ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Μελέτη της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων φυσικών πληθυσμών της Atherina boyeri (Οικ. Atherinidae) με χρήση μικροδορυφορικών δεικτών

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΜΑΓΚΑΦΑ ΑΣΗΜΙΝΑ

ΒΙΟΛΟΓΟΣ

ΠΑΤΡΑ-2013

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Μελέτη της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων φυσικών πληθυσμών της Atherina boyeri (Οικ. Atherinidae) με χρήση μικροδορυφορικών δεικτών

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΜΑΓΚΑΦΑ ΑΣΗΜΙΝΑ

ΒΙΟΛΟΓΟΣ

ΠΑΤΡΑ-2013 ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ:

Επιβλέπων Καθηγητής:

Κίλιας Γ. Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών

Μέλη: Κλώσσα-Κίλια Ε. Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών

Παπασωτηρόπουλος Β. Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Τεχνολόγων Γεωπόνων Τ.Ε.Ι. Δυτικής Ελλάδας

Πρόλογος

Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής του Γενετικής, Βιολογία Κυττάρου και Ανάπτυξης, του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κατά τα έτη 2012-2013. Έχοντας πλέον φτάσει στο τέλος της εργασίας αυτής, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους εκείνους που συνετέλεσαν προκειμένου να ολοκληρωθεί η προσπάθεια αυτή. Κατ’ αρχήν θα ήθελα να ευχαριστήσω πολύ τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Κίλια, ο οποίος ήταν ο κύριος επιβλέποντας της παρούσας εργασίας. Τον ευχαριστώ θερμά που με δέχθηκε στο εργαστήριό του και φυσικά για όλη του την βοήθεια προκειμένου να ολοκληρωθεί η μεταπτυχιακή διατριβή μου. Οι συμβουλές, οι εύστοχες παρεμβάσεις του και οι προβληματισμοί που έθετε βοήθησαν στην ανάπτυξη της επιστημονικής μου σκέψης και θα είναι πολύτιμα εφόδια για την μετέπειτα πορεία μου. Στο σημείο αυτό θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να δώσω και στην Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Έλενα Κλώσσα-Κίλια, η βοήθεια της οποίας ήταν εξίσου σημαντική για την ολοκλήρωση της εργασίας αυτής. Οι συμβουλές της, η ενθάρρυνσή της και η πάντα αισιόδοξη στάση της συνέβαλαν ώστε να υπάρξει μια όμορφη και εποικοδομητική συνεργασία. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Βασίλη Παπασωτηρόπουλο τόσο για την οικονομική υποστήριξη του συγκεκριμένου προγράμματος, χωρίς την οποία δεν θα ήταν δυνατή η ολοκλήρωσή του, όσο και για την συνολική βοήθεια του για την επιτυχή περάτωση της εργασίας αυτής. Επιπλέον,θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον μεταδιδάκτορα του τμήματος Βιολογίας Αντώνη Αυγουστίνο, η βοήθεια του οποίου στο εργαστηριακό μέρος της διατριβής αυτής ήταν ανεκτίμητη. Οι συμβουλές του, η ορθή καθοδήγησή του και η πολύτιμη εμπειρία του υπήρξαν σημαντικοί παράγοντες προκείμενου να ολοκληρωθεί η προσπάθεια αυτή. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους προπτυχιακούς και μεταπτυχιακούς φοιτητές του εργαστηρίου για την βοήθεια τους αλλά πάνω από όλα για το όμορφο κλίμα που επικρατούσε μεταξύ μας. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να δώσω στις υποψήφιες διδάκτορες Χαρά Παπαϊωάννου και Μαρία Καμηλάρη για την πολύτιμη βοήθεια τους στην παρούσα εργασία αλλά και την αρμονική συνεργασία που είχαμε αυτά τα χρόνια, ενώ επίσης θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στη Σπυριδούλα Κράιτσεκ, η οποία έθεσε τις βάσεις του ευρύτερου προγράμματος μελέτης της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων των πληθυσμών της Atherina boyeri, στο οποίο εντάσσεται και η παρούσα εργασία.

Πάτρα, 2013 Μαγκαφά Ασημίνα

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1

Α.1 Γενικά 1 Α.1.1 Βιοποικιλότητα 1

Α.2 Γενικά για το είδος 2 Α.2.1 Ορισμός του είδους 2 Α.2.2 Ειδογένεση 3 Α.2.3 Συστηματική κατάταξη 6

Α.3 Δείκτες πυρηνικού DNA 7 Α.3.1 Οι μικροδορυφόροι 7 Α.3.2 Εφαρμογές των μικροδορυφόρων στην έρευνα 9

Α.4 Στοιχεία για τον υπό μελέτη οργανισμό 10 Α.4.1 Η Atherina boyeri 10

A.5 Σκοπός της παρούσας εργασίας 17

Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 19

Β.2.1 Περιοχές δειγματοληψίας 19 Β.2.2 Απομόνωση γενετικού υλικού από Atherina boyeri 20 Β.2.2.1 Αρχή της μεθόδου απομόνωσης DNA 20 Β.2.2.2 Εφαρμογή της μεθόδου 21 Β.2.3 Ηλεκτροφόρηση ολικού DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 22 Β.2.3.1 Γενικά 22 Β.2.4 Πολλαπλασιασμός γονιδιακών τμημάτων με τη βοήθεια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) 22 Β.2.4.1 Αρχή της μεθόδου 24 Β.2.4.2 Εφαρμογή της μεθόδου 25 Β.2.5 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 29 Β.2.5.1 Αρχή της μεθόδου 29 Β.2.5.2 Παρασκευή πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου 29 Β.2.5.3 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 30

Β.3 Επεξεργασία αποτελεσμάτων με υπολογιστικά προγράμματα 30

Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 32

Γ.1.1 Οι έντεκα μικροδορυφορικοί δείκτες 32 Γ.1.1.1 Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης 32 Γ.1.1.2 Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 43 Γ.2 Επεξεργασία των δεδομένων σε υπολογιστικά προγράμματα 57

Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 67

Δ.1 Αξιολογηση δεικτών 67 Δ.2 Έλεγχος κατάταξης των ελληνικών πληθυσμών στις τρεις προτεινόμενες ομάδες 70 Δ.3 Μελλοντικοί στόχοι για την χρησιμοποίηση των μικροδορυφορικών δεικτών 71 Δ.4 Ανακεφαλαίωση 72

Ε. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 73

ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 75

1

Α. Εισαγωγή

Α.1 Γενικά Α.1.1. Βιοποικιλότητα

Η έννοια της βιοποικιλότητας (biodiversity,biological diversity) αποτελεί ένα αμφιλεγόμενο θέμα που έχει προξενήσει πολλές φορές διαφωνίες τόσο μεταξύ των μελών της επιστημονικής κοινότητας όσο και στο ευρύ κοινό. Πολλά έχουν δημοσιευτεί επί του συγκεκριμένου θέματος από τότε που πρωτοεμφανίστηκε στο διεθνές φόρουμ για την Βιοποικιλότητα (National Forum on Biological Diversity) το Σεπτέμβριο του 1986. Ο όρος βιοποικιλότητα χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από τον περιβαλλοντολόγο Raymond F.Dasman το 1968 στο βιβλίο με τίτλο «A different Kind of Country», στο οποίο τασσόταν εμφανώς υπέρ της διαφύλαξής της. Η ορολογία αυτή, ωστόσο, υιοθετήθηκε από τον επιστημονικό κόσμο σχεδόν μετά από μια δεκαετία, αφού μέχρι τότε επικρατούσε ο όρος «φυσική ποικιλότητα» (natural diversity). Στη δεκαετία του ‘80, ο Robert E.Jenkins, o Thomas Lovejoy και άλλοι επιφανείς περιβαλλοντολόγοι της εποχής εισήγαγαν σταδιακά την έννοια της βιολογικής ποικιλότητας, γνωστής αργότερα από τον συνηρημένο τύπο της ως βιοποικιλότητα από τον W.G.Rosen το 1985 στο National Forum on Biological Diversity, τα πρακτικά του οποίου δημοσιεύτηκαν το 1988 από τον Ε.Ο.Wilson, γνωρίζοντας μεγάλη επιτυχία. Η βιοποικιλότητα, αν και όχι πλήρως καθορισμένη ακόμα και σήμερα, αποτελεί την διαφορετικότητα, την ποικιλομορφία της ζωής όπως αυτή μπορεί να εκφράζεται μέσα από το σύνολο των γονιδίων (genetic diversity), των βιολογικών ειδών (species diversity), των οικοσυστημάτων (ecosystem diversity) ή και ολόκληρου του πλανήτη και είναι αποτέλεσμα εκατοντάδων εκατομμυρίων χρόνων εξελικτικής ιστορίας. Το 2003 ο καθηγητής του Πανεπιστημίου του Cardiff, Anthony Campbell, όρισε και άλλο ένα επίπεδο ποικιλότητας, αυτό της μοριακής βιοποικιλότητας (molecular biodiversity). Τα ερωτήματα που εγείρονται σχετικά με τον όρο βιοποικιλότητα είναι πολλά. Τι ακριβώς ορίζεται ως βιοποικιλότητα; Είναι απλά ο αριθμός των ειδών σε μια περιοχή και αν είναι κάτι παραπάνω πώς μπορεί αυτό να μετρηθεί; Πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η ενδοειδική γενετική διαφοροποίηση, όλα τα είδη είναι εξίσου σημαντικά για τον προσδιορισμό της και τελικά η διατήρησή της είναι τόσο αυτονόητη και επιτακτική όπως θεωρούνταν κάποτε; Όπως γίνεται αντιληπτό, αυτά είναι μόνο μερικά από τα ερωτήματα που καλείται να απαντήσει ο επιστημονικός κόσμος. Αυτό που θεωρείται δεδομένο είναι ότι η βιοποικιλότητα δεν κατανέμεται με ομοιόμορφο τρόπο στην Γη (Gaston,1996). Συγκεκριμένα φαίνεται να υπάρχουν 2

περιοχές με έντονη βιολογική ποικιλομορφία όπως είναι τα τροπικά δάση και οι κοραλλιογενείς ύφαλοι, άλλες που δείχνουν να έχουν ελάχιστη, όπως οι έρημοι και οι πολικές περιοχές και όλες οι υπόλοιπες κινούνται σε ενδιάμεσα αυτών επίπεδα. Υπάρχει δηλαδή μια τάση αύξησης της ποικιλότητας από τους πόλους προς τις τροπικές περιοχές. Ωστόσο αρκετές έρευνες (Roy et al., 1998, Chown et al.,2012) υποστηρίζουν πως αυτό ισχύει για τους χερσαίους οργανισμούς αφού οι υδρόβιοι και κυρίως οι θαλάσσιοι δεν φαίνεται να ακολουθούν παρόμοιο πρότυπο. Οι σημαντικότεροι παράγοντες που την επηρεάζουν πέραν του γεωγραφικού πλάτους είναι η θερμοκρασία, το υψόμετρο, η μορφολογία του εδάφους, η ατμοσφαιρική κατακρήμνιση (βροχοπτώσεις,χιονοπτώσεις κ.ά) και η παρουσία άλλων ειδών. Μέχρι σήμερα δεν έχει καταστεί δυνατό να υπολογιστεί ο ακριβής αριθμός ειδών που υπάρχουν στον πλανήτη. Σύμφωνα με τους τελευταίους υπολογισμούς, ο αριθμός των αναγνωρισμένων ειδών ανέρχεται γύρω στα 1,2 εκατομμύρια. Βάση μιας πρόσφατης μελέτης των Mora et al. (2011) υπολογίζεται ότι ο συνολικός αριθμός των ειδών παγκοσμίως φτάνει στα 8,7 εκατομμύρια (± 1,3 εκατομμύρια) εκ των οποίων θεωρείται ότι τα 2,2 εκατομμύρια (± 0,18 εκατομμύρια) είναι θαλάσσιοι οργανισμοί. Άρα όπως γίνεται κατανοητό μένει να αναγνωριστούν ακόμα το 86% των χερσαίων και το 91% των θαλάσσιων οργανισμών. Στα πλαίσια αυτής της αναζήτησης της βιοποικιλότητας και του ακριβούς αριθμού ειδών, θα μπορούσαμε να πούμε ότι εντάσσεται και η παρούσα εργασία η οποία μελετά την πιθανή ύπαρξη κρυπτικών ειδών στο είδος Atherina boyeri, όπως θα αναλύσουμε παρακάτω.

Α.2 Γενικά για το είδος Α.2.1 Ορισμός του είδους

Πολλοί ορισμοί έχουν προταθεί κατά καιρούς προκειμένου να περιγράψουν τι είναι τελικά το «είδος». Μέχρι σήμερα δεν έχει καταστεί εφικτό να επικρατήσει καθολικά ένας ορισμός μιας και καθένας από τους προτεινόμενους έχει τα πλεονεκτήματα αλλά και τα μειονεκτήματά του. Αυτός που θεωρείται γενικά ο πιο αποδεκτός μέχρι σήμερα και που θα υιοθετηθεί στην παρούσα εργασία είναι ο βιολογικός ορισμός του είδους, ο οποίος και προτείνει ως είδος μια ομάδα αμφιγονικά αναπαραγόμενων φυσικών πληθυσμών που είναι αναπαραγωγικά απομονωμένη και ανεξάρτητη από άλλες τέτοιες ομάδες (Conye & Orr,2004). Η ορολογία αυτή τυγχάνει μεγάλης αποδοχής αφού εξηγεί διασταυρώσεις οι οποίες συμβαίνουν σε συνθήκες αιχμαλωσίας, όπου το φυσιολογικό ταίρι δεν είναι διαθέσιμο, ή διασταυρώσεις που έγιναν έπειτα από ανθρώπινη παρέμβαση. Επίσης ερμηνεύει γιατί άτομα τα οποία από άποψη φυσιολογίας είναι ικανά να αναπαραχθούν μεταξύ τους, δεν το κάνουν στα φυσικά ενδιαιτήματά τους. Ωστόσο στα μειονεκτήματα του ορισμού αυτού πρέπει να αναφέρουμε την ανεπάρκειά του στο να περιγράψει τους οργανισμούς που αναπαράγονται με αφυλετικό τρόπο ή με παρθενογένεση, ενώ παράλληλα είναι 3

δύσκολο να εξηγήσει αν άτομα που προέρχονται από γεωγραφικά απομονωμένους πληθυσμούς και άρα δεν έχουν την δυνατότητα επαφής, αν θα μπορούσαν να διασταυρωθούν κάτω από κατάλληλες συνθήκες (Bickford et al., 2007). Για τους μονογονικά αναπαραγόμενους οργανισμούς, που αναφέρθηκαν παραπάνω, χρησιμοποιείται ο μοριακός ορισμός του είδους ο οποίος με την σειρά του προτείνει ως είδος ένα σύνολο ατόμων με όμοιες βασικές γονιδιωματικές αλληλουχίες DNA (Αλαχιώτης, 2007).

Α.2.2 Ειδογένεση

Με τον όρο ειδογένεση αναφερόμαστε στην εξελικτική διαδικασία δημιουργίας ενός ή περισσότερων νέων ειδών, (Staley et al.,2009). Η μεγάλη ποικιλότητα των οργανισμών που υπάρχει σήμερα αποδίδεται ακριβώς σε αυτή τη μακροχρόνια διαδικασία της ειδογένεσης. Για να διαχωριστούν πάντως γενετικά δυο πληθυσμοί μεταξύ τους και να οδηγήσουν στο σχηματισμό νέου είδους είναι απαραίτητο να είναι πλήρως απομονωμένοι. Η απομόνωση αυτή μπορεί να είναι είτε γεωγραφική είτε αναπαραγωγική. Ως προς το πρώτο σκέλος, τέσσερις είναι οι κύριες κατηγορίες ειδογένεσης: 1.Απότομη ή Αλματώδης ειδογένεση: Αποτελεί τη μοναδική περίπτωση δηµιουργίας νέων ειδών σε πολύ σύντοµο χρονικό διάστηµα, ακόμα και µέσα σε µία ή δύο γενιές. Αποδίδεται είτε σε µεταλλάξεις, είτε σε πολυπλοειδία. Μια µετάλλαξη για να οδηγήσει σε απότοµη ειδογένεση πρέπει να πληροί κάποιες προϋποθέσεις όπως το να αποµονώνει γενετικά το μεταλλαγμένο άτοµο, να µην προκαλεί στειρότητα ή θνησιµότητα, ενώ σε περιπτώσεις φυλετικά αναπαραγόμενων πληθυσμών πρέπει να εµφανίζεται ταυτόχρονα σε δύο ή περισσότερα ετεροφυλετικά άτοµα. Επίσης πρέπει να συναντηθούν και να γονιµοποιηθούν δύο ετεροφυλετικά άτοµα µε την ίδια µετάλλαξη, ενώ τέλος οι απόγονοί τους πρέπει να είναι βιώσιµοι και γόνιµοι. Όλες αυτές οι προϋποθέσεις αυτές καθιστούν την απότοµη ειδογένεση µέσω µεταλλάξεων, εξαιρετικά σπάνια. Οι πιθανότητες όµως αυξάνουν σημαντικά σε είδη που αναπαράγονται μέσω παρθενογένεσης. Η απότοµη ειδογένεση προερχόμενη από πολυπλοειδία είναι ένα ιδιαίτερα σύνηθες φαινόµενο στα φυτά (Αλαχιώτης,2007) και μάλιστα έχει υπολογιστεί ότι περισσότερο από το 40% των ανθοφόρων ειδών οφείλεται σε πολυπλοειδία. 2. Αλλοπάτρια ή γεωγραφική ειδογένεση: Είναι η πιο συνήθης µορφή ειδογένεσης αν και πολλοί επιστήµονες υποστηρίζουν ότι είναι ο µοναδικός µηχανισµός ειδογένεσης στα ζώα. Η αλλοπάτρια ειδογένεση συντελείται σε τρία στάδια. Στο πρώτο και σηµαντικότερο στάδιο, ένας πληθυσµός ή οµάδα ατόµων από ένα πληθυσµό, αποµονώνονται γεωγραφικά. Αυτό µπορεί να συµβεί πολύ συχνά στη φύση, είτε µε τη διαίρεση µιας ενιαίας περιοχής εξάπλωσης, όπως είναι ένα δάσος που καταστρέφεται και αποµένουν συστάδες ή ένα λιβάδι που διαχωρίζεται από ένα ποτάµι, είτε µε τη µετανάστευση µερικών ατόµων σε µια µη 4

κατειληµµένη περιοχή, φαινόµενο σύνηθες στα νησιωτικά συμπλέγματα. Στο δεύτερο στάδιο οι αποµονωµένοι πληθυσµοί εξελίσσονται ανεξάρτητα µέσω της φυσικής επιλογής και διαφοροποιούνται µορφολογικά και γενετικά. Κατά το τρίτο στάδιο, που δεν είναι απαραίτητο στην όλη διαδικασία της αλλοπάτριας ειδογένεσης, οι αποµονωµένοι πληθυσµοί έρχονται ξανά σε επαφή είτε µε την επανένωση της περιοχής εξάπλωσης είτε µε την επανάκαµψη ατόµων από το δευτερογενή πληθυσµό. Τα αποτελέσματα από την ανάμειξη τέτοιων πληθυσμών μπορούν να διαφέρουν σημαντικά. Σε περίπτωση που η ειδογένεση έχει συντελεστεί πλήρως και τα νέα είδη αντιμετωπίσουν με επιτυχία τον ανταγωνισμό, τότε αυτά μπορούν να συνυπάρξουν μεταξύ τους. Εάν όμως το ένα είδος είναι πιο ανταγωνιστικό από το άλλο τότε θα έχουμε τον αφανισμό του πιο αδύνατου. Σε αντίθετη περίπτωση, εάν δηλαδή δεν έχει ολοκληρωθεί πλήρως η διαδικασία της ειδογένεσης και οι πληθυσμοί δεν έχουν απομονωθεί γενετικά τότε είναι πιθανό ο ένας πληθυσμός να αφομοιωθεί από τον άλλον. Υπάρχει βέβαια και το ενδεχόμενο, και πάλι εφόσων η ειδογενετική πορεία δεν έχει συντελεστεί πλήρως, αλλά οι πληθυσμοί βρίσκονται σε ανταγωνισμό μεταξύ τους να επιταχυνθούν τότε οι διαδικασίες της ειδογένεσης. Αυτό συµβαίνει γιατί οι δύο πληθυσµοί προσπαθώντας να αποφύγουν τον ανταγωνισµό αποµονώνονται οικολογικά ή ηθολογικά και έτσι γίνεται δυνατή η συµπλήρωση της ειδογένεσης Στην περίπτωση αυτή η ειδογένεση δεν είναι µόνο αλλοπάτρια αλλά είναι και παραπάτρια όπως θα δούµε και παρακάτω. Η αλλοπάτρια ειδογένεση που συντελείται χωρίς τη µετανάστευση ατόµων, αλλά µόνο µε την κατάτµηση της προϋπάρχουσας κατανοµής καλείται βικαριανιστική. 3&4. Παραπάτρια και συμπάτρια ειδογένεση: Πρόκειται για παραπλήσιους µηχανισµούς ειδογένεσης όπου η γενετική αποµόνωση συντελείται µέσα στα όρια εξάπλωσης ενός πληθυσµού και σε αντίθεση µε την αλλοπάτρια ειδογένεση δεν απαιτείται γεωγραφική αποµόνωση. Η παραπάτρια ειδογενετική πορεία (Abbot et al., 2008) συντελείται όταν, µέσα στα όρια ενός πληθυσµού, κάποια γενετικά διαφοροποιηµένα άτοµα αποµονώνονται ηθολογικά ή οικολογικά. Η αποµόνωση αυτή επιτείνει περισσότερο τη γενετική και τη µορφολογική διαφοροποίηση. Μπορούµε να δεχτούµε ότι στην παραπάτρια ειδογένεση η απόκλιση στη µορφή συντελείται παράλληλα µε τη γενετική αποµόνωση, ενώ αντίθετα στην αλλοπάτρια, πρώτα συντελείται η µορφολογική διαφοροποίηση και έπεται η γενετική. Στη συµπάτρια ειδογένεση επίσης συντελείται πλήρης γενετική αποµόνωση οµάδας ή οµάδων ατόµων ενός πληθυσµού, πριν από οποιαδήποτε µορφολογική, ανατοµική και φυσιολογική διαφοροποίηση. Υπάρχουν δεδοµένα προερχόµενα από παρατηρήσεις πειραµατικών και φυσικών πληθυσµών που δείχνουν ότι κάποιος βαθµός γενετικής αποµόνωσης µπορεί να δηµιουργηθεί συµπάτρια, ωστόσο είναι αδύνατον να παρατηρηθεί πλήρης συµπάτρια ειδογένεση. Μερικοί επιστήµονες αποδίδουν στη συµπάτρια ειδογένεση, τη διαφοροποίηση που εµφανίζουν µερικές κατηγορίες ειδών, όπως τα παράσιτα των οποίων οι θυγατρικές γενιές παραµένουν για µεγάλο διάστηµα στον ίδιο ξενιστή καθώς και τα φυτοφάγα έντοµα που τρέφονται αποκλειστικά από ένα είδος φυτού. Τόσο η συµπάτρια όσο και η παραπάτρια ειδογένεση αντιµετωπίζονται µε σκεπτικισµό από τους 5

επιστήµονες. Το γεγονός είναι ότι αν πράγµατι υπάρχουν θα συντελούνται πολύ σπάνια. Ως προς την αναπαραγωγική απομόνωση τώρα πρέπει να αναφέρουμε αρχικά ότι αποτελείται από όλους εκείνους τους μηχανισμούς, είτε αυτοί είναι προσυζευκτικοί είτε είναι μετασυζευκτικοί, που εμποδίζουν την αναπαραγωγή μεταξύ δυο συμπατρικών πληθυσμών. Η πρώτη κατηγορία, οι προσυζευκτικοί µηχανισµοί αποµόνωσης δηλαδή, περιλαμβάνει τα ακόλουθα: 1. Μηχανισµός χρονικής αποµόνωσης: Συντελείται όταν η αναπαραγωγική περίοδος δύο ή περισσότερων συµπάτριων ή γειτονικών πληθυσµών ή ακόµα και υποοµάδων ενός πληθυσµού δεν συµπίπτει χρονικά (διαφορετική ώρα ή εποχή). Στο ζωικό κόσµο είναι ιδιαίτερα γνωστή στα έντοµα. 2. Μηχανισµός οικολογικής αποµόνωσης: Συντελείται όταν δύο ή περισσότεροι συµπάτριοι ή γειτονικοί πληθυσµοί ή άτοµα και υποοµάδες ενός πληθυσµού κατέχουν διαφορετική και καλά καθορισµένη θέση µέσα σε ένα οικοσύστηµα. Για παράδειγµα, υπάρχουν πληθυσµοί χερσαίων σαλιγκαριών που στο ίδιο οικοσύστηµα συναντώνται τόσο πάνω στα βράχια όσο και κάτω από πέτρες, χωρίς να εµφανίζουν διάθεση ανάµειξης. Έτσι στις δύο αυτές υποοµάδες βρίσκεται σε εξέλιξη ο µηχανισµός οικολογικής αποµόνωσης. 3. Μηχανισµός ηθολογικής αποµόνωσης: Σε πολλά είδη ανώτερων ζώων αλλά ακόµα σε µαλάκια, αρθρόποδα και εχινόδερµα παρατηρείται διαφορετική συµπεριφορά πριν το ζευγάρωµα. Συγγενικοί πληθυσµοί που έχουν διαφορετική συµπεριφορά ζευγαρώµατος όταν βρεθούν στον ίδιο χώρο, λόγω ηθολογικής αποµόνωσης δεν διασταυρώνονται, ακόµα και αν δεν αποτελούν καλά καθορισµένα είδη. Είχε παρατηρηθεί, για παράδειγμα, σε πληθυσµούς ψαριών που ζούσαν σε γειτονικές λίµνες στη Ν. Αυστραλία, διαφορετική συµπεριφορά ζευγαρώµατος χωρίς καµιά άλλη µορφολογική διαφοροποίηση. Όταν τεχνητά έργα ένωσαν µερικές λίµνες οι πληθυσµοί εξαπλώθηκαν στο χώρο και υπήρξε επικάλυψη χωρίς όµως η ηθολογική αποµόνωση να επιτρέπει ροή γενετικού υλικού μεταξύ τους. Σε ενυδρεία, ψάρια από τους πληθυσµούς αυτούς, χάνουν τις ηθολογικές τους ιδιαιτερότητες και συµπεριφέρονται σαν ενιαίος πληθυσµός. 4. Μηχανική αποµόνωση: ΄Εχει παρατηρηθεί σε είδη ότι η κατασκευή των γεννητικών οργάνων των ατόμων είναι τέτοια που εμποδίζει τη μεταφορά σπέρματος και συνεπώς την αναπαραγωγή. Ένας άλλος τρόπος με τον οποίο μπορούν να σχηματιστούν νέα είδη είναι ο υβριδισμός ύστερα από πολυπλοειδία άλλων, που προϋπήρχαν. Η προέλευση ενός τέτοιου νέου είδους μπορεί να είναι το αποτέλεσμα εγκαθίδρυσης αναπαραγωγικής απομόνωσης που αναπτύσσεται μεταξύ του υβριδικού είδους και των προγονικών, εξαιτίας της δημιουργίας γενετικής δυσαρμονίας κατά τη μείωση. Η αναπαραγωγική απομόνωση που προκύπτει με αυτόν τον τρόπο είναι σε γενικές γραμμές πιο αυστηρή στα ζωικά παρά στα φυτικά είδη. Σημειώνεται ότι η σπουδαιότητα του τύπου αυτού υβριδικής ειδογένεσης μπορεί να προκύψει και από το γεγονός ότι οι αρχικοί υβριδικοί απόγονοι, που είναι μερικώς στείροι με το ένα ή με το άλλο γονικό είδος, μπορεί να επαναδιασταυρωθούν με τον έναν ή με τον άλλον γονέα, με αποτέλεσμα σε 6

λίγες γενιές να έχει δημιουργηθεί μια σειρά διαειδικών υβριδίων, μερικά από τα οποία θα είναι πολύ όμοια με τον έναν ή με τον άλλον γονέα. Το αποτέλεσμα θα είναι η υβριδοποίηση μεταξύ των γονικών τύπων να γίνεται πιο σπάνια, επειδή μεσολαβεί η υβριδική ζώνη, και, σε συνδυασμό με το ότι οι υβριδικοί απόγονοι έχουν χαμηλή αρμοστικότητα, οι γονικοί τύποι θα διατηρούνται χωριστά, γεγονός που ενισχύει την περαιτέρω διαφοροποίηση και εξέλιξή τους.

Α.2.3 Συστηματική Κατάταξη

Αρχικά, η συστηματική κατάταξη των ειδών γινόταν με βάση τις ομοιότητες στα μορφολογικά χαρακτηριστικά των διαφόρων οργανισμών. Η Φαινετική συστηματική, όπως αυτή ονομάζεται, είναι η προσπάθεια καθορισμού των σχέσεων μεταξύ των οργανισμών μέσω του βαθμού ομοιότητάς τους σε επίπεδο ορατών χαρακτήρων, χωρίς να λαμβάνει υπόψη την φυλογένεια ή τις εξελικτικές σχέσεις (Sneath Peter, Sokal Robert,1973). Όπως γίνεται αντιληπτό, αυτός ο τρόπος ταξινόμησης των ειδών, παρόλο που είναι αρκετά απλός ελλοχεύει τον κίνδυνο να καταταχθούν στο ίδιο είδος οργανισμοί οι οποίοι μοιάζουν φαινοτυπικά λόγο συγκλίνουσας εξέλιξης -οργανισμοί δηλαδή που αν και ανήκουν σε διαφορετικούς εξελικτικούς κλάδους απέκτησαν στην πορεία ίδια χαρακτηριστικά εξαιτίας της προσαρμογής τους σε κοινά περιβάλλοντα- ή λόγο προσαρμοστικής διάσπασης, φαινόμενο που χαρακτηρίζεται από μια γρήγορη διαφοροποίηση της προγονικής μορφής ώστε να καλυφθούν όλοι οι ελεύθεροι οικολογικοί χώροι. Αναφορικά μόνο παραθέτουμε ότι απέναντι από την Φαινετική βρίσκεται η Κλαδιστική Σχολή, η οποία δίνει έμφαση στο κριτήριο της κοινής καταγωγής και υποστηρίζει ότι όσο πιο πρόσφατος είναι ο χωρισμός δυο ειδών τόσο περισσότερα κοινά γνωρίσματα πρέπει να έχουν. Τα τελευταία χρόνια, χάρη στην άνθιση νέων μοριακών τεχνικών, οι επιστήμονες έχουν στρέψει την προσοχή τους σε πολυμορφισμούς στο επίπεδο του DNA προκειμένου να απαντήσουν σε ερωτήματα σχετικά με την ειδογένεση. Η πρώτη τέτοια προσπάθεια που βασίστηκε συγκεκριμένα στην χρήση βιοχημικών πολυμορφισμών έγινε στη δεκαετία του ΄60. Αφορούσε το σύστημα ΑΒΟ των ομάδων αίματος (Landsteiner 1900, Nuttall, 1904) και η ανάλυση πολυμορφισμού έγινε με την τεχνική της ηλεκτροφόρησης ισοενζύμων, δεδομένου ότι είχε παρατηρηθεί ότι πολλά ένζυμα παρουσίαζαν ισομορφές, ενζυμικές μορφές δηλαδή που είχαν διαφορετική ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Η μελέτη της γενετικής ποικιλότητας με την ηλεκτροφόρηση ενζύμων καθιερώθηκε μετά το 1960 (Harris, 1966; Lewontin & Hubby, 1966) και έκτοτε χρησιμοποιείται μέχρι και σήμερα. Τα βασικά στάδια της μεθόδου αυτής είναι η απομόνωση ολικού πρωτεϊνικού δείγματος, διαχωρισμός των πρωτεϊνών σε κατάλληλο πήκτωμα, χρώση και επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Ως βασικό της πλεονέκτημα προβάλλει το γεγονός ότι είναι χαμηλού κόστους, απλή και γρήγορη ενώ ταυτόχρονα δεν απαιτεί εξειδικευμένο εξοπλισμό. Σημαντικό μειονέκτημα ωστόσο της μεθόδου είναι ότι κάθε μετάλλαξη που συμβαίνει σε ένα γενετικό τόπο δεν οδηγεί απαραίτητα και σε διαφορετική 7

ηλεκτροφορητική κινητικότητα της πρωτεΐνης (Ashburner, 1991), ενώ πρέπει επίσης να αναφέρουμε ότι η απομόνωση και διατήρηση πρωτεϊνικών δειγμάτων είναι ένα αρκετά δύσκολο εγχείρημα. Εν συνεχεία, χάρη και στην αλληλούχιση του DNA, η μελέτη για τη βιοποικιλότητα στηρίχθηκε κυρίως στους γενετικούς μάρτυρες. Οι γενετικοί δείκτες (Hurst,Jiggins, 2005) είναι γονιδιακές ή μη αλληλουχίες που χρησιμοποιούνται ευρύτατα είτε σε ενδοειδικές είτε σε διαειδικές μελέτες (Pleines et al., 2009). Αναμφισβήτητα ο πιο ευρέως χρησιμοποιούμενος δείκτης στις πληθυσμιακές, βιογεωγραφικές και φυλογενετικές έρευνες είναι το μιτοχονδριακό DNA(mtDNA). Η μεγάλη απήχησή του οφείλεται στην έλλειψη ιστονών για την συγκρότηση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος, την περιορισμένη ικανότητα επιδιόρθωσης των λαθών κατά την αντιγραφή με αποτέλεσμα την εμφάνιση υψηλού ρυθμού μεταλλακτικότητας αλλά και της γρήγορης σταθεροποίησης των μεταλλάξεων αυτών στο γονιδίωμα. Εκτός των προαναφερθέντων, η έλλειψη ανασυνδυασμού (Clayton,1982; Hayashi et al., 1985) και ο γρήγορος πολλαπλασιασμός του κάνουν σαφές για ποιο λόγο θεωρείται εξαιρετικό εργαλείο στα χέρια των ερευνητών (Michaels et al., 1982; Robin and Wong, 1988). Ωστόσο, όπως συμβαίνει με κάθε χρησιμοποιούμενο δείκτη, το mtDNA παρουσιάζει ορισμένα μειονεκτήματα. Το κυριότερο εξ’ αυτών είναι η παρουσία μιτοχονδριακών ψευδογονιδίων στο πυρηνικό γονιδίωμα αρκετών οργανισμών. Παρά την ύπαρξη μεθόδων και τεχνικών που σκοπό έχουν να μειώσουν την επιρροή των ψευδογονιδίων στα υπό μελέτη δεδομένα, η αποτελεσματικότητά τους είναι μικρή και συνεπώς η χρήση του mtDNA απαιτεί μεγάλη προσοχή. Επιπλέον το γεγονός ότι το μιτοχονδριακό γενετικό υλικό αποτελεί έναν μοναδικό απλότυπο από τους πολλούς που υπάρχουν συνιστά έναν εξ’ ορισμού περιορισμό, καθώς έτσι μπορούμε να παρακολουθήσουμε την εξέλιξη μόνο από την «μητρική σκοπιά» (πλην ορισμένων εξαιρέσεων) χωρίς αυτό φυσικά να σημαίνει ότι αντανακλά τη συνολική εξελικτική ιστορία του πληθυσμού ή του είδους. Επίσης πρέπει να αναφέρουμε ότι το δραστικό μέγεθος πληθυσμού του mtDNA είναι το ένα τέταρτο συγκριτικά με αυτό των πυρηνικών αυτοσωμικών δεικτών (Zhang & Hewitt, 2003), ενώ η ύπαρξη πιθανής μιτοχονδριακής ετερογένειας (ετεροπλασμία) εφιστά την προσοχή για τη χρήση του mtDNA ως μοριακού δείκτη.

Α.3 Δείκτες πυρηνικού DNA Α.3.1 Οι μικροδορυφόροι

Εκτός από το μιτοχονδριακό DNA, η δεύτερη πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη τάξη δεικτών είναι αυτή των πυρηνικών. Για τους σκοπούς της παρούσας εργασίας χρησιμοποιούνται μικροδορυφορικές αλληλουχίες, οι οποίες κατατάσσονται στην ευρύτερη κατηγορία των SSLPs (Simple Sequence Length Polymorphisms). Οι μικροδορυφόροι είναι διαδοχικές επαναλήψεις ενός DNA μοτίβου που αποτελείται από 1-6 βάσεις (Wan et al., 2004). Οι απλές αυτές επαναλαμβανόμενες 8

αλληλουχίες είναι ευρέως διαδεδομένες σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς που έχουν μελετηθεί (Tautz & Schlotterer, 1994). Η χρήση τους στις πληθυσμιακές αναλύσεις έχει βοηθήσει σημαντικά στον προσδιορισμό της γενετικής δομής πληθυσμών και της γενετικής ποικιλότητας ενώ καθοριστικός είναι και ο ρόλος τους ως δείκτες στη γενετική χαρτογράφηση (Dietrich et al., 1996; Dib et al., 1996; Bruford & Wayne, 1993; Schlotterer & Pemberton, 1994). Τα βασικά πλεονεκτήματα τους σε αυτές τις μελέτες είναι ότι: α) είναι άφθονοι στα γονιδιώματα όλων των οργανισμών στους οποίους έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα. Μάλιστα έχει παρατηρηθεί ότι είναι χαρακτηριστικά πολυπληθέστεροι στους ευκαρυωτικούς σε σχέση με τους προκαρυωτικούς οργανισμούς. β) είναι υψηλά πολυμορφικοί δείκτες, επειδή έχουν πολύ υψηλό ρυθμό μεταλλακτικότητας. γ) κληρονομούνται ως συνυπερέχοντες Μεντελικοί δείκτες, γεγονός που καθιστά εφικτή τη διάκριση αλληλομόρφων ανάλογα με το αν είναι πατρικής ή μητρικής προέλευσης. δ) είναι διάσπαρτοι κατά μήκος του γονιδιώματος και συνεπώς μας δίνεται η δυνατότητα μελέτης της εξέλιξης ολόκληρου του γονιδιώματος. ε) η ανάλυσή τους γίνεται με τη χρήση της τεχνικής της PCR, που σημαίνει ότι απαιτείται μόνο μικρή ποσότητα DNA από κάθε άτομο που αναλύεται (ιδιαίτερα χρήσιμο σε αναλύσεις με πολλούς δείκτες). Το γεγονός αυτό προσδίδει μεγάλο πλεονέκτημα όταν το DNA είναι λίγο, οπότε οι μικροδορυφόροι είναι προτιμητέοι για την ανάλυση υπολειμμάτων οστών (Hagelberg et al., 1992), μουσειακών ειδών (Ellegren, 1991), ριζών τριχών (Morin et al., 1994) και περιττωμάτων (Deuter et al., 1995). η) η απομόνωσή τους δεν παρουσιάζει κάποια ιδιαίτερη δυσκολία. θ) είναι εύκολη η χαρτογράφησή τους με in situ υβριδοποίηση, πράγμα σημαντικό στη φυσική χαρτογράφηση.

Η ποικιλία στο μέγεθος αυτών των γενετικών τόπων, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, οφείλεται στους ιδιαίτερα υψηλούς ρυθμούς μεταλλαξιγένεσης, ενώ οι αλλαγές αφορούν κυρίως τον αριθμό των επαναλήψεων στο μοτίβο του μικροδορυφόρου (Brock et al., 1999; Hancock, 1999; Ellegren, 2000; Schlotterer, 2000). Οι κύριοι παράγοντες τώρα που φαίνεται να επηρεάζουν τον ρυθμό μεταλλαξιγένεσης των μικροδορυφόρων είναι: το μοτίβο επανάληψης, το μέγεθος των αλληλομόρφων, η θέση στο χρωμόσωμα, το περιεχόμενο σε CG των γειτνιαζουσών αλληλουχιών, το είδος της κυτταρικής διαίρεσης και το φύλο. Δυο μηχανισμοί μεταλλαξιγένεσης μπορούν να εξηγήσουν αυτούς τους υψηλούς ρυθμούς. Ο πρώτος αφορά στον ανασυνδυασμό μεταξύ των αλυσίδων του DNA (Harding et al., 1992) και ο δεύτερος στο γλίστρημα του DNA κατά τη διαδικασία της αντιγραφής (Tachida and Iizuka, 1992). Ο ανασυνδυασμός μπορεί να αλλάξει το μήκος των μικροδορυφόρων είτε με άνισο διασκελισμό είτε με γονιδιακή μετατροπή (Brohele and Ellegren, 1999; Hancock, 1999; Jakupsiak and Welles, 2000; Richard 9 and Paques, 2000). Η πλειοψηφία όμως των αλλαγών του αριθμού των επαναλήψεων στους μικροδορυφόρους οφείλονται σε λάθος ζευγάρωμα κατά την αντιγραφή λόγω γλιστρήματος της μιας αλυσίδας ως προς την άλλη (Eisen et al., 1999). Η διαδικασία αυτή μπορεί να οδηγήσει είτε στην αύξηση είτε στη μείωση του αριθμού των επαναλήψεων της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Πιο συγκεκριμένα, αν κατά την αντιγραφή, η νεοσυντιθέμενη αλυσίδα σχηματίσει μια θηλιά όπου περιέχεται μια επανάληψη και αυτό δεν γίνει αντιληπτό από τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης, τότε η νέα αλυσίδα θα είναι κατά μια επανάληψη μεγαλύτερη. Αν όμως η θηλιά σχηματιστεί στη μητρική αλυσίδα πριν το πέρασμα της διχάλας της αντιγραφής, τότε η θυγατρική αλυσίδα θα είναι μικρότερη κατά μια επανάληψη.

Α.3.2 Εφαρμογές των μικροδορυφόρων στην έρευνα

Η μεγάλη χρησιμότητα των μικροδορυφόρων έχει λύσει τα χέρια των ερευνητών σε διαφόρου τύπου μελέτες και έχει συνεισφέρει πολλά σε διάφορα πεδία της σύγχρονης έρευνας. Αρχικά αποτελούν ένα χρήσιμο εργαλείο στις πληθυσμιακές μελέτες όπου λόγω των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους είναι σε θέση να ανιχνεύσουν πολύ μικρές διαφορές ανάμεσα στους υπό μελέτη φυσικούς πληθυσμούς (Caracristi and Schlotterer, 2003). Μεγάλη είναι η συμβολή τους και στον υπολογισμό γενετικών αποστάσεων μεταξύ δυο ή περισσοτέρων πληθυσμών,στην ανάλυση του δραστικού μεγέθους (τον πραγματικό αριθμό των ατόμων ενός πληθυσμού που συνεισφέρουν στην δημιουργία της επόμενης γενιάς) και τη μελέτη της αναπαραγωγικής ικανότητας ενός πληθυσμού (Matocq, 2004). Πολλές σύγχρονες έρευνες χρησιμοποιούν τους μικροδορυφορικούς δείκτες με τη μέθοδο της δια-ειδικής ενίσχυσης, όπου δηλαδή γίνεται έλεγχος των εκκινητών που έχουν σχεδιαστεί στις μοναδικές περιοχές εκατέρωθεν της αλληλουχίας των μικροδορυφόρων για το κατά πόσο μπορούν να ενισχύσουν το ίδιο προϊόν σε συγγενικά είδη. Εφαρμογή βρίσκουν επίσης σε φυλογενετικές μελέτες κοντινών ή και κρυπτικών ειδών. Ενδεικτικά αναφέρουμε τη μελέτη των Pakaki et al. (2009) για τον μεσογειακό γαύρο (Engraulis encrasicolus) και την μελέτη των Makinen et al. (2006) για τον γαστερόστεο (Gasterosteus aculeatus), που αποτελούν έρευνες γύρω από θαλάσσιους οργανισμούς όπως και η παρούσα εργασία. Η μεγάλη αφθονία με την οποία απαντώνται στο γονιδίωμα καθώς και ο υψηλός βαθμός πολυμορφισμού τους είναι επίσης στοιχεία που αξιοποιούνται για την κατασκευή και τον εμπλουτισμό γενετικών χαρτών (Burt et al., 2003). Για τους ίδιους λόγους δε, είναι ιδιαίτερα δημοφιλείς στην εγκληματολογία και στην ανίχνευση πατρότητας και αυτό γιατί με την αφθονία και την ποικιλομορφία τους είναι πρακτικά αδύνατο να δώσουν το ίδιο πρότυπο όταν ελέγχονται σε διαφορετικά άτομα. Μεγάλη εφαρμογή έχουν και στην ιατρική καθώς χρησιμοποιούνται ως δείκτες διάγνωσης καρκίνου στα πρώιμα στάδια (Loeb, 1994; Claij and Riele, 1999). Τα αίτια πολλών νευρολογικών διαταραχών, όπως η νόσος Huntigton και η νόσος Parkinson, αποδίδονται στην ύπαρξη επαναλαμβανόμενων τρινουκλεοτιδίων σε ορισμένα 10

γονίδια οι οποίες τριπλέτες μπορούν με την σειρά τους να θεωρηθούν ως δείκτες διάγνωσης των συγκεκριμένων παθήσεων (Masino and Pastore, 2001).

Ωστόσο, η χρήση των μικροδορυφόρων στις εκάστοτε μελέτες απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή για πολλούς λόγους. Αρχικά πρέπει να επισημάνουμε τον κίνδυνο να οδηγηθούμε σε λανθασμένα συμπεράσματα σχετικά με την εξελικτική ιστορία ενός είδους (Wan et al., 2004) λόγω ομοπλασίας μεγέθους των μικροδορυφόρων. Συγκεκριμένα έχουν παρατηρηθεί ενθέσεις και απαλοιφές (indels) 1-5 νουκλεοτιδίων με μεγάλη συχνότητα στις περιοχές πλευρικά των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών. Εξαιτίας αυτών των indels αλλάζει το μέγεθος των προϊόντων που προκύπτουν έπειτα από PCR και μπορεί αυτά να μεταναστεύσουν κατά την ηλεκτροφόρηση μαζί με άλλα αλληλόμορφα τα οποία δεν φέρουν indels. Κατ’ αυτόν τον τρόπο οδηγούμαστε σε λανθασμένη ταυτοποίηση των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων, ειδικά αν αυτή στηρίζεται μόνο στον υπολογισμό του μεγέθους των αλληλομόρφων. Να αναφέρουμε βέβαια σε αυτό το σημείο, πως πλέον χάρη στην αλληλούχιση Μικροδορυφόροι, οι οποίοι έχουν σχεδιαστεί για συγκεκριμένα είδη μπορούν συχνά να χρησιμοποιηθούν και σε συγγενικά τους είδη, ωστόσο το ποσοστό των γενετικών τόπων που θα ενισχυθούν με επιτυχία πιθανότατα μειώνεται όσο αυξάνεται η γενετική απόσταση. Επίσης, σημειακές μεταλλάξεις στις μοναδικές (unique) αλληλουχίες, που γειτονεύουν με τους μικροδορυφορικούς τόπους και που είναι οι περιοχές πρόσδεσης των εκάστοτε εκκινητών μπορούν να οδηγήσουν στην εμφάνιση null αλληλομόρφων. Τα εσφαλμένα συμπεράσματα που μπορούμε να βγάλουμε εξαιτίας της ύπαρξης αυτών των αλληλομόρφων θα αναλυθούν λεπτομερώς παρακάτω. Σημαντικό είναι επίσης να αναφέρουμε την έντονη αμφισβήτηση που επικρατεί ως προς την ουδετερότητα ορισμένων μικροδορυφορικών αλληλουχιών καθώς διάφορες μελέτες (Rico et al., 1996; Martin et al,, 2002) διαπιστώνουν την επίμονη διατήρηση ορισμένων μικροδορυφορικών τόπων ακόμα και μεταξύ μη συγγενικών ειδών. Αυτό εφιστά την προσοχή μας κατά την χρησιμοποίησή τους στις διάφορες γενετικές και πληθυσμιακές μελέτες.

Α.4 Στοιχεία για τον υπό μελέτη οργανισμό Α.4.1 Η Atherina boyeri

Σύμφωνα με τη βάση δεδομένων Fishbase (www.fishbase.org) (Froese & Pauly, 2010) η οικογένεια Atherinidae περιλαμβάνει 25 γένη και 165 είδη, αν και φαίνεται να υπάρχουν αρκετές διχογνωμίες σχετικά με τον ακριβή αριθμό των ειδών. Η σύγχυση αυτή οφείλεται στην έντονη ενδοειδική ποικιλομορφία καθώς και στο γεγονός ότι πολλά είδη χαρακτηρίστηκαν με βάση άτομα που προέρχονταν από διαφορετικές περιοχές (Francisco et al., 2008). Μετά την αναθεώρηση των Kiener & Spilman (1969) μόνο τρία είδη έγιναν αποδεκτά: η Atherina hepsetus (Linnaeus, 1758), που απαντάται στην Μεσόγειο, η Atherina presbyter (Cuvier, 1829) στον 11

βορειο-ανατολικό Ατλαντικό και ενίοτε στη Μεσόγειο και η Atherina boyeri (Risso, 1810) την οποία συναντάμε και στις δυο περιοχές. Παρόλο που η μελέτη των Bamber & Henderson (1985) υποστήριξε πως η Atherina boyeri και η Atherina presbyter είναι το ίδιο πράγμα, ακολούθησε η μελέτη του Creech (1991) που της κατέταξε τελικά ως διαφορετικά είδη. Εν συνεχεία αναγνωρίστηκαν άλλα δυο είδη: η Atherina lopeziana (Rossignol & Blache, 1961), η οποία συναντάται στον Κόλπο της Γουινέας και η Atherina breviceps (Valenciennes, 1835) που βρίσκεται στον νοτιο-ανατολικό Ατλαντικό και στον Ινδικό ωκεανό (Mauge, 1990). Σε αυτό το σημείο πρέπει να αναφέρουμε πως σχετικά με τον υπό μελέτη οργανισμό μας, δηλαδή την Atherina boyeri, έχουν αναγνωρισθεί δυο υποείδη: η Atherina boyeri caspia που συναντάται στην Κασπία θάλασσα και η Atherina boyeri pontica (Eichwald, 1838) που βρίσκεται στην Μαύρη θάλασσα.

Η Atherina boyeri, φυσικοί πληθυσμοί της οποίας μελετώνται στην παρούσα εργασία, είναι ένας μικρός, βραχύβιος και ευρύαλος ιχθύς. Έχει την αξιοσημείωτη ικανότητα να διαβιεί από περιβάλλοντα υψηλής αλατότητας, όπως παράκτιες περιοχές, εκβολές ποταμών, λιμνοθάλασσες μέχρι και σε ρηχά, υφάλμυρα νερά (Andreau-Soler, 2003; Patimar, 2009), ενώ σπανιότερα απαντάται και σε ενδιαιτήματα με γλυκά νερά. Πιο συγκεκριμένα οι πληθυσμοί της εκτείνονται κυρίως στην βορειοανατολική πλευρά του Ατλαντικού, από την Πορτογαλία και την Ισπανία μέχρι την Μαδέιρα, κατά μήκος των ακτών της Μεσογείου (Henderson & Bamber, 1987 όπως επίσης στην Μαύρη και στην Κασπία θάλασσα (Marckevich, 1977). Μεμονωμένοι πληθυσμοί του είδους έχουν αναφερθεί στις ακτές της Αγγλίας και της Ολλανδίας (Quignard & Pras, 1986).

12

Εικ.1.: Η γεωγραφική εξάπλωση της Atherina boyeri σε όλο τον κόσμο.

Η συστηματική κατάταξη της Atherina boyeri ανακτήθηκε από τη βάση δεδομένων IT IS ( Integrated Taxonomic Information System: http: //www.itis.gov) (9/2010) και είναι η εξής:

Πίνακας 1.: Η συστηματική κατάταξη της Atherina boyeri Φύλο Χορδωτά Υποφύλο Σπονδυλωτά Υπέρκλαση Οστεϊχθύες Κλάση Ακτινοπτερύγιοι Υποκλάση Νεοπτερύγιοι Μεσοκλάση Τελεόστεοι Υπέρταξη Ακανθοπτερύγιοι Τάξη Atheriniformes Υπόταξη Atherinoidei Οικογένεια Atherinidae Υποοικογένεια Atherininae Γένος Atherina Είδος Atherina boyeri

Εικ.2.: Εικόνα όπου φαίνεται η Atherina boyeri.

13

Η βιολογία της A. boyeri έχει μελετηθεί ήδη σε ένα πολύ μεγάλο φάσμα των περιοχών όπου απαντάται. Συγκεκριμένα έχει μελετηθεί στη δυτική Μεσόγειο και στις ανατολικές ακτές του Ατλαντικού (Castel et al., 1977, Guevera and Sautier- Casaseca, 1977, Palmer and Culley, 1983, Henderson and Bamber, 1987, Fernandez- Delgado et al., 1988, Creech, 1992a, Andreau-Soler et al., 2003, Pombo et al., 2005), στις ιταλικές ακτές (Boscolo et al., 1970, Bartulovic et al., 2004) και στο Ισραήλ (Gon and Ben-Tuvia, 1983). Έχουν μελετηθεί επίσης πληθυσμοί της στην Τουρκία (Özeren, 2009), στην Κασπία θάλασσα (Patimar et al., 2009) όπως και στην Ελλάδα (Leonardos, 2001, Leonardos and Sinis, 2000, Koutrakis et al., 2004).

Η Atherina boyeri είναι ένας σχετικά μικρός ιχθύς, με χαρακτηριστικό ασημένιο χρώμα, που σχηματίζει συνήθως μεγάλα κοπάδια. Οι μελέτες δείχνουν πως έχει μικρό χρόνο ζωής, αφού φαίνεται να μην ξεπερνά τα τρία χρόνια (Economou et al., 1994). Αυξάνεται γρήγορα, δεδομένου ότι έχει ήδη φτάσει στο 52,3% της αύξησής της στον πρώτο χρόνο ζωής της (Leonardos, 2001). Μετά παρατηρείται σημαντική μείωση του ετήσιου ρυθμού αύξησης (Fernandez-Delgado et al., 1988, Creech, 1992a). Το συνολικό της μήκος στα ενήλικα κυμαίνεται περίπου στα 44-110mm και για τα δυο φύλα, ενώ το σωματικό βάρος,το οποίο αυξάνεται αλλομετρικά σε σχέση με το μήκος, κυμαίνεται στα 0,62-10,64gr (Leonardos, 2001). Η Atherina boyeri τρέφεται κατά κύριο λόγο με μικρά οστρακόδερμα είτε αυτά είναι πλαγκτονικής είτε βενθικής προέλευσης. Η μελέτη των Vizzini and Mazzola (2005), στην οποία διερεύνησαν τις διατροφικές συνήθειες της A.boyeri μέσω ανάλυσης του στομαχικού περιεχομένου και χρήσης ισοτόπων αζώτου και σταθερού άνθρακα, υποστηρίζει πως όταν η Atherina boyeri διαβιεί σε περιοχές με μεγάλο βάθος προτιμά την πλαγκτονική λεία (π.χ. κωπήποδα) ενώ σε ρηχές περιοχές τρέφεται κυρίως με βενθικούς οργανισμούς (π.χ αμφίποδα). Εποχιακές διαφοροποιήσεις ως προς την επιλογή της τροφής αποκαλύπτουν οι μελέτες των Trabelsi et al., (1994) και Scipiloti (1998). Η Atherina boyeri παρουσιάζει μια εκτεταμένη περίοδο ωοτοκίας η οποία διαφοροποιείται σημαντικά ανάλογα με το γεωγραφικό πλάτος και τις επικρατούσες κλιματολογικές συνθήκες (Maci and Basset, 2010). Πιθανολογείται ότι η παρατεταμένη αυτή αναπαραγωγική περίοδος συνδέεται με μια προσπάθεια για αύξηση της αναπαραγωγικής επιτυχίας του είδους (Fernandez-Delgado et al., 1988, Creech, 1992a). Γεννά αυγά κατά δεσμίδες, το μέγεθος των οποίων διαφέρει πολύ από μελέτη σε μελέτη. Συγκεκριμένα οι Tomasini et al. (1996) συνέλεξαν αυγά με μέγεθος περίπου 1,34-1,94mm, ενώ αντίστοιχα οι Patimar et al. (2009) παρατήρησαν αυγά διαστάσεων 0,03-2,00mm, διαφορά την οποία απέδωσαν στον ιδιόμορφο τρόπο ωοτοκίας της A.boyeri. Τα αυγά είναι βενθικά και χάρη στις μακριές χοριακές τους λάχνες προσκολλώνται σε φύλλα νηματοειδών φυκών. Οι λάρβες από την άλλη είναι πελαγικές και μπορούν να μετακινούνται από λίμνες ή λιμνοθάλασσες σε παραθαλάσσιες περιοχές. Όπως έχουμε ήδη αναφέρει η A.boyeri έχει την ικανότητα να διαβιεί σε πολύ διαφορετικά περιβάλλοντα χάρη στην μεγάλη προσαρμοστική ικανότητά της. Φαίνεται όμως ότι όταν οι πληθυσμοί εγκατασταθούν σε ένα συγκεκριμένο μέρος 14

παραμένουν σε μόνιμη βάση εκεί και δεν μετακινούνται (Rosecchi and Crivelli, 1995). Παρόλα αυτά οι αθερίνες που διαβιούν σε λιμνοθάλασσες έχουν την ικανότητα να μεταναστεύουν προς τις παράκτιες περιοχές συνήθως την περίοδο της ωοτοκίας ή κατά τη διάρκεια συγκεκριμένων αναπτυξιακών σταδίων (Berrebi and Britton-Davidian, 1980, Marfin, 1982). Σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζουν και οι μετεωρολογικές μεταβολές. Η μελέτη των Rosecchi and Crivelli (1995) καταδεικνύει την φωτοπερίοδο, την θερμοκρασία καθώς και διάφορους ωσμορυθμιστικούς μηχανισμούς ως υπεύθυνους παράγοντες για την μετανάστευση. Παρόλα αυτά αναγνωρίζουν και πως υπάρχουν και άλλα αίτια που την επηρεάζουν ενώ επίσης δεν είναι γνωστός ο τρόπος με τον οποίο όλα τα παραπάνω αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Από όλα τα παραπάνω αντιλαμβανόμαστε ότι η βιολογία του συγκεκριμένου οργανισμού χαρακτηρίζεται από μια έντονη ποικιλομορφία απόρροια της ασυνήθιστης ικανότητάς του να διαβιεί σε ενδιαιτήματα με πολύ διαφορετικές συνθήκες. Οι διαφορές αυτές λοιπόν αποδίδονται στην μεγάλη προσαρμοστικότητα του είδους στις εκάστοτε συνθήκες (Patimar et al., 2009). Σε αυτό το σημείο πρέπει να αναφέρουμε ότι η μελέτη της Atherina boyeri παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον αφενός για την αξιοσημείωτη ικανότητά της να προσαρμόζεται σε διαφορετικά περιβάλλοντα και αφετέρου γιατί είναι ένας οργανισμός με μεγάλο οικονομικό ενδιαφέρον. Σε πολλά οικοσυστήματα, κυρίως μεσογειακά, είναι ευρύτατα διαδεδομένη και εμπορικά εκμεταλλεύσιμη, όπως στις λιμνοθάλασσες της Ισπανίας (Guevera and Sautier-Casaseca, 1977), στις ιταλικές ακτές (Boscolo, 1970), στις εκβολές ποταμών της Κροατίας (Bartulovic et al., 2004) καθώς και στην τουρκική λίμνη Iznik (Özeren, 2009). Στην Ελλάδα απαντάται στις παράκτιες περιοχές όπως επίστης στην Βιστωνίδα (Koutrakis et al., 2004), στην Τριχωνίδα (Leonardos, 2001), στο Μεσολόγγι και το Αιτωλικό (Leonardos and Sinis, 2000). Στις λίμνες της Τριχωνίδας και της Βιστωνίδας δε, η A.boyeri αποτελεί το σημαντικότερο εμπορικά είδος όπως και στην λίμνη Iznik από όπου συλλέγεται και εξάγεται στο εξωτερικό. Η Atherina boyeri διαβιεί σε περιβάλλοντα με μεγάλο εύρος αλατότητας αλλά και θερμοκρασίας και μάλιστα να προσαρμόζεται άριστα σε αυτά. Η ιδιότητά της να αποικίζει τόσο διαφορετικά ενδιαιτήματα έχουν οδηγήσει τους ερευνητές στην πεποίθηση ότι η A. boyeri συνιστά ένα πολυμορφικό σύμπλεγμα (Focant et al.,1999, Francisco et al., 2008). Οι πρώτες μελέτες που την αφορούσαν βασίστηκαν σε μη γενετικούς χαρακτήρες, όπως γίνεται άλλωστε και στους περισσότερους οργανισμούς. Συγκεκριμένα οι Kiener and Spillman (1969) εξέτασαν τον αριθμό των βραγχιακών ακάνθων σε διάφορους πληθυσμούς της A. boyeri, εν συνεχεία οι Berrebi and Britton-Davidian (1980) έλεγξαν την παρουσία παρασίτων ενώ οι Mistri and Colombo (1988) ασχολήθηκαν με διάφορους μορφομετρικούς και μεριστικούς χαρακτήρες. Αργότερα, οι μελέτες στράφηκαν περισσότερο σε γενετικό και βιοχημικό επίπεδο, όπου οι Focant et al. (1992,1993,1999) και οι Cammarata et al. (1996) υποστήριξαν έπειτα από μελέτη δειγμάτων της Μεσογείου ότι η A.boyeri μπορεί να χωριστεί σε επιμέρους πληθυσμούς. Συγκεκριμένα, οι αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν από τους Cammarata et al. (1996) με βάση μορφομετρικούς και γενετικούς χαρακτήρες έδειξαν ότι οι πληθυσμοί της A. boyeri που συλλέχτηκαν από 15

δύο περιοχές της δυτικής Σικελίας παρουσίασαν αρκετά διαφορετικές συχνότητες στην εμφάνιση ορισμένων αλληλομόρφων. Οι Trabelsi et al. (2002a) εν συνεχεία προσδιόρισαν τρεις διαφορετικούς τύπους στην αθερίνα, χρησιμοποιώντας μορφομετρικές και μεριστικές παραμέτρους από διαφορετικά δείγματα που συλλέχτηκαν από τη Μεσόγειο θάλασσα (από λιμνοθάλασσες αλλά και θαλάσσιες περιοχές): τον θαλάσσιο, εστιγμένο τύπο (punctuated), τον θαλάσσιο μη εστιγμένο (non punctuated) και τον λιμναίο/λιμνοθαλάσσιο τύπο. Τα αποτελέσματα αυτά υποστήριζαν πλέον την ιδέα της ύπαρξης δυο νέων ειδών στην οικογένεια των Atherinidae. Οι διαφορές των δυο αυτών θαλάσσιων ομάδων σχετίζονται με το χρωματισμό, τη μορφολογία και με βιοχημικά χαρακτηριστικά. Η διάκριση γίνεται με βάση την παρουσία ή απουσία μιας σειράς σκουρόχρωμων κηλίδων κατά μήκος της πλευρικής γραμμής, διαχωρίζοντας τους θαλάσσιους πληθυσμούς σε εστιγμένους και μη εστιγμένους αντίστοιχα.

Εικ.3.: Atherina boyeri όπου φαίνονται τα χαρακτηριστικά μαύρα στίγματα κάτω από την πλευρική γραμμή (punctuated).

Τα άτομα του εστιγμένου τύπου είχαν επίσης μεγαλύτερο μέγεθος οφθαλμών, μικρότερο αριθμό σπονδύλων και βραγχιακών ακάνθων, ενώ απουσιάζει από τους μύες η παραλβουμίνη V (Trabelsi et al., 2002b). Οι Trabelsi et al., ήδη με μελέτη τους το 1995 για την μυϊκή πρωτεΐνη παραλβουμίνη (ΡΑ), είχαν διαπιστώσει ότι οι μύες της A.hepsetus (Linnaeus, 1758) διέθεταν τις ισομορφές ΡΑ V και PA IV, όταν οι αντίστοιχες της A.boyeri εμφάνιζαν ισομορφές PA V, PA IV και PA III αναλόγως με το μέρος που ζούσαν. Αναλυτικότερα, όσο αφορούσε τους θαλάσσιους πληθυσμούς η Atherina boyeri και η Atherina hepsetus παρουσίασαν τις ίδιες ισομορφές (PA V και PA IV). Αντίθετα στους λιμνοθαλάσσιους πληθυσμούς της Atherina boyeri απουσιάζει εντελώς η PA V, ενώ επίσης τα επίπεδα των PA IV αι PA III διαφέρουν χαρακτηριστικά. Μετέπειτα μελέτη των Focant et al. (1999) αναφορικά με τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα της ΡΑ έδειξε διαφορική κατανομή των ισομορφών ανάμεσα στους υπό μελέτη πληθυσμούς της Γαλλίας. Η μελέτη των Kilia-Klossa et al. (2002) που πραγματοποιήθηκε με RFLP ανάλυση σε 8 ελληνικούς πληθυσμούς της Atherina boyeri (λιμναίους/λιμνοθαλάσσιους και 16

θαλάσσιους) και η μετέπειτα εκτενέστερη μελέτη των Kraitsek at al. (2008) που έγινε σε 14 ελληνικούς πληθυσμούς και έναν από την λίμνη Iznik της Τουρκίας, επιβεβαίωσαν τη διάκριση μεταξύ λιμναίου και θαλάσσιου τύπου. Άξιο αναφοράς είναι το γεγονός ότι τόσο στην μελέτη των Kraitsek et al. (2008) όσο και σε αυτή των Trabelsi et al. (2009), άτομα που προέρχονταν από θεωρητικά θαλάσσιες περιοχές παρουσίασαν περιοριστικά πρότυπα που ταίριαζαν στην λιμναία ομάδα. Αυτό το γεγονός αποδόθηκε στις ιδιαίτερες συνθήκες αλατότητας που επικρατούσαν στις περιοχές από όπου συλλέχτηκαν τα άτομα αυτά π.χ. ο θαλάσσιος πληθυσμός της Καλύμνου (Kraitsek et al., 2008) συλλέχτηκε από έναν μικρό κόλπο, όπου ανέβλυζε γλυκό νερό. Σημαντικό είναι επίσης ότι και οι δυο προαναφερθείσες μελέτες έδειξαν μεγάλες τιμές νουκλεοτιδικών αποκλίσεων μεταξύ των λιμναίων και θαλάσσιων πληθυσμών αντίστοιχες μς αυτές που παρατηρούνται μεταξύ διαφορετικών ειδών του ίδιου γένους, με αποτέλεσμα οι συγγραφείς να θέτουν πλέον θέμα επανεξέτασης της κατάταξής τους στο ίδιο taxon (Klossa-Kilia et al., 2002, Kraitsek et al., 2008). Οι Congiu et al.(2002) μελετώντας πληθυσμούς που προέρχονταν από διάφορες λιμνοθάλασσες των ιταλικών ακτών και πραγματοποιώντας ανάλυση RAPD’s κατέληξαν στην διαπίστωση ύπαρξης διαφορικής γενετικής δομής των πληθυσμών αυτών κατά μήκος των ακτών της Ιταλίας. Η συσχέτιση ωστόσο μεταξύ των γενετικών και γεωγραφικών αποστάσεων μαρτυρά μεταναστευτική κίνηση κατά μήκος της ακτογραμμής. Σε παρόμοια πλαίσια και η μελέτη των Trabelsi et al. (2004) που με χρήση μορφομετρικών χαρακτήρων πέρα από τη διάκριση των λιμναίων από τους δυο τύπους θαλάσσιων πληθυσμών υποστήριξε και την ύπαρξη διαφορετικών ταξινομικών μονάδων (taxa) μεταξύ πληθυσμών της A.boyeri που διαβιούν σε απομακρυσμένες λιμνοθάλασσες της Γαλλίας και της Τυνησίας. Οι Astolfi et al. (2005) έπειτα από ανάλυση της αλληλουχίας της μιτοχονδριακής περιοχής ελέγχου (CR) σε λιμνοθαλάσσιους πληθυσμούς των ευρωπαϊκών ακτών του Ατλαντικού, από τη βόρειο Μεσόγειο και από τη Μαύρη θάλασσα διαπίστωσαν επίσης την ύπαρξη γεωγραφικού προτύπου και συσχέτισης των γενετικών αποστάσεων. Στη συνέχεια οι Mauro et al. (2007) χρησιμοποιώντας αλλοένζυμα σε πληθυσμούς από εκβολές ποταμών και θαλάσσιων περιοχών της Ιταλίας συνηγόρησαν στην ύπαρξη διαχωρισμού των εν λόγω πληθυσμών βάση του περιβάλλοντος που διαβιούσαν. Οι Francisco et al. (2008) με τη σειρά τους εξετάζοντας πληθυσμούς της Atherina boyeri καθώς και των Atherina hepsetus και Atherina presbyter, που είναι είδη του ίδιου γένους αλλά διαφορετικής οικογένειας, μελέτησαν με αλληλούχιση τμήμα του 12s rDNA και της περιοχής ελέγχου CR του mtDNA προκειμένου να προσδιορίσουν τις φυλογενετικές σχέσεις των ανωτέρω ειδών. Κατέληξαν στην ύπαρξη τεσσάρων κύριων κλάδων: αυτόν της Atherina hepsetus, αυτόν της Atherina presbyter, έναν που περιελάμβανε το θαλάσσιο τύπο της Atherina boyeri είτε ήταν εστιγμένοι είτε μη (punctuated και non-punctuated) καθώς και έναν κλάδο που περιελάμβανε τους λιμναίους πληθυσμούς της Atherina boyeri. Η συγκεκριμένη μελέτη δεν διευκρίνισε ωστόσο τίποτα παραπάνω αναφορικά με τις σχέσεις των λιμναίων πληθυσμών με τους θαλάσσιους εστιγμένους και μη εστιγμένους. Σε αυτό το σημείο σημαντικά ήταν τα αποτελέσματα της έρευνας των Milana et al. (2008) . Η συγκεκριμένη ομάδα παρατήρησε την ύπαρξη μιας ένθεσης 200 περίπου 17

βάσεων μεταξύ του tRNA του γλουταμινικού οξέος και του γενετικού τόπου για το κυτόχρωμα b στο mtDNA. Η ένθεση αυτή ήταν παρούσα σε άτομα από λιμναίους και θαλάσσιους εστιγμένους πληθυσμούς, ενώ απουσίαζε στα μη εστιγμένα θαλάσσια άτομα της Atherina boyeri, καθώς και από τα άτομα της Atherina hepsetus, της Atherina presbyter και αυτά της Menidia menidia, είδος το οποίο ανήκει στην ίδια τάξη αλλά στην οικογένεια Atherinopsidae. Η ίδια ομάδα με νέα μελέτη της το 2009, απομόνωσε 11 μικροδορυφορικούς δείκτες αποκλειστικά από πληθυσμούς της Atherina boyeri από την ιταλική λίμνη Trasimeno, τους οποίους εν συνεχεία έλεγξε στους πληθυσμούς των δυο θαλάσσιων τύπων της Atherina boyeri, καθώς και στην Atherina hepsetus, την Atherina presbyter και την Μenidia menidia. Ενδιαφέρουσα είναι η μελέτη και πάλι των Μilana et al. (2012) στην οποία εξέτασαν με τους μικροδορυφορικούς δείκτες που οι ίδιοι είχαν απομονώσει (Milana et al., 2009) άτομα από έντεκα λιμνοθάλασσες κατά μήκος των ιταλικών και αλβανικών ακτών και τριών ιταλικών λιμνών. Το αποτέλεσμα ήταν η διαπίστωση ύπαρξης γεωγραφικής κατανομής της γενετικής διαφοροποίησης της A. boyeri. Aυτό σημαίνει ότι ούτε οι λιμναίοι πληθυσμοί παρουσιάζουν ένα κοινό πρότυπο, δεν συμπεριφέρονται δηλαδή ως μια ενιαία ομάδα και άρα τίθενται νέα ερωτήματα αν η A. boyeri μπορεί να διαχωριστεί απλά στους δυο θαλάσσιους τύπους και τον λιμναίο ή αν υπάρχουν περισσότερες ομάδες. Σε αυτό το σημείο είναι απαραίτητο να σταθούμε στην ορολογία γύρω από τα προτεινόμενα είδη της A. boyeri. Οι Trabelsi et al. (2002,a,b) ήταν οι πρώτοι που εισήγαγαν τον όρο Atherina lagunae για τις αθερίνες που διαβιούν σε λιμνοθάλασσες της Μεσογείου. Οι πληθυσμοί που χρησιμοποιήθηκαν στις συγκεκριμένες μελέτες όπως και σε προηγούμενες των ίδιων ερευνητών έχουν συζητηθεί από τον Kottelat (1997), ο οποίος κατέληξε πως το είδος που διαβιεί στις λιμνοθάλασσες είναι η A. boyeri. Αν το όνομα A. lagunae γίνει τελικά αποδεκτό θα πρέπει να ταυτιστεί με αυτό της A.boyeri (Francisco et al., 2008). Ο όρος punctuated που έχει χρησιμοποιηθεί για τον εστιγμένο τύπο και ο nοn-punctuated για τον μη εστιγμένο τύπο αντίστοιχα δεν θεωρούνται απόλυτα αποδεκτοί δεδομένου ότι έχουν βρεθεί άτομα τα οποία έφεραν τα χαρακτηριστικά μαύρα στίγματα κάτω από την πλευρική τους γραμμή αλλά το γενετικό τους πρότυπο ταίριαζε με αυτό των μη εστιγμένων ατόμων και το αντίστροφο (Kraitsek et al., 2012). Για αυτόν τον λόγο στην παρούσα εργασία θα υιοθετηθεί η ορολογία «θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι» για τους αντίστοιχους μη- εστιγμένους και «θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου ΙΙ» για τους εστιγμένους, ενώ ο όρος Atherina boyeri θα αναφέρεται τόσο στους θαλάσσιους όσο και στους λιμναίους πληθυσμούς του είδους.

Α.5 Σκοπός της παρούσας εργασίας

Όπως γίνεται κατανοητό από όλα όσα έχουν αναφερθεί μέχρι τώρα, υπάρχει μεγάλη σύγχυση και διχογνωμία αναφορικά με την ταξινόμηση της Atherina boyeri αλλά και 18

των ακριβών φυλογενετικών σχέσεων που διέπουν τους διάφορους τύπους πληθυσμών της. Αυτό είναι αποτέλεσμα της ιδιαίτερα μεγάλης γενετικής και μορφολογικής διαφοροποίησης που επιδεικνύει ο συγκεκριμένος οργανισμός. Η παρούσα εργασία έχει στόχο να μελετήσει την γενετική δομή και τις φυλογενετικές σχέσεις των ελληνικών πληθυσμών της A. boyeri με χρήση πυρηνικών δεικτών και πιο συγκεκριμένα μικροδορυφόρων που απομονώθηκαν από τους Milana et al. (2009). Σκοπός λοιπόν ήταν αρχικά να διαπιστωθεί αν οι δείκτες αυτοί είναι λειτουργικοί για τους ελληνικούς πληθυσμούς και εν συνεχεία να ελεγχθεί αν όντως υφίσταται η ύπαρξη των τριών ειδών (θαλάσσιος τύπος Ι, θαλάσσιος τύπος ΙΙ και λιμναίος τύπος) όπως προτείνεται σε μεγάλο βαθμό από την παγκόσμια βιβλιογραφία ή αν η διάκριση των πληθυσμών της A. boyeri είναι διαφορετική. Επιπλέον γίνεται σύγκριση των αποτελεσμάτων που προκύπτουν με τα αποτελέσματα προηγούμενων εργασιών του εργαστηρίου στις οποίες οι ίδιοι πληθυσμοί αναλύθηκαν με χρήση του πυρηκικού δείκτη της ροδοψίνης αλλά και με διάφορες αλληλουχίες μιτοχονδριακού DNA (Kraitsek et al., 2012).

19

Β. Υλικά και Μέθοδοι

Β.2.1 Περιοχές δειγματοληψίας

Το εργαστήριο διαθέτει μια μεγάλη συλλογή πληθυσμών του είδους Atherina boyeri, που προέρχονται από παράκτιες περιοχές αλλά και λίμνες/λιμνοθάλασσες της ηπειρωτικής Ελλάδας καθώς και των νησιών του Ιονίου και Αιγαίου πελάγους. Στόχος ήταν να καλυφθεί στον μεγαλύτερο δυνατό βαθμό όλη η επικράτεια της χώρας. Συνολικά συλλέχθηκαν είκοσι δύο πληθυσμοί και οι περιοχές στις οποίες συλλέχθηκαν φαίνονται στον ακόλουθο πίνακα. Στο σημείο αυτό πρέπει να αναφέρουμε ότι η κατάταξη του εκάστοτε πληθυσμού στις τρεις ομάδες (θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι,τύπου ΙΙ,λιμναίοι/λιμνοθαλάσσιοι πληθυσμοί) βασίστηκε σε πειραματικά δεδομένα με μιτοχονδριακούς δείκτες από προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου (Kraitsek et al., 2012) ενώ μένει να διευκρινιστεί σε ποια ομάδα πληθυσμών ανήκει η Καβάλα. Τα άτομα που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία συλλέχθηκαν με δίχτυα (άνοιγμα ματιού 8mm) και αφού αναγνωρίσθηκαν και επιβεβαιώθηκαν ότι ανήκουν στο είδος Atherina boyeri φυλάχθηκαν σε θερμοκρασία -80ο C μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Από κάθε πληθυσμό αναλύθηκαν δεκαπέντε άτομα.

Πίνακας 2: Περιοχές δειγματοληψίας των ελληνικών πληθυσμών της Atherina boyeri. Θαλάσσιες περιοχές Θαλάσσιες περιοχές Λίμνες/Λιμνοθάλασσες (πληθυσμοί τύπου Ι) (πληθυσμοί τύπου ΙΙ) 1. Ηγουμενίτσα 1. Πρέβεζα 1. Αιτωλικό 2. Λευκάδα 2. Εύβοια 2. Τριχωνίδα 3. Ζάκυνθος 3. Κως 3. Ροδιά (Αμβρακικός) 4. Νίσυρος 4. Κούταβος (Κεφαλονιά) 5. Λήμνος 5. Κουρνά 6. Κάσος 6. Βιστωνίδα 7. Λέσβος 7. Κάλυμνος 8. Κορινθιακός 8. Κύμη 9. Κυπαρισσία 9. Νέα Μουδανιά Κρήνη (Καβάλα)

20

Εικ.4.: Εικόνα όπου φαίνονται οι περιοχές δειγματοληψίας για τους πληθυσμούς της Atherina boyeri. Με μαύρο αναπαριστώνται οι πληθυσμοί από τις θαλάσσιες περιοχές και με κόκκινο από τις λιμναίες/λιμνοθαλάσσιες.

Β.2.2 Απομόνωση γενετικού υλικού από την Atherina boyeri

Στην παρούσα εργασία απομονώθηκε ολικό DNA από την Atherina boyeri με τη χρήση εμπορικού σκευάσματος (kit) που διατίθεται από την εταιρεία Macherey-Nagel με την ονομασία Nucleospin Tissue kit. Β.2.2.1 Αρχή της μεθόδου απομόνωσης DNA

Η μέθοδος απομόνωσης ολικού DNA με τη μέθοδο που χρησιμοποιήσαμε στηρίζεται στην χρήση στηλών διοξειδίου του πυριτίου. Συγκεκριμένα, το DNA συνδέεται με τα μόρια του διοξειδίου του πυριτίου, ενώ τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνονται με πλύση και το DNA παραλαμβάνεται έπειτα από έκλουση (Hoelzel, 1998). Πιο αναλυτικά, η λύση του ιστού επιτυγχάνεται με την επώαση των δειγμάτων σε διαλύματα πρωτεϊνάσης Κ και SDS. Εν συνεχεία, γίνεται προσθήκη χαοτροπικών αλάτων και αιθανόλης στο διάλυμα λύσης, προκειμένου να προσδεθεί το DNA στις στήλες που περιέχουν μεμβράνη διοξειδίου του πυριτίου (Nucleospin Tissue Columns). Η διαδικασία σύνδεσης του DNA στη μεμβράνη πυριτίου είναι αναστρέψιμη και ειδική για τα νουκλεϊνικά οξέα. Οι προσμίξεις απομακρύνονται μέσω της πλύσης με δυο διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα, ενώ τελικά συλλέγουμε 21

καθαρό ολικό DNA σε ένα ελαφρώς αλκαλικό διάλυμα έκλουσης. (Nucleospin Tissue User Manual, 2009).

B.2.2.2 Εφαρμογή της μεθόδου

Πρωτόκολλο απομόνωσης ολικού DNA

1. Ζύγιση 25-30mg μυϊκού ιστού (συμπεριλαμβάνονται και λέπια) και τεμαχισμός των δειγμάτων με τη χρήση νυστεριού. 2. Μεταφορά του ιστού σε σωληνάριο τύπου eppendorf (1.5ml) και προσθήκη 180μl διαλύματος Τ1 και 25μl Proteinase K. Ανάδευση των δειγμάτων σε μηχανικό αναδευτήρα (vortex). 3. Επώαση των δειγμάτων επί 3 ώρες στους 56ο C. Κατά τη διάρκεια της επώασης τα δείγματα αναδεύονται ανά τακτά χρονικά διαστήματα. 4. Προσθήκη 200μl διαλύματος Β3 και επώαση στους 70ο C επί 10min. 5. Ελαφριά ανάδευση των δειγμάτων σε περιστροφικό αναδευτήρα φιαλιδίων. Προσθήκη 210μl απόλυτης αιθανόλης και ανάδευση σε μηχανικό αναδευτήρα. 6. Τοποθέτηση ισάριθμων με τα δείγματα ειδικών στηλών με μεμβράνη πυριτίου (Nucleospin Tissue Column) σε σωληνάρια συλλογής και μεταφορά των δειγμάτων στις στήλες. 7. Φυγοκέντρηση στα 11.000 x g για 1 min. Απομάκρυνση του υποκείμενου και τοποθέτηση της στήλης στο σωληνάριο συλλογής. 8. Προσθήκη 500μl διαλύματος BW. Φυγοκέντρηση στα 11.000 x g για 1min. Απομάκρυνση του υποκείμενου και τοποθέτηση της στήλης στο σωληνάριο συλλογής. 9. Προσθήκη 600μl διαλύματος Β5. Φυγοκέντρηση στα 11.000 x g για 1min. Απομάκρυνση του υποκείμενου και τοποθέτηση της στήλης στο σωληνάριο συλλογής. 10. Φυγοκέντρηση στα 11.000 x g για 1min. 11. Τοποθέτηση της στήλης σε σωληνάριο τύπου eppendorf 1.5ml και προσθήκη 100μl διαλύματος ΒΕ. Φυγοκέντρηση στα 11.000 x g για 1min. 12. Τοποθέτησηη της στήλης σε νέο σωληνάριο τύπου eppendorf 1,5ml και προσθήκη 50μl διαλύματος ΒΕ. Φυγοκέντρηση στα 11.000 x g για 1min. 13. Συλλογή των υποκείμενων των δυο τελευταίων φυγοκεντρήσεων σε ένα σωληνάριο τύπου eppendorf 1,5ml και φύλαξη του απομονωμένου DNA στους -20ο C έως ότου χρησιμοποιηθεί.

22

Β.2.3 Ηλεκτροφόρηση ολικού DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Β.2.3.1 Γενικά

Ο ποιοτικός και ποσοτικός έλεγχος του ολικού DNA που είχε απομονωθεί γινόταν με την μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης. Η ηλεκτροφόρηση είναι μια ευρύτατα διαδεδομένη, εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται προκειμένου να διαχωρίσει τμήματα νουκλεϊνικών οξέων μεταξύ τους. Η ικανότητά της αυτή οφείλεται στην ύπαρξη αρνητικού φορτίου λόγω των φωσφορικών ομάδων του DNA με αποτέλεσμα υπό την επίδραση ενός ηλεκτρικού πεδίου τα μόρια του DNA να αναγκάζονται να κινηθούν προς την άνοδο, με ταχύτητα αντιστρόφως ανάλογη του λογάριθμου του μοριακού τους βάρους( Helling et al.,1974). Σημαντικοί παράγοντες που επηρεάζουν την κινητικότητα των μορίων κατά την ηλεκτροφόρηση είναι οι ακόλουθοι:

 Το μέγεθος των μορίων DNA  Η συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα Συγκεκριμένα, ένα γραμμικό τμήμα DNA γνωστού μεγέθους μεταναστεύει με διαφορετικό ρυθμό σε πηκτώματα αγαρόζης διαφορετικής συγκέντρωσης. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA (μ) και η συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα συνδέονται με μια γραμμική σχέση που περιγράφεται από την εξίσωση: Log μ= Log μο – Kr όπου: μο= η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA και Kr= ο συντελεστής καθυστέρησης (retardation coefficient), μια σταθερά που σχετίζεται με τις ιδιότητες του πηκτώματος, το μέγεθος και το σχήμα των προς ανάλυση μορίων. Με τον τρόπο αυτό χρησιμοποιώντας πηκτώματα διαφορετικών συγκεντρώσεων μπορούμε να διαχωρίσουμε ένα ευρύ φάσμα μεγεθών DNA.  Η τάση του ηλεκτρικού πεδίου που εφαρμόζεται  Η παρουσία του βρωμιούχου αιθιδίου Συγκεκριμένα, η πρόσδεση του βρωμιούχου αιθιδίου στο DNA αλλοιώνει την μάζα του μορίου και συνεπώς την κινητικότητά του.  Η διαμόρφωση του DNA στο χώρο (γραμμικό, κυκλικό, υπερελικωμένο)  Ο τύπος της αγαρόζης που χρησιμοποιείται (κανονική ή χαμηλής τήξης)  Το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης που χρησιμοποιείται (Sambrook et al.,1989).

Προκειμένου να γίνει ορατή η ζώνη DNA στο πήκτωμα αγαρόζης γίνεται χρήση βρωμιούχου αιθιδίου. Το βρωμιούχο αιθίδιο είναι μια φθορίζουσα χρωστική που έχει την ικανότητα χάρη σε μια πλευρική ομάδα που διαθέτει να παρεμβάλλεται μεταξύ διαδοχικών ζευγών βάσεων του DNA και να δεσμεύεται σε αυτό, ενώ όταν ακτινοβολείται με υπεριώδες φως, δύναται να φθορίζει. Συγκεκριμένα η υπεριώδης ακτινοβολία που απορροφάται από το DNA στα 260 nm μεταφέρεται στη χρωστική, 23

η οποία επανεκπέμπεται στα 590 nm στην κίτρινο-πορτοκαλί περιοχή του ορατού φάσματος (Russell et al., 2009).

Β.2.3.2 Εφαρμογή της μεθόδου

Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν

Διάλυμα ΤΒΕ (Tris-borate) (5x) (Sambrook et al.,1989)

Διάλυμα αποθήκευσης (stock) 5x (ανά λίτρο)

 54g Tris base  27.5g Boric acid  20ml 0,5M EDTA pH 8,0

Διάλυμα φόρτωσης Bromophenol blue (6x) (Sambrook et al.,1989)

 0,25% bromophenol blue  30% γλυκερόλη σε νερό

Πρωτόκολλο ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης

Παρασκευή πηκτώματος αγαρόζης 1,5%

1. Ογκομέτρηση 90ml TBE 1x. 2. Προσθήκη 1,35gr αγαρόζης. 3. Τοποθέτηση του μίγματος σε φούρνο μικροκυμάτων για περίπου 1,5min, έως ότου να διαλυθεί πλήρως η αγαρόζη. (Το σημείο τήξης της κανονικής αγαρόζης κυμαίνεται μεταξύ των 85-90ο C ανάλογα δηλαδή με το φύκος από το οποίο έχει απομονωθεί). 4. Το διάλυμα αφήνεται να κρυώσει μέχρι την θερμοκρασία των 60ο C οπότε και προστίθενται 4,5μl βρωμιούχο αιθίδιο (αρχική συγκέντρωση: 10mg/ml/ τελική συγκέντρωση 0,05mg/ml). 5. Ανάδευση και έκχυση του μίγματος στο εκμαγείο ηλεκτροφόρησης, στο οποίο έχουν ήδη τοποθετηθεί οι ειδικές διατάξεις (χτενάκια), που θα δημιουργήσουν τις θέσεις τοποθέτησης των δειγμάτων. 6. Αναμονή έως ότου ψυχθεί το μίγμα και σχηματιστεί το πήκτωμα. 24

7. Τοποθέτηση δειγμάτων στις θέσεις ενός μικροπλακιδίου 96 θέσεων. Σε κάθε θέση τοποθετούνται είτε 20μl DNA (αν πρόκειται για προϊόν απομόνωσης) και 5μl διαλύματος φόρτωσης-bromophenol blue είτε 5μl DNA,αν πρόκειται για προϊόν PCR και 2μl bromophenol blue. 8. Μεταφορά του πηκτώματος στην οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης, η οποία περιέχει διάλυμα ηλεκτροφόρησης ΤΒΕ 1x. 9. Τοποθέτηση των δειγμάτων στο πήκτωμα. 10. Ρύθμιση τάσης και χρονικής διάρκειας ηλεκτροφόρησης στα 100mV για 35min. 11. Μεταφορά του πηκτώματος σε πλάκα υπεριώδους φωτός, παρατήρησή του και φωτογράφηση του πηκτώματος με τη χρήση ψηφιακής μηχανής. Μεταφορά των δεδομένων σε ηλεκτρονικό υπολογιστή.

Β.2.4 Πολλαπλασιασμός γονιδιακών τμημάτων με τη βοήθεια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμερεράσης (PCR)

B.2.4.1 Αρχή της μεθόδου

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια σχετικά πρόσφατα ανακαλυφθείσα τεχνική εξέλιξη της μοριακής βιολογίας. Θεωρείται μία από τις πιο επαναστατικές και σημαντικές επιστημονικές ανακαλύψεις του 20ου αιώνα , η οποία έχει αλλάξει ριζικά την προσέγγιση στην γονιδιακή ανάλυση. Η PCR δίνει την in vitro δυνατότητα παραγωγής πολλαπλών αντιγράφων μιας συγκεκριμένης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (Russel et al.,2009). Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει συνοπτικά τρία στάδια:

 Αποδιάταξη του DNA (denaturation)  Υβριδοποίηση των εκκινητών-primers με το DNA (annealing)  Επιμήκυνση των εκκινητών (extension)

Αναλυτικότερα, ένας πλήρης κύκλος αποτελείται από επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες και γίνεται αυτόματα από ειδικά μηχανήματα τους θερμοκυκλοποιητές (thermal cyclers). Σε μια τυπική αντίδραση, το δίκλωνο DNA αποδιατάσσεται έπειτα από θέρμανση στους 95ο C. Εν συνεχεία, μικρές ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες-εκκινητές (primers) που βρίσκονται σε περίσσεια υβριδοποιούνται με τις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες στο DNA εκμαγείο κατόπιν ψύξης του δείγματος στους 50-60ο C. Ακολουθεί επώαση στους 72ο C προκειμένου να επιτευχθεί η επιμήκυνση των εκκινητών από μια θερμοανθεκτική πολυμεράση παρουσία των τεσσάρων νουκλεοτιδίων. Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται, οι νεοσύστατοι κλώνοι με τη σειρά τους χρησιμοποιούνται ως εκμαγεία για την in vitro σύνθεση του DNA. Μετά από μερικούς κύκλους το επικρατές προϊόν είναι ένα DNA θραύσμα, το μέγεθος του 25

οποίου αντιστοιχεί στην μεταξύ των δύο αρχικών εκκινητών απόσταση. Συνηθέστερα απαιτούνται 20 με 30 κύκλοι της αντίδρασης προκειμένου να ενισχυθεί το επιθυμητό κατά περίπτωση DNA θραύσμα. Σε κάθε κύκλο ο αριθμός αντιγράφων του DNA διπλασιάζεται. Συνεπώς η παραγωγή της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας που στοχεύουμε αυξάνεται εκθετικά, ενώ όλες οι υπόλοιπες αλληλουχίες του αρχικού DNA δεν πολλαπλασιάζονται (Mullis, 1983).

Β.2.4.2 Εφαρμογή της μεθόδου

Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν μικροδορυφορικοί δείκτες για την διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των πληθυσμών της Atherina boyeri. Οι έντεκα μικροδορυφορικές αλληλουχίες που ελέγχθηκαν στην εργασία αυτή είχαν απομονωθεί από την Atherina boyeri της ιταλικής λίμνης Trasimeno και περιγράφονται από τους Milana et al (2008). Σε αυτό το σημείο πρέπει να διευκρινιστεί ότι για τους σκοπούς της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκαν δυο είδους αντιδράσεις PCR. Μια αντίδραση PCR, όπως αυτή περιγράφεται λίγο πιο κάτω, η οποία γινόταν με σκοπό να ελεγχθούν αν οι έντεκα δείκτες ήταν λειτουργικοί με τους εξεταζόμενους πληθυσμούς της Atherina boyeri. Η διαδικασία αυτή γινόταν προκειμένου να αποφύγουμε την άσκοπη χρησιμοποίηση πληθυσμών στην κατά πολύ πιο χρονοβόρα και δαπανηρή ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου ( επίσης περιγράφεται παρακάτω). Η δεύτερη αντίδραση PCR είναι ίδια με την προαναφερθείσα μόνο που ο ένας εκ των δυο εκκινητών ήταν ραδιενεργά σημασμένος. Η ηλεκτροφόρηση σε αυτήν την περίπτωση γινόταν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου ενώ ακολουθούσε και αυτοραδιογραφία. Οι εκκινητές, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για τον πολλαπλασιασμό του εκάστοτε μικροδορυφορικού δείκτη είναι οι ακόλουθοι:

Πίνακας 3.: Πίνακας όπου φαίνονται οι αλληλουχίες των έντεκα μικροδορυφορικών ζευγών εκκινητών όπως αυτοί σχεδιάστηκαν από τους Milana et al. (2009) καθώς επίσης και το μοτίβο επανάληψής τους. Γενετικός Αλληλουχία εκκινητή (5΄-3΄) Μοτίβο τόπος επανάληψης A10 F-CTATGATCCCCAGAAATAACTATG R-CCTATTCCCACCCTCATTCA (ATCT)38 B2 F-ACATATGTAGCTTCACACATTGGC R-CCCTAAGGCAGTGTTTTATGGC (AC)11 B5 F-GCCCAAATTGTGACCAATTCATTCAG R-CCTTTTGCTGCTGCTGGAATTTCC (TAGA)25 B10 F-ACCAAATTGTGACCTCTAGTGGTG (TAGA)2(TGGA) R-AACAGGGGCAACAAAAGGCGG (TGGT)(TGGA)2(TAGA)14 C4 F-GTATCAGAGTCTAAAGGAGAGG R-AATAGAAACAAAGCTGGACTGG (TG)22 D6 F-GTTGTCATTAGATCTGAAGTGTCC R-CTAATGAAGACTGACAGTTCAGGC (CA)14 26

E5 F-TAGCTGTCGTGTTGAGGCATGTCG R-AGGTGTCAGGAGTCACAAAGGACC (GT)9 F1 F-AGCAGGACTGTGAGTTGCAGC R-ACCTGAACGTTGTTGTAAGGTGC (TCAA)20 F3 F-TTGTAACTGGATTAGTTTATCCC (ACGT)(AC)2(ACGT) R-CTAGTCGTATCCTTCCTGAC (AC)54 F6 F-AACAGTGAAGGGAACAAACCAGAG R-TTGTTTGCAACCACCCAACATGTC (ACA)26 G6 F-CAAATCCAGCTAACTGAGTTAGCG (TGT)11(TTC)(TTT) (TTC)(TCT)6 R-CCTGAGTGGCAGTATTGTGCC

Η διαδικασία της αντίδρασης της PCR για τον πολλαπλασιασμό του εκάστοτε μικροδορυφορικού δείκτη, χωρίς την χρήση ραδιενεργού εκκινητή είχε ως εξής:

1. Τοποθέτηση 1 μl DNA στο σωληνάκι μικροφυγοκέντρου και κλείσιμο του πώματος. 2. Προετοιμασία μίγματος που θα επαρκούσε για τον εκάστοτε αριθμό αντιδράσεων PCR που θα πραγματοποιούσαμε συν δυο ακόμα. 3. Τοποθέτηση 9 μl από το μίγμα αυτό σε κάθε σωληνάκι μικροφυγονέντρου. Παρακάτω παρατίθεται πίνακας όπου περιγράφονται αναλυτικά οι ποσότητες που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή του ανωτέρου μίγματος όπως και οι συνθήκες της αντίδρασης PCR που ακολούθησε.

Παρασκευή μίγματος

STOCK Ποσότητα (για τελικό όγκο 10μl) Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 10x 1,0 μl

dNTPs 25mM 1,0 μl

Εκκινητής εμπρόσθιος 10pmol/μl 0,5 μl

Εκκινητής οπίσθιος 10pmol/μl 0,5 μl

Taq πολυμεράση 5u/μl 0,1 μl

ddH2O 5,9 μl

Κατανομή κύκλων 27

Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος

Προεπώαση 94ο C 5min

ο Αποδιάταξη 94 C 30sec

Υβριδοποίηση 56ο C/60ο C 1min

Πολλαπλασιασμός 72ο C 1min Επιπλέον βήμα πολλαπλασιασμού 72ο C 10min

Αριθμός κύκλων 30

ο Θερμοκρασία αναμονής 4 C

Όπως προαναφέρθηκε, πριν την πραγματοποίηση του δεύτερου τύπου αντίδρασης PCR γινόταν σήμανση με ραδιενεργό φώσφορο του ενός εκ των δυο εκκινητών και συγκεκριμένα του εμπρόσθιου εκκινητή (forward). Τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια συνήθως έχουν υδροξυλικές ομάδες στο 5΄ άκρο και άρα είναι έτοιμα για την αντίδραση της κινάσης (Zheng, 1997). Η σήμανση που περιγράφεται παρακάτω είναι σχεδιασμένη ώστε να μπορεί να αναλύσει επαρκώς 60 υπό μελέτη άτομα.

Πίνακας με τα αντιδραστήρια για την σήμανση με ραδιενεργό φώσφορο του εμπρόσθιου εκκινητή.

Αντιδραστήρια Ποσότητα (για σωληνάκι των 1.5 ml) Ρυθμιστικό διάλυμα κινάσης (10x) 1,5 μl Τ4ΡΝΚ κινάση (10 u/μl) 1,5 μl γ-32P ΑΤΡ (>5.000 Ci/mMol) 3,0 μl Εκκινητής (20μΜ) 3,0 μl ddH2O 6,0 μl Τελικός όγκος 15,0 μl

Μετά την παραπάνω διαδικασία, ακολουθούσε επώαση στους 37ο C για 30 λεπτά, μεταφορά στους 65ο C για 10 λεπτά με σκοπό την αδρανοποίηση του ενζύμου και εν συνεχεία μεταφορά στον πάγο. Οι αντιδράσεις αυτές μπορούν να διατηρηθούν για αρκετά μεγάλο διάστημα αφού ο μόνος περιοριστικός παράγοντας είναι ο χρόνος ημιζωής του ραδιενεργού (περίπου 14 ημέρες).

Η διαδικασία της PCR είχε ως εξής:

1.Τοποθέτηση 1 μl DNA σε σωληνάκι μικροφυγοκέντρου και κλείσιμο του πώματος. 28

2. Ετοιμασία μίγματος, το οποίο να επαρκεί για 60 αντιδράσεις PCR:

Αντιδραστήρια Ποσότητα 10X PCR buffer 60 μl Εκκινητής εμπρόσθιος (20 mM) 12 μl

Εκκινητής οπίσθιος (20 mM) 15 μl

Taq πολυμεράση (5 u/μl) 3 μl dNTPs (10μM κάθε νουκλεοτιδίου) 2 μl ddH2O 433 μl

Τελικός όγκος: 525 μl

3. Μεταφορά του παραπάνω μίγματος στο σωληνάκι που είναι ο σημασμένος εκκινητής. Ακολουθεί καλή ανάδευση και μεταφορά 8,75 μl σε κάθε σωλήνα όπου υπάρχει 1μl μήτρας DNA. 4. Τα σωληνάκια τοποθετούνται στη συσκευή της PCR, η οποία ρυθμίζεται να εκτελέσει το ακόλουθο πρόγραμμα.

Κατανομή κύκλων

Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος

Προεπώαση 94ο C 5min

ο Αποδιάταξη 94 C 30sec

Υβριδοποίηση 56ο C/60ο C 1min

Πολλαπλασιασμός 72ο C 1min Επιπλέον βήμα πολλαπλασιασμού 72ο C 10min

Αριθμός κύκλων 30

Θερμοκρασία αναμονής 4ο C

5. Αποθήκευση στους 4ο C (σε κουτί προστατευτικό από την ραδιενέργεια). 29

Β.2.5 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου Β.2.5.1 Αρχή της μεθόδου

Τα πηκτώματα πολυακριλαμιδίου έχουν την ικανότητα να διαχωρίσουν τμήματα DNA τα οποία μπορεί να διαφέρουν μεταξύ τους μόνο κατά μία βάση. Βασικό τους πλεονέκτημα είναι ότι μπορούν να δεχτούν μεγάλες ποσότητες DNA (μέχρι και 10 µg) χωρίς καμία επίπτωση στην διαχωριστική τους ικανότητα. Ανάλογα με τις απαιτήσεις του εκάστοτε πειράματος μπορούν να παρασκευαστούν είτε αποδιατακτικά (περιέχουν ουρία ή άλλο αποδιατακτικό παράγοντα) είτε μη αποδιατακτικά πηκτώματα ΤΒΕ. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε αποδιατακτικό πήκτωμα.

Εφαρμογές των Αποδιατακτικών πηκτωμάτων:

1. Ανάλυση ολιγονουκλεοτιδίων 2. Διαχωρισμός μονόκλωνων αλυσίδων DNA 3. Απομόνωση ραδιενεργά σημασμένων DNA ανιχνευτών 4. S1 nuclease assay 5. DNA footprinting 6. RNase protection assays

Εφαρμογές μη αποδιατακτικών πηκτωμάτων:

1. Διαχωρισμός τμημάτων DNA που ποικίλουν σε μέγεθος από 20 bp - 2000 bp 2. Μελέτη αλληλεπιδράσεων DNA-πρωτεΐνης (Gel Shift Assay)

Β.2.5.2 Παρασκευή πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου 1. Σε ποτήρι ζέσεως προσθέτονται τα παρακάτω: διάλυμα ουρίας 46,7% : 40 ml TBE, 5X: 16 ml ακρυλαμίδιο: 10 ml dH2O: 14 ml 2. Τα δύο τζάμια, όπου θα πακεταριστεί το πήκτωμα, πλένονται πολύ καλά. 3. Αφήνονται να στεγνώσουν και καθαρίζονται με αιθανόλη. 4. Τοποθετούνται 2 ml σιλικόνης στο ένα από τα δύο τζάμια (στο ίδιο πάντα) και απλώνονται γρήγορα με χαρτί. 5. Το μεγάλο τζάμι τοποθετείται σε οριζόντια θέση και απάνω του τοποθετούνται οι δύο ειδικές πλαστικές ταινίες, με τρόπο που να επικάθονται στα άκρα των δύο μεγάλων πλευρών του τζαμιού. Από πάνω αφήνεται το μικρό τζάμι, έτσι ώστε να καλύπτει ακριβώς το μεγάλο τζάμι. 6. Τα άκρα των τζαμιών ενώνονται σε διάφορες θέσεις με μεταλλικά clips, έτσι ώστε να υπάρχει καλύτερη επαφή μεταξύ τους. 30

7. Στο διάλυμα που έχει ήδη φτιαχτεί προσθέτονται 100 μl APS (Ammonium persulfate) και 250 μl TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine), ώστε να αρχίσει ο πολυμερισμός του ακρυλαμιδίου. 8. Το διάλυμα αφήνεται να ρεύσει αργά και σταθερά, στο τμήμα του μεγάλου τζαμιού που προεξέχει. Το διάλυμα αρχίζει να εισχωρεί μεταξύ των τζαμιών. Με μικρά κτυπήματα οδηγείται προς το κάτω μέρος, προσέχοντας να μην κάνει φυσαλίδες. 9. Όταν το διάλυμα γεμίσει όλο το χώρο μεταξύ των τζαμιών, τοποθετούνται στο πάνω μέρος (εκεί που τελειώνει το μικρό τζάμι) μεταξύ των δύο τζαμιών τα ειδικά πλαστικά κτενάκια, με τα δοντάκια προς τα πάνω. 10. Το πήκτωμα αφήνεται για τουλάχιστον 2 h να στερεοποιηθεί, πριν φορτωθούν τα δείγματα.

Β.2.5.3 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 1. Το πήκτωμα τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης και η συσκευή ρυθμίζεται σε 1500 V (και όχι σε περισσότερα από 50 W). 2. Τα κτενάκια τοποθετούνται ανάποδα, ώστε να σχηματιστούν τα πηγαδάκια της ηλεκτροφόρησης. Φορτώνονται 2-3 μl μόνο χρωστικής σε κάθε δεύτερο πηγαδάκι και η συσκευή μπαίνει σε λειτουργία. Έτσι, από την πορεία της χρωστικής διαπιστώνεται ποια πηγαδάκια είναι καλά, ώστε να φορτωθεί το DΝΑ, ενώ παράλληλα θερμαίνεται το πήκτωμα (πρέπει να έχει θερμοκρασία 45-50ο C σε όλη του την επιφάνεια). 3. Μετά από μια ώρα περίπου, η συσκευή σταματά και φορτώνονται 2 μl δείγματος ανά πηγαδάκι. 4. Η συσκευή ρυθμίζεται στο ίδιο πρόγραμμα. 5. Η ηλεκτροφόρηση αφήνεται να εξελιχθεί για χρονικό διάστημα που εξαρτάται από τo μέγεθος του τμήματος DNA. 6. Το πήκτωμα απομακρύνεται από τη συσκευή και τα δύο τζάμια αποχωρίζονται, προσέχοντας να μείνει όλο το πήκτωμα στο ένα τζάμι. 7. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, το πήκτωμα μεταφέρεται σε χαρτί 3ΜΜ Whatmann και σκεπάζεται με νάιλον μεμβράνη. 8. Ξηραίνεται για περίπου 90 min. σε υψηλή θερμοκρασία υπό κενό. 9. Το πήκτωμα εκτίθεται σε φιλμ αυτοραδιογραφίας (overnight). 10. Εμφάνιση του φιλμ.

Β.3 Επεξεργασία αποτελεσμάτων με υπολογιστικά προγράμματα

Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη βοήθεια του υπολογιστικού προγράμματος Popgene v.3.2 (Yeh et al., 1999) το οποίο είναι ένα ιδιαίτερα απλό και εύχρηστο πρόγραμμα πληθυσμιακής ανάλυσης. Χάρη σε αυτό έχουμε τη δυνατότητα να μελετήσουμε την υπάρχουσα γενετική ποικιλότητα τόσο μεταξύ των πληθυσμών όσο και μέσα σε αυτούς. Το Popgene v.3.2 χρησιμοποιεί υπερέχοντες και συνυπερέχοντες δείκτες, καθώς επίσης και ποσοτικούς χαρακτήρες (QTLs) για την 31

ανάλυση τόσο απλοειδών όσο και διπλοειδών δεδομένων. Είναι σε θέση να εκτελέσει σχεδόν κάθε είδους ανάλυση δεδομένων που αφορούν πληθυσμιακές αναλύσεις όπως υπολογισμό γονιδιακών συχνοτήτων, δημιουργία κλαδογραμμάτων και έλεγχο των υπό μελέτη πληθυσμών για ισορροπία κατά Hardy-Weinberg. Είναι επίσης σε θέση να υπολογίζει την παρατηρούμενη και αναμενόμενη ομοζυγωτία ή ετεροζυγωτία, τον διαφορετικό αριθμό αλληλομόρφων, τις γενετικές αποστάσεις μεταξύ των πληθυσμών καθώς και πληθώρα άλλων χαρακτηριστικών. Το πρόγραμμα PHYLIP 3.6C (ή PHYLogeny Inference Package) (Felsenstein, 2004) είναι ένα πακέτο προγραμμάτων για φυλογενετικές αναλύσεις. Διατίθεται δωρεάν στο δίκτυο και είναι συμβατό με σχεδόν όλα τα είδη υπολογιστικών προγραμμάτων. Προσφέρει τη δυνατότητα μιας πληθώρας μεθόδων ανάλυσης, όπως φειδωλότητας, μήτρας γενετικών αποστάσεων, μέγιστης πιθανοφάνειας και δημιουργία εξελικτικών δέντρων. Μπορεί να χειριστεί δεδομένα στη μορφή αλληλουχιών, γονιδιακών συχνοτήτων, θέσεων αναγνώρισης από ενδονουκλεάσες περιορισμού, μήτρας γενετικών αποστάσεων καθώς και πολλά άλλα.. Όσον αφορά τα κλαδογράμματα που παρατίθενται στην παρούσα εργασία, πρέπει να επισημάνουμε πως κατασκευάστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο Neighbor-Joining (Μέθοδος Σύνδεσης-Γειτόνων) από το πρόγραμμα Phylip 3.6C. Η μέθοδος αυτή αναπτύχθηκε από τους Saitou and Nei (1987) και τροποποιήθηκε από τους Studier and Keppler (1988). Αποτελεί σήμερα την πλέον χρησιμοποιούμενη μέθοδο κατασκευής φυλογενετικού δέντρου που στηρίζεται σε μήτρα αποστάσεων (Lemey et al., 2009). Το φυλογενετικό δέντρο κατασκευάζεται μέσω της διαδοχικής εύρεσης ζευγών γειτόνων.

32

Γ. Αποτελέσματα

Γ.1.1 Οι έντεκα μικροδορυφορικοί δείκτες Γ.1.1.1 Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης

Οι έντεκα μικροδορυφορικοί δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία, όπως έχει ήδη αναφερθεί, απομονώθηκαν από την ερευνητική ομάδα της Milana (2009) από λιμναίους πληθυσμούς της Atherina boyeri. Οι πληθυσμοί αυτοί προέρχονται συγκεκριμένα από την ιταλική λίμνη Trasimeno. Η συγκεκριμένη ομάδα έλεγξε τους μικροδορυφόρους σε πέντε άτομα από: τα δυο νέα προτεινόμενα είδη της A. boyeri, τα punctuated (εστιγμένα) και τα non-punctuated (μη-εστιγμένα), από τα δυο συγγενικά είδη A. presbyter και A. hepsetus καθώς επίσης και από την Menidia menidia, η οποία ανήκει στην ίδια τάξη αλλά στην οικογένεια Atherinopsidae.Έπειτα από PCR και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης τα αποτελέσματα είχαν ως εξής:

Πίνακας 4.: Πίνακας για τα έντεκα μικροδορυφορικά ζεύγη εκκινητών (Milana et al., 2009) που φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από PCR και ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τα πέντε άτομα από κάθε πληθυσμό για τον οποίο εξετάστηκαν.

Γενετικός Ta Α.Α. Εύρος μήκους pu nPu Ahe Apr Mm τόπος (ο C) (σε βάσεις) AthA10 58 14 354-194 -- -- + -- -- AthB2 60 5 132-120 + + + + -- AthB5 60 11 254-158 + + + + + AthB10 60 9 234-178 + + + + + AthC4 64 11 247-179 + + + + + AthD6 60 7 196-112 + + + + -- AthE5 58 7 136-108 + + + + + AthF1 62 8 213-121 + + + + -- AthF3 56 14 244-170 + + + + -- AthF6 62 11 239-146 -- + + + -- AthG6 58 5 166-151 -- + + -- +

Στον παραπάνω πίνακα με το (+) συμβολίζουμε την ύπαρξη ευδιάκριτης ζώνης κατά την ηλεκτροφόρηση, ενώ με το (--) την απουσία της.

Τa: θερμοκρασία υβριδοποίησης Ahe: Atherina hepsetus Α.Α.: αριθμός αλληλομόρφων Apr: Atherina presbyter pu: punctuated (εστιγμένοι) Mm: Menidia menidia npu: non punctuated (εστιγμένοι) 33

Σύμφωνα λοιπόν με τον παραπάνω πίνακα αναμένουμε όλοι οι δείκτες μας να είναι λειτουργικοί για τους εστιγμένους πληθυσμούς εκτός από τους δείκτες A10, F6, G6 ενώ για τους μη εστιγμένους αναμένεται να είναι λειτουργικοί όλοι εκτός του Α10. Δεδομένου ότι οι δείκτες έχουν απομονωθεί από A. boyeri λιμναίου τύπου είναι λογικό να περιμένουμε να ενισχύσουν το DNA των ατόμων από τέτοιους πληθυσμούς. Αρχικά λοιπόν ελέγχθηκε το σύνολο των πληθυσμών του εργαστηρίου μας (22) με τους διαθέσιμους δείκτες. Αυτό έγινε μέσω PCR και ακολούθως με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Παρακάτω παρατίθενται ενδεικτικά μερικά από τα αποτελέσματά μας.

 Δείκτης Β5

Εικ.5.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση για τον δείκτη Β5. Θ Ι: θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι Θ ΙΙ: θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου ΙΙ Λ: λιμναίοι/λιμνοθαλάσσιοι πληθυσμοί

Σύμφωνα λοιπόν με τα αποτελέσματα της παραπάνω εικόνας φαίνεται το πόσο διαφορετικό είναι το πρότυπο των αλληλομόρφων μεταξύ των θαλάσσιων πληθυσμών (επάνω πήκτωμα), ανεξάρτητα αν αυτοί είναι τύπου Ι ή ΙΙ, και των λιμναίων (κάτω πήκτωμα). Επίσης, πιο έντονες είναι οι ομοιότητες μεταξύ των πληθυσμών της Πρέβεζας, της Εύβοιας και της Κω (Θ ΙΙ) σε σχέση με το αντίστοιχο πρότυπο ζωνών της Ζακύνθου και της Λευκάδας (Θ Ι). Αυτό όμως που προκαλεί περισσότερο ενδιαφέρον είναι η ύπαρξη έντονου πολυμορφισμού στους υπό μελέτη πληθυσμούς, ορατού ακόμα και σε επίπεδο αγαρόζης. Είναι γνωστό ότι στην αγαρόζη 34

δεν μπορούν να διαχωριστούν ζώνες DNA οι οποίες διαφέρουν μεταξύ τους μόνο κατά λίγες βάσεις. Στην εικόνα μας, διαπιστώνουμε την ύπαρξη πολλών ζωνών με διαφορετικά μεγέθη και άρα την ύπαρξη διαφορετικών αλληλομόρφων, ένδειξη του μεγάλου πολυμορφισμού που χαρακτηρίζει τους πληθυσμούς μας. Βάση της μελέτης των Milana et al. τα αναμενόμενα μεγέθη για τον δείκτη Β5 είναι περίπου 150-250 βάσεις, πράγμα που συμφωνεί και με τα δικά μας αποτελέσματα.

 Δείκτης Α10

Εικ.6.: Εικόνα με τα αποτελέσματα από ηλεκτροφόρηση για τον δείκτη Α10, όπου έχει ηλεκτροφορηθεί DNA από πέντε διαφορετικά άτομα (mix DNA) για τον κάθε πληθυσμό. Λ: Λήμνος, Δ: Λευκάδα, Ζ: Ζάκυνθος, Π: Πρέβεζα, Ε: Εύβοια, Ω: Κως, Τ: Κεφαλονιά, Κ: Κάλυμνος, Ρ: Κουρνά. Το (Ν) αναπαριστά τον πληθυσμό της Νισύρου ο οποίος δεν αναλύεται στην παρούσα εργασία όπως και ο πληθυσμός της Τουρκίας (λίμνη Iznik) και ο πληθυσμός από το Μοναστηράκι που αναφέρονται παρακάτω. Στην πρώτη θέση ηλεκτροφόρησης φαίνεται ο μάρτυρας 100bp που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα αλλά και όλες τις ηλεκτροφορήσεις που ακολουθούν.

Εικ.7.: Εικόνα με τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη Α10. 35

Αναφορικά με τον δείκτη Α10, παρατηρούμε ότι ήταν λειτουργικός για τους λιμναίου τύπου πληθυσμούς, δίνοντας ένα παρεμφερές πρότυπο αλληλομόρφων. Ωστόσο δεν ήταν λειτουργικός για την Λευκάδα που είναι θαλάσσιος πληθυσμός τύπου Ι, παρόλο που στο αντίστοιχο mix DNA είχε ενισχύσει το αναμενόμενο τμήμα. Γενικά διαπιστώνουμε ότι το ζεύγος εκκινητών Α10 ενίσχυσε τα τμήματα DNA σε όλους τους θαλάσσιους πληθυσμούς και του τύπου Ι και του ΙΙ (εκτός της Λευκάδας), όπως αυτό φαίνεται από την εικόνα 6, πράγμα που έρχεται σε ασυμφωνία με τα αποτελέσματα των Milana et al., όπου ο αντίστοιχος δείκτης δεν ήταν λειτουργικός για τους εστιγμένους και μη εστιγμένους πληθυσμούς. Η πλειοψηφία πάντως των ζωνών που πήραμε στην ηλεκτροφόρηση ήταν στα αναμενόμενα για τον δείκτη μεγέθη, δηλαδή γύρω στις 200-350 βάσεις, ενώ και ο Α10 καταδεικνύεται ως ένας ιδιαίτερα πολυμορφικός δείκτης. Δεν πρέπει να αγνοήσουμε επίσης ότι κάποιοι πληθυσμοί, όπως για παράδειγμα η Πρέβεζα και η Εύβοια, εμφάνισαν πολλές ζώνες στην ηλεκτροφόρηση, ένδειξη ότι το συγκεκριμένο ζεύγος εκκινητών δεν είναι απόλυτα ειδικό και υβριδοποιήθηκε σε περισσότερες από μια θέσεις.

 Δείκτης F6

Εικ.8.: Εικόνα με τα αποτελέσματα από την ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη F6.

Εικ.9.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη F6. Ο πληθυσμός της Τουρκίας όπως έχει ήδη αναφερθεί δεν αναλύεται στην παρούσα εργασία. 36

Παρατηρούμε για τον δείκτη F6 ότι αποδείχθηκε λειτουργικός για όλους τους λιμναίους πληθυσμούς. Ωστόσο οι πολλαπλές ζώνες που εμφάνισαν τα άτομα από τα Κουρνά υπονοούν ότι το συγκεκριμένο ζεύγος εκκινητών υβριδοποιήθηκε και σε περιοχή που δεν αντιστοιχεί σε μικροδορυφορικά αλληλόμορφα. Στο ίδιο συμπέρασμα καταλήγουμε βλέποντας και τις ζώνες που έδωσαν τα άτομα από την Κυπαρισσία με μήκος περίπου στις 800 βάσεις, οι οποίες επίσης δεν αντιστοιχούν σε περιοχή μικροδορυφόρων. Ο F6 καταδεικνύεται ως λειτουργικός δείκτης και για τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι, στους οποίους βέβαια επέδειξε χαμηλότερη ενίσχυση, πιθανότατα λόγω συσσώρευσης μεταλλάξεων στις περιοχές όπου προσδένουν οι εκκινητές. Οι ζώνες που πήραμε στην ηλεκτροφόρηση από τους παραπάνω πληθυσμούς κυμαίνονται κυρίως μεταξύ 150-250 βάσεις. Οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου ΙΙ επειδή ελέγχθηκαν κατευθείαν σε επίπεδο πολυακρυλαμιδίου με τον συγκεκριμένο δείκτη ο οποίος και αποδείχτηκε λειτουργικός για αυτούς, δεν χρειάστηκε να ελεγχθούν και σε επίπεδο αγαρόζης. Τα αποτελέσματα σε πολυακρυλαμίδιο παρατίθενται παρακάτω.

 Δείκτης F3

Εικ.10.: Εικόνα με τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη F3.

Εικ.11.: Εικόνα με τα αποτελέσματα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη F3. 37

Παρατηρούμε ότι ο δείκτης F3 ήταν λειτουργικός τόσο για τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι, δίνοντας ένα παρόμοιο πρότυπο αλληλομόρφων, όσο και για τους λιμναίους. Είναι έντονα πολυμορφικός , οι ζώνες που εμφάνισαν οι θαλάσσιοι πληθυσμοί ήταν στα αναμενόμενα για τον δείκτη μεγέθη (150-250 βάσεις) βάση των Milana et al., όχι όμως και οι ζώνες των λιμναίων που κυμάνθηκαν στις 300-350 βάσεις. Οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου ΙΙ είχαν ελεγχθεί νωρίτερα σε επίπεδο πολυακρυλαμιδίου με τον συγκεκριμένο δείκτη και είχαν ενισχυθεί πολύ καλά οπότε δεν χρειάστηκε να ξαναελεγχθούν σε επίπεδο αγαρόζης. Τα αποτελέσματα σε πολυακρυλαμίδιο παρατίθενται παρακάτω.

 Δείκτης Β10

Εικ.12.: Εικόνα με τα αποτελέσματα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη Β10.

Εικ.13.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη B10. 38

Για τον δείκτη Β10 μπορούμε να πούμε σε γενικές γραμμές πως ήταν λειτουργικός τόσο για τους θαλάσσιους πληθυσμούς, ανεξάρτητα αν ήταν τύπου Ι ή ΙΙ, όσο και για τους λιμναίους/λιμνοθαλάσσιους. Αυτό που ωστόσο προκαλεί εντύπωση είναι η ενίσχυση ορισμένων μόνο ατόμων σε κάποιους πληθυσμούς ( π.χ. στην Κάσο και την Καβάλα), ένδειξη πιθανής ύπαρξης null αλληλομόρφων. Τα null αλληλόμορφα είναι αποτέλεσμα συσσώρευσης μεταλλάξεων στην περιοχή πρόσδεσης των εκκινητών. Κάποια άτομα έχουν τόσες μεταλλάξεις στις συγκεκριμένες περιοχές ώστε να μην δημιουργούν πρόβλημα στην πρόσδεση των εκκινητών, ενώ κάποια άλλα έχουν συσσωρεύσει τόσες πολλές ώστε να καθίσταται αδύνατη υβριδοποίηση με το ζεύγος εκκινητών. Παρατηρούμε επίσης την έντονη πολυμορφικότητα που επιδεικνύει ο συγκεκριμένος δείκτης καθώς και την μεγάλη γκάμα σε επίπεδο μεγέθους για τα μικροδορυφορικά αλληλόμορφα (150-300 βάσεις).

 Δείκτης C4

Εικ.14.: Εικόνα με τα αποτελέσματα από την ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη C4.

Παρατηρούμε ότι o C4 ήταν λειτουργικός τόσο στους λιμναίους όσο και στους θαλάσσιους τύπου Ι πληθυσμούς. Έδωσε επίσης αρκετά διαφορετικά αλληλόμορφα, αλλά συγκριτικά με άλλους δείκτες φαίνεται να είναι λιγότερο πολυμορφικός. Τα μεγέθη των ζωνών κυμάνθηκαν περίπου μεταξύ 100-200 βάσεων, πράγμα που συμφωνεί με τα προσδοκώμενα για τον δείκτη μεγέθη. Χαρακτηριστική είναι η ύπαρξη null αλληλομόρφων και για αυτόν τον δείκτη σε πληθυσμούς όπως ο Κορινθιακός, η Μυτιλήνη και η Βιστωνίδα. Δεν ελέγθηκαν σε επίπεδο αγαρόζης για τον C4 οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου ΙΙ, αφού είχαν δοκιμαστεί σε επίπεδο πολυακρυλαμιδίου και είχαν ενισχυθει εξαιρετικά. Τα αποτελέσματα σε πολυακρυλαμίδιο παρατίθενται παρακάτω. 39

 Δείκτης Β2

Εικ.15.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη Β2.

Εικ.16.: Εικόνα με τα αποτελέσματα από την ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη Β2.

Παρατηρούμε ότι ενισχύθηκαν πολύ καλά τα αναμενόμενα τμήματα DNA τόσο στους λιμναίους (με εξαίρεση την Βιστωνίδα και τον Βόλο όπου βλέπουμε χαμηλή ενίσχυση ορισμένων μόνο ατόμων) όσο και στους θαλάσσιος τύπου Ι δίνοντας μάλιστα σε όλες τις περιπτώσεις ένα πρότυπο ζωνών γύρω στις 130-150 βάσεις, καθιστώντας τον έτσι ως έναν λιγότερο πολυμορφικό δείκτη συγκριτικά με τους άλλους.

40

 Δείκτης G6

Εικ.17.: Εικόνα με τα αποτελέσματα από την ηλεκτροφόρηση για τον δείκτη G6.

Κάθε ζώνη αναπαριστά το DNA μιας ομάδας 5 ατόμων από τους ακόλουθους πληθυσμούς: Α:Καβάλα, Ξ:Τουρκία, Β:Βιστωνίδα, Υ:Βόλος, Θ:Κορινθιακός, Σ:Κυπαρισσία, Ψ:Μυτιλήνη, Στ:Μοναστηράκι, Η:Ηγουμενίτσα, Ο:Ν.Μουδανιά και Γ:Κάσος. Όπως φαίνεται από την εικόνα ο δείκτης G6 δεν ήταν λειτουργικός για κανέναν από τους πληθυσμούς μας ανεξάρτητα από τον τύπο που άνηκε (η ζώνη που βλέπουμε στην Ηγουμενίτσα υπολογίζεται κοντά στις 800 βάσεις και δεν θεωρείται ότι είναι αλληλόμορφο των υπό μελέτη μικροδορυφόρων). Είναι πιθανό ωστόσο το συγκεκριμένο ζεύγος εκκινητών να πρέπει να δοκιμαστεί σε διαφορετική θερμοκρασία υβριδοποίησης (annealing temperature), πιο χαμηλή από αυτή των 60οC που δοκιμάστηκε εν προκειμένου, όπου ίσως να έδινε πιο αξιοποιήσιμα αποτελέσματα.

 Δείκτης D6

Εικ.18.: Εικόνα με τα αποτελέσματα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη D6.

41

Εικ.19.: Εικόνα με τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη D6.

Παρατηρούμε ότι ο δείκτης D6 ήταν λειτουργικός και για τις τρεις ομάδες πληθυσμών παρόλο που ορισμένοι πληθυσμοί επέδειξαν πιο χαμηλή ενίσχυση των αντίστοιχων τμημάτων DNA τους. Φαίνεται να είναι ένας αρκετά πολυμορφικός δείκτης ενώ οι ζώνες που παίρνουμε στην ηλεκτροφόρηση είναι περίπου στις 100-150 βάσεις, πράγμα που συμφωνεί με τα αντίστοιχα αποτελέσματα των Milana et al. (2009).

 Δείκτης Ε5

Εικ.20.: Εικόνα με τα αποτελέσματα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη Ε5.

42

Εικ.21.: Εικόνα με τα αποτελέσματα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη Ε5.

Παρατηρούμε ότι ο δείκτης Ε5 είναι λειτουργικός τόσο για τους λιμναίους όσο και για τους θαλάσσιους τύπου Ι παρόλο που πολλοί από αυτούς έδωσαν αχνές ζώνες στην ηλεκτροφόρηση, απόρροια της χαμηλής ενίσχυσης των αντίστοιχων τμημάτων DNA. Τα μεγέθη των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων κυμαίνονται μεταξύ 100- 150 βάσεων και άρα είναι στα αναμενόμενα για τον δείκτη μεγέθη. Οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου ΙΙ είχαν ήδη μελετηθεί σε επίπεδο πολυακρυλαμιδίου και για αυτόν τον λόγο δεν ξαναελέγχθηκαν σε αγαρόζη. Τα αποτελέσματα σε πολυακρυλαμίδιο παρατίθενται παρακάτω.

 Δείκτης F1

Εικ.22.: Εικόνα με τα αποτελέσματα από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη για τον δείκτη F1.

43

O F1 αποδεικνύεται ως ένας μερικώς λειτουργικός δείκτης για τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι και τους λιμναίους. Οι ζώνες DNA που πήραμε κατά την ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη κυμαίνονται μεταξύ 100-250 βάσεις, όσο δηλαδή αναμενόταν βάση των πειραμάτων των Milana et al. (2009). Αυτό που παρατηρούμε και σε αυτόν τον δείκτη είναι η έντονη παρουσία null αλληλομόρφων σε πολλούς πληθυσμούς, όπως π.χ. στον Βόλο και στον Κορινθιακό.

Γ.1.1.2 Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου

Η παρούσα εργασία σκοπό είχε να εξετάσει αν οι διαθέσιμοι μικροδορυφόροι από την μελέτη των Milana et al. (2009) όταν θα ελέγχονταν με τους δικούς μας ελληνικούς πληθυσμούς θα επιβεβαίωναν ή όχι την ύπαρξη των τριών προτεινόμενων ομάδων πληθυσμών: δηλαδή την ομάδα των θαλάσσιων πληθυσμών τύπου Ι, την ομάδα των θαλάσσιων πληθυσμών τύπου ΙΙ και την αντίστοιχη των λιμναίων/λιμνοθαλάσσιων πληθυσμών. Για τον λόγο αυτό προχωρήσαμε σε ηλεκτροφόρηση σε επίπεδο πολυακρυλαμιδίου για όλους τους διαθέσιμους δείκτες με τρεις πληθυσμούς, που επιλέχτηκαν τυχαία, από την κάθε ομάδα πληθυσμών. Κάθε δείκτης, ανάλογα και με τη διαθεσιμότητα του DNA ελεγχόταν με κάποιους από αυτούς τους εννέα πληθυσμούς. Έτσι από τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι επιλέχτηκαν οι: Λήμνος, Λευκάδα, Ζάκυνθος, από τους θαλάσσιους τύπου ΙΙ επιλέχτηκαν οι: Πρέβεζα, Εύβοια, Κως και από τους λιμναίους/λιμνοθαλάσσιους επιλέχτηκαν οι: Κεφαλονιά, Κάλυμνος και τα Κουρνά.

 Δείκτης C4

Εικ.23.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη C4. 44

Εικ.24.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη C4.

Εικ.25.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη C4.Διακρίνονται οι ζώνες του DNA από τους πληθυσμούς της Λήμνου και της Ζακύνθου αλλά και από control-άτομα, δηλαδή άτομα που γνωρίζουμε ήδη τον γενότυπό τους.

Ο C4 είναι όπως φαίνεται και από τις ανωτέρω εικόνες ο πλέον συντηρημένος δείκτης καθώς είναι λειτουργικός και για τις τρεις ομάδες πληθυσμών. Παρατηρούμε ότι το συγκεκριμένο ζεύγος εκκινητών ενίσχυσε πολύ καλά τα αναμενόμενα τμήματα DNA στους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου ΙΙ, όπου δε στην Εύβοια και στην Κω έδωσε εξαιρετικά παρόμοιο πρότυπο αλληλομόρφων, το οποίο διαφέρει από το 45

αντίστοιχο των θαλάσσιων τύπου Ι και των λιμναίων. Ως προς τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι, όπως προαναφέρθηκε, ο C4 ήταν ένας λειτουργικός δείκτης, ενώ για τους λιμναίους τα αποτελέσματα είναι πιο περίπλοκα. Συγκεκριμένα βλέπουμε ότι ενισχύθηκαν εξαιρετικά τα αλληλόμορφα των μικροδορυφόρων στην Κεφαλονιά, στην Κάλυμνο διαπιστώνουμε ενίσχυση μερικών μόνο ατόμων, ένδειξη ύπαρξης null αλληλομόρφων, ενώ στα Κουρνά έχουμε πολύ αχνή ενίσχυση, πράγμα που υποδηλώνει μεγάλη διαφοροποίηση του συγκεκριμένου πληθυσμού σε σχέση με τους άλλους λιμναίους πληθυσμούς.

 Δείκτης D6

Εικ.26.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη D6.

Εικ.27.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη D6. 46

Εικ.28.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη D6.

Ο D6 είναι ένας δείκτης ο οποίος έδωσε αρκετά διαφορετικά αποτελέσματα για τις τρεις ομάδες πληθυσμών. Συγκεκριμένα βλέπουμε ότι έδωσε πολλαπλές ζώνες στην Εύβοια και στην Κω, με αποτέλεσμα να μην μπορούμε να ταυτοποιήσουμε αλληλόμορφα και άρα ούτε να υπολογίσουμε συχνότητες αλληλομόρφων στους συγκεκριμένους πληθυσμούς. Αντιθέτως, ο τρίτος εκπρόσωπος των θαλάσσιων πληθυσμών τύπου ΙΙ, η Πρέβεζα, έδειξε να ενισχύθηκε πολύ καλά, δίνοντας ένα πρότυπο αλληλομόρφων το οποίο διαφέρει σε σχέση με αυτό της Ζακύνθου και της Λήμνου. Η Λήμνος και η Ζάκυνθος, που είναι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι, μοιράστηκαν αρκετά κοινά αλληλόμορφα και γενικά το πρότυπο αλληλομόρφων ήταν αρκετά παρόμοιο. Αναφορικά με τους λιμναίους, ενισχύθηκαν πολύ καλά τα αλληλόμορφα στην Κάλυμνο, δίνοντας ομολογουμένως μικρό αριθμό διαφορετικών αλληλομόρφων συγκριτικά με άλλους πληθυσμούς, ενώ στην Κεφαλονιά έχουμε ενίσχυση ορισμένων μόνο ατόμων δίνοντας αλληλόμορφα πολύ διαφορετικά από αυτά της Καλύμνου. Τα Κουρνά ενισχύθηκαν επίσης πολύ καλά και το πρότυπο τους μοιάζει αρκετά με αυτό της Καλύμνου.

47

 Δείκτης Β2

Εικ.29.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη B2.

Εικ.30.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη B2.

Ως προς τον δείκτη Β2 παρατηρούμε ότι ήταν μερικώς λειτουργικός μόνο για τους θαλάσσιους πληθυσμούς. Συγκεκριμένα η Εύβοια και η Κως, οι οποίοι είναι θαλάσσιοι τύπου ΙΙ, έδωσαν και πάλι παρεμφερές πρότυπο αλληλομόρφων, ωστόσο τα άτομα της Πρέβεζας δεν ενισχύθηκαν καλά με αποτέλεσμα να μην μπορούμε να ταυτοποιήσουμε μικροδορυφορικά αλληλόμορφα. Ως προς τις άλλες δυο ομάδες πληθυσμών, έχουμε αρκετά ικανοποιητική ενίσχυση των ατόμων στους θαλάσσιους 48

τύπου Ι (Λήμνο, Ζάκυνθο) ενώ στην Κεφαλονιά (λιμναίος πληθυσμός) δεν είναι δυνατόν να γίνει αναγνώριση αλληλομόρφων. Γίνεται αντιληπτό λοιπό πως ο δείκτης Β2 δεν ήταν ιδιαίτερα χρήσιμος και πληροφοριακός για την μελέτη μας. Ωστόσο και αυτός ο δείκτης δείχνει να επιβεβαιώνει ότι η Εύβοια και η Κως διαχωρίζονται ξεκάθαρα από τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι, ενώ η Πρέβεζα που ναι μεν θεωρείται και αυτή θαλάσσιος πληθυσμός τύπου ΙΙ, δεν φαίνεται να ταιριάζει το ίδιο καλά με τους δυο προαναφερθέντες.

 Δείκτης Β10

Εικ.31.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη B10.

Εικ.32.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη B10. 49

Εικ.33.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη B10.

Ο δείκτης Β10 δεν ήταν λειτουργικός για καμία ομάδα πληθυσμών καθώς έδωσε πολλαπλές ζώνες με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η ταυτοποίηση των αλληλομόρφων. Προφανώς είναι ένας μη αξιοποιήσιμος δείκτης για την μελέτη μας.

 Δείκτης Β5

Εικ.34.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη B5.

50

Εικ.35.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη B5.

Εικ.36.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη B5.

Για τον δείκτη Β5 ως προς τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου ΙΙ, διαπιστώνουμε την ύπαρξη null αλληλομόρφων στην Εύβοια και στην Κω, αλληλομόρφων που όπως προ είπαμε έχουν συσσωρευμένες μεταλλάξεις στην περιοχή πρόσδεσης των 51

εκκινητών. Η Πρέβεζα με την σειρά της έδωσε πολλαπλές ζώνες όπου δεν μπορούμε να ανιχνεύσουμε τα μικροδορυφορικά αλληλόμορφα. Ως προς τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι τα αποτελέσματα είναι επίσης περίπλοκα. Τα άτομα της Ζακύνθου ενισχύθηκαν ικανοποιητικά, δίνοντας μάλιστα μεγάλη γκάμα διαφορετικών αλληλομόρφων. Από την άλλη πλευρά, η Λήμνος και η Λευκάδα επέδειξαν ενίσχυση των αντίστοιχων τμημάτων DNA ωστόσο δεν ήταν δυνατόν να αναγνωριστεί η περιοχή ύπαρξης των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων. Οι λιμναίοι πληθυσμοί για μια ακόμα φορά δεν φαίνεται να συμπεριφέρονται ως μια ενιαία ομάδα πληθυσμών. Συγκεκριμένα τα άτομα των Κουρνών ενισχύθηκαν εξαιρετικά με αποτέλεσμα να ταυτοποηθούν τα αλληλόμορφα και να γίνει υπολογισμός των αντίστοιχων συχνοτήτων. Τα άτομα της Καλύμνου με τη σειρά τους ενισχύθηκαν πιο αχνά, αρκετά καλά όμως ώστε να αναγνωριστούν τα αλληλόμορφα,τα οποία ήταν σε τελείως διαφορετικά μεγέθη από αυτά των Κουρνών. Τέλος, τα άτομα της Κεφαλονιάς ενισχύθηκαν επίσης πιο αχνά, δίνοντας αλληλόμορφα με πολύ μεγάλες διαφορές μεγέθους μεταξύ τους αλλά και αρκετά διαφορετικά από αυτά των άλλων δυο λιμναίων πληθυσμών.

 Δείκτης Ε5

Εικ.37.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη E5.

52

Εικ.38.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη E5.

Ο δείκτης Ε5 ήταν λειτουργικός για τους δυο εκπροσώπους των θαλάσσιων πληθυσμών τύπου ΙΙ, την Εύβοια και την Κω δηλαδή, όπου και έδωσε ένα παρεμφερές πρότυπο αλληλομόρφων, ενώ δεν ήταν λειτουργικός για τους θαλάσσιους τύπου Ι, όπου δεν έχουμε ενίσχυση των αντίστοιχων ατόμων. Αναφορικά με τους λιμναίους, η Κάλυμνος ενισχύθηκε πολύ καλά, δίνοντας περιορισμένο αριθμό αλληλομόρφων (μόλις δύο), αισθητά λιγότερα δηλαδή αλληλόμορφα συγκριτικά με άλλους πληθυσμούς και τελείως διαφορετικά από αυτά των θαλάσσιων τύπου ΙΙ. Τα Κουρνά και η Κεφαλονιά από την άλλη δεν ενισχύθηκαν επαρκώς με αποτέλεσμα να μην μπορούμε να ταυτοποιήσουμε αλληλόμορφα στους εν λόγω πληθυσμούς.

 Δείκτης F1

Εικ.39.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη F1. 53

Εικ.40.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη F1.

Ο δείκτης F1 ήταν λειτουργικός για τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου ΙΙ, αφού ενισχύθηκαν εξαιρετικά και οι τρεις πληθυσμοί (η Πρέβεζα δεν φαίνεται στις παραπάνω εικόνες) που κατατάσσονται εκεί, δίνοντας μάλιστα ίδιο πρότυπο αλληλομόρφων και έχοντας μεταξύ τους κοινά αλληλόμορφα. Να επισημάνουμε σε αυτό το σημείο πως είχαμε μικρό αριθμό αλληλομόρφων, καθιστώντας έτσι τον δείκτη F1 ως λιγότερο πολυμορφικό συγκρινόμενος πάντα με άλλους δείκτες. Αρκετά ικανοποιητικά ενισχύθηκαν τα άτομα της Λήμνου και της Ζακύνθου, τα οποία μεταξύ τους επέδειξαν ένα αρκετά παρόμοιο πρότυπο αλληλομόρφων το όποιο με τη σειρά του φαίνεται να διαφέρει αρκετά από το αντίστοιχο των θαλάσσιων τύπου ΙΙ. Η Κεφαλονιά, η μόνη εκπρόσωπος των λιμναίων/λιμνοθαλάσσιων πληθυσμών, έδωσε πολλαπλές ζώνες με αποτέλεσμα να μην μπορούμε να εξάγουμε μετρήσιμα αποτελέσματα από αυτήν.

 Δείκτης F3

Εικ.41.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη F3. 54

Εικ.42.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη F3.

Εικ.43.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη F3.

Ο F3 με τη σειρά του αποδείχτηκε ένας ιδιαίτερα λειτουργικός δείκτης για τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου ΙΙ, αφού οι Εύβοια, Κως και Πρέβεζα ενισχύθηκαν εξαιρετικά, δίνοντας μάλιστα παρόμοιο πρότυπο αλληλομόρφων. Εξίσου λειτουργικός αποδείχτηκε και για τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι, αφού Λευκάδα, Λήμνος και Ζάκυνθος έδωσαν χαρακτηριστικά παρόμοιο πρότυπο ζωνών, το οποίο διέφερε από το αντίστοιχο των θαλάσσιων τύπου ΙΙ. Αυτό που παρατηρούμε και στις δυο ομάδες θαλάσσιων πληθυσμών είναι ο σχετικά μικρός αριθμός αλληλομόρφων, που καθιστούν τον F3 λιγότερο πολυμορφικό σε σχέση με άλλους 55

δείκτες όπως παραδείγματος χάριν ο Β5. Ο ίδιος δείκτης ωστόσο δεν ήταν τόσο λειτουργικός για τους λιμναίους πληθυσμούς. Συγκεκριμένα παρατηρούμε μόνο μια μερική ενίσχυση ατόμων στην Κεφαλονιά, μια πολύ αχνή ενίσχυση στα άτομα της Καλύμνου και αντίστοιχα μη ικανοποιητική ενίσχυση των ατόμων στα Κουρνά.

 Δείκτης F6

Εικ.44.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη F6.

Εικ.45.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη F6. 56

Εικ.46.: Εικόνα όπου φαίνονται τα αποτελέσματα έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον δείκτη F6.

Ο F6 ήταν μερικώς λειτουργικός για τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου ΙΙ, αφού τα άτομα της Εύβοιας και της Κω ενισχύθηκαν καλά, στην Πρέβεζα όμως είναι αδύνατο να ταυτοποιήσουμε ποια είναι η ζώνη με τα αλληλόμορφα των μικροδορυφόρων. Στους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι παρατηρούμε αχνή ενίσχυση των αντίστοιχων ατόμων με εξαίρεση την Λευκάδα που ήταν αρκετά καλή. Οι λιμναίοι για μια ακόμη φορά δείχνουν μια ετερογένεια και δεν συμπεριφέρονται ως μια ενιαία ομάδα. Συγκεκριμένα στην Κεφαλονιά έχουμε ενίσχυση μερικών μόνο ατόμων, στην Κάλυμνο είχαμε πολύ αχνή ενίσχυση ενώ στα Κουρνά όπου είχαμε την καλύτερη ενίσχυση, οι ζώνες που πήραμε κατά την ηλεκτροφόρηση ήταν σε τελείως διαφορετικά μεγέθη από αυτά των άλλων πληθυσμών. Για τους δείκτες A10, F6, G6 δεν παρατίθενται εικόνες από τα πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου διότι οι δείκτες αυτοί αποδείχτηκαν μη λειτουργικοί ως προς τους πληθυσμούς κάθε τύπου και άρα δεν ενισχύθηκαν τα αντίστοιχα τμήματα DNA. Καθότι γίνεται κατανοητό αυτοί οι δείκτες δεν ήταν πληροφοριακοί για την εργασία μας, τουλάχιστον σε επίπεδο μετρήσιμων αποτελεσμάτων, αφού το γεγονός ότι δεν ήταν λειτουργικοί στους ελληνικούς πληθυσμούς είναι ένδειξη μεγάλης γενετικής διαφοροποίησης σε σχέση με τους αντίστοιχους ιταλικούς.

Γ.2 Επεξεργασία των δεδομένων σε υπολογιστικά προγράμματα

Επόμενο βήμα της εργασίας ήταν να ελέγξουμε τα δεδομένα μας μέσω υπολογιστικών προγραμμάτων και πιο συγκεκριμένα του Popgene v.3.2., στο οποίο καταχωρήσαμε τους γενοτύπους των ατόμων από κάθε πληθυσμό και δείκτη όποτε ήταν αυτό δυνατό. Σε αυτό το σημείο υπενθυμίζουμε ότι όλοι δείκτες δεν ήταν λειτουργικοί για τους πληθυσμούς μας, ενώ παράλληλα η ύπαρξη null αλληλομόρφων και πολλαπλών ζωνών καθιστούσε πολλές φορές αδύνατη την 57

ταυτοποίηση του εκάστοτε γενοτύπου. Χάρη στο Popgene, λοιπόν, είμαστε σε θέση να υπολογίσουμε συχνότητες αλληλομόρφων, να ελέγξουμε την ισορροπία των πληθυσμών κατά Hardy-Weinberg, να υπολογίσουμε γενετικές αποστάσεις και πολλές άλλες εφαρμογές. Το πρώτο πράγμα που ελέγξαμε λοιπόν είναι εάν το σύνολο των πληθυσμών μας ήταν σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg για όλους τους διαθέσιμους δείκτες και εν συνεχεία υπολογίσαμε την παρατηρούμενη και αναμενόμενη ετεροζυγωτία όπως και το πραγματικό και δραστικό αριθμό αλληλομόρφων, οι οποίοι είναι δείκτες πολυμορφισμού.

Πληθυσμός: Λήμνος

Γενετικός Μέγεθος Π.Ε. Α.Ε. H/W τόπος δείγματος Α.Α. Δ.Μ. ισορροπία Β2 0 ------Β5 0 ------C4 28 7,0000 4,2609 0,7143 0,7937 (+) D6 20 6,0000 4,3478 0,6000 0,8105 (+) E5 0 ------F1 0 ------F3 30 4,0000 1,2295 0,2000 0,1931 (+) Μέσος όρος 26 5,6667 3,2794 0,5048 0,5991 Τυπ.απόκλιση 1,5275 1,7758 0,2700 0,3517

Α.Α. = πραγματικός αριθμός αλληλομόρφων (ο αριθμός αλληλομόρφων που παρατηρήθηκαν σε έναν πληθυσμό) Δ.Μ. = δραστικός αριθμός αλληλομόρφων (ο αριθμός των αλληλομόρφων που χρειάζονται προκειμένου να δώσουν τον ίδιο βαθμό ετεροζυγωτίας σε έναν πληθυσμό) [Kimura and Crow (1964)] Π.Ε.= παρατηρούμενη ετεροζυγωτία Α.Ε.= αναμενόμενη ετεροζυγωτία H/W ισορροπία = ισορροπία κατά Hardy-Weinberg Το (+) στην τελευταία στήλη του πίνακα εξηγεί ότι ο πληθυσμός ελεγχόμενος με τον εκάστοτε δείκτη βρισκόταν σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg. Τα άτομα της Λήμνου όταν ελέγχθηκαν με το δείκτη Ε5 παρουσίασαν null αλληλόμορφα, με τους δείκτες Β5 και Β2 παρουσίασαν πολλαπλές ζώνες, ενώ με τον F3 είχαμε χαμηλή ενίσχυση των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων. Σε κάθε περίπτωση ήταν αδύνατη η ταυτοποίηση των αλληλομόρφων (----).

58

Πληθυσμός: Λευκάδα

Γενετικός Μέγεθος H/W τόπος δείγματος Α.Α. Δ.Μ. Π.Ε. Α.Ε. ισορροπία B2 0 ------B5 0 ------C4 26 6.0000 5.4516 0.7692 0.8492 (+) D6 0 ------E5 0 ------F1 0 ------F3 30 3.0000 1.3120 0.2667 0.2460 (+) Μέσος όρος 28 4.5000 3.3818 0.5179 0.5476 Τυπ.απόκλιση 2.1213 2.9272 0.4266 0.4093

Α.Α. = πραγματικός αριθμός αλληλομόρφων Δ.Μ. = δραστικός αριθμός αλληλομόρφων [Kimura and Crow (1964)] Π.Ε.= παρατηρούμενη ετεροζυγωτία Α.Ε.= αναμενόμενη ετεροζυγωτία H/W ισορροπία = ισορροπία κατά Hardy-Weinberg Το (+) στην τελευταία στήλη του πίνακα εξηγεί ότι ο πληθυσμός ελεγχόμενος με τον εκάστοτε δείκτη βρισκόταν σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg. Τα άτομα της Λευκάδας όταν ελέγχθηκαν με τους δείκτες Β2 και F1 έδωσαν πολλαπλές ζώνες, με το δείκτη Β5 έδωσαν null αλληλόμορφα, ενώ δεν εξετάστηκαν με τους δείκτες D6 και Ε5 (----).

Πληθυσμός: Ζάκυνθος

Γενετικός Μέγεθος H/W τόπος δείγματος Α.Α. Δ.Μ. Π.Ε. Α.Ε. ισορροπία Β2 0 ------Β5 0 ------C4 28 7.0000 4.7229 0.6429 0.8175 (+) D6 30 6.0000 3.6290 0.7333 0.7494 (+) E5 0 ------F1 0 ------F3 30 2.0000 1.1421 0.1333 0.1287 (+) Μέσος όρος 29 5.0000 3.1647 0.5032 0.5652 Τυπ.απόκλιση 2.6458 1.8350 0.3235 0.3795

Α.Α. = πραγματικός αριθμός αλληλομόρφων Δ.Μ. = δραστικός αριθμός αλληλομόρφων [Kimura and Crow (1964)] H/W ισορροπία = ισορροπία κατά Hardy-Weinberg Το (+) στην τελευταία στήλη του πίνακα εξηγεί ότι ο πληθυσμός ελεγχόμενος με τον εκάστοτε δείκτη βρισκόταν σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg. Τα άτομα της 59

Ζακύνθου όταν ελέγχθηκαν με τους δείκτες Β2 και Β5 παρουσίασαν πολλαπλές ζώνες αλληλομόρφων ενώ με τους δείκτες Ε5 και F1 παρατηρήσαμε χαμηλή ενίσχυση των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων με αποτέλεσμα να μην μπορούμε να τα ταυτοποιήσουμε (----).

Πληθυσμός: Πρέβεζα

Γενετικός Μέγεθος H/W τόπος δείγματος Α.Α. Δ.Μ. Π.Ε. Α.Ε. ισορροπία Β2 0 ------Β5 0 ------C4 30 8.0000 4.7368 0.5333 0.8161 (+) D6 28 7.0000 4.2609 0.8571 0.7937 (+) E5 20 4.0000 2.0408 0.6000 0.5368 (+) F1 30 2.0000 1.4706 0.4000 0.3310 (+) F3 30 2.0000 1.8000 0.4000 0.4598 (+) Μέσος όρος 28 4.6000 2.8618 0.5581 0.5875 Τυπ.απόκλιση 2.7928 1.5174 0.1883 0.2118

Α.Α. = πραγματικός αριθμός αλληλομόρφων Δ.Μ. = δραστικός αριθμός αλληλομόρφων [Kimura and Crow (1964)] Π.Ε.= παρατηρούμενη ετεροζυγωτία Α.Ε.= αναμενόμενη ετεροζυγωτία H/W ισορροπία = ισορροπία κατά Hardy-Weinberg Το (+) στην τελευταία στήλη του πίνακα εξηγεί ότι ο πληθυσμός ελεγχόμενος με τον εκάστοτε δείκτη βρισκόταν σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg. Τα άτομα της Πρέβεζας όταν ελέγχθηκαν με τους δείκτες Β2 και Β5 έδωσαν πολλαπλές ζώνες με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η αναγνώριση των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων (----).

Πληθυσμός: Εύβοια

Γενετικός Μέγεθος H/W τόπος δείγματος Α.Α. Δ.Μ. Π.Ε. Α.Ε. ισορροπία Β2 30 5.0000 1.5306 0.3333 0.3586 (+) Β5 0 ------C4 30 13.0000 4.0909 0.6000 0.7816 (+) 60

D6 0 ------E5 28 3.0000 1.5556 0.4286 0.3704 (+) F1 30 4.0000 1.2295 0.2000 0.1931 (+) F3 28 5.0000 1.4627 0.2857 0.3280 (+) Μέσος όρος 29 6.0000 1.9739 0.3695 0.4063 Τυπ.απόκλιση 4.0000 1.1905 0.1530 0.2214

Α.Α. = πραγματικός αριθμός αλληλομόρφων Δ.Μ. = δραστικός αριθμός αλληλομόρφων [Kimura and Crow (1964)] Π.Ε.= παρατηρούμενη ετεροζυγωτία Α.Ε.= αναμενόμενη ετεροζυγωτία H/W ισορροπία = ισορροπία κατά Hardy-Weinberg Το (+) στην τελευταία στήλη του πίνακα εξηγεί ότι ο πληθυσμός ελεγχόμενος με τον εκάστοτε δείκτη βρισκόταν σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg. Τα άτομα της Εύβοιας όταν ελέγχθηκαν με τον δείκτη Β2 έδωσαν πολλαπλές ζώνες DNA, ενώ με τον δείκτη Β5 παρατηρήθηκε η ύπαρξη null αλληλομόρφων, με αποτέλεσμα και στις δύο περιπτώσεις να μην είναι δυνατή η ταυτοποίηση των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων (----).

Πληθυσμός: Κως

Γενετικός Μέγεθος H/W τόπος δείγματος Α.Α. Δ.Μ. Π.Ε. Α.Ε. ισορροπία Β2 28 5,0000 1,4627 0.2143 0.3280 (+) Β5 0 ------C4 30 11,0000 3,5433 0.5333 0.7425 (+) D6 0 ------E5 28 5,0000 2,2147 0.3571 0.5688 (+) F1 26 5,0000 1,5089 0.3077 0.3508 (+) F3 30 2,0000 1,7241 0.4667 0.4345 (+) Μέσος όρος 28 5,6000 2,0907 0,3758 0.4849 Τυπ.απόκλιση 3,2863 0,8650 0,1266 0.1722

Α.Α. = πραγματικός αριθμός αλληλομόρφων Δ.Μ. = δραστικός αριθμός αλληλομόρφων [Kimura and Crow (1964)] Π.Ε.= παρατηρούμενη ετεροζυγωτία Α.Ε.= αναμενόμενη ετεροζυγωτία H/W ισορροπία = ισορροπία κατά Hardy-Weinberg Το (+) στην τελευταία στήλη του πίνακα εξηγεί ότι ο πληθυσμός ελεγχόμενος με τον εκάστοτε δείκτη βρισκόταν σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg. . Τα άτομα της Κω όταν ελέγχθηκαν με τον δείκτη Β2 έδωσαν πολλαπλές ζώνες DNA, ενώ με τον δείκτη 61

Β5 παρατηρήθηκε η ύπαρξη null αλληλομόρφων, με αποτέλεσμα και στις δύο περιπτώσεις να μην είναι δυνατή η ταυτοποίηση των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων (----).

Πληθυσμός: Κεφαλονιά

Γενετικός Μέγεθος H/W τόπος δείγματος Α.Α. Δ.Μ. Π.Ε. Α.Ε. ισορροπία Β2 0 ------(+) Β5 0 ------(+) C4 28 4.0000 2.6309 0.6429 0.6429 (+) D6 18 6.0000 5.2258 0.7778 0.8562 (+) E5 0 ------(+) F1 0 ------(+) F3 0 ------(+) Μέσος όρος 23 5.0000 3.9283 0.7103 0.7495 Τυπ.απόκλιση 1.4142 1.8349 0.0954 0.1509

Α.Α. = πραγματικός αριθμός αλληλομόρφων Δ.Μ. = δραστικός αριθμός αλληλομόρφων [Kimura and Crow (1964)] Π.Ε.= παρατηρούμενη ετεροζυγωτία Α.Ε.= αναμενόμενη ετεροζυγωτία H/W ισορροπία = ισορροπία κατά Hardy-Weinberg Το (+) στην τελευταία στήλη του πίνακα εξηγεί ότι ο πληθυσμός ελεγχόμενος με τον εκάστοτε δείκτη βρισκόταν σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg. Τα άτομα της Κεφαλονιάς όταν ελέγχθηκαν με τους δείκτες Β2 και Β5 έδωσαν πολλαπλές ζώνες DNA, με τον δείκτη F3 έδωσαν null αλληλόμορφα, ενώ με τους δείκτες Ε5 και F1 είχαμε κακή ενίσχυση των αναμενόμενων τμημάτων DNA (----).

Πληθυσμός: Κάλυμνος

Γενετικός Μέγεθος H/W τόπος δείγματος Α.Α. Δ.Μ. Π.E. Α.E. ισορροπία Β2 0 ------Β5 30 6,0000 5.2941 0.7333 0.8391 (+) C4 0 ------D6 28 3,0000 2.2924 0.5000 0.5847 (+) E5 30 2,0000 1.3846 0.3333 0.2874 (+) F1 0 ------62

F3 0 ------Μέσος όρος 28 3,6667 2.9904 0.5222 0.5704 Τυπ.απόκλιση 2.0817 2.0461 0.2009 0.2761

Α.Α. = πραγματικός αριθμός αλληλομόρφων Δ.Μ. = δραστικός αριθμός αλληλομόρφων [Kimura and Crow (1964)] Π.Ε.= παρατηρούμενη ετεροζυγωτία Α.Ε.= αναμενόμενη ετεροζυγωτία H/W ισορροπία = ισορροπία κατά Hardy-Weinberg Το (+) στην τελευταία στήλη του πίνακα εξηγεί ότι ο πληθυσμός ελεγχόμενος με τον εκάστοτε δείκτη βρισκόταν σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg. Τα άτομα της Καλύμνου όταν ελέγχθηκαν με τους δείκτες Β2, C4, F1 και F3 δεν ενισχύθηκαν επαρκώς, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η αναγνώριση των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων (----).

Πληθυσμός: Κουρνά

Γενετικός Μέγεθος H/W τόπος δείγματος Α.Α. Δ.Μ. Π.Ε. Α.Ε. ισορροπία Β2 0 ------(+) Β5 28 5.0000 2.4968 0.5714 0.6217 (+) C4 0 ------(+) D6 28 3.0000 2.5290 0.5000 0.6270 (+) E5 0 ------(+) F1 0 ------(+) F3 0 ------(+) Μέσος όρος 28 4.0000 2.5129 0.5357 0.6243 Τυπ.απόκλιση 1.4142 0.0228 0.0505 0.0037

Α.Α. = πραγματικός αριθμός αλληλομόρφων Δ.Μ. = δραστικός αριθμός αλληλομόρφων [Kimura and Crow (1964)] Π.Ε.= παρατηρούμενη ετεροζυγωτία Α.Ε.= αναμενόμενη ετεροζυγωτία H/W ισορροπία = ισορροπία κατά Hardy-Weinberg Το (+) στην στην τελευταία στήλη του πίνακα εξηγεί ότι ο πληθυσμός ελεγχόμενος με τον εκάστοτε δείκτη βρισκόταν σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg. Τα άτομα των Κουρνών όταν ελέγχθηκαν με τους δείκτες Β2, C4, Ε5 και F3 δεν ενισχύθηκαν επαρκώς, ενώ με τον δείκτη F1 παρατηρήθηκαν πολλαπλές ζώνες DNA. Σε κάθε περίπτωση ήταν αδύνατο να γίνει ταυτοποίηση των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων (----). Να αναφερθεί σε αυτό το σημείο ότι ο υπολογισμός της αναμενόμενης και παρατηρούμενης ετεροζυγωτίας έγινε βάση του Levene (1949).

63

Όπως γίνεται αντιληπτό από την στιγμή που όλοι οι διαθέσιμοι δείκτες δεν ήταν λειτουργικοί για όλους τους πληθυσμούς μας, συν το γεγονός ότι παρατηρήθηκαν null αλληλόμορφα, πολλαπλές ζώνες και χαμηλή ενίσχυση κάποιων πληθυσμών, αντιλαμβανόμαστε πως η πληροφορία δεν είναι αρκετή ώστε να μας οδηγήσει σε ακριβή κλαδογράμματα από όπου θα μπορούμε να δούμε τις φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των τριών ομάδων πληθυσμών της A. boyeri. Ωστόσο για όποιους πληθυσμούς πήραμε καλά μετρήσιμα αποτελέσματα παραθέτουμε παρακάτω τα κλαδογράμματα που προέκυψαν από το Phylip πρόγραμμα με τον εκάστοτε δείκτη που χρησιμοποιήθηκε. Πριν από αυτά όμως παρουσιάζονται οι γενετικές αποστάσεις των υπό μελέτη πληθυσμών της Atherina boyeri έπειτα από έλεγχο με τους εκάστοτε μικροδορυφορικούς δείκτες. Βάση αυτών των γενετικών αποστάσεων άλλωστε κατασκευάζονται και τα φυλογενετικά δέντρα που ακολουθούν.

Πίνακας 5. Πίνακας όπου φαίνεται η γενετική ομοιότητα(Ι) μεταξύ των πληθυσμών (πάνω από τη διαγώνιο) και η γενετική απόσταση (D) μεταξύ των πληθυσμών (κάτω από τη διαγώνιο) έπειτα από έλεγχο με τους δείκτες C4 και F3 (Nei, 1972). Πληθυσμοί Λήμνος Λευκάδα Ζάκυνθος Πρέβεζα Εύβοια Κως Λήμνος **** 0.9177 0.9216 0.4184 0.0845 0.3679 Λευκάδα 0.0859 **** 0.9614 0.4402 0.1325 0.4001 Ζάκυνθος 0.0816 0.0393 **** 0.4972 0.2157 0.4994 Πρέβεζα 0.8714 0.8206 0.6987 **** 0.8675 0.9102 Εύβοια 2.4711 2.0208 1.5339 0.1422 **** 0.9317 Κως 0.9998 0.9160 0.6943 0.0941 0.0707 ****

Κλαδόγραμμα 1: Κλαδόγραμμα Neighbor-Joining όπου απεικονίζονται όλοι οι θαλάσσιοι πληθυσμοί ανεξαρτήτος τύπου όπως αυτοί προέκυψαν έπειτα από έλεγχο με τους δείκτες C4 και F3. 64

Παρατηρείται ότι η γενετική ομοιότητα μεταξύ των θαλάσσιων πληθυσμών τύπου Ι είναι εξαιρετικά μεγάλη (και κατ’ αναλογία πολύ μικρή η μεταξύ τους γενετική απόσταση) όπως το ίδιο συμβαίνει και για τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου ΙΙ. Από την άλλη παρατηρούμε την μεγάλη γενετική απόσταση που υπάρχει μεταξύ των Θ.Τ.Ι και Θ.Τ.ΙΙ, πράγμα που φαίνεται να επιβαβαιώνει την διάκριση των θαλάσσιων πληθυσμών της Atherina boyeri στους δύο αυτούς τύπους.

Πίνακας 6. Πίνακας όπου φαίνεται η γενετική ομοιότητα (Ι) μεταξύ των πληθυσμών (πάνω από τη διαγώνιο) και η γενετική απόσταση (D) μεταξύ των πληθυσμών (κάτω από τη διαγώνιο) έπειτα από έλεγχο με τους δείκτες C4 και D6 (Nei, 1972). Πληθυσμοί Λήμνος Ζάκυνθος Πρέβεζα Κεφαλονιά Λήμνος **** 0.7704 0.2786 0.1337 Ζάκυνθος 0.2609 **** 0.4521 0.4351 Πρέβεζα 1.2781 0.7939 **** 0.2728 Κεφαλονιά 2.0125 0.8322 1.2990 ****

Κλαδόγραμμα 2: Κλαδόγραμμα Neighbor-Joining όπου απεικονίζονται οι πληθυσμοί όπως αυτοί προέκυψαν έπειτα από έλεγχο με τους δείκτες C4 και D6.

Παρατηρείται και πάλι πως οι πληθυσμοί της Λήμνου και της Ζακύνθου έχουν μεγάλη γενετική ομοιότητα μεταξύ τους δεδομένου ότι και οι δύο είναι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι και ταυτόχρονα έχουν μικρή ομοιότητα (και αντίστοιχα μεγάλη γενετική απόσταση) με την Πρέβεζα που ανήκει στους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου ΙΙ. Η Κεφαλονιά, εκπρόσωπος των λιμναίων/λιμνοθαλάσσιων πληθυσμών, έχει 65

μεγάλη γενετική απόσταση από όλους τους παραπάνω θαλάσσιους πληθυσμούς, ανεξαρτήτως ποιου τύπου είναι.

Πίνακας 7. Πίνακας όπου φαίνεται η γενετική ομοιότητα (I) μεταξύ των πληθυσμών (πάνω από τη διαγώνιο) και η γενετική απόσταση (D) μεταξύ των πληθυσμών (κάτω από τη διαγώνιο) έπειτα από έλεγχο με τους δείκτες C4, D6 και F3 (Nei, 1972). Πληθυσμοί Λήμνος Ζάκυνθος Πρέβεζα Λήμνος **** 0.9159 0.3773 Ζάκυνθος 0.0878 **** 0.4467 Πρέβεζα 0.9748 0.8059 ****

Κλαδόγραμμα 3: Κλαδόγραμμα Neighbor-Joining όπου απεικονίζονται οι πληθυσμοί όπως αυτοί προέκυψαν έπειτα από έλεγχο με τους δείκτες C4, D6 και F3.

Παρατηρείται η μεγάλη γενετική ομοιότητα μεταξύ της Λήμνου και της Ζακύνθου, οι οποίοι είναι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι και αντίστοιχα η μεγάλη γενετική απόσταση των δύο αυτών πληθυσμών με την Πρέβεζα που κατατάσσεται στους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου ΙΙ.

66

Δ. Συζήτηση

Δ.1 Αξιολόγηση δεικτών

Από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, όπως αυτά περιγράφηκαν αναλυτικά παραπάνω, το πρώτο συμπέρασμα που μπορούμε να εξάγουμε είναι ότι δεν ήταν λειτουργικοί και οι έντεκα διαθέσιμοι δείκτες για το σύνολο των ελληνικών πληθυσμών της Atherina boyeri. Tα συγκεκριμένα ζεύγη εκκινητών, λοιπόν, αν και έχουν σχεδιαστεί ειδικά για την Atherina boyeri από τους Milana et al. (2009) δεν κατάφεραν να ενισχύσουν τα αναμενόμενα τμήματα DNA. Το αξιοπρόσεκτο δε είναι ότι οι μικροδορυφορικοί δείκτες δεν ήταν λειτουργικοί πολλές φορές ούτε καν στους λιμναίους πληθυσμούς παρόλο που έχουν σχεδιαστεί από άτομα της ιταλικής λίμνης Trasimeno. Αυτό από μόνο του ήδη μας μαρτυρά την μεγάλη γενετική διαφοροποίηση που υφίστανται μεταξύ των ιταλικών και των ελληνικών πληθυσμών της A.boyeri. Τα αποτελέσματα για τον εκάστοτε δείκτη όπως αυτά προέκυψαν από την ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη αλλά κυρίως από την ηλεκτροφόρηση σε πολυακρυλαμίδιο θα μπορούσαν να συνοψιστούν ως εξής:

 Α10: ήταν ένας μη λειτουργικός δείκτης για τους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι και ΙΙ (πράγμα αναμενόμενο βάση των αποτελεσμάτων των Milana et al., 2009), αλλά ήταν λειτουργικός για τους λιμναίους/λιμνοθαλάσσιους πληθυσμούς. Σε αυτό το σημείο πρέπει να διευκρινίσουμε την εκ πρώτης όψεως ασυμφωνία που δείχνει ο συγκεκριμένος δείκτης ως προς την εικόνα του στην ηλεκτροφόρηση σε επίπεδο αγαρόζης και την αντίστοιχη σε πολυακρυλαμίδιο. Στην ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη δοκιμάστηκε κυρίως σε mix DNΑ από πέντε ατόμα με αποτέλεσμα να μην γνωρίζουμε αν η ζώνη DNA που πήραμε προέκυψε από το σύνολο των ατόμων ή από μερικά από αυτά. Όταν ωστόσο οι αντίστοιχοι πληθυσμοί ελέγχθηκαν σε επίπεδο πολυακρυλαμιδίου (όπου ελέγχονται δεκαπέντε άτομα μεμονωμένα) δεν ενισχύθηκαν επαρκώς τα αναμενόμενα τμήματα DNA καθιστώντας έτσι τον συγκεκριμένο δείκτη μη πληροφοριακό για την εργασία μας. Παρόλα αυτά δεν ξεχνάμε αυτό που έχουμε αναφέρει πολλάκις και παραπάνω , ότι δηλαδή όταν ένας δείκτης που έχει σχεδιαστεί για το συγκεκριμένο είδος δεν είναι λειτουργικός για κάποιους πληθυσμούς του είδους αυτού, τότε αυτό είναι ένδειξη μεγάλης γενετικής διαφοροποίησης για τους συγκεκριμένους πληθυσμούς.  Β2: από τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης στην αγαρόζη αποδεικνύεται ως ένας αρκετά λειτουργικός δείκτης και για τις τρεις ομάδες πληθυσμών. Στο πολυακρυλαμίδιο ενισχύθηκαν πολύ καλά τα μικροδορυφορικά αλληλόμορφα των θαλάσσιων πληθυσμών τύπου ΙΙ (Θ.Τ.ΙΙ), ενώ όσο αφορά τους Θ.Τ.Ι και τους λιμναίους υπήρξε μια πιο διαφορετική εικόνα, αφού κάποιοι πληθυσμοί 67

ενισχύθηκαν πολύ καλά αλλά υπήρχαν και ορισμένοι (π.χ. Κεφαλονιά και Λήμνος) όπου δεν ήταν εύκολο να γίνει ταυτοποίηση των αλληλομόρφων.  Β5: ο συγκεκριμένος δείκτης έδωσε αρκετά διαφορετικά αποτελέσματα. Τα άτομα της Εύβοιας και της Κω, που ανήκουν στους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου ΙΙ, εμφάνισαν null αλληλόμορφα ενώ τα αντίστοιχα της Πρέβεζας (Θ.Τ.ΙΙ), της Λήμνου και της Λευκάδας έδωσαν πολλαπλές ζώνες DNA με αποτέλεσμα να είναι αδύνατη η ταυτοποίηση των αλληλομόρφων. Οι υπόλοιποι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι ενισχύθηκαν αρκετά καλά, όπως άλλωστε και οι λιμναίοι, οι οποίοι έδωσαν πολύ μεγάλη γκάμα διαφορετικών αλληλομόρφων. Εξαίρεση για μια ακόμα φορά όπως θα δούμε και παρακάτω αποτελούν τα Κουρνά τα οποία ενισχύθηκαν εξαιρετικά αλλά έδωσαν πρότυπο ζωνών τελείως διαφορετικό από τους υπόλοιπους λιμναίους πληθυσμούς.  Β10: έδωσε πολλαπλές ζώνες στους πληθυσμούς και των τριών προτεινόμενων ομάδων (πράγμα που ήταν ορατό ήδη από την ηλεκτροφόρηση σε επίπεδο αγαρόζης) με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατόν να αναγνωριστεί ποια είναι η περιοχή με τα αλληλόμορφα των μικροδορυφόρων. Συνεπώς ο Β10 κρίνεται ως ένας μη πληροφοριακός δείκτης, τουλάχιστον σε επίπεδο μετρήσιμων αποτελεσμάτων, για την εργασία μας.  C4: αποδεικνύεται ως ο πλέον λειτουργικός και άρα χρήσιμος για την μελέτη μας δείκτης. Ενίσχυσε εξαιρετικά καλά και τις τρεις ομάδες πληθυσμών με χαρακτηριστική εξαίρεση και πάλι τον λιμναίο πληθυσμό των Κουρνών. Είναι ο μοναδικός δείκτης ο οποίος ξεκάθαρα διαχωρίζει τους θαλάσσιους πληθυσμούς μεταξύ τους αφού δίνουν διακριτά γενετικά πρότυπα, ενώ παράλληλα οι πληθυσμοί που έχουν καταταχθεί εντός της ίδιας ομάδας (είτε στους Θ.Τ.Ι. είτε στους Θ.Τ.ΙΙ) παρουσιάζουν κοινό πρότυπο ζωνών.  D6: ένας δείκτης ο οποίος έδωσε επίσης αρκετά διαφορετικά αποτελέσματα. Από τους πληθυσμούς που ανήκουν στους Θ.Τ.ΙΙ, τα άτομα της Εύβοιας και της Κω παρουσίασαν null αλληλόμορφα, όχι όμως και της Πρέβεζας, όπως ακριβώς δηλαδή είχε συμβεί και με τον δείκτη Β5. Οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι ενισχύθηκαν καλά και έδωσαν μάλιστα ένα αρκετά παρεμφερές πρότυπο μεταξύ τους σε αντίθεση με τους λιμναίους/λιμνοθαλάσσιους οι οποίοι ναι μεν ενισχύθηκαν επαρκώς δεν έδωσαν όμως κάποιο κοινό πρότυπο ζωνών, εντείνοντας την υπόθεση ότι οι λιμναίοι πληθυσμοί δύσκολα μπορούν να θεωρηθούν ως μια ενιαία ομάδα.  E5: ο συγκεκριμένος δείκτης δεν ήταν λειτουργικός για του θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι, ενώ αντίθετα ενισχύθηκαν πολύ καλά η Εύβοια και η Κως (Θ.Τ.ΙΙ) οι οποίες έδωσαν παρόμοιο γενετικό πρότυπο. Οι λιμναίοι πληθυσμοί από την άλλη δεν ενισχύθηκαν καλά με μοναδική εξαίρεση την Κάλυμνο που επέδειξε καλή ενίσχυση και τα Κουρνά που παρουσίασαν μια πολύ αχνή ενίσχυση των αλληλομόρφων.  F1: ήταν ένας λειτουργικός δείκτης και για τους δυο θαλάσσιου τύπου πληθυσμούς. Συγκεκριμένα ενισχύθηκαν εξαιρετικά τα άτομα των Θ.Τ.ΙΙ. δίνοντας παρόμοιο πρότυπο το οποίο με την σειρά του διέφερε αρκετά από το 68

αντίστοιχο πρότυπο που επέδειξαν οι Θ.Τ.Ι. Από την άλλη πλευρά, είτε δεν είχαμε καθόλου ενίσχυση των λιμναίων/λιμνοθαλάσσιων πληθυσμών είτε είχαμε πολλαπλές ζώνες με αποτέλεσμα και πάλι να μην μπορούμε να αναγνωρίσουμε τα αλληλόμορφα των μικροδορυφόρων. Ως προς τα αποτελέσματα που πήραμε από αυτόν τον δείκτη θα μπορούσαμε να πούμε πως ταιριάζουν αρκετά με αυτά που έδωσε ο δείκτης C4.  F3: ήταν επίσης ένας λειτουργικός δείκτης για τους θαλάσσιους πληθυσμούς της Atherina boyeri. Όπως ο προαναφερθείσας F1 αλλά και ο C4 δείκτης, έτσι και αυτός έδωσε παρόμοιο μοτίβο ζωνών ανάμεσα στους πληθυσμούς που κατατάσσονται στους Θ.Τ.Ι, σε αυτούς που κατατάσσονται στους Θ.Τ.ΙΙ ενώ παράλληλα έδωσε διαφορικό πρότυπο ανάμεσα στους δυο θαλάσσιους τύπους. Ως προς τους λιμναίους πληθυσμούς τα αποτελέσματα και πάλι φαίνονται να μην ακολουθούν μια κοινή γραμμή. Αναλυτικότερα, η Κεφαλονιά παρουσίασε null αλληλόμορφα, η Κάλυμνος επέδειξε ασθενή πλην αρκετά καλή ενίσχυση αν κρίνουμε και από τα αποτελέσματα της στην αγαρόζη, ενώ τα άτομα των Κουρνών δεν ενισχύθηκαν επαρκώς. Βασιζόμενοι κυρίως στην εικόνα από την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης πιθανολογούμε ότι το συγκεκριμένο ζεύγος εκκινητών υβριδοποιήθηκε και σε άλλες μη ειδικές περιοχές (εκτός δηλαδή της περιοχής των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων) αφού οι ζώνες DNA που πήραμε ήταν σε πολύ διαφορετικά μεγέθη από τα αναμενόμενα για τον δείκτη.  F6: ήταν ένας ζεύγος εκκινητών το οποίο χαρακτηρίζεται για την μέτρια ενίσχυση των θαλάσσιων πληθυσμών ανεξαρτήτως τύπου, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η ταυτοποίηση γενοτύπου στα άτομα κανενός πληθυσμού. Δεν ήταν ιδιαίτερα λειτουργικός ως δείκτης ούτε ως προς τους λιμναίους πληθυσμούς καθώς παρατηρούμε πως ναι μεν τα Κουρνά ενισχύθηκαν καλά, ωστόσο η Κάλυμνος επέδειξε πολύ χαμηλή ενίσχυση ενώ η Κεφαλονιά έδωσε πολλαπλές ζώνες όπως οι περισσότεροι άλλωστε και από τους θαλάσσιους πληθυσμούς. Εμφανές είναι και πάλι το γεγονός, όπως και στον δείκτη F3 ότι το ζεύγος εκκινητών F6 υβριδοποιήθηκε μη ειδικά. Από όλα τα παραπάνω καταλαβαίνουμε πως ήταν επίσης ένας μη πληροφοριακός δείκτης για την εργασία μας.  G6: βάση των αποτελεσμάτων των Milana et al. (2009) δεν περιμέναμε να είναι λειτουργικός για τους θαλάσσιους πληθυσμούς, όπως και έγινε άλλωστε στην παρούσα εργασία, ωστόσο δεν ήταν λειτουργικός ούτε για τους λιμναίους πληθυσμούς. Δεν έδωσε ζώνη DNA σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης ούτε όταν δοκιμάστηκε mix ατόμων από κάθε πληθυσμό.

69

Δ.2 Έλεγχος κατάταξης των ελληνικών πληθυσμών στις τρεις προτεινόμενες ομάδες

Ένας από τους κύριους στόχους της παρούσας εργασίας ήταν να ελεγχθεί αν για το σύνολο των ελληνικών πληθυσμών της Atherina boyeri που διαθέτει το εργαστήριο μας υφίσταται η ταξινόμηση που έχει γίνει στην εκάστοτε από τρεις μεγάλες κατηγορίες πληθυσμών, δηλαδή στους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι, τύπου ΙΙ καθώς και στους λιμναίους/λιμνοθαλάσσιους πληθυσμούς. Σε αυτό το σημείο αξίζει να υπενθυμίσουμε πως η κατάταξη του κάθε πληθυσμού έχει γίνει σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου και βασιζόταν κυρίως σε μιτοχονδριακούς δείκτες (συγκεκριμένα ελέγχθηκε η υπομονάδα I της κυτοχρωματικής οξειδάσης (COI), ο βρόγχος εκτόπισης (D-loop) και το κυτοχρώμα b (Cytb)) αλλά και σε πυρηνικούς δείκτες (γενετικός τόπος της ροδοψίνης) (Kraitsek et al., 2012). Με βάση τα αποτελέσματα από την ηλεκτροφόρηση σε επίπεδο αγαρόζης αλλά και πολυακρυλαμιδίου όπως επίσης και από τα αποτελέσματα του Popgene φαίνεται να επιβεβαιώνεται σε πρώτη φάση η διάκριση των δυο θαλάσσιων τύπων. Αναλυτικότερα η Εύβοια και η Κως βάση όλων των μικροδορυφορικών δεικτών παρουσιάζαν ένα παρόμοιο γενετικό πρότυπο μεταξύ τους και ταυτόχρονα διακριτό από αυτό των θαλάσσιων πληθυσμών τύπου Ι. Το γενετικό πρότυπο της Πρέβεζα αν και με βάση οριμένους δείκτες, π.χ. με τον D6, έμοιαζε να μην ταιριάζει απόλυτα με το αντίστοιχο της Εύβοιας και της Κω (πράγμα λογικό αφού οι Εύβοια και Κως βρίσκονται στο Αιγαίο πέλαγος, ενώ η Πρέβεζα στο Ιόνιο) ενώ διακρινόταν ξεκάθαρα από αυτό των Θ.Τ.Ι οπότε δικαίως κατατάσσεται στους Θ.Τ.ΙΙ ή διαφορετικά τους λεγόμενους εστιγμένους πληθυσμούς. Η γενετική ομοιότητα επίσης μεταξύ των πληθυσμών της Εύβοιας, της Κω και της Πρέβεζας, όπως αυτή παρουσιάστηκε παραπάνω, ήταν πολύ μεγάλη και ταυτόχρονα εξαιρετικά μεγάλες ήταν οι γενετικές αποστάσεις αυτών των πληθυσμών από τους αντίστοιχους Θ.Τ.Ι. Δεν υπάρχει κάποιο γεωγραφικό πρότυπο μεταξύ των θαλάσσιων πληθυσμών του Αιγαίου και του Ιονίου πελάγους όπως είχε διαπιστωθεί ήδη από την μελέτη των Kraitsek et al (2012). Οι δυο μελέτες συγκλίνουν επίσης στο γεγονός πως η χρωματική ιδιομορφία (τα σκουρόχρωμα στίγματα κάτω από την πλευρική γραμμή) δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό στοιχείο για τη διάκριση των δυο θαλάσσιων τύπων πληθυσμών της A. boyeri. Οι υπόλοιποι θαλάσσιοι πληθυσμοί παρόλο που διακρίνονται για τον έντονο πολυμορφισμό τους, έπειτα από έλεγχο σχεδόν με το σύνολο των μικροδορυφορικών δεικτών έδειξαν να χαρακτηρίζονται από ένα κοινό γενετικό προφίλ. Η Καβάλα που στην αρχή της εργασίας ήταν ο μόνος απροσδιόριστος πληθυσμός φαίνεται να ταιριάζει περισσότερο στους θαλάσσιους πληθυσμούς τύπου Ι. Η εικόνα βέβαια που έχουμε για την Καβάλα προκύπτει μόνο από τα αποτελέσματα σε επίπεδο αγαρόζης και άρα γίνεται κατανοητό πως πρέπει να ακολουθηθεί λεπτομερέστερη ανάλυση προκειμένου να καταταχθεί με ασφάλεια σε μια από τις τρεις ομάδες. Πάντως με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας όσοι δείκτες ήταν λειτουργικοί με τους Θ.Τ.Ι πληθυσμούς ήταν και με την Καβάλα όπως αντίστοιχα όσοι δεν ενίσχυσαν 70

τους Θ.Τ.Ι δεν ενίσχυσαν και την Καβάλα. Να αναφέρουμε πάντως στο σημείο αυτό ότι οι θαλάσσιοι πληθυσμοί ανεξαρτήτος τύπου δεν εμφάνισαν κάποιο γεωγραφικό πρότυπο όπως π.χ. θαλάσσιοι πληθυσμοί Αιγαίου και θαλάσσιοι πληθυσμοί Ιονίου, πράγμα που έρχεται σε αντίθεση με τη μελέτη των Kraitsek et al. (2012). Ως προς τους λιμναίους/λιμνοθαλάσσιους πληθυσμούς τα πράγματα μοιάζουν να είναι πιο περίπλοκα καθώς δύσκολα μπορούμε να τους θεωρήσουμε ως μια ενιαία και ομοιογενή ομάδα. Πρώτα πρώτα τα άτομα από τα Κουρνά, που προέρχονται από την απομονωμένη λίμνη της Κρήτης και άρα δεν είναι δυνατή η ανταλλαγή γενετικού υλικού με άλλους πληθυσμούς της A. boyeri, παρουσιάζουν ένα ιδιαίτερο πρότυπο ξεχωριστό από αυτό των υπολοίπων λιμναίων πληθυσμών. Επίσης οι λιμναίοι/λιμνοθαλάσσιοι πληθυσμοί δεν έδειξαν κοινό πρότυπο ζωνών DNA στην ηλεκτροφόρηση ούτε όταν ελέγχθηκαν με τους δείκτες C4 και F3 οι οποίοι ήταν οι πλέον λειτουργικοί δείκτες σε αυτήν την εργασία. Έτσι φαίνεται μάλλον απίθανο να μπορούν αυτοί οι πληθυσμοί να συγκροτήσουν μια ενιαία ομάδα πράγμα που έρχεται σε συμφωνία με την πρόσφατη μελέτη των Milana et al. (2012), όπου σε έλεγχο λιμναίων πληθυσμών της Ιταλίας βρήκαν περισσότερα του ενός γενετικά πρότυπα, υποδεικνύοντας κατ’ αυτόν τον τρόπο την ετερογένεια αυτής της ομάδας πληθυσμών. Συνοψίζοντας λοιπόν μπορούμε να πούμε ότι οι τιμές των γενετικών αποστάσεων όπως αυτές υπολογίστηκαν στην παρούσα εργασία είναι ιδιαίτερα υψηλές αλλά η γενετική απόσταση δεν είναι αρκετά ασφαλής οδηγός (Turner, 1999) για το αν οι πληθυσμοί συνιστούν διακριτά είδη ή όχι. Είναι σαφής ο διαχωρισμός των δυο θαλάσσιων τύπων μεταξύ τους αλλά ο λιμναίος/λιμνοθαλάσσιος τύπος φαίνεται να μην συνιστά μια ενιαία ομάδα και άρα βάση αυτής της μελέτης τελικά δεν κατέστη δυνατό να αποσαφηνιστούν οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των τριών ομάδων πληθυσμών της Atherina boyeri.

Δ.3 Μελλοντικοί στόχοι για την χρησιμοποίηση των μικροδορυφορικών δεικτών

Όπως έχουμε ήδη αναφέρει στην πορεία αυτής της μελέτης προέκυψαν συγκεκριμένες δυσκολίες σχετικά με την ταυτοποίηση των αλληλομόρφων των μικροδορυφόρων όπως ήταν η μη επαρκής ενίσχυσή τους από τους έντεκα χρησιμοποιούμενους μικροδορυφόρους και η έντονη παρουσία null αλληλομόρφων. Οι μικροδορυφορικοί δείκτες οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία ελέγχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν στη μετέπειτα πειραματική διαδικασία στις ακόλουθες θερμοκρασίες:

56ο C 60ο C A10 B2 D6 E5 B5 F1 F3 B10 F6 G6 C4

71

Όπως γίνεται αντιληπτό σε ζεύγη εκκινητών, όπως κυρίως ο G6, ο οποίος δεν ενίσχυσε καθόλου το DNA των υπό μελέτη ατόμων της Atherina boyeri θα πρέπει να ελεγχθούν και σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Συγκεκριμένα ο G6 πρέπει να εξεταστεί σε χαμηλότερη των 60ο C θερμοκρασία ώστε να ελεγχθεί αν εκεί αποδειχτεί λειτουργικός και άρα χρήσιμος για την μελέτη. Ως προς την ύπαρξη null αλληλομόρφων μια μελλοντική σκέψη θα ήταν να γίνει κλωνοποίηση των αλληλομόρφων από τα άτομα εκείνα των οποίων το DNA ενισχύθηκε επαρκώς. Αναλυτικότερα, θα μπορούσε να γίνει μετασχηματισμός σε κατάλληλλα κύτταρα-ξενιστές το DNA των ατόμων αυτών και ακολούθως αλληλούχιση προκειμένου να αναγνωριστεί η ακριβής αλληλουχία του μικροδορυφορικού αλληλομόρφου. Έτσι έχοντας πλέον την αλληλουχία θα μπορούσε να γίνει σχεδιασμός εσωτερικών εκκινητών οι οποίοι θα υβριδοποιούνταν με δεδομένη επιτυχία στο DNA των ατόμων της Atherina boyeri.

Δ.4 Ανακεφαλαίωση

Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας επιβεβαιώνουν πως η Atherina boyeri συνιστά έναν ιδιαίτερα περίπλοκο κλάδο, οι σχέσεις εντός του οποίου δεν κατέστη δυνατό να διευκρινιστούν. Δεδομένη θεωρείται η ύπαρξη των δύο θαλάσσιων τύπων. Πιο συγκεκριμένα ως προς τους θαλάσσιους πληθυσμούς επιβεβαιώνεται ότι οι πληθυσμοί της Πρέβεζας, της Εύβοιας και της Κω συνιστούν μια ομάδα, ξεχωριστή από αυτή των υπολοίπων ελληνικών θαλάσσιων πληθυσμών και ότι η χρωματική ιδιομορφία αναφορικά με τα μαύρα στίγματα κάτω από την πλευρική γραμμή δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό χαρακτηριστικό για τη διάκριση μεταξύ των δύο θαλάσσιων τύπων πληθυσμών της A. boyeri (Kraitsek et al., 2012). Αναφορικά με τους λιμναίους/λιμνοθαλάσσιους πληθυσμούς, όλα τα δεδομένα της παρούσας εργασίας συγκλίνουν στο ότι δεν συνιστούν μια ενιαία ομάδα πληθυσμών, αλλά ο καθένας τους παρουσιάζει το δικό του πρότυπο, πράγμα που έρχεται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των Milana et al. (2012), όπου επίσης οι λιμναίοι πληθυσμοί εμφάνισαν μεγάλη ετερογένεια. Όλοι οι ελληνικοί, λιμναίοι πληθυσμοί εξαιτίας της γεωγραφικής τους απομόνωσης και άρα της μη ανταλλαγής γενετικού υλικού μεταξύ τους παρουσιάζουν διαφορετικό γενετικό πρότυπο και επομένως δεν εμφανίζουν κάποιο γεωγραφικό πρότυπο μεταξύ Ιονίου και Αιγαίου πελάγους, όπως συνέβη στη μελέτη των Kraitsek et al. (2012). Επίσης η παρούσα εργασία έδειξε ότι όλοι οι πληθυσμοί της A. boyeri ανεξαρτήτος τύπου, έπειτα από έλεγχο με τους μικροδορυφορικούς δείκτες, εμφάνισαν πολύ μεγάλο βαθμό πολυμορφισμού και έντονη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ τους όπως φάνηκε από τις διαφορές στις συχνότητες των αλληλομόρφων των μικροδορυφορικών δεικτών.

72

Ε. Περίληψη

Στην παρούσα εργασία αξιολογήθηκε η χρήση των μικροδορυφορικών δεικτών για τη μελέτη της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων των φυσικών πληθυσμών της Atherina boyeri που προέρχονταν τόσο από θαλάσσιες όσο και λιμναίες/λιμνοθαλάσσιες περιοχές της Ελλάδας. Προηγούμενες μελέτες βασιζόμενες κυρίως σε μιτοχονδριακούς και RAPD δείκτες έχουν υποδείξει την πιθανή παρουσία τριών ομάδων πληθυσμών στην Atherina boyeri με τόσο υψηλές γενετικές αποστάσεις μεταξύ τους που θα μπορούσαν να τις καθιστούν ακόμα και διαφορετικά είδη. Οι ομάδες αυτές είναι: οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι (μη εστιγμένοι),οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου ΙΙ (εστιγμένοι) και οι λιμναίοι/λιμνοθαλάσσιοι πληθυσμοί. Η ανάλυση στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε με χρήση 11 μικροδορυφορικών δεικτών που σχεδιάστηκαν από τους Milana et al. (2009). Οι μικροδορυφορικοί δείκτες θεωρούνται εξαιρετικό εργαλείο μελέτης των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ πρόσφατα διαχωρισμένων ειδών δεδομένου ότι είναι άφθονοι, πυρηνικοί, διάσπαρτοι στο γονιδίωμα, υψηλά πολυμορφικοί και ταχέως εξελισσόμενοι. Τα αποτελέσματα έδειξαν πολύ υψηλό βαθμό πολυμορφισμού στους υπό ανάλυση πληθυσμούς και μεγάλη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των ελληνικών πληθυσμών του είδους όπως αυτή εκφράζεται από τις διαφορές στις συχνότητες των αλληλομόρφων των μικροδορυφορικών δεικτών. Φαίνεται επίσης να επιβεβαιώνεται η διάκριση μεταξύ των δυο θαλάσσιων τύπων της Atherina boyeri, ωστόσο οι λιμναίοι/λιμνοθαλάσσιοι πληθυσμοί παρουσιάζουν τόσο διαφορετικό γενετικό πρότυπο που θεωρείται εξαιρετικά δύσκολο να συνιστούν μια ενιαία ομάδα πληθυσμών. Οι δείκτες αυτοί δεν ήταν δυνατό να χρησιμοποιηθούν στην ανάλυση όλων των διαθέσιμων πληθυσμών, κυρίως λόγω της παρουσίας μη ενισχυόμενων (null) αλληλομόρφων, καθώς επίσης και πολλαπλών ή/και ασθενών ζωνών, γεγονός που επίσης υποδεικνύει την ύπαρξη μεγάλων γενετικών διαφοροποιήσεων, που πιθανώς ξεπερνούν τα όρια του είδους. Προκείμενου να ξεπεραστούν τα ανωτέρω προβλήματα απαιτείται η βελτιστοποίησή τους ανά ομάδα πληθυσμών, μέσω α) αλλαγών στις συνθήκες των PCR αντιδράσεων και β) κλωνοποίησης και αλληλούχισης των δεικτών αυτών από άτομα των πληθυσμών στα οποία ήταν λειτουργικοί, ώστε να επιτευχθεί ο σχεδιασμός νέων ζευγών εκκινητών, ειδικών για επιμέρους ομάδες πληθυσμών.

73

Summary

The present study aims at the measure of the genetic differentiation and the resolution of the phylogenetic relationships among A.boyeri populations originating from lakes/lagoons and marine sites of Greece. Previously studies based on RAPD and mitochondrial markers suggest the existence of three forms of populations of A.boyeri which could represent three different species. These three types are: marine type I, which includes almost all marine populations (non-punctuated), excluding specimens collected from Preveza, Evoia and Kos, which form the marine type II (punctuated) and the “lagoon” type which consists of all the lagoon/lake populations. In the present study, eleven microsatellite markers designed by Milana et al. (2009), were used. Microsatellite markers are supposed to be great tools in phylogenetic studies among recently separated species because they are abundant, nuclear, dispersed around the genome, highly polymorphic and rapidly evolving. Our results showed very high degree of polymorphism in the analyzed populations and extended genetic differentiation among Greek populations of the species as expressed by differences in allele frequencies of the microsatellite markers. They also seems to confirm the distinction between the two marine types of A.boyeri, but the lagoon/lake populations present different allele paterns, pointing to the possible existence of differentiated groups among them. Some of the markers could not be used in the analysis of all the available populations. This is mainly attributed to the presence of null alleles for some of the populations and to scoring difficulties raising from the presence of multiple and/or weak amplicons. This also indicates the existence of great genetic variations, which possibly exceed species limit. To overcome the above difficulties, optimization per marker is required, including a) optimization of PCR conditions and b) cloning and sequencing of these markers from individuals of the population that were functional to achieve the design of new prime pairs, specific for each group of populations .

74

ΣΤ. Βιβλιογραφία

 Αλαχιώτης ΣΝ. 2007. Εισαγωγή στην εξέλιξη. Εκδοτικός οίκος ΑΑ.Α. Λιβάνη, Αθήνα.  Andreu-Soler A., Oliva-Paterna FJ., Fernández-Delgado, Torralva M. 2003. Age and growth of the sand smelt Atherina boyeri (Risso, 1810) in the Mar Menor coastal lagoon (SE Iberian Peninsula). J. Appl. Ichthyol. 19: 202-208.  Ashburner M (1991) Mapping insect genomes. In: Insect Molecular Science. Crampton JM and Eggleston P edition. Academic Press, London.  Astolfi L., Dupanloup I., Possi R., Bisol P.M., Faure E., Congiu L. 2005. Mitochondrial variability of sand smelt Atherina boyeri populations from north Mediterranean coastal lagoons. Mar Ecol Prog Ser. 297:233-243.  Bamber RN., Henderson PA. 1985. Morphological variation in British atherinids, and the status of Atherina presbyter Cuvier (Pisces: Atherinidae). Biol. J. Linn. Soc. 25: 61-76.  Bamber RN., Henderson PA. 1988. Pre-adaptive plasticity in atherinids and the estuarine seat of teleost evolution. J. Fish. Biol. 33 (Supplement A):71-23.  Bartulović V., Glamuzina B., Conides A., Dulčić J., Lučić D., Kožul V. 2004. Age,growth, mortality and sex ratio of sand smelt, Atherina boyeri Risso 1810(Pisces: Atherinidae) in the esuary of the Mala Neretva River (middle- eastern Adriatic, Croatia). J. Appl. Icthyol. 20: 427-430.  Berrebi P., Britton-Davidian J. 1980. Enzymatic survey of four populations of Atherina boyeri based on electrophoresis and the occurrence of a microsporidiosis. J. Fish Biol. 16: 149-157.  Bickford D., Lohman D., Sodhi N., Ng PL., Meier R., Winker K., Ingram K. Das I. 2007. Cryptic species as a window on diversity and conservation. Trends Ecol. Evol. 22 (3): 148-155.  Boscolo L. 1970. Osservazioni sulla biologia e sulla pesca dell’ Atherina boyeri Risso 1810 (Osteichtyes, Atherinidae) vivente nelle acque dell’ Alto Adriatico. Boll. Pesca Piscic. Idrobiol. 25: 61-79.  Brock GJ, Anderson NH and Monckton DG (1999) Cis-acting modifiers of expanded CAG/CTG triplet repeat expandability: association with flanking GC content and proximity to CpG islands. Human Molecular Genetics, 8: 1061–1067.  Brohele J and Ellegren H (1999) Microsatellite evolution: polarity of substitution within repeats and neutrality of flanking sequences. Proceedings of Royal Society of London B, Biological Sciences, 266: 825–833.  Bruford MW and Wayne RK (1993) Current Opinions in Genetics and Development, 3: 939. 75

 Burt DW, Morrice DR, Sewalem A, Smith J, Paton IR, Smith EJ, Bentley J and Hocking PM (2003) Preliminary linkage map of the turkey (Meleagris gallopavo) based on microsatellite markers. Animal Genetics 34: 399-409.  Cammarata M., Mauro A., Mazzola A., Scilipoti D., Arcuelo M., Parrinello N. 1996. A biochemical genetic study of isoenzymes polymorphism within and between two populations of Atherina boyeri Risso. Genetika. 32:1220-1224.  Caracristi G and Schlotterer C (2003) Genetic differentiation between American and European Drosophila melanogaster populations could be attributed to admixture of African alleles. Mol. Biol. Evol., 20(5): 792-799.  Claij N and Riele H (1999) Microsatellite instability in human cancer: a prognostic marker for chemotherapy? Experimental Cell Research, 246: 1-10.  Clayton D.A. 1982. Structure and function of the mitochondrial genome. JIMD 15:439-447.  Congiu L., Rossi R., Colombo G. 2002. Population analysis of the sand smelt Atherina boyeri (Teleostei Atherinidae), from Italian coastal lagoons by random amplified polymorphic DNA. Mar Ecol Prog Ser . 229:279-289.  Conye JA., Orr HA. 2004.Speciation. Sunderland, MA. Sinauer Associates.  Creech S. 1991. An electrophoretic investigation of populations of Atherina boyeri Risso 1810 and A. presbyter Cuvier, 1829 (Teleostei: Atherinidae): genetic evidence in support of the two species. J. Fish Biol. 39:807-816.  Creech S. 1992a. A study of the population biology of Atherina boyeri Risso, 1810 in Aberthaw Lagoon, on the Bristol Channel, in South Wales. J. Fish Biol. 41:277-286.  Dib C et al. (1996). A comprehensive genetic map of the human genome based on 5.264 microsatellites. Nature, 380: 149-152.  Dietrich WF, Miller J, Steen R, Merchant MA, Damron-Boles D, Husain Z, Dredge R, Daly MJ, Ingalls KA, O’Connor TJ, Evans CA, DeAngells MM, Levinson DM, Kruglyak L, Goodman N, Copeland NG, Jenkins NA, Hawkins TL, Stein L, Page DC and Lander ES (1996) A comprehensive genetic map of the mouse genome. Nature, 380: 149-152.  Eisen JA (1999) Mechanistic basis for microsatellite instability. In: Microsatellites: Evolution and Applications. Goldstein DB and Schlötterer C edition, pp. 34–48. Oxford University Press, Oxford.  Ellegren H (2000) Microsatellite mutations in the germline: implications for evolutionary inference. Trends in Genetics, 16: 551-558.  Fernandez-Delgado C., Hernando JA., Herrera M., Bellido M. 1988. Life history patterns of the sand smelt Atherina boyeri, Risso, 1810 in the estuary of the Guadalquivir River, Spain. Est. Coast. Shelf Sci. 27: 697-706.  Francisco SM., Congiu L., Stefanni S., Castilho R., Brito A., Ivanova PP., Levy A., Cabral H., Kilias G., Doadrio I., Almada VC. 2008. Phylogenetic relationships of the North-eastern Atlantic and the Mediterranean forms of Atherina (Pisces, Atherinidae). Mol. Phylogenet. Evol. 48: 782-788. 76

 Focant B., Rosecchi E., Crivelli A. 1999. Attempt at biochemical characterization of sand smelt Atherina boyeri Risso, 1810 (Pisces, Atherinidae) populations from the Camargue (Rhone delta, France). Comp. Bioch. Physiol. B. 122: 261-267.  Focant B., Trabelsi M., Cartas F., Quignard JP. 1992. Caracterisation biotechimique de trois populaitons d’ Atherina boyeri des milieus lagunaires mediterranéens. Rapp. Comm. Int Mer Medit. 33:94.  Froese R., Pauly D. 2010. Fishbase. World Wide Web electronic publication. www.fishbase.org, version (05/2010).  Gaston, K.J. 1996. The multiple forms of the interspecific abundance- distribution relationship. Oikos 75, 211-220.  Gon O., Ben-Tuvia A. 1983. The biology of Boyer’s sand smelt, Atherina boyeri Risso in the Bardawil Lagoon on the Mediterrannean coast of Sinai. J. Fish. Biol. 22: 537-547.  Guevara J., Sautier-Casaseca GA. 1977. Datos sobre las condiciones ambientales y fauna ictiológica del Mar Menor. CRIS. 155: 18-20.  Hancock JM (1999) Microsatellites and other simple sequences: genomic context and mutational mechanisms. In: Microsatellites: Evolution and Applications. Goldstein DB and Schlötterer C edition, pp. 1–9. Oxford University Press, Oxford.  Harding RM, Boyce AJ and Clegg JB (1992) The evolution of tandemly repetitive DNA: recombination rules. Genetics, 132: 847–859.  Harris H (1966) Enzyme polymorphisms in man. Proceedings of the Royal Society of London, B 164: 298-310.  Helling RB, Goodman HM., Boyer HW. 1974. Analysis of endonuclease R EcoRI fragments of DNA from Lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14:1235-1244.  Henderson PA., Bamber RN. 1987. On the reproductive biology of tghe sand smelt Atherina boyeri Risso (Pisces: Atherinidae) and its evolutionary potential. Biol. J. Linn. Soc. 32: 395-415.  Hayashi J.I., Tagashira Y., Yoshida M.C. 1985. Absence of extensive recombination between inerspecies and intraspecies mitochondrial DNA.  Hoelzel AR. 1998. Molecular Genetic Analysis of Populations. A practical approach. Second Edition. Oxford University Press.  Hurst G., Jiggins F. 2005. Problems with mitochondrial DNA as a marker in population, phylogeographic and phylogenetic studies: the effects of inherited symbionts. Proc. R. Soc. B 272: 1525-1534.  Jakupciak JP and Wells RD (2000) Gene conversion (recombination) mediates expansions of CTG.CAG repeats. Journal of Biological Chemistry, 275: 4003–4013. 77

 Kiener A., Spillman CJ. 1969. Contribution à l ’ etude systematique et écologique des atherines des côtes françaises. Mem. Mus. Natl. Hist. Nat. – Ser A 60: 1-74.  Klossa-Kilia E., Papasotiropoulos V., Tryfonopoulos G., Alahiotis S., Kilias G. 2007. Phylogenetic relationships of Atherina hepsetus and Atherina boyeri populations from Greece, based on mtDNA sequences. Biol. J. Linn. Soc.92:151-161.  Klossa-Kilia E., Prassa M., Papasotiropoulos V., Alahiotis S., Kilias G. 2002. Mitochondrial diversity in Atherina boyeri populations as determined by RFLP analysis of three mtDNA segments. Heredity 89:363-370.  Kottelat M.1997. European freshwater fishes. An heuristic checklist of the freshwater fishes of Europe (exclusive of former USSR), with an introduction for non-systematists and comments on nomenclature and conservation. Biologia, Bratislava, Section Zoology.52 (Suppl.5):1-271.  Koutrakis ET., Kamidis NI., Leonardos ID. 2004. Age, growth and mortality of a semi-isolated lagoon population of sand smelt, Atherina boyeri (Risso, 1810) (Pisces:Atehrinidae) in an estuarine system of northen Greece. J. Appl. Ichthyol. 20: 382-388.  Kraitsek S., Klossa-Kilia E., Papasotiropoulos V., Alahiotis S., Kilias G. 2008. Genetic divergence among marine and lagoon Atherina boyeri populations in Greece using mtDNA analysis. Biochem Genet. 46:781-798.  Kraitsek S., Klossa-Kilia E., Papasotiropoulos V., Alahiotis S., Kilias G. 2008. Nuclear and mitochondrial phylogenetic analysis of big-scale sand smelt Atherina boyeri complex in Greece. J Fish Biol. 81:1559-77.  Landsteiner K (1900) Zur Kentnis der antifermentativen lytischen und agglutiniereden wirkung des Blutserum und der Lymph. Zentr. Bacteriol. Parasitenk., 27: 357-362.  Leonardos ID. 2001. Ecology and exploitation pattern of a landlocked population of sand smelt, Atherina boyeri (Risso 1810), in Trichonis Lake (Western Greece). J. Appl. Ichthyol. 17: 262-266.  Leonardos ID., Sinis A. 2000. Age, growth and mortality of Atherina boyeri Risso, 1810 (Pisces: Atherinidae) in the Mesolongi and Etolikon lagoons (W. Greece). Fish. Research. 45: 81-91.  Levene H (1949) On a matching problem in genetics. Ann. Math. Stat., 20: 91- 94.  Loeb LA (1994) Microsatellite instability: marker of a mutator phenotype in cancer. Cancer Research, 54: 5059-5063.  Maci A., Basset A. 2010. Spatio-temporal patterns of abundance, size structure and body condition of Atherina boyeri (Pisces: Atherinidae) in a small non-tidal Mediterranean lagoon. Estuar. Coast. Shelf Sci. 87: 125-134.  Mäkinen HS, Cano JM, Merilä J. Genetic relationships among marine and freshwater populations of the European three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus) revealed by microsatellites. Mol Ecol. 15: 1519-34. 78

 Marfin JP. 1982. Croissance de l’Atherine Atherina boyeri Risso, 1810 dans trios milieu saumatres du Roussillion. Bull. Inst. Natl. Sci. Tech. Oceanogr. Peche Salammbo. 9: 89-109.  Markevich NB. 1977. Some morphological indices of the silverside Atherina mochon pontica, in the Aral Sea in connection with age structure of its population. J. Ichthyol. 17: 618-626.  Martin AP., Burg TM. 2002. Perils of paralogy: using HSP70 genes for inferring organismal phylogenies. Syst Biol. 51: 570-587.  Masino L and Pastore A (2001) A structural approach to trinucleotide expansion diseases. Brain Research Bulletin of the, 56: 183–189.  Matocq MD (2004) Reproductive success and effective population size in woodrats (Neotoma macrotis). Molecular Ecology, 13: 1635-1642.  Maugé LA. 1990. Atherinidae. In: Quire JC., Hureau JC., Karrer C., Post A., Saldanha L. (Eds), Check-list of the fishes of the eastern tropical Atlantic (CLOFETA), vol. 2. Paris. 604-605.  Mauro A., Arculeo M., Mazzola A., Parrinello N. 2007. Are there any distinct genetic sub-populations of sand-smelt, Atherina boyeri (Teleostei: Atherinidae) along Italian coasts? Evidence from allozyme analysis. Folia Zool. 56:194-200.  Michaels G.S., Hauswirth W.W., Laipis P.J. 1982. Mitochondrial DNA copy number in bovine oocytes and somatic cells. Dev. Biol. 94: 246-251.  Milana V., Sola L., Congiu L., Rossi AR. 2008. Mitochondrial DNA in Atherina (Teleostei, Atheriniformes): Differential distribution of an intergenic spacer in lagoon and marine forms of Atherina boyeri. J. Fish Biol. 73:1216- 1227.  Milana V., Sola L., Rossi AR., Barbisan F., Congiu L. 2008. Isolation, characterization and cross-species testing of microsatellites obtained from a sand smelt (Atherina boyeri) genomic library. Mol Ecol Resour. 9:889-92.  Milana V., Franchini P., Sola L., Angiulli E., Rossi AR. 2012. Genetic structure in lagoons: the effects of habitat discontinuity and low dispersal ability on populations of Atherina boyeri. Mar Biol. 159: 399-411.  Mistri M., Colombo G. 1988. Morphometric variabilità in sandsmelt, Atherina boyeri Risso 1810, populations from different Italian sites. Boll. Zool. 3:129- 132.  Özeren SC. 2009. Age, growth and reproductive biology of the sand smelt Atherina boyeri Risso, 1810 (Pisces: Atherinidae) in Lake Iznik, Turkey. IJFAS. 4 (2): 34-39.  Pakaki V, Magoulas A, Kasapidis P. 2009. New polymorphic microsatellite loci for population studies in the European anchovy, Engraulis encrasicolus (L.). Mol Ecol Resour: 1406-9.  Palmer CJ., Culley MB. 1983. Aspects of the biology of the sandsmelt Atherina boyeri Risso, 1810 (Teleostei: Atherinidae) at Oldbury-upon-Severn, Gloucestershire, England. Estuar. Coast. Shelf Sci. 16: 163-172. 79

 Patimar R., Yousefi M., Hosieni SM. 2009. Age, growth and reproduction of the sand smelt Atherina boyeri Risso 1810 in the Gomishan wetland – southeast Caspian Sea. Estuar. Coast. Shelf Sci. 81: 457-462.  Pleines T., Jakob SS., Blattner FR. 2009. Application of non-coding DNA regions in intraspecific analyses. Plant. Syst. Evol. 282: 281-294.  Pombo L., Elliott M., Rebelo JE. 2005. Ecology, age and growth of Atherina boyeri and Atherina presbyter in the Ria de Aveiro, Portugal. Cymbium. 29(1): 47- 55.  Quignard JP., Pras A. 1986. Atherinidae. In: Whitehead P., Bauchot ML., Hureau JC., Nielsen J., Tortonese E. (Eds), Fishes of the North-eastern Atlantic and the Mediterraneas. UNESCO, Paris. 1207-1210.  Richard GF and Pâques F (2000) Mini- and microsatellite expansions: the recombination connection. EMBO Reports, 11: 122–126.  Rico C., Rico I., Hewitt G. 1996. 470 million years of conservation of microsatellite loci among fish species. Proc Roy Soc Lond Ser B. 263: 549- 557.  Robin E.D., Wong R. 1988. Mitochondrial DNA molecules and virtual number of mitochondria per cell in mammalian cells. J. Cell Physiol. 136: 507-513.  Rosecchi E., Crivelli AJ. 1995. Sand smelt (Atherina boyeri) migration within the waters system of the Camargue, southern France. Hydrobiologia. 300/301. 289-298.  Russell PJ. 2009. iGenetics: Μία μεντελική προσέγγιση (1η έκδοση). Pearson Education, Inc.- Benjamin Cummings. Ελληνική μετάφραση.  Sambrook J., Fritsch EF., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning – A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor. Laboratory Press.  Schlotterer C and Pemberton J (1994) In: Molecular Ecology and Evolution: approaches and applications. Schierwater B, Streit B, Wagner GP and DeSalle R edition, p. 203, Birkhauser, Verlag, Basel.  Schlötterer C (2000) Evolutionary dynamics of microsatellite DNA. Chromosoma, 109: 365– 371.  Scilipoti D. 1998. Studio della comunità ittica residente all’interno dello Stagnone di Marsal (Sicilia occidentale): distribuzione delle specie e ripartizione delle risorse in dipendenza di habita a diversa complessità strutturale, PhD Dissertation, Unicersity of Messina, Italy. 256 pp.  Tachida H and Iizuka M (1992) Persistence of repeated sequences that evolve by replication slippage. Genetics, 131: 471–478.  Tautz D and Schlotterer C (1994) Simple sequences. Current Opinions in Genetics and Development, 4: 832-837.  Tomasini JA., Collart D., Quignard JP. 1996. Female reproductive biology of the sand smelt in brackish lagoons of the southern France. J. Fish Biol. 49: 594- 612. 80

 Trabelsi M., Bourigat N., Aurelle D., Quignard J-P., Barthelemy R., Faure E. 2009. Some marine Tunisian Atherina boyeri populations (Teleostei) have morphological and molecular characteristics of lagoon fishes. Open Mar. Biol. J. 3:59-69.  Trabelsi M., Faure E., Quignard J-P., Boussaid M., Focantn B., Maamouri F. 2002a. Atherina punctuata and Atherina lagunae (Pisces, Atherinidae) new species found in the Mediterranean Sea. 1. Biometric investigations of three Atherinid species. CR Biol. 325:967-975.  Trabelsi M., Gilles A., Fleury C., Maamouri F., Quignard J-P., Faure E. 2002b. Atherina Punctata and Atherina Lagunae (Pisces, Atherinidae), new species found in the Mediterranean Sea. 2. Molecular investigations of three atherinid species. CR Biol. 325:1119-1128.  Trabelsi M., Focant B., Tomasini J-A., Quignard J-P. 1995. Originalité du complexe Atherina boyeri Risso, 1810 (Poissons, Téleostéens, Athérinidés) de la reserve naturelle des iles Lavezzi (Corse). Trav. Sci. Parc. Nat. Reg. Res. Nat. Corse. Fr. 56:83-105.  Trabelsi M., Quignard J-P., Kartas F. 1994a. Atherina boyeri: première mention en Méditerranée de deux populations marines sympatriques. Cybium 18(4):457- 459.  Trabelsi M., Kartas F., Quignard JP. 1994b. Comparaison du régime alimentaire d’une population marine et d’ une population lagunaire d’ Atherina boyeri des côtes tunisiennes. Vie Milieu. 44: 117-123.  Trabelsi M., Maamouri F., Quignard J-P., Boussaid M., Faure E. 2004. Morphometric or morpho-anatomal and genetic investigations highlight allopatric speciation in western Mediterranean lagoons within the Atherina lagunae species (Teleostei, Atherinidae). Estuar Coast Shelf Sci. 61:713-723.  Trabelsi M., Quignard J-P., Tomasini J-A., Boussaid M., Focant B., Maamouri F. 2000. Discriminative value of the meristic characteristics of punctuated sand smelts marine populations. Obelia 26: 75-88.  Turner G. 1999. What is a fish species. Rev. Fish Biol. Fish. 9:281-297.  Staley JM. 2009. Universal species concept: pipe dream or a step toward unifying biology? J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36: 1331-1336.  Vizzini S., Mazzola A. 2005. Feeding ecology of the sand smelt Atherina boyeri (Risso 1810) (Osteichtyes, Atherinidae) in the western Mediterranean: evidence for spatial variability based on stable carbon and nitrogen isotopes. Environ. Biol. Fish. 72: 259-266.  Wan QH., Wu H., Fujihara T., Fang SG. 2004. Which genetic marker for conservation genetic issue? Electrophoresis 25: 2165-2176.  Yeh FC, Yang RC and Boyle T (1999) Popgene version 1.31. Microsoft Window – based Freeware for population genetic analysis.  Zhang DX., Hewitt G. 2003. Nuclear DNA analyses in genetic studies of populations: practice, problems and prospects. Mol. Ecol. 12: 563-584. 81

Διαδικτυακές πηγές: Integrated Taxonomic Information System: http://www.itis.