ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ

ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ

ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός ουσιών που μεταβάλλουν τα

επίπεδα H 2 S: μεταβολές στην κυτταρική σηματοδότηση και επιπτώσεις στις κυτταρικές λειτουργίες.

ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΑΣΗΜΑΚΟΠΟΥΛΟΥ ΑΝΤΩΝΙΑ

ΧΗΜΙΚΟΣ, MSc

ΠΑΤΡΑ 2017

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ

ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ

ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός ουσιών που μεταβάλλουν τα

επίπεδα H 2 S: μεταβολές στην κυτταρική σηματοδότηση και επιπτώσεις στις κυτταρικές λειτουργίες.

ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) – Ερευνητικό Χρημα τοδοτούμενο Έργο: ΘΑΛΗΣ:

«Υδρόθειο (H 2 S) ένας νέος ενδογενής ρυθμιστής της αγγειογένεσης: μελέτες σηματοδότησης, φυσιολογικοί και παθοφυσιολογικοί ρόλοι και ανάπτυξη φαρμακολογικών αναστολέων». MIS : 380259, Φ.Κ.: D 554

ΑΣΗΜΑΚΟΠΟΥΛΟΥ ΑΝΤΩΝΙΑ ΧΗΜΙΚΟΣ, MSc

ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός ουσιών που μεταβάλλουν τα επίπεδα H 2 S: μεταβολές στην κυτταρική σηματοδότηση και επιπτώσεις στις κυτταρικές λειτουργίες.

ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ

ΤΟΠΟΥΖΗΣ ΣΤΑΥΡΟΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ

ΠΑΠΑΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΣ ΑΝΔΡΕΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΚΠΑ ΜΕΛΟΣ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ

ΣΠΥΡΟΥΛΙΑΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΜΕΛΟΣ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚ ΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ

ΚΥΠΡΑΙΟΣ ΚΥΡΙΑΚΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ

ΠΑΠΑΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ

ΠΟΥΛΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ

ΦΟΥΣΤΕΡΗΣ ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Με την ολοκλήρωση της παρούσας διδακτορικής διατριβής, θα ήθελα να ευχαριστ ήσω όλους όσους συνέβαλλαν, ο καθένας με το δικό του τρόπο, σε αυτή την προσπάθεια . Είχα την τιμή να συνεργαστώ με αξιόλογους και διακεκριμένους ανθρώπους, ερευνητές, καθηγητές και θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου . Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον επιβλέποντα Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Σταύρο Τοπούζη για την άρι στη συνεργασία, την ευγενική διάθεση, τις πολύτιμες συμβουλές αλλά και τη δημιουργική κριτική και καθοδήγηση, την εμπιστοσύνη και κατανόηση που μου έδειξε όλα τα χρόνια της συνεργασίας μας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ολόθερμα τον Καθηγητή κ. Ανδρέα Παπαπετρόπ ουλο, μέλος τη ς τριμελ ούς συμβουλευτικής επιτροπής, για την άψογη συνεργασία , την αστείρευτη εμπιστοσύνη και γενναιοδωρία , την καθοδήγηση και υποστήριξη, αλλά και την αμέριστη κατανόηση και συμπαράσταση, όλα τα χρόνια της συνεργασίας μας. Επίσης θα ήθελα ν α ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Γεώργιο Σπυρούλια , για τη συμμετοχή του στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή, την ειλικρινή διάθεση για συνεχή και εποικοδομητική συνεργασία, τη ν ανιδιοτελή βοήθεια και φιλοξενία , αλλά και την ευχάριστη ατμόσφαιρα από όλα τα μέ λη της ομάδας του. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την Καθηγήτρια κ. Ευαγγελία Παπαδημητρίου και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Εμμανουήλ Φουστέρη , για τη συμμετοχή στην επταμελή εξεταστική επιτροπή, για την ειλικρινή και ευγενική διάθεση αλλά και για τις γνώσεις και συμβουλές που μου παρείχ αν όλα τα χρόνια της παρουσίας μου στο Τμήμα Φαρμακευτικής . Είναι τιμή μου, και ευχαριστώ πάρα πολύ, να συμμετέχουν στην επταμελή εξεταστική επιτροπή ο Αναπληρωτής Καθηγ ητής κ. Κωνσταντίνος Πουλάς και ο Καθηγητής κ. Κυριάκος Κυπραίος. Δεν μπορώ να παραλείψω και να μην ευχαριστήσω τον αείμνηστο φίλο ερευνητή Ciro Coletta και τον Καθηγητή του UTMB, Csaba Szabo, των οποίων η προσφορά και διάθεση ήταν καταλυτική μεν για την ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής, πολύ περισσότ ερο δε για τη διαμόρφωση του επιστημονικού, αλλά και προσωπικού, χαρακτήρα. Ευχαριστώ επίσης τους ερευνητές Zongmin Zhou και Katalin Modis για την συνεχή και αστείρευτη διάθεση, την εκμάθηση και κατάρτιση επιστημονικών αλλά και τεχνικών γνώσεων. Θα ήθελα ν α ευχαριστήσω ακόμα τον Καθηγητή Αθανάσιο Γιάννη και τον Ερευνητή Διονύσιο Βουρλούμη, για την εμπιστοσύνη τους να μελετήσω τις ενώσεις που συνέθεσαν οι ομάδες τους, καθώς και τον Καθηγητή κ. Σπύρο Τζαμαρία, την Ερευνήτρια Β΄ κ. Ελένη Ντότσικα και τον Ερευνητή Γ΄ κ. Δημήτριο Μπέη, οι οποίοι συνέβαλλαν, ο καθένας με διαφορετικό τρόπο, στην προσπάθειά μου να ολοκληρώσω την διδακτορική μου διατριβή. Είχα την τιμή και χαρά να δουλέψω και να συνεργαστώ με διάφορες επιστημονικές ομάδες σε διαφορετικά εργαστήρ ια. Από όλη τη διαδρομή μου στο επιστημονικό αυτό μονοπάτι, ξεχώρισαν για τη φιλία, την ευχάριστη και αμέριστη διάθεση, την κατανόηση, συμπαράσταση και υποστήριξη, οι συνάδελφοι και φίλοι Κατερίνα Τσίκα, Αθανασία Παυλίδου, Αντωνία Κατσούδα, Ίρις Μπιμπλή, Α θανασία Χατζηαναστασίου και ιδιαίτερα οι φίλοι μου, η Γεωργία Λαϊνιώτη και ο Παναγιώτης Μπουντούρης, οι οποίοι με βοήθησαν και με στήριξαν σε σημαντικά προσωπικά θέματα. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω την οικογένειά μου, τα αδέρφια μου Γεράσιμο και Σπυριδούλα και τους γονείς μας, Ανδρέα και Βίτα, οι οποίοι είναι αρωγοί σε κάθε βήμα μου και για αυτό τους αφιερώνω το πόνημα αυτό. Τους ευγνωμονώ και τους αγαπάω πάντα!

Περιεχόμενα

Περίληψη

Summary

Συντμήσεις

1. Εισαγωγή 1

1.1 Το H 2 S 3

1.2 Φυσικοχημικές ιδιότητες του H 2 S 4

1.3 Μεταβολισμός του H 2 S 5

1.3.1 Ενδογενής παραγωγή H 2 S 5

1.3.2 Ένζυμα βιοσύνθεσης H 2 S 6

1.3.3 Καταβολισμός του H 2 S 13

1.4 Μηχανισμοί σηματοδότησης που εκκινούνται από το H 2 S 14

1.5 Βιολογικές δράσεις του H 2 S 16

1.5.1 Το H 2 S στο κεντρικό νευρικό σύστημα 17

1.5.2 Το H 2 S στο καρδιαγγειακό σύστημα 17

1.5.3 H 2 S και καρκίνος 19

1.5.4 H 2 S και μεταβολισμός 21

1.5.5 H 2 S και οξειδωτικό στρες 22

1.6 Φαρμακολογία του H 2 S 23 1.7 Τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού 28

2. Σκοπός 33

3. Μέθοδοι 37

3.1 Καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων 39 3.1.1 Παρασκευή στερεού θρεπτικού υλικού 39 3.1.2 Εισαγωγή πλασμιδίου σε κύτταρα E.coli (μετασχηματισμός) 39 3.1.3 Αποθήκευση βακτηρίων 41 3.1.4 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (mini prep) 42 3.1.5 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεγάλης κλίμακας (midi prep) 44 3.1.6 Εύρεση βέλτιστων συνθηκών πρωτεϊνικής έκφρασης 45 3.1.6.1 Ανάπτυξη προκαλλιέργειας 46 3.1.6.2 Ανάπτυξη καλλιέργειας μικρής κλίμακας 47 3.1.7 Καλλιέργεια μεγάλης κλίμακας 48 3.1.7.1 Kαλλιέργεια για την έκφραση της GST - CSE 48 3.1.7.2 Καλλιέργεια για την έκφραση της GST - CBS 48 3.1.7.3 Kαλλιέργεια για την έκφραση της GST - 3ΜSΤ 48 3.1.8 Λύση των βακτηριακών κυττάρων 49 3.2 Απομόνωση GST - χιμαιρικών πρωτεϊνών με χρωματογραφία συγγένειας 50 3.3 Καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων 53 3.3.1 Θρεπτικά μέσα καλλιέργειας κυττάρων 54 3.3.2 Ανακαλλιέργεια κυττάρων 54 3.3.3 Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer 56 3.3.4 Κατάψυξη κυττάρων 57 3.3.5 Απόψυξη κυττάρων 58 3.4 Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων 59 3.5 Προσδιορισμός συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης σε διάλυμα 60 Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτ ωμα πολυακρυλαμιδίου 3.6 61 (SDS - PAGE) 3.7 Απεικόνιση πρωτεϊνών με χρώση Coomassie 63 3.8 Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western 64 3.9 Προσδιορισμός παραγωγής υδροθείου 66 3.9.1 Tεχνική του κυανού του μεθυλενίου 66 3.9.2 Τεχνική του AzMC φθορισμού 71 3.10 Έλεγχος της επίδρασης ουσιών στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 73 3.10.1 Τεχνική του ΜΤΤ 73 3.10.2 Τεχνολογία του xCELLigence 75 3.11 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων 76

4. Αποτελέσματα 77 Σάρωση χημικών ενώσεων και επιλογή ουσιών με ανασταλτική δράση 4.1 81 έναντι των ενζύμων βιοσύνθεσης H 2 S 4.1.1 Απομόνωση των ενζύμων CSE και CBS 81

4.1.2 Μελέτη και χαρακτηρισμός ουσιών ως αναστολέων παραγωγής H 2 S 82 4.1.3 Σάρωση βιβλιοθήκης χημικών ενώσεων LOPAC 88 4.1.4 Έκφραση και απομόνωση του ενζύμου 3MST 90 4.1.5 Έλεγχος δραστικότητας του ενζύμου 3MST in vitro 91 Προσδιορισμός συνθηκών αντίδρασης για την παραγωγή H S από το 4.1.6 2 92 ένζυμο 3MST in vitro 4.1.6.1 Μελέτη της ποσότητας του ενζύμου 92 4.1.6.2 Μελέτη της συγκέντρωσης του υποστρώματος 92 Έλεγχος της εκλεκτικότητας των αναστολέων των ενζύμων βιοσύνθεσης 4.1.7 94 H 2 S Μελέτη των τετρακυκλινών ως αναστολείς των ενζύμων βιοσύνθεσης 4.2 99 Η 2 S Επίδραση της Δοξυκυκλίνης και Δεμεκλοκυκλίνης στην παραγωγή Η S 4.2.1 2 99 in vitro

4.2.2 Επίδραση των τετρακυκλινών στην παραγωγή Η 2 S in vitro 102 Επίδραση της Δοξυκυκλίνης και Δεμεκλοκυκλίνη ς στον κυτταρικό 4.2.3 104 πολλαπλασιασμό

4.3 Επίδραση της SAM στο σηματοδοτικό μονοπάτι CBS/ H 2 S 109 4.3.1 Επίδραση της SAM στη δραστικότητα του ενζύμου CBS in vitro 109

4.3.2 Επίδραση της SAM στην παραγωγή H 2 S σε κυτταρικό σύστημα 110 4.3.3 Επίδραση της SAM στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό 112

5. Συζήτηση 117

Παράρτημα Αποτελεσμάτων 139 Πίνακας α ποτελ ε σμ ά τ ων σάρωσης της βιβλιοθήκης LOPAC έναντι του ενζύμου 141 C Β S Πίνακας α ποτελ ε σμ ά τ ων σάρωσης της βιβλιοθήκης LOPAC έναντι του ενζύμου 156 CSΕ Σάρωση της βιβλιοθήκης LOPAC έναντι του ενζύμου CBS 171 Σάρωση της βιβλιοθ ήκης LOPAC έναντι του ενζύμου C S Ε 174

Βιβλιογραφία 177

Δημοσιεύσεις 213

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Το υδρόθειο (H 2 S), είτε ενδογενώς παραγόμενο είτε εξωγενώς χορηγούμενο (μέσω «δοτών»), αποτελεί ένα σηματοδοτικό μόριο , με πλειοτροπικές και πολυπαραγοντικές

βιολογικές δράσεις. Το H 2 S επηρεάζει διάφορε ς φυσιολογικές λειτουργίες όπως τη ρύθμιση του αγ γειακού τόνου, την αγγειογένεση και τη νευροδιαβίβαση, αλλά απορρύθμιση της παραγωγής του μ πορεί να οδηγήσει και σε παθολογικές καταστάσεις όπως νευροεκφυλιστικές καταστάσεις, καρκίνο, κυκλοφορικές και ενδοκρινικές διαταραχές. Η βιοσύνθεσ ή του γίνεται από ένζυμα του μεταβολισμού της L - κυστεΐνης, τη β - συνθετάση της κυσταθειονίνης (cystathionine β synthase, CBS) και τη γ - λυάση της κυσταθειονίνης (cystathionine γ lyase, CSE) καθώς και από το ένζυμο σουλφοτρανσφεράση του 3 - μερκαπτοπυροσταφυλικού (3 - mercaptopyruvate sulphurtransferase, 3MST). Τα δύο πρώτα ένζυμα χρησιμοποιούν ως υπόστρωμα το αμινοξύ L - κυστεΐνη ή/και την ομοκυστεΐνη και η δράση τους εξαρτάται από το συνένζυμο φωσφορική πυριδοξάλη (pyridoxal - 5’ - phosphate, PLP). Το ένζυμο 3MST

καταλύει την αντίδραση του 3 - μερκαπτοπυροσταφυλικού σε πυροσταφυλικό και H 2 S . Η επαρκής τεκμηρίωση του ρόλου του υδροθείου στη φυσιολογία και παθολογία, αλλά και η εξακρίβωση των μηχανισμών δράσης του, δυσχεραίνεται από την έλλειψη των απαραίτητ ων φαρμακολογικ ών εργαλεί ων , όπως πχ εκλεκτικ ών αναστολ έων καθενός από τα τρία έ νζυμα της βιοσύνθεσ ή ς του ή ενεργοποιητών τη ς ενδογενούς

παραγωγής, δηλ. διακριτών απο τους δότες H 2 S . Για να καλύψουμε αυτό το σημαντικό κενό, σ την παρούσα διατριβή αρχικά μελετήσαμε in vitro σε απομονωμένα ένζυμα, νέες ενώσεις που συντέθηκαν βάσει σχεδιασμού ως πιθανοί αναστολείς για τα ένζυμα CBS και CSE, αλλά και εμπορικά διαθέσιμες ουσίες από τη βιβλιοθήκη 1280 ενώσεων LOPAC ( Library of Pharmacologically Active Compounds ), ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν τα ένζυμ α βιοσύνθεσ ης του υδροθείου . Στη συνέχεια έγινε πιο εκτεταμένος φαρμακολογικός χαρακτηρισμός επιλεγμένων ενώσεων για τυχόν εκλεκτική ανασταλτική δράση έναντι των ενζύμων CBS, CSE και 3MST. Από τη μελέτη μας βρέθηκε πως οι νεοσυντεθείσες ενώσεις Hydrazino - glycine και Hydrazino - L - alanine , αν και με περιορισμένη εκλεκτικότητα, αναστέλλουν τα ένζυμα CBS και CSE , και θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως αρχικές ενώσεις για τον σχεδιασμό ακόμη πιο εκλεκτικών φαρμακολογικών αναστολέων των ενζύμων αυτών. Στις in vitro δοκιμές μας παρατηρήθηκε επίσης, ότι η ένωση Aminoethoxyvinyl -

glycine (AVG) αναστέλλει εκλεκτικά το ένζυμο CSE έναντι του CBS με IC 50 : 1,0 ± 0,1μΜ , γεγονός που την καθιστά ως τον πιο δραστικό και εκλεκτικό ταυτοχρόνως αναστολέα του ενζύμου CSE που έχει αναφερθεί μέχρι σήμερα. Επίσης, από τα αποτελέσματα της σάρωσης της βιβλιοθήκης LOPAC, προέκυψαν μερικές ενώσεις (hits) ως εν δυνάμει αναστολείς, οι οποίες μπορούν να χρησιμεύσουν ως βάση για τη σύνθεση αναλόγων ή νέων ουσιών που να έχουν εκλεκτι κά ανασταλτική δράση έναντι των ενζύμων CBS ή 3ΜSΤ. Βάσει των ευρημάτων μας, η δοξυκυκλίνη και η δεμεκλοκυκλίνη μπορεί να θεωρηθούν ως χρήσιμοι, σε μικρές συγκεντρώσεις εκλεκτικοί, αναστολείς του ενζύμου 3ΜSΤ, για το οποίο μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν επαρκώς χαρακτηρισμένοι εκλεκτικοί αναστολείς. Από εκτενή μελέτη άλλων τετρακυκλινών δεν προέκυψαν άλλα μόρια με παρόμοια δραστικότητα. Θέλοντας να ερευνήσουμε την επίδραση σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες της τροποποίησης των επιπέδων του ενδογενώς παραγόμενου υδροθείου, χρησιμοποιήσαμε την S - αδενόσυλο - L - μεθειονίνη (S - adenosyl - L - methionine, SAM) , ένα ν αλλοστερικό ενεργοποιητή του ενζύμου CBS , και την εξετάσαμε σε σχέση με τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού σε φυσιολογικά και καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα κόλου . Διαπι στώσαμε πως, σε χαμηλές συγκεντρώσεις (0,1 - 1mM), σε έκθεση 12 ωρών, η SAM επάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων HCT116 , τα οποία υπερεκφράζουν το CBS , ενώ σε κύτταρα με μειωμένη έκφραση του CBS , όπως τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα κόλου NCM356, και σε HCT116 κύτταρα που ανεστάλη φαρμακολογικά (ή μέσω sh RNA ) το ένζυμο CBS , η SAM δεν επάγει τον πολλαπλασιασμό. Αντιθέτως, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (3 mM) και μεγαλύτερης διάρκειας έκθεση (12 - 24h), η SAM παρουσιάζει ανασταλτική δράση στ ο ν πολ λαπλασιασμό , η οποία μάλιστα διατηρείται και στα NCM356 κύτταρα με μειωμένη έκφραση του CBS και σε κύτταρα που ανεστάλη φαρμακολογικά (ή μέσω sh RNA ) το CBS. Επομένως, συμπεραίνουμε πως η αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού από τη SAM (χαμηλές συγκεντρώσε ις) εξαρτάται από την αυξημένη παρουσία και ενεργότητα του CBS, ενώ οι ανασταλτικές δράσεις της

πιθανόν οφείλονται σε μηχανισμούς ανεξάρτητους από το μονοπάτι CBS/H 2 S. Συνολικά, η παρούσα εργασία κατέληξε α) στην αναγνώριση και χαρακτηρισμό συγκεκριμένων μοριακών δομών, μεταξύ αυτών και γνωστών φαρμάκων, των τετρακυκλινών, ως υπό συγκεκριμένες συνθήκες εκλεκτικών αναστολέων των ενζύμων παραγωγής του υδροθείου, με δυνατότ ητα βελτιστοποίησης της δράσης και εκλεκτικότητάς τους στο μέλλον, και β) στον εκτενή χαρακτηρισμό του ρόλου του ενζύμου CBS , μέσω της χρήσης του αλλοστερικού ενεργοποιητή SAM , στην αύξηση των καρκινικών κυττάρων του κόλου που υπερεκφράζουν το ένζυμο αυτό.

SUMMARY

Hydrogen sulfide (H 2 S), is a signaling molecule with multiple modes of action and biological functions . It regulates physiological processes such as vascular tone, angiogenesis and neurotransmission, but de regulation of its production is implicated in pathologies such as neurodegener at ion, cancer and endocrine disorders. Endogenous h ydrogen sulfide is in major part generated by two pyridoxal - 5´ - phosphate - dependent enzymes, cystathionine - γ - lyase (CSE) and cystathionine - β - synthase (CBS) , bot h using L - cysteine as the main substrate. Another enzymatic pathway involves the conversion of 3 - mercaptopyruvate to h ydrogen sulfide and pyruvate by 3 - mercaptopyruvate sulphurtransferase, 3MST. The lack of useful pharmacological research tools, such as po tent and selective inhibitors for each enzyme , or stimulators of the enzyme ( i.e. distinct from H 2 S donors) , has a negative impact on research addressing the translational potential of h ydrogen sulfide and the mechanism of its action. In order to fill th is gap , we carried out an in vitro screening , using in - house purified recombinant enzymes, of several new compounds that have been specifically synthesized as potential inhibitors for CBS and CSE . We also screened a collection of 1280 clinically used drugs a nd well - annotated pharmacological compounds (LOPAC library). After that we conducted a more extensive pharmacological characterization of selected compounds in order to establish their selectivity. We found that the new ly synthesized compounds, Hydrazino - g lycine and Hydrazino - L - alanine , inhibit both CBS and CSE, displaying limited selectivity, so that they could be come the base for synthesis of mo re selective inhibitors of these enzymes. We also observed that the IC 50 of AVG for CSE is 1 μ M, making AVG the most potent available inhibitor for this enzyme. Initial hits from the LOPAC library screening were further examined. Our results showed that doxycycline and demeclocycline could be used as useful (in low concentrations selective) inhibitors for 3MST, espe cially since there are currently no selective annotated inhibitor s for this enzyme . An additional purpose of the current study was to investigate the effect of the allosteric CBS activator S - adenosyl - L - methionine (SAM) on the proliferation of the CBS - hyper expressing colon cancer cell line HCT116. The non - transformed, non - tumorigenic colon epithelial cell line NCM356 was used as control. SAM exerted time - and concentration - dependent modulatory effects on cell proliferation. At 0,1 – 1mM SAM increased HCT116 pr oliferation between 0 and 12 h, while t he highest SAM concentration (3 mM) inhibited proliferation. The se short - term stimulatory effects of SAM were attenuated by the CBS inhibitor AOAA or by stable silencing of CBS via shRNA . In contrast, the inhibitory ef fects of SAM on cell proliferation was unaffected by CBS inhibition or CBS silencing. In addition, SAM failed to exert the stimulatory effects on NCM356 proliferation , although the SAM - induced suppression of NCM356 proliferation was maintained. We conclude that a signi fi cant portion of SAM’s pro - proliferative effects seen in the current study are, in fact, related to increased endogenous H 2 S production via CBS; however, the long - term growth

inhibitory/antitumor effects of SAM involve CBS / H 2 S - independent mechanisms. Collectively, our study resulted in a) the identification and characterization of compounds, among them approved drugs (tetracyclines), as selective (in certain concentrations) inhibitors of H 2 S - synthesizing enzymes, thus providing initial stru ctures for optimiz ation of their potency and selectivity in the future, and b) the extensive characterization of the role of the allosteric CBS activator SAM, on the proliferation of the CBS - hyperexpressing colon cancer cells .

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ

3MST 3 - mercaptopyruvate sulfurtransferase AOAA Aminooxyacetic acid AVG Aminoethoxyvinylglycine AzMC 7 - azido - 4 - methylcoumarin CBS Cystathionine -- synthase CSE Cystathionine -- lyase GST Glutathionine - S - transferase H2S Hydrogen sulfide IPTG Isopropyl - b - D - thiogalactopyranoside PAG Propargylglycine PLP Pyridoxal - 5' - phosphate SAM S - adenosyl - L - methionine

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

2

1.1 Το H 2S

Το υδρόθειο , H 2S, είναι ένα άχρωµο και εύφλεκτο αέριο το οποίο είναι γνωστό για την προέλευσή του από τα ηφαίστεια , το πετρέλαιο , τους υπονόµους και τις βιοµηχανίες .1 Μέχρι πρόσφατα η όποια αναφορά γινόταν σε αυτό το αέριο αφορούσε την τοξικότητά του . Πέρα από το γεγονός ότι αποτελεί περιβαλλοντικό ρύπο , το θείο

ανήκει στα πρώτα µόρια , µαζί µε το υδρογόνο , Η2, το µονοξείδιο του άνθρακα , CO

και το άζωτο , N2, που χρησιµοποιούνταν από αρχαίες µορφές ζωής ως θρεπτικά συστατικά για την παραγωγή ενέργειας αλλά και την εξέλιξη της ζωής . Χρησιµοποιείται από αερόβιους αλλά και αναερόβιους µικροοργανισµούς , είτε µέσω οξείδωσης είτε αναγωγής , για την παραγωγή ενέργειας .2,3 Άλλες ανόργανες ενώσεις που περιέχουν θείο και χρησιµοποιούνται επίσης από τους µικροοργανισµούς ως δέκτες ηλεκτρονίων για την παραγωγή ενέργειας , είναι το θειώδες , το θειοθειικό και 4,5 το ατοµικό θείο που παράγουν το υδρόθειο (H 2S). Το υδρόθειο αποτελεί πηγή ενέργειας για βακτήρια , φυτά , ασπόνδυλα και σπονδυλωτά . Τα θηλαστικά απορροφούν το θείο κυρίως µέσω της διατροφής από τα αµινοξέα µεθειονίνη και κυστεΐνη , τα οποία αποτελούν τα πρόδροµα µόρια για τη βιοσύνθεση του υδροθείου και άλλων µεταβολιτών αναγκαίων για την κυτταρική οµοιόσταση . Μολονότι η ικανότητα των θηλαστικών να παράγουν υδρόθειο ήταν γνωστή από καιρό , οι επιστηµονικές µελέτες των τελευταίων ετών αποδεικνύουν τη

βιολογική σηµασία των φυσιολογικών δράσεων του H 2S σε διάφορα συστήµατα του 6,7 οργανισµού . Το υδρόθειο (H2S) αναγνωρίζεται πλέον ως ένα σηµατοδοτικό µόριο και αναφέρεται ως ο τρίτος φυσιολογικός αέριος διαβιβαστής µαζί µε το οξείδιο του αζώτου ( ΝΟ ) και το µονοξείδιο του άνθρακα (CO). 8

3

1.2 Φυσικοχηµικές ιδιότητες του H2S

Το υδρόθειο είναι ασθενές οξύ και σε υδατικά διαλύµατα ιοντίζεται σε κατιόντα Η+ - o o και ανιόντα υδροσουλφιδίου ΗS (pKa 1=7,04 στους 25 C και pKa 1=6,76 στους 37 C), + -2 τα οποία στη συνέχεια διίστανται σε κατιόντα Η και ανιόντα S (pKa 2=11,96 στους 25 oC).

Σχήµα 1.1: ∆ιάσταση H 2S

Σε φυσιολογικές συνθήκες , δηλαδή pH=7,4 και 37 oC, λιγότερο του 20% του αερίου είναι αδιάστατο , ενώ η χηµική µορφή S -2 υπάρχει σε πολύ χαµηλά επίπεδα , εφόσον η διάσταση του ανιόντος ΗS- απαιτεί αλκαλικό pH. Συνεπώς η µορφή του υδροθείου που απαντάται σε µεγαλύτερη συγκέντρωση στα υδατικά διαλύµατα µε φυσιολογικό pH είναι το ανιόν υδροσουλφιδίου ΗS-. Πρόκειται για ένα ιδιαίτερα λιπόφιλο , µικρού µεγέθους , αέριο που µπορεί να διαπερνά εύκολα τις βιολογικές µεµβράνες όλων των κυτταρικών τύπων και συνεπώς η δράση του δεν εξαρτάται από τη σύνδεσή του σε µεµβρανικούς υποδοχείς . Η δράση του µπορεί να είναι ενδοκρινική , παρακρινική ή αυτοκρινική . Οι ιδιότητες αυτές προσδίδουν στο υδρόθειο µεγάλη βιολογική δραστικότητα .9,10,11 Το υδρόθειο που παράγεται ενδογενώς µπορεί να προκαλέσει άµεσα τις δράσεις του ή να αποθηκευθεί ως " δεσµευµένο θείο " δηµιουργώντας ενδοκυττάριες αποθήκες θείου (acid-labile sulfur και sulfane sulfur) από τις οποίες µπορεί να απελευθερωθεί υπό ορισµένες συνθήκες οξείδωσης ή αναγωγής .12,13 Η δέσµευση του θείου στις ενδοκυττάριες αποθήκες θείου εξαρτάται από το είδος του ιστού , το ρυθµό ενζυµικής παραγωγής υδροθείου και το ρυθµό απελευθέρωσής του . Οι µορφές µε τις οποίες 2- αποθηκεύεται περιλαµβάνουν το θειοθειϊκό ιόν (S2O3 ), θειοσουλφονικοί εστέρες (R- -2 S-SO 2-R), δισουλφίδια (R-S-SH), ανιόντα πολυσουλφιδίων (Sn ) και οργανικά

πολυσουλφίδια (RS nR,όπου R είναι άλκυλο - ή αρυλο -οµάδα ), πολυθειονικό ανιόν 2- (SnO6 ), και το στοιχειακό θείο (S8). Η απελευθέρωση του υδροθείου εξαρτάται από οξειδοαναγωγικούς παράγοντες .14

4

1.3 Μεταβολισµός του H 2S

1.3.1 Ενδογενής παραγωγή H 2S

Το υδρόθειο παράγεται στον ανθρώπινο οργανισµό κυρίως ενζυµικά και µικρό µερίδιο της βιοσύνθεσης οφείλεται σε µη ενζυµικά µονοπάτια . Επιπρόσθετα της ενζυµικής παραγωγής , το υδρόθειο µπορεί να συντεθεί και από τη µικροβιακή χλωρίδα του εντέρου , µε αναγωγή του θειϊκού ή/και ενώσεων που έχουν θείο , από διάφορα βακτήρια .15,16 Τα ένζυµα που καταλύουν τις αντιδράσεις βιοσύνθεσης του υδροθείου είναι η β-συνθετάση της κυσταθειονίνης (cystathionine β-synthase, CBS), η γ-λυάση της κυσταθειονίνης (cystathionine γ-lyase, CSE) και η σουλφοτρανσφεράση του 3-µερκαπτοπυροσταφυλικού (3-mercaptopyruvate sulphurtransferase, 3MST). Τα ένζυµα CBS και CSE χρησιµοποιούν ως συνένζυµο τη φωσφορική πυριδοξάλη (pyridoxal-5’-phosphate, PLP), ενώ το ένζυµο 3MST συνθέτει υδρόθειο χωρίς την παρουσία συνενζύµου .17,18,19 Οι σηµαντικότερες

αντιδράσεις που ευθύνονται για την ενδογενή παραγωγή H 2S διαµεσολαβούνται από το µεταβολικό µονοπάτι βιοσύνθεσης της κυστεΐνης . Συγκεκριµένα (Σχήµα 1.2):

• Το ένζυµο CBS υδρολύει το αµινοξύ L-κυστεΐνη παράγοντας ισοµοριακές 20 ποσότητες L-σερίνης και H 2S.

• Το ένζυµο CSE χρησιµοποιώντας ως υπόστρωµα την L-κυστεΐνη παράγει H2S, πυροσταφυλικό και αµµωνία .21

• Η αντίδραση L-κυστεΐνης και οµοκυστεΐνης παράγει κυσταθειονίνη και H 2S και καταλύεται από το ένζυµο CBS.22,23 • Το ένζυµο αµινοτρανσφεράση κυστεΐνης (cysteine aminotransferase, CAT) µε τη συµµετοχή του συνενζύµου PLP, και το ένζυµο οξειδάση των D-αµινοξέων (D- aminoacid oxidase, DAO) χρησιµοποιούν ως υπόστρωµα την L-κυστεΐνη και την D-κυστεΐνη , αντίστοιχα , για το σχηµατισµό 3-µερκαπτοπυροσταφυλικού , το οποίο

στη συνέχεια χρησιµοποιείται ως υπόστρωµα από το 3MST για την παραγωγή H 2S και πυροσταφυλικού .24,25

5

26 Σχήµα 1.2: Μεταβολικά µονοπάτια βιοσύνθεσης και καταβολισµού του H2S.

1.3.2 Ένζυµα βιοσύνθεσης H 2S

Τα ένζυµα που συµµετέχουν στη βιοσύνθεση του υδροθείου , CBS, CSE και 3MST, εκτός από τη δοµή διαφέρουν και στην κυτταρική εντόπιση , στον τρόπο ρύθµισής τους , στα υποστρώµατα που χρησιµοποιούν καθώς και στη χρήση συνενζύµου .27,28 Πιο αναλυτικά αναπτύσσονται στη συνέχεια .

‹ β-συνθετάση της κυσταθειονίνης (CBS)

Το ένζυµο CBS (EC 4.2.1.22) ονοµάζεται επίσης υδρολυάση της L-σερίνης , β- θειονάση , συνθάση κυστεΐνης και συνθάση µεθυλοκυστεΐνης . Το γονίδιο για το ένζυµο του ανθρώπινου οργανισµού εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 21 (21q22.3). Είναι οµοτετραµερές αποτελούµενο από υποµονάδες µε µοριακό βάρος 63kDa. Η κάθε υποµονάδα περιέχει 551 κατάλοιπα αµινοξέων .29 Είναι βασικό ένζυµο στο µονοπάτι µεταβολισµού της µεθειονίνης και της κυστεΐνης . Καταλύει την αντίδραση αντικατάστασης του υδροξυλίου (-OH) της σερίνης από την οµοκυστεΐνη

6

αποδίδοντας κυσταθειονίνη και εν συνεχεία καταλύει την αντίδραση αντικατάστασης του υδροσουλφιδίου (-SH) κυστεΐνης από την οµοκυστεΐνη αποδίδοντας 30,31 κυσταθειονίνη και υδρόθειο ( Η2S). Το CBS του ανθρώπινου οργανισµού είναι ένα ένζυµο µε ιδιαίτερα πολύπλοκη δοµή και µηχανισµό ρύθµισης . Είναι το µοναδικό PLP-εξαρτώµενο ένζυµο που χρειάζεται την αίµη ως προσθετική οµάδα και η δράση του ρυθµίζεται από έναν αλλοστερικό ενεργοποιητή , την S-αδενόσυλο -L-µεθειονίνη (S-adenosyl-L-methionine, SAM ή AdoMet). 32,33 Η κάθε υποµονάδα του τετραµερούς αποτελείται από τρεις λειτουργικές περιοχές ( Εικόνα 1.1).

Εικόνα 1.1: Απεικόνιση της αλληλουχίας της υποµονάδας του ενζύµου CBS όπου φαίνονται οι τρεις λειτουργικές περιοχές του .30

Η πρώτη συνιστά την περιοχή όπου προσδένεται η αίµη , η οποία συναρµόζεται µέσω της θειόλης του καταλοίπου C52 και του ιµιδαζολίου του καταλοίπου H65 και βρίσκεται στη Ν-τελική περιοχή του ενζύµου . Ο ρόλος της αίµης δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως , στη βιβλιογραφία αναφέρονται και δοµικές και ρυθµιστικές λειτουργίες αυτής .34,35 Η αίµη θεωρείται ως ένας κυτταρικός οξειδοαναγωγικός "αισθητήρας ", ικανός να δεσµεύει προσδέµατα όπως το µονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ ) και το µονοξείδιο του άνθρακα (CΟ), αλλά και να σταθεροποιεί δοµικά το CBS ώστε να βελτιώνει τη στερεοδοµή του .36 Ενώ το ένζυµο είναι πλήρως ενεργό όταν η αίµη είναι σε κατάσταση Fe +3 , αναγωγή της αίµης σε κατάσταση Fe +2 οδηγεί σε αδρανοποίηση του ενζύµου που αποδίδεται στην πρόσδεση αέριων διαβιβαστών όπως τα ΝΟ , C Ο. Η κεντρική και καταλυτική περιοχή περιέχει συνδεδεµένη οµοιοπολικά τη φωσφορική πυριδοξάλη (PLP) µε µια Schiff βάση µε το κατάλοιπο Κ119.37 Από τη δοµή του ενζύµου επιβεβαιώνεται ότι εκτείνεται µια α-έλικα µεταξύ των κοιλοτήτων όπου προσδένονται η αίµη και η φωσφορική πυριδοξάλη , η οποία λειτουργεί ως

7

µεταγωγέας σήµατος µεταξύ των συµπαραγόντων αυτών . Στο ένα άκρο της έλικας η πλευρική αλυσίδα του καταλοίπου R266 συνδέεται µέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων µε τη θειόλη του καταλοίπου C52, ενώ το άλλο άκρο της έλικας οδηγεί στο φωσφορικό τµήµα του PLP όπου εκτείνονται πολλαπλοί δεσµοί υδρογόνου µεταξύ των καταλοίπων G256, T257, G258, G259, T260 και του φωσφορικού του PLP. 38,39 Ένας δεσµός υδρογόνου µεταξύ του οξυγόνου της φαινόλης του PLP και του κατάλοιπου N149 του ενεργού κέντρου του ενζύµου σταθεροποιεί το PLP στην ενεργή µορφή του ταυτοµερούς (Εικόνα 1.2).39

Εικόνα 1.2: Απεικόνιση της έλικας του CBS µεταξύ των κοιλοτήτων όπου προσδένονται η αίµη και η φωσφορική πυριδοξάλη , PLP, καθώς και των απαραίτητων καταλοίπων που συµµετέχουν για την επικοινωνία µεταξύ των µορίων αυτών . (PDB file: 1M54)

Τέλος , η C-τελική και ρυθµιστική περιοχή , αποτελείται από ένα διαδοχικό µοτίβο CBS τµηµάτων στο οποίο προσδένεται η S-αδενόσυλο -L-µεθειονίνη , SAM, η οποία οδηγεί στη συνέχεια σε αύξηση της δραστικότητας του ενζύµου .40,41 Στο CBS µοτίβο , που καλείται " µονάδα Bateman", οφείλεται η τετραµερής δοµή του ενζύµου και η αυξηµένη ενεργότητα από την πρόσδεση της SAM.29,42,43 Στο τετραµερές ένζυµο , η C-τελική περιοχή στην οποία δεν είναι προσδεµένη η SAM, προκαλεί ένα είδος αυτο - αναστολής εφόσον παρεµποδίζει στερικά την πρόσβαση του υποστρώµατος στο ενεργό κέντρο . Η αλλοστερική διαµόρφωση του ενζύµου µετά την πρόσδεση της SAM στη µονάδα Bateman επιτρέπει την προσέγγιση του υποστρώµατος στην καταλυτική περιοχή µε επακόλουθη αύξηση στην ενεργότητα του ενζύµου (Εικόνα 1.3).44 Πρωτεόλυση του ενζύµου στο κατάλοιπο R413 και κατά συνέπεια αποκοπή της µονάδας Bateman, οδηγεί σε σταθεροποίηση του ενζύµου σε διµερές µοριακού βάρους 45kDa, το οποίο δεν ανταποκρίνεται στη SAM αλλά εµφανίζει αυξηµένη δραστικότητα σε σχέση µε το τετραµερές ένζυµο στη βασική του στερεοδοµή .36

8

Εικόνα 1.3: Μοντέλο που απεικονίζει την επίδραση της πρόσδεσης της SAM ( ή AdoMet) στο διµερές ένζυµο CBS. Η µονάδα Bateman παρεµποδίζει την προσέγγιση του υποστρώµατος στο ενεργό κέντρο του ενζύµου . Η αλλοστερική διαµόρφωση του ενζύµου µε την πρόσδεση της SAM επιτρέπει την πρόσβαση του υποστρώµατος στην καταλυτική περιοχή του ενζύµου .44

Το ένζυµο CBS τροποποιείται µετα -µεταφραστικά από την πρωτεΐνη small ubiquitin- like modifier-1, SUMO-1, στην C-τελική περιοχή . Αυτή η τροποποίηση (SUMOylation) ενισχύεται από την πρωτεΐνη human polycomb group protein 2, hPc2, και επιτρέπει την παλινδροµική µετακίνηση του ενζύµου στον πυρήνα .45 Προτείνεται µάλιστα πως η µετακίνηση στον πυρήνα λαµβάνει χώρα όταν η ανάγκη για γλουταθειόνη είναι υψηλή οπότε το CBS είναι απαραίτητο για το µεταβολικό µονοπάτι της σύνθεσης της κυστεΐνης , του αµινοξέος που συµβάλει στη σύνθεση γλουταθειόνης .46 Ένας άλλος τρόπος µετα -µεταφραστικής τροποποίησης του CBS που έχει αναφερθεί είναι η γλουταθειονιλίωση στο κατάλοιπο C346. Κάτω από συνθήκες οξειδωτικού στρες η γλουταθειονιλίωση αυξάνει την ενεργότητα του CBS και κατά συνέπεια τη σύνθεση της κυστεΐνης .47 Πρόσφατη µελέτη που αφορά στη µετα -µεταφραστική τροποποίηση του CBS αναφέρει ότι η φωσφορική κινάση G, PKG, φωσφορυλιώνει το ένζυµο στο αµινοξικό κατάλοιπο S227 µε αποτέλεσµα την αυξηµένη δραστικότητα του ενζύµου .48 Άλλα µόρια που έχουν αναφερθεί ότι ρυθµίζουν τη δραστικότητα του CBS είναι η τεστοστερόνη ,49 τα γλυκοκορτικοειδή , ο επιδερµικός αυξητικός παράγοντας ( ΕGF), ο µετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας -α (TGF-α), το cAMP και η ινσουλίνη .50,51 Το ένζυµο CBS εντοπίζεται βασικά στο κυτταρόπλασµα αλλά µπορεί να µετατοπιστεί και στα µιτοχόνδρια κάτω από ορισµένες συνθήκες . Αναφέρεται πως διατηρεί τη φυσιολογική ισορροπία ενέργειας των κυττάρων , επάγει την οξειδωτική φωσφορυλίωση και τη γλυκόλυση και κατά συνέπεια τον κυτταρικό

9

πολλαπλασιασµό .52,53,54 Το ένζυµο CBS εκφράζεται κυρίως στον εγκέφαλο και είναι

η κύρια συνθετική πηγή του H 2S που παράγεται στο κεντρικό νευρικό σύστηµα . Εντοπίζεται συγκεκριµένα στη γλοία και τα αστροκύτταρα . Επίσης εκφράζεται και σε ιστούς , όπως ήπαρ , νεφρούς , ειλεό , µήτρα , πάγκρεας .55,56 Σε άλλους ιστούς όπως , καρδιαγγειακό σύστηµα , αναπνευστικό , επινεφρίδια ή σπλήνα , η έκφραση του CBS είναι περιορισµένη , µπορεί όµως να επαχθεί η έκφραση του σε συνθήκες όπου τα επίπεδα της οµοκυστεΐνης είναι υψηλά , ώστε αυτή να µεταβολιστεί .31,45 Αυξηµένη έκφραση του CBS παρατηρείται και σε διάφορους τύπους καρκίνου , όπως σε καρκινικά κύτταρα κόλου ,53 προστάτη 57 , ωοθηκών 58 και µαστού .59 Στους ανθρώπους είτε η απουσία του ενζύµου , είτε η µειωµένη ενεργότητά του (λόγω µετάλλαξης σε κάποια από τις ρυθµιστικές περιοχές του ), µπορεί να οδηγήσει σε αυξηµένα επίπεδα οµοκυστεΐνης οδηγώντας στην ανάπτυξη οµοκυστεϊναιµίας . Η οµοκυστεϊναιµία αποτελεί έναν από τους σηµαντικότερους παράγοντες κινδύνου καρδιαγγειακής νόσου . Τα αυξηµένα επίπεδα οµοκυστεΐνης οδηγούν σε καρδιαγγειακές βλάβες , ενδοθηλιακή δυσλειτουργία , σκελετικές ανωµαλίες και διανοητική καθυστέρηση .60

‹ γ-λυάση της κυσταθειονίνης (CS Ε)

Το ένζυµο CSE (EC 4.4.1.1) αρχικά ονοµαζόταν ως κυσταθειονάση εφόσον είναι το ένζυµο για την υδρολυτική αποικοδόµηση της κυσταθειονίνης .61 Άλλες ονοµασίες µε τις οποίες αναφέρεται είναι , γ-κυσταθειονάση , λυάση της κυστεΐνης , απαµινάση ή αφυδατάση οµοσερίνης . Στον ανθρώπινο οργανισµό το γονίδιο για το ένζυµο CSE εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 1 (1p31.1). 62 Το CSE διαµορφώνεται ως οµοτετραµερές όπου η κάθε υποµονάδα αποτελείται από 405 αµινοξέα µε µοριακό βάρος 45kDa. 63 Η κάθε υποµονάδα περιέχει δύο CXXC µοτίβα , αλλά δεν είναι γνωστό κατά πόσο επηρεάζουν τη δραστικότητα του ενζύµου υπό οξειδοαναγωγικές συνθήκες . Το CSE είναι βασικό ένζυµο στο µεταβολισµό της κυστεΐνης και καταλύει την αντίδραση µεταβολισµού της κυσταθειονίνης σε κυστεΐνη , αµµωνία και α-κετοβουτυρικό .64 Έχει εξειδίκευση για διάφορα υποστρώµατα πέραν της κυσταθειονίνης , όπως την κυστεΐνη , θειοκυστεΐνη , οµοκυστεΐνη τα οποία χρησιµοποιεί σε διαφορετικές αντιδράσεις για τη βιοσύνθεση υδροθείου .65 Το σηµείο πρόσδεσης είναι το ίδιο για όλα τα υποστρώµατα όπου ανταγωνίζονται να σχηµατίσουν µια βάση Schiff µε το

10

συνένζυµο PLP, το οποίο συνδέεται στο κατάλοιπο Κ212 του ενεργού κέντρου του ενζύµου .66

Εικόνα 1.4: ∆οµή του ανθρώπινου ενζύµου γ-λυάση κυσταθειονίνης (CSE). (PDB code: 2NMP).

Το ένζυµο CSE εντοπίζεται στο κυτταρόπλασµα , αλλά όπως αναφέρθηκε και για το CΒS, υπό ορισµένες συνθήκες µπορεί να µετακινηθεί στα µιτοχόνδρια .67 Εκφράζεται στο καρδιαγγειακό σύστηµα , όπου αναφέρεται ως το κύριο ένζυµο (υπό φυσιολογικές συνθήκες ) που συµβάλλει στην παραγωγή υδροθείου , το οποίο ρυθµίζει τον αγγειακό τόνο και την πίεση του αίµατος . Επίσης εκφράζεται και σε άλλους ιστούς , όπως τους πνεύµονες , το ήπαρ , τους νεφρούς , το πάγκρεας και το έντερο ,68,69 καθώς και σε καρκινικά κύτταρα µελανώµατος 70 , κόλου 71 , προστάτη και πνεύµονα .72,73 Η έκφραση του ενζύµου εξαρτάται από παράγοντες , όπως ο δάκτυλος ψευδαργύρου µυελοειδούς MZF1 (myeloid zinc finger 1),74 ο µεταγραφικός παράγοντας SP1 (specificity protein 1) 75 και ο µεταγραφικός παράγοντας ATF4 (activating transcription factor 4) σε συνθήκες στρες του ενδοπλασµατικού δικτύου .76 Αυξηµένη έκφραση του ενζύµου παρατηρείται στο ήπαρ και πάγκρεας πειραµατικού µοντέλου διαβήτη σε επίµυες .77,78 Μετα -µεταφραστικές τροποποιήσεις του ενζύµου που έχουν αναφερθεί , είναι από την πρωτεΐνη SUMO, σε in vitro πειράµατα µε πιθανή µετακίνηση του ενζύµου στον πυρήνα ,46 καθώς και φωσφορυλίωση από την φωσφοκινάση G, PKG, στο αµινοξικό κατάλοιπο S377 µε επακόλουθη αναστολή της δραστικότητας του ενζύµου .79 Επιδράσεις όπως αύξηση στη δραστικότητα του ενζύµου αναφέρεται ότι επιφέρει το ασβέστιο και η καλµοδουλίνη ,80,81 δότες µονοξειδίου του αζώτου ,82 καθώς και η τεστοστερόνη .83 Μεταλλάξεις ή ανεπάρκεια στο ένζυµο οδηγούν σε µειωµένο καταβολισµό της κυσταθειονίνης µε αποτέλεσµα την υπερ -κυσταθειονιναιµία και κυσταθειονινουρία , η οποία αυξάνει τον κίνδυνο για αθηροσκλήρωση και καρκίνο

11

της ουροδόχου κύστεως και κληρονοµείται µε αυτοσωµικό υπολειπόµενο τρόπο .84 Γενετική αποσιώπηση αµφότερων των αλλήλων του ενζύµου προκαλεί υπέρταση , όπως έχει παρατηρηθεί σε οµόζυγα διαγονιδιακούς µύες CSE -/-.81

‹ Σουλφοτρανσφεράση του 3-µερκαπτοπυροσταφυλικού (3 ΜSΤ)

Το ένζυµο 3 ΜSΤ (EC 2.8.1.2) καταλύει την αντίδραση µεταβολισµού του 3- µερκαπτοπυροσταφυλικού σε πυροσταφυλικό και υδρόθειο (δεσµευµένο , το οποίο απελευθερώνεται µε αναγωγή ) στο µονοπάτι αποικοδόµησης της κυστεΐνης , µε την συζευγµένη δράση του ενζύµου αµινοτρανσφεράση κυστεΐνης , CAT, το οποίο χρησιµοποιεί ως υπόστρωµα την κυστεΐνη και συνένζυµο τη φωσφορική πυριδοξάλη .85 Το 3 ΜSΤ είναι ένα µονοµερές 33kDa ή διµερές ( µέσω δισουλφιδικών δεσµών ), που περιέχει δυο περιοχές ροδανάσης και συντηρεί στο ενεργό του κέντρο ένα καταλυτικό αµινοξικό κατάλοιπο κυστεΐνης , C248, το οποίο λειτουργεί ως πυρηνόφιλο που δεσµεύει το µεταφερόµενο θείο από το 3-µερκαπτοπυροσταφυλικό , µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό δισουλφιδίου .86,87 ∆ύο κατάλοιπα αργινίνης αναφέρεται ότι αλληλεπιδρούν µε το οξυγόνο του καρβονυλίου και το καρβοξυλικό του 3-µερκαπτοπυροσταφυλικού , τα οποία είναι σηµαντικά για την εξειδίκευση του 3MST για το 3-µερκαπτοπυροσταφυλικό έναντι του θειοθειΐκού .88 Η αποδέσµευση του θείου από το σχηµατιζόµενο δισουλφίδιο του καταλοίπου C248 του 3MST γίνεται παρουσία αναγωγικών παραγόντων , όπως η θειορεδοξίνη και το διϋδρο - λιποϊκό οξύ.89 Στον άνθρωπο , το γονίδιο για το ένζυµο 3 ΜSΤ εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 22 (22q12.3) και το ένζυµο 3 ΜSΤ εντοπίζεται στο κυτταρόπλασµα και στα µιτοχόνδρια .90 Το 3 ΜSΤ εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους ιστούς που έχουν µελετηθεί , αλλά αναφέρεται κυρίως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστηµα , στους νεφρούς , το ήπαρ , το ενδοθήλιο των αγγείων και την καρδιά .91,92,93 Έχει αναφερθεί αυξηµένη έκφραση και σε είδη καρκίνων όπως µελάνωµα και αστροκύτωµα .94 ∆εν έχει αναφερθεί κάποια µετα -µεταφραστική τροποποίηση του 3MST, αλλά έχει αποδειχθεί πως το οξειδωτικό στρες ελαττώνει τη δραστικότητα του ενζύµου , ώστε να διατηρηθούν υψηλά τα επίπεδα της κυστεΐνης και κατά συνέπεια της θειορεδοξίνης και της γλουταθειόνης , ουσιών απαραίτητων για τη διατήρηση της κυτταρικής οξειδοαναγωγικής οµοιόστασης . Μάλιστα οι αναγωγικές αυτές ουσίες

12

µπορούν να αποκαταστήσουν την ενεργότητα του 3MST. Συνεπώς , η οξειδοαναγωγική κατάσταση ρυθµίζει τη δραστικότητα του ενζύµου 3MST στο πρωτεϊνικό επίπεδο και το ένζυµο ελέγχει την οξειδοαναγωγική κατάσταση του κυττάρου µέσω της µεταβολικής ρύθµισης της αποικοδόµησης της κυστεΐνης .95,96 Αποσιώπηση του ενζύµου ( σε διαγονιδιακούς “knock-out” µύες 3MST -/-) αναφέρεται ότι προκαλεί αγχώδεις διαταραχές και τη νόσο mercaptolactate-cysteine disulfiduria (MCDU), η οποία σχετίζεται µε διανοητική καθυστέρηση .97

Εικόνα 1.5: Κρυσταλλική δοµή του ενζύµου 3MST. Η Ν-τελική περιοχή παρουσιάζεται σε µπλε χρώµα , η C-τελική περιοχή σε µωβ χρώµα και η συνδετική αλληλουχία των δυο περιοχών σε ροζ χρώµα . Απεικονίζονται επίσης ως κλαδιά , το δισουλφίδιο του καταλοίπου C248, το προϊόν της ενζυµικής αντίδρασης πυροσταφυλικό, καθώς και τα αµινοξικά κατάλοιπα του ενεργού κέντρου του ενζύµου . (PDB code: 3OLH).

1.3.3 Καταβολισµός του H 2S

Υπάρχουν διάφορες οδοί µε τις οποίες το H 2S µπορεί να καταβολιστεί . Ως αναγωγικός παράγοντας µπορεί εύκολα να αντιδράσει µε διάφορα οξειδωτικά , όπως - 98 - 99 - 100 υπεροξυνιτρώδες ( ΟΝΟΟ ), υποχλωριώδες (ClO ), ρίζες οξυγόνου ( Ο2 ) και 101 υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2). Επίσης αντιδρά µε το ΝΟ µε επακόλουθη 102,103 αδρανοποίησή του . Το H 2S αντιδρά µε τη µεθαιµοσφαιρίνη παράγοντας θειαιµοσφαιρίνη ,104 µε µέταλλα , αλλά και µε δισουλφίδια βιοµορίων ( π.χ. οξειδωµένη 105 γλουταθειόνη GSSG). Εναλλακτική πορεία καταβολισµού του H 2S, που συµβαίνει στο κυτταρόπλασµα , αποτελεί η µεθυλίωση από το ένζυµο S-µεθυλοτρανσφεράση

13

θειολών (thiol S-methyltransferase, TSMT) σε µεθανοθειόλη και στη συνέχεια 106 διµεθυλοσουλφίδιο . Άλλος τρόπος καταβολισµού του H2S, είναι µε οξείδωση στα

µιτοχόνδρια . To H2S αντιδρά µε την οξειδοαναγωγάση θείου -ουβικινόνης (sulfide:quinone oxidoreductase, SQR) ενός ενζύµου συζευγµένου µε το σύµπλοκο II 107 της αναπνευστικής αλυσίδας , σχηµατίζοντας δισουλφίδιο (SQRS-S). Στη συνέχεια , -2 -2 η µεταφορά του θείου σε ανιόν θειώδους (SO 3 ) σχηµατίζει θειοθειϊκό (S 2O3 ) και µέσω του ενζύµου ροδενάση , µεταφέται στη γλουταθειόνη GS Η σχηµατίζοντας την οξειδωµένη γλουταθειόνη GSSG. Ακολούθως , µέσω του ενζύµου διοξυγονάση -2 δισουλφιδίου (persulfide dioxygenase, ΕΤΗΕ 1) προκύπτει ανιόν θειώδους (SO 3 ) το -2 οποίο µετατρέπεται στο κύριο και σταθερό παράγωγο θειϊκό ανιόν (SO 4 ) µέσω του 108,109 ενζύµου οξειδάση του θειώδους (sulfite oxidase, SO). Το H2S αποµακρύνεται από τον οργανισµό είτε µέσω της εκπνοής ή µέσω των ούρων ως θειϊκό άλας –είτε ως ελεύθερο θειϊκό ιόν , είτε ως θειοθειϊκό – και στα κόπρανα ως ελεύθερο σουλφίδιο .6

1.4. Μηχανισµοί σηµατοδότησης που εκκινούνται από το H 2S.

Ένας από τους µηχανισµούς σηµατοδότησης του υδροθείου είναι η οµοιοπολική τροποποίηση των καταλοίπων κυστεΐνης στις πρωτεΐνες µέσω S-σουλφυδρυλίωσης . Μετατρέπει δηλαδή τις οξειδωµένες κυστεΐνες και τις θειόλες αυτών σε δισουλφίδια (–SSH), µεταβάλλοντας µε αυτό τον τρόπο τη λειτουργικότητα των πρωτεϊνών .110 Στις πρωτεΐνες που η δράση τους µεταβάλλεται µέσω S-σουλφυδρυλίωσης συγκαταλέγονται µεταξύ άλλων , η αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης , GAPDH, 111 η Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) 112 και η υποµονάδα p65 του µεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ .113 Με τον ίδιο τρόπο θεωρείται

ότι ενεργοποιεί και τα ιοντικά κανάλια καλίου που εξαρτώνται από το ATP (K ATP channels) οδηγώντας σε άνοιγµα των καναλιών και υπερπόλωση των λείων µυϊκών κυττάρων , η οποία οδηγεί σε αγγειοδιαστολή .82,114 Η S-σουλφυδρυλίωση της κυστεΐνης του ενεργού κέντρου της φωσφατάσης τυροσίνης ΡΤΡ 1Β αναστέλλει τη δραστικότητα της πρωτεΐνης µε αποτέλεσµα τη συσσώρευση της φωσφορυλιωµένης πρωτεϊνικής κινάσης PERK (protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase) και κατά συνέπεια την ενισχυµένη κυτταρική απόκριση στο στρες του ενδοπλασµατικού δικτύου .115

14

Εικόνα 1.6: Στόχοι σηµατοδότησης του H 2S.

Το υδρόθειο αναφέρεται ότι αλληλεπιδρά µε το ΝΟ σχηµατίζοντας µια S- νιτροσοθειόλη (HSNO), η οποία διαχέεται διαµέσου των µεµβρανών και µπορεί να απελευθερώσει ΝΟ +, ΝΟ -, ΝΟ • και ΗΝΟ . Τα µόρια αυτά στη συνέχεια δρουν έναντι διαφορετικών στόχων , ρυθµίζοντας έτσι διαφορετικές λειτουργίες .103,116 Ένας άλλος µηχανισµός σηµατοδότησης του υδροθείου αποτελεί η αλληλεπίδραση του µε τα µέταλλα των ενεργών κέντρων των πρωτεϊνών . Βάσει των στερεοηλεκτροχηµικών χαρακτηριστικών των ενεργών κέντρων των πρωτεϊνών , το υδρόθειο είτε ανάγει (πολικά κέντρα ) είτε συντονίζεται µε το µέταλλο ( µη πολικά κέντρα ). 117 Χαρακτηριστικά παραδείγµατα αποτελούν η µεθαιµοσφαιρίνη µέσω της οποίας καταβολίζεται το υδρόθειο ,104 αλλά και η οξειδάση του κυτοχρώµατος c, στην οποία ,

σε αυξηµένες συγκεντρώσεις , το υδρόθειο δεσµεύει την αίµη α3 και το Cu B στο διπολικό κέντρο µε αποτέλεσµα την αντιστρεπτή αναστολή του ενζύµου .118,119 Η ιδιότητά του ως αναγωγικό µόριο επηρεάζει συν τοις άλλοις τη λειτουργία των µιτοχονδρίων και την ενεργειακή οµοιόσταση των κυττάρων . Το υδρόθειο ενεργεί ως δότης ηλεκτρονίων στην αλυσίδα µεταφοράς ηλεκτρονίων µέσω της οξειδοαναγωγάσης SQR στο σύµπλοκο II της αναπνευστικής αλυσίδας των µιτοχονδρίων , επάγοντας µε τον τρόπο αυτό την παραγωγή ΑΤΡ .120

15

1.5 Βιολογικές δράσεις του H 2S

Οι βιολογικές δράσεις του υδροθείου που παράγεται ενδογενώς στον οργανισµό είναι πλειοτροπικές και πολυπαραγοντικές . Ρυθµίζει διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες αλλά εµπλέκεται και σε ποικίλες παθολογικές καταστάσεις . Η αναγνώριση του ρόλου του υδροθείου καθώς και η εξακρίβωση των µηχανισµών δράσης του , είναι αναγκαία για την κατανόηση της φυσιολογίας και παθολογίας του οργανισµού και για τη θεραπευτική αντιµετώπιση διαφόρων νόσων . Ένα χαρακτηριστικό του υδροθείου είναι η διττή , δοσο -εξαρτώµενη βιολογική δράση του , η οποία εξαρτάται από το ρυθµό παραγωγής /καταβολισµού του .

Πίνακας 1.1: Παραδείγµατα των «διφασικών » βιολογικών δράσεων του H2S. Σε χαµηλές συγκεντρώσεις οι δράσεις του είναι ωφέλιµες , ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις εµφανίζει δυσµενείς δράσεις .121

Χαµηλές συγκεντρώσεις H 2S Υψηλές συγκεντρώσεις H 2S

∆ιεγείρει τη µιτοχονδριακή αλυσίδα µεταφοράς Αναστέλλει την κυτταρική ∆ράσεις στην ενεργειακή ηλεκτρονίων , ενισχύει τις αναπνοή , την βιοενεργητική οµοιόσταση δράσεις της ενεργειακής κατάσταση και µειώνει τα οµοιόστασης και αυξάνει τα επίπεδα ΑΤΡ . επίπεδα ΑΤΡ .

Οξειδωτικές / Αντιοξειδωτικές δράσεις , Οξειδωτικές δράσεις , DNA αντιοξειδωτικές δράσεις αναγωγικός παράγοντας βλάβες , γονιδιοτοξικότητα

Φυσιολογική αγγειοδιαστολή , Τοξική αγγειοχάλαση ή Αγγειακές δράσεις επαγωγή της αγγειογένεσης αγγειοσύσπαση

Καταστολή έκφρασης Προφλεγµονώδεις δράσεις , Ρύθµιση φλεγµονής προφλεγµονωδών γονιδίων , ερεθίσµατα πόνου αντιφλεγµονώδεις δράσεις

Καταστολή κυτταρικής Προφύλαξη από οξειδωτικό Επίδραση στην κυτταρική βιωσιµότητας , επαγωγή στρες , βελτίωση κυτταρικής βιωσιµότητα κυτταρικής νέκρωσης ή/και βιωσιµότητας απόπτωσης

Στη συνέχεια παρατίθενται ενδεικτικά παραδείγµατα των βιολογικών δράσεων του υδροθείου στα διάφορα συστήµατα του οργανισµού .

16

1.5.1 Το H2S στο κεντρικό νευρικό σύστηµα

Η έκφραση του ενζύµου CBS και η παραγωγή υδροθείου στον εγκέφαλο παρατηρήθηκε το 1996 από τους Abe K και Kimura H. 122 Έχει αποδειχθεί ο ρόλος του στη νευροδιαµόρφωση και νευροπροστασία σε πληθώρα µελετών και ασθενειών όπως , η νόσος Parkinson, η νόσος Alzheimer, το σύνδροµο Down και η νόσος Huntington.123,124 Αναφέρεται ότι το υδρόθειο προστατεύει τους νευρώνες από το οξειδωτικό στρες µέσω της αναστολής της οξειδωτικής βλάβης που προκαλείται από το υποχλωριώδες οξύ , καθώς και από τη νίτρωση των πρωτεϊνών και την κυτταροτοξικότητα που µεσολαβείται από το υπεροξυνιτρώδες ανιόν (ΟΝΟΟ -), όπως έχει µελετηθεί σε κύτταρα από νευροβλάστωµα .125,126 Το υδρόθειο επάγει τη συµµετοχή του σηµατοδοτικού µονοπατιού cAMP/ ΡΚΑ και ενεργοποιεί τους NMDA υποδοχείς ρυθµίζοντας τις διαδικασίες που αφορούν τη µνήµη και τη µάθηση στον ιππόκαµπο .122,127 Ρυθµίζει επίσης την οµοιόσταση του ασβεστίου σε νευρώνες ,128 αστροκύτταρα ,129 µικρογλοία 130 και στον ιππόκαµπο 131 µε την ενεργοποίηση των εξαρτώµενων από το δυναµικό καναλιών ασβεστίου (VDCC). 132,133 Το υδρόθειο 134 αυξάνει την έκφραση των υποδοχέων GABA B και επιδρά στον εγκέφαλο ρυθµίζοντας τα επίπεδα της επινεφρίνης , νορεπινεφρίνης και σεροτονίνης .135,136,137 Η τοξικότητα που επιφέρει το γλουταµινικό στους νευρώνες µέσω της ελάττωσης των αντιοξειδωτικών GSH και GSSG ανατρέπεται από το υδρόθειο , το οποίο αυξάνει τα επίπεδα γλουταθειόνης και καταστέλλει το οξειδωτικό στρες στα µιτοχόνδρια .138,139 Επιπρόσθετα , το υδρόθειο αναστέλλει µέσω των κινασών p38-MAPK τη φλεγµονή στη µικρογλοία .140 Αναφέρεται επίσης ότι οι ασθενείς µε νόσο Alzheimer εµφανίζουν µειωµένα επίπεδα έκφρασης της S-αδενοσυλοµεθειονίνης (SAM), 141 αυξηµένα επίπεδα οµοκυστεΐνης στον ορό 142 και χαµηλά επίπεδα υδροθείου .143,144 Οι αντιφλεγµονώδεις και νευροπροστατευτικές αυτές επιδράσεις του υδροθείου προσφέρουν νέες προσεγγίσεις για τη θεραπεία των νευροεκφυλιστικών ασθενειών .

1.5.2 Το H 2S στο καρδιαγγειακό σύστηµα

Πολλές από τις µελέτες των τελευταίων δεκαετιών που αφορούν τη βιολογία του υδροθείου αναφέρουν το σηµαντικό ρόλο που παρουσιάζει στην καρδιά αλλά και στο

17

αγγειακό σύστηµα . Βέβαια οι επιδράσεις του εξαρτώνται από το είδος των κυττάρων και των ιστών , καθώς και από το πειραµατικό µοντέλο που µελετάται . Έχει αποδειχθεί πως η χορήγηση φυσιολογικών ή φαρµακολογικών δόσεων υδροθείου µειώνει τη βλάβη του µυοκαρδίου , προφυλάσσει τα αγγεία , περιορίζει τις φλεγµονές και ρυθµίζει τον αγγειακό τόνο . Στη βιβλιογραφία αναφέρονται αγγειοδιασταλτικές και αγγειοσυσταλτικές δράσεις του υδροθείου . Μύες που έχουν υποστεί αποσιώπηση του γονιδίου που εκφράζει το ένζυµο CSE και κατά συνέπεια έχουν ελαττωµένα επίπεδα υδροθείου , εµφανίζουν υπέρταση και µειωµένη ενδοθηλιακή αγγειοχάλαση .81 Εξωγενής χορήγηση υδροθείου προκαλεί δοσο -εξαρτώµενη χάλαση σε λεία µυϊκά κύτταρα σε διάφορους τύπους αγγείων , όπως η αορτή και η πυλαία φλέβα 145 αλλά και στη µεσεντέριο αρτηρία επίµυων , ρυθµίζοντας την πίεση του αίµατος .146 Εν αντιθέσει µε τα προηγούµενα , έχει αναφερθεί ότι το υδρόθειο προκαλεί συστολή σε τµήµατα αορτής , µε πιθανή συµµετοχή του ΝΟ .102 Οι αποκλίσεις στα ευρήµατα αυτά ενδεχοµένως να οφείλονται στη συγκέντρωση του υδροθείου , στο τµήµα των αγγείων , στα επίπεδα του οξυγόνου στον ιστό που µελετήθηκε , καθώς αναφέρεται πως σε χαµηλά ή αυξηµένα επίπεδα οξυγόνου το υδρόθειο επάγει αγγειοχάλαση ή αγγειοσύσπαση , αντίστοιχα .147 Η αθηροσκλήρωση προκαλείται από την προσκόλληση λευκοκυττάρων , τη δηµιουργία των αφρωδών µακροφάγων και την ενδοθηλιακή δυσλειτουργία . Το υδρόθειο εµφανίζει αντιφλεγµονώδεις ιδιότητες και προστατεύει τα αγγεία από την αθηροσκλήρωση αναστέλλοντας τα αθηρογενετικά πρόδροµα µόρια των µακροφάγων .148,149 Στην αγγειογένεση το υδρόθειο παρουσιάζει δραστικό ρόλο . Αναφέρεται πως επάγει τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων , µε συνέπεια είτε να ενισχύει την αγγειογένεση είτε να επάγει τη νεοαγγειογένεση .150 Συµµετέχει στο µονοπάτι του αυξητικού παράγοντα αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF) επάγοντας το σηµατοδοτικό µονοπάτι PI3K/Akt, αναστέλλοντας τη φωσφοδιεστεράση PDE5, µε αποτέλεσµα την επαγωγή της πρωτεϊνικής κινάσης G (PKG) και των κινασών Erk και p38. Επιπρόσθετα ενεργοποιεί τη διάνοιξη των ιοντικών καναλιών καλίου που εξαρτώνται από το ATP 80 (K ATP channels). Αποσιώπηση του γονιδίου που εκφράζει το ένζυµο CSE ή το 3MST, ή φαρµακολογική αναστολή της σύνθεσης υδροθείου , µειώνει το ρυθµό ανάπτυξης των ενδοθηλιακών κυττάρων .151,152,153 Αναφέρεται επίσης ότι αυξάνει τη δραστικότητα της ενδοθηλιακής συνθετάσης του ΝΟ (eNOS), επάγοντας το διµερισµό της και ανάγει τη διαλυτή γουανυλική κυκλάση , sGC, στη µορφή που αποκρίνεται στο ερέθισµα του ΝΟ .154,155 Επιπλέον των δράσεων στα αγγεία , το

18

υδρόθειο έχει φυσιολογική δράση και στην καρδιά . Η βιοσύνθεση του επάγει ενδογενείς µηχανισµούς που προστατεύουν το µυοκάρδιο από ισχαιµία και τις βλάβες που ακολουθούνται από την επαναιµάτωση .156 Εξωγενής χορήγηση υδροθείου προστατεύει την καρδιά και µειώνει το µέγεθος της ισχαιµικής ζώνης .157 Ένας πιθανός µηχανισµός περιλαµβάνει το σηµατοδοτικό µονοπάτι της φωσφολαµβάνης , cGMP/PKG/PLN. 158 Προσφέρει αντιοξειδωτική προστασία στο µυοκάρδιο 159 αλλά και γενικότερα στα αγγειακά κύτταρα , είτε από µόνο του είτε µε το να επάγει τη λειτουργία άλλων αντιοξειδωτικών µηχανισµών (GSH, Nrf2). 160,161

1.5.3 H 2S και καρκίνος

Παρ ’όλη την εκτεταµένη έρευνα σχετικά µε τους αέριους διαβιβαστές (NO, CO, H2S) στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, τα ευρήµατα που προκύπτουν είναι αντιφατικά . Ειδικότερα για το υδρόθειο , ένα εµπόδιο για την κατανόηση του ρόλου του στον καρκίνο είναι οι µελέτες µε αντίθετα αποτελέσµατα όπου φαίνεται η διττή δράση του είτε ως προκαρκινικός ή ως αντικαρκινικός παράγοντας . Πρόσφατες µελέτες σε διάφορα είδη καρκίνου περιγράφουν το διφασικό φαρµακολογικό χαρακτήρα του υδροθείου . Είναι φανερό ότι οι δράσεις του εξαρτώνται από τη 162 συγκέντρωση του . Όπως προαναφέρθηκε , το υδρόθειο επιδρά στους K ATP ιοντικούς διαύλους 6 και στα cGMP/P ΚG, PI3K/Akt,80 p38-MAPK 163 και Nrf2 µονοπάτια 164 . Ειδικότερα σε χαµηλές συγκεντρώσεις το υδρόθειο τείνει να έχει κυτταροπροστατευτικές , αντιοξειδωτικές και αντιφλεγµονώδεις αποκρίσεις ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις επάγει προφλεγµονώδεις αποκρίσεις και µπορεί να οδηγήσει στον κυτταρικό θάνατο .121 Αναφέρεται ότι σε κύτταρα καρκίνου του κόλου ,53 των ωοθηκών ,58 του προστάτη 165 και του µαστού 59 υπερεκφράζεται το ένζυµο CBS -και ως εκ τούτου παράγονται αυξηµένα επίπεδα υδροθείου - σε σύγκριση µε τους αντίστοιχους µη καρκινικούς ιστούς . Ο ρόλος του CBS στον πολλαπλασιασµό , µετανάστευση και διάχυση του καρκίνου , έχει µελετηθεί µε in vitro προσεγγίσεις , είτε µε γονιδιακή αποσιώπηση των ενζύµων είτε µε φαρµακολογικά εργαλεία ( αναστολείς ενζύµων ). Βρέθηκε ότι , η αναστολή παραγωγής του , µέσω ( εν µέρει ) αναστολής του CBS έχει ως αποτέλεσµα τον περιορισµό της ανάπτυξης του καρκίνου λόγω αναστολής της κυτταρικής αναπνοής και γλυκόλυσης , καθώς και απορρυθµίζοντας

19

την απόπτωση µέσω των NF-κB και p53 µονοπατιών .53,58,59,165 Ένα άλλο αποτέλεσµα της αναστολής του CBS στον καρκίνο , είναι η αύξηση των ελεύθερων ριζών οξυγόνου (ROS), 58 µηχανισµός ο οποίος ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα ώστε να φαγοκυτταρωθούν από τα µακροφάγα όπως έδειξε in vitro µελέτη µε καρκινικά κύτταρα του µαστού .59 Σε in vivo µοντέλα µυών µε ξενοµοσχεύµατα καρκίνου του κόλου και των ωοθηκών , στα οποία προηγουµένως έγινε αποσιώπηση του γονιδίου του ενζύµου CBS, παρατηρήθηκε αξιοσηµείωτη µείωση (40-50%) του αριθµού των καρκινικών λοβών µε χαρακτηριστική µείωση της αγγειογένεσης του όγκου .53,59,59,165 Αυτό το φαινόµενο παρατηρήθηκε και µε τη χρήση του αναστολέα ΑΟΑΑ ,53 η οποία προκάλεσε επίσης την ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων µε την ταυτόχρονη χορήγηση χηµειοθεραπείας .58,166 Είναι ενδιαφέρον ότι , σε ένα µοντέλο γλοιώµατος η αναστολή του CBS είχε ως αποτέλεσµα την ενίσχυση της ανάπτυξης του όγκου .167 Αυτά τα ερευνητικά αποτελέσµατα απεικονίζουν τη διαφορά στο ρόλο του υδροθείου που φαίνεται να εξαρτάται από το είδος του όγκου που µελετάται . Η βιβλιογραφία σχετικά µε τον ρόλο του CSE και του 3MST είναι περιορισµένη σε σχέση µε το CBS. Αναφέρεται ότι αυξηµένη έκφραση του CSE εµφανίζεται σε διάφορους καρκίνους όπως , µελάνωµα , καρκίνο του προστάτη και των πνευµόνων , ενώ υπερέκφραση του 3MST έχει αναφερθεί σε αστροκύττωµα και µελάνωµα .73,168,169,170,171,172 Όπως αναφέρεται , γονιδιακή αποσιώπηση του CSE ανέστειλε τον πολλαπλασιασµό των καρκινικών κυττάρων σε in vitro και in vivo µοντέλο καρκίνου κόλου ,173 ενώ σε άλλη µελέτη η αναστολή του CSE ή γονιδιακή αποσιώπηση δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασµό των καρκινικών κυττάρων µελανώµατος .169 Μια προτεινόµενη θεραπευτική προσέγγιση , σε όγκους των οποίων η ανάπτυξη καταστέλλεται από το υδρόθειο , αποτελεί η χρήση δοτών υδροθείου . Μέχρι σήµερα έχουν µελετηθεί οι δότες GYY4137, 174,175,176 S-προπαργυλο - κυστεΐνη ,177 διάφορα ΜΣΑΦ συζευγµένα µε οµάδα απελευθέρωσης υδροθείου ,178,179,180 καθώς και τα φυσικά πολυσουλφίδια που προέρχονται από το σκόρδο ( διάλλυλο δισουλφίδιο , DADS και διάλλυλο τρισουλφίδιο , DATS). 181,182 Σε µελέτη µε ανοσοκατεσταλµένους µύες (SCID mice), η χορήγηση του GYY4137 προκάλεσε εξασθένηση της ανάπτυξης του υποδόριου όγκου .175 Σε άλλο in vivo µοντέλο ηπατικού καρκινώµατος παρατηρήθηκε σαφής αντικαρκινική δράση του δότη GYY4137. 183 Οι δότες που προέρχονται από φυσικά προϊόντα , όπως DADS ή DATS, αναφέρεται ότι προκαλούν περιορισµό των καρκινικών όγκων σε in vivo

20

µοντέλα όπως , γλοιοβλάστωµα ,184 µελάνωµα , καρκίνο του στοµάχου , οστεοσάρκωµα , αδενοκαρκίνωµα πνευµόνων 185 και καρκίνο του κόλου .186,187

1.5.4 H 2S και µεταβολισµός

Η παχυσαρκία και ο διαβήτης είναι παθολογικές καταστάσεις στις οποίες είναι διαταραγµένη η οµοιόσταση του µεταβολισµού . Έχει αποδειχθεί ότι το υδρόθειο επηρεάζει το µεταβολισµό της γλυκόζης , αλλάζοντας την έκκριση της ινσουλίνης . Συγκεκριµένα , αναφέρεται ότι η εξωγενής χορήγηση υδροθείου , αναστέλλει την επαγόµενη από υψηλή γλυκόζη έκκριση της ινσουλίνης , αλλά και η υπερέκφραση ή αποσιώπηση του γονιδίου CSE έχουν ως αποτέλεσµα την αναστολή και την επαγωγή της έκκρισης ινσουλίνης αντίστοιχα .188 Αυτό αποτελεί µια µόνο ένδειξη , από τις πολλές που υπάρχουν , για την σχέση του υδροθείου µε την παθολογική κατάσταση του διαβήτη . Μια πολύ ισχυρή συσχέτιση γίνεται µε τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του CSE, και κατ ’ επέκταση των επιπέδων του υδροθείου στο πάγκρεας των Zucker διαβητικών /παχύσαρκων επίµυων , ένα ζωικό πρότυπο µελέτης του σακχαρώδους διαβήτη τύπου 2. 189 Τα επίπεδα των CSE και υδροθείου φαίνεται να αποτελούν έναν µηχανισµό ελέγχου της επαγόµενης από γλυκόζη έκκρισης της ινσουλίνης , αφού υψηλά επίπεδα γλυκόζης µειώνουν τα επίπεδα έκφρασης του CSE και την παραγωγή του υδροθείου σε INS-1E κύτταρα .190 Έχει παρατηρηθεί σε πειραµατικά µοντέλα υπεργλυκαιµίας και διαβήτη , αλλά και σε διαβητικούς ασθενείς , ότι τα επίπεδα υδροθείου στην κυκλοφορία είναι µειωµένα 191,192,193 και η µείωση των επιπέδων

CSE/H 2S οδηγεί σε αυξηµένα επίπεδα ROS και κατά συνέπεια σε ενδοθηλιακή δυσλειτουργία .194 Αναφέρεται επίσης ότι η υπεργλυκαιµία επηρεάζει και το µονοπάτι

3ΜSΤ/H 2S στο αγγειακό σύστηµα , ένα φαινόµενο που ανατρέπεται από το αντιοξειδωτικό λιποΐκό οξύ .195 Ο διαβήτης , αλλά και η παχυσαρκία , έχουν σχετιστεί επίσης µε µειωµένα , αντίστοιχα και αυξηµένα , επίπεδα κυστεΐνης στο πλάσµα .196,197 Ο λιπώδης ιστός συνθέτει υδρόθειο µέσω των ενζύµων CSE/C ΒS. Έχει αποδειχθεί πως το υδρόθειο έχει αρνητική επίδραση στην επαγόµενη από ινσουλίνη πρόσληψη γλυκόζης στα λιποκύτταρα .198 Αντιφατικά αποτελέσµατα παρουσιάζονται από άλλες ερευνητικές οµάδες , οι οποίες αναφέρουν το θετικό ρόλο του υδροθείου στην επαγόµενη από βιταµίνη D µετατόπισης του GLUT4 και την πρόσληψη γλυκόζης στα

21

λιποκύτταρα .199 Όσον αφορά στη λιπόλυση , το υδρόθειο φαίνεται να έχει αντι - λιπολυτική δράση , εφόσον σε µελέτες όπου χορηγήθηκε ο δότης υδροθείου GYY4137 σε λιποκύτταρα 3T3-L1 αυξήθηκε ο σχηµατισµός σταγονιδίων λίπους και ανεστάλη η λιπόλυση .200 Σε άλλη µελέτη αντίστοιχα , εξωγενής χορήγηση του GYY4137 σε µύες µείωσε τη λιπόλυση , αν και δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην παχυσαρκία .201 Παρ ’όλο που , όπως αναφέρεται , το υδρόθειο εµπλέκεται στην παχυσαρκία και τις µεταβολικές νόσους , χρειάζονται περαιτέρω έρευνες για να ξεκαθαρίσουν τον ακριβή του ρόλο στο πεδίο αυτό .

1.5.5 H 2S και οξειδωτικό στρες

Το οξειδωτικό στρες σχετίζεται µε ποικίλες νόσους , όπως διάφορες νευροεκφυλιστικές , καρδιαγγειακές , τον καρκίνο αλλά και τη γήρανση . Όταν η παραγωγή των ROS ξεπερνά τα φυσιολογικά όρια , επάγονται µηχανισµοί για την εξισορρόπηση των ενδοκυττάριων επιπέδων . Στους µηχανισµούς αυτούς ανήκει , µεταξύ άλλων , το υδρόθειο το οποίο ως αναγωγικό µόριο έχει την ικανότητα να αντιδρά απευθείας µε τις ROS. 202,203 Η αντιοξειδωτική δράση του υδροθείου ωστόσο καλύπτει περαιτέρω µηχανισµούς πέραν της αναγωγικής του ικανότητας . Υπάρχουν πολλές µελέτες στη βιβλιογραφία που αναφέρουν πως το υδρόθειο επάγει την παραγωγή των αντιοξειδωτικών GSH και Trx1. 202 Επίσης , επάγει τις υποµονάδες της λιγάσης της γλουταµικής κυστεΐνης (glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, GCLC και glutamate-cysteine ligase modifier subunit, GCLM).204 Ένας πιθανός µηχανισµός αποτελεί η ενεργοποίηση του µεταγραφικού παράγοντα Nrf2 µέσω της S- σουλφυδρυλίωσης της Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1). 112,205 Αναφέρεται ακόµα πως το υδρόθειο επάγει την έκφραση αλλά αυξάνει και τη δραστικότητα των αντιοξειδωτικών ενζύµων όπως , η δισµουτάση του υπεροξειδίου , SOD, η καταλάση , CAT και η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης , GPx, µέσω των µεταγραφικών παραγόντων Nrf2 και NF-κΒ .202 Τέλος , το υδρόθειο αναστέλλει την παραγωγή των ROS από τα µιτοχόνδρια . Ο µηχανισµός δράσης αφορά στο σηµατοδοτικό µονοπάτι της πρωτεΐνης p66Shc µέσω της S-σουλφυδρυλίωσης στο κατάλοιπο C59. 206

22

Εικόνα 1.7: Επίδραση του υδροθείου στην ενδοκυττάρια παραγωγή , ενζυµικών και µη , αντιοξειδωτικών παραγόντων , καθώς και στην παραγωγή ROS από τα µιτοχόνδρια .

1.6 Φαρµακολογία του H 2S

Η ικανότητα της ρύθµισης των κυτταρικών επιπέδων υδροθείου αποτελεί τη βάση για τη διερεύνηση των βιολογικών δράσεων του . Η ρύθµιση της ενδογενούς βιοδιαθεσιµότητας του υδροθείου επιτυγχάνεται µε εκλεκτική γονιδιακή αποσιώπηση ή φαρµακολογικά µε χορήγηση εκλεκτικών αναστολέων των ένζυµων βιοσύνθεσης υδροθείου . Επίσης µπορεί να γίνει εξωγενής χορήγηση κάποιου δότη που να απελευθερώνει υδρόθειο ή χορήγηση υποστρώµατος των ενζύµων βιοσύνθεσης υδροθείου .207

• Αναστολείς ενζύµων

Μικρά µόρια αναστολείς των ενζύµων βιοσύνθεσης υδροθείου χρησιµοποιούνται ευρέως σε µελέτες που χρησιµοποιούν αποµονωµένα ένζυµα ή κυτταρικά συστήµατα . Σηµαντική προσπάθεια γίνεται ώστε να ανακαλυφθούν ή να σχεδιαστούν νέοι δραστικοί αναστολείς για τα ένζυµα βιοσύνθεσης υδροθείου , αν και ακόµα παραµένει πρόκληση η ταυτοποίηση ισχυρών αναστολέων µε εκλεκτικότητα έναντι των ενζύµων . Αναστολείς που χρησιµοποιούνται ευρέως για το ένζυµο CSE είναι η L-

προπαργυλογλυκίνη (L-propargylglycine, PAG) µε IC 50 : 40 µΜ και η β-κυανο -L- 208 αλανίνη ( β-cyano-L-alanine, BCA) µε IC 50 : 14 µΜ . Οι αναστολείς αυτοί έχουν περιορισµένη διαπερατότητα από τις βιολογικές µεµβράνες και για το λόγο αυτό χρησιµοποιούνται µεγαλύτερες συγκεντρώσεις προκειµένου να µελετηθούν οι

23

δράσεις του ενδογενούς υδροθείου .27 Οι αναστολείς αυτοί παρεµποδίζουν την πρόσδεση και τη λειτουργία του συνενζύµου PLP. Είναι εκλεκτικοί ως προς τα άλλα ένζυµα βιοσύνθεσης υδροθείου , παρόλα αυτά αναστέλλουν και άλλα ένζυµα των οποίων η ενεργότητα εξαρτάται από το συνένζυµο PLP. 10 Ο PAG είναι µη αντιστρέψιµος αναστολέας για το CSE αλλά επηρεάζει επίσης µεταβολικά ενζύµα , όπως οι τρανσαµινάσες 209 και µεταβολίζεται σε µια νεφροτοξική ένωση προκαλώντας πρωτεϊνουρία και γλυκοζουρία .210 Ο BCA είναι αναστρέψιµος αναστολέας 211 και έχει νευροτοξικές ιδιότητες .212 Η τριφθοροαλανίνη (trifluoroalanine) έχει επίσης χρησιµοποιηθεί για την αναστολή του CSE, δεν είναι όµως εκλεκτική εφόσον αναστέλλει και άλλα ένζυµα που εξαρτώνται από το PLP, ανάµεσά τους και το CΒS. 208,213 Επί σειρά ετών θεωρούταν ότι το αµινοξυοξικό οξύ (aminooxyacetic acid, ΑΟΑΑ ) είναι εκλεκτικός αναστολέας του C ΒS έναντι του CSE, παρόλο που η δράση του ανταγωνίζεται το συνένζυµο PLP. Μάλιστα στις συγκεντρώσεις που χρησιµοποιείτο ( τάξεως mM) αναφέρεται ότι ανέστειλε τις αντιδράσεις τρανσαµίνωσης , την οξειδωτική φωσφορυλίωση , τη µεταφορά των αµινοξέων αλλά και την πρωτεϊνοσύνθεση .85 Ωστόσο πρόσφατη µελέτη απέδειξε πως ο ΑΟΑΑ αναστέλλει και το ένζυµο CSE. Μάλιστα είναι πιο δραστικός αναστολέας για το CSE 208 (IC 50 : 1,1 µΜ ) έναντι του C ΒS (IC 50 : 8,5 µΜ ). Η υδροξυλαµίνη είναι µια ένωση που χρησιµοποιείται ως C ΒS αναστολέας , παρόλο που αναστέλλει και το CSE, 208 η οποία απελευθερώνει •ΝΟ . Εποµένως η χρήση της ως αναστολέας της σύνθεσης υδροθείου περιορίζεται δεδοµένων των παράπλευρων αυτών δράσεων της .85

Εικόνα 1.8: ∆οµές των αναστολέων των ενζύµων CSE και C ΒS

Για αναστολή της σύνθεσης του υδροθείου από το ένζυµο 3MST δεν υπάρχουν κάποιοι διαθέσιµοι αναστολείς . Το πυροσταφυλικό οξύ ή κάποια παράγωγα αυτού έχουν χρησιµοποιηθεί σε µεγάλες συγκεντρώσεις , παρουσιάζοντας τοξικότητα και καµία εκλεκτικότητα .85

24

Συνεπώς είναι δύσκολο να γίνει η κατάλληλη έρευνα γύρω από το υδρόθειο µε φαρµακολογικά εργαλεία µόνο , εφόσον δεν χρησιµοποιούνται ισχυροί και εκλεκτικοί αναστολείς για το κάθε ένζυµο ξεχωριστά . Εποµένως για την αξιοπιστία των ερευνητικών συµπερασµάτων είναι απαραίτητη η χρήση γενετικών και µοριακών µεθόδων σε συνδυασµό µε τις φαρµακολογικές προσεγγίσεις .

• ∆ότες υδροθείου

Συµπληρωµατική µέθοδος στη ρύθµιση των κυτταρικών επιπέδων υδροθείου είναι η εξωγενής χορήγηση ενώσεων που απελευθερώνουν υδρόθειο . ∆ότες που χρησιµοποιούνται στη βασική έρευνα είναι αυτοί που απελευθερώνουν απευθείας υδρόθειο όταν διαλυθούν , αλλά και τα υποστρώµατα της ενζυµικής βιοσύνθεσης του υδροθείου (κυστεΐνη , ανάλογα κυστεΐνης ). Επίσης υπάρχουν και κάποια υποψήφια φάρµακα που έχουν προκύψει µετά από σύζευξη διαθέσιµων φαρµάκων µε µια οµάδα που απελευθερώνει υδρόθειο . Το υδροσουλφίδιο του νατρίου (NaHS) είναι ο συνηθέστερος δότης που

χρησιµοποιείται , όπως και το σουλφίδιο του νατρίου , Na 2S, τα οποία έχουν δείξει θεραπευτικά αποτελέσµατα σε πολλές προκλινικές µελέτες . Το µειονέκτηµα των ανόργανων αυτών ενώσεων είναι ότι απελευθερώνουν γρήγορα µεγάλες ποσότητες υδροθείου και η δράση τους δεν έχει διάρκεια , γεγονός που δεν προσοµοιάζει την αργή , συνεχόµενη , ενζυµατική ενδογενή παραγωγή υδροθείου . Επιπλέον η απότοµη απελευθέρωση του υδροθείου µπορεί να οδηγήσει σε τοξικές αποκρίσεις .10,214 Για να αντιµετωπίσουν τα προαναφερθέντα µειονεκτήµατα οι ερευνητές , προσπάθησαν να συνθέσουν ουσίες που να απελευθερώνουν υδρόθειο σταδιακά ώστε τα επίπεδα που εκλύονται να µιµούνται την ενδογενή παραγωγή . Μία από τις ευρέως χρησιµοποιούµενες και εµπορικά διαθέσιµες ενώσεις είναι το GYY4137 (phosphinodithioate-morpholinium salt), καθώς και νέα αντίστοιχα παράγωγα του αντιδραστηρίου Lawesson’s (Phosphordithioates, 2,3-Dihydro-2-phenyl-2- sulfanylenebenzo[ d][1,3,2]oxazaphospholes), οι οποίες ενώσεις υδρολύονται και απελευθερώνουν υδρόθειο µε αργό ρυθµό .215,216 Άλλες οργανικές ενώσεις που απελευθερώνουν υδρόθειο είναι τα θειοαµινοξέα θειοβαλίνη και θειογλυκίνη ,217 το 4CPI (4-carboxy phenyl-isothiocyanate) 218 και δότες που ενεργοποιούνται από την πυρηνόφιλη αντίδραση µε τις ενδογενείς θειόλες (κυστεΐνη , γλουταθειόνη ).219,220,221 Ο σχεδιασµός των τελευταίων εµπνεύστηκε από τα οργανικά πολυσουλφίδια , διάλλυλο δισουλφίδιο και διάλλυλο τρισουλφίδιο (diallyl disulfide/DADS,

25 diallyltrisulfide/DATS), που προέρχονται από το σκόρδο και ενεργούν ως δότες υδροθείου όταν αντιδρούν µε βιολογικές θειόλες , όπως η γλουταθειόνη .222 Επίσης , η S-αλλυλοκυστεΐνη προέρχεται από το σκόρδο και χρησιµεύει ως υπόστρωµα για τα ένζυµα CBS/CSE για ενδογενή σύνθεση υδροθείου .223 Αντίστοιχα , λειτουργούν και τα ανάλογα κυστεΐνης , Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC), S-προπυλοκυστεΐνη (SPC) και S- προπαργυλοκυστεΐνη (SPRC), των οποίων η ικανότητα παραγωγής υδροθείου εξαρτάται από τα ένζυµα .224,225 Έχουν σχεδιαστεί υβριδικές ενώσεις συζευγµένες µε τµήµατα που αποδεσµεύουν υδρόθειο (dithiolethione-OH, ADT-OH ή thiobenzamide, TBZ), όπως η ένωση AP-39 (10-oxo-10-(4-(3-thioxo-3H-1,2-dithiol-5- yl)phenoxy)decyl) triphenylphosphonium bromide) η οποία προκύπτει από τη σύνδεση µε αλειφατικό δεσµό του ADT-OH µε την ένωση triphenylphosphonium (TPP+), η οποία στοχεύει και διαπερνά τα µιτοχόνδρια .226,227 Επίσης , πολλά από τα εµπορικώς διαθέσιµα φάρµακα έχουν συνδεθεί µε τµήµατα που αποδεσµεύουν υδρόθειο (dithiolethione-OH, ADT-OH ή thiobenzamide, TBZ), τα οποία εµφανίζουν βελτιωµένη δραστικότητα και µειωµένη τοξικότητα σε σχέση µε τα πρόδροµα φάρµακα .228,229 Τα περισσότερα είναι τροποποιηµένα ανάλογα µη στεροειδών αντιφλεγµονωδών φαρµάκων (S-ΜΣΑΦ ) όπως S-ασπιρίνη (ACS14), S-δικλοφαινάκη (ACS15, ATB-337) και S-ναπροξένη (ATB346), αλλά έχουν σχεδιαστεί ανάλογες υβριδικές ενώσεις και άλλων φαρµάκων , όπως η S-λατανοπρόστη , S-µεσαλαµίνη , S- λεβοντόπα , S-σιλδεναφίλη και S-παράγωγα του νικοτινικού οξέος .228,230,231 Κάποιες από αυτές τις ενώσεις βρίσκονται σε προκλινικές µελέτες και πολλές παρουσιάζουν καλύτερες δράσεις σε σχέση µε το αρχικό φάρµακο . Το σηµαντικό πλεονέκτηµα είναι ότι το υδρόθειο που απελευθερώνεται µειώνει τις παρενέργειες που εµφανίζουν τα συνήθη αντιφλεγµονώδη φάρµακα στο γαστρεντερικό σύστηµα .232 Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι τα υβριδικά S-ΜΣΑΦ χρησιµεύουν και ως αντικαρκινικοί παράγοντες σε κάποια µοντέλα που µελετήθηκαν .233,234 Ένα άλλο φάρµακο που κυκλοφορεί στην αγορά , η ζοφενοπρίλη , ένας αναστολέας του µετατρεπτικού ενζύµου αγγειοτενσίνης Ι, αναφέρεται πως έχει επιπλέον δράσεις ως δότης υδροθείου . Η ζοφενοπρίλη (zofenopril) στους ιστούς µετατρέπεται στο δραστικό παράγωγο zofenoprilat που περιέχει µια θειόλη , η οποία ευθύνεται για τις ωφέλιµες δράσεις του στις αγγειακές λειτουργίες .235 Οι ενώσεις αυτές χρησιµεύουν για τη θεραπευτική αντιµετώπιση ασθενειών και δεν είναι οι ιδανικές ενώσεις για τη µελέτη και έρευνα των δράσεων του υδροθείου στα βιολογικά συστήµατα , εφόσον είναι πολυλειτουργικές ενώσεις .

26

Εικόνα 1.9: ∆οµές των ευρέως χρησιµοποιούµενων δοτών υδροθείου .

27

1.7 Τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισµού

Για την επιτυχή αξιολόγηση και ρύθµιση της ενδογενούς βιοδιαθεσιµότητας του υδροθείου στη βασική έρευνα , είναι απαραίτητη η ανίχνευση και ο ακριβής προσδιορισµός του . Είναι αναγκαίο να υπάρχουν µέθοδοι που να επιτρέπουν στους ερευνητές να προσδιορίζουν τη συγκέντρωση του υδροθείου στους ιστούς αλλά και στα κυτταρικά συστήµατα , για την αξιολόγηση των πειραµάτων και των αποτελεσµάτων . Η αξιολόγηση αυτή στη συνέχεια θα αποτελέσει οδηγό για τις σωστές φαρµακολογικές και θεραπευτικές προσεγγίσεις (αναστολείς , δότες ). Παράγοντες όπως η εύκολη εφαρµογή , η ευαισθησία αλλά και η αναπαραγωγή των πειραµατικών µεθόδων προσδιορισµού καθορίζουν την αξιοποίηση τους από τους ερευνητές . Έχουν αναπτυχθεί διάφορες µέθοδοι προσδιορισµού του υδροθείου , µεταξύ των οποίων φασµατοφωτοµετρικές , φθορισµοµετρικές , χηµειοφθορισµικές , χρωµατογραφικές και πολαρογραφικές προσεγγίσεις καθώς και µέθοδοι βασιζόµενοι στη χρήση ηλεκτροδίων ανίχνευσης ανιόντων υδροθείου .225 Η γρήγορη οξείδωση και αποµάκρυνση του αερίου από τα βιολογικά συστήµατα είναι η µεγαλύτερη πρόκληση για τον ακριβή και γρήγορο προσδιορισµό του . Επίσης πολλές από τις µεθόδους , πέραν του ελεύθερου ανιόντος υδροθείου , µετρούν και τις ενδοκυττάριες αποθήκες θείου ή/και τις θειόλες , των οποίων η απελευθέρωση εξαρτάται από τις όξινες ή βασικές συνθήκες της εκάστοτε χρησιµοποιούµενης µεθόδου .236 Μια εναλλακτική προσέγγιση είναι ο προσδιορισµός των µεταβολιτών του υδροθείου (θειΐκό , θειοθειΐκό ) ως δείκτες που αντανακλούν τα επίπεδα του υδροθείου . Ωστόσο αυτή η προσέγγιση προσδιορισµού δεν χρησιµοποιείται προς το παρόν εφόσον δεν έχει αξιολογηθεί ως ακριβής µέθοδος .6 Η τεχνική που είναι ευρέως διαδεδοµένη και χρησιµοποιείται συχνότερα από τους ερευνητές είναι η µέθοδος προσδιορισµού που αναφέρεται ως «του κυανού του µεθυλενίου » (methylene blue assay). Πρόκειται για µια φασµατοφωτοµετρική αναλυτική µέθοδο , όπου η βασική της αρχή στηρίζεται στην αντίδραση του υδροθείου µε το αντιδραστήριο Ν,Ν-διµεθυλο -p-φαινυλοδιαµίνη , παρουσία ενός οξειδωτικού παράγοντα για το σχηµατισµό της χρωστικής κυανού του µεθυλενίου . Η χρωστική απορροφά σε µήκος κύµατος 650-670nm. 237 Η µέθοδος αυτή µπορεί να χρησιµοποιηθεί για να υπολογίσει τη συγκέντρωση του υδροθείου σε ιστούς , κύτταρα , πλάσµα , αλλά και σε ελεύθερα από κύτταρα συστήµατα . Στα µειονεκτήµατα

28

της µεθόδου περιλαµβάνεται το υψηλό όριο ανίχνευσης (>1 µΜ ), η αλληλεπίδραση µε έγχρωµες ενώσεις και το γεγονός ότι βάσει των ιδιαίτερα όξινων συνθηκών της αντίδρασης απελευθερώνεται και προσδιορίζεται επιπλέον το δεσµευµένο υδρόθειο .238 Για τον προσδιορισµό του υδροθείου χρησιµοποιούνται επίσης ηλεκτροχηµικές µέθοδοι . Αυτές έχουν το πλεονέκτηµα ότι ο υπολογισµός γίνεται σε πραγµατικό χρόνο , οπότε µπορεί να µελετηθεί και η σχέση χρόνου -συγκέντρωσης ταυτόχρονα . Μια από αυτές τις τεχνικές περιλαµβάνει τη χρήση ειδικών ηλεκτροδίων για σουλφίδια , τα οποία έχουν γραµµική απόκριση σε συγκεντρώσεις εύρους 10 µΜ -0,1 Μ και όριο ανίχνευσης 1-10 µΜ . Βασικό µειονέκτηµα είναι ότι τα ηλεκτρόδια αυτά µετράνε τα ιόντα S 2-, οπότε χρειάζονται αλκαλικές συνθήκες και για το λόγο αυτό µετράνε και τα σουλφίδια από την αποθείωση των πρωτεϊνών . Επίσης , οι µετρήσεις επηρεάζονται από τυχόν προσµίξεις του διαλύµατος ή/και άλλα ιόντα που αλληλεπιδρούν µε το ηλεκτρόδιο .239 Άλλη ηλεκτροχηµική τεχνική εφαρµόζεται µε πολαρογραφική προσέγγιση . Στη µέθοδο αυτή γίνεται χρήση ειδικού βολτάµετρου που περιλαµβάνει µια άνοδο , µια κάθοδο και µια διαπερατή µεµβράνη που επιτρέπει - 2- την µετακίνηση και την απευθείας µέτρηση του αερίου (H 2S, HS , S ) από τα βιολογικά συστήµατα ( κύτταρα , ιστούς , όργανα ) χωρίς τροποποίηση του δείγµατος και σε πραγµατικό χρόνο . Η εφαρµογή αυτή έχει υψηλή ευαισθησία και γρήγορη απόκριση στον προσδιορισµό του αερίου , στο εύρος συγκεντρώσεων της τάξεως nM.147,240,241 Η ανίχνευση του υδροθείου επιτυγχάνεται επίσης µε τις τεχνικές της χρωµατογραφίας . Συγκεκριµένα έχουν χρησιµοποιηθεί η υγρή χρωµατογραφία , µε ή χωρίς παραγοντοποίηση , η χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής και η αέρια χρωµατογραφία . H αέρια χρωµατογραφία έχει εφαρµοστεί επίσης σε συνδυασµό µε φασµατοµετρία µάζας .242 H υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) είναι επίσης κατάλληλη για την ανάλυση σουλφιδίων , εφόσον τα τελευταία µετατραπούν σε κυανό του µεθυλενίου ή θειονίνη .236 Μια νέα και ευαίσθητη µέθοδος προσδιορισµού των φυσιολογικών επιπέδων υδροθείου από το πλάσµα , το κυτταρόλυµα και οµογενοποίηµα ιστού αποτελεί ο συνδυασµός φθορισµού µε την υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης και ανάστροφης φάσης (RP-HPLC). Σε αυτή τη µέθοδο το υδρόθειο αντιδρά µε την ένωση mBB (monobromobimane) παράγοντας τη φθορίζουσα ένωση SdB (sulfide dibimane). Ωστόσο , το γεγονός ότι η ένωση mBB δεν αντιδρά µόνο µε τα ιόντα υδροθείου , αλλά και µε θειόλες , τα φθορίζοντα

29

παράγωγα διαχωρίζονται µε την RP-HPLC. Πλεονέκτηµα της µεθόδου είναι το όριο ανίχνευσης (2n Μ), ο διαχωρισµός του ελεύθερου υδροθείου από τις ενδοκυττάριες πηγές δεσµευµένου θείου (acid-labile, sulfane sulfur pool), καθώς και ο προσδιορισµός των πολυσουλφιδίων .243,244,245 Τα τελευταία έτη αναπτύχθηκε πληθώρα βελτιωµένων ανιχνευτών που φθορίζουν µετά την αντίδρασή τους µε υδρόθειο . Η στρατηγική της σύνθεσης του εκάστοτε ανιχνευτή εξαρτάται από τον τρόπο µε τον οποίο θα αντιδράσει µε το υδρόθειο . Οι αντιδράσεις αυτές βασίζονται στις ιδιότητες του υδροθείου είτε ως αναγωγικό µέσο , είτε ως νουκλεόφιλο µόριο είτε στην ιδιότητα να αντιδρά µε µέταλλα .246,247,248 Ένα βασικό µειονέκτηµα των ανιχνευτών είναι η αδυναµία τους να προσδιορίζουν τα ενδογενή επίπεδα υδροθείου στα βιολογικά συστήµατα ( κύτταρα , πλάσµα , οµογενοποιήµατα ιστών ή κυττάρων ). Επίσης , η µέθοδος ανίχνευσης είναι µη αναστρέψιµη µε αποτέλεσµα να προσδιορίζεται η συσσώρευση των ανιχνευτών που ενεργοποιήθηκαν από το υδρόθειο παρά η ενδογενής παραγωγή του στον πραγµατικό χρόνο . Από τους εµπορικά διαθέσιµους ανιχνευτές που βρίσκουν εφαρµογή από τους ερευνητές είναι η 7-αζιδο -4-µεθυλοκουµαρίνη (7-azido-4-methylcoumarin, AzMC). Η αρχή της αντίδρασης βασίζεται στην αναγωγή της ένωσης από το ελεύθερο υδρόθειο -και όχι θειόλες - στο φθορίζον παράγωγο 7-αµινο -4-µεθυλοκουµαρίνη (7- amino-4-methylcoumarin, AMC). 249,250 Ο ανιχνευτής AzMC αναφέρεται σε διάφορες µελέτες , εφόσον µπορεί να ανιχνεύει και να προσδιορίζει το ελεύθερο υδρόθειο σε οµογενοποιήµατα κυττάρων αλλά και σε ζωντανά κύτταρα σε πραγµατικό χρόνο .251,252

Εικόνα 1.10: Ανιχνευτής AzMC ειδικός για το υδρόθειο παράγοντας τη φθορίζουσα ένωση AMC.

Στην πρόσφατη βιβλιογραφία αναφέρονται αρκετές µελέτες που έχουν αναπτύξει νέους ανιχνευτές ειδικούς για το υδρόθειο , ή/και για το δεσµευµένο ως θειόλη και πολυσουλφίδιο .253,254,255 Μάλιστα αναφέρεται πως έχουν την ικανότητα να προσδιορίζουν το υδρόθειο και στα βιολογικά συστήµατα , δηλαδή κύτταρα ,256,257

30

ιστούς ή πλάσµα ,258,259,260 ακόµα και in vivo σε πειραµατόζωα όπως µύες και ζεβροϊχθύες (zebrafish).261,262

Εικόνα 1.11: Ανιχνευτές υδροθείου µε φθορίζουσα απόκριση .

Επιπλέον νέες µέθοδοι φθορισµού έχουν αναπτυχθεί που ανιχνεύουν βιοµόρια , µεταξύ των οποίων και το υδρόθειο , κάνοντας χρήση ανιχνευτών ειδικών για το κάθε κυτταρικό οργανίδιο .263 Άλλοι ανιχνευτές χρησιµοποιούν φθορίζοντες

31

χηµειοαισθητήρες που φέρουν στην επιφάνεια τους µέταλλο , όπως Cu 2+ , το οποίο αντιδρά µε το υδρόθειο .264 Αντίστοιχοι ανιχνευτές που βασίζονται στην αντίδραση του υδροθείου µε Cu 2+ αναφέρονται από προηγούµενα χρόνια χωρίς ωστόσο να εφαρµόζονται από τους ερευνητές .265,266 Συνοπτικά , µέχρι σήµερα δεν υπάρχει κάποια τεχνική που να είναι ιδανική και χωρίς περιορισµούς , παρά ταύτα οι µέθοδοι και οι ανιχνευτές που ήδη εφαρµόζονται παρέχουν κάποια πληροφορία σχετικά µε την απόδοση των φαρµακολογικών παρεµβάσεων και χρησιµοποιούνται κατά περίσταση µε βάση τη συµβατότητα µε το δείγµα και την ευαισθησία τους .

32

2. ΣΚΟΠΟΣ

33

34

Σκοπός εργασίας

Το υδρόθειο όπως έχει προκύψει από τις πρόσφατες ερευνητικές µελέτες αποτελεί ένα σηµαντικό βιολογικό σηµατοδοτικό µόριο µε ποικίλες δράσεις στην ανθρώπινη υγεία και φυσιολογία . Μολονότι αρχικά θεωρήθηκε ένα τοξικό αέριο µε δηλητηριώδεις επιδράσεις , πλέον αναγνωρίζεται ως διαβιβαστής και σηµατοδότης όπως το µονοξείδιο του αζώτου , ΝΟ και το µονοξείδιο του άνθρακα , CO. ∆ηλαδή µικρά , ενζυµατικώς παραγόµενα , αέρια µόρια µε ρυθµιζόµενο µεταβολισµό που επηρεάζει τις φυσιολογικές λειτουργίες . Οι χηµικές ιδιότητες του υδροθείου , όπως η οξειδοαναγωγική δραστηριότητα , η οξύτητα και η πυρηνόφιλη συµπεριφορά , του προσδίδουν ισχυρή δραστικότητα στις αντιδράσεις του µε διάφορους κυτταρικούς στόχους , ιδιότητες που συµβάλλουν στη σηµατοδοτική του ικανότητα . Η βιοσύνθεση του γίνεται από ένζυµα του µεταβολισµού κυστεΐνης , τη β-συνθετάση της κυσταθειονίνης (cystathionine β synthase, CBS) και τη γ-λυάση της κυσταθειονίνης (cystathionine γ lyase, CSE) καθώς και από το ένζυµο σουλφοτρανσφεράση του 3- µερκαπτοπυροσταφυλικού (3-mercaptopyruvate sulphurtransferase, 3MST). Τα δύο πρώτα ένζυµα χρησιµοποιούν ως υπόστρωµα το αµινοξύ L-κυστεΐνη ή/και την οµοκυστεΐνη και η δράση τους εξαρτάται από το συνένζυµο φωσφορική πυριδοξάλη (pyridoxal-5’-phosphate, PLP). Το ένζυµο 3MST καταλύει την αντίδραση του 3- µερκαπτοπυροσταφυλικού σε πυροσταφυλικό και υδρόθειο . Τα ένζυµα βιοσύνθεσης διαφέρουν στη δοµή αλλά και στην κυτταρική εντόπιση . Καθώς η ενδογενής παραγωγή του υδροθείου εµπλέκεται σε διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες όπως , η ρύθµιση του αγγειακού τόνου , η αγγειογένεση , η νευροδιαβίβαση και οι ανοσολογικές αποκρίσεις , η απορρύθµισή της µπορεί να οδηγήσει σε παθολογικές καταστάσεις όπως νευροεκφυλιστικές καταστάσεις , καρκίνο , κυκλοφορικές και ενδοκρινικές διαταραχές . ∆εδοµένης της βιολογικής σηµασίας του υδροθείου , είναι αναγκαίο να ξεκαθαριστεί ο ρόλος του στη φυσιολογία και την παθολογία , µε προοπτική την ανάπτυξη εργαλείων για θεραπευτικές παρεµβάσεις . Για την επίτευξη του στόχου αυτού πρέπει να υπάρχουν τα απαραίτητα φαρµακολογικά εργαλεία , όπως δότες υδροθείου και εκλεκτικοί αναστολείς των ενζύµων βιοσύνθεσής του . Όπως γνωρίζουµε από τη βιβλιογραφία , καθώς και από προηγούµενη µελέτη της ερευνητικής οµάδας µας , δεν υπάρχουν εκλεκτικοί αναστολείς για τα ένζυµα

35

βιοσύνθεσης του υδροθείου , παρά µόνο για το CSE. Εποµένως είναι σηµαντικό να βρεθούν εκλεκτικοί αναστολείς και για τα άλλα ένζυµα παραγωγής , CBS και 3MST. Στην παρούσα διατριβή αρχικά εξετάσαµε είτε νέες συνθετικές ενώσεις είτε εµπορικά διαθέσιµες ουσίες , ως προς την επίδραση τους στη δραστικότητα των ενζύµων CBS και CSE in vitro . Μελετήθηκαν ενώσεις που η σύνθεσή τους έγινε βάσει σχεδιασµού ως πιθανοί αναστολείς για τα ένζυµα CBS και CSE καθώς και η βιβλιοθήκη LOPAC (Library of Pharmacologically Active Compounds). Στη συνέχεια εξετάστηκαν οι πιο δραστικές ενώσεις ως προς την εκλεκτικότητά τους έναντι και των τριών ενζύµων CBS, CSE και 3MST. Από τη βιβλιογραφία είναι γνωστό πως η S-αδενοσυλο -L-µεθειονίνη (S-adenosyl-L- methionine, SAM), είναι ένας αλλοστερικός ενεργοποιητής του ενζύµου CBS. Στην ανάγκη να βρεθούν νέα φαρµακολογικά εργαλεία για τη µελέτη της βιολογίας του υδροθείου , εκτός από δραστικότερους και πιο εκλεκτικούς αναστολείς των ενζύµων βιοσύνθεσης υδροθείου , προσπαθήσαµε να διερευνήσουµε τις επιδράσεις που µπορεί να έχει η SAM µέσω του CBS στις κυτταρικές λειτουργίες , όπως ο πολλαπλασιασµός .

36

3. ΜΕΘΟ∆ΟΙ

37

38

3.1 Καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων

3.1.1 Παρασκευή στερεού θρεπτικού υλικού

Για την ανάπτυξη βακτηρίων χρησιµοποιούνται θρεπτικά υλικά , τα οποία πρέπει να περιέχουν πηγή άνθρακα , πηγή αζώτου , άλατα και ιόντα . Τα υγρά θρεπτικά υλικά περιέχουν όλα τα παραπάνω συστατικά διαλυµένα σε νερό . Όσον αφορά στους τύπους της υγρής καλλιέργειας ως µέσο ανάπτυξης των βακτηρίων που χρησιµοποιήθηκαν είναι η καλλιέργεια πλούσιων θρεπτικών µέσων (LB, rich media). Τα στερεά θρεπτικά υλικά παρασκευάζονται µε ανάµιξη του υγρού θρεπτικού υλικού µε έναν πολυσακχαρίτη που προέρχεται από φύκη , το άγαρ . Το άγαρ είναι ρευστό σε θερµοκρασίες πάνω από 45 οC και στερεοποιείται σε χαµηλότερες θερµοκρασίες . Συγκεκριµένα , σε πλήρες θρεπτικό υλικό L.B. προστίθεται 1,5% w/v άγαρ και το διάλυµα αποστειρώνεται . Με το πέρας της αποστείρωσης και προτού στερεοποιηθεί το διάλυµα , προστίθεται σε αυτό αµπικιλλίνη σε τελική συγκέντρωση 100mg/mL και επιστρώνεται σε τρυβλία , τα οποία στη συνέχεια φυλλάσσονται στους 4 οC. Η διαδικασία πραγµατοποιείται υπό φλόγα .

Υλικά και διαλύµατα

L.B.(rich media): 1% w/w tryptone, 0,5% w/w yeast extract, 1% w/w NaCl. Άγαρ 1,5% w/v σε L.B. ∆ιάλυµα αµπικιλλίνης : 0,1 g/mL σε 50% v/v αιθανόλης ( αποθήκευση -20 οC).

3.1.2 Εισαγωγή πλασµιδίου σε κύτταρα E.coli (µετασχηµατισµός )

Τα στελέχη E.coli που χρησιµοποιήθηκαν ήταν τα πρωτοτροφικά BL21(DE3) codon plus. Τα κύτταρα αυτά συνθέτουν όλα τα αµινοξέα χρησιµοποιώντας µια πηγή άνθρακα και µια πηγή αζώτου που προστίθεται εξωγενώς . Η βακτηριακή αυτή σειρά περιέχει επιπλέον αντίγραφα γονιδίων που εκφράζουν τα tRNA που είναι απαραίτητα για τη µετάφραση ετερόλογων ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών σε E.coli . Τα κύτταρα

39

αυτά είναι επιδεκτικά και παρέχουν την έκφραση των πρωτεϊνών σε υψηλά επίπεδα µετά από επαγωγή της έκφρασης µε IPTG. Ο πλασµιδιακός φορέας που χρησιµοποιήθηκε είναι ο pGEX-KG. Το πλασµίδιο pGEX είναι βακτηριακό και έχει σχεδιαστεί για να επιτρέπει τη γρήγορη παραγωγή µεγάλης ποσότητας της πρωτεΐνης -στόχου , όταν ενεργοποιείται . Το πλασµίδιο αυτό φέρει κάποιες σηµαντικές περιοχές : ένα γονίδιο lacI q (λακτόζης Ι) που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη -καταστολέα της λακτόζης , έναν tac-προαγωγέα που ρυθµίζει την έκφραση και επάγεται από το ανάλογο της λακτόζης IPTG, καθώς και γονίδιο αντίστασης στην αµπικιλλίνη . Έτσι υπάρχει έλεγχος της πρωτεϊνικής έκφρασης η οποία επάγεται όταν προστεθεί το IPTG.

Εικόνα 3.1: Χάρτης του φορέα κλωνοποιήσης pGEX.

Τα επιδεκτικά κύτταρα , τα οποία περιγράφηκαν παραπάνω , µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την εισαγωγή σε αυτά πλασµιδιακού DNA που φέρει το γονίδιο του 3 ΜSΤ. Συγκεκριµένα : 1. Τα κύτταρα E.coli BL21(DE3) codon plus και το πλασµίδιο pGEX-KG/GST- 3MST τοποθετούνται στον πάγο . 2. Σε 100 µL κυττάρων προστίθενται 100ng πλασµιδίου και παραµένουν στον πάγο για 30 λεπτά .

40

3. Στη συνέχεια µεταφέρονται σε υδατόλουτρο και υπόκεινται σε θερµικό σοκ για 45 δευτερόλεπτα στους 42 οC. 4. Τα κύτταρα τοποθετούνται άµεσα στον πάγο για 2 λεπτά . 5. Ακολουθεί η προσθήκη 500 µL υγρού θρεπτικού υλικού (SOC medium) και επώαση στους 37 οC για 1 ώρα υπό ανάδευση 200rpm. 6. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε 10000rpm. 7. Αφαιρείται το µεγαλύτερο µέρος του υπερκείµενου και στο υπόλοιπο γίνεται επαναδιάλυση του ιζήµατος των κυττάρων . Τέλος , τα κύτταρα µε το υγρό θρεπτικό υλικό επιστρώνονται σε τρυβλία µε στερεό θρεπτικό υλικό (L.B.-άγαρ -αµπικιλλίνη ) και επωάζονται στους 37 οC για 12-16 ώρες . Τα πλασµίδια αυτού του τύπου φέρουν γονίδιο ανθεκτικότητας σε αµπικιλλίνη , µε αποτέλεσµα οι αποικίες που εµφανίζονται στο τρυβλίο να αποτελούνται αποκλειστικά από κύτταρα που φέρουν τον πλασµιδιακό φορέα , δηλαδή έχουν µετασχηµατιστεί επιτυχώς . Η διαδικασία αυτή διεξάγεται υπό στείρες συνθήκες και τα αναλώσιµα και τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιούνται είναι αποστειρωµένα .

Υλικά και διαλύµατα

Η βακτηριακή σειρά που χρησιµοποιήθηκε για την έκφραση του ενζύµου 3 ΜSΤ, ήταν E.coli BL-21(DE3) Codon Plus . Το πλασµίδιο που χρησιµοποιήθηκε ήταν το pGEX-KG/GST-3MST , όπου είναι συντηγµένο το ένζυµο 3 ΜSΤ µε τη GST στο Ν΄τελικό άκρο . SOC medium. Τρυβλία L.B.-άγαρ -αµπικιλλίνης .

3.1.3 Αποθήκευση βακτηρίων

Για την αποθήκευση των βακτηρίων που έχουν µετασχηµατιστεί , αναπτύσσεται υγρή καλλιέργεια LB, στην οποία εµβολιάζεται µία αποικία µετασχηµατισµένων βακτηρίων από το στερεό θρεπτικό υλικό . Συγκεκριµένα : 1. Σε πλαστικό σωλήνα των 50mL που περιέχει 10mL υγρού θρεπτικού υλικού LB και αµπικιλλίνη 100mg/mL πραγµατοποιείται εµβολιασµός της αποικίας µε τα

41

κύτταρα E.coli BL21(DE3) Codon Plus που έχουν µετασχηµατιστεί και φέρουν το πλασµίδιο µε την επιθυµητή πρωτεΐνη . 2. Η προκαλλιέργεια αυτή επωάζεται σε επωαστικό κλίβανο στους 37 οC, υπό ανάδευση 180rpm για περίπου 12-16 ώρες . 3. Την επόµενη µέρα σε αποστειρωµένα σωληνάρια µικροφυγοκέντρου (eppendorf), προστίθενται 700 µL από την προκαλλιέργεια και 300 µL αποστειρωµένη γλυκερόλη . 4. Ακολουθεί καλή ανάδευση και αποθήκευση στους -80 οC. Έτσι υπάρχει απόθεµα µετασχηµατισµένων κυττάρων E.coli BL-21 (DE3) Codon Plus µε το επιθυµητό πλασµίδιο που φέρει το γονίδιο της πρωτεΐνης που θέλουµε να εκφράσουµε . Η διαδικασία διεξάγεται υπό στείρες συνθήκες .

Υλικά και διαλύµατα

L.B.(rich media): 1% w/w tryptone, 0,5% w/w yeast extract, 1% w/w NaCl. ∆ιάλυµα αµπικιλλίνης : 0,1 g/mL σε 50% v/v αιθανόλης ( αποθήκευση -20 οC). Αποστειρωµένη γλυκερόλη .

3.1.4 Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µικρής κλίµακας (mini prep)

Η αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA από βακτηριακά κύτταρα E.coli BL21(DE3) Codon Plus για το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο που φέρει το cDNA για τη χιµαιρική πρωτεΐνη GST-3ΜSΤ έγινε µε τη χρήση των αντιδραστηρίων της εταιρίας Macherey- Nagel (Nucleospin Plasmid). H µέθοδος χρησιµοποιεί µικρές ιοντοανταλλακτικές στήλες φυγοκέντρησης οι οποίες επιτρέπουν γρήγορη ροή του δείγµατος , υψηλή ανακτησιµότητα του δεσµευµένου DNA και αποµάκρυνση ενδοτοξινών . Συγκεκριµένα : 1. Αρχικά αναπτύσσεται 5mL προκαλλιέργεια βακτηρίων E. coli σε θρεπτικό υλικό LB-αµπικιλλίνη , η οποία επωάζεται στους 37 oC ολονυκτίως µε ανάδευση (250rpm). 2. Με την αποµάκρυνση από τον επωαστικό θάλαµο µεταφέρεται για κάθε δείγµα µία ποσότητα (1mL) σε αποστειρωµένα σωληνάρια µικροφυγοκέντρου (eppendorf) και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στη µέγιστη ταχύτητα .

42

3. Στη συνέχεια αποµακρύνεται το υπερκείµενο και σε κάθε δείγµα προστίθενται 250 µL από το διάλυµα Α1 (Resuspension Buffer+RNAase A) και επαναδιαλύονται τα κύτταρα µε την πιπέτα . 4. Σε κάθε eppendorf προστίθενται 250 µL από το διάλυµα Α2 (Lysis Buffer), γίνεται ήπια ανακίνηση 6-8 φορές και τέλος τα δείγµατα αφήνονται για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (25 οC). Αυτό έχει ως αποτέλεσµα να σπάνε τα βακτηριακά κύτταρα και να απελευθερώνεται το πλασµιδιακό DNA. 5. Ακολουθεί προσθήκη 300 µL από το διάλυµα A3 (Neutralization Buffer), ήπια ανακίνηση 6-8 φορές και φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στα 11000g. Το διάλυµα A3 προκαλεί κατακρήµνιση των πρωτεϊνών και του βακτηριακού DNA. 6. Εν συνεχεία γίνεται αφαίρεση του υπερκείµενου προσεκτικά µε την πιπέτα , τοποθέτηση του φίλτρου στην κολώνα και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 11000xg. 7. Αφού αποµακρυνθεί από το σωλήνα συλλογής το διάλυµα που διαπέρασε το φίλτρο , προστίθενται σε κάθε φίλτρο 500 µL από το διάλυµα AW (Wash Buffer) το οποίο έχει ήδη θερµανθεί στους 50 οC. 8. Πραγµατοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 11000g. Αποµάκρυνση από το σωλήνα συλλογής του διαλύµατος που διαπέρασε το φίλτρο . 9. Στη συνέχεια προστίθενται σε κάθε φίλτρο 600 µL από το διάλυµα Α4 (Wash Buffer) και γίνεται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 11000g. Με το διάλυµα Α4 αποµακρύνεται το αλάτι , οι µεταβολίτες και κάθε είδους άχρηστο συστατικό που µπορεί να υπάρχει στο δείγµα µας . 10. Αφού αποµακρυνθεί το υγρό που διαπερνά το φίλτρο επαναλαµβάνεται φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα 11000g ώστε να στεγνώσει πολύ καλά η µεµβράνη . 11. Τοποθέτηση του κάθε φίλτρου σε σωλήνα eppendorf και προσθήκη 50 µL από το διάλυµα ΑΕ (Elution Buffer). Αφήνουµε τα δείγµατα για 1 λεπτό σε θερµοκρασία δωµατίου (25 οC). 12. Τέλος , πραγµατοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 11000g. Tα καθαρά πλασµίδια αποθηκεύονται στους 4 οC.

Υλικά και διαλύµατα

L.B.(rich media): 1% w/w tryptone, 0,5% w/w yeast extract, 1% w/w NaCl.

43

∆ιάλυµα αµπικιλλίνης : 0,1 g/mL σε 50% v/v αιθανόλης ( αποθήκευση -20 οC). Macherey-Nagel Kit (Nucleospin Plasmid).

3.1.5 Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µεγάλης κλίµακας (midi prep)

Η διαδικασία πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση των αντιδραστηρίων της εταιρείας Macherey–Nagel (NucleoBond Xtra Midi). Συγκεκριµένα : 1. Αρχικά αναπτύσσεται 100mL προκαλλιέργεια βακτηρίων E. coli σε θρεπτικό υλικό LB-αµπικιλίνη , η οποία επωάζεται στους 37 oC ολονυκτίως µε ανάδευση (250 rpm). 2. Η καλλιέργεια µεταφέρεται σε αποστειρωµένο πλαστικό σωλήνα των 50mL και φυγοκεντρείται σε 2500rpm, για 10 λεπτά στους 4 οC. 3. Ακολουθεί αποµάκρυνση του υπερκειµένου και επαναδιάλυση του ιζήµατος των βακτηρίων µε 8mL από το διάλυµα επαναιώρησης των κυττάρων (Buffer RES). 4. Στη συνέχεια προστίθενται στο σωλήνα 8mL από το διάλυµα λύσης των κυττάρων (Buffer LYS). Ο σωλήνας αναδεύεται 5-6 φορές και επωάζεται για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου . 5. Εξισορρόπηση τη στήλης µε 12mL από το διάλυµα ΕQU. Η στήλη αφήνεται να αδειάσει µε τη βοήθεια της βαρύτητας ενώ βεβαιώνεται ότι το εσωτερικό φίλτρο έχει βραχεί καλά . 6. Ακολουθεί προσθήκη 8mL στο σωλήνα από το διάλυµα ουδετεροποίησης ΝΕ U και αφού αναδευτεί το δείγµα 10-15 φόρες καλά , περιχύνεται το περιεχόµενό του στη στήλη . 7. Αναµένεται µέχρι να περάσει όλο το περιεχόµενο της στήλης από το εσωτερικό φίλτρο και στη συνέχεια η στήλη ξεπλένεται µε 5mL από το διάλυµα ΕQU. 8. Στη συνέχεια αφαιρείται το φίλτρο της στήλης και ακολουθεί δεύτερο ξέπλυµα της στήλης µε 8mL από το διάλυµα W ΑSH. 9. Η έκλουση του DNA από το εσωτερικό φίλτρο της στήλης γίνεται µε την προσθήκη 5mL από το διάλυµα έκλουσης ( ΕLU) και το περιεχόµενο συλλέγεται σε καθαρό αποστειρωµένο σωλήνα . 10. Έπειτα προστίθεται στο σωλήνα 3,5mL ισοπροπανόλης για να κατακρηµινιστεί το πλασµιδιακό DNA. Το περιεχόµενο αναδεύεται πολύ καλά και αφήνεται για 2

44

λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου . Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 15000g για 30 λεπτά στους 4 οC. 11. Αφαιρείται προσεκτικά το υπερκείµενο του σωλήνα και το ίζηµα επαναιωρείται µε 2mL αιθανόλης 70%. Το περιεχόµενο µεταφέρεται σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου eppendorf και φυγοκεντρείται στα 15000g για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου . 12. Αφαιρείται προσεχτικά το µεγαλύτερο µέρος της αιθανόλης από το σωληνάριο και αφού στεγνώσει το ίζηµα για 5-10 λεπτά , το DNA επαναιωρείται σε 200 µL αποστειρωµένου απεσταγµένου νερού .

Υλικά και διαλύµατα

L.B.(rich media): 1% w/w tryptone, 0,5% w/w yeast extract, 1% w/w NaCl. ∆ιάλυµα αµπικιλλίνης : 0,1 g/mL σε 50% v/v αιθανόλης ( αποθήκευση -20 οC). Macherey-Nagel Kit ( NucleoBond Xtra Midi ). Αιθανόλη 70% v/v. Αποστειρωµένο απεσταγµένο νερό .

3.1.6 Εύρεση βέλτιστων συνθηκών πρωτεϊνικής έκφρασης

Σε κάθε πρωτεΐνη οι συνθήκες έκφρασής της ποικίλουν ως προς το θρεπτικό υλικό , τη θερµοκρασία , το χρόνο επαγωγής και τη συγκέντρωση IPTG που προστίθεται . Η επαγωγή της έκφρασης για τα βακτηριακά κύτταρα επιλέγεται να γίνει κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης , δηλαδή της απότοµης αύξησης των κυττάρων . Αυτό ελέγχεται µε τη µέτρηση της οπτικής πυκνότητας (optical density, OD) στα 600nm και θα πρέπει να κυµαίνεται µεταξύ 0,6 και 0,8. Η επαγωγή της έκφρασης γίνεται µε προσθήκη του IPTG. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την έκφραση της πρωτεΐνης και που επιδέχονται βελτιστοποίηση είναι : • Η συγκέντρωση του IPTG : Γενικά η αποτελεσµατικότερη απελευθέρωση του υποκινητή και η επαγόµενη έκφραση παρατηρούνται για συγκεντρώσεις IPTG 1mM. Σε περιπτώσεις που η ραγδαία αύξηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης αποτελεί αιτία κατακρήµνισης της πρωτεΐνης ή εµφάνισης τοξικότητας για τα βακτηριακά κύτταρα , επιλέγονται συγκεντρώσεις 0,1-0,8mM.

45

• Η θερµοκρασία : Οι υψηλές θερµοκρασίες επαγωγής (>32 οC) ευνοούν τα ποσοστά έκφρασης της πρωτεΐνης . Σε περιπτώσεις εµφάνισης τοξικότητας στα κύτταρα ή κατακρήµνισης της πρωτεΐνης , η µείωση της θερµοκρασίας ευνοεί την επαγωγή της έκφρασης σε ορισµένες περιπτώσεις . • Ο χρόνος επαγωγής κατά τον οποίο υπερεκφράζεται η πρωτεΐνη -στόχος : Η υπερέκφραση των πρωτεϊνών συµβαίνει συνήθως κατά τις πρώτες ώρες της επαγωγής της έκφρασης και στη συνέχεια µειώνεται εκθετικά , καθώς τα κύτταρα περνούν στη φάση θανάτου . Αυτό όµως εξαρτάται και από την θερµοκρασία στην οποία επωάζεται η καλλιέργεια . Ο βέλτιστος χρόνος επαγωγής της έκφρασης εξετάζεται µετά από λήψη δειγµάτων κυττάρων από την καλλιέργεια (1,5ml δείγµατος , φυγοκέντρηση και απόρριψη του υπερκείµενου ) και µετά από έλεγχο µε SDS-PAGE, για 0, 2, 4, 6, 8h έως και 16h. Οι συνθήκες έκφρασης των πρωτεϊνών GST-CSE και GST-CBS είναι γνωστές από προηγούµενη µελέτη και αναφέρονται στις παραγράφους 3.1.7.1 και 3.1.7.2. Στην παρούσα παράγραφο αναφέρεται η διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών έκφρασης της πρωτεΐνης GST-3MST.

3.1.6.1 Ανάπτυξη προκαλλιέργειας

1. Σε πλαστικό σωλήνα των 50mL προστίθενται 10mL αποστειρωµένου θρεπτικού υλικού LB, αµπικιλλίνη 100mg/mL και γίνεται εµβολιασµός µικρής ποσότητας από το απόθεµα βακτηριακών κυττάρων σε γλυκερόλη . 2. Επώαση υπό ανάδευση 180rpm στους 37 οC για 12-16 ώρες .

Υλικά και διαλύµατα

L.B.(rich media): 1% w/w tryptone, 0,5% w/w yeast extract, 1% w/w NaCl. ∆ιάλυµα αµπικιλλίνης : 0,1 g/mL σε 50% v/v αιθανόλης ( αποθήκευση -20 οC). Απόθεµα βακτηριακών κυττάρων σε γλυκερόλη .

46

3.1.6.2 Ανάπτυξη καλλιέργειας µικρής κλίµακας

1. Σε κωνική φιάλη των 250mL, που περιέχει 100mL L.B, προστίθενται αµπικιλλίνη 100mg/mL και 10mL από την προκαλλιέργεια των βακτηριακών κυττάρων E.coli BL21(DE3) codon plus/GST-3MST, η οποία αναπτύχθηκε τις προηγούµενες 12-16 ώρες . 2. Πραγµατοποιείται επώαση στους 37 οC υπό ανάδευση 250rpm µέχρι η οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας (Optical Density, OD), που µετρείται στα 600nm, να φτάσει στις τιµές 0,6-0,8 όπου τα κύτταρα βρίσκονται στην εκθετική φάση ανάπτυξης . 3. Φυλάσσεται δείγµα 1,5mL από την καλλιέργεια ως το δείγµα πριν την επαγωγή της έκφρασης. 4. Αµέσως µετά γίνεται προσθήκη του επαγωγέα της έκφρασης , IPTG 0,1m Μ και η καλλιέργεια επωάζεται για τις επόµενες 21 ώρες στους 20 οC υπό ανάδευση 180rpm. 5. Μετά την προσθήκη του IPTG, συλλέγονται σε σωληνάρια µικροφυγοκέντρου eppendorf, δείγµατα των 1,5mL από την καλλιέργεια σε διάφορες ώρες κατά το διάστηµα της επώασης µέχρι και την τελευταία ώρα . 6. Τα δείγµατα που συλλέγονται φυγοκεντρούνται σε 15000 rpm για 2 λεπτά , απορρίπτεται το υπερκείµενο και το ίζηµα φυλάσσεται στους -20 οC. 7. Στο τέλος της επώασης η καλλιέργεια φυγοκεντρείται σε 8000 rpm για 15 λεπτά και το ίζηµα φυλάσσεται στους -20 οC. Τα κυτταρικά δείγµατα που συλλέχθηκαν πριν και µετά την επαγωγή της έκφρασης προετοιµάζονται για ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου -SDS για να εξακριβωθεί η έκφραση και η ακριβής ώρα της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης .

Υλικά και διαλύµατα

L.B.(rich media): 1% w/w tryptone, 0,5% w/w yeast extract, 1% w/w NaCl. ∆ιάλυµα αµπικιλλίνης : 0,1 g/mL σε 50% v/v αιθανόλης ( αποθήκευση -20 οC). ο ∆ιάλυµα IPTG 1Μ: 2,38 g / 10mL ddH 2O ( αποθήκευση -20 C).

47

3.1.7 Καλλιέργεια µεγάλης κλίµακας

3.1.7.1 K αλλιέργεια για την έκφραση της GST-CSE

Η παρακάτω διαδικασία πραγµατοποιείται σε αποστειρωµένες συνθήκες . 1. Αναπτύσσεται υγρή καλλιέργεια µε 1L πλήρες θρεπτικό υλικό LB που περιέχει αµπικιλλίνη 100mg/mL και 10mL της προκαλλιέργειας E. coli BL21(DE3) codon plus/ GST-CSE. ο 2. Πραγµατοποιείται επώαση στους 37 C υπό ανάδευση 250rpm µέχρι OD 600 =0,6- 0,8. T ότε προστίθεται IPTG 0,1mM. 3. Η επώαση της καλλιέργειας συνεχίζει στους 18 οC υπό ανάδευση 180 rpm για 16 ώρες . 4. Ακολουθεί η συλλογή των κυττάρων µε φυγοκέντρηση σε 8000rpm για 20 λεπτά . 5. Το ίζηµα συλλέγεται µε PBS 1x σε πλαστικό σωλήνα των 50mL και φυλάσσεται στους -20 οC µέχρι τη διαδικασία της αποµόνωσης της πρωτεΐνης .

3.1.7.2 Καλλιέργεια για την έκφραση της GST-CBS

Η παρακάτω διαδικασία πραγµατοποιείται σε αποστειρωµένες συνθήκες . 1. Αναπτύσσεται υγρή καλλιέργεια µε 1L πλήρες θρεπτικό υλικό LB που περιέχει αµπικιλλίνη 100mg/mL, δ-ALA 0,3mM και 10mL της προκαλλιέργειας E. coli BL21(DE3) codon plus/ GST-CΒS. ο 2. Πραγµατοποιείται επώαση στους 37 C υπό ανάδευση 250rpm µέχρι OD 600 =0,6- 0,8. Τότε προστίθεται IPTG 0,1mM. 3. Η επώαση της καλλιέργειας συνεχίζει στους 30 οC υπό ανάδευση 180rpm για 16 ώρες . 4. Ακολουθεί η συλλογή των κυττάρων µε φυγοκέντρηση σε 8000rpm για 20 λεπτά . 5. Το ίζηµα συλλέγεται µε PBS 1x σε πλαστικό σωλήνα των 50mL και φυλάσσεται στους -20 οC µέχρι τη διαδικασία της αποµόνωσης της πρωτεΐνης .

3.1.7.3 K αλλιέργεια για την έκφραση της GST-3ΜSΤ

Η παρακάτω διαδικασία πραγµατοποιείται σε αποστειρωµένες συνθήκες .

48

1. Αναπτύσσεται υγρή καλλιέργεια µε 1L πλήρες θρεπτικό υλικό LB που περιέχει αµπικιλλίνη 100mg/mL και 10mL της προκαλλιέργειας E. coli BL21(DE3) codon plus/ GST-3ΜSΤ. ο 2. Πραγµατοποιείται επώαση στους 37 C υπό ανάδευση 250rpm µέχρι OD 600 =0,6- 0,8. Τότε προστίθεται IPTG 0,1mM. 3. Η επώαση της καλλιέργειας συνεχίζει στους 20 οC υπό ανάδευση 180rpm για 16 ώρες . 4. Ακολουθεί η συλλογή των κυττάρων µε φυγοκέντρηση σε 8000rpm για 20 λεπτά . 5. Το ίζηµα συλλέγεται µε PBS 1x σε πλαστικό σωλήνα των 50mL και φυλάσσεται στους -20 οC µέχρι τη διαδικασία της αποµόνωσης της πρωτεΐνης .

Υλικά και διαλύµατα

L.B.(rich media): 1% w/w tryptone, 0,5% w/w yeast extract, 1% w/w NaCl. ∆ιάλυµα αµπικιλλίνης : 0,1 g/mL σε 50% v/v αιθανόλης ( αποθήκευση -20 οC). ο ∆ιάλυµα IPTG 1Μ: 2,38 g / 10mL ddH 2O ( αποθήκευση -20 C). Για την έκφραση αίµης για το ένζυµο CΒS χρησιµοποιήθηκε το δ-αµινολεβουλινικό οξύ ( δ-ALA): ο ∆ιάλυµα δ-ALA 1 Μ: 167,59 mg / 1mL ddH 2O ( αποθήκευση -20 C). Προκαλλιέργεια E. coli BL21(DE3) codon plus GST-CS Ε ή GST-CΒS ή GST- 3ΜSΤ.

3.1.8 Λύση των βακτηριακών κυττάρων

• Για τις GST-CSE και GST-3ΜSΤ καλλιέργειες , στο ίζηµα της καλλιέργειας µεγάλης κλίµακας προστίθενται 5mL ρυθµιστικού διαλύµατος 1x PBS και διάλυµα αναστολέων πρωτεασών . • Για την GST-CΒS καλλιέργεια , στο ίζηµα της καλλιέργειας µεγάλης κλίµακας προστίθενται 5mL ρυθµιστικού διαλύµατος 1x PBS, DTT 5mM, 1% Triton X- 100, PLP 100 µM και διάλυµα αναστολέων πρωτεασών .

49

1. Το διάλυµα τοποθετείται σε πάγο , ούτως ώστε να αποφεύγεται η αύξηση της θερµοκρασίας , και µεταφέρεται στο µηχάνηµα υπερήχων για τη λύση των κυττάρων . 2. Ακολουθείται η εξής διαδικασία : 2. Φροντίζουµε ώστε το microtip να µην ακουµπάει στη βάση του πλαστικού σωλήνα που περιέχει το διάλυµα . Ρυθµίζουµε τη διάρκεια των υπερήχων να είναι 10 δευτερόλεπτα . Η παύση από τους υπερήχους είναι διάρκειας 2:30 λεπτών . Ο χρόνος της λύσης είναι 1:20 λεπτά το οποίο σηµαίνει 8 φορές τα 10 δευτερόλεπτα των υπερήχων . Ο χρόνος της λύσης εξαρτάται από την πυκνότητα του διαλύµατος . Οπότε πρακτικά µπορεί να είναι και περισσότερος . 3. Με το πέρας των υπερήχων το διάλυµα φυγοκεντρείται σε 10000rpm στους 4 οC για 30 λεπτά για την αποµάκρυνση των µεµβρανικών δοµών . 4. Στη συνέχεια γίνεται διήθηση µε φίλτρο Whatman µε διάµετρο πόρου 0,2 µm.

Υλικά και διαλύµατα

Ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών PBS 1x: 140mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM

Na2HPO 4, 1,8mM KH 2PO 4, pH 8. ο ∆ιάλυµα DTT 1 Μ: 0,1542 g σε 1 mL dH 2O (αποθήκευση -20 C). Triton X-100

∆ιάλυµα Φωσφορικής πυριδοξάλης PLP 2mM σε ddH 2O. ∆ιάλυµα αναστολέων πρωτεασών για εκχύλισµα βακτηριακών κυττάρων (Protease Inhibitor Coctail) που περιέχει AEBSF 23mM, Aprotinin 2mM, Bestatin 130 µM, EDTA 100mM, E-64 0,3mM, Pepstatin A 0,3 mM.

3.2 Αποµόνωση GST-χιµαιρικών πρωτεϊνών µε χρωµατογραφία συγγένειας

Η χρωµατογραφία συγγένειας αποτελεί µια αποτελεσµατική τεχνική διαχωρισµού και αποµόνωσης πρωτεϊνών . Η αρχή της τεχνικής αυτής στηρίζεται στην υψηλή συγγένεια που εµφανίζουν πολλές πρωτεΐνες για ειδικές χηµικές οµάδες . Στην περίπτωση αυτή η αποµόνωση γίνεται µε χρωµατογραφία συγγένειας µε κολόνες GSTrap FF, όπου είναι ακινητοποιηµένη σε σεφαρόζη , η γλουταθειόνη (Glutathione,

50

GSH). Οι πρωτεΐνες -στόχοι είναι συνεκφρασµένες µε GST (Glutathione-S- Transferase) στο Ν-τελικό άκρο τους και µπορούν να δεσµεύονται στη στήλη , ενώ άλλες προσµίξεις αποµακρύνονται µε έκπλυση µε το κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα για τη δέσµευση των προσµίξεων στη στήλη ( Εικόνα 3.2). Συγκεκριµένα : 1. Αρχικά βαθµονοµείται η στήλη , πρώτα µε διπλά απεσταγµένο νερό και στη συνέχεια µε ρυθµιστικό διάλυµα 1x PBS, 5 φορές τον όγκο της στήλης .

Εικόνα 3.2: Τεχνική χρωµατογραφίας συγγένειας µε κολόνες GSTrap FF.

2. Στη συνέχεια φορτώνεται το διάλυµα µε το πρωτεϊνικό εκχύλισµα από τη λύση των βακτηρίων σε πολύ χαµηλή ταχύτητα ροής . Με τον τρόπο αυτό η GST- χιµαιρική πρωτεΐνη δεσµεύεται στη στήλη και το υπόλοιπο κυτταρόλυµα εκλούεται . 3. Έπειτα η στήλη εκπλένεται µε ρυθµιστικό διάλυµα 1x PBS 5 φορές τον όγκο της για να αποµακρυνθούν τυχόν προσµίξεις . 4. Τέλος , εισάγουµε το διάλυµα έκλουσης που περιέχει την ανηγµένη γλουταθειόνη σε όγκο 10 φορές τον όγκο της στήλης και εκλούεται η GST-χιµαιρική πρωτεΐνη . Προσοχή απαιτείται στη ροή έκλουσης , η οποία θέλουµε να είναι σχετικά αργή γιατί επηρεάζει τη δέσµευση της πρωτεΐνης στη γλουταθειόνη . 5. Συλλέγονται όλα τα κλάσµατα της αποµόνωσης τα οποία στη συνέχεια αναλύονται µε ηλεκτοφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου -SDS για την εξακρίβωση της επιτυχούς αποµόνωσης . Στο δείγµα µε τη GST-χιµαιρική πρωτεΐνη που είναι σε διάλυµα ανηγµένης γλουταθειόνης πραγµατοποιείται αλλαγή σε διάλυµα φωσφορικών 10mM + DTT 1mM µε pH: 8,2. Η αλλαγή γίνεται µε τη χρήση πλαστικού σωλήνα (amicon) που

51

περιέχει φίλτρο συµπύκνωσης 10000 MWCO (Molecular Weight Cut-Off). Η διαδικασία στηρίζεται σε επαναλαµβανόµενες φυγοκεντρήσεις , όπου περνάει µέσω του φίλτρου µόνο ο διαλύτης ενώ η πρωτεΐνη συγκρατείται . Έτσι στη συνέχεια εισάγεται το νέο διάλυµα στο οποίο θέλουµε να διατηρήσουµε την πρωτεΐνη και να συµπυκνώσουµε . Συγκεκριµένα : 1. Εισάγεται το διάλυµα µε την πρωτεΐνη στον πλαστικό σωλήνα (amicon) και φυγοκεντρείται σε 5000 rpm όσες φορές είναι απαραίτητο µέχρι να συµπυκνωθεί η πρωτεΐνη στα 500 µL περίπου . 2. Στη συνέχεια προστίθεται το διάλυµα φωσφορικών και επαναλαµβάνονται οι φυγοκεντρήσεις µέχρι να συµπυκνωθεί εκ νέου η πρωτεΐνη . 3. Αυτή η διαδικασία γίνεται τρεις φορές και εφόσον συµπυκνωθεί η πρωτεΐνη στα 2mL περίπου . 4. Ακολουθεί προσδιορισµός της συγκέντρωσης πρωτεΐνης . 5. Συλλογή των δειγµάτων και αποθήκευση στους -80 οC.

Υλικά και διαλύµατα

Ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών PBS 1x: 140mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM

Na 2HPO 4, 1,8mM KH 2PO 4, pH 8. ∆ιάλυµα ανηγµένης γλουταθειόνης (διάλυµα έκλουσης ): 10mM GSH, 50mM Tris- HCl pH 8 ( αποθήκευση 4 οC).

∆ιάλυµα φωσφορικών (Sodium Phosphate Buffer) 1 Μ: 93,2 mL Na 2HPO 4 1Μ, 6,8 mL NaH 2PO 4 1Μ pH 8,2. Αραίωση σε 10mM µε ddH 2O πριν τη χρήση του . ο ∆ιάλυµα DTT 1 Μ: 0,1542 g σε 1 mL ddH 2O (αποθήκευση -20 C).

52

3.3 Καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων

Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν οι παρακάτω κυτταρικές σειρές :

HCT116 επιθηλιακά κύτταρα ορθοκολικού καρκινώµατος

HT29 επιθηλιακά κύτταρα ορθοκολικού αδενοκαρκινώµατος

NCM356 Επιθηλιακά κύτταρα φυσιολογικού κόλου

Επίσης χρησιµοποιήθηκαν τα κύτταρα shC ΒS HCT116 στα οποία έχει γίνει γονιδιακή αποσιώπηση του ενζύµου CBS µε τµήµατα RNA τύπου φουρκέτας µέσω ρετροϊών (lentiviral vectors) και τα κύτταρα αναφοράς shCTL HCT116, στα οποία εκφράζεται φυσιολογικά το ένζυµο CBS.

53

3.3.1 Θρεπτικά µέσα καλλιέργειας κυττάρων

Τα θρεπτικά µέσα που χρησιµοποιήθηκαν είναι : • Για τα HCT116, HT29, shC ΒS HCT116 και shCTL HCT116 Mc COY’s 5A D- γλυκόζη 3,0 g/L ∆ιττανθρακικό νάτριο 2,2 g/L

(N αΗ CO 3) L-γλουταµίνη 1,5 mM Πενικιλίνη -στρεπτοµυκίνη 100 U/mL

• Για τα NCM356 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) D- γλυκόζη 1,0 g/L ∆ιττανθρακικό νάτριο 3,7 g/L

(N αΗ CO 3) L-γλουταµίνη 4 mM Na-Πυροσταφυλικό 0,1 g/L Πενικιλίνη -στρεπτοµυκίνη 100 U/mL

Σε όλα τα θρεπτικά µέσα προστίθεται 10% ορός νεογέννητου βοός (Fetal Bovine Serum, FBS) και φυλάσσονται στους 4 οC. Για τα shC ΒS HCT116 και shCTL HCT116 κύτταρα στο θρεπτικό µέσο προστέθηκε επίσης το αντιβιοτικό πουροµυκίνη (2 µg/mL) . ο Όλες οι καλλιέργειες πραγµατοποιήθηκαν σε 37 C και 5% CO 2.

3.3.2 Ανακαλλιέργεια κυττάρων

Αρχικά παρατηρούνται τα κύτταρα στο µικροσκόπιο . Η µορφολογία των κυττάρων είναι ενδεικτική της κατάστασής τους . Η ανακαλλιέργεια πραγµατοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται . Ο προσδιορισµός του βαθµού κάλυψης γίνεται µε παρατήρηση του

54

τρυβλίου στο µικροσκόπιο . Κύτταρα υγιή θεωρούνται αυτά που είναι προσκολληµένα στον πυθµένα του τρυβλίου χωρίς να έχει αλλάξει η µορφολογία τους . Η διαδικασία της ανακαλλιέργειας περιλαµβάνει τα κάτωθι βήµατα : 1. Μεταφορά του τρυβλίου σε θάλαµο νηµατικής ροής , όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες . 2. Αναρρόφηση του θρεπτικού µέσου της καλλιέργειας µε πιπέτα Pasteur υπό κενό . 3. Έκπλυση των κυττάρων δύο φορές µε PBS 1x pH:7,4. Με τη διαδικασία αυτή αποµακρύνονται τυχόν εναποµείναντα ίχνη ορού , τα οποία περιέχουν αναστολείς τρυψίνης . 4. Προσθήκη 1mL τρυψίνης ανά τρυβλίο διαµέτρου 100mm ή 0,5mL τρυψίνης ανά τρυβλίο διαµέτρου 60mm. 5. Παρατήρηση της αποκόλλησης των κυττάρων στο µικροσκόπιο . Υπό την επίδραση της τρυψίνης , τα κύτταρα αποκτούν σφαιρική µορφή και αποκολλώνται από το υπόστρωµα . 6. Μετά την αποκόλληση των κυττάρων , προστίθενται 3mL πλήρους θρεπτικού µέσου για την αναστολή της δράσης της τρυψίνης . 7. Μεταφορά του εναιωρήµατος των κυττάρων σε αποστειρωµένο σωλήνα falcon των 15mL. 8. Προσθήκη PBS 1x και συλλογή των κυττάρων που έχουν εναποµείνει µέσα στο τρυβλίο . 9. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στους 25 oC σε 1500rpm. 10. Αποµάκρυνση του υπερκείµενου θρεπτικού µέσου και προσθήκη 3mL πλήρους θρεπτικού µέσου . Επαναιώρηση των κυττάρων µε την βοήθεια πιπέτας . 11. Προσθήκη 10 µL από το εναιώρηµα των κυττάρων στην ειδική υποδοχή του αιµατοκυτταρόµετρου και µέτρηση του αριθµού των κυττάρων στο µικροσκόπιο . 12. Για κάθε ανακαλλιέργεια κυττάρων χρησιµοποιήθηκαν 10 6 κύτταρα .

Υλικά και διαλύµατα

Αποστειρωµένο ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών PBS 1x: Na 2HPO 4 10mM,

KH 2PO 4 5mM, NaCl 20mM, pH 7.4. Πλήρες θρεπτικό µέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (Παράγραφο 3.3.1). Τρυψίνη EDTA 0.05% .

55

3.3.3 Μέτρηση κυττάρων σε αιµατοκυτταρόµετρο Neubauer

Είναι η πιο άµεση , απλή και αποδοτική µέθοδος µέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρηµα . Το αιµατοκυτταρόµετρο ( Εικόνα 3.3) είναι µια τροποποιηµένη και διαβαθµισµένη αντικειµενοφόρος πλάκα , που περιέχει δυο κατάλληλα κατεργασµένες , λείες επιφάνειες . Σε κάθε µια από αυτές διακρίνεται µια διαγράµµιση σε µορφή τετραγωνισµένου πλέγµατος , το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα µε µήκος πλευράς 1mm ( το εµβαδόν του τετραγώνου είναι 1mm 2). Το καθένα από αυτά τα τετράγωνα ορίζεται από τρεις παράλληλες γραµµές που απέχουν µεταξύ τους µόλις 2,5 µm και χρησιµεύουν για τον καθορισµό της θέσης των κυττάρων ( εντός ή εκτός του πλέγµατος ). Το κάθε τετράγωνο εµφανίζει διαβαθµίσεις για διευκόλυνση της µέτρησης των κυττάρων . Το αιµατοκυτταρόµετρο εµφανίζει δύο ίσου µεγέθους , λείες , προεξέχουσες επιφάνειες , µε επίπεδο παράλληλο µε τις διαγραµµισµένες , που ονοµάζονται « ράχες » και στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα . Οι διαγραµµισµένες επιφάνειες βρίσκονται 0,1mm χαµηλότερα από τις « ράχες ». Μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισµένης επιφάνειας και των σηµείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα , υπάρχει µία κοίλη επιφάνεια . Στην κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρηµα , το οποίο µε τριχοειδικά φαινόµενα απλώνεται στην τετραγωνισµένη επιφάνεια .

Εικόνα 3.3: Αιµατοκυτταρόµετρο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηµατικά και ο τρόπος υπολογισµού των κυττάρων .

56

Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήµατος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα τετράγωνα είναι 0,1mm 3 (1mm 2 x 0,1mm) ή 10 -4mL. Εποµένως , η συγκέντρωση των κυττάρων στο κυτταρικό εναιώρηµα ( κύτταρα /mL) είναι : Αριθµός κυττάρων στο ένα από τα κύρια τετράγωνα x 10 4

3.3.4 Κατάψυξη κυττάρων

Η διατήρηση των κυττάρων για µεγάλο χρονικό διάστηµα είναι δυνατή µε την αποθήκευση τους σε υγρό άζωτο σε θερµοκρασίες µεταξύ -195 oC και -210 oC. Για µικρότερο χρονικό διάστηµα ( λίγους µήνες ), µπορούν να διατηρηθούν και σε θερµοκρασίες -80 οC. Για την επιτυχή διατήρηση τους είναι απαραίτητο να βρίσκονται σε καλή µεταβολική κατάσταση πριν από την ψύξη τους και για το λόγο αυτό κατά γενικό κανόνα η ψύξη των κυττάρων πραγµατοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου . Επιπλέον , η ψύξη των κυττάρων πραγµατοποιείται βαθµιαία ( περίπου 1 oC ανά ώρα ) µέχρι η θερµοκρασία τους να φτάσει ένα κρίσιµο σηµείο (-20 oC). Η βαθµιαία ψύξη επιτυγχάνεται µε τη χρήση µιας συσκευής µε υποδοχές , η οποία περιέχει ισοπροπανόλη , λόγω της οποίας γίνεται και η σταδιακή ψύξη . Προκειµένου να αποφευχθεί ο σχηµατισµός πάγου στο εσωτερικό τους και να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια νερού , χρησιµοποιείται διµεθυλο - σουλφοξείδιο (dimethyl-sulfoxide, DMSO). Η διαδικασία κατάψυξης των κυττάρων περιγράφεται παρακάτω : 1. Αποκόλληση των κυττάρων από την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται , όπως περιγράφτηκε στην Παράγραφο 3.3.2. 2. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στους 25 oC σε 1500rpm. 3. Ενώ πραγµατοποιείται η φυγοκέντρηση , σηµειώνεται σε φιαλίδιο cryovial ο κυτταρικός τύπος , η ηµεροµηνία ψύξης , ο αριθµός και η γενιά των κυττάρων . 4. Όταν ολοκληρωθεί η φυγοκέντρηση , αφαιρείται το υπερκείµενο θρεπτικό µέσο µε πιπέτα Pasteur υπό κενό. 5. Επαναιώρηση του ιζήµατος των κυττάρων σε 1mL πλήρους θρεπτικού µέσου περιεκτικότητας 10% DMSO. 6. Τοποθέτηση των φιαλιδίων στις κατάλληλες υποδοχές του δοχείου ψύξης κυττάρων που περιέχει παγωµένη ισοπροπανόλη και εναπόθεση του δοχείου ψύξης στους -80 οC για 24 ώρες . Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η σταδιακή µείωση της θερµοκρασίας ( περίπου 1 οC ανά ώρα ).

57

7. Τοποθέτηση του φιαλιδίου cryovial για την ψύξη των κυττάρων σε ειδική υποδοχή βυθισµένη σε υγρό άζωτο στο δοχείο Dewar. 8. Καταγραφή στο τετράδιο του δοχείου Dewar της θέσης που βρίσκεται το φιαλίδιο , του είδους των κυττάρων , της ηµεροµηνίας και της γενιάς που θα έχουν τα κύτταρα όταν ξεπαγώσουν .

Υλικά και διαλύµατα

∆ιµεθυλο -σουλφοξείδιο (DMSO): ειδικό για κυτταροκαλλιέργειες (cell culture grade). Πλήρες θρεπτικό µέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (Παράγραφο 3.3.1). Τρυψίνη EDTA 0.05% . Ειδικά φιαλίδια για την ψύξη των κυττάρων (cryovials). ∆οχείο ψύξης κυττάρων µε ισοπροπανόλη . ∆οχείο Dewar µε υγρό άζωτο και ειδικές υποδοχές για την αποθήκευση των φιαλιδίων µε τα κύτταρα .

3.3.5 Απόψυξη κυττάρων

1. Σε αποστειρωµένο σωλήνα falcon των 15mL προστίθενται 9mL απλού θρεπτικού µέσου των συγκεκριµένων κυττάρων . 2. Αφαίρεση των κυττάρων από το υγρό άζωτο . 3. Σύντοµο ξεπάγωµα σε υδατόλουτρο στους 37 οC. 4. Μεταφορά των κυττάρων στ o σωλήνα µε τα 9mL και γρήγορη ανάδευση . Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο θρεπτικό µέσο που βρίσκονται τα κύτταρα . 5. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στους 25 οC σε 1500rpm. 6. Απόρριψη του υπερκειµένου µε πιπέτα Pasteur υπό κενό . 7. Επαναιώρηση του ιζήµατος των κυττάρων σε 3mL θρεπτικού µέσου στο δοκιµαστικό σωλήνα . Προσθήκη θρεπτικού µέσου µέχρι 10mL. 8. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στους 25 οC σε 1500rpm. 9. Απόρριψη του υπερκειµένου µε πιπέτα Pasteur υπό κενό .6

58

10. Επαναιώρηση του ιζήµατος των κυττάρων σε 3mL πλήρους θρεπτικού µέσου στο δοκιµαστικό σωλήνα . Προσθήκη πλήρους θρεπτικού µέσου µέχρι 10mL. 11. Μεταφορά των κυττάρων σε τρυβλίο καλλιέργειας . 12. Παρατήρηση των κυττάρων στο µικροσκόπιο . 13. Μεταφορά του τρυβλίου στον επωαστικό θάλαµο . 14. Αλλαγή πλήρους θρεπτικού µέσου κάθε 2-3 ηµέρες µέχρι τα κύτταρα να φθάνουν σε βαθµό επικάλυψης του τρυβλίου 80-90%.

Υλικά και διαλύµατα

Θρεπτικό µέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (Παράγραφο 3.3.1). Πλήρες θρεπτικό µέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (Παράγραφο 3.3.1).

3.4 Αποµόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων

1. Αφαίρεση του θρεπτικού µέσου της καλλιέργειας µε πιπέτα Pasteur υπό κενό . 2. Τοποθέτηση του τρυβλίου σε πάγο . 3. Έκπλυση των κυττάρων δύο φορές µε κρύο PBS 1x. 4. Προσθήκη 0,5mL κρύου διαλύµατος RIPA µε αναστολείς πρωτεασών σε τρυβλίο 100mm ή 250 µL σε τρυβλίο 60mm και παραµονή σε πάγο για 10 λεπτά . 5. Λύση των κυττάρων µε µηχανικό τρόπο µε ελαστική ξύστρα (cell scraper) πάντα σε πάγο . 6. Μεταφορά του οµογενοποιήµατος σε σωληνάριο φυγοκέντρου . 7. Φυγοκέντρηση σε 10000g για 15 λεπτά στους 4 οC. 8. Μεταφορά του υπερκειµένου σε νέο σωληνάριο φυγοκέντρου . 9. Στη συνέχεια γίνεται προσδιορισµός της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης .

Υλικά και διαλύµατα

Αποστειρωµένο ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών PBS 1x: Na 2HPO 4 10mM,

KH 2PO 4 5mM, NaCl 20mM, pH 7.4.

59

∆ιάλυµα RIPA (RIPA buffer) pH 7.4: 20mM Tris, 150mM NaCl, 50mM NaF, 1mM EGTA, 1mM EDTA, 1mM glycerol phosphatase, 1% Triton X-100, 0,5% SDS. ∆ισκία αναστολέων πρωτεασών (Complete Mini, Roche).

3.5 Προσδιορισµός συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης σε διάλυµα

Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης σε διάλυµα γίνεται µε τη χρήση των αντιδραστηρίων “DC Protein assay kit” της εταιρείας Biorad. Πρόκειται για µια χρωµατοµετρική µέθοδο προσδιορισµού της συγκέντρωσης πρωτεΐνης . Η διαδικασία περιλαµβάνει τα εξής βήµατα : 1. Ετοιµάζουµε 8 διαλύµατα BSA (Bovine Serum Alboumin) µε γνωστές πρότυπες συγκεντρώσεις 0 έως 4mg/mL. Η πρότυπη καµπύλη αναφοράς ετοιµάζεται πριν από κάθε µέτρηση και είναι στο ίδιο διάλυµα λύσης µε τα προς εξέταση δείγµατα . 2. Αναµειγνύονται καλά σε πλαστικό σωλήνα , 1mL από το Reagent A και 20 µL από το Reagent S. Αυτό το διάλυµα ετοιµάζεται ακριβώς πριν από την εκάστοτε χρήση . 3. Με τη χρήση πιπέτας προσθέτουµε 25 µL από το παραπάνω διάλυµα αντιδραστηρίων στις κυψελίδες ενός πλακιδίου 96-µικροκυψελίδων . 4. Στη συνέχεια µεταφέρουµε 5 µL από τα 8 διαλύµατα πρωτεΐνης BSA γνωστής συγκέντρωσης σε κάθε µικροκυψελίδα του πλακιδίου αντίστοιχα και την ίδια ποσότητα από τα προς µέτρηση δείγµατα . Φροντίζουµε τα δείγµατά µας να βρίσκονται στον πάγο κατά τη διάρκεια της όλης διαδικασίας . 5. Έπειτα προσθέτουµε 200 µL από το Reagent Β σε κάθε µικροκυψελίδα . 6. Κάνουµε ήπια ανάδευση του πλακιδίου για 30 δευτερόλεπτα προσεκτικά ώστε να µην αναµειχθούν τα δείγµατα και να αποφύγουµε το σχηµατισµό φυσαλίδων . 7. Καλύπτουµε το πλακίδιο µε διάφανη µεµβράνη και επωάζουµε σε θερµοκρασία δωµατίου για 15 λεπτά , ελέγχουµε τυχόν παρουσία φυσαλίδων τις οποίες και αφαιρούµε και µετράµε την απορρόφηση σε µήκος κύµατος 750nm.

60

3.6 Ανάλυση πρωτεϊνών µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου (SDS-PAGE)

Η ανάλυση των πρωτεϊνών έγινε µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου , παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων (SDS, DTT). Το SDS είναι ένα ιοντικό απορρυπαντικό το οποίο δεσµεύεται στις πρωτεΐνες µε σταθερή αναλογία βάρους . Η επιπλέον χρήση αναγωγικών παραγόντων , όπως είναι η διθειοθρεϊτόλη (DTT) ή η β- µερκαπτοαιθανόλη , έχει ως αποτέλεσµα την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσµών των πρωτεϊνών . Η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται µε θέρµανση των πρωτεϊνικών δειγµάτων για 4 λεπτά στους 100 οC, παρουσία όλων των παραπάνω αποδιατακτικών παραγόντων . Εξαιτίας του SDS, οι πρωτεΐνες που περιέχονται στα δείγµατα έχουν φορτιστεί αρνητικά και είναι δυνατή η κίνησή τους όταν βρεθούν εντός ηλεκτρικού πεδίου . Η ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα είναι συνάρτηση του µοριακού τους βάρους . Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής : 1. ∆ιαµορφώνεται ειδική υάλινη µήτρα διαστάσεων 9,5cm x 7,5cm x 0,1cm, µέσα στην οποία θα πραγµατοποιηθεί ο πολυµερισµός των πηκτωµάτων διαχωρισµού και φόρτωσης . 2. Πραγµατοποιείται πολύ καλή και γρήγορη ανάδευση των συστατικών που απαρτίζουν το πήκτωµα διαχωρισµού . 3. Μεταφορά του πηκτώµατος διαχωρισµού στην υάλινη µήτρα και επικάλυψη µε απεσταγµένο νερό . Παρατηρούµε τον πολυµερισµό του πηκτώµατος έτσι ώστε να βεβαιωθούµε ότι πραγµατοποιείται φυσιολογικά (15-30 λεπτά , ανάλογα µε τη σύσταση του πηκτώµατος ή/και τη θερµοκρασία του περιβάλλοντος ). 4. Αποµακρύνεται το απεσταγµένο νερό από την επιφάνεια του πηκτώµατος . 5. Πραγµατοποιείται πολύ καλή και γρήγορη ανάδευση του πηκτώµατος φόρτωσης . 6. Μεταφορά του πηκτώµατος φόρτωσης στην υάλινη µήτρα , πάνω από την επιφάνεια του πηκτώµατος διαχωρισµού . Παρατηρούµε τον πολυµερισµό του πηκτώµατος για να βεβαιωθούµε ότι πραγµατοποιείται φυσιολογικά (5-15 λεπτά ανάλογα µε τη θερµοκρασία του περιβάλλοντος ). 7. Προσθήκη των δειγµάτων στις ειδικές υποδοχές του πηκτώµατος φόρτωσης . • Στο ίζηµα από τα κυτταρικά δείγµατα που συλλέχθησαν από την υγρή καλλιέργεια των βακτηρίων προστίθενται 100 µL διαλύµατος φόρτωσης 1x και 50mM DTT. Ακολουθεί επώαση σε υδατόλουτρο 100 οC για 4 λεπτά . Έπειτα

61

ψύξη στους -80 οC για 30 λεπτά και επώαση ξανά στους 100 οC για 2 λεπτά . Τα δείγµατα φυγοκεντρούνται σε 15000 rpm για 1 λεπτό και στη συνέχεια τοποθετούνται στις ειδικές υποδοχές του πηκτώµατος φόρτωσης . • Στα δείγµατα πρωτεϊνικού εκχυλίσµατος (30 µL), προστίθεται 10 µL διαλύµατος φόρτωσης πρωτεϊνών 4x. Τα δείγµατα επωάζονται για 5 λεπτά σε υδατόλουτρο 100 οC, φυγοκεντρούνται σε 15000rpm για 1 λεπτό και στη συνέχεια τοποθετούνται στις ειδικές υποδοχές του πηκτώµατος φόρτωσης . 8. Παράλληλα µε τα προς εξέταση δείγµατα γίνεται ανάλυση µείγµατος πρωτεϊνών γνωστών µοριακών µεγεθών . 9. Γεµίζουµε το χώρο της συσκευής µε το διάλυµα ηλεκτροφόρησης , κλείνουµε τη συσκευή και συνδέουµε το τροφοδοτικό µηχάνηµα . 10. Ρυθµίζουµε το τροφοδοτικό στα 120V/20mA για µισή ώρα και µετά στα 160V.

Υλικά και διαλύµατα

Tris-HCl 0,5M, pH 6.8: Tris-base 6.055 g σε απεσταγµένο νερό . Αρχική προσθήκη 80mL απεσταγµένου νερού , ρύθµιση του διαλύµατος σε pH=6.8 και προσθήκη απεσταγµένου νερού µέχρι τελικού όγκου 100mL. Tris-HCl 1,5M, pH 8.8: Tris-base 18.165 g σε απεσταγµένο νερό . Αρχική προσθήκη 80mL απεσταγµένου νερού , ρύθµιση του διαλύµατος σε pH=8.8 και προσθήκη απεσταγµένου νερού µέχρι τελικού όγκου 100mL. ∆ιάλυµα δωδεκακυλοθειικού νατρίου (SDS) 10% w/v. SDS 10 g σε a πεσταγµένο νερό . Αρχική προσθήκη 90mL απεσταγµένου νερού , ρύθµιση του διαλύµατος σε pH=7.9 και προσθήκη απεσταγµένου νερού µέχρι τελικού όγκου 100mL. ∆ιάλυµα APS 10%: 1 g APS σε 10mL απεσταγµένου νερού (αποθήκευση -20 οC) Ν,Ν,Ν’, Ν’-Τετραµεθυλ -αιθυλεν -διαµίνη (N,N,N’,N’-Tetramethylenethylene- diamine, TEMED) Ρυθµιστικό διάλυµα φόρτωσης δειγµάτων για πρωτεΐνες 4x: 40% γλυκερόλης , 10%SDS, 0,1M Tris-HCl pH 6,8, 2% κυανό της βρωµοφαινόλης , 20% µερκαπτοαιθανόλη . Ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης : 3 g/L Tris-base, 14,4 g/L γλυκίνη , 1gr SDS,

ddH2O µέχρι το 1L.

62

Πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου -SDS συµπύκνωσης : 3mL ddH 2O, 0,5mL ακρυλαµιδίου 40%, 1,25mL Tris-HCl 0,5M pH 6,8, 10% w/v SDS, 25 µL APS 10%, 5µL TEMED.

Πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου -SDS διαχωρισµού 12%: 3,8mL ddH 2O, 2,5mL ακρυλαµιδίου 40%, 2,2mL Tris-HCl 1,5M pH 8,8, 10% w/v SDS, 50 µL APS 10%, 5µL TEMED.

Πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου -SDS διαχωρισµού 15%: 3,1mL ddH 2O, 3,2mL ακρυλαµιδίου 40%, 2,2mL Tris-HCl 1,5M pH 8,8, 10% w/v SDS, 50 µL APS 10%, 5µL TEMED. Έγχρωµοι µάρτυρες διαφόρων µοριακών µεγεθών από Nippon Genetics Europe GmbH.

3.7 Απεικόνιση πρωτεϊνών µε χρώση Coomassie

Τα δείγµατα πρωτεΐνης από την αποµόνωση µε χρωµατογραφία ( όρα Παράγραφο 3.2) απεικονίζονται µετά την ηλεκτροφόρηση , µε χρώση Coomassie. Η χρωστική Coomassie blue προσδένεται σε αρωµατικά αµινοξέα των πρωτεϊνών , αλλάζοντας χρώµα από κοκκινωπό -καφέ έως έντονο µπλε . Ακολουθεί η εξής διαδικασία : 1. Όταν τελειώσει η ηλεκτροφόρηση αφαιρούµε το πήκτωµα διαχωρισµού , αφού ανοίξουµε τις γυάλινες πλάκες και το τοποθετούµε σε ένα πλαστικό δοχείο µε τη χρωστική Coomassie blue. 2. Προστίθεται το διάλυµα χρωµατισµού , τόσο ώστε να καλύψει την επιφάνεια του πηκτώµατος , για µία ώρα . 3. Αποχύνουµε τη χρωστική , µετά προσθέτουµε το διάλυµα αποχρωµατισµού και αφήνουµε για µισή ώρα . 4. Αποχύνουµε το διάλυµα αποχρωµατισµού και προσθέτουµε νέα ποσότητα . 5. Ακολουθεί το παραπάνω βήµα όσες φορές είναι απαραίτητο µέχρις ότου διακριθούν οι πρωτεϊνικές µπάντες . 6. Όταν εµφανιστούν οι πρωτεϊνικές µπάντες αποχύνουµε το διάλυµα αποχρωµατισµού και φωτογραφίζουµε την πηκτή .

63

Υλικά και διαλύµατα

∆ιάλυµα χρωµατισµού της πηκτής πολυακρυλαµιδίου : 0,1% κ.β. Coomassie Blue R-250, 40%v/v αιθανόλη , 10% οξικό οξύ . ∆ιάλυµα αποχρωµατισµού της πηκτής πολυακρυλαµιδίου : 5%v/v µεθανόλη , 7,5% v/v οξικό οξύ .

3.8 Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western

Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης , γίνεται τοποθέτηση του πηκτώµατος διαχωρισµού σε κατάλληλη συσκευή , για µεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωµα σε µεµβράνη PVDF. 1. Αρχικά γίνεται επώαση της µεµβράνης PVDF µε µεθανόλη για 5 λεπτά . 2. Στη συνέχεια επωάζεται µε το ρυθµιστικό διάλυµα µεταφοράς για 5 λεπτά . 3. Τοποθέτηση της µεµβράνης PVDF µε το πήκτωµα διαχωρισµού ανάµεσα σε δύο διηθητικά χαρτιά τύπου Whatman και στη συνέχεια ανάµεσα σε δύο σπόγγους . Εναπόθεση της παραπάνω διάταξης στη συσκευή ηλεκτροµεταφοράς πρωτεϊνών . 4. Εφαρµογή σταθερής τάσης 100V για 1,5 ώρα . Τα δείγµατα µεταφέρονται από τον αρνητικό στο θετικό πόλο . 5. Ακολουθεί κορεσµός των µη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωµάτων (blocking) µε επώαση της µεµβράνης σε ρυθµιστικό διάλυµα TBS-T µε 5% άπαχο γάλα για 1 ώρα υπό ανακίνηση σε θερµοκρασία δωµατίου . 6. Εµβάπτιση της µεµβράνης και επώαση σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει το πρώτο αντίσωµα σε κατάλληλη αραίωση . Ολονύκτια επώαση στους 4 οC υπό ανακίνηση . 7. Την επόµενη µέρα πραγµατοποιούνται 2 ξεπλύµατα της µεµβράνης για 10 λεπτά µε ρυθµιστικό διάλυµα TBS–T 0,2% σε θερµοκρασία δωµατίου . 8. Εµβάπτιση της µεµβράνης και επώαση σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει το δεύτερο αντίσωµα , σε θερµοκρασία δωµατίου για 2 ώρες υπό ανακίνηση . 9. Πραγµατοποιούνται 3 ξεπλύµατα της µεµβράνης για 10 λεπτά µε ρυθµιστικό διάλυµα TBS–T 0,2% σε θερµοκρασία δωµατίου .

64

10. Το ανοσοαποτύπωµα της πρωτεΐνης στη µεµβράνη εµφανίζεται στο φιλµ µε τη χρήση του συστήµατος χηµειοφωταύγειας (ECL).

Υλικά και διαλύµατα

Ρυθµιστικό διάλυµα για τη συσκευή µεταφοράς πρωτεϊνών: Γλυκίνη 7,5 g, Tris- base 1,5 g, Μεθανόλη ( απόλυτη ) 10% w/v. Αρχικά προστίθενται η γλυκίνη και Tris- base σε 800mL απεσταγµένο νερό υπό ανάδευση , στη συνέχεια 100mL µεθανόλης και τέλος συµπληρώνεται το απεσταγµένο νερό µέχρι τελικού όγκου διαλύµατος 1L. Ρυθµιστικό διάλυµα TBS pH 7,4 (10x): Tris-base 24,2 g, NaCl 80 g σε απεσταγµένο νερό . Αρχικά προστίθενται Tris-base και NaCl σε 800mL απεσταγµένο νερό υπό ανάδευση , ρυθµίζεται το pH 7,4 και τέλος συµπληρώνεται το απεσταγµένο νερό µέχρι τελικού όγκου διαλύµατος 1L. Αραίωση του διαλύµατος 1:10 πριν τη χρήση του . Ρυθµιστικό διάλυµα TBS-Tween 20, pH 7,4 (TBS-T): Ρυθµιστικό διάλυµα TBS (1x) και 0,2% Tween-20. Μεµβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride): Millipore Immobilon-P Transfer Membrane. Άπαχο γάλα σε σκόνη (Regilait): 5% σε ρυθµιστικό διάλυµα TBS-T. Πρώτα αντισωµάτα : • CBS (Rabbit mAb , Abnova): 1:1000 σε ρυθµιστικό διάλυµα TBS-T. • β-actin (13E5 Rabbit mAb , Cell Signalling): 1:4000 σε διάλυµα TBS-T. ∆εύτερο αντίσωµα : Anti-rabbit IgG (#7074, goat) συνδεδεµένο µε υπεροξειδάση (Cell Signalling): 1:2000 σε ρυθµιστικό διάλυµα TBS-T. Σύστηµα χηµειοφωταύγειας : Χρησιµοποιείται το ολοκληρωµένο σύστηµα χηµειοφωταύγειας από την Pierce (ECL detection kit) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA).

65

3.9 Προσδιορισµός παραγωγής υδροθείου

3.9.1 T εχνική του κυανού του µεθυλενίου

Πρόκειται για µια χρωµατοµετρική αναλυτική µέθοδο . Βασική αρχή της µεθόδου είναι η αντίδραση του παραχθέντος υδροθείου από τα ένζυµα CSE, CBS και 3 ΜSΤ µε µια φαινυλενοδιαµίνη (N,N-dimethyl-p-Phenylenediamine sulphate, DPD) παρουσία του οξειδωτικού παράγοντα Fe 3+ σε υδροχλωρικό οξύ για τη σύνθεση του

Σχήµα : Αντίδραση H2S µε DPD σε στοιχειοµετρία 1:2 παράγει κυανό του µεθυλενίου

κυανού του µεθυλενίου ( Σχήµα ). Στη συνέχεια υπολογίζεται η απορρόφηση του στα 655nm και η συγκέντρωση των προς ανάλυση δειγµάτων προσδιορίζεται βάσει µιας

πρότυπης καµπύλης ενός δότη σουλφιδίου (Na 2S) γνωστών συγκεντρώσεων . Η διαδικασία που ακολουθείται διαφέρει στο αρχικό στάδιο προετοιµασίας των δειγµάτων ανάλογα µε το ένζυµο που χρησιµοποιείται και ανάλογα µε τα προς µελέτη δείγµατα ( συγκέντρωση συνενζύµου , υποστρώµατος , αναστολέα ). Για τα ένζυµα CSE και C ΒS είναι γνωστές οι συνθήκες για την παραγωγή υδροθείου και την τεχνική του κυανού του µεθυλενίου και περιγράφονται παρακάτω .

• Παραγωγή H2S από CSE Κάθε δείγµα συνολικού όγκου 100 µL αποτελείται από το καθαρό αποµονωµένο ένζυµο CSE (5 µg), το υπόστρωµα L-κυστεΐνη (1mM), το συνένζυµο φωσφορική

πυριδοξάλη , PLP (0,01mM) και διάλυµα φωσφορικών (Na 2HPO 4 και NaH 2PO 4) 50m Μ, pH:8,2. Η προετοιµασία των δειγµάτων γίνεται πάντα σε πάγο . Η διαδικασία είναι η εξής : 1. Αρχικά τοποθετείται σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου eppendorf το διάλυµα φωσφορικών , το συνένζυµο και το ένζυµο . 2. Στις περιπτώσεις που µελετούνται αναστολείς προστίθεται και ο ανάλογος αναστολέας διατηρώντας τον τελικό όγκο του διαλύµατος στα 100 µL.

66

3. Τα δείγµατα αφήνονται στον πάγο για 15 λεπτά και στη συνέχεια προστίθεται το υπόστρωµα L-κυστεΐνη . 4. Τα eppendorf κλείνουν µε την προσθήκη parafilm και τοποθετούνται για επώαση σε υδατόλουτρο 37 οC υπό ανάδευση για 1 ώρα . 5. Κατά τη διάρκεια της επώασης των δειγµάτων ετοιµάζονται τα δείγµατα της πρότυπης καµπύλης υδροθείου 0/7,8/15,6/31,25/62,5/125/250 µΜ σε διάλυµα

φωσφορικών (Na 2HPO 4 και NaH 2PO 4) 50mM pH 8,2 και τοποθετούνται στον πάγο . 6. Με το πέρας της επώασης τα eppendorf µε τα δείγµατα τοποθετούνται αµέσως στον πάγο και ξεκινάει η µέθοδος ανάλυσης του κυανού του µεθυλενίου . 7. Αρχικά προστίθενται στα δείγµατα 100 µL ZnAc 1% ώστε να δεσµεύσει το υδρόθειο που έχει παραχθεί . Γίνεται ήπια ανάδευση µε το χέρι και επανατοποθετούνται τα δείγµατα στον πάγο . 8. Στη συνέχεια προστίθενται στα διαλύµατα 100 µL TCA 10% για την καταβύθιση των πρωτεϊνών και χωρίς να αναδεύσουµε τοποθετούµε τα δείγµατα στον πάγο . 9. Έπειτα 49 µL DPD 20mM και γίνεται ισχυρή ανάδευση .

10. Μετά από 1 λεπτό προστίθενται 43 µL FeCl 3 30mM και γίνεται ισχυρή ανάδευση . 11. Τέλος , τα δείγµατα επωάζονται σε θερµοκρασία δωµατίου προστατευµένα από φως για 15 λεπτά ώστε να γίνει ο σχηµατισµός του κυανού του µεθυλενίου . 12. Στη συνέχεια τοποθετούνται 200 µL των δειγµάτων σε πλακίδιο 96- µικροκυψελίδων και µετρείται η απορρόφησή τους στα 655nm µε τη χρήση φασµατοφωτοµέτρου .

• Παραγωγή H2S από CBS Κάθε δείγµα συνολικού όγκου 100 µL αποτελείται από το καθαρό αποµονωµένο ένζυµο CΒS (5 µg), τα υποστρώµατα L-κυστεΐνη (1mM) και οµοκυστεΐνη (1mM), το συνένζυµο φωσφορική πυριδοξάλη , PLP (0,01mM) και διάλυµα φωσφορικών

(Na 2HPO 4 και NaH 2PO 4) 50m Μ, pH:8,2. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι ακριβώς ίδια µε αυτή που περιγράφηκε για το CSE, µε κάποια τροποποίηση . Η διαφορά είναι στο 1 ο βήµα όπου , στα σωληνάρια µικροφυγοκέντρου eppendorf, µαζί µε το ένζυµο , το συνένζυµο και το διάλυµα φωσφορικών προστίθεται και η οµοκυστεΐνη .

67

• Παραγωγή H2S από 3 ΜSΤ Για το ένζυµο 3ΜSΤ δεν είναι γνωστές οι συνθήκες για την παραγωγή υδροθείου και την τεχνική του κυανού του µεθυλενίου . Εκτός από το διάλυµα των φωσφορικών , που έχει πάντα την ίδια συγκέντρωση , το ένζυµο 3ΜSΤ και το υπόστρωµα 3- µερκαπτοπυροσταφυλικό , 3 ΜΡ , µελετήθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών παραγωγής υδροθείου που να προσοµοιάζει τα επίπεδα σε φυσιολογικές καταστάσεις . Το ένζυµο µελετήθηκε απουσία και παρουσία υποστρώµατος (50 µΜ 3 ΜΡ ), µελετήθηκε σε ποσότητες 1-5-10-15 µg και σε συγκεντρώσεις 0-2,5m Μ υποστρώµατος 3 ΜΡ . Κάθε δείγµα συνολικού όγκου 100 µL αποτελείται από το καθαρό αποµονωµένο ένζυµο 3ΜSΤ, το υπόστρωµά του , 3-

µερκαπτοπυροσταφυλικό και το διάλυµα φωσφορικών (Na 2HPO 4 και NaH 2PO 4) 50m Μ, pH:8,2. Η προετοιµασία των δειγµάτων γίνεται πάντα σε πάγο . Η διαδικασία είναι η εξής : 1. Αρχικά τοποθετείται σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου eppendorf το διάλυµα φωσφορικών και το ένζυµο . 2. Στις περιπτώσεις που µελετούνται αναστολείς προστίθεται και ο ανάλογος αναστολέας διατηρώντας τον τελικό όγκο του διαλύµατος στα 100 µL. 3. Τα δείγµατα αφήνονται στον πάγο για 15 λεπτά και στη συνέχεια προστίθεται το υπόστρωµα 3-µερκαπτοπυροσταφυλικό . 4. Τα eppendorf κλείνουν µε την προσθήκη parafilm και τοποθετούνται για επώαση σε υδατόλουτρο 37 οC υπό ανάδευση για 1 ώρα . 5. Κατά τη διάρκεια της επώασης των δειγµάτων ετοιµάζονται τα δείγµατα της πρότυπης καµπύλης υδροθείου 0/7,8/15,6/31,25/62,5/125/250 µΜ σε διάλυµα

φωσφορικών (Na 2HPO 4 και NaH 2PO 4) 50mM pH 8,2 και τοποθετούνται στον πάγο . 6. Με το πέρας της επώασης τα eppendorf µε τα δείγµατα τοποθετούνται αµέσως στον πάγο και ξεκινάει η µέθοδος ανάλυσης του κυανού του µεθυλενίου . 7. Αρχικά προστίθενται στα δείγµατα 100 µL ZnAc 1% ώστε να δεσµεύσει το υδρόθειο που έχει παραχθεί . Γίνεται ήπια ανάδευση µε το χέρι και επανατοποθετούνται τα δείγµατα στον πάγο . 8. Στη συνέχεια προστίθενται στα διαλύµατα 100 µL TCA 10% για την καταβύθιση των πρωτεϊνών και χωρίς να αναδεύσουµε τοποθετούµε τα δείγµατα στον πάγο . 9. Έπειτα 49 µL DPD 20mM και γίνεται ισχυρή ανάδευση .

68

10. Μετά από 1 λεπτό προστίθενται 43 µL FeCl 3 30mM και γίνεται ισχυρή ανάδευση . 11. Τέλος , τα δείγµατα επωάζονται σε θερµοκρασία δωµατίου προστατευµένα από φως για 15 λεπτά ώστε να γίνει ο σχηµατισµός του κυανού του µεθυλενίου . 12. Στη συνέχεια τοποθετούνται 200 µL των δειγµάτων σε πλακίδιο 96- µικροκυψελίδων και µετρείται η απορρόφησή τους στα 655nm µε τη χρήση φασµατοφωτοµέτρου . Σηµείωση : Τα διαλύµατα των υποστρωµάτων (L-κυστεΐνη , οµοκυστεΐνη και 3-

µερκαπτοπυροσταφυλικό ) καθώς και τα διαλύµατα DPD και FeCl 3 ετοιµάζονται πάντα φρέσκα λίγο πριν τη χρήση τους .

• Σάρωση των ουσιών της βιβλιοθήκης LOPAC Η σάρωση των ουσιών έγινε µε την τεχνική του κυανού µεθυλενίου µε ορισµένες τροποποιήσεις . Οι ποσότητες των ενζύµων CSE και C ΒS που χρησιµοποιήθηκαν είναι 3 µg. Η διαδικασία περιγράφεται παρακάτω : 1. Κάθε δείγµα συνολικού όγκου 60 µL αποτελείται από το καθαρό αποµονωµένο ένζυµο CSE ή C ΒS (3 µg), τα υποστρώµατα L-κυστεΐνη (1mM) ή/και οµοκυστεΐνη (1mM), το συνένζυµο φωσφορική πυριδοξάλη , PLP (0,01mM), το

διάλυµα φωσφορικών (Na 2HPO 4 και NaH 2PO 4) 50m Μ, pH:8,2 και DMSO 1% για τα δείγµατα του µάρτυρα ή τις ουσίες της βιβλιοθήκης προς µελέτη . 2. Αρχικά τοποθετείται σε πλαστικό σωλήνα 15mL το διάλυµα φωσφορικών , το συνένζυµο και το ένζυµο (στην περίπτωση του C ΒS προστίθεται και οµοκυστεΐνη ) για συνολικά 96 δείγµατα ( πάντα υπολογίζουµε παραπάνω ποσότητα ). 3. Με τη χρήση πολλαπλής πιπέτας προσθέτουµε 48 µL από το διάλυµα του 2 ου βήµατος σε κάθε σωληνάριο ενός πλακιδίου 96-σωληναρίων πολυπροπυλενίου . 4. Στις περιπτώσεις του µάρτυρα προστίθεται 6 µL DMSO 10% και για τις ουσίες προς µελέτη προστίθενται 6 µL των ουσιών σε συγκέντρωση 1mΜ ( ούτως ώστε στο τελικό δείγµα των 60 µL να έχουν συγκέντρωση 100 µΜ ). 5. Τα δείγµατα αφήνονται στον πάγο για 15 λεπτά και στη συνέχεια προστίθενται 6µL µε το υπόστρωµα L-κυστεΐνη . 6. Καλύπτουµε τα σωληνάρια µε ειδικό κάλυµµα σιλικόνης και το πλακίδιο τοποθετείται για επώαση σε υδατόλουτρο 37 οC υπό ανάδευση για 1 ώρα .

69

7. Κατά τη διάρκεια της επώασης των δειγµάτων ετοιµάζονται τα δείγµατα της πρότυπης καµπύλης υδροθείου 0/7,8/15,6/31,25/62,5/125/250 µΜ σε διάλυµα

φωσφορικών (Na 2HPO 4 και NaH 2PO 4) 50mM, DMSO 1% και pH 8,2 σε συνολικό όγκο 60 µL και τοποθετούνται στον πάγο . 8. Με το πέρας της επώασης το πλακίδιο µε τα δείγµατα τοποθετείται αµέσως στον πάγο και ξεκινάει η µέθοδος ανάλυσης του κυανού του µεθυλενίου . 9. Αρχικά προστίθενται στα δείγµατα , µε τη χρήση πολλαπλής πιπέτας , 60 µL ZnAc 1%. 10. Στη συνέχεια προστίθενται στα διαλύµατα 60 µL TCA 10%. 11. Έπειτα 10 µL DPD 47,5mM.

12. Μετά από 1 λεπτό προστίθενται 10 µL FeCl 3 66mM. 13. Τέλος , τα δείγµατα επωάζονται σε θερµοκρασία δωµατίου προστατευµένα από φως για 15 λεπτά ώστε να γίνει ο σχηµατισµός του κυανού του µεθυλενίου . 14. Στη συνέχεια αφαιρούνται τα 200 µL των δειγµάτων και τοποθετούνται σε πλακίδιο πολυστυρενίου 96-µικροκυψελίδων και µετρείται η απορρόφησή τους στα 655nm µε τη χρήση φασµατοφωτοµέτρου .

Υλικά και διαλύµατα

∆ιάλυµα φωσφορικών 1 Μ: 93,2 mL Na 2HPO 4 1Μ, 6,8 mL NaH 2PO 4 1Μ pH 8,2. Αραίωση µε απεσταγµένο νερό σε 50mM πριν τη χρήση του .

∆ιάλυµα φωσφορικής πυριδοξάλης , PLP 2mM σε ddH 2O. ∆ιαλύµατα L-κυστεΐνη , οµοκυστεΐνη και 3-µερκαπτοπυροσταφυλικό , 3 ΜΡ , σε

ddH 2O.

∆ιάλυµα ZnAc 1%: 0,5g σε 50mL ddH 2O.

∆ιάλυµα TCA 10%: 5g σε 50mL ddH 2O. ∆ιάλυµα DPD 20mM και 47,5mM σε HCl 7,2M.

∆ιάλυµα FeCl 3 30mM και 66mM σε HCl 1,2M. ∆ιµεθυλο -σουλφοξείδιο (DMSO)

Na 2S και GYY4137 σε ddH 2O ή DMSO, ανάλογα την περίπτωση . Οι αναστολείς που χρησιµοποιήθηκαν είναι :

Αminooxyacetate (AOAA) και D,L-propargylglycine (PAG): σε ddH 2O ή DMSO, ανάλογα την περίπτωση .

70

Οι ουσίες που µελετήθηκαν διαλυτοποιήθηκαν σε ddH 2O ή DMSO, ανάλογα την περίπτωση : Aminoethoxyvinyl-glycine (AVG), Hydrazino-L-alanine, Hydrazino-glycine και S-

αδενόσυλο -L-µεθειονίνη (S-adenosyl-L-methionine, SAM) σε ddH 2O. Τα PLP ανάλογα , οι ουσίες της βιβλιοθήκης LOPAC και οι τετρακυκλίνες σε DMSO .

3.9.2 Τεχνική του AzMC φθορισµού

Η αρχή της µεθόδου βασίζεται στην αναγωγή της ένωσης 7-αζιδο -4- µεθυλοκουµαρίνη (7-azido-4-methylcoumarin, AzMC) από το ελεύθερο υδρόθειο , στο φθορίζον παράγωγο 7-αµινο -4-µεθυλοκουµαρίνη (7-amino-4-methylcoumarin, AMC). Ο προσδιορισµός της παραγωγής υδροθείου από τον ανιχνευτή AzMC πραγµατοποιείται σε οµογενοποιήµατα κυττάρων αλλά και σε ζωντανά κύτταρα σε πραγµατικό χρόνο .

• Παραγωγή H2S σε οµογενοποιήµατα κυττάρων Αρχικά γίνεται η αποµόνωση του πρωτεϊνικού εκχυλίσµατος από την καλλιέργεια των κυττάρων . Τα βήµατα έχουν ως εξής : 1. Αφαίρεση του θρεπτικού µέσου της καλλιέργειας µε πιπέτα Pasteur υπό κενό . 2. Τοποθέτηση του τρυβλίου σε πάγο . 3. Έκπλυση των κυττάρων δύο φορές µε κρύο PBS 1x. 4. Προσθήκη 10mL κρύου PBS 1x σε φιάλη 225cm 2 και παραµονή σε πάγο για 10 λεπτά . 5. Συλλογή των κυττάρων µε ελαστική ξύστρα (cell scraper) πάντα σε πάγο . 6. Μεταφορά σε πλαστικό σωλήνα φυγοκέντρου . 7. Φυγοκέντρηση σε 700g για 10 λεπτά στους 4 οC. 8. Επαναδιάλυση του ιζήµατος των κυττάρων σε κρύο διάλυµα λύσης µη - αποδιατακατικών παραγόντων ΝP-40. 9. Παραµονή στον πάγο για 1 ώρα . 10. Φυγοκέντρηση σε 20000g για 5 λεπτά στους 4 οC. 11. Μεταφορά του υπερκειµένου σε νέο σωλήνα φυγοκέντρου .

71

12. Στη συνέχεια γίνεται προσδιορισµός της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης . Εφόσον υπολογιστεί η συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης , ετοιµάζονται τα δείγµατα σε πλακίδιο 96-µικροκυψελίδων , συνολικού όγκου 200 µL: 1. Κάθε δείγµα περιέχει 300 µg πρωτεϊνικού εκχυλίσµατος , 100mM Tris-HCl pH:8, 50 µΜ PLP, 10mM L-κυστεΐνη , 0,5mM οµοκυστεΐνη , 0,1-3mM SAM και 10 µΜ AzMC. 2. Τα δείγµατα της πρότυπης καµπύλης υδροθείου 0/7,8/15,6/31,25/62,5/125/250 µΜ ετοιµάζονται σε διάλυµα 100mM Tris-HCl pH:8, 10 µΜ AzMC. 3. Τα δείγµατα επωάζονται στους 37 οC για 2 ώρες .

4. Μετρείται ο φθορισµός σε µήκος κύµατος διέγερσης λex :365nm και µήκος

κύµατος εκποµπής λem :450nm µε τη χρήση φασµατοφωτόµετρου .

Υλικά και διαλύµατα

Αποστειρωµένο ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών PBS 1x: Na 2HPO 4 10mM,

KH 2PO 4 5mM, NaCl 20mM, pH 7.4. Ρυθµιστικό διάλυµα λύσης µη -αποδιατακατικών παραγόντων ΝP-40: 50mM Tris-HCl pH:8, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% Triton X-100. Ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl 100mM pH:8.

∆ιάλυµα φωσφορικής πυριδοξάλης , PLP 2mM σε ddH 2O. ∆ιαλύµατα L-κυστεΐνη , οµοκυστεΐνη , S-αδενόσυλο -L-µεθειονίνη (S-adenosyl-L- methionine, SAM) και Αminooxyacetate (AOAA), σε ddH 2O. ∆ιµεθυλο -σουλφοξείδιο (DMSO).

Na 2S και AzMC σε DMSO.

• Ανίχνευση H2S σε κύτταρα σε πραγµατικό χρόνο Για τη µέθοδο αυτή αρχικά ανακαλλιεργούνται τα κύτταρα ( όρα Παράγραφο 3.3.2) και επιστρώνονται 30000 κύτταρα σε γυάλινο θάλαµο (Lab-Tek II chamber) καλυµµένο µε καλυπτρίδα . Η διαδικασία για την ανίχνευση υδροθείου στα κύτταρα περιγράφεται παρακάτω : 1. Τα κύτταρα επωάζονται ολονυκτίως σε επωαστικό θάλαµο στους 37 οC και 10%

CO 2.

72

2. Την επόµενη µέρα προστίθεται στο θρεπτικό µέσο των κυττάρων 10 µΜ AzMC και τα κύτταρα επωάζονται για 30 λεπτά . 3. Έπειτα προστίθενται στο θρεπτικό µέσο οι ουσίες προς µελέτη και η επώαση συνεχίζεται για 1 ώρα . 4. Ακολουθεί έκπλυση των κυττάρων τρεις φορές µε PBS 1x. 5. Ο φθορισµός των κυττάρων γίνεται ορατός µε ειδικό µικροσκόπιο φθορισµού µε κάµερα (Nikon eclipse 80i inverted microscope/ Photometric CoolSNAP HQ2 camera/ NIS-Elements BR 3.10 software).

Υλικά και διαλύµατα

Αποστειρωµένο ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών PBS 1x: Na 2HPO 4 10mM,

KH 2PO 4 5mM, NaCl 20mM, pH 7.4. Πλήρες θρεπτικό µέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (Παράγραφο 3.3.1). Τρυψίνη EDTA 0.05% . ∆ιαλύµατα S-αδενόσυλο -L-µεθειονίνη (S-adenosyl-L-methionine, SAM) και

Αminooxyacetate (AOAA) σε αποστειρωµένο ddH 2O. ∆ιµεθυλο -σουλφοξείδιο (DMSO) ειδικό για κυτταροκαλλιέργειες (cell culture grade). AzMC σε DMSO.

3.10 Έλεγχος της επίδρασης ουσιών στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων

3.10.1 Τεχνική του ΜΤΤ

Η µέθοδος µέτρησης της βιωσιµότητας των κυττάρων , ή αλλιώς τεχνική του ΜΤΤ (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tertrazolium bromide), χρησιµοποιείται και ως µέθοδος υπολογισµού του κυτταρικού πολλαπλασιασµού . Η αρχή της µεθόδου βασίζεται στην αναγωγή του τετραζολίου σε κρυστάλλους φορµαζάνης , από την µιτοχονδριακή αναγωγάση . Σε περιπτώσεις φυσιολογικών κυττάρων η ενεργότητα της αναγωγάσης εξαρτάται από ειδικά ένζυµα που συµµετέχουν στη µιτοχονδριακή

73

φωσφορυλίωση και τα οποία δεν παρατηρούνται σε περιπτώσεις νέκρωσης . Οι κρύσταλλοι φορµαζάνης εµφανίζουν ιώδες χρώµα και η απορρόφηση αυτών µετρείται µε φασµατοφωτόµετρο . Πρόκειται για µια ευρέως αποδεκτή και αποτελεσµατική µέθοδο για την εκτίµηση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού . Η διαδικασία περιλαµβάνει τα κάτωθι βήµατα : 1. Πραγµατοποιείται ανακαλλιέργεια των κυττάρων και επίστρωση 5000 κυττάρων σε όγκο 50 µL σε κάθε κυψελίδα ενός αποστειρωµένου πλακιδίου , ειδικού για καλλιέργειες κυττάρων , 96 µικροκυψελίδων . ο 2. Επώαση σε θάλαµο µε 37 C και 5% CO 2 για 24 ώρες . 3. ∆ιάλυση των ουσιών προς µελέτη σε 50 µL θρεπτικού µέσου και προσθήκη στις µικροκυψελίδες µε τα κύτταρα . ο 4. Επώαση σε θάλαµο µε 37 C και 5% CO 2 για 24 ώρες . 5. Προσθήκη 10 µL ΜΤΤ 5mg/mL σε κάθε µικροκυψελίδα µε κύτταρα . ο 6. Επώαση σε θάλαµο µε 37 C και 5% CO 2 για 4 ώρες . 7. Παρατήρηση στο µικροσκόπιο . Η µετατροπή του ΜΤΤ σε κρυστάλλους φορµαζάνης αποτελεί ένδειξη για τη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων . 8. Αφαίρεση του θρεπτικού µέσου από τις µικροκυψελίδες µε πιπέτα Pasteur υπό κενό . 9. ∆ιαλυτοποίηση των κρυστάλλων φορµαζάνης µε 100 µL διαλύµατος ισοπροπανόλης 0,3 Μ HCl, 10% Triton X-100. 10. Επώαση σε θερµοκρασία δωµατίου για 15 λεπτά . 11. Μέτρηση σε φασµατοφωτόµετρο σε µήκος κύµατος 595nm.

Υλικά και διαλύµατα

Αποστειρωµένο ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών PBS 1x: Na 2HPO 4 10mM,

KH 2PO 4 5mM, NaCl 20mM, pH 7.4. Πλήρες θρεπτικό µέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (Παράγραφο 3.3.1). Τρυψίνη EDTA 0.05% . ∆ιµεθυλο -σουλφοξείδιο (DMSO) ειδικό για κυτταροκαλλιέργειες (cell culture grade). ∆οξυκυκλίνη , δεµεκλοκυκλίνη και ΑΟΑΑ σε DMSO. ΜΤΤ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tertrazolium bromide): απόθεµα 5mg/mL σε αποστειρωµένο απεσταγµένο νερό .

74

∆ιάλυµα διαλυτοποίηση των κρυστάλλων φορµαζάνης : ισοπροπανόλη 0,3 Μ HCl, 10% Triton X-100.

3.10.2 Τεχνολογία του xCELLigence

Η τεχνολογία του xCELLigence (RT-CES system, Roche) εφαρµόζει µη επεκτατικά µικρο -ηλεκτρόδια µε βιοαισθητήρες σε ειδικά πλακίδια 96 µικροκυψελίδων (E-plate) µε σκοπό την παρακολούθηση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού για ώρες ή/και µέρες αποδίδοντας τα αποτελέσµατα σε πραγµατικό χρόνο . Οι βιοαισθητήρες στον πάτο των κυψελίδων µετρούν την ηλεκτρική αντίσταση των κυττάρων ( καταγράφεται ως δείκτης κυττάρων , Cell Index, CI) σε κάθε µικροκυψελίδα παρέχοντας ποσοτικές πληροφορίες για την κατάσταση των κυττάρων , όπως τον αριθµό , τη βιωσιµότητα αλλά και τη µορφολογία . Η διαδικασία για τον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασµού περιγράφεται παρακάτω : 1. Πραγµατοποιείται ανακαλλιέργεια των κυττάρων και επίστρωση 6000 κυττάρων σε όγκο 200 µL (30000 κύτταρα /mL) σε κάθε κυψελίδα του ειδικού πλακιδίου (E- plate 96), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά . ο 2. Επώαση σε θάλαµο µε 37 C και 5% CO 2 για 24 ώρες . 3. Αφαίρεση του θρεπτικού µέσου της καλλιέργειας µε πιπέτα Pasteur υπό κενό . 4. ∆ιάλυση των ουσιών προς µελέτη σε θρεπτικό µέσο και προσθήκη 200 µL µε τις επιθυµητές συγκεντρώσεις στις µικροκυψελίδες µε τα κύτταρα . ο 5. Επώαση σε θάλαµο µε 37 C και 5% CO 2 για 48 ώρες . 6. Παρακολούθηση και καταγραφή των αποτελεσµάτων σε υπολογιστή .

Υλικά και διαλύµατα

Αποστειρωµένο ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών PBS 1x: Na 2HPO 4 10mM,

KH 2PO 4 5mM, NaCl 20mM, pH 7.4. Πλήρες θρεπτικό µέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (Παράγραφο 3.3.1). Τρυψίνη EDTA 0.05% . ∆ιαλύµατα S-αδενόσυλο -L-µεθειονίνη (S-adenosyl-L-methionine, SAM) και

Αminooxyacetate (AOAA) σε αποστειρωµένο ddH 2O.

75

3.11 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων

Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων έγινε µε τη χρήση του τεστ one way ANOVA. Τα αποτελέσµατα εκφράσθηκαν ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * και # υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05, σε σχέση µε το µάρτυρα .

76

4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

77

78

1ο ΜΕΡΟΣ

79

80

4.1 Σάρωση χηµικών ενώσεων και επιλογή ουσιών µε ανασταλτική

δράση έναντι των ενζύµων βιοσύνθεσης H 2S

Από τη βιβλιογραφία καθώς και από προηγούµενη µελέτη της ερευνητικής οµάδας µας γνωρίζουµε πως δεν υπάρχουν εκλεκτικοί αναστολείς για τα ένζυµα βιοσύνθεσης

του H 2S, παρά µόνο για το CSE. ∆εδοµένης της βιολογικής σηµασίας του H 2S σε διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις , είναι αναγκαίο να βρεθούν τα απαραίτητα φαρµακολογικά εργαλεία , όπως εκλεκτικοί αναστολείς και για τα άλλα ένζυµα παραγωγής του , CBS και 3MST. Στην παρούσα διατριβή αρχικά εξετάσαµε είτε νέες συνθετικές ενώσεις είτε εµπορικά διαθέσιµες ουσίες , ως προς την επίδραση τους στη δραστικότητα των ενζύµων CBS και CSE in vitro . Μελετήθηκαν α) ενώσεις που η σύνθεσή τους έγινε βάσει σχεδιασµού ως πιθανών αναστολέων των ενζύµων CBS και CSE καθώς και β) η βιβλιοθήκη χηµικών ενώσεων LOPAC (Library of Pharmacologically Active Compounds), η οποία περιλαµβάνει 1280 ενώσεις µε φαρµακολογική δραστικότητα , όπως φάρµακα που κυκλοφορούν στην αγορά και βιοδραστικές ενώσεις µε χαρακτηριστικά φαρµακευτικών µορίων µε βιολογικές δράσεις .

4.1.1 Αποµόνωση των ενζύµων CSE και CBS

Για τη διερεύνηση της δράσης των υπό µελέτη ουσιών , αρχικά έγινε η αποµόνωση των ενζύµων CSE και CBS. Οι συνθήκες έκφρασης και αποµόνωσης αυτών των ενζύµων είναι γνωστές από προηγούµενη µελέτη της οµάδας ( Μεθόδους 3.1.7.1 και 3.1.7.2). Συγκεκριµένα , για το ένζυµο CSE αναπτύχθηκε βακτηριακή καλλιέργεια στην οποία έγινε επώαση για 16 ώρες µετά την επαγωγή µε IPTG 0,1mM, στους 18 oC. Ακολούθησε η λύση των κυττάρων και η διαδικασία της αποµόνωσης του ενζύµου µε χρωµατογραφία συγγένειας µε τη χρήση GSTrap FF στηλών ( Μεθόδους 3.1.8 και 3.2). Το κλάσµα της αποµόνωσης που περιέχει το ένζυµο GST-CSE (75kDa) αναλύθηκε στη συνέχεια µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 15% περιεκτικότητας σε ακρυλαµίδιο ( Εικόνα 4.1).

81

Εικόνα 4.2: SDS-PAGE όπου απεικονίζεται η αποµόνωση του ενζύµου GST-CSE µετά την έκλουση από τη GSTrapFF στήλη

Για το ένζυµο CBS αναπτύχθηκε βακτηριακή καλλιέργεια παρουσία του πρόδροµου της αίµης , δ-ALA 0,3mM, στην οποία έγινε επώαση για 16 ώρες µετά την επαγωγή µε IPTG 0,1mM, στη θερµοκρασία 30 oC. Ακολούθησε η λύση των κυττάρων και η διαδικασία της αποµόνωσης του ενζύµου ( Μεθόδους 3.1.8 και 3.2). Το κλάσµα της αποµόνωσης που περιέχει το ένζυµο GST-CBS (88kDa) αναλύθηκε στη συνέχεια µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 12% περιεκτικότητας σε ακρυλαµίδιο ( Εικόνα 4.2).

Εικόνα 4.2: SDS-PAGE όπου απεικονίζεται η αποµόνωση του ενζύµου GST-CBS µετά την έκλουση από τη GSTrapFF στήλη

4.1.2 Μελέτη και χαρακτηρισµός ουσιών ως αναστολέων παραγωγής H 2S

Αρχικά µελετήθηκαν ουσίες που η σύνθεσή τους έγινε βάσει ειδικού σχεδιασµού από την οµάδα του Καθηγητή Αθανασίου Γιάννη στο Πανεπιστήµιο της Λειψίας . Οι

82

αναστολείς αυτοί έχουν σκοπό να καλύψουν την πλειονότητα των αλληλεπιδράσεων στο ενεργό κέντρο , ανταγωνιζόµενοι τη σύνδεση του φυσικού υποστρώµατος των ενζύµων CSE και CBS, L-κυστεΐνη . Οι ενώσεις Hydrazino-L-alanine και Hydrazino- glycine, εξετάστηκαν έναντι των ενζύµων CSE και CBS, που η αποµόνωσή τους περιγράφηκε στην παράγραφο 4.1.1. Μελετήθηκαν στις συγκεντρώσεις 5, 50, 200 και 500 µΜ έναντι του µάρτυρα , δηλαδή µίγµατος ενεργού ενζύµου χωρίς την προσθήκη των ενώσεων ( Εικόνες 4.3-4.6). Το παραγόµενο υδρόθειο µετρήθηκε µε την τεχνική του κυανού του µεθυλενίου ( Μεθόδους 3.9.1) Όπως προκύπτει , οι δύο ενώσεις Hydrazino-L-alanine και Hydrazino-glycine αναστέλλουν και τα δύο ένζυµα σε συγκεντρώσεις ≥50 µΜ . Παρόλα αυτά , στη συγκέντρωση 5 µΜ η Hydrazino-glycine φαίνεται να αναστέλλει εκλεκτικά το ένζυµο CBS ( κατά 25%) έναντι του CSE, ενώ η Hydrazino-L-alanine στα 5 µΜ αναστέλλει εκλεκτικά ( κατά 60%) το ένζυµο CSE έναντι του CBS.

Εικόνα 4.3: Επίδραση της Hydrazino-Alanine στην παραγωγή H 2S από CSE in vitro . Η ένωση επωάστηκε µε 5 µg ενζύµου , 1mM L-cys και 0,01mM PLP στους 37 oC για 1 ώρα . Τα αποτελέσµατα είναι από 3 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 σε σχέση µε το µάρτυρα .

83

Εικόνα 4.4: Επίδραση της Hydrazino-Alanine στην παραγωγή H 2S από CBS in vitro . Η ένωση επωάστηκε µε 5 µg ενζύµου , 1mM L-cys, 1mM Hcy και 0,01mM PLP στους 37 oC για 1 ώρα . Τα αποτελέσµατα είναι από 3 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 σε σχέση µε το µάρτυρα .

Εικόνα 4.5: Επίδραση της Hydrazino-Glycine στην παραγωγή H 2S από CSE in vitro . Η ένωση επωάστηκε µε 5 µg ενζύµου , 1mM L-cys και 0,01mM PLP στους 37 oC για 1 ώρα . Τα αποτελέσµατα είναι από 3 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 σε σχέση µε το µάρτυρα .

84

Εικόνα 4.6: Επίδραση της Hydrazino-Glycine στην παραγωγή H 2S από CBS in vitro . Η ένωση επωάστηκε µε 5 µg ενζύµου , 1mM L-cys, 1mM Hcy και 0,01mM PLP στους 37 oC για 1 ώρα . Τα αποτελέσµατα είναι από 3 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 σε σχέση µε το µάρτυρα .

Από τις δοµές των ενώσεων αυτών παρατηρήσαµε οµοιότητα µε την δοµή της ουσίας , Aminoethoxyvinyl-glycine, AVG ( Εικόνα 4.7), η οποία στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι µεταβάλλει τη δράση ορισµένων PLP-εξαρτώµενων ενζύµων . Ακολούθως µελετήθηκε η επίδραση της ένωσης AVG στα ένζυµα CSE και CBS. Εξετάστηκαν οι συγκεντρώσεις της AVG 1, 10, 100 και 1000 µΜ και παρατηρήθηκε ότι αναστέλλει εκλεκτικά και µε δοσο -εξαρτώµενο τρόπο το ένζυµο CSE, µε συγκέντρωση που

προκαλεί 50% αναστολή στην παραγωγή H 2S, IC 50 : 1,0 ± 0,1 µΜ ( Εικόνα 4.8).

Εικόνα 4.7: ∆οµές των Aminoethoxyvinyl-glycine, Hydrazino-L-alanine και Hydrazino- glycine.

85

Εικόνα 4.8: Επίδραση της AVG στην παραγωγή H 2S από CSE και CBS in vitro . Κάθε αντίδραση περιλαµβάνει 5 µg ενζύµου , 1mM L-cys και 0,01mM PLP. Οι αντιδράσεις του CBS περιέχουν επίσης 1mM Hcy. Η επώαση έγινε στους 37 oC για 1 ώρα . Τα αποτελέσµατα είναι από 9 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 σε σχέση µε το µάρτυρα .

Η AVG όπως είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία , ανταγωνίζεται τη δράση του συνενζύµου PLP, αφού αναστέλλει και άλλα PLP-εξαρτώµενα ένζυµα . Παρόλο που µοιάζει δοµικά µε τις ενώσεις Hydrazino-L-Alanine και Hydrazino-Glycine, ο τρόπος δράσης της είναι διαφορετικός εφόσον οι συνθετικές ενώσεις σχεδιάστηκαν ώστε να ανταγωνίζονται το υπόστρωµα L-cys των ενζύµων CSE και CBS.

∆εδοµένου ότι για τη δράση των δύο ενζύµων απαιτείται το συνένζυµο 5-φωσφορική πυριδοξάλη , PLP, βασιζόµενη στην πληροφορία αυτή , η οµάδα του κ. Βουρλούµη από το E.K.E. Φ.E. « ∆ηµόκριτος » σχεδίασε και συνέθεσε ουσίες που να ανταγωνίζονται τη δράση του PLP ( Εικόνα 4.9). Τα ανάλογα αυτά µελετήθηκαν σε συγκέντρωση 100 µΜ που θεωρήθηκε ως υψηλή φαρµακολογικά και εξετάστηκε η επίδρασή τους στη δραστικότητα των ενζύµων CSE και CBS ( Εικόνα 4.10). ∆εν

παρατηρήθηκε αναστολή στην παραγωγή H 2S από τα ένζυµα CSE και CBS από τις συνθετικές αυτές ενώσεις .

86

Εικόνα 4.9: ∆οµές των PLP αναλόγων .

Εικόνα 4.10: Επίδραση των αναλόγων της φωσφορικής πυριδοξάλης στην παραγωγή H 2S από τα ένζυµα C ΒS και CS Ε in vitro . Η συγκέντρωση που µελετήθηκε είναι 100 µΜ . Τα αποτελέσµατα είναι από 3 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζον ται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM).

87

4.1.3 Σάρωση βιβλιοθήκης χηµικών ενώσεων LOPAC

Η βιβλιοθήκη LOPAC αποτελεί µια συλλογή από ενώσεις µε διαπιστωµένη βιοδραστικότητα . Περιλαµβάνει αναστολείς και προσδέµατα υποδοχέων , ενώσεις που χρησιµοποιούνται για την ανάπτυξη φαρµάκων καθώς και εγκεκριµένα φάρµακα , η δράση των οποίων καλύπτει τα περισσότερα σηµατοδοτικά µονοπάτια . Συνολικά 1280 ενώσεις µελετήθηκαν σε συγκέντρωση 100 µΜ έναντι των αποµονωµένων ενζύµων CBS και CSE, όπως προηγουµένως . Από τη σάρωση αυτή προέκυψαν

ενώσεις ως αναστολείς των δύο ενζύµων βιοσύνθεσης Η2S, µε ποικίλα ποσοστά αναστολής . Τα αποτελέσµατα της σάρωσης παρουσιάζονται στο Παράρτηµα Αποτελεσµάτων ( Πίνακες Π.Α.1 και Π.Α.2). Σηµαντικό ποσοστό αναστολής (>75%)

στην παραγωγή H 2S παρατηρήθηκε µόνο από ορισµένες ενώσεις έναντι του ενζύµου CBS, που παρατίθενται στον Πίνακα 4.1. Όσον αφορά το ένζυµο CSE, καµία από τις ενώσεις δεν εµφάνισε σηµαντικό ποσοστό αναστολής του ( Πίνακας Π.Α.2).

Από τις ενώσεις αυτές επιλέχθηκαν για περαιτέρω µελέτη οι εξής : Demeclocycline, Doxycycline, Me-3,4-Dephostatin, Rottlerin και Aurintricarboxylic acid. Η επιλογή βασίστηκε σε κριτήρια όπως την ευκολία διάθεσης των ουσιών , τις γνωστές δράσεις τους , τη δοµή τους και τη δυνατότητα σύνθεσης αναλόγων καθώς και την περίπτωση να απελευθερώνουν αφ ’εαυτού υδρόθειο και κατ΄επέκταση να επηρεάσουν τα αποτελέσµατα των µετρήσεων . Οι πέντε αυτές ενώσεις εξετάστηκαν στη συνέχεια για την εκλεκτικότητα τους έναντι και των τριών ενζύµων βιοσύνθεσης υδροθείου , CSE, CBS και 3MST. Η αποµόνωση των ενζύµων CSE και CBS έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο 4.1.1. Εποµένως , ακολούθησε η έκφραση και η αποµόνωση του ενζύµου 3MST και στη συνέχεια ο έλεγχος για την εκλεκτικότητα των προαναφερθέντων

ενώσεων στην αναστολή των ενζύµων βιοσύνθεσης Η2S.

88

Πίνακας 4.1: Ενώσεις (100 µΜ ) µε ανασταλτική δράση >75% έναντι των ενζύµων CBS. % CBS A/A Name Class inhibition 1 2,3-Dimethoxy-1,4-naphthoquinone Cell Stress 106,2

2 Demeclocycline hydrochloride Antibiotic 95,61

3 Doxycycline hydrochloride Antibiotic 94,38

4 GW5074 Phosphorylation 93,84

5 Sodium nitroprusside dihydrate Nitric Oxide 90,82

6 Phenserine Neurotransmission 90,45

7 ABT-418 hydrochloride Cholinergic 88,51 O-(Carboxymethyl)hydroxylamine 8 Biochemistry 84,64 hemihydrochl oride 9 Me-3,4-dephostatin Phosphorylation 83,86

10 Pentoxifylline Cyclic Nucleotides 82,91

11 Rottlerin Phosphorylation 82,61

12 GW7647 Transcription 82

13 SID7969543 Gene Regulation 79,23

14 6-Hydroxy-DL-DOPA Adrenoceptor 78,92

15 Aurintricarboxylic acid Apoptosis 78,13

16 NSC 95397 Phosphorylation 76,96

17 (-)-Eseroline fumarate Cholinergic 75,86

89

4.1.4 Έκφραση και αποµόνωση του ενζύµου 3MST

Η έκφραση του ενζύµου 3MST έγινε µε τη διαµόλυνση στη βακτηριακή σειρά Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) µε τον πλασµιδιακό φορέα pGEX-Kg-GST- 3MST. Πρώτα εξετάστηκαν οι συνθήκες για το βέλτιστο χρόνο έκφρασης στη θερµοκρασία 20 oC. Η συγκέντρωση του επαγωγέα της έκφρασης που χρησιµοποιήθηκε ήταν 0,1mM IPTG. ∆είγµατα ελήφθησαν πριν την επαγωγή της έκφρασης µε IPTG και κατά τις 3, 6, 18 και 21 ώρες έκφρασης . Τα ολικά δείγµατα εξετάστηκαν στη συνέχεια µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 15% περιεκτικότητας σε ακρυλαµίδιο . Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4.11 µέγιστη έκφραση επιτυγχάνεται µετά από έξι ώρες αλλά και ολονύκτια επώαση .

Εικόνα 4.11: SDS-PAGE των πρωτεΐνικών εκχυλισµάτων όπου απεικονίζεται η έκφραση του ενζύµου GST-3MST σε 0, 3, 6, 18 και 21 ώρες µετά την επαγωγή µε IPTG 0,1mM.

Για την αποµόνωση του GST-3MST αναπτύχθηκε βακτηριακή καλλιέργεια στην οποία έγινε επώαση για 18 ώρες µετά την επαγωγή µε IPTG 0,1mM, στη θερµοκρασία 20 oC. Ακολούθησε η λύση των κυττάρων και η διαδικασία της αποµόνωσης του ενζύµου µε χρωµατογραφία συγγένειας µε τη χρήση GSTrap FF στηλών ( Μεθόδους 3.1.6-3.1.9). Το κλάσµα της αποµόνωσης που περιέχει το ένζυµο GST-3MST (60kDa) αναλύθηκε στη συνέχεια µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS- PAGE 15% περιεκτικότητας σε ακρυλαµίδιο . Η επιτυχής αποµόνωση φαίνεται στην Εικόνα 4.12.

90

Εικόνα 4.12: SDS-PAGE όπου απεικονίζεται η αποµόνωση του ενζύµου GST-3MST µετά την έκλουση από τη GSTrapFF στήλη .

4.1.5 Έλεγχος δραστικότητας του ενζύµου 3MST in vitro

Στη συνέχεια έγινε έλεγχος για τη δραστικότητα του ενζύµου GST-3MST που αποµονώθηκε . Το 3MST όπως είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία , χρησιµοποιεί ως υπόστρωµα το 3-µερκαπτοπυροσταφυλικό (3-mercaptopyruvate, 3MP). Για να

εξακριβωθεί η ενεργότητα του ενζύµου , µελετήθηκε η παραγωγή H 2S από το ένζυµο µε την τεχνική του κυανού του µεθυλενίου . Το 3MST εξετάστηκε απουσία και παρουσία του υποστρώµατος 3MP. Επίσης εξετάστηκε και το υπόστρωµα µόνο του

για να επιβεβαιωθεί ότι δεν αλληλεπιδρά µε τη µέθοδο ή ότι δεν απελευθερώνει H 2S

µη -ενζυµατικά . Παρατηρήθηκε πως το 3MST είναι ενεργό , εφόσον παράγει H 2S µόνο µε την παρουσία του υποστρώµατος 3MP ( Εικόνα 4.13).

Εικόνα 4.13 : Παραγωγή H 2S από το ένζυµο 3MST in vitro . Έγινε επώαση 5 µg ενζύµου 3MST απουσία και παρουσία 50 µΜ 3MP στους 37 oC για 1 ώρα . Επίσης έγινε έλεγχος στο υπόστρωµα 3MP χωρίς ένζυµο .

91

4.1.6 Προσδιορισµός συνθηκών αντίδρασης για την παραγωγή H 2S από το ένζυµο 3MST in vitro

4.1.6.1 Μελέτη της ποσότητας του ενζύµου

Για τον προσδιορισµό της παραγωγής H 2S από διαφορετικές ποσότητες του ενζύµου χρησιµοποιήθηκαν 1, 5, 10 και 15 µg. Το ένζυµο επωάστηκε παρουσία υποστρώµατος o 15 µΜ 3MP στους 37 C για 60 λεπτά . Όπως παρατηρήθηκε , η παραγωγή H 2S από το ένζυµο 3MST γίνεται µε δοσο -εξαρτώµενο τρόπο ( Εικόνα 4.14). Η ποσότητα που επιλέχθηκε να χρησιµοποιείται ανά αντίδραση είναι τα 5 µg, αφού σε αυτές τις συνθήκες ανιχνεύεται επαρκές σήµα και περιορίζεται η χρήση της ποσότητας του ενζύµου .

Εικόνα 4.14: Παραγωγή H 2S από το ένζυµο 3MST in vitro . Η επώαση του ενζύµου έγινε παρουσία του υποστρώµατος 15 µΜ 3MP στους 37 oC για 1 ώρα .

4.1.6.2 Μελέτη της συγκέντρωσης του υποστρώµατος

Για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών προσδιορισµού της παραγωγής H 2S µελετήθηκαν οι συγκεντρώσεις υποστρώµατος 0, 0,1, 1, 5, 15 και 50 µΜ 3MP. Χρησιµοποιήθηκαν 5 µg ενζύµου (0,08nmoles)/ αντίδραση για επώαση στους 37 oC,

όπως προαναφέρθηκε . Στην Εικόνα 4.15 φαίνεται η δοσο -εξαρτώµενη παραγωγή H 2S του ενζύµου από το υπόστρωµα .

92

Εικόνα 4.15: Παραγωγή H 2S από το ένζυµο 3MST in vitro . Η επώαση έγινε παρουσία του υποστρώµατος 3MP (0-50 µΜ ) στους 37 oC για 1 ώρα .

Στη συνέχεια µελετήθηκε η κινητική της δραστικότητας του ενζύµου 3MST µε το µοντέλο Michaelis-Menten. Υπολογίστηκε η παραγωγή υδροθείου ανά mg ενζύµου

ανά λεπτό (nmoles H 2S/ mg ενζύµου / min) σε σχέση µε τη συγκέντρωση του

υποστρώµατος 3MP. Η σταθερά Michaelis, ΚΜ, όπως υπολογίστηκε είναι 12,6 µΜ (Εικόνα 4.16).

Εικόνα 4.16: Κινητική παραγωγής H 2S από το ένζυµο 3MST. Η επώαση έγινε παρουσία του υποστρώµατος 3MP (0-50 µΜ ) στους 37 oC για 1 ώρα .

Σύµφωνα µε τα παραπάνω , οι συνθήκες που επιλέχθηκαν για την αντίδραση

παραγωγής H 2S από το ένζυµο 3MST είναι 5 µg ενζύµου και 15 µΜ 3MP για επώαση

93

60 λεπτών στους 37 oC. Κάθε 1 µg ενζύµου GST-3MST ισοδυναµεί µε 0,016nmoles, το οποίο είναι σε συµφωνία µε την ποσότητα των ενζύµων CSE και CBS που χρησιµοποιούνται στην αντίστοιχη δοκιµή , δηλαδή 0,013 και 0,011nmoles αντίστοιχα .

4.1.7 Έλεγχος της εκλεκτικότητας των αναστολέων των ενζύµων

βιοσύνθεσης H 2S

Από τη σάρωση της βιβλιοθήκης LOPAC οι ενώσεις που αναστέλλουν το ένζυµο CBS, Aurintricarboxylic acid, Demeclocycline, Doxycycline, Me-3,4-Dephostatin και Rottlerin εξετάστηκαν για την εκλεκτικότητα τους έναντι των ενζύµων βιοσύνθεσης

H2S. Οι προαναφερθείσες ενώσεις σε συγκέντρωση 100 µΜ επωάστηκαν µε τα o ένζυµα CSE, CBS και 3MST στους 37 C για 60 λεπτά και η παραγωγή H 2S προσδιορίστηκε µε τη µέθοδο του κυανού του µεθυλενίου . Η εκλεκτικότητα των αναστολέων φαίνεται στην Εικόνα 4.17. Οι ουσίες αυτές εξετάσθηκαν στη συνέχεια για ενδεχόµενη αλληλεπίδρασή τους µε

τη µέθοδο προσδιορισµού ή µε το παραγόµενο H 2S. Για το λόγο αυτό εξετάστηκε αν

η οπτική απορρόφηση µιας καµπύλης γνωστών συγκεντρώσεων του δότη H2S επηρεάζεται από την παρουσία των ενώσεων στη συγκέντρωση των 100 µΜ που µελετήθηκαν . Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 4.18, η ένωση Me-3,4-Dephostatin

επηρεάζει την καµπύλη απορρόφησης ( ΟD) του εκλυόµενου H 2S, εποµένως δεν

µπορεί να θεωρηθεί ως αναστολέας της παραγωγής H 2S.

94

Εικόνα 4.17: Έλεγχος εκλεκτικότητας των Aurintricarboxylic acid, Demeclocycline, Doxycycline, Me-3,4-Dephostatin και Rottlerin σε συγκέντρωση 100 µΜ έναντι των ενζύµων CSE, CBS και 3MST in vitro . Τα αποτελέσµατα είναι από 9 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). ). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 αντίστοιχα σε σχέση µε το µάρτυρα .

95

Εικόνα 4.18: Σχηµατική απεικόνιση της απορρόφησης όπου φαίνεται η αλληλεπίδραση των Aurintricarboxylic acid, Demeclocycline, Doxycycline, Me-3,4-Dephostatin και Rottlerin µε

τη µέθοδο προσδιορισµού H 2S. Οι ουσίες επωάστηκαν για 1 ώρα µε το δότη Na 2S.

Από τη συνολική µελέτη της σάρωσης της LOPAC προκύπτει ότι οι ενώσεις Aurintricarboxylic acid και Rottlerin αναστέλλουν εκλεκτικά το ένζυµο CBS στη

µελέτη της παραγωγής Η2S in vitro . Τα αντιβιοτικά Demeclocycline και Doxycycline αναστέλλουν το 3MST κατά 60% ενώ παρουσιάζουν µερική αναστολή και στο CBS (~20%) στη συγκέντρωση που µελετήθηκαν .

96

ο 2 ΜΕΡΟΣ

97

98

4.2 Μελέτη των τετρακυκλινών ως αναστολείς των ενζύµων

βιοσύνθεσης Η2S

4.2.1 Επίδραση της ∆οξυκυκλίνης και ∆εµεκλοκυκλίνης στην παραγωγή

Η2S in vitro

Από τη σάρωση της βιβλιοθήκης προέκυψαν ενώσεις ως αναστολείς των ενζύµων

βιοσύνθεσης Η2S, µε ποικίλα ποσοστά αναστολής . Από τις ενώσεις που επιλέχθηκαν για τον έλεγχο εκλεκτικότητας , όπως περιγράφηκε στο κεφάλαιο 4.1.6, δύο αντιβιοτικά εµφάνισαν εκλεκτικότητα για το ένζυµο 3MST: η δοξυκυκλίνη και η δεµεκλοκυκλίνη στη συγκέντρωση των 100 µΜ αναστέλλουν το ένζυµο 3MST κατά 60%. Οι ίδιες τετρακυκλίνες δεν επηρέασαν τη δραστικότητα του CSE, αλλά εµφάνισαν µια σηµαντική αλλά µικρή αναστολή ως προς το CBS κατά 20% στη συγκέντρωση που αναφέρθηκε ( Εικόνα 4.19).

Εικόνα 4.19: Aναστολή των ενζύµων CSE, CBS και 3MST in vitro από τις τετρακυκλίνες δοξυκυκλίνη και δεµεκλοκυκλίνη σε συγκέντρωση 100 µΜ . Το ΑΟΑΑ χρησιµοποιήθηκε σε συγκέντρωση 100 µΜ ως θετικός µάρτυρας για την αναστολή των CSE, CBS. Τα αποτελέσµατα είναι από 9 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 αντίστοιχα σε σχέση µε το µάρτυρα .

99

Στη συνέχεια για να διαπιστωθεί αν οι προαναφερόµενες τετρακυκλίνες αναστέλλουν µε δοσο -εξαρτώµενο τρόπο τα ένζυµα CSE, CBS και 3MST, µελετήθηκαν οι συγκεντρώσεις 1,10,100 και 300 µΜ . Από τα αποτελέσµατα προκύπτει ότι και οι δύο τετρακυκλίνες , δοξυκυκλίνη και δεµεκλοκυκλίνη , αναστέλλουν το 3MST µε δοσο -

εξαρτώµενο τρόπο και η συγκέντρωση που επιφέρει 50% της αναστολής , (IC 50 ), είναι 19,4 µΜ και 28,8 µΜ για τη δοξυκυκλίνη και τη δεµεκλοκυκλίνη αντίστοιχα ( Εικόνα 4.20). Οι τετρακυκλίνες αυτές , ακόµη και στη συγκέντρωση των 300 µΜ , δεν επηρέασαν τα ένζυµα CSE και CBS σε βαθµό ώστε να προκληθεί αναστολή της δράσης τους κατά 50% ( Εικόνες 4.21, 4.22).

Εικόνα 4.20: Αναστολή της παραγωγής H 2S από το 3 ΜSΤ in vitro . Η προσθήκη της δοξυκυκλίνης και δεµεκλοκυκλίνης έγινε στις συγκεντρώσεις 1,10,100 και 300 µΜ . Τα αποτελέσµατα είναι από 9 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία *, # υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 της δοξυκυκλίνης και δεµεκλοκυκλίνης αντίστοιχα σε σχέση µε το µάρτυρα .

100

Εικόνα 4.21: Αναστολή της παραγωγής H 2S από το CS Ε in vitro . Η προσθήκη της δοξυκυκλίνης και δεµεκλοκυκλίνης έγινε στις συγκεντρώσεις 1,10,100 και 300 µΜ . Τα αποτελέσµατα είναι από 9 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία *, # υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 της δοξυκυκλίνης και δεµεκλοκυκλίνης αντίστοιχα σε σχέση µε το µάρτυρα .

Εικόνα 4.22: Αναστολή της παραγωγής H 2S από το C ΒS in vitro . Η προσθήκη της δοξυκυκλίνης και δεµεκλοκυκλίνης έγινε στις συγκεντρώσεις 1,10,100 και 300 µΜ . Τα αποτελέσµατα είναι από 9 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία *, # υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 της δοξυκυκλίνης και δεµεκλοκυκλίνης αντίστοιχα σε σχέση µε το µάρτυρα .

101

Για την εξακρίβωση ότι η µέγιστη συγκέντρωση των τετρακυκλινών που

χρησιµοποιήθηκε δεν επηρεάζει τη µέτρηση του παραγόµενου Η2S από τα ένζυµα , εξετάστηκε η οπτική απορρόφηση µιας καµπύλης γνωστών συγκεντρώσεων του δότη

Η2S, GYY4137, µε την προσθήκη 300 µΜ δοξυκυκλίνης και δεµεκλοκυκλίνης . Στην Εικόνα 4.23 φαίνεται πως οι τετρακυκλίνες δεν αλληλεπιδρούν µε τη µέθοδο

προσδιορισµού Η2S.

Εικόνα 4.23: Σχηµατική απεικόνιση της απορρόφησης όπου φαίνεται η αλληλεπίδραση της

δοξυκυκλίνης και δεµεκλοκυκλίνης µε τη µέθοδο προσδιορισµού H 2S. Οι ουσίες επωάστηκαν για 60 λεπτά µε το δότη GYY4137.

4.2.2 Επίδραση των τετρακυκλινών στην παραγωγή Η2S in vitro

Λαµβάνοντας υπόψιν ότι η δοξυκυκλίνη και η δεµεκλοκυκλίνη που ανήκουν στην ευρύτερη οµάδα των τετρακυκλινών αντιβιοτικών , αναστέλλουν τη δραστικότητα του ενζύµου 3MST, εξετάσαµε στη συνέχεια όλες τις υπόλοιπες εµπορικά διαθέσιµες

τετρακυκλίνες στην ενζυµική παραγωγή Η2S από το 3MST in vitro . Μελετήθηκαν οι µεκλοκυκλίνη , µεθακυκλίνη, οξυτετρακυκλίνη , τετρακυκλίνη , τιγεκυκλίνη και µινοκυκλίνη στις συγκεντρώσεις 1,10,100 και 300 µΜ . Από τις παραπάνω τετρακυκλίνες δε βρέθηκε κάποια που να επηρεάζει σηµαντικά τη δραστικότητα του 3MST ώστε να προκαλεί 50% αναστολή ( Εικόνα 4.24), σίγουρα όχι σε συγκεντρώσεις µέχρι 300 µΜ .

102

Εικόνα 4.24: Αναστολή στην παραγωγή H 2S του ενζύµου 3 ΜSΤ από τις τετρακυκλίνες . Οι συγκεντρώσεις των τετρακυκλινών , µεκλοκυκλίνη [ Α], µεθακυκλίνη [B], µινοκυκλίνη [C], οξυτετρακυκλίνη [D], τετρακυκλίνη [E] και τιγεκυκλίνη [F] που µελετήθηκαν είναι 1,10,100 και 300 µΜ . Τα αποτελέσµατα είναι από 9 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 αντίστοιχα σε σχέση µε το µάρτυρα .

103

Οι ίδιες τετρακυκλίνες εξετάσθηκαν και για επίδραση στα ένζυµα CSE και CBS στη συγκέντρωση των 100 µΜ . Από αυτές , η οξυτετρακυκλίνη και η µεκλοκυκλίνη ανέστειλαν το ένζυµο CBS κατά 20% περίπου , ενώ η τετρακυκλίνη και η τιγεκυκλίνη φαίνεται να επηρεάζουν και τα δύο ένζυµα , CSE και CBS. Πιο συγκεκριµένα , η τετρακυκλίνη αναστέλλει τα ένζυµα CSE και CBS κατά 25% και 30% αντίστοιχα , ενώ η τιγεκυκλίνη αναστέλλει κατά 30% και 50% αντίστοιχα ( Εικόνα 4.25).

Εικόνα 4.25: Αναστολή της παραγωγής H2S των ενζύµων CSE και CBS από τις τετρακυκλίνες . Οι µεκλοκυκλίνη , οξυτετρακυκλίνη , τετρακυκλίνη , τιγεκυκλίνη , µινοκυκλίνη και µεθακυκλίνη προστέθηκαν στη συγκέντρωση των 100 µΜ . Τα αποτελέσµατα είναι από 6 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία *, # υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 σε σχέση µε το µάρτυρα .

4.2.3 Επίδραση της ∆οξυκυκλίνης και ∆εµεκλοκυκλίνης στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό

Όπως προαναφέραµε , η δοξυκυκλίνη και η δεµεκλοκυκλίνη αναστέλλουν το ένζυµο

3MST και την παραγωγή H2S in vitro. Για να διαπιστωθεί αν αυτή η αναστολή επηρεάζει τις λειτουργίες σε κυτταρικό επίπεδο , εξετάσθηκε η επίδραση της δοξυκυκλίνης και δεµεκλοκυκλίνης στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων HCT116 και HT29. Πρόκειται για δύο κυτταρικές σειρές επιθηλιακών κυττάρων από

104

ορθοκολικό καρκίνωµα και αδενοκαρκίνωµα ανθρώπου , στις οποίες το H2S παίζει σηµαντικό ρόλο επάγοντας τον πολλαπλασιασµό τους .53 Οι συγκεντρώσεις που µελετήθηκαν είναι 10, 25, 75, 200 και 500 µΜ και ο πολλαπλασιασµός των κυττάρων µετρήθηκε µε την τεχνική του ΜΤΤ ( Μεθόδους 3.10.1). Από τις παραπάνω τετρακυκλίνες η δοξυκυκλίνη δεν προκάλεσε αναστολή στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό , παρά µόνο στη συγκέντρωση των 500 µΜ που εµφάνισε 18% και 14% αναστολή στον πολλαπλασιασµό των HCT116 και HT29 αντίστοιχα . Η δεµεκλοκυκλίνη παρατηρήθηκε ότι προκαλεί δοσο -εξαρτώµενη αναστολή στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και των δύο καρκινικών σειρών . Συγκεκριµένα , στις συγκεντρώσεις των 200 µΜ και 500 µΜ η δεµεκλοκυκλίνη ανέστειλε τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων κατά 30% και 40% αντίστοιχα στα HT29 και κατά 45% και 50% αντίστοιχα στα HCT116 κύτταρα ( Εικόνες 4.26, 4.27). Σε αυτό το βαθµό αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό στα ΗΤ-29 ( πολύ λιγότερο στα HCT116) και το ΑΟΑΑ , ένωση αναφοράς που χρησιµοποιείται για την αναστολή του

H2S και την επακόλουθη αναστολή του πολλαπλασιασµού των καρκινικών κυττάρων .

Εικόνα 4.26: Αναστολή του πολλαπλασιασµού ΗΤ 29 κυττάρων από τις τετρακυκλίνες δοξυκυκλίνη και δεµεκλοκυκλίνη µετά από έκθεση κατά 24 ώρες . Το ΑΟΑΑ χρησιµοποιήθηκε ως θετικός µάρτυρας για την αναστολή του πολλαπλασιασµού των κυττάρων . Τα αποτελέσµατα είναι από 3 ανεξάρτητα πειράµατα και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 αντίστοιχα σε σχέση µε το µάρτυρα .

105

Εικόνα 4.27: Αναστολή του πολλαπλασιασµού ΗΤ 29 κυττάρων από τις τετρακυκλίνες δοξυκυκλίνη και δεµεκλοκυκλίνη µετά από έκθεση κατά 24 ώρες. Το ΑΟΑΑ χρησιµοποιήθηκε ως θετικός µάρτυρας για την αναστολή του πολλαπλασιασµού των κυττάρων . Τα αποτελέσµατα είναι από 3 ανεξάρτητα πειράµατα και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 αντίστοιχα σε σχέση µε το µάρτυρα .

106

ο 3 ΜΕΡΟΣ

107

108

4.3 Επίδραση της SAM στο σηµατοδοτικό µονοπάτι CBS/H 2S

Τα αποτελέσµατα που παρουσιάζονται σε αυτή την ενότητα περιέχονται το 201 4 στην παρακάτω δηµοσίευση , απ' όπου και αντλούνται τα σχήµατα που παρατίθενται : Modis K*, Coletta C*, Asimakopoulou A*, Szczesny B, Chao C, Papapetropoulos A, Hellmich MR, Szabo C. Effect of S-adenosyl-l-methionine (SAM), an allosteric activator of cystathionine -β-synthase (CBS) on colorectal cancer cell proliferation and bioenergetics in vitro. Nitric Oxide . 2014 Sep 15;41:146-56. *equally contributed

4.3.1 Επίδραση της SAM στη δραστικότητα του ενζύµου CBS in vitro

Από τη βιβλιογραφία είναι γνωστό πως η S -αδενοσυλο -L-µεθειονίνη (S -adenosyl-L- methionine, SAM), είναι ένας αλλοστερικός ενεργοποιητής του ενζύµου CBS. 32 Στην ανάγκη να βρεθούν νέα φαρµακολογικά εργαλεία για τη µελέτη της βιολογίας του

H2S, εκτός από δραστικότερους και πιο εκλε κτικούς αναστολείς των ενζύµων

βιοσύνθεσης H 2S, διερευνήσαµε την επίδραση που µπορεί να έχει η SAM µέσω του CBS σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες , όπως ο πολλαπλασιασµός .

Εικόνα 4.28: ∆οµή της S-αδενόσυλο -L-µεθειονίνη (SAM).

Για να εξεταστεί η επίδραση της SAM στο ένζυµο CBS, µελετήθηκε αρχικά η

παραγωγή H 2S in vitro . Όπως αναφέρεται και στη βιβλιογραφία , η παραγωγή H 2S από το ένζυµο CBS είναι µεγαλύτερη όταν γίνεται συνδυασµός των υποστρωµάτων L-cys και Hcy σε σχέση µε αυτή που παρατηρείται µε µοναδικό υπόστρωµα την L - cys. Εποµένως , η επίδραση της SAM µελετήθηκε στην ενζυµική αντίδραση µε υπόστρωµα την L-cys καθώς και στην ενζυµική αντίδραση µε παρόντα και τα δύο

109

υποστρώµατα , L-cys και Hcy. Όπως παρατηρήθηκε , στην αντίδραση του CBS που χρησιµοποιείται ως υπόστρωµα µόνο η L-cys, η παρουσία της SAM αυξάνει τα

επίπεδα H 2S κατά έξι φορές , ενώ στην ενζυµική αντίδραση που χρησιµοποιείται συνδυασµός των υποστρωµάτων L-cys και Hcy, η SAM αυξάνει κατά τρεις φορές τα

επίπεδα H 2S ( Εικόνα 4.29).

Εικόνα 4.29: Παραγωγή H 2S από το ένζυµο CBS in vitro . Η προσθήκη 1mM SAM έγινε είτε παρουσία 10mM L-cys είτε παρουσία του συνδυασµού 10mM L-cys και 0,5mM Hcy. Ο

προσδιορισµός της παραγωγής H 2S έγινε µε την τεχνική του κυανού του µεθυλενίου . Τα αποτελέσµατα είναι από 9 διαφορετικές αντιδράσεις και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 σε σχέση µε το µάρτυρα .

4.3.2 Επίδραση της SAM στην παραγωγή H 2S σε κυτταρικό σύστηµα

Για να διαπιστωθεί αν η SAM επιδρά στη δραστικότητα του CBS σε κυτταρικό

σύστηµα , µελετήθηκε η παραγωγή H 2S στα επιθηλιακά κύτταρα από ορθοκολικό καρκίνωµα ανθρώπου , HCT116. Πρόκειται για µια κυτταρική σειρά στην οποία , όπως αναφέρει η βιβλιογραφία , υπερ -εκφράζεται το ένζυµο CBS σε σχέση µε τα επιθηλιακά κύτταρα βλέννης φυσιολογικού κόλου , NCM356. 53 Αρχικά εξετάστηκε η

παραγωγή H 2S από το πρωτεϊνικό εκχύλισµα των κυττάρων . Σε κάθε αντίδραση που περιείχε 300 µg πρωτεΐνης , 10mM L-cys και 0,5mM Hcy, προστέθηκε η SAM σε συγκεντρώσεις 0,1-3mM και στη συνέχεια έγινε επώαση στους 37 oC για 2 ώρες . Η

παραγωγή H 2S µετρήθηκε µε τη χρήση της φθορίζουσας ουσίας AzMC ( Μεθόδους

110

3.9.2). Παρατηρήθηκε πως η SAM αυξάνει µε δοσο -εξαρτώµενο τρόπο την

παραγωγή H 2S στα HCT116 κύτταρα ( Εικόνα 4.30).

Εικόνα 4.30: Παραγωγή H 2S από πρωτεϊνικό εκχύλισµα κυττάρων HCT116. Η επίδραση της

SAM (0,1-3mM) στην παραγωγή H 2S έγινε παρουσία των υποστρωµάτων 10mM L-cys και

0,5mM Hcy. Ο προσδιορισµός της παραγωγής H 2S έγινε µε την τεχνική του AzMC φθορισµού . Τα αποτελέσµατα είναι από 3 ανεξάρτητα πειράµατα και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία * υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 σε σχέση µε το µάρτυρα .

Ακολούθως µελετήθηκε η επίδραση της SAM στην παραγωγή H 2S µε πειράµατα φθορισµού σε πραγµατικό χρόνο , σε κύτταρα HCT116 καθώς και σε κύτταρα NCM356. Η κυτταρική σειρά NCM356 αποτελείται από επιθηλιακά κύτταρα βλέννης φυσιολογικού κόλου . Χρησιµοποιήθηκαν ως κύτταρα αναφοράς , εφόσον έχουν µειωµένη έκφραση του ενζύµου CBS σε σχέση µε τα HCT116. 53 Η επώαση των κυττάρων µε 3mM SAM δίνει ενισχυµένο σήµα φθορισµού σε σχέση µε το µάρτυρα , γεγονός που αναστρέφεται µε την προσθήκη 1mM ΑΟΑΑ . Η επίδραση αυτή παρατηρείται και στις δύο κυτταρικές σειρές , παρόλα αυτά είναι εντονότερη στα HCT116 κύτταρα που η έκφραση του CBS είναι αυξηµένη σε σχέση µε τα NCM356

κύτταρα . Η παραγωγή H 2S απεικονίζεται µε τη χρήση της φθορίζουσας ουσίας

AzMC που ανιχνεύει το H 2S ( Μεθόδους 3.9.2). ( Εικόνα 4.31).

111

Εικόνα 4.31: Απεικόνιση µε φθορισµό της επίδρασης της SAM στην παραγωγή H 2S σε HCT116 και NCM356 κύτταρα . Η προσθήκη της SAM (3mM) έγινε είτε απουσία είτε παρουσία του αναστολέα ΑΟΑΑ (1mM). Η ανίχνευση έγινε µε τη χρήση του AzMC (10 µΜ ).

4.3.3 Επίδραση της SAM στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό

Όπως περιγράφηκε παραπάνω , η SAM αυξάνει τα επίπεδα H 2S στην ενζυµική αντίδραση του CBS, τόσο σε cell-free σύστηµα αλλά και σε κυτταρικό σύστηµα . Για

να διερευνηθεί αν η αύξηση της παραγωγής H 2S από τη SAM µπορεί να επηρεάσει κυτταρικές λειτουργίες , µελετήθηκε η επίδραση της SAM στον πολλαπλασιασµό HCT116 και NCM356 κυττάρων . Συγκεκριµένα , HCT116 κύτταρα σε συγκέντρωση 3x10 4 κύτταρα /mL επωάστηκαν µε τη SAM στις συγκεντρώσεις 0,1-3mM. Η επίδραση στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό µελετήθηκε για 24 ώρες µε την τεχνολογία του xCELLigence ( Μεθόδους 3.10.2). ∆ιαπιστώθηκε ότι η SAM στις συγκεντρώσεις 0,1-1mM επάγει τον πολλαπλασιασµό µε δοσο -εξαρτώµενο τρόπο για τις πρώτες 12 ώρες ( Εικόνα 4.32 Α,B). Με το πέρας των 12 ωρών και στη συνέχεια της επώασης µέχρι τις 24 ώρες , η SAM σε συγκέντρωση 0,1mM εξακολουθεί να

112

επάγει τον πολλαπλασιασµό , ενώ στις συγκεντρώσεις 0,3-3mM φαίνεται να τον αναστέλλει ( Εικόνα 4.32 Α,C).

Εικόνα 4.32: Επίδραση της SAM (0,1-3mM) στον πολλαπλασιασµό κυττάρων HCT116. Η επώαση πραγµατοποιήθηκε για 24h. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται επίσης ως εµβαδόν της καµπύλης (AUC) του συντελεστή κυτταρικού πολλαπλασιασµού (CI) ανά χρόνο (h). Τα αποτελέσµατα είναι από 4 ανεξάρτητα πειράµατα και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία *, # υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 επαγωγής και αναστολής αντίστοιχα , σε σχέση µε το µάρτυρα .

Στη συνέχεια µελετήθηκε η επίδραση της SAM στα NCM356 κύτταρα , στα οποία όπως προαναφέρθηκε εµφανίζουν µειωµένη έκφραση του ενζύµου CBS. Τα NCM356 κύτταρα αναπτύσσονται µε πιο αργό ρυθµό σε σχέση µε τα καρκινικά HCT116. Εποµένως , αρχικά εξετάστηκε ο ρυθµός πολλαπλασιασµού στις συγκεντρώσεις 3x10 4, 1x10 5 και 3x10 5 κύτταρα /mL. Ενώ τα καρκινικά HCT116 κύτταρα µελετήθηκαν στη συγκέντρωση 3x10 4 κύτταρα /mL, τα επίπεδα του ρυθµού πολλαπλασιασµού των NCM356 σε αυτή τη συγκέντρωση ήταν σχεδόν µη ανιχνεύσιµα . Συνεπώς , για τα πειράµατα επιλέχθηκε η συγκέντρωση 1x10 5 κύτταρα /mL, που εµφανίζει παρόµοιο ρυθµό πολλαπλασιασµού µε τα HCT116 κύτταρα ( Εικόνα 4.33 Α). Τα NCM356 κύτταρα επωάστηκαν µε τη SAM στις ίδιες

113

συγκεντρώσεις (0,1-3mM) µε τα HCT116 κύτταρα . Παρατηρήθηκε ότι η SAM στις πρώτες 12 ώρες δεν επηρεάζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό ( Εικόνα 4.33B,C). Για τις επόµενες 12 ώρες (12-24h) διαπιστώθηκε ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό στις συγκεντρώσεις 0,3-3mM, γεγονός που παρατηρήθηκε και στα HCT116 κύτταρα (Εικόνα 4.33 Β,D).

Εικόνα 4.33: Επίδραση της SAM (0,1-3mM) στον πολλαπλασιασµό NCM356 κυττάρων . Η επώαση πραγµατοποιήθηκε για 24h. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται επίσης ως εµβαδόν της καµπύλης (AUC) του συντελεστή κυτταρικού πολλαπλασιασµού (CI) ανά χρόνο (h). Τα αποτελέσµατα είναι από 4 ανεξάρτητα πειράµατα και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία # υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 αναστολής σε σχέση µε το µάρτυρα .

Για να εξακριβωθεί αν η επίδραση της SAM στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό είναι συνέπεια της δράσης της έναντι του ενζύµου CBS, µελετήθηκε ο πολλαπλασιασµός των HCT116 κυττάρων είτε µε φαρµακολογική αναστολή του CBS είτε µε αποσιώπηση του γονιδίου που εκφράζει το ένζυµο CBS. Αρχικά εξετάσθηκε ο πολλαπλασιασµός των HCT116 κυττάρων αφού έγινε προηγουµένως επώαση µε τον αναστολέα ΑΟΑΑ . Η δράση της SAM που παρατηρήθηκε στις πρώτες 12 ώρες στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό , εξαλείφθηκε όταν τα κύτταρα επωάστηκαν µε 1mM AOAA. Στην επώαση µεγαλύτερης διάρκειας (12-24h) και στις υψηλές συγκεντρώσεις (3mM) η SAM διατηρεί την ανασταλτική της δράση (Εικόνα 4.34).

114

Εικόνα 4.34: Επίδραση της SAM (0,1-3mM) στον πολλαπλασιασµό HCT116 κυττάρων απουσία και παρουσία του αναστολέα ΑΟΑΑ 1mM ( Α,Β). Η επώαση πραγµατοποιήθηκε για 24h. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται επίσης ως εµβαδόν της καµπύλης (AUC) του συντελεστή κυτταρικού πολλαπλασιασµού (CI) ανά χρόνο (h) (C,D). Τα αποτελέσµατα είναι από 4 ανεξάρτητα πειράµατα και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία *, # υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 επαγωγής και αναστολής αντίστοιχα , σε σχέση µε το µάρτυρα .

Ακολούθως µελετήθηκε η δράση της SAM σε κύτταρα shCBS HCT116. Πρόκειται για κύτταρα στα οποία έχει γίνει γονιδιακή αποσιώπηση του CBS µε τµήµατα RNA τύπου φουρκέτας µέσω ρετροϊών (lentiviral vectors). Ως κύτταρα αναφοράς χρησιµοποιήθηκαν τα shCTL HCT116 κύτταρα , στα οποία εκφράζεται φυσιολογικά το ένζυµο CBS. Αρχικά επιβεβαιώθηκε η µειωµένη έκφραση του CBS στα shCBS HCT116 κύτταρα µε ανοσοαποτύπωση τύπου Western ( Εικόνα 4.35 Α). Στη συνέχεια εξετάσθηκε η δράση της SAM στον πολλαπλασιασµό των shCTL και shCBS HCT116 κυττάρων . Η SAM, απέτυχε να διατηρήσει τη διεγερτική της δράση στον πολλαπλασιασµό των shCBS HCT116 κυττάρων στις χαµηλές συγκεντρώσεις και στη µικρής διάρκειας έκθεση (0-12h), ενώ φαίνεται να διατηρεί την ανασταλτική της δράση στις υψηλές συγκεντρώσεις (>1mM) στο µεγαλύτερο χρόνο επώασης (12-24h). Στα shCTL HCT116 είχε παρόµοια δράση µε αυτή που παρατηρήθηκε στα µη -διαµολυµµένα HCT116 κύτταρα . Η µειωµένη έκφραση του CBS αφ ’εαυτή στα shCBS HCT116

115

κύτταρα είχε ως αποτέλεσµα την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασµού ανεξάρτητα της επώασης µε τη SAM ( Εικόνα 4.35B,C,D,E).

Εικόνα 4.35: Απεικόνιση έκφρασης του CBS σε shCTL και shCBS HCT116 κύτταρα µε ανοσοαποτύπωση τύπου Western ( Α). Επίδραση της SAM (0,1-3mM) στον πολλαπλασιασµό των shCTL και shCBS HCT116 κυττάρων ( Β,C). Η επώαση πραγµατοποιήθηκε για 24h. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται επίσης ως εµβαδόν της καµπύλης (AUC) του συντελεστή κυτταρικού πολλαπλασιασµού (CI) ανά χρόνο (h) (D,E). Τα αποτελέσµατα είναι από 6 ανεξάρτητα πειράµατα και εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της µέσης τιµής (mean ± SEM). Τα σηµεία *, # υποδηλώνουν επίπεδο σηµαντικότητας P<0,05 επαγωγής και αναστολής αντίστοιχα , σε σχέση µε το µάρτυρα .

116

5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

117

118

Τα τρία ένζυµα βιοσύνθεσης του υδροθείου διαφέρουν πέραν της δοµής και της κυτταρικής εντόπισης , στον τρόπο που µεταβάλλεται η δράση τους . Καθώς επιτελούν δύο κοινούς σκοπούς , το µεταβολισµό της κυστεΐνης και τη βιοσύνθεση του υδροθείου , η θέση του καθενός στο µονοπάτι που καλείται reverse transsulfuration pathway, βρίσκεται σε διαφορετικό σηµείο . Για το λόγο αυτό επιτελούν µε διαφορετικό τρόπο τους κοινούς αυτούς σκοπούς . Το ένζυµο CBS, καταλύει την αποικοδόµηση της οµοκυστεΐνης σε κυσταθειονίνη , την οποία στη συνέχεια µεταβολίζει το ένζυµο CSE σε κυστεΐνη . Το ένζυµο 3MST, όπως και τα ένζυµα CSE και CBS, εµπλέκεται στην αποικοδόµηση της κυστεΐνης . Μέσα από το µεταβολισµό της κυστεΐνης ξεπηδούν παράπλευρες αντιδράσεις µέσω των οποίων γίνεται η βιοσύνθεση του υδροθείου .6 Στα πλαίσια των µερικώς αλληλεπικαλυπτόµενων και διακριτών ρόλων τους πιθανόν να εξηγείται η διαφορετική κυτταρική εντόπιση αλλά και ο διαφορετικός τρόπος µε τον οποίο µεταβάλλεται η δραστικότητά τους . Όπως προαναφέρθηκε στην εισαγωγή της παρούσας διατριβής , οι δράσεις των CBS και CSE εξαρτώνται από ένα κοινό µόριο , το συνένζυµο PLP, αλλά και από πληθώρα µετα -µεταφραστικών τροποποιήσεων , διαφορετικών για το κάθε ένα από αυτά . Το ένζυµο 3MST είναι λιγότερο µελετηµένο , απλά αναφέρεται ότι η βιοσύνθεση του υδροθείου από το 3MST είναι εξαρτώµενη από αναγωγικούς παράγοντες και η δράση του επηρεάζεται από τις οξειδοαναγωγικές συνθήκες . Οι αναστολείς των ενζύµων CSE και CBS που χρησιµοποιούνται µέχρι σήµερα στοχεύουν ένα κοινό στοιχείο τους , την PLP. Για το λόγο αυτό γενικά δεν είναι εκλεκτικοί , εκτός των αναστολέων PAG και BCA, οι οποίοι εµφανίζουν εκλεκτικότητα για το ένζυµο CSE έναντι του CBS.208 Ο λόγος που είναι εκλεκτικός ο αναστολέας PAG οφείλεται στο γεγονός ότι καταλαµβάνει µία θέση στο ενεργό κέντρο του CSE δηµιουργώντας σύµπλοκο µε το ένζυµο και την PLP παρεµποδίζοντας την πρόσδεση του υποστρώµατος .267 Μελέτη της κρυσταλλικής δοµής του CSE µε τον αναστολέα BCA δεν υπάρχει , οπότε παραµένει προς το παρόν δυσεξήγητη η εκλεκτικότητα σε σύγκριση µε το CBS, αλλά είναι γνωστό ότι στοχεύει την πρόσδεση της PLP, εφόσον αναστέλλει και άλλα PLP-εξαρτώµενα ένζυµα .208 Όσον αφορά το ένζυµο 3MST δεν υπάρχει κάποιος εκλεκτικός και µη τοξικός αναστολέας που να χρησιµοποιείται .85 Η βιολογική σηµασία του υδροθείου , καθιστά αναγκαία την εύρεση φαρµακολογικών εργαλείων και ειδικά εκλεκτικών αναστολέων που θα ξεκαθαρίσουν το ρόλο του κάθε ενζύµου στην κυτταρική βιολογία , τη

119

φυσιολογία αλλά και παθοφυσιολογία του ανθρώπου , καθώς επίσης µπορούν να χρησιµεύσουν στο µέλλον και ως πιθανά θεραπευτικά εργαλεία . Στην παρούσα διατριβή , στα πλαίσια εύρεσης και ταυτοποίησης νέων και εκλεκτικών αναστολέων των ενζύµων βιοσύνθεσης του υδροθείου , εξετάστηκαν νέες συνθετικές ενώσεις και εµπορικά διαθέσιµες ουσίες , ως προς την ικανότητα να αναστέλλουν τη δραστικότητα των ενζύµων CBS και CSE in vitro . Στη συνέχεια εξετάστηκαν οι πιο δραστικές ενώσεις ως προς την εκλεκτικότητά τους έναντι και των τριών συντεθιµένων ενζύµων : CBS, CSE και 3MST. Για την υλοποίηση της µελέτης εκφράστηκαν αρχικά τα ένζυµα ως χιµαιρικές πρωτεΐνες συντηγµένες µε GST (Glutathione-S-Transferase). Η αποµόνωση των ενζύµων έγινε µέσω χρωµατογραφίας συγγένειας µε κολώνες στις οποίες είναι ακινητοποιηµένη η γλουταθειόνη (GSH). Επιλέχθηκε ο συγκεκριµένος τρόπος έκφρασης και αποµόνωσης των ενζύµων καθώς είναι ευρέως χρησιµοποιούµενος και αποδεκτός από την επιστηµονική κοινότητα , ενώ έχει αποδειχθεί ότι τα ένζυµα µπορούν να εκφραστούν ως χιµαιρικές GST πρωτεΐνες και µετά την αποµόνωσή τους να διατηρούν την ενζυµική τους δραστικότητα .96 ,208,268 Επίσης , στα πλαίσια της διερεύνησης των επιδράσεων των µεταβολών της βιοδιαθεσιµότητας του υδροθείου στις κυτταρικές λειτουργίες , εκτός από πιθανούς αναστολείς , µελετήθηκε η επίδραση της SAM, ενός αλλοστερικού ενεργοποιητή του ενζύµου CBS, στη δραστικότητα του ενζύµου και στη συνέχεια στον πολλαπλασιασµό καρκινικών κυττάρων in vitro . Αρχικά , µελετήθηκαν κάποιες ενώσεις οι οποίες σχεδιάστηκαν από συνεργάτες µας ειδικά ως πιθανοί αναστολείς των ενζύµων CBS και CSE. Για τη διερεύνηση της δράσης τους , πρωτίστως έγινε η αποµόνωση των εκφραζόµενων ενζύµων CSE και CBS ως χιµαιρικές πρωτεΐνες µε GST. Οι συνθήκες έκφρασης και αποµόνωσης των ενζύµων είναι γνωστές από προηγούµενη µελέτη της οµάδας µας . Η επώαση της καλλιέργειας για την έκφραση του ενζύµου CSE έγινε στη θερµοκρασία 18 oC για 16 ώρες µετά την επαγωγή µε IPTG 0,1mM, ενώ για την έκφραση του CBS η επώαση πραγµατοποιήθηκε στη θερµοκρασία 30 oC για 16 ώρες µετά την επαγωγή µε IPTG 0,1mM. Επιλέχθηκαν αυτές οι συνθήκες , στις οποίες επιτυγχάνεται η µέγιστη έκφραση .208 Η επιτυχής αποµόνωση τους επιβεβαιώθηκε µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE, όπως φαίνεται στις Εικόνες 4.1 και 4.2. Η οµάδα του συνεργάτη µας , Καθηγητή Αθανασίου Γιάννη στο Πανεπιστήµιο της Λειψίας , σχεδίασε και συνέθεσε πιθανούς αναστολείς οι οποίοι δρουν µε σκοπό να καλύψουν την πλειονότητα των αλληλεπιδράσεων στο ενεργό κέντρο ,

120

ανταγωνιζόµενοι την σύνδεση του φυσικού υποστρώµατος των ενζύµων CSE και CBS, της L-κυστεΐνης. Οι ενώσεις αυτές , Hydrazino-L-alanine και Hydrazino- glycine, εξετάστηκαν έναντι της δραστικότητας των ενζύµων CSE και CBS, µε την τεχνική του κυανού του µεθυλενίου , µια µέθοδο που προσδιορίζει την παραγωγή υδροθείου . Οι συνθήκες για την παραγωγή του υδροθείου από τα ένζυµα CSE και CBS είναι γνωστές από προηγούµενη µελέτη της οµάδας µας και αναφέρονται λεπτοµερώς στην παράγραφο 3.1.7.208 Παρατηρήθηκε πως και οι δύο αυτές ενώσεις αναστέλλουν και τα δύο ένζυµα , CSE και CBS, και µάλιστα σε συγκεντρώσεις µεγαλύτερες των 50 µΜ . Ωστόσο , η Hydrazino-glycine σε συγκέντρωση 5 µΜ φαίνεται να αναστέλλει εκλεκτικά το ένζυµο CBS ( κατά 25%) έναντι του CSE, ενώ η Hydrazino-L-alanine στα 5 µΜ αναστέλλει εκλεκτικά ( κατά 60%) το ένζυµο CSE έναντι του CBS ( Εικόνες 4.3-4.6). Οι παρατηρήσεις µας βέβαια προκύπτουν βάσει των συγκεκριµένων συνθηκών που µελετήθηκαν ( συγκεντρώσεις ενζύµων , συνενζύµου , υποστρώµατος κλπ ). Καθώς ήταν περιορισµένη η ποσότητα των συντιθέµενων αυτών ενώσεων δεν ήταν εφικτό να προχωρήσουµε στην περαιτέρω µελέτη σε κυτταρικό σύστηµα για να επιβεβαιωθεί η δράση τους in cellulo . Παρά ταύτα παραµένει ένα πεδίο που αξίζει περαιτέρω διερεύνηση , στο οποίο πρέπει να γίνουν επιπλέον φαρµακοκινητικές , φαρµακοδυναµικές και προκλινικές µελέτες ώστε να αξιολογηθεί η δυναµικότητα και εκλεκτικότητα αυτών των αναστολέων , όπως και τυχόν σύνθεση και αξιολόγηση τροποποιηµένων αναλόγων των αρχικών ενώσεων . Από τις δοµές των ενώσεων Hydrazino-L-alanine και Hydrazino-glycine παρατηρήσαµε οµοιότητα µε την δοµή της ουσίας , Aminoethoxyvinyl-glycine, AVG (Εικόνα 4.7). Η AVG ανακαλύφθηκε στο θρεπτικό υλικό ζύµωσης ενός µη ταυτοποιηµένου είδους Streptomyces ως αµινοξικός αντιµεταβολίτης που ανέστειλε την ανάπτυξη του Streptomyces cellulosae .269 Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι αναστέλλει ένα ένζυµο του µεταβολισµού της µεθειονίνης , τη β-λυάση της κυσταθειονίνης (cystathionine beta-lyase, CBL), ένα ένζυµο που εντοπίζεται στα βακτήρια και τα φυτά. Επίσης , η AVG µεταβάλλει τη δράση ορισµένων PLP- εξαρτώµενων ενζύµων .270 Με αφορµή την πληροφορία αυτή , µελετήθηκε η δράση της έναντι των ενζύµων CSE και CBS. Παρατηρήθηκε πως στις in vitro δοκιµές µας , αναστέλλει εκλεκτικά το ένζυµο CSE έναντι του CBS και η συγκέντρωση που

προκαλεί κατά 50% αναστολή στη δραστικότητα του CSE είναι IC 50 : 1,0 ± 0,1 µΜ . Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι ενώ αναφέρεται πως αναστέλλει κι άλλα PLP- εξαρτώµενα ένζυµα , οι παρατηρήσεις µας καθιστούν την AVG ως τον πιο δραστικό -

121

και εκλεκτικό για τη βιοσύνθεση του υδροθείου ταυτοχρόνως - αναστολέα του ενζύµου CSE που έχει αναφερθεί µέχρι σήµερα (Εικόνα 4.8). Μελέτες πρόσδεσης στο ενεργό κέντρο των CBS/CSE θα βοηθήσουν στο µέλλον ώστε να εξηγηθεί και η δραστικότητα αλλά και η εκλεκτικότητα της ένωσης . Στη συνέχεια µια άλλη οµάδα συνεργατών µας , του Ερευνητή ∆ιονυσίου Βουρλούµη από το E.K.E. Φ.E. « ∆ηµόκριτος », βασιζόµενη στην πληροφορία ότι για τη δράση των δύο ενζύµων CSE και CBS απαιτείται το συνένζυµο 5-φωσφορική πυριδοξάλη , PLP, σχεδίασε και συνέθεσε ουσίες που να ανταγωνίζονται τη δράση της PLP. Τα ανάλογα αυτά (Εικόνα 4.9), µελετήθηκαν σε συγκέντρωση 100 µΜ , η οποία θεωρείται υψηλή φαρµακολογικά και εξετάστηκε η επίδρασή τους στη δραστικότητα των ενζύµων CSE και CBS. ∆υστυχώς δεν παρατηρήθηκε καµία σηµαντική µεταβολή στην ενζυµατική παραγωγή υδροθείου από τις συνθετικές αυτές ενώσεις ( Εικόνα 4.10), αν και ο σχεδιασµός αναστολέων µε βάση την PLP έχει σηµαντικά όρια και δεν θα πρέπει να ακολουθηθεί στο µέλλον εφόσον υπάρχουν πάρα πολλά ένζυµα που χρησιµοποιούν την PLP ως συνένζυµο και ως εκ τούτου θα µειονεκτούν ως προς την ειδικότητα .271 Ως συµπληρωµατική προσέγγιση σε σχέση µε τον στοχευµένο σχεδιασµό και σύνθεση , αποφασίσαµε να προσπαθήσουµε να ταυτοποιήσουµε αναστολείς που τυχόν περιέχονται σε µία ευρεία συλλογή ποικίλων ενώσεων , ώστε να δούµε αν υπάρχουν δοµικά στοιχεία που µπορεί να µας διαφωτίσουν στην έρευνά µας . Έτσι , στη συνέχεια προχωρήσαµε στη σάρωση 1280 ενώσεων που περιλαµβάνονται στη βιβλιοθήκη LOPAC. Πρόκειται για βιοδραστικές ενώσεις , όπως αναστολείς και προσδέµατα υποδοχέων , η δράση των οποίων καλύπτει τις µείζονες κατηγορίες στόχων των φαρµάκων . Οι ενώσεις µελετήθηκαν έναντι των ενζύµων CSE και CBS, ως προς την επίδρασή τους στην ενζυµική παραγωγή υδροθείου . Από τα αποτελέσµατα της σάρωσης ( Παράρτηµα Αποτελεσµάτων , Πίνακες Π.Α.1 και Π.Α.2) ξεχωρίσαµε ως επιτυχείς “hits” ορισµένες ενώσεις που , στη συγκέντρωση των 100 µΜ που µελετήθηκαν , ανέστειλαν τα ένζυµα σε ποσοστό >75% ( Πίνακας 4.1). Με αυτό το κριτήριο προέκυψαν αναστολείς µόνο για το CBS, εφόσον για το ένζυµο CSE η µέγιστη αναστολή που προκλήθηκε ήταν 42% ( Πίνακας Π.Α.2, Παράρτηµα Αποτελεσµάτων ). Επιλέχθηκαν οι εξής πέντε ενώσεις για περαιτέρω µελέτη ως πιθανοί αναστολείς : Demeclocycline, Doxycycline, Me-3,4-Dephostatin, Rottlerin και Aurintricarboxylic acid (Εικόνα 5.1).

122

Εικόνα 5.1: ∆οµές των ενώσεων που µελετήθηκαν .

Η επιλογή βασίστηκε σε κριτήρια όπως η ευκολία διάθεσης των ουσιών , οι γνωστές δράσεις τους , η δοµή τους και η δυνατότητα σύνθεσης αναλόγων . Αντίθετα , αποκλείστηκαν ενώσεις που είχαν την πιθανότητα να απελευθερώνουν αφ ’εαυτού υδρόθειο ή/και να επηρεάσουν τα αποτελέσµατα των µετρήσεων . Για να επιβεβαιωθεί η εκλεκτικότητα των αναστολέων αυτών η µελέτη έπρεπε να γίνει έναντι και των τριών ενζύµων βιοσύνθεσης υδροθείου , CSE, CBS και 3 ΜSΤ. Για τα δύο πρώτα ένζυµα είχε ήδη γίνει η έκφραση και αποµόνωση τους ως χιµαιρικές πρωτεΐνες µε GST. Εποµένως προχωρήσαµε στην έκφραση και αποµόνωση του 3 ΜSΤ επίσης ως GST χιµαιρική πρωτεΐνη . Κατά τον έλεγχο της έκφρασης , ένα από τα κριτήρια ήταν να αποφευχθεί τυχόν κατακρήµνιση της πρωτεΐνης λόγω συσσώρευσής της σε σωµάτια εγκλεισµού , κάτι το οποίο παρατηρείται σε πρωτεΐνες που εκφράζονται σε µεγάλες ποσότητες µέσα σε σύντοµο χρονικό διάστηµα . Η έκφραση του ενζύµου επιτυγχάνεται είτε µετά από τις έξι ώρες είτε µετά από ολονύκτια επώαση ( Εικόνα 4.11). Εποµένως επιλέχθηκαν για τη συνέχεια των πειραµάτων οι συνθήκες έκφρασης στη θερµοκρασία 20 oC για 18 ώρες . Επίσης , για την αποφυγή της δηµιουργίας δυσδιάλυτης ή µη ορθά αναδιπλούµενης πρωτεΐνης χρησιµοποιήθηκε 0,1mM του επαγωγέα της έκφρασης , IPTG, συνθήκες που προτείνονται και από την βιβλιογραφία .272,273 Η αποµόνωση του ενζύµου GST-3ΜSΤ ήταν επιτυχής (Εικόνα 4.12). Στη συνέχεια έγινε έλεγχος της ενεργότητας του ενζύµου ως προς την παραγωγή υδροθείου µε την τεχνική του

123

κυανού του µεθυλενίου . Το ένζυµο που αποµονώθηκε είναι ενεργό εφόσον παράγει υδρόθειο µόνο στην παρουσία του υποστρώµατός του , 3-µερκαπτοπυροσταφυλικού , 3ΜΡ (Εικόνα 4.13). Για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών παραγωγής υδροθείου από το 3 ΜSΤ, αρχικά µελετήθηκε η παραγωγή υδροθείου από διάφορες ποσότητες του ενζύµου . Η ποσότητα που επιλέχθηκε είναι τα 5 µg, δεδοµένου ότι και για τα άλλα ένζυµα χρησιµοποιείται η ίδια ποσότητα , η οποία επίσης βρίσκεται στη γραµµική φάση της αντίδρασης , παρουσιάζει ικανοποιητική σχέση µεταξύ θορύβου και σήµατος , αλλά είναι και η ελάχιστη δυνατή για να αποδώσει αξιόπιστο αποτέλεσµα (Εικόνα 4.14). Στη συνέχεια εξετάστηκε η παραγωγή υδροθείου από το ένζυµο σε διάφορες συγκεντρώσεις του υποστρώµατος , 3 ΜΡ ( Εικόνα 4.15) και ακολούθως µελετήθηκε η κινητική της δραστικότητας του ενζύµου 3MST σε σχέση µε το

υπόστρωµα 3 ΜΡ , µε το µοντέλο Michaelis-Menten. Η ΚΜ για το 3 ΜΡ όπως υπολογίστηκε είναι 12,6 µΜ ( Εικόνα 4.16), εποµένως επιλέχθηκε για τα επόµενα πειράµατα η συγκέντρωση του υποστρώµατος 15 µΜ . Στη βιβλιογραφία δεν υπάρχουν πολλές αναφορές για την παραγωγή υδροθείου από αποµονωµένο ένζυµο

3ΜSΤ και οι τιµές ΚΜ για το 3 ΜΡ που αναφέρονται έχουν σηµαντική απόκλιση από την τιµή που υπολογίσαµε (1,2mM, 4,5mM και 20-350 µΜ ).273,274 Το γεγονός αυτό ίσως οφείλεται στις διαφορετικές πειραµατικές µεθόδους που χρησιµοποιούνται , όπως για παράδειγµα το τελικό προϊόν της αντίδρασης που προσδιορίζεται , η ύπαρξη επιπλέον υποστρωµάτων ή κάποιου αποδέκτη ( αναγωγικού ). Έχοντας πλέον στη διάθεση µας και τα τρία ένζυµα προς µελέτη , ακολούθησε ο έλεγχος της εκλεκτικότητας των αναστολέων που επιλέχθηκαν από τη σάρωση της βιβλιοθήκης LOPAC. Εφόσον το κάθε 1 µg ενζύµου 3MST, CSE και CBS ισοδυναµεί µε 0,016, 0,013 και 0,011nmoles αντίστοιχα , τα οποία είναι σχεδόν ισοδύναµα , καθώς επίσης αφού χρησιµοποιήθηκαν ίσες ποσότητες ενζύµων θεωρούµε πως οι συνθήκες εξέτασης των αναστολέων για εκλεκτικότητα είναι εξαιρετικά συγκρίσιµες . Οι ενώσεις Demeclocycline, Doxycycline, Me-3,4-Dephostatin, Rottlerin και Aurintricarboxylic acid µελετήθηκαν στη συγκέντρωση 100 µΜ και τα αποτελέσµατα που προέκυψαν συνοπτικά είναι : α) καµία από τις ενώσεις δεν ανέστειλε το ένζυµο CSE, β) το ένζυµο 3MST ανεστάλη σε βαθµό >50% από τις ενώσεις Demeclocycline, Doxycycline και Me-3,4-Dephostatin, γ) το ένζυµο CBS ανεστάλη σε ποικίλα ποσοστά από όλες τις ενώσεις ( Εικόνα 4.17). Για να εξακριβώσουµε αν κάποια από αυτές τις ενώσεις αλληλεπιδρά µε τη µέθοδο προσδιορισµού ή µε την παραγωγή υδροθείου , εξετάστηκε αν η οπτική απορρόφηση καµπύλης γνωστών συγκεντρώσεων

124

ενός δότη υδροθείου επηρεάζεται από την παρουσία των ενώσεων στη συγκέντρωση των 100 µΜ που µελετήθηκαν . Από τις ενώσεις αυτές µόνο η Me-3,4-Dephostatin έδειξε να επηρεάζει σηµαντικά τις µετρήσεις της µεθόδου ( Εικόνα 4.18). Συνεπώς αποκλείστηκε από περαιτέρω διερεύνηση ως αναστολέας . Ενδεικτικά , όπως προέκυψε από τον έλεγχο εκλεκτικότητας , οι ενώσεις Aurintricarboxylic acid και Rottlerin αναστέλλουν εκλεκτικά το ένζυµο CBS. Τα αντιβιοτικά Demeclocycline και Doxycycline αναστέλλουν το 3MST κατά 60% ενώ παρουσιάζουν µερική αναστολή και στο CBS (~20%) στη συγκέντρωση που µελετήθηκαν . Τα αποτελέσµατα αυτά είναι πολύ ενθαρρυντικά εφόσον υποδεικνύουν δύο εκλεκτικούς αναστολείς για το ένζυµο CBS έναντι των άλλων ενζύµων βιοσύνθεσης υδροθείου , καθώς και δύο δυναµικούς και κατά τι εκλεκτικούς (αναλόγως της συγκέντρωσης ) αναστολείς για το ένζυµο 3MST. Η ένωση Aurintricarboxylic acid, από όσο γνωρίζουµε , δεν έχει αναφερθεί ως αναστολέας για το CBS. Πρόκειται για µία ένωση που έχει την τάση να πολυµερίζεται σε υδατικά διαλύµατα , σχηµατίζοντας µια σταθερή ελεύθερη ρίζα που όπως έχει δειχθεί αναστέλλει διάφορες αλληλεπιδράσεις µεταξύ πρωτεϊνών - νουκλεϊκών οξέων .275 Επίσης αναφέρεται πως έχει ποικίλες φαρµακολογικές δράσεις , µεταξύ άλλων την αναστολή πρωτεασών , ριβονουκλεασών και νευραµινιδασών .276,277,278,279 Επιπρόσθετα έχει αναφερθεί πως διεγείρει τον υποδοχέα IGFR1 και τα Akt και ERK σηµατοδοτικά µονοπάτια .280,281,282 Σε συνεργασία µε άλλη οµάδα µελετήθηκε η επίδρασή της στον πολλαπλασιασµό των επιθηλιακών κυττάρων από ορθοκολικό καρκίνωµα HCT116, που υπερεκφράζουν το ένζυµο CBS. 283 Παρατηρήθηκε αύξηση στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό , γεγονός που συµφωνεί µε άλλες µελέτες όπου αναφέρουν διεγερτική δράση στον πολλαπλασιασµό διαφόρων κυτταρικών σειρών από αυτή την ένωση , που ίσως οφείλονται στην ικανότητα της να επάγει διάφορα σηµατοδοτικά µονοπάτια που αφορούν τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό .284,285,286 Οι ποικίλες φαρµακολογικές δράσεις της εποµένως υποδηλώνουν έλλειψη εκλεκτικότητας και χρησιµότητας ως αναστολέας του ενζύµου CBS. Η ένωση Rottlerin, γνωστή και µε την ονοµασία mallotoxin, ανήκει στις πολυφαινόλες και είναι φυσικό προϊόν που προέρχεται από το φυτό Mallotus phillippinensis . Η mallotoxin προτάθηκε σε δίπλωµα ευρεσιτεχνίας το 2006 ως φάρµακο για τη θεραπεία της υπέρτασης (patent WO/2006/060196). 287 Η Rottlerin εµφανίζει οµοίως ένα ευρύ και πολύπλοκο φαρµακολογικό φάσµα . Συνοπτικά ,

125

αναφέρεται πως είναι µη εκλεκτικός αναστολέας της πρωτεϊνικής κινάσης PKC δ,288 ενεργοποιεί τα ιοντικά κανάλια Kv7.1/KCNE1 και BKCa ++ ,287,289 είναι αποζεύκτης της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης 290 και παρουσιάζει αντικαρκινική δράση µέσω µειορρύθµισης της ογκοπρωτεΐνης ΤΑΖ ή αδρανοποίησης της πρωτεΐνης Skp2 (S- phase kinase associated protein 2).291,292 Οι παραπάνω αναφερόµενες , οι οποίες είναι µερικές από τις συνολικές δράσεις της Rottlerin, την καθιστούν ως µια ένωση µη εκλεκτική η οποία είναι δύσκολο να χρησιµοποιηθεί για τη µελέτη ενός συγκεκριµένου σηµατοδοτικού µονοπατιού . Στη µελέτη µας η Rottlerin χρησιµοποιήθηκε στη συγκέντρωση των 100 µΜ , η οποία υπερβαίνει τις συνήθεις συγκεντρώσεις που χρησιµοποιείται , της τάξεως 1-5µΜ .287,291 ,291 Σε κάποια προκαταρκτικά πειράµατά µας όπου µελετήθηκε η Rottlerin έναντι του CBS σε συγκεντρώσεις 1,10,100 µΜ , προκάλεσε αναστολή µόνο στη συγκέντρωση των 100 µΜ , προκαλώντας µικρό ποσοστό αναστολής (13% περίπου ) στη συγκέντρωση των 10 µΜ (ανέκδοτα δεδοµένα ). Τα αποτελέσµατα αυτά υποδεικνύουν πως στις συγκεντρώσεις που επιφέρει µεταβολή στη δραστικότητα του CBS, δεν είναι δυνατή η χρήση της Rottlerin, λόγω πολλαπλών άλλων ενεργειών της . Από τη σάρωση της βιβλιοθήκης LOPAC προέκυψαν , τέλος , δύο αντιβιοτικά της οικογένειας των τετρακυκλινών , η δεµεκλοκυκλίνη και η δοξυκυκλίνη , ως δυναµικοί αναστολείς του ενζύµου 3 ΜSΤ ( Εικόνα 4.17), µετρίως εκλεκτικοί , εφόσον παρουσίασαν εν µέρει αναστολή (~20%) και στο ένζυµο CBS στη συγκέντρωση των 100 µΜ που µελετήθηκαν (Εικόνα 4.19). Παρόλο που για το ένζυµο CS Ε δεν παρουσίασαν αναστολή ( µάλιστα η δεµεκλοκυκλίνη εµφάνισε ελαφρώς αύξηση στη δραστικότητα του ), προχωρήσαµε σε λεπτοµερέστερη εξέταση έναντι και των τριών ενζύµων για να διαπιστωθεί η δοσο -εξαρτώµενη δράση τους . Από τα αποτελέσµατα προέκυψε ότι και οι δύο τετρακυκλίνες , δοξυκυκλίνη και δεµεκλοκυκλίνη , αναστέλλουν το 3MST µε δοσο -εξαρτώµενο τρόπο και η συγκέντρωση που προκαλεί

αναστολή κατά 50% επί της συνολικής αναστολής, είναι IC 50 : 19,4µΜ για τη

δοξυκυκλίνη και IC 50 : 28,8 µΜ για τη δεµεκλοκυκλίνη (Εικόνα 4.20). Για τα άλλα ένζυµα , λόγω της αδυναµίας να βρεθεί “plateau” σε συγκεντρώσεις µέχρι και 300 µΜ ,

δεν είναι δυνατόν να προσδιοριστεί IC 50 . Οι τετρακυκλίνες αυτές , ακόµη και στη συγκέντρωση των 300 µΜ , δεν επηρέασαν αρκετά τα ένζυµα CSE και CBS σε βαθµό ώστε να προκληθεί αναστολή της δράσης τους τουλάχιστον κατά 50% ( Εικόνες 4.21 και 4.22). Για να είµαστε σίγουροι ότι η δράση τους αποδίδεται όντως σε αναστολή του ενζύµου 3 ΜSΤ, οι προαναφερόµενες δύο τετρακυκλίνες εξετάστηκαν για πιθανή

126

αλληλεπίδραση µε τη µέθοδο προσδιορισµού ή την παραγωγή υδροθείου από δότη . Εφόσον η καµπύλη απορρόφησης του δότη υδροθείου δεν επηρεάστηκε από την παρουσία της µέγιστης χρησιµοποιηθείσας συγκέντρωσης των τετρακυκλινών (300µΜ ), µπορούµε µε σχετική ασφάλεια να αποδώσουµε την µείωση στην χρωµογένεση από την ενζυµική αντίδραση στην ανασταλτική τους δράση έναντι του ενζύµου 3 ΜSΤ (Εικόνα 4.23). Οι τετρακυκλίνες αποτελούν µια οικογένεια βακτηριοστατικών αντιβιοτικών ευρέως φάσµατος . Το πρώτο αντιβιοτικό αυτής της οµάδας , η χλωροτετρακυκλίνη , αποµονώθηκε το 1947 από το είδος Streptomyces aureofaciens. 293 Η αντιµικροβιακή τους δράση οφείλεται κυρίως στη σύνδεσή τους µε την υποµονάδα 30S του βακτηριακού ριβοσώµατος και στην κατ ’επέκταση αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης στα βακτήρια .294 Αν και εµφανίζουν όλες αντιµικροβιακή δράση , παρά ταύτα αναφέρονται ανεξάρτητες και πλειοτροπικές δράσεις των αντιβιοτικών αυτών . Η βασική τους δοµή αποτελείται από τέσσερις συνενωµένους δακτυλίους µε ένα σύστηµα συζυγών διπλών δεσµών και οι διαφορές στη δράση τους οφείλονται στους διαφορετικούς υποκαταστάτες των δακτυλίων ( Εικόνα 5.2). 295,296,297 Η δεµεκλοκυκλίνη πέραν της αντιµικροβιακής της δράσης , αναφέρεται ότι προκαλεί επίσης διούρηση και νεφρογενή άποιο διαβήτη.298,299 Χρησιµοποιείται συν τοις άλλοις για τη θεραπεία της υπονατριαιµίας σε ασθενείς µε σύνδροµο της απρόσφορης έκκρισης αντιδιουρητικής ορµόνης (Syndrome of Inappropriate Antidiuretic Hormone Secretion, SIADH) εµποδίζοντας τη δράση της ορµόνης .300,301 Η δοξυκυκλίνη εµφανίζει περισσότερες δράσεις από τη δεµεκλοκυκλίνη . Μεταξύ άλλων αναφέρεται πως αναστέλλει τη φλεγµονή αναστέλλοντας τη φωσφολιπάση Α2302 και την έκφραση της συνθετάσης του µονοξειδίου του αζώτου ,303 εµποδίζει τη βλαστική εξαλλαγή των λεµφοκυττάρων 304 και αναστέλλει την αγγειογένεση αναστέλλοντας τη σύνθεση ή την δραστικότητα ορισµένων µεταλλοπρεωτεϊνασών της θεµέλιας ουσίας (ΜΜΡ -2, ΜΜΡ -8, ΜΜΡ -9). 305,306

127

Εικόνα 5.3: ∆οµές των εξεταζόµενων τετρακυκλινών .

Βασιζόµενοι στο εύρηµα ότι οι δύο προαναφερόµενες τετρακυκλίνες , που χρησιµοποιούνται ευρέως στη θεραπευτική ως αντιβιοτικά , αναστέλλουν το ένζυµο 3ΜSΤ, αναρωτηθήκαµε αν και οι υπόλοιπες εµπορικά διαθέσιµες τετρακυκλίνες θα έχουν ανάλογη δράση . Συνεπώς προχωρήσαµε στη µελέτη της δοσο -εξαρτώµενης δράσης των τετρακυκλινών µεκλοκυκλίνη , µεθακυκλίνη , οξυτετρακυκλίνη , τετρακυκλίνη , τιγεκυκλίνη και µινοκυκλίνη έναντι της παραγωγής υδροθείου από το ένζυµο 3ΜSΤ. Όπως παρατηρήθηκε στη µελέτη µας , καµία από τις επιπλέον εξεταζόµενες τετρακυκλίνες δεν επηρέασε τη δραστικότητα του ενζύµου σε βαθµό που να επιφέρει αναστολή µεγαλύτερη από 50%. Υπήρξε ωστόσο ένα εύρος αναστολής 25-40% στη µέγιστη συγκέντρωση (300 µΜ ) (Εικόνα 4.24). Για να διερευνήσουµε αν οι ίδιες τετρακυκλίνες επηρεάζουν τη δραστικότητα των άλλων ενζύµων βιοσύνθεσης του υδροθείου , εξετάστηκαν στη συγκέντρωση των 100 µΜ για τυχόν αναστολή των ενζύµων CSE και CBS. Όπως παρατηρήθηκε , η οξυτετρακυκλίνη και η µεκλοκυκλίνη ανέστειλαν το ένζυµο CBS κατά 20% περίπου , ενώ η τετρακυκλίνη και η τιγεκυκλίνη φαίνεται να επηρεάζουν και τα δύο ένζυµα ,

128

CSE και CBS. Πιο συγκεκριµένα , η τετρακυκλίνη αναστέλλει τα ένζυµα CSE και CBS κατά 25% και 30% αντίστοιχα , ενώ η τιγεκυκλίνη αναστέλλει κατά 30% και 50% αντίστοιχα (Εικόνα 4.25). Η διαφορετική δοµή τους ως προς τους υποκαταστάτες των δακτυλίων µπορεί να εξηγήσει τις διαφορετικές τους δράσεις . Όπως προαναφέρθηκε , στη βιβλιογραφία αναφέρονται για τις τετρακυκλίνες κι άλλες δράσεις , πέραν της αντιβιοτικής , όπως ότι επηρεάζουν τη φλεγµονή ,307 τους ανοσορυθµιστικούς µηχανισµούς , τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και την αγγειογένεση .296,308,309,310 Η διµεθυλαµινο -οµάδα στον C4 ( που είναι κοινή για όλες τις τετρακυκλίνες ) είναι υπεύθυνη για την αντιµικροβιακή τους δράση .311,312 Οι υποκαταστάτες των C11 και C12 εµφανίζουν ανασταλτική δράση έναντι ορισµένων κολλαγενασών .313,314 Οι επιδράσεις αυτές αναφέρθηκαν πρώτα από µια οµάδα ερευνητών οι οποίοι σχεδίασαν και συνέθεσαν χηµικά τροποποιηµένες τετρακυκλίνες (chemically modified tetracyclines, CMTs) που δεν εµφανίζουν αντιµικροβιακή δράση (οπότε δε θα υπάρχει και βακτηριακή αντοχή από αυτές ) και διατηρούν τις υπόλοιπες δράσεις τους (Εικόνα 5.3).313,315,316 Ορισµένες από τις χηµικά τροποποιηµένες τετρακυκλίνες , καθώς και η δοξυκυκλίνη σε χαµηλές ( µη -αντιµικροβιακές ) δόσεις , παρουσιάζουν µείωση της έκφρασης αλλά και ανασταλτική δράση έναντι της ενζυµικής δραστικότητας διαφόρων ΜΜΡ s. 317 Μάλιστα η δοξυκυκλίνη (periostat 20mg), σε χαµηλές µη αντιµικροβιακές δόσεις , έχει εγκριθεί ως αναστολέας των ΜΜΡ s για τη θεραπεία της περιοδοντίτιδας και της ροδόχρου ακµής 318 και η χηµικά τροποποιηµένη τετρακυκλίνη CMT-3 ( ή COL-3 ή metastat) βρίσκεται σε προκλινικές µελέτες για ορισµένους καρκινικούς τύπους 316,319,320 αλλά και σε κλινική φάση II για τη θεραπεία του σαρκώµατος Kaposi.321 Σε άλλες προκλινικές µελέτες παρατηρήθηκε ότι οι τετρακυκλίνες αυτές αναστέλλουν τη µετανάστευση κυττάρων ορθοκολικού καρκίνου µειώνοντας την έκφραση του θρυψινογόνου -2, 322 καθώς και ότι µειώνουν τη διήθηση και µετάσταση του καρκίνου στους πνεύµονες ως ΜΜΡ αναστολείς .323,324

129

Εικόνα 5.3: ∆οµές των χηµικά τροποποιηµένων τετρακυκλινών (CMTs).

Από όλες τις τετρακυκλίνες που εξετάστηκαν στην ενζυµική παραγωγή υδροθείου έναντι καθενός των τριών ενζύµων , παρατηρήθηκε αξιοσηµείωτη αναστολή από τη δοξυκυκλίνη και τη δεµεκλοκυκλίνη οι οποίες σε ορισµένες δόσεις δρουν εκλεκτικά έναντι του 3 ΜSΤ ( Εικόνες 4.20-4.22). Οι υπόλοιπες τετρακυκλίνες , στις µέγιστες υπό µελέτη συγκεντρώσεις (100, 300 µΜ ), είτε δεν εµφάνισαν σηµαντική δράση είτε ανέστειλαν σε κάποιο ποσοστό και τα τρία ένζυµα βιοσύνθεσης υδροθείου , γεγονός που τις καθιστά ως µη δραστικούς ή/και µη εκλεκτικούς αναστολείς της παραγωγής υδροθείου (Εικόνες 4.24-4.25). Για να διαπιστωθεί η αναστολή της παραγωγής υδροθείου από τη δοξυκυκλίνη και τη δεµεκλοκυκλίνη σε κυτταρικό επίπεδο , εξετάσθηκε η επίδραση τους στον πολλαπλασιασµό των κυτταρικών σειρών HCT116 και HT29 στις οποίες το υδρόθειο παίζει σηµαντικό ρόλο επάγοντας τον πολλαπλασιασµό τους .53 Η δοξυκυκλίνη όπως παρατηρήθηκε , δεν προκάλεσε αναστολή στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό , παρά µόνο στη συγκέντρωση των 500 µΜ που εµφάνισε 18% και 14% αναστολή στον πολλαπλασιασµό των HCT116 και HT29 αντίστοιχα (Εικόνες 4.26, 4.27). Το γεγονός αυτό έρχεται σε αντίθεση µε άλλες µελέτες , όπου αναφέρουν πως η δοξυκυκλίνη επάγει την απόπτωση κυττάρων ορθοκολικού καρκίνου ( µε εξαρτώµενους από τα µιτοχόνδρια µηχανισµούς )

130

αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασµό τους , καθώς και άλλων τύπων καρκίνου , µάλιστα σε δόσεις (2-100 µΜ ) µικρότερες από αυτές που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα µελέτη .316,325 Η δεµεκλοκυκλίνη , σε αντίθεση µε την δοξυκυκλίνη , παρατηρήθηκε ότι προκαλεί δοσο -εξαρτώµενη αναστολή στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και των δύο καρκινικών σειρών . Συγκεκριµένα , ανέστειλε τον πολλαπλασιασµό των HT29 κυττάρων κατά 40% στη συγκέντρωση των 500 µΜ και κατά 45% και 50% στα HCT116 κύτταρα στις συγκεντρώσεις των 200 µΜ και 500 µΜ αντίστοιχα (Εικόνες 4.26, 4.27). Σε σύγκριση , ο αναστολέας της παραγωγής υδροθείου , ΑΟΑΑ , έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει επίσης σε παρόµοιο βαθµό τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό στα ΗΤ -29, αν και λιγότερο στα HCT116.53,252 Στη βιβλιογραφία δεν υπάρχει κάποια µελέτη όπου να αναφέρεται η δράση της δεµεκλοκυκλίνης σε καρκινικά κύτταρα , παρά µόνο ως φθορίζουσα ουσία για την ανίχνευση και τον προσδιορισµό ορισµένων τύπων καρκίνου .326,327,328 Συνολικά , τα παραπάνω ευρήµατα της µελέτης µας , έδειξαν ότι η δεµεκλοκυκλίνη αναστέλλει εκλεκτικά την ενζυµική παραγωγή υδροθείου από το 3MST in vitro αλλά και τον πολλαπλασιασµό των καρκινικών κυττάρων στα οποία το υδρόθειο επάγει την ανάπτυξή τους , άρα υπάρχει µία συσχέτιση του ενός µε το άλλο , χωρίς να είµαστε απόλυτα σίγουροι για την σχέση αιτίου -αιτιατού . Βέβαια , η συγκέντρωση που παρατηρήσαµε ως ανασταλτική για το 3 ΜSΤ στο cell-free σύστηµα που

µελετήθηκε (IC 50 :28,8 µΜ ) είναι αρκετά µεγαλύτερη σε σχέση µε τη συγκέντρωση που αναφέρεται πως κυκλοφορεί στο πλάσµα αίµατος µε τις θεραπευτικές δόσεις που χρησιµοποιούνται (2-2,7 µg/mL ή 4-5,5 µΜ ).329,330 Εποµένως , θεωρούµε πως στις θεραπευτικές δόσεις που χρησιµοποιείται η δεµεκλοκυκλίνη , πιθανό να µην εµφανίζει ανασταλτική δράση έναντι του ενζύµου 3 ΜSΤ. Ο µηχανισµός της αναστολής της ενζυµικής δράσης του ενζύµου 3 ΜSΤ δεν είναι διευκρινισµένος , αν και µια υπόθεση µπορεί να βασιστεί στο γεγονός ότι οι τετρακυκλίνες δρουν και ως χηλικοί παράγοντες για µεταλλικά ιόντα .296,331 Μάλιστα η δεµεκλοκυκλίνη περιέχει χλώριο ως υποκαταστάτη στον C7, γεγονός που µπορεί να εξηγήσει την εκλεκτικότητα ως προς το 3MST, εφόσον µπορεί να δεσµεύει τα ιόντα Zn που υπάρχουν στο ένζυµο 3MST, αν και αυτό αναφέρεται µόνο για το βακτηριακό ένζυµο .332 Αναφέρεται πως τα βακτήρια που συνθέτουν υδρόθειο ενζυµατικά ( µέσω των CBS/CSE ή του 3MST), εµφανίζουν αντοχή στα αντιβιοτικά , η οποία είναι αναστρέψιµη µε αναστολή της παραγωγής υδροθείου .333 Το γεγονός πως η

131

δεµεκλοκυκλίνη αναστέλλει το ένζυµο 3MST, που εκφράζεται σε πληθώρα βακτηρίων , ενδεχοµένως να της δίνει το πλεονέκτηµα της ισχυρότερης αντι - µικροβιακής δράσης . Μέχρι σήµερα δεν είχε αναφερθεί κάποιος εύχρηστος ή δραστικός αναστολέας για το ανθρώπινο ένζυµο 3MST που να είναι κατάλληλος για βιολογικές µελέτες .334,335 Πολύ πρόσφατα όµως , µία οµάδα ερευνητών δηµοσίευσε την ανακάλυψη δύο εκλεκτικών αναστολέων έναντι του ενζύµου 3MST, χωρίς να αναφέρουν ποιες είναι αυτές , δίνοντας µόνο την πληροφορία ότι εµφανίζουν παρόµοιες δοµές µε τον αρωµατικό δακτύλιο της καρβονυλο -S-πυριµιδόνης .336 Επίσης , έχει αναφερθεί ως αναστολέας του 3MST η µεναδιόνη , ένα συνθετικό προϊόν που µετατρέπεται σε βιταµίνη Κ. Η τοξικότητα που προκαλείται αυξάνοντας τις δραστικές ρίζες οξυγόνου (ROS) είτε αφ ’εαυτής είτε µέσω µείωσης των επιπέδων γλουταθειόνης , την καθιστά όµως µη λειτουργικό αναστολέα .337 Βέβαια , η παρατηρούµενη αναστολή του 3MST από τη µεναδιόνη ίσως να οφείλεται στην αύξηση του οξειδωτικού στρες , γεγονός που έχει αποδειχθεί ως ανασταλτικός παράγοντας του 3MST από άλλες µελέτες .96 Εποµένως , η δεµεκλοκυκλίνη ή ίσως και η χηµικά τροποποιηµένη τετρακυκλίνη CMT-4 ( Εικόνα 5.3), που έχει παρόµοια δοµή µε βελτιωµένη δράση ( µη αντι - µικροβιακή ) θα µπορούσαν να χρησιµεύσουν ως αρχικά φαρµακολογικά εργαλεία για την έρευνα γύρω από το ένζυµο 3MST και τη βιολογία του υδροθείου . Επίσης , θα µπορούσαν να σχεδιαστούν κάποια ανάλογα της δεµεκλοκυκλίνης και να εξεταστούν ως προς τη δράση τους έναντι του ενζύµου 3MST. Σίγουρα όµως απαιτείται περαιτέρω µελέτη σε κύτταρα in vitro ή και σε µελέτες in vivo όπου θα είναι αποσιωπηµένη η έκφραση του 3MST, για την ολοκληρωµένη και εµπεριστατωµένη έρευνα περί της αναστολής του 3MST από τη δεµεκλοκυκλίνη. Από τις έρευνες που έχουν πραγµατοποιηθεί τα τελευταία χρόνια αλλά και τη δική µας µελέτη , όπου αναφέρεται η σηµασία του υδροθείου στις διάφορες κυτταρικές λειτουργίες και τη σηµατοδότηση , ιδιαίτερη συζήτηση γίνεται για το ρόλο που παίζουν τα ένζυµα βιοσύνθεσης υδροθείου αλλά και την σύγχρονη έλλειψη χρήσιµων φαρµακολογικών εργαλείων που να µπορούν να διαλευκάνουν τη δράση του καθενός από αυτά . Η ενζυµική προέλευση του υδροθείου σε κάθε περίπτωση µπορεί να διαφέρει , άλλοτε προέρχεται από το CSE ή το CBS, άλλοτε από το 3MST και πολλές φορές από το συνδυασµό αυτών . Το γεγονός οφείλεται στην εκάστοτε κυτταρική έκφραση και εντόπιση του κάθε ενζύµου αλλά και στα πιθανά ερεθίσµατα που δέχεται το κάθε κύτταρο , όπως συµβαίνει συχνά σε διάφορες παθολογικές

132

καταστάσεις . Το ένζυµο CBS αναφέρεται στη βιβλιογραφία ως ένας σηµαντικός παράγοντας στη ρύθµιση της βιολογίας καρκινικών κυττάρων .53,59 ,59 Συνεργάτες της οµάδας µας έχουν δείξει πως το υδρόθειο που προέρχεται από το ένζυµο CBS επάγει τον πολλαπλασιασµό , βελτιώνει την ενεργειακή κατάσταση των κυττάρων και αυξάνει τη µετανάστευση και διάχυση του καρκίνου του κόλου .53 Βασιζόµενοι στα ευρήµατα αυτά , θελήσαµε να διερευνήσουµε µία διαφορετική προσέγγιση στην τροποποίηση των επιπέδων του ενδογενώς παραγόµενου υδροθείου , δηλαδή εάν η επίδραση του αλλοστερικού ενεργοποιητή του CBS, της S-αδενοσυλο - L-µεθειονίνης (SAM), αυξάνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό της καρκινικής σειράς επιθηλιακών κυττάρων από ορθοκολικό καρκίνωµα ανθρώπου , HCT116, στην οποία υπερ -εκφράζεται το ένζυµο CBS. Η επιθηλιακή κυτταρική σειρά βλεννογόνου φυσιολογικού κόλου , NCM356, χρησιµοποιήθηκε ως αναφορά , διότι παρόλη την παρόµοια προέλευσή τους , εκφράζουν σε πολύ χαµηλά , συγκριτικά , επίπεδα το ένζυµο CBS.53 Εφόσον είναι γνωστό πως το υδρόθειο εµφανίζει διφασικό φαρµακολογικό χαρακτήρα , δηλαδή σε χαµηλές συγκεντρώσεις επάγει τον πολλαπλασιασµό και τη βιοενεργητική κατάσταση των κυττάρων ενώ οι υψηλές συγκεντρώσεις λειτουργεί ανασταλτικά , αναρωτηθήκαµε αν θα είναι ανάλογη και η δράση της SAM. Η SAM αρχικά είχε αναγνωριστεί ως ένας σηµαντικός ενδοκυττάριος ρυθµιστής , απαραίτητος για τη µεταφορά µεθυλοµάδων , ένας τελεστής των αντιδράσεων τρανσµεθυλίωσης . Η σύνθεσή της γίνεται στο µεταβολικό µονοπάτι της µεθειονίνης , µε τη µεταφορά της αδενοσίνης του ΑΤΡ στη µεθειονίνη . Η SAM προσφέρει τη µεθυλοµάδα σε πρωτεΐνες , λιπίδια αλλά και νουκλεΐκά οξέα , ρυθµίζοντας κατά συνέπεια λειτουργίες όπως την κυτταρική διαίρεση , τον κυτταρικό θάνατο , τη µεταγραφή , την ισορροπία οξειδωτικών /αντιοξειδωτικών και την οµοιόσταση των πολυαµινών .338 Επιπλέον , χορηγείται στον άνθρωπο για θεραπευτικούς σκοπούς ως θρεπτικό συµπλήρωµα και σε ορισµένες χώρες ως φάρµακο για διάφορες ασθένειες όπως οστεοαρθρίτιδα και ηπατικές βλάβες .339,340,341 Η SAM λειτουργεί επίσης ως αλλοστερικός ενεργοποιητής ενζύµων που κατέχουν ένα υδρόφοβο διαδοχικό µοτίβο τµηµάτων αναλόγων µε αυτά του CBS στο οποίο προσδένονται διάφορα νουκλεοτίδια αδενίνης . Η πρόσδεση της SAM στο ένζυµο CBS, όπως προαναφέρθηκε , οδηγεί σε αλλαγή της χωροδιάταξης του ενζύµου και επιτρέπει καλύτερη προσέγγιση του υποστρώµατος στην καταλυτική περιοχή µε την επακόλουθη αύξηση της δραστικότητας του ενζύµου .36,342

133

Για να διερευνηθεί η δράση της SAM µέσω του CBS στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό , εν πρώτοις εξετάστηκε η επίδρασή της στο ένζυµο . Για την επίτευξη αυτού µελετήθηκε η δραστικότητα του αποµονωµένου ενζύµου CBS παρουσία 1mM SAM in vitro µε την τεχνική του κυανού του µεθυλενίου για τον προσδιορισµό της παραγωγής υδροθείου . Οι ενζυµικές αντιδράσεις πραγµατοποιήθηκαν µε τη χρήση είτε κυστεΐνης ως υπόστρωµα είτε συνδυασµού κυστεΐνης -οµοκυστεΐνης . Η δραστικότητα του CBS είναι γνωστό πως είναι µεγαλύτερη υπό την παρουσία των δύο υποστρωµάτων κυστεΐνης -οµοκυστεΐνης σε σχέση µε την κυστεΐνη µόνη της ,66,208 γεγονός που παρατηρήθηκε και στη µελέτη µας . Η παρουσία της SAM αύξησε τη δραστικότητα του CBS και στις δύο περιπτώσεις . Συγκεκριµένα στην αντίδραση µε τα δύο υποστρώµατα η παραγωγή του υδροθείου αυξήθηκε κατά 3 φορές , ενώ υπό την παρουσία της κυστεΐνης ως µοναδικό υπόστρωµα η παραγωγή του υδροθείου αυξήθηκε κατά 6 φορές (Εικόνα 4.29). Στη συνέχεια µελετήθηκε η επίδραση της SAM στην παραγωγή υδροθείου από το CBS σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα των κυττάρων που υπερεκφράζουν το CBS, HCT116. Παρατηρήθηκε πως η SAM αυξάνει µε δοσο -εξαρτώµενο τρόπο την παραγωγή υδροθείου στα HCT116 κύτταρα , µάλιστα στη συγκέντρωση 1mM SAM η παραγωγή υδροθείου είναι τρεις φορές µεγαλύτερη σε σχέση µε το µάρτυρα (Εικόνα 4.30). Είναι αξιοσηµείωτο να αναφερθεί πως σε µελέτη όπου χορηγήθηκε σε µύες ένα ανάλογο µεθειονίνης που µετατρέπεται in vivo σε SAM, παρατηρήθηκε στην κυκλοφορία αύξηση κατά τρεις φορές περίπου στα επίπεδα υδροθείου .343,344 Τα ευρήµατα αυτά επιβεβαιώνουν την in vivo απόκριση του ενζύµου CBS στη SAM αλλά υποδηλώνουν επίσης ότι , ενώ η SAM υπάρχει σε αφθονία στα κύτταρα , το ένζυµο CBS δεν παρουσιάζει in vivo τη µέγιστη δυνατή δραστικότητα υπό φυσιολογικές συνθήκες . Σε συµφωνία βρίσκονται και τα αποτελέσµατα της µελέτης µας όπου , σε HCT116 κύτταρα στα οποία χορηγήθηκε SAM σε συγκέντρωση 3mM, παρατηρήθηκε αύξηση στην παραγωγή υδροθείου σε πραγµατικό χρόνο , όπως φαίνεται από τη φθορίζουσα απεικόνιση των κυττάρων που επωάστηκαν µε τον ειδικό για το υδρόθειο ανιχνευτή AzMC (Εικόνα 4.31). Η συγχορήγηση του γνωστού αναστολέα του ενζύµου CBS, ΑΟΑΑ , µείωσε την SAM-εξαρτώµενη αύξηση της παραγωγής υδροθείου των κυττάρων . Επίσης , στα κύτταρα αναφοράς NCM356 όπου εκφράζεται ελάχιστα το CBS, η SAM στη συγκέντρωση 3mM παρουσίασε λιγότερο αισθητή αύξηση στην παραγωγή υδροθείου , όπως παρατηρήθηκε από το φθορισµό των κυττάρων ( Εικόνα

134

4.31). Τα δύο τελευταία δεδοµένα υποδηλώνουν πως η αύξηση του υδροθείου στα HCT116 κύτταρα προκαλείται από την απόκριση του ενζύµου CBS στη SAM. Υπάρχουν πολλές µελέτες που έχουν επιβεβαιώσει ότι η εξωγενής χορήγηση ή η αύξηση της ενδογενούς παραγωγής υδροθείου επάγει την κυτταρική διαίρεση και τον πολλαπλασιασµό .150 ,151,345,346,347 Συνεπώς , εφόσον επιβεβαιώθηκε in vitro σε κύτταρα η θετική επίδραση της SAM στην παραγωγή υδροθείου από το ένζυµο CBS, εξετάσαµε στη συνέχεια την επίδραση της SAM στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό . Όπως έχει προαναφερθεί , το υδρόθειο έχει διττό φαρµακολογικό χαρακτήρα σε διάφορες βιολογικές λειτουργίες . Σε χαµηλές συγκεντρώσεις επάγει τον πολλαπλασιασµό , την κυτταροπροστασία και είναι αντιοξειδωτικός παράγοντας ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις είναι κυτταροτοξικό και αναστέλλει πολλές από τις βιολογικές διεργασίες .121 Εποµένως υποθέσαµε πως , σε χαµηλές συγκεντρώσεις της SAM πιθανό να επιτυγχάνεται η ενεργοποίηση του CBS σε ιδανικά επίπεδα παραγωγής υδροθείου όπου θα υπερισχύει ο επαγωγικός του ρόλος ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις SAM να παράγονται τοξικά επίπεδα υδροθείου . Για να διερευνηθεί η επίδραση της SAM στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό , χρησιµοποιήθηκαν τα κύτταρα HCT116 και NCM356 τα οποία , όπως παρατηρήθηκε από τα προηγούµενα αποτελέσµατα , αποκρίνονται λειτουργικά στη SAM. Η επώαση των κυττάρων µε τη SAM (0,1-3mM) έγινε για 24 ώρες και ο πολλαπλασιασµός των κυττάρων µελετήθηκε µε την τεχνολογία του xCELLigence, που επιτρέπει την παρατήρηση του πολλαπλασιασµού και την καταγραφή των αποτελεσµάτων σε πραγµατικό χρόνο . Πράγµατι , η SAM σε χαµηλές συγκεντρώσεις ( ως 1mM) και σε µικρής διάρκειας έκθεση (0-12 ώρες ) επάγει τον πολλαπλασιασµό των HCT116 κυττάρων ενώ σε υψηλή συγκέντρωση (3mM) ή/και σε περισσότερο χρονικό διάστηµα (24 ώρες ) η δράση της είναι ανασταλτική ( Εικόνα 4.32). Τα NCM356 κύτταρα αναπτύσσονται µε πιο αργό ρυθµό σε σχέση µε τα καρκινικά HCT116. 53 Εποµένως , αφού αρχικά εξετάστηκε ο ρυθµός πολλαπλασιασµού τους , επιλέχθηκε η συγκέντρωση 1x10 5 κύτταρα /mL, που εµφανίζει παρόµοιο ρυθµό πολλαπλασιασµού µε τη συγκέντρωση των HCT116 κυττάρων (Εικόνα 4.33 Α). Η διεγερτική δράση των χαµηλών συγκεντρώσεων της SAM στον πολλαπλασιασµό των HCT116 κυττάρων δεν παρατηρήθηκε στα NCM356 (Εικόνα 4.33B,C). Εν τούτοις , η ανασταλτική επίδραση της SAM ήταν εµφανής στο χρονικό διάστηµα 12-24 ωρών ( Εικόνα 4.33B,D). Το ερώτηµα που παραµένει είναι αν η διεγερτική δράση της SAM ( στις χαµηλές συγκεντρώσεις ) ή/και η ανασταλτική της δράση ( σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ή

135

περισσότερο χρόνο επώασης ) µεσολαβείται όντως από το µονοπάτι CBS/H 2S. Για να απαντηθεί η διερώτηση αυτή , προβήκαµε στην αναστολή του ενζύµου CBS φαρµακολογικά αλλά και µε γονιδιακή αποσιώπηση . Αρχικά χρησιµοποιήθηκε ο αναστολέας ΑΟΑΑ στην ευρέως χρησιµοποιούµενη συγκέντρωση του 1mM. Η επίδραση του αναστολέα ανέτρεψε πλήρως το αποτέλεσµα της διεγερτικής δράσης της SAM στο βραχύ χρόνο επώασης (0-12 ώρες ) στο εύρος των συγκεντρώσεων (0,1- 3mM) ( Εικόνα 4.34B,C). Στη µεγαλύτερης διάρκειας έκθεση (12-24 ώρες ) η παρουσία ΑΟΑΑ , ανέστειλε τη διεγερτική δράση της SAM στη χαµηλότερη συγκέντρωση (0,1mM), αλλά διατήρησε την ανασταλτική δράση της στην υψηλότερη συγκέντρωση (3mM). Αξίζει να σηµειωθεί πως το ΑΟΑΑ από µόνο του προκαλεί αναστολή του πολλαπλασιασµού (Εικόνα 4.34B,D). Παρόµοια αποτελέσµατα παρατηρήθηκαν και στα κύτταρα shCBS HCT116 στα οποία έγινε γονιδιακή αποσιώπηση του CBS (Εικόνα 4.35 Α). Η SAM, απέτυχε να διατηρήσει τη διεγερτική της δράση στον πολλαπλασιασµό των shCBS HCT116 κυττάρων στις χαµηλές συγκεντρώσεις και στη µικρής διάρκειας έκθεση (0-12 ώρες ), ενώ φαίνεται να διατηρεί την ανασταλτική της δράση στις υψηλές συγκεντρώσεις (>1mM) στο µεγαλύτερο χρόνο επώασης (12-24 ώρες ). Στα κύτταρα αναφοράς , shCTL HCT116, είχε παραπλήσια δράση µε αυτή που παρατηρήθηκε στα µη - διαµολυµµένα HCT116 κύτταρα . Η µειωµένη έκφραση του CBS αφ ’εαυτή στα shCBS HCT116 κύτταρα είχε ως αποτέλεσµα την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασµού ανεξάρτητα της επώασης µε τη SAM (Εικόνα 4.35B,C,D,E). Από τα παραπάνω προκύπτει ότι η διεγερτική δράση των χαµηλών συγκεντρώσεων , καθώς και της µικρής διάρκειας έκθεσης της SAM στον πολλαπλασιασµό των HCT116 κυττάρων , δεν παρατηρήθηκε ούτε στα κύτταρα µε τη µειωµένη έκφραση του CBS, NCM356, καθώς ούτε και στα HCT116 κύτταρα µε φαρµακολογικά ανεσταλµένη τη δράση του CBS ή µε αποσιώπηση της γονιδιακής του έκφρασης . Τα ευρήµατα αυτά φαίνεται να επιβεβαιώνουν την αρχική µας υπόθεση , πως σηµαντικό µέρος της θετικής επίδρασης της SAM µεσολαβείται πράγµατι από αυξηµένη

ενεργότητα του µονοπατιού CBS/H 2S. Στο πλαίσιο αυτό είναι αξιοσηµείωτο να αναφερθεί πως σε προηγούµενες µελέτες είχε παρατηρηθεί πως τα ενδοκυττάρια επίπεδα της SAM είναι υψηλότερα κατά τη διάρκεια της φάσης του πολλαπλασιασµού διαφόρων κυττάρων 348 ενώ σε άλλη έρευνα απεδείχθη ότι µείωση των ενδογενών επιπέδων της SAM οδηγεί σε καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασµού .349 Τα ευρήµατα αυτά συµφωνούν µε τις παρατηρήσεις µας , ότι η

136

εξωγενής SAM, σε χαµηλές συγκεντρώσεις επάγει τον πολλαπλασιασµό . Παρά ταύτα , η αναστολή του πολλαπλασιασµού στις υψηλές συγκεντρώσεις και στη µεγαλύτερης διάρκειας έκθεση της SAM που παρατηρήθηκε τόσο στα HCT116 αλλά και στα NCM356 κύτταρα , υποδεικνύει ότι η SAM παρουσιάζει τοξικές δράσεις , αλλά δεν είναι απόλυτα αποσαφηνισµένο αν διαµεσολαβούνται µέσω µηχανισµών

ανεξάρτητων των CBS/H 2S. Η SAM, όπως αναφέρεται , µειώνει τον πολλαπλασιασµό των καρκινικών κυττάρων , επιδρώντας σε διάφορες κυτταρικές αντιδράσεις µεταξύ των οποίων , το σχηµατισµό ισχυρών οξειδωτικών ( όπως 5'-δεοξυαδενοσυλο ρίζα ), την µεθυλίωση του DNA και τη ρύθµιση των ενδοκυττάριων επιπέδων πολυαµινών .350,351 Θεωρούµε πιθανότερο ότι οι διεργασίες αυτές , και λιγότερο η αυξηµένη παραγωγή υδροθείου , άµεσα ή έµµεσα µπορούν να συµβάλλουν στην απώλεια της κυτταρικής βιωσιµότητας παρουσία υψηλών επιπέδων της SAM. 338,352 Τα ευρήµατα της παρούσας µελέτης µπορούν να συσχετιστούν µε την αντικαρκινική δράση της SAM. Βασιζόµενοι στο γεγονός ότι , όπως έχει προκύψει από πρόσφατες µελέτες , το υδρόθειο επηρεάζει τον πολλαπλασιασµό και την παραγωγή ενέργειας σε διάφορους τύπους καρκίνου ,53,59 ,59 αλλά και το ότι σε αυξηµένα ενδοκυτταρικά επίπεδα το υδρόθειο δρά ανασταλτικά ή/και τοξικά ,121 θελήσαµε να διερευνήσουµε την επίδραση της SAM στον πολλαπλασιασµό καρκινικών κυττάρων . Πράγµατι , διαπιστώσαµε πως σε υψηλά επίπεδα (3mM) ή/και µεγαλύτερης διάρκειας έκθεση (24 ώρες ), η SAM παρουσιάζει ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασµό των καρκινικών κυττάρων HCT116. Οι συγκεντρώσεις στις οποίες παρατηρήθηκε η ανασταλτική δράση της SAM είναι συγκρίσιµες µε το εύρος των συγκεντρώσεων (1- 10mM) που έχουν αναφερθεί σε άλλες µελέτες ως ανασταλτικές του πολλαπλασιασµού .353,354,355 Ωστόσο , η ανασταλτική δράση της SAM στον πολλαπλασιασµό διατηρήθηκε και στα shCBS HCT116 κύτταρα , αλλά και στα κύτταρα που ανεστάλη φαρµακολογικά το ένζυµο CBS. Πέραν αυτού , στην 24 ώρη έκθεση η SAM αδιακρίτως ανέστειλε τον πολλαπλασιασµό στα HCT116, αλλά και στα µειωµένης CBS έκφρασης κύτταρα NCM356. Συνεπώς , από τα ευρήµατα της παρούσας διατριβής συµπεραίνουµε πως οι ανασταλτικές δράσεις της SAM στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό πιθανόν σχετίζονται µε µηχανισµούς ανεξάρτητους από

το µονοπάτι CBS/H 2S.

137

ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Συµπερασµατικά , από το σύνολο των επί µέρους µελετών στα πλαίσια της διατριβής καταλήγουµε στα εξής : α) οι ενώσεις Hydrazino-glycine και Hydrazino-L-alanine έχουν περιορισµένη εκλεκτικότητα ως αναστολείς των ενζύµων CBS και CSE, αλλά θα µπορούσαν να χρησιµεύσουν ως αρχικές ενώσεις για τον σχεδιασµό ακόµη πιο εκλεκτικών φαρµακολογικών αναστολέων , που είναι κρίσιµα εργαλεία για την έρευνα της βιολογίας των διακριτών ενζύµων βιοσύνθεσης του υδροθείου , β) από τις in vitro δοκιµές µας βρέθηκε πως η Aminoethoxyvinyl-glycine, AVG, αναστέλλει εκλεκτικά

το ένζυµο CSE έναντι του CBS µε IC 50 : 1,0 ± 0,1 µΜ , γεγονός που την καθιστά ως τον πιο δραστικό και εκλεκτικό για τη βιοσύνθεση του υδροθείου αναστολέα του ενζύµου CSE, γ) τα αποτελέσµατα της σάρωσης της βιβλιοθήκης LOPAC µπορούν να χρησιµεύσουν ως αρχική βάση για τη σύνθεση αναλόγων ή νέων ουσιών που να έχουν εκλεκτικά ανασταλτική δράση έναντι των ενζύµων CBS ή 3 ΜSΤ, δ) η δεµεκλοκυκλίνη , βάσει των ευρηµάτων µας , µπορεί να θεωρηθεί ως ένας χρήσιµος (και µοναδικός µέχρι στιγµής ) αναστολέας του 3 ΜSΤ, αν και χρειάζεται περαιτέρω in vitro και in vivo µελέτη για τη διακρίβωση της εκλεκτικότητάς της , ε) η µελέτη της σύνδεσης της δεµεκλοκυκλίνης και των χηµικά τροποποιηµένων τετρακυκλινών (CMTs), θα µπορούσε να χρησιµεύσει για τη σύνθεση αναλόγων ή νέων ουσιών µε βελτιωµένη ειδικότητα και ισχύ έναντι του 3 ΜSΤ και τέλος , στ ) η SAM, ένα εγκεκριµένο θεραπευτικό µόριο , έχει διττή επίδραση στον πολλαπλασιασµό καρκινικών κυττάρων in vitro : σε χαµηλές συγκεντρώσεις επάγει τον πολλαπλασιασµό µέσω ενεργοποίησης του ενζύµου CBS, ενώ σε υψηλότερες συγκεντρώσεις αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό τους , µε µηχανισµούς πιθανότατα

ανεξάρτητους του µονοπατιού CBS/ Η2S και ως εκ τούτου χρήζει περαιτέρω µελέτης στην προκλινική ογκολογική έρευνα .

138

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

139

140

Πίνακας Π.Α.1: Αποτελέσµατα σάρωσης της βιβλιοθήκης LOPAC έναντι του ενζύµου CBS. Οι ενώσεις µελετήθηκαν σε συγκέντρωση 100 µΜ .

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

2,3-Dimethoxy-1,4- R(-)-2,10,11-Trihydroxy- 1 Cell Stress 106,2 31 N-propylnoraporphine Dopamine 65,14 61 Tyrphostin AG 835 Phosphorylation 56,39 naphthoquinone hydrobromide

Demeclocycline 8-Bromo-cGMP Cyclic (±)-6-Chloro-PB 2 Antibiotic 95,61 32 63,66 62 Dopamine 55,94 hydrochloride sodium Nucleotides hydrobromide

Doxycycline 1,3-Dipropyl-8-p- 3 Antibiotic 94,38 33 MK-886 Leukotriene 63,5 63 Adenosine 55,83 hydrochloride sulfophenylxanthine

trans-Azetidine-2,4- 6,7-ADTN 4 GW5074 Phosphorylation 93,84 34 Glutamate 63,25 64 Dopamine 55,78 dicarboxylic acid hydrobromide

Sodium nitroprusside 5 Nitric Oxide 90,82 35 S(-)-Atenolol Adrenoceptor 63,11 65 Quinolinic acid Glutamate 55,67 dihydrate

6 Phenserine Neurotransmission 90,45 36 Bromoenol lactone Lipid 62,88 66 (±)-Taxifolin Cell Stress 55,53

8-(p- ABT-418 L(-)-Norepinephrine 7 Cholinergic 88,51 37 Adrenoceptor 61,98 67 Sulfophenyl)theophyll Adenosine 55,52 hydrochloride bitartrate ine

O- Alaproclate 8 (Carboxymethyl)hydroxyl Biochemistry 84,64 38 Serotonin 61,95 68 Indirubin-3'-oxime Phosphorylation 55,2 amine hemihydrochloride hydrochloride

9 Me-3,4-dephostatin Phosphorylation 83,86 39 beta-Lapachone Apoptosis 61,19 69 A3 hydrochloride Phosphorylation 54,94

Cyclic (±)-Isoproterenol 10 Pentoxifylline 82,91 40 Adrenoceptor 60,72 70 S-(-)-Carbidopa Biochemistry 54,86 Nucleotides hydrochloride

Arecaidine propargyl 11 Rottlerin Phosphorylation 82,61 41 Cholinergic 60,38 71 BF-170 hydrochloride Neurodegeneration 54,85 ester hydrobromide

SKF-89145 12 GW7647 Transcription 82 42 Phaclofen GABA 59,5 72 Dopamine 54,81 hydrobromide

R(-)-N- 5-(N,N- 13 SID7969543 Gene Regulation 79,23 43 Allylnorapomorphine Dopamine 59,29 73 hexamethylene)amilor Ion Pump 54,7 hydrobromide ide

6-Hydroxy-DL- N-Methyldopamine 14 Adrenoceptor 78,92 44 Fenoldopam bromide Dopamine 58,92 74 Dopamine 54,36 DOPA hydrochloride

N6-2-(4- Aurintricarboxylic 15 Apoptosis 78,13 45 SU 6656 Phosphorylation 58,82 75 Aminophenyl)ethylad Adenosine 54,34 acid enosine

16 NSC 95397 Phosphorylation 76,96 46 Sepiapterin Nitric Oxide 58,68 76 Piceatannol Phosphorylation 53,73

Protriptyline 17 (-)-Eseroline fumarate Cholinergic 75,86 47 ATPA Glutamate 58,52 77 Adrenoceptor 53,71 hydrochloride

R(-)- 18 Org 27569 Cannabinoid 74,56 48 Ro 90-7501 Neurodegeneration 58,52 78 Propylnorapomorphin Dopamine 53,65 e hydrochloride

(±)-SKF 38393, N- 19 Dopamine 74,17 49 CB 1954 DNA 58,42 79 DL-Thiorphan Neurotransmission 53,65 allyl-, hydrobromide

S-(p- Multi-Drug 20 Emodin Phosphorylation 74,04 50 IC 261 Phosphorylation 57,95 80 Azidophenacyl)glutat 53,58 Resistance hione

4-(2- 21 Myricetin Phosphorylation 73,86 51 Aminoethyl)benzenesulfo Biochemistry 57,56 81 1-Phenylbiguanide Serotonin 53,55 nyl fluoride hydrochloride

Benserazide 22 Biochemistry 70,14 52 (±)-HA-966 Glutamate 57,51 82 Quinidine sulfate Na+ Channel 53,43 hydrochloride

Guanidinyl- 23 Pirenperone Serotonin 70,06 53 naltrindole di- Opioid 57,42 83 (±)-alpha-Lipoic Acid Cell Stress 53,41 trifluoroacetate

A-77636 Adenosine 3',5'-cyclic gamma-Acetylinic 24 Dopamine 68,46 54 Phosphorylation 57,15 84 GABA 52,94 hydrochloride monophosphate GABA

Cyclic 25 Pinacidil K+ Channel 68,31 55 Quercetin dihydrate 57,04 85 Phenelzine sulfate Neurotransmission 52,86 Nucleotides

Protoporphyrin IX Cyclic 26 68,19 56 Amoxapine Adrenoceptor 56,95 86 Tyrphostin AG 490 Phosphorylation 52,83 disodium Nucleotides

R(-)-Isoproterenol 6-Nitroso-1,2- 27 Adrenoceptor 67,58 57 Transcription 56,79 87 Piribedil maleate Dopamine 52,63 (+)-bitartrate benzopyrone

GBR-12935 SDZ-205,557 6(5H)- 28 Dopamine 67,42 58 Serotonin 56,52 88 Transcription 52,47 dihydrochloride hydrochloride Phenanthridinone

S(+)-PD 128,907 Pregnenolone sulfate 29 BTO-1 Phosphorylation 66,79 59 Dopamine 56,49 89 GABA 52,32 hydrochloride sodium

30 K114 Neurotransmission 65,68 60 PD 168,077 maleate Dopamine 56,49 90 PPADS P2 Receptor 51,88

141

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

6-Aminohexanoic LP 12 hydrochloride 91 Immune System 51,82 121 Paromomycin sulfate Antibiotic 48,76 151 Serotonin 45,84 acid hydrate

Ziprasidone Fluoxetine 92 Aminobenztropine Cholinergic 51,66 122 hydrochloride Neurotransmission 48,71 152 Serotonin 45,75 hydrochloride monohydrate

(±)-PD 128,907 93 ARP 101 ECM 51,63 123 Phosphonoacetic acid DNA 48,51 153 Dopamine 45,75 hydrochloride

Phenylbenzene- 94 omega-phosphono- Glycine 51,61 124 Isotharine mesylate Adrenoceptor 48,15 154 Tyrphostin AG 494 Phosphorylation 45,67 alpha-amino acid

Quinelorane 95 Dopamine 51,61 125 Tyrphostin AG 698 Phosphorylation 47,79 155 Tyrphostin AG 555 Phosphorylation 45,64 dihydrochloride

Quipazine, 6-nitro-, 1,10-Phenanthroline 96 Serotonin 51,52 126 Biochemistry 47,75 156 Pifithrin-mu Apoptosis 45,5 maleate monohydrate

Tiapride 97 (+)-Quisqualic acid Glutamate 51,47 127 Dopamine 47,51 157 Bicalutamide (CDX) Gene Regulation 45,49 hydrochloride

(S)-Propranolol (±)-PPHT 98 Adrenoceptor 51,38 128 CBIQ K+ Channel 47,49 158 Dopamine 45,47 hydrochloride hydrochloride

R(-)-2,10,11- Propionylpromazine 99 Trihydroxyaporphine Dopamine 51,24 129 L-Tryptophan Serotonin 47,4 159 Dopamine 45,45 hydrochloride hybrobromide

Quinacrine S(-)-3PPP Prazosin 100 Neurotransmission 51,2 130 Dopamine 47,3 160 Adrenoceptor 45,45 dihydrochloride hydrochloride hydrochloride

Tranylcypromine L-Glutamic acid 101 Tyrphostin 23 Phosphorylation 51,13 131 Neurotransmission 47,27 161 Glutamate 45,43 hydrochloride hydrochloride

(-)-Quinpirole 102 p-Benzoquinone DNA Repair 50,95 132 Dopamine 47,25 162 Dephostatin Phosphorylation 45,31 hydrochloride

103 Propentofylline Adenosine 50,95 133 (±)-Ibotenic acid Glutamate 47,2 163 Taurine Glycine 45,28

1,4-PBIT Dequalinium chloride 104 Nitric Oxide 50,79 134 K+ Channel 47,18 164 Tyrphostin AG 537 Phosphorylation 45,28 dihydrobromide hydrate

105 HEMADO Adenosine 50,7 135 Phenylbutazone Prostaglandin 47,18 165 Pheniramine maleate Histamine 45,15

Phenamil Putrescine 106 AS-252424 Phosphorylation 50,67 136 Na+ Channel 47,16 166 Glutamate 44,97 methanesulfonate dihydrochloride

4- 107 Quinine sulfate K+ Channel 50,6 137 Cortexolone Hormone 47 167 Hydroxyphenethylami Dopamine 44,87 ne hydrochloride

Prilocaine Propantheline R(+)-3PPP 108 Na+ Channel 50,35 138 Cholinergic 46,91 168 Dopamine 44,83 hydrochloride bromide hydrochloride

Procaine 109 Na+ Channel 50,24 139 Suramin sodium salt P2 Receptor 46,83 169 Picotamide Thromboxane 44,77 hydrochloride

1-Amino-1- Nordihydroguaiaretic acid 110 cyclohexanecarboxyli Neurotransmission 50,03 140 Enalaprilat dihydrate Neurotransmitters 46,82 170 from Larrea divaricata Leukotriene 44,61 c acid hydrochloride (creosote bush) 2- Tulobuterol 111 H-7 dihydrochloride Phosphorylation 49,83 141 Adrenoceptor 46,57 171 Phenylaminoadenosin Adenosine 44,56 hydrochloride e

Terazosin 112 Nimodipine Ca2+ Channel 49,81 142 Genistein Phosphorylation 46,55 172 Adrenoceptor 44,55 hydrochloride

5alpha-Pregnan- 2,3-Butanedione 113 GABA 49,76 143 Tranilast Leukotriene 46,44 173 K+ Channel 44,47 3alpha-ol-20-one monoxime

114 Bay 11-7082 Phosphorylation 49,58 144 Hispidin Phosphorylation 46,38 174 AIDA Glutamate 44,44

7,7-Dimethyl- 2-(Methylthio)adenosine 115 (5Z,8Z)-eicosadienoic Lipid 49,37 145 Morin Cell Stress 46,29 175 5'-diphosphate trisodium Purinoceptor 44,4 acid salt hydrate

Cytoskeleton and Procainamide 116 Gallamine triethiodide Cholinergic 49,17 146 Clodronic acid 46,26 176 Na+ Channel 44,38 ECM hydrochloride

alpha- (±)-Quinpirole Uridine 5'- 117 Dopamine 49,17 147 P2 Receptor 46,03 177 Guanidinoglutaric Nitric Oxide 44,3 dihydrochloride diphosphate sodium acid

Tetrahydrozoline Tetradecylthioacetic 118 SMER28 Cell Biology 49,1 148 Adrenoceptor 45,99 178 Transcription 44,16 hydrochloride acid

Cyclic (±)-cis-Piperidine-2,3- Xanthine amine 119 Quazinone 49,05 149 Glutamate 45,93 179 Adenosine 44,07 Nucleotides dicarboxylic acid congener

Pirenzepine Terbutaline Granisetron 120 Cholinergic 48,85 150 Adrenoceptor 45,86 180 Serotonin 43,95 dihydrochloride hemisulfate hydrochloride

142

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

(6R)-5,6,7,8-Tetrahydro- Neurotransmission 181 S(-)-Timolol maleate Adrenoceptor 43,93 211 L-biopterin hydrochloride 40,28 241 Amisulpride Dopamine 37,8

BAY 61-3606 182 Aniracetam Glutamate 43,67 212 Phosphorylation 40,28 242 TTNPB Transcription 37,69 hydrochloride hydrate

BIX 01294 (±)-SKF-38393 cis-4-Aminocrotonic 183 trihydrochloride Gene Regulation 43,67 213 Dopamine 40,21 243 GABA 37,55 hydrochloride acid hydrate

184 PD 98,059 Phosphorylation 43,6 214 PNU-37883A K+ Channel 40,2 244 Parthenolide Serotonin 37,49

Trazodone 185 L-Canavanine Cell Stress 43,4 215 Serotonin 40,13 245 ML-7 Phosphorylation 37,47 hydrochloride

Promethazine 186 ATPO Glutamate 43,25 216 Ketoprofen Prostaglandin 39,8 246 Histamine 37,37 hydrochloride

Na-p-Tosyl-L-lysine (±)-p- Cyclic 187 Biochemistry 43,07 217 chloromethyl ketone 39,79 247 Tolbutamide Hormone 37,37 Aminoglutethimide Nucleotides hydrochloride

Succinylcholine 188 Tyrphostin AG 112 Phosphorylation 42,92 218 Cholinergic 39,76 248 Fenofibrate Transcription 37,28 chloride

Trihexyphenidyl 189 cDPCP Cell Cycle 42,86 219 Cholinergic 39,75 249 3-n-Propylxanthine Adenosine 37,2 hydrochloride

(±)-3-(3,4- Aprindine 190 dihydroxyphenyl)-2- Neurotransmission 42,8 220 K+ Channel 39,71 250 TCPOBOP Transcription 37,19 hydrochloride methyl-DL-alanine

Phentolamine 191 Fulvestrant Hormone 42,79 221 Adrenoceptor 39,66 251 SB 222200 Tachykinin 37,16 mesylate

1-(2- ICI 204,448 192 Opioid 42,68 222 Methoxyphenyl)piper Serotonin 39,6 252 Pentylenetetrazole Neurotransmission 37,16 hydrochloride azine hydrochloride

L-Beta-threo-benzyl- 193 Tyrphostin AG 1478 Phosphorylation 42,66 223 Neurotransmission 39,55 253 Reactive Blue 2 P2 Receptor 37,06 aspartate

DL-Buthionine-[S,R]- Multi-Drug Amsacrine 194 TBBz Phosphorylation 42,56 224 39,44 254 DNA Repair 37,03 sulfoximine Resistance hydrochloride

Pergolide 195 Dopamine 42,48 225 SB-525334 Phosphorylation 39,37 255 JWH-015 Cannabinoid 37 methanesulfonate

L-Glutamic acid, N- 196 GW2974 Phosphorylation 42,46 226 LFM-A13 Phosphorylation 39,19 256 Glutamate 36,96 phthaloyl-

(±)-Norepinephrine 197 Phloretin Ca2+ Channel 42,39 227 Pyrazinecarboxamide Antibiotic 39,04 257 Adrenoceptor 36,86 (+)bitartrate

Tetramisole 198 Kynurenic acid Glutamate 42,34 228 Phosphorylation 38,68 258 Ifenprodil tartrate Glutamate 36,78 hydrochloride

199 (-)-Physostigmine Cholinergic 42,17 229 Kenpaullone Phosphorylation 38,38 259 Theobromine Adenosine 36,75

Triprolidine Cyclic 200 Histamine 41,91 230 DPO-1 K+ Channel 38,35 260 Isoliquiritigenin 36,57 hydrochloride Nucleotides

1-[2- Cytoskeleton and 201 (Trifluoromethyl)phe Nitric Oxide 41,53 231 Taxol 38,35 261 SU 4312 Phosphorylation 36,55 ECM nyl]imidazole N-p-Tosyl-L- 202 Ellipticine Cell Cycle 41,5 232 Bezafibrate Transcription 38,29 262 phenylalanine Biochemistry 36,55 chloromethyl ketone

(±)-Octoclothepin cis-Azetidine-2,4- Triflupromazine 203 Dopamine 41,42 233 Glutamate 38,25 263 Dopamine 36,47 maleate dicarboxylic acid hydrochloride

5'-Amino-5'- Pyridostigmine 204 deoxyadenosine p- Adenosine 41,11 234 PAPP Serotonin 38,18 264 Cholinergic 36,35 bromide toluenesulfonate salt

Antozoline Sertraline 205 Imidazoline 40,95 235 (-)-Perillic acid G protein 38,13 265 Serotonin 36,11 hydrochloride hydrochloride

Dipropyldopamine Tetraethylthiuram 206 Triamcinolone Hormone 40,95 236 Dopamine 38,11 266 Biochemistry 36,1 hydrobromide disulfide

1-Allyl-3,7-dimethyl- 2-Methylthioadenosine 207 8-p- Adenosine 40,75 237 triphosphate tetrasodium P2 Receptor 38,04 267 Theophylline Adenosine 36,1 sulfophenylxanthine (R,R)-cis-Diethyl 208 Pyrilamine maleate Histamine 40,72 238 tetrahydro-2,8- Hormone 37,98 268 Astaxanthin Cell Stress 36 chrysenediol

Esomeprazole 209 Triamterene Na+ Channel 40,58 239 Ion Channel 37,94 269 (±)-Ibuprofen Prostaglandin 35,96 magnesium dihydrate

Fenoterol 210 Adrenoceptor 40,54 240 Tyrphostin 1 Phosphorylation 37,88 270 Daphnetin Phosphorylation 35,95 hydrobromide

143

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

LY-294,002 271 1,5-Isoquinolinediol Apoptosis 35,88 301 Olvanil Neurotransmission 33,42 331 Phosphorylation 31,4 hydrochloride

Intracellular 272 Thio-NADP sodium 35,74 302 LY-367,265 Serotonin 33,34 332 Formoterol Adrenoceptor 31,37 Calcium

Cytoskeleton and 273 Tyrphostin 47 Phosphorylation 35,68 303 Tyrphostin AG 879 Phosphorylation 33,33 333 Colchicine 31,33 ECM

1-benzoyl-5-methoxy- SB 206553 Naltriben Multi-Drug 274 Serotonin 35,67 304 Opioid 33,24 334 2-methylindole-3- 31,31 hydrochloride methanesulfonate Resistance acetic acid

Imipramine 275 SR-95531 GABA 35,65 305 L-Canavanine sulfate Nitric Oxide 33,21 335 Serotonin 31,23 hydrochloride

Fexofenadine DNA 276 Histamine 35,57 306 Altretamine 33,02 336 L-Glutamine Glutamate 31,18 hydrochloride Metabolism

(±)-AMT 277 L-765,314 Adrenoceptor 35,5 307 Nitric Oxide 33,01 337 U-73343 G-protein 31,14 hydrochloride

278 Spiroxatrine Serotonin 35,33 308 Allopurinol Cell Stress 32,88 338 Loratadine Histamine 31,14

3- 279 L-Aspartic acid Glutamate 35,26 309 Morpholinosydnonimi Nitric Oxide 32,86 339 Nilutamide Hormone 31,12 ne hydrochloride

I-OMe-Tyrphostin 280 Phosphorylation 35,24 310 Aurothioglucose Phosphorylation 32,86 340 Loxapine succinate Dopamine 31,01 AG 538

(E)-4-amino-2- Amiodarone 281 GABA 35,11 311 SIB 1757 Glutamate 32,86 341 Adrenoceptor 30,98 butenoic acid hydrochloride

DNA Promazine 282 Acetohexamide Hormone 35,1 312 Idarubicin 32,76 342 Dopamine 30,94 Metabolism hydrochloride

(±)-Chloro-APB 283 Piracetam Glutamate 35,01 313 Dopamine 32,75 343 SCH-28080 Ion Channels 30,92 hydrobromide

SB 200646 Opipramol 284 Serotonin 34,99 314 Sigma receptor 32,69 344 JL-18 Dopamine 30,88 hydrochloride dihydrochloride

S(+)-Isoproterenol Multi-Drug 285 Adrenoceptor 34,93 315 Ketoconazole 32,69 345 TBB Phosphorylation 30,88 (+)-bitartrate Resistance

(-)-Tetramisole 286 NNC 55-0396 Ca2+ Channel 34,89 316 Phosphorylation 32,69 346 UK 14,304 Adrenoceptor 30,68 hydrochloride

5'-N- Aminoguanidine 287 Ethylcarboxamidoade Adenosine 34,82 317 Nitric Oxide 32,66 347 FPL 64176 Ca2+ Channel 30,65 hydrochloride nosine

288 Piroxicam Prostaglandin 34,64 318 3,5-Dinitrocatechol Neurotransmission 32,57 348 (S)-(+)-Camptothecin Apoptosis 30,61

289 Isonipecotic acid GABA 34,59 319 Pyrocatechol Cell Cycle 32,31 349 GR-89696 fumarate Opioid 30,61

290 trans-(±)-ACPD Glutamate 34,52 320 Etoposide Apoptosis 32,31 350 HA-100 Phosphorylation 30,57

Lercanidipine Alprenolol 291 Adrenoceptor 34,46 321 hydrochloride Calcium Channel 32,27 351 NSC348884 hydrate Apoptosis 30,57 hydrochloride hemihydrate

292 Kainic acid Glutamate 34,41 322 UCL 2077 Ion Channels 32,25 352 Flutamide Hormone 30,33

Molindone 293 Tyrphostin 51 Phosphorylation 34,24 323 Dopamine 32,18 353 MRS 2159 P2 Receptor 30,21 hydrochloride

294 4-Aminopyridine K+ Channel 34,14 324 Trimipramine maleate Serotonin 31,94 354 Oleic Acid Phosphorylation 30,14

N-(4-Amino-2- DL-alpha- 295 chlorophenyl)phthali Anticonvulsant 34,14 325 Difluoromethylornithi Angiogenesis 31,9 355 Praziquantel Antibiotic 30,14 mide ne hydrochloride 6-Methoxy-1,2,3,4- ARL 67156 trisodium 3-Aminopropionitrile Multi-Drug 296 P2 Receptor 34 326 31,81 356 tetrahydro-9H- Neurotransmission 30,05 salt fumarate Resistance pyrido[3,4b] indole

(±)-2,3-Dichloro-alpha- 297 L-701,324 Glutamate 33,86 327 Famotidine Histamine 31,75 357 methylbenzylamine Neurotransmission 30,05 hydrochloride 3,4- (±)-Epinephrine Ancitabine DNA 298 Adrenoceptor 33,83 328 Dihydroxyphenylaceti Dopamine 31,69 358 30,02 hydrochloride hydrochloride Metabolism c acid

S-Nitroso-N- Amitriptyline 299 Nitric Oxide 33,82 329 PNU-282987 Cholinergic 31,63 359 Adrenoceptor 29,96 acetylpenicillamine hydrochloride

300 beta-Estradiol Hormone 33,62 330 Fusaric acid Dopamine 31,61 360 O6-benzylguanine DNA Repair 29,95

144

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

Caffeic acid Iofetamine 361 Cell Cycle 29,88 391 Psora-4 K+ Channel 28,73 421 Neurotransmission 26,54 phenethyl ester hydrochloride

BRL 52537 Phenylephrine 362 Neurotransmission 29,88 392 Adrenoceptor 28,69 422 SB 216763 Phosphorylation 26,54 hydrochloride hydrochloride

Telenzepine 4-Methylpyrazole 363 Linopirdine Cholinergic 29,86 393 Cholinergic 28,63 423 Biochemistry 26,49 dihydrochloride hydrochloride

Emetine (-)-Isoproterenol 364 Adrenoceptor 29,77 394 dihydrochloride Apoptosis 28,57 424 L-allylglycine Biochemistry 26,48 hydrochloride hydrate N-Methyl-beta- (-)-alpha- Centrophenoxine 365 Adrenoceptor 29,76 395 Nootropic 28,51 425 carboline-3- GABA 26,43 Methylnorepinephrine hydrochloride carboxamide

Diacylglycerol kinase Cyclic 366 Phosphorylation 29,6 396 SIB 1893 Glutamate 28,47 426 Forskolin 26,43 inhibitor I Nucleotides

N,N,N',N'- (±)-DOI 367 Serotonin 29,59 397 Indomethacin Prostaglandin 28,3 427 Tetramethylazodicarb Cell Stress 26,42 hydrochloride oxamide

368 Pilocarpine nitrate Cholinergic 29,56 398 Adenosine Adenosine 28,18 428 L-2-aminoadipic acid Glutamate 26,23

N,N,N-trimethyl-1-(4- (+)-MK-801 hydrogen 369 AL-8810 Prostaglandin 29,51 399 trans-stilbenoxy)-2- Cholinergic 28,06 429 Glutamate 26,17 propylammonium iodide maleate Ammonium N-(3,3- 370 pyrrolidinedithiocarba Nitric Oxide 29,51 400 Lansoprazole Ion Pump 28,04 430 Diphenylpropyl)glyci Glutamate 26,13 mate namide

371 Alloxazine Adenosine 29,45 401 Tolazamide Hormone 27,97 431 L-162,313 Neurotransmission 26,06

p-Iodoclonidine 372 Flupirtine maleate Glutamate 29,45 402 Iproniazid phosphate Neurotransmission 27,87 432 Adrenoceptor 26,02 hydrochloride

2-Cyclooctyl-2- S-(+)-Fluoxetine 373 Tracazolate GABA 29,42 403 hydroxyethylamine Neurotransmission 27,77 433 Serotonin 25,97 hydrochloride hydrochloride

Trequinsin Cyclic Naltrindole 374 29,41 404 S(+)-Ibuprofen Prostaglandin 27,7 434 Opioid 25,84 hydrochloride Nucleotides hydrochloride

Idazoxan NAN-190 375 Imidazoline 29,38 405 Serotonin 27,62 435 Stevioside Ion Channels 25,76 hydrochloride hydrobromide

(-)-Epinephrine 376 BW 284c51 Cholinergic 29,31 406 E-64 Biochemistry 27,59 436 Adrenoceptor 25,73 bitartrate

Clemizole 377 NADPH tetrasodium Nitric Oxide 29,25 407 Histamine 27,45 437 R(+)-Butylindazone Ion Pump 25,69 hydrochloride

5- Dobutamine 378 Adrenoceptor 29,19 408 Carboxamidotryptami Serotonin 27,34 438 LE 300 Dopamine 25,68 hydrochloride ne maleate 3-(1H-Imidazol-4- Cyclic 379 Enoximone 29,18 409 yl)propyl di(p- Histamine 27,23 439 Cefaclor Antibiotic 25,57 Nucleotides fluorophenyl)methyl ether hydrochloride

(+)-Pilocarpine Atropine methyl 380 Cholinergic 29,1 410 Cholinergic 27,18 440 Pindolol Adrenoceptor 25,55 hydrochloride nitrate

Paroxetine hydrochloride A-68930 381 hemihydrate (MW = Serotonin 29,06 411 Dopamine 27,07 441 Fluspirilene Dopamine 25,47 374.83) hydrochloride

Epibestatin 382 Benzamide Apoptosis 29 412 Biochemistry 27,05 442 Felodipine Ca2+ Channel 25,36 hydrochloride

Prochlorperazine 5alpha-Pregnan- 383 Dopamine 28,98 413 GABA 26,87 443 Ganciclovir Cell Cycle 25,36 dimaleate 3alpha-ol-11,20-dione

m- SKF 89976A 384 GABA 28,96 414 NBI 27914 Neurotransmission 26,86 444 Iodobenzylguanidine Apoptosis 25,29 hydrochloride hemisulfate

Tetraethylammonium 385 Cholinergic 28,96 415 AB-MECA Adenosine 26,83 445 Phenytoin sodium Anticonvulsant 25,28 chloride

386 Etodolac Prostaglandin 28,95 416 Niclosamide Antibiotic 26,78 446 Perphenazine Dopamine 25,22

Dihydro-beta- 387 erythroidine Cholinergic 28,9 417 Ketorolac tris salt Prostaglandin 26,75 447 Ketotifen fumarate Histamine 25,12 hydrobromide 7-Cyclopentyl -5-(4 - phenoxy)phenyl-7H- 388 Beclomethasone Hormone 28,89 418 D-609 potassium Lipid 26,66 448 pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4- Phosphorylation 25,1 ylamine L-Buthionine- Multi-Drug 3,7-Dimethyl-1- 389 L-655,708 Benzodiazepine 28,86 419 26,6 449 Adenosine 24,87 sulfoximine Resistance propargylxanthine

(S)-3,5- NS8593 390 Ca2+ Channel 28,75 420 BRL 50481 Phosphodiesterase 26,6 450 Dihydroxyphenylglyc Glutamate 24,85 hydrochloride ine 145

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

3-Isobutyl-1- 451 Adenosine 24,81 481 Glybenclamide K+ Channel 22,63 511 N-Acetyl-L-Cysteine Glutamate 21,09 methylxanthine

Phosphomycin Labetalol 452 Antibiotic 24,81 482 SKF 89626 Dopamine 22,59 512 Adrenoceptor 21,03 disodium hydrochloride

Fenspiride Alfuzosin 453 SD-169 Phosphorylation 24,73 483 Adrenoceptor 22,47 513 Adrenoceptor 21,02 hydrochloride hydrochloride

Memantine 454 Glutamate 24,63 484 Genipin Cell Biology 22,45 514 Flumazenil Benzodiazepine 20,95 hydrochloride

S-(4-Nitrobenzyl)-6- 455 Adenosine 24,54 485 U-73122 Lipid 22,34 515 5-Fluorouracil Cell Cycle 20,82 thioguanosine

LY-310,762 NG-Monomethyl-L- 456 Serotonin 24,47 486 Nitric Oxide 22,33 516 AS 604850 Phosphorylation 20,71 hydrochloride arginine acetate

Minocycline 457 Cell Cycle 24,39 487 CGS-15943 Adenosine 22,29 517 CR 2249 Glutamate 20,52 hydrochloride

L-750,667 458 Cantharidic Acid Phosphorylation 24,37 488 Dopamine 22,29 518 Cantharidin Phosphorylation 20,49 trihydrochloride

GYKI 52466 Diethylenetriaminepe Cyclophosphamide 459 Glutamate 24,29 489 Biochemistry 22,23 519 DNA 20,47 hydrochloride ntaacetic acid monohydrate

SKF 75670 460 Dopamine 24,29 490 Ebselen Leukotriene 22,21 520 SP600125 Phosphorylation 20,41 hydrobromide

N^G,N^G- 5-fluoro-5'- DNA 461 Dimethylarginine Nitric Oxide 24,21 491 (±)-Atenolol Adrenoceptor 22,09 521 20,39 deoxyuridine Metabolism hydrochloride

Anisotropine methyl 462 K 185 Melatonin 24,21 492 Muscarinic 22,08 522 SB 415286 Phosphorylation 20,36 bromide

S(-)-UH-301 (±)-CGP-12177A 463 Serotonin 24,21 493 Adrenoceptor 22,01 523 Domperidone Dopamine 20,31 hydrochloride hydrochloride

3,4- 464 Biochemistry 24,15 494 1,10-Diaminodecane Glutamate 22 524 NU6027 Phosphorylation 20,23 Dichloroisocoumarin

9-Amino-1,2,3,4- IMID-4F 465 U-74389G maleate Cell Stress 23,83 495 tetrahydroacridine Cholinergic 21,99 525 K+ Channel 20,2 hydrochloride hydrochloride N,N-Dipropyl-5- 466 Leflunomide Immune System 23,52 496 Tyrphostin AG 538 Phosphorylation 21,86 526 carboxamidotryptami Serotonin 20,18 ne maleate

DNA L-687,384 467 Melphalan 23,51 497 SR 59230A oxalate Adrenoceptor 21,76 527 Opioid 20,08 Metabolism hydrochloride

Flunarizine 468 Isoxanthopterin Cell Stress 23,48 498 Ion Pump 21,75 528 Cisplatin DNA 20,01 dihydrochloride

p-Fluoro-L- 469 N-Acetyltryptamine Melatonin 23,43 499 Neurotransmission 21,73 529 U-69593 Opioid 19,93 phenylalanine

D(-)-2-Amino-5- beta-Chloro-L-alanine 470 phosphonopentanoic Glutamate 23,41 500 MDL 28170 Cell Cycle 21,7 530 Biochemistry 19,89 hydrochloride acid

Pargyline 471 Neurotransmission 23,39 501 BIO Phosphorylation 21,66 531 Valproic acid sodium Anticonvulsant 19,89 hydrochloride

Dextromethorphan Lidocaine 472 1,7-Dimethylxanthine Adenosine 23,36 502 hydrobromide Glutamate 21,65 532 Na+ Channel 19,82 hydrochloride monohydrate L-3,4- Imiloxan 473 Adrenoceptor 23,35 503 Dihydrocapsaicin Vanilloid 21,63 533 Dihydroxyphenylalani Dopamine 19,74 hydrochloride ne

(+)-Brompheniramine 474 Histamine 23,26 504 Furafylline Biochemistry 21,62 534 MK-912 Adrenoceptor 19,74 maleate

3-alpha,21- R(+)-SCH-23390 475 Dihydroxy-5-alpha- GABA 23,15 505 Dopamine 21,56 535 (-)-Naproxen sodium Prostaglandin 19,59 hydrochloride pregnan-20-one

(±)-alpha-Methyl-4- 476 JX401 Phosphorylation 23,12 506 CX 546 Glutamate 21,51 536 Glutamate 19,59 carboxyphenylglycine

3- Chlormethiazole N- 477 GABA 22,91 507 Cholinergic 21,43 537 Morpholinosydnonimi Nitric Oxide 19,31 hydrochloride Desmethylclozapine ne hydrochloride Apomorphine Fluphenazine 478 Dopamine 22,87 508 hydrochloride Dopamine 21,42 538 Capsazepine Vanilloid 19,24 dihydrochloride hemihydrate Cytosine-1-beta-D- Indatraline DNA 479 Dopamine 22,75 509 GW9508 Lipids 21,22 539 arabinofuranoside 19,21 hydrochloride Metabolism hydrochloride

Vanillic acid Imetit 480 Vanilloid 22,72 510 Histamine 21,16 540 R(+)-IAA-94 Cl- Channel 19,18 diethylamide dihydrobromide

146

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

541 Chloro-IB-MECA Adenosine 19,16 571 Furegrelate sodium Phosphorylation 17,61 601 Cephalexin hydrate Antibiotic 16,31

542 Icilin Neurotransmission 19,05 572 Ivermectin Cholinergic 17,54 602 Fusidic acid sodium Cell Cycle 16,3

GR 55562 2,4-Diamino-6- 543 Serotonin 18,95 573 Phosphorylation 17,49 603 FSCPX Adenosine 16,22 dihydrobromide pyrimidinone

Disopyramide Guanfacine 544 K+ Channel 18,92 574 Adrenoceptor 17,29 604 CGS-12066A maleate Serotonin 16,18 phosphate hydrochloride

L-alpha-Methyl Intracellular 545 Biochemistry 18,89 575 Pancuronium bromide Cholinergic 17,16 605 Calcimycin 16,14 DOPA Calcium

Phorbol 12-myristate 546 Phosphorylation 18,85 576 Doxazosin mesylate Adrenoceptor 17,1 606 Neostigmine bromide Cholinergic 16,09 13-acetate

(±)-Brompheniramine 547 CyPPA K+ Channels 18,83 577 Eliprodil Glutamate 17,1 607 Histamine 16 maleate

L-N6-(1- Pentamidine 548 Glutamate 18,81 578 Iminoethyl)lysine Nitric Oxide 17,07 608 Caffeic Acid Cell Stress 16 isethionate hydrochloride

Pentolinium di[L(+)- Fiduxosin Calmidazolium Intracellular 549 Cholinergic 18,81 579 Adrenoceptor 17,02 609 15,8 tartrate] hydrochloride chloride Calcium

550 Fluvoxamine maleate Serotonin 18,79 580 Iodoacetamide Biochemistry 16,99 610 PD 169316 Phosphorylation 15,74

Venlafaxine 551 Serotonin 18,72 581 AMG 9810 Ion Channels 16,92 611 2-methoxyestradiol Hormone 15,7 hydrochloride

Orphenadrine Palmitoylethanolamid 552 Estrone Hormone 18,68 582 Cholinergic 16,91 612 Cannabinoid 15,67 hydrochloride e

4-Hydroxy-3- SKF 83959 553 Cibenzoline succinate K+ Channels 18,57 583 Dopamine 16,89 613 methoxyphenylacetic Dopamine 15,65 hydrobromide acid

Cysteamine 554 U-99194A maleate Dopamine 18,57 584 Somatostatin 16,88 614 Nefiracetam Neurotransmission 15,59 hydrochloride

5,5-Dimethyl-1- Amiloride 555 Cell Stress 18,52 585 CPCCOEt Glutamate 16,82 615 Na+ Channel 15,47 pyrroline-N-oxide hydrochloride

Retinoic acid p- 556 PPNDS tetrasodium P2 Receptor 18,48 586 T0070907 Gene Regulation 16,79 616 Cell Cycle 15,42 hydroxyanilide

Propafenone 557 Primidone Anticonvulsant 18,44 587 Oxaprozin Prostaglandin 16,75 617 K+ Channel 15,26 hydrochloride

5,7- cis-(Z)-Flupenthixol 558 Dopamine 18,28 588 Dichlorokynurenic Glutamate 16,69 618 Carvedilol Adrenoceptor 15,11 dihydrochloride acid

(+)-Bromocriptine 559 Dopamine 18,23 589 MRS 1845 Ca2+ Channel 16,65 619 AS605240 Biochemistry 15,05 methanesulfonate

1-(5 - Phenoxybenzamine Metoclopramide 560 Adrenoceptor 18,23 590 Isoquinolinylsulfonyl)-3- Phosphorylation 16,59 620 Dopamine 14,96 hydrochloride methylpiperazine hydrochloride dihydrochloride erythro-9-(2-Hydroxy-3- 561 MG 624 Cholinergic 18,1 591 nonyl)adenine Adenosine 16,57 621 PRE-084 Opioid 14,89 hydrochloride

Bepridil L-703,606 oxalate salt 562 Ipratropium bromide Cholinergic 18,05 592 Ca2+ Channel 16,56 622 Tachykinin 14,8 hydrochloride hydrate

L-3,4- 563 Dihydroxyphenylalanine Dopamine 18,03 593 FAUC 213 Dopamine 16,56 623 AC-93253 iodide Hormone 14,74 methyl ester hydrochloride 4- NO-711 564 Amidinophenylmethanesul Biochemistry 17,93 594 GABA 16,55 624 Nomifensine maleate Dopamine 14,69 fonyl fluoride hydrochloride hydrochloride 1- 565 Aminocyclopropanecarbo Glutamate 17,77 595 Chlorothiazide Biochemistry 16,52 625 Norcantharidin Phosphorylation 14,69 xylic acid hydrochloride

S-Ethylisothiourea Etazolate 566 Nitric Oxide 17,72 596 Alinidine K+ Channels 16,52 626 Adenosine 14,64 hydrobromide hydrochloride

Efaroxan Cyclic 567 Imidazoline 17,72 597 Furosemide Ion Pump 16,49 627 Milrinone 14,61 hydrochloride Nucleotides

2,6-Difluoro-4-[2- GBR-12909 568 (phenylsulfonylamino)eth Glutamate 17,7 598 Dopamine 16,46 628 CI-976 Lipid Signaling 14,59 ylthio]phenoxyacetamide dihydrochloride P1,P4-Di(adenosine- 1,3-Dipropyl-7- 569 IB-MECA Adenosine 17,67 599 Adenosine 16,33 629 5')tetraphosphate Biochemistry 14,33 methylxanthine triammonium

Antibiotics/ 570 Tamoxifen 17,64 600 Tropicamide Cholinergic 16,33 630 Atropine sulfate Cholinergic 14,16 Phosphorylation

147

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

4- Z-L-Phe chloromethyl 631 Chloromercuribenzoic Biochemistry 14,13 661 Biochemistry 12,21 691 PAC-1 Apoptosis 10,57 ketone acid

S-Methyl-L- 632 L-741,626 Dopamine 14,1 662 DBO-83 Cholinergic 12,18 692 Nitric Oxide 10,53 thiocitrulline acetate

L-745,870 Naftopidil Thioridazine 633 Dopamine 14,06 663 Adrenoceptor 12,16 693 Dopamine 10,17 hydrochloride dihydrochloride hydrochloride

Hydroxylamine Dopamine 634 Cyclothiazide Glutamate 14,04 664 Neurotransmission 12,12 694 Dopamine 10,16 hydrochloride hydrochloride

635 loxoprofen Prostaglandin 14,01 665 NS 521 oxalate Glutamate 11,98 695 Metrazoline oxalate Imidazoline 9,98

636 2,2'-Bipyridyl Biochemistry 13,82 666 Cinoxacin Antibiotic 11,96 696 Paliperidone Neurotransmission 9,96

Zimelidine Cephalosporin C zinc 637 Mifepristone Hormone 13,75 667 Serotonin 11,93 697 Antibiotic 9,65 dihydrochloride salt

Moxisylyte 638 Mephetyl tetrazole K+ Channel 13,74 668 Adrenoceptor 11,59 698 Cortisone 21-acetate Hormone 9,57 hydrochloride

(+)-Norfenfluramine 639 Felbamate Glutamate 13,71 669 Serotonin 11,5 699 Diazoxide K+ Channel 9,56 hydrochloride

5-Aminovaleric acid 640 Nitrendipine Ca2+ Channel 13,65 670 GABA 11,47 700 Tomoxetine Adrenoceptor 9,51 hydrochloride

DL-erythro- (±) trans-U-50488 641 Phosphorylation 13,61 671 Opioid 11,43 701 AFMK Inflammation 9,43 Dihydrosphingosine methanesulfonate

8-Cyclopentyl-1,3- 642 XCT790 Gene Regulation 13,6 672 Adenosine 11,34 702 Dihydrokainic acid Glutamate 9,42 dimethylxanthine

N-omega-Methyl-5- Bisoprolol 643 hydroxytryptamine Serotonin 13,55 673 Adrenoceptor 11,29 703 DL-Cycloserine Sphingolipid 9,35 hemifumarate salt oxalate salt

1-Methylhistamine 1-Phenyl-3-(2- Intracellular 644 Histamine 13,51 674 Dopamine 11,25 704 Thapsigargin 9,26 dihydrochloride thiazolyl)-2-thiourea Calcium

Histamine, R(-)- Cyclic 645 CGP 57380 Phosphorylation 13,49 675 alpha-methyl-, Histamine 11,22 705 Cilostamide 9,14 Nucleotides dihydrochloride

Lomefloxacin (±)-Metoprolol (+)- CGS-21680 646 Antibiotic 13,41 676 Adrenoceptor 11,12 706 Adenosine 9,14 hydrochloride tartrate hydrochloride

647 Metolazone Na+ Channel 13,37 677 Gossypol Apoptosis 11,09 707 Cambinol Gene Regulation 9,07

648 Thiolactomycin Antibiotic 13,36 678 Lonidamine Cell Stress 11,08 708 Diclofenac sodium Prostaglandin 9,07

R(-)-N6-(2- 1-(2-Chlorophenyl)-1- 649 Phenylisopropyl)aden Adenosine 13,36 679 Chelerythrine chloride Phosphorylation 10,93 709 (4-chlorophenyl)-2,2- Hormone 9,06 osine dichloroethane 1,3,5-tris(4- Benzamil BNTX maleate salt 650 Ion Pump 13,21 680 Opiods 10,9 710 hydroxyphenyl)-4- Hormone 9,02 hydrochloride hydrate propyl-1H-pyrazole

R(-)-Apocodeine L-Mimosine from 651 Dopamine 13,1 681 Apoptosis 10,89 711 TG003 Cell Cycle 9,02 hydrochloride Koa hoale seeds

652 Gabapentin Anticonvulsant 13,1 682 MRS 1523 Adenosine 10,84 712 Clemastine fumarate Histamine 8,97

(±)-threo-1-Phenyl-2- GW405833 653 decanoylamino-3- Sphingolipid 12,94 683 Cannabanoid 10,84 713 Ethosuximide Anticonvulsant 8,95 morpholino-1-propanol hydrochloride hydrochloride

Epinastine Neurotransmissio 654 Histamine 12,91 684 AMN082 Glutamate 10,81 714 SB 218795 8,94 hydrochloride n

Bendamustine 655 TMPH hydrochloride Cholinergic 12,88 685 Apoptosis 10,78 715 Minoxidil K+ Channel 8,92 hydrochloride

1-(4- R-(-)- 1-Deoxynojirimycin 656 Hydroxybenzyl)imida Dopamine 12,83 686 Biochemistry 10,77 716 Desmethyldeprenyl Neurotransmission 8,82 hydrochloride zole-2-thiol hydrochloride

(±)-Normetanephrine S-(-)-Eticlopride 657 MDL 105,519 Glutamate 12,68 687 Adrenoceptor 10,72 717 Dopamine 8,82 hydrochloride hydrochloride

6-Methyl-2- Oxotremorine 658 Progesterone Hormone 12,37 688 Cholinergic 10,71 718 (phenylethynyl)pyridi Glutamate 8,8 sesquifumarate salt ne hydrochloride

Ethopropazine Cytoskeleton and 659 Neurotransmission 12,26 689 Nocodazole 10,69 719 Dipyridamole Adenosine 8,77 hydrochloride ECM

Trifluoperazine 660 Dopamine 12,25 690 O-Phospho-L-serine Glutamate 10,67 720 NS-1619 K+ Channel 8,77 dihydrochloride

148

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

Sematilide Cytoskeleton and K+ Channel 721 Podophyllotoxin 8,77 751 monohydrochloride 7,02 781 THIP hydrochloride GABA 5,43 ECM Modulator monohydrate

4-Imidazoleacrylic 722 MRS 2179 P2 Receptor 8,72 752 Histamine 7,02 782 AGK2 Gene Regulation 5,34 acid

Y-27632 Methiothepin 723 Phosphorylation 8,5 753 Serotonin 6,98 783 IPA-3 Phosphorylation 5,26 dihydrochloride mesylate

p-MPPF 724 Trandolapril Neurotransmission 8,4 754 Serotonin 6,98 784 Lamotrigine Anticonvulsant 5,18 dihydrochloride

Lidocaine N-ethyl 725 Ruthenium red Ion Pump 8,34 755 LP44 Serotonin 6,95 785 bromide quaternary Na+ Channel 5,18 salt

(-)-Nicotine hydrogen Vancomycin 726 Cholinergic 8,29 756 Oxolinic acid Antibiotic 6,75 786 hydrochloride from Antibiotic 5 tartrate salt Streptomyces orientalis

S-(4-Nitrobenzyl)-6- 727 Adenosine 8,24 757 Daidzein Cell Cycle 6,74 787 Nimesulide Prostaglandin 4,88 thioinosine

Cyclic L-Methionine 728 Imazodan 8,23 758 Glutamate 6,69 788 (+)-Catechin Hydrate Cell Stress 4,84 Nucleotides sulfoximine

(±)- Arecoline 729 Cholinergic 8,21 759 Methoxyverapamil Ca2+ Channel 6,69 789 Cephradine Antibiotic 4,79 hydrobromide hydrochloride

1,4-Dideoxy-1,4- Chlorpromazine 730 Phosphorylation 8,14 760 Dopamine 6,67 790 SKF 95282 dimaleate Histamine 4,79 imino-D-arabinitol hydrochloride

Mianserin Citalopram (±)-Muscarine 731 Serotonin 8,06 761 Serotonin 6,5 791 Cholinergic 4,74 hydrochloride hydrobromide chloride

Dicyclomine 732 6-Hydroxymelatonin Melatonin 8,04 762 Cholinergic 6,43 792 NBQX disodium Glutamate 4,72 hydrochloride

Clorgyline Naltrexone 733 Neurotransmission 8,02 763 EGTA Biochemistry 6,36 793 Opioid 4,7 hydrochloride hydrochloride

Naloxonazine 734 Olomoucine Phosphorylation 7,95 764 Sodium Oxamate Biochemistry 6,29 794 Opioid 4,64 dihydrochloride

N-Acetyl-2,3- Naphazoline Moxonidine 735 dehydro-2- Biochemistry 7,79 765 Adrenoceptor 6,24 795 Adrenoceptor 4,57 hydrochloride hydrochloride deoxyneuraminic acid

Methylergonovine 736 Dopamine 7,78 766 NU2058 Cell Cycle 6,21 796 Cilnidipine Ca2+ Channels 4,51 maleate

(-)-cis-(1S,2R)-U- Yohimbine 737 Neurotransmission 7,74 767 Adrenoceptor 6,15 797 BW 723C86 Serotonin 4,45 50488 tartrate hydrochloride

2-Methyl-5- Loperamide 738 GR 79236X Adenosine 7,61 768 hydroxytryptamine Serotonin 6,1 798 Opioid 4,37 hydrochloride maleate

L-alpha-Methyl-p- R-(+)-8-Hydroxy- cis(+/-)-8-OH-PBZI 739 Neurotransmission 7,59 769 Serotonin 6,03 799 Dopamine 4,37 tyrosine DPAT hydrobromide hydrobromide

740 McN-A-343 Cholinergic 7,56 770 Propofol Cholinergic 6,02 800 BU224 hydrochloride Imidazoline 4,28

Cefsulodin sodium ABT-702 741 Edrophonium chloride Cholinergic 7,54 771 Antibiotic 5,98 801 Phosphorylation 4,27 salt hydrate dihydrochloride

Cytoskeleton and Naloxone GR 127935 742 Opioid 7,45 772 Serotonin 5,94 802 5HPP-33 extracellular 4,11 hydrochloride hydrochloride hydrate matrix

Palmitoyl-DL- Multi-Drug Metaproterenol 743 Phosphorylation 7,45 773 1-Aminobenzotriazole 5,93 803 Adrenoceptor 4,1 Carnitine chloride Resistance hemisulfate

8-Methoxymethyl-3- Cyclic 744 isobutyl-1- 7,31 774 N-Ethylmaleimide Biochemistry 5,91 804 Mevastatin Antibiotic 4,06 Nucleotides methylxanthine

alpha-Lobeline 3-Tropanyl-3,5- 745 Cholinergic 7,29 775 Serotonin 5,89 805 CCT007093 Apoptosis 4,03 hydrochloride dichlorobenzoate

Cirazoline Imipenem 746 Adrenoceptor 7,22 776 Bethanechol chloride Cholinergic 5,81 806 Antibiotic 3,94 hydrochloride monohydrate

D- Hydroxytacrine 747 Pirfenidone Immune System 7,2 777 Cholinergic 5,8 807 ribofuranosylbenzimi Transcription 3,88 maleate dazole

Mibefradil 748 Ca2+ Channel 7,08 778 SB-215505 Serotonin 5,68 808 Melatonin Melatonin 3,78 dihydrochloride

Mexiletene 749 Na+ Channel 7,04 779 Carisoprodol Neurotransmission 5,6 809 Niflumic acid Prostaglandin 3,72 hydrochloride

Papaverine Cyclic Meclofenamic acid 750 7,04 780 Prostaglandin 5,51 810 SB 204741 Serotonin 3,68 hydrochloride Nucleotides sodium

149

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

5,5- L-Histidine 811 Anticonvulsant 3,59 841 Ouabain Ion Pump 2,04 871 Histamine 0,62 Diphenylhydantoin hydrochloride

Cyclic WAY-100635 812 Nialamide Neurotransmission 3,58 842 ODQ 1,99 872 Serotonin 0,62 Nucleotides maleate

( R)-(+)-WIN 55,212- Cystamine 813 Cannabinoid 3,54 843 Picrotoxin GABA 1,87 873 Glutamate 0,61 2 mesylate dihydrochloride

Cyclic Trifluperidol 814 YC-1 3,54 844 Dopamine 1,87 874 S15535 Serotonin 0,59 Nucleotides hydrochloride

N6- Hexamethonium 815 Adenosine 3,38 845 Glipizide K+ Channel 1,76 875 Cholinergic 0,5 Cyclopentyladenosine bromide

NG-Nitro-L-arginine Clonidine 816 Adrenoceptor 3,34 846 methyl ester Nitric Oxide 1,76 876 TPMPA GABA 0,33 hydrochloride hydrochloride

1,3-Dimethyl-8- 817 Molsidomine Nitric Oxide 3,31 847 Adenosine 1,75 877 Cefazolin sodium Antibiotic 0,31 phenylxanthine

Diphenyleneiodonium 818 ET-18-OCH3 Lipid 3,25 848 Nitric Oxide 1,67 878 Trimethoprim Antibiotic 0,22 chloride

819 Cortisone Hormone 3,16 849 Ofloxacin Antibiotic 1,66 879 Stattic Gene Regulation -0,06

SB 242084 820 dihydrochloride Serotonin 3,07 850 Metergoline Serotonin 1,63 880 Rufinamide Neurotransmission -0,1 hydrate Se- 821 SANT-1 Angiogensis 3,02 851 JS-K Nitric Oxide 1,6 881 (methyl)selenocystein Cell Cycle -0,18 e hydrochloride

nor-Binaltorphimine N-Methyl-1- 822 Opioid 2,97 852 Biochemistry 1,53 882 Cinnarizine Ca2+ Channel -0,25 dihydrochloride deoxynojirimycin

DL-Homatropine 823 Droperidol Dopamine 2,95 853 Cholinergic 1,52 883 DM 235 Nootropic -0,25 hydrobromide

5-(N-Ethyl-N- Naloxone Doxepin 824 Ion Pump 2,92 854 Opioid 1,5 884 Adrenoceptor -0,32 isopropyl)amiloride benzoylhydrazone hydrochloride

1-(m-Chlorophenyl)- 5-Hydroxyindolacetic 825 Serotonin 2,89 855 NCS-382 GABA 1,48 885 biguanide Serotonin -0,39 acid hydrochloride

826 GW9662 Transcription 2,69 856 WIN 62,577 Tachykinin 1,47 886 BBMP Cell Stress -0,45

N-Methyl-D-aspartic 827 Clofibrate Lipid 2,66 857 Oxiracetam Nootropic 1,42 887 Glutamate -0,45 acid

alpha-Methyl-DL- Cyproheptadine Cytoskeleton and 828 tyrosine methyl ester Neurotransmission 2,61 858 Serotonin 1,33 888 Vincristine sulfate -0,48 hydrochloride ECM hydrochloride (E)-5-(2- Oxymetazoline 829 Bromovinyl)-2'- Immune System 2,6 859 Adrenoceptor 1,25 889 YS-035 hydrochloride Ca2+ Channel -0,48 hydrochloride deoxyuridine

S-Methylisothiourea 830 Nitric Oxide 2,57 860 DSP-4 hydrochloride Adrenoceptor 1,21 890 Oxybutynin Chloride Cholinergic -0,49 hemisulfate

3-Methoxy- 831 morphanin Glutamate 2,46 861 Clotrimazole K+ Channel 1,12 891 Apigenin Cell Cycle -0,51 hydrochloride

(±)-Propranolol (±)-Vesamicol Cetirizine 832 Adrenoceptor 2,45 862 Cholinergic 1 892 Histamine -0,53 hydrochloride hydrochloride dihydrochloride

Nylidrin 833 Adrenoceptor 2,37 863 CPNQ Neurotransmission 0,97 893 DNQX Glutamate -0,53 hydrochloride

DL-p- Methoxamine Olprinone 834 Chlorophenylalanine Neurotransmission 2,31 864 Adrenoceptor 0,96 894 Phosphodiesterase -0,54 methyl ester hydrochloride hydrochloride hydrochloride

3-Bromo-7- 835 Pimozide Dopamine 2,24 865 Nitric Oxide 0,93 895 p-MPPI hydrochloride Serotonin -0,61 nitroindazole

N- Methoctramine 836 Cholinergic 2,22 866 CHM-1 hydrate Apoptosis 0,88 896 Methylhistaprodifen Histamine -0,68 tetrahydrochloride dioxalate salt

R-(+)-7-Hydroxy- SKF-525A Multi-Drug Tetracaine 837 Dopamine 2,15 867 0,88 897 Na+ Channel -0,8 DPAT hydrobromide hydrochloride Resistance hydrochloride

Intracellular ZM 39923 Xylazine 838 TMB-8 hydrochloride 2,1 868 Phosphorylation 0,73 898 Adrenoceptor -0,82 Calcium hydrochloride hydrochloride

5-Nitro-2-(3- (-)-trans-(1S,2S)-U- 839 Cefmetazole sodium Antibiotic 2,06 869 phenylpropylamino)b Cl- Channel 0,73 899 Opioid -0,84 50488 hydrochloride enzoic acid

5-hydroxydecanoic 840 Supercinnamaldehyde Ion Channels 2,05 870 Sanguinarine chloride Ion Pump 0,68 900 K+ Channel -0,87 acid sodium

150

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

901 DCEBIO K+ Channel -0,93 931 N-Bromoacetamide Na+ Channel -2,98 961 Hydroquinone Leukotriene -5,03

Decamethonium 902 Cholinergic -0,96 932 Ro 41-0960 Neurotransmission -2,98 962 Haloperidol Dopamine -5,11 dibromide

N- 903 (±)-Sulpiride Dopamine -0,99 933 Levallorphan tartrate Opioid -3,12 963 Sphingolipid -5,11 Oleoylethanolamine

O-Methylserotonin 904 A-315456 Adrenoceptor -1,03 934 Lorglumide sodium Cholecystokinin -3,23 964 Serotonin -5,16 hydrochloride

17alpha- Diltiazem (±)-Octopamine 905 Hormone -1,11 935 Ca2+ Channel -3,24 965 Adrenoceptor -5,16 hydroxyprogesterone hydrochloride hydrochloride

906 Clozapine Dopamine -1,18 936 Sulindac Prostaglandin -3,43 966 2-Chloroadenosine Adenosine -5,19

(±)-Vanillylmandelic Vinblastine sulfate Cytoskeleton and Oxotremorine 907 Adrenoceptor -1,27 937 -3,49 967 Cholinergic -5,36 acid salt ECM methiodide

Intracellular 908 Dantrolene sodium -1,44 938 Imperatorin Phosphorylation -3,57 968 U0126 Phosphorylation -5,37 Calcium

WB-4101 Guvacine 909 Adrenoceptor -1,46 939 (-)-Cotinine Cholinergic -3,62 969 GABA -5,47 hydrochloride hydrochloride

alpha,beta-Methylene DNA 910 U-62066 Opioid -1,47 940 Mizoribine -3,63 970 adenosine 5'- P2 Receptor -5,51 Metabolism triphosphate dilithium alpha-Methyl-5- 911 hydroxytryptamine Serotonin -1,56 941 Auranofin Phosphrylation -3,65 971 Thioperamide maleate Histamine -5,67 maleate

CGP-74514A 912 Phosphorylation -1,65 942 Chelidamic acid Glutamate -3,66 972 Tamoxifen citrate Phosphorylation -5,71 hydrochloride

Wortmannin from Tryptamine 913 Serotonin -1,66 943 (+)-Cyclazocine Opioid -3,73 973 Penicillium Phosphorylation -5,77 hydrochloride funiculosum

(S)-MAP4 914 Glutamate -1,67 944 R(-)-Me5 Na+ Channel -3,78 974 Debrisoquin sulfate Neurotransmission -5,87 hydrochloride

Ro 04-6790 915 Ebastine Histaminergics -1,74 945 Meloxicam sodium Prostaglandin -3,9 975 Serotonin -5,94 dihydrochloride

Nisoxetine Cyclic 916 Adrenoceptor -1,77 946 SQ 22536 -3,98 976 L-165,041 Lipid Signaling -6,05 hydrochloride Nucleotides

917 DFB Glutamate -1,79 947 Cyproterone acetate Hormone -4 977 N6-Methyladenosine Adenosine -6,18

Benoxathian Urapidil 918 Adrenoceptor -1,86 948 Adrenoceptor -4,12 978 Danazol Hormone -6,32 hydrochloride hydrochloride

N,N-Dihexyl-2-(4- Cyclic 919 fluorophenyl)indole- Benzodiazepine -1,88 949 Urapidil, 5-Methyl- Adrenoceptor -4,4 979 Cilostazol -6,33 Nucleotides 3-acetamide

5-Fluoroindole-2- 920 Glutamate -1,93 950 Ceftriaxone sodium Antibiotic -4,43 980 Carboplatin DNA -6,33 carboxylic acid

Chloroquine 921 Arcaine sulfate Glutamate -2,05 951 DNA -4,43 981 Lithium Chloride Neurotransmission -6,33 diphosphate

Imidazole-4-acetic Caroverine 922 Azathioprine P2 Receptor -2,07 952 GABA -4,45 982 Glutamatergics -6,36 acid hydrochloride hydrochloride

Staurosporine Cyclic Nortriptyline 923 Phosphorylation -2,08 953 NS 2028 -4,58 983 Adrenoceptor -6,46 aglycone Nucleotides hydrochloride

Tetraisopropyl 924 MNS Phosphorylation -2,09 954 Corticosterone Hormone -4,65 984 Biochemistry -6,53 pyrophosphoramide

Clomipramine 5-Hydroxy-L- 925 3-Iodo-L-tyrosine Neurotransmission -2,13 955 Serotonin -4,73 985 Serotonin -6,76 hydrochloride tryptophan

Cytidine 5'- 1,1-Dimethyl-4- 926 diphosphocholine Lipid Signaling -2,21 956 phenyl-piperazinium Cholinergic -4,73 986 Caffeine Adenosine -6,88 sodium salt hydrate iodide 3-Tropanyl-indole-3- DL-threo-beta- 927 carboxylate Serotonin -2,21 957 Glutamate -4,8 987 Doxylamine succinate Histamine -6,93 hydroxyaspartic acid hydrochloride

(±)-p- 928 CK2 Inhibitor 2 Phosphorylation -2,31 958 Neurotransmission -4,81 988 Hydrocortisone Hormone -7,23 Chlorophenylalanine

S(-)-p- DNA 929 Bromotetramisole Phosphorylation -2,5 959 Azelaic acid -4,84 989 Captopril Neurotransmission -7,24 Metabolism oxalate

MHPG sulfate 930 ML 10302 Serotonin -2,61 960 Adrenoceptor -5,03 990 Harmane Imidazoline -7,31 potassium

151

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

4-Imidazolemethanol 991 Cefotaxime sodium Antibiotic -7,33 1021 N-arachidonylglycine Cannabinoid -9,38 1051 Histamine -12,73 hydrochloride

N-(2 -[4 -(4 - Chlorophenyl)piperazin-1- 992 CL 316,243 Adrenoceptor -7,41 1022 yl]ethyl)-3- Dopamine -9,38 1052 SR 2640 Leukotriene -12,83 methoxybenzamide

N-Phenylanthranilic Spermidine 993 Cl- Channel -7,49 1023 Glutamate -9,83 1053 AA-861 Leukotriene -13 acid trihydrochloride

994 SB 205384 GABA -7,5 1024 Acetylsalicylic acid Prostaglandin -9,85 1054 6-Chloromelatonin Melatonin -13,02

S-(+)-PD 123177 995 Aminopterin Antibiotic -7,61 1025 BU99006 Imidazoline -10,02 1055 trifluoroacetate salt Neurotransmission -13,02 hydrate 5-(N,N- 996 Disopyramide Na+ Channel -7,62 1026 SU 5416 Phosphorylation -10,16 1056 Dimethyl)amiloride Ion Pump -13,03 hydrochloride 1-(1- 2-(2- 997 Naphthyl)piperazine Serotonin -7,63 1027 DAPH Phosphorylation -10,23 1057 Aminoethyl)isothiour Nitric Oxide -13,03 hydrochloride ea dihydrobromide

(+)-Chlorpheniramine Hexamethonium 998 Histamine -7,67 1028 Cholinergic -10,45 1058 (±)-CPP Glutamate -13,05 maleate dichloride

Cyclic Cyclic 999 ICI 63,137 -7,7 1029 Ara-G hydrate Apoptosis -10,47 1059 Vinpocetine -13,31 nucleotides Nucleotides

2',3'-didehydro-3'- 1000 Immune System -7,79 1030 Agmatine sulfate Imidazoline -10,71 1060 Reserpine Serotonin -13,45 deoxythymidine

7-Chloro-4-hydroxy- (±)-Butaclamol 1001 Zonisamide sodium Anticonvulsant -7,89 1031 2-phenyl-1,8- Adenosine -10,83 1061 Dopamine -13,58 hydrochloride naphthyridine

Amiprilose (±)-Chlorpheniramine Cyclic 1002 Immune System -8,01 1032 Histamine -10,87 1062 YM 976 -13,64 hydrochloride maleate nucleotides

Acetylthiocholine Aminophylline 1003 Terfenadine Histamine -8,18 1033 Cholinergic -10,93 1063 Adenosine -13,67 chloride ethylenediamine

Acetyl-beta- (±)-2-Amino-4- 3'-Azido-3'- 1004 methylcholine Cholinergic -8,21 1034 Immune System -11 1064 phosphonobutyric Glutamate -13,89 deoxythymidine chloride acid

N-Acetyl-5- DL-Stearoylcarnitine 1005 Melatonin -8,26 1035 Phosphorylation -11,05 1065 AC-55649 Gene Regulation -13,92 hydroxytryptamine chloride

L-azetidine-2- 1006 Hydrochlorothiazide Biochemistry -8,37 1036 ATPO Glutamate -11,08 1066 Biochemistry -14,11 carboxylic acid

4- DNA 1007 Hemicholinium-3 Cholinergic -8,37 1037 Hydroxybenzhydrazid Biochemistry -11,16 1067 Mitoxantrone -14,21 Metabolism e

1008 3-deazaadenosine Immune System -8,42 1038 Roscovitine Phosphorylation -11,17 1068 Ibandronate sodium Lipid Signaling -14,31

A-134974 (-)-Scopolamine 1009 dihydrochloride Phosphorylation -8,71 1039 Dilazep hydrochloride Adenosine -11,2 1069 Cholinergic -14,34 methyl bromide hydrate 2-Chloroadenosine Nimustine 1010 triphosphate P2 Receptor -8,85 1040 LY2183240 Νeurotransmission -11,21 1070 DNA -14,35 hydrochloride tetrasodium

(±)-gamma-Vinyl (±)-AMPA 1011 GABA -8,88 1041 U-75302 Leukotriene -11,64 1071 Glutamate -14,53 GABA hydrobromide

(±)-2-Amino-3- DNA Dihydroergotamine 1012 5-azacytidine -8,98 1042 Serotonin -11,7 1072 phosphonopropionic Glutamate -14,6 Metabolism methanesulfonate acid

Aminoguanidine 1013 Tyrphostin A9 Phosphorylation -9,05 1043 Nitric Oxide -11,77 1073 Ketanserin tartrate Serotonin -14,6 hemisulfate

8-Cyclopentyl-1,3- 1014 4-DAMP methiodide Cholinergic -9,06 1044 Adenosine -11,77 1074 Acetazolamide Biochemistry -15 dipropylxanthine

Cytoskeleton and Hydralazine (+)-Butaclamol 1015 (±)-Thalidomide -9,1 1045 Neurotransmission -11,9 1075 Dopamine -15,01 ECM hydrochloride hydrochloride

(±)-Verapamil 1016 JFD00244 Gene Regulation -9,19 1046 Ca2+ Channel -12 1076 (-)-Sulpiride Dopamine -15,12 hydrochloride

DNA Cyclic 1017 3-aminobenzamide Apoptosis -9,28 1047 Methotrexate hydrate -12,05 1077 Zaprinast -15,19 Metabolism Nucleotides

1018 CNS-1102 Glutamate -9,29 1048 Rotenone Cell Stress -12,05 1078 SKF 86466 Adrenoceptor -15,27

3-Amino-1- 1019 Metolazone Ion Pump -9,35 1049 U-101958 maleate Dopamine -12,48 1079 propanesulfonic acid GABA -15,34 sodium 3-Tropanylindole-3- Tocainide Spiperone 1020 carboxylate Serotonin -9,37 1050 Na+ Channel -12,55 1080 Dopamine -15,34 hydrochloride hydrochloride methiodide 152

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

Ro 41-1049 1081 Ro 8-4304 Glutamate -15,42 1111 S-Nitrosoglutathione Nitric Oxide -18,17 1141 Neurotransmission -20,78 hydrochloride

p-Aminoclonidine N6- 1082 Adrenoceptor -15,55 1112 Chlormezanone Neurotransmission -18,31 1142 Adenosine -21,01 hydrochloride Cyclohexyladenosine

Sodium Taurocholate Multi-Drug N2-Ethyl-2'- 1083 -15,55 1113 Acyclovir Immune System -19,01 1143 Gene Regulation -21,23 hydrate Resistance deoxyguanosine

Spermine 1084 (±)-Nipecotic acid GABA -15,64 1114 2',3'-dideoxycytidine Immune System -19,02 1144 Glutamate -21,34 tetrahydrochloride

4-Amino-1,8- 1085 GABA GABA -15,75 1115 Apoptosis -19,06 1145 Carbachol Cholinergic -21,41 naphthalimide

R(+)-6-Bromo-APB 1086 Dopamine -15,81 1116 Sulindac sulfone Prostaglandin -19,08 1146 Actinonin Biochemistry -21,64 hydrobromide

DL-alpha-Methyl-p- 1087 Neurotransmission -15,99 1117 Amifostine Cell Stress -19,09 1147 MHPG piperazine Adrenoceptor -21,95 tyrosine

1088 L-Arginine Nitric Oxide -16,03 1118 BP 897 Dopamine -19,16 1148 N-Oleoyldopamine Neurotransmission -22

Cytoskeleton and 1089 2,3-Butanedione -16,04 1119 Dihydroouabain Ion Pump -19,16 1149 BIA 2-093 Na+ Channels -22,08 ECM

2-Chloro-2-deoxy-D- 1090 GR 46611 Serotonin -16,43 1120 Aconitine Ion Pump -19,23 1150 Biochemistry -22,15 glucose

Raloxifene Hexahydro-sila-difenidol 1091 Hormone -16,53 1121 hydrochloride, p-fluoro Cholinergic -19,28 1151 SB-366791 Vanilloid -22,15 hydrochloride analog 3- 1092 2-Hydroxysaclofen GABA -16,54 1122 Aminopropylphospho GABA -19,31 1152 Spironolactone Hormone -22,3 nic acid

4-Androsten-4-ol- (-)-Scopolamine 1093 SR 57227A Serotonin -16,6 1123 Hormone -19,42 1153 Cholinergic -22,34 3,17-dione hydrobromide

1094 Salmeterol xinafoate Adrenoceptor -16,64 1124 CNQX disodium Glutamate -19,66 1154 Sandoz 58-035 Lipid -22,39

Cyclic 1095 Chlorzoxazone Nitric Oxide -16,67 1125 Ibudilast -19,67 1155 (±)-Baclofen GABA -22,51 Nucleotides

Tizanidine Atropine methyl 1096 Adrenoceptor -16,68 1126 SNC80 Opioid -19,67 1156 Cholinergic -22,68 hydrochloride bromide

4-Aminobenzamidine 1097 Biochemistry -16,87 1127 Chlorambucil DNA -19,72 1157 Acetamide Biochemistry -22,79 dihydrochloride

Ritodrine Amantadine (±)-7-Hydroxy-DPAT 1098 Adrenoceptor -16,97 1128 Dopamine -19,88 1158 Dopamine -23,29 hydrochloride hydrochloride hydrobromide

Semicarbazide 1099 Neurotransmission -16,97 1129 10058-F4 Apoptosis -20,14 1159 L-732,138 Tachykinin -23,39 hydrochloride

Histamine Phosphoramidon Buspirone 1100 Histamine -17,04 1130 Biochemistry -20,15 1160 Serotonin -23,63 dihydrochloride disodium hydrochloride

(-)-Scopolamine,n- Cyclic 1101 Guanabenz acetate Adrenoceptor -17,12 1131 Cholinergic -20,15 1161 9-cyclopentyladenine -23,71 Butyl-, bromide Nucleotides

(-)-Scopolamine 1102 IRAK-1/4 Inhibitor I Phosphorylation -17,23 1132 Cholinergic -20,19 1162 Steviol Ion Channels -23,85 methyl nitrate

8-(3- 1103 Adenosine -17,24 1133 SB 202190 Phosphorylation -20,28 1163 Retinoic acid Apoptosis -23,97 Chlorostyryl)caffeine

Gabaculine 1104 GABA -17,37 1134 BRL 54443 maleate Serotonin -20,28 1164 Sobuzoxane Gene Regulation -23,97 hydrochloride

1-(4-Chlorobenzyl)-5- Multi-Drug 1105 N-Succinyl-L-proline Neurotransmission -17,38 1135 methoxy-2-methylindole- -20,28 1165 (+)-Hydrastine GABA -24,31 3-acetic acid Resistance (±)-2-Amino-7- SB 269970 1106 phosphonoheptanoic Glutamate -17,51 1136 SKF 96365 Ca2+ Channel -20,45 1166 Serotonin -24,45 hydrochloride acid

Rilmenidine 1107 Imidazoline -17,79 1137 Nemadipine-A Ca2+ Channels -20,46 1167 Carbamazepine Anticonvulsant -24,57 hemifumarate

(±)-2-Amino-5- L-Cysteinesulfinic 1108 OXA-22 Cholinergic -17,81 1138 phosphonopentanoic Glutamate -20,51 1168 Glutamate -24,69 Acid acid

5-Bromo-2'- DNA 1109 -18,05 1139 Cephalothin sodium Antibiotic -20,55 1169 Riluzole Glutamate -25 deoxyuridine Metabolism

Biperiden 1110 Cholinergic -18,05 1140 SCH 58261 Purinoceptor -20,61 1170 D-Cycloserine Glutamate -25,33 hydrochloride

153

% CBS % CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition Inhibition

Cyclobenzaprine (±)-Sotalol 1171 Hypotaurine Cell Stress -25,4 1201 Serotonin -29,13 1231 Adrenoceptor -36,25 hydrochloride hydrochloride

Amperozide 1172 Serotonin -25,53 1202 Choline bromide Cholinergic -29,21 1232 L-Cycloserine Sphingolipid -37,02 hydrochloride

Ciproxifan 1173 Tetrabenazine Neurotransmission -25,56 1203 Histamine -29,33 1233 Ritanserin Serotonin -37,06 hydrochloride

Desipramine 1174 D-Serine Glutamate -25,7 1204 Adrenoceptor -29,48 1234 L-Hyoscyamine Cholinergic -37,34 hydrochloride

(±)-8-Hydroxy-DPAT 1175 Serotonin -25,92 1205 IMS2186 Cell Cycle -29,63 1235 Methysergide maleate Serotonin -37,5 hydrobromide

8-(4- Nicardipine Cyclic 1176 Ca2+ Channel -25,92 1206 Chlorophenylthio)- -29,77 1236 Cyclosporin A Phosphorylation -38,01 hydrochloride Nucleotides cAMP sodium

Methapyrilene Serotonin 1177 Histamine -26,02 1207 Serotonin -29,88 1237 CGP-13501 GABA -38,14 hydrochloride hydrochloride

Ropinirole Mecamylamine 1178 Carbetapentane citrate Opioid -26,14 1208 Dopamine -30 1238 Cholinergic -38,25 hydrochloride hydrochloride

Multi-Drug 1179 Sulfaphenazole -26,33 1209 Benazoline oxalate Imidazoline -30,33 1239 Fenobam Glutamate -38,25 Resistance

Org 24598 lithium 1180 BWB70C Leukotriene -26,42 1210 13-cis-retinoic acid Transcription -30,37 1240 Neurotransmission -38,37 salt

CGP 20712A Maprotiline 1181 Ciprofibrate Transcription -26,42 1211 Adrenoceptor -30,61 1241 Adrenoceptor -39,65 methanesulfonate hydrochloride

(2S,1'S,2'S)-2- N- Bestatin 1182 (carboxycyclopropyl) Glutamate -26,56 1212 Acetylprocainamide Na+ Channel -30,66 1242 Biochemistry -39,81 hydrochloride glycine hydrochloride

Diphenhydramine Noscapine Bromoacetyl 1183 Histamine -26,92 1213 Opioid -30,73 1243 Adrenoceptor -40,37 hydrochloride hydrchloride alprenolol menthane

Muscimol 1184 GABA -26,94 1214 REV 5901 Leukotriene -30,85 1244 Nalidixic acid sodium Antibiotic -40,44 hydrobromide

Sivelestat sodium salt 1185 Albuterol hemisulfate Adrenoceptor -26,96 1215 Biochemistry -31,1 1245 H-8 dihydrochloride Phosphorylation -40,58 hydrate

(-)-Bicuculline (-)-MK-801 hydrogen 1186 GR 113808 Serotonin -27,25 1216 Glutamate -31,57 1246 methbromide, 1(S), GABA -40,93 maleate 9(R)

Xylometazoline 1187 Adrenoceptor -27,26 1217 Nifedipine Ca2+ Channel -31,62 1247 Rutaecarpine K+ Channel -41,39 hydrochloride

S(+)-Raclopride L- Chloroethylclonidine 1188 Dopamine -27,3 1218 (±)-Synephrine Adrenoceptor -31,74 1248 Adrenoceptor -41,49 tartrate dihydrochloride

1189 Cimetidine Histamine -27,34 1219 Ribavirin Cell Cycle -31,85 1249 7-Nitroindazole Nitric Oxide -42,03

Ranolazine Benzamidine 1190 CGP-7930 GABA -27,53 1220 Lipid -32,59 1250 Biochemistry -42,05 dihydrochloride hydrochloride

6- 1191 CP55940 Cannabinoid -27,53 1221 Levetiracetam Neurotransmission -32,64 1251 Fluoronorepinephrine Adrenoceptor -43,16 hydrochloride

1192 Chlorpropamide Hormone -27,53 1222 NCS-356 GABA -32,92 1252 Betaine hydrochloride Biochemistry -44,28

Rauwolscine B-HT 933 1193 Adrenoceptor -27,74 1223 Adrenoceptor -33,12 1253 Proglumide Cholecystokinin -44,78 hydrochloride dihydrochloride

Brefeldin A from Cytoskeleton and 1194 SC 19220 Prostaglandin -27,85 1224 Resveratrol Prostaglandin -33,44 1254 Penicillium -44,84 ECM brefeldianum

SCH-202676 DNA 1195 G protein -28 1225 Hydroxyurea -34,71 1255 Budesonide Hormone -44,84 hydrobromide Metabolism

Chlorprothixene Ranitidine Cyclic 1196 Dopamine -28,09 1226 Histamine -35,18 1256 Ro 20-1724 -45,4 hydrochloride hydrochloride Nucleotides

RX 821002 1197 Adrenoceptor -28,52 1227 Betamethasone Hormone -35,35 1257 1-Methylimidazole Prostaglandin -46,04 hydrochloride

Diacylglycerol Kinase 1198 Phosphorylation -28,55 1228 BTCP hydrochloride Dopamine -35,35 1258 3-Nitropropionic acid Cell Stress -46,93 Inhibitor II

1199 BRL 37344 sodium Adrenoceptor -28,65 1229 Carmustine DNA -35,35 1259 Ganaxolone GABA -47,18

Ro 25-6981 Cyclic Betaine aldehyde 1200 Glutamate -29,07 1230 Rolipram -35,77 1260 Cholinergic -47,63 hydrochloride Nucleotides chloride

154

% CBS % CBS A/A Name Class A/A Name Class Inhibition Inhibition

8-Bromo-cAMP Cyclic Bupropion 1261 -48,74 1271 Dopamine -56,56 sodium Nucleotides hydrochloride

1262 Bay 11-7085 Cell Cycle -49,3 1272 (±)-Bay K 8644 Ca2+ Channel -57,12

Betaxolol Cytokines & 1263 Adrenoceptor -50,42 1273 CV-3988 -57,79 hydrochloride Growth Factors

1264 Benztropine mesylate Cholinergic -51,53 1274 BRL 15572 Serotonin -59,35

Bromoacetylcholine 1265 PK 11195 GABA -51,53 1275 Cholinergic -63,26 bromide

Isoguvacine 1266 Moclobemide Neurotransmission -51,83 1276 GABA -67,64 hydrochloride

BMY 7378 1267 S(-)-Pindolol Adrenergic -53,16 1277 Serotonin -68,28 dihydrochloride

1268 Bumetanide Ion Pump -53,21 1278 ML-9 Phosphorylation -68,28

MDL 26,630 VER-3323 1269 Glutamate -53,7 1279 Serotonin -83,11 trihydrochloride hemifumarate salt

1270 NG-Nitro-L-arginine Nitric Oxide -55,84 1280 NF 023 P2 Receptor -101,4

155

Πίνακας Π.Α.2: Αποτελέσµατα σάρωσης της βιβλιοθήκης LOPAC έναντι του ενζύµου CSΕ. Οι ενώσεις µελετήθηκαν σε συγκέντρωση 100 µΜ .

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

R(-)- Fluphenazine 1 Propylnorapomorphin Dopamine 42,02 31 Dopamine 16,89 61 Dihydrokainic acid Glutamate 9,68 dihydrochloride e hydrochloride 2-Chloroadenosine N-Methyldopamine Benserazide 2 Dopamine 39,19 32 Biochemistry 16,44 62 triphosphate P2 Receptor 9,60 hydrochloride hydrochloride tetrasodium

Cytoskeleton and 3 (-)-Eseroline fumarate Cholinergic 38,52 33 DNQX Glutamate 16,21 63 2,3-Butanedione 9,60 ECM

3,4- 4 Etodolac Prostaglandin 34,10 34 Dihydroxyphenylaceti Dopamine 15,49 64 Dihydroouabain Ion Pump 9,37 c acid L-3,4- S-Nitroso-N- 5 Nitric Oxide 32,83 35 Dihydroxyphenylalani Dopamine 15,49 65 N-Ethylmaleimide Biochemistry 9,33 acetylpenicillamine ne

2,3-Dimethoxy-1,4- Nelfinavir mesylate Immune 6 Cell Stress 31,11 36 Epalrestat Cell Stress 15,48 66 9,15 naphthoquinone hydrate Signaling

Apomorphine Cyclic 7 hydrochloride Dopamine 30,71 37 Isoliquiritigenin 14,77 67 Felbamate Glutamate 8,86 Nucleotides hemihydrate

Minocycline 8 Phenserine Neurotransmission 30,14 38 Sunitinib malate Tyrosine Kinase 14,76 68 Cell Cycle 8,86 hydrochloride

Doxycycline Cirazoline 9 Antibiotic 28,91 39 BTO-1 Phosphorylation 14,65 69 Adrenoceptor 8,86 hydrochloride hydrochloride

5-(N,N- 8-Cyclopentyl-1,3- Arecaidine propargyl 10 hexamethylene)amilor Ion Pump 28,00 40 Adenosine 14,12 70 Cholinergic 8,83 dimethylxanthine ester hydrobromide ide

(±)-Chloro-APB 11 Dopamine 26,81 41 Niclosamide Antibiotic 13,94 71 LDN-27219 Neurobiology 8,62 hydrobromide

Decamethonium 12 NSC 95397 Phosphorylation 25,06 42 Piroxicam Prostaglandin 13,47 72 Cholinergic 8,38 dibromide

Hydroxylamine Fiduxosin Cytoskeleton and 13 Neurotransmission 24,89 43 Adrenoceptor 13,21 73 Clodronic acid 8,35 hydrochloride hydrochloride ECM

Lercanidipine 14 S-(-)-Carbidopa Biochemistry 24,83 44 L-Dopa ethyl ester Dopaminergics 13,15 74 hydrochloride Calcium Channel 8,03 hemihydrate

15 Ruthenium red Ion Pump 23,10 45 Nimesulide Prostaglandin 12,92 75 CNQX disodium Glutamate 7,82

16 PD173952 Kinase 22,86 46 Capsazepine Vanilloid 12,62 76 Tyrphostin AG 112 Phosphorylation 7,59

(2S,1'S,2'S)-2- 5,5- 17 Fenoldopam bromide Dopamine 22,67 47 (carboxycyclopropyl) Glutamate 12,51 77 Anticonvulsant 7,56 Diphenylhydantoin glycine 2-Cyclooctyl-2- O- Demeclocycline 18 (Carboxymethyl)hydroxyl Biochemistry 22,50 48 hydroxyethylamine Neurotransmission 12,23 78 Antibiotic 7,51 hydrochloride amine hemihydrochloride hydrochloride

Protoporphyrin IX Cyclic CGS-21680 A-77636 19 21,95 49 Adenosine 11,86 79 Dopamine 7,48 disodium Nucleotides hydrochloride hydrochloride

R(-)-2,10,11-Trihydroxy- 20 N-propylnoraporphine Dopamine 21,10 50 Emodin Phosphorylation 11,80 80 SB 216763 Phosphorylation 7,40 hydrobromide

6-Nitroso-1,2- 21 TG003 Cell Cycle 20,97 51 Transcription 11,52 81 Pimozide Dopamine 7,17 benzopyrone

Dopamine 22 X80 Apoptosis 20,78 52 Dopamine 11,48 82 GW9508 Lipids 7,07 hydrochloride

23 AS-252424 Phosphorylation 20,52 53 Amoxapine Adrenoceptor 11,31 83 Ro 11-1464 Lipid Signaling 7,07

S-(+)-Fluoxetine Flunarizine Cyclic 24 Serotonin 20,32 54 Ion Pump 11,08 84 Pentoxifylline 6,96 hydrochloride dihydrochloride Nucleotides

Diacylglycerol Kinase (-)-alpha- 25 GW5074 Phosphorylation 20,07 55 Phosphorylation 10,81 85 Adrenoceptor 6,88 Inhibitor II Methylnorepinephrine 4-(2- 26 Myricetin Phosphorylation 19,99 56 Carvedilol Adrenoceptor 10,39 86 Aminoethyl)benzenes Biochemistry 6,79 ulfonyl fluoride hydrochloride 6-Hydroxy-DL- 27 Flutamide Hormone 18,88 57 Rottlerin Phosphorylation 10,27 87 Adrenoceptor 6,78 DOPA

Dequalinium chloride Diphenyleneiodonium 28 K+ Channel 18,25 58 Nitric Oxide 10,02 88 Formoterol Adrenoceptor 6,76 hydrate chloride

ABT-418 29 Tyrphostin 51 Phosphorylation 18,14 59 p-Benzoquinone DNA Repair 9,90 89 Cholinergic 6,62 hydrochloride

L-3,4- 30 Dihydroxyphenylalanine Dopamine 17,71 60 S(-)-Atenolol Adrenoceptor 9,76 90 CP-91149 Phosphorylation 6,54 methyl ester hydrochloride

156

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

PHA 767491 kinase 91 1,7-Dimethylxanthine Adenosine 6,46 121 5,15 151 Fusaric acid Dopamine 3,66 hydrochloride phosphotase

1-(m-Chlorophenyl)- Diphenhydramine 92 Histamine 6,40 122 Nialamide Neurotransmission 5,06 152 biguanide Serotonin 3,63 hydrochloride hydrochloride

Fenspiride 93 Adrenoceptor 6,37 123 (-)-Physostigmine Cholinergic 4,96 153 Etoposide Apoptosis 3,41 hydrochloride

Antibiotics/Phosp 94 L-2-aminoadipic acid Glutamate 6,36 124 Tamoxifen 4,96 154 Ganciclovir Cell Cycle 3,39 horylation

95 Cambinol Gene Regulation 6,32 125 Fusidic acid sodium Cell Cycle 4,96 155 Ketanserin tartrate Serotonin 3,25

erythro-9-(2-Hydroxy-3- 96 Chlormezanone Neurotransmission 6,23 126 Ganaxolone GABA 4,96 156 nonyl)adenine Adenosine 3,25 hydrochloride

5alpha-Pregnan- Nisoxetine NS8593 97 GABA 6,22 127 Adrenoceptor 4,76 157 Ca2+ Channel 3,19 3alpha-ol-11,20-dione hydrochloride hydrochloride

Fenoterol 98 7-Nitroindazole Nitric Oxide 6,08 128 Cisplatin DNA 4,76 158 Adrenoceptor 3,16 hydrobromide

D- Cetirizine 99 ribofuranosylbenzimi Transcription 6,06 129 Genistein Phosphorylation 4,66 159 Histamine 3,15 dihydrochloride dazole N,N,N',N'- Alprenolol 100 Tetramethylazodicarb Cell Stress 6,06 130 NBQX disodium Glutamate 4,59 160 Adrenoceptor 3,14 hydrochloride oxamide

p-Fluoro-L- 101 Neurotransmission 6,01 131 Niflumic acid Prostaglandin 4,57 161 Parthenolide Serotonin 3,13 phenylalanine

5-Hydroxyindolacetic ARL 67156 trisodium 102 Serotonin 5,98 132 beta-Estradiol Hormone 4,46 162 P2 Receptor 3,08 acid salt

P1,P4-Di(adenosine- N-Methyl-1- 103 Biochemistry 5,95 133 5')tetraphosphate Biochemistry 4,45 163 3,5-Dinitrocatechol Neurotransmission 3,06 deoxynojirimycin triammonium

Paroxetine hydrochloride 104 SB 415286 Phosphorylation 5,93 134 hemihydrate (MW = Serotonin 4,43 164 Aminobenztropine Cholinergic 2,99 374.83) N6-2-(4- (±)-CGP-12177A Naloxone 105 Adrenoceptor 5,75 135 Opioid 4,41 165 Aminophenyl)ethylad Adenosine 2,91 hydrochloride hydrochloride enosine

106 Estrone Hormone 5,74 136 PD-184161 Kinase 4,29 166 Nimodipine Ca2+ Channel 2,89

Tocainide 107 Temsirolimus Autophagy 5,68 137 Tranilast Leukotriene 4,19 167 Na+ Channel 2,87 hydrochloride

NAN-190 L-Glutamic acid 108 Serotonin 5,65 138 Glutamate 4,13 168 Lomeguatrib Gene Regulation 2,81 hydrobromide hydrochloride

Dihydroergotamine Oxotremorine Cyclic 109 Serotonin 5,61 139 Cholinergic 4,08 169 Imazodan 2,77 methanesulfonate sesquifumarate salt Nucleotides

Efaroxan Excitatory 110 Hispidin Phosphorylation 5,59 140 Imidazoline 4,05 170 MTEP hydrochloride 2,76 hydrochloride Amino Acids

Ancitabine DNA 111 5,58 141 SIB 1893 Glutamate 3,92 171 Tolazamide Hormone 2,75 hydrochloride Metabolism

(-)-Epinephrine 112 Adrenoceptor 5,57 142 L-Aspartic acid Glutamate 3,88 172 3-Nitropropionic acid Cell Stress 2,71 bitartrate

SB 200646 113 Furosemide Ion Pump 5,54 143 TBBz Phosphorylation 3,88 173 Serotonin 2,71 hydrochloride

Dextromethorphan Y-27632 114 hydrobromide Glutamate 5,33 144 Phosphorylation 3,86 174 Voriconazole Immunomodulators 2,62 dihydrochloride monohydrate

Aminoguanidine R-(+)-8-Hydroxy- 115 Flumazenil Benzodiazepine 5,27 145 Nitric Oxide 3,86 175 Serotonin 2,49 hydrochloride DPAT hydrobromide

116 Oxaprozin Prostaglandin 5,20 146 Ellipticine Cell Cycle 3,77 176 Fenofibrate Transcription 2,39

5- cis-(Z)-Flupenthixol 117 Carboxamidotryptami Serotonin 5,19 147 Dopamine 3,77 177 2-Methylthioadenosine P2 Receptor 2,33 dihydrochloride triphosphate tetrasodium ne maleate

Cyclic 118 Furegrelate sodium Phosphorylation 5,18 148 Forskolin 3,75 178 Fluspirilene Dopamine 2,28 Nucleotides

119 Dilazep hydrochloride Adenosine 5,16 149 Famotidine Histamine 3,72 179 Fluvoxamine maleate Serotonin 2,25

120 Genipin Cell Biology 5,16 150 SB-525334 Phosphorylation 3,68 180 NS5806 Ion Channels 2,22

157

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

Fexofenadine Naphazoline 181 Gallamine triethiodide Cholinergic 2,20 211 Histamine 1,09 241 Adrenoceptor -0,44 hydrochloride hydrochloride

Sertraline 182 JS-K Nitric Oxide 2,15 212 TBB Phosphorylation 1,03 242 Serotonin -0,44 hydrochloride

183 MNS Phosphorylation 2,15 213 beta-Lapachone Apoptosis 1,00 243 FPL 64176 Ca2+ Channel -0,54

S-(-)-Eticlopride SKF-89145 L(-)-Norepinephrine 184 Dopamine 2,14 214 Dopamine 0,98 244 Adrenoceptor -0,55 hydrochloride hydrobromide bitartrate

Naltrexone Tetraethylammonium 185 Opioid 2,05 215 DPO-1 K+ Channel 0,95 245 Cholinergic -0,56 hydrochloride chloride

R(-)-N6-(2- CGP 20712A 186 Adrenoceptor 2,02 216 Adenosine Adenosine 0,92 246 Phenylisopropyl)aden Adenosine -0,57 methanesulfonate osine

Edrophonium Antozoline 187 Cholinergic 1,97 217 AIDA Glutamate 0,78 247 Imidazoline -0,60 chloride hydrochloride

DNA-RNA Brequinar sodium salt Diltiazem 188 Bezafibrate Transcription 1,97 218 transcription 0,72 248 Ca2+ Channel -0,64 hydrate hydrochloride regulators

189 HEMADO Adenosine 1,96 219 JFD00244 Gene Regulation 0,65 249 CR 2249 Glutamate -0,67

190 Doxylamine succinate Histamine 1,94 220 Daphnetin Phosphorylation 0,61 250 Nomifensine maleate Dopamine -0,73

Fluoxetine 191 Serotonin 1,92 221 Rabeprazole sodium Ion Channels 0,55 251 L-allylglycine Biochemistry -0,75 hydrochloride

1,4-Dideoxy-1,4- 192 Phosphorylation 1,80 222 Piracetam Glutamate 0,52 252 ATPA Glutamate -0,75 imino-D-arabinitol

NG-Nitro-L-arginine Immune 193 Linezolid 1,73 223 methyl ester Nitric Oxide 0,51 253 Moclobemide Neurotransmission -0,86 Signaling hydrochloride

Esomeprazole 4-Amino-1,8- 194 Ion Channel 1,73 224 2',3'-dideoxycytidine Immune System 0,49 254 Apoptosis -0,89 magnesium dihydrate naphthalimide

cis-4-Aminocrotonic 195 CID2858522 Gene Regulation 1,73 225 BW 284c51 Cholinergic 0,49 255 GABA -0,89 acid

1,1-Dimethyl-4- Cytoskeleton and 196 Podophyllotoxin 1,64 226 Praziquantel Antibiotic 0,42 256 phenyl-piperazinium Cholinergic -0,92 ECM iodide

8-Bromo-cGMP Cyclic 197 Theobromine Adenosine 1,61 227 0,23 257 CX 546 Glutamate -0,95 sodium Nucleotides

S-(4-Nitrobenzyl)-6- (±)-Normetanephrine 198 Adenosine 1,59 228 Adrenoceptor 0,15 258 Sepiapterin Nitric Oxide -0,96 thioinosine hydrochloride

Kinase/ L-alpha-Methyl 199 PF-573228 1,53 229 Biochemistry 0,12 259 cDPCP Cell Cycle -0,96 Phosphatase DOPA

Cyclic (±)-p- 200 EGTA Biochemistry 1,42 230 Quercetin dihydrate 0,10 260 Biochemistry -0,98 Nucleotides Aminoglutethimide

DNA Dobutamine 201 Idarubicin 1,41 231 Adrenoceptor 0,07 261 Dofetilide Ion Channels -1,00 Metabolism hydrochloride

S-Ethylisothiourea 202 Droperidol Dopamine 1,40 232 Nitric Oxide 0,01 262 SIB 1757 Glutamate -1,02 hydrobromide

Trequinsin Cyclic 203 UCL 2077 Ion Channels 1,39 233 Ethosuximide Anticonvulsant -0,10 263 -1,06 hydrochloride Nucleotides

4- Desipramine 204 Amidinophenylmethanesu Biochemistry 1,39 234 Picrotoxin GABA -0,16 264 Adrenoceptor -1,12 lfonyl fluoride hydrochloride hydrochloride (-)-MK-801 hydrogen 205 Glutamate 1,33 235 Pivmecillinam Antibiotics -0,19 265 Levetiracetam Neurotransmission -1,13 maleate

Immunomodulators 206 KRM-III and Antibiotics 1,20 236 AC-93253 iodide Hormone -0,21 266 Olomoucine Phosphorylation -1,18

3- 8-Cyclopentyl-1,3- 207 Morpholinosydnonimi Nitric Oxide 1,17 237 DM 235 Nootropic -0,27 267 Adenosine -1,23 dipropylxanthine ne hydrochloride

Opipramol 208 Sigma receptor 1,15 238 CGS-12066A maleate Serotonin -0,30 268 (+)-Cyclazocine Opioid -1,26 dihydrochloride

Naftopidil 2-Chloro-2-deoxy-D- 209 Adrenoceptor 1,09 239 Biochemistry -0,38 269 AS605240 Biochemistry -1,31 dihydrochloride glucose

Tetramisole 210 PNU-282987 Cholinergic 1,09 240 Phosphorylation -0,42 270 Tetrabenazine Neurotransmission -1,33 hydrochloride

158

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

271 RS504393 Cytokines -1,39 301 AB-MECA Adenosine -2,27 331 Fulvestrant Hormone -3,63

272 5-Fluorouracil Cell Cycle -1,40 302 GW7647 Transcription -2,31 332 (±)-Atenolol Adrenoceptor -3,71

N6- 273 Adenosine -1,43 303 Ouabain Ion Pump -2,33 333 (±)-HA-966 Glutamate -3,74 Cyclohexyladenosine

2',3'-didehydro-3'- 274 Immune System -1,43 304 S(-)-Pindolol Adrenergic -2,36 334 IB-MECA Adenosine -3,76 deoxythymidine

(S)-3,5- R(-)-Isoproterenol Papaverine Cyclic 275 Adrenoceptor -1,44 305 Dihydroxyphenylglyc Glutamate -2,39 335 -3,82 (+)-bitartrate hydrochloride Nucleotides ine Tirofiban 276 OBAA Phospholipases -1,47 306 hydrochloride Cell Signaling -2,46 336 3-Iodo-L-tyrosine Neurotransmission -3,83 monohydrate 5-Nitro-2-(3- Nylidrin Retinoic acid p- 277 Adrenoceptor -1,55 307 Cell Cycle -2,49 337 phenylpropylamino)b Cl- Channel -3,91 hydrochloride hydroxyanilide enzoic acid

Amitriptyline 278 Adrenoceptor -1,55 308 NG-Nitro-L-arginine Nitric Oxide -2,50 338 Aniracetam Glutamate -3,94 hydrochloride

Alaproclate N- 279 Serotonin -1,55 309 Pilocarpine nitrate Cholinergic -2,57 339 Sphingolipid -3,96 hydrochloride Oleoylethanolamine

L-Beta-threo-benzyl- 280 Allopurinol Cell Stress -1,61 310 Felodipine Ca2+ Channel -2,59 340 Neurotransmission -3,99 aspartate

BNTX maleate salt 281 Sodium Oxamate Biochemistry -1,62 311 Opiods -2,62 341 Beclomethasone Hormone -4,09 hydrate

Quipazine, 6-nitro-, Azithromycin Immune Cell 282 Glybenclamide K+ Channel -1,62 312 Serotonin -2,66 342 -4,12 maleate dihydrate Signaling

5-fluoro-5'- DNA 283 -1,65 313 PF-04418948 Lipid Signaling -2,70 343 Hydroquinone Leukotriene -4,12 deoxyuridine Metabolism

284 Cyclothiazide Glutamate -1,71 314 NADPH tetrasodium Nitric Oxide -2,70 344 Flupirtine maleate Glutamate -4,17

Naltriben Tetraisopropyl 285 EBPC Lipids -1,76 315 Opioid -2,70 345 Biochemistry -4,23 methanesulfonate pyrophosphoramide

Chlormethiazole 286 Efavirenz Gene Regulation -1,78 316 GABA -2,76 346 CP-66713 Purinergics -4,23 hydrochloride

Epinastine ZM 39923 Aprindine 287 Histamine -1,79 317 Phosphorylation -2,93 347 K+ Channel -4,29 hydrochloride hydrochloride hydrochloride

Danshensu sodium 2-(Methylthio)adenosine Doxepin 288 Cell Stress -1,79 318 5'-diphosphate trisodium Purinoceptor -3,05 348 Adrenoceptor -4,34 salt salt hydrate hydrochloride

GYKI 52466 (±)-Epinephrine 289 JW55 Gene Regulation -1,82 319 Glutamate -3,08 349 Adrenoceptor -4,39 hydrochloride hydrochloride

1-Amino-1- Amiodarone 290 cyclohexanecarboxyli Neurotransmission -1,84 320 Adrenoceptor -3,08 350 NBI 27914 Neurotransmission -4,44 hydrochloride c acid hydrochloride

SKF-525A Multi-Drug 291 10058-F4 Apoptosis -1,85 321 PRE-084 Opioid -3,11 351 -4,60 hydrochloride Resistance

L-Glutamic acid, N- 292 S15535 Serotonin -1,88 322 SR-95531 GABA -3,13 352 Glutamate -4,60 phthaloyl-

Palmitoyl-DL- 293 Phosphorylation -1,92 323 Tyrphostin AG 879 Phosphorylation -3,13 353 trans-(±)-ACPD Glutamate -4,69 Carnitine chloride

alpha-Methyl-5- 294 L-Glutamine Glutamate -2,01 324 hydroxytryptamine Serotonin -3,19 354 NS-1619 K+ Channel -4,71 maleate

WB-4101 295 Perphenazine Dopamine -2,03 325 Furafylline Biochemistry -3,31 355 Adrenoceptor -4,71 hydrochloride

N-(4-Amino-2- 296 chlorophenyl)phthali Anticonvulsant -2,10 326 13-cis-retinoic acid Transcription -3,33 356 Tolbutamide Hormone -4,73 mide

297 Oxybutynin Chloride Cholinergic -2,13 327 SC 19220 Prostaglandin -3,37 357 Isotharine mesylate Adrenoceptor -4,73

Extracellular 298 NNGH -2,16 328 Triamcinolone Hormone -3,49 358 Ro 41-0960 Neurotransmission -4,74 Matrix

Nortriptyline 5,5-Dimethyl-1- Immune 299 Adrenoceptor -2,17 329 Cell Stress -3,52 359 BLI-489 hydrate -4,75 hydrochloride pyrroline-N-oxide Signaling

300 Bexarotene Gene Regulation -2,20 330 GSK1210151A Gene Regulation -3,53 360 Phloretin Ca2+ Channel -4,91

159

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

Cyclic Propafenone 361 Enoximone -4,92 391 Neostigmine bromide Cholinergic -5,97 421 K+ Channel -6,78 Nucleotides hydrochloride

Benidipine 362 Oleic Acid Phosphorylation -5,05 392 Ion Channel -6,04 422 Olvanil Neurotransmission -6,78 hydrochloride

Cyclic Phosphomycin 363 Ro 90-7501 Neurodegeneration -5,05 393 Rolipram -6,04 423 Antibiotic -6,84 Nucleotides disodium

Oxymetazoline 364 RepSox Neuroscience -5,08 394 L-165,041 Lipid Signaling -6,07 424 Adrenoceptor -6,88 hydrochloride

gamma-Acetylinic 365 L-Tryptophan Serotonin -5,16 395 Retinoic acid Apoptosis -6,08 425 GABA -6,88 GABA

Enzyme IMID-4F 366 IC 261 Phosphorylation -5,17 396 Methazolamide -6,08 426 K+ Channel -6,94 Inhibitors hydrochloride

Cyclic 367 ODQ -5,21 397 CP-335963 Kinases -6,08 427 Mitiglinide calcium Ion channels -6,98 Nucleotides

LY-294,002 Methapyrilene 368 Phosphorylation -5,25 398 (±)-CPP Glutamate -6,15 428 Histamine -7,02 hydrochloride hydrochloride

Ro 25-6981 (±)-Muscarine Immune 369 Glutamate -5,30 399 Cholinergic -6,17 429 Nedocromil -7,03 hydrochloride chloride Signaling

Extracellular (±)-Octopamine 370 Phenelzine sulfate Neurotransmission -5,35 400 NSC405020 -6,27 430 Adrenoceptor -7,05 Matrix hydrochloride

Intracellular Hydralazine 371 Auranofin Phosphrylation -5,37 401 Dantrolene sodium -6,30 431 Neurotransmission -7,05 Calcium hydrochloride

Lidocaine 372 Zofenopril calcium Angiotensin -5,43 402 S(-)-Timolol maleate Adrenoceptor -6,30 432 Na+ Channel -7,10 hydrochloride

1-[2- 373 (Trifluoromethyl)phe Nitric Oxide -5,50 403 JW74 Transcription -6,30 433 Pindolol Adrenoceptor -7,15 nyl]imidazole

Tulobuterol Spiperone 374 Adrenoceptor -5,53 404 Dopamine -6,36 434 3-n-Propylxanthine Adenosine -7,15 hydrochloride hydrochloride

Apoptosis and Dipropyldopamine 375 PMEG hydrate -5,55 405 Lamotrigine Anticonvulsant -6,37 435 Dopamine -7,16 Cell Cycle hydrobromide

Oxotremorine 376 SANT-1 Angiogensis -5,58 406 Cholinergic -6,37 436 Ibandronate sodium Lipid Signaling -7,17 methiodide

7,7-Dimethyl- 377 (5Z,8Z)-eicosadienoic Lipid -5,59 407 SB 222200 Tachykinin -6,39 437 Morin Cell Stress -7,19 acid

DNA Bisdemethoxycurcum 378 Altretamine -5,61 408 AMN082 Glutamate -6,40 438 Ion Channels -7,22 Metabolism in

Nimustine 379 DNA -5,64 409 Nitidine chloride Apoptosis -6,46 439 Piperlongumine Apoptosis -7,25 hydrochloride

Pentamidine 380 GW2974 Phosphorylation -5,66 410 Glutamate -6,47 440 Bay 11-7082 Phosphorylation -7,27 isethionate

Phenylephrine RX 821002 381 Debrisoquin sulfate Neurotransmission -5,67 411 Adrenoceptor -6,47 441 Adrenoceptor -7,31 hydrochloride hydrochloride

Indatraline 382 Pirfenidone Immune System -5,69 412 Dopamine -6,47 442 A3 hydrochloride Phosphorylation -7,31 hydrochloride

Bisoprolol 383 PD-166866 Tyrosine Kinase -5,73 413 Tegafur Apoptosis -6,50 443 Adrenoceptor -7,32 hemifumarate salt

Cyclic Semicarbazide 384 Perifosine Phosphorylation -5,78 414 SQ 22536 -6,53 444 Neurotransmission -7,38 Nucleotides hydrochloride

Imetit 385 Lonidamine Cell Stress -5,78 415 Progesterone Hormone -6,54 445 Histamine -7,41 dihydrobromide

Epibestatin 386 Biochemistry -5,78 416 Oxiracetam Nootropic -6,57 446 (-)-Naproxen sodium Prostaglandin -7,43 hydrochloride

387 6-Hydroxymelatonin Melatonin -5,83 417 Benzamide Apoptosis -6,62 447 SU 4312 Phosphorylation -7,47

Raloxifene Granisetron 388 Hormone -5,94 418 Phenytoin sodium Anticonvulsant -6,66 448 Serotonin -7,47 hydrochloride hydrochloride

LY-310,762 389 T0070907 Gene Regulation -5,94 419 H-8 dihydrochloride Phosphorylation -6,69 449 Serotonin -7,48 hydrochloride

(+)-CP-99994 390 Indomethacin Prostaglandin -5,95 420 Tachykinins -6,71 450 Sulindac sulfone Prostaglandin -7,52 dihydrochloride

160

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

Multi-Drug L-alpha-Methyl-p- 451 CPNQ Neurotransmission -7,53 481 Sulfaphenazole -8,50 511 Neurotransmission -9,77 Resistance tyrosine

(-)-Isoproterenol 452 Adrenoceptor -7,55 482 Sulindac Prostaglandin -8,50 512 SNC80 Opioid -9,80 hydrochloride

CID 11210285 Histamine 453 Daurisoline Ion Channels -7,55 483 Gene Regulation -8,61 513 Histamine -9,83 hydrochloride dihydrochloride

(±)-AMT 454 Nalidixic acid sodium Antibiotic -7,61 484 Tirapazamine Apoptosis -8,63 514 Nitric Oxide -9,93 hydrochloride

3-(1H -Imidazol -4- 2,3-Butanedione 455 K+ Channel -7,63 485 yl)propyl di(p- Histamine -8,70 515 Theophylline Adenosine -9,97 monoxime fluorophenyl)methyl ether hydrochloride

1-Phenyl-3-(2- 456 Dopamine -7,66 486 SU 5416 Phosphorylation -8,78 516 PD 169316 Phosphorylation -10,01 thiazolyl)-2-thiourea

3-alpha,21- Rauwolscine 457 Dihydroxy-5-alpha- GABA -7,69 487 D-Serine Glutamate -8,85 517 Adrenoceptor -10,01 hydrochloride pregnan-20-one

GR 55562 458 Serotonin -7,71 488 (+)-Quisqualic acid Glutamate -8,87 518 PPADS P2 Receptor -10,07 dihydrobromide

Chloroquine Promethazine 459 DNA -7,78 489 Nifedipine Ca2+ Channel -8,95 519 Histamine -10,13 diphosphate hydrochloride

(±)-Propranolol (±)-SKF-38393 460 Adrenoceptor -7,79 490 SR 142948A Cell signaling -8,96 520 Dopamine -10,14 hydrochloride hydrochloride

Mecamylamine Hexahydro-sila-difenidol 461 CGS-15943 Adenosine -7,90 491 Cholinergic -8,99 521 hydrochloride, p-fluoro Cholinergic -10,15 hydrochloride analog

Ethopropazine Tizanidine 462 Neurotransmission -7,90 492 Eprosartan mesylate Angiotensins -8,99 522 Adrenoceptor -10,15 hydrochloride hydrochloride

5-Hydroxy-L- 463 N-Acetyl-L-Cysteine Glutamate -7,91 493 Serotonin -9,03 523 Proglumide Cholecystokinin -10,26 tryptophan

7,8-Dihydroxyflavone Cytokines, Growth 464 Pentylenetetrazole Neurotransmission -7,93 494 Factors and -9,10 524 (±)-Taxifolin Cell Stress -10,27 hydrate Hormones

p-MPPF Loperamide Amsacrine 465 Serotonin -7,97 495 Opioid -9,15 525 DNA Repair -10,30 dihydrochloride hydrochloride hydrochloride

Phosphodiesterase 466 Sildenafil citrate salt -7,97 496 (+)-Hydrastine GABA -9,35 526 (±)-Ibuprofen Prostaglandin -10,44 Inhibitors

Naltrindole SKF 83959 467 Opioid -8,04 497 MHPG piperazine Adrenoceptor -9,38 527 Dopamine -10,61 hydrochloride hydrobromide

Hexamethonium 468 Cibenzoline succinate K+ Channels -8,07 498 Cholinergic -9,45 528 Glipizide K+ Channel -10,63 dichloride

Spermine 469 Reactive Blue 2 P2 Receptor -8,08 499 IMS2186 Cell Cycle -9,45 529 Glutamate -10,65 tetrahydrochloride

Ziprasidone S(+)-Raclopride L- 470 Dopamine -8,08 500 hydrochloride Neurotransmission -9,46 530 Gossypol Apoptosis -10,66 tartrate monohydrate

Ciproxifan Iofetamine 471 Histamine -8,20 501 Neurotransmission -9,46 531 PF-04885614 Ion Channels -10,73 hydrochloride hydrochloride

ZD 7114 472 Adrenergics -8,20 502 Riluzole Glutamate -9,49 532 CyPPA K+ Channels -10,75 hydrochloride

(+)-Pilocarpine Nicardipine 473 Cholinergic -8,30 503 Ca2+ Channel -9,51 533 SR 27897 hydrate Cholecystokinin -10,77 hydrochloride hydrochloride

Na-p-Tosyl-L-lysine Cyclic Guvacine 474 DFB Glutamate -8,33 504 chloromethyl ketone -9,67 534 GABA -10,81 Nucleotides hydrochloride hydrochloride

Heat Shock 475 AEG 3482 -8,35 505 Ketorolac tris salt Prostaglandin -9,67 535 Loxapine succinate Dopamine -10,82 Proteins

Rilmenidine 476 Ketotifen fumarate Histamine -8,35 506 Kynurenic acid Glutamate -9,67 536 Imidazoline -10,86 hemifumarate

Cytoskeleton and 477 Suramin sodium salt P2 Receptor -8,40 507 Colchicine -9,68 537 Resveratrol Prostaglandin -10,93 ECM

6-Aminohexanoic 478 Hydrochlorothiazide Biochemistry -8,41 508 Ro 8-4304 Glutamate -9,70 538 Immune System -10,96 acid

(±)-Isoproterenol Maprotiline 479 NCS-382 GABA -8,46 509 Adrenoceptor -9,71 539 Adrenoceptor -11,02 hydrochloride hydrochloride

6,7-ADTN SCH-202676 Hexamethonium 480 Dopamine -8,47 510 G protein -9,77 540 Cholinergic -11,02 hydrobromide hydrobromide bromide

161

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

541 BPTES Oxidative Stress -11,04 571 (+/-)-Anisodamine Cholinergic -12,13 601 Valproic acid sodium Anticonvulsant -12,95

1-(2- Bendamustine 542 Methoxyphenyl)piper Serotonin -11,07 572 Apoptosis -12,13 602 K 185 Melatonin -13,08 hydrochloride azine hydrochloride

3,4- 543 Guanabenz acetate Adrenoceptor -11,09 573 Cortexolone Hormone -12,15 603 Biochemistry -13,09 Dichloroisocoumarin

Ranitidine 544 Pifithrin-mu Apoptosis -11,14 574 Steviol Ion Channels -12,16 604 Histamine -13,18 hydrochloride

1-(5 - Vanillic acid Protriptyline 545 Isoquinolinylsulfonyl)-2- Phosphorylation -11,17 575 Vanilloid -12,19 605 Adrenoceptor -13,24 methylpiperazine diethylamide hydrochloride dihydrochloride

Tetradecylthioacetic (±)-8-Hydroxy-DPAT 546 Transcription -11,17 576 Serotonin -12,20 606 R(+)-Butylindazone Ion Pump -13,25 acid hydrobromide

Sematilide (±)-2,3-Dichloro-alpha- K+ Channel alpha-Lobeline 547 methylbenzylamine Neurotransmission -11,23 577 monohydrochloride -12,20 607 Cholinergic -13,29 Modulator hydrochloride hydrochloride monohydrate

(-)-Scopolamine,n- Orphenadrine Methiothepin 548 Cholinergic -11,24 578 Cholinergic -12,24 608 Serotonin -13,31 Butyl-, bromide hydrochloride mesylate

N-p-Tosyl-L- 549 Tyrphostin 23 Phosphorylation -11,37 579 Nilutamide Hormone -12,26 609 phenylalanine Biochemistry -13,31 chloromethyl ketone

1,3-Dimethyl-8- Ranolazine Lubeluzole 550 Adenosine -11,39 580 Lipid -12,37 610 Glutamate -13,34 phenylxanthine dihydrochloride dihydrochloride

BAY 61-3606 551 2,2'-Bipyridyl Biochemistry -11,39 581 Gabapentin Anticonvulsant -12,38 611 Phosphorylation -13,34 hydrochloride hydrate

Cyclic Clemizole 552 Pyrilamine maleate Histamine -11,42 582 Ibudilast -12,38 612 Histamine -13,36 Nucleotides hydrochloride

1,3,5-tris(4- (+)-Chlorpheniramine 553 Histamine -11,43 583 hydroxyphenyl)-4- Hormone -12,41 613 Triflusal Anticoagulants -13,38 maleate propyl-1H-pyrazole

Memantine Angiogenic 554 Glutamate -11,44 584 E-64 Biochemistry -12,41 614 GANT61 -13,38 hydrochloride Factors

N- Pramipexole 555 Methylhistaprodifen Histamine -11,50 585 Dopaminergics -12,44 615 Fenobam Glutamate -13,41 dihydrochloride dioxalate salt

Quinelorane 556 L-701,324 Glutamate -11,51 586 Dopamine -12,44 616 PHA-543613 Neurotransmission -13,52 dihydrochloride

Histamine, R(-)- Imiloxan 557 loxoprofen Prostaglandin -11,51 587 alpha-methyl-, Histamine -12,45 617 Adrenoceptor -13,53 hydrochloride dihydrochloride 7-Cyclopentyl -5-(4 - DL-Homatropine phenoxy)phenyl-7H- 558 Cholinergic -11,54 588 Phosphorylation -12,61 618 LP44 Serotonin -13,59 hydrobromide pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4- ylamine

(-)-Scopolamine Immune cell Immune Cell 559 Cholinergic -11,63 589 Mifamurtide -12,63 619 Famciclovir -13,66 hydrobromide signaling Signaling

5'-N- 560 Ethylcarboxamidoade Adenosine -11,65 590 Danazol Hormone -12,67 620 LY-367,265 Serotonin -13,67 nosine

Prochlorperazine Sivelestat sodium salt Adenosine 3',5'-cyclic 561 Dopamine -11,78 591 Biochemistry -12,69 621 Phosphorylation -13,73 dimaleate hydrate monophosphate

Methoctramine 562 Cholinergic -11,80 592 Tyrphostin 47 Phosphorylation -12,72 622 1-Phenylbiguanide Serotonin -13,75 tetrahydrochloride

Phosphoramidon 563 LE 300 Dopamine -11,86 593 Biochemistry -12,72 623 Norcantharidin Phosphorylation -13,77 disodium

Nordihydroguaiaretic acid L-745,870 564 from Larrea divaricata Leukotriene -11,87 594 Quinolinic acid Glutamate -12,73 624 Dopamine -13,78 (creosote bush) hydrochloride 4-Hydroxy-3- L-687,384 565 Kenpaullone Phosphorylation -11,90 595 Opioid -12,73 625 methoxyphenylacetic Dopamine -13,84 hydrochloride acid Cytoskeleton and 566 Bicalutamide (CDX) Gene Regulation -11,93 596 CP-471474 Extracellular -12,80 626 Ketoprofen Prostaglandin -13,84 Matrix

567 Stevioside Ion Channels -11,97 597 DL-Thiorphan Neurotransmission -12,81 627 (-)-Sulpiride Dopamine -13,84

SB 206553 568 Spironolactone Hormone -11,98 598 Trimipramine maleate Serotonin -12,91 628 Serotonin -13,88 hydrochloride

569 L-Canavanine Cell Stress -12,00 599 L-655,708 Benzodiazepine -12,94 629 Clozapine Dopamine -13,89

Clomipramine (±)-Octoclothepin Imipramine 570 Serotonin -12,10 600 Dopamine -12,95 630 Serotonin -13,91 hydrochloride maleate hydrochloride

162

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

631 4-DAMP methiodide Cholinergic -13,92 661 Cantharidic Acid Phosphorylation -14,87 691 Leflunomide Immune System -15,65

Lidocaine N-ethyl Phorbol 12-myristate 632 Propofol Cholinergic -13,95 662 bromide quaternary Na+ Channel -14,89 692 Phosphorylation -15,74 13-acetate salt

633 Iodoacetamide Biochemistry -13,98 663 rac BHFF Neurotransmission -14,91 693 (-)-Cotinine Cholinergic -15,75

634 FAUC 213 Dopamine -14,01 664 Mephetyl tetrazole K+ Channel -14,91 694 CCT007093 Apoptosis -15,77

NO-711 Oltipraz metabolite 635 GABA -14,03 665 Hydrocortisone Hormone -14,99 695 Lipid Signaling -15,78 hydrochloride M2

Molindone SDZ-205,557 636 Dopamine -14,05 666 Serotonin -15,04 696 Pirenperone Serotonin -15,78 hydrochloride hydrochloride

Anisotropine methyl 637 Mifepristone Hormone -14,06 667 Muscarinic -15,07 697 Ritanserin Serotonin -15,81 bromide

Olprinone Phosphodiesteras 638 -14,10 668 Lansoprazole Ion Pump -15,13 698 Pancuronium bromide Cholinergic -15,90 hydrochloride e

4- 639 Hydroxyphenethylami Dopamine -14,14 669 (±)-alpha-Lipoic Acid Cell Stress -15,14 699 R(+)-IAA-94 Cl- Channel -15,93 ne hydrochloride

(+)-Norfenfluramine (+)-MK-801 640 Serotonin -14,17 670 CP-226269 Dopamine -15,18 700 Glutamate -15,99 hydrochloride hydrogen maleate

5-(N,N- CP-154526 641 Dimethyl)amiloride Ion Pump -14,20 671 Ipratropium bromide Cholinergic -15,23 701 Neurotransmission -16,07 hydrochloride hydrochloride

Naratriptan 642 Hemicholinium-3 Cholinergic -14,29 672 Serotonin -15,23 702 Candesartan cilexetil Cell Signaling -16,11 hydrochloride

N- (-)-Tetramisole 643 Hypotaurine Cell Stress -14,40 673 Cholinergic -15,27 703 Phosphorylation -16,14 Desmethylclozapine hydrochloride

Valganciclovir 644 Antiviral -14,40 674 GSK2578215A Phosphorylation -15,27 704 Galloflavin potassium Cell Stress -16,20 hydrochloride hydrate

(±)-PPHT (±)-Vanillylmandelic Succinylcholine 645 Dopamine -14,40 675 Adrenoceptor -15,30 705 Cholinergic -16,23 hydrochloride acid chloride

646 Eliprodil Glutamate -14,40 676 Kainic acid Glutamate -15,34 706 Lithium Chloride Neurotransmission -16,28

Venlafaxine 647 SC-57461A Lipids -14,44 677 (-)-Perillic acid G protein -15,35 707 Serotonin -16,29 hydrochloride

Noscapine 648 Olanzapine Dopaminergics -14,54 678 Opioid -15,40 708 SC-514 Phosphorylation -16,31 hydrchloride

Idazoxan 649 PAPP Serotonin -14,61 679 Imidazoline -15,41 709 Rotenone Cell Stress -16,34 hydrochloride

Tetraethylthiuram 650 ATPO Glutamate -14,64 680 Biochemistry -15,41 710 O-Phospho-L-serine Glutamate -16,37 disulfide

Ropinirole 651 Cinoxacin Antibiotic -14,66 681 Cilnidipine Ca2+ Channels -15,43 711 Dopamine -16,37 hydrochloride

DL-alpha- 652 BIO Phosphorylation -14,73 682 Difluoromethylornithi Angiogenesis -15,43 712 Captopril Neurotransmission -16,38 ne hydrochloride

Kinase/Phosphot 653 BIA 2-093 Na+ Channels -14,76 683 DMH4 -15,47 713 Nitrendipine Ca2+ Channel -16,48 ase

654 KB-R7493 Calcium Channel -14,78 684 DCEBIO K+ Channel -15,49 714 Imperatorin Phosphorylation -16,48

Fosmidomycin Arachidonic Acid Tranylcypromine Tiapride 655 -14,78 685 Neurotransmission -15,60 715 Dopamine -16,55 sodium salt hydrate Cascade hydrochloride hydrochloride

656 1,10-Diaminodecane Glutamate -14,78 686 JNJ-40418677 Neurobiology -15,60 716 Pseudocantharidin C Gene Regulation -16,58

SB 269970 657 Albuterol hemisulfate Adrenoceptor -14,79 687 Serotonin -15,60 717 Ifenprodil tartrate Glutamate -16,59 hydrochloride

1,10-Phenanthroline Triflupromazine Propantheline 658 Biochemistry -14,80 688 Dopamine -15,61 718 Cholinergic -16,62 monohydrate hydrochloride bromide

1-Methylnicotinamide DNA 659 Inflammation -14,84 689 L-Hyoscyamine Cholinergic -15,61 719 Hydroxyurea -16,62 chloride Metabolism

5,7- (±)-AMPA 2,4-Diamino-6- 660 Glutamate -14,85 690 Dichlorokynurenic Glutamate -15,65 720 Phosphorylation -16,64 hydrobromide pyrimidinone acid 163

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

Triprolidine 721 Histamine -16,65 751 TCPOBOP Transcription -17,65 781 Phosphonoacetic acid DNA -18,69 hydrochloride

Cytidine 5'- 4-Imidazolemethanol Putrescine 722 Histamine -16,66 752 diphosphocholine Lipid Signaling -17,67 782 Glutamate -18,73 hydrochloride dihydrochloride sodium salt hydrate

Trifluoperazine Propionylpromazine 723 Dopamine -16,73 753 Paliperidone Neurotransmission -17,77 783 Dopamine -18,76 dihydrochloride hydrochloride

724 Primidone Anticonvulsant -16,76 754 Stattic Gene Regulation -17,78 784 Diazoxide K+ Channel -18,82

Cytosine-1-beta-D- DNA 725 arabinofuranoside -16,77 755 DBO-83 Cholinergic -17,80 785 Nefiracetam Neurotransmission -18,92 Metabolism hydrochloride

Tetracaine Argatroban 726 Roslin 2 -16,77 756 Na+ Channel -17,84 786 Cell signaling -19,01 hydrochloride monohydrate

Pyridostatin Etazolate 727 Gene Regulation -16,80 757 Cefazolin sodium Antibiotic -17,85 787 Adenosine -19,01 trifluoroacetate salt hydrochloride

Pregnenolone sulfate 5alpha-Pregnan- 728 GABA -16,84 758 GABA -17,89 788 PD 98,059 Phosphorylation -19,09 sodium 3alpha-ol-20-one

729 Agomelatine Melatonins -16,87 759 Aurothioglucose Phosphorylation -17,95 789 Amisulpride Dopamine -19,18

Multi-Drug 730 SMER28 Cell Biology -16,98 760 Ketoconazole -17,95 790 N-Oleoyldopamine Neurotransmission -19,19 Resistance

731 SR 59230A oxalate Adrenoceptor -17,01 761 Pheniramine maleate Histamine -17,96 791 U-73343 G-protein -19,27

(±)-7-Hydroxy-DPAT Terbutaline 732 Icilin Neurotransmission -17,06 762 Dopamine -17,98 792 Adrenoceptor -19,32 hydrobromide hemisulfate

N-Methyl-beta- 733 carboline-3- GABA -17,12 763 AGK2 Gene Regulation -17,99 793 Tyrphostin 1 Phosphorylation -19,32 carboxamide

734 Psora-4 K+ Channel -17,15 764 BF-170 hydrochloride Neurodegeneration -18,00 794 L-798106 Lipids -19,33

3,7-Dimethyl-1- Eletriptan 735 Adenosine -17,16 765 Serotonin -18,08 795 MRS 2159 P2 Receptor -19,43 propargylxanthine hydrobromide

R-(+)-7-Hydroxy- (-)-Scopolamine 736 Dopamine -17,18 766 Cholinergic -18,10 796 3-deazaadenosine Immune System -19,53 DPAT hydrobromide methyl nitrate

GBR-12909 (±)-SKF 38393, N- 737 Loratadine Histamine -17,18 767 Dopamine -18,12 797 Dopamine -19,55 dihydrochloride allyl-, hydrobromide

Ammonium Kinase/ 738 S(+)-Ibuprofen Prostaglandin -17,25 768 pyrrolidinedithiocarba Nitric Oxide -18,25 798 PD-166285 hydrate -19,57 Phosphatase mate

L-Histidine 5-hydroxydecanoic 739 Histamine -17,29 769 K+ Channel -18,30 799 Icaritin PPAR -19,61 hydrochloride acid sodium

8-(4- 1,3-Dipropyl-7- Spermidine Cyclic 740 Adenosine -17,32 770 Glutamate -18,31 800 Chlorophenylthio)- -19,71 methylxanthine trihydrochloride Nucleotides cAMP sodium Emetine p-Iodoclonidine Calmidazolium Intracellular 741 Adrenoceptor -17,32 771 -18,31 801 dihydrochloride Apoptosis -19,72 hydrochloride chloride Calcium hydrate

A-68930 17alpha- 742 Dopamine -17,34 772 Enalaprilat dihydrate Neurotransmitters -18,33 802 Hormone -19,72 hydrochloride hydroxyprogesterone

m- (±)-p- 743 Neurotransmission -17,40 773 Iodobenzylguanidine Apoptosis -18,33 803 Benztropine mesylate Cholinergic -19,74 Chlorophenylalanine hemisulfate

R(-)-Apocodeine 744 Carbachol Cholinergic -17,43 774 Oxolinic acid Antibiotic -18,44 804 Dopamine -19,75 hydrochloride

(±) -threo -1-Phenyl -2- decanoylamino-3- Donitriptan 745 Isonipecotic acid GABA -17,46 775 Sphingolipid -18,51 805 Neurotransmission -19,78 morpholino-1-propanol monohydrochloride hydrochloride

1-Deoxynojirimycin 746 Sanguinarine chloride Ion Pump -17,46 776 Biochemistry -18,53 806 ML-7 Phosphorylation -19,82 hydrochloride

CGP 55845 Intracellular 747 GABA -17,54 777 Thio-NADP sodium -18,55 807 GR 79236X Adenosine -19,85 hydrochloride Calcium

(±)-Chlorpheniramine 748 Histamine -17,57 778 ONO-RS-082 Lipids -18,61 808 Rofecoxib Lipid Signaling -19,88 maleate

3-Tropanyl-indole-3- Dicyclomine Tetrahydrozoline 749 Cholinergic -17,60 779 carboxylate Serotonin -18,65 809 Adrenoceptor -19,88 hydrochloride hydrochloride hydrochloride CP-100263 750 dihydrochloride Neurotransmission -17,61 780 Acetohexamide Hormone -18,68 810 Disopyramide Na+ Channel -19,91 hydrate 164

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

(±)-Sotalol 6(5H)- 811 Adrenoceptor -19,92 841 Transcription -21,42 871 L2-b Cell Biology -22,81 hydrochloride Phenanthridinone

Isoguvacine S(-)-3PPP (E)-4-amino-2- 812 GABA -19,93 842 Dopamine -21,45 872 GABA -22,89 hydrochloride hydrochloride butenoic acid

Pargyline 813 S-Nitrosoglutathione Nitric Oxide -19,96 843 Alloxazine Adenosine -21,47 873 Neurotransmission -22,94 hydrochloride

(±) trans-U-50488 Clonidine Gemcitabine Apoptosis and 814 Opioid -20,07 844 Adrenoceptor -21,54 874 -22,95 methanesulfonate hydrochloride hydrochloride Cell Cycle

Citalopram 815 Ebastine Histaminergics -20,11 845 Serotonin -21,61 875 BRL 37344 sodium Adrenoceptor -22,95 hydrobromide

816 SCH-28080 Ion Channels -20,13 846 Chlorothiazide Biochemistry -21,64 876 D-Cycloserine Glutamate -22,98

Intracellular 817 Thapsigargin -20,18 847 Wiskostatin Actin -21,71 877 GR 113808 Serotonin -23,05 Calcium

818 Paromomycin sulfate Antibiotic -20,22 848 Ribavirin Cell Cycle -21,79 878 Cortisone 21-acetate Hormone -23,12

819 GR-89696 fumarate Opioid -20,25 849 UK 14,304 Adrenoceptor -21,82 879 SB 205384 GABA -23,19

820 Tenidap Lipid Signaling -20,25 850 Phenylbutazone Prostaglandin -21,92 880 ET-18-OCH3 Lipid -23,21

Cyclic (S)-Propranolol 821 Tamoxifen citrate Phosphorylation -20,29 851 Vinpocetine -21,96 881 Adrenoceptor -23,27 Nucleotides hydrochloride

Pergolide 822 PD-407824 Kinase -20,32 852 Dopamine -21,96 882 Clofibrate Lipid -23,36 methanesulfonate

L-Cysteinesulfinic Prilocaine 823 Nestorone Lipid Signaling -20,42 853 Glutamate -22,03 883 Na+ Channel -23,38 Acid hydrochloride

Urapidil (-)-Scopolamine 824 Adrenoceptor -20,47 854 Cholinergic -22,03 884 D-609 potassium Lipid -23,42 hydrochloride methyl bromide

N,N-Dihexyl-2-(4- N6- 825 Adenosine -20,52 855 Pinacidil K+ Channel -22,18 885 fluorophenyl)indole- Benzodiazepine -23,50 Cyclopentyladenosine 3-acetamide R-(-)- ICI 204,448 826 Desmethyldeprenyl Neurotransmission -20,55 856 Opioid -22,19 886 BTCP hydrochloride Dopamine -23,56 hydrochloride hydrochloride

Disopyramide (6R)-5,6,7,8-Tetrahydro- Imidazole-4-acetic 827 K+ Channel -20,58 857 Neurotransmission -22,22 887 GABA -23,66 phosphate L-biopterin hydrochloride acid hydrochloride

DL-threo-beta- 828 Carbamazepine Anticonvulsant -20,59 858 Glutamate -22,33 888 Bay 11-7085 Cell Cycle -23,71 hydroxyaspartic acid

Cyclic 829 9-cyclopentyladenine -20,63 859 SANT-2 Gene Regulation -22,36 889 Phaclofen GABA -23,85 Nucleotides

Ritodrine 830 CNS-1102 Glutamate -20,70 860 Capecitabine Gene Regulation -22,43 890 Adrenoceptor -23,93 hydrochloride

D(-)-2-Amino-5- Diethylenetriaminepe 831 (±)-Synephrine Adrenoceptor -20,70 861 phosphonopentanoic Glutamate -22,44 891 Biochemistry -23,95 ntaacetic acid acid

S-Methyl-L- 832 EMPA Orexin -20,82 862 Nitric Oxide -22,45 892 Ceftriaxone sodium Antibiotic -24,03 thiocitrulline acetate

Cyclic 833 Ro 20-1724 -20,85 863 U-101958 maleate Dopamine -22,53 893 THIP hydrochloride GABA -24,06 Nucleotides

Procaine 834 BMS-193885 Neurotransmission -20,91 864 Diclofenac sodium Prostaglandin -22,54 894 Na+ Channel -24,07 hydrochloride

Pyridostigmine Immunomodulator 835 Cholinergic -20,98 865 Picotamide Thromboxane -22,62 895 Lumefantrine -24,10 bromide s and Antibiotics

2- 836 ML 10302 Serotonin -21,00 866 Phenylaminoadenosin Adenosine -22,62 896 Carmustine DNA -24,13 e

837 Pyrazinecarboxamide Antibiotic -21,05 867 Quinidine sulfate Na+ Channel -22,65 897 Iproniazid phosphate Neurotransmission -24,14

4-Imidazoleacrylic O-Methylserotonin 838 CP-346086 dihydrate Lipids -21,19 868 Histamine -22,67 898 Serotonin -24,14 acid hydrochloride

839 Ivermectin Cholinergic -21,22 869 Carbetapentane citrate Opioid -22,70 899 Haloperidol Dopamine -24,15

Dolasetron mesylate Caroverine 840 Celecoxib Lipids -21,22 870 Serotonergics -22,76 900 Glutamatergics -24,23 hydrate hydrochloride

165

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

Wortmannin from 901 Penicillium Phosphorylation -24,27 931 Cinnarizine Ca2+ Channel -25,99 961 L-Canavanine sulfate Nitric Oxide -27,99 funiculosum

(-)-Quinpirole BMY 7378 902 Dopamine -24,36 932 Serotonin -26,27 962 (±)-Baclofen GABA -28,03 hydrochloride dihydrochloride

Pirenzepine 903 Taurine Glycine -24,53 933 Cholinergic -26,29 963 Cephalothin sodium Antibiotic -28,03 dihydrochloride

904 Chlorzoxazone Nitric Oxide -24,56 934 AMG 9810 Ion Channels -26,30 964 CP-135807 Serotonergics -28,11

Phentolamine N-Methyl-D-aspartic 905 Adrenoceptor -24,58 935 Cimetidine Histamine -26,31 965 Glutamate -28,14 mesylate acid

(±)-Verapamil GR 127935 906 Bethanechol chloride Cholinergic -24,66 936 Ca2+ Channel -26,37 966 Serotonin -28,38 hydrochloride hydrochloride hydrate

(-)-trans-(1S,2S)-U- Acepromazine Thioridazine 907 Opioid -24,70 937 Neurotransmission -26,54 967 Dopamine -28,61 50488 hydrochloride maleate hydrochloride

Xylometazoline 908 2-Chloroadenosine Adenosine -24,70 938 Adrenoceptor -26,58 968 AA-861 Leukotriene -28,62 hydrochloride

3- Cyproheptadine 909 Morpholinosydnonimi Nitric Oxide -24,77 939 Carmofur Apoptosis -26,81 969 Serotonin -28,63 hydrochloride ne hydrochloride

Cephalosporin C zinc Immunomodulators 910 Antibiotic -24,87 940 PAC-1 Apoptosis -26,86 970 Artemether -28,80 salt and Antibiotics

911 BMS-299897 Cell Biology -24,87 941 Brinzolamide anydrases -26,94 971 Clemastine fumarate Histamine -28,84

Caffeic acid 912 Cell Cycle -24,94 942 Cefmetazole sodium Antibiotic -26,94 972 Cantharidin Phosphorylation -28,91 phenethyl ester

Bepridil Cystamine 913 Ca2+ Channel -25,05 943 Glutamate -27,05 973 (±)-Sulpiride Dopamine -28,92 hydrochloride dihydrochloride

Zimelidine 914 Serotonin -25,16 944 ML277 Ion Channels -27,15 974 Cefotaxime sodium Antibiotic -28,94 dihydrochloride

DL-p- 915 MG 624 Cholinergic -25,17 945 Clotrimazole K+ Channel -27,19 975 Chlorophenylalanine Neurotransmission -29,01 methyl ester hydrochloride

Cyclobenzaprine Cyclophosphamide 916 Serotonin -25,19 946 DNA -27,34 976 Roscovitine Phosphorylation -29,08 hydrochloride monohydrate

917 Piceatannol Phosphorylation -25,23 947 SKF 95282 dimaleate Histamine -27,36 977 Cyproterone acetate Hormone -29,12

3-Isobutyl-1- 918 Adenosine -25,25 948 Quinine sulfate K+ Channel -27,38 978 McN-A-343 Cholinergic -29,26 methylxanthine

N-(2-[4-(4- Cytoskeleton and 919 (±)-Thalidomide -25,26 949 Zonisamide sodium Anticonvulsant -27,47 979 Chlorophenyl)piperazin-1- Dopamine -29,29 ECM yl]ethyl)-3- methoxybenzamide

Trifluperidol Lomefloxacin 920 Dopamine -25,30 950 NNC 55-0396 Ca2+ Channel -27,47 980 Antibiotic -29,42 hydrochloride hydrochloride

5-(N-Ethyl-N- (±)-Vesamicol 921 Urapidil, 5-Methyl- Adrenoceptor -25,30 951 Ion Pump -27,55 981 Cholinergic -29,49 isopropyl)amiloride hydrochloride

R(+)-3PPP DNA Xylazine 922 Dopamine -25,38 952 Mitoxantrone -27,56 982 Adrenoceptor -29,49 hydrochloride Metabolism hydrochloride

LP 12 hydrochloride 923 Domperidone Dopamine -25,39 953 Chelidamic acid Glutamate -27,57 983 Serotonin -29,52 hydrate

Procainamide Ro 04-6790 924 Na+ Channel -25,60 954 Serotonin -27,59 984 Tropicamide Cholinergic -29,71 hydrochloride dihydrochloride

L-N6-(1- R(+)-6-Bromo-APB 925 Iminoethyl)lysine Nitric Oxide -25,63 955 Tyrphostin AG 1478 Phosphorylation -27,60 985 Dopamine -29,79 hydrobromide hydrochloride

R(+)-SCH-23390 L-Mimosine from 926 Dopamine -25,64 956 Pyrocatechol Cell Cycle -27,61 986 Apoptosis -29,89 hydrochloride Koa hoale seeds

927 Tyrphostin AG 538 Apoptosis -25,80 957 U-62066 Opioid -27,65 987 Droxinostat Gene Regulation -29,89

4- 928 DL-Cycloserine Sphingolipid -25,82 958 Hydroxybenzhydrazid Biochemistry -27,77 988 Azathioprine P2 Receptor -29,94 e

Centrophenoxine 929 Piribedil maleate Dopamine -25,89 959 SB 204741 Serotonin -27,96 989 Nootropic -29,96 hydrochloride

1-Allyl-3,7-dimethyl- Trihexyphenidyl 930 Cholinergic -25,89 960 Ara-G hydrate Apoptosis -27,97 990 8-p- Adenosine -30,04 hydrochloride sulfophenylxanthine 166

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

(±)-3-(3,4- WAY-100635 Moxisylyte 991 Serotonin -30,06 1021 Adrenoceptor -31,68 1051 dihydroxyphenyl)-2- Neurotransmission -33,46 maleate hydrochloride methyl-DL-alanine

Cysteamine L-azetidine-2- Mibefradil 992 Somatostatin -30,12 1022 Biochemistry -31,81 1052 Ca2+ Channel -33,50 hydrochloride carboxylic acid dihydrochloride

CP-31398 Bestatin Apoptosis and 993 Biochemistry -30,13 1023 dihydrochloride -31,91 1053 Ro 61-8048 Neuroscience -33,62 hydrochloride Cell Cycle hydrate (±)- Promazine 994 Dopamine -30,14 1024 Bropirimine Immunomodulators -31,95 1054 Methoxyverapamil Ca2+ Channel -33,62 hydrochloride hydrochloride

Antioxidants and 995 Sorbinil -30,17 1025 (±)-Bay K 8644 Ca2+ Channel -31,96 1055 DAPH Phosphorylation -33,76 Cytoprotectants

Cytoskeleton and Intracellular 996 5HPP-33 extracellular -30,28 1026 BRL 54443 maleate Serotonin -31,96 1056 TMB-8 hydrochloride -33,77 Calcium matrix

Cyclic Metoclopramide 997 Zaprinast -30,28 1027 Dopamine -31,97 1057 Apigenin Cell Cycle -33,88 Nucleotides hydrochloride

998 Acetamide Biochemistry -30,34 1028 L-DOPS Adrenergics -32,01 1058 SP600125 Phosphorylation -33,91

Imipenem 999 Antibiotic -30,35 1029 K114 Neurotransmission -32,10 1059 Supercinnamaldehyde Ion Channels -33,91 monohydrate

Benoxathian Cyclic Aurintricarboxylic 1000 Adrenoceptor -30,40 1030 Quazinone -32,14 1060 Apoptosis -33,96 hydrochloride Nucleotides acid

1001 Minoxidil K+ Channel -30,41 1031 3-MFA Ion Channels -32,30 1061 Cortisone Hormone -34,07

Clorgyline 1002 4-DAMP Cholinergics -30,42 1032 Neurotransmission -32,30 1062 1,5-Isoquinolinediol Apoptosis -34,12 hydrochloride

Kinase/ 1003 Rhodblock 6 -30,63 1033 PF-431396 hydrate Kinase inhibitors -32,31 1063 Carboplatin DNA -34,14 Phosphatase

CP-93129 Rizatriptan benzoate Gisadenafil besylate 1004 dihydrochloride Serotonergics -30,64 1034 Neurotransmission -32,45 1064 Phosphodiesteras -34,22 salt salt hydrate e inhibitors

1005 Thioperamide maleate Histamine -30,67 1035 Clonixin Inflammation -32,50 1065 Chlorpropamide Hormone -34,22

1006 Arvanil Neurotransmission -30,78 1036 Melatonin Melatonin -32,51 1066 U-74389G maleate Cell Stress -34,40

Bromoacetylcholine 1007 AC-55649 Gene Regulation -30,85 1037 U0126 Phosphorylation -32,55 1067 Cholinergic -34,45 bromide

Biperiden DNA 1008 N-Bromoacetamide Na+ Channel -30,89 1038 Cholinergic -32,58 1068 Azelaic acid -34,76 hydrochloride Metabolism

Chlorpromazine 1009 Dopamine -30,98 1039 NF 023 P2 Receptor -32,63 1069 Dihydrocapsaicin Vanilloid -34,78 hydrochloride

Acetyl-beta- 1010 IRAK-1/4 Inhibitor I Phosphorylation -31,00 1040 methylcholine Cholinergic -32,65 1070 Metrazoline oxalate Imidazoline -34,82 chloride

(+)-Bromocriptine 1011 Loxiglumide Cholinergics -31,01 1041 PK 11195 GABA -32,69 1071 Dopamine -34,98 methanesulfonate

(±)-2-Amino-4- Bioactive Small 1012 Terfenadine Histamine -31,09 1042 G15 -32,80 1072 phosphonobutyric Glutamate -35,12 Molecules acid

8-Bromo-cAMP Cyclic 1013 SCH 58261 Purinoceptor -31,17 1043 SC-236 Lipids -32,88 1073 -35,14 sodium Nucleotides

S-(+)-PD 123177 1014 CIQ Neurotransmission -31,31 1044 A-315456 Adrenoceptor -33,05 1074 trifluoroacetate salt Neurotransmission -35,21 hydrate alpha-Methyl-DL- Mianserin 1015 Serotonin -31,35 1045 L-Arginine Nitric Oxide -33,09 1075 tyrosine methyl ester Neurotransmission -35,23 hydrochloride hydrochloride

Trazodone 1016 Rutaecarpine K+ Channel -31,45 1046 Serotonin -33,11 1076 CB 1954 DNA -35,25 hydrochloride

Cyclic Betaxolol 1017 Cilostazol -31,54 1047 Adrenoceptor -33,23 1077 (+)-Catechin Hydrate Cell Stress -35,29 Nucleotides hydrochloride

Mexiletene (±)-gamma-Vinyl cis(+/-)-8-OH-PBZI 1018 Na+ Channel -31,56 1048 GABA -33,33 1078 Dopamine -35,44 hydrochloride GABA hydrobromide

3-Amino-1- 1019 propanesulfonic acid GABA -31,57 1049 TNP Ion Channels -33,37 1079 BWB70C Leukotriene -35,52 sodium

(±)-cis-Piperidine-2,3- 1020 Glutamate -31,67 1050 TPMPA GABA -33,44 1080 SC-58125 Lipids -35,60 dicarboxylic acid

167

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

Immunomodulators N-omega-Methyl-5- Trovafloxacin Gabaculine 1081 and -35,88 1111 hydroxytryptamine Serotonin -37,99 1141 GABA -40,54 mesylate Antibiotics hydrochloride oxalate salt

DL-Buthionine-[S,R]- Multi-Drug 1082 -35,90 1112 Mevastatin Antibiotic -38,03 1142 Varenicline tartrate Cholinergics -40,58 sulfoximine Resistance

2-(2- 1083 Aminoethyl)isothiour Nitric Oxide -35,92 1113 XCT790 Gene Regulation -38,06 1143 MK-912 Adrenoceptor -40,80 ea dihydrobromide

(±)-Butaclamol 1084 Meloxicam sodium Prostaglandin -36,01 1114 Dopamine -38,15 1144 MDL 28170 Cell Cycle -41,09 hydrochloride

3- 1-(4-Chlorobenzyl)-5- Multi-Drug Serotonin 1085 methoxy-2-methylindole- -36,01 1115 Aminopropylphospho GABA -38,23 1145 Serotonin -41,24 Resistance hydrochloride 3-acetic acid nic acid alpha,beta-Methylene L-703,606 oxalate salt 1086 adenosine 5'- P2 Receptor -36,10 1116 Levallorphan tartrate Opioid -38,41 1146 Tachykinin -41,25 hydrate triphosphate dilithium

1087 SB 202190 Phosphorylation -36,24 1117 Tomoxetine Adrenoceptor -38,45 1147 4-Aminopyridine K+ Channel -41,34

Cytoskeleton and (±)-2-Amino-3- Cyclic 1088 Milrinone -36,26 1118 CP-101537 Extracellular -38,53 1148 phosphonopropionic Glutamate -41,42 Nucleotides Matrix acid

Cytoskeleton and 1089 Vincristine sulfate -36,28 1119 GW9662 Transcription -38,94 1149 Trimethoprim Antibiotic -41,47 ECM Atorvastatin calcium Lipids in Cell N-Acetyl-5- 1090 salt trihydrate -36,32 1120 Melatonin -38,98 1150 Linopirdine Cholinergic -41,58 Signaling hydroxytryptamine

Vancomycin Benzamidine Metaproterenol 1091 hydrochloride from Antibiotic -36,32 1121 Biochemistry -38,99 1151 Adrenoceptor -41,62 Streptomyces orientalis hydrochloride hemisulfate

Cytoskeleton and Yohimbine 1092 Corticosterone Hormone -36,32 1122 Nocodazole -39,02 1152 Adrenoceptor -41,65 ECM hydrochloride

(-)-cis-(1S,2R)-U- (±)-Brompheniramine 1093 Neurotransmission -36,39 1123 Histamine -39,07 1153 U-99194A maleate Dopamine -41,76 50488 tartrate maleate

6-Methyl-2- 3-Aminopropionitrile Multi-Drug 1094 -36,67 1124 (phenylethynyl)pyridi Glutamate -39,11 1154 Benazoline oxalate Imidazoline -41,78 fumarate Resistance ne hydrochloride Brefeldin A from Cytoskeleton and 3'-Azido-3'- 1095 Penicillium -36,82 1125 Sandoz 58-035 Lipid -39,14 1155 Immune System -41,97 ECM deoxythymidine brefeldianum

(+)-Brompheniramine 1096 Histamine -36,85 1126 YS-035 hydrochloride Ca2+ Channel -39,23 1156 Caffeine Adenosine -42,01 maleate

Telenzepine 1097 Budesonide Hormone -37,01 1127 Cholinergic -39,45 1157 CGP-7930 GABA -42,17 dihydrochloride

Betaine aldehyde 1098 L-Cycloserine Sphingolipid -37,08 1128 Cholinergic -39,57 1158 Cephradine Antibiotic -42,17 chloride

Bupropion 1099 ML-9 Phosphorylation -37,08 1129 Dopamine -39,61 1159 Arcaine sulfate Glutamate -42,21 hydrochloride

2,6-Difluoro-4-[2- Neurotransmission 1100 Cephalexin hydrate Antibiotic -37,15 1130 (phenylsulfonylamino)eth Glutamate -39,64 1160 PD-156707 -42,26 ylthio]phenoxyacetamide and endothelins 9-Amino-1,2,3,4- Tryptamine 1101 tetrahydroacridine Cholinergic -37,19 1131 Serotonin -39,70 1161 Cyclosporin A Phosphorylation -42,38 hydrochloride hydrochloride

Zoledronic acid 1102 CBIQ K+ Channel -37,21 1132 Kinase -39,89 1162 Acyclovir Immune System -42,41 monohydrate

8-(3- L-Methionine 1103 Molsidomine Nitric Oxide -37,33 1133 Adenosine -40,07 1163 Glutamate -42,53 Chlorostyryl)caffeine sulfoximine

Acetylthiocholine 1104 Cholinergic -37,39 1134 Acetylsalicylic acid Prostaglandin -40,10 1164 2-Hydroxysaclofen GABA -42,53 chloride

Atropine methyl 1105 L-732,138 Tachykinin -37,43 1135 Cholinergic -40,14 1165 O6-benzylguanine DNA Repair -42,70 nitrate

Org 24598 lithium 1106 U-69593 Opioid -37,46 1136 Neurotransmission -40,14 1166 Betamethasone Hormone -42,70 salt

1- Moxonidine 1107 Aminocyclopropanecarbo Glutamate -37,47 1137 Adrenoceptor -40,34 1167 Ciprofibrate Transcription -42,81 xylic acid hydrochloride hydrochloride

S-Methylisothiourea 5-Fluoroindole-2- 1108 Nitric Oxide -37,54 1138 Nitisinone Cell Stress -40,39 1168 Glutamate -42,89 hemisulfate carboxylic acid

Vinblastine sulfate Cytoskeleton and (±)-Norepinephrine 1109 -37,92 1139 L-741,626 Dopamine -40,39 1169 Adrenoceptor -43,01 salt ECM (+)bitartrate

Immune Uridine 5'- (+)-Butaclamol 1110 Maraviroc -37,95 1140 P2 Receptor -40,51 1170 Dopamine -43,33 signaling diphosphate sodium hydrochloride

168

% CSE % CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition inhibition

8-Methoxymethyl-3- Cyclic Cyclic 4-Methylpyrazole 1171 isobutyl-1- -43,35 1201 Cilostamide -46,59 1231 Biochemistry -52,35 Nucleotides Nucleotides hydrochloride methylxanthine

Sodium Taurocholate Multi-Drug 1172 BW 723C86 Serotonin -43,40 1202 Atropine sulfate Cholinergic -46,64 1232 -52,89 hydrate Resistance

Arecoline Amantadine 1173 Cholinergic -43,45 1203 Acetazolamide Biochemistry -46,68 1233 Dopamine -53,69 hydrobromide hydrochloride

Kinase 1174 PD 0325901 phosphotase -43,53 1204 Nemadipine-A Ca2+ Channels -46,68 1234 Actinonin Biochemistry -54,68 biology

PD153035 p-Aminoclonidine 1-Methylhistamine 1175 Phosphorylation -43,62 1205 Adrenoceptor -46,83 1235 Histamine -54,78 hydrochloride hydrochloride dihydrochloride

B-HT 933 L-Buthionine- Multi-Drug 1176 2-methoxyestradiol Hormone -43,77 1206 Adrenoceptor -46,98 1236 -55,42 dihydrochloride sulfoximine Resistance

(S)-MAP4 (±)-Metoprolol (+)- 1177 Glutamate -43,93 1207 Lorglumide sodium Cholecystokinin -47,85 1237 Adrenoceptor -55,52 hydrochloride tartrate

N-Phenylanthranilic 1178 Cl- Channel -43,97 1208 Choline bromide Cholinergic -47,86 1238 GABA GABA -56,28 acid

Buspirone Indinavir sulfate salt immune cell 1179 Serotonin -44,23 1209 Amifostine Cell Stress -47,95 1239 -56,28 hydrochloride hydrate signaling

6-Methoxy-1,2,3,4- Meclofenamic acid 4-Aminobenzamidine 1180 Prostaglandin -44,30 1210 Biochemistry -48,31 1240 tetrahydro-9H- Neurotransmission -56,44 sodium dihydrochloride pyrido[3,4b] indole

DNA Atropine methyl 1181 5-azacytidine -44,44 1211 Cholinergic -48,63 1241 Agmatine sulfate Imidazoline -57,67 Metabolism bromide

PF-429242 1182 BP 897 Dopamine -44,53 1212 Gene Regulation -48,63 1242 Daidzein Cell Cycle -57,90 dihydrochloride

Aminophylline 1183 Betaine hydrochloride Biochemistry -44,57 1213 Metolazone Na+ Channel -48,70 1243 Adenosine -59,11 ethylenediamine

Cyclic 1184 YC-1 -44,64 1214 TMPH hydrochloride Cholinergic -48,76 1244 IPA-3 Phosphorylation -60,74 Nucleotides

(±)-2-Amino-5- Multidrug 1185 phosphonopentanoic Glutamate -44,72 1215 Aconitine Ion Pump -48,83 1245 Tienilic acid -60,86 Resistance acid

Cefsulodin sodium DL-alpha-Methyl-p- 1186 Rufinamide Neurotransmission -44,88 1216 Antibiotic -48,91 1246 Neurotransmission -61,18 salt hydrate tyrosine

(±)-6-Chloro-PB Phenamil 1187 Dopamine -45,16 1217 MRS 1523 Adenosine -49,13 1247 Na+ Channel -61,22 hydrobromide methanesulfonate

Cyclic 1188 CP-380736 Tyrosine Kinase -45,34 1218 Metergoline Serotonin -49,13 1248 YM 976 -61,34 nucleotides

1189 Reserpine Serotonin -45,36 1219 Cefaclor Antibiotic -49,61 1249 Zanamivir Antiviral -62,49

Methoxamine Aminoguanidine 1190 Adrenoceptor -45,42 1220 Nitric Oxide -50,10 1250 Caffeic Acid Cell Stress -62,76 hydrochloride hemisulfate

S(-)-p- 5-Bromo-2'- DNA 1191 Bromotetramisole Phosphorylation -45,56 1221 WIN 62,577 Tachykinin -50,29 1251 -63,94 deoxyuridine Metabolism oxalate

Labetalol 1192 Adrenoceptor -45,80 1222 (±)-Nipecotic acid GABA -50,46 1252 Ofloxacin Antibiotic -67,73 hydrochloride

Intracellular 1193 Aminopterin Antibiotic -45,92 1223 Metolazone Ion Pump -50,51 1253 Calcimycin -72,27 Calcium

1194 ANA-12 Cytokines -46,00 1224 GNF-5 Phosphorylation -50,58 1254 SB-366791 Vanilloid -76,76

NG-Monomethyl-L- 1195 Nitric Oxide -46,08 1225 PF-4778574 -50,61 1255 Bumetanide Ion Pump -78,61 arginine acetate

N- Multi-Drug 1196 1-Aminobenzotriazole -46,24 1226 Acetylprocainamide Na+ Channel -50,86 1256 Dipyridamole Adenosine -82,83 Resistance hydrochloride 7-Chloro-4-hydroxy- (±)-alpha-Methyl-4- Amiloride 1197 2-phenyl-1,8- Adenosine -46,24 1227 Glutamate -51,07 1257 Na+ Channel -83,51 carboxyphenylglycine hydrochloride naphthyridine

5-Aminovaleric acid Chlorprothixene 1198 GABA -46,28 1228 Dopamine -51,45 1258 Auraptene Cell Signaling -91,73 hydrochloride hydrochloride

Quinacrine 1199 CGP-13501 GABA -46,44 1229 PF 3845 hydrate Cannabinoids -51,64 1259 Neurotransmission -100,05 dihydrochloride

Methylergonovine 1200 R(-)-Me5 Na+ Channel -46,49 1230 Lometrexol hydrate Apoptosis -51,89 1260 Dopamine -103,81 maleate

169

% CSE % CSE A/A Name Class A/A Name Class inhibition inhibition

1,3-Dipropyl-8-p- 1261 Eupatorin Cell Cycle -105,22 1271 Adenosine -266,27 sulfophenylxanthine

1262 Tazarotene Cell Biology -106,25 1272 Bosutinib kinase -274,80

Alfuzosin 1263 TTNPB Transcription -131,02 1273 Adrenoceptor -353,89 hydrochloride

Cell signaling/ 1264 Isoxanthopterin Cell Stress -145,32 1274 PD-180970 -354,05 tyrosine kinase

Topotecan Apoptosis and 1265 -177,25 1275 Harmane Imidazoline -354,13 hydrochloride hydrate Cell Cycle

BIX 01294 8-(p- 1266 trihydrochloride Gene Regulation -189,41 1276 Sulfophenyl)theophyll Adenosine -356,37 hydrate ine

Benzamil CP-100356 1267 Ion Pump -190,67 1277 Cell Signaling -395,11 hydrochloride monohydrochloride

1268 Methysergide maleate Serotonin -194,67 1278 Amlexanox -683,63

1269 Doxazosin mesylate Adrenoceptor -212,25 1279 Triamterene Na+ Channel -928,69

Prazosin 1270 Adrenoceptor -262,87 1280 (S)-(+)-Camptothecin Apoptosis - hydrochloride

170

Σάρωση της βιβλιοθήκης LOPAC έναντι του ενζύµου CBS.

Εικόνα Π.Α.4: Σάρωση του LOPAC plate 01 (100 µΜ ) έναντι του CBS. Εικόνα Π.Α.7: Σάρωση του LOPAC plate 02 (100 µΜ ) έναντι του CBS.

Εικόνα Π.Α.5: Σάρωση του LOPAC plate 03 (100 µΜ ) έναντι του CBS . Εικόνα Π.Α.8: Σάρωση του LOPAC plate 04 (100 µΜ ) έναντι του CBS.

Εικόνα Π.Α.6: Σάρωση του LOPAC plate 05 (100 µΜ ) έναντι του CBS. Εικόνα Π.Α.9: Σάρωση του LOPAC plate 06 (100 µΜ ) έναντι του CBS.

171

Εικόνα Π.Α.10 : Σάρωση του LOPAC plate 07 (100 µΜ ) έναντι του CBS. Εικόνα Π.Α.13: Σάρωση του LOPAC plate 08 (100 µΜ ) έναντι του CBS.

Εικόνα Π.Α.11 : Σάρωση του LOPAC plate 09 (100 µΜ ) έναντι του CBS. Εικόνα Π.Α.14 : Σάρωση του LOPAC plate 10 (100 µΜ ) έναντι του CBS.

Εικόνα Π.Α.12 : Σάρωση του LOPAC plate 11 (100 µΜ ) έναντι του CBS. Εικόνα Π.Α.15 : Σάρωση του LOPAC plate 12 (100 µΜ ) έναντι του CBS.

172

Εικόνα Π.Α.16 : Σάρωση του LOPAC plate 13 (100 µΜ ) έναντι του CBS. Εικόνα Π.Α.18: Σάρωση του LOPAC plate 14 (100 µΜ ) έναντι του CBS.

Εικόνα Π.Α.17: Σάρωση του LOPAC plate 15 (100 µΜ ) έναντι του CBS. Εικόνα Π.Α.19 : Σάρωση του LOPAC plate 16 (100 µΜ ) έναντι του CBS.

173

Σάρωση της βιβλιοθήκης LOPAC έναντι του ενζύµου CSE.

Εικόνα Π.Α.20 : Σάρωση του LOPAC plate 01 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε. Εικόνα Π.Α.23 : Σάρωση του LOPAC plate 02 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε.

Εικόνα Π.Α.21 : Σάρωση του LOPAC plate 03 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε. Εικόνα Π.Α.24 : Σάρωση του LOPAC plate 04 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε.

Εικόνα Π.Α.22 : Σάρωση του LOPAC plate 05 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε. Εικόνα Π.Α.25 : Σάρωση του LOPAC plate 06 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε.

174

Εικόνα Π.Α.26 : Σάρωση του LOPAC plate 07 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε. Εικόνα Π.Α.29 : Σάρωση του LOPAC plate 08 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε.

Εικόνα Π.Α.27 : Σάρωση του LOPAC plate 09 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε. Εικόνα Π.Α.30 : Σάρωση του LOPAC plate 10 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε.

Εικόνα Π.Α.28 : Σάρωση του LOPAC plate 11 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε. Εικόνα Π.Α.31 : Σάρωση του LOPAC plate 12 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε.

175

Εικόνα Π.Α.32 : Σάρωση του LOPAC plate 13 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε. Εικόνα Π.Α.34 : Σάρωση του LOPAC plate 14 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε.

Εικόνα Π.Α.33: Σάρωση του LOPAC plate 15 (100 µΜ ) έναντι του CS Ε. Εικόνα Π.Α.35 : Σάρωση του LOPAC plate 16 (100 µΜ ) έναντι του CSΕ.

176

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

177

178

Βιβλιογραφία

1. Szabo C. 2010. Gaseotransmitters: New frontiers for translational science. Sci. Transl. Med. 2:59ps54 2. Kletzin A, Urich T, Muller F, Bandeiras TM, Gomes CM. 2004. Dissimilatory oxidation and reduction of elemental sulfur in thermophilic archaea. J. Bioenerg. Biomembr. 36:77–91 3. Overmann J, van Gemerden H. 2000. Microbial interactions involving sulfur bacteria: implications for the ecology and evolution of bacterial communities. FEMS Microbiol. Rev. 24:591–99 4. Barton LL, Fauque GD. 2009. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Adv. Appl. Microbiol. 68:41–98 5. Muyzer G, Stams AJ. 2008. The ecology and biotechnology of sulphate-reducing bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 6:441–54 6. Wang R. 2012. Physiological implications of hydrogen sulfide: a whiff exploration that blossomed. Physiol.Rev. 92:791–896 7. Olson KR. 2013. Hydrogen sulfide: both feet on the gas and none on the brake? Front. Physiol. 4:2 8. Gadalla M, Snyder SH. 2010. Hydrogen sulfide as a gasotransmitter. J Neurochem . 113(1):14-26 9. Hughes MN, Centelles MN, Moore KP. 2009. Making and working with hydrogen sulfide: The chemistry and generation of hydrogen sulfide in vitro and its measurement in vivo : a review. Free Radic. Biol. Med . 47(10):1346-53 10 . Caliendo G, Cirino G, Santagada V, Wallace JL. 2010. Synthesis and biological effects of hydrogen sulfide (H 2S): development of H 2S-releasing drugs as pharmaceuticals. J. Med. Chem. 53(17): 6275-6286

11 . Wang R. 2002. Two’s company, three’s a crowd: can H 2S be the third endogenous gaseous transmitter? FASEB J. 16: 1792–1798 12 . Ogasawara Y, Isoda S, Tanabe S. 1994. Tissue and subcellular distribution of bound and acid-labile sulfur, the enzymic capacity for sulfide production in the rat. Biol. Pharm. Bull. 17: 1535–1542 13 . Toohey JI. 1989. Sulphane sulphur in biological systems: a possible regulatory role. Biochem. J. 264: 625–632

179

14 . Ishigami M, Hiraki K, Umemura K, Ogasawara Y, Ishii K, Kimura H. 2009. A source of hydrogen sulfide and a mechanism of its release in the brain. Antioxid. Redox Signal. 11: 205–214 15 . Blachier F, Davila AM, Mimoun S, Benetti PH, Atanasiu C, Andriamihaja M, Benamouzig R, Bouillaud F, Tome D. 2010. Luminal sulfide and large intestine mucosa: friend or foe?, Amino Acids , 39:335–347 16 . Oleskin AV, Shenderov BA. 2016. Neuromodulatory effects and targets of the SCFAs and gasotransmitters produced by the human symbiotic microbiota. Microb. Ecol. Health Dis . 27:30971 17 . Kabil O, Vitvitsky V, Xie P, Banerjee R. 2011. The quantitative significance of the transsulfuration enzymes for H 2S production in murine tissues. Antioxid Redox Signal 15: 363–372. 18 . Steegborn C, Clausen T, Sondermann P, Jacob U, Worbs M, Marinkovic S, Huber R, Wahl MC. 1999. Κinetics and inhibition of recombinant human cystathionine gamma-lyase. Toward the rational control of transsulfuration. J. Biol. Chem. 274(18): 12675-12684 19 . Shibuya N, Mikami Y, Kimura Y, Nagahara N, Kimura H. 2009. Vascular endothelium expresses 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase and produces hydrogen sulfide. J. Biochem. 146: 623–626 20 . Porter PN, Grishaver MS, Jones OW. 1974. Characterization of human cystathionine beta synthase. Evidence for the identity of human L-serine dehydratase and cystathionine beta-synthase. Biochim. Biophys. Acta 364: 128–139 21 . Kabil O, Banerjee R. 2010. The redox biochemistry of hydrogen sulfide. J. Biol. Chem. 285: 21903–21907 22 . Kamoun P. 2004. Endogenous production of hydrogen sulfide in mammals. Amino Acids. 26: 243–254

23 . Chen X, Jhee KH, Kruger WD. 2004. Production of the neuromodulator H 2S by cystathionine beta-synthase via the condensation of cysteine and homocysteine. J. Biol. Chem. 279:52082–52086 24 . Kuo SM, Lea TC, Stipanuk MH. 1983. Developmental pattern, tissue distribution, and subcellular distribution of cysteine: Alpha-ketoglutarate aminotransferase and 3- mercaptopyruvate sulfurtransferase activities in the rat. Biol. Neonate. 43: 23–32

180

25 . Shibuya N, Tanaka M, Yoshida M, Ogasawara Y, Togawa T, Ishii K, Kimura H. 2009. 3-Mercaptopyruvate sulfurtransferase produces hydrogen sulfide and bound sulfane sulfur in the brain. Antioxid. Redox Signal. 11: 703-714 26 . Olson KR, Deleon ER, Gao Y, Hurley K, Sadauskas V, Batz C, Stoy GF. 2013. Thiosulfate: a readily accessible source of hydrogen sulfide in oxygen sensing. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 305: R592–R603 27 . Szabo C. 2007. Hydrogen sulfide and its therapeutic potential. Nat. Rev. Drug Discov . 6: 917–935 28 . Kimura H. 2011. Hydrogen sulfide: its production, release and functions. Amino Acids 41: 113–121 29 . Kery V, Poneleit L, Kraus JP. 1998. Trypsin cleavage of human cystathionine β- synthase into an evolutionarily conserved active core: structural and functional consequences. Arch. Biochem. Biophys. 355: 222-232 30 . Miles EW, Kraus JP. 2004. Cystathionine beta-synthase: Structure, function, regulation, and location of homocystinuria-causing mutations. J. Biol. Chem. 279 (29): 29871–29874 31 . Jhee KH, Kruger WD. 2005. The role of cystathionine beta-synthase in homocysteine metabolism. Antioxid. Redox Signal. 7(5-6): 813-822 32 . Singh S, Madzelan P, Banerjee R. 2007. Properties of an unusual heme cofactor in PLP dependent cystathionine beta-synthase. Nat. Prod. Rep. 24 (3): 631–639 33 . Janosik M, Kery V, Gaustadnes M, MacLean KN, Kraus, JP. 2001. Regulation of human cystathionine β-synthase by S-adenosyl-L-methionine: evidence for two catalytically active conformations involving an autoinhibitory domain in the C- terminal region. Biochemistry. 40: 10625-10633 34 . Taoka S, Lepore BW, Kabil O, Ojha S, Ringe D, Banerjee R. 2002. Human cystathionine beta-synthase is a heme sensor protein. Evidence that the redox sensor is heme and not the vicinal cysteines in the CXXC motif seen in the crystal structure of the truncated enzyme. Biochemistry. 41 (33): 10454–10461 35 . Weeks CL, Singh S, Madzelan P, Banerjee R, Spiro TG. 2009. Heme regulation of human cystathionine beta-synthase activity: Insights from fluorescence and Raman spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 131 (35): 12809–12816

181

36 . Oliveriusova J, Kery V, Maclean KN, Kraus JP. 2002. Deletion mutagenesis of human cystathionine beta-synthase. Impact on activity, oligomeric status, and S- adenosylmethionine regulation. J. Biol. Chem . 277: 48386–48394 37 . Meier M, Janosik M, Kery V, Kraus JP, Burkhard P. 2001. Structure of human cystathionine beta-synthase: A unique pyridoxal 5 ′-phosphate-dependent heme protein. EMBO J. 20 (15): 3910–3916 38 . Evande R, Ojha S, Banerjee R. 2004. Visualization of PLP-bound intermediates in hemeless variants of human cystathionine β-synthase. Evidence that lysine 119 is a general base. Arch. Biochem. Biophys. 427: 188–196 39 . Yadav PK, Xie P, Banerjee R. 2012. Allosteric communication between the pyridoxal 5 ′-phosphate (PLP) and heme sites in the H 2S generator human cystathionine beta-synthase. J. Biol. Chem . 287: 37611–37620 40 . Ignoul S, Eggermont J. 2005. CBS domains: Structure, function, and pathology in human proteins. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 289 (6): C1369–C1378 41 . Majtan T, Kraus JP. 2012. Folding and activity of mutant cystathionine β-synthase depends on the position and nature of the purification tag: Characterization of the R266K CBS mutant. Protein. Expr. Purif. 82 (2): 317–324 42 . Bateman A. 1997. The structure of a domain common to archaebacteria and the homocystinuria disease protein. Trends Biochem. Sci. 22(1): 12–13 43 . Ereño-Orbea J, Oyenarte I, Martínez-Cruz LA. 2013. CBS domains: Ligand binding sites and conformational variability. Arch. Biochem. Biophys. 540 (1-2): 70– 81 44 . J. Ereno-Orbea, T. Majtan, I. Oyenarte, J.P. Kraus, L.A. Martinez-Cruz. 2014. Structural insight into the molecular mechanism of allosteric activation of human cystathionine beta-synthase by S-adenosylmethionine. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A . 111: E3845–E3852 45 . Kabil O, Zhou Y, Banerjee R. 2006. Human cystathionine beta synthase is a target for sumoylation. Biochemistry. 45: 13528-13536 46 . Agrawal N, Banerjee R. 2008. Human polycomb 2 protein is a SUMO E3 ligase and alleviates substrate-induced inhibition of cystathionine beta-synthase sumoylation. PLoS One . 3(12): e4032

182

47 . Niu WN, Yadav PK, Adamec J, Banerjee R. 2015. S-glutathionylation enhances human cystathionine b-synthase activity under oxidative stress conditions. Antioxid. Redox. Signal. ;22-5 48 . d'Emmanuele di Villa Bianca R, Mitidieri E, Esposito D, Donnarumma E, Donnarumm E, Russo A, Fusco F, Ianaro A, Mirone V, Cirino G, Russo G, Sorrentino. 2015. Human Cystathionine-β-Synthase Phosphorylation on Serine227 Modulates Hydrogen Sulfide Production in Human Urothelium. PLoS One . ;10(10): e0141027 49 . Vitvitsky V, Prudova A, Stabler S, Dayal S, Lentz SR, Banerjee R. 2007. Testosterone regulation of renal cystathionine beta-synthase: implications for sex- dependent differences in plasma homocysteine levels. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 293: F594–600 50 . Ratnam S, Maclean KN, Jacobs RL, Brosnan ME, Kraus JP, Brosnan JT. 2002. Hormonal regulation of cystathionine β-synthase expression in liver. J. Biol. Chem. 277: 42912–18 51 . Enokido Y, Suzuki E, Iwasawa K, Namekata K, OkazawaH, KimuraH. 2005. Cystathionine β-synthase, a key enzyme for homocysteinemetabolism, is preferentially expressed in the radial glia/astrocyte lineage of developing mouse CNS. FASEB J. 19: 1854–56 52 . Teng H, Wu B, Zhao K, Yang G, Wu L, Wang R. 2013. Oxygen-sensitive mitochondrial accumulation of cystathionine b-synthase mediated by Lon protease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A . 110: 12679–12684 53 . Szabo C, Coletta C, Chao C, Modis K, Szczesny B, Papapetropoulos A, Hellmich MR. 2013. Tumor-derived hydrogen sulfide, produced by cystathionine-beta synthase, stimulates bioenergetics, cell proliferation, and angiogenesis in colon cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A . 110: 12474–12479

54 . Paul BD, Snyder SH. 2012. H2S signalling through protein sulfhydration and beyond. Nat. Rev. Mol. Cell Biol . 13: 499–507 55 . Kaneko Y, Kimura Y, Kimura H, Niki I. 2006. L-cysteine inhibits insulin release from the pancreatic beta-cell: possible involvement of metabolic production of hydrogen sulfide, a novel gasotransmitter. Diabetes ;55(5): 1391-7

183

56 . Patel P, Vatish M, Heptinstall J, Wang R, Carson RJ. 2009. The endogenous production of hydrogen sulphide in intrauterine tissues. Reprod. Biol. Endocrinol . ;7:10 57 . Guo H, Gai JW, Wang Y, Jin HF, Du JB, Jin J. 2012. Characterization of hydrogen sulfide and its synthases, cystathionine β-synthase and cystathionine γ-lyase, in human prostatic tissue and cells. Urology. 79(2): 483.e1-5 58 . Bhattacharyya S, Saha S, Giri K, Lanza IR, Nair KS, Jennings NB, Rodriguez- Aguayo C, Lopez-Berestein G, Basal E, Weaver AL, Visscher DW, Cliby W, Sood AK, Bhattacharya R, Mukherjee P. 2013. Cystathionine beta-synthase (CBS) contributes to advanced ovarian cancer progression and drug resistance. PLoS One. 8(11): e79167 59 . Sen S, Kawahara B, Gupta D, Tsai R, Khachatryan M, Roy-Chowdhuri S, Bose S, Yoon A, Faull K, Farias-Eisner R, Chaudhuri G. 2015. Role of cystathionine β-synthase in human breast cancer. Free Radic. Biol. Med. 86, 228–238 60 . Kruger WD, Evans AA, Wang L, Malinow MR, Duell PB, Anderson PH, Block PC, Hess DL, Graf EE, Upson B. 2000. Polymorphisms in the CBS gene associated with decreased risk of coronary artery disease and increased responsiveness to total homocysteine lowering by folic acid. Mol. Genet. Metab . 70: 53–60 61 . Chatagner F. 1969. Biosynthesis of cystathionine from homoserine and cysteine by rat liver cystathionase. FEBS Lett . 4: 231–233 62 . Levonen AL, Lapatto R, Saksela M, Raivio KO. 2000. Human cystathionine γ- lyase: developmental and in vitro expression of two isoforms. Biochem. J . 347: 291– 295. 63 . Caliendo G, Cirino G, Santagada V, Wallace JL. 2010. Synthesis and biological effects of hydrogen sulfide (H 2S): development of H 2S-releasing drugs as pharmaceuticals. J. Med. Chem . 53(17): 6275-6286 64 . Aitken SM, Kirsch JF. 2005. The enzymology of cystathionine biosynthesis: strategies for the control of substrate and reaction specificity. Arch. Biochem. Biophys. 433: 166-175 65 . Zhao K, Li H, Li S, Yang G. 2014. Regulation of cystathionine gamma-lyase/H ₂S system and its pathological implication. Front. Biosci . (Landmark Ed.);19: 1355-69 66 . Singh S, Padovani D, Leslie RA, Chiku T, and Banerjee R. 2009. Relative contributions of cystathionine beta-synthase and gamma-cystathionase to H 2S

184

biogenesis via alternative trans-sulfuration reactions. J. Biol. Chem . 284: 22457– 22466

67 . Fu M, Zhang W, Wu L, Yang G, Li H, Wang R. 2012. Hydrogen sulfide (H 2S) metabolism in mitochondria and its regulatory role in energy production. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A . 109: 2943–2948 68 . Li L, Moore PK. 2007. An overview of the biological significance of endogenous gases: new roles for old molecules. Biochemical Society Transactions .;35(5): 1138– 1141 69 . Olas B. 2015. Hydrogen sulfide in signaling pathways. Clinica Chimica Acta ; 439:212–218 70 . Panza E, De Cicco P, Armogida C, Scognamiglio G, Gigantino V, Botti G, Germano D, Napolitano M, Papapetropoulos A, Bucci M, Cirino G, Ianaro A. 2015. Role of the cystathionine γ lyase/ hydrogen sulfide pathway in human melanoma progression. Pigment Cell Melanoma Res. 28(1): 61-72 71 . Fan K, Li N, Qi J, Yin P, Zhao C, Wang L, Li Z, Zha X. 2014. Wnt/ β-catenin signaling induces the transcription of cystathionine-γ-lyase, a stimulator of tumor in colon cancer. Cell Signal. 26(12): 2801-8 72 . Szczesny B, Brunyanszki A, Hellmich MR, Szabo C. 2015. Hydrogen sulfide in lung adenocarcinoma: a tumor cell survival factor, an enhancer of mitochondrial DNA repair and a cellular bioenergetic stimulator. Nitric Oxide PP81 47:S46 73 . Jurkowska H, Placha W, Nagahara N, Wróbel M. 2011. The expression and activity of cystathionine-γ-lyase and 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase in human neoplastic cell lines. Amino Acids. 41: 151–158 74 . Ishii I, Akahoshi N, Yu XN, Kobayashi Y, Namekata K, Komaki G, Kimura H. 2004. Murine cystathionine-lyase: complete cDNA and genomic sequences, promoter activity, tissue distribution and developmental expression. Biochem. J. 381: 113–123 75 . Yang G, Pei Y, Teng H, Cao Q, Wang R. 2011. Specificity protein-1 as a critical regulator of human cystathionine gamma-lyase expression in smooth muscle cells. J. Biol. Chem . 286: 26450–26460 76 . Dickhout JG, Carlisle RE, Jerome DE, Mohammed-Ali Z, Jiang H, Yang G, Mani S, Garg SK, Banerjee R, Kaufman RJ, Maclean KN, Wang R, Austin RC. 2012. Integrated stress response modulates cellular redox state via induction of

185

cystathionine gamma-lyase: cross-talk between integrated stress response and thiol metabolism. J. Biol. Chem . 287: 7603–7614 77 . Kaneko Y, Kimura Y, Kimura H, Niki I. 2006. L-cysteine inhibits insulin release from the pancreatic beta-cell: possible involvement of metabolic production of hydrogen sulfide, a novel gasotransmitter. Diabetes 55: 1391–1397 78 . Yusuf M, Kwong Huat BT, Hsu A, Whiteman M, Bhatia M, Moore PK. 2005. Streptozotocin-induced diabetes in the rat is associated with enhanced tissue hydrogen sulfide biosynthesis. Biochem. Biophys. Res. Commun . 333: 1146–1152 79 . Yuan G, Vasavda C, Peng YJ, Makarenko VV, Raghuraman G, Nanduri J, Gadalla MM, Semenza GL, Kumar GK, Snyder SH, Prabhakar ΝR. 2015. Protein

Kinase G-Regulated Production of H 2S Governs Oxygen Sensing. Sci. Signaling , 8(373):ra37 80 . Coletta C, Papapetropoulos A, Erdelyi K, Olah G, Modis K, Panopoulos P, Asimakopoulou A, Gero D, Sharina I, Martin E, Szabo C. 2012. Hydrogen sulfide and nitric oxide are mutually dependent in the regulation of angiogenesis and endothelium-dependent vasorelaxation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA . 109(23): 9161- 9166 81 . Yang G, Wu L, Jiang B, Yang W, Qi J, Cao K, Meng Q, Mustafa AK, Mu W,

Zhang S, Snyder SH, Wang R. 2008. H2S as a physiologic vasorelaxant: hypertension in mice with deletion of cystathionine gamma-lyase. Science . 322: 587–590

82 . Zhao W, Zhang J, Lu Y, Wang R. 2001. The vasorelaxant effect of H 2S as a novel endogenous gaseous KATP channel opener. EMBO J . 20(21): 6008-6016 83 . Bucci M, Mirone V, Di Lorenzo A, Vellecco V, Roviezzo F, Brancaleone V, Ciro I, Cirino G. 2009. Hydrogen sulfide is involved in testosterone vascular effect. Eur. Urol . 5: 378–384 84 . Renga B. 2011. Hydrogen sulfide generation in mammals: the molecular biology of cystathionine-β-synthase (CBS) and cystathionine-γ-lyase (CSE) . Inflamm. Allergy Drug Targets . 10: 85–91 85 . Whiteman M, Le Trionnaire S, Chopra M, Fox B, Whatmore J. 2011. Emerging role of hydrogen sulfide in health and disease: critical appraisal of biomarkers and pharmacological tools. Clin. Sci . (Lond.) 121(11): 459-488 86 . Spallarossa A, Forlani F, Carpen A, Armirotti A, Pagani S, Bolognesi M, Bordo D. 2004. The “rhodanese” fold and catalytic mechanism of 3-mercaptopyruvate

186

sulfurtransferases. Crystal structure of SseA from Escherichia coli . J. Mol. Biol. 335, 583–593 87 . Yadav PK , Yamada K , Chiku T , Koutmos M , Banerjee R. 2013 . Structure and kinetic analysis of H 2S production by human mercaptopyruvate sulfurtransferase . J. Biol. Chem. 288 : 20002 –20013 88 . Nagahara N, Nishino T. 1996. Role of amino acid residues in the active site of rat liver mercaptopyruvate sulfurtransferase. J. Biol. Chem. 271, 27395–27401 89 . Mikami Y, Shibuya N, Kimura Y, Nagahara N, Ogasawara Y, Kimura H. 2011. Thioredoxin and dihydrolipoic acid are required for 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase to produce hydrogen sulfide. Biochem. J.; 439:479–85 90 . Jarabak R, Westley J. 1978. Steady-state kinetics of 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase from bovine kidney. Arch. Biochem. Biophys. 185, 458–465 91 . Nagahara N, Ito T, Kitamura H, Nishino T. 1998. Tissue and subcellular distribution of mercaptopyruvate sulfurtransferase in the rat. Confocal laser fluorescence and immunoelectron microscopic studies combined with biochemical analysis. Histochem. Cell Biol. 110, 243–250 92 . Shibuya N, Mikami Y, Kimura Y, Nagahara N, Kimura H. 2009. Vascular endothelium expresses 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase and produces hydrogen sulfide. J. Biochem. 146: 623–626 93 . Kuo MM, Kim DH, Jandu S, Bergman Y, Tan S, Wang H, Pandey DR, Abraham TP, Shoukas AA, Berkowitz DE, Santhanam L. 2016. MPST but not CSE is the primary regulator of hydrogen sulfide production and function in the coronary artery. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol . 310(1): H71-9 94 . Jurkowska H, Placha W, Nagahara N, Wróbel M. 2011. The expression and activity of cystathionine-γ-lyase and 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase in human neoplastic cell lines. Amino Acids. 41, 151–158 95 . Nagahara N, Katayama A. 2005. Post-translational regulation of mercaptopyruvate sulfurtransferase via a low redox potential cysteine-sulfenate in the maintenance of redox homeostasis. J. Biol. Chem . 280: 34569–34576 96 . Módis K, Asimakopoulou A, Coletta C, Papapetropoulos A, Szabo C. 2013. Oxidative stress suppresses the cellular bioenergetic effect of the 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase/ hydrogen sulfide pathway. Biochem. Biophys. Res. Commun . 433(4): 401–407

187

97 . Nagahara N, Nagano M, Ito T, Shimamura K, Akimoto T, Suzuki H. 2013. Antioxidant enzyme, 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase-knockout mice exhibit increased anxiety-like behaviors: a model for human mercaptolactate-cysteine disulfiduria. Sci. Rep . 3: 1986 98 . Whiteman M, Armstrong JS, Chu SH, Siau JL, Wong BS, Cheung NS, Halliwell B, Moore PK. 2004. The novel neuromodulator hydrogen sulfide: an endogenous peroxynitrite “scavenger”? J. Neurochem . 90: 765–768 99 . Whiteman M, Cheung NS, Zhu YZ, Chu SH, Siau JL, Wong BS, Armstrong JS, Moore PK. 2005. Hydrogen sulphide: a novel inhibitor of hypochlorous acidmediated oxidative damage in the brain? Biochem. Biophys. Res. Commun . 326: 794–798 100 . Chang L, Geng B, Yu F, Zhao J, Jiang H, Du J, Tang C. 2008. Hydrogen sulfide inhibits myocardial injury induced by homocysteine in rats. Amino Acids . 34: 573– 585

101 . Geng B, Yang J, Qi Y, Zhao J, Pang Y, Du J, Tang C. 2004. H2S generated by heart in rat and its effects on cardiac function. Biochem. Biophys. Res. Commun . 313:362–368 102 . Ali MY, Ping CY, Mok YYP, Ling L, Whiteman M, Bhatia M, Moore PK. 2006. Regulation of vascular nitric oxide in vitro and in vivo : a new role for endogenous hydrogen sulphide? Br. J. Pharmacol . 149: 625–634 103 . Whiteman M, Li L, Kostetski I, Chu SH, Siau JL, Bhatia M, Moore PK. 2006. Evidence for the formation of a novel nitrosothiol from the gaseous mediators nitric oxide and hydrogen sulphide. Biochem. Biophys. Res. Commun . 343: 303– 310 104 . Park CM, Nagel RL. 1984. Sulfhemoglobinemia. Clinical and molecular aspects. N. Engl. J. Med . 310(24):1579-84 105 . Smith R.P, Abbanat, RA. 1966. Protective effect of oxidized glutathione on acute sulfide poisoning. Toxicol. Appl. Pharmacol. 9, 209–217 106 . Furne J, Springfield J, Koenig T, DeMaster E, Levitt MD. 2001. Oxidation of hydrogen sulfide and methanethiol to thiosulfate by rat tissues: a specialized function of the colonic mucosa. Biochem. Pharmacol . 62: 255–259 107 . Jackson MR, Melideo SL, Jorns MS. 2012. Human sulfide: quinone oxidoreductase catalyzes the first step in hydrogen sulfide metabolism and produces a sulfane sulfur metabolite. Biochemistry . 51: 6804–6815

188

108 . Goubern M, Andriamihaja M, Nubel T, Blachier F, Bouillaud F. 2007. Sulfide, the first inorganic substrate for human cells. FASEB J . 21:1699–1706 109 . Libiad M, Yadav PK, Vitvitsky V, Martinov M, Banerjee R. 2014. Organization of the human mitochondrial hydrogen sulfide oxidation pathway. J. Biol. Chem. 289: 30901–30910 110 . Greiner R, Palinkas Z, Basell K, Becher D, Antelmann H, Nagy P, Dick TP.

2013. Polysulfides link H 2S to protein thiol oxidation. Antioxid. Redox Signal. 19:1749–65 111 . Mustafa AK, Gadalla MM, Sen N, Kim S, Mu W, Gazi SK, Barrow RK, Yang

G, Wang R, Solomon H. 2009. H2S signals through protein S-sulfhydration. Sci. Signal. 2: ra72 112 . Yang G, Zhao K, Ju Y, Mani S, Cao Q, Puukila S, Khaper N, Wu L, Wang R. 2013. Hydrogen sulfide protects against cellular senescence via S-sulfhydration of Keap1 and activation of Nrf2. Antioxid. Redox Signal . 18: 1906–1919 113 . Sen N, Paul BD, Gadalla MM, Mustafa AK, Sen T, Xu R, Kim S, Snyder SH. 2012. Hydrogen sulfide-linked sulfhydration of NF-κB mediates its antiapoptotic actions. Mol. Cell. 45:13–24 114 . MustafaAK, Sikka G, Gazi SK, Steppan J, Jung SM, Bhunia AK, Barodka VM, Gazi FK, Barrow RK, Wang R, Amzel LM, Berkowitz DE, Snyder SH. 2011. Hydrogen sulfide as endothelium-derived hyperpolarizing factor sulfhydrates potassium channels. Circ. Res. 109:1259–68

115 . Krishnan N, Fu C, Pappin DJ, TonksNK. 2011. H2S-induced sulfhydration of the phosphatase PTP1B and its role in the endoplasmic reticulum stress response. Sci. Signal. 4:ra86 116 . Filipovic MR, Miljkovic J, Nauser T, Royzen M, Klos K, Shubina T, Koppenol WH, Lippard SJ, Ivanovi ć-Burmazovi ć I. 2012. Chemical characterization of the smallest S-nitrosothiol, HSNO; cellular cross-talk of H 2S and S-nitrosothiols. J. Am. Chem. Soc. 134:12016–27 117 . Pietri R, Lewis A, Leon RG, Casabona G, Kiger L, et al. 2009. Factors controlling the reactivity of hydrogen sulfide with hemeproteins. Biochemistry 48:4881–94

189

118 . Hill BC,Woon TC, Nicholls P, Peterson J, Greenwood C, Thomson AJ. 1984. Interactions of sulphide and other ligands with cytochrome c oxidase. An electron- paramagnetic-resonance study. Biochem. J. 224:591–600

119 . Blackstone E, Morrison M, Roth MB. 2005. H 2S induces a suspended animation- like state in mice. Science 308:518 120 . Modis K, Coletta C, Erdelyi K, Papapetropoulos A, Szabo C. 2013. Intramitochondrial hydrogen sulfide production by 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase maintains mitochondrial electron flow and supports cellular bioenergetics. FASEB J .;27(2):601-11 121 . Szabo C, Ransy C, Modis K, Andriamihaja M, Murghes B, Coletta C, Olah G, Yanagi K, Bouillaud F. 2014. Regulation of mitochondrial bioenergetic function by hydrogen sulfide. Part I. Biochemical and physiological mechanisms. Br. J. Pharmacol . 171 2099–2122 122 . Abe K, Kimura H. 1996. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulator. J. Neurosci . 16(3): 1066-1071 123 . Kimura H. 2013. Physiological role of hydrogen sulfide and polysulfide in the central nervous system. Neurochemistry International . 63(5):492-7 124 . Zhang X, Bian JS. 2014. Hydrogen sulfide: a neuromodulator and neuroprotectant in the central nervous system. ACS Chemical Neuroscience , 5(10):876-83. 125 . Whiteman M, Cheung NS, Zhu YZ, Chu SH, Siau JL, Wong BS, Armstrong JS, Moore PK. 2005. Hydrogen sulphide: a novel inhibitor of hypochlorous acid- mediated oxidative damage in the brain? Biochem. Biophys. Res. Commun. ;326(4):794-8 126 . Whiteman M, Armstrong JS, Chu SH, Jia-Ling S, Wong BS, Cheung NS, Halliwell B, Moore PK. 2004. The novel neuromodulator hydrogen sulfide: an endogenous peroxynitrite ‘scavenger’? J. Neurochem. ;90(3):765-8 127 . Wang JF, Li Y,. Song JN, Pang HG. 2014. Role of hydrogen sulfide in secondary neuronal injury. Neurochem. Int. ;64:37-47 128 . Yong QC, Choo CH, Tan BH, Low CM, Bian JS. 2010. Effect of hydrogen sulfide on intracellular calcium homeostasis in neuronal cells. Neurochem. Int. 56:508–15

190

129 . Nagai Y, Tsugane M, Oka J, Kimura H. 2004. Hydrogen sulfide induces calcium waves in astrocytes. FASEB J. 18:557–59 130 . Lee SW, Hu YS,Hu LF, Lu Q, Dawe GS, Moore PK, Wong PT, Bian JS. 2006. Hydrogen sulphide regulates calcium homeostasis in microglial cells. Glia. 54:116–24 131 . Kimura H. 2014. Production and physiological effects of hydrogen sulfide. Antioxid. Redox Signal. 20(5): 783-93 132 . Garcia-Bereguiain MA, Samhan-Arias AK, Martin-Romero FJ, Gutierrez- Merino C. 2008. Hydrogen sulfide raises cytosolic calcium in neurons through activation of L-type Ca2+ channels. Antioxid. Redox Signal. 10:31–42 133 . Kimura H. 2010. Hydrogen sulfide: from brain to gut. Antioxid. Redox Signal. 12:1111–23 134 . Han Y, Qin J, Chang X, Yang Z, Bu D, Du J. 2005. Modulating effect of hydrogen sulfide on gamma-aminobutyric acid B receptor in recurrent febrile seizures in rats. Neurosci. Res. ;53(2): 216-9 135 . Warenycia MW, Smith KA, Blashko CS, Kombian SB, Reiffenstein RJ. 1989. Monoamine oxidase inhibition as a sequel of hydrogen sulfide intoxication: increases in brain catecholamine and 5- hydroxytryptamine levels. Arch. Toxicol. 63:131–36 136 . Kulkarni KH, Monjok EM, Zeyssig R, Kouamou G, Bongmba ON, Opere CA, Njie YF, Ohia SE. 2009. Effect of hydrogen sulfide on sympathetic neurotransmission and catecholamine levels in isolated porcine iris-ciliary body. Neurochem. Res. 34:400–6 137 . Skrajny B, Hannah RS, Roth SH. 1992. Low concentrations of hydrogen sulphide alter monoamine levels in the developing rat central nervous system. Can. J. Physiol. Pharmacol. 70:1515–18 138 . Kimura Y, Goto Y, Kimura H. 2010. Hydrogen sulfide increases glutathione production and suppresses oxidative stress in mitochondria. Antioxid. Redox Signal. 12:1–13 139 . Kimura Y, Kimura H. 2004. Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stress. FASEB J. 18:1165– 67 140 . Hu LF, Wong PT, Moore PK, Bian JS. 2007. Hydrogen sulfide attenuates lipopolysaccharide-induced inflammation by inhibition of p38 mitogen activated protein kinase in microglia. J. Neurochem . 100(4):1121-8

191

141 . Morrison LD, Smith DD, Kish SJ. 1996. Brain S-adenosylmethionine levels are severely decreased in Alzheimer’s disease. J. Neurochem . 67: 1328–1331 142 . Clarke R, Smith AD, Jobst KA, Refsum H, Sutton L, Ueland PM. 1998. Folate, vitamin B12, and serum total homocysteine levels in confirmed Alzheimer disease. Arch. Neurol . 55: 1449–1455 143 . Tang XQ, Shen XT, Huang YE, Ren YK, Chen RQ, Hu B, He JQ, Yin WL, Xu JH, Jiang ZS. 2010. Hydrogen sulfide antagonizes homocysteine-induced neurotoxicity in PC12 cells. Neurosci. Res. ;68(3):241-9 144 . Eto K, Asada T, Arima K, Makifuchi T, Kimura H. 2002. Brain hydrogen sulfide is severely decreased in Alzheimer’s disease. Biochem. Biophys. Res. Commun . 293: 1485–1488 145 . Hosoki R, Matsuki N, Kimura H. 1997. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous smooth muscle relaxant in synergy with nitric oxide. Biochem. Biophys. Res. Commun . 237(3): 527-531 146 . Cheng Y, Ndisang JF, Tang G, Cao K, Wang R. 2004. Hydrogen sulfide induced relaxation of resistance mesenteric artery beds of rats. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol . 287: H2316–H2323 147 . Koenitzer JR, Isbell TS, Patel HD, Benavides GA, Dickinson DA, Patel RP, Darley-Usmar VM, Lancaster JR Jr, Doeller JE, Kraus DW. 2007. Hydrogen sulfide mediates vasoactivity in an O2-dependent manner. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol . ;292:H1953–H1960 148 . Wang Y, Zhao X, Jin H, Wei H, Li W, Bu D, Tang X, Ren Y, Tang C, Du J. 2009. Role of hydrogen sulfide in the development of atherosclerotic lesions in apolipoprotein E knockout mice. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. ; 29:173–179 149 . Zanardo RC, Brancaleone V, Distrutti E, Fiorucci S, Cirino G, Wallace JL. 2006. Hydrogen sulfide is an endogenous modulator of leukocyte-mediated inflammation. FASEB J.; 20: 2118–2120 150 . Szabó C, Papapetropoulos A. 2011. Hydrogen sulphide and angiogenesis: mechanisms and applications. Br. J. Pharmacol . ;164:853–865 151 . Papapetropoulos A, Pyriochou A, Altaany Z, Yang G, Marazioti A, Zhou Z, Jeschke MG, Branski LK, Herndon DN, Wang R, Szabo C. 2009. Hydrogen sulfide is an endogenous stimulator of angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A . 106 21972– 21977

192

152 . Saha S, Chakraborty PK, Xiong X, Dwivedi SKD, Mustafi SB, Leigh NR, Ramchandran R, Mukherjee P, Bhattacharya R. 2016. Cystathionine beta synthase regulates endothelial function via protein S-sulfhydration. FASEB J . ;30 441–456 153 . Coletta C, Módis K, Szczesny B, Brunyánszki A, Oláh G, Rios ECS, Yanagi K, Ahmad A, Papapetropoulos A, Szabo C. 2015. Regulation of vascular tone, angiogenesis and cellular bioenergetics by the 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase/H 2S pathway: functional impairment by hyperglycemia and restoration by dl- Lipoic acid. Mol. Med . 21 1–14 154 . Altaany Z, Ju Y, Yang G, Wang R. 2014. The coordination of S-sulfhydration, S-nitrosylation and phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase by hydrogen sulfide. Sci. Signal . 7 ra87 155 . Zhou Z, Martin E, Sharina I, Esposito I, Szabo C, Bucci M, Cirino G, Papapetropoulos A. 2016. Regulation of soluble guanylyl cyclase redox state by hydrogen sulfide. Pharmacol. Res . 111 556–562

156 . Johansen D, Ytrehus K, Baxter GF. 2006. Exogenous hydrogen sulfide (H 2S) protects against regional myocardial ischemia-reperfusion injury: Evidence for a role of KATP channels. Basic Res. Cardiol. 101: 53–60 157 . Elrod JW, Calvert JW, Morrison J, Doeller JE, Kraus DW, Tao L, Jiao X, Scalia R, Kiss L, Szabo C, Kimura H, Chow CW, Lefer DJ. 2007. Hydrogen sulfide attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury by preservation of mitochondrial function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 104: 15560–15565 158 . Bibli SI, Andreadou I, Chatzianastasiou A, Tzimas C, Sanoudou D, Kranias E, Brouckaert P, Coletta C, Szabo C, Kremastinos DT, Iliodromitis EK, Papapetropoulos

A. 2015. Cardioprotection by H 2S engages a cGMP-dependent protein kinase G/phospholamban pathway. Cardiovasc. Res .;106(3):432-42 159 . Geng B, Chang L, Pan C, Qi Y, Zhao J, Pang Y, Du J, Tang C. 2004. Endogenous hydrogen sulfide regulation of myocardial injury induced by isoproterenol. Biochem. Biophys. Res. Commun.; 318: 756–763 160 . Maron BA, Michel T. Subcellular localization of oxidants and redox modulation of endothelial nitric oxide synthase. Circ J 2012; 76: 2497 – 2512. 161 . Shimizu Y, Nicholson CK, Lambert JP, Barr LA, Kuek N, Herszenhaut D, Tan L, Murohara T, Hansen JM, Husain A, Naqvi N, Calvert JW. 2016. Sodium Sulfide

193

Attenuates Ischemic-Induced Heart Failure by Enhancing Proteasomal Function in an Nrf2-Dependent Manner. Circ. Heart Fail .;9(4): e002368 162 . Szabo C. 2015. Gasotransmitters in cancer: from pathophysiology to experimental therapy. Nat. Rev. Drug Discov . 15(3):185-203 163 . Zhao L, Wang Y, Yan Q, Lv W, Zhang Y, He S. 2015. Exogenous hydrogen sulfide exhibits anti-cancer effects though p38 MAPK signaling pathway in C6 glioma cells. Biol. Chem . ;396(11):1247-53 164 . Xie L, Gu Y, Wen M, Zhao S, Wang W, Ma Y, Meng G, Han Y, Wang Y, Liu G, Moore PK, Wang X, Wang H, Zhang Z, Yu Y, Ferro A, Huang Z, Ji Y. 2016. Hydrogen Sulfide Induces Keap1 S-sulfhydration and Suppresses Diabetes- Accelerated Atherosclerosis via Nrf2 Activation. Diabetes . ;65(10):3171-84 165 . Guo H, Gai JW, Wang Y, Jin HF, Du JB, Jin J. 2012. Characterization of hydrogen sulfide and its synthases, cystathionine β-synthase and cystathionine γ- lyase, in human prostatic tissue and cells. Urology 79: 483 166 . Chao C, Bohannon FJ, Mrazek A, Coletta C, Szabo C, Hellmich MR. 2014. Cysthionine-b-synthetase inhibition in combination with standard-chemotherapy decreases colorectal cancer metastasis to the liver. Nitric Oxide 39: S21 167 . Takano N, Sarfraz Y, Gilkes DM, Chaturvedi P, Xiang L, Suematsu M, Zagzag D, Semenza GL. 2014 Decreased expression of cystathionine β-synthase promotes glioma tumorigenesis. Mol. Cancer Res .;12(10):1398-406 168 . Hellmich MR, Coletta C, Chao C, Szabo C. 2015. The therapeutic potential of cystathionine β-synthetase/ hydrogen sulfide inhibition in cancer. Antioxid. Redox Signal . ;22(5):424-48 169 . Panza E, De Cicco P, Armogida C, Scognamiglio G, Gigantino V, Botti G, Germano D, Napolitano M, Papapetropoulos A, Bucci M, Cirino G, Ianaro A. 2015. Role of the cystathionine γ lyase/ hydrogen sulfide pathway in human melanoma progression. Pigment Cell Melanoma Res . ;28(1):61-72 170 . De Vos J, Thykjaer T, Tarte K, Ensslen M, Raynaud P, Requirand G, Pellet F, Pantesco V, Rème T, Jourdan M, Rossi JF, Ørntoft T, Klein B. 2002. Comparison of gene expression profiling between malignant and normal plasma cells with oligonucleotide arrays. Oncogene ;21(44):6848-57 171 . Hansel DE, Rahman A, Hidalgo M, Thuluvath PJ, Lillemoe KD, Shulick R, Ku JL, Park JG, Miyazaki K, Ashfaq R, Wistuba II, Varma R, Hawthorne L, Geradts J,

194

Argani P, and Maitra A. 2003. Identification of novel cellular targets in biliary tract cancers using global gene expression technology. Am. J. Pathol . 163: 217–229 172 . Zhang W, Braun A, Bauman Z, Olteanu H, Madzelan P, Banerjee R. 2005. Expression profiling of homocysteine junction enzymes in the NCI60 panel of human cancer cell lines. Cancer Res . 65: 1554–1560 173 . Fan K, Li N, Qi J, Yin P, Zhao C, Wang L, Li Z, Zha X. 2014. Wnt/β-catenin signaling induces the transcription of cystathionine-γ-lyase, a stimulator of tumor in colon cancer. Cell Signal . ;26(12):2801-8 174 . Han Y, Zeng F, Tan G, Yang C, Tang H, Luo Y, Feng J, Xiong H, Guo Q. 2013. Hydrogen sulfide inhibits abnormal proliferation of lymphocytes via AKT/GSK3 β signal pathway in systemic lupus erythematosus patients. Cell Physiol. Biochem . ;31(6): 795-804 175 . Lee ZW, Zhou J, Chen CS, Zhao Y, Tan CH, Li L, Moore PK, Deng LW. 2011. The slow-releasing hydrogen sulfide donor, GYY4137, exhibits novel anti-cancer effects in vitro and in vivo . PLoS One. 6: e21077 176 . Lee ZW, Teo XY, Tay EY, Tan CH, Hagen T, Moore PK, Deng LW. 2014. Utilizing hydrogen sulfide as a novel anti-cancer agent by targeting cancer glycolysis and pH imbalance. Br. J. Pharmacol . ;171(18):4322-36

177 . Ma K, Liu Y, Zhu Q, Liu CH, Duan JL, Tan BK, Zhu YZ. H 2S donor, S- propargyl-cysteine, increases CSE in SGC-7901 and cancer-induced mice: evidence

for a novel anti-cancer effect of endogenous H 2S? PLoS One . 6: e20525 178 . Chattopadhyay M, Kodela R, Nath N, Barsegian A, Boring D, Kashfi K. 2012. Hydrogen sulfide-releasing aspirin suppresses NF-κB signaling in estrogen receptor negative breast cancer cells in vitro and in vivo . Biochem. Pharmacol . 15;83(6): 723- 32 179 . Kashfi K, Olson KR. 2013. Biology and therapeutic potential of hydrogen sulfide and hydrogen sulfide-releasing chimeras. Biochem. Pharmacol . 1;85(5):689-703 180 . Gemici B, Elsheikh W, Feitosa KB, Costa SK, Muscara MN, Wallace JL. 2015.

H2S-releasing drugs: anti-inflammatory, cytoprotective and chemopreventative potential. Nitric Oxide . 30;46:25-31 181 . Benavides GA, Squadrito GL, Mills RW, Patel HD, Isbell TS, Patel RP, Darley- Usmar VM, Doeller JE, Kraus DW. 2007. Hydrogen sulfide mediates the vasoactivity of garlic. Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 104: 17977–17982

195

182 . Predmore BL, Kondo K, Bhushan S, Zlatopolsky MA, King AL, Aragon JP, Grinsfelder DB, Condit ME, Lefer DJ. 2012. The polysulfide diallyl trisulfide protects the ischemic myocardium by preservation of endogenous hydrogen sulfide and increasing nitric oxide bioavailability. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol . 1;302(11): H2410-8 183 . Lu S, Gao Y, Huang X, Wang X. 2014. GYY4137, a hydrogen sulfide (H ₂S) donor, shows potent anti-hepatocellular carcinoma activity through blocking the STAT3 pathway. Int. J. Oncol . ;44(4): 1259-67 184 . Wallace GC 4th, Haar CP, Vandergrift WA 3rd, Giglio P, Dixon-Mah YN, Varma AK, Ray SK, Patel SJ, Banik NL, Das A. 2013. Multi-targeted DATS prevents tumor progression and promotes apoptosis in ectopic glioblastoma xenografts in SCID mice via HDAC inhibition. J. Neurooncol . ;114(1):43-50 185 . Li W, Tian H, Li L, Li S, Yue W, Chen Z, Qi L, Hu W, Zhu Y, Hao B, Gao C, Si L, Gao F. 2012. Diallyl trisulfide induces apoptosis and inhibits proliferation of A549 cells in vitro and in vivo . Acta Biochim. Biophys. Sin . (Shanghai). ;44(7):577-83 186 . Singh SV, Powolny AA, Stan SD, Xiao D, Arlotti JA, Warin R, Hahm ER, Marynowski SW, Bommareddy A, Potter DM, Dhir R. 2008. Garlic constituent diallyl trisulfide prevents development of poorly differentiated prostate cancer and pulmonary metastasis multiplicity in TRAMP mice. Cancer Res . ;68(22): 9503-11 187 . Wu PP, Liu KC, Huang WW, Chueh FS, Ko YC, Chiu TH, Lin JP, Kuo JH, Yang JS, Chung JG. 2011. Diallyl trisulfide (DATS) inhibits mouse colon tumor in mouse CT-26 cells allograft model in vivo . Phytomedicine . ;18(8-9): 672-6 188 . Yang W, Yang G, Jia X, Wu L, Wang R. 2005. Activation of KATP channels by

H2S in rat insulin-secreting cells and the underlying mechanisms . J. Physiol. ;569: 519–531

189 . Jia X, Yang W, Jakic Z, Wang R. 2004. The role of H 2S in insulin resistance. Can. J. Cardiol . 20 Suppl D: CCC-Abstract-041 190 . Zhang L, Yang G, Tang G, Wu L, Wang R. 2011. Rat pancreatic level of cystathionine gamma-lyase is regulated by glucose level via SP1 phosphorylation. Diabetologia . 54:2615–2625 191 . Brancaleone V, Roviezzo F, Vellecco V, De Gruttola L, Bucci M, Cirino G.

2008. Biosynthesis of H2S is impaired in non-obese diabetic (nod) mice. Br. J. Pharmacol ;155(5): 673–680

196

192 . Jain SK, Bull R, Rains JL, Bass PF, Levine SN, Reddy S, McVie R, Bocchini JA. 2010. Low levels of hydrogen sulfide in the blood of diabetes patients and streptozotocin-treated rats causes vascular inflammation? Antioxid. Redox Signal . ;12:1333-1337 193 . Whiteman M, Gooding KM, Whatmore JL, Ball CI, Mawson D, Skinner K, Tooke JE, Shore AC. 2010. Adiposity is a major determinant of plasma levels of the novel vasodilator hydrogen sulphide. Diabetologia . ;53:1722-1726 194 . Suzuki K, Olah G, Modis K, Coletta C, Kulp G, Gerö D, Szoleczky P, Chang T, Zhou Z, Wu L, Wang R, Papapetropoulos A, Szabo C. 2011. Hydrogen sulfide replacement therapy protects the vascular endothelium in hyperglycemia by preserving mitochondrial function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA . ;108(33): 13829-34 195 . Coletta C, Módis K, Szczesny B, Brunyánszki A, Oláh G, Rios EC, Yanagi K, Ahmad A, Papapetropoulos A, Szabo C. 2015. Regulation of Vascular Tone, Angiogenesis and Cellular Bioenergetics by the 3-Mercaptopyruvate

Sulfurtransferase/H 2S Pathway: Functional Impairment by Hyperglycemia and Restoration by DL-α-Lipoic Acid. Mol. Med . ;21:1-14 196 . Elshorbagy AK, Nurk E, Gjesdal CG Tell GS, Ueland PM, Nygard O, Tverdal A, Vollset SE, Refsum H. 2008. Homocysteine, cysteine, and body composition in the Hordaland Homocysteine Study: does cysteine link amino acid and lipid metabolism? Am. J. Clin. Nutr. ; 88: 738–746 197 . Jain SK, Micinski D, Huning L, Kahlon G, Bass PF, Levine SN. 2014. Vitamin D and L-cysteine levels correlate positively with GSH and negatively with insulinresistance levels in the blood of type 2 diabetic patients. Eur. J. Clin. Nutr. ;68: 1148–1153 198 . Feng X, Chen Y, Zhao J, Tang C, Jiang Z, Geng B. 2009. Hydrogen sulfide from adipose tissue is a novel insulin resistance regulator. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380(1):153-9 199 . Manna P, Jain SK. 2012. Vitamin D up-regulates glucose transporter 4 (GLUT4) translocation and glucose utilization mediated by cystathionine--lyase (CSE)

activation and H 2S formation in 3T3L1 adipocytes. J. Biol. Chem . 287(50):42324-32 200 . Tsai CY, Peh MT, Feng W, Dymock BW, Moore PK. 2015. Hydrogen sulfide promotes adipogenesis in 3T3L1 cells. PLoS One. ;10: 1–16

197

201 . Geng B, Cai B, Liao F, Zheng Y, Zeng Q, Fan X, Gong Y, Yang J, Cui QH, Tang C, Xu GH. 2013. Increase or decrease hydrogen sulfide exert opposite lipolysis, but reduce global insulin resistance in high fatty diet induced obese mice. PLoS One. 8(9):e73892 202 . Xie ZZ, Liu Y, Bian JS. 2016. Hydrogen sulfide and cellular redox homeostasis. Oxid. Med. Cell Longev . ;2016:6043038 203 . Predmore BL, Lefer DJ, Gojon G. 2012. Hydrogen sulfide in biochemistry and medicine. Antioxid. Redox Signal. 17(1):119-40 204 . Jain SK, Huning L, Micinski D. 2014. Hydrogen sulfide upregulates glutamate- cysteine ligase catalytic subunit, glutamatecysteine ligase modifier subunit, and glutathione and inhibits interleukin-1 beta secretion in monocytes exposed to high glucose levels. Metab. Syndr. Relat. Disord. ;12(5):299-302 205 . Calvert JW, Jha S, Gundewar S Elrod JW, Ramachandran A, Pattillo CB, Kevil CG, Lefer DJ. 2009. Hydrogen sulfide mediates cardioprotection through Nrf2 signaling. Circ. Res. ;105(4):365-74 206 . Xie ZZ, Shi MM, Xie L, Wu ZY, Li G, Hua F, Bian JS. 2014. Sulfhydration of p66Shc at Cysteine59 mediates the antioxidant effect of hydrogen sulfide. Antioxid. Redox Signal. ;21(18):2531-42

207 . Łowicka E, Bełtowski J. 2007. Hydrogen sulfide (H2S)-the third gas of interest for pharmacologists. Pharmacol. Rep . 59(1):4-24 208 . Asimakopoulou A, Panopoulos P, Chasapis CT, Coletta C, Zhou Z, Cirino G, Giannis A, Szabo C, Spyroulias GA, Papapetropoulos A. 2013. Selectivity of commonly used pharmacological inhibitors for cystathionine β synthase (CBS) and cystathionine γ lyase (CSE). Br. J. Pharmacol. 169(4):922-32 209 . Burnett G, Macotte P, Walsh C. 1997. Mechanism-based inactivation of pig heart l-alanine transaminase by l-propargylglycine: half-site reactivity. Biol. Rhythms. Res . 18, 9–16 210 . Konno R, Ikeda M, Yamaguchi K, Ueda Y, Niwa A. 2000. Nephrotoxicity of d- proparglyglycine in mice. Arch. Toxicol . 74, 473–479 211 . Pfeffer M, Ressler C. 1967. Beta-cyanoalanine, an inhibitor of rat liver cystathionase. Biochem. Pharmacol . 16(12): 2299-2308 212 . Roy DN, Sabri MI, Kayton RJ, Spencer PS. 1996. β-Cyano-l-alanine toxicity: evidence for the involvement of an excitotoxic mechanism. Nat. Toxins . 4, 247–253

198

213 . Alexeev D, Baxter RL, Campopiano DJ, Kerbarh O, Sawyer L, Tomczyk N, Watt R, Webster SP. 2006. Suicide inhibition of alpha-oxamine synthases: structures of the covalent adducts of 8-amino-7-oxononanoate synthase with trifluoroalanine. Org. Biomol. Chem . 4(7): 1209-1212 214 . Pyriochou A, Papapetropoulos A, Olah G, Wintner E, Jeschke M, Branski L, Herndon D, Traber D, Szabo C. 2008. The hydrogen sulfide donor IK-1001 stimulates neovascularization and improves wound healing. FASEB J . 22, 912–942 215 . Li L, Whiteman M, Guan YY, Neo KL, Cheng Y, Lee SW, Zhao Y, Baskar R, Tan CH, Moore PK. 2008. Characterization of a novel, water-soluble hydrogen sulfide-releasing molecule (GYY4137). New insights into the biology of hydrogen sulfide. Circulation . 117 (18), 2351–2360 216 . Feng W, Teo X, Novera W, Ramanujulu PM, Dong L, Huang D, Moore PK,

Deng LW, Dymock BW. 2015. Discovery of new H 2S releasing phosphordithioates and 2,3-dihydro-2-phenyl-2-sulfanylenebenzo[d][1,3,2]oxazaphospholes with improved antiproliferative activity. J. Med. Chem . 58 (16) 6456–6480 217 . Zhou Z, von Wantoch Rekowski M, Coletta C, Szabo C, Bucci M, Cirino G, Topouzis S, Papapetropoulos A, Giannis A. 2012. Thioglycine and L-thiovaline: biologically active H 2S-donors. Bioorg. Med. Chem . 20: 2675–20678 218 . Martelli A, Testai L, Citi V, Marino A, Bellagambi FG, Ghimenti S, Breschi MC, Calderone V. 2014. Pharmacological characterization of the vascular effectsof aryl isothiocyanates: is hydrogen sulfide the real player? Vasc. Pharmacol . 60, 32–41 219 . Zhao Y, Yang C, Organ C, Li Z, Bhushan S, Otsuka H, Pacheco A, Kang J, Aguilar HC, Lefer DJ, Xian M. 2015. Design, synthesis, and cardioprotective effects of N-mercapto-based hydrogen sulfide donors. J. Med. Chem . 58 , 7501-7511 220 . Zhao Y, Bhushan S, Yang C, Otsuka H, Stein JD, Pacheco A, Peng B, Devarie NO, Aguilar HC, Lefer DJ, Xian M. 2013. Controllable hydrogen sulfide donors and the activity against myocardial ischemia-reperfusion injury. ACS Chem. Biol. 8, 1283- 1290

221 . Zhao Y, Wang H, Xian M. 2011. Cysteine activated hydrogen sulfide (H 2S) donors. J. Am. Chem. Soc . 133 , 15 222 . Benavides GA, Squadrito GL, Mills RW, Patel HD, Isbell TS, Patel RP, Darley- Usmar VM, Doeller J, Kraus DW. 2007. Hydrogen sulfide mediates the vasoactivity of garlic. Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 104: 17977–17982

199

223 . Chuah SC, Moore PK, Zhu YZ. 2007. S-allylcysteine mediates cardioprotection in an acute myocardial infarction rat model via a hydrogen sulfide-mediated pathway. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol . 293: H2693–H2701 224 . Wang Q, Wang XL, Liu HR, Rose P, Zhu YZ. 2010. Protective effects of cysteine analogues on acute myocardial ischemia: novel modulators of endogenous

H2S production. Antioxid. Redox Signal . 12(10): 1155–65 225 . Papapetropoulos Α, Whiteman Μ, Cirino G. 2015. Pharmacological tools for hydrogen sulphide research: a brief, introductory guide for beginners Br. J. Pharmacol . 172, 1633–1637 226 . Le Trionnaire S, Perry A, Szczesny B, Szabo C, Winyard PG, Whatmore JL, Wood ME, Whiteman M. 2014. The synthesis and functional evaluation of a mitochondria-targeted hydrogen sulfide donor, (10-oxo-10-(4-(3-thioxo-3H-1,2- dithiol-5-yl)phenoxy)decyl)triphenylphosphonium bromide (AP39). Med. Chem. Commun . 728–736 227 . Szczesny B, Módis K, Yanagi K, Coletta C, Le Trionnaire S, Perry A, Wood ME, Whiteman M, Szabo C. 2014. AP39, a novel mitochondria-targeted hydrogen sulfide donor, stimulates cellular bioenergetics, exerts cytoprotective effects and protects against the loss of mitochondrial DNA integrity in oxidatively stressed endothelial cells in vitro. Nitric Oxide . 41:120-30 228 . Beltowski J. 2015. Hydrogen sulfide in pharmacology and medicine – An update. Pharmacol. Rep . 7, 647–658 229 . Kashfi K, Olson KR. 2013. Biology and therapeutic potential of hydrogen sulfide and hydrogen sulfide-releasing chimeras. Biochem. Pharmacol . 85: 689–703 230 . Martelli A, Testai L, Breschi MC, Blandizzi C, Virdis A, Taddei S, Calderone V. 2010. Hydrogen sulphide: novel opportunity for drug discovery. Med. Res. Rev . 32(6): 1093-130 231 . Sun Y, Zhang Y, Li Y, Cheng J, Chen S, Xiao Y, Ao G. 2016. Synthesis and biological evaluation of novel hydrogen sulfide releasing nicotinic acid derivatives. Bioorg. Med. Chem . 24(21): 5368-5373 232 . Wallace JL, Caliendo G, Santagada V, Cirino G, Fiorucci S. 2007. Gastrointestinal safety and anti-inflammatory effects of a hydrogen sulfide releasing diclofenac derivative in the rat. Gastroenterology. 132, 261–271

200

233 . Ianaro A, Cirino G, Wallace JL. 2016. Hydrogen sulfide-releasing anti- inflammatory drugs for chemoprevention and treatment of cancer. Pharmacol. Res . 111:652-8 234 . Chattopadhyay M, Kodela R, Nath N, Dastagirzada YM, Velazquez-Martinez CA, Boring D, Kashfi K. 2012. Hydrogen sulfide-releasing NSAIDs inhibit the growth of human cancer cells: a general property and evidence of a tissue type- independent effect. Biochem. Pharmacol . 83(6): 715-22 235 . Bucci M, Vellecco V, Cantalupo A, Brancaleone V, Zhou Z, Evangelista S, Calderone V, Papapetropoulos A, Cirino G. 2014. Hydrogen sulfide accounts for the peripheral vascular effects of zofenopril independently of ACE inhibition. Cardiovasc. Res . 102(1): 138-47 236 . Ubuka T. 2002. Assay methods and biological roles of labile sulfur in animal tissues. J. Chromatogr . 781: 227–249 237 . Stipanuk MH, Beck PW. 1982. Characterization of the enzymic capacity for cysteine desulphhydration in liver and kidney of the rat. Biochem. J. 206: 267–277 238 . Olson KR. 2009. Is hydrogen sulfide a circulating gasotransmitter in vertebrate blood? Biochim. Biophys. Acta . 1787: 856–886 239 . Searcy DG, Peterson MA. 2004. Hydrogen sulfide consumption measured at low steady state concentrations using a sulfidostat. Anal. Biochem . 324: 269–275 240 . Doeller JE, Isbell TS, Benavides G, Koenitzer J, Patel H, Patel RP, Lancaster JR Jr, Darley-Usmar VM, Kraus DW. 2005. Polarographic measurement of hydrogen sulfide production and consumption by mammalian tissues. Anal. Biochem . 341: 40– 51 241 . Xu T, Scafa N, Xu LP, Zhou S, Abdullah Al-Ghanem K, Mahboob S, Fugetsu B, Zhang X. 2016. Electrochemical hydrogen sulfide biosensors. Analyst . 141,1185– 1195 242 . Hyspler R, Ticha A, Indrova M, Zakak ZK, Hysplerova L, Gasparic J, Churacek J. 2002. A simple, optimized method for the determination of sulphide in whole blood by GC-MS as a marker of bowel fermentation processes. J. Chromatog. B. Anal. Tech. Biomed. Life Sci . 770: 255–259 243 . Shen X, Pattillo CB, Pardue S, Bir SC, Wang R, Kevil CG. 2011. Measurement of plasma hydrogen sulfide in vivo and in vitro . Free Radic. Biol. Med . 50: 1021– 1031

201

244 . Shen X, Peter EA, Bir S, Wang R, Kevil CG. 2012. Analytical Measurement of Discrete Hydrogen Sulfide Pools in Biological Specimens. Free Radical. Biol. Med . 52, 2276–2283 245 Ida T, Sawa T, Ihara H, Tsuchiya Y, Watanabe Y, Kumagai Y, Suematsu M, Motohashi H, Fujii S, Matsunaga T, Yamamoto M, Ono K, Devarie-Baez NO, Xian M, Fukuto JM, Akaike T. 2014. Reactive cysteine persulfides and S-polythiolation regulate oxidative stress and redox signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 111, 7606– 7611 246 . Lin VS, Chang CJ. 2012. Fluorescent probes for sensing and imaging biological hydrogen sulfide. Curr. Opin. Chem. Biol . 16: 595–601 247 . Xuan W, Sheng C, Cao Y, He W, Wang W. 2012. Fluorescent probes for the detection of hydrogen sulfide in biological systems. Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 51(10): 2282-4

248 . Hartle MD, Pluth MD. 2016. A practical guide to working with H 2S at the interface of chemistry and biology. Chem. Soc. Rev . 45(22): 6108-6117 249 . Chen B, Li W, Lv C, Zhao M, Jin H, Du J, Zhang L, Tang X. 2013. Fluorescent probe for highly selective and sensitive detection of hydrogen sulfide in living cells and cardiac tissues. Analyst . 138, 946–951 250 . Thorson MK, Majtan T, Kraus JP, Barrios AM. 2013. Identification of cystathionine β-synthase inhibitors using a hydrogen sulfide selective probe. Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 52(17):4641-4 251 . Szczesny B, Marcatti M, Zatarain JR, Druzhyna N, Wiktorowicz JE, Nagy P, Hellmich MR, Szabo C. 2016. Inhibition of hydrogen sulfide biosynthesis sensitizes lung adenocarcinoma to chemotherapeutic drugs by inhibiting mitochondrial DNA repair and suppressing cellular bioenergetics. Sci. Rep . 6: 36125 252 . Chao C, Zatarain JR, Ding Y, Coletta C, Mrazek AA, Druzhyna N, Johnson P, Chen H, Hellmich JL, Asimakopoulou A, Yanagi K, Olah G, Szoleczky P, Törö G, Bohanon FJ, Cheema M, Lewis R, Eckelbarger D, Ahmad A, Módis K, Untereiner A, Szczesny B, Papapetropoulos A, Zhou J, Hellmich MR, Szabo C. 2016. Cystathionine-beta-synthase inhibition for colon cancer: Enhancement of the efficacy of aminooxyacetic acid via the prodrug approach. Mol. Med . 22

202

253 . Chen W, Liu C, Peng B, Zhao Y, Pacheco A, Xian M. 2013. New fluorescent probes for sulfane sulfurs and the application in bioimaging. Chem. Sci . 4, 2892–2896 254 . Chen W, Rosser EW, Matsunaga T, Pacheco A, Akaike T, Xian M. 2015. The Development of Fluorescent Probes for Visualizing Intracellular Hydrogen Polysulfides. Angew. Chem. Int . Ed. 54, 13961–13965 255 . Karaku ş E, Üçüncü M, Emrullaho ğlu M. 2016. Electrophilic Cyanate As a Recognition Motif for Reactive Sulfur Species: Selective Fluorescence Detection of

H2S. Anal. Chem . 88(1): 1039-43 256 . Montoya LA, Pluth MD. 2012. Selective turn-on fluorescent probes for imaging hydrogen sulfide in living cells. Chem. Commun . (Camb). 48(39): 4767-9 257 . Qian Y, Karpus J, Kabil O, Zhang SY, Zhu HL, Banerjee R, Zhao J, He C. 2011. Selective fluorescent probes for live-cell monitoring of sulphide. Nat. Commun . 2: 495 258 . Qian Y, Zhang L, Ding S, Deng X, He C, Zheng XE, Zhu HL, Zhao J. 2012. A Fluorescent Probe for Rapid Detection of Hydrogen Sulfide in Blood Plasma and Brain Tissues in Mice. Chem. Sci . 3, 2920–2923 259 . Zeng YS, Gao RC, Wu TW, Cho C, Tan KT. 2016. Fluorescent Probe Encapsulated in SNAP-Tag Protein Cavity To Eliminate Nonspecific Fluorescence and Increase Detection Sensitivity. Bioconjug. Chem . 27(8): 1872-9 260 . Wu TW, Lee FH, Gao RC, Chew CY, Tan KT. 2016. Fluorescent Probe Encapsulated in Avidin Protein to Eliminate Nonspecific Fluorescence and Increase Detection Sensitivity in Blood Serum. Anal. Chem . 88(16): 7873-7 261 . Wang P, Wu J, Di C, Zhou R, Zhang H, Su P, Xu C, Zhou P, Ge Y, Liu D, Liu W, Tang Y. 2016. A Novel Peptide-based Fluorescence Chemosensor for Selective Imaging of Hydrogen Sulfide both in Living Cells and Zebrafish. Biosens. Bioelectron . pii: S0956-5663 (16) 31065-X 262 . Park CS, Ha TH, Choi SA, Nguyen DN, Noh S, Kwon OS, Lee CS, Yoon H. 2016. A Near-Infrared “Turn-On” Fluorescent Probe with a Self-Immolative Linker for the In Vivo Quantitative Detection and Imaging of Hydrogen Sulfide. Biosens . Bioelectron . pii: S0956-5663 (16) 30980-0 263 . Zhu H, Fan J, Du J, Peng X. 2016. Fluorescent Probes for Sensing and Imaging within Specific Cellular Organelles. Acc. Chem. Res . 49(10): 2115-2126

203

264 . Guo Y, Gong Y, Qi L, Gao Y, Yu L. 2017. A polyoxometalate-based supramolecular chemosensor for rapid detection of hydrogen sulfide with dual signals. J. Colloid. Interface. Sci . 485: 280-287 265 . Sasakura K, Hanaoka K, Shibuya N, Mikami Y, Kimura Y, Komatsu T, Ueno T, Terai T, Kimura H, Nagano T. 2011. Development of a Highly Selective Fluorescence Probe for Hydrogen Sulfide. J. Am. Chem. Soc . 133, 18003–18005 266 . Li X, Yang C, Wu K, Hu Y, Han Y, Liang SH. 2014. A highly specific probe for sensing hydrogen sulfide in live cells based on copper-initiated fluorogen with aggregation-induced emission characteristics. Theranostics . 4(12): 1233-8 267 . Sun Q, Collins R, Huang S, Holmberg-Schiavone L, Anand GS, Tan CH, van- den-Berg S, Deng LW, Moore PK, Karlberg T, Sivaraman J. 2008. Structural basis for the inhibition mechanism of human cystathionine gamma-lyase, an enzyme

responsible for the production of H 2S. J. Biol. Chem . 284(5): 3076-3085 268 . Frank N, Kent JO, Meier M, Kraus JP. 2008. Purification and characterization of the wild type and truncated human cystathionine beta-synthase enzymes expressed in E. coli . Arch. Biochem. Biophys . 470(1): 64-72 269 . Pruess DL, Scannell JP, Kellett M, Ax HA, Janecek J, Williams TH, Stempel A, Berger J. 1974. Antimetabolites produced by microorganisms. X. L-2-amino-4-(2- aminoethoxy)-trans-3-butenoic acid. J. Antibiot . (Tokyo) 27: 229–233 270 . Clausen T, Huber R, Messerschmidt A, Pohlenz HD, Laber B. 1997. Slow- binding inhibition of Escherichia coli cystathionine beta-lyase by L- aminoethoxyvinylglycine: a kinetic and X-ray study. Biochemistry . 36: 12633–12643 271 . Phillips RS. 2015. Chemistry and diversity of pyridoxal-5'-phosphate dependent enzymes. Biochim. Biophys. Acta . 1854(9): 1167-74 272 . Kimura Y, Toyofuku Y, Koike S, Shibuya N, Nagahara N, Lefer D, Ogasawara

Y, Kimura H. 2015 . Identification of H 2S3 and H 2S produced by 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase in the brain. Sci. Rep. 5, 14774 273 . Yadav PK, Yamada K, Chiku T, Koutmos M, Banerjee R. 2013. Structure and kinetic analysis of H 2S production by human mercaptopyruvate sulfurtransferase. J. Biol. Chem . 288(27): 20002-13 274 . Nagahara N, Okazaki T, Nishino T. 1995. Cytosolic mercaptopyruvate sulfurtransferase is evolutionarily related to mitochondrial rhodanese. Striking similarity in active site amino acid sequence and the increase in the mercaptopyruvate

204

sulfurtransferase activity of rhodanese by site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem . 270, 16230–16235 275 . Blumenthal T, Landers TA. 1973. The inhibition of nucleic- acid binding proteins by aurintricarboxylic acid. Biochem. Biophys. Res. Commun . 55 680–688 276 . Skidmore AF, Beebee TJ. 1989. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochem. J . 263 (1) 73–80 277 . Hashem AM, Flaman AS, Farnsworth A, Brown EG, van Domselaar G, He R, Li X. 2009. Aurintricarboxylic acid is a potent inhibitor of influenza A and B virus neuraminidases. PLoS One . 4 (12) e8350 278 . Lipo E, Cashman SM, Kumar-Singh R. 2013. Aurintricarboxylic acid inhibits complement activation, membrane attack complex, and choroidal neovascularization in a model of macular degeneration. Invest. Ophthalmol.Vis. Sci . 54, 7107–7114 279 . Lee M, Narayanan S, McGeer EG, McGeer PL. 2014. Aurintricarboxylic acid protects against red blood cell hemolysis in patients with paroxysmalnocturnal hemoglobinemia. PLoS One . 9, e87316 280 . Pattingre S, Bauvy C, Codogno P. 2003. Amino acids interfere with the ERK1/2- dependent control of macroautophagy by controlling the activation of Raf-1 in human colon cancer HT-29 cells. J. Biol. Chem . 278, 16667–16674 281 . Zhang F, Wei W, Chai H, Xie X. 2013. Aurintricarboxylic acid ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis by blocking chemokine-mediated pathogenic cell migration and infiltration. J. Immunol . 190, 1017–1025 282 . Laufenberg LJ, Kazi AA, Lang CH. 2014. Salutary effect of aurintricarboxylic acid on endotoxin- and sepsis-induced changes in muscle protein synthesis and inflammation. Shock . 41, 420–428 283 . Druzhyna N, Szczesny B, Olah G, Módis K, Asimakopoulou A, Pavlidou A, Szoleczky P, Gerö D, Yanagi K, Törö G, López-García I, Myrianthopoulos V, Mikros E, Zatarain JR, Chao C, Papapetropoulos A, Hellmich MR, Szabo C. 2016. Screening of a composite library of clinically used drugs and well-characterized pharmacological compounds for cystathionine β-synthase inhibition identifies benserazide as a drug potentially suitable for repurposing for the experimental therapy of colon cancer. Pharmacol. Res . 113(Pt A): 18-37

205

284 . Andrew DJ, Hay AW, Evans SW. 1999. Aurintricarboxylic acid inhibits apoptosis and supports proliferation in a haemopoietic growth-factor dependent myeloid cell line. Immunopharmacology . 41, 1–10 285 . Liu C, Chu I, Hwang S. 2001. Aurintricarboxylic acid exerts insulin-like growth stimulating effects on Chinese hamster ovary cells under serum-free conditions. J. Biosci. Bioeng . 91(6) 576–580 286 . Lee TY, Chen WS, Huang YA, Liu TW, Hwang E, Tseng CP. 2012. Cation of aurintricarboxylic acid for the adherence of mouse P19 neurons and primary hippocampal neurons to non coated surface in serum-free culture. Biotechnol.Prog . 28 1566–1574 287 . Matschke V, Piccini I, Schubert J, Wrobel E, Lang F, Matschke J, Amedonu E, Meuth SG, Strünker T, Strutz-Seebohm N, Greber B, Scherkenbeck J, Seebohm G. 2016. The Natural Plant Product Rottlerin Activates Kv7.1/KCNE1 Channels. Cell Physiol. Biochem . 40(6): 1549-1558 288 . Soltoff SP. 2007. Rottlerin: an inappropriate and ineffective inhibitor of PKCdelta. Trends Pharmacol. Sci . 28(9): 453-8 289 . Clements RT, Cordeiro B, Feng J, Bianchi C, Sellke FW. 2011. Rottlerin increases cardiac contractile performance and coronary perfusion through BKCa ++ channel activation after cold cardioplegic arrest in isolated hearts. Circulation . 124: S55-61 290 . Soltoff SP. 2001. Rottlerin is a mitochondrial uncoupler that decreases cellular ATP levels and indirectly blocks protein kinase C delta tyrosine phosphorylation. J. Biol. Chem . 276(41): 37986-92 291 . Zhao Z, Zheng N, Wang L, Hou Y, Zhou X, Wang Z. 2016. Rottlerin exhibits antitumor activity via down-regulation of TAZ in non-small cell lung cancer. Oncotarget . 8(5):7827-7838 292 . Su J, Wang L, Yin X, Zhao Z, Hou Y, Ye X, Zhou X, Wang Z. 2016. Rottlerin exhibits anti-cancer effect through inactivation of S phase kinase-associated protein 2 in pancreatic cancer cells. Am. J. Cancer Res . 6(10): 2178-2191 293 . Duggar BM. 1948. Aureomycin: a product of the continuing search for new antibiotics. Ann. NY. Acad. Sci. 51: 177–181 294 . Hash JH, Wishnick M, Miller PA. 1964. On the mode of action of the tetracycline antibiotics in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 239: 2070–2078

206

295 . Griffin MO, Fricovsky E, Ceballos G, Villarreal F. 2010. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C539–C548 296 . Sapadin AN, Fleischmajer R. 2006. Tetracyclines: nonantibiotic properties and their clinical implications . J. Am. Acad. Dermatol. 54 , 258 –265 297 . Walker CB. 1996. Selected antimicrobial agents: mechanisms of action, side effects and drug interactions. Periodontol. 2000 . 10: 12-28 298 . Forrest JN Jr, Cohen AD, Torretti J, Himmelhoch JM, Epstein FH. 1974. On the mechanism of lithium-induced diabetes insipidus in man and the rat. J. Clin. Invest. 53: 1115–1123 299 . Singer I, Rotenberg D. 1973. Demeclocycline-induced nephrogenic diabetes insipidus. In-vivo and in-vitro studies. Ann. Intern. Med. 79: 679–683 300 . Sherlock M, Thompson CJ. 2010. The syndrome of inappropriate antidiuretic hormone: current and future management options. Eur. J. Endocrinol. 162, Suppl 1: S13–S18 301 . Verbalis JG, Goldsmith SR, Greenberg A, Schrier RW, Sterns RH. 2007. Hyponatremia treatment guidelines 2007: expert panel recommendations. Am. J. Med. 120: S1–S21 302 . Pruzanski W, Greenwald RA, Street IP, Laliberte F, Stefanski E, Vadas P. 1992. Inhibition of enzymatic activity of phospholipase A2 by minocycline and doxycycline. Biochem. Pharmacol. P44: 1165-70. 303 . Amin AR, Attur MG, Thakker GD, Patel PD, Vyas PR, Patel RN Patel IR, Abramson SB. 1996. A novel mechanism of action of tetracyclines: effects of nitric oxide synthases. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 93: 14014-9 304 . Thong YH, Ferrante A. 1979. Inhibition of mitogen-induced human lymphocyte proliferative responses to tetracycline analogues. Clin. Exp. Immunol. 35: 443-6 305 . Hanemaaijer R, Visser H, Koolwijk P, Sorsa T, Salo T, Golub LM, van Hinsbergh VW. 1998. Inhibition of MMP synthesis by doxycycline and chemically modified tetracyclines (CMTs) in human endothelial cells. Adv. Dent. Res. 12: 114-8 306 . Fife R, Sledge G. 1995. Effects of doxycycline on in vitro growth, migration, and gelatinase activity of breast carcinoma cells. J. Lab. Clin. Med . 125, 407–411 307 . Shapira LL, Soskolne WA, Houri Y, Barak V, Halabi A, Stabholz A. 1996. Protection against endotoxic shock and lipopolysaccharide induced local

207

inflammation by tetracycline: correlation with inhibition of cytokine secretion. Infect. Immun. 64: 825-8 308 . Golub LM, Lee HM, Ryan ME, Giannobile WV, Payne J, Sorsa T. 1998. Tetracyclines inhibit connective tissue breakdown by multiple non-antimicrobial mechanisms. Adv. Dent. Res. 12:12-26 309 . Griffin MO, Ceballos G, Villarreal FJ. 2011. Tetracycline compounds with non- antimicrobial organ protective properties: possible mechanisms of action. Pharmacol. Res. 63: 102-7 310 . Saikali Z, Singh G. 2003. Doxycycline and other tetracyclines in the treatment of bone metastasis. Anticancer. Drugs. 14: 773–778 311 . McNamara TF, Golub LM, D'Angelo G, Ramamurthy NS. 1986. The synthesis and characterization of a non-antibacterial chemically-modified tetracycline (CMT). J. Dent. Res . 65 (Spec. Iss.), IADR 515 312 . McNamara TF, Golub LM, Yu Z, Ramamurthy N. 1990. Chemically modified tetracyclines (CMTs) fail to induce microbial resistance. J. Dent. Res . 69 (Spec. Iss.), IADR. 1091 313 . Golub LM, Ramamurthy NS, McNamara TF, Greenwald RA, Rifkin BR. 1991. Tetracyclines inhibit connective tissue breakdown: new therapeutic implications for an old family of drugs. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 2: 297-321 314 . Golub LM, McNamara TF, D’Angelo G, Greenwald RA, Ramamurthy NS. 1987. A non-antibacterial chemically-modified tetracycline inhibits mammalian collagenase activity. J. Dent. Res . 66, 1310–1314 315 . Acharya MR, Venitz E, Figg WD, Sparreboom A. 2004. Chemically modified tetracyclines as inhibitors of matrix metalloproteinases. Drug Resist. Updates. 7, 195−208 316 . Lokeshwar ΒL. 2011. Chemically Modified Non-Antimicrobial Tetracyclines are Multifunctional Drugs against Advanced Cancers. Pharmacol. Res . 63(2): 146–150 317 . Gialeli C, Theocharis AD, Karamanos NK. 2011. Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting. FEBS J . 278(1): 16-27 318 . Golub LM, Elburki MS, Walker C, Ryan M, Sorsa, Tenenbaum H, Goldberg M, Wolff M, Gu Y. 2016. Non-antibacterial tetracycline formulations: host-modulators in

208

the treatment of periodontitis and relevant systemic diseases . Int. Dent. J. 66(3): 127- 35 319 . Rudek MA, New P, Mikkelsen T, Phuphanich S, Alavi JB, Nabors LB, Piantadosi S, Fisher JD, Grossman SA. 2011. Phase I and pharmacokinetic study of COL-3 in patients with recurrent high-grade gliomas. J. Neurooncol . 105(2): 375– 381. 320 . Song H, Fares M, Maguire KR, Sidén A, Potácová Z. 2014. Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells. PLoS One . 9(12): e114457 321 . Dezube BJ, Krown SE, Lee JY, Bauer KS, Aboulafia DM. 2006. Randomized phase II trial of matrix metalloproteinase inhibitor COL-3 in AIDS-related Kaposi’s sarcoma: an AIDS Malignancy Consortium Study. J. Clin. Oncol. 24: 1389–1394 322 . Lukkonen A, Sorsa T, Salo T, Tervahartiala T, Koivunen E, Golub L, Simon S, Stenman UH. 2000. Down-regulation of trypsinogen-2 expression by chemically modified tetracyclines: association with reduced cancer cell migration. Int. J. Cancer . 15; 86(4): 577-81 323 . Chen X, Su Y, Fingleton B, Acuff H, Matrisian LM, Zent R, Pozzi A. 2005. Increased plasma MMP9 in integrin alpha1-null mice enhances lung metastasis of colon carcinoma cells. Int. J. Cancer . 10;116(1): 52-61 324 . Pozzi A, LeVine WF, Gardner HA. 2002. Low plasma levels of matrix metalloproteinase 9 permit increased tumor angiogenesis. Oncogene . 10;21(2): 272- 81 325 . Onoda T, Ono T, Dhar DK, Yamanoi A, Nagasue N. 2006. Tetracycline analogues (doxycycline and COL-3) induce caspase-dependent and -independent apoptosis in human colon cancer cells. Int. J. Cancer .118(5): 1309-15 326 . Yaroslavsky AN, Neel V, Anderson RR. 2003. Demarcation of non melanoma skin cancer margins using multispectral polarized-light imaging. J. Invest. Dermatol . 121 259–66 327 . Wirth D, Smith TW, Moser R, Yaroslavsky AN. 2015. Demeclocycline as a contrast agent for detecting brain neoplasms using confocal microscopy. Phys. Med. Biol . 60(7):3003-11 328 . Ibsen KH, Berk JE, Morimoto AM. 1967. A chromatographic modification of the tetracycline fluorescence test for gastric cancer. Cancer Res . 27(7):1296-300

209

329 . Miller PD, Linas SL, Schrier RW. 1980. Plasma demeclocycline concentrations and nephrotoxicity: correlation in hyponatremic cirrhotic patients. JAMA . 243: 2513- 2515 330 . Potts RC, MacConnachie Α, Brown RA, Gibbs JH, Robertson AJ, Hassan HAA, Swansonbeck J. 1983. Some tetracycline drugs suppress mitogen-stimulated lymphocyte growth but others do not. Br. J. Clin Pharmacol . 16, pp. 127–132 331 . Ryan ME, Usman A, Ramamurthy NS, Golub LM, Greenwald RA. 2001. Excessive matrix metalloproteinase activity in diabetes: inhibition by tetracycline analogues with zinc reactivity. Curr. Med. Chem . 8(3): 305-16 332 . Vachek H, Wood JL. 1972. Purification and properties of mercaptopyruvate sulfur transferase of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta . 258(1): 133-46

333 . Shatalin K, Shatalina E, Mironov A, Nudler E. 2011. H 2S: a universal defense against antibiotics in bacteria. Science . 334, pp. 986–990 334 . Porter DW, Baskin SI. 1996. The effect of three α -keto acids on 3- mercaptopyruvate sulfurtransferase activity. J. Biochem. Toxicol. 11, 45–50 335 . Nagahara N, Sawada N, Nakagawa T. 2004. Affinity labeling of a catalytic site, cysteine247 in rat mercaptopyruvate sulfurtransferase by chloropyruvate as an analog of a substrate. Biochimie. 86, 723–729 336 . Hanaoka K, Sasakura K, Suwanai Y, Toma-Fukai S, Shimamoto K, Takano Y, Shibuya N, Terai T, Komatsu T, Ueno T, Ogasawara Y, Tsuchiya Y, Watanabe Y, Kimura H, Wang C, Uchiyama M, Kojima H, Okabe T, Urano Y, Shimizu T, Nagano

T. 2017. Discovery and Mechanistic Characterization of Selective Inhibitors of H 2S- producing Enzyme: 3-Mercaptopyruvate Sulfurtransferase (3MST) Targeting Active- site Cysteine Persulfide. Sci. Rep . 7: 40227 337 . Wróbel M, Jurkowska H. 2007. Menadione effect on l-cysteine desulfuration in U373 cells. Acta Biochim. Pol . 54(2): 407-11 338 . Lu SC, Mato JM. 2012. S-adenosylmethionine in liver health, injury, and cancer. Physiol. Rev . 92 1515–1542 339 . Williams AL, Girard C, Jui D, Sabina A, Katz DL. 2005. S-adenosylmethionine as treatment for depression: a systematic review. Clin. Invest. Med . 28 132–139 340 . Lopez HL. 2012. Nutritional interventions to prevent and treat osteoarthritis. Part II: focus onmicronutrients and supportive nutraceuticals. PMR 4 S155–S168

210

341 . Anstee QM, Day CP. 2012. S-adenosylmethionine therapy in liver disease: a review of current evidence and clinical utility. J. Hepatol . 57 1097–1109 342 . Ereno-Orbea J, Majtan T, Oyenarte I, Kraus JP, Martinez-Cruz LA. 2013. Structural basis of regulation and oligomerization of human cystathionine b-synthase, the central enzyme of transsulfuration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 110 E3790–E3799 343 . Jensen KK, Geoghagen NS, Jin L, Holt TG, Luo Q, Malkowitz L, Ni W, Quan S, Waters MG, Zhang A, Zhou HH, Cheng K, Luo MJ. 2011. Pharmacological activation and genetic manipulation of cystathionine beta-synthase alter circulating levels of homocysteine and hydrogen sulfide in mice. Eur. J. Pharmacol . 650 86–93 344 . Finkelstein JD, Kyle WE, Martin JL, Pick AM. 1975. Activation of cystathionine synthase by adenosylmethionine and adenosylethionine. Biochem. Biophys. Res. Commun . 66 81–87 345 . Cai WJ, Wang MJ, Ju LH, Wang C, Zhu YC. 2010. Hydrogen sulfide induces human colon cancer cell proliferation: role of Akt, ERK and p21. Cell Biol. Int . 34 565–572 346 . Zhao Y, Wei H, Kong G, Shim W, Zhang G. 2013. Hydrogen sulfide augments the proliferation and survival of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stromal cells through inhibition of BKCa. Cytotherapy . 15 1395–1405 347 . Szabo C, Hellmich MR. 2013. Endogenously produced hydrogen sulfide supports tumor cell growth and proliferation. Cell Cycle . 12 2915–2916 348 . Maclean KN, Janosik M, Kraus E, Kozich V, Allen RH, Raab BK, Kraus JP. 2002. Cystathionine beta-synthase is coordinately regulated with proliferation through a redox-sensitive mechanism in cultured human cells and Saccharomyces cerevisiae. J. Cell. Physiol . 192 81–92 349 . Lin DW, Chung BP, Kaiser P. 2014. S-adenosylmethionine limitation induces p38 mitogen activated protein kinase and triggers cell cycle arrest in G1. J. Cell Sci . 127(Pt 1): 50-9 350 . Pascale RM, Simile MM, Satta G, Seddaiu MA, Daino L, Pinna G, Vinci MA, Gaspa L, Feo F. 1991. Comparative effects of L-methionine, S-adenosyl-L- methionine and 5’-methylthioadenosine on the growth of preneoplastic lesions and DNA methylation in rat liver during the early stages of hepatocarcinogenesis. Anticancer Res . 11 1617–1624

211

351 . Regenass U, Caravatti G, Mett H, Stanek J, Schneider P, Muller M, Matter A, Vertino P, Porter CW. 1992. New S-adenosylmethionine decarboxylase inhibitors with potent antitumor activity. Cancer Res . 52 4712–4718 352 . Atta M, Mulliez E, Arragain S, Forouhar F, Hunt JF, Fontecave M. 2010. S- Adenosylmethionine-dependent radical-based modification of biological macromolecules. Curr. Opin. Struct. Biol . 2, 684–692 353 . Zhao Y, Li JS, Guo MZ, Feng BS, Zhang JP. 2010. Inhibitory effect of S- adenosylmethionine on the growth of human gastric cancer cells in vivo and in vitro . Chin. J. Cancer . 29, 752–760 354 . Luo J, Li YN, Wang F, Zhang WM, Geng X. 2010. S-adenosylmethionine inhibits the growth of cancer cells by reversing the hypomethylation status of c-myc and H-ras in human gastric cancer and colon cancer. Int. J. Biol. Sci . 6, 784–795 355 . Hussain Z, Khan MI, Shahid M, Almajhdi FN. 2013. S-adenosylmethionine, a methyl donor, up regulates tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in colorectal cancer. Genet. Mol. Res . 12, 1106–1118

212

∆ΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ

1. Coletta C, Papapetropoulos A, Erdelyi K, Olah G, Módis K, Panopoulos P, Asimakopoulou A , Gerö D, Sharina I, Martin E, Szabo C. Hydrogen sulfide and nitric oxide are mutually dependent in the regulation of angiogenesis and endothelium- dependent vasorelaxation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012. 109(23):9161-6. 2. Módis K, Asimakopoulou A , Coletta C, Papapetropoulos A, Szabo C. Oxidative stress suppresses the cellular bioenergetic effect of the 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase/hydrogen sulfide pathway. Biochem Biophys Res Commun . 2013 Apr 19;433(4):401-7. 3. Asimakopoulou A *, Panopoulos P *, Chasapis C, Coletta C, Zhou Z, Cirino G, Giannis A, Szabo C, Spyroulias G, Papapetropoulos A. Selectivity of commonly used pharmacological inhibitors for cystathionine beta synthase (CBS) and cystathionine gamma lyase (CSE). Br J Pharmacol . 2013 Jun;169(4):922-32. 4. Modis K *, Coletta C *, Asimakopoulou A *, Szczesny B, Chao C, Papapetropoulos A, Hellmich MR, Szabo C. Effect of S-adenosyl-l-methionine (SAM), an allosteric activator of cystathionine-β-synthase (CBS) on colorectal cancer cell proliferation and bioenergetics in vitro. Nitric Oxide . 2014; 41:146-56. * equally contributed 5. Brancaleone V, Esposito I, Gargiulo A, Velleco V, Asimakopoulou A , Citi V, Calderone V, Gobbetti T, Perretti M, Papapetropoulos A, Bucci M, Cirino G. D -penicillamine

modulates hydrogen sulfide (H 2S) pathway through selective inhibition of cystathionine-γ- lyase (CSE). Br J Pharmacol . 2016 May;173(9):1556-65. 6. Chao C, Zatarain J, Ding Y, Mrazek A, Druzhyna N, Johnson P, Chen H, Hellmich J, Asimakopoulou A , Yanagi K, Oláh G, Szoleczky P, Törö G, Bohanon F, Cheema M, Lewis R, Eckelbarger D, Ahmad A, Módis K, Untereiner A, Szczesny B, Papapetropoulos A, Zhou J, Hellmich M, Szabo C. Cystathionine-beta-synthase inhibition for colon cancer: Enhancement of the efficacy of aminooxyacetic acid via the prodrug approach. Mol Med. 2016 May 16;22. 7. Druzhyna N, Szczesny B, Olah G, Módis K, Asimakopoulou A , Pavlidou A, Szoleczky P, Gerö D, Yanagi K, Törö G, López-García I, Myrianthopoulos V, Mikros E, Zatarain JR, Chao C, Papapetropoulos A, Hellmich MR, Szabo C. Screening of a composite library of clinically used drugs and well-characterized pharmacological compounds for cystathionine β-synthase inhibition identifies benserazide as a drug potentially suitable for repurposing for the experimental therapy of colon cancer. Pharmacol Res . 2016 Aug 10;113(Pt A):18- 37.

213