ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Μελέτη της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων φυσικών πληθυσμών της Atherina boyeri (Οικ. Atherinidae) με χρήση μικροδορυφορικών δεικτών ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΑΓΚΑΦΑ ΑΣΗΜΙΝΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ-2013 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Μελέτη της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων φυσικών πληθυσμών της Atherina boyeri (Οικ. Atherinidae) με χρήση μικροδορυφορικών δεικτών ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΑΓΚΑΦΑ ΑΣΗΜΙΝΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ-2013 ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Επιβλέπων Καθηγητής: Κίλιας Γ. Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών Μέλη: Κλώσσα-Κίλια Ε. Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών Παπασωτηρόπουλος Β. Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Τεχνολόγων Γεωπόνων Τ.Ε.Ι. Δυτικής Ελλάδας Πρόλογος Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής του Γενετικής, Βιολογία Κυττάρου και Ανάπτυξης, του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κατά τα έτη 2012-2013. Έχοντας πλέον φτάσει στο τέλος της εργασίας αυτής, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους εκείνους που συνετέλεσαν προκειμένου να ολοκληρωθεί η προσπάθεια αυτή. Κατ’ αρχήν θα ήθελα να ευχαριστήσω πολύ τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Κίλια, ο οποίος ήταν ο κύριος επιβλέποντας της παρούσας εργασίας. Τον ευχαριστώ θερμά που με δέχθηκε στο εργαστήριό του και φυσικά για όλη του την βοήθεια προκειμένου να ολοκληρωθεί η μεταπτυχιακή διατριβή μου. Οι συμβουλές, οι εύστοχες παρεμβάσεις του και οι προβληματισμοί που έθετε βοήθησαν στην ανάπτυξη της επιστημονικής μου σκέψης και θα είναι πολύτιμα εφόδια για την μετέπειτα πορεία μου. Στο σημείο αυτό θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να δώσω και στην Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Έλενα Κλώσσα-Κίλια, η βοήθεια της οποίας ήταν εξίσου σημαντική για την ολοκλήρωση της εργασίας αυτής. Οι συμβουλές της, η ενθάρρυνσή της και η πάντα αισιόδοξη στάση της συνέβαλαν ώστε να υπάρξει μια όμορφη και εποικοδομητική συνεργασία. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Βασίλη Παπασωτηρόπουλο τόσο για την οικονομική υποστήριξη του συγκεκριμένου προγράμματος, χωρίς την οποία δεν θα ήταν δυνατή η ολοκλήρωσή του, όσο και για την συνολική βοήθεια του για την επιτυχή περάτωση της εργασίας αυτής. Επιπλέον,θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον μεταδιδάκτορα του τμήματος Βιολογίας Αντώνη Αυγουστίνο, η βοήθεια του οποίου στο εργαστηριακό μέρος της διατριβής αυτής ήταν ανεκτίμητη. Οι συμβουλές του, η ορθή καθοδήγησή του και η πολύτιμη εμπειρία του υπήρξαν σημαντικοί παράγοντες προκείμενου να ολοκληρωθεί η προσπάθεια αυτή. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους προπτυχιακούς και μεταπτυχιακούς φοιτητές του εργαστηρίου για την βοήθεια τους αλλά πάνω από όλα για το όμορφο κλίμα που επικρατούσε μεταξύ μας. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να δώσω στις υποψήφιες διδάκτορες Χαρά Παπαϊωάννου και Μαρία Καμηλάρη για την πολύτιμη βοήθεια τους στην παρούσα εργασία αλλά και την αρμονική συνεργασία που είχαμε αυτά τα χρόνια, ενώ επίσης θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στη Σπυριδούλα Κράιτσεκ, η οποία έθεσε τις βάσεις του ευρύτερου προγράμματος μελέτης της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων των πληθυσμών της Atherina boyeri, στο οποίο εντάσσεται και η παρούσα εργασία. Πάτρα, 2013 Μαγκαφά Ασημίνα ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 Α.1 Γενικά 1 Α.1.1 Βιοποικιλότητα 1 Α.2 Γενικά για το είδος 2 Α.2.1 Ορισμός του είδους 2 Α.2.2 Ειδογένεση 3 Α.2.3 Συστηματική κατάταξη 6 Α.3 Δείκτες πυρηνικού DNA 7 Α.3.1 Οι μικροδορυφόροι 7 Α.3.2 Εφαρμογές των μικροδορυφόρων στην έρευνα 9 Α.4 Στοιχεία για τον υπό μελέτη οργανισμό 10 Α.4.1 Η Atherina boyeri 10 A.5 Σκοπός της παρούσας εργασίας 17 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 19 Β.2.1 Περιοχές δειγματοληψίας 19 Β.2.2 Απομόνωση γενετικού υλικού από Atherina boyeri 20 Β.2.2.1 Αρχή της μεθόδου απομόνωσης DNA 20 Β.2.2.2 Εφαρμογή της μεθόδου 21 Β.2.3 Ηλεκτροφόρηση ολικού DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 22 Β.2.3.1 Γενικά 22 Β.2.4 Πολλαπλασιασμός γονιδιακών τμημάτων με τη βοήθεια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) 22 Β.2.4.1 Αρχή της μεθόδου 24 Β.2.4.2 Εφαρμογή της μεθόδου 25 Β.2.5 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 29 Β.2.5.1 Αρχή της μεθόδου 29 Β.2.5.2 Παρασκευή πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου 29 Β.2.5.3 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 30 Β.3 Επεξεργασία αποτελεσμάτων με υπολογιστικά προγράμματα 30 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 32 Γ.1.1 Οι έντεκα μικροδορυφορικοί δείκτες 32 Γ.1.1.1 Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης 32 Γ.1.1.2 Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 43 Γ.2 Επεξεργασία των δεδομένων σε υπολογιστικά προγράμματα 57 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 67 Δ.1 Αξιολογηση δεικτών 67 Δ.2 Έλεγχος κατάταξης των ελληνικών πληθυσμών στις τρεις προτεινόμενες ομάδες 70 Δ.3 Μελλοντικοί στόχοι για την χρησιμοποίηση των μικροδορυφορικών δεικτών 71 Δ.4 Ανακεφαλαίωση 72 Ε. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 73 ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 75 1 Α. Εισαγωγή Α.1 Γενικά Α.1.1. Βιοποικιλότητα Η έννοια της βιοποικιλότητας (biodiversity,biological diversity) αποτελεί ένα αμφιλεγόμενο θέμα που έχει προξενήσει πολλές φορές διαφωνίες τόσο μεταξύ των μελών της επιστημονικής κοινότητας όσο και στο ευρύ κοινό. Πολλά έχουν δημοσιευτεί επί του συγκεκριμένου θέματος από τότε που πρωτοεμφανίστηκε στο διεθνές φόρουμ για την Βιοποικιλότητα (National Forum on Biological Diversity) το Σεπτέμβριο του 1986. Ο όρος βιοποικιλότητα χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από τον περιβαλλοντολόγο Raymond F.Dasman το 1968 στο βιβλίο με τίτλο «A different Kind of Country», στο οποίο τασσόταν εμφανώς υπέρ της διαφύλαξής της. Η ορολογία αυτή, ωστόσο, υιοθετήθηκε από τον επιστημονικό κόσμο σχεδόν μετά από μια δεκαετία, αφού μέχρι τότε επικρατούσε ο όρος «φυσική ποικιλότητα» (natural diversity). Στη δεκαετία του ‘80, ο Robert E.Jenkins, o Thomas Lovejoy και άλλοι επιφανείς περιβαλλοντολόγοι της εποχής εισήγαγαν σταδιακά την έννοια της βιολογικής ποικιλότητας, γνωστής αργότερα από τον συνηρημένο τύπο της ως βιοποικιλότητα από τον W.G.Rosen το 1985 στο National Forum on Biological Diversity, τα πρακτικά του οποίου δημοσιεύτηκαν το 1988 από τον Ε.Ο.Wilson, γνωρίζοντας μεγάλη επιτυχία. Η βιοποικιλότητα, αν και όχι πλήρως καθορισμένη ακόμα και σήμερα, αποτελεί την διαφορετικότητα, την ποικιλομορφία της ζωής όπως αυτή μπορεί να εκφράζεται μέσα από το σύνολο των γονιδίων (genetic diversity), των βιολογικών ειδών (species diversity), των οικοσυστημάτων (ecosystem diversity) ή και ολόκληρου του πλανήτη και είναι αποτέλεσμα εκατοντάδων εκατομμυρίων χρόνων εξελικτικής ιστορίας. Το 2003 ο καθηγητής του Πανεπιστημίου του Cardiff, Anthony Campbell, όρισε και άλλο ένα επίπεδο ποικιλότητας, αυτό της μοριακής βιοποικιλότητας (molecular biodiversity). Τα ερωτήματα που εγείρονται σχετικά με τον όρο βιοποικιλότητα είναι πολλά. Τι ακριβώς ορίζεται ως βιοποικιλότητα; Είναι απλά ο αριθμός των ειδών σε μια περιοχή και αν είναι κάτι παραπάνω πώς μπορεί αυτό να μετρηθεί; Πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η ενδοειδική γενετική διαφοροποίηση, όλα τα είδη είναι εξίσου σημαντικά για τον προσδιορισμό της και τελικά η διατήρησή της είναι τόσο αυτονόητη και επιτακτική όπως θεωρούνταν κάποτε; Όπως γίνεται αντιληπτό, αυτά είναι μόνο μερικά από τα ερωτήματα που καλείται να απαντήσει ο επιστημονικός κόσμος. Αυτό που θεωρείται δεδομένο είναι ότι η βιοποικιλότητα δεν κατανέμεται με ομοιόμορφο τρόπο στην Γη (Gaston,1996). Συγκεκριμένα φαίνεται να υπάρχουν 2 περιοχές με έντονη βιολογική ποικιλομορφία όπως είναι τα τροπικά δάση και οι κοραλλιογενείς ύφαλοι, άλλες που δείχνουν να έχουν ελάχιστη, όπως οι έρημοι και οι πολικές περιοχές και όλες οι υπόλοιπες κινούνται σε ενδιάμεσα αυτών επίπεδα. Υπάρχει δηλαδή μια τάση αύξησης της ποικιλότητας από τους πόλους προς τις τροπικές περιοχές. Ωστόσο αρκετές έρευνες (Roy et al., 1998, Chown et al.,2012) υποστηρίζουν πως αυτό ισχύει για τους χερσαίους οργανισμούς αφού οι υδρόβιοι και κυρίως οι θαλάσσιοι δεν φαίνεται να ακολουθούν παρόμοιο πρότυπο. Οι σημαντικότεροι παράγοντες που την επηρεάζουν πέραν του γεωγραφικού πλάτους είναι η θερμοκρασία, το υψόμετρο, η μορφολογία του εδάφους, η ατμοσφαιρική κατακρήμνιση (βροχοπτώσεις,χιονοπτώσεις κ.ά) και η παρουσία άλλων ειδών. Μέχρι σήμερα δεν έχει καταστεί δυνατό να υπολογιστεί ο ακριβής αριθμός ειδών που υπάρχουν στον πλανήτη. Σύμφωνα με τους τελευταίους υπολογισμούς, ο αριθμός των αναγνωρισμένων ειδών ανέρχεται γύρω στα 1,2 εκατομμύρια. Βάση μιας πρόσφατης μελέτης των Mora et al. (2011) υπολογίζεται ότι ο συνολικός αριθμός των ειδών παγκοσμίως φτάνει στα 8,7 εκατομμύρια (± 1,3 εκατομμύρια) εκ των οποίων θεωρείται ότι τα 2,2 εκατομμύρια (± 0,18 εκατομμύρια) είναι θαλάσσιοι οργανισμοί. Άρα όπως γίνεται κατανοητό μένει να αναγνωριστούν ακόμα το 86% των χερσαίων και το 91% των θαλάσσιων οργανισμών. Στα πλαίσια αυτής της αναζήτησης της βιοποικιλότητας και του ακριβούς αριθμού ειδών, θα μπορούσαμε να πούμε ότι εντάσσεται και η παρούσα εργασία η οποία μελετά την πιθανή ύπαρξη κρυπτικών ειδών στο είδος Atherina boyeri, όπως θα αναλύσουμε παρακάτω. Α.2 Γενικά για το είδος Α.2.1 Ορισμός του είδους Πολλοί ορισμοί έχουν προταθεί κατά καιρούς προκειμένου να περιγράψουν τι είναι τελικά το «είδος». Μέχρι σήμερα δεν έχει καταστεί εφικτό να επικρατήσει καθολικά ένας ορισμός μιας και καθένας από τους προτεινόμενους έχει τα πλεονεκτήματα αλλά και τα μειονεκτήματά του. Αυτός που θεωρείται γενικά ο πιο αποδεκτός μέχρι σήμερα και που θα υιοθετηθεί στην παρούσα εργασία είναι ο βιολογικός ορισμός του είδους, ο οποίος και προτείνει ως είδος μια ομάδα αμφιγονικά αναπαραγόμενων φυσικών πληθυσμών που είναι αναπαραγωγικά απομονωμένη και ανεξάρτητη από άλλες τέτοιες ομάδες (Conye & Orr,2004). Η ορολογία αυτή τυγχάνει μεγάλης