Síntese E Estudo Da Atividade Antinociceptiva De Pep13, Peptídeo Derivado De Pntx4(6-1), Uma Toxina Da Peçonha Da Aranha Phoneutria Nigriventer
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA Síntese e estudo da atividade antinociceptiva de Pep13, peptídeo derivado de PnTx4(6-1), uma toxina da peçonha da aranha Phoneutria nigriventer. Bruna Luiza Emerich Magalhães Belo Horizonte Maio - 2017 Bruna Luiza Emerich Magalhães Síntese e estudo da atividade antinociceptiva de Pep13, peptídeo derivado de PnTx4(6-1), uma toxina da peçonha da aranha Phoneutria nigriventer. Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito para a obtenção do grau de Doutora em Bioquímica e Imunologia. Orientadora: Profa. Dra. Maria Elena de Lima Perez Garcia Co-Orientadores: Prof. Dr. Igor Dimitri Gama Duarte Drª. Marie France Martin-Eauclaire a Dr Marie France Martin Eauclaire Belo Horizonte Maio - 2017 Este trabalho foi realizado no Laboratório de Venenos e Toxinas Animais (LVTA), do Departamento de Bioquímica e Imunologia, no Laboratório de Dor e Analgesia (LDA) do Departamento de Farmacologia, ambos do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais. A síntese do peptídeo foi realizada no Laboratório de Síntese e Estrutura de Peptídeos (LASEP) e no Laboratório de Imunoquímica de Proteínas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG. Os experimentos relativos ao estágio sanduiche foram realizados no Laboratoire de Biochimie, Faculté de Médecine Nord, Marseille, France. Órgãos financiadores: CNPq, CAPES, FAPEMIG. AGRADECIMENTOS Dedico os mais sinceros agradecimentos às inúmeras pessoas, que pelos mais variados motivos, me auxiliaram na realização deste trabalho. À minha família que com toda a paciência e amor me deram apoio e são sempre, a base para todo o meu desenvolvimento. Aos amigos e colegas de “Bases” que estiveram comigo durante essa longa, porém rápida, caminhada e não mediram esforços para me ajudar e me fazer feliz! Aos alunos e à equipe do LVTA – Laboratório de Venenos e Toxinas Animais, pela presença e pela enorme disponibilidade para nos socorrer sempre que precisamos! Aos alunos e à equipe do Laboratório de Dor e Analgesia por todas as técnicas e conceitos transmitidos e todos os experimentos compartilhados. À equipe do Laboratoire de Biochimie, Faculté de Médecine Nord, por me acolher e fazer de Marseille, também, minha casa. Pierre, Brigitte, Maya, Géraldine, Christian et Marie France, merci beaucoup! À equipe do Laboratório de Síntese e Estrutura de Peptídeos, especialmente ao Felipe, Karla e Virgílio, por me auxiliarem na síntese do peptídeo. À equipe do Cebio e à equipe dos Biotérios do ICB, por cuidarem da nossa matéria prima e serem sempre tão solícitos. À querida Drª Marta do Nascimento Cordeiro pelo início desta caminhada! À minha orientadora, Profa. Maria Elena de Lima Perez Garcia, por me receber no LVTA e por acreditar no meu potencial! Ao meu co-orientador, Prof. Igor Dimitri Gama Duarte, que com toda sua versatilidade, me acolheu e orientou. À minha co-orientadora Dra Marie France Martin-Eauclaire, por me estimular a conhecer um novo mundo e uma nova forma de fazer ciência! Aos Profs. Adriano Pimenta, Thiago Romero, Jader Cruz e Dawidson Gomes pelas contribuições científicas. À banca examinadora pela disponibilidade e contribuições. Aos professores e funcionários do Departamento de Bioquímica e Imunologia. Jamil, Alexandre e Orlando, muito obrigada! Aos meus Anjos da Guarda Franceses, Géraldine et Nicolas, merci! Aos amigos que me cercam de amor! LISTA DE FIGURAS Figura 1: Espécimes de Phoneutria nigriventer.. ..................................................................... 12 Figura 2: Organograma dos estágios de purificação da peçonha bruta da aranha Phoneutria nigriventer e as principais toxinas obtidas. .............................................................................. 13 Figura 3: Tipos de fibras sensitivas.......................................................................................... 19 Figura 4: Estrutura dos canais para sódio sensíveis a voltagem. ............................................... 21 Figura 5: Representações da estrutura do domínio S1-S4 de KvAP. com “paddle motif”. ......... 22 Figura 6: Esquema da integração entre as estruturas cerebrais envolvidas na inibição e modulação das vias de controle descendente da informação nociceptiva. ................................. 24 Figura 7: Resumo da sinalização do receptor opióide. .............................................................. 28 Figura 8: Administração intraplantar em ratos. ........................................................................ 45 Figura 9: Administração intratecal em ratos.. ........................................................................... 46 Figura 10 - Aparelho algesimétrico (Ugo Basile, Itália). .......................................................... 47 Figura 11: Teste de retirada da cauda mediante ao estímulo térmico. ....................................... 50 Figura 12 - Ensaio de toxicidade em mosca (Musca domestica).. ............................................. 52 Figura 13: Representação esquemática de um sensor utilizado na técnica de ressonância plasmônica de superfície.. ....................................................................................................... 53 Figura 14 - Comparação das sequências de aminoácidos de três toxinas com propriedades antinociceptivas, da fração PhTx4. .......................................................................................... 57 Figura 15 - Representação gráfica da predição de acessibilidade à superfície da toxina PnTx4(6- 1). ........................................................................................................................................... 58 Figura 16 - Predição para a formação de pontes de dissulfeto em PnTx4(6-1). ......................... 59 Figura 17 - Perfil cromatográfico da purificação de Pep13, a partir dos produtos obtidos após a síntese. .................................................................................................................................... 60 Figura 18 - Perfil da espectrometria de massa de Pep13. .......................................................... 62 Figura 19: Perfil de fragmentação de Pep13 gerado por espectrometria de massa.. ................... 63 Figura 20: Efeito da administração intratecal de diferentes doses do peptídeo Pep13 sobre a hiperalgesia induzida por PGE2.. ............................................................................................. 65 Figura 21: Efeito do antagonista não específico de receptores opioides, naloxona, na antinocicepção induzida por Pep13, sobre a hiperalgesia induzida por PGE2. ........................... 67 Figura 22: Efeito do antagonista do receptor CB1, AM251, na antinocicepção induzida por Pep13, sobre a hiperalgesia evocada por PGE2. ....................................................................... 68 Figura 23: Efeito do antagonista do receptor CB2, AM630, na antinocicepção induzida por Pep13, sobre a hiperalgesia evocada por PGE2. ....................................................................... 69 Figura 24: Efeito da administração intraplantar de diferentes doses do peptídeo Pep13 sobre a hiperalgesia induzida por PGE2 (2 µg/pata). ............................................................................ 71 Figura 25: Teste de exclusão do efeito sistêmico de Pep13 na dose de 20 µg.. ......................... 73 Figura 26: Efeito do antagonista não específico dos receptores opoides, naloxona, na antinocicepção induzida por Pep13, sobre a hiperalgesia induzida por PGE2. ........................... 75 Figura 27: Efeito do antagonista do receptor CB1, AM251, na antinocicepção induzida por Pep13 sobre a hiperalgesia induzida por PGE2. ........................................................................ 76 Figura 28: Efeito do antagonista do receptor CB2, AM630, na antinocicepção induzida por Pep13 sobre a hiperalgesia induzida por PGE2.. ....................................................................... 78 Figura 29: Efeito da ação de MAFP na antinocicepção induzida por Pep13 sobre a hiperalgesia induzida por PGE2................................................................................................................... 79 Figura 30: Efeito da ação de VDM11 na antinocicepção induzida por Pep13 sobre a hiperalgesia induzida por PGE2................................................................................................................... 80 Figura 31: Efeito de administração intratecal de Pep13 mediante ao estímulo térmico. ............. 82 Figura 32: Ensaios de ligação das toxinas AaHII, PnTx4(6-1), PnTx4-3, Pep13 e KTX ao peptídeo paddle Nav1.2 DIV ................................................................................................... 84 Figura 33: Sensorgrama mostrando o ensaio da ligação das toxinas AaHII, PnTx4(6-1), PnTx4- 3, ao peptídeo paddle Nav1.2 DIV ........................................................................................... 85 Figura 34: Sensorgrama mostrando o ensaio de ligação das toxinas AaHII e Pep13 ao peptídeo paddle Nav1.2 DIV.................................................................................................................. 86 Figura 35: Ensaios de ligação das toxinas AaHII, PnTx4(6-1), PnTx4-3 e Pep13 ao peptídeo paddle Nav1.7 DIV.................................................................................................................