Docteur De L'universite De La Mediterranee

UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE AIX-MARSEILLE II Faculté des Sciences de Luminy 163, avenue de Luminy 13288 MARSEILLE Cedex 9

N° attribué par la bibliothèque

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE

Discipline : Chimie Organique

Présentée et soutenue publiquement Par

Alain César Biraboneye

Le 02 /02 /2011

INNOVATION MOLECULAIRE A VISEE THERAPEUTIQUE : CONCEPTION, SYNTHESE ET

EVALUATION BIOLOGIQUE DE NOUVEAUX DERIVES CONTRE L’ISCHEMIE CEREBRALE

Directeur de thèse: Professeur Jean-Louis KRAUS

JURY

M. Jean-Yves WINUM Maître de conférences, UMR 5247 CNRS, Montpellier Rapporteur M. Jean DESSOLIN Chargé de recherche, UMR 5248 CNRS, Bordeaux Rapporteur M. Christian ROUSSEL Professeur, UMR 6263 CNRS Marseille Examinateur M. Jean Louis KRAUS Professeur, UMR 6216 CNRS Marseille Directeur de Thèse

Remerciements

Ce travail de recherche a été effectué dans le Laboratoire de Chimie Biomoléculaire, CNRS, IBDML-UMR-6216 situé sur le Campus de Luminy.

Je remercie le Pr. Jean Louis KRAUS pour m’avoir accueilli dans son laboratoire. Ce travail n’aurait pas pu se faire sans son aide précieuse, sa patience, ses compétences en chimie-biologie et son professionnalisme. Ses encouragements, associés aux moyens matériels dont j’ai disposé, m’ont permis de mener à bien la recherche présentée dans ce rapport. Je le remercie également pour m’avoir permis de valoriser ces travaux de thèse par la publication de plusieurs articles scientifiques. C’est pourquoi je lui exprime ma plus grande gratitude.

Je remercie plus particulièrement Dr. Jean-Yves WINUM et Dr. Jean DESSOLIN d’avoir accepté la charge d’être rapporteurs de ce travail.Pr. Christian ROUSSEL me fait l’honneur en acceptant de participer au jury de cette thèse. Je leur exprime ma plus grande gratitude et mon plus profond respect.

J’adresse aussi mes remerciements au Dr. Pamela MAHER et au Dr. Slavica KRANTIC pour avoir réalisé les tests biologiques. Je remercie aussi Dr.Valérie MONNIER pour avoir effectué les spectres de masses.

Je remercie également le Dr. Sébastien Madonna et le Dr. Patrick Secondo dont les précieux conseils et le soutient moral m’ont beaucoup aidé au cours de ma thèse.

Je présente enfin mes amitiés à tous les étudiants qui ont travaillé dans ce laboratoire, durant cette période, et à tous les doctorants ou ex-doctorants de notre laboratoire, que j’ai eu le plaisir de rencontrer, Dr. Laras Younes, Dr. Amandine Rolland, Vincent Moret et Clément Weck. Ils ont fait de cette thèse un travail très intéressant et agréable et m’ont beaucoup apporté sur le plan humain. Enfin, merci à tous ceux qui par un mot ou un geste m’ont rendu un service au cours de ces dernières années.

Je tiens à terminer en remerciant les membres de ma famille et mes amis.

iii

Liste de Figures Figure 1. Mortalité par accident cérébraux vasculaire dans le monde. Figure 2. Représentation schématique du polygone artériel de Willis. Figure 3. Mécanismes de franchissement de la BHE. Figure 4. Différentes causes d’AVC. Figure 5. Les dommages cérébraux qui se produisent pendant l'ischémie cérébrale. Figure 6. Représentation schématique de la pénombre. Figure 7. Cinétique des mécanismes impliqués dans l'ischémie cérébrale. Figure 8. Principaux intervenants dans l’homéostasie neuronale du calcium. Figure 9. Rôle initiateur du calcium sur les principaux mécanismes cellulaires mis en jeu au cours de l’ischémie cérébrale. Figure10. Implication du monoxyde d’azote (NO) dans les mécanismes cellulaires au cours de l’ischémie cérébrale. Figure11. Implication de la mitochondrie dans le développement de l’apoptose au cours de l’ischémie cérébrale. Figure12. Nouvelles entités chimiques acceptées par la FDA (courbe bleue) et investissements en R&D aux Etats-Unis (courbe rouge) entre 1996 et 2003. Figure 13. Quelques isostères monovalents. Figure 14. Exemples des isostères classiques divalents. Figure 15. Analogie structurale du tétrazole avec l’acide carboxylique. Figure 16. AP5 Antagoniste du récepteur NMDA. Figure 17. ATPO comme antagoniste du récepteur AMPA. Figure 18. Structure de 1,2,4 oxadiazolidine-3,5-dione. Figure 19. Quisqualamine (à gauche) et GABA (à droite). Figure 20. Structure de GM1 (monosialotetrahexosylganglioside). Figure 21. Structure d’acide gras. Figure 22. Nomenclature des acides gras. Figure 23. Conformation linéaire d’un acide gras saturé. Figure 24. La structure simplifiée de « GM1-like » analogue. Figure 25. La structure générale des composés cibles. Figure 26. Molécules cibles analogues portant des résidus sérine, cystéine et tyrosine. Figure 27. Quelques structures des agents de couplage. Figure 28. Molécules ciblées : bioisostères phosphoniques. Figure 29. Les molécules ciblées

Figure 30. Molécules ciblées portant le résidu thiazolidine-2,4-dione. Figure 31. Les structures de molécules Ciblées comportant le motif acide ascorbique. Figure 32. Sites d’action des protéines Ser/Thr et Tyr kinases Figure 33. La représentation schématique des cascades ischémiques impliquant les MAPK et leurs rôles dans les mécanismes cellulaires. Figure 34. Schéma réactionnel de modifications chimiques conduisant à l'introduction d'un groupement carboxylique. Figure 35. Cytotoxicité de l’IAA sur les cellules HT22. Figure 36. Structure moléculaire du TTC. Figure 37. Courbe dose-réponse de neuroprotection des cellules HT22 par divers acides gras contre la toxicité de l’IAA. Figure 38. La fisétine (3, 7,3’,4’-tétrahydroxyflavone) le produit de référence.

Figure 39. Représentation comparatif des valeurs EC50. Figure 40. Courbes représentatifs montrant la neuroprotection de quelques composés contre la toxicité de l’IAA sur les cellules HT22. Figure 41. Effet neuroprotecteur des composés 2 et 8 sur les tranches de cerveau lésées par 1 µM le glutamate. Figure 42. Effets de composés sur c-Jun et la phosphorylation MAPAPK2. Figure 43. Effets de composés sur JNK and p38 MAPK phosphorylation. Figure 44. Effets de composés sur la phosphorylation d’ERK.

Liste de tableaux

Tableau 1. Estimation du nombre de cas d’AVC en France. Tableau 2. Quelques composés qui ont échoué au stade d’évaluation clinique de l’ischémie cérébrale. Tableau 3. logP de bioisostères de l’acide carboxylique. Tableau 4. Présentation de quelques structures privilégiées issue de la littérature. Tableau 5. Groupe d’isostère selon « Langmuir ». Tableau 6. Loi de déplacement des protons de Grimm. Tableau 7. Isostères bases sur le nombre d’électrons périphériques. Tableau 8. La famille des bioisostères classiques. Tableau 9. «Les bioisostères non classiques ». Tableau 10. Les bioisostères de la liaison amide.

Tableau 11. Les Bioisostères de l’acide carboxylique sur lesquels on a constitué une chimiothèque. Tableau 12. La similarité entre le tétrazole et l’acide carboxylique.

Tableau 13. Valeurs des Perméations (PD50) des acides carboxyliques saturés et insaturés à travers de membranes de vésicules de dihexadecyl phosphates et Leurs logP. Tableau 14. Résultats des analogues portant des résidus sérine, couplés à des acides gras. Tableau 15. Résultats des analogues portant des résidus tyrosine couplés à des acides gras. Tableau 16. Résultats des analogues portant des résidus cystéine couplés à des acides gras. Tableau 17. Résultats de la saponification (analogues portant le résidu sérine). Tableau 18. Résultats de la saponification (analogues portant le résidu tyrosine). Tableau 19. Résultats de la Saponification (analogues portant le résidu cystéine). Tableau 20. Les résultats obtenus de la molécule 36 et 37. Tableau 21. Les résultats obtenus pour les oximes. Tableau 22. Les résultats obtenus pour les hydroxylamines. Tableau 23. Les résultats obtenus pour les N-hydroxurées. Tableau 24. Les résultats obtenus pour les produits cyclisés. Tableau 25. Les rendements obtenus. Tableau 26. Les rendements obtenus du composé 74 à 83. Tableau 27. Résultats du produit de référence la fisétine. Tableau 28. Résultats des analogues portant de résidu sérine, couplés à des acides gras. Tableau 29. Résultats des analogues portant des résidus tyrosine couplés à des acides gras. Tableau 30. Résultats des analogues portant des résidus cystéine couplés à des acides gras. Tableau 31. Résultats des analogues portant de bioisostères tétrazole 33 et phosphonique 40 et 41 couplés à des acides gras. Tableau 32. Résultats des analogues de N-alkyl oximes. Tableau 33. Résultats des analogues de N-alkyl hydroxylamines. Tableau 34. Résultats des analogues de N-alkyl hydroxylamine éthyle formylcarbamate et N- octadecylhydroxylamine éthyle thioformylcarbamate. Tableau 35. Résultats des analogues de 2-Alkyl-1,2, 4-oxadiazolidine-3,5-dione et 2-alkyl-3-thioxo-1, 2,4-oxadiazolidin-5 none. Tableau 36. Résultats des analogues acides gras couplés à l’acide ascorbique. Tableau 37. Effet de la neuroprotection des composés 60, 55, 46, 56, et 62 sur JNK, p38 MAP kinase et l’activation de l’ERK.

Liste des Abréviations

Partie Chimique Partie Biologique

Å Angström Aβ Peptide β-amyloïde AA Acide Arachidonique ACE Angiotensin Converting Enzyme Ac Acétyle ADMET Absorption, Distribution, Métabolisme, Excrétion et Toxicité AcOEt Acétate d’éthyle ADN Acide désoxyribonucléique AcOH Acide acétique AIF Facteur induisant l‘Apoptose AC2O Anhydride acétique AMPA-R Récepteur α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4- AGPI Acide gras polyinsaturés isoxazole propionate Atm Atmosphère APAF-1 Apoptosis activating factor-1 Bn Benzyl Arg Arginine Boc2O Ditert-butyldicarbonate ARN Acide ribonucléique BOP Hexafluorophosphate de benzotriazol-1- ARNm Acide ribonucléique messager yl-oxy-tri (diméthylamino) phosphonium Bu Butyl Asn Asparagine C Charbon Asp Acide aspartique °C Degré(s) Celsius ATP Adénosine triphosphate CSL Lectine Cérébelleuse Soluble Cat Catalytique Cyt c Cytochrome c [Ca2+]e/i Concentration calcique extra- et D Acide aspartique intracellulaire D-APV D-2-amino-5-phosphonovalerate DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium DSC débit sanguin cérébral CCM : Chromatographie sur couche mince E Acide glutamique δ : Déplacement chimique en RMN Enz Enzyme (exprimé en ppm) Δ Chauffage ERK Extracellular signal-regulated kinases D Doublet FDA Food and Drug Administration FCS Fetal calf serum DCC Dicyclohexylcarbodiimide G Glycine DCM Dichlorométhane GABA l'acide gamma-aminobutyrique DEAD Diéthyl azodicarboxylate GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate DHA Acide Docosohexaénoïque Gln glutamine DiBAl-H Hydrure de diisobutylaluminium Glu Acide glutamique DIC : Diisopropylcarbodiimide GSH Glutathion DIEA Diisopropyléthylamine GSL Glycosphingolipides : DMF : N, N-Diméthylformamide I Isoleucine DMS Diméthylsulfure IAA Acide Iodoacétique : DMSO Diméthylsulfoxide IC50 Concentration requise pour inhiber 50% de la : l'activité enzymatique EDC 1-(3-dimethylaminopropyl)-3- ICAM Intercellular adhesion molecule Ethylcarbodiimide Eq Equivalent IL Interleukine

vii

Et Ethyle Ile Isoleucine IP3R Récepteur de l’inositol triphosphate Fe Fer JNK c-JUN N-terminal kinases H Heure(s) K Lysine hν Lumière KA-R Récepteur kaïnate HBTU Hexafluorophosphate de O-(1H- kDa Kilodalton(s) benzotriazol-1-yl)-N-N-N'-N'-tétraméthyl uronium KO Knock Out HOBt N-Hydroxybenzotriazole L Leucine HMPA Hexaméthylphosphotriamide Lys lysine HPLC Chromatographie Liquide Haute MAPK mitogen-activated protein kinases Performance MP monophosphate Hz Hertz MSK Mitogen- and stress-activated kinase (2,3- NBQX dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl- benzo[f]quinoxaline-2,3-dione Λ Longueur d’onde en U.V. (exprimée en Nd Non déterminé nm) L Litre(s) NMDA-R Récepteur N-méthyl-Daspartate LDA Diisopropylamidure de lithium NOS Monoxyde d’azote synthase µ Micro PAM Pression artérielle moyenne PBS phosphate-buffered saline µg Microgramme(s) PEG Polyéthylène glycol µl Microlitre(s) PLC Phospholipase C µm Micromètre(s) PPC Pression de perfusion cérébrale µM Micromole(s) / litre Pro Proline m Mètre(s) Q Glutamine m Milli R Rectus m Multiplet RE Réticulum endoplasmique M Mole(s) / litre Ser Sérine Mm Millimètre(s) SNC Système nerveux central Mmol Millimole(s) T Thréonine Me Méthyle TTC 2, 3, 5-triphenyltetrazolium Chloride MeCN Acétonitrile Thr Thréonine Met Méthionine TGF Transforming growth factor (le facteur de croissance transformant) Mg Milligramme(s) TNF Tumor Necrosis Factor mHz Mégahertz Tyr Tyrosine Min Minute(s) V Valine Ml Millilitre(s) VCAM Vascular cell adhesion molecule MTT bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)- Val Valine 2,5-diphényltétrazolium ν Fréquence en I.R. (exprimée en cm-1) VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine N Nano

Nbr Nombre NBS N-Bromosuccinimide nd Non déterminé nm Nanomètre(s) nM Nanomole(s) / litre

viii

Pd Palladium Ph Phényle Phe Phénylalanine PhMe Toluène PMSF Phenyl methyl sulfonyl fluoride ppm Parties par million PyBOP Hexafluorophosphate de benzotriazol- 1-yloxy-tripyrrolidinophosphonium R Rectus R&D Recherche et développement rdt rendement Rf Rapport frontal RMN Résonance Magnétique Nucléaire T Triplet tBu tert-Butyle TBAI Iodure de tétrabutylammonium TTC Triphényl-2, 3,5-tétrazolium chlorure TEA Triéthylamine TFA Acide trifluoroacétique THF Tétrahydrofurane TMSI Triméthylesilane de l’iode U.V. Ultraviolet Z Benzyloxycarbonyle Zn Zinc

Sommaire

CHAPITRE I : INTRODUCTION ...... 16 I.1 Prise de conscience...... 17 I.1.1 Epidémiologie...... 17 I.2 Physiologie du système nerveux central...... 19 I.2.1 La circulation cérébrale...... 19 I.2.2 Physiologie de la circulation cérébrale...... 20 I.2.2.1 Vascularisation cérébrale...... 20 I.2.2.2 Barriere hémato-encéphalique (BHE)...... 21 I.2.2.3 Les processus de transport...... 21 I.2.3 Formation du liquide extracellulaire cérébral...... 22 I.2.4 Œdème cérébral...... 23 I.3 Les accidents vasculaires cérébraux...... 23 I.3.1 Accidents ischémiques cérébraux...... 23 I.3.1.1 Définition...... 23 I.3.2 Étiologies et les facteurs de risques...... 24 I.4 Physiopathologie de l’ischémie cérébrale...... 25 I.4.1 Infarctus cérébral et pénombre ischémique...... 25 I.5 Principaux mécanismes vasculaires à l’origine d’un infarctus cérébral...... 28 I.5.1 Mécanisme embolique...... 28 I.5.2 Mécanisme hémodynamique...... 29 I.5.3 Atteinte des artères perforantes...... 29 I.6 Principaux mécanismes cellulaires mis en jeu au cours de l’ischémie cérébrale...... 30 I.6.1 Homéostasie et toxicité du calcium au sein du tissu neuronal...... 30 I.6.2 Le glutamate...... 32 I.6.2.1 Glutamate et Excitotoxicité : les récepteurs du glutamate au centre des perturbations ischémiques...... 33 I.6.3 Œdème et dépolarisation péri-infarctus...... 34 I.6.4 L’oxyde nitrique (NO) et l’ischémie cérébrale...... 34 I.6.5 Inflammation post-ischémique...... 36 I.6.6 Apoptose et ischémie cérébrale...... 36 I.6.7 Stress oxydant et l’ischémie cérébrale...... 38 I.7 Conséquences de l’ischémie cérébrale humaine...... 39 I.8 Les traitements actuels et les perspectives de traitements de l’ischémie cérébrale...... 40 I.8.1 Traitement préventif...... 41 I.8.1.1 Prévention primaire...... 41 I.8.1.2 Prévention secondaire...... 42

Sommaire

I.8.2 Traitement curatif...... 42 I.8.2.1 La fibrinolyse...... 43 I.8.2.2 Les traitements neuro-cytoprotecteurs...... 43 I.8.3 Echec de la neuroprotection...... 45 I.9 Conclusion...... 47 CHAPITRE II: PRESENTATION DU PROJET ...... 48 II.1 Généralités...... 51 II.2 Etude des relations structure-activité...... 52 II.2.1 Etude QSAR...... 52 II.3 Comparaison des propriétés physico-chimique de fonctions bioisostères de l’acide carboxylique. 53 II.3.1 Le caractère lipophile des composés...... 54 II.4 La structure privilégiée...... 55 II.4.1 Notion des structures privilégiées...... 55 II.4.2 Le devenir normal du médicament dans l'organisme...... 57 II.5 Choix des molécules : La bioisostérie...... 58 II.5.1 Introduction...... 59 II.5.2 La bioisostèrie comme stratégie de modification moléculaire...... 64 II.5.2.1 Les bioisostères de l’acide carboxylique...... 65 II.6 Paramètres chimiques et biologiques qui ont été à la base de la conception des nouveaux modèles de molécules neuroprotectrices...... 70 II.6.1 Les gangliosides...... 70 II.6.2 Les acides gras...... 71 II.6.2.1 Introduction...... 71 II.6.2.2 Structures et nomenclatures des acides gras...... 71 II.6.2.3 Propriétés physico-chimiques des acides gras...... 72 II.7 Le choix de la conception des nouvelles molécules à propriétés neuroprotectrices...... 73 II.8 Evaluations biologiques des composés...... 75 CHAPITRE III: PARTIE CHIMIQUE ...... 77 III.1 Les molécules ciblées...... 78 III.1.1 Analogues portant des résidus sérine, cystéine et tyrosine couplés à des chaînes grasses saturées ou insaturées...... 78 III.1.1.1 Analyse rétrosynthétique...... 79 III.1.1.2 Couplage des acides gras sur la fonction amine des acides amines...... 79 III.1.1.3 Saponification de la fonction ester...... 84 III.1.2 Analogues bioisostères de la fonction carboxylique...... 87 III.1.2.1 La synthèse des bioisostères tétrazoles...... 87 III.1.2.2 Synthèses des composés bioisostères phosphoniques...... 91

Sommaire

III.1.2.3 Synthèses de ((2R, 3R)-3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-2H-pyran-2-yl) stéarate de méthyle...... 96 III.1.2.4 Synthèses de N-Alkyl-1, 2,4-oxadiazolidine-3,5-diones, de N-Alkyl-3-thioxo-1, 2,4- oxadiazolidin-5-one et de N-Alkyl-1, 2,4-oxadiazinane-3,6-dione...... 98 III.1.3 Autres analogues...... 103 III.1.3.1 Synthèse de N-Alkylthiazolidine-2,4-dione...... 103 III.1.3.2 Les synthèses des analogues comportant le motif acide ascorbique...... 104 III.1.4 Conclusion...... 111 CHAPITRE IV: PARTIE BIOLOGIQUE ...... 112 IV 1 Etude préliminaire des mécanismes de la neuroprotection...... 113 IV.1.1 Les Protéines Kinases...... 113 IV.1.2 Les voies d’activation intracellulaire impliquées dans l’ischémie cérébrale...... 114 IV.1.3 Les MAPKs et l’ischémie cérébrale...... 116 IV.1.4 Le concept de la neuroprotection : Cible thérapeutique...... 116 IV.2 Evaluation de l’activité neuroprotectrice des composés...... 117 IV 2.1 Un modèle de culture cellulaire (les cellules HT22)...... 117 IV.2.1.1 Description du test...... 117 IV.2.2 Le modèle tissulaire...... 119 IV.2.2.1 Description du modèle...... 119 IV.3 Résultats des évaluations des activités neuroprotectrices des composés...... 122 IV.3.1 Résultats issus du modèle cellulaire...... 122 IV.3.1.1 Commentaires de résultats issus des tests cellulaires...... 130 IV.3.1.2 Etablissement des courbes doses réponses...... 132 IV.3.2 Résultats issus du modèle tissulaire...... 132 IV.4 Influence de la présence des liaisons insaturées et de la nature des parties lipophiles et hydrophiles...... 133 IV.5 L’activité des composés sur les marqueurs spécifiques des voies de signalisation...... 134 IV.5.1 Sur GSH et l’ATP...... 134 IV.5.2 Sur P38 MAP Kinase et JNK...... 134 IV.5.3 Sur ERK...... 136 LES CONCLUSIONS ET LES PERSPECTIVES ...... 139 PARTIES EXPERIMENTALES CHIMIQUES ...... 143 PARTIES EXPERIMENTALES BIOLOGIQUES...... 188 1 Cell culture...... 189 1.1 Cytotoxicity Assay...... 189 1.2 Total intracellular glutathione (GSH)...... 189 1.3 Intracellular ATP...... 190 1.4 SDS-PAGE and Immunoblotting...... 190

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Sommaire

2 Slice Culture...... 191 2.1 Materials and Methods...... 191 2.1.1 Animal preparation...... 191 2.1.2 Dissection...... 191 2.1.3 Preincubation...... 191 2.1.4 Incubation...... 191 2.1.5 Measure of Optical Density...... 192 Références...... 193 ANNEXES ...... 204

XIII

Sommaire

XIV

Avant propos

AVANT PROPOS

Cette thèse intitulée « Innovation Moléculaire à Visée Thérapeutique. Conception, Synthèse et Evaluation Biologique de nouveaux dérivés contre l’ischémie cérébrale » présente les travaux réalisés depuis trois ans au sein du laboratoire de chimie biomoléculaire du Pr. Jean Louis Kraus (IBDML-6216- CNRS) sur la thématique des pathologies neurodégénératives. Situé à l’interface Chimie–Biologie, notre objectif était de concevoir, de synthétiser et d’évaluer les propriétés biologiques de nouvelles molécules pour la compréhension des mécanismes biologiques de l’ischémie cérébrale et à plus long terme, pour son traitement. L’idée qui a prévalu pour la conception et le développement des différentes séries de composés, a été d’introduire des chaînes grasses saturées ou insaturées sur un motif sérine, tyrosine cystéine ou de remplacer la fonction acide carboxylique par des groupes bioiostères de cette fonction : tétrazolique, phosphonique, N-Alkyl-1, 2,4-oxadiazolidine-3,5-diones,et N-Alkyl-1,2,4-oxadiazinane-3,6-dione, le motif acide ascorbique a été introduit pour faciliter le passage de ce type de composés à travers la barrière hématoencéphalique (BHE). L’acide ascorbique étant reconnu pour faciliter le franchissement de la BHE de composés neuractifs sur lesquels il est couplé, on peut penser que l’élaboration de composés neuroprotecteurs couplés à une entité acide ascorbique pourrait s’avérer d’un grand intérêt thérapeutique pour le traitement de l’ischémie cérébrale. Ce manuscrit est constitué par quatre chapitres, complété par les conclusions, les perspectives, et les parties expérimentales. La première partie regroupe des données bibliographiques concernant l’Ischémie cérébrale, les phénomènes biochimiques impliqués dans cette pathologie ainsi que les thérapies actuelles. La deuxième partie expose les différents objectifs du projet de recherche tant au niveau chimique que biologique. La troisième partie est consacrée aux différentes méthodologies de synthèse chimique et aux schémas rétrosynthétiques. La dernière partie de ce manuscrit est consacrée à l’évaluation des propriétés biologiques des nouvelles molécules.

Les parties expérimentales seront rédigées en anglais dans un styles « publication ». En effet, la synthèse d’un certain nombre de composés a déjà été décrite et publié au cours du travail de thèse et d’autres composés seront susceptibles de l’être dans les jours à venir.

Chapitre I : Introduction

CHAPITRE I : INTRODUCTION

Chapitre I : Introduction

I.1 Prise de conscience.

I.1.1 Epidémiologie.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) parfois appelé « attaque cérébrale » sont des problèmes majeurs qui affectent chaque année un peu plus de 15 millions des personnes dans le monde entier. Ce sont les 3èmes causes principales de mortalité et les causes de handicap dans les pays industrialisés. Ils représentent un problème de santé publique en raison de leurs fréquences, de leurs mortalités et des handicaps physiques et cognitifs qu'ils entraînent. Plus de la moitié des sujets ayant eu un accident vasculaire cérébral gardent un handicap physique ou intellectuel permanent1. Six millions des personnes sont mortes des AVC en 2005 et plus de 90% de ces décès se sont produits dans des pays pauvres. Sans action d'urgence, le taux de la mortalité augmentera de 12% dans les années à venir. Et en 2015 il y aura plus de 50 millions de perte des vies humaines à causer des AVC2. Les AVC comprennent les accidents ischémiques, (qui seront approfondis dans cette mémoire de thèse) de loin les plus fréquents (80%) et les accidents hémorragiques : Les AVC hémorragiques regroupent les hémorragies primitives cérébrales (environ 15% des AVC) et les hémorragies cérébro- méningées (environ 5% des AVC). Les AVC hémorragiques résultent de la rupture d’un vaisseau sanguin éventuellement liée à un anévrisme ou consécutive à des dissections (lésion directe de l’artère carotide ou vertébrale), des malformations artérielles (dysplasies) favorisées par l'hypertension ou par un traitement antithrombotique, ou des anomalies généralement héréditaires (facteurs de coagulation). 150 000 cas des AVC sont enregistrés chaque année en France. 75% des sujets présentant un AVC ont plus de 65 ans, après 50 ans, l’incidence double tous les 10 ans3.

1. Lloyd-Jones, D.; Adams, R. J.; Brown, T. M.; Carnethon, M.; Dai, S.; De Simone, G.; Ferguson, T. B.; Ford, E.; Furie, K.; Gillespie, C.; Go, A.; Greenlund, K.; Haase, N.; Hailpern, S.; Ho, P. M.; Howard, V.; Kissela, B.; Kittner, S.; Lackland, D.; Lisabeth, L.; Marelli, A.; McDermott, M. M.; Meigs, J.; Mozaffarian, D.; Mussolino, M.; Nichol, G.; Roger, V.; Rosamond, W.; Sacco, R.; Sorlie, P.; Stafford, R.; Thom, T.; Wasserthiel-Smoller, S.; Wong, N. D.; Wylie-Rosett, J., Heart Disease and Stroke Statistics 2010 Update. A Report From the American Heart Association. Circulation 2009.

2. Tackling the global burden of stroke. Lancet Neurol 2005, 4 (11), 689.

3. available from Internet on http://www.vulgaris medical.com/encyclopedia/accident-vasculaire-cérébral- 5760.html

Chapitre I : Introduction

Tableau 1. estimation du nombre de cas d’AVC en France. Âge Estimation du nombre d’AVC par an pour 100 000 habitants

15 à 45 ans 10 à 30 55 à 64 ans 170 à 360 65 à 74 ans 490 à 890 À partir de 75 ans 1 350 à 1790

Figure 1. Mortalité par accident cérébraux vasculaire dans le monde (Image de Shanthi Mendis et David Webber. Organisation mondiale de la santé)4.

4. Mendis, S., Cardiovascular risk assessment and management in developing countries. Vasc Health Risk Manag 2005, 1 (1), 15-8.

Chapitre I : Introduction

I.2 Physiologie du système nerveux central.

Même si le cerveau humain ne représente que 2% du poids total du corps humain, environ 20% du sang pompé par le cœur se dirige vers le cerveau lequel est extrêmement sensible à toute interruption d'apport en oxygène5. L’ensemble du corps humain (muscles, organes, peau) ainsi que ses fonctions (régulations hormonales, respiration, battements cardiaques etc.) sont sous la commande du système nerveux central (SNC). La transmission des ordres édités à partir du SNC vers la périphérie se fait par intermédiaire des nerfs. Ainsi le SNC, est un organe majeur dont la moindre lésion peut occasionner une perte de fonction (motrice, sensorielle, cognitive, …) variant selon la zone, et selon la fonction qu’elle définit. Les lésions occasionnées au cerveau aussi bien qu’à la moelle épinière peuvent être d’origines diverses : tumeurs cancéreuses (malignes) ou non (bénignes), traumatisme, infection, inflammation, malformations ; mais parfois c’est un déficit en apport d’oxygène qui engendre une asphyxie totale ou partielle du cerveau. Lors de l’arrivée du sang au niveau du cerveau, les globules rouges vont larguer de l’oxygène indispensable au fonctionnement du plus petit élément de la cellule cérébrale qui est le neurone et récupérer afin de l’évacuer, le gaz carbonique (CO2) qui est un déchet produit par la cellule. Lorsque le sang n’arrive plus à destination, la cellule n’a plus de carburant. Or la cellule continue à fonctionner tant qu’elle est encore vivante. En fonctionnant sans oxygène (situation d’hypoxie) elle utilise un mauvais carburant ; par voie de conséquence elle produit des substances toxiques, et détruit ainsi sa propre machinerie : en terme imagé, elle tombe en panne, ce qui l’empêche d’assurer ses fonctions de commande d’où la paralysie. Cette panne sera plus ou moins réparable, en fonction de la durée de la privation. Le délai entre l’arrêt de l’apport en oxygène et la panne irréparable (c’est à dire la mort cellulaire ou nécrose) est en moyenne de 6 h chez l’être humain. Ainsi si dans six premières heures rien n’est fait pour rétablir la circulation sanguine, il y a alors la destruction définitive de la zone en souffrance et cette zone meurt. C’est l’ischémie ou l’infarctus.

I.2.1 La circulation cérébrale.

Les principaux déterminants de l'homéostasie cérébrale sont la volémie, la pression artérielle moyenne (PAM), la pression de perfusion cérébrale (PPC), l'apport cérébral en oxygène, les pressions osmotiques et oncotiques ainsi que la structure de la barrière hémato-encéphalique (BHE).

5. Doyle, K. P.; Simon, R. P.; Stenzel-Poore, M. P., Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology 2008, 55 (3), 310-318.

Chapitre I : Introduction

I.2.2 Physiologie de la circulation cérébrale.

I.2.2.1 Vascularisation cérébrale.

Deux paires d’artères irriguent le cerveau : les artères vertébrales et les artères carotides internes. Les artères vertébrales convergent à la base du pont, pour former l’artère basilaire. Les artères basales et vertébrales irriguent le tronc cérébral et le cervelet. Au niveau du mésencéphale, l’artère basilaire se sépare en plusieurs branches : les artères cérébelleuses supérieures droite et gauche et les artères cérébrales postérieures. Les artères cérébrales postérieures forment les artères communicantes postérieures qui les connectent aux carotides internes. Celles-ci se divisent pour former les artères cérébrales moyennes et les artères cérébrales antérieures. Les artères cérébrales antérieures de chaque hémisphère sont interconnectées, par l’artère communicante antérieure. Par conséquent, les artères cérébrales postérieures et communicantes, les carotides internes

Figure 2. Vue ventrale du polygone artériel de Willis. (Image Wikipédia du 18/11/2010) available from internet : http://en.wikipedia.org/wiki/Circle_of_Willis.

et les artères cérébrales antérieures et communicantes forment un anneau d’artères interconnectées à la base du cerveau. Ce réseau dense représente le cercle de Willis6, un réseau anastomotique plus ou moins développé selon les individus. Cette organisation en réseaux des artères cérébrales contribue, dans une certaine mesure, à la protection du cerveau au cours des épisodes d’ischémie cérébrale.

6. Mark Bear, F.; Barry Connors, W.; Michael Paradiso, A., à la decouverte du cerveau 3éme Edition Neurosciences : Chapitre 7.

Chapitre I : Introduction

I.2.2.2 Barriere hémato-encéphalique (BHE).

Le cerveau possède plusieurs fonctions vitales et de formidables mécanismes de protection qui l’isolent et le protègent du milieu extérieur. La BHE est l’une de ces systèmes. Cependant ces mêmes mécanismes diminuent le potentiel de chimiothérapie chez le patient atteints de maladies neurodégénératives. Par conséquent, un grand nombre de médicaments sont inefficaces sur des pathologies qui affectent le CNS, seulement environ 2% de médicaments conçu en laboratoire traversent cette BHE parce qu’ils n’arrivent pas à atteindre le cerveau et/ou, parce qu’ils sont éliminés rapidement du cerveau7. En effet, un composé très actif in vitro sur sa cible sera sans effet in vivo s’il ne peut atteindre le système nerveux. - Caractéristiques morphologiques Des jonctions serrées sont présentées entre les cellules endothéliales des capillaires cérébraux, sauf dans l’hypophyse, la région ventrale de l’hypothalamus, l’area postrema du bulbe et la glande pinéale. Leur expression dépend du tissu qui environne les capillaires et non du programme génétique des cellules endothéliales. Elles représentent l’élément principal de la barrière hémato- encéphalique. - Caractéristiques fonctionnelles La perméabilité de la barrière hémato-encéphalique est grande pour les molécules liposolubles

(alcool, anesthésiques, etc.…), pour O2 et CO2 qui traversent par simple diffusion, et plus faible pour le glucose et les acides aminés neutres qui traversent à l’aide de transporteurs présents dans les membranes luminale et basale des cellules endothéliales. Ces substances peuvent donc traverser la barrière hémato-encéphalique dans les deux sens. Sa perméabilité aux ions est faible. Les ions K+ et certains acides aminés qui jouent un rôle de neurotransmetteur sont transportés activement du milieu extracellulaire vers le sang uniquement grâce à un système de transport présent dans la membrane basale des cellules endothéliales.

I.2.2.3 Les processus de transport.

Les processus de transport à travers les membranes sont classés en deux catégories :

Le processus de transport passif

Le processus de transport actif

7. Pardridge, W. M., Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron 2002, 36 (4), 555-558.

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-Transport passif et diffusion : La plus grande partie des échanges transmembranaires se fait par diffusion. Chaque fois qu’une substance présente une plus grande concentration d’un côte de la membrane par rapport à l’autre, elle a tendance à diffuser à travers la membrane selon un gradient de concentration (à condition que la membrane soit perméable à cette substance). Lorsque la diffusion s’effectue librement, sans l’aide d’une protéine de transport, on parle « de la diffusion simple », si la protéine de transport intervient dans la diffusion, on parle de « diffusion facilitée ». -Transport actif : Le transport actif est le transport d’une substance à travers les membranes à l’aide de protéines qui peuvent surmonter la force exercée par le gradient de concentration du soluté. Le transport actif nécessite un apport énergétique, généralement sous forme d’ATP. Un exemple de ce transport est la pompe Na+/K+-ATPase, Mg2+/dépendante, qui utilise l’énergie de l’ATP pour repolariser la cellule en expulsant trois ions Na+ et en facilitant l’entrée des deux ions K+. Cet échange crée une différence de potentiel entre le milieu intracellulaire et le milieu extracellulaire.

Figure 3. Mécanismes de franchissement de la BHE8.

I.2.3 Formation du liquide extracellulaire cérébral.

Il représente 15% du poids du cerveau soit 250 à 300 ml chez l’homme. Sa formation, qui est lente, (0,2 μl /g/min chez le rat) est expliquée par le passage de Na+ (Na+/K+ATPase basolatérale) et Cl- (électrodiffusion) du plasma vers le liquide extracellulaire (ECF). Elle entraîne par convection la formation de liquide céphalorachidien (CSF).Lorsque l’osmolalité plasmatique augmente (hypernatrémie), les cellules cérébrales sont protégées contre une contraction de leur volume (ICF) par la captation de Na+, Cl- et K+ qui viennent du liquide céphalorachidien par inversion de flux (70%) et du plasma (30%). La compensation se fait ensuite par génération d’osmolytes (acides aminés comme la taurine).

8. Available from internet: http://www.vigicell.fr/pdf/VigiCell_BBB.pdf.

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I.2.4 Œdème cérébral.

Il est défini par une augmentation du contenu en eau du cerveau à l’origine d’une expansion de son volume. Celle-ci provoque une augmentation de la pression intracrânienne qui réduit la pression de perfusion et peut entraîner l’engagement du tissu cérébral (par exemple des amygdales cérébelleuses dans le trou occipital). L’œdème peut être intracellulaire (gonflement des cellules nerveuses et gliales lié à l’ischémie) ou interstitiel (par rupture de la barrière hémato-encéphalique). La rupture de la barrière hémato-encéphalique peut être due à des lésions traumatiques, à une augmentation de la pression artérielle qui rompt les jonctions serrées entre cellules endothéliales ou à la perfusion rapide de solutions hypertoniques qui provoque la contraction des cellules endothéliales et donc l’ouverture des jonctions serrées. I.3 Les accidents vasculaires cérébraux.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC), sont des événements délétères qui se produisent sur les artères et les vaisseaux qui nourrissent le cerveau en oxygène et en différentes substances indispensables à sa survie. La privation en oxygène sur une partie du cerveau, occasionnera un dysfonctionnement dont la répercussion sera la perte d’une fonction de commande (motricité) ou de perception (sensibilité). Il existe globalement deux types d’accidents vasculaires cérébraux, il s’agit « Accidents Ischémiques Cérébraux et hémorragies cérébrales ». Dans cette thèse on se focalise sur l’AVC ischémique, qui représente environ 80% de tous les AVC. L’AVC ischémique est causé par l’occlusion localisée d’un vaisseau conduisant à un arrêt de l’apport en oxygène et en glucose au cerveau, entraînant un effondrement des processus métaboliques dans un territoire affecté. I.3.1 Accidents ischémiques cérébraux.

I.3.1.1 Définition.

L’ischémie cérébrale humaine est une pathologie qui affecte le système nerveux central en causant des dommages irréversibles. Elle peut avoir différentes causes :

Des causes endogènes, par exemple des excès de glutamate qui se traduisent par une excitotoxicité, une production de radicaux libres, et des activités inflammatoires9.

9. Nakata, N.; Kato, H.; Liu, Y.; Kogure, K., Effects of pretreatment with sublethal ischemia on the extracellular glutamate concentrations during secondary ischemia in the gerbil hippocampus evaluated with intracerebral microdialysis. Neurosci Lett 1992, 138 (1), 86-8.

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Des causes exogènes qui font suite à des blessures, les traumatismes crâniens, qui causent des perturbations au niveau de l‘apport en oxygène et en glucose des tissus lésés, s’il est trop long, il peut entraîner la mort des cellules cérébrales dans la partie du cerveau touché. Si l'apport de sang et d’oxygène est suspendu trop longtemps, des réactions chimiques en chaîne, déclenchées par la privation d'oxygène, contribuent à la mort du tissu cérébral. Elles entraînent différentes altérations cérébro-vasculaires,provoquant des perturbations physiologiques du fonctionnement cérébral en rapport avec la localisation de la zone du cerveau touchée et la sévérité de l’atteinte. On distingue schématiquement deux types d’AVC ischémiques : Les AIT (Accident Ischémique transitoire) qui correspondent à un dysfonctionnement neurologique en relation avec une ischémie focale cérébrale ou rétinienne, dans ce cas l’épisode neurologique est entièrement résolutif en moins de 24 h. Les AIC (Accidents Ischémiques Constitués) correspondent à la constitution d’un infarctus cérébral.

I.3.2 Étiologies et les facteurs de risques.

L’étiologie des AVC peut être ischémique dans 80% des cas (interruption du flux sanguin dans les artères cérébrales engendrant un ramollissement des tissus). Plusieurs grandes causes dominent l'étiologie des AVC ischémiques10. Parmi elles on peut citer : L'athérosclérose qui est la cause la plus fréquente. Elle est liée à la formation d'une plaque d'athérome au niveau de l'intima du vaisseau. Un petit infarctus de quelques millimètres de diamètre résultant de l'occlusion d'une artériole. Les embolies d'origine cardiaque. Ces embolies proviennent d’un thrombus cardiaque lorsqu’une fibrillation auriculaire, un infarctus du myocarde ou une anomalie valvulaire est développé(e). Certains de ces facteurs de risques sont potentiellement modifiables (le diabète, le cholestérol, le tabac, l’alcool...) alors que de nombreux autres, comme l’âge avancé, les antécédents familiaux d’AVC,…) ne sont bien évidemment accessibles à aucune action thérapeutique, par contre ces facteurs permettent de dépister les personnes à haut risque d’AVC et auprès desquelles la prévention est

10. Alberts, M. J.; Ovbiagele, B., Current strategies for ischemic stroke prevention: role of multimodal combination therapies. J Neurol 2007, 254 (10), 1414-26.

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particulièrement importante. De plus, s’il se présente une accumulation de plusieurs de ces facteurs au cours du temps, le risque de survenue d’un AVC augmente considérablement. Ainsi, les AVC sont fréquents chez les sujets âgés, mais on constate de plus en plus de cas chez des patients jeunes (30– 35 ans) dont les causes sont encore mal connues.

Figure 4. Différentes causes d’AVC (image organisation mondiale de la santé11).

I.4 Physiopathologie de l’ischémie cérébrale.

I.4.1 Infarctus cérébral et pénombre ischémique.

Le cerveau intact couvre ses besoins en énergie presque exclusivement par l’oxydation du glucose. L’interruption du débit sanguin entraîne une diminution des apports d'O2 et de glucose au niveau du cerveau et donc à une rupture de l'équilibre énergétique. Le débit sanguin cérébral se définit par le rapport entre la pression de perfusion cérébrale (PPC) et la résistance vasculaire cérébrale (RVC). La PPC est la différence entre la pression artérielle à l’entrée et la pression veineuse cérébrale, celle-ci étant négligeable dans les conditions physiologiques, la PPC peut être assimilée à la pression Artérielle12. La RVC résulte, quant à elle, de l’ensemble des forces qui s’opposent au passage du flot sanguin dans les vaisseaux (pression intracrânienne, viscosité du sang, état du lit vasculaire, tonus vasculaire). Dans les conditions physiologiques, la RVC dépend principalement du calibre des artères et artérioles cérébrales13.

11. Mendis, S., Cardiovascular risk assessment and management in developing countries. Vasc Health Risk Manag 2005, 1 (1),15-8. 12. Rosner M.J., Rosner S.D., Johnson A.H., Cerebral perfusion pressure: management protocol and clinical results. J. Neurosurg., 1995, 83, 949-962.

13. Busija, D. W.; Heistad, D. D., Factors involved in the physiological regulation of the cerebral circulation. Rev Physiol Biochem Pharmacol 1984, 101, 161-211.

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Le débit sanguin cérébral est en moyenne de 50ml/mn/100g de tissu cérébral chez l’adulte. En situation physiologique, ce débit varie parallèlement à l’état de dilatation ou de contraction des artères cérébrales. Lorsque le débit sanguin atteint des valeurs de l’ordre de 20 ml/mn/100 g de tissu cérébral, le métabolisme cellulaire est altèré; des symptômes neurologiques peuvent alors apparaitre, et des anomalies des traces électro-encéphalographiques et des potentiels évoqués ainsi que des anomalies en IRM sont constatées. Entre 15 et 20 ml/mn/100g de tissu, la zone d’oligémie maximale tolérée est atteinte. On parle alors de zone de pénombre ischémique14. En revanche, si cet état d’oligémie se prolonge plus de quelques dizaines de minutes, on passe au stade de la nécrose tissulaire. La nécrose survient aussi lorsque le débit sanguin cérébral est maintenu plus de trois minutes à moins de 10 ml/mn/100 g de tissu cérébral. (Figure 5)

Figure 5. Les dommages cérébraux qui se produisent pendant l'ischémie cérébrale. Au niveau du cœur de l’ischémie on y observe la nécrose massive. La région qui est autour du noyau ischémique s'appelle la pénombre ischémique, le débit sanguin est diminué mais n'est pas totalement interrompu. La région de pénombre est entourée par une région de tissu viable. (Image selon Ram Raghubir et al)15.

14. Astrup, J.; Siesjo, B. K.; Symon, L., Thresholds in cerebral ischemia - the ischemic penumbra. Stroke 1981, 12 (6), 723-5.

15. Suresh L. Mehta, Namratta Manhas, Ram Raghubir Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain research reviews 2007 (54) 34–66.

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Figure 6. Représentation schématique de la pénombre (d’après Baron JC)16.

Les dommages cérébraux consécutifs à l’ischémie résultent d'une séquence d’événements physiopathologiques délétères, évolutifs dans le temps et dans leurs localisations (Figure 6). Au niveau du cœur de l’ischémie, l'absence totale d'apport sanguin cause aux cellules des dommages irréversibles, on y observe une zone de nécrose massive. En ce qui concerne la zone de pénombre, le débit sanguin est diminué mais n'est pas totalement interrompu. Il semble trop faible pour qu'une activité électrique soit maintenue mais suffisant pour préserver les gradients ioniques. Même si les neurones sont fonctionnellement inactifs, ils sont structurellement intacts et restent donc viables. L’extension de la zone du cœur ischémique est un phénomène dépendant du temps. Les cellules meurent dans les heures ou jours qui suivent dans une série d'évènements appelée cascade ischémique. Les mécanismes principaux de cette séquence sont l'excitotoxicité, la dépolarisation péri- infarctus qui endommagent de façon irréversible les neurones et les cellules gliales et endothéliales au sein du cœur de l’ischémie17.

16. Baron, J. C., Mapping the ischaemic penumbra with PET: implications for acute stroke treatment. Cerebrovasc Dis 1999, 9 (4), 193-201.

17. Hossmann, K. A., Viability thresholds and the penumbra of focal ischemia. Ann Neurol 1994, 36 (4), 557- 65.

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Au niveau de la zone de pénombre, on remarque d’autres mécanismes comme le stress oxydant puis, plus tardivement l'inflammation et l’apoptose18. Chacun de ces processus physiopathologiques apparaît donc à un moment défini dans le phénomène ischémique, certains arrivant après quelques minutes, d’autres après quelques heures voire jours (Figure 7). Plus longtemps le flux sanguin est interrompu, plus l’extension du cœur de l’ischémie est importante au détriment de la zone de pénombre qui nécessite d’être reperfusée le plus rapidement possible. [Ces faits suggèrent qu’une intervention pharmacologique rapide peut être apportée dans le but d’arrêter la mort neuronale retardée de la zone de pénombre. Malheureusement, peu de moyens d’agir sont à notre disposition, montrant tout l’intérêt de mettre en évidence de nouvelles approches pharmacologiques.]

Figure 7. Cinétique des mécanismes impliqués dans l'ischémie cérébrale19.

I.5 Principaux mécanismes vasculaires à l’origine d’un infarctus cérébral.

La diminution du débit sanguin cérébral à l’origine du développement de lésions ischémiques, voire d’un infarctus cérébral, peut résulter de causes et de mécanismes divers. Trois mécanismes principaux sont à retenir : le mécanisme embolique artérioartériel ou d’origine cardiaque, le mécanisme hémodynamique et l’atteinte des artères perforantes. I.5.1 Mécanisme embolique.

Le mécanisme embolique, surtout évoqué par l’apparition brutale du déficit neurologique, semble être le plus souvent impliqué dans la pathogénie des infarctus cérébraux20.

18. Doyle, K. P.; Simon, R. P.; Stenzel-Poore, M. P., Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology 2008, 55 (3), 310-8.

19 . Dirnagl U, Iadecola C, Moskowitz M.A., Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci 1999; 22:391-7.

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Il peut s’agir d’une embolie fibrinoplaquettaire à partir d’un thrombus blanc résultant de l’adhésion des plaquettes sur la plaque d’athérosclérose, d’une embolie fibrinocruorique provenant de la fragmentation d’un thrombus mural à partir d’une plaque d’athérosclérose ulcérée, d’un thrombus formé dans une cavité cardiaque ou encore, ce qui est plus rare, de la migration à travers un foramen ovale perméable d’un thrombus veineux profond21. Il peut s’agir aussi d’une embolie de cholestérol provenant du contenu athéromateux de la plaque, migrant dans la circulation à l’occasion de la rupture de celle-ci, d’une exceptionnelle embolie calcaire à partir d’un rétrécissement aortique calcifié ou encore de l’embolie de matériel septique dans le cadre d’une endocardite infectieuse.

I.5.2 Mécanisme hémodynamique.

L’accident hémodynamique est lui surtout évoqué lorsque la symptomatologie neurologique déficitaire est fluctuante, en particulier lorsque cette fluctuation clinique est corrélée aux changements de position (lever brusque, passage en station assise) ou si elle est associée à une diminution de la pression artérielle, et ce, quelle qu’en soit la cause. Ce type de mécanisme s’observe parfois en cas de rétrécissement sévère d’une grosse artère à destinée cérébrale, que ce rétrécissement soit d’origine athéromateuse ou non comme c’est le cas lors de certaines dissections artérielles22, 23.

I.5.3 Atteinte des artères perforantes.

L’atteinte des artères perforantes est le plus souvent consécutive à une pathologie de la paroi artérielle sous la forme d’une lipohyalinose dans le contexte d’une hypertension artérielle ou d’un diabète24.

20. Pessin, M. S.; Hinton, R. C.; Davis, K. R.; Duncan, G. W.; Roberson, G. H.; Ackerman, R. H.; Mohr, J. P., Mechanisms of acute carotid stroke. Ann Neurol 1979, 6 (3), 245-52.

21. Bogousslavsky, J.; Garazi, S.; Jeanrenaud, X.; Aebischer, N.; Van Melle, G., Stroke recurrence in patients with patent foramen ovale: the Lausanne Study. Lausanne Stroke with Paradoxal Embolism Study Group. Neurology 1996, 46 (5), 1301-5.

22. Bogousslavsky, J.; Regli, F., Unilateral watershed cerebral infarcts. Neurology 1986, 36 (3), 373-7.

23. Lucas, C.; Moulin, T.; Deplanque, D.; Tatu, L.; Chavot, D., Stroke patterns of internal carotid artery dissection in 40 patients. Stroke 1998, 29 (12), 2646-8.

24. You, R.; McNeil, J. J.; O'Malley, H. M.; Davis, S. M.; Donnan, G. A., Risk factors for lacunar infarction syndromes. Neurology 1995, 45 (8), 1483-7.

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La pathologie de ces petites artères se traduit cliniquement par le développement de lésions ischémiques dites lacunaires (infarctus cérébraux de petite taille) ou par la survenue d’hémorragies profondes. Il semblerait que l’infarctus soit déterminé par l’obturation de l’une des branches perforantes profondes mais le mécanisme précis de la constitution de tels infarctus demeure encore à discuter25.

I.6 Principaux mécanismes cellulaires mis en jeu au cours de l’ischémie cérébrale.

On ne peut actuellement résumer les lésions tissulaires cérébrales induites par l’ischémie aux seuls effets directs de la privation en métabolites énergétiques et en oxygène26. En effet, les lésions du tissu cérébral au cours de l’ischémie sont la résultante de mécanismes complexes et variantes dans l’espace et le temps. Le cœur de l’ischémie est le siège d’une nécrose, souvent rapide et secondaire à des processus de mort cellulaire d’origine cytoplasmique où la libération massive de calcium joue un rôle important. En revanche, la zone de pénombre, celle-là même ou persiste une certaine perfusion, est le siège de l’apoptose, un processus de mort cellulaire programmée au niveau nucléaire. La maturation des lésions ischémiques est par ailleurs la résultante de la mise en œuvre d’une succession de processus délétères débutant immédiatement au décours de l’ischémie, tels que l’excitotoxicité ou le stress oxydant, et se prolongeant parfois plusieurs jours, comme l’inflammation post ischémique25. (Figure 7) I.6.1 Homéostasie et toxicité du calcium au sein du tissu neuronal.

Le calcium constitue l’un des principaux seconds messagers au sein des cellules neuronales. Il est impliqué dans les mécanismes de libération des neurotransmetteurs, dans l’excitabilité membranaire et dans la modulation de nombreux processus métaboliques27. En l’absence de tout processus actif, le calcium aurait spontanément tendance à passer du milieu extracellulaire au milieu intracellulaire en raison d’un important gradient de concentration transmembranaire. En effet, la concentration en calcium du milieu extracellulaire est environ 10 000 fois plus importante que celle du milieu intracellulaire. (Figure 8) Si le calcium peut pénétrer la cellule par l’intermédiaire de

25. Horowitz, D. R.; Tuhrim, S.; Weinberger, J. M.; Rudolph, S. H., Mechanisms in lacunar infarction. Stroke 1992, 23 (3), 325-7.

26. Dirnagl, U.; Iadecola, C.; Moskowitz, M. A., Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci 1999, 22 (9), 391-7.

27. Kristian, T.; Siesjo, B. K., Calcium in ischemic cell death. Stroke 1998, 29 (3), 705-18.

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canaux calciques voltage-dépendants ou via les récepteurs des canaux N-méthyle-D-aspartate (NMDA), le maintien d’une faible concentration intracellulaire en calcium s’effectue, dans les conditions physiologiques, par la mise en jeu de différents systèmes dont le fonctionnement est coûteux en énergie.

D’une part, le calcium intracellulaire peut être stocké au sein des protéines cytoplasmiques, du réticulum endoplasmique ou encore dans les mitochondries où un état d’équilibre parfois précaire est maintenu par les échangeurs Na+/Ca2+ et H+/Ca2+. D’autre part, une partie du calcium peut être extériorisée par la mise en jeu de la Na +/K+ adénosine triphosphatase

Figure 8. Principaux intervenants dans l’homéostasie neuronale du calcium28.

(ATPase), de l’échangeur Na+/Ca2+ et de la Ca2+ ATPase au sein de la membrane plasmique28. Le fonctionnement de ces systèmes requiert une importante consommation d’énergie, la déplétion énergétique induite par l’ischémie va donc brusquement interrompre la régulation des flux calciques, ce qui implique la saturation rapide des différents systèmes de stockage et l’augmentation des concentrations intracellulaires en calcium. Cette élévation du calcium intracellulaire, largement facilitée par ailleurs par la libération du glutamate, va initier une cascade d’événements délétères pour le tissu cérébral parmi lesquels un dysfonctionnement des mitochondries (déficit énergétique et synthèse de radicaux libres toxiques), la mise en jeu de systèmes enzymatiques capables de dégrader différentes structures de la cellule (lipase, endonucléases et protéases) ou encore l’activation de la NO synthase de typeI (production de NO cytotoxique), autant d’éléments à même de contribuer directement ou indirectement à la mort neuronale (Figure 9).

28. Neumar, R. W., Molecular mechanisms of ischemic neuronal injury. Ann Emerg Med 2000, 36 (5), 483- 506.

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Figure 9. Rôle initiateur du calcium sur les principaux mécanismes cellulaires mis en jeu au cours de l’ischémie cérébrale.

I.6.2 Le glutamate.

Le glutamate est un acide aminé, synthétisé par l'organisme et présent en grande quantité dans le système nerveux central (SNC). Historiquement, c’est Hayashi qui en 1954 décrivit l’effet excitateur du glutamate en appliquant l’acide aminé sur la surface du cortex cérébral. Quelques années plus tard, les travaux de Curtis (Curtis and Watkins 1960) ont montré que certains neurones de la moelle épinière sont stimulés par l’application de glutamate ou d'aspartate. Malgré des réticences initiales, ces observations furent confirmées par de nombreuses études ultérieures, conduisant au concept selon lequel le glutamate aurait, en plus de ses multiples rôles dans le métabolisme cellulaire, une fonction de neurotransmetteur. Le glutamate répond effectivement aux critères exigés pour être considéré comme un neurotransmetteur : Il est présent dans les terminaisons des cellules présynaptiques. Il est libéré de manière dépendante du calcium suite à la stimulation des afférences. Il agit sur des récepteurs spécifiques présents à la surface des cellules postsynaptiques. D’autres critères renforcent l’idée que le glutamate est un neurotransmetteur, comme par exemple sa recapture par les neurones et les cellules gliales après sa libération. Aujourd’hui, on sait que le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du SNC chez les vertébrés29.

29. Fonnum, F., Glutamate: a neurotransmitter in mammalian brain. J Neurochem 1984, 42 (1), 1-11.

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Toutefois, il est intéressant de noter que chez la plupart des espèces d’invertébrés, le glutamate est le neurotransmetteur de la jonction neuromusculaire (système nerveux périphérique)30. Dans les conditions normales le glutamate ne passe pas la barrière hémato-encéphalique (BHE). Il est, en fait, synthétisé au niveau des terminaisons présynaptiques des neurones par la glutamate-déshydrogénase, à partir de l'acide α-cétoglutarique. Toutefois, le glutamate peut aussi être produit par transamination à partir de l’acétyl-aspartyl-glutamate, de l'acide aspartique, ainsi que par déamination de la glutamine élaborée par les cellules gliales. L’arrivée d’un potentiel d’action dans les terminaisons synaptiques glutamatergiques induit une entrée de calcium via les canaux calciques sensibles au voltage. L’augmentation brève de calcium intracellulaire qui s’ensuit déclenche à son tour la brusque libération de glutamate dans l’espace synaptique.

I.6.2.1 Glutamate et Excitotoxicité : les récepteurs du glutamate au centre des perturbations ischémiques.

La déplétion énergétique secondaire à l’ischémie favorise la dépolarisation neuronale et gliale. Dans ces conditions, les canaux calciques voltage-dépendants se trouvent activés, facilitant ainsi la libération de glutamate dans l’espace extracellulaire31. L’élévation de la concentration du glutamate est d’autre part consécutive à l’altération de sa recapture présynaptique, elle aussi dépendante de mécanismes consommateurs d’énergie32.Par l’activation de différents récepteurs, le glutamate présent au sein de l’espace synaptique va contribuer à l’augmentation de la concentration intracellulaire en calcium. Parmi les récepteurs qui activent le glutamate, on décrit des récepteurs ionotropiques ou récepteurs canaux qui sont perméables aux ions Na+, K+ et/ou Ca2+33. Ces récepteurs sont aussi caractérisés par leurs réponses à d’autres agents pharmacologiques comme le NMDA, AMPA ou le kaïnate.

30. Usherwood, P. N.; Machili, P.; Leaf, G., L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses. Nature 1968, 219 (5159), 1169-72.

31. Katsura, K.; Kristian, T.; Siesjo, B. K., Energy metabolism, ion homeostasis, and cell damage in the brain. Biochem Soc Trans 1994, 22 (4), 991-6.

32. Dirnagl, U.; Iadecola, C.; Moskowitz, M. A., Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci 1999, 22 (9), 391-7.

33. Stone, T. W.; Addae, J. I., The pharmacological manipulation of glutamate receptors and neuroprotection. Eur J Pharmacol 2002, 447 (2-3), 285-96.

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Il est par ailleurs décrit plusieurs récepteurs métabotropiques qui, par définition, sont couplés à une protéine G et à différents systèmes de signalisation intracellulaire, en particulier à la phospholipase C et à la protéine kinase C36.

I.6.3 Œdème et dépolarisation péri-infarctus.

L'entrée massive de cations dans la cellule conduit à une dépolarisation membranaire se transmettant aux neurones excitateurs qui libèrent les ions potassium afin de repolariser leur membrane. La mise en jeu des récepteurs ionotropiques sensibles au glutamate entretient ce phénomène, qui se transmet de proche en proche dans le tissu cérébral. La dépolarisation péri- infarctus correspond à la propagation, dans le tissu cérébral, de ces dépolarisations membranaires répétées34, qui semblent pouvoir se reproduire plusieurs fois par heure et ce de manière prolongée avec un effet délétère sur le tissu cérébral35. Chez le rat, le nombre de ces dépolarisations est corrélé à l’importance des lésions cérébrales36. D'autre part, l'entrée massive d'ions sodium dans la cellule va être associée à un afflux de molécules d'eau, responsables d'un œdème cellulaire lui aussi cytotoxique37.

I.6.4 L’oxyde nitrique (NO) et l’ischémie cérébrale.

De nombreux travaux réalisés ces dernières années ont permis de mettre en évidence l’implication Importante du NO au cours de l’ischémie cérébrale38. Les effets délétères, mais aussi parfois bénéfiques, de celui-ci au cours du processus ischémique sont dépendants de la mise en jeu des différentes isoformés de la NOS. L’activation, sous l’effet de l’élévation de la concentration en calcium intracellulaire, de la NOS neuronale (NOS de type I) dans les 10 min suivant l’ischémie va constituer l’une des premières étapes

34. Hossmann, K. A., Periinfarct depolarizations. Cerebrovasc Brain Metab Rev 1996, 8 (3), 195-208.

35. Fonnum, F., Glutamate: a neurotransmitter in mammalian brain. J Neurochem 1984, 42 (1), 1-11.

36. Mies, G.; Iijima, T.; Hossmann, K. A., Correlation between peri-infarct DC shifts and ischaemic neuronal damage in rat. Neuroreport 1993, 4 (6), 709-11.

37 . Ayata, C.; Ropper, A. H., Ischaemic brain oedema. J Clin Neurosci 2002, 9 (2), 113-24.

38 . Moro, M. A.; Cardenas, A.; Hurtado, O.; Leza, J. C.; Lizasoain, I., Role of nitric oxide after brain ischaemia. Cell Calcium 2004, 36 (3-4), 265-75.

Chapitre I : Introduction

de la toxicité du NO. Dans les 12 h suivantes, l’augmentation de l’activité de la NOS inductible (NOS de type II), exprimée par les cellules astrocytaires et gliales, l’endothélium vasculaire et les macrophages, va conduire là encore à la majoration des lésions ischémiques. La synthèse de NO par les NOS de types I et II va contribuer au stress oxydant par la formation de radicaux libres, en particulier de peroxynitrites qui, au niveau des cellules neuronales mais aussi endothéliales, seront responsables de la peroxydation des lipides membranaires et de l’oxydation des protéines, contribuant ainsi à la mort cellulaire39. Il a aussi été démontré que le NO produit par les NOS de types I et II pouvait avoir une action délétère plus directe du fait de : La majoration de l’excitotoxicité induite par le glutamate. L’aggravation du déficit énergétique cellulaire par activation de la poly-(ADP-ribose) synthétase(PARS). L’induction de lésions de l’ADN par inhibition de la ribonucléoside-réductase. En contrepartie, le NO produit par la NOS endothéliale (NOS de type III), dès la première heure de l’ischémie, aurait quant à lui un rôle protecteur. Il serait en effet capable de diminuer l’adhésion leuco- plaquettaire, de contrôler le tonus vasculaire et d’améliorer ainsi le débit sanguin cérébral, de même qu’il pourrait favoriser les processus antithrombotiques et fibrinolytiques à la surface de l’endothélium vasculaire (Figure 10).

Figure 10. Implication du monoxyde d’azote (NO) dans les mécanismes cellulaires au cours de l’ischémie cérébrale39.

39. Moro, M. A.; Cardenas, A.; Hurtado, O.; Leza, J. C.; Lizasoain, I., Role of nitric oxide after brain ischaemia. Cell Calcium 2004, 36 (3-4), 265-75.

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I.6.5 Inflammation post-ischémique.

La réaction inflammatoire est une composante de la réponse immune et répond à une agression d'origine exogène (infection, traumatisme...) ou endogène (cause immunologique, traumatisme tissulaire...). Elle est adaptée et contrôlée par de multiples systèmes régulateurs et s'avère souvent protectrice en participant aux processus de défense naturelle et à la réparation des lésions tissulaires. Les concentrations intracellulaires élevées en calcium, la production de NO et de radicaux libres ainsi que l’hypoxie vont contribuer à l’activation de nombreux facteurs de transcription pro-inflammatoire, en particulier du facteur NF-κB40. L’activation de ce facteur de transcription a de nombreux effets délétères : Augmentation de la synthèse de NO via la NOS de type II, renforçant ainsi les effets délétères de celle-ci. Expression de la cyclo-oxygénase de type 2 (COX-2), enzyme impliquée dans la synthèse de prostanoϊdes toxiques et oxydatifs. Expression de nombreuses cytokines telles que le tumor necrosis factor α (TNFα) et l’interleukine 1s (IL-1s), cytokines impliquées dans l’activation des cellules gliales et des macrophages (synthèse de NOS de type II et de COX-2) ainsi que dans les processus favorisants l’adhésion des polynucléaires et des monocytes à l’endothélium vasculaire (activation des protéines d’adhésion ICAM-1, selectine P, selectine E, etc.) et leur migration au sein du parenchyme cérébral, contribuant de cette manière à la majoration des lésions ischémiques. I.6.6 Apoptose et ischémie cérébrale.

Ce type de mort cellulaire se différencie de la nécrose par ses aspects fonctionnels organisés et anatomiques (modifications des membranes, réorganisation du cytosquelette, condensation de la chromatine, fragmentation de l’ADN et formation des corps apoptotiques).L’apoptose est un mécanisme de mort cellulaire qui s’est développé avec la naissance des organismes multicellulaires et constitue, en quelque sorte, un suicide. L’évolution vers la nécrose ou l’apoptose dépend en partie de la nature et de l’intensité du stimulus (activation des récepteurs du glutamate, surcharge en calcium, radicaux libres,

40. O'Neill, L. A.; Kaltschmidt, C., NF-kappa B: a crucial transcription factor for glial and neuronal cell function. Trends Neurosci 1997, 20 (6), 252-8.

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NO, lésions de la mitochondrie, inflammation…) mais aussi du type cellulaire concerné ainsi que de son état de développement41. La mort cellulaire par apoptose peut être initiée par des signaux intrinsèques. La cellule active un programme interne de destruction cellulaire en réponse à une horloge interne, à la réduction des facteurs de survie, à une perte de contact ou à des modifications hémodynamiques. Toute cellule possède l’ensemble de la machinerie suicidaire et peut s’engager dans un processus actif d’autodestruction à moins qu’elle ne soit stimulée pour l’en empêcher. D’autre part, l’apoptose peut être initiée par de nombreux stimuli extérieurs dont l’irradiation (γ, UV), les agents de chimiothérapie, les cytokines, les lipides oxydés ou encore les bactéries et les virus. Ce sont l’abondance et l’activité relatives des protéines et molécules pro-apoptotique et anti-apoptotiques qui déterminent à un moment donné le sort (de survie ou de mort) de la cellule. On distingue ainsi des protéines dont l’expression va favoriser le développement de l’apoptose (protéines pro-apoptotiques : Bax, Bid,…) et des protéines qui au contraire limitent le développement de ce type de mort cellulaire (protéines anti-apoptotiques : Bcl-2, Bcl-XL…). (Figure 11) Il est à noter que NF-қB est connu comme un régulateur clé des gènes activés dans l’apoptose suivant l’ischémie cérébrale (p-53, Bcl-2 et BCL-x). Dans certaines conditions pathologiques telles que l’ischémie cérébrale, la balance entre ces protéines représente la capacité de décision de la cellule et peut conduire vers la mort cellulaire42.

La phase effectrice de l’apoptose est en partie modulée au niveau des mitochondries et met en jeu deux voies différentes, l’une indirecte dépendant des caspases (cysteinyl aspartate proteinase specifique), l’autre permettant une fragmentation plus directe de l’ADN cellulaire.

Figure 11. Implication de la mitochondrie dans le développement de l’apoptose au cours de l’ischémie cérébrale43.

41. Leist, M.; Nicotera, P., Apoptosis, excitotoxicity, and neuropathology. Exp Cell Res 1998, 239 (2), 183-201.

42. Graham, S. H.; Chen, J., Programmed cell death in cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 2001, 21 (2), 99-109.

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L’activation de la voie dépendante des caspases nécessite la libération de cytochrome C et l’activation d’un complexe proapoptotique43. Celui-ci associe un facteur activateur de l’apoptose (APAF- 1) et la caspase 9. Ce complexe proapoptotique permet le développement de la phase finale de l’apoptose par activation de la caspase 3 et d’une ADNase caspase-dépendante44. L’autre voie, plus directe, met en jeu le facteur inducteur de l’apoptose (AIF) libéré par la mitochondrie et capable d’induire la fragmentation de l’ADN cellulaire indépendamment de l’action de toute autre ADNase (Figure 11)41. Cette description simplifiée des processus concourant au développement de l’apoptose ne laisse peut-être pas apparaître l’extrême complexité des mécanismes mis en jeu au cours de celle- ci. D’une part, il existe des arguments pour une activation très précoce de l’apoptose au cœur de l’ischémie par des voies indépendantes de la mitochondrie et de la caspase 945. D’autre part, plus de 12 caspases sont en fait impliquées dans le développement de l’apoptose au cours de l’ischémie cérébrale et ce, tant lors de l’initiation de celle-ci qu’au moment de la mise en jeu des mécanismes effecteurs. Le développement et la mise au point d’inhibiteurs des caspases pourraient ouvrir, dans ce contexte, d’importantes perspectives thérapeutiques.

I.6.7 Stress oxydant et l’ischémie cérébrale.

Le stress oxydant représente un paramètre essentiel de l’ischémie cérébral et il est représenté par l’ensemble des réactions faisant intervenir des espèces réactives de l’oxygène(ROS), elles-mêmes caractérisées par la présence d’un électron célibataire très réactif (radical libre). Le stress oxydant a plusieurs origines possibles incluant la réduction inachevée de l'oxygène pendant la respiration, l'exposition à une hypoxie puis une réoxygénation, une exposition à des produits chimiques ou composés biologiques, un empoisonnement, une irradiation. Toutes ces conditions produisent des ROS qui sont les médiateurs des effets de ce stress. L’ischémie cérébrale et la reperfusion en particulier sont responsables du stress oxydant menant à la formation de radicaux libres, lequel aboutit à des effets délétères durant la pathogenèse46. Le cerveau

43. Sims, N. R.; Anderson, M. F., Mitochondrial contributions to tissue damage in stroke. Neurochem Int 2002, 40 (6), 511-26.

44. Graham, S. H.; Chen, J., Programmed cell death in cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 2001, 21 (2), 99-109.

45. Benchoua, A.; Guegan, C.; Couriaud, C.; Hosseini, H.; Sampaio, N.; Morin, D.; Onteniente, B., Specific caspase pathways are activated in the two stages of cerebral infarction. J Neurosci 2001, 21 (18), 7127-34.

46 . Lewen, A.; Matz, P.; Chan, P. H., Free radical pathways in CNS injury. J Neurotrauma 2000, 17 (10), 871- 90.

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en particulier est extrêmement sensible aux attaques générées par les radicaux libres en raison de son haut contenu lipidique. De plus, une génération excessive de radicaux libres apporte un effet préjudiciable sur l’ensemble des fonctions physiologiques importantes pour la survie. Au moment de l’ischémie, la perturbation de l’homéostasie ionique, l’excitotoxicité, l’anoxie localisée et l’inflammation favorisent la production de radicaux libres dérivés de l’oxygène par plusieurs mécanismes47: diminution des capacités de défense antioxydantes. altération du système de transformation de la xanthine en hypoxanthine accumulation d'eicosanoïdes par induction principalement de la COX2. altération de l'activité mitochondriale. induction des NOS. Durant le stress oxydant, une rapide surproduction de radicaux libres submerge la détoxification et la capacité de piégeage des enzymes antioxydantes de la cellule à savoir la superoxyde dismutase (SOD), la catalase (CAT), la glutathion peroxydase (GPx), et des antioxydants non-enzymatiques à savoir la vitamine E, la vitamine C et le glutathion (GSH). Ce phénomène résulte en des dommages graves et immédiats pour les protéines cellulaires, l’ADN et les lipides48. Les espèces activées de l’oxygène (ROS) qui sont particulièrement responsables du stress oxydant

•- • •- sont O2 , OH , peroxyde d’hydrogène (H2O2), NO et ONOO . Aucune pathologie n’est initiée par le stress oxydant, mais les désordres métaboliques engendrés par toute agression (d’ordre infectieux, génétique, ischémique…) se trouvent amplifiés lorsque l’équilibre entre production radicalaire / défenses antioxydantes est rompu au profit du stress oxydant.

I.7 Conséquences de l’ischémie cérébrale humaine.

L’ischémie cérébrale entraîne une défaillance des pompes ioniques membranaires, ce qui déclenche alors des mécanismes complexes qui vont mener au gonflement des cellules et à un œdème cérébral d’origine cellulaire : l’œdème cytotoxique. La perturbation de l’homéostasie ionique déclenche un mouvement osmotique passif d’eau vers les cellules. L'augmentation de la teneur en eau du tissu cérébral affecte la substance grise et blanche, ce qui se traduit macroscopiquement par une augmentation du volume, et donc leurs limites deviennent

47. Love, S., Oxidative stress in brain ischemia. Brain Pathol 1999, 9 (1), 119-31.

48. Sies H. Strategies of antioxidant defense. Eur. J. Biochem. 1993, 215, 213–219.

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plus difficiles à préciser. L'œdème atteint son développement maximum le quatrième jour puis régresse au cours de la deuxième semaine. L'effet de masse est d'autant plus important que l'infarctus est volumineux. Parallèlement, l’ischémie-reperfusion altère les vaisseaux et la barrière hémato-encéphalique (BHE) pour aboutir à la formation d’un œdème dont l’origine est la fuite capillaire : l’œdème vasogénique. Lorsque l’intégrité de la BHE est perturbée, le liquide et les protéines plasmatiques ainsi que les cellules inflammatoires pénètrent dans le tissu cérébral. La plupart des voies biologiques qui mènent à l'œdème sont présentées lors de l'ischémie: libération excessive de glutamate, stress oxydant, cascade inflammatoire49. De plus, l'augmentation du volume cérébral engendre une augmentation de la pression intracrânienne et une diminution de la perfusion cérébrale, qui amplifie le phénomène ischémique. Enfin, l'œdème cytotoxique, comme l'œdème vasogénique, peuvent être aggravés par la reperfusion, en raison de l'exacerbation du stress oxydant et de la réponse inflammatoire mais également du dysfonctionnement de la BHE.

I.8 Les traitements actuels et les perspectives de traitements de l’ischémie cérébrale.

Même si le cœur de l’ischémie meurt rapidement suite au manque d’afflux sanguin, la pénombre ischémique peut encore être sauvée par une intervention thérapeutique rapide permettant la restauration du flux sanguin et/ou l’arrêt du processus apoptotique. Il existe actuellement peu d’interventions cliniques thérapeutiques effectives dans le traitement aigu de l’AVC ischémique50. De plus, l’efficacité de ces traitements est tributaire du moment de l’intervention, c’est à dire qu’il faut prendre en compte la fenêtre thérapeutique. Cette fenêtre thérapeutique est définie comme la période de temps la plus longue entre l’ischémie (occlusion du vaisseau) et le traitement médicamenteux pour laquelle un bénéfice neuroprotecteur significatif est encore observé. En fait, plus on attend avant d’administrer le traitement, moins celui-ci sera efficace; trop tardif, il pourrait même devenir délétère. La fenêtre thérapeutique est donc un élément clé dans le choix du traitement : après un délai de 3 heures, le risque d’hémorragie suite à l’administration du traitement devient important. Entre 5 et 10% des patients pourront donc bénéficier de ce type de traitement, les

49. Gasche, Y.; Copin, J. C., [Blood-brain barrier pathophysiology and ischaemic brain oedema]. Ann Fr Anesth Reanim 2003, 22 (4), 312-9.

50. Fatahzadeh, M.; Glick, M., Stroke: epidemiology, classification, risk factors, complications, diagnosis, prevention, and medical and dental management. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2006, 102 (2), 180-91.

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autres patients ne pouvant plus être candidats à certaines thérapies du fait d’une prise en charge trop tardive. L’efficacité des traitements est aussi influencée par le déroulement dans le temps des mécanismes délétères qu’ils ciblent, puisque ces mécanismes sont des processus déterminés dans le temps. Si le traitement cible un mécanisme spécifique apparaissant à un moment donné dans l’ischémie, mais que ce traitement est donné après que ce mécanisme d’action soit apparu, le traitement ne sera pas seulement inefficace, mais pourrait aussi être potentiellement vecteur d’un déséquilibre supplémentaire et ainsi exacerber la détérioration. L’évolution des interventions thérapeutiques doit changer, pour s’adapter à la progression de la maladie. En thérapie aiguë, si le caillot sanguin est toujours présent, la fibrinolyse semble la plus appropriée. Alors que, une fois la recanalisation restaurée, un agent neuroprotecteur est requis, puisque la plupart des dommages neurologiques associés à l’ischémie cérébrale est attribuée au stress oxydant causé par la reperfusion51. Tout ceci explique qu’actuellement encore, l’élément essentiel de l’attitude thérapeutique vise la prévention, puisqu’une fois l’accident ischémique survenu, les ressources thérapeutiques deviennent limitées. I.8.1 Traitement préventif.

I.8.1.1 Prévention primaire.

Un élément essentiel de la lutte contre les AVC est la prévention. La prévention doit avant tout prendre en compte les nombreuses étiologies des AVC qui requièrent chacune une stratégie préventive spécifique. La majorité des AVC de type ischémique lié à l’athérosclérose est due au développement, sur une plaque d’athérome, d’un thrombus qui peut soit se fragmenter et devenir source d’embolies distales, soit s’accroître et aboutir à une occlusion de l’artère. Le traitement préventif primaire sera basé sur le dépistage et le traitement des facteurs de risque (essentiellement l’hypertension artérielle) pour tenter de prévenir la formation de la plaque d’athérome.

51. Hill, M. D.; Hachinski, V., Stroke treatment: time is brain. Lancet 1998, 352, 3, 104.

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I.8.1.2 Prévention secondaire.

L’utilisation des traitements antithrombotiques (aspirine et antiplaquettaires)52 est plus efficace en prévention secondaire qu’en prévention primaire et permet de lutter contre les récidives par des processus thromboemboliques secondaires. Dans les cas très sévères de sténose ou anomalies artérielles particulières, un acte chirurgical (endartérectomie carotidienne principalement) peut être pratiqué à titre préventif. Par ailleurs, la prévention des accidents vasculaires cérébraux par embolie d’origine cardiaque repose sur le traitement de la cardiopathie causale et le recours aux anticoagulants, héparine en prévention à court terme, anticoagulants oraux en prévention au long cours. La prévention des hémorragies cérébrales quant à elle, repose essentiellement sur le traitement de l’hypertension artérielle qui multiplie par dix le risque d’hémorragie. L’utilisation incorrecte des anticoagulants en particulier chez le sujet hypertendu ou ayant eu un accident ischémique cérébral, peut parfois être une cause non négligeable d’hémorragie cérébrale. Des méthodes non-médicamenteuses (régimes moins riches en sel, diminution de la consommation d’alcool, arrêt du tabac, exercice physique, contrôle du diabète,…) destinées pourront également permettre d’améliorer les différents facteurs de risques et ainsi diminuer le risque d’AVC. Cette procédure est d’autant plus efficace que ces mesures de prévention sont mises en œuvre le plus précocement possible53. I.8.2 Traitement curatif.

L’utilisation de traitement curatif apparaît à la suite d’un premier AVC. Les thérapeutiques curatives de la phase aiguë de l’infarctus cérébral restent encore peu nombreuses. Le but du traitement est de réduire le handicap et la mortalité des infarctus cérébraux. Pour cela les thérapeutiques tentent de limiter l’extension des lésions cérébrales et de lutter contre l’occlusion vasculaire. Il existe deux classes principales d’approches thérapeutiques face aux AVC ischémiques aigües : La fibrinolyse qui restaure le flux sanguin cérébral. Les agents neuroprotecteurs ciblant les voies biochimiques qui contrôlent le destin cellulaire en vue de préserver les fonctions cérébrales et/ou d’améliorer la réparation et la récupération neuronale.

52. Wilterdink, J. L.; Bendixen, B.; Adams, H. P. Jr.; Woolson, R. F.; Clarke, W. R.; Hansen, M. D., Effect of prior aspirin use on stroke severity in the trial of Org 10172 in acute stroke treatment (TOAST). Stroke 2001, 32 (12), 2836-40.

53. Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. N Engl J Med 1995, 333 (24), 1581-7.

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I.8.2.1 La fibrinolyse.

La fibrinolyse correspond à la dégradation de la fibrine par la plasmine, conduisant à un délitement du caillot. Le principe de la fibrinolyse pharmacologiquement induite repose sur l’accélération et l’amplification de la fibrinolyse physiologique. Ces traitements visent à améliorer la reperfusion en brisant le thrombus occlusif et en rétablissant le flux sanguin cérébral. Si la thrombolyse, et donc la recirculation, est retardée, le résultat thérapeutique dépend de la progression du cœur ischémique vers la pénombre avant l’initiation de la reperfusion. Cela explique que l’effet thérapeutique diminue avec l’augmentation du délai d’administration, jusqu’à ce qu’une amélioration ne puisse plus être attendue, après 3 à 6 heures. Actuellement, la seule molécule ayant l'indication de la fibrinolyse à la phase aiguë de l'infarctus cérébral est le rt-PA ou activateur tissulaire recombinant du plasminogène. Le rt-PA se lie à la fibrine au niveau du thrombus et convertit le plasminogène en plasmine, lequel aide à briser le réseau de fibrine54. Le rt-PA ne peut activer le plasminogène qu’en présence de fibrine, ce qui lui confère une spécificité d’action sur le caillot constitué. On note deux limites majeures à son utilisation au cours de l’ischémie cérébrale : Une étroitesse de la fenêtre thérapeutique et un risque d’hémorragie. Tout récemment l’étude ECASS III a permis d’étendre la fenêtre thérapeutique du rt-PA de 3h à 4h3055. Malheureusement, même si ces agents reperfusent les tissu ischémiques, ils n’aident guère à la neuroprotection. Une solution pour pallier à ce problème consiste à combiner traitements thrombolytiques et neuroprotecteurs, ces derniers visant à minimiser la détérioration neurologique post-ischémique. I.8.2.2 Les traitements neuro-cytoprotecteurs.

La neuroprotection peut être définie comme toute stratégie ou combinaison de stratégies, qui inhibe, interrompt ou ralentit les événements délétères cellulaires ou moléculaires qui, laissés incontrôlés, pourraient conduire à des lésions ischémiques irréversibles56, 57.

54. Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. N Engl J Med 1995, 333 (24), 1581-7.

55. Bluhmki, E.; Chamorro, A.; Davalos, A.; Machnig, T.; Sauce, C.; Wahlgren, N.; Wardlaw, J.; Hacke, W., Stroke treatment with alteplase given 3.0-4.5 h after onset of acute ischaemic stroke (ECASS III): additional outcomes and subgroup analysis of a randomised controlled trial. Lancet Neurol 2009, 8 (12), 1095-102.

56. Ginsberg, M. D., Current status of neuroprotection for cerebral ischemia: synoptic overview. Stroke 2009, 40 (3 Suppl), S111-4.

57 Ginsberg, M. D., Neuroprotection for ischemic stroke: past, present and future. Neuropharmacology 2008, 55 (3), 363-89.

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La neuroprotection exclut les thérapeutiques qui visent à agir directement sur l’obstruction artérielle. Les agents neuroprotecteurs ont pour cibles les différents mécanismes délétères apparaissant dans l’ischémie cérébrale, dans le but de limiter l’extension du cœur ischémique. Il existe un nombre important de types d’agents neuroprotecteurs qui ont été étudiés à différentes phases d’essais cliniques, en se basant sur des modèles expérimentaux reproduisant la pathologie vasculaire cérébrale et sur les mécanismes physiopathologique (excitotoxicité, stress oxydant,…). Quelques uns ont été décrits brièvement et plusieurs types d’antioxydants ont été étudiés58. Le calcium joue un rôle important dans la physiopathologie de l’ischémie cérébrale. Le blocage des canaux calciques au niveau du cerveau réduirait l’entrée du calcium dans les neurones, ce qui aurait potentiellement une action salutaire dans l’ischémie cérébrale en intervenant au niveau du mécanisme d’excitotoxicité. Le glutamate est un le principal neuromédiateur excitateur capable d’induire des effets cytotoxiques. Il interagit avec les récepteurs NMDA (N-méthyl-D-aspartate) et AMPA (acide 3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazole propionique), qui sont tous deux des cibles pertinentes dans la neuroprotection. Des antagonistes du glutamate pourraient fournir une neuroprotection. Le lubéluzole est un composé qui prévient l’augmentation du glutamate extracellulaire, normalise la balance ionique dans la zone de pénombre et inhibe la production de NO activée par le glutamate59. Il y a malgré tout un manque de développement de cette classe d’agents antagoniste des récepteurs du glutamate, dû à la nature hyper-aiguë des événements qui permettent le relargage du glutamate, ce qui exclut leur utilisation effective en clinique. Certains neuroprotecteurs ciblent l’événement inflammatoire. La réponse inflammatoire après un événement ischémique est marquée par une infiltration leucocytaire (monocytes et neutrophiles) et par l’activation de la microglie, des astrocytes et des cellules endothéliales dans les heures et les jours qui suivent l’ischémie. La sur-régulation et la libération de cytokines inflammatoires induisent des lésions par rupture de la BHE et de la matrice extracellulaire. Cela mène à un œdème de type vasogénique. La famille des protéines tyrosine kinase s’est montrée capable de réguler plusieurs de ces processus via une phosphorylation directe de la matrice cellulaire.

58. Maher, P.; Salgado, K. F.; Zivin, J. A.; Lapchak, P. A., A novel approach to screening for new neuroprotective compounds for the treatment of stroke. Brain Research 2007, 1173, 117-25.

59. Grotta, J., Lubeluzole treatment of acute ischemic stroke. The US and Canadian Lubeluzole ischemic stroke study Group. Stroke 1997, 28 (12), 2338-46.

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Réduire les niveaux des cytokines inflammatoires IL-1 et TNF-α devrait fournir une bonne stratégie pour améliorer les résultats des attaques cérébrales, car ces molécules jouent un rôle majeur dans les lésions apparaissant au niveau du tissu cérébral60.

I.8.3 Echec de la neuroprotection.

Même si les pistes explorées par les différents essais étaient des plus prometteuses, la plupart de molécules n’ont, en définitive, pas montré d’efficacité significative, ou alors une efficacité limitée, et se sont même parfois montrées délétères. Ces échecs se traduisent par plusieurs facteurs : Les différences physiologiques entre les rongeurs et l’homme. Les différences entre les ischémies cérébrales expérimentales et les AVC spontanés chez les patients. Certaines raisons attribuables à la pharmacologie, aux mécanismes d’actions et au protocole d’administration du composé. Le manque évident de solution thérapeutique disponible pour faire face aux accidents vasculaires cérébraux et à l’échec au niveau des traitements neuroprotecteurs conduisent logiquement à la recherche de nouvelles cibles pharmacologiques. De ce point de vue, Les peptides mimant les gangliosides GM1 ou les flavonoïdes comme la fisétine pourraient être une approche intéressante61, 62.

60. Pan, W.; Kastin, A. J., Tumor necrosis factor and stroke: role of the blood-brain barrier. Prog Neurobiol 2007, 83 (6), 363-74.

61. Green, A. R.; Shuaib, A., Therapeutic strategies for the treatment of stroke. Drug Discov Today 2006, 11 (15-16), 681-93.

62 . Maher, P.; Salgado, K. F.; Zivin, J. A.; Lapchak, P. A., A novel approach to screening for new neuroprotective compounds for the treatment of stroke. Brain Research 2007, 1173, 117-25.

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Tableau 2. Quelques composés qui ont échoué au stade d’évaluation clinique de l’ischémie cérébrale. Structure Chimique Composés Mécanisme Période Résultat Causes référe d’action d’inclusio (Phase) nce n(h) PO2H2 Selfotel Antagoniste 6 Négatif Effets 63 des récepteurs (III) indésirables NMDA N COOH H Aptiganel Antagoniste 6 Négatif Inefficace 64 N N des récepteurs (III) NMDA NH2 H Cl N Gavestinel Antagoniste du 6 Négatif Inefficace 65 CO2Na site de la (III) glycine- NMDA Cl N O H OH Eliprodil Bloque le site 6 Négatif Effets 66 N F de polyamine, (III) indésirables NMDA Cl Lubéluzole Inhibiteur de 8 Négatif Inefficace 67 N S OH NOS (III) F O N N

63. Perez-Pinzon, M. A.; Maier, C. M.; Yoon, E. J.; Sun, G. H.; Giffard, R. G.; Steinberg, G. K., Correlation of CGS 19755 neuroprotection against in vitro excitotoxicity and focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 1995, 15 (5), 865-76.

64. Albers, G.; Goldstein, L.B.; Hall, D., Lesko, L.M., Aptiganel hydrochloride in acute Ischemic stroke. JAMA 2001; 286: 2673-2682.

65. Lees, K. R.; Asplund, K.; Carolei, A.; Davis, S. M.; Diener, H. C.; Kaste, M.; Orgogozo, J. M.; Whitehead, J., Glycine antagonist (gavestinel) in neuroprotection (GAIN International) in patients with acute stroke: a randomised controlled trial. GAIN International Investigators. Lancet 2000, 355 (9219), 1949-54.

66. Cudennec, A.; Duverger, D.; Benavides, J.; Scatton, B.; Nowicki, J. P., Effect of eliprodil, an NMDA receptor antagonist acting at the polyamine modulatory site, on local cerebral glucose use in the rat in the rat brain. Brain Res 1994, 664 (1-2), 41-8.

67. Grotta, J., Lubeluzole treatment of acute ischemic stroke. The US and Canadian Lubeluzole Ischemic Stroke Study Group. Stroke 1997, 28 (12), 2338-46.

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I.9 Conclusion.

Dans les pays pauvres tous manqués pour diagnostiquer les AVC ! Le rapport récent de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS, WHO)) sur « The public-health challenges of neurological disorders » mérite d’être salué, car il permettra de porter une attention particulière sur les affections neurologiques, considérées dans la plupart des pays sub-sahariens comme étant marginales68.

Un simple petit caillot dans le cerveau peut rendre invalide de façon irréversible. À ce jour, il n'existe aucun traitement véritable des AVC chez l'homme. Néanmoins d’importants progrès ont été réalisés dans le domaine de la physiopathologie de l’ischémie cérébrale, en particulier à partir des données expérimentales. Les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu sont ainsi mieux connus. Les travaux de ces dernières années ont confirmé la multiplicité de ces mécanismes, leur intrication ainsi que leur caractère évolutif. Face à cette complexité, l’échec des traitements neuroprotecteurs lors des essais thérapeutiques est plus facilement compréhensible. Les perspectives thérapeutiques demeurent cependant importantes dans la mesure où de nombreuses voies n’ont pas encore ou très peu été explorées. Notre objectif a été: de rechercher en premier lieu, de nouvelles petites molécules susceptibles de révéler de nouvelles cibles biologiques impliquées dans la phénoménologie qu’engendre l’ischémie, d’utiliser ces molécules comme des outils moléculaires permettant d’appréhender les mécanismes mis en jeu lors d’un modèle d’ischémie sur un modèle cellulaire, ischémie provoquée par une lésion chimique ou biologique. Ce n’est que lorsque ces mécanismes seront bien compris que l’on pourra peut-être concevoir des traitements chimiothérapeutiques préventifs voire curatifs.

68. Available from internet: http://www.who.int/mental_health/neurology/neurodiso/en/index.html.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

CHAPITRE II: PRESENTATION DU PROJET DE RECHERCHE

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Le seul traitement des accidents cérébraux vasculaires (AVC) consiste à l’injection intraveineuse d’une protéase, l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), lequel va après activation du plasminogène en plasmine permettre la dégradation du caillot de fibrine à l’origine de l’ischémie cérébrale. Néanmoins, les risques inhérents à ce type de traitement font que la fenêtre thérapeutique d’intervention est limitée aux trois premières heures qui suivent le début des premiers symptômes69.

Au vu du manque de solution thérapeutique disponible, la recherche de nouvelles voies pharmacologiques pour agir dans le cadre des AVC reste un sujet en constante évolution. Dans cette perspective, il vaut mieux appréhender la diversité des mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires mis en jeu lors de la mort neuronale d’origine ischémique. Le stress oxydant, lié à la libération excessive de radicaux libres, constitue une des voies physiopathologiques conduisant à la mort neuronale dans de telles pathologies70.

Ce chapitre est consacré à la description du projet de recherche. Après une introduction sur les accidents cérébraux vasculaire, et ses conséquences nous aborderons le choix de la neuroprotection, et plus particulièrement nous décrirons les arguments d’ordre chimiques, biologiques qui sont à l’origine de la conception des nouvelles molécules à propriétés neuroprotectrices. Les agents neuroprotecteurs sont souvent utilisés pour la restauration des fonctions des neurones et interférent dans un ou plusieurs mécanismes impliqués dans des cascades ischémiques, limitant de ce fait les dommages cellulaires ou tissulaires. La recherche est basée sur la connaissance des processus biochimiques impliqués dans des cascades ischémiques (comme la privation de l’oxygène, réduction de l’énergie,…) qui sont liés à l’augmentation du glutamate et à l’afflux de calcium causant la surcharge des ions calcium dans des cellules nerveuses et la production de l’oxyde nitrique (NO), de protéase, activation des phospholipase et des radicaux libres71.

69. Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. N.Engl.J.Med 1995, 333 (24), 1581-7.

70. Pak Chan, H.; Reactive Oxygen Radicals in Signaling and Damage in the Ischemic Brain. J Cereb Blood Flow and Metab 2001, 21, 2-14.

71. Kwon, M. O.; Fischer, F.; Matthisson, M.; Herrling, P., List of drugs in development for neurodegenerative diseases. Update June 2004. Neurodegener. Dis 2004, 1 (2-3), 113-52.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

A ce jour plus de 1000 traitements expérimentaux ont été étudiés et aucun d’entre eux n'a été retenu comme efficace. En 2004, seulement 511 molécules étaient en cours d’évaluation dans les domaines des maladies neurodegeneratives (y compris l’ischémie cérébrale) la plupart de ces molécules ont été récemment découvertes et restent aux stades d’expérimentations72. Nous avons conçu et synthétisé des mini chimiothèques focalisées sur des motifs structuraux spécifiques que nous allons développer. L’idée qui a prévalu pour la conception, des nouvelles structures a été : La plupart d’introduire des chaînes grasses saturées ou insaturées sur un motif sérine, tyrosine ou cystéine. De remplacer la fonction carboxylique par des groupements reconnus comme bioisostères classiques ou non classiques de cette fonction ; comme par exemple les fonctions phosphonique, tétrazolique, 2,4-oxadiazolidine-3,5-diones et oxadiazinane-3,6-dione. L’élaboration d’un nouveau modèle de composé neuroprotecteur dans lequel une chaîne grasse est couplée à une entité acide ascorbique ; cette dernière servirait de vecteur actif pour améliorer le passage des composés à travers la BHE. Le projet de recherche est ainsi architecturé par : 1. Les paramètres chimiques et biologiques qui ont servi de base pour le «design» des molécules synthétisées. 2. La représentation des structures de base sélectionnées pour la constitution des mini chimiothèques focalisées. 3. Les méthodologies de synthèse de la première série de molécules qui constituent le premier modèle de molécules neuroprotectrices. 4. Les méthodologies de synthèse de la seconde série de molécules incorporant des groupements bioiostères de la fonction carboxylique. 5. L’evaluation de l'activité neuroprotectrice des composés sur un modèle cellulaire et sur un modèle tissulaire. 6. La corrélation entre la structure et l’activité neuroprotectrice de nos composés : analyse et hypothèses.

72 . Valentine, L.; Kwon, M. O.; Herrling, P., List of drugs in development for neurodegenerative diseases. Update March 2005. Neurodegener Dis 2004, 1 (6), 269-322.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

II.1 Généralités.

La découverte de médicaments est un processus long et complexe. On estime qu’il faut entre 12 et 15 ans et environ 800 millions d’euros pour la mise au point d’un médicament73. La figure 12, qui présente l’évolution des nouvelles entités chimiques mises sur le marché et les investissements des entreprises pharmaceutiques en R&D aux Etats-Unis ces dernières années, illustre une situation problématique pour le monde de la recherche pharmaceutique : alors que les investissements sont en augmentation constante, le nombre de nouvelles entités chimiques introduites sur le marché n’augmente pas. Cela signifie que le coût de mise au point d’un médicament est, tout comme les investissements, en augmentation constante. L’une des raisons de cette augmentation est le durcissement des critères d’acceptation des médicaments par les organismes gouvernementaux.

Figure 12. Nouvelles entités chimiques acceptées par la FDA (courbe bleue) et investissements en R&D aux Etats-Unis (courbe rouge) entre 1996 et 200374.

Pour lutter contre cet état de fait, le monde de la recherche pharmaceutique optimise constamment toutes les étapes de son processus de découverte et de mise au point de médicaments. La chemoinformatique est un outil de choix pour diminuer le temps et le coût de développement d’un médicament.

73. Irwin, J. J.; Shoichet, B. K., ZINC a free database of commercially available compounds for virtual screening. J Chem Inf Model 2005, 45 (1), 177-82.

74. Chen, W. L., Chemoinformatics: past, present, and future. J Chem Inf Model 2006, 46 (6), 2230-55.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Cette discipline peut intervenir à différents niveaux du processus de découverte d’un médicament. Parmi les techniques de chemoinformatique nous pouvons citer le criblage de chimiothèques (techniques de QSAR, de docking et de pharmacophores), la conception de chimiothèques virtuelles, la conception de composés de novo, la prédiction de propriétés et l’étude de l’affinité protéine-ligand.

II.2 Etude des relations structure-activité.

II.2.1 Etude QSAR.

Le principe d’une étude QSAR, consiste à trouver une corrélation entre une activité biologique mesurée pour un panel de composés et certains descripteurs moléculaires. En effet, une fonction mathématique permet de relier l’activité biologique à certains de ces paramètres physico-chimiques.

• Activité biologique = f (propriétés physico-chimiques)

L'association des variations de l'activité aux paramètres structuraux permet d'obtenir un système d'équations pour une série chimique donnée et pour une activité définie, une équation de corrélation. L'intérêt essentiel de cette équation est qu'elle doit permettre de déterminer les valeurs des paramètres qui correspondent à une activité maximale et ainsi de prévoir l'activité des molécules qui n'ont pas encore été synthétisées. Ainsi, Hansch et al sont les premiers à établir une relation entre les propriétés physico-chimiques (logP, pKa, paramètres stériques et électroniques) et l’activité biologique75. En 1971, ils réalisent une étude de relation structure-activité sur les différentes familles d’antifongiques (les benzoquinones, les sels d’alkylpyridinium, les imidazoles et les phénols76). L’activité antifongique dépend du coefficient de partage octanol-eau mesuré expérimentalement ou calculé. Les techniques QSAR s’appuient sur le concept postulant que des structures similaires ont des propriétés similaires77, plus les molécules sont différentes, plus il est difficile à corréler les propriétés physico-chimiques et l’activité biologique, alors que le contraire est plus aisé.

75. Hansch, C.; Kiehs, K.; Lawrence, G. L., The role of substituents in the hydrophobic bonding of phenols by serum and mitochondrial proteins. J Am Chem Soc 1965, 87 (24), 5770-3.

76 Hansch, C.; Lien, E. J., Structure-activity relationships in antifungal agents. A survey. J Med Chem 1971, 14 (8), 653-70.

77. Maldonado, A. G.; Doucet, J. P.; Petitjean, M.; Fan, B. T., Molecular similarity and diversity in chemoinformatics: from theory to applications. Mol Divers 2006, 10 (1), 39-79.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Ce type d’étude a donc pour vocation d’une part d’expliquer les paramètres moléculaires impliqués dans l’activité biologique mesurée et d’autre part de prévoir l’influence de certaines modifications structurales dans l’activité biologique. Les descripteurs moléculaires calculés sont classiquement de trois types : physicochimiques (lipophilie, pKa …), électroniques (moment dipolaire…) et topologiques. Ces descripteurs sont eux mêmes caractéristiques de la structure en deux dimensions ou en trois dimensions de la molécule.

II.3 Comparaison des propriétés physico-chimique de fonctions bioisostères de l’acide carboxylique.

Le partage d’une molécule entre une phase aqueuse et une phase lipidique conditionne en partie ses propriétés biologiques telles que le transport, le passage à travers les membranes, la biodisponibilité (distribution et accumulation), l’affinité pour un récepteur et la fixation par une protéine, l’activité pharmacologique ou encore la toxicité. Depuis les travaux de Collander78, puis ceux du groupe de Hansch quelques années plus tard79, 80 le coefficient de partage P1 d’une molécule dans un système biphasique constitué de deux solvants non-miscibles (le plus souvent le système n octanol/eau), est reconnu pour sa faculté à mimer le passage de cette molécule à travers les membranes biologiques.

Coctanol logP = log C 2OH

Pour des solutions diluées, ce coefficient de partage n-octanol/eau est le rapport de la concentration d’une molécule de soluté dans le n-octanol(Coctanol) sur sa concentration dans l’eau (CH20) lorsque le système biphasique est en équilibre. En fait, comme les valeurs de P mesurées s’étendent sur au moins douze unités de grandeur (10-4 – 108), on utilise de préférence les logarithmes décimaux. Le partage est donc une propriété physico-chimique importante qui peut être utilisée pour représenter la nature lipophile ou hydrophile d’une molécule.

78. Collander, R., Selective Absorption of Cations by Higher Plants. Plant Physiol 1941, 16 (4), 691-720.

79. Hansch, C.; Lien, E. J.; Helmer, F., Structure--activity correlations in the metabolism of drugs. Arch Biochem Biophys 1968, 128 (2), 319-30.

80 Hansch, C.; Lien, E. J., Structure-activity relationships in antifungal agents. A survey. J Med Chem 1971, 14 (8), 653-70.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Quant au logP, il constitue un paramètre unique qui regroupe plusieurs effets : tous les types d’interactions non covalentes, la solvatation ainsi qu’une composante d’entropie. Il est très largement utilisé dans des études de relations structure-activity quantitatives relationships (QSARs) dans les sciences pharmaceutiques, biochimiques, toxicologiques et dans les sciences de l’environnement. II.3.1 Le caractère lipophile des composés.

Le calcul de la valeur du logP nous permet de déterminer le caractère lipophile des molécules, qui renseigne partiellement sur leurs aptitudes à traverser les membranes biologiques. Pour qu’un produit soit actif il est nécessaire qu’il entre dans la cellule. Ainsi, dans le cas où ce transport n’est pas optimal, il peut limiter la biodisponibilité de l’agent neuroprotecteur et par conséquent diminuer son activité. Tableau 3. Exemple de logP de bioisostères de l’acide carboxylique. avec R = stéaryl Structure alogP

H O 6,60 ± 0,39 R N OH O OH O O 5,65 ± 0,49 S R N OH H O

N N 6,55 ± 0,62 N O NH OH R N H R O O 7,69 ± 0,65 N NH O O 7,44 ± 0,64 O NH N R O O 8,04 ± 0,65 O NH N R S [a ] Le logP est déterminé en utilisant ACD (Advanced Chemistry Development, Inc).

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Lors d’un transport passif à travers une membrane, l’augmentation de l’hydrophobicité ou de la lipophilie, devrait faciliter le passage des composés à travers la membrane plasmique, entraînant une meilleure internalisation cellulaire de la drogue; ceci peut améliorer le potentiel thérapeutique de la drogue parente. Toutefois, il est important de souligner que l’augmentation du caractère lipophile de la molécule n’est pas forcément synonyme de la meilleure activité. En effet, d’autres facteurs entrent en jeu (solubilité, stabilité, polymorphisme, toxicité…). L’analyse des résultats concernant les valeurs de logP permet de faire plusieurs remarques quant à l’influence des modifications structurales apportées sur le caractère hydrophobe de nos molécules. Par contre nos résultats biologiques n’ont pas permis à corréler l’effet neuroprotecteur et l’hydrophobicité de nos molécules, une étude du passage de la barrière hématoencéphalique par nos composes et à prévoir. Ces valeurs de logP restent purement théoriques.

II.4 La structure privilégiée.

II.4.1 Notion des structures privilégiées.

Une structure privilégiée est une sous-structure de grande taille présente dans les ligands de différents récepteurs biologiques. Généralement, cette sous-structure est la partie centrale de la molécule. Dans la majorité des cas, la structure privilégiée est constituée de deux ou trois cycles liés par des simples liaisons ou par fusion des cycles81. Une structure privilégiée est un critère important dans la conception des molécules bioactives, en effet une drogue peut inhiber l’activité d’une enzyme grâce aux fortes interactions qu’elle peut avoir avec le site actif de cette enzyme. Ce terme a été introduit par Evans en 1988 après une étude sur les benzodiazépines82. Evans a montré que le squelette benzodiazépine constitue un excellent exemple de structure privilégiée dans la mesure où dépendant des substituant portés par ce motif, les molécules résultantes sont dotées d’activités biologiques variées. Depuis une quinzaine d’année, le concept de structure privilégiée a émergé comme une approche complémentaire pour la recherche de nouvelles molécules bioactives.

81. DeSimone, R. W.; Currie, K. S.; Mitchell, S. A.; Darrow, J. W.; Pippin, D. A., Privileged structures: applications in drug discovery. Comb Chem High Throughput Screen 2004, 7 (5), 473-94.

82. Evans, B. E.; Rittle, K. E.; Bock, M. G.; DiPardo, R. M.; Freidinger, R. M.; Whitter, W. L.; Lundell, G. F.; Veber, D. F.; Anderson, P. S.; Chang, R. S.; et al., Methods for drug discovery: development of potent, selective, orally effective cholecystokinin antagonists. J Med Chem 1988, 31 (12), 2235-46.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Depuis l’apparition de cette terminologie, de nombreux groupes ont présenté des structures répondant à ces caractéristiques et appartenant à des composés biologiquement actifs83. Le tableau 4 montre quelques exemples significatifs de structures privilégiées et les molécules ou médicaments auxquels elles ont donné naissance. Tableau 4. présentation de quelques structures privilégiées issue de la littérature Références H O O 84 N N N N N O H

1,4-benzodiazepin-2-one Devazepide (MK-329) Antagoniste CCK-A Cl 85 N OH N

H N N N N Losartan Bi-phenyl Antagoniste AT-1

83. Ye, Z.; Gao, Y.; Bakshi, R. K.; Chen, M. H.; Rohrer, S. P.; Feighner, S. D.; Pong, S. S.; Howard, A. D.; Blake, A.; Birzin, E. T.; Locco, L.; Parmar, R. M.; Chan, W. W.; Schaeffer, J. M.; Smith, R. G.; Patchett, A. A.; Nargund, R. P., Modeling directed design and biological evaluation of quinazolinones as non-peptidic growth hormone secretagogues. Bioorg Med Chem Lett 2000, 10 (1), 5-8.

84. Hill, D.R.; Woodruff, G.N.; Differentiation of central cholecystokinin receptor binding sites using the nonpeptide antagonists MK-329 and L-365,260. Brain Research. 1990 3 (2):276-83.

85. Dahlöf, B.; Devereux, R.B.; Kjeldsen, S.E.; Julius, S.; Beevers, G.; de Faire, U.; Fyhrquist, F.; Ibsen, H.; Kristiansson, K.; Lederballe-Pedersen O.; Lindholm, L.H.; Nieminen, M.S.; Omvik, P.; Oparil, S.; Wedel, H.; "Cardiovascular morbidity and mortality in the Losartan Intervention For Endpoint reduction in hypertension study (LIFE): a randomised trial against atenolol". Lancet 2002 9311: 995–1003.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

NO2 N MeOOC COOMe H N H Nifedipine 1,4 dihydropyridine Modulateur de canaux calciques COOH 87 MeO N H N

O Cl Indométhacine indole antiinflammatoire

II.4.2 Le devenir normal du médicament dans l'organisme.

L’étude du devenir du médicament dans l’organisme est importante pour définir les modalités d’administration du médicament en développement, à savoir la voie d’administration, la dose et le rythme d’administration, l’influence potentielle des caractéristiques du sujet (âge,…) ou d’autres molécules. On pourrait assimiler les étapes du devenir du médicament à un " parcours de santé " d’une substance devant atteindre une cible avant de disparaître, parcours semé d’embûches ou au contraire d’entrains, parcours nécessitant le passage par certaines barrières et la diffusion dans certains liquides... En termes pharmacocinétiques, ces étapes regroupent l’absorption de la molécule, la distribution dans l’organisme, l’élimination sous forme de biotransformation et d’excrétion. Ces paramètres lies à l’ADMET (Absorption, Distribution, Métabolisme, Excrétion et Toxicité) permettent d’identifier les molécules bioactives qui sont aptés à devenir des médicaments « Drug like », ces données qui dépendent en partie de la solubilité et de la lipophilie peuvent être modélisées ou calculées au moyen de programmes informatiques (logP, pKa, potentiel électrostatique, surface polaire).

86. Brown, M.J.; Palmer, C.R.; Castaigne, A. et al. "Morbidity and mortality in patients randomised to double- blind treatment with a long-acting calcium-channel blocker or diuretic in the International Nifedipine GITS study: Intervention as a Goal in Hypertension Treatment (INSIGHT)". Lancet 2000 356 (9227): 366–72.

87. Lum, G.M.; Aisenbrey, G.A.; Dunn, M.J.; Berl, T.; Schrier, R.W.; McDonald, K.M.; "In vivo effect of indomethacin to potentiate the renal medullary cyclic AMP response to vasopressin". Journal of Clinical Investigations. 1977 59 (1): 8–13.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Lipinski, après une étude statistique sur des médicaments ayant reçu l’autorisation de mise sur le marché (AMM ou FDA approved) pris par voie orale, a proposé une définition des caractères structuraux critiques pour qu’une molécule soit prédite avec une biodisponibilité acceptable. Ces règles sont communément regroupées sous le nom de « règles de 5 »88. Sur la plupart des médicaments actifs par voie orale, il en ressort que ces principes actifs ont en commun plusieurs caractéristiques physico-chimiques :

• Un poids moléculaire inferieur à 500. • Un logP inferieur à 5. • Moins de 5 possibilité de donner une liaison hydrogène (soit la somme des fonctions OH, NH et SH). • Moins de 10 possibilités d’accepter une liaison hydrogène (soit la somme des fonctions O, N et S). Trois au moins de ces paramètres doivent être satisfaits. La prise en compte de ces différents paramètres ne constitue en aucun cas une assurance de biodisponibilité de la molécule résultante, mais l’intégration des ces règles associée au choix d’une structure privilégiée permet d’optimiser les chances pour qu’une molécule soit biodisponible.

II.5 Choix des molécules : La bioisostérie.

Le passage de la découverte d’une molécule à sa mise sur le marché est le fruit de nombreuses années de travail. Malheureusement il arrive qu’un médicament qui s’est avéré très actif in vivo doive être retiré du marché pour des effets secondaires indésirables. Le bioisostèrisme joue un rôle important dans la découverte de nouveaux médicaments, l’utilisation de la bioisostérie permet d’introduire de la diversité chimique pour modifier la structure d’un principe actif dans l’espoir de diminuer ses effets secondaires et d’accroître son efficacité. L’intérêt des bioisostèrismes est qu’on peut changer les propriétés chimiques et physiques de la molécule sans pour autant changer l‘activité biologique. Bien sur il existe toujours les difficultés fondamentales dues au fait que le moindre changement structural de la molécule peut entraîner la toxicité in vivo89.

88. Lipinski, C. A.; Lombardo, F.; Dominy, B. W.; Feeney, P. J., Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev 2001, 46 (1-3), 3-26.

89. Kennewell, E. A.; Willett, P.; Ducrot, P.; Luttmann, C., Identification of target-specific bioisosteric fragments from ligand-protein crystallographic data. J Comput Aided Mol Des 2006, 20 (6), 385-94.

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II.5.1 Introduction.

L’origine de ce concept remonte en 1919 avec les travaux de Langmuir90. Qui évoquèrent pour la première fois la notion d’isostèrisme. Il observera les similarités d’un grand nombre de propriétés physico-chimiques associées à des atomes, des groupes d’atomes, des radicaux et des molécules. En se basant sur ces similarités, il identifia 21 groupes d’isostères dont une partie est représentée dans le tableau suivant :

Tableau 5. La notion d’isostérie selon « Langmuir ». Groupe Isostères 1 H+, He, Li+ 2 O2-, F-, Ne, Na+, Mg2+, Al3+ 3 S2-, Cl-, Ar, K+, Ca2+ 4 Cu+, Zn2+

- 8 N2, CO, CN

+ 9 CH4, NH4

- - 10 CO2, N2O, N3 , CNO

- 2- 20 MnO4 , CrO4

2- 3- 21 SeO4 , AsO4

Par la suite, il déduisit de la théorie de l’octet que le nombre et l’arrangement dans ces molécules étaient identiques. D’où la définition initiale des isostères comme étant des composés ou groupes d’atomes qui possèdent une répartition électronique comparable. Une extension de ce concept est venue en 1925 par Grimm avec sa « loi du déplacement du proton». Ainsi Grimm stipula que sur un tableau périodique, l’ajout d’un ou de quatre protons à un atome placé une à quatre places avant le gaz inerte lui confère des propriétés physico-chimique similaire à l’élément chimique placé respectivement un à quatre groupes à sa droite. Chaque colonne illustrée dans le tableau présente les groupes d’isostères selon Grimm.

90. Langmuir, I.; The Structure of Atoms and the Octet Theory of Valence. Proc Natl Acad Sci U S A 1919, 5 (7), 252-9.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Tableau 6. Loi de déplacement des protons de Grimm C N O F Ne Na CH NH OH FH

+ CH2 NH2 OH2 FH2

+ CH3 NH3 OH3

+ CH4 NH4

Cette loi qui représente les similitudes entre les groupes qui ont le même nombre de valence électronique, mais qui ont un nombre d’atome différent fut étendu par Erlenmeyer91. Il redéfinit la classification faite par Grimm et l’étendit à des atomes, des ions et des molécules pour lesquels la couche périphérique électronique peut être considérée comme identique (voir tableau 7). Tableau 7. Isostères basés sur le nombre d’électrons périphériques. Nombre d électrons périphériques

5 6 7 8 N O Cl ClH P S Br BrH As Se I IH

Sb Te SH2

PH3

L’application de ce concept d’isostèrisme pour modifier une activité biologique a donné naissance au terme de « Bioisostèrisme ». C’est en 1951 que Friedman92 a défini pour la première fois le terme de bioisostère. Les bioisostères englobent tous les atomes et molécules qui correspondent à la définition d’isostère et qui ont le même type d’activité biologique. La définition du bioisostèrisme a été élargie par Burger93 pour qui les bioisostères sont « des composées ou groupes qui possèdent des volumes et des surfaces moléculaires très proches, qui ont à peu près la même distribution électronique et qui exhibent des propriétés physique similaire».

91. Erlenmeyer, H; Leo, M., On pseudoatomes. Helv. Chim. Acta, 1932, 15, 1171-1186.

92. Friedman, H. L., Relationship between chemical structure and biological activity in mercurial compounds. Ann N Y Acad Sci 1957, 65 (5), 461-70.

93. Burger, A., Isosterism and bioisosterism in drug design. Prog Drug Res 1991, 37, 287-371.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Le point crucial du bioisostèrisme réside dans le fait que les bioisostères ont la même cible thérapeutique. Leurs propriétés biologiques sur cette cible peuvent être soit de nature agoniste soit de nature antagoniste. Les bioisostères ont été qualifiés pour certains de classiques et pour d’autres de non classiques, la loi de déplacement du proton de Grimm et la définition d’isostèrisme selon Erlenmeyer se réfèrent au bioisostères classiques. La famille des bioisostères classiques peut êtres divisée en cinq catégories qui sont : Tableau 8. La famille des bioisostères classiques.

1. Atomes et groupes monovalents

CH3 NH2 OH F Cl

Cl PH2 SH Br i-Pr I t-Bu 2. Atomes et groupes divalents

H O S Se N O O O O C R C R C R C R N O S H 3. Atomes et groupes trivalents

P As 4. Atomes et groupes tétravalents

C Si

C N P 5. Equivalents des cycles.

S (benzène, thiophène) (benzène, pyridine) N O S H (tétrahydrofurane, N tétrahydrothiophène, cyclopentane, pyrolidine)

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OH O Dans le travail de thèse nous avons appliqué OH N le concept de bioisostère classique H O monovalent et divalent. Pour les isostères Acide 3-hydroxy-2-stéaramido propanoïque 2 monovalent l’objectif était de remplacer la SH O fonction hydroxyle (OH) par une fonction OH N mercapto(SH). H O Acide 3-mércapto-2-stéaramido propanoïque 99 Figure 13. Quelques isostères monovalents

Les isostères classiques divalents O O englobent les permutations de NH N fonctions qui ont une double liaison 62 O (C=C, C=N, C=O, C=S) et deux O O simples liaisons. L’illustration de cette NH N division d’isostères divalents se 64 S retrouve dans certaines molécules Figure 14. Exemples des isostères classiques divalents. synthétisées 62 et 64.

Quant aux bioisostères non classiques, ils n’obéissent pas aux définitions stériques et électroniques des bioisostères classiques. Une seconde caractéristique des bioisostères non classiques vient du fait qu’ils n’ont pas le même nombre d’atomes que les fonctions qu’ils doivent remplacer. La famille des bioisostères non classiques peut être divisée en deux catégories qui sont : Le remplacement de cycles par des structures non cycliques. Le remplacement par échange de groupes fonctionnels : Bioisostères non-classiques. Le tableau présente les remplacements bioisostèriques non classiques de divers groupes fonctionnels. Tableau 9. «Les bioisostères non classiques».

NC CN 1. Groupes carbonyles O O O O C S S

O O CN C S N O N CH

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2. Groupes acide carboxylique O O O O O S S P P OH OH N OH OH O O NH2 OEt R O O O N N CN N OH N N H N OH H O 3. Groupes hydroxyles H H O O N SO R H 2 N NH2 N R H CN N CN OH OH CN 4. Catéchol HO O N O N X HO HO N HO H X=O, N-R 5. Halogènes X CF3 N(CN)2 C(CN) 3 6. Thioéther NC CN CN S O N

7. Thiourée H H H N NH N NH2 N NH2 2 S N CN NO2 8. Azométhane CN N

9. Pyridine

N N R NR NO2 3 10. Groupes espaceurs. 3

11. Hydrogène H F

Tableau 9 (suite) NB : Dans cette catégorie nous nous sommes intéressés plus particulièrement sur le groupe des bioisostères de l’acide carboxylique sur lequel une mini chimiothèque a été constituée.

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Une autre fonction modifiable par un bioisostère non classique est la fonction amide. Les fonctions bioisostères de la fonction amide sont d’autant plus importantes que la fonction amide est l’une des fonctions caractéristiques du monde biologique, qui est la base de la constitution des protéines. La bioisostèrie de la fonction amide a permis le développement de la chimie des pseudopeptides94. Le tableau représente les formes bioisostères possibles de la fonction amide. Tableau 10. les bioisostères de la liaison amide. bioisostère formule Amide -NHCO- Retro inverso -CONH- thioamide -NHCS-

Homologue amide -CH2NHCO-

Céto méthylène -COCH2- urée -NHCONH-

Méthylène amino -CH2NH- carbamate -NHCO2- thiocarbamate -NHCOS- ester -CO2- sulfonamide -NHSO2- hydroxyéthylène -CH(OH) CH2

Lors du remplacement d’une fonction organique par une fonction organique isostère, un ou plusieurs paramètres physico-chimiques peuvent varier ; ces paramètres sont la taille, la géométrie, la répartition électronique, la solubilité, le pKa, la réactivité chimique ou encore la capacité à favoriser la formation des liaisons hydrogènes. Une modification isostérique entraîne rarement la variation simultanée de tous ces paramètres. Il est primordial de pouvoir déterminer lesquels sont essentiels et lesquels pourront le mieux générer l’activité biologique souhaitée.

II.5.2 La bioisostèrie comme stratégie de modification moléculaire.

94. Crozet, Y.; Wen, J.J.; Loo, R. O.; Andrews, P. C.; Spatola, A. F., Synthesis and characterization of cyclic pseudopeptide libraries containing thiomethylene and thiomethylene-sulfoxide amide bond surrogates. Mol Divers 1997, 3 (4), 261-76.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

II.5.2.1 Les bioisostères de l’acide carboxylique.

Un composé avec une activité pharmacologique désirée peut avoir les effets secondaires indésirables qui limitent sa biodisponibilité ou sa structure qui influence défavorablement à son métabolisme et excrétion dans l’organisme humain. Des bioisostères de carboxylate ont été étudiés95. De ces derniers, les plus souvent utilisés comme biomimétiques sont les groupes phosphoniques, sulfoniques et tétrazoles. Tableau 11. les bioisostères de l’acide carboxylique sur lesquels on a constitué une chimiothèque. O Acide carboxylique OH O Acide phosphonique P OH OH N N Tétrazole N N H O 3-hydroxy-2H-pyran-4(3H)-one

HO O O 1,2,4- oxadiazolidine-3,5-dione HN O NH O O Thiazolidine-2,4-dione

NH S O O O 1,2,4-oxadiazinane-3,6-dione HN

O N H D’autres bioisostères de carboxylate, qui sont moins étudiés, sont le groupe de bioisostère de 1,2,4- oxadiazolidine-3,5-dione de 1,2,4-oxadiazinane-3,6-dione,de 3-hydroxy-2H-pyran-4(3H)-one et thiazolidine-2,4-dione.

95. Patani, G. A.; LaVoie, E. J., Bioisosterism: A Rational Approach in Drug Design. Chem Rev 1996, 96 (8), 3147-3176.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

La fonction acide carboxylique possède d’importantes capacités de liaisons aux protéines. Elle peut aider à la solubilité des composés en milieu hydrophile et peut être facilement protégée sous la forme d’une prodrogue. L’utilisation de bioisostères de l’acide carboxylique peut apporter une amélioration de la stabilité métabolique des composés acides. Par exemple la fonction tétrazole présente des interactions similaires à l’acide carboxylique et un pKa proche. (Tableau 12)

Tableau 12. la similarité entre le tétrazole et l’acide carboxylique. Composés alogP bpKa O OH 2,0496 4,297

N N 1,4998 4,5499 N NH N

[a] logP calculé : coefficient de partage dans un mélange biphasique n-octanol / H2O, déterminé à l’aide du logiciel « ACD logP (Advanced Chemistry Development, Inc) » [b] pKa est déterminé en utilisant la spectroscopie UV/Vis (Sirius Analytical Instruments Ltd., “Applications and Theory)

II.5.2.1.1 Tétrazole.

Les bioisostères tétrazoliques sont surtout utilisés pour le remplacement de groupements acides carboxyliques. Ils établissent des interactions similaires avec les cibles pharmacologiques. Ils sont utilisés pour améliorer les propriétés biologiques et pharmacologiques du produit.

96. Da Y-Z, Ito, K.; Fujiwara, H., Energy Aspects of Oil/Water Partition Leading to the Novel Hydrophobic Parameters for analysis of Quantitative Structure-Activity Relationships. J Med Chem. 1992; 35: 3382-3387.

97. Levitan, H.; Barker, J., Salicylate: A Structure-Activity Study of its Effects on Membrane Permeability. Science, 1972; 176:423-425.

98. Robert, G.; Franz, Comparisons of pKa and logP Values of Some Carboxylic and Phosphonic Acids: Synthesis and Measurement. AAPS Pharmsci 2001; 3 (2)10.

99. Herbst, R.M.; Wilson K R, Apparent Acidic Dissociation of some 5-Aryltetrazole. J Org Chem. 1957;22: 1142-1145.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Ce remplacement représente une méthodologie précieuse pour améliorer les propriétés pharmacologiques d’un candidat médicament. Comme leurs analogues carboxyliques, les tétrazoles sont ionisés à pH physiologique et montrent de même une structure plane (Figure 15). Cependant il a été montré que le tétrazolate est plus lipophile que son isostère carboxylate tout en ayant une constante d’acidité proche (tétrazole : pKa 4,5-4,9 ; acide carboxylique : pKa 4,2-4,4)100. Cette plus grande lipophilie du tétrazolate peut expliquer la plus grande capacité de pénétration des membranes cellulaires par les composés tétrazoliques.

R O R O R N R N N N OH O HN N N N

Acide carboxylique Carboxylate Tétrazole Tétrazolate Figure 15. Analogie structurale du tétrazole avec l’acide carboxylique. II.5.2.1.2 Les acides α-aminophosphoniques.

Une classe intéressante de ces mimétiques est formée par les acides aminophosphoniques, définis comme étant des analogues des aminoacides dans lesquelles la fonction carboxylique est remplacée par une fonction phosphonique. Ces composés sont importants car ils concurrencent les fonctions carboxyliques dans le site actif des enzymes et des récepteurs cellulaires. Bien qu’étant des bioisostères, ces molécules ont des propriétés physicochimiques différentes. Les acides phosphoniques diffèrent des acides carboxyliques par leur encombrement, leur géométrie et leur acidité. En effet, l’atome de phosphore a un rayon significativement plus grand que celui de l’atome de carbone. L’acide carboxylique a une géométrie trigonale plane alors que l’acide phosphonique a une géométrie tétraédrique. En plus l’acide phosphonique est plus acide que l’acide carboxylique d’environ trois unités de pKa (pKa 1-3). Les acides aminophosphoniques ont de nombreuses activités en chimie médicinale, en tant qu’inhibiteurs enzymatiques, agonistes ou antagonistes de récepteurs du système nerveux central, analogues de produits naturels et complexant de métaux101. Le premier exemple d’acide aminophosphonique comme inhibiteur enzymatique remonte à 1959. Beaucoup de protéases sont impliquées dans des maladies humaines variées. Les substrats

100. Wexler, R. R.; Greenlee, W. J.; Irvin, J. D.; Goldberg, M. R.; Prendergast, K.; Smith, R. D.; Timmermans, P. B., Nonpeptide angiotensin II receptor antagonists: the next generation in antihypertensive therapy. J Med Chem 1996, 39 (3), 625-56.

101. Kafarski, P.; Lejczak, B., Aminophosphonic acids of potential medical importance. Curr Med Chem Anticancer Agents 2001, 1 (3), 301-12.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

peptidiques dans lesquels un groupement phosphonate mime l’état de transition tétraédrique de la réaction de clivage de la liaison peptidique sont souvent de bons inhibiteurs de ces enzymes. Tous ces récepteurs fonctionnent grâce à leur ligand endogène et au glutamate et sont des cibles potentiellement intéressantes pour le traitement de maladies neurologiques telles que l’ischémie cérébrale. Les dérivés aminophosphoniques se retrouvent principalement en tant qu’antagonistes des récepteurs NMDA et AMPA.

La molécule AP5 (acide 2-amino-5- O NH2 P phosphonopentanoique) a été utilisée comme « HO CO H OH 2 lead » et a permis la découverte de beaucoup AP5 d’antagonistes puissants, sélectifs et compétitifs. Figure 16. AP5 Antagoniste du récepteur NMDA102.

O Les premières études pharmacologiques sur les

HO P CO2H HO O récepteurs AMPA ont été entravées par le manque NH2 de sélectivité d’antagonistes efficaces. L’ATPO a été N O tBu développé en utilisant l’AMPA comme « lead108 ».

ATPO

Figure 17. ATPO comme antagoniste du récepteur AMPA103,104.

102. Morris, R.G.; Synaptic plasticity and learning: selective impairment of learning rats and blockade of long- term potentiation in vivo by the N-methyl-D-aspartate receptor antagonist AP5. J. Neurosci. 1989, 9(9):3040-57.

103. Wahl, P.; Anker, C.; Traynelis, S.; Egebjerg, J.; Jesper S.; Rasmussen, P.; Antagonist Properties of a Phosphono Isoxazole Amino Acid at Glutamate R1–4 (R,S)-2-Amino-3-(3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolyl)propionic Acid Receptor Subty Molecular pharmacology 1998, 53:590–596.

104. Sibille, P.; Lopez, S.; Brabet, I.; Valenti, O.; Oueslati, N.; Gaven, F.; Goudet, C.; Bertrand, H. O.; Neyton, J.; Marino, M. J.; Amalric, M.; Pin, J. P.; Acher, F. C., Synthesis and biological evaluation of 1-amino-2- phosphono methyl cyclopropane carboxylic acids, new group III metabotropic glutamate receptor agonists. J Med Chem 2007, 50 (15), 3585-95.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

II.5.2.1.3 oxadiazolidine-3,5-dione.

O HN O NH O

1,2,4-oxadiazolidine-3,5-dione Figure 18. Structure. Le groupe de bioisostère de 1,2,4 oxadiazolidine-3,5-dione est trouvé dans l’acide quisqualique, un composé isolé dans les graines de diverses variétés de chinesis de Quisqualis, Q.indica, et Q.fructus105. Il s'avère que les propriétés biologiques du quisqualamine sont semblables à celles du neurotransmetteur acide ɤ-aminobutyrique GABA (Figure 19)106. pKa2,26 NH2 O O HN NH2 OH N O O pKa2,16

Figure 19. Quisqualamine (à gauche) et GABA (à droite).

Des composés contenant 1,2,4 oxadiazolidine-3,5-dione se sont avérés très activés en tant qu'agents anti-hyperglycemiques107,108. L’hypothèse qui a motivé le remplacement de la fonction carboxylique par la fonction 1,2,4- oxadiazolidine-3,5-dione est que ces deux fonctions possèdent des propriétés acides semblables et le fait qu’elles pourraient produire des effets biologiques similaires.

105. (a) Takemoto, T.; Koike, K.; Nakajima, T.; Arihara, S., [Studies on the constituents of Quisqualis fructus. III. synthesis of quisqualic acid and the related compounds (author's transl)]. Yakugaku Zasshi 1975, 95 (4), 448-52; (b) Takemoto, T.; Nakajima, T.; Arihara, S.; Koike, K., [Studies on the constituents of Quisqualis Fructus. II. Structure of quisqualic acid (author's transl)]. Yakugaku Zasshi 1975, 95 (3), 326-32; (c) Takemoto, T.; Takagi, N.; Nakajima, T.; Koike, K., [Studies on the constituents of Quisqualis Fructus. I. On the amino acids (author's transl)]. Yakugaku Zasshi 1975, 95 (2), 176-9.

106. Evans, R. H.; Francis, A. A.; Hunt, K.; Martin, M. R.; Watkins, J. C., Quisqualamine, a novel gamma- aminobutyric acid (GABA) related depressant amino acid. J Pharm Pharmacol 1978, 30 (6), 364-7. 107. Malamas, M. S.; Millen, J., Quinazoline acetic acids and related analogues as aldose reductase inhibitors. J Med Chem 1991, 34 (4), 1492-503.

108. Malamas, M. S.; Sredy, J.; McCaleb, M.; Gunawan, I.; Mihan, B.; Sullivan, D., Antihyperglycemic activity of new 1,2,4-oxadiazolidine-3,5-diones. Eur J Med Chem 2001, 36 (1), 31-42.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

II.6 Paramètres chimiques et biologiques qui ont été à la base de la conception des nouveaux modèles de molécules neuroprotectrices.

II.6.1 Les gangliosides.

Les gangliosides GM1 (II3 NeuAc-GgOsc4Cer), (Figure 20) sont des composants majeurs du feuillet externe de la membrane cellulaire au niveau du système nerveux central109. Les gangliosides GM1 ont des propriétés protectrices vis-à-vis de l’agression in vivo des cultures de neurones granulaires de cervelet et in vitro pour des modèles encéphaliques de lésion ischémique, toxique ou traumatique. GM1 a un effet protecteur in vitro sur les cultures de neurones subissant une agression excitotoxique et une privation d’oxygène110.

Figure 20. Structure de GM1 (monosialotetrahexosylganglioside). Cet effet protecteur existe également in vivo dans des modèles d’ischémie neuronale, en particulier traumatique. Cet effet parait lié à la promotion de la signalétique de survie intracellulaire, à la réduction du calcium intracellulaire, à la diminution de production du monoxyde d’azote, et aux effets anti-oxydants et anti-inflammatoires. A partir des travaux publiés par Hadjiconstantinou et al111, les gangliosides GM1ont des effets antineurotoxiques, neuroprotecteurs et les propriétés neurorestoratrices sur les divers neurotransmetteurs du SNC mais pour le moment ils n’ont pas des valeurs thérapeutiques en raison de leurs manques de biodisponibilité et de leurs manques de perméabilité de la barrière hématoencéphalique.

109. Van Echten, G. and Sandhoff, K. Ganglioside metabolism. Enzymology, topology and regulation. J. Biol. Chem. 1993, 5341–5344.

110. M. Hadjiconstantinou, N.H.; Neff, GM1 ganglioside: in vivo and in vitro trophic actions on central neurotransmitter systems, J. Neurochem 1998, 70.1335–1345.

111. Hadjiconstantinou, M.; Neff, N. H., GM1 ganglioside: in vivo and in vitro trophic actions on central neurotransmitter systems. J. Neurochem 1998, 70 (4), 1335-45.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

II.6.2 Les acides gras.

II.6.2.1 Introduction.

Les acides gras appartiennent à la classe des lipides et sont présents chez tous les êtres vivants. Les acides gras sont principalement estérifiés à des alcools comme le glycérol, la sphingosine ou le cholestérol. De petites quantités se retrouvent sous forme d’acides gras non estérifiés, désignés sous le terme d’acides gras libres. Les acides gras ont au moins quatre rôles physiologiques majeurs 112: Rôle structural: entre dans la composition des membranes neuronales. Rôle énergétique: carburant énergétique essentiel pour de nombreux types cellulaires. Précurseurs des eicosanoïdes: prostaglandines et leucotriènes. Rôle de médiateur: régulation de la transmission membranaire du signal. II.6.2.2 Structures et nomenclatures des acides gras.

Les acides gras sont des acides organiques possédant une longue chaîne hydrocarbonée. Ils se distinguent par leurs nombres de carbones et de doubles liaisons. Les acides gras trouvés dans les graisses naturelles sont des dérivés à chaînes linéaires et contiennent un nombre pair d’atomes de carbone car ils sont synthétisés à partir d’éléments à 2 carbones. La numérotation de la chaîne carbonée part du carbone du groupement carboxyle (carbone n°1). L’atome adjacent au carbone carboxylique (n° 2) est aussi connu comme étant le carbone α. L’atome de carbone n° 3 est le carbone β et le carbone méthylique terminal est connu sous le nom de carbone ω ou carbone n.

Groupe carboxylique (acide) Numérotation des carbones à partir du groupe carboxyle

2 OH OH 3 1 n n Chaîne hydrocarbure O O

les carbones 2,3 et le dernier sont appelés respectivement alpha beta et omega

Figure 21. Structures et nomenclatures des acides gras.

112. Bourre, J.M.; Dumont,O.; Piciotti, M.; Clement, M.; Chaudiere,J.; Bonneil, M., Nalbone,G. ; Lafont,H.; Pascal, G.; Durand, G.; Essentiality of omega 3 fatty acids for brain structure and function. World Rev Nutr Diet 1991 66, 103-117.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Le nom d’un acide gras est formé à partir du nom de l’hydrocarbure à même nombre d’atomes de carbone suivi du suffixe anoïque pour les acides gras sans double liaison et par énoïque pour les acides gras avec double(s) liaison(s). La position de la première double liaison est toujours comptabilisée à partir de l’extrémité méthyle. Pour tout acide gras polyinsaturé (AGPI), les doubles liaisons sont toujours espacées d’un groupe méthylène et le sens de la désaturation est toujours réalisé en direction du groupe carboxyle. Diverses conventions sont utilisées pour indiquer le nombre et la position de la ou des doubles liaisons.

Figure 22. Nomenclature des acides gras.

II.6.2.3 Propriétés physico-chimiques des acides gras.

Les chaînes carbonées des acides gras saturés adoptent une conformation linéaire. A basses températures, cette chaîne est en extension. A températures plus élevées, quelques liaisons pivotent causant un rétrécissement de la chaîne ce qui explique pourquoi les membranes s’amincissent avec l’augmentation de la température. En ce qui concerne les acides gras insaturés, il existe des isomères géométriques d’acides gras, c’est-à-dire que pour un acide gras insaturé donné, un groupement carbonyle peut s’orienter différemment autour de l’axe de double liaison. Les acides gras insaturés naturels sont presque tous de configuration cis. La molécule forme un repli de 120 °C au niveau du site de la double liaison. Ainsi, l’OA, 1 liaison cis, prend la forme L tandis que l’acide élaïdique, son isomère, demeure rectiligne à l’endroit de sa double liaison trans. L’accroissement du nombre de doubles liaisons cis dans un acide gras amène la molécule à adopter une diversité de configurations spatiales.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Figure 23. Conformation linéaire d’un acide gras saturé (a), configuration cis d’un acide gras mono- (b) et polyinsaturé (c), configuration trans d’un acide gras insaturé (d) et isomères géométriques (b, d).

II.7 Le choix de la conception des nouvelles molécules à propriétés neuroprotectrices.

L’idée majeure du projet de recherche était de concevoir des petites molécules capables d’imiter ou de mimer ces gangliosides GM1 sans qu’elles ne soient dégradées avant d’atteindre leurs cibles biologiques. Nous avons simplifié ces structures en couplant les acides gras saturés et insaturés qui constituent la partie hydrophobe liée à une partie hydrophile.

OH O

N une chaîne lipophile saturée H - COOH ou insaturée -P(O)(OH)2 -Tetrazolyl

Figure 24. La structure simplifiée de « GM1-like » analogue.

Plusieurs analogues portant les chaînes grasses saturées, cycliquées et polyinsaturées (stéarique, linoléique, linolénique, arachidonique, docosahexaénoïque, rétinoïque…) ont été décrits comme renfermant des propriétés neuroprotectrices. Ces analogues simplifiés des GM1 pouvaient être vus comme constitués d’une partie hydrophobe (chaînes saturées ou insaturées) reliée à une partie hydrophile (fonction carboxylique ou osidique pour les GM1) par différents types de liaisons.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

L’idée qui a prévalu dans l’élaboration de ces modèles moléculaires, est l’étude de l’influence des paramètres structuraux suivants : La nature de la partie hydrophobe (chaîne grasse hydrocarbonée), La nature de la partie hydrophile (fonction bioisostère de la fonction carboxylique), La nature de la liaison entre ces deux parties hydrophile et hydrophobe sur l’activité neuroprotectrice des modèles résultants. A cet effet, nous avons introduit des chaînes grasses insaturées, en remplacement des chaînes saturées. Dans la mesure où une des conditions essentielles pour que ces composés présentent une activité neuroprotectrice, était leur facilité de perméation dans les différents tissus neuronaux qu’ils doivent protéger. Il était nécessaire que ces dérivés présentent une excellente perméation de la BHE. Lors de travaux antérieurs le Pr Jean Louis Kraus a montré qu’à partir de modèles de membrane de vésicules de dihexadecyl phosphates encapsulant un chromophore contenant un complexe du Ruthénium, la nature d’un agent perméable possédant une chaîne saturée ou insaturée influençait de manière très sensible les propriétés de la perméation des acides ou alcools gras résultants113.

Tableau 13 -Valeurs des Perméations (PD50) des acides carboxyliques saturés et insaturés à travers de membranes de vésicules de dihexadecyl phosphates et Leurs LogP 119. Nom Structure Valeurs des blogP

a -1 PD50 (M l )

-2 Acide stéarique CH3(CH2)16COOH 0,90.10 8,21 ± 0,18

-2 Acide arachidique CH3 (CH2)18COOH 0,90.10 9,27 ± 0,18

-2 Acide béhénique CH3 (CH2)20COOH 0,90.10 10,34 ± 0,18

-2 Acide lignocérique CH3 (CH2)22 COOH 0,90.10 11,40 ± 0,18 Acide linoléique 0,04.10-2 7,18 ± 0,25 COOH Acide arachidonique COOH 0,02.10-2 6,91 ± 0,41

a • PD50 est déterminé à partir du spectromètre Kontron 860 (Kontron/ Instrument Division) • blogP est déterminé en utilisant ACD (Advanced Chemistry Development, Inc.)

113. Pernice, P.; Castaing, M.; Menassa, P.; Kraus, J. L., A comparative study of the permeation of dihexadecyl phosphate vesicles by various carboxylic acids and some of their tetrazole analogues. Biophys Chem 1988, 32 (1), 15-20.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Comme le montrent les résultats indiqués dans le tableau 13, la perméation membranaire induite par les acides gras ne dépend pas uniquement de l’hydrophobicité des composés (les valeurs des logP calculées à partir du logiciel ACD/Labs de ces différents analogues étant relativement proches) mais également de paramètres conformationnels. Les chaînes insaturées, par leurs structures relativement plus contraintes que celles de leurs homologues saturés, provoquent des perturbations plus importantes de la membrane. Des pores peuvent se créer favorisant ainsi des échanges intramembranaires. Ainsi on peut observer une différence de deux ordres de magnitude entre la perméation induite par les chaînes saturées et celle induite par les chaînes insaturées. Les analogues à chaînes insaturées étant les plus perméantes. Ces résultats de perméation membranaire obtenus à partir de modèles de vésicules, nous ont conduits à concevoir de nouveaux analogues originaux dans lesquels diverses chaînes grasses insaturées ont été introduites sur la fonction aminée de la sérine, tyrosine et cystéine par rapport aux travaux publiés sur les propriétés neuroprotectrices de dérivés analogues à chaîne saturées114. Pour les besoins de comparaison des activités neuroprotectrices des nouveaux dérivés, nous avons également synthétisés les analogues à chaînes grasses saturées. II.8 Evaluations biologiques des composés.

Une autre partie de notre projet de recherché a consisté à réaliser des tests d’évaluation des propriétés neuroprotecteurs de quelques uns de nos produits synthétisés sur les cellules HT22 et sur les tissus des cerveaux de rats. Nous avons essayé d’identifier le mode d’action des nos composés sur les cibles biologiques sur lesquelles nous avons testé l’activité des molécules synthétisées, pour cela nous avons réalisé les tests sur les voies de signalisations qui sont impliqués dans l’ischémie cérébrale en savoir l’excès du glutamate, GSH, ATP et les MAPKs.

114. Wang, Z. J.; Li, G. M.; Tang, W. L.; Yin, M., Neuroprotective effects of stearic acid against toxicity of oxygen/glucose deprivation or glutamate on rat cortical or hippocampal slices. Acta Pharmacol Sin 2006, 27 (2), 145-50.

Chapitre II : Présentation du Projet de Recherche

Chapitre III: Partie chimique

CHAPITRE III: PARTIE CHIMIQUE

Chapitre III: Partie chimique

III.1 Les molécules ciblées.

Ce chapitre chimique porte sur la partie synthèse des composés portant une chaîne lipophile saturée ou insaturée couplée à une partie hydrophile. Dans un premier temps, nous décrirons la synthèse des intermédiaires requis pour l’élaboration d’une chimiothèque focalisée de composés à activité neuroprotectrice puis nous aborderons la partie synthèse relative à l’obtention des molécules ciblées finales. La synthèse d’intermédiaires spécifiques sera aussi décrite. La conception des nouveaux dérivés découle d’une analyse bibliographique sur les agents neuroprotecteurs déjà décrits, qui nous a conduit à proposer une structure simplifiée qui contient les parties structurales essentielles : une partie hydrophile comprenant une fonction acide carboxylique ou des fonctions isostère (Tétrazole ou Acide phosphonique) ou tout autre motif hydrophile (Oxadiazolidione, Oxadiazinanedione). Une partie hydrophobe constituée par une chaîne grasse saturée ou insaturée. Les deux parties peuvent être liées ou non liées entre elles par un espaceur (Linker) au moyen de différentes fonctions (amide, ester, ou autres). La figure ci-dessous résume la structure générale des composés cibles.

Chaîne hydrophobe Y saturéeou insaturée Linker X Fonction hydrophile

XetY:Fonctionamideouester

Figure 25. La structure générale des composés cibles.

III.1.1 Analogues portant des résidus sérine, cystéine et tyrosine couplés à des chaînes grasses saturées ou insaturées.

Les résidus aminoacides sérine, tyrosine et cystéine ont été choisis pour les fonctions latérales qui confèrent une hydrophilicité accrue en même temps que des possibilités de liaisons hydrogènes avec des récepteurs biologiques. Dans un premier temps, nous décrirons l’analyse rétrosynthétique des molécules ciblées puis les schémas de synthèse utilisés pour obtenir ces molécules ciblées. (Figure 26)

Chapitre III: Partie chimique

OH OH SH O O O OH OH OH R N R N R N H H O H O O R = Chaîne grasse saturée ou insaturée

Figure 26. Molécules ciblées analogues portant des résidus sérine, cystéine et tyrosine.

III.1.1.1 Analyse rétrosynthétique.

L’analyse rétrosynthétique se fait en deux étapes (Schéma 1):

La molécule cible résulte de la saponification de la partie ester d’éthyle. La deuxième déconnection envisagée se fait au niveau de la fonction amide.

X,Y,Z X,Y,Z X,Y,Z O O O C-N amide OH O O R N R N R OH + H2N H O H O O

R = Chaîne grasse saturée X= OH , Y= OH , Z= S ou insaturée

Schéma 1

III.1.1.2 Couplage des acides gras sur la fonction amine des acides amines.

X,Y,Z X,Y,Z X,Y, Z O O i O O ii OH HCl. H2N R N R N H O O H O

X=OH, Y= OH , Z= S

i : RCOOH, DCC/HOBt, N-méthylmorpholine, CH2Cl2, 0 °C à température ambiante ii: LiOH. H O,EtOH/H O(3:1). 2 2 Schéma 2

Chapitre III: Partie chimique

Développées principalement en synthèse peptidique, les techniques de couplage permettant d’acyler les amines sont nombreuses et variées115. Parmi ces méthodes d’acylation de la fonction carboxylique, l’estérification par les carbodiimides, les anhydrides mixtes ou les N-hydroxysuccinimides sont souvent les plus employées, ces méthodes permettent d’activer les acides. Les carbodiimides représentent une famille de composés chimiques de formule générale R-N=C=N-R’, dont la stabilité dépend des groupements R et R’ présents et dont la réactivité est liée à leur caractère insaturé. Le carbodiimide le plus utilisé en synthèse organique est le dicyclohexylcarbodiimide (DCC). La dicyclohexylurée (DCU), produit de la réaction, est insoluble et précipite dans la plupart des solvants. Les réactions des carbodiimides avec les acides carboxyliques sont particulièrement intéressantes 116 en particulier pour l’obtention de dérivés amides lors du couplage d’acides carboxyliques avec des amines.

N N N N O N O N - N - N C N N P PF P PF6 N 6 N N N

BOP PyBOP DCC

Figure 27. Quelques structures des agents de couplage. Pour réaliser ces réactions de N-acylation, nous avons fait réagir la fonction amine de l’ester de la L- sérine, L-cystéine(protégée par un groupement benzyl (Bzl)) et la L-tyrosine avec la fonction carboxylique de différents acides gras saturés ou insaturés en présence de l’agent de couplage DCC. D’autres méthodes faisant appel à d’autres agents de couplage peptidique (comme BOP ou le PyBOP (Figure 27) auraient pu être également utilisés. Nous avons choisi d’utiliser le couple DCC/HOBt. En effet le groupement activateur HOBt (N-hydroxybenzotriazole) permet d’accélérer la formation de l’espèce activée, qui réagit avec les amines pour former la liaison amide. Les rendements du couplage souvent faibles s’en trouvent améliorés. Les composés obtenus et les rendements sont présentés dans les tableaux suivants :

115. Bodanszky, M.B. A, The practice of peptide synthesis. 1994 ; 2nd edition. Springer- Verlag : Berlin Heildelberg.

116. Khorana, H.G., The chemistry of carbodiimides. Chem.Rev. 1953, 53,145.

Chapitre III: Partie chimique

Tableau 14. Résultats des analogues portant le résidu sérine, couplés à des acides gras.

N° Structure Rdt %

1 H O 42 N O O OH

3 H O 30 N O O OH

5 H O 43 N O O OH

7 H O 30 N O O OH 9 54 H O N O O OH 11 50

H O N O O OH 13 OH 60 O OH O N H O O

15 OH 41 O O N H OH O

Chapitre III: Partie chimique

Tableau 15. Résultats des analogues portant le résidu tyrosine couplés à des acides gras.

18 H O quantitatif N O O

OH 20 quantitatif H O N O O

OH 22 H O quantitatif N O O

24 21

H O N O O

Chapitre III: Partie chimique

Tableau 16. Résultats des analogues portant le résidu cystéine couplés à des acides gras. 26 H O quantitatif N O O S

28 86 H

O H N O O S

La formation d’une liaison amide entre une fonction amine et une fonction acide carboxylique implique deux étapes :

La première étape consiste en l’activation de la fonction carboxylique de l’acide par la formation d’un ester activé. (addition/élimination)

La seconde étape correspond à l’attaque nucléophile du dérivé amine sur le groupement carbonyle activé. Cette étape d’attaque nucléophile dépend à la fois de la nature de l’espèce activée ainsi que de la nature du nucléophile impliqué. Le mécanisme réactionnel de cette réaction de couplage est le suivant :

O N N O B BH O H R O N Etape1 HN N R OH R O N C N OH Ester activé DCC N N N X,Y,Z OH O O H H NH2 + N C N O O R O R N N O H Etape 2 O Z,Y,X O N N Amide DCU B= Base X=OH, Y= OH , Z= S R= Chaîne alkyle saturée ou insaturée

Schéma 3

Chapitre III: Partie chimique

L’activation est amorcée par une substitution nucléophile par l’entité benzotriazole à l’aide du DCC avec génération de l’espèce ester activé, l’attaque nucléophile de l’amine sur cet ester activé conduit alors à l’amide attendu, en libérant la molécule de l’ Hydroxybenzotriazole (HOBt). Remarque : Nous avons observé qu’il n’était pas nécessaire de protéger la fonction hydroxyle de la sérine, et de la L-tyrosine, en effet seule la réaction de N-acylation était observée, aucun produit d’O- acylation de la sérine et de la tyrosine n’a été isolé dans les conditions opératoires. III.1.1.3 Saponification de la fonction ester.

La dernière étape implique la saponification de la fonction ester. Pour cela nous avons effectué une saponification en utilisant l’hydroxyde de lithium monohydrate dans un mélange éthanol/eau (3/1) à température ambiante. Les rendements et la durée de cette réaction de saponification sont améliorés par rapport à l’utilisation classique de la soude. (Tableau 17) La réaction se fait en milieu basique pour obtenir l’acide carboxylique correspondant (Schéma 4)

X,Y,Z X,Y,Z X,Y, Z O O O Li OH OH O O OH R N R N R N H O H O H O Li

X=OH, Y= OH , Z= S R= Chaîne grasse

Schéma 4 Tableau 17. Résultats de la saponification (Analogues portant le résidu sérine).

N° Structure Rdt %

2 H O 81 N OH O OH

4 H O 64 N OH O OH

6 H O 75 N OH O OH

Chapitre III: Partie chimique

8 H O quantitatif N OH O OH 10 98 H O N OH O OH 12 71

H O N OH O OH 14 OH 71 O OH OH N H O O Tableau 18. Résultats de la saponification (Analogues portant le résidu tyrosine).

19 H O quantitatif N OH O

21 H O quantitatif N OH O

23 H O 42 N OH O

Chapitre III: Partie chimique

25 66

H O N OH O

Tableau 19. Résultats de la Saponification (Analogues portant le résidu cystéine).

27 H O 94 N OH O S

29 16 H

O H N HO O S

Dans cette première partie, nous avons élaboré une « mini-chimiothèque » de différents acides gras couplés directement sans la présence de linkers avec des résidus sérine, cystéine et tyrosine. Nous avons utilisé des méthodologies de synthèse standards appropriées, en tenant compte du choix des groupements protecteurs, des agents de couplage adaptés, sans avoir nécessairement cherché à optimiser les rendements et faire l’analyse stéréochimique des molécules, l’objectif prioritaire demeurant l’obtention des produits désirés.

Chapitre III: Partie chimique

III.1.2 Analogues bioisostères de la fonction carboxylique.

III.1.2.1 La synthèse des bioisostères tétrazoles.

L’intérêt principal du remplacement de la fonction carboxylique par une fonction tétrazole sur les molécules vient d’une part : De leur acidité voisine de celle de leur homologue acides carboxyliques : le pKa de la perte du proton de NH pour donner un anion est d’environ 5, (L’anion est stabilisé par mésomérie). De leur géométrie spatiale plane. De leur stabilité métabolique, en particulier vis-à-vis à des oxydations microsomales dépendantes du cytochrome P450. Cette fonction tétrazole résistant aux décarboxylases, permet une meilleure rémanence métabolique des composés la renfermant dans leurs structures. Pour réaliser cette synthèse, différentes stratégies basées sur une analyse rétrosynthétique et sur des références bibliographiques ont été envisagées afin d’aboutir à la molécule clée.

III.1.2.1.1 Analyse rétrosynthétique.

N N N N N N N NH N NH N NH O O O OH O O + R N R N H2N R OH H H O O 35 34 31

N N N NH CN HO O +NaN NN HO O N N O O A30 Schéma 5

Cette voie de synthèse comporte quatre étapes. La première étape est une réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire qui permet la transformation de 2-oxime cyanoglyoxylate d’éthyle (A) et de l’azoture de sodium en acide 2-tétrazol-5-yl-2-oximino-acétique 30, suivie d’une réaction de la réduction d’une fonction oxime pour conduire au composé aminé correspondant α-amino α-tétrazolacétate d’éthyle.

Chapitre III: Partie chimique

La troisième étape fait appel au couplage entre l’acide gras sélectionné et le substrat aminé précédent 31 qui conduit à l’intermédiaire 34. La fonction ester de ce dernier est ensuite réduite en fonction alcool correspondante, pour aboutir au produit final 35.

III.1.2.1.2 Synthèse.

La méthode de synthèse de l’analogue 35 portant le motif tétrazole est la suivante : la première étape consiste à faire réagir le cyanoglyoxylate oxime d’éthyle avec azidure de sodium pour obtenir l’acide 2-tétrazol-5-yl-2-oximinoacétique avec 39% de rendement. L’oxime 30 réduite par hydrogénation catalysée par le palladium sur charbon conduit à l’amine correspondante avec de rendement quantitatif. L’étape suivante de couplage entre l’acide linoléique et le composé 31 a été réalisée dans un mélange de chloroformate d’éthyle et de pyridine à 0 °C, elle permet l’obtention de l’amide correspondante avec 47% de rendement pour le composé 34. La réduction par le borohydrure de sodium (NaBH4) de la fonction ester de ce dernier, conduit au produit final 35 avec 34% de rendement.

NN NN CN N NH ii N NH HO O i N HO O O O N H2N O .HCl O 30 31 iii

NN NN N NH N NH O O iv O OH R N R N H H O 35 34 34 et 35 R= Linoléyl

(i) NaN3 (10eq),DMF,70°C;(ii)Pd(OH)2/C, H2 (1 atm), MeOH, 3N HCl à température ambiante; (iii) acide gras, chloroformate d'éthyle, pyridine, CH2Cl2, à température ambiante ; (iv) NaBH4, LiCl,THF/EtOH(1:2), à température ambiante.

Schéma 6

Chapitre III: Partie chimique

III.1.2.1.3 Mécanisme réactionnel.

Une analyse des données de la littérature sur la synthèse de fonctions tétrazoles montre que dans la majorité des cas, la fonction tétrazole est obtenue à partir d’un précurseur nitrile117. Le mécanisme réactionnel, est donné dans le schéma 7.

OH R OH OH N R N N N HN N N NH C N HNR3 H N H Na N O N N O + N3 N N O N O N O O O N 30 O

imidoyl d'azoture

Schéma 7

La fonction oxime du composé 30 est hydrogénée en son amine correspondante dans les conditions classiques d’hydrogénation catalytique. Celle-ci est réalisée dans le méthanol sous atmosphère d’hydrogène en présence du catalyseur

118 Pd(OH)2 selon des protocoles expérimentaux décrits dans la littérature .

Pd(OH)2 R-CH=N-OH + H2 R-CH2-NH2 MeOH

Schéma 8

L’amine a été obtenue sous forme de chlorhydrate par précipitation dans une solution d’acide chlorhydrique dans l’éther éthylique, j’obtiens le dérive correspondant 31119. La 3ème étape de la synthèse consiste en un couplage peptidique entre les dérivés aminés obtenus et les différents acides gras saturés ou insaturés. Pour réaliser cette réaction de couplage j’ai d’abord essayé la méthode de couplage classique DCC/HOBt, sans succès et j’ai opté pour la méthode d’activation in situ de la fonction carboxylique par le chloroformâtes d’éthyle pour former l’intermédiaire activé sur lequel est

117. Himo, F.; Demko, Z. P.; Noodleman, L.; Sharpless, K. B., Mechanisms of tetrazole formation by addition of azide to nitriles. J Am Chem Soc 2002, 124 (41), 12210-6.

118. Winans et Adkins, Hydrogénation catalytique des composés éthyléniques et azotés en présence du nickel de raney J.Am.Chem.Soc., 1933-55-4169.

119. Winans, C. F., Formation of a large alcohol bead. Science 1939, 90 (2339), 394-395.

Chapitre III: Partie chimique ensuite condense le substrat aminé. Dans un premier temps, je prépare cet intermédiaire active de l’acide gras que je veux coupler à la fonction amine ; par réaction du chloroformâtes d’éthyle sur l’acide gras en présence d’une base pyridine puis j’additionne les substrats aminés précédemment préparés et j’ai obtenu les dérivés amides correspondants. (Schéma 9)

O N N H N N NH O O Cl O Cl O O N O R OH R O R O O + H2N O

R=Acidegras N N N NH O O R N H O

Schéma 9 La dernière étape de cette synthèse consiste à réduire la fonction ester en alcool correspondant, pour ce faire on a eu recours à la méthode du borohydrure de sodium pour réduire sélectivement la fonction ester sans réduire la fonction amide120. Dans ces conditions douces, la réaction chimiosélective est lente mais a permis l’obtention de l’alcool attendu. Les sels de bore et sodium soluble dans l’eau sont facilement élimines pendant l’extraction. Le mécanisme réactionnel de cette réaction de réduction est le suivant:

120. Su-Dong, C.; Yong-Dae P.; Jeum-Jong, K.; Falck, J. R.; Yong-Jin, Y.; Facile Reduction of Carboxylic Acids, Esters, Acid Chlorides, Amides and Nitriles to Alcohols or Amines Using NaBH4/BF3·Et2O. Bull. Korean Chem. Soc. 2004, Vol. 25, No. 3

Chapitre III: Partie chimique

Na O H HOEt O Na R N H O O H R N H NaBH4 O R N O H B H O N EtOH O H NH H N NH O N N N N N NH N N

R=Acidegras Na BH3 Na BH H OH R H O H O 3 H O R N N R N H H+ R N H H H H H B H O H O H O H N N N O N H NH NH NH N NH N N N N N N N

Schéma 10

III.1.2.2 Synthèses des composés bioisostères phosphoniques.

Ce paragraphe est consacré aux voies de synthèse des acides N-alkylamidoéthyl- phosphoniques et des acides N-alkylamido-2-hydroxyéthyl-phosphoniques. En particulier la synthèse des molécules cibles dont les structures sont données dans la figure 28 nous décrirons les voies de synthèses générales permettant d’accéder à ces molécules.

H N OH P OH O O 2-Stéaramidoéthyl-phosphonique 36 H N OH P OH OH O O O OH 2-Abietylamidoéthyl- OH N P phosphonique 37 H O Stéaramido-2-hydroxyéthyl-phosphonique 41

Figure 28. Molécules ciblées : bioisostères phosphoniques.

III.1.2.2.1 Synthèse des acides N-alkyl-amidoéthyl-phosphoniques.

Les synthèses sont réalisées en trois étapes :

La première étape consiste en la préparation des anhydrides mixtes des acides gras correspondants.

Chapitre III: Partie chimique

La seconde étape requiert la protection des groupements hydroxyles de l’acide aminophosphonique. La troisième étape est la déprotection qui conduit aux produits finaux. Afin de réaliser les réactions de N-acylation désirées, nous avons utilisé deux acides carboxyliques : l’acide stéarique et l’acide abiétique. La synthèse d’anhydride mixte s’effectue facilement en présence d’un chlorure d’acide ou par échange d’anhydrides. Pour réaliser une acylation sélective, il est préférable que le chlorure d’acide ou l’anhydride utilisé ait un encombrement stérique important pour favoriser une réaction d’acylation sélective en faveur de l’acide carboxylique. Pour obtenir ces anhydrides mixtes, nous avons fait réagir les acides carboxyliques en présence de triméthylamine, du chlorure de 4-méthoxy benzoyle et l’acétate d’éthyle comme solvant. Les rendements des produits isolés sont bons, 80-90%. Dans un second temps la protection de deux fonctions hydroxyles de l’acide aminophosphonique est réalisée par le réactif hexaméthyldisilazane.

Les anhydrides obtenus et le substrat protégé sont directement couplés en milieu basique (Et3N) pour obtenir les molécules finales 36 et 37 avec des rendements indiqués dans le tableau ci-dessous.

Tableau 20. les résultats obtenus de la molécule 36 et 37.

N° Structure Rdt % 36 H 80% N OH P OH O O 37 quantitatif

H N OH P OH O O

Le Schéma de synthèse est le suivant :

Chapitre III: Partie chimique

O OSiMe3 P i Me 3SiO NHSiMe3 H2N OH P OH O A

O O O O O ii iii P R OH R O R N OSiMe3 SiMe 3 OSiMe3 OCH3

O O 36.R=stéaryl P R N OH 37. R = abiétyl H OH 36et 37

i) hexaméthyldisilazane, 150 °C, 2-5 h ; ii) 4-méthoxy Chlorule de benzoyle, Et3N, -5 °C, 1h ; iii) N,O,O-triméthylsilylamino phosphonate d'éthyl A, -5 °C, 2 h, 20 °C, 2h, 80 °C ; iv) aq.NaHCO ,10 % aq HCl à pH 2 3 Schéma 11

III.1.2.2.2 Synthèse des acides N-alkylamido-2-hydroxyéthyl-phosphonique.

Différentes stratégies basées sur une analyse retrosynthétique ont été envisagées enfin d’aboutir à la molécule clée 41 celle qui a été choisi est la suivante :

O O HO OH O O O O O P O P O O O O O P P O OH OH O O R N R N H N H H R N 2 + R OH H O O 41 40 39 38

O O O P O BocHN O

Schéma 12

Chapitre III: Partie chimique

La méthode proposée s’effectue simplement à partir du couplage peptidique entre l’acide stéarique avec le fragment 38, ce lui-ci a été obtenu à partir de la déprotection du ±Boc-α-phosphonoglycine triméthyl ester commercialement disponible. La fonction ester du produit de couplage obtenu 39 est réduite par borohydrure de sodium pour donner l’alcool correspondant 40, enfin la déprotection (par le

121 réactif ISiMe3) de la fonction phosphonique conduit au motif final souhaité 41.

III.1.2.2.2.1 Les méthodes de synthèses envisagées.

Pour obtenir la molécule souhaitée, plusieurs voies de synthèse ont été envisagées. La première méthode de synthèse consiste en l’amination du diméthylphosphonoacetate d’éthyle122. Cette réaction devait être réalisée à partir du mécanisme réactionnel qui comportait trois étapes : Addition d’hydrure pour générer le carbanion, Addition de l’anion azoture, pour former un intermédiaire diazo, La transformation de ce dernier en groupement aminé après une hydrogénation, puis cette méthode a du être abandonnée, lors de cet étape d’hydrogénation catalytique de l’intermédiaire diazonium123,124. Le mécanisme réactionnel est le suivant (Schéma 13):

121. Charles, F.; Schwender; Scott, A.; Beers, E.; Malloy, K.; Demarest, L.; Minor, K.H.W.; Lau1-Naphthyl methyl phosphonic acid derivative as osteoclastic acid phosphatase inhibitors Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,1995, Vol. 5, No. 16, pp. 1801-1806.

122. Ptzold, G., Henning, G.H. Naturwissenschaften 1967, 54, 469

123. Freifelder, M.; Anderson, T.; Ng, Y. H.; Papendick, V., Catalytic Hydrogenation of Acetophenone. J Pharm Sci 1964, 53, 967.

124. Freifelder, M.; Ng, Y. H.; Helgren, P. F., Some Catalytic Hydrogenations in the Presence of Aryl Chloride. J Med Chem 1964, 7, 381-2.

Chapitre III: Partie chimique

1/2H O O 2 O O O O O O N NN O P P P O O O O O O H H N2 H ,Pd(OAc) HNa 2 2

O O Na O O O O P P O O O O NH2

Schéma 13 La deuxième stratégie implique la formation du carbanion du substrat 2-tert- butoxycarbonylamino propanoate de méthyle par l’hydrure de sodium dans du diméthoxy-1,2 éthane anhydre DME. Sur lequel on fait réagir du diméthyle de chlorophosphate fraîchement distillé. On n’a constaté aucune évolution de la réaction même après un chauffage prolongé.

O HNa O O O O H H O O P O O P O O N O N O O O N H Cl H O O H O

Schéma 14 Nous avons finalement opté pour la méthodologie décrite dans le schéma 15. A partir du dérivé commercial la ± Boc -α-phosphonoglycine triméthyl ester, le composé non déprotégé n’étant pas commercialement disponible est déprotégé de façon classique avec HCl dans l’éther et N-acylé par l’acide stéarique, selon la technique classique de couplage utilisant le DCC/HOBt. Après purification, le composé 39 a été isolé à 48% de rendements. La fonction ester de ce dernier est ensuite réduite par le borohydrure de sodium pour conduire à l’alcool correspondant 40 avec un rendement de 22%.

Chapitre III: Partie chimique

O O O O O O O O P O P O P O O O O O N i HCl H2N ii R N H O O H O 38 39

iii

OH O O O O O P OH iv O P OH OH R N R N H H R=stéaryl 41 40

(i) HCl dans l'ether; (ii) acide stéarique, DCC/HOBt, CH2Cl2, température ambiante; (iii) NaBH4, LiCl, THF/EtOH, température ambiante; (iv) le TMSI, CH2Cl2, température ambiante.

Schéma 15 La dernière étape consiste en la déprotection des groupements O-méthyle de l’ester phosphonique par le TMSI dans dichlorométhane le produit désiré 41 est obtenu avec de rendement raisonable. III.1.2.3 Synthèses de ((2R, 3R)-3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-2H-pyran-2-yl) stéarate de méthyle.

O O O O O HO MsO O O i ii R iii R O HO HO HO HO OH OH OH O 42 43 44 R=Stéaryl (i) MsCl, pyridine, CH2Cl2, 0 °C température ambiante; (ii) Acide stéarique, DCM, N-méthylmolpholine (iii) MnO2,CH2Cl2, température ambiante. Schéma 16 Le composé 44 a été synthétisé en trois étapes (Schéma 16). Lors de la première étape le substrat D-Glucal est O-mésylé en position 6, par le chlorure de mésyle en présence de pyridine, le composé mésylé correspondant 42 est obtenu avec 20% de rendement. La deuxième étape est une réaction de substitution nucléophile du groupement mésyle par un groupement stéaryle, qui s’effectue directement en présence de NMM (N-méthylmorpholine) dans le DCM, après purification le composé 43 est obtenu avec 80% des rendements. La dernière étape de la synthèse est une oxydation sélective de la fonction hydroxyle en position 4 du composé 43, pour donner le dérivé carbonylé correspondant 44. Cette oxydation est effectuée par

Chapitre III: Partie chimique

125 l’utilisation du catalyseur dioxyde de manganèse (MnO2) qui permet d’obtenir de rendement quantitatif.

III.1.2.3.1 Mécanisme réactionnel.

Les mécanismes réactionnels mis en jeu au cours des différentes étapes de la synthèse sont les suivants : Réaction de mésylation Le chlorure de méthanesulfonyle en présence d’une base, réagit facilement avec les alcools pour donner les dérivés méthanesulfonates correspondants. La première étape de cette réaction est une élimination de HCl qui conduit à un intermédiaire sulfène très réactif, qui réagit ensuite avec le groupement hydroxyle pour conduire au produit désiré. Notons que cette réaction à l’aide du chlorure de mésyle est différente de celle que l’on peut attendre par utilisation du chlorure de tosyle dans la mesure où, dans ce cas un intermédiaire de type sulfène ne peut être généré, aucun proton n’étant disponible. Le mécanisme suggéré de cette réaction d’O– acylations est représenté ci-dessous : - Formation des tosylate (Schéma 17)

H O R OH O O R S R S O O O O O S Cl

Schéma 17 Donc une fois l’étape de mésylation terminée, on réalise la réaction d’estérification avec l’acide stéarique. La synthèse est suivie par l’oxydation sélective du groupement hydroxyle situe sur la position 3126.

125. Brimacombe, J. S.; Tucker, L. C.; Da'aboul, I. Syntheses of L-vallarose (6-deoxy-3-O-methyl-L-altrose) and D-digitalose (6-deoxy-3-O-methyl-D-galactose). J Chem Soc Perkin 1 1971, 22, 3762-5.

126. Ainoliisa J.; Pihko, K.; Nicolaou, C.; Ari, M. P.; Koskinen, An expedient synthesis of D-callipeltose Tetrahedron: Asymmetry 2001,12 ,937–942.

Chapitre III: Partie chimique

III.1.2.4 Synthèses de N-Alkyl-1, 2,4-oxadiazolidine-3,5-diones, de N-Alkyl-3-thioxo-1, 2,4- oxadiazolidin-5-one et de N-Alkyl-1, 2,4-oxadiazinane-3,6-dione.

N° Structure

O 48 N O O NH

O 50 N O S NH O O 52 N O NH

O 57 N O O NH

O 62 N O O NH

O 64 N O S NH

O O 66 N O NH

Figure 29. Les molécules ciblées.

Pour réaliser la synthèse de ces différentes molécules ciblées nous avons élaboré le schéma rétrosynthètique (Schéma 18). Les alcools primaires sélectionnés sont oxydés en aldéhydes correspondantes en utilisant la méthodologie classique dite du réactif de Collins. Ces aldéhydes sont ensuite transformés en leurs oximes correspondantes en présence d’hydroxylamine, ces dernières sont réduites pour donner les dérivés hydoxylamines correspondantes. A partir de cette molécule intermédiaire N-alkylhydroxylamine, il est possible d’accéder aux molécules hétérocycliques désirées 3-thioxo-1,2,4-oxadiazolidin-5-one ; 1,2,4-oxadiazolidine-3,5-diones ou 1,2,4-oxadiazinane-3,6-dione.

Chapitre III: Partie chimique

O O O R N O R N X= O, S X NH O N H D B

X O O O R N N O R N N H OH H OH O C A

OH R N H

OH R N

O R H

R OH

Schéma 18 Le détail de la méthodologie de synthèse envisagée est donné dans le schéma 19. Suite à cette oxydation (utilisant Le réactif de Collins, le chlorochromate de pyridinium (PCC))127, les aldéhydes sont obtenus avec des rendements après purification compris entre 70-80%, et ils sont traités par l’hydroxylamine en présence de carbonate de sodium. Après recristallisation, on obtient des cristaux des oximes correspondantes. Les analyses CCM et la caractérisation par RMN 1H dans CDCl3 ont montré que pour chacune des oximes les deux isomères Cis et Trans étaient obtenues. La réduction de ces deux isomères par le cyanoborohydrure de sodium dans des conditions acides permet l’obtention des hydroxylamines accompagnées également des amines correspondantes montrant ainsi que la réduction des hydroxylamines est également possible.

127. Corey, E. J.; William, J.; Suggs pyrdinium chlorocromate.an efficient reagent for oxydation of primary and secondary alcohols to carbonyl compound Tetrahedron Letters 1975 31, 2647 – 2650.

Chapitre III: Partie chimique

O O O R N O vii R N N O H O NH OH iv O iii i ii OH OH R OH R H R N R N H R = Chaînegrasse vi v O O S O O R N vii O vii R N O R N N R N N O O N OH H O H S NH H OH

i) PCC, DCM anhydre; ii) NH2OH.HCl, 10 % NaOH, EtOH; iii) NaCNBH3, pH 3; iv) isocyanatoformate d'éthyle, DCM anhydre; v) isothiocyanate d'ethoxycarbonyl, DCM anhydre ;vi) isocyanatoacetate d'éthyl DCM anhydre; vii) 3,5N NaOH, dioxane

Schéma 19 Des exemples de la littérature128 mentionnent également ces possibilités de réduction des oximes en amines.L’étape suivante est une addition de différents isocyanates sur les composés hydroxylamines obtenus. Cette étape est effectuée en mélangeant les dérivés isocyanates, et les substrats hydroxylamines DCM anhydre. Les dérivés ciblés sont isolés avec des rendements relativement faibles ne dépassant pas 20%.Les composés obtenus ont été caractérisés par RMN et spectrométrie de masse. Les isocyanates réagissent avec les hydroxylamines nucléophiles pour donner la N-hydroxurée. L’attaque nucléophile se produit sur le carbone linéaire (sp) central, électrophile de l’isocyanate. Le mécanisme suggéré pour cette réaction de substitution est présenté sur le schéma suivant :

O OH H H OH H N O C N O N N O N N O R OH R R O O O O Isocyanate N-hydroxyurée

Schéma 20

128. Lours, R.; Egeribaldmi; Ichelr, O.; Marceal, Z.; Can. J. Chem. 1975 53, 3227-3239.

100

Chapitre III: Partie chimique

III.1.2.4.1 La cyclisation de l’ N-hydroxyurée.

La réaction de cyclisation intramoléculaire s’effectue spontanément, Il semble évident que l‟extrémité la plus nucléophile sera l’atome d’azote, mais cela dépend du pH de la solution. Normalement l’hydroxylamine étant instable, il est apportée sous la forme de son chlorhydrate cristallisé et on ajoute une base pour obtenir le nucléophile.(les pKa concernés sont indiqués dans le schéma 21) Les bases telles que la pyridine ou l’acétate de sodium produisent un peu de N-hydroxurée neutre et réactif en présence du cation moins réactif, mais la présence de NaOH donne l’anion qui permet l’attaque sur le carbone électrophile pour conduire à la cyclisation thermodynamiquement la plus favorable, dans ce cas un hétérocycle à 5 ou 6 atomes.

OH OH O H H H H R N N O N N O NaOH N N O + N O R R R H O O O O O O O O N pKa 6 pKa 13 H

Inerte réactif très réactif

L'état de l'hydroxylamine varie avec le pH: l'atome le plus nucléophile est indiqué en rouge

Schéma 21

Les rendements de ces réactions de cyclisation sont donnés dans les tableaux suivants :

Tableau 21. Les résultats obtenus pour les oximes. N° Structure Rdt % 45 NOH quantitatif 54 NOH quantitatif 59 quantitatif NOH

Tableau 22. Les résultats obtenus pour les hydroxylamines.

46 NHOH 55 55 NHOH 94 60 NHOH quantitatif

Tableau 23. Les résultats obtenus pour les N-hydroxurées. 47 OH H 46 N N O O O

101

Chapitre III: Partie chimique

49 OH H 15 N N O S O 51 OH H O quantitatif N N O O 56 OH H quantitatif N N O O O 61 OH H 18 N N O O O 63 OH H quantitatif N N O S O 65 OH H O quantitatif N N O O

Tableau 24. Les résultats obtenus pour les produits cyclisés. 48 O quantitatif O N NH O 50 O 60 O N NH S 52 O 56 O N NH O 57 O 58 O N NH O 62 O 62 O N NH O

102

Chapitre III: Partie chimique

64 O 47 O N NH S 66 O quantitatif O N NH O

III.1.3 Autres analogues.

III.1.3.1 Synthèse de N-Alkylthiazolidine-2,4-dione.

N° Structure

O 68 NH S O O

70 NH S O

Figure 30. Molécules ciblées portant le résidu thiazolidine-2,4-dione. Pour réaliser la synthèse de ces dérivés nous avons opté pour la séquence réactionnelle suivante (Schéma 22)

O O O O i R ii R R H + NH NH NH S S S O O O 67,68 R= Hexyl 67,69 68,70 69,70 R= Stéaryl i) Acide benzoique, piperidine, toluène au reflux; ii) Pd/C, AcOH/H2O(8:2)

Schéma 22 Une addition nucléophile des aldéhydes sélectionnés sur la 2,4-thiazolidine, permet l’obtention des analogues insaturés 67,69 correspondants avec de faibles rendements. La réduction de ces intermédiaires par l’hydrogénation catalytique conduit aux molécules finales 68 et 70 avec des rendements raisonnables.

103

Chapitre III: Partie chimique

Tableau 25. les rendements obtenus.

N° Structures Rdt % 67 O 10 NH S O 68 O 29 NH S O 69 O 53 NH S O 70 O 64 NH S O

III.1.3.2 Les synthèses des analogues comportant le motif acide ascorbique.

N° Structure OH 75 O O O O HO OH

O OH O O 80 N O H O HO OH

O OH O O 82 N O H O HO OH

Figure 31. Les structures de molécules ciblées comportant le motif acide ascorbique.

104

Chapitre III: Partie chimique

Mécanismes mis en jeu lors de la synthèse du composé 73

HO O O HO O O O O O HO i O O iiO O iii HO O HO OH HO OH BnO OBn BnO OBn 71 72 73

i) acétone anhydre, chlorure d'acétyl à température ambiante; ii) acétone anhydre, K2CO3,bromure de benzyle au reflux ; iii) 2M HCl, THF/MeOH (1:1) à température ambiante.

Schéma 23 La molécule d’acide ascorbique présente quatre groupements hydroxylés réactifs et deux d’entre elles qui sont sous la formé d’énols peuvent être oxydées pour donner l’acide déhydroascorbique129. Les deux autres fonctions hydroxylées peuvent être sélectivement protégées dans la mesure où elles se différencient par leurs fonctions alcools primaire ou secondaire. Ces réactions de protection sélectives de l’acide ascorbique s’effectuent en 3 étapes130. Dans un premier temps, les deux fonctions alcools de la chaîne latérale sont protégées sous forme de cétal, par réaction de l’acétone en présence d’une quantité catalytique de chlorure d’acétyle pour aboutir au composé 71. Le solide résultant non purifié est directement traité dans l’acétone à reflux en présence du bromure de benzyle en milieu basique pour conduire au composé 72. La troisième étape consiste en la déprotection de l’intermédiaire cétal en milieu acide, conduisant ainsi au synthon acide ascorbique déprotégé73. Les groupements benzyles introduits sur cette molécule seront ultérieurement déprotégés par simple hydrogénation catalytique.

129. Firouzabadi, H.; Iranpoor, N.; Nowrouzi, F.; Amani, K., Aluminium dodecatungstophosphate (AlPW12O40) as a highly efficient catalyst for the selective acetylation of -OH, -SH and -NH2 functional groups in the absence of solvent at room temperature. Chem Commun (Camb) 2003, 6, 764-5.

130. Kato, K.; Terao, S.; Shimamoto, N.; Hirata, M., Studies on scavengers of active oxygen species. 1. Synthesis and biological activity of 2-O-alkylascorbic acids. J Med Chem 1988, 31 (4), 793-8.

105

Chapitre III: Partie chimique

III.1.3.2.1 Couplage direct : Chaîne grasse – Acide ascorbique.

Deux méthodes de couplage ont été envisagées, la première consiste à coupler les acides gras saturés ou insaturés à l’aide de l’agent de couplage le Hexafluorophosphate de benzotriazol-1-yl-oxy-tri (diméthylamino) phosphonium (BOP) avec l’acide ascorbique protégé suivi par la réaction de déprotection des groupements benzyles par l’hydrogénation classique.

OH OH O HO O O O O O HO O i R ii R O R OH + O O BnO OBn O HO OH BnO OBn R=Stéaryl 74 75

i) BOP, DIEA, CH2Cl2 à température ambiante; (ii) H2,Pd(OH)2/C MeOH à température ambiante.

Schéma 24 Cette méthode a été abandonnée, l’étape de la déprotection par réduction des groupements benzyles ayant échoué. En effet lors de cette réduction, les doubles liaisons des chaînes des acides gras insaturés étaient également réduites. Cette méthodologie était uniquement applicable aux chaînes saturées. Nous avons essayé une autre méthode déjà décrite qui consiste à coupler directement les acides gras avec l’acide ascorbique non protégé en présence de l’acide sulfurique concentré à 98% pendant 24h131. Cette méthode nous a permis de réaliser l’estérification de l’alcool primaire de l’acide ascorbique avec la fonction acide carboxylique de l’acide gras saturé, nous avons obtenu 80% de rendement.Toutefois la méthode n’est pas viable pour les acides gras insaturés et cycliques du fait du grand nombre de produits secondaires formés (dimérisation, attaque de la mauvaise fonction alcool…).

HO OH O HO O O O + O i R O R OH O HO OH HO OH R= Stéaryl Acide ascorbique 75

(i) H SO concentré à température ambiante 2 4 Schéma 25

131. Cousins, R. C.; Seib, P. A.; Hoseney, R. C.; Deyoe, C. W.; Liang, Y. T.; Lillard, D. W., Jr., Synthesis of 6- fatty acid esters of L-ascorbic acid. J Am Oil Chem Soc 1977, 54 (8), 308-12.

106

Chapitre III: Partie chimique

Le mécanisme réactionnel est le suivant 137 :

HO O HO3SOH2 R HO R O HO H O 4H2SO4 O 2 H2O HO O 4H SO O RCOOH O H2O O O 2 4 OH OH O HO HO OH HO OH OH HO OH + R=stéaryl H3O+3HSO4

Schéma 26

III.1.3.2.2 Couplage indirect : chaîne grasse-espaceur-acide ascorbique.

La rétrosynthèse envisagée suit deux stratégies (Schéma 27) : a) La première stratégie met en jeu le couplage peptidique de l’acide linoléique et le synthon 78.

Ce dernier est obtenu par la déprotection du synthon 77 par hydrogénation catalytique. La déconnection de la liaison ester de ce dernier nous donne deux fragments 73 et 76. La debocylation dans des conditions acides et la bocylation de l’acide aminocaproϊque concrétisent la pensée de cette stratégie de rétrosynthèse. b) La deuxième stratégie est basée sur la déprotection de groupements benzyles. Le fragment 77 et l’acide stéarique dont l’assemblage est réalisé via à un couplage au BOP/DIEA pour donner la formation de la liaison amide de la molécule 79 protégée laquelle est déprotégée par hydrogénation catalytique pour aboutir à la molécule ciblée.

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Chapitre III: Partie chimique

O H O O R N OH O O OH OH

a b

O O O O O O H Linoléyl OH Stéaryl N OBn + TFA.H N OH O 2 O O O OH OBn OH OH 78 79

Stéaryl OH O + O O O TFA.H N OBn 2 O OH OBn 77 O O O OBn Boc.HN HO + OH OH OBn 76 73

O O H N O O 2 OH O BnO OBn

O O O O HO OH

HO O O HO HO OH

Schéma 27

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Chapitre III: Partie chimique

La synthèse envisagée

O OH OH O H N OH O O 2 5 i O N 5 ii, iii TFA.H2N 5 H O O O BnO OBn 76 77

O OH O OH v O O iv 77 R O R O O O N 5 N 5 H H O O iv BnO OBn HO OH 79,81,83 80

OH O OH O O O O O TFA.H2N 5 R O N 5 V H O O HO OH HO OH 78 79,80 R= Stéaryl 82 81,82. R = Linoleyl 83. R = Abietyl

(i) tBoc2O, 1M NaOH, 1dioxane-1H2O; (ii) acide 2, 3-di-O-benzyl-L-ascorbique, BOP, DIEA, CH2Cl2, température ambiante; (iii) TFA, CH2Cl2, température ambiante; (iv) H2,Pd(OH)2/C MeOH à température ambiante; (v) RCOOH, BOP, DIEA, CH2Cl2. Schéma 28

Les analogues contenant le motif acide ascorbique ont été synthétisés selon deux voies de synthèses différentes, selon que les molécules ciblées contiennent des chaînes grasses saturées ou insaturées et ces dernières nécessitant une étape de réduction sélective. Dans un premier temps l’acide 6-aminocaproϊque est protégé sur sa fonction amine par un groupement N-Boc, puis la fonction acide est estérifiée par l’acide ascorbique protégé, l’acide 2,3-di-O- benzyl- ascorbique 73, La déprotection du groupement N-Boc de celui-ci a été réalisée dans des conditions acides en utilisant l’acide trifluoroacétique (TFA) en fait d’obtenir le produit 77 sous forme de sel avec des rendements quantitatifs. L’acylation de ce dernier par l’acide stéarique, l’acide linoléique et l’acide abiétique est effectuée à l’aide de l’agent de couplage BOP selon un protocole expérimental déjà utilisé dans les réactions décrites antérieurement, on obtient les analogues correspondants 79, 81,83 protégés par les groupements dibenzyles. L’analogue dérivé de couplage avec l’acide stéarique 79 a été déprotégé par hydrogénation catalytique en donnant le produit désiré 80 avec un rendement quantitatif.

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Chapitre III: Partie chimique

Par contre, les analogues insaturés de l’acide linoléique et l’acide abiétique n’ont pu être déprotégés par réduction classique, car les doubles liaisons sont hydrogénés également à leurs tours, d’où la raison de les synthétiser à partir de la molécule 77, qui a été déprotégé pour donner la molécule 78 et enfin la réaction de couplage avec les acides linoléique et abiétique à l’aide du BOP a aboutit aux molécules clées. Mais seul l’analogue portant l’acide linoléique 82 a été validé par les analyses du spectre de masse, 44% des rendements ont été obtenus. Mécanisme de réaction utilisant le BOP est rappelé dans le schéma ci-dessous.

N R O O 1 + N + P(NMe2)3 O N R1 O PF N O 6 N P(NMe2)3 PF6 O N

O=P(NMe2)3 O R2OH R2 R1 O R1 O N O N N N N N OH Schéma 29 Tableau 26. Les rendements obtenus N° Structure Rdt % 74 OH quantitatif O O O O BnO OBn 75 OH 45 O O O O HO OH 79 O OH 26 O N O O H O BnO OBn

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Chapitre III: Partie chimique

80 O OH quantitatif O O N O H O HO OH 81 O OH 26 O O N O H O BnO OBn 82 O OH 44 O O N O H O HO OH 83 20 H O O O BnO H N O BnO OH O

III.1.4 Conclusion.

Cette partie chimique consacrée à la synthèse de composés capable à mimer le GM1 ganglioside a conduit à l’élaboration d’une chimiothèque focalisée de composés basée sur la présence d’une entité hydrophile qui comprend soit des fonctions carboxyliques ou leurs bioisostères ou des entités bifonctionnelles (fonctions hydroxyle et carboxylique) et d’une entité d’hydrophobicité variable comprenant des chaînes grasses saturées, insaturées ou spécifiques. L’ensemble des composés synthétises ont été purifiés, identifiés, caractérisés sur le plan de leurs structures (RMN, SM) et de leurs puretés par les techniques chromatographiques.

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Chapitre IV : Partie Biologique

CHAPITRE IV: PARTIE BIOLOGIQUE

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Chapitre IV : Partie Biologique

Ce dernier chapitre regroupe l’ensemble des résultats concernant les propriétés neuroprotectrices des composés et leurs analyses. Après une étude préliminaire, nous décrirons les principales méthodes d’évaluation in vitro des effets neuroprotecteurs des nouvelles molécules. Ensuite, nous exposerons les résultats obtenus lors des tests d’évaluation de la neuroprotection in vitro en cultures cellulaires (les cellules HT22 représentant un modèle relevant pour étudier les effets induits par l’ischémie cérébrale) et en cultures tissulaires (tissus lésées par le glutamate). Enfin, nous analyserons ces résultats et nous tenterons d’établir des relations entre les structures moléculaires et l’activité neuroprotectrice des composés. Nous aborderons également dans ce chapitre l’étude de leurs mécanismes d’actions respectifs au niveau cellulaire. IV 1 Etude préliminaire des mécanismes de la neuroprotection.

IV.1.1 Les Protéines Kinases.

La plupart des mécanismes de régulation intracellulaires impliquent des processus de phosphorylation/déphosphorylation par les kinases et les phosphatases132. Les kinases représentent un groupe ubiquitaire d’enzymes qui sont impliquées dans un grand nombre de processus cellulaires. Par définition, le mot kinase est appliqué aux enzymes qui catalysent le transfert du groupement phosphate terminal de l’ATP vers un substrat qui peut être une petite molécule, un lipide ou une protéine. La plupart des kinases sont impliquées dans les différentes voies de transduction du signal régulant le fonctionnement cellulaire sous tous ses aspects, et en sont des composants essentiels. D’autres kinases ont un rôle important dans le métabolisme des glucides, des lipides, des nucléotides, des vitamines, etc. D’autres encore participent à la régulation des gènes ou encore à la contraction musculaire. Du fait de leurs rôles dans les processus cellulaires, les kinases font partie des enzymes les plus étudiées au niveau structural, biochimique ainsi qu’au niveau cellulaire. Les protéines kinases, plus particulièrement, représentent une des plus grandes familles de protéines, ce sont des enzymes comptant plus de 500 membres dans le génome humain133. La plupart des cancers sont associés au dérèglement de protéines kinases, tels que des mutations génétiques qui conduisent à une sur-expression ou à une activation constitutive de ces protéines. Elles sont également impliquées dans des pathologies neurodégénératives.

132. Hunter, T.; Protein Kinases and Phosphatases: The Ying and Yang of Protein Phosphorylation and Signalling. Cell, 1995, 80, 225-236.

133. Noble M. E. M.; Endicott J. A.; Johnson L. N. Protein Kinase Inhibitors: Insights into Drug Design from Structure. Science, 2004, 3003, 1800-1805.

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Chapitre IV : Partie Biologique

La fonction catalytique commune des protéines kinases consiste en la phosphorylation covalente d’une protéine-substrat qui se fait par le transfert du groupement phosphate ɤ de l’ATP à un résidu thréonine, sérine ou tyrosine du substrat134. Voire figure ci-dessous.

NH 2 NH2 N N N N O O O N N N O O P P P O N O O O O P P O O O O OO OO O HO ATP OH HO OH ADP Protéine Kinase activée

HO PO3 O H O O O O N NH2 H HO N N NH O H HO N 2 HO O H O OH PO 3 O Ser Thr Tyr Ser Thr Tyr PO3

Figure 32. Sites d’action des protéines Ser/Thr et Tyr kinases136.

IV.1.2 Les voies d’activation intracellulaire impliquées dans l’ischémie cérébrale.

L'ischémie cérébrale active plusieurs voies de signalisation intracellulaires, l’une de ces cascades ischémiques implique les protéines kinases «Mitogen Activated Protein Kinases» (MAPK), membres de la superfamille des sérine/thréonine kinases. Les MAPK sont des enzymes activées en réponse à des stimuli externes tels que les stimulations mécaniques, les facteurs de croissance, les hormones ou les cytokines. Elles jouent un rôle essentiel dans la régulation de nombreux processus cellulaires tels que la croissance, la survie, la différentiation ou la mort cellulaire135.

134. Engh, R.A.; Bossemeyer, D.; The Protein Kinase Activity Modulation Sites: Mechanisms for Cellular Regulation-Targets for Therapeutic Intervention. Advan. Enzyme Regul., 2001, 41, 121-149. 135. Nozaki, K.; Nishimura, M.; Hashimoto, N.; Mitogen-activated protein kinases and cerebral ischemia. Mol. Neurobiol. 2001.23, 1–19.

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Chapitre IV : Partie Biologique

La famille des MAPKs est constitué par trois principaux membres, Extracellular signal-regulated kinase (ERK), p38 et c-Jun N-terminal kinase ou Stress-Activated protein kinases (JNK ou SAPKs) (Figure 33). Ray & Sturgill ont identifié les premiers membres de la famille de MAPKs en 1987136.

Figure 33. La représentation schématique des cascades ischémiques impliquant les MAPK et leurs rôles dans les mécanismes cellulaires. Les trois principaux MAPK (ERK, p38 et JNK/SAPK), et leurs substrats (MEK et MEKK) ont été illustrés137.

La plus connue et la plus étudiées de ces kinases est ERK. Il en existe 2 isoformes, ERK1 et ERK2. ERK peut être activée par une cascade de phosphorylation induite par la fixation d’un facteur de croissance sur son récepteur. Deux voies majeures permettent l’activation d’ERK dans les oligodendrocytes137 :

136. Ray, L. B.; Sturgill, T. W., Rapid stimulation by insulin of a serine/threonine kinase in 3T3-L1 adipocytes that phosphorylates microtubule-associated protein 2 in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 84, 1502-1506.

137. Kanashiro, C.A.; Khali, l.R.A., Signal transduction by protein kinase C in mammalian cells. Clin Exp Pharmacol Physiol 1998 25, 974-985.

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Chapitre IV : Partie Biologique

La première implique une cascade de nombreuses kinases dont les plus importantes sont Ras, Raf et MEK. La seconde voie d’activation se fait par l’intermédiaire de la PKC qui, une fois activée, peut phosphoryler Raf, ce qui aboutit à l’activation d’ERK. Le deuxième membre de la famille MAPK est la JNK qui est activée en réponse à un stress, à l’irradiation aux U.V, à l’acide okadaïque. JNK peut aussi être activée par les récepteurs du TNF-α, les interleukines et les neurotrophines. JNK active alors des facteurs de transcription tels que c-jun138. Le troisième membre de cette famille est la p38 qui peut être activée par les mêmes agents que JNK mais aussi en réponse à un changement d’osmolarité139. IV.1.3 Les MAPKs et l’ischémie cérébrale.

Ces MAPKs sont activées par la phosphorylation de résidus thréonines et tyrosines et des cascades de protéines kinases. Après l’ischémie cérébrale, JNK, p38 et ERK sont activées140 et elles jouent un rôle important dans la survie des neurones. Leurs activations peuvent également participer à l'angiogenèse lors de l’ischémie cérébrale141. IV.1.4 Le concept de la neuroprotection : Cible thérapeutique.

Les protéines kinases représentent une des plus grandes familles d’enzymes impliquées dans la transduction du signal intracellulaire ou encore dans sa régulation. Leur disfonctionnement est à l’origine des pathologies neurodégénératives et de nombreux cancers, d’où l’intérêt d’obtenir des ligands sélectifs et puissants capables de moduler l’action de ces kinases dans un but thérapeutique ou dans un but plus fondamental (outil pharmacologique). Une des conséquences de l’ischémie est l’activation de certaines MAP Kinases, qui sera contrôlée afin de tester l’activité spécifique de nos composés. Ces travaux présentaient un double intérêt, pharmacochimique d'une part, par la conception de nouveaux inhibiteurs de protéine kinases et

138. Stariha, R.L.; Kim, S.U., Mitogen-activated protein kinase signalling in oligodendrocytes: a comparison of primary cultures and CG-4. Int J Dev Neurosci 2001 19, 427-437.

139. Yamagishi, S.; Yamada, M.; Ishikawa, Y.; Matsumoto,T.; Ikeuchi,T.; & Hatanaka, H., p38 mitogen activated protein kinase regulates low potassium induced c-Jun phosphorylation and apoptosis in cultured cerebellar granule neurons. J Biol Chem. 2001 276, 5129-5133.

140. Sugino, T.; Nozaki, K.; Hashimoto, N.; Activation of mitogen-activated protein kinases in gerbil hippocampus with ischemic tolerance induced by 3-nitropropionic acid. Neurosci. Lett 2000. 278, 101–104.

141. Lennmyr, F.; Karlsson, S.; Gerwins, P.; Ata, K.A.; Terent, A.; Activation of mitogen-activated protein kinases in experimental cerebral ischemia. Acta Neurol. Scand. 2002, 106, 333–340.

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Chapitre IV : Partie Biologique

synthétique, d'autre part par le développement de nouvelles voies synthétiques dans le domaine plus spécifique de la chimie peptidique.

IV.2 Evaluation de l’activité neuroprotectrice des composés.

Deux modèles biologiques in vitro ont été utilisés : Un modèle cellulaire (cellules HT22). Un modèle tissulaire (coupes de cerveaux).

IV 2.1 Un modèle de culture cellulaire (les cellules HT22).

IV.2.1.1 Description du test.

L’évaluation de l’activité neuroprotectrice de nos composés a été réalisée par l’équipe du docteur P. Maher de l’institut ; The Salk Institute for Biological Studies.

Ce modèle utilise la technique décrite récemment par P. Maher et al142. Ce modèle cellulaire mime les effets pathophysiologiques induits lors d’une l’ischémie cérébrale (dégradation irréversible des tissus principalement par manque d’oxygène). Pour ce faire, des cellules HT22 de l’hippocampe de souris sont soumises à l’action de l’acide iodo acétique (IAA), un inhibiteur irréversible ou bien à une lésion par le glutamate un agent connu pour ses propriétés d’excitotoxicité dont nous parlerons dans le modèle tissulaire. La plupart des modèles de culture cellulaire de l’ischémie cérébrale utilisent les cultures corticales qui sont exposées à une certaine forme d'hypoxie/privation de glucose. Ces essais sont souvent plus utilisés in vivo plus que les cellules neuronales, mais ils ont un certain nombre de problèmes qui les rendent difficiles à utiliser pour les essais cellulaires des composés neuroprotecteurs. Parmi eux on peut citer : les conditions requises pour avoir le maximum des cellules lésées à un pourcentage fixe sont extrêmement variables d’une expérience à l’autre. Pour éviter tous ces problèmes nous avons utilisé les cellules hippocampals de la souris « les cellules HT22 » en combinaison avec l’IAA comme un initial. Selon Maher ces cellules HT22 représentent un modèle relevant pour étudier les effets induits par l’ischémie cérébrale.

142. Maher, P.; Salgado, K. F.; Zivin, J. A.; Lapchak, P. A.; A novel approach to screening for new neuroprotective compounds for the treatment of stroke. Brain Research 2007, 1173, 117-25.

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Chapitre IV : Partie Biologique

L’acide iodo acétique est utilisé pour induire la lésion des cellules HT22 en raison de ses propriétés biologiques spécifiques143 : L'acide iodacétique est un composé toxique, comme beaucoup des halogénures d’alkyles c’est un agent d’alkylation. Il réagit avec des groupements cystéine (-SH) pour former une protéine carboxyméthylée, et empêcher la formation des liaisons disulfures dans la séquence des protéines. Il est employé comme inhibiteur enzymatique dans la recherche biochimique.

O O O pH > 7 I OH Protéine NH2 + OH Protéine N H Acide iodoacétique O

Figure 34. Schéma réactionnel de modifications chimiques conduisant à l'introduction d'un groupement carboxylique. La carboxyméthylation à l'aide d'haloacétates (ex:acide iodoacétique) est également utilisée pour accroître la charge négative de la protéine. La réaction peut avoir lieu sur les groupements ε-aminés, phénol, imidazole, indole ou thiol et thioéther des protéines.

Dans un premier temps , une étude de l’activité cytoxique de l’IAA sur le modèle cellulaire HT22 a permis d’établir une corrélation entre la concentration en IAA et le pourcentage de mort cellulaire . La figure ci-après traduit cette corrélation.

Figure 35. Cytotoxicité de l’IAA sur les cellules HT22. Les cellules HT22 ont été lésées par l’addition croissante d’IAA. La mort cellulaire est évaluée après 24 h, par la méthode colorimétrique classique dite au MTT qui permet de quantifier le taux de cellules vivantes

Cette étude ayant démontré la relevance du modèle cellulaire HT22 proposé par lésion avec l’acide iodo acétique 144 nous pouvions utiliser ce modèle cellulaire pour étudier l’activité neuroprotectrice des composés synthétisés. Pour ce faire nous avons utilisé le protocole expérimental suivant :

143. Fawzia, A. F.; Esmat, A.Y.; Essam, A.M.; Emad, K. I. "Antitumor Activities of Iodoacetate and Dimethylsulphoxide against Solid Ehrlich Carcinoma Growth in Mice". Biol. Res. 2003 36 (2): 253–262.

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Chapitre IV : Partie Biologique

préincubation des cellules HT22 en présence de différentes concentrations de composés neuroprotecteurs pendant une durée donnée. lésion des cellules préincubées par l’IAA. détermination du pourcentage de survie cellulaire par comparaison avec des cellules non traitées. Ce protocole expérimental permet d’évaluer le potentiel neuroprotecteur des nouveaux dérivés et d’établir des comparaisons de l’activité neuroprotectrice des nouveaux composés entre eux et également par rapport au pouvoir neuroprotecteur des substances connues comme la fisétine145.

IV.2.2 Le modèle tissulaire.

Ce modèle est basé sur l’utilisation de tranches de certaines parties du cerveau de rats qui peuvent être lésées dans différentes conditions : comme par exemple la présence de différentes concentrations de glutamate, et la privation du glucose ou d’oxygène ; ces lésions provoquant la mort des tissus. Il s’agit d’un modèle plus complexe que le modèle cellulaire, plus proche de l’ischémie cérébrale humaine mais plus difficile à réaliser car les paramètres impliqués étant plus nombreux. Seuls les composés 2 et 8 ont pu être testés avec ce modèle.

IV.2.2.1 Description du modèle.

Les tissus du cortex et de l’hippocampe sont prélevés sur des cerveaux de rat âgés de 5 mois selon des techniques standard (avec la collaboration du Dr S. Krantic, INMED, Marseille, France). Ces tissus sont ensuite sectionnés en tranches fines de 400 µm à l’aide d’un microtome et ils sont immergés dans un milieu biologique spécifique alimenté en continu par un flôt gazeux d’oxygène. Après stabilisation du système, les tissus sont ensuite lésés à l’aide de différentes concentrations de glutamate, un agent chimique connu pour ses propriétés excitotoxique.

144. Maher, P.; Salgado, K. F.; Zivin, J. A.; Lapchak, P. A., A novel approach to screening for new neuroprotective compounds for the treatment of stroke. Brain Research 2007, 1173, 117-25.

145. Bidisa, S.; Anwesha, B.; Pradeep, K.; Sengupta, Interactions of the plant flavonoid fisetin with macromolecular targets: Insights from fluorescence spectroscopic studies. J. Photochem. Photobiol., B ,2005 80 79–86.

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Chapitre IV : Partie Biologique

L'excitotoxicité est un processus pathologique d'altération et de destruction neuronale ou neurotoxicité, par hyperactivation par l'acide glutamique et ses analogues, regroupés sous la dénomination d'acides aminés excitateurs, des récepteurs excitateurs neuronaux comme les récepteurs NMDA(N-méthyl-D-aspartate) et AMPA(α-Amino-3-hydroxy-5-méthylisoazol-4-propionate).

Les glutamates en trop grande concentration, en se liant à ces récepteurs provoquent une entrée massive dans la cellule d'ion calcium.

Le Ca2+ active à son tour un certain nombre d'enzymes dont des phospholipases C, des endonucléases et des protéases telle que la calpaïne. Ces enzymes dégradent alors les structures cellulaires : cytosquelette, membrane cellulaire et l’ADN. Ce mécanisme physiopathologique est incriminé dans un certain nombre de maladies neurologiques comme l'épilepsie et les accidents vasculaires cérébraux, ou neurodégénératives du système nerveux central comme la sclérose en plaques, la maladie d'Alzheimer, la sclérose en latérale amyotrophique, la fibromyalgie, la maladie de parkinson ou enfin la chorée de Huntington.

Pour mettre en évidence une activité neuroprotectrice éventuelle des composés synthétisés, on a traité les tissus lésés par le glutamate. Les tissus sont incubés pendant des durées variables et par des concentrations variables avec les composés synthétisés. Ces derniers peuvent être introduits dans le milieu d’incubation, soit simultanément avec le glutamate, soit sur les tissus non traités avant soit après de la lésion au glutamate pendant une durée déterminée. Le pouvoir neuroprotecteur des composés est déterminé, en mesurant par colorimétrie le taux de tissus vivants traités par les agents neuroprotecteurs par rapport au taux de tissus vivants non traités par des agents neuroprotecteurs. Pour ce faire on utilise un réactif classique, le TTC (Chlorure de triphényl 2,3,5 tétrazolium146.(Figure 36)

146. (a) Sandritter, W.; Schiemer, H. G.; Alt, W.; Muller, D.; Behrouzi, E., [Histochemistry of sputum cells. III. Dry weight determination by interference microscopy.]. Frankf Z Pathol 1958, 69 (2), 167-93; (b) Sandritter, W.; Muller, D.; Schafer, H.; Schiemer, H. G., [Histochemistry of sputum cells. II. Quantitative ultraviolet microspectrophotometric determination of nucleic acids.]. Frankf Z Pathol 1958, 68 (6), 710-27; (c) Sandritter, W.; Schreiber, M., [Histochemistry of sputum cells. I. Qualitative histochemical studies.]. Frankf Z Pathol 1958, 68 (6), 693-709.

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Chapitre IV : Partie Biologique

Chlorure de triphényl 2,3,5 tétrazolium (TTC)

N Cl- N+ N N Formule Chimique: C19H15ClN4 Masse Moléculaire: 334,8

Figure 36. Structure moléculaire du TTC. Le mécanisme d’action du TTC est basé sur une réaction enzymatique d’oxydo-réduction. Les tissus vivants pourvus d’enzymes appartenant à la famille des deshydrogénases, oxydent le substrat TTC pour conduire à une espèce oxydée dont le chromophore absorbe dans le spectre visible avec un maximum d’absorption à 490 nm. Pour déterminer l’activité neuroprotectrice des composés par cette technique de colorimétrie, on utilise le protocole expérimental suivant : - Après les traitements précédents, les tissus sont immergés dans un mélange DMSO/Ethanol (1/1 en volume), pour extraire les espèces réduites et oxydées du TTC. Une mesure des densités optiques à 490 nm, permet de mesurer l’activité neuroprotectrice des dérivés. Plus la densité optique mesurée dans le surnageant DMSO/éthanol est élevée, plus l’activité neuroprotectrice des composés a été efficace. L’activité enzymatique dans les tissus vivants étant plus grande que dans les tissus morts dépourvus d’activité enzymatique. Dans ces conditions, on a effectué les mesures suivantes :

La mesure des DO pour les tissus du cortex, non lésés, traités par TTC constituent «la mesure de la survie des tissus contrôle.» La mesure des DO pour les tissus du cortex, lésés, traités par TTC, constituent « la mesure de la survie des tissus lésés. » La mesure des DO pour les tissus du cortex tissus lésés en présence des produits neuroprotecteurs, constituent « la mesure de la survie des tissus lésés traités par les agents neuroprotecteurs. » La détermination de ces différentes valeurs des densités optiques obtenues pour ces trois conditions : tissus contrôle, tissus lésés, tissus lésés protégés, permet de mettre en évidence le pouvoir neuroprotecteur des composés.

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Chapitre IV : Partie Biologique

IV.3 Résultats des évaluations des activités neuroprotectrices des composés.

IV.3.1 Résultats issus du modèle cellulaire.

Dans un premier temps, dans le cadre d’essais de contrôle nous avons testé les activités neuroprotectrices de quelques acides gras saturés et insaturés, pour valider le nouveau modèle moléculaire qui consistait à greffer directement ou par l’intermédiaire d’un espaceur d’une partie hydrophobe à une partie hydrophile. L’acides stéarique 86, l’acide linoléique 87, l’acide docosahexaénoique 90 et l’acide abiétique 91 ont été testés comme acides gras de références sur le modèle cellulaire HT22.Comme on peut le remarquer sur la figure 37, les effets neuroprotecteur de ces acides n’atteignent pas 50% de cellules vivantes, pour des concentrations moyennes de l’ordre de 1 à 2μM.

Figure 37. Courbe dose-réponse de neuroprotection des cellules HT22 par divers acides gras contre la toxicité de l’IAA. Les cellules HT22 ont été lésées par l’addition de 20 µM de l’IAA à l’absence ou en présence des doses croissantes de l’acide stéarique 86, de l’acide linoléique 87, de l’acide docosahexaénoique 90 et de l’acide abiétique 91 pendant 2 h. Les mêmes concentrations de ces composés sont également incluses dans « fresh medium » après 2 h de traitement de l’IAA. Les cellules vivantes ont été évaluées après 24 h, par la méthode colorimétrique classique dite au MTT. Trois à cinq expériences indépendantes ont été réalisées, conduisant à des résultats similaires.

Dans un deuxième temps, nous avons procédé à l’évaluation des propriétés neuroprotectrices de l’ensemble des nouveaux dérivés synthétisés à savoir les dérivés appartenant aux différentes séries présentées précédemment dans la partie synthèse chimique.

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Chapitre IV : Partie Biologique

Au total 47 dérivés ont été testés dans les conditions décrites dans le protocole expérimental. Pour ce test, le composé 98 qui a servi de référence est la fisétine (flavonoïde bioactive d’un immense intérêt thérapeutique)147.

OH OH B HO O A C OH O

Figure 38. La fisétine (3,7,3’,4’-tetrahydroxyflavone) le produit de référence.

La fisétine peut activer des voies de signalisation qui sont impliquées dans le développement de la mémoire, il inhibe les vois d’activation intracellulaire et il protège les cellules nerveuses contre le stress oxydant, c’est un anti-oxydant qui a les propriétés de facteurs neurotrophiques classiques148. Dans cette partie, sont résumés sous forme de tableaux les résultats des tests cellulaires, nous avons également un caractéristique physique important de ces dérivés (logP) pour la discussion des relations structures activités. Tableau 27. Résultats du produit de référence la fisétine.

N° Structure aEC50 (µM) b% max. cToxicité à dHT22/ elogP glutamate(% HT22/IAA protection 10µM (essai max. protection) MTT) 98 OH OH HO O 2,8 ± 0,5 95% 15% 95% 2,51± 0,61 OH O

Parmi les flavonoïdes testés la fisétine a montré une activité plus élevée par rapport aux autres (Ec50= 2,8) d’où la raison qu’il a été choisi pour être le produit de référence. Il protège les cellules HT22 à 95% contre la toxicité de l’IAA et la lésion causée par le glutamate.

147. Maher, P.; Salgado, K. F.; Zivin, J. A.; Lapchak, P. A., A novel approach to screening for new neuroprotective compounds for the treatment of stroke. Brain Research 2007, 1173, 117-25.

148 . Maher, P.; Akaishi T.; Abe, K. , Flavonoid fisetin promotes ERK-dependent long-term potentiation and enhances memory. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006 103 (44) 16568-16573.

123

Chapitre IV : Partie Biologique

Tableau 28. Résultats des analogues portant le résidu sérine, couplé à des acides gras.

N° Structure aEC50 (µM) b% cToxicité à dHT22/ elogP glutama HT22/IAA max. 10µM (essai te(% prote MTT) max. ction protecti on)

1 H O 9,8 ± 1,3 56% 53% 16% 7,06 ± 0,37 N O O OH

2 H O 3,2 ± 1,4 65% 28% 16% 6,60 ± 0,39 N OH O OH

4 H O 2,9 ± 1,3 70% 17% 12% 5,57 ± 0,45 N OH O OH

5 H O 17,1 ± 1.5 40% 25% 11% 5,88 ± 0,49 N O O OH

6 H O 30,2 ± 1,2 38% 32% 18% 4,89 ± 0,51 N OH O OH

8 H O 2,6 ± 1,1 83% 40% 15% 5,39 ± 0,56 N OH O OH 9 11,6 ± 1,4 45% 15% 14% 6,08 ± 0,47 H O N O O OH 10 4,1 ± 1,4 63% 20% 16% 4,96 ± 0,46 H O N OH O OH 11 1,05 ± 1,1 85% 25% 55% 5,92 ± 0,46

H O N O O OH

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Chapitre IV : Partie Biologique

12 - 27% 26% 10% 4,98 ± 0,42

H O N OH O OH 13 OH 13,6 ± 1,4 39% 1% 21% 1,07 ± 0,50 O OH O N H O O 14 OH 2,7 ± 1,3 70% 40% 14% -0,04± 0,49 O OH OH N H O O

Tableau 29. Résultats des analogues portant le résidu tyrosine couplé à des acides gras.

N° Structure aEC50 b% max. cToxicité dHT22/ elogP glutama (µM) protection à 10µM te(% HT22/IAA (essai max. MTT) protecti on)

18 H O 137 28% 33% ND 9,03±0,47 N O O

19 H O 7,5 66% 15% ND 8,54±0,43 N OH O

20 H O 4,5 70% 26% ND 8,33±0,45 N O O

OH 21 H O - 45% 13% ND 7,50±0,48 N OH O

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Chapitre IV : Partie Biologique

22 H O 4,7 61% 57% ND 8,74±0,48 N O O

OH 23 H O 8,8 55% 13% ND 7,79±0,49 N OH O

24 7,7 74% 31% ND 7,69±0,48

H O N O O

OH 25 - 31% 21% ND 6,86±0,50

H O N OH O

Tableau 30. Résultats des analogues portant le résidu cystéine couplé à des acides gras.

N° Structure EC50 (µM) HT22/IAA Toxicité à HT22/ logP glutama HT22/IAA % max. 10µM te(% protectio (essai max. n MTT) protecti on)

26 H O - 45% 23% ND 10,76±0,69 N O O S 28 H O 34,4 46% 6% ND 9,79 ± 0,73 N OH O S 29 11,7 54% 2% ND 8,11 ± 0,82 H

O H N HO O S

126

Chapitre IV : Partie Biologique

L’ensemble des résultats qui sont résumés dans les tableaux 28,29 et 30 montre que nos composés présentent une activité neuroprotectrice. La concentration requise pour 50% de cellules protégées contre la toxicité de l’IAA (EC50) varie de 1,05 à 137 µM, seul le composé 11 qui contient l’abiétyle comme partie hydrophobe couplée à une serine (protégée sous forme d’un ester) protège les cellules HT22 contre la toxicité de l’IAA et la lésion causée par le glutamate à plus de 50% de cellules protégées. Par contre son homologue saponifié le composé 12 n’a pas la concentration requise pour avoir 50% de cellules protégées contre la toxicité de l’IAA. Nous avons remarqué les résultats similaires pour les composés 20 et 24 qui contient la linoléiyle et abiétyle comme parties hydrophobes couplées à une tyrosine (sous forme d’un ester EC50=4,5µM et 7,7µM respectivement) et leurs homologues les composés 21 et 25 saponifiés. On peut noter que pour des molécules relativement proches d’un point de vue structural, les variations au niveau de l’activité neuroprotectrice sont très importantes, pour le moment je ne peux pas donner les explications, il faut faire les testes très approfondis au niveau neuronal.

Tableau 31. Résultats des analogues portant de bioisostères comportant un tétrazole 33 et un acide phosphonique 40 et 41 couplés à des acides gras.

N° Structure aEC50 (µM) HT22/IAAb% cToxicité dHT22/ elogP HT22/IAA max. à 10µM glutamate(% protection (essai max. MTT) protection) 34 11,3 ± 1,5 41% 4 % 8 % 6,96 ±0,66 O O O H N N H N N N 40 O O 4,1 ± 1,2 64 % 11 % 17 % 6,48 ± 0,44 O P O OH N H O OH 41 O P 2,1 ± 1,4 74% 50% 20% 5,44 ± 0,64 OH OH N H

Les composés 34,40 et 41 montrent une plus faible capacité à protéger des cultures cellulaires HT22 par rapport à la fisétine, à la fois sur la toxicite de l’IAA et sur la lésion au glutamate. Le fait de remplacer la fonction acide carboxylique par des groupes bioiostères de cette fonction, tétrazolique et phosphonique a amélioré l’activité neuroprotectrice pour le composé 41(EC50=2,1 µM) par rapport au composé 2 (EC50=3,2 µM), par contre pour le composé 34 (EC50=11,3 µM) il n y a pas eu une augmentation de l’activité neuroprotectrice par rapport à celle du composé 3 (EC50=4,1µM).

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Chapitre IV : Partie Biologique

Tableau 32. Résultats des analogues de N-alkyloximes.

N° Structure aEC50 (µM) HT22/IAAb cToxicit dHT22/ elogP HT22/IAA % max. é à glutamate( protection 10µM % max. (essai protection) MTT) OH 54 N 5,8 ± 1,4 62% 12% 9,4% 4,12 ± 0,27 OH 59 N 8,9 ± 1,1 49% 61% ND 8,37 ± 0,27

Tableau 33. Résultats des analogues de N-alkylhydroxylamines.

N° Structure aEC50 (µM) b% cToxicit dHT22/ elogP HT22/IAA max. é à glutamate(% prote 10µM max. ction (essai protection) MTT) 46 OH 2,7 ± 1,1 76% 6% 9,2% 2,18 ± 0,46 N H 55 OH 1 ± 1,2 83% 3% 62% 4,30 ± 0,46 N H OH 60 N 2 ± 1,3 62% 50% 13,5% 8,45 ± 0,55 H

Tableau 34. Résultats des analogues N-alkylhydroxylamine éthyle formylcarbamate et N-octadécylhydroxylamine éthyle thioformylcarbamate.

N° Structure aEC50 (µM) HT22/IA cToxicit dHT22/ elogP HT22/IAA Ab% é à glutamate max. 10µM (% max. protecti (essai protectio on MTT) n) 47 O O - 14% 10% ND 2,18 ± 0,59 N N O OH H 49 S O 9,7 ± 1,6 58% 11% 6,7% 2,78 ± 0.61 N N O OH H 56 O O 6 ± 1,3 62% 6% 96% 4,30 ± 0,59 N N O OH H 61 O O 8,9 ± 1,2 50% 11% 12,8% 8,02 ± 0,59 N N O OH H

128

Chapitre IV : Partie Biologique

Tableau 35. Résultats des analogues de 2-Alkyl-1,2,4-oxadiazolidine-3,5-dione et de 2-alkyl-3-thioxo-1,2,4- oxadiazolidin-5 none. N° Structure aEC50 (µM) HT22/IAA cToxicité dHT22/ elogP HT22/IAA b% max. à 10µM glutamate( protectio (essai % max. n MTT) protection) 48 N O 8,1± 1,1 50% 7% 9,5% 1,06 ± 0,64 O O N H 52 O - 30% 3% ND 1,31 ± 0,65 O N NH O 57 N O - 4% 4% ND 3,15 ± 0,64 O N O H

N O 62 O 6± 1,4 60% 0% 9,9% 7,44 ± 0,64 N O H

64 18,6± 1,5 37% 6% 7,7% 8,04 ± 0,65

N O O N S H

L’ensemble de résultats détaillés dans les tableaux 32, 33,34 et 35, montre que ces composés possèdent une activité neuroprotectrice comprise entre 1 et 20 µM. Les composés le plus actifs dans cette catégories sont 55 (EC50=1µM qui contient décanyl comme la partie hydrophobe) et 60

(EC50=2µM qui contient stéaryle comme la partie hydrophobe). Les chaînes alkyles de ces deux composés sont liées à une fonction hydroxylamine. Le plus étonnant, le remplacement de la fonction acide carboxylique par une fonction hydroxylamine semble augmenter considérablement l'effet neuroprotecteur, car ces analogues ont les valeurs de EC50 meilleures que celle de l'acide stéarique

(EC50=6.3 µM). Sur ce point, nous soulignons que les effets neuroprotecteurs des composés N-alkylhydroxylamines sont mal connus. Car ces composés sont instables et s’oxydent facilement alors leurs potentiels neuroprotecteurs deviennent limités, mais il est possible de les stabiliser sous leurs formes chlorhydrates cristallisés. Ils ont une activité neuroprotectrice semblable à celle de la fisétine sauf que pour la fisétine le maximum de protection de cellules HT22 contre la toxicité de l’IAA est de 95% alors qu’il est de 83% pour le composé 55 et 62% pour le composé 60.

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Chapitre IV : Partie Biologique

Tableau 36. Résultats des analogues d’acides gras couplés à l’acide ascorbique.

N° Structure aEC50 (µM) HT22/IAAb cToxicit dHT22/ elogP HT22/IAA % max. é à glutamate( protection 10µM % max. (essai protection) MTT) 75 OH 3,9 ± 1,1 83% 15% ND 7,12 ± 0,54 O O O O HO OH

O OH 79 O O 2,5 ± 1,4 68% 48% 19% 10,85±0,77 N O 5 H O BnO OBn O OH 80 O O 1,8 ± 1,3 92% 40% 65% 6,91 ± 0,64 N O 5 H O HO OH O OH 81 O O 8,2 ± 1,1 59% 7% 13% 9,81±0,80 N O 5 H O BnO OBn O OH 82 O O 6,4 ± 1,3 55% 19% 32% 5,87± 0,68 N O 5 H O HO OH [a] concentration requise pour 50% de cellules protégées contre la toxicité de l’IAA ; [b] le maximum de cellules vivantes, protégées par nos composés à des concentrations qui varient entre 1 à 137 µM ; [c] estimation de la toxicité des nos composés sur les cellules HT22;[d] maximum de protection pour les cellules HT22 lésés par le glutamate ; [e] logP calculé : coefficient de partage dans un mélange biphasique n-octanol/H2O, déterminé à l’aide du logiciel «ACD logP (Advanced Chemistry Development, Inc)» ND: non déterminé.

Au vu des résultats exposés dans le tableau 34 nous constatons que la longueur du bras espaceur et le motif acide ascorbique ne nous permettent pas de savoir si l’activité neuroprotectrice par rapport à celles de leurs homologues qui contiennent comme partie hydrophile l’acide carboxylique est amélioré. En effet, l’ensemble de ces composés testés possède une activité neuroprotectrice comprise entre 1,8 µM et 6,4 µM seul le composé 80 qui contient stéaryle comme partie hydrophobe protège les cellules HT22 contre la toxicité de l’IAA et la lésion causée par le glutamate à plus de 50%. IV.3.1.1 Commentaires de résultats issus des tests cellulaires.

On a montré que ces composés peuvent protéger des cellules de cerveau de rat contre des dommages causé par le glutamate. Ces résultats ont été obtenus sur un modèle de culture cellulaire décrit précédemment par P. Maher et al. On remarque que les concentrations auxquelles la majorité de certains de ces composés présentent les effets neuroprotecteurs qui se situent entre 1-137 μM. Les analogues les plus actifs sont le composé 55 qui est une hydroxylamine avec un groupe décanyle comme partie hydrophobe (EC50=1μM), le composé 11 qui contient l’abiétyle comme partie hydrophobe

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Chapitre IV : Partie Biologique

avec (EC50 =1,05 μM) et le composé 80 avec (EC50 = 1,8 μM) qui inclut une partie stéarylique couplée à une partie acide ascorbique par le biais d’un espaceur l’acide aminocaproïque. Les effets neuroprotecteurs de ces nouveaux composés ont été établis, ceci nous a permis d’identifier les composés qui pourraient avoir les activités neuroprotectrices sur les modèles animaux à lésions neurologiques.Pour établir des comparaisons du potentiel de neuroprotection des composés nous avons choisi une représentation plus significative des activés neuroprotectrices, qui est représentée dans la figure suivante :

Figure 39. Représentation comparatif des valeurs EC50(EC50 : représente la concentration d'un composé où on observe 50% de son effet neuroprotecteur maximal) de quelques composés pour la protection de cellules HT22 contre la toxicité de l’IAA. Par cette représentation on remarque que les composés 11, 41,55, 60 et 80 sont les plus actifs au niveau de la neuroprotection des cellules HT22.

Sur la figure ci-dessus on voit que les effets neuropotecteurs de nos composés sont similaires aux effets neuroprotecteurs déjà présentés dans une étude récente réalisée par P.Maher sur les flavonoïdes. Nous avons donc utilisé la fisétine comme le produit de référence pour nos tests (réalisés sur les cellules HT22)149. Pour certains composés comme 4,5, et 41 représentent une diminution de leurs efficacités neuroprotectrice à des concentrations plus élevées, ces phénomènes ne sont pas liés à la toxicité de ces produits. Ces résultats suggèrent que certains de ces composés pourraient agir sur les récepteurs spécifiques qui sont sur les surfaces de cellules, en déclenchant les affinités entre les

149. Maher, P.; Akaishi, T.; Abe, K., Flavonoid fisetin promotes ERK-dependent long-term potentiation and enhances memory. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, 103 (44), 16568-73.

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Chapitre IV : Partie Biologique

récepteurs et obligeant ces mêmes récepteurs à se regrouper, comme ça a été souvent observé sur des réponses immunologiques 150. IV.3.1.2 Etablissement des courbes doses réponses.

Nous avons également procédé à une étude dose réponse pour l’ensemble des composés. Sur la figure ci-dessous sont reproduits, les profils des courbes dose réponse obtenues pour les composés les plus représentatifs.

Figure 40. Courbes représentatives montrant la neuroprotection de quelques composés contre la toxicité de l’IAA sur les cellules HT22. Les cellules HT22 ont été lésées par l’addition de 20 µM de l’IAA à l’absence ou en présence des doses croissantes des composés 11, 4, 12 79 ou 80 pendant 2h. Les mêmes concentrations de ces composés sont également incluses dans « fresh medium » après 2 h de traitement de l’IAA. Les cellules vivantes ont été évaluées après 24h, par la méthode colorimétrique classique dite au MTT. Trois à cinq expériences indépendantes ont été réalisées, conduisant à des résultats similaires.

L’observation des courbes dose-réponses montre qu’il s’agit de courbes en cloche avec un taux de protection maximum qui se situe aux environ de 70 et 90% de cellules lésées, avec des valeurs moyennes de concentration en dérivés comprises entre 2 et 5 µM. On remarque que le pourcentage de cellules protégées est largement supérieur à celui observé lors des essais avec les seuls acides gras, ce qui valide déjà en partie ce modèle cellulaire.

IV.3.2 Résultats issus du modèle tissulaire.

Pour les raisons évoquées précédemment seuls deux composés 2 et 8 ont été soumis au test tissulaire. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 41

150. Dintzis, R. Z.; Vogelstein, B.; Dintzis, H. M., Specific cellular stimulation in the primary immune response: experimental test of a quantized model. Proc Natl Acad Sci U S A 1982, 79 (3), 884-8.

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Chapitre IV : Partie Biologique

Figure 41. Effet neuroprotecteur des composés 2 et 8 sur les tranches de cerveau lésées par 1 µM le glutamate. Les cultures de coupes de cerveau ont été réalisées avec des inhibiteurs 1 h avant et pendant l'application de glutamate, elles sont ensuite incubées pendant 2 h à 37 °C. La viabilité des cellules a été évaluée par un dosage colorimétrique par la méthode dite au TTC dont le temps d’extraction de la coloration du chromophore en milieu DMSO/EtOH pour avoir une DO significative est de 24 h.

On constate moins de 50% des cellules vivantes sur les coupes de cerveau lésée par 10 µM le glutamate, bien que ces deux composés aient un effet neuroprotecteur significatif, le composé 8 est plus efficace que le composé 2, ces résultats confirment ceux du test cellulaire.

IV.4 Influence de la présence des liaisons insaturées et de la nature des parties lipophiles et hydrophiles.

En se basant sur les résultats obtenus on remarque que les parties lipophiles et hydrophiles influencent l’activité neuroprotectrice de nos composés. En prenant comme exemple les composés 2, 4, 79, 80, 81 et 82 qui portent les acides stéarique et linoléique comme chaînes hydrophobes, les résultats de ces analogues montrent des effets neuroprotecteurs différents pour des analogues portant les chaînes latérales saturées ou insaturées. Plus récemment dans la littérature Stronkin et al 151 ont montré que les acides gras polyinsaturés, tels que l'acide docosahexaénoique présente les effets neuroprotecteurs après hypoxie/hypoglycémie, nos résultats prouvent clairement que les composés qui portent la chaîne stéarique (saturée) sont plus actifs que leurs analogues insaturés correspondants.

151. Strokin, M.; Chechneva, O.; Reymann, K. G.; Reiser, G., Neuroprotection of rat hippocampal slices exposed to oxygen-glucose deprivation by enrichment with docosahexaenoic acid and by inhibition of hydrolysis of docosahexaenoic acid-containing phospholipids by calcium independent phospholipase A2. Neuroscience 2006, 140 (2), 547-53.

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Chapitre IV : Partie Biologique

IV.5 L’activité des composés sur les marqueurs spécifiques des voies de signalisation.

IV.5.1 Sur GSH et l’ATP.

La diminution des niveaux d’ATP et du GSH fait partie des signes distinctifs de l’ischémie cérébrale152 qui est corrélée à une lésion par l’IAA153. Après avoir mis en évidence les effets neuroprotecteurs des nouveaux composés, connaitre leurs mécanismes d’actions reste un problème à résoudre. Précédemment, l’équipe de Maher a montré que, quelques flavonoïdes protègent les cellules HT22 contre la toxicité de l’IAA. Ces flavonoïdes empêchent aussi la perte de GSH et/ou de l’ATP154. Cependant, aucun des nos composés n’a montré l’effet neuroprotecteur au niveau de ces antioxydants intracellulaires, logiquement il fallait considérer d'autres mécanismes d’action.

IV.5.2 Sur P38 MAP Kinase et JNK.

Nous avons ensuite étudié les voies de signalisations de kinase p38MAPK et JNK car elles sont activées pendant le processus de toxicité due aux cellules HT22. Il est possible qu’in vitro et dans les modèles animaux de l’ischémie cérébrale l’activation de ces deux voies de signalisations soit impliquée dans la mort cellulaire155, ce qui nous amène à penser que les phosphorylations de l'une ou de l'autre ou de ces voies pourraient être inhibée par nos composés, réduisant ainsi la mort de cellules. En utilisant les anticorps phosphorylés de p38 MAPK et de JNK aussi bien que de leurs substrats, MAPKAP kinase 2 et c-jun, les effets neuroprotecteurs de nos molécules sur ces deux voies de signalisations ont été examinés. Toutes les valeurs des nos composés ont été testés dans cet essai et les résultats des composés 11, 6, 8, 41 et 80 sont affichés sur les figures 42 et 43.

152. Lipton, P., Ischemic death in brain neurons. Physiol. Rev. 1999, 79, 1431–1568.

153. Winkler, B.S.; Sauer, M.W.; Starnes, C.A., Modulation of the Pasteur effect in retinal cells: implications for understanding compensatory metabolic mechanisms. Exp. Eye Res. 2003, 76, 715–723.

154 . Maher, P.; Salgado, K. F.; Zivin, J. A.; Lapchak, P. A. A novel approach to screening for new neuroprotective compounds for the treatment of stroke. Brain Res. 2007, 1173, 117–125.

155. Mehta, S. L.; Manhas, N.; Raghubir, R., Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev 2007, 54 (1), 34-66.

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Chapitre IV : Partie Biologique

Figure 42. Effets de composés sur c-Jun et la phosphorylation MAPAPK2. Les cellules HT22 non traitées (cellules contrôles) ou traitées avec le 10 μM de 8, 6, 11, 41 et 80 en l'absence (-) ou en présence (+) de 20 μM d’IAA pendant 2 H. Après, les cellules ont été préparés et analysées par SDS- PAGE et immunomarquage avec des anticorps phosphorylés et Jun et des anticorps phosphorylés et le MAPKAPK2.

Figure 43. Effets de composés sur JNK and p38 MAPK phosphorylation. Les cellules HT22 non traitées (cellules contrôles) ou traitées avec le 10 μM de 8, 6, 11, 41, et 80 en l'absence (-) ou la présence (+) de 20 μM d’IAA pendant 2 h. Après, les cellules ont été préparés et analysées par SDS-PAGE et immunomarquage avec des anticorps phosphorylés et sur JNK et des anticorps phosphorylés et sur p38 MAPK.

Seul le composé 11 a réduit la phosphorylation de kinase p38 et l’activation de JNK et il inhibe complètement la phosphorylation de leurs substrats respectifs MAPKAP kinase 2 et de c-jun. En revanche 6,8, 41 et 80 n'ont eu aucun effet sur l'activation de ces kinases ou sur la phosphorylation de leurs substrats. Ces résultats suggèrent que les effets neuroprotecteurs de ces composés n’ont pas les mêmes mécanismes d’actions, et agissent d’une façon différente.

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Chapitre IV : Partie Biologique

IV.5.3 Sur ERK.

Nous avons également étudié si la voie de signalisation de Ras-ERK cascade, qui est impliquée dans la survie de cellules nerveuses pourrait être activée par les nouveaux analogues156,157,158. L’analogue 6 a été examiné en tant qu'activateur possible de l’ERK-2, ces résultats suggèrent que l’utilisation des anticorps de MAPK MEK1 et de MAPK ERK2, MEK1 et ERK2 ne soient affectés par le composé 6 même avec des concentrations très élevées allant jusqu'à 200 μM. Les mêmes résultats ont été obtenus avec les analogues 3, 4, 2, 12 et 17. Ceux-ci montrent que ces composés ne soient pas les inhibiteurs ou les activateurs sélectifs de la voie de signalisation de MAPK. Nous avons encore testé les composés qui ont EC50 (la valeur maximale de concentrations) de moins de 10 μM les résultats similaires ont été obtenu pour les composés 11, 6, 8, 41, 80 ces molécules ne sont pas les inhibiteurs ou activateurs de la cascade Ras ERK. (Figure 44)

Figure 44. Effets de composés sur la phosphorylation d’ERK. Les cellules HT22 non traitées (cellules contrôles) ou traitées avec le 10 μM de 8,6,11,41,et 80 en l'absence (-) ou la présence (+) de 20 μM d’IAA pendant 2h.Après, les cellules ont été préparés et analysées par SDS-PAGE et immunomarquage avec des anticorps phosphorylés et sur ERK.

156. Bonni, A.; Brunet, A.; West, A. E.; Datta, S. R.; Takasu, M. A.; Greenberg, M. E., Cell survival promoted by the Ras-MAPK signaling pathway by transcription-dependent and -independent mechanisms. Science 1999, 286 (5443), 1358-62.

157. Ghatan, S.; Larner, S.; Kinoshita, Y.; Hetman, M.; Patel, L.; Xia, Z.; Youle, R. J.; Morrison, R. S., p38 MAP kinase mediates bax translocation in nitric oxide-induced apoptosis in neurons. J Cell Biol 2000, 150 (2), 335-47.

158. Maher, P., How protein kinase C activation protects nerve cells from oxidative stress-induced cell death. Journal of Neuroscience 2001, 21 (9), 2929-2938.

136

Chapitre IV : Partie Biologique

Tableau 37. Effet de la neuroprotection des composés 60, 55, 46, 56, et 62 sur JNK, p38 MAP kinase et l’activation de l’ERK. Composé Structure aActivation de bActivation JNK/p38 d’ERK MAPK 60 NHOH Pas d’effet Augmenté 55 NHOH Pas d’effet Augmenté 46 NHOH Pas d’effet Augmenté 56 OH H Pas d’effet Augmenté N N O O O 62 O Pas d’effet Pas d’effet O N NH O Fisétine OH Diminué Augmenté OH B HO O A C OH O [a] Effets de nouveaux composés sur l’activation de JNK et de p38 MAP kinase. [b] Effets de nouveaux composés sur la phosphorylation d’ERK.

Par contre les résultats rapportés dans le tableau suggèrent que les analogues 60, 55, 46, 56, et 62 exercent leurs effets neuroprotecteurs par les mécanismes différents, les composés 60, 56, 46, et 56 induisent l'activation d'ERK, alors que 62 n'a aucun effet. D'ailleurs, aucun des analogues examinés n'affecte JNK ou p38MAPK kinases; ceci indique que tous ces analogues induisent des effets neuroprotecteurs par les voies qui sont partiellement différentes à celles de la fisétine et plus semblables à celles des analogues 6,8,11,41 et 80 que nous avons décrits au dessus. L’ensemble de ces données montrent que les nouveaux analogues ne réagissent pas en tant que les antioxydants, mais plutôt comme inducteurs des antioxydants. Bien que leurs mécanismes d'action n’aient pour instant pas élucidé, nos expériences préliminaires ont montré que les effets neuroprotecteurs de ces composés n’ont pas le même mécanisme d’action que la fisétine, elles n'ont aucun effet sur les voies de signalisation JNK ou p38MAPK kinases.Cependant, ces composés activent ERK comme ce flavonoïde de référence, sauf le composé 62 qui n’active pas ERK kinase.

137

Chapitre IV : Partie Biologique

138

Conclusions et Perspectives

LES CONCLUSIONS ET LES PERSPECTIVES

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Conclusions et Perspectives

Actuellement, Il y a de plus en plus des recherches qui sont fondées sur la protection des neurones ainsi que sur la neuroplasticité du cerveau. Ces approches restent actuellement décevantes sur le plan clinique. Sur le plan de la recherche plusieurs hypothèses sont à mentionner dans l’espoir de trouver un jour les thérapies qu’il faut pour résoudre ce problème d’AVC. Les travaux décrits dans ce mémoire de thèse avaient pour but la conception, la synthèse et l’élaboration des mini chimiothèques focalisées à partir du concept de bioisostérisme. Ces chimiothèques étant destinées à être testées sur les modèles physiopathologiques de différentes pathologies ischémiques. Différents résultats peuvent être tirés de l’ensemble de ce travail aussi bien sur le plan chimique que sur le plan de l’évaluation biologique.

1 Sur le plan chimique.

Nous nous sommes particulièrement intéressés à la synthèse de plusieurs chimiothèques focalisées d’acides gras, N-acyles par des chaînes saturées et insaturées au niveau de la sérine, tyrosine, cystéine ou les bioisostères portant les groupements phosphonique, tétrazolique, N-Alkyl-1, 2,4-oxadiazolidine-3,5-diones, N-Alkyl-1,2,4- oxadiazinane-3,6-dione, ((2R, 3R)-3-hydroxy-4-oxo-3,4- dihydro-2H-pyran-2-yl) méthyle Alkylnoate et N-Alkylthiazolidine-2,4-dione. Nous avons mis au point et optimisé les méthodologies de synthèse appropriées: choix des groupements protecteurs, recherche des agents de couplage les plus adaptés, schémas de retrosynthèse à nombre minimum d’étapes. L’ensemble des analogues synthétisés ont été analysés sur le plan de leur structure (RMN, SM) et de leur pureté chromatographique (chromatographie sur Colonne et sur CCM).

Ainsi, nous avons pu élaborer une chimothèque, constituée d’une centaine de composés. Les méthodologies de synthèses appropriées et optimisées ont permis de faire varier différents paramètres structuraux constituants ces nouveaux analogues tels que : Le remplacement de la fonction acide carboxylique par les bioisostères de celui-ci. On a fait varier les parties hydrophobes en incorporant certaines acides gras saturés, insaturés et cycliques. Nous avons élaboré un nouveau modèle de composé neuroprotecteur dans lequel une chaîne grasse est couplée à une entité acide ascorbique pour faciliter le passage de la BHE.

140

Conclusions et Perspectives

2 Sur le plan biologique.

On sait que l’excitotoxicité active la voie de signalisations intracellulaires de la kinase qui déclenche les mécanismes de mort cellulaire dans le SNC d’où la raison qu’il ne faut pas considérer seulement l’ischémie cérébrale comme une maladie de neurones mais comme une maladie du cerveau.

2.1 Au niveau cellulaire.

Nous avons évalué l’efficacité de nos composés à protéger les neurones et nous avons remarqué que nos produits ont des activités neuroprotectrice différentes qui varient de 1 à 137 µM. Le composé 55

étant le plus actif, qui est une hydroxylamine avec décanyl comme partie hydrophobe (Ec50 = 1 µM).

Son effet neuroprotecteur s’avère supérieure à celui de la fisétine 98 (Ec50 = 2,8 µM), notre composé de référence. Nos composés induisent des effets neuroprotecteurs par les voies qui sont partiellement différentes, nous avons essayé d’identifier leurs mécanismes d’action au niveau cellulaire mais nous n’avons pas réussi à connaitre le mode d’action de chaque groupe bioisostère. Les résultats obtenus n’ont pas permis de corréler la structure et l’activité neuroprotectrice. Les études sont en cours. Au cours de notre travail, nous avons également mesuré l’activité antioxydant des nos composés, ils ont montré des activités comparable à celles des flavonoïdes vis-à-vis aux cellules HT22 lésés par l’IAA, mais les études faites par le Dr Maher P nous ont permis de constater que ces deux motifs n’agissent pas de la même façon.

2.2 Au niveau tissulaire.

Il faut préciser que ce modèle tissulaire est un modèle plus complexe que le modèle cellulaire, plus proche de l’ischémie cérébrale humaine mais plus difficile à réaliser, car les paramètres impliqués étant plus nombreux dans la mesure où la mise en œuvre du protocole expérimental implique plusieurs paramètres qui peuvent influencer les mesures des DO, en savoir : La concentration en glutamate pour induire une lésion des tissus compatible avec les mesures des DO. La concentration minimale en composés neuroprotecteurs pour observer leurs effets. L’ordre d’introduction du réactif excitotoxique (glutamate) simultanément ou non avec les composés neuroprotecteurs.

141

Conclusions et Perspectives

La durée de préincubation des tissus avec les composés neuroprotecteurs. La durée d’incubation, lorsque les tissus sont en contact avec le glutamate et les composés neuroprotectrices. La durée de l’extraction des colorants TTC par le mélange DMSO/Ethanol après les temps d’incubation. La variabilité des tissus prélevés selon les animaux. Les difficultés inhérentes au prélèvement des tissus du cerveau. Pour l’ensemble de ces raisons, un nombre non négligeable d’essais est requis pour obtenir des valeurs des DO acceptables, ce qui a eu pour conséquence de ne tester qu’un nombre restreint de composés dans ce modèle. Seuls les composés 2 et 8 ont pu être testés.

L’ensemble de tests biologique que nous avons réalisé nous a fourni quelques renseignements sur l’activité neuroprotectrice de nos composés mais n’a pas permis d’établir la corrélation entre la structure et l’activité neuroprotectrice. Quelques perspectives sont à envisager : Une évaluation des propriétés neuroprotectrice des composés sur les cellules lésées par le glutamate est à effectuer. Il serait tout particulièrement intéressant de déterminer la cible biologique de ces composés et une étude du mécanisme d’action de chaque série de composés est à effectuer. Mesurer la stabilité de ces composés dans différents milieux biologiques. Aptitude de ces composés à traverser la barrière hémato-encéphalique.

Ces travaux ont fait l'objet de 2 publications:

¾ Biraboneye, A.C.; Madonna, S.; Maher, P.; Younes, L.; Krantic, S.; Kraus,J-L., "Potential neuroprotective drugs in cerebral ischemia: new saturated and polyunsaturated lipids coupled to hydrophilic moieties: synthesis and biological activity.J Med Chem, 2009, 52(14): 4358-4369.

¾ Biraboneye, A.C.; Madonna, S.; Maher, P.; Kraus,J-L., Neuroprotective Effects against in vitro Cerebral Ischemia of N-alkyl-1,2,4-oxadiazolidine-3,5-diones and Their Corresponding Synthetic Intermediates N-Alkylhydroxylamines and N-1-Alkyl-3-carbonyl-1-hydroxyureas Chem.Med.Chem, 2010 5,79-85.

142

Parties Expérimentales Chimiques

PARTIES EXPERIMENTALES CHIMIQUES

143

Parties Expérimentales Chimiques

Experimental section.

Unless otherwise noted, starting materials and reagents were obtained from commercial suppliers and were used without purification. Tetrahydrofuran (THF) was distilled over sodium benzophenone ketyl immediately prior to use. Methylene dichloride (CH2Cl2) was distilled over P2O5 just prior to use. Nuclear magnetic resonance spectra were recorded at 250 MHz for 1H and 62.9 MHz for 13C on a Brϋker AC- 250 spectrometer. Elemental analyses were within (0.4% of theorical values for all compounds. Chemical shifts are expressed as ppm units (part per million) downfield from TMS (tetramethylsilane). Electrospray mass spectra were obtained on a Waters Micromass ZMD spectrometer by direct injection of the sample solubilized in CH3CN. Analytical thin layer chromatographies (TLC) and preparative thin layers chromatographies (PLC) were performed using silica gel plates 0.2 mm thick and 1 mm thick, respectively (60F254 Merck). Preparative flash column chromatographies were carried out on silica gel (230-240 mesh, G60 Merck). Purity of the compounds has been controlled by centesimal analysis.

144

Parties Expérimentales Chimiques

Procedure A (Coupling reaction by DCC/HOBt). Ethyl 3-hydroxy-2-stearamidopropanoate (1).

H O N O Chemical Formula: C H NO 23 45 4 O OH Molecular Weight: 399,61

To a solution of Stearic acid (500 mg, 1.75 mmol) in methylene dichloride (DCM) (15 mL) distilled and under inert atmosphere, were added N-methylmorpholine (0.576 mL, 5.27 mmol), 1,3 dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (361 mg, 1.75 mmol) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) (237mg, 1.75 mmol). The reaction mixture was stirred at 0 °C for 1 h. Then L-serine ethyl ester hydrochloride (296 mg, 1.75 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature under nitrogen for 24 h. After filtration, 10 mL of DCM was added at 0 °C to the filtrate to precipitate the DCU. The DCM was evaporated under reduced pressure. The residue was washed with 5% citric acid (3 x 15 mL), 5%

NaHCO3 (3 x 15 mL) and Brine (2 x 15 mL). The organic phase was dried over MgSO4. After filtration and evaporation under reduced pressure, silica gel chromatography of the residue (cyclohexane/EtoAc

1 (1: 1)) gave (300 mg, 42 % yield) as a white solid Rf 0.5 (cyclohexane/EtoAc (1:1)) H NMR (250 MHz,

CDCl3) δ: 6.54 (d, J=6.8 Hz, 1H, -(O)CNH-); 4.65 (m, 1H, –HNCHCOO-); 4.23 (q, J=7.10 Hz, 2H, -

COOCH2CH3); 3.95 (m, 2H, -CH2OH); 2.25 (t, J = 7.6 Hz, 2H, -CH2C(O)-); 1.61 (m, 2H, CH2CH2C(O)-);

13 1.23 (m, 31H, -(CH2)14- and CH3CH2O-); 0.85 (m, 3H, -CH3). C NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 173.8, 171.0, 63.7, 62.1, 55.9, 36.5, 31.9, 29.7, 29.5, 29.3, 29.2, 25.5, 22.7,14.1. S.M. (ESI): m/z 400 ([M+H]+),

100%. Anal. (C23H45NO4)C, H, N. Procedure B ( ester hydrolysis ). 3-hydroxy-2-stearamidopropanoic acid (2).

H O N OH O Chemical Formula: C21H41NO4 OH Molecular Weight: 371,55

To a solution of compound 1 (263 mg, 0.65 mmol) in EtOH/H2O, (3:1) was added lithium hydroxide monohydrate (82 mg, 0.45 mmol) at room temperature and then stirred for 1 h. The progress of the reaction was followed by TLC. After an overnight reaction followed by evaporation of the solvent, the residue was acidified with 5% KHSO4 to pH 3. After extraction with methylene dichloride (DCM) (3 x 20 mL), the residue was dried and the solvent evaporated.

145

Parties Expérimentales Chimiques

1 A solid white compound was obtained (198 mg, 81% yield). H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 6.54 (d, J=6.8

Hz, 1H, -(O)CNH- ); 4.67 (m, 1H, –HNCHCOOH); 3.94 (m, 2H, -CH2OH ); 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 2H, -

13 CH2C(O)-); 1.66 (m, 2H, -CH2CH2C(O)-); 1.21(m, 28H, -(CH2)14-); 0.89 (3H, m, -CH3). C NMR (250 MHz, MeOH) δ: 173.8; 171.0; 63.7; 55.9; 36.5; 31.9; 29.7; 29.5; 29.3; 29.2; 25.5; 22.7; 14.1. S.M. (ESI):

+ m/z 372 ([M+H] ), 100%. Anal. (C21H41NO4)C, H, N. Ethyl 3-hydroxy-2-(9E, 12 E)-octadeca-9, 12-dienamidopropanoate (3).

H O N O Chemical Formula: C23H41NO4 O OH Molecular Weight: 395,58

According to general procedure A, the reaction of linoleic acid (200 mg, 0.71 mmol) with L-serine ethyl ester chlorhydrate (120 mg, 0.71 mmol) afforded the title compound 3 as a transparent oil (80 mg,

30% yield) Rf 0.12 (CH2Cl2:MeOH,.98:2). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.52 (s, 1H, -NH); 5.34 (m, 4H, -

CH=CH-); 4.64 (m, 1H, -CHNCO); 4.21 (m, 2H, O-CH2CH3); 3.9 (m, 2H, -CH2OH); 2.75 (m, 2H, -

HC=CHCH2CH=CH-); 2.25 (m, 4H, 2 -HC=CH-CH2-); 2.02 (m, 2H, -CH2C(O)NH 1.63 ( m, 2H, -

CH2CH2C(O)); 1.29 (m, 18H, (-CH2)9); 0.87 (m, 3H, -CH3). RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3) δ: 174.0; 170.7; 130.3; 130.1; 128.1; 128.0; 63.8; 62.6; 54.9; 54.4; 36.6; 31.6; 29.7; 29.5; 29.4; 29.3(2C); 28.6; 27.4; 25.7;

+ 25.2; 22.7; 14.2. S.M. (ESI): m/z 396 ([M+H] ), 100%. Anal (C23H41NO4) C, H, N. 3-hydroxy-2-(9E, 12E)-octadeca-9,12-dienamidopropanoic acid (4).

H O N OH Chemical Formula: C H NO 21 37 4 O OH Molecular Weight: 367,52

According to general procedure B, the reaction of Ethyl 3-hydroxy-2-(9E, 12 E)-octadeca-9, 12- dienamidopropanoate 3 (100 mg, 0.25 mmol) with lithium hydroxide monohydrate (19 mg, 0.45 mmol) afforded the title compound 4 as a yellow solid A solid white compound was obtained (54 mg, 64% yield).

Rf 0.10 (CH2Cl2:MeOH,.95:5) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ:5.32 (m, 4H, -CH=CH-); 4.49 (m, 1H,

CHNCO); 3.77 (m, 2H, -CH2OH); 2.75 (m, 2H, -CH=CHCH2CH=CH-); 2.21 ( m, 2H, -CH2NC(O)); 2.02 (m,

4H, –CH=CHCH2-); 1.59 (m, 2H, -CH2CH2NC(O)); 1.28 (m, 18H, -(CH2)9- ); 0.87 (m, 3H, -CH3). RMN ¹³C

(250 MHZ, CDCl3) δ:181.6; 181.4; 130.2; 129.9; 128.0; 127.8; 60.8; 56.9; 37.6; 36.5; 33.8(2C); 31.5;

+ 29.7; 29.3; 29.3; 28.6; 27.1; 25.6; 22.6; 14.1. S.M. (ESI): m/z 368 ([M+H] ), 100 %. Anal. (C21H37NO4)C, H, N.

146

Parties Expérimentales Chimiques

Ethyl 3-hydroxy-2-(3E,6E,9E)-octadeca-3,6,9-trienamidopropanoate (5).

H O N O Chemical Formula: C23H39NO4 O OH Molecular Weight: 393,56

According to general procedure A, the reaction of linolenic acid (200 mg, 0.71 mmol) with L-serine ethyl hydrochloride (121 mg, 0.71 mmol) afforded the title compound 5 as white oil (120 mg, 43% yield).

Rf 0.15 (3cHex/1AcOet) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.39 (d, J=6.7 Hz, 1H, -NH-); 5.35 (m, 6H, - CH=CH-); 4.67 (m, 1H, -(O)CNCHCOO-); 4.23 (q , J =7.1 Hz, 2H, -COOCH2CH3); 3.94 (d, J =3.9 Hz, 2H,

-CH2OH); 2.80 (m, 4H, -CH=CHCH2CH=CH-); 2.26 (t, J=7.3Hz, 2H, -CH2NC(O)); 2.07 (m, 4H, -

CH=CHCH2-); 1.64 (m, 2H, -CH2CH2NC(O)); 1.33 (m, 14H, -(CH2)7-); 0.97 (t, J=7.51 Hz, 3H, -CH3). RMN

¹³C (250 MHZ, CDCl3) δ: 174.3; 170.9; 132.8; 130.7; 128.8; 128.7; 128.2; 127.7; 64.2; 62.5; 55.5; 36.9; 30.0; 29.8; 29.7; 29.6; 27.7; 26.1; 26.0; 21.0; 20.9; 15.0; 14.2. S.M. (ESI): m/z 394 ([M+H]+), 100%. Anal.

(C23H39NO4)C, H, N. 3-hydroxy-2-(3E,6E,9E)-octadeca-3,6,9-trienamidopropanoic acid (6).

H O N OH Chemical Formula: C21H35NO4 O OH Molecular Weight: 365,51

According to general procedure B, the reaction of ethyl 3-hydroxy-2-(9Z, 12Z, 15Z)-octadeca- 9,12,15-trienamidopropanoate (101 mg, 0.25 mmol) with lithium hydroxide monohydrate (32 mg, 0.76 mmol) afforded the title compound 6 as a yellow solid (70 mg, 75% yield). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ:

5.34 (m, 6H, -CH=CH-); 4.47 (s, 1H, -CHNC(O)); 3.91 (m, 2H, -CH2OH); 2.78 (t, J=5.1 Hz ,4H, -CH2-

C=CH-); 2.22 (s, 2H, -CH2NC(O)); 2.03 (m, 4H, 2 -HC=CHCH2-); 1.57 (s, 2H, -CH2CH2NC(O)); 1.28 (m,

10H, -(CH2)5-); 0.96 (t , J =7.5 Hz, 3H, -CH3). RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3) δ: 174.3; 170.9; 132.0; 130.2; 128.8; 127.9; 127.4; 60.8; 56.9; 37.7; 36.5; 33.8; 29.9; 29.7; 29.4; 28.6; 26.9; 25.2; 13.9. S.M. (ESI): m/z

+ 366 ([M+H] ), 100%. Anal. (C21H35NO4)C, H, N.

147

Parties Expérimentales Chimiques

Ethyl-3-hydroxy-2-(5E,8E,11E,14E)-icosa-5,8,11,14-tetraenamidopropanoate (7).

OH O O N H Chemical Formula: C25H41NO4 O Molecular Weight: 419,60

According to general procedure A, the reaction of arachidonic acid (50 mg, 0.16 mmol) with L- serine ethyl ester chlorhydrate (19 mg, 0.16 mmol) afforded the title compound 7 as yellow oil (20 mg, 30

1 % yield). H NMR (CDCl3, 250 MHz) δ: 5.40 (m, 8H, 4 -CH=CH-), 4.70 (m, 1H, -(O)CN-CH-COO-), 4.25

(m, 2H, -CH2OCH3); 3.95(m, 2H, -CH2OH), 2.80 (m, 6H, -CH=CHCH2CH=CH-), 2.40 (m, 2H, -CH2NC(O)-

), 2.15 (m, 4H, 2 -HC=CH-CH2-), 1.70 (m, 2H, -CH2CH2NC(O)-), 1.30 (m, 6H, -CH2-), 0.85 (m, 3H, -CH3).

13 C NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 174.2, 171.0, 130.5, 129.0, 128.7, 128.5, 127.8, 127.5, 63.4, 63.0, 61.7, 54.3, 32.7, 31.5, 29.7, 27.2, 26.4, 25.6, 24.5, 22.5, 14.0. S.M. (ESI): m/z 420 ([M+H]+), 100%.

3-hydroxy-2-(5E,8E,11E,14E)-icosa-5,8,11,14-tetraenamidopropanoic acid (8).

OH O OH N H Chemical Formula: C23H37NO 4 O Molecular Weight: 391,54

According to general procedure B, the reaction of ethyl 3-hydroxy-2-(5E,8E,11E,14E)-icosa- 5,8,11,14-tetraenamidopropanoate (7) (20 mg, 0.047 mmol) with lithium hydroxide monohydrate (5 mg,

1 0.14 mmol) afforded the title compound 8 as a yellow oil with a quantitative yield. H NMR (CDCl3, 250

MHz) δ: 5.40 (m, 8H, 4 -CH=CH-), 4.70 (s, 1H, -(O)CNCHC(O)-), 3.95 (m, 2H, -CH2OH); 2.80 (m, 6H, 3 -

CH=CHCH2CH=CH-), 2.40 (m, 2H, -CH2NC(O)-), 2.15 (m, H, 4H, 2 -CH=CHCH2-), , 1.70 (m, 2H, -

13 CH2CH2NC(O)-), 1.30 (m, 6H, 3 -CH2-), 0.85 (m, 3H, -CH3). C NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 174.2, 171.0, 130.51, 129.0, 128.7, 128.6, 127.8, 127.5, 63.4, 63.07, 54.3, 32.7, 31.5, 29.7, 27.2, 26.4, 25.6, 24.5, 22.5,

+ 14.0. S.M. (ESI): m/z 392 ([M+H] ), 100%. Anal. (C23H37NO4)C, H, N.

148

Parties Expérimentales Chimiques

Ethyl 2-((2Z,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-enyl)nona-2,4,6,8- tetraenamido)-3-hydroxypropanoate (9).

H O N O O OH Chemical Formula: C25H37NO4 Molecular Weight: 415,57

According to general procedure A, the reaction of retinoic acid (300 mg, 0.99 mmol) with L-serine ethyl ester chlorhydrate (169 mg, 1 mmol) afforded the title compound 9 as a yellow solid (215 mg, 54%, yield). Rf 0.12 (3cHex/1AcOet)RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.72 (m, 2H, -CH=CH-); 6.13 (m, 4H, -

CH=CH-); 4.66 (m, 1H, -CHNC(O)); 4.20 (q , J=6.9 Hz, 2H, -CH2OH); 3.92 (t , J= 4.5 Hz, 2H, -

COOCH2CH3); 1.96 (m, 2H, -CH2); 1.68 (s, 3H, -HC=HCCH3); 1.39 (m, 4H, 2 -CH2-); 1.26 (m, 3H, -CH3);

0.99 (m, 6H, C-(CH3)2); RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3) δ: 170.7; 167.3; 149.8; 139.0; 137.5; 137.2; 135.2; 130.2; 129.8; 1 29.4; 128.3; 1 20.4; 63.4; 61.8; 54.7; 39.4; 34.1; 33.0; 28.8; 26.8; 21.6; 19.1; 14.0; 13.5;

+ 12.8. S.M. (ESI): m/z 416 ([M+H] ) 100%. Anal. (C25H37NO4)C, H, N. 2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-enyl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-3- hydroxypropanoic acid (10).

H O N OH O OH Chemical Formula: C23H33NO4 Molecular Weight: 387,51

According to general procedure B, the reaction of ethyl-2-((2Z,4E,6Z,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6- trimethylcyclohexa-1-enyl)nona-2,4,6,8-tetraenamido)-3-hydroxypropanoate (9) (150 mg, 0.24 mmol) with lithium hydroxide monohydrate (45 mg, 0.72 mmol) afforded the title compound 10 as a yellow solid (130

1 mg, 98% yield). H NMR (CDCl3, 250 MHz) δ: 6.95 (d, J = 11 Hz, 1H, -(O)CNH-); 6.29-6.14 (m, 4H, --

CH=CH-), 5.75 (s, 2H, -(O)CCH=CH- and -CH=CH-), 4.67 (m, 1H, -CH2OH), 4.17 (d, 1H, (O)CNCH-),

3.82 (d, J = 9 Hz, 2H,-CH2OH), 2.36 (m, 2H, -CH2-), 2.06 (m, 2H, -CH2-), 1.99 (s, 3H, -CH=CCH3), 1.74

(s, 4H, -CH2-), 1.61 (m, 2H, -CH2-), 1.48 (m, 3H, -CH3), 1.03 (s, 6H, -C(CH3)2). S.M. (ESI): m/z 388

+ ([M+H] ),100%. Anal. (C23H33NO4)C, H, N.

149

Parties Expérimentales Chimiques

Ethyl3-hydroxy-2-((1R,4aR,4bR,10aR)-7-isopropyl-1,4a-dimethyl-1,2,3,4a,4b,5,6,10,10a decahydrophenanthrene-1-carboxamido)propanoate (11).

According to general procedure A, the reaction of abietic acid (1 g, 3.3 mmol) with L-serine ethyl ester chlorhydrate (559 mg, 3.3 mmol) afforded the title compound 11 as a white solid H (Rf 0.62, cHex/AcOEt, 1/1; 500 mg, 50 % yield). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.76 (m, 1H, -(O)CNH-); 5.72 (s, 1H, -CH=CH- Chemical Formula: C25H39NO4 ); 5.31 (m, 1H, -HC=CH-); 4.59 (m, 1H, –HNCHCOO-); 4.21 O O Molecular Weight: 417,58 (m, 2H, -COOCH2CH3 ); 3.89 (m, 2H, -CH2OH ); 1.97 (m, 4H, HN 4 -CH2CHCH2-); 1.56 (m, 3H, -CCH3); 1.40 (s, 5H,- O CH2CH2CHH-); 1.26 (m, 8H, 4 -CH2-); 0.962 (m, 6H, - OH C(CH3)2); 0.816 (s, 3H, -CH3). RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3) δ:179.0; 170.4; 144.9; 139.0; 134.9; 122.0; 120.0; 63.3; 61.6; 54.6; 50.5; 45.5; 45.3; 37.8; 37.0; 34.5; 34.2; 29.8; 27.0; 26.5; 24.9; 22.1; 21.0; 20.5; 17.9; 16.5; 13.8. S.M. (ESI): m/z 418 + ([M+H] ), 100 %. Anal. (C25H39NO4)C, H, N. 3-hydroxy-2-((1R,4aR,4bR,10aR)-7-isopropyl-1,4a-dimethyl-1,2,3,4a,4b,5,6,10,10ª decahydrophenanthrene-1-carboxamido)propanoic acid (12).

Chemical Formula: C23H35NO4 O O Molecular Weight: 389,53 HN OH

OH According to general procedure B, the reaction of ethyl 3-hydroxy-2-((1R,4aR,4bR,10aR)-7- isopropyl-1,4a-dimethyl-1,2,3,4a,4b,5,6,10,10adecahydrophenanthrene-1 carboxamido)propanoate (11) (300 mg, 0.71 mmol) with lithium hydroxide monohydrate (90 mg, 2,1 mmol) afforded the title compound

12 (200 mg, 71% yield). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 5.72 (s, 1H, -CH=CH-); 5.28 (m, 1H, -CH=CH-);

4.54 (m, 1H, –HNCHCOO-); 3.98 (m, 2H, -CH2OH); 2.16 (m, 5H, 4 -CH2CHCH2-); 1.56 (m, 3H, -CCH3);

1.29 (m, 8H, 4 -CH2-); 0.99 (m, 6H, -CH2(CH3)2); 0,811 (s, 3H, -CH3). RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3) δ: 180.0; 173.6; 146.0; 136.0; 122.9; 120.9; 63.3; 55.5; 53.9; 51.4; 47.1; 46.0; 38.7; 35.4; 35.1; 28.0; 25.3;

+ 21.9 ; 21.4; 18.8; 17.3; 14.7. S.M. (ESI): m/z 390 ([M+H] ),100%. Anal. (C23H35NO4)C,H,N.

150

Parties Expérimentales Chimiques

Ethyl 3-hydroxy-2-((2E,4E)-5-(1-hydroxy-2,6,6-trimethyl-4-oxocyclohex-2-enyl)-3-methylpenta-2,4- dienamido)propanoate (13).

OH O OH O N H O O

Chemical Formula: C20H29NO6 Molecular Weight: 379,45

According to general procedure A, the reaction of abscisic acid (200 mg, 0.75 mmol) with L-serine ethyl ester chlorhydrate (128.2 mg, 0.75 mmol) afforded the title compound 13 as a white solid (Rf 0.13, cHex/AcOEt, 1/1; 170 mg 60%, yield). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 7.73 (m, 1H, -(O)C-NH-); 6.80 (m, 1H, -CH=CH-C-OH); 5.85 (s, 1H, -CH=CH-C(O)-); 5.74 (s, 1H, -CH=CHC(O)-); 4.67 (m, 1H, –HN-CH-

COO-); 4.21 ( m, 2H, -COO-CH2-CH3 ); 3.94 (m, 2H, -CH2OH); 2.28 (m, 2H, -CH2-C(O)-); 2.01 (m, 6H, -

C(CH3)2); 1.71 (m, 6H, 2 CH=CCH3-); 1.05 (m, 3H, -CH3); 0.953 (s, 3H, -CH3). RMN ¹³C (250 MHZ,

CDCl3) δ:198.3; 170.8; 166.5; 163.7; 145.7; 135.6; 128.1; 126.6; 121.2; 79.6; 63.2; 62.1; 60.5; 54.6; 49.9;

+ 41.6; 24.5; 23.3; 21.2; 19.2; 14.2. S.M. (ESI): m/z 380 ([M+H] ), 100%. Anal. (C20H29NO6)C, H, N. 3-hydroxy-2-((2E,4E)-5-(1-hydroxy-2,6,6-trimethyl-4-oxocyclohex-2-enyl)-3-methylpenta-2,4- dienamido)propanoic acid (14).

OH O OH OH N H O O

Chemical Formula: C18H25NO6 Molecular Weight: 351,39

According to general procedure B, the reaction of ethyl 3-hydroxy-2-((2E,4E)-5-(1-hydroxy-2,6,6- trimethyl-4-oxocyclohex-2-enyl)-3-methylpenta-2,4dienamido)propanoate (13) (300 mg, 0.71 mmol) with lithium hydroxide monohydrate (90 mg, 2.1 mmol) afforded the title compound 14 (200 mg, 71% yield).

RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 7.79 (d, 1H, -(O)CNH-); 6.23 (d, 1H, -CH=CHCOH); 5.95 (s, 2H, 2 -

HC=CH-); 4.47 (m, 1H, –HNCHCOO-); 3.90 (m, 2H, -CH2OH ); 2.62 (m, 1H, (O)CCH2C); 1.97 (m, 6H,

+ CH3C=CH-); 1.33 (m, 3H, -CH3); 1.09 (m, 6H, -C(CH3)2). S.M. (ESI): m/z 352 ([M+H] ),100%. Anal.

(C18H25NO6)C, H, N.

151

Parties Expérimentales Chimiques

Ethyl 3-hydroxy-2-(2-(3-hydroxy-4, 7, 7-trimethylbicyclo [2.2.1] heptan-2-yl) acetamido) propanoate (15).

OH O O N H OH O

Chemical Formula: C17H29NO5 Molecular Weight: 327,42

According to general procedure A the reaction of heptane-2- acetic acid (300 mg, 1.4 mmol) with L serine ethyl ester chlorhydrate (239.15 mg, 1.4 mmol) afforded the title compound 15 as white solid

(Rf 0,13 ,cHex/AcOEt, 1/1; 173 mg 41%, yield) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ : 4.59 (m, 1H); 4.17 (m, 2H); 3.89 (s, 2H); 3.45 (s, 1H); 3.19 (m, 1H ); 2.32 (m, 3H); 1.59 (m, 3H); 1.25(m, 4H); 1.03 (m, 3H);

0.83 (m, 7H). RMN ¹³C (62,5 MHZ, CDCl3) δ :174.1; 85.9; 62.7; 62.0; 54.9; 49.9; 49.5; 47.6; 45.9; 38.7; 34.7; 20.6; 19.7; 14.2; 11.5. S.M. (ESI): m/z 328 ([M+H]+),100%). Ethyl-3-hydroxy-2-adamant-1-amidopropanoate (16).

OH O O N O H O

Chemical Formula: C16H25NO5 Molecular Weight: 311,37

To a solution of L serine ethyl ester chlorhydrate (100 mg, 0.58 mmol) in anhydrous THF (12 mL) were added 1-adamantylfluoroformate (116.8 mg, 0.58 mmol), and 360 µL of TEA (triethylamine). The reaction mixture was stirred at room temperature under nitrogen during 24 h. After; the solvent is evaporated under reduced pressure. The residue was washed by (2 X 5 mL) 5% citric acid, (2 X 5 mL) 5

% NaHCO3 and (1 X 10 mL) water. The organic phase is dried over MgSO4, after filtration and evaporation under reduced pressure, the residue was purified by column chromatography, eluting with cyclohexane: AcOEt (6:1 to 3:1) to give 16 as white oil Rf 0, 62 (84 mg, 80% yield). RMN ¹H (250 MHZ,

CDCl3) δ :5.53 (s, 1H); 4.33 (m, 1H); 4.19 (q, 2H); 3.89 (t, 2H); 2.07 (m, 9H ); 1.62 (m, 7H); 1.27 (t,

3H). RMN ¹³C (62,5 MHZ, CDCl3) δ :170.7; 155.4; 80.0; 63.4; 61.7; 55.7; 43.3; 41.4; 36.0; 30.7; 30.0; 26.8; 14.0. S.M. (ESI): m/z 312 ([M+H]+),100%).

152

Parties Expérimentales Chimiques

Ethyl 3-hydroxy-2-adamant-1-amidopropanoic (17).

OH O OH N O H O

Chemical Formula: C14H21NO5 Molecular Weight: 283,32

According to general procedure B, reaction of ethyl-3-hydroxy-2-adamant-1- amidopropanoate(16) ( 64 mg, 0.2 mmol) with hydroxyde lithium monohydrate (25 mg, 0.6 mmol) afforded the title compound 17 (25 mg, 43% yield) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ : 5.80 (m, 1H); 4.34 (m, 1H); 4.04 (m, 2H); 2.17 (m, 9H); 1.64 (m, 5H ); 1.25(m, 1H). S.M. (ESI): m/z 284 ([M+H]+),100%).

Ethyl 3-(4-hydroxyphenyl)-2-stearamidopropanoate (18).

H O N O O Chemical Formula: C29H49NO4 Molecular Weight: 475,70 OH

According to general procedure A. Reaction of stearic acid (200 mg, 0.71 mmol) with L tyrosine ethyl ester hydrochloride (147 mg, 0.71 mmol) afforded the title compound Ethyl 3-(4- hydroxyphenyl)-2-stearamidopropanoate (18) as white solid with quantitative yield Rf 0.7 1CHex/1AcOet 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 6.93 (d, J= 8.48 Hz, 2H, ArH ); 6.75 (d, J=8.49 Hz, 2H,

ArH); 4.83 (m, 1H, -HNCHCOO-); 4.23 (q, J=7.13 Hz, 2H, COOCH2CH3); 3.46 (m, 2H, -CH2OH);

2.13 (t, J=7.2 Hz, 2H, -CH2C(O)-); 1.55 (m, 4H, CH2CH2C-(O)-); 1.23 (m, 31H, -(CH2)14- and

+ CH3CH2O-); 0.87 (m, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 476 ([M+H] ), 100%.

153

Parties Expérimentales Chimiques

3-(4-hydroxyphenyl)-2-stearamidopropanoic acid ( 19).

H O N OH O Chemical Formula: C27H45NO4 Molecular Weight: 447,65 OH

According to general procedure B. Reaction of Ethyl 3-(4-hydroxyphenyl)-2- stearamidopropanoate ( 246 mg, 0.5 mmol) with hydroxyde lithium monohydrate (65 mg, 1.5 mmol) afforded the title compound 3-(4-hydroxyphenyl)-2-stearamidopropanoic) acid (19) as a white solid with

1 quantitative yield. H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 7.05 (d, J= 8.42 Hz, 2H, ArH ); 6.73 (d, J=8.34 Hz,

2H, ArH); 4.80 (m, 1H, –HNCHCOOH); 3.13 (m, 2H, -CH2OH ); 2.20 (m, 2H, -CH2C(O)-); 1.53 (m, 2H, -

+ CH2CH2C(O)-); 1.31 (m, 28H, -(CH2)14-); 0.93 (m, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 448 ([M+H] ), 100%.

Ethyl -3-(4-hydroxyphenyl)-2-((9E, 12E)-octadeca-9-12-dienamidopropanoate (20).

H O N O O Chemical Formula: C29H45NO4 Molecular Weight: 471,67 OH

According to general procedure A. Reaction of linoleic acid (300 mg, 1 mmol) with L-tyrosine ethyl ester hydrochloride (221.7 mg, 1 mmol) afforded the title compound Ethyl -3-(4- hydroxyphenyl)-2-((9E, 12E)-octadeca-9-12-dienamidopropanoate (20) as transparent oil with quantitative yield Rf 0.7 1CHex/1AcOet. RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.95 (d, J= 8.32 Hz, 2H, ArH ); 6.74 (d, J=8.28 Hz, 2H, ArH); 6.05 (s, 1H, -NH); 5.34 (m, 4H, -CH=CH-); 4.85 (m, 1H, -CHNCO); 4.16

(m, 2H, O-CH2CH3); 3.01 (m, 2H, -CH2OH); 2.17 (m, 2H, -HC=CHCH2CH=CH-); 2.04 (m, 4H, 2 -

HC=CH-CH2-); 1.57 (m, 2H, -CH2C(O)NH 1.41 ( m, 2H, -CH2CH2C(O)); 1.25 (m, 18H, (-CH2)9); 0.87 (m,

+ 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 472 ([M+H] ), 100%.

154

Parties Expérimentales Chimiques

3-(4-hydroxyphenyl)-2-(9E,12E)-octadeca-9,12-dienamidopropanoic acid (21).

H O N OH O Chemical Formula: C27H41NO4 Molecular Weight: 443,62 OH

According to general procedure B, the reaction of Ethyl -3-(4-hydroxyphenyl)-2-((9E, 12E)- octadeca-9-12-dienamidopropanoate (102 mg, 0.26 mmol) with lithium hydroxide monohydrate (27 mg, 0.6 mmol) afforded the title compound 3-(4-hydroxyphenyl)-2-(9E,12E)-octadeca-9,12- dienamidopropanoic acid (21) as a transparent oil with quantitative yield RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.86 (m, 2H, ArH ); 6.64 (m, 2H, ArH); 6.16 (s, 1H, -NH); 5.26 (m, 4H, -CH=CH-); 4.80 (m, 1H, CHNCO);

3.77 (m, 2H, -CH2OH); 2.75 (m, 2H, -CH=CHCH2CH=CH-); 2.12 ( m, 2H, -CH2NC(O)); 1.95 (m, 4H, –

CH=CHCH2-); 1.49 (m, 2H, -CH2CH2NC(O)); 1.19 (m, 18H, -(CH2)9- ); 0.80 (m, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 444 ([M+H]+), 100%. Ethyl-2-(2E,4E,6E,8E,10E,12E)-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenamido-3-(4-hydroxyphenyl) propanoate (22).

H O N O Chemical Formula: C33H45NO4 O Molecular Weight: 519,71 OH

According to general procedure A. Reaction of docosahexaenoic acid (200 mg, 0.6 mmol) with L tyrosine ethyl ester hydrochloride (127.1 mg, 0.6 mmol) afforded the title compound Ethyl-2- (2E,4E,6E,8E,10E,12E)-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenamido-3-(4-hydroxyphenyl) propanoate (22) as transparent oïl with quantitative yield Rf 0.8 1CHex/1AcOet. RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.91 (m, 2H, ArH ); 6.73 (m, 2H, ArH); 5.97 (m, 1H, -NH); 5.35 (m, 10H, -CH=CH-); 4.81 (m, 1H, -CHNCO); 4.14 (m,

2H, O-CH2CH3); 3.16 (m, 2H, -CH2OH); 2.05 (m, 4H, 2 -HC=CH-CH2-); 1.25 (m, 19H, (-CH2)8 and -

+ CH3); 0.95 (m, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 520 ([M+H] ), 100%.

155

Parties Expérimentales Chimiques

2-(2E,4E,6E,8E,10E,12E)-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenamido-3-(4-hydroxyphenyl) propanoic acid (23).

H O N OH O

Chemical Formula:C31H41NO4 Molecular Weight: 491,66 OH

According to general procedure B, the reaction of Ethyl-2-(2E,4E,6E,8E,10E,12E)-docosa- 2,4,6,8,10,12-hexaenamido-3-(4-hydroxyphenyl) propanoate (282 mg, 0.5 mmol) with lithium hydroxide monohydrate (70 mg, 1 mmol) afforded the title compound 2-(2E,4E,6E,8E,10E,12E)-docosa-

2,4,6,8,10,12-hexaenamido-3-(4-hydroxyphenyl) propanoic acid (23) as a transparent oil Rf 0.4 cHex/AcOet (1:1) (113 mg, 42% yield). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 7.01 (m, 2H, ArH ); 6.74 (m, 2H,

ArH); 6.03 (s, 1H, -NH); 5.37 (m, 12H, -CH=CH-); 4.81 (m, 1H, CHNCO); 3.44 (m, 2H, -CH2OH); 1.95

+ (m, 2H, –CH=CHCH2-); 1.19 (m, 16H, -(CH2)8- ); 0.96 (m, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 492 ([M+H] ), 100%. Ethyl -3-(4-hydroxyphenyl)-2-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4ª-dimethyl 1,2,3,4,4ª,4b,5,6,10,10ª- decahydrophenanthrene-1-carboxamido)propanoate (24).

O OH HN

O Chemical Formula: C31H43NO4 O Molecular Weight: 493,68

According to general procedure A. Reaction of abietic acid (300 mg, 0.99 mmol) with L tyrosine ethyl ester hydrochloride (207 mg, 0.99 mmol) afforded the title compound Ethyl -3-(4- hydroxyphenyl)-2-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4ª-dimethyl1,2,3,4,4ª,4b,5,6,10,10ª- decahydrophenanthrene-1-carboxamido)propanoate (24) as yellow solid Rf 0.7 1CHex/1AcOet (105 mg,

21% yield) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.97 (d, J= 8.42 Hz, 2H, ArH ); 6.73 (d, J=8.34 Hz, 2H, ArH); 6.15 (m, 1H, -(O)CNH-); 5.73 (s, 1H, -CH=CH-); 5.26 (m, 1H, -HC=CH-); 4.80 (m, 1H, –

HNCHCOO-); 4.15 (m, 2H, -COOCH2CH3 ); 3.02 (m, 2H, -CH2OH ); 2.04 (m, 4H, 4 -CH2CHCH2-); 1.62

156

Parties Expérimentales Chimiques

(m, 3H, -CCH3); 1.53 (s, 5H,-CH2CH2CHH-); 1.24 (m, 8H, 4 -CH2-); 1.19 (m, 6H, -C(CH3)2); 0.79 (s, 3H,

+ -CH3). S.M. (ESI): m/z 494 ([M+H] ), 100%. 3-(4-hydroxyphenyl)-2-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4ª-dimethyl-1,2,3,4,4ª,4b,5,6,10,10ª- decahydrophenanthrene-1-carboxamido)propanoic acid (25).

O OH HN O Chemical Formula: C29H39NO4 OH Molecular Weight: 465,62

According to general procedure B. Reaction of Ethyl -3-(4-hydroxyphenyl)-2-((1S,4aR,4bS)-7- isopropyl-1,4ª-dimethyl1,2,3,4,4ª,4b,5,6,10,10ª-decahydrophenanthrene-1-carboxamido)propanoate ( 40 mg, 0.08 mmol) with hydroxyde lithium monohydrate (10 mg, 0.2 mmol) afforded the title compound 3-(4-hydroxyphenyl)-2-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4ª-dimethyl-1,2,3,4,4ª,4b,5,6,10,10ª- decahydrophenanthrene-1-carboxamido)propanoic acid (25) as a yellow solid Rf 0.2 cHex/AcOet (1:1)

(28 mg, 66% yield). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.98 (m, 2H, ArH ); 6.75 (m, 2H, ArH); 6.19 (m, 1H, -

CH=CH-); 5.73 (s, 1H, -CH=CH-); 4.77 (m, 1H, –HNCHCOO-); 3.08 (m, 2H, -CH2OH); 2.14 (m, 6H, 4 -

CH2CHCH2-); 1.51 (m, 3H, -CCH3); 1.18 (m, 8H, 4 -CH2-); 0.97 (m, 6H, -CH2(CH3)2); 0,78 (s, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 466 ([M+H]+), 100%. Ethyl 3-(benzylthio)-2-stearamidopropanoate (26).

H O N O O Chemical Formula: C30H51NO3S SBzl Molecular Weight: 505,80

According to general procedure A. Reaction of stearic acid (1 g, 3 mmol) with H cyst(Bzl) ethyl ester hydrochloride (970 mg, 3 mmol) afforded the title compound Ethyl 3 (benzylthio)-2-

1 stearamidopropanoate (26) as yellow solid with quantitative yield Rf 0.8, 10% DCM/MeOH H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 7.27 (m, 5H, ArH); 6.47 (m, 1H, (O)CHNC); 4.78 (m, 1H, -HNCHCOO-); 4.13 (q,

J=7.13 Hz, 2H, COOCH2CH3); 3.67 (m, 2H, -CH2SC H2Bzl); 2.85 (m, 2H, -CH2SC H2Bzl); 2.17 (t,

157

Parties Expérimentales Chimiques

J=7.5 Hz, 2H, -CH2C(O)-); 1.60 (m, 2H, CH2CH2C(O)); 1.23 (m, 31H, -(CH2)14- and CH3CH2O-); 0.87

+ (m, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 506 ([M+H] ), 100%. Ethyl 3-(benzylthio)-2-stearamidopropanoic acid (27).

H O N OH O Chemical Formula: C28H47NO3S SBzl Molecular Weight: 477,74

According to general procedure B. Reaction of Ethyl 3-(benzylthio)-2-stearamidopropanoate ( 500 mg, 0.9 mmol) with hydroxyde lithium monohydrate (124 mg, 2.9 mmol) afforded the title compound Ethyl 3-(benzylthio)-2-stearamidopropanoic acid (27) as a yellow solid Rf 0.6 10%

1 DCM/MeOH ( 446 mg 94% yield) . H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 7.28 (m, 5H, ArH); 6.34 (m, 1H,

(O)CHNC); 4.73 (m, 1H, –HNCHCOOH); 3.67 (m, 2H, -CH2SCH2Bzl); 2.85 (m, 2H, -CH2SC H2Bzl);

2.18 (m, 2H, -CH2CH2C(O)-); 1.54 (m, 2H, -CH2CH2C(O)-); 1.22 (m, 28H, -(CH2)14-); 0.84 (m, 3H, -

+ CH3). S.M. (ESI): m/z 478 ([M+H] ), 100%. Ethyl 3-(benzylthio)-2-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4a-dimethyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10a- decahydrophenanthrene-1-carboxamido)propanoate (28).

OO Chemical Formula: C32H45NO3S HN Molecular Weight: 523,77 O

SBzl According to general procedure A, the reaction of abietic acid (500 mg, 1.6 mmol) with H cyst(Bzl) ethyl ester hydrochloride ( 441 mg, 1.6 mmol) afforded the title compound Ethyl 3-(benzylthio)-2- ((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4a-dimethyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10a-decahydrophenanthrene-1- carboxamido)propanoate (28) as a white solid (Rf 0.8, 5% DCM/MeOH ( 722 mg, 86% yield). RMN ¹H

(250 MHZ, CDCl3) δ: 7.40 (m, 5H, ArH); 6.52 (m, 1H, (O)CHNC); 5.78 (s, 1H, -CH=CH-); 5.43 (m, 1H,

-HC=CH-); 4.68 (m, 1H, –HNCHCOO-); 4.48 (m, 2H, -COOCH2CH3 ); 3.67 (m, 2H, -CH2SCH2Bzl); 2.82

(m, 2H, -CH2SC H2Bzl); 1.97 (m, 4H, 4 -CH2CHCH2-); 1.56 (m, 3H, -CCH3); 1.40 (s, 5H,-CH2CH2CHH-);

+ 1.26 (m, 8H, 4 -CH2-); 0.962 (m, 6H, -C(CH3)2); 0.816 (s, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 524 ([M+H] ),

100%. Anal. (C32H45NO3S)C, H, N.

158

Parties Expérimentales Chimiques

3-(benzylthio)-2-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4a-dimethyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10a- decahydrophenanthrene-1-carboxamido)propanoic acid (29).

OO Chemical Formula: C30H41NO3S HN Molecular Weight: 495,72 OH

SBzl According to general procedure B, the reaction of Ethyl 3-(benzylthio)-2-((1S,4aR,4bS)-7- isopropyl-1,4a-dimethyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10a-decahydrophenanthrene-1-carboxamido)propanoate (500 mg, 0.9 mmol) with lithium hydroxide monohydrate (120 mg, 2,8 mmol) afforded the title compound 3-(benzylthio)-2-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4a-dimethyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10a- decahydrophenanthrene-1-carboxamido)propanoic acid (29) Rf 0.7 5% DCM/MeOH ( 80 mg, 16% yield). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 7.31 (m, 5H, ArH); 6.54 (m, 1H, (O)CHNC); 5.72 (s, 1H, -

CH=CH-); 5.30 (m, 1H, -HC=CH-); 4.61 (m, 1H, –HNCHCOO-); 3.68 (m, 2H, -CH2SCH2Bzl); 2.88 (m,

2H, -CH2SC H2Bzl); 1.94 (m, 4H, 4 -CH2CHCH2-); 1.56 (m, 3H, -CCH3); 1.40 (s, 5H,-CH2CH2CHH-);

+ 1.26 (m, 8H, 4 -CH2-); 0.962 (m, 6H, -C(CH3)2); 0.816 (s, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 524 ([M+H] ),

100%. Anal. (C30H41NO3S) C, H, N. Ethyl 2-Tetrazol -5-yl-2-oximinoacetate (30).

NN N NH HO O N O Chemical Formula: C5H7N5O3 Molecular Weight: 185,14

A mixture of (3 g, 21.12 mmol) of ethyl 2-cyano-2-oximinoacetate and (1.5 g, 0.22 mmol) of sodium azide (NaN3) was stirred in 20 mL of dry DMF in an oil bath maintained at 70 °C for 30 h. The reaction mixture was then concentrated under reduced pressure which was subjected to rotary evaporation for 2 h to remove most of the DMF. Then 70 mL of ethyl acetate and 20 mL of water were added, and the mixture was stirred until solution was complete. The pH was adjusted to pH 1 by the addition of 5 mL of 5N HCl. The phases were separated and the ethyl acetate was washed with 20 mL of

H2O, dried, and evaporated under reduced pressure.

159

Parties Expérimentales Chimiques

The residue was purified by column chromatography eluting with cyclohexane/EtoAc (1: 1) gave as a solid

Rf 0.23 (1.5 g, 39% yield). RMN ¹H (250 MHZ, DMSO-d6) δ: 4.28 (q, J= 7.1 Hz, 2H, CH3CH2COO-); 1,.25

+ (m, 3H, CH3CH2COO-). S.M. (ESI): m/z 186 ([M+H] ), 100%. Ethyl 2- amino-2-(1H-tetrazol-5-yl) acetate (31).

NN N NH O H2N .HCl O

Chemical Formula: C5H9N5O2 Molecular Weight: 171,16

A solution of 5-ethyl 2-tetrazol-5-yl-2-oximinoacetate (30) was dissolved in 10 mL of MeOH. 40 mg of 10% in weight of Pearlman’s catalyst (Pd(OH)2 over activated charcoal) was added to the solution and the resulting suspension was stirred at room temperature under H2 atmosphere for 2 h. 6 mL of a solution of 3N HCl/MeOH was added and the reaction was stirred for 18 h at room temperature. The solution was filtered and concentrated under reduced pressure to give compound 31 as a yellow solid with a quantitative yield. RMN ¹H (250 MHZ, DMSO-d6) δ: 4.78 (m, 1H, NH2-CH-C(O); 4.24 (m, 2H,

+ CH3CH2COO-; 1.15 (m, 3H, CH3CH2COO-). S.M. (ESI): m/z 172 ([M+H] ), 100%. Ethyl 2-(9Z, 12Z)-heptadeca-9, 12-dienamido-2-(1H-tetrazol-5-yl) acetate (34).

H O N O O Chemical Formula: C23H39N5O3 N NH N Molecular Weight: 433,59 N

A mixture of linoleic acid (229 mg, 0.82 mmol), ethyl chloroformate (98.28 mg, 0.91 mmol) and pyridine in CH2Cl2 was stirred at 0 °C for 20 min and then a solution of ethyl 2-amino-2-(1H-tetrazol-5- yl)acetate (31) (150 mg, 0.70 mmol) in CH2Cl2 was added dropwise at 0 °C. The reaction mixture was stirred for 2 h at room temperature. The solution was evaporated under reduced pressure, 5 ml of ethyl acetate was added, and the residue was washed by (3 x 10 mL) H2O. The organic phase was dried over

MgSO4 and after filtration and evaporation under reduced pressure, silica gel chromatography (cyclohexane/EtOAc (1: 1)) of the residue gave transparent oil (140 mg, 47% yield). RMN ¹H (250 MHZ,

DMSO-d6) δ: 5.30 (m, 4H, 2 -CH=CH-); 4.78 (m, 1H, NH2CHC(O)); 4.03 (q, J= 7.1 Hz, 2H,

CH3CH2OC(O)); 2.63 (m, 2H, –CH=CHCH2CH=CH- ); 2.28 (m, 2H, -CH2CH2C(O)-); 2.07 (m, 6H, -

160

Parties Expérimentales Chimiques

CH2C(O)- and 2 -CH2C=CH- ); 1.49 (m, 2H, CH2CH2C(O)); 1.24 (m, 17H, -CH2-); 0.84 (m, 3H, -CH3). S.M.

+ (ESI): m/z 420 ([M+H] ). 100%.Anal (C23H45N5O3) C,H,N. (9Z, 12Z)-N-(2-hydroxy-1-(1H-tetrazol-5-yl) ethyl) heptadeca-9, 12-dienamide (35).

H N OH O NH Chemical Formula: C21H37N5O2 N N Molecular Weight: 391,55 N

Ethyl 2-(9Z, 12Z)-heptadeca-9, 12-dienamido-2-(1H-tetrazol-5-yl) acetate 34 (100 mg, 0.23 mmol) was dissolved in THF (5 mL), and anhydrous calcium chloride (25 mg, 0.23 mmol) and NaBH4 (17,4 mg, 0.46 mmol) were added. After addition of ethanol (10 mL), the mixture was stirred at room temperature overnight. The mixture was cooled with ice-water, adjusted to pH 4 by the gradual addition of 10% citric acid (3.8 mL), and concentrated in vacuo. Water (20 mL) was added to the residue, which was extracted with methylene chloride three times and dried (Mg2SO4). Removal of the solvent and purification by column chromatography over silica gel eluting with CH2Cl2-ether-MeOH (4:4:0.5) gave 35 (30 mg, 34%). RMN ¹H (250 MHZ, DMSO-d6) δ : 5.33 (m, 4H), 4.90 ( m, 1H), 4.13 ( m, 2H), 2.76 ( m, 2H), 2.28 (m, 2H), 2.02 (m, 2H), 1.61 (m, 2H), 1.24 (m, 12H), 0.88 (m, 3H), S.M. (ESI): m/z 378 ([M+H]+),100%). The protected aminoethylphosphonic acid (A).

Me SiO 3 P Me3SiO NHSiMe O 3

Chemical Formula: C8H22O3PSi2 Molecular Weight: 253,40

A mixture of the 1-aminoethylphosphonic acid (64 mg, 0.46 mmol) and hexamethyldisilazane (222 mg, 1.3 mmol) was heated on an oil bath at 150-160 °C until all the solid dissolved (4h). Excess hexamethyldisilazane was evaporated and the residue was distilled to give the N, O, O-trisily derivative as a colourless with quantitative yield.

161

Parties Expérimentales Chimiques

2-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4a-dimethyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10a-decahydrophenanthrene-1- carboxamido) ethylphosphonic acid (37).

OH H HO N P O O

Chemical Formula: C22H36NO4P Molecular Weight: 409,50

A solution of abietic acid (100 mg, 0.33 mmol) in dry ethyl acetate (5 mL) was stilled at -5 °C then treated sequentially with triethylamine (140 µL) and acetyl chloride (47 µL), the latter added dropwise. The resulting cloudy mixture was stirred at – 5 °C for 1h, then a solution on tri-silyl derivative in ethyl acetate (5 mL) was added dropwise and resulting mixture stirred at the same temperature for 2h, then for 4h without cooling and finally for 3h at 80 °C. The volatiles were removed from the cooled mixture by rotary evaporation. The residue was dissolved in a saturated aqueous sodium bicarbonate and resulting solution acidified to pH 2 using 10% of hydrochloric acid and then washed with (3 x 10 mL) of DCM.

The organic phase was dried over MgSO4. After filtration and evaporation under reduced pressure to give the 1-abietylaminoethylphosphonic acid 37 as yellow oil with quantitative yield (Rf 0.7 1Chex/

1AcOet) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.34 (m, 1H, -CH=CH-); 5.73 (s, 1H, -CH=CH-); 4.09 (m, 2H, –

HNCH2CH2P-); 3.08 (m, 2H, CH2P(O)(OH)2); 2.14 (m, 6H, 4 -CH2CHCH2-); 1.51 (m, 3H, -CCH3); 1.18

+ (m, 8H, 4 -CH2-); 0.97 (m, 6H, -CH2(CH3)2); 0,78 (s, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 410 ([M+H] ), 100%. Methyl 2-Amino-2-(dimethoxyphosphoryl) acetate (38).

O O O HCl.H2N P O O

Chemical Formula: C5H10O5P Molecular Weight: 181,10

HCl in ether (2 mL) was added to a solution of Boc-α-phosphonoglycine trimethyl ester (1 g, 3.6 mmol) in diethyl ether, and the solution was stirred for 24 h at room temperature. Evaporation of the solvent gave the desired product Methyl 2-Amino-2 (dimethoxyphosphoryl) acetate (38) as a white solid

162

Parties Expérimentales Chimiques

in quantitative yield. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 4.65 (m, 1H, HNCHCOO-); 4.24 (m, 6H,

+ (CH3O)2P(O)); 4.04 (m, 3H, -COO-CH3). MS (ESI): m/z 198 ([M + H] ), 100%. Methyl 2-(Dimethoxyphosphoryl)-2-stearamidoacetate (39).

O O O P O O N H O

Chemical Formula: C23H46NO6P Molecular Weight: 463,59

According to general procedure A, the reaction of stearic acid (545 mg, 1.9 mmol) with methyl 2- amino-2-(dimethoxyphosphoryl) acetate (384 mg, 1.61 mmol) afforded the title compound 39 as yellow

1 oil (358 mg, 48% yield), Rf 0.6. (Diethylether) H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 4.40 (m, 1H, -HNCHCOO-);

3.80 (m, 3H, -COOCH3); 3.64 (m, 6H, (CH3O)2P(O)); 1.83 (m, 2H, -CH2- CH2C(O)); 1.62 (m, 2H, -

CH2CH2C(O); 1.23 (m, 28H, (-CH2-)14); 0.87 (m, 3H, -CH3). 13C NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 181.3; 172.9; 54.1; 53.4; 49.5; 25.4; 36.3; 33.7; 32.0; 29.7; 29.4; 29.2; 25.6; 24.9; 22.8; 14.2 MS (ESI): m/z 464 ([M + H]+), 100%. Dimethyl 2-Hydroxy-1-stearamidoethylphosphonate (40).

O O O P O OH N H

Chemical Formula: C22H46NO5P Molecular Weight: 435,58

Methyl 2-(dimethoxyphosphoryl)-2-steramidoacetate 39 (150 mg, 0.32 mmol) was dissolved in THF

(5.5 mL), and anhydrous lithium chloride (273 mg, 6.4 mmol) and NaBH4 (244 mg, 6.4 mmol) were added. After addition of ethanol (11 mL), themixture was stirred at room temperature overnight. The mixture was cooled with icewater, adjusted to pH 4 by the gradual addition of 10% citric acid (3.8 mL), and concentrated in vacuo. Water (70 mL) was added to the residue, which was extracted withmethylene chloride three times and dried over MgSO4. Removal of the solvent and purification by column chromatography over silica gel, eluting with CH2Cl2- ether-MeOH (4:4:0.5) gave 40 (30 mg, 22

%, yield) (Rf 0.5). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 6.54 (m, 1H, - (O) CNH-); 4.50 (m, 1H, NHCHCOO-);

3.99 (m, 1H, -CHHOH); 3.80 (m, 2H, -CHHOH and -CHNC(O)); 3.43 (m, 6H, (CH3O)2P(O)); 2.25 (m,

2H, -CH2C(O)-); 1.94 (m, 2H, -CH2CH2C(O)-), 1.24 (m, 28H. -(CH2)14-); 0.87 (m, 3H, -CH3). 13C NMR

163

Parties Expérimentales Chimiques

(250 MHz, CDCl3) δ: 181.3; 36.3; 31.7; 29.5; 29.1; 25.4; 25.2; 24.5; 22.5; 22.2; 13.9.MS(ESI):m/z 436

+ ([M+H] ), 100%.Anal. (C22H46NO5P)C, H, N. 2-Hydroxy-1-stearamidoethylphosphonic Acid (41).

O OH O P OH OH N H

Chemical Formula:C20H42NO5P Molecular Weight: 407,52

Ester dimethyl 2-hydroxyl-1-stearamidoethylphosphonate 40 was dissolved in methylene chloride.

Iodotrimethylsilane (5.0 mol equiv) was added, and the mixture was stirred overnight at 50 °C under N2.

Evaporation in vacuo gave 41 as yellow oil which was crystallized from 1MeOH-1H2O (32 mg, 22%) (Rf

1 0.3, CH2Cl2-ether-MeOH (4:4:0.5). H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 4.50 (m, 1H, - (OH)P(O); 3.95 (m, 1H,

(OH)P(O)); 3.74 (m, 2H, -CH2OH); 3.54 (m, 1H, -(O)CNHCHP); 2.31 (m, 2H, -CH2C- (O)-); 1.88 (m, 2H,-

CH2CH2C(O)-); 1.67 (m, 2H,-CH2CH2C- (O)-); 1.24 (m, 28H.-CH2-); 0.87 (m, 3H,-CH3).MS(ESI): m/z 408

+ ([M+H] ), 100%. Anal. (C20H42NO5P) C, H, N. 6-O-mesyl-D-glucal (42).

O MsO HO OH

Chemical Formula: C7H12O6S Molecular Weight: 224,23

To a stirred solution of D-glucal (0.5 g, 3.4 mmol) in pyridine (8 mL) and CH2Cl2 (10 mL), cooled at 0 °C, was added mesyl chloride (7.78 g, 40.8 mmol) and the cooling bath was removed. After stirring for all night at ambient temperature, the reaction mixture was cooled again to 0 °C, quenched with water (10 mL) and stirred for 1h30 min. More water (10 mL) was added; the organic layer was separated and washed with sat. aq. HCl (3 x 10 mL), NaHCO3 (3 x 10 mL) and brine (1 x 15 mL). The combined aqueous phases (excluding the first water layer) were extracted with CH2Cl2 (2 x 20 mL) and those organic extracts were washed with water (2 x 10 mL). The combined organic extracts were washed with brine (20 mL), dried on MgSO4, filtered and concentrated to provide crude 6-O-mesyl-D-glucal 42 as yellow oil (132 mg, 20% yield). Rf 0.7 (5% DCM/MeOH); RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.37 (m, 1H, CH=CH-); 5.29 (m, 1H, -(OH)HC-CH(OH)); 5.05 (t, J= 5.5 Hz, 1H, -CH=CH-); 4.78 (m, 1H,

OCH2CHOCH=); 4.45 (m, 1H, –(O2)SCH2CH-); 4.18 (m, 2H, -(OH)HC-CH(OH)); 3.90 (m, 1H, -

164

Parties Expérimentales Chimiques

(OH)HC-CH(OH)); 3.54 (m, 1H, -(OH)HC-CH(OH)); 3.22 (m, 3H, -CH3S(O2)CH2-) S.M. (ESI): m/z 225 ([M+H]+), 100%. ((2R, 3S, 4R)-3, 4-dihydroxy-3, 4-dihydro-2H-pyran-2-yl) methyl stearate (43).

O O OH O OH Chemical Formula: C24H44O5 Molecular Weight: 412,60

To a solution of stearic acid (167 mg, 0.58 mmol) in methylene dichloride (10 mL),distilled and under inert atmosphere, were added drop wise N-methylmorpholine, 1,3 dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (121 mg, 0.58 mmol), 4-DMAP (35 mg, 0.29 mmol) and 6-O-mesyl-D-glucal (132 mg, 0.58 mmol ) . The reaction mixture was stirred at room temperature under nitrogen for 24 h. After filtration, 10 mL of DCM was added at 0 °C to the filtrate to precipitate the DCU. The residue was washed with 10%

NaHCO3 (3 x10 mL), and brine (2 x 15 mL). The organic phase was dried over MgSO4. After filtration and evaporation under reduced pressure, silica gel chromatography of the residue (cyclohexane/EtoAc (3:1)) gave ((2R, 3S, 4R)-3, 4-dihydroxy-3, 4-dihydro-2H-pyran-2-yl) methyl stearate 43 as a white solid

1 with a quantitative yield. Rf 0.4 (cyclohexane/EtoAc (3:1)). H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 6.44 (m, 1H,

(O)HC=CH-); 6.11 (m, 1H, –HC=CH); 4.56 (m, 2H, -OOCCH2CHO-); 3.87 (m, 2H, -OOCCH2CHO-); 3.00

(m, 2H, -CHOH); 2.32 (m, 2H, -CH2C(O)-); 1.24 (m, 28H, -(CH2)14); 0.85 (m, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 411 ([M+H]+), 100%. (ESI): m/z 400 ([M+H]+), 100%. Anal. ((2R,3S,4R)-3,4-oxo-3,4-dihydro-2H-pyran-2-yl) methyl stearate (44).

O O O O OH Chemical Formula:C24H42O5 Molecular Weight: 410,59

To a stirred solution of ((2R, 3S, 4R)-3, 4-dihydroxy-3, 4-dihydro-2H-pyran-2-yl) methyl stearate 43

(100 mg, 0.24 mmol) in CH2Cl2 (6 mL) at room temperature was added MnO2 (208 mg, 2.40 mmol).

After 3 h, more MnO2 (208 mg, 2.40 mmol) was added and the stirring was continued. After 15 h, the reaction mixture was diluted with CH2Cl2 (10 mL), filtered through a pad of Celite (EtOAc rinse) and

165

Parties Expérimentales Chimiques

concentrated. Purification by flash chromatography (silica, 3/1 cHex/ EtOAc) provided compound 44 as

1 a white solid with quantitative yield. Rf 0.3 ((3/1) cHex/AcOet). H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 7.68 (m,

1H, (O)HC=CH-); 6.37 (m, 1H, –HC=CH); 4.56 (m, 2H, -OOCCH2CHO-); 4.22 (m, 2H, -OOCCH2CHO-);

3.83 (m, 2H, -CHOH); 2.32 (m, 2H, -CH2C(O)-); 1.24 (m, 28H, -(CH2)14); 0.85 (m, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 411 ([M+H]+), 100%.

Pyridinium Chlorochromate. (PCC).

To 18 mL of 6 M HCl was added (10 g, 0.1 mol) of CrO3 rapidly with stirring. After 5 min. the homogeneous solution was cooled to 0 °C and (7.9 g, 0.1 mol) of pyridine was carefully added over 10 min. Recooling to 0 °C gave a yellow-orange solid which was collected by suction filtration and dried for 1 h –in vacuum (quantitative yield)

General procedure C Aldehyde formation. Stearaldehyde (58).

H O Chemical Formula: C18H36O Molecular Weight: 268,48

In a 500-ml round-bottomed flask fitted with a reflux condenser was suspended (1 g, 5.4 mmol of pyridinium chlorochromate in (10 mL) of anhydrous CH2Cl2). 1-Steaol (1 g, 3.6 mmol) in (20 mL) of

CH2C12) was added in one portion to the magnetically stirred solution. After 2 h, (15 mL) of dry ether was added and the supernatant decanted. The insoluble residue was washed thoroughly 3 times with (10 mL) portions of anhydrous ether whereupon it became a black granular solid. The combined organic solution was dried and the solvent evaporated. A solid white compound was obtained (808 mg, 83%): Rf

0.8 cHex/AcoEt 9:1).RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3): δ= 9.73 (s, 1H, C(O)H), 2.40 (m, 2H, -CH2C(O)); 1.57

(s, 2H, -CH2CH2C(O)); 1.22 (m, 28H, -(CH2)14-); 0.96 ppm (m, 3H, -CH3). RMN ¹³C (250 MHZ,

+ CDCl3): δ= 203.6; 44.0; 32.0; 29.8; (2) 29.5; 22.8; 22.2; 21.4; 14.3 ppm; S.M. (ESI): m/z 269 ([M+H] ).

166

Parties Expérimentales Chimiques

Stearaldehyde oxime (59).

N OH

Chemical Formula: C18H37NO Molecular Weight: 283,49

To a solution of stearaldehyde (0.8 g, 2.9 mmol) in (10 mL) of ethanol, a solution of hydroxylamine hydrochloride (1g, 14.5 mmol) in (10 mL) of water was added followed by the addition of 10% NaOH until a precipitate was formed. The reaction mixture was heated for 2 h, cooled to room temperature and the white precipitate was filtered, washed with cold water and dried. White solid was

1 obtained with quantitative yield. Rf 0.87 cHex/AcOet 3:1) H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 7.43 (m, 1H, -

CH=N(OH),trans), 6.93 (m, 1H, -CH=NOH,cis); 2.44 (m, 2H, -CH2CH=N(OH));1.50 (m, 2H,

CH2CH2CH=N(OH)); 1.29(m, 28H, -(CH2)14); 0.87 ppm (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ= 152.5; 31.8; 30.2; 29.8; (12C); 25.2; 22.2; 21.4; 14.5 ppm; S.M. (ESI): m/z 284 ([M+H]+), 100%; Anal. calcd for C18H37NO: C 76.32, H 13.14, N 4.94, O 5.64 General procedure D Reduction of Oxime. N-octadecylhydroxylamine (60).

H N OH

Chemical Formula: C18H39NO Molecular Weight: 285,51

A soln of NaBH3CN (133 mg, 2.2 mmol) in MeOH (2 mL) was added together with concurrent dropwise addition of aqueous 6 N HCl/MeOH 1: 1 to a stirred soln of the oxime 59 (500 mg, 1.7 mmol) in MeOH (10 mL) and at -60 °C. Then the mixture was allowed to attain -20 °C during 2 h (maintaining the pH 3). After evaporation the entire work-up was carried out at 0 °C; addition of saturation solution of

NaCl aq, basification with 6 N KOH. Extraction with Et2O, drying over MgS04 and evaporation of the

Organic phase gave the corresponding hydroxylamine which was used either without purification. Rf 0.3 cHex/AcOet 2:1. RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 2.87 (m, 2H, -CH2CHN (OH)); 1.50 (m, 2H, -

CH2CH2CHN (OH)); 1.24 (m, 28H, -(CH2)14-); 0.83 (m, 3H, -CH3); ppm; RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ= 44.5; 31.8; 29.7; 29.5; (10C); 29.3; 27.2; 22.7; 14.1 ppm; S.M. (ESI): m/z 286 ([M+H]+), 100%; Anal. calcd for C18H39NO: C 75.72, H 13.70, N 4.91, O 5.60.

167

Parties Expérimentales Chimiques

General procedure E. Ethyl {[hydroxyl (octadecyl) amino]carbonyl} carbamate (61).

OH H N N O O O Chemical Formula: C22H44N2O4 Molecular Weight: 400,6

Hydroxylamine N-octadecylhydroxylamine 60 (0.24 g, 0.8 mmol) was dissolved in anhydrous dichloromethane (10 mL). Ethylisocyanotoformate (0.098 g, 0.8 mmol) was added to room temperature. The reaction mixture was maintained at room temperature for 6 h. The solution was evaporated under reduced pressure, 10 mL of ethyl acetate was added, and the residue was washed by (3 x 10 mL) of

H2O. The organic phase was dried over MgSO4 and after filtration and evaporation under reduced pressure, silica gel chromatography (cHex/EtoAc 2: 1) of the residue gave transparent oil (62 mg, 18%)

Rf 0.5 (cHex/EtoAc 2: 1). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 9.36 (s, 1H, NH ); 8.09 (s, 1H, NOH); 4.25 (q, J

= 7.12 Hz, 2H, CH3CH2OC(O)); 3.68 (t, J = 7.5 Hz, ,2H, -CH2N(OH)); 1.69 (m, 2H, -CH2CH2N(OH));

1.24 (m, 31H, -(CH2)14- and CH3CH2OC(O)); 0.83 ppm (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ= 153.5;151.5; 58.8; 52.5; 31.5; 30.2; 29.8; (13C); 26.6; 23.7; 22.4; 14.5 ppm; S.M. (ESI): m/z 401

+ ([M+H] ), 100%; Anal. calcd for C22H44N2O4: C 65.96, H 11.14, N 6.99, O 15.98. Ethyl { [hydroxy (octadecyl) amino] carbonothioyl} carbamate (63).

OH H N N O S O Chemical Formula: C22H44N2O3S Molecular Weight: 416,66

According to general procedure E, the reaction of N-octadecylhydroxylamine (44 mg, 0.15 mmol) with Ethoxycarbonylisothiocyanate (30 mg, 0.23 mmol) afforded the compound 63 as yellow oil with quantitative yield Rf 0.8 (AcOet). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3): δ = 9.69 (s, 1H, NH ); 7.98 (s, 1H, NOH);

4.20 (q, J = 7.12 Hz, 2H, CH3CH2OC(O)); 3.61 (t, J =7.5 Hz, ,2H, -CH2N(OH)); 1.69 (m, 2H, -

CH2CH2N(OH)); 1.24 (m, 31H, -(CH2)14- and CH3CH2OC(O)); 0.83 ppm (m, 3H, -CH3). RMN ¹³C (250

MHZ, CDCl3): δ= 183.2; 153.4; 59.1; 57.5; 31.8; 30.2; 29.7; (12C); 27.6; 24.0; 22.7; 14.5; 13.8 ppm;

+ S.M. (ESI): m/z 417 ([M+H] ), 100%; Anal. calcd for C22H44N2O3S: C 63.42, H 10.14, N 6.72, O 11.52, S 7.70.

168

Parties Expérimentales Chimiques

Ethyl 2-(3-hydroxy-3-octadecylureido) acetate (65).

OH H O N N O O Chemical Formula: C23H46N2O4 Molecular Weight: 414,62

According to general procedure E, the reaction of N-decylhydroxylamine (100 mg, 0.5 mmol) with Ethyl isocyanatoformate (66 mg, 0.5 mmol) afforded the compound 65 as white solid Rf 0.8 (AcOet) with a quantitative yield. RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 9.70 (s, 1H, NH ); 7.98 (s, 1H, NOH); 4.13 (q, 4H,

CH3CH2OC(O)); 3.45 (t, J =7.5 Hz, ,2H, -CH2N(OH)); 1.54 (m, 2H, -CH2CH2N(OH)); 1.15 (m, 31H, -

(CH2)14- and CH3CH2OC(O)); 0.80 ppm (m, 3H, -CH3). RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ= 169.3;156.2; 61.2; 52.8; 43.1; 31.8; 30.2; 29.9; (13C); 26.6; 23.7; 22.4; 14.8; 14,4 ppm; S.M. (ESI): m/z 415 ([M+H]+),

100%; Anal. calcd for C23H46N2O4: C 66.62, H 11.18, N 6.76, O 15.54.

Generale procedure F. 2-octadecyl-1,2,4-oxadiazolidine-3,5-dione (62).

O O N NH O Chemical Formula: C20H38N2O3 Molecular Weight: 354,53

To a solution of 61 (0.062 g, 0.15 mmol,) in dioxane (4 mL) at 0 °C was added slowly under stirring (4 mL) of 3.5 N NaOH. The mixture was stirred at 0 °C during 15 min. and 7 h at room temperature. The solvent was evaporated, the residue taken up in water and the aqueous solution acidified to pH 5 with 1N HCl. The solution was extracted with ethyl acetate, the organic layers dried over MgS04 and the solvent evaporated to yield a white solid (34 mg, 62%). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3):

δ = 3.68 (t, J =7.5 Hz, ,2H, -CH2N(OH)); 1.70 (m, 2H, -CH2CH2N(OH)); 1.24 (m, 30H, -(CH2)15-); 0.83 ppm (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ= 157.3;153.2; 48.7; 31.5; 29.5; (12C); 26.3; 23.5;

+ 22.7; 14.2 ppm; S.M. (ESI): m/z 355 ([M+H] ), 100%; Anal. calcd for C20H38N2O3: C 67.72, H 10.80, N 7.86, O 13.54.

169

Parties Expérimentales Chimiques

2-octadecyl-3-thioxo-1,2,4-oxadiazolidin-5-one (64).

O N O NH Chemical Formula: C20H38N2O2S S Molecular Weight: 370,59

According to general procedure F, the reaction of 63 (0.67 g, 0.16 mmol) with sodium hydroxide

(10 mL) afforded the 2-octadecyl-3-thioxo-1, 2, 4-oxadiazolidin-5-one 64 as white solid Rf 0.6 AcOet (28 mg, 47%). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3): δ = 3.70 (t, J =7.5 Hz, ,2H, -CH2N(OH)); 1.75 (m, 2H, -

CH2CH2N(OH)); 1.29 (m, 30H, -(CH2)15-); 0.88 (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ= 183.3;159.2; 48.7; 31.5; 29.5; (12C); 26.3; 23.5; 22.7; 14.2 ppm; S.M. (ESI): m/z 371 ([M+H]+), 100%;

Anal. calcd for C20H38N2O2S: C 64.82, H 10.30, N 7.56, O 8.54, S 8.65.

2-octadecyl-1,2,4-oxadiazinane-3,6-dione (66).

O O N

Chemical Formula: C H N O O N 21 40 2 3 H Molecular Weight: 368,55

According to general procedure F, the reaction of 65 (0.4 g, 0.1 mmol) with sodium hydroxide (10 mL) afforded to the 2-octadecyl-1, 2, 4-oxadiazinane-3, 6-dione 66 as white solid with quantitative yield Rf 0.7 (cHex/AcOet 1:1) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 4.10 (m, 2H, -(O)CCH2NH); 3.42 (t, J =7.1

Hz, ,2H, -CH2N(OH)); 1.63 (m, 2H, -CH2CH2N(OH)); 1.20 (m, 30H, -(CH2)15-); 0.81 (m, 3H, -CH3);

RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ= 176.5;156.4; 48.7; 31.5; 29.5; (12C); 26.3; 23.5; 22.7; 14.2 ppm; S.M.

+ (ESI): m/z 369 ([M+H] ), 100%; Anal. calcd for C21H40N2O3: C 68.44, H 10.94, N 7.60, O 13.04.

170

Parties Expérimentales Chimiques

Decanal (53).

O Chemical Formula: C10H20O Molecular Weight: 156,27

According to general procedure C, the reaction of oxidation of decanol (1 g, 6.3 mmol) with pyridinium chlorochromate (1.35 g, 6.3 mmol) afforded the title compound decanal 53 as white oil with a quantitative yield. RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3): δ = 9.76 (s, 1H, C(O)H), 2.41 (m, 2H, -CH2C(O)); 1.61 (s,

2H, -CH2CH2C(O)); 1.28 (m, 12H, -(CH2)6-); 0.96 (m, 3H, -CH3). RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ = 202.6;

+ 43.2; 33.3; 31.2; (2) 28.6; 24.0; 22.0; 21.4; 13.4; S.M. (ESI): m/z 157 ([M+H] ), 100%. Anal. (C10H20O)C, H. General procedure G. (E)-decanal Oxime (54).

HO N

Chemical Formula: C10H21NO Molecular Weight: 171,28

To a reflux condenser, a thermometer and a separatory funnel are placed an aqueous solution of hydroxylamine hydrochloride (1.05 g, 13 mmol) in (2 mL) of cold water and decanal(1 g, 6.6 mmol) stirring is started, and a solution of anhydrous sodium carbonate (1.08 g, 10 mmol) in (4 mL) of cold water is added until a precipitation was formed at such a rate that the temperature of the reaction mixture does not rise above 45 °C.the reaction mixture was stirred about 4 h and after cooled to room temperature and the white precipitate was filtered ,washed with cold water and dried. Transparent oil was obtained without any purification with a quantitave yield Rf 0.5 (cHex/AcOet 3:1). RMN ¹H (250

MHZ,CDCl3)δ=7.44 (m, 1H, -CH=NOH,trans), 6.72 (m, 1H, -CH=NOH,cis); 2.35 (m, 2H, -CH2CH=NOH);

1.48 (m, 14H, -(CH2)7-); 0.97 ppm (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ = 152.6; 31.8; 30.3;

+ 30.2; 29.6; 25.2; 22.7; 14.4 ppm S.M. (ESI): m/z 172 ([M+H] ), 100%; Anal. calcd for C10H21NO: C 70.14, H 12.34, N 8.10, O 9.34.

171

Parties Expérimentales Chimiques

N-decylhydroxylamine (55).

HO N H

Chemical Formula: C10H23NO Molecular Weight: 173,3

According to general procedure D, the reaction of (E)-decanal Oxime 54 (200 mg, 1.1 mmol) with sodium cyanoborohydride (293 mg, 4.6 mmol) afforded the N-decylhydroxylamine 55 as white solide (180 mg, 94%): Rf 0.16 (cHex/AcOet 3:1). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3): δ = 2.92 (m, 2H, -CH2CHNOH); 1.52 (m,

2H, -CH2CH2CHNOH); 1.48 (m, 12H, -(CH2)6-); 0.87 ppm (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ = 44.6; 31.8; 29.3(2C) ; 29.2(2C); 27.0; 26.2; 22.6; 14.1 ppm ; S.M. (ESI): m/z 174 ([M+H]+), 100%; Anal. calcd for C10H23NO: C 69.34, H 13.38, N 8.08, O 9.23.

Ethyl { [ decyl (hydroxy) amino] carbonyl} carbamate (56).

O O OH O N N H

Chemical Formula: C14H28N2O4 Molecular Weight: 288,38

According to general procedure E, the reaction of N-decylhydroxylamine (100 mg, 0.5 mmol) with

Ethyl isocyanatoformate (66 mg, 0.5 mmol) afforded the 56 as white solid in quantitative yield: Rf 0.8

(AcOet). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ : 8.71 (s, 1H, NH ); 8.52 (s, 1H, NOH); 4.18 (q, J =6.8 Hz, 2H,

CH3CH2OC(O)); 3.49 (t, J =7.1 Hz, ,2H, -CH2NOH); 1.61 (m, 2H, -CH2CH2NOH); 1.25 (m, 17H, -(CH2)7- and CH3CH2OC(O)); 0.86 (m, 3H, -CH3). RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ = 153.5; 151.8; 61.6; 51.5 48.5; 31.6; 29.3; (2) 29.1; 26.4; 22.4; 21.4; 13.9 ppm ; S.M. (ESI): m/z 289 ([M+H]+), 100%; Anal. calcd for

C14H28N2O4: C 58.31, H 9.79, N 9.71, O 22.19.

172

Parties Expérimentales Chimiques

2-decyl-1,2,4-oxadiazolidine-3,5-dione (57).

O O N HN O Chemical Formula: C12H22N2O3 Molecular Weight: 242,31

According to general procedure F, the reaction of 56 (100 mg, 0.34 mmol) with sodium hydroxide (10 mL) afforded the 2-decyl-1,2,4-oxadiazolidine-3,5-dione 57 as white solid (48 mg, 58%):

Rf 0.6 (AcOet); RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 9.58 (s, 1H, NH ); 3.66 (t, J =7.1 Hz, ,2H, -CH2NO); 1.70

(m, 2H, -CH2CH2NO); 1.25 (m, 14H, -(CH2)7- and CH3CH2OC(O)); 0.87 ppm (m, 3H, -CH3). RMN ¹³C

(250 MHZ, CDCl3): δ = 153.5; 151.8; 48.5; 31.6; 29.3; (2) 29.1; 26.4; 22.4; 21.4; 13.9 ppm ; S.M. (ESI):

+ m/z 243 ([M+H] ), 100%; Anal. calcd for C12H22N2O3: C 59.48, H 9.15, N 11.56, O 19.81.

(E)-hexanal oxime (45).

HO N

Chemical Formula: C6H13NO Molecular Weight: 115,17

According to general procedure G, the reaction of hexanal (1 g, 9.9 mmol) with hydroxylamine hydrochloride (1.38 g, 19 mmol) afforded the (E)-hexanal oxime 45 as transparent oil with a quantitative yield: Rf 0.6 (cHex/AcOet 3:1) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3): δ = 7.35 (m, 1H, -CH=N(OH),trans), 6.65 (m,

1H, -CH=N(OH),cis); 2.32 (m, 2H, -CH2CH=N(OH)); 1.25 (m, 6H, -(CH2)3-); 0.83 ppm (m, 3H, -CH3);

+ RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ = 152.5; 32.3; 30.2; 24.9; 22.4; 14.3 ppm ; S.M. (ESI): m/z 116 ([M+H] ),

100%; Anal. calcd for C6H13NO: C 62.57, H 11.38, N 12.16, O 13.89.

173

Parties Expérimentales Chimiques

N-hexylhydroxylamine(46).

HO N H

Chemical Formula: C6H15NO Molecular Weight: 117,19

According to general procedure D, the reaction of (E)-hexanal Oxime 45 (1.43 g, 12.1 mmol) with sodium cyanoborohydride (0.93 g, 14.8 mmol) afforded the N-hexylhydroxylamine 46 as white solide

(828 mg, 55%): Rf 0.37 (cHex/AcOet 2:1) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3): δ = 2.87 (m, 2H, -CH2CHN(OH));

1.50 (m, 2H, -CH2CH2CHN(OH)); 1.24 (m, 6H, -(CH2)3-); 0.83 ppm (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250 MHZ,

+ CDCl3): δ = 44.5; 31.5; 26.5; 26.7; 22.7; 14.0 ppm ; S.M. (ESI): m/z 118 ([M+H] ), 100%; Anal. calcd for

C14H28N2O4: C 61.49, H 12.90, N 11.95, O 13.65.

Ethyl 2-(3-hexylureido)acetate (51).

O O N N O H OH Chemical Formula: C11H22N2O4 Molecular Weight: 246,3

According to general procedure E, the reaction of N-hexylhydroxylamine 46 (0.8 g, 0.5 mmol) with

Ethyl isocyanatoacetate (0.87 g, 0.5 mmol) afforded the 51 as white solid with a quantitative yield: Rf

0.8 (AcOet) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3): δ = 7.94 (s, 1H, NH ); 6.47 (s, 1H, NOH); 4.14 (m, 2H,

CH3CH2OC(O)); 3.90 (m, 2H, -OC(O)CH2NH) 3.44 (m, 2H, -CH2NOH); 1.56 (m, 2H, -CH2CH2NOH);

1.25 (m, 9H, -(CH2)3- and CH3CH2OC(O)); 0.83 ppm (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ = 169.5; 156.5; 61.0; 52.8; 44.5; 31.2 26.3; 23.7; 22.7; 14.1 ppm ; S.M. (ESI): m/z 247 ([M+H]+), 100%;

Anal. calcd for C11H22N2O4: C 53.31, H 9.09, N 11.31, O 25.99.

174

Parties Expérimentales Chimiques

2-hexyl-1,2,4-oxadiazinane-3,6-dione (52).

O O N HN O Chemical Formula:C9H16N2O3 Molecular Weight: 200,23

According to general procedure F, the reaction of 51 (1.8 g, 7.7 mmol) with sodium hydroxide (10 mL) afforded the 2-hexyl-1, 2, 4-oxadiazinane-3,6-dione 52 as white solid (875 mg, 56%). Rf 0.6 (AcOet)

RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3): δ = 4.14 (m, 2H, -OC (O) CH2NH); 3.90 (m, 2H, -OC (O) CH2NH) 3.51 (m,

2H, -CH2NO); 1.59 (m, 2H, -CH2CH2NO); 1.25 (m, 6H, -(CH2)3); 0.87ppm (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250

MHZ, CDCl3): δ = 176.5; 156.4; 50.7; 49.8; 31.2 26.3; 23.7; 22.7; 14.1 ppm ; S.M. (ESI): m/z 201

+ ([M+H] ), 100%; Anal. calcd for C9H16N2O3: C 53.31, H 8.09, N 13.99, O 23.97.

Ethyl { [ hexyl (hydroxy) amino] carbonyl} carbamate (47).

O O N N O OH H Chemical Formula: C10H20N2O4 Molecular Weight: 232,28

According to general procedure E, the reaction of N-hexylhydroxylamine 46 (0.1 g, 0.8 mmol) with Ethyl isocyanatoformate (0.098 mg, 0.8 mmol) afforded the compound 47 as white solid (92 mg, 46%):

Rf 0.8 (AcOet). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3): δ = 8.61 (s, 1H, NH ); 4.17 (m, 2H, CH3CH2OC(O)); 3.53

(m, 2H, -CH2N(OH)); 1.64 (m, 2H, -CH2CH2N(OH)); 1.26 (m, 9H, -(CH2)3- and CH3CH2OC(O)); 0.83 ppm (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ = 153.5; 151.5; 61.0; 52.4; 31.0 26.2; 23.2; 22.6;

+ 13.8 ppm ; S.M. (ESI): m/z 233 ([M+H] ), 100%; Anal. calcd for C10H20N2O4: C 51.71, H 8.69, N 12.01, O 27.55.

175

Parties Expérimentales Chimiques

Ethyl { [hexyl (hydroxy) amino] carbonothioyl } carbamate (49).

S O N N O OH H Chemical Formula: C10H20N2O3S Molecular Weight: 248,34

According to general procedure E, the reaction of N-hexylhydroxylamine 46 (0.2 g, 1.7 mmol) with Ethoxycarbonyl isothiocyanate (0.22 mg, 1.7 mmol) afforded the compound 49 as white solid (64 mg,

15%) Rf 0.8 (AcOet); RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3): δ = 9.67 (s, 1H, NH ); 8.03 (s, 1H, NOH); 4.22 (m,

2H, CH3CH2OC(O)); 3.64 (m, 2H, -CH2N(OH)); 1.62 (m, 2H, -CH2CH2N(OH)); 1.30 (m, 9H, -(CH2)3- and CH3CH2OC(O)); 0.88 ppm (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3): δ = 183.5; 152.9; 59.0; 57.4; 31.5; 27.2; 24.2; 22.8; 13.8 ppm ; S.M. (ESI): m/z 249 ([M+H]+), 100%; Anal. calcd for

C10H20N2O3S: C 48.31, H 8.19, N 11.21, O 19.33, S 12.91.

2-hexyl-1,2,4-oxadiazolidine-3,5-dione (48).

O N O NH O

Chemical Formula: C8H14N2O3 Molecular Weight: 186,21

According to general procedure F, the reaction of 47 (1.8 g, 0.3 mmol) with 3.5 M sodium hydroxide (10 mL) afforded the 2-hexyl-1, 2, 4-oxadiazolidine-3, 5-dione 48 as a transparent oil with quantitative yield Rf 0.6 (AcOet). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 9.77 (s, 1H, NH ); 3.66 (t, J = 6.9Hz 2H,

-CH2N ); 1.69 (m, 2H, -CH2CH2N ); 1.31 (m, 6H, -(CH2)3-); 0.88 (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C (250 MHZ,

+ CDCl3) δ: 157.5; 153.9; 48.9; 31.7; 26.2; 23.6; 22.7; 14.2 ppm; S.M. (ESI): m/z 187 ([M+H] ), 100%;

Anal. calcd for C8H14N2O3: C 51.60, H 7.58, N 15.01, O 25.78.

176

Parties Expérimentales Chimiques

2-hexyl-3-thioxo1,2,4-oxadiazolidin-5-one (50).

O N O NH S Chemical Formula: C8H14N2O2S Molecular Weight: 202,27

According to general procedure F, the reaction of 49 (35 mg, 0.14 mmol) with 3.5 M sodium hydroxide (4 mL) afforded the 2-hexyl-3-thioxo1, 2,4-oxadiazolidin-5-one 50 as a yellow oil with quantitative yield (17 mg, 60%) Rf 0.7 (AcOet); RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.77 (s, 1H, NH ); 3.12

(m, 2H, -CH2N ); 1.60 (m, 2H, -CH2CH2N ); 1.30 (m, 6H, -(CH2)3-); 0.86 ppm (m, 3H, -CH3); RMN ¹³C

(250 MHZ, CDCl3) δ: 184.5; 159.9; 54.9; 31.7; 27.2; 24.2; 23.0; 14.0 ppm; S.M. (ESI): m/z 203

+ ([M+H] ), 100%; Anal. calcd for C8H14N2O2S: C 47.51, H 6.98, N 13.85, O 15.83, S 15.81. Generale procedure H (E)-5-hexylidenethiazolidine-2, 4-Dione (67).

O NH O S

Chemical Formula: C9H13NO2S Molecular Weight: 199,27

To hexanal was added thiazolidine-2, 4-dione (1.28 g, 12 mmol), benzoic acid (0.10 g), piperdine (168 µL), toluene (15.0 mL) were heated to azotropically reflux for 4-8 h, cool to 25-35 °C for 1h.Toluene was evaporated under reduced pressure, dried at 60-70 °C. after the residue was taken in

DCM and washed with 30 mL of water. The organic phase was dried over MgSO4. After filtration and evaporation under reduced pressure, silica gel chromatography of the residue (cyclohexane/EtoAc

(3:1)) gave (E)-5-hexylidenethiazolidine-2,4-dione 67 as a transparent oil (220 mg, 10% yield) (Rf 0.5

3cHex/1AcOet). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ : 9.35 (m, 1H, HN); 6.43 (t, J= 7.4 Hz , 1H, -

H2CH=C(S)(CO); 2.32 (m, 2H, -CH2CHC(S)(CO)); 1.49 (m, 6H, -(CH2)3-); 0.88 (m, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 200 ([M+H]+), 100%.

177

Parties Expérimentales Chimiques

Generale procedure I. 5-hexylthiazolidine-2, 4-Dione (68).

O NH O S

Chemical Formula: C9H15NO2S Molecular Weight: 201,29

A mixture of compound (E)-5-hexylidenethiazolidine-2,4-dione 67 (0.14 g, 0.71 mmol), acetic acid and water mixture 10 mL (8:2) and wet palladium carbon (0.15 g, 1. 4mmol) were stirred under hydrogenation atmosphere for all night, the reaction mass was filtered through hyflow, washed with acetic acid and pH was adjust to 6-7 with 2M NaOH, followed by extracted with dichloromethane (3 x 10 mL), the organic layer was distilled completely and product 68 was isolated in isopropyl alcohol, (42 mg,

29% yield) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 5.37 (s, 1H, HN); 4.20 (m, 1H, -CH2CH2CH(O)); 2.01 (m, 2H,

-CH2C(O)); 1.57 (s, 2H, -CH2CH2C(O)); 1.31 (m, 6H, -(CH2)3-); 0.88 (m, 3H, -CH3).

(E)-5-octadecylidenethiazolidine-2,4-dione (69).

O NH O S

Chemical Formula: C21H37NO2S Molecular Weight: 367,59

According to general procedure H the reaction between stearaldehyde and thiazolidine-2, 4- dione (0.16 g, 0.59 mmol), gave (E)-5 octadecylidenethiazolidine-2, 4-dione 69 as a white solid. (63 mg,

53 % yield) Rf 0.5 (3:1 cHex/AcOet) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 8.44 ( s, 1H, NH); 7.04 (t, J= 7.4 Hz,

1H, -H2CH=C(S)(CO)); 2.19 (m, 2H, -H2CH=C(S)(CO)); 1.57 (s, 2H, -CH2CH2C=C)); 1.22 (m, 28H, -

+ (CH2)14-); 0.96 (m, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 368 ([M+H] ).

178

Parties Expérimentales Chimiques

5-octadecylthiazolidine-2, 4-Dione (70).

O NH O S

Chemical Formula: C21H39NO2S Molecular Weight: 369,60

According to general procedure I a reaction between compound ((E)-5 octadecylidenethiazolidine-2,4-dione 69 (0.06 g, 0.15 mmol), acetic acid and water mixture 10 mL (8:2) and wet palladium carbon (0.05 g, 0. 3 mmol) stirred under hydrogenation atmosphere for all night, gave 5-octadecylthiazolidine-2, 4-Dione 70 as a yellow solid (36 mg, 64% yield) Rf 0.3 (3:1 cHex/AcOet)

RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 7.73 (s, 1H, HN), 2.01 (m, 2H, -CH2C(O)); 1.61 (s, 2H, -CH2CH2CH(O));

+ 1.24 (m, 28H, -(CH2)14-); 0.88 (m, 3H, -CH3). S.M. (ESI): m/z 370 ([M+H] ).

5-(2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)-3,4-dihydroxyfuran-2(5H)-one (71).

O O O O

HO OH

Chemical Formula: C9H12O6 Molecular Weight: 216,19

Ascorbic acid (1.00 g, 1.0 equiv., 5.70 mmol) was suspended in 10 mL of anhydrous acetone. A catalytic amount of acetyl chloride (21 μL, 0.05 equiv., 0.29 mmol) was then added and the slurry mixture was stirred overnight at room temperature. The solid was filtered, washed with EtOAc and dried under vacuum to afford the desired ketal 71 as a white solid (0.81 g 58% yield) which was used without any further purification Rf 0.4 (EtOAc–hexane 4: 1). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ : 4.71 (d, J = 3.0 Hz, 1H); 4.27 (t, J = 7.0, 1H); 4.11 (d, J = 7.0 Hz, 1H); 3.89 (d, J = 6.3 Hz, 1H); 1.25 (s, 6 H).

179

Parties Expérimentales Chimiques

3,4-bis(benzyloxy)-5-(2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl) furan-2 (5H)-one (72).

O O O O

BnO OBn

Chemical Formula: C23H24O6 Molecular Weight: 396,43

The previous ketal (4.3 g, 1.0 equiv., 3.6 mmol) was suspended in anhydrous acetone (20 mL).

K2CO3 (6.87 g, 2.5 equiv., 49.8 mmol) was then added and the heterogenous mixture was refluxed. The insoluble ketal progressively dissolved in acetone whilst the temperature was rising. At reflux, one lot of benzyl bromide (1.43 mL, 2.3 equiv., 49 mmol) was added, and the solution was refluxed. The reaction mixture turned orange and after 2 h it was allowed to cool to room temperature. The solution was concentrated under reduced pressure and the residue was diluted by Et2O (30 mL). The organic layer was washed with brine (30 mL) and the aqueous layer was extracted twice with Et2O (2 x 30 mL). The combined organic layers were dried over anhydrous MgSO4, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude material was purified by flash chromatography (EtOAc–hexane 1: 4 then 1: 1) to afford the dibenzyl derivative 72 as a pale yellow solid. (60% Yield Rf 0.7 (1cHex/1AcoEt)) RMN ¹H

(250 MHZ, CDCl3) δ : 7.40 (m, 10H); 5.13 (m, 4H); 4.56 (m, 1H); 4.28 (m, 1H); 4.04 (m, 2H); 1.39 (m, 6H). S.M. (ESI): m/z 397 ([M+H]+),100%) 2,3-Di-O-benzyl-L-ascorbic acid, (73).

HO HO O O

BnO OBn Chemical Formula: C20H20O6 Molecular Weight: 356,37

The tetra protected ascorbic acid derivative (0.2 g, 0.5 mmol) was dissolved in a mixture of 2 mL of THF and 2 mL of MeOH. An aqueous solution of HCl 2 M was added and the reaction mixture was stirred overnight at room temperature. The solution was concentrated under reduced pressure. The residue was diluted in EtOAc (10 mL) and washed with H2O (2 x 5 mL). The organic layer was dried over anhydrous MgSO4, filtered and concentrated under reduced pressure to afford the desired Compound 73 as yellow oil which slowly solidified.

180

Parties Expérimentales Chimiques

53% yield, Rf 0.21 (1cHex/1AcOet) RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 7.29 (m, 10H); 5.12 (m, 4H); 4.63 (m, 1H); 3.91 (m, 1H); 3.64 (m, 4H). S.M. (ESI): m/z 357 ([M+H]+),100%).

2-(3, 4-bis (benzyloxy)-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl)-hydroxyethyl stearate (74).

OH O O O O Chemical Formula: C38H54O7 BnO Molecular Weight: 622,83 OBn

74 were synthesized from stearic acid (0.063 g, 0.22 mmol) with 2, 3-Di-O-benzyl-L-ascorbic acid, (73) (0.08 g, 0.22 mmol) following the general procedure J, the raction gave quantitative yield.

1 HNMR (250MHz, CDCl3) δ: 7.31 (m, 10H, ArH); 5.28 (m, 4H, -OCH2- C6H5); 5.02 (m, 1H, -

COOCH2CH(OH)CH-); 4.33 (m, 1H,COOCH2CHOH); 4.33 (m, 1H, -COOCH2CHOH); 2.25 (m, 2H, -

CH2COO-); 2.18 (m, 2H, -CH2CH2C(O)-); 1.29 (m, 30H, -(CH2)15-); 0.88 (m, 3H, -CH3). MS (ESI): m/z 623 ([M+H] +, 100%.

2-(3, 4-dihydroxy-5-oxo-2, 5-dihydrofuran-2-yl)-2-hydroxyethyl stearate (75).

OH O O O O HO OH Chemical Formula: C24H42O7 Molecular Weight: 442,59

Stearic acid (581 mg, 1.7 mmol) was dissolved in 95-97% sulfuric acid (15 mL) is initially introduced under azote atmosphere and warmed to 55 °C. Then ascoribic acid (200 mg, 1, 13 mmol) is introduced slowly, during which the temperature is held at a maximum of 75 °C. The mixture is subsequently stirred at this temperature for 12 h. the reaction mixture is cooled using an ice bath and introduced into 20 mL of water, 20 mL of ethyl acetate was added, the mixture is filtered through celite, the aqueous phase is separated off and extracted again with a little ethyl acetate, and the oraganic phases are combined, washed with (4 x 10 mL) of water, dried on MgSO4, filtered and avaporated in a rotary evaporator. The crude material was purified by flash chromatography (4DCM/4EtO/0.5MeOH) to

1 afford compound 75 as a white solid.(343 mg, 45% yield) Rf 0.5. H NMR (250 MHz, CDCl3) δ: 4.72 (d,

2J = 7.15 Hz, 3J = 14.28 Hz 1H, -OCH2-CH (OH)-CH-), 4.61 (s, 1 H, -CH (OH)-), 4.39 (m, 1H, -O-CHH-

181

Parties Expérimentales Chimiques

CH (OH)-CH-); 2.31 (m, 2H, -CH2C- (O)-); 1.59 (m, 2H,-CH2CH2C- (O)-); 1.24 (m, 28H.-CH2-); 0.87 (m,

+ 3H,-CH3). MS(ESI): m/z 443 ([M+H] ), 100%. 6-N-(tert-Butyloxycarbonyl) aminocaproic acid (76).

O OH O N H O

Chemical Formula: C11H21NO4 Molecular Weight: 231,29

6-aminocaproic acid (2.62 g, 20.0 mmol) was dissolved in a dioxane–H2O (2: 1) solution. The reaction mixture was cooled to 0 °C and a 1M aqueous solution of NaOH (20 mL, 20.0 mmol) was added, followed by Boc2O (4.80 g, 22.0 mmol) which was added as a solid. The reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours.The solutions were concentrated under reduced pressure. The basic aqueous residue was washed once with EtOAc (50 mL).The aqueous layer was acidified by aqueous 1 M HCl until pH 1 and then extracted with EtOAc (3 x 50 mL). The combined organic layers were dried over anhydrous MgSO4, filtered and concentrated under reduced pressure to afford the desired compound 76 as colourless oil which slowly crystallized (4.01 g, quantitative). Rf 0.71 (EtOAc).

RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ : 3.63 (s, 1H, broad s, NH ); 3.01 (m, 2H, -NHCH2-); 2.25 (t, J= 7.5Hz,

2H, -CH2COOH); 1.56-1.17 (m, 15H, -CH2(CH2)3CH2- and CH3 Boc). RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3) δ :178.4; 66.7; 60.2; 53.2; 40.0; 29.4; 28.1; 26.0; 24.5; 20.6; 13.9. S.M. (ESI): m/z 232 ([M+H]+,100%.

Generale procedure J (Coupling reaction procedure DIEA/BOP). 6-Aminocaproyl 2, 3-di-O-benzyl-L-ascorbic acid trifluoroacetic Acid salt (77).

OH O O TFA.H2N O O BnO OBn Chemical Formula: C28H30F3NO9 Molecular Weight: 582,54

6-N-(tert-Butyloxycarbonyl)-aminocaproic acid (0.47 g, 2.07 mmol) was dissolved in freshly distilled CH2Cl2 (10 mL) with 1 equiv. (1.14 g, 2.59 mmol) of BOP reagent. The reaction mixture was cooled to 0 °C and then 1.0 equiv. of DIEA (443 μL, 2.59 mmol) was added dropwise. The reaction mixture was stirred for 1 h at room temperature and then once again cooled to 0 °C.

182

Parties Expérimentales Chimiques

A CH2Cl2 solution (30 mL) of (0.92 g, 2.59 mmol) of alcohol 2, 3-di-O-benzyl-L-ascorbic acid and (886 μL, 5.18 mmol) of DIEA was added dropwise. The solution was allowed to warm and stirred overnight at room temperature. The solvent was removed under reduced pressure and the residue was dissolved in EtOAc (100 mL). The organic layer was washed successively by using 5% aqueous citric acid (3 x 50 mL), brine (50 mL), 5% aqueous NaHCO3 (3 x 50 mL) and brine (50 mL),was dried over anhydrous

MgSO4, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude residue was purified by flash chromatography (EtOAc–hexane 2: 3 then 1: 1) to give the desired compound (0, 88 g, 71% yield) as a

1 white solid. H NMR (CDCl3, 250 MHz) δ : 7.41 (m, 10H, ArH), 5.20 (s, 4H, -OCH2C6H5), 4.72 (d, 1H, -

OCH2CH (OH)-CH-), 4.61 (s, 1 H, -CH (OH)-), 4.35 (d, 2J = 11.5 Hz, 3J = 7.0 Hz 1 H, -O-CHHCH-),

4.23 (d, 2J = 11.5 Hz, 3J = 4.8 Hz, 1 H, -OCHHCHCH-), 4.14 (s, 1 H, -OCH2CH(OH)CH-), 3.19–3.02

(m, 2 H , -NHCH2-), 2.36 (t, 3J = 6.3 Hz, 2 H, -CH2C(O)O-), 1.87–1.36 (m, 15H, CH3 Boc and -

+ NHCH2(CH2)3CH2C(O)O-). S.M. (ESI): m/z 570 ([M+H] ,100%. The N-Boc derivative (0.8 g, 2.0 mmol) was dissolved in CH2Cl2 (15 mL). The solution was cooled to 0 °C and trifluoroacetic acid (1 mL, 20.0 mmol) was added dropwise. The resulting reaction mixture was stirred for 2 h at room temperature. The solvent and excess of TFA were removed under reduced pressure. The residue was triturated in Et2O and the title compound 77 was quantitatively isolated as a white solid (0.84 g). Rf 0.16 1cHex/1AcOet.

1 H NMR (CDCl3, 250 MHz) δ : 7.41 (m, 10H, ArH), 5.22 (s, 4H, -O-CH2-C6H5), 4.71 (d, 1H, -OCH2-CH (OH)-CH-), 4.61 (s, 1 H, -CH (OH)-), 4.39 (d, 2J = 11.5 Hz, 3J = 7.0 Hz 1 H, -O-CHH-CH (OH)-CH-),

4.23 (d, 2J = 11.5 Hz, 3J = 4.8 Hz, 2 H, -O-CHH-CH (OH)-CH-), 3.18–3.04 (m, 2 H , -NH2-CH2-), 2.36

(t, 3J = 6.3 Hz, 2 H, -CH2-C(O)-O-), 1.71–1.26 (m, 6H, NH2-CH2-(CH2)3-CH2-C(O)-O-). S.M. (ESI): m/z 583 ([M+H]+,100%. 6-Aminocaproyl 2, 3-L-ascorbic acid trifluoroacetic acid salt (78).

OH O O TFA.H2N O O HO OH Chemical Formula: C14H17F3NO9 Molecular Weight: 402,26

The protected ascorbic acid derivative (848 mg, 1.4 mmol) was dissolved in 3 mL of MeOH. 10 % in weight of Pearlman’s catalyst (Pd (OH) 2 over activated charcoal) was added to the previous solution and the resulting suspension was stirred at room temperature under H2 atmosphere for 2 h. The solution was filtered and concentrated under reduced pressure to yield the deprotected ascorbic acid derivative

1 78 (460 mg, 85% yield) as a white solid. H NMR (CDCl3, 250 MHz) δ: 4.72 (d, 1H, -OCH2-CH (OH)-CH- ), 4.61 (s, 1 H, -CH (OH)-), 4.39 (d, 2J = 11.5 Hz, 3J = 7.0 Hz 1 H, -O-CHH-CH (OH)-CH-), 4.23 (d, 2J =

183

Parties Expérimentales Chimiques

11.5 Hz, 3J = 4.8 Hz, 2 H, -O-CHH-CH (OH)-CH-), 3.04–3.18 (m, 2 H , -NH2-CH2-), 2.36 (t, 3J = 6.3 Hz,

2 H, -CH2-C(O)-O-), 1.71–1.40 (m, 6H, NH2-CH2-(CH2)3-CH2-C(O)-O-). S.M. (ESI): m/z 403 ([M+H]+,100%. N-(9-(3,4-Bis(benzyloxy)-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl)-9-hydroxy-6-oxononyl)stearamide (79).

O OH O O N O H O BnO Chemical Formula: C44H65NO8 OBn Molecular Weight: 735,99

79 was synthesized from stearic acid (0.106 g, 0.53 mmol) with 6-aminocaproyl-2, 3-di-o-benzyl- Lascorbic acid trifluoroacetic acid salt (77) (0.25 g, 0.53 mmol) following the general procedure J (100

1 mg, 26 % yield). HNMR (250MHz, CDCl3) δ: 7.31 (m, 10H, ArH); 5.28 (m, 4H, -OCH2- C6H5); 5.02 (m,

1H, -COOCH2CH(OH)CH-); 4.33 (m, 1H,COOCH2CHOH); 4.33 (m, 1H, -COOCH2CHOH); 3.24 (m, 2H,

-(O)CNHCH2-); 2.25 (m, 2H, -CH2COO-); 2.18 (m, 2H, -CH2CH2C(O)-); 1.61 (m, 6H, -

+ (O)CNH(CH2)3COO-); 1.29 (m, 30H, -(CH2)15-); 0.88 (m, 3H, -CH3). MS (ESI): m/z 736 ([M+H] , 100%.

Anal. (C44H65NO8) C, H, N. N-(9-(3,4-Dihydroxy-5-oxo-2.5-dihydrofuran-2-yl)-9-hydroxy- 6-oxononyl)stearamide (80).

O OH O O N O H O HO Chemical Formula: C30H53NO8 OH Molecular Weight: 555,74

The protected ascorbic acid derivative 79 (100 mg, 0.14 mmol) was dissolved in 3 mL of

MeOH. Then 10 % in weight of Pearlman’s catalyst (Pd (OH) 2 over activated charcoal) was added to the previous solution and the resulting suspension was stirred at room temperature under H2 atmosphere for 2 h. The solution was filtered and concentrated under reduced pressure to give the deprotected ascorbic acid derivative 80 as a white solid in quantitative yield. 1H NMR (250 MHz, CDCl3)

δ: 5.10 (m, 1H, -COOCH2CH(OH)CH-)); 4.44 (m, 1H,-COOCH2CH(OH)CH-); 4.30 (m, 2H,-

COOCH2CHOH); 3.20 (m, 2H, (O)CNHCH2-); 2.25 (m, 2H, -CH2COO-); 2.18 (m, 2H, -CH2C(O)N); 1.68

+ (m, 4H, -NHCH2CH2CH2C- (O)-); 1.30 (m, 32H,-(CH2)16-); 0.88 (m, 3H,-CH3).MS(ESI): m/z 556 ([M+H] ,

100%. Anal. (C30H53NO8) C, H, N.

184

Parties Expérimentales Chimiques

2-(3,4-bis(benzyloxy)-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl)-2-hydroxyethyl 6-(9E,12E)-octadeca-9,12- dienamidohexanoate (81).

O OH O O N O H O Chemical Formula: C44H61NO8 BnO OBn

Molecular Weight: 551,71

81 was synthesized from linoleic acid (0.148 g, 0.53 mmol) with 6-aminocaproyl 2, 3-di-o-benzyl- L-ascorbic acid trifluoroacetic acid salt 77 (0.25 g, 0.53 mmol) following the general procedure J. (100 mg, 26% yield). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ : 7.37 (m, 10H, ArH); 5.33 (m, 4H, 2-CH=CH-); 5.29 (m,

2H, -OCH2C6H5); 5.19 (m, 2H, -O-CH4-C6H5); 5.08 (m, 1H, -O-CH2-CH(OH)-CH-); 4.33 (m, 1H, -

OCH2CH(OH)-CH-); 4.29 (m, 1H, -OCHHCH-); 4.22 (m, 1H, -OCHH-CH-); 3.24 (m, 2H, -(O)CNHCH2-

); 2.76 (m, 2H, -CH=CHCH2CH=CH-); 2.34 (t, d, J = 7.2 Hz, 2H, -CH2C(O)NH-); 2.14 (t, d, J = 7.2 Hz,

2H, -CH2C(O)O-); 2.02 (m, 4H, CH2CH2C(O)- and (O)CNHCH2CH2-); 1.96 (m, 4H, 2 -CH2CH=CH-);

1.28 (m, 18H-(CH2)9-); 0.88 (m, 3H, -CH3). RMN ¹³C (250 MHZ, CDCl3) δ :173.7; 169.4; 157.0; 135.9; 135.3; 127.8; 31.4; 29.6; 29.3; 27.1; 25.8; 25.6; 24.2; 23.9; 22.4; 19.3; 14.0. S.M. (ESI): m/z 734

+ ([M+H] ), 100%. Anal. (C44H61NO8)C, H, N. 2-(3,4-dihydroxy-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl)-2-hydroxyethyl 6-(9Z,12Z)-octadeca-9,12- dienamidohexanoate (82).

O OH O O N O H O HO OH

Chemical Formula: C30H49NO8 Molecular Weight: 551,71

82 was synthesized from linoleic acid (0.23 g, 0.82 mmol) with 6-aminocaproyl 2, 3-L-ascorbic acid trifluoroacetic acid salt 78 (0.237 g, 0.82 mmol) following the general procedure J. (0, 2 g, 44% yield) as a white oil. RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ : 6.06 (m, 1H, -NH- ); 5.35 (m, 4H, 2 -CH=CH-);

5.05 (m, 1H, OHC=COHCHOC(O)); 4.74 (m, 1H,-COOCH2CHOH); 4.34 (m, 2H, -COOCH2CHOH);

3.21 (m, 2H, -(O)CNHCH2CH2-); 2.75 (t, d, J = 5.5 Hz, 2H, -CH=CHCH2CH=CH-); 2.48 (m, 2H, -

CH2C(O)NH); 2.32 (m, 2H, -CH2C(O)O-); 2.05 (m, 4H, 2 -CH2CH=CH-); 1.59 (m, 4H, -CH2CH2C(O)- and (O)CNHCH2CH2-); 1.28 (m, 18H, -(CH2)9-); 0.87 (d, J = 6.5 Hz, 3H, CH3-). RMN ¹³C (250 MHZ,

185

Parties Expérimentales Chimiques

CDCl3) δ :181.6; 147.0; 130.2; 129.9; 128.0; 127.8; 31.4; 29.6; 29.3; 27.1; 25.8; 25.6; 24.2; 23.9;

+ 22.4; 19.3; 14.0. S.M. (ESI): m/z 554 ([M+H] ), 100%. Anal. (C30H49NO8)C, H, N. Methyl 6-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4a-dimethyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10a- decahydrophenanthrene-1-carboxamido)hexanoate (83).

Chemical Formula: C27H43NO3 Molecular Weight: 429,64 O O HN O According to general procedure A, the reaction of abietic acid (1 g, 3.3 mmol) with methyl 6- aminohexanoate chlorhydrate (479 mg, 3.3 mmol) afforded the title compound 83 as a yellow oil Rf 0.8, cHex/AcOEt, 1/1; ( 228 mg, 16% yield). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 6.73 (m, 1H, -(O)CNH-); 5.74 (s,

1H, -CH=CH-); 5.33 (m, 1H, -HC=CH-); 3.65 (m, 3H, -COOCH3 ); 1.97 (m, 4H, 4 -CH2CHCH2-); 1.56 (m,

3H, -CCH3); 1.40 (s, 5H,-CH2CH2CHH-); 1.26 (m, 8H, 4 -CH2-); 0.962 (m, 6H, -C(CH3)2); 0.816 (s, 3H, -

+ CH3). S.M. (ESI): m/z 430 ([M+H] ), 100%. Anal. (C27H43NO3)C, H, N. 6-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4a-dimethyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10a-decahydrophenanthrene-1- carboxamido)hexanoic acid.(84)

H Chemical Formula: C26H41NO3 Molecular Weight: 415,61 O OH HN O

According to general procedure B, the reaction of Methyl6-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl-1,4a- dimethyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10a decahydrophenanthrene-1-carboxamido)hexanoate 83 (300 mg, 0.71 mmol) with lithium hydroxide monohydrate (90 mg, 2,1 mmol) afforded the title compound 84 Rf 0.5

1cHex/1AcOEt (168 mg, 86 % yield). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ: 5.74 (s, 1H, -CH=CH-); 5.33 (m, 1H, -

CH=CH-); 3.22 (m, 2H, -CH2OH); 2.16 (m, 5H, 4 -CH2CHCH2-); 1.56 (m, 3H, -CCH3); 1.29 (m, 8H, 4 -

+ CH2-); 0.99 (m, 6H, -CH2(CH3)2); 0,811 (s, 3H, -CH3). (ESI): m/z 416 ([M+H] ), 100%. Anal. (C26H41NO3)C, H, N.

186

Parties Expérimentales Chimiques

2-(3,4-bis(benzyloxy)-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl)-2-hydroxyethyl,6-((1S,4aR,4bS)-7-isopropyl- 1,4a-dimethyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10a-decahydrophenanthrene-1-carboxamido)hexanoate (85).

O OH O O HN O O BnO OBn

Chemical Formula: C46H59NO8 Molecular Weight: 753,96

Compound 85 was synthesized from abietic acid (0.043 g, 0.14 mmol) with 6-aminocaproyl 2,3-di- o-benzyl-L-ascorbic acid trifluoroacetic acid salt (77) (0.25 g, 0.18 mmol) following the general procedure J. (20 mg, 20% yield). RMN ¹H (250 MHZ, CDCl3) δ : 7.37 (m, 10H, ArH); 5.74 (s, 1H, -

CH=CH-); 5.33 (m, 1H, -CH=CH-); 5.29 (m, 2H, -OCH2C6H5); 5.19 (m, 2H, -O-CH2-C6H5); 5.08 (m, 1H,

-O-CH2-CH(OH)-CH-); 4.33 (m, 1H, -OCH2CH(OH)-CH-); 4.29 (m, 1H, -OCHHCH-); 4.22 (m, 1H, -

OCHH-CH-); 3.24 (m, 2H, -(O)CNHCH2-); 2.34 (t, d, J = 7.2 Hz, 2H, -CH2C(O)NH-); 2.14 (t, d, J = 7.2

Hz, 2H, -CH2C(O)O-); 2.02 (m, 4H, CH2CH2C(O)- and (O)CNHCH2CH2-); 1.96 (m, 4H, 2 -CH2CH=CH-

); 1.28 (m, 18H-(CH2)9-); 0.99 (m, 6H, -CH2(CH3)2); 0.81 (s, 3H, -CH3).

187

Parties Expérimentales Biologiques

PARTIES EXPERIMENTALES BIOLOGIQUES

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Parties Expérimentales Biologiques

1 Cell culture.

Fetal calf serum (FCS) and dialyzed FCS (DFCS) were from Hyclone (Logan, UT). Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) was purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA). HT22 cells 28 were grown in DMEM supplemented with 10% FCS and antibiotics.

1.1 Cytotoxicity Assay.

Cell viability was determined by a modified version of 3-(4, 5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay based on the standard procedure. 29 Cells were seeded into 96-well microtiter plates at a density of 5 x 103 cells per well. For the in vitro ischemia assay, the next day, the medium was replaced with DMEM supplemented with 7.5% of DFCS and the cells were treated with 20 μM of iodoacetic acid (IAA) alone or in the presence of the differents compounds. After 2 h the medium in each well was aspirated and replaced with fresh medium without IAA but containing the compounds. After 20 h, the medium in each well was aspirated and replaced with fresh medium containing 2.5μg/mL MTT. After 4 h of incubation at 37 °C, the cells were solubilized with 100 μL of a solution containing 50% dimethylformamide and 20% SDS (pH 4.7). For the oxidative glutamate toxicity assay, the next day, the medium was replaced With DMEM supplemented with 7.5 % DFCS and the cells were treated with the different compounds alone or in the presence of 5 mM glutamate. After 24 h, the medium in each well was aspirated and replaced with fresh medium containing 2.5 μg/mL MTT. After 4 h of incubation at 37 °C, the cells were solubilized with 100 μL of a solution containing 50% dimethylformamide and 20% SDS (pH 4.7). For both assays, the absorbance at 570 nm was measured on the following day with a microplate reader (Molecular Devices). Results were confirmed by visual inspection of the wells. Controls included compound alone to test for toxicity and compound with no cells to test for interference with the assay chemistry.

1.2 Total intracellular glutathione (GSH).

Total intracellular GSH was determined using whole cell lysates from untreated, IAA treated, GM1- like compounds treated and IAA plus compounds treated cells as described 159 and normalized to total cellular protein. For each compounds tested, the concentration which was most effective at preventing cell death as determined by a dose response experiment was used.

159. Maher, P.; Hanneken, A. Flavonoids protect retinal ganglion cells from oxidative stress-induced death. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2005, 46, 4796–4803.

189

Parties Expérimentales Biologiques

1.3 Intracellular ATP.

Intracellular ATP was determined using lysates from untreated, IAA treated, compounds treated and IAA plus compounds treated cells. HT22 cells from the same density cultures as used for the cell death assays were washed twice in cold phosphate-buffered saline (PBS) then scraped into lysis buffer containing 50mM HEPES, pH7.4, 150mM NaCl, 50mM NaF, 1.5 mM MgCl2, 1mM EDTA, 10 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4 and 1% Triton X-100. Lysates were incubated at 4 °C for 30 min, and then cleared by centrifugation at 14,000×g for 10 min. ATP levels were determined using a chemiluminescent kit from Molecular Probes and normalized to total cellular protein. For each compound tested, the concentration which was most effective at preventing cell death as determined by a dose response experiment was used.

1.4 SDS-PAGE and Immunoblotting.

HT22 cells from the same density cultures as used for the cell death assays were untreated or treated with ours compounds alone or in the presence of 20 μM IAA for 2 h followed by 2 h of recovery in the presence of our compounds. The cells were washed twice in phosphate buffered saline and solubilized in SDS sample buffer containing 0.1 mM Na3VO4 and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), boiled for 5 min, and either analyzed immediately or stored frozen at -70 °C. Proteins were separated on 10% SDS-polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose.

Equal loading and transfer of the samples were confirmed by staining the nitrocellulose with Ponceau-S. Transfers were blocked for 1 h at room temperature with 5% nonfat milk in TBS/0.1% Tween-20 and then incubated overnight at 4 °C in the primary antibody diluted in 5% BSA in TBS/0.05 % Tween-20. The primary antibodies used were phospho-p44/42 MAP kinase antibody (no. 9101, 1/1000), phospho-p38 MAP kinase (no. 9211, 1/1000), phospho-SAPK/JNK (no. 9255, 1/ 1000), phospho c-Jun (no. 9261, 1/1000), phospho-MAPKAPK-2 antibody (no. 3041, 1/1000), and total MAPKAPK- 2 (no. 3042, 1/1000) from Cell Signaling (Beverly, MA); total p38 antibody (no. sc-728, 1/500) and c-Jun/AP-1 antibody (no. sc-44-G) from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); JNK1 antibody (no. 15701A, 1/500) from Pharmingen and pan ERK antibody (no. E17120, 1/10000) from Transduction Laboratories (San Diego, CA). The transfers were rinsed with TBS/0.05% Tween-20 and incubated for 1 h at room temperature in horseradish peroxidase-goat antirabbit or goat antimouse (Biorad, Hercules, CA) diluted 1/5000 in 5 % nonfat milk in TBS/0.1% Tween-20. The immunoblots were developed with the Super Signal reagent (Pierce, Rockford, IL).

190

Parties Expérimentales Biologiques

2 Slice Culture.

2.1 Materials and Methods.

2.1.1 Animal preparation.

Adult (6 to 8 weeks) race Sprague-Dawley rats weighing 100 to 150 g were used. All procedures met National Institutes of Health guidelines with the approval of the Oregon Health & Science University Institutional Animal Care and Use Committee. 2.1.2 Dissection.

Whole brain from male Sprague- Dawley rats were obtained after decapitation and quickly removed to iced normal artificial cerebrospinal (ACSF), which had the following composition (in mM): choline 220,

KCl 3.5, NaH2PO4 1.2, NaHCO3 26, MgCl2 1.3, CaCl2 2.0, D-Glucose 10, MgSO4 7 (pH 7.4) and maintain at 4° C. Brain was cut coronally into 400 µM thickness section with Microtome. Cortical and hippocampal slices were quickly isolated from the appropriated section. 2.1.3 Preincubation.

After slices were incubated in ACSF bubbled with a solution of oxygen ACSF which contenant 5 µM of NBQX (2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo[f]quinoxaline-2,3-dione) (receptors antagonist of glutamate: types AMPA and Kainate) and 40µM of D-APV (receptors antagonist of glutamate: types NMDA) at room temperature during 1h recover, brain slices were transferred into experimental chambers randomly. Slices were exposed to OGD injury for 30 min in solution which contenant (in mM) :

( NaCl 126, KCl 3.5, NaH2PO4 1.2, NaHCO3 26, MgCl2 1.3, CaCl2 2.0, D-glucose10, pH 7.4 and distilled water) and 1mM of ours compounds, including 15 min before putting a glutamate solution and 15 min afterwards. After the exposure, slices were reoxygenated in ACSF at 37° C for 15 min contenant or not 1 µM of glutamate. 2.1.4 Incubation.

They are then transferred in tubes containing fresh ACSF oxygenated during 2 h at 37 °C. After insulted, brain slices were immersed into 2% of TTC solution at 37 °C for 1 h and wet weight of the slices was measured after the slices were rinsed twice with ACSF. A mixture of ethanol and dimethylsulfoxide (50:50) was added at a rate of 20 mL per 1g of slices.

191

Parties Expérimentales Biologiques

2.1.5 Measure of Optical Density.

After 24 h extraction in dark, absorbance was measured at 490 nm by using a spectrophotometer Safas Monaco.

192

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9 Descamps, E. La protéine disulfide isomérase et l’ischémie cérébrale : une voie de la neuroprotection ? Université de Lille II présenté le 15/06/2009.

9 Chansard, M. Roles des MAPK dans les rythmes biologiques des noyaux,Supra chiasmatiques et des oscillateurs périphériques. L’Université Louis Pasteur Strasbourg I. présenté le 04/04/2007

9 Physiopathologie de l’ischémie cérébrale de la pathologie des vaisseaux aux mécanismes cellulaires…D. Deplanque*, R. Bordet, Excitotoxicité et ischémie cérébrale : quoi de neuf ? Entre cytokines et protéases, D. Vivien*, K. Benchenane*, C. Ali, Imagerie de la pénombre au cours de l’ischémie cérébrale : évolution des concepts ; N. Nighoghossian.Correspondances en neurologie vasculaire - Vol. V - n° 2 - octobre-decembre 2005 - Vol. VI - n° 1 - janvier-mars 2006.

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Annexes

ANNEXES

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Annexes

Acide okadaïque. Est un poly-éther de l'acide gras C38. C'est l'une des phycotoxines (toxines produites par certaines espèces phytoplanctoniques) ; par les Dinoflagellés, notamment du genre Dinophysis. C'est une neurotoxine et surtout une toxine diarrhéique (en anglais DSP, pour « Diarrheic Shellfish Poison »).

Adénosine monophosphate cyclique (AMPc). Second messager produit à partir de l’ATP, par l’action de l’enzyme adénylate cyclase.

Adénosine triphosphate(ATP). Est la molécule qui, dans tous les organismes vivants, fournit lors de son hydrolyse l'énergie nécessaire aux réactions chimiques des cellules. C'est également le précurseur d'un certain nombre de cofacteurs enzymatiques essentiels comme le NAD+ ou le coenzyme A. L'ATP est aussi l'un des quatre monomères utilisés dans la synthèse des ARN cellulaires.

Agoniste du récepteur. Drogue qui se fixe au récepteur et qui l’active.

Anévrisme. Est une dilatation localisée de la paroi d'une artère aboutissant à la formation d'une poche de taille variable, communiquant avec l'artère au moyen d'une zone rétrécie que l'on nomme le collet. Sa forme habituelle est celle d'un sac, son diamètre pouvant atteindre plusieurs centimètres. La rupture d'anévrisme représente environ 10 % des accidents vasculaires cérébraux (AVC). Lorsqu'elle survient subitement, la mort est souvent inévitable.

Angiome. Est un terme peu précis, souvent associé à l'expression tache de naissance, et désignant une malformation résultant de vaisseaux sanguins ou lymphatiques anormalement dilatés, dont l'origine est mal connue et l'évolution mal comprise.

Antagoniste du récepteur. Drogue qui se fixe au récepteur et inhibe sa fonction.

Asphyxie. Est un terme médical signifiant l'arrêt plus ou moins long de la circulation d'oxygène dans le corps.

Astrocytes. Sont des cellules gliales de forme étoilée que l'on trouve généralement dans le cerveau et plus généralement dans le système nerveux central.

Athérome. Partie lipidique des plaques athéroscléreuses. L'athérome (du grec athêrôma signifiant « loupe de matière graisseuse ») correspond à un remaniement de l'intima des artères de gros et moyen calibre (aorte et ses branches, artères coronaires, artères cérébrales, artères des membres inférieurs) par accumulation segmentaire de lipides, glucides complexes, sang et produits sanguins, tissus adipeux, dépôts calcaires et autres minéraux.

Axone. Neurite qui conduit les influx nerveux ou potentiels d’action vers les terminaisons nerveuses, en partant du soma.

Barrière hémato-encéphalique. Disposition particulière des capillaires qui limite l’accès de l’encéphale à la plupart des substances. Permet une stricte maîtrise de l’environnement chimique extracellulaire du système nerveux central.

Benigne. Une tumeur bénigne est une tumeur sans gravité, c'est-à-dire ne pouvant donner lieu à des métastases et n'étant pas mortelle, comme une verrue, par exemple. Néanmoins, une telle tumeur peut évoluer vers une tumeur maligne, qui peut, elle, être fatale si elle n'est pas traitée.

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Annexes

Brain-derived neurotrophic factor also known as BDNF is a protein that, in humans, is encoded by the BDNF gene. BDNF is a member of the "neurotrophin" family of growth factors, which are related to the canonical "Nerve Growth Factor", NGF. Neurotrophic factors are found in the brain and the periphery.

Canal calcique dépendant du potentiel. Protéine formant un pore transmembranaire perméable aux ions Ca2+, dont l’ouverture dépend de la dépolarisation de la membrane.

Canal ionique. Protéine transmembranaire qui forme un pore permettant le passage d’ions d’un côté de la membrane à l’autre.

Canal ionique sensible au transmetteur. Protéine transmembranaire formant un pore perméable aux ions et dont l’ouverture est contrôlée par un neurotransmetteur.

Caspases. (de l'anglais cysteine-dependent aspartate-cleaving proteases) sont des groupes de protéases à cystéine qui jouent un rôle essentiel dans les phénomènes d’apoptose, de nécrose et d’inflammation.

Cellule gliale. Tissu de soutien du système nerveux, composé d'un fin réseau de cellules très ramifiées (cellules gliales ou névrogliques). On distingue trois types de cellules : la macroglie (astrocytes), l'oligodendroglie (oligodendrocytes) et la microglie. La macroglie et l'oligodendroglie dérivent de l'ectoderme, la microglie est d'origine mésodermique. Ces dernières représentent 50% du volume cérébral. Contrairement à la grande majorité des neurones, les cellules gliales peuvent se diviser par mitose. Elles remplissent différentes fonctions : guide de migration, développement neuronal, myélinisation, compartimentation, soutien, homéostasie ionique, régulation du pH, recyclage des neurotransmetteurs, défense immunitaire, plasticité synaptique…

Conception de novo. La conception de novo s’appuie sur les mêmes principes que la conception de chimiothèques virtuelles focalisées, mais avec pour objectif d’obtenir non pas une chimiothèque, mais la structure qui sera identifiée par l’algorithme comme étant la plus active. Le principe est de construire un ligand le mieux adapté à un site actif. De manière générale, on dispose d’une base de fragments, conçue par des spécialistes, ou d’après des algorithmes de rétrosynthèse. Une molécule de départ est alors choisie, ou générée de manière aléatoire. L’algorithme d’optimisation (généralement un algorithme génétique ou un recuit simulé) prend en charge la modification de la molécule afin d’améliorer le critère choisi (similarité à un composé actif déjà existant, score de docking…). L’espace chimique parcouru ainsi est donc très important.

Cortex. Fine couche de neurones, à la surface du cerveau.

Cytokines. Sont des substances solubles de communication, synthétisées par les cellules du système immunitaire ou par d'autres cellules et/ou tissus, agissant à distance sur d'autres cellules pour en réguler l'activité et la fonction.

Cytoplasme. Désigne le contenu d'une cellule vivante. Plus exactement, il s'agit de la totalité du matériel cellulaire du protoplasme délimité par la membrane plasmique et le noyau . Le cytoplasme est constituée d'un réseau de filaments protéinés qui confère à la cellule sa forme et son organisation interne et lui permet de se déplacer.

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Annexes

Descripteur moléculaire. est n'importe quelle propriété moléculaire pour caractériser la molécule pour rechercher par la base de données, pour calculer une autre propriété moléculaire etc.

"Le descripteur moléculaire est le résultat final d'une logique et d'un procédé mathématique qui transforme l'information chimique codée dans une représentation symbolique d'une molécule en nombre utile ou résultat d'une certaine expérience normalisée

Docking. Is a method which predicts the preferred orientation of one molecule to a second when bound to each other to form a stable complex. Computational simulation of a candidate ligand binding to a receptor.

Dysplasie. Est une malformation ou déformation résultant d'une anomalie du développement d'un tissu ou d'un organe, qui survient au cours de la période embryonnaire ou après la naissance.

Effet de Gibbs-Donnan. (également connu sous le nom d'effet Donnan, loi de Donnan, ou encore équilibre de Gibbs-Donnan) concerne le comportement des particules chargées proches d'une membrane hémiperméable qui parfois ne sont pas distribuées également de chaque côté de la membrane. La cause principale est la présence de différentes substances chargées ce qui rend impossible de passer à travers la membrane et ce qui crée ainsi une charge électrique inégale. L'effet Gibbs-Donnan peut empêcher les pompes sodium/potassium des cellules malades de fonctionner correctement.

Eicosanoïdes. Sont des molécules du groupe des lipides constituées de 20 atomes de carbone.

Electro-encéphalographie (EEG) est la mesure de l'activité électrique du cerveau par des électrodes placées sur le cuir chevelu souvent représentée sous la forme d'un tracé appelé électro- encéphalogramme.

Endocardite. Est une inflammation de l'endocarde (structures et enveloppe interne du cœur, incluant les valves cardiaques).

Endothélium vasculaire : est la couche la plus interne des vaisseaux sanguins, celle en contact avec le sang.

Facteur de croissance transformant bêta. (TGF-β) contrôle la prolifération, la différenciation cellulaire, et d'autres fonctions dans la plupart des cellules. Il joue un rôle dans l'immunité, le cancer. Certaines cellules sécrètent des TGF-β, et ont aussi des récepteurs pour le TGF-β. C'est ce qu'on appelle la signalisation autocrine.

Facteur de nécrose tumorale. (TNFα), acronyme de l'anglais tumor necrosis factor alpha, encore appelé cachexine ou cachectine) est une importante cytokine impliquée dans l'inflammation systémique et dans la réaction de phase aiguë.

Facteur de risque. Est un paramètre augmentant la probabilité de faire une maladie. Il peut ne pas être modifiable (âge, sexe, antécédents familiaux, origine ethnique). Il peut être lié au style de vie (tabac, alcool, alimentation, sédentarité…) ou constitutionnels (tension artérielle, diabète, cholestérol…). Il faut les traquer et les traiter pour diminuer le risque de faire une attaque cérébrale.

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Annexes

Foramen ovale perméable. Est un type d'anomalie de la cloison située entre les deux oreillettes entraînant une communication entre ces deux dernières. Il est observé avec une grande fréquence et serait possiblement impliquée dans diverses maladies, dont la survenue d'accidents vasculaires chez des sujets jeunes.

Génomique. Est une discipline de la biologie moderne. Elle étudie le fonctionnement d'un organisme, d'un organe, d'un cancer, etc. à l'échelle du génome, et non plus limitée à celle d'un seul gène. La génomique se divise en deux branches :

• La génomique structurale, qui se charge du séquençage du génome entier ; • La génomique fonctionnelle, qui vise à déterminer la fonction et l'expression des gènes séquencés en caractérisant le transcriptome et le protéome.

Glande pinéale ou épiphyse : est une petite glande endocrine de l'épithalamus du cerveau des vertébrés. Elle sécrète la mélatonine (dérivé de la sérotonine sécrétée elle par les tissus nerveux), et joue par son intermédiaire un rôle central dans la régulation du rythme biologique. Dans l'espèce humaine, l'épiphyse a la forme d'un petit cône (d'environ 8 mm) situé en position médiane en arrière du troisième ventricule, au-dessus des colliculi supérieurs derrière la stria medullaris.

Hémorragie intracérébrale. est un accident vasculaire cérébral provoqué par la rupture d'une artère cérébrale qui entraîne une hémorragie au sein du parenchyme à l'origine d'un hématome dilacérant le tissu cérébral.

Hémorragie méningée. correspond à l'irruption massive de sang dans les méninges, plus précisément dans les espaces sous arachnoïdiens (entre l'arachnoïde et la pie-mère), le plus souvent après une rupture d'anévrisme. C'est un accident grave, parfois mortel, qui impose un transfert urgent en neurochirurgie lorsqu'il est diagnostiqué à temps.

Chorée de Huntington. Aussi connue sous le nom de maladie de Huntington, est une maladie héréditaire incurable d'évolution inexorable vers la mort. Cette maladie se traduit par une dégénérescence neuronale affectant les fonctions motrices et cognitives aboutissant à une démence. Ses manifestations psychiatriques s'accompagnent de manifestations neurologiques avec, chez le sujet éveillé, des gestes incohérents et anormaux (mouvements choréiques) indépendants de sa volonté, des troubles de l'équilibre et une léthargie.

Hypoxie. Consiste en une oxygénation insuffisante des tissus. L'hypoxémie se produit lorsque l'oxygène artériel se situe sous la valeur normale. Une hypoxémie non corrigée peut conduire à une hypoxie. Imagerie par résonance magnétique (IRM). est une technique d'imagerie médicale d'apparition récente (début des années 1980) permettant d'avoir une vue 2D ou 3D d'une partie du corps, notamment du cerveau. L'IRM repose sur la technique de résonance magnétique nucléaire (RMN).

Incubation:On parle de période d'incubation pour décrire le temps qui s'écoule entre la contamination et l'apparition des premiers symptômes d'une maladie.

Interleukines. Sont des groupes de cytokines, ainsi nommées car les premières observations semblaient montrer qu'elles étaient exprimées par les globules blancs (leucocytes, d'où -leukin) en guise de moyen de communication (d'où inter-). Le terme a été créé en 1979, une époque où il n'existait de connues que deux interleukines (IL-1 et IL-2).

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Annexes

Intima. Est la tunique interne d'un vaisseau artériel. En effet la paroi des artères est composée de trois tuniques qui sont de l'intérieur vers l'extérieur : l'intima, la media et l'adventice. L'intima est un endothélium "posé" sur un tissu conjonctif.

Knock-Out. Est une mutagenèse ciblée dans la mesure où elle n'altère que la séquence du gène étudié.

Liquide cephalo-rachidien (LCR). Ce liquide est celui dans lequel baignent le cerveau, le cervelet, le tronc cérébral et la moelle épinière. Il permet de protéger et de nourrir le cerveau.

Maladie de Huntington. Maladie héréditaire à transmission autosomique dominante, due à la mutation d’un seul gène ; elle se traduit par des altérations de la personnalité, par une perte progressive du contrôle volontaire des mouvements et par une issue fatale. Elle affecte essentiellement les ganglions de la base.

Maligne. Une tumeur maligne est une tumeur capable d'envahir et de détruire les structures qui lui sont adjacentes et qui peut s'étendre à distance par le biais de métastases (cellule se détachant de la tumeur originelle pour proliférer à distance).

Nécrose. est la forme principale de mort d'une cellule, d'un tissu ou d'un organe lors d’accidents traumatiques, suite à certaines maladies ou lors de déficits métaboliques. Selon le niveau d'organisation considéré, on distingue la nécrose cellulaire, la nécrose tissulaire et la nécrose d'organe.

Neurotransmetteur. Substance libérée par les terminaisons synaptiques pour transmettre les informations d’une cellule nerveuse à une autre.

Neurotrophic factors. Are a family of proteins that are responsible for the growth and survival of developing neurons and the maintenance of mature neurons. Recent research has proven that neurotrophic factors promote the initial growth and development of neurons in the CNS and PNS and that they are capable of regrowing damaged neurons in test tubes and animal models. Neurotrophines. (NTs) forment une famille de polypeptides qui sont des facteurs essentiels pour la survie et la différenciation des neurones du système nerveux périphérique au cours du développement. Elle regroupe des molécules telles que le nerve growth factor (NGF) et le brain-derived neurotrophic factor (BDNF). N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Sont des récepteurs ionotropes activés par le glutamate. Ils sont perméables au sodium, mais aussi au potassium et au calcium. Dû à la perméabilité du sodium et du potassium, le potentiel de réversion des NMDAR est autour de 0mV.

Obstruction. Engorgement, embarras qui se forme dans les conduits de l'organisme. Obstruction intestinale. Il se dit aussi de toute espèce d'engorgement dans toute espèce de conduits, canaux, voies de communication.

Œdème. Correspond au gonflement d'un organe ou d'un tissu dû à une accumulation ou un excès intratissulaire de liquides dans le milieu interstitiel. L'œdème peut être dû à de nombreuses causes primitives.

Oligémie ou l'hypovascularisation. Diminution généralisée ou localisée du calibre des vaisseaux artériels pulmonaires et/ou de leur visibilité en périphérie.

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Annexes

Osmose. est définie par sa mise en évidence expérimentale comme le phénomène de diffusion de molécules de solvant (l'eau de façon générale) à travers une membrane semi-perméable qui sépare deux liquides de concentrations en soluté différentes. Le passage de solvant d'un compartiment à l'autre va créer une différence de pression hydrostatique qui va compenser exactement la différence de pression osmotique.

Pathogenèse ou pathogénie. Est l'étude du ou des mécanismes responsables du déclenchement et du développement d'une maladie. La pathogenèse fait intervenir souvent plusieurs mécanismes pathologiques pour une seule maladie dans lesquels les gènes, l'environnement, le conditionnement, l'individu (comme esprit unique et corps unique) et d'autres facteurs très nombreux jouent un rôle important.

Pénombre ischémique. Zone d’ischémie cérébrale réversible, où les cellules peuvent être sauvées par un traitement médical rapide.

Pharmacophore. Est l'ensemble des groupements fonctionnels disposés selon un arrangement spatial adéquat, assurant la fixation du médicament sur le récepteur et donc capable d'induire la réponse physiologique. Il est constitué par une partie pharmacologiquement active d'une molécule servant de modèle. Les pharmacophores sont donc des ensembles d'atomes actifs utilisés dans la conception de médicaments.

Phospholipases. Sont des enzymes hydrolysant les liaisons esters des phospholipides. Il existe quatre liaisons ester dans un phospholipide. On distingue donc plusieurs enzymes selon leur site d’action sur la molécule. La phospholipase C est l'une d'entre elles. Elle intervient sur la fonction ester liant le glycérol et le phosphate, libérant un diglycéride et un phosphoalcool.

Physiologie. étudie le rôle, le fonctionnement et l'organisation mécanique, physique et biochimique des organismes vivants et de leurs composants (organes, tissus, cellules et organites cellulaires). La physiologie étudie également les interactions entre un organisme vivant et son environnement.

Physiopathologie. est la discipline biologique qui traite des dérèglements de la physiologie, c’est-à-dire les dérèglements du mode de fonctionnement normal des éléments constitutifs du corps humain, d'un animal ou d'un végétal. La physiopathologie envisage à la fois les mécanismes physiques, cellulaires ou biochimiques qui conduisent à l'apparition d'une maladie et les conséquences de celle-ci.

Polygone de Willis. Anastomose artérielle, sur l’aspect ventral du mésencéphale, connectant la circulation de la partie antérieure du cerveau et celle de sa partie postérieure.

Polymorphisme. Est la faculté que possède une substance de cristalliser dans des structures différentes selon les conditions ambiantes.

Pression artérielle. Correspond à la pression du sang dans les artères. On parle aussi de tension artérielle, car cette pression est aussi la force exercée par le sang sur la paroi des artères, elle tend la paroi de l'artère.

Pression Intra-crânienne (PIC). C’est la pression qui règne à l’intérieur de la boîte crânienne.

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Annexes

Pression osmotique. Se définit comme la pression minimum qu’il faut exercer pour empêcher le passage d’un solvant d’une solution moins concentrée à une solution plus concentrée au travers d’une membrane semi-perméable (membrane hémiperméable).

Prostanoïde. est le terme employé pour décrire une sous-classe de eicosanoids se composer par prostaglandines (médiateurs de inflammatoire), par thromboxanes (médiateurs de vasoconstriction) et par prostacyclines (actif dans la phase de résolution de l'inflammation.)

Protéines G. sont des protéines qui permettent le transfert d'informations à l'intérieur de la cellule. Elles participent ainsi à un mécanisme appelé transduction du signal. Ces protéines sont appelées ainsi car elles utilisent l'échange de GDP en GTP comme un « interrupteur moléculaire » pour déclencher ou inhiber des réactions biochimiques dans la cellule.

Protéine Kinase. Catégorie d’enzyme qui phosphoryle les protéines. Cette réaction modifie la morphologie de la protéine et son activité biologique.

Protéome. Est l'ensemble des protéines exprimées dans une cellule, une partie d'une cellule (membranes, organites) ou un groupe de cellules (organe, organisme, groupe d'organismes) dans des conditions données et à un moment donné.

Pression de perfusion cérébrale (PPC). Est la différence entre la pression artérielle à l’entrée et la pression veineuse cérébrale, celle-ci étant négligeable dans les conditions physiologiques, la PPC peut être assimilée à la pression artérielle.

Solvatation. Est le phénomène observé lorsqu'un composé chimique, introduit à l'état solide dans un solvant, réussit à rompre les liaisons qui le maintiennent dans l'état solide, et se dissout dans le solvant. L'énergie de solvatation d'une espèce dépend de la nature du solvant et du soluté : un composé polaire est généralement très bien solvaté dans un solvant également polaire, tandis qu'un composé apolaire est mieux solvaté dans un solvant apolaire. L’énergie de solvatation est ainsi souvent associée à son énergie de transfert d’un milieu hydrophobe vers un milieu hydrophile, mesurée par le coefficient de partage. Pour l'industrie pharmaceutique, cette propriété est donc un facteur clé dans le choix d'une molécule, car elle détermine son devenir dans le corps humain.

Transport paracellulaire: se rapporte au transfert des substances entre cellules d' épithélium. Il est contrairement « au transport transcellular », où les substances voyagent à travers la cellule, passant par tous les deux membrane apicale et membrane basolateral.

Thrombolyse. Action ayant pour objectif de dissoudre le caillot à l’origine de l’occlusion d’une artère. Cela n’est possible que dans les trois premières heures suivant le début de l’attaque cérébrale.

Thrombus ou caillot sanguin : est le produit final de la coagulation sanguine, par l'agrégation plaquettaire et l'activation du système de coagulation humorale. La thrombose consiste en la formation d'un thrombus obturant un vaisseau sanguin.

Volémie : est la quantité totale de sang dans l'organisme.

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Annexes

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Résumé

Accidents Vasculaire Cérébraux (parfois appelés AVC ou attaques cérébrales) sont les 3èmes causes principales de mortalité et les causes de handicap dans les pays industrialisés. Ils représentent un problème de santé publique en raison de leurs fréquences, de leurs mortalités et des handicaps physiques et cognitifs qu'ils entraînent. Malgré d’importants progrès réalisés dans le domaine de la physiopathogénie de l’ischémie cérébrale, on ne dispose pas encore, aujourd’hui, de thérapeutiques efficaces pour traiter un accident vasculaire cérébral lors de sa phase aiguë. Les gangliosides GM1 sont des composants majeurs du feuillet externe de la membrane cellulaire au niveau du système nerveux central. Ces gangliosides ont des effets antineurotoxiques, neuroprotecteurs et les propriétés neurorestoratrices sur les divers neurotransmetteurs du SNC mais pour le moment ils n’ont pas des valeurs thérapeutiques en raison de leurs manques de biodisponibilités et de leurs manques de perméabilité de la barrière hématoencéphalique (BHE). Nous avons synthétisé les structures simplifiées de ces gangliosides GM1, L’idée qui a prévalu pour la conception, des nouvelles structures a été : d’introduire des chaînes grasses saturées ou insaturées sur un motif sérine, tyrosine ou cystéine, de remplacer la fonction carboxylique par des groupements reconnus comme bioisostères classiques ou non classiques de cette fonction ; comme par exemple les fonctions phosphonique, tétrazolique, 2,4-oxadiazolidine-3,5-dione. Nous avons élaboré un nouveau modèle de composé neuroprotecteur dans lequel une chaîne grasse est couplée à une entité acide ascorbique pour améliorer le passage de la BHE. Pour étudier l’activité neuroprotectrice des composés synthétisés nous avons utilisé deux modèles biologiques in vitro : un modèle cellulaire (cellules HT22) et un modèle tissulaire (tranches de cerveaux).

Thèse de Doctorat en Chimie Organique.

Mots clés : Ischémie cérébrale, Les gangliosides GM1, MAPKs, Neuroprotection, Cellules HT22, Glutamate, Pénombre ischémique, Thrombolyse, Excitotoxicité, Bioisostérisme.

Laboratoire de Chimie Biomoléculaire, CNRS IBDML-UMR 6216, Campus de Luminy 163 avenue de Luminy- Case 907 Université de la Méditerranée 13288 Marseille Cedex 09 (France)

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Résumé

Stroke is the third leading cause of mortality and the primary cause of disability in adults. Therefore, it is critical to identify new, efficacious pharmacological treatments. One pharmacological approach for treatment of stroke is called neuroprotective therapy. It has been reported that the amphiphilic, monosialotetrahexosylganglioside (GM1) (II3 NeuAc-GgOsc4Cer) has antineurotoxic, neuroprotective, and neurorestorative effects on various central neurotransmitter systems. Since GM1 is not of therapeutic value because of its lack of bioavailability and its low blood-brain barrier (BBB) permeation. Thus, molecules that mimic GM1 represent a novel approach to neuroprotection. We have synthesized the smalls GM1-like analogues whose simplified structure includes various lipophilic saturated, unsaturated, or cyclic polyunsaturated moieties have been introduced, while in the second series, the carboxylic acid function was replaced by different hydrophilic groups including bioisosters of the carboxylate, such as a phosphonic acid, a tetrazole, the 1,2,4-oxadiazolidine-3,5-dione or an ascorbic acid moiety. Introduction of ascorbic acid was supported by several reports that showed that ascorbic acid conjugates can improve BBB permeation properties. We report their neuroprotective effects in two distinct models of nerve cell death using hippocampus-derived HT22 cells and an additional neuroprotective assays using cortical slices injured by glutamate confirmed these results.

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Résumé

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