VYTAUTO DIDŢIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOLOGIJOS KATEDRA

LINA ZYBARTAITĖ

KETURBRIAUNĖS JONAŢOLĖS ( MACULATUM CRANTZ) LIETUVOS POPULIACIJŲ GENETINĖ ĮVAIROVĖ

Magistro baigiamasis darbas

Biologijos studijų programa, valstybinis kodas 62401B107 Biologijos studijų kryptis

Vadovas: prof. habil. dr. Eugenija Kupčinskienė ______(Mokls. laipsnis, vardas, pavardė) (Parašas) (Data)

Apginta: prof. h.p. Algimantas Paulauskas ______(Fakulteto/studijų instituto dekanas/direktorius) (Parašas) (Data)

Kaunas, 2011 Darbas atliktas: 2010–2011 m. Vytauto Didţiojo universitete, Biologijos katedroje, Paduvos universitete, Aplinkosauginės agronomijos ir augalininkystės mokslų katedroje

Recenzentas: dr. Brigita Tamutė

Darbas ginamas: viešame magistrų darbų gynimo komisijos posėdyje 2011 metų birţelio 2 d. Vytauto Didţiojo universitete, Biologijos katedroje, 801 auditorijoje. Adresas: Vileikos g. 8, LT-44404 Kaunas, Lietuva.

Protokolo Nr.

darbo vykdytojo pavardė ir parašas: ______

mokslinio vadovo(-ai) pavardė ir parašas: ______

katedros, atsakingos uţ magistro darbo parengimą, Biologijos katedra pavadinimas, jos vedėjo pavardė ir parašas A. Sruoga ______

2 TURINYS

SANTRUMPOS...... 5 SANTRAUKA...... 7 SUMMARY...... 8 ĮVADAS...... 9 1. LITERATŪROS APŢVALGA...... 11 1.1. Jonaţolės (Hypericum spp.) genties sistematinė, morfologinė-fiziologinė charakteristika...... 11 1.2. Jonaţolių citogenetiniai poţymiai...... 13 1.3. Jonaţolių antriniai metabolitai...... 13 1.4. Jonaţolių genetiniai tyrimo metodai...... 16 1.4.1. Atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR metodo pritaikymas...... 17 1.4.2. Numatytų sekų polimerazinės grandininės reakcijos metodas...... 20 1.4.3. Amplifikuotų ir restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo metodo pritaikymas...... 21 1.4.4. Mikrosatelitinių ţymenų metodo pritaikymas...... 23 1.4.5. Kiti metodai taikomi genetinės įvairovės tyrimuose...... 25 1.5. Jonaţolių genetinio profilio ryšys su antriniais junginiais...... 27 2. MEDŢIAGA IR METODIKA...... 29 2.1. Augalinės medţiagos rinkimo vietos...... 29 2.2. DNR išskyrimas...... 31 2.3. APPD analizės sąlygos...... 32 2.4. Populiacijų APPD analizės sąlygos...... 33 2.5. AP-PGR analizės sąlygos...... 34 2.6. AP-PGR produktų valymas...... 35 2.7. PKS analizės sąlygos...... 36 2.8. DNR elektroforezė agarozės gelyje...... 38 2.9. PGR fragmento ekstrakcija iš agarozės gelio...... 39 2.10. PGR fragmento pakartotinas pagausinimas...... 41 2.11. PGR fragmento klonavimo sąlygos...... 41 2.12. Plazmidţių išskyrimas iš ląstelių...... 43 2.13. Kapiliarinė elektroforezė ir DNR sekoskaita...... 44

3 2.14. Statistinė duomenų analizė...... 44 3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS...... 46 3.1. DNR išskyrimo iš keturbriaunės jonaţolės metodo parinkimas...... 46 3.2. APPD metodo sąlygų optimizavimas keturbriaunės jonaţolės genetinės įvairovės tyrimams...... 46 3.2.1. APPD PGR mišinio sudėties parinkimas...... 46 3.2.2. APPD DNR pagausinimo programos sąlygų optimizavimas...... 46 3.3. AP-PGR metodo sąlygų optimizavimas keturbriaunės jonaţolės genetinės įvairovės tyrimams...... 48 3.4. PKS metodo sąlygų optimizavimas keturbriaunės jonaţolės genetinės įvairovės tyrimams...... 56 3.4.1. Mikrosatelitinių pradmenų kūrimas...... 56 3.4.2. PKS metodo PGR mišinio sudėties parinkimas...... 57 3.4.3. PKS metodo pagausinimo programos sąlygų optimizavimas...... 58 3.4.4. PGR fragmento klonavimas...... 59 3.5. Keturbriaunės jonaţolės populiacijų genetinės įvairovė, įvertinta APPD metodu...... 61 IŠVADOS...... 72 LITERATŪROS SĄRAŠAS...... 74 PADĖKA...... 80 MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS IR PRANEŠIMAI...... 81 PRIEDAI...... 83

4 SANTRUMPOS AFIP – amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmas (angl. Amplified Fragment Length Polymorphism) AMOVA – molekulinės genetinės įvairovės analizė (angl. Analysis of Molecular Variance) AOX – alternatyvios oksidazės genas (angl. Alternative oxidase gene) APPD – atsitiktinai pagausinta polimorfinė DNR (angl. Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) AP-PGR – numatytų sekų polimerazinė grandininė reakcija (angl. Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction – AP-PCR) bp – bazių pora (angl. base pair) CTAB – cetiltrimetilamonio bromidas (angl. Cetyltrimethylammonium bromide) DNR – deoksiribonukleorūgštis (angl. Deoxyribonucleic acid, DNA) dNTP – deoksiribonukleotidai FCSS – srovės citometrinis sėklų įvertinimas (angl. Flow Cytometric Seed Screen, FCSS)

GDxy – genetinis atstumas tarp x ir y genotipų (angl. Genetic Distance)

Gst – genetinės diferenciacijos koeficientas (Nei, 1973) H – genetinė įvairovė (Nei, 1973) I – Šenono (Shannon‟o) informacinis indeksas ITS – transkriptų vidiniai skirtukai (angl. Internal Transcribed Spacer, ITS) IVNP – introno vieno nukleotido polimorfizmas (angl. Intron Single Nucleotide Polymorphism, ISNP) LC-MS/MS – skystinė chromatografija, masių spektrometrija

Na – stebimas alelių skaičius lokuse NCBI – nacionalinis biotechnologinės informacijos centras (angl. National Center for Biotechnology Information)

Ne – efektyvių alelių skaičius lokuse

Nm – genų srautas tarp populiacijų (angl. Gene flow) P – polimorfinių lokusų procentas PGR – polimerazinė grandininė reakcija (angl. Polymerase Chain Reaction, PCR) PKA – principinių koordinačių analizė (angl. Principal Coordinates Analysis, PCA) PKS – paprastosios kartotinės sekos (angl. Simple Sequence Repeat, SSR) PPSI – paprastųjų pasikartojančių sekų intarpai (angl. Inter-Simples Sequence Repeats, ISSR) RFIP – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmas (angl. Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) SDS – natrio dodecilsulfatas (angl. Sodium dodecyl sulphate)

5 UPGMA – porų grupavimo pagal aritmetinius vidurkius metodas su vienodais svoriais (angl. Unweighted Pair-Group Method of arithmetic Averages)

ΦPT – fiksacijos indekso FST analogas, populiacijų diferenciacijos matas

6 SANTRAUKA Autorius: Lina Zybartaitė Pavadinimas: Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum Crantz) Lietuvos populiacijų genetinė įvairovė Vadovas: prof. habil. dr. Eugenija Kupčinskienė Pristatyta: Vytauto Didţiojo Universitetas, Gamtos mokslų fakultetas, Kaunas, 2011, birţelis. Puslapių skaičius: 82 (87 įskaitant priedus) Lentelių skaičius: 37 Paveikslų skaičius: 23 Priedų skaičius: 2 Literatūros nuorodų skaičius: 76

Jonaţolės genties augalai – yra vieni iš pasaulyje daţniausiai naudojamų vaistinių augalų, dėl jos sudėtyje randamų naudingų antrinių metabolitų – flavonoidų bei eterinių aliejų. Antra pagal gausumą Lietuvoje šios genties rūšis – keturbriaunė jonaţolė yra maţiau ištirta. Darbo tikslu buvo pritaikyti molekulinės genetikos metodus keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum) Lietuvos populiacijų įvairovės tyrimams. Atrinktas DNR išskyrimo būdas silikagelio kolonėlėmis. Pritaikytos APPD ir AP-PGR metodų sąlygos: PGR mišinio komponentų koncentracijos, pagausinimo programos ciklai, laikas, temperatūros. Buvo siekiama parinkti tinkančias keturbriaunei jonaţolei paprastųjų kartotinių sekų (PKS) metodo sąlygas. Tuo tikslu sukurta 19 porų mikrosatelinių pradmenų, naudojant juos ieškota: tinkamiausių PGR mišinio komponentų koncentracijų, pradinio ir pakartotino DNR pagausinimo ciklų, jų trukmės ir temperatūros sąlygų. Atrinkti fragmentai buvo transformuoti į E. coli ląsteles. Atlikta keturbriaunės jonaţolės genetinės įvairovės analizė APPD metodu. Ištirta 12 skirtingų Lietuvos populiacijų po 15 individų, panaudojant 6 oligonukleotidinius pradmenis. Nustatyta, kad polimorfizmas tarp populiacijų svyravo 22 % (Paltupių) – 46 % (Daugodų) ribose (vidutinis – 36 %). Didesnė genetinės įvairovės dalis tenka tarppopuliacinei įvairovei – 58 %. Daugiausia (4) savitų fragmentų nustatyta Daugodų populiacijoje. Pagal genetinius atstumus labiausiai atsiskiria Paltupiai nuo Padubysio, Pajūrio ir Svėdasų populiacijų, panašiausios yra Kretingos, Girionių ir Katauskių populiacijos. Populiacijų grupavimas pagal genetinius atstumus neatspindėjo jų geografinės padėties. Didţiausiu genetiniu polimorfizmu pasiţyminčios Daugodų populiacijos lapų oksiduotų seskviterpenų procentinė koncentracija buvo didţiausia, ypač globulolio. Genetiškai išskirtiniausios, pagal UPGMA dendrogramą, Padubysio populiacijos lapų ir ţiedų seskviterpenų procentinė koncentracija buvo didţiausia, ypač germakreno D ir β-kariofileno.

7 SUMMARY Author of term paper: Lina Zybartaitė Full title of term paper: Genetic diversity of Hypericum maculatum Crantz populations growing in Lithuania Term paper advisor: Habitual Doctor in Biomedical Sciences, Professor Eugenija Kupčinskienė Presented at: Vytautas Magnus University, Faculty of Nature Sciences, Kaunas, 2011, June. Number of pages: 82 (87 including appendixes) Number of tables: 37 Number of figures: 23 Number of appendixes: 2 Number of references: 76

Due to secondary metabolites – flavonoids and essential oils Hypericum genus are among the most important world plants used for medicinal purposes. In Lithuania insufficient attention is paid to the second according to the abundance species of Hypericum genus – H. maculatum. The aim of this study was to develop and specialize molecular genetic methods for H. maculatum and based on it to evaluate genetic diversity of populations growing wild in Lithuania. For DNA extraction silica gel columns were selected. Main tasks were to specify RAPD and AP-PCR conditions such as: composition of PCR mix, the number of cycles, duration, temperatures for DNA amplification. For SSR application 19 microsatellite primer pairs were designed at the same time DNA amplification conditions like those mentioned for RAPD and AP-PCR were adjusted. Some selected bands were transformed into E. coli and later on amplification of SSR regions was performed. Genetic diversity of Lithuanian populations of H. maculatum was estimated using RAPD method. Twelve populations with 15 individuals in each were examined employing six 10-mer primers. The highest level of DNA polymorphism (46 %) was observed for Daugodai population, while the lowest (22 %) for Paltupiai population. Polymorphic loci mean for all populations was – 36 %. Molecular variance among populations was big enough 58 %. The highest number of private bands (4) were in Daugodai population. According to Nei„s distances the most contrasting were Paltupiai population compared to Padubysys Pajurys or Svedasai populations, while very similar were Kretinga, Girionys and Katauskiai populations. UPGMA dendrogram did not reflect geographic location of populations. The highest percentage concentration of oxygenated sesquiterpenes (especially globulol) was determined for the most polymorphic Daugodai population. The highest percentage concentration of sesquiterpenes especially germakrene D ir β-cariophylene) was observed for leaves and flowers of Padubysys population which was the most distinct one according to the UPGMA dendrogram.

8 ĮVADAS Jonaţolės (Hypericum spp.) yra daugiamečių, ţolinių augalų gentis, paplitusi visoje Europoje ir Azijoje. Lietuvoje labiausiai paplitusios dvi jonaţolės rūšys, tai paprastoji jonaţolė ( L.) ir keturbriaunė jonaţolė (Hypericum maculatum Crantz ar H. quadrangulum L.) (Snarskis, 1968; Jankevičienė, 1998). Tiek pasaulyje tiek ir Lietuvoje labiau ištirta paprastoji jonaţolė (Hypericum perforatum L.). Keturbriaunė jonaţolė kaip vaistinis augalas auginama Suomijoje. Hypericum genties augalai nuo senų laikų naudojami kaip vaistas gydant opas, nudegimus, ţaizdas, pilvo skausmus ir bakterines ligas. Pastaruoju metu atliekami šių augalų klinikiniai tyrimai, ieškant vaistų depresijos ir virusinių ligų gydymui (Butterweck 2003; Karppinen et al., 2007; Capasso et al.,

2004). Gamtinių H. perforatum ir H. maculatum populiacijų augalams būdingas didelis morfologinis ir cheminis polimorfizmas, todėl yra galimybė atrinkti augalus, kurie sukaupia daug veikliųjų medţiagų ir yra produktyvūs (Zobayed, Saxena, 2004). Tokius tyrimus labai palengvintų ir suteiktų jiems tikslumo molekulinės genetikos metodų pritaikymas. Pasaulio keturbriaunės jonaţolės tyrimuose naudojami įvairūs DNR analizės būdai. Atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR (APPD) metodas taikomas tirti dauginimosi apomiksio būdu dėsningumus (Arnholdt-Schmidt et al., 2000), palyginti natūraliai augančius ir iš audinių kultūrų sudaigintus augalus (Halušková, Košuth, 2003), nustatyti sąryšį tarp hipericino koncentracijos ir genetinio profilio (Smelcerovic et al., 2005; Tonk et al., 201) bei tarp fenolinių junginių kiekio ir genetinio profilio (Verma el al., 2007) taip pat įvertinanti genetinę įvairovę ir diferenciaciją tarp populiacijų ir jų viduje (Barcaccia et al., 2006). Amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmo tyrimas taikomas ištirti genetinius skirtumus tarp laukinių ir pramoniniu būdu auginamų H. perforatum populiacijų bei ploidiškumui įvertinti (Mayo, Langridge, 2003), nustatyti H. perforatum rūšiai būdingi speciniai ţymenys (Percifield et al., 2007). Chloroplastų DNR tyrimo metodas taikomas tirti skirtingų Hypericum rūšių chloroplastų DNR polimorfizmą (Pilepi, 2002). Taip pat naudojamas intronų polimorfizmo tyrimas atskirų H. perforatum individų identifikavimui (Ferreira et al., 2009), bei tiriamos branduolio ribosomų genų sekos rūšių filogenetiniams ryšiams įvertinti (Crockett et al., 2004). Lietuvoje H. perforatum L. ir H. maculatum Crantz aprašyti morfologiniai bruoţai, fenotipinių poţymių įvairovė, augaviečių charakteristika, antriniai metabolitai, ypač eterinių aliejų sudėtis (Radušienė ir kt. 2004; Kazlauskas, Bagdonaitė, 2004; Bagdonaitė, 2003b; Bagdonaitė ir kt. 2007; Radušienė ir kt. 2007; Mockutė ir kt., 2003). Kariologiniai H. perforatum L. ir H. maculatum Crantz tyrimai parodė, kad H. maculatum Botanikos instituto kolekciniuose pavyzdţiuose vyrauja diploidinis

9 chromosomų rinkinys, tuo tarpu H. perforatum kolekciniuose pavyzdţiuose aptinkamas tetraploidinis ir heksaploidinis chromosomų rinkiniai (Bagdonaitė, 2003a). Genetiniame lygmenyje Lietuvos H. perforatum L. ir H. maculatum Crantz nėra analizuotos. Tyrimo tikslas – pritaikyti molekulinės genetikos metodus keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum Crantz) tyrimams ir jų pagrindu ištirti šio augalo Lietuvos populiacijų įvairovę.

Tyrimo uţdaviniai: 1. Nustatyti tinkamiausią H. maculatum DNR išskyrimo metodą. 2. Pritaikyti APPD metodo sąlygas tinkančias H. maculatum genetinės įvairovės tyrimams. 3. Parinkti AP-PGR metodo sąlygas tinkančias H. maculatum genetinės įvairovės tyrimams. 4. Įsisavinti paprastųjų kartotinių sekų metodiką pritaikant jas H. maculatum genetinės įvairovės tyrimams. 5. APPD metodu ištirti Lietuvoje augančios H. maculatum genetinę įvairovę. 6. Palyginti H. maculatum populiacijų genetinį polimorfizmą su eterinių aliejų kiekybine sudėtimi.

10 1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Jonaţolės (Hypericum spp.) genties sistematinė, morfologinė-fiziologinė charakteristika Pagal naujausią pasaulio klasifikaciją jonaţolė (Hypericum) priklauso Angiospermae poklasiui, Fabanae anteiliui, eilei, šeimai (APG III, 2009). Pagal Tahtajan (1997) metų klasifikaciją (paplitusią Lietuvoje), ši gentis priklauso Magnoliophyta skyriui, Magnoliopsida klasei, Dilleniidae poklasiui, Theales eilei, Clusiaceae šeimai. Jonaţolės genties augalai – tai daugiametės, labai retai vienametės ţolės arba puskrūmiai bei krūmai. Lapai priešiniai, retkarčiais menturiniai, lygiakraščiai, be prielapių, bekočiai arba trumpakočiai, su 2 rūšių sekrecijos liaukutėmis, kurių vienos ţiūrint į lapą atrodo kaip peršviečiami taškeliai, o kitos – pigmentuotos, juodų neperšviečiamų taškelių pavidalo. Ţiedai pavieniai arba grupėmis susitelkę skydiškuose arba šluotelės pavidalo ţiedynuose, taisyklingi, dvilyčiai. Vainiklapiai 5, retkarčiais 4, geltoni, skaisčiai arba tamsiai geltoni, išorinėje pusėje kartais purpuriniai arba roţiniai. Mezginė viršutinė, su 3–5 lizdais, retkarčiais vienalizdė; liemenėliai 3–5, laisvai arba tarpusavyje suaugę. Vaisius – su 3–5 lizdais, kartais vienalizdė, sąvaromis atsidaranti dėţutė, retkarčiais uogos pavidalo vienalizdis, neatsidarantis.

a) b) 1.1 pav. Jonaţolių skiriamieji poţymiai: a) keturbriaunės, b) paprastosios

11

Gentyje yra apie 200 rūšių, paplitusių vidutinio klimato, paatogrąţių ir atogrąţų srityje, ypač daug Vidurţemio pajūrio srityje. Lietuvoje – 6 rūšys (Snarskis, 1968), iš jų labiausiai paplitusios dvi: paprastoji ir keturbriaunė jonaţolė (1.1 pav.).

Keturbriaunė jonaţolė (H. maculatum Crantz) Stiebas nesparnuotas, stačias, keturbriaunis. Lapai priešiniai, kiaušiniški arba ovališki, be peršviečiamų arba su nedaug peršviečiamų taškelių. Taurėlapiai elipsiški arba ovališki, buki, su juodomis taškinėmis liaukutėmis apatinėje pusėje, maţdaug tokio pat ilgio kaip mezginės. Vainiklapiai geltoni, padengti juodų taškinių liaukučių. Daugiametis, su ilgomis palaipomis plikas augalas. Aukštis 20–70 cm. Ţydi birţelio–rugsėjo mėnesiais. Auga mišriuose ir lapuočių miškuose, pievose, pagrioviuose. Lietuvoje daţna. Paprastoji jonaţolė (H. perforatum L.) Stiebas dvibriaunis – su dviem išilginėmis briaunomis šonuose. Lapai priešiniai, pailgai kiaušiniški, pailgi arba linijiški, su gausiais peršviečiamais taškeliais. Taurėlapiai lancetiški, lygiakraščiai arba kartais su retomis liaukutėmis pakraščiuose, maţdaug du kartus ilgesni uţ mezgines. Vainiklapiai tamsiai geltoni. Daugiametis. Aukštis 30–80 cm. Ţydi birţelio–rugsėjo mėnesiais. Auga miškuose, pievose, pagrioviuose, dirvonuose. Lietuvoje daţna (Lekavičius, 1989). Nustatyta, kad Lietuvos H. perforatum augaviečių dirvoţemio vidutinis fosforo kiekis 102,06 mg/kg, kalio – 185,24 mg/kg. Gamtinių H. maculatum populiacijų dirvoţemio vidutinis fosforo kiekis – 105,10 mg/kg, kalio kiekis – 299,43 mg/kg (Bagdonaitė, 2003a; b). Dirvoţemis vidutinio humusingumo (2,2 %) bei maţo rūgštumo (pH 5,4). H. perforatum ir H. maculatum vegetacijos trukmė 165–183 dienos, tačiau fenofazių eiga skirtingais metais įvairuoja ir priklauso nuo meteorologinių sąlygų. Augimo intensyvumo stebėjimai rodo, kad H. perforatum augalai stipriausiai auga iki butonizacijos pradţios, vėliau augimas lėtėja, o ţydėjimo pabaigoje augalai nustoja augti. H. maculatum augalai intensyviausiai auga iki butonizacijos pradţios, butonizacijos metu augalų augimo intensyvumas lėtėja, o nuo ţydėjimo iki sėklų brandos pradţios jie auga dar lėčiau, galiausiai nustoja augti. Nustatyta, kad H. perforatum Vilniaus Botanikos instituto kolekciniai augalai yra homogeniški pagal aukštį (V=6,47–14,69 %), vainiklapių ilgį (V=6,85–12,97 %) bei jų plotį (V=3,40–20,59 %) ir taurėlapių ilgį (V=9,47–13,98 %), o labiausiai įvairuoja pagal viso augalo (V=29,90–60,36 %) ir jo ţiedų (V=29,53–69,60 %), lapų (V=31,35–60,40 %) bei stiebų (V=30,01–67,17 %) masę. H. maculatum kolekciniai pavyzdţiai homogeniškiausi buvo pagal augalų aukštį (V=9,18–13,68 %), vainiklapių ilgį (V=9,93–22,88 %) ir jų plotį (V=10,28–21,36 %), taurėlapių ilgį (V=11,10–27,18 %), o 12 labiausiai įvairavo pagal viso augalo (V=27,18–79,99 %) ir jo ţiedų (V=43,85–94,71 %), lapų (V=32,77–64,57 %) bei stiebų (V=30,56–70,44 %) masę (Bagdonaitė, 2003 b).

1.2. Jonaţolių citogenetiniai poţymiai Viena iš svarbiausių augalo citologinių charakteristikų yra chromosomų skaičius (Robson, 2002). Paprastoji jonaţolė yra tetraploidinė rūšis (2n = 4x = 32) su pradiniu chromosomų skaičiumi (x = 8). Ši rūšis kilo susikryţminus diploidams H. maculatum Crantz ir H. attenuatum L. (Brutovska et al., 1998). Paprastosios jonaţolės individai besidauginantys nelytiškai taip pat gali būti tetraploidai, heksaploidai, diploidai ir aneuploidai. H. perforatum chromosomų skaičiaus įvairavimas susijęs su specifiniu dauginimosi būdu – fakultatyvine apomikse ir tarprūšine hibridizacija. Apomiksė tai belyčio (be gametų susiliejimo) dauginimosi būdas, susidarant sėkloms. Palikuonys gauti apmiksės būdu yra tiksli motininio augalo kopija (Savidan, 2000). Apomiksiniu būdu susidariusios sėklos turi 4x gemalą ir 10x endospermą. Lytiniu dauginimosi metu uţsimezgę sėklos turi 4x gemalą ir 6x endospermą. Vilniaus Botanikos instituto jonaţolių kolekcijoje vyrauja diploidinis (2n = 16) H. maculatum chromosomų rinkinys. Srovės citometriniu metodu (FCSS) buvo nustatytas gemalo ir endospermio DNR kiekis branduolyje. H. maculatum yra diploidas ir dauginasi lytiniu būdu, nes visų tirtų sėklų gemalas buvo 2x, o endospermas 3x. H. perforatum kolekciniuose augaluose buvo rasti tetraploidinis (2n = 32) ir heksaploidinis (2n = 48) chromosomų rinkiniai (Bagdonaitė, 2003a). Buvo palyginta diploidinių ir tetraploidinių daigų (pavienių individų) antrinių metabolitų sudėtis. Analizė atskleidė, kad šio vystymosi tarpsnio augalai su skirtingu ploidiškumu reikšmingai nesiskiria pagal antrinius junginius (Košuth et al., 2003). Genetiniai jonaţolės tyrimai atliekami, tam kad būtų galima identifikuoti genetinį tapatumą ir išteklius, gali padėti išveisti genetiškai palankiausias rūšis, taip pat genetinių tyrimų išvados gali būti kaip įrankis gamintojams, kuriant geriausius vaistinės ţaliavos ruošinius (Percifield et al., 2007).

1.3. Jonaţolių antriniai metabolitai

Molekuliniai ţymenys – tai organizmų biocheminės sudėtinės dalys: pirminiams metabolitams priskiriamos makromolekulės (pvz., baltymai ir DNR) bei antriniai metabolitai. Šių junginių nustatymas yra labai svarbus taksonomijai, filogenetiniam giminingumai tirti, augalų rūšių nustatymui, fiziologijai, embriologijai, augalų dauginimui, geografinės variacijos identifikavimui, ekologijai ir t.t. Molekuliniai ţymenys pritaikomi genų inţinerijoje, augalų genetinių ţemėlapių sudarymui, genetinės

13 įvairovės tyrimams, ypač svarbūs augalinės kilmės vaistų kūrimui, farmakologiniam apibūdinimui. Šios krypties darbų standartizacija ir kokybė turi būti labai tiksli (Joshi et al., 2004). Be pirminių metabolitų, kurie aptinkami visuose augaluose, yra didelė įvairovė savitų antrinių metabolitų. Šie antriniai metabolitai augalams reikalingi savęs apsaugojimui, ryšio su aplinka palaikymui. Antriniai metabolitai skirstomi į šias grupes: sudėtiniai alkaloidai, izoprenoidai, fenilpropanoidai. Daugelis jų skirti apsiginti nuo gyvūnų ir mikroorganizmų. Alkaloidai sintetinami iš amino rūgščių ir turi vieną ar kelis N atomus. Alkaloidai daţniausiai yra laikomi protonuotoje formoje vakuolėse. Izoprenoidai būdingi visiems augalams. Iki 1997 metų nustatyta daugiau nei 23 tūstančiai izoprenoidų ir nustatomi vis nauji (Heldt, 2005). Pirminiame metabolizme jie funkcionuoja kaip membranos sudedamosios dalys, fotosintetinantys pigmentai, elektronų pernešėjai ir augalų hormonai. Dauguma izoprenoidų gaminami kaip atsakas į bakterinę ar grybinę infekciją. Kai kurie augalų sintetinami izoprenoidai, stabdo konkurentinių augalų sudygimą ir vystymąsi. Kiti izoprenoidai, kurie augalui suteikia spalvą arba kvapą, pasitarnauja priviliojant vabzdţius ţiedadulkių ir sėklų pernešimui. Augalų izoprenoidai yra svarbūs įvairiai pramonei, kaip junginiai maistui, gėrimams ar kosmetikai suteikiantys kvapus, natūralūs insekticidai, tirpikliai, guma. Augalų izoprenoidai yra svarbūs farmacijoje. Vykdomi tyrinėjimai, siekiant genetinės inţinerijos būdu padidinti augalų gaminamų izoprenoidų kiekį. Izoprenoidai dar vadinami terpenoidais. Lakūs terpenoidai – eteriniai aliejai seniai domina chemikus. Eteriniuose aliejuose gausu ciklinių darinių su 10, 15, 20 ar daugiau C atomų. Šių junginių randama daugelyje augalų, tame tarpe ir jonaţolėse. Eteriniai jonaţolių aliejai tyrinėti visame pasaulyje (Saroglou et al., 2006; Smelcerovic et al., 2007), tame tarpe ir Lietuvoje (Mockutė ir kt., 2003). Ištirta paprastosios jonaţolės, augančios Rytinėje Lietuvoje, cheminė eterinio aliejaus sudėtis. Identifikuoti 46 junginiai sudarė 85,3–97,2 % tirtų eterinių aliejų. Nustatyta, kad didţioji dalis lakiųjų junginių yra seskviterpenoidai. Antrinių metabolitų analizė yra skirta tik tam tikrų rūšių augalams, gaminantiems tam tikrą antrinių metabolitų grupę, kuri gali būti lengvai analizuojama ir yra rūšį išskiriantis poţymis. Tyrinėjant augalus labai svarbu nustatyti tikslią augalo rūšį. Botaninių preparatų apibūdinimo standartizavimas chromatografine technika turi trūkumų, nes sudėtinės dalys ir cheminių junginių santykiniai kiekiai tarp skirtingų rūšių varijuoja, dėl augimo, derėjimo ir laikymo sąlygų. Dėl panašios cheminės sudėties labai sunku atskirti glaudţiai susijusias rūšis. Paprastai cheminis antrinių metabolitų identifikavimas yra nepakankamas, kad leistų lengvai paaiškinti rezultatus. Todėl labai svarbu plėtoti efektyvesnę, tikslesnę, patikimesnę ir jautresnę technologiją apibūdinant augalus (Sharma et al., 2008). Jonaţolės yra plačiai naudojamos fitofarmacinėje pramonėje, todėl labai svarbu plėtoti jų ţymenų sistemą, kuri turėtų būti nebrangi ir patikima, tiksliai identifikuotų H. perforatum augalus, kad 14 padėtų gamintojams apsaugoti vartotojus nuo negrynos produkcijos (Percifield et al., 2007), nes veikliųjų medţiagų koncentracijų svyravimai gali priklausyti nuo augalų geografinės padėties, aplinkos veiksnių, augalo vidinių savybių, genetinių ypatumų, genetinės informacijos realizavimo ypatumų (Nahrstedt et al., 1997). Vaistinė ţaliava – natūraliai augančios arba auginamos jonaţolės ţolė – lapuotos stiebų viršūnės su ţiedais, ţiedpumpuriais, kartais neprinokusiais vaisiais. Ţolė daţniausiai renkama ţydėjimo metu, kol susiformuoja vaisiai. Kerpamos viršūnėlės iki 25 cm be sumedėjusių pagrindinių stiebelių. H. perforatum populiacijose vidutinis ţiedyno ilgis yra 20,9 cm, o H. maculatum – 17,6 cm, todėl vaistinei ţaliavai geriausiai rinkti ne ilgesnius kaip 30 cm ţydinčius ūglius (Bagdonaite, 2003a). Jonaţolės ţolė veikia spazmolitiškai, palengvina tulţies, šlapimo išsiskyrimą, pagreitina šlapimo filtravimo inkstuose procesą, stiprina kapiliarų sieneles, gerina veninio kraujo apykaitą ir vidaus organų kraujotaką. Jonaţolės ekstraktai sėkmingai vartojami sergant neurozėmis, depresija, ypač menopauzės metu ir išsekus organizmui. Preparatai naikina mikrobus, gydo ţaizdas, nudegimus, regeneruoja paţeistas organizmo ląsteles, skatina medţiagų apykaitą, gerina savijautą, ramina nervus. Jonaţolės preparatai vartojami sergant skrandţio ir ţarnyno ligomis (opos, viduriavimas, gastroenteritas), gydant nuo naktinio šlapinimosi į lovą, hemorojaus, podagros, tuberkuliozės, gerklės, nosies gleivinės uţdegimo. Išoriškai gydomi odos nudegimai, furunkulai, ţaizdos, nosies ir ryklės gleivinės uţdegimai (Ragaţinskienė ir kt., 2005). Taip pat vartojama ir inhaliacijos būdu, sergant plaučių uţdegimu, osteomielitu (Pipinys ir kt., 1973). Paprastosios jonaţolės veikliųjų medţiagų kiekio ir kitimo dėsningumai įvertinti didelio slėgio skysčių chromatografijos metodu. Paprastosios jonaţolės veikliųjų medţiagų koncentracijos labai kinta. Pastebėta, kad svarbiausia veiklioji jonaţolės medţiaga – hipericinas pasiţymi su šviesa susijusiu biologiniu aktyvumu, nukreiptu prieš vabzdţius, mikroorganizmus ir virusus (Towers et al., 1997). Dėl insekticidinio hipericino veikimo, buvo pastebėta, kad vabzdţiai, besimaitinantys jonaţolės lapais, ne tik pakoregavo savo maitinimosi būdą vengdami lapo dalių, kuriose gausu tamsiai raudonos spalvos leukučių, turinčių hipericino, bet ir demonstruoja neigiamą fototaksį, vengdami fototoksinio hipericino poveikio (Guillet et al., 2000). Pagrindinės Hypericum rūšies veikliosios medţiagos yra naftodiantronai (hipericinas ir pseudohipericinas), flavonoidai (hiperrozidas, rutinas, kvercitrinas) ir floroglucinolio dariniai (hiperforinas, adhiperforinas; Nahrstedt, Butterweck, 1997). Paprastosios jonaţolės vaistinėje ţaliavoje susikaupia daug rutino ir izokvercitrino. Lietuvos paprastosios jonaţolės ţiedų ekstrakte rutino vidutinis kiekis buvo 9,68 ± 0,30 mg/g, izokvercitrino – 9,47 ± 0,68 mg/g, kvercetino – 2,43 ± 0,20 mg/g, hipericino – 0,26 ± 0,03 mg/g (Kazlauskas, 15 Bagdonaitė, 2004). Nustatyta, kad lapuose susikaupia didesni rutino, o ţieduose – kvercetino, izokvercitrino ir hipericino kiekiai. Jonaţolės ţieduose – rasta vidutiniškai 29 % didesnis hipericino kiekis, palyginus su lapais. Ţieduose didėjant hipericino kiekiui, maţėja kvercetino kiekis. Pastebėta, kad veikliųjų medţiagų kiekio kitimas susijęs su augalų augimo sezoniškumu. Didţiausias veikliųjų medţiagų kiekis augalinėje ţaliavoje rastas butonizacijos ir ţydėjimo metu. Rutino kiekis pasiekia maksimumą vegetatyvinio vystymosi tarpsnio pabaigoje (17,7 mg/g), butonizacijos metu jo neţymiai sumaţėja (15,11 mg/g). Izokvercitrino daugiausia yra butonizacijos metu (10,7 mg/g), vėliau kiekis maţėja, maţiausiai izokvercitrino rasta lapuose ţydėjimo laikotarpiu (6,7 mg/g). Kvercetino minimalus kiekis rastas vegetacijos pradţioje (1,2 mg/g), butonizacijos metu, kvercetino kiekis ţymiai padidėja (1,5 mg/g), didėjimas tęsiasi iki pilno ţydėjimo. Ţieduose susikaupia maksimalus kvercetino kiekis (3,1 mg/g). Hipericino kiekis vegetacijos pradţioje varijuoja nuo 0,04 iki 0,14 mg/g, vėliau, prasidėjus butonizacijai, jo kiekis intensyviai didėja ir maksimumą pasiekia ţydėjimo metu. Pastebėtas didelis hipericino ir flavonoidų kiekio įvairavimas natūraliose paprastosios jonaţolės augavietėse, tai suteikia galimybę atrinkti vertingus augalų bandinius vykdant tolesnę jų atranką ir apsaugą lauko kolekcijoje. Lietuvos paprastoji jonaţolė pasiţymi didele morfologine ir chemine įvairove ex situ sąlygomis. Hipericino ir flavonoidų kiekiai svyruoja tiek tarp Vilniaus botanikos sodo kolekcinių pavyzdţių, tiek ir jų viduje – tarp morfotipų (Bagdonaitė ir kt. 2007). Lietuvos jonaţolių morfologinės– biocheminės savybės lyginamos su Šiaurės Turkijoje augančiomis jonaţolėmis (Cirak et al., 2007).

1.4. Jonaţolių genetiniai tyrimo metodai Antrinių metabolitų kokybinės ir kiekybinės analizės duomenimis negalima visiškai pasikliauti, interpretuojant gaunamus rezultatus. Todėl labai svarbu plėtoti našesnę, tikslesnę ir patikimesnę technologiją apibūdinant augalus. Metabolitai, kuriuos norima naudoti kaip ţymenis, turi būti idealiai neutralūs aplinkos pokyčiams. Iš visų molekulinių ţymenų, DNR ţymenys yra tinkamiausi ir aptinkami daugumoje gyvų organizmų. Tyrinėjant augalus labai svarbu nustatyti tikslią augalo rūšį. Pastaraisiais metais augalų identifikavimui pritaikomi įvairūs DNR analizės metodai, specifinių genų sekoskaita ir sudėtingos schemos hibridizacija, tokia kaip mikrogardelės. Nuo to laiko kai 1980 m. buvo parengta metodika polimerazinei grandininei reakcijai (PGR; Saiki et al., 1985) prasidėjo genomų tyrimai panaudojant DNR ţymenis. Tai palengvino DNR ţymenų taikymą agronomiškai svarbių genų klonavimui, įvairovės tyrinėjimams, filogenetinės analizės tyrimams, ieškomų genotipų selekcijai. DNR ţymenys pateikia objektyvius augalų analizės duomenis, tuo jie yra pranašesni prieš tradicinius fenotipinius ţymenis.

16 Genetinis polimorfizmas apibrėţiamas, kaip genetinių savybių įvairovė toje pačioje populiacijoje, pasiţyminčioje dviem ar daugiau genotipais. DNR sekoskaita yra brangus ir kruopštumo reikalaujantis metodas, bet tai yra labai tikslus būdas apibūdinant lokusų pakitimus. Pastaraisiais metais išvystyta daug metodų DNR sekų polimorfizmo nustatymui (Sharma et al., 2008). Molekulinių metodų naudojimas augalų sėklų gemalinių audinių charakterizavimui, tampa vis svarbesnis tyrinėjant genetinius išteklius, bet kiekvienas molekulinis metodas turi trūkumų, dėl to visame pasaulyje kuriami didelės apimties informacijos sėklų genų bankai, kad perspektyvoje tyrimams būtų galima panaudoti naujų ţymenų. Izozimų ir / ar DNR duomenų bazės išvystymas būtinas įvairovės / rūšies identifikavimui ir apsaugai. DNR pirštų atspaudų metodas leidţia išsamiai apibūdinti augalinę ţaliavą ir jos produktus, augalų veisimui ir našumui padidinti. Yra daug polimorfinių ţymenų tinkančių genotipų identifikavimui. Analizės būdas (ribotaipingas, APPD, pirštų antspaudų metodas, AFIP metodas ar mikrosatelitinių ţymenų metodas ir t.t.) pasirenkamas priklausomai nuo tyrimo tikslo (Smelcerovic et al., 2005).

1.4.1. Atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR metodo pritaikymas Lyginant su kitais molekuliniais metodais (pvz. AFIP) atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR (APPD, angl. Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) metodas nėra sudėtingas, galima naudoti skirtingus pradmenis, kurie pagausina vieną arba kelias genomo sekas. Todėl nevienodos kilmės genomų skirtumai gali būti greitai patikrinti (Arnholdt-Schmidt et al., 2000). APPD metodas susijęs su DNR pagausinimu polimerazinės grandininės reakcijos metu. Taikant šį metodą naudojami pradmenys prikimba prie DNR komplementarių sričių. DNR sekoje pradmeniui komplementarių sričių gali būti daug, todėl PGR reakcijos metu susidaro įvairaus ilgio fragmentai, kuriuos galima atskirti elektroforezės metu. Netgi labai artimai susiję individai gali turėti skirtingus pagausintus produktus, nes naudojami atsitiktinai sukurti pradmenys skirtingų individų ir taksonų polimorfinės DNR sritims identifikuoti. APPD metodas daţnai naudojamas nustatyti genetinius skirtumus tarp rūšių, ypač artimai susijusių, be to, neretai sėkmingai pritaikomas filogenetiniuose tyrinėjimuose nustatant ryšius rūšies viduje. APPD būdu gauti duomenys ne visada pakartojami, nes metodas labai jautrus PGR sąlygoms, be to panašių fragmentų homologijos prieţastis skirtinguose taksonuose gali būti neaiški. Genetinė įvairovė dėl sukeltų mutacijų ne visada aptinkama APPD metodu (Fourré et al., 1997; Simpson, 2010). Pasitelkiant APPD metodą, buvo tirta Vokietijoje augančios H. perforatum L. kryţmadulka. Buvo lyginami augalai, sudaiginti iš botanikos sodo kolekcijos sėklų (Arnholdt-Schmidt et al., 2000), ir iš laukinių populiacijų kolekcijos sėklų, ţinant sėklų kilmę. Tyrime panaudoti 6 APPD pradmenys (1.1 lentelė). 17 1.1 lentelė. APPD pradmenys naudoti Vokietijos jonaţolės tyrimams (Arnholdt-Schmidt et al., 2000) Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens pavadinimas seka 5′→3′ pavadinimas seka 5′→3′ 001 GGTGCGGGAA 020 TCTCCCTCAG 006 CCCGTCAGCA 025 TGAGCGGACA 026 ACCTGAACGG 029 CTCTGGAGAC

Nustatyta, kad APPD metodu individai, išauginti iš to paties tėvinio organizmo sėklų lengvai atskiriami nuo kitų ir pagal šiuos rezultatus galima apskaičiuoti kryţmadulkių augalų procentą. APPD metodas buvo pritaikytas palyginti natūraliai genetiškai pakitusios ir iš audinių kultūros išaugintos paprastosios jonaţolės DNR. Somatoklonai auginti in vitro iš 14 donorinių augalų, iš kurių 7 buvo kilę iš ʻTopasʼ veislės, kiti 7 iš R1 augalų, išaugintų iš 5 gamtinių R0 Hypericum perforatum somatoklonų. Hypericum perforatum DNR įvairovė įvertinta sudaiginus 75 augalus in vitro, iš ʻTopasʼ motininių augalų (skirtingų nei prieš tai naudotų donorinių augalų) ir 47 diploidinių augalų. Hypericum perforatum DNR pagausinimo tyrimuose išbandyta 40 APPD pradmenų (30 Roth ir 10 Life Technologies) ir tolimesniems tyrimams atrinkti 2 Roth pradmenys: 160–10 (5‟-GCAGACTGA G-3‟) ir 360–10 (5„-GAGCAGGCTG-3‟), su kuriais APPD profiliai atsikartodavo. APPD analizės metodu nustatyti DNR pakitimai somatokloniniuose Hypericum perforatum L. augaluose, kurie auginami vieną ar du regeneracijos ciklus in vitro. Naudojant pradmenį 360–10 nustatyta, kad iš vieno motininio augalo kilę augalai turėjo identiškus APPD profilius. Palyginus visus augalus, sudaigintus iš 8 skirtingų motinių augalų nustatyta, kad kai kurie neturi dviejų fragmentų. Augalai, kurie buvo sudaiginti iš to paties motinio augalo ir turėjo du polimorfinius fragmentus identifikuoti kaip Hypericum perforatum diploidai (Halušková, Košuth, 2003). Ieškant sąryšio tarp genetinio profilio ir hipericino kiekio APPD metodu buvo ištirta 11 H. perforatum klonų, išaugintų iš įvairiose Turkijos vietovėse surinktų sėklų (Tonk et al., 2011), atrenkant pagal vertingiausias agronomines ir technologines savybes. Kaip kontrolė naudota lenkiška veislė ʻTopazʼ (Seidler-Lozykowska, Dabrowska, 1996). Išbandyti 26 APPD dešimties nukleotidų ilgio pradmenys (1.2 lentelė).

18 1.2 lentelė. APPD pradmenys, naudoti Turkijos jonaţolės tyrimams (Tonk et al., 2011) Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens pavadinimas seka 5′→3′ pavadinimas seka 5′→3′ pavadinimas seka 5′→3′ OPA-16 AGCCAGCGAA OPC-13 AAGCCTCGTC OPG-11 TGCCCGTCGT OPAG-02 CTGAGGTCCT OPC-14 TGCGTGCTTG OPG-13 CTCTCCGCCA OPAG-04 GGAGCGTACT OPC-15 GACGGATCAG OPG-15 ACTGGGACTC OPAG-06 GGTGGCCAAG OPC-16 CACACTCCAG OPC-18 TGAGTGGGTG OPB-15 GGAGGGTGTT OPE-03 CCAGATGCAC OPC-19 GTTGCCAGCC OPC-06 GAACGGACTC OPE-10 CACCAGGTGA OPC-20 ACTTCGCCAC OPC-10 TGTCTGGGTG OPE-14 CCAGATGCAC OPE-02 GGTGCGGGAA OPC-11 AAAGCTGCGG OPG-02 GGCACTGAGG OPC-17 TTCCCCCCAG OPC-12 TGTCATCCCC OPG-09 CTGACGTCAC

Pradmenys generavo 378 skirtingus lokusus, 298 iš jų buvo polimorfiniai (polimorfizmo lygis 76 %), kiekvienas pradmuo turėjo nuo 1 iki 23 polimorfinių lokusų. Polimorfizmo lygis naudojant skirtingus pradmenis svyravo nuo 33 % iki 100 %. Nustatyta, kad APPD analize galima sėkmingai tyrinėti jonaţolės genetinę įvairovę ir klonų giminingumą. Naudojant APPD metodą ištirta šiaurės rytų Italijos 15 paprastosios jonaţolės populiacijų genetinė įvairovė ir diferenciacija populiacijų viduje (Barcaccia et al., 2006). Iš kiekvienos populiacijos buvo atsitiktinai surinkta po 12 individų, vėliau pasirinktos 9 išsiskirtiniausios populiacijos bei viena veislė ʻTopazʼ ir auginant šiltnamyje analizuota po 30 iš sėklų išaugusių individų. Analizė atlikta panaudojant 14 APPD pradmenų (1.3 lentelė).

1.3 lentelė. APPD pradmenys, naudoti Italijos jonaţolės tyrimams (Barcaccia et al., 2006) Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens pavadinimas seka 5′→3′ pavadinimas seka 5′→3′ pavadinimas seka 5′→3′ OP-A1 CAGGCCCTTC OP-B19 ACCCCCGAAG OP-D19a CTGGGGACTT OP-A4 AATCGGGCTG OP-C6a GAACGGACTC OP-D20 ACCCGGTCAC OP-A9 GGGTAACGCC OP-C7a GTCCCGACGA OP-Q2 TCTGTCGGTC OP-B12 CCTTGACGCA OP-C11 AAAGCTGCGG OP-Q11 TCTCCGCAAC OP-B13 TTCCCCCGCT OP-C19 GTTGCCAGCC

Iš viso suskaičiuoti 102 APPD lokusai. Atskirų individų DNR analizė parodė, kad populiacijų viduje individai gana vienodi, genetinis panašumas svyravo nuo 0,857 iki 0,994. Visos tirtos vietinės populiacijos buvo multikloninės. Naudojant APPD metodą ištirta Serbijoje augančių Hypericum genties genetinė įvairovė (Smelcerovic et al., 2005). Iš 52 patikrintų pradmenų 10 generavo optimalius APPD profilius (1.4 lentelė).

19 1.4 lentelė. APPD pradmenys, naudoti Serbijos jonaţolės tyrimams (Smelcerovic et al., 2005) Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens pavadinimas seka 5′→3′ pavadinimas seka 5′→3′ pavadinimas seka 5′→3′ PL-4 GGACTGGAGT PL-143 TCAGGGAGGT PL-160 AACGGTGACC PL-51 AGCGCCATTG PL-145 GACGGATCAG PL-175 CCAGATGCAC PL-71 AAAGCTGCGG PL-146 AAGACCCCTC PL-126 GGGAATTCGG PL-159 ACGGCGTATG

Naudojant šiuos pradmenis gauta 111 polimorfinių lokusų. Gautų lokusų skaičius svyravo nuo 4 iki 10, vidutinis lokusų skaičius vienam pradmeniui buvo 7. Pagausintų atkarpų dydis svyravo nuo 50 iki 2500 bp. Polimorfinių lokusų skaičius pradmeniui sudarė 93 % ir svyravo nuo 81 % iki 100 %. APPD metodu ištirta 8 Indijos vietovių paprastoji jonaţolė (Verma el al., 2007). Iš 49 atsitiktinai pasirinktų pradmenų tik 9 generavo polimorfinius lokusus (1.5 lentelė).

1.5 lentelė. APPD pradmenys, naudoti Indijos jonaţolės tyrimams (Verma el al., 2007) Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens Pradmens pavadinimas seka 5′→3′ pavadinimas seka 5′→3′ pavadinimas seka 5′→3′ PL 7 GGTGACGCAG PL 20 GGACCCTTAC PL 139 CCTCTAGACC PL 17 AGGGAACGAG PL 42 GGACCCAAGG PL 151 GAGTCTCAGG PL 18 CCACAGCAGT PL 63 GGGGGTCTTT PL 159 AACGGTGACC

Iš 93 lokusų, gautų naudojant šiuos pradmenis 63 buvo polimorfiniai. Kiekviename individe lokusų skaičius svyravo nuo 4 iki 11, o pagausintų produktų dydis įvairavo nuo 50 bp iki 2500 bp. Vidutinis lokusų skaičius vienam pradmeniui įvairavo nuo 5 iki 16.

1.4.2. Numatytų sekų polimerazinės grandininės reakcijos metodas Santykinai neapibrėţtų genomų tyrimuose, kai tiriama daug lokusų taikomas numatytų sekų polimerazinės grandininės reakcijos metodas – AP-PGR metodas (angl. arbitrarily primed polymerase chain reaction – AP-PCR). Tuomet, jei rūšys pasiţymi pakankamu polimorfizmu, šiuo metodu galima greitai patikrinti daug lokusų. AP-PGR profiliai ypač informatyvūs augalams, nes augalų sekų įvairovė yra didesnė negu kitų organizmų. Pagrindinis metodo privalumas, kad galima patikrinti daug genų net neţinant konkrečios jų sekos. Jei randamas specifinis fragmentas reikia atlikti papildomus tyrimus (Micheli, Bova, 1997). AP-PGR naudojami du atsitiktiniai pradmenys, daţniausiai ilgesni nei APPD (Power, 1996). Pagrindinis šio metodo minusas yra toks, kad pradmenys prie DNR sekos prikimba atsitiktinai, o ţymenys yra dominantiniai. Šis metodas gali būti pritaikytas ne tik genominės DNR tyrimuose, bet ir RNR tyrimuose. Taip pat gali būti naudojamas tiriant genų ekspresijos pokyčius. AP-

20 PGR produktų pagausinimui naudojama programa daţniausiai susideda iš dviejų ciklų, kuriuos sudaro ne tokios grieţtos sąlygos (denatūracijos laikas, pradmens prikibimo temperatūra, fragmento ilginimo laikas), kuriuos vėliau keičia daug ciklų grieţtesnėmis sąlygomis. Esant pakankamai ţemai temperatūrai pradmenys gali prikibti prie daugiau sekų, bet su didesne nesutapimų tikimybe. Fragmento ilginimo laikas priklauso nuo kiekvieno pradmens iš pradmenų poros gebėjimo prikibti prie sekos ir ilginimo efektyvumo. Pirmuose cikluose dominuoja pradmenų prikibimas, vėlesniuose – pradmenų ilginimas. Fragmentų atsikartojamumas ir intensyvumas priklauso nuo įvairių parametrų, tokių kaip: druskų koncentracijos reakcijos mišinyje, pradmenų prikibimo temperatūros, DNR koncentracijos, pradmens ilgio ir pradmens sekos. Specifinės AP-PGR pradmenų poros gali būti naudojamos identifikuojant genus tam tikrose rūšyse ar veislėse (Welsh, McClelland, 1990). Mūsų ţiniomis literatūroje nėra tyrimų pritaikant AP-PGR metodiką Hypericum genties populiacijų polimorfizmo vertinimui.

1.4.3. Amplifikuotų ir restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo metodo pritaikymas

Amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmo (AFIP, angl. Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) metodas kaip ir restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo (RFIP, angl. Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) metodas remiasi DNR grandinės sukarpymu į keletą smulkesnių dalių, kurių kiekviena, priklausomai nuo restrikcijos fermentų, baigiasi tam tikra nukleotidų seka. Tada prie sukarpytų DNR fragmentų galų, naudojant DNR ligazes, prijungiami pradmenų adapteriai. Šie pradmenų adapteriai yra sukurti taip, kad atitinkamai prisijungtų prie restrikcijos fragmentų komplementarių sekų. Tada sukuriami pradmenys, kurie prisijungia prie pradmenų adapterių ir polimerazinės reakcijos metu pagausina DNR fragmentus. Elektroforezės metu atskiriami pagausinti DNR fragmentai, pasiţymintys skirtingu ilgiu, tai leidţia atpaţinti skirtingus genetinius ţymenis. AFIP duomenys yra lengviau atkartojami, nei APPD duomenys. Metodas gali būti naudojamas nustatyti genetiniams skirtumams tarp individų. AFIP metodo trūkumas: susidaro daug DNR fragmentų, kuriuos sunku išskirstyti elektroforezės metu. AFIP plačiai naudojamas populiacijų genetiniams tyrimams, taip pat artimai susijusių rūšių tyrimuose ir netgi aukštesnių taksonų kladistinėje analizėje (Simpson, 2010). AFIP metodu bandyta įvertinti Australijos laukinių Hypericum spp. populiacijų genetinę įvairovę (Mayo, Langridge, 2003). Australijoje H. perforatum laikomos piktţolėmis / invazine rūšimi. Pagal AFIP buvo įvertinti genetiniai skirtumai tarp pramonei auginamų H. perforatum populiacijų, laukinių populiacijų ir individų tų populiacijų viduje. Sukurtas rūšiai specifiškų ţymenų rinkinys, kurį

21 galima panaudoti atpaţįstant augalinėje ţaliavoje paprastąją jonaţolę. Iš dviejų populiacijų buvo surinktos augalų sėklos kryţmadulkos dėsningumams tirti. Išbandytos šių AFIP pradmenų kombinacijos: MseI+CAC, MseI+CCA, MseI+CGT, MseI+CAA, MseI+CAG, PstI+AG, PstI+AA, PstI+AT, PstI+AC. Iš pradţių buvo panaudotas RFIP metodas (DNR karpymui panaudojant HaeIII restriktazę), vėliau nustatyta, kad AFIP metodas yra tinkamesnis. Buvo įvertintas tiriamų individų ploidiškumas. Tetraploidiniai tėviniai individai ir kryţmadulkos būdu pasidauginę palikuonys ištirti RFIP ir AFIP metodais. Iš 22 RFIP lokusų 14 (3,6 %) buvo polimorfiniai abiejuose populiacijose. Populiacijos viduje augalai turėjo identiškus RFIP profilius. Vėliau panaudota 19 AFIP pradmenų, kiekvienas pradmenų rinkinys vidutiniškai generavo 8,6 polimorfinius fragmentus (kiekviename tėviniame augale vienoje populiacijoje dominavo 87, kitoje – 76 fragmentai, iš viso suskaičiuota 1020 fragmentai), polimorfizmo lygis 16 %. AFIP metodu iš visų 36 palikuonių rekombinacija buvo nustatyta tik tuose pačiuose dviejuose palikuonyse kaip ir RFIP metodu. Kiekvienas rekombinantas turėjo 5 iš 6 galimų donorinių fragmentų, nors tikrasis AFIP juostų skaičius kiekvienu atveju įvairavo. Visi nerekombinantiniai palikuonys ištirti AFIP metodu buvo tetraploidai. Tiek RFIP metodas tiek AFIP tiko atskiriant du tėvinius Hypericum perforatum genotipus ir buvo galima išskirti tą patį rekombinantinį palikuonį. Padaryta išvada, kad šiais metodais galima greitai identifikuoti genetinę įvairovę specialiai auginamose kolekcijose ir laukinėse populiacijose. Panaudojant AFIP technologiją Amerikoje buvo ištirta pasaulio jonaţolių genties genetinė įvairovė ir nustatyti rūšims specifiniai ţymenys (Percifield et al., 2007). Ištirta 56 vietų (po 3 augalus) individai, kuriuos sudarė surinkti iš trijų skirtingų kontinentų 11 skirtingų jonaţolės rūšių (H. perforatum L.,, H. tetrapterum Fr., H. undulatum Schousb., H. punctatum Lam., H. hirsutum L., H. humifusum L., H. densiflorum Pursh, H. adpressum W. P. C. Barton, H. ascyron subsp. pyramidatum N. Robson, H. androsaemum L., H. gentianoides L.), 38 laukinių populiacijų, 4 auginamų kultūrų ir 2 kitų rūšių (Triadenum walteri) populiacijos. Nustatyti 2 monomorfiniai ir 28 polimorfiniai rūšiai specifiniai ţymenys, kurie gali būti naudojami tiksliam H. perforatum augalinės medţiagos atpaţinimui. 4 AFIP pradmenų deriniai generavo 298 aiškiai suskaičiuojamus ir atkartojamus DNR fragmentus. 42 H. perforatum rinkiniai turėjo 221 fragmentą, iš kurių 204 (92 %) buvo polimorfiniai ir 17 (8 %) monomorfiniai. Iš 17 monomorfinių fragnetų tik du buvo specifiški H. perforatum, tuo tarpu kiti 15 buvo aptinkami ir tarp kitos rūšies augalų. Panaudojant AFIP analizę buvo gauti 28 polimorfiniai H. perforatum specifiški fragmentai, 10 iš jų pasireikšdavo 50 ar daugiau procentų daţnumu, 9 fragmentai 20–49 % ir 11 maţiau nei 20 % daţnumu. Atlikus panašumo (angl. Neighbor- joining) analizę pastebėta, kad atsiskiria monofiletinė H. perforatum grupė, įkėlų reikšmė – 80. H. perforatum grupės viduje atsiskyrė pagrindinė monofiletinė grupė, sudaryta iš Lietuvos individų, įkėlų 22 reikšmė 99. Visi likę H. perforatum individai yra seseriniai šiai bazinei lietuviškai grupei ir pasiskirsto į dvi papildomas dideles šakas ir vieną maţą parafiletinę grupę. AMOVA parodė, kad 88 % įvairovė pasireiškia populiacijų viduje, dėl skirtingų geografinių regionų, tuo tarpu tik 12 % įvairovė nustatyti tarp skirtingų populiacijų. Jei populiacijos yra auginamos įvairovė populiacijos viduje padidėja iki 94 %, o įvairovė tarp populiacijų sumaţėja iki 6 %. Suskirsčius H. perforatum individus į 4 populiacijas, remiantis giminingumu filogenetiniame medyje, nustatyta, kad tarppopuliacinė įvairovė yra 33 %, vidupopuliacinė – 67 %. AFIP metodu buvo ištirta 15 šiaurės rytų Italijos paprastosios jonaţolės populiacijų genetinė įvairovė ir diferenciacija tarp natūralių populiacijų ir jų viduje (Barcaccia et al., 2006). Panaudoti šie AFIP pradmenys: E+CAC/M+AAG, E+CAC/M+ACT, P+AG/M+CCAa, P+AT/M+CATa. Gauti 274 AFIP lokusai, iš kurių 250 (60,8 %) buvo polimorfiniai. Vidutiniškai 18,5 % ţymenų buvo polimorfiniai visuose individuose, polimorfizmas svyravo nuo 4,1 % iki 43,4 %.

1.4.4. Mikrosatelitinių ţymenų metodo pritaikymas Pastaraisiais metais atliekama daug molekulinių tyrimų pasitelkiant kodominantinius genetinius ţymenis (Balloux et al., 2002), kuriems priskiriami mikrosatelitiniai ţymenys. Lyginant su kitais, mikrosatelitiniai ţymenys yra plačiai pritaikomi augalų genetikai ir selekcijai (Powell et al., 1996). Mikrosatelitai arba paprastosios kartotinės sekos (PKS, angl. simple sequence repeats, SSR) – tai trumpos (1–6 bp) vorele pasikartojančios DNR atkarpos, susidedančios iš mono-, di-, tri, tetra- ar pentanukleotidų. Tokios PKS plačiai paplitę eukariotų genomuose. Mikrosatelitai yra unikalūs ir vertingi dėl to kad yra multialeliški, kodominantiniai, lengvai aptinkami polimerazinės grandininės reakcijos metu, pasiţymi santykine gausa, plačiai aprėpia genomą, pradinei reakcijai reikalingas nedidelis DNR kiekis. Nustatyta, kad augalų genomuose 20 bp ilgio sekos vidutiniškai kartojasi kas 33 kb, tuo tarpu ţinduoliuose kas – 6 kb. Augalų genome dominuoja dinukleotido AT pasikartojimas. Santykinai nedidelis mikrosatelitų daţnumas augalų genomuose sukelia problemų nustatant mikrosatelitines sekas (Powell et al., 1996). Norint nustatyti mikrosateltines sekas, reikia ţinoti jas juosiančių DNR atkarpų sekas, daţniausiai tai 20–25 bp atkarpos, pagal jas sukuriamos vienos grandinės DNR atkarpos – PGR pradmenys. Kiekvieno lokuso tyrimui reikalingi du specifiniai pradmenys: tiesioginis (angl. forward) ir atvirkštinis (angl. reverse). Turint pradmenis galima identifikuoti ir PGR pagalba pagausinti unikalų PKS regioną. Mikrosatelitų metodu parodomas paprastų sekų pasikartojimo skaičiaus skirtumus tarp lyginamų genotipų (kartotinių sekų atkarpos ilgio polimorfizmas). Šis metodas leidţia atskirti alelius 23 besiskiriančius tik viena bazių pora. Be to, keletas lokusų gali būti analizuojama tame pačiame gelyje vienu metu. Sekos randamos blotingu arba amplifikuojant specialiais pradmenimis. Mikrosatelitai naudingi dėl dviejų prieţasčių: pasiţymi dideliu informatyvumu (dėl aptinkamų alelių skaičiaus ir daţnumo) ir paprasto genotipavimo. Naudojant mikrosatelitinius pradmenis galima nustatyti skirtumas tarp labai artimų individų, daug tiksliau nei kitais metodais ištirti polimorfizmą, nustatyti hibridus, analizuoti genų telkinių įvairovę, galima sukurti aukštos kokybės giminingumo ţemėlapius, taip pat mikrosatelitus galima naudoti kaip diagnostinius ţymenis, nustatant svarbias augalų selekcijai savybes (Powell et al., 1996). Panaudojant mikrosatetus galima tirti nulinių alelių (alelių, kurios polimerazinės grandininės reakcijos metu negeneruoja produkto) pasireiškimą (Varshney et al., 2005). Naudojant PKS metodą ištirta Serbijoje augančių Hypericum genties genetinė įvairovė (Smelcerovic et al., 2005). Visų 6 tirtų Hypericum rūšių 8 iš 10 naudotų pradmenų (1.6 lentelė) generavo polimorfinius profilius.

1.6 lentelė. PKS pradmenys, naudoti Serbijos jonaţolės tyrimams (Smelcerovic et al., 2005) Pradmens Pradmens seka 5′→3′ Pradmens Pradmens seka 3′→5′ pavadinimas pavadinimas PL 553 TGCACGGGGAAGAGGAGAGA PL 554 AACCGAAGCGCAAGAACCCA PL 561 CGCCGCCGTACTGCTCCATC PL 562 GCGGAGGAGACCTGCGGGT PL 569 CTCGCCGTCGAATCCGCCAT PL 570 CACTCTCCTCTCCTGGCCCG PL 575 GTTTCTCACGTCTCTCTCGCTG PL 576 TCCTCCTCCTACGGCTTCTC PL 581 TTTATCCGCGTCCCTAGCTT PL 582 GCCGCCGGGGTCACAGGTCA PL 589 ATATATCCAGCCAGCCGAT PL 590 GGGCCGTGCCGTGCCTCACC PL 591 CTCCTCGATCTTCCTCTACT PL 592 TCGACCCCATCACAAATCCA PL 595 GGGATGATCATCTCCGATGC PL 596 CCCTTCTCCCACTCTTCTCC

Naudojant šiuos pradmenis gauta 50 fragmentų. Fragmentų skaičius pradmeniui svyravo nuo 4 iki 9. Vidutinis polimorfinių lokusų skaičius pradmeniui buvo 90,6 %. Gauti PKS analizės rezultatai rodo šio metodo efektyvumą tikrinant genetinę įvairovę tarp skirtingų Hypericum rūšių. Buvo ištirta aštuonių Indijoje augančių Hypericum perforatum populiacijų genetinė įvairovė (Verma el al., 2007). PKS analizės metu 7 iš 11 išbandytų pradmenų (1.7 lentelė) atskleidė polimorfizmą.

24 1.7 lentelė. PKS pradmenys, naudoti Indijos jonaţolės tyrimams (Verma el al., 2007) Pradmens Pradmens seka 5′→3′ Pradmens Pradmens seka 3′→5′ pavadinimas pavadinimas PL 557 CGCCGAAGTGGTAGAGGCAA PL 558 TGCAGGAGGCAGGAGGAGAA PL 561 CGCCGCCGTACTGCTCCATC PL 562 GCGGAGGAGACCTGCGGGT PL 565 ACTTTGCGTGCGAGGCGAGG PL 566 CGAGGTCGAGTAGAAGGCGT PL 569 CTCGCCGTCGAATCCGCCCAT PL 570 CACTCTCCTCTCCTGGCCCG PL 571 GCCAATTTT ACGCTAAACCC PL 572 GGCGCCGAAGATGGCCGAGA PL 579 ATCTCTTCGCAGATCCACCT PL 580 GCTGAGACGCGCGGGTCGGA PL 591 CTCCTCGATCTTCCTCTACT PL 592 TCGACCCCA TCACAAATCCA

Šie pradmenys iš viso generavo 50 fragmentų. Fragmentų skaičius vienam pradmeniui įvairavo nuo 4 iki 10. Vidutinis procentinis polimorfizmas buvo 74 %, vidutinis Šanono indeksas buvo 1,74. NCBI (angl. National Center for Biotechnology Information) nukleotidų duomenų bazėje apie Hypericum genties mikrosatelitines sekas pateikiama informacija tik apie vienos rūšies Hypericum cumulicola (Small) P. Adams nustatytas 19 mikrosatelitines sekas (Edwards et al., 2007).

1.4.5. Kiti metodai taikomi genetinės įvairovės tyrimuose

Chloroplastų DNR molekulinė analizė yra svarbi filogenetiniuose ir biogeografiniuose tyrinėjimuose, nes teikia informacijos apie struktūrinių pakitimų mastą, formuojantis naujoms rūšims ir vykstant hibridizacijai. Tiriant Kroatijos 6 vietovių 4 jonaţolės rūšių (tarp jų paprastosios ir keturbriaunės jonaţolių rūšys) chloroplastinę DNR, įvertintas Hypericum tarprūšinis chloroplastinės DNR kintamumas (Pilepi, 2002). Šių duomenų pagrindu buvo nustatomi vidurūšiniai ir tarprūšiniai jonaţolių ryšiai. Buvo naudotos trys poros universalių pradmenų: AS (psaA ir trnS), CD (trnC ir trnD), DT (trnD ir trnT). Tik naudojant AS ir CD pradmenų poras gauti aiškūs ir atsikartojantys fragmentai. Tuo tarpu DT pradmenų pora negeneravo jokio pastebimo produkto. Amplifikacija su AS pradmenų pora generavo 2,7 kb amplifikacijos produktus visose rūšyse ir porūšiuose. Amplifikuoti produktai buvo sukarpyti restrikcine endonukleaze Hinf I. Amplifikacija su CD chloroplastų DNR pradmenų pora generavo 2,5 kb produktą visose rūšyse ir porūšiuose. Amplifikuoti produktai buvo sukarpyti Taq I endonukleaze, gauti 4 skirtingi restrikcijos fragmentai. Nei vienas iš fragmentų nebuvo paplitęs visose rūšyse. Ir H. perforatum L. ir H. maculatum Crantz pavyzdţiai pasiţymėjo 190 bp ir 290 bp ilgio fragmentais (1.2 paveikslas).

25 a b 1.2 pav. PGR pagausinti produktai su chloroplastinių pradmenų – AS (a) ir CD (b) pora. Hp-t – H. perforatum L. subsp. typicum Beck, Hp-v – H. perforatum L. subsp. veronense (Schrank) Beck, Hp-a – H. perforatum L. subsp. angustifolium DC., Hm – H. maculatum Crantz, Hmt – H. montanum L., Ha – H. androsaemum L., M – 500 bp markeris

Atlikus dendrografinę analizę, nustatyta, kad chloroplastinė DNR yra labai specifiška kiekvienai tirtai jonaţolių rūšiai (1.3 pav.). Šis metodas galėtų būti naudingas filogenetiniuose tyrinėjimuose, panaudojant universalius pradmenis ir restrikcijos fermentus.

1.3 pav. Keturių jonaţolės genties rūšių, su 3 paprastosios jonaţolės porūšiais dendrograma Hp-t H. perforatum L. subsp. typicum Beck, Hp-v – H. perforatum L. subsp. veronense (Schrank) Beck, Hp-a – H. perforatum L. subsp. Angustifolium DC., Hm – H. maculatum Crantz, Hmt – H. montanum L., Ha – H. androsaemum L.

Portugalijoje, surinkus iš 6 skirtingų vietovių H. perforatum, intronų polimorfizmo metodu (angl. Intron polymorphism pattern) buvo vertintos galimybės atskirti jonaţolių individus (Ferreira et al., 2009). Iš H. perforatum individų genominės DNR gautos 4 AOX (AOX – alternatyvios oksidazės) genų sekos. Visoms sekoms buvo būdinga branduolio egzonų–intronų jungtis 5'-GU / AG-3'. Trys genų sekos priklausė AOX1 (HpAOX1 a, b ir c) ir viena AOX2 pošeimiams. Po PGR reakcijos dalinės HpAOX1a geno sekos fragmentų ilgiai buvo skirtingi, dėl jų skirtingo ilgio dviejuose intronuose. Atlikus EPIC (angl. Exon Primed Intron Crossing) PGR, visi augalai pasiţymėjo dviem tais pačiais

26 fragmentais, jų egzonų sekos buvo vienodos, o visų augalų intronų tose pačiose vietose nustatytos insercijos arba delecijos. Insercijos / delecijos abiejuose intronuose buvo susiję su pasikartojančio introno vieno nukleotido polimorfizmu – IVNP (angl. Intron Single Nucleotide Polymorphism, ISNP). Pagal polimorfinius profilius buvo galima atskirti kiekvieną individą. Šio tyrimo autoriai teigia, kad alternatyvios oksidazės genų sekų polimorfizmą galima naudoti H. perforatum genetinės ir biologinės įvairovės tyrimuose. JAV Misisipės universitete panaudojant PGR paremtą DNR pagausinimo metodą bandyta genetiškai atskirti paprastąją jonaţolę nuo kitų jonaţolių rūšių (Crockett et al., 2004). Branduolio ribosomų genų sekos iš ITS (transkriptų vidinių skirtukų – angl. Internal Transcribed Spacer) regionų ištirtos 50 Hypericum taksonų (taksonai, parinkti iš Amerikos ir kitų ţemynų, priklausė 11 iš pastaruoju metu pripaţintų 36 taksonominių sekcijų). Pagal ITS genų sekų skirtumus pavyko atskirti H. perforatum nuo kitų Hypericum rūšių. Gauti rezultatai leidţia ITS sekas panaudoti nustatant jonaţolių rūšių filogenetinius ryšius, išskiriant 3 pastovius monofiletinius klasterius ir kelias antrines monofiletines grupes.

1.5. Jonaţolių genetinio profilio ryšys su antriniais junginiais Serbijos Hypericum rūšies augalams tirtas ryšys tarp genetinės įvairovės ir antrinių metabolitų (Smelcerovic et al., 2005). Antrinių metabolitų kiekis nustatytas naudojant skystinę chromatografiją su masių spektrometrija. Ištyrus šešių skirtingų rūšių Hypericum (H. barbatum, H. hirsutum, H. linarioides, H. maculatum, H. rumeliacum ir H. tetrapterum) aktyviąsias medţiagas buvo pastebėti reikšmingi koncentracijų skirtumai tarp toje pačioje vietovėje augančių augalų, tai reiškia, kad genetinis veiksnys yra labai svarbus, nulemiant aktyviųjų medţiagų sudėtį. H. barbatum nustatytas didţiausias hipericino ir pseudohipericino kiekis, H. tetrapterum – didţiausias kiekis hiperforino ir kvercitrino, H. maculatum (mūsų tiriamai rūšiai) – didţiausias hiperozido (flavonoidų klasei priklausantis junginys) kiekis. Hipericino rasta visose šešiose rūšyse. Pastebėti aktyviųjų junginių reikšmingi skirtumai net tarp skirtingų augalų, rinktų iš tos pačios vietovės. Įvertinus genetinę įvairovę 2 metodais, stipresnė antrinių metabolitų koncentracijos koreliacija nustatyta su APPD duomenimis, negu su PKS. Kadangi PKS metodu vertinamos pasikartojančios sekos, padaryta prielaida, kad rūšys labiau nukrypsta viena nuo kitos dėl kartotinių sekų, nei dėl baltymus koduojančių genomo sekų skirtumų. Šio tyrimo autoriai siūlo APPD ţymenis naudoti augalų selekcijoje, sistematinių vienetų nustatymui, vaistinės ţaliavos kokybės nustatymui.

27 H. perforatum klonų, sudaigintų iš sėklų, surinktų iš skirtingų vietovių Turkijoje, palyginus hipericino kiekio dendrogramas su dendrogramomis, gautomis atlikus APPD analizę, nustatyta reikšminga koreliacija tarp APPD duomenų ir hipericino koncentracijos tiek klonuose, tiek kontrolinėje veislėje (Tonk et al., 2011). Ištirtas ryšys tarp Indijos 8 populiacijų Hypericum perforatum L. genetinio profilio (įvertinto APPD ir PKS metodais) ir fenolinių junginių (Verma el al., 2007). Tirtiems augalams buvo nustatytos fenolinių junginių (pseudohipericino, hipericino, hiperforino, rutino, hiperozido, kvercitrino ir kvercetino) koncentracijos. Daugiau hipericinų gaminantys augalai pasiţymėjo ir didesnėmis flavonoidų koncentracijomis, ši koreliacija galėtų būti paaiškinama bendru biosintezės pirmtaku. Nustatyta dalinė koreliacija tarp antrinių metabolitų sudėties ir APPD bei PKS analizės duomenų. Manoma, kad ne tik genetiniai veiksniai, bet ir aplinka įtakoja antrinių metabolitų susidarymą.

28 2. MEDŢIAGA IR METODIKA 2.1. Augalinės medţiagos rinkimo vietos 2009 metų birţelio‒liepos mėnesiais iš 12 skirtingų Lietuvos vietovių surinkta keturbriaunė jonaţolė (Hypericum maculatum) po 15 individų iš kiekvienos populiacijos, viso genetinei analizei naudota 180 individų. Augaviečių apibūdinimas pateiktas 2.1 lentelėje, geografinė padėtis 2.2 lentelėje, atstumai tarp populiacijų 2.3 lentelėje.

2.1 lentelė. Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum) rinkimo vietos ir augaviečių apibūdinimas Radavietė Augavietės apibūdinimas Gruzdiškė Atviro vandens telkinio arti nesimato; greta pavieniai medţiai; netoli (50–100 m atstumu) yra kelias su didele mašinų apkrova, uţmiestyje; netoli (20–50 m atstumu) yra kaimo keliukas; greta gyvenamieji namai / ūkiniai pastatai / sodybos; šalia yra šienaujamos pievos Girkalnis Netoli yra uţţėlęs tvenkinys; greta netankūs krūmynai; netoli (50–100 m atstumu) yra greitkelis; greta yra vienkiemis; šalia yra šienaujamos pievos Paltupiai Atviro vandens telkinio arti nesimato; netoli yra miškas; netoli (50–100 m atstumu) yra ţvyrkelis; arti gyvenamųjų pastatų nėra; šalia yra dirbami laukai Daugodai Netoli (50–100 m atstumu) yra upė; greta pavieniai medţiai; netoli (20–50 m atstumu) yra kaimo keliukas; greta yra vienkiemis; pievos, kuriose ganomi gyvuliai Padubysys Netoli (50–100 m atstumu) yra upė; atvira vieta, greta tik ţoliniai augalai; jokio kelio / takelio aplink nėra; arti gyvenamųjų pastatų nėra; šalia yra natūralios pievos Lyduvėnai Netoli yra upelis; greta pavieniai medţiai; netoli (20–50 m atstumu) yra kaimo keliukas; greta yra buvusi sodyba; šalia yra dirbami laukai; šalia yra natūralios pievos Kretinga Atviro vandens telkinio arti nesimato; atvira vieta, greta tik ţoliniai augalai; jokio kelio / takelio aplink nėra; netoli yra sodų bendrija; pievos, kuriose ganomi gyvuliai Girionys Atviro vandens telkinio arti nesimato; netoli yra miškas; netoli (20–50 m atstumu) yra kaimo keliukas; netoli yra sodų bendrija; šalia yra natūralios pievos Pajūris Atviro vandens telkinio arti nesimato; greta pavieniai medţiai; jokio kelio / takelio aplink nėra; greta yra vienkiemis; pievos, kuriose ganomi gyvuliai Katauskiai Atviro vandens telkinio arti nesimato; greta pavieniai medţiai; netoli (20–50 m atstumu) yra kaimo keliukas; greta gyvenamieji namai / ūkiniai pastatai / sodybos; pievos, kuriose ganomi gyvuliai Noreikiškės Atviro vandens telkinio arti nesimato; netoli yra miškas; netoli (50–100 m atstumu) yra kelias su nedidele mašinų apkrova, uţmiestyje; greta gyvenamieji namai / ūkiniai pastatai / sodybos; šalia yra šienaujamos pievos Svėdasai Netoli yra tvenkinys; netoli yra miškas; netoli (20–50 m atstumu) yra kaimo keliukas; greta yra vienkiemis; šalia yra natūralios pievos

29 2.2 lentelė. Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum Crantz) rinkimo vietų geografinė padėtis Augavietė Geografinė augavietės padėtis Šiaurės platuma Rytų ilguma Gruzdiškė 55° 24' 19.170" 23° 10' 18.584" Girkalnis 55° 19' 39.216" 23° 10' 43.536" Paltupiai 55° 29' 57.120" 23° 5' 2.796" E Daugodai 55° 25' 20.928" 23° 13' 18.120" Padubysys 55° 15' 11.412" 23° 27' 58.608" Lyduvėnai 55° 30' 43.510" 23° 4' 42.326" Kretinga 55° 54' 18.292" 21° 13' 44.083" Girionys 54° 51' 29.196" 24° 2' 49.020" Pajūris 55° 40' 17.148" 21° 54' 46.368" Katauskiai 55° 28' 27.062" 23° 10' 59.448" Noreikiškės 54° 37' 40.404" 24° 20' 41.568" Svėdasai 55° 40' 53.904" 25° 21' 56.016"

2.3 lentelė. Atstumai tarp skirtingų keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum) populiacijų (km) Paj 96 Lyd 161 98 Pal 160 96 2 Kat 156 107 8 8 Gruz 148 84 18 17 13 Girk 152 88 30 30 25 17 Dau 153 89 23 22 19 6 22 Pad 171 107 52 67 47 40 25 44 Nor 221 157 103 101 98 90 75 94 67 Girio 236 172 118 116 112 104 90 109 83 20 Svė 334 270 188 190 181 193 190 178 180 150 142 Kre Paj Lyd Pal Kat Gruz Girk Dau Pad Nor Girio

Augalinės medţiagos rinkimo vietos pavaizduotos 2.1 paveiksle.

2.1 pav. Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum Crantz) rinkimo vietos

30 Kiekvienas renkamas augalas buvo tikrinamas pagal būdingus keturbriaunės jonaţolės poţymius ir atrenkami tik sveiki individai. Augalai šaltkrepšyje buvo perveţami į laboratoriją, nuo augalų atskirti jauni ir nepakitę lapai ir nedelsiant uţšaldomi ‒20 °C temperatūroje.

2.2. DNR išskyrimas Keturbriaunės jonaţolės DNR išskyrimui naudojome šiuos reagentus ir atitinkamus metodus: universalų genominės DNR išskyrimo rinkinį (#K0512) (,,Fermentas”, Lietuva) ir CTAB (Doyle, Doyle, 1987), tačiau šiais metodais nepavyko išskirti tinkamos koncentracijos ir kokybės DNR. Todėl DNR išskyrimui iš H. maculatum vėliau naudojome reagentų rinkinį NucleoSpin II Kit su silikagelio kolonėlėmis (Macherey-Nagel, Vokietija), sudarytą iš lizės buferių PL2 ir PL3, RNazės A, DNR rišančio PC buferio, plovimo buferių PW1 ir PW2, taip pat PE buferio.

Darbo eiga: 1. Mėginio homogenizavimas. Svėrėme po 30 mg kiekvieno augalo lapų. Juos sudėjome į grūstuvėlį ir skystu azotu sutrynėme iki miltelių. Homogenizuotus mėginius perkėlėme į 1,5 ml talpos NucleoSpin mėgintuvėlius. 2. Ląstelių lizavimas. Į mėgintuvėlį su homogenizuotais mėginiais įpylėme 300 μl lizės buferio PL2 ir turinį maišėme Vortex aparatu. Į lizės mišinį įpylėme 10 μl RNazės A ir sumaišėme. Suspensiją inkubavome 10 min 65 °C temperatūroje. Po inkubacijos įpylėme 75 μl PL3 buferio, sumaišėme ir 5 min inkubavome 0°C temperatūroje tam, kad visiškai nusėstų SDS (sodium dodecyl sulphate). 3. Lizato filtravimas. Nucleospin filtrinę kolonėlę (vienkartinio naudojimo, su violetiniu ţiedu) įdėjome į Nucleospin surenkamąjį mėgintuvėlį, tuomet ant kolonėlės membranos pylėme lizatą. Mėgintuvėlius centrifugavome 2 min 11 000 aps/min greičiu ir tolimesnei analizei naudojome skystąją dalį. 4. DNR surišimo sąlygų optimizavimas. Į naują mėgintuvėlį supylėme filtratą ir 450 μl rišančio PC buferio, sumaišėme. 5. DNR surišimas ant kolonėlės membranos. Nucleospin Plant II kolonėlę (vienkartinio naudojimo, su ţaliu ţiedu) įdėjome į naują Nucleospin surenkamąjį mėgintuvėlį ir supylėme mėginį su rišančiu PC buferiu. Centrifugavome 1 min 11 000 aps/min greičiu ir tolimesnei analizei naudojome ant membranos likusią medţiagą.

31 6. Silicio dioksido membranos plovimas. Į Nucleospin Palnt II kolonėlę įpylėme 400 μl plovimo buferio PW1. Centrifugavome 1 min 11 000 aps/min greičiu. Filtratą išpylėme. 7. Silicio dioksido membranos plovimas ir dţiovinimas. Į kolonėlę įpylėme 700 μl PW2 buferio. Centrifugavome 1 min 11 000 aps/min greičiu. Filtratą išpylėme. Į kolonėlę įpylėme 200 μl PW2 buferio. Centrifugavome 1 min 11 000 aps/min greičiu. Filtratą išpylėme. Dar kartą centrifugavome 1 min 11 000 aps/min greičiu. Centrifugavimo metu visiškai pašalinamas plovimo buferis ir silicio membrana išdţiovinama. 8. Švarios DNR ištirpinimas ir pernešimas į mėgintuvėlį. Kolonėlę su išvalyta DNR įdėjome į naują 1,5 ml mėgintuvėlį. Pipete ant membranos pylėme 50 μl PE buferio, pašildyto iki 70 °C. Nucleospin Plant II kolonėlę 5 min inkubavome 70 °C temperatūroje. Centrifugavome 1 min 11 000 aps/min greičiu, taip nuo membranos nuplaunama DNR į mėgintuvėlį. Tą pačią membraną pakartotinai plovėme 50 μl PE buferio (pakaitinto iki 70 °C) ir centrifugavimo būdu perkėlėme į tą patį mėgintuvėlį (kolonėlė išmetama). 9. Mėginius laikėme + 4 °C temperatūroje. Ilgesnį laiką nenaudojamą DNR saugojome ‒20 °C temperatūroje.

DNR išeiga ir kokybė patikrinta spektrofotometru (Eppendorf BioPhotometer, Vokietija) ir elektroforezės būdu. 2.3. APPD analizės sąlygos H. maculatum populiacijų polimorfizmui ištirti naudojome atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR metodą (APPD) (Williams et al., 1990). DNR pagausinimui išbandėme 14 atsitiktinių pradmenų, kurių ilgis 10 nukleotidų (2.4 lentelė). Šie pradmenys buvo naudoti Italijos paprastosios jonaţolės (Hypericum perforatum L.) genetinio polimorfizmo tyrimuose (Barcaccia et al., 2006).

32 2.4 lentelė. APPD analizei naudoti pradmenys Pavadinimas Seka (5‟–3‟) Lydymosi temperatūra, Tm (ºC) OP-A1 CAGGCCCTTC 34 OP-A4 AATCGGGCTG 32 OP-A9 GGGTAACGCC 34 OP-B12 CCTTGACGCA 32 OP-B13 TTCCCCCGCT 34 OP-B19 ACCCCCGAAG 34 OP-C6a GAACGGACTC 32 OP-C7a GTCCCGACGA 34 OP-C11 AAAGCTGCGG 32 OP-C19 GTTGCCAGCC 34 OP-D19a CTGGGGACTT 32 OP-D20 ACCCGGTCAC 34 OP-Q2 TCTGTCGGTC 32 OP-Q11 TCTCCGCAAC 32

Kadangi lentelėje nurodytiems pradmenimis tikslių DNR pagausinimo reakcijos sąlygų literatūroje neradome, teko naudoti ir tobulinti mūsų laboratorijos spanguolių analizės metodus (Ţukauskienė, 2009). Tuo tikslu su DNR, išskirta iš 4 individų, priklausančių skirtingoms populiacijoms, buvo patikrinti visi 14 pradmenų. Pradinė mišinio sudėtis vienam mėginiui ruošti buvo sudaryta iš: 14,55 µl dejonizuoto vandens; 2,5 µl Taq reakcijos buferio (,,Fermentas”, Lietuva), išbandytas skirtingos sudėties Taq buferis: a) su (NH4)2SO4, b) su KCl ir c) be minėtų druskų, 0,2 µl dNTP mišinio (25 nM)

(,,Fermentas”, Lietuva), 1,5 µl MgCl2 (25 nM) (,,Fermentas”, Lietuva), 2 µl kiekvieno pradmens (10 pmol/µl) (Biomers.net, Vokietija), 0,25 µl Taq DNR polimerazė (,,Fermentas”, Lietuva) ir 4 µl genominės DNR. Darbo eigoje pradinė naudota pradmenų prikibimo temperatūra 27 ir 30 bei 29, 32 (priklausomai nuo pradmens) netiko pagausinimui ir toliau tyrimai buvo atliekami naudojant 32 ºC ir 34 ºC temperatūras, bei keičiamas ciklų skaičius:35, 40, 45. Po patikrinimo atrinkome šiuos informatyviausius pradmenis: OP-A1, OP-A9, OP-B19, OP- A4, OP-C11 OP-C7a ir juos naudojome tolimesniuose APPD tyrimuose.

2.4. Populiacijų APPD analizės sąlygos APPD polimerazinei grandininei reakcijai (1-am mėginiui) naudojome 25 µl bendro tūrio mišinį, kurį sudarė: 14,55 µl dejonizuoto vandens; 2,5 µl Taq reakcijos buferio (,,Fermentas”, Lietuva)

(su KCl), 0,2 µl dNTP mišinio (25 nM) (,,Fermentas”, Lietuva), 1,5 µl MgCl2 (25 nM) (,,Fermentas”, 33 Lietuva), 2 µl kiekvieno pradmens (10 pmol/µl) (Biomers.net, Vokietija), 0,25 Taq DNR polimerazės (,,Fermentas”, Lietuva) ir 4 µl genominės DNR. Genominės DNR pagausinimo reakcijos atliktos Mastercycler gradient (Eppendorf, Vokietija) amplifikatoriuje. Reakcija buvo atliekama pagal 2.5 lentelėje pateiktas sąlygas.

2.5 lentelė. APPD pagausinimui naudota programa Etapai Temperatūra Laikas Ciklai Pirminė DNR denatūracija 94 ºC 2 min 1 DNR denatūracija 94 ºC 30 s

Pradmenų prilipimas 32 ºC arba 34 ºC (priklausomai nuo pradmens) 35 s 40 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 1 min Galutinis DNR fragmento ilginimas 72 ºC 2 min 1

2.5. AP-PGR analizės sąlygos AP-PGR (angl. arbitrarily primed-polymerase chain reaction, AP-PCR) metodas, aprašytas Welsh ir McClelland (1990) pritaikytas keturbriaunės jonaţolės tyrimams. Išbandyti 5 skirtingi AP- PGR pradmenys, su įterptu universaliu pradmeniu M13 (GACGGCCAGT) (2.6 lentelė).

2.6 lentelė. AP-PCR analizei naudoti pradmenys Pavadinimas Seka (5‟–3‟) APPCR_KA2 GACGGCCAGTCGTGTCCGAG APPCR_KB2 GACGGCCAGTCGTATACTCC APPCR_KM2 GACGGCCAGTTTGTACATGAC APPCR_KR2 TTGTAAAACGACGGCCAGTRTGTATACATAYGTAAC APPCR_KX2 GACGGCCAGTTACGCACAAC R – A arba G nukleotidas Y – C arba T nukleotidas

Taip pat naudoti trys pradmenys su skirtingai fluorescuojančiomis ţymėmis – 6 FAM (mėlynai), HEX (ţaliai), TAMRA (juodai) ir prikabinta inkarine dalimi, jų sekos pateiktos 2.7 lentelėje.

2.7 lentelė. AP-PCR analizei naudoti inkarinę dalį turintys pradmenys M13 pradmuo Seka (5‟–3‟) 6 FAM_M13 [6 FAM] TTGTAAAACGACGGCC HEX_M13 [HEX] GTAAAACGACGGCCAGT TAMRA_M13 [TAM] TTGTAAAACGACGGCCA

34 AP-PGR vienai reakcijai ruošti naudojome 25 µl bendro tūrio mišinį. Pagal aukščiau nurodytą

šaltinį pradinis mišinys ruoštas tokiu būdu: 11,8 µl dejonizuoto vandens; 2 µl 10xNH4 Taq reakcijos buferio be MgCl2 (Bioline, Jungtinė Karalystė), 1,2 µl MgCl2 (50 nM) (Bioline, Jungtinė Karalystė), 0,8 µl dNTP mišinio (25 nM) (Invitrogen, JAV), 0,5 µl pradmens (100 µM/µl) (Sigma, JAV), 0,2 µl Taq DNR polimerazės (500 U/µl) (Bioline, Jungtinė Karalystė) ir 3 µl genominės DNR.

Pasirinkus po 1 individą iš 5 skirtingų populiacijų keitėme MgCl2 kiekį iš 1,2 µl į 0,8 µl, taip pat keitėme pradmenų koncentraciją mišinyje ir jų įdėjimo laiką. Genominės DNR pagausinimo reakcijos atliktos GeneAmp, PCR System 9700 (Applied Biosystems, JAV) amplifikatoriumi. Pradiniam pagausinimui taikyta aprašyta programa (2.8 lentelė).

2.8 lentelė. AP-PGR metu DNR pagausinimui naudota programa (Welsh, McClelland, 1990) Etapai Temperatūra Laikas Ciklai Pirminė DNR denatūracija 94 ºC 5 min 1 DNR denatūracija 94 ºC 2 min Pradmens prilipimas 45 ºC 2 min 2 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 1 min DNR denatūracija 94 ºC 30 s Pradmens prilipimas 58 ºC 30 s 40 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 30 s Galutinis DNR fragmento ilginimas 72 ºC 7 min 1

Tyrimo eigoje keistas pagausinimo ciklų skaičius, juos išskirstant į tris dalis (4, 6, 30; 2, 10, 40; 2, 10, 30). Taip pat keistas DNR fragmentų ilginimo laikas (taikyta 5 min, 1 min, 30 s, 20 s), skirtingoms pradmenų kombinacijoms tiko skirtingas ilginimo laikas. Pritaikyta pradmenų prikibimo temperatūra (kiekviename pagausinimo cikle atitinkamai naudojant 45 ºC, 58 ºC, 58 ºC; 40 ºC, 58 ºC, 62 ºC; 45 ºC, gradientinę nuo 57 ºC iki 62 ºC, 62 ºC), priklausomai nuo pradmenų tiko 40 ºC, 58 ºC, 62 ºC temperatūros ir 45 ºC, gradientinė nuo 57 ºC iki 62 ºC, 62 ºC.

2.6. AP-PGR produktų valymas PGR produktų išvalymui nuo priemaišų naudojome MinElute 96 UF PCR Purification (Qiagen Vokietija) plokštelę su 96 filtravimo šulinėliais. Darbo eiga: 1. Į plokštelės šulinėlius supylėme PGR produktus.

35 2. Plokštelę uţdėjome ant vakuuminio prietaiso Millipore (USA) ir esant -800 mbar slėgiui, laukėme kol iš šulinėlių pasišalins skystis.

3. Į plokštelės šulinėlius įpylėme po 20 µl bidistiliuoto H2O ir vėl įjungėme vakuumą kol membrana išdţius. 4. Plokštelę atsargiai nuėmėme nuo vakuumo, dėjome ant sugeriamojo popieriaus.

5. Į plokštelės šulinėlius įpylėme po 20 µl bidistiliuoto H2O ir šulinėlių turinys buvo maišomas purtant plokštelę 5 min (purtiklio darbo reţimas prieš maišymą buvo parinktas taip, kad skystis, esantis šulinėliuose neišsilaistytų). 6. Skystį maišant pipete, kad DNR vėl nenusėstų ant membranų pernešėme į mėgintuvėlius.

2.7. PKS analizės sąlygos H. maculatum genetinės įvairovės tyrimuose panaudojome mikrosatelitinių pradmenų metodą. Mūsų ţiniomis mikrosatelitinės sekos H. perforatum nei H. maculatum nėra nustatytos, NCBI duomenų bazėje radome duomenis tik apie Hypericum cumulicola (Small) P. Adams mikrosatelitines sekas. Remiantis jomis ir pasitelkiant įvairias kompiuterines programas: NCBI Primer BLAST, Perl Primer v1.1.19 (Marshall, 2004), Geneious Pro™ 3.6 (Drummond et al., 2006), CG-SSR (Pai et al., 2009) ir SSRIT (Temnykh et al., 2001) buvo sukurta ir vėliau išbandyta 19 mikrosatelitinių pradmenų porų, vienas pradmuo iš pradmenų poros turėjo universalaus pradmens M13 5„ inkarinę dalį, PKS pradmenų sekos pateiktos 2.9 lentelėje.

36 2.9 lentelė. PKS analizei naudoti mūsų sukurti pradmenys Pavadinimas Seka (5‟–3‟) 0625_for CAACATAGTATAGCTTGACAACTCAA 0625_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTCAAAGCGTAGGGAAGGAAAGTG 0626_for CAACATGAGTTACTTTTATATTGAG 0626_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTACCATTTTTCATTTCAGACCA 0627_for TTGTAAAACGACGGCCAGTTCTACTACTCCATCGCCACGCA 0627_rev TCACTCACTGTCACCTCCGTTT 0628_for CGTAGGTGAGGTGGTTGTCGT 0628_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTCTCCCGCTCCCGCATCTC 0629_for CCTTTTCCTCTTCGCCAATTCA 0629_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTCTTCCGTTCCTCCCTCTCCTTC 0630_for TTGTAAAACGACGGCCAGTCAGAGCAGCACCGAAAGAAACC 0630_rev ATGAAAATAGCGAAAGCACCGTTG 0631_for TTGTAAAACGACGGCCAGTGCCCCTCCATTATCTTTCTCC 0631_rev GTTGTGTGGTCTAACATTTGG 0632_for TTGTAAAACGACGGCCAGTCATCGTGGGGATATTGAAGT 0632_rev CACACACAAGGGTTTTGGAA 0633_for CTCTGTGGTATTCCCTAACG 0633_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTTGGAGGAAAAGTTAAAGAGAAGT 0634_for AAACTGACGGGTGGTGTGATG 0634_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTCTAAGCTCAAACGATGTCCTGAT 0635_for CTTCGTCGCTTTGGTCTTTT 0635_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTCACCCCAACCCCTCAGATTA 0636_for GATTCCATCGTCAGGGTAC 0636_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTCACATATAAAATGCAGCGACT 0637_for TTGTAAAACGACGGCCAGTGCCATTTTGTACCATGAAGAAC 0637_rev TCCCTGAAGCCAAGAAGACG 0638_for GTTTTCACAAGGACCAACCAATC 0638_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTAAGCAAGCGAATCACGACCAA 0639_for TTGTAAAACGACGGCCAGTTTCTCACTGTTGGGGTTTAGG 0639_rev CAGCCCGTTGTAGATGCCTT 0640_for TTGTAAAACGACGGCCAGTAATCCTCCGAACAAAGCATC 0640_rev TTTAGTTTCTTCCAGTCCTTG 0641_for CATTCGTTGCTTGTTCCACCTT 0641_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTAGCCCTACCCTCTGTAAGTCC 0642_for GAGCCGCCACATTTTAACAA 0642_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTACCTTTCCAACCTTTTCTCC 0643_for ACCCGCCCCTATTTAGTTTG 0643_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTTTCTCTTCTCCAGTCCCAAT

Remiantis Paduvos universitete naudojama metodika (Barcaccia et al., 2003) mikrosatelitinių pradmenų polimerazinei grandininei reakcijai (1-am mėginiui) ruošti naudojome 20 µl bendro tūrio mišinį, kurį sudarė: 10,75 µl dejonizuoto vandens; 2 µl 10xNH4 Taq reakcijos buferio be MgCl2

(Bioline, Jungtinė Karalystė), 0,6 µl MgCl2 (50 nM) (Bioline, Jungtinė Karalystė), 0,8 µl dNTP (25 nM) (Invitrogen, JAV), 0,1 µl pradmens su inkarine dalimi, 0,3 µl pradmens be inkarinės dalies (100 37 µM/µl) (Invitrogen, JAV), 0,2 Taq DNR polimerazės (500 U/µl) (Bioline, Jungtinė Karalystė) ir 5 µl

DNR. Tyrimų eigoje keitėme MgCl2 kiekį į 1,2 µl, išbandėme skirtingas pradmenų koncentracijas (0,1 µl mikrosatelitinio pradmens su M13 inkarine dalimi, 0,3 µl be inkarinės dalies; 0,25 µl atvirkštinio M13 pradmens arba jo nenaudojant, kai nenaudojamas – tuomet abiejų mikrosatelitinių pradmenų po 0,3 µl ar 0,5 µl) bei DNR koncentraciją. Genominės DNR pagausinimo reakcijos atliktos GeneAmp, PCR System 9700 (Applied Biosystems, JAV) amplifikatoriuje. Pradinės reakcijos sąlygos pateiktos 2.10 lentelėje.

2.10 lentelė. PKS metu DNR pagausinimui naudota programa Etapai Temperatūra Laikas Ciklai Pirminė DNR denatūracija 94 ºC 5 min 1 DNR denatūracija 94 ºC 30 s Pradmens prilipimas Temperatūra, priklausomai nuo pradmens 30 s 5 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 1 min DNR denatūracija 94 ºC 30 s Pradmens prilipimas Temperatūra, priklausomai nuo pradmens 30 s 45 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 1 min Galutinis DNR fragmento ilginimas 72 ºC 7 min 1

Keitėme pradmenų prikibimo temperatūrą (kiekvienam pradmeniui skirtingai, priklausomai nuo lydymosi temperatūros). Pagausinant pirmiausia naudojome 5 (kai DNR denatūracijos ir pradmens prikibimo laikas 1 min) ir 40 (kai DNR denatūracijos ir pradmens prikibimo laikas 30 s) ciklų, vėliau 45 ciklus (kai DNR denatūracijos ir pradmens prikibimo laikas 30 s).

2.8. DNR elektroforezė agarozės gelyje APPD reakcijos produktai frakcionuoti elektroforezės būdu, 1,5 % agarozės gelyje (Agarozė Top VisionTM LE GQ, ,,Fermentas“, Lietuva), pavyzdţiams išryškinti naudotas etidţio bromidas, koncentracija 5 mg/ml (Roth, Vokietija). Darbo eiga: 1. Pasiruošėme 1,5 % agarozės gelį, agarozės miltelius ištirpinome 0,5 x TBE buferyje (,,Fermentas“, Lietuva). 2. Kaitinome mikrobangų krosnelėje, kol tirpalas pasidarė skaidrus ir vientisos konsistencijos. 3. Į atvėsintą agarozę įpylėme 25 μl etidţio bromido. 4. Agarozės tirpalą supylėme į paruoštą formą, įstatėme „šukutes“ palaukėme kol sustings.

38 5. Sustingus geliui ištraukėme ,,šukutes“. 6. Gelį įstatėme į elektroforezės vonelę, pripildytą 0,5 x TBE buferio. 7. Į šulinėlius įnešėme 25 μl APPD PGR produkto, sumaišyto su 2 μl bromfenolio mėlio daţais. Į šoninius šulinėlius leidome 3 μl 100 bp DNR ilgio standartą (GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Plus, ,,Fermentas“, Lietuva). 8. Prieš paleidţiant elektros srovę į buferį įpylėme 20 μl etidţio bromido. 9. Nustatėme 110 V elektros srovę. 10. Elektroforezę vykdėme apie 2 val. 11. Geliai fotografuoti UV - transliuminatoriuje (Herolab transliuminator, Vokietija), naudojant Win 32 sistemą. Fragmentų ilgis išmatuotas pagal 100 bp DNR ilgio standartą (Gene ruler DNA Ladder Plus, ,,Fermentas”, Lietuva). Fragmentų buvimas vertintas 1, nebuvimas 0. Vertinti tik aiškūs ir atsikartojantys fragmentai (Williams et al., 1990). Fragmentai trumpesni nei 250 bp nevertinti. AP-PGR ir PKS analizės metu PGR produktai frakcionuoti 2 % agarozės gelyje (Ultra Pure Agarose, Invitrogen, JAV) ruoštame 1 x TAE arba 1 x TBE buferyje, pavyzdţių išryškinimui naudotas SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen, JAV) daţas. Geliai fotografuoti naudojant Gel Logic 100 Imaging sistemą (Kodak, JAV). Fragmentų ilgiui išmatuoti naudotas 1 kb ilgio standartas (1 kb Plus DNA Ladder, Invitrogen, JAV).

2.9. PGR fragmento ekstrakcija iš agarozės gelio PGR fragmento ekstrakcijai iš agarozės gelio naudojome MiniElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Vokietija), kurį sudaro: QG buferis, izopropanolis, PE buferis, EB buferis. Darbo eiga: 1. Iš agarozės gelio steriliu vienkartiniu skalpeliu iškirpome DNR fragmentą ir patalpinome jį į 2 ml sterilų mėgintuvėlį. 2. Gelio gabalėlį pasvėrėme ir vieną dalį gelio masės papildėme 3 dalimis QG buferio. 3. Inkubavome 50 ºC temperatūroje 10–15 min kol gelis visiškai ištirpo, kas 2–3 min mėgintuvėlius pavartėme. 4. Įpylėme gelio masę atitinkantį izopropanolio tūrį ir kelis kartus pavartėme mėgintuvėlį. 5. MiniElute kolonėlę įdėjome į 2 ml surenkamąjį mėgintuvėlį, į ją supylėme pavyzdţius ir centrifugavome 1 min 17,900 x g (13000 rpm) apsisukimų per minutę greičiu. 6. Supernatantą nupylėme ir kolonėlės įdėjome į ta patį surenkamąjį mėgintuvėlį.

39 7. Į kolonėlę įpylėme 500 µl buferio QG ir centrifugavome 1 min 17,900 x g (13000 rpm) apsisukimų per minutę greičiu. 8. Supernatantą nupylėme ir kolonėlės įdėjome į ta patį surenkamąjį mėgintuvėlį. 9. Membranos plovimui į kolonėlę įpylėme 750 µl buferio PE, 2–5 min palaikėme ir centrifugavome 1 min 17,900 x g (13000 rpm) apsisukimų per minutę greičiu. 10. Supernatantą nupylėme, kolonėlės įdėjome į ta patį surenkamąjį mėgintuvėlį ir centrifugavome dar kartą 1 min 17,900 x g (13000 rpm) apsisukimų per minutę greičiu, tam kad išdţiovinti membraną. 11. MiniElute kolonėles perkėlėme į 1,5 ml talpos mėgintuvėlius. 12. DNR išplovimui tiesiai ant membranos uţpylėme 10 µl EB buferio (10 mM Tris Cl, pH 8,5), palaikėme 5–10 min ir centrifugavome dar kartą 1 min 17,900 x g (13000 rpm) apsisukimų per minutę greičiu. Taip pat naudojome ir kitą PGR fragmento ekstrakcijos iš agarozės gelio metodą, naudojant amonio acetatą. Darbo eiga: 1. Iš agarozės gelio steriliu vienkartiniu skalpeliu iškirpome DNR fragmentą ir patalpinome jį į 2 ml mėgintuvėlį. 2. Paruošėme 7,5 M amonio acetato tirpalą (Sigma, JAV). 3. Pasiruošėme parafilmo lapelius. Lapelį perlenkėme pusiau, įdėjome gelio gabalėlį ir išspaudėme visą skystį (buferį) esantį jame, skystį perkėlėme į sterilius 1,5 ml mėgintuvėlius. 4. Įpylėme vieną dešimtąją skysčio (buferio) tūrio amonio acetato tirpalo ir vieną dalį izopropanolio ir kelis kartus pavartėme mėgintuvėlį. 5. 20 min mėgintuvėlius laikėme –80 ºC. 6. Centrifugavome 15 min 14000 rpm apsisukimų per minutę greičiu. Supernatantą atsargiai nupylėme nuo susidariusių nuosėdų. 7. Įpylėme 1 ml 70 % etanolio. 8. Centrifugavome 5 min 14000 rpm apsisukimų per minutę greičiu. Nupylėme etanolį nuo susidariusių nuosėdų ir dţiovinome 50 ºC temperatūroje. 9. Nuosėdas ištirpinome 12 µl TE buferyje.

40 2.10. PGR fragmento pakartotinas pagausinimas Iš gelio išskirto PGR fragmento DNR pakartotino pagausinimo polimerazinei grandininei reakcijai (1-am mėginiui ruošti) naudojome 20 µl bendro tūrio mišinį, kurį sudaro: 13,5 µl dejonizuoto vandens; 2 µl 10xNH4 Taq reakcijos buferio be MgCl2 (Bioline, Jungtinė Karalystė), 0,6 µl MgCl2 (50 nM) (Bioline, Jungtinė Karalystė), 0,8 µl dNTP mišinio (25 nM) (Invitrogen, JAV), 0,5 µl M13 pradmens ir 0,5 µl kiekvieno mikrosatelitonio tiesioginio arba atvirkštinio pradmens, kuris yra be M13 inkarinės dalies (100 µM/µl) (Invitrogen, JAV), 0,1 Taq DNR polimerazės (500 U/µl) (Bioline, Jungtinė Karalystė) ir 1 µl iš gelio išskirto PGR produkto, skiesto 1:10. Pagausinimo reakcijos atliktos GeneAmp, PCR System 9700 (Applied Biosystems, JAV) amplifikatoriuje. Reakcija buvo atliekama pagal 2.11 lentelėje pateiktas sąlygas.

2.11 lentelė. PGR fragmento pakartotinam pagausinimai naudota programa Etapai Temperatūra Laikas Ciklai Pirminė DNR denatūracija 94 ºC 5 min 1 DNR denatūracija 94 ºC 30 s

Pradmens prilipimas Temperatūra, priklausomai nuo pradmens 30 s 45 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 1 min Galutinis DNR fragmento iginimas 72 ºC 7 min 1

Keitėme pradmenų prikibimo temperatūrą, priklausomai nuo pradmens lydymosi temperatūros ir M13 pradmens temperatūros, taikėme vidurkį ir išbandėme keliais laipsniais aukštesnę ar ţemesnę temperatūrą. Pirmiausia naudojome 40 ciklų, vėliau padidinome iki 45 ir išbandėme 50 ciklų (kai DNR denatūracijos ir pradmens prikibimo laikas 30s, fragmento ilginimas 1 min.).

2.11. PGR fragmento klonavimo sąlygos Išskirto iš gelio PGR fragmento pagausinimui naudojome fragmento klonavimą. Klonavimas atliktas naudojant TOPO TA Cloning rinkinį (Invitrogen, JAV). Darbo eiga: Terpės paruošimas Petri lėkštelėse: 1. Pagaminome LB terpę. Vienam litrui terpės paruošti naudojome: 10 g triptono (Biochemika Fluka, Sigma, JAV), 10 g NaCl (Riedel-de Haen, Sigma, JAV), 5 g mikrogranuliuoto mielių ekstrakto (Formedium, Anglija), 15 g agaro (Duchefa Biochemic, Nyderlandai) ir skiedėme bidistiliuotu vandeniu iki 1 litro, viską gerai sumaišėme, naudodami maišyklę. Terpę autoklavavome 120 ºC temperatūroje 10 min.

41 2. Terpę atvėsinome iki 50 ºC. Vienai Petri lėkštelei su LB terpe paruošti naudojome 20 µl ampilicino (100 mg/ml), 20 µl X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolil-β-D-galaktopiranozidas; 20 mg/ml) ir 10 µl IPTG (izopropil β-D-1-thiogalaktopiranozidas; 1 M). 3. Terpę išpilstėme į Petri lėkšteles ir leidome sustingti. Nenaudojamas lėkšteles su terpe laikėme +4 ºC temperatūroje.

Klonavimo reakcijos paruošimas 1. Vienai klonavimo reakcijai paruošėme 6 µl mišinio, naudojome: 0,5 µl bidistiliuoto

H2O, 1 µl druskos tirpalo (1,2 M NaCl, 0,00 M MgCl2), 4 µl PGR produkto ir 0,5 µl TOPO vektoriaus. 2. Mišinį kelis kartus švelniai supipetavome ir 30 min laikėme kambario temperatūroje. 3. Mėgintuvėlius perkėlėme ant ledo.

Cheminis klonavimas 1. One Shot E. coli TOP 10 ląsteles atitirpdėme ant ledo. 2. Į ląstelių suspensiją įpylėme 2 µl klonavimo reakcijos mišinio ir švelniai sumaišėme. 3. Mėgintuvėlius inkubavome ant ledo 30 min. 4. Ląstelėms sukėlėme karščio šoką, 30 s mėgintuvėlius pamerkdami į 42 ºC temperatūros vandens vonią. 5. Į mėgintuvėlius įpylėme 250 µl kambario temperatūros S.O.C. Medium terpės. 6. Mėgintuvėlius 1 val. inkubavome 37 ºC temperatūroje, purtant 200 rpm. 7. Visą tirpalo tūrį paskleidėme lėkštelėse su LB terpe. 8. Lėkšteles 16–18 val. inkubavome 37 ºC temperatūroje. 9. Atrinkome didţiausias baltas ląstelių kolonijas ir su jomis vykdėme kolonijų PGR.

Ląstelių kolonijų PGR Kolonijų polimerazinei grandininei reakcijai ruošti naudojome 25 µl bendro tūrio mišinį, kurį sudaro: 14,9 µl dejonizuoto vandens; 2 µl 10xNH4 Taq reakcijos buferio be MgCl2 (Bioline, Jungtinė

Karalystė), 1,2 µl MgCl2 (50 nM) (Bioline, Jungtinė Karalystė), 0,8 µl dNTP (25 nM) (Invitrogen, JAV), po 0,5 µl kiekvieno pradmens (100 µM/µl) (Invitrogen, JAV) 0,1 Taq DNR polimerazės (500 U/µl) (Bioline, Jungtinė Karalystė) ir viena ląstelių kolonija arba 3 µl terpės su kolonija (kai ląstelės pakartotinai auginamos). Kai PGR metu naudojome terpę su kolonomis, į reakcijos mišinį dėjome BSA kofaktoriaus (Biolabs, Jungtinė Karalystė), kuris pagerina reakcijos efektyvumą, padeda vykti reakcijai

42 jei mišinyje yra antrinių metabolitų. Reakcijai naudojome tris skirtingus pradmenis: M13 tiesioginį, M13 atvikrštinį, T7 tiesioginį (2.12 lentelė) ir klonuoto fragmento tiesioginį bei atvirkštinį pradmenį.

2.12 lentelė. Ląstelių kolonijų PGR naudoti pradmenys Pavadinimas Seka (5‟–3‟) M13 tiesioginis GTAAAACGACGGCCAG M13 atvirkštinis CAGGAAACAGCTATGAC T7 tiesioginis CCCTATAGTGAGTCGTATTA

Šie pradmenys pagausina į plazmidę įterptą PGR fragmentą, kartu su sekomis esančiomis greta, plazmidės ţemėlapis pateiktas 2.2 paveiksle.

2.2 pav. Į E.coli plazmidę įterpto PGR fragmento vektoriaus ţemėlapis (Sambrook et al.,1989)

Tiesioginis M13 pradmuo pagausina 391–406 bp ilgio fragmentą, atvirkštinis M13 pradmuo – 205–221 bp ilgio fragmentą, tiesioginis T7 pradmuo – 364–383 bp ilgio fragmentą. Ląstelių koloniją, naudotą PGR reakcijai, perkėlėme į 1,5 ml mėgintuvėlius su 20 µl LB medium terpės ir jei PGR reakcija teigiama, šią terpę perlėkėme į 15 ml talpos mėgintuvėlius su 2 ml LB terpe ir atlikome antrą ląstelių auginimą (16–18 val.) purtant 200 rmp greičiu, 37 ºC temperatūroje.

2.12. Plazmidţių išskyrimas iš ląstelių Plazmidţių išskyrimui iš ląstelių naudojome GenEluteTM Plasmid Miniprep Kit (Sigma- Aldrich, JAV). Darbo eiga:

43 1. Pakartotinai LB terpėje augintas E.coli ląsteles perkėlėme į 2 ml mėgintuvėlius ir nusodinome ląsteles ant mėgintuvėlio dugno centrifuguodami 1 min 14000 rpm apsisukimų per minutę greičiu. Supernatantą nupylėme. 2. Ląstelių resuspendavimui įpylėme 200 µl resuspendavimo tirpalo ir 1,3 µl RNase A tirpalo ir gerai sumaišėme. 3. Ląstelių lizavimui įpylėme 200 µl lizės tirpalo. Mėgintuvėlius 6–8 kartus pavartėme, kol mėginys tapo šviesus ir klampus. Lizavimo reakcijos negalima vykdyti ilgiau nei 5 min, nes superspiralizuota plazmidė gali denatūruoti. 4. Lizuotų ląstelių precipitavimui įpylėme 350 µl neutralizavimo/rišančio tirpalo. Mėgintuvėlius 4–6 kartus švelniai pavartėme. Nusodinome ląsteles centrifuguodami 10 min 14000 rpm apsisukimų per minutę greičiu. 5. GeneElute Miniprep Binding kolonėles įdėjome į centrifuginius mėgintuvėlius ir įpylėme 500 µl kolonėlių paruošimo tirpalo, centrifugavome 1 min 14000 rpm apsisukimų per minutę greičiu. Centrifugatą išpylėme. 6. Į paruoštas kolonėles supylėme išvalytą lizatą ir centrifugavome 1 min 14000 rpm apsisukimų per minutę greičiu. Centrifugatą išpylėme. 7. Kolonėlės išplovimui į ją įpylėme 700 µl plovimo tirpalo ir centrifugavome 1 min 14000 rpm apsisukimų per minutę greičiu. Šiame plovimo ţingsnyje pašalinamos druskų liekanos ir kitos kontaminuojančios medţiagos. Centrifugatą nupylėme ir centrifugavome dar kart 2 min 14000 rpm apsisukimų per minutę greičiu, tam kad pašalinti etanolio perteklių. 8. Kolonėles perkėlėme į naują surenkamąjį mėgintuvėlį. Įpylėme 60 µl eliucijos tirpalo ir centrifugavome 1 min 14000 rpm apsisukimų per minutę greičiu. Gautas DNR tirpalas laikomas –20 ºC temperatūroje.

2.13. Kapiliarinė elektroforezė ir DNR sekoskaita Kapiliarinė elektroforezė ir DNR sekų sekvenavimas atliktas privačios įmonės BMR Genomics, naudojant naujos kartos Roche genome sequencer flx (titanim version) sekvenatorių su Life science 454 technologija.

2.14. Statistinė duomenų analizė Duomenys apdoroti naudojant šias kompiuterines programas: Popgen 1.32 (angl. Population genetic analysis), Treecon, GenaAIEx 6 (angl. Genetic Analysis in Exel) ir MEGA 5.03.

44 Naudojant Popgen 1.32 (angl. Population genetic analysis) kompiuterinę programą tarprūšinei ir vidurūšinei genetinei įvairovei įvertinti apskaičiuotas DNR polimorfizmo lygis (P), Na – stebimų alelių skaičius, Ne – efektyvių alelių skaičius (Kimura, Crow 1964), H – genetinė įvairovė (Nei, 1973), I – Šanono indeksas (1972), apskaičiuoti genetiniai atstumai (Nei, 1978). Genetiniai atstumai įvertinti atlikus UPGMA (angl. Unweight Pair Group Method with Arithmetic Mean) klasterinę analizę pagal M. Nei ir W. Li algoritmus (Nei, Li, 1979; Link et al., 1995). Dendrogramos nubraiţytos naudojant Treecon (Van de Peer, De Wacher, 1994) ir MEGA 5.03 kompiuterines programas (Tamura et.al., 2007). GenaAIEx 6 (angl. Genetic Analysis in Exel; Peakall, Smouse, 2006) kompiuterine programa atlikta principinių koordinačių analizė (angl. Principal Coordinates Analysis), molekulinės genetinės įvairovės analizė AMOVA (angl. Analysis of Molecular Variance; Excoffier et al., 1992; Mengoni ir Bazzicalupo, 2002), apskaičiuotas tarppopuliacinę genetinę įvairovę apibrėţiantis komponentas ΦPT bei fiksacijos indeksas FST.

45 3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. DNR išskyrimo iš keturbriaunės jonaţolės metodo parinkimas Išbandėme skirti DNR iš keturbriaunės jonaţolės naudojant ,,Fermento” (#K0512) genominės DNR išskyrimo rinkinį. Skiriant pirmąjį kartą naudojome 150 ng lapų ir rėmėmės gamintojų rekomendacijomis. Išskirtos DNR koncentracija buvo labai maţa. Bandėme modifikuoti DNR skyrimo sąlygas. Padidinome lapų kiekį iki 300 ng ir uţpylę 96 % etanoliu šaldiklyje laikėme ne 20 min, o visą parą. Tačiau DNR koncentracija taip pat buvo maţa, nepakankama APPD analizei. DNR koncentracija svyravo 4,18–7,82 ng / µl ribose. CTAB (Doyle, Doyle, 1987) metodu išskirti pakankamos koncentracijos DNR iš keturbriaunės jonaţolės nepavyko, koncentracija svyravo nuo 0 iki 3 ng / µl. Naudojant išskyrimo rinkinį – Macherey-Nagel NucleoSpin Plant II su silikagelio kolonėlėmis pagal gamintojo rekomendacijas išskirta iš keturbriaunės jonaţolės DNR koncentracija buvo didesnė – 10–26,9 g / µl, todėl šį metodą ir naudojome tolimesnei analizei.

3.2. APPD metodo sąlygų optimizavimas keturbriaunės jonaţolės genetinės įvairovės tyrimams 3.2.1. APPD PGR mišinio sudėties parinkimas Remiantis anksčiau mūsų laboratorijoje atliktais tyrimais (Ţukauskienė, 2009), PGR naudojome 2xPCR Master Mix, su kuriuo ištyrėme DNR pagausinimą naudojant 14 pradmenų, iš jų tik su 3 pradmenimis – OP-A1, OP-A9 ir OP-C11, pagausinome DNR. Tolimesni bandymai buvo skirti PGR mišinio tobulinimui – vietoje 2xPCR Master Mix naudojome iš atskirų komponentų sudaromus mišinius: išbandėme 3 skirtingos sudėties Taq buferius, praturtintus: 1) (NH4)2SO4, 2) KCl, 3) be minėtų druskų. Remiantis šiais bandymais, vienam mėginiui ruošti toliau naudojome tokios sudėties PGR mišinį: 14,55 µl dejonizuoto vandens, 2,5 µl Taq buferio, praturtinto KCl, 0,2 µl dNTP mišinio,

1,5 µl MgCl2, 2 µl kiekvieno pradmens, 0,25 Taq DNR polimerazės ir 4 µl genominės DNR.

3.2.2. APPD DNR pagausinimo programos sąlygų optimizavimas DNR pagausinimo programos pritaikymui keturbriaunės jonaţolės tyrimams modifikavome kai kurias sąlygas. Pagal mūsų laboratorijoje spanguolėms taikytą programą, išbandėme pagausinimą naudojant 35, 40 ir 45 ciklus ir pasirinkome 40 ciklų. Nustatėme, kad su pradmenimis OP-A1, OP-A9, OP-B19, OP-C7a, OP-C19, OP-D20 taikant 40 ciklų pagausinimo fragmentai buvo ryškesni negu su 35

46 ciklais. Naudojant pradmenis OP-C6a, OP-C11, OP-D19a, OP-Q2, OP-Q11 DNR pagausinimas vyko tik taikant 40 ciklų. Tolimesniuose bandymuose DNR pagausinimui su visais pradmenimis naudojome 40 ciklų. Pagausinimo metu išbandėme skirtingas pradmenų prikibimo temperatūras. Pradmenims, kurių lydymosi temperatūra 32 ºC ištyrėme pagausinimą prie 30 ir 32 ºC. Pradmenims, kurių lydymosi temperatūra 34 ºC ištyrėme pagausinimą prie 29, 32 ir 34 ºC. Optimaliausia pradmenų prikibimo temperatūra atitiko jų lydymosi temperatūrą. Apibendrinant aukščiau pateiktus tyrimus keturbriaunės jonaţolės PGR taikėme: 1) mūsų pačių ruošiamą mišinį, sudaromą iš atskirų dalių, 2) DNR gausinome 40 ciklų, 3) temperatūrą, kuri atitiko pradmenų lydymosi temperatūras, 4) iš 14 APPD pradmenų atrinkome 6. Atidirbtos sąlygos apibendrintai pateiktos 3.1 lentelėje.

3.1 lentelė. Daugiaveiksnio tyrimo, skirto APPD DNR fragmentų pagausinimui, palankiausių sąlygų atrankos schema

Ciklų skaičius Temperatūra, ºC Pradmuo Taq buferio sudėtis Pradinis gausinimo etapas OP-A4 OP-B12 OP-C6a 35 40 45 27 30 32 OP-C11 OP-D19a be su su OP-Q2 papildomų Pagrindinis (NH ) SO OP-Q11 4 2 4 KCl druskų gausinimo OP-A1 etapas OP-A9 OP-B13 35 40 45 29 32 34 OP-B19 OP-C7a OP-D20 OP-C19 Galutinis gausinimo etapas

47 3.3. AP-PGR metodo sąlygų optimizavimas keturbriaunės jonaţolės genetinės įvairovės tyrimams Keturbriaunės jonaţolės genetinės įvairovės ištyrimui išbandėme AP-PGR metodą. Pagausinimui naudojome 5 skirtingus AP-PGR pradmenis ir universalų M13 pradmenį su skirtinga 5„ inkarine dalimi bei išbandėme įvairias šių pradmenų kombinacijas (sekos pateiktos 2.4 ir 2.5 lentelėse).

PGR mišiniui ruošti vienam mėginiui naudojome 11,8 µl dejonizuoto vandens, 2 µl 10xNH4

Taq reakcijos buferio be MgCl2, 1,2 µl MgCl2, 0,8 µl dNTP mišinio, 0,5 µl kiekvieno pradmens, 0,2 µl Taq polimerazė ir 3 µl genominės DNR. AP-PGR išbandėme skirtingos koncentracijos DNR įtaką pagausinimui ir nustatėme, kad skiedimas 20 kartų pagausinimo produktų susidarymui įtakos beveik neturėjo (3.1 pav.).

M 1a 2b 3c 1a 2b 3c 1a 2b 3c

3.1 pav. Skirtingos koncentracijos keturbriaunės jonaţolės DNR pagausinimas su pradmenimis APPGR_KA2, APPGR_KR2 ir 6 FAM_M13 (1–3 – skirtingi individai; a – DNR skiedimas 1:3, b – DNR skiedimas 1:10, c – DNR skiedimas 1:20; M – DNR dydţio standartas)

Pirmiausia išbandėme pagausinimą su visais 5 pradmenimis, kai poroje naudojamas universalus pradmuo M13 (iš viso penkios pradmenų poros), taip pat išmėginome pagausinimą kai naudojamas tik M13 pradmuo. Pagausinimui naudojome programą pateiktą 3.2 lentelėje.

3.2 lentelė. AP-PGR metu naudota pagausinimo programa (Welsh, McClelland, 1990) Etapai Temperatūra Laikas Ciklai Pirminė DNR denatūracija 94 ºC 5 min 1 DNR denatūracija 94 ºC 2 min Pradmens prilipimas 45 ºC 2 min 2 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 1 min DNR denatūracija 94 ºC 30 s Pradmens prilipimas 58 ºC 30 s 40 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 30 s Galutinis DNR fragmento ilginimas 72 ºC 7 min 1

48 Gavome spektrus pateiktus 3.2 pav.

M 1a 2a 3a 4a 5a K 1b 2b 3b 4b 5b K M 1c 2c 3c 4c 5c K 1d 2d 3d 4d 5d K M 1e 2e 3e 4e 5e K 1f 2f 3f 4f 5f K

3.2 pav. Keturbriaunės jonaţolės pagausintos genominės DNR spektrai, gauti panaudojus AP-PGR pradmenis (1–5 skirtingi individai, a – pradmuo AP-PGR_KM2, b – pradmuo AP-PGR_KR2, c – pradmuo M13, d – pradmuo AP-PGR_KX2, e – pradmuo AP-PGR_KA2, f – pradmuo AP-PGR_KB2, M – DNR dydţio standartas, K – neigiama kontrolė)

Atlikę pirminį patikrinimą keitėme analizės sąlygas, kad rezultatai atitiktų mūsų keliamus reikalavimus: susidarę fragmentai neturi viršyti 1000 bp, pradmenys sąveikaudami tarpusavyje neturi sudaryti nespecinių fragmentų, matomų neigiamoje kontrolėje, susidarytų kuo daugiau polimorfinių fragmentų ir kuo maţiau dimerų. Naudojant tas pačias mišinio komponentų koncentracijas, tik sutrumpinant gausinimo programos DNR fragmento ilginimo laiką iki 30 s išbandėme pagausinimą su pradmenis APPCR_KA2 ir APPCR_KM2, gavome spektrus pateiktus 3.3 pav.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K

3.3 pav. Keturbriaunės jonaţolės pagausintos genominės DNR spektrai, gauti su pradmenis APPCR_KA2 (kairėje) ir APPCR_KM2 (dešinėje), naudojant universalų M13 pradmenį (1–10 – skirtingi individai, M – DNR dydţio standartas, K – neigiama kontrolė)

Kadangi dėl pačių pradmenų sąveikos neigiamoje kontrolėje buvo matomi nespecifiniai fragmentai, išbandėme kaip vyksta pagausinimas naudojant tik pradmenis APPCR_KA2 ir APPCR_KM2, poroje nenaudojant universalaus pradmens M13 ir taikant tas pačias mišinio bei pagausinimo sąlygas, gavome spektrus pavaizduotus 3.4 pav. 49

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K

3.4 pav. Keturbriaunės jonaţolės pagausintos genominės DNR spektrai, gauti su pradmenis APPCR_KA2 (kairėje) ir APPCR_KM2 (dešinėje), nenaudojant universalaus M13 pradmens (1–10 – skirtingi individai, M – DNR dydţio standartas, K – neigiama kontrolė)

Išbandėme pagausinimą naudojant kiekvieną pradmenį poroje su pradmeniu APPCR_KR2, nes šis pradmuo yra ilgiausias ir jo sekoje yra degeneruotų nukleotidų. Taikėme tas pačias mišinio komponentų koncentracijas. DNR fragmento ilginimą vykdėme ne 30 s, o 1 min. Gavome pagausinimo spektrus pateiktus 3.5 pav.

M 1a 2a 3a 4a 5a K 1b 2b 3b 4b 5b K M 1c 2c 3c 4c 5c K 1d 2d 3d 4d 5d K

3.5 pav. Keturbriaunės jonaţolės pagausintos genominės DNR spektrai, gauti su APPGR pradmenimis, (1–5 skirtingi individai, a –APPGR_KA2 ir APPGR_KR2, b – APPGR_KB2 ir APPGR_KR2, c – APPGR_KM2 ir APPGR_KR2, d – APPGR_KX2 ir APPGR_KR2, M – DNR dydţio standartas, K – neigiama kontrolė)

Kadangi gauti spektrai ne visais atvejais atitiko mūsų keliamus reikalavimus išbandėme pagausinimą (3.3 lentelė), kai PGR mišinyje naudojami visi komponentai tokiomis pačiomis koncentracijomis, kaip minėta anksčiau, tik keičiamas pradmenų įdėjimo į mišinį laikas; taip pat išbandėme pagausinimą, kai mišinyje yra arba nėra tam tikrų pradmenų.

50 3.3 lentelė. AP-PGR mišinių paruošimo tvarka ir sudėtis Nr. AP-PGR pradmenų įdėjimo į mišinį tvarka 1 AP-PGR pradmenys į pirmąjį mišinį nededami, antrajame mišinį naudojamas M13 pradmuo, pagausinimui naudojama vieno individo (Svė3) DNR 2 Į pirmąjį mišinį dedami AP-PGR pradmenys, M13 pradmuo nenaudojamas, antrasis mišinys taip pat, pagausinimui naudojama vieno individo (Svė3) DNR 3 Į pirmąjį mišinį dedami AP-PGR pradmenys, antrajame mišinyje naudojamas M13 pradmuo, pagausinimui naudojama vieno individo (Svė3) DNR 4 Pirmajame mišinyje naudojami AP-PGR pradmenys ir M13 pradmuo, antrasis mišinys nededamas, pagausinimui naudojama vieno individo (Svė3) DNR 5 Į pirmąjį mišinį dedami AP-PGR pradmenys, antrajame mišinyje naudojamas M13 pradmuo, pagausinimui naudojama individo (Kre11) DNR 6 Į pirmąjį mišinį dedami AP-PGR pradmenys, antrajame mišinyje naudojamas M13 pradmuo, pagausinimui naudojama individo (Paj1) DNR 7 Į pirmąjį mišinį dedami AP-PGR pradmenys, antrajame mišinyje naudojamas M13 pradmuo, pagausinimui naudojama individo (Girk9) DNR 8 Į pirmąjį mišinį dedami AP-PGR pradmenys, antrajame mišinyje naudojamas M13 pradmuo, pagausinimui naudojama individo (Pal6) DNR 9 Į pirmąjį mišinį dedami AP-PGR pradmenys, antrajame mišinyje naudojamas M13 pradmuo, pagausinimui naudojama individo (Svė 3) DNR 10 Kontrolė, kai į pirmąjį mišinį dedami AP-PGR pradmenys, antrajame mišinyje naudojamas M13 pradmuo, vietoj DNR naudojamas H2O

AP-PGR pagausinimo metu naudojome du PGR mišinius, pirmuosiuose cikluose pagausinimą vykdėme naudojami pirmąjį PGR mišinį, tada programą sustabdėme ir pridėjome antrąjį PGR mišinį. Šiam pagausinimui naudojome programą, pateiktą 3.4 lentelėje.

3.4 lentelė. AP-PGR metu naudota pagausinimo programa Etapai Temperatūra Laikas Ciklai Pirminė DNR denatūracija 94 ºC 5 min 1 DNR denatūracija 94 ºC 2 min Pradmens prilipimas 45 ºC 2 min 4 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 1 min DNR denatūracija 94 ºC 30 s Pradmens prilipimas 58 ºC 30 s 6 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 1 min DNR denatūracija 94 ºC 30 s Pradmens prilipimas 58 ºC 30 s 30 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 1 min Galutinis DNR fragmento ilginimas 72 ºC 7 min 1

Pritaikius šią bandymų schemą gavome pagausinimo spektrą pateiktą 3.6 pav.

51

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 3.6 pav. Keturbriaunės jonaţolės pagausintos genominės DNR spektras, gautas pritaikius 3.3 lentelėje pateiktą bandymų schemą (1–10 numeris, M – DNR dydţio standartas, K – neigiama kontrolė)

Kadangi spektras nebuvo pakankamai kokybiškas, bei neigiamoje kontrolėje susidarė daug intensyvių nespecifinių fragmentų, naudodami tas pačias mišinio komponentų koncentracijas ir bandymų schemą pritaikėme kitą pasausinimo programą, kuomet pagrindinio gausinimo ciklų skaičius: 2, 10, 30, o fragmento ilginimo laikas atitinkamai: 5 min, 1 min ir 1 min. Gavome spektrą pateiktą 3.7 pav.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3.7 pav. Keturbriaunės jonaţolės pagausintos genominės DNR spektras, gautas pritaikius 3.3 lentelėje pateiktą bandymo schemą, pakeitus gausinimo programą (1–10 numeris, M – DNR dydţio standartas, K – neigiama kontrolė)

Atlikę šį eksperimentą nustatėme, kad pagausinimas geriausiai vyksta, kai naudojami du PGR mišiniai, į pirmąjį dedami AP-PGR pradmenys, į antrąjį M13 pradmuo, antrasis mišinys pridedamas po pirmųjų 13 pagausinimo ciklų. Šiomis sąlygomis išmėginome visas pradmenų poras, kartu su skirtingu pradmeniu M13: APPGR_KA2, APPGR_KR2 ir 6 FAM_M13; APPGR_KM2, APPGR_KR2 ir HEX_M13; APPGR_KB2, APPGR_KR2 ir TAMRA_M13; APPGR_KX2, APPGR_KR2 ir 6 FAM_M13. Patikrinę visus pradmenis, toliau eksperimentuose nebenaudojome pradmens APPGR_KB2 dėl susidariusių intensyvių, ilgesnių nei 1000 bp fragmentų. Naudodami tris pradmenų poras išmėginome pagausinimą taikydami šią schemą, tik dar kart modifikavome pagausinimo ciklų programą. Išbandėme programą, kai DNR fragmentų ilginimo laikas 52 sutrumpinamas iki 20 s visuose cikluose. Nustatėme, kad šis pagausinimas tinkamas pradmenų porai APPGR_KM2 ir APPGR_KR2. Kitoms pradmenų poroms APPGR_KA2, APPGR_KR2 ir APPGR_KX2, APPGR_KR2 jis nebuvo pakankamai efektyvus todėl, taikydami tą pačią pagausinimo programą, PGR mišinyje pamėginome naudoti 4 µl CES priedo, kurio sudėtyje yra DTT, DMSO, Betaino, BSA, šie pagalbiniai junginiai padeda vykti reakcijai, kai jai vykti trukdo antriniai metabotilai ar kitos reakciją inhibuojančios medţiagos. Gavome spektrą pateiktą 3.8 pav.

M 1a 2a 3a 4a K 1b 2b 3b 4b K

3.8 pav. Keturbriaunės jonaţolės pagausintos genominės DNR spektras, gautas su pradmenimis APPGR_KA2, APPGR_KR2 (kairėje) ir APPGR_KX2, APPGR_KR2 (dešinėje) kartu su 6 FAM_M13 (1–4 skirtingi individai, M – DNR dydţio standartas, K – neigiama kontrolė)

Atlikę bandymą, kai reakcijoje naudojamas ir nenaudojamas CES priedas nustatėme, kad pradmenų porai APPGR_KA2 ir APPGR_KR2 labiau tinka pagausinimas kai PGR mišinyje naudojamas CES priedas, tuo tarpu pradmenų porai APPGR_KX2 ir APPGR_KR2 – nenaudojant. Tuomet visoms trims pradmenų poroms išbandėme pagausinimo programą, kai nuo 13-to pagausinimo ciklo, kas kiekvieną ciklą temperatūra keliama 0,5 ºC laipsnio, pradedant nuo 57 ºC baigiant 62 ºC laipsniais, o DNR fragmentų ilginimo laikas prailginamas iki 30 s, visuose cikluose. Ši pagausinimo programa buvo tinkama tik pradmenų porai APPGR_KX2 ir APPGR_KR2. Naudodami pradmenų porą APPGR_KM2 ir APPGR_KR2 išbandėme pagausinimo programą, pakeitus fragmento ilginimo laiką į 20 s, 1 min, 20s, gausinimą vykdant 2, 10 ir 40 ciklų, ji buvo tinkama pagausinimui šiais pradmenimis. Pritaikę tinkamą pagausinimo programą kiekvienai pradmenų porai išbandėme PGR mišinyje sumaţinti MgCl2 kiekį iki 0,8 µl. Pagausinimo spektrai pateikti 3.9 pav. Geresnius spektrus, sumaţinus

MgCl2 kiekį, gavome su pradmenų poromis APPGR_KX2 ir APPGR_KR2 bei APPGR_KA2 ir

APPGR_KR2, pradmenų porai APPGR_KA2 ir APPGR_KR2 sumaţintas MgCl2 kiekis netiko, susidarė ilgesnių nei 1500 bp fragmentų, jie buvo nepakankamai intensyvūs.

53

M 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a K 1b 2b 3b 4b M 5b 6b 7b K 1c 2c 3c 4c 5c 6c 7c K 3.9 pav. Keturbriaunės jonaţolės pagausintos genominės DNR spektrai, gauti su APPGR pradmenimis,

PGR mišinyje pakeitus MgCl2 kiekį (1–7 skirtingi individai, a – APPGR_KA2 ir APPGR_KR2, b – APPGR_KM2 ir APPGR_KR2, c – APPGR_KX2 ir APPGR_KR2, kartu su 6 FAM_M13, M – DNR dydţio standartas, K – neigiama kontrolė)

Pritaikius tinkamą pagausinimą agarozės gelyje, PGR produktai patikrinti kapiliarinės elektroforezės būdu (šiuos tyrimus atliko įmonė BMR Genomics; Paduva, Italija). Rezultatai parodė, kad PGR produktus reikia valyti nuo priemaišų, dalelių su krūviais. PGR produktus valėme MinElute filtrinėse plokštelėse, tuomet kapiliarinės elektroforezės rezultatai buvo kokybiškesni. Atidirbtos metodikos sąlygos apibendrintai pateiktos 3.5 – 3.10 lentelėse.

3.5 lentelė. Bendroji pradmenų derinių paieškos schema 1-as AP-PGR 2-as AP-PGR Universalus Nespecifiniai pradmuo pradmuo pradmuo pagausinti fragmentai 1 a) + a) + + 2 a) + - 3 a) + a) + a) + + 4 a) + a) + a) b) + -

3.6 lentelė. Pradmenų derinių paieškos nuodugni schema 1-as 2-as 3-as Nespecifiniai AP-PGR AP-PGR universalus pagausinti pradmuo pradmuo pradmuo fragmentai 1 APPGR_KA2 - M13 + APPGR_KB2 - M13 + APPGR_KM2 - M13 + APPGR_KR2 - M13 + APPGR_KX2 - M13 + 2 APPGR_KA2 - - - APPGR_KB2 - - - APPGR_KM2 - - - APPGR_KR2 - - - APPGR_KX2 - - -

54 3.6 lentelė. Pradmenų derinių paieškos nuodugni schema (tęsinys) 3 APPGR_KA2 APPGR_ KR2 - - APPGR_KB2 APPGR_ KR2 - - APPGR_KM2 APPGR_ KR2 - - APPGR_KX2 APPGR_ KR2 - - 4 APPGR_KA2 APPGR_ KR2 M13 + APPGR_KB2 APPGR_ KR2 M13 + APPGR_KM2 APPGR_ KR2 M13 + APPGR_KX2 APPGR_ KR2 M13 + 5 APPGR_KA2 APPGR_ KR2 a) - b) M13 - APPGR_KB2 APPGR_ KR2 a) - - b) M13 APPGR_KM2 APPGR_ KR2 a) - - b) M13 APPGR_KX2 APPGR_ KR2 a) - - b) M13

3.7 lentelė. Daugiaveiksnio tyrimo, skirto AP-PGR DNR fragmentų pagausinimui, palankiausių sąlygų atrankos schema Fragmento Pradmens MgCl Ciklų skaičius ilginimo prikibimo Pradmenys 2 (50 nM) trukmė, s temperatūra, ºC Pradinis 2 + 2 gausinimo M13 0,8 µl 1,2 µl

etapas 2 4 2 300 30 20 40 º 45 º 45 º Pagrindinis 10 6 10 1 30 20 58 º 58 º 57 º→ M13

gausinimo 62 º etapas 30 30 10 1 30 20 62 º 58 º 62 º

Galutinis gausinimo etapas

3.8 lentelė. APPGR_KR2+APPGR_KM2 pradmenų porai atrinktos specifinės AP-PGR sąlygos ir PGR mišinio sudėtinės dalys Fragmento Pradmens Pradmenys, Ciklų ilginimo prikibimo jų įvedimo PGR mišinio sudėtinės dalys skaičius trukmė, min temperatūra, ºC seka 12,2 µl H2O 2 µl 10xNH Taq buferis, Pradinis gausinimo 0,5 µl KR2 4 1 94 º 1,2 µl MgCl etapas 0,1 µl KM2 2 0,8 µl dNTP 0,2 µl Taq polimerazė 2 5 40 º

3,95 µl H2O Pagrindinis 10 1 58 º 0,25 µl M13 0,5 µl 10xNH4 Taq gausinimo etapas 0,3 µl MgCl2 10 1 62 º Galutinis 1 72 º gausinimo etapas

55 3.9 lentelė. APPGR_KR2+APPGR_KX2 pradmenų porai atrinktos specifinės AP-PGR sąlygos ir PGR mišinio sudėtinės dalys Fragmento Pradmenys, Ciklų Pradmens prikibimo ilginimo jų įvedimo PGR mišinio sudėtinės dalys skaičius temperatūra, ºC trukmė, s seka 12,2 µl H2O 2 µl 10xNH Taq buferis, Pradinis gausinimo 0,5 µl KR2 4 1 94 º 1,2 µl MgCl etapas 0,1 µl KX2 2, 0,8 µl dNTP, 0,2 µl Taq polimerazė 2 30 45 º

Nuo 57 º 3,95 µl H2O, laipsniškai 0,5 µl 10xNH Taq, Pagrindinis 10 30 0,25 µl M13 4 gausinimo etapas keliama 0,3 µl MgCl2 iki 62 º 10 30 62 º Galutinis gausinimo 1 72 º etapas

3.10 lentelė. APPGR_KR2+APPGR_KM2 pradmenų porai atrinktos specifinės AP-PGR sąlygos ir PGR mišinio sudėtinės dalys Fragmento Pradmens Pradmenys, Ciklų ilginimo prikibimo jų įvedimo PGR mišinio sudėtinės dalys skaičius trukmė, s temperatūra, ºC seka 12,2 µl H2O Pradinis 2 µl 10xNH Taq buferis, 0,5 µl KR2 4 gausinimo 1 94 º 0,8 µl MgCl 0,1 µl KM2 2, etapas 0,8 µl dNTP, 0,2 µl Taq polimerazė 2 20 40 º Pagrindinis 3,95 µl H2O, gausinimo 10 20 58 º 0,25 µl M13 0,5 µl 10xNH4 Taq, etapas 0,3 µl MgCl2, 10 20 62 º Galutinis gausinimo 1 72 º etapas

3.4. PKS metodo sąlygų optimizavimas keturbriaunės jonaţolės genetinės įvairovės tyrimams 3.4.1. Mikrosatelitinių pradmenų kūrimas NCBI duomenų bazėje nėra ţinių apie mikrosatelitines H. perforatum ir H. maculatum sekas. Radome tik kitos jonaţolės rūšies – Hypericum cumulicola (Small) P. Adams nustatytas 19 mikrosatelitinių sekų (Edwards et al., 2007; 1 priedas). Remdamiesi jomis sukūrėme mikrosatelitinius pradmenis ieškoti šių sekų Lietuvos keturbriaunei jonaţolei.

56 Sekų palyginimui naudojome NCBI duomenų bazės parinktį Primer BLAST. Programa CG- SSR ir SSRIT ţinomoje nukleotidų sekoje suradome mikrosatelitines sekas. Programoje Geneious Pro™ 3.6 įrašėme Hypericum cumulicola nukleotidų seką, nurodydami, kur yra mikrosatelitinės sekos ir pateikdami įvairias sąlygas, suradome visas galimas nukleotidų sekas, atitinkančias mikrosatelitinius pradmenis. Naudojant kitą programą Perl Primer v1.1.19 patikrinome programos siūlomas sekas ir atrinkome geriausiai atitinkančios šias sąlygas: tiesioginis ir atvirkštinis pradmuo turi turėti kuo panašesnę lydymosi temperatūrą Tm, dimerų susidarymo tikimybė turi būti kuo maţesnė, nukleotidų sekos, atitinkančios pradmenis, turi būti kuo arčiau mikrosatelitinės sekos, G ir C nukleotidų procentas sekoje turi būti apie 50, pradmens ilgis turi būti apie 20–23 bazių porų ilgio. Sukūrėme 19 mikrosatelitinių pradmenų porų. Kiekvienoje pradmenų poroje prie vieno pradmens buvo prijungta universalaus pradmens M13 5„ inkarinė dalis. PKS pradmenų sekos pateiktos 2.7 lentelėje. Tam, kad perskaityti DNR fragmentų seką, jie turi būti ţymėti specialiu fluorescuojančiu daţu, kuris prikimba prie M13 pradmens sekos. Patikrinus 19 mikrosatelitinių pradmenų porų pagausinimą su keturbriaunės jonaţolės DNR naudojant Paduvos universiteto laboratorijoje atidirbtą metodiką (Barcaccia et al., 2003) nustatėme, kad ji netinka mūsų tyrimams, susidaro keli įvairaus ilgio pagausinimo produktai, todėl metodiką teko modifikuoti. Dvi pradmenų poros (0627 ir 0628) visiškai negeneravo pagausinimo produktų, jų tolimesniuose tyrimuose nenaudojome. Siekėme agarozės gelyje gauti vieną tikėtino ilgio fragmentą, arba kuo intensyvesnį, didelės koncentracijos tikėtiną fragmentą, kad būtų galima jį iškirpti iš agarozės gelio ir suţinoti jo nukleotidų seką.

3.4.2. PKS metodo PGR mišinio optimizavimas

PKS metodu PGR reakcijoje vienam mėginiui ruošti visada naudojome 2 µl 10xNH4 Taq reakcijos buferio be MgCl2, nes šio komponento koncentracijos keitimas mišinyje neturi įtakos fragmentų susidarymui. Taip pat naudojome pastovų kiekį 0,8 µl dNTP ir 0,2 µl Taq DNR polimerazės. Tik vienu atveju, tam kad gautume maţiau fragmentų pabandėme naudoti 0,1 µl Taq polimerazės. Daţniausiai naudojome optimalų MgCl2 kiekį 0,6 µl, norėdami gauti intensyvesnius fragmentus, kurių koncentracija būtų didesnė, MgCl2 kiekį padidinome dvigubai iki 1,2 µl, tačiau tuomet susidarydavo ir daugiau pagausinimo produktų. Elektroforezės metu patikrinę gryną keturbriaunės jonaţolės DNR ir vizualiai įvertinę jos koncentraciją išbandėme ar vyksta pagausinimas skiedţiant genominę DNR 10 kartų. Nustatėme, kad pagausinimas vyksta ir į reakcijos mišinį dėjome 2 µl DNR. Vėliau išbandėme DNR praskiesti 20 kartų, pagausinimas taip pat vyko, o į reakcijos mišinį dėjome 4 µl DNR. 57 Kiekvieną kartą pakeitus sąlygas ir gaunat įvairaus ilgio fragmentus, iš agarozės gelio iškirpdavome tikėtino ilgio fragmentą arba kitą intensyvumu išsiskiriantį fragmentą. Iš fragmento išskyrėme DNR ir ją pakartotinai pagausinome, tam kad gautume tikslų šio fragmento pagausinimą. Pakartotino pagausinimo metu naudojome 10 kartų skiestą fragmento DNR ir jos į mišinį dėjome 2 µl, taip pat išbandėme dėti 1 µl 10 kartų skiestos fragmento DNR ir 1 µl – neskiestos. Išmėginome įvairias pradmenų koncentracijas. Pradinio pagausinimo metu pradmens, kuris turėjo universalaus pradmens M13 5„ inkarinę dalį į reakcijos mišinį dėjome maţiau – 0,1 µl, nes šis pradmuo ilgesnis, pradmens be inkarinės dalies dėjome daugiau – 0,3 µl, taip pat naudojome 0,25 µl atvirkštinio M13 pradmens. Tačiau pagausinimo metu susidarė keli skirtingo ilgio fragmentai. Todėl išbandėme pagausinimą, kai mišinyje nenaudojamas M13 pradmuo, nes gal būt jis sąlygoja nereikalingų fragmentų susidarymą, o tiesioginio ir atvirkštinio pradmens dėjome vienodą kiekį – po 0,3 µl, vėliau po 0,5 µl ir modifikavome pagausimo programą. Pakartotino pagausinimo metu naudojome po 0,3 µl M13 pradmens ir pradmens be inkarinės dalies, taip pat mišinyje bandėme naudoti po 0,5 µl šių pradmenų ir maţesnės koncentracijos fragmento DNR.

3.4.3. PKS metodo pagausinimo programos sąlygų optimizavimas Pradinio pagausinimo metu kiekvienam pradmeniui, kuris neturėjo M13 5„ inkarinės dalies apskaičiavome lydymosi temperatūrą (3.11 lentelė). Pradmens prikibimui su visais pradmenimis pirmiausia naudojome trim laipsniais ţemesnę temperatūrą nei pradmens lydymosi temperatūra, tačiau gavome kelis skirtingo ilgio pagausinimo fragmentus. Todėl pagal gautus spektrus pradmenų 0631, 0633, 0636, 0642, 0643 prikibimui išmėginome temperatūrą sumaţinti dar dviem laipsniais, pradmenims 0625, 0626, 0635, 0640 padidinome vienu laipsniu, o pradmenims 0629, 0630, 0634, 0638, 0639 naudojome vienu laipsniu ţemesnę temperatūrą, nei jų lydymosi temperatūra, pradmeniui 0641 naudojome jo lydymosi temperatūrą.

58 3.11 lentelė. Keturbriaunės jonaţolės sukurtų PKS pradmenų apskaičiuotos lydymosi

temperatūros (Tm) ir tikėtinas pagausinto fragmento ilgis

Pradmuo, neturintis Tm (ºC) Fragmento ilgis, bp M13 inkarinės dalies 0625 61 209 0626 56 251 0627 66 365 0628 67 324 0629 64 323 0630 60 542 0631 60 177 0632 60 260 0633 63 162 0634 62 226 0635 62 491 0636 59 115 0637 60 233 0638 63 341 0639 62 201 0640 58 116 0641 64 184 0642 60 422 0643 60 198

Pakartotino pagausinimo metu pradmenų prikibimui naudojome temperatūrą, atsiţvelgdami į konkretaus pradmens, be inkarinės dalies lydymosi temperatūrą ir M13 pradmens lydymosi temperatūrą, kuri yra 62,4 ºC. Jei pradmens lydymosi temperatūra buvo 56 ar 58 ºC laipsniai pirmiausia pradmenų prikibimui išbandėme 57 ºC temperatūrą, vėliau pabandėme temperatūrą sumaţinti dar dviem laipsniais (55 ºC). Jei lydymosi temperatūra buvo 60 ºC laipsnių pirmiausia išbandėme 58 ºC laipsnių temperatūrą, vėliau 60 ºC. Jei pradmens lydymosi temperatūra buvo didesnė nei 60 ºC (nuo 61 iki 65 ºC ) pirmiausia prikibinimui naudojome 60 ºC temperatūrą, vėliau 62 ºC temperatūrą. Labiausiai tiko vėliausiai išbandyta temperatūra. Pirminės DNR denatūracijos ir galutinio DNR fragmento ilginimo etapo vykdymo laiko ir temperatūros nekeitėme. Keitėme kitų etapų ciklų skaičių. Pradiniam pradmenų pagausinimui naudojome programą pateiktą 3.12 lentelėje. Kuomet gausinimo etapas, dalinamas į dvi dalis, viena trumpesnė – penkių ciklų (kai fragmento ilginimas ir pradmens prikibimas vykdomas 1 min.), kita ilgesnė – 45 ciklų (kai fragmento ilginimas ir pradmens prikibimas vykdomas 30 s).

59 3.12 lentelė. PKS metu naudota DNR fragmentų pagausinimo programa Etapai Temperatūra Laikas Ciklai Pirminė DNR denatūracija 94 ºC 5 min 1 DNR denatūracija 94 ºC 1 min Pradmens prilipimas Temperatūra, priklausomai nuo pradmens 1 min 5 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 30 s DNR denatūracija 94 ºC 30 s Pradmens prilipimas Temperatūra, priklausomai nuo pradmens 30 s 45 DNR fragmento ilginimas 72 ºC 30 s Galutinis DNR fragmento ilginimas 72 ºC 7 min 1

Tačiau taip gausinant negavome norimų rezultatų, todėl vėliau naudojome paprastą programą su 45 ciklais. Pakartotinam pagausinimui pirmiausia naudojome 40 ciklų, vėliau padidinome iki 45 ir išbandėme 50 ciklų. Pagausinimas geriausiai vyko naudojant 45 ciklus.

3.4.4. PGR fragmento klonavimas Pakartotino pagausinimo metu negavome pakankamos koncentracijos sekoskaitai produktų, todėl pagausinimui naudojome PGR fragmento klonavimą. Klonavome šiuos PGR fragmentus: 0625a, 0625b, 0626, 0629d, 0630, 0640a ir 0640c. Keitėme transformacijos mišinio komponentų sudėtį. Išmėginome protokolus, pateiktus 3.13 lentelėje. 3.13 lentelė. Transformacijos skirtingų mišinių sudėtis I mišinys II mišinys III mišinys IV mišinys PGR mišinio 4 µl 4 µl 1 µl 0,5 µl Druskų 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl H2O 1 µl 0,5 µl 3 µl 4 µl Vektoriaus 1 µl 0,5 µl 1 µl 0,5 µl

Nustatėme, kad transformacija vyksta kai naudojamos III ir IV mišinio komponentų koncentracijos. Kolonijų PGR pagausinimui pirmiausia naudojome M13 tiesioginį ir M13 atvirkštinį pradmenis, tačiau pagausinimui nevykstat, išbandėme naudoti T7 tiesioginį ir M13 atvirkštinį pradmenis (sekos pateiktos 2.7 lentelėje) , su šiais pradmenimis pagausinimas vyko. Naudojant III mišinį pavyko klonuoti 0625a fragmentą, tačiau transformacija buvo sėkminga tik vienoje ląstelių kolonijoje (3.10 pav.).

60

3.10 pav. DNR fragmento 0625a transformacija E.coli ląstelių kolonijoje

Naudojat IV mišinį pavyko klonuoti 0630 fragmentą trijose ląstelių kolonijose (3.11 pav.).

3.11 pav. DNR fragmento 0630 transformacija E.coli ląstelių kolonijose

Ląstelių kolonijas, į kurias pavyko įterpti DNR fragmentą, pakartotinai auginome, tuomet išskyrėme šių ląstelių plazmides ir patikrinome jas agarozės gelyje (3.12 pav.).

3.12 pav. E.coli ląstelių plazmidinė DNR su įterptu DNR fragmentu

Plazmidėse po sekoskaitos mikrosatelitinių sekų nerasta. Nors įvairiuose pasaulio ţemynuose auga apie 400 jonaţolės rūšių, ir tarp jų H. maculatum (ar net H. perforatum) yra svarbiausi vaistiniai augalai, NCBI nukleotidų duomenų bazėje aptikome tik Hypericum cumulicola, kuri yra retas, endeminis, sukulentinis Floridos krūmokšnis (augantis baltame smėlyje, miškų properšose) sekas. Specifiškai pagausinti mūsų tiriamos keturbriaunės jonaţolės sekų nepavyko tikriausiai dėl to, kad išvaizda ir geografija besiskirianti rūšis labai skiriasi ir genetiškai.

61 3.5. Keturbriaunės jonaţolės populiacijų genetinės įvairovė, įvertinta APPD metodu H. maculatum genetinei įvairovei ištirti pritaikėme atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR metodą. Išbandėme 14 oligonukleotidinių APPD pradmenų: OP-A1, OP-A9, OP-B13, OP-B19, OP- C7a, OP-C19, OP-D20, OP-A4, OP-B12, OP-C6a, OP-C11, OP-D19a, OP-Q2 ir OP-Q11. Tolimesniuose tyrimuose naudojome 6 informatyviausius, geriausiai atsikartojančius ir duodančius aiškius spektrus pradmenis (3.14 lentelė).

3.14 lentelė. Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum) Lietuvos populiacijų

polimorfinių lokusų skaičius (Pn) ir jų procentas (P %), pagal pasirinktus APPD pradmenis (Barcaccia et al., 2006)

Pradmens Pradmens DNR atkarpų Pn P (%) pavadinimas seka (5‟–3‟) dydis, bp OP-A1 CAGGCCCTTC 250–2100 20 100 OP-A4 AATCGGGCTG 230–2000 19 100 OP-A9 GGGTAACGCC 250–1200 12 100 OP-B19 ACCCCCGAAG 400–2500 15 100 OP-C7a GTCCCGACGA 350–3200 21 100 OP-C11 AAAGCTGCGG 250–1700 17 100

DNR fragmentų dydis svyravo nuo 230 iki 3200 bp. Su pradmeniu OP-A1 pagausintų fragmentų ilgis buvo nuo 250 bp iki 2100 bp, su pradmeniu OP-A9 nuo 250 bp iki 1200 bp, su pradmeniu OP-B19 nuo 400 bp iki 2500 bp, su pradmeniu OP-C7a nuo 350 bp iki 3200 bp, su pradmeniu OP-A4 nuo 230 bp iki 2000 bp, o su pradmeniu OP-C11 nuo 250 bp iki 1700 bp. Naudojant 6 pradmenis polimorfinių lokusų skaičius svyravo nuo 15 iki 21. Daugiausiai polimorfinių lokusų generavo pradmuo OP-C7a, maţiausiai – OP-A9. Kiekvieno pradmens visi generuoti fragmentai buvo polimorfiniai, ir sudarė 100 %. Keturbriaunės jonaţolės visų populiacijų vidutinis DNR polimorfizmo lygis su visais pradmenimis buvo 35,82 % (3.15 lentelė).

62 3.15 lentelė. Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum) Lietuvos populiacijų polimorfizmas (P %) pagal kiekvieną pradmenį ir bendras OP-A1 OP-A4 OP-A9 OP-B19 OP-C7a OP-C11 P %, su visais pradmenimis Gruzdiškė 55,00 36,84 33,33 40,00 33,33 41,18 40,38 Girkalnis 65,00 26,32 33,33 26,67 19,05 35,29 34,62 Paltupiai 25,00 21,05 25,00 0,00 23,81 35,29 22,12 Daugodai 45,00 47,37 75,00 33,33 33,33 52,94 46,15 Padubysys 50,00 21,05 58,33 26,67 28,57 29,41 34,62 Lyduvėnai 40,00 63,16 50,00 33,33 23,81 64,71 45,19 Kretinga 45,00 21,05 16,67 40,00 38,10 5,88 28,85 Girionys 35,00 52,63 25,00 20,00 33,33 35,29 34,62 Pajūris 20,00 26,32 25,00 40,00 42,86 35,29 31,73 Katauskiai 30,00 47,37 25,00 20,00 23,81 41,18 31,73 Noreikiškės 60,00 73,68 66,67 0,00 38,10 11,76 42,31 Svėdasai 40,00 47,37 66,67 46,67 19,05 17,65 37,50

Didţiausias polimorfizmo lygis 46,15 % nustatytas Daugodų populiacijoje, maţiausias – 22,12 % Paltupių. Pagal atskirus pradmenis didţiausias polimorfizmas nustatytas su OP-A9 pradmeniu Daugodų populiacijoje, maţiausias su OP-C11 pradmeniu Kretingos populiacijoje. Popgene programa genetinė įvairovė tarp populiacijų ir populiacijų viduje, įvertinta pagal

šiuos rodiklius: Na – stebimų alelių skaičių, Ne – efektyvių alelių skaičių (Kimura, Crow, 1964), H – Nei genetinę įvairovę (Nei, 1973) ir I – Šanono indeksą (Shanon, 1972) (3.16 lentelė). Stebimų alelių skaičius (Na), gautas su visais pradmenimis tarp visų keturbriaunės jonaţolės populiacijų svyravo nuo 1,317 iki 1,462. Vidutinis visų populiacijų stebimų alelių skaičius buvo 1,36. Efektyvių alelių skaičius

(Ne) svyravo nuo 1,127 iki 1,240. Vidutinis efektyvių alelių skaičius sudarė 1,219. Didţiausia Nei genetinė įvairovė (H) 0,143 buvo nustatyta Daugodų populiacijoje, maţiausia 0,08 – Noreikiškių populiacijoje, vidutinė 0,1. Didţiausias Šanono indeksas (I) 0,218 buvo Daugodų populiacijoje, maţiausias 0,125 – Katauskių populiacijoje, vidutinis – 0,16.

63 3.16 lentelė. Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum) Lietuvos populiacijų genetinės įvairovės rodikliai, gauti panaudojant 6 APPD pradmenimis

Populiacijos Na Ne H I Vid. PI Vid. PI Vid. PI Vid. PI Gruzdiškė 1,404 0,249 1,203 0,176 0,117 0,092 0,179 0,132 Girkalnis 1,346 0,242 1,188 0,165 0,111 0,090 0,167 0,130 Paltupiai 1,221 0,211 1,156 0,165 0,086 0,088 0,126 0,126 Daugodai 1,462 0,254 1,240 0,173 0,143 0,095 0,218 0,137 Padubysys 1,346 0,242 1,164 0,147 0,101 0,083 0,156 0,122 Lyduvėnai 1,452 0,253 1,226 0,174 0,133 0,094 0,203 0,135 Kretinga 1,289 0,230 1,137 0,142 0,082 0,079 0,126 0,116 Girionys 1,346 0,242 1,127 0,123 0,082 0,072 0,133 0,108 Pajūris 1,317 0,237 1,134 0,140 0,082 0,077 0,129 0,112 Katauskiai 1,317 0,237 1,131 0,139 0,080 0,077 0,125 0,112 Noreikiškės 1,423 0,251 1,152 0,135 0,098 0,076 0,158 0,113 Svėdasai 1,375 0,246 1,198 0,164 0,118 0,091 0,180 0,131 Vid. popul. 1,36 0,04 1,17 0,02 0,1 0,01 0,16 0,01 Vid. – vidurkis; PI – pasikliautinis intervalas; n = 15; Na – stebimų alelių skaičius, Ne – efektyvių alelių skaičius; H – Nei genetinė įvairovė; I – Šanono indeksas

Pagal Popgene programą apskaičiuotas populiacijų genetinės diferenciacijos koeficientas (Gst) ir genų srautas (Nm) tarp populiacijų pagal atskirus pradmenis (3.17 lentelė). Diferenciacijos koeficientas (Gst) tarp populiacijų pagal atskirus pradmenis svyravo nuo 0,263 iki 0,438. Didţiausias diferenciacijos koeficientas tarp populiacijų gautas pagal pradmenį OP-B19, maţiausias – pagal OP- C11. 3.17 lentelė. Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum) Lietuvos populiacijų genetinės

diferenciacijos koeficientas (Gst) ir genų srautas (Nm) tarp populiacijų pagal atskirus pradmenis

Pradmens Gst Nm pavadinimas OP-A1 0,336 0,999 OP-A4 0,341 0,965 OP-A9 0,304 1,147 OP-B19 0,438 0,643 OP-C7a 0,285 1,253 OP-C11 0,263 1,400 Pagal visus 0,327 1,068

Genų srautas (Nm) tarp populiacijų, įvertintas su kiekvienu pradmeniu svyravo nuo 0,643 iki 1,4. Didţiausias genų srautas nustatytas su pradmeniu OP-C11, maţiausias su – OP-B19. Pagal visus pradmenis nustatytas diferenciacijos lygis yra gana vidutinis (0,327), esant tarp jų gana dideliam genų srautui (1,068).

64 Pagal GenAlex v.6 programą Lietuvoje rinktų keturbriaunės jonaţolės populiacijų genetinė

įvairovė (AMOVA) yra gana didelė 42 % (ΦPT = 0,42). Pagal procentinį molekulinės įvairovės pasiskirstymą tarp populiacijų ir jų viduje, vidupopuliacinė genetinė įvairovė – 58 % (3.13 pav.) yra didesnė.

Tarp populiacijų 42%

Populiacijų viduje 58%

3.13 pav. Procentinis molekulinės įvairovės pasiskirstymas tarp keturbriaunės jonaţolės populiacijų ir populiacijų viduje

Apskaičiavome genetinius atstumus pagal atskirus pradmenis (2 priedas). Su pradmeniu OP- A1 didţiausias (0,17) genetinis atstumas nustatytas tarp Padubysio ir Paltupių populiacijų, maţiausias (0,018) tarp Kretingos ir Svėdasų. Su pradmeniu OP-A4 didţiausias (0,211) genetinis atstumas nustatytas tarp Padubysio ir Paltupių populiacijų, maţiausias (0,015) tarp Noreikiškių ir Girionių. Su pradmeniu OP-A9 didţiausias (0,244) genetinis atstumas nustatytas tarp Padubysio ir Pajūrio populiacijų, maţiausias (0,003) tarp Kretingos ir Girionių. Su pradmeniu OP-B19 didţiausias (0,214) genetinis atstumas nustatytas tarp Pajūrio ir Paltupių populiacijų, maţiausias (0,003) tarp Kretingos ir Katauskių, bei Noreikiškių ir Girionių. Su pradmeniu OP-C7a didţiausias (0,118) genetinis atstumas nustatytas tarp Pajūrio ir Girkalnio populiacijų, maţiausias (0,007) tarp Noreikiškių ir Girionių. Su pradmeniu OP-C11 didţiausias (0,121) genetinis atstumas nustatytas tarp Kretingos ir Paltupių populiacijų, Kretingos ir Noreikiškių populiacijos buvo vienodos. Popgene programa apskaičiuoti visų keturbriaunės jonaţolės populiacijų genetiniai atstumai, panaudojus 6 APPD pradmenis (3.18 lentelė).

65 3.18 lentelė. Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum) genetiniai atstumai tarp populiacijų pagal 6 APPD pradmenis (Nei, 1972)

Kre Paj 0,062 Lyd 0,054 0,083 Pal 0,093 0,106 0,100 Kat 0,017 0,065 0,052 0,090 Gruz 0,045 0,058 0,071 0,073 0,048 Girk 0,048 0,068 0,068 0,084 0,055 0,044 Dau 0,047 0,067 0,076 0,088 0,050 0,068 0,075 Pad 0,054 0,102 0,087 0,125 0,059 0,103 0,069 0,075 Nor 0,029 0,047 0,066 0,084 0,025 0,040 0,056 0,054 0,075 Girio 0,020 0,066 0,054 0,096 0,017 0,041 0,055 0,053 0,070 0,027 Svė 0,028 0,062 0,062 0,110 0,033 0,060 0,075 0,060 0,081 0,042 0,032 Kre Paj Lyd Pal Kat Gruz Girk Dau Pad Nor Girio Svė

Genetiniai atstumai tarp populiacijų svyravo nuo 0,017 iki 0,125. Labiausiai skyrėsi Paltupių ir Padubysio populiacijos (0,125), taip pat Paltupių ir Svėdasų populiacijos (0,110), bei Paltupių ir Pajūrio (0,106) populiacijos, tačiau šie genetiniai atstumai yra nedideli. Maţiausias genetinis atstumas (0,017) nustatytas tarp Kretingos ir Katauskių populiacijų, taip pat tarp Girionių ir Katauskių (0,017), bei tarp Kretingos ir Girionių (0,020) populiacijų, šie duomenys rodo, kad šios populiacijos yra genetiškai artimiausios. GenAlEx v.6 kompiuterine programa atlikome fragmentų skaičiaus populiacijose vertinimą (3.14 pav.).

60 0,180 Fragmentų skaičius, kurių 0,160 50 daţnis didenis nei 5% 0,140 Savitų fragmentų skaičius 40 0,120 0,100 30 Efektyvių fragmentų 0,080 skaičius (<=25%) Skaičius 20 0,060 Efektyvių fragmentų 0,040 10 skaičius (<=50%) 0,020 0 0,000 Heterozigitiškumas Tikėtino heterozigotiškumo vidurkis

Pajūris Girionys GruzdiškėGirkalnisPaltupiaiDaugodai Kretinga Svėdasai PadubysysLyduvėnai KatauskiaiNoreikiškės Populiacijos

3.14 pav. Keturbriaunės jonaţolės populiacijose APPD būdu pagausintų DNR fragmentų skaičius Didesnio nei 5 % daţnio fragmentų skaičius populiacijose svyravo nuo 27 iki 48, daugiausia fragmentų nustatyta Daugodų populiacijoje, maţiausiai – Paltupių. Girkalnio, Paltupių ir Kretingos populiacijose savitų fragmentų nenustatyta, kitų populiacijų savitų fragmentų skaičius svyravo nuo 1 iki 4, daugiausia jų buvo būdinga Daugodų populiacijai. Efektyvių alelių skaičius, kurių (≤ 25 % ir ≤

66 50 %) svyravo atitinkamai 3–13 ir 11–24 ribose. Tikėtino heterozigotiškumo vidurkis buvo 0,08–0,118 ribose, maţiausias – Katauskių populiacijos, didţiausias – Svėdasų. Remiantis genetiniais atstumais ir panaudojant UPGMA grupavimo metodą nustatytas populiacijų giminingumas (3.15 pav.).

Gruzdiske Girkalnis Daugodai Kretinga Katauskiai Girionys Noreikiskes Svedasai Lyduvenai Pajuris Padubysys Paltupiai

1 3.15 pav. Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum) Lietuvos populiacijų genetinio panašumo UPGMA dendrograma pagal Nei (1972)

Genetinio panašumo dendrogramoje labiausiai atsiskiria Paltupių, Padubysio, Pajūrio ir Lyduvėnų populiacijos. Kitos populiacijos sudaro vieną didesnį klasterį, kuris savo ruoţtu dalinasi į dvi maţesnes šakas, iš kurių viena susideda iš Gruzdiškės ir Girkalnio populiacijų, o kita susideda iš daug populiacijų – Kretingos, Katauskių, Girionių, Noreikiškių, Svėdasų ir labiau atsiskiriančios Daugodų populiacijos. Atlikus visų populiacijų genetinio panašumo principinių koordinačių analizę (3.16 pav.) nustatyta, kad pagal 3 koordinačių ašis aprašyta 63,17 % bendrosios genetinės įvairovės, pagal 1-ąją ašį – 27,12 %, pagal 2-ąją – 20,57 %, pagal 3-ąją – 15,48 %.

Padubysys

Paltupiai Girkalnis Lyduvėnai Daugodai Kretinga Katauskiai

Koordinatė2(20,57 %) Girionys Noreikiskes Svėdasai Gruzdiškė Pajuris Koordinatė 1 (27,12 %)

3.16 pav. Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum) 12-os Lietuvos populiacijų išsidėstymas dvimatėje erdvėje (principinių koordinačių analizė) pagal genetinį panašumą

67 Kaip ir UPGMA dendrogramoje, principinių koordinačių analizės metu labiausiai atsiskiria Paltupių ir Padubysio populiacijos. Pagal principinių koordinačių analizę artimiausios buvo 5 populiacijos – tai Kretingos, Katauskių, Girionių, Svėdasų ir Noreikiškių, UPGMA dendrogramoje šios populiacijos taip pat sudarė vieną klasterį. Pajūrio ir Gruzdiškių padėtis taikant skirtingus statistinės analizės metodus labai skyrėsi: principinių koordinačių sistemoje šios dvi populiacijos grupuojasi į vieną koordinačių sistemą, tuo tarpu UPGMA dendrogramoje jos yra gana atsiskyrusios. Atlikome visų keturbriaunės jonaţolės individų genetinio panašumo principinių koordinačių analizę (3.17 pav.).

Gruzdiškė Girkalnis Paltupiai Daugodai Padubysys Lyduvėnai Kretinga

Ašis2(19,63 %) Girionys Pajuris Katauskiai Noreikiskes Ašis 1 (24,24 %) Svėdasai

3.17 pav. Keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum) Lietuvos populiacijų individų (12 populiacijų, kiekvienoje jų – po 15 individų) išsidėstymas dvimatėje erdvėje (principinių koordinačių analizė) pagal genetinį panašumą

Principinių koordinačių analizė parodė, kad Paltupių populiacijos individai yra tarpusavyje panašiausi, taip pat panašaus giminingumo yra Padubysio ir Pajūrio populiacijų individai. Didţiausi skirtumai nustatyti tarp Daugodų populiacijos individų. Nubraiţyta UPGMA dendrograma, atspindinti tirtų pavyzdţių genetinį giminingumą (3.18 pav.). Šioje dendrogramoje individai pagal populiacijas aiškiai neatsiskyrė. Tik trys individų poros (Lyduvėnai 5 ir Katauskiai 9, Kretinga 6 ir Katauskiai 6 bei Kautauskiai 2 ir Girionys 12) buvo identiškos. Gauti 177 APPD fenotipai. Visi kiti individai buvo unikalūs ir išsiskiriančių klasterių nesudarė.

68

3.18 pav. Keturbriaunės jonaţolės 12 populiacijų individų genetinio panašumo dendrograma (UPGMA)

69 Palyginus populiacijų genetinės įvairovės duomenis su eterinių aliejų duomenimis (Zybartaitė, 2009), pastebėta, kad didţiausiu genetiniu polimorfizmu pasiţyminčios Daugodų populiacijos lapų eteriniuose aliejuose oksiduotų seskviterpenų procentinė koncentracija (57,3 %) buvo didţiausia, taip pat šioje populiacijoje nustatyta ir didţiausia šios grupės komponento globulolio (22,7 %) koncentracija. Pastebėta, kad vienos iš genetiškai išskirtiniausios (pagal UPGMA dendrogramą) – Padubysio populiacijos, lapų ir ţiedų eteriniuose aliejuose seskviterpenų procentinė koncentracija (32,6 %) buvo didţiausia, taip pat čia nustatyta ir didţiausia koncentracija šios grupės komponentų germakreno D (24,6 %) bei β-kariofileno (6,1 %) koncentracija. Palyginus populiacijų genetinių atstumų duomenis (3.15 pav.) su geografinių atstumų tarp populiacijų (2.3 lentelė) duomenimis ryšio nenustatyta. Geografiškai tolimiausios populiacijos Kretinga ir Svėdasai genetinio panašumo dendrogramoje sukrenta į vieną klasterį, tuo tarpu geografiškai artimiausios vietovės Lyduvėnai ir Paltupiai genetinio panašumo dendrogramoje sudaro atskiras šakas. Palyginome mūsų duomenis apie Lietuvos keturbriaunę jonaţolę su kitų šalių jonaţolių genties rezultatais panaudojant APPD metodą. Pagal tirtų augalų skaičių jonaţolių tyrimai tarp šalių pasiskirstė taip: mes ištyrėme 180 keturbriaunės jonaţolės individų iš 12 laukinių populiacijų, o Vokietijoje ištirta 30 individų, išaugusių iš 3 augalų (paprastosios jonaţolės; Arnholdt-Schmidt et al., 2000), Slovakijoje ištirta 14 motininių, 47 diploidiniai ir 75 kontroliniai ʻTopazʼ veislės individų (paprastoji jonaţolė, Halušková, Košuth, 2003), Turkijoje ištirta 11 paprastosios jonaţolės klonų išaugintų iš įvairiose vietovėse surinktų sėklų ir iš kontrolinės veislės ʻTopazʼ (Tonk et al., 2011), Italijoje ištirti 298 paprastosios jonaţolės individai iš 9 populiacijų ir kontrolinė veislė ʻTopazʼ (Barcaccia et al., 2006), Serbijoje ištirtos 6 skirtingos Hypericum rūšys (tarp jų keturbriaunė jonaţolė), (Smelcerovic et al., 2005), Indijoje ištirtos 8 populiacijos (paprastoji jonaţolė; Verma el al., 2007). APPD naudotų pradmenų skaičiumi aprašyti tyrimai pasiskirstė taip: Lietuvos - 6 pradmenys (OP-A1, OP-A4, OP-A9, OP-B19, OP-C7a, OP-C11; sekos pateiktos 2.3 lentelėje), Vokietijos - 6 pradmenys (001, 006, 026, 020, 025, 029; sekos pateiktos 1.1 lentelėje), Slovakijos - 2 pradmenys (160–10, 360– 10), Turkijos - 26 pradmenys (OPA-16, OPAG-02, OPAG-04, OPAG-06, OPB-15, OPC-06, OPC-10, OPC-11, OPC-12, OPC-13, OPC-14, OPC-15, OPC-16, OPE-03, OPE-10, OPE-14, OPG-02, OPG-09, OPG-11OPG-13, OPG-15, OPC-18, OPC-19, OPC-20, OPE-02, OPC-17, sekos pateiktos 1.2 lentelėje), Italijos - 14 ADDP pradmenų (OP-A1, OP-A4, OP-A9, OP-B12, OP-B13, OP-B19, OP-C6a, OP-C7a, OP-C11, OP-C19, OP-D19a, OP-D20, OP-Q2, OP-Q11, sekos pateiktos 1.3 lentelėje), Serbijos - 10 pradmenų (PL-4, PL-51, PL-71, PL-126, PL-143, PL-145, PL-146, PL-159, PL-160, PL- 175 sekos pateiktos 1.4 lentelėje), Indijos - 9 pradmenys (PL 7, PL 17, PL 18, PL 20, PL 42, PL 63, PL 70 139, PL 151, PL 159 sekos pateiktos 1.5 lentelėje). Palyginome su visais pradmenimis įvertintą polimorfizmo lygį. Mūsų atveju populiacijų polimorfizmas su kiekvienu pradmeniu svyravo 22–46 % ribose, Turkijoje tirtiems augalams polimorfizmas – 76 % (svyravo 33,3–100 % ribose), Serbijoje polimorfizmas svyravo 81–100 % ribose, Indijoje nustatytas 46–92 % polimorfizmas. Šanono indeksas mūsų tirtose populiacijose buvo 0,199–0,322 ribose, Serbijoje 1,28–4,25, Indijoje – 1,70–4,57. Palyginti maţesnį uţ kitas šalis Lietuvos keturbriaunės jonaţolės genetinį polimorfizmą galima būtų susieti su maţesne šalies teritorija ir atitinkamai vienodesnėmis dirvoţemio bei klimato savybėmis.

71 IŠVADOS

Tiriant keturbriaunės jonaţolės (Hypericum maculatum Crantz) Lietuvos populiacijas

1. Nustatytas tinkamiausiais DNR išskyrimo būdas silikagelio kolonėlėmis. 2. Atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR (APPD) tyrimams išrinkta: a) PGR mišiniui tinkamiausiais Taq buferis su KCl; b) PGR produktų pagausinimo ciklų skaičius 40; c) tinkamiausia pradmenų temperatūra atitinka naudotų pradmenų lydymosi temperatūrą; d) polimorfizmo tyrimams iš APPD 14 pradmenų atrinkti 6 informatyviausi. 3. AP-PGR metodas pritaikytas keturbriaunės jonaţolės tyrimams: a) iš 5 pradmenų atrinktos 3 pradmenų poros tinkamos pagausinimui; b) PGR metu universalų pradmenį geriausia įvesti vėliau uţ pradmenų poras; c) surastos pagrindinio gausinimo etapo atskirų dalių palankiausios temperatūros, ciklų skaičius, trukmė; d) pagausinti produktai ištirti kapiliarinės elektroforezės būdu. 4. Įsisavintas paprastųjų kartotinių sekų (PKS) metodas siekiant pritaikyti jį keturbriaunei jonaţolei: a) ištirti pradmenų deriniai: tiesioginis + atvirkštinis +/- fluorescuojantis M13 pradmuo; b) parinkta palankiausia DNR koncentracija (0,75 ng/µl) PGR vykti; c) tobulinta DNR pagausinimo programa, keičiant pagrindinio etapo ciklų skaičių, trukmę ir pradmenų prikibimo temperatūrą; d) atrinkti 7-i (pagal apskaičiavimus) laukiamo ilgio fragmentai transformuoti į E. coli ląsteles, vėliau plazmidėse ieškota mikrosatelitinių sekų; e) pagal Hypericum cumulicola sekas sukurti mikrosatelitiniai pradmenys, specifiškai nepagausino keturbriaunės jonaţolės mikrosatelitinių sekų. 5. APPD metodu ištyrus keturbriaunės jonaţolės populiacijų genetinę įvairovę nustatyta: a) polimorfizmas tarp populiacijų svyravo 22 % (Paltupių) – 46 % (Daugodų) ribose (vidutinis – 36 %); b) didesnė genetinės įvairovės dalis tenka tarppopuliacinei įvairovei (58 %), negu vidupopuliacinei; c) daugiausia savitų fragmentų (4) nustatyta Daugodų populiacijoje; d) pagal genetinius atstumus labiausiai atsiskiria Paltupiai nuo Padubysio, Pajūrio ir Svėdasų populiacijų, panašiausios yra Kretingos, Girionių ir Katauskių populiacijos; e) populiacijų grupavimas pagal genetinius atstumus neatspindėjo jų geografinės padėties; 72 f) palyginus su kitų šalių jonaţolių tyrimais, Lietuvos keturbriaunės jonaţolės genetinis polimorfizmas buvo maţesnis. 6. Palyginus keturbriaunės jonaţolės genetinę įvairovę su eterinių aliejų profiliu, didţiausiu genetiniu polimorfizmu pasiţyminčios Daugodų populiacijos lapų oksiduotų seskviterpenų procentinė koncentracija buvo didţiausia, ypač globulolio. Vienos iš genetiškai išskirtiniausių (pagal UPGMA dendrogramą) – Padubysio populiacijos, lapų ir ţiedų seskviterpenų procentinė koncentracija buvo didţiausia, ypač germakreno D ir β-kariofileno.

73 LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. APG III. 2009. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants. Botanical Journal of the Linnean Society, 161, 105–121. 2. APG III. 2009. The Linear Angiosperm Phylogeny Group (LAPG) III: a linear sequence of the families. Botanical Journal of the Linnean Society, 161, 128–131. 3. Arnold-Schmitt B. 2000. RAPD analysis: a method to investigate aspects of the reproductive biology of Hypericum perforatum L. Theoretical and Applied Genetics, 100, 906–911. 4. Bagdonaitė E. 2003a. Jonaţolės (Hypericum L.) rūšių fenotipinių poţymių įvairovė, atranka bei panaudojimo galimybės. Daktaro disertacija. Botanikos institutas. Biomedicinos mokslai, botanika. Vilnius. 5. Bagdonaitė E. 2003b. Aplinkos poveikis jonaţolės (Hypericum) augimo intensyvumui, fenofazių trukmei, morfologinių poţymių įvairovei. Botanica Lituanica, 5, 3–9. 6. Bagdonaitė E., Janulis V., Ivanauskas L., Labokas J. 2007. Ex situ studies on chemical and morphological variability of Hypericum perforatum L. in Lithuania. Biologija, 53 (3), 63–70. 7. Balloux F.O., Lugon-Moulin N. 2002. The estimation of population differentiation with microsatellite markes. Molecular Ecology, 11, 155–165. 8. Barcaccia G., Albertini E., Rosellini D., Tavoletti S., Veronesi F. 2000. Inheritance and mapping of 2n-egg production in diploid alfalfa. Genome, 43, 528–537. 9. Barcaccia G., Arzenton F., Sharbe T.F., Varotto S., Parrini P., Lucchin M. 2006. Genetic diversity and reproductive biology in ecotypes of the facultative apomict Hypericum perforatum L. Heredity, 96, 322–334. 10. Barcaccia G., Lucchin M., Parrini P. 2003. Characterization of a flint maize (Zea mays var. indurata) Italian landrace: II. Genetic diversity and relatedness assessed by PCR-based molecular markers. Genetic Resources and Crop Evolution, 50, 253–271. 11. Barcaccia G., Mazzucato A., Albertini E., Zethof J., Pezzotti M., Gerats M. 1998. Inheritance of parthenogenesis in Poa pratensis L.: auxin test and AFLP linkage analyses support monogenic control. Theoretical and Applied Genetics, 97, 74–82. 12. Barcaccia G., Mazzucato A., Belardinelli A., Pezzotti M., Lucretti S., Falcinelli M. 1997. Inheritance of parental genomes in progenies of Poa pratensis L. from sexual and apomictic genotypes as assessed by RAPD markers and flow cytometry. Theoretical and Applied Genetics, 95, 516–524.

74 13. Brutovska R., Cellarova E., Dolezel J. 1998. Cytogenetic variability of in vitro regenerated Hypericum perforatum L. plants and their seed progenies. Plant Science, 133, 221–229. 14. Butterweck V. 2003. Mechanism of action of St. John‟s wort in depression. CNS Drugs, 17, 539–562. 15. Capasso R., Borrelli F., Capasso F., Mascolo N., Izzo A.A. 2004. Inhibitory effect of the antidepressant St. John„s wort (Hypericum perforatum) on rat bladder contractility in vitro. Urology, 64 (1), 168–172. 16. Cirak C., Saglam B., Ayan A.K., Kevseroglu K. 2006. Morphogenetic and diurnal variation of hypericin in some Hypericum species from Turkey during the course of ontogenesis. Biochemical Systematics and Ecology, 34, 1–13. 17. Crockett S.L., Douglas A.W., Scheffler B.E., Khan I. 2004. Genetic profiling of Hypericum (St.John's Wort) species by nuclear ribosomal ITS sequence analysis. Planta Medica, 70 (10), 929–935. 18. Edwards C.E., Arakaki M., Quintana-Ascencio P.F., Soltis D.E., Soltis P.S. 2007. Isolation and characterization of microsatellite loci from the endangered highlands scrub hypericum (Hypericum cumulicola). Molecular Ecology Notes, 7 (6), 1135–1137. 19. Doyle J.J., Doyle J.L. 1987. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12, 13–15. 20. Drummond A.J., Kearse M., Heled J., Moir R., Thierer T., Ashton B., 2006. Geneious 3.6.1. 21. Excoffier L., Smouse P.E., Quattro J.M. 1992. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: Application to human mitochondrial DNA restriction sites. Genetics, 131, 479–491. 22. Ferreiraa A.O., Cardosoa H.G., Macedoa E.S., Breviariob D., Arnholdt-Schmitta B. 2009. Intron polymorphism pattern in AOX1b of wild St John‟s wort (Hypericum perforatum) allows discrimination between individual plants. Physiologia Plantarum, 137, 520–531. 23. Fourré J.L., Berger P., Niquet L., André P. 1997. Somatic embryogenesis and somaclonal variation in Norway spruce: morphogenetic, cytogenetic and molecular approaches. Theoretical and Applied Genetics, 94, 159–169. 24. Guillet G., Podeszfinski C., Regnault-Roger C., Arnason J.T., Philogene B.J.R. 2000. Behavioral and biochemical adaptations of generalist and specialist herbivorous insects feeding on Hypericum perforatum (Guttiferae). Environmental Entomology, 29, 135–139. 25. Halušková J., Košuth J. 2003. RAPD analysis of somaclonal and natural DNA variation in Hypericum perforatum L. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 45 (2), 101–104. 26. Heldt H.W. 2005. Plant Biochemistry. 3th ed. Elsevier Academic Press, Amsterdam. 75 27. Jankevičienė R. 1998. Botanikos vardų ţodynas. Botanikos instituto leidykla. Vilnius. 28. Joshi K., Chavan P., Warude D., Patwardhan B. 2004. Molecular markers in herbal drug technology. Current Science, 87 (2), 159–165. 29. Karppinen K., Hokkanen J., Tolonen A., Mattila S., Hohtola A. 2007. Biosynthesis of hyperforin and adhyperforin from amino acid precursors in shoot cultures of Hypericum perforatum. Phytochemistry, 68, 1038–1045. 30. Kazlauskas S., Bagdonaitė E. 2004. Paprastosios jonaţolės (Hypericum perforatum L.) veikliųjų medţiagų kiekybinė analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Medicina, 40 (10), 975–981. 31. Košuth J., Koperdakova J., Tolonen A., Hohtola A., Cellarova E. 2003. The content of hypericins and phloroglucinols in Hypericum perforatum L. seedlings at early stage of development. Plant Science, 165, 515–521. 32. Marshall O.J. 2004. PerlPrimer: cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics, 20 (15), 2471–2472. 33. Martonfi P., Brutovska R., Cellarova E., Repcak M. 1996. Apomixis and hybridity in Hypericum perforatum. Folia Geobot Phytotax, 31, 389–396. 34. Mayo G.M., Langridge P. 2003. Modes of reproduction in Australian populations of Hypericum perforatum L. (St. John‟s wort) revealed by DNA fingerprinting and cytological methods. Genome, 46, 573–579. 35. Mengoni A., Bazzicalupo M. 2002. The statistical treatment of data and the analysis of molecular variance (AMOVA) in molecular microbial ecology. Annals of microbiology, 52, 95–101. 36. Micheli M.R, Bova R. 1997. Fingerprinting Methods Based on Arbitrarily Primed PCR. Springer-Verlag, 13 (7), 291–298. 37. Minkevičius A., Jankevičius K., Dagys J., Lekavičius A., Natkevičaitė-Ivanauskienė M. 1971. Lietuvos TSR flora. IV tomas. Mokslas. Vilnius. 38. Mockutė D., Bernotienė G., Judţentienė A. 2003. Volatile compounds of the aerial parts of wild St. Jon„s wort (Hypericum perforatum L.) plants. Chemija, 14 (3), 108–111. 39. Nahrstedt A., Butterweck V. 1997. Biologically active and other chemical constituents of the herb of Hypericum perforatum L. Pharmacopsychiatry, 30, 129–34. 40. Nei M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences America, 70, 3321–3323.

76 41. Nei M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a smals number of individuals. Genetics, 89, 583–590. 42. Nei M., Li W. 1979. Mathematical model for studying genetic variance in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences America, 76, 5269–5273. 43. Pai T.W., Chen C.M., Hsiao M.C., Cheng R., Tzou W.S., Hu C.H. 2009. An online conserved SSR discovery through cross-species comparison. Journal of Computational Biology and Chemistry: Advances and Applications, 2, 23–35. 44. Peakall R., Smouse P.E. 2006. Genalex 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes, 6, 288–295. 45. Percifield R.J., Hawkins J.S., McCoy J., Widrlechner M.P., Wendel J.F. 2007. Genetic Diversity in Hypericum and AFLP Markers for Species-Specific Identification of H. perforatum L. Planta Medica, 73 (15), 1614–1621. 46. Pilepic K. H. 2002. Analysis of chloroplast DNA variability among some Hypericum species in Croatia. Periodicum Biologorum, 104 (4), 457–462. 47. Pipinys J., Jaskonis J., Vaičiūnienė J. 1973. Vaistiniai augalai. Mintis. Vilnius. 48. Powell W., Machray G.C., Provan J. 1996. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends in Plant Science, 1, 215–222. 49. Power E.G.M. 1996. RAPD typing in microbiology – a technical review. Journal of Hospital Infection, 34, 247–265. 50. Radušienė J., Janulis V., Cirak C., Karabük B.S. 2007. Variation of bioactive substances and morphological traits in Hypericum perforatum populations from Northern Turkey. Biochemical Systematics and Ecology, 35, 403–409. 51. Radušienė J., Judţentienė A., Bernotienė G. 2004. Essential oil composition and variability of Hypericum perforatum L. growing in Lithuania. Biochemical Systematics and Ecology, 33, 113–124. 52. Ragaţinskienė O., Rimkienė S., Sasnauskas V. 2005. Vaistinių augalų enciklopedija. Lututė. Kaunas. 53. Robson N.K.B. 2002. Studies in the genus Hypericum L. (Guttiferae) 4 (2). Section 9. Hypericum sensu lato (part 2): subsection 1. Hypericum series 1. Hypericum, Bull. Br. Mus. (Nat. Hist.). Botanica, 32, 61–123. 54. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. 1985. Enzymatic amplificationof beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230, 1350–1354. 77 55. Sambrook J., Fritsch E.F, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd, Cold Spring Harbor Laaboratory Press, New York. 56. Saroglou V., Marin P.D., Rancic A., Veljic M., Skaltsa H. 2006. Composition and antimicrobial activity of the essential oil of six Hypericum species from Serbia. Biochemical Systematics and Ecology, 35, 146–152. 57. Savidan Y. 2000. Apomixis: genetics and breeding. Plant Breeding, 18, 13–86. 58. Seidler-Lozykowska K., Dabrowska J. 1996. Topaz-the polish variety of St. John‟s wort (Hypericum perforatum L.). Herba Polonica, 42, 140–143. 59. Sharma A., Namdeo A.G. Mahadik K.R. 2008. Molecular Markers: New Prospects in Plant Genome Analysis. Pharmacognosy Reviews, 2 (3), 23–34. 60. Simpson M.G. 2010. Plant Systematics. Elsevier Academic Press. Amsterdam 61. Smelcerovic A., Spiteller M., Ligon A.P., Smelcerovic Z., Raabe N. 2007. Essential oil composition of Hypericum L. species from Southeastern Serbia and their chemotaxonomy. Biochemical Systematics and Ecology, 35, 99–113. 62. Smelcerovic A., Verma V., Spitelle M., Ahmad S.M., Puri S.C., Qazi G.N. 2005. Phytochemical analysis and genetic characterization of six Hypericum species from Serbia. Phytochemistry, 67 (2), 171–177. 63. Snarskis P. 1968. Vadovas Lietuvos augalams paţinti. Mintis. Vilnius. 64. Tamura K., Dudley J., Masatoshi M., Kumar S. 2007. Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 5.0. Molecular Biology and Evolution, 24 (8), 1596–1599. 65. Temnykh S., DeClerck G., Lukashova A., Lipovich L., Cartinhour S., McCouch S. 2001. Computational and experimental analysis of microsatellites in rice (Oryza sativa L.): frequency, length variation, transposon associations, and genetic marker potential. Genome research, 11, 1441–1452. 66. Tonk F.A., Giachino R.R.A., Sönmez Ç., Yüce S., Bayram E., Telci I., Furan M. A. 2011. Characterization of Hypericum perforatum L. plants from various accessions by RAPD fingerprinting. Herbs, Spices, Medicinal Plants, 9, 163–169. 67. Towers G.H.N., Page J.E., Hudson J.B. 1997. Light-mediated biological activities of natural products from plants and fungi. Current Organic Chemistry, 1, 395–414. 68. Turnpenny P., Ellard S. 2005. Emery's Elements of Medical Genetics, 12th ed. Elsevier, London.

78 69. Van de Peer Y., De Wacher R. 1994. Treecon for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Computer Applications in the Biosciences, 10, 569–570. 70. Varshney R.K., Graner A., Sorrells M.E. 2005. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trends in Biotechnology, 23, 48–.55 71. Verma V., Smelcerovic A., Zuehlke S., Hussain M.A., Ahmad S.M., Ziebach T., Qazi G.N., Spiteller M. 2007. Phenolic constituents and genetic profile of Hypericum perforatum L. from India. Biochemical Systematics and Ecology, 36 (3), 201–206. 72. Welsh J., McClelland M., 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary privers. Nucleic Acids Research, 18, 24 7213–7218. 73. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18, 6531–6536. 74. Zobayed S., Saxena P.K. 2004. Production of St. John‟s wort plants under controlled environment for maximizing biomass and secondary metabolites. In vitro Cellular and Developmental Biology – Plant, 40 (1) 108–114. 75. Zybartaitė L., Būdienė J., Judţentienė A., Kupčinskienė E. 2009. Composition of essential oil of Hypericum maculatum growing in some places of Lithuania. In: 3rd International Conference the Vital Nature Sign, 22nd-23rd May, 2009. Kaunas, 148–151. 76. Ţukauskienė J., 2009. Paprastosios spanguolės (Vaccinium oxycoccos L.) DNR įvairovės ir fenolinių junginių uogose tyrimai. Daktaro disertacija.

79 PADĖKA Nuoširdţiai dėkoju darbo vadovei prof. habil. dr. Eugenijai Kupčinskienei uţ visapusišką pagalbą, rūpestį ir palaikymą ruošiant magistro darbą. Dėkoju prof. h. p. Algimantui Paulauskui, dr. Juditai Ţukauskienei ir dr. Janai Radzijevskajai uţ vertingus metodinius patarimus ir paskatinimą. Esu dėkinga visiems Biologijos katedros darbuotojams uţ pagalbą ir suteiktą galimybę atlikti darbus laboratorijoje. Dėkoju Paduvos universiteto prof. G. Barcaccia ir dr. G. Galla uţ metodinius pamokymus, patarimus ir suteiktą galimybę atlikti tyrimus jų universitete. Ačiū tariu artimiesiems uţ rūpestį ir palaikymą.

80 MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS

Moksliniai straipsniai jonaţolės tema paskelbti leidiniuose, bakalauro studijų metu: Zybartaitė L., Kupčinskienė E., Judţentienė A., Marozas V. 2009. Hypericum maculatum Crantz morfometrinių rodiklių dinamika ir elementinės sudėties ypatumai. Kn: Ţmogaus ir gamtos sauga 2009. Tarptautinės mokslinės-praktinės konferencijos medţiaga, 2-oji dalis. Akademija (Kauno r.), 140–143. Zybartaitė L., Pavilonis A., Judţentienė A., Kupčinskienė E. 2009. Keturbriaunės jonaţolės epifilinės mikrofloros gausumas vegetacijos sezono eigoje. Kn: Ţmogaus ir gamtos sauga 2009. Tarptautinės mokslinės-praktinės konferencijos medţiaga, 2-oji dalis. Akademija (Kauno r.), 133–136. Zybartaitė L., Būdienė J., Judţentienė A., Kupčinskienė E. 2009. Composition of essential oil of Hypericum maculatum growing in some places of Lithuania. In: The Vital Nature Sign. Proceedings of International Young Scientists Conference. Kaunas, 148–151.

Moksliniai straipsniai jonaţolės tema paskelbti leidiniuose, magistrantūros studijų metu: Zybartaitė L., Kupčinskienė E., Judţentienė A., Marozas V., Sabienė N. 2010. Hypericum perforatum L. ir Hypericum maculatum Crantz stiebų azoto koncentracijos ypatumai. Tarptautinės mokslinės- praktinės konferencijos medţiaga. Akademija (Kauno r.), 44–46. Zybartaitė L., Kupčinskienė E., Judţentienė A., Marozas V., Sabienė N. 2010. Sunkiųjų metalų kaupimasis kai kurių Lietuvos vietovių paprastosios ir keturbriaunės jonaţolės stiebuose. Tarptautinės mokslinės-praktinės konferencijos medţiaga. Akademija (Kauno r.), 47–50. Zybartaitė L., Ţukauskienė J., Kupčinskienė E., Paulauskas A. 2010. Adoption of RAPD-related methodology for analyses of Hypericum macutatum Crantz growing wild in Lithuania. In: The Vital Nature Sign. Proceedings of International Young Scientists Conference. Kaunas, p. 5. Kupcinskiene E., Zybartaite L., Zukauskiene J., Paulauskas A. Biology of populations of Hypericum macutatum Crantz growing wild in Lithuania. International Symposium Forest and Sustainable Development. Brassov, Romania 15-16 October, 2010. Priimta.

Konferencijų pranešimų tezės jonaţolės tema, magistrantūros studijų metu: Zybartaitė L., Kupčinskienė E., Judţentienė A., Marozas V., Sabienė N. 2010. Hypericum perforatum L. ir Hypericum maculatum Crantz stiebų azoto koncentracijos ypatumai. Tarptautinės mokslinės- praktinės konferencijos medţiaga. Akademija (Kauno r.), 44–46. Perskaitytas ţodinis pranešimas.

81 Zybartaitė L., Kupčinskienė E., Judţentienė A., Marozas V., Sabienė N. 2010. Sunkiųjų metalų kaupimasis kai kurių Lietuvos vietovių paprastosios ir keturbriaunės jonaţolės stiebuose. Tarptautinės mokslinės-praktinės konferencijos medţiaga. Akademija (Kauno r.), 47–50. Perskaitytas ţodinis pranešimas. Zybartaitė L., Ţukauskienė J., Kupčinskienė E., Paulauskas A. 2010. Adoption of RAPD-related methodology for analyses of Hypericum macutatum Crantz growing wild in Lithuania. In: The Vital Nature Sign. Proceedings of International Young Scientists Conference. Kaunas, p. 5. Perskaitytas ţodinis pranešimas.

Konferencijų pranešimų tezės kitomis temomis, magistrantūros studijų metu: Zybartaite L., Jodinskiene M., Zukauskiene J., Paulauskas A., Kupcinskiene E. 2011. Genetic characteristics of populations of Impatiens glandulifera growing in some Baltic areas. 3rd International Symposium on Weeds and Invasive Plants. Ascona. Switzerland. Priimta. Kupcinskiene E., Jankauskaite R., Zybartaite L., Zukauskiene J., Paulauskas A. 2011. Invasive and native Balsaminaceae species of Baltic region. XVIII International Botanical Congress, Melbourne, Australia. Priimta. Jankauskaite R., Zybartaite L., Jodinskiene M., Zukauskiene J., Paulauskas A., Kupcinskiene E. 2011. Diversity of habitats of Impatiens spp. alien in Lithuania. 6th International conference „Research and Conservation of Biological Diversity in Baltic Region“. Daugavpils. Book of Abstracts. Daugavpils University Academic Press "Saule", Daugavpils, p. 57.

82 PRIEDAI 1 Priedas Hypericum cumulicola mikrosatelitinės sekos >gi|149228005|gb|EF440643.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp46 sequence GCAATGCATCTGTAAATCACTTTCTTGGTCCCATCCACCATCATCTTCATACAAACTTATCATTGTCTTAGGTT TATTTTTAATTTCAGCAGCCGTTCTAAAAGAAATGGAATTTAAACCAGACATTTAGCTATATTGTACATCTCTT GCAAGTTTCAGAAGCATGAGCTAATTTTGTAGTGGGCCATCATGAAACAAGATGTTTCAGAACATCAGAGAC CATTTTACAGGCGCATAAACACAAACACAAACACATACACTCTTCCTCCGTGACAATAGTGGTGATTGTTGAG CACAAAAGCCACATCCTCTTCTCCTATTTTTGAAACGACAGTTAAAGAGCTTTACAACCTTACCCGCCCCTATT TAGTTTGCCCTTACCCCCACCCGTAGCATAAAAACCAAAGGTGGTGGAGGAATGGGATGTGTGGCCTTGTGTC TCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTGGGTCTATGAAAAAAAAGGGATTTTGGAAGGCTCGTACACTAACTACATT GGGACTGGAGAAGAGAACCCCACTTCCACAAACTCATTTTTTTATAACCCTAACCAATAATTTACACCTAAAA

>gi|149228004|gb|EF440642.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp43 sequence ATCTCAACTAGGCAATCATGTCCTTCTCCCTTGAGCCGCCACATTTTAACAACCCGCAGATGTTACTGCATTCT TTCCAGGCTTCCATTTTTTGAGTTGCACTTTGGTGTGTTGAACAGGTGCAGGTCTATGCTTTGCATTTTCACTTG TGTTTTTTTCTTTGGATAATTAGTTAACAAGTGCATATGATGAGGAAAAGCATGGTTGTGTTTTCTAATGATAA TTTCTCAATAATGCAATTTTGGGCCATGGTCACTTAGCATGACATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTCGGGTTATGCTGTGATAGTGTCAGCATATCTCTGGTGAAAATT TTTAACTTTCAGGAGTTTTTATTTGTGCAGCATTTTTATGGAGAAAAGGTTGGAAAGGTCGACACATGACATA ACTGCTGTAGACTTGGATGCACAAGGAGATGAATTCTGTGGGAAACAAAATTTAGATGCCTCTGTA

>gi|149228003|gb|EF440641.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp41 sequence AAAAGAAAGAGAAAAGTACAAACAATAGTTCATTTTTTTTAATCACCTCTTTTCCATTTTTGTAAATTTGGAG GGAGACGTAATTTTATTAAATACACAATACATAGGCAGCGCTACGCTTTTATAGCCGTGCTTCCCGTACTCAG TGTTGGAGTCCATGCAAAGCCTTGTCAAGTAAGGAGTCCTTTTCACCAACACATCACATTCGTTGCTTGTTCCA CCTTATAATTCTTATTAGTTTCAATTACCCTGCCTGTACCTAATTCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACACACT GACACACATATTGGCTTCTAGTGTGGCTAAGTGCTACTTGTGTTTTGGACTTACAGAGGGTAGGGCTCATCCC TTTTGTCCCAGCTAATGGTCCTAATATTATAAAACTACAGAAGATTACAGTTCTGCCCCACATATCAATGGTG GGTTCATATTCCCCATAAACCTACCTACCCCCTTTTTTTTCCGTGCAGAAATGGAGTGGCTCCTAAAAGTTGAA GATAAATATGCCATGTCTCCCTCCCTCACTGTAAGAACGTTTCAAAACTAAATGCATCTGATGATTCT

>gi|149228002|gb|EF440640.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp40 sequence ATCAACGTAAAGTTGGAATCTTGAAGGAGAATGATGCCTACTGTTCTGATAAAAAAAACTCCAAGGAACAAT GGAGCACACATTRCTTTATAGGTGACGTAAATGTCATTCTTTTCAATTTGCAGAATTGTTCTTGTGCTAATCGA TTTGGAATCCTCCGAACAAAGCATCATACACACACACACACACACACAACAAGTTCAGGTGATTTCATCACC AAATTTTTTAGTTTCTTCCAGTCCTTGCTAAAGCTG

>gi|149228001|gb|EF440639.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp38 sequence TCTCGATGGAATATTTATTCTCACTGTTGGGGTTTAGGAGCGGTTCCATATTGTTTTCTTTTAGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGATGGTGGTTTGGGTGATAATGATGCAGATCACGTATCACTTCTTCCACTGGA AGAAAGGGACGCCGTTCGCGGACGACCAAGGCATCTACAACGGGCTGACTTGGTGGGAGCAGATTGAGAAC GGCAAGCAGCTCACCAGAAACCGCAAGTTCCTCACTGTAGTCCCCATCGTTCTGTGAGTCGAACTTCTCCCTT ACTCATCCTTATCGTGCTCTTTTGTGTGTGATTATCTC

>gi|149228000|gb|EF440638.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp33 sequence TCCATAATATAATATACATGACAAAAAAATTATGAACATCCATGTCAGACATTCATCGTCTACCTCATCTTGG GCTTGCATTGGTCAAACTCAAACATACAATTAACTTTGTGTTCAGATTTATCATGTGAACACCCAGCCAACTA GCCACTCATCGTTTTCACAAGGACCAACCAATCCAATTCAAATGGACTCTGAGCCTCGCATGTGTGTGGTGTG GTGGTGGACAAAGAACATTATAGAAGTGGGTATGGGAAATTGAAATACATGTCCAAGAACAAATTATTACTA TGTTATCTACTACTGTCATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGAACCCAACCATACAAATTACAGAGT ATCCAATCTCCCAAGCCAAGGCAGCTCGTTACGTCATTGTGAGCATGTACATTTCTAAATGCCAATTTTGACT GTTCATATGCATAGCTTGGTCGTGATTCGCTTGCTTCATGGGATGGGAGGTCCAAGAGATGCGCAGTTTCTCG TGACTAATAATCATTTGAAGTGAGCCCCCACCCAAAAATAATCATTTGAAGAGTTGCTTGTAAATGACAATGT CTAAATTTTATTTCGTGAGAGACTAAAGTAGACAAAAAATATTTTAGACCCGTAACCTAAAATATCCGCGCAT GGGTCGGAAGCAAAACATTTTGTTGTATTTTTTAAACATATTGATAATTGCCTTGGCGCTTCTT 83

>gi|149227999|gb|EF440637.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp32 sequence TATTAGAACCCTAGATAGCCATTTTGTACCATGAAGAACCCATCGATAGCCTCTCTTCTTAGGCAACCTGACT TGAAGTTCACCAATTTCCTAACCATAATACACTCATACTACACACACACACACACACACACAAAGTGATTAAG TCATGTCTCCTCTTCTTTTCTACATGTTCATTGCATCTTTGAGCGTTCATGCATGCAATTGTCGTCTTCTTGGCT TCAGGGATGACAAGAGAATTAATGTCCAGAGTGGAGTCTCAGGAACTTCGGCTTTAGGTCAGTTCCATAACCT TCATAGCATGTTTTACTTCTCGTGGATTTGGGTTATTGTTTTCTTCTT

>gi|149227998|gb|EF440636.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp31 sequence GCACTCTCGGCGCCAGCCTCCTCAGGCTCCACTTCCATGATTCCATCGTCAGGGTACGTACACACACACACAC ACATATATCTGATAGAGCCTAAGTCATTAGTCTGAGTCGCTGCATTTTATATGTGCAGGGTTGTGACGCGTCC GTGCTGTTGAACCACGAGGGCAGCGAGAGGAGCGCCCACACTAGCAAGACCCTGAGAGGGTTCGAGGTCATC GACGACATCAAGGCCGAGATCGAGAAGCACTGCCCTCGGACCGTCTCCTGTGCGGACATCCTGACGGCGGCT TCCAGGGACGCCACCGTCTTCCTCGGGGGACC

>gi|149227997|gb|EF440635.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp30 sequence ATCCATCTTTTTCAGAAGTCTTGGCTTCGTCGCTTTGGTCTTTTGGTAACATTCAGCTTATGTGGCAGGATGAT TCCATCGAGAGTGAAAATATGGCCAACTTCTCTCAAGTGTGGAATGAATTCATACTTTCTATGAGAACGGAAG ATTTGCTAAGCAATCAGTTGAGGCTTTTCTTACCCTAGTGTTAATCTACTTCCGCGGATACATACTCCCAATCT TATTCTTCTAGGCTTGTTACGTCACAGTGAAAGGGATTTGCTACTTGTTCCGTATTCTTCTATGGATGTCTCTGT CGTCCAATGGCCACCTTTTCTGCTAGCTAGCAAGGTATAAAATCACACACACACACACACACACAACACACA CACACACTATTTTGGAAGTCTCTTTTATCTCTCTATCTTCTACTTTATCCTTTTTGTTATTTTCTCTTTCTTTACTT CAGATGAGTTAGTTATTTACATCGATTAATCTGAGGGGTTGGGGTGGGTGGGGGTGTTGGGTG

>gi|149227996|gb|EF440634.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp28 sequence GCTCTCTTGATTTGGTATGCGACAACATTGTGCTTATCCATATTAGTTTTCTCTCTATTATTCTTGCTTGGGAAT CTCATATGCTTCTCTATTAGATTTGCAAGGATAAAGTAGAGGCTGAGCTCTGGATTTCAGGCGTAAAGGCAAT AATTTCCTCTGGTCAGGATGGGCGCTCCAAAACTGACGGGTGGTGTGATGGTGGCCTTTACATTGATGTAATT AAACTTCCATCCAAGGCAAATTTGGATTGTTTCCTCATCACACACACACACACACCTTCATACTCCATTTTGGG TGCTGTCTTGTTTCTTTTTGCTCATCTTATCATAAATAGAATGCTTATCTAACCAGGCCAAACATCAGGACATC GTTTGAGCTTAGGCTGGTAAGGCTAGAAGTGGAAGATTATAATTAGTCATGTCCTTTTGATTTATTTTCTTGTT TTTTAGCTAATGGATATTCTCTTGTTAATC

>gi|149227995|gb|EF440633.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp27 sequence GATCAGTCACTCTGTGGTATTCCCTAACGTTTGCTGTCTTTGCAACTACCAATGAATTATATATAAAGTGAAAT TCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACACACACATTCTTTCACCGGACGTCACTTCTCTTTAACTTTTCCTCCATC TTTTTTTTAATATCAAGTAGATCATAGCATTAAATAAGAAAGCAAAGGGATAATAGAACTATTGGGGTATAA GCTTCTTAGTTGTTCTCTTTTGTAAAATAATTGGCAAAATTTGAAACTAGGCATATACTTTAGAAATTGTTCTA TTGTAGAATAGCATTAAAGTCTAGGTGTCATAACA

>gi|149227994|gb|EF440632.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp24 sequence GCTCACGCAAGTTGGTATCTGGAATATCATAATCTGTGTGGCTGGGAATTGGGACGAGGCGGCAGGTTGAGG TCGAAATCGCGAAATGACATCGTGGGGATATTGAAGTGGTGGAAACTCCAGGTAGCTTGGAGATAAAGTGTT CGCTGAACATAAAACTAAATTAAGATGCAGACTTAAGAGGGGATATTTCTCTCCCAGAGTGTGTGTGTGTGTG TGGTCTTAGTTCCAATGGGGTAAGGTGTGGCTGTAATCCGTTCTATCACTTTATCTCCAACATTGCTTTCTCAG CCTCATGCTACCTGCTTCCAAAACCCTTGTGTGTGGTGACAAAACAGGATGAGAGAGAGAGAGAGAAGCTAA CTAATTATTAATCAATTGTCTTCATTCA

>gi|149227993|gb|EF440631.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp23 sequence GATCTAATCTCTAGTCAAGAAAATAATTAGTGATAGATTAGAGAAAAATCTTTTAAGCAAATAATTACAACTA TCATAGAGTTATGTTTATATGGCCCCTCCATTATCTTTCTCCCACATTCAAGCTTCCTAATTCACTCATCTCTCT CTCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGCCACACCTACAGTA ATCTAACCAAATGTTAGACCACACAACAAAAAAAAAAGAAAGATCATCCGATACTATGTAACCCAGTCTGAC TAGTCTTGGCCATCGCCTCAAAATGTGAAATACCAAGGTGTCTCTTATGTGACAGAAGTCAACTAAAGTTGCA AGTCATCATTCTGCTCAAGTTACATCCCAAGATGTTGTTGGATTATGATAATCAACTCCTCCCTACCA

>gi|149227992|gb|EF440630.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp21 sequence GATCAGCCAGAGCAGCACCGAAAGAAACCCTAACGCCCACCGCTGTTGACCAAGGTTTACATCGTTCCTAGA TTATATGCGTTTCTTGGAAATCACGTAGATGCTTGTTCCTTCCCAGTACAAAATTAGTGTGGTGTGTCCGTATA 84 CGGTGTACCAGCTCTGCCAGAATCTGACAAGGAAAAAAACGGAAAAAAGAAGAATCAAGTGATTGGCCTCG AGACGTCCGTACCTCAGACACTCTTCTCCTTGTACTTGCTAGGGTCAGCGCATTCTAGTCTCTTCTTGCCGGCT CAGTCCAGAGCTTCCTCAGATACGGGCTGATTCTATTATGAATCAGCTAGGGGAGGTGTGTGTGGGTGTCTGT GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATTTACGTAAATTGTGGCTATCACTTCTAACACGTTCAGCTAAGAGA CATTAGTTACCTACTACTTTAATTAATGGTGATTTCTTAAGCCTTTTAAACTTGAGCGTGATTGGCCCAACGGT GCTTTCGCTATTTTCAT

>gi|149227991|gb|EF440629.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp12 sequence GCTCGTAATTTATTTGAATTCTCTTACTAACAATATACCCTTTTCCTCTTCGCCAATTCATACAATTCTACAGCT TGAAGAGTAATCATCTTCGCATCGATTACGGCCGCCGCGGGGCGATGGTTTCAGCAAACTACTTACTAAACGA AAGAAGAAGAACACCACAGAAATTGGGAACGAACCAAATCGCGCATGTCTGGAACAGTAAACAGAGAAGTC AACGAACGCATGCGCGCGCGCGCACACACACACACACACACACATAAACAGTTGTTATCTGGTGTAGCCAGA CTGACACACACGTAGCAAGTTCAAAGAAGGAGAGGGAGGAACGGAAGGTTGAAGAAGAAGAAGTGTATAAG AAGAAAAGTGGTACCGGAAGAGGTAGATGGTCTCCTGCGGGACTTCCAGGA

>gi|149227990|gb|EF440628.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp9 sequence ATCTTGGTGTCGCCGCCGACGTAGGTGAGGTGGTTGTCGTGGGGGCGGGGCTGGATCCTCCCTCCGTAGCTAC AAAGGAACTTAGCCTTGGCGGCGGGCAGAGGCGGGTGGTCGTCGAAGGAGGACTGGGTCTGGTCGTCCATTT CACGATACCGCGGCGAGGAATCTCCTGATTCCGAGTAGGAGAAGTTCTCCATCAAATTTTGGGTGAGAGAGA GAGGAGGAGAGAGTGTGCGTCGGATGTTGGAGTTGGTTGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGGCGGGGATACGG TTTTAAGGTAAAGGAGATGCGGGAGCGGGAGCGGGAGCGGGAGCGGGAGGGTCCACTATTAATGTGGG

>gi|149227989|gb|EF440627.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp7 sequence GTTGCCTATTTGATTTGAACACTTCACTTCACATCAATCAGATATTCAGATGGATGGATGGATGGGAGGAAGA GACTAGTCTACTACTCCATCGCCACGCATTTTTATAAAAGACGACCATAAAGACTCGACTCACTCCACTCCAC CACACACCACACACCACACACCAAACTAGGTCTAGTACCCTCCAAAACCCAAATCCATCTTTTTTCTTATAAT TCATTACAAAAATTGACCCGACCCAAGTGTGTTCTGTCGCAACATTACACTACCTCTCTCTTTTTCTCACATAT TATCTCTCTCTCTCTCTCTGTATCTATCTCTTCCGTTCTCTGTGTGTTGTGTGTGGGGATGTCAGATGTGTGAGT AAATTGTAATATAAACGTGGTGGAATATAAACGGAGGTGACAGTGAGTGAGGTTAAGCTGATTGGTTCTGGT TTCTACCACCGCTCGACCCGACCCGAGTAAGTTCTTCTCTTTCCTACTACTTCCTTT

>gi|149227988|gb|EF440626.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp2 sequence CGACAGATGTCCATAAACAGTGTGCCCAAAAAGTATAAATTATATTCTTGCTTTACATACATTCTACAATCAA GCTATTTTCTTAATTTGTTTAATGACTGTGCATCAGTGCAACATGAGTTACTTTTATATTGAGCAAAAGACAAG TATGTACATCCATCCATCTCTCTCTCTCTCTCACGTGCTCTGTGTGTGTGGTTGGTTATCTTTGAATGCATGGTA CCTTTTGATAGAGTAAAAGACAAGTATATACATCTGTGTGTGTGTGTGTGGTTGGTAACGCTGTTGTCTTAGC CCTGAATTGTCAGTCCTGCTTTTATCTTGGAATCCAACCCTTTATGGTCTGAAATGAAAAATGGTACCTCCTAG ATTAGTTAAGAGTTTCTAAGAATTTGTGGACTGTTGGCATGCCAAGAATCTTCCAGTTAATAAATTTATCACT GATTTCATGTAAACCCTTTACATGTGATTATACAAGTGAATTCTTTCCTCTTATTTTCAATTATATACTGAGAG TGCTCCGACAAATGTCCTAGTTTACATTACAATGTGAACC

>gi|149227987|gb|EF440625.1| Hypericum cumulicola microsatellite Hyp1 sequence CATTTCAGCTAACTAAGTCAATGTCACGAATTGTCAACTTTTAACTGACATCCCTACACTTTATTTGACAACAA GTCAACATAGTATAGCTTGACAACTCAAAAATGAAAAATAAAACAAAAAAGACGACAAAGTCTCTCCCTCCC ACACTTAACACATCGCATTGTCCCCAATGCGAGAGAGAGGGAGAGTGATAAACACACACACACACACATAAG CCGCACATCCATTGAAAATCACTTTCCTTCCCTACGCTTTGAACAAAATATGTCCACAATGTAGAGTTAGGAA CAAAATGACAATGGTGCTACATGCCTTAAAAACATCCGAATAAAGTCAAAGTCACAAGCACATAACAAAACA CACTAAAGTCACTTGAACAATAAAAATAGATGTCCATAAGATACGGAACTAAACATATGGAGCATCAAGGGT ACTCCCTCATCAGCAGGCGGATAATGTGGTGGTCAAAGATGTTGACAAAAGTAAACCTGGAGTCTCATGGTA TCCATGTATCTCGCAACCTAGACTTCATCTTGCCATGCCAGGAGGATAA

85 2 Priedas Keturbriaunės jonaţolės populiacijų genetiniai atstumai pagal atskirus pradmenis

OP-A1 Kre Paj 0,099 Lyd 0,054 0,111 Pal 0,149 0,048 0,125 Kat 0,024 0,067 0,061 0,120 Gruz 0,051 0,044 0,084 0,082 0,049 Girk 0,039 0,054 0,057 0,083 0,045 0,029 Dau 0,122 0,079 0,126 0,063 0,095 0,083 0,094 Pad 0,088 0,159 0,111 0,170 0,106 0,122 0,050 0,199 Nor 0,088 0,022 0,121 0,061 0,077 0,026 0,043 0,095 0,147 Girio 0,025 0,109 0,078 0,177 0,039 0,067 0,037 0,127 0,074 0,094 Svė 0,018 0,092 0,063 0,127 0,049 0,055 0,047 0,130 0,103 0,089 0,057 Kre Paj Lyd Pal Kat Gruz Girk Dau Pad Nor Girio Svė

OP-A4 Kre Paj 0,032 Lyd 0,111 0,110 Pal 0,128 0,091 0,167 Kat 0,028 0,046 0,089 0,140 Gruz 0,058 0,038 0,113 0,068 0,066 Girk 0,111 0,051 0,168 0,126 0,111 0,061 Dau 0,026 0,049 0,132 0,133 0,049 0,082 0,144 Pad 0,072 0,054 0,216 0,211 0,086 0,140 0,080 0,110 Nor 0,023 0,031 0,068 0,107 0,017 0,051 0,095 0,047 0,081 Girio 0,031 0,042 0,066 0,071 0,027 0,041 0,121 0,044 0,140 0,015 Svė 0,028 0,069 0,093 0,158 0,031 0,095 0,176 0,038 0,137 0,027 0,025 Kre Paj Lyd Pal Kat Gruz Girk Dau Pad Nor Girio Svė

OP-A9 Kre Paj 0,134 Lyd 0,033 0,055 Pal 0,020 0,141 0,068 Kat 0,008 0,196 0,052 0,041 Gruz 0,014 0,065 0,012 0,036 0,038 Girk 0,028 0,052 0,024 0,040 0,063 0,004 Dau 0,064 0,141 0,076 0,036 0,086 0,072 0,081 Pad 0,045 0,244 0,084 0,073 0,026 0,085 0,120 0,071 Nor 0,033 0,158 0,058 0,069 0,036 0,044 0,063 0,121 0,072 Girio 0,003 0,162 0,037 0,035 0,002 0,023 0,044 0,077 0,033 0,030 Svė 0,047 0,158 0,053 0,078 0,047 0,052 0,070 0,084 0,037 0,081 0,044 Kre Paj Lyd Pal Kat Gruz Girk Dau Pad Nor Girio Svė

86 OP-B19 Kre Paj 0,083 Lyd 0,019 0,103 Pal 0,115 0,214 0,118 Kat 0,003 0,078 0,025 0,123 Gruz 0,039 0,106 0,079 0,116 0,032 Girk 0,006 0,088 0,020 0,154 0,010 0,045 Dau 0,022 0,104 0,016 0,166 0,031 0,068 0,013 Pad 0,069 0,156 0,023 0,181 0,081 0,145 0,062 0,042 Nor 0,012 0,082 0,051 0,143 0,004 0,027 0,019 0,051 0,121 Girio 0,016 0,086 0,056 0,150 0,008 0,029 0,023 0,053 0,129 0,003 Svė 0,024 0,060 0,063 0,162 0,016 0,028 0,030 0,051 0,134 0,010 0,010 Kre Paj Lyd Pal Kat Gruz Girk Dau Pad Nor Girio Svė

OP-C7a Kre Paj 0,039 Lyd 0,044 0,060 Pal 0,016 0,062 0,043 Kat 0,017 0,039 0,035 0,035 Gruz 0,018 0,049 0,039 0,004 0,028 Girk 0,046 0,118 0,068 0,029 0,076 0,033 Dau 0,038 0,049 0,044 0,028 0,033 0,027 0,083 Pad 0,033 0,044 0,045 0,034 0,030 0,032 0,081 0,015 Nor 0,016 0,031 0,042 0,021 0,009 0,015 0,072 0,022 0,027 Girio 0,025 0,027 0,033 0,029 0,011 0,019 0,078 0,021 0,023 0,007 Svė 0,042 0,013 0,046 0,058 0,046 0,050 0,092 0,047 0,053 0,044 0,034 Kre Paj Lyd Pal Kat Gruz Girk Dau Pad Nor Girio Svė

OP-C11 Kre Paj 0,014 Lyd 0,049 0,046 Pal 0,121 0,129 0,079 Kat 0,011 0,017 0,047 0,079 Gruz 0,080 0,059 0,090 0,150 0,070 Girk 0,040 0,029 0,056 0,078 0,016 0,083 Dau 0,015 0,016 0,055 0,113 0,014 0,084 0,024 Pad 0,014 0,030 0,036 0,083 0,016 0,107 0,031 0,020 Nor 0,000 0,013 0,048 0,114 0,008 0,077 0,035 0,014 0,014 Girio 0,012 0,008 0,051 0,116 0,009 0,063 0,015 0,010 0,025 0,010 Svė 0,012 0,023 0,046 0,074 0,002 0,071 0,023 0,018 0,015 0,009 0,016 Kre Paj Lyd Pal Kat Gruz Girk Dau Pad Nor Girio Svė

87