CRISTINA GURSKI ANATOMIA DE FRUTOS E SEMENTES DE ESPÉCIES DE Passiflora L

CRISTINA GURSKI

ANATOMIA DE FRUTOS E SEMENTES DE ESPÉCIES DE Passiflora L. – SUBGÊNEROS Decaloba (DC.) RCHB. E Passiflora L. (PASSIFLORACEAE)

Campinas, 2015

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RESUMO Passiflora L. é o maior gênero de Passifloraceae, com mais de 530 espécies de ervas, árvores e lianas. Os estudos sobre a diversidade morfológica de Passifloraceae são escassos, mesmo inexistentes para muitas espécies. Estudos morfoanatômicos de frutos e sementes possuem grande importância, uma vez que esses órgãos são bastante conservados e exibem pouca plasticidade fenotípica. Assim, o presente trabalho teve como objetivo descrever ontogeneticamente a estrutura de frutos e sementes de dez espécies do gênero Passiflora, a fim de correlacionar através de comparações com os dados da literatura, os caracteres observados com possíveis significados taxonômico e/ou ecológico. Para tal, o material vegetal foi coletado e processado de acordo com técnicas de microscopia óptica e eletrônica de varredura. No ovário, a epiderme externa e a epiderme interna são uniestratificadas, com cutícula e estômatos em ambas; além de tricomas unicelulares na placenta e na base do funículo em P. morifolia. O mesofilo ovariano é homogêneo, com presença de idioblastos fenólicos, cristalíferos e, idioblastos contendo proteínas e polissacarídeos, associados aos feixes vasculares. O fruto exibe exocarpo uniestratificado com cutícula, mais espessa em P. mucronata e em P. cincinnata; tricomas não glandulares unicelulares em P. morifolia e em P. foetida e, tricomas não glandulares pluricelulares em P. coccinea. O mesocarpo é dividido em três regiões: mesocarpo externo, formado por células parenquimáticas e por um anel de esclerênquima; mesocarpo médio, formado por células parenquimáticas ligeiramente maiores; e, mesocarpo interno, que apresenta espaços intercelulares, com a formação de aerênquima em três espécies. O endocarpo é uniestratificado, com cutícula e estômatos. Os óvulos são anátropos, bitegumentados, e em P. morifolia, a micrópila é em ziguezague. As sementes são bitegumentadas, com presença de sarcotesta e arilo. Ambos os tegumentos seminais são formados por três regiões. Durante o desenvolvimento da semente, ocorre alongamento celular diferencial do exotégmen e da endostesta, resultando no endosperma ruminado. A testa constitui a sarcotesta, com amido e espessamento em “U” na endotesta. O exotégmen é formado por macroesclereídes em paliçada, e o mesotégmen e o endotégmen formam uma camada colapsada. O arilo é formado por células parenquimáticas contendo compostos fenólicos e amido. O endosperma é formado por células aproximadamente isodiamétricas com proteínas e lipídios. O embrião é linear, com cotilédones amplos e finos. Muitos caracteres encontrados são bastante conservados e

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unificadores na família, tais como: exocarpo e endocarpo uniestratificados com cutícula e estômatos, idioblastos associados aos feixes vasculares; óvulo anátropo, bitegumentado e com tegumento interno com três camadas; e, semente exotégmica com sarcotesta e arilo funicular, com uma camada de células colapsadas e endosperma ruminado. Contudo, outras características são variáveis e podem vir a serem úteis taxonomicamente, como o tipo de micrópila, bem como, a localização do anel de esclerênquima pericárpico e o número de camadas de esclereídes que o compõe. Além disso, discute-se que a diversidade morfológica pode ser em parte devido à influência de fatores ambientais, como interações animal-planta e condições ecológicas. Assim, ressalta-se a importância de novos estudos morfológicos, incluindo mais espécies, a fim de ajudar a elucidar as relações infragenéricas em Passiflora, aumentando o conhecimento da biologia de Passifloraceae e apresentando novas possibilidades para o estudo estrutural na família.

Palavras-chave: ontogenia, histoquímica, pericarpo, tegumento seminal, Malpighiales.

ABSTRACT Passiflora L. is the largest genus of Passifloraceae with over 530 species of climbing herbs, trees, and woody lianas. Studies on morphological diversity of Passifloraceae are scarce, even inexistent for many species. Morphological and anatomical study of fruits and seeds have great importance due to data showing that these organs are quite conservative and show little phenotypic plasticity. Thus, the present work aimed to describe, ontogenetically the structure of fruits and seeds from ten species of the genus Passiflora, in order to correlate through comparisons with literature data, the traits observed with possible taxonomic and/or ecological meanings. For this, the plant material were collected and processed according to conventional techniques for light and scanning electron microscopy. In the ovary, the outer and the inner epidermis are unistratified, with cuticle and stomata; intra-ovarian trichomes occur in the placenta and at the base of the funicle in P. morifolia. The ovarian mesophyll is homogeneous, with the presence of phenolic compounds, crystals and idioblasts containing proteins and polysaccharide associate to the vascular bundles. The fruit exhibits exocarp unistratified with cuticle, thicker in P. mucronata and in P. cincinnata; unicellular non-glandular trichomes in P. morifolia and in P. foetida and multicellular non-glandular trichomes in P. coccinea. The mesocarp is organized in three regions: the outer mesocarp, formed by parenchyma cells and a sclerenchyma ring; the medium mesocarp, formed by larger parenchyma cells; and, the inner mesocarp, with intercellular spaces that increase from the outer mesocarp towards the endocarp, with formation of aerenchyma in three species. The endocarp is unistratified, with cuticle and stomata. The ovules are anatropous, bitégmica and in P. morifolia, the micropyle is zigzag shaped. The seeds are bitegmic, with presence of sarcotesta and aril. The seed coat is formed by six cell layers. During the development of the seed occurs differential cell elongation of the exotegmen and of the endostesta, resulting in a ruminate endosperm. The testa forms a sarcotesta, with starch and U-shaped thickening in the endotesta. The exotegmen is formed by macrosclereids in palisade, and the mesotegmen and the endotegmen form a collapsed layer. The aril is formed by parenchymatic cells with phenolic compounds and starch. The endosperm is formed by isodiametric cells that contain proteins and lipids. The embryo is linear, with large and thin cotyledons. Many traits observed are quite conserved and unified within the family, such as unistratified

exocarp and endocarp, with cuticle and stomata; idioblasts associate to the vascular bundles; bitegmic anatropous ovules, with three-layered inner integument; and, exotegmic seeds, with presence of sarcotesta and funicular aril, with a layer of collapsed cells and ruminated endosperm. However other traits are variable and could be useful taxonomically, such as the type of micropyle, as well as the sclerenchyma ring position and the number of sclereids layers in the pericarp. Moreover, it is discussed that the morphological diversity can be due in part to the influence of environmental factors such as plant-animal interactions and ecological conditions. Thus, we emphasize the importance of further morphological studies including more species to help to elucidate the infrageneric relationships in Passiflora, increasing the knowledge about the biology of Passifloraceae and presenting new possibilities for the structural studies in the family.

Keywords: ontogeny, histochemistry, pericarp, seed coat, Malpighiales.

SUMÁRIO

RESUMO ...... vii ABSTRACT ...... ix

DEDICATÓRIA ...... xiii

AGRADECIMENTOS ...... xvii

1. INTRODUÇÃO GERAL ...... 01

1.1 Família Passifloraceae Juss. ex Roussel ...... 01 1.2 Passiflora L...... 04 1.2.1 Subgênero Decaloba (DC.) Rchb ...... 07 1.2.2 Subgênero Passiflora L...... 08 1.3 Espécies estudadas ...... 09 1.4 Estudos morfoanatômicos ...... 15 1.5 Objetivos ...... 17 1.6 Formato da tese ...... 17 1.7 Referências bibliográficas ...... 18 Capítulo I. Anatomia e desenvolvimento do pericarpo de espécies neotropicais de Passiflora L. (Passifloraceae) ...... 25

Resumo ...... 26 Introdução ...... 26 Material e Métodos ...... 28 Resultados ...... 30 Discussão ...... 34 Agradecimentos ...... 41 Referências ...... 42 Figuras ...... 46 Capítulo II. Ontogênese dos tegumentos seminais e anatomia de sementes em espécies de Passiflora L. (Passifloraceae) ...... 55

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Resumo ...... 56 Introdução ...... 56 Material e Métodos ...... 58 Resultados ...... 60 Discussão ...... 64 Agradecimentos ...... 69 Referências bibliográficas ...... 70 Figuras ...... 74 CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 81

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À minha família, com amor.

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“A morte da flor só vem para o desatento, que se esquece de que é preciso findar para recomeçar. Mais um dos ciclos da natureza... as flores desabrocham e murcham para que venham os frutos e as sementes. Que o conhecimento nos ajude a perpetuá-los, porque os nossos futuros irmãos precisam das flores e do milagre que elas encerram.”

C.G.

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AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelas bolsas de estudo concedidas.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal, do Instituto de Biologia, UNICAMP, especialmente ao Laboratório de Anatomia por toda infraestrutura e suporte para a realização deste trabalho.

À Profa. Dra. Sandra Maria Carmello-Guerreiro pela oportunidade de realizar esse projeto sob sua orientação, pela confiança, autonomia e pelo conhecimento compartilhado, tanto profissional quanto pessoal.

Aos professores e funcionários do Departamento de Biologia Vegetal da UNICAMP pelos ensinamentos compartilhados e auxílios prestados nas diferentes etapas deste trabalho, com especial menção ao Prof. Dr. João Semir que me ajudou na obtenção de parte do material estudado e ao Prof. André Olmos Simões pelas valiosas sugestões. Ao Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia da UNICAMP, por permitir o acesso às suas instalações, especialmente a Adriane, Ana e Stella, pela simpatia e auxílio na preparação dos materiais. Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação, que sempre foram dedicados a atender minhas solicitações. À secretária Maria Roseli de Melo pela paciência e dedicação para esclarecer as minhas dúvidas.

À Profa. Dra. Beatriz Appezzato-da-Gloria, Profa. Dra. Letícia Souto e Dr. Diego Demarco pela participação no meu exame de qualificação, com valiosas sugestões que permitiram a melhoria desta tese. Aos membros suplentes da Banca Examinadora desta tese, Dra. Simone de Pádua Teixeira, Dr. João Semir e Dra. Michaele Alvim Milward-de-Azevedo, pela consideração e atenção. Aos membros titulares da Banca Examinadora desta tese, Dra. Denise Maria Trombert de Oliveira, Dra. Letícia Souto, Dra. Juliana Lischka Sampaio Mayer e Dr. André Olmos Simões, por aceitarem participar da defesa desta tese, colaborando com sugestões muito importantes para a melhoria desse trabalho. Aos técnicos Sebastião Henrique Militão Jr. (Laboratório de Anatomia – UNICAMP), pela dedicação, simpatia e assistência técnica e, João Carlos Galvão (Laboratório de Taxonomia – UNICAMP), pela dedicação, simpatia e auxílio nas coletas. A todos os funcionários do Herbário da UNICAMP, pela dedicação e auxílio na confecção das exsicatas, especialmente a Lívia Cordi, que além de toda ajuda no herbário, se tornou uma amiga.

Ao Mauro Peixoto (Brazilian Plants) e Harri Lorenzi (Plantarum) por terem permitido o acesso às instalações, com intuito de realizar coletas, além de todo o suporte, incentivo e simpatia.

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Ao Dr. Luís Carlos Bernacci (IAC) pela confirmação da identificação botânica de Passiflora cincinnata.

Ao meu amigo Dr. Renato Pirani Ghilardi por ter me apresentado à Dra. Veridiana de Lara Weiser Bramante, a qual foi essencial na coleta de material para essa tese.

Ao Jardim Botânico de Bauru e a todos os funcionários, especialmente ao Diretor Luiz Carlos e a Sônia por permitirem o acesso as instalações, além de todo o suporte e simpatia.

À Dra. Julie H. A. Dutilh pela grande ajuda nas coletas, por todos os valiosos conselhos profissionais, pelo incentivo, pelas conversas e pela amizade.

À Ana e Claudemir Dalponti por terem permitido a coleta de Passiflora alata no Sítio Alegria.

Aos meus colegas do Departamento pelo convívio, companheirismo, sorrisos e incentivo nos laboratórios, nos corredores e nas disciplinas cursadas. Ao Gustavo agradeço por todo carinho e auxílio, me indicando locais de coleta. À Thaíssa e ao Antonio agradeço pelo auxílio na obtenção de material, sem a ajuda de vocês, essas coletas não teria sido possíveis. À Caroline, Ana Moraes, Talita e Zildamara, pelo convívio, amizade e por terem me hospedado e me dado suporte quando cheguei a Campinas.

Aos meus queridos colegas e ex-colegas do Laboratório de Anatomia Vegetal: Ana, Ana Paula, Bárbara, Carolina, Diego, Edimar, Elimar, Elisabeth, Emília, Juliana, Débora, Liliana, Priscila, Ramom, Vanessa e Zildamara. Agradeço pelo convívio, amizade, incentivos e por toda ajuda durante todas as etapas dessa tese. Aos meus pais, Maria e Ludovico, pelo amor, incentivo e apoio incondicionais que tenho recebido durante toda a minha vida e que fizeram toda a diferença durante o doutorado.

A toda a minha família, com menção especial a minha avó Aparecida, meus irmãos Sérgio e Fernando, meu sobrinho Theo e aos cachorrinhos da minha vida, especialmente as saudosas Baby e Meg (eu penso em vocês e sorrio!).

Ao meu avô Branco (in memorian) e a minha tia Glória (in memorian) que estão entre os meus maiores incentivadores e mesmo com toda saudade e tristeza que suas ausências me causam, eu sempre encontrei forças lembrando dos nossos momentos e de suas palavras inspiradoras. A Deus por todo amor e bênçãos a mim concedidos, por ser meu guia, por facilitar os meus caminhos, trazendo sempre pessoas maravilhosas ao meu encontro.

Tem sido uma longa jornada... às vezes parece que foram mais que quatro anos, outras, nem tanto assim. Tive grandes perdas, pequenas vitórias diárias, mas acima de tudo, sinto que conquistei grandes amigos, pessoas que ficarão para sempre na minha memória e na minha vida. Todos os que aqui foram citados e mesmo aqueles que não o foram e que de alguma forma contribuíram para o meu desenvolvimento profissional, muito obrigada.

1. INTRODUÇÃO GERAL

1.1 Família Passifloraceae Juss. ex Roussel

Passifloraceae possui 17 gêneros e entre 700 a 750 espécies, compostas por lianas, ervas, arbustos e pequenas árvores, distribuídas nos paleotrópicos, com poucas espécies ocorrendo em regiões temperadas da América do Sul e do Norte, sul da China e Nova Zelândia (Feuillet & MacDougal 2007). O gênero Passiflora foi estabelecido por Linnæus em 1735, ratificando o nome empregado por L. Pluckenet (Cervi 1997). Em 1753, Linnæus utilizou a tese de um de seus pupilos, Johann G. Hallman, contendo a descrição de 22 espécies reconhecidas, como base para a definição das espécies no gênero Passiflora L.. Outra grande contribuição veio de Masters, que em 1871 escreveu uma monografia sobre a história natural da família e em 1872 editou uma seção sobre Passifloraceae na Flora Brasiliensis de Martius (Ulmer & MacDougal 2004). Taxonomicamente a família foi considerada por Takhtajan (1997), como integrante da ordem Passiflorales, relacionada com Turneraceae, Loasaceae e Malesherbiaceae. Baseando-se em evidências morfológicas, Cronquist (1981) considerou a família como membro da ordem Violales, próximo a Flacourtiaceae, Scyphostegiaceae, Violaceae, Turneraceae, Achriaceae e Malesherbiaceae. Com a adição de dados moleculares nas análises filogenéticas, Passifloraceae foi reposicionada e passou a integrar a ordem Malpighiales (APGII 2003; APGIII 2009). O sistema de classificação Angiosperm Phylogeny Group (APG III 2009) inclui em Passifloraceae sensu lato três famílias antes tradicionalmente reconhecidas: Passifloraceae sensu stricto, com duas tribos, 17 gêneros e cerca de 700 espécies (Feuillet & MacDougal 2007); Malesherbiaceae com um único gênero Malesherbia Ruiz & Pav., composto por 27 espécies encontradas no Chile e no Peru (Kubitzki 2007); e, Turneraceae com 10 gêneros, e cerca de 200 espécies (Arbo 2007), sendo que dois gêneros são encontrados no Brasil: Turnera L. e Piriqueta Aubl. (Souza & Lorenzi 2008). Essa proposta de sinonimização das três famílias em Passifloraceae s.l. foi proposta em APGII (2003) e justifica-se pelo fato delas possuírem como características comuns, compostos secundários glicosídeos cianogênicos ciclopentenoides (Chase et al. 2002), além de hipanto como estrutura

individualizada não associado aos estames. Turneraceae e Passifloraceae compartilham ainda outras características, como a presença de nectários extraflorais no pecíolo ou na base da lâmina foliar, além de transmissão bipaternal ou paterna de plastídios (Shore et al. 1994; APGII 2003). Já a inclusão de Malesherbiaceae é justificada devido à presença de corona (APG III 2009). Em uma análise filogenética de Passifloraceae sensu lato, baseando-se no DNA plastidial do rDNA de 25 gêneros: 16 gêneros de Passifloraceae s.s., oito gêneros de Turneraceae e o único gênero de Malesherbiaceae, Tokuoka (2012) encontrou resultados que sugerem a monofilia de Passifloraceae s.l., embora as famílias previamente estabelecidas individualmente também sejam monofiléticas (Figura 1).

Figura 1. Árvore filogenética baseada nas sequências dos marcadores rbcL, atpB, matK, e 18S, retirada de Tokuoka (2012).

Souza & Lorenzi (2008) preferiram adotar uma circunscrição menos abrangente para a família, justificando que não há total clareza quanto aos critérios utilizados por APG III (2009) e que os caracteres morfológicos de Passifloraceae s.s. permitem a sua distinção. Passifloraceae s.s. é formada por duas tribos, Passifloreae DC. e Paropsieae DC. (Figura 1), ambas monofiléticas (Tokuoka 2012). Passifloreae apresenta como claras sinapomorfias o hábito escandente, gavinhas axilares e flores altamente especializadas. A tribo é composta por 11 gêneros e cerca de 700 espécies, distribuídas em regiões tropicais (Judd et al. 1999) (Figura 2A). No Brasil registros indicam apenas a presença de espécies de Passifloreae, ocorrendo quatro gêneros: Ancistrothysus Harms, Dilkea Mast., Mitostemma Mast. e Passiflora L. (Cervi et al. 2012; Bernacci et al. 2013). Paropsieae é composta por arbustos ou árvores sem gavinhas, apresenta seis gêneros e aproximadamente 27 espécies, distribuídas especialmente no oeste da África (Escobar 1988) (Figura 2B).

Figura 2. Mapa de distribuição de espécies da família Passifloraceae s.s. A. Tribo Passifloreae DC.. B. Tribo Paropsieae DC., retirado de http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/.

1.2 Passiflora L. Passiflora é o mais representativo e importante gênero da família, possuindo entre 400 (Judd et al. 2009) a 530 espécies (Feuillet & MacDougal 2007), distribuídas predominantemente em regiões tropicais e subtropicais. Noventa por cento das espécies do gênero são originárias das Américas e muitas delas são nativas do Brasil (Inglez de Sousa & Meletti 1997). No país são registradas 135 espécies, sendo 81 endêmicas, e 11 variedades, sendo oito endêmicas (Bernacci et al. 2013), encontradas principalmente em bordas de florestas por todo o país (Souza & Lorenzi 2008). A denominação Passiflora vem do latim, passio, ‘paixão’ e flos, ‘flor’, e surgiu da interpretação religiosa dos colonizadores europeus da flor, cuja morfologia sugere uma relação com símbolos da paixão de Cristo (Inglez Sousa & Meletti 1997). As espécies de Passiflora são designadas popularmente de forma generalizada como ‘maracujás’, nome derivado de maraú-ya, que para os indígenas significa ‘fruto de sorver’ (Instituto de Tecnologia de Alimentos 1994). O gênero possui diversas espécies com importância econômica, já que algumas são cultivadas como plantas ornamentais devido à beleza de suas flores e outras fornecem frutos comestíveis (Judd et al. 2009). De acordo com Coppens d’Eeckenbrugge et al. (2003) cerca de 81 espécies são descritas como tendo frutos comestíveis, entretanto, apenas Passiflora edulis Sims (maracujá-roxo), P. edulis f. flavicarpa Degener (maracujá-azedo ou amarelo) e, Passiflora alata Curtis (maracujá-doce), são extensivamente cultivadas no Brasil (Inglez de Souza & Meletti 1997). Passiflora edulis é muito apreciado e amplamente cultivado no Brasil, representando cerca de 95% da área cultivada dentre os maracujás (Meletti 2003). Sua comercialização é feita in natura e como matéria-prima nas indústrias de suco (Mercadante et al. 1998). O maracujá-doce (P. alata) é consumido in natura, devido a sua baixa acidez, mas tem sua produção e comercialização limitadas pela falta de hábito de consumo da população (Meletti 2003). O maracujá é uma das plantas de uso medicinal mais conhecidas no Brasil, devido à presença de passiflorina que confere suas propriedades calmantes e sedativas (Inglez de Sousa & Meletti 1997). Folhas de P. alata e P. incarnata possuem grande importância medicinal, sendo utilizadas na elaboração de fitoterápicos para o tratamento de insônia e irritabilidade (Paris et al. 2002). A casca do maracujá, um dos subprodutos da produção de

sucos é rica em fibras solúveis especialmente pectina, que pode auxiliar na prevenção de doenças cardiovasculares e gastrointestinais, e contribuir no tratamento de diabetes e obesidade (Turano et al. 2002). Além disso, estudos relatam a presença de flavonoides, carotenoides, ácidos orgânicos, proteínas, lipídeos e vitaminas, que indicam o potencial do fruto como um alimento funcional (Zeraik 2010).

A última revisão sistemática do gênero Passiflora para as espécies americanas foi realizada no início do século XX (Killip 1938), sendo baseada em caracteres morfológicos, especialmente na morfologia floral. De acordo com essa classificação, as espécies de Passiflora estariam distribuídas em 22 subgêneros, 23 seções e 26 séries. Escobar (1989) acrescentou mais um subgênero a esta classificação, totalizando 23 subgêneros.

Alguns trabalhos recentes (Feuillet & MacDougal 2003; Muschner et al. 2003; Yockteng & Nadot 2004; Muschner 2005) têm sugerido a reorganização taxonômica do gênero, questionando especialmente a delimitação dos subgêneros (Killip 1938; Escobar 1989) e as relações entre eles. Dentre eles, o estudo de Feuillet & MacDougal (2003) baseado principalmente na morfologia externa e em características ecológicas das espécies, propôs uma classificação com apenas quatro subgêneros, sendo eles Decaloba, Astrophea, Passiflora e Deidamioides. Essa proposta é bem sustentada por estudos filogenéticos baseados em dados moleculares.

O primeiro trabalho filogenético do gênero, realizado por Muschner et al. (2003), utilizando sequências gênicas, separou as 61 espécies estudadas em três grandes clados: Decaloba, Astrophea e Passiflora, com a posição de Deidamioides não resolvida. Uma análise filogenética molecular com outros marcadores, não corroborou a classificação de Feuillet & MacDougal (2003), sendo proposta a divisão do gênero em oito subgêneros (Yockteng & Nadot 2004). Em análise posterior, abrangendo 104 espécies distribuídas em 19 dos 23 subgêneros propostos por Killip (1938) e Escobar (1989), Muschner (2005) reafirmou os resultados obtidos por Feuillet & MacDougal (2003), com três dos subgêneros - Decaloba, Astrophea e Passiflora - formando grupos monofiléticos. Contudo, Deidamioides não se confirmou monofilético e propôs-se sua divisão em dois subgêneros, Deidamioides e Tryphostemmatoides. Hansen et al. (2006) utilizando outras sequências moleculares reconheceu os quatro subgêneros como monofiléticos. Krosnick et al. (2009)

reconheceram o subgênero Tetrapathea (DC.) P. S. Green, aumentando o número de subgêneros para cinco.

O gênero Passiflora atualmente é dividido em cinco subgêneros: Deidamioides (Harms) Killip, Decaloba (DC.) Rchb, Astrophea (DC.) Mast, Passiflora (Feuillet & MacDougal 2003) e Tetrapathea (DC.) P. S. Green (Krosnick et al. 2009). Contudo, a sistemática de Passiflora, ainda não está completamente elucidada, sendo que de acordo com Krosnick et al. (2013), as relações infragenéricas em Passiflora ainda são pouco compreendidas.

O subgênero Astrophea consiste em cerca de 60 espécies de lianas lenhosas, algumas vezes árvores pequenas, distribuídas na América do Sul e Central. Suas flores apresentam opérculo ereto, não plicado e o estilete é rígido e projetando-se para cima. O subgênero Deidamioides é um grupo de 13 espécies de raras trepadeiras e lianas lenhosas, encontradas na América do Sul e Central, com flores possuindo opérculo mais ou menos plicado e estilete não rígido e ereto (Ulmer & MacDougal 2004). Decaloba tem cerca de 230 espécies reconhecidas e mais de uma dezena ainda não descritas (Krosnick et al. 2013). É o único subgênero a possuir espécies distribuídas tanto no Novo quanto no Velho Mundo. É caracterizado por flores e frutos pequenos, opérculo membranoso plicado e estilete delgado (Ulmer & MacDougal 2004; Krosnick et al. 2013). O subgênero Tetrapathea é o menor dentro de Passiflora, com três espécies de lianas dioicas, encontradas na Austrália, Papua Nova Guiné, e Nova Zelândia (Krosnick et al. 2009). Por fim, Passiflora é o subgênero com maior número de espécies, compreendendo cerca de 250 espécies, sendo atualmente dividido em seis superseções, possui flores e frutos relativamente grandes, opérculo não plicado e estiletes frequentemente claviformes (Feuillet & MacDougal 2003; MacDougal & Feuillet 2004). Como supracitado, a sistemática de Passiflora, ainda não está completamente esclarecida, especialmente na delimitação de níveis infragenéricos e os pesquisadores parecem ser unânimes ao sugerir a realização de novos estudos mais abrangentes, com maior número de espécies e de sequências gênicas utilizadas, bem como, estudos abordando aspectos biológicos das espécies.

1.2.1 Subgênero Decaloba (DC.) Rchb.

O subgênero Decaloba atrai especial interesse pela beleza de suas folhas e rápido crescimento (Dornelas et al. 2006). A maioria das espécies tem porte pequeno e hábito escandente, com flores pequenas com cinco sépalas e pétalas (Killip 1938; Ulmer & MacDougal 2004). Apresentam como sinapomorfias, as folhas jovens variegadas, opérculo membranoso plicado e redução da corona (duas a três séries de filamentos) (Krosnick et al. 2013).

Os frutos podem ser pequenos carnosos do tipo baga uniloculares, que variam em coloração de púrpura a azul (Figura 3A), ou de amarelo a vermelho, com poucas sementes dispersas por pássaros ou ainda, frutos que se abrem quando maduros expondo sementes cobertas por arilos secos e sem odor que caem no chão e provavelmente são dispersas por formigas (Ulmer & MacDougal 2004).

Figura 3. Frutos maduros expostos na planta-mãe. A. Passiflora morifolia Mast. – subgênero Decaloba. B. Passiflora foetida L. – subgênero Passiflora.

O subgênero Decaloba foi dividido em oito superseções (Feuillet & MacDougal 2003; MacDougal & Feuillet 2004): Pterosperma (L. E. Gilbert & J. M. MacDougal) J. M. MacDougal & Feuillet (quatro espécies), com folhas não lobadas, múltiplos pares de nectários no pecíolo e sementes aladas (Krosnick et al. 2013); Hahniopathanthus (Harms.) M. MacDougal & Feuillet (seis espécies), com grandes estípulas folhosas e ausência de bandeamento na corona (Krosnick et al. 2013); Auriculata M. MacDougal & Feuillet (oito

espécies), possui um par único de nectários auriculares no pecíolo e pétalas reduzidas (Krosnick et al. 2013); Disemma (Labill.) M. MacDougal & Feuillet (21 espécies), maioria das espécies com flores brancas e umas poucas apresentam folhas bilobadas e variegadas (Ulmer & MacDougal 2004); Multiflora (Small) M. MacDougal & Feuillet (22 espécies), apresentando características apomórficas e plesiomórficas (Krosnick et al. 2013); Bryonioides (Harms.) M. MacDougal & Feuillet (22 espécies), tricomas unciformes, arilos alaranjados e um a vários pares de dentes na base da lâmina (Krosnick et al. 2013); Cieca (Medik.) M. MacDougal & Feuillet (19 espécies), apresenta perda de pétalas, redução de brácteas e formato foliar peltado nas plântulas (Krosnick et al. 2013); e Decaloba (DC.) M. MacDougal & Feuillet (130 espécies), perda de nectário no pecíolo, folhas frequentemente bilobadas e sementes sulcadas (Krosnick et al. 2013).

Enquanto progresso tem sido feito na compreensão das relações filogenéticas entre os subgêneros de Passiflora, muito pouco se sabe sobre as relações entre eles (Krosnick et al. 2013). Krosnick et al. (2013) realizou uma análise bastante completa para elucidar a posição do subgênero Decaloba em relação ao restante do gênero; testar a classificação infragenérica de Feuillet & MacDougal (2003); e, verificar as relações entre as superseções em Decaloba. Seus resultados indicam que a análise molecular combinada forneceu novos insights sobre a evolução desse subgênero, resultando na identificação de clados que necessitam de revisão, bem como aqueles que requerem investigação adicional em relação a caracteres morfológicos, evolução cromossômica e clonagem molecular.

1.2.2 Subgênero Passiflora

O subgênero Passiflora é mais diversificado na América do Sul e é usualmente caracterizado por suas folhas não variegadas, opérculo não plicado, sementes reticuladas e número cromossômico n=9, também 10 ou 11 (Ulmer & MacDougal 2004).

Em algumas espécies os frutos são carnosos e permanecem expostos por um tempo, mesmo depois de maduros (Figura 3B), sendo suas sementes dispersas por morcegos. Característicos são os grandes frutos amarelados com arilo perfumado e colorido, encontrados em muitas espécies, sendo dispersos principalmente por mamíferos (Feuillet & MacDougal 2007).

Passiflora é o subgênero com maior número de espécies, com cerca de 250 espécies, sendo atualmente dividido em seis superseções (Feuillet & MacDougal 2003; MacDougal & Feuillet 2004): Passiflora (19 espécies), Stipulata Feuillet & MacDougal (95 espécies), Laurifolia (Cervi) Feuillet & MacDougal (42 espécies), Coccinea Feuillet & MacDougal (14 espécies), Distephana (D.C.) Feuillet & MacDougal (três espécies) e Tacsonia (Juss.) Feuillet & MacDougal (61 espécies). As análises filogenéticas de dados de sequências de DNA para o subgênero Passiflora até o momento, não incluem alguns níveis taxonômicos, tais como os níveis infragenéricos. A delimitação das superseções, seções e séries é baseada em caracteres morfológicos e ecológicos (Feuillet & MacDougal 2003; MacDougal & Feuillet 2004). De acordo com Feuillet & MacDougal (2003) e MacDougal & Feuillet (2004), a superseção Passiflora compreende espécies com estípulas lineares a lanceoladas, folhas serradas, brácteas livres serradas e flores com uma corona conspícua. A superseção Stipulata possui espécies com estípulas sub-reniformes ou oblongo-ovadas, brácteas livres e flores voltadas para cima ou raramente pendentes, com uma grande e conspícua corona (exceto espécies das seções Tacsonioides e Kermesinae). A superseção Laurifolia tem uma característica peculiar, flores pendentes grandes com corona predominante que rodeia o ovário em um modo campanulado. Espécies da superseção Coccinea têm estípulas linear- lanceoladas e suntuosas flores vermelhas com uma corona curta e elevada, fina pubescência, folhas serradas e grandes brácteas. As poucas espécies da superseção Distephana são caracterizadas por terem uma leve pubescência ou ausência da mesma, estípulas linear-lanceoladas, folhas inteiras não lobadas, brácteas livres muito estreitas, e flores elevadas. A distribuição geográfica das espécies da superseção Tacsonia abrange desde a Venezuela até Colômbia, Equador, Peru, a Bolívia e Chile (Escobar 1988). Suas flores pendentes diferem da maioria das outras passifloras por seu longo tubo floral e corona reduzida a um anel colorido com pequenos elementos com poucos milímetros de comprimento (Escobar 1988). 1.3 Espécies estudadas

As espécies estudadas pertencem a dois subgêneros: nove espécies do subgênero Passiflora (Tabela 1) e uma espécie do subgênero Decaloba, sendo que todas apresentam frutos do tipo baga, indeiscentes.

Como previamente descrito, a delimitação das superseções, seções e séries é baseada em caracteres morfológicos e ecológicos, que muitas vezes se sobrepõe. Estes, portanto, podem não corresponder necessariamente a grupos naturais, sugerindo a necessidade de estudos filogenéticos complementares e ainda, uma revisão cuidadosa dos caracteres morfológicos tipicamente utilizados para a sua delimitação. Dessa forma, as espécies foram escolhidas, considerando representantes nativos de quatro das cinco Superseções do subgênero Passiflora com o intuito de contribuir com possíveis características anatômicas que possam ser úteis na delimitação desses níveis; além de incluir uma espécie do subgênero Decaloba, com fruto do tipo baga, com intuito de comparação entre os subgêneros.

Tabela 1. Lista de espécies do subgênero Passiflora utilizadas neste estudo, segundo classificação de Feuillet & MacDougal (2003). Espécie Superseção Seção Série Passiflora cincinnata Mast. Passiflora (17 espécies) --- Passiflora (13 espécies)

Passiflora elegans Mast. Stipulata Feuillet & MacDougal (95 Granadillastrum Triana & Planch.(66 --- espécies) espécies)

Passiflora mucronata Lam. Stipulata Feuillet & MacDougal Granadillastrum Triana & Planch. ---

Passiflora gibertii N. E. Brown Stipulata Feuillet & MacDougal Granadillastrum Triana & Planch. ---

Passifora eichleriana Mast. Stipulata Feuillet & MacDougal Granadillastrum Triana & Planch. ---

Passiflora edmundoi Sacco Stipulata Feuillet & MacDougal Kermesinae (Cervi) Feuillet & --- MacDougal (4 espécies)

Passiflora foetida L. Stipulata Feuillet & MacDougal Dysosmia DC.(20 espécies) ---

Passiflora alata Curtis Laurifolia (Cervi) Feuillet & --- Quadrangulares MacDougal (41 espécies) Feuillet & MacDougal (6 espécies)

Passiflora coccinea Aubl. Coccinea Feuillet & MacDougal ------(14 espécies)

Passiflora morifolia Mast. é a única espécie representante do subgênero Decaloba, seção Pseudodysosmia (Figura 4), apresenta estípulas foliáceas, pecíolos com um par de glândulas, flores com corona unisseriada (Figura 4A), disco nectarífero, ovário densamente

setuloso, frutos azulados, roxos ou nigrescentes (Figura 4B), denso à esparsamente setulosos e sementes com arilo alaranjado ou vermelho e testa foveolada (Milward-de- Azevedo & Baumgratz 2004). A espécie possui distribuição geográfica disjunta pelas Américas, ocorrendo em vários estados brasileiros. Na Região Sudeste do Brasil, é encontrada em cerrado e floresta pluvial sub-montana (Milward-de-Azevedo & Baumgratz 2004).

Figura 4. Aspectos morfológicos de Passiflora morifolia Mast. A. Ramo com flor em antese e botões florais. B. Folhas, fruto maduro e botões florais.

As demais nove espécies pertencem ao subgênero Passiflora, distribuídas em quatro das seis superseções do subgênero (Tabela 1). Passiflora cincinnata Mast. (Figura 5), possui flores com corona multisseriada, conspícua, ondulada, a qual é púrpura na base, com bandas mais claras no meio e violeta-azul na porção superior (Figura 5A). O ovário é glabro e o fruto é ovoide esverdeado (Figura 5B), com sementes grosseiramente reticuladas (Ulmer & MacDougal 2004) e com arilo amarelo. Ocorre em diversos estados brasileiros: Alagoas, Bahia, Brasília, Ceará, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Pará, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do Norte, Rio de Janeiro e São Paulo; bem como em outros países sul-americanos, como Argentina, Bolívia, Colômbia, Paraguai e Venezuela. É uma espécie heliófita, sendo muito comum na orla da mata e capoeiras, inclusive na orla de cultivos (Cervi 1997). A superseção com maior número de espécies é Stipulata, que neste estudo está representada por seis espécies (Figura 6): Passiflora edmundoi Sacco, Passiflora foetida L.,

Passiflora eichleriana Mast., Passiflora mucronata Lam., Passiflora gibertii N. E. Brown e Passiflora elegans Mast..

Figura 5. Aspectos morfológicos de Passiflora cincinnata Mast. A. Ramo com flor em antese e botões florais. B. Fruto maduro. Barra: 1 cm.

Passiflora edmundoi possui brácteas pecioladas, púrpuras (Figura 6A), sendo bastante persistentes e a corona é formada por 2-3 séries de filamentos, sendo que o filamento exterior é superior a 0,6 cm de comprimento, além de o fruto ser oblongo e elipsoide (Ulmer & MacDougal 2004). A espécie frequentemente é confundida com Passiflora kermesinae Link & Otto, pois, suas flores são bastante semelhantes à primeira vista, ambas sendo polinizadas por beija-flores. Contudo, existem diferenças marcantes com relação às brácteas, corona e fruto (Ulmer & MacDougal 2004). De acordo com Cervi (1997) ocorre nos estados da Bahia, Goiás, Rio de Janeiro, Minas Gerais e Piauí, sendo uma espécie indiferente ao tipo de solo, ocorrendo na caatinga, como em orla de floresta com luz difusa. Passiflora foetida caracteriza-se por apresentar brácteas 1-4 pinatissectas, pilosas, glandulosas (Ulmer & MacDougal 2004), que geralmente persistem no fruto maduro. Flores com corona em quatro séries filamentosas variando de cor (Figura 6B). Fruto com pericarpo fino, sementes triapiculadas no ápice, grosseiramente reticuladas (Ulmer & MacDougal 2004) e arilo branco translúcido. É a espécie mais variável em todo o gênero, particularmente com relação às flores e frutos, com quase 50 variedades sendo sugeridas (Ulmer & MacDougal 2004), sendo que Killip (1938), já reconhecia 37 variedades. Essa espécie heliófita, pode ser encontrada em diferentes tipos vegetacionais e, segundo

Bernacci et al. (2013) é encontrada em todos os estados brasileiros, comportando-se como invasora em áreas degradadas.

Figura 6. Aspectos morfológicos de flores e frutos de espécies de Passiflora superseção Stipulata. A. Flor em antese e botão floral de Passiflora edmundoi Sacco. B. Flor em antese e frutos em desenvolvimento de Passiflora foetida L. C. Fruto maduro de Passiflora eichleriana Mast. D. Flor em antese e botões florais de Passiflora mucronata Lam. E. Flor em antese e frutos em desenvolvimento de Passiflora gibertii N. E. Brown. F. Fruto maduro de Passiflora elegans Mast.. Barras: 1 cm.

Passiflora eichleriana possui corona em seis séries de filamentos, ovário ovoide, glabro. O fruto é globoso, amarelo-claro quando maduro (Figura 6C) e as sementes são foveoladas (Cervi 1997), com arilo amarelo. Tem distribuição geográfica abrangendo os estados de Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e São Paulo; além do Paraguai. É uma espécie heliófita e seletiva higrófita da orla da floresta, capoeiras e capoeirões (Cervi 1997). Passiflora mucronata é uma planta glabra, com flores brancas, corona curta e branca, com duas séries de filamentos; ovário e fruto ovoides, esverdeados; com sementes reticuladas (Ulmer & MacDougal 2004) e arilo amarelo. Suas flores são brancas (Figura 6D), com antese noturna e a polinização se realiza por quirópteros. Além disso, após a abertura das flores, tanto as anteras como os estigmas agrupam-se em semicírculo (devido aos movimentos dos filetes e estiletes), tornando a flor zigomorfa em relação ao androceu e gineceu, atributos incomuns em Passiflora (Cervi 1997). A espécie é encontrada nos

estados da Bahia, Espírito Santo, Paraíba, Pernambuco e Rio de Janeiro. É uma espécie heliófita que vive exclusivamente na restinga (Cervi 1997). Passiflora gibertii é uma liana de grande porte com numerosas flores perfumadas. Assemelha-se a P. eichleriana, P. elegans e a P. subpeltata, as quais é proximamente relacionada, devido ao seu habito e a suas folhas trilobadas. Suas flores possuem corona com 5-6 séries de filamentos brancos com listras roxas (Figura 6E). Os frutos são amarelos a alaranjados, com sementes reticuladas (Ulmer & MacDougal 2004) e com arilo alaranjado. Tem distribuição geográfica abrangendo Argentina, Paraguai e Brasil, cresce em solos úmidos, sendo encontrada em estuários, planícies de inundação, ilhas, represas, bordas de rios, lagoas e cursos d’água em geral (Deginani 2001). Passiflora elegans possui flores com corona em quatro séries filamentosas: as duas séries externas com filamentos subulados bandeados de branco e lilás na porção inferior e de branco e roxo no ápice, com cerca de 1,5 cm; e, as duas séries internas reduzidas a pequenos tubérculos de coloração lilás. Ovário globoso, glabro. Fruto amarelo quando maduro, com sementes reticulado-foveoladas (Cervi 1997) e arilo amarelo (Figura 6F). Ocorre na Argentina e Uruguai e, no Brasil, ocorre no Rio Grande do Sul e Santa Catarina. É uma planta heliófita e seletiva higrófita que ocorre no interior e borda das florestas, capoeiras e capoeirões (Cervi 1997). Passiflora coccinea Aubl., difere das outras espécies da superseção por suas folhas não lobadas, duplamente serreadas e grandes brácteas. Possui flor vermelha com corona com três séries de filamentos brancos ou violáceos (Figura 7A), ovário densamente tomentoso e fruto esverdeado com listras (Figura 7B); as sementes são minuciosamente reticuladas (Ulmer & MacDougal 2004) e com arilo amarelo. A espécie é encontrada na Bolívia, Brasil, Guiana, Peru e Venezuela, crescendo em Floresta Amazônica em áreas não inundadas (Ulmer & MacDougal 2004).

Por fim, Passiflora alata Curtis possui caule quadrangular e grandes flores com sépalas e pétalas vermelhas e corona com 4-6 séries de filamentos violetas e brancos. Os frutos são grandes, obovoides ou piriformes, amarelos (Figura 7C), com sementes reticuladas (Ulmer & MacDougal 2004) e arilo amarelo, fragrante. É bastante cultivada pela beleza de suas folhas, flores e frutos e por seus frutos comestíveis (Cervi 1997), sendo conhecida popularmente como maracujá-doce. Ocorre em vários estados brasileiros, além de

Argentina, Paraguai e Peru. É uma espécie heliófita, seletiva higrófita, ocorre principalmente nas capoeiras, capoeirões e áreas de restinga litorânea, raramente em orla de floresta.

Figura 7. Aspectos morfológicos da flor e frutos de espécies de Passiflora superseção Coccinea (A-B) e Laurifolia (C). A. Flor em antese de Passiflora coccinea Aubl. B. Fruto maduro de Passiflora coccinea Aubl.. C. Fruto maduro de Passiflora alata Curtis. Barras: 1 cm.

1.4 Estudos morfoanatômicos

A despeito da importância econômica, ecológica e a riqueza de espécies de Passiflora, não existem muitos estudos abordando os aspectos morfoanatômicos das espécies do gênero. Os estudos anatômicos em sua maioria abordam aspectos morfoanatômicos de folhas, gavinhas, caules (Gangstad 1938; Meruvia et al. 1993a,b; Kurtz et al. 2003; Beraldo & Kato 2010) e a pronunciada plasticidade fenotípica, especialmente em relação aos órgãos vegetativos de algumas espécies de Passiflora (Barp et al. 2006; Araújo & Alves 2007). Trabalhos sobre morfoanatomia floral também são escassos e de modo geral, se destacam estudos sobre aspectos gerais da anatomia (Puri 1947) e da morfologia floral Endress (1994), estudo de padrões de desenvolvimento floral (Bernhard 1999; Krosnick et al. 2006; Krosnick et al. 2009), ultraestrutura da corona (Amela García et al. 2007), produção de néctar, pigmentos e odores envolvidos na polinização (Varassin et al. 2001), comparação morfológica e estrutural dos nectários florais e extraflorais (Troleis et al. 2008), estrutura, histoquímica e citoquímica do estigma e estilete (Souza et al. 2006) e

ontogênese e histoquímica da superfície estigmática (Silvério & Mariath 2010). Outros estudos relacionam-se com os aspectos embriológicos e transmissão da herança plastidial (Silvério et al. 2009). Além de anatomia comparada da antera (Dettke & Santos 2009), ultraestrutura do pólen (Carreira 1977; Araújo & Santos 2004), formação e viabilidade do grão de pólen associando-os com o tamanho do botão floral e da antera (Souza et al. 2002) e, movimento do androginóforo em espécies da seção Xerogona (Scorza & Dornelas 2014). Com relação a estudos morfoanatômicos de frutos e sementes de Passiflora, a carência fica ainda mais evidente. Trabalhos sobre a morfologia das sementes de espécies do gênero Passiflora abordam vários aspectos, tais como tamanho, coloração, forma e a presença de ornamentações na superfície das mesmas, que se mostram especialmente úteis na identificação de espécies, possuindo valor taxonômico. O valor diagnóstico da anatomia das sementes de Passiflora foi constatado por Killip (1938) e Raju (1955), bem como em outros trabalhos (MacDougal 1994; Pérez-Cortéz et al. 1995; Pérez-Cortéz et al. 2002; Pérez-Cortéz et al. 2005; Pérez-Cortéz et al. 2009; Cárdenas-Hernández et al. 2011). MacDougal (1994) realizou uma revisão taxonômica da seção Pseudodysosmia do subgênero Decaloba (DC.) Rchb e dentre os caracteres utilizados para a descrição, estão incluídos o tamanho das sementes e as ornamentações da superfície seminal, que de acordo com o autor são bons caracteres taxonômicos para este gênero. Pérez-Cortéz et al. (2002) realizaram um estudo morfológico de 51 espécies do gênero Passiflora, elaborando uma chave artificial. Os autores constataram ser possível identificar 48 das espécies estudadas e concluíram que a ornamentação seminal é de grande valor diagnóstico, sendo útil para a caracterização das mesmas. Dentre os trabalhos que estudaram as sementes da família Passifloraceae s.l., destacam-se os estudos da embriogênese de Passiflora calcarata Mast. (Raju 1955), estrutura e desenvolvimento do óvulo e sementes de P. foetida (Singh 1962), desenvolvimento do arilo em Passiflora suberosa L. e em Turnera ulmifolia L. (Kloos & Bouman 1980), desenvolvimento do saco embrionário em P. edulis (Souza et al. 2002), megasporogênese e megagametogênese em P. suberosa (Silvério et al. 2009), anatomia do tegumento (Pérez-Cortéz et al. 2005; Pérez-Cortéz et al. 2009; Cárdenas-Hernandéz et al. 2011) e ontogenia de frutos e sementes de cinco espécies do gênero Passiflora, subgênero Decaloba, seção Xerogona (Milani 2014). Os trabalhos existentes na literatura levam a crer

que existe uma constância em muitos caracteres dentro da família, entretanto, existem caracteres diferenciais bastante relevantes com relação ao número de camadas dos tegumentos do óvulo, tipo de micrópila e número de tegumentos seminais. Não foram encontrados muitos trabalhos sobre a anatomia dos frutos de espécies da família Passifloraceae, destacando-se o trabalho de Gonzalez (2010), que consistiu na análise anatômica e ontogenia dos frutos de 12 espécies de Piriqueta e de 30 espécies de Turnera, tendo como um dos objetivos identificar as estruturas relacionadas com a deiscência das cápsulas; bem como, os estudos de Milani (2014) que objetivou elucidar a ontogenia do fruto e da semente de espécies do gênero Passiflora, subgênero Decaloba, seção Xerogona que apresentam frutos do tipo cápsula, buscando descrever o processo de desenvolvimento desses órgãos.

1.5 Objetivos O objetivo geral desta tese foi realizar estudos morfológicos, anatômicos e ontogenéticos de frutos e sementes de espécies do gênero Passiflora – subgêneros Decaloba e Passiflora (Passifloraceae). Especificamente, foi estabelecido o seguinte objetivo: - Analisar a morfologia, anatomia e ontogênese dos frutos e sementes de Passiflora, a fim de verificar a existência de padrões estruturais no desenvolvimento desses órgãos, que possam contribuir na caracterização das espécies e/ou de outros níveis taxonômicos, bem como discutir possíveis relações entre os caracteres e o ambiente.

1.6 Formato da tese Os resultados obtidos durante a execução deste Projeto de Doutorado foram reunidos em dois capítulos:

Capítulo I: ANATOMIA E DESENVOLVIMENTO DO PERICARPO DE ESPÉCIES NEOTROPICAIS DE Passiflora L. (PASSIFLORACEAE). Redigido segundo as normas da Flora.

Capítulo II: ONTOGÊNESE DOS TEGUMENTOS SEMINAIS E ANATOMIA DE SEMENTES EM ESPÉCIES DE Passiflora L. (PASSIFLORACEAE). Redigido segundo as normas do Australian Journal of Botany.

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Capítulo 1.

Anatomia e desenvolvimento do pericarpo de espécies neotropicais de Passiflora L. (Passifloraceae)

Cristina Gurskia & Sandra Maria Carmello-Guerreiroa,b,*

aPrograma de Pós-graduação em Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil. bDepartamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil.

______*Autor para correspondência. Endereços de e-mail: [email protected] (C. Gurski), [email protected] (S.M. Carmello-Guerreiro).

RESUMO

Passiflora é o mais representativo e importante gênero de Passifloraceae, tendo diversas espécies com importância econômica. Este trabalho teve como objetivo descrever a anatomia de frutos de Passiflora morifolia, P. foetida, P. mucronata, P. edmundoi, P. gibertii. P. eichleriana, P. cincinnata, P. elegans, P. alata e P. coccinea, com o intuito de identificar padrões comuns ou diferenciais no desenvolvimento, que possam contribuir na caracterização das espécies e/ou de outros níveis taxonômicos, bem como discutir possíveis relações entre os caracteres e o ambiente. Para tal, flores e frutos foram coletados e processados segundo técnicas anatômicas usuais. O ovário apresenta epiderme externa uniestratificada, mesofilo homogêneo e idioblastos com proteínas e polissacarídeos associados aos feixes. A epiderme interna é uniestratificada e a placenta possui células papilosas, além de tricomas unicelulares em P. morifolia. Os frutos exibem exocarpo uniestratificado com cutícula, espessa e com flanges em P. cincinnata e P. mucronata, tricomas não glandulares unicelulares em P. morifolia e P. foetida e pluricelulares em P. coccinea. O mesocarpo diferencia-se em mesocarpo externo delimitado por um anel de esclerênquima, que surge a partir da segunda camada subepidérmica ou de camadas mais internas; mesocarpo médio, parenquimático e, mesocarpo interno com formação de aerênquima em P. gibertii, P. eichleriana e P. elegans. Endocarpo é uniestratificado e com estômatos. Os resultados são consistentes com os dados da literatura para a família e a despeito da uniformidade de muitos caracteres, existem características diferenciais para cada espécie, tais como tricomas pluricelulares e presença de proteínas no mesocarpo externo de P. coccinea ou ainda, presença de cristais prismáticos apenas em P. cincinnata. Acredita-se que um caráter em particular, a localização do anel de esclerênquima, pode ser útil taxonomicamente, pois, variou bastante entre as espécies de diferentes superseções. Além disso, discute-se que a diversidade morfológica pode ser em parte devido à influência de fatores ambientais, como interações animal-planta e condições ecológicas. Palavras-chave: ontogênese, histoquímica, fruto, maracujá, caracteres anatômicos, Malpighiales.

Introdução

Passiflora L. é o maior e mais representativo gênero da família Passifloraceae com mais de 530 espécies de lianas, ervas, arbustos e pequenas árvores, distribuídas predominantemente em regiões tropicais e subtropicais (Feuillet e MacDougal, 2007). Diversas espécies possuem importância econômica, já que algumas são cultivadas como plantas ornamentais devido à beleza de suas flores, outras fornecem frutos comestíveis e algumas ainda possuem valor medicinal e tem sido usadas na medicina por anos (Killip; 1938; Judd et al., 1999).

O gênero caracteriza-se por exibir vários caracteres florais únicos, incluindo séries múltiplas de filamentos da corona, a qual varia grandemente no gênero, presença de opérculo, androginóforo e elaborados nectários florais (Ulmer e MacDougal, 2004). Passiflora atualmente é dividido em cinco subgêneros: Deidamioides (Harms) Killip, Decaloba (DC.) Rchb, Astrophea (DC.) Mast, Passiflora (Feuillet & MacDougal 2003) e Tetrapathea (DC.) P. S. Green (Krosnick et al. 2009). Contudo, a sistemática de Passiflora ainda não está completamente elucidada, sendo que de acordo com Krosnick et al. (2013), as relações infragenéricas em Passiflora ainda são pouco compreendidas.

Em uma análise bastante completa do subgênero Decaloba, Krosnick et al. (2013) obtiveram resultados indicando que as análises moleculares combinadas forneceram novos insights sobre a evolução do subgênero, resultando na identificação de clados que necessitam de revisão, no que diz respeito aos caracteres morfológicos, evolução cromossômica e/ou clonagem molecular. Considerando que alguns aspectos taxonômicos do gênero permanecem desconhecidos, existe a necessidade de revisão dos caracteres morfológicos, bem como adição de novos caracteres, utilizados para a delimitação de alguns níveis infragenéricos.

Nesse sentido, estudos morfoanatômicos de frutos podem ser úteis, uma vez que frutos e sementes podem apresentar caracteres importantes para a caracterização de grupos, especialmente por serem unidades relativamente conservadas filogeneticamente (Roth, 1977), exibirem pequena plasticidade fenotípica e estarem envolvidos na dispersão de sementes por agentes bióticos e abióticos (Von Teichman e Van Wyk, 1991; Barroso et al., 1999). Ainda que haja considerável diversidade carpológica no gênero, a anatomia do pericarpo de Passiflora é pouco conhecida ou desconhecida para maioria das espécies (Ulmer e MacDougal, 2004). Considerando a importância econômica, ecológica e a riqueza de espécies de Passiflora, bem como a ausência de estudos anatômicos dos frutos do gênero, o objetivo deste estudo foi analisar a ontogenia dos frutos de espécies neotropicais de Passiflora, com o intuito de identificar padrões comuns e/ou diferenças no desenvolvimento, bem como discutir possíveis relações entre os caracteres e o ambiente, utilizando dados da literatura. Além disso, foi objetivo do trabalho avaliar a possível

presença de caracteres diagnósticos, que possam contribuir na caracterização das espécies e/ou de outros níveis taxonômicos. Para isso o presente trabalho analisou a ontogenia de quatro espécies e a anatomia do pericarpo maduro de outras seis espécies, encontradas em diferentes tipos vegetacionais - Passiflora morifolia Mast. pertencente ao subgênero Decaloba, superseção Bryonioides (Harms.) M. MacDougal & Feuillet e, as demais pertencentes ao subgênero Passiflora, distribuídas em quatro das seis superseções: Passiflora cincinnata Mast. (superseção Passiflora), Passiflora coccinea Aubl. (superseção Coccinea Feuillet & MacDougal), Passiflora alata Curtis (superseção Laurifolia (Cervi) Feuillet & MacDougal), Passiflora edmundoi Sacco (superseção Stipulata Feuillet & MacDougal, seção Kermesinae (Cervi) Feuillet & MacDougal), Passiflora foetida L. (superseção Stipulata, seção Dysosmia DC.), Passiflora eichleriana Mast., Passiflora elegans Mast., Passiflora gibertii N. E. Brown, e Passiflora mucronata Lam. (superseção Stipulata, seção Granadillastrum Triana & Planch.).

Material e Métodos

Foram coletados entre dez e 30 botões florais e flores em antese e, entre três a 30 frutos em diferentes estádios de desenvolvimento, a partir de dois a cinco indivíduos cultivados e de populações naturais. Para análise da ontogenia foram selecionadas as espécies P. morifolia, P. foetida, P. mucronata e P. gibertii (Figs. 1A-F). Com intuito de facilitar a análise comparativa dos taxa, foram definidos quatro estádios de desenvolvimento do fruto para descrição das espécies, de acordo com eventos de divisão, alongamento e maturação celular do mesocarpo: I – Ovário proveniente de botões florais e de flor em antese, selecionados com base na variação do seu comprimento (Fig. 1A); II – Fruto em desenvolvimento I, onde prevalece o crescimento em comprimento (Fig. 1B); III – Fruto em desenvolvimento II, divisões celulares mais restritas ao mesocarpo externo; prevalecendo o alongamento celular nas demais regiões (Figs. 1C e E); e IV – Fruto maduro, evidenciando a maturação dos tecidos (Figs. 1D e F). A ontogenia de quatro espécies foi considerada suficiente para compreender o desenvolvimento do pericarpo, com as diferenças mais acentuadas sendo observadas no estádio IV. Dessa forma, optou-se pela realização de estudo anatômico do pericarpo maduro de outras seis espécies: P. alata, P. cincinnata, P. coccinea, P. edmundoi, P.

eichleriana e P. elegans. Os materiais testemunho foram depositados no herbário da Universidade Estadual de Campinas sob os números: P. alata - Gurski UEC 182753, P. cincinnata - Gurski UEC 178288, P. coccinea - Gurski UEC 179005, P. edmundoi - Gurski UEC 179002, P. eichleriana - Lorenzi HPL 06331, P. elegans - Lorenzi HPL 06478, P. foetida - Gurski UEC 179000, P. gibertii – Salviani e Lorenzi HPL 06336, P. morifolia - Lorenzi HPL 06308 e P. mucronata - Gurski UEC 179006. Parte do material foi fixado em FAA (formaldeído, ácido acético, etanol 50%; 1:1:18 v/v) por 24 horas para o estudo anatômico e, parte em Formalina Neutra Tamponada 4% por 48 horas, para realização de testes histoquímicos (Johansen, 1940). Para o estudo anatômico e histoquímico, o material foi submetido à série de desidratação etanólica e posteriormente, incluído em 2-hidroxietil-metacrilato. O material foi cortado em secções (transversais e longitudinais) com 8 μm de espessura usando um micrótomo rotativo. Os cortes foram corados com Azul de Toluidina a 0,05% em tampão acetato, pH 4,7 (O'Brien et al., 1964 modificado) e as lâminas montadas temporariamente em água. Para a análise histoquímica as secções foram submetidas aos seguintes reagentes: Vermelho de Rutênio (Jensen, 1962) para identificar polissacarídeos diversos e pectinas; Ácido periódico e Reagente de Schiff (PAS) (McManus, 1948) para polissacarídeos totais; Lugol (Johansen, 1940) para a detecção de amido; Sudan Black B (Pearse, 1980), para a detecção de substâncias lipídicas; Sulfato Azul do Nilo (Cain, 1947) para lipídios ácidos e neutros; Xylidine Ponceau (Cortelazzo e Vidal, 1991) e Aniline Blue Black (Fisher, 1968) para proteínas totais e Cloreto de Ferro III (Johansen, 1940) para compostos fenólicos. Fotomicrografias foram obtidas com câmera digital (Olympus DP71) acoplada ao microscópio óptico (Olympus BX51). A descrição dos resultados e imagens ilustradas são os mais representativos para todas as espécies estudadas, sendo que as variações e peculiaridades de cada espécie foram apresentadas quando necessário. A terminologia adotada para definir as camadas de pericarpo está de acordo com Roth (1977), a nomenclatura utilizada para descrever o tipo de fruto foi baseada em Barroso et al. (1999) e a nomenclatura utilizada para descrever o formato dos frutos foi baseada em Radford et al. (1974).

Resultados

Morfologia do fruto

O fruto maduro das dez espécies é simples e indeiscente (Fig. 2A-I). O formato apresentou grande variabilidade entre as espécies, sendo obovoide em P. gibertii (Fig. 1D) e em P. alata (Fig. 2A); ovoide a globoso em P. eichleriana (Fig. 2B) e em P. elegans (Fig. 2C); subgloboso em P. foetida (Fig. 2D); ovoide em P. cincinnata (Fig. 2E), em P. coccinea (Fig. 2F), em P. morifolia (Fig. 2G) e em P. mucronata (Fig. 2H); e, oblongo- elipsoide em P. edmundoi (Fig. 2I). A cor dos frutos também variou bastante, sendo alaranjado em P. gibertii (Fig. 1D); amarelos em P. alata (Fig. 2A) e em P. foetida (Fig. 2D); amarelo-claro em P. eichleriana (Fig. 2B) e em P. elegans (Fig. 2C); verdes em P. cincinnata (Fig. 2E), em P. mucronata (Fig. 2H) e em P. edmundoi (material fixado); verde com manchas amarelo-esverdeadas em P. coccinea (Fig. 2F); e, roxo-azulado em P. morifolia (Fig. 2G). Anatomia do fruto

Estádio I

O estádio inicial de desenvolvimento do fruto consiste no ovário dos botões florais e de flores em antese. O ovário é súpero (Fig. 1A), tricarpelar, sincárpico, unilocular e com placentação parietal (Fig. 3A). A epiderme externa do ovário é uniestratificada e, tanto em secções longitudinais quanto transversais (Figs. 3B e C), apresenta células ligeiramente alongadas no sentido radial, com núcleo conspícuo; há presença de estômatos (Fig. 3A), e tricomas não glandulares unicelulares em P. foetida (Fig. 3A) e em P. morifolia (Fig. 3C). O mesofilo é formado por células parenquimáticas de arranjo compacto e as células próximas às epidermes interna e externa são menores que as demais (Figs. 3A, C e D). Divisões celulares em diversos planos são observadas em todo o mesofilo, sendo que nas células das camadas subepidérmicas, tanto externa quanto interna, observam-se principalmente divisões anticlinais e periclinais descontínuas (Figs. 3B e D). Em P. mucronata (Fig. 3B), em P. foetida (Fig. 3E) e em P. gibertii, idioblastos dispersos contendo drusas são observados. A epiderme interna é uniestratificada, com células ligeiramente alongadas no

sentido radial, núcleo evidente geralmente na região central; é observada a presença de estômatos (Fig. 3D). Na região da placenta as células são papilosas, sendo alongadas radialmente (Fig. 3F). Em P. morifolia tricomas unicelulares são observados na placenta e na base do funículo (Fig. 3G). A vascularização consiste em feixes vasculares colaterais, distribuídos de forma concêntrica na periferia do órgão. Cada carpelo apresenta um feixe dorsal e dois feixes ventrais unidos entre carpelos, distribuídos em uma porção mais interna (Fig. 3A). Em todas as espécies, os feixes vasculares possuem idioblastos associados ao floema (Fig. 3H), contendo polissacarídeos (Fig. 3I) e proteínas (Fig. 3J). Estádio II Neste estádio, o fruto exibe inúmeras divisões celulares e o pericarpo compreende três regiões distintas: o exocarpo, o mesocarpo e o endocarpo (Fig. 4A). O exocarpo é uniestratificado (Figs. 4B-C), recoberto por cutícula, composto por células radialmente alongadas e com presença de estômatos (Fig. 4C), que se mantém até a maturação do fruto. Tricomas não glandulares unicelulares observados nos ovários de P. morifolia (Fig. 4B) e de P. foetida (Fig. 4D) mantêm-se e, conforme o fruto se desenvolve, vão se tornando esparsos, uma vez que o fruto cresce sem produzir outros tricomas. O mesocarpo é parenquimático, apresenta divisões celulares anticlinais e periclinais e pode ser diferenciado em três regiões: o mesocarpo externo, que é constituído por camadas celulares derivadas das camadas subepidérmicas do ovário, composto por uma a três camadas, de células maiores, e por cerca de seis camadas de células menores (Figs. 4A-D); o mesocarpo médio, formado por células parenquimáticas ligeiramente maiores, arredondadas, com paredes finas (Figs. 4A e D), ricas em grãos de amido (Fig. 4E); e, o mesocarpo interno, formado por células parenquimáticas, com pequenos espaços intercelulares, que ficam mais evidentes próximo ao endocarpo (Figs. 4F-G). Os feixes vasculares estão distribuídos especialmente no mesocarpo médio. Verifica-se um aumento no número desses feixes, muitos dos quais completamente diferenciados, com aumento do calibre dos feixes, devido à diferenciação de células xilemáticas e floemáticas, bem como o aumento do número de idioblastos próximos ao floema. Observa-se ainda, a presença de idioblastos com drusas em P. mucronata (Fig. 4C) e em P. gibertii. Nesta espécie ainda são observados idioblastos com compostos fenólicos (Fig. 4G), também presentes em P. morifolia (Fig. 4F). O endocarpo originado a partir da

epiderme interna é uniestratificado recoberto por cutícula fina e com presença de estômatos (Figs. 4F e G). Estádio III

Nesta fase, verifica-se o maior desenvolvimento em volume do fruto imaturo (Figs. 5A-B). O exocarpo permanece uniestratificado, não exibindo modificações marcantes em comparação com o estádio anterior (Figs. 5A-E). O mesocarpo apresenta divisões celulares mais restritas ao mesocarpo externo (Figs. 5B-E). Nessa região do mesocarpo tem início o espessamento e lignificação de algumas células nas camadas subepidérmicas (Figs. 5A-C), culminando na formação de uma faixa contínua de esclereídes (Figs. 5D-E). A lignificação em P. morifolia tem início entre a quarta a sexta camadas subepidérmicas (Figs. 5C-D) e nas demais espécies, a lignificação inicia-se a partir da segunda camada subepidérmica (Figs. 5B e E). Aumenta o número de idioblastos contendo compostos fenólicos dispersos por todo mesocarpo em P. mucronata (Fig. 5A), em P. gibertii (Fig. 5B) e em P. morifolia (Figs. 5D e F). No mesocarpo interno, próximo ao endocarpo, ampliam-se os espaços intercelulares, devido ao afastamento e lise celular (Figs. 5A, F e G). A ampliação desses espaços resulta na formação de um parênquima laxo. Em P. gibertii esses processos não estão restritos ao mesocarpo interno, abrangendo a metade interna do mesocarpo médio, sendo observado o surgimento de grandes espaços, constituindo um aerênquima (Fig. 5B). À medida que o fruto se desenvolve, as células associadas ao floema passam a exibir um aspecto hialino, contrastando com o aspecto denso anterior, devido à ausência de reservas (Fig. 5H), e apresentam resultados negativos para a presença de polissacarídeos e proteínas.

Estádio IV

Este estádio compreende o fruto maduro e inclui a descrição das dez espécies estudadas. Neste estádio ocorrem alterações mais expressivas no mesocarpo que variam desde a presença de parênquima laxo, formação de aerênquima e a compactação de algumas camadas celulares (Figs. 6A-D). Durante o processo de amadurecimento, as células do mesocarpo médio e interno aumentam muito de volume e, conjugado ao processo de lise celular, observa-se aumento no número e tamanho dos espaços intercelulares entre as células mesocárpicas, resultando na formação de parênquima laxo na maioria das espécies (Figs. 6A). Em P. gibertii (Fig. 6B), em P. elegans (Figs. 6C-D), e em

P. eichleriana, ocorre a formação de aerênquima, caracterizado por grandes lacunas em parte do mesocarpo médio e no mesocarpo interno; e, ao contrário do que ocorre nas demais espécies, o pericarpo de P. foetida (Fig. 6E) apresenta redução significativa da espessura, devido ao colapso e compactação de várias camadas de células do mesocarpo interno.

O exocarpo é recoberto por cutícula (Figs. 6F-H), impregnada por compostos lipídicos evidenciada por meio de teste específico (Figs. 6G), mais espessa e com flanges cuticulares em P. cincinnata, que apresenta ainda células exocárpicas de formato trapezoidal (Fig. 6F) e em P. mucronata (Figs. 6G-H). As paredes periclinais externas das células exocárpicas são mais espessas em P. alata, P. foetida, P. morifolia e em P. mucronata (Fig. 6H). Tricomas não glandulares unicelulares e estômatos ainda são observados nos frutos de P. morifolia (Fig. 6I) e tricomas não glandulares pluricelulares unisseriados são observados em P. coccinea (Fig. 6J), que apresenta ainda estômatos. Estômatos também são observados em P. elegans, em P. mucronata e em P. edmundoi (Fig. 6K). Idioblastos contendo compostos fenólicos são encontrados no exocarpo de P. alata (Fig. 6L), de P. foetida (Fig. 6M) e de P. coccinea (Fig. 6J).

O mesocarpo externo é formado mais externamente por camadas de células parenquimáticas e internamente por camadas de esclereídes, cujo espessamento e lignificação acentuam-se neste estádio (Figs. 6F-N). Essas camadas variam em número entre as espécies compondo dois tipos organizacionais: 1) espécies que apresentam uma única camada de células parenquimáticas: P. gibertii, P. elegans, P. mucronata, P. edmundoi (Fig. 6K), P. foetida (Fig. 6M) e P. eichleriana (Fig. 6N); e, 2) espécies que apresentam mais de uma camada de células parenquimáticas: P. cincinnata (Fig. 6F), P. morifolia (Fig. 6I), P. coccinea (Fig. 6J) e P. alata (Fig. 6L). O número de camadas de esclereídes varia muito entre as espécies e foi detalhado na Tabela 1.

Drusas são observadas em células do mesocarpo externo na maioria das espécies, com exceção de P. coccinea e de P. morifolia. Em P. eichleriana, idioblastos contendo drusas estão distribuídos de forma descontínua na primeira camada subepidérmica do mesocarpo externo (Fig. 6N).

Passiflora coccinea apresentou uma característica exclusiva, a presença de proteínas nas células das camadas subepidérmicas do mesocarpo externo evidenciada através de testes específicos (Figs. 7A).

Em P. mucronata (Fig. 7B) e em P. alata (Fig. 7C) observa-se, a formação de grande quantidade de esclerênquima no mesocarpo médio. As esclereídes possuem um formato aproximadamente isodiamétrico, com paredes moderadamente espessas, distribuídos em grupos, abrangendo várias camadas do mesocarpo médio.

Passiflora cincinnata foi a única espécie que apresentou cristais prismáticos distribuídos por todo o mesocarpo (Figs. 6F e 7D), além de grande quantidade de idioblastos contendo drusas (Fig. 7E). Idioblastos contendo drusas também foram observados no mesocarpo interno da maioria das espécies, com exceção de P. coccinea e de P. morifolia. Observou-se ainda, idioblastos contendo compostos fenólicos dispersos no mesocarpo interno da maioria das espécies (Figs. 7F-G), exceto em P. cincinnata, em P. edmundoi e em P. elegans.

O endocarpo mantém sua integridade estrutural (Fig. 7B e 7G-H), com exceção de P. morifolia, cujo endocarpo apresenta um arranjo laxo (Fig. 7F), projetando-se para o interior do fruto em alguns pontos. O endocarpo é recoberto por cutícula (Fig. 7G) e as paredes periclinais externas das células endocárpicas são mais espessas em P. alata, P. cincinnata, P. eichleriana, P. elegans, P. gibertii e em P. mucronata (Fig. 7H).

Os caracteres anatômicos de todas as espécies estudadas estão sumarizados na Tabela 1, com o intuito de comparar os dados apresentados neste estudo.

Discussão Apesar da existência de grande variabilidade morfológica nos frutos de Passiflora, especialmente com relação ao tamanho, cor e alguns caracteres anatômicos, que podem inclusive auxiliar na identificação e caracterização das espécies, os frutos apresentaram grande similaridade, com muitos caracteres homogêneos e unificadores, o que indica a existência de um padrão de desenvolvimento e anatômico para a família.

Algumas características, como por exemplo, exocarpo e endocarpo uniestratificados, com presença de estômatos e cutícula, são bem conservadas e parecem ser comuns não somente nas espécies do gênero, bem como da família Passifloraceae s.l., sendo suas presenças descritas por Milani (2014), em seu estudo ontogenético do fruto de espécies de Passiflora, subgênero Decaloba, seção Xerogona e, por Gonzalez (2010), que analisou a ontogenia dos frutos de espécies dos gêneros Turnera L. e Piriqueta Aubl., ambos os estudos com frutos do tipo cápsula. De modo geral, os estômatos são mais comuns no exocarpo e a ocorrência deles no endocarpo pode estar relacionada com a aeração e ainda com trocas gasosas entre pericarpo e o interior do fruto (Roth, 1977). A cutícula por sua vez, forma uma barreira mecânica contra a penetração de fungos e a ação de insetos herbívoros (Kerstiens, 1996), além de ser a principal barreira à perda de água (Schönherr e Schmidt, 1979).

Dentre as características que variaram entre as espécies, ressalta-se a presença de tricomas não glandulares unicelulares na epiderme externa dos ovários e no exocarpo dos frutos de P. morifolia e P. foetida, e tricomas não glandulares pluricelulares no exocarpo de P. coccinea. A presença de tricomas não glandulares unicelulares em três das espécies estudadas e, pluricelulares em Passiflora citrina J.M.MacDougal e em Passiflora sanguinolenta Mast. & Linden foi constatada por Milani (2014). Gonzalez (2010) também observou tricomas não glandulares unicelulares, estrelados e ainda, tricomas glandulares em espécies de Turnera e Piriqueta. A análise de mais espécies pode vir a revelar o potencial diagnóstico da presença dos tricomas nos frutos de Passifloraceae, contudo, por ora, acredita-se que essa variação não esteja relacionada à filogenia. De modo geral, os tricomas contribuem para a redução da perda de água por transpiração (Levin, 1973), sendo bastante frequentes em frutos jovens, podendo ser perdidos conforme o fruto se desenvolve (Roth, 1977).

Tricomas unicelulares foram encontrados na região da placenta no ovário de P. morifolia, não sendo relatados até o presente para outras espécies da família. Tricomas ovarianos internos têm evoluído independentemente em muitos taxa, diferindo com relação à posição, número, estrutura e função, podendo, por exemplo, atuar como um obturador ou como um tecido de transmissão de pólen especializado; contudo, em muitos casos, a sua

possível função não é evidente (Puff e Igersheim, 1994). Esse parece ser o caso de P. morifolia, uma vez que a posição, direção e a densidade dos tricomas observados não corrobora o papel de obturador (localizados abaixo da micrópila, uns em direção oposta às micrópilas e, com conteúdo citoplasmático pouco denso). Em Arisaema sikokianum (Araceae), por exemplo, os tricomas estão localizados em lado oposto ao dos óvulos e os tubos polínicos crescem entre os tricomas, encurtando a distância até as micrópilas (Fukai, 2004). Já em Jackiopsis ornata (Rubiaceae), assim como neste estudo, os tricomas não parecem ter uma função evidente e os autores descartaram a possibilidade de que atuem como obturador, devido a sua posição e distribuição dentro do lóculo (Puff e Igersheim, 1994).

Uma característica encontrada nas espécies durante os estádios iniciais de desenvolvimento foi a presença de idioblastos associados aos feixes vasculares voltados para o floema, contendo proteínas e polissacarídeos. Estes idioblastos vão se tornando escassos à medida que o pericarpo se desenvolve e não foram observados nos frutos maduros, sugerindo que haja uma mobilização dessas substâncias durante o crescimento do fruto e das sementes. Esses idioblastos também foram descritos por Milani (2014) para todas as espécies estudadas e, por Gonzalez (2010); entretanto, nas espécies de Turnera e de Piriqueta, esses idioblastos floemáticos apresentaram taninos. Da mesma forma, a presença de grãos de amido, abundantes nos ovários e frutos jovens, não foi detectada nos frutos maduros, sendo que, de acordo com Roth (1977), o amido é gradualmente reduzido durante a maturação do fruto, sendo transformado em outros tipos de polissacarídeos. A presença de cristais de oxalato de cálcio no formato de drusas, além de cristais prismáticos em P. cincinnata, distribuídos em idioblastos isolados ou em pequenos grupos, foi constatada no ovário e no mesocarpo da maioria das espécies, com exceção de P. coccinea e de P. morifolia. Drusas foram observadas no mesocarpo de P. capsularis L. e P. cervii Milward-de-Azevedo por Milani (2014) e, Gonzalez (2010) constatou a presença de drusas no ovário das espécies estudadas, além de uma capa cristalífera no mesocarpo externo dos frutos de Piriqueta racemosa (Jacq.) Sweet.e P. cistoides (L.) Griseb. subsp. caroliniana (Walter) Arbo. A deposição de oxalato de cálcio pode fornecer suporte mecânico, proteção contra herbívoros (Molano-Flores, 2001), ou ainda estar relacionada com o controle do excesso de cálcio na planta (Webb, 1999), o que parece ser o mais

provável neste estudo, considerando a quantidade e distribuição dos cristais nas espécies. De qualquer modo, parece não haver consenso entre os autores em torno de um único significado funcional dos cristais nas plantas. O número de camadas de esclereídes no mesocarpo externo variou bastante entre os frutos estudados, mas esteve presente em todas as espécies, inclusive em P. morifolia (subgênero Decaloba). Essa é uma constatação interessante, uma vez que esse anel de esclereídes não ocorre em P. suberosa L. (subgênero Decaloba, superseção Cieca) e nem em espécies da seção Xerogona estudadas (subgênero Decaloba, superseção Decaloba) (Milani, 2014). Em espécies de Turnera e Piriqueta, braquiesclereídes desenvolvem-se a partir de células de camadas externas, médias ou internas do mesofilo ovariano, além de ocorrer o desenvolvimento de macroesclereídes em algumas espécies (Gonzalez, 2010). Gonzalez (2010) definiu sete tipos de desenvolvimento dos frutos, com dois tipos básicos de estrato mecânico, com as braquiesclereídes constituindo um cilindro contínuo ou formando grupos. Acredita-se que esse caráter tenha um valor diagnóstico com potencial taxonômico, já que seis espécies estudadas, todas pertencentes à superseção Stipulata, compartilham um padrão de desenvolvimento similar, apresentando a lignificação a partir da segunda camada subepidérmica, o que não ocorre nas espécies das outras superseções. Apesar de todas as espécies terem apresentado parênquima laxo, o grau de desenvolvimento deste tecido variou bastante entre as espécies estudadas. Passiflora gibertii, P. eichleriana e P. elegans, espécies higrófitas, encontradas no interior de matas, apresentam aerênquima amplo. O aerênquima geralmente está associado à dispersão pela água ou em frutos alados, mas também se desenvolve em outros tipos de frutos (Roth, 1977). O parênquima laxo não é tão desenvolvido em P. edmundoi, P. mucronata, P. cincinnata, P. morifolia e em P. alata, espécies heliófitas, encontradas em caatinga, restinga e, as três últimas em cerrado, ambientes com condições bastante restritivas. Considerando a natureza dos carpelos, que é usualmente considerado uma folha modificada, na qual a parte laminar prevalece (Roth, 1977), acredita-se que um parênquima laxo menos desenvolvido poderia evitar a perda excessiva de água pelo fruto, auxiliando na manutenção do teor de umidade do pericarpo, à semelhança do que ocorre em folhas. Nestes órgãos, menos espaços intercelulares minimizam a exposição das superfícies,

evitando a perda excessiva de água, sendo uma característica comum em plantas de ambientes mais secos (Fahn, 1990). Três dessas espécies também compartilham outras particularidades que podem estar relacionadas a ambientes com menor disponibilidade de água, tais como, a cutícula espessa do exocarpo (P. mucronata e P. cincinnata), que impede uma excessiva perda de água, uma vez que cutícula e/ou ceras agem como barreiras parciais a saída de vapor de água do fruto para o meio (Nobel, 1983); e, um tecido esclerenquimático bem desenvolvido no mesocarpo médio (P. mucronata e P. alata). Frutos do tipo baga usualmente são caracterizados pela ausência de tecidos lignificados, mas em alguns casos, o pericarpo pode consistir de uma combinação de parênquima e esclereídes em diferentes proporções (Roth, 1977). O esclerênquima, de acordo com Roth (1977), atua como um tecido de suporte em alguns frutos carnosos, ajudando a proteger a semente de injúrias, podendo ainda, ter valor taxonômico. No caso de P. alata, cujo fruto possui de 8-11 cm de comprimento e 5-8 cm de largura (Ulmer e MacDougal, 2004), o esclerênquima parece ter um papel relevante como tecido de suporte, especialmente quando consideramos as grandes dimensões do fruto. Além disso, a presença de tecidos lignificados é uma característica associada a plantas xerófitas (Dickison, 2000). De modo geral, muitas espécies apresentam características morfoanatômicas que as capacitam não apenas a sobreviver, mas também a se desenvolver em ambientes com condições restritivas. Nesse ponto, muitas espécies do cerrado, da caatinga e da restinga convergem, apresentando caracteres xeromórficos típicos. Apesar das espécies que apresentam aerênquima bem desenvolvido serem todas da superseção Stipulata, seção Granadillastrum, acredita-se que esse caráter não tem valor diagnóstico, uma vez que não ocorre em P. mucronata, outra espécie representante da seção e, parece ter mais relação com o tipo de ambiente em que as espécies se encontram. Chiarini e Barboza (2009), por exemplo, estudando a anatomia do fruto de dez espécies de Solanum seção Acanthophora Dunal, sugeriram que a variação morfológica nestas espécies estaria mais associada a condições ecológicas e reprodutivas, que à filogenia. Passiflora foetida por sua vez, apresentou menor número de camadas do pericarpo maduro, devido ao fato de que camadas do mesocarpo interno foram comprimidas, resultando em um pericarpo de espessura bastante reduzida. Essa espécie heliófita, pode ser encontrada em diferentes tipos vegetacionais e, segundo Bernacci et al. (2013), é

encontrada em todos os estados brasileiros, comportando-se como invasora em áreas degradadas. Dentre as características de espécies colonizadoras, destaca-se a tendência de se reproduzir rapidamente, apresentando estratégias reprodutivas de baixo custo (Baker, 1955). Nessa espécie, os frutos são bem pequenos (Ulmer e MacDougal, 2004), e dessa forma, acredita-se que um pericarpo mais fino poderia ser vantajoso, uma vez que permitiria acomodar uma maior quantidade de sementes. Por fim, P. coccinea, encontrada na Floresta Amazônica em áreas não inundadas, foi a espécie que apresentou mais características exclusivas, tais como tricomas não glandulares pluricelulares, maior número de camadas de esclereídes no mesocarpo externo e proteínas acumuladas nas camadas subexocárpicas. Em geral, com exceção dos legumes, os frutos são pobres em proteínas (Roth, 1977), contudo Araújo et al. (2004) mediram a atividade biológica de proteínas totais presentes em várias polpas de frutos tropicais, e a polpa do maracujá apresentou a maior quantidade de proteínas (0,8 mg de proteínas/g de polpa) entre as amostras testadas. Nesse sentido, estudos complementares sobre as proteínas presentes no fruto de P. coccinea seriam interessantes e estes, inclusive, poderiam constituir uma fonte alimentar de bom valor nutricional, na alimentação humana e/ou animal. Com relação ao maior número de camadas de esclereídes, acredita-se que estas podem proporcionar uma maior proteção contra a predação dos frutos e sementes.

Muitas características de sementes e frutos são consideradas adaptações para a dispersão de sementes (Pijl, 1982). No caso específico de Passiflora, de acordo com Ulmer e MacDougal (2004), a natureza dos seus frutos está intimamente relacionada ao mecanismo de dispersão para cada espécie, sendo que as sementes de quase todas são dispersas por animais, principalmente por pássaros e mamíferos.

Além de caracteres relacionados à dispersão dos frutos, outras características parecem estar relacionadas com a proteção contra a predação. De acordo com Pijl (1982), a proteção contra o consumo prematuro é característica das espécies dispersas por pássaros e, nas espécies desse estudo, ela parece ser provida pela camada protetora formada pelo exocarpo mais o anel de esclereídes. Chiarini e Barboza (2009) destacaram a presença de hipoderme colenquimatosa na maioria das espécies de Solanum por eles estudadas, com a formação de colênquima esclerificado em algumas. Essa hipoderme colenquimatosa,

segundo os autores, pode tornar o fruto mais resistente à deformação e, possivelmente, seja uma defesa contra o ataque de insetos fitófagos.

Aliado à presença do anel de esclereídes, em três espécies (P. alata, P. coccinea e P. foetida) observou-se o acúmulo de compostos fenólicos nas células exocárpicas. A distribuição desses compostos nas camadas epidérmicas e subepidérmicas pode representar uma função protetora contra ataques de insetos e patógenos (Schmid, 1972). Essa é uma importante consideração, pois, caracteres dos frutos, geralmente, são interpretados em relação a interações com vertebrados, enquanto ataques de insetos e patógenos, os quais são mais importantes, são negligenciados (Tewksbury, 2002). A predação por insetos, por exemplo, frequentemente é considerada a maior causa de mortalidade das sementes, especialmente nas regiões tropicais (Janzen, 1982; Sallabanks & Courtney, 1992).

Idioblastos contendo compostos fenólicos também foram observados no mesocarpo de cinco das espécies estudadas. Os compostos fenólicos incluem uma classe muito ampla de substâncias, tais como os flavonoides, taninos, ligninas, antocianinas, entre outros (Vermerris e Nicholson, 2008), cujas funções na planta são muito variadas. Em frutos carnosos, os compostos fenólicos são sintetizados por vias metabólicas durante o desenvolvimento e a maturação dos frutos, atuando em mecanismos de defesa, atratividade e como antioxidantes (Pourcel et al., 2007). De acordo com Veberic et al. (2008), os compostos fenólicos são um importante constituinte dos frutos, pois, contribuem com a coloração, sabor e propriedades nutritivas dos mesmos.

Dessa forma, acredita-se que características morfoanatômicas dos frutos e sementes de Passiflora, não estejam apenas relacionadas aos dispersores, mas ainda, à pressão de predação. Enquanto caracteres como a presença de mesocarpo majoritariamente parenquimático (que não oferece tanta resistência à retirada das sementes por vertebrados), aliado à presença de sarcotesta e arilo nas sementes, sejam adaptações que incentivam a remoção de sementes por frugívoros (Pijl, 1972; Janzen, 1982), o exocarpo com cutícula e presença de compostos fenólicos, por exemplo, juntamente com o anel de esclereídes podem atuar como uma barreira protetora, limitando o acesso de alguns insetos predadores de sementes.

Krosnick et al. (2013) examinando as variações nos caracteres morfológicos e relacionando-as com estudos sobre interações planta-animal em espécies de Passiflora, destacaram que a diversidade morfológica observada nos caracteres, sem dúvida, foi influenciada pelas inúmeras associações ecológicas que Passiflora possui, tanto com polinizadores quanto com herbívoros.

Apesar de caracteres morfoanatômicos serem bastante estáveis, acredita-se que eles sofram a influência de fatores seletivos ambientais, como a interação com dispersores, predadores, além de condições climáticas de seus habitats. A maioria dos caracteres anatômicos dos frutos de espécies de Passiflora são bastante conservados e unificadores dentro do gênero, contudo, existem algumas características diferenciais bastante relevantes que, se combinadas, podem inclusive auxiliar na identificação de espécies, tais como tricomas pluricelulares e presença de proteínas no mesocarpo externo de P. coccinea ou ainda, presença de cristais prismáticos apenas em P. cincinnata. Além disso, a localização do anel de esclerênquima é um caráter com potencial diagnóstico, uma vez que esse caráter é variável, ocorrendo diferentes padrões de desenvolvimento entre espécies de diferentes superseções do subgênero Passiflora. Assim, acredita-se que esses dados contribuam para o conhecimento da biologia de Passiflora e que, conjugados a futuros dados para outras espécies, possam ter valor diagnóstico, auxiliando na caracterização das espécies e até mesmo de níveis infragenéricos.

Agradecimentos As autoras agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo suporte financeiro e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de doutorado de C. Gurski (Processo nº 148500/2012-9). À Dra. Julie H. A. Dutilh, à Dra. Veridiana de L. W. Bramante, ao Dr. João Semir, ao Sr. Antonio Campos Rocha, ao Sr. Claudemir Dalponti e ao Sr. Mauro Peixoto, pelo auxílio na coleta das espécies; ao Dr. Harri Lorenzi e ao Jardim Botânico de Bauru, por permitirem o acesso às instalações e suporte para a coleta de material botânico.

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Tabela 1. Caracteres anatômicos observados em frutos maduros de dez espécies de Passiflora L. Exocarpo Mesocarpo Endocarpo Espécie Cutícula Tricoma (tipo) Idioblastos Idioblastos Início da Número de Mesocarpo Esclerênquima Idioblastos Parede fenólicos cristalíferos lignificação camadas de interno no mesocarpo fenólicos Periclinal (tipo) (camada esclereídes médio Externa subepidérmica (mesocarpo Espessa externa) externo) P. alata Fina Ausente Presente drusas nona 3 Parênquima Presente Presente Presente laxo P. cincinnata Espessa, Ausente Ausente drusas e quarta 5-6 Parênquima Ausente Ausente Presente com cristais laxo flanges prismáticos P. coccinea Fina Presente Presente Ausente terceira 7 Parênquima Ausente Presente Ausente (pluricelular) laxo P. edmundoi Fina Ausente Ausente drusas segunda 1-2 Parênquima Ausente Ausente Ausente laxo P. eichleriana Fina Ausente Ausente drusas segunda 1-2 Aerênquima Ausente Presente Presente P. elegans Fina Ausente Ausente drusas segunda 3 Aerênquima Ausente Ausente Presente P. foetida Fina Presente Presente drusas segunda 2 Células Ausente Presente Ausente (unicelular) comprimidas P. gibertii Fina Ausente Ausente drusas segunda 6 Aerênquima Ausente Presente Presente P. morifolia Fina Presente Ausente Ausente quinta 5 Parênquima Ausente Presente Ausente (unicelular) laxo P. mucronata Espessa, Ausente Ausente drusas segunda 2-3 Parênquima Presente Presente Presente com laxo flanges

Fig. 1. Morfologia dos botões florais, flor em antese, ovário e frutos de Passiflora gibertii. (A) Estádio I - botões florais, flor em antese e, detalhe do ovário (seta). (B) Estádio II – frutos em desenvolvimento. (C) Estádio III – frutos em desenvolvimento. (D) Estádio IV – fruto maduro. (E) Secção transversal do fruto em desenvolvimento. (F) Secção transversal do fruto maduro. Barras em (A, E) = 10 mm, (B) = 5 mm, (C, D, F) = 20 mm.

Fig. 2. Morfologia dos frutos maduros de espécies de Passiflora. (A) Passiflora alata. (B) Passiflora eichleriana. (C) Passiflora elegans. (D) Passiflora foetida. (E) Passiflora cincinnata. (F) Passiflora coccinea. (G) Passiflora morifolia. (H) Passiflora mucronata. (I) Passiflora edmundoi (fixado). Barras em (A) = 2 cm e em (B-H) = 1 cm.

Fig. 3. Estádio I - Ovários de botões florais e de flores em antese de espécies de Passiflora foetida (A, E, J), Passiflora mucronata (B, H-I), Passiflora morifolia (C-D, G) e Passiflora gibertii (F). Secções longitudinais (C-E), secções transversais (A, B, F-J). (A) Vista geral do ovário, no destaque, notar o estômato na epiderme externa. (B) Parede ovariana, evidenciando a epiderme externa, drusas e as divisões celulares no mesofilo ovariano (setas). (C) Parede ovariana, mostrando a epiderme externa com tricomas não glandulares, mesofilo ovariano e epiderme interna com estômatos (setas). (D) Parede ovariana, observar a epiderme interna com estômatos e divisões celulares no mesofilo (setas). (E) Parede ovariana, evidenciando as drusas (setas), vistas sob luz polarizada. (F) Região da placenta, evidenciando células papilosas, alongadas radialmente (setas). (G) Região da placenta, evidenciando os tricomas unicelulares na placenta e na base do funículo (setas). (H-J) Detalhe de feixe vascular, com idioblastos associados ao feixe (setas em H) e idiobastos corados com Reagente de Schiff (PAS), indicando a presença de polissacarídeos (seta em I) e evidenciando a presença de idioblastos corados com Xylidine Ponceau, indicando a presença de proteínas (seta em J). ee, epiderme externa; ei, epiderme interna; es, estômato; fd: feixe dorsal; ft: feixe ventral; fv: feixe vascular; mo, mesofilo ovariano; ov, óvulo; tr, tricoma não glandular. Barras em (A) = 200 µm, (B), (E), (H) e (J) = 20 µm, (C), (D) e (F-G) = 50 µm, (I) = 10 µm.

Fig. 4. Estádio II - Frutos em desenvolvimento de Passiflora mucronata (A, C), Passiflora morifolia (B, E, F), Passiflora foetida (D) e Passiflora gibertii (G). Secções transversais. (A) Aspecto geral do pericarpo com exocarpo uniestratificado, mesocarpo externo, médio e interno parenquimáticos e, endocarpo uniestratificado; notar um feixe vascular dorsal bem desenvolvido (seta). (B) Detalhe do exocarpo evidenciando um tricoma não glandular unicelular (seta), e do mesocarpo externo com células pequenas. (C) Detalhe do exocarpo, observar a presença de estômato e mesocarpo externo com drusas (setas). (D) Aspecto geral do pericarpo, ilustrando feixes vasculares distribuídos no mesocarpo médio e drusas (setas), além de tricomas não glandulares unicelulares no exocarpo. (E) Aspecto geral do pericarpo ilustrando a grande quantidade de grãos de amido, evidenciados através do teste com Lugol, concentrados principalmente no mesocarpo médio (setas).

(F) Detalhe do endocarpo uniestratificado, evidenciando a presença de estômato, idioblastos com compostos fenólicos nas células do mesocarpo interno e espaços intercelulares (setas). (G) Detalhe do endocarpo, observar estômato, além de compostos fenólicos nas células do mesocarpo interno e espaços intercelulares (seta). en, endocarpo; ex, exocarpo; es, estômato; if, idioblastos fenólicos; me, mesocarpo externo; mi, mesocarpo interno; mm, mesocarpo médio; tr, tricoma não glandular. Barras em (A), (C) = 50 µm, (B) = 200 µm, (D) = 100 µm, (E-H) = 20 µm.

Fig. 5. Estádio III - Frutos em desenvolvimento de Passiflora mucronata (A, H), Passiflora gibertii (B), Passiflora morifolia (C-D, F) e de Passiflora foetida (E, G). Secções transversais. (A) Aspecto geral do pericarpo, notar os idioblastos fenólicos no mesocarpo e os espaços intercelulares no mesocarpo interno (setas). No detalhe, observar exocarpo e mesocarpo externo, onde tem início o espessamento e lignificação das células na segunda camada subepidérmica (seta) e presença de estômato. (B) Mesocarpo com idioblastos fenólicos (setas) e grandes espaços no mesocarpo, constituindo o aerênquima. No detalhe, exocarpo e mesocarpo externo, onde tem início o espessamento e lignificação na segunda camada subepidérmica (seta). (C) Detalhe do exocarpo e do mesocarpo externo, onde tem início a lignificação a partir da sexta camada subepidérmica (seta). (D-E) Mesocarpo externo com uma faixa de esclereídes praticamente contínua (seta), notar os idioblastos fenólicos em (D) e presença de estômato no exocarpo em (E). (F) Detalhe do endocarpo com estômato e de camadas do mesocarpo interno com espaços intercelulares (setas), além de idioblastos fenólicos. (G) Detalhe do endocarpo e do mesocarpo interno com espaços intercelulares, evidenciando a lise celular (seta). (H) Detalhe de um feixe vascular, notar as células associadas ao floema com aspecto hialino, que anteriormente apresentavam aspecto denso, devido à presença de reservas (setas). ar, aerênquima; dr, drusas; es, estômato; if, idioblastos fenólicos. Barras em (A), (C), (F) e (H) = 50 µm, (B) = 200 µm, (E) = 200 µm, (D) = 100 µm, (E) e (G) = 20 µm.

Fig. 6. Estádio IV - Frutos maduros de Passiflora morifolia (A, I), Passiflora gibertii (B), Passiflora elegans (C-D), Passiflora foetida (E, M), Passiflora cincinnata (F), Passiflora mucronata (G-H), Passiflora coccinea (J), Passiflora edmundoi (K), Passiflora alata (L) e de Passiflora eichleriana (N). Secção longitudinal (N). Secções transversais (A-M). (A) Aspecto geral do pericarpo, ilustrando as três regiões do mesocarpo, com aspecto laxo devido aos espaços intercelulares. (B) Aspecto geral do pericarpo, com rompimento celular em grande parte do mesocarpo médio e mesocarpo interno, formando um aerênquima amplo. (C) Mesocarpo externo com faixa de esclereídes contínua e parte do mesocarpo médio, evidenciando espaços intercelulares (setas). Notar estômato no exocarpo. (D) Aerênquima amplo, devido ao rompimento celular em grande parte do mesocarpo médio e mesocarpo interno. Observar estômato no endocarpo. (E) Aspecto geral do pericarpo, com várias camadas do mesocarpo interno colapsadas. (F) Detalhe do exocarpo com células trapezoidais e cutícula espessa com flanges e do mesocarpo externo com cerca de cinco camadas de esclereídes. Notar

idioblastos com cristais prismáticos no mesocarpo externo (setas). (G) Detalhe do exocarpo, evidenciando cutícula espessa, com flanges cuticulares, corada com Sudan Black B, indicando a presença de compostos lipídicos. (H) Detalhe do exocarpo, evidenciando parede periclinal externa espessa, corada com Vermelho de Rutênio (seta). Notar a presença de estômato no exocarpo. (I) Detalhe do exocarpo com estômato (seta) e tricoma não glandular unicelular e do mesocarpo externo com cerca de quatro camadas de esclereídes. (J) Detalhe do exocarpo com idioblasto fenólico (seta) e tricoma não glandular pluricelular e, do mesocarpo externo com cerca de sete camadas de esclereídes. (K) Detalhe do exocarpo com estômato (seta) e do mesocarpo externo com uma camada de esclereídes. (L) Detalhe do exocarpo com idioblastos fenólicos (setas) e do mesocarpo externo com cerca de três camadas de esclereídes. (M) Detalhe do exocarpo com idioblastos fenólicos (setas) e do mesocarpo externo com cerca de duas camadas de esclereídes. (N) Detalhe do exocarpo e do mesocarpo externo com uma camada de esclereídes, notar drusas na primeira camada subepidérmica (setas). ar, aerênquima; es, estômato; me, mesocarpo externo; mi, mesocarpo interno; mm, mesocarpo médio; tm, tricoma não glandular pluricelular; tr, tricoma não glandular unicelular. Barras em (A- B) = 200 µm, (C-D) = 100 µm, (E-H), (J) e (M) = 20 µm e (I), (K-L) e (N) = 50 µm.

Fig. 7. Estádio IV - Frutos maduros de Passiflora coccinea (A), Passiflora mucronata (B, H), Passiflora alata (C, G), Passiflora cincinnata (D-E) e Passiflora morifolia (F). Secção longitudinal (G). Secções transversais (A-F, H). (A) Detalhe do exocarpo e do mesocarpo externo, notar células mesocárpicas coradas com Xylidine Ponceau, indicando a presença de proteínas. (B) Mesocarpo médio com esclerênquima (setas), espaços intercelulares no mesocarpo interno e endocarpo uniestratificado. (C) Detalhe das esclereídes no mesocarpo médio. (D) Mesocarpo interno, evidenciando cristais prismáticos (setas) e algumas células mesocárpicas em processo lítico. (E) Idioblastos com drusas em um feixe vascular, vistos sob luz polarizada. (F) Mesocarpo interno e endocarpo com aspecto laxo. Notar idioblasto fenólico (seta). (G) Detalhe de células endocárpicas com cutícula e idioblastos fenólicos no mesocarpo interno (seta). (H) Mesocarpo interno e detalhe de células endocárpicas com paredes periclinais externas espessas, coradas com Vermelho de Rutênio. Observar drusa no mesocarpo interno (seta). dr, drusas; ec, esclereídes; en, endocarpo; ex, exocarpo; mi: mesocarpo interno. Barras em (A) e (G) = 20 µm, (B), (C), (E) e (H) = 100 µm e (D) e (F) = 50 µm.

Capítulo 2.

Ontogênese dos tegumentos seminais e anatomia de sementes em espécies de Passiflora L. (Passifloraceae)

Cristina GurskiA e Sandra Maria Carmello-GuerreiroB,C

APrograma de Pós-graduação em Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil.

BDepartamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil.

CAutor para correspondência. E-mail: [email protected]

Resumo. Passiflora L. é o maior gênero de Passifloraceae, com mais de 530 espécies de ervas, árvores e lianas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ontogênese dos tegumentos seminais e a morfoanatomia e histoquímica de sementes maduras de espécies de Passiflora, com o intuito de avaliar a possível presença de caracteres diagnósticos, que possam contribuir na caracterização das espécies e/ou de outros níveis taxonômicos. Os óvulos são anátropos, bitegumentados, com o tegumento externo formado por três camadas nas espécies do subgênero Passiflora, e por duas camadas em Passiflora morifolia L., esta espécie apresentou ainda a micrópila em ziguezague. As sementes são bitegumentadas, com sarcotesta e arilo funicular. Durante o desenvolvimento da semente, ocorre alongamento celular diferencial do exotégmen e da endostesta, resultando no endosperma ruminado, que possui proteínas e lipídios armazenados. A testa constitui a sarcotesta, com amido e espessamento em “U” na endotesta. O exotégmen é formado por macroesclereídes em paliçada, e o mesotégmen e o endotégmen formam uma camada obliterada. Apesar da maioria dos caracteres observados serem bastante conservados e unificadores, identificaram-se características diferenciais, como as ornamentações da superfície das sementes, com valor diagnóstico para identificação das mesmas e, o número de camadas dos tegumentos dos óvulos e o tipo de micrópila, que variou entre os subgêneros. Acredita- se que estes caracteres possam ter valor na caracterização das espécies e favorecer a compreensão das relações entre os taxa.

Palavras-chave: morfologia, histoquímica, semente exotestal, Malpighiales.

Introdução

Sementes podem apresentar caracteres importantes para a delimitação de grupos, especialmente por serem os órgãos reprodutivos mais conservados, e assim como os frutos, exibirem pequena plasticidade fenotípica (Von Teichman e Van Wyk 1991). Sementes de espécies de Passiflora L. apresentam ornamentações na superfície que podem ser úteis na identificação de espécies e ter valor taxonômico. O valor diagnóstico da morfologia das sementes de Passiflora foi constatado por vários autores (Killip 1938; Raju 1955; Pérez-Cortéz et al. 1995; MacDougal 1994; Deginani 2001; Pérez-Cortéz et al. 2002; Pérez-Cortéz et al. 2005). Dentre os trabalhos que estudaram as sementes de Passifloraceae sensu lato, destacam-se os estudos da embriogênese de Passiflora calcarata Mast. (Raju 1955), estrutura e desenvolvimento do óvulo e sementes de P. foetida L. (Singh 1962), desenvolvimento do arilo em P. suberosa L. e em Turnera ulmifolia L. (Kloos e Bouman 1980), desenvolvimento do saco embrionário em P. edulis L. Sims (Souza et al. 2002), megasporogênese e megagametogênese em P. suberosa (Silvério et al. 2009), anatomia do

tegumento de P. ligularis Juss. (Cárdenas-Hernández et al. 2011) e de várias espécies do gênero Passiflora (Pérez-Cortéz et al. 2005; Pérez-Cortéz et al. 2009) e ontogenia de frutos e sementes de espécies do subgênero Decaloba, seção Xerogona (Milani 2014). Os trabalhos existentes na literatura levam a crer que muitos caracteres, tais como óvulo anátropo e bitegumentado; e, semente exotégmica, com arilo, sarcotesta e endosperma ruminado, por exemplo, são bastante conservados na família. Contudo, considerando os estudos sobre a anatomia do tegumento, parece haver uma variação com relação ao número de tegumentos observados (Pérez-Cortéz et al. 2005; Pérez-Cortéz et al. 2009). Cárdenas- Hernández et al. (2011), por exemplo, estudando P. ligularis, identificou testa e tégmen cada qual com três camadas bem diferenciadas, contudo, o autor reporta que é mais comum na literatura encontrar registro de número reduzido de camadas em cada tegumento, sem especificar se diz respeito à testa ou ao tégmen. Diante disto, ressalta-se a importância de estudos ontogenéticos, que permitem identificar a origem das estruturas encontradas nas sementes, bem como acompanhar o seu desenvolvimento.

Passiflora atualmente é dividido em cinco subgêneros: Deidamioides (Harms) Killip, Decaloba (DC.) Rchb, Astrophea (DC.) Mast, Passiflora (Feuillet & MacDougal 2003) e Tetrapathea (DC.) P. S. Green (Krosnick et al. 2009). Contudo, a sistemática de Passiflora, ainda não está completamente esclarecida, sendo que as relações infragenéricas em Passiflora ainda são pouco compreendidas (Krosnick et al. 2013). Decaloba e Passiflora são os subgêneros com maior número de espécies e diferenciam-se por caracteres vegetativos, florais e citológicos (Hansen et al. 2006; Feuillet e MacDougal 2007). Decaloba inclui mais de 230 espécies, divididas em oito superseções (Krosnick et al. 2013) e está representado nesse trabalho por Passiflora morifolia Mast.. O subgênero Passiflora possui mais de 250 espécies, divididas em seis superseções (Feuillet e MacDougal 2003) e nesse estudo está representado por sete espécies distribuídas em quatro superseções.

A despeito da importância econômica, ecológica e a riqueza de espécies de Passiflora, a morfologia e anatomia dos frutos e sementes é pouco conhecida ou desconhecida para maioria das espécies, entretanto, é certo que há considerável diversidade

no gênero (Ulmer e MacDougal 2004). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a ontogênese dos tegumentos seminais e a morfoanatomia de sementes maduras de espécies de Passiflora, bem como realizar estudo histoquímico, com o intuito de avaliar a possível presença de caracteres diagnósticos, que possam contribuir na caracterização das espécies e/ou de outros níveis taxonômicos.

Material e métodos Para a análise da ontogenia foram coletados entre 10 e 30 botões florais e flores em antese e, entre 20 e 30 frutos em diferentes estádios de desenvolvimento para a retirada dos óvulos e das sementes de quatro espécies do gênero Passiflora, a partir de dois a cinco indivíduos cultivados e de populações naturais: Passiflora foetida L., espécie heliófita encontrada em diferentes tipos vegetacionais, comportando-se como invasora em áreas degradadas; Passiflora gibertii N. E. Brown, espécie que cresce em solos úmidos, sendo encontrada associada a cursos d’água em geral; Passiflora mucronata Lam., espécie heliófita que vive exclusivamente na restinga (subgênero Passiflora); e P. morifolia, espécie heliófita, encontrada em cerrado e floresta pluvial sub-montana (subgênero Decaloba). O estudo ontogenético das quatro espécies mostrou que o desenvolvimento ocorre de modo bastante similar. Dessa forma, foi possível analisar outras espécies apenas em semente madura e ainda assim, ter segurança para delimitar os tecidos (testa e tégmen). Para o estudo anatômico da semente madura, foram coletados frutos maduros de quatro espécies do gênero, todas pertencentes ao subgênero Passiflora: Passiflora cincinnata Mast., espécie heliófita, sendo muito comum em orla de mata e capoeiras; Passiflora alata Curtis, espécie heliófita e seletiva higrófita, que ocorre principalmente nas capoeiras e áreas de restinga litorânea; Passiflora coccinea Aubl., espécie encontrada na Floresta Amazônica em áreas não inundadas; e Passiflora eichleriana Mast., espécie heliófita e seletiva higrófita da orla da floresta, capoeiras e capoeirões. Os espécimes voucher são: (P. alata - C Gurski UEC 182753, P. cincinnata - C Gurski UEC 178288, P. coccinea - C Gurski UEC 179005, P. eichleriana - H Lorenzi HPL 06331, P. foetida - C Gurski UEC 179000, P. gibertii – ER Salviani e H Lorenzi HPL 06336, P. morifolia - H Lorenzi HPL 06308 e P. mucronata - C Gurski UEC 179006).

As descrições morfológicas foram realizadas por meio de observações diretas e em estereomicroscópio Leica modelo MSV266 e as medições foram realizadas com auxílio de paquímetro digital, utilizando-se 25 sementes de cada espécie. Para realizar as descrições, adotou-se a nomenclatura para o gênero, modificada a partir de Cervi (1997) e de Ulmer e MacDougal (2004). Parte do material foi fixado em FAA (formaldeído, ácido acético, etanol 50%; 1:1:18 v/v) por 24 horas para o estudo anatômico e, parte em Formalina Neutra Tamponada 4% por 48 horas, para realização de testes histoquímicos (Johansen 1940). Considerando que a inclusão prévia mostrou-se insatisfatória, devido à dureza do material, o mesmo foi previamente submetido à solução de etilenodiamina 10% por três dias (Carlquist 1982), sendo então, submetido à série de desidratação etanólica e posteriormente, incluído em 2- hidroxietil-metacrilato. O material foi cortado em secções (transversais e longitudinais) com 8 μm de espessura usando um micrótomo rotativo. Os cortes foram corados com Azul de Toluidina a 0,05% em tampão acetato, pH 4,7 (O'Brien et al. 1964 modificado) e as lâminas montadas temporariamente em água. Para a análise histoquímica as secções foram submetidas aos seguintes corantes e/ou reagentes: Ácido periódico e Reagente de Schiff (PAS) (McManus 1948) para polissacarídeos totais; Lugol (Johansen 1940) para a detecção de amido; Sudan Black B (Pearse 1980), para a detecção de substâncias lipídicas; Sulfato Azul do Nilo (Cain 1947) para lipídios ácidos e neutros; Xylidine Ponceau (Cortelazzo e Vidal 1991) e Aniline Blue Black (Fisher 1968) para proteínas totais e Cloreto de Ferro III (Johansen 1940) para compostos fenólicos. Fotomicrografias foram obtidas com câmera digital (Olympus DP71) acoplada ao microscópio óptico (Olympus BX51). Para a realização do exame de superfície em Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), amostras de sementes maduras sem o arilo foram desidratadas em série etanólica até álcool 100%, submetidas ao ponto crítico em um aparelho Bal-Tec CPD 030, montadas em suportes metálicos com fita adesiva de carbono e cobertas com ouro em metalizador Bal-Tec SCD 050 por 180 segundos. As observações foram feitas em um microscópio JEOL JSM 5200, sendo as imagens obtidas em câmera fotográfica JEOL MP. A descrição dos resultados e imagens ilustradas são os mais representativos para todas as espécies estudadas, sendo que as variações e peculiaridades de cada espécie foram

apresentadas quando necessário. A nomenclatura utilizada para descrever as sementes foi baseada em Corner (1976) e Werker (1997) e a nomenclatura utilizada para descrever o formato das sementes foi baseada em Radford et al. (1974). Resultados

Morfologia da semente

As sementes são ligeiramente comprimidas, com funículo longo (Figs. 1a), de coloração variando de marrom escuro a preta, com superfície lisa e brilhante, devido à presença da sarcotesta (Figs. 1b-c) e recobertas completamente por arilo (Figs. 1d-j). O arilo é amarelo em P. alata (Fig. 1d), P. cincinnata (dado não mostrado), P. coccinea (Fig. 1e), P. eichleriana (Fig. 1f) e em P. mucronata (Fig. 1j), branco-translúcido em P. foetida (Fig. 1g), alaranjado em P. gibertii (Fig. 1h) e alaranjado a vermelho em P. morifolia (Fig. 1i).

Com exceção de P. foetida que apresentou um formato oblongo, todas as demais sementes são obovadas. A escultura do tegumento e o tamanho apresentaram-se mais variáveis entre as espécies, sendo apiculada, com margem levemente estriada, foveolada com 200-205 fóveas, 7,5-8,5 x 4,5-6 mm, em P. alata (Fig. 2a); apiculada, com margem inteira, falsamente foveoladas, com 20-22 fóveas, 6-6,5 x 4-5 mm, em P. cincinnata (Fig. 2b); apiculada, com margem inteira e foveolada com 26-28 fóveas, 5,5 x 3,5 mm, em P. coccinea (Fig. 2c); triapiculada, com margem inteira e falsamente foveolada com 15-18 fóveas, 5-5,5 x 3,5-4 mm, em P. eichleriana (Fig. 2d); triapiculada, com margem inteira e foveoladas com 18-20 fóveas, 6-6,5 x 3-4 mm, em P. foetida (Fig. 2e); apiculada, com margem inteira, foveolada com 62-64 fóveas circulares, 6-6,5 x 4-4,5 mm, em P. gibertii (Fig. 2f); apiculada, com margem inteira, foveoladas com 8-9 fóveas, sendo 1-2 grandes na porção central e cerca de 7 fóveas menores ao redor, 4,5-5 x 3,5-4 mm, em P. morifolia (Fig. 2g); e apiculada, com margem inteira, foveoladas com 20 fóveas, com margem dentada, 5 x 3,5-4 mm, em P. mucronata (Fig. 2h).

Óvulo

O óvulo é anátropo e bitegumentado e permanece preso à placenta por funículo longo, onde é possível observar o desenvolvimento do arilo (Figs. 3a-e).

Os tegumentos seminais em P. foetida, P. gibertii e P. mucronata, apresentam três camadas celulares (Figs. 3e-g) e a micrópila, formada pelo exostômio e endostômio, apresenta abertura dos tegumentos coincidentes (Fig. 3a). O tegumento externo em P. morifolia apresenta duas camadas de células contínuas na maior parte de sua extensão (Figs. 3b-d), e entre elas, células são observadas em alguns pontos, proliferando próximo à micrópila (Fig. 3b). Já o tegumento interno apresenta três camadas celulares distintas. Nessa espécie, a micrópila, formada pelo exostômio e endostômio, é do tipo ziguezague, devido às aberturas dos tegumentos não serem coincidentes (Fig. 3b). No tegumento externo, a camada externa é uniestratificada e formada por células um pouco maiores e ligeiramente achatadas tangencialmente (Figs. 3f-h). A camada média encontra-se comprimida e é composta por uma camada de células, proliferando principalmente na região da rafe (Fig. 3g, 3h). A camada interna do tegumento externo é uniestratificada, com células isodiamétricas (Figs. 3f-h).

O feixe vascular é anficrival e atravessa o funículo e a rafe, terminando na calaza, composta por células pequenas de paredes finas, sem emitir extensões (Fig. 3b).

O tegumento interno é constituído por três camadas de células ligeiramente achatadas tangencialmente, menores que as do tegumento externo, com paredes delgadas, citoplasma denso e núcleos evidentes (Figs. 3d-h).

Idioblastos com cristais do tipo drusa foram observados distribuídos na camada média do tegumento externo (Figs. 3b, h) e no funículo (Fig. 3i). Observaram-se ainda grãos de amido nas células que envolvem o feixe vascular e no nucelo, especialmente na região central e próxima a calaza (Fig. 3j).

Durante o desenvolvimento do óvulo, é possível observar a formação do megagametófito, reto (Fig. 3a). O nucelo é constituído por células volumosas, maiores na região central, com paredes delgadas e citoplasma hialino (Figs. 3a-b). Conforme o megagametófito vai se desenvolvendo, é possível observar que as células do nucelo adjacentes a ele vão sendo reabsorvidas, notando-se a presença de resíduos celulares (Figs. 3c, e).

Semente em desenvolvimento

A semente é anátropa, constituída por arilo, testa, tégmen, resquícios de nucelo, endosperma e embrião. A semente aumenta seu tamanho devido principalmente ao desenvolvimento do endosperma e dos tegumentos (Figs. 4a-j; 5a-f).

A diferenciação dos tegumentos ocorre por divisões anticlinais (testa e tégmen) e alongamento radial (endotesta e exotégmen). Nos estádios iniciais do desenvolvimento, a testa é composta pela exotesta com células cuboides e de parede periclinal externa espessa (Figs. 4b-c, 4f-h), além de estômatos, observados em P. mucronata (Figs. 5b, d) e em P. foetida (Fig. 4h). Em P. morifolia observa-se um aumento no número de células na mesotesta e conforme a semente se desenvolve, não é possível notar nenhuma diferença entre as espécies com relação a esse aspecto (Figs. 4b-c). A mesotesta é composta por células parenquimáticas em camada descontínua, ligeiramente retangulares, com espaços intercelulares e aumento do número de camadas em alguns pontos (Figs. 4e-g); na região calazal, o número de camadas é maior que no restante do tegumento (Figs. 4d). A endostesta é constituída por células parenquimáticas inicialmente pequenas e alongadas radialmente (Figs. 4b-c, 4e-g).

O tégmen é composto por três camadas celulares, com citoplasma mais denso (Figs. 4b-c, 4e-g). É constituído pelo exotégmen, inicialmente formado por uma camada de células, visivelmente maiores que as células das outras camadas tégmicas (Figs. 4b, e), e que posteriormente alongam-se radialmente (Figs. 4c, f, g) e lignificam-se (5c-e). O mesotégmen e o endotégmen são compostos cada um por uma camada de células pequenas (Figs. 4b-c, 4e-g).

O crescimento dos tegumentos seminais ocorre por alongamento radial desigual da endotesta e do exotégmen, formando-se projeções cônicas em direção ao nucelo e endosperma, correspondendo às depressões na superfície da semente, resultando em uma escultura bastante única para cada espécie (Figs. 4i-j; 5e-g).

As células do exotégmen começam a alongar-se, e posteriormente, observa-se o alongamento das células da endotesta, intercaladas com regiões onde as células da endotesta permanecem cuboides (Figs. 4c, g; 5d, e, g).

É possível observar que conforme o endosperma vai sendo formado, o nucelo permanece justaposto à camada tegumentar mais interna (Figs. 4j). As células do nucelo restantes e as células do endosperma se acomodam nas projeções formadas pelos tegumentos, resultando no aspecto ruminado (Figs. 4i-j; 5e-f).

A calaza não apresenta modificações marcantes, sendo que a região mais interna, é constituída por células pequenas, com conteúdo citoplasmático denso (Figs. 4d, h; 5c).

Nas sementes em desenvolvimento, constatou-se que a testa, que na semente madura constituirá a sarcostesta, apresenta grande quantidade de grãos de amido, especialmente na endotesta (Figs. 5h-i). Grãos de amido em menor quantidade também foram observados nas células exotégmicas de sementes em desenvolvimento (Fig. 5i). Compostos fenólicos foram observados nas células do endotégmen (Fig. 5j).

Durante o desenvolvimento seminal, o arilo se projeta a partir do funículo para o exterior inicialmente formando uma ligeira borda (Figs. 4a, i; 5f) e culmina recobrindo toda a semente. O arilo é constituído por células parenquimáticas de paredes finas (Fig. 5a, d, k), com cerca de 12 células de espessura na base, diminuindo para poucas camadas celulares na borda (Fig. 5g). Foram observados idioblastos com drusas no arilo de P. mucronata (Fig. 5a), além de idioblastos com compostos fenólicos e grãos de amido nas células do arilo, com uma incidência maior próximo ao funículo (Fig. 5k).

Semente madura

Na semente madura, alterações marcantes ocorrem especialmente nos tegumentos e na região calazal de algumas espécies (Figs. 6a-g; 7a-f). A semente vai sendo completamente envolta por um arilo suculento que não apresenta feixe vascular (Fig. 6a), podendo apresentar idioblastos contendo compostos fenólicos, especialmente na região próxima ao funículo (Fig. 6d).

A testa da semente constitui a sarcosteta, que a olho nu assemelha-se a uma película, sendo composta por exotesta, mesotesta e endotesta. A exotesta é formada por células cuboides grandes, a face periclinal externa mais espessa (Figs. 6b, g; 7a-c, e). A mesotesta se mantém descontínua, formada por células pequenas, ausentes em alguns

pontos (Fig. 6b) e proliferando em outros (Fig. 7a). A endotesta apresenta células grandes, alongadas radialmente e com espessamento em “U” na face periclinal interna, em contato com o exotégmen (Figs. 6b, g; 7a-e). Em P. morifolia (Fig. 6b), em P. cincinnata (Fig. 7b) e em P. mucronata esses espessamentos são pectocelulósicos, mas nas demais espécies esse espessamento é lignificado (Figs. 6g; 7a, c, e). Em P. gibertii divisões periclinais foram observadas na endostesta (Fig. 7c).

As sementes são exotégmicas, com espessamentos de parede lignificados, constituindo a camada de macrosclereídes (Figs. 6b, g; 7a-e). Em P. foetida, foram observadas células com presença de drusas no mesotégmen (Fig. 7f), e, conforme a semente se desenvolve, as duas camadas do tégmen apresentam-se comprimidas junto ao endosperma, não sendo possível delimitá-las (Figs. 6b, g), além de apresentar compostos fenólicos, que se acumulam nas células do mesotégmen e endotégmen.

Na maioria das espécies não foram observadas alterações marcantes na região calazal (Fig. 6c). Contudo, P. coccinea (Fig. 6f) e P. eichleriana (Fig. 7d), apresentam uma hipóstase diferenciada, pouco desenvolvida, reconhecida pelas células com conteúdo fenólico que delimitam, internamente, a calaza.

Observam-se resquícios de nucelo junto ao tégmen (Fig. 6c) e uma grande quantidade de endosperma, cujas células são justapostas (Figs. 6a-c; 7a, c). O embrião é linear, localizado no centro da semente, com plúmula indiferenciada e cotilédones amplos e finos (Figs. 6a-b).

Testes histoquímicos evidenciaram a presença de proteínas no endosperma e nos cotilédones, além de presença de lipídios no endosperma (dados não mostrados).

Discussão As características encontradas nos óvulos e nas sementes de Passiflora estudadas mostraram-se bastante conservadas e unificadoras dentro da família, sendo elas: óvulo anátropo, bitegumentado e com tegumento interno com 2-3 camadas; sementes exotégmicas com arilo funicular e sarcotesta, endosperma ruminado, lipídico e, embrião reto. Essas características já foram destacadas na caracterização da família feita por Corner (1976). Os caracteres encontrados nos óvulos, bem como o embrião reto, ocorrem ainda em

outras famílias de Malpighiales, como Salicaceae, Violaceae (Corner 1976) e Turneraceae (Raju 1956). Com relação à semente, Corner (1976) menciona o exotégmen fibroso de Violaceae e de Turneraceae.

Com relação aos caracteres morfológicos, a combinação de aspectos como tamanho, número de fóveas na superfície das sementes, bem como, ápice e margem, permitem a diferenciação entre as espécies, ficando evidente o valor diagnóstico da superfície das sementes de Passiflora, como já constatado em outros trabalhos (Killip 1938; Raju 1955; Pérez-Cortéz et al. 1995; MacDougal 1994; Deginani 2001; Pérez-Cortéz et al. 2002; Pérez-Cortéz et al. 2005). Caracteres morfológicos das sementes de Passiflora podem ainda ser particularmente úteis na classificação de outros níveis taxonômicos. MacDougal (1994), por exemplo, realizou uma revisão taxonômica da seção Pseudodysosmia do subgênero Decaloba (DC.) Rchb. e dentre os caracteres utilizados para a descrição, estão incluídos o tamanho e as ornamentações da superfície seminal que, de acordo com o autor, são bons caracteres taxonômicos para este gênero. Pérez-Cortéz et al. (2002) realizaram um estudo morfológico de 51 espécies do gênero Passiflora, elaborando uma chave artificial, constatando ser possível identificar 48 das espécies estudadas e concluindo que a ornamentação seminal é de grande valor diagnóstico, sendo útil para a caracterização das mesmas. A micrópila em ziguezague, condição em que a micrópila é formada por ambos os tegumentos, porém, esses não são coincidentes, ocorrente em P. morifolia (Bryonioides (Harms.) M. MacDougal & Feuillet) também foi descrito para P. suberosa (superseção Cieca (Medik.) M. MacDougal & Feuillet) (Silvério et al. 2009) e nas espécies da seção Xerogona (Raf.) Killip (superseção Decaloba (DC.) M. MacDougal & Feuillet) (Milani 2014), bem como em todas as espécies de Piriqueta L. e Turnera L. estudadas por Gonzalez e Arbo (2005). Nas espécies do subgênero Passiflora estudadas, a micrópila, formada pelo exostômio e endostômio, apresenta abertura dos tegumentos coincidentes, que também foi descrita para P. foetida (Singh 1962), P. suberosa (Kloos e Bouman 1980) e P. edulis (Souza et al. 2002). O número de camadas do tegumento externo do óvulo também varia entre as espécies de Passifloraceae s.l.. Em P. morifolia, ele é composto por duas camadas ao longo de sua maior extensão, sendo que em alguns pontos, verifica-se a presença de células entre as duas

camadas, mas não formando uma terceira camada propriamente dita. Nas espécies da seção Xerogona estudadas por Milani (2014), o tegumento externo é formado por duas camadas e em P. suberosa, ele é composto por duas camadas ao longo de sua maior extensão, quatro na porção contígua ao funículo e três em sua porção oposta, apresentando maior espessura na região micropilar (Silvério et al. 2009). Espécies de Piriqueta e Turnera também apresentam o tegumento externo biestratificado (Gonzalez e Arbo 2005). Já nas espécies do subgênero Passiflora estudadas e em P. edulis f. flavicarpa (Souza et al. 2002), o tegumento externo é formado por três camadas bem distintas.

Acredita-se que apesar de ainda não ser possível estabelecer um padrão, o tipo de micrópila e o número de tegumentos externos nos óvulos são caracteres que podem vir a ter valor diagnóstico, sendo característicos de cada subgênero e especialmente constantes para as espécies do subgênero Passiflora. Além disso, esses caracteres podem ser interessantes considerando espécies do subgênero Decaloba, e poderiam auxiliar na classificação de níveis infragenéricos, uma vez que de acordo com Krosnick et al. (2013), as superseções Bryonioides, Cieca e Decaloba formam um clado com monofilia fraca, sem sinapomorfias, sendo que Bryonioides seria irmã de Decaloba.

Em todas as espécies estudadas, inclusive em P. morifolia verifica-se testa com três camadas distintas, sendo também observadas em Passiflora ligularis Juss (Cárdenas- Hernández et al. 2011). Já em Turmera ulmifolia L. (Raju 1956) e em espécies da seção Xerogona e em P. suberosa (Milani 2014), a testa é formada por duas camadas. De acordo com Corner (1976), existe certa uniformidade das sementes no gênero Passiflora, com algumas espécies apresentando testa com duas camadas e outras, três camadas. Parece haver uma constância com relação a esse caráter no subgênero Passiflora, contudo, o mesmo não pode ser afirmado para espécies do subgênero Decaloba.

Peréz-Cortéz et al. (2005), ao contrário, realizando um estudo anatômico de sementes de oito espécies de Passiflora, evidenciaram o mínimo de três a um máximo de cinco camadas celulares, sendo que duas delas foram descritas para todas as espécies e correspondem a camada de macroesclereídes e a camada de células obliteradas que, neste presente estudo, foram identificadas como exotégmen, e mesotégmen e endotégmen, respectivamente, que constitui uma camada obliterada na semente madura. Para P. alata, o

autor observou quatro camadas celulares, em discordância com este estudo. Em um estudo com outras sete espécies (Peréz-Cortéz et al. 2009), os autores também obtiveram resultados divergentes, com a descrição de por exemplo, quatro camadas celulares para P. foetida. Acredita-se que isso se deva ao fato de que tanto a endostesta quanto a mesotesta são bastante delicadas e podem ser perdidas ou danificadas dependendo da técnica utilizada. Uma observação semelhante foi feita por Cárdenas-Hernández et al. (2011). Durante o desenvolvimento da semente e na semente madura de todas as espécies, foi possível observar o espessamento em “U” nas células da endostesta, sendo inclusive lignificado em P. morifolia e em duas espécies do subgênero Passiflora. Peréz-Cortéz et al. (2005) descreveram a presença do espessamento em “U” para quatro das espécies estudadas, incluindo P. alata, corroborando este estudo. Entretanto, Perez-Cortéz et al. (2009) não se referem a esse espessamento para P. foetida, cuja presença foi evidenciada neste presente trabalho. Esse espessamento em “U” parece auxiliar a manter a coesão entre a testa e o exotégmen. Nas espécies estudadas, observam-se estômatos e drusas na exotesta e acúmulo de amido, especialmente na endostesta durante o desenvolvimento da semente. A presença de estômatos na exotesta já havia sido relatada por Raju (1956) em sua descrição de T. ulmifolia e a presença de amido na endotesta foi constatada em espécies da seção Xerogona (Milani 2014). Na semente madura, a testa torna-se suculenta, formando a sarcotesta, uma característica comum às espécies do gênero (Corner 1976) e que, juntamente com o arilo, estão relacionados à dispersão das sementes de Passiflora. Nesse aspecto, as sementes podem ser retiradas a partir do fruto por pássaros, sendo posteriormente extraídas do arilo e descartadas ao invés de serem engolidas (Ulmer e MacDougal 2004). Segundo a classificação de Corner (1976), na qual o tipo de semente é determinado pela posição e estrutura de sua camada mecânica, as sementes são exotégmicas, uma característica comum à família, sendo relatado em estudos sobre a anatomia dos tegumentos (Pérez-Cortéz et al. 2005; Pérez-Cortéz et al. 2009; Cárdenas-Hernández et al. 2011; Milani 2014), com exceção de Raju (1955), que em seu estudo com Adenia venenata não reportou sua ocorrência. Esses estudos também relataram a presença de uma camada de células obliteradas, que neste estudo foram identificadas em estádios anteriores do

desenvolvimento da semente, como células, arranjadas em duas camadas bem distintas: o mesotégmen e o endotégmen. O endotégmen apresentou acúmulo de compostos fenólicos, que também foram observados em outras espécies do gênero (Cárdenas-Hernández et al. 2011; Milani 2014). A presença de compostos fenólicos em tegumentos seminais é amplamente difundida (Werker 1997), podendo proteger a semente contra herbívoros e patógenos, além de conferir impermeabilidade e dureza à semente, muitas vezes atuando como inibidores de germinação (Swain 1979; Werker 1997). Entretanto, considerando a pequena quantidade de compostos fenólicos evidenciados neste estudo, acredita-se que esses papéis não se aplicam as sementes estudadas. Uma hipóstase pouco conspícua ocorreu em duas das espécies estudadas, sendo descritas ainda para algumas espécies de Violaceae e de Turneraceae (Corner 1976) e para as espécies da seção Xerogona (Milani 2014), não sendo observada neste estudo em P. morifolia, também do subgênero Decaloba. De acordo com Von Teichman e Van Wyk (1991) a hipóstase é frequentemente encontrada em óvulo e sementes, ocorrendo em 81 famílias de dicotiledôneas. Segundo Bouman (1984), há uma grande variabilidade na estrutura da hipóstase dependendo da espécie, bem como, nas funções atribuídas a ela.

Outra característica comum à família é a presença de endosperma ruminado, também presente em mais de 32 famílias de Angiospermas. Periasamy (1962 apud Werker 1997) distinguiu sete tipos básicos de ruminação, com base na forma de crescimento das células e, as sementes da família se enquadram na classificação de “tipo Passiflora”, com crescimento por alongamento radial desigual das células da endotesta e do exotégmen, que formam projeções cônicas para o interior da semente, enquanto as células remanescentes do nucelo e o endosperma se acomodam a essas projeções.

Quanto às reservas do óvulo e da semente, evidenciou-se o acúmulo de amido no nucelo, também constatado em P. suberosa (Silvério et al. 2009), além de lipídios no endosperma e, proteínas nos cotilédones, resquícios de nucelo e endosperma da semente madura. De acordo com Ferrari et al. (2004), sementes de P. edulis possuem elevado teor de ácidos graxos insaturados, além de significativo teor proteico e de fibras. Tozzi e Takaki (2011) analisaram os aspectos histoquímicos da mobilização de reservas das sementes de P.

edulis, durante os primeiros dez dias de germinação e constataram que os lipídios presentes no endosperma exercem um papel principal de reserva no início da germinação, com o seu nível diminuindo à medida que ocorre a protrusão da raiz primária. Os autores também destacam o papel dos corpos proteicos, que são degradados à medida que ocorre a germinação e são consumidos quase totalmente quando ocorre a protrusão da raiz primária. Corner (1976) estabeleceu que o endosperma de Passiflora seria principalmente lipídico, assim como o endosperma de espécies das famílias Salicaceae, Violaceae e Turneraceae. Assim, destaca-se que a ocorrência de lipídios parece ser comum não apenas na família Passifloraceae, mas ainda em outras famílias de Malpighiales.

Comparando-se as espécies estudadas, verifica-se que a maioria dos caracteres anatômicos das sementes de Passiflora são bastante homogêneos e unificadores dentro do gênero e corroboram os dados encontrados para a família. Contudo, existem algumas características diferenciais que merecem atenção, tais como as ornamentações da superfície das sementes, com valor diagnóstico para identificação das mesmas; o número de camadas dos tegumentos dos óvulos e o tipo de micrópila que variou entre os subgêneros; além da presença do espessamento em “U” lignificado ou não nas células da endostesta, bem como a presença de hipóstase em duas espécies, que apesar de não poderem ser utilizados como subsídio para classificações infragénericas, podem auxiliar na delimitação das espécies. Acredita-se que estes caracteres possam ter valor na caracterização das espécies e vir a favorecer a compreensão das relações entre os taxa. Além disso, a análise da ontogenia de sementes do gênero Passiflora ampliou o conhecimento sobre a origem e número de tegumentos seminais, eliminando possíveis dúvidas, uma vez que em todas as espécies estudadas, o número de camadas dos tegumentos nunca foi inferior a seis, divergindo de alguns dados encontrados na literatura.

João Semir, ao Sr. Antonio Campos Rocha, ao Sr. Claudemir Dalponti e ao Sr. Mauro Peixoto, pelo auxílio na coleta das espécies; ao Dr. Harri Lorenzi e ao Jardim Botânico de Bauru, por permitirem o acesso às instalações e suporte para a coleta de material botânico.

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Fig.1. Aspectos morfológicos de sementes de Passiflora morifolia (a, i), P. alata (b, d), P. mucronata (c,j), P. coccinea (e), P. eichleriana (f) , P. foetida (g) e P. gibertii (h). (a) Semente com funículo longo (seta). (b-c) Sementes sem arilo, evidenciando a sarcotesta (setas). (d-j) Sementes com arilo. Barras de escala = 2 mm (a- e, g-j) e 1 mm (f).

Fig. 2. Sementes maduras sem arilo e sem sarcotesta em Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) de Passiflora alata (a), P. cincinnata (b), P. coccinea (c), P. eichleriana (d), P. foetida (e), P. gibertii (f), P. morifolia (g), P. mucronata (h). Barras de escala = 1 mm.

Fig. 3. Óvulos de Passiflora foetida (a, i), P. morifolia (b-d, j), P. mucronata (e) e P. gibertii (f-h). Secções longitudinais (a-b, h-j); secções transversais (c-g). (a-b) Aspecto geral do óvulo ligado à placenta através do funículo longo, onde se origina o arilo. Notar drusas no funículo em (b) (seta e detalhe). (c-d) Detalhe do óvulo, evidenciando o tegumento externo com duas camadas e o tegumento interno com três camadas. (e-f) Detalhe do óvulo, mostrando os tegumentos externo e interno, ambos com três camadas. Notar parte do nucelo reabsorvido em (E), com presença de resíduos celulares (seta). (g) Detalhe dos tegumentos, evidenciando a presença de idioblasto com drusa no tegumento externo (seta). (h) Detalhe da rafe. Notar um idioblastos com drusa (seta). (i) Idioblastos contendo drusas (setas) no funículo (luz polarizada). (j) Óvulo corado com Lugol, evidenciando os grãos de amido (setas). ar, arilo; ca, calaza; fv, feixe vascular; me, megagametófito; nu, nucelo; te, tegumento externo; ti, tegumento interno. Barras de escala = 150 µm (a-b), 100 µm (c, j), 20 µm (d, g-i) e 10 µm (f).

Fig. 4. Sementes em desenvolvimento de Passiflora morifolia (a-d, i), P. gibertii (e-f) e P. foetida (g-h, j). Secções longitudinais (a, d-f, h-j); secções transversais (b-c, g). (a) Aspecto geral da semente mostrando o nucelo amplo, o funículo longo e o arilo em desenvolvimento. (b-c) Detalhe dos tegumentos, evidenciando as camadas da testa e tégmen. Notar mesotesta descontínua (seta) e células alongadas do tégmen em (c). (d) Detalhe da calaza. (e-f) Tegumento em fase mais avançada de desenvolvimento, evidenciando o alongamento das células da endostesta e do exotégmen (seta). (g) Tegumento em fase mais avançada de desenvolvimento, evidenciando mesotesta com mais de uma camada celular, alongamento do exotégmen e, células pequenas do meso e endotégmen. (h) Detalhe do feixe vascular. Notar exotesta com células de paredes espessas e presença de estômato (seta). (i-j) Semente em estádio posterior de desenvolvimento, evidenciando os resquícios de nucelo, o endosperma, arilo e o início da formação das projeções dos tegumentos (setas em j). ar, arilo; ca, calaza; ed, endotégmen; eg, exotégmen; en, endosperma; et, endotesta; ex, exotesta; fv, feixe vascular; mg, mesotégmen; mt, mesotesta; nu, nucelo; tg, tégmen; tt, testa. Barras de escala = 200 µm (a, i), 100 µm (g, j), 50 µm (b-f) e 20 µm (h).

Fig. 5. Sementes em desenvolvimento de Passiflora mucronata (a-d), P. foetida (e-g) e P. morifolia (h-k). Secções longitudinais. (a) Detalhe do arilo com presença de idioblasto com drusa (seta). e dos tegumentos, evidenciando as camadas da testa e tégmen. (b) Detalhe da exotesta com células de paredes espessas e

presença de estômato (seta). (c) Detalhe da calaza. (d) Tegumento em fase mais avançada de desenvolvimento, evidenciando a exotesta com estômato (seta), mesotesta bastante proliferada ao redor do feixe vascular e endotesta com células alongadas. Notar ainda, o exotégmen com células alongadas e lignificadas, além do meso e endotégmen com células pequenas de conteúdo denso. (e) Detalhe do tegumento, evidenciando as três camadas da testa e do tégmen e, a ruminação resultante da projeção dos tegumentos. (f) Aspecto geral da semente, evidenciando o endosperma ruminado e o arilo desenvolvido. (h) Detalhe da borda do arilo e dos tegumentos, mostrando as camadas da testa e do tégmen. (h-i) Detalhe da região da calaza e dos tegumentos, respectivamente, ilustrando grãos de amido corados com Lugol (setas), presentes nas células endotestais. (j) Idioblastos corados Cloreto de Ferro III, evidenciando compostos fenólicos nas células do endotégmen. (k) Idioblastos fenólicos e grãos de amido (setas) nas células do arilo, com uma frequência maior próximo ao funículo. ar, arilo; ed, endotégmen; eg, exotégmen; en, endosperma; et, endotesta; ex, exotesta; fv, feixe vascular; if, idioblasto fenólico; mg, mesotégmen; mt, mesotesta; tg, tégmen; tt, testa. Barras de escala = 20 µm (a, i, j), 50 µm (b-e, g, k), 100 µm (f) e. 200 µm (h).

Fig. 6. Sementes maduras de Passiflora morifolia (a-d) e P. coccinea (e-g). Secções longitudinais. (a) Aspecto geral da semente mostrando o arilo bem desenvolvido, o embrião linear, resquícios de nucelo e amplo endosperma. (b) Detalhe da semente, evidenciando o espessamento em U em células da endotesta (seta) e exotégmen lignificado. (c) Detalhe da calaza, mostrando resquícios de nucelo e o endosperma. (d) Detalhe do funículo com idioblastos fenólicos (setas). (e) Aspecto geral da semente com amplo endosperma. (f) Detalhe da calaza, mostrando a hipóstase (seta). (g) Detalhe dos tegumentos, evidenciando o espessamento em U em células da endotesta (seta), exotégmen lignificado e, mesotégmen e endotégmen comprimidos, não sendo possível delimitá-los. ar, arilo; ed, endotégmen; eg, exotégmen; em, embrião; en, endosperma; et, endotesta; ex, exotesta; fv, feixe vascular; mg, mesotégmen; nu, nucelo. Barras de escala = 200 µm (a), 100 µm (b), 50 µm (c, e- g) e 20 µm (d).

Fig. 7. Semente madura de Passiflora alata (a), P. cincinnata (b), P. gibertii (c), P. eichleriana (d-e) e P. foetida (f). Secções longitudinais. (a) Detalhe do endosperma e dos tegumentos, evidenciando o espessamento em U lignificado em células da endotesta (seta) e o exotégmen lignificado. (b) Detalhe do endosperma e dos tegumentos, evidenciando o espessamento em U em células da endotesta (seta) e o exotégmen lignificado. (c) Detalhe do endosperma e dos tegumentos, evidenciando o espessamento em U lignificado em células da endotesta e divisões anticlinais (seta), além do exotégmen lignificado. (d) Detalhe da calaza, ilustrando a hipóstase pouco desenvolvida (seta). (e) Detalhe dos tegumentos, evidenciando o espessamento em U lignificado em células da endotesta (seta) e o exotégmen lignificado. (f) Detalhe da tégmen, evidenciando drusas no mesotégmen (seta). ar, arilo; eg, exotégmen; et, endotesta; ex, exotesta; mt, mesotesta. Barras de escala = 50 µm (a, c-d), 100 µm (b, f) e 20 µm (e).

CONSIDERAÇÕES FINAIS

As análises morfoanatômicas e ontogenéticas de frutos e sementes de espécies do gênero Passiflora apresentaram dados ainda não relatados para o gênero Passiflora e padrões estruturais que podem ser úteis taxonomicamente, aumentando o conhecimento da biologia de Passifloraceae e apresentando novas possibilidades para o estudo estrutural na família.

Através deste estudo foi possível constatar o valor diagnóstico da localização do anel de esclerênquima nos frutos, que poderia auxiliar na delimitação de superseções do subgênero Passiflora, uma vez que esse caráter é variável, ocorrendo diferentes padrões de desenvolvimento entre espécies de diferentes superseções. Ressalta-se a importância da realização de estudos complementares sobre o pericarpo de espécies de Passiflora, especialmente do subgênero Passiflora, ampliando o número de espécies das superseções Passiflora, Coccinea e Laurifolia, além da inclusão de espécies das superseções Distephana e Tacsonia, não contempladas neste estudo. Este estudo permitiu observar ainda que existe uma variação entre os subgêneros Passiflora e Decaloba com relação a alguns caracteres dos óvulos - tipo de micrópila e o número de tegumentos externos. Assim, outra possibilidade seria realizar estudos com mais espécies do subgênero Decaloba e ainda com outros subgêneros de Passiflora, a fim de identificar qual a extensão da variação desses caracteres e seu valor diagnóstico, bem como compreender a evolução dos mesmos. A análise da ontogenia de sementes do gênero Passiflora ampliou o conhecimento sobre a origem e número de tegumentos seminais, eliminando possíveis dúvidas, uma vez que em todas as espécies estudadas, o número de camadas dos tegumentos nunca foi inferior a seis, divergindo de dados encontrados na literatura. Neste ponto, observa-se a importância das técnicas utilizadas no processamento das amostras e no caso específico de sementes de Passiflora, que apresentam uma grande quantidade de tecidos lignificados, ressalta-se o valor da utilização de uma técnica para amolecimento do material. Através das análises morfoanatômicas de frutos e sementes, este trabalho constatou caracteres que combinados podem ser úteis na individualização de espécies, tais como,

presença de cristais prismáticos em P. cincinnata; tricomas unicelulares no ovário de P. morifolia; tricomas pluricelulares e presença de proteínas acumuladas nas camadas subepidérmicas abaixo do exocarpo em P. coccinea; ornamentações na superfície das sementes, espessamento em “U” lignificado das células da endostesta e/ou a presença de hipóstase. Por fim, apesar de não ter sido objetivo deste trabalho, a análise dos caracteres dos frutos conjugada a dados da literatura forneceu um indício de que a diversidade morfológica deve-se em parte à influência de fatores ambientais, como interações animal- planta e condições ecológicas dos seus habitats. Desta forma, estudos complementares sobre essas associações são imprescindíveis para compreender o surgimento e o significado ecológico de alguns caracteres nas espécies de Passiflora.