Und Jugendmedizin Der Universität Zu Köln Klinik Und Poliklinik Für Kinder- Und Jugendmedizin Direktor: Universitätsprofessor Dr

Aus dem Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin der Universität zu Köln Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. J. Dötsch

Vergleich des Transkriptoms mikrodissezierter Neuroblastome mit fetalen Neuroblasten

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln

vorgelegt von Ute Susanne Beutenmüller aus Schopfheim

promoviert am 23. Juli 2014

Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln 2014 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg 1. Berichterstatter: Professor Dr. med. M. Fischer 2. Berichterstatter: Privatdozent Dr. med. L. Heukamp

Erklärung

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.

Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten: Professor Dr. med. Matthias Fischer.

Weitere Personen waren an der geistigen Vorstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/ eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen.

Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Köln, 29.04.2013______(Ute Beutenmüller) Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind von mir mit Unterstützung meines Betreuers Herrn Professor Dr. med. Matthias Fischer und den medizinisch-technischen Assistentinnen Frau Yvonne Kahlert, Frau Nadine Hemstedt und Frau Anne Engesser durchgeführt worden. Bei bioinformatischen Fragestellungen erfolgte die Unterstützung von Herrn Dr. Frederik Roels, Frau Dr. Ruth Volland und Frau Dr. Barbara Hero. Beratend in Bezug auf technische und organisatorische Fragen standen mir Frau Dr. Hayriye Kocak, Frau Dr. Sandra Ackermann und Frau Heike Düren zur Seite.

Die immunhistochemische Färbung, Zellerkennung und Zellgewinnung mittels Lasermikroskopie erfolgte zu großen Teilen in Frankfurt am Main mit Hilfe von Frau Privatdozentin Dr. med. Sylvia Hartmann, Herrn Ralf Lieberz und der technischen Assistentin Frau Yvonne Michel des Dr. Senckenbergischen Instituts für Pathologie des Klinikums der J. W. Goethe-Universität Frankfurt am Main unter Leitung von Herrn Professor Dr. med. Dr. h.c. Martin-Leo Hansmann.

Die Zellgewinnung in Köln erfolgte mit Hilfe des Lasermikroskops der Pathologie des Universitätsklinikums zu Köln der Forschungsgruppe unter Frau Privatdozentin Dr. med. Margarete Odenthal unter Leitung von Herrn Professor Dr. med. Reinhard Büttner.

Danksagung

Ich danke Herrn Professor Dr. med. Frank Berthold für die Möglichkeit, mich dieser Arbeit zu widmen. Ganz besonderer Dank gilt Herrn Professor Dr. med. Matthias Fischer, der viel Zeit in die Betreuung dieser Arbeit investiert hat, für die sehr gute wissenschaftliche Unterstützung und zahlreiche Diskussionen. Des Weiteren danke ich allen Mitarbeitern des Labors für pädiatrische Onkologie des Universitätsklinikums zu Köln, die mir direkt oder indirekt geholfen haben. Ohne die Unterstützung und Hilfe der medizinisch-technischen Assistentinnen Frau Yvonne Kahlert, Frau Nadine Hemstedt und Frau Anne Engesser wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Des Weiteren möchte ich mich bei Herrn Dr. Frederik Roels, Frau Dr. Ruth Volland und Frau Dr. Barbara Hero für die Unterstützung im Bereich Bioinformatik und Statistik bedanken. Mein Dank gilt auch Frau Dr. Hayriye Kocak, Frau Dr. Sandra Ackermann und Frau Heike Düren für die geduldige Unterstützung und Beantwortung vieler Fragen.

Herrn Professor Dr. med. Dr. hc. Martin-Leo Hansmann und der Abteilung für Pathologie des Klinikums der J. W. Goethe-Universität Frankfurt am Main, insbesondere Frau Privatdozentin Dr. Sylvia Hartmann, Herrn Ralf Lieberz und der technischen Assistentin Frau Yvonne Michel gilt mein besonderer Dank für die freundliche Unterstützung bei der immunhistochemischen Färbung, Zellerkennung und Zellgewinnung mittels Lasermikroskopie.

Ebenso danke ich Herrn Professor Dr. Reinhard Büttner des Instituts für Pathologie des Universitätsklinikums zu Köln und insbesondere Frau Privatdozentin Dr. med. Margarete Odenthal für die Bereitstellung der technischen Hilfsmittel zur Lasermikroskopie.

Zu guter Letzt gilt ganz besonderer Dank meiner Mutter Susanne Beutenmüller und Martin Hellmann für die langjährige Unterstützung und Ermutigung.

Für Martin

Verzeichnisse I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ...... IV

1 Einleitung ...... 1

1.1 Prognosemarker des Neuroblastoms ...... 2 1.1.1 Tumorstadium ...... 3 1.1.2 Alter ...... 4 1.1.3 MYCN Amplifikation ...... 5 1.1.4 Tumorzellploidie ...... 5 1.1.5 Zytogenetische Aberrationen ...... 6 1.1.6 Neurotrophinrezeptor TrkA, TrkB, und TrkC ...... 6 1.1.7 Histologie ...... 7 1.2 Krankheitsverlauf des Neuroblastoms ...... 8 1.3 Neuroblastomentstehung ...... 9 1.4 Laser Mikrodissektion ...... 11 1.5 Genexpressionsanalysen ...... 13 1.5.1 Mikroarrays und Hybridisierung ...... 13 1.5.2 Genexpressionsanalysen in der onkologischen Forschung .. 14

Fragestellung der Arbeit ...... 17

2 Material und Methoden ...... 18

2.1 Systematik der angewandten Methoden ...... 18 2.2 Patientenmaterial ...... 19 2.3 Identifikation der Zellen ...... 20 2.4 Immunhistochemie ...... 21 2.4.1 BCL-2 ...... 22 2.4.2 NCAM ...... 22 2.5 Schnitte und Hämatoxylin-Eosin Färbung ...... 23 2.6 Lasermikrodissektion ...... 24 2.7 Amplifikation ...... 25 2.7.1 Zelllyse, mRNA Markierung und magnetische mRNA Isolation ...... 27 2.7.2 cDNA Synthese im Säulchen ...... 28 2.7.3 Anhängen einer DNA Sequenz (TAG) an die cDNA ...... 29 2.7.4 Amplifikation der cDNA durch Polymerasekettenreaktion ..... 29 2.7.5 Klenow Markierung der amplifizierten cDNA ...... 31 2.8 Aufreinigung ...... 32 2.8.1 PCR Produkt Aufreinigung ...... 32 2.8.2 Illustra CyScribe GFX Aufreinigung ...... 32 2.9 Methoden der Qualitäts- und Quantitätskontrolle ...... 33 2.9.1 Mikroelektrophoretische Kontrolle ...... 33 2.9.2 Spectrophotometrische Kontrolle ...... 34 2.10 Mikroarray Analyse ...... 35 II Verzeichnisse

2.10.1 Hybridisierung ...... 35 2.10.2 Scannen der Mikroarrays ...... 37 2.11 Statistische Methoden ...... 38 2.11.1 Nicht überwachte Cluster Analysen ...... 38 2.11.2 Hauptkomponentenanalyse ...... 38 2.11.3 Varianzanalyse ...... 39 2.12 Gene Ontology Analysen ...... 39 2.13 Chargeneinfluss (Batch Effect) ...... 40

3 Ergebnisse ...... 41

3.1 Färbung und Immunhistochemie ...... 41 3.2 RNA Qualitätskontrolle mit Bioanalyzer/ Pico Chip ® ...... 42 3.3 Quantifizierung der cDNA mit Nano Drop ...... 45 3.4 Vergleich von Neuroblasten mit kortikalen Zellen ...... 48 3.4.1 Gene Ontology Analysen der Neuroblasten und kortikalen Zellen ...... 53 3.5 Vergleich von Neuroblasten mit Neuroblastomen ...... 58 3.5.1 Chargeneinfluss (Batch Effect) der untersuchten Proben ..... 60 3.5.2 Reduktion des Chargeneffekts (Batch Effect Removal) ...... 65 3.6 Differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblasten und Neuroblastomen ...... 68 3.6.1 Differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblastomen des Stadiums 1 und Neuroblasten ...... 69 3.6.2 Differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblastomen des Stadiums 4 und Neuroblasten ...... 70 3.6.3 Differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblastomen des Stadiums 4S und Neuroblasten ...... 70 3.6.4 Differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblastomen des Stadiums 4 mit MYCN Amplifikation und Neuroblasten ...... 70 3.7 Neue Kandidatengene günstiger und ungünstiger Neuroblastome ...... 70 3.7.1 Drosophila Delta like homologue 1 (DLK1) ...... 71 3.7.2 Tyrosine Hydroxylase (TH) ...... 73 3.7.3 V-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived, avian (MYCN) ...... 74 3.7.4 V-myc myelocytomatosis viral related oncogene, avian ( MYC ) ...... 75 3.7.5 Preferentially expressed antigen in melanoma (PRAME ) ..... 76 3.7.6 Anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase ( ALK ) ...... 77 3.7.7 Repressor element 1-silencing transcription factor ( REST ) .. 79 3.7.8 Homebox C9 ( HOXC9 ) ...... 82 3.7.9 Transcription factor AP-2 beta ( TFAP2B ) ...... 84 3.7.10 Baculoviral IAP repeat containing 5 ( BIRC5 ) ...... 85 3.7.11 Paired-like homeobox 2b ( PHOX2B ) ...... 86 Verzeichnisse III

4 Diskussion ...... 88

4.1 Einleitung der Diskussion ...... 88 4.2 Technische Aspekte und inhaltliche Auswertung ...... 88 4.3 Chargeneinfluss (Batch Effekt) auf die Daten ...... 91 4.3.1 Bewertung der Bereinigung des Batch Effekts der Daten ..... 92 4.4 Beschreibung und Bewertung neuer Kandidatengene des Neuroblastoms ...... 93 4.5 Ausblick ...... 98

5 Zusammenfassung ...... 100

6 Literaturverzeichnis ...... 101

7 Anhang ...... 114

7.1 Abbildungsverzeichnis ...... 114 7.2 Tabellenverzeichnis ...... 116 7.3 Liste charakteristischer Gene ...... 117 7.4 Listen differentiell exprimierter Gene zwischen Neuroblasten und Stadium 1, 4, 4S und MYCN amplifizierten Neuroblastomen ...... 119 7.5 Batch Effekt Removal „ber“ ...... 131

8 Lebenslauf ...... 132

IV Verzeichnisse

Abkürzungsverzeichnis

% Prozent °C Grad Celsius Abb. Abbildung ANOVA Analysis of variance, Varianzanalyse BCL-2 B-cell CLL/Lymphoma 2 ca. circa cDNA complementary DNA CNV Copy Number Variations CpG Cytosin, Phosphat und Guanin Bereiche der DNA Cy 3, Cy5 Cyanin 3, Cyanin 5 DAVID Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery dCTP Cyanin 3 deoxynucleosid Cythidin Triphosphat DNS, DNA Desoxyribonukleinsäure, desoxyribonucleinacid E.coli Escherichia coli EFS Event Free Survival et al. und Kollegen FGFR Fibroblasten Growth Factor Receptors FISH Fluorezenz in Situ Hybridisierung FU Fluoreszenz-Einheiten G Gramm g Einheit der Beschleunigung GO Gene Ontology h Stunde HE Hämatoxylin-Eosin HSR Homogeneously Staining Regions INPC International Neuroblastoma Pathology Classification INSS International Neuroblastoma Staging System l Liter LK Lymphknoten LMPC Laser Capture Microdissection and Pressure Catapulting Verzeichnisse V

LOH Loss of heterozygosity LSAB Labelled (Strept-)Avidin-Biotin m Milli M Molar; mol/l; Mol pro Liter min Minute Mio. Millionen mRNA messenger RNA MKI Mitose-Karyorrhexis-Index µ mikro n,η nano; Anzahl NB Neuroblastom NCAM Neuronal Cell Adhesion Molecule, CD56 NGF Nerve Growth Factor NIH National Institute of Health NSE Neuronen-spezifische-Enolase nt Nukleotide OCT Optimal Cutting Temperature oligo (dT) oligo deoxythymidylic p Piko PAM Prediction Analysis for Microarrays PCA Principle Component Analysis, Hauptkomponentenanalyse PCR Polymerasekettenreaktion, polymerase chain reaction pH potentia Hydrogenii ppb parts per billion QPCR Quantitative Polymerasekettenreaktion RNA Ribonukleinsäure, ribonucleic acid RNAsin RNAse Inhibitor rpm rounds per minute RT Reverse Transkription s Sekunde SAGE Serial Expression of Gene Expression SNP Single Nucleotide Polymorphism, Einzelnukleotidpolymorphis- VI Verzeichnisse

men

Tab. Tabelle TdT Terminale Deoxynucleotidyl Transferase tRNA transfer-RNA TSG Tumorsuppressorgen TNM Tumor Nodes Metastases U Umdrehung, Unit UV Ultraviolett V Volt vgl. Vergleiche W Watt WebGestalt WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit

1 Einleitung 1

1 Einleitung

Das Neuroblastom gehört zur Gruppe der fetalen Tumoren und hat damit, so wird allgemein angenommen, seinen Ursprung in einem Entwicklungsdefekt von der Vorläuferzelle aus der Neuralleiste, dem Neuroblasten, zur reifen neuronalen Zelle (118, 94). Trotz seltener familiärer Häufungen von Neuroblas- tomerkrankungen, in 1-2 % der Fälle (57, 145, 95, 86, 82), und damit verbunde- ner Assoziation mit dem Phox2b -Gen auf Chromosom 4p12 (paired like homeobox transcription factor 2b) und dem ALK -Gen (102) ist diese Tumorentität keine typisch hereditäre Erkrankung (96, 169, 176). Gestörte molekulare Si- gnalwege der normalen Entwicklung neuroendokriner Zellen spielen eine große Rolle bei der Genese und dem Forschreiten dieser Erkrankung (59). Das Neuroblastom ist nach Leukämien und zerebralen Neoplasien der dritthäufigste Tumor im Kindesalter. Es ist als peripherer Nervenzelltumor mit 7,5 % Präva- lenz aller Malignome im Kindesalter, vgl. Abbildung 1.1 (73), der am häufigsten tödlich verlaufende extrakranielle, solide Tumor in dieser Kohorte und bietet ein erstaunliches Maß an klinischer Variabilität von lokalisierten bis hin zu hoch metastasierten Verläufen.

Leukämien

ZNS Tumoren

Lymphome

Periphere Nervenzelltumoren Weichteilsarkome

Nierentumoren

Sonstige Diagnosen

Knochentumoren

Keimzelltumoren

Abbildung 1.1: Prävalenz der Tumoren im Kindesalter (1999-2008). Quelle: (1)

Durchschnittlich liegt das Erkrankungsalter am Neuroblastom bei 2 Jahren (37, 138). Das männliche Geschlecht ist mit 1,2 zu 1 geringfügig überrepräsentiert (135). 2 1 Einleitung

Lokalisierte Stadien des Neuroblastoms haben im Allgemeinen eine bessere Prognose zu verzeichnen als metastasierte Stadien. Von dieser Regel weichen Stadium 4S - S steht für spezial - Tumoren ab, welche vor allem im Säuglings- alter auftreten, lokal auf Leber und Haut limitierte Metastasen aufweisen und zu spontaner Regression neigen (55, 45). Jährlich werden in Deutschland rund 130 Fälle von Neuroblastomen neu diagnostiziert. Fasst man die Gruppe der Neuroblastome und Ganglioneurome zusammen, so weisen sie eine Inzidenz von 14 bezogen auf 1.000.000 Kinder unter 15 Jahren und eine 5-Jahres- Überlebensrate von 79 % auf, vgl. Tabelle 1.1 (1).

Tabelle 1.1: Inzidenz und Überlebenswahrscheinlichkeit der 5 häufigsten onkologischen Diagnosen im Kindesalter (1999-2008). Quelle: (1)

Krebserkrankung Inzidenz* Überlebenswahrscheinlichkeiten in %** nach 3 Jah- nach 5 Jah- nach 10 Jah- ren ren ren Akute lymphatische 44 92 90 87 Leukämien Astrozytome 16 81 79 76 Neuroblastome und 14 84 79 77 Ganglioneuroblastome Nephroblastome 10 94 93 92 Intrakranielle u. intra- 8 71 65 57 spinale embryonale Tumoren Alle Malignome 159 86 83 81 *bezogen auf 1.000.000 Kinder unter 15 Jahren, altersstandardisiert, Standard: Segi- Weltbevölkerung

**Quelle (27)

1.1 Prognosemarker des Neuroblastoms Die Neuroblastomstudie 2004 klassifiziert am Neuroblastom erkrankte Patien- ten aktuell in drei Gruppen: eine Gruppe mit geringem Risiko, eine mittlere Risi- kogruppe und eine Gruppe mit Hochrisikoprofil. Auf der Grundlage definierter Prognosemarker wie unter anderem Tumorstadium nach dem International Neuroblastoma Staging System (INSS), Patientenalter bei Diagnose und MYCN Amplifikationsstatus wird für jeden Patienten individuell über therapeutische 1 Einleitung 3

Interventionen entschieden. Die klinische Erfahrung hat gezeigt, dass stets einige Patienten dennoch nicht ihrer Ausprägung der Erkrankung entsprechend klassifiziert werden, keine ausreichende Therapie erhalten und Rezidive erlei- den oder aber einer therapeutischen Strategie unterliegen, die ihr Risiko über- schätzt.

1.1.1 Tumorstadium Das Neuroblastom wird ähnlich der TNM Klassifikation gemäß der Kriterien des International Neuroblastoma Staging System seit 1988, mit einer Revision 1993 nach Ausbreitung des Primärherdes, Befall von Lymphknoten und Vorhanden- sein einer Fernmetastasierung eingeteilt (34). Hinzu kommt das Ausmaß der Resektion des Primärtumors, vgl. Tabelle 1.2.

Tabelle 1.2: International Neuroblastoma Staging System Quelle: (34, 103)

Stadium Beschreibung 1 Lokalisierter Tumor mit makroskopisch kompletter Entfernung (mit oder ohne mikroskopischen Resttumor); auffindbare ipsi - und kontralaterale Lymphknoten (LK) sind histologisch ohne Tumorbefall. 2a Unilateraler Tumor mit makroskopisch inkompletter Entfernung; auffindbare ipsi - und kontralaterale LK sind histologisch ohne T u- morbefall. 2b Unilateraler Tumor; mit makroskopisch kompletter oder inkompletter Entfernung; mit positiven regionalen und ipsilateralen LK; auffindbare kontralaterale LK sind histologisch ohne Tumorbefall. 3 Nichtresektabler unilateraler Tumor mit Überschreiten der Mittelli- nie mit oder ohne regionalen LK -Befall oder unilateraler Tumor mit kontralateralem regionalem LK -Befall oder nichtresektabler Mittel- linientumor mit bilateraler Ausdehnung du rch Infiltration oder durch LK-Befall (bis zur oder über die jeweilige Wirbelkante hinaus). 4 Disseminierung des Tumors in Knochenmark, Knochen, entfernte LK, Leber oder anderen Organen. 4S Lokalisierter Primärtumor bei Kindern unter 1 Jahr (lokalisiert wie in Stadium 1, 2a oder 2b) mit Disseminierung beschrän kt auf L e- ber, Haut oder Knochenmark (<10% maligne Zellen)

Tumoren des Stadiums 1 sind unilateral lokalisiert und können chirurgisch makroskopisch komplett reseziert werden. Das ereignisfreie 5-Jahres-Überleben (Event Free Survival; EFS) dieser Patientengruppe liegt bei über 90 %. Gelingt die komplette Entfernung nicht und weisen die Tumoren keine strukturellen 4 1 Einleitung chromosomalen Defekte auf, so spricht man von Tumoren des Stadiums 2, wird die Mittellinie überschritten und ist der Tumor nicht resektabel oder handelt es sich um einen Tumor bilateraler Ausdehnung, beschreibt man dies als Tumoren des dritten Stadiums.

Zu den Tumoren des Stadiums 4 zählen disseminierte Stadien sowie Tumoren des Stadiums 4S. Dabei weisen Stadium 4S Tumoren trotz bestehender Metas- tasierung in Haut und Leber oftmals eine spontane Regression auf und zeigen ein exzellentes 5-Jahres-Überleben von 90 %. Therapeutisch wird in diesem Fall sehr zurückhaltend bis hin zum „wait -and-see-approach“ interveniert (166, 1). Stadium 4 Tumoren zeichnen sich durch einen rasch progredienten malignen Verlauf und trotz multimodaler Therapie mit myeloablativer Chemothera- pie, ein 5-Jahres-Überleben von 25 – 30 % aus (55). Bezieht man die genetischen Voraussetzungen mit ein, definieren sich Hochrisikostadien sowohl durch Metastasierung, als auch durch genetische Alterationen wie die MYCN Amplifi- kation (34).

Die unterschiedliche Stadienverteilung spiegelt ein ausgeglichenes Bild zwischen sehr aggressiven Verläufen und Tumoren mit günstiger Prognose wieder vgl. Abbildung 1.2.

StadiumSt

4 S

Abbildung 1.2: Stadienverteilung des Neuroblastoms nach der Studie NB 97 Quelle: (55)

1.1.2 Alter Eine erhöhte Krebsinzidenz im Kindesalter konnte mit dem Wachstumsgipfel von Organsystemen korreliert werden (123). Das Alter der Patienten bei Dia- gnose des Neuroblastoms ist ein guter Vorhersageparameter zur Abschätzung 1 Einleitung 5 des klinischen Verlaufs (20, 28). So weisen Patienten mit einem Alter <18 Mo- naten einen deutlich günstigeren Verlauf auf als Patienten > 2 Jahren.

1.1.3 MYCN Amplifikation Trotz multimodaler Therapie sind die Überlebensraten für das aggressive Neuroblastom gering. Bereits 1983/84 wurde die chromosomale Region 2p23- 24, d.h. auf dem kurzen Arm des Chromosom 2 mit dem Onkogen MYCN als Gen entdeckt und etablierte sich im Verlauf bis dato als bedeutender Tumor- prognosemarker (137, 136). Die Amplifikation des MYCN Protoonkogens ist mit 20 % die häufigste genetische Aberration im Neuroblastom und mit aggressi- vem klinischem Verlauf, hohem Tumorstadium und ungünstiger Prognose assoziiert (136, 35, 138, 96, 140, 79, 65). In 90 % der MYCN amplifizierten Neuroblastomzelllinien findet sich die amplifizierte DNA extrachromosomal in Genpartikeln, sogenannten Double-Minute-Chromosomen oder in Homoge- neously Staining Regions (HSR) unterschiedlicher Chromosomenloki (32, 84, 137).

Als Teil der MYC Genfamilie und Transkriptionsfaktor spielt MYCN auf molekulargenetischer Ebene durch Genexpression eine Rolle bei der Proteinsynthese und Zellproliferation (24, 13). Eine Deregulation dieses Gens führt zu Tumor- wachstum, Proliferation und Metastasierung (35, 19, 139, 140). Im Umkehr- schluss ist bei niedriger MYCN Expression das Proliferationspotenzial verringert (130). In ungünstigen Tumoren führt die experimentelle Induktion von MYCN erwartungsgemäß zu erhöhter Genexpression bei Genen der Proteinsynthese und Zellproliferation (13, 24).

MYCN Amplifikation findet sich häufiger bei Patienten mit einem Alter über einem Jahr. Das Auftreten der MYCN Amplifikation beläuft sich in den fortgeschrittenen Stadien 3 und 4 auf bis zu 30 %, wohingegen Stadium 1, 2 und 4S nur in Ausnahmefällen eine MYCN Amplifikation aufweisen (42).

Obwohl die MYCN Amplifikation als kritisches, genetisches Ereignis bei der Entstehung des Neuroblastoms gewertet werden kann, ist seine Kodierung eines Transkriptionsfaktors wohl auch zukünftig kein pharmakologisches Target für therapeutische Strategien. 6 1 Einleitung

1.1.4 Tumorzellploidie Zugewinn und Verlust eines oder mehrerer Chromosomen eines diploiden Ge- noms bedingt eine häufige Form der genetischen Instabilität beim Neuroblas- tom. Die Ploidie von Zellen, d.h. deren DNA-Gehalt kann mittels durchflusszy- tometrischer Untersuchungen bestimmt werden und ist unter anderem beim Neuroblastom ein geeigneter prognostischer Parameter.

Zusammenfassend ist ein diploider DNA-Gehalt laut Kaneko et al. beim Neuro- blastom mit einer ungünstigen Prognose assoziiert, ein hyperdiploider DNA- Gehalt hingegen mit einem günstigeren Verlauf (78, 77). Es konnte gezeigt werden, dass Diploidie, fortgeschrittenes Tumorstadium und Tumorwachstum in Korrelation stehen, Hyperdiploidie hingegen bei weniger fortgeschrittenem Tu- morstadium, Alter unter einem Jahr und gutem Therapieansprechen auftritt (90, 91, 155).

1.1.5 Zytogenetische Aberrationen Array basierte Daten deuten darauf hin, dass weitere numerische und strukturelle genetische Aberrationen richtungsweisend sind zur Phänotypisierung der Tumorentität (31, 152, 22). Diese Aberrationen schließen Chromosom 11p und 17q Zugewinn, sowie den Verlust der Heterozygotie bei 1p, 11q und 14q mit ein. Ein Zugewinn am Chromosom 17 ist mit über 50 % betroffener Neuroblas- tompatienten die häufigste genetische Aberration, als prognostischer Marker jedoch nicht unumstritten (173, 149). Areale chromosomaler Verluste, wie beispielsweise 1p36 in 30-35% der primären Tumoren, 11q23 in 44 % der Fälle oder 14q23-qter in 22 % der Fälle sind Anhaltspunkte für die Lokalisierung potenzieller Tumorsuppressorgene des Neuroblastoms (96).

Generell ist davon auszugehen, dass strukturelle Aberrationen wie 1p und 11q Deletionen Hinweis auf eine ungünstige Prognose geben (23, 150, 151, 17). In 23 % der Neuroblastome wiesen Attiyeh et al. einen Verlust der Heterozygotie von 1p36 nach, welche sowohl mit einer MYCN Amplifikation, als auch einem near diploidem bzw. tetraploidem Karyotyp einhergeht. Diese Konstellation ist typisch für die Gruppe der Patienten mit Hochrisikoprofil (17, 32). In Fluores- zenz in Situ Hybridisierungsanalysen (FISH) von Spitz et al. konnte an 144 Neuroblastomen gezeigt werden, dass sowohl MYCN Amplifikation und 1p36 Deletion, als auch 1p Imbalancen Indikatoren für einen prognostisch ungünsti- gen Verlauf des Neuroblastoms darstellen (151, 148). 1 Einleitung 7

1.1.6 Neurotrophinrezeptor TrkA, TrkB, und TrkC Die differentielle Expression der Neurotrophinrezeptoren TrkA, TrkB und TrkC in Neuroblastomsubtypen und deren Assoziation mit Differenzierung und Apop- tose von Tumorzellen gilt als weiterer Anhaltspunkt bei der Erklärung der Tu- morgenesemechanismen des Neuroblastoms (31). Proapoptotische Gene und Inhibitoren der Gefäßneubildung werden durch TrkA Expression hochreguliert (52, 70). Der Nerve Growth Factor ( NGF ) aktiviert TrkA und führt zur Differen- zierung von Neuroblasten und Vorläuferzellen zu reifen Nervenzellen, seine Inhibition induziert Apoptosemechanismen. Die Korrelation zwischen TrkA Ex- pression, geringem Patientenalter, weniger weit fortgeschrittenem Stadium und fehlender MYCN Amplifikation erklärt den prognostisch günstigen Verlauf dieses Neuroblastomsubtyps (83, 154).

TrkB hingegen fördert durch erhöhte Expression die Therapieresistenz und In- vasion bzw. Gefäßentwicklung (134). Die vollständige TrkB Form tritt bei MYCN amplifizierten Tumoren auf, die verkürzte Form des Neurotrophinrezeptors eher in hochdifferenzierten Tumoren wie Ganglioneuromen (106). Bei der fehlenden Differenzierung des Neuroblastoms spielt die Assoziation zwischen MYCN Am- plifikation, TrkB Expression und Exprimierung des Liganden Brain-derived neurotrophic factor (BDNF ) eine tragende Rolle (12, 97). Diese Signalkaskade er- möglicht den Tumorzellen einen Vorteil bei Proliferation und expansivem Wachstum.

Bei niedrigen Tumorstadien ohne MYCN Amplifikation dient TrkC ähnlich der Mechanismen bei TrkA als Marker für prognostisch günstige Verläufe.

1.1.7 Histologie Die Histologie des Neuroblastoms ist heterogen: neben undifferenzierten Zellen neuroektodermalen Ursprungs, mit Ähnlichkeit zu Neuroblasten während der Embryogenese weisen die Tumoren einen variablen Anteil an Schwannzell- Stroma auf (173).

Histopathologisch lässt sich das Neuroblastom nach Shimada et al. anhand des Stromagehalts, der Differenzierung, des Mitose-Karyorrhexis-Index (MKI) und des Alters der Patienten bei Diagnosestellung mit seinem klinischen Verhalten korrelieren (142). Aktuell gültig ist die histologische Unterteilung des Neuroblas- toms nach der International Neuroblastoma Pathology Classification (INPC) (143, 144) 8 1 Einleitung

Nach Ausmaß des Stromagehalts und damit auch prognostischen Kriterien unterscheiden sich Neuroblastome, Ganglioneuroblastome-intermixed, Gang- lioneurome, noduläre Ganglioneuroblastome und neuroblastische Tumorentitä- ten (55, 142, 143).

1.2 Krankheitsverlauf des Neuroblastoms Der Verlauf des Neuroblastoms gestaltet sich sehr heterogen. Prozesse der Progression, Regression und Differenzierung prägen das klinische Bild der Er- krankung. Während einige Tumoren des Stadiums 1 spontan regredient sind oder ohne Therapie in gutartige Ganglioneurome ausdifferenzieren, zeigen andere Tumoren klinisch aggressive Verläufe und erfordern intensive Chemothe- rapie. Ungefähr 60 –70 % der Hochrisiko-Neuroblastompatienten erliegen trotz multimodaler, intensiver Chemo- und Radiotherapie der Erkrankung (119, 46, 98). Bei Diagnose erfolgte bei ca. 50 % der Neuroblastompatienten bereits eine Metastasierung in Knochen und Knochenmark. Eine lymphogene, zerebellär- intrakranielle, dermale oder hepatische Metastasierung ist seltener (68).

Genaue Mechanismen der Tumorregression, Reifung und Progression sind bisher noch nicht bekannt. Einige Modelle liefern Erklärungsansätze für die spontane Regression von Tumoren. Möglicherweise spielt die spezifische Regulation der Apoptose in der Zellentwicklung der Neuroblasten eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Neuroblastoms und dessen Reifung bzw. Regression (104, 156, 81).

Spontan regrediente und aggressiv wachsende Subtypen des Neuroblastoms unterscheiden sich innerhalb ihrer Genexpression, was als Zeichen einer unterschiedlichen Ausprägung der neuronalen Differenzierung von Tumorzellen ge- deutet wird. Kommt es im Rahmen der Tumorentstehung zur Amplifikation oder Deletion chromosomaler Bereiche, so kann es zur Überexpression oder zum Verlust dort lokalisierter Gene kommen (96).

Daten aus Untersuchungen an IMR-5 Zelllinien konnten mit Hilfe von Serial analysis of gene expression (SAGE) eine erhöhte Genexpression für Gene der neuronalen Differenzierung bei Tumoren des Stadiums 4S zeigen (1). Ein Pro- zess der Dedifferenzierung in neoplastischen Zellen der Tumoren des Stadiums 4 könnte dieser Theorie folgend eine maligne Transformation induziert haben. Eine weitere mögliche Erklärung des Phänomens bietet die Theorie der Exis- 1 Einleitung 9 tenz zweier Vorläuferzellpopulationen verschiedener Entwicklungsstadien als Ursprung der klinisch variablen Differenzierung.

1.3 Neuroblastomentstehung In der 8. Entwicklungswoche entsteht das Zuckerkandl’sche Organ an der B i- furkation der Arteria mesenterica superior zur Aorta als vegetatives Paragan- glion. Betrachtet man seine Entwicklung weiter, so unterliegt es bis ins dritte Lebensjahr einer Regression und ist danach nur noch rudimentär nachweisbar (118). Das sympathische Nervensystem zeichnet sich folglich auch ohne patho- logischen Stellenwert durch Vorgänge der Regression und Progression aus.

Das sympathische Nervensystem besteht aus sympathischen Nervensträngen, Paraganglien und adrenalen Anteilen der Nebennieren. Im sympathischen Ner- vensystem finden sich Neuroblasten als unreife Vorläuferzellen während der fetalen Entwicklung. Extraadrenale Chromaffinzellen bilden den Hauptteil der Paraganglien, wohingegen die adrenalen Anteile während der Entwicklung aus adrenalen Chromaffinzellen und Neuroblasten entstehen. Das fetale Nebennie- renmark besteht folglich aus einer Ansammlung chromaffiner Zellen, reifer Ganglionzellen sowie unreifen Neuroblasten (62, 71). Die Weiterentwicklung der Neuroblasten konnte bisher nicht gänzlich geklärt werden: einige entwickeln sich zu intraadrenalen Neuronen, andere gehen im Rahmen der fetalen Ent- wicklung verloren.

Präpartal bilden die chromaffinen Zellen den vorherrschenden adrenalen Zell- typ. Nach der Geburt kann man vor allem im extraadrenalen Teil des sympathischen Nervensystems einen Verlust an chromaffinen Zellen zugunsten der neuronalen Zellen verzeichnen. Neuroblastome haben, so wird allgemein angenommen, ihren Ursprung in beiden Zelltypen oder einer pluripotenten Vorläufer- zelle, da sowohl neuronale als auch chromaffine Charakteristika in den Tumo- ren auftreten können (61, 43, 71).

Die Annahme der Neuroblasten als Neuroblastomvorläuferzellen stützt sich auf die These, dass diese im adrenalen Gewebe oder entlang der Grenzstränge sowie am Zuckerkandl’schen Organ nahe der A. mesenterica superior vorko m- men. Das Auftreten in Assoziation mit sympathischen Ganglienzellen und der neuroblastische Phänotyp dieser Zellen lassen weitere Rückschlüsse auf deren Genese zu. Während im Nebennierenmark über 50 % der Neuroblastome ent- 10 1 Einleitung stehen, liegt der Anteil der Tumoren in paraspinalen sympathischen Ganglien im thorakalen (20 %) und pelvinen (5 %) Bereich darunter (31, 76). Entlang des abdominellen sympathischen Grenzstranges finden sich weitere 25 % der Neuroblastome.

Tumoren bei Kindern unterscheiden sich grundsätzlich von Tumoren im Er- wachsenenalter, sowohl in ihren Ursprungszellen als auch in den genetischen Läsionen, welche zur malignen Tumorgenese beitragen. Mutationen und Zyto- toxizität in den frühsten Stadien der embryonalen Genese führen zu pränatalem Absterben des Embryos und Spontanabort (124). Sogenannte embryonale Tu- moren wie Retinoblastome, Nephroblastome, Medulloblastome, embryonale Rhabdomyosarkome, Keimzelltumoren oder das Neuroblastom, sind im Kin- desalter gehäuft und treten meist vor dem 5. Lebensjahr auf. Karzinome sind, mit etwa 2 % der malignen Erkrankungen, äußerst selten während dieses Le- bensabschnitts (1). Embryonale Vorläuferzellen spielen, so wird allgemein angenommen, als Progenitorzellen der Onkogenese in embryonalen Tumoren eine herausragende Rolle. Pritchard et al. erklären die Onkogenese des Neuro- blastoms durch die Persistenz embryonaler Zellen über den Zeitraum der Ge- burt hinaus. (122, 131).

Brodeur geht von einer Vorläuferzelle bei der Neuroblastomentstehung aus (31, 29, 30), welche sich nach Tumorinitiierung in zwei Subtypen Typ 1 und Typ 2 differenzieren kann. Ausschlaggebend für die Unterteilung sind MYCN Amplifi- kation, DNA-Gehalt und zytogenetische Veränderungen, vgl. Tabelle 1.3 (33).

Tabelle 1.3: Typen des Neuroblastoms nach Brodeur 1994 Quelle: (30)

Charakteristik Typ 1 Typ 2a Typ 2b MYCN 1 Kopie 1 Kopie amplifiziert DNA Ploidie hyperdiploid/ nahezu diploid/ nahezu diploid/ nahezu triploid nahezu tetra- nahezu tetraploid ploid 1 p LOH* fehlend +/- vorhanden norm. vorhanden 14 q LOH* fehlend +/- vorhanden norm. vorhanden TRK-A Expression hoch Variabel niedrig/ fehlend Alter norm. < 1 Jahr jeden Alters 1-5 Jahre Stadium 1, 2, 4S 3, 4 3, 4 1 Einleitung 11

3 Jahres Überle- 95 % 20 - 25 % <5 % ben * LOH = Loss of heterozygosity; Verlust der Heterozygotie

Die Differenzierung des Typ 1 ist mit prognostisch günstigem Verlauf, Erkran- kungsalter < 1 Jahr und lokalisiertem Tumor assoziiert (31): Durch dysfunktio- nale Mechanismen während der Mitose entstehen Zellen eines hyperdiploi- den/near-triploiden Karyotyps, jedoch ohne strukturelle Aberrationen der DNA. Hohe TrkA Expression ermöglicht einerseits den Weg der Ausdifferenzierung, andererseits aber auch die Induktion von Apoptosemechanismen.

Typ 2 Tumoren mit near-diploidem Karyotyp zeichnen sich hingegen durch strukturelle chromosomale Veränderungen aus. Eine weitere Unterklassifikation unterscheidet vermehrte 11q und 14q Deletionen und hohe TrkB Expression, Alter > 1 Jahr und langsam progredienten Tumorverlauf bei intermediärem Risi- koprofil in Typ 2a Tumoren und aggressive, rasch progrediente Verläufe mit MYCN Amplifikation, 1p Deletion, TrkB und BDNF Expression in Typ 2b Tu- morentitäten bei Patienten zwischen einem Jahr und fünf Jahren (31).

John M. Maris and Katherine K. Matthay fassten die molekularbiologischen Er- gebnisse zur Onkogenese des Neuroblastoms, angelehnt an das Modell nach Brodeur, graphisch anschaulich zusammen, vgl. Abbildung 1.3 (96).

Vorläuferzelle Erste Genetische Variationen Weitere Genetische Variationen Mitotische + NGF Differenzierung Instabilität

TrkA TYP 1

3n - NGF Apoptose

Ploidie

Neuroblast 2n/4n + 17q TYP 2 - 11q -14q Proliferation TrkB Genomische + 17q MYCN Neurotrophine Instabilität - 1p amp

TYP 3

Abbildung 1.3: Hypothetisches Modell der Neuroblastomentstehung nach Maris und Matthay - überarbeitet Quelle: (96) 12 1 Einleitung

1.4 Laser Mikrodissektion Im Rahmen von Mikroarray Technologien lassen sich Gene von gesunden Zel- len und Tumoren molekulargenetisch untersuchen und deren Genexpression vergleichen. Diese Entwicklung brachte eine Revolution der molekulargeneti- schen Forschung mit sich (128, 167). Weiterhin Bestand hatte hingegen noch bis in die neunziger Jahre die Tatsache, dass meist Stromazellen und die Tu- morzellen umgebende Parenchymzellen die Genanalyse der Präparate beein- flussten. „Laser Capture Microdissection and Pressure Catapulting “ (LMPC) wurde entwickelt, um diese Hürde zu überwinden und somit reine Zelllysate zur Genanalyse zu gewinnen. Die Reinheit und Homogenität der untersuchten Zel- len kann mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen und deren Qualität mittels Gelelektrophorese im Chipformat gesichert werden.

Die Isolation spezifischer Einzelzellen aus einem Zellkomplex wurde bereits vor Jahren im Rahmen von Genanalysen mittels mechanischer, mikroskopischer Gewinnung dieser Zellen aus Gewebesektionen durchgeführt. Die aufwendige Technik ging aufgrund des hohen Zeitaufwandes, der mangelnden Effektivität und der fehlenden Präzision nicht in die Routinediagnostik ein. 1996 wurde von der Arbeitsgruppe unter Emmert-Buck am National Institute of Health (NIH) in Bethesda, Maryland, USA erstmals die Methode der Laser Mikrodissektion vor- gestellt und kam durch Arcturus Engineering als PixCell System in den kom- merziellen Vertrieb (53, 44). Weitere Hersteller folgten dem Vorbild, unter anderem PALM Microlaser Technologies von Zeiss (10).

Die PALM MicroBeam Lasertechnologie von Carl Zeiss ermöglicht nun das kon- taktfreie Sammeln biologischer Zellproben inklusive in Kultur lebender Zellen. Mit Hilfe eines präzise kontrollierten Laserimpulses wird das entsprechende Zellnest, in diesem Fall Neuroblasten, bzw. die Einzelzelle vertikal aus dem Zellverband gelasert. Die Zellen auf der Membran des Objektträgers werden dabei entgegen der Schwerkraft in ein Auffanggefäß – hier der an der Innensei- te beschichtete Deckel eines Reaktionsgefäßes (PALM Adhesive Cup Reak- tionsgefäße) – katapultiert. Diese sogenannte LMPC Technik erfolgt ohne Kon- takt der Zellen mit weiteren Oberflächen, reduziert RNA Degradierung und Ver- lust auf ein Minimum und gewährleistet ein akkurates Auswählen der Zielzell- population. 1 Einleitung 13

LMPC weist trotz zahlreicher Vorteile auch einige ungünstige methodische Pro- bleme auf. Zum einen sind die Gewebe auf der Membran ohne Deckglas aufgebracht und sind somit nicht vor Austrocknung geschützt, was die Visualisie- rung der Zellmorphologie mitunter erschwert. Ein Lichtdiffusor am Lasermikro- skop verbessert in diesem Fall die Zellerkennung. Durch LMPC können nur sehr geringe DNA, RNA oder Proteinmengen gewonnen werden. Lange Färbe- protokolle oder immunhistochemische Färbungen können bei LMPC nicht zum Einsatz kommen, da die RNA- und Proteinqualität unter längeren Prozeduren stark abnimmt. Die Wasch- und Färbezeiten müssen für diese Methode minimal gehalten werden.

Für das Neuroblastom wurde die LMPC Technik 2003 erstmals angewandt und veröffentlicht. Hierbei wurde im Speziellen die Bestimmung der Anzahl der MYCN Kopien mit Hilfe der Quantitativen Polymerase Kettenreaktion (QPCR), Analysen der 1p, 3p- und 11q-Deletionen und Verlust der Heterozygotie und Q- PCR Expressionsanalyse mikrodissezierter Neuroblasten und Neuroblastomzel- len untersucht (47).

1.5 Genexpressionsanalysen Nach der Entschlüsselung des prinzipiellen Aufbaus der DNA im Jahre 1953 durch Watson und Crick (170) konnten, sowohl durch die Didesoxymethode der DNA Sequenzierung nach Sanger (126, 127), der den enzymatischen Aufbau der DNA beschrieb, als auch durch die Sequenzierung nach Maxam und Gilbert (99), welche die basenspezifische chemischen Spaltung der DNA voraussetz- ten, die Abfolge der Nukleotide innerhalb der DNA bestimmt werden.

Die Methodik der Genexpressionsanalyse basiert auf zwei unterschiedlichen Modellen: dem geschlossenen System der Hybridisierung, welches Gene nachweisen kann, die bereits durch ein bekanntes Oligonukleotid repräsentiert sind und dem offenen System des Sequencing, welches keine Sequenzinforma- tion enthält und damit ermöglicht, auch unbekannte Transkripte zu identifizieren (87, 88). Im folgenden Abschnitt soll ausschließlich auf Mikroarray Technolo- gien und das geschlossene System eingegangen werden.

1.5.1 Mikroarrays und Hybridisierung Bei der geschlossenen Methode können fluoreszenzmarkierte, komplementäre DNA Fragmente (cDNA) nach Amplifikation von mRNA mit Oligonukleotidpri- 14 1 Einleitung mern und reverser Transkription auf einen Array mit zuvor bestimmten Genson- den oder Transkriptvarianten hybridisiert werden. Gensonden sind ausgewählte Nukleinsäurefragmente, Oligonukleotide oder cDNA Klone, welche auf einer Glas- oder Nylonmatrix als Trägermaterial haften und ein bestimmtes Gen bzw. dessen Transkriptvarianten repräsentieren. Darauf basierend unterscheidet man zwischen Oligonukleoidarrays und cDNA Mikroarrays. Das System der Hybridisierung mit Proben und Sonden beruht auf dem Prinzip der komplemen- tären Basen.

An die Isolation der Gesamt-RNA des Zielgewebes bzw. der Zellkultur schließt sich eine Reverse Transkription der mRNA mit Hilfe von oligo(dT)-Primern an. Die daraus resultierende cDNA wird im Rahmen der Amplifikation durch eine T7-Polymerase mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) vervielfältigt und nach Aufreinigung in Pufferlösung aufgenommen. Um eine ausreichende Men- ge an RNA guter Qualität zu erhalten, muss nach der RNA Extraktion mindestens ein Amplifikationsschritt integriert werden. Oligonukleotidarrays der Firma Affymetrix dient Phycoerythrin als Farbstoff. Bei cDNA- und Oligonukleotid- Mikroarrays von Agilent, welche in den beschriebenen Experimenten Verwen- dung fanden, erfolgt die Markierung mit den fluoreszierenden Farbstoffen Cya- nin 3 oder 5 (Cy3, Cy5) der Polymethinegruppe. Cy3 und Cy5 dienen nach der Hybridisierung als Fluoreszenzfarbstoffe zur Visualisierung und Quantifikation der cDNA.

Die Intensität der Signalstärke entspricht der Menge an mRNA, welche von einem bestimmten Gen transkribiert wurde. In Genexpressionsanalysen zieht man aus der Intensität der mRNA Transkription, gemessen als Signalstärke einer Sonde des Mikroarrays, Rückschlüsse auf die Aktivität eines Gens. Die darauffolgende Extraktion und anschließende Normalisierung der Daten dient der Beseitigung systematischer methodischer Fehler. Vorteilhaft ist bei der geschlossenen Methode die Automatisierung, Schnelligkeit und Einheitlichkeit der Prozeduren sowie die Materialersparnis und Kosteneffektivität der Analyse.

Auf mRNA Ebene konnten durch die Einführung der Mikroarrays als Weiterent- wicklung der Northern Blot Hybridisierung (15) Genexpressionsprofile erstellt werden, welche die simultane quantitative Analyse von mehreren zehntausend Genen ermöglichen (128, 146, 89). Das Transkriptom wird anhand von Intensi- 1 Einleitung 15 tätsprofilen graphisch dargestellt. Diese Werte ermöglichen jedoch nicht zwin- gend Rückschlüsse auf den Proteingehalt innerhalb der Zelle (87).

1.5.2 Genexpressionsanalysen in der onkologischen Forschung Die methodischen Entwicklungen der Genexpressionsanalysen dienten in der onkologischen Forschung der Untersuchung spezifischer Expressionsmuster unterschiedlicher Tumorentitäten, welche sich sowohl in ihren histopathologischen Eigenschaften als auch in ihrer Gensignatur unterscheiden (80, 64). Vom Genexpressionsprofil eines Tumors sind Rückschlüsse auf sein klinisches Er- scheinungsbild, d.h. seinen Phänotyp möglich. Bewegt man sich auf DNA Ebe- ne, so kann man Aufschluss über genetische Aberrationen erhalten. Erst auf Transkriptomebene, durch Analyse der RNA erhält man jedoch den funktionellen Status der arbeitenden Zellen und kann so Zielgene und Mechanismen der Onkogenese aufschlüsseln (39).

Den Hintergrund für das unkontrollierte, expansive Wachstum von Tumoren und deren Fähigkeit zur Metastasierung bilden diverse Veränderungen auf genomi- scher Ebene. Sowohl strukturelle und numerische Aberrationen, als auch Me- thylierung der DNA oder Veränderungen an den Histonen führen zu einer ver- änderten Expression von Genen, d.h. einerseits kommt es zu direkten Modifika- tionen des Genoms, andererseits verändert sich das Transkriptom und damit Apoptosekontrollmechanismen, Differenzierung von Zellen und das Zellwachs- tum.

In der Neuroblastomforschung kamen zur Analyse von Genexpressionsmustern in den vergangenen Jahren sowohl Verfahren der Hybridisierung als auch der Sequenzierung vermehrt zum Einsatz. Einzelgene wie FYN , NTRK1 und PRAME wurden in der Literatur bereits als Marker des Tumorverhaltens identifiziert (105, 110, 21). Ebenso werden CAMTA1 (67), CSD5 (117) und KIF1B (129) auf Chromosom 1 als Tumorsuppressorgene des Neuroblastoms diskutiert. Die Gene PRAME (110), DLK1 (162), MEIS1 (147), CCND1 (101), DDX1 (54), DEIN (168), ALK (112) wiesen nach Untersuchung in Neuroblastomzellini- en und Primärtumoren eine erhöhte Expression auf und unterlagen intensiver Studien bezüglich möglicher Pathomechanismen des Neuroblastoms.

Mikroarray-basierte Ansätze ermöglichen die Identifizierung spezifischer Subty- pen des Neuroblastoms anhand von Expressionsunterschieden und erlauben die Diskriminierung günstiger Stadien von ungünstigen Stadien bzw. MYCN 16 1 Einleitung amplifizierten Tumoren (21, 13, 177, 132, 113, 116). Die auf Mikroarrays basie- rende Genexpressionsanalyse ist der Vorhersagekraft klinischer Parameter in Bezug auf Prognose und Einteilung in Risikoprofile überlegen (108, 109). Gen- expressionsbasierte Klassifikatoren des Neuroblastoms bauen auf der Analyse zahlreicher Transkripte auf und dienen zunehmend als valide Prognoseparame- ter für den klinischen Verlauf von Patienten (134, 171, 116, 16, 109).

Fragestellung der Arbeit 17

Fragestellung der Arbeit Die Mechanismen der spontanen Regression und Progression des Neuroblas- toms sind bis heute nicht geklärt. Bisher untersuchten und verglichen viele Stu- dien günstige und ungünstige Neuroblastome miteinander, um Einblick in mög- liche Pathomechanismen des Neuroblastoms zu gewinnen (114, 113).

Es wird postuliert, dass sich Neuroblastomzellen aus fetalen Neuroblasten entwickeln und die spontane Regression der ontogenetischen Regression ähnelt. Da Neuroblasten nur im embryonalen bzw. fetalen Stadium der menschlichen Entwicklung verfügbar sind, widmen sich Untersuchungen selten dieser Zellgat- tung. Der Vergleich von Neuroblasten mit Neuroblastomen zeigt Ähnlichkeiten auf und lässt Rückschlüsse auf die zeitliche Entwicklung und Entstehung von Veränderungen von der Ursprungszelle hin zum Neuroblastom zu.

In dieser Arbeit soll untersucht werden, inwieweit Genexpressionsprofile regre- dienter und progredienter Neuroblastome den Genexpressionsprofilen fetaler Neuroblasten ähneln, um Rückschlüsse auf die Pathogenese des Neuroblas- toms zu ziehen.

Nach Etablierung einer neuen Methode können Genexpressionsprofile weitgehend homogener Zellpopulationen der Neuroblastomzellen und Neuroblasten analysiert werden. Durch die Untersuchung und den Vergleich von Genexpres- sionsprofilen mikrodissezierter Zellen von Neuroblastomen und Neuroblasten werden differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblasten und Neuroblasto- men günstiger und ungünstiger Stadien ermittelt. Diese differentiell exprimierten Gene können durch Gene Ontology Analysen in funktionelle Klassen eingeteilt werden, um so Aufschluss über die molekularbiologischen Mechanismen der Tumorzellen und deren Vorläuferzellen zu erhalten. Das Betrachten von differentiell exprimierten Einzelgenen und der Vergleich mit bereits beforschten Ge- nen des Neuroblastoms in der Literatur dient darüber hinaus der Validierung bereits untersuchter Gene und ermöglicht es eine Liste in Zukunft möglicher- weise vielversprechender noch unbekannter Kandidatengene zu ermitteln und damit die Grundlage für weitere Forschung und Therapieansätze zu bieten.

18 2 Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Systematik der angewandten Methoden Diese Arbeit diente methodisch in einem ersten Schritt der Etablierung einer zuverlässigen und reproduzierbaren Methodik zur Gewinnung reiner Zellproben. Damit gelang die Erstellung von Genexpressionsprofilen auf der Basis sehr geringer Probenmengen beim Neuroblastom und fetalen Neuroblasten. In einem zweiten Schritt widmet sich die Arbeit der Analyse von Kandidatengenen und Signalwegen der Tumorigenese des Neuroblastoms, vgl. Abbildung 2.1.

Immunhistochemie und Identifikation der Zellen

Kryosektion und Färbung

Laser Mikrodissektion

Isolation Amplifikation Markierung Hybridisierung

Mikroarray

Resolver Analysen: Gene Ontology Analysen: Varianzanalyse (ANOVA) WebGestalt Hauptkomponentenanalyse DAVID Clusteranalyse

Abbildung 2.1: Systematik der angewandten Methoden

Dafür wurden humane adrenale Neuroblasten aus 3 fetalen Nebennieren identifiziert. Kortikale Zellen der fetalen Proben und eine repräsentative Stichprobe von 22 Neuroblastomen der Kölner Tumorbank dienten als Vergleich. Neuro- blastome, Neuroblasten und angrenzende kortikale Zellen als Kontrolle wurden mittels Lasertechnik in Köln und Frankfurt am Main mikrodisseziert, in Extrak- tionspuffer lysiert, anschließend isoliert und amplifiziert. Durch das Poolen verschiedener Isolate derselben fetalen Nebenniere konnte eine für die Hybridisie- rung ausreichende Menge an RNA für jede der Neuroblastenproben gewonnen werden. Nach zweirundiger Amplifizierung und Farbmarkierung von 3 Neuro- blastenproben, 2 kortikalen Proben und 22 Neuroblastomproben verschiedener Stadien wurden die Proben auf 44K Agilent Arrays hybridisiert. 2 Material und Methoden 19

Die Expressionsprofile von Neuroblasten und kortikalen Zellen wurden danach mit Hilfe von Varianzanalysen (Analysis of Variance; ANOVA), Hauptkompo- nentenanalysen (Principle Component Analysis; PCA) und der Gene Ontology Analysesoftware „We bGestalt“ und „DAVID“ verglichen, welche auch bei e iner geringen Anzahl von Proben eine Aussage über differentiell exprimierte Gene liefern können.

2.2 Patientenmaterial Grundlage der Untersuchungen bildeten zusammengefasst fünf Tumoren des Stadium 1, sieben Tumoren des Stadiums 4, sechs Tumoren des Stadiums 4S und vier MYCN amplifizierte Tumoren. Außerdem wurden 3 Proben fetaler Neuroblasten und 2 Proben kortikaler Zellen derselben fetalen Nebennieren in die Untersuchung eingeschlossen. Kryoschnitte der dritten fetalen Probe zur Untersuchung der kortikalen Zellen erfüllten bereits nach der Färberoutine nicht die qualitativen Voraussetzungen, um diese weiter bearbeiten zu können. Da- her konnten für diese Probe keine kortikalen Zellen als Vergleichsprobe gewonnen werden. Ein Tumor wurde aufgrund von Tumorheterogenität mit MYCN Zu- gewinn als Stadium 4 Tumor gewertet.

Tabelle 2.1: Übersicht der Proben und Probendaten Alter bei Diagnose MYCN Infiltrationsgrad Probe in Tagen Stadium Status in % NB1 466 1 1 40-85 NB2 497 1 1 70-85 NB3 3 4S 1 80-95 14 NB4 447 4 (amplifiziert) 50-80 40 NB5 837 4 (amplifiziert) 55-90 NB6 546 1 1 95 NB7 8 4S 1 20-80 NB8 4394 4 1 80-90 NB9 25 1 1 60-95 NB10 1282 4 1,5 80-98 NB11 0 1 1 30-90 150 NB12 625 4 (amplifiziert) 80-98 20 2 Material und Methoden

NB13 3394 4 1 65-90 NB14 107 4S 1 60-95 NB15 16 4S 1 80-95 NB16 49 4S 1 20-80 50 NB17 423 3 (amplifiziert) 40-85 15 NB18 982 4 (amplifiziert) 90 NB19 215 4 1,5 60-95 987 NB20 4S 1 80-90 5465 NB21 4 1 65-95 46 NB22 4 1,5 70-90 NN1 fetal NN2 fetal NN3 fetal KOR1 fetal KOR2 fetal

Legende:

NB , Neuroblastom; NN, Neuroblasten; KOR, kortikale Zellen.

2.3 Identifikation der Zellen Zur Identifikation der Neuroblasten in den Proben humaner Nebennieren wurden sowohl immunhistochemische Nachweismethoden mit Hilfe des Dako REAL TM Detektionssystems eingesetzt, als auch die visuelle Expertise einer Pa- thologin bei Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbten Schnitten. Folgeschnitte der für die LMPC verwandten Proben wurden mit Antikörpern gegen Neuronal Cell Ad- hesion Molecule (NCAM oder CD56) und B-cell lymphoma 2 (BCL-2) gefärbt. Die Immunreaktivität von sowohl NCAM, als auch BCL-2 mit Neuroblasten war hoch und ermöglichte ein eindeutiges Identifizieren der in größeren Clustern auftretenden Neuroblasten.

Lichtmikroskopisch traten Neuroblasten in fetalen Nebennieren auf HE Schnit- ten als kleine Nester blau gefärbter, runder Zellen in Erscheinung. In der HE 2 Material und Methoden 21

Färbung imponierten die Zellen mit dichtem, blauem Kern und spärlichem Zyto- plasma.

2.4 Immunhistochemie Die Immunhistochemische Färbung erfolgte mit dem Dako REAL TM Detection System an Gefrierschnitten mit einer Schnittbreite von 4-6 μm (4). Die Proben wurden auf Frozen-Mikroskop-Objektträgern flach und ohne Falten fixiert. Ba- sierend auf der Labelled (Strept-)Avidin-Biotin-Methode (LSAB) wurde das Ma- terial hierbei in einem Drei-Schritt Verfahren bearbeitet. Zuerst inkubierte man das Gewebe mit einem primären Kaninchen- oder Mausantikörper, danach mit Dako REAL TM Link biotinylierten Sekundärantikörpern und schlussendlich mit Dako REAL TM Streptavidin Alkaline Phosphatase, vgl. Abbildung 2.2.

Antigene Primärer Sekundärer Antikörper Antikörper anti- NCAM (biotyniliert) anti- BCL-2 Chromogen Red

Roter Farbstoff

Streptavidin Biotin Alkalische Phosphatase

Objektträger mit Gewebeschnitt

Abbildung 2.2: Dako REAL TM Detektionssystem

Der Sekundärantikörper wurde hierfür mit Biotin markiert, d. h. biotinyliert, und anschließend an das Streptavidin Protein aus Streptomyces avidinii nicht kova- lent gebunden und mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm konjugiert. Die alkalische Phosphatase hat als Enzym die Eigenschaft Phosphatgruppen chro- mogener Substrate zu spalten und dadurch eine Farbreaktion entstehen zu lassen.

Zur Sichtbarmachung der Reaktion diente Red Chromogen, ein roter Farbstoff. Als primärer Antikörper wurden Antikörper gegen die Antigene BCL-2 und anti- 22 2 Material und Methoden

CD56/NCAM eingesetzt, die beide in Neuroblasten exprimiert werden (4, 118, 48).

Zur Erhöhung der Empfindlichkeit des Detektionssystems erfolgte die Markie- rung des sekundären Antikörpers mit Biotin mit Hilfe eines Spacer-Arms aus 7 Atomen. So konnte jedes biotinylierte Antikörper-Molekül mit mehreren mit alkalischer Phosphatase konjugierten Streptavidin-Molekülen reagieren.

Für die Gegenfärbung wurde zur Blaufärbung der Zellkerne Hämatoxylin eingesetzt.

2.4.1 BCL-2 B-cell CLL/Lymphoma 2 (BCL-2) ist ein humanes Proto-Onkogen, wurde erstmals in B-Zellen von Lymphomen isoliert und wird mit Prozessen der Apoptose, Aktivierung von Procaspasen und Tumorproliferation in Verbindung gebracht (160, 41). BCL-2 supprimiert die Apoptose einer Vielzahl von Zellsystemen ein- schließlich Faktor-abhängiger lymphohämatopoetischer und neuronaler Zellen. Es reguliert den programmierten Zelltod durch Kontrolle der mitochondrialen Permeabilität und inhibiert Caspasen in einem Feedback-Schleifen System entweder durch das Verhindern einer Cytochrom-C Freisetzung aus Mitochon- drien oder durch Bindung an den Apoptose-Aktivierungs-Faktor 1 ( APAF-1) (56). Anti-Human BCL-2 (Klon 124, Dako), ein monoklonaler Mausantikörper diente in den Versuchen als primärer Antikörper zur immunhistochemischen Färbung der Neuroblasten.

2.4.2 NCAM Das Neural Cell Adhesion Molecule ( NCAM , CD56 ) wurde 1974 erstmals identifiziert und 1977 als ein homophil bindendes, synaptisches Glykoprotein, welches an der Zelloberfläche von Neuronen, Gliazellen, Skelettmuskelzellen und natürlichen Killerzellen auftritt, beschrieben (157). NCAM spielt eine Rolle bei der Zell-Zell Adhäsion, neuronalen Wachstumsvorgängen, synaptischer Plasti- zität, Lernprozessen und Erinnerung. Das Aussprossen neuronaler Fortsätze, die Neuronenreifung und die Moderation zwischen Neuronen sind unabdingba- re Prozesse der Entwicklung des Zentralnervensystems. NCAM dient als Wachstumssignal neuronaler Zellverbände mit Hilfe des Fibroblasten Growth Factor Receptors ( FGFR ) und erzielt über den p59Fyn Weg seine Wirkung. Das normalerweise membranständige Protein besitzt verschiedene Isoformen und kann als NCAM 120 auch ins Serum abgegeben werden (66, 40). 2 Material und Methoden 23

Neuroblastome exprimieren NCAM in polysialisierter Form, wobei das Ausmaß der Expression mit dem Differenzierungsgrad, dem Stadium und der MYCN Amplifikation korreliert (175).

NCAM spezifische Antikörper können an das Oberflächenprotein binden und so direkt eine Wachstumshemmung induzieren. Anti-CD-56/NCAM Antikörper mit Biotin als Konjugat ermöglichen die Identifikation von Neuroblasten durch eine wie oben beschriebene spezifische immunhistochemische Färbung (161).

2.5 Schnitte und Hämatoxylin-Eosin Färbung Zur Mikrodissektion wurden 5 μm Kryosektionen auf mit einer Membran b e- schichteten Objektträgern (PALM, Bernried, Deutschland) aufgebracht. Um die hydrophobe Natur der Objektträgermembran zu überwinden, wurden die Ob- jektträger zuvor über einen Zeitraum von 30 Minuten mit ultraviolettem (UV) Licht im Bereich von 254 nm Wellenlänge bestrahlt. So wurde die Membran hydrophiler und die Sektionen hafteten besser an ihrer Oberfläche. Die Bestrah- lung mit UV Licht diente außerdem der Sterilisation und Zerstörung potenziell kontaminierender Nukleinsäuren.

Generell sind gefrorene Gewebeproben den in Paraffin eingebetteten Proben zur Mikrodissektion vorzuziehen, da die Einbettung in Paraffin und die vorherige Fixierung des Gewebes einen ungünstigen Einfluss auf die RNA Integrität hat (1).

Zur Aufbringung der Materialien wurde das Gefriermedium OCT Compound verwendet. Alle Klingen und Oberflächen des Kryostaten wurden vor Bearbei- tung der Proben mit 80 % Alkohol desinfiziert und gesäubert. Das OCT wurde während der Färberoutine durch Waschschritte mit kaltem RNAse-freiem Was- ser entfernt, wodurch eine Reduktion der Lasereffektivität durch das Gefrierme- dium verhindert werden konnte.

Die Hämatoxylin-Eosin Färbung erfolgte in leicht abgeänderter Form in Anleh- nung an das Protokoll des Center for Medical Genetics, Ghent University Hospi- tal Belgium (47). Direkt nach dem Schnitt der bei -80° C gelagerten Proben in einem Kryostaten wurden die 5 μm dicken Schnitte zur optimalen RNA Prote k- tion auf der Trägermembran von PALM Objektträgern für ca. 2 - 3 Minuten getrocknet und darauffolgend in 70% Ethanol bei einer Temperatur von 4-8° C zwischen 30 Sekunden und 5 Minuten fixiert. Anschließend wurden die Schnitte 24 2 Material und Methoden

5 Sekunden in gekühltem RNAse-freiem Wasser gespült, um daraufhin die Fär- bung mit RNAse-freiem Mayer’s Hämatoxylin über 30 Sekunden vornehmen zu können. Durch Zugabe von 5 μl RNAsin (RNAse Inhibitor) zu 2000 μl der be i- den Färbereagenzien (1:400) sollte eine Degradierung der RNA zusätzlich verhindert werden.

Ein weiterer Waschschritt über 5 Sekunden mit RNAse-freiem gekühltem Was- ser schloss sich an die Färbung direkt an. Eine aufsteigende Ethanolreihe si- cherte ebenfalls das fixierte Resultat. Beginnend bei 70 % Ethanol für 60 Se- kunden, über 95 % Ethanol für 60 Sekunden mit anschließender Eosin-Färbung für maximal 30 Sekunden - eine geringere Färbezeit des Eosins verbesserte das optische Resultat mitunter erheblich - setzte sich nach dem zweiten Färbe- schritt die Folge über ein weiteres Mal 95 % Ethanol über 60 Sekunden und ein zweimaliges Fixieren in 100 % Ethanol über je 60 Sekunden in zwei unterschiedlichen Küvetten fort. Die residuale Feuchtigkeit wurde soweit möglich mit einem partikelfreien Papiertuch an den Seiten des Objektträgers entfernt und dieser mindestens 2 Minuten vor der LMPC bei Raumtemperatur getrocknet. Die Objektträger wurden trocken und staubfrei gelagert und schnellstmöglich im Rahmen der LMPC weiterverarbeitet.

2.6 Lasermikrodissektion Die PALM LMPC Technik wurde stets unter RNAse freien Bedingungen durch- geführt. Die gelaserten Zellen wurden in „PALM Adhesive Caps “ aufgefangen, welche LMPC ohne den direkten Einsatz eines Lysepuffers während des Sam- melns der Zellen gestattet. Ohne Flüssigkeit im Deckel der LMPC Reaktionsge- fäße wurde die RNAse Aktivität so gering wie möglich gehalten. Des Weiteren ließ diese Technik ein niedrigenergetischeres Vorgehen aufgrund der geringen räumlichen Distanz zwischen Objektträger und Sammelgefäß zu.

Die Lasertechnologie wurde in Frankfurt am Main durch das Zeiss Axiovert 200M Mikroskop mit dem PALM Mikrodissektionssystem bereitgestellt. In Köln diente ein Vorläufermodell des gleichen Herstellers als technische Grundlage zur Laser Mikrodissektion, vgl. Abbildung 2.3. 2 Material und Methoden 25

HE-Schnitt einer fetalen Nebenniere

Parenchym des Nebennierenmarks

Neuroblasten Lasermikrodissektion von Zellnestern

Zeiss Axiovert 200M Mikroskop mit dem PALM Mikrodissektionssystem

Abbildung 2.3: Laser Mikrodissektion und Pressure Catapulting in Frankfurt am Main

Das Abschätzen der Menge an gelaserten Zellen resultierte aus der Auszäh- lung der Zellen in einem umschriebenen Areal mit bekannter Oberfläche und Hochrechnung auf die zur Zellgewinnung benötigte Fläche. Das Lasern der Zel- lareale erfolgte standardisiert mit einem 20 x Objektiv bei einer Wiederholungs- rate von 75 - 80 MHz und einem Fokus von 45.

2.7 Amplifikation Die Amplifikation mit dem μ MACS TM SuperAmp TM Kit von Miltenyi Biotec diente der Isolation und Amplifizierung von RNA Mengen im Picogramm Bereich. Sie ermöglicht Genexpressionsanalysen von 1 bis 10.000 Zellen oder einer vergleichbaren Gewebemenge.

Die MACS TM Zellseparation basiert auf der Anwendung sogenannter Microbe- ads, 50 nm große superparamagnetische Partikel, die entweder an Antikörper gebunden sind, welche an Zelloberflächenantigene binden oder an Oligo(dT) Primer, um an poly(A)-Reste von mRNA binden zu können. Als Nanopartikel können Microbeads nicht durch Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden. Sie beeinflussen weder die Funktionalität, Struktur noch den Aktivitätssta- tus der Zelle und binden spezifisch an Oberflächenzellstrukturen, um Zellen magnetisch zu markieren. 26 2 Material und Methoden

MACS TM Säulchen bestehen aus einer sphärischen Stahlmatrix. Plaziert man das Säulchen in einem Magneten, so wird ein Magnetfeld mit hohem Gradien- ten innerhalb der Säule aufgebaut. Dadurch können Zellen oder Zellbestandtei- le wie beispielsweise mRNA, die magnetisch markiert wurden, in der Säule festgehalten werden.

Die Amplifikation mit dem µMACS TM SuperAmp TM Kit setzte sich aus den folgenden 5 Schritten zusammen, vgl. Abbildung 2.4:

1 Zelllyse, mRNA Markierung und magnetische mRNA Isolation

2 cDNA Synthese im Säulchen

3 Anhängen einer DNA Sequenz (TAG) an die cDNA

4 Amplifikation der cDNA durch PCR

5 Klenow Markierung der cDNA mit Random Primern

1. Zellyse, mRNA-Markierung und magnetische RNA Isolation Zelllyse mit Proteinase K und Lyse-/ Cluster mikrodissezierter Zellen Bindungspuffer

Zugabe von 䃛MACS ™ SuperAmp ™MicroBeads und mRNA Bindung

A A A T T T N N N cTAG cTAG

Applikation des Lysats auf ein 䃛-Säulchen in einem 䃛MACS™Seperator und Waschen der mRNA Bindung

2. cDNA Synthese im Säulchen

N N N A A A N N N cTAG T T T cTAG

3. Anhängen einer DNA Sequenz (TAG) an die cDNA

TAG N N N cTAG TAG T T T cTAG

2 Material und Methoden 27

4. Amplifikation der cDNA durch PCR

Primer Primer TAG N N N cTAG TAG T T T cTAG

Primer N N N TAG Primer A A A TAG TAG N N N cTAG TAG T T T cTAG

Primer N N N TAG Primer A A A TAG Primer Primer

Primer Primer N N N T T T TAG cTAG TAG cTAG

5. Klenow Markierung der cDNA mit Random Primern

Legende Fluoreszenz oder Biotinmarkierung TAG Nukleinsäure Strang cTAG komplementärer Strang

Abbildung 2.4: Prinzip der µMACS TM SuperAmp TM Kit Technologie von Miltenyi Quelle: (7) überarbeitet

2.7.1 Zelllyse, mRNA Markierung und magnetische mRNA Isolation Im folgenden Abschnitt werden die Schritte nach der LMPC, d.h. die Freiset- zung der mRNA durch Zellyse und deren Isolation und Aufreinigung beschrieben.

Nach Abschluss der LMPC wurden die Zellen in Reaktionsgefäßen auf Eis gelagert, um eine RNA Degradation zu vermeiden. In 6,4 µl Reagenz aus 25 µl Lyse-/Bindungspuffer, 1 µl Proteinase K (5 μg/μl) und 2 μl tRNA Lösung wurden anschließend die Zellen gepoolt und resuspendiert. Dabei war darauf zu achten 28 2 Material und Methoden die Zellen nicht häufiger als 10 - 20 mal zu pipettieren. Das mehrmalige Pipet- tieren von Lösungen zur Mischung derselben kann den Gehalt der Nukleinsäu- ren durch Adhäsion an der Plastikoberfläche negativ beeinflussen. Daher wurde im Weiteren das Zelllysat gevortext und mehrmaliges pipettieren vermieden. Darauffolgend wurden die Zellen über 15 Minuten bei 45 °C und weitere 5 Minu- ten bei 75 °C in einem 200 μl Reaktionsgefäß in einem Thermocycler inkubiert, vgl. Tabelle 2.2. Dabei wurde das Zelllysat nach 15 Minuten bei 2500 x g herunterzentrifugiert und nach einer weiteren Minute bei 75 °C bei 1000 x g zentrifugiert.

Zum Zelllysat wurden 5 μl superparamag netische Microbeads gegeben, deren Oligo(dT) Primer an die poly(A)-Reste der mRNA bindeten. Anschließend wurde das Lysat gevortext und bei 1000 x g herunterzentrifugiert.

Die markierten Zelllysate wurden auf ein μ -Säulchen gegeben, welches sich im Magnetfeld eines thermoMACS TM Seperators, d.h. einem beheizbaren Magne- ten, befand. Das Säulchen wurde zunächst mit 100 μl Lyse -/ Bindungspuffer gespült und darauffolgend mit dem Zellysat befüllt. Die magnetisch markierte mRNA wurde in dem magnetischen Feld zurückgehalten, während darauf folgende Waschschritte alle weiteren Zellbestandteile entfernten. Die Waschung mit 4 x 100 μl Waschpuffer entfernt e Proteine, DNA und ribosomale RNA.

2.7.2 cDNA Synthese im Säulchen Der folgende Abschnitt beschreibt die Herstellung der komplemetären DNA (cDNA) aus der aufgereinigten mRNA.

Die cDNA Synthese und Aufreinigung wurde im selben Säulchen durchgeführt wie bereits die Isolation, um unnötige Materialverluste zu vermeiden. Dies ist für eine verlässliche Amplifikation sehr kleiner mRNA Mengen entscheidend. Die Microbead Mixtur generierte Erststrang cDNA Fragmente von einheitlicher Grö- ße und ermöglichte eine weitgehend gleichmäßige Amplifikation während der PCR.

Hierfür wurde das Säulchen zweimalig mit 200 μl Equilibrierungs -/Waschpuffer gespült. Der lyophilisierte cDNA-Synthese Mix wurde in 20 μl Resuspension s- puffer C gelöst, 1 μl RNAsin RNAse Inhibitor hinzugegeben und 20 μl der M i- schung auf das Säulchen gegeben. Residuale Flüssigkeitsreste an der Säul- chenspitze wurden mit einer RNAsefreien Pipettenspitze entfernt. Im thermo- 2 Material und Methoden 29

MACS TM Seperator wurde nun die cDNA Synthese bei 42 °C über 45 Minuten direkt vollzogen. Die darauffolgende Waschung mit 2 x 100 μl Tailing Wasc h- puffer bereitete die Säule bereits auf den nächsten Arbeitsschritt vor.

2.7.3 Anhängen einer DNA Sequenz (TAG) an die cDNA Der nächste Schritt beschreibt das Anhängen einer DNA Sequenz (Oligo (G)TAG) an die cDNA. An diese DNA Sequenz konnten bei der anschließenden Amplifizierung Oligo(C)-Primer binden, um Doppelstrang DNA zu generieren.

Zuerst wurde der lyophilisierte Tailing Mix zweier Reaktionsgefäße in jeweils 50 μl Resuspensionspuffer gelöst, um anschließend in zwei Waschschritten mit jeweils 50 μl auf das Säulche n gegeben zu werden. Abermals wurde residuale Flüssigkeit von der Säulchenspitze entfernt.

Das Säulchen wurde nun erstmals aus dem Magneten entfernt und in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt. Durch das Zentrifugieren des Säulchens bei 300 x g über 10 Sekunden erhielt man ein bräunliches Eluat, welches in ein frisches 200 μl Reaktionsgefäß überführt wurde. Es folgte die Denaturierung der cDNA mit Hilfe eines 4 minütigen Inkubationsschritts bei 94° C in einem Thermocycler, vgl. Tabelle 2.2. Das sofortige Kühlen auf Eis schonte die cDNA.

Nachdem die cDNA Fragmente von dem Säulchen eluiert wurden, wurde mit Hilfe von 20 Units (1μl) Terminaler Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) über 60 Minuten bei 37° C in einem Thermocycler eine kurze DNA Sequenz (TAG) an das 3’ Ende jedes cDNA Fragments gefügt. Kurzes Vortexen und Herunterze n- trifugieren bei 1000 x g stellte sicher, dass zuvor eine homogene Mischung ent- stand. Das Enzym wurde im folgenden Schritt über 5 Minuten bei 70° C deaktiviert und die Probe auf Eis gelagert.

Alle folgenden Schritte erfolgten außerhalb des beheizbaren Magneten.

2.7.4 Amplifikation der cDNA durch Polymerasekettenreaktion Die PCR Technik ermöglicht eine millionenfache Amplifizierung der cDNA Fragmente. Dies bildete die Grundlage um ausreichend Zielmaterial für die Mi- kroarray Hybridisierung zu erhalten.

Die PCR wurde mit zwei spezifischen Oligo(C)-Primern ausgeführt, die an die DNA(G) Sequenz banden. Die Bindungsstelle der Primer wurde während des Tailing Vorgangs an das 3’ Ende der cDNA angefügt. Die komplementäre S e- 30 2 Material und Methoden quenz des TAGs wurde an das 5’ Ende der cDNA Fragmente während der cDNA Synthese eingefügt.

Zu Beginn dieser Arbeitsschritte wurde der lyophilisierte PCR Mix in 60 μl R e- suspensionspuffer gelöst. Danach gab man 7 μl des Expand Long Template Puffer 1, sowie 3 μl des DNA P ool Mix zur Lösung und übertrug die Lösung (70 μl ) in die cDNA-Probe. Kurzes vortexen und zentrifugieren bei 1000 x g si- cherte die homogene Mischung. Der PCR Ansatz wurde nun in einem Thermo- cycler nach dem folgenden Schema zur Amplifikation inkubiert, vgl. Tabelle 2.2.

Tabelle 2.2: Übersicht der Thermocycler Schritte bei der Amplifikation Programm Temperatur Dauer Lyse 45°C 10 min 75°C 1 min Denaturierung 94°C 4 min 4°C Halten Tailing 37°C 1 Stunde 70°C 5 min Amplifikation Deckel 102°C 78°C 30 s 94°C 15 s 65°C 30 s 68°C 2 min Die letzten vier Schritte in 20 Zyklen wiederholen 94°C 15 s 65°C 30 s 68°C 2 min 30 s Die letzten 3 Schritte in 7 Zyklen wiederholen 94°C 15 s 65°C 30 s 68°C 3 min 40 s Die letzten 3 Schritte in 7 Zyklen wiederholen 94°C 15 s 65°C 30 s 68°C 5 min 50 s

2 Material und Methoden 31

Die letzten 3 Schritte in 7 Zyklen wiederholen 68°C 7 min 4°C Halten

2.7.5 Klenow Markierung der amplifizierten cDNA An der cDNA wurde nun im folgenden Schritt mit Hilfe des Klenow Fragments mit DNA-Polymeraseaktivität und Random Primern eine Markierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff vorgenommen.

Setzt man die DNA Polymerase I von E.coli der Proteinase Subtilisin aus, spal- tet diese das Molekül in kleine Fragmente, welche die 3’ -5’ Exonukleaseaktivität behalten, und das größere so genannte Klenow Fragment mit DNA Polymera- seaktivität und 3’ -5’ Exonukleaseaktivität. Das Klenow Fragment wird abgese- hen von dessen Gewinnung durch Proteolyse auch mittels bakterieller Expres- sion eines verkürzten DNA Polymerase I Gens kommerziell hergestellt (69).

Nach einer Aufreinigung der PCR Produkte ermöglichte das Klenow Fragment in Anwesenheit von Random Primern und fluoreszenzmarkierten Cyanin-3- deoxynucleosid-Cythidin-Triphosphat-(dCTP)Nukleotiden das Markieren der DNA Fragmente.

Vom aufgereinigten PCR Produkt wurden 200 ng in ein neues 1,5 ml Reak- tionsgefäß gegeben. Um auf ein Gesamtvolumen von 22 μl zu ge langen, wurde doppelt destilliertes Wasser hinzugefügt. Nach Lösen des Klenow Mix I in 20 μl Resuspensionspuffer K wurde die Lösung zur Probe gegeben und anschlie- ßend gevortext und zentrifugiert. Bei einem Inkubationsschritt von 99 °C über 5 Minuten in einem Thermocycler wurden DNA Stränge mit Hilfe von Puffern und Enzymen separiert. Von dem mit 10 μl Resuspensionspu ffer K gelösten Klenow Mix II wurden 5 μl zur Probe gegeben und gevortext, zentrifugiert und sofort auf Eis gestellt, um enzymatische Reaktionen zu verhindern. Dieser Schritt bereitete die Lösung auf die folgende Reaktion mit dem temperatur-instabilen Klenow Fragement vor.

Anschließend wurden 2 μl Klenow Fragment und 1 μl Cy -3-dCTP der Probe hinzugefügt und gevortext und zentrifugiert. Die Proben wurden über 2 Stunden im Dunkeln bei 37 °C Temperatur in einem Thermocycler inkubiert, wodurch die cDNA markiert wurde. Anschließend wurde das Enzym bei 70° C über 5 Minu- ten deaktiviert. 32 2 Material und Methoden

2.8 Aufreinigung 2.8.1 PCR Produkt Aufreinigung Das PCR Produkt wurde in einem Zwischenschritt nach der Amplifikation und vor der Fluoreszenzmarkierung aufgereinigt, um überschüssige Reagenzien, nicht gebundene Nukleotide und Puffer zu entfernen und ein Eluat mit weitgehend reiner cDNA zu erhalten.

Die Aufreinigung des PCR Produktes erfolgte mit dem High Pure PCR Product Purification Kit ® von Roche. Zu 100 μl des PCR Produktes wu rden 500 μl Bi n- dungspuffer gegeben und die Lösung gut gemischt. Daraufhin wurde die Probe in das Reservoir eines Filtersäulchens gegeben und 60 Sekunden bei maxima- ler Geschwindigkeit, d.h. 13500 x g in einer Standardzentrifuge bei 15-25 °C zentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen. Nachdem die cDNA im Säulchen gebunden hatte, folgten die Waschschritte. Nach einmaligem Waschen mit 500 μl Waschpuffer und Zentrifugieren über 1 Minute mit anschließendem Verwerfen des Eluats folgte ein Waschschritt mit 200 μl Waschpuffer und gleichem Vorg e- hen. Nun wurde das Säulchen in ein neues Auffanggefäß überführt und 50 μl Elutionspuffer in das Reservoir gegeben. Vor der Elution der Probe wurde diese über 4 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um so die Menge an Eluat zu maximieren. Nach dieser Aufreinigung konnte die amplifizierte cDNA bei -20° C aufbewahrt werden.

2.8.2 Illustra CyScribe GFX Aufreinigung An die Fluoreszenzmarkierung mit Hilfe des Klenow Fragments und Random Primern wurde eine zweite Aufreinigungsprozedur angeschlossen, um wiederum überschüssige Reagenzien wie Puffer und überschüssige fluoreszenzmarkierte Nukleotide zu entfernen.

Das markierte Produkt wurde im Folgenden mit Hilfe des Illustra CyScribe GFX Purification Kit ® gereinigt. Dabei band die cDNA in Anwesenheit chirotropher Salze an eine Glasmatrix, überschüssige Salze und Kontaminanten wurden im Rahmen der Waschprozeduren entfernt. Zu ca. 100 μl Pro be fluoreszenzmar- kierter cDNA wurden 500 μl Capture Puffer gegeben und durch vorsichtige I n- version des Reaktionsgefäßes eine homogene Mischung geschaffen. Die Probe wurde ohne weitere Unterbrechung zeitnah auf ein Säulchen gegeben, um die Qualität des Eluats zu erhalten. Anschließend zentrifugierte man das Säulchen bei 13800 x g für 30 Sekunden. Das Eluat wurde verworfen und die fluores- 2 Material und Methoden 33 zenzmarkierte Probe band im Säulchen. Darauffolgend wurden mit 600 μl Waschpuffer Typ 3 und Zentrifugation über 30 Sekunden bei 13800 x g weitere Verunreinigungen aus dem Säulchen gewaschen und jeweils das Eluat verworfen. Diese Waschroutine wurde dreimal wiederholt, um im Anschluss daran das Säulchen in ein neues, RNAse freies 1.5 ml Reaktionsgefäß zu überführen. Die Probe wurde im Anschluß an die Waschung mit 60 μl Elutionspuffer, der auf 65 °C erhitzt wurde, eluiert. Eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur nach Auftragen auf das Säulchen verbesserte das Resultat. Nun konnte die Probe vom Säulchen bei 13800 x g über 1 Minute gewaschen werden. An- schließend ließ sich die Probe bei -20 °C ohne Lichtexposition einige Tage la- gern.

2.9 Methoden der Qualitäts- und Quantitätskontrolle 2.9.1 Mikroelektrophoretische Kontrolle Zur Kontrolle der RNA-Integrität wurde mit Hilfe des RNA 6000 Pico Lab Chips ® (Fa. Agilent Technologies GmbH, Böblingen) die Integrität der RNA ermittelt. Die Gelelektrophoresetechnik ist hierbei auf ein Chipformat reduziert, was eine Verminderung der Separationszeit und eine Reduktion des verwendeten Mate- rials zur Folge hat.

Der Chip umfasst 11 Auffanggefäße, sogenannte Wells, für die Proben, drei für das Gel und eine Weitere für einen externen Standard in Form einer RNA Lei- ter. Mikrokanäle aus Glas verbinden die Wells miteinander. Während des Reak- tionsaufbaus werden diese Kanäle mit einem Siebpolymer und einem Fluores- zenzfarbstoff gefüllt. Durch diese Füllung wird der Chip zu einem elektrischen Kreislauf. Jede der 16 Elektroden ist an eine unabhängige Stromquelle angeschlossen. Geladene RNA Biomoleküle werden durch einen Spannungsgra- dienten elektrophoretisch transportiert. Der Molekularsiebeffekt eines nachge- schalteten Polymers ermöglicht die Auftrennung nach Fragmentgrößen.

Als Hinweis auf eine ausreichend gute Qualität der RNA diente die Ratioanaly- se der ribosomalen 28S/18S RNA Banden. Für den Pico-Lab Chip reichten RNA Mengen im Bereich zwischen 5 und 500 ng aus, um die Integrität und Quantität der RNA zu bestimmen. Für RNA Assays wurde die Quantifizierung mit Hilfe der Leiterbereiche berechnet. Die Fläche unter der Leiter wurde mit der Summe der Proben Peak Flächen verglichen. Aus den gewonnenen Daten ge- 34 2 Material und Methoden nerierte die Bioanalyzer-Software ein Elektropherogramm und Bilder, die zur besseren Anschaulichkeit dem Ergebnis der Gelelektrophorese ähnelten.

2.9.2 Spectrophotometrische Kontrolle Das NanoDrop ®-ND-1000-UV-VIS Spektrophotometer (Fa. NanoDrop Techno- logies, Wilmington, DE, USA) ist ein speziell für die Messung geringer Nuklein- säuren- oder Proteinkonzentrationen entwickeltes Photometer mit einem Ab- sorptionsspektrum zwischen 220 und 350 nm.

Reine RNA weist einen Absorptionsquotienten von 1,9-2,1 auf, während erheb- liche Verunreinigungen mit Lösungsmitteln zu Werten unter 1,7 führen. Um keine Materialverluste in Kauf zu nehmen, wurden die Proben nur einfach bestimmt.

Zur Quantifizierung der cDNA-Konzentration und Reinheit sowie der Cy3- Konzentration wurde mit Hilfe des Nano-Drop ® Spectrophotometer die markierte Probe vermessen.

Der cDNA-Gehalt berechnete sich wie folgt: cDNA-Konzentration (ng/μl) * μl (Elutionsvolumen) /1000 = μg der cDNA.

Aus der Konzentration der cDNA (ng/ μL) und Cyanin 3 (pmol/μL) ließ sich die spezifische Aktivität wie folgt berechnen:

(Cy3-Konzentration)/(Konzentration der cD NA) *1000 = pmol Cy3 per μg c DNA

War der cDNA-Gehalt unter 825 ng und die spezifische Aktivität unter 8 pmol Cy3 pro μg cDNA , war ein weiteres Vorgehen mit der Hybridisierung nicht sinn- voll und wurde unterlassen.

Die quantitative cDNA Bestimmung mittels Nano-Drop ® Spectrophotometer Software (Version 3.2.1) erfolgte im Menü „Microarray Measurements “. Der Probenladeplatz wurde zuerst mit nukleasefreiem Wasser gesäubert. Anschlie- ßend konnte der NanoDrop mit 1 μL nukleasefreiem Wasser initialisiert werden. Die Vermessung lief im Probentyp-Menü „RNA-40 “. Mit 1 μL nukleasefreiem Wasser wurde die Referenz bestimmt, um die Proben im Vergleich zu absorp- tionsfreiem Wasser quantifizieren zu können. 2 Material und Methoden 35

2.10 Mikroarray Analyse 2.10.1 Hybridisierung Die mit Fluoreszenzfarbstoff markierte cDNA wurde im folgenden Schritt für die Hybridisierung auf Oligonukleotid-Mikroarrays (44 K-Format; Fa. Agilent) vorbereitet.

Zur Hybridisierung der markierten cDNA mit den Oligonukleotidsonden des Mi- kroarrays wurden 1,65 μg mit Cy3 markierter , linear amplifizierter cDNA, 11 μl 10 x Blocking Agent und Nuclease freies Wasser hinzugegeben, bis das Volu- men von 52,8 μl erreicht war . Durch Zugabe von 2,2 μl des 25 x Fragmentie- rungspuffers gelangte man zu einem Zielvolumen von 55 μl, vgl. Tabelle 2.3. Die Reagenzien wurden bei 60° C über 30 Minuten equilibriert und die cDNA fragmentiert.

Tabelle 2.3: Erster Hybridisierungsschritt Komponenten Volumen/Masse cyanin 3 markierte, linear amplifizierte cDNA 1,65 μg 10 x Blocking Agent 11 μL Nuclease freies Wasser ad 52,8 μL 25 x Fragmentierungspuffer 2,2 μL Gesamtvolumen 55 μL

Die anschließende Kühlung auf Eis und Zugabe des 2 x GEx Hybridisierungs- puffers HI-RPM stoppte die Fragmentierungsreaktion, vgl.Tabelle 2.4. Hierbei war ein sorgfältiges Pipettieren – keinesfalls vortexen – ohne das Erzeugen von Luftblasen erforderlich. In einer Mikrozentrifuge wurde die Probe 1 Minute bei 13000 Umdrehungen zentrifugiert, um die Probe von den Wänden und dem Deckel des Reaktionsgefäßes zu lösen und Luftblasen zu reduzieren.

Tabelle 2.4: Zweiter Hybridisierungsschritt Komponenten Volumen pro Hybridisierung cDNA von Fragmentierungsmix 55 μL 2 x GEx Hybridisierungspuffeer HI-RPM 55 μL vorbereitetes Volumen 110 μL Volumen zur Hybridisierung 100 μL

36 2 Material und Methoden

Im Folgenden wurden die markierten cDNA Fragmente auf den Oligonukleotid- Mikroarray hybridisiert. Ohne Zeitverlust wurden erst die Proben auf Eis gesetzt und dann umgehend auf den Oligonukleotid-Mikroarray pipettiert. Ein neuer Objektträger mit Dich- tungsplatte konnte in die Agilent SureHyb Kammerbasis mit dem Label nach oben gerichtet und axial an der rechteckigen Kammerbasis ausgerichtet einge- legt werden. Das bündige und waagrechte Aufliegen des Objektträgers auf der Kammerbasis ist essentiell für das gleichmäßige und langsame Auftragen der Proben (drag and dispense manner).

Beim Auflegen des Mikroarrays auf den SureHyb Objektträger mit Dichtungs- platte musste Wert darauf gelegt werden, beide Objektträger parallel und de- ckungsgleich zu halten, um so eine gleichmäßige Hybridisierung und Verteilung der cDNA auf der Objektträgeroberfläche zu gewährleisten. Der Agilent Bar- code des Mikroarrays war auf der unteren Seite, d.h. der aktiven Array Seite angebracht. Der numerische Barcode war nach Auflegen des Arrays an der Oberseite des Objektträgerpaares sichtbar.

Die SureHyb Abdeckung wurde nun auf der Basis mit einem Bügel fest justiert. Bei vertikalem Rotieren der Kammer wurden Luftblasen gelöst, die sich frei in der Kammer bewegen konnten und die Benetzung aller Bereiche des Arrays sicherstellten. Festsitzende Luftblasen konnten durch leichtes Abklopfen auf einer harten Oberfläche gelöst werden. Der Array wurde in einem Rotatorofen bei 65° C 17 Stunden bei einer Geschwindigkeit von 10 Runden pro Minu- te (rounds per minute; rpm) hybridisiert. Nach der Hybridisierung erfolgten erneut Waschschritte, um nicht gebundene cDNA Fragmente und Puffer von dem Array zu entfernen und diesen für den Scanvorgang vorzubereiten. Durch Zugabe von 0.005 % Triton X-102 zu den Genexpressions-Waschpuffern wurden Array Waschartefakte reduziert. Alle Küvetten, Behälter, Rührfische und Objektträgerhalter wurden zuvor mit Acetonitril unter einer Abzugshaube ge- säubert. Die Küvette mit Waschpuffer 1 wurde bei Raumtemperatur vorbereitet. Ein Objektträgerhalter und ein magnetischer Rührfisch wurden in einer zweiten Küvette mit Waschpuffer 1 auf einem Magnetrührer bereitgestellt. Eine weitere Küvette mit 37 °C vorgewärmtem Waschpuffer 2 wurde vorbereitet. Der Waschpuffer sollten erst zu Beginn der ersten Waschung in die Küvette gefüllt 2 Material und Methoden 37 werden, um die thermische Wirkung zu erhalten. Das freie Rotieren der Luftblasen in der Arraymatrix wurde nochmals nach dem Entfernen der Hybridisierungskammer aus dem Inkubator kontrolliert. Auf einer ebenen Oberfläche konnte nun der Array aus der Hybridisierungskammer genommen und in den ersten Waschpuffer mit der Barcode Seite nach oben be- fördert werden. In der ersten Küvette mit Waschpuffer 1 wurde anschließend der Array von der Dichtungsplatte befreit und in drei Waschschritten weiter pro- zessiert, vgl. Tabelle 2.5.

Tabelle 2.5: Waschprozedur nach der Hybridisierung Prozedur Gefäß Waschpuffer Temperatur Zeit Demontage 1 GE Waschpuffer 1 Raumtemperatur ca. 1 min 1. Wasch- 2 GE Waschpuffer 1 Raumtemperatur 1 min schritt 2. Wasch- 3 GE Waschpuffer 2 erhöhte Termpera- 1 min schritt tur Trocknung 4 Acetonitril Raumtemperatur ca. 1 min

Zur Trocknung der Array Objektträger wurde ein weiterer einminütiger Wasch- schritt in Acetonitril angeschlossen. Nach dem langsamen Herausnehmen des Arrays aus der Lösung wurde der trockene Objektträger umgehend in die Ar- rayscanner Halterung überführt und im Scanner Karussell platziert und ge- scannt.

2.10.2 Scannen der Mikroarrays Die Verwendung eines kundenindividuell erstellten Oligonukleotid Mikroarrays mit ca. 44.000 Sonden ermöglichte eine an das Genprofil des Neuroblastoms angepasste Analyse der Daten.

Der Agilent Mikroarray Scanner G 2505C ® in „Extended Dynamic Range M ode “ diente bei allen Analysen als technische Grundlage zur Erfassung der 4x44 K Extraktionsarrays (111).

Für 44K Arrays wurde das Profil „AgilentHD_GX_1Color for 4x44K “ ausgewählt. Die Informationen der Genexpression aus dem Mikroarray Scan wurden mit Hilfe einer Feature Extraction Software in nutzbare Daten im .tif, .mage, .jpg und .txt Format umgewandelt. In diesem Falle diente das Protokoll der Feature Extraction (FE) Software Version 10.5 von Agilent als Grundlage zur Datenex- traktion. 38 2 Material und Methoden

2.11 Statistische Methoden Die Analysen der Arraydaten erfolgten mit dem Rosetta Resolver ® System 7.2.1 von Rosetta Biosoftware Merck & Co., Inc (9), Software Anwendungen der Pro- grammiersprache „R“ s owie Gene Ontology Analyse Verfahren (6).

2.11.1 Nicht überwachte Cluster Analysen Um zuvor nicht bekannte Gruppierungen von Proben oder Genen zu identifizieren, können so genannte „nicht -überwachte Clusteranalysen“ durchgeführt we r- den.

Grundlage der hier angewandten Analysen bildete ein agglomerativer Algorith- mus, der nach dem Bottom Up Prinzip von der gröbsten Einteilung ausgehend eine Einteilung der Proben vornimmt. Der Algorithmus behandelte hierbei alle Eingabedaten mit gleicher Gewichtung. So wurde die Mehrdimensionalität der Daten reduziert und die Datenmenge graphisch übersichtlich gestaltet. Auch divisive Einteilungen sind möglich. Sie bilden Gruppen nach dem Top Down Prinzip, finden in Genanalysen jedoch weniger Verwendung.

Bei der Wahl des Distanzmaßes konnte hier zwischen Euklidian Distance, Manhattan Distance und Maximum Distance unterschieden werden. Die Korre- lation der Daten war mit Hilfe der Pearson Correlation oder Cosine Correlation möglich.

Das Ziel der Clusteranalysen ist es, hochkomplexe Daten in Gruppen mit ähnli- chen Eigenschaften zu unterteilen, um Muster zu erkennen. Bei Genexpres- sionsdaten können sowohl die Gene als auch die Proben in Subgruppen unter- teilt werden. Hierdurch kann man Aussagen über die mögliche molekulare Ver- wandschaft der Proben oder über hypothetische Koregulation und funktionelle Verwandschaft der Gene treffen (85, 107).

2.11.2 Hauptkomponentenanalyse Die Hauptkomponentenanalyse nach Pearson (120) diente der graphischen Darstellung von Ähnlichkeiten in den Expressionsprofilen nach Berechnung mehrerer (hier: drei) Hauptkomponenten zur Unterscheidung genetischer Varia- tionen.

Zur Reduktion der Mehrdimensionalität der Daten wurden Dimensionen, in denen die Daten keine starke Variation zeigen, zugunsten eines neuen Koordi- 2 Material und Methoden 39 natensystems basierend auf 3 Hauptvektoren reduziert. Mathematisch entspricht dies einer Hauptachsentransformation (85).

2.11.3 Varianzanalyse „Die Varianzanalyse (engl.: analysis of variance) ist ein statistisches Ver- fahren, um zu entscheiden, ob sich die Werte einer »kontinuierlichen« »Zielvariablen« in verschiedenen Subgruppen der Stichprobe signifikant unterscheiden.“ (2)

Die Varianz lässt sich unterteilen in die Varianz zwischen den Gruppen, die Abweichung der Gruppenmittelwerte vom Gesamtmittelwert über alle Untersu- chungseinheiten und die Varianz innerhalb der Gruppen (die Abweichung der einzelnen Messwerte innerhalb der Gruppen vom Gruppenmittelwert). Die Gruppenzugehörigkeit hat Einfluss auf die abhängige Variable, wenn bei geringer Varianz innerhalb der Gruppen die Varianz zwischen den Gruppen relativ groß ist. So kann entschieden werden, ob die Unterteilung in die Gruppen sinn- voll ist und ob sich diese signifikant voneinander unterscheiden (125).

In dieser Arbeit kam eine univariate Varianzanalyse (Analysis of Variance, ANOVA) mit einer unabhängigen Variablen (Faktor) zur Anwendung. Gene mit p <0.01 wurden hier als differentiell exprimiert kategorisiert.

2.12 Gene Ontology Analysen Die Software WebGestalt steht für "WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit" und ist ein Werkzeug zur funktionellen Genom- und Proteomanalyse von Listen differentiell exprimierter Gene oder koexprimierter Gene (179, 50). WebGestalt setzt sich aus vier Modulen zusammen: Gen Set Management, Informationsab- frage, Organisation/Visualisierung und Statistik. Zur besseren Darstellung und Interpretation der Genlisten wurde in dieser Arbeit das Visualisierungstool „GO Tree “ angewendet (180). Als Darstellungsform diente ein Entscheidungsbaum, der Gengruppen unter den Überbegriffen „biological process“, „molecular fun c- tion“ und „cellular component“ nach Funktionen sortierte. Grundlage der funktionellen Einteilung bildeten Begriffe der Gene Ontology Datenbank. Diese Datenbank hat das Ziel Gene und Genprodukte zu beschreiben und zu klassifi- zieren (6).

Die Software DAVID („Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery “) verarbeitet ebenso wie WebGestalt Genlisten und ordnet sie GO 40 2 Material und Methoden

Begriffen zu. DAVID setzt sich aus Annotation Tool, GoCharts, KeggCharts und DomainCharts zusammen (49). DAVID diente als Vergleichsparameter zu den Analysen mit WebGestalt und ermöglichte eine vereinfachte, weitere Einteilung der Gene in Gene Ontology Kategorien.

2.13 Chargeneinfluss (Batch Effect) Der Begriff Chargeneinfluss oder Batch Effect beschreibt die Auswirkung unterschiedlicher Faktoren innerhalb der Versuchsanordnung auf eine Gruppe von Experimenten. Da in der vorliegenden Arbeit die Untersuchungschargen Ein- fluss auf die Ergebnisse der Experimente nahmen, wird in den folgenden Kapi- teln die Datenvalidität und Standardisierung der Arbeitsroutinen beschrieben und detaillierter auf dieses Phänomen eingegangen.

Der Vergleich verschiedener Chargen von Daten aus unterschiedlichen Gewe- bestückchen und Experimenten stellt den Untersucher stets vor wiederkehren- de Probleme. Die Auswahl der Zellen ist trotz identischer Versuchsanordnung und gleich bleibender Protokolle gewissen Schwankungen unterlegen. Batch Effekte treten gehäuft in Daten auf, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten erstellt wurden, sind mit Veränderungen der Arbeitsroutinen und Protokolle, der Rea- genzien oder auch der Proben selber in Verbindung zu bringen.

Einige der häufigsten Ursachen für Chargeneinflüsse wurden von Luo et al. übersichtlich zusammengefasst: Der Mikroarray-Typ oder seine Charge kann Unterschiede zu Folgetypen bzw. -chargen aufweisen. Unterschiedliche Labore arbeiten mit verschiedenen Standards und Routinen. Protokolle können im Lau- fe der Zeit Änderungen erfahren. Die Lagerung und der Transport der Proben unterliegen mitunter erheblichen Veränderungen. Prozeduren wie Isolation, cDNA Synthese, Amplifikation, Fluoreszenzmarkierung und Hybridisierung set- zen chemische Substanzen wie beispielsweise Enzyme oder Puffer voraus, die in entsprechenden Kits möglicherweise aufgrund veränderter Technologie einen Wechsel erfahren. Die Bedingungen bei der Aufreinigung, wie beispielsweise Temperaturbedingungen, Ionenstärke oder Reinigungsroutinen der Auffangge- fäße können variieren. Raumtemperatur und Ozonkonzentrationen spielen bei der Mikroarray-Messung eine Rolle. Auch Modifikationen des Scanners, der Kalibrierung und Instandhaltung können zu unerwünschten Chargeneinflüssen führen (92). 3 Ergebnisse 41

3 Ergebnisse

3.1 Färbung und Immunhistochemie Mittels HE Färbung wurden spezifische Neuroblasten-Nester in fetalen Neben- nieren nachgewiesen (vgl. Kapitel 2.2). Drei Neuroblastenproben und 2 Proben kortikaler Zellen darauffolgender Kryoschnitte als Negativkontrolle wurden unter Mithilfe von Fr. Dr. S. Hartmann (Pathologin am Seckenbergischen Institut in Frankfurt am Main) blickdiagnostisch und immunhistochemisch differenziert und mittels LMPC homogene Zellnester gewonnen. Die 22 Proben des Tumorver- gleichskollektivs wurden mittels Hämatoxylin-Eosin angefärbt und ausschließ- lich Areale mit hoher Tumordichte mikrodisseziert.

Den Nachweis, dass es sich tatsächlich um Neuroblasten handelt und die Überprüfung der Durchmischung mit chromaffinen Zellen erfolgte mit Hilfe der Antikörper BCL-2 und NCAM, vgl. Abbildung 3.1 und Abbildung 3.2. Um die Validität der Daten zu untermauern wurden mit BCL-2 und NCAM zwei bereits untersuchte Antikörper bzw. immunhistochemische Marker ausgewählt (72). Die für Neuroblasten typischen Zellcluster färbten sich entsprechend der immunhistochemischen Nachweismethode rot an, die größeren chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks blieben hingegen ungefärbt.

Parenchym des Parenchym des Nebennierenmarks Nebennierenmarks

Neuroblasten Neuroblasten

Parenchym des Nebennieren- kortex

Neuroblasten

Abbildung 3.1: Immunhistochemische Nachweisfärbung der Neuroblasten mit BCL-2

42 3 Ergebnisse

Parenchym des Parenchym des Nebennierenmarks Nebennierenmarks

Neuroblasten Neuroblasten

Parenchym des Nebennieren- kortex

Neuroblasten

Abbildung 3.2: Immunhistochemische Nachweisfärbung der Neuroblasten mit NCAM

Die immunhistochemischen Nachweisfärbungen ergaben sowohl in der BCL-2, als auch der NCAM Färbung deutlich abgrenzbare Zellnester kleiner, runder Zellen, welche sich zytopathologisch gut von den umliegenden chromaffinen Zellen abheben. Neuroblasten traten im Gewebe auch vereinzelt auf oder bildeten sowohl teils kettenartig und in Bahnen angeordnete Stränge. Besonderhei- ten der Lokalisation beispielsweise in Gefäßnähe waren dabei nicht auszuma- chen.

Kortikale Zellen und Neuroblasten waren im Bereich kortikaler Areale der fetalen Nebennieren mittels HE Färbung schwer abgrenzbar. Die Zellkerne der Neuroblasten ließen sich jedoch auch in diesen Arealen immunhistochemisch stärker anfärben als die Kerne kortikaler Zellen, welche im direkten Vergleich auch eine andere Zellmorphologie mit großen runden Zellen und schwächer gefärbtem Zytoplasma aufwiesen.

Das Lasern von zwischen 1000 und 5000 Neuroblastomzellen bzw. Neuroblas- ten und kortikalen Zellen in Nestern auf HE-gefärbten Schnitten erfolgte für 22 Tumorproben und 3 fetale Proben mittels LMPC (vgl. Kapitel 2.2 bis 2.6).

3.2 RNA Qualitätskontrolle mit Bioanalyzer/ Pico Chip ® Die erste Kontrolle der isolierten Nukleinsäuren der Proben erfolgte nach der Isolierung der RNA und deren erster Amplifikationsrunde. Die RNA Qualität der Proben wurde hierbei mittels Gelelektrophorese im Pico-Chipformat mit Hilfe 3 Ergebnisse 43 des Agilent 2100 Bioanalyzer ® geprüft, vgl. Abbildung 3.3. Auf der Ordinate ist die Signalstärke, definiert als Höhe des Signals in Fluoreszenz-Einheiten (FU) und auf der Abszisse die Zeit in Sekunden (s) bzw. die dazu entsprechende Fragmentgröße in Nukleotiden (nt) dargestellt. Die Leiter als Vergleichsparame- ter war bei allen Proben im Normbereich.

a) Pico Chip Analyse der Probe NN1

c) Leiter und Probe NN1

Leiter NN1

b) Standard Vergleichskurve Agilent

a) Pico Chip Analyse der Neuroblasten Probe NN1 und Markerleiter im Vergleich b) Standard Vergleichskurve von Agilent mit Markerleiter; Quelle: (3) c) Leiter und Beispielprobe der Neuroblasten Abbildung 3.3: Pico Chip Analyse mikrodissezierter, fetaler Neuroblasten

Exemplarisch dient eine Probe (NN1) der mikrodissezierten, fetalen Neuroblas- ten im Vergleich zur Standardreferenz von Agilent als Anschauungsobjekt. Deutlich zu erkennen ist die der Standardreferenz von Agilent entsprechende Relation der Fragmentgrößen der Leiter mit Maxima der FU bei 25, 200, 500, 1000, 2000, 4000 und 6000 nt bei vergleichbarem Absorptionsspektrum. Dieses Beispiel zeigt das erwünschte Maximum der FU zwischen 200 und 750 nt bei einer Menge von 53.569 pg/μl RNA in 50 μl Eluat. Eine Übersicht aller Daten ist in Tabelle 3.1 zusammengefasst. Hierbei fällt auf, dass in Wiederholungsexpe- rimenten der Untersuchungskohorten wie beispielsweise zwischen NB 3a, NB 3b, und NB 3c die Gesamtmenge der aus den Zellen gewonnenen cDNA vari- iert. Insgesamt weisen Neuroblastome der ersten Untersuchungskohorte NB 1 bis 10, Neuroblasten und kortikale Zellen deutlich höhere cDNA Konzentratio- nen nach Amplifikation auf. 44 3 Ergebnisse

Tabelle 3.1: Pico Chip Daten der Proben Probe Zellzahl cDNA Konzentra- Menge cDNA bei tion mit Pico Chip 200ng Probe (pg/ μl) (μl) NB1 5000 42384 4,72 NB2a 1000 24780 8,13 NB2b 10000 31350 6,38 NB2c Verdünnte Ge- 27791 7,20 samt RNA* NB3a 5000 42306 4,73 NB3b 4000 13300 15 NB3c 5000 6475 30,88 NB4a 5000 48469 4,1 NB4b 5000 32070 6,24 NB5 5000 38696 5,2 NB6 10000 31651 6,32 NB7 5000 33515,5 5,96 NB8 5000 40226,5 4,97 NB9 4000 28652 6,98 NB10 5000 36609 5,46 NB11a 5000 9735,5 20,5 NB11b 5000 7842 25,5 NB12a 5000 15119 13,3 NB12b 5000 10055 19,89 NB13a 5000 10700 18,69 NB13b 5000 10482 19,08 NB14 5000 11500 17,39 NB15 5000 9060 22,1 NB16 5000 9200 21,74 NB17 5000 11100 18,02 NB18 5000 16600 12,05 NB19 5000 7250 27,6 NB20 5000 1045 191,39 NB21 5000 14922 13,4 NB22 5000 13401 14,92 NN1 5000 53569 3,73 3 Ergebnisse 45

NN2 5000 48586 4,12 NN3 5000 30744 6,50 KOR1 5000 41647 4,80 KOR2 5000 54049 3,70

Legende:

NB , Neuroblastom; NN, Neuroblasten; KOR, kortikale Zellen a) , b) , c) unterschiedliche Probenläufe desselben Patienten, bzw. Wiederholun- gen der Proben durch unterschiedliche Untersucher

* Diese Tumorprobe wurde nicht mikrodisseziert. Die RNA enthält Stroma und wurde auf eine den mikrodissezierten Proben entsprechende RNA Menge ver- dünnt (1: 200).

Die weiteren Proben wiesen ebenfalls erwartungsgemäß RNA Fragmente mit Maxima zwischen 200 und 750 nt in einer Konzentration von durchschnittlich 24710,9 pg/μl (1045 bis 54049 pg/μl) gelöst in 50 μl Eluat auf .

3.3 Quantifizierung der cDNA mit Nano Drop Zur Quantifizierung der cDNA wurde mit Hilfe des NanoDrop ® ND-1000 UV-VIS Spektrophotometers vor der Hybridisierung die Konzentration der markierten Proben vermessen. Hierbei wurden die Cy3 Konzentration (pmol/μl), die DNA Absorptionsratio (260/280 nm) und die cDNA Konzentration (ng/μl) ermittelt.

Beispielhaft sind hier zwei Vermessungen des NanoDrop® ND-1000 UV-VIS Spektrophotometers von cDNA Proben der Neuroblasten dargestellt, vgl. Ab- bildung 3.4.

Auf der Abszisse ist die Wellenlänge in nm abgetragen, die Ordinate beschreibt 1 mm Absorption. Gemessen wurde jeweils 1 μl cDNA L ösung.

46 3 Ergebnisse

cDNAcDNA NN1 NN1 cDNAcDNA NN2 NN2

Probe NN1: Probe NN2: Konzentration = 94,3 ng/ 䃛l Konzentration = 89,1 ng/ 䃛l OD260/280 = 1,85 OD260/280 = 1,86

Abbildung 3.4: cDNA-Reinheits- und Konzentrationsbestimmung mit dem Nano- Drop ®- Spektrophotometer an zwei cDNA Proben von Neuroblasten

Der cDNA Gehalt berechnet sich wie folgt: cDNA Konzentratio n (ng/μl) * μl (Elutionsvolumen) /1000 = μg der cDNA

94.3 ng/ μl *50 μl Elutionsvolumen/1000 = 4,715 μg cDNA

89.1 ng/ μl *50 μl Elutionsvolumen/1000 = 4,455 μg cDNA

Aus der Konzentration der cDNA (ng/μl) und Cyanin 3 (pmol/μl) lässt sich die spezifische Aktivität folgendermaßen berechnen:

(Cy3 Konzentration) /(Konzentration der cDNA) *1000 = pmol Cy3 pro μg cDNA

(2.2 pmol/ μl)/(94.3 ng/ μl) *1000= 23,33 pmol Cy3 pro μg cDNA

(2.5 pmol/ μl )/(89.1 ng/ μl) *1000= 28,05 pmol Cy3 pro μg cDNA

Ist der cDNA-Gehalt unter 825 ng und die spezifische Aktivität unter 8 pmol Cy3 pro μg cDNA wurden die Proben nicht hybridisiert. In den Proben dieser Studie liegt der cDNA Gehalt bei 4715 bzw. 4455 ng bei einer spezifischen Aktivität von 23,33 bzw. 28,05 pmol Cy3 pro μg cDNA.

Um die Reinheit der DNA oder RNA zu bestimmen, misst man die Probenab- sorptionsrate bei 260 und 280 nm. Eine Ratio aus 260/280 nm Absorptionsrate von 1.8 wird allgemein als reine DNA akzeptiert, eine Ratio von 2.0 als reine RNA (8). Bei Vorhandensein von Proteinen, Phenol oder weiteren Kontaminan- ten, welche bei 280 nm absorbieren ist die Ratio niedriger. Die Proben der Neuroblasten zeigten Ratios von 1,8 und 1,86, vgl. Tabelle 3.2. 3 Ergebnisse 47

Bei einer Ratio (260/280) von 1.78 (Minimum) bis 1.96 (Maximum) in den be- arbeiteten Proben waren alle Proben für eine weitere Hybridisierung geeignet.

Tabelle 3.2: Nano Drop ® Daten der Proben Name Nano Dye 1 Dye 2 Ratio 1,65 μg gelabelter Drop (Cy-3) (Kontr 260/280 Probe (ng/ μl) (pmol/ olle) (μl ) μl) (pmol/ μl) NB1 89,82 2,388 0,0704 1,8112 18,4 NB2a 74,18 1,92 0,1 1,85 21,4 NB2b 65,1 1,4 0 1,89 25,35 NB2c 89,8 2,0 0 1,86 18,4 NB3a 82,24 1,9747 0,0134 1,7877 20,1 NB3b 166,46 2,9872 0,0825 1,875 9,9 NB3c 132,92 1,4307 0,0178 1,9077 12,2 NB4a 90,28 2,3342 0,1439 1,7986 18,3 NB4b 82,11 2,0695 0,009 1,8634 20,1 NB5 88,73 2,3764 0,0352 1,8603 18,6 NB6 68,4 2,3 0 1,78 24,1 NB7 88,16 2,84 k.A. k.A. 18,7 NB8 96,3 2,71 k.A. k.A. 17,1 NB9 98,47 2,8043 k.A. k.A. 16,8 NB10 99,39 2,8766 k.A. k.A. 16,6 NB11a 148,78 3,3545 0,1696 1,8367 11,1 NB11b 126,23 1,3869 0,0844 1,9280 13,1 NB12a 150,84 3,1497 0,2562 1,868 10,9 NB12b 137.37 1,3321 0,0823 1,9423 12,4 NB13a 173,31 3,6788 0,1605 1,9558 9,5 NB13b 135,17 1,9094 0,1169 1,9384 12 NB14 190,53 3,5769 0,1475 1,941 8,7 NB15 180,1 3,6945 0,1483 1,8859 9,2 NB16 221,83 4,5366 0,1673 1,9388 7,4 NB17 146,29 1,9218 0,1419 1,9299 11,3 NB18 151,22 3,0948 0,0965 1,9039 10,9 NB19 165,47 2,2697 0,0198 1,98 10 48 3 Ergebnisse

NB20 120,1 2,8621 - 1,8973 24,1 0,0935 NB21 46,49 0,9309 - 1,8405 20 0,0829 NB22 85,68 0,8623 - 1,9639 10,5 0,0301 NN1 53,569 2,2 0 1,85 17,49 NN2 89,1 2,5 0,1 1,86 19,23 NN3 64,72 2,01 0,11 1,8 25,4 KOR1 107,21 2,4181 0,0338 1,8792 15,4 KOR2 93,56 1,8832 0,0305 1,8581 17,6

Legende:

NB , Neuroblastom; NN, Neuroblasten; KOR, kortikale Zellen a) , b) , c) unterschiedliche Probenläufe desselben Patienten, bzw. Wiederholun- gen der Proben durch unterschiedliche Untersucher

Nano Drop (ng/ μl): Vermessung der Probenkonzentration mittels Nano Drop Photometer in (ng/ μl)

Dye 1 (Cy 3): Cyanin 3 Fluoreszenzfabrstoff Konzentration in (pmol/ μl)

Dye 2 (Kontrolle): Kontrollfarbstoff Konzentration in (pmol/ μl)

Ratio (260/280): Absorptionsratio von 260 nm ÷ 280 nm

1,65 μg gelabelter Probe ( μl): berechnete Menge von 1,65 μg gelabelter Pro- be in μl zur weiteren Bearbeitung 3.4 Vergleich von Neuroblasten mit kortikalen Zellen Die Analyse differentiell exprimierter Gene zwischen fetalen kortikalen Zellen und Neuroblasten derselben Patientenproben dient dem Nachweis der Reinheit und Validität der Genexpressionsprofile der Neuroblasten. Im Fall der Neuro- blasten erwartet man als Vorläuferzellen des vegetativen Nervensystems Gene der neuronalen Entwicklung und des Katecholaminmetabolismus. Kortikale Zel- len zeichnen sich durch Gene des Cholesterin- und Lipidmetabolismus aus.

Die Expressionsprofile von Neuroblasten und kortikalen Zellen werden im folgenden Abschnitt mit Hilfe bioinformatischer Auswertungen (ANOVA, Cluster- analysen, Hauptkomponentenanalysen und web-basierter Gene Ontology Ana- 3 Ergebnisse 49 lysen) näher beschrieben. Aus den Daten differentiell exprimierter Gene zwischen kortikalen Zellen und Neuroblasten wurden zwei Listen mit 2005 und 1105 Genen ermittelt, wobei erstere in Neuroblasten, letztere in kortikalen Zel- len höher exprimiert vorliegen. Gene Ontology Analysen ermitteln Kategorien von Genen, die bestimmten biologischen Prozessen zugeordnet werden kön- nen, und in den zellspezifischen Genlisten signifikant überrepräsentiert sind.

Zur Feststellung ob es sich bei den gewonnenen Proben tatsächlich um Neuro- blasten handelt, werden diese den kortikalen Zellen mittels Clusteranalyse gegenübergestellt. Abbildung 3.5. zeigt einen kleinen Ausschnitt dieser Clus- teranalyse – die Gene (Gensequenzen) sind nur partiell dargestellt. Die Clus- teranalyse erfolgt hierbei mit dem Konvertierungsmodus Z-score. Der Z-score ist ein statistisches Maß, das gemessen in Standardabweichungen angibt, wie weit ein Datenpunkt von dem Mittelwert des Datensets entfernt liegt.

Im direkten Vergleich wiesen 2 der 3 Proben eine eindeutige Unterscheidung zu den kortikalen Zellen auf. Die dritte Probe zeigte abhängig von der Normalisie- rung weniger eindeutige Ergebnisse. Im Vergleich der beiden Neuroblastenpro- ben mit den entsprechenden kortikalen Zellen aus Folgeschnitten als Referenz zeigte sich im Cluster eine eindeutige Differenzierung in zwei Paare.

Gensequenzen

NN1 NN3 NN2 KOR1 KOR2 Neuroblasten und kortikale Zellen

Abbildung 3.5: Clusterausschnitt Neuroblasten vs. kortikale Zellen nach Resolver Analyse

50 3 Ergebnisse

Auch nach einer alternativen Normalisierung (quantile Normalisierung) der Daten und Darstellung mit Hilfe von „R“ zeigt sich diese Gruppierung weite rhin, vgl. Abbildung 3.6.

NN2 ht ig Height He

NN1 NN3

KOR1KO R1 KOR2

Abbildung 3.6: Cluster Dendrogramm Neuroblasten vs. kortikale Zellen mit „R“ An a- lyse

Betrachtet man die fetalen Proben in einer Hauptkomponentenanalyse, so zeigen die beiden Proben kortikaler Zellen eine Tendenz sich zu gruppieren, die Neuroblasten hingegen weisen in der Analyse stärkere Differenzen auf, gruppieren sich jedoch nicht zu den kortikalen Zellen, vgl. Abbildung 3.7.

Principle Component 2 Principle Component 2

NN3 NN3

NN1

NN1 NN2

NN2 Principle Component 1 KOR1 KOR2 KOR2 Principle Principle KOR1 Component 3 Component 1

Principle Component 3 Legende Neuroblasten Kortikale Zellen

Abbildung 3.7: Hauptkomponentenanalyse von Neuroblasten vs. kortikale Zellen in Frontal- und Schrägansicht

3 Ergebnisse 51

In einer direkten Gegenüberstellung von Neuroblasten mit ihren entsprechenden kortikalen Zellen mit Hilfe einer univariaten Varianzanalyse ergaben sich 6880 Gene nach Anpassung der Parameter, vgl. Tabelle 3.3.

Tabelle 3.3: Analyseparameter der univariaten Varianzanalyse kortikaler Zellen und Neuroblasten mit Resolver Biosoftware Modus One way ANOVA ANOVA Typ error weighed (Fehler gewichtet) Experimtentelle Analyseebene Intensity Experiments Genanalyseebene Sequences Spezies Datenbank Human Konvertierung Ratios Fold Change 2.0 p-Wert 0,001 Gene werden nur in die Untersuchung Einschränkung eingeschlossen, wenn mindestens 2 Proben das Gen beinhalten.

Nach Restriktion ergaben sich hieraus 3110 Gene, welche eine differenzielle Exprimierung aufwiesen, 8 invariante Gene und 3778 Gene, welche als „U n- changed“ klassif iziert wurden, vgl. Abbildung 3.8.

P <= 0.0010 ANOVA: Factor 1 P-value Multiple Test Correction applied: None Number of Groups: 2 Percentage of Signature Sequences: 45.09861% Percentage of Invariant Sequences: 0.11601% Log 10(p-value)

Legende: Signatur (3110) Unchanged (3778) Invariant (8)

Gen Sequenzen

Abbildung 3.8: Varianzanalyse von Neuroblasten vs. kortikale Zellen

In einem Cluster wurden darauffolgend auf Basis der 3110 Gene, welche in der ANOVA ermittelt wurden, spezifische Gene gesucht, welche entweder in kortikalen Zellen oder in Neuroblasten hoch exprimiert vorliegen, vgl. Tabelle 3.4 52 3 Ergebnisse und Abbildung 3.9. Hierzu wurden nur die beiden gematchten Proben verwendet - kortikale Zellen und Neuroblasten derselben Probe.

Tabelle 3.4: Analyseparameter der Clusteranalyse kortikaler Zellen und Neuroblasten mit Resolver Biosoftware Modus Cluster Analyse Cluster Typ error weighed (Fehler gewichtet) Algorithmus der Intensitäten der Pro- Agglomerativ ben Heuristisches Kriterium der Intensitä- Average link ten der Proben Ähnlichkeitsmaß der Intensitäten der Metrisch, Cosinus Korrelation (error Proben weighed; Fehler gewichtet) Algorithmus der Gene Agglomerative Heuristisches Kriterium der Gene Average Link Metrisch, Cosinus Korrelation (Fehler Ähnlichkeitsmaß der Gene gewichtet) Konvertierung Z-score p-Wert 0,001

Von den 3110 Genen wurden im Folgenden bei einem p-Wert von 0.001 1105 charakteristische Gene für kortikale Zellen, welche in dieser Gruppe hoch exprimiert vorliegen und 2005 Gene für Neuroblasten mittels Cluster identifiziert, vgl. Abbildung 3.9. Diese Gene dienten als Grundlage für anschließende Ana- lysen mit Hilfe von GO Analysewerkzeugen wie WebGestalt und DAVID.

Gensequenzen

NN1

NN2

KOR1

KOR2 Neuroblasten und kortikale Zellen

Abbildung 3.9: Cluster differentiell exprimierter Gene zwischen Neuroblasten und kortikalen Zellen 3 Ergebnisse 53

3.4.1 Gene Ontology Analysen der Neuroblasten und kortikalen Zellen Bei der Untersuchung hoch exprimierter Gene der Neuroblasten ergab sich in der graphischen Darstellung der Gene Ontology Zuordnung mit Hilfe von Web- Gestalt ein Muster zugunsten der neuronalen Differenzierung. Der hypergeometrische Test diente der Enrichment Analyse als Grundlage, als „Multiple Test Adjustment “ wurde die Methode nach Benjamini & Hochberg (1995) (BH) verwendet, als Signifikanzniveau ein p-Wert von 0.01 gewählt und die minimale Anzahl der Gene für eine Kategorie auf zwei beschränkt. Alle Gene des menschlichen Genoms, bzw. „hsapiens_agilent_wholegenome“, diente n als Referenz der Enrichment Analyse. Die Darstellung erfolgte als „Directed Acyclic Graph“ (DAG) in Form eines Bau mdiagramms.

Unter der Kategorie „Biological Process“ finden sich 40 Subkategorien, unter „Molecular Function“ 23 Subkategorien und unter der Kategorie „Cellular Com- ponent“ 36 Subkategorien. Die Kategorie „Biological Process“ umfasst dabei 162 Gene zu “Nervous System Development“, davon 85 Gene des Terms „Neurogenesis“, 79 Gene „Generation of Neurons“, 77 Gene zu „Neuron Diff e- rentiation“ weitere zu „Regulation of Neurogenesis“, „Neuron Projection D e- velopment“ und „Neuron -“ sowie „Dendrite development“ und „Morphogenesis“. Eine Vielzahl der GO Kategorien dieses Gensets konnten mit für Neuroblasten typischen Funktionen und Zellkompartimenten in Verbindung gebracht werden. Die Kategorie mit der höchsten Signifikanz und einem p-Wert von 1,13 x 10 -29 stellte „Nervous System D evelo pment“ mit 162 Genen dar.

Kortikale Zellen weisen bei dieser Untersuchung mittels GO-Baumdiagramm unter der Kategorie „Biological process“ vermehrt Gene im Bereich „Lipid -“ und „Steroid Met abolic Process“ auf. Ebenso wie bei der für Neuroblasten typischen Genliste diente der hypergeometrische Test der Enrichment Analyse als Grund- lage, als „Multiple Test Adjustment “ wurde ebenfalls die Methode nach Benja- mini & Hochberg (1995) (BH) verwendet, als Signifikanzniveau „Top10“ gewählt und die minimale Anzahl der Gene für eine Kategorie auf zwei beschränkt. Als Referenz der Enrichment Analyse wurde wiederum „hs a- piens_agilent_wholegenome“ gewählt. Unter der GO Klasse “Biological Pr o- cess“ konnten 10 Subkategorien, darunter mit höchster Signifikanz die Katego- rie Lipid bindender Gene (28 Gene) mit einem p-Wert von 1,5 x 10 -3, und unter der Kategorie „Molecular Function“ 9 Subkategorien darunter steroidhormonr e- 54 3 Ergebnisse zeptoraktive Gene und Gene mit Steroid-Hydroxylase-Aktivität gefunden werden.

Für dieses Genset ergaben sich bei der KEGG Pathway Analyse auf Basis der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes mittels WebGestalt 10 Signalwe- ge. Gene der Kategorie „C21 -Steroid Hormone Metabolismus“ waren angerei- chert (rawP=5.34e-06; adjP=0.0002) mit Verwendung aller Gene des menschlichen Genoms als Referenz.

Zur Überprüfung der Validität der Daten wurde anhand der Listen hochexpri- mierter Gene von Neuroblasten und kortikaler Zellen mittels eines alternativen GO-basierten Auswertungsprogramms (DAVID) eine Klassifizierung der GO- Klassen vorgenommen, vgl. Tabelle 3.5. und Tabelle 3.6. Hierbei zeigte sich ebenfalls eine deutliche Tendenz zugunsten der oben beschriebenen GO- Klassen der neuronalen Differenzierung und des Steroidmetabolismus.

Tabelle 3.5: DAVID GO Analyse der Neuroblasten Annotation Cluster 1 Enrichment Score: 16.3228769914355 GO Term GO Description Count P-Value GO:0045202 Synapse 74 7,25E-06 SP_PIR_KEYWORDS Synapse 54 2,33E-03 SP_PIR_KEYWORDS cell junction 70 1,43E+01 GO:0044456 synapse part 54 1,58E+01 GO:0030054 cell junction 83 6,37E+00 Annotation Cluster 2 Enrichment Score: 12.565759677846486 GO Term Description Count P-Value GO:0007268 synaptic transmission 64 8,08E-04 GO:0019226 transmission of nerve impulse 70 8,99E-04 GO:0007267 cell-cell signaling 82 6,10E+03 GO:0050877 neurological system process 100 0.0012307 88997555 1553 Annotation Cluster 3 Enrichment Score: 8.43929451274886 GO Term GO Description Count P-Value GO:0030182 neuron differentiation 73 5,48E+00 GO:0031175 neuron projection development 47 2,40E+05 3 Ergebnisse 55

GO:0048666 neuron development 55 5,43E+04 GO:0048812 neuron projection morphoge- 40 4,58E+06 nesis GO:0007409 Axonogenesis 37 1,27E+07 GO:0048858 cell projection morphogenesis 42 2,71E+07 GO:0048667 cell morphogenesis involved in 38 3,37E+07 neuron differentiation GO:0032990 cell part morphogenesis 42 1,01E+08 GO:0030030 cell projection organization 52 2,51E+07 GO:0000904 cell morphogenesis involved in 39 7,55E+07 differentiation GO:0032989 cellular component morphoge- 53 1,19E+09 nesis GO:0000902 cell morphogenesis 47 9,49E+08 GO:0007411 axon guidance 18 2,35E+12 Annotation Cluster Enrichment Score: 16 2.9970058276299514 GO Term GO Description Count P-Value GO:0051960 regulation of nervous system 31 1,65E+10 development GO:0050767 regulation of neurogenesis 27 7,69E+09 GO:0045664 regulation of neuron differen- 23 1,58E+10 tiation GO:0060284 regulation of cell development 30 1,78E+11 GO:0031344 regulation of cell projection 18 2,15E+11 organization GO:0010975 regulation of neuron projection 15 6,67E+10 development GO:0010769 regulation of cell morphogene- 14 6,88E+11 sis involved in differentiation GO:0050768 negative regulation of neuro- 10 0.0013223 genesis 29024303 8737 GO:0050773 regulation of dendrite de- 6 0.0014722 velopment 33947810 6443 GO:0010721 negative regulation of cell de- 10 0.0021260 velopment 91110649 144 56 3 Ergebnisse

GO:0048814 regulation of dendrite morpho- 5 0.0045201 genesis 87064731 975 GO:0022604 regulation of cell morphogene- 17 0.0058524 sis 58483947 848 GO:0045596 negative regulation of cell dif- 24 0.0062374 ferentiation 83697284 165 GO:0050770 regulation of axonogenesis 9 0.0211166 05625248 15 GO:0031345 negative regulation of cell pro- 6 0.0250513 jectio n organization 77402084 976 GO:0030516 regulation of axon extension 5 0.0300584 55524608 788 GO:0051129 negative regulation of cellular 13 0.1546926 component organization 39924855 38 GO:0050771 negative regulation of axono- 4 0.1918523 genesis 92530459 83

Legende:

Annotation Cluster X: Erläuterung zur Gruppe der Gene des Clusters X

Enrichment Score: Der Enrichtment Score gibt den Grad wider, in welchem Maße ein Set von Genen in einer nach Rang geordneten Reihe von Genen besonders hoch oder niedrig klassifiziert und damit in den Extrembereichen über- repräsentiert ist.

Category: Einordnung zu GO-Klassen oder Schlüsselwörtern

Term: GO-Klasse

Count: Anzahl der Gene für diese GO-Klasse

P-Value: P-Wert

3 Ergebnisse 57

Tabelle 3.6: DAVID GO Analyse kortikaler Zellen Annotation Cluster 1 Enrichment Score: 2.9263750930157615 GO Term GO Description Count P-Value SP_PIR_KEYWORDS lipid transport 10 2,61E+11 GO:0010876 lipid localization 15 0.002171086822 471028 GO:0006869 lipid transport 14 0.002939303777 635653 Annotation Cluster 6 Enrichment Score: 2.1869626363954215 Category Term Count P-Value GO:0008202 steroid metabolic process 23 6,27E+10 GO:0008203 cholesterol metabolic process 11 0.002167175718 291684 GO:0016125 sterol metabolic process 11 0.004296117287 023566 SP_PIR_KEYWORDS steroid metabolism 6 0.024354011800 753698 SP_PIR_KEYWORDS cholesterol metabolism 4 0.097135501331 93055 SP_PIR_KEYWORDS Lipid metabolism 7 0.422050440442 3473 Annotation Cluster 7 Enrichment Score: 2.14074900280214 Category Term Count P-Value SP_PIR_KEYWORDS Lipid-binding 11 0.001165642059 9002013 GO:0005496 steroid binding 8 0.010456415689 51114 SP_PIR_KEYWORDS steroid-binding 4 0.013663875419 025173

Legende:

Annotation Cluster X: Erläuterung zur Gruppe der Gene des Clusters X

Category: Einordnung zu GO-Klassen oder Schlüsselwörtern

Term: GO-Klasse

Count: Anzahl der Gene für diese GO-Klasse

P-Value: P-Wert

Die vergleichende Analyse fetaler Neuroblasten und kortikaler Zellen zeigte zusammenfassend für die Liste hoch exprimierter Gene der Neuroblasten zahlreiche Treffer im Bereich Neurogenese und anderer neuronaler Prozesse, wohingegen Kortexzellen vermehrt in Prozesse des Steroid- und Cholesterolmetabo- lismus integriert sind. Dies entspricht den Erwartungen an die funktionellen Eigenschaften der jeweiligen Zellgattungen.

Berechnet man zur bioinformatischen Validierung der Ergebnisse mittels „R“ die Mittelwerte der Intensitäten der Proben der Neuroblasten und der kortikalen Zellen, so können die Intensitäten anhand ihrer Expression geordnet werden. Das erste Quantil (1%) der am höchsten exprimierten Gene ergab zwei Listen von jeweils 447 Genen für Neuroblasten bzw. kortikale Zellen und diente als Grundlage für weitere Analysen.

Die Zusammenstellung der in kortikalen Zellen hoch exprimierten Gene ergab im Rahmen von GO Analysen mittels WebGestalt funktionell einen Schwer- punkt im Bereich „steroid metabolism“. Die Liste der Neuroblasten umfasste vor allem Gene welche in ribosomale Aktivität involviert sind.

Eine Liste mit den sowohl in Neuroblasten als auch kortikalen Zellen am höchs- ten exprimierten Genen ergab mit Hilfe von GO Analysen einen für sich rasch entwickelnde Gewebe typischen funktionellen Schwerpunkt im Bereich riboso- maler und metabolischer Prozesse, was als Zeichen der Aktivität der Protein- biosynthese gewertet werden kann.

Ausgehend von der Annahme, dass die richtigen Zellen mikrodisseziert wurden und es sich um weitgehend reine Zellpopulationen handelt, wurden in den darauf folgenden Untersuchungen Neuroblasten und Neuroblastomzellen verglichen.

3.5 Vergleich von Neuroblasten mit Neuroblastomen Obwohl allgemein angenommen wird, dass Neuroblasten die Ursprungszellen des Neuroblastoms bilden, gibt es nur wenige Untersuchungen, welche Neuro- 3 Ergebnisse 59 blasten und Neuroblastome auf molekulargenetischer Ebene vergleichen (48). Da Zellen der Embryonalentwicklung postnatal meist nicht mehr nachweisbar sind und folglich das Transkriptionsprofil schwer zugänglich ist, standen lange Zeit Informationen zur Molekulargenetik der Neuroblasten der vergleichenden Forschung nicht zur Verfügung. Erstmals konnte de Preter et al. 2006 in einer Studie an fetalen Nebennieren mittels molekulargenetischer Methoden zeigen, dass Neuroblasten aufgrund der Ähnlichkeiten im Expressionsprofil mit Neuro- blastomen tatsächlich mit hoher Wahrscheinlichkeit die Ursprungszellen des Neuroblastoms darstellen. Anhand einer supervisierten Auswahl mit Hilfe von Rangprodukten konnten in dieser Studie bereits differentiell exprimierte Gene in Neuroblasten gegenüber Neuroblastomen ermittelt werden (47, 48). In dieser Untersuchung lagen Neuroblastomzellen jedoch nicht in mikrodissezierter Form vor: Einflüsse von Stromazellen auf das Untersuchungsergebnmis konnten in dieser Studie folglich nicht ausgeschlossen werden.

In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe von Rangprodukten differentiell exprimierte Gene zwischen den Subgruppen Stadium 1, Stadium 4, Stadium 4S, MYCN amplifizierten Neuroblastomen, fetalen Neuroblasten und kortikalen Zel- len fetaler Nebennieren mit einem falsch positiven Cutoff von 0.001 ermittelt. Eines von 1000 differentiell exprimierten Genen dieser Liste ist damit erwar- tungsgemäß falsch positiv, d.h. tatsächlich nicht differentiell exprimiert. Daraus ergab sich eine Liste von 1430 Genen, welche in den oben genannten Sub- gruppen differentiell exprimiert vorliegen und im Folgenden weiter untersucht wurden.

Da alle differentiell exprimierten Gene der Subgruppen nun untereinander verglichen werden können, ergibt sich für jede Gruppe theoretisch eine Liste charakteristischer Gene relativ zur ganzen Gruppe, d.h. Gene, die sich in jedem Vergleich zu den anderen Subgruppen wiederfinden. Betrachtet man in einer vergleichenden Analyse die charakteristischen Gene der einzelnen Subgruppen miteinander und wählt hierbei die Parameter sehr restriktiv, ergeben sich für die Stadien 1, 4S und Neuroblasten keine charakteristischen Gene, was deren Ähnlichkeit untermauert. In Tumoren des Stadiums 4 treten zwei Gene, unter anderem MAGEA9, in MYCN amplifizierten Tumoren ebenfalls zwei Gene ge- häuft auf. Auffallend bei dieser Analyse ist die Tatsache, dass die kortikalen Zellen 59 Gene aufweisen, die für diese Zellgattung typisch sind, vgl. Anhang 60 3 Ergebnisse

7.3 . Auch in dieser Analyse lässt sich folglich die Ähnlichkeit von Neuroblasten mit Neuroblastomen und deren Unterscheidung zu den Proben kortikaler Zellen belegen.

3.5.1 Chargeneinfluss (Batch Effect) der untersuchten Proben Der Einfluss der Experimentserie – einer Folge von Experimenten, die bei der Analyse der Daten eine Ähnlichkeit aufweisen beziehungsweise sich von da- rauffolgenden Proben und Experimenten unterscheiden - auf die Untersu- chungsergebnisse wird im Folgenden als Chargeneinfluss bzw. Batch Effekt bezeichnet. Bei den Untersuchungen dienten unterschiedliche Amplifikationskits als Grundlage der Experimente. Diese scheinen einen Einfluss auf die Ergeb- nisse der Intensitäten der Gensonden zu haben.

Zum anschaulichen Vergleich aller Proben wird eine Hauptkomponentenanaly- se („ Principle Component Analysis “ (PCA)) durchgeführt, vgl. Abbildung 3.10 . Parameter der Hauptkomponentenanalyse sind in der Tabelle 3.7 zusammengefasst.

Tabelle 3.7: Analyseparameter der Hauptkomponentenanalyse von Neuroblasten, kortikalen Zellen und Neuroblastomen Percent Variatio 95.00000 Maximale Anzahl der Hauptkompo- 3 nenten p-Wert 0,01

Vergleicht man alle Proben mit Hilfe dieser Hauptkomponentenanalyse, so lässt sich eindeutig ein Chargeneinfluss erkennen: die Proben teilen sich in zwei Subgruppen vgl. Abbildung 3.10 . 3 Ergebnisse 61

Principle Component 2 Principle Component 2

Principle Principle Component 1 Principle Component 3 Component 1

Principle Component 3 Legende Neuroblasten Kortikale Zellen Neuroblastome

Abbildung 3.10: Hauptkomponentenanalyse aller Proben

Konzentriert man sich auf die Klassifikation der fetalen Proben in der Haupt- komponentenanalyse, so unterscheiden sich Neuroblasten von kortikalen Zellen dahingehend, dass erstere sich homogen in die erste Charge der Neuroblasto- me einordnen, die kortikalen Zellen hingegen sich von dieser Gruppe räumlich separieren, obwohl sie experimentell dieser Charge zuzuordnen sind. Dies lässt den Schluss zu, dass die genetische Signatur von Neuroblasten tatsächlich Ähnlichkeiten zu Neuroblastomen aufweist, kortikale Zellen hingegen eine eigene Entität bilden.

In einem Vergleich von Neuroblasten mit Neuroblastomen der vorliegenden Daten mit Hilfe einer Cluster Analyse weisen die fetalen Proben eine starke Ähnlichkeit auf und gruppieren sich zusammen, vgl. Abbildung 3.11 und Ta- belle 3.8.

Die eindeutige Differenzierung in 2 Subklassen über genetische Effekte hinweg beruht hingegen auf dem Chargeneffekt der Daten, welcher nicht einmal durch den starken Einflussfaktor der MYCN Amplifikation in diesem Datenset über- wunden wird. Zur Abklärung verschiedener Einflüsse auf die unterschiedlichen Proben und zur Sicherung der Datenvalidität wurden einige Experimente wiederholt.

62 3 Ergebnisse

Tabelle 3.8: Analyseparameter der Clusteranalyse aller Proben Darstellungstyp Clusteranalyse Konvertierung Z-score Korrelation Cosinus Heuristisches Kriterium Average link P-Wert 0,01

Gensequenzen

NB1 NB2a NB2c NB2b NB3a NB4a Batch 1 NB4b NB5 NB7 NB8 NB10 NB9 NB6 NB20 NN1 NN2 NN3b KOR1 KOR2 NB17 Patientenproben NB12a NB14 NB11a NB15 NB16 Batch 2- 4 NB18 NB19 NB3 NB12b NB11b NB3c NB13b NB13a NB22 NB21

Abbildung 3.11: Cluster aller Proben mit Batch Effekt

Die Probe NB2, welche in dieser Untersuchung dreifach als NB2a, NB2b und NB2c auftritt, wurde zum Ausschluss starker Effekte der Zellmenge auf das Er- gebnis mit unterschiedlichen Ausgangsmengen mikrodissezierter RNA, d.h. 1000 und 10000 Zellen bzw. vorliegender verdünnter RNA aus nicht mikrodissezierten Tumorproben amplifiziert und hybridisiert. Die gemeinsame Gruppie- rung der Proben gibt Anhalt für die Annahme, dass die eingesetzte Zellmenge bedingt durch die tausendfache Amplifikation nur einen sehr geringen Einfluss auf die Genexpression des Arrays zeigt.

Zum Ausschluss eines systematischen Untersucherfehlers wurden 2 Proben des NB4 von zwei Untersuchern so weit wie möglich technisch identisch bearbeitet. Angesichts der Tatsache, dass die Proben stets im Cluster eine starke 3 Ergebnisse 63

Ähnlichkeit aufweisen, gibt es keinen Anhaltspunkt für Untersuchereffekte im Rahmen der Experimente.

Die Proben NB3b und 3c, NB11b, NB12b und NB13b dienten als Wiederholung von Proben der ersten Gruppe, welcher mit einer ersten Charge eines Amplifi- kationskits durchgeführt wurde, zur Ermittlung der Ursache des Chargeneffek- tes. Legt man der Datenmenge in einer Clusteranalyse keine Restriktionen zu Grunde, bilden die Kontrollproben eine eigene Gruppe, zeigen folglich einen weiteren Batch Effekt.

Eine Gruppe von Genen, welche als Pam Klassifikator bezeichnet werden, trennen Subgruppen des Neuroblastoms auf und dienen als Prognosemarker durch die Einteilung und Risikostratifizierung von Neuerkrankungen (109). Gruppiert man die Daten auf der Grundlage der Pam Gene so wird dieser Effekt gemildert und die Proben der Wiederholungen gruppieren sich zu den entsprechenden primären Proben, der Batch Effekt kann jedoch nicht vollständig über- wunden werden.

Tumoren des Stadiums 4 ohne MYCN Amplifikation, Tumoren des Stadiums 4S und Tumoren des Stadiums 1 bilden keine eindeutigen Subgruppen. Eine nicht völlig einheitliche Klassifizierung unterschiedlicher Tumorklassen ist auf ein hohes Hintergrundrauschen der Daten, die technischen Grundlagen der Mikroar- rays und womöglich die Ähnlichkeit der Genexpressionsprofile zurückzuführen. In Clusteranalysen nicht-mikrodissezierter Neuroblastomproben zeigte sich in Vorarbeiten ebenfalls keine eindeutige Trennung der Tumoren der Stadien 1, 4 und 4S. Lediglich MYCN amplifizierte Proben separieren sich mit einer relativen Stabilität.

Bei weiteren Clusteranalysen der Daten mit Hilfe von „R“ zeigen sich bei der Darstellung der Daten ohne Batch Effekt Removal ebenfalls die bereits beschriebenen Muster.

Die Untersuchung des ersten Batches soll erste Anhaltspunkte zur Datenvalidi- tät unter Ausschluß des Chargeneffekts geben, um die Ergebnisse nach einer bioinformatischen Reduktion des Chargeneffekts (Batch Effekt Removal) besser bewerten zu können. Wählt man zum Ausschluss des Batch Effekts die Proben der ersten Untersuchungskohorte aus so bilden sich vier Subgruppen aus. Un- abhängig von der Wahl der Normalisierung gruppieren sich Neuroblasten mit Tumoren des Stadium 1 zusammen, vgl. Abbildung 3.12 und Tabelle 3.9. 64 3 Ergebnisse

Betrachtet man die Gruppierung der Gene, lässt sich kein eindeutiges Muster hoch- oder herrunterregulierter Gene erkennen.

Tabelle 3.9: Analyseparameter der Clusteranalyse der ersten Charge Algorithmus Agglomerativ Ähnlichkeitsmaß Cosinus Korrelation Konvertierung Z-score P-Wert 0,001

Gensequenzen

Patient Stadium NB1 1 NB2a 1 NB2b 1 NB2c 1 NN1 NN2 NN3 NB3 4S NB4a MYC NB4b MYC NB5 MYC NB6 1 NB7 4S NB8 4 NB9 1 NB10 4

Abbildung 3.12: Cluster der ersten Charge mit 16 Proben

Betrachtet man in der Hauptkomponentenanalyse ein 3D Modell der Verteilung der Ähnlichkeiten des Genexpressionsprofils von Neuroblastomen und Neuro- blasten bilden Neuroblasten wieder eine eigene Subgruppe, eine große Anzahl der Neuroblastome erscheinen als relativ homogene Gruppe. Differenziert man jedoch die Neuroblastome nach Stadien, so zeigt sich auch hier eine klare Ten- denz der Gruppierung von Tumoren des Stadiums 1 und Neuroblasten, vgl. Abbildung 3.13 und Tabelle 3.10 .

Tabelle 3.10: Analyseparameter der Hauptkomponentenanalyse der ersten Charge P-Wert 0,01 Konvertierung Ratios

3 Ergebnisse 65

Principle Component 2 Principle Component 2

Principle Component 1 Principle Principle Component 1 Component 3 Principle Component 3

Legende Stadium 1 Stadium 4S Stadium 4 MYCN amplifiziert Neuroblasten

Abbildung 3.13: Hauptkomponentenanalyse der ersten Charge mit 16 Proben in Fron- tal- und Schrägansicht

3.5.2 Reduktion des Chargeneffekts (Batch Effect Removal) Die quantile Normalisierung ist ein häufig verwendetes Mittel um systematische Chargeneinflüsse zu reduzieren und Daten interpretierbar zu machen (153). In diesem Fall bedienten wir uns zum einen dieses Hilfsmittels als auch eines speziell entwickelten bioinformatischen „Batch Effekt Removals “, um den Ein- fluss dieses Effekts auf die Daten zu minimieren. Abbildung 3.14 zeigt anhand einer Hauptkomponentenanalyse die Daten nach quantiler Normalisierung, welche den Batch Effekt der Daten noch nicht ausreichend eliminiert. Um diesen Effekt zu überwinden, eignet sich die eigens für diese Anwendung entworfene Funktion in „R“ namens Batch E ffect Removal (ber), vgl. Anhang 7.5 (63). Auf der Abszisse und Ordinate sind die beiden Hauptkomponenten PC1 und PC2 dargestellt. Die Neuroblastome, Neuroblasten und kortikalen Zellen stellen sich als Punktwolke in Chargen bzw. Stadien farblich markiert dar.

Der Batch Effekt tritt nach Bearbeitung der Daten mit dem „ber“ Tool in der Hauptkomponentenanalyse nicht mehr in Erscheinung. Die Auflösung der Struktur der Subgruppen und deren Streuung sind in dieser Form der Darstel- lung offensichtlich. Die Principle Component Analyse spiegelt das größte Maß an Unterschieden zwischen den einzelnen Proben wider und sollte daher nicht Anlaß dazu geben, die Darstellung in Bezug auf genetische Merkmale und 66 3 Ergebnisse

Subgruppen zu stark zu werten. Oftmals sind geringe Unterschiede in weniger hoch exprimierten Genen sehr charakteristisch in Subgruppen, werden jedoch von der Principle Component Analyse nicht erfasst.

Batch effect removal Algorithmus: QuantileNormalisierungNo

Batcheffect removal AlAlgorithmus:go rithmus: QuantileNo Normalisierung und „ber “

Legende: Legende: Batch 1 Stadium 1 Batch 2 Stadium 4 Batch 3 Stadium 4S Batch 4 MYCN amplifiziert Neuroblasten Kortikale Zellen

Abbildung 3.14: Hauptkomponentenanalyse aller Proben nach quantiler Normalisie- rung und Batch Effekt Removal mit „R“

3 Ergebnisse 67

Um Ähnlichkeiten und Unterschiede der Subgruppen besser darstellen zu kön- nen, wurden Cluster Analysen nach quantiler Normalisierung und nach Anwen- dung des Batch Effect Removal dargestellt, und die Subgruppen anhand differentiell exprimierter Gene definiert.

Grundlage der Untersuchung sind ausschließlich die Gene, die im Vergleich der Subgruppen mindestens einmal differentiell exprimiert auftraten. Da diese Gene die Unterschiede der Subgruppen herausstellen bilden sie die Grundlage der folgenden Clusteranalysen.

In einer ersten Darstellung nach quantiler Normalisierung finden sich die bereits bekannten Subgruppen der Chargen wieder. Wiederholte Experimente der Pa- tienten gruppieren sich innerhalb der Chargen zusammen, überwinden jedoch nicht den Chargeneffekt. MYCN amplifizierte Tumoren zeigen in der unbereinig- ten Analyse keinen Zusammenschluss als Subgruppe, vgl. Abbildung 3.15. Im weiteren Verlauf soll daher die Gruppierung der MYCN amplifizierten Tumoren als ein entscheidendes Kriterium für die Validität des Clusters gelten.

Batch 2-4 Batch 1 BatchBa tc h 2-42 4 BatchBa tc h 1 N N N N BN 6 Height Height KOR N BN 20 N BN 9 N N N N BN 10 N BN 22 N BN 21 N BN 19 N BN 7 N BN 8 N BN 1 N BN 3 N N N KOR N BN 2 N BN 4 N BN 14 N BN 15 N BN 5 N BN 4 N BN 16 N BN 2 N BN 2 N BN 18 N BN 11 N BN 11 N BN 3 N BN 3 N BN 17 N BN 12 N BN 13 N BN 13 N BN 12

Legende: 1: Neuroblastome Stadium 1 4: Neuroblastome Stadium 4 4S: Neuroblastome Stadium 4S MYC: MYC-N amplifizierte Neuroblastome NN: Fetale Neuroblasten KOR: Fetale kortikale Zellen NB 1 – 22: Mikrodissezierte Neuroblastome Patient 1 - 22

Abbildung 3.15: Cluster al ler Proben nach quantiler Normalisierung mit „R“

68 3 Ergebnisse

Bereinigt man die Daten mit Hilfe des Batch Effekt Removals und bildet erneut ein Cluster, so zeigt sich eine Auflösung der Batches. Nach quantiler Normali- sierung und Batch Effekt Removal lassen sich Subgruppen des Neuroblastoms differenzieren und ein Cluster MYCN amplifizierter Tumoren nachweisen, vgl. Abbildung 3.16 . N BN 9 N BN 6 Height Height N N N N BN 15 N BN 8 N BN 3 N BN 11 N BN 11 N BN 20 N BN 12 N BN 19 N N N N BN 13 N BN 13 N BN 3 N BN 12 N BN 17 N BN 7 N BN 10 N BN 14 N BN 18 N N N N BN 16 N BN 3 N BN 1 N BN 5 N BN 22 N BN 21 N BN 2 N BN 2 N BN 2 N BN 4 N BN 4 KOR KOR

Abbildung 3.16: Cluster aller Proben nach quantiler Normalisierung und Batch Effekt Removal mit „R“

Die Wiederholungen der Patienten bilden im Cluster weitgehend Pärchen aus. Die fetalen Neuroblasten ordnen sich inhomogen in die Guppe der nicht MYCN amplifizierten Tumoren ein. Stadium 1, 4S und 4 lassen sich in dieser Analyse nicht klar voneinander trennen.

3.6 Differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblasten und Neuroblastomen Die Analyse differentiell exprimierter Gene zwischen Neuroblasten und Neuro- blastomen gibt Anhaltspunkte für die Identifizierung von Genen und Signalwe- gen, die möglicherweise in der Pathogenese des Neuroblastoms eine Rolle 3 Ergebnisse 69 spielen. Sowohl hoch exprimierte Gene, als auch niedriger exprimierte Gene, sind mögliche Einflussfaktoren auf die Tumorigenese.

Ein Ziel dieser Arbeit ist es, differentiell exprimierte Gene zwischen allen Sub- gruppen, d.h. Tumoren des Stadiums 1, Stadiums 4, Stadiums 4S, MYCN amplifizierten Neuroblastomen, fetalen Neuroblasten und kortikalen Zellen fetaler Nebennieren zu ermitteln. Mit Hilfe von Rangprodukten ergeben sich differentiell exprimierte Gene zwischen den Subgruppen. Der prozentuale Wert der falsch positiven Ergebnisse (percentage false positive, pcp) wird in dieser Ana- lyse für das Erstellen der Genlisten als entscheidendes Kriterium gewählt. Die Grenze wird bei einem pfp-Wert von 0.001 gesetzt, um eine möglichst hohe Zuverlässigkeit der Analysen zu gewährleisten. Von 1000 differentiell exprimierten Genen ist damit statistisch eines falsch positiv, d.h. nicht differentiell exprimiert, vgl. Anhang 7.4 .

Mit Hilfe von WebGestalt wird eine Einteilung der Gene in GO Kategorien vorgenommen. Hierbei dienen als statistische Grundlage das Referenzset „hs a- piens_agilent_wholegenome“ und der hypergeometrische T est, welcher für En- richment Evaluationsanalysen derzeit häufig Verwendung findet. Da verschiedene Kategorien unter dem Begriff „Molecular Function“ zeitgleich analysiert werden, müssen die P-Werte angepasst werden. Hierzu verwendet WebGestalt die „R“ Funktion „p.adjust“. Die Datenanalyse erfolgt mit der Methode nach Be n- jamini & Hochberg. Mit der Option "Top 10" wurden 10 Kategorien ausgewählt, die das höchste Signifikanzniveau der p-Werte zu verzeichnen haben. Die minimale Zahl der Gene für eine Kategorie liegt bei 2.

3.6.1 Differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblastomen des Sta- diums 1 und Neuroblasten Betrachtet man mit Hilfe von GO Baumdiagrammen differentiell exprimierte Ge- ne zwischen Neuroblasten und Neuroblastomen des Stadiums 1, so ergeben sich in Neuroblasten im Vergleich zu Neuroblastomen des Stadiums 1 höher exprimie rte Gene der GO Kategorien „ Glutathion metabolism “, „Steroid metabolism “ und „reproductive developmental process “. Die Neuroblastome des St a- diums 1 hingegen weisen im Vergleich zu Neuroblasten vermehrt differentiell exprimierte Gene unter den GO Terms „ Immunglobulin “, „Immunresponse “, „lymphocyte activation “, „Cell adhesion molecules “, „regulation of apoptosis “ und „cell death “ auf. 70 3 Ergebnisse

3.6.2 Differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblastomen des Sta- diums 4 und Neuroblasten Im Vergleich zu Tumoren des Stadiums 4 finden sich in Neuroblasten unter anderem vermehrt Gene, die unter den GO Begriffen „ glutathion transferase activity“ , „regulation of hormone levels“ und „steroid biosynthetic process “ subsu m- miert werden. In den Tumoren des Stadiums 4 sind im Vergleich zu Neuroblas- ten höher exprimierte Gene der Subkategorien „neuron development“ , „cellular developmental process“, „transcription factor binding“ und „chemotaxis “ zu e r- mitteln.

3.6.3 Differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblastomen des Sta- diums 4S und Neuroblasten Durch den Vergleich von Neuroblasten mit Tumoren des Stadiums 4S kann man möglicherweise Rückschlüsse auf typische Mechanismen der Regression ziehen, die bei dieser inhomogenen Gruppe von Tumoren eine Rolle spielen.

In Neuroblasten ergeben sich unter d en GO Kategorien „ mitochondrion “, „lipid metabolic process “ und „oxidoreductase activity “ vermehrt differentiell expr i- mierte Gene, wohingegen im Vergleich in Tumorzellen des Stadiums 4S vermehrt differentiell exprimierte Gene unter der Kategorie „regulation of cell differentiation “, „axon extension “ und „nervous system development “ auftreten.

3.6.4 Differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblastomen des Sta- diums 4 mit MYCN Amplifikation und Neuroblasten Im Vergleich zwischen Neuroblasten und MYCN amplifizierten Tumoren ergeben sich unter den GO Kategorien „negative regulation of myeloid leucozyte differentiation “, „steroid metabolic process “ und „gluthatione transferase activity “ in Neuroblasten vermehrt differentiell exprimierte Gene. Im Vergleich hierzu zeigen MYCN amplifizierte Tumoren Gene, die sich in die Kategorien „regul a- tion of neuron differentiation“, „regulation of axogenesis “ und „developmental cell growth “ eingru ppieren.

3.7 Neue Kandidatengene günstiger und ungünstiger Neuroblastome Durch intensive molekulargenetische Forschung zum Neuroblastom ergaben sich bereits einige interessante Kandidatengene in günstigen bzw. ungünstigen Neuroblastomen. De Preter et al. untersuchten differentiell exprimierte Gene 3 Ergebnisse 71 zwischen günstigen und ungünstigen Neuroblastomen und fetalen Neuroblas- ten (48).

Diese Arbeit vergleicht erstmals mikrodissezierte Proben von Neuroblasten und mikrodissezierte Neuroblastomzellen miteinander. Der Ausschluss des Stromas und die Analyse der RNA ermöglichen einen direkten Vergleich zwischen der genetischen Signatur der Zelle im pränatalen fetalen Stadium und derer im postnatalen Tumor.

Um einerseits die Datenvalidität zu prüfen, andererseits Aussagen über interessante Kandidatengene des Neuroblastoms, die aktuell intensiver Forschung unterliegen, treffen zu können, werden einzelne Gene im Hinblick auf ihre absoluten Werte der Intensitäten bezogen auf die Stadien 1, 4, 4S, MYCN amplifizierte Tumoren, Neuroblasten und kortikale Zellen untersucht. Mikrodissezierte Neuroblastomzellen, fetale kortikale Zellen und Neuroblasten werden nachfol- gend mit den entsprechenden Proben des Gesamtkollektivs, welche auf Tu- morproben mit Stromaanteil basieren, verglichen. Dabei entsprechen die Tu- morproben mit Stromaanteil den mikrodissezierten Tumorproben.

So kann der Einfluss des Stromas bewertet werden, bzw. gezeigt werden, ob sich Korrelationen im Gesamtkollektiv wiederfinden. Zur besseren Anschaulich- keit werden sowohl die einzelnen Intensitätswerte der Patientenproben dargestellt als auch die über alle Proben einer Gruppe erhobenen Mittelwerte der In- tensitäten.

3.7.1 Drosophila Delta like homologue 1 (DLK1) Das Gen Drosophila Delta Like homologue 1 ( DLK1 ) konnte in vorangegangenen Studien mittels Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) in SK-N-FI Zel- linien hoch exprimiert nachgewiesen werden (162). Diese Arbeit folgt der Theo- rie, dass fehlgeleitete genetische Mechanismen im Rahmen der fetalen Ent- wicklung zur Pathogenese des Neuroblastoms führen. Diese Mechanismen beeinflussen dieser Theorie weiter folgend die Differenzierung der Zellen bzw. deren Entartung in frühen Stadien der zellulären Entwicklung. DLK1 zeigt in adulter adrenaler Medulla ein hohes Expressionsniveau, kortikale Zellen weisen hingegen im adulten Organismus ein variables Expressionsniveau auf. Wäh- rend in der äußersten Schicht des Kortex der Nebennieren, der Zona glomerulosa, Studien zu Folge im adulten Organismus eine erhöhte Expression von DLK1 zu verzeichnen ist, weisen die beiden inneren Schichten des Kortex (Zo- 72 3 Ergebnisse na fasciculata und retikularis) keine DLK1 Expression auf (165). In fetalen Neuroblasten zeigen sich hohe Expressionswerte der gemittelten absoluten Intensitäten, vgl. Abbildung 3.17 .

Kortikale Zellen weisen ebenfalls eine erhöhte Expression und Intensität auf. Da die gewonnenen kortikalen Zellen aus dem äußeren Randbereich, d.h. dem Bereich der späteren Zona glomerulosa gewonnen wurden, entspricht dieses Ergebnis den Erwartungen. Dies untermauert erneut die Validität der Daten und unterstützt die Annahme, dass bei der Mikrodissektion sowohl die Neuroblasten als auch die kortikalen Zellen weitgehend homogene Zellmuster aufweisen.

Betrachtet man isoliert die Neuroblastomzellen, so zeigt sich in den Tumorpro- ben mit Stromaanteil ein recht homogenes Muster. Dieses bildet sich auch in den mikrodissezierten Zellen ab. Tumoren des Stadiums 1, 4S und MYCN amplifizierte Tumoren weisen in den mikrodissezierten Proben eine leicht erhöhte Expression auf. In den entsprechenden Tumorproben mit Stromaanteil zeigen sich innerhalb der Subgruppen starke individuelle Unterschiede.

Vergleich der Intensitäten der mikrodissezierten Proben für DLK1

Mikrodissezierte Tumoren Mittelwerte mikrodissezierter Tumoren

Intensität Intensität x 1000 x 1000

Stadium Stadium Vergleich der Intensitäten der Proben mit Stromaanteil für DLK1

Tumoren mit Stromaanteil Mittelwerte der Tumoren mit Stromaanteil

Intensität Intensität x 100

Stadium Stadium

Abbildung 3.17: Vergleich der Intensitäten von DLK1 aller Proben 3 Ergebnisse 73

3.7.2 Tyrosine Hydroxylase (TH) Zur weiteren Validierung der Daten wurde das Gen Tyrosine Hydroxylase aus- gewählt, das, vorangegangenen Studien zu Folge, in chromaffinen Zellen eine höhere Expression aufweist, als in Neuroblasten (48, 72).

Chromaffine Zellen mit hoher TH Expression finden sich in der fetalen Neben- niere auch vereinzelt im adrenalen Kortex, die tatsächlichen kortikalen Zellen weisen jedoch keine TH Expression auf (48, 72).

Im Vergleich der Tumoren mit Stromaanteil fällt die annähernd homogene Ver- teilung der Proben auf, vgl. Abbildung 3.18 . Keine der vier Subgruppen sticht durch ein besonders auffälliges Expressionsniveau heraus. Die Werte der In- tensitäten spiegeln einen durchweg niedrigen Level der Expression wider. We- der Neuroblasten noch kortikale Zellen zeigen ein erhöhtes Expressionsniveau. Die Annahme, es handle sich um weitgehend homogene Zellcluster mit nur geringer Verunreinigung mit chromaffinen Zellen, kann durch dieses Ergebnis untermauert werden. Eine sehr geringe Expression von Tyrosine Hydroxylase in kortikalen Zellen kann vermutlich auf vereinzelte chromaffine Zellen innerhalb der mikrodissezierten kortikalen Zellnester oder eine geringe den kortikalen Zel- len inherente Expression zurückgeführt werden.

Vergleich der Intensitäten der mikrodissezierten Proben für TH

Mikrodissezierte Tumoren Mittelwerte mikrodissezierter Tumoren

Intensität Intensität

Stadium Stadium 74 3 Ergebnisse

Vergleich der Intensitäten der Proben mit Stromaanteil für TH

Tumoren mit Stromaanteil Mittelwerte der Tumoren mit Stromaanteil

Intensität Intensität x 100 x 100

Stadium Stadium

Abbildung 3.18: Vergleich der Intensitäten von TH aller Proben

3.7.3 V-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived, avian (MYCN) Das Expressionsprofil von MYCN amplifizierten Tumoren unterscheidet sich signifikant von anderen Subgruppen des Neuroblastoms (174). Diese Beson- derheit der Expression spiegelt sich auch in den mikrodissezierten Zellen wider, vgl. Abbildung 3.19 .

Vergleicht man die Absolutwerte der MYCN Intensitäten von Tumoren mit bekannter MYCN Amplifizierung mit den Werten der anderen Subgruppen, d.h. Stadium 1, 4, 4S, Neuroblasten und kortikalen Zellen, so fällt das hohe Expres- sionsniveau der als MYCN benannten Tumoren auf. Weder fetale kortikale Zel- len noch Neuroblasten erreichen ein annähernd hohes Expressionsniveau. Be- trachtet man die Intensitäten derselben Patientenproben aus dem Kollektiv der nicht mikrodissezierten Tumoren mit Stromaanteil und vergleicht diese mit den mikrodissezierten Entsprechungen, so ergibt sich ein ähnliches Muster der In- tensitäten. 3 Ergebnisse 75

Vergleich der Intensitäten der mikrodissezierten Proben für MYCN

Mikrodissezierte Tumoren Mittelwerte mikrodissezierter Tumoren

Intensität Intensität x 1000 x 1000

Stadium Stadium

Vergleich der Intensitäten der Proben mit Stromaanteil für MYCN

Tumoren mit Stromaanteil Mittelwerte der Tumoren mit Stromaanteil

Intensität Intensität x 10 000 x 10 000

Stadium Stadium

Abbildung 3.19: Vergleich der Intensitäten von MYCN aller Proben

3.7.4 V-myc myelocytomatosis viral related oncogene, avian ( MYC ) MYC gehört wie auch MYCN und MYCL zur Gruppe der MYC Genfamilie und spielt in zahlreichen Tumorentitäten eine Rolle. Diese Gene kodieren für basic Helix-loop-helix Leucine Zipper Proteine, welche mit ihrem Partnerprotein MAX Heterodimere bilden (5).

Neuroblastomzelllinien, die keine MYCN Amplifikation aufweisen, zeigen eine erhöhte Expression von MYC im Vergleich zu MYCN amplifizierten Zelllinien. Häufig haben diese Tumoren höhere Expressionswerte als Normalgewebe. Da eine hohe MYCN Proteinkonzentration die mRNA Expression von MYC hemmt, bedingt dies bei MYCN amplifizierten Tumoren eine geringere MYC Expression (172, 26).

Diese Daten konnten an einem Kollektiv von 251 Tumoren von Westermann et al. verfiziert werden (172). Betrachtet man hingegen die Gruppe der Tumoren, 76 3 Ergebnisse welche für die Untersuchung dieser Arbeit ausgewählt wurde, so ist dieser Trend im Tumorgewebe der mit Stroma amplifizierten Tumoren nicht klar aus- zumachen, vgl. Abbildung 3.20 . Insgesamt erscheinen alle Intensitätswerte der mikrodissezierten Proben für MYC im Vergleich zu anderen Genen auf sehr geringem Niveau, was die Interpretation des Ergebnisses erschwert. Auch hier ist die Unterscheidung zwischen MYCN amplifizierten Tumoren und anderen Subgruppen nur bedingt möglich. Ein Erklärungsansatz zu diesen Daten bietet die Theorie, dass der Einfluss von Hintergrundrauschen auf die Daten bei niedrigen Intensitäten möglicherweise eine große Rolle spielt und somit eine Inter- pretation der Daten erschwert.

Vergleich der Intensitäten der mikrodissezierten Proben für MYC

Mikrodissezierte Tumoren Mittelwerte mikrodissezierter Tumoren

Intensität Intensität

Stadium Stadium

Vergleich der Intensitäten der Proben mit Stromaanteil für MYC

Tumoren mit Stromaanteil Mittelwerte der Tumoren mit Stromaanteil

Intensität Intensität x 10 000 x 10 000

Stadium Stadium

Abbildung 3.20: Vergleich der Intensitäten von MYC aller Proben

3.7.5 Preferentially expressed antigen in melanoma (PRAME ) PRAME gilt in der Onkologie als tumorassoziiertes Antigen und potenzielles Zielgen für Immuntherapie. In Neuroblastomen konnte mit Hilfe von RT-PCR Analysen von 101 Neuroblastompatienten eine erhöhte Expression dieses 3 Ergebnisse 77

Gens in fortgeschrittenen Tumoren nachgewiesen werden. PRAME kann somit möglicherweise zukünftig als prognostischer Marker dienen und könnte laut Oberthuer et al. auf noch unbekannte Art und Weise mit der Pathogenese ag- gressiver Neuroblastom-Subtypen in Verbindung stehen (110).

Betrachtet man die PRAME Expression in Neuroblastomen, Neuroblasten und kortikalen Zellen, so weisen Hochrisikogruppen wie Tumoren des Stadiums 4 und MYCN amplifizierte Tumoren eine erhöhte Expression auf, Neuroblasten und auch kortikale Zellen haben eine sehr geringe Genexpression von PRAME zu verzeichnen, vgl. Abbildung 3.21 . Dies entspricht den Daten der entsprechenden Proben des Tumorkollektivs.

Vergleich der Intensitäten der mikrodissezierten Proben für PRAME

Mikrodissezierte Tumoren Mittelwerte mikrodissezierter Tumoren

Intensität Intensität x 1000 x 1000

Stadium Stadium

Vergleich der Intensitäten der Proben mit Stromaanteil für PRAME

Tumoren mit Stromaanteil Mittelwerte der Tumoren mit Stromaanteil

Intensität Intensität x 1000 x 1000

Stadium Stadium

Abbildung 3.21: Vergleich der Intensitäten von PRAME aller Proben

3.7.6 Anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase ( ALK ) Anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase ( ALK ) ist eine Rezeptortyrosinki- nase, die in etwa 8 % der sporadischen Fälle von Neuroblastomen somatische 78 3 Ergebnisse

Mutationen aufweist (133). Des Weiteren spielen Keimzellmutationen des ALK Gens Studien zu Folge eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung hereditä- rer Neuroblastome. Da die Inhibition von ALK in Zellinien zu einem reduzierten Zellwachstum und einer Inhibition entsprechender, nachgeschalteter Signalwe- ge führt, spielen möglicherweise in Kürze ALK Inhibitoren als zielgerichtete The- rapieform für ALK Mutationen tragende Tumorpatienten klinisch eine Rolle (133, 38, 60, 112).

Betrachtet man ALK in Neuroblastomen, Neuroblasten und kortikalen Zellen, so zeigen sich sowohl in MYCN amplifizierten Tumoren, als auch in Stadium 4 Tumoren erhöhte Werte der gemittelten Intensitäten, vgl. Abbildung 3.22 . Neuroblasten und kortikale Zellen haben eine geringere Expression von ALK zu verzeichnen. Auch im Vergleich zu den nicht-mikrodissezierten Proben des Kol- lektivs lassen sich diese Trends verifizieren.

Vergleich der Intensitäten der mikrodissezierten Proben für ALK

Mikrodissezierte Tumoren Mittelwerte mikrodissezierter Tumoren

Intensität Intensität x 100 x 100

Stadium Stadium

Vergleich der Intensitäten der Proben mit Stromaanteil für ALK

Tumoren mit Stromaanteil Mittelwerte der Tumoren mit Stromaanteil

Intensität Intensität x 1000 x 1000

Stadium Stadium

Abbildung 3.22: Vergleich der Intensitäten von ALK aller Proben

3 Ergebnisse 79

3.7.7 Repressor element 1-silencing transcription factor ( REST ) Das Gen Repressor element 1-silencing transcription factor ( REST ) unterdrückt die Transkription neuronaler Gene in nicht neuronalem Gewebe durch das Bin- den eines DNA-Sequenz-Elements namens Neuron-restrictive Silencer Ele- ment. REST ist ein Mitglied der „Kruppel -type Zinc Finger Transcription Factor“ Familie und findet sich in undifferenzierten neuronalen Vorläuferzellen, um möglicherweise dort als bedeutender Faktor der negativen Regulation der Neurogenese zu fungieren (5).

Betrachtet man die gemittelten Intensitäten der verschiedenen untersuchten Subgruppen, so zeichnet sich grundlegend eine eher geringe Expression gemessen in absoluten Intensitäten ab, vgl. Abbildung 3.23 . Bei der Agilent Son- de A_246787 zeigt sich ein deutliches Maximum in den mikrodissezierten MYCN amplifizierten Zellen sowie den Neuroblasten und kortikalen Zellen, wobei die zweite Sonde starke Abweichungen bezüglich ihres Intensitätsniveaus und auch ihrer Maxima aufweist.

Die erhöhten Werte von REST in den fetalen Zellen spiegeln einen typischen Mechanismus fetaler Zellen generell wider: So werden diese Zellen bezüglich ihrer Differenzierung und Entwicklung durch Faktoren wie REST gehemmt und verbleiben in einem noch undifferenzierten, neuronalen Vorläuferstadium.

Vergleich der Intensitäten der mikrodissezierten Proben für REST

Mikrodissezierte Tumoren Mittelwerte mikrodissezierter Tumoren

Intensität Intensität

Stadium Stadium 80 3 Ergebnisse

Vergleich der Intensitäten der Proben mit Stromaanteil für REST

Tumoren mit Stromaanteil Mittelwerte der Tumoren mit Stromaanteil

Intensität Intensität x 100 x 100

Stadium Stadium

Abbildung 3.23: Vergleich der Intensitäten von REST aller Proben

Betrachtet man die Genexpression in nicht mikrodissezierten Proben so zeigt sich ein anderes Bild. Vor allem die Stadium 1 Tumoren und Stadium 4 Tumo- ren weisen eine hohe Expression von REST auf, weniger hingegen die Stadium 4S und MYCN amplifizierten Tumoren. Die Unterschiede innerhalb der Sonden bleiben bestehen. Inwiefern Stromaanteile eine Rolle spielen und die unterschiedlichen Ergebnisse der Untersuchungen erklären, kann letzendlich nicht geklärt werden.

Boxplots eines Patientenkollektivs mit 341 Neuroblastomen zeigen eine erhöhte Genexpression von REST in Tumoren des Stadiums 1 und 4S, vgl. Abbil- dung 3.24 . Im folgenden Abschnitt wurde dieser Zusammenhang auf Signifi- kanz geprüft.

3 Ergebnisse 81

a) Boxplot des Gesamtkollektivs b) Boxplot des Gesamtkollektivs zu REST Sonde A_24_P246787 zu REST Sonde A_23_P167081

Intensitäten Intensitäten Sonde A_23_P167081 Sonde Sonde A_24_P246787 Sonde REST REST

Stadium 1 Stadium 4 Stadium 4S MYCN Stadium 1 Stadium 4 Stadium 4S MYCN amplifiziert amplifiziert Stadium Stadium

Abbildung 3.24: Boxplots zu REST des Kollektivs mit 341 Patientenproben

Tabelle 3.11: Tests auf Unterschiede zwischen zwei und mehr Gruppen für REST

Vergleiche N A_24_P246787 A_23_P167081 p-value p-value Gesamt 341 Stadium 1 114 0.0005528 0.09992 Stadium 4 105 Stadium 4S 56 MYCN amplifiziert 66 Gesamt 180 Stadium 1 114 0.0001027 0.1413 MYCN amplifiziert 66 Gesamt 171 Stadium 4 105 0.423 0.9431 MYCN amplifiziert 66 Gesamt 122 Stadium 4S 56 0.003434 0.07934 MYCN amplifiziert 66 Gesamt 341 Stadium 1 + 4 + 4S 275 0.00304 0.2574 MYCN amplifiziert 66

82 3 Ergebnisse

Für das Testen auf Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurde der Mann- Whitney U Test verwendet und dabei ein Signifikanzniveau von 0,05 gewählt. Dieser Test vergleicht die zentrale Tendenz zweier unabhängiger Stichproben durch die Berechnung von Rangplatzsummen. P-Werte größer als 0,05, also über dem Signifikanzniveau werden als nicht signifikant gewertet und davon ausgegangen, dass kein statistisch signifikanter Unterschied der zentralen Ten- denz zwischen den Stadien vorliegt. P-Werte unter 0,05 sind als statistisch signifikant zu werten. Es ist davon auszugehen, dass ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen diesen Stadien vorliegt.

Für das Testen auf Unterschiede zwischen mehr als zwei Gruppen wurde der Kruskal-Wallis Test verwendet. Dieser Test basiert, wie auch der Mann-Whitney U Test auf dem Vergleich rangskalierter Daten. Wählt man erneut ein Signifi- kanzniveau von 0,05, so kann man bei Werten über 0,05 davon ausgehen, dass sich die zentrale Tendenz der Stadien in Bezug auf ihre Verteilung der Intensi- täten nicht signifikant unterscheidet.

Für die Gensonde A_24_P246787 besteht zwischen den Stadien 1, 4, 4S und MYCN amplifizierten Neuroblastomen demzufolge bei einem p-Wert von 0.0005528 in einem Kollektiv von 341 Tumoren ein signifikanter Unterschied der Verteilung. Dies trifft auch auf den Vergleich der Tumoren des Stadiums 1 mit MYCN amplifizierten Tumoren, 4S mit MYCN amplifizierten Tumoren und die Gruppierung der Stadien 1, 4 und 4S im Vergleich zu MYCN amplifizierten Tumoren zu. Der Unterschied der zentralen Tendenz zwischen Tumoren des Stadiums 4 im Vergleich zu MYCN amplifizierten Tumoren ist mit einem p-Wert von 0,423 nicht signifikant.

Für die Gensonde A_23_P167081 besteht in keiner der untersuchten Gruppen ein statistisch signifikanter Unterschied der zentralen Tendenz.

3.7.8 Homebox C9 ( HOXC9 ) Homeboxgene gehören zur Gruppe der Transkriptionsfaktoren und sind Teil eines speziellen Regulationssystems der Morphogenese und Zellspezifizierung. Sie sind ein wichtiger Bestandteil der Regulierung und Entwicklung des Ner- vensystems. Insbesondere HOXC9 scheint eine Schlüsselrolle in der Pathoge- nese des Neuroblastoms und Regulator der Neuroblastomdifferenzierung zuzu- kommen. HOXC9 unterdrückt Mao et. al. zu Folge wachstumsfördernde Gene und aktiviert Gene der neuronalen Differenzierung. Tumoren des Stadiums 4S 3 Ergebnisse 83 weisen nach dieser Studie ein relativ hohes Niveau an HOXC9 auf, was den Schluss nahe legt, dass HOXC9 möglicherweise in Prozessen der spontanen Regression eine Rolle spielt (93).

Vergleicht man die absoluten Intensitäten der Mittelwerte von HOXC9 der Untersuchungsgruppen mit den entsprechenden Vorläuferzellen, so zeigt sich eine höhere Expression in Stadium 4S und Stadium 1 Tumoren im Vergleich zu Stadium 4 und MYCN amplifizierten Tumoren, vgl. Abbildung 3.25 . Neuroblas- ten zeigen im Vergleich ein mittleres Expressionsniveau auf und unterscheiden sich in dieser Analyse eindeutig von den kortikalen Zellen.

Diese Einteilung spiegelt sich auch im Vergleich zu den entsprechenden Pro- ben des Kollektivs mit Stromaanteil wider.

Vergleich der Intensitäten der mikrodissezierten Proben für HOXC9

Mikrodissezierte Tumoren Mittelwerte mikrodissezierter Tumoren

Intensität Intensität

Stadium Stadium

Vergleich der Intensitäten der Proben mit Stromaanteil für HOXC9

Tumoren mit Stromaanteil Mittelwerte der Tumoren mit Stromaanteil

Intensität Intensität x 1000 x 1000

Stadium Stadium

Abbildung 3.25: Vergleich der Intensitäten von HOXC9 aller Proben

84 3 Ergebnisse

3.7.9 Transcription factor AP-2 beta ( TFAP2B ) Das Gen TFAP2B ist ein Transkriptionsfaktor, kodiert für ein AP-2 Protein und bindet spezifisch an die DNA Sequenz 5'-GCCNNNGGC-3'. Dieses Protein ist an der Stimulation des Zellwachstums beteiligt. Es wird davon ausgegangen, dass AP-2 Proteine die terminale Differenzierung bestimmter Zelltypen während der fetalen Entwicklung unterdrücken können. TFAP2B ist an der Entwicklung der Nieren, des Neuralrohrs und an der durch Retinsäure induzierten Differen- zierung neuronaler Vorläuferzellen beteiligt und hat sowohl die Funktion als transkriptioneller Aktivator als auch als Repressor inne (5, 158).

In Neuroblastomen weist dieses Gen Thorell et al. zu Folge eine signifikant niedrigere Expression in ungünstigen Stadien auf. TFAP2B wird als eines der Gene diskutiert, welches die Unterscheidung stromareicher von stromaarmen Tumoren ermöglicht (14). TFAP2B tritt, folgt man dieser Studie, in stromarei- chen Tumoren, d.h. Ganglioneuroblastomen mit hohem Schwannzellanteil häu- figer auf als in stromaarmen Neuroblastomen.

Sowohl in den mikrodissezierten Proben als auch in den Tumorproben des Ge- samtkollektivs mit Stromaanteil zeigen sich erhöhte Genexpressionswerte von TFAP2B in den Stadien 1 und 4S und niedrigere Werte der Intensitäten bei MYCN amplifizierten Tumoren, vgl. Abbildung 3.26 . Stadium 4 Tumoren kön- nen in den Tumorproben des Gesamtkollektivs mit Stromaanteil eine niedrigere Expression verzeichnen.

Die Expression von TFAP2B in Neuroblasten und die sehr geringe Expression in kortikalen Zellen entspricht vorangegangenen Studien in denen TFAP2B als Differenzierungsgen neuronaler Vorläuferzellen beschrieben wurde (5). Nach de Preter et al. ist TFAP2B in Neuroblasten im Vergleich zu ungünstigen Neuroblastomen erhöht. Im Vergleich von Neuroblastomen mit MYCN Amplifi- kation mit Neuroblasten ließ sich diese Tendenz auch in den vorliegenden Daten bestätigen (48). 3 Ergebnisse 85

Vergleich der Intensitäten der mikrodissezierten Proben für TFAP2B

Mikrodissezierte Tumoren Mittelwerte mikrodissezierter Tumoren

Intensität Intensität x 1000 x 1000

Stadium Stadium

Vergleich der Intensitäten der Proben mit Stromaanteil für TFAP2B

Tumoren mit Stromaanteil Mittelwerte der Tumoren mit Stromaanteil

Intensität Intensität x 1000 x 1000

Stadium Stadium

Abbildung 3.26: Vergleich der Intensitäten von TFAP2B aller Proben

3.7.10 Baculoviral IAP repeat containing 5 ( BIRC5 ) BIRC5 (survivin) liegt auf Chromosom 17q25, wirkt anti-apoptotisch, wird in fortgeschrittenen Neuroblastomen hoch exprimiert und konnte mit einer schlechten Prognose der Patienten assoziiert werden (74, 100). In Neuroblas- tomen unterliegt diese chromosomale Region häufiger einem Zugewinn (17q gain). Eckerle et al. wiesen nach, dass BIRC5 indirekt durch MYCN induziert wird (11, 51). Albino et al. zeigten eine erhöhte Expression in stromaarmen Neuroblastomen (14).

In den mikrodissezierten Zellen zeigen sich erwartungsgemäß erhöhte BIRC5 Werte in Stadium 4 und MYCN amplifizierten Tumoren, d.h. zusammengefasst in Tumoren mit schlechter Prognose für beide Gensonden in unterschiedlich hoher Intensität, vgl. Abbildung 3.27 . Stadium 1 Tumoren, Neuroblasten und kortikale Zellen weisen ein niedrigeres Expressionsniveau auf. 86 3 Ergebnisse

Betrachtet man die entsprechenden Tumorproben des Gesamtkollektivs mit Stromaanteil so zeigen sich auch hier diese Trends, wobei eine ausgeprägte interindividuelle Variabilität besteht. Die Abbildung lässt den generellen Trend mit erhöhten Intensitätsniveaus der MYCN amplifizierten und Stadium 4 Tumo- ren dennoch erkennen. Diese Daten bestätigen Ergebnisse der De Preter Gruppe (48).

Vergleich der Intensitäten der mikrodissezierten Proben für BIRC5

Mikrodissezierte Tumoren Mittelwerte mikrodissezierter Tumoren

Intensität Intensität

Stadium Stadium

Vergleich der Intensitäten der Proben mit Stromaanteil für BIRC5

Tumoren mit Stromaanteil Mittelwerte der Tumoren mit Stromaanteil

Intensität Intensität x 1000 x 1000

Stadium Stadium

Abbildung 3.27: Vergleich der Intensitäten von BIRC5 aller Proben

3.7.11 Paired-like homeobox 2b ( PHOX2B ) PHOX2B ist ein hochkonservierter Transkriptionsfaktor, der in Zellen des sich entwickelnden sympathischen und parasympathischen autonomen Nervensys- tems eine bedeutende Rolle spielt. In PHOX2B knock-out Mäusen konnte eine mangelhafte Entwicklung neuronaler Ganglien nachgewiesen werden. Trochet und Bourdeaut wiesen bereits 2004 Keimzellmutationen von PHOX2B in Fällen des familiären Neuroblastoms nach (25, 159). Ein oligogenetisches Modell ist jedoch im Fall des sehr heterogenen Neuroblastoms wahrscheinlicher als ein 3 Ergebnisse 87 monogenetischer Ansatz, um die Entstehung des familiären Neuroblastoms zu erklären (121). PHOX2a und PHOX2b kontrollieren die Expression von Genen die für Enzyme der Noradrenalinsynthese wie DBH und TH kodieren (178).

PHOX2B lässt sich mit TrkA und dem Delta-Notch Signalweg bei sporadisch auftretendem Neuroblastom assoziieren (115, 116).

Betrachtet man die PHOX2B Expression in mikrodissezierten sporadischen Neuroblastomen, so fallen vor allem in Stadium 4S Tumoren erhöhte Expres- sionswerte auf, vgl. Abbildung 3.28 . Neuroblasten verzeichnen eine im Ver- gleich niedrigere Expression als Neuroblastomzellen und grenzen sich eindeutig von den kortikalen Zellen mit sehr geringer Expression ab. Auch in den Tu- moren des Gesamtkollektivs mit Stromaanteil zeigen sich Unterschiede der Ex- pression, wobei die MYCN amplifizierten Tumoren im Vergleich geringere Wer- te der absoluten Intensitäten zu verzeichnen haben.

Vergleich der Intensitäten der mikrodissezierten Proben für PHOX2B

Mikrodissezierte Tumoren Mittelwerte mikrodissezierter Tumoren

Intensität Intensität x 10 000 x 10 000

Stadium Stadium

Vergleich der Intensitäten der Proben mit Stromaanteil für PHOX2B

Tumoren mit Stromaanteil Mittelwerte der Tumoren mit Stromaanteil

Intensität Intensität x 10 000 x 10 000

Stadium Stadium

Abbildung 3.28: Vergleich der Intensitäten von PHOX2B aller Proben

88 4 Diskussion

4 Diskussion

4.1 Einleitung der Diskussion In dieser Arbeit sollte eine Methode etabliert werden um reine Zellproben auf der Basis sehr geringer Probenmengen beim Neuroblastom und fetalen Neuro- blasten zur Erstellung von Genexpressionsprofilen zu gewinnen.

Der Vergleich des funktionellen Repertoires von Tumorzellen auf molekulargenetischer Ebene mit ihren nicht entarteten Vorläuferzellen dient in vielen Stu- dien als Strategie, Entwicklung und Pathophysiologie der Tumoren besser zu verstehen. Diese Arbeit unterstützt die These, dass es sich bei Neuroblasten um die Ursprungszellen des Neuroblastoms handelt und gewährt Einblick in typische Pathomechanismen, Signalwege und Genmuster des Neuroblastoms.

Die Überprüfung der qualitativen Voraussetzungen erfolgte durch den Vergleich fetaler Zellen mit kortikalen Zellen derselben fetalen Sektionen. Die Validität der Datenerhebung wurde mit Hilfe des Vergleichs der Daten mit bereits publizier- ten Studien zum Neuroblastom und anderen bekannten Neoplasien untermauert.

Im folgenden Abschnitt erfolgt primär die Evaluation technischer Aspekte und im Anschluss daran die inhaltliche Auswertung der Ergebnisse gefolgt von einem kurzen Ausblick.

4.2 Technische Aspekte und inhaltliche Auswertung Die Auswahl der Stichprobe der Neuroblastompatienten erfolgte anhand des Infiltrationsgrades der Tumorzellen. Zu jeder mikrodissezierten Stichprobe lag bereits vor Beginn der Experimente eine Tumorprobe mit Stromaanteil in Form eines Mikroarrays vor. So konnte im Anschluss eine Kontrolle der mikrodissezierten Zellproben durch diese Tumorproben des Gesamtkollektivs vorgenommen werden.

Da auf einen hohen Infiltrationsgrad der Tumorzellen des Neuroblastomkollek- tivs geachtet wurde, konnten Neuroblastomzellen in Schnitten blickdiagnostisch identifiziert und mittels Mikrodissektion gewonnen werden.

Die LMPC Technik kann sowohl als sogenannte „wet“ Technik, mit einem E x- traktions- und Lysepuffer direkt im Deckel des Auffanggefäßes oder aber als „dry“ Technik mit einer trockenen Matrix im Deckel des Auffanggefäßes erfo l- 4 Diskussion 89 gen. Verschiedene Vorversuche zeigten eine deutlich höhere RNA Menge und Qualität bei Anwendung der „dry“ Tech nik, weshalb diese in der vorliegenden Arbeit zur Anwendung kam.

Die Zellyse, Isolation und cDNA Synthese erfolgte mit Hilfe superparamagneti- scher Partikel (gebunden an Oligo(dT) Primern; MACS Microbeads), um Mate- rialverluste möglichst klein zu halten. Häufiges pipettieren, zentrifugieren und aufwärmen des Zelllysats wurden zur Reduktion des Materialverlusts und der RNA Degradation vermieden.

Das Überprüfen der RNA Qualität mit Hilfe des Bioanalyzer/ Pico Chip ® ließ den Schluss zu, die Amplifikation der Tumorproben habe zu mit Referenzproben vergleichbaren Fragmentgrößen geführt. Die Gesamtmenge der aus den Zellen gewonnenen RNA war positiv zu bewerten, obgleich hierbei deutliche Unter- schiede zwischen der ersten Untersuchungskohorte und der zweiten, dritten und vierten Gruppe auftraten (vgl. Kapitel 2.9.1 und Kapitel 2.13).

Die Kontrolle der Daten mit Hilfe des Nano Drop ® nach der Markierung mit Fluo- reszenzfarbstoffen ermöglichte eine Aussage über die Qualität der Proben. Eine ausreichende spezifische Aktivität des Cy 3, der cDNA Gehalt der Proben und die Probenabsorbtionsrate ermöglichten die Hybridisierung auf Mikroarrays.

Die Untersuchung der Einzelgene und deren Korrelation zu den Tumorproben des Gesamtkollektivs mit Stromaanteil war ein weiteres Kriterium zur Überprü- fung der Qualität des mikrodissezierten Materials. Da die mikrodissezierten Proben und die Tumorproben des Gesamtkollektivs mit Stromaanteil im direkten Vergleich zahlreiche Übereinstimmungen aufwiesen, ist davon auszugehen, dass Tendenzen in der Stichprobe auch auf ein größeres Kollektiv übertragen werden dürfen. Unterschiede der Proben können sowohl aufgrund der unterschiedlichen Technik, als auch der histopathologischen Voraussetzungen - stromafreies, mikrodisseziertes vs. stromareiches Ausgangsmaterial - auftreten.

Neuroblasten wurden anhand immunhistochemischer Kriterien identifiziert: die Zellmorphologie, das Auftreten in Clustern und die Nachweisfärbungen mit NCAM und BCL-2-Antikörpern ließen innerhalb der fetalen Nebennieren eine klare Differenzierung zwischen kortikalen Zellen, chromaffinen Zellen des fetalen Nebennierenmarks und Neuroblasten zu. Die immunhistochemische Markie- rung mit dem Antikörper NCAM zeigte besonders anschaulich die Unterschei- dung zwischen Neuroblasten als Vetreter neuronaler Zellen und kortikalen Zel- 90 4 Diskussion len. Fetale Neuroblasten des Gehirns exprimieren Studien zu Folge zwischen dem fetalen Alter von 13 Wochen bis 30 Wochen NCAM . Die Expression von NCAM in fetalen Neuroblasten des Nebennierenmarks konnte in dieser Arbeit untermauert werden (175).

Sowohl die Überprüfung der fetalen Proben mit Hilfe des Pico Chip/Bioanalyzer, als auch die Kontrolle der Fluoreszenzmarkierung durch die Messung mit dem Nano Drop bestätigten die RNA Quantität und Qualität der Neuroblasten und kortikalen Zellen im Bereich der Tumorproben und sicherten die qualitativen Voraussetzungen für eine erfolgreiche Hybridisierung der Proben auf die 44K Mikroarrays.

Untersucht man kortikale Zellen und Neuroblasten mittels Cluster im direkten Vergleich ohne Einfluss der Neuroblastome, so zeigt sich im Cluster die Grup- pierung in die erwarteten Subgruppen. Die Zuordnung der kortikalen Zellen zu den fetalen Zellen in der Clusteranalyse aller Proben lässt sich dadurch erklä- ren, dass auch Neuroblasten in Prozesse des Lipid- und Cholesterinmetabolis- mus involviert sind und daher molekulare Ähnlichkeiten aufweisen.

Dieser Tatsache steht die Trennung der kortikalen Zellen von den weiteren Proben in der Hauptkomponentenanalyse nicht entgegen, da die agglomerative Clusteranalyse auf die Darstellung von Ähnlichkeiten abzielt, die Hauptkompo- nentenanalyse jedoch stärker Unterschiede widerspiegelt. Die Differenzen der Genexpression innerhalb der Gruppe der Neuroblasten in der Hauptkomponen- tenanalyse konnten anhand der Tatsache erklärt werden, dass sich bei sehr kleinen Gruppen Differenzen stärker ausprägen als bei größeren Kollektiven.

Die untersuchten Neuroblasten weisen spezifische Genexpressionsmuster auf, die denen von Neuroblastomen des Stadiums 1 ähneln. Neuroblasten sind den Tumoren des Stadiums 1 in ihrer genetischen Signatur damit ähnlicher als Tu- moren der Stadien 4, 4S und MYCN amplifizierten Tumoren. Neuroblastome des Stadiums 4 erfahren hingegen, folgt man dieser Theorie im Verlauf weitere molekulargenetische Veränderungen.

Eine weitere Erklärung bietet der Ansatz, dass Neuroblastome unterschiedlicher Stadien auf Vorläuferzellen unterschiedlicher Differenzierungsstadien zurückge- führt werden können. Möglicherweise gibt es beim Neuroblastom keinen einen allen Stadien gemeinsamen genetischen Defekt, der den Ursprung der Erkran- kung erklärt und verkörpert, sondern vielmehr zahlreiche unterschiedliche ge- 4 Diskussion 91 störte molekulare Signalwege und Kaskaden, die dasselbe genetische Material der Neuroblasten als Grundlage haben, in ihrer malignen Entwicklung und Ge- netik jedoch stets Unterschiede aufweisen.

Die weiteren Untersuchungen des Genexpressionsmusters der gewonnenen Zellen mit WebGestalt und DAVID zeigen für die entsprechenden Zellen typische Charakteristika auf. Ausgehend von der Hypothese, dass Neuroblasten im Allgemeinen spezifische Gene neuronaler Mechanismen aufweisen, konnte anhand des Vergleichs mit kortikalen Zellen gezeigt werden, dass es sich bei den gewonnenen Zellproben um Neuroblasten handelt. In Neuroblasten konnten zahlreiche Gene nachgewiesen werden, die in neuronale Prozesse involviert sind. Kortikale Zellen zeichnen sich durch Gene des Lipid- und Cholesterin- metabolismus aus. Obgleich Neuroblasten im direkten Vergleich zu Neuroblas- tomen auch in Prozesse des Steroid- und Lipidmetabolismus integriert sind, ist ihre Unterscheidung von kortikalen Zellen und die Ähnlichkeit zu Neuroblasto- men ein klares Indiz für die Korrektheit der These der Ursprungszellen.

Die Einzelgenanalysen dieser Arbeit weisen spezifische Unterschiede zwischen Neuroblasten und fetalen kortikalen Zellen nach. So zeigt sich beispielsweise bei der Untersuchung der Gene TFAP2B und PHOX2B eine stärkere Expres- sion in Neuroblasten im Vergleich zu kortikalen Zellen. Im Vergleich der Ex- pression des HOXC9 Gens zwischen den Subgruppen spiegeln sich die Unter- schiede der Intensitäten ebenfalls wider. Kortikale Zellen und fetale Neuroblas- ten zeigen bei der HOXC9 Expression deutliche Unterschiede im direkten Ver- gleich der absoluten Intensitäten.

4.3 Chargeneinfluss (Batch Effekt) auf die Daten Der Begriff „Batch Effekt“ bezeichnet einen Einfluss im Ablauf eines Experi- ments auf die Resultate einer Untersuchungscharge (vgl. Kapitel. 2.13 ).

Im folgenden Abschnitt werden Schritte der Datenvalidierung erläutert, Arbeits- routinen beschrieben und der Einfluss von Chargen auf die Experimente bewertet.

Die Mikroarrays der vorliegenden Arbeit unterlagen Qualitätsstandards, wurden derselben Charge entnommen und zeigten keine Veränderungen im Vergleich zu vorherigen Untersuchungen. Proben desselben Neuroblastompatienten wurden von unterschiedlichen Untersuchern gefärbt, mikrodisseziert und moleku- 92 4 Diskussion largenetisch weiter bearbeitet bis zur Hybridisierung auf den Array und letztend- lich Datenextraktion. Untersuchereffekte konnten in den Experimenten damit ausgeschlossen werden. Die experimentelle Untersuchung erfolgte ausschließ- lich in einem Labor und unterlag weder Veränderungen bezüglich des Trans- ports der Proben noch sonstigen technischen Veränderungen. Die Bearbeitung der Proben und die Protokolle oder Scanroutine unterlagen keinerlei Verände- rungen, welche einen Chargeneinfluss (vgl. Kapitel. 2.13) erklären könnten. Auch die Bedingungen bei der Aufreinigung der Proben waren stets vergleichbar und größere Unterschiede der Raumtemperatur konnten ausgeschlossen werden. Vorherige Experimente zum Einfluss der eingesetzten Zellmenge auf das Resultat zeigten nach der Amplifikation keine erheblichen Unterschiede bezogen auf die Qualität und Quantität der Ergebnisse was diesen Einflussfak- tor auch weitgehend ausschließt.

In dieser Arbeit wurde für die zweite Gruppe der Proben, die einen Chargenein- fluss aufweist, ein neuer μMACS TM SuperAmp TM Kit verwendet, was die Vermu- tung nahe legt, es handle sich bei dem Effekt um ein Problem innerhalb der Routine der cDNA-Amplifikation. Nach Herstellerangaben lagen jedoch keine Veränderungen der Reagenzien vor. Die durchschnittliche Menge der cDNA nach Isolation und Amplifikation betrug in der ersten Charge 1908 ng in 50 μl, in der zweiten Charge 567 ng in 50 μl, in der dritten Charge 435 ng in 50 μl und in der vierten Charge 489 ng in 50 μl. Die durchschnittliche cDNA Menge war fol g- lich im zweiten Batch im Vergleich zum ersten Batch um 70 % reduziert, im dritten Batch im Vergleich zum ersten Batch um 77 % und im vierten Batch im Ver- gleich zum ersten Batch um 74 % reduziert. Obwohl nach Herstellerangaben keine Veränderungen der Reagenzien des μMACS TM SuperAmp TM Kits bekannt sind, führte eine Wiederholung der Proben erneut zu einem Chargeneffekt. Es liegt der Schluss nahe, dass unterschiedliche Kit-Chargen und damit Reagenzi- en einen unbekannten Einfluss auf die Ergebnisse der Experimente zeigten.

4.3.1 Bewertung der Bereinigung des Batch Effekts der Daten Die quantile Normalisierung der Daten und Bildung von Rangprodukten ist ein bioinfomatischer Ansatz zur Überwindung von Chargeneffekten. Das MAQC-II Projekt hat gezeigt, dass ein Großteil der Chargeneffekte dennoch durch die Strategie der Datennormalisierung alleine nicht ausgeglichen werden kann (141). 4 Diskussion 93

Daher wurde mit Hilfe eines eigens zur Überwindung des Chargeneffekts kreier- ten Algorithmus der Programmiersprache „R“ diesem Problem begegnet, vgl. Anhang 7.5 . Da gezeigt werden konnte, dass nach Anwendung des Batch Ef- fekt Removals (ber) anhand von Principle Component Analysen der Chargenef- fekt der Datenmatrix nicht mehr visuell sichtbar ist, kann man vermuten, dass die Daten verschiedener Chargen nach Anwendung dieses Mittels bei darauf folgenden Analysen vergleichbar sind. Diese Gruppierungen basieren demzufolge auf der tatsächlichen und normalisierten Genexpression der untersuchten Proben und sind nicht mehr Ausdruck der unterschiedlichen Untersuchungs- zeitpunkte oder Amplifikationskits.

Die Untersuchung der Daten mittels Cluster Analysen zuerst ohne und nachfol- gend nach einer Auswahl differenziell exprimierter Gene zeigt die Effizienz des Batch Effekt Removals. Ein starker Einflussfaktor auf das Genexpressionsprofil, die MYCN Amplifizierung (171) wird nach Anwendung der quantilen Normalisie- rung, des Batch Effekt Removals und der Auswahl differentiell exprimierter Ge- ne sichtbar. Die Zuordnung der Neuroblasten zu einzelnen Tumorstadien ist nicht möglich, da sowohl Stadium 1, 4 als auch 4S Tumoren bei dieser Analyse trotz der Auswahl differentiell exprimierter Gene keine eindeutige Zuordnung in Subgruppen aufweisen.

4.4 Beschreibung und Bewertung neuer Kandidatengene des Neuroblastoms Differentiell exprimierte Gene zwischen Neuroblasten und den einzelnen Tu- morsubgruppen Stadium 1, 4, 4S und MYCN amplifizierten Tumoren sollen Aufschluss über mögliche neue Kandidatengene geben. Eine Sichtung der Genlisten ergab eine Anzahl möglicherweise in Prozesse der Pathogenese des Neuroblastoms involvierter Kandidatengene, welchen in Zukunft mehr Augen- merk geschenkt werden könnte. Im Anhang sind diese differentiell exprimierten Gene zwischen den einzelnen Subgruppen und damit möglicherweise vielver- sprechende Kandidatengene aufgelistet, vgl. Anhang 7.4 .

Zusammenfassend ermöglicht diese Übersicht die Schlussfolgerung, dass in den einzelnen Subgruppen verschiedene Mechanismen bei der Transformation von Neuroblasten in maligne Tumorzellen eine Rolle spielen. Die Gene Ontolo- gy Analysen der Listen differentiell exprimierter Gene geben möglicherweise 94 4 Diskussion

Aufschluss über neue Signalwege und Pathomechanismen, die bei der Entwick- lung von Neuroblastomen eine Rolle spielen.

Wann Veränderungen genau einsetzen, ob Prozesse der fetalen Entwicklung und Differenzierung eine Rolle spielen und welche Mechanismen ursächlich an Prozessen der malignen Transformation beteiligt sind, ist noch unklar. Die progrediente Entwicklung von Neuroblastomen des Stadium 1 zu Stadium 4 Tumo- ren wäre damit nicht erklärt. Vielmehr geht diese Theorie davon aus, dass bereits früh in der Entwicklung genetische Abberationen, Veränderungen und Stö- rungen in molekularbiologischen Signalwegen festlegen, welches Tumorsta- dium, bzw. welches Risikoprofil das spezifische Neuroblastom des Patienten entwickelt.

Das Vorhandensein eines entscheidenden Gens des Neuroblastoms, welches spezifisch weitere Downstream Gene verändert ist theoretisch möglich, es wurde jedoch noch kein Kandidatengen gefunden, das entsprechende Eigenschaf- ten erfüllen könnte. Veränderungen genetischer Loki auf Chromosom 1p, 11q, 14q, und 17q sind von besonderem Interesse bei der Entwicklung des Neuro- blastoms und unterliegen daher intensiver Forschung. Von dieser Annahme ausgehend, stellt sich die Forschungsgemeinschaft aktuell die Frage nach dem entscheidenen Hit, der Hochrisiko- und Niedrigrisiko-Neuroblastome trennt, um Patienten individuell in Risikoklassen einzuteilen und demzufolge Therapie- schemata zu unterziehen.

In Gene Ontology Analysen mit Hilfe von WebGestalt ergaben sich im Vergleich differentiell exprimierter Gene zwischen Neuroblasten und Neuroblastomen Si- gnalwege und pathogenetische Prozesse, die möglicherweise Anhaltspunkt für funktionelle Analysen bieten (vgl. Kapitel 3.6).

In Tumoren des Stadiums 1 zeigten sich beispielsweise Gene vermehrt exprimiert, die bei der Regulation der Apoptose eine Rolle spielen. Ein möglicher Weg um Apoptose in überzähligen Zellen des Nervensystems zu induzieren ist der Entzug von NGF . TRKA dient als Rezeptor für NGF und sich entwickelnde Neuronen differenzieren unter NGF Einfluss aus oder beschreiten einen Apop- toseweg, wird ihnen NGF entzogen (96, 18).

. 4 Diskussion 95

De Preter et al. konnten bei dem Vergleich von Neuroblastomen mit deren Vor- läuferzellen bereits verschieden Gene identifizieren, die möglicherweise eine Rolle in der Pathogenese des Neuroblastoms spielen (48). APOE auf 19q13.31 und INHBA auf 7p14.1, welche in Neuroblastomen höher exprimiert werden sind in Apoptosemechanismen und Prozesse der Neurogenese involviert. Wei- tere Möglichkeiten zur Initiierung des programmierten Zelltodes liegen in der Aktivierung von p75, Retinsäure und CD95/Fas Signalwegen (96, 36, 58).

Sowohl in Tumoren des Stadiums 4S, als auch in Hochrisikotumoren mit MYCN Amplifikation und Tumoren des Stadiums 4 scheinen, den GO Analysen zu Fol- ge, Gene, die in Zellwachstumsprozesse involviert sind, eine entscheidende Rolle zu spielen. Gene zur Regulation der Zelldifferenzierung sind in Folge ein möglicher entscheidender Faktor im Hinblick auf die maligne Entwicklung bzw. Regression der Tumoren im Verlauf der Erkrankung.

In dieser Arbeit wurden einige ausgewählte Gene genauer betrachtet und mit ihren Vorläuferzellen, den Neuroblasten verglichen (vgl. Kapitel 3.7). Die Gene DLK1, TH, MYCN, MYC, PRAME, ALK, REST, HOXC9, TFAP2B, BIRC5 und PHOX2B standen bereits und stehen aktuell auf dem Prüfstand bezüglich ihrer Rolle bei der Entstehung des Neuroblastoms.

Die Untersuchung der Tyrosine Hydroxylase diente der Testung der Datenvali- dität, da dieses Gen in Zellen der sympathoadrenalen Linie exprimiert wird (48, 72).

MYCN zeigt erwartungsgemäß eine sehr starke Expression in einem defini- tionsgemäß als MYCN amplifizierte Tumoren klassifiziertem Kollektiv, was bereits bekannte Studien zu MYCN bestätigt (174). Die niedrige Expression von MYCN in Neuroblasten untermauert seine Rolle als Gen in der Pathogenese des Neuroblastoms. Anhand der schwachen Expression von MYC lassen sich bereits vorliegende Studien zu diesem Gen nur teilweise verifizieren (174, 172).

Die Daten untermauern die Rolle von PRAME, BIRC5 und ALK als potenzielle Kandidatengene im Rahmen der Pathogenese des Neuroblastoms. PRAME und BIRC5 wurden in vorangegangenen Studien mit aggressiven Neuroblas- tom-Subtypen assoziiert (110). (74, 100). BIRC5 wird vermutlich indirekt durch MYCN induziert (11, 51). 96 4 Diskussion

Neuere Forschungsergebnisse diskutieren Gain-of-function Mutationen in der ALK (Anaplastic lymphoma kinase) Gen Domäne als pathogenetisch bedeut- samer Faktor des familiären Neuroblastoms und bewerten ihre Bedeutung in einer Gruppe von sporadisch auftretenden Neuroblastomen. Mutierte ALK Ki- nasen könnten therapeutisch als Ziel von Kinaseinhibitoren einen großen Fort- schritt in der Behandlung des Neuroblastoms bedeuten, noch sind die For- schungsergebnisse jedoch nicht ausreichend, um perspektivisch ALK als Tar- getgen zu benennen (102, 75, 60, 38, 112, 133).

Sowohl Tumoren des Stadiums 4 als auch MYCN amplifizierte Tumoren zeigen eine erhöhte Genexpression von PRAME, BIRC5 und ALK im Vergleich zu derer der Neuroblasten und Tumoren der Stadien 1 und 4S. Weniger eindeutig fallen die Ergebnisse für das Gen REST aus.

Eine scheinbare Korrelation von REST und MYCN im mikrodissezierten Kollek- tiv lässt sich in einem größeren Tumorkollektiv mit 341 Tumoren nicht bestäti- gen. Eine Verbindung von REST und MYCN in Bezug auf pathogenetische Me- chanismen bzw. Signalkaskaden ist damit jedoch nicht generell auszuschlie- ßen. Eine erhöhte REST Expression im Rahmen einer negativen Regulation der Neurogenese lässt sich sowohl bei fetalen Zellen als auch bei undifferenzierten Tumorzellen erklären (5). Eine erhöhte REST Expression in Tumoren des Sta- diums 4S legt nahe, dass REST in Prozesse der Regression involviert ist. Zu der Gensonde A_23_P167081 ist bei fehlender Signifikanz der Ergebnisse keine eindeutige Aussage zur Verteilung und Unterscheidung der Stadien möglich.

Vergleichende Analysen von Neuroblastomen mit Neuroblasten von de Preter et al. ergaben unter anderem DLK1 auf 14q32 als Kandidatengen der Pathoge- nese des Neuroblastoms (47, 48). DLK1 weist in der vorliegenden Arbeit in allen Stadien des Neuroblastoms im Vergleich zu Neuroblasten sehr niedrige Ex- pressionswerte auf, was die Studienergebnisse der Arbeit von de Preter et al. unterstützt.

Die Werte von HOXC9 zeigen ebenfalls seine potenzielle Rolle als Kandidaten- gen der Pathogenese des Neuroblastoms. Sowohl Wachstumsgene als auch Gene der neuronalen Differenzierung spielen in Stadium 1 und 4S Tumoren eine wichtige Rolle. HOXC9 unterdrückt Mao et. al. zu Folge Gene die Wachs- tum bedingen und aktiviert Gene der neuronalen Differenzierung (93). Die Daten dieser Arbeit bestätigen vorhandene Studien und zeigen eine erhöhte 4 Diskussion 97

HOXC9 Genexpression für Tumoren der Stadien 1 und 4S im Vergleich zu Tu- moren des Stadiums 4, MYCN amplifizierten Tumoren und kortikalen Zellen. Die höhere Expression in Neuroblasten läßt sich vermutlich dadurch erklären, dass diese Zellen in ihrem frühen Entwicklungsstadium ebenfalls Prozessen der Differenzierung und des Wachstums unterliegen. Hochrisikoneuroblastome, wie Stadium 4 oder MYCN amplifizierte Tumoren zeigen demgegenüber eine geringere Tendenz zur Ausdifferenzierung. Diese Daten lassen sich auch durch die Betrachtung der Tumorproben mit Stromaanteil bestätigen.

TFAP2B steht als Kandidatengen des Neuroblastoms derzeit auf dem Prüf- stand. De Preter et al. konnten TFAP2B auf 6p12.3 als Gen identifizieren, welches in dieser Studie in Neuroblasten höher exprimiert wird, als in Neuroblas- tomen (47, 48). Subgruppen der Neuroblastome wurden hierbei nicht differenziert. TFAP2B scheint eine entscheidende Rolle bei Mechanismen der Neuro- genese zu spielen. Die vorliegende Arbeit konnte diese Ergebnisse zu TFAP2B nur teilweise reproduzieren. Es konnte in den mikrodissezierten Proben gezeigt werden, dass ungünstige Tumoren, hier vor allem die Subgruppe der MYCN amplifizierten Tumoren eine niedrigere Expression aufweisen als günstige Sta- dien. In den Tumoren mit Stromaanteil wiesen sowohl Tumoren des Stadiums 4, als auch MYCN amplifizierte Tumoren eine im Vergleich zu Tumoren der Stadien 1 und 4S niedrigere Genexpression auf. Die Daten sprechen für eine Assoziation der Expression von MYCN und TFAP2B bzw. dessen Assoziation mit Hochrisikopatienten.

Die erhöhte Expression von PHOX2B in Neuroblasten im Vergleich zu kortikalen Zellen lässt sich anhand seiner Rolle als Transkriptionsfaktor in Zellen des Nervensystems schlüssig ableiten (163, 164). Dieses Ergebnis untermauert die Validität der Daten bezüglich der Abgrenzung der Neuroblasten zu den fetalen kortikalen Zellen. In wieweit PHOX2B bei sporadischen Neuroblastomen eine Rolle spielt, kann nicht abschließend geklärt werden. Die Assoziation zu TrkA und damit eher günstigen Neuroblastomen geht aus den Daten nicht hervor. In dieser Arbeit zeigt sich PHOX2B entgegengesetzt korreliert zu MYCN amplifizierten Neuroblastomen, d.h. MYCN amplifizierte Tumoren weisen eine niedrigere PHOX2B Expression, welche annähernd dem Niveau der fetalen Vorläu- ferzellen entspricht, auf. 98 4 Diskussion

Abschließend lässt sich der Einfluss des Stromas bei der Analyse der Neuro- blastome bewerten. Aktuelle Genexpressionsdatenbanken des Neuroblastoms basieren auf mit Stroma kontaminierten Proben. Dabei werden neben Tumor- zellen unter anderem auch Immunzellen, Fibroblasten und Blutzellbestandteile isoliert und analysiert. Um diesen Einfluss so gering wie möglich zu halten wurden in dieser Arbeit Neuroblastomzellen mikrodisseziert, um sie genetisch mit ihren Vorläuferzellen ohne störende Einflüsse anderer Zellen vergleichen zu können. Starke genetische Einflüsse wie beispielsweise die MYCN Amplifika- tion werden sowohl in den mikrodissezierten Zellen als auch in den Tumorpro- ben mit Stromaanteil sichtbar. Auch HOXC9 bildet in beiden Untersuchungs- gruppen einheitliche Ergebnisse. Eine Inhomogenität der Ergebnisse der mikrodissezierten Proben und der Tumoren mit Stromaanteil wie beispielsweise bei REST ist möglicherweise auf stärkere Einflüsse des Stromas oder die kleine Probenkohorte zurückzuführen und kann nur durch weitere funktionelle Einzel- genanalysen geklärt werden.

An diese weitgehend statistischen Analysen werden sich RT-PCR Analysen möglicherweise bedeutender Kandidatengene zur Validierung der Ergebnisse anschließen müssen.

4.5 Ausblick Einige Fragen bleiben auch nach Abschluss dieser Arbeit unbeantwortet: Kommt es im Anschluss an einen primären genetischen Hit zu weiteren konse- kutiven genetischen Veränderungen, die zu den bekannten verschieden Risiko- typen des Neuroblastoms und damit zu maligner Progression und Regression führen oder ist das komplexe genetische Profil bereits sehr früh in der Entwick- lung des Neuroblastoms vorprogrammiert? Wie ist es möglich, dass Neuroblas- tome, die postnatal früher in Erscheinung treten sich durch eine höhere Le- benserwartung und ein niedrigeres Risikoprofil auszeichnen?

Ein wichtiger Weg, um in der Onkologie effizientere und zielgerichtete Thera- pieschemata zu implementieren besteht in der Erforschung tumorspezifischer, deregulierter Signalwege. Die Analyse von Genexpressionsprofilen diverser Tumorentitäten ist aktuellen Studien zu Folge ein geeignetes Mittel, um An- haltspunkte für die Pathogenese, das klinische Verhalten und mögliche tumor- spezifische Therapieansätze zu erhalten. Der Vergleich maligne entarteter Zel- len mit ihren nicht pathogenen Vorläuferzellen lässt Rückschlüsse auf mögliche 4 Diskussion 99 deregulierte Signalwege und genetische Aberrationen zu und ist ein zentraler Bestandteil der Studien zur Identifikation einzelner, die Pathologie von Tumoren bestimmender, Gene.

Neu entwickelte Gen-Classifier ermöglichen eine Einteilung von Patienten in Subgruppen und deren Risikostratifizierung. Um Prozesse der Regression, Progression und Differenzierung des Neuroblastoms jedoch detailliert zu verstehen, müssen sich funktionelle Analysen der Kandidatengene an bereits be- stehende Studien anschließen. Die diversen molekularen Eigenschaften und Defekte der Neuroblastomzelle lassen auf viele mögliche, zielgerichtet Ansätze der therapeutischen Intervention hoffen. Zielgerichtete Therapie konzentriert sich auf defekte Gene oder Proteine, welche bei der malignen Transformation zur Tumorzelle eine entscheidende Rolle spielen.

Diese Arbeit veröffentlicht eine Auswahl an möglichen Kandidatengenen anhand validierter Daten und bietet somit Ansatzpunkte für weitere funktionelle und target-orientierte Einzelgenanalysen.

100 5 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Den Rahmen dieser Arbeit bildete einleitend die Charakterisierung des Neuro- blastoms anhand seiner Ätiologie, seines Krankheitsverlaufs und seiner Pro- gnosemarker. Des Weiteren wurden Theorien der Entstehung des Neuroblas- toms diskutiert. Eine kurze Übersicht zu den methodischen Grundlagen der Ex- perimente und zur Statistik bildete das theoretische Fundament für den experimentellen und analytischen Teil der Arbeit.

Das Ziel dieser Arbeit war es in einem ersten Schritt eine experimentelle Me- thodik zur Mikrodissektion und Herstellung von Genexpressionsprofilen kleiner Zellmengen (ca. 5000 Zellen) für das Neuroblastom zu etablieren. Die Kontrolle der Ergebnisse erfolgte bereits während der experimentellen Phase sowohl quantitativ als auch qualitativ. Die Validierung der Daten durch den Vergleich verschiedener Zelltypen aus fetalen Nebennieren schloss sich an die experimentelle Phase an. Dabei wurden Genexpressionsprofile kortikaler Zellen den Profilen fetaler Neuroblasten gegenübergestellt. Das Auftreten eines Chargen- einflusses in den Daten wurde diskutiert und dem Problem bioinformatisch begegnet.

Anschließend wurde in einem zweiten Schritt das Transkriptom von mikrodissezierten Neuroblastomproben von 22 Patienten der Stadien 1, 4, 4S und von MYCN amplifizierten Tumoren mit dem Transkriptom von 3 Proben von Neuro- blastomvorläuferzellen, d.h. Neuroblasten gesunder Feten verglichen. Die The- se Neuroblastome des Stadiums 1 ähnelten Neuroblasten mehr, als Tumoren der Stadien 4, 4S und MYCN amplifizierten Neuroblastomen konnte anhand der Daten untermauert werden. Aus den Genexpressionsdaten resultierende vergleichende Einzelgenanalysen aktuell beforschter Kandidatengene von Neuro- blastomen mit günstiger bzw. ungünstiger Prognose untermauern ihre Rolle als möglicherweise wichtige Gene der Pathogenese des Neuroblastoms anhand des Vergleichs mit den nichtentarteten Vorläuferzellen. Listen differentiell exprimierter Gene zwischen den Subgruppen dienten im weiteren Verlauf als Grundlage für Analysen mit Hilfe der Gene Ontology Datenbank und der Ermitt- lung neuer Kandidatengene, die möglicherweise bei der Entstehung des Neuroblastoms eine Rolle spielen könnten.

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114 7 Anhang

7 Anhang

7.1 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Prävalenz der Tumoren im Kindesalter (1999-2008)...... 1 Abbildung 1.2: Stadienverteilung des Neuroblastoms nach der Studie NB 97 ...... 4 Abbildung 1.3: Hypothetisches Modell der Neuroblastomentstehung nach Maris und Matthay - überarbeitet ...... 11 Abbildung 2.1: Systematik der angewandten Methoden ...... 18 Abbildung 2.2: Dako REAL TM Detektionssystem ...... 21 Abbildung 2.3: Laser Mikrodissektion und Pressure Catapulting in Frankfurt am Main ...... 25 Abbildung 2.4: Prinzip der µMACS TM SuperAmp TM Kit Technologie von Miltenyi ...... 27 Abbildung 3.1: Immunhistochemische Nachweisfärbung der Neuroblasten mit BCL-2 ...... 41 Abbildung 3.2: Immunhistochemische Nachweisfärbung der Neuroblasten mit NCAM ...... 42 Abbildung 3.3: Pico Chip Analyse mikrodissezierter, fetaler Neuroblasten. 43 Abbildung 3.4: cDNA-Reinheits- und Konzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop ®- Spektrophotometer an zwei cDNA Proben von Neuroblasten ...... 46 Abbildung 3.5: Clusterausschnitt Neuroblasten vs. kortikale Zellen nach Resolver Analyse ...... 49 Abbildung 3.6: Cluster Dendrogramm Neuroblasten vs. kortikale Zellen mit „R“ Analyse ...... 50 Abbildung 3.7: Hauptkomponentenanalyse von Neuroblasten vs. kortikale Zellen in Frontal- und Schrägansicht ...... 50 Abbildung 3.8: Varianzanalyse von Neuroblasten vs. kortikale Zellen ...... 51 Abbildung 3.9: Cluster differentiell exprimierter Gene zwischen Neuroblasten und kortikalen Zellen ...... 52 Abbildung 3.10: Hauptkomponentenanalyse aller Proben ...... 61 Abbildung 3.11: Cluster aller Proben mit Batch Effekt ...... 62 Abbildung 3.12: Cluster der ersten Charge mit 16 Proben ...... 64 Abbildung 3.13: Hauptkomponentenanalyse der ersten Charge mit 16 Proben in Frontal- und Schrägansicht ...... 65 Abbildung 3.14: Hauptkomponentenanalyse aller Proben nach quantiler Normalisierung und Batch Effekt Removal mit „R“ ...... 66 Abbildung 3.15: Cluster aller Proben nach quantiler Normalisierung mit „R“ 67 Abbildung 3.16: Cluster aller Proben nach quantiler Normalisierung und Batch Effekt Removal mit „R“ ...... 68 7 Anhang 115

Abbildung 3.17: Vergleich der Intensitäten von DLK1 aller Proben ...... 72 Abbildung 3.18: Vergleich der Intensitäten von TH aller Proben ...... 74 Abbildung 3.19: Vergleich der Intensitäten von MYCN aller Proben ...... 75 Abbildung 3.20: Vergleich der Intensitäten von MYC aller Proben ...... 76 Abbildung 3.21: Vergleich der Intensitäten von PRAME aller Proben ...... 77 Abbildung 3.22: Vergleich der Intensitäten von ALK aller Proben ...... 78 Abbildung 3.23: Vergleich der Intensitäten von REST aller Proben ...... 80 Abbildung 3.24: Boxplots zu REST des Kollektivs mit 341 Patientenproben 81 Abbildung 3.25: Vergleich der Intensitäten von HOXC9 aller Proben ...... 83 Abbildung 3.26: Vergleich der Intensitäten von TFAP2B aller Proben ...... 85 Abbildung 3.27: Vergleich der Intensitäten von BIRC5 aller Proben ...... 86 Abbildung 3.28: Vergleich der Intensitäten von PHOX2B aller Proben ...... 87

116 7 Anhang

7.2 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.1: Inzidenz und Überlebenswahrscheinlichkeit der 5 häufigsten onkologischen Diagnosen im Kindesalter (1999-2008)...... 2 Tabelle 1.2: International Neuroblastoma Staging System ...... 3 Tabelle 1.3: Typen des Neuroblastoms nach Brodeur 1994 ...... 10 Tabelle 3.1: Übersicht der Proben und Probendaten...... 19 Tabelle 3.2: Übersicht der Thermocycler Schritte bei der Amplifikation .. 30 Tabelle 3.3: Erster Hybridisierungsschritt ...... 35 Tabelle 3.4: Zweiter Hybridisierungsschritt ...... 35 Tabelle 3.5: Waschprozedur nach der Hybridisierung ...... 37 Tabelle 4.1: Pico Chip Daten der Proben ...... 44 Tabelle 4.2: Nano Drop ® Daten der Proben ...... 47 Tabelle 4.3: Analyseparameter der univariaten Varianzanalyse kortikaler Zellen und Neuroblasten mit Resolver Biosoftware ...... 51 Tabelle 4.4: Analyseparameter der Clusteranalyse kortikaler Zellen und Neuroblasten mit Resolver Biosoftware ...... 52 Tabelle 4.5: DAVID GO Analyse der Neuroblasten ...... 54 Tabelle 4.6: DAVID GO Analyse kortikaler Zellen ...... 57 Tabelle 4.7: Analyseparameter der Hauptkomponentenanalyse von Neuroblasten, kortikalen Zellen und Neuroblastomen ...... 60 Tabelle 4.8: Analyseparameter der Clusteranalyse aller Proben ...... 62 Tabelle 4.9: Analyseparameter der Clusteranalyse der ersten Charge .. 64 Tabelle 4.10: Analyseparameter der Hauptkomponentenanalyse der ersten Charge ...... 64 Tabelle 4.11: Tests auf Unterschiede zwischen zwei und mehr Gruppen für REST ...... 81

7 Anhang 117

7.3 Liste charakteristischer Gene

Stadium Genname Agilent Sequence Code 1 Keine charakteristischen Gene gefunden 4 NA Hs271565.1 MAGEA9 A_32_P29965 4S Keine charakteristischen Gene gefunden MYC SLC30A3 A_23_P302568 NA A_23_P67952 NN Keine charakteristischen Gene gefunden KOR CNKSR2 A_32_P764790 DCX A_23_P500328 INA A_23_P35444 CTNNA2 A_23_P84736 SLC7A14 A_32_P88259 SLC10A4 A_23_P314811 PCDHA11 A_24_P360206 LOC157627 A_32_P81674 SYT4 A_23_P208030 RNF182 A_32_P231097 Symbol Unknown A_32_P3545 EYA1 A_23_P502363 PTCHD1 A_23_P303251 STMN2 A_23_P146274 PHOX2B A_23_P213228 TFAP2B A_24_P20954 SCN9A A_23_P112726 NPY A_23_P256470 SCN3A A_24_P85888 ATCAY A_23_P101671 GPR22 A_23_P20172 GAP43 A_23_P253446 Symbol Unknown A_32_P74964 NBLA00301 Hs177532.2 NA A_32_P212483 MARCH4 A_23_P333228 PRSS2 A_32_P94444 RNF182 A_23_P399255 TUBB2B A_24_P314477 Symbol Unknown A_24_P132703 LHFPL4 A_32_P94 INSM2 A_23_P48530 SLC38A1 A_24_P261734 NMNAT2 A_23_P354908 LOC283454 A_32_P170454 ISL1 A_23_P81529 NBLA00301 A_23_P133000 ECE2 A_23_P377299 SCG3 A_23_P54267 HAND2 A_23_P373521 CTNND2 A_24_P380196 C1orf133 A_32_P207169 RIMBP2 A_24_P162226 CD24 A_32_P231250 NA A_24_P119665 GNAO1 A_32_P235145 118 7 Anhang

SVOP A_23_P112982 HMP19 A_23_P319005 SEZ6L A_32_P124819 NA A_32_P154361 CD24 A_23_P85250 PRPH A_23_P13713 Symbol Unknown A_32_P167761 GRIK3 A_24_P870799 ELAVL4 A_24_P944336 FSTL5 A_24_P251734 SPOCK1 A_24_P354689 DPYSL5 A_23_P210224 STMN2 A_23_P399265

Legende: MYC , MYCN amplifizierte Tumoren; NN , fetale Neuroblasten; KOR , fetale kortikale Zellen NA : Gene name is „not available“, Genname ist nicht verfügbar Symbol Unknown: Gensymbol ist nicht bekannt Agilent Sequence Code: Bezeichnung der Gensonde der Firma Agilent

7 Anhang 119

7.4 Listen differentiell exprimierter Gene zwischen Neuroblas- ten und Stadium 1, 4, 4S und MYCN amplifizierten Neuro- blastomen Genexpression in Neuroblasten > Genexpression in Stadium 1 Neuroblastomen

Agilent Sequence RP/Rsu FC: Genname Code m (class1/class2) pfp P-value CYP17A1 A_24_P52597 16424 5,4962 6e-04 0 SULT2A1 A_23_P67381 16153 8,2051 3e-04 0 STAR A_23_P8981 27388 10,0211 5e-04 0 GSTA1 A_23_P135417 19994 18,5 6e-04 0 STAR Hs3132,2 34227 21,5194 8e-04 0 LOC285986 A_32_P130999 36945 30,911 0,0015 0 C6orf176 A_32_P8546 39385 37,5492 0,0027 0 GSTA2 A_24_P300394 1075 43,4812 0,0027 0 C6orf176 A_24_P636301 16053 45,9228 0,003 0 CYP11A1 A_23_P129169 37193 46,7922 0,0019 0 MT3 A_23_P129629 28398 47,7064 0,0035 0 CYP21A2 A_23_P257478 16773 51,0768 0,0065 8e-04 GSTA5 A_23_P93141 43239 52,7837 0,002 8e-04 HBG1 A_23_P53137 34665 59,6408 0,013 7e-04 MRAP A_24_P126210 35008 61,8321 0,0034 7e-04 SPINK5L3 A_23_P58706 35221 77,712 0,004 6e-04 C5orf23 A_23_P58676 42822 77,8415 0,0054 6e-04 CLRN1 A_23_P364567 14665 87,3297 0,0026 6e-04 LOC389023 A_32_P86578 28859 96,1388 0,0027 5e-04 INHA A_23_P51039 21054 96,5489 0,004 5e-04 LOC728175 A_32_P19519 23886 99,9793 0,0126 5e-04 HBG1 A_23_P64539 43508 100,1582 0,0214 5e-04 HBG2 A_32_P142635 14043 102,7192 0,0126 4e-04 NPTX1 A_23_P124905 6661 102,8908 0,0071 4e-04 PAQR9 A_32_P196193 25863 103,4965 0,0034 4e-04 MT3 A_23_P315273 20820 106,8159 0,0102 4e-04 DLK1 A_24_P236251 36497 118,5001 0,0218 4e-04 FGG A_23_P148088 34766 124,269 0,0076 4e-04 DLK1 A_32_P196837 513 127,1652 0,0264 3e-04 RNF128 A_23_P148345 11630 128,354 0,0226 3e-04 CYP11B2 A_23_P215997 18745 129,9557 0,014 3e-04 ALAS2 A_32_P22654 24498 139,0087 0,0086 3e-04 H19 A_24_P52697 22161 139,9743 0,0304 3e-04 FDX1 A_23_P357780 11882 146,2242 0,0202 3e-04 Un- known_symbol A_23_P20578 29876 146,8404 0,0078 3e-04 Un- known_symbol A_32_P47121 4892 147,5254 0,0074 3e-04 CXorf57 A_23_P96369 36783 150,2021 0,0071 3e-04 GSTA3 A_23_P253495 8648 155,2786 0,0085 3e-04 ALAS2 A_32_P385587 17873 161,2787 0,0094 3e-04 C4B A_23_P42282 36409 165,2757 0,0251 2e-04 MRAP A_23_P381172 6919 165,4795 0,0057 2e-04 SCARB1 A_23_P203900 43713 169,6897 0,0069 2e-04 HPGD A_24_P71904 20954 170,7561 0,0094 2e-04 HIF3A A_23_P142187 26944 175,087 0,0179 2e-04 RPSA A_32_P156237 6507 180,8967 0,0207 2e-04 PLEK2 A_23_P151506 20821 186,9719 0,0086 4e-04 120 7 Anhang

HBA2 A_23_P26457 32917 187,4223 0,0477 4e-04 TDGF1 A_23_P366376 1616 189,717 0,0116 6e-04 PRR15 A_32_P154911 35189 190,7369 0,0156 6e-04 AOX1 A_23_P154037 31936 194,3909 0,0098 6e-04 MGST1 A_23_P36658 13286 197,3092 0,0121 6e-04 NR0B1 A_23_P73632 6632 200,0215 0,0118 6e-04 HPGD A_23_P213050 24648 205,301 0,0117 6e-04 C20orf58 A_23_P17316 40928 207,3648 0,0319 6e-04 SULT2A1 A_24_P224684 8892 208,8487 0,0109 5e-04 AMDHD1 A_32_P122226 43071 217,9313 0,0257 7e-04 GRB14 A_23_P154526 6191 228,729 0,0154 9e-04 Un- known_symbol A_23_P50517 5341 237,3123 0,0204 9e-04 Un- known_symbol A_24_P659202 6409 238,0237 0,0346 8e-04 MGC24125 A_23_P379111 32825 238,6378 0,0127 8e-04 XLKD1 A_23_P150457 38640 241,6773 0,0114 0,001 OSAP A_23_P255331 1786 254,6304 0,0128 0,001

Genexpression in Neuroblasten < Genexpression in Stadium 1 Neuroblastomen

Agilent Sequen- FC: Genname ce Code RP/Rsum (class1/class2) pfp P-value CCL18 A_23_P55270 7932 25,1984 455,7477 0 IGKC Hs406565.493 12510 70,2665 1845,7701 0 TP53TG3 A_23_P49391 44419 85,103 109,4854 0 IGH@ A_32_P200144 7981 89,0125 2081,7835 0 HLA-DQA1 A_24_P196827 12413 92,3348 118,8674 0 PRAME A_23_P166360 30124 95,9499 84,8001 0 Unknown_symbol A_24_P653054 43323 101,1075 120,2517 0 HOXC10 A_23_P36546 20851 127,1146 123,7931 0 IGH@ A_23_P158817 28728 178,3767 700,1423 0 Unknown_symbol A_23_P43979 42793 209,9114 438,9807 0 Unknown_symbol A_24_P104980 13205 226,0652 403,6124 0 Unknown_symbol A_24_P605563 6554 238,9886 262,9881 0 NA A_23_P30900 1000 273,0224 50,9494 0 Unknown_symbol A_23_P72330 21665 304,3122 552,2402 0 Unknown_symbol A_32_P129406 30139 325,5078 72,2712 0 ACTN2 A_23_P115021 38153 327,9346 44,3451 0 ITK A_23_P354146 28928 347,0119 59,6871 0 ADAMDEC1 A_23_P256425 25358 350,4245 65,023 0 Unknown_symbol A_24_P357847 3567 351,5571 811,4291 0 SLAMF7 A_24_P353638 1625 369,6465 59,5523 0 Unknown_symbol A_32_P222460 33701 391,3599 70,1529 0 CCR7 A_23_P343398 26279 391,8772 150,6246 0 HLA-DQA2 A_24_P852756 5568 402,0939 97,1524 0 NA Hs355711.1 41373 408,6447 47,2959 0 LOC731682 A_24_P326084 40119 417,3531 436,231 0 Unknown_symbol A_24_P494425 15614 423,1813 260,4789 0 TRAC A_23_P258504 13582 428,3199 146,1636 0 Unknown_symbol A_32_P39440 346 476,4816 465,1856 0 CD3D A_23_P138985 37201 483,8683 43,7539 0 Unknown_symbol A_32_P156006 17294 513,7429 35,5358 0 CD2 A_23_P161076 37516 522,9269 49,2858 0 NA A_24_P810476 37381 527,3828 32,3663 0 IL24 A_23_P51951 7667 528,7653 121,9215 0 KLRB1 A_23_P99275 38380 532,3888 36,2064 0 7 Anhang 121

OCLN A_23_P92672 6512 539,493 49,4172 0 CD8B A_23_P159335 10243 540,0449 36,7182 0 LGALS2 A_23_P120902 11160 556,9449 98,0287 3e-04 PAGE2B A_32_P109683 16966 561,407 135,364 3e-04 UBD A_23_P81898 16886 571,9923 40,5989 3e-04 Unknown_symbol A_24_P510357 2855 584,2462 123,0164 2e-04 NA A_32_P502165 20212 588,4327 48,3805 2e-04 IGKC A_24_P272146 34526 593,8075 355,3908 2e-04 PAGE2 A_32_P70927 30393 615,8298 170,7301 2e-04 NA A_23_P352861 42886 616,2703 89,1265 2e-04 Unknown_symbol A_32_P113462 790 629,0531 34,6128 2e-04 Unknown_symbol A_32_P159192 39768 646,6998 343,0505 2e-04 PAGE5 A_23_P22744 32225 652,4483 165,4857 4e-04 RBM5 A_24_P919510 7280 654,6139 29,7381 4e-04 PRND A_32_P68103 32551 655,5618 24,1521 4e-04 C3 A_32_P123701 8048 662,804 155,8971 4e-04 KCTD1 A_23_P130343 15283 664,0316 45,5848 4e-04 SIRPG A_23_P28857 35106 669,0316 61,9248 4e-04 Unknown_symbol A_32_P148118 9941 672,4207 275,9818 4e-04 IL2RB A_24_P203000 7876 706,9733 55,7011 4e-04 CD96 A_23_P44155 9562 713,5922 20,9152 4e-04 Unknown_symbol A_23_P84791 21855 725,9286 317,4082 4e-04 KCNC2 A_24_P347319 29613 731,3858 37,2942 5e-04 ITGAD A_23_P129665 36941 766,3463 33,1379 5e-04 CD52 A_23_P85800 24482 767,5645 65,0884 5e-04 MMP9 A_23_P40174 22073 775,2673 29,4199 7e-04 Unknown_symbol A_32_P157927 38628 776,0843 310,9152 7e-04 Unknown_symbol A_24_P490109 24189 786,5385 149,125 8e-04 Unknown_symbol A_23_P435390 22817 839,9555 123,2562 0,001 IGKC A_32_P148122 19144 861,9213 217,3474 9e-04 Unknown_symbol A_24_P626951 6476 868,6613 99,0144 9e-04

Genexpression in Neuroblasten > Genexpression in Stadium 4 Neuroblastomen

Agilent Sequence FC: Genname Code RP/Rsum (class1/class2) pfp P-value CYP17A1 A_24_P52597 16424 5,5421 11157,7829 0 HBG1 A_23_P53137 34665 8,3985 9447,5856 0 HBG1 A_23_P64539 43508 12,4957 4834,7385 0 HBG2 A_32_P142635 14043 12,5912 5160,4942 0 HBA1 A_23_P37856 30091 13,8234 665,1776 0 HBA2 A_23_P26457 32917 19,2642 476,1771 0 CYP21A2 A_23_P257478 16773 21,5082 1261,0704 0 DLK1 A_24_P236251 36497 28,0119 1368,771 0 HBG1 A_24_P289709 38058 41,9129 1852,0294 0 DLK1 A_32_P196837 513 49,9161 1151,7334 0 STAR A_23_P8981 27388 58,8514 1045,212 0 SULT2A1 A_23_P67381 16153 67,6358 411,1537 0 C4B A_23_P42282 36409 78,9684 285,6868 0 MT1H A_23_P163782 11454 79,367 55,988 0 MT3 A_23_P129629 28398 88,7789 770,5941 0 MRAP A_24_P126210 35008 106,2294 869,807 0 STAR Hs3132.2 34227 115,7395 663,2145 0 H19 A_24_P52697 22161 120,3397 137,2431 0 HBA2 A_24_P142305 11951 122,5961 656,1812 0 Unknown_symbol A_32_P42989 3119 126,3374 409,6224 0 122 7 Anhang

INHA A_23_P51039 21054 127,7784 410,6345 0 RPSA A_32_P156237 6507 133,0365 356,6992 0 RPS28 A_32_P150950 39006 141,8545 4,4995 0 Unknown_symbol A_24_P659202 6409 142,8655 391,5786 0 GSTA1 A_23_P135417 19994 146,2768 323,3232 0 CYP11A1 A_23_P129169 37193 150,9736 626,4072 0 Unknown_symbol A_32_P161836 8277 169,0598 468,5177 0 RPL35 A_23_P112429 39236 169,965 4,0496 0 RPL35 A_24_P403403 11247 174,784 2,1849 0 Unknown_symbol A_32_P83795 7353 182,9539 3,6053 0 LOC285986 A_32_P130999 36945 193,9254 356,002 0 C6orf176 A_32_P8546 39385 194,0074 314,0309 0 C5orf23 A_23_P58676 42822 196,1476 89,2993 0 MT1H A_23_P414343 19520 196,5026 58,8186 0 GSTA2 A_24_P300394 1075 208,5701 292,6956 3,00E-04 RPL35 A_32_P25371 8009 221,8021 2,4785 6,00E-04 Unknown_symbol A_24_P15502 42856 222,8098 56,8859 5,00E-04 Unknown_symbol A_24_P936758 13164 229,4002 244,6404 5,00E-04 GSTA5 A_23_P93141 43239 236,7582 343,9057 8,00E-04 Unknown_symbol A_32_P127036 26736 236,8574 3,5633 8,00E-04 RPLP2 Hs302588.1 25106 236,9502 1,8863 7,00E-04 RPL13A A_24_P272061 27352 237,8709 2,7584 7,00E-04 RPS15 A_24_P225010 13729 242,0368 4,0501 7,00E-04 LOC728175 A_32_P19519 23886 242,9244 164,058 7,00E-04 NA A_24_P731549 28104 244,4502 225,8545 7,00E-04 PLEK2 A_23_P151506 20821 246,8152 68,0434 7,00E-04

Genexpression in Neuroblasten < Genexpression in Stadium 4 Neuroblastomen

Agilent Sequence FC: P- Genname Code RP/Rsum (class1/class2) pfp value Unknown_symbol A_32_P129406 30139 16,6635 0,0013 0 Unknown_symbol A_24_P653054 43323 17,8017 0,002 0 PRAME A_23_P166360 30124 23,9773 0,0051 0 Unknown_symbol A_32_P222460 33701 37,8529 0,0028 0 TP53TG3 A_23_P49391 44419 40,2457 0,0056 0 MAGEA1 A_23_P96291 24712 85,3315 0,0028 0 MAGEA9 A_32_P29965 38370 89,6453 0,0028 0 NA Hs355711.1 41373 101,1032 0,0085 0 Unknown_symbol A_32_P108938 39183 111,9238 0,0049 0 Unknown_symbol A_24_P827096 26870 120,0286 0,0069 0 CCL18 A_23_P55270 7932 146,2606 0,0128 0 GNGT1 A_23_P123096 33620 174,1501 0,0083 0 LOC375010 A_23_P317359 35730 178,7444 0,0096 0 GNGT1 A_24_P196665 33157 180,8235 0,0092 0 PAGE2 A_32_P70927 30393 205,1896 0,0031 0 NA A_32_P502165 20212 206,7216 0,0125 0 KCNC2 A_24_P347319 29613 216,706 0,0124 0 Unknown_symbol A_32_P69956 9384 224,1699 0,1332 0 DUXAP10 A_24_P788227 23942 231,2539 0,0085 0 FAM112B A_23_P47950 28471 240,1363 0,0024 0 7 Anhang 123

NA A_32_P69793 37715 240,5825 0,0143 0 Unknown_symbol A_24_P760368 28489 245,822 0,0126 0 TEX14 A_23_P54996 17839 248,1479 0,019 0 FLJ39632 A_24_P497235 9370 254,1828 0,0138 0 NA Hs378940.1 23502 255,2589 0,0117 0 PAGE5 A_23_P22744 32225 258,1202 0,0036 0 NA A_32_P202798 1251 277,9529 0,0138 0 LOC728783 A_24_P778906 39682 290,7444 0,018 0 TMEM161B A_23_P156355 14500 295,5012 0,0065 0 Unknown_symbol A_32_P64286 7804 299,4075 0,0118 0 NA A_32_P29429 14048 306,0582 0,0215 0 Unknown_symbol A_32_P156006 17294 331,8713 0,0147 0 ACTN2 A_23_P115021 38153 334,1647 0,024 0 NA Hs271565.1 36478 336,7138 0,0045 0 KCTD1 A_23_P130343 15283 348,9912 0,0185 0 Unknown_symbol A_32_P162192 15610 356,2538 0,0215 0 IGH@ A_32_P200144 7981 399,3692 9e-04 0 Unknown_symbol A_32_P116957 33379 399,9851 0,0224 0 LPPR4 A_32_P148538 23844 404,1076 0,0148 0 TMEM108 A_23_P254688 20390 439,3143 0,0196 0 Unknown_symbol A_24_P139761 39578 446,0632 0,0595 0 TMEM108 A_24_P71781 16007 448,0078 0,0145 0 Unknown_symbol A_32_P30339 10993 462,2653 0,0143 2,0E-04 BTBD1 A_23_P205830 37503 482,4916 0,0104 2,0E-04 MUC15 A_23_P24332 42805 514,0127 0,0117 2,0E-04 Unknown_symbol A_24_P683829 7418 518,676 0,0304 2,0E-04 Unknown_symbol A_32_P168701 35576 577,2298 0,0533 2,0E-04 GTPBP2 A_23_P379026 19738 579,5203 0,0159 2,0E-04 ENPP2 A_23_P94338 13523 580,9526 0,0292 2,0E-04 Unknown_symbol A_24_P105648 10506 590,6971 0,0246 2,0E-04 SMN2 A_23_P58466 41140 597,1622 0,0268 2,0E-04 Unknown_symbol A_32_P13151 12410 610,1877 0,0298 4,0E-04 PAGE2B A_32_P109683 16966 619,6766 0,0101 4,0E-04 NA A_24_P810476 37381 626,4991 0,011 4,0E-04 RFPL2 A_23_P254434 41818 645,008 0,0518 4,0E-04 Unknown_symbol A_24_P773539 4495 653,994 0,0273 4,0E-04 NA Hs21658.1 37446 679,1722 0,0238 5,0E-04 GRM8 A_32_P8221 42595 694,7634 0,0158 7,0E-04 Unknown_symbol A_32_P233784 16241 701,4518 0,0566 7,0E-04 NA A_32_P744196 13414 711,9985 0,0165 8,0E-04 CD2 A_23_P161076 37516 713,8183 0,0283 8,0E-04 Unknown_symbol A_24_P803621 13149 734,6047 0,0229 8,0E-04

Genexpression in Neuroblasten > Genexpression in Stadium 4S Neuroblasto- men

Agilent Sequence FC: P- Genname Code RP/Rsum (class1/class2) pfp value CYP17A1 A_24_P52597 16424 11,9126 2e-04 0 HBA1 A_23_P37856 30091 15,1266 0,0086 0 CYP21A2 A_23_P257478 16773 21,3302 4e-04 0 HBA2 A_23_P26457 32917 39,1208 0,0124 0 C4B A_23_P42282 36409 41,9408 7e-04 0 MT1H A_23_P163782 11454 43,3493 0,0025 0 Unknown_symbol A_32_P83795 7353 48,7364 0,2705 0 Unknown_symbol A_32_P127036 26736 58,6033 0,2551 0 124 7 Anhang

STAR A_23_P8981 27388 66,6079 6e-04 0 SULT2A1 A_23_P67381 16153 67,5726 8e-04 0 MT3 A_23_P129629 28398 69,1521 7e-04 0 RPS11 A_23_P101532 27101 75,744 0,2017 0 Unknown_symbol A_32_P42104 29186 75,8923 0,1603 0 H19 A_24_P52697 22161 81,8457 0,0026 0 RPS28 A_32_P150950 39006 81,9354 0,2386 0 INHA A_23_P51039 21054 87,465 0,002 0 RPLP1 A_32_P105200 36586 94,9742 0,2879 0 Unknown_symbol A_24_P659202 6409 104,7897 0,001 0 RPL13A A_24_P272061 27352 109,877 0,3061 0 RPL28 A_23_P208358 29833 112,9981 0,1953 0 GSTA1 A_23_P135417 19994 115,4087 8e-04 0 Unknown_symbol A_24_P109973 35820 115,9205 0,1836 0 STAR Hs3132.2 34227 119,4007 0,001 0 MT1X A_24_P125096 15574 123,1815 0,0042 0 RPL35 A_32_P25371 8009 124,6747 0,3412 0 ATP5G2 A_23_P87616 26077 144,3187 0,1805 0 CYP11A1 A_23_P129169 37193 147,4905 0,0012 0 MRAP A_24_P126210 35008 147,7139 0,0018 0 RPSA A_32_P156237 6507 158,4809 0,0087 3e-04 IFITM3 A_23_P87545 17975 159,5696 0,023 3e-04 RPS15 A_24_P225010 13729 167,449 0,2017 3e-04 LOC285986 A_32_P130999 36945 169,7399 0,0034 3e-04 HBA2 A_24_P142305 11951 174,6147 0,0078 6e-04 DLK1 A_24_P236251 36497 183,7702 0,0702 6e-04 RPLP2 Hs302588.1 25106 187,039 0,2872 6e-04 RPS26 A_24_P289404 27900 191,5307 0,1528 6e-04 HBG1 A_23_P53137 34665 193,7152 0,0081 5e-04 Unknown_symbol A_32_P193079 9765 198,584 0,2455 5e-04 RPS5 Hs356019.10 11806 200,0401 0,4648 5e-04 RPL10 Hs458148.20 16881 200,4461 0,3726 8e-04 Unknown_symbol A_24_P246692 30382 200,8072 0,155 7e-04 Unknown_symbol A_24_P375435 36648 205,6295 0,2982 7e-04 Unknown_symbol A_32_P167592 25853 211,7541 0,0178 7e-04 Unknown_symbol A_32_P194962 35685 215,5621 0,2955 7e-04 APOC1 A_24_P109214 29671 216,608 0,022 7e-04 RPL10 A_23_P217666 8963 217,4484 0,3087 7e-04 Unknown_symbol A_32_P119204 41399 217,5486 0,3266 6e-04 PRDX5 A_23_P12989 17624 217,8559 0,1167 6e-04 RPL35 A_24_P403403 11247 218,1183 0,4268 6e-04 Unknown_symbol A_24_P41250 25946 224,258 0,3078 6e-04 MT1G A_23_P60933 22403 229,8853 0,0041 6e-04 SNRPD2 A_32_P40611 33322 234,2485 0,1679 0,001 GSTA2 A_24_P300394 1075 235,5504 0,0034 9e-04 Unknown_symbol A_24_P161494 37328 245,0132 0,168 9e-04

Genexpression in Neuroblasten < Genexpression in Stadium 4S Neuroblasto- men

Agilent Sequence FC: P- Genname Code RP/Rsum (class1/class2) pfp value Unknown_symbol A_32_P129406 30139 60,5511 322,0416 0 NA A_32_P44831 27826 83,1202 153,511 0 MMP12 A_23_P340698 5652 98,4633 1633,3738 0 CADM1 A_24_P227230 27252 125,5759 127,5271 0 7 Anhang 125

TMEM161B A_23_P156355 14500 146,2412 142,1274 0 POU4F2 A_23_P302038 14919 149,7335 152,0047 0 MMP12 A_23_P150316 7513 159,7733 1704,7463 0 RPS4Y2 A_23_P324384 39371 163,4788 1,9229 0 TMEM108 A_24_P71781 16007 165,7277 103,6706 0 KCTD1 A_23_P130343 15283 169,0164 74,9641 0 PCDH7 A_24_P914638 16152 171,6994 78,3171 0 TSPAN2 A_24_P62659 5589 195,3617 131,6753 0 Unknown_symbol A_32_P156006 17294 195,7146 83,9643 0 DDX3Y A_23_P217797 27925 201,7391 3,8153 0 BTBD1 A_23_P205830 37503 214,6347 134,8917 0 Unknown_symbol A_24_P686247 41295 216,0793 56,4373 0 LPPR4 A_32_P148538 23844 226,4076 118,9244 0 CCL18 A_23_P55270 7932 235,1649 82,9224 0 OCLN A_23_P92672 6512 237,6236 83,2615 0 Unknown_symbol A_24_P686243 19700 251,7036 56,4243 0 UTY A_23_P329835 7850 257,6476 19,1476 0 GRM8 A_32_P8221 42595 272,9947 72,0509 0 PCDH7 A_32_P442998 35588 276,0103 53,6429 0 BAT2D1 A_23_P412409 34347 276,5149 55,8367 0 Unknown_symbol A_32_P113462 790 279,5732 30,5343 0 PDE11A A_32_P116857 25243 280,7921 163,3297 0 TMEFF1 A_24_P274987 6755 286,2239 18,3343 0 TMEFF1 A_23_P135194 16362 289,5069 30,721 0 Unknown_symbol A_24_P8333 17280 293,1771 87,437 0 LOC728176 A_32_P49764 6868 305,0219 67,2787 0 GTPBP2 A_23_P379026 19738 312,5216 82,6788 0 MAP2 A_23_P153917 1282 314,1052 45,4822 0 Unknown_symbol A_32_P181826 30533 316,3808 65,3512 0 Unknown_symbol A_32_P141969 11540 327,1106 96,1375 0 NA A_24_P810476 37381 327,7471 86,6315 0 ATP8B2 A_32_P185229 10642 329,1757 72,9756 0 TTTY15 A_24_P348861 44583 335,9517 3,923 0 NA Hs445581.1 14348 337,8762 39,6841 0 Unknown_symbol A_32_P96752 19954 342,1103 31,0208 0 ADAMDEC1 A_23_P256425 25358 356,613 90,689 0 Unknown_symbol A_32_P85753 21916 357,1948 81,6254 0 NA Hs434972.1 35533 366,5812 79,3193 0 Unknown_symbol A_32_P149254 30113 377,9896 32,9222 0 TMEM108 A_23_P254688 20390 393,2746 70,6717 0 Unknown_symbol A_32_P69956 9384 410,6181 4,2663 2e-04 RPS4Y1 A_23_P259314 27071 415,5205 1,6662 2e-04 Unknown_symbol A_32_P155512 11552 426,5529 78,3922 2e-04 FMN1 A_32_P180825 42233 429,6221 35,5905 2e-04 SERTAD4 A_23_P318904 42281 481,038 24,4496 2e-04 Unknown_symbol A_32_P64286 7804 482,8552 41,8034 2e-04 GRIA2 A_23_P340617 36479 491,768 61,8402 2e-04 ODF2L A_23_P328298 6025 492,9503 46,7751 2e-04 Unknown_symbol A_32_P26461 21022 493,7184 38,5709 2e-04 OCLN A_24_P102053 24269 497,1435 40,7394 2e-04 BCL11A A_23_P218584 26229 511,1104 70,8398 2e-04 PRND A_32_P68103 32551 516,0105 81,3143 2e-04 NA A_32_P826845 10829 517,8521 33,5129 2e-04 KIAA1468 A_23_P356125 3992 522,4342 37,9909 2e-04 TP53TG3 A_23_P49391 44419 525,6945 99,0359 2e-04 EPHA5 A_32_P149640 20282 550,61 76,5115 2e-04 NEK1 A_24_P914599 26050 552,9438 19,8894 2e-04 126 7 Anhang

NA Hs117269.1 24111 561,5641 17,6219 2e-04 TMTC2 A_23_P382705 29051 567,2703 31,9398 2e-04 NA A_32_P86533 23736 574,5935 36,5748 2e-04 SMN2 A_23_P58466 41140 579,997 32,5033 2e-04 Unknown_symbol A_32_P134427 1547 581,6951 16,9734 2e-04 ZNF566 A_23_P306956 25459 587,3709 74,5992 1e-04 DACT2 A_24_P289260 8035 596,4646 40,1966 1e-04 ARPP-21 A_23_P315602 6822 599,8175 46,0871 1e-04 C1orf96 Hs4983.1 16276 621,2974 38,7867 1e-04 OSBPL3 A_24_P377499 14157 623,3653 28,1352 1e-04 C8orf79 A_32_P159234 29490 624,6911 25,5696 1e-04 NA A_32_P884425 19900 627,1554 29,9642 1e-04 IL7 A_23_P8961 3557 647,4868 35,9805 1e-04 Unknown_symbol A_32_P171427 30689 654,1379 41,8112 1e-04 RFPL2 A_23_P254434 41818 654,5328 6,8076 1e-04 Unknown_symbol A_24_P849245 18757 656,1079 57,6665 1e-04 KLB A_23_P350617 18469 663,4461 35,2893 1e-04 SLC6A15 A_24_P307653 15017 664,1076 39,6558 1e-04 DKFZp667E0512 A_24_P282377 21951 670,8769 24,8444 1e-04 Unknown_symbol A_24_P572974 18728 673,8354 26,8436 1e-04 Unknown_symbol A_24_P922953 40450 684,7377 31,468 1e-04 NA R93820_1 8817 685,0586 30,3473 1e-04 CYorf14 A_23_P73848 30976 701,9877 7,3467 1e-04 TAF2 A_23_P43248 8851 714,6012 34,2869 1e-04 Unknown_symbol A_32_P174258 42113 716,8363 34,5457 1e-04 USP6NL A_24_P398130 22772 720,3817 31,338 1e-04 Unknown_symbol A_32_P200934 5252 736,2092 8,7973 2e-04 NA A_32_P501031 14073 746,0063 14,7415 2e-04 LOC375010 A_23_P317359 35730 754,1972 40,521 2e-04 ATP8A1 Hs144931.1 15939 760,8407 21,8122 2e-04 Unknown_symbol A_32_P47474 25941 761,7169 37,9233 2e-04 NA A_32_P941450 1720 765,6486 19,3183 2e-04 KLHL29 A_23_P209360 21262 766,7296 25,7969 2e-04 Unknown_symbol A_32_P56961 19987 782,7533 10,507 3e-04 ADAM22 A_24_P243741 14401 786,929 26,6118 3e-04 LRRTM4 A_24_P174294 3879 787,3122 26,2375 4e-04 NA Hs4267.1 15033 791,7275 49,6299 4e-04 ARHGAP21 A_23_P115608 40784 802,4954 42,817 4e-04 Unknown_symbol A_32_P231463 21698 809,7981 31,8209 4e-04 SYNJ1 A_23_P324718 36502 814,7129 22,5689 4e-04 DQX1 A_23_P56659 7811 823,051 17,7613 4e-04 RAPGEF6 A_23_P144999 35851 832,8622 15,2764 4e-04 GABRG2 A_32_P25514 9312 843,2185 60,1239 4e-04 Unknown_symbol A_32_P50943 32192 850,6085 27,8334 4e-04 C6orf159 A_32_P216566 30175 853,0761 30,5713 4e-04 LOC731748 A_32_P925529 24137 862,2021 53,2572 4e-04 SLC1A1 A_23_P216468 18195 864,2486 24,6775 4e-04 NA H38658_1 25576 873,0165 52,4669 4e-04 SGIP1 A_23_P62881 29925 876,4013 18,9813 4e-04 CXADR A_23_P57268 22813 883,3246 31,5873 5e-04 TOP2A A_23_P118834 29863 888,3151 31,3625 4e-04 DCT A_24_P390150 24064 892,9456 50,8435 4e-04 ZYG11B A_24_P49533 12539 893,7034 23,477 4e-04 CREG2 A_23_P394986 10890 895,0777 26,5561 4e-04 DENR A_23_P162256 4440 901,0487 35,014 5e-04 TRIM2 A_23_P213141 14974 902,3712 19,3618 5e-04 PGAP1 A_23_P79247 12971 902,6866 33,9378 5e-04 7 Anhang 127

CDKN2B A_24_P360674 19463 911,1823 34,0148 5e-04 YIPF4 A_23_P424080 2280 916,3492 37,5096 5e-04 RKHD3 A_24_P65060 23143 916,967 21,6434 5e-04 RNF17 A_23_P99373 14635 921,22 15,6319 5e-04 CD200 A_23_P121480 20353 923,9742 22,5281 5e-04 Unknown_symbol A_32_P223370 2025 929,3122 29,9347 5e-04 CCDC82 A_24_P372580 41612 942,3603 21,4745 5e-04 CACNB2 A_23_P326852 18247 944,1728 23,6465 5e-04 THOC1 A_23_P78372 8227 944,4382 15,8421 5e-04 KIAA0828 A_24_P72518 23378 944,9162 50,007 5e-04 NA A_32_P154361 36538 947,1072 32,1308 5e-04 RBM5 A_24_P919510 7280 948,3593 24,4944 5e-04 CNR1 A_23_P214208 14644 948,8423 27,5571 5e-04 MCM3APAS A_23_P391238 23838 950,4005 25,9285 5e-04 Unknown_symbol A_24_P726399 33202 953,45 24,5762 5e-04 HISPPD2A A_23_P205818 40616 956,556 41,1125 4e-04 Unknown_symbol A_32_P94976 6787 959,2517 64,575 4e-04 Unknown_symbol A_32_P225021 42713 959,4177 25,2928 4e-04 ATXN1 Hs371342.4 35140 977,8629 14,8825 7e-04 NDST3 A_23_P73170 38708 980,8979 15,4503 7e-04 Unknown_symbol A_24_P803621 13149 986,8419 54,0885 6e-04 WBSCR19 A_32_P180435 13502 987,2449 47,5014 6e-04 GABRG1 A_32_P89899 12952 990,0406 46,5585 6e-04 KLF5 A_23_P53891 15764 992,8273 27,5731 6e-04 LOC653071 A_32_P94199 16251 1002,1954 22,3052 6e-04 CASC5 A_24_P940678 1207 1004,3835 16,7114 6e-04 Unknown_symbol A_24_P233406 40513 1005,2318 51,2091 6e-04 Unknown_symbol A_32_P195346 15534 1008,7075 55,7186 7e-04 Unknown_symbol A_32_P226157 14277 1011,6094 47,5628 7e-04 Unknown_symbol A_32_P234378 3438 1020,8133 39,4294 7e-04 EBF1 A_32_P197561 15643 1026,7202 22,154 8e-04 DKFZP586B0319 A_24_P128255 19507 1039,7264 9,4331 9e-04 CYorf15B A_24_P307993 21806 1043,4186 19,8445 9e-04 PPAT A_23_P80940 12341 1045,5584 7,3012 9e-04 MIB1 A_24_P943156 22016 1052,2129 18,9609 0,001 CHL1 A_23_P212241 7919 1054,2687 28,0486 0,001

Genexpression in Neuroblasten > Genexpression in MYCN amplifizierten Neuroblastomen

Agilent Sequence FC: Genname Code RP/Rsum (class1/class2) pfp P-value CYP17A1 A_24_P52597 16424 4,9487 9643,4138 0 HBG1 A_23_P53137 34665 6,4528 4760,7829 0 HBG2 A_32_P142635 14043 10,7345 3474,4182 0 CYP21A2 A_23_P257478 16773 10,8128 2197,491 0 SULT2A1 A_23_P67381 16153 24,5327 2328,0813 0 HBG1 A_23_P64539 43508 24,9818 2320,7648 0 STAR A_23_P8981 27388 37,9551 1643,5729 0 GSTA1 A_23_P135417 19994 42,7901 1680,4229 0 C4B A_23_P42282 36409 43,2571 586,7757 0 MT1H A_23_P163782 11454 51,315 266,4881 0 STAR Hs3132.2 34227 57,1801 396,0165 0 IGF2 A_23_P150609 28453 57,2256 530,5926 0 DLK1 A_24_P236251 36497 59,5829 17,9543 0 HBA1 A_23_P37856 30091 61,5678 48,8086 0 128 7 Anhang

LOC285986 A_32_P130999 36945 64,9354 765,7362 0 INHA A_23_P51039 21054 65,9901 567,4026 0 C6orf176 A_32_P8546 39385 69,5268 993,9314 0 GSTA2 A_24_P300394 1075 75,8352 766,1716 0 HBA2 A_23_P26457 32917 80,911 35,3524 0 C5orf23 A_23_P58676 42822 84,9973 214,44 0 MRAP A_24_P126210 35008 86,5125 732,6063 0 HBG1 A_24_P289709 38058 88,5954 284,3539 0 MT3 A_23_P129629 28398 90,4796 450,3327 0 MT1X A_24_P125096 15574 94,5175 195,8139 0 CYP11A1 A_23_P129169 37193 95,8789 573,7576 0 Unknown_symbol A_24_P659202 6409 100,2577 386,9269 0 CARTPT A_23_P167493 16789 108,5581 936,9841 0 LOC728175 A_32_P19519 23886 110,8056 658,4615 0 H19 A_24_P52697 22161 113,9419 49,2223 0 NPTX1 A_23_P124905 6661 121,5951 466,2343 0 Unknown_symbol A_24_P936758 13164 125,7508 365,1822 0 PLEK2 A_23_P151506 20821 126,5774 459,3694 0 GSTA5 A_23_P93141 43239 128,7295 326,2943 0 Unknown_symbol A_32_P42989 3119 133,1591 303,7833 0 SPINK5L3 A_23_P58706 35221 135,8156 338,0562 0 C6orf176 A_24_P636301 16053 136,1923 280,171 0 ERAF A_23_P135486 10114 140,0732 491,9411 0 GATA6 A_23_P304450 13822 140,5258 287,1516 0 MT1F Hs381097.4 20549 153,1661 221,6188 0 CLRN1 A_23_P364567 14665 158,274 474,5579 0 RNF128 A_23_P148345 11630 171,5981 266,4734 0 HPGD A_24_P71904 20954 172,5585 220,6076 0 RPSA A_32_P156237 6507 178,3508 69,1956 2,00E-04 AQP2 A_23_P204721 24464 194,2476 311,7691 2,00E-04 MT1H A_23_P414343 19520 198,0359 199,557 2,00E-04 PAPSS2 A_24_P940166 23795 199,5158 222,8914 4,00E-04 MT1B A_23_P37983 38296 200,1409 105,1885 4,00E-04 MT3 A_23_P315273 20820 200,2071 258,7981 4,00E-04 C20orf58 A_23_P17316 40928 201,5481 255,8231 4,00E-04 MT1F A_23_P15174 31142 204,8767 165,6175 4,00E-04 MT1X A_23_P303242 2533 204,9437 200,7301 4,00E-04 MT1G A_23_P206707 34552 205,9906 155,2973 6,00E-04 Unknown_symbol A_32_P167592 25853 206,2209 20,8483 6,00E-04

Genexpression in Neuroblasten < Genexpression in MYCN amplifizierten Neuroblastomen

Agilent Sequence FC: Genname Code RP/Rsum (class1/class2) pfp P-value DUXAP10 A_24_P788227 23942 12,2578 0,0035 0 Unknown_symbol A_24_P827096 26870 13,246 0,002 0 TP53TG3 A_23_P49391 44419 18,9774 0,0058 0 PRAME A_23_P166360 30124 20,7002 0,0044 0 NA Hs355711.1 41373 54,7027 0,0101 0 NA A_32_P19101 34411 61,2793 0,0112 0 CCL18 A_23_P55270 7932 67,2385 0,0082 0 SLC35F2 A_32_P122639 25792 96,2282 0,0132 0 FLJ39632 A_24_P497235 9370 98,21 0,0121 0 Unknown_symbol A_32_P129406 30139 98,5091 0,0137 0 NA A_32_P502165 20212 100,563 0,013 0 7 Anhang 129

NA A_23_P67952 24908 108,5088 0,0127 0 SLC30A3 A_23_P302568 27363 118,2228 0,0101 0 VIP A_23_P19650 25167 123,2831 0,0124 0 POPDC3 A_23_P358597 6121 123,6313 0,0179 0 NFIB A_24_P804992 14765 130,7323 0,0154 0 ADAM22 A_24_P243741 14401 153,4308 0,0149 0 Unknown_symbol A_24_P901856 10398 154,0483 0,0173 0 Unknown_symbol A_32_P85360 14451 156,1977 0,0191 0 MYCN A_24_P94402 6159 168,2985 0,0272 0 Unknown_symbol A_32_P201754 27133 179,4491 0,025 0 Unknown_symbol A_32_P64286 7804 192,5328 0,0091 0 CRYGD A_23_P320705 9049 208,7432 0,0265 0 SLC35F2 A_23_P339098 24980 211,4887 0,0223 0 NA Hs406351.1 14286 214,3451 0,0108 0 FAM112B A_23_P47950 28471 222,3359 0,0194 0 NA Hs59982.1 43429 232,8854 0,0407 0 NA A_32_P202798 1251 239,4975 0,0188 0 NA A_24_P810476 37381 247,6564 0,0194 0 CHODL A_23_P68669 34069 252,9785 0,0204 0 MGC16291 A_23_P63736 5982 261,1796 0,0664 0 Unknown_symbol A_24_P922953 40450 264,9611 0,0194 0 LOC375010 A_23_P317359 35730 266,196 0,0211 0 Unknown_symbol A_32_P113462 790 275,7679 0,0133 0 GRM8 A_32_P8221 42595 278,5815 0,0164 0 UNQ6975 A_24_P929565 18146 294,3602 0,0837 0 ZNF566 A_23_P306956 25459 308,2367 0,0263 0 TMEFF1 A_24_P274987 6755 333,82 0,0695 0 LOC349160 A_32_P506908 6234 340,4651 0,0124 0 Unknown_symbol A_32_P39944 14265 346,7583 0,0279 0 SEMA3A A_24_P192301 18471 368,4223 0,0333 0 Unknown_symbol A_23_P121234 26689 371,1075 0,0222 0 PLD5 A_23_P510 21664 388,9655 0,0354 7,00E-04 DACT2 A_24_P289260 8035 395,1787 0,0301 7,00E-04 TMEM108 A_24_P71781 16007 406,9915 0,0068 7,00E-04 MKI67 A_24_P346855 3335 412,3089 0,036 7,00E-04 Unknown_symbol A_32_P214020 1924 415,6394 0,0023 6,00E-04 NA A_32_P941771 37399 421,804 0,022 6,00E-04 NA A_32_P85366 23445 424,6383 0,0364 6,00E-04 TLL2 A_23_P436158 18154 429,2517 0,042 6,00E-04 CBLN1 A_24_P313431 9132 456,5475 0,0298 0.001 RLN2 A_23_P216455 29380 457,1064 0,0812 0.001 CUX2 A_23_P2543 36204 463,2716 0,0392 9,00E-04

Legende: Agilent Sequence Code: Bezeichnung der Gensonde der Firma Agilent RP/Rsum: rank-product/rank-sum; Rangprodukt/Rangsumme FC(class1/class2): fold change of the average expression levels under two conditions; x-fache Änderung des durchschnittlichen Expressionsniveaus unter 2 Bedingungen. pfp: Percentage of false positive predictions P-value: P-Wert 130 7 Anhang

Unknown_symbol: unbekannter Genname NA: Gene name „not available“, Genname nicht verfügbar

7 Anhang 131

7.5 Batch Effekt Removal „ber“

Typ Package Titel Batch Effect Removal Version 2.0 Datum der Veröffentlichung 01.11.2011 Author Marco Giordan Referenz M. Giordan (Submitted). An efficient two-stage procedure for rem oving batch effects in high dimensional data experiments. Maintainer [email protected] Sugge sts MASS, golubEsets, vsn Lizenz GLP -2 LazyLoad Ja Repository CRAN

Beschreibung: Die Funktion in diesem Software Paket entfernt Batch Effekte von normalisierten Mikroarray Daten. Die Expressionslevel der Gene werden in einer Matrix repräsentiert, in der Zeilen unabhängigen Proben und Spalten Genen (Variablen) entsprechen. Die Batches werden als kategoriale Variablen dargestellt. Falls weitere Kovariablen von Interesse und ver- fügbar sind, können sie dazu verwendet werden effektiv Batch Effekte zu entfernen und die Daten anzupassen.

Usage: ber (Y, b) Arguments: Y A matrix with n rows and g columns, where n is the number of objects and g is the number of variables. In the case of gene expression data, columns correspond to genes and rows to samples. b A vector of class factor with the element in position i (i = 1, . . . , n) representing the batch from which observation i belongs to. Value: A matrix of adjusted data with n rows and g columns.

132 8 Lebenslauf

8 Lebenslauf

Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht.