação Parasito Hospedeiro – LAERPH/IPTSP/UFG.

Os caramujos da espécie B. glabrata possuem um sistema circulatório composto por coração com duas cavidades: aurícula e ventrículo. O fluido que preenche o corpo do caramujo é chamado de hemolinfa, que se compõe de células denominadas hemócitos, plasma rico em água, bicarbonatos, cloreto de sódio e hemoglobina. A hemoglobina pode utilizar o oxigênio à baixa tensão porque contém ferro dissolvido. A hemoglobina 12

constitui 97 % das proteínas presentes na hemolinfa de B. glabrata. (Verrengia-Guerrero et al. 1997; Pessôa & Martins 2011). Os hemócitos são as principais células do sistema de defesa do caramujo, podem estar livres, circulantes na hemolinfa ou nos tecidos. A hemolinfa dos caramujos circula em um sistema do tipo semiaberto. Ela é impulsionada pelo coração, de onde parte a artéria aorta, que se ramifica para diversos tecidos, drenando nos seios venosos e retornando ao coração pelas veias pulmonar e renal, após ser reoxigenada na parede pulmonar (Negrão-Corrêa et al. 2008). Os hemócitos, também chamados de amebócitos, podem ser produzidos por vários tecidos hematopoiéticos. Em B. glabrata, estas células provavelmente são produzidas por uma região bem definida localizada entre o pericárdio e o epitélio posterior da cavidade do manto, também designado de amebocyte producing organ (APO). Outros estudos demonstraram que a porção sacular dos túbulos renais, margeando o pericárdio e, ocasionalmente, a região dorsal do reto, também é capaz de produzir hemócitos (Knaap & Loker 1990; Negrão- Corrêa et al. 2008; Pila et al. 2017).

Os hemócitos são considerados as principais células efetoras do sistema de defesa dos moluscos, participando da fagocitose de partículas como, por exemplo, bactérias e protozoários, e do processo de encapsulação de patógenos maiores, como larvas de helmintos (Loker et al. 1986; Adema & Loker, 1997). Além disso, os hemócitos também produzem fatores solúveis, que são lançados na hemolinfa ou estão expressos em sua membrana, que participam da ativação dos próprios hemócitos e na destruição de agentes patogênicos (Negrão-Corrêa et al. 2008).

Alguns autores consideram a existência de subpopulações de hemócitos circulantes na hemolinfa de Gastropoda. Em geral, os pesquisadores se baseiam nas características morfológicas, ultra estruturais e no conteúdo enzimático destas células para fazer essa classificação. Em B. glabrata a maioria dos autores distingue duas subpopulações de hemócitos circulantes: os granulócitos e os hialinócitos. Os granulócitos são células que medem aproximadamente 7 a 11 µm de diâmetro, apresentam um núcleo excêntrico, esférico, rico em grumos de cromatina fortemente condensada (heterocromatina) e um nucléolo proeminente. O citoplasma é granulado e é envolto por uma membrana bem definida, e apresenta uma delimitação acentuada entre o endoplasma, que é rico em organelas, e o ectoplasma homogêneo. Estas células possuem ainda numerosos prolongamentos citoplasmáticos, delgados e longos denominados filopódios. Bayne et al. (1980) consideram que os granulócitos de Gastropoda, em geral, 13

são células com funções semelhantes aos macrófagos de mamíferos. Os hialinócitos são menores, medindo de 4 µm a 8 µm de diâmetro, apresentam contorno circular, citoplasma contendo raras organelas e pouco ou nenhum lisossomo e ausência de pseudópodes extensos (Harris, 1975; Yoshino, 1976; Lie et al. 1987; Barraco et al. 1993; Borges & Andrade, 2003; Negrão-Corrêa et al. 2008)

1.4 Distribuição geográfica de Biomphalaria glabrata no Brasil

A espécie B. glabrata é considerada a espécie de molusco mais importante na transmissão da esquistossomose mansônica, em vista de sua ampla distribuição geográfica, grande compatibilidade com o parasito e os altos índices de infecção (Scholte et al. 2012; Souza et al. 2017). Alguns estudos já relataram a presença dessa espécie em 17 estados do país, compreendendo 801 municípios (Alagoas, Bahia, Espírito Santo, Distrito Federal, Goiás, Maranhão, Minas Gerais, Pará, Paraíba, Paraná, Pernambuco, Piauí, Rio de Janeiro, Rio Grande do Norte, Rio Grande do Sul, São Paulo e Sergipe) (Figura 7) (Carvalho et al. 2008; Brasil 2014; Silva 2018).

Figura 7 - Distribuição de Biomphalaria glabrata no Brasil. Fonte: Brasil 2014.

O estabelecimento e a expansão territorial de populações de Biomphalaria spp são comumente relacionados a regiões de bacias hidrográficas (Carvalho et al. 1985; Telles 1996; Fernandez et al. 2001; Telles 2005; Lofty 2009; El-Wakeil et al. 2013; Abou-el- Naga 2015; Leite et al. 2016). Entretanto, outros estudos sugerem que a presença de uma

bacia hidrográfica não é o principal determinante da frequência de locais de reprodução, uma vez que os estados da região sul apresentam baixa frequência de criadouros, apesar de possuir um número considerável de bacias hidrográficas. Nestes locais a ocupação dos caramujos está fortemente relacionada às características da ocupação humana na área (David et al. 2018).

Outro fator que contribui significativamente para a distribuição geográfica do B. glabrata são as chuvas que ocorrem nestas regiões citadas. Alguns estudos têm relatado que um aumento na precipitação faz com que a água flua para fora dos locais de reprodução, provocando um efeito de arrasto e dispersão destes moluscos, criando novos focos destes hospedeiros em outras localidades (Giovanelli et al. 2001; Araújo et al. 2007; Souza et al. 2010; Barbosa et al. 2015).

Este cenário demonstra que a distribuição de B. glabrata é extremamente relacionada à ocorrência de esquistossomose no Brasil (Scholte et al. 2012; Filho 2016). O conhecimento da distribuição das espécies de Biomphalaria hospedeiras naturais de S. mansoni podem servir como uma importante ferramenta para o planejamento e seleção das intervenções de controle da esquistossomose, direcionando ações e economizando recursos (Stensgaard et al. 2013).

1.5 Controle da esquistossomose Através da percepção de que a esquistossomose é um problema de saúde pública que depende de vários fatores, controle desta doença sempre foi uma pauta importante para a OMS que adotou diversas estratégias desde 1950. Ao longo da história o combate a esquistossomose se baseou em duas medidas principais: tratamento do hospedeiro definitivo (humano), com ações sobre o parasito e medidas visando o hospedeiro intermediário (moluscos) para impedir a morbidade e reduzir a transmissão, respectivamente (WHO 2013). Estas estratégias empregadas sempre variaram de acordo com os recursos técnicos disponíveis bem como com as necessidades e disponibilidades financeira de cada país (Aagaard-Hansen & Bruun 2008). Na década de 50 um comitê de especialistas em esquistossomose criado pela OMS recomendou a realização de estudos nas áreas de taxonomia, morfologia, suscetibilidade, ecologia e fisiologia dos moluscos hospedeiros, e outros fatores socioeconômicos associados à transmissão da doença (WHO 1953). Como resultado desses estudos, esse

mesmo comitê determinou que os programas de controle da esquistossomose agissem principalmente no combate do hospedeiro intermediário, através do uso de moluscicidas, já que os estudos demonstraram que os fármacos disponíveis não eram promissores no combate de S. mansoni (WHO 1965a; WHO 1965b; Barbosa et al. 2008). Em 1979, foi lançado a oxamniquina (Pfizer) e o praziquantel, fármacos que possuíam alta eficácia, poucos efeitos colaterais e custo. Com isso impulsionou-se o uso de quimioterápicos associados a agente moluscicidas, com a comprovação que o uso simultâneo desses novos fármacos permitia resultados mais rápidos sobre a incidência, prevalência e transmissão da doença (WHO 2002; Carvalho et al. 2008; Rapado 2013; Filho 2016).

Portanto a OMS estabeleceu algumas diretrizes para o combate a esquistossomose. O tratamento de grupos de risco com o Praziquantel se tornou a medida principal (WHO 2006). Mas sozinha essa medida não é eficaz, por isso o controle da doença deve se basear na cooperação de diversos setores pare integrar abordagens preventivas e direcionadas à população. Dentre essas abordagens se destacam: estrutura de saneamento básico, educação sanitária e combate ao caramujo hospedeiro intermediário do ciclo do parasito (WHO 2006; Grimes et al. 2015; Othman & Soliman 2015).

1.6 Utilização de moluscicidas no controle da esquistossomose

Visto a necessidade de controle dos moluscos hospedeiros intermediários de S. mansoni muitas metodologias foram utilizadas para a eliminação desses caramujos durante os anos (Figura 8). As principais medidas adotadas se dividem em três categorias: alterações no habitat, controle biológico e uso de agentes químicos (Teles & Carvalho 2008; Moraes 2011; King & Bertsch 2015).

Figura 8 - Países que utilizaram o controle de hospedeiros intermediários de Schistosoma spp. para o controle da esquistossomose. Os destaques em verde escuro indicam as áreas onde foi feito o controle dos hospedeiros intermediários de Schistosoma spp. A parte destacada com um aumento mostra os países da bacia do Caribe (adaptado de King & Bertsch 2015).

Os primeiros registros do uso de agentes químicos como moluscicidas para controle do caramujo hospedeiro intermediário da esquistossomose foi datado em 1918 no Japão, com o óxido de cálcio (Jordan & Rosenfield 1983). Dois anos depois, o sulfato de cobre começou a ser utilizado no Egito, e em 1940 um composto denominado cianamida cálcica começou a ser utilizada. Com o avanço dos estudos nesta área, vários agentes químicos com potencial moluscicida surgiram como o pentaclorofenato de sódio e a tritilmorfolina. Em 1959 a Niclosamida teve suas propriedades moluscicidas descobertas e com os resultados satisfatórios apresentados, passou a ser o fármaco recomendado pela OMS (Jordan & Rosenfield 1983; Tanaka & Tsuji 1997; Inobaya et al. 2014; Filho 2016).

Em 1960 o trifenmorph, um fármaco com muitos efeitos tóxicos, teve sua ação moluscicida comprovada, porém seu uso era limitado. Depois disso outros agentes químicos foram descobertos, como o yurimin e o phebrol (Duncan 1981; Jordan & Rosenfield 1983; Tanaka & Tsuji 1997; Inobaya et al. 2014). Paralelo aos estudos de agentes químicos, estudos utilizando moluscicidas de origem vegetal também foram realizados (Santos et al. 2000; Cantanhede et al. 2010).

1.7 Niclosamida

Desde a década de 60 até os dias atuais, a niclosamida (Bayluscida®) é o único moluscicida recomendado pela OMS, por ser comprovada sua alta atividade contra todas as fases de vida do caramujo em concentrações inferiores a 1 mg L-1 após 8 horas de exposição. Além de moluscicida, a niclosamida possui grande toxicidade sobre helmintos da classe Cestoda e está contida nas preparações de Yomesan®, Mansonil® e Lintex ®, utilizados na medicina humana e veterinária no tratamento da teníase. Sua apresentação comercial tem peso molecular de 327,1 g/mol e fórmula química C13H8Cl2N2O4 (2′,5- dichloro-4′nitrosalicylanilide) (Figura 9) (Andrews et al. 1983; Filho 2016).

Figura 9 - Fórmula molecular do composto 5-cloro-N-(2-cloro-4-nitrofenil)-2hidroxibenzamida, Niclosamida, comercialmente chamada de Bayluscida® (adaptado de https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/4477#section=Top).

O mecanismo de ação da niclosamida ainda não foi totalmente elucidado. Entretanto, sabe-se que ele é baseado no desacoplamento da fosforilação oxidativa mitocondrial. Assim como outros desacopladores, a niclosamida estimula a respiração mitocondrial em baixíssimas concentrações, porém inibe a respiração à medida que a concentração é aumentada (Hollingworth et al. 2001). A niclosamida também diminui a -1 captação de água mesmo em concentrações abaixo da CL50 (0,08 mg L ) (Duncan et al. 1977; Oliveira-Filho et al. 2010).

O fato de a niclosamida interferir nos processos osmorregulatórios já foi mencionado por de Villiers & Mackenzie (1963). Aparentemente a niclosamida não é irritante para os caramujos. Eles não evitam o contato com ela, tentando escapar da água, um comportamento que é observado com outros moluscicidas (Etges & Gilbertson 1966).

Outro efeito estudado da niclosamida, foi nos tecidos dos caramujos. Sabe-se que este composto inibe a oxidação de succinato em concentrações acima de 0,03 mg L-1. Além disso também há a oxidação do glutamato e da redução da tetrametil-p-fenileno diamina pelos tecidos de Biomphalaria sp (Ishak et al. 1970; Andrews et al. 1983). A inibição de processos oxidativo também foi observada em B. alexandrina após exposição a niclosamida (Ishak et al. 1972). Essa inibição pode ser parcialmente explicada pelo acúmulo de oxaloacetato, um inibidor metabólico natural da enzima succinato desidrogenase. Adição de ATP, que permite a remoção do oxaloacetato na forma de piruvato de fosfoenol, preveniu completamente a inibição da oxidação do succinato. A reação de transaminação do glutamato também pareceu ser sensível à niclosamida.

Entretanto, apesar de ser eficaz, a niclosamida possui desvantagens como a toxicidade a outros animais aquáticos e plantas, apresenta dificuldade para ser solubilizada tanto em solventes orgânicos quanto em água, possui alto custo, se decompõe sob luz solar e provoca irritação em pele e mucosas (Yuan et al. 2005; Rapado et al. 2013; Dai et al. 2014; King & Bertsch 2015).

Coura-Filho et al. (1992) demonstraram que o uso contínuo de niclosamida como medida única não diminui a população de planorbídeos, já que após o uso do moluscicida a população de caramujos se refazia em até três meses, garantindo assim a possibilidade de transmissão de esquistossomose na área. Além disto, deve ser considerar que o uso contínuo de um mesmo moluscicida químico pode provocar uma seleção de moluscos resistentes ao produto químico aplicado. Todos esses fatores demonstram a necessidade de investimento em pesquisas que busquem novas alternativas mais bem-sucedidas no controle desses caramujos (Brasil 2010).

1.8 Cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) 1.8.1 Estrutura

O uso das biguanida como agentes microbianos para a preservação de produtos industrializados tem sido bastante difundido ao longo dos anos. Por este motivo o interesse no desenvolvimento de biguanida poliméricas como agentes antimicrobianos e antissépticos tem despertado o interesse de diversos pesquisadores (Cunha et al. 2001).

A estrutura do cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) (Figura 10) consiste em um polímero caracterizado por repetição de grupos biguanida ligados a terminais que podem ser aminas, guanidinas ou ciano-guanidinas. A atividade antimicrobiana do PHMB é conferida pelas moléculas da cadeia principal, que possuem como característica elevada basicidade (Afonso 2013).

Figura 10 – Fórmula molecular do cloridrato de polihexametileno biguanida (PHMB) – (Adaptado de: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/52987646#section=Top.)

O PHMB forma soluções incolores, inodoras, de natureza catiônica, quimicamente estável, não volátil, de alta atividade contra uma série de microrganismos, principalmente bactérias Gram-negativas, e de baixa toxicidade para mamíferos (Muangman et al. 2011). Muitos estudos têm sido realizados para elucidar o mecanismo de ação antimicrobiana do PHMB, mas o atual entendimento sobre a molécula mostra que este composto é um agente citoplasmático de membrana (Wessels & Ingmer 2013). O mecanismo de ação deste composto se inicia quando o PHMB é adsorvido na superfície da bicamada fosfatidilglicerol (PG) fosfolipídica ácida, via interação com os grupos de 20

cabeças polares dos lipídios com os grupos biguanida. Essa interação provoca uma desorganização na bicamada de fosfatidilglicerol que por sua vez leva a maior fluidez, expansão lateral e maior permeabilidade (Ikeda et al. 1984). Essas alterações causam uma falha no mecanismo de defesa da célula e a ruptura da parede da mesma. O PHMB provoca na célula bacteriana a perda de substâncias de baixo peso molecular, como íons de potássio, cálcio e a inibição de enzimas responsáveis pela união da membrana, como por exemplo a ATPase. Subsequentemente há a ruptura da membrana plasmática que pode induzir à perda de substâncias macromoleculares e à precipitação das substâncias celulares (Gilbert et al. 1990; Santos & Fernandes 2010; Wessels & Ingmer 2013).

1.8.2 Aplicações e benefícios

O PHMB tem sido alvo de vários estudos para uso como um composto em formulações de desinfetantes para indústria alimentícia, farmacêutica, têxtil e bem como a medicina possuindo uma excelente atividade no controle de microrganismos patogênicos, como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosas, Salmonella cholerasuis, bem como endósporos de bactérias termo resistentes, alguns fungos (Aspergillus niger, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Trichophyton mentagrophytes), protozoários (Acanthamoeba sp.) e até alguns vírus (Herpes Vírus, Fowlpox Vírus, Swine Vírus) (Allen et al. 2004; Santos & Fernandes 2010; Afonso 2013).

No que diz respeito à não toxicidade em seres humanos, o PHMB tem sido referenciado como um composto bastante tolerado quando em terapia tópica nos olhos, epitélio nasal e feridas (Afonso 2013). Por isso, durante muitos anos, esta substância tem sido usada como antimicrobiano em cosméticos (Kramer, 2010; Frenzel et al. 2011). Além disto o PHMB tem sido bastante usado em soluções de lente de contato já que se demonstrou eficaz contra a ceratite causada por Acanthamoeba em concentrações baixa como 0,025% (250 g / ml) como substância única, bem como em combinação com propamidina e neomicina (Behrens-Baumann & Kramer 2002).

O custo benefício do PHMB é confirmado quando este é comparado aos tradicionais desinfetantes, devido ao seu amplo espectro de ação na presença de matéria orgânica aliado ao baixo índice tóxico tanto para a saúde pública como para o meio ambiente, baixa corrosividade e alta solubilidade em água (Santos & Fernandes 2010).

Fumarola (2011) afirma que as propriedades anti-inflamatórias do PHMB estão associadas a um registro insignificante de resistências, tornando-o um dos antissépticos mais relevantes da atualidade. Além disto, este composto promove um aumento significativo da cicatrização de feridas, sendo bem tolerado pela pele e mantendo uma baixa toxicidade sistêmica. Os resultados satisfatórios dos estudos do PHMB como agente antimicrobiano têm proporcionado a sua utilização em uma ampla variedade de dispositivos médicos, assim como em soluções de desinfecção ocular (Afonso 2013).

Firdessa et al. (2015) demonstraram que o PHMB possui diversos potenciais efeitos contra a leishmaniose. Entre eles destaca-se a aceleração do processo de fechamento da ferida, melhorando assim as implicações provenientes da Leishmaniose Cutânea e prevenindo infecções bacterianas e / ou fúngicas secundárias que muitas vezes retardam a cicatrização de feridas em pacientes com Leishmaniose Cutânea. Os mesmos autores também comprovaram a eficácia do PHMB em eliminar diretamente os parasitos.

1.9 Testes genotóxicos Os testes de genotoxicidade são realizados com o intuito de esclarecer os efeitos de agentes xenobióticos sobre o material genético e alterações nos produtos gênicos. Estes agentes podem provocar quebras em fita simples ou dupla do DNA. Essas alterações na molécula do DNA, quando não reparadas podem ocasionar mutações e morte celular (Grisolia et al. 2004; Carvalho 2018). Os danos causados por esses agentes químicos dependem de diversos fatores, concentração e duração da exposição, natureza química do composto, a associação que este composto pode realizar com outros compostos químicos, e de características da espécie estudada e do ambiente (Bolognesi 2003). Os danos genéticos podem ser diferenciados em duas categorias, aneugênicos e clastogênicos. Danos aneugênicos provocam alterações na distribuição dos cromossomos durante o processo de divisão celular, dando origem as aneuploidias. Os danos clastogênicos, induzem quebras e produzem alterações na estrutura do cromossomo (Rabello-Gay et al. 1991; Collins 2004). Em grande parte dos casos, os danos genéticos são reparados pelo próprio organismo, mas essa capacidade de reparo do DNA diminui com o passar do tempo (Grisolia 2004). Quando o reparo não ocorre ou não é feito de forma correta, as alterações podem ser transmitidas para as células filhas, sendo então chamadas de mutações hereditárias (Obe et al. 2004). A identificação dessas alterações pelos agentes 22

mutagênicos, em fases iniciais, é imprescindível para evitar danos mais extremos sobre o comportamento da população estudada (Sarkar et al. 2006).

1.9.1 O Ensaio cometa na avaliação de danos do DNA Ao longo dos anos o ensaio cometa, também conhecido como eletroforese em gel de célula única, tornou-se um dos métodos referência para avaliar o dano do DNA. Suas diversas modificações podem ser aplicadas em vários campos da genotoxicologia. Dentre as diversas vantagens que a técnica apresenta destacam-se a simplicidade, sensibilidade para detectar danos no DNA, possibilidade de análise de dados ao nível de células individuais, uso de amostras de células extremamente pequenas, possibilidade de ser realizado em praticamente qualquer célula eucariota, velocidade e o baixo custo. Embora seja usado na maioria das vezes somente para demonstrar danos no DNA, o ensaio cometa possui outras aplicações pouco exploradas (Collins 2004; Speit & Rothfuss 2012). Atualmente existe quatro grandes áreas de pesquisa em que o ensaio cometa é bastante adotado. A primeira é a avaliação de segurança de novas drogas, cosméticos ou outros produtos químicos (Hartman et al. 2003). Normalmente é usado para avaliar quebra no DNA, mas quando acrescido de outras técnicas como o aumento da sensibilidade e a inclusão de endonucleases de reparo podem medir tipos de lesões específicas (Asqueta & Collins 2013). A ecogenotoxicologia é a segunda área de aplicação. A relevância da compreensão dos efeitos da genotoxicidade induzida por poluentes gerados por atividades industriais, agrícolas e domésticas, e do risco imposto a espécies ambientais, bem como para a saúde humana através da cadeia alimentar tornou a técnica do ensaio cometa bastante utilizada para avaliar o nível de contaminação em ambientes aquáticos e terrestres, através de organismos biomarcadores presentes nestes locais (Grazeffe et al. 2008; Jah 2008; Martins & Costa 2015). Outra área de igual importância é o biomonitoramento humano. Entre as aplicações na saúde humana, o ensaio cometa é bastante empregado para o monitoramento da exposição ocupacional a produtos químicos genotóxicos como inseticidas e pesticidas, na avaliação do estresse oxidativo vinculado à algumas doenças, na detecção de danos causado pelo tabagismo e dietas que diferem no conteúdo lipídico (Somorovská 1999; Jenkinson 2001; Izzotti et al. 2001; Bolognesi et al. 2004; Franco et al. 2016). Por fim, mas não menos importante, o ensaio cometa também tem sido bastante utilizado para estudar os mecanismos de reparo do DNA lesado (Asqueta & Collins 2013). Uma das abordagens amplamente utilizada

nesse campo de estudo é monitorar uma remoção dependente do tempo de lesões após o tratamento com um agente prejudicial ao DNA.

1.9.2 Fundamentos do ensaio cometa Na década de 70, Peter Cook e colaboradores desenvolveram uma metodologia para estudar a estrutura nuclear através da lise de células com detergente não iônico e cloreto de sódio de alta molaridade. Esses reagentes com alto teor de sal promovem a remoção de vários componentes celulares, como membranas, citoplasma, nucleoplasma e proteínas histonas. O que resta é o nucleóide, constituído de ácido ribonucleico e proteínas, juntamente com o DNA condensado. A adição de brometo de etídio promoveu o desenrolamento do DNA, permitindo a rotação livre do DNA (Collins 2004). Mais tarde Ostling e Johanson (1984) fizeram o primeiro ensaio cometa em condições alcalinas, referindo ao modelo de nucleóide de Cook e colaboradores. Esse modelo permitia a detecção de quebras de fita dupla de DNA. Posteriormente Singh et al. (1988) apresentaram a versão alcalina do teste, que além das detecções apresentadas pelo modelo de Ostling e Johanson, ainda permitiam a detecção de quebras de fita simples, sítios álcali- lábeis do DNA, dano oxidativo do DNA, DNA-DNA ou DNA-proteína e ligações cruzadas (Pavanello & Clonfero 2000, Collins et al. 2008, Dhawan et al. 2009 Kumar & Dhawan 2013; Gonçalves 2015). Nos dias de hoje na técnica de eletroforese de microgel, ensaio cometa, um pequeno número de células suspensas em um gel de agarose fino em uma lâmina de microscópio, são lisadas, submetidas a eletroforese e coradas com um corante fluorescente de ligação ao DNA. Como resultado da corrida eletroforética, os fragmentos resultantes de DNA com lesões migram em velocidade diferente da cabeça do nucleóide, formando a típica figura de um cometa (Figura 11), e quanto mais lesões apresentadas, maior a cauda desse cometa e maior quantidade de DNA na cauda. Caso as células não apresentem dano no DNA, este migrará em conjunto com o nucleóide, formando um círculo (Olive et al. 1990; Collins et al. 1997; Speit & Rothfuss 2012).

Figura 11 – Imagem de nucleóide em hemócitos de Biomphalaria glabrata, formando cometa com dano ao DNA. Fonte: Laboratório de Estudos da Relação Parasito Hospedeiro – LAERPH/IPTSP/UFG.

Existem vários programas de análise de imagem que podem medir os danos no DNA e quantificar a intensidade de DNA na cauda. Os programas oferecem parâmetros quantitativos que correspondem aos danos ocorridos no DNA em cada uma das células analisadas. Os parâmetros mais utilizados são o comprimento da cauda, intensidade relativa de fluorescência da cabeça e da cauda (normalmente expressa como porcentagem do DNA na cauda) e momento da cauda olive (OTM) (Hartman et al. 2003; Collins 2004).

1.9.3 Ensaio cometa em Biomphalaria glabrata

Há algum tempo, pesquisadores vinham estudando a possibilidade da padronização da técnica do ensaio cometa em caramujos de água doce. Essa escolha se justificou pelo fato dos invertebrados representarem mais de 90 % das espécies aquáticas, estando em contato com todos os resíduos que são descartados nos rios e lagoas. (Silva 2010; Monteiro 2017).

Foi demonstrado que o ensaio cometa é uma ferramenta rápida, sensível e útil para detectar danos no DNA de caramujos da espécie B. glabrata. Como foi comprovado por Grazeffe et al. (2008), que utilizou a técnica para detectar danos no DNA de hemócitos circulantes do caramujo adulto B. glabrata após a exposição à radiação gama com doses

de 2,5; 5; 10 e 20 Gy de radiação gama Co60 a 2,82 KGy/h. Várias espécies de moluscos aquáticos têm sido utilizadas para acompanhar a disseminação de mutagênicos ambientais que são descartados no meio ambiente de forma descontrolada e sem acompanhamento dos órgãos de fiscalização (Klobucar et al. 2003; Vilela et al. 2006; Bineli et al. 2008).

1.10 Teste do micronúcleo Micronúcleos (MN) são pequenos fragmentos que se formam sempre que um cromossomo ou um fragmento de um cromossomo não é incorporado em um dos núcleos da célula filha após a divisão celular, devido à falta de centrômeros, defeitos de centrímeros ou defeitos de citoquineses (Vincent-Hubert et al. 2011; Touahri et al. 2016). O teste que avalia a presença de MN e consequentemente estima danos cromossômicos em diferentes populações é denominado de teste do micronúcleo (MN) (Toosi et al. 2017). O teste do MN in vitro é um método que fornece uma base abrangente para investigar o potencial prejudicial do cromossomo porque tanto os danos de origem aneugênicos quanto clastogênicos podem ser detectados em células que foram submetidos a divisão celular durante ou após à exposição ao produto químico (OECD 2014). A primeira vez que o MN foi utilizado como marcadores para danos citogenéticos foi em 1959, por Evans e colaboradores. Mais tarde, Boller & Schimid (1970) comprovaram o avanço decisivo dos MNs como sistema de ensaio para o potencial genotóxico de agentes externos, sugerindo pela primeira vez o termo teste de MN (Kirsch-Volders 2003).

Para análise em nível celular de agentes xenobióticos o teste do MN pode ser utilizado como bioindicador de genotoxicidade. Os xenobióticos podem agir de duas formas no núcleo: diretamente sobre o cromossomo ou sobre o fuso mitótico, levando a perda de parte dos cromossomos, ou de todo cromossomo (Arias 2007). Estes, durante a citocinese, quando na formação do envoltório nuclear, se não forem incorporados pelo núcleo principal, formam seu próprio envoltório sendo considerados MNs (Villela et al. 2006). Em alguns casos, observam-se pontes nucleoplásmicas entre núcleos em uma célula binucleada. Estes cromossomos são chamados de dicêntricos, quando os dois centrômeros foram puxados para polos opostos da célula e o DNA na ponte resultante é coberto por membrana nuclear. Essas pontes nucleoplásmicas em células binucleadas, também são alterações nucleares importantes na avaliação de dano cromossômico e fornecem uma medida adicional de rearranjo, que pode ser pontuado juntamente com a contagem de MN (Fenech & Morley 1985; Fenech 2000). 26

Os MNs são facilmente distinguidos do núcleo, já que para serem introduzidos nesta categoria devem ter um tamanho de até 1/3 do núcleo principal. Além disso devem possuir bordas distinguíveis e com a mesma refringência do núcleo principal (Al-Sabti & Metcalfe 1995; Al-Sabti 2000; Gustavino et al. 2001). Para realizar a contagem desses MNs são analisadas entre 1000 e 3000 células, que devem possuir membranas citoplasmáticas e nucleares intactas, não sendo analisadas aquelas que estejam sobrepostas ou danificadas (Al-Sabti & Metcalfe 1995).

Assim como o ensaio cometa, o MN também é recomendado para avaliação do potencial mutagênico de agentes químicos e físicos, sendo bastante empregado em estudos ecotoxicológicos. Além disso o MN também é utilizado para registro de novos produtos químicos que serão liberados para comercialização (Gautier et al. 1999; Chung et al. 2002; Ding et al. 2003; Ribeiro 2003).

A análise de MN só pode ser realizada em células que tenham a capacidade de entrarem em divisão (Fenech 2000). Entretanto a técnica já foi padronizada em diversos tipos celulares, como células de medula óssea, células de epitélio, células de brônquios, da bexiga urinária e de sangue periférico (Nepomuceno et al. 1997). O MN também foi padronizado em diversas espécies de animais: peixes (Al-Sabati 2000), anfíbios (Cabagna et al. 2006), répteis (Lopéz-González et al. 2013) e mamíferos (Rodrigues 2013). Em moluscos, o teste do MN foi utilizado por Filippi et al. (2018) para detectar o efeito mutagênico causado pela poluição de uma usina de carvão na Itália no caracol terrestre Helix aspersa. Neste experimento foi observado que após uma exposição de 13 dias em locais de diferentes proximidades da usina de carvão, a frequência de micronúcleos foi significativamente maior nos locais mais próximos a usina. Em outro estudo, o teste de micronúcleo demonstrou aumento na frequência de micronúcleos em mexilhões Mytilus galloprovincialis após a exposição a água contaminada de um porto comercial, em relação ao não exposto (Touahri et al. 2016).

A importância de padronização do teste de micronúcleos e HNA no caramujo, advém do fato de que o presente estudo é pioneiro na avaliação do teste de micronúcleos e HNA em B. glabrata, uma espécie considerada como bioindicador aquático.

2. JUSTIFICATIVA

A esquistossomose é considerada um problema de saúde pública mundial, por ser uma doença crônica, altamente debilitante para os acometidos e apresentar uma alta taxa de morbidade em todo o mundo. Esta doença também causa um impacto negativo na saúde, como consequência de manifestações inespecíficas, como anemia, intolerância ao exercício, desnutrição e dificuldades de aprendizagem (Gazzinelli et al. 2015). Além disso, as taxas de reinfecção apresentadas pela esquistossomose são bastante altas, provocando graves consequências na economia dos países endêmicos (King 2010; Barsoum 2013; Siqueira et al. 2017).

Diversos estudos demonstraram que a integração entre medidas profiláticas, como o tratamento de pessoas infectadas, quimioterapia preventiva, controle dos moluscos hospedeiros intermediários, educação em saúde, o fornecimento de água potável e o saneamento básico podem controlar a esquistossomose no mundo. Atualmente o único moluscicida recomendado para uso controlado pela OMS é a niclosamida. Entretanto este composto químico provoca acumulo em órgãos de outros animais aquáticos, além do seu alto custo impedir o seu uso em países subdesenvolvidos (Dai et al. 2014; King & Bertsch 2015). A niclosamida também possui baixa solubilidade em água e outros solventes orgânicos, e o uso indiscriminado contribui para o aumento de casos de linhagens de caramujos resistentes (Yuan et al. 2005; Dai et al. 2014; King & Bertsch 2015).

Os programas com foco no tratamento dos doentes são elaborados com base em um único medicamento, o praziquantel (PQZ). O PQZ não apresenta eficácia quanto as formas imaturas do parasito, e alguns estudos relataram resistência a essa droga (Song et al. 2012; Cioli et al. 2014; King & Bertsch 2015; Othman e Soliman 2015). No Brasil apenas 50,3 % da população tem acesso ao saneamento básico, e são poucos os programas de educação sanitária com foco na esquistossomose (Brasil 2016; Snis 2015).

Na tentativa de busca de novos compostos químicos com potencial moluscicida, o alvo do presente estudo é a molécula do PHMB. Este composto possui alto potencial biológico, e a sua alta atividade antimicrobiana é conferida através da cadeia principal de sua molécula, sendo considerado uma das substâncias mais promissoras disponíveis atualmente do ponto de vista clínico (Hubner & Kramer 2010; Afonso 2013). Dentre outras vantagens do uso desse composto químico destaca-se a boa solubilidade, o que 28

propicia o seu uso no ambiente natural do caramujo B. glabrata. Além disso, já foi demonstrado que este composto possui baixa toxicidade para outros organismos não alvo, comprovando a segurança do uso deste composto no meio ambiente (Christen et al. 2017). Devido à sua interação forte e inespecífica com fosfolipídios de membrana, o PHMB tem amplo espectro antimicrobiano incluindo bactérias gram-positivas e gram-negativas, bactérias formadoras de placas e de formação de biofilme, bactérias formadoras de esporos, bactérias intracelulares como clamídias e micoplasmas e fungos incluindo Candida spp. bem como Aspergillus spp. A ruptura da parede bacteriana juntamente com a inibição do metabolismo energético desses microrganismos torna o desenvolvimento de resistência ao PHMB improvável (Hubner & Kramer 2010).

Levando em consideração todos os problemas da esquistossomose que ainda precisam ser enfrentados, e a necessidade de novas buscas e identificação de compostos moluscicidas que sejam altamente seletivos e não tóxicos para outras espécies de animais e plantas aquáticas, este estudo objetiva encontrar possíveis alternativas para o controle desta doença através da diminuição do B. glabrata, que é o hospedeiro intermediário de S. mansoni mais importante (Knight et al. 2000). Este é o primeiro estudo que pretende avaliar a atividade moluscicida do composto PHMB através de testes genotóxicos e mutagênicos.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar a atividade moluscicida do cloridrato polihexametileno biguanida (PHMB) em Biomphalaria glabrata por meio de testes de toxicidade.

3.2 Objetivo Específico

Avaliar a atividade moluscicida do PHMB em embriões, recém-eclodidos e adultos do caramujo B. glabrata.

Determinar a CL50-144h do PHMB para embriões de B. glabrata, e a CL50-96h para caramujos recém-eclodidos e adultos de B. glabrata.

Avaliar a taxa de eclosão de embriões de B. glabrata expostos ao PHMB.

Identificar alterações morfológicas em embriões de B. glabrata após a exposição ao PHMB.

Avaliar alterações no comportamento do caramujo adulto de B. glabrata após a exposição do PHMB.

Avaliar os efeitos genotóxicos da exposição do PHMB em adultos de B. glabrata via ensaio cometa.

Identificar efeitos mutagênicos no caramujo adulto de B. glabrata causadas pela exposição ao PHMB, através do teste do micronúcleo.

Capítulo II

Artigo I

CAPÍTULO II – ARTIGO I

Graphical Abstract

Highlights

• Morphological changes in B. glabrata embryos after exposure to PHMB;

• Toxicity of PHMB to newborns and adult B. glabrata is dependent concentration;

• Behavioral changes in adults of B. glabrata after exposure to PHMB.

• PHMB is a potencial molluscicide.

Molluscicidal activity of polyhexamethylene biguanide hydrochloride on the early- life stages and adults of the Biomphalaria glabrata (Say, 1818)

Atividade moluscicida do cloridrato polihexametileno biguanida nos estágios iniciais de vida e adultos de Biomphalaria glabrata (Say, 1818)

Amanda de Oliveira Meloa; Daniela Braz Santosa; Luciana Damacena Silvab; Thiago Lopes Rochac*; José Clecildo Barreto Bezerraa

a Laboratory of Studies of the Host-parasite Relationship, Institute of Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goiás, Goiânia, Goiás. b Laboratory of Host-Parasite Interactions, State University of Goiás, Anápolis, Goiás, Brazil. c Laboratory of Environmental Biotechnology and Ecotoxicology, Institute of Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goiás, Goiânia, Goiás.

ABSTRACT

Schistosomiasis is a disease that affects tropical and subtropical areas and is considered the second most prevalent parasitic disease in the world. One of the ways of combating this disease is the use of molluscicidal agents to eliminate or reduce the population of intermediate host snails. Polyhexamethylene biguanide hydrochloride (PHMB) is a chemical biocide commonly used as a disinfectant and antiseptic in the food industry and very successfully for the disinfection of swimming pools. The US Environmental Protection Agency (USEPA) indicated the PHMB as low environmental risk. The present study aimed to evaluate the molluscicidal activity of the PHMB in freshwater snail (Biomphalaria glabrata), intermediate host of Schistosoma mansoni. The PHMB showed high toxicity against all stages of the snail B. glabrata: embryos, new- -1 -1 -1 borns and adults. The LC50 estimated was 0.98 mg L ; 1.43 mg L and 1.49 mg L , respectively, after exposure of 144 hours for embryos and 96 hours for new-borns and adults. PHMB did not prevent the development of embryos within the egg mass, since at all concentrations evaluated 80 % of the embryos managed to develop until the hypo- stage, which is the last stage of development before hatching. However, PHMB inhibited the hatching of embryos by 100 % at all concentrations above 1.6 mg L-1. PHMB proved to be a promising substance in the fight against schistosomiasis by eliminating the intermediate host (B. glabrata). This was the first study that makes an experimental observation of the molluscicidal activity of PHMB.

Keywords: schistosomiasis; snail; intermediate host; embryotoxicity; Schistosoma mansoni; PHMB.

1. Introduction Schistosomiasis, also known as bilharziosis, is a Neglected Tropical Disease (NTD) considered by the World Health Organization (WHO) as the second most widespread parasitic disease in more than 70 countries in the Americas, Africa and Asia. It is estimated that some 390-600 million people are infected worldwide, while 800 million remain in areas at risk of infection (Hotez et al. 2014; Grimes et al. 2015). In Brazil, it is estimated that more than 25 million people live in areas at risk for contracting this disease. The disease reflects socioeconomic problems in endemic countries, and the main approach to combating disease transmission is related to the periodic treatment of people living in areas at risk of anti-schistosomiasis drugs (Lambertucci, 2010; Grimes et al. 2015; Hotez et al. 2014). Freshwater snails of the genus Biomphalaria act as the intermediate host of schistosomiasis. Among the three freshwater snail species naturally infected by Schistosoma mansoni in Brazil, Biomphalaria glabrata (Say, 1818) is more relevant due to its wide geographic distribution, greater susceptibility to infection and efficacy in the transmission of schistosomiasis (Costeau et al. 2015; Scholte et al. 2014). In addition to the presence of an intermediate host with easy adaptation throughout the Brazilian territory, the economic situation of the population, basic sanitation systems for only 50.3 % of the population and low level of health education further aggravate the transmission of schistosomiasis in Brazil according reports (Brazil, 2010; Snis 2015). Prophylactic public health measures in endemic regions for schistosomiasis consist of treatment of infected persons, basic sanitation, health education, and control of snails. However, it is recognized that the most effective schistosomiasis control method to interrupt the cycle of S. mansoni is eliminating or reducing the number of intermediate hosts in endemic areas (Pile et al, 2002; Brazil, 2008; Bruun & Aagaard-Hansen, 2008; WHO, 2013; Sokolow et al. 2016). The WHO recommends the use of synthetic molluscicide niclosamide (Bayluscide®) as one of the strategies to combat schistosomiasis in the world (WHO, 2002). However, the niclosamide has high production value and can induced several secondary effects, such as bioaccumulation and high toxicity in non-target animals (Oliveira-Filho et al. 2010; King & Bertsch, 2015). In addition, the re-colonization of snail populations is observed after a few months of application of the niclosamide, demonstrating the niclosamide-resistant snail populations following repeated, extensive use of this molluscicide (Coura-Filho et al. 1992; Martins et al. 2014). In this context, the 35

discovery of new molluscicides, which could be more selective to Biomphalaria and less harmful to the aquatic environment is of urgent need for the combat of the schistosomiasis (Albuquerque et al. 2014; Coelho & Caldeira, 2016; Silva et al. 2018; Rocha-Filho et al. 2015). Polyhexamethylene biguanide hydrochloride (PHMB) is a chemical biocide and a member of the polymeric guanidine family commonly used as a disinfectant and antiseptic in the food industry and very successfully for the disinfection of swimming pools (Mashat, 2016). The US Environmental Protection Agency (USEPA) indicated the PHMB as low environmental risk (United States Enviromental Protection Agency, 2002). Toxic effects of PHMB have been reported for gram-negative and gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa) (Fjeld & Lingaas, 2016) and leishmaniosis with direct effect on the parasite (Firdessa et al. 2015). The mechanism of action (MoA) and toxicity of the PHMB in gram-negative and gram-positive bacteria was associated with binds to negatively charged phosphate groups in the cell wall, causing greater stiffness, rupturing and altering the permeability of the cytoplasmic membrane, and promoting the extravasation of cytoplasm that culminates in cell death. On the other hand, no PHMB-resistant bacteria have been previously reported (Kaehn, 2010). However, to the best of our knowledge, no data is available on the PHMB toxicity in the snail Biomphalaria. Accordingly, the aim of this study was to analyse the toxic effects of PHMB on the early-life stages and adults of the snail B. glabrata. Therefore, the effects of PHMB on the embryonic development, hatching rate, survival and morphological alterations of embryos, new-borns and adult snails were determined. The hypothesis of this study was that the PHMB has molluscicidal activity on B. glabrata, the snail intermediate host of S. mansoni.

2. Materials and methods

2.1 Test substance

The polyhexamethylene biguanide hydrochlori (PHMB) (Vantocil IB®) (CAS nº 32289-58-0; 20 % w/w) was donated from Arch Química do Brasil (São Paulo, Brazil). The PHMB stock solution (100 mg L-1) was made with milli-Q water. The Niclosamide (Bayluscide®, Bayer AG Leverkusen, Germany) (CAS nº 50-65-7) was purchased from 36

Sigma-Aldrich (São Paulo, Brazil) and the stock solution (0.1 mg mL-1) was made in milli-Q water.

2.2. Snails Adult B. glabrata snails (shell diameter: 10 ± 2 mm; total weight: 0.40 ± 0.10 g) were maintained in the Institute of Tropical Pathology and Public Health from Federal University of Goiás, such as recommended by OECD guideline nº 243 (OECD, 2016). Snails were kept in aerated glass tanks (24 × 16 × 9 cm) with 40 L of dechlorinated water under 12:12 h light/dark cycles, temperature (25 ± 1 °C) and pH (7,0 ± 1). Snails were fed ad libitum three times per week with lettuce leaves (Lactuca sativa).

2.3. Snail embryotoxicity test

The developmental toxicity of PHMB on B. glabrata was analyzed by embryotoxicity test according to Ducrot & Charles (2015) and OECD guideline nº 243 (OECD, 2016). Snail egg-clutches with 25 ± 10 embryos in the blastula stage (~ 12 h) were placed into 6-wells cell culture plates and exposed to PHMB (0.60, 1.0, 1.6, 2.0, 2.6, 3.0 and 3.6 mg L-1) during 144 h, jointly with a negative control group kept in reconstituted water (OECD, 2016) and a positive control exposed to niclosamide ® -1 (Bayslucida ) at 0.08 mg L (median lethal concentration – LC90-144h according to Oliveira-Filho et al. 2010). All experimental procedures were conducted in a static condition (5 mL per well) and a triplicate design (3 plates with 3 egg-clutches per condition) under 12:12 h light/dark cycles and environmental temperature of 25 ± 1 °C.

During the exposure period (24, 48, 72, 96, 120 and 144 h), the frequency (%) of viable and unviable embryos, embryo development stages and abnormal development were analyzed using a microscope (Leica DM 750) associated with the LEICA ICC50 HD camera and the LAS EZ software. Embryos were considered as unviable according to Oliveira-Filho et al. 2010: disaggregated dead embryos, embryos with no rotational movements, no foot movements or a heartbeat. The early development stages of B. glabrata were classified in five stages (blastulae, gastrulae, trochophore, veliger and hippo-stage) (Fig. 1), such as recommended by Rapado et al. (2013). The morphological changes during embryonic development of snails (shell malformations, poliophtalmia, reduced size and colour changes) were analyzed according to Oliveira-Filho et al. (2010) and Silva et al. (2018). 37

Figure 1. Early developmental stages of Biomphalaria glabrata. (A) Blastulae. (B) Gastrulae. (C) Trocophore. (D) Veliger. (E) Hypo-stage. Magnification 40x; bar scale = 500 µm.

At the end of exposure period (144 h), the hatching rate (%) was determined using the equation (1) described by OECD 243:

푁푢푚푏푒푟 표푓 ℎ푎푡푐ℎ푒푑 푒푚푏푟푦표푠 푥 100 (1) 푇표푡푎푙 푛푢푚푏푒푟 표푓 푒푚푏푟푦표푠

2.4. Acute toxicity tests with new-borns and adult snails

The acute toxicity tests (96 h) were conducted with new-borns (shell diameter: 2 ± 2 mm) and adult snails (shell diameter: 10 ± 2; total weight: 0.45 ± 0.10 g). Ten new- borns or adult snails were exposed to PHMB (0.60, 1.0, 1.6, 2.0, 2.6, 3.0 and 3.6 mg L-1) during 96 h, jointly with a negative control group kept in reconstituted water (OECD, 2016) and a positive control exposed to niclosamide (Bayluscide®) at 0.10 mg mL-1 for new-borns and adults (LC90-96h according to Ribeiro et al. 2009). Experiments were conducted in a static condition were placed into 6-wells culture cells plates (5 mL per well) for new-borns snail and glass aquariums (3 L) for adults, a triplicate design under 12:12 h light/dark cycles and environmental temperature of 25 ± 1 °C. The snails were no fed during the exposure period (OECD, 2016). The animals were considered dead according to the parameters described by Miyasato et al. (2012) and Tallarico et al. (2014): immobility, discolouration of shells, exposure of visceral mass, release of hemolymph and lack of heart beats.

2.5. Behavioural assessment

After the adult snail exposure to PHMB for 96 h, the frequency (%) of the following behavioural alterations was determined: total retraction into its shell; lethargy 38

when stimulated in the cephalopodal mass with forceps; displacement to the periphery and edges of the aquariums, production and secretion of mucus in the opening of the shell.

2.6 Statistical analysis

Statistical analyses were carried out using the Project R software (R Core Team, 2016). The results were compared using parametric tests (two-way ANOVA, followed by

Turkeys’ test). The median letal concentration (LC50) including its associated lower and upper confidence limits, were estimated using an appropriated statistical method based on a regression analysis. Furthermore, the No Observed Effect Concentration (NOEC) and the Lowest Observed Effect Concentration (LOEC) were evaluated by one-way analyses of variance (ANOVA) followed by multiple comparison procedure. Results were considered significant when p < 0.05.

3. Results and discussion

3.1 Embryotoxicity

The unexposed snail embryos showed a low mortality rate (15 ± 5 %) and high hatching rate (85 ± 5 %) after 144 h. Moreover, the embryos exposed to niclosamide (positive control group) showed the effects described in the literature generating a high mortality rate (95 ± 5 %), while complete inhibition of hatching (100 %) was observed throughout the experimental period, such as reported in previous studies (Oliveira-Filho et al. 2010). On the other hand, the results that showed that the embryos exposed to PHMB at all concentrations (0.6 to 3.6) were able to develop to the last stage of development, known as hypo-stage (Fig. 2), different from that of the positive control (Niclosamide) when embryos can only achieve reach the trochophore.

Figure 2. Frequency (%) of the early developmental stages of Biomphalaria glabrata after exposure to polyhexamethylene hydrochloride biguanide (PHMB) for 144 h. NC – negative control. PC – positive control.

The exposure to PHMB induced significant decrease in the hatching success of B. glabrata, especially at 1.0 mg L-1 (9 ± 8 %) and 1.6 mg L-1 (6 ± 5 %) (p<0.05; Fig. 3). Similar to niclosamide, complete inhibition of hatching (100 %) was observed after the exposure to high PHMB concentrations (2.0 to 3.6 mg L-1) (Fig. 3). In environmental situations, this inhibition of hatching may reduce the reproductive capacity and survival, promoting a reduction of snail’s population in an infested region, such as reported for Oliveira-Filho et al. (2010).

Figure 3. Hatching rate (%) of Biomphalaria glabrata after exposure to polyhexamethylene hydrochloride biguanide (PHMB) for 144 h. Results are presented as means ± standard deviations. The asterisk (*) indicates zero values. NC – negative control (reconstituted water). PC – positive control (niclosamide at 0.08 mg L-1).

The PHMB exposure induced several effects on embryos during the B. glabrata ontogenesis in an exposure time and concentration dependent patterns. The morphological alterations induced by PHMB on the early-life stages of B. glabrata are in Fig 4 and Table 2. The embryotoxic effects of PHMB are concentration dependent, wherein higher frequency of abnormalities was observed after exposure to 2.0 – 3.6 mg L-1 (Table 2). The embryotoxicity was mainly related to the presence of reduced and malformation shell (Fig. 4B), color changes (Fig. 4D) and poliophtalmia (Fig. 4C; Table 2).

Figure 4. Morphological changes in Biomphalaria glabrata embryos after exposure to hexamethylene biguanide hydrochloride (PHMB) for 144 h. (A) Unexposed embryos (negative control). (B) Embryos exposed to PHMB at 2.0 mg L-1; 1- embryo with shell malformation. (C) Embryo exposed to PHMB at 3.0 mg L-1; 1- embryo with right biophthalmia. (D) Embryos exposed to PHMB at 2.6 mg L-1; 1- embryo with reduced shell size. (E) Embryos exposed to PHMB at 3.6 mg L-1; 1 - Hydropic embryo; 2 - embryonic development delay; 3 - dead embryo. (F) Embryos exposed to niclosamide at 0.08 mg L-1 (Bayluscide®); 1 – dead embryo. Magnification 40x.

Table 1 - Frequency (%) of morphological alterations in early developmental stages of Biomphalaria glabrata after exposure to polyhexamethylene hydrochloride biguanide (PHMB) for 144 h. Results are presented as means ± standard deviations.

Morphological Control PHMB (mg L-1) Niclosamide alteration (%) 0.6 1.0 1.6 2.0 2.6 3.0 3.6 Normal 93.5 (± 0.03) 92.9 85 ± 0.14 79.1 ± 0.01 23.7 ± 0.05 54.6 ± 0.19 38.2 ± 0.28 43 ± 0.26 0 ± 0 Reduced and 0 (± 0) 3.8 2.8 ± 0.03 0.74 ± 0.01 65.6 ± 0.08 25 ± 0 28.4 ± 0.17 44.7 ±0.21 0 ± 0 malfomation shell Poliophthalmia 0 (± 0) 0 0 ± 0 0.74 ± 0.01 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 Color changes 1.6 (± 0.02) 0 4.6 ± 0.02 12.4 ± 0.05 0 ± 0 1.5 ± 0.02 5.9 ± 0.04 1.3 ± 0.04 0 ± 0 Dead 4.9 (± 0.002) 3.3 7.6 ± 0.08 7.02 ± 0.04 10.7 ± 0.05 18.9 ± 0.19 27.5 ± 0.27 11 ± 0.27 100 ± 0

In addition to the sublethal effects, the embryos exposed to PHMB showed a linear increase of the mortality during the exposure period (Y = 25.618X + 27.498, r2 = 0.7555, -1 p < 0.01). After the 144 h of exposure, IC50 of PHMB to snail embryos were 0.98 mg L

(upper limit: 0.97 – inferior limit: 1.0) (Table 1). The LC50 values of PHMB to B. glabrata embryos were lower than the minimum inhibitory concentration (MIC: 0.5 to 4.0 mg L- 1) and minimum bactericidal concentration (MBC: 1.0 to 32 mg L-1) reported for gram- positive and gram-negative bacteria (Koburger et al., 2010) and the LC50 of latex -1 Euphorbia milii (LC50-96h: 34.03 mg L ) (Oliveira-Filho, 2010), confirming their toxicity to early developmental stages of B. glabrata. On the other hand, the LC50 of PHMB for

B. glabrata embryos is higher than those reported for divaric acid (LC50, 24h: 0.01029 mg -1 -1 L (Silva et al. 2018) and potassium salt (LC50-24h 0.00577 μg ml ) (Martins et al. 2014).

-1 Table 2 - LC50-144 hours and LC50-96 hours values (in mg/L ), based on embryos, new-borns and adult snails of B. glabrata survival data analyses. Lowest Observed Effect Concentration (LOEC); No Observed Effect Concentration (NOEC).

Parameters Embryos New-borns snail Adult snail

LC50 0.98 1.43 1.49 [0.97 – 1.0] [ 0,44 – 2,00] [ 0.78 – 1.64] NOEC - - 0.6 LOEC 0.6 0.6 1.0

The toxicity of a compound to B. glabrata embryos depends on several factors and particularities of the molecule studied. These organoleptic characteristics are fundamental to determine the ability of the compound to penetrate the gelatinous capsule of the egg, formed of a perivitelinic substance rich in lipids, proteins and glycogen, which protects the embryo (Duarte et al., 2015; Hathaway et al., 2010; Miyasato et al., 2012; Ribeiro-Paes et al., 1994).

3.2 Toxicity to new-borns and adult snails The unexposed new-borns snail showed low mortality rate (5 ± 5 %) after 96 h, while no mortality was observed in the and unexposed adult snails (Fig. 5). In addition,

the niclosamide at 0.10 mg L-1 (positive control) induced 100 % of mortality in both new- borns and adult snails, such as previously reported by Ribeiro et al. (2009).

Figure 5. Mortality rate (%) of embryos (A) newborns (B) and adults (C) of Biomphalaria glabrata after exposure to polyhexamethylene hydrochloride biguanide (PHMB) for 144 hours for embryos and 96 hours for newborns and adults. Results are presented as means ± standard deviations. The asterisk (*) indicates zero values. P < 0.05. NC – negative control (reconstituted water). Different letters indicate significant differences of each concentration during the exposition period. PC – positive control.

The mortality of new-borns snails increased in a concentration dependent manner -1 with PHMB at concentrations above 0.6 mg L (Fig. 5 B). LC50, 96h of PHMB to hatched snails was 1.43 mg L-1 (upper limit: 0.44 – inferior limit: 2.00). Higher mortality was observed in new-borns snails after exposure to PHMB at 3.0 mg L-1 (90 ± 3.85 %) and 3.6 mg L-1 (100 ± 0 %) (Figure 5B).

Similar to new-borns snails, the toxicity of PHMB to adult snail was concentration -1 dependent (Table 1). The LC50 of PHMB for adult snail was 1.49 mg L (0.78 – 1.64). After 96 hours exposure, a higher mortality was observed after the exposure at 2.0 mg L- 1 (87.5 ± 12.5 %) and 2.6 mg L-1 (100 ± 0 %) (Figure 5C). The concentrations tested showed statistically significant results in relation to the control (p <0.05).

The LC50 values for adult snail of B. glabrata obtained in this study were lower than the values obtained in other older studies, such as the evaluation of molluscicidal -1 activity of Synadenium carinatum boiss (LC50-24h: 0.5 mg L ); of lectins from Cratylia -1 -1 floribunda (LC50-24h: 25.5 mg L ); Dioclea guianensis (LC50-24h: 23.1 mg L ); -1 -1 Amphimedon viridis (LC50-24h: 20 mg L ); Liagora farinosa (LC50-24h: 120 mg L ); Piper -1 - tuberculatum (LC50-24h: 4.19 mg L ) and usnic acid potassium salt (LC50-24h: 5.77 mg L 1) (Moreira et al. 2010; Santos et al. 2010; Miyassato et al. 2012; Rapado et al. 2013).

These results confirm that the PHMB has LC50 for embryos of B. glabrata smaller than the studies mentioned.

The mortality of the B. glabrata embryos may be associated with PHMB interference in the energy metabolism of the animals, as well as in the loss of calcium ions and enzymes important for the cellular membrane, because in bacteria the MoA of PHMB begins with the rapid attraction of the molecule, which has a cationic nature, on the negatively charged bacterial surface, causing a failure in the defence mechanism of the cell and rupture of the cell wall. PHMB is then attracted to the cytoplasmic membrane, causing the loss of low molecular weight substances such as potassium ions, calcium and inhibition of enzymes responsible for membrane junction, such as ATPase. Subsequently, there is a rupture of the cytoplasmic membrane that can induce the loss of macromolecular substances and the precipitation of cellular substances (Kaenh, 2010). This action promoted by PHMB can justify the rupture of the cellular membrane of the cells of the integument of B. glabrata snails, causing the hemolymph to be released. In addition, the interaction between the compound and the egg mass can alter the gas exchanges preventing embryo hatching. However, further studies are need to understand the MoA of PHMB to snails and their effects on energy metabolism, calcium metabolism and membrane integrity.

Previous studies with B. glabrata have confirmed that it is common for some compounds to be more toxic to adult snails than embryos, in addition the evaluated

compound may be lethal to adult individuals without impeding embryo development (Oliveira-Filho et al. 2010; Rapado et al. 2012). However, our data presented different results, since the LC50 for embryos was lower than the LC50 for adult snails, and although it does not impede the embryonic development, the PHMB prevents embryos from hatching after 144 hours of analysis. Through the results found, we can state that the PHMB can act in all the studied phases (embryos, new-borns and adults), being the embryonic phase the most sensitive to the compound. After 96 hours of exposure, no behavioural changes were observed in adult snails from negative control, while 100 % of snails died after exposure to niclosamide (positive control), inmates into their shells and displaced to the periphery of the aquariums. The exposure to PHMB at 1.6 mg L-1 induced lethargy (26 ± 0.02 %), reclusion into the shell (43 ± 0.02 %) and mucus secretion (63 ± 0.001 %), while 100 % of snails moved to the edges of the aquarium. On the other hand, after exposure to PHMB at concentrations above 2.6 mg L-1, all snails were already dead with reclusion into their shells and shifting to the periphery of the test aquarium (Fig. 6). The behavior of the snail against exposure of this compound, such as reclusion into the shell and mucus secretion demonstrate that the molluscicidal action of PHMB is the result of several actions that affect more than a system (WHO, 1983). Changes in behavior observed after exposure to compost can be considered as a defence mechanism of the animal, the secretion of mucus in the opening of the shell for example, can be understood as a way to block the entrance of the compost.

Figure 6. Proportion of changes in behaviour adults of Biomphalaria glabrata after the exposure to polyhexamethylene hydrochloride biguanide (PHMB) for 96 hours. NC – negative control. PC – positive control (niclosamide at 0.08 mg L-1).

Among the MoA of the PHMB, the breakdown of the cytoplasmic membrane due to its electrostatic interaction with phospholipids present in it is outstanding (Kaehn, 2010; Mashat, 2016). In our study, all experimental aquaria with concentrations above 1.6 mg L-1 contained hemolymph scattered in the test solution. This fact may explain the release of hemolymph from snails when in contact with the evaluated compound, a behavior that was also observed in other studies evaluating the molluscicidal potential of other substances (El-Beshbishi et al., 2015, Rapado et al., 2012). PHMB demonstrated low toxicity to human liver cells when compared to quaternary ammonium compounds such as BAC (composition: C12-C14- alkyl (ethylbenzyl) dimethylammonium chloride), Barquat (composition: C14 alkyl 50 %, C16 dimethyl benzyl chloride 10 % ammonia, 40 % C12) and benzalkonium chloride. In addition, PHMB also showed the highest LC50 and consequently low toxicity for zebrafish fish cells when compared to BAC, Barquat, benzalkonium chloride and glutaraldehyde (Christen et al. 2017), indicating that the PHMB has fewer side effects such as toxicity and bioaccumulation, in non-target animals, than niclosamide.

4. Conclusion

The results of the present study demonstrated that the PHMB failed to interrupt the development of the embryos until the last stage, a fact that can be explained by the protection conferred by the gelatinous capsule around the embryos. However, even with this result, and with the non-significant induction of malformations, PHMB was able to inhibit embryonic hatching of B. glabrata, an effect that certainly contributes to the fight against schistosomiasis.

All stages of B. glabrata snail evaluated in this study were susceptible to the toxic effects of PHMB, the embryonic phase being the most sensitive. In new-borns snails the -1 LC50 was estimated to be 1.43 mg L . In adult snails PHMB was able to cause changes -1 in the snail behavior, and LC50 was estimated to be 1.49 mg L . These data demonstrate that these results are within the parameters established by the WHO, which argues that the molluscicidal activity of a compound is recognized at concentrations below 100 ppm (WHO, 1993).

Acknowledgements

This work was funded by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, demanda social, edital 002/2016) and by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG, edital nº 04/17 – Programa Pesquisa para o SUS: Gestão Compartilhada em Saúde ‒ FAPEG/SES-GO/CNPq/MS- DECIT/2017– PPSUS/UFG/GO), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/MS/DECIT n. 37/2014. Projeto 470298/2014-6).

The authors thank the company Arch Quimica do Brasil for the donation of the compound evaluated in the present study.

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Capítulo III

Artigo II

CAPÍTULO III – ARTIGO II

Graphical Abstract

Highlights

 PHMB induces genotoxicity in snails B. glabrata in a non-concentration- dependent manner.  Higher mutagenic effects in B. glabrata after at higher concentrations.  Hemocytes of B. glabrata are important target for the toxicity of PHMB.

Genotoxic and mutagenic effects of Polyhexamethylene biguanide hydrochloride to Biomphalaria glabrata (Say, 1818)

Efeitos genotóxicos e mutagênicos do cloridrato polihexametileno biguanida para Biomphalaria glabrata (Say, 1818)

Amanda de Oliveira Meloa; Daniela Braz dos? Santosa; Juliana Boaventura Avelara;

Daniela de Melo e Silvab; Thiago Lopes Rochac*; José Clecildo Barreto Bezerraa

aLaboratory of Studies of the Host-parasite Relationship, Institute of Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goiás, Goiânia, Goiás. b Laboratory of Mutagenese, Institute of Biological Sciences, Federal University of Goiás,

Goiânia, Goiás. c Laboratory of Environmental Biotechnology and Ecotoxicology, Institute of Tropical

Pathology and Public Health, Federal University of Goiás, Goiânia, Goiás.

*Corresponding author at: T. L. Rocha, Universidade Federal de Goiás, Instituto de

Patologia Tropical e Saúde Pública, Rua 235, Setor Universitário, Goiânia, Goiás, Brasil.

CEP: 74605050, Goiânia, Goiás, Brasil. Tel.: +55 (62) 3209-6109; Fax: +55 (62) 3209-

6363. E-mail address: [email protected]

ABSTRACT

Schistosomiasis is a disease that is still prevalent in Africa, Asia and South America. Considered the second most prevalent parasitic disease in the world, it affects more than 250 million people. The most affected patients live in conditions of poverty and little or no sanitation, where there are few resources for research. The consensus on the best control strategy for schistosomiasis has varied greatly over the years, but the World Heatlh Organization (WHO) since 1940 advises on the use of integrated measures including access to clean water and sanitation, health education, patient care and snail control host of the parasite. Since then the efforts to discover new molluscicidal agents have grown considerably. The present study aimed to evaluate the genotoxicity and mutagenicity of polyhexamethylene biguanide hydrochloride (PHMB) in the intermediate host of Schistosoma mansoni, the freshwater snail Biomphalaria glabrata. Snails were exposed to PHMB (0.5, 1.0 and 1.5 mg L-1) for 48 h and the genotoxicity (Comet assay – DNA damage) and mutagenicity (mincronucleus test and hemocyte nuclear abnormalities assay) were analyzed in the circulating hemocytes. The results showed that PHMB induced greater genotoxicity at 1.0 and 1.5 mg L-1 after 48 hours of exposure. As for mutagenicity, PHMB induced the formation of micronuclei and nuclear alterations at 1.0 mg L-1 after 48 hours of exposure. The results indicate that B. glabrata hemocytes are immune cells suitable for evaluating the genotoxic and mutagenic effects of potential molluscicidal compounds. Further investigations are needed to determine the mode of action of PHMB on the snail and to explain the molluscicidal activity that this compound has on B. glabrata.

Keywords: schistosomiasis; snail; micronucleus test, comet assay, intermediate host, S. mansoni.

1. Introduction According to the World Health Organization (WHO), about 240 million people worldwide are affected by schistosomiasis, and another 700 million people live in areas at risk of contracting the disease. The schistosomiasis belongs to the class of Neglected Tropical Diseases (NTD) that cause great morbidity to the patients. This disease occurs in 78 countries across South America, Asia, and Africa, and are originates from infection with parasitic trematode worms of the genus Schistosoma. Among the damages caused by this disease, can cite the decreases both the growth and intellectual development of children and the production and working capacity of adults (Collaborators, 2017; Colley et al., 2014; Sanogo et al., 2018). Currently, three forms are used to control the transmission of schistosomiasis. The first is periodical treatment of people living in risk areas with anti-schistosomicidal drugs. The second method involves the elimination of the intermediate host from the biological cycle of Schistosoma mansoni, such as the freshwater snail of the genus Biomphalaria Last but not least, health education is the third form of disease control (Faria et al., 2018; Othman & Soliman, 2015; WHO, 2010). It is known that the distribution of the diseases caused by snailborne trematodes especially schistosomiasis is focal. Therefore, the parasites distribution is strongly dependente on the intermediate snail hosts distribution (Abe et al., 2018; Gordy et al., 2016; Hanington et al., 2012). Among the intermediate host of schistosomiasis, the B. glabrata snails play an integral role in the transmission of S. mansoni (Chistsulo et al., 2000; Katz et al., 2018; Noya et al., 2015). The WHO recommends utilization of niclosamide (Bayluscide®) to control of the intermediate host of Schistosomiasis (WHO, 1992). However, the niclosamide has high production value and can induced several secondary effects, such as photodegradation, bioaccumulation and high toxicity in non-target animals (Faria et al., 2018; Hartmann et al., 2011; Oliveira-Filho et al., 2010; Pereira et al., 2017). In addition, the re-colonization of snail populations is observed after a few months of application of the niclosamide, demonstrating the niclosamide-resistant snail populations following repeated, extensive use of this molluscicide (Coura-Filho et al., 1992; Martins et al., 2014). Therefore, the importance for the search of new compounds with potential molluscicidal activity. Genotoxicity studies analyse the effects of xenobiotic agents on genetic material, which may result in single or double strand breaks of DNA, also promoting the formation of adducts. These changes occurring in the DNA molecule, when unrepaired may lead to 61

mutations and/or cell death, as well as decrease the fertility and their ability to respond to environmental changes (Collins, 2004; Gunasekarana et al., 2015). In terms of genotoxicity biomarkers, the comet assay has been indicated as a sensitive technique for detection of DNA damage in hemocytes of several species of the molluscs (Ibrahim et al. 2018; Rocha-Filho et al., 2015). On the other hand, the micronucleus (MN) and hemocyte abnormalities assay (HNA) are suitable approaches to assess the chromosomal alterations (Filippi et al., 2018; Touahri et al. 2016). The guanidines family, the Polyhexamethylene Hydrochloride Biguanide (PHMB) is originally used as disinfectant and antiseptic (Mashat, 2016). PHMB acts on gram positive and negative bacteria through the negatively charged phosphate groups present in the wall of these microorganisms, promoting the extravasation of cytoplasm that causes cell death (Kaehn, 2010). PHMB has been described as an inhibitory agent of bacteria, fungi and parasites (Firdessa et al., 2015; Fjeld and Lingaas, 2016). The mechanism of toxicity of PHMB has not yet been described for the snails of the genus Biomphalaria sp. In this study the genotoxic (DNA damage) and mutagenic effects (chromossal alterations) of PHMB were analysed in hemolymph of in the adult snails B. glabrata during acute exposure (48 h) in order to verify its mechanism of action (MoA) associated to its molluscicidal activity.

2. Materials and Methods 2.1 Snails Adult snails B. glabrata with shell diameter of 10 ± 2 mm and total weight of 0.40 ± 0.10 g were kept at the Tropical Pathology and Public Health Institute of the Federal University of Goiás, as recommended by the guideline of OECD nº 243 (OECD, 2016). The snails were kept in aerated glass tanks of 24 × 16 × 9 cm diameter with a capacity of 40 L of dechlorinated water in light / dark cycles of 12:12 h, temperature of 25 ± 1 ° C and pH around 7.0 ± 1. The snails were fed ad libitum three times a week with lettuce leaves (Lactuca sativa).

2.2 Substance test

The Polyhexamethylene biguanide hydrochloride (PHMB), commercially known as Vantocil IB® (CAS No. 32289-58-0; 20 % w / w), was donated from Arch Química do Brasil (São Paulo, Brazil). The stock solution of PHMB (100 mg L-1) was made in Milli- Q water.

2.3 Exposure

Adult snails were exposed to PHMB (0.5, 1.0, 1.5 mg L-1) during 48 h, jointly with a negative control group kept in reconstituted water (OECD, 2016) in glass aquarium (3 L final water volume in the aquarium). Experiments were conducted a triplicate design under 12:12 h light/dark cycles and environmental temperature of 25 ± 1 °C. The snails were no fed during the exposure period (OECD, 2016). The mortality was analyzed daily (0, 24 and 48 h), while the cumulative mortality rate (%) was obtained at the end of the experiment (48 h) was determined using the equation:

푁푢푚푏푒푟 표푓 푑푒푎푑 푠푛푎푖푙푠 푀표푟푡푎푙푖푡푦 푟푎푡푒 (%) = ∗ 100 푇표푡푎푙 푛푢푚푏푒푟 표푓 푠푛푎푖푙푠

The animals were considered dead according to the parameters described by Miyasato et al. (2011) and Tallarico et al. (2014): immobility, discoloration of shells, exposure of visceral mass, release of hemolymph and lack of heart beats.

After the exposure period, the collection of hemolymph followed the procedures described by Grazeffe et al. (2008). All the snails were carefully cleaned with absorbent paper and 100 µL of hemolymph was collected by puncturing the foot with a micropipette. The hemolymph samples were stored into 1.5 ml centrifuge microtube with 100 µL of EDTA.

2.4 Genotoxicity The genotoxicity of PHMB in B. glabrata was evaluated by comet assay in circulating hemocytes, according to Sing et al. (1988) and Grazeffe et al. (2008) with modifications. A volume of 100 µL of hemolymph with EDTA was dissolved in 500 µL

of 0.5 % low melting agarose, and 100 µL of this solution was placed on microscope slide covered with 1.5 % normal melting agarose (Sigma). After the solidification at 4°C (10 - 15 min), the slides were placed in lysis solution (1 % Triton X-100, 10 % DMSO, Stock Lysis Solution pH = 10) at 4 °C during 2 h. The electrophoresis was conducted alkaline conditions (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH > 13, 30 min unwinding, 30 min electrophoresis at 300 mA and 25V, at 4 °C). The slides were then neutralized with 0.4 M Tris buffer, pH 7.5, fixed with absolute ethanol for 10 min, and stained with 50 µL SYBR green Staining solution S (430 Sigma Aldrich). The comets (n = ??? per animal; n = ??? per experimental condition) were analyzed under a fluorescence microscope (Carl Zeiss) associated to ISIS® software (MetaSystems, Altlußheim, Germany) at 400×, with an exciting filter of 515–560 nm and a barrier filter of 590 nm. Slides were coded independently and scored blindly.

For the evaluation of the DNA damage, used the TriTek Comet ScoreTM program, version 1.5. This software evaluated pixel intensity to provide corresponding values to estimate genomic damage, as arbitrary units (AU). DNA damages was quantified in terms of the tail length (TL), the percentage of DNA in the tail (% DNA), and the Olive tail moment (OTM) (Collins 2004). To classify the DNA degree in the tail, the cells were classified according to the parameters of Almeida et al. (2011): zero or minimal 10 % tail, low damage 10 e 25 %, mid damage 25 e 50 %, high damage 50 e 75 %, and extreme damage > 75 %.

2.5 Mutagenicity Mutagenicity of PMBH to snails was analyzed by micronucleus (MN) test and hemocyte abnormalities assay (HNA) according to the protocol described by Carrasco et al. (1990) with modifications. The procedures used to prepare the slides in the MN test were performed according to Silva (2010). A volume of 100 μl of hemolymph was collected from each snail (n = 5 per experimental condition), which was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes at 4 °C. A volume of 20 μL of the centrifuged hemolymph was then spread on a slide, which was placed in a moist chamber for 30 minutes. The slides were fixed with methanol (10 %) for 10 minutes and stained with Pantype solution (NewProv) for 10 minutes. An average of 3000 intact cells with nuclear and cellular distinction were counted per slide (n = 3000 per animal; n = 3000 per experimental

condition). The MN test and HNA were measured by determining the frequency of hemocytes with micronucleus (MN), binucleated nucleus (BN), lobed nucleus (LN), kidney-shaped nucleus (KN), blebbed nucleus (BB) and nucleus type broken-eggs (BE), according to Fenech et al. (2003); Pavlica et al. (2000) and Vignardi et al. (2015).

2.6 Statistical analysis

The results were compared using parametric tests (two-way ANOVA, followed by the Tukey’s test) and/or non-parametric test (Kruskall-Wallis), depending on the distribution of the data and homogeneity of variance (Shapiro-Wilk and Levene's tests). Results were considered significant when p<0.05. Statistical analyses were carried out using the Statistica 7.0 software (Statsoft Inc., 2005, Tulsa, OK, USA).

3. Results and discussion

3.1 Comet assay

DNA damage in B. glabrata adult hemocytes was analyzed by the comet assay, and the results were expressed as percentage (%) DNA in the tail of the comet (Figure 1 and Figure 2). The unexposed snails (control group) showed no significant DNA damage, and no significant changes were detected in any of the parameters during the experiment (p> 0.05; Fig. 1). After 48 hours of exposure, early DNA damage was detected in hemocytes of snails exposed to PHMB at 1.0 mg L-1, 2.9-fold greater than DNA damage caused by the non-exposed group (p < 0.05; Figure 1), while the PHMB at 1.5 mg L-1 induced higher DNA damage (2.4-fold) when compared to control group. But this damage was lower than the damage caused by concentration of 1.0 mg L-1 in the same evaluated period (p <0.05).

Figure 1. DNA damage expressed as tail DNA % (mean ± SD) in Biomphalaria glabrata from control and exposed to PHMB during 48 hours.

Figure 2. Representative comet assay image in hemocytes of Biomphalaria glabrata from control and exposed to PHMB, control group (A), 0.5 mg L-1 (B), 1.0 mg L-1 (C), 1.5 mg L-1 (D). Cells were stained with SYBR® Green and the image was recorded with an Axio Imager 2 (Zeiss®) optical fluorescence microscope associated with ISIS® software (MetaSystems) using a total magnification of 400x.

The percentage of DNA in the tail was used to classify the degree of DNA damage of B. glabrata adult snails exposed to PHMB (Table 1). The hemocytes of unexposed snails had minimal (18.8 %) and low damages (39.6 %). However, the PHMB exposure induced genotoxic effects in a concentration-dependent patterns. The snails exposed to PHMB at 0.5 mg L-1 for 48 h showed 74 % of the hemocytes with minimal (44.6 %) or low damage (29.7 %), while those exposed to 1.0 mg L-1 showed 44.7 % of hemocytes presented high damage and 39.8 % presented extreme damage, and snails exposed to 1.5 mg L-1 also presented higher percentage of cells with high (52.2 %) and extreme (19.6 %) damage.

The comet assay has been successfully used as a nonspecific, fast and low-cost biomarker for detecting genetic damage in different species (Katsumiti et al., 2009; Kumaravel & Jha, 2006; Ramsdorf et al., 2012). The use of hemolymph hemocytes for 67

genotoxic evaluation through the comet assay has already been described in other species of molluscs (Al-Fanharawi et al., 2018; Bhattacharya et al., 2016; Sarkar et al., 2013), and the positive result of the use of these cells is due to the fact that hemocytes play a fundamental role in the transport of substances toxins that enter the body as well as the defence mechanisms of animals (Bolognesi et al., 2004; Grazeffe et al., 2008), such as observed in the B. glabrata exposed to PHMB (Figure 2).

Table 1 - Frequency of hemocytes (%) distributed by grade of DNA damage in Biomphalaria glabrata from control and exposed to PHMB for 48 and 96 hours.

Time (h) Minimal Low Mid Hight Extreme

damage damage damage damage damage

0 Control 18.8 39.6 33.7 6.9 1.0 48 22.5 41.9 29.9 4.8 0.9 -1 0.5 mg L 48 44.6 29.7 21.8 3.5 0.5 -1 1.0 mg L 48 0.0 2.9 12.6 44.7 39.8 -1 1.5 mg L 48 4.3 6.5 17.4 52.2 19.6

PHMB penetrates the nucleus of the hemocytes and interacts with the DNA or nuclear proteins indicating that this compound has genotoxic action and causes DNA fragmentation in the hemocytes of the B. glabrata snail, since other authors have demonstrated that PHMB does not interact indirectly with the molecule in mammalian cells (Muller et al. 2013; Creppy et al., 2014). Since there are no studies evaluating the genotoxic and mutagenic effects of the exposure of other chemical compounds on the B. glabrata snail, it can’t be said that the damage caused is a consequence of secondary non-nucleus lesions, such as through interaction with other nuclear structures. According to previous studies (OECD 2002a, OECD 2002b, OECD 2002c), the PHMB was not classified as genotoxic for bacteria and mammalian cell. However, the results of the present study demonstrated that PHMB is genotoxic for B. glabrata snail, inducing DNA damage, as can be observed by the results of the comet assay.

In addition, PHMB does not induce significant oxidative stress in mammalian cells, with MDA (malondialdehyde) production or lipoperoxidation, nor does it induce DNA hydroxylation and / or hypermethylation. PHMB also failed to induce significant production of mitogenic cytokines, such as TNF-α (tumor necrosis factor), interleukins (IL-1 alpha) and transcription factor kappa nuclear factor B (NF-κB) that can cause apoptosis or stimulate the growth of transformed cells or tumors, indicating that there was no DNA cleavage, as demonstrated by Creppy et al. (2014). Therefore, this leads us to believe that the damage caused by this compound is the result of direct interaction with the DNA molecule. The mechanism by which PHMB kills cells from different organisms is still the subject of much research. It is known that mammalian cells treated with PHMB had no or very weak activation of Caspase-3, indicating that the cells are not undergoing apoptosis (Creppy et al., 2014). In our results, we observed that the hemocytes of the snails after exposure to the concentration of 1.5 mg L-1 underwent apoptosis, which decreased the amount of cells per slide and prevented the evaluation of this concentration in the MN test.

3.2 Micronucleus Test

Six types of HNA induced by PHMB exposure were found in the present study (Figure 4). The mutagenic effects induced by PHMB were concentration dependent, as higher HNA were found at higher concentrations. It was not possible to observe nuclear alterations in hemocytes of snails in the concentration of 1.5 mg L-1. The frequency of MN and HNA in the control group remained unchanged throughout the bioassay. After exposure to PHMB at 1.0 mg L-1, it was possible to observe 12, 86% of cells with some kind of nuclear alteration. Moreover, in this same concentration, 6.16% had micronuclei, and about 1.6% had 2 nuclei (binucleated haemocytes), corresponding to 35% and 13%, respectively, of cells with this type of nuclear alteration of all the changes found. Figures 3 and 4 show some of the cellular changes that were analyzed in adult B. glabrata snails.

Figure 3. Hemocyte nuclear alterations observed in Biomphalaria glabrata after exposure to PHMB. (A)

Normal nucleus. (B) Micronucleus (arrow head). (C) Binucleated nucleus (asterisk). (D) Blebbed nucleus

(arrow). (E) Lobed nucleus (arrow). (F) Kidney-shaped nucleus (arrow). (G) Broken-eggs nucleus (arrow).

Figure 4. Total hemocyte nuclear alterations (A) and frequency of the hemocytes micronucleus (B), binucleated cells (C), with blebbed nucleus (D), with lobed nucleus (E), with kidney-shaped nucleus (F), and broken eggs nucleus (G) in Biomphalaria glabrata from control and exposed to polyhexamethylene hydrochloride biguanide (PHMB) for 48 hours. Results are expressed as mean ± SD.

Genotoxicity tests are performed to clarify the effects of xenobiotic agents on genetic material and changes in gene products (polypeptides and proteins). These agents can cause single or double strand breaks of DNA. These changes in the DNA molecule, when unrepaired, can cause mutations (Grisolia 2005).

The MN test is a method that provides a comprehensive basis for investigating the harmful potential of the chromosome because both aneugenic and clastogenic origin damage can be detected in cells that have been subjected to cell division during or after exposure to the chemical (OECD 2014).

Micronuclei (MN) are small fragments that form whenever a chromosome or a fragment of a chromosome is not embedded in one of the daughter cell nuclei after cell division due to lack of centromere, centromere defects, or cytokine defects (Touahri et al., 2016; Vincent- Hubert et al., 2011). As previously described, PHMB does not cause indirect DNA damage, ie through mechanisms such as oxidative stress, lipoperoxidation in mammalian cells (Creppy et al., 2014). In this context the results of the HNA frequency of the short-term exposure of PHMB leads us to infer that the mechanisms that lead to the formation of these nuclear alterations are derived from the direct interaction of the compound with the DNA molecules. In addition, blebbed and fragmented nuclei, and binucleate cells have been associated with failure of tubulin polymerization and mitotic spindles caused by aneugenic actions (Qualhato et al., 2017; Sadiqul et al., 2016).

The binding between PHMB with single stranded DNA and double stranded DNA and RNA molecules has been described (Allen et al., 2004). Taking into account that PHMB interacts with the genetic code, and the fact that transcriptional regulation is a key factor in the ability to adapt to hostile environments, after this interaction of the compound with the DNA molecule, the mechanism of cell repair is probably acting to correct this damaged DNA, since a large amount of damage is not observed through the micronucleus test.

4. Conclusion

The present study evaluated the genotoxic and mutagenic effects of the PHMB, which has been indicated as potential a molluscicide against S. mansoni intermediate host snail. This is the first study to evaluate the genotoxicity and mutagenicity of this 72

compound in B. glabrata snail. The hemocytes of B. glabrata were cells of the immune system suitable for analysis of DNA damage and nuclear alterations induced by compounds with potential molluscicidal action.

The results indicated that the comet assay was an effective technique to assess early DNA damage induced by exposure of PHMB in B. glabrata hemocytes. Other studies indicated that PHMB is not genotoxic for other species, but the same compound has been shown to be genotoxic to the snail, demonstrating a specific toxicity to B. glabrata at the concentration of 1.0 mg L-1. The results presented by the MN test and HNA showed that the PHMB at the concentration of 1.0 mg L-1 and the exposure time of 48 hours induced the formation of MN and nuclear alterations in hemocytes of B. glabrata. The results indicated that the PHMB has genotoxic action on the genetic material of B. glabrata.

Acknowledgements

This work was funded by the Foundation for Research Support of the State of Goiás (FAPEG, edital nº 04/17 - Program for Research on SUS: Shared Health Management - FAPEG / SES-GO / CNPq / MS-DECIT / 2017- PPSUS / UFG / GO) and by the Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES, social issue 002/2016), and the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq / MS / DECIT 37/2014 Project 470298/2014 -6 ]). We would like to thank the Mutagenic Laboratory of the Federal University of Goiás (Labmut - UFG). The authors thank the company Arch Quimica do Brasil for the donation of the compound evaluated in the present study.

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Capítulo IV

Considerações finais

CAPÍTULO IV – CONSIDERAÇÕES FINAIS

Este foi o primeiro trabalho realizado por meio de bioensaios, que avaliou a atividade moluscicida do PHMB em todas as fases de vida do caramujo B. glabrata, hospedeiro intermediário de S. mansoni. Também foi possível avaliar as alterações comportamentais nos caramujos adultos, a genotoxicidade e a mutagenicidade através dos danos genéticos causados pela exposição deste composto.

Os resultados demonstraram que o PHMB não interrompeu o desenvolvimento embrionário, fato que pode ser explicado pela proteção conferida pela cápsula gelatinosa ao redor dos embriões. No entanto, mesmo com este resultado, e com a indução não significativa de malformações, o PHMB foi capaz de inibir a eclosão de B. glabrata, um efeito que certamente contribui para a redução da população de caramujos de uma região infestada.

Todas as fases do caramujo B. glabrata avaliadas neste estudo foram suscetíveis - aos efeitos tóxicos do PHMB, sendo a fase embrionária a mais sensível (CL50 0,98 mg L 1 -1 ). Nos caramujos recém-eclodidos a CL50 foi estimada em 1,43 mg L . Nos caramujos adultos, o PHMB foi capaz de causar alterações no comportamento do caramujo e a CL50 foi estimada em 1,49 mg L-1.

Esses dados demonstram que esses resultados estão dentro dos parâmetros estabelecidos pela OMS, que argumentam que a atividade moluscicida de um composto é reconhecida em concentrações abaixo de 100 ppm (WHO 1993).

Os resultados dissertados confirmam que os hemócitos de B. glabrata foram células do sistema imune adequadas para análise de danos no DNA e alterações nucleares induzidas por compostos com potencial ação moluscicida. Os resultados também indicaram que o ensaio cometa foi uma técnica eficaz para avaliar danos precoces no DNA induzidos pela exposição de PHMB a hemócitos de B. glabrata. O PHMB nas concentrações de 1,0 e 1,5 mg L-1 após 48 horas de exposição foi genotóxico sem efeito concentração-resposta.

Os resultados apresentados pelo teste do MN mostraram que o PHMB na concentração de 1,0 mg L-1 e no tempo de exposição de 48 horas induz a formação de micronúcleos e alterações nucleares no hemócitos de B. glabrata. Os resultados

apresentados neste teste, juntamente com os resultados do ensaio cometa, podem sugerir que o PHMB tem ação genotóxica e mutagênica nos hemócitos de B. glabrata.

ANEXOS

Produções científicas

Resumos em congressos e seminários

XXIV Congresso Latino-americano de Parasitologia:  Avaliação do efeito moluscicida do cloridrato polihexametileno biguanida em Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário de Schistosoma mansoni.  Alternativa de intervenção na esquistossomose por triagem in silico de novos compostos moluscicidas para Biomphalaria glabrata (MOLLUSCA, PLANORBIDAE)  Avaliação in silico da atividade do Tiabendazol, Albendazol, Alendronato e Metronidazol contra enzimas do metabolismo energético do Schistosoma mansoni  Embriotoxicidade de nanopartículas de óxido de zinco em caramujos Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário de Schistosoma mansoni  Estímulo ao estudo da parasitologia pela educação empreendedora em biotecnologia e formação de força de trabalho

XIII Seminário de Patologia Tropical e Saúde Pública e VIII Semana da Biotecnologia:  Formação de força de trabalho em biotecnologia: resultados da educação empreendedora no processo de formação, motivação e iniciativas profissionais na última década no IPTSP/UFG.

Participação em cursos, estágios e congressos  Proponente da palestra “Iniciativa Biotec - Movimento Biotec Brasil” - NÚCLEO’17 - III Encontro Nacional de Estudantes de Biotecnologia.  Proponente do minicurso “Gastrópodes de Importância Médica” - 28a Semana do ICB.  Comissão organizadora do II Simpósio de Nanobiotecnologia e Saúde Ambiental.

Artigos submetidos em revistas científicas

 Molluscicidal activity of polyhexamethylene biguanide hydrochloride on the early-life stages and adults of the Biomphalaria glabrata (Say, 1818) 84

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