Dott. Francesco Fiume Genere Badnavirus Classificazione

Gruppo IV (+ssRNA) Ordine Ortervirales Genere Badnavirus. Il genere Badnavirus, la cui specie tipo è Commelina yellow mottle virus (CYMV, comprende le seguenti specie: 1. Aglaonema bacilliform virus (ABV) 2. Banana streak GF virus (BSGFV) 3. Banana streak IM virus (BSIMV) 4. Banana streak MY virus (BSMYV) 5. Banana streak OL virus (BSOLV) 6. Banana streak UA virus (BSUAV) 7. Banana streak UI virus (BSUIV) 8. Banana streak UL virus (BSULV) 9. Banana streak UM virus (BSUMV) 10. Banana streak VN virus (BSVNV) 11. Bougainvillea chlorotic vein banding virus (BCVBV) 12. Cacao mild mosaic virus (CMMV) 13. Cacao swollen shoot CD virus (CSSCDV) 14. Cacao swollen shoot Togo A virus (CSSTAV) 15. Cacao swollen shoot virus (CSSV) 16. Cacao yellow vein banding virus (CYVBV) 17. Canna yellow mottle virus (CaYMV) 18. Citrus yellow mosaic virus (CYMV) 19. Commelina yellow mottle virus (CoYMV) 20. Dioscorea bacilliform AL virus (DBALV) 21. Dioscorea bacilliform RT virus 1 (DBRTV1) 22. Dioscorea bacilliform RT virus 2 (DBRTV2) 23. Dioscorea bacilliform SN virus (DBSNV) 24. Dioscorea bacilliform TR virus (DBTRV) 25. Fig badnavirus 1 (FBaV-1) 26. Gooseberry vein banding associated virus (GVBaV) 27. Grapevine Roditis leaf discoloration-associated virus (GRLDaV) 28. Grapevine vein clearing virus (GVCV) 29. Kalanchoe top-spotting virus (KTSV) 30. Mulberry badnavirus 1 (MBV-1) 31. Pagoda yellow mosaic associated virus (PYMAV) 32. Pineapple bacilliform CO virus (PBCOV) 33. Pineapple bacilliform ER virus (PBERV) 34. Piper yellow mottle virus (PYMV) 35. Rubus yellow net virus (RYNV) 36. Schefflera ringspot virus (SRV) 37. Spiraea yellow leafspot virus (SYLSV) 38. Sugarcane bacilliform Guadeloupe A virus (SCBGAV) 39. Sugarcane bacilliform Guadeloupe D virus (SCBGDV) 40. Sugarcane bacilliform IM virus (SBIMV) 41. Sugarcane bacilliform MO virus (SBMOV) 42. Sweet potato pakakuy virus (SPPV) 43. Taro bacilliform CH virus (TBCHV) 44. Taro bacilliform virus (TBV) 45. Wisteria badnavirus 1 (WBV1) 46. Yacon necrotic mottle virus (YNMoV).

Le piante sono gli ospiti naturali di questo virus. Ci sono attualmente 46 specie in questo genere le cui malattie associate includono i seguenti sintomi: clorosi fogliare, necrosi delle radici, benda delle vene rosse in foglie giovani, piccoli baccelli chiazzati, gonfiori nella radice e nel fusto cui può seguire la morte delle piante. L'infezione riduce la resa del 25% entro un anno, del 50% entro due anni e di solito le piante muoiono entro 3-4 anni. Distribuzione geografica Il virus è presente nella sottoregione dell'Africa occidentale nei paesi della Costa d’Avorio, Ghana, Togo e Nigeria (figura 1).

Figura 1 – Distribuzione geografica dei Badnavirus. Struttura del virus e ciclo vitale I Badnavirus sono privi di pericapside, con geometrie bacilliformi. Il genoma è circolare con segmentazione monopartitica. Le particelle virali hanno una larghezza di circa 30 nm e una lunghezza di 90-900 nm (figura 2).

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Figura 2 - Particelle del genere Badnavirus, senza pericapside, bacilliformi, di 30 nm di larghezza e 90-900 nm di lunghezza.

I genomi sono circolari e non segmentati (figura 3). La replicazione virale è nucleare/citoplasmatica. L'ingresso nella cellula ospite si ottiene con l’attacco delle proteine virali ai recettori ospiti, che mediano l'endocitosi. La replica è quella del modello di replica del dsDNA (RT, reverse transcriptasi). La trascrizione basata sul DNA, in particolare la trascrizione dsdna (rt) è il metodo di trascrizione. Il virus esce dalla cellula ospite mediante l'esportazione di pori nucleari ed il movimento virale guidato dai tubuli. Le piante fungono da ospiti naturali. Il virus viene trasmesso tramite un vettore rappresentato da varie specie di cocciniglie, anche se, in generale, i percorsi della trasmissione sono vettoriali, meccanici ed attraverso i semi.

Figura 3 – Genoma dei Badnavirus, monopartito, a DNA circolare aperto a doppio filamento, di circa 7200 paia di basi, con discontinuità in entrambi i filamenti: uno nel filamento trascritto e tre in quello non trascritto. La poliproteina ORF1 è presumibilmente tagliata in diverse catene da proteasi virali. La replicazione virale avviene secondo le seguenti fasi: 1. L’attacco delle proteine virali ai recettori ospiti media l’entrata virale nella cellula ospite.

3 2. Il dsDNA virale viene rilasciato nel nucleo dove viene trascritto dalla polimerasi II dell’RNA dell’ospite. 3. La traduzione dell'RNA produce proteine virali. 4. L'RNA genomico è retrotrascritto nel citoplasma in nuovi genomi di dsDNA. 5. I genomi sono incapsidati con la proteina capsidica, rilasciando nuovi virioni. Organizzazione del genoma e ciclo di replicazione Nella figura 4 è riportato il ciclo di Cauliflower mosaic virus (CaMV), un badnavirus il cui genoma è lungo da 7,2 a 9,2 kb volte quello do in DNA circolare con sovrapposizione del singolo filamento. Questi sono i segni dell'inizio della sintesi del DNA positivo e negativo per la trascrizione inversa (Hohn et Rothnie, 2013 ). La trascrizione inversa si riscontra all'interno del capside del virus con il risultato che il DNA viene trasferito al nucleo, dove le discontinuità vengono riparate ed i mini- cromosomi sono formati dall'associazione del DNA supercoltivato chiuso covalentemente con le proteine istoniche (Hull, 2002).

Figura 4 - Ciclo di replicazione dei pararetrovirus delle piante (partenza in senso orario a 12 ore): una particella virale contenente DNA circolare aperto è entrato nella cellula. Il suo DNA è importato nel nucleo, dove gli spazi vuoti vengono riparati per produrre dsDNA superarrotolato. Viene prodotto RNA terminale, ridondante e trasportato nel citoplasma. Le copie dell'RNA sono tradotte in proteine virali e/o impaccate come due copie in particelle virali. Avviene la trascrizione inversa. Il dsDNA circolare aperto risultante rientra nel ciclo di replica. In basso a sinistra viene mostrato come la ricombinazione può avvenire per modello commutazione. A destra viene mostrato quanto raramente i frammenti del DNA del virus incorporino nella pianta genoma, che porta a sequenze virali endogene.

4 Una regione intergenomica lunga da 631 a 1177 pb (figura 5) include un promotore ed un segnale di poliadenilazione.

Figura 5 - Organizzazione del genoma di badnavirus rappresentativi con un numero variabile di ORF. Banana streak MY virus (BSMYV); Bougainvillea spectabilis chlorotic vein banding virus (BsCVBV); Cacao swollen shoot virus (CSSV); Citrus yellow mosaic virus (CYMV), Rubus yellow net virus (RYNV). Il DNA mini-cromosomico viene quindi trascritto utilizzando l'RNA dipendente dalla polimerasi II del DNA codificato dall'ospite, creando un RNA terminale ridondante che funge da pregenoma e messaggero policistronico del RNA. La ridondanza viene creata ignorando il segnale di poliadenilazione sul DNA circolare, durante il primo incontro con la RNA polimerasi e riconoscendolo al secondo (Sanfaçon et Hohn, 1990). Nella fase finale della replicazione, l'RNA pregenomico viene riconvertito in dsDNA mediante l'azione di una trascrittasi inversa. La sintesi del DNA a singolo filamento, senso (-), è innescata da tRNAmet e di senso (+) del DNA da prodotti di clivaggio ricchi in purine rimasti dopo la digestione con RNasi H del pregenomico RNA (Medberry et al., 1990; Hohn, et Rothnie, 2013). L'ORF I dei badnavirus contiene da 399 a 927 bp a seconda della specie. Nel membro del tipo

5 ComYMV, ORF I è lungo 602 bp e si traduce in un polipeptide di 23 kD, che si è dimostrato essere (Cheng et al., 1996) associato al virione (virion-associated). L'ORF II è il più piccolo, che va da 312 a 561 bp. In CSSV, il suo prodotto è stato identificato come proteina legante l'acido nucleico (Jacquot et al 1996); ComYMV, è stato anche mostrato di legarsi al capside del virus (Medberry et al., 1990; Cheng et al., 1996). ORF III è il più grande ORF, di lunghezza compresa tra 5100 e 6000 bp. Codifica una poliproteina che viene scissa in quattro o cinque prodotti quali: 1. proteina del capside, 2. aspartato proteasi, 3. transcriptasi inversa, 4. RNasi H 5. una presunta proteina di movimento cellula-cellula (Medberry et al., 1990; Jacquot et al., 1996; Hohn et Fütterer, 1997). La scissione di questa poliproteina nelle sue subunità funzionali è raggiunta dalla proteasi aspartica (Hohn et Fütterer, 1997). La proteina del capside include un motivo Cys, come nella maggior parte degli elementi di trascrizione inversa, ed un secondo motivo Cys (CX2CX11CX2CX4CX2C) trovato solo nei membri dei generi. Alcuni badnavirus hanno ORF aggiuntivi: Piper yellow mottle virus (PYMoV), Bougainvillea spectabilis chlorotic vein-banding virus (BsCVBV), Dioscorea bacilliform SN virus (DBSNV), Grapevine Roditis leaf discoloration-associated virus (GRLDaV), Taro bacilliform virus (TaBV) e Yacon necrotic mottle virus (YNMoV) hanno un ORF aggiuntivo (Hany et al., 2014; Lee et al., 2015; Maliogka et al., 2015; Seal et al., 2007; Wang et al., 2016; Yang et al., 2003). Pagoda yellow mosaic associated virus (PYMAV) ne ha due (Hagen et al., 1993; Wang et al., 2014); Cymbidium mosaic virus (CYMV) e Taro bacilliform CH virus (TaBCHV) ne hanno tre (Borah et al., 2009; Huang et al., 2001; Kazmi et al., 2015); DrMV e RYNV hanno quattro ORF aggiuntivi. Due di questi ultimi sono posizionati sul filamento antisenso (Su et al., 2007; Kalischukng et al., 2013). Non è noto se questi ORF siano espressi, né quale potrebbe essere la loro funzione. Le trascrizioni dei pararetrovirus delle piante hanno una lunghezza di circa 600 nt, sono altamente strutturate, contengono diversi ORF corti, con la possibilità di formare una grande struttura, stem-loop (conformazione intramolecolare basata sull'accoppiamento delle basi azotate che può insorgere a livello di un DNA a singolo filamento) nota per essere la traduzione transitoria. La formazione di questa struttura porta il primo ORF lungo nella stretta vicinanza spaziale di un ORF prossimale 5' corto che termina a 5-10 nt a monte dell’elemento strutturale stabile. Questo elemento viene deviato dal ribosoma di scansione e porta alla traduzione del primo lungo ORF (Fütterer et al., 1993; Ryabova et Hohn, 2000). La conservazione di questi elementi suggerisce la conservazione del meccanismo shunt ribosoma anche nei badnavirus (Pooggin et al., 1999). La maggior parte degli RNA dei Badnavirus include tre ORF posizionati esclusivamente sul filamento sensibile codificando delle proteine di circa 23, 15 e 216 kD (figura 4). Come sono tradotti questi ORF dall’RNA policistronico del virus? Gli ORF I e II hanno solo codoni start iniziali deboli o non-AUG. Per Rice tungro bacilliform virus (RTBV) è stato dimostrato che alcuni ribosomi di scansione avviano la traduzione in quei deboli start codoni, mentre altri li superano con una scansione che perde, iniziando alla fine la traduzione agli ORF II e III (Fütterer et al., 1997) . Attualmente, 70 sequenze complete del genoma rappresentano 28 specie riconosciute e 20 sequenze complete genomiche che rappresentano 16 specie putative disponibili nel database GenBank. CSSV ha il più piccolo (7006 bp) e BsCVBV il più grande (8759 bp) genoma tra le specie confermate. Nella figura 6 è riportata la filogenesi di massima verosimiglianza di 52 isolati di badnavirus che rappresentano specie diverse in base all'allineamento di un frammento di 540-bp di RT/RNase H di cui la regione virale è mostrata. La storia evolutiva è stata desunta usando il Massimo Metodo di verosimiglianza basato sul modello di Tamura-Nei. Le analisi evolutive sono state condotte su MEGA7.

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Figura 6 - Filogenesi di massima probabilità di 52 isolati di badnavirus, rappresentanti diverse specie, basato sull'allineamento di un frammento di 540-bp della regione virale T/RNase H. I valori di bootstrap di 1000 repliche sono date con valori inferiori al 50%. L'albero è disegnato in scala, con lunghezze dei rami misurati nel numero di sostituzioni per sito. I cladi 1, 2 e 3 sono mostrati nelle aree della figura per le analisi filogenetiche. 7 Gli alberi iniziali per la ricerca euristica sono stati ottenuti automaticamente applicando gli algoritmi di Neighbor-Join e BioNJ, ad una matrice di coppie le cui distanze sono state stimate utilizzando l’approccio della massima probabilità della verosimiglianza composita (MCL, Maximum Composite Likelihood) e quindi selezionando la topologia con un valore logaritmico superiore di verosimiglianza. Le 52 sequenze di badnavirus raggruppate in due gruppi principali ed il gruppo 1 potrebbe essere suddiviso in: • primo sottogruppo, che contiene Banana streak virus (BSV) e Sugarcane bacilliform virus (SCBVs) del clade 3 pubblicati (Iskra-Caruana et al., 2014); • secondo sottogruppo, che consiste di Gooseberry vein banding associated virus (GVBaV), di Rubus yellow net virus (RYNV), Grapevine vein clearing virus (GVCV), Grapevine virus vena clearing virus (GVCV), Yacon necrotic mottle virus (YNMoV), Dracaena mottle virus (DrMV) e Pelargonium veiling banding virus (PVBV). • terzo sottogruppo che comprende tutte le specie BSV del clade 1. Gli altri membri di questo sottogruppo sono Pineapple bacilliform CO virus (PBCOV), Mulberry badnavirus 1 (MBV-1) e Cycad necrotic leafspot virus (CyNLV).

Il secondo gruppo è stato ulteriormente diviso in due sottogruppi: • sottogruppo 2a con due specie, quali PYMoV e TaBCHV • sottogruppo 2b costituiti dai membri di BSV, CSSV e CYMV. Gli altri membri sono Fig badnavirus 1 (FBV-1) e Grapevine Roditis leaf discoloration-associated virus (GRLDaV). Integrazione nucleare dei Badnavirus (Badnavirus endogeni) I Badnavirus ed altri pararetrovirus, come Cavemovirus, Caulimovirus, Petuvirus, Solendovirus e Tungrovirus sono presenti anche come sequenze frammentarie integrate in alcuni genomi di piante ospiti. Questi sono indicati come pararetrovirus endogeni, EPRV (Staginnus et Richert-Poggeler, 2006; Hohn et al., 2008; Harper et al., 2002; Pahalawatta et al., 2008). Un genere separato, precisamente Florendovirus, sotto i Caulimoviridae, con 34 specie distinte, che esistono solo come sequenze virali endogene, è stato segnalato (Geering et al., 2014). L'integrazione avviene tramite la ricombinazione non standard in genomi ospiti e la loro presenza non è necessariamente associata all'infezione. Sequenze endogene rappresentano solitamente forme frammentate e lineari del DNA virale circolare originale. Metodi come ibridazione in situ di sonde virali marcate sul cromosoma, Southern hybridization della sonda virale al DNA digerito dell'ospite, immunocapture (IC) -PCR, amplificazione rolling circle (RCA) ed, infine, il sequenziamento del genoma vegetale è stato impiegato da diversi ricercatori per differenziare le forme episomali ed integrate del virus. Esistono due forme di integranti: quelle che possono formare infezioni episomali virali e quelle che finora non possono formare infezioni episomali virali. Integranti di tre Badnavirus, quali Banana streak OL virus (BSOLV), Banana streak GF virus (BSGFV) e Banana streak IM virus (BSIMV) (Chabannes et al., 2013; Gayral et al., 2008), così come diversi altri pararetrovirus di piante, comel Tobacco vein clearing virus (genere: Cavemovirus) (Lockhart et al., 2000) e Petunia vein clearing virus (genere: Petuvirus) (Richert- Pöggeler et al., 2003), sono noti per generare infezioni episomali in alcune piante ibride in Italia, in risposta a stress abiotici causati dalla temperatura, acqua, sostanze nutritive, coltura di tessuti, ferite, cambiamenti in termini di lunghezza del giorno, innesto e processi di riproduzione, come gli incroci. Essi ricostituiscono de novo particelle infettive possibilmente attraverso una ricombinazione omologa intra-filamento a due fasi (Chabannes et Iskra-Caruana, 2013), liberando così un genoma virale che causa successive infezioni esogene (Iskra-Caruana et al., 2014a; Iskra-Caruana et al., 2014b)[46,53]. Sono presenti integranti di altri badnavirus, come alcuni BSV (diversi da BSOLV, BSGFV e BSIMV), DBV, FBV-1, KTSV, DrMV e TaBV non sono noti per dare origine ad infezioni episomali, come solo piccole porzioni del genoma virale, insufficiente a dare origine a sequenze complete di virus (Su et al., 2007; Iskra-Caruana et al., 2014; Harper et al., 2002; Iskra-Caruana et 8 al., 2014; Geering et al., 2001; Laney et al., 2012; Seal et al., 2014; Yang et al., 2003; Yang et al., 2005). La presenza di virus endogeni complica gli approcci necessari per la diagnosi, la tassonomia, il movimento sicuro del germoplasma e la gestione delle malattie da badnavirus. Alcuni virus endogeni possono semplicemente servire come componenti dei genomi vegetali, mentre altri potrebbero fornire immunità virale (Chabannes et al., 2013; Iskra-Caruana et al., 2014; Mette et al., 2002). Diagnosi e cura dei Badnavirus I sintomi causati da infezioni da badnavirus sono variabili e le piante dalla trasmissione ad indicatore sono difficili e complesse a causa della ristretta gamma di questi virus (Lockhart, 1995). Le ispezioni visive dei sintomi sono spesso inaffidabili poiché sono periodiche e possono essere confuse con i sintomi causati da altri virus. Lockhart (1986) ha riportato per primo il rilevamento di BSV mediante metodi sierologici. Data l'eterogeneità degli isolati di BSV, il metodo non ha avuto generalmente successo. Quindi, l'antisiero prodotto contro una miscela di isolati di BSV è stata utilizzata con un certo grado di successo. Selvarajan et al. (2016) hanno segnalato l’ELISA e l’immunocattura PCR (IC-PCR) utilizzando antisiero policlonale rilasciato contro la proteina associata al virus di BSMYV. Poiché l'ORF II è distinto tra le specie di BSV, è stato possibile sviluppare un rilevamento specifico per specie nell'ELISA. L'eterogeneità sierologica e genomica dei badnavirus è considerato il motivo della bassa sensibilità dei metodi sierologici. Quindi metodi alternativi sono stati ideati da vari ricercatori. La PCR è stata utilizzata per il rapido, sensibile e rilevamento affidabile di virus che infettano colture e vettori diversi (Yang et al., 2005; Braithwaite et al., 1995; Harper et al., 1999; Jones et al., 2001; Muller et al., 2001; Thomson et al., 1996). L’analisi PCR in tempo reale e l’esame Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) sono stati effettuati per il rilevamento di pochissimi badnavirus (Anthony-Johnson et al., 2014; Bhat et al., 2013; Bhat et Siljo, 2014). Come accennato in precedenza, i virus endogeni rappresentano una seria sfida ai test diagnostici. Un test che rileverà sequenze di virus episomali può anche rilevare sequenze integrate dovute alla similarità nelle sequenze utilizzate per progettare i primer. In tal modo, per consentire il rilevamento del DNA del virus episomale da solo, è stata utilizzata la reazione a catena della polimerasi IC-PCR o multiplex immuno-capture (IC-PCR) (Harper et al., 1999; Geering et al., 2000; Le Provost et al., 2006). L'amplificazione a rotazione circolare (RCA) è un nuovo metodo promettente per il rilevamento e l'amplificazione del genoma circolare del DNA dei pararetrovirus delle piante (Laney et al., 2012; 1999; James et al., 2011). RCA utilizza la polimerasi del batteriofago Φ29 DNA per amplificare le molecole circolari del DNA in modo indipendente dalla sequenza (Blanco et al., 1989; Johne et al., 2009). Dai genomi episomali dei badnavirus che sono circolari (al contrario di quelli endogeni), la RCA può discriminare il genoma virale circolare ds e le sequenze virali endogene e quindi superare i falsi positivi, un problema comune nella PCR standard. La RCA sarebbe anche di aiuto nel rilevamento e nell'identificazione di nuovi badnaviruses. RCA combinato con RFLP è stato impiegato con successo nel rilevamento di specie di BSV e di FBV-1 (Laney et al., 2012; James et al., 2012;) [55,73,77]. Una combinazione di microscopia elettronica immunosorbente (ISEM), IC-PCR, RCA, purificazione del virus, ibridizaztione southern ed in situ e sequenziamento completo del genoma virale può essere richiesto per chiarire l'identificazione precisa del tipo di sequenze presenti. Caratterizzazione del virus Il genere contiene diversi virus di importanza economica a causa delle gravi malattie che causano: Banana streak virus (BSV), Cocoa swollen shoot virus (CSSV), Citrus yellow mosaic virus (CYMV), Dioscorea bacilliform virus (DBV), Piper yellow mottle virus (PYMoV), Sugarcane bacilliform virus (SCBV) e Taro bacilliform virus (TaBV).

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L’International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) elenca 32 specie nel genere e altre 20 specie sono in attesa di riconoscimento. L'ICTV ha prescritto le linee guida per la delimitazione delle specie all'interno del genere. I criteri per definire le specie sono <80% di identità nella sequenza aminoacidica) o <89% di identità (sequenza amminoacidica) nella codifica conservata della trascrittasi inversa (RT)/ribonucleasi H (RNasi H) della regione codificante (King et al., 2012). Banana streak virus (BSV): BSGFV, BSIMV BSMYV, BSOLV, BSUAV, BSUIV, BSULV, BSUMV e BSVNV Banana streak virus è una malattia virale del banano diffusa in tutto il mondo ed è causata da una specie del virus delle banane (BSV). Dal suo primo rapporto in Marocco nel 1974, è stata segnalata la presenza di BSV in numerosi paesi dell’Africa, Sud America e del Pacifico e probabilmente si riscontra in tutto il mondo, ovunque sia coltivato il banano (Lockhart, 1995; Kumar et al., 2015; Lockhart et Jones, 2000). I sintomi di streak disease variano notevolmente e sono influenzati dalla cultivar, dalla specie virale e dalle condizioni ambientali. I sintomi tipici includono: • striature clorotiche discontinue e/o necrotiche che corrono parallele alle venature della lamina fogliare, • ramificazione del fusto pseudorami. • in alcuni casi, necrosi interna, emergenza anomala di grappoli, scissione della buccia del frutto, con macchie necrotiche. I sintomi possono riapparire con periodi di crescita senza sintomi, con la temperatura che può essere considerata un fattore nell'espressione della malattia. I sintomi ed il carico del virus dipendono fortemente dalla temperatura. L'espressione sintomatica migliorata è stata osservata quando le piante crescevano continuamente a 22 ° C, ma diventata indiscernibile quando le piante vennero spostate ad una crescita continua da 28 ° C a 35 ˝C. D'altra parte, piante asintomatiche o moderatamente sintomatiche coltivated a 28 ˝C a 35 ˝C aumentarono significativamente la gravità dei sintomi e del carico virale nove mesi dopo il trasferimento a 22 ˝C (Dahal et al., 1998; Dahal et al., 2000). Piante di banane in vaso (cv. Virupakshi, AAB) tenute a 22 ° C in una serra ini vetro a prova di insetti per sei mesi ad un anno hanno sviluppato sintomi della malattia e l'infezione da BSGFV è stata confermata da RCA e sequenziamento (Selvarajan, 2015). L'infezione da BSV della banana “Cavendish” (genoma AAA) ha comportato un ritardo di 18 giorni nel raccolto, provocando una riduzione del 6% della resa annua in Australia (Daniells et al., 2001). La gravità della malattia è maggiore tra le nuove linee di riproduzione di banano e tra gli ibridi micropropagati. I genotipi interspecifici.Musa acuminata x Musa balbisiana, compresi molti ibridi di nuova creazione, hanno mostrato infezione da BSV derivata da piante originariamente prive di virus propagate dalla coltura tissutale, probabilmente generate da sequenze endogene (Dallot et al., 2001). La BSV viene trasmessa, orizzontalmente, alle piante di banano in modo semi-persistente da cocciniglie, di cui Planococcus citri è la più diffusa e, verticalmente, per micropropagazione di massa, il modo principale per propagare le piante di banana o polloni. Inizialmente si distinguevano molte specie di BSV (BSV), sulla base di informazioni di sequenza e analisi genetiche e sierologiche (Geering et al., 2000; Geering et al., 2011; Geering et al., 2005; Harper et al., 2005; Harper et al., 2004; Lheureux et al., 2007). Il primo isolato di BSV ad essere completamente sequenziato era dalla Nigeria; esso conteneva 7389 bp, potenzialmente codificante una proteina di 20,8, 14,5 e 208 kD (Harper et al., 1998). L'isolato ha mostrato la più alta identità di sequenza con SCBV. Questo isolato fu in seguito identificato come una specie distinta e divenne noto come BSOLV (Banana streak OL virus). Questo è stato seguito da un sequenziamento completo del genoma di due specie australiane, cioè Banana streak MY virus (BSMYV) e Banana streak GF virus (BSGFV) (Geering et al., 2000; Geering et al., 2005).

10 Harper et al. [88,89] hanno riferito che la variabilità di BSV nelle banane dall'Uganda era estremamente alta e identificarono 13 nuove specie di BSV sulla base della sequenza di DNA della regione conservata RT/RNasi H. Altre tre distinte sequenze BSV di lunghezza completa, cioè Banana streak VN virus (BSVNV), Banana streak IM virus (BSIMV) e Banana streak Yunnan virus sono stati segnalate (Geering et al., 2011; Lheureux et al., 2007). James et al. (2011)[hann proposto sei nuove specie dall'Uganda e dal Kenya, cioè BSUAV, BSUIV, BSULV, BSUMV, BSCAV e BSIMV. Finora, l'ICTV ha riconosciuto nove specie, ovvero BSGFV, BSIMV, BSMYV, BSOLV, BSUAV, BSUIV, BSULV, BSUMV e BSVNV; altri sono in attesa di riconoscimento (Geering et al., 2011; Harper et Hull, 1998). Le specie BSV possono essere ordinate in tre cladi: • il clade 1 include diverse specie che causano streak disease in tutto il mondo; • il clade 2 comprende badnavirus endogeni del genere Musa senza contropartite episomali; • clade 3 è costituito da tutte le specie di BSV derivate dall'Uganda eccetto BSUAV (Iskra- Caruana et al., 2014; Iskra-Caruana et al., 2014; Iskra-Caruana et al., 2014).

Figura 7 - Raggruppamento filogenetico di 27 isolati appartenenti a diverse specie di BSV basato sulla sequenza amminoacidica dell’ ORF III. RTBV (Rice tungro bacilliform virus) è stato utilizzato come outgroup.

11 Diversi isolati di alcune specie di BSV sono raggruppati insieme, sebbene le loro origini geografiche fossero diverse. Tre di quattro specie distinte provenienti dall'Uganda (BSUMV, BSUIV e BSULV) sono raggruppate insieme, mentre un isolato del Kenia, BSUAV, è stato raggruppato insieme agli isolati BSCAV. BSOLV isolati dall'India, dalla Cina, dalla Francia, e dalla Nigeria si raggruppano insieme, così come gli isolati di BSMYV provenienti da India, Australia, Francia e Tonga. Diversi BSV, chiamati BSV endogeni (eBSV), sono diventati parte del materiale genetico della loro specie ospite per endogenizzazione dei progenitori antenati. Gli ospiti sono molti di Musa A (Musa acuminata), B (Musa balbisiana) e S (Musa schizocarpa) (Geering et al., 2005). In questo momento, eBSV è il nome comune per le sequenze virali endogene corrispondenti ad un BSV episomale noto. Al momento solo BSOLV (Banana streak OL virus), BSGFV (Banana streak GF virus), BSIMV (Banana streak IM virus) e BSMYV (Banana streak MY virus) hanno una controparte di eBSV (Staginnus et al., 2009). Questi eBSV sono presenti solo nel genoma (genoma B) di Musa balbisiana. Le altre sequenze endogene di badnavirus descritte (Harper et al., 2004; Geering et al., 2005), nominate da Geering et al., 2005 come BEV (banana endogeno badnavirus), non hanno avuto una controparte episomica, finora identificato. Probabilmente corrispondono a vecchi eventi di integrazioni di virus ancestrali (il bisnonno di BSV) e sono ampiamente distribuiti tra i genomi del genere Musa (Iskra-Caruana et al., 2014; D’Hont et al., 2012; Gayral et al., 2009). È stato dimostrato mediante il doppio obiettivo di integrazione di ibridazione in situ delle sequenze BSOLV in cromosomi in metafase e pro-metafase della cultivar di banana, “Obino l'Ewai” in due loci. l'ibridazione in situ del filamento di DNA ha indicato che una di esse è di circa 150 kb lungo, mentre l'altro è stimato a 50 kb di lunghezza (Harper et al., 2002; Harper et al., 1999). Ad ogni locus, le sequenze di eBSV sono interrotte da sequenze di Musa non correlate. I dati di sequenza hanno rivelato eBSV interrotti e troncati con delezioni, inserzioni, duplicazioni o inversioni. Le analisi degli integranti dei badnavirus in Musa acuminata hanno mostrato la loro distribuzione tra tutti gli 11 cromosomi (D’Hont et al., 2012). Tutti gli integranti dei badnavirus appaiono frammentati e altamente riorganizzati, con una dimensione che va da 100 bp a 18 kbp. Basato sui rapporti dell'evoluzione e sulla pressione selettiva sulle sequenze di BSV e BEV, Gayral e Iskra- Caruana (2009) hanno riportato che ci sono stati almeno 27 eventi di integrazione indipendenti che si sono verificati dopo la divergenza di tre specie di banano, indicando che l'integrazione virale è un fenomeno relativamente frequente. Le ricombinazioni arbitrarie ed omologhe è il meccanismo principale per l'integrazione. Hanno osservato che la maggior parte degli integrali virali nella banana sono difettosi a causa della pseudogenizzazione guidata dall’evoluzione del genoma ospite. Tuttavia, tre eBSV esistenti nel genoma di Musa balbisiana sono infettivi (Chabannes et al., 2013; Gayral et al., 2008; Ndowora et al., 1999) e contengono genomi virali completi ma per lo più riarrangiati. Il salvataggio di virus infettivi da eBSV è segnalato solo per BSOLV, BSIMV e BSGFV. Ciò è avvenuto tramite l'attivazione mediante coltura tissutale, ibridizzazione o differenze di temperatura negli ibridi di banana interspecifica di nuova creazione (Côte et al., 2010; Côte et al., 2010; Dallot et al., 2001; Ndowora et al., 1999). Viene proposto un percorso di ricombinazione omologa per questo evento (Chabannes et al., 2013). Però, un percorso alternativo di ricostituzione del virus è il cambio di modello durante la trascrizione inversa da RNA frammentato. Gli eBSV infettivi costituiscono un caso estremo di parassitismo, oltre ad una strategia recentemente descritta per la trasmissione verticale del virus (Gayral et al., 2010). Le particelle BSV attivate possono anche essere trasmesse da cocciniglie (Meyer et al., 2008). Le sequenze integrate non attivate di altri eBSV e BEV sono frammentate, riarrangiate e subiscono mutazioni inattivanti. Sono quindi replicazioni difettose e quindi non infettive (Geering et al., 2005; Gayral et al., 2009). La banana è propagata vegetativamente, sia con la coltura dei tessuti, sia con la produzione di polloni. Quindi sono necessari ed accurati metodi diagnostici per l'identificazione di materiale privo di virus. La presenza di alti livelli di variabilità sierologica tra le specie di BSV e la presenza di

12 sequenze di eBSV può rendere difficile la diagnosi sierologica basata sulla PCR. Per le piante di banane che contengono il genoma "B" ed entrambi i BSV endogeni episodici e attivabili (BSOLV, BSIMV e BSGFV), l'uso di RCA e PCR sono necessari , mentre per altri banani si può usare solo RCA per distinguere tra genomi virali endogeni e liberi. Sviluppo di PCR in tempo reale per il rilevamento rapido dei virus sono stati segnalati (BSOLV e BSMYV) (Delanoy et al., 2003; Selvarajan et al., 2011). Multiplex immunocapture PCR (M-IC-PCR) e l’amplificazione a rotazione circolare (RCA) sono state sviluppate per il rilevamento di genomi BSV (Le Provost et al., 2006; James et al., 2011; Javer-Higginson et al., 2013). Nel rilevamento di BSV, la RCA è stata più sensibile rispetto alla PCR ed ai metodi basati sulla sierologia (Wambulwa et al., 2012). Selvarajan et al. (2016) hanno sviluppato il rilevamento sierologico di BSMYV usando il ricombinante proteina associata a virus codificata da ORF II, che è molto specifica per ciascuna specie di BSV. Helliot et al. (2002) hanno segnalato la crioconservazione per l'eliminazione di BSV dalle cv di banano. Bougainvillea spectabilis chlorotic vein-banding virus (BsCVBV) Bougainvillea chlorotic vein-banding causata da Bougainvillea spectabilis chlorotic vein-banding virus (BsCVBV) è stata segnalata per la prima volta in Brasile nel 2001 e, successivamente, in Taiwan ed India (Rivas et al., 2005; Tsai et al., 2005; Baranwal et al., 2010). Le piante di buganvillea malate hanno sviluppato sintomi quali la chiazzatura, la clorosi, il bendaggio delle nervature, la distorsione delle foglie e l'arresto della crescita. Variabilità dei sintomi delle diverse cultivar, a Taiwan, è stata segnalata (Tsai et al., 2008). Il virus viene trasmesso attraverso l'innesto di gemme ed è stato caratterizzato al microscopio elettronico, che ha mostrato particelle tipicamente bacilliformi e sequenziamento di una porzione dell'ORF 3, rivelando somiglianze con altri noti virus. Il genoma completo contiene 8759 bp con quattro ORF (Wang et al., 2016) come mostrato in figura 5. Due distinti badnavirus che infettano Bougainvillea spectabilis, in due diverse località dell'India, e con sintomi distinti (mosaico giallo grave e nervature clorotiche, rispettivamente) potrebbero essere distinti mediante il sequenziamento della regione RT/RNaseH (Baranwal et al., 2010). Cocoa swollen shoot virus (CSSV) Cocoa swollen shoot virus (CSSV), che infetta il cacao (Theobroma cacao), è stato scoperto per la prima volta nella regione orientale del Ghana nel 1936. Provoca una malattia devastante che colpisce la maggior parte delle coltivazioni di cacao dei Paesi dell'Africa occidentale (Thresh, 1980). La malattia è caratterizzata da ingrossamento delle radici e dello stelo, con foglie che diventano rosse (Posnette, 1950). Sono noti sia i ceppi più virulenti che quelli che causano sintomi lievi di CSSV. I ceppi gravi possono causare la morte delle piante di cacao entro due anni (Posnette, 1947). La recente ed unica colonizzazione del cacao in Africa, probabilmente a causa della continua presenza della stessa coltivazione sullo stesso terreno e dell'elevata diversità del virus nei principali paesi in cui si trova la malattia, (Costa d'Avorio, Ghana, Togo) sono le ragioni della gravità della stessa. Il virus ha una gamma di ospiti limitata. Non è trasmesso meccanicamente, ma in modo semi- persistente da Planococcoides njalensis, Planococus citri ed almeno altre 12 specie di cocciniglie (Roivainen, 1976). La diffusione della malattia è dovuta principalmente all'impiego di piante infette (su lunghe distanze), alla trasmissione mediata dall'infiorescenza (a breve distanza) ed a nuove piantagioni sensibili nelle aree forestali primarie. Recentemente, la trasmissione attraverso il seme è stata segnalata (Quainoo et al., 2008). CSSV è stato trovato in tutte le parti del seme di cacao infetto e nelle piantine ottenute da semi infetti da

13 CSSV piante. Sebbene il CSSV sia stato rilevato anche nel polline, il virus non può essere trasmesso attraverso l'impollinazione incrociata (Ameyaw et al., 2013). Il primo sequenziamento completo del genoma di CSSV ha mostrato di contenere 7161 bp con cinque ORF, vale a dire proteine di codifica ORF I, II, III, X e Y di 16,7, di 14,4, 211, 13 e 14 KD, rispettivamente, ed una regione intergenica (Hagen et al., 1993), come mostrato in figura 5. È stato dimostrato che ORF II di CSSV è una proteina legante l'acido nucleico, mentre le funzioni di ORF I, X e Y sono sconosciute. ORF III codifica la poliproteina del virus standard (Jacquot et al., 1996; Hagen et al., 1993). Oro et al. (2012) hanno riportato la diversità molecolare di CSSV basata sui confronti della sequenza 120 della prima parte di ORF III e di tre gruppi distinti. La sequenza completa del genoma di cinque ceppi di CSSV originari del Togo e del Ghana hanno rivelato l'esistenza di variabilità fino al 29% tra diversi isolati geografici (Muller et Sackey, 2005). ORF X differiva considerevolmente in dimensioni e sequenza tra i ceppi virali. Un saggio basato sulla PCR è stato sviluppato per la diagnosi precoce di CSSV in impianti di cacao (Muller et al., 2001). Inoltre al virus episomale, Geering et al. (Geering et al., 2014) ha riportato la presenza di un virus endogeno appartenente al recentemente proposto genere Florendovirus nella pianta del cacao. Jacquot et al. (1999) hanno riportato l'agro-inoculazione di CSSV, utilizzando 1,2 unità di lunghezza del genoma CSSV in piante di cacao ed osservato che i virioni di CSSV si trovavano solo nel citoplasma delle cellule gemellari del floema ed in alcune cellule del parenchima xilematico. Con la microscopia è stato riportato che il rigonfiamento dello stelo derivava da una proliferazione delle cellule dello xilema, del floema e della corteccia. Quainoo et al. (2008) hanno riportato un metodo basato sull'embriogenesi somatica per l'eliminazione di CSSV dalle piante infette. Il CSSV è stato trovato in tutti i tessuti del callo indotti dalle piante infette. Il virus è stato trasmesso agli embrioni somatici primari con un tasso del 14-19%. Gli embrioni somatici primari privi del virus sono derivati da tessuto del callo infetto convertito in piantine testate negativamente per CSSV. Canna yellow mottle virus (CaYMV) Canna yellow mottle virus (CaYMV) causa la malattia della canna gialla (Canna indica), caratterizzata da necrosi nervale e screziature combinate con striature dello stelo e dei fiori. La malattia è stata originariamente riportata nel Minnesota, in Florida ed a Washington, negli USA (Lockhart, 1988; Pappu et al., 2008) e successivamente in Cina, Giappone, Italia e Paesi Bassi (Jianguo et al., 2008; Marino et al., 2008). La maggior parte delle piante malate rimane senza sintomi e l’associazione di Cucumber mosaic virus ed un virus a forma di bastoncino flessibile non identificato è stato riportato in pochi casi. Il virus causale è stato identificato sulla base della microscopia elettronica, ISEM, PCR ed analisi sequenziale di una porzione della regione RT/RNaseH (Momol et al., 2004). Recentemente, l’associazione di CaYMV con Yellow mosaic disease di Piper betel è stata riportata da Uttar Pradesh (2015), in India. Citrus yellow mosaic virus (CYMV) Ahlawat et al. (1996) ha riportato l'associazione di un badnavirus con la malattia, che è stata in seguito chiamata Citrus yellow mosaic virus, basata sulla morfologia delle particelle, sulla sierologia e sulla sequenza parziale del nucleotide del genoma virale. Citrus yellow mosaic virus (mosaico degli agrumi) è stato segnalato finora solo in India. È comune e particolarmente grave nell'arancio dolce (Citrus sinensis), con un tasso di incidenza che va dal 10 al 70%. La riduzione della resa produttiva è stata del 77% ed i frutti delle piante colpite ha il 10% in meno di succo e di acido ascorbico (Ahlawat et al., 1996). I sintomi più caratteristici della malattia sono mosaici gialli delle foglie e foglie ingiallite lungo le nervature. L'innesto e la cuscuta hanno trasmesso il virus a 14 specie di agrumi e cultivar, tra cui l’arancia dolce, il pomelo (Citrus maxima), la limetta di Rangpur (Citrus limonia), Citrus volkameriana e Citrus aurantium. Il virus è meccanicamente trasmissibile a Citrus decumana, Satgudi all'arancia dolce e Citrus maxima (pumelo). La prima sequenza completa del genoma del virus dell'arancio dolce e la costruzione di un clone infettivo di CYMV è stato riportato (Huang et al., 2001). Il genoma CYMV

14 è composto da 7559 bp, con sei ORF sul filamento positivo del genoma, ciascuno in grado di codificare una proteina maggiore di 10kD (figura 5). L'analisi filogenetica ha rivelato che CYMV (Citrus yellow mosaic virus) è strettamente correlato a CSSV (Cacao swollen shoot virus). La determinazione riuscita di CYMV in diverse specie di agrumi e cultivar, utilizzando saggi PCR e di ibridazione dell’ acido nucleico sono stati riportati (Baranwal et al., 2003; Gopi et al., 2010). Il sequenziamento completo del genoma degli isolati virali da Ctrus sinensis (arancio dolce), Ctrus jambhiri (limone rugoso), Ctrus aurantifolia (limetta) e Ctrus grandis (pomelo) hanno rivelato omologia con tutti gli isolati di virus (Borah et al., 2009; Anthony-Johnson et al., 2012). Geering et al. (2014) hanno segnalato la presenza di Florendovirus endogeni in piante di agrumi. Commelina yellow mottle virus (ComYMV) Commelina yellow mottle virus (ComYMV) è la specie tipo del genere Badnavirus. Il virus infetta le monocotiledoni, tra cui Commelina diffusa. Il genoma completo del virus è costituito da 7489 bp con i tre tipici ORF dei Badnavirus in grado di codificare proteine di 23, 15 e 216 kD (Medberry et al., 1990). Gli anticorpi contro il C-terminale della proteina ORF I hanno rilevato una proteina specifica del virus da 20 kD sulla superficie dei virioni. Questa associazione è stata confermata dalla microscopia elettronica immunosorbente. Un antisiero impiegato contro il prodotto putativo del gene ORF II ha rilevato una proteina virus specifica da 15 kD che conferma che anche questa è associata ad un virus (Cheng et al., 1996). Attraverso studi di mutazione , Tzafrir et al. (1997) hanno dimostrato che la regione N-terminale di ORF III è necessaria per il sistema di movimento ma non per la replica di ComYMV. Un costrutto contenente 1,3 copie del genoma ComYMV è risultato infettivo quando introdotto in Commelina diffusa attraverso l'infezione mediata da Agrobacterium. L'analisi della trascrizione virale indica che il virus codifica un singolo terminatore ridondante trascritto dal genoma-length-plus-120-nucleotide (Medberry et al., 1990; Tzafrir et al., 1997). Le sezioni ultrasottili delle piante infette hanno mostrato la presenza di strutture tubulari contenenti i virioni. L'esterno di questi tubuli ha reagito con anticorpi alla proteina di movimento ComYMV, ma non con anticorpi di rivestimento delle proteine, indicando che essi giocano un ruolo nel movimento da cellula a cellula dei virioni (Van Lent1 et al., 1991), come riportato per molti altri virus delle piante. Medberry et al. (1992) hanno riferito che il promotore di ComYMV guida l'espressione di GUS in tabacco transgenico principalmente nel floema, le cellule associate al floema ed il parenchima assiale delle radici,steli, foglie e fiori tra cui antere. Rispetto al duplicato del promotore di CaMV 35S, il promotore di ComYMV è attivo nel 30% nel tabacco e fino al 25% nelle cellule di sospensione del mais. Uno studio che ha comportato l'espressione transgenica di GUS guidata dal promotore ComYMV in avena ha rivelato che l'espressione di GUS è localizzata principalmente nei tessuti vascolari dei germogli, foglie, brattee floreali e radici (Torbert et al., 1998). Analisi di delezione e studi funzionali del promotore di ComYMV nel tabacco transgenico ha rivelato che la regione tra -870 bp e -232 bp è responsabile dell'attività principale del promotore e la regione a valle di essa per l'espressione specifica tissutale (floema) (Wu et al., 1999) Matsuda et al. (2002) hanno segnalato che il promotore di ComYMV guida l'espressione genica specifica delle cellule compagno nelle foglie, steli e radici del tabacco transgenico, indicandone l’utilità negli studi sulle funzioni delle cellule compagne ed anche nelle colture ingegneristiche che producono determinati prodotti genici in quelle cellule per bloccare le cellule di movimento nelle lunghe distanze degli agenti patogeni. Dioscorea bacilliform virus (DBV), Dioscorea bacilliform AL virus (DBALV) e Dioscorea bacilliform AL virus (DBSNV) Dioscorea bacilliform virus (DBV) si riscontra comunemente in diverse specie di Dioscorea (Yam) nell’emisfero sud. I sintomi della malattia includono il mosaico clorotico sulle foglie, che porta ad una riduzione nella formazione di zucchero e di stoccaggio minimo dell'amido, causando così una

15 significativa riduzione della resa dei tuberi e della loro qualità. Il virus viene trasmesso vegetativamente mediante cocciniglie (Planococcus citri). I badnavirus sono stati segnalati per la prima volta nell'a patata dolce in associazione con un virus flessibile, causando Internal brown spot disease in Dioscorea alata e Dioscorea cayenensis-rotundata nei Caraibi (Phillips et al., 1999). I badnavirus isolati dalla Dioscorea alata nigeriana sono denominati Dioscorea alata bacilliform virus (DBALV). Il sequenziamento completo del genoma dei due isolati di DBALV provenienti dalla Nigeria includono 7413 bp e 7415 bp ciascuno con tre ORF standard di badnavirus potenzialmente codificanti per proteine di 29,5, 25,2 e 228,3 kD (Briddon et al., 1999). Più tardi, Seal e Muller (2007) hanno riportato sequenze complete del genoma di due isolati di badnavirus da da Dioscorea sansibarensis dal Benin con solo il 62% di identità con DBALV, rappresentando così una nuova specie di badnavirus chiamata Dioscorea sansibarensis bacilliform virus (DBSNV). I due isolati di DBSNV sono 7262 e 7276 bp di lunghezza, con quattro ORF ciascuno codificante per proteine di 143, 126, 1887 e 95 amminoacido (Seal et Muller, 2007). In aggiunta alla sequenza completa di DBALV e DBSNV, sono state generate molte sequenze parziali di badnavirus usando i primer degenerati di badnavirus dal germoplasma di patata. Studi sulla diversità genetica di 19 isolati di badnavirus di patate dolci, mediante sequenziamento della regione di codifica RT/ NaseH hanno rivelato un'elevata variabilità tra gli isolati, unendosi in grappolo con DBALV o DBSNV. Uno degli isolati mostrava solo il 75-77% d’identità con DBALV o DBSNV, che indica la presenza di una terza specie (Eni et al., 2008). Il confronto della regione di codifica RT/RNaseH ha portato a Kenyon et al. (2008) a proporre che ci siano almeno 11 specie di badnavirus di patate dolci nella sola regione del Pacifico meridionale. In studi successivi che riguardano la filogenesi ed il confronto di 121 sequenze di trascrittasi inversa parziale, 12 specie di virus di patata dolce sono state distinte, tra cui DBALV e DBSNV, menzionati sopra (Bousalem et al., 2009). Cinque di quelli,caratterizzati da un'ampia gamma di ospiti, sono di origine africana, mentre gli altri sono caratterizzati da una gamma di ospiti limitata e di origine asiatico-pacifica. Studi di ibridazione ELISA e Southern che coinvolgono campioni di grandi dimensioni, che rappresentano otto specie di patata dolce, supportano la presenza di DBV endogeno (eDBV) in Dioscorea rotundata, ma non in Dioscorea. praehensilis, Dioscorea abyssinica, Dioscorea alata e Dioscorea trifida (Seal et al., 2014). Umber et al. (2014) hanno riportato la caratterizzazione molecolare delle sequenze di eDBV nel genoma della patata dolce africana del complesso Dioscorea cayenesis-rotundata che mostrava una sequenza originata da varie parti dei genomi del virus, risultando in una struttura a mosaico. Glii eDBV appartengono ad almeno quattro distinti badnavirus ed indicano più eventi di endogenizzazione indipendenti. Finora non c'è nessun rapporto sull'eDBV sull’abilità di generare particelle virali infettive in condizioni di stress abiotico. Fig badnavirus 1 (FBV-1) Fig badnavirus 1 (FBV-1), che causa la malattia del mosaico nel fico (Ficus carica), è stato rilevato mediante PCR e RCA in 19 paesi in Europa, Australia, Africa e Sud e Nord America (Laney et al., 2012; Minafra et al., 2012). Il virus può essere trasmesso meccanicamente a diversi ospiti erbacei. Basato sulla sequenza completa del genoma, FBV-1 è stato identificato come una specie distinta di badnavirus. L'intero genoma ha mostrato che contiene 7140 bp con quattro ORF che codificano per proteine di 15,3, 16,5, 212,5 e 17,0 kD. I motivi chiave dei badnavirus, con l'eccezione del motivo della proteasi, sono stati trovati nella poliproteina derivata dall'ORF lunga 212,5 kD. Il virus ha mostrato una stretta relazione con CSSV e CYMV (Laney et al., 2012). Sulla base della southern hybridization, RT-PCR e RCA, il virus è stato dimostrato presente sia episodicamente, sia integrato nel genoma di Fig badnavirus 1 (eFBV-1). Tuttavia, non è ancora disponibile alcuna informazione sulla possibilità di attivare eFBV-1 per originare FBV-1 infettivo in condizioni di stress. Gooseberry vein banding associated virus (GVBaV) Gooseberry vein banding disease (GVBD), la malattia delle bande della nervatura dell'uva spina, si riscontra nelle cultivar di ribes in Europa e nel Nord America. Le foglie malate mostrano un tessuto

16 laminare clorotico adiacente alle nervature fogliari centrali (Jones et al., 2001). Il virus causale, Gooseberry vein banding associated virus (GVBaV) è trasmesso in modo semi-persistente da diverse specie di afidi (Aphis grossulariae, Nasonovia ribisnigri e Hyperomyzus spp.). Ribes spp. è propagato vegetativamente e, quindi, la diffusione primaria della malattia avviene con mezzi vegetativi. GVBD potrebbe essere trasmesso meccanicamente dall'uva spina infetta alla Nicotiana occidentalis (Jones et al., 2001). Xu et al. (2011) riporta sequenze genomiche segnalate di lunghezza intera (7649-7663 bp) di quattro isolati di GVBaV da diversi ospiti e regioni geografiche. Questi isolati hanno condiviso identità elevate (96,4-97,3%). Analisi filogenetica, mediante l’impiego dellla sequenza aminoacidica della proteina putativa derivata dall'ORF III, ha mostrato che i gruppi GVBaV sono più strettamente associati a DBV, PVBV e TaBV (Xu et al., 2011). Grapevine vein clearing virus (GVCV) Grapevine vein clearing virus (GVCV) è associato ad una severa eliminazione delle nervature fogliari ed al declino della vite, sindrome che appare siu vitigni (Vitis vinifera) nella regione del Midwest degli Stati Uniti. Il tipico sintomo è rappresentato dalla clorosi della nervatura sulle giovani foglie (che diviene traslucida), internodi corti e declino del vigore della vite. La malattia potrebbe essere trasmessa mediante l'innesto. Il sequenziamento del genoma completo del virus ha rivelato una sequenza di 7753 bp, che codifica per i tre ORF standard dei badnavirus (Zhang et al., 2011)[144]. Studi basati su RT-PCR di piante infette hanno mostrato chiaramente la presenza di trascritti specifici di GVCV in piante infette dal virus. Oltre ai virus episomali, Geering et al. (Geering et al., 2014) riportava la presenza di un virus endogeno appartenente al genere recentemente proposto dei Florendovirus per l’uva spina. Inoltre, hanno riferito che nell'uva, il 9% dei locus endogeni dei Florendovirus si trova all'interno degli introni e, pertanto, può influenzare l'espressione genica.dell’ospite. Kalanchoë top-spotting virus (KTSV) Kalanchoë top-spotting virus (KTSV), la malattia delle macchie di kalanchoë (Kalanchoë blossfeldiana) è caratterizzata da numerose macchie gialle sulle foglie delle piante colpite. La malattia si riscontra in molte cultivar commercializzate di Kalanchoë blossfeldiana in Europa e Nord America e può essere economicamente dannosa. La malattia è trasmessa per innesto, sementi e polline. Può anche essere trasmessa per inoculazione meccanica e dal Pseudococcidae Planococcus citri. Nel kalanchoë cresciuto commercialmente, la diffusione del virus avviene principalmente attraverso la propagazione vegetativa delle piante infette (Lockhart et Ferji, 1988). Il genoma di KTSV è lungo 7591 bp e contiene i tre tipici ORF dei badnavirus. Parecchie coppie di primer oligonucleotidici, basate sulla sequenza genomica KTSV, sono state utilizzate per rilevare in modo efficiente il virus attraverso lo screening di stock di propagazione di kalanchoë e di linee di riproduzione. Due sequenze di KTSV, uno che induce i sintomi e l'altro che non induce sintomi, sono stati identificati e differenziati mediante amplificazione PCR e digestione degli ampliconi risultanti, con enzimi di restrizione. Risultati preliminari da test di trasmissione mediante l'innesto e l'indicizzazione della PCR suggeriscono che la forma non sintomatica di KTSV può rappresentare un elemento virale integrato (Yang et al., 2005). Pagoda yellow mosaic associated virus (PYMAV) Pagoda yellow mosaic associated virus (PYMAV), il virus associato del mosaico pagoda giallo (PYMAV) è stato segnalato per la prima volta in Cina. Ha causato, nel 2013, la malattia del mosaico giallo delle piante pagode (Styphnolobium japonicum). Il genoma completo del virus determinato dal sequenziamento di siRNA comprende 7424 bp, con cinque ORF con una condivisione del 40% -45% di identità con altri badnavirus (Wang et al., 2014). PYMAV insieme a GVBV e GVCV formano un gruppo separato che è distinto da altri gruppi di badnavirus. I siRNA specifici per PYMAV sono principalmente di 21 nucleotidi di lunghezza e distribuiti lungo il genoma completo del virus.

17 Pineapple bacilliform comosus virus (PBCOV) e Pineapple bacilliform erectifolius virus (PBERV) Usando la microscopia ISEM, Pineapple bacilliform virus è stato rilevato per la prima volta negli ibridi di ananas in Australia, durante il 1995. È trasmesso dal Pseudococcidae, Dysmicoccus neobrevipes, ed è sierologicamente correlato a Sugarcane bacilliform virus (SCBV) (Lockhart et Ferji, 1988). È stato anche osservato un virus dell’ananas non identificato nelle Hawaii (Sether et Hu, 2002). A causa dell'ubiquità del virus nelle piante sia sane che malate, è improbabile che il virus sia la causa principale della malattia causata dal Caulimovirus (Pahalawatta et al., 2008). Due badnavirus, in particolare Pineapple bacilliform comosus virus (PBCOV) e Pineapple bacilliform erectifolius virus (PBERV), sono stati segnalati dall'Australia (Gambley et al., 2008). Oltre a questi, un badnavirus endogeno (Pineapple pararetrovirus 1) e un retrotrasposone di Anannus metavirus (AMtV) sono risultati associati con la malattia Pineapple mealybug wilt disease. Le sequenze complete del genoma degli isolati del virus provenienti dalla Cina e dalle Hawaii comprendono 7451 bp, con i tre ORF standard dei Badnavirus (Liting et al., 2010). Le sequenze dei pararetrovirus endogeni sono state anche identificate nell'ananas (Sether et al., 2012). Piper yellow mottle virus (PYMoV) Piper yellow mottle virus (PYMoV) è stato segnalato per la prima volta, nel 1997, nel pepe nero (Piper nigrum) e nella vite di betel (Piper betle) in Malesia, Filippine, Sri Lanka e Thailandia (Lockhart et al., 1997). I sintomi della malattia variano ampiamente e sono influenzati dalle cultivar e dalle condizioni ambientali. I sintomi tipici includono screziature clorotiche, clorosi, schiarimento della nervatura, distorsione delle foglie, ridotto vigore delle piante e frutti scadenti. Sorprendentemente ed in contrasto con altri casi, l'espressione sintomatica migliorata è stata osservata su piante continuamente esposte a temperature elevate (circa 35 °C) ed in seguito divenne indiscernibile quando le piante si svilupparono continuamente ad una temperatura più bassa (22-28 ˝C). Quando sono state coltivate piante asintomatiche a 22-28 ° C e poi trasferie a 35 ˝C, si è verificato un significativo aumento della gravità dei sintomi e della concentrazione di virus entro 15-30 giorni (Umadevi et al., 2016). L'incidenza di PYMoV è stata riportata anche dall'India nel pepe nero, vite di betel e pepe lungo indiano (Bhat et al., 2003; Hareesh et Bhat, 2008; Siju et al., 2008) e recentemente anche in molte altre specie del genere Piper (Bhat et al., 2014). La diffusione primaria del virus avviene attraverso mezzi di lavoro e semi vegetativi (Hareesh et Bhat, 2010; Deeshma et Bhat, 2014), mentre la diffusione secondaria nel campo avviene attraverso diverse specie di cocciniglie, come il Planococcus citri e Ferrisia virgata (Lockhart et al., 1997; Bhat et al., 2003), e con l'insetto della famiglia Tingidae, Diconocoris distanti (De Silva et al., 2002). La prima sequenza completa del genoma di un isolato di PYMoV dall'India ha rivelato 7622 bp con quattro ORF (Hany et al., 2014). Gli ORF I, II e IV di PYMoV sono riportati come proteine ipotetiche di funzione sconosciuta con una massa molecolare prevista di 15,7 kD, 17,1 kD e 17,9 kD, rispettivamente, mentre l’ORF III codifica una poliproteina standard dei badnavirus di 218,6 kD. Di recente, completa il sequenziamento del genoma di altri tre isolati di PYMoV (dimensioni del genoma comprese tra 7559 e 7584 bp), che infettano il pepe nero, la vite di betel ed il peperone indiano che ha rivelato un'elevata omologia tra gli isolati (dall'89% al 99%) (Deeshma et Bhat, 2015). Talee prive del virus PYMoV sono importanti per la piantagione di pepe nero, una coltura perenne propagata vegetativamente. Ciò è dovuto alla natura senza sintomi di alcune piante infette, alle analisi sensibili come PCR, PCR in tempo reale e l'amplificazione isotermica loop-mediata (LAMP) che sono state sviluppate per l'identificazione di piante madri per la propagazione esenti da virus (Bhat et al., 2013; Bhat et Siljo, 2014; De Silva et al., 2002). Rubus yellow net virus (RYNV) Rubus yellow net virus (RYNV), il virus della rete gialla del Rubus, che infetta le specie di Rubus e le sue cultivar, principalmente nel Nord America ed in Europa, è un componente essenziale del complesso della malattia del mosaico della fascia del lampone, che provoca un serio declino del

18 vigore e della produttività delle piante. Il virus viene trasmesso in modo semi-persistente dal grande afide del lampone, Amphorophora idaei, in Europa e Amphorophora agathonica nel Nord America. Le piante infettate dal virus sono o non sintomatiche o mostrano sulle foglie una rete nervale molto debole. I primer specifici per i virus sono stati progettati per rilevare la presenza del virus nelle piante infette (Jones et al., 2002). Ciò è stato rivelato con il sequenziamento completo del genoma di un isolato di RYNV, proveniente dall'Alberta, in Canada, che è di 7932 bp e sette ORF (Kalischuk et al., 2013) e che ricorda più da vicino la sequenza di GVBV. Inoltre, alle proteine standard dei Badnavirus codificate dagli ORF I, II e III, le proteine di 15 e 17 kD possono essere predette dalle ORF IV e V sul filamento positivo e le proteine di 16 kD da entrambi le ORF VI e VII, sul filamento antisenso (figura 5). Le piante di lampone e di fragola agro-inoculate con più di un clone genomico di lunghezza intera del virus potrebbe essere rilevato 14 giorni dopo l'inoculazione mediante un saggio di immunocattura. Sequenza di piccole sequenze di RNA di tessuto fogliare rosso lampone infetto da RYNV ha prodotto una distribuzione del genoma ampia e disomogenea di siRNAs derivati dal virus (vsiRNA), con forte produzione di grappoli in piccole regioni definite, distribuite su entrambi i filamenti del genoma RYNV indicando che la via dell’RNA che interferisce con il lampone si rivolge a specifiche aree della sequenza del virus, possibilmente come un meccanismo di difesa antivirale (Kalischuk et al., 2013). In alternativa, gli RNA potrebbero rappresentare richiami, come riportato per CaMV e RTBV (Blevins et al., 2011; Rajeswaran et al, 2014). Schefflera ringspot virus (SRV) Schefflera ringspot virus (SRV) infetta Brassaia actinophylla (albero ad ombrello), Schefflera arboricola (Ombrello nano) e Aralia (Polyscias balfouriana, Polyscias balfouriana “Marginata”, Polyscias fruticosa e Polyscias guilfoylei) in Australia, Barbados, Cuba, Mauritius, Honduras, Taiwan, Tailandia e USA (Lockhart et Olszewsk, 1996). SRV causa chiazze fogliare e punti con anello clorotico e necrotico a piante del genere Schefflera, e clorosi, eliminazione delle nervature e riduzione delle dimensioni delle foglie in Aralia. Il virus viene trasmesso dalla cocciniglia Planococcus citri. Nei test ISEM, i virus sono bacilliformi in Schefflera ed Aralia e sono intrappolati in antisiero in BSV, CSSV, RTBV e SCBV. Sulla basato della morfologia delle particelle, della proprietà del genoma, della parentela sierologica e della trasmissibilità della cocciniglia, il virus causale è stato concluso per essere un membro del genere Badnavirus. Spiraea yellow leaf spot virus (SLSV) Spiraea yellow leaf spot virus (SLSV) provoca una malattia della foglia che diventa gialla dello spiraea nel medio-ovest degli USA. Il virus ha un genoma di dsDNA del peso di 7,4 kb e assomiglia alle proprietà della particella e del genoma dei badnavirus. .Eccezionalmente, questo virus è trasmesso da un afide, Aphis spiraecola (Lockhart et Geering, 2002). Sugarcane bacilliform virus (SCBV), Sugarcane bacilliform IM virus (SCBIMV) e Sugarcane bacilliform MO virus (SCBMOV) Sugarcane bacilliform virus (SCBV) è stato osservato per la prima volta a Cuba, nel 1985, e poi nella canna da zucchero in molti paesi di tutto il mondo (Autrey et al., 1992). Causa clorosi, screziature e sintomi di lentiggine fogliare, ma molte delle piante infette sono asintomatiche. Il peso della canna da zucchero è ridotto come pure il contenuto di saccarosio della canna infetta da SCBV in Cina ()Li et al., 2010). È postulato che il virus è nato al centro dell'origine della canna da zucchero, in Papua Nuova Guinea, e si è diffuso ad altre aree coltivate con il movimento del germoplasma, in particolare le canne. Ulteriore diffusione è stata fatta dal suo vettore di cocciniglia Sacharicoccus sachhari. L'SCBV può essere trasmesso da Sacharicoccus sachhari dalla canna da zucchero infetta al banano, con banane infette da SCBV che sviluppano sintomi indistinguibili da quelli descritti per BSV, in condizioni di laboratorio; tuttavia, l'infezione naturale di SCBV nelle banane in condizioni di campo non è stato segnalato Un ceppo marocchino di BSV è

19 sierologicamente indistinguibile da alcuni isolati di SCBV. In esperimenti di laboratorio, SCBV (e BSV) possono anche essere trasmessi meccanicamente alla canna da zucchero e al banano (Lockhart et Autrey, 1988). Sulla base dell saggio PCR, Braithwaite et al. (2001) hanno riportato la presenza di SCBV in canne nobili (Saccharum officinarum), ibridi commerciali e cloni all'interno del complesso di “Saccharum” compreso Saccharum robustum, Saccharum spontaneum, Saccharum barberi, Erianthus arundinaceus ed Erianthus ravennae. Singh et al. (2009) hanno rilevato un'infezione mista di SCBV con altri virus della canna da zucchero in India mediante la PCR. Il primo sequenziamento completo del genoma del virus (isolato in Marocco, ora noto come SCBMOV) ha rivelato un genoma di 7568 bp con i tre ORF standard e la regione intergenica (Bouhida et al., 1993). Un costrutto contenente 1,1 copie del SCBMOV clonato è risultato infettivo sia per il riso, sia per il banano, mediante agroinoculazione (Bouhida et al., 1993). Sequenziamento completo del genoma di un isolato australiano (isolato di Ireng Maleng) di SCBV (ora noto come SCBIMV) ha rivelato un genoma di 7687 bp (Geijskes et al., 2002). I genomi di SCBMOV e SCBIMV condividono solo l'identità della sequenza nucleotidica al 72% e sono quindi considerati come due specie distinte da ICTV. Sulla base di sequenze parziali di SCBV, che rappresentano il dominio RT/RNase H di 35 isolati introdotti da Guadalupa, Muller et al. (2011) hanno riportato un'alta variabilità molecolare nel genoma di SCBV, distinguendo sette gruppi filogenetici denominati da A a G, tra cui SCBMOV (gruppo E) e SCBIMV (gruppo F). I gruppi A, B, C e D di SCBV appartengono al gruppo 1 dei badnavirus, mentre i gruppi E, F e G di SCBV appartengono al gruppo 3 dei badnavirus, con riferimento ai gruppi di badnavirus analizzati (Gayral et Iskra-Caruana, 2009). Basato sulla soglia dell’identità del nucleotide dell’80% nel dominio RT/RNaseH, gli isolati SCBV del gruppo A-B, C e D sono membri di tre specie aggiuntive di SCBV. Di questi, completano le sequenze del genoma di due isolati di gruppo A (7444 bp e 7446 bp) ed un isolato del gruppo D (7317 bp) chiamati provvisoriamente come Sugarcane bacilliform Guadeloupe A virus e Sugarcane bacilliform Guadeloupe D virus (Muller et al., 2011). Basato sul completo sequenziamento del genoma di cinque isolati di SCBV derivati dall'India (dimensione del genoma che va da 7568 a 7687 bp), Karuppaiah et al. (2013) hanno riportato un'identità del 69-85% tra i cinque isolati indiani, identità condivisa tra 70% e 82% con SCBIMV e SCBMOV, indicando che gli isolati SCBV indiani lo sono distinti dagli altri isolati di SCBV. L’analisi filogenetica basata sulla sequenza parziale RT/RNasi H ha identificato tre nuove specie derivate dall'India, per le quali i nomi di Sugarcane bacilliform black Reunion virus (SCBBRV), Sugarcane bacilliform BO virus (SCBBOV) e Sugarcane bacilliform BB virus (SCBBBV) sono stati proposti (Karuppaiah et al., 2013). L'analisi Southern delle piante infette di Saccharum officinarum ha indicato che l'SCBV non è integrato nel genoma della canna da zucchero (Geijskes et al., 2004). Tuttavia, è stata segnalata l'insorgenza di molecole di DNA di SCBV più grande della lunghezza unitaria di 7,6 kb, possibili eventualmente concatenatori formati durante la replicazione, nelle piante infette e nei virioni. Tuttavia, Cai et al. (2009) hanno riportato, sulla base delle analisi di amplificazione PCR e di Southern hybridization, l’integrazione di frammenti di DNA di SCBV nei genomi di ibridi interspecifici di Saccharum (varietà “ROC 205”) coltivati in Cina. È stato dimostrato che la regione variabile di SCBV funge da espressione di promotore di alto livello di geni estranei in entrambe le piante transgeniche monocotiledoni e dicotiledoni (Braithwaite et al., 2004; Schenk et al., 1999). Sweet potato pakakuy virus (Sweet potato badnavirus a + Sweet potato badnavirus b) Basato su un piccolo sequenziamento dell'RNA di una varietà di patata dolce peruviana, Kreuze et al. (2009) hanno riportato l’esistenza di due distinti virus, il Sweet potato badnavirus a (SPVa) e Sweet potato badnavirus b (SPVb), che sono collettivamente chiamati Sweet potato pakakuy virus (SPPV). La sequenza del genoma completo di entrambi i virus è stata riportata dopo aver riempito il vuoto lasciato nella sequenza (ottenuto dal piccolo sequenziamento dell'RNA) tramite l'amplificazione PCR. Il genoma completo di SPVa è 8082 bp e quello di SPVb è lungo 7961 bp, entrambi codificanti per

20 quattro ORF. Il sequenziamento profondo di piccoli RNA sintomatici, in piante di patata dolce provenienti da Honduras, Guatemala (Kashif et al., 2012) e Tanzania (Mbanzibwa et al., 2014), hanno rivelato la presenza dei due virus. È stato sviluppato un metodo basato sulla PCR per il rilevamento affidabile di entrambi. Un terzo SPV è indicato da una sequenza parziale (3065 nucleotidi) che codifica il movimento ipotetico e le proteine del capside, mostrando un’identità di 86,3% e 73,1% a SPVb e SPVa, rispettivamente. Taro bacilliform virus (TaBV) Taro bacilliform virus (TaBV) infetta taro (Colocasia esculenta) che è distribuito in tutte le isole del Pacifico. La malattia è caratterizzata da clorosi della nervatura, arresto della crescita e curvatura verso il basso delle lamelle fogliari. Il TaBV è trasmesso da semi e dalla cocciniglia Pseudococcus solomonensis (Devitt et al., 2005; Yang et al., 2003a; Yang et al., 2003b). La sequenza completo nucleotidica di un isolato proveniente dalla Papua Nuova Guinea comprende 7458 bp con quattro ORF. La dimensione e l'organizzazione degli ORF da da I a III di TaBV sono simili a quelli principali dei virus standard, mentre le posizioni di ORF IV e X sono simili a quelle di ORF IV di CYMV e ORF X di CSSV. L'analisi filogenetica ha mostrato che il TaBV è strettamente correlato al DBV (Yang et al., 2003). L’analisi delle sequenze della regione di codifica RT/RNaseH di 22 isolati di TaBV da Fiji, Polinesia francese, Nuova Caledonia, Papua Nuova Guinea (PNG), Samoa, Isole Salomone e Vanuatu hanno rivelato una variabilità del 23% e del 14% nel nucleotide e delle sequenze di amminoacidi, mentre è stata osservata una variabilità maggiore del 33% per la regione CP (Yang et al., 2003). L'analisi filogenetica degli isolati di TaBV provenienti dalle Isole Salomone ha rivelato i più grandi e quelli dalla Nuova Caledonia e PNG hanno la variabilità più bassa. Sulla base delle sequenze della regione di codifica RT/RNaseH, è stato sviluppato un test diagnostico fondato sulla PCR che rileva tutti gli isolati di TaBV noti (Yang et al., 2003). Una sequenza che mostra una sequenza di identità nucleotidica del 50% in TaBV in tutti i campioni di taro testati nella regione RT/RNase H, indicando che questo può rappresentare sia TaBV endogeno o il genoma di un badnavirus aggiuntivo. Recentemente, sulla base del sequenziamento di piccoli RNA di piante sintomatiche di taro provenienti dalla Cina, Kazmi et al. (2015) hanno riportato la sequenza completa del genoma di due isolati che condividevano il nucleotide con somiglianze del 44,1% al 55,8% con altri badnavirus (45,5% con TaBV), suggerendo l’esistenza di una nuova specie di badnavirus in taro, provvisoriamente chiamata Taro bacilliform CH virus (TaBCHV). Il completo genoma di due isolati di TaBCHV è di 7641 bp di lunghezza con sei ORF che codificano proteine di 16,8, 14,1, 206.4, 13.2, 11.9 e 12.4 kD. Una regione del genoma TaBV ha mostrato di avere attività di promotore nella foglia di taro, cellule di sospensione di banano e callo di tabacco. Quando questi promotori sono stati valutati in tutte le piante transgeniche di banana e tabacco coltivate in modo stabile e trasformato, tutte sono state trovate alla guida espressione quasi costitutiva di un gene reporter nella radice (o pseudostelo), foglie e radici, con l'espressione più forte osservata nel tessuto vascolare, indicando che i promotori derivati da TaBV è utile per l'espressione costitutiva di alto livello dei transgeni in specie dicotiledoni o monocotiledoni (Yang et al., 2003). Specie addizionali putative Ambrosia asymptomatic virus 2 e Ambrosia asymptomatic virus 4 Il riscontro di due distinti virus, Ambrosia asymptomatic virus 2 e Ambrosia asymptomatic virus 4 è stato segnalato nelle piante asintomatiche di Ambrosia psilostachya (ambrosia occidentale) negli Stati Uniti. Acido nucleico isolato da particelle simili a virus preparati da piante asintomatiche, quando amplificate e sequenziate, hanno mostrato la presenza di quattro virus, inclusi due badnavirus (Melcher et al., 2008). Aucuba bacilliform virus (AuBV) Aucuba bacilliform virus (AuBV) provoca un anello giallo o un mosaico giallo in Aucuba japonica. Il virus viene trasmesso attraverso semi e da cocciniglie. 21 Cycad necrotic leafspot virus (CyLNV) Cycad necrotic leafspot virus (CyLNV) causa la malattia della necrosi fogliare di diverse cicadi (Ceratozamia, Stangeria e Zamia spp.). I sintomi sono caratterizzati da lesioni fogliari clorotiche e necrotiche che si espandono e producono zone necrotiche più grandi La microscopia elettronica di estratti parzialmente purificati ha mostrato virioni bacilliformi di 30x 150 nm che contengono un genoma di dsDNA di 9,5 kb (Lockhrat et al., 2006). Il genoma completo del virus proveniente dagli Stati Uniti conteneva 9205 nucleotidi con tre ORF. Dracaena mottle virus (DrMV) Dracaena mottle virus (DrMV), la malattia a chiazze di Dracaena è caratterizzata da macchie chiazzate e clorotiche sulle foglie di Dracaena sanderiana (conosciuta come "lucky bamboo"). Il genoma virale è composto da 7531 bp e possiede sette ORF putative sul filamento che potenzialmente codifica più per proteine di 17,6, 14,9, 215,0, 11,9, 11,3, 16,1 e 11,0 kD. L'ORF III di DrMV corrisponde a quello dei badnavirus. Tuttavia, il nucleotide la codifica in sequenza per il dominio RT e RNase H di DrMV e condivide un'omologia inferiore al 68% con quella di qualsiasi altro virus noto. L’analisi di Southern hybridization del DNA della pianta infetta ha indicato la sequenza DrMV che è anche integrata nel genoma di Dracaena sanderiana (Su et al., 2007). Grapevine Roditis leaf discoloration-associated virus (GRLDaV) Grapevine Roditis leaf discoloration-associated virus (GRLDaV) ha causato la decolorazione delle foglie di Roditis (RLD), nella vite, cv. "Roditis", nella Grecia centrale all'inizio degli anni '80 (Rumbos et al., 1989). I sintomi RLD includono colorazioni gialle e/o rossastre, malformazioni delle foglie giovani, ridotte dimensioni e basso contenuto di zucchero nelle bacche. Il sequenziamento di siRNA da una vite infetta ha mostrato la presenza di un badnavirus di 6988 bp, inclusi quattro ORF. Il codice di ORF I, II e IV è per proteine con funzioni sconosciute, mentre ORF III codifica una poliproteina con motivi relativi alla replica, incapsidazione e motivi di movimento dei badnavirus. L'analisi filogenetica ha mostrato FBV-1 come il più vicino a GRLDaV (Maliogka et al., 2015). Mulberry badnavirus 1 (MBV-1) Mulberry badnavirus 1 (MBV-1) è stato riportato infettare il gelso (Morus alba) in Libano, mostrando i sintomi della screziatura delle foglie e dell'ingiallimento delle nervature fogliari. Tipiche particelle simili a quelle dei badnavirus (150 x 30 nm) sono state viste in una preparazione parzialmente purificata e in sezioni sottilissime di piante infette. Il virus è stato rilevato anche da campioni di gelso raccolti dalla Turchia e dall'Italia, nonostante la maggior parte dei campioni erano privi di sintomi. Il genoma completo di MBV-1, ottenuto mediante sequenziamento di piccoli RNA, contiene tutte le caratteristiche di sequenza ed i domini funzionali caratteristici del genere Badnavirus. Il genoma completo è lungo 6945 bp con due ORF e somiglianza elevata condivisa (54%) con FBV-1. Al contrario dei badnavirus, MBV-1 assomiglia all'organizzazione del genoma di PVCV (genere: Petuvirus), che ha un singolo ORF (Chiumenti et al., 2014; Elbeaino et al., 2013). Red Clover bacilliform virus (RCBV) Red Clover bacilliform virus (RCBV) riportato in piante di Trifolium pratense induce sintomi di nanismo e sintomi di mosaico, nella Repubblica Ceca dove sono stati osservati virioni bacilliformi nei tessuti del floema le cui misure sono 220-500 nm x 30-31,5 nm. Il virus è trasmesso meccanicamente in Nicotiana occidentalis Wheeler, accessione 37 B. La sequenza nucleotidica parziale con somiglianza con ORF III del il genoma dei badnavirus dopo amplificazione ha mostrato un'identità nucleotidica del 74,4% rispetto a quella di Ananas comosus virus endogeno nel gene poliproteico che copre la trascrittasi inversa (Fránová). Stilbocarpa mosaic bacilliform virus (SMBV) La presenza di Stilbocarpa mosaic bacilliform virus (SMBV) nelle piante di Stilbocarpa polaris mostra sintomi del mosaico giallo da lieve a severo, sull'isola subantartica Macquarie tra

22 l’Australia e l'Antartide dove è stata osservata nel 1993 (Skotnicki et al., 2003). Il citoplasma dei tessuti dei campioni malati conteneva particelle bacilliformi di dimensioni variabili fino a 100 nm di lunghezza e circa 20 nm di diametro. Il sequenziamento del DNA è stato effettuato dalla della regione della trascrittasi inversa del virus, utilizzando il virus del degenerato specifico. I primer hanno mostrato somiglianze con altri badnavirus, in particolare con i virus dell’ananas e della canna da zucchero (Skotnicki et al., 2003). Yacon necrotic mottle virus (YNMoV) Yacon necrotic mottle virus (YNMoV) che infettava yacon (Smallanthus sonchifolius) in Corea era riferito al 2013. Le piante infette mostrano necrosi, clorosi, arresto della crescita e malformazioni delle foglie. Il sequenziamento del trascrittoma delle piante infette ha rivelato il genoma completo del virus di 7661 bp in lunghezza con quattro ORF, in cui l’ORF III ha mostrato un'identità amminoacidica del 45% con quella di FBV-1 (Lee et al., 2015). Yucca bacilliform virus (YBV) Yucca bacilliform virus (YBV) è stato segnalato per la prima volta nel 2001 nelle piante di Yucca elephantipes importate in Cina, Nuova Zelanda, dalla Costa Rica e dal Guatemala (Clover et al., 2003). Il virus provoca lesioni clorotiche sulle foglie secondo la loro lunghezza, con intensità crescente verso le punte, che diventano gradualmente necrotiche nel tempo. Il virus causale è stato identificato come un membro dei badnavirus sulla base della microscopia elettronica, PCR ed analisi di sequenza della regione RT/RNase H dello stesso virus. Anche il DNA dei Badnavirus è stato amplificato da Yucca elephantipes in Nuova Zelanda che era priva di sintomi e di particelle virali, suggerendo che YBV si presenta anche come una forma endogena nel suo ospite. Conclusioni e necessità di future ricerche I Badnavirus sono virus a DNA bacilliformi senza involucro con un genoma monopartito. Attualmente, sono confermate 32 specie, alcune delle quali sono economicamente importanti in quanto causano gravi malattie ai tropici in colture come banana, pepe nero, cacao, agrumi, canna da zucchero, taro e patata dolce. La maggior parte dei badnavirus ha un intervallo di ospiti limitato. Molti dei badnavirus che infettano le piante rimangono asintomatici o mostrano solo sintomi lievi. Il mascheramento dei sintomi tipici e la loro ricomparsa sotto stress abiotico non sono rari. Da qui il ruolo di fattori abiotici come temperatura, siccità (stress da deficit di umidità del suolo) e stress dei nutrienti nello sviluppo dei sintomi e la severità della malattia deve essere studiata in tali virus. Il possibile ruolo dello stress biotico nello sviluppo e nella gravità della malattia da badnavirus, come quello causato da altri patogeni rappresentati da altri virus, batteri, nematodi, funghi ed insetti devono ancora essere studiati. La lunghezza del genoma dei badnavirus varia tra 7200 e 9200 bp con 3-7 ORF. Tranne l’ORF III, che è una poliproteina, le funzioni degli altri ORF non sono ancora note. Le regioni intergeniche dei badnavirus hanno il potenziale per essere usate come promotore e potrebbero essere sfruttate nell'espressione dei geni estranei nelle piante. Molti dei pararetrovirus, inclusi i badnavirus, si presentano anche come virus endogeni. Il genere Florendovirus della famiglia Caulimoviridae ha 34 specie distinte conosciute per esistere solo come virus endogeni, in un gran numero di piante. Di questi, BSOLV endogeno, BSGFV e BSIMV possono dare origine a virus episomali, in alcuni ibridi se sottoposti all'uno o all'altro stress abiotico, mentre i virus endogeni di altri virus segnalati finora non sono noti per dare origine a virus episomali infettivi in condizioni di stress. PCR, IC-PCR, real-time PCR, LAMP e analisi basate su RCA sono stati sviluppati per l’individuazione sensibile di alcuni badnavirus. Poiché i metodi basati sulla PCR possono dare risultati falsi positivi a causa della presenza di badnavirus endogeni, vi è un'urgente necessità di sviluppare altri metodi infallibili per rilevare e distinguere i badnavirus episomali ed endogeni nelle piante. Metodi come RCA e PCR sono necessari per rilevare le piante che ospitano BSV e eBSV che possono dare origine ad infezioni

23 virali, mentre la sola RCA può identificare piante esenti da virus che ospitano virus endogeni non infettivi. Questo è importante per l'identificazione di piante prive di virus da utilizzare per la propagazione e anche per lo scambio di germoplasma internazionale. Sebbene i badnavirus possano essere curati mediante il germoplasma della pianta, utilizzando la crioconservazione, la chemioterapia e la termoterapia combinate con la coltura apicale meristematica, il successo percentuale è trascurabile. Nel caso della CSSV, è stata utilizzata l'embriogenesi somatica per ottenere l'assenza di virus da piante di cacao. Questi sforzi devono essere perseguiti ulteriormente per tutti i badnavirus per la produzione di piantine certificate prive di virus. L’uso di materiale colturale senza badnavirus, purché integrato con nutrienti, pratiche culturali e misure chimiche per il controllo del vettore possono aiutare a gestire la malattia in una certa misura, ma lo sviluppo di cultivar resistenti sarebbe la migliore opzione in via di sviluppo della cura delle malattie virali. Circa i programmi IPM, finora non ne sono stati segnalati. Con l'avvento di strumenti di modifica del genoma come TALENS, Zinc-finger nucleases (ZFNs) ed il recente CRISPR-Cas9 con metodi basati su RNA a guida breve, diventa possibile eliminare le sequenze virali integrate indesiderate, che possono dare spontaneamente dar luogo a forme episomali. Lo sforzo per svelare il significato delle sequenze badnavirali integrate potrebbe portare ad una migliore comprensione dell'immunità acquisita e dell'RNAi naturale nelle colture vegetali.

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