Thèse De Doctorat Spécialité Microbiologie Présentée Par Thomas Brauge
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N° Ordre : 41839 UNIVERSITE LILLE 1 – SCIENCES ET TECHNOLOGIES Ecole Doctorale des Sciences de la Matière, du Rayonnement et de l'Environnement Thèse de Doctorat Spécialité Microbiologie Présentée par Thomas Brauge ETUDE DES EXOPOLYSACCHARIDES DE LA MATRICE EXTRACELLULAIRE DES BIOFILMS DE LISTERIA MONOCYTOGENES Directeur de thèse : Mme Graziella BOURDIN Co-directeur : M. Thierry BENEZECH Soutenue le 17 Décembre 2015 Devant le jury composé de : Mme Marie-Pierre CHAPOT-CHARTIER Directeur de recherche, INRA, Jouy en Josas Rapporteur M. Pascal PIVETEAU Maître de Conférences, Université de Bourgogne, Dijon Rapporteur M. Alain CHARBIT Directeur de recherche, CNRS, Paris Examinateur M. Michel HEBRAUD Directeur de recherche, INRA, Clermont Ferrand Examinateur Mme Stéphanie LA CARBONA Chargée de projet, ACTALIA, Caen Examinateur Mme Christine FAILLE Directrice de recherche, INRA, Villeneuve d'Ascq Invitée Mme Irina SADOVSKAYA Chargée d’étude, ULCO, Boulogne-sur-Mer Invitée 2 RESUME L’objectif de ces travaux a été d’étudier le rôle des exopolysaccharides dans la formation des biofilms de Listeria monocytogenes et dans leur résistance face à des procédures de nettoyage rencontrées en entreprise dans des circuits fermés. Nous avons montré que l’exopolysaccharide majeur dans la matrice extracellulaire était l’acide téichoïque qui était de structure identique à l’acide téichoïque pariétal. De plus, nous avons identifié que 50% des 93 souches de sérotype 1/2a étudiées avaient une mutation non-sens ou silencieuse ou faux-sens sur le gène lmo2550 ce qui pouvait entraîner la non-ramification de l’acide téichoïque avec le résidu N-Acétylglucosamine (GlcNAc). Nous avons donc étudié des mutants de la souche de référence EGD-e qui avaient des gènes lmo2549 ou lmo2550 ou lmo2537 ou tagO1tagO2 inactivés ce qui a permis de mettre en évidence que l’absence de résidu GlcNAc sur les acides téichoïques avait modifié les propriétés de surface de L. monocytogenes, diminué l’adhésion à l’acier inoxydable et modifié l’architecture des biofilms de 48h. Par ailleurs, ils étaient plus sensibles à une procédure de nettoyage en circuit fermé avec un détachement plus important, une modification de l’architecture des biofilms et la présence uniquement de cellules viables non cultivables et mortes après passage du flux de soude versus la souche sauvage EGD-e. Le but de ces travaux était de mieux comprendre le rôle de la matrice extracellulaire dans la formation des biofilms de L. monocytogenes pour ensuite trouver le meilleur moyen de l’éradiquer dans l’environnement industriel. 3 4 ABSTRACT TITLE: STUDY OF EXOPOLYSACCHARIDES FROM EXTRACELLULAR MATRIX OF LISTERIA MONOCYTOGENES BIOFILMS The objective of this work was to study the role of exopolysaccharides in the formation of Listeria monocytogenes biofilm and their resistance to cleaning procedure in industry. We showed that the exopolysaccharide in major extracellular matrix was teichoic acid, which was identical at the structure to the parietal teichoic acid. In addition, we identified that 50% of 93 strains of 1/2a serotype studied had a non-sense mutation or mis-sense or silent on the lmo2550 gene that could lead to non-branching of the teichoic acid with the residue N- Acetylglucosamine (GlcNAc). We therefore examined mutants of EGD-e reference strain which had inactivated lmo2549 or lmo2550 or lmo2537 or tagO1tagO2 genes allowing highlighting the absence of the GlcNAc residue on teichoic acids. The mutation of these genes had changed the L. monocytogenes surface properties, decreased the adhesion to stainless steel and modified the architecture of 48h-biofilms. Furthermore, they were more susceptible to a circuit cleaning procedure with an important detachment, a change in the architecture of the biofilm and the presence of non-cultivable but viable cells and dead cells after passage of the caustic soda flow versus the wild-type EGD-e strain. The aim of this work was to better understand of the role of the extracellular matrix in the formation of L. monocytogenes biofilms and then find the procedure to eradicate it in the industrial environment. 5 6 Mots clefs: Listeria monocytogenes, biofilm, matrice extracellulaire, exopolysaccharides Keywords: Listeria monocytogenes, biofilm, extracellular matrix, exopolysaccharides Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail Laboratoire de Sécurité des Aliments Département des Produits de la Pêche et de l'Aquaculture Boulevard du Bassin Napoléon - 62200 Boulogne sur mer 7 8 REMERCIEMENTS J’adresse mes sincères remerciements à Mme Marie-Pierre Chapot-Chartier et M. Pascal Piveteau pour avoir accepté d’être rapporteurs de ce travail. Je remercie également Mme Stephanie La Carbona, M. Alain Charbit et M. Michel Hebraud d’avoir accepté d’être examinateurs de ce manuscrit. Ce travail a été réalisé à l’Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail, dans le laboratoire de sécurité des aliments de Boulogne sur Mer. Je remercie de ce fait Mme Anne Brisabois, M. Laurent Laloux et M. Pierre Malle pour m’avoir accueilli au sein de cette structure. La thèse constitue une expérience intense, passionnante. Cette « aventure » à l’image du temps du Nord fut emplie de grands rayons de soleil mais aussi parfois de petites averses pluvieuses. J’ai eu cependant la chance d’être entouré de quatre personnes, Graziella, Irina, Christine et Thierry qui m’ont permis de vivre pleinement ces 3 années. Ils m’ont appris à surfer sur les rayons solaires mais aussi à me dépatouiller et me sortir de la gadoue des jours pluvieux. Les mots me manquent pour exprimer tout ma gratitude à Graziella Bourdin. Merci. Merci pour ton enthousiasme, ta gentillesse et ton avertissement. Que rêver de mieux qu’une responsable de thèse qui est là pour vous guider, mais qui vous fait surtout confiance et vous laisse libre de vos choix. Merci pour tout ce que tu m’as appris, scientifiquement comme humainement. Merci pour ton amitié. Merci à mon co-directeur de thèse Thierry Benezech pour ses remarques pertinentes, ainsi que pour l’intérêt pour mes recherches et les nombreuses discussions que nous avons eues lors de mes comités. Merci à mes deux supers co-encadrantes : Irina Sadovskaya, pour tes encouragements de tout instant et pour m’avoir enseigné l’obscur biochimie des sucres et Christine Faille pour son investissement sans faille dans mes projets et qui m’a toujours accueilli avec la plus grande gentillesse dans son laboratoire. A vous 4 sincèrement, Merci. Je voudrai aussi témoigner toute mon amitié à mes chers collègues de Laboratoire, pour votre leçon de courage; car il vous en a fallu certainement beaucoup pour me supporter durant ces 3 années mais aussi pour votre aide à la réalisation de cette thèse. Merci donc à Charlotte, Gaëlle, Guillaume, Marie- Ange, Mélanie, Odile, Régine, Sabine, Stéphanie, Sylvie, et Virginie. 9 10 Une mention spéciale à ceux avec qui j’ai pu travailler directement. Merci à Cindy bien sûr, d’avoir toujours accueilli mes commandes de MCDB 202 avec de grands sourires et de m’avoir donné ainsi de solides fondations pour réaliser ce travail de thèse. Clémence et Guylaine parce que vous êtes trop swag et aussi parce que les manips avec vous c’était swag. Merci à l’équipe administrative, Corinne, Sophie et Karine avec qui je n’ai jamais rencontré ou même entendu parler de « Bug ». Merci pour tous ces ordres de missions, les commandes et j’en passe. Bref merci d’avoir géré la paperasse de ma thèse comme des chefs ! Merci également aux équipes de l’ULCO, Merci à la souriante équipe BPA : Thierry Grard pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et pour m’avoir confié des enseignements au sein de sa formation QPAH. Un grand merci également à Maryse et Perrine pour votre gentillesse et nos petites escapades gustatives ou sportives à l’occasion de déménagement. Merci à Pierrette, Philippe et Denis de m’avoir toujours accueilli avec sympathie. Merci également à mes collègues de Tp, Valérie Lencel et Solène Croquelois. Une pensée très chaleureuse pour Gilles et Annette, deux piliers de l’équipe processus aux Interfaces et Hygiène des Matériaux pour leur gentillesse et leur soutien technique lors des manipulations en microscopie électronique à balayage et à transmission. Merci à mes stagiaires : Arnaud et Johan pour leur aide à la réalisation de ce travail ainsi que Jean Romain et Vainui à qui je souhaite une belle et grande carrière dans la recherche. Je voudrai également témoigner toute mon amitié aux doctorants avec qui je partage mon bureau. Alexandre et Yuwalee, à qui je souhaite le meilleur et Estelle, Mamadou et Daline pour les pauses papotages tellement appréciables. Plus personnellement, cette thèse est l'occasion pour moi de remercier toutes les personnes qui me sont chères. Merci aux Meymacois, grâce à qui j’ai toujours passé des vacances d'anthologie. Merci à mes amis Limougeaud : Fred, Seb, Sophie, la bande du Gite et JP sans qui mes premières années d’études n’aurait pas rencontré le succès qu’elles ont trouvées. Merci à mes amis du Nord Pas De Calais, Clément, Damien, Elmer, les Kevin, La Huche, Stan, Louis et leurs copines ainsi que tous mes coéquipiers du rugby club boulonnais qui m’ont accueilli sur les terrains nordiques mieux que nulle part ailleurs. Merci pour tous ces merveilleux souvenirs que nous 11 12 avons construits ensemble. Merci à mes amis de toujours Anne-so, Benoit, Clem, Laure et Vincent. Vous avez été présents dans tous les bons moments comme dans les mauvais, on a vécu un bon nombre d’aventures ensemble et j’espère que ça continuera jusqu’à nos vieux jours !!! Merci d’avoir été là pour moi, de me rappeler qu’il n’y a pas que la thèse dans la vie et que les amis sont indispensables pour tenir le coup ! Merci à la famille Bisserié et Quiertant pour vos encouragements de tout instant, ainsi que pour votre gentillesse, vos valeurs et vos qualités humaines à tous.