Listeria Monocytogenes Dans Les Ateliers Agro-Alimentaire : Influence De Facteurs Environnementaux Et Étude Des Mécanismes D’Adaptation Aux Stress Anaïs Overney

Persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaire : influence de facteurs environnementaux et étude des mécanismes d’adaptation aux stress Anaïs Overney

To cite this version:

Anaïs Overney. Persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaire : influence de facteurs environnementaux et étude des mécanismes d’adaptation aux stress. Alimentation et Nutrition. Université Paris-Est, 2016. Français. NNT : 2016PESC1018. tel-01624502

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T H È S E pour obtenir le grade de docteur délivré par

L’Université Paris Est et L’Ecole Doctorale ABIES

Spécialité : Sciences de la Vie et de la Santé

Présentée et soutenue publiquement par

Anaïs OVERNEY

Le 9 décembre 2016

Persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires : influence de facteurs environnementaux et étude des mécanismes d’adaptation aux stress

Directeur de thèse : Mme Brigitte CARPENTIER Co-directeur de thèse : M. Jean-Christophe AUGUSTIN Encadrant : M. Olivier FIRMESSE

Jury

M. Frédéric CARLIN , Directeur de Recherche, INRA, Avignon, France Rapporteur

M. Pascal PIVETEAU , Maître de Conférences, INRA/Université de Bourgogne, Dijon, France Rapporteur

M. Romain BRIANDET , Directeur de Recherche, INRA/AgroParisTech, Massy, France Examinateur

M. Eric METTLER , Soredab, France Examinateur

Mme Christine FAILLE , Directeur de Recherche, INRA, Villeneuve d’Ascq, France Invité

Mme Brigitte CARPENTIER , Directeur de Recherche, Anses, Maisons-Alfort, France Invité

M. Jean-Christophe AUGUSTIN , Professeur, ENVA/Anses, Maisons-Alfort, France Co-directeur

M. Olivier FIRMESSE , Ingénieur d’Etude, Anses, Maisons-Alfort, France Encadrant

Anses – Laboratoire de sécurité des aliments – Unité SEL – Equipe Listeria 14 rue Pierre et Marie Curie – 94701 Maisons-Alfort cedex

RESUME

Un des objectifs a été de vérifier si les milieux de culture conventionnels fréquemment utilisés pour les expérimentations en laboratoire étaient représentatifs des conditions environnementales des ateliers agro-alimentaires et de définir pour la suite des expérimentations un milieu synthétique pouvant modéliser une souillure alimentaire. Pour assurer la sécurité sanitaire des aliments et préserver la santé des consommateurs, optimiser les opérations d’hygiène est une nécessité. Dans ce but, la survie des cellules adhérentes de L. monocytogenes soumises à des conditions simulant en laboratoire l’alternance des phases de N&D et de production a été étudiée. Plusieurs facteurs pouvant influencer la survie de ces cellules ont été pris en considération et combinés par un plan d’expériences fractionnaire : la souillure alimentaire, la souche de L. monocytogenes , le matériau de surface, la présence d’une souche de Pseudomonas fluorescens qui favorise l’adhésion de L. monocytogenes et le scénario de l’opération d’hygiène. Dans les industries agro-alimentaires, les bactéries sont soumises à de nombreux stress, nécessitant pour survivre l’expression et l’induction appropriées de gènes et de protéines de réponse aux stress. Les mécanismes de réponse aux stress mis en place par les cellules adhérentes de L. monocytogenes après stress hydrique (dessiccation), stress chimique (N&D) et stress froid ont été déterminés par une analyse transcriptomique.

Selon les critères étudiés (croissance, forces d’adhésion, distribution spatiale et état physiologique des cellules adhérentes), il s’avère que le milieu TSB/5 m peut modéliser le jus de saumon fumé. Au contraire, aucun des milieux synthétiques testés ne permet de remplacer l’utilisation de l’exsudat de viande pour mimer les conditions de terrain. Concernant les facteurs influençant la survie de L. monocytogenes , les opérations d’hygiène impactent uniquement la cultivabilité des cellules adhérentes ; toutefois, le séchage des surfaces permet une optimisation de l’efficacité de la procédure de N&D, d’autant plus lorsqu’il est réalisé quotidiennement.

Mots-clés : Listeria monocytogenes , persistance, nettoyage & désinfection, séchage, adaptation aux stress, viable non cultivable

ABSTRACT

One aim was to verify whether the conventional culture media commonly used for laboratory experiments were representative of the environmental conditions of food processing plants and define for further experiments a synthetic medium that can model a food soil. Optimization of the C&D procedures is necessary to ensure food safety and protect the health of consumers. For this purpose, the survival of L. monocytogenes adherent cells subjected to laboratory conditions simulating alternating phases of C&D and production was studied. Several factors that may influence the survival of these cells were considered and combined with a fractional factorial design, including: the food soil, the strain of L. monocytogenes , the surface material, the presence of a strain of Pseudomonas fluorescens, which enhances the adhesion of L. monocytogenes, and the scenario of the sanitation procedure. Moreover, in the food industry, bacteria can be subjected to many stresses; thus, the expression and induction of appropriate genes and stress response proteins are required for survival. The stress response mechanisms set up by the adherent L. monocytogenes cells after hydric stress (i.e. desiccation), chemical stress (i.e. C&D), and cold stress were determined by a transcriptomic analysis.

According to the criteria studied (i.e. growth, adhesion forces, spatial distribution, and physiological state of adherent cells), TSB/5 m medium was found to be a sufficient model for smoked salmon juice. In contrast, none of the tested synthetic media can replace the use of meat exudate to mimic field conditions. About the factors influencing the survival of L. monocytogenes , C&D procedures were found to only impact the culturability of adherent cells; however, drying surfaces were found to optimize the effectiveness of the C&D procedures, especially when performed daily.

Keywords : Listeria monocytogenes , persistence, cleaning & disinfection, drying, stress adaptation, viable but non culturable

6 REMERCIEMENTS

Bien que cette page soit la première d’un mémoire de thèse, c’est souvent la dernière et probablement la plus difficile à écrire, la difficulté résidant dans le désir et le devoir de n’oublier aucune des personnes ayant contribué, de près ou de loin, à la réalisation de ce travail. La rédaction des remerciements, symbole de l’accomplissement et de la conclusion d’une aventure humaine et scientifique, fait remonter à la surface des souvenirs et des anecdotes. Fruit d’une graine plantée il y a déjà trois ans, ce mémoire récapitule un travail qui n’aurait pu aboutir sans l’aide de nombreuses personnes que je remercie sincèrement :

Frédéric CARLIN et Pascal PIVETEAU pour le temps consacré à l’évaluation de ce travail en tant que rapporteurs de la thèse,

Romain BRIANDET, Christine FAILLE et Eric METTLER pour leur participation à la soutenance de la thèse en tant que membres du jury,

Laurent LALOUX, Michel-Yves MISTOU, Renaud LAILLER, David ALBERT et Sophie ROUSSEL pour l’accueil qu’ils m’ont réservé au sein du Laboratoire de sécurité des aliments de l’Agence et plus particulièrement dans l’unité Salmonella , E. coli et Listeria du département de microbiologie,

Jean-Christophe AUGUSTIN, Mickaël DESVAUX, Christine FAILLE, Cosette GRANVALET et Colin TINSLEY, membres du comité de la thèse, pour leurs conseils avisés,

Brigitte CARPENTIER, à qui j’ai pensé chaque jour de cette thèse, pour m'avoir donné l'occasion d'intégrer une équipe pleine de valeurs humaines et m'avoir fait confiance pour la réalisation de cette thèse,

Jean-Christophe AUGUSTIN pour avoir accepté de prendre le flambeau de la direction de la thèse,

Olivier FIRMESSE "juste" pour avoir persisté à mes côtés pour m'épauler dans ce projet,

Laurent GUILLIER pour son aide qui a significativement fait la différence, inutile de le démontrer statistiquement, tous les modèles mathématiques corroborent cette hypothèse,

Danielle CHASSAING pour son accueil à bras ouverts au laboratoire, son implication à me former avec rigueur, son oreille attentive et sa gentillesse qui ont été autant d’éléments m’ayant permis d’atteindre les objectifs fixés,

Patricia NG pour son investissement dans mon travail de thèse mais aussi pour toutes ses délicates attentions qui ont rendu mon quotidien plus doux et agréable,

7 Léa BENMAGHNIA pour sa générosité et son organisation sans faille pour m’approvisionner en vaisselle propre et ce, toujours avec ce sourire qui a égayé mes journées,

Joséphine JACQUES-ANDRE-COQUIN et Lena FRITSCH, deux stagiaires que j’ai eu l’occasion de former et d’encadrer, pour avoir enrichi chacune à leur manière cette expérience humaine,

Meryl VILA NOVA et Kévin DURIMEL pour leur implication et leur motivation incontestables à me faire voyager dans l’univers de la bioinformatique, monde parallèle m’ayant permis d’illustrer la dernière partie de ce manuscrit,

Graziella MIDELET-BOURDIN et Thomas BRAUGE pour leur soutien, même à distance, tout au long de ces trois années de thèse,

Sabine DELANNOY pour ses nombreux conseils scientifiques mais pas seulement …

Clémentine HENRI et Benjamin GLASSET pour les moments partagés et l’amitié nouée,

Ainsi que tous les membres de l’équipe Listeria et plus globalement toutes les personnes du laboratoire avec qui j’ai eu l’occasion d’échanger.

Enfin, ces remerciements ne seraient pas complets sans une pensée particulière à :

Mes parents qui m’ont fait grandir à l’abri de tout souci affectif et qui m’ont offert ce luxe inouï de faire aujourd’hui ce qui m’épanouit, mais ces quelques mots ne pourront pas suffire à exprimer toute ma reconnaissance alors j’ajouterai seulement que cette thèse est un peu la leur aussi,

Et Nicolas, mon compagnon de chaque jour, n otre couple a mûri avec mon projet professionnel, le premier servant de socle solide à l'épanouissement du second.

Non sans émotion, j’ai rédigé ces remerciements qui clôturent l’écriture de ce manuscrit ainsi que ce chapitre de ma vie. J’espère que ceux que j’aurais eu l’indélicatesse d’oublier sauront me pardonner …

« Soyons reconnaissants aux personnes qui nous donnent du bonheur ; elles sont les charmants jardiniers par qui nos âmes sont fleuries. » Marcel Proust

8 TABLE DES MATIERES

PREAMBULE ...... 23

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ...... 27

CHAPITRE 1 : Listeria monocytogenes ...... 29 1. Listeria monocytogenes : taxonomie et caractéristiques ...... 29 1.1. Taxonomie ...... 29 1.2. Les caractéristiques phénotypiques...... 30 1.3. L. monocytogenes : un germe ubiquitaire ...... 30 2. La listériose : une maladie atypique ...... 31 2.1. Physiopathologie ...... 31 2.2. Epidémiologie ...... 32 CHAPITRE 2 : Présence de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires ...... 37 1. Formation de biofilms sur les surfaces ...... 37 1.1. Définition ...... 37 1.2. Processus de formation de biofilms ...... 37 1.3. Les facteurs impliqués dans la formation de biofilms ...... 40 1.4. Les propriétés particulières des cellules adhérentes ...... 44 2. Moyens de lutte contre l’implantation de biofilms dans les ateliers agro-alimentaires ...... 44 2.1. Les procédures de nettoyage & désinfection ...... 45 2.2. Les méthodes alternatives ...... 55 2.3. Une étape supplémentaire : le séchage des surfaces ...... 58 2.4. Les paramètres influençant l’efficacité des opérations d’hygiène ...... 58 3. La persistance au sein des ateliers agro-alimentaires ...... 62 3.1. La persistance de L. monocytogenes : une évidence ...... 62 3.2. Plusieurs hypothèses pour expliquer la persistance ...... 63 3.3. De nombreuses études pour tenter d’expliquer et comprendre la persistance ...... 66 3.4. Lutter contre la persistance : une nécessité ...... 68 CHAPITRE 3 : Adaptation de Listeria monocytogenes aux stress rencontrés dans les ateliers agro- alimentaires ...... 71 1. L. monocytogenes : une bactérie aux nombreuses capacités d’adaptation ...... 71 2. Compréhension des mécanismes d’adaptation aux stress ...... 72 2.1. Plusieurs méthodes pour l’étude des mécanismes d’adaptation aux stress ...... 72 2.2. Etude des mécanismes d’adaptation à différents stress ...... 73 2.3. Protection croisée ...... 82 2.4. Adaptation aux stress et virulence ...... 83 3. Etat viable non cultivable ...... 84 3.1. Qu’est-ce que l’état viable non cultivable ? ...... 84

9 3.2. Les bactéries viables non cultivables peuvent-elles retrouver leur cultivabilité ? ...... 85 3.3. Quelles sont les méthodes de détection des bactéries viables non cultivables ? ...... 85 3.4. Un problème de sécurité sanitaire ...... 89

ETUDES EXPERIMENTALES ...... 91

Démarche expérimentale ...... 93 CHAPITRE 1 : Recherche de milieux de culture modélisant des souillures alimentaires pour étudier le comportement de Listeria monocytogenes sur les surfaces en acier inoxydable ...... 95 1. Contexte et objectifs ...... 95 2. Matériels et méthodes ...... 97 2.1. Souches et conditions de culture ...... 97 2.2. Préparation des souillures alimentaires et des milieux de culture modèles ...... 97 2.3. Croissance bactérienne ...... 99 2.4. Etude des populations adhérentes ...... 99 2.5. Analyses statistiques ...... 103 3. Résultats ...... 104 3.1. Etude des cellules de L. monocytogenes adhérentes sur l’acier inoxydable en présence de jus de saumon fumé ou d’exsudat de viande ...... 104 3.2. Comparaison du comportement des cellules de L. monocytogenes adhérentes cultivées avec du jus de saumon fumé ou de milieux synthétiques ...... 108 3.3. Comparaison du comportement des cellules de L. monocytogenes adhérentes cultivées en présence d’exsudat de viande ou de milieux synthétiques ...... 112 4. Discussion ...... 114 4.1. Caractérisation du comportement de L. monocytogenes en présence de souillures alimentaires ...... 114 4.2. Recherche de milieux de culture modèles ...... 115 5. Conclusion et perspectives ...... 118 6. Publication dans International Journal of Food Microbiology ...... 120 CHAPITRE 2 : Etude de facteurs environnementaux pouvant influencer la survie et la persistance de Listeria monocytogenes sur les surfaces ...... 131 1. Contexte et objectifs ...... 131 2. Matériels et méthodes ...... 134 2.1. Souches ...... 134 2.2. Milieux de culture ...... 135 2.3. Sélection de produits et de protocoles de N&D ...... 135 2.4. Réalisation de biofilms ...... 137 2.5. Méthodes de décrochement des cellules ...... 142 2.6. Quantification des cellules selon leur état physiologique ...... 142 2.7. Réalisation d’un plan d’expériences fractionnaire pour l’étude de facteurs environnementaux pouvant influencer la survie des cellules de L. monocytogenes ...... 143 2.8. Analyses statistiques ...... 147

10 3. Résultats ...... 150 3.1. Sélection des souches favorisant l’adhésion de L. monocytogenes ...... 150 3.2. Test d’efficacité des protocoles de N&D ...... 153 3.3. Obtention de cellules survivantes sur acier inoxydable ...... 155 3.4. Sélection de la méthode de décrochement des cellules...... 156 3.5. Etat physiologique des cellules adhérentes résiduelles lors de la simulation des conditions rencontrées dans les ateliers agro-alimentaires pendant une semaine ...... 157 3.6. Impact de facteurs environnementaux étudiés par un plan d’expériences fractionnaire.. 158 4. Discussion ...... 164 4.1. Recherche de souches favorisant l’adhésion de L. monocytogenes ...... 164 4.2. Efficacité des protocoles de N&D et obtention de populations survivantes ...... 165 4.3. Choix de la méthode de décrochement des cellules adhérentes ...... 166 4.4. Etat physiologique des cellules adhérentes après simulation des conditions rencontrées dans les ateliers agro-alimentaires pendant une semaine ...... 167 4.5. Etude de l’impact de facteurs environnementaux sur la survie de L. monocytogenes ..... 168 5. Conclusion et perspectives ...... 173 5.1. Etudier les interactions entre les espèces bactériennes ...... 173 5.2. Compléter le plan d’expériences fractionnaire ...... 174 5.3. Adaptation aux stress ...... 176 6. Soumission dans International Journal of Food Microbiology ...... 177 CHAPITRE 3 : Etude des mécanismes de réponse aux stress par une approche transcriptomique 201 1. Contexte et objectifs ...... 201 2. Matériels et méthodes ...... 202 2.1. Souches et conditions de culture ...... 202 2.2. Milieux de culture ...... 202 2.3. Réalisation de biofilms ...... 202 2.4. Application de stress ...... 203 2.5. Décrochement des cellules adhérentes ...... 205 2.6. Extraction d’ARN ...... 206 2.7. Préparation des échantillons et séquençage par le prestataire de services GenoScreen .. 206 2.8. Analyse bio-informatique des données ...... 208 3. Résultats ...... 212 3.1. Extraction d’ARN ...... 212 3.2. Qualité du séquençage et réalignement des reads sur la référence ...... 212 3.3. Comparaison de l’expression des gènes des cellules adhérentes cultivées en présence de deux milieux de culture différents ...... 213 3.4. Etude de la réponse à différents stress : froid, nettoyage, désinfection et séchage ...... 215 3.5. Impact de la récurrence de l’application du séchage ...... 230 4. Discussion ...... 238

11 4.1. Comparaison de l’expression des gènes après culture des cellules de L. monocytogenes en présence de jus de saumon fumé et du milieu TSB/5 m ...... 238 4.2. Réponse à différents stress ...... 239 5. Conclusion et perspectives ...... 245 5.1. Compléter l’analyse des données ...... 245 5.2. Renforcer la compréhension des mécanismes d’adaptation aux stress ...... 247 5.3. Recherche de marqueurs de viabilité ...... 248

CONCLUSION ...... 251

VALORISATION ...... 257

BILAN PERSONNEL ...... 263

1. Contexte de la thèse ...... 265 2. Motivations personnelles ...... 265 3. Gestion du projet ...... 266 3.1. Préparation et cadrage du projet ...... 266 3.2. Conduite du projet ...... 266 4. Compétences mises en œuvre...... 267 5. Un projet professionnel ...... 268

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 271

ANNEXES ...... 293

12 TABLE DES ANNEXES

Annexe 1 : Principe et protocole de l’extraction de l’ADN avec le kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III (Roche) ...... 295

Annexe 2 : Script pour la réalisation du plan expériences fractionnaire avec l’application PLANOR du logiciel R 3.2.1 (Kobilinsky et al. , 2015 ; Monod et al. , 2012) ...... 297

Annexe 3 : Script pour le traitement des données et gérer les données censurées avec l’application PLANOR du logiciel R 3.2.1 (Kobilinsky et al. , 2015 ; Monod et al. , 2012) ...... 299

Annexe 4 : Script pour déterminer l’effet de chacun des cinq facteurs environnements testés et générer les graphiques correspondants avec le plan d’expériences fractionnaire avec l’application PLANOR du logiciel R 3.2.1 (Kobilinsky et al. , 2015 ; Monod et al. , 2012) ...... 307

Annexe 5 : Protocole d’extraction d’ARN avec le kit high Pure RNA Isolation ...... 310

Annexe 6 : Principe et protocole de la quantification de l’ARN d’un échantillon avec le kit RNA 6000 Nano Kit avec le Bioanalyzer 2100 (Agilent) ...... 311

Annexe 7 : Script MACLiK pour la détermination des catégories COG de chaque gène différentiellement exprimé ...... 315

13 TABLE DES ILLUSTRATIONS

FIGURES

Figure 1 : Incidence annuelle de la listériose par million d’habitants en France de 1999 à 2014 (InVS, 2015a)...... 34

Figure 2 : Schématisation de la formation d’un biofilm bactérien (Bryers et Ratner, 2004). .. 38

Figure 3 : Modèle conceptuel de la persistance ( □) et de la non persistance ( ♦) suite à l’évolution de la densité cellulaire d’une souche bactérienne dans un site de rétention contaminé une fois et soumis à des opérations de N&D à des intervalles de temps réguliers (Carpentier et Cerf, 2011)...... 65

Figure 4 : Trou de débullage dans une surface en polychlorure de vinyle (PVC) observé par microscopie électronique à balayage avant (à gauche) et après (à droite) colonisation par P. fluorescens cultivé en présence d’exsudat de viande (Midelet, 2002)...... 66

Figure 5 : Observation au microscope à épifluorescence après marquage au CTC (à gauche) et à l’INT (à droite) de cellules de L. monocytogenes (Bovill et al. , 1994). Les cellules métaboliquement actives contiennent des dépôts de formazan fluorescents...... 86

Figure 6 : Observation au microscope à épifluorescence après marquage au Syto9® et à l’IP (kit LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability ) de cellules de L. monocytogenes . Les cellules vertes sont considérées comme vivantes contrairement aux cellules rouges considérées comme mortes (Ercolini et al., 2006)...... 88

Figure 7 : Principe de la PMA-PCRq (Nocker et al. , 2006)...... 88

Figure 8 : Observation au microscope à épifluorescence après marquage au Syto9 ® de cellules de L. monocytogenes CCL500 cultivées en présence de jus de saumon fumé (A), d’exsudat

de viande (B), du milieu TSB/5 m (C) et du milieu BHI/20 pH 5,4 (D) sur acier inoxydable pendant 24 heures à 25°C...... 105

successifs. Le seuil de détection était de 1,3 log 10 (UFC/écouvillon). Seuls les écouvillons pour lesquels les valeurs de dénombrement étaient supérieures ou égales au seuil de détection sont représentés...... 106

Figure 10 : Observation au microscope à épifluorescence après marquage au Syto9 ® de cellules de L. monocytogenes CCL207 (A et B), CCL128 (C et D), et LO28 (E et F) cultivées en

présence de jus de saumon fumé (A, C et E) et du milieu TSB/5 m (B, D et F) sur acier inoxydable pendant 24 heures à 25°C...... 111

14 Figure 11 : Schématisation de la démarche expérimentale...... 133

Figure 12 : Boîte de dessiccation utilisée pour l’application de l’étape de séchage à 75% HR à 25°C pendant 3 heures...... 141

Figure 13 : Représentation d’un plan d’expériences complet de trois facteurs à trois niveaux...... 144

Figure 14 : Schématisation du protocole expérimental pour la quantification des cellules adhérentes avant et après application des opérations d’hygiène dans le cadre du plan d’expériences fractionnaire...... 147

δ J1-Jx correspond à la différence entre la quantité de cellules avant l’application de l’opération d’hygiène à J1 et celle obtenue après l’opération d’hygiène chacun des x jours

suivants. δ J1-J4 correspond à la différence entre la quantité de cellules avant l’application

de l’opération d’hygiène à J1 et celle obtenue après l’opération d’hygiène à J4. Eff OH correspond à l’efficacité de l’opération d’hygiène...... 149

Figure 16 : Population cultivable adhérente sur acier inoxydable à 25°C décrochée par traitement aux US de la souche de L. monocytogenes LO28 en présence (en bleu) ou non (en rouge) d’une souche de Pseudomonas (n = 4, soit 2 expériences réalisées). Le seuil de

détection était de 4,6 log 10 (UFC/coupon)...... 151

Figure 17 : Population cultivable adhérente sur acier inoxydable à 25°C décrochée par traitement aux US des souches de L. monocytogenes EGD-e et LO28 en présence ou non de la souche de S. capitis CCL54 (n = 4, soit 2 expériences réalisées). Le seuil de détection

était de 2,6 log 10 (UFC/coupon)...... 152

Figure 18: Observation au microscope à épifluorescence après coloration au Syto9 ® de la population adhérente de L. monocytogenes LO28 cultivée seule (A) ou en présence de P. fluorescens 09empf87 (B) ou de S. capitis CCL54 (C) sur acier inoxydable à 25°C en

présence du milieu TSB/5 m...... 153

réalisées). Les seuils de détection étaient de 1,3 log 10 (UFC/coupon) et

2,8 log10 (UFC/coupon) respectivement pour l’écouvillonnage et le traitement aux US. . 154

15 adhérentes restantes par dépôt de jus de saumon fumé quotidiennement durant quatre jours (n = 6, soit 2 expériences réalisées). Les seuils de détection étaient de

1,3 log 10 (UFC/coupon) et 2,8 log 10 (UFC/coupon) respectivement pour l’écouvillonnage et le traitement aux US...... 156

saumon fumé. Le seuil de détection des cellules cultivables était de 1,3 log 10 (UFC/coupon)

et celui des cellules viables et totales de 4 log 10 (cellules/coupon). Pour les mesures obtenues après les opérations de N&D, les symboles sont légèrement décalés à droite de ceux obtenus avant N&D (n = 6, 2 expériences)...... 158

Figure 22 : Valeurs de δ J1-J4 pour les cellules cultivables, viables et totales pour chaque scénario d’opération d’hygiène testé...... 161

Figure 23 : Efficacité de chacun des scénarios de l’opération d’hygiène sur les populations cultivables à chaque jour de la semaine...... 162

Figure 24 : Valeurs de δ J1-Jx pour les cellules cultivables pour chaque scénario de l’opération d’hygiène chacun des jours de la semaine en comparaison à la population cultivable initiale...... 163

Figure 25 : Etapes de préparation des échantillons et séquençage par le prestataire de services GenoScreen...... 207

Figure 26 : Quantification et abondance relative des catégories fonctionnelles COG des gènes différentiellement exprimés spécifiquement par les cellules adhérentes de L. monocytogenes

EGD-e cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m par rapport aux cellules adhérentes cultivées en présence de jus de saumon fumé...... 214

Figure 27 : Quantification des gènes sur-exprimés et sous-exprimés par les cellules adhérentes

de L. monocytogenes EGD-e cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) par rapport aux cellules n’ayant pas subi de stress...... 215

Figure 28 : Abondance relative des catégories COG de l’ensemble des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e cultivées sur acier

inoxydable en présence du milieu TSB/5 m après avoir subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress...... 216

Figure 29 : Abondance relative des catégories COG des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e cultivées sur acier inoxydable en

présence du milieu TSB/5 m spécifiquement après avoir subi un stress froid (24 heures

16 à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) ou de façon commune aux quatre stress, en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress...... 217

Figure 30 : Quantification des gènes sur-exprimés et sous-exprimés par les cellules adhérentes

de L. monocytogenes LO28 cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) par rapport aux cellules n’ayant pas subi de stress...... 221

Figure 31 : Abondance relative des catégories COG de l’ensemble des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes LO28 cultivées sur acier

inoxydable en présence du milieu TSB/5 m spécifiquement après avoir subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress...... 222

Figure 32 : Abondance relative des catégories COG des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes LO28 cultivées sur acier inoxydable en

présence du milieu TSB/5 m spécifiquement après avoir subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) ou de façon commune aux quatre stress, en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress...... 223

Figure 33 : Abondance relative des catégories COG des gènes différentiellement exprimés de façon commune par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e et LO28 cultivées

sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) appliqué une seule fois ou quotidiennement pendant une semaine en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress...... 228

Figure 34 : Quantification et abondance relative des catégories COG des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e

cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) appliquée une seule fois ou quotidiennement durant une semaine par rapport aux cellules n’ayant pas subi de séchage...... 232

Figure 35 : Quantification et abondance relative des catégories COG des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes LO28 cultivées

sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) appliquée une seule fois ou quotidiennement durant une semaine par rapport aux cellules n’ayant pas subi de séchage...... 235

Figure 36 : Abondance relative des catégories COG de l’ensemble des gènes différentiellement exprimés de façon commune par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e et

LO28 cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi une étape

17 de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) appliqué une seule fois ou quotidiennement pendant une semaine en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress...... 237

Figure 37 : Voie simplifiée de la biosynthèse des pentoses-phosphates. Les protéines codées par les gènes sur-exprimés par les cellules de L. monocytogenes EGD-e ayant subi une étape de séchage quotidiennement pendant une semaine sont représentées en rouge...... 247

TABLEAUX

Tableau 1 : Dix-huit espèces de Listeria recensées en 2015 ...... 29

Tableau 2 : Lignées, sérogroupes moléculaires et sérotypes de L. monocytogenes (Doumith et al. , 2004) ...... 30

Tableau 3 : Propriétés principales, avantages et inconvénients des principales catégories de produits détergents ...... 49

Tableau 4 : Avantages, inconvénients et spectre d’action des principales catégories de produits désinfectants ...... 53

Tableau 5 : Méthodes alternatives à l’utilisation de produits conventionnels de N&D ayant des applications concrètes actuellement dans les ateliers agro-alimentaires ...... 56

Tableau 6 : Cas de persistance de L. monocytogenes au sein d’ateliers agro-alimentaires (Tompkin, 2002) ...... 63

Tableau 7 : Systèmes de réponse au stress osmotique chez L. monocytogenes (Burgess et al. , 2016) ...... 79

Tableau 8 : Principales fonctions induites (+) ou réprimées (-) selon le stress à partir des données résumées dans la synthèse bibliographique ci-jointe ...... 81

Tableau 9 : Impact de conditions de pré-incubation sur la résistance ou la sensibilisation à des conditions létales pour L. monocytogenes ...... 82

Tableau 10 : Forces d’adhésion relatives de cellules de L. monocytogenes cultivées en présence de jus de saumon fumé, d’exsudat de viande ou de milieux de culture synthétiques sur acier inoxydable durant 24 heures à 25°C ...... 106

Tableau 11 : Quantification des cellules adhérentes de L. monocytogenes cultivées en présence de jus de saumon fumé, d’exsudat de viande ou de milieux de culture synthétiques sur acier inoxydable pendant 24 heures à 25°C ...... 107

Tableau 12 : Paramètres de croissance des cellules de L. monocytogenes CCL500 cultivées dans le jus de saumon fumé et les milieux de culture synthétiques associés à 25°C ...... 109

Tableau 13 : Paramètres de croissance des cellules de L. monocytogenes CCL207, CCL128 et

LO28 cultivées dans le jus de saumon fumé et le milieu TSB/5 m à 25°C ...... 110

Tableau 14 : Paramètres de croissance des cellules de L. monocytogenes CCL500 cultivées dans l’exsudat de viande et les milieux de culture synthétiques associés à 25°C...... 112

Tableau 15 : Souches de Pseudomonas utilisées pour la recherche d’une souche favorisant l’adhésion de L. monocytogenes ...... 134

Tableau 16 : Protocole de N&D considéré comme peu respectueux de l’environnement ..... 136

Tableau 17 : Protocole de N&D considéré comme relativement respectueux de l’environnement ...... 137

Tableau 18 : Plan d’expériences fractionnaire suivi pour l’étude des cinq facteurs environnementaux ...... 146

Tableau 19 : Résultats statistiques de l’impact de la souche de L. monocytogenes, du matériau de surface, de la présence d’une souche favorisant l’adhésion de L. monocytogenes , de la souillure alimentaire et du scénario de l’opération d’hygiène sur la survie des cellules L. monocytogenes selon leur état physiologique ...... 159

Tableau 20 : Conditions testées avec la souche de L. monocytogenes EGD-e ...... 204

Tableau 21 : Conditions testées avec la souche de L. monocytogenes LO28 ...... 205

Tableau 22 : Catégories fonctionnelles COG chez Listeria (NCBI, 2014 ; Tatusov et al. , 1997) ...... 210

Tableau 23 : Vérification de la qualité des résultats de séquençage ...... 212

Tableau 24 : Quantification de l’ensemble des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes LO28 et EGD-e cultivées sur acier inoxydable en présence

du milieu TSB/5 m et ayant subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress...... 227

LISTE DES ABREVIATIONS

ADN (c) Acide désoxyribonucléique (complémentaire) AFLP Amplified fragment length polymorphism ALOA Agar pour Listeria selon Ottaviani et Agosti ANOVA Analyse de variance Anses Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail ARN (m, r, t) Acide ribonucléique (messager, ribosomique, de transfert) aw Activité de l’eau BAC Chlorure de benzalkonium BHI Brain heart infusion

BHI m BHI modifié

BHI pH 5,4 BHI dont le pH a été ajusté à 5,4 BZT Chlorure de benzéthonium CNR Centre National de Référence COG Clusters of orthologous groups Ct Cycle seuil ( threshold cycle ) CTC 5-cyano-2,3-ditolyltetrazolium chloride DGAl Direction Générale de l’Alimentation DGCCRF Direction Générale de la Consommation, de la Concurrence, et de la Répression des Fraudes DGS Direction Générale de la Santé DO Densité optique

DO max Densité optique maximale atteinte en phase stationnaire DVC Direct viable count EDTA Ethylène diamine tétra-acétate

Eff OH Efficacité de l’opération d’hygiène EMA Monoazoture d’éthidium EP Eau peptonée à 1 g/l HACCP Hazard Analysis Critical Control Point INT 2-(4-iodophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-phényl-tétrazolium-chloride InVS Institut de Veille Sanitaire IP Iodure de propidium JCVI J. Craig Venter Institute MLST Multi-locus sequence typing N&D Nettoyage & désinfection

NEP Nettoyage en place

Nmax Population maximale de bactéries atteinte en phase stationnaire pb Paire de bases PBS Phospate buffered saline PCR Polymerase chain reaction Pε Probabilité d’erreur PFGE Pulse-field gel electrophoresis PMA Monoazoture de propidium PVC Polychlorure de vinyle QAC Composés d’ammoniums quaternaires RIN RNA integrity number RNA-seq Séquençage du transcriptome RMTB Read Mapped Back onto Transcript RT Transcription inverse SCN Staphylococcus à coagulase négative TSA Tryptone soya agar TSB Tryptone soya broth

TSB m TSB modifié

TSB pH 5,4 TSB dont le pH a été ajusté à 5,4 TIAC Toxi-infection alimentaire collective

µmax Taux de croissance maximal UFC Unité formant colonie US Ultra-sons Usp Universal stress protein UV Ultra-violets VNC Viable non cultivable % HR Pourcentage d’humidité relative

PREAMBULE

Préambule

Dans les ateliers agro-alimentaires, les opérations de nettoyage et désinfection (N&D) sont appliquées quotidiennement pour lutter contre la formation de biofilms sur les surfaces, que ces dernières soient en contact avec les denrées alimentaires ou non. Cependant, la persistance de Listeria monocytogenes , c’est-à-dire sa présence au sein d’un atelier pendant des mois voire des années malgré l’application correcte et fréquente des opérations d’hygiène, est un problème majeur qui n’est plus à démontrer (Carpentier et Cerf, 2011 ; Møretrø et Langsrud, 2004 ; Tompkin, 2002). Les bactéries persistantes sur les surfaces peuvent se retrouver en contact avec des produits alimentaires et les contaminer par un phénomène de contamination croisée (Lundén et al. , 2002 ; Reij et Den Aantrekker, 2004). Ces denrées contaminées, de plus en plus souvent prêtes à la consommation pour répondre à la demande et aux nouvelles habitudes alimentaires des consommateurs, peuvent être responsables de cas de listériose aux conséquences désastreuses (Donovan, 2015 ; Goulet et al. , 2012).

Les biofilms se développent dans les zones humides des ateliers agro-alimentaires, l’eau étant nécessaire à la croissance microbienne. La manipulation de produits alimentaires humides et les procédures de N&D apportent beaucoup d’eau sur les surfaces. Dans la lutte contre la persistance de L. monocytogenes dans les environnements agro-alimentaires, le séchage des surfaces après les opérations de N&D, en provoquant un stress hydrique sur les bactéries survivantes, apparaît être une barrière supplémentaire efficace (Bang et al. , 2014 ; Fuster-Valls et al. , 2008 ; Zoz et al. , 2016). Le concept de l’usine « sèche » reste encore aujourd’hui un vrai challenge pour les industriels. Une étape de séchage des surfaces permet une réduction des populations microbiennes et/ou limite, au moins temporairement, la croissance des cellules survivantes ainsi que leur circulation dans les ateliers. S’il est connu que L. monocytogenes peut survivre au stress hydrique (Vogel et al. , 2010), notamment sous forme non cultivable, les mécanismes de résistance et d’adaptation à ce stress sont quasiment inconnus.

C’est dans ce contexte que s’inscrivent les travaux présentés dans ce manuscrit. Ils font partie intégrante du projet EcoSec (ANR-12-ALID-0005) financé par l’Agence Nationale de la Recherche dans le cadre du programme Alimentation Durable de 2012 et labellisé par le pôle de compétitivité Vitagora. Le projet EcoSec a pour principal objectif d’optimiser la déshumidification de l’air pour diminuer l’impact environnemental des opérations d’hygiène dans les ateliers agro-alimentaires réfrigérés. Afin de rendre les opérations de N&D plus respectueuses de l’environnement tout en assurant leur efficacité, il conviendrait de réduire les volumes d’eau et de produits chimiques utilisés mais aussi d’utiliser des produits d’hygiène plus écologiques. Les travaux de thèse se sont articulés autour de trois objectifs principaux, chacun faisant l’objet d’un chapitre de ce manuscrit suite à la synthèse bibliographique :

25 Préambule

(i) étudier le comportement de cellules de L. monocytogenes adhérentes sur des surfaces en présence d’exsudat de viande ou de jus de saumon fumé pour définir des milieux de culture modélisant chacune de ces deux souillures, (ii) étudier l’impact de différents facteurs environnementaux représentatifs des conditions rencontrées dans les environnements agro- alimentaires sur la survie et la persistance de cellules de L. monocytogenes , et (iii) mieux comprendre les mécanismes de réponse aux stress mis en place par ce pathogène pour persister.

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Synthèse bibliographique – Chapitre 1

CHAPITRE 1 : Listeria monocytogenes

1. Listeria monocytogenes : taxonomie et caractéristiques

1.1. Taxonomie

Officiellement découverte en 1924 lors d’une épidémie touchant des animaux d’une animalerie en Angleterre et d’abord appelée Bacterium monocytogenes (Murray et al. , 1926), cette bactérie est ensuite mise en cause lors d’infections humaines et rebaptisée Listeria monocytogenes .

Cependant, des études d’hybridation ADN-ADN ont mis en évidence la grande hétérogénéité génomique des souches initialement regroupées sous le nom de L. monocytogenes . En utilisant des méthodes biochimiques et génétiques, cette espèce a donc par la suite été distinguée des autres espèces de Listeria . A ce jour, le genre Listeria (Phylum : Firmicutes, Classe : Bacilli , Ordre : Bacilliales , Famille : Listeriaceae ) regroupe 18 espèces bactériennes dont L. monocytogenes qui est la principale pathogène pour l’Homme (Guillet et al. , 2010) (Tableau 1).

Tableau 1 : Dix-huit espèces de Listeria recensées en 2015

Espèce de Listeria Référence L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, Wiedmann (2002) L. grayi, L. denitrificans et L. ivanovii L. marthii Graves et al. (2010) L. rocourtiae Leclercq et al. (2010) L. fleischmannii Bertsch et al. (2013) L. weihenstephanensis Halter et al. (2013) L. floridensis, L. aquatica, L. cornellensis, L. riparia et den Bakker et al. (2014) L. grandensis L. booriae et L. newyorkensis Weller et al. (2015)

Les souches de L. monocytogenes sont classées en quatre lignées définies comme étant des ensembles homogènes de groupes clonaux dérivant tous d’un ancêtre commun (Nadon et al. , 2001 ; Orsi et al. , 2011 ; Piffaretti et al. , 1989). Chaque lignée regroupe plusieurs sérotypes qui sont déterminés par une méthode de sérotypage par agglutination basée sur les

29 Synthèse bibliographique – Chapitre 1 réactions anticorps/antigènes (typage phénotypique). Pour définir les treize sérotypes (Seeliger et Jones, 1986), sont ciblés les treize antigènes somatiques et les quatre antigènes flagellaires. L’espèce L. monocytogenes est également classée en cinq sérogroupes moléculaires déterminés par une technique de polymerase chain reaction (PCR) (Doumith et al. , 2004) : IIa (sérotypes 1/2a et 3a), IIb (sérotypes 1/2b, 3b et 7), IIc (sérotypes 1/2c et 3c), IVb (sérotypes 4b, 4d et 4e et 4ab) et IVa (sérotypes 4a et 4c) (Tableau 2).

Tableau 2 : Lignées, sérogroupes moléculaires et sérotypes de L. monocytogenes (Doumith et al. , 2004)

Lignée Sérogroupe moléculaire Sérotype (agglutination) I IIb 1/2b, 3b, et 7 IVb 4b, 4d, 4e et 4ab II IIa 1/2a et 3a IIc 1/2c et 3c III IVa 4a et 4c IV Lignée récente peu caractérisée

1.2. Les caractéristiques phénotypiques

L. monocytogenes est un bacille (2 µm x 0,5 µm) à Gram positif, aéro-anaérobie facultatif, non sporulé, non capsulé, isolé ou en chaînettes, mobile grâce à des flagelles péritriches entre 20°C et 25°C, catalase positif, oxydase négatif et capable de fermenter, sans production de gaz, de nombreux glucides comme le mannitol ou le rhamnose qui sont utilisés dans les tests biochimiques d’identification de L. monocytogenes (Anses, 2011 ; Donovan, 2015 ; Rocourt et al. , 1983).

L. monocytogenes est une bactérie psychrotrophe pouvant se développer à température ambiante (croissance optimale à 37°C) mais aussi aux températures de réfrigération (0°C - 4°C) (Augustin et al. , 1999 ; Walker et al. , 1990). Elle a également d’importantes capacités à se multiplier sur une large gamme de pH (4,0 - 9,6) (Giotis et al. , 2008b ; Walker et al. , 1990) et d’activité de l’eau (aw, 0,92 - 0,99) (Farber et al. , 1992). Sur gélose nutritive, cette bactérie forme des colonies de 0,5 à 1,5 mm à 37°C en 24 à 48 heures.

1.3. L. monocytogenes : un germe ubiquitaire

30 Synthèse bibliographique – Chapitre 1

L. monocytogenes est présente dans de nombreuses niches écologiques. Elle est particulièrement répandue au niveau des sols, dans l’eau et la végétation en décomposition et est également présente dans les ateliers agro-alimentaires. La contamination de l’environnement résulte principalement du relargage de la bactérie via les excréments d’animaux qu’ils soient porteurs sains ou malades (Anses, 2011).

2. La listériose : une maladie atypique

2.1. Physiopathologie

L. monocytogenes est l’agent responsable de la listériose : pathologie à caractère zoonotique. La transmission de ce germe opportuniste se fait, dans 99% des cas, par voie alimentaire (InVS, 2015a).

La listériose est une des infections d’origine alimentaire les plus sévères avec un faible taux de morbidité mais un taux de létalité très élevé (20 à 30% des cas) et un taux de prédilection important pour les personnes immunodéprimées (nouveaux-nés, personnes âgées, personnes sous traitement immunosuppresseur, etc.) et les femmes enceintes (Donovan, 2015 ; Goulet et al. , 2012). La listériose peut être de deux formes : non invasive ou invasive.

La forme non invasive se caractérise principalement par des gastroentérites fébriles et touche généralement une population en bonne santé ayant consommé des produits contaminés (au moins 10 2 unités formant colonie (UFC) par gramme de produit) (Berche et al. , 2000). La probabilité pour un consommateur de déclencher une listériose est fonction de la quantité de cellules ingérées (dose-réponse), du sérotype et du statut immunitaire (Pouillot et al. , 2015). La matrice alimentaire dans laquelle L. monocytogenes s’est développée pourrait également jouer un rôle (Midelet-Bourdin et al. , 2006 ; Rantsiou et al. , 2012).

Quant à la forme invasive, elle peut entraîner aussi bien des infections locales que des septicémies/bactériémies ou des méningo-encéphalites qui sont les formes cliniques les plus fréquemment observées lors d’épidémies liées à la consommation de produits contaminés par des personnes dont le système immunitaire est affaibli (Goulet et al. , 2012 ; Rocourt, 1996).

La transmission directe est également possible in utero de la mère au fœtus. Comme évoqué par Rocourt (1996), dans les cas de listériose materno-néonatale, l’infection de la mère peut être soit asymptomatique, soit caractérisée par un état grippal mais les symptômes sont plus sévères en ce qui concerne le fœtus (malformations, naissance prématurée, mort intra-

31 Synthèse bibliographique – Chapitre 1 utérine, etc.). De façon exceptionnelle, elle peut également se transmettre par contact avec un animal infecté (InVS, 2015a).

La durée d’incubation de L. monocytogenes est comprise entre 1 et 90 jours, selon le type de listériose, ce qui ne facilite pas l’identification de la source de contamination en cas de maladie déclarée (Goulet et al. , 2013).

Le traitement de la listériose consiste en une antibiothérapie d’une dizaine de jours environ. Prenant en compte la résistance intrinsèque de L. monocytogenes aux céphalosporines, l’antibiotique généralement utilisé est l’ampicilline (Donovan, 2015).

2.2. Epidémiologie

2.2.1. Les sources de contamination

Comme évoqué précédemment, la listériose est une maladie d’origine principalement alimentaire. Toutes les catégories de produits alimentaires (produits carnés et charcuteries, produits de la mer, végétaux et produits laitiers) sont considérées comme étant à risques. La contamination des aliments peut survenir à tous les stades de la chaîne alimentaire (Anses, 2011 ; EFSA, 2013 ; Rocourt, 1996).

De par les changements de style de vie, les produits réfrigérés prêts à la consommation (par exemple : tartares de viande et poisson, charcuteries, salades et crudités de 4 ème et 5 ème gammes) sont devenus très populaires. Particulièrement surveillés car considérés comme les plus à risques (Okada et al. , 2013 ; Rocourt et al. , 2003 ; Tompkin, 2002), ce sont des denrées consommées directement après une période de réfrigération sans cuisson ni autre étape de préparation bactéricide. Les étapes intervenant après le process de fabrication doivent d’ailleurs être prises en compte dans l’évaluation des risques. En effet, le risque de listériose augmente notamment avec la quantité de bactéries ingérées lors de la consommation d’un produit. Pour limiter au mieux ce risque, la réglementation européenne, par le règlement N°2073/2005 , fixe deux critères à respecter selon le type de produit considéré (CE, 2005) : - pour les denrées alimentaires prêtes à être consommées destinées aux nourrissons ou à des fins médicales spécifiques : l’absence de bactéries dans 25 grammes de produit pendant la durée de conservation, - pour les autres produits alimentaires : une limite maximale de 100 UFC par gramme de produit pendant la durée de conservation.

32 Synthèse bibliographique – Chapitre 1

De bonnes pratiques de fabrication, une hygiène appropriée et un contrôle de la température de conservation des produits sont nécessaires pour limiter la contamination des produits et/ou la croissance potentielle de L. monocytogenes dans les aliments en vue de maintenir des niveaux inférieurs à 100 UFC/g de produit (EFSA, 2013). La maîtrise de la température, de la production jusqu’à la consommation des aliments à risques, est un élément incontournable (Duret et al. , 2014). Okada et al. (2013) ont d’ailleurs démontré que le risque de listériose est augmenté lorsque les aliments sont conservés à mauvaise température, la concentration de cellules pouvant être jusqu’à 3,5 log 10 (UFC/g) supérieure dans des sardines cuites prêtes à la consommation après 7 jours de conservation à 10°C plutôt qu’à 4°C.

D’après les connaissances actuelles, toutes les souches de L. monocytogenes sont considérées comme potentiellement pathogènes pour l’Homme, mais il apparaît que certains groupes clonaux sont plus virulents que d’autres (Henri et al. , 2016 ; Maury et al. , 2016). Il a par ailleurs été constaté que la majorité des cas de listériose humaine est due aux sérotypes 1/2a, 1/2b et 4b (Donovan, 2015 ; Maury et al. , 2016 ; Wiedmann, 2002).

2.2.2. Surveillance et incidence de la listériose

En 2014, plus de 1300 toxi-infections alimentaires collectives (TIAC), impliquant plus de 12000 malades, ont été déclarées (InVS, 2015b). Les trois agents pathogènes les plus fréquemment impliqués sont Staphylococcus aureus (30% des cas confirmés ou suspectés), Bacillus cereus (22%) et Salmonella spp. (15%) (InVS, 2015c). Depuis plusieurs années, L. monocytogenes n’est pas impliquée dans des TIAC mais des cas isolés de listériose ont été recensés (359 cas en 2014), positionnant ce pathogène en troisième position des pathogènes impliqués dans les cas isolés après Salmonella spp. (10680 cas) et Campylobacter (6048 cas) (InVS, 2015a, b).

En France, la surveillance de la listériose est assurée conjointement par l’Institut de Veille Sanitaire (InVS) grâce, depuis 1998, à la déclaration obligatoire qui permet le suivi des tendances évolutives de la maladie en France, et par le Centre National de Référence (CNR) Listeria situé à l’Institut Pasteur qui centralise et caractérise toutes les souches de L. monocytogenes isolées chez l’Homme (CNR, 2015 ; InVS, 2015a). Ceci permet de distinguer les cas isolés des épidémies. De plus, les données cliniques et microbiologiques sont systématiquement complétées par une enquête alimentaire. Grâce à celle-ci, l’aliment incriminé est parfois identifié. Dans ce cas, l’InVS active alors la « Cellule Listeria » au sein de laquelle interviennent le CNR Listeria, le Département des Urgences Sanitaires de la Direction Générale

33 Synthèse bibliographique – Chapitre 1 de la Santé (DGS), la Mission des Urgences Sanitaires de la Direction Générale de l’Alimentation (DGAl), la Direction Générale de la Consommation, de la Concurrence, et de la Répression des Fraudes (DGCCRF) et l’Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail (Anses). La coordination de ces institutions permet alors la mise en œuvre des mesures nécessaires (inspections d’usines, prélèvements tout au long de la chaîne alimentaire, retrait ou rappel de lots contaminés, etc.) (InVS, 2015a).

D’après le rapport de Goulet et al. (2012) et les dernières données épidémiologiques de l’InVS (2015a), l’incidence annuelle de la listériose en France est relativement stable depuis 2007 : 5 cas par million d’habitants (Figure 1), soit environ 300 cas chaque année dont plus d’une cinquantaine de décès. Depuis 2013, une augmentation modérée de l’incidence par rapport aux incidences annuelles observées entre 1999 et 2012 est constatée (InVS, 2015a). L’incidence a tendance à augmenter avec l’âge de la population, principalement à partir de 60 ans (Goulet et al. , 2012 ; Rocourt, 1996). Reflet des habitudes de consommation de produits prêts à la consommation, il a été remarqué que les pays industrialisés sont les principaux pays concernés par la listériose dans le monde (Rocourt, 1996).

Figure 1 : Incidence annuelle de la listériose par million d’habitants en France de 1999 à 2014 (InVS, 2015a).

Compte tenu des progrès thérapeutiques et de l’allongement de l’espérance de vie, le nombre de personnes vivant avec des défenses immunitaires affaiblies risque d’augmenter notablement dans les prochaines décennies. Pour éviter une remontée de l’incidence de la listériose, voire inverser la tendance, il est donc important non seulement de maintenir et renforcer la maîtrise

34 Synthèse bibliographique – Chapitre 1 de ce pathogène dans la chaîne alimentaire mais également de promouvoir auprès des personnes les plus vulnérables les recommandations hygiéno-diététiques diffusées par le ministère chargé de la Santé (Goulet et al. , 2012).

Synthèse bibliographique – Chapitre 2

CHAPITRE 2 : Présence de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires

1. Formation de biofilms sur les surfaces

1.1. Définition

Les micro-organismes ont la capacité d’adhérer sur les surfaces biotiques et abiotiques et de s’y multiplier. S’ils ne sont pas éliminés et que les conditions sont propices, ces cellules peuvent alors former un biofilm.

Plusieurs définitions du terme « biofilm » existent dans la littérature. Dans le cadre des travaux présentés dans ce manuscrit, la définition retenue est celle de Characklis (1989) selon laquelle un biofilm est considéré comme une communauté de micro-organismes adhérents à une surface, parfois incluse dans une matrice de polymères extracellulaires organiques d’origine microbienne.

1.2. Processus de formation de biofilms

La formation d’un biofilm est un processus naturel et dynamique qui suit différentes étapes (Carpentier et Cerf, 1993 ; Donlan, 2002 ; Jefferson, 2004) (Figure 2) : - le conditionnement de la surface, - le transport des bactéries vers la surface, - l’adhésion des bactéries, - la maturation du biofilm avec éventuellement la formation de micro-colonies voire d’un biofilm de plusieurs couches piégées dans une matrice de polymères extracellulaires, - le détachement des cellules.

37 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

Figure 2 : Schématisation de la formation d’un biofilm bactérien (Bryers et Ratner, 2004).

1.2.1. Le conditionnement de la surface

Dès lors qu’une surface est en contact avec un milieu aqueux ou une denrée alimentaire, des ions et des macromolécules vont spontanément s’y adsorber. C’est la formation du film conditionnant qui entraîne la modification des propriétés physico-chimiques du support (caractère hydrophile ou hydrophobe, rugosité, etc.). L’encrassement de la surface par la matière organique constitue une source de nutriments favorisant la chimiotaxie et la croissance des bactéries sur la surface.

1.2.2. Le transport des bactéries vers la surface

Tout comme les souillures, les micro-organismes sont en contact permanent avec les surfaces. Dans les ateliers agro-alimentaires, les cellules peuvent se déposer sur les surfaces lors d’un événement de contamination ou par un processus continu, autrement dit par l’apport permanent par la matière première contaminée (Verran et Whitehead, 2006).

L’approche des bactéries vers la surface peut être active ou passive. Le transport actif se fait grâce à la mobilité bactérienne alors que le transport passif dépend du milieu aqueux environnant (viscosité, écoulement des fluides, etc.).

38 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

1.2.3. L’adhésion des cellules au support

L’adhésion des cellules à un support fait intervenir les forces de Van der Waals, les forces électrostatiques, les interactions acido-basiques mais aussi des interactions spécifiques entre le support et les cellules grâce aux pili , aux adhésines ou aux exopolysaccharides (Carpentier et Cerf, 1993 ; Marshall et al. , 1971).

L. monocytogenes est capable d’adhérer à de nombreux supports présents dans les ateliers agro- alimentaires dont l’acier inoxydable, le polyuréthane, le marbre et le silicone qui ne sont que quelques exemples (Beresford et al. , 2001 ; Pereira da Silva et Pereira De Martinis, 2013 ; Silva et al. , 2008 ; Verran et al. , 2008). Sur une même surface, les forces d’adhésion de L. monocytogenes sont plus importantes que celles d’autres bactéries dont Staphylococcus sciuri , Pseudomonas putida ou Comamonas sp. (Midelet et Carpentier, 2002). Ceci peut contribuer à expliquer les difficultés rencontrées dans les environnements agro-alimentaires pour éliminer cette bactérie pathogène.

1.2.4. La maturation du biofilm

Après l’adhésion, si les conditions propices à la croissance bactérienne sont réunies, les cellules liées à la surface peuvent se développer et former des micro-colonies. Dans certains cas, les micro-organismes continuent à se multiplier jusqu’à former une structure tridimensionnelle constituée de plusieurs couches cellulaires (Guilbaud et al. , 2015). L’augmentation de la masse microbienne et le développement de l’architecture du biofilm sont accompagnés par la production d’une matrice extracellulaire adhésive et protectrice, y compris chez L. monocytogenes (Borucki et al. , 2003 ; Colagiorgi et al. , 2016).

La composition de cette matrice est fonction du milieu dans lequel se développe le biofilm et du patrimoine génétique des micro-organismes qui le constituent. La matrice extracellulaire est majoritairement constituée d’eau mais elle contient également des nutriments, des métabolites, des produits de la lyse cellulaire et des exopolymères. Ces derniers, également appelés EPS, regroupent entre autres des polysaccharides extracellulaires (exopolysaccharides) qui sont des acides téichoïques chez L. monocytogenes (Brauge et al. , 2015), des protéines et des acides nucléiques (Colagiorgi et al. , 2016 ; Combrouse et al. , 2013 ; Guilbaud et al. , 2015).

39 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

1.2.5. Le détachement et la propagation des bactéries

Un biofilm est un système dynamique qui résulte de l’équilibre entre l’adhésion des cellules et leur détachement et dont la périodicité varie d’une souche à l’autre (Folsom et al. , 2006). Les cellules se détachent et sont transférées vers d’autres surfaces qu’elles peuvent alors coloniser.

Lorsque la dispersion est provoquée par les forces que le milieu environnant exerce sur le biofilm (forces mécaniques ou forces chimiques lors des opérations d’hygiène par exemple), elle est qualifiée de passive. Cependant, la dispersion des cellules peut également être considérée comme active. Dans ce cas, elle est initiée par les cellules selon un processus hautement régulé, notamment via le quorum sensing (Solano et al. , 2014). La dispersion est en effet un phénomène important dans la colonisation d’environnements et donc pour la survie de l’espèce (Solano et al. , 2014 ; Wood et al. , 2011).

1.3. Les facteurs impliqués dans la formation de biofilms

La formation des biofilms est impactée par des facteurs intrinsèques relatifs aux propriétés cellulaires, mais est aussi sous l’influence de facteurs extrinsèques relatifs à l’environnement dans lequel se développent les cellules.

1.3.1. Les facteurs intrinsèques

• La souche bactérienne

Les souches de L. monocytogenes diffèrent dans leur capacité à adhérer aux surfaces et à former des biofilms. Mais les données de la littérature restent actuellement très contradictoires quant à une éventuelle relation entre le sérotype et la capacité à adhérer. Selon Norwood et Gilmour (1999) et Lundén et al. (2000), les souches de L. monocytogenes du sérotype 1/2c adhérent en plus grande quantité que celles des sérotypes 4b, 1/2a et 1/2b. Mais pour Borucki et al. (2003) et Djordjevic et al. (2002), la corrélation se fait plutôt au niveau de la lignée des souches, celles de la lignée II (regroupant les sérotypes 1/2a et 1/2c) formant moins de biofilms que celles de la lignée I (regroupant les sérotypes 1/2b et 4b). Récemment, ce résultat a été contredit par Combrouse et al. (2013). De plus, les études de Kalmokoff et al. (2001) et de Folsom et al. (2006) renforcent l’hypothèse qu’il n’y a pas de corrélation évidente entre la quantité de cellules adhérentes à la surface et le sérotype, ni l’origine de la souche. Enfin, aucune corrélation n’a été trouvée entre l’architecture des biofilms et l’origine des souches (Guilbaud et al. , 2015).

40 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

La difficulté à établir nettement une relation entre les caractéristiques d’une souche et sa capacité à se développer sous forme de biofilms est probablement due aux multiples approches utilisées pour répondre à cette problématique. En effet, l’interprétation des résultats de quantification des biofilms est dépendante des conditions de croissance (milieu de culture, température, etc.), de la viabilité des cellules et des méthodes de préparation et de détection des biofilms (Combrouse et al. , 2013).

• La surface des cellules

D’après Donlan (2002), l’hydrophobicité de la surface cellulaire, la présence de flagelles et de pili ainsi que la production d’exopolysaccharides influencent la vitesse et le degré d’attachement des cellules. Les flagelles participent à la formation des biofilms de L. monocytogenes , jouant un rôle important dans l’adhésion initiale des cellules sur la surface et la formation du biofilm (Lemon et al. , 2007). Plus récemment, il a été montré que l’absence de flagelles n’empêchait pas la formation de biofilms. Il en résulte cependant des biofilms à l’architecture désordonnée suggérant que les flagelles interviennent dans l’adhésion des cellules à la surface mais également dans l’architecture des biofilms (Guilbaud et al. , 2015).

• Le quorum sensing

Le quorum sensing consiste en la sécrétion de signaux dont les concentrations sont dépendantes de la densité cellulaire, de la détection de ces signaux moléculaires par les cellules et enfin de la coordination de l’expression des gènes en réponse à ces signaux : l’objectif étant de moduler les activités collectives de la population pour répondre à des conditions environnementales données (Jayaraman et Wood, 2008). Le rôle du quorum sensing dans la formation de biofilms chez de nombreuses espèces bactériennes n’est plus à démontrer (Annous et al. , 2009 ; Davies et al. , 1998). Les systèmes de communication cellule-cellule font intervenir des molécules extracellulaires appelées « autoinducteurs ». La production de l’autoinducteur 2 et les voies de signalisation médiées par des peptides, dont le système agr , font partie de ces systèmes de communication au sein d’une population bactérienne à Gram positif.

Peu d’éléments sont connus concernant le lien entre le quorum sensing et la formation des biofilms chez L. monocytogenes (Gandhi et Chikindas, 2007). Cependant, L. monocytogenes possède un système de régulation agr comportant quatre gènes ( agrA , agrB , agrC et agrD ) regroupés dans l’opéron agr . Rieu et al. (2007) ont montré que l’adhésion des cellules et la formation des biofilms étaient perturbées après la délétion des gènes agrA et agrD .

41 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

1.3.2. Les facteurs extrinsèques

• La présence de matières organiques et inorganiques et la composition du milieu environnant

Outre les micro-organismes, la matière organique et les résidus inorganiques peuvent également se fixer aux surfaces ; ceci correspond à la formation d’un film conditionnant dont l’influence sur l’adhésion des cellules est plutôt controversée.

Il semblerait que la distribution des souillures sur une surface et leur effet sur l’adhésion et la répartition spatiale des cellules soient relatifs au type de souillure (Whitehead et al. , 2010). Certaines, comme le jus de poisson et le lactose, favorisent plus que d’autres (exsudat de viande, cholestérol et souillure fromagère par exemple) la rétention de cellules sur les surfaces (Whitehead et al. , 2010). Les souillures alimentaires peuvent réduire jusqu’à dix fois l’adhésion de cellules de L. monocytogenes sur l’acier inoxydable (Bernbom et al. , 2009 ; Chasseignaux et al. , 2002). L’albumine de sérum bovin est moins favorable à l’adhésion de L. monocytogenes sur les surfaces en silice que les protéines de lait (Al-Makhlafi et al. , 1994). Barnes et al. (1999) ont, quant à eux, démontré que la présence de lait écrémé ou de protéines de lait (caséine et lactalbumine) sur des surfaces en acier inoxydable engendre une réduction du nombre de cellules adhérentes de plusieurs micro-organismes dont L. monocytogenes . De plus, une souillure n’a pas toujours le même effet sur tous les micro-organismes (Hood et Zottola, 1997), rendant l’impact de cette souillure sur l’adhésion microbienne difficile à établir et à généraliser.

D’après des études réalisées en laboratoire, il s’avère que la composition du milieu et la disponibilité des nutriments ont également un impact sur la capacité des micro-organismes à adhérer à l’acier inoxydable (Folsom et al. , 2006 ; Hood et Zottola, 1997). Quant à Lacoste- Armynot et al. (1995), ils ont montré que la quantité de cellules adhérentes sur le téflon est nettement supérieure en présence de milieux synthétiques (milieu « biofilm-glucose » et milieu Whelshimer modifié) qu’en présence de souillures alimentaires (suspensions de lait, de jambon ou de carotte). La concentration en sel du milieu joue également un rôle sur l’adhésion des cellules qui sont plus adhérentes dans un milieu contenant 9,5% de NaCl que dans un milieu n’en contenant que 0,5% (Belessi et al. , 2011). Ceci indique que le taux d’attachement augmente avec la force ionique du milieu. De plus, la présence de trypsine, une endoprotéase, dans le milieu de culture testé par Smoot et Pierson (1998), engendre une réduction de 99,9% de la population microbienne adhérente sur les surfaces en acier inoxydable ou en caoutchouc

42 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

Buna-N. Ceci renforce l’hypothèse que les protéines présentes dans le milieu jouent un rôle dans le processus d’attachement de L. monocytogenes sur les surfaces.

Enfin, le milieu dans lequel se développe les cellules adhérentes impacte la composition et la quantité de substances polymériques extracellulaires produites, et donc l’adhésion des populations de L. monocytogenes (Else et al. , 2003 ; Lacoste-Armynot et al. , 1995).

• Les paramètres physiques de l’environnement : la température, le pH et le taux d’humidité

L’influence du milieu environnant sur l’adhésion des cellules et la formation de biofilms n’est plus à démontrer (Carpentier et Cerf, 1993 ; Donlan, 2002).

La température est aussi un des paramètres qui peut influencer l’adhésion des cellules de L. monocytogenes aux surfaces. Belessi et al. (2011) ont observé une plus grande quantité de cellules adhérentes sur les surfaces en acier inoxydable à 20°C qu’à 5°C, et ce probablement du fait d’une meilleure croissance et d’une augmentation de la production de flagelles favorisant la colonisation des surfaces. D’après Smoot et Pierson (1998), il s’avère que les cellules adhérentes sur des surfaces en acier inoxydable ou en caoutchouc Buna-N sont plus nombreuses quand la température augmente de 10°C à 45°C.

Tout comme la température, le pH peut également impacter significativement la quantité de cellules sessiles. En faisant varier le pH du milieu de culture de 4 à 9, Smoot et Pierson (1998) ont démontré que la quantité de cellules adhérentes de L. monocytogenes était plus faible dans les conditions alcalines.

De plus, d’après Else et al. (2003), la diminution du pourcentage d’humidité relative (% HR) entrave la formation des biofilms de L. monocytogenes sur des surfaces en nickel, en acier inoxydable et en titane.

• Les interactions entre les micro-organismes

Dans les industries agro-alimentaires, les biofilms sont généralement composés de plusieurs genres bactériens favorisant les interactions entre les micro-organismes (Burmølle et

43 Synthèse bibliographique – Chapitre 2 al. , 2014). La croissance de L. monocytogenes et son adhésion sur les surfaces peuvent être favorisées ou, au contraire, diminuées par la présence d’autres bactéries (Alavi et Hansen, 2013 ; Carpentier et Chassaing, 2004). Guðbjörnsdóttir et al. (2005) ont mis en évidence que la colonisation des surfaces en acier inoxydable par L. monocytogenes est favorisée par la présence de souches de plusieurs espèces de Pseudomonas . En revanche, la souche de Staphylococcus sciuri utilisée dans l’étude de Leriche et Carpentier (2000) réduit l’adhésion de L. monocytogenes et ce, probablement à cause d’une compétition pour les nutriments et des propriétés anti-adhésives de S. sciuri .

1.4. Les propriétés particulières des cellules adhérentes

Les cellules sessiles ont une meilleure résistance aux opérations de nettoyage & désinfection (N&D) que les cellules planctoniques (Cruz et Fletcher, 2012 ; Kim et al. , 2007 ; Nakamura et al. , 2013 ; Ronner et Wong, 1993). Eginton et al. (1998) précisent que les bactéries formant des biofilms sont moins sensibles aux biocides que les cellules planctoniques mais que leur attachement aux surfaces est tout de même affaibli par ces traitements. Cette différence de résistance aux opérations d’hygiène est probablement expliquée par la présence de la matrice extracellulaire qui protège les cellules vis-à-vis des stress. D’après Pan et al. (2006), la résistance aux traitements chimiques des cellules formant des biofilms est liée à la présence de substances polymères extracellulaires plutôt qu’aux propriétés intrinsèques des cellules. De plus, il a aussi été montré que la présence de ces composés extracellulaires a un effet protecteur des cellules vis-à-vis du séchage (Hingston et al. , 2013 ; Nocker et al. , 2012).

2. Moyens de lutte contre l’implantation de biofilms dans les ateliers agro- alimentaires

Les industries agro-alimentaires sont des environnements propices au développement des biofilms et ce, quels que soient les produits alimentaires qui y sont fabriqués (Srey et al. , 2013). Les biofilms dits positifs, c’est-à-dire les biofilms d’intérêt biotechnologique ainsi que ceux qui sont bénéfiques pour leur environnement, sont à préserver. A contrario , il est indispensable de lutter contre le développement des biofilms dits négatifs. En effet, le risque de contamination de produits alimentaires engendrée par le détachement de bactéries des surfaces est un problème de santé publique évident, d’où l’intérêt croissant porté à la lutte contre l’installation de populations sessiles dans les environnements agro-alimentaires. La réglementation européenne (Paquet Hygiène, les normes ISO 22000) recommande d’adopter

44 Synthèse bibliographique – Chapitre 2 de bonnes pratiques d’hygiène dont fait partie l’application rigoureuse d’opérations de N&D (CE, 2005 ; Garry, 2011).

2.1. Les procédures de nettoyage & désinfection

Des opérations d’hygiène sont réalisées au moins quotidiennement dans les ateliers agro- alimentaires après la production, soit en interne soit en sous-traitance, par des personnels obligatoirement formés pour cette mission. Une opération de N&D se déroule en plusieurs étapes successives (Beauclair et al. , 2011) : - le rangement de l’atelier et la protection des appareils fragiles, - le pré-nettoyage pour éliminer les plus gros résidus alimentaires faiblement accrochés aux surfaces, - le nettoyage dont l’objectif est d’éliminer les souillures plus difficiles à décrocher, - le rinçage intermédiaire visant à évacuer les souillures décrochées par les produits détergents, - la désinfection dans le but d’éliminer les micro-organismes, - le rinçage final pour enlever les produits désinfectants (étape obligatoire pour les surfaces en contact avec les produits alimentaires), - le séchage.

Dans certains cas, les étapes de nettoyage et de désinfection peuvent être combinées et ont lieu simultanément sans rinçage intermédiaire. L’intérêt du gain de temps engendré et de la réduction des coûts est souvent minimisé par le fait que la désinfection est souvent moins efficace lors de cette combinaison.

Les surfaces ouvertes sont généralement accessibles aux interventions humaines, notamment pour l’application des actions mécaniques lors du nettoyage. Quant aux surfaces fermées qui ne sont pas accessibles, elles doivent subir une procédure dite de nettoyage en place (NEP). Sans être démontés, les tuyaux, les vannes, les pompes et les cuves sont nettoyés et désinfectés par circulation d’eau et de différents produits de N&D selon des cycles déterminés. L’action mécanique est dans ce cas exercée par les forces de cisaillement dues aux mouvements des liquides (Amgar et al. , 1998). Les petits équipements (couteaux, planches à découper, etc.) peuvent, quant à eux, être nettoyés et désinfectés par trempage. Tout comme pour le NEP, cette méthode d’application des produits de N&D assure le recouvrement complet des surfaces par immersion (Holah et al. , 2002).

45 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

2.1.1. Le nettoyage

Selon la norme NF EN ISO 862 (Anonyme, 1995), le nettoyage, également appelé détergence, est l’étape qui consiste à détacher les salissures de leur substrat pour les mettre en solution et permettre leur dispersion.

Afin de rendre les surfaces visuellement propres, cette étape fait intervenir des procédés mécaniques et/ou chimiques : racler les grosses salissures, humidifier les surfaces pour ramollir les souillures, brosser les surfaces, décoller les souillures avec des jets (basse, moyenne ou haute pression) et appliquer un ou plusieurs détergents. La réalisation minutieuse du nettoyage a pour principal objectif de renforcer l’action du désinfectant qui est appliqué dans un second temps en lui permettant de pénétrer plus facilement jusqu’aux micro-organismes pour exercer son effet (Li et al. , 2014b). Jessen et Lammert (2003) soulignent la nécessité des actions mécaniques en couplage aux actions chimiques : frotter pendant le nettoyage est plus efficace que de ne pas frotter puis de compenser en prolongeant l’étape de désinfection.

Les détergents sont les produits utilisés pour le nettoyage. Ils contiennent des agents tensioactifs destinés à favoriser l’élimination par l’eau de souillures non solubles dans l’eau pure. Le détergent idéal devrait réunir les caractéristiques suivantes (Jaudon et al. , 2000) : - propriété de mouillage des surfaces et des souillures : les agents tensioactifs entrent en contact avec les souillures et les décollent en supprimant les forces d’adhésion qui les retiennent au support, - propriété de dispersion des particules dans l’eau en les maintenant en suspension pour éviter la floculation, - propriété émulsifiante : les souillures grasses insolubles dans l’eau sont éliminées par la création d’une émulsion avec l’eau et la solution de nettoyage, - propriété de rinçage et de drainage, - pouvoir corrosif réduit, - dangerosité limitée voire nulle pour les manipulateurs.

Or, aucun détergent ne possède toutes ces propriétés. Pour s’assurer d’un nettoyage optimal, il faut donc choisir efficacement le produit détergent parmi la grande variété de produits existants notamment en tenant compte de la nature des souillures présentes dans les ateliers (Jaudon et al., 2000 ; Leveau et Bouix, 1999) (Tableau 3).

• Les détergents alcalins et alcalins chlorés

46 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

Un détergent alcalin est un produit dont le pH, à la dilution d’emploi, est supérieur ou égal à 8,2 (Amgar et al. , 1998). Les substances les plus utilisées sont des bases telles que la soude, la potasse caustique et les alcanolamines, et des sels minéraux alcalins comme les carbonates, les silicates, les phosphates alcalins et les polyphosphates. Ces produits sont actifs sur les souillures organiques en permettant l’émulsification des matières grasses et la solubilisation des protéines en les hydrolysant. Les alcalins chlorés permettent en plus l’élimination des matières colorées comme les tanins ou le sang séché.

• Les détergents acides

L’utilisation de ces produits est à privilégier lorsque les souillures sont majoritairement minérales (tartres, galatithe, etc.). Dans la pratique, les principaux acides utilisés sont les acides phosphorique, nitrique, citrique, lactique, hydroxyacétique et sulfamique. Sachant que le dépôt de tartre inclut généralement de la matière organique, il est nécessaire d’ajouter dans la formulation du détergent acide d’autres composés pour éliminer la totalité de la souillure. Par contre, les détergents acides ont l’inconvénient d’être corrosifs pour les surfaces métalliques.

• Les détergents neutres

Les détergents neutres sont une famille de produits composés essentiellement d’agents tensioactifs et d’agents anti-précipitants. L’objectif principal de leur utilisation est de renforcer l’action des détergents alcalins et acides.

Les agents tensioactifs peuvent être classés en quatre catégories : - les tensioactifs anioniques (le plus souvent sous forme de sulfates ou de sulfonates) qui produisent une grande quantité de mousse, - les tensioactifs non ioniques qui bénéficient d’une grande stabilité en eau dure pour une large gamme de pH, - les tensioactifs cationiques (essentiellement de la famille des ammoniums quaternaires) qui sont de moins bons détergents mais qui ont une activité bactéricide, - les tensioactifs amphotères qui aident à prévenir les dépôts de matière minérale et présentent des propriétés antibactériennes.

Des agents anti-précipitants sont ajoutés aux produits de nettoyage pour prévenir la précipitation des sels présents dans l’eau et donc la formation de tartre. Ces substances sont réparties en deux classes :

47 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

- les dispersants, composés inorganiques, qui sont de bons émulsifiants, dissolvants ou dispersants y compris à faible concentration, - les séquestrants, également appelés chélatants, qui sont des composés organiques dont l’éthylène diamine tétra-acétate (EDTA) est un exemple bien connu.

• Les détergents enzymatiques

En complément des détergents chimiques, des détergents enzymatiques sont disponibles sur le marché. Leur efficacité est comparable à celle des détergents chimiques. Les détergents enzymatiques augmentent l’efficacité de la désinfection en permettant un meilleur accès des désinfectants aux cibles bactériennes enveloppées dans les biofilms et participent également au décollement des germes des surfaces. Pour faire face à la nature complexe des souillures, les produits enzymatiques sont généralement composés d’un cocktail d’enzymes (lipases, protéases, etc.) (Simões et al. , 2010). Actifs à faible dose et à pH neutre, ces produits ne sont pas corrosifs et présentent un impact environnemental réduit de par leur biodégradabilité. En revanche, ils sont plus coûteux que les détergents conventionnels et se conservent moins longtemps. Il faut également préciser que les enzymes ne sont pas efficaces sur les souillures minérales et colorées.

48 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

Tableau 3 : Propriétés principales, avantages et inconvénients des principales catégories de produits détergents

Produits détergents Propriétés principales Avantages Inconvénients Détergents alcalins Emulsification des matières grasses Stables, résistants aux températures Corrosifs sur les matériaux légers et alcalins chlorés Solubilisation des protéines Insensibles aux eaux dures (aluminium et alliages) Elimination des matières colorées Facilement rinçables Détergents acides Dissolution des souillures minérales Corrosifs sur les surfaces métalliques (pouvoir détartrant et désincrustant) A coupler avec d’autres détergents pour éliminer la totalité des souillures Détergents neutres Renforcement de l’action des détergents Tensio-actifs acides et alcalins Anti-précipitants Produits Amélioration de la destruction des Actifs à faible dose Coûts plus élevés que les détergents enzymatiques biofilms lors du nettoyage par une action Non corrosifs conventionnels positive des enzymes sur le décollement Respect strict de la température, du pH des germes adhérents Diminution du colmatage et de l’engorgement des siphons et canalisations et du temps d’application Amélioration du processus de purification Peu efficaces sur les souillures sèches, des affluents cuites et très adhérentes Biodégradabilité totale Aucune efficacité sur les souillures minérales

49 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

2.1.2. La désinfection

Selon la norme EN T72-101 (Anonyme, 1981), la désinfection est une opération permettant d'éliminer ou de tuer les micro-organismes et/ou d'inactiver les virus indésirables portés par des milieux inertes (sols et autres surfaces) contaminés en fonction des objectifs fixés. Le résultat de cette opération est limité aux micro-organismes présents au moment de l’application des produits désinfectants qui contiennent au moins un principe actif doté de propriétés antimicrobiennes. Les composés désinfectants ne tuent pas forcément les cellules mais participent a minima à leur décrochement des surfaces.

Les critères fondamentaux d’un bon désinfectant sont (Jaudon et al. , 2000 ; Simões et al. , 2010) : - un large spectre d’activité, - une utilisation à faible concentration, - une action durable, - un rinçage facile pour ne laisser aucun résidu toxique sur les surfaces, - une dangerosité limitée voire nulle pour les manipulateurs.

Tout comme les détergents, la gamme de produits désinfectants est très variée. Les principaux produits de désinfection utilisables dans les industries agro-alimentaires sont décrits ci-après (Amgar et al. , 1998 ; Jaudon et al. , 2000 ; Leveau et Bouix, 1999 ; McDonnell et Russell, 1999) (Tableau 4).

• Les halogènes : produits chlorés et produits iodés

La famille des désinfectants halogènes regroupe des produits chlorés et des produits iodés.

Parmi les produits chlorés, l’hypochlorite de sodium, plus communément appelé eau de Javel, est le plus connu. Les produits chlorés agissent aussi bien sur les micro-organismes par l’oxydation des structures protéiques de la membrane cellulaire, que sur les spores en agissant sur leur tunique. Ces produits ont donc un large spectre d’activité, sont actifs rapidement et ont également l’avantage d’être peu coûteux. En revanche, ce sont des produits corrosifs à dose élevée et en milieu acide. En outre, ils sont très instables à la chaleur et à la lumière. Les émanations gazeuses dégagées lors de leur utilisation sont dangereuses pour les muqueuses respiratoires des manipulateurs.

50 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

Les produits iodés présentent un large spectre d’activité, et ce à faible dose, en agissant par oxydation sur les protéines enzymatiques et structurales. Malgré leur faible toxicité, leur utilisation est actuellement très limitée en France. De nombreux inconvénients liés à leur usage sont répertoriés comme le coût élevé, l’instabilité à la chaleur, la corrosion des matériaux, le rinçage difficile et la coloration jaunâtre des surfaces.

• Les ammoniums quaternaires

Stables et non-corrosifs à pH neutre, ces molécules cationiques agissent en perturbant la perméabilité de la paroi cellulaire et interagissent également avec des cibles intracellulaires dont l’ADN (Gerba, 2015). Les composés d’ammoniums quaternaires (QAC) sont particulièrement utilisés pour la détergence et la désinfection des surfaces ouvertes du fait de leur aptitude à mousser. En revanche, ils présentent plusieurs inconvénients dont un coût plus élevé que les produits chlorés, une activité sporicide et une activité virucide très faibles et des difficultés pour les rincer. De plus, de nombreuses souches tolérantes à cette famille de produits ont été isolées dans les ateliers agro-alimentaires (Aase et al. , 2000 ; Lundén et al. , 2003a ; Mereghetti et al. , 2000).

• Les oxydes et peroxydes

Ce sont des molécules oxydantes dont le représentant majeur est l'acide peracétique. Leur action est similaire à celle des produits halogénés, ce qui leur confère un large spectre d’activité à faible concentration. Le mécanisme d’action de l’acide peracétique repose sur la perturbation des réactions vitales intracellulaires et membranaires par la rupture des liaisons intramoléculaires des enzymes et des composants membranaires. L’acide peracétique, obtenu par la combinaison d’acide acétique et de peroxyde d’hydrogène (H 2O2), se décompose en acide acétique et en oxygène ; son impact environnemental est donc réduit. Ce composé présente l’avantage d’être compatible avec de nombreux matériaux.

• Les aldéhydes

Parmi les aldéhydes, un des produits les plus connus est le formaldéhyde (monoaldéhyde) qui est de moins en moins utilisé dans les industries car il est cancérigène. Le glutaraldéhyde (dialdéhyde) également utilisé présente l’intérêt d’être beaucoup moins toxique et de ne pas être un agent chimique agressif vis-à-vis des matériaux couramment utilisés dans les ateliers. Le pouvoir désinfectant de ces composés est dû à leur réaction avec les protéines pariétales qui

51 Synthèse bibliographique – Chapitre 2 provoque l’imperméabilisation de la paroi. Le large spectre d’action (bactéricide, sporicide, fongicide et virucide) peut être renforcé par l’association avec un ammonium quaternaire.

• Les alcools

Les alcools, dont l’éthanol et l’isopropanol sont les principaux représentants, sont des désinfectants bactéricides utilisés sur les plans de travail. Les solutions alcooliques agissent sur les bactéries en dénaturant leurs protéines et en solubilisant les lipides. Un avantage est qu’elles sont auto-séchantes et permettent donc de garder les surfaces sèches. Leurs inconvénients résident dans le fait qu’il s’agit de produits inflammables dont le coût est élevé.

52 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

Tableau 4 : Avantages, inconvénients et spectre d’action des principales catégories de produits désinfectants

Produits désinfectants Avantages Inconvénients Spectre d’action

Produits Produits Action rapide Inactivés en présence de matières organiques Bactéricides halogénés chlorés Peu ou non moussants Solutions instables à chaud et à la lumière Virucides Peu coûteux Corrosifs à dose élevée et en milieux acides Activité sporicide discutée Rinçage facultatif Polluants (production de produits dérivés) Activité fongicide peu marquée Faible toxicité Production d’émanations gazeuses irritantes Faible mouillance Produits Actifs à faible dose et à basse Sensibles à la présence de matières organiques Bactéricides iodés température Coûteux Fongicides Faible toxicité Instabilité à la chaleur Peu efficaces sur les spores et Corrosifs les virus Rinçage difficile, laissant une coloration jaunâtre sur les surfaces Ammoniums Action détergente et désinfectante Action lente et inhibée par les matières organiques Bactéricides quaternaires Peu toxiques Plus coûteux que les produits chlorés Fongicides Peu coûteux Très moussant, rinçage difficile Peu efficaces sur les spores et Stables (pH, température) Adaptation de L. monocytogenes les virus Non corrosifs à pH neutre

53 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

Tableau 4 : Avantages, inconvénients et spectre d’action des principales catégories de produits désinfectants (suite)

Produits désinfectants Avantages Inconvénients Spectre d’action

Oxydes et peroxydes Actifs à faible dose et à basse Sensibles à la présence de matières organiques Bactéricides (acide peracétique température Vapeurs irritantes Sporicides principalement) Action rapide Conductivité insuffisante pour suivre et réguler la Fongicides Non moussants, bonne rinçabilité concentration de manière automatique en circuit Virucides Peu coûteux fermé Impact environnemental réduit Compatibles avec de nombreux matériaux Aldéhydes Insensibles à la présence de matières Action lente Bactéricides organiques Précipitation des protéines Sporicides Peu coûteux Odeur piquante Fongicides Non corrosifs Toxiques et allergisants Virucides Bonne rinçabilité Polluants Alcools Action rapide Précipitation des protéines Activité bactéricide modeste Peu toxiques Coûteux Non sporicides Non corrosifs Inflammables Activité fongicide négligeable Solutions auto-séchantes Toxiques et allergisants Polluants

54 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

2.2. Les méthodes alternatives

Dans une politique de développement durable et notamment au regard des préoccupations liées au respect de l’environnement, il est nécessaire de trouver des alternatives aux procédures de N&D actuelles en vue de réduire leur impact environnemental tout en préservant leur efficacité. Il s’agit notamment de mettre en place des solutions pour minimiser la consommation d’eau (Esnouf et al. , 2011 ; Ölmez et Kretzschmar, 2009) et pour réduire l’utilisation de produits chimiques.

Un des objectifs à atteindre est de réduire le recours aux produits chlorés. En effet, la formation de produits dérivés halogénés toxiques tels que les trihalométhanes a été constatée lorsque le chlore réagit avec la matière organique présente dans le milieu environnant (Hua et Reckhow, 2007). De plus, l’utilisation des produits comme les aldéhydes, les QAC et les composés chlorés n’est pas sans effet sur la santé humaine, certains opérateurs pouvant être sujets à des dermatoses et/ou des allergies (Crepy, 2001).

De nouvelles stratégies, dont certaines ont déjà des applications concrètes dans les environnements agro-alimentaires (Tableau 5), ont donc été envisagées pour réduire l’utilisation de produits chimiques tout en assurant la maîtrise de l’implantation des pathogènes sur les surfaces (Bridier et al. , 2015 ; Cappitelli et al. , 2014 ; Christieans, 2015 ; Fong et al. , 2004 ; Jayaraman et Wood, 2008 ; Simões et al. , 2010) : - utilisation de biocides générés sur site (l’eau ozonée et la vapeur sèche par exemple), - application de bactériophages, de molécules antagonistes du quorum sensing ou de composés antimicrobiens d’origine microbienne comme la nisine, - implantation de biofilms protecteurs, - utilisation de procédés physiques dont les ultra-violets (UV).

Certaines de ces techniques souvent prometteuses nécessitent encore des étapes de validation. Elles restent actuellement peu utilisées du fait du coût d’investissement parfois élevé, d’une réglementation encore floue et du manque de recul (Christieans, 2015 ; Fong et al. , 2004).

55 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

Tableau 5 : Méthodes alternatives à l’utilisation de produits conventionnels de N&D ayant des applications concrètes actuellement dans les ateliers agro-alimentaires

Méthodes Spectre Utilisations principales Propriétés/Actions Avantages Inconvénients alternatives d’action Eau Désinfection des Détergence (eau alcaline) Action rapide (15 secondes) Eau acide corrosive Bactéricide électrolysée aliments, des ustensiles Désinfection (eau acide) Pas de résidus toxiques sur les Précautions à prendre du fait des Fongicide et des surfaces Désodorisation surfaces émanations de chlore gazeux dans Sporicide Lavage des mains les chambres d’électrolyse (notamment des produits Inoffensive pour les manipulateurs Virucide de la mer) Economique Dissipation rapide de l’activité antimicrobienne Production en abondance rapide et facile Génération sur site Ozone, eau Traitement de l’air Oxydant puissant Production en abondance rapide et Très instable (demi-vie de Bactéricide ozonée Désinfection de agissant sur les facile 30 minutes), dissipation rapide de Fongicide membranes cellulaires l’activité antimicrobienne contenants et Pas de résidus toxiques sur les Virucide d’emballages de cuisson surfaces Demande d’autorisation Parasiticide Traitement des eaux de Décomposition en oxygène sans d’utilisation nécessaire rinçage laisser de produits dérivés Sécurité des opérateurs Traitement des surfaces Efficace à faible concentration et controversée (présence humaine des équipements avec pour des périodes de contact interdite lors du fonctionnement l’eau ozonée courtes, même à faible température du procédé) Elimination des odeurs Génération sur site Vapeur sèche N&D des outils et des Propriétés dissolvantes et Volume d’eau utilisée réduit de Coût d’investissement élevé Bactéricide saturée surfaces dégraissantes 90% Désinfection chimique Fongicide (110°C, haute Propriétés désinfectantes Risque chimique limité supplémentaire nécessaire dans la pression) (choc thermique) Gain de temps de 40% (N&D en filière viande (élimination des une seule étape) protéines coagulées) Séchage des surfaces accéléré Génération sur site

56 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

Tableau 5 : Méthodes alternatives à l’utilisation de produits conventionnels de N&D ayant des applications concrètes actuellement dans les ateliers agro-alimentaires (suite)

Méthodes Spectre Utilisations principales Propriétés/Actions Avantages Inconvénients alternatives d’action Photocatalyse Désinfection et Particules polluantes Plus écologique que la Coût ? Bactéricide (UV) purification de l’air adsorbées/oxydées à la fumigation Fongicide Utilisation seule ou surface du catalyseur Conception sur mesure pour tenir combinée avec la (dioxyde de titane) sous compte de l’environnement de filtration l’effet des UV chaque atelier Réduction de la consommation énergétique des installations (échangeurs thermiques plus nécessaires pour le prélèvement d’air extérieur) Génération sur site (pas de stockage) Plasma froid, Désinfection des Prive les cellules de leur Elimination des odeurs Procédé encore en cours Bactéricide gaz produits alimentaires hydrogène Action rapide et prolongée après d’expérimentation Fongicide électriquement (ex : légumes) l’arrêt de la source énergétique Coût ? Sporicide énergisé Désinfection de l’air Génération sur site (pas de Virucide stockage)

57 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

2.3. Une étape supplémentaire : le séchage des surfaces

Le séchage des surfaces permet un meilleur contrôle de la croissance bactérienne sur les surfaces. Sachant que l’eau est un élément essentiel à la croissance microbienne et à la formation de biofilms, l’étude de Fuster-Valls et al. (2008) confirme l’importance de sécher rapidement les surfaces après les étapes de fabrication et les opérations d’hygiène pour réduire 2 la prolifération des bactéries de 2 à 3,5 log 10 (cellules/cm ) sur les surfaces. Sécher les surfaces après l’opération de N&D est également fortement recommandé par Rückerl et al. (2014) pour faciliter l’éradication de L. monocytogenes . Bien connue dans le domaine de la préservation des aliments, la question de la dessiccation représente également un défi pour la désinfection des surfaces (Burgess et al. , 2016), d’autant que l’eau est omniprésente sur les surfaces dans les ateliers de production (Rückerl et al. , 2014).

En séchant les surfaces, les bactéries ayant survécu aux procédures de N&D subissent alors un stress hydrique qui provoque une mortalité cellulaire supplémentaire. Le recours aux fluctuations de l’humidité relative est un moyen efficace pour éviter l’implantation de L. monocytogenes sur les surfaces, les cellules subissant des contraintes mécaniques, structurales et oxydatives (variation du volume cellulaire, altération de la membrane plasmique, ralentissement et dysfonctionnement du métabolisme cellulaire) (Zoz et al. , 2016). Bang et al. (2014) ont également montré qu’il y avait un effet synergique du couplage du traitement chimique (dioxyde de chlore (ClO 2) à 200 μg/ml, 10 minutes) et du séchage (6 heures, 43% HR, 22°C).

Le séchage peut être mécanique par le raclage des sols et/ou utilisation de papier absorbant sur les équipements et les surfaces de travail. Les surfaces peuvent également être séchées par mise en contact avec un air sec déshumidifié grâce à un dessiccateur.

Dans certains ateliers, des procédures de nettoyage à sec sont désormais mises en place. Dans ce cas, les surfaces ne sont ni aspergées par les solutions détergentes et désinfectantes, ni rincées avec de l’eau mais les produits de N&D sont simplement pulvérisés sur les surfaces puis essuyés avec du papier absorbant.

2.4. Les paramètres influençant l’efficacité des opérations d’hygiène

Les prélèvements de surface sont indispensables pour permettre aux industriels de contrôler la contamination des équipements et des locaux afin d’évaluer et de valider les opérations d’hygiène appliquées pour l’élimination des micro-organismes (Garry, 2011). L’efficacité des

58 Synthèse bibliographique – Chapitre 2 procédures de N&D s’inscrit dans la volonté affirmée de minimiser la contamination environnementale qui est la source majeure de contamination post-process des produits alimentaires (Malley et al. , 2015). L’efficacité des opérations d’hygiène est d’ailleurs un point souvent abordé dans l’application de plans Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP) qui sont mis en place dans les ateliers pour cartographier, entre autres, les points problématiques concernés par la contamination par L. monocytogenes et donc mieux cibler les procédures de N&D (Rotariou et al. , 2014).

Dans les ateliers agro-alimentaires, les prélèvements de surface sont effectués selon la norme NF ISO 18593 (Anonyme, 2004). Plusieurs méthodes de prélèvements existent : ils peuvent être réalisés soit par frottis (écouvillonnage et chiffonnage), soit par contact avec des lames ou des boîtes gélosées (Anonyme, 2004 ; Garry, 2011). La méthode de prélèvement doit évidemment être adaptée à chaque situation de prélèvement ; à titre d’exemple, contrairement à une boîte contact, un écouvillon permet de prélever un échantillon dans une zone difficile d’accès.

2.4.1. Les pratiques

Impérativement réalisées par un personnel formé et rigoureux, les conditions d’application des produits (temps de contact, température, etc.) ont un grand impact sur le résultat (Pleitner et al. , 2014). Un moyen mnémotechnique consiste à se souvenir qu’il faut laver avec « TACT » (Amgar et al. , 1998) : - T comme « température » de l’eau : l’eau chaude optimise l’efficacité des détergents et participe à la dissolution des matières grasses, - A comme « action mécanique » : frotter, racler, brosser, etc., - C comme « concentration » des produits de N&D, - T comme « temps de contact » : la durée de l’action des produits doit être suffisamment importante.

Certains produits sont appliqués avec des canons à mousse, procédé qui a notamment pour avantage d’augmenter le temps de contact avec les surfaces (Corrégé et Cornou, 2002).

La concentration du produit et le temps d’application recommandé par le fournisseur doivent être scrupuleusement respectés. Si la concentration en principe actif est trop faible ou son temps d’application insuffisant, l’efficacité du traitement ne peut pas être garantie. De plus, exposer les cellules à des concentrations sublétales de principe actif engendre une adaptation des

59 Synthèse bibliographique – Chapitre 2 cellules (Ibusquiza et al. , 2012), et donc une perte d’efficacité des opérations de N&D sur le long terme.

Pour éviter un phénomène d’accoutumance par modifications génétiques de certains micro- organismes et donc préserver l’efficacité des produits, il est recommandé d’alterner régulièrement les produits désinfectants (Jaudon et al. , 2000). Par exemple, dans les ateliers de la filière viande, le programme de N&D consiste le plus généralement en quatre jours d’utilisation d’un détergent et d’un désinfectant alcalins puis d’un jour d’utilisation d’un détergent et d’un désinfectant acides (Jessen et Lammert, 2003).

2.4.2. La conception des locaux et des équipements

La conception hygiénique des ateliers et des équipements est un autre point indispensable pour assurer des procédures de N&D efficaces (Beauclair et al. , 2011). Le nombre d’endroits inaccessibles aux produits chimiques et aux actions mécaniques dans les ateliers est à réduire impérativement car ce sont des sites potentiels pour héberger des biofilms (Carpentier, 2005a). Certaines machines ou parties de machines sont également très difficiles à nettoyer et désinfecter, d’autant qu’elles ne sont pas toujours facilement démontables ou accessibles. Le NEP peut être mis en place mais son efficacité dépend de la conception des équipements (Amgar et al. , 1998).

2.4.3. Les matériaux de surface

Il est bien connu que l’efficacité des opérations d’hygiène dépend du matériau de la surface (Garry, 1994). L’inactivation des cellules adhérentes d’ Escherichia coli par un traitement avec un produit désinfectant varie significativement selon les types de surface (verre, polyéthylène, bois et acier inoxydable) car ces derniers ont des degrés de rugosité différents (Bang et al. , 2014 ; Chasseignaux et al. , 2002). Chaque aspérité du matériau représente une niche potentielle de rétention de souillures et/ou de micro-organismes. Visuellement lisse, l’acier inoxydable a pourtant une nettoyabilité différente selon sa finition (Boyd et al. , 2001 ; Leclercq-Perlat et Lalande, 1994).

Les surfaces ont en effet des statuts hygiéniques variables. Les surfaces les plus hygiéniques sont plutôt dures, inertes et faciles à nettoyer (acier inoxydable, verre, porcelaine, etc.) alors que les surfaces plus problématiques sont généralement tendres et flexibles (plastiques, caoutchouc, etc.) (Verran et al. , 2008). De plus, Beltarme et al. (2015) ont mis en évidence qu’un matériau usé, quel que soit son statut initial, est moins hygiénique qu’un matériau neuf.

60 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

Comme les sols ne sont pas en contact direct avec les aliments, certains considèrent que les matériaux qui les composent n’ont pas une importance primordiale pour obtenir la meilleure qualité microbiologique d’un produit alimentaire (Carpentier, 2005b). Seulement, la dispersion des micro-organismes sous forme d’aérosols lors de l’utilisation de jets à forte pression pour le rinçage des surfaces, dont les sols, après l’application des produits d’hygiène a bien été mise en évidence (Berrang et Frank, 2012 ; Gibson et al. , 1999). Un intérêt particulier doit donc être porté sur le choix des revêtements de sols, même si leur résistance au glissement, par l’augmentation de leur rugosité, apparaît comme difficilement compatible avec leur nettoyabilité (Carpentier, 2000).

2.4.4. Les souillures présentes sur les surfaces

Afin d’assurer une désinfection efficace, il est indispensable de porter un grand intérêt au nettoyage. Cette étape de la procédure de N&D est incontournable car la présence de matières organiques réduit très fortement l’efficacité des opérations d’hygiène (Lourenço et al. , 2009). La population de cellules de L. monocytogenes qui adhèrent sur acier inoxydable n’est pas réduite par la désinfection si celle-ci n’est pas précédée d’une phase de nettoyage des souillures (Gram et al. , 2007). De plus, l’efficacité des produits chlorés est plus affectée par la matière organique que celle d’autres produits tels que les QAC (Jaudon et al. , 2000 ; Lourenço et al. , 2009 ; Nyati et al. , 2012). Ceci est en accord avec Ruiz-Cruz et al. (2007) dont l’étude a permis de démontrer que la présence de matières organiques dans l’eau diminue significativement l’efficacité antibactérienne du chlore mais pas celle de l’acide peracétique. Enfin, le nettoyage des surfaces est clairement dépendant de la présence de souillures mais également de leur nature (Garry, 1994 ; Kuisma et al. , 2005). Il est donc important de choisir correctement le produit détergent pour optimiser l’efficacité de la phase de nettoyage.

La présence de souillures n’influence pas uniquement l’efficacité du nettoyage mais également celle de la désinfection. En effet, d’après Kim et al. (2007) ainsi que Li et al. (2014b), les bactéries sont protégées des produits désinfectants en présence de lait. D’autres auteurs ont remarqué que la présence de protéines sur les surfaces peut réduire l’efficacité des désinfectants en neutralisant les molécules actives comme le chlore et que la consommation du chlore libre augmente avec l’âge du biofilm (Leriche et Carpentier, 1995).

Enfin, la présence de souillures a également un effet protecteur sur des cellules de L. monocytogenes durant la dessiccation (Vogel et al. , 2010).

61 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

3. La persistance au sein des ateliers agro-alimentaires

3.1. La persistance de L. monocytogenes : une évidence

Malgré l’application des opérations d’hygiène et les nombreux contrôles de l’environnement de production, il a été remarqué que certaines souches de L. monocytogenes peuvent s’établir au sein des industries agro-alimentaires et y rester ainsi plusieurs mois, voire des années (Ferreira et al. , 2014 ; Tompkin, 2002).

3.1.1. Définition de la persistance et exemples de cas

En opposition aux souches dites sporadiques/présumées non persistantes/transitoires, les souches persistantes sont également appelées souches résidentes et souches permanentes (Carpentier et Cerf, 2011 ; Larsen et al. , 2014).

Une souche est considérée comme persistante lorsqu’elle est retrouvée dans plusieurs prélèvements durant un intervalle de temps donné malgré le respect des procédures de N&D (Carpentier et Cerf, 2011 ; Keto-Timonen et al. , 2007). La définition exacte d’une souche persistante varie d’une étude à l’autre. Par exemple, selon Lundén et al. (2003b), est considérée comme persistante une souche retrouvée au moins cinq fois sur une période de plus de trois mois. Leong et al. (2014) définissent qu’une souche est persistante quand elle est isolée plusieurs fois à six mois d’écart ou plus. Des auteurs considèrent qu’une souche est persistante dès lors qu’elle est isolée dans trois échantillons à des dates différentes (Latorre et al. , 2011 ; Wang et al. , 2015). La persistance de souches dans les ateliers reflète la durée du plan d’échantillonnage plutôt que le temps réel de la persistance. En réalité, les souches sont probablement présentes dans l’atelier avant et après la période des prélèvements : il se peut que la persistance soit plus longue (Holah et al. , 2002).

En outre, pour déclarer une souche comme étant persistante, il faut s’assurer qu’elle n’entre pas régulièrement dans l’atelier de production par l’intermédiaire des matières premières (Carpentier et Cerf, 2011 ; Lundén et al. , 2003b). Un véritable défi pour le contrôle des pathogènes persistants est d’ailleurs de différencier la vraie persistance de l’entrée répétée d’une souche donnée (Malley et al. , 2013).

De nombreuses études, récapitulées entre autres par Ferreira et al. (2014) et Møretrø et Langsrud (2004), ont permis de mettre en évidence la capacité de L. monocytogenes à persister dans les environnements de production de denrées alimentaires. Ces résultats ont été confirmés

62 Synthèse bibliographique – Chapitre 2 par d’autres auteurs, aussi bien par les techniques multi-locus sequence typing (MLST) et pulse- field gel electrophoresis (PFGE) (Rückerl et al. , 2014) que par le séquençage du génome complet des souches (Stasiewicz et al. , 2015). Quelques exemples de cas de persistance de L. monocytogenes sont récapitulés dans le Tableau 6. Ils reflètent bien le fait que le sérotype des souches persistantes est varié, tout comme la durée de la persistance et le type de produit fabriqué dans l’atelier incriminé (Tompkin, 2002).

Tableau 6 : Cas de persistance de L. monocytogenes au sein d’ateliers agro-alimentaires (Tompkin, 2002)

Durée de Cause de Produits Pays Sérotype résidence listériose Fromage 4 ans Suisse Oui 4b Fromage persillé 7 ans Suède Non 3b Fromage de chèvre 11 mois Royaume-Uni Oui 4b Poisson fumé 14 mois Finlande Non 1/2a et 4b Crème glacée 7 ans Finlande Non 1/2 Moules fumées 3 ans Nouvelle Zélande Oui 1/2 Langue de porc en Plusieurs mois France Oui 4b gelée

3.2. Plusieurs hypothèses pour expliquer la persistance

Dans la littérature, plusieurs hypothèses coexistent actuellement pour tenter d’expliquer la persistance bactérienne.

3.2.1. Des caractères génétiques spécifiques pour persister

Une des hypothèses suggère que les bactéries persistantes sont génétiquement distinctes des souches transitoires (Autio et al. , 2003 ; Holch et al. , 2013 ; Wulff et al. , 2006). Ces caractères génétiques spécifiques leur confèreraient des propriétés particulières telles une capacité accrue à adhérer sur un support pourtant visuellement propre ou une meilleure résistance aux agents nettoyants et désinfectants.

Basées sur cette hypothèse, de nombreuses études ont consisté en la recherche de la présence ou de l’absence de gènes particuliers ou de leurs expressions spécifiques pour expliquer la

63 Synthèse bibliographique – Chapitre 2 capacité à persister (Mazza et al. , 2015). D’après Autio et al. (2003) étudiant des génotypes par combinaison des résultats de typage obtenus par PFGE et amplified fragment length polymorphism (AFLP), 13 génotypes sur 15 des souches persistantes étudiées sont spécifiques aux souches persistantes et 94% des génotypes des souches sporadiques ne sont associés qu’à ces dernières. De plus, le typage moléculaire de souches persistantes a montré qu’elles appartenaient toutes à un même groupe génétique (Wulff et al. , 2006), correspondant au complexe clonal CC121 (Holch et al. , 2013). Ceci suggère que certains génotypes de L. monocytogenes sont plus aptes que d’autres à engendrer des contaminations persistantes.

Néanmoins, cette hypothèse est discutable dans le sens où des souches de L. monocytogenes ayant un type PFGE similaire ont été catégorisées comme persistantes dans un atelier agro- alimentaire mais non persistantes dans un autre, révélant ainsi la nature complexe de la contamination persistante (Lundén et al. , 2003b).

3.2.2. Des niches de rétention favorables à la persistance

Une autre hypothèse, notamment avancée par Carpentier et Cerf (2011), est qu’il n’existe pas de souches ayant des gènes spécifiques de la persistance mais que les micro-organismes ont des gènes leur conférant la capacité de s’adapter aux conditions environnementales et de persister dans l’environnement. Est alors évoquée la notion de niches qui les protègeraient et favoriseraient leur rétention dans les surfaces pas parfaitement lisses, notamment celles qui ne sont pas en contact avec les aliments (sols, égouts, etc.). Selon ces auteurs, la persistance résulte de la relation entre l’introduction de micro-organismes, leur capacité de survie, leur croissance et leur résistance à l’élimination.

Selon cette hypothèse, l’établissement de la persistance de L. monocytogenes dans un environnement spécifique est un événement stochastique plutôt qu’un phénomène expliqué par des caractéristiques génétiques et phénotypiques spécifiques d’une souche (Ferreira et al. , 2011). En effet, le sérotype des souches ne semble pas avoir d’influence sur la persistance (Lundén et al. , 2003b). De plus, il n’y a pas encore de profils génétiques robustes mis en évidence pour expliquer la persistance des souches et il est peu probable que des gènes individuels soient responsables de la persistance (Carpentier et Cerf, 2011 ; Ferreira et al. , 2014 ; Stasiewicz et al. , 2015). Enfin, aucun marqueur parmi les gènes étudiés ( pocR , eutJ et quaH ) et sélectionnés car pouvant avoir une implication potentielle dans la persistance, n’a été trouvé pour identifier clairement les souches persistantes de L. monocytogenes (Mazza et al. , 2015).

64 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

Les travaux soutenant cette hypothèse mettent en avant le fait que la conception hygiénique des ateliers de production et des équipements est un élément incontournable dans la lutte contre la persistance. Les zones difficiles à nettoyer, dont les canalisations, les sols et les rigoles d’évacuation d’eau, représentent des réservoirs de L. monocytogenes (Dzieciol et al. , 2016). Dans ces zones de rétention, s’accumulent également des résidus de matière organique et de l’eau, permettant aux bactéries de s’y établir et de s’y multiplier (Verghese et al. , 2011). De plus, ces micro-organismes sont ainsi protégés des actions mécaniques et chimiques des opérations d’hygiène. Ces niches protectrices sont donc des zones idéales pour la croissance microbienne et l’adaptation des cellules aux stress de l’environnement de l’atelier agro- alimentaire (Carpentier et Cerf, 2011 ; Dunsmore et al. , 1981).

Inspiré par Dunsmore et al. (1981), un modèle conceptuel de la persistance/non persistance d’une souche bactérienne a été proposé par Carpentier et Cerf (2011) (Figure 3).

La présence de cellules d’une souche spécifique dans une zone de rétention dépend de l’efficacité des étapes de N&D et de la quantité de cellules avant l’opération de N&D. En considérant que le nombre initial de cellules est suffisamment grand pour que quelques cellules survivent aux opérations d’hygiène quotidiennes et sachant que ces cellules ont la capacité de

65 Synthèse bibliographique – Chapitre 2 s’adapter aux stress, si les conditions (température, disponibilité des nutriments, pH, etc.) sont propices, la croissance bactérienne reprend entre deux opérations de N&D. La persistance a lieu si la réduction du nombre de cellules due aux opérations d’hygiène est plus faible que le nombre de cellules qui se multiplient entre deux opérations de N&D. A l’inverse, quand l’efficacité des opérations d’hygiène est supérieure à la croissance bactérienne, les cellules ne persistent pas. De telles situations ont été observées expérimentalement avec des souches de Pseudomonas fluorescens et Escherichia coli O157 : H7 (Marouani-Gadri et al. , 2010 ; Peneau et al. , 2007).

Une attention toute particulière doit être portée sur le choix du matériau des surfaces. Les trous de débullage formés durant la polymérisation des matériaux de surface sont des zones de rétention importantes (Mettler et Carpentier, 1999), comme le montrent les photos de la Figure 4 prises sur une surface de tapis convoyeur en polychlorure de vinyle (PVC) (Midelet, 2002). Les sols, pourtant nettoyés et désinfectés, sont également un réservoir important de bactéries au sein d’un atelier (Campdepadrós et al. , 2012).

3.3. De nombreuses études pour tenter d’expliquer et comprendre la persistance

Au cœur des préoccupations dans la lutte contre la contamination des ateliers et des produits alimentaires qui y sont fabriqués, la persistance de L. monocytogenes a fait l’objet de

66 Synthèse bibliographique – Chapitre 2 nombreuses études basées sur la comparaison des souches persistantes et des souches sporadiques pour mieux comprendre ce phénomène.

Une des premières interrogations porte sur un éventuel lien entre la persistance et la capacité à adhérer sur des surfaces. Des travaux ont mis en évidence que les souches de L. monocytogenes persistantes sont plus adhérentes que les souches sporadiques, que ce soit sur l’acier inoxydable (Borucki et al. , 2003 ; Norwood et Gilmour, 1999) ou dans des microplaques en PVC (Borucki et al. , 2003 ; Wang et al. , 2015). A l’inverse, Djordjevic et al. (2002) et Costa et al. (2016) n’ont pas relevé de différence significative entre les souches persistantes et les souches transitoires. Selon les travaux de Lundén et al. (2000), alors que les souches persistantes adhèrent jusqu’à 11 fois plus que les souches présumées non persistantes après un temps de contact d’une ou deux heure(s), la différence entre les deux types de souches n’est plus visible lorsque l’incubation des cellules en contact avec la surface dure 72 heures. En réalité, d’après les données de la littérature, le lien entre la capacité à adhérer et la persistance n’est pas clairement établi. Les différences de résultats constatées entre les études peuvent probablement être expliquées par l’utilisation de différentes méthodologies : différences entre les souches utilisées, les milieux de culture, les propriétés physico-chimiques des surfaces, etc. (Borucki et al. , 2003 ; Carpentier et Cerf, 2011).

Des études visent à élucider une relation potentielle entre la capacité à persister et celle à résister aux produits de N&D. La différence de sensibilité aux désinfectants entre les bactéries persistantes et les bactéries présumées non persistantes est controversée. Contrairement à certains auteurs (Aase et al. , 2000 ; Lundén et al. , 2003a), cette différence n’est pas été mise en évidence par d’autres (Costa et al. , 2016 ; Holah et al. , 2002 ; Kastbjerg et Gram, 2009 ; Lourenço et al. , 2009 ; Magalhães et al. , 2016 ; Wang et al. , 2015). Lourenço et al. (2009) soulignent qu’il est possible que des avantages compétitifs, autres que la résistance à des biocides, interviennent pour permettre à certains clones de L. monocytogenes de persister (utilisation de sources nutritives limitées, croissance rapide, etc.).

Enfin, notons qu’une des difficultés des études comparant les souches persistantes et celles présumées non persistantes est la classification des cellules dans ces deux catégories car une souche non encore déclarée comme persistante (car pas encore isolée plusieurs fois durant un intervalle de temps donné) peut tout de même devenir persistante par la suite (Ferreira et al. , 2014).

67 Synthèse bibliographique – Chapitre 2

3.4. Lutter contre la persistance : une nécessité

En plus d’avoir un impact important sur la santé publique, la contamination et la persistance de L. monocytogenes sont à l’origine de pertes économiques considérables (Thomas et al. , 2015). En effet, outre le manque à gagner dû à la destruction et au retrait de la vente des produits incriminés, les pertes liées à la détérioration de l’image de la marque des produits ne sont pas négligeables.

Comme le montrent les quelques exemples présentés dans le Tableau 6 (Tompkin, 2002) et le soulignent Wulff et al. (2006), les souches persistantes de L. monocytogenes exercent une pression continue de contamination sur les produits et peuvent être à l’origine de cas de listériose. En 2008, l’entreprise canadienne Maple Leaf Foods a été à l’origine de la production et mise sur le marché de produits carnés contaminés par L. monocytogenes . L’épidémie de listériose a alors entraîné la mort de 21 personnes et plus de 200 lots de produits ont fait l’objet d’un rappel. Après enquête, il a été établi que la source de la contamination était une trancheuse hébergeant des bactéries persistantes (Howell et Miller, 2010). Des cellules persistantes sur un tapis convoyeur de salades prêtes à la consommation ont également été responsables de 32 cas de listériose en Suisse en 2013 et 2014 (Stephan et al. , 2015).

Ces exemples illustrent le phénomène de contamination croisée au sein des ateliers agro- alimentaires, comme le rapportent également Reij et Den Aantrekker (2004). En d’autres termes, des micro-organismes qui persistent sur une surface peuvent être transférés par simple contact sur un produit alimentaire (Midelet et Carpentier, 2002). Et plus la population de bactéries qui adhérent aux surfaces est dense, plus la quantité de cellules transférées sur un aliment par contact est importante (Midelet et Carpentier, 2002). Le produit en question est alors contaminé, le risque étant accru lorsque cette recontamination a lieu après la cuisson d’un aliment prêt à la consommation. Le transfert d’une flore d’altération et la transmission de pathogènes après le process de fabrication engendrent un raccourcissement de la durée de vie des produits, cette contamination post-process peut atteindre un niveau très élevé au moment de la date limite de consommation des produits (Jorgensen et Huss, 1998).

Les contaminants peuvent également être transférés au sein d’un atelier, d’une ligne de production à une autre, par le personnel ou les équipements (couteaux, planches à découper, etc.) (Lundén et al. , 2003b). Il a aussi été rapporté qu’une souche persistante pouvait même être transférée d’un atelier à un autre (Fagerlund et al. , 2016), via le transfert de machines

68 Synthèse bibliographique – Chapitre 2 telle qu’une trancheuse par exemple (Lundén et al. , 2002). Par conséquent, une attention particulière doit être portée sur les équipements et les machines utilisés. Certains sont très difficiles à nettoyer et représentent donc des niches propices à la persistance de L. monocytogenes . Lundén et al. (2002) conseillent d’ailleurs de démonter régulièrement les appareils afin de nettoyer et désinfecter efficacement tous les recoins pour empêcher l’établissement des bactéries à l’intérieur et/ou éradiquer la persistance.

Synthèse bibliographique – Chapitre 3

CHAPITRE 3 : Adaptation de Listeria monocytogenes aux stress rencontrés dans les ateliers agro-alimentaires

1. L. monocytogenes : une bactérie aux nombreuses capacités d’adaptation

L’application de stress est une stratégie appliquée tout au long de la chaîne alimentaire pour réduire la contamination des ateliers et assurer la préservation des aliments (Wesche et al. , 2009). Pourtant, l’adaptation des bactéries à passer outre est désormais une évidence (Hill et al. , 2002). L’adaptation au stress repose sur le principe qu’une population, préalablement exposée à une situation stressante ou cultivée dans des conditions sub-optimales, devient plus résistante dans l’environnement stressant qu’une population non-stressée au préalable (Guillier, 2005).

C’est parce que les bactéries s’adaptent aux stress qu’elles peuvent persister (McDouglas et al. , 1998), ce qui les rend d’autant plus difficiles à éliminer dans les ateliers agro-alimentaires (Lundén et al. , 2002 ; Vogel et al. , 2010). Magalhães et al. (2016) ont d’ailleurs démontré que les souches persistantes s’adaptent mieux que les souches présumées non persistantes pour croître dans des conditions stressantes fréquemment rencontrées dans les environnements agro- alimentaires.

L. monocytogenes est capable de s’adapter à de très nombreux stress environnementaux et de croître dans des conditions défavorables pour coloniser de nombreuses niches écologiques (Gandhi et Chikindas, 2007). Comme évoqué précédemment (Synthèse bibliographique, Chapitre 1, Paragraphe 0, Page 30), ce pathogène a, entre autres, la capacité de se multiplier aux températures de réfrigération, à des concentrations élevées en sels, à un pH variant de 4,0

à 9,6 et à une a w allant jusqu’à 0,92. Cette bactérie peut aussi résister aux opérations d’hygiène (Aase et al. , 2000 ; Langsrud et al. , 2003) et s’adapter à la dessiccation (plus de 91 jours de séchage à 43% HR à 15°C sur acier inoxydable) (Vogel et al. , 2010). De plus, l’adaptation de L. monocytogenes à un stress sublétal peut ensuite la protéger d’un stress létal qu’il soit du même type ou autre (Koutsoumanis et al. , 2003 ; Lou et Yousef, 1997 ; Taormina et Beuchat, 2002 ; Walton et al. , 2008). Ses capacités de résistance et d’adaptation font de L. monocytogenes une bactérie parmi les agents pathogènes les plus surveillés dans les ateliers agro-alimentaires. Pour mieux lutter contre son implantation et sa multiplication tout au long de la chaîne de production, comprendre les mécanismes qu’elle met en place pour mieux s’adapter et donc persister est l’objet de nombreuses études.

71 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

2. Compréhension des mécanismes d’adaptation aux stress

Une des problématiques scientifiques est l’identification et la compréhension des mécanismes qui contrôlent le ou les changements qui permettent aux bactéries de s’adapter aux stress (Abee et al. , 2016 ; Boor, 2006 ; Soni et al. , 2011).

2.1. Plusieurs méthodes pour l’étude des mécanismes d’adaptation aux stress

Plusieurs méthodes permettent d’étudier les mécanismes d’adaptation aux stress.

Certains auteurs provoquent des mutations de gènes ciblés. Ils observent ensuite la réponse phénotypique des cellules après l’application d’un stress donné et en déduisent ainsi le rôle de ces gènes ciblés pour l’adaptation des cellules à ce stress (Cotter et al. , 1999 ; Hingston et al. , 2015).

D’autres études sont fondées sur l’analyse de l’expression des gènes. Pour ce faire, il faut s’intéresser à la production des ARN : c’est l’étude transcriptomique. Généralement, les méthodes utilisées pour étudier les ARN nécessitent une étape de transcription inverse (RT), c’est-à-dire la synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) à partir de l’ARN extrait.

La recherche d’ARN peut ensuite être réalisée par RT-PCR qui permet d’étudier uniquement l’expression de gènes ciblés (Makariti et al. , 2015 ; Mazza et al. , 2015 ; Ringus et al. , 2012 ; Tamburro et al. , 2015).

Le niveau d’expression de gènes peut également être évalué par l’utilisation de micro-puces (Cordero et al. , 2016 ; Garmyn et al. , 2012 ; Hain et al. , 2008 ; Pleitner et al. , 2014). Cette technique est basée sur l’hybridation des ADNc issus des ARN présents dans l’échantillon et les sondes d’ADN fixées sur la puce. Il est important de noter que le recours à une micro-puce donne des informations seulement sur les séquences avec lesquelles elle a été conçue et généralement ces séquences sont uniquement celles de gènes connus.

Désormais, grâce au développement de techniques à haut débit, il est possible d’étudier l’expression génique globale d’un micro-organisme en séquençant l’ensemble de son transcriptome par RNA-seq (Creecy et Conway, 2015 ; Croucher et Thomson, 2010 ; Deng et al. , 2012 ; Pinto et al. , 2011 ; Sharma et Vogel, 2014). La technique de RNA-seq est basée sur l’analyse des séquences par alignement sur le génome annoté pour générer un transcriptome reflétant un statut cellulaire particulier dans des conditions données (Cossart et Archambaud,

72 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

2009), en quantifiant notamment l’activité des promoteurs et l’expression différentielle de transcrits (Creecy et Conway, 2015 ; Croucher et Thomson, 2010 ; Sharma et Vogel, 2014). Un des avantages du pyroséquençage est qu’il apporte une information à la fois sur les transcrits connus et sur les inconnus.

Les études des mécanismes d’adaptation aux stress par approche transcriptomique peuvent être complétées par des analyses protéomiques (électrophorèse bi-dimensionnelle et spectrométrie de masse), consistant à identifier et quantifier les protéines exprimées par les bactéries selon les conditions environnementales (Giotis et al. , 2008b ; Soni et al. , 2011).

2.2. Etude des mécanismes d’adaptation à différents stress

2.2.1. La réponse générale et universelle aux stress

De nombreuses bactéries répondent aux conditions environnementales défavorables en augmentant l’expression et l’action des facteurs sigma (σ) alternatifs qui réorientent l’action de l’ARN-polymérase de la transcription de gènes de ménage vers la transcription d’autres gènes dont les produits permettent aux bactéries de mieux s’adapter (Chaturongakul et al. , 2008 ; Hain et al. , 2008 ; van Schaik et Abee, 2005). Dans ce but, le facteur alternatif sigma B (σB), codé par le gène sigB , joue un rôle dans la coordination de nombreux mécanismes permettant à L. monocytogenes de s’adapter à des stress divers et variés : stress osmotique (Becker et al. , 1998 ; Utratna et al. , 2011), stress nutritionnel (Huang et al. , 2015), stress salin (Ringus et al. , 2012), stress alcalin (Giotis et al. , 2008a), stress acide (Oliver et al. , 2010), stress chimique (Pleitner et al. , 2014), stress chaud (Hu et al. , 2007 ; van der Veen et al. , 2007) et stress oxydatif (Oliver et al. , 2010). Par exemple, après un traitement B au ClO 2, 113 gènes dont l’expression est sous la régulation du facteur σ sont exprimés différentiellement. Parmi ces gènes, 51 sont directement précédés par un promoteur facteur σB- dépendant ou sont dans un des 43 opérons précédés par un promoteur facteur σB-dépendant (Pleitner et al. , 2014). Enfin, l’expression du transcrit σB est plus importante dans les cellules adaptées à un stress sublétal avant l’application d’un stress plus délétère. C’est le cas pour des cellules adaptées au stress alcalin (adaptation à pH 9,5 puis exposition au stress pH 12) en comparaison à des cellules non adaptées (Giotis et al. , 2008a). De plus, l’activation du facteur σB est rapide, transitoire et proportionnelle à la magnitude du stress osmotique subi (Utratna et al. , 2011).

Les protéines universelles de réponse aux stress Usp (Universal stress proteins ) sont également induites et s’accumulent dans les cellules dans des conditions de stress variées (stress chaud,

73 Synthèse bibliographique – Chapitre 3 stress oxydatif, stress acide, exposition à des agents antimicrobiens, etc.) (Seifart Gomes et al. , 2011) et sont nécessaires pour la gestion des dommages de l’ADN et des chromosomes durant la division cellulaire (Hain et al. , 2008). Régulés par le facteur σB (Aase et al. , 2000 ; Hain et al. , 2008 ; Raengpradub et al. , 2008), les gènes lmo0515 , lmo1580 et lmo2673 codent trois protéines Usp chez L. monocytogenes .

Un autre système de régulation de la transcription est le système CtsR qui est un répresseur de gènes de réponse aux stress, dont les gènes clp (clp P, clp E, clp B et clp C) qui codent des protéines de réponse générale aux stress (Hu et al. , 2007). Il participe entre autres à la survie de

L. monocytogenes à une exposition au ClO 2 (Pleitner et al. , 2014), à un stress salin (Ringus et al. , 2012) mais également au stress chaud (van der Veen et al. , 2007).

De plus, il a été démontré que le locus génétique lisRK qui code un système à deux composants de transduction du signal, est impliqué dans la réponse aux stress dont l’acidité (Cotter et al. , 1999 ; Gahan et Hill, 1999), la présence de fortes concentrations en éthanol (Cotter et al. , 1999), le stress oxydatif (Kallipolitis et Ingmer, 2001), le stress froid (Pöntinen et al. , 2015) et le stress osmotique (Sleator et Hill, 2015).

2.2.2. Réponse aux stress thermiques

• Réponse au stress chaud

En utilisant la méthode des micro-puces à ADN, van der Veen et al. (2007) ont pu étudier l’impact du stress chaud sur des cellules de L. monocytogenes après croissance à 37°C. Après 3 minutes d’exposition à 48°C, 25% des gènes étaient différentiellement transcrits alors qu’après 40 minutes, seulement 2% des gènes avaient une expression différentielle. Ce résultat traduit le fait que la réponse au choc thermique est de nature transitoire.

La majorité des gènes induits suite à un stress chaud codent des protéases et des protéines chaperonnes qui permettent de protéger d’autres protéines et enzymes et de dégrader les protéines mal conformées. Maintenir la qualité des protéines est important pour la croissance des cellules et essentiel dans des conditions de stress. Les protéines heat shock sont réparties en trois classes (Hecker et al. , 1996 ; van der Veen et al. , 2007) : - Classe I : gènes, incluant dnaK , dnaJ, groES et groEL , contrôlés par le répresseur HrcA et codant des protéines chaperonnes, - Classe II : gènes, dont l’expression est contrôlée par le facteur σB, codant des protéines de réponse au stress général,

74 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

- Classe III : gènes, dont l’expression est régulée par le répresseur CtsR, codant des protéines chaperonnes et des protéases Clp ATP-dépendantes.

Suite à une exposition à 48°C de cellules de L. monocytogenes , les gènes de la classe I sont sur- exprimés contrairement à ceux de la classe III qui ont une expression différentielle transitoire. Les gènes de la classe II, dont l’opéron opuC , sont sur-exprimés mais de façon moins importante que pour la classe I (van der Veen et al. , 2007).

La majorité des gènes parmi les 714 ayant une expression différentielle suite à un stress chaud dans l’étude de van der Veen et al. (2007), font partie des classes fonctionnelles suivantes : transport et métabolisme des glucides, transport et métabolisme des acides aminés, transcription et traduction. Au moins 80% des gènes impliqués dans le métabolisme et le transport des glucides et ceux codant pour la transcription sont sur-exprimés contrairement à ceux impliqués dans la traduction qui sont majoritairement sous-exprimés. Sont également sur-exprimés les gènes impliqués dans le mécanisme de réponse SOS notamment pour la réparation de l’ADN. Par contre, une sous-expression des gènes de la division cellulaire a été constatée.

• Réponse au stress froid

Lors de la croissance à basse température, la composition en lipides des membranes cellulaires est modifiée pour assurer le maintien de la fluidité membranaire et ainsi assurer les activités enzymatiques et les transports transmembranaires (Gandhi et Chikindas, 2007).

Durack et al. (2013) ont mis en évidence que l’adaptation au froid induit les gènes relatifs à la transcription et à la biosynthèse du peptidoglycane et des acides gras alors que les gènes impliqués dans la chimiotaxie et la mobilité sont réprimés. De plus, la survie à basse température entraîne l’augmentation de l’expression de protéines chaperonnes telles que GroEL, ClpP et ClpB pour palier la production importante de protéines anormales (Liu et al. , 2002).

2.2.3. Réponse au stress chimique

Les opérations de N&D représentent un stress chimique pour les bactéries. Comme le montrent Fox et al. (2011), des gènes différentiellement exprimés ont été identifiés chez L. monocytogenes (une souche persistante et une souche sporadique) après un traitement au chlorure de benzéthonium (BZT). Les nombreux gènes sur-exprimés qui ont été identifiés après ce traitement chimique sont principalement ceux impliqués dans le renforcement de la paroi

75 Synthèse bibliographique – Chapitre 3 cellulaire, le métabolisme des sucres, la transcription, la régulation du pH et la biosynthèse de cofacteurs. La sur-expression de gènes impliqués dans la synthèse du peptidoglycane suggère que les mécanismes de résistance aux effets bactéricides des QAC impliquent la régénération et/ou la réorganisation du peptidoglycane (Fox et al. , 2011).

Le travail de Casey et al. (2014) a consisté en l’évaluation de la réponse moléculaire d’une souche persistante de L. monocytogenes à une exposition à des concentrations sublétales de BZT en comparant son profil transcriptomique à celui de la souche n’ayant pas subi le traitement chimique. Les résultats ont permis de mettre en évidence qu’environ 600 gènes avaient un niveau d’expression au moins quatre fois supérieur chez les cellules traitées au BZT. Tout comme dans l’étude de Fox et al. (2011), les gènes impliqués dans la synthèse du peptidoglycane et des acides téichoïques, le métabolisme des acides gras, la glycolyse et les systèmes de phosphotransférase voient leur niveau d’expression augmenter. Casey et al. (2014) ont également montré une sur-expression des gènes impliqués dans la chimiotaxie, l’assemblage des flagelles et la biosynthèse de cobalamine (vitamine B12). Par contre, selon ces mêmes auteurs, les gènes codant les protéines de phages sont considérablement sous-exprimées après l’exposition au BZT.

Dans l’étude de Pleitner et al. (2014) fondée sur la technique de micro-puces sur génome entier, 340 gènes ont une expression différentielle après une exposition de cellules en phase exponentielle à un traitement au ClO 2. Suite à ce stress, trois catégories de gènes, définies selon le J. Craig Venter Institute (JCVI), sont principalement représentées parmi les gènes sur- exprimés : - le métabolisme énergétique comprenant les gènes codant les systèmes phospho- transférase, le gène lmo0613 codant une oxydoréductase, le gène lmo2830 codant une thiorédoxine, le gène lmo1789 codant une protéine de fonction inconnue et le gène lmo2528 codant une ATP-synthase transportant des protons, - la machinerie cellulaire avec notamment les gènes lmo0669 codant une oxydoréductase, lmo0906 et lmo1433 codant des glutathion-réductases et lmo1439 codant une superoxyde-dismutase, - le traitement des protéines avec des gènes codant des protéines chaperonnes et des protéines heat shock .

Sont également sur-exprimés après ce traitement au ClO 2 des gènes impliqués dans la synthèse protéique et dans la constitution de l’enveloppe cellulaire.

76 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

L. monocytogenes est exposée à une variété de désinfectants et parfois à des concentrations inférieures à celles recommandées par le fabricant, ceci est particulièrement vrai pour les produits rémanents (dont les QAC et les produits à base de phénols) qui persistent sur les surfaces. Cette persistance des produits facilite le développement de la tolérance, en particulier l’expression et l’activité de pompes à efflux (Allen et al. , 2016). Tamburro et al. (2015) ont d’ailleurs mis en évidence une corrélation significative entre la sur- expression du gène mdrL codant une pompe à efflux et la diminution de l’activité du chlorure de benzalkonium (BAC).

2.2.4. Réponse au stress osmotique et à la dessiccation

Le stress osmotique, également appelé stress hydrique, est rencontré lorsque les cellules sont dans un environnement hyperosmotique ou lors de la déshydratation. La dessiccation est le fait d’éliminer l’eau substantielle des cellules sous la contrainte du séchage. Dans le cas de la dessiccation, l’environnement immédiat des cellules est l’atmosphère (les surfaces cellulaires sont exposées à une phase gazeuse), tandis que les cellules sous un stress osmotique sont dans une solution aqueuse dont l’a w est diminuée (Potts, 1994).

La réponse des micro-organismes au stress osmotique, appelée osmoadaptation, implique des changements physiologiques et des variations de profils d’expression des gènes (Hill et al. , 2002 ; Okada et al. , 2008). Moins sensible que les bactéries à Gram négatif (Alavi et Hansen, 2013 ; Kuda et al. , 2015), le taux de survie à la dessiccation dépend de la souche de L. monocytogenes (Alavi et Hansen, 2013 ; Takahashi et al. , 2011). Les mécanismes de la survie de ce pathogène au séchage ne sont pas encore totalement élucidés mais au moins quatre mécanismes de tolérance sont rapportés par Alpert (2006) : - l’accumulation de sucres, - la synthèse de protéines, - la sur-expression d’antioxydants, - la réparation des dommages cellulaires accumulés.

Des gènes impliqués dans l’adaptation à la dessiccation et au stress osmotique ont été déterminés grâce à des insertions mutationnelles (Hingston et al. , 2015). Les résultats ont révélé que la tolérance à la dessiccation est un processus complexe impliquant une grande variété de gènes (Hingston et al. , 2015). C’est également ce qui transparait de la revue de Burgess et al. (2016) qui récapitule de nombreux mécanismes de réponses au stress osmotique chez L. monocytogenes (Tableau 7).

77 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

L’adaptation au stress osmotique entraîne des changements dans l’enveloppe cellulaire et le transport membranaire en activant, entre autres, les gènes de la biosynthèse du peptidoglycane et des acides gras et ceux codant pour les transporteurs des solutés compatibles. Après un stress osmotique sont également induits les gènes impliqués dans la division cellulaire mais aussi ceux impliqués dans le métabolisme des sucres, tout comme les gènes relatifs à la transcription associés à la réparation, la recombinaison et la stabilisation de l’ADN et les gènes liés à la traduction (Durack et al. , 2013). Cette même étude met en évidence que les gènes impliqués dans la chimiotaxie et les protéines membranaires externes dont les protéines associées à l’assemblage des flagelles, sont au contraire réprimés.

Les gènes influençant la survie de L. monocytogenes à la dessiccation sont impliqués dans la mobilité, la biosynthèse des lipides membranaires, la production d’énergie, le transport membranaire, le métabolisme protéique et la virulence. La tolérance à la dessiccation implique une mobilité réduite, une diminution de la fluidité membranaire et une modification du métabolisme des acides gras avec une augmentation du pourcentage d'acides gras saturés pour limiter les effets de l’oxydation lors de la déshydratation (Hingston et al. , 2015).

Pour s’adapter au stress osmotique et à la dessiccation, les cellules doivent empêcher la plasmolyse et restaurer leur turgescence. Pour ce faire, une des réponses est de type « KCl » avec une accumulation intracellulaire d’ions K + (Elmnasser et al. , 2006). Cette réponse est transitoire et valable sur le court terme. Une autre des réponses est de type « solutés compatibles ». Cette réponse à long terme consiste en l’accumulation de solutés organiques comme la glycine-bétaïne, le tréhalose, la carnitine et la proline (Dreux et al. , 2008 ; Elmnasser et al. , 2006). Ces substances prennent la place de l’eau pour prévenir la formation d’agrégats de macromolécules et la désintégration des membranes (Potts, 2001). Les solutés compatibles peuvent être synthétisés par les cellules ou absorbés à partir du milieu extérieur. Le transport de la glycine-bétaïne et de la carnitine se fait par l’intermédiaire des transporteurs BetL mais aussi OpuC et GbuABC (Angelidis et Smith, 2003). Parmi les substances qui influencent la viabilité de façon positive, le sucrose et le tréhalose sont celles ayant le plus fort effet (Nocker et al. , 2012). Notamment, il résulte de la présence de tréhalose une meilleure croissance, une meilleure intégrité membranaire et une activité redox élevée. De plus, la glycine-bétaïne a un pouvoir osmoprotecteur plus important que la carnitine (Angelidis et Smith, 2003).

Enfin, Ringus et al. (2012) ont établi que l’exposition de cellules de L. monocytogenes à un stress osmotique (6 % de NaCl, 10 minutes, 37°C) induit l’expression des gènes inlA et gadD3 régulés par le facteur σB et des gènes lmo1138 et clpB régulés par le système CtsR.

78 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

Tableau 7 : Systèmes de réponse au stress osmotique chez L. monocytogenes (Burgess et al. , 2016)

Systèmes de réponse au Fonctions stress osmotique BetL et Gbu Transport de glycine-bétaïne OpuC Transport de carnitine KdpED ATPase, système à deux composants pour l’absorption de K + ProBA Biosynthèse de la proline OppA et DtpT Transport d’oligopeptides TreA Phosphotréhalase Lmo0501 Régulation de la transcription Lmo1078 UDP-glucose phosphorylase Lmo2085 Protéine LPXTG liée au peptidoglycane HtrA Protéine de réponse générale aux stress, sérine protéase ClpC Protéine de réponse générale aux stress, ATPase ClpP Protéine de réponse générale aux stress, protéase CspABD Protéines cold shock RelA (p)ppGpp synthétase Ctc Protéines ribosomales (Famille L25) de réponse générale aux stress LisRK Système de régulation à deux composants Iap Protéine associée à l’invasion MrpABCDEFG Antipore Na +/H + σB Facteur alternatif σB

2.2.5. Réponse au stress alcalin

Les souches de L. monocytogenes présentes dans les ateliers agro-alimentaires peuvent se retrouver dans des conditions alcalines sublétales associées à l’utilisation de produits de N&D alcalins. Les stratégies d’adaptation mises en œuvre par les bactéries incluent des changements métaboliques pour augmenter la production d’acides par l’induction de transporteurs et d’enzymes impliqués dans la rétention de protons H + , mais aussi des modifications de la surface cellulaire pour une meilleure rétention cytoplasmique de protons H+ (Soni et al. , 2011).

79 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

Des analyses transcriptomiques ont révélé que 390 gènes étaient différentiellement exprimés chez L. monocytogenes en réponse à une exposition d’une heure à un pH de 9,5 (Giotis et al. , 2008b). D’après cette étude, sont induits les gènes impliqués dans le métabolisme du glycérol, l’expression de phosphatases et d’anti-porteurs Na +/H + pour minimiser l’augmentation du pH intracellulaire, la réponse générale au stress, et également des gènes codant des protéines heat shock . Au contraire, les gènes impliqués dans la glycolyse et la voie du pentose-phosphate, le métabolisme des phospholipides et des acides gras, la synthèse des acides aminés, la synthèse protéique et la synthèse de la paroi cellulaire sont sous-exprimés après un stress alcalin (Giotis et al. , 2008b). C’est également le cas pour les gènes impliqués dans la division cellulaire (Giotis et al. , 2008a ; Giotis et al. , 2008b).

2.2.6. Réponse au stress acide

L’adaptation aux environnements acides fait intervenir la régulation de l’homéostasie du pH qui est assurée par le transport de protons H+ à travers la membrane plasmique. Chez L. monocytogenes , ce transport a lieu de deux façons : le transport actif de protons H + couplé au transport d’électrons dans la chaîne de respiration et la récupération de protons H+ disponibles suite à l’hydrolyse de l’ATP par les H +-ATPases (Gandhi et Chikindas, 2007).

La survie de L. monocytogenes à l’acidité requiert l’activation du système de décarboxylation du glutamate (GAD) codé par les trois gènes gadA , gadB et gadC (Cotter et al. , 2001 ; Makariti et al. , 2015). Le système GAD convertit une molécule de glutamate extracellulaire en une molécule de γ-aminobutyrate extracellulaire, ce qui consomme un proton H+ intracellulaire. Ainsi, le cytoplasme est acidifié par la réduction de la concentration intracellulaire en protons H+ alors que le milieu environnant est alcalinisé (Cotter et al. , 2001).

2.2.7. Bilan

Le Tableau 8 est un résumé des informations bibliographiques récapitulées dans les paragraphes précédents.

80 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

Tableau 8 : Principales fonctions induites (+) ou réprimées (-) selon le stress à partir des données résumées dans la synthèse bibliographique ci-jointe

Stress Voie cellulaire/métabolisme Osmotique Chimique Chaud Froid Acide Alcalin Dessiccation

Transcription + + + + Traduction + - - Transport et métabolisme des + + + - sucres Transport et métabolisme des + + - acides gras Transport et métabolisme des + - acides aminés Protéines heat shock + + + +

Transport transmembranaire + + + Transport de solutés + + + compatibles Régulation du pH + + + intracellulaire Synthèse du peptidoglycane + + + - et de la paroi cellulaire Division cellulaire + - - Mobilité et chimiotaxie + - - Casey et al. (2014) Hingston et al. (2015) van der Veen et al. Durack et al. (2013) Cotter et al. (2001) Giotis et al. (2008b) Fox et al. (2011) Durack et al. (2013) (2007) Liu et al. (2002) Gandhi et Chikindas Soni et al. (2011) Pleitner et al. (2014) Burgess et al. (2016) (2007)

81 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

2.3. Protection croisée

Plusieurs études démontrent que l’adaptation à un stress donné permet également la survie à d’autres stress : c’est la protection croisée. L’influence de différentes conditions de pré- incubation sur la survie dans un environnement stressant a largement été étudiée, les auteurs cherchent dans ce cas à observer l’existence d’une résistance ou d’une sensibilisation à un stress létal de cellules préalablement exposées à des conditions sub-létales (Guillier, 2005 ; Wesche et al. , 2009) (Tableau 9).

Tableau 9 : Impact de conditions de pré-incubation sur la résistance ou la sensibilisation à des conditions létales pour L. monocytogenes

Condition Stress Effet Référence pré-incubatoire

Ethanol NaCl, acidité, H 2O2, Protection Lou et Yousef (1997) éthanol Nutritionnel Sans effet Lou et Yousef (1997)

H2O2 H2O2 Protection Lou et Yousef (1997) Nutritionnel Sans effet Lou et Yousef (1997) Acidité Acidité Protection Hill et al. (2002), Koutsoumanis et al. (2003) Osmotique Protection Faleiro et al. (2003) Alcalinité Chlorure de benzalkonium Sensibilisation Taormina et Beuchat (2002) Osmotique, éthanol Protection Giotis et al. (2008a)

Température NaCl, éthanol, H 2O2 Protection Lou et Yousef (1997) sub-optimale Nutritionnel Sans effet Lou et Yousef (1997) Acidité Sensibilisation Koutsoumanis et al. (2003)

Concentration H2O2, NaCl, acidité, Protection Lou et Yousef (1997), en NaCl élevée osmotique Faleiro et al. (2003) Nutritionnel Sans effet Lou et Yousef (1997)

La croissance et l’adaptation des bactéries à des conditions de stress permettent généralement une augmentation de la résistance de ces dernières aux facteurs létaux : c’est la notion de stress préparant (Elmnasser et al. , 2006). La protection croisée de cellules vis-à-vis de différents stress indique que les mécanismes d’adaptation peuvent être communs à plusieurs stress.

82 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

Une protection contre le stress osmotique après une exposition à un stress alcalin a été mise en évidence chez L. monocytogenes (Giotis et al. , 2008a). C’est également le cas pour une protection des cellules à une exposition à l’éthanol après avoir subi un stress alcalin (Giotis et al. , 2008a). Lou et Yousef (1997) ont, quant à eux, démontré qu’une incubation d’une heure à 45°C (stress chaud) augmente la résistance à l’exposition à l’éthanol et au stress salin.

L’adaptation croisée aux désinfectants ayant des mécanismes d’action similaires ou différents a déjà été constatée (Lundén et al. , 2003a). Le ou les mécanisme(s) permettant l’adaptation n’est (ne sont) donc pas spécifique(s). Ceci remet ainsi en question l’utilité de la rotation des agents désinfectants ayant des mécanismes d’action différents pour éviter l’adaptation aux opérations d’hygiène comme évoqué dans le Chapitre 2, Paragraphe 2.4.1 (Page 59).

2.4. Adaptation aux stress et virulence

L’inactivation de gènes de virulence ayant peu ou pas de rôle dans la survie aux stress peut être un mécanisme de conservation de l’énergie, notamment pour la survie à la dessiccation (Hingston et al. , 2015). Chez les bactéries adaptées au stress osmotique et au froid, les gènes codant les protéines membranaires externes impliquées dans la virulence sont réprimés (Durack et al. , 2013). Pourtant, les réponses aux stress, dont l’expression de lisRK et du facteur σB, peuvent réguler la virulence de L. monocytogenes (Cotter et al. , 1999 ; Kallipolitis et Ingmer, 2001 ; Oliver et al. , 2010). De plus, une induction constante a été observée, suite à un stress chaud, pour le gène prfA qui code pour un régulateur majeur des gènes de virulence de L. monocytogenes (Gahan et Hill, 1999 ; van der Veen et al. , 2007) . Les résultats de ces auteurs ont permis de démontrer l’importance des mécanismes fonctionnels de réponse aux stress pour une infection de l’hôte réussie.

83 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

3. Etat viable non cultivable

De par les nombreux stress présents dans les ateliers agro-alimentaires (Wesche et al. , 2009), les bactéries peuvent entrer dans l’état physiologique dit « viable non cultivable ».

3.1. Qu’est-ce que l’état viable non cultivable ?

3.1.1. Définition et caractéristiques générales

Les bactéries viables non cultivables (VNC) sont des bactéries vivantes, c’est-à-dire métaboliquement actives, mais qui ont perdu leur capacité à former des colonies sur les milieux de culture conventionnels non sélectifs (Oliver, 2005, 2010).

L’état VNC a été mis en évidence chez certaines bactéries dont des pathogènes humains retrouvés dans notre alimentation comme E. coli et Salmonella sp. (Li et al. , 2014a ; Oliver, 2005). L. monocytogenes ne fait pas exception à ce constat (Chae et Schraft, 2001 ; Lindbäck et al. , 2010) .

D’après la revue de Fakruddin et al. (2013), les bactéries VNC maintiennent leur intégrité et leur activité cellulaires. L’expression des gènes est continue, les plasmides sont maintenus et les bactéries répondent aux stimuli externes par l’expression de gènes spécifiques. Leur activité métabolique est relativement faible ce qui induit notamment une augmentation de la résistance aux antibiotiques. Le potentiel de membrane est maintenu mais des modifications de la composition en acides gras des membranes cytoplasmiques ont été constatées, tout comme des modifications du profil protéique de la membrane externe. Enfin, il s’avère que le transport des nutriments est réduit et que le taux d’ATP reste élevé.

3.1.2. Les facteurs induisant l’entrée dans l’état viable non cultivable

Oliver (2005) évoque différentes causes pouvant expliquer la perte de la cultivabilité des bactéries viables. Nombreux sont les paramètres influençant L. monocytogenes dans son entrée dans l’état VNC (Besnard et al. , 2002) ; le séchage n’en est qu’un exemple parmi tant d’autres (Dreux et al. , 2007). Le milieu de culture lui-même ou les conditions de culture (une température trop basse par exemple) peuvent ne pas être adaptés pour la culture d’un micro- organisme donné. Il a également été remarqué que les bactéries exposées à une quantité de nutriments élevée produisent des radicaux libres tels que le peroxyde d’hydrogène inhibant leur croissance sur des milieux de culture conventionnels non sélectifs.

84 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

Il est généralement admis que cette modification d’état physiologique est une stratégie de survie à des conditions environnementales rudes pour répondre aux différents stress environnementaux (Oliver, 2005, 2010). Plus résistantes à des conditions peu adaptées à la croissance, les bactéries VNC constituent un réservoir important de pathogènes dans l’environnement (Oliver, 2010).

3.2. Les bactéries viables non cultivables peuvent-elles retrouver leur cultivabilité ?

Une des préoccupations essentielles liées à la présence de micro-organismes VNC est leur éventuel retour à la cultivabilité. En d’autres termes, il est question de savoir si des bactéries VNC peuvent à nouveau se multiplier après contact avec un produit alimentaire ou après leur ingestion.

D’après Lindbäck et al. (2010), les bactéries VNC peuvent retrouver leur cultivabilité suite à un apport de nutriments mais aussi par l’ajout d’agents dégradant les radicaux libres tel que le Na-pyruvate dans le milieu de culture utilisé. Selon Oliver (2005), le retour à la cultivabilité des bactéries VNC est probablement un événement génétiquement contrôlé. Il évoque aussi l’influence de plusieurs facteurs tels un changement de température ou la présence d’autres micro-organismes. D’après Colwell et al. (1996), des cellules de Vibrio cholerae et Campylobacter jejuni initialement VNC sont à nouveau cultivables après passage dans le tractus humain ou animal, ces bactéries sont alors qualifiées de cellules « ressuscitées ». Cappelier et al. (2007) ont mis en évidence le retour à la cultivabilité de L. monocytogenes dans des œufs embryonnés.

Il faut être particulièrement attentif à ne pas confondre le retour à la cultivabilité des bactéries VNC et la croissance de cellules cultivables non détectées au préalable (Oliver, 2005, 2010). Les résultats de Dreux et al. (2007) indiquent que l’augmentation du nombre de cellules cultivables après un retour à 100% HR est probablement due à la multiplication des cellules cultivables résiduelles plutôt qu’au retour à la cultivabilité des bactéries VNC apparues suite au séchage d’une suspension de L. monocytogenes sur des feuilles de persil.

3.3. Quelles sont les méthodes de détection des bactéries viables non cultivables ?

L’impossibilité de détecter les cellules VNC par les techniques de culture conventionnelles est problématique. Néanmoins, des méthodes moléculaires indépendantes de la culture ont été mises au point afin de permettre la détection de ces cellules. Ces méthodes sont fondées sur la

85 Synthèse bibliographique – Chapitre 3 détection de l’activité métabolique des micro-organismes ou sur leur intégrité membranaire (Fakruddin et al. , 2013 ; Li et al. , 2014a ; McDouglas et al. , 1998 ; Rowan, 2004).

3.3.1. Les méthodes basées sur la mise en évidence de l’activité métabolique

La recherche d’une éventuelle activité métabolique pour détecter les bactéries viables fait l’objet de plusieurs techniques dont quelques exemples sont évoqués ci-après.

• Mise en évidence de l’activité respiratoire

La présence d’une activité respiratoire peut être recherchée grâce à des techniques de fluorescence en utilisant des molécules telles que le 5-cyano-2,3-ditolyl-tétrazolium-chloride (CTC) (Pyle et al. , 1995) ou le 2-(4-iodophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-phényl-tétrazolium- chloride (INT) (Zimmermann et al. , 1978). Ces molécules jouent le rôle d’accepteurs d’électrons ; leur réduction grâce à l’activité de la chaîne respiratoire entraîne la formation de précipités intracellulaires fluorescents (dépôts de formazan) observables en microscopie à épifluorescence indiquant ainsi que les cellules sont viables.

• Mise en évidence de la croissance cellulaire

L’activité métabolique peut également être mise en évidence par la technique direct viable count (DVC) (Kogure et al. , 1979). Développée pour L. monocytogenes par Besnard et al. (2000), cette technique consiste en l’analyse des bactéries après une incubation dans un milieu de culture enrichi en extrait de levure et contenant un antibiotique de la famille

86 Synthèse bibliographique – Chapitre 3 des quinolones inhibant la division cellulaire du fait du blocage de l’ADN-gyrase. Dans ces conditions, les cellules bactériennes métaboliquement actives ne se divisent pas malgré leur croissance. Ceci leur confère une forme allongée, les rendant facilement distinguables des cellules mortes par observation en microscopie à épifluorescence ou lors des analyses par cytométrie en flux.

• Mise en évidence de l’expression des gènes

Un autre marqueur de viabilité est l’expression continue de gènes qui se traduit par la présence d’ARN m dans les cellules. La réalisation d’une RT-PCR permet la détection de ces transcrits ayant un rôle central dans le métabolisme cellulaire (Oliver, 2010 ; Xiao et al. , 2012).

3.3.2. Les méthodes basées sur l’intégrité membranaire des cellules

Il est communément considéré que les bactéries viables ont une membrane cellulaire intacte. Plusieurs techniques ont donc été développées pour évaluer l’intégrité membranaire des bactéries.

• Etude par observations microscopiques

Un exemple est l’utilisation du kit LIVE/DEAD ® BacLight™ Bacterial Viability Kit qui comprend deux intercalants de l’ADN : le Syto 9® et l’iodure de propidium (IP) qui fluorescent respectivement vert (émission maximale à 498 nm) et rouge (émission maximale à 617 nm) (Figure 6) (Boulos et al. , 1999). Le premier pénètre dans toutes les cellules, que leur membrane plasmique soit intacte ou altérée. Quant au second, il entre uniquement dans les cellules dont la membrane est endommagée, empêchant ainsi la fixation du Syto 9® à l’ADN.

Lors des observations par microscopie à épifluorescence, les bactéries considérées comme viables apparaissent vertes, tandis que les mortes sont rouges. En revanche, l’utilité de l’IP comme indicateur universel de la viabilité cellulaire est remise en cause par certains auteurs. En effet, il a été montré qu’une grande partie des cellules d’ E. coli qui étaient marquées à l’IP étaient en réalité vivantes (Shi et al. , 2007).

87 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

• Etude par PCR

Une autre méthode consiste en la réalisation d’un traitement au monoazoture d’éthidium (EMA) (Nogva et al. , 2003) ou au monoazoture de propidium (PMA) (Nocker et al. , 2006 ; Pan et Breidt, 2007) avant une PCR quantitative (PCRq). Ces deux molécules, comme l’IP, s’intercalent uniquement dans l’ADN des cellules ayant perdu leur intégrité membranaire. Une forte exposition à une source lumineuse permet une liaison covalente de l’EMA ou du PMA à l’ADN des cellules mortes et l’inactivation des molécules libres d’EMA ou de PMA. Ainsi, seul l’ADN des cellules dont la membrane est intacte est amplifié lors de la PCRq (Figure 7) (Nocker et al. , 2006 ; Pan et Breidt, 2007). Cette technique allie l’utilisation d’un intercalant de l’ADN permettant la distinction des cellules vivantes des cellules mortes à la rapidité et la sensibilité de la PCRq (Nocker et al. , 2006).

Figure 7 : Principe de la PMA-PCRq (Nocker et al. , 2006).

88 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

En outre, Pan et Breidt (2007) ont montré que l’EMA, contrairement au PMA, présente une certaine toxicité pour les cellules vivantes et peut tout de même pénétrer dans ces dernières malgré l’intégrité de leur membrane ; ceci entraîne alors une perte partielle de l’ADN à quantifier. La membrane cellulaire est plus imperméable au PMA, probablement du fait de sa charge plus importante que l’EMA. Le PMA est plus spécifique dans sa capacité à différencier une membrane intacte d’une membrane perméabilisée (Nocker et al. , 2006). De plus, le PMA n’a pas d’effet antimicrobien sur L. monocytogenes (Pan et Breidt, 2007). Ceci met donc en avant l’intérêt de privilégier l’utilisation de la PMA-PCRq, aux dépens de l’EMA-PCRq, pour la détection et la quantification des bactéries viables.

Malgré leur efficacité prouvée et leur intérêt, les techniques évoquées ci-dessus ne font pas partie des procédures utilisées en routine pour l’analyse de prélèvements réalisés dans les industries agro-alimentaires (contrôle des environnements et des denrées alimentaires), principalement du fait qu’elles ne soient pas encore recommandées par les normes.

3.4. Un problème de sécurité sanitaire

La présence de bactéries VNC a été mise en évidence malgré le respect des opérations d’hygiène (Leriche et Carpentier, 1995 ; Marouani-Gadri et al. , 2010 ; Peneau et al. , 2007). Par conséquent, le dénombrement des cellules cultivables lors d’un prélèvement de surface n’est pas un critère suffisant pour évaluer la présence potentielle d’une espèce bactérienne (Marouani-Gadri et al. , 2010). En effet, ce n’est pas parce qu’aucune cellule n’est détectée par les méthodes culturales que la surface est exempte de cellules vivantes et persistantes, cellules potentiellement capables de contaminer des produits alimentaires et de s’y multiplier. Par conséquent, il faut faire particulièrement attention au sentiment de fausse propreté que les résultats obtenus après culture sur milieu gélosé peuvent procurer.

Les bactéries VNC n’étant pas détectées par les techniques de microbiologie conventionnelle, elles représentent donc un risque de sécurité sanitaire dans le sens où un échantillon peut éventuellement être considéré comme négatif vis-à-vis d’un micro-organisme alors qu’il est en réalité contaminé (Ferrentino et al. , 2015). Pour mieux évaluer le risque, des auteurs se sont penchés sur le potentiel de virulence des bactéries VNC. Les résultats sont controversés : les cellules VNC restent probablement virulentes pour Gilmartin et al. (2016) alors que pour Cappelier et al. (2007), le retour à la cultivabilité est nécessaire pour l’expression de la virulence. A notre connaissance, les risques réels encourus par l’ingestion de pathogènes VNC d’origine alimentaire, dont L. monocytogenes, restent encore inconnus.

89 Synthèse bibliographique – Chapitre 3

Cependant, les méthodes culturales sont efficaces dans la mesure où elles permettent, depuis des décennies, de préserver la santé publique. En revanche, pour l’évaluation des risques et les études épidémiologiques, ces méthodes doivent être complétées par les méthodes de biologie moléculaire indépendantes de la cultivabilité des cellules pour un meilleur contrôle des cellules VNC (Ayrapetyan et Oliver, 2016 ; Bonilauri et al. , 2016 ; Sardessai, 2005).

ETUDES EXPERIMENTALES

Etudes expérimentales - Démarche expérimentale

Démarche expérimentale

Pour préserver, voire améliorer la sécurité sanitaire des environnements agro-alimentaires vis- à-vis de L. monocytogenes , il est primordial d’approfondir les connaissances sur l’adhésion et la persistance de ce pathogène sur les surfaces en contact ou non avec les produits alimentaires. Les bactéries peuvent en effet contaminer les produits par contamination croisée et être à l’origine de cas de listériose et de pertes économiques liées à la destruction et au rappel de lots. De plus, il a été démontré que L. monocytogenes pouvait entrer dans l’état VNC sous l’effet des stress rencontrés dans l’environnement (Besnard et al. , 2002 ; Lindbäck et al. , 2010). Cet état physiologique représente un risque potentiel pour les industriels et les consommateurs car les bactéries sont vivantes mais non détectées par les méthodes culturales généralement utilisées pour la recherche de L. monocytogenes dans un prélèvement de surface, d’où la nécessité d’étudier plus en détail la thématique de la viabilité. Pour répondre à ces problématiques, le travail expérimental de la thèse a été organisé en trois objectifs, chacun faisant l’objet d’un chapitre de ce manuscrit.

Dans un premier temps, le comportement de cellules de L. monocytogenes adhérentes sur des surfaces en acier inoxydable en présence de deux souillures alimentaires (l’exsudat de viande et le jus de saumon fumé) a été étudié. En effet, les études visant à mieux comprendre les phénomènes de persistance sont désormais nombreuses mais elles ne sont pas forcément représentatives des conditions rencontrées dans les environnements agro-alimentaires. Il est donc nécessaire de compléter les données disponibles dans la littérature par des expérimentations simulant au mieux en laboratoire les conditions environnementales industrielles. Pour ce faire, les expériences peuvent être réalisées en utilisant des souillures alimentaires (Gram et al. , 2007 ; Hood et Zottola, 1997). Or, l’utilisation de celles-ci présentent de nombreux inconvénients (manque d’homogénéité d’un lot à un autre, milieux non autoclavables, etc.). Le premier objectif de ces travaux a donc consisté à vérifier la capacité des milieux de culture de microbiologie conventionnelle à modéliser les deux souillures retenues et à définir des milieux de culture synthétiques pouvant les mimer.

Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’impact de différents facteurs environnementaux représentatifs des conditions rencontrées dans les environnements agro-alimentaires sur la survie de cellules de L. monocytogenes , à savoir (i) le type de matériau utilisé pour la préparation des biofilms, (ii) la souche de L. monocytogenes , (iii) la souillure alimentaire utilisée comme milieu de culture, (iv) la présence ou non d’une souche bactérienne favorisant l’adhésion de L. monocytogenes et (v) le scénario de l’opération d’hygiène. La survie

93 Etudes expérimentales - Démarche expérimentale bactérienne a été suivie par méthode culturale mais également par méthodes de biologie moléculaire permettant de mettre en évidence l’éventuelle présence des populations VNC.

Enfin, le troisième objectif de ces travaux était de mieux comprendre, par une approche transcriptomique, les mécanismes de réponse aux stress mis en place par L. monocytogenes pour s’adapter et persister au sein des ateliers agro-alimentaires. Il est en effet nécessaire de développer les connaissances sur la persistance de ce pathogène par des approches de biologie moléculaire, afin de mieux lutter contre son implantation dans les ateliers agro-alimentaires (Abee et al. , 2016).

94 Etudes expérimentales – Chapitre 1

CHAPITRE 1 : Recherche de milieux de culture modélisant des souillures alimentaires pour étudier le comportement de Listeria monocytogenes sur les surfaces en acier inoxydable

1. Contexte et objectifs

Comme évoqué précédemment, la persistance de L. monocytogenes dans les ateliers agro- alimentaires est l’objet de nombreuses études. Afin d’étudier le comportement de ce pathogène, les travaux expérimentaux réalisés en laboratoire reposent actuellement sur l’utilisation de milieux de culture de microbiologie conventionnelle (sans avoir vérifié si ces derniers sont représentatifs des environnements agro-alimentaires) ou, au mieux, de souillures alimentaires visant à représenter les conditions environnementales rencontrées dans les industries agro- alimentaires (Gram et al. , 2007 ; Hood et Zottola, 1997 ; Kuda et al. , 2015 ; Takahashi et al. , 2011). Or, l’utilisation de ces souillures présente de nombreux inconvénients. La qualité et la composition de ces dernières ne sont pas homogènes d’un lot à un autre. De plus, elles présentent le double inconvénient de ne pas être autoclavables du fait de la précipitation des protéines à haute température et de ne se conserver que relativement peu de temps. Pour faciliter et optimiser les expérimentations microbiologiques, il est donc souhaitable de définir un milieu de culture pouvant modéliser une souillure alimentaire (Hwang, 2009).

Le premier objectif était de caractériser le comportement des cellules de L. monocytogenes adhérentes sur acier inoxydable après culture en présence de souillures alimentaires. Sachant que les produits prêts à la consommation à base de viande ou de poisson peuvent être à l’origine de cas de listériose (EFSA, 2013), les deux souillures retenues pour les expérimentations étaient le jus de saumon fumé et l’exsudat de viande. Cette étude a été réalisée en utilisant des critères liés aux populations bactériennes adhérentes après une incubation de 24 heures à 25°C sur une surface en acier inoxydable : (i) la distribution spatiale observée par microscopie à épifluorescence, (ii) les forces d'adhérence estimées au moyen de droites de détachement établies après plusieurs écouvillonnages et (iii) l'état physiologique de ces cellules sessiles. Pour compléter le dénombrement des populations cultivables, les populations totales (les cellules mortes et les cellules vivantes) ont été quantifiées par PCRq en temps réel et les populations viables par PMA-PCRq en temps réel (Nocker et al. , 2007), ce qui a permis de mettre en évidence l’éventuelle présence de cellules VNC.

95 Etudes expérimentales – Chapitre 1

Le second objectif était de définir un milieu de culture pouvant modéliser chacune de ces deux souillures. Les critères de sélection étaient (i) la croissance en milieu liquide, (ii) la distribution spatiale, (iii) les forces d’adhésion et (iv) l’état physiologique des cellules adhérentes. Le choix du milieu de culture synthétique présélectionné lors de l’étude de la croissance de L. monocytogenes en milieu liquide a ensuite été complété par l’étude du comportement des cellules sessiles selon les critères mentionnés ci-dessus.

96 Etudes expérimentales – Chapitre 1

2. Matériels et méthodes

2.1. Souches et conditions de culture

Quatre souches de L. monocytogenes , de sérotypes et d’origines variés, ont été utilisées : CCL500 (sérotype 1/2b, origine : industrie laitière), CCL128 (sérotype 1/2b, origine : industrie fromagère), CCL207 (sérotype 1/2b, origine : industrie des produits de la mer) et LO28 (sérotype 1/2c, origine : isolat humain).

Les cultures « longue conservation », stockées à -80°C en milieu glycérolé, ont été utilisées pour inoculer des géloses en pente de tryptone soya agar (TSA, AES Chemunex, Bruz, France). Ces tubes de gélose en pente inoculée ont ensuite été conservés jusqu’à leur utilisation à 4°C pendant au maximum un mois. La veille de chaque expérimentation, une culture maintenue sur milieu gélosé à 4°C a été repiquée sur une seconde gélose en pente de TSA et incubée 24 heures à 25°C.

Pour les expérimentations, les bactéries ont été remises en suspension dans de l’eau peptonée à 1 g/l (EP, AES Chemunex). La densité optique (DO) à 600 nm de la suspension bactérienne a été ajustée à 0,15 dans des tubes de 1,5 cm de diamètre avec le colorimètre WPA Biowave (Cambridge, Royaume-Uni), correspondant à une concentration d’environ 10 8 UFC/ml.

2.2. Préparation des souillures alimentaires et des milieux de culture modèles

2.2.1. Le jus de saumon fumé

Vingt grammes de saumon fumé (poisson élevé en Norvège, Carrefour Discount, Paris, France) décongelé et découpé en petits morceaux ont été broyés dans un bol Waring Blender contenant 50 grammes d’eau stérilisée pendant 30 secondes. Le broyat a ensuite été centrifugé à 11000 g durant 10 minutes à 4°C. Le surnageant a été conservé à -80°C pour une durée maximale de quatre mois.

Avant chaque expérimentation, la solution a été décongelée à température ambiante, centrifugée à 2100 g pendant 10 minutes à température ambiante puis stérilisée par filtration sur une unité filtrante avec des pores de 0,22 µm de diamètre (Millipore, Saint-Quentin, France) munie d’une membrane pré-filtre avec des pores de 2 µm de diamètre (Millipore).

Le saumon fumé contenait du sel à 2,3 g/100 g, du phénol à 0,84 mg/100 g et son pH était de 6,2 (ISHA, Institut Scientifique d’Hygiène et d’Analyse, Longjumeau, France).

97 Etudes expérimentales – Chapitre 1

2.2.2. L’exsudat de viande

L’exsudat de viande a été préparé comme décrit par Midelet et Carpentier (2002). La viande a été fournie par la société Socopa Normandie (Le Neubourg, France). Il s’agit de viande de jeunes bovins de même race et de même élevage afin de garantir au mieux l’homogénéité inter- lots dans le but de minimiser le risque de dérive d’une expérimentation à l’autre. L’exsudat de viande a été obtenu suite à la décongélation et pression de la viande découpée en petits morceaux. Il a été conservé à -80°C et utilisé dans les six mois qui ont suivi sa fabrication.

Avant de l’utiliser, le volume d’exsudat de viande nécessaire a été décongelé, centrifugé 2100 g pendant 10 minutes à température ambiante et le surnageant stérilisé par filtration comme décrit pour le jus de saumon fumé.

La concentration en sel dans l’exsudat de viande était de 0,09 g/100 g et le pH était de 5,4 (ISHA).

2.2.3. Les milieux de culture synthétiques

Les milieux de culture modèles ont été fabriqués à partir de milieux de culture fréquemment utilisés dans les études expérimentales portant sur L. monocytogenes : le bouillon brain heart infusion (BHI, Oxoid, Dardilly, France) et le bouillon tryptone soya broth (TSB, AES Chemunex).

Pour se rapprocher de la composition du jus de saumon fumé, après dilution à 1/2, au 1/5 ème ou 1/10 ème , la composition des milieux de culture a été ajustée selon les données de l’étude de Cornu et al. (2006). La concentration en sel a été ajustée par ajout de chlorure de sodium (NaCl, Emsure, Merck KgaA, Darmstadt, Germany). La concentration en composés phénoliques a été ajustée avec de la fumée liquide (Lutetia, Plailly, France) pour simuler le fumage du poisson avec du bois naturel (Hwang, 2009 ; Membré et al. , 1997). L’acide chlorhydrique (Sigma- Alrich, Saint Quentin Fallavier, France) a été utilisé pour ajuster le pH à 6,2. Les milieux ajustés après dilution ont été nommés TSB modifié (TSB m) et BHI modifié (BHI m).

Pour les milieux de culture préparés pour mimer l’exsudat de viande, après leur dilution au 1/10 ème , 1/15 ème ou 1/20 ème , seul le pH a été ajusté à 5,4 par l’ajout d’acide chlorhydrique.

Les milieux TSB et BHI modifiés ont respectivement été nommés TSB pH 5,4 et BHI pH 5,4 .

Tous les milieux de culture ont été stérilisés par filtration sur une membrane ayant des pores de 0,22 µm de diamètre munie d’une membrane pré-filtre avec des pores de 2 µm de diamètre.

98 Etudes expérimentales – Chapitre 1

2.3. Croissance bactérienne

2.3.1. Croissance dans le jus de saumon fumé et les milieux mimant cette souillure

La croissance bactérienne à 25°C a été évaluée par mesure de la DO à 590 nm par le FLUOstar Galaxy (BGM Labtechnologies, Offenburg, Allemagne) piloté par le logiciel associé FLUOstar Galaxy software, version 4.31-0. Pour ce faire, 200 µl de chaque milieu (jus de saumon fumé, 4 TSB m et BHI m) inoculé avec un inoculum initial de 10 UFC/ml, ont été déposés dans une microplaque de 96 puits (Nunc TM Brand Products, VWR, Fontenay-sous-Bois, France). Une mesure de la DO a été effectuée dans chaque puits toutes les 15 minutes pendant 24 heures sans agitation.

2.3.2. Croissance dans l’exsudat de viande et les milieux mimant cette souillure

La couleur rouge foncé de l'exsudat de viande ne permet pas la mesure de la DO pour évaluer la croissance bactérienne. Celle-ci a donc été suivie par dénombrement des UFC à partir de prélèvements de milieu de culture. L’exsudat de viande et les milieux de culture synthétiques 3 (TSB pH 5.4 et BHI pH 5.4 ) ont été inoculés avec un inoculum initial de 10 UFC/ml et incubé à 25°C pendant 48 heures sans agitation. A des temps donnés, 100 µl de milieu ont été prélevés, dilués, ensemencés sur le milieu TSA par un ensemenceur (Spiral ® DS, Interscience, Saint- Nom-La-Bretèche, France), puis dénombrés après une incubation de 24 heures à 37°C.

2.3.3. Analyse des données

L’étude de la croissance de L. monocytogenes dans les différents milieux de culture et les deux souillures alimentaires a été basée sur la comparaison de deux paramètres : le taux de croissance maximal atteint lors de la phase exponentielle de croissance ( µmax ) et la population maximale de bactéries atteinte en phase stationnaire (N max exprimée en DO pour le jus de saumon fumé ou en UFC/ml pour l’exsudat de viande).

L’ensemble des données obtenues dans chaque puits a été ajusté au modèle de croissance de Baranyi (Baranyi et Roberts, 1994) avec le logiciel MicroFit version 1.0 (Institute of Food Research, 2011).

2.4. Etude des populations adhérentes

99 Etudes expérimentales – Chapitre 1

2.4.1. Réalisation des biofilms selon le protocole « goutte »

Les biofilms ont été préparés sur des coupons (3 cm x 2.5 cm) en acier inoxydable de finition 2 RB, AISI 304 B (Inox Industrie, Aulnay-sous-Bois, France). Comme décrit précédemment par Leriche et Carpentier (1995), chaque coupon a été frotté avec un mélange d’alcool à 95% et d’acétone (3V/1V) pour enlever les débris du process de fabrication et les résidus de graisses, lavés, autoclavés (20 minutes à 121°C), séchés sous flux laminaire en conditions stériles et finalement conservés stérilement jusqu’à leur utilisation.

Les coupons nécessaires à chaque expérimentation ont été répartis dans des boîtes de Petri de 90 mm de diamètre, lesquelles ont été placées dans de plus grandes boîtes contenant du papier absorbant stérile humidifié avec de l’eau distillée stérilisée pour maintenir une atmosphère humide et éviter la déshydratation des biofilms.

Les biofilms ont été réalisés selon le protocole « goutte ». Cent µl de la suspension bactérienne de DO égale à 0,15 (correspondant à une concentration bactérienne de 10 8 UFC/ml) ont été déposés au centre des coupons en acier inoxydable. Après une incubation de 3 heures à 25°C, les coupons ont été rincés par écoulement de 25 ml d’EP afin d’éliminer les cellules non- adhérentes. Ensuite, 150 µl de jus de saumon fumé, d’exsudat de viande ou de chaque milieu de culture synthétique ont été déposés à l’emplacement du premier dépôt afin de permettre la croissance bactérienne en simulant l’environnement de fabrication des produits alimentaires. Suite à une incubation de 21 heures à 25°C, les biofilms ont été obtenus après avoir éliminé les cellules planctoniques en rinçant les coupons par écoulement de 25 ml d’eau distillée stérilisée.

2.4.2. Distribution spatiale des populations adhérentes

Les biofilms préparés ont été marqués au Syto 9® à 5 mM (Molecular probes ® Invitrogen ™, Life technologies ™, Saint-Aubin, France), incubés à l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes et rincés avec 10 ml d’eau distillée stérilisée. Les cellules marquées ont été visualisées, en immersion, avec un microscope à épifluorescence (Axioskop, Carl Zeiss SAS, Le Pecq, France) muni de l’objectif 100 Néofluar (excitation à 485 nm, émission à 498 nm) et d’une caméra (Axiocam, Carl Zeiss SAS). Les champs microscopiques ont été choisis de façon aléatoire pour prendre au moins cinq photos par coupon avec le logiciel IndusGab version 2.2.0 (Adersa, Palaiseau, France).

100 Etudes expérimentales – Chapitre 1

2.4.3. Décrochage des cellules adhérentes par écouvillonnage

Pour analyser les populations adhérentes, un écouvillon (Copan, Brescia, Italie) dont l’embout en coton a été préalablement humidifié avec de l’EP, a été utilisé pour écouvillonner la surface dans trois directions (sur la longueur et la largeur puis en diagonale) selon la norme NF ISO 18593 (Anonyme, 2004). L’embout de l’écouvillon a ensuite été séparé de la tige en bois puis placé dans un tube contenant 1 ml d’EP. Les cellules ont été dissociées de l’écouvillon en vortexant les tubes pendant 10 secondes. Les embouts ont ensuite été retirés de la suspension obtenue.

2.4.4. Mesure des forces d’adhésion des cellules sur l’acier inoxydable

Les droites de décrochement ont été tracées suite à l’écouvillonnage d’un même coupon avec dix écouvillons successifs. Elles ont été construites en exprimant le logarithme du nombre de cellules cultivables décrochées pour chacun des dix écouvillonnages. L’étude des forces d’adhésion relatives des cellules adhérentes est basée sur la comparaison des pentes des droites de décrochement. Plus la valeur absolue de la pente est importante, moins les cellules sont adhérentes à la surface (Eginton et al. , 1995 ; Eginton et al. , 1998 ; Midelet et Carpentier, 2002).

2.4.5. Dénombrement des cellules adhérentes cultivables

La quantification des cellules cultivables a été effectuée au cours de la réalisation des droites de décrochement. Les suspensions bactériennes ont été diluées, ensemencées sur le milieu TSA comme décrit ci-dessus (Paragraphe 2.3.2, Page 99) et dénombrées après une incubation de 24 heures à 37°C.

2.4.6. Quantification des cellules adhérentes totales par PCRq en temps réel

L’ADN bactérien a été extrait à partir de 100 µl de la suspension obtenue suite au premier écouvillonnage de la surface à l’aide du kit MagNa Pure LC DNA isolation kit III (Roche Diagnostics ®, Meylan, France) avec lequel l’ADN est isolé par une technologie utilisant des billes magnétiques (détails du principe et du protocole en Annexe 1). L’extraction a été réalisée avec le robot extracteur MagNa Pure (Roche) associé au logiciel MagNA Pure version 3.0. Les échantillons d’ADN ont été conservés après l’extraction à -25°C jusqu’à la réalisation de la PCRq en temps réel.

101 Etudes expérimentales – Chapitre 1

La PCRq en temps réel a été réalisée avec le thermocycleur LightCycler ® 2.0 System (Roche Diagnostics ®, Meylan, France) en utilisant le kit LightCycler ® 480 SYBR Green I Master du même fournisseur. Le gène de virulence hlyA codant la listériolysine O, et spécifique de L. monocytogenes , a été amplifié grâce aux amorces spécifiques dessinées par Nogva et al. (2000) (Forward : 5’ - TGC AAG TCC TAA GAC GCC A - 3’ ; Reverse : 5’ - CAC TGC ATC TCC GTG GTA TAC TAA - 3’). Chaque échantillon analysé était composé de 10 µl de la solution d’ADN extrait et 15 µl de mix (12,5 µl de tampon SYBR Green I Master, 1,5 µl d’eau moléculaire et 0,5 µl de chaque amorce à la concentration finale de 200 nM). Le programme suivi est : un cycle de pré-incubation (10 minutes à 95°C), 40 cycles d’amplification (10 secondes à 95°C puis 1 minute à 60°C), un cycle de fusion (5 secondes à 95°C puis 1 minute à 70°C) et enfin un cycle de refroidissement (30 secondes à 40°C). Dans chaque run de PCRq, l’eau moléculaire a été utilisée comme contrôle négatif.

Pour la quantification, une relation de proportionnalité a été établie entre le nombre d’UFC et les valeurs de cycle seuil (Ct) déterminées par PCRq à partir de solutions d’ADN extrait de plusieurs dilutions décimales d’une suspension bactérienne de DO égale à 0,15 (Marouani- Gadri et al. , 2010). La courbe exprimant le nombre de Ct en fonction du nombre d’UFC correspond à la droite standard de quantification. L’efficacité de la PCRq était de 95% minimum, le seuil de détection égal à 4,0 log 10 (UFC/ml).

2.4.7. Quantification des cellules adhérentes viables par PMA-PCRq en temps réel

Avant l’extraction d’ADN, du PMA (Biotium, Hayward, United States) a été ajouté à 100 µl de suspension obtenue par écouvillonnage à une concentration finale de 100 µM suivant le protocole de Nocker et al. (2006). Suite à une incubation de 5 minutes à l’obscurité à température ambiante, les échantillons ont été exposés, durant 2 minutes, dans la glace pour éviter un échauffement, sous la lampe Osram SLG 1000 munie d’une ampoule halogène de 650 W placée 20 centimètres au-dessus d’eux. Cette incubation brève sous la source lumineuse intense permet de lier de façon covalente le PMA à l’ADN et d’inactiver les molécules de PMA libres. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 15000 g pendant 3 minutes à température ambiante. Le culot obtenu a alors été repris dans 200 µl de phospate buffered saline (PBS, Dulbecco A, Oxoïd Limited, Hampshire, Angleterre).

L’extraction de l’ADN et la PCRq en temps réel ont été réalisées comme décrit préalablement pour la quantification des cellules totales.

102 Etudes expérimentales – Chapitre 1

2.5. Analyses statistiques

Pour chaque condition, au moins deux expériences indépendantes ont été menées. Dans chaque expérience, au moins deux réplicats ont été réalisés. Les données présentées sont les valeurs moyennes ± l’écart-type. Les données ont été statistiquement analysées par une analyse de variance (ANOVA) à au moins deux facteurs à l’aide du logiciel Statgraphics Centurion XV version 15.2.00 (Statpoint Technologies Inc., SigmaPlus, Levallois-Perret, France).

Il a été considéré qu’une différence était significative lorsque la probabilité critique p-value était inférieure ou égale à 0,05. L’effet dû à la répétition des expériences et l’interaction entre les facteurs étudiés ont été pris en compte dans les analyses ANOVA.

103 Etudes expérimentales – Chapitre 1

3. Résultats

L’objectif de cette étude était de développer des milieux de culture modèles pour mimer le jus de saumon fumé et l’exsudat de viande.

La première étape a consisté en la caractérisation (i) de la distribution spatiale, (ii) des forces d’adhésion et (iii) de l’état physiologique de cellules de L. monocytogenes CCL500 cultivées sur des surfaces en acier inoxydable en présence de chacune des deux souillures alimentaires. La seconde étape était la recherche d’un milieu de culture synthétique pouvant mimer chaque souillure alimentaire. Pour cela, la croissance de L. monocytogenes CCL500 dans chaque souillure et plusieurs milieux de culture synthétiques a été étudiée. Ensuite, nous avons comparé la distribution spatiale, les forces d’adhésion et l’état physiologique de cellules de L. monocytogenes CCL500 cultivées sur des surfaces en acier inoxydable en présence de la souillure et du milieu de culture modèle potentiel sélectionné. Enfin, uniquement dans le cas du jus de saumon fumé, les expériences ont été poursuivies avec les trois souches de L. monocytogenes CCL128, CCL207 et LO28 pour valider le choix du milieu de culture synthétique retenu.

3.1. Etude des cellules de L. monocytogenes adhérentes sur l’acier inoxydable en présence de jus de saumon fumé ou d’exsudat de viande

3.1.1. Distribution spatiale des populations adhérentes

Les observations faites en microscopie à épifluorescence des populations adhérentes de L. monocytogenes CCL500 cultivées en présence de jus de saumon fumé ou d’exsudat de viande sur acier inoxydable après 24 heures à 25°C sont présentées dans la Figure 8 (photos A et B).

La distribution spatiale des populations sessiles de L. monocytogenes CCL500 était dépendante de la souillure utilisée comme milieu de culture. Dans le jus de saumon fumé, les cellules étaient séparées les unes des autres et réparties uniformément sur toute la surface (Figure 8 A). Au contraire, dans l’exsudat de viande, les cellules formaient de longues chaînes regroupées autour de précipités qui pourraient être des composés de l’exsudat de viande ou des expolymères (Figure 8 B).

104 Etudes expérimentales – Chapitre 1

Figure 8 : Observation au microscope à épifluorescence après marquage au Syto9 ® de cellules de L. monocytogenes CCL500 cultivées en présence de jus de saumon fumé (A), d’exsudat de viande (B), du milieu TSB/5 m (C) et du milieu BHI/20 pH 5,4 (D) sur acier inoxydable pendant 24 heures à 25°C.

3.1.2. Forces d’adhésion des cellules sur l’acier inoxydable

Les forces d’adhésion des cellules sessiles de L. monocytogenes CCL500 cultivées en présence de jus de saumon fumé ou d’exsudat de viande ont été évaluées en réalisant les droites de décrochement suite à des écouvillonnages successifs après 24 heures d’incubation à 25°C. Un exemple représentatif d’une droite de décrochement, pour chacune des deux souillures, est présenté dans la Figure 9. Les valeurs moyennes des pentes de décrochement sont récapitulées dans le Tableau 10.

Une différence significative ( p-value < 0,05) a été observée entre les deux souillures alimentaires. La valeur absolue de la pente est deux fois plus élevée dans le cas de l’utilisation du jus de saumon fumé. Comme décrit auparavant, plus la pente est forte, plus les forces d’adhésion sont faibles. Les forces d’adhésion des cellules cultivées sur l’acier inoxydable en

105 Etudes expérimentales – Chapitre 1 présence de jus de saumon fumé (pente = -2,03 ± 0,56) étaient donc plus faibles que celles des cellules cultivées avec l’exsudat de viande (pente = -0,99 ± 0,22).

En présence de jus de saumon fumé En présence d’exsudat de viande

Figure 9 : Exemple représentatif d’une droite de décrochement de cellules adhérentes de L. monocytogenes CCL500 cultivées en présence de jus de saumon fumé ou d’exsudat de viande pendant 24 heures à 25°C sur acier inoxydable et décrochées par écouvillonnages successifs. Le seuil de détection était de 1,3 log 10 (UFC/écouvillon). Seuls les écouvillons pour lesquels les valeurs de dénombrement étaient supérieures ou égales au seuil de détection sont représentés.

Souche Milieu de culture Pente P-value a CCL500 Exsudat de viande (n = 12) -0,99 ± 0,22 <0,05

BHI/20 pH 5,4 (n = 6) -1,78 ± 0,19 Jus de saumon fumé (n = 15) -2,03 ± 0,56 0,63

TSB/5 m (n = 12) -1,93 ± 0,49 CCL128 Jus de saumon fumé (n = 7) -1,56 ± 0,34 0,49

TSB/5 m (n = 7) -1,67 ± 0,19 CCL207 Jus de saumon fumé (n = 7) -1,44 ± 0,33 0,99

TSB/5 m (n = 7) -1,44 ± 0,42 LO28 Jus de saumon fumé (n = 7) -1,60 ± 0,71 0,41

TSB/5 m (n = 7) -1,63 ± 0,80 a : Les analyses statistiques visent à comparer deux milieux pour chaque souche. Les souches n’ont pas été comparées entre elles.

106 Etudes expérimentales – Chapitre 1

3.1.3. Quantification des populations sessiles selon leur état physiologique

La proportion de cellules adhérentes viables après culture en présence de chacune des deux souillures alimentaires a été mesurée par PCRq et PMA-PCRq en temps réel (Tableau 11).

Cellules Cellules Cellules Cellules totales (1) a viables (2) mortes cultivables log 10 (cellules/ml log 10 (cellules/ml) (1)-(2) log 10 (UFC/ml) Milieu de ) Souche culture Moyenne Moyenne Moyenne (% relatif aux Moyenne ± Ecart-type ± Ecart-type cellules ± Ecart-type totales) CCL50 Exsudat de 0 viande 8,11 ± 0,31 A 7,21 ± 0,31 B 0,90 (87%) 6,51 ± 0,23 C (n=8) BHI/20, pH 5,4 7,49 ± 0,17 D 6,52 ± 0,13 E 0,97 (89%) 6,07 ± 0,19 F (n=6) Jus de saumon 6,82 ± 0,36 A 5,78 ± 0,46 B 1,04 (91%) 5,85 ± 0,29 B (n=7) TSB/5 m 7,10 ± 0,25 A 6,26 ± 0,29 B, C 0,84 (86%) 6,33 ± 0,22 C (n = 7) CCL12 Jus de saumon 7,11 ± 0,59 A 6,17 ± 0,48 B 0,94 (87%) 5,77 ± 0,23 C 8 (n=7) TSB/5 m 7,03 ± 0,48 A 6,06 ± 0,40 B 0,97 (89%) 6,25 ± 0,30 B (n = 7) CCL20 Jus de saumon 5,63 ± 0,64 A 4,77 ± 0,51 B 0,86 (86%) 4,84 ± 0,37 B 7 (n=7) TSB/5 m 5,70 ± 0,66 A 4,63 ± 0,64 B, C 1,07 (92%) 4,44 ± 0,49 C (n=7) LO28 Jus de saumon 5,48 ± 0,48 A 4,38 ± 0,46 B 1,10 (92%) 4,61 ± 0,16 B (n=7) TSB/5 m 5,36 ± 0,43 A 4,34 ± 0,36 B, C 1,02 (91%) 4,33 ± 0,38 B (n=7) a : Les analyses statistiques visent à comparer deux milieux pour chaque souche. Les souches n’ont pas été comparées entre elles. Les lettres en exposant indiquent les différences significatives entre les trois états physiologiques pour chacune des souches.

107 Etudes expérimentales – Chapitre 1

Pour le jus de saumon fumé, tout comme pour l’exsudat de viande, la différence significative entre la quantité de cellules totales et la quantité de cellules viables indiquait qu’environ 90% des cellules adhérentes étaient mortes. Cependant, il y avait tout de même des différences entre les deux souillures : la quantité de cellules totales était significativement plus élevée après culture en présence d’exsudat de viande (8,11 log 10 (cellules/ml)) qu’en présence de jus de saumon fumé (6,82 log 10 (cellules/ml)). Un constat important était que dans le jus de saumon fumé, 100% des cellules viables étaient cultivables sur le milieu TSA (p-value = 0,98) alors que dans l’exsudat de viande, seulement 20% des cellules l’étaient (p-value < 0,05). Les résultats indiquent que l’exsudat de viande est un milieu de culture stressant induisant l’apparition de cellules VNC.

3.2. Comparaison du comportement des cellules de L. monocytogenes adhérentes cultivées avec du jus de saumon fumé ou de milieux synthétiques

3.2.1. Recherche d’un milieu de culture pouvant modéliser le jus de saumon fumé

Nous avons comparé la croissance de L. monocytogenes CCL500 dans le jus de saumon fumé et dans plusieurs milieux de culture synthétiques (TSB m, TSB/2 m, TSB/5 m, TSB/10 m, BHI m,

BHI/2 m, BHI/5 m et BHI/10 m) préparés pour mimer le jus de saumon fumé dans le but de sélectionner un potentiel milieu de culture modèle. Le comportement des cellules de L. monocytogenes CCL500 adhérentes sur l’acier inoxydable a ensuite été comparé en présence de jus de saumon fumé ou du milieu synthétique sélectionné. Comme décrit pour l’étude des deux souillures alimentaires, les critères de comparaison étaient la distribution spatiale, les forces d’adhésion relatives et l’état physiologique des cellules sessiles.

Les paramètres de croissance de L. monocytogenes CCL500 cultivée à 25°C dans le jus de saumon fumé et les milieux TSB et BHI plus ou moins dilués sont présentés dans le

Tableau 12. Prenant en compte le paramètre µDO , la croissance de L. monocytogenes CCL500 était la même dans le jus de saumon fumé et dans tous les milieux de culture synthétiques, mis

à part le milieu TSB/10 m dans lequel la croissance était plus lente ( p-value < 0,05). En considérant simultanément les deux paramètres de croissance µDO et DO max , seul le milieu

TSB/5 m n’était pas significativement différent du jus de saumon fumé. Par conséquent, le milieu

TSB/5 m était le milieu de culture qui a été retenu pour la suite de l’étude.

108 Etudes expérimentales – Chapitre 1

Tableau 12 : Paramètres de croissance des cellules de L. monocytogenes CCL500 cultivées dans le jus de saumon fumé et les milieux de culture synthétiques associés à 25°C

µDO DO max log 10 (DO/heure) DO Milieu de culture Moyenne Moyenne P-value a P-value ± Ecart-type ± Ecart-type Jus de saumon fumé 0,24 ±0,08 - 0,23 ± 0,04 - (n = 30)

TSB m (n = 15) 0,20 ± 0,07 0,25 0,43 ± 0,04 < 0,05

TSB/2 m (n = 15) 0,22 ± 0,04 0,57 0,31 ± 0,03 < 0,05

TSB/5 m (n = 15) 0,24 ± 0,06 0,63 0,23 ± 0,02 0,79

TSB/10 m (n = 15) 0,13 ± 0,04 < 0,05 0,12 ± 0,02 < 0,05

BHI m (n = 15) 0,18 ± 0,04 0,59 0,12 ± 0,02 < 0,05

BHI/2 m (n = 15) 0,21 ± 0,04 0,35 0,34 ± 0,02 < 0,05

BHI/5 m (n = 15) 0,22 ± 0,05 0,72 0,18 ± 0,01 < 0,05

BHI/10 m (n = 15) 0,19 ± 0,06 0,84 0,11 ± 0,01 < 0,05 a : Les analyses statistiques visent à comparer chaque milieu synthétique au saumon fumé. Les milieux de culture synthétiques n’ont pas été comparés entre eux.

La distribution spatiale des populations adhérentes de L. monocytogenes CCL500 était similaire pour le jus de saumon fumé (Figure 8 A) et le milieu TSB/5 m (Figure 8 C) après une incubation à 25°C pendant 24 heures. Les cellules étaient isolées les unes des autres et réparties uniformément sur toute la surface.

De plus, la pente de la courbe de décrochement des cellules cultivées dans le milieu TSB/5 m n’était pas significativement différente de celle des cellules cultivées en présence de jus de saumon fumé ( p-value = 0,31) (Tableau 10).

Aucune différence significative n’a été mise en évidence entre la quantité de cellules totales décrochées par écouvillonnage après culture en présence de jus de saumon fumé et du milieu

TSB/5 m (p-value = 0,23) (Tableau 11). La proportion de cellules viables et de cellules cultivables parmi les cellules totales était la même quel que soit le milieu de culture. Une différence significative ( p-value < 0,05) a été observée entre la quantité de cellules totales et la quantité de cellules viables, révélant ainsi que seulement environ 10-15% des cellules adhérentes étaient vivantes. Comme dans le jus de saumon fumé, le nombre de cellules viables

109 Etudes expérimentales – Chapitre 1 et celui de cellules cultivables n’étaient pas significativement différents quand les biofilms ont

été préparés avec le milieu TSB/5 m (p-value = 0,72).

D’après tous ces résultats, nous avons conclu que le milieu TSB/5 m peut être considéré comme un bon milieu de culture pouvant modéliser le jus de saumon fumé en prenant en considération les quatre critères de sélection.

3.2.2. Validation du milieu TSB/5 m comme milieu de culture modèle mimant le jus de saumon fumé

Pour valider le choix du milieu TSB/5 m comme substitut du jus de saumon fumé, nous avons étudié les mêmes critères de sélection que précédemment pour trois souches supplémentaires de L. monocytogenes CCL128, CCL207 et LO28 isolées de différents environnements.

Les résultats concernant les paramètres de croissance de L. monocytogenes CCL128, CCL207 et LO28 cultivées à 25°C dans le jus de saumon fumé et le milieu TSB/5 m sont présentés dans le Tableau 13. Pour les souches CCL128, CCL207 et LO28, le paramètre µDO n’était pas significativement différent dans le jus de saumon fumé et le milieu TSB/5 m (p-value = 0,06 ; 0,52 et 0,05 respectivement). Cette observation était la même pour les deux souches CCL128 et LO28 concernant le paramètre DO max (p-value = 0,19 et 0,57 respectivement). Pour la souche

CCL207, une différence significative a été constatée pour le paramètre DO max (p-value = 0,02).

Tableau 13 : Paramètres de croissance des cellules de L. monocytogenes CCL207, CCL128 et LO28 cultivées dans le jus de saumon fumé et le milieu TSB/5 m à 25°C

µDO DO max log 10 (DO/heure) DO Souche Milieu de culture Moyenne Moyenne P-value a P-value ± Ecart-type ± Ecart-type CCL128 Jus de saumon fumé (n = 10) 0,22 ± 0,06 0,24 ± 0,06 0,06 0,19 TSB/5 m (n = 10) 0,26 ± 0,05 0,23 ± 0,05 CCL207 Jus de saumon fumé (n = 10) 0,33 ± 0,14 0,25 ± 0,07 0,52 0,02 TSB/5 m (n = 10) 0,30 ± 0,03 0,21 ± 0,03 LO28 Jus de saumon fumé (n = 10) 0,29 ± 0,06 0,17 ± 0,02 0,05 0,57 TSB/5 m (n = 10) 0,34 ± 0,10 0,17 ± 0,04 a : Les analyses statistiques visent à comparer deux milieux pour chaque souche. Les souches n’ont pas été comparées entre elles.

110 Etudes expérimentales – Chapitre 1

Les observations faites par microscopie à épifluorescence des populations adhérentes de L. monocytogenes CCL128, CCL207 et LO28 cultivées avec du jus de saumon fumé ou du milieu TSB/5 m sur acier inoxydable pendant 24 heures à 25°C sont présentées dans la Figure 10. Quelle que soit la souche, les cellules adhérentes étaient isolées en présence de jus de saumon fumé (Figure 10 A, C et E) et du milieu TSB/5 m (Figure 10 B, D et F). La distribution spatiale des cellules était la même dans tous les cas mais la densité cellulaire était souche- dépendante. En effet, la souche CCL128 semblait plus adhérente que les souches CCL207 et LO28.

Figure 10 : Observation au microscope à épifluorescence après marquage au Syto9 ® de cellules de L. monocytogenes CCL207 (A et B), CCL128 (C et D), et LO28 (E et F) cultivées en présence de jus de saumon fumé (A, C et E) et du milieu TSB/5 m (B, D et F) sur acier inoxydable pendant 24 heures à 25°C.

La pente de la droite de décrochement des cellules cultivées en présence de jus de saumon fumé n’était pas significativement différente de la pente de la droite de décrochement des cellules cultivées en présence du milieu TSB/5 m et ce, pour les trois souches CCL128, CCL207 et LO28 (p-value = 0,49 ; 0,99 et 0,41 respectivement) (Tableau 10).

La population totale décrochée par écouvillonnage après culture en présence de jus de saumon fumé et du milieu TSB/5 m était équivalente en termes de quantité pour les trois souches CCL128, CCL207 et LO28 (p-value = 0,55 ; 0,58 et 0,06 respectivement) (Tableau 11). De plus, la même proportion de cellules viables et de cellules cultivables parmi les cellules totales

111 Etudes expérimentales – Chapitre 1 a été observée pour les deux milieux de culture. La différence significative entre la quantité de cellules totales et celle de cellules viables, pour les trois souches dans les deux milieux de culture, indiquait que la majorité des cellules adhérentes étaient mortes. Seulement 8 à 14% étaient viables. La totalité des cellules viables des deux souches CCL207 et LO28 décrochées par écouvillonnage suite à une incubation en présence de jus de saumon fumé ou du milieu

TSB/5 m étaient cultivables sur le milieu TSA. La seule différence significative concerne la souche CCL128 pour laquelle uniquement 40% des cellules viables formaient des colonies sur le milieu TSA.

3.3. Comparaison du comportement des cellules de L. monocytogenes adhérentes cultivées en présence d’exsudat de viande ou de milieux synthétiques

Comme décrit pour le jus de saumon fumé, nous avons ensuite comparé la croissance et le comportement des cellules de L. monocytogenes CCL500 dans l’exsudat de viande et différents milieux de culture synthétiques (TSB/10 pH 5,4 , TSB/15 pH 5,4 , TSB/20 pH 5,4 , BHI/10 pH 5,4 ,

BHI/15 pH 5,4 et BHI/20 pH 5,4 ).

Toutes les données de croissance bactérienne de L. monocytogenes CCL500 à 25°C dans l’exsudat de viande et les milieux de culture modifiés associés ont été obtenues par dénombrement des UFC et sont récapitulées dans le Tableau 14.

Tableau 14 : Paramètres de croissance des cellules de L. monocytogenes CCL500 cultivées dans l’exsudat de viande et les milieux de culture synthétiques associés à 25°C

µmax Nmax log 10 (UFC/heure) log 10 (UFC/ml) Milieu de culture Moyenne Moyenne P-value a P-value ± Ecart-type ± Ecart-type Exsudat de viande (n = 8) 0,19 ± 0,05 - 7,70 ± 0.13 -

TSB/10 pH 5,4 (n = 4) 0,19 ± 0,02 0,97 7,75 ± 0.05 0,47

TSB/15 pH 5,4 (n = 6) 0,13 ± 0,02 < 0,05 7,38 ± 0.17 < 0,05

TSB/20 pH 5,4 (n = 4) 0,19 ± 0,05 0,97 7,50 ± 0.12 < 0,05

BHI/10 pH 5,4 (n = 4) 0,20 ± 0,05 0,58 7,99 ± 0.05 < 0,05

BHI/15 pH 5,4 (n = 4) 0,16 ± 0,02 0,42 7,89 ± 0.35 0,19

BHI/20 pH 5,4 (n = 6) 0,21 ± 0,07 0,50 7,63 ± 0.27 0,55 a : Les analyses statistiques visent à comparer chaque milieu synthétique à l’exsudat de viande. Les milieux de culture synthétiques n’ont pas été comparés entre eux.

112 Etudes expérimentales – Chapitre 1

Prenant en compte simultanément les deux paramètres de croissance µmax et Nmax , les milieux TSB/10 pH 5,4 , BHI/10 pH 5,4 et BHI/20 pH 5,4 n’étaient pas significativement différents de l’exsudat de viande. Comme cette souillure semble être un milieu stressant pour L. monocytogenes (Tableau 11), nous avons décidé de retenir le milieu de culture synthétique le plus stressant, c’est-à-dire le milieu le moins riche en nutriments. Nous avons donc sélectionné le milieu BHI/20 pH 5,4 pour poursuivre les expérimentations.

La distribution spatiale des cellules adhérentes de L. monocytogenes CCL500 après 24 heures à 25°C dépendait du milieu de culture utilisé pour la préparation des biofilms. En effet, la distribution spatiale n’était pas la même quand les biofilms étaient réalisés avec l’exsudat de viande (Figure 8 B) ou avec le milieu BHI/20 pH 5,4 dans lequel les cellules étaient petites et séparées les unes des autres (Figure 8 D).

Les forces d’adhésion étaient également significativement différentes ( p-value < 0,05) : les cellules étaient deux fois plus adhérentes dans l’exsudat de viande que dans le milieu

BHI/20 pH 5,4 (Tableau 13).

Une différence significative ( p-value < 0,05) a également été observée entre les quantités de cellules totales décrochées par écouvillonnage : la quantité de cellules totales était plus faible de 0,6 log 10 (cellules/ml) dans le milieu BHI/20 pH 5,4 que dans l’exsudat de viande (Tableau 11). Pour les deux milieux de culture, la différence n’était pas significative entre la quantité de cellules totales et la quantité de cellules viables, indiquant qu’environ 90% des cellules adhérentes étaient mortes. De plus, d’après la différence significative observée, il y avait des cellules VNC (20% des cellules viables dans l’exsudat de viande et 35% dans le milieu

BHI/20 pH 5,4 ).D’après ces résultats mettant en avant de nombreuses différences, nous en avons conclu que l’exsudat de viande ne pouvait pas être remplacé par le BHI/20 pH 5,4 pour les expérimentations.

113 Etudes expérimentales – Chapitre 1

4. Discussion

4.1. Caractérisation du comportement de L. monocytogenes en présence de souillures alimentaires

Dans le but de développer par la suite des milieux de culture synthétiques pour remplacer l’utilisation du jus de saumon fumé et de l’exsudat de viande, le comportement des cellules adhérentes de L. monocytogenes a été étudié en présence de chacune de ces deux souillures alimentaires. L’exsudat de viande apparaît comme étant un milieu de culture plus stressant que le jus de saumon fumé. Dans l’exsudat de viande, les cellules adhérentes qui se sont développées sur l’acier inoxydable présentaient un phénotype de croissance sous forme de chaînettes caractéristique d’une division cellulaire incomplète et étaient plus fortement attachées que les cellules cultivées dans le jus de saumon fumé qui se divisaient correctement (Tableau 10 et Figure 8). Comme indiqué dans le Tableau 11, la croissance en présence d’exsudat de viande générait des cellules VNC, ce qui n’était pas le cas dans le jus de saumon fumé. De plus, la croissance bactérienne était plus lente dans l’exsudat de viande ( Nmax atteint en 48 heures) que dans le jus de saumon fumé ( DO max atteinte en 24 heures).

Une hypothèse pour expliquer toutes les différences observées entre le jus de saumon fumé et l’exsudat de viande repose sur la différence de pH qui est un stress environnemental pour les bactéries (6,2 pour le jus de saumon fumé contre 5,4 pour l’exsudat de viande). Schillinger et al. (1991) ont d’ailleurs montré que les cellules de L. monocytogenes survivaient mais n’étaient pas capables de se multiplier dans la viande à un pH de 5,6 – 5,8 ou dans les saucisses préparées avec cette viande. Cependant, la croissance était plus rapide dans les saucisses avec un pH plus élevé (6,3). De plus, il est probable que la concentration en sel impacte le nombre de cellules adhérentes sur les surfaces et leur agrégation (Belessi et al. , 2011 ; Jensen et al. , 2007). Néanmoins, d’après nos résultats, le faible pH de l’exsudat de viande semble être plus stressant que la forte concentration en NaCl du jus de saumon fumé.

Les résultats concernant la distribution spatiale (Figure 8), les forces d’adhésion relatives (Tableau 10) et l’état physiologique (Tableau 11) des populations adhérentes montrent que le comportement de L. monocytogenes dépend de la souillure alimentaire utilisée. Celle-ci influence l’état physiologique des cellules mais aussi l’efficacité des opérations de N&D (Gram et al. , 2007). Il faut donc que les procédures de N&D soient adaptées aux types de souillures présentes dans l’atelier agro-alimentaire pour maximiser l’élimination de L. monocytogenes .

114 Etudes expérimentales – Chapitre 1

4.2. Recherche de milieux de culture modèles

Pour comprendre le comportement de L. monocytogenes sur les surfaces, les études sont souvent fondées sur l’utilisation de milieux de culture conventionnels (Kalmokoff et al. , 2001 ; Ronner et Wong, 1993 ; Smoot et Pierson, 1998). Ceux-ci sont parfois remplacés par des souillures alimentaires qui visent à représenter les conditions rencontrées dans les environnements agro-alimentaires (Gram et al. , 2007 ; Hood et Zottola, 1997 ; Marouani-Gadri et al. , 2010 ; Midelet et Carpentier, 2002 ; Whitehead et al. , 2010). Comme Hwang (2009) le souligne dans son étude de modélisation de la croissance de L. monocytogenes dans le saumon et le milieu TSB, utiliser un bouillon de culture plutôt qu’un produit alimentaire ou une souillure présente de nombreux avantages concernant notamment la production, la conservation, la reproductibilité et l’homogénéité.

Pour reproduire autant que possible les conditions de production dans les ateliers, Huang et al. (2015) ont simulé des souillures alimentaires en ajoutant du glucose ou du NaCl dans les milieux TSB et BHI pour étudier la survie à la dessiccation de L. monocytogenes cultivées sur des surfaces en acier inoxydable. De façon similaire, dans notre étude, nous avons utilisé les milieux TSB et BHI comme milieux de culture de base que nous avons modifiés/dilués de manière à avoir un comportement bactérien similaire à celui obtenu avec les deux souillures alimentaires : le jus de saumon fumé et l’exsudat de viande. A notre connaissance, notre travail est le premier à porter sur une analyse comparative entre des souillures alimentaires et des milieux de culture synthétiques les modélisant.

Selon nos résultats portant sur la croissance bactérienne en milieu liquide, la distribution spatiale, les forces d’adhésion et l’état physiologique des populations de L. monocytogenes adhérentes sur acier inoxydable à 25°C, le milieu TSB/5 m peut modéliser le jus de saumon fumé. Ce choix a été validé avec quatre souches de L. monocytogenes de deux sérotypes différents et d’origines variées. Pour représenter le jus de saumon fumé, il est très important de prendre en considération les concentrations en composés phénoliques et en sel, car ces paramètres influencent la croissance de L. monocytogenes comme l’ont démontré plusieurs études (Cornu et al. , 2006 ; Hwang, 2009 ; Membré et al. , 1997 ; Porsby et al. , 2008). Après culture en présence de jus de saumon fumé et du milieu TSB/5 m, les cellules de L. monocytogenes ne formaient pas de micro-colonies, les cellules sessiles étaient isolées sur la surface (Figure 8 et Figure 10). Ces observations microscopiques sont en accord avec d’autres travaux précédents concernant L. monocytogenes (Hood et Zottola, 1997 ; Kalmokoff et al. , 2001).

115 Etudes expérimentales – Chapitre 1

Le nombre de cellules sessiles observées par microscopie à épifluorescence différait parmi les quatre souches de L. monocytogenes (Figure 8 et Figure 10), en accord avec la quantification par PCRq des populations totales (Tableau 11). La capacité d’adhésion de L. monocytogenes varie d’une souche à l’autre (Silva et al. , 2008), mais la relation entre la capacité à adhérer et le sérotype est encore controversée (Folsom et al. , 2006 ; Norwood et Gilmour, 1999).

En appliquant nos critères de sélection, nous n’avons pas trouvé de milieu de culture modèle parmi les milieux de culture testés pour remplacer l’exsudat de viande. Par ailleurs, Ellouze et Augustin (2010) ont également observé un comportement particulier de L. monocytogenes dans le bœuf haché. La croissance observée était plus faible que celle prédite par un modèle secondaire développé dans un bouillon de culture ou de la viande cuite. La nature de l’acide utilisé pour acidifier les milieux de culture synthétiques pourrait expliquer la différence observée. La présence d’acide lactique dans l’exsudat de viande engendrerait des conditions plus stressantes, l’acide lactique étant connu pour réduire la croissance des pathogènes (Zuliani et al. , 2007). Considérant la différence de distribution spatiale des populations sessiles observée après culture en présence d’exsudat de viande ou du milieu BHI/20 pH 5,4 (Figure 8), il paraît difficile de définir un milieu de culture mimant l’exsudat de viande. La formation de chaînettes par L. monocytogenes est une conformation typiquement observée dans les conditions stressantes. Renier et al. (2014) suggèrent que cette conformation est liée à l’inactivation de la voie SecA2. Les forces d’adhésion des cellules adhérentes cultivées avec l’exsudat de viande ou le milieu BHI/20 pH 5,4 étaient significativement différentes (Tableau 10). En d’autres termes, les cellules en agrégats étaient plus fortement adhérentes que les cellules isolées. Au contraire, Midelet et Carpentier (2004) ont montré que les micro- colonies formées par S. sciuri ou P. fluorescens étaient décrochées plus facilement que les cellules isolées. Une hypothèse pour expliquer la différence de forces d’adhésion entre l’exsudat de viande et le milieu BHI/20 pH 5,4 est la présence plus importante de protéines dans l’exsudat de viande qui augmente l’adhérence. Al-Makhlafi et al. (1994) ont démontré que plusieurs protéines dont la β-lactoglobuline par exemple, favorisaient l’adhésion de L. monocytogenes . Ces auteurs ont également pu observer que l’ajout de trypsine, une protéase, réduisait l’adhésion des cellules sur les surfaces.

Malgré les modifications des milieux de culture, nous n’avons trouvé aucun milieu comme étant approprié pour modéliser l’exsudat de viande. Ceci démontre que les milieux de culture de microbiologie conventionnelle qui sont souvent utilisés pour étudier le comportement de L. monocytogenes, ne sont pas représentatifs des souillures alimentaires, et donc peu représentatifs des conditions rencontrées par les micro-organismes dans les environnements

116 Etudes expérimentales – Chapitre 1 agro-alimentaires. Par exemple, Gram et al. (2007) ont démontré que les cellules de L. monocytogenes étaient mieux protégées des opérations de N&D en présence de souillures alimentaires plutôt qu’en présence de bouillons de culture. Par conséquent, les résultats et conclusions obtenus suite aux expérimentations réalisées avec des milieux de culture conventionnels ne sont pas forcément pertinents pour tenter d’expliquer ce qui se passe dans les environnements agro-alimentaires.

117 Etudes expérimentales – Chapitre 1

5. Conclusion et perspectives

Contrairement à l’exsudat de viande pour lequel aucun milieu de culture synthétique n’a été retenu, le milieu TSB/5 m peut modéliser le jus de saumon fumé selon les critères étudiés. Cependant, les travaux réalisés soulignent la difficulté d’obtenir un milieu de culture conventionnel qui peut représenter les souillures alimentaires présentes dans les ateliers agro- alimentaires.

Faute de pouvoir justifier scientifiquement le recours à un milieu de culture synthétique, il est préférable d’utiliser une souillure alimentaire qui correspond à la filière alimentaire concernée par l’étude menée en laboratoire pour se rapprocher autant que possible des conditions rencontrées sur le terrain, et améliorer ainsi la compréhension du comportement de micro- organismes dont notamment de L. monocytogenes sur les surfaces des ateliers de production pour prévenir et éviter leur persistance.

La présence de cellules de L. monocytogenes VNC durant la formation de biofilms en présence d’exsudat de viande peut présenter une menace supplémentaire pour ce secteur agro- alimentaire, et doit être prise en considération pour mieux appréhender ce risque.

Le choix du milieu de culture modèle était un travail préliminaire essentiel pour la suite des expérimentations menées pour cette thèse. Les critères de sélection ont été choisis pour répondre à notre thématique, à savoir que ceux-ci ont une importance pour expliquer la persistance microbienne (croissance, adhésion, etc.). Cependant, les critères de sélection sont à adapter à chaque projet de recherche. Le matériau utilisé pour la préparation des biofilms et le genre microbien peuvent par exemple être des facteurs à tester pour renforcer et valider le choix d’un milieu de culture synthétique pour modéliser une souillure alimentaire. Dans le cadre de la thèse, la validation du milieu TSB/5 m a été complétée par l’étude de l’expression des gènes des cellules adhérentes à l’acier inoxydable en présence de jus de saumon fumé et de ce milieu de culture modèle (Etudes expérimentales, Chapitre 3, Page 201).

L’exsudat de viande et le jus de saumon fumé ont été utilisés pour la réalisation des expériences de la thèse dans le but de simuler au mieux les conditions rencontrées dans les industries agro- alimentaires des filières « viande » et « poisson » lors de l’étude de l’impact de facteurs environnementaux sur la persistance de L. monocytogenes (Etudes expérimentales, Chapitre 2, Page 131). Pour faciliter certaines étapes et expériences, le jus de saumon fumé a été remplacé par le milieu TSB/5 m, notamment lors de la préparation de suspensions bactériennes, de la

118 Etudes expérimentales – Chapitre 1 sélection de souches favorisant l’adhésion de L. monocytogenes (Etudes expérimentales, Chapitre 2, Page 131) et de l’étude transcriptomique (Etudes expérimentales, Chapitre 3, Page 201).

119 Etudes expérimentales – Chapitre 1

6. Publication dans International Journal of Food Microbiology

Development of synthetic media mimicking food soils to study the behaviour of Listeria monocytogenes on stainless steel surfaces

Anaïs Overney, Danielle Chassaing, Brigitte Carpentier, Laurent Guillier, Olivier Firmesse *

Université Paris-Est, Anses, Laboratory for Food Safety

14 rue Pierre et Marie Curie 94701-Maisons-Alfort, France.

* Corresponding author. Tel.: +33 1 49 77 22 67; Fax: +33 1 49 77 46 66; E-mail address: [email protected]

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Etudes expérimentales – Chapitre 2

CHAPITRE 2 : Etude de facteurs environnementaux pouvant influencer la survie et la persistance de Listeria monocytogenes sur les surfaces

1. Contexte et objectifs

L’application quotidienne des opérations de N&D est la mesure la plus importante pour optimiser la maîtrise des risques liés à L. monocytogenes (Jessen et Lammert, 2003 ; Rotariou et al. , 2014). Cependant, quand les opérations d’hygiène sont mal réalisées et que la conception hygiénique des ateliers n’est pas optimale, des souches bactériennes peuvent s’établir dans l’environnement et y persister durant des mois voire des années (Autio et al. , 2003 ; Ferreira et al. , 2014 ; Lundén et al. , 2003b ; Møretrø et Langsrud, 2004 ; Tompkin, 2002 ; Wulff et al. , 2006). En effet, ces souches peuvent être protégées dans des zones de rétention et être ainsi potentiellement exposées à des concentrations sublétales de produits de N&D. La présence de cellules persistantes sur les surfaces en contact avec les denrées alimentaires est une source de (re)contamination de ces dernières (Lundén et al. , 2002 ; Reij et Den Aantrekker, 2004), ce qui représente un risque pour les consommateurs.

La capacité des cellules à adhérer aux surfaces et à y persister rend la contamination difficile à maîtriser et à éradiquer. L’élimination des cellules est toujours plus compliquée dès lors qu’elles ont adhéré aux surfaces, se multiplient, forment des biofilms et s’adaptent aux stress (Donlan, 2002 ; Møretrø et Langsrud, 2004 ; Pereira da Silva et Pereira De Martinis, 2013 ; Ronner et Wong, 1993). Par conséquent, il est important de trouver des moyens efficaces de prévenir l’établissement de L. monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires afin d’éviter la formation de biofilms et la persistance de ce pathogène.

Les opérations d’hygiène étaient au centre des expérimentations réalisées et décrites dans ce deuxième chapitre. Pour répondre à la nécessité d’appliquer des procédures de N&D plus respectueuses des manipulateurs et de l’environnement (Crepy, 2001 ; Hua et Reckhow, 2007), l’efficacité de deux protocoles de N&D pour réduire la population cultivable de L. monocytogenes a été comparée : (i) un protocole considéré comme peu respectueux de l’environnement faisant intervenir un détergent alcalin chloré et un biocide à base d’ammonium quaternaire et (ii) un protocole considéré comme relativement plus écologique avec un détergent enzymatique et un désinfectant à base d’acide peracétique.

131 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Après avoir mis au point les conditions permettant d’obtenir en laboratoire des populations survivantes de L. monocytogenes , l’objectif principal était de déterminer, grâce à un plan d’expériences fractionnaire, l’impact de cinq facteurs environnementaux retrouvés dans les ateliers agro-alimentaires sur la survie et la persistance de cellules de L. monocytogenes. Les études visant à déterminer l’effet d’un facteur (température, milieu de culture, souche, etc.) sur la formation de biofilms et/ou la persistance sont nombreuses. Néanmoins, les données disponibles dans la littérature scientifique sont parfois contradictoires et ne permettent pas toujours une généralisation des conclusions. Il n’était pas possible de prévoir si un facteur aurait un effet plus important qu’un autre sur la survie de L. monocytogenes . Nous avons donc retenu cinq facteurs pour la construction du plan d’expériences fractionnaire : (i) l’utilisation de jus de saumon fumé ou d’exsudat de viande comme milieu de culture, (ii) l’utilisation de deux matériaux ayant un statut hygiénique différent, (iii) l’utilisation de deux souches de L. monocytogenes présentant des profils de résistance à la dessiccation différents, (iv) la culture de L. monocytogenes en culture pure ou en co-culture avec une souche de Pseudomonas fluorescens qui favorise son adhésion et (v) l’application de quatre scénarios d’opérations d’hygiène incluant ou non une étape de séchage.

Pour répondre à cet objectif, des cellules adhérentes ont été soumises quotidiennement durant une semaine à une opération d’hygiène puis remises en culture par un dépôt de souillure alimentaire pour simuler en laboratoire l’alternance des opérations de N&D et des phases de production qui ont lieu dans les ateliers agro-alimentaires. Les cellules ont été quantifiées selon leur état physiologique par dénombrement des UFC, quantification des cellules totales par PCRq et des cellules viables par PMA-PCRq (Figure 11).

132 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Figure 11 : Schématisation de la démarche expérimentale.

133 Etudes expérimentales – Chapitre 2

2. Matériels et méthodes

2.1. Souches

Trois souches de L. monocytogenes ont été utilisées : CCL500 (sérotype 1/2b, origine : industrie laitière), EGD-e (isolat animal de sérotype 1/2a) et LO28 (isolat humain de sérotype 1/2c).

Concernant les biofilms préparés en co-culture, L. monocytogenes a été cultivée en présence de 35 souches de Pseudomonas principalement isolées lors d’une campagne de prélèvement dans un atelier de découpe de viande bovine (Khamisse, 2012) (Tableau 15), et de la souche de Staphylococcus capitis CCL54 isolée sur une ligne de pasteurisation de lait (Carpentier et Chassaing, 2004).

Tableau 15 : Souches de Pseudomonas utilisées pour la recherche d’une souche favorisant l’adhésion de L. monocytogenes

Origine Espèce Identifiant Atelier de désossage de viande P. fluorescens 09empf37, 09empf40, 09empf54, 09empf215, bovine (avant N&D) 09empf247 et 10empf18 P. psychrophila 10empf 60 et 10empf71 P. brenneri 10empf11 P. aeruginosa 09empf210 P. alicaligenes 10empf12 Atelier de désossage de viande P. fluorescens 09empf13, 09empf16, 09empf17, 09empf18, bovine (après N&D) 09empf29, 09empf42, 09empf45, 09empf49, 09empf70, 09empf72, 09empf79, 09empf87, 09empf90, 09empf283, 09empf272 et 10empf101 P. putida 09empf71, 09empf197, 09empf200, 10empf24 et 10empf30 P. mendocina 09empf92 P. grimontii 09empf59 Ligne de pasteurisation de lait P. fluorescens CCL49

134 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Les souches ont été repiquées et conservées comme expliqué dans le chapitre précédent (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.1, Page 97). Pour les expérimentations, les bactéries ont été remises en suspension dans un milieu de culture liquide dépendant de l’expérience à réaliser. La DO à 600 nm de la suspension bactérienne a été ajustée à la valeur souhaitée (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.1, Page 97).

2.2. Milieux de culture

Le jus de saumon fumé et l’exsudat de viande ont été préparés et utilisés comme détaillé dans le chapitre précédent (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.2, Page 97).

D’après les résultats obtenus lors de la recherche de milieux de culture pouvant modéliser des souillures alimentaires (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Page 95), il a été décidé d’utiliser le milieu TSB/5 m pour remplacer le jus de saumon fumé dans le cadre de certaines expériences pour faciliter leur réalisation.

Tous les milieux de culture ont été stérilisés par filtration sur une unité filtrante avec des pores de 0,22 µm de diamètre (Millipore, Saint-Quentin, France) munie d’une membrane pré-filtre avec des pores de 2 µm de diamètre (Millipore).

2.3. Sélection de produits et de protocoles de N&D

Les produits de N&D et les protocoles d’utilisation correspondants ont été fournis par la société Ecolab (Arcueil, France).

2.3.1. Protocole considéré comme peu respectueux de l’environnement

Dans le but de simuler au mieux les conditions actuelles rencontrées dans les ateliers agro- alimentaires, un protocole de N&D fréquemment utilisé a été retenu. Ce protocole fait intervenir un nettoyant alcalin chloré (Topax 66 dont la substance active principale est l’hypochlorite de sodium) et un désinfectant à base de QAC (Triquart MS contenant du BAC) (Tableau 16). Cette procédure de N&D est considérée comme peu écologique du fait de l’utilisation d’un produit chloré (Hua et Reckhow, 2007).

135 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Tableau 16 : Protocole de N&D considéré comme peu respectueux de l’environnement

Concentration Temps de Etape du protocole Température du produit a contact Prélavage à l’eau 55°C Nettoyage avec un détergent alcalin chloré 3% Ambiante 15 minutes (Topax 66) Rinçage intermédiaire à l’eau 55°C Désinfection avec un désinfectant à base de 2% Ambiante 30 minutes QAC (Triquart MS) Rinçage final à l’eau potable Ambiante a : Concentration d’utilisation des produits recommandée par le fournisseur.

2.3.2. Protocole considéré comme relativement respectueux de l’environnement

Pour répondre à l’objectif du projet EcoSec qui s’inscrit dans la thématique de la durabilité et du respect de l’environnement, la société Ecolab a proposé un second protocole de N&D. Celui- ci se déroule en trois étapes incluant un nettoyage avec un détergent enzymatique (VR2710- 2 LP, combinaison de protéases et de lipases), un nettoyage à base d’un détergent non chloré (Topmaxx 422 dont le principe actif est l’hydroxyde de sodium) pour désactiver le détergent enzymatique et enfin une désinfection avec un biocide à base d’acide peracétique (Topactive OKTO) (Tableau 17). Il est considéré comme plus respectueux de l’environnement que le protocole décrit dans Tableau 16, car il ne fait intervenir aucun produit chloré et l’acide peracétique se dégrade en acide acétique et en oxygène (Hua et Reckhow, 2007 ; Ölmez et Kretzschmar, 2009).

136 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Tableau 17 : Protocole de N&D considéré comme relativement respectueux de l’environnement

Concentration Temps de Etape du protocole Température du produit a contact Prélavage à l’eau 55°C

Nettoyage avec un détergent enzymatique 0,05% (VR2710-2) (VR2710-2 LP) utilisé dans un détergent 50°C 20 minutes alcalin (Topmaxx 422) 0,1% (Topmaxx) Rinçage intermédiaire à l’eau 55°C Nettoyage avec un détergent alcalin 3% Ambiante 15 minutes (Topmaxx 422) Rinçage intermédiaire à l’eau Ambiante Désinfection avec un désinfectant à base de 2% Ambiante 30 minutes QAC (Triquart MS) Rinçage final à l’eau potable Ambiante a : Concentration d’utilisation des produits recommandée par le fournisseur.

2.4. Réalisation de biofilms

2.4.1. Les matériaux

Deux matériaux ont été utilisés pour la préparation des biofilms : (i) l’acier inoxydable de finition 2 RB, AISI 304 (Laser 53, Bazougers, France) et (ii) la céramique non vernie (Argelith Bodenkeramik, Bad Essen, Allemagne).

Une partie des expérimentations a été réalisée avec des biofilms préparés selon le protocole « goutte » mais des biofilms ont également été préparés selon le protocole « piscine ». Pour ce faire, comme décrit par Peneau et al. (2007), il a été nécessaire de déposer un joint de silicone (Fischer, France) sur les bords de chaque coupon afin d’obtenir une zone qui pourrait être maintenue immergée.

Les coupons (4 cm x 2,5 cm) ont été préparés, lavés, autoclavés et séchés en conditions stériles comme décrit auparavant (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.4.1, Page 100).

Les coupons nécessaires à chaque expérimentation ont été répartis dans des boîtes de Petri de 90 mm de diamètre, lesquelles ont été placées dans de plus grandes boîtes contenant du papier absorbant humidifié avec de l’eau stérilisée pour maintenir une atmosphère humide et éviter la déshydratation des biofilms tout au long de l’expérience.

137 Etudes expérimentales – Chapitre 2

2.4.2. Protocole « goutte »

Pour discriminer rapidement les souches de Pseudomonas de notre collection (Tableau 15) pour sélectionner celles qui favorisaient l’adhésion des cellules de L. monocytogenes et vérifier que la souche de S. capitis CCL54 augmentait également la quantité de cellules adhérentes de

L. monocytogenes, des biofilms mixtes en présence du milieu TSB/5 m ont été réalisés sur des coupons en acier inoxydable selon le protocole « goutte » décrit dans le chapitre précédent (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.4.1, Page 100).

Les cellules de Pseudomonas ont été remises en suspension, la DO a été ajustée à 0,15 puis la suspension a été diluée au 1/100 ème (soit une concentration bactérienne de 10 6 UFC/ml). La DO de la suspension de S. capitis CCL54 a, quant à elle, été ajustée à 1,5 (soit une concentration bactérienne de 10 9 UFC/ml). Une suspension de cellules de L. monocytogenes a été préparée à une DO égale à 0,15 puis diluée au 1/10000 ème (soit une concentration de 10 4 UFC/ml).

• Biofilms préparés en mono-culture

Pour la réalisation de biofilms de L. monocytogenes en mono-culture, le protocole est identique à celui du chapitre précédent (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.4.1, Page 100).

• Biofilms préparés en co-culture

Cent microlitres de la suspension de Pseudomonas ou de S. capitis CCL54 ont été déposés au centre des coupons. Après une incubation de 3 heures à 25°C, les surfaces ont été rincées par écoulement de 25 ml d’EP. Les cellules adhérentes restantes ont été remises en culture par un dépôt de 100 µl de la suspension de L. monocytogenes puis incubées à 25°C pendant 21 heures.

2.4.3. Protocole « piscine »

Pour l’étude de l’efficacité des protocoles de N&D et les expériences du plan d’expériences fractionnaire décrit ci-après, les biofilms ont été préparés sur la totalité de la surface des coupons selon le protocole « piscine ».

• Mono-culture

Dans le cas de la préparation de biofilms visant à reproduire les conditions rencontrées dans les ateliers de la filière « poisson », les cellules de L. monocytogenes ont été remises en suspension

138 Etudes expérimentales – Chapitre 2 dans du milieu TSB/5 m. La DO a alors été ajustée à 1,5 (soit une concentration bactérienne de 10 9 UFC/ml).

Dans le cas de biofilms préparés en présence d’exsudat de viande, le volume nécessaire à l’expérimentation de la suspension de L. monocytogenes de DO égale à 1,5 a été préparé dans de l’EP, puis centrifugé à 2100 g pendant 10 minutes à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et le culot suspendu dans le même volume d’exsudat de viande.

Un millilitre de suspension bactérienne a été déposé sur chaque coupon. Après une incubation de 3 heures à 25°C, les cellules non-adhérentes ont été éliminées par écoulement de 25 ml d’EP. Ensuite, 1 ml de jus de saumon fumé ou d’exsudat de viande a été déposé pour recouvrir les cellules adhérentes et les coupons ont été incubés à 25°C durant 21 heures.

• Co-culture

Les cellules de Pseudomonas ont été remises en suspension dans de l’EP. La DO a été ajustée à 1,5 et diluée au 1/100 ème (soit une concentration bactérienne de 10 7 UFC/ml) dans le jus de saumon fumé ou l’exsudat de viande. Les cellules de L. monocytogenes ont également été mises en solution dans de l’EP. En revanche, la DO a été ajustée à 0,15 et ensuite diluée au 1/1000 ème (soit une concentration bactérienne de 10 5 UFC/ml) dans le jus de saumon fumé ou l’exsudat de viande comme décrit précédemment.

Pour la réalisation de biofilms mixtes, 1 ml de la suspension de Pseudomonas a été déposé sur la surface. Après une incubation de 3 heures à 25°C, les cellules non-adhérentes ont été éliminées comme décrit ci-dessus. Ensuite, 1 ml de la suspension de L. monocytogenes a été déposé sur la surface. Les coupons ont finalement été incubés à 25°C pendant 21 heures.

2.4.4. Simulation des conditions environnementales des ateliers agro-alimentaires par encrassements répétés des surfaces

Afin de simuler au mieux les conditions rencontrées dans les ateliers agro-alimentaires, l’alternance des phases de production et de N&D a été simulée par l’encrassement des surfaces et l’application des procédures d’hygiène quotidiennement durant une semaine (Marouani- Gadri et al. , 2010 ; Peneau et al. , 2007). La durée totale des expérimentations était de quatre jours, le premier jour étant celui au cours duquel l’opération d’hygiène a été appliquée pour la première fois.

139 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Les biofilms en mono ou en co-culture ont été réalisés selon le protocole « piscine ». Les coupons ont ensuite été rincés pour éliminer les cellules non-adhérentes en aspirant délicatement le surnageant avec une pipette, puis l’opération d’hygiène a été réalisée et les éventuelles cellules adhérentes restantes sur la surface remises en culture par un dépôt de jus de saumon fumé ou d’exsudat de viande et ce, quotidiennement durant quatre jours.

Dans ce protocole, une opération d’hygiène pouvait être l’application d’un protocole de N&D couplé ou non à une étape de séchage.

• Application des protocoles de N&D

Pour l’application de la procédure de N&D considérée comme peu écologique (Tableau 16), le protocole expérimental a été le suivant. Sur la surface, 1,5 ml d’eau stérilisée à 55°C a été déposé pendant 2 minutes, puis les coupons ont été traités avec les produits de N&D. Dans un premier temps, 1,2 ml de Topax 66 a été déposé sur chaque coupon et incubé ainsi à température ambiante pendant 15 minutes. Le produit a ensuite été éliminé délicatement avec une pipette. L’étape de rinçage intermédiaire a été réalisée avec 1,5 ml d’eau stérilisée à 55°C pendant 2 minutes. Dans un second temps, chaque coupon a été en contact avec 1,2 ml de Triquart MS pendant 30 minutes à température ambiante. Pour finir, les coupons ont été rincés avec 1,5 ml d’eau stérilisée pendant 2 minutes à température ambiante.

L’application des produits de N&D du protocole considéré comme plus respectueux de l’environnement (Tableau 17) a été faite de la façon suivante. Après un rinçage de 2 minutes avec 1,5 ml d’eau stérilisée à 55°C, les coupons ont été nettoyés avec 1,2 ml de détergent enzymatique VR2710-2 LP préparé dans du Topmaxx 422, le temps de contact étant de 20 minutes à 50°C. Suite au rinçage intermédiaire de 2 minutes avec 1,5 ml d’eau stérilisée à 55°C, la seconde étape de nettoyage a été réalisée en déposant 1,5 ml de Topmaxx 422 à température ambiante pendant 15 minutes. Les coupons ont ensuite été à nouveau rincés comme décrit ci-dessus avec de l’eau stérilisée à température ambiante puis désinfectés pendant 30 minutes à température ambiante avec 1,2 ml de Triquart MS. Les coupons ont finalement été rincés avec 1,5 ml d’eau stérilisée pendant 2 minutes à température ambiante.

Dans le cas où les cellules adhérentes ont été décrochées pour être dénombrées, une étape supplémentaire a été nécessaire après l’étape de désinfection. En effet, les résidus de désinfectant ont été inactivés par un dépôt sur la surface du neutralisant recommandé par la norme ISO 18593 (Anonyme, 2004) (1,5 ml appliqué pendant 5 minutes).

140 Etudes expérimentales – Chapitre 2

• Etape de séchage des surfaces par la déshumidification de l’air

Pour simuler le séchage dans les ateliers agro-alimentaires, le stress de dessiccation a été appliqué selon le protocole décrit par Zoz et al. (2016), en utilisant des boîtes hermétiques en plastique (longueur : 20 cm, hauteur : 13 cm, largeur : 6 cm, Lock & Lock, France) (Figure 12).

Figure 12 : Boîte de dessiccation utilisée pour l’application de l’étape de séchage à 75% HR à 25°C pendant 3 heures.

Les enceintes de dessiccation ont été désinfectées avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, deux petits ventilateurs de 4,1 W à 7 pales (80 mm de diamètre, Sunon, Radiospares, France) y ont été placés avec un voltage fixé à 5 V. Dans le fond de chaque boîte, une solution saturée en NaCl (VWR) a été déposée pour ajuster l’humidité relative à 75%. Avant chaque expérimentation, les boîtes utilisées ont été soumises aux UV pendant 30 minutes.

Après le rinçage des biofilms avec de l’eau à 55°C ou après le rinçage final de l’opération de N&D, les coupons ont été déposés dans des couvercles de boîtes de Petri de 90 mm de diamètre, puis placés dans les boîtes de dessiccation sur le support qui permet d’éviter tout contact avec la solution saline. Les boîtes de dessiccation ont été ouvertes le plus brièvement possible pour y introduire les coupons et éviter ainsi une grande variation de l’humidité relative. Durant les 3 heures d’incubation à 25°C, les ventilateurs étaient en fonctionnement. Une sonde de mesure

141 Etudes expérimentales – Chapitre 2 de la température et du % HR (EL-USB-2-LCD data logger, Dataq Instruments, Akron, USA) était également placée dans l’enceinte de dessiccation.

2.5. Méthodes de décrochement des cellules

2.5.1. Ecouvillonnage

Une des méthodes utilisées pour récupérer les cellules adhérentes était l’écouvillonnage avec des écouvillons dont l’embout était en coton (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.4.3, Page 101).

2.5.2. Traitement aux ultra-sons

Une autre méthode utilisée pour remettre les cellules adhérentes en suspension est le traitement aux ultra-sons (US). Dans ce cas, chaque coupon a été immergé dans des flacons stériles en plastique (VWR) contenant de l’EP (20 ml pour les coupons en céramique et 30 ml pour les coupons en acier inoxydable) et placé dans un bain de sonication (Delta220, Deltasonic, Meaux, France). Le traitement aux US a duré 4 minutes à 30°C (28 kHz, 150 W) (Asséré et al. , 2008).

2.6. Quantification des cellules selon leur état physiologique

2.6.1. Dénombrement des UFC

La cultivabilité de cellules de L. monocytogenes a été évaluée en termes d’UFC. Les suspensions bactériennes obtenues après écouvillonnage ou traitement aux US ont été diluées avec de l’EP, ensemencées avec un ensemenceur (Spiral WASP 2, AES, Combourg, France) sur milieu gélosé TSA dans le cas des biofilms en mono-culture ou ALOA (Agar pour Listeria selon Ottaviani et Agosti , Biomérieux, Marcy l’Etoile, France) dans le cas de la co-culture. Les UFC ont été dénombrées après une incubation à 37°C de 24 heures sur le milieu TSA ou 48 heures sur le milieu ALOA.

Les dénombrements des UFC de Pseudomonas et de S. capitis CCL54 dans les suspensions utilisées pour la préparation des biofilms en co-culture ont été faits sur le milieu TSA après une incubation de 24 heures, respectivement à 30°C et 37°C.

2.6.2. Quantification des populations totales par PCRq en temps réel

L’extraction d’ADN a été réalisée selon le protocole décrit dans le chapitre précédent (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.4.6, Page 101).

142 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Le protocole d’amplification et de détection par PCRq en temps réel était identique à celui suivi dans le chapitre précédent (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.4.6, Page 101), avec pour unique différence l’utilisation du kit Brilliant III Ultra-Fast SYBR ® Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies ®, Cedar Creek, USA). L’efficacité de l’amplification était d’au moins 86%. La limite de quantification était de 4.0 log 10 (UFC/ml).

2.6.1. Quantification des populations viables par PMA-PCRq en temps réel

Pour réaliser le traitement au PMA nécessaire à la quantification des cellules viables par PMA-PCRq en temps réel, nous avons suivi le même protocole que celui utilisé dans le chapitre précédent (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.4.7, Page 102). Par contre, dans ce cas, le traitement lumineux de 5 minutes à température ambiante pour fixer de façon covalente le PMA à l’ADN et inactiver les molécules libres de PMA a été réalisé avec un boîtier spécifique contenant des LED (PMA-lite TM LED Photolysis Device, Biotium, Hayward, United States).

2.7. Réalisation d’un plan d’expériences fractionnaire pour l’étude de facteurs environnementaux pouvant influencer la survie des cellules de L. monocytogenes

2.7.1. Le principe

Un plan d’expériences est une suite ordonnée d’essais d’une expérimentation, obtenue en contrôlant un ou plusieurs paramètres d’entrée pour obtenir des résultats sur un phénomène. Il est à distinguer du plan d’échantillonnage.

Dans un système avec plusieurs variables d'entrée et une variable de sortie, un plan d'expériences a pour objectif essentiel de quantifier les effets des variables d'entrée sur la variable de sortie en un nombre minimal d'expériences. Le plan doit permettre de sélectionner les variables/facteurs qui ont un effet significatif et de quantifier ces effets. Les modèles utilisés pour quantifier les effets sont généralement des modèles polynomiaux (les termes ai sont les effets principaux du facteur xi, les termes aij sont l’effet de l’interaction entre les facteurs i et j, et ε est l’erreur) :

= + + ∙ ∙ + ⋯ +

143 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Pour un plan factoriel complet, le nombre d’essais correspond à l’ensemble des combinaisons des niveaux pris par chaque facteur. p facteurs à respectivement n 1, n2, …, np niveaux, constituent un ensemble d’essais de n 1 × n2 × … × np combinaisons de niveaux. A titre d’exemple, la Figure 13 représente un plan complet de trois facteurs à trois niveaux, soit 27 expériences.

Figure 13 : Représentation d’un plan d’expériences complet de trois facteurs à trois niveaux.

Le plan factoriel complet est intéressant de par ses propriétés statistiques mais conduit à un nombre d’essais prohibitif dès lors que le nombre de facteurs est un tant soit peu grand (2 p dans le cas de p facteurs à deux modalités). Pour un plan factoriel complet, le nombre d’expériences à réaliser est égal au nombre de paramètres à estimer.

Un plan factoriel fractionnaire permet, quant à lui, de réduire le nombre d'essais d'un plan complet à p f acteurs. Il est possible de diviser le nombre d'essais par une puissance de 2 : on parle alors de plan 2 p-q, ce qui signifie que l’effet de p facteurs est apprécié avec 2 p-q essais et que le nombre initial d’essais est réduit de 2 q.

2.7.2. Le plan d’expériences suivi pour l’étude de l’impact de facteurs environnementaux pouvant influencer la survie des cellules de L. monocytogenes

Préparé à l’aide du package R PLANOR (Kobilinsky et al. , 2015 ; Monod et al. , 2012) (Annexe 2), le plan d’expériences proposé vise à évaluer l’effet de plusieurs facteurs environnementaux sur la survie de L. monocytogenes . Les facteurs étudiés dans le cadre de ce travail étaient les suivants :

144 Etudes expérimentales – Chapitre 2

- la souche de L. monocytogenes (deux niveaux) : la souche EGD-e (souche plus résistante à la dessiccation) et la souche LO28 (souche moins résistante à la dessiccation) (Zoz et al. , 2016), - le type de matériau de surface (deux niveaux) : l’acier inoxydable et la céramique, - la souillure utilisée comme milieu de culture (deux niveaux) : le jus de saumon fumé et l’exsudat de viande, - la présence ou non d’une souche favorisant l’adhésion de L. monocytogenes (deux niveaux) : en mono-culture ou en co-culture en présence de la souche de P. fluorescens 09empf87, - le scénario de l’opération d’hygiène (quatre niveaux) : N&D sans séchage, séchage quotidien sans N&D, N&D avec une étape de séchage quotidienne et N&D avec une étape de séchage uniquement en fin de semaine.

Le plan d’expériences complet comptant 64 expériences a été réduit à un plan fractionnaire de résolution III de 16 expériences (Tableau 18). Afin de compléter ce plan et renforcer les résultats concernant l’impact du scénario de l’opération d’hygiène faisant intervenir une étape de séchage, deux conditions supplémentaires ont été sélectionnées et réalisées (Tableau 18, lignes 17 et 18).

Chaque ligne du plan d’expériences fractionnaire correspond à la préparation de 24 biofilms selon le protocole d’encrassement et de N&D des surfaces décrit précédemment. Dans le cadre des expériences du plan fractionnaire, les produits de N&D ont été appliqués après dilution par rapport à la concentration recommandée par le fournisseur selon le facteur de dilution définie suite aux résultats décrits dans le paragraphe 3.3 de ce chapitre. Chaque jour, trois coupons ont été retirés de l’expérience avant l’application de l’opération d’hygiène (N&D et/ou séchage) et trois coupons après. Les cellules adhérentes de ces six coupons ont ensuite été décrochées par un traitement aux US, pour être quantifiées en termes de populations cultivables, viables et totales.

145 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Tableau 18 : Plan d’expériences fractionnaire suivi pour l’étude des cinq facteurs environnementaux

N° Culture a Matériau Scénario b Souche Souillure c 1 Mono-culture Inox N&D Lm EGD-e Viande 2 Mono-culture Inox N&D Lm EGD-e Saumon 3 Co-culture Céramique N&D Lm LO28 Viande 4 Co-culture Céramique N&D Lm LO28 Saumon 5 Co-culture Inox N&D et séchage quotidien Lm EGD-e Viande 6 Co-culture Inox N&D et séchage quotidien Lm EGD-e Saumon 7 Mono-culture Céramique N&D et séchage quotidien Lm LO28 Viande 8 Mono-culture Céramique N&D et séchage quotidien Lm LO28 Saumon 9 Mono-culture Céramique Séchage quotidien Lm EGD-e Viande 10 Mono-culture Céramique Séchage quotidien Lm EGD-e Saumon 11 Co-culture Inox Séchage quotidien Lm LO28 Viande 12 Co-culture Inox Séchage quotidien Lm LO28 Saumon 13 Co-culture Céramique N&D et séchage final Lm EGD-e Viande 14 Co-culture Céramique N&D et séchage final Lm EGD-e Saumon 15 Mono-culture Inox N&D et séchage final Lm LO28 Viande 16 Mono-culture Inox N&D et séchage final Lm LO28 Saumon 17 Mono-culture Inox N&D et séchage quotidien Lm EGD-e Saumon 18 Mono-culture Inox N&D et séchage final Lm EGD-e Saumon a : Préparation des biofilms en culture pure de L. monocytogenes (mono-culture) ou en présence de P. fluorescens 09empf87 (co-culture) b : Application quotidienne durant quatre jours du protocole de N&D avec les produits dilués au 1/10 ème (N&D), suivi d’une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) quotidiennement (N&D et séchage quotidien) ou uniquement le quatrième jour (N&D et séchage final) ou application quotidienne durant quatre jours uniquement de l’étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) (Séchage quotidien) c : Remise en culture des cellules adhérentes par un dépôt de jus de saumon fumé (Saumon) ou d’exsudat de viande (Viande)

146 Etudes expérimentales – Chapitre 2

2.8. Analyses statistiques

Pour chaque expérience, au moins deux réplicats biologiques indépendants ont été réalisés. Pour chaque réplicat biologique, au minimum deux réplicats techniques ont été faits.

Il est considéré qu’une différence est significative lorsque la probabilité critique p-value est inférieure ou égale à 0,05.

2.8.1. ANOVA

Pour les expériences concernant la recherche de souches psychrotrophes favorisant l’adhésion de L. monocytogenes , l’étude de l’efficacité des protocoles de N&D et la mise au point des conditions permettant l’obtention de populations survivantes, les données ont été statistiquement analysées par ANOVA à l’aide du logiciel Statgraphics Centurion XV version 15.2.00 (Statpoint Technologies Inc., SigmaPlus, Levallois-Perret, France). L’effet dû à la répétition des expériences et l’interaction entre les facteurs étudiés ont été pris en compte.

147 Etudes expérimentales – Chapitre 2

2.8.2. Analyses des données du plan d’expériences fractionnaire

Les données obtenues grâce au plan d’expériences fractionnaire (Tableau 18) ont été analysées avec le logiciel R 3.2.1 selon les codes détaillés en Annexe 3 et Annexe 4.

Pour évaluer l’effet de chacun des facteurs environnementaux testés, la quantité de cellules décrochées par traitement aux US le premier jour (J1) avant l’application de l’opération d’hygiène a été comparée à celle obtenue le dernier jour de la semaine (J4) après application de l’opération d’hygiène. Cette différence correspond à la valeur δ J1-J4 (Figure 15).

Afin de déterminer si l’effet de chaque facteur observé le dernier jour de la semaine (J4) était apparu rapidement ou non, la différence entre la quantité initiale de cellules avant l’application de l’opération d’hygiène le premier jour de la semaine (J1) et celle obtenue après l’opération d’hygiène chacun des jours suivants (Jx où x représente le numéro du jour) a été calculée. Ceci correspond aux valeurs δ J1-Jx (Figure 15).

Pour finir, nous avons également étudié l’évolution de l’efficacité de chaque scénario de l’opération d’hygiène au cours du temps. Dans ce but, pour chaque jour de la semaine, nous avons calculé la différence entre la quantité de cellules avant l’application de l’opération d’hygiène et la quantité restante sur la surface après cette opération, correspondant à l’efficacité de l’opération d’hygiène (Eff OH ) (Figure 15).

La fonction « lm » du logiciel R 3.2.1 a été utilisée pour adapter le modèle linéaire qui permet de quantifier l’effet de chacun des facteurs environnementaux testés à partir des valeurs δ J1-J4. L’importance de l’effet des facteurs testés au niveau 0,05 a été évaluée grâce à la fonction « Anova.lm ». L’application « effects » (Fox et al. , 2016) pour le logiciel R 3.2.1 a été utilisée pour établir la différence dans les niveaux de chacun des facteurs environnementaux testés. La fonction « fitdistcens » de l’application « fitdistrplus » (Delignette-Muller et Dutang, 2015) a été utilisée pour les niveaux de quantification de cellules où au moins un des dénombrements de cellules parmi les trois était en dessous de la limite de détection de la méthode.

148 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Figure 15 : Schématisation des valeurs calculées pour l’analyse des données obtenues avec le plan d’expériences fractionnaire. Les symboles des valeurs obtenues après les opérations d’hygiène sont légèrement décalés à droite de ceux obtenus avant les opérations d’hygiène. δ J1-Jx correspond à la différence entre la quantité de cellules avant l’application de l’opération d’hygiène à J1 et celle obtenue après l’opération d’hygiène chacun des x jours suivants. δ J1-J4 correspond à la différence entre la quantité de cellules avant l’application de l’opération d’hygiène à J1 et celle obtenue après l’opération d’hygiène à J4. Eff OH correspond à l’efficacité de l’opération d’hygiène.

149 Etudes expérimentales – Chapitre 2

3. Résultats

3.1. Sélection des souches favorisant l’adhésion de L. monocytogenes

3.1.1. Recherche d’une souche psychrotrophe de Pseudomonas

L’étude de la croissance bactérienne dans le milieu TSB à 10°C, condition souvent rencontrée dans les ateliers agro-alimentaires des filières « viande » et « poisson », nous a permis de sélectionner 35 souches psychrotrophes de Pseudomonas dans la collection du laboratoire (résultats non montrés).

Afin de déterminer si ces souches de Pseudomonas favorisaient l’adhésion de L. monocytogenes , des biofilms de 24 heures à 25°C ont été préparés sur acier inoxydable selon le protocole « goutte » par des dépôts successifs d’une des souches de Pseudomonas puis de la souche de L. monocytogenes LO28 en présence du milieu TSB/5 m. Les cellules adhérentes ont alors été récupérées par un traitement aux US puis dénombrées. Les résultats du criblage des 35 souches de Pseudomonas sont présentés dans la Figure 16 .

Parmi les 35 souches de Pseudomonas testées en co-culture, 31 ne favorisaient pas significativement l’adhésion des cellules de la souche L. monocytogenes LO28. Seules les souches de Pseudomonas 09empf29, 09empf42 et 09empf87 permettaient d’augmenter significativement la quantité de cellules cultivables de L. monocytogenes LO28 (p-value < 0,05).

La souche de P. fluorescens 09empf87 était celle qui favorisait le plus l’adhésion de la souche de L. monocytogenes LO28. L’augmentation significative de la quantité de cellules de

L. monocytogenes LO28 était de 3,7 log 10 (UFC/coupon) ( p-value < 0,05).

Ce résultat a été validé avec la souche de L. monocytogenes EGD-e pour laquelle la population cultivable avait augmenté de 4,3 log 10 (UFC/coupon) en moyenne en présence de la souche de P. fluorescens 09empf87.

Pour la suite des expérimentations, la souche de P. fluorescens 09empf87 a été retenue.

150 Etudes expérimentales – Chapitre 2

3.1.2. Culture de cellules adhérentes de L. monocytogenes en présence de la souche de S. capitis CCL54

Les travaux menés par Carpentier et Chassaing (2004) ont permis de démontrer que la présence de la souche de S. capitis CCL54 entraînait une augmentation de la quantité de cellules cultivables de souches de L. monocytogenes. Après avoir validé la croissance de cette souche à 10°C (résultats non montrés), nous avons vérifié qu’elle favorisait également l’adhésion des deux souches de L. monocytogenes LO28 et EGD-e dans nos conditions de culture.

Dans ce but, des biofilms de 24 heures à 25°C ont été réalisés sur acier inoxydable selon le protocole « goutte » par des dépôts successifs de la souche de S. capitis CCL54 puis de la souche de L. monocytogenes LO28 ou EGD-e en présence du milieu TSB/5 m. Les cellules adhérentes décrochées par traitement aux US ont ensuite été dénombrées.

D’après les résultats présentés en Figure 17, en présence de la souche de S. capitis CCL54, la quantité de cellules de L. monocytogenes LO28 et EGD-e était significativement plus importante (p-value < 0,05), respectivement de 2,8 et 2,1 log 10 (UFC/coupon) en moyenne. La

151 Etudes expérimentales – Chapitre 2 souche de S. capitis CCL54 favorisait donc l’adhésion des deux souches de L. monocytogenes sur l’acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m.

3.1.3. Distribution spatiale des cellules dans les biofilms mixtes

Des biofilms mixtes de 24 heures réalisés à 25°C avec le milieu TSB/5 m ont été préparés sur des coupons en acier inoxydable, colorés au Syto9 ® puis observés au microscope à épifluorescence (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.4.2, Page 100) (Figure 18).

D’après les résultats obtenus en mono-culture, les cellules de L. monocytogenes LO28 étaient isolées les unes des autres et réparties de façon homogène sur toute la surface. En co-culture avec P. fluorescens 09empf87, la distribution spatiale était similaire. Par contre, en présence de la souche de S. capitis CCL54, les cellules de L. monocytogenes LO28 étaient en chaînettes et regroupées autour d’amas de cellules de S. capitis CCL54.

152 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Figure 18 : Observation au microscope à épifluorescence après coloration au Syto9 ® de la population adhérente de L. monocytogenes LO28 cultivée seule (A) ou en présence de P. fluorescens 09empf87 (B) ou de S. capitis CCL54 (C) sur acier inoxydable à 25°C en présence du milieu TSB/5 m.

3.1.4. Bilan

Il s’est finalement avéré qu’il n’était pas possible d’utiliser les deux souches psychrotrophes (P. fluorescens 09empf87 ou S. capitis CCL54) favorisant l’adhésion de L. monocytogenes pour la suite des expérimentations, au risque de compliquer le plan d’expériences fractionnaire décrit précédemment.

La population adhérente de L. monocytogenes est plus importante en présence de

P. fluorescens 09empf87 (autour de 7,0 log 10 (UFC/coupon)) qu’en présence de

S. capitis CCL54 (autour de 6,0 log 10 (UFC/coupon)) (Figure 16 et Figure 17). De plus, la distribution spatiale des cellules adhérentes de L. monocytogenes n’étant pas modifiée en présence de P. fluorescens 09empf87 (Figure 18), il a donc été décidé d’utiliser cette souche, plutôt que la souche de S. capitis CCL54 pour la suite de ce travail. Ainsi, des modifications de la distribution spatiale des cellules adhérentes ne pourront pas être à l’origine de différences de résultats entre les conditions « biofilms en mono-culture » et « biofilms en co-culture ».

3.2. Test d’efficacité des protocoles de N&D

L’efficacité des protocoles de N&D proposés par la société Ecolab (Tableau 16 et Tableau 17) a été vérifiée dans les conditions de laboratoire. Pour ce faire, des biofilms de 24 heures de L. monocytogenes CCL500 ont été préparés selon le protocole « piscine » à 25°C en présence de jus de saumon fumé sur des coupons en acier inoxydable. Les protocoles de N&D ont été appliqués puis les cellules adhérentes résiduelles sur la surface ont été remises en culture par dépôt de jus de saumon fumé et ce, quotidiennement durant quatre jours. Les produits de N&D

153 Etudes expérimentales – Chapitre 2 ont été utilisés aux concentrations recommandées par le fournisseur. Les cellules adhérentes résiduelles ont ensuite été récupérées par écouvillonnage puis par traitement aux US. Les résultats des dénombrements sont présentés dans la Figure 19.

Figure 19 : Population cultivable de L. monocytogenes CCL500 adhérente sur acier inoxydable décrochée par écouvillonnage puis par traitement aux US, sans ou après application du protocole de N&D et remise en culture des cellules adhérentes restantes par dépôt de jus de saumon fumé quotidiennement durant quatre jours (n = 6 ou 12, soit 2 ou 4 expériences réalisées). Les seuils de détection étaient de 1,3 log 10 (UFC/coupon) et 2,8 log 10 (UFC/coupon) respectivement pour l’écouvillonnage et le traitement aux US.

Selon les résultats des prélèvements par écouvillonnage, une diminution significative (p-value < 0,05) de la quantité de cellules cultivables après l’application quotidienne durant quatre jours des protocoles de N&D a été constatée. La réduction, d’au moins

7,0 log 10 (UFC/ml), était telle que les valeurs obtenues étaient inférieures au seuil de détection de la méthode de dénombrement. L’efficacité du protocole de N&D a donc été vérifiée.

Pour les dénombrements faits après traitement aux US, les valeurs obtenues concernant l’acier inoxydable sont également sous le seuil de détection de la méthode de quantification

(soit 2,8 log 10 (UFC/ml)) et ce, pour les deux protocoles de N&D testés. En revanche, le traitement aux US appliqué sur les coupons en céramique a révélé la présence de cellules

154 Etudes expérimentales – Chapitre 2 cultivables après l’application quotidienne des opérations d’hygiène durant quatre jours consécutifs.

D’après les résultats obtenus, pour un matériau donné, aucune différence significative n’a été observée entre les deux protocoles de N&D.

3.3. Obtention de cellules survivantes sur acier inoxydable

L’étude portant sur les populations survivantes de L. monocytogenes, il a fallu mettre au point au laboratoire les conditions d’obtention de ces populations sur l’acier inoxydable qui est considéré comme un matériau hygiénique (Figure 19) (Boulangé-Petermann et al. , 1994 ; Taylor et Holah, 1996). La mise au point des conditions d’obtention des bactéries survivantes a donc été faite dans une situation plus drastique qu’avec le matériau en céramique considéré comme moins hygiénique. Ainsi, nous pouvons considérer que s’il y a des populations survivantes sur l’acier inoxydable, les conditions définies permettront d’en obtenir également sur les surfaces en céramique. Deux possibilités étaient envisageables pour obtenir les cellules survivantes : réduire le temps de contact des produits de N&D ou les diluer ; c’est cette seconde option qui a été retenue.

Pour ce faire, des biofilms de L. monocytogenes CCL500 ont été préparés sur des coupons en acier inoxydable selon le protocole d’encrassement et de N&D des surfaces défini. Ce travail a été réalisé uniquement avec le protocole de N&D considéré comme peu respectueux de l’environnement (Tableau 16) pour lequel le Topax 66 et le Triquart MS ont été dilués au 1/10 ème . Les cellules adhérentes résiduelles ont été décrochées par écouvillonnage puis par traitement aux US.

Les résultats présentés dans la Figure 20 montrent qu’aucune UFC n’a été dénombrée suite à l’écouvillonnage des surfaces. Toutes les valeurs étaient sous le seuil de détection de la méthode

(1,3 log 10 (UFC/coupon)). Par contre, suite au traitement aux US, 44% des valeurs de dénombrements d’UFC étaient supérieures au seuil de quantification. De plus, la dilution des produits de N&D au 1/10 ème était la dilution testée la plus faible permettant d’obtenir des cellules survivantes après l’application quotidienne durant une semaine du protocole de N&D (résultats non montrés). L’application des produits de N&D de ce protocole d’hygiène dilués au 1/10 ème a donc permis d’obtenir des populations survivantes sur les surfaces en acier inoxydable.

155 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Figure 20 : Population cultivable de L. monocytogenes adhérente sur acier inoxydable décrochée par écouvillonnage puis par traitement aux US, après application du protocole de N&D avec les produits non dilués ou dilués au 1/10 ème et remise en culture des cellules adhérentes restantes par dépôt de jus de saumon fumé quotidiennement durant quatre jours (n = 6, soit 2 expériences réalisées). Les seuils de détection étaient de 1,3 log 10 (UFC/coupon) et 2,8 log 10 (UFC/coupon) respectivement pour l’écouvillonnage et le traitement aux US.

3.4. Sélection de la méthode de décrochement des cellules

Lors de la réalisation des expériences de mise au point des conditions permettant d’obtenir les populations survivantes sur acier inoxydable, il a été constaté que les valeurs de dénombrement des cellules récupérées par écouvillonnage étaient généralement sous le seuil de détection de la méthode, contrairement aux valeurs de dénombrement des cellules décrochées par traitement aux US (Figure 20). Ces résultats indiquent que plus les cellules étaient stressées, plus leurs forces d’adhésion étaient élevées. L’écouvillonnage, méthode de décrochement des cellules plus douce que le traitement aux US, ne permettait donc pas de récupérer la majorité des cellules. Ces résultats sont en accord avec ceux d’études précédentes (Asséré et al. , 2008 ; Guðbjörnsdóttir et al. , 2005). Il a donc été décidé d’abandonner l’écouvillonnage au profit du traitement aux US, pour décrocher un maximum de cellules lors des expérimentations suivantes.

156 Etudes expérimentales – Chapitre 2

3.5. Etat physiologique des cellules adhérentes résiduelles lors de la simulation des conditions rencontrées dans les ateliers agro-alimentaires pendant une semaine

Chaque jour de la semaine, l’état physiologique des cellules sessiles a été étudié avant et après l’opération d’hygiène par dénombrement des UFC, PCRq et PMA-PCRq pour respectivement quantifier les cellules cultivables, totales et viables.

L’évolution des populations de L. monocytogenes EGD-e adhérentes sur les coupons en acier inoxydable après application quotidienne des opérations d’hygiène avec les produits de N&D dilués au 1/10 ème puis remises en culture avec du jus de saumon fumé est présentée dans la Figure 21.

Avant l’application de la procédure de N&D, les cellules viables étaient toutes cultivables. Les populations totales et viables atteignaient plus de 8 log 10 (cellules/coupon). Les quantités de cellules totales et de cellules viables diminuaient d’environ 1 log 10 (cellules/coupon) après la première opération de N&D puis restaient stables les jours suivants, respectivement autour de

7,2 et 6,5 log 10 (cellules/coupon) en moyenne.

Le nombre de cellules viables était toujours inférieur à celui de cellules totales. Nous avons en effet observé un écart allant de 0,3 à 1,4 log 10 (cellules/coupon) entre ces deux populations, indiquant qu’une partie des cellules adhérentes étaient mortes.

Quant aux cellules cultivables, leur nombre a diminué tout au long de la semaine. Dès le premier traitement de N&D puis les jours suivants, une différence entre la quantité de cellules viables et celle de cellules cultivables a été mise en évidence, traduisant qu’une fraction de la population était VNC.

157 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Figure 21 : Influence des opérations de N&D appliquées quotidiennement durant une semaine avec les produits de N&D dilués au 1/10 ème sur les cellules de L. monocytogenes EGD-e cultivables, viables et totales cultivées à 25°C sur acier inoxydable en présence de jus de saumon fumé. Le seuil de détection des cellules cultivables était de 1,3 log 10 (UFC/coupon) et celui des cellules viables et totales de 4 log 10 (cellules/coupon). Pour les mesures obtenues après les opérations de N&D, les symboles sont légèrement décalés à droite de ceux obtenus avant N&D (n = 6, 2 expériences).

3.6. Impact de facteurs environnementaux étudiés par un plan d’expériences fractionnaire

Après avoir défini les conditions permettant d’obtenir les populations survivantes, donc potentiellement persistantes, sur les surfaces en acier inoxydable, nous avons étudié par un plan d’expériences fractionnaire (Tableau 18) l’impact de cinq facteurs environnementaux retrouvés dans les ateliers agro-alimentaires sur ces populations : (i) la souche de L. monocytogenes , (ii) le type de matériau de surface, (iii) la présence ou non d’une souche favorisant l’adhésion des cellules de L. monocytogenes , (iv) la souillure alimentaire et (v) le scénario de l’opération d’hygiène.

Pour évaluer l’effet de chaque facteur environnemental testé, nous avons comparé la quantité de cellules décrochées par traitement aux US le premier jour (J1) avant l’application de l’opération d’hygiène et le dernier jour de la semaine (J4) après l’application de l’opération d’hygiène, ce qui correspond aux valeurs δ J1-J4 (Figure 15). En d’autres termes, plus l’écart

158 Etudes expérimentales – Chapitre 2 entre la population initiale (J1) et la population finale (J4) est petit, plus le facteur environnemental étudié est propice à la survie des cellules de L. monocytogenes . La survie bactérienne a été évaluée par dénombrement des UFC, par PCRq et par PMA-PCRq.

Les résultats des analyses statistiques concernant l’impact de chacun des cinq facteurs environnementaux testés sont présentés dans le Tableau 19.

P-value Facteurs environnementaux Cellules cultivables Cellules viables Cellules totales Souche de L. monocytogenes 0,30 0,23 0,51 Matériau de surface 0,06 0,14 0,10 Présence d’une souche favorisant l’adhésion de 0,08 0,71 0,26 L. monocytogenes Souillure alimentaire 0,89 0,60 0,13 Scénario de l’opération 0,004 0,02 0,05 d’hygiène

3.6.1. Effet de la souche de L. monocytogenes

Deux souches de L. monocytogenes ont été utilisées : la souche de L. monocytogenes EGD-e qui est résistante à la dessiccation et la souche de L. monocytogenes LO28 qui est relativement plus sensible à la dessiccation que la souche précédente (Zoz et al. , 2016). D’après les résultats

(Tableau 19), les valeurs de δ J1-J4 n’étaient pas significativement différentes entre les deux souches de L. monocytogenes concernant les populations cultivables, viables et totales (p- value = 0,30 ; 0,23 et 0,51, respectivement). L’absence d’effet de la souche de L. monocytogenes est valable pour tous les jours de la semaine (données non montrées).

3.6.2. Effet du type de matériau de surface

Aucune différence significative n’a été trouvée entre les surfaces en céramique et en acier inoxydable. Après l’application quotidienne durant une semaine des opérations d’hygiène,

159 Etudes expérimentales – Chapitre 2 les valeurs δ J1-J4 pour les populations cultivables, viables et totales n’étaient pas significativement influencées par le matériau de surface (p-value = 0,06 ; 0,14 et 0,10, respectivement) (Tableau 19). Ce résultat était valable quel que soit le jour de la semaine (données non montrées).

3.6.3. Effet de la présence d’une souche favorisant l’adhésion de L. monocytogenes

La présence de la souche de P. fluorescens 09empf87, qui favorise l’adhésion des cellules de L. monocytogenes, n’avait pas d’impact significatif sur la survie des populations de L. monocytogenes , et ce que les cellules soient cultivables (p-value = 0,08) ou viables (p-value = 0,71). La population totale de L. monocytogenes n’a pas non plus été significativement impactée par la présence de la souche de P. fluorescens 09empf87 (p-value = 0,26) (Tableau 19). Ce résultat était le même quel que soit le jour de la semaine (données non montrées).

3.6.4. Effet de la souillure alimentaire utilisée comme milieu de culture

La valeur δ J1-J4 n’était pas significativement différente quand les cellules étaient cultivées en présence soit de jus de saumon fumé soit d’exsudat de viande. Ce constat était valable pour les populations cultivables, viables et totales (p-value = 0,89 ; 0,60 et 0,13, respectivement)

(Tableau 19). Il n’y avait pas non plus de différence significative pour les valeurs de δ J1-Jx , indiquant l’absence d’effet de ce facteur tout au long de la semaine d’expérimentation (données non montrées). D’après ces résultats, nous avons conclu que les deux souillures alimentaires utilisées comme milieu de culture avaient la même influence sur la survie des cellules de L. monocytogenes .

3.6.5. Effet du scénario de l’opération d’hygiène

Le scénario de l’opération d’hygiène est le seul facteur environnemental étudié qui a eu un impact significatif sur les valeurs δ J1-J4 des populations cultivables, viables et totales (p-value = 0,004 ; 0,02 et 0,05, respectivement) (Tableau 19).

• Effet de chaque scénario

Les valeurs de δ J1-J4 pour chacun des quatre scénarios testés sont présentées dans la Figure 22. Pour évaluer plus précisément l’influence de chaque scénario sur la survie des cellules de L. monocytogenes , nous avons calculé la différence entre les valeurs de δ J1-J4

160 Etudes expérimentales – Chapitre 2 obtenues après le traitement de N&D (scénario pris pour référence car c’est la procédure d’hygiène actuellement la plus fréquemment suivie dans les ateliers agro-alimentaires) et les valeurs de δ J1-J4 obtenues après avoir appliqués les autres scénarios.

Figure 22 : Valeurs de δ J1-J4 pour les cellules cultivables, viables et totales pour chaque scénario d’opération d’hygiène testé.

Selon les résultats obtenus, une étape de séchage quotidienne est moins efficace pour réduire les populations survivantes qu’un traitement de N&D quotidien. En comparaison avec l’opération de N&D quotidienne, les valeurs de δ J1-J4 pour une étape de séchage quotidienne différaient de -0,95 ; -1,74 et -0,88 log 10 (cellules/coupon) respectivement pour les populations cultivables, viables et totales. Pour les populations totales et viables, les valeurs de δ J1-J4 étaient négatives quand le séchage quotidien était appliqué sans traitement de N&D préalable, indiquant que les cellules s’accumulaient sur les surfaces.

La procédure de N&D suivie d’une étape de séchage est plus efficace pour diminuer les populations adhérentes que le même traitement de N&D sans étape de séchage. Toutes les valeurs de δ J1-J4 étaient plus élevées quand le traitement de N&D était suivi d’une étape de séchage (Figure 22). De plus, l’efficacité sur les populations cultivables et viables était amplifiée quand l’étape de séchage était appliquée quotidiennement après l’opération de N&D plutôt qu’une seule fois à la fin de la semaine. En comparaison avec le cas où il n’y avait pas de séchage après la procédure de N&D, quand les étapes de N&D étaient suivies quotidiennement d’une étape de séchage, la valeur de δ J1-J4 était plus élevée de

5,87 log 10 (cellules/coupon) pour les populations cultivables et de 0,07 log 10 (cellules/coupon) pour les populations viables.

161 Etudes expérimentales – Chapitre 2

• Effet du scénario de l’opération d’hygiène au cours du temps sur les populations cultivables

Nous avons cherché à évaluer l’évolution de l’effet de chaque scénario de l’opération d’hygiène au cours du temps sur les populations cultivables. Dans ce but, pour chaque jour de la semaine, nous avons calculé l’efficacité de l’opération d’hygiène (Eff OH ) (Figure 15). Aucune différence significative n’a été mise en évidence entre les quatre jours de la semaine mais les résultats indiquent que l’efficacité de l’opération de N&D tendait à diminuer au cours de la semaine (Figure 23).

Figure 23 : Efficacité de chacun des scénarios de l’opération d’hygiène sur les populations cultivables à chaque jour de la semaine.

Enfin, afin de déterminer si l’effet du scénario de l’opération d’hygiène observé le dernier jour de la semaine était apparu rapidement ou non au cours de la semaine d’expérimentation, la différence entre la quantité de cellules cultivables avant l’application de l’opération d’hygiène le premier jour de la semaine et celle obtenue après l’opération d’hygiène chacun des x jours suivants a été calculée (Figure 15), correspondant aux valeurs δ J1-Jx présentées par la Figure 24. Pour chacun des scénarios, aucune différence significative n’a été observée entre les quatre

162 Etudes expérimentales – Chapitre 2 jours de la semaine. Ceci signifie que l’effet observé à J4 était le même dès J1, puis les jours suivants.

Figure 24 : Valeurs de δ J1-Jx pour les cellules cultivables pour chaque scénario de l’opération d’hygiène chacun des jours de la semaine en comparaison à la population cultivable initiale.

163 Etudes expérimentales – Chapitre 2

4. Discussion

4.1. Recherche de souches favorisant l’adhésion de L. monocytogenes

Afin de reproduire la formation de biofilms poly-microbiens présents dans les environnements agro-alimentaires (Dzieciol et al. , 2016 ; Langsrud et al. , 2015), et se placer dans des conditions « critiques » pour l’élimination de L. monocytogenes (van der Veen et Abee, 2011), nous avons cherché des souches bactériennes capables de favoriser son adhésion sur les surfaces, à savoir une souche de Pseudomonas et une souche de SCN car ce sont les espèces prédominantes dans certains ateliers après les opérations de N&D (Khamisse et al. , 2012), donc les espèces les plus susceptibles d’être en contact avec L. monocytogenes .

Les expériences réalisées ont permis de sélectionner deux souches permettant d’augmenter la quantité de cellules de L. monocytogenes adhérentes sur l’acier inoxydable : la souche de P. fluorescens 09empf87 isolée dans un atelier de découpe de viande (Figure 16) et la souche de S. capitis CCL54 isolée dans un atelier de la filière laitière (Figure 17). Carpentier et Chassaing (2004) avaient déjà montré l’augmentation de la population de L. monocytogenes sur des coupons en acier inoxydable en présence de cellules de S. capitis CCL54 et d’autres espèces de Pseudomonas .

Les observations en microscopie à épifluorescence des biofilms mixtes ont mis en évidence deux types de distribution spatiale des cellules adhérentes sur les coupons en acier inoxydable (Figure 18). Les cellules de L. monocytogenes co-cultivées en présence de cellules de P. fluorescens 09empf87 présentaient la même distribution spatiale que lorsqu’elles étaient cultivées seules : les cellules étaient isolées les unes des autres et réparties uniformément sur toute la surface. Au contraire, en présence de cellules de S. capitis CCL54, la distribution spatiale des bactéries était modifiée : les cellules de L. monocytogenes formaient des chaînettes regroupées autour d’amas de cellules de S. capitis CCL54.

Cette distribution spatiale a déjà été observée en microscopie électronique à balayage par Leriche et al. (2003). En effet, après avoir subi un traitement avec un produit alcalin chloré, les cellules de Kocuria sp . formaient des micro-colonies autour desquelles se trouvaient les cellules de S. sciuri . De plus, Carpentier et Chassaing (2004) avaient également observé la formation de micro-colonies sur l’acier inoxydable par les cellules de S. capitis CCL54. La disposition des cellules de L. monocytogenes autour de ces micro-colonies pourrait expliquer l’augmentation de la population de L. monocytogenes par un phénomène de co-agrégation.

164 Etudes expérimentales – Chapitre 2

4.2. Efficacité des protocoles de N&D et obtention de populations survivantes

4.2.1. Comparaison des deux protocoles de N&D

D’après les résultats obtenus (Figure 19), pour un matériau donné, aucune différence significative n’a été observée entre les deux protocoles de N&D qu’ils soient considérés comme peu respectueux de l’environnement (Tableau 16) ou au contraire relativement plus écologique (Tableau 17). Il est donc possible d’appliquer des procédures plus respectueuses de l’environnement tout en préservant l’efficacité des opérations de N&D pour l’élimination des cellules de L. monocytogenes .

Néanmoins, les détergents enzymatiques sont actuellement encore très peu utilisés, notamment du fait de leur coût et de leur spectre d’action moins large que celui des détergents alcalins chlorés. Les produits enzymatiques sont utilisés, plutôt ponctuellement comme traitement curatif, principalement pour le NEP de circuits fermés et de systèmes membranaires ou par trempage pour des petits équipements. De plus, leur application nécessite de respecter de nombreux paramètres, notamment la température, le pH et le temps d’application relativement long, ce qui n’est pas toujours adapté pour une utilisation optimale dans les ateliers agro- alimentaires.

Enfin, considérer le protocole faisant intervenir le détergent enzymatique puis un détergent alcalin non chloré (Tableau 17) comme étant plus respectueux de l’environnement que le protocole faisant intervenir uniquement un détergent chloré (Tableau 16) pourrait être remis en cause. En effet, ce protocole implique une étape de rinçage supplémentaire, augmentant la consommation d’eau et donc le volume d’eau à traiter. Par ailleurs, les changements de température sont plus importants pour assurer une activité optimale du détergent enzymatique, ce qui représente une surconsommation en énergie dans la configuration d’un atelier agro- alimentaire réfrigéré.

4.2.2. Comparaison des deux matériaux de surface pour un protocole de N&D donné

Pour un protocole de N&D donné et appliqué avec les produits préparés aux concentrations recommandées par le fournisseur, une différence entre les supports en acier inoxydable et en céramique a été mise en évidence lors de la récupération des cellules adhérentes par traitement aux US. La quantité de cellules adhérentes était plus importante sur le matériau en céramique que sur l’acier inoxydable (Figure 19). Il est connu que l’efficacité des opérations de N&D est dépendante du matériau car les surfaces ont différents degrés de rugosité (Whitehead et Verran,

165 Etudes expérimentales – Chapitre 2

2006). En effet, les aspérités présentes à la surface du matériau en céramique permettent la rétention de cellules, d’eau et de matières organiques (Mettler et Carpentier, 1999), ce qui est propice à la persistance microbienne (Carpentier et Cerf, 2011 ; Verghese et al. , 2011). La présence de ces cellules dans les aspérités du matériau représente un risque potentiel car les micro-organismes peuvent être transférés par simple contact entre la surface d’un équipement et l’aliment (Lundén et al. , 2002 ; Midelet et Carpentier, 2004).

4.2.3. Obtention de cellules survivantes sur acier inoxydable

Le protocole de N&D étant efficace, aucune cellule cultivable n’a été mise en évidence sur les coupons en acier inoxydable (Figure 19). Comme dans les études de Peneau et al. (2007) et de Marouani-Gadri et al. (2010), pour obtenir des cellules de L. monocytogenes survivantes, il a été nécessaire de diluer les produits de N&D. Après avoir testé plusieurs facteurs de dilution (résultats non montrés), il s’avère que l’application quotidienne durant une semaine des produits dilués au 1/10 ème a permis d’obtenir, sur des coupons en acier inoxydable, des cellules survivantes (Figure 20). Le choix de diluer les produits de N&D est pertinent car dans les environnements agro-alimentaires, un mauvais dosage des produits de N&D, tout comme la désinfection de surfaces mouillées, peut se traduire par la dilution des produits lors de leur utilisation (Berrang et Frank, 2012 ; Cerf et al. , 2010 ; Rückerl et al. , 2014). A des concentrations sub-inhibitrices, l’efficacité des désinfectants est réduite (Berrang et Frank, 2012 ; Martínez-Suárez et al. , 2016).

4.3. Choix de la méthode de décrochement des cellules adhérentes

Initialement, un même coupon était soumis successivement à un prélèvement de surface par écouvillonnage puis à un traitement aux US. Cependant, les résultats ont permis de démontrer que l’écouvillonnage ne permettait pas de récupérer la totalité des cellules adhérentes (Figure 20). De plus, plus les cellules étaient stressées suite à l’application des opérations de N&D, plus elles étaient adhérentes donc difficile à décrocher (Figure 20). Ce constat met en évidence le fait que les protocoles de N&D ne sont pas aussi efficaces que ce qu’il est possible de penser si seul l’écouvillonnage avait été utilisé pour décrocher les cellules adhérentes comme préconisé par la norme ISO 18593 lors de prélèvements de surface dans les environnements agro-alimentaires (Anonyme, 2004). La notion de propreté est donc à relativiser et à utiliser avec précautions selon le matériau de surface considéré et la méthode de prélèvement utilisée.

Pour les expérimentations réalisées dans cette étude, il a donc été décidé d’abandonner le décrochement des populations sessiles par écouvillonnage au profit du traitement aux US afin

166 Etudes expérimentales – Chapitre 2 de ne pas avoir de biais entre les conditions testées (plus ou moins stressantes) dû à la méthode de prélèvement.

Mais avoir recours uniquement au traitement aux US présente néanmoins quelques limites. Premièrement, contrairement à l’utilisation d’écouvillons, il n’est pas possible de faire des courbes de décrochement des populations adhérentes pour comparer les forces d’adhésion entre deux conditions de culture. En effet, la succession de traitements aux US engendre une perte de cultivabilité des cellules, ce qui entraînerait un biais dans les dénombrements d’UFC réalisés pour construire les courbes de décrochement. Deuxièmement, l’écouvillonnage permet de récupérer les cellules présentes à la surface du matériau alors que le traitement aux US permet de décrocher les bactéries situées dans les aspérités du matériau. La succession des deux prélèvements nous aurait permis de mieux estimer la quantité de cellules présentes dans les pores du matériau en céramique et la quantité de cellules présentes à la surface.

Dans notre cas, nous nous sommes intéressés aux populations décrochées des surfaces par écouvillonnage et/ou traitement aux US. Cependant, le risque de contamination persiste si des cellules restent attachées à ces surfaces, d’autant plus si elles sont viables. Etudier plus en détail les populations microbiennes que nous n’avons pas réussi à détacher pourrait compléter notre travail. Par exemple, les coupons ayant subi un traitement aux US pourraient être placés dans un milieu de culture nutritif (TSB ou BHI par exemple) afin de déterminer si des cellules y étaient toujours accrochées selon que le milieu devenait trouble ou non. Ceci a été fait pour certains coupons sélectionnés au hasard lors de la réalisation du plan d’expériences fractionnaire. Il s’avère que pour des coupons ayant subi des opérations d’hygiène, alors qu’aucune UFC n’avait été dénombrée sur gélose, la turbidité du milieu de culture avait pourtant été observée. Ce constat renforce le fait que les méthodes de prélèvement de surface (écouvillonnage et traitement aux US dans notre cas) ne permettent pas de décrocher toutes les bactéries. La quantification des cellules adhérentes et le risque de contamination associé sont donc sous-estimés (Cerf et al. , 2010).

4.4. Etat physiologique des cellules adhérentes après simulation des conditions rencontrées dans les ateliers agro-alimentaires pendant une semaine

L’état physiologique des cellules adhérentes sur acier inoxydable soumises à une opération de N&D quotidienne durant une semaine a été étudié. Les résultats obtenus (Figure 21) montrent qu’initialement toutes les cellules étaient viables et cultivables. De plus, une diminution significative a été constatée tout au long de la semaine uniquement pour les populations

167 Etudes expérimentales – Chapitre 2 cultivables ; les populations totales et viables, quant à elles, diminuent seulement après le premier traitement de N&D et restent ensuite stables autour de 6 log 10 (cellules/coupon) les jours suivants.

Comme cela a déjà été montré (Firmesse et al. , 2012), les résultats indiquent que les opérations de N&D engendrent uniquement une perte de cultivabilité des cellules et représentent un stress qui induit l’apparition de cellules VNC. Ces résultats accentuent l’intérêt de prendre en compte l’état VNC. Ceci pourrait conduire à (i) de nouvelles pistes pour améliorer les opérations d’hygiène, (ii) mieux caractériser le risque que représente L. monocytogenes dans les environnements agro-alimentaires par des méthodes de détection perfectionnées et (iii) expliquer des cas d’épidémies encore non élucidés. En effet, rien n’empêche que les bactéries VNC puissent retrouver leur capacité à se développer une fois en contact avec les produits alimentaires, puis se multiplier jusqu’à atteindre une concentration critique, voire entrainer des cas de listériose (Cappelier et al. , 2007 ; Oliver, 2005 ; Rowan, 2004).

4.5. Etude de l’impact de facteurs environnementaux sur la survie de L. monocytogenes

L’étude de l’influence de cinq facteurs environnementaux (la souche de L. monocytogenes , le matériau de surface, la présence d’une souche favorisant l’adhésion des cellules de L. monocytogenes , la souillure alimentaire et le scénario de l’opération d’hygiène) sur la survie de L. monocytogenes a été réalisée grâce à un plan d’expériences fractionnaire de résolution III (Tableau 18) (Kobilinsky et al. , 2015 ; Monod et al. , 2012). Ceci signifie que l’effet de chacun des facteurs étudiés a pu être déterminé mais que l’interaction entre les différents facteurs n’a par contre pas pu être estimée. Dans le cas d’un plan d’expériences de résolution IV ou V faisant intervenir moins de facteurs environnementaux, les conclusions auraient été plus précises. Cependant, le recours à un plan d’expériences de résolution III nous a tout de même permis d’optimiser l’exploration du poids de différents facteurs environnementaux sur la survie de L. monocytogenes et d’obtenir des conclusions solides sans avoir de connaissances préalables sur l’éventuel effet de chacun de ses facteurs.

4.5.1. Effet de la souche de L. monocytogenes

Alors que des études mettent en avant que la survie et la persistance de L. monocytogenes est souche-dépendante (Holch et al. , 2013 ; Wulff et al. , 2006), les deux souches de

168 Etudes expérimentales – Chapitre 2

L. monocytogenes utilisées dans le cadre du plan d’expériences fractionnaire ont des comportements similaires sur les surfaces étudiées (Tableau 19).

4.5.2. Effet du matériau de surface

Dans le cadre du plan d’expériences fractionnaire suivi, aucune différence significative n’a été démontrée entre le matériau en céramique et l’acier inoxydable concernant leur impact sur la persistance de L. monocytogenes (Tableau 19), bien que l’acier inoxydable soit considéré comme l’un des matériaux les plus hygiéniques (Boulangé-Petermann et al. , 1994 ; Taylor et Holah, 1996 ; Verran et al. , 2008). Ceci est probablement une conséquence de la dilution des produits de N&D pour nous permettre d’obtenir les populations survivantes d’intérêt.

4.5.3. Effet de la présence d’une souche favorisant l’adhésion de L. monocytogenes

Dans les environnements agro-alimentaires, les biofilms sont généralement composés de plusieurs genres et/ou espèces microbiens, favorisant les interactions entre les micro- organismes (Burmølle et al. , 2014). La croissance de L. monocytogenes et son adhésion sur les surfaces peuvent être favorisées, ou au contraire diminuées, par la présence d’autres bactéries. Guðbjörnsdóttir et al. (2005) ont d’ailleurs montré que la colonisation de surfaces en acier inoxydable était amplifiée par la présence de différentes espèces de Pseudomonas . En revanche, Leriche et Carpentier (2000) ont montré qu’une souche de S. sciuri réduisait l’adhésion de L. monocytogenes . De plus, l’interaction entre les espèces microbiennes peut permettre une meilleure tolérance aux stress environnementaux (Burmølle et al. , 2014). Il a par exemple été démontré que des cellules de L. monocytogenes cultivées avec des cellules de Lactobacillus plantarum pour former des biofilms sont plus résistantes à la désinfection que lorsqu’elles sont cultivées séparément (van der Veen et Abee, 2011)

Cependant, l’adhésion est seulement un des événements qui se produisent dans les ateliers agro- alimentaires et une augmentation du nombre de cellules adhérentes ne donne aucune information sur le sort après les opérations d’hygiène des cellules de L. monocytogenes quand elles sont associées à d’autres espèces bactériennes. D’après nos résultats (Tableau 19), la survie des cellules de L. monocytogenes n’est pas différente, qu’elles soient en présence ou non d’une souche qui favorise leur adhésion. La présence d’une souche qui augmente la population adhérente de L. monocytogenes n’est donc pas une nécessité pour la survie, et donc la persistance, de ce pathogène.

169 Etudes expérimentales – Chapitre 2

4.5.4. Effet de la souillure alimentaire utilisée comme milieu de culture

Les analyses statistiques n’ont pas mis en évidence de différence significative entre le jus de saumon fumé et l’exsudat de viande concernant leur impact sur la survie des cellules de L. monocytogenes (Tableau 19).

La présence de matières organiques sur les surfaces réduit largement l’efficacité des opérations de N&D (Kuda et al. , 2008 ; Lourenço et al. , 2009 ; Nyati et al. , 2012 ; Ruiz-Cruz et al. , 2007). Par exemple, les bactéries sont protégées des désinfectants en présence de lait (Best et al. , 1990 ; Kim et al. , 2007 ; Li et al. , 2014b). De plus, la présence de souillures a également un effet protecteur des cellules de L. monocytogenes contre d’autres types de stress comme la dessiccation (Kuda et al. , 2015 ; Takahashi et al. , 2011 ; Vogel et al. , 2010).

4.5.5. Effet du scénario de l’opération d’hygiène

Parmi les facteurs environnementaux testés dans le cadre du plan d’expériences fractionnaire, seul le scénario de l’opération d’hygiène a été mis en évidence comme ayant une influence significative sur la survie des cellules de L. monocytogenes (Tableau 19).

A notre connaissance, peu d’études axées sur la survie et la persistance bactérienne sont fondées sur la reproduction en laboratoire des conditions rencontrées dans les ateliers agro-alimentaires en alternant pendant plusieurs jours successifs l’application de procédures de N&D et des étapes de culture en présence de souillures alimentaires (Marouani-Gadri et al. , 2010 ; Peneau et al. , 2007). C’est pourtant un moyen de mimer au mieux, au laboratoire, la succession des opérations d’hygiène et des phases de production.

Les résultats obtenus (Figure 22) indiquent que l’application du séchage (3 heures à 75% HR à 25°C) sans traitement chimique préalable était moins efficace que l’opération de N&D. Le séchage des surfaces par la déshumidification de l’air ne peut donc pas remplacer l’utilisation de produits de N&D.

Il a même été constaté une accumulation de cellules sur les surfaces lorsque le séchage était appliqué en remplacement des opérations de N&D. Ceci n’est pas sans conséquence car l’accumulation de cellules, même mortes, représente une source d’éléments nutritifs et de débris permettant la croissance des cellules vivantes présentes à la surface et l’adhésion potentielle de nouvelles cellules. Les expérimentations réalisées par Fritsch (2016) ont montré que la phase de latence de cellules adhérentes ayant subi une phase de séchage était moins longue que celle

170 Etudes expérimentales – Chapitre 2 de cellules ayant subi d’autres stress comme un stress chaud (Guillier, 2005). Suite à une étape de séchage, la reprise de croissance est donc plus rapide que suite à une opération de N&D, ce qui pourrait expliquer que le séchage appliqué seul est moins efficace que l’application d’une procédure de N&D sans séchage.

Par contre, il a été montré que le séchage permettait d’optimiser le protocole de N&D et ce d’autant plus quand son application est quotidienne (Figure 22).

Comme décrit par Campdepadrós et al. (2012), les procédures de N&D permettent de réduire la quantité de micro-organismes mais ne parviennent pas à les éradiquer complètement. De plus, l’effet des opérations de N&D tend à diminuer au fil du temps (Figure 23), comme suggéré par le modèle conceptuel de Carpentier et Cerf (2011) (Figure 3). En effet, il a été démontré que plus les cellules adhèrent à la surface depuis longtemps, moins les procédures de N&D sont efficaces (Firmesse et al. , 2012 ; Marouani-Gadri et al. , 2010). Il est donc nécessaire d’améliorer les protocoles de N&D pour réduire et éviter la persistance bactérienne. Sécher les surfaces durant la production et/ou après les opérations d’hygiène permet une meilleure maîtrise de la croissance bactérienne sur les surfaces. La présence d’eau sur les surfaces favorise le développement de biofilms en 24 heures alors que le séchage peut significativement réduire les populations microbiennes (Fuster-Valls et al. , 2008 ; Rückerl et al. , 2014). Par le séchage des surfaces, les bactéries ayant survécu aux traitements de N&D doivent faire face à un stress supplémentaire. Ceci réduit leur croissance, les maintient dans un état de stress et peut même mener à la mort cellulaire.

En outre, Bang et al. (2014) ont également démontré que la diminution de la population cultivable adhérente sur du bois était plus importante quand l’application de produits d’hygiène

(ClO 2 appliqué 10 minutes à une concentration de 200 μg/ml) était suivie d’une étape de séchage (43% HR pendant 6 heures à 22°C) en comparaison avec le cas où le protocole de N&D était appliqué sans séchage. Cependant, la dessiccation semble plus efficace sur des biofilms récemment formés plutôt que sur des biofilms plus matures (Hansen et Vogel, 2011 ; Hingston et al. , 2013), renforçant l’hypothèse que la matrice extracellulaire joue un rôle important dans la protection des cellules adhérentes vis-à-vis des stress. De plus, les cellules en phase exponentielle sont plus sensibles au séchage que les cellules en phase stationnaire (Kuda et al. , 2008). Enfin, l’efficacité du séchage est optimale seulement si l’étape de nettoyage a été correctement réalisée : les souillures ayant un effet protecteur sur L. monocytogenes vis-à-vis de la dessiccation (Takahashi et al. , 2011 ; Vogel et al. , 2010).

171 Etudes expérimentales – Chapitre 2

L’étude de Zoz et al. (2016) indique que la succession de cycles « déshydratation - réhydratation » engendrait une plus grande diminution de la population microbienne qu’une seule étape de séchage, et ce d’autant plus lorsque la réhydratation est rapide. Il est supposé qu’une réhydratation instantanée induit une entrée rapide d’eau dans les cellules, ce qui conduit à leur mort du fait de la lyse des membranes alors qu’une réhydratation progressive est plus favorable au maintien de l’intégrité membranaire. Ces éléments pourraient permettre d’expliquer l’impact plus important d’un séchage quotidien en comparaison avec un séchage appliqué uniquement hebdomadairement. En effet, dans le premier cas, les cellules adhérentes subissent plusieurs étapes de séchage après N&D puis de réhydratation rapide lors de la remise en culture par un dépôt de souillure alimentaire alors que dans le second, les cellules ne subissent qu’une seule fois cette succession d’étapes.

172 Etudes expérimentales – Chapitre 2

5. Conclusion et perspectives

Cette étude nous a permis de mieux comprendre le comportement de L. monocytogenes sur les surfaces dans des conditions rencontrées dans les environnements industriels agro-alimentaires mais souligne la difficulté qu’est de réduire la présence de cellules sessiles persistantes et viables. En effet, les opérations d’hygiène engendrent uniquement une perte de la cultivabilité des cellules et entraînent l’apparition d’une population VNC. Cependant, nos résultats montrent qu’une étape de séchage quotidienne après le traitement de N&D permet d’optimiser l’efficacité des opérations d’hygiène.

Pour approfondir ce travail, plusieurs perspectives peuvent être évoquées, notamment (i) étudier plus précisément les interactions entre les souches bactériennes, (ii) compléter les résultats du plan d’expériences fractionnaire avec des expérimentations mettant en jeu d’autres souillures, d’autres matériaux, d’autres souches de L. monocytogenes et d’autres conditions de co-culture, et (iii) rechercher des conditions optimisées pour l’amélioration continue des opérations d’hygiène.

5.1. Etudier les interactions entre les espèces bactériennes

D’un point de vue plus fondamental, il serait intéressant de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les souches de P. fluorescens 09empf87 et S. capitis CCL54 favorisent l’adhésion de L. monocytogenes .

Pour ce faire, une des premières étapes serait de déterminer si la présence de la souche de Pseudomonas ou de SCN est nécessaire pour obtenir ce résultat ou si le surnageant de culture de ces deux souches est suffisant. En d’autres termes, il est question de savoir si l’effet obtenu est dû à la co-culture des souches ou à un élément sécrété dans le milieu de culture par la souche de Pseudomonas ou de SCN. Cependant, d’après l’étude de Carpentier et Chassaing (2004), le surnageant de culture de S. capitis CCL54 ne permet pas de favoriser l’adhésion des cellules de L. monocytogenes , la présence de cette souche est donc nécessaire pour favoriser l’adhésion de L. monocytogenes .

L’étape suivante serait de déterminer la nature des molécules intervenant dans l’interaction entre les souches. Par exemple, le surnageant de culture bactérienne pourrait être utilisé après traitement avec des protéases (comme la trypsine), ce qui permettrait de définir si les mécanismes d’interaction sont d’origine protéique. Toutefois, avant d’entamer de plus amples recherches sur ce point, il conviendrait de vérifier que les souches de Pseudomonas et de SCN

173 Etudes expérimentales – Chapitre 2 sont séquencées. Faute de quoi, il serait compliqué d’identifier les éventuels facteurs protéiques impliqués dans cette interaction.

Dans le cas de la souche de S. capitis CCL54, aucun lien n’a été mis en évidence entre la production d’exopolysaccharides et la capacité à augmenter la population adhérente de L. monocytogenes (Carpentier et Chassaing, 2004) mais il serait intéressant de déterminer si l’interaction entre la souche P. fluorescens 09empf87 et celle de L. monocytogenes est liée à la production de ces composés.

5.2. Compléter le plan d’expériences fractionnaire

5.2.1. Effet de la souche de L. monocytogenes

Il serait pertinent de compléter cette étude en utilisant un plus grand nombre de souches incluant des souches persistantes isolées sur le terrain.

5.2.2. Effet du matériau de surface

Comme décrit précédemment, une hypothèse expliquant la persistance bactérienne est la présence de niches de rétention pouvant abriter des cellules et des souillures (Carpentier et Cerf, 2011). Pour faire un lien avec le statut hygiénique des deux matériaux utilisés dans cette étude, il serait intéressant de les observer au microscope électronique à balayage, avant et après simulation des conditions rencontrées dans les ateliers agro-alimentaires par l’application quotidienne durant une semaine des procédures de N&D et remise en culture des cellules adhérentes par un dépôt de souillure alimentaire.

De plus, il pourrait être pertinent de compléter les résultats obtenus avec le plan d’expériences en réalisant des expérimentations avec d’autres matériaux présents dans les environnements agro-alimentaires (PVC, verre, polyuréthane souvent utilisé pour les tapis de convoyeurs, etc.), sur lesquels l’adhésion de cellules de L. monocytogenes a déjà été démontrée (Beresford et al. , 2001 ; Szlavik et al. , 2012). Des matériaux usés ou réutilisés d’une expérience à une autre pourraient également être étudiés, simulant ainsi une plus grande cohérence avec la réalité industrielle. En effet, un matériau usé est moins nettoyable et désinfectable que ce même matériau neuf (Beltarme et al. , 2015), ce qui pourrait influencer la quantité de cellules persistantes sur la surface.

174 Etudes expérimentales – Chapitre 2

5.2.3. Effet de la présence d’une souche favorisant l’adhésion de L. monocytogenes

La flore résidente d’un atelier de production, en plus d’augmenter la population de L. monocytogenes , peut également favoriser l’adhésion de cellules de L. monocytogenes en augmentant leurs forces d’adhésion. C’est une notion importante à prendre en compte car plus les cellules sont fortement adhérentes, plus il est difficile de les éliminer, favorisant ainsi leur persistance sur les surfaces. Il pourrait donc être intéressant de comparer les forces d’adhésion de cellules de L. monocytogenes cultivées en culture pure avec celles de cellules de L. monocytogenes co-cultivées en présence de la souche de P. fluorescens 09empf87.

Enfin, pour compléter cette étude, il conviendrait de réaliser les mêmes expériences avec la souche de S. capitis CCL54 sélectionnée lors des expériences préliminaires au plan d’expériences fractionnaire. En effet, la distribution spatiale des cellules adhérentes de L. monocytogenes étant modifiée en présence de la souche de S. capitis CCL54 (Figure 18), il se pourrait que l’évolution des populations adhérentes de L. monocytogenes , et donc sa persistance, soit différente.

Sachant que la présence de L. monocytogenes sur les surfaces est un équilibre avec les souches qui favorisent ou non son adhésion, une autre perspective consisterait en la réalisation de biofilms mixtes préparés avec un ensemble de souches pour se rapprocher au mieux des conditions de terrain.

5.2.4. Effet de la souillure alimentaire utilisée comme milieu de culture

L’utilisation d’autres souillures comme milieux de culture pourrait également compléter ce travail. Sachant que le lait et les produits laitiers peuvent être contaminés par L. monocytogenes (EFSA, 2013 ; InVS, 2015a), remettre en culture les cellules adhérentes en présence de lait après les opérations d’hygiène pour simuler les conditions rencontrées dans les ateliers de la filière laitière semble pertinent.

5.2.5. Effet du scénario de l’opération d’hygiène

Les résultats obtenus permettraient d’optimiser les procédures d’hygiène dans les environnements agro-alimentaires en y intégrant systématiquement une étape de séchage des surfaces avant la reprise de la production. En revanche, l’efficacité du séchage pourrait encore être améliorée. En effet, d’après les résultats présentés par Zoz et al. (2016), le séchage à 68% HR est plus délétère qu’à 75% HR. Tout en restant dans des conditions applicables dans

175 Etudes expérimentales – Chapitre 2 un atelier agro-alimentaire, il serait pertinent de reproduire certaines expériences à plusieurs humidités relatives, dont 68%, pour tenter d’optimiser le séchage pour (i) limiter la présence de zones humides dans les ateliers et (ii) augmenter l’impact de ce stress sur les cellules qui n’auraient pas été éliminées lors de l’opération de N&D. Ces expériences permettraient de compléter le modèle de microbiologie prévisionnelle créé dans le cadre du projet EcoSec en collaboration avec le partenaire IRSTEA.

Pour éviter l’apparition de résistance aux produits désinfectants chez les micro-organismes et maintenir une efficacité optimale des opérations d’hygiène, il est conseillé d’alterner les protocoles de N&D (Jaudon et al. , 2000). Dans le cadre de ce travail, il pourrait être intéressant d’étudier l’impact sur la persistance de L. monocytogenes de l’alternance des deux protocoles de N&D retenus dans le projet : un protocole actuellement fréquemment utilisé et considéré comme peu respectueux de l’environnement (Tableau 16) et un protocole faisant intervenir un détergent enzymatique considéré comme plus écologique (Tableau 17).

5.3. Adaptation aux stress

Malgré l’application de stress comme les opérations d’hygiène, les résultats obtenus dans ce chapitre mettent en évidence la capacité de L. monocytogenes à s’adapter à des conditions environnementales défavorables. Afin de mieux comprendre les mécanismes de réponse aux stress permettant la persistance et d’optimiser l’élimination des bactéries dans les industries agro-alimentaires, des connaissances fondamentales sont nécessaires sur les mécanismes cellulaires mis en place par les micro-organismes pour répondre aux stress et survivre.

176 Etudes expérimentales – Chapitre 2

6. Soumission dans International Journal of Food Microbiology

Soumission le 8 septembre 2016

Impact of environmental factors on the survival of Listeria monocytogenes under conditions encountered in food processing plants

Anaïs Overney, Joséphine Jacques-André-Coquin, Patricia Ng, Brigitte Carpentier, Laurent Guillier, Olivier Firmesse *

Université Paris-Est, Anses, Laboratory for Food Safety

14 rue Pierre et Marie Curie 94701-Maisons-Alfort, France.

* Corresponding author. Tel.: +33 1 49 77 22 67; Fax: +33 1 49 77 46 66; E-mail address: [email protected]

177 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Abstract

The ability of Listeria monocytogenes to adhere to and persist on surfaces for months or even years may be responsible for its transmission from contaminated surfaces to food products. Hence the necessity to find effective means to prevent the establishment of L. monocytogenes in food processing environments. The aim of this study was to assess, through a fractional experimental design, the environmental factors that could affect the survival of L. monocytogenes cells on surfaces to thereby prevent the persistence of this pathogen in conditions mimicking those encountered in food processing plants: culture with smoked salmon juice or meat exudate, use of two materials with different hygiene status, biofilm of L. monocytogenes in pure-culture or dual-culture with a Pseudomonas fluorescens strain, application of a drying step after cleaning and disinfection (C&D) and comparison of two strains of L. monocytogenes . Bacterial survival was assessed by culture, qPCR to quantify total cells, and propidium monoazide coupled with qPCR to quantify viable cells and highlight viable but non-culturable (VBNC) cells. Our results showed that failure to apply C&D causes cell persistence on surfaces. Moreover, the sanitation procedure leads only to a loss of culturability and appearance of VBNC populations. However, an additional daily drying step after C&D optimises the effectiveness of these procedures.

Keywords: Listeria monocytogenes, persistence, survival, drying, cleaning & disinfection, viable but non culturable

1. Introduction

Listeria monocytogenes is a zoonotic pathogen causing the rare but serious listeriosis (Donovan, 2015). This foodborne disease primarily affects the developing fetus during pregnancy and immunosuppressed individuals, leading to death in 15-30% of cases (Goulet et al. , 2012 ; Rocourt, 1996). Outbreaks are generally due to consumption of ready-to-eat products (Rocourt et al. , 2003 ; Tompkin, 2002), with contamination occurring throughout the food chain. L. monocytogenes is in fact distributed in many environments, including food processing plants.

To eliminate this pathogen in factories, cleaning and disinfection (C&D) procedures are performed daily and are some of the most important measures for L. monocytogenes risk control (Jessen et Lammert, 2003 ; Rotariou et al. , 2014). However, failure of C&D procedures have been reported to result in cases of survival of L. monocytogenes in several food processing

178 Etudes expérimentales – Chapitre 2 environments causing the apparition of persistent strains (Autio et al. , 2003 ; Ferreira et al. , 2014 ; Lundén et al. , 2003b ; Møretrø et Langsrud, 2004 ; Tompkin, 2002 ; Wulff et al. , 2006). Persistence can be defined as the repeated isolation of organisms of a specific molecular subtype from the same processing environment despite the frequent and correct application of C&D procedures (Carpentier et Cerf, 2011 ; Keto-Timonen et al. , 2007).

Thus, strains of L. monocytogenes can remain on equipment or surfaces in niches (Mettler et Carpentier, 1999) for several months or years (Carpentier et Cerf, 2011 ; Jessen et Lammert, 2003). These strains may be protected by retention areas and thus exposed to sublethal concentrations of sanitisers. What is of concern is that the presence of persistent cells on food-contact surfaces can be a source of recontamination (Lundén et al. , 2002 ; Reij et Den Aantrekker, 2004). The risk of cross-contamination by transfer of cells from surfaces and equipment to food products is a major threat to the food industry and consumers.

One hypothesis to explain persistence is the ability of bacteria to adapt to and survive environmental stresses such as nutrient deprivation, heat or cold temperatures, sanitisers and preservatives, desiccation, low pH, and high salt concentrations (Carpentier et Cerf, 2011 ; Melo et al. , 2015 ; Thévenot et al. , 2006). This ability to persist makes contamination difficult to control and eradicate. Elimination is even more difficult as cells adhere to several materials found in food processing environments, where they grow and form biofilms (Donlan, 2002 ; Møretrø et Langsrud, 2004 ; Pereira da Silva et Pereira De Martinis, 2013 ; Ronner et Wong, 1993). Microbial populations growing in biofilms can be difficult to destroy because they often have greater disinfectant resistance than planktonic organisms (Nakamura et al. , 2013 ; Pan et al. , 2006). Consequently, it is important to find effective means to prevent the establishment of L. monocytogenes in food processing environments to avoid biofilm formation and bacterial persistence.

Moreover, the multitude of adverse environmental conditions in food processing environments can lead to the appearance of viable but non-culturable (VBNC) cells that have lost their ability to form colonies on conventional culture media but remain alive (Li et al. , 2014a ; Oliver, 2005). Given that detection of L. monocytogenes in surface samples from food processing environments is based only on conventional microbiological methods, VBNC cells represent a real risk because they are not detected but are potentially a source of contamination of food products.

179 Etudes expérimentales – Chapitre 2

The aim of this study was to test environmental factors commonly found in food processing plants to determine their impact on the survival and persistence of L. monocytogenes cells. Environmental factors included (i) comparison of two different strains of L. monocytogenes strongly and weakly resistant to desiccation, (ii) use of two surface materials with a different hygiene status for biofilm formation, (iii) biofilm of L. monocytogenes in pure-culture biofilm or in dual-culture biofilm with a Pseudomonas fluorescens strain that promotes its adhesion, (iv) use of smoked salmon juice or meat exudate as culture medium, and (v) application of a drying step daily for a week or only once a week after C&D. For this purpose, sessile cells were subjected daily for a week to sanitation procedure and cultured with a food soil simulating in the laboratory the alternation of C&D and production steps. To study the impact of these environmental factors on the survival of L. monocytogenes , bacterial concentration evolution (the initial population compared to the remaining population after sanitation procedures applied daily for a week) was assessed by cell culture, quantitative PCR (qPCR) to quantify total cells, and propidium monoazide (PMA) coupled with qPCR (PMA-qPCR) to quantify viable cells and highlight VBNC cells.

2. Experimental procedures

2.1. Bacterial strains and culture conditions

Two strains of L. monocytogenes were used: LO28 (human isolate, 1/2c serotype) and EGD-e (animal isolate, 1/2a serotype). For dual-culture biofilms, L. monocytogenes was cultured in presence of the Pseudomonas fluorescens 09empf87 strain, which enhances the adhesion of L. monocytogenes on the surface (unpublished results).

Long-shelf-life stock cultures of the strains used in this study were stored at −80°C. They were used to inoculate tryptone soya agar (TSA, Biomérieux, Bruz, France) slopes incubated for 24 h at 25°C. These were then maintained at 4°C for no more than one month until use. The day before each experiment, the refrigerated culture was transferred to another TSA slope and incubated for 24 h at 25°C.

For pure-culture biofilm experiments with smoked salmon juice, L. monocytogenes cells were suspended in TSB/5 m, which is the culture medium developed to mimic this food soil (Overney et al. , 2016). The optical density (OD) at 600 nm of the suspension was adjusted to 1.5 (corresponding to a concentration of about 10 9 CFU/ml) in a 1.5-cm-diameter tube. For pure- culture biofilm experiments with meat exudate, bacteria were suspended in 1 g/l peptone water (AES Chemunex, Bruz, France) and the OD adjusted as described above. The volume of the

180 Etudes expérimentales – Chapitre 2 suspension necessary for the experiment was then centrifuged at 2100 g for 10 min at room temperature, the supernatant removed, and the pellet suspended in the same volume of filter- sterilised meat exudate.

For dual-culture biofilm experiments, bacterial suspensions were prepared differently. P. fluorescens cells were suspended in 1 g/l peptone water, the OD adjusted to 1.5, and then diluted to 1:100 (corresponding to a concentration of about 10 7 CFU/ml) in smoked salmon juice or in meat exudate. L. monocytogenes cells were suspended in 1 g/l peptone water, the OD adjusted to 0.15, and then diluted to 1:1000 (corresponding to a concentration of about 10 5 CFU/ml) in smoked salmon juice or in meat exudate.

2.2. Preparation of food soils

Smoked salmon juice and meat exudate were prepared as previously described (Midelet et Carpentier, 2004 ; Overney et al. , 2016). Prior to use, the required volume of food soil was thawed, centrifuged (2100 g, 10 min, 20°C) and the supernatant was then filter-sterilised through a 0.22-µm-pore-size Stericup filter with a 2-µm-pore-size prefilter (Millipore, Saint- Quentin-en-Yvelines, France).

2.3. Biofilm development

Biofilms were prepared on coupons (4 cm by 2.5 cm) in stainless steel (SS, 2 RB finish, AISI 304, Laser 53, Bazougers, France) or in ceramic (Argelith Bodenkeramik, Bad Essen, Germany). SS coupons were rubbed with a mixture of ethanol at 95% and acetone (3V/1V) to remove any manufacturing process debris and grease. As previously described by Peneau et al. (2007), a silicon joint sealant (Fischer, France) was applied along the edges of each coupon to obtain an area than could be kept flooded for experiments. Each SS and ceramic coupon was then washed and autoclaved (Aase et al. , 2000 ; Leriche et Carpentier, 1995). Lastly, SS surfaces were placed in 90-mm-diameter Petri dishes. To prevent dehydration of biofilms during incubation, each 90-mm-diameter Petri dish was then placed in a 120-mm-diameter Petri dish containing 25 ml of sterile water. Ceramic coupons were placed into sterilised boxes measuring 26 cm by 15 cm containing 50 ml of sterile water.

For pure-culture biofilms on ceramic and SS surfaces, 1 ml of the L. monocytogenes suspension prepared as described above was left on clean coupons. These were incubated at 25°C for 3 h to allow adhesion of bacteria. Then, the non-adherent bacteria were removed by pouring 25 ml

181 Etudes expérimentales – Chapitre 2 of 1 g/l peptone water over the bacterial deposit. A volume of 1 ml of filter-sterilised food soil was deposited so as to cover sessile cells. Lastly, coupons were incubated for 21 h at 25°C.

For dual-culture biofilms on ceramic and SS surfaces, 1 ml of the P. fluorescens suspension prepared as described above was deposited on coupons. After incubation at 25°C for 3 h, the non-adherent cells were removed as described above. Then, 1 ml of the L. monocytogenes suspension was left. The coupons were then incubated for 21 h at 25°C.

2.4. Repeated soiling and chemical treatments of the coupons

Repeating soiling and C&D procedures were applied without mechanical action (Marouani- Gadri et al. , 2010 ; Peneau et al. , 2007). The total duration of the experiments was 4 days taking as the starting point the day on which the first C&D was performed. Topax 66 (Ecolab, Arcueil, France) is a chlorinated alkaline cleaner used at a concentration of 3% (vol/vol). Triquart MS (Ecolab) is a quaternary ammonium-based disinfectant with a recommended concentration of 2% (vol/vol). Both chemical products are frequently used in the meat and fish industries. To obtain surviving populations on SS surfaces and then to study the impact of parameters on the survival of L. monocytogenes , Topax 66 and Triquart MS were used in our experiments at 1:10 of the doses recommended by the manufacturer.

After biofilm preparation and before treatment, the coupons were first rinsed to eliminate non- adhering cells by removing the supernatant with a pipette. Then, 1.5 ml of sterile water at 55°C was left for 2 min. The coupons were then treated with two chemical products. First, 1.2 ml of Topax 66 at 0.3% (vol/vol) was deposited on each coupon and left for 15 min at room temperature. The product was then removed in the same way. Afterwards, a rinsing step was performed with 1.5 ml of sterile water at 55°C for 2 min. Then, 1.2 ml of Triquart MS at 0.2% (vol/vol) was deposited on each coupon and left for 30 min at room temperature. Finally, coupons were rinsed with 1.5 ml of sterile water at room temperature for 2 min. Immediately after C&D, 1 ml of smoked salmon juice or meat exudate, sterilised by filtration, was deposited onto each coupon to simulate the food processing environment and to allow growth. The coupons were then re-incubated at 25°C.

After a C&D procedure and before enumeration, the disinfectant residues were inactivated by depositing 1.5 ml neutraliser, as recommended by ISO Standard 18593 (Anonymous, 2004) for 5 min.

182 Etudes expérimentales – Chapitre 2

2.5. Drying step

The drying step was performed as described by Zoz et al. (2016). To simulate desiccation in a food processing plant, hermetic plastic boxes (20 cm by 13 cm by 6 cm, Lock&Lock, France) were used. Drying chambers were disinfected with 70% ethanol. Then, two small ventilators of 4.1 W with a diameter of 80 mm and a height of 25 mm comprising seven blades (Sunon, Radiospares, France) were placed in each box with a voltage of 5 V. A saturated salt solution of sodium chloride (VWR, Fontenay-sous-Bois, France) was added at the bottom of the drying chambers to adjust the relative air humidity (RH) to 75%. Before each experiment, the container was treated for 15 min under UV light.

After the rinsing step with water at 55°C as described above, the coupons were deposited in a 90-mm-petri dish and then placed in a drying chamber on a rack to keep them above the salt solution. Therefore, the drying chamber was opened for just a short time to avoid high variation of the RH. Afterwards, the container was incubated for 3 h at 25°C and the ventilators were turned on for that time. A probe (EL-USB-2-LCD data logger, Dataq Instruments, Akron, USA) was placed in the container to measure the %RH and the temperature during the experiment.

2.6. Sonication

Sessile cells were removed from the surface by sonication which is able to remove more sessile cells than with swabbing with no harm to the cells (Midelet et Carpentier, 2002). Each coupon was immersed in a plastic bottle containing 1 g/l peptone water (20 ml for ceramic coupons and 30 ml for SS coupons) and placed in a Delta220 sonication bath (Deltasonic, Meaux, France). Ultrasounds were generated for 4 min at 30°C (28 kHz, 150 W) as described by Asséré et al. (2008).

2.7. Enumeration of CFU

Culturability of L. monocytogenes cells was assessed in terms of CFU. Suspensions from ultrasound treatments were diluted with 1 g/l peptone water, plated by spiral plating (WASP 2 spiral plater, AES Chemunex) on TSA in the case of pure-culture biofilms or on ALOA (Agar for Listeria according to Ottaviani and Agosti, Biomérieux) in the case of coculture. CFU were enumerated after incubation of 24 h on TSA or 48 h on ALOA at 37°C.

2.8. DNA extraction

183 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Samples of 2 ml of suspension obtained after sonication were centrifuged at 13000 g for 3 min at room temperature. The supernatant was removed and the pellet suspended in 200 µl of phosphate buffered saline 1X (PBS, Dulbecco A, Oxoid Limited, Hampshire, England, UK). Cellular DNA was then extracted using the MagNa Pure LC DNA isolation III kit (Roche Diagnostics, Meylan, France).

2.9. Enumeration of total L. monocytogenes cells by qPCR

Quantitative real-time PCR amplification and detection were performed with a LightCycler ® 2.0 System (Roche Diagnostics). Each reaction mixture (25 µl) was composed of 12.5 µl of Brilliant III Ultra-Fast SYBR ® Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies), 1.5 µl of molecular grade water, 0.5 µl of each hlyA gene DNA primers (Forward: 5’- TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’; Reverse: 5’-CACTGCATCTCCGTGG TATACTAA-3’) (Nogva et al. , 2000) used at a final concentration of 200 mM, and 10 µl of DNA solution extracted from the bacterial suspensions. The hlyA gene, encoding listeriolysin O, is a specific gene of L. monocytogenes . The amplification programme consisted of one cycle at 95°C for 10 min and 40 amplification cycles (95°C for 10 s, 60°C for 1 min and 70°C for 1 min). Water was included as a negative control in each PCR run.

For quantification, standard curves were obtained using DNA extracted from serial decimal dilutions of an L. monocytogenes suspension prepared as described above in 1 g/l peptone water with known CFU counts (Marouani-Gadri et al. , 2010). Standard curves were generated by plotting the threshold cycles (Ct) obtained after amplification against the CFU counts of the samples. The efficiency of amplification was at least 85%. The quantification limit was 4.0 log 10 (cells/coupon).

2.10. Enumeration of viable L. monocytogenes cells by PMA-qPCR

Before DNA extraction, propidium monoazide (PMA, Biotium, Hayward, United States) was added to the samples at a final concentration of 100 µM, following the method used by Nocker et al. (2007). PMA is a DNA intercalating agent that penetrates only bacteria with altered membranes (dead cells). Only the PMA-free DNA of viable cells is amplified by PCR. Samples were then incubated in the dark at room temperature for 5 min and exposed to light for 5 min, using a PMA-lite TM LED Photolysis Device (Biotium). Samples were then centrifuged at 13000 g for 3 min at room temperature, the supernatant was removed, and the pellet suspended in 200 µl of PBS 1X. DNA extraction and amplification were performed as described above.

184 Etudes expérimentales – Chapitre 2

2.11. Statistical analysis

For each experiment, at least two independent replicates were tested. Within each replicate, cell quantification was performed from three coupons.

First, to verify C&D effectiveness and define the conditions needed to obtain surviving cells on SS surfaces, data were processed statistically through a multi-way analysis of variance (ANOVA) using Statgraphics Centurion XV software, version 15.2.00 (Statpoint Technologies Inc., SigmaPlus, Levallois-Perret, France).

Then, a fractional factorial design was used to assess the impact of environmental factors on the ability of L. monocytogenes to survive. A full factorial design corresponds to 64 experiments for the five environmental factors: L. monocytogenes strain (2 levels), surface material (2 levels), presence of a strain enhancing L. monocytogenes adhesion (2 levels), food soil (2 levels), and scenario of sanitation procedure (4 levels). Using a fractional factorial design of resolution III, 16 experiments were carried out. The asymmetric fractional design (as the number of levels differs between factors) was generated with the Planor R package (Kobilinsky et al. , 2015 ; Monod et al. , 2012) using R 3.2.1 software. The sixteen combinations of factors generated are shown in Table 1; two additional experiments were carried out (Table 1). The lm function of the R 3.2.1 software was used to fit a linear model that quantifies the effect of the five environmental factors on δ d1-d4 values. The Anova.lm function was used to test for the significance of effect of factors at the 0.05 level. The package effect for R (Fox et al. , 2016) was used to test for differences within levels of each factor. The fitdistcens function of the R fitdistrplus package (Delignette-Muller et Dutang, 2015) was used for levels of cell counts where at least one of the enumerated coupons present had cell counts under the detection limits.

3. Results & discussion

3.1. Obtaining surviving cells on SS surfaces after repeated soiling and C&D treatments daily for a week

185 Etudes expérimentales – Chapitre 2

3.1.1. Conditions to obtain surviving cells

To verify the effectiveness of C&D products used for this study in laboratory conditions, C&D procedures were carried out daily for a week at the concentrations recommended by the manufacturer. Results are presented in Fig. 1. When undiluted C&D products were applied daily for a week on SS surfaces, the decrease of the CFU amount was around

5 log 10 (CFU/coupon), and all enumeration values were below the detection threshold

(2.8 log 10 (CFU/coupon)).

To obtain surviving populations on SS surfaces and then to study the impact of environmental factors on the survival of L. monocytogenes , Topax 66 and Triquart MS were used in our experiment at 1:10 of the concentrations recommended by the manufacturer to model what occurs in retention zones that cannot be reached by mechanical action of cleaning and where some water remains before product application (Marouani-Gadri et al. , 2010 ; Peneau et al. , 2007). With the C&D products diluted to 1:10, 44% of the values were higher than the detection threshold (Fig. 1). Moreover, this dilution was the smallest for which we had a population on SS surfaces after the application of C&D procedures daily for a week (data not published). The use of C&D products diluted to 1:10 enabled us to obtain surviving cells on SS surfaces in laboratory conditions. As reviewed by Martínez-Suárez et al. (2016), in food processing environments, dosage failure, such as disinfection of wet surfaces, can lead to sub- inhibitory concentrations of disinfectants, thus reducing their effectiveness.

3.1.2. Physiological state of sessile cells after repeated soiling and C&D treatments daily for a week

Each day of the week, the physiological state of sessile cells before and after C&D was assessed by CFU enumeration, qPCR to quantify total cells, and PMA-qPCR to quantify viable cells.

Changes in sessile L. monocytogenes EGD-e populations on SS coupons after daily C&D treatments with C&D products diluted to 1:10 and soiling with smoked salmon juice are presented in Fig. 2. Initially, all viable sessile cells were culturable and the total and culturable sessile cell counts reached more than 8 log 10 (cells/coupon). The total and viable cell counts decreased around 1 log 10 (cells/coupon) with the first C&D treatment of the week, and remained stable on the following days at around 7.2 and 6.5 log 10 (cells/coupon), respectively. The number of viable cells was always below that of total cells. We observed that there was a range between

0.3 and 1.4 log 10 (cells/coupon) between the total and viable cells counts, meaning that some sessile cells were dead. The culturable cell count decreased throughout the week. After the first

186 Etudes expérimentales – Chapitre 2

C&D treatment, a significant difference between the viable and the culturable cell counts appeared and remained on the following days. As already shown by Firmesse et al. (2012), our results indicate that C&D treatments lead only to a loss of culturability of cells and represent a stress inducing the appearance of VBNC cells. These results highlight the importance of taking into account the VBNC state, and could lead to new ways of improving sanitation procedures, to better characterisation of the L. monocytogenes risk in food processing plants by perfected detection methods, and could help to explain unsolved cases of outbreaks. Importantly, there is no reason to assume that VBNC bacteria cannot regain their ability to develop in food products, grow to reach a critical concentration, and cause disease (Cappelier et al. , 2007 ; Oliver, 2005 ; Rowan, 2004).

3.2. Impact of environmental factors commonly encountered in food processing plants on the survival of L. monocytogenes

After defining the conditions that enabled the survival of L. monocytogenes populations on SS surfaces, we studied the influence of five environmental factors found in food processing environments ( L. monocytogenes strain, surface material, presence of a strain enhancing L. monocytogenes adhesion, food soil, and scenario of sanitation procedure) on these populations, through a fractional design (Table 1). To assess the effect of each environmental factor, we compared the number of cells recovered by sonication between the first day (day 1) before stress application and the last day of the week (day 4) after stress application, corresponding to the Delta-values ( δ d1-d4 values). The narrower the gap between initial and final cell counts, the more the environmental factor promoted the survival of L. monocytogenes . Bacterial survival was assessed by CFU enumeration, qPCR and PMA-qPCR.

3.2.1. Impact of the L. monocytogenes strain

Two L. monocytogenes strains were used: L. monocytogenes EGD-e which is resistant to desiccation and L. monocytogenes LO28 which is relatively more sensitive to desiccation than

L. monocytogenes EGD-e (Zoz et al. , 2016). According to our results, δ d1-d4 values were not significantly different between the two L. monocytogenes strains concerning the culturable, viable and total populations (p-value = 0.30, 0.23 and 0.51, respectively) (Table 2).

Some studies suggested that surviving and persistent bacteria are genetically distinct from transient strains (Autio et al. , 2003 ; Holch et al. , 2013 ; Wulff et al. , 2006). Based on this hypothesis, many studies focused on looking for the presence or absence of specific genes to explain the ability to persist (Mazza et al. , 2015). Studies have demonstrated by molecular

187 Etudes expérimentales – Chapitre 2 typing that persistent strains all belonged to the same genetic group (Wulff et al. , 2006), corresponding to the clonal complex CC121 (Holch et al. , 2013). This suggests that some genotypes of L. monocytogenes are more likely than others to persist.

For other authors, bacterial persistence is a stochastic event that cannot be explained by specific genetic characteristics (Carpentier et Cerf, 2011 ; Ferreira et al. , 2014 ; Stasiewicz et al. , 2015). On the basis of this hypothesis, bacteria persist because they can adhere to surfaces, grow and adapt to stress conditions. It is sometimes explained that bacteria are persistent because they are more sessile than non-persistent bacteria (Borucki et al. , 2003 ; Norwood et Gilmour, 1999 ; Wang et al. , 2015), but this difference is disputed (Djordjevic et al. , 2002). Other results suggest that strains can persist because they are more resistant to chemical products used for C&D (Aase et al. , 2000 ; Lundén et al. , 2003a). However, the difference in sensitivity to disinfectants between persistent and transient bacteria is not always demonstrated (Holah et al. , 2002 ; Kastbjerg et Gram, 2009 ; Lourenço et al. , 2009 ; Magalhães et al. , 2016 ; Wang et al. , 2015).

3.2.2. Impact of the surface material

No significant difference was found between SS and ceramic surfaces. After sanitation procedures applied daily for a week, the quantity of culturable, viable and total populations was not influenced by the surface material (p-value = 0.06, 0.14 and 0.10, respectively) (Table 2), although SS is considered one of the most hygienic materials (Verran et al. , 2008). This result is probably the consequence of the dilution of C&D products.

It is well established that the effectiveness of C&D depends on the surface material, because surfaces have different degrees of roughness (Garry 1994; Bang et al, 2014). Each irregularity represents a potential retention zone for water, organic matter and microorganisms, and can enhance bacterial persistence (Verghese et al. , 2011). For example, holes formed during the manufacturing process of materials are important retention areas for microorganisms (Mettler et Carpentier, 1999). Moreover, Beltarme et al. (2015) showed that worn materials are less hygienic than new materials. The harbourage sites cannot be reached by mechanical action and some water may collect before product application. This is why, in our study, chemical products were diluted to obtain a surviving population on surfaces and were applied without mechanical action.

3.2.3. Impact of the presence of a strain enhancing L. monocytogenes adhesion

188 Etudes expérimentales – Chapitre 2

The presence of Pseudomonas fluorescens 09empf87 which enhances L. monocytogenes adhesion did not significantly impact the survival of L. monocytogenes , whatever the physiological state of cells (p-value = 0.08 for culturable cells, 0.71 for viable cells and 0.26 for total cells) (Table 2).

In food processing environments, biofilms are generally composed of several bacterial species promoting interactions between microorganisms (Burmølle et al. , 2014). The growth of L. monocytogenes and its adherence to surfaces may be favoured or, conversely, reduced by the presence of other bacteria. Guðbjörnsdóttir et al. (2005) showed that colonisation of SS surfaces by L. monocytogenes was enhanced by the presence of several species of Pseudomonas . In contrast, Staphylococcus sciuri reduced adhesion of L. monocytogenes probably because of competition for nutrients and the anti-adhesive properties of S. sciuri (Leriche et Carpentier, 2000). However, adhesion is only one of the events that occur in processing plants and an increase in the number of sessile cells does not give any indication of the fate of L. monocytogenes after C&D when associated with another bacterial species. Nevertheless, according to our results, L. monocytogenes was identically surviving with or without the presence of a strain which favoured its adhesion on surfaces.

3.2.4. Impact of the food soil

The difference between initial and final cell counts was not significantly different when cells were cultured in presence of smoked salmon juice or meat exudate. This result was true for culturable, viable and total populations (p-value = 0.89, 0.60 and 0.13, respectively) (Table 2). From these results, we concluded that the two tested food soils influence the survival of L. monocytogenes in the same way.

Overney et al. (2016) demonstrated that the food soil had an impact on L. monocytogenes growth and its behaviour (spatial distribution, adhesion forces and physiological state) on SS surfaces. Furthermore, the presence of organic matter on surfaces greatly reduced the effectiveness of C&D (Jaudon et al. , 2000 ; Lourenço et al. , 2009 ; Nyati et al. , 2012 ; Ruiz- Cruz et al. , 2007). For instance, the presence of milk protected bacteria from disinfectants (Kim et al. , 2007 ; Li et al. , 2014b). Moreover, the presence of organic matter had a protective effect on L. monocytogenes cells against other types of stress, such as desiccation (Vogel et al. , 2010).

3.2.5. Impact of sanitation procedure

189 Etudes expérimentales – Chapitre 2

The scenario of the sanitation procedure was the only environmental factor that had a significant impact on the δ d1-d4 values of the culturable, viable and total populations (p-value = 0.004, 0.02 and 0.05, respectively) (Table 2). To assess the influence of each sanitation procedure on L. monocytogenes survival, we can calculate the difference between

δ d1-d4 values obtained after daily C&D and δ d1-d4 values obtained with other scenarios of sanitation procedures. Daily C&D is used as a reference because it is currently the most common procedure used in food processing plants.

According to our results, a daily drying step was less effective than the daily C&D to reduce the surviving populations. The δ d1-d4 values for daily drying step were lower by -0.95, -1.74 and -0.88 log 10 (cells/coupon) respectively for culturable, viable and total populations (Fig. 3) compared to daily C&D. For viable and total populations, δ d1-d4 values were even negative when only daily drying was applied, indicating that cells accumulated on surfaces.

C&D with a drying step was more effective in decreasing sessile populations than C&D without a drying step. All δ d1-d4 values were higher when C&D were followed by a drying step (Fig. 3). Moreover, the efficacy on culturable and viable populations was enhanced when the drying step was applied daily for a week rather than just once at the end of the week. When the drying step was applied daily after C&D, the δ d1-d4 value was higher by 5.87 log 10 (cells/coupon) for the culturable populations, and higher by 0.07 log 10 (cells/coupon) for the viable populations compared to the value obtained for the procedure with no drying step after C&D (Fig. 3).

To our knowledge, very few studies on bacterial survival are based on reproducing the conditions encountered in food processing plants in the laboratory by alternating C&D procedures and culture steps with food soils over several days, to mimic the succession of C&D and production steps (Marouani-Gadri et al. , 2010 ; Peneau et al. , 2007). As described by Campdepadrós et al. (2012), sanitation procedures were able to reduce the L. monocytogenes load, but not to eradicate the microorganisms completely. It is particularly important to improve C&D in order to reduce and prevent bacterial persistence. Drying surfaces during production and/or after C&D enables greater control of bacterial growth on surfaces. The presence of water on surfaces favours the development of biofilms in 24 h, whereas drying can significantly reduce the bacterial population (Fuster-Valls et al. , 2008 ; Rückerl et al. , 2014). By drying surfaces, bacteria surviving C&D undergo an additional stress that reduces their growth and can lead to cell death. Fluctuations in relative humidity are an effective way to prevent the persistence of L. monocytogenes cells on surfaces (Zoz et al. , 2016). Furthermore, Bang et al.

190 Etudes expérimentales – Chapitre 2

(2014) also showed that the decrease of the culturable population was higher when C&D were followed by a drying step, rather than when C&D were applied without drying.

3. Conclusion

Our study increases the understanding of the behaviour of microorganisms such as L. monocytogenes on surfaces in conditions encountered in food processing plants, and highlights the difficulty in reducing the occurrence of viable persistent sessile cells. Sanitation procedures alone lead to a loss of culturability and appearance of VBNC populations. However, an additional daily drying step after C&D optimises the effectiveness of C&D.

Acknowledgments

This study is part of the EcoSec project to reduce the environmental impact of C&D procedures in refrigerated food processing plants through optimal use of air drying. This project is funded by the French National Research Agency within the framework of the ALID programme (ANR- 12-ALID-0005) and supported by the Vitagora competitiveness cluster. The authors are grateful to Denis Boudot from Ecolab (Arcueil, France) for providing C&D products.

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Vogel B.F., Hansen L.T., Mordhorst H., and Gram L. (2010). The survival of Listeria monocytogenes during long term desiccation is facilitated by sodium chloride and organic material. International Journal of Food Microbiology 140 , 192-200.

Wang J., Ray A.J., Hammons S.R., and Oliver H.F. (2015). Persistent and transient Liseteria monocytogenes strains from retail deli environments vary in their ability to adhere and form biofilms and rarely have inlA premature stop codons. Foodborne Pathogens and Disease 12 , 151-158.

Wulff G., Gram L., Ahrens P., and Fonnesbech Vogel B. (2006). One group of genetically similar Listeria monocytogenes strains frequently dominates and persists in several fish slaughter- and smokehouses. Applied and Environmental Microbiology 72 , 4313-4322.

Zoz F., Iaconelli C., Lang E., Iddir H., Guyot S., Grandvalet C., Gervais P., and Beney L. (2016). Control of relative air humidity as a potential means to improve hygiene on surfaces: a preliminary approach with Listeria monocytogenes . Plos One 11 , 1-14.

196 Etudes expérimentales – Chapitre 2

TABLES

Table 1: Experimental design followed to study the impact of L. monocytogenes strain, surface material, the presence of a strain enhancing L. monocytogenes adhesion, food soil, and scenario of sanitation procedure on the survival of L. monocytogenes

Presence of a Scenario of strain enhancing Surface Experiment sanitation Strain Food soil L. monocytogenes material procedure adhesion 1 Pure-culture SS C&D Lm EGD-e Meat exudate Smoked salmon 2 Pure-culture SS C&D Lm EGD-e juice 3 Dual-culture Ceramic C&D Lm LO28 Meat exudate Smoked salmon 4 Dual-culture Ceramic C&D Lm LO28 juice C&D + daily 5 Dual-culture SS Lm EGD-e Meat exudate drying step C&D + daily Smoked salmon 6 Dual-culture SS Lm EGD-e drying step juice C&D + daily 7 Pure-culture Ceramic Lm LO28 Meat exudate drying step C&D + daily Smoked salmon 8 Pure-culture Ceramic Lm LO28 drying step juice Daily drying 9 Pure-culture Ceramic Lm EGD-e Meat exudate step Daily drying Smoked salmon 10 Pure-culture Ceramic Lm EGD-e step juice Daily drying 11 Dual-culture SS Lm LO28 Meat exudate step Daily drying Smoked salmon 12 Dual-culture SS Lm LO28 step juice C&D + final 13 Dual-culture Ceramic Lm EGD-e Meat exudate drying step C&D + final Smoked salmon 14 Dual-culture Ceramic Lm EGD-e drying step juice C&D + final 15 Pure-culture SS Lm LO28 Meat exudate drying step C&D + final Smoked salmon 16 Pure-culture SS Lm LO28 drying step juice C&D + daily Smoked salmon 17 Pure-culture SS Lm EGD-e drying step juice C&D + final Smoked salmon 18 Pure-culture SS Lm EGD-e drying step juice

197 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Table 2: Statistical results of the impact of L. monocytogenes strain, surface material, the presence of a strain enhancing L. monocytogenes adhesion, food soil, and scenario of sanitation procedure on the survival of L. monocytogenes according to its physiological state

P-value Environmental factor Culturable Viable cells Total cells cells L. monocytogenes strain 0.30 0.23 0.51 Surface material 0.06 0.14 0.10 Presence of a strain enhancing 0.08 0.71 0.26 L. monocytogenes adhesion Food soil 0.89 0.60 0.13 Scenario of sanitation procedure 0.004 0.02 0.05

FIGURE

Figure 1: Culturable population of L. monocytogenes EGD-e cultured on SS coupons with smoked salmon juice, obtained after five days without daily C&D treatment, and after daily C&D treatments with undiluted C&D products and products diluted to 1:10. CFU detection threshold 2.8 log 10 (CFU/coupon) (n = 6, 9 or 12, i.e. 2, 3 or 4 experiments).

198 Etudes expérimentales – Chapitre 2

Figure 2: Influence of daily C&D treatments with C&D products diluted to 1:10 on culturable, viable and total L. monocytogenes EGD-e cells cultured on SS with smoked salmon juice. CFU detection threshold 1.3 log 10 (CFU/coupon) and viable/total cells detection threshold 4 log 10 (cells/coupon). For the measures obtained after C&D treatment, the symbols are slightly to the right of those obtained before C&D treatment (n = 6, i.e. 2 experiments).

Figure 3: δ d1-d4 values for culturable, viable and total cells for each tested scenario of sanitation procedure.

199

Etudes expérimentales – Chapitre 3

CHAPITRE 3 : Etude des mécanismes de réponse aux stress par une approche transcriptomique

1. Contexte et objectifs

Dans le but de réduire au maximum la contamination microbienne dans les environnements agro-alimentaires, l’application de stress est une stratégie appliquée tout au long de la chaîne alimentaire. Cependant, il a été démontré, dans le chapitre précédent et par d’autres études (Campdepadrós et al. , 2012 ; Firmesse et al. , 2012), que les opérations d’hygiène ne permettaient pas d’éliminer totalement les populations microbiennes. Leur application entraîne une perte de cultivabilité des cellules, mais les populations vivantes peuvent persister et entrer dans l’état VNC. Il est en effet bien connu que L. monocytogenes est capable de s’adapter à de très nombreux stress environnementaux, de croître dans des conditions défavorables et d’y persister (Gandhi et Chikindas, 2007). Pour mieux lutter contre son implantation et sa multiplication dans les ateliers agro-alimentaires, compléter les connaissances sur la persistance de ce micro-organisme par des approches comparatives de génomique, transcriptomique et protéomique est une nécessité (Abee et al. , 2016).

L’objectif principal de ce troisième chapitre était donc de déterminer les gènes différentiellement exprimés selon le stress appliqué grâce à une approche transcriptomique, afin de mieux comprendre les mécanismes d’adaptation des cellules de L. monocytogenes . Pour ce faire, des biofilms ont été préparés sur des surfaces en acier inoxydable et soumis à différentes conditions de culture en appliquant des stress simulant les conditions rencontrées dans les ateliers agro-alimentaires : stress froid, stress chimique avec l’application de produits de N&D et stress de séchage. Parallèlement, dans le but de renforcer le choix du milieu TSB/5 m comme milieu de culture représentant le jus de saumon fumé (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Page 95), le profil d’expression des gènes a également été étudié après culture des cellules adhérentes sur acier inoxydable en présence de ces deux milieux de culture.

Les données obtenues par RNA-seq ont été analysées afin de mettre en évidence les gènes différentiellement exprimés d’une condition à l’autre dans le but de définir les gènes sur- et sous-exprimés de façon spécifique à chaque condition mais aussi différentiellement exprimés de façon commune à deux conditions.

201 Etudes expérimentales – Chapitre 3

2. Matériels et méthodes

2.1. Souches et conditions de culture

Deux souches de L. monocytogenes ont été utilisées : EGD-e (isolat animal de sérotype 1/2a) et LO28 (isolat humain de sérotype 1/2c).

Les souches ont été repiquées et conservées comme expliqué précédemment (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.1, Page 97). Pour les expérimentations, les bactéries ont été remises en suspension dans le milieu de culture TSB/5 m. La DO à 600 nm de la suspension bactérienne a été ajustée à 1,5, correspondant à une concentration de 10 9 UFC/ml (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.1, Page 97).

2.2. Milieux de culture

Deux milieux de culture ont été utilisés pour cette étude : (i) le jus de saumon fumé

(Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.2.1, Page 97) et (ii) le milieu TSB/5 m (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Paragraphe 2.2.3, Page 98).

2.3. Réalisation de biofilms

Comme pour l’étude de Leriche et Carpentier (2000), les biofilms ont été préparés sur des disques en acier inoxydable de finition AISI 304L de 38,5 cm 2 et ayant un rebord de 5 mm (Humeau, La Chapelle-sur-Erdre, France), autoclavés (15 minutes à 121°C) avant leur utilisation.

Sept ml d’une suspension de L. monocytogenes de DO égale à 1,5 ont été déposés sur les disques. Suite à une incubation de 3 heures à 25°C, le milieu de culture a été délicatement éliminé avec une pipette puis renouvelé par un dépôt de 7 ml de milieu stérile (du jus de saumon fumé ou du milieu TSB/5 m selon l’expérience). Les disques ont alors été incubés à 25°C pendant 21 heures. Avant la récupération des cellules adhérentes ou l’application d’un stress, le milieu de culture a été délicatement enlevé des disques par pipetage pour n’y laisser que la population bactérienne adhérente.

202 Etudes expérimentales – Chapitre 3

2.4. Application de stress

Toutes les conditions de stress testées sont récapitulées dans le Tableau 20 pour la souche EGD- e et dans le Tableau 21 pour la souche LO28. Pour chaque condition, trois biofilms ont été réalisés et analysés par une approche transcriptomique.

2.4.1. Stress froid

Suite à la préparation de biofilms de 24 heures à 25°C avec le milieu TSB/5 m, les cellules adhérentes ont été soumises à un stress froid. Pour ce faire, le milieu de culture a été délicatement renouvelé par pipetage délicat pour éliminer les cellules non adhérentes puis dépôt de 7 ml du milieu TSB/5 m. Les biofilms ont ensuite été incubés 24 heures à 10°C.

2.4.2. Stress chimique

Pour obtenir une population adhérente suffisamment importante et étudier l’impact du stress chimique (nettoyage ou désinfection), il a été nécessaire de préparer des biofilms de quatre jours. Dans ce but, le même protocole que pour les biofilms de 24 heures a été suivi, puis le milieu de culture a été renouvelé délicatement chaque jour jusqu’à l’application du stress chimique le dernier jour de la semaine.

Le stress chimique a consisté en l’exposition des cellules adhérentes obtenues après une semaine à une étape de nettoyage ou une étape de désinfection avec les produits de N&D utilisés dans le protocole considéré comme peu respectueux de l’environnement (Etudes expérimentales, Chapitre 2, Tableau 16, Page 136).

Après avoir délicatement pipeté le milieu de culture, 7 ml de Topax 66 (Ecolab) à 0,3% ou de Triquart MS (Ecolab) à 0,2% ont été déposés sur la surface pour un temps d’incubation à température ambiante de respectivement 15 et 30 minutes. Le produit a ensuite été éliminé et les cellules ont été mises en contact pendant 5 minutes avec 7 ml de neutralisant comme recommandé par la norme ISO 18593 (Anonyme, 2004).

2.4.3. Stress de dessiccation

Le séchage a été réalisé à 25°C pendant 3 heures à 75% HR comme décrit dans le chapitre précédent (Etudes expérimentales, Chapitre 2, Paragraphe 2.4.4, Page 139).

203 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Tableau 20 : Conditions testées avec la souche de L. monocytogenes EGD-e

Concentration en ARN Condition Milieu RIN a (ng/µl) Biofilms de 24 heures à 25°C Jus de saumon fumé 44 8,6 83 8,7 99 9

TSB/5 m 2100 - 1750 - 2320 -

Biofilms de 24 heures à 25°C TSB/5 m 588 9,2 puis 24 heures à 10°C 718 9,8 1170 9,5 Biofilms de 24 heures à 25°C TSB/5 m 903 - et 3 heures de séchage à 25°C 882 - 1444 7,7

Biofilms d’une semaine à 25°C TSB/5 m 349 8,9 puis nettoyage 203 8,8 155 8,8

Biofilms d’une semaine à 25°C TSB/5 m 69 7,7 puis désinfection 97 7,5 195 7,7

Biofilms de 24 heures à 25°C TSB/5 m 528 7,4 séchés quotidiennement durant une semaine 370 8,6 327 7,8 a : - signifie que le RIN n’a pas été communiqué par le logiciel du Bioanalyzer 2100

204 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Tableau 21 : Conditions testées avec la souche de L. monocytogenes LO28

Concentration en ARN Condition Milieu RIN a (ng/µl)

Biofilms de 24 heures à 25°C TSB/5 m 656 8,7 687 8,8 1058 8,6

Biofilms de 24 heures à 25°C TSB/5 m 698 9 puis 24 heures à 10°C 172 8,4 483 8,5

Biofilms de 24 heures à 25°C TSB/5 m 581 7,4 et 3 heures de séchage à 25°C 332 8,9 578 8,9

Biofilms de 1 semaine à 25°C TSB/5 m 26 - puis nettoyage 79 8,3 49 8,6

Biofilms d’une semaine à 25°C TSB/5 m 145 4,3 puis désinfection 177 - 167 4,5

Biofilms de 24 heures à 25°C TSB/5 m 27 8,7 séchés quotidiennement durant une semaine 20 8,1 20 7,5 a : - signifie que le RIN n’a pas été communiqué par le logiciel du Bioanalyzer 2100

2.5. Décrochement des cellules adhérentes

Pour décrocher les cellules adhérentes, 5 ml d’EP ont été déposés sur chaque disque. Les disques ont ensuite été grattés avec une spatule en polycarbonate (Polylabo, Strasbourg, France) (Leriche et Carpentier, 2000). La suspension obtenue a été collectée dans un tube de 15 ml. Cette opération a été répétée une seconde fois, les cellules sessiles ont donc été remises en suspension dans 10 ml d’EP au total.

205 Etudes expérimentales – Chapitre 3

2.6. Extraction d’ARN

L’ARN des suspensions obtenues par grattage des surfaces a été extrait à l’aide du kit High Pure RNA Isolation kit (Roche) dont les détails sont exposés en Annexe 5. Le protocole suivi était basé sur une lyse enzymatique par un traitement au lysozyme, couplée à une lyse mécanique par l’utilisation de billes. Les échantillons ont été conservés à -80°C jusqu’au séquençage.

La quantification de l’ARN et l’estimation de la qualité des échantillons ont été réalisées grâce au kit RNA 6000 Nano Kit (Agilent) avec le Bioanalyzer 2100 (Agilent) dont le principe et le protocole sont en Annexe 6.

La qualité de l’ARN est estimée selon la valeur de RNA Integrity Number (RIN), considérée comme satisfaisante lorsqu’elle est supérieure à 7 (recommandation du fournisseur). Pour chaque condition testée, la concentration et la valeur de RIN sont indiquées dans le Tableau 20 pour la souche EGD-e et le Tableau 21 pour la souche LO28.

2.7. Préparation des échantillons et séquençage par le prestataire de services GenoScreen

Les étapes techniques décrites ci-après et récapitulées dans la Figure 25 ont été réalisées par le prestataire de services GenoScreen (Lille, France) où ont été envoyés les échantillons pour le séquençage haut débit.

206 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Figure 25 : Etapes de préparation des échantillons et séquençage par le prestataire de services GenoScreen.

2.7.1. Vérification de la qualité des échantillons

Après réception des échantillons, la concentration en ARN des échantillons a été vérifiée par dosage avec le kit Quant-iT™ RiboGreen ® RNA , tout comme l’intégrité des ARN avec le kit RNA 6000 Nano Kit (Agilent) et le Bioanalyzer 2100 (Agilent).

2.7.2. Préparation des librairies

Afin d’optimiser le séquençage des ARN m, la déplétion des ARN r a été réalisée à l’aide du kit Ribo-Zero TM rRNA Removal Kit (Bacteria) (Illumina).

L’étape suivante a consisté en la préparation des librairies avec le kit ScriptSeq Complete Bacteria (Illumina). Les échantillons ont été purifiés puis fragmentés.

207 Etudes expérimentales – Chapitre 3

L’ADN c double brin a été synthétisé en utilisant des random primers et de la RNase H. Les extrémités ont ensuite été réparées afin de permettre une ligation d’adaptateurs. Les fragments de taille désirée ont été purifiés grâce à des billes et utilisés comme matrice pour générer par amplification PCR les colonies d’ADN formant les librairies.

Les librairies ainsi générées sont contrôlées sur des puces High sensitivity (Agilent) lues par le Bioanalyzer 2100 (Agilent).

2.7.3. Séquençage haut débit : RNA-seq

Les librairies ont été poolées et séquencées avec un séquenceur HiSeq 2500 (Illumina) en

2x100 paires de bases (pb). Le séquençage réalisé était orienté et pairé (les deux brins d’ADN c ont été séquencés).

2.8. Analyse bio-informatique des données

2.8.1. Etapes réalisées par le prestataire de services GenoScreen

• Analyse de la qualité des reads

Une analyse de la qualité des reads a été réalisée à l’aide du logiciel FastQC version 0.11.3 (Babraham Bioinformatics). La vérification de la qualité des résultats a été évaluée selon deux indicateurs : le taux d’erreur PhiX et la valeur Q30.

Le taux d’erreur PhiX correspond au taux d’erreur de séquençage observé sur le phage PhiX séquencé par rapport au génome de référence de ce phage. Il doit être inférieur à 1,5% pour des reads de 100 pb.

Le score qualité est usuellement annoté QXX où XX représente le score. Pour une base nucléotidique, il y a une probabilité d’erreur (P ε) égale à 10 (-XX/10) . Par conséquent, QXX est

égal à -10 log 10 (P ε). Un score Q30 est associé à un taux d’erreur de 0,1%. Un run de séquençage est validé lorsqu’au minimum 80% des reads ont un score Q30.

208 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Les résultats obtenus avec le logiciel FastQC version 0.11.3 ont permis de rechercher la présence d’adaptateurs et de déterminer les paramètres de nettoyage les plus adaptés pour les séquences. Les reads ont été filtrés : - avec le logiciel Cutadapt version 1.8.3 (Martin, 2016) afin de supprimer les séquences d’adaptateurs en terminaisons 5’ et 3’, - avec le logiciel PRINSEQ version 0.20.4 (Schmieder et Edwards, 2011) selon les paramètres suivants : -noniupac, -ns_max_n 0, -min_len 60, -trim_qual_right 30, -ns_max_n 0, -min_qual_mean 30.

Toutes les séquences contenant des nucléotides indéterminés ainsi que toutes les séquences ou portions de séquences dont le score qualité moyen était inférieur à 30 (Q30) ont été éliminées. La taille minimale des séquences conservées a été fixée à 60 pb.

A l’issue de ce nettoyage, une seconde analyse de la qualité a été réalisée à l’aide du logiciel FastQC version 0.11.5 pour valider le jeu de données filtrées.

• Sélection d’une référence et alignement des reads

Les reads obtenus ont été alignés sur l’ensemble des 2855 séquences d’ADNc de L. monocytogenes EGD-e disponibles en ligne dans la base de données EnsemblGenomes (Kersey et al. , 2015). En d’autres termes, les séquences de référence correspondaient aux transcrits obtenus à partir de la prédiction de gènes sur la référence L. monocytogenes EGD-e ASM19603v1.31 .

La proximité des échantillons avec la référence choisie a été vérifiée par calcul de l’indice Read Mapped Back onto Transcript (RMTB) qui consiste à aligner les reads sur les transcrits afin d’évaluer le pourcentage de reads utilisés. Cet indice est calculé avec le logiciel BOWTIE version 2.1.0 en utilisant des paramètres stringents afin de s’assurer de la qualité des alignements : seuls les reads qui s’alignent sur toute la longueur, sans gap et dont la paire a pu être alignée ont été conservés.

• Analyse d’expression différentielle

L’analyse d’expression différentielle a été réalisée avec le logiciel RSEM version 2.1.23. Le niveau d’expression de chaque transcrit a été calculé en réalignant les reads de chaque échantillon sur la référence. Un gène a été considéré comme différentiellement exprimé quand il était au minimum deux fois sur- ou sous-exprimé par rapport à la condition témoin, pour un

209 Etudes expérimentales – Chapitre 3 taux de faux positifs de 0,001. Le gène a été considéré comme fortement sur- ou sous-exprimé lorsque l’expression était au moins 10 fois supérieure ou inférieure à celle observée dans la condition témoin.

2.8.2. Suite des analyses faites à l’Anses

A partir des fichiers d’expression différentielle fournis par GenoScreen, les analyses ont été poursuivies pour identifier et quantifier les gènes différentiellement exprimés spécifiquement dans chaque condition et de façon commune à plusieurs conditions en comparaison à une condition de référence.

Afin de classer les gènes différentiellement exprimés en catégories fonctionnelles, il a été décidé d’utiliser la base de données des clusters of orthologous groups (COG) du NCBI, mise à jour en 2014 (NCBI, 2014 ; Tatusov et al. , 1997). A chaque gène est associé un identifiant COG (exemple : COG0001), chaque identifiant étant lui-même lié à une catégorie fonctionnelle générale (Traitement et stockage de l'information, Métabolisme, Signalisation et processus cellulaires ou Mauvaise caractérisation) et à une catégorie fonctionnelle plus spécifique désignée par une lettre de l’alphabet (Tableau 22). La détermination des catégories COG des gènes différentiellement exprimés de L. monocytogenes EGD-e obtenus à partir d'expériences de transcriptomique a déjà été réalisée précédemment (Cordero et al. , 2016 ; Hain et al. , 2008 ; Toledo-Arana et al. , 2009) en utilisant les données concernant L. innocua Clip11262 disponibles pour le genre Listeria dans la base de données (NCBI, 2014). En s’inspirant du script COGNITOR du logiciel COGsoft (NCBI, 2014), le script MACLiK (Annexe 7) a été créé pour associer chaque gène différentiellement exprimé à une catégorie fonctionnelle COG.

Tableau 22 : Catégories fonctionnelles COG chez Listeria (NCBI, 2014 ; Tatusov et al. , 1997)

210 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Catégorie fonctionnelle Catégorie fonctionnelle spécifique générale Métabolisme (C) Production et conversion de l'énergie (3,6%) (36%) a (E) Transport et métabolisme des acides aminés (7,4%) (F) Transport et métabolisme des nucléotides (2,8%) (G) Transport et métabolisme des glucides (9,6%) (H) Transport et métabolisme des coenzymes (4,6%) (I) Transport et métabolisme des lipides (2,1%) (P) Transport et métabolisme d'ions inorganiques (4,1%) (Q) Catabolisme, biogenèse et transport de métabolites secondaires (1,5%) Signalisation et (D) Contrôle du cycle cellulaire, division cellulaire et séparation des processus cellulaires chromosomes (1,8%) (18%) (M) Biogenèse de la paroi, des membranes et de l'enveloppe (4,0%) (N) Mobilité cellulaire (1,5%) (O) Modifications post-traductionnelles, renouvellement des protéines et protéines chaperonnes (2,5%) (T) Mécanismes de transduction des signaux (3,8%) (U) Trafic intracellulaire, sécrétion et transport vésiculaire (0,7%) (V) Mécanismes de défense et virulence (3,1%) (W) Structures extracellulaires (0,1%) Traitement et stockage (J) Traduction, structure et biogenèse des ribosomes (7,3%) de l'information (21%) (K) Transcription (9,9%) (L) Réplication, recombinaison et réparation (3,9%) Mauvaise (R) Fonction générale prédite uniquement (6,8%) caractérisation (26%) (S) Fonction inconnue (18%) (X) Non classé (0,9%) a : Pourcentage des régions codantes référencées dans la base de données EnsemblGenomes appartenant à chaque catégorie fonctionnelle de la base de données COG

211 Etudes expérimentales – Chapitre 3

3. Résultats

3.1. Extraction d’ARN

La quantité de cellules adhérentes récupérées par grattage des surfaces à la spatule était comprise entre 2,8 log 10 (UFC) (biofilms de L. monocytogenes EGD-e ayant subi une étape de désinfection en fin de semaine) et 9,9 log 10 (UFC) (biofilms de L. monocytogenes EGD-e ayant ensuite subi un stress froid).

Les valeurs de RIN calculées par le Bioanalyzer 2100 étaient quasiment toutes supérieures à 7, indiquant que la qualité des échantillons d’ARN était suffisante pour le séquençage. Ces résultats ont été validés par le prestataire GenoScreen avant chaque run de séquençage. La qualité des trois échantillons pour lesquels la valeur de RIN était inférieure à 7 et ceux pour lesquels nous n’avions pas obtenu de valeur de RIN a également été considérée comme satisfaisante pour le séquençage par le prestataire de services GenoScreen (Tableau 20 et Tableau 21).

3.2. Qualité du séquençage et réalignement des reads sur la référence

Trois runs de séquençage ont été réalisés. Pour chaque run , le nombre de reads séquencés, le taux d’erreur PhiX et le score qualité Q30 ont été calculés (Tableau 23). L’analyse de ces résultats montre que les deux premiers runs étaient de bonne qualité et que le troisième était à la limite de la qualité requise. Suite au nettoyage des données brutes, il s’est avéré que la qualité des données des trois runs était satisfaisante, permettant une analyse bio-informatique des données.

Tableau 23 : Vérification de la qualité des résultats de séquençage

Critères Run 1 Run 2 Run 3 Nombres de reads séquencés a 227 357 754 140 852 255 163 980 139 Taux d’erreur PhiX b 0,28% 0,52% 0,74% Valeur Q30 c 93,7% 88,4% 79% a : 125 millions de reads attendus au minimum b : Taux d’erreur considéré comme satisfaisant s’il est inférieur à 1,5% c : Valeur considérée comme satisfaisante si elle est au minimum de 80%

212 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Le calcul de l’indice RMTB indique que pour la majorité de nos échantillons il était possible de réaligner sur la référence entre 30 et 75% des reads . La portion de reads non alignés peut s’expliquer par le fait que les échantillons contenaient des séquences non codantes qui n’étaient pas représentées dans la référence. De plus, certains échantillons provenaient de la souche LO28, ce qui a pu également interférer dans l’étape d’alignement.

3.3. Comparaison de l’expression des gènes des cellules adhérentes cultivées en présence de deux milieux de culture différents

L’expression des gènes a été comparée entre des cellules de L. monocytogenes adhérentes sur acier inoxydable cultivées à 25°C en présence de jus de saumon fumé (condition témoin) et du milieu TSB/5 m. Les gènes différentiellement exprimés par les cellules cultivées avec le milieu

TSB/5 m par rapport à celles cultivées en présence de jus de saumon fumé ont été quantifiés et leurs catégories fonctionnelles COG associées (Figure 26).

L’analyse des données a permis de mettre en évidence 34 gènes différentiellement exprimés par les cellules cultivées en présence du milieu TSB/5 m, dont 27 sur-exprimés et 7 sous- exprimés.

Les 27 gènes sur-exprimés par les cellules cultivées en présence du milieu TSB/5 m par rapport à celles ayant formé des biofilms en présence de jus de saumon fumé, étaient répartis en 10 catégories COG. Mise à part la catégorie (S) des gènes de fonction inconnue (12% des gènes sur-exprimés), les trois catégories prédominantes étaient la catégorie (C) associée à la production d’énergie, la catégorie (G) associée au métabolisme des glucides, ainsi que la catégorie (J) liée à la traduction, avec respectivement 15%, 31% et 15% des gènes sur-exprimés.

Parmi les 7 gènes sous-exprimés par les bactéries cultivées en présence du milieu TSB/5 m par rapport à la condition témoin, 43% ont été associés à la catégorie (S) regroupant des gènes dont la fonction est inconnue. Les autres gènes avaient une fonction mieux définie et ont été associés à la catégorie (K) liée à la transcription (1 gène), à la catégorie (P) pour les gènes du métabolisme d’ions inorganiques (1 gène) et à la catégorie (M) liée à la biogenèse des structures pariétales et membranaires (2 gènes).

213 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Sur-expression Sous-expression

(C) Production et conversion de l'énergie (E) Transport et métabolisme des acides aminés (G) Transport et métabolisme des glucides (P) Transport et métabolisme d'ions inorganiques (Q) Catabolisme, biogenèse et transport de métabolites secondaires (M) Biogenèse de la paroi, des membranes et de l'enveloppe (T) Mécanismes de transduction des signaux (J) Traduction, structure et biogenèse des ribosomes (K) Transcription (R) Fonction générale prédite uniquement (S) Fonction inconnue

Figure 26 : Quantification et abondance relative des catégories fonctionnelles COG des gènes différentiellement exprimés spécifiquement par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m par rapport aux cellules adhérentes cultivées en présence de jus de saumon fumé.

214 Etudes expérimentales – Chapitre 3

3.4. Etude de la réponse à différents stress : froid, nettoyage, désinfection et séchage

L’expression des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de

L. monocytogenes cultivées sur acier inoxydable à 25°C en présence du milieu TSB/5 m et ayant été soumises à un stress a été mise en évidence par comparaison à des cellules cultivées dans les mêmes conditions mais n’ayant pas subi de stress. Les quatre stress étudiés étaient les suivants : (i) le stress froid (incubation 24 heures à 10°C), (ii) le nettoyage (application d’un détergent), (iii) la désinfection (application d’un produit désinfectant) et (iv) le séchage (3 heures à 25°C à 75% HR).

3.4.1. Réponse des cellules de L. monocytogenes de la souche EGD-e

Les gènes différentiellement exprimés suite à l’application d’un stress ont été quantifiés. Les résultats obtenus avec la souche EGD-e sont présentés sous forme de diagrammes de Venn dans la Figure 27. L’abondance relative des catégories fonctionnelles COG a également été calculée pour l’ensemble des gènes différentiellement exprimés par les cellules ayant subi un stress (Figure 28) mais aussi pour les gènes sur- et sous-exprimés spécifiquement à chacun de ces stress ou de façon commune aux quatre stress (Figure 29).

Sur-expression Sous-expression

Figure 27 : Quantification des gènes sur-exprimés et sous-exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) par rapport aux cellules n’ayant pas subi de stress.

215 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Sur-expression Sous-expression (C) Production et conversion de l'énergie Stress froid (E) Transport et métabolisme des acides aminés

(F) Transport et métabolisme des nucléotides

(G) Transport et métabolisme des glucides

(H) Transport et métabolisme des coenzymes

(I) Transport et métabolisme des lipides

Nettoyage (P) Transport et métabolisme d'ions inorganiques

(Q) Catabolisme, biogenèse et transport de métabolites secondaires (D) Contrôle du cycle cellulaire, division cellulaire et séparation des chromosomes (M) Biogenèse de la paroi, des membranes et de l'enveloppe (N) Mobilité cellulaire

(O) Modifications post-traductionnelles, renouvellement des protéines et protéines chaperonnes Désinfection (T) Mécanismes de transduction des signaux

(U) Trafic intracellulaire, sécrétion et transport vésiculaire (V) Mécanismes de défense et virulence

(W) Structures extracellulaires

(J) Traduction, structure et biogenèse des ribosomes

(K) Transcription Séchage (L) Réplication, recombinaison et réparation

(R) Fonction générale prédite uniquement

(S) Fonction inconnue

(X) Non classé

Figure 28 : Abondance relative des catégories COG de l’ensemble des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m après avoir subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress.

216 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Sur-expression Sous-expression (C) Production et conversion de l'énergie Commun aux quatre stress

(E) Transport et métabolisme des acides aminés

Aucun gène (F) Transport et métabolisme des nucléotides différentiellement sous-exprimé (G) Transport et métabolisme des glucides

(H) Transport et métabolisme des coenzymes Spécifique au stress froid (I) Transport et métabolisme des lipides

(P) Transport et métabolisme d'ions inorganiques

(O) Modifications post-traductionnelles, renouvellement des protéines et protéines chaperonnes (T) Mécanismes de transduction des signaux

(U) Trafic intracellulaire, sécrétion et transport vésiculaire

(V) Mécanismes de défense et virulence Spécifique à la désinfection (W) Structures extracellulaires

(J) Traduction, structure et biogenèse des ribosomes

(K) Transcription

(L) Réplication, recombinaison et réparation

Spécifique au séchage (R) Fonction générale prédite uniquement

(S) Fonction inconnue Aucun gène différentiellement (X) Non classé sous-exprimé

Figure 29 : Abondance relative des catégories COG des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m spécifiquement après avoir subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) ou de façon commune aux quatre stress, en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress.

217 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Tous stress confondus, 1086 gènes étaient sur-exprimés et 901 sous-exprimés par les cellules stressées en comparaison aux bactéries n’ayant pas subi de stress (Figure 27). Le pourcentage de ces gènes différentiellement exprimés qui étaient de fonction inconnue ou mal caractérisée (catégories (R), (S) et (X)) était compris entre 8% et 50% selon les conditions (Figure 28 et Figure 29).

• Gènes différentiellement exprimés suite au stress froid

Une incubation des cellules adhérentes à 10°C a induit la sur- et sous-expression de respectivement 484 et 301 gènes par rapport à la condition témoin (Figure 27).

Les 484 gènes sur-exprimés ont été essentiellement répartis dans la catégorie (G) associée au métabolisme des glucides (9% des gènes) et la catégorie (K) liée à la transcription (14% des gènes). Quant aux 301 gènes sous-exprimés suite au stress froid, les catégories dominantes auxquelles ils ont été associés étaient les catégories (E) pour 17% des gènes et (G) pour 15% des gènes, impliquées respectivement dans le métabolisme des acides aminés et celui des glucides (Figure 28).

D’après les résultats, les principales catégories COG de l’ensemble des gènes différentiellement exprimés suite au stress froid sont les mêmes que celles auxquelles sont associées les gènes sur- et sous-exprimés de façon spécifique à ce stress. Parmi les 484 gènes sur-exprimés après le stress froid, 99 gènes l’étaient de façon spécifique à ce stress (Figure 27). Ces gènes appartenaient principalement aux catégories (G) liée au métabolisme des glucides et (K) liée à la transcription pour respectivement 10% et 21% des gènes (Figure 29). Les trois catégories prédominantes des 45 gènes sous-exprimés spécifiquement après le stress froid étaient la catégorie (E) associée au métabolisme des acides aminés, la catégorie (G) associée au métabolisme des glucides et la catégorie (J) liée à la traduction, avec respectivement 20%, 9% et 13% des gènes sous-exprimés (Figure 29).

• Gènes différentiellement exprimés suite au nettoyage

D’après les données d’analyse d’expression différentielle, nous avons constaté la sur- expression de 964 gènes et la sous-expression de 840 gènes après l’application du produit détergent sur les cellules adhérentes par rapport aux cellules n’ayant pas été soumises à ce stress (Figure 27).

218 Etudes expérimentales – Chapitre 3

La catégorie (J) liée à la traduction et la catégorie (K) liée à la transcription étaient les catégories principales des gènes sur-exprimés suite au nettoyage avec respectivement 14% et 9% des gènes. La catégorie (K) associée à la transcription était également une des catégories prédominantes auxquelles appartenaient les gènes sous-exprimés (9% des gènes), tout comme les catégories (E) liée au métabolisme des acides aminés (10% des gènes) et (G) liée au métabolisme des glucides (14% des gènes) (Figure 28).

Les résultats obtenus concernant l’expression des gènes suite au nettoyage ont mis en évidence que les 311 gènes sur-exprimés spécifiquement par les cellules ayant subi ce stress étaient répartis dans 21 catégories COG dont les catégories (J) liée à la traduction (11% des gènes) et (L) associée à la réplication et réparation de l’ADN (10% des gènes) étaient les principales. Les gènes impliqués dans le métabolisme des glucides (catégorie (G)) et la transcription (catégorie (K)) représentaient respectivement 13% et 12% des 531 gènes sous- exprimés de façon spécifique par les cellules ayant subi une étape de nettoyage (Figure 27 et Figure 29).

• Gènes différentiellement exprimés suite à la désinfection

D’après les résultats présentés dans la Figure 27, 553 et 183 gènes étaient sur- et sous-exprimés après traitement des cellules adhérentes avec un produit désinfectant par rapport aux cellules non stressées (Figure 27).

Alors que 16% des gènes sur-exprimés étaient associés à la catégorie (J) liée à la traduction et 10% à la catégorie (K) liée à la transcription, les gènes sous-exprimés étaient principalement dans les catégories (E) liée au métabolisme des acides aminés pour 19% des gènes et (G) liée au métabolisme des glucides pour 14% des gènes (Figure 28).

Parmi les 553 gènes sur-exprimés suite à la désinfection, 13 uniquement l’étaient spécifiquement à ce stress (Figure 27). Quatre de ces 13 gènes sur-exprimés étaient impliqués dans les mécanismes de la transcription (catégorie (K)) (Figure 29). Les 13 gènes sous-exprimés de façon spécifique suite à la désinfection (Figure 27) étaient répartis à 15% dans la catégorie (H) associée au métabolisme des coenzymes et à 62% dans la catégorie (G) liée au métabolisme des glucides (Figure 29).

219 Etudes expérimentales – Chapitre 3

• Gènes différentiellement exprimés suite au séchage

Comparativement aux autres stress, relativement peu de gènes étaient différentiellement exprimés par les bactéries ayant subi une étape de séchage : 100 gènes sur-exprimés et 2 gènes sous-exprimés (Figure 27).

La catégorie regroupant le plus grand nombre (11%) de gènes sur-exprimés et ayant une fonction bien caractérisée était la catégorie (K) associée à la transcription. Un des deux gènes sous-exprimés après le séchage était également associé à cette catégorie (Figure 28)

Alors qu’aucun gène spécifiquement sous-exprimé après application du séchage n’a été mis en évidence, l’étude de la sur-expression a montré que 6 gènes étaient sur-exprimés de façon spécifique après le séchage (Figure 27), dont la moitié appartenait à la catégorie (G) liée au métabolisme des glucides (Figure 29).

• Gènes exprimés de façon commune aux quatre stress

Alors que 67 gènes étaient sur-exprimés en commun par les cellules ayant subi un des quatre stress, aucun gène sous-exprimé de façon commune par les bactéries stressées n’a été mis en évidence (Figure 27).

Les gènes sur-exprimés de façon commune étaient répartis dans 12 catégories COG dont majoritairement les catégories (K) liée à la transcription pour 12% des gènes sur-exprimés et (T) liée aux mécanismes de transduction des signaux pour 9% des gènes sur-exprimés. Presque la moitié des gènes sur-exprimés avaient une fonction mal caractérisée et étaient classés dans les catégories (R) et (S) (Figure 29).

3.4.2. Réponse des cellules de L. monocytogenes de la souche LO28

Les expériences ont également été réalisées avec la souche de L. monocytogenes LO28. Le nombre de gènes différentiellement exprimés par les cellules de cette souche suite à un stress froid, à un stress chimique ou au séchage a été calculé (Figure 30). L’abondance relative des catégories fonctionnelles COG pour l’ensemble des gènes différentiellement exprimés suite à l’application d’un stress est présentée dans la Figure 31. Quant aux catégories associées aux gènes sur- et sous-exprimés par les cellules de L. monocytogenes LO28 spécifiquement à chacun des quatre stress et de façon commune aux quatre stress, elles sont récapitulées Figure 32.

220 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Sur-expression Sous-expression

Figure 30 : Quantification des gènes sur-exprimés et sous-exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes LO28 cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) par rapport aux cellules n’ayant pas subi de stress.

221 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Sur-expression Sous-expression (C) Production et conversion de l'énergie Stress froid (E) Transport et métabolisme des acides aminés

(F) Transport et métabolisme des nucléotides

(G) Transport et métabolisme des glucides

(H) Transport et métabolisme des coenzymes

(I) Transport et métabolisme des lipides

Nettoyage (P) Transport et métabolisme d'ions inorganiques

(O) Modifications post-traductionnelles, Désinfection renouvellement des protéines et protéines chaperonnes (T) Mécanismes de transduction des signaux

(U) Trafic intracellulaire, sécrétion et transport vésiculaire (V) Mécanismes de défense et virulence

(J) Traduction, structure et biogenèse des ribosomes

(K) Transcription Séchage (L) Réplication, recombinaison et réparation

(R) Fonction générale prédite uniquement Les deux gènes différentiellement sur- (S) Fonction inconnue exprimés sont dans la catégorie (S) (X) Non classé

Figure 31 : Abondance relative des catégories COG de l’ensemble des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes LO28 cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m spécifiquement après avoir subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress.

222 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Sur-expression Sous-expression (C) Production et conversion de l'énergie Commun aux quatre stress

(E) Transport et métabolisme des acides aminés

Aucun gène (F) Transport et métabolisme des nucléotides différentiellement sur-exprimé (G) Transport et métabolisme des glucides

(H) Transport et métabolisme des coenzymes Spécifique au stress froid (I) Transport et métabolisme des lipides

(P) Transport et métabolisme d'ions inorganiques

(Q) Catabolisme, biogenèse et transport de métabolites secondaires (D) Contrôle du cycle cellulaire, division cellulaire et séparation des chromosomes Spécifique au nettoyage (M) Biogenèse de la paroi, des membranes et de l'enveloppe

(N) Mobilité cellulaire

(O) Modifications post-traductionnelles, renouvellement des protéines et protéines chaperonnes

(T) Mécanismes de transduction des signaux

(U) Trafic intracellulaire, sécrétion et transport Spécifique à la désinfection vésiculaire (V) Mécanismes de défense et virulence

(J) Traduction, structure et biogenèse des ribosomes

(K) Transcription

(L) Réplication, recombinaison et réparation

Spécifique au séchage (R) Fonction générale prédite uniquement

Les deux gènes (S) Fonction inconnue différentiellement sur- exprimés sont dans la (X) Non classé catégorie (S)

Figure 32 : Abondance relative des catégories COG des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes LO28 cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m spécifiquement après avoir subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) ou de façon commune aux quatre stress, en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress.

223 Etudes expérimentales – Chapitre 3

D’après les résultats obtenus, 994 gènes étaient différentiellement exprimés suite à l’application d’un stress dont 350 sur-exprimés et 644 sous-exprimés (Figure 30).

• Gènes différentiellement exprimés suite au stress froid

Il y avait 27 gènes sur-exprimés après une incubation des cellules à 10°C et 340 gènes sous- exprimés (Figure 30).

Les catégories principales des gènes sur-exprimés suite au stress froid étaient la catégorie (F) liée au métabolisme des nucléotides pour 15% des gènes et la catégorie (K) associée au métabolisme des ions inorganiques pour 15% des gènes. Concernant l’ensemble des gènes sous- exprimés, respectivement 9%, 10%, 12% et 13% étaient impliqués dans la production d’énergie (catégorie (C)), le métabolisme des acides aminés (catégorie (E)), le métabolisme des glucides (catégorie (G)) et dans la traduction (catégorie (J)) (Figure 31).

Parmi les 27 gènes sur-exprimés par les cellules ayant été soumises au froid, 14 gènes étaient sur-exprimés spécifiquement suite à ce stress. Les deux catégories regroupant le plus de gènes étaient les catégories (F) pour 14% des gènes et (P) pour 21% des gènes, respectivement impliquées dans le métabolisme des nucléotides et celui des ions inorganiques. Les données concernant les 20 gènes sous-exprimés spécifiquement après le stress froid indiquaient que 10% de ces gènes avaient un rôle dans les mécanismes de défense et de virulence, 10% dans la traduction et 15% dans la réplication et la réparation de l’ADN (catégories (V), (J) et (L)) (Figure 32).

• Gènes différentiellement exprimés suite au nettoyage

L’ensemble des gènes différentiellement exprimés après application du produit nettoyant comprenait 306 gènes sur-exprimés et 406 gènes sous-exprimés (Figure 30).

Les cellules ayant subi une étape de nettoyage présentaient un profil d’expression de gènes dont 10% des gènes sur-exprimés étaient classés dans la catégorie (J) liée à la traduction et 9% dans la catégorie (K) associée à la transcription. Les catégories (E), (G) et (J) impliquées dans le métabolisme des acides aminés, celui des glucides ainsi que dans les mécanismes de traduction étaient les principales catégories auxquelles appartenaient les gènes sous-exprimés après le nettoyage (respectivement 11%, 11% et 32% des gènes) (Figure 31).

224 Etudes expérimentales – Chapitre 3

D’après les résultats présentés dans la Figure 30, 81% des gènes sur-exprimés après le traitement des cellules avec le produit détergent l’étaient de façon spécifique à ce stress. Les 249 gènes sur-exprimés spécifiquement par les cellules ayant été soumises au nettoyage ont été classés dans 20 catégories COG dont les prédominantes étaient la catégorie (J) associée à la traduction (10% des gènes) et la catégorie (K) liée à la transcription (9% des gènes). Le nettoyage a spécifiquement induit la sous-expression de 59 gènes appartenant principalement à la catégorie (E) liée au métabolisme des acides aminés (17%), la catégorie (G) liée au métabolisme des glucides (12%) et la catégorie (H) liée au métabolisme des coenzymes (14%) (Figure 30 et Figure 32).

• Gènes différentiellement exprimés suite à la désinfection

La désinfection a engendré la sur-expression de 79 gènes et la sous-expression de 558 gènes (Figure 30).

L’ensemble des gènes sur-exprimés suite à la désinfection a été réparti dans 17 catégories COG dont les principales étaient la catégorie (E) liée au métabolisme des acides aminés (13% des gènes), la catégorie (J) liée à la traduction (9% des gènes) et la catégorie (K) liée à la transcription (10% des gènes). Les gènes sous-exprimés après traitement des cellules avec le produit désinfectant ont majoritairement été classés dans les catégories (E) liée au métabolisme des acides aminés (9% des gènes), (G) liée au métabolisme des glucides (12% des gènes), (J) liée à la traduction (12% des gènes) et (K) liée à la transcription (9% des gènes) (Figure 31).

Vingt-sept gènes étaient sur-exprimés spécifiquement après la désinfection en comparaison aux autres stress. Les résultats ont montré que les catégories principales dans lesquelles ont été répartis les gènes sur-exprimés étaient la catégorie (E) liée au métabolisme des acides aminés (15% des gènes), la catégorie (J) liée à la traduction (11% des gènes) ainsi que la catégorie (G) liée au métabolisme des glucides (11% des gènes). Parmi les 558 gènes sous-exprimés, 130 gènes étaient sous-exprimés spécifiquement suite au stress de désinfection (Figure 30). Ces derniers appartenaient principalement aux catégories (G) pour 12% d’entre eux, (J) pour 15% et (K) pour 10%, catégories respectivement impliquées dans le métabolisme des glucides, la traduction et la transcription (Figure 32).

225 Etudes expérimentales – Chapitre 3

• Gènes différentiellement exprimés suite au séchage

Tout comme pour la souche de L. monocytogenes EGD-e (Figure 27), parmi les gènes différentiellement exprimés peu l’étaient suite au séchage : 2 gènes sur-exprimés et 15 gènes sous-exprimés (Figure 30).

Alors que les 2 gènes sur-exprimés étaient de fonction inconnue (catégorie (S)), 5 des 15 gènes sous-exprimés étaient associés à la catégorie (G) liée au métabolisme des glucides et 4 à la catégorie (K) liée à la transcription (Figure 31).

Les 2 gènes sur-exprimés par les cellules ayant subi une étape de séchage l’étaient de façon spécifique à ce stress. Parmi les 15 gènes dont l’expression était réduite par rapport à la condition témoin, 5 gènes étaient sous-exprimés spécifiquement dans le cas du séchage dont 1 gène de la catégorie (K) liée à la transcription et 1 gène de la catégorie (L) liée à la réplication et la réparation de l’ADN (Figure 32).

• Gènes exprimés de façon commune aux quatre stress

Deux gènes uniquement étaient différentiellement exprimés de façon commune à toutes les cellules, quel que soit le stress subi (Figure 30). Ces deux gènes, un de fonction mal caractérisée de la catégorie (R) et l’autre impliqué dans le métabolisme des glucides de la catégorie (G), étaient sous-exprimés (Figure 32).

3.4.3. Comparaison des réponses aux stress des cellules de L. monocytogenes des souches EGD-e et LO28

Afin de renforcer les résultats obtenus avec les souches de L. monocytogenes EGD-e et LO28, l’ensemble des gènes différentiellement exprimés suite à chacun des quatre stress a été comparée entre les deux souches.

Les résultats de quantification des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes des deux souches cultivées sur acier inoxydable à 25°C en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi un stress par rapport aux cellules non stressées sont résumés dans le Tableau 24. Les catégories fonctionnelles COG ont été associées aux gènes différentiellement exprimés de façon commune par les deux souches de L. monocytogenes (Figure 33).

Entre 0 et 107 gènes étaient sur-exprimés de façon commune par les deux souches de L. monocytogenes EGD-e et LO28 après avoir subi un stress. La comparaison des gènes sous-

226 Etudes expérimentales – Chapitre 3 exprimés a mis en évidence qu’aucun gène n’était sous-exprimé de façon commune par les cellules des deux souches suite au séchage. En revanche, 12, 18 et 55 gènes étaient sous- exprimés respectivement suite à l’application de la désinfection, du stress froid ou du nettoyage (Tableau 24).

Tableau 24 : Quantification de l’ensemble des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes LO28 et EGD-e cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress.

Gènes sur-exprimés Gènes sous-exprimés Communs Communs Stress Souche Souche Souche Souche aux deux aux deux EGD-e LO28 EGD-e LO28 souches souches

Froid 484 27 4 301 340 18 Nettoyage 964 306 107 840 406 55 Désinfection 553 79 0 183 558 12 Séchage 100 2 1 2 15 0

227 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Sur-expression Sous-expression (C) Production et conversion de l'énergie Stress froid (E) Transport et métabolisme des acides aminés

(F) Transport et métabolisme des nucléotides

(G) Transport et métabolisme des glucides

(H) Transport et métabolisme des coenzymes

(I) Transport et métabolisme des lipides

(P) Transport et métabolisme d'ions inorganiques Nettoyage

(O) Modifications post-traductionnelles, renouvellement des protéines et protéines chaperonnes Désinfection (T) Mécanismes de transduction des signaux

(U) Trafic intracellulaire, sécrétion et transport vésiculaire (V) Mécanismes de défense et virulence Aucun gène différentiellement (J) Traduction, structure et biogenèse des ribosomes sur-exprimé (K) Transcription

(L) Réplication, recombinaison et réparation Séchage appliqué une seule fois (R) Fonction générale prédite uniquement

L’unique gène (S) Fonction inconnue Aucun gène différentiellement différentiellement sur-exprimé est de la (X) Non classé sous-exprimé catégorie (S)

Figure 33 : Abondance relative des catégories COG des gènes différentiellement exprimés de façon commune par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e et LO28 cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi un stress froid (24 heures à 10°C) ou un stress chimique (nettoyage ou désinfection) ou une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) appliqué une seule fois ou quotidiennement pendant une semaine en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress.

228 Etudes expérimentales – Chapitre 3

• Gènes différentiellement exprimés suite au stress froid

Deux des quatre gènes sur-exprimés de façon commune par les deux souches suite à un stress froid étaient de fonction inconnue. Les deux autres gènes étaient impliqués dans le métabolisme des lipides (catégorie (I)) et la transcription (catégorie (K)).

La moitié des 18 gènes sous-exprimés par les cellules de L. monocytogenes EGD-e et LO28 ayant été soumises à une incubation à 10°C étaient classés dans la catégorie (N) associée à la mobilité cellulaire. L’autre catégorie dominante regroupant 28% des gènes sous-exprimés suite au stress froid était la catégorie (E) associée au métabolisme des acides aminés (Figure 33).

• Gènes différentiellement exprimés suite au nettoyage

Les 107 gènes sur-exprimés par les cellules ayant subi une étape de nettoyage étaient répartis dans 18 catégories COG dont les principales étaient la catégorie (L) liée à la réplication et la réparation de l’ADN (9% des gènes), la catégorie (K) associée à la transcription (9% des gènes), la catégorie (J) liée à la traduction (16% des gènes) et la catégorie (O) associée aux modifications post-traductionnelles et au renouvellement des protéines (11% des gènes).

Les 55 gènes sous-exprimés par les cellules des deux souches étaient, quant à eux, principalement impliqués dans le métabolisme des acides aminés (20% des gènes dans la catégorie (E)), la mobilité (25% des gènes dans la catégorie (N)) et les mécanismes de transduction des signaux (11% des gènes dans la catégorie (T)) (Figure 33).

• Gènes différentiellement exprimés suite à la désinfection

La comparaison des profils d’expression de gènes des souches EGD-e et LO28 n’a pas permis de mettre en évidence la sur-expression de gènes (Tableau 24).

Par contre, l’application du produit désinfectant a induit la sous-expression de 12 gènes communs aux cellules des deux souches (Tableau 24), dont 5 appartenant à la catégorie (G) associée au métabolisme des glucides et 3 à la catégorie (N) liée à la mobilité cellulaire (Figure 33).

229 Etudes expérimentales – Chapitre 3

• Gènes différentiellement exprimés suite au séchage

Un seul gène, de fonction inconnue, était sur-exprimé après le séchage de façon commune aux deux souches utilisées pour les expérimentations. La comparaison des gènes sous-exprimés a mis en évidence qu’aucun gène n’était sous-exprimé de façon commune par les cellules des deux souches suite au séchage (Figure 33).

3.5. Impact de la récurrence de l’application du séchage

Afin d’étudier l’impact de la récurrence d’un stress de séchage, des cellules de

L. monocytogenes adhérentes sur acier inoxydable cultivées en présence du milieu TSB/5 m ont été soumises à une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) quotidiennement durant une semaine. L’expression des gènes de ces cellules a ensuite été comparée à celle des cellules ayant été soumises à une seule étape de séchage et à celle des cellules non stressées.

3.5.1. Réponse des cellules de L. monocytogenes de la souche EGD-e

A partir des résultats de quantification des gènes différentiellement exprimés par les cellules de la souche EGD-e, l’abondance relative des catégories COG associées à ces gènes a pu être déterminée (Figure 34).

D’après les analyses d’expression différentielle des gènes, 839 gènes étaient sur-exprimés et 673 sous-exprimés après application du séchage, qu’il soit appliqué une fois ou quotidiennement durant une semaine.

• Gènes différentiellement exprimés suite au séchage appliqué une seule fois

Seulement 3 gènes étaient sur-exprimés spécifiquement suite au séchage appliqué une seule fois, 2 étaient de fonction mal caractérisée (catégorie (R)) et 1 appartenait à la catégorie (G) liée au métabolisme des glucides.

Aucun gène n’a été mis en évidence comme étant sous-exprimé de façon spécifique par les cellules ayant subi une seule étape de séchage.

230 Etudes expérimentales – Chapitre 3

• Gènes différentiellement exprimés suite au séchage appliqué quotidiennement

Le nombre de gènes différentiellement exprimés spécifiquement suite à l’application récurrente du séchage sur une semaine est beaucoup plus important que lors d’une étape de séchage appliqué une seule fois : 739 gènes sur-exprimés et 671 gènes sous-exprimés.

Ces 739 gènes sur-exprimés ont été classés en 20 catégories COG, dont les dominantes étaient la catégorie (G) associée au métabolisme des glucides (9% des gènes), la catégorie (J) liée la traduction (13% des gènes) et la catégorie (K) associée à la transcription (11% des gènes).

Parmi les 21 catégories COG dans lesquelles ont été répartis les 671 gènes sous-exprimés, la catégorie (E) liée au métabolisme des acides aminés regroupait 13% des gènes et la catégorie (G) associée au métabolisme des glucides 16% des gènes.

• Gènes différentiellement exprimés en commun aux deux types de séchage

D’après la comparaison des gènes différentiellement exprimés par les cellules ayant subi un seul stress de séchage avec ceux sur- et sous-exprimés par les cellules ayant été séchées quotidiennement durant une semaine, 97 gènes étaient sur-exprimés de façon commune aux deux conditions de séchage. Ces derniers étaient répartis dans 15 catégories COG mais les gènes sur-exprimés étaient essentiellement impliqués dans les mécanismes de la transcription de la catégorie (K) (11% des gènes).

Par contre, uniquement 2 gènes étaient sous-exprimés de façon commune dans les deux conditions de séchage : 1 gène dans la catégorie (K) liée à la transcription et 1 gène de fonction inconnue (catégorie (S)).

231 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Sur-expression Sous-expression

(E) Transport et métabolisme des acides aminés

(F) Transport et métabolisme des nucléotides

(G) Transport et métabolisme des glucides

Commun aux deux conditions de séchage (H) Transport et métabolisme des coenzymes

(I) Transport et métabolisme des lipides

(P) Transport et métabolisme d'ions inorganiques

(Q) Catabolisme, biogenèse et transport de métabolites secondaires (D) Contrôle du cycle cellulaire, division cellulaire et séparation des chromosomes

(M) Biogenèse de la paroi, des membranes et de l'enveloppe Spécifique au séchage appliqué une seule fois (N) Mobilité cellulaire

(O) Modifications post-traductionnelles, renouvellement des protéines et protéines chaperonnes (T) Mécanismes de transduction des signaux Aucun gène différentiellement (U) Trafic intracellulaire, sécrétion et transport sous-exprimé vésiculaire (V) Mécanismes de défense et virulence

(J) Traduction, structure et biogenèse des ribosomes Spécifique au séchage (K) Transcription appliqué quotidiennement durant une semaine

(L) Réplication, recombinaison et réparation

(R) Fonction générale prédite uniquement

(S) Fonction inconnue

(X) Non classé

Figure 34 : Quantification et abondance relative des catégories COG des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) appliquée une seule fois ou quotidiennement durant une semaine par rapport aux cellules n’ayant pas subi de séchage.

232 Etudes expérimentales – Chapitre 3

3.5.2. Réponse des cellules de L. monocytogenes de la souche LO28

Les résultats concernant la quantification et l’abondance relative des catégories COG des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes LO28 cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) appliquée une seule fois ou quotidiennement durant une semaine par rapport aux cellules n’ayant pas subi de séchage sont présentés dans la Figure 35.

D’après les résultats obtenus, 164 gènes étaient sur-exprimés et 92 sous-exprimés après l’application du séchage, qu’il soit unique ou quotidien.

• Gènes différentiellement exprimés suite au séchage appliqué une seule fois

Les 2 gènes sur-exprimés spécifiquement par les cellules ayant subi une seule étape de séchage appartenaient à la catégorie (S) regroupant les gènes de fonction inconnue.

Aucun gène sous-exprimé de façon spécifique au séchage appliqué une seule fois n’a été mis en évidence.

• Gènes différentiellement exprimés suite au séchage appliqué quotidiennement

Pour la souche LO28, le constat était le même que pour la souche EGD-e : le nombre de gènes sur- et sous-exprimés étaient plus important après l’application quotidienne du séchage (respectivement 162 et 92 gènes) en comparaison avec l’application ponctuelle de ce stress (2 gènes sur-exprimés et 6 sous-exprimés).

Le nombre de gènes spécifiquement sur-exprimés après l’application récurrente du séchage était égal à 162. Parmi ces gènes sur-exprimés, 15% participaient au métabolisme des glucides (catégorie (G)) et 10% aux mécanismes de la traduction (catégorie (J)).

L’application répétée du séchage a spécifiquement induit la sous-expression de 86 gènes appartenant principalement à la catégorie (G) liée au métabolisme des glucides (16% des gènes) et la catégorie (H) liée au métabolisme des coenzymes (9% des gènes).

• Gènes différentiellement exprimés en commun aux deux types de séchage

Alors qu’aucun gène différentiellement exprimé n’a été trouvé comme étant sur-exprimé de façon commune aux deux types de séchage, 6 gènes étaient sous-exprimés dans les deux cas.

233 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Ils appartenaient aux catégories (K) liée à la transcription et (G) associée au métabolisme des glucides pour respectivement 1 et 5 gènes.

234 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Sur-expression Sous-expression (C) Production et conversion de l'énergie

(E) Transport et métabolisme des acides aminés

(F) Transport et métabolisme des nucléotides

(G) Transport et métabolisme des glucides

(H) Transport et métabolisme des coenzymes Commun aux deux conditions de séchage (I) Transport et métabolisme des lipides

(P) Transport et métabolisme d'ions inorganiques Aucun gène différentiellement (Q) Catabolisme, biogenèse et transport de sous-exprimé métabolites secondaires (D) Contrôle du cycle cellulaire, division cellulaire et séparation des chromosomes

(M) Biogenèse de la paroi, des membranes et de Spécifique au séchage appliqué une seule fois l'enveloppe (N) Mobilité cellulaire

(O) Modifications post-traductionnelles, Les deux gènes Aucun gène renouvellement des protéines et protéines chaperonnes différentiellement sur- différentiellement expriméssont dans la (T) Mécanismes de transduction des signaux sous-exprimé catégorie (S) (U) Trafic intracellulaire, sécrétion et transport vésiculaire

(V) Mécanismes de défense et virulence Spécifique au séchage appliqué quotidiennement durant une semaine (J) Traduction, structure et biogenèse des ribosomes

(K) Transcription

(L) Réplication, recombinaison et réparation

(R) Fonction générale prédite uniquement

(S) Fonction inconnue

Figure 35 : Quantification et abondance relative des catégories COG des gènes différentiellement exprimés par les cellules adhérentes de L. monocytogenes LO28 cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) appliquée une seule fois ou quotidiennement durant une semaine par rapport aux cellules n’ayant pas subi de séchage.

235 Etudes expérimentales – Chapitre 3

3.5.3. Comparaison de l’expression des gènes des cellules de L. monocytogenes des souches EGD-e et LO28

Les gènes différentiellement exprimés suite à l’application d’une étape de séchage quotidienne pendant une semaine ont été quantifiés et comparés entre les deux souches de L. monocytogenes EGD-e et LO28. Les gènes communs aux deux souches ont ensuite été classés selon leur catégorie fonctionnelle COG (Figure 36).

Après application du séchage quotidiennement durant une semaine, 836 gènes étaient sur- exprimés par les cellules de la souche EGD-e (Figure 34) et 162 par celles de la souche LO28 (Figure 35). La comparaison des gènes a permis de montrer qu’il y avait 74 gènes sur-exprimés en commun entre les deux souches. Ces gènes sur-exprimés appartenaient principalement aux catégories (G) pour 19% d’entre eux, (N) pour 11% et (K) pour 12%, catégories respectivement impliquées dans le métabolisme des glucides, la mobilité cellulaire et la transcription.

D’après les résultats de comparaison de profil d’expression des gènes en réponse au séchage quotidien, 47 gènes étaient sous-exprimés de façon commune par les deux souches de L. monocytogenes parmi les 673 gènes qui étaient sous-exprimés par les cellules de la souche EGD-e (Figure 34) et les 92 par celles de la souche LO28 (Figure 35). Les gènes sous- exprimés étaient classés dans 14 catégories COG dont majoritairement la catégorie (E) liée au métabolisme des acides aminés, la catégorie (G) impliquée dans le métabolisme des glucides ainsi que la catégorie (H) associée au métabolisme des coenzymes, pour respectivement 9%, 21% et 9% des gènes.

236 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Sur-expression Sous-expression

(C) Production et conversion de l'énergie (E) Transport et métabolisme des acides aminés (F) Transport et métabolisme des nucléotides (G) Transport et métabolisme des glucides (H) Transport et métabolisme des coenzymes (I) Transport et métabolisme des lipides (P) Transport et métabolisme d'ions inorganiques (Q) Catabolisme, biogenèse et transport de métabolites secondaires (D) Contrôle du cycle cellulaire, division cellulaire et séparation des chromosomes (M) Biogenèse de la paroi, des membranes et de l'enveloppe (N) Mobilité cellulaire (O) Modifications post-traductionnelles, renouvellement des protéines et protéines chaperonnes (T) Mécanismes de transduction des signaux (V) Mécanismes de défense et virulence (J) Traduction, structure et biogenèse des ribosomes (K) Transcription (L) Réplication, recombinaison et réparation (R) Fonction générale prédite uniquement (S) Fonction inconnue

Figure 36 : Abondance relative des catégories COG de l’ensemble des gènes différentiellement exprimés de façon commune par les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e et LO28 cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et ayant subi une étape de séchage (3 heures à 25°C à 75% HR) appliqué une seule fois ou quotidiennement pendant une semaine en comparaison aux cellules n’ayant pas subi de stress.

237 Etudes expérimentales – Chapitre 3

4. Discussion

Des cellules de L. monocytogenes des souches EGD-e et/ou LO28 ont été cultivées dans deux milieux de culture différents (le jus de saumon fumé et le milieu TSB/5 m) et soumises à différents stress (froid, nettoyage, désinfection et séchage). Les données obtenues après séquençage du transcriptome de ces cellules a permis d’étudier les différents profils d’expression des gènes dans chaque condition.

4.1. Comparaison de l’expression des gènes après culture des cellules de

L. monocytogenes en présence de jus de saumon fumé et du milieu TSB/5 m

Le faible nombre de gènes différentiellement exprimés indique que le profil d’expression des gènes différait très peu entre les cellules adhérentes de L. monocytogenes EGD-e cultivées sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m et celles cultivées avec le jus de saumon fumé

(Figure 26). Ceci est un critère supplémentaire de validation du milieu TSB/5 m pour modéliser la souillure alimentaire dans le cadre des analyses transcriptomiques.

L’expression des gènes de cellules cultivées dans différents milieux de culture a également été étudiée par d’autres auteurs. Par exemple, Tang et al. (2015) ont comparé l’expression des gènes de L. monocytogenes cultivées sur du saumon fumé et dans des milieux de culture liquides. Des différences significatives de profils d’expression des gènes ont été mises en évidence entre les conditions de culture. Rantsiou et al. (2012) ont, quant à eux, étudié le profil d’expression de gènes impliqués dans la virulence de L. monocytogenes dans deux souillures alimentaires (le jus de saucisses fermentées et le jus de viande hachée) en comparaison avec le milieu BHI. Les résultats de cette étude ont démontré que l’expression des gènes est matrice- dépendante et souche-dépendante. De plus, Deng et al. (2012) ont également observé de grandes différences d’activités transcriptomiques après inoculation des cellules de Salmonella dans un bouillon Luria-Bertani et après inoculation dans de l’huile d’arachide, suggérant que le milieu de culture influence l’état physiologique des cellules et donc leur expression génique. Ces travaux confirment qu’utiliser un milieu de culture conventionnel pour étudier l’expression des gènes durant la croissance de L. monocytogenes dans un aliment ou une souillure alimentaire peut présenter des limites (Deng et al. , 2012 ; Rantsiou et al. , 2012 ; Tang et al. , 2015).

238 Etudes expérimentales – Chapitre 3

4.2. Réponse à différents stress

La capacité des souches à tolérer un stress peut affecter leur survie dans des environnements défavorables ; certaines souches qui s’adaptent mieux que d’autres sont sélectionnées et survivent causant alors une contamination persistante (Autio et al. , 2003 ; Metselaar et al. , 2015).

Les analyses d’expression différentielle ont mis en évidence que les catégories (G), (J) et (K), respectivement associées au métabolisme des glucides, à la traduction et à la transcription, étaient les catégories COG majoritaires auxquelles appartenaient les gènes différentiellement exprimés dans les conditions testées. Ces résultats semblent cohérents mais sont à relativiser en prenant en compte le fait que ces trois catégories sont parmi les catégories dominantes dans la base de données EnsemblGenomes (Tableau 22) (NCBI, 2014).

Pour l’analyse préliminaire des résultats, nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux gènes exprimés suite à chacun des quatre stress. Cependant, dans certains cas, un grand nombre de gènes sur- ou sous-exprimés étaient communs à au moins deux stress. Par exemple, comme montré dans la Figure 27, les cellules de la souche EGD-e sur-exprimaient 964 gènes suite au nettoyage, 553 après la désinfection et 540 gènes étaient sur-exprimés de façon commune suite aux deux stress. Ceci démontre que la majorité des mécanismes de réponse à un stress sont également impliqués dans la réponse à un ou plusieurs autres stress.

4.2.1. Stress froid

Les résultats obtenus montrent que les gènes sur-exprimés après un stress froid sont impliqués dans la transcription (catégorie K)), le métabolisme et le transport des glucides (catégorie (G)), des nucléotides (catégorie (F)) et des ions inorganiques (catégorie (P)) alors que ceux liés à la traduction (catégorie (J)), la réplication et la réparation de l’ADN (catégorie (L)), la virulence (catégorie (V)), la production d’énergie (catégorie (C)) et le métabolisme des acides aminés (catégorie (E)) sont réprimés. De plus, comme l’avaient remarqué Durack et al. (2013) et Cordero et al. (2016), la mobilité cellulaire est réduite après une étape de croissance à 10°C. En effet, la moitié des gènes sous-exprimés de façon commune par les cellules des deux souches EGD-e et LO28 après un stress froid était associée à la catégorie (N) liée à la mobilité cellulaire (Figure 33) et comprenait les gènes fliD, fliF, fliG, fliM , fliY, flgE , flgK, motA et motB impliqués dans la biosynthèse des flagelles.

239 Etudes expérimentales – Chapitre 3

D’après les données présentées dans la Figure 33, une partie des gènes sur-exprimés de façon commune par les souches de L. monocytogenes EGD-e et LO28 étaient impliqués dans le métabolisme des lipides. Ceci est en accord avec des études précédentes selon lesquelles le maintien d’un certain degré de fluidité des membranes est essentiel pour l’adaptation au froid (Gandhi et Chikindas, 2007 ; Hébraud et Potier, 1999). La fluidité membranaire à faible température peut être maintenue par (i) une augmentation du ratio d’acides gras insaturés et/ou de liaisons doubles cis et (ii) un raccourcissement des chaînes carbonées des acides gras (Hébraud et Potier, 1999). Les changements de lipides en réponse à un changement de température peuvent être liés à (i) l’activation d’enzymes responsables de la modification de lipides préexistants et (ii) la synthèse de novo d’enzymes spécifiques (Hébraud et Potier, 1999).

D’après Angelidis et Smith (2003), l’accumulation de cryoprotectants comme la carnitine et la glycine-bétaïne assure une meilleure survie des cellules suite à un stress froid. Dans notre cas, les analyses d’expression différentielle des cellules ayant subi un stress froid n’ont pas permis de mettre en évidence l’expression de transporteurs de ces solutés compatibles, ni des protéines liées à leur production.

Les résultats obtenus confirment en revanche ceux de Liu et al. (2002) qui avaient également remarqué la sur-expression des gènes codant des protéines chaperonnes suite au stress froid. En effet, nous avons constaté que les protéines chaperonnes DnaJ et Clp étaient sur-exprimées par les cellules de la souche EGD-e après incubation des cellules à 10°C.

Après un stress froid, Cordero et al. (2016) ont montré que les cellules entraient dans une phase d’acclimatation au cours de laquelle la multiplication cellulaire est arrêtée puis dans une phase d’adaptation avec la reprise de la croissance et l’expression de gènes adéquate pour la survie. Pour L. monocytogenes qui a la capacité de croître à 4°C, une étape de culture à 10°C n’entraîne pas une réelle réponse au stress froid avec l’expression momentanée de protéines cold shock mais plutôt une réponse d’acclimatation au froid avec l’induction continue de protéines cold acclimation (Hébraud et Potier, 1999). Ceci pourrait expliquer que nous n’ayons pas retrouvé de gènes codant des protéines cold shock dans la liste des gènes sur-exprimés par les cellules suite à l’incubation à 10°C.

Alors que le facteur σB est associé à la réponse générale au stress (Synthèse bibliographique, Chapitre 3, Paragraphe 2.2.1, Page 73), un des seuls cas où les données l’ont mis en évidence est le stress froid appliqué aux cellules de la souche EGD-e.

240 Etudes expérimentales – Chapitre 3

4.2.2. Stress chimique

D’après nos résultats (Figure 33), le nettoyage et la désinfection ont induit la sous-expression de gènes impliqués dans la mobilité cellulaire des cellules des souches EGD-e et LO28 avec notamment la répression des gènes fliD , fliF , fliG, fliM , fliY, flgE, flgG, flgK , flgL, flhF, motA et motB après application du détergent. La catégorie (N) associée aux gènes impliqués dans la mobilité cellulaire regroupait seulement 5% des gènes sous-exprimés par les cellules de la souche LO28 suite à au nettoyage mais les gènes c heV , flgE et fliY ont été identifiés comme étant fortement sous-exprimés. Au contraire, Casey et al. (2014) ont mis en évidence la sur- expression des gènes impliqués dans la chimiotaxie (les gènes MCP et cheA , cheY et cheV ) et la biosynthèse des flagelles ( flaA, fliD, fliG, fliM, fliN, flip, fliQ, fliR, fliS, flgC, flgE, flgG, flgK , flgL, motA et motB ) après traitement des cellules au BZT. D’après ces auteurs, la mobilité des cellules est nécessaire pour se déplacer vers un environnement moins stressant. Une hypothèse pour expliquer la divergence des résultats obtenus entre notre étude et celle de Casey et al. (2014) repose sur le fait que nous avons étudié les profils d’expression des gènes de cellules adhérentes alors que Casey et al. (2014) ont utilisé des cellules planctoniques.

L’existence de mécanismes de résistance aux QAC a déjà été démontrée chez L. monocytogenes (Aase et al. , 2000 ; McDonnell et Russell, 1999). Pour résister aux effets bactéricides des QAC, les cellules régénèrent et réorganisent leur peptidoglycane afin de prévenir l’accumulation intra-cellulaire de molécules de désinfectants (Fox et al. , 2011). La résistance est donc associée à l’expression de pompes à efflux, notamment la pompe MdrL qui est sur-exprimée après l’application de QAC (Magalhães et al. , 2016 ; Mereghetti et al. , 2000). Nos résultats n’ont pas mis en évidence la sur-expression des gènes codant de telles pompes à efflux suite à l’application du désinfectant Triquart MS, biocide à base d’ammonium quaternaire.

Comme Pleitner et al. (2014), nous avons constaté que parmi les 11% de gènes sur-exprimés par les cellules des souches EGD-e et LO28 après nettoyage et regroupés dans la catégorie (O) associée aux modifications post-traductionnelles et au renouvellement des protéines, il y avait des gènes codant des protéines chaperonnes (DnaJ, DnaK, GrpE et GroES) et des protéines de la famille Clp.

Ces auteurs avaient également relevé la sur-expression d’autres gènes après traitement des cellules au ClO 2 (Synthèse bibliographique, Chapitre 3, Paragraphe 2.2.3, Page 75) (Pleitner et al. , 2014). D’après nos résultats, le gène lmo2830 codant une thiorédoxine, le gène

241 Etudes expérimentales – Chapitre 3 lmo2528 codant une ATP-synthase, les gènes lmo0906 et lmo1433 codant des glutathion- réductases et le gène lmo1439 codant une superoxyde-dismutase font aussi partie de la liste des gènes sur-exprimés par les cellules de L. monocytogenes EGD-e ayant été soumises à une étape de nettoyage ou de désinfection.

Après application du nettoyage ou de la désinfection, respectivement 2% et 1% de l’ensemble des gènes sur-exprimés par les cellules de la souche EGD-e (Figure 28) et de la souche LO28 (Figure 31) étaient impliqués dans le métabolisme des lipides (catégorie (I)). D’après Ceragioli et al. (2010) ayant étudié le profil transcriptomique de cellules de Bacillus cereus suite à l’application de différents désinfectants, des gènes impliqués dans le métabolisme des acides gras étaient sur-exprimés après exposition des bactéries au BAC, ce qui corrèle avec le mode d’action de ce désinfectant qui entraîne des dommages membranaires. Ces auteurs ont également démontré que la réponse d’expression des gènes était différente selon le désinfectant utilisé, renforçant ainsi l’hypothèse selon laquelle la combinaison de désinfectants peut avoir un effet synergique pour l’élimination de pathogènes dans les ateliers agro-alimentaires.

Comme l’avaient constaté Casey et al. (2014) pour les gènes de virulence codant les internalines et la listériolysine O, l’analyse des profils transcriptomiques obtenus après nettoyage ou désinfection n’a pas mis en évidence de modifications importantes d’expression des gènes impliqués dans les mécanismes de défense et de virulence (catégorie (V)) par rapport à la condition témoin dans laquelle les cellules n’avaient pas subi de stress. Cependant, nous avons constaté qu’une hydrolase de sels biliaires était fortement sur-exprimée par les cellules de la souche EGD-e après le nettoyage. En induisant la sur-expression de cette protéine, les cellules deviennent alors plus tolérantes aux conditions rencontrées in vivo après ingestion par un hôte (Dussurget et al. , 2002).

4.2.3. Séchage

Le stress osmotique est plus étudié que la dessiccation mais il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes d’adaptation au séchage car il a été démontré que L. monocytogenes pouvait y résister, ce qui pourrait favoriser sa persistance dans les industries agro-alimentaires (Takahashi et al. , 2011 ; Vogel et al. , 2010).

Les résultats montrent que très peu de gènes étaient différentiellement exprimés par les cellules des souches EGD-e et LO28 ayant été soumises au séchage appliqué une seule fois en comparaison aux cellules ayant subi l’application répétée de ce stress (Figure 34 et Figure 35). Il semblerait donc qu’il soit nécessaire d’appliquer plusieurs fois successives le séchage pour

242 Etudes expérimentales – Chapitre 3 obtenir une réponse significative à ce stress (plusieurs centaines de gènes différentiellement exprimés dans le cas de la souche EGD-e) (Figure 34).

L’application quotidienne du séchage durant une semaine a induit la sur-expression des gènes codant les transporteurs de glycine-bétaïne et de tréhalose par les cellules des souches EGD-e et LO28. Ces résultats sont en accord avec les données de la littérature selon lesquelles les mécanismes d’adaptation au séchage consistent à éviter les perturbations membranaires et protéger les structures des macromolécules par l’accumulation de solutés compatibles tels que la proline, le tréhalose, la glycine-bétaïne et la carnitine. Dreux et al. (2008) ont montré une amélioration de la survie des bactéries à un séchage à 60% HR en présence de glycine-bétaïne exogène sur des feuilles de persil et en culture en microplaque. L’effet protecteur d’osmolytes exogènes présents dans le milieu de culture a été confirmé par d’autres études chez L. monocytogenes (Huang et al. , 2015 ; Vogel et al. , 2010) et chez Salmonella (Li, 2012). Suite à un stress osmotique ou de dessiccation, les cellules sur-expriment les transporteurs de ces molécules osmoprotectrices et activent également les voies métaboliques permettant d’en synthétiser de novo (Angelidis et Smith, 2003). De plus, lorsque le transport de glycine-bétaïne et de carnitine est perturbé, les cellules peuvent également accumuler du glutamate pour mieux tolérer la dessiccation (Angelidis et Smith, 2003).

Hingston et al. (2015) ont démontré, en provoquant des mutations dans les gènes codant les éléments constitutifs des flagelles, que les cellules soumises à un stress de dessiccation avaient une meilleure survie lorsque leur mobilité était perturbée. D’après nos résultats, l’application quotidienne du séchage a entraîné la sous-expression de gènes chez les cellules de la souche EGD-e dont ceux impliqués dans la biosynthèse des flagelles ( flgG, flhA, flhB, flhF, fliD, fliR, fliY, motA et motB ). La biosynthèse des flagelles peut être considérée comme énergivore pour les bactéries qui, dans des conditions environnementales défavorables, redistribuent stratégiquement leur énergie dans d’autres voies métaboliques pour assurer leur survie (Hingston et al. , 2015).

La catégorie (I) associée au métabolisme des lipides ne faisait pas partie des catégories majoritairement représentées dans les gènes différentiellement exprimés suite au séchage (au maximum 3% de l’ensemble des gènes sur- ou sous-exprimés par les cellules des souches EGD- e et LO28 après le séchage quotidien). Cependant, le métabolisme des acides gras en lien avec la diminution de la fluidité membranaire permettrait une meilleure survie des cellules ayant subi ce stress (Hingston et al. , 2015).

243 Etudes expérimentales – Chapitre 3

L’étude des gènes fortement sur-exprimés spécifiquement par les cellules de la souche EGD-e suite au stress quotidien a permis de mettre en évidence la sur-expression du gène codant une (p)ppGpp synthétase, protéine nécessaire à la tolérance au stress osmotique (Okada et al. , 2002). Etaient également sur-exprimés par ces cellules le gène codant un antagoniste de la protéine RsbW qui est protéine anti-facteur σB et celui codant un facteur σ. Ceci renforce le rôle de σB dans la réponse à ce stress (Becker et al. , 1998) .

Enfin, en accord avec les données de la revue de Burgess et al. (2016), les gènes codant plusieurs protéines de la réponse générale aux stress (régulateur de la transcription de la famille CtsR, des protéases de la famille Clp, une protéine cold shock et les protéines heat shock 90, GrpE et HtpX) étaient sur-exprimées, voire fortement sur-exprimées, tout comme les gènes codant les protéines chaperonnes GroES, GroEL, DnaJ et DnaK.

4.2.4. Comparaison de deux souches de L. monocytogenes

Alors que les cellules de chacune des deux souches de L. monocytogenes pouvaient sur- et sous- exprimer jusqu’à plusieurs centaines de gènes suite à l’application d’un stress, le nombre de gènes différentiellement exprimés de façon commune par les deux souches après un stress donné pouvait être très faible, voire égal à zéro, comme dans le cas des gènes sur-exprimés après la désinfection (Tableau 24). Cossart et Archambaud (2009) ont également constaté des variations importantes d’expression des gènes entre les souches, rendant difficile l’élaboration de principes généraux. Tamburro et al. (2015) soulignent également de fortes différences inter- souches dans l’expression des gènes après application d’un stress de désinfection. Leur étude n’a pas permis de faire de corrélation entre les niveaux de transcription de gènes et le sérotype.

244 Etudes expérimentales – Chapitre 3

5. Conclusion et perspectives

L’utilisation des analyses transcriptomiques permet une évaluation détaillée de l’état physiologique des pathogènes présents dans/sur des produits alimentaires et dans les ateliers agro-alimentaires. Les résultats offrent de nouvelles connaissances sur l’adaptation de pathogènes d’origine alimentaire à des conditions complexes, ce qui est une clé pour le développement de stratégies plus efficaces pour le contrôle du développement microbien (Tang et al. , 2015).

La comparaison de l’expression des gènes de cellules adhérentes de L. monocytogenes cultivées en présence de jus de saumon fumé ou du milieu TSB/5 m a permis de renforcer le choix de ce milieu de culture synthétique comme milieu pouvant modéliser le jus de saumon fumé (Etudes expérimentales, Chapitre 1, Page 95).

Parallèlement, les profils transcriptomiques obtenus par RNA-seq ont permis de mettre en évidence l’expression différentielle de gènes des cellules de L. monocytogenes adhérentes sur acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m dans plusieurs conditions environnementales stressantes, à savoir le stress froid, le nettoyage, la désinfection et le séchage. Cependant, les résultats d’analyse des données restent à ce jour préliminaires. De nombreuses perspectives peuvent être abordées pour parfaire ce travail : (i) compléter l’analyse des données, (ii) renforcer la compréhension des mécanismes d’adaptation des bactéries et (iii) chercher des marqueurs de viabilité des cellules.

5.1. Compléter l’analyse des données

Dans un premier temps, il conviendrait de valider les résultats des analyses d’expression différentielle des gènes obtenus suite au RNA-seq en réalisant des RT-PCR sur des gènes ciblés. Comme évoqué par certains auteurs (Piveteau et al. , 2011 ; Pleitner et al. , 2014), cela permettrait de confirmer le niveau d’expression de certains gènes et ainsi consolider les profils d’expression des gènes.

De plus, alors que le facteur σB est connu pour intervenir dans la réponse cellulaire à de nombreux stress, nous n’avons pas détecté la sur-expression de ce facteur dans toutes les conditions de stress et ce, pour les deux souches de L. monocytogenes utilisées. Une hypothèse à discuter pour expliquer ce constat consiste à supposer que l’adhésion des cellules sur l’acier inoxydable en présence du milieu TSB/5 m est une condition déjà stressante et que l’application d’un stress supplémentaire n’induit pas de sur-expression. Pour répondre à cette supposition, il

245 Etudes expérimentales – Chapitre 3 faudrait comparer l’expression des gènes de cellules planctoniques et celle de cellules adhérentes cultivées avec le milieu TSB/5 m et s’intéresser plus particulièrement à l’expression du gène sigB codant le facteur σB.

D’après les résultats obtenus, nous avons montré que l’application quotidienne durant une semaine du séchage induisait l’expression différentielle d’un plus grand nombre de gènes par rapport au cas où le séchage n’a été appliqué qu’une seule fois. Contrairement au stress froid et au stress chimique (nettoyage ou désinfection), la réponse cellulaire au séchage a donc nécessité la répétition de son application pour se mettre en place. Il pourrait être intéressant de comparer les gènes sur- et sous-exprimés après l’application répétée du séchage avec ceux différentiellement exprimés par les cellules ayant été soumises au froid, au nettoyage ou à la désinfection pour déterminer les gènes différentiellement exprimés de façon commune à ces quatre stress et ainsi renforcer le choix de marqueurs de viabilité comme décrit ci-après.

Afin de pouvoir trier les gènes différentiellement exprimés et les associer à des fonctions cellulaires, la base de données COG a été utilisée. Ceci nous a permis de déterminer le pourcentage de gènes différentiellement exprimés impliqués dans chaque voie cellulaire. Cependant, il est désormais nécessaire de pouvoir associer plus précisément chaque gène de fonction définie à une voie métabolique. A titre d’exemple, ce travail a été réalisé pour quelques gènes différentiellement exprimés par les cellules ayant subi une étape de séchage quotidiennement durant une semaine. La protéine SpoVG faisait partie de la liste des gènes sur- exprimés suite à ce stress. Cette protéine est nécessaire à l’expression de centaines de gènes de L. monocytogenes dont ceux impliqués dans le métabolisme des glucides (Burke et Portnoy, 2016). Nous nous sommes donc plus particulièrement intéressés à ce métabolisme et avons mis en évidence la sur-expression des gènes codant plusieurs protéines impliquées dans la voie de biosynthèse des pentoses-phosphates (Figure 37). L’automatisation de la recherche des voies métaboliques impliquées dans les mécanismes d’adaptation aux stress pourrait notamment se faire en utilisant des bases de données complètes sur L. monocytogenes dont la base de données MetaCyc (Caspi et al. , 2016).

246 Etudes expérimentales – Chapitre 3

Enfin, il serait également intéressant de compléter les résultats obtenus par cette approche transcriptomique avec ceux obtenus en protéomique pour savoir si les profils d’expression des gènes observés se traduisent de la même façon au niveau protéique. Dans le cadre du projet EcoSec, les protocoles de préparation de biofilms et d’application de stress ont été harmonisés entre l’Anses et le partenaire INRA de Theix en charge des analyses protéomiques. Ainsi, les résultats obtenus pourront être mis en commun et comparés.

5.2. Renforcer la compréhension des mécanismes d’adaptation aux stress

Afin de se rapprocher des conditions rencontrées dans les industries agro-alimentaires, il conviendrait d’étudier l’expression des gènes de cellules de souches isolées du terrain, notamment des souches persistantes retrouvées dans des ateliers de différentes filières agro- alimentaires. Il pourrait également être pertinent de soumettre les bactéries à une combinaison de stress successifs et/ou simultanés pour étudier les profils transcriptomiques, la limite à cette

247 Etudes expérimentales – Chapitre 3 perspective étant d’obtenir suffisamment de biomasse. En effet, dans notre étude, le stress froid, le nettoyage et la désinfection n’ont été appliqués qu’une seule fois. Nous avons donc étudié la réponse cellulaire à un stress ponctuel et non les mécanismes d’adaptation qui nécessitent que les cellules subissent plusieurs fois les variations des conditions environnementales. La réalisation de ces expériences permettrait donc de compléter la compréhension des mécanismes d’adaptation des cellules qui survivent dans les ateliers de production mais aussi de consolider le choix de marqueurs de viabilité comme décrit ci-après.

Pour l’interprétation de nos résultats, il a été considéré que la population bactérienne était homogène mais ceci ne correspond pas nécessairement à la réalité, l’hétérogénéité d’une population étant un élément indispensable pour la survie d’une espèce (Abee et al. , 2016 ; Booth, 2002). Dans le cadre de notre étude, seule l’expression de la population globale a été prise en compte mais d’après de nombreux auteurs, il existe une sous-population qui pré-existe dans la population bactérienne et qui pourrait avoir une expression génique spécifique. Cette sous-population correspond aux persister cells . Ce sont des cellules phénotypiquement résistantes à de nombreuses conditions environnementales défavorables ; leurs caractéristiques phénotypiques ne sont pas héréditaires (Abee et al. , 2016 ; Balaban et al. , 2004 ; Keren et al. , 2004 ; Kussell et al. , 2005 ; Lewis, 2005). L’application répétitive de stress pourrait réduire la population cellulaire que nous avons observée et sélectionner la population de persister cells , initialement minoritaire, qui deviendrait alors dominante. Le profil d’expression des gènes observé serait dans ce cas probablement différent.

Notre étude des mécanismes de réponse aux stress a été basée sur l’expression différentielle des régions codantes du génome dans une condition où les cellules ont subi un stress par rapport à une condition témoin dans laquelle les cellules n’ont pas été stressées. Cependant, il a été démontré que des petits ARN non-codants étaient également importants pour la régulation de l’expression des gènes et donc de l’adaptation à des conditions environnementales stressantes (Cho et al. , 2013 ; Toledo-Arana et al. , 2009 ; Wurtzel et al. , 2012). Dans le but d’étudier une réponse à un stress donné dans son intégralité, il pourrait donc être judicieux de prêter une attention supplémentaire à l’expression des régions non-codantes du génome de L. monocytogenes .

5.3. Recherche de marqueurs de viabilité

Afin de mieux comprendre les mécanismes de réponse à chacun des stress étudiés, nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux gènes différentiellement exprimés de façon

248 Etudes expérimentales – Chapitre 3 spécifique à chaque stress. Cependant, les gènes différentiellement exprimés, et plus particulièrement sur-exprimés, de façon commune à plusieurs stress sont également intéressants. Le fait que des gènes soient sur-exprimés témoigne d’une activité métabolique des cellules et donc de leur viabilité. Ces gènes représentent donc des cibles potentielles dans la recherche de marqueurs de viabilité. Déterminer des biomarqueurs est une nouvelle approche pour la sécurité des aliments en microbiologie et permet une meilleure compréhension des mécanismes de réponse aux stress (Desriac et al. , 2013). En d’autres termes, à partir des gènes sur-exprimés dans plusieurs conditions environnementales, il s’agirait de déterminer des marqueurs de viabilité permettant la détection des cellules de L. monocytogenes indépendamment de leur état physiologique (cultivables ou VNC). En effet, pour un meilleur contrôle des populations de L. monocytogenes adhérentes sur les surfaces en contact ou non avec les produits alimentaires, il conviendrait de compléter les méthodes de microbiologie conventionnelle par des méthodes de biologie moléculaire permettant de détecter les bactéries VNC (Bonilauri et al. , 2016 ; Sardessai, 2005).

Dans le cas de l’optimisation de la détection de L. monocytogenes dans un prélèvement de surface ou dans un échantillon de produit alimentaire par exemple, il faudrait définir des marqueurs de viabilité spécifiques à cette espèce (Desriac et al. , 2013). Pour que la sélection des marqueurs soit optimale, il serait nécessaire de tester d’autres conditions de stress et/ou de combinaisons de stress. De plus, les expériences sont à reproduire avec une collection de souches de L. monocytogenes plus complète et représentative de la diversité des souches isolées dans les environnements agro-alimentaires, pour que les marqueurs sélectionnés soient représentatifs de l’espèce et non pas spécifiques d’une souche.

Après avoir retenu des marqueurs de viabilité, l’outil de détection des cellules par RT-PCR est à développer, avec notamment le design d’amorces spécifiques aux gènes sélectionnés. L’idéal serait de pouvoir mettre au moins un outil de détection quantitatif en établissant une relation entre la détection d’un ARN particulier et la quantité de cellules de L. monocytogenes présentes dans un échantillon. Pour ce faire, il faudrait effectuer des tests de sensibilité de la méthode de RT-PCR en variant la quantité de cellules stressées.

Cependant, à court terme, utiliser en routine des techniques comme la PMA-PCR permettrait de détecter de façon fiable les cellules viables, qu’elles soient cultivables ou non.

249

CONCLUSION

Conclusion

Les consommateurs, adeptes de produits frais peu transformés et prêts à la consommation, maintiennent leur niveau d’exigence quant à la qualité de leurs produits alimentaires. Menace pour la santé publique, L. monocytogenes est aussi à l’origine de pertes économiques considérables pour les industriels qui doivent détruire des lots de produits. Dans ce contexte, ce pathogène est au centre des attentions et sa présence est particulièrement contrôlée dans les environnements agro-alimentaires. L. monocytogenes a en effet la capacité d’adhérer aux surfaces, de s’adapter à des conditions environnementales défavorables et de persister dans les ateliers agro-alimentaires malgré les opérations d’hygiène. La nécessité de mieux comprendre la persistance microbienne et d’optimiser les procédures de N&D pour lutter contre l’implantation de ce pathogène dans les ateliers n’est plus à démontrer. C’est dans ce contexte que s’est inscrite la thèse présentée dans ce manuscrit et réalisée dans le cadre du projet EcoSec.

D’après les résultats du premier chapitre, les cellules de L. monocytogenes ont un comportement différent qu’elles soient cultivées en présence de jus de saumon fumé ou d’exsudat de viande. Cela signifie que les résultats obtenus avec une souillure ou un milieu de culture ne peuvent pas

être extrapolés à toutes les conditions de terrain. De plus, le milieu de culture TSB/5 m peut modéliser le jus de saumon fumé mais aucun milieu de culture synthétique n’a été retenu pour remplacer l’exsudat de viande malgré les modifications de milieux de culture de microbiologie conventionnelle pour qu’ils puissent le mimer. Ainsi, afin de se rapprocher des conditions rencontrées dans les industries agro-alimentaires lors des expérimentations réalisées en laboratoire, l’utilisation de souillures alimentaires est à privilégier lorsque le recours à un milieu de culture synthétique n’a pas pu être scientifiquement justifié.

Les opérations d’hygiène, thématique centrale du deuxième chapitre, sont à considérer comme une stratégie globale dans la lutte contre la persistance et la contamination des produits alimentaires pour (i) prévenir le développement de biofilms microbiens grâce à la conception hygiénique des ateliers et équipements, (ii) agir pour éliminer les contaminations par l’application de protocoles de N&D optimisés et (iii) corriger les éventuels problèmes rencontrés par la mise en œuvre d’autres techniques de N&D (par exemple avec l’alternance de protocoles d’hygiène ou l’utilisation de méthodes alternatives). L’étude de l’impact de facteurs environnementaux sur la persistance de L. monocytogenes a permis de démontrer que le séchage des surfaces, par la déshumidification de l’air, n’était pas suffisamment efficace pour empêcher la persistance mais qu’il permettait une optimisation de la procédure de N&D et ce, d’autant plus lorsqu’il est appliqué quotidiennement comme une étape supplémentaire dans le protocole de N&D. Pour compléter le travail expérimental, plusieurs perspectives peuvent être évoquées : (i) étudier les interactions entre les souches bactériennes pour mieux comprendre les

253 Conclusion mécanismes par lesquels certaines souches de Pseudomonas et de SCN par exemple augmentent la population adhérente de L. monocytogenes , (ii) parfaire les résultats du plan d’expériences fractionnaire avec des expériences mettant en jeu d’autres souillures, d’autres matériaux, d’autres souches de L. monocytogenes dont des souches persistantes isolées dans des ateliers agro-alimentaires et d’autres conditions de co-culture, (iii) tester l’alternance de deux protocoles de N&D et (iv) tester d’autres valeurs d’humidité relative de l’air pour mieux définir la valeur optimale à atteindre afin d’augmenter la létalité des micro-organismes non éliminés par la procédure de N&D.

Les résultats obtenus pourraient faire l’objet de recommandations destinées aux industriels afin d’optimiser les procédures actuelles de N&D. Pour répondre à la thématique de la durabilité devenue incontournable, ces recommandations pourraient également introduire la nécessité de réduire la quantité d’eau utilisée pour les opérations d’hygiène et d’utiliser des produits de N&D à la fois plus respectueux de l’environnement et moins dangereux pour les manipulateurs. La comparaison de deux procédures de N&D nous a permis de conclure que le protocole considéré comme plus respectueux de l’environnement était tout aussi efficace au regard de la réduction des populations adhérentes cultivables que le protocole peu écologique actuellement très fréquemment utilisé dans les ateliers agro-alimentaires. Il est donc possible de suivre des procédures durables tout en maintenant l’efficacité des opérations d’hygiène. Comme le souligne l’étude de Guillier et al. (2016), la politique alimentaire se doit désormais de prendre en compte plusieurs critères dont la qualité des aliments mais aussi la consommation d’énergie et l’impact environnemental de la production (gaspillage, volume d’eau, etc.). Des procédures d’hygiène optimisées et durables permettraient de lutter contre le gaspillage alimentaire et de réduire les coûts en diminuant le nombre de lots détruits. Ceci pourrait être renforcé par une analyse « coûts/bénéfices » mettant entre autres en balance l’installation d’un dessiccateur, l’efficacité des opérations d’hygiène avec l’application de produits écologiques et les coûts engendrés lors de la destruction de denrées alimentaires avant leur commercialisation.

L’étude de l’état physiologique des cellules a mis en évidence la diminution des populations cultivables et l’apparition de cellules VNC suite à l’application des opérations d’hygiène. Celles-ci représentent donc un stress pour les cellules mais ne permettent pas leur élimination totale au sein d’un atelier. Les populations VNC représentent un danger potentiel car elles pourraient retrouver leur capacité à se multiplier une fois en contact avec un aliment ou après ingestion par un consommateur. Les méthodes culturales actuellement utilisées lors de la recherche de L. monocytogenes dans un prélèvement de surface ou dans un aliment ne permettent pas de détecter les cellules VNC. Le recours à des méthodes de biologie moléculaire

254 Conclusion comme la PMA-PCRq permettrait une meilleure quantification des populations viables présentes, indépendamment de leur cultivabilité.

Les bactéries ont la capacité à s’adapter aux stress rencontrés dans les environnements agro- alimentaires pour y persister en ajustant l’expression de leurs gènes en réponse aux changements des conditions environnementales. Les mécanismes de réponse aux stress (froid, nettoyage, désinfection et séchage) ont été étudiés au cours du troisième chapitre. Les analyses d’expression différentielle des gènes ont mis en évidence la grande diversité des catégories fonctionnelles dans lesquelles étaient classés les gènes sur- et sous-exprimés suite à l’application d’un stress. Ce travail préliminaire ouvre de nombreuses perspectives : (i) compléter l’analyse des données par la validation des données par RT-PCR, la recherche des voies métaboliques impactées par les stress et la comparaison des résultats avec ceux obtenus en protéomique, (ii) renforcer la compréhension des mécanismes d’adaptation des bactéries en appliquant plusieurs stress successifs et/ou simultanés et en étudiant l’impact des ARN non- codants et (iii) identifier des marqueurs de viabilité des cellules pour leur détection quel que soit leur état physiologique.

255

VALORISATION

Valorisation

PUBLICATIONS

Development of synthetic media mimicking food soils to study the behaviour of Listeria monocytogenes on stainless steel surfaces. Anaïs Overney, Danielle Chassaing, Brigitte Carpentier, Laurent Guillier, Olivier Firmesse. Publication en décembre 2016 dans International Journal of Food Microbiology, 238, 7-14

Impact of environmental factors on the survival of Listeria monocytogenes under conditions encountered in food processing plants. Anaïs Overney, Joséphine Jacques-André- Coquin, Patricia Ng, Brigitte Carpentier, Laurent Guillier, Olivier Firmesse. Soumission le 8 septembre 2016 pour une publication dans International Journal of Food Microbiology

COMMUNICATIONS ORALES

Comparaison de souillures alimentaires sur l’adhésion de Listeria monocytogenes sur une surface en acier inoxydable et recherche de milieux de culture modèles. 10 ème congrès national de la Société Française de Microbiologie (31 mars et 1er avril 2014), Institut Pasteur, Paris (France) .

Matériaux : tous égaux face aux opérations d’hygiène ? 1er workshop du projet EcoSec (2 décembre 2014), Dijon (France).

Persistance de Listeria monocytogenes dans les conditions rencontrées sur les surfaces des ateliers agro-alimentaires réfrigérés de la filière poisson. Journées des doctorants de l’Ecole doctorale ABIES (14 et 15 avril 2015), AgroParisTech, Paris (France). 2ème prix du meilleur exposé oral.

Comparison of simple diluents and diluents-neutralisers to increase the probability of detection of Listeria monocytogenes in surface samples in food factories. Journée de travail AFNOR, V08/WG17 pour la révision de la norme NF ISO 18593 (17 avril 2015), AFNOR, La Plaine, Saint-Denis (France).

Séchage : peut-il empêcher la persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers ? 2ème workshop du projet EcoSec (1 er octobre 2015), INRA, Clermont-Ferrand (France).

259 Valorisation

Etude de paramètres influençant la persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires réfrigérés. Journées des doctorants et post-doctorants de l’Anses (19 novembre 2015), Anses, Maisons-Alfort (France) .

Etude de paramètres influençant la persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires réfrigérés. 7ème colloque du Réseau National des Biofilms (2 et 3 décembre 2015), ENSIACET, Toulouse (France) .

Etude de paramètres influençant la persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires. 12 ème congrès national de la Société Française de Microbiologie (22 et 23 mars 2016), Institut Pasteur, Paris (France) .

Optimisation des opérations d’hygiène par le séchage des surfaces. 3ème workshop du projet EcoSec (6 juin 2016), Anses, Maisons-Alfort (France).

Etude transcriptomique de cellules de Listeria monocytogenes soumises à des stress rencontrés dans les ateliers agro-alimentaires. Journées des doctorants et post-doctorants de l’Anses (6 octobre 2016), Anses, Maisons-Alfort (France) .

Impact of various parameters on the survival of Listeria monocytogenes under conditions encountered in food processing plants. 8ème conférence internationale Food Factory (19 au 21 octobre 2016), Laval (France) .

A venir

Etude de paramètres influençant la persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires. Réunion conjointe des réseaux officiels de laboratoires de contrôle officiel pour Listeria monocytogenes et Staphylocoques/entérotoxines (24 et 25 novembre 2016), Anses, Maisons-Alfort (France) .

COMMUNICATIONS AFFICHEES

260 Valorisation

Comparison of food soils on the adhesion of Listeria monocytogenes on stainless steel and research of culture media models. Anaïs Overney, Danielle Chassaing, Brigitte Carpentier, Olivier Firmesse. Congrès international Biofilms 6 (11 au 13 mai 2014), Université de Vienne (Autriche).

Comparison of food soils on the adhesion of Listeria monocytogenes on stainless steel and research of culture media models. Anaïs Overney, Danielle Chassaing, Brigitte Carpentier, Olivier Firmesse. Congrès international FoodMicro (1 au 4 septembre 2014), Cité des congrès de Nantes (France).

Suivi du devenir de Listeria monocytogenes sur des surfaces soumises aux stress industriels des ateliers agro-alimentaires réfrigérés et étude du transcriptome après application de ces stress. Anaïs Overney, Danielle Chassaing, Patricia Ng, Laurent Guillier, Brigitte Carpentier, Olivier Firmesse. Journées des doctorants et post-doctorants de l’Anses (27 et 28 novembre 2014), Anses , Maisons-Alfort (France).

Transcriptomic study of Listeria monocytogenes subjected to stresses encountered in food processing plants. Anaïs Overney, Joséphine Jacques-André-Coquin, Brigitte Carpentier, Laurent Guillier, Olivier Firmesse. Congrès international Biofilms 7 (26 au 28 juin 2016), Université de Porto (Portugal).

261

BILAN PERSONNEL

Bilan personnel

1. Contexte de la thèse

La thèse a débuté en novembre 2013, au sein de l’équipe Hygiène et Ecophysiologie Microbienne de Surfaces (HEMS) qui faisait partie de l’unité Maîtrise de l’Hygiène (MAHY) du Laboratoire de sécurité des aliments de l’Anses de Maisons-Alfort. La réorganisation du laboratoire ayant eu lieu en 2014, de nouvelles unités et équipes ont été créées. A cette occasion j’ai intégré l’équipe Listeria de l’unité Salmonella , E. coli et Listeria (SEL) dont les activités de recherche visent à appuyer les activités de référence.

Mon travail de thèse s’est intégré dans le projet EcoSec (ANR-12-ALID-0005), financé par l’Agence Nationale de la Recherche dans le cadre du programme Alimentation Durable (ALID) de 2012 et labellisé par le pôle de compétitivité Vitagora. Sept partenaires interdisciplinaires ont participé à ce projet coordonné par l’Anses : Labeyrie, MF Conseil, Dessica, l’unité de Génie des Procédés Frigorifiques d’Irstea, Inra de Theix et UMR PAM de l’Université de Bourgogne.

Ma directrice de thèse, Brigitte Carpentier, étant absente pour maladie dès le début de ma thèse, le rôle d’Olivier Firmesse a été prépondérant. Responsable de l’équipe Clostridium de l’unité Staphylococcus , Bacillus , Clostridum et Lait (SBCL), il a repris la coordination du projet EcoSec pour remplacer Brigitte Carpentier. Laurent Guillier, de l’unité Génomique Analyse Modélisation Risque (GAMeR), a également activement participé à l’avancement de mon projet de thèse. A partir de début 2016, Jean-Christophe Augustin de l’Ecole Vétérinaire de Maisons-Alfort a accepté d’être co-directeur de la thèse. Ce projet était construit pour être mené avec l’aide de Danielle Chassaing, finalement partie à la retraite en 2014. Une partie des expérimentations ont donc été réalisées par une stagiaire, Joséphine Jacques-André-Coquin, et une technicienne de l’unité SEL, Patricia Ng.

2. Motivations personnelles

Tout au long de mon cursus, j’ai eu l’occasion de réaliser plusieurs stages de recherche appliquée dans le domaine de l’agro-alimentaire, de la formulation d’un produit à sa conservation. Pour valider mon master de Sciences, Technologie, Santé, spécialité Microbiologie Appliquée et Génie Biologique, j’ai réalisé en 2013 un stage à l’Anses. Ce stage était en fait un travail préliminaire pour ce projet de thèse. Ceci m’a permis de découvrir l’environnement de travail et la thématique scientifique. Cette expérience m’a conforté dans mon désir de poursuivre dans cette voie, la thèse s’est alors imposée à moi comme une évidence.

265 Bilan personnel

Le fait que le sujet de thèse porte sur une problématique de santé publique et puisse apporter des applications concrètes aux industriels a renforcé cette envie d’enrichir mes compétences dans ce domaine.

3. Gestion du projet

3.1. Préparation et cadrage du projet

Le financement intégral du projet de thèse, assuré par l’ANR, était déjà obtenu avant son commencement. De ce fait, le programme de la thèse était déjà établi avant mon arrivée, l’ANR imposant une planification du projet avec des délivrables à fournir. Je n’ai donc pas participé à la programmation initiale du projet. Cependant, ma contribution a été, je le pense, autant active que possible pour définir plus finement les objectifs et le plan de travail tout au long du projet.

3.2. Conduite du projet

3.2.1. Echanges et réunions

Le projet de thèse a été mené sous Management Qualité en Recherche sur la base des documents mis en place par la Mission Qualité du Laboratoire. Deux audits ont été réalisés par les membres de cette Mission, pour vérifier la traçabilité de la démarche intellectuelle et des expérimentations et la fiabilité des résultats.

Dans le cadre du projet EcoSec, deux réunions semestrielles étaient organisées au cours desquelles chaque partenaire exposait ses résultats. Ces réunions étaient l’occasion de discuter des soucis rencontrés, de faire un bilan de l’avancement des travaux, de renforcer les liens entre partenaires et éventuellement de reformuler certaines hypothèses de travail voire de réorienter des réflexions et/ou des pistes de travail.

Dès le début de la thèse, un comité de spécialistes de Listeria et de la persistance a été constitué. Au total, trois comités de thèse ont eu lieu en 2014 et 2015. Ils étaient alors une excellente opportunité de présenter les résultats et de les discuter pour apporter de nouvelles perspectives au projet.

En plus petit comité réunissant mon encadrant Olivier Firmesse, Laurent Guillier et Patricia Ng, j’ai organisé des réunions régulières durant les trois années de thèse afin de faire des bilans et planifier la suite du projet. Ces rencontres étaient nécessaires, d’autant que la participation

266 Bilan personnel de Patricia Ng au projet EcoSec ne devait pas nuire aux activités de sérotypage auxquelles elle participait au sein de l’équipe Salmonella .

3.2.2. Des difficultés rencontrées

Comme dans tout projet de recherche, il a fallu faire face à de nombreux aléas. J’ai été amenée à montrer mes capacités à réagir lors de situations complexes et faire preuve de recul, de flexibilité et d’adaptabilité.

Nous avons été confrontés à certains problèmes, notamment liés à la nature vivante de notre objet de recherche. La thématique étant la persistance de L. monocytogenes sur les surfaces, il a fallu mettre au point au laboratoire les conditions d’obtention de ces populations. Malgré la persévérance et la mobilisation d’une stagiaire, cette étape du projet a pris plusieurs mois, nous obligeant par la suite à revoir nos ambitions à la baisse. Il était en effet prévu d’étudier l’utilisation de produits plus respectueux de l’environnement pour savoir s’ils pouvaient remplacer l’utilisation de biocides peu écologiques, mais ce travail a été malheureusement très réduit.

Enfin, la dernière partie du projet portant sur l’analyse transcriptomique des mécanismes de réponse de L. monocytogenes à différents stress a été effectuée en collaboration avec le laboratoire GenoScreen. Les délais d’attente pour le séquençage de nos échantillons ont été plus longs que prévus. Le séquençage des échantillons envoyés en mai n’ayant été réalisé qu’en août 2016, les données d’expression différentielle des gènes nous ont été communiquées mi- septembre 2016. De plus, toutes les analyses des données de transcriptomique devaient initialement être réalisées par GenoScreen mais il s’est avéré que ce n’était pas possible. J’ai donc dû mobiliser plus de temps que prévu pour pouvoir remplir mes objectifs et ce, dans le délai imparti. Pour ce faire, une collaboration avec des stagiaires de l’unité GAMeR a été très bénéfique et m’a permis de faire mes premiers pas dans l’univers de la bio-informatique.

D’un point de vue humain, l’absence de Brigitte Carpentier, ma directrice de thèse, et de Danielle Chassaing qui m’avait formée au laboratoire pendant mon stage de fin d’étude ont été à mon sens des éléments « déstabilisants » pour la conduite de ce projet.

4. Compétences mises en œuvre

Outre les compétences techniques et scientifiques de microbiologie conventionnelle et de biologie moléculaire, cette première expérience professionnelle de trois ans a été pour moi

267 Bilan personnel l’occasion de découvrir de nouvelles problématiques scientifiques et de renforcer certaines de mes compétences ayant trait notamment à la gestion de projet.

Durant ce projet de thèse, j’ai beaucoup apprécié travailler avec les partenaires interdisciplinaires du projet EcoSec. Ceci m’a permis (i) d’ouvrir mes connaissances à d’autres approches et thématiques, (ii) d’apprendre à prendre du recul sur mes résultats en les replaçant dans un contexte plus large et (iii) à partager différentes visions scientifiques selon la discipline de l’interlocuteur. Trois séminaires EcoSec, ouverts aux industriels agro-alimentaires, ont été organisés. Y participer a été pour moi l’occasion d’apprendre à vulgariser mon discours scientifique et à mieux prendre conscience des enjeux des industriels. Les échanges construits durant ces rencontres ont été un des moteurs de ma motivation et de ma persévérance pour atteindre les objectifs au laboratoire.

Adapter mon discours à l’auditoire est un exercice auquel j’ai dû me confronter régulièrement. En effet, j’ai participé à plusieurs conférences durant les trois ans, devant des publics très variés (industriels, scientifiques avertis, doctorants de tout horizon, etc.). Communiquer sur mon travail de thèse et ses enjeux m’a beaucoup plu.

J’ai également pu découvrir l’intérêt de transmettre mes connaissances techniques et scientifiques par l’encadrement et la formation, aussi bien d’une technicienne que de deux stagiaires (Joséphine Jacques-André-Coquin de formation universitaire et Lena Fritsch en cursus d’ingénieur en Allemagne). Patience, diplomatie, remise en question et fédération ont été les maîtres mots. De plus, accepter de déléguer le travail a été pour ma part tout un apprentissage.

Ce travail effectué sous Management Qualité en Recherche m’a permis d’approfondir mon sens de la rigueur : élaboration de protocoles expérimentaux, métrologie, traçabilité, gestion de la documentation avec le logiciel Ennov et du matériel avec le logiciel LIMS. Ma sollicitation dans le cadre du groupe AFNOR V08/WG17 m’a fait découvrir un autre visage de la qualité. J’ai en effet eu l’occasion de participer à la révision de la norme ISO 18593 « Microbiologie des aliments - Méthodes horizontales pour les techniques de prélèvement sur des surfaces, au moyen de boîtes de contact et d'écouvillons ».

5. Un projet professionnel

Forte de cette expérience de thèse, mon envie de poursuivre dans le domaine de l’agro- alimentaire est une évidence. Les échanges avec les industriels que j’ai pu rencontrer ont

268 Bilan personnel développé mon goût pour le terrain et la nécessité de travailler sur la sécurité sanitaire des aliments. Proposer, mettre en place et/ou optimiser des protocoles de nettoyage et désinfection, accompagner les industriels dans leur démarche d’amélioration continue du fonctionnement d’un atelier et les sensibiliser à certaines problématiques comme la viabilité des micro- organismes pourraient être un prolongement de mon sujet de thèse.

Dans un premier temps, je n’envisage pas de mobilité internationale mais reste mobile à l’échelle nationale. Mon choix n’est pas arrêté entre les secteurs public ou privé. Cependant, je ressens le besoin de travailler dans un environnement fédérateur autour d’un projet partagé au sein d’une équipe. Une force d’émulation autour de ce projet me paraît indispensable pour garder motivation et intérêt au travail. Que la structure soit grande ou petite n’est pas ma principale préoccupation, je souhaite surtout travailler au sein d’une structure en recherche permanente d’améliorations et de performances et idéalement au sein d’une équipe motivée et dynamique où la communication et les relations humaines sont de vraies valeurs.

« Pour ce qui est de l'avenir, il ne s'agit pas de le prévoir, mais de le rendre possible. » Antoine de Saint-Exupéry

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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Références bibliographiques

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Abee, T., Koomen, J., Metselaar, K. I., Zwietering, M. H., and den Besten, H. M. W. (2016). Impact of pathogen population heterogeneity and stress-resistant variants on food safety. Annual review of food Science and Technology 7, 20.1-20.18.

Al-Makhlafi, H., McGuire, J., and Daeschel, M. (1994). Influence of preadsorbed milk proteins on adhesion of Listeria monocytogenes to hydrophobic and hydrophilic silica surfaces. Applied and Environmental Microbiology 60, 3560-3565.

Alavi, H. E. D., and Hansen, L. T. (2013). Kinetics of biofilm formation and desiccation survival of Listeria monocytogenes in single and dual species biofilms with Pseudomonas fluorescens, Serratia proteamaculans or S hewanella baltica on food-grade stainless steel surfaces. Biofouling 29, 1253-1268.

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292

ANNEXES

Annexe 1

Annexe 1 : Principe et protocole de l’extraction de l’ADN avec le kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III (Roche)

Référence du kit : 03 264 785 001

• Principe

La procédure d’isolement est basée sur une technologie utilisant des billes magnétiques. Les échantillons sont lysés par incubation dans un tampon contenant des sels chaotropiques et de la protéinase K. Des particules en verre magnétisées sont ajoutées et l’ADN se fixe à leur surface. Les substances non fixées sont éliminées par l’intermédiaire de plusieurs lavages, puis l’ADN est élué. Les étapes du principe de l’isolement de l’ADN sont les suivantes : - 1 : L’échantillon est placé dans les puits de la cartouche. - 2 : Le tampon de lyse et de fixation est ajouté à l’échantillon, favorisant la lyse cellulaire complète et le relargage des acides nucléiques. Les nucléases sont dénaturées. - 3 : La protéinase K est ajoutée. Les protéines sont dénaturées. - 4 : L’ADN se fixe à la surface des billes de silice grâce aux conditions chaotropiques, à l’isopropanol et à la haute stringence ionique du tampon de lyse et d’accrochage. - 5 : Les billes sur lesquelles l’ADN s’est fixé sont magnétiquement séparées du reste de l’échantillon lysé. - 6 : Les billes sont lavées plusieurs fois avec du tampon de lavage pour éliminer les protéines (nucléases), les membranes et les inhibiteurs de la PCR, et pour réduire enfin la concentration en sels. - 7 : Les billes sont magnétiquement séparées du tampon de lavage contenant les débris résiduels. - 8 : L’ADN purifié est élué des billes magnétiques à 70°C et transféré dans la cartouche d’élution tandis que les billes sont retenues dans le cône de réaction, puis jetées.

295 Annexe 1

• Protocole

Ajouter à l’échantillon du tampon PBS qsp 200 µl. Ajouter 180 µl de tampon de lyse et 20 µl de protéinase K aux 200 µl d’échantillon. Mélanger en vortexant 5 secondes. Incuber pendant 10 minutes à 65°C et incuber ensuite les échantillons à 95°C pendant 10 minutes. Transférer la totalité des échantillons dans des tubes de 2 ml contenant des billes en silice de 0,1 mm (MP Biomedicals, Lysing Matrix B). Homogénéiser les échantillons à l’aide du MagNA Lyser (vitesse : 6000 ; temps : 30 secondes). Centrifuger à 17000 g durant 5 minutes à 4°C

Prélever 200 µl de chaque échantillon et procéder au transfert dans la plaque MagNA Pure LC Sample cartridge . Réaliser l’extraction et la purification de l’ADN avec l’automate selon le mode opératoire du fournisseur. Conserver les échantillons à -25°C.

296 Annexe 2

Annexe 2 : Script pour la réalisation du plan expériences fractionnaire avec l’application PLANOR du logiciel R 3.2.1 (Kobilinsky et al. , 2015 ; Monod et al. , 2012)

#======# Name : R script for DOE generation of ECOSEC project # Authors : L. Guillier, A. Overney # Date : 08/07/2015 # Version: v2 # Aim : Plan d'expériences ##======

#======# Packages #======

# 3 lignes de commande ne fonctionnant pas à l'Anses (alternative charger le zip sur le CRAN) install.packages("planor") install.packages("gridExtra") install.packages("gtable") library(planor) library(gridExtra) library(gtable) set.seed(123)

#======#Définition des facteurs #======ecosecfactor1<-planor.factors( factors=list( sechage=c("N&D - pas de séchage","N&D - séchage quotidien","pas de N&D - séchage quotidien","N&D - séchage en fin de semaine"), souche=c("plus résistante à la dessiccation","moins résistante à la dessiccation"), souillure=c("exsudat de viande","jus de saumon fumé"), materiau=c("acier inoxydable","céramique"), culture=c("monoculture de L. monocytogenes","coculture de L. monocytogenes avec Pseudomonas")))

#======#Conception du plan d'expériences fractionnaire #======ecosecmodel1<-planor.model(model=~(sechage+souche+souillure+materiau+culture)^2, estimate=~sechage+souche+souillure+materiau+culture) frac.key1 <- planor.designkey( factors = ecosecfactor1, model = ecosecmodel1,resolution=3, nunits=16, base=~sechage+souche+souillure) frac.plan1 <- planor.design(frac.key1) data1<-(frac.plan1@design) df1<-data.frame(culture=data1$culture, materiau=data1$materiau, sechage=data1$sechage, souche=data1$souche, souillure=data1$souillure) grid.table(df1) write.csv2(df1, file = "X:/DPTMIC/MMODAQR/Projets scientifiques/Projets en cours/Ecosec/planfractionnaire1.csv")

297

Annexe 3

Annexe 3 : Script pour le traitement des données et gérer les données censurées avec l’application PLANOR du logiciel R 3.2.1 (Kobilinsky et al. , 2015 ; Monod et al. , 2012)

Le code ci-dessous permet de lire les fichiers récapitulant toutes les données brutes obtenues suite au plan d’expériences fractionnaire, de générer les courbes d’allure des 18 expériences et de gérer les données censurées.

#setwd("X:/DPTMIC/MMODAQR/Projets scientifiques/Projets en cours/Ecosec/ecosec2") #setwd("F:/") setwd("E:/") # Adapter le chemin dans lequel se trouvent les fichiers d'entrée csv library(ggplot2) library(fitdistrplus) library(gridExtra)

############################################################ ### 1. Analyse sur les données exprimées en UFC ############################################################ data<-read.table("AO2_data_final.csv",header=TRUE,sep=";") delta_1b_4a_c<-c() delta_1b_3a_c<-c() delta_1b_2a_c<-c() delta_1b_1a_c<-c() eff_1b_1a_c<-c() eff_2b_2a_c<-c() eff_3b_3a_c<-c() eff_4b_4a_c<-c() a1_cfu<-c() a2_cfu<-c() a3_cfu<-c() a4_cfu<-c() b1_cfu<-c() b2_cfu<-c() b3_cfu<-c() b4_cfu<-c() numero<-levels(data[,1]) for (n in 1:length(numero)) { data_n<-data[which(data[,1]==numero[n]),] data_n_b<-data_n[which(data_n[,4]=="before"),] data_n_a<-data_n[which(data_n[,4]=="after"),]

# Cas 1 données avant les stress "_b" dim_b<-dim(data_n_b) rlogcfu<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=10) rtime<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=10) time_m<-c() cfu_b_m<-c() cfu_b_sd<-c() time<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=3) cfu_r<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=3) cfu_l<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=3) for (i in 1:c(dim_b[1]/3)) { print(i) time[i,]<-c(data_n_b[(i-1)*3+1,3],data_n_b[(i-1)*3+2,3],data_n_b[(i-1)*3+3,3]) time_m[i]<-mean(time[i,]) cfu_r[i,1:3]<-c(as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+1,8])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+2,8])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i-1)*3+3,8]))) cfu_l[i,]<-c(as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+1,7])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+2,7])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i-1)*3+3,7])))

299 Annexe 3

# Cas 2 données aprés les stress "_a" dim_a<-dim(data_n_a) rlogcfu<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=10) rtime<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=10) time_m<-c() cfu_a_m<-c() cfu_a_sd<-c() time<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=3) cfu_r<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=3) cfu_l<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=3) for (i in 1:c(dim_b[1]/3)) { print(i) time[i,]<-c(data_n_a[(i-1)*3+1,3],data_n_a[(i-1)*3+2,3],data_n_a[(i-1)*3+3,3]) time_m[i]<-mean(time[i,]) cfu_r[i,1:3]<-c(as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+1,8])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+2,8])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i-1)*3+3,8]))) cfu_l[i,]<-c(as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+1,7])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+2,7])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i-1)*3+3,7])))

if (any(is.na(cfu_l[i,])==T)) { if (any(is.na(cfu_l[i,])==F)) {censored<-data.frame(left = cfu_l[i,],right= cfu_r[i,]) fcensored<-fitdistcens(censored, "norm") cfu_a_m[i]=fcensored$estim[1] cfu_a_sd[i]=fcensored$estim[2]} else {cfu_a_m[i]=-1 cfu_a_sd[i]=1} } else {cfu_a_m[i]=mean(cfu_r[i,]) cfu_a_sd[i]=sd(cfu_r[i,])} rtime[i,1:10]<-rep(time_m[i],10) rlogcfu[i,1:10]<-c(rnorm(10,cfu_a_m[i],cfu_a_sd[i])) } # Fin de la boucle i "temps" data_plota<- data.frame(t=as.numeric(as.character(rtime)),logcfu=as.numeric(as.character(rlogcfu))) plot_a<-ggplot(data_plota,aes(t,logcfu))+geom_smooth(color="red",size=1.5)+ylim(-2,9) #print(plot_a) p3<-grid.arrange(plot_b,plot_a,nrow=2) print(p3) ggsave(paste(numero[n],"cfu.png"),p3) delta_1b_4a_c[n]<-cfu_a_m[length(cfu_a_m)]-cfu_b_m[1] delta_1b_1a_c[n]<-cfu_a_m[1]-cfu_b_m[1] delta_1b_2a_c[n]<-cfu_a_m[2]-cfu_b_m[1] delta_1b_3a_c[n]<-cfu_a_m[3]-cfu_b_m[1] eff_1b_1a_c[n]<-cfu_a_m[1]-cfu_b_m[1] eff_2b_2a_c[n]<-cfu_a_m[2]-cfu_b_m[2] eff_3b_3a_c[n]<-cfu_a_m[3]-cfu_b_m[3] eff_4b_4a_c[n]<-cfu_a_m[4]-cfu_b_m[4]

300 Annexe 3

a1_cfu[n]<-cfu_a_m[1] a2_cfu[n]<-cfu_a_m[2] a3_cfu[n]<-cfu_a_m[3] a4_cfu[n]<-cfu_a_m[4] b1_cfu[n]<-cfu_b_m[1] b2_cfu[n]<-cfu_b_m[2] b3_cfu[n]<-cfu_b_m[3] b4_cfu[n]<-cfu_b_m[4]

}#fin de la boucle n "manip"

############################################################ ### 2. Analyse sur les données exprimées en cellules viables ############################################################ data<-read.table("AO2_data_final_viable.csv",header=TRUE,sep=";") delta_1b_4a_v<-c() delta_1b_3a_v<-c() delta_1b_2a_v<-c() delta_1b_1a_v<-c() eff_1b_1a_v<-c() eff_2b_2a_v<-c() eff_3b_3a_v<-c() eff_4b_4a_v<-c() a1_viable<-c() a2_viable<-c() a3_viable<-c() a4_viable<-c() b1_viable<-c() b2_viable<-c() b3_viable<-c() b4_viable<-c() numero<-levels(data[,1]) for (n in 1:length(numero)) { data_n<-data[which(data[,1]==numero[n]),] data_n_b<-data_n[which(data_n[,4]=="before"),] data_n_a<-data_n[which(data_n[,4]=="after"),]

# Cas 1 données avant les stress "_b" dim_b<-dim(data_n_b) rlogviablecell<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=10) rtime<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=10) time_m<-c() viablecell_b_m<-c() viablecell_b_sd<-c() time<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=3) viablecell_r<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=3) viablecell_l<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=3) for (i in 1:c(dim_b[1]/3)) { print(i) time[i,]<-c(data_n_b[(i-1)*3+1,3],data_n_b[(i-1)*3+2,3],data_n_b[(i-1)*3+3,3]) time_m[i]<-mean(time[i,]) viablecell_r[i,1:3]<-c(as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+1,8])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+2,8])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i-1)*3+3,8]))) viablecell_l[i,]<-c(as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+1,7])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+2,7])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i-1)*3+3,7])))

301 Annexe 3 viablecell_b_sd[i]=1} } else {viablecell_b_m[i]=mean(viablecell_r[i,]) viablecell_b_sd[i]=sd(viablecell_r[i,])} rtime[i,1:10]<-rep(time_m[i],10) rlogviablecell[i,1:10]<-c(rnorm(10,viablecell_b_m[i],viablecell_b_sd[i])) } # Fin de la boucle i "temps" data_plotb<- data.frame(t=as.numeric(as.character(rtime)),logviablecell=as.numeric(as.character(rlogviablec ell))) plot_b<-ggplot(data_plotb,aes(t,logviablecell))+geom_smooth(color="blue",size=1.5)+ylim(-2,9) #print(plot_b)

# Cas 2 données aprés les stress "_a" dim_a<-dim(data_n_a) rlogviablecell<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=10) rtime<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=10) time_m<-c() viablecell_a_m<-c() viablecell_a_sd<-c() time<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=3) viablecell_r<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=3) viablecell_l<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=3) for (i in 1:c(dim_a[1]/3)) { print(i) time[i,]<-c(data_n_a[(i-1)*3+1,3],data_n_a[(i-1)*3+2,3],data_n_a[(i-1)*3+3,3]) time_m[i]<-mean(time[i,]) viablecell_r[i,1:3]<-c(as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+1,8])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+2,8])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i-1)*3+3,8]))) viablecell_l[i,]<-c(as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+1,7])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+2,7])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i-1)*3+3,7])))

if (any(is.na(viablecell_l[i,])==T)) { if (any(is.na(viablecell_l[i,])==F)) {censored<-data.frame(left = viablecell_l[i,],right= viablecell_r[i,]) fcensored<-fitdistcens(censored, "norm") viablecell_a_m[i]=fcensored$estim[1] viablecell_a_sd[i]=fcensored$estim[2]} else {viablecell_a_m[i]=-1 viablecell_a_sd[i]=1} } else {viablecell_a_m[i]=mean(viablecell_r[i,]) viablecell_a_sd[i]=sd(viablecell_r[i,])} rtime[i,1:10]<-rep(time_m[i],10) rlogviablecell[i,1:10]<-c(rnorm(10,viablecell_a_m[i],viablecell_a_sd[i])) } # Fin de la boucle i "temps" data_plota<- data.frame(t=as.numeric(as.character(rtime)),logviablecell=as.numeric(as.character(rlogviablec ell))) plot_a<-ggplot(data_plota,aes(t,logviablecell))+geom_smooth(color="red",size=1.5)+ylim(-2,9) #print(plot_a) p3<-grid.arrange(plot_b,plot_a,nrow=2,top=numero[n]) print(p3) ggsave(paste(numero[n],"viable.png"),p3) delta_1b_4a_v[n]<-viablecell_a_m[length(viablecell_a_m)]-viablecell_b_m[1] delta_1b_1a_v[n]<-viablecell_a_m[1]-viablecell_b_m[1] delta_1b_2a_v[n]<-viablecell_a_m[2]-viablecell_b_m[1] delta_1b_3a_v[n]<-viablecell_a_m[3]-viablecell_b_m[1] eff_1b_1a_v[n]<-viablecell_a_m[1]-viablecell_b_m[1] eff_2b_2a_v[n]<-viablecell_a_m[2]-viablecell_b_m[2] eff_3b_3a_v[n]<-viablecell_a_m[3]-viablecell_b_m[3] eff_4b_4a_v[n]<-viablecell_a_m[4]-viablecell_b_m[4] a1_viable[n]<-viablecell_a_m[1] a2_viable[n]<-viablecell_a_m[2] a3_viable[n]<-viablecell_a_m[3] a4_viable[n]<-viablecell_a_m[4] b1_viable[n]<-viablecell_b_m[1] b2_viable[n]<-viablecell_b_m[2]

302 Annexe 3 b3_viable[n]<-viablecell_b_m[3] b4_viable[n]<-viablecell_b_m[4]

}#fin de la boucle n "manip"

############################################################ ### 4. Analyse sur les données exprimées en cellules totales ############################################################ data<-read.table("AO2_data_final_totale.csv",header=TRUE,sep=";") delta_1b_4a<-c() delta_1b_3a<-c() delta_1b_2a<-c() delta_1b_1a<-c() eff_1b_1a<-c() eff_2b_2a<-c() eff_3b_3a<-c() eff_4b_4a<-c() a1_totales<-c() a2_totales<-c() a3_totales<-c() a4_totales<-c() b1_totales<-c() b2_totales<-c() b3_totales<-c() b4_totales<-c() numero<-levels(data[,1]) for (n in 1:length(numero)) { data_n<-data[which(data[,1]==numero[n]),] data_n_b<-data_n[which(data_n[,4]=="before"),] data_n_a<-data_n[which(data_n[,4]=="after"),]

# Cas 1 données avant les stress "_b" dim_b<-dim(data_n_b) rlogcelltot<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=10) rtime<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=10) time_m<-c() celltot_b_m<-c() celltot_b_sd<-c() time<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=3) celltot_r<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=3) celltot_l<-matrix(nrow=dim_b[1]/3,ncol=3) for (i in 1:c(dim_b[1]/3)) { print(i) time[i,]<-c(data_n_b[(i-1)*3+1,3],data_n_b[(i-1)*3+2,3],data_n_b[(i-1)*3+3,3]) time_m[i]<-mean(time[i,]) celltot_r[i,1:3]<-c(as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+1,8])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+2,8])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i-1)*3+3,8]))) celltot_l[i,]<-c(as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+1,7])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i- 1)*3+2,7])),as.numeric(as.character(data_n_b[(i-1)*3+3,7])))

303 Annexe 3 data_plotb<- data.frame(t=as.numeric(as.character(rtime)),logcelltot=as.numeric(as.character(rlogcelltot))) plot_b<-ggplot(data_plotb,aes(t,logcelltot))+geom_smooth(color="blue",size=1.5)+ylim(-2,9) #print(plot_b)

# Cas 2 données aprés les stress "_a" dim_a<-dim(data_n_a) rlogcelltot<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=10) rtime<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=10) time_m<-c() celltot_a_m<-c() celltot_a_sd<-c() time<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=3) celltot_r<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=3) celltot_l<-matrix(nrow=dim_a[1]/3,ncol=3) for (i in 1:c(dim_a[1]/3)) { print(i) time[i,]<-c(data_n_a[(i-1)*3+1,3],data_n_a[(i-1)*3+2,3],data_n_a[(i-1)*3+3,3]) time_m[i]<-mean(time[i,]) celltot_r[i,1:3]<-c(as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+1,8])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+2,8])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i-1)*3+3,8]))) celltot_l[i,]<-c(as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+1,7])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i- 1)*3+2,7])),as.numeric(as.character(data_n_a[(i-1)*3+3,7])))

if (any(is.na(celltot_l[i,])==T)) { if (any(is.na(celltot_l[i,])==F)) {censored<-data.frame(left = celltot_l[i,],right= celltot_r[i,]) fcensored<-fitdistcens(censored, "norm") celltot_a_m[i]=fcensored$estim[1] celltot_a_sd[i]=fcensored$estim[2]} else {celltot_a_m[i]=-1 celltot_a_sd[i]=1} } else {celltot_a_m[i]=mean(celltot_r[i,]) celltot_a_sd[i]=sd(celltot_r[i,])} rtime[i,1:10]<-rep(time_m[i],10) rlogcelltot[i,1:10]<-c(rnorm(10,celltot_a_m[i],celltot_a_sd[i])) } # Fin de la boucle i "temps" data_plota<- data.frame(t=as.numeric(as.character(rtime)),logcelltot=as.numeric(as.character(rlogcelltot))) plot_a<-ggplot(data_plota,aes(t,logcelltot))+geom_smooth(color="red",size=1.5)+ylim(-2,9) #print(plot_a) p3<-grid.arrange(plot_b,plot_a,nrow=2) print(p3) ggsave(paste(numero[n],"totale.png"),p3) delta_1b_4a[n]<-celltot_a_m[length(celltot_a_m)]-celltot_b_m[1] delta_1b_1a[n]<-celltot_a_m[1]-celltot_b_m[1] delta_1b_2a[n]<-celltot_a_m[2]-celltot_b_m[1] delta_1b_3a[n]<-celltot_a_m[3]-celltot_b_m[1] eff_1b_1a[n]<-celltot_a_m[1]-celltot_b_m[1] eff_2b_2a[n]<-celltot_a_m[2]-celltot_b_m[2] eff_3b_3a[n]<-celltot_a_m[3]-celltot_b_m[3] eff_4b_4a[n]<-celltot_a_m[4]-celltot_b_m[4] a1_totales[n]<-celltot_a_m[1] a2_totales[n]<-celltot_a_m[2] a3_totales[n]<-celltot_a_m[3] a4_totales[n]<-celltot_a_m[4] b1_totales[n]<-celltot_b_m[1] b2_totales[n]<-celltot_b_m[2] b3_totales[n]<-celltot_b_m[3] b4_totales[n]<-celltot_b_m[4]

}#fin de la boucle n "manip"

304 Annexe 3

############################################################ ### 5. Analyse sur les données exprimées en cellules mortes ############################################################

# Estimation des valeurs de mortes after CD mortes_a1<-log10(10â1_totales-10â1_viable) mortes_a2<-log10(10â2_totales10â2_viable) mortes_a3<-log10(10â3_totales-10â3_viable) mortes_a4<-log10(10â4_totales-10â4_viable)

# Estimation des valeurs des mortes avant CD mortes_b1<-log10(10^b1_totales-10^b1_viable) mortes_b2<-log10(10^b2_totales-10^b2_viable) mortes_b3<-log10(10^b3_totales-10^b3_viable) mortes_b4<-log10(10^b4_totales-10^b4_viable)

# delta 14 mortes delta_1b_4a_morte<-mortes_a4-mortes_b1

305

Annexe 4

Le code ci-dessous permet de tester l’effet des facteurs environnements et de générer les graphiques présentés dans ce manuscrit. Les termes du code sont à adapter selon que l’état physiologique des populations étudiées (cultivables, viables ou totales). library(gplots) library(effects) library(qualityTools)

#Persistance b1a4 setwd("E:/") #Chemin vers le dossier contenant les fichiers csv à changer data4<-read.csv("data_ecosec_plan16_better.csv",header=TRUE,sep=';') mp_delta14 <- lm(delta14 ~ C+M+Sec+Strain+Soil, data4) summary(mp_delta14) anova(mp_delta14) # http://www.ats.ucla.edu/stat/r/library/contrast_coding.html # http://docplayer.net/14088102-Visualizing-categorical-data-with-sas-and-r-part-4-model- based-methods-for-categorical-data-modeling-approaches-overview.html plot(effect("C",mp_delta14),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Sec",mp_delta14),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Soil",mp_delta14),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Strain",mp_delta14),ylim=c(-2,12)) plot(effect("M",mp_delta14),ylim=c(-2,12)) plot(allEffects(mp_delta14),ylim=c(-2,12))

#Persistance b1a3 data3<-read.csv("data_ecosec_plan16_better_delta1b3a.csv",header=TRUE,sep=';') mp_delta13 <- lm(delta13 ~ C+M+Sec+Strain+Soil, data3) summary(mp_delta13) anova(mp_delta13) # http://www.ats.ucla.edu/stat/r/library/contrast_coding.html # http://docplayer.net/14088102-Visualizing-categorical-data-with-sas-and-r-part-4-model- based-methods-for-categorical-data-modeling-approaches-overview.html plot(effect("C",mp_delta13),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Sec",mp_delta13),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Soil",mp_delta13),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Strain",mp_delta13),ylim=c(-2,12)) plot(effect("M",mp_delta13),ylim=c(-2,12)) plot(allEffects(mp_delta13),ylim=c(-2,12))

#Persistance b1a2 data2<-read.csv("data_ecosec_plan16_better_delta1b2a.csv",header=TRUE,sep=';') mp_delta12 <- lm(delta12 ~ C+M+Sec+Strain+Soil, data2) summary(mp_delta12) anova(mp_delta12) # http://www.ats.ucla.edu/stat/r/library/contrast_coding.html # http://docplayer.net/14088102-Visualizing-categorical-data-with-sas-and-r-part-4-model- based-methods-for-categorical-data-modeling-approaches-overview.html plot(effect("C",mp_delta12),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Sec",mp_delta12),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Soil",mp_delta12),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Strain",mp_delta12),ylim=c(-2,12)) plot(effect("M",mp_delta12),ylim=c(-2,12)) plot(allEffects(mp_delta12),ylim=c(-2,12))

#Persistance b1a1 data1<-read.csv("data_ecosec_plan16_better_delta1b1a.csv",header=TRUE,sep=';') mp_delta11 <- lm(delta11 ~ C+M+Sec+Strain+Soil, data1) summary(mp_delta11) anova(mp_delta11) # http://www.ats.ucla.edu/stat/r/library/contrast_coding.html

307 Annexe 4

# http://docplayer.net/14088102-Visualizing-categorical-data-with-sas-and-r-part-4-model- based-methods-for-categorical-data-modeling-approaches-overview.html plot(effect("C",mp_delta11),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Sec",mp_delta11),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Soil",mp_delta11),ylim=c(-2,12)) plot(effect("Strain",mp_delta11),ylim=c(-2,12)) plot(effect("M",mp_delta11),ylim=c(-2,12)) plot(allEffects(mp_delta11),ylim=c(-2,12))

Sec1<-effect("Sec",mp_delta11) Sec2<-effect("Sec",mp_delta12) Sec3<-effect("Sec",mp_delta13) Sec4<-effect("Sec",mp_delta14)

Sec_CD<-c(Sec1$fit[1],Sec2$fit[1],Sec3$fit[1],Sec4$fit[1]) Sec_noCD_dailySec<-c(Sec1$fit[2],Sec2$fit[2],Sec3$fit[2],Sec4$fit[2]) Sec_CD_finalSec<-c(Sec1$fit[3],Sec2$fit[3],Sec3$fit[3],Sec4$fit[3]) Sec_CD_dailySec<-c(Sec1$fit[4],Sec2$fit[4],Sec3$fit[4],Sec4$fit[4])

Sec_CD_l<-c(Sec1$lower[1],Sec2$lower[1],Sec3$lower[1],Sec4$lower[1]) Sec_noCD_dailySec_l<-c(Sec1$lower[2],Sec2$lower[2],Sec3$lower[2],Sec4$lower[2]) Sec_CD_finalSec_l<-c(Sec1$lower[3],Sec2$lower[3],Sec3$lower[3],Sec4$lower[3]) Sec_CD_dailySec_l<-c(Sec1$lower[4],Sec2$lower[4],Sec3$lower[4],Sec4$lower[4])

Sec_CD_u<-c(Sec1$upper[1],Sec2$upper[1],Sec3$upper[1],Sec4$upper[1]) Sec_noCD_dailySec_u<-c(Sec1$upper[2],Sec2$upper[2],Sec3$upper[2],Sec4$upper[2]) Sec_CD_finalSec_u<-c(Sec1$upper[3],Sec2$upper[3],Sec3$upper[3],Sec4$upper[3]) Sec_CD_dailySec_u<-c(Sec1$upper[4],Sec2$upper[4],Sec3$upper[4],Sec4$upper[4]) a=data.frame(SEC=c("CD","CD","CD","CD","noCD_dailySec","noCD_dailySec","noCD_dailySec","noCD_d ailySec","CD_finalSec","CD_finalSec","CD_finalSec","CD_finalSec","CD_dailySec","CD_dailySec"," CD_dailySec","CD_dailySec"), logred=c(Sec_CD,Sec_noCD_dailySec,Sec_CD_finalSec,Sec_CD_dailySec), lower=c(Sec_CD_l,Sec_noCD_dailySec_l,Sec_CD_finalSec_l,Sec_CD_dailySec_l), upper=c(Sec_CD_u,Sec_noCD_dailySec_u,Sec_CD_finalSec_u,Sec_CD_dailySec_u),day=c('day1','day2', 'day3','day4','day1','day2','day3','day4','day1','day2','day3','day4','day1','day2','day3','da y4')) ggplot() + geom_pointrange(data=a, mapping=aes(x=SEC, y=logred, ymin=upper, ymax=lower,color=day), size=2, fill="white", shape=22 ,position = position_dodge(0.5), size = .2)

#efficacité J1 data1<-read.csv("data_ecosec_plan16_better_cfu_eff1.csv",header=TRUE,sep=';') mp_eff1 <- lm(eff1 ~ C+M+Sec+Strain+Soil, data1) summary(mp_eff1) anova(mp_eff1) # http://www.ats.ucla.edu/stat/r/library/contrast_coding.html # http://docplayer.net/14088102-Visualizing-categorical-data-with-sas-and-r-part-4-model- based-methods-for-categorical-data-modeling-approaches-overview.html plot(effect("C",mp_eff1)) plot(effect("Sec",mp_eff1)) plot(effect("Soil",mp_eff1)) plot(effect("Strain",mp_eff1)) plot(allEffects(mp_eff1))

#efficacité J2 data2<-read.csv("data_ecosec_plan16_better_cfu_eff2.csv",header=TRUE,sep=';') mp_eff2<- lm(eff2 ~ C+M+Sec+Strain+Soil, data2) summary(mp_eff2) anova(mp_eff2) # http://www.ats.ucla.edu/stat/r/library/contrast_coding.html # http://docplayer.net/14088102-Visualizing-categorical-data-with-sas-and-r-part-4-model- based-methods-for-categorical-data-modeling-approaches-overview.html plot(effect("C",mp_eff2)) plot(effect("Sec",mp_eff2)) plot(effect("Soil",mp_eff2)) plot(effect("Strain",mp_eff2)) plot(allEffects(mp_eff2))

#efficacité J3 data3<-read.csv("data_ecosec_plan16_better_cfu_eff3.csv",header=TRUE,sep=';') mp_eff3 <- lm(eff3 ~ C+M+Sec+Strain+Soil, data3) summary(mp_eff3) anova(mp_eff3) # http://www.ats.ucla.edu/stat/r/library/contrast_coding.html

308 Annexe 4

# http://docplayer.net/14088102-Visualizing-categorical-data-with-sas-and-r-part-4-model- based-methods-for-categorical-data-modeling-approaches-overview.html plot(effect("C",mp_eff3)) plot(effect("Sec",mp_eff3)) plot(effect("Soil",mp_eff3)) plot(effect("Strain",mp_eff3)) plot(allEffects(mp_eff3))

#efficacité J4 data4<-read.csv("data_ecosec_plan16_better_cfu_eff4.csv",header=TRUE,sep=';') mp_eff4 <- lm(eff4 ~ C+M+Sec+Strain+Soil, data4) summary(mp_eff4) anova(mp_eff4) # http://www.ats.ucla.edu/stat/r/library/contrast_coding.html # http://docplayer.net/14088102-Visualizing-categorical-data-with-sas-and-r-part-4-model- based-methods-for-categorical-data-modeling-approaches-overview.html plot(effect("C",mp_eff4)) plot(effect("Sec",mp_eff4)) plot(effect("Soil",mp_eff4)) plot(effect("Strain",mp_eff4)) plot(allEffects(mp_eff4))

Sec1<-effect("Sec",mp_eff1) Sec2<-effect("Sec",mp_eff2) Sec3<-effect("Sec",mp_eff3) Sec4<-effect("Sec",mp_eff4)

309 Annexe 5

Annexe 5 : Protocole d’extraction d’ARN avec le kit high Pure RNA Isolation

Référence Roche du kit : 11 828 665 001

Centrifuger les échantillons de 10 ml à 7000 g pendant 10 minutes à température ambiante (à 10°C dans le cas de l’étude du stress froid). Eliminer le surnageant puis resuspendre le culot dans 500 µl de tampon Tris 10 mM, pH 8. Ajouter 5 µl de lysozyme à 100 mg/ml et incuber à 37°C pendant 10 minutes.

Transférer la totalité des échantillons dans des tubes de 2 ml contenant des billes en silice de 0,1 mm (MP Biomedicals, Lysing Matrix B). Homogénéiser les échantillons à l’aide du MagNA Lyser (vitesse : 6000 ; temps : 30 secondes). Centrifuger à 17000 g durant 5 minutes à température ambiante. Prélever 204 µl de surnageant et les mélanger avec 400 µl de tampon de lyse (flacon au bouchon vert) et vortexer pendant 15 secondes. Transférer chacun des échantillons (700 µl au maximum) dans un tube à filtre qui est placé sur un tube collecteur. Centrifuger à 8000 g pendant 15 secondes. Jeter l’éluat et déposer sur le filtre 100 µl de la solution de DNase en mélangeant 90 µl du tampon d’incubation de la DNase (flacon au bouchon blanc) et 10 µl de DNase. Incuber à 25°C pendant 15 minutes. Ajouter 500 µl de tampon I de lavage (flacon au bouchon noir) dans le tube à filtre et centrifuger à 8000 g pendant 15 secondes. Eliminer l’éluat. Ajouter 500 µl de tampon II (flacon au bouchon bleu) de lavage dans le tube à filtre et centrifuger à 8000 g pendant 15 secondes. Eliminer l’éluat. Ajouter 200 µl de tampon II de lavage dans le tube à filtre et centrifuger à 13000 g pendant 2 minutes. Jeter le tube collecteur et placer le tube à filtre dans un tube stérile de 1,5 ml. Eluer l’ARN en déposant 50 µl de tampon d’élution (flacon au bouchon transparent), puis en centrifugeant à 8000 g durant 1 minute après une incubation de 5 minutes à température ambiante. Conserver les échantillons à -80°C.

310 Annexe 6

Annexe 6 : Principe et protocole de la quantification de l’ARN d’un échantillon avec le kit RNA 6000 Nano Kit avec le Bioanalyzer 2100 (Agilent)

Référence du kit : 5067-1511

311 Annexe 6

312 Annexe 6

313 Annexe 6

314 Annexe 7

Annexe 7 : Script MACLiK pour la détermination des catégories COG de chaque gène différentiellement exprimé

1. Récupération des séquences au format FASTA

Création d’un fichier avec les identifiants NP des différents transcrits, ici 2855 NP (fichier fichier_nom_ID). Elimination des doublons au sein de la liste des NP avec le logiciel disponible en ligne (http://textmechanic.com/text-tools/basic-text-tools/remove-duplicate-lines/), création du fichier fichier_nom_ID_sans_doublons. Récupération des séquences au format FASTA de chaque NP grâce au logiciel BatchEntrez du NCBI (fichier sequence.fasta).

2. Création de la base de données des séquences protéiques

Création d’une base de données référençant la séquence protéique associée pour chaque NP : téléchargement de NCBI_BLAST 2.4.0+ pour l’utilisation de la fonction makeblastdb et utilisation de la ligne de commande suivante :

/ncbi-blast-2.4.0+/bin/makeblastdb -in / /sequence.fasta -dbtype prot -out GenThree

Obtention des informations suivantes sur le terminal :

Building a new DB, current time: 09/13/2016 11:52:05 New DB name: /GenThree New DB title: /sequence.fasta Sequence type: Protein Keep MBits: T Maximum file size: 1000000000B Adding sequences from FASTA; added 2846 sequences in 0.159657 seconds

Obtention des trois fichiers de sortie : GenThree.pin , GenThree.psq et GenThree.phr.

3. Création de la base de données des séquences protéiques de Listeria innocua

Réduction de la base de données des séquences protéiques (ayant un lien avec les COG) aux données de Listeria innocua pour réduire le temps de calcul et les possibles erreurs. Utilisation d’une commande AWK, que nous avons appliqué sur la base de données téléchargée sur le site du NCBI : awk 'BEGIN(!!! INVALID CITATION !!! {}) /Listeria innocua/ {print">"$0}' prot2003-2014.fa > prot2003-2014-listeria.fa

Obtention du fichier de sortie : prot2003-2014-listeria.fa.

Modification de ce fichier contenant des lignes dites « vides » avec le script Python listeria.py. def listeria (filenameIn, filenameOut): with open (filenameIn, "r") as inputfile: fpIn = inputfile.readlines() with open (filenameOut, "w") as fpOut: for line in fpIn: if line != '\n': fpOut.write(line)

### MAIN ### fileIn = '/prot2003-2014-listeria.fa' fileOut = '/prot2003-2014-listeria-innocua.fa' listeria (fileIn, fileOut)

315 Annexe 7

Utiliser de la fonction makeblastdb pour obtenir une base de données sous le même format que celle de Listeria monocytogenes

/ncbi-blast-2.4.0+/bin/makeblastdb -in /prot2003-2014-listeria-innocua.fa -dbtype prot -out COGs

Obtention des informations suivantes sur le terminal :

Building a new DB, current time: 07/28/2016 14:42:58 New DB name: /COGs New DB title: /prot2003-2014-listeria-innocua.fa Sequence type: Protein Keep MBits: T Maximum file size: 1000000000B Adding sequences from FASTA; added 2473 sequences in 0.12959 seconds.

Obtention des trois fichiers de sortie : COGs.pin , COGs.psq et COGs.phr.

4. Lancement du BLAST

Réalisation du Blast en utilisant BLASTno (Blast non filtré) et BLASTff (Blast filtré) du package NCBI_BLAST2.4.0+.

/ncbi-blast-2.4.0+/bin/psiblast -query sequence.fasta -db COGs -show_gis -outfmt 7 - num_descriptions 1000 -num_alignments 1000 -dbsize 100000000 -comp_based_stats F -seg no -out BLASTno/QueryCOGs.tab

Obtention des informations suivantes sur le terminal :

Warning: [psiblast] The parameter -num_descriptions is ignored for output formats > 4 . Use - max_target_seqs to control output

Obtention du fichier de sortie : QueryCOGsBLASTno.tab.

/ncbi-blast-2.4.0+/bin/psiblast -query sequence.fasta -db COGs -show_gis -outfmt 7 - num_descriptions 1000 -num_alignments 1000 -dbsize 100000000 -comp_based_stats T -seg yes -out BLASTff/QueryCOGs.tab

Obtention des informations suivantes sur le terminal :

Warning: [psiblast] The parameter -num_descriptions is ignored for output formats > 4 . Use - max_target_seqs to control output

Obtention du fichier de sortie : QueryCOGsBLASTff.tab.

5. Lecture du BLAST

Utilisation du script PERL parse.pl pour garder uniquement le résultat de chaque BLAST ayant la e-value la plus faible et le score le plus élevé dans le fichier QueryCOGs

#PROGRAMME FONCTIONNEL / VERSION AVEC GESTION DE FICHIERS use strict; use warnings; my $ligneprec; open(F1, 'QueryCOGs.tab'); #j'ouvre F1 en écriture donc "<" while() { if(/#/) #si présece de motif print { { open(F0, '>>prints.txt'); #j'ouvre F0 en écriture donc print(F0); $ligneprec=1; } } if(/Query:/) #si présece de motif print { { open(F0, '>>prints.txt'); #j'ouvre F0 en écriture donc print(F0); $ligneprec=1;

316 Annexe 7

} } if(/gi/) #si présece de motif print { { open(F0, '>>prints.txt'); #j'ouvre F0 en écriture donc if ($ligneprec!=0) { print(F0); $ligneprec=0; } } } } close(F0); close(F1);

Ligne de commande : cat prints.txt | uniq > printsUNIQ.txt

Obtention des fichiers de sortie : printsUNIQBLASTno.txt et printsUNIQBLASTff.txt.

6. Mise en relation des séquences protéiques au COG associé .

Réduction de la base de données COG au simple COG présent dans Listeria innocua en utilisant un GREP. grep Listeria_innocua cog2003-2014.csv > cog2003-2014-Listeria.csv

Obtention du fichier de sortie : cog2003-2014-Listeria.csv.

Création d’un tableau Excel permettant de mettre en relation pour chaque protéine le COG associé, tout en conservant les informations associées ( e-value , score, pourcentage d'identité, etc.) grâce au script Python blastCOG.py def firstblast(filenameInBlast, filenameInCog, filenameOut): with open (filenameInBlast, "r") as fileInB: fpInB = fileInB.readlines() with open (filenameInCog, "r") as fileInC: fpInC = fileInC.readlines() with open (filenameOut, "w") as fileOut: commentbis = ''.join("GI L.mono") + "\t" + ''.join("NP L.mono") + "\t" + ''.join("Description") + "\t" + ''.join("GI L.inno") + "\t" + ''.join("NP L.inno") + "\t" + ''.join("identity") + "\t" + ''.join("alignment length") + "\t" + ''.join("evalue") + "\t" + ''.join("bit score") + "\t" + ''.join("COG") + "\n" fileOut.write(commentbis) for line in fpInB: if line.startswith("# Query"): GImono = line.split("|")[1] NPmono = line.split("|")[3] Description1 = line.split("|")[4] Description=Description1.rstrip() elif line.startswith("gi"): GIinno=line.split("|")[5] NPinno=line.split("|")[7] identity=line.split("\t")[2] alignment=line.split("\t")[3] evalue=line.split("\t")[10] score1=line.split("\t")[11] score=score1.rstrip() for lineC in fpInC: idCOG=lineC.split(",")[0] if GIinno == idCOG: COG=lineC.split(",")[6] commentfinal=''.join(GImono) + "\t" + ''.join(NPmono) + "\t" + ''.join(Description) + "\t" + ''.join(GIinno) + "\t" + ''.join(NPinno) + "\t" + ''.join(identity) + "\t" + ''.join(alignment) + "\t" + ''.join(evalue) + "\t" + ''.join(score) + "\t" + ''.join(COG) + "\n" fileOut.write(commentfinal)

### MAIN ### filenameInB ='/printsUNIQBLASTno.txt' / $filenameInB ='/printsUNIQBLASTff.txt' filenameInC = '/cog2003-2014-Listeria.csv' filenameOut ='/essaiBLASTCOG.csv' firstblast (filenameInB, filenameInC, filenameOut)

317 Annexe 7

Obtention des fichiers de sortie : essaiBLASTCOGno.csv et essaiBLASTCOGff.csv.

Ajout de toutes les informations disponible au sein de fichier FASTA pour chaque NP dans le fichier Excel avec le script Python fichierNP.py. def firstblast(filenameInBlast, filenameOut): with open (filenameInBlast, "r") as fileInB: fpInB = fileInB.readlines() with open (filenameOut, "w") as fileOut: commentbis = ''.join("GI L.mono") + "\t" + ''.join("NP L.mono") + "\t" + ''.join("Description") + "\n" fileOut.write(commentbis) for line in fpInB: if line.startswith("# Query"): GImono = line.split("|")[1] NPmono = line.split("|")[3] Description1 = line.split("|")[4] Description=Description1.rstrip() commentfinal=''.join(GImono) + "\t" + ''.join(NPmono) + "\t" + ''.join(Description) + "\n" fileOut.write(commentfinal)

### MAIN ### filenameInB ='/Users/Meryl/Desktop/printsUNIQBLASTno.txt' / $filenameInB ='/Users/Meryl/Desktop/printsUNIQBLASTff.txt' filenameOut ='/Users/Meryl/Desktop/essaiNPno.csv' / $filenameOut ='/Users/Meryl/Desktop/essaiNPff.csv' firstblast (filenameInB, filenameOut)

Obtention des fichiers de sortie : essaiNPno.csv et essaiNPff.csv.

Ajout au fichier final les identifiants NP ne possédant pas de COG grâce au script Python merge.py. def dico(filenameInB): dictionnary={} with open (filenameInB, "r") as fileInB: fpInBF = fileInB.readline() fpInB = fileInB.readlines() for lineB in fpInB: np2 = lineB.split("\t")[1] dictionnary[np2]=[lineB] return dictionnary def merge(filenameBlast, filenameNP, dico): with open (filenameBlast, "a") as fileInB: with open (filenameNP, "r") as fileInN: fpInN1 = fileInN.readline() fpInN = fileInN.readlines() for lineNP in fpInN: np = lineNP.split("\t")[1] if np not in dico.keys(): fileInB.write(lineNP) ### MAIN ### filenameInB ='/Users/Meryl/Desktop/essaiBLASTCOG.csv' filenameInN ='/Users/Meryl/Desktop/essaiNP.csv' dico = dico(filenameInB) merge (filenameInB, filenameInN, dico)

Obtention des fichiers de sortie : essaiBLASTCOGno.csv et essaiBLASTCOGff.csv.

318

Persistance de Listeria monocytogenes dans les ateliers agro-alimentaires : influence de facteurs environnementaux et étude des mécanismes d’adaptation aux stress

La capacité de Listeria monocytogenes à adhérer et à persister sur les surfaces dans les ateliers agro-alimentaires pendant de longues périodes malgré l’application correcte et fréquente des opérations de nettoyage & désinfection (N&D), peut être responsable de la contamination croisée de produits alimentaires par simple contact avec une surface contaminée. De plus, il est important de prendre en considération la présence potentielle de bactéries viables non cultivables (VNC) qui ne sont pas détectées par les méthodes culturales utilisées lors de la recherche de L. monocytogenes dans un prélèvement de surface. Un des objectifs a été de vérifier si les milieux de culture conventionnels fréquemment utilisés pour les expérimentations en laboratoire étaient représentatifs des conditions environnementales des ateliers agro-alimentaires et de définir pour la suite des expérimentations un milieu synthétique pouvant modéliser une souillure alimentaire. Pour assurer la sécurité sanitaire des aliments et préserver la santé des consommateurs, optimiser les opérations d’hygiène est une nécessité. Dans ce but, la survie des cellules adhérentes de L. monocytogenes soumises à des conditions simulant en laboratoire l’alternance des phases de N&D et de production a été étudiée. Plusieurs facteurs pouvant influencer la survie de ces cellules ont été pris en considération et combinés par un plan d’expériences fractionnaire : la souillure alimentaire, la souche de L. monocytogenes , le matériau de surface, la présence d’une souche de Pseudomonas fluorescens qui favorise l’adhésion de L. monocytogenes et le scénario de l’opération d’hygiène. Dans les industries agro-alimentaires, les bactéries sont soumises à de nombreux stress, nécessitant pour survivre l’expression et l’induction appropriées de gènes et de protéines de réponse aux stress. Les mécanismes de réponse aux stress mis en place par les cellules adhérentes de L. monocytogenes après stress hydrique (dessiccation), stress chimique (N&D) et stress froid ont été déterminés par une analyse transcriptomique. Selon les critères étudiés (croissance, forces d’adhésion, distribution spatiale et état physiologique des cellules adhérentes), il s’avère que le milieu TSB/5 m peut modéliser le jus de saumon fumé. Au contraire, aucun des milieux synthétiques testés ne permet de remplacer l’utilisation de l’exsudat de viande pour mimer les conditions de terrain. Concernant les facteurs influençant la survie de L. monocytogenes , les opérations d’hygiène impactent uniquement la cultivabilité des cellules adhérentes ; toutefois, le séchage des surfaces permet une optimisation de l’efficacité de la procédure de N&D, d’autant plus lorsqu’il est réalisé quotidiennement.

Mots clés : Listeria monocytogenes , persistance, nettoyage & désinfection, séchage, adaptation aux stress, viable non cultivable

Despite the correct and frequent application of cleaning & disinfection (C&D), Listeria monocytogenes has the ability to adhere to and persist on surfaces in food processing plants for long periods. Consequently, L. monocytogenes may be responsible for cross-contamination of food through contact with contaminated surfaces. In addition, it is important to consider the potential presence of viable but non culturable (VBNC) bacteria that are not detected by the microbiological methods used in the research of L. monocytogenes in a surface sample. One aim was to verify whether the conventional culture media commonly used for laboratory experiments were representative of the environmental conditions of food processing plants and define for further experiments a synthetic medium that can model a food soil. Optimization of the C&D procedures is necessary to ensure food safety and protect the health of consumers. For this purpose, the survival of L. monocytogenes adherent cells subjected to laboratory conditions simulating alternating phases of C&D and production was studied. Several factors that may influence the survival of these cells were considered and combined with a fractional factorial design, including: the food soil, the strain of L. monocytogenes , the surface material, the presence of a strain of Pseudomonas fluorescens, which enhances the adhesion of L. monocytogenes, and the scenario of the sanitation procedure. Moreover, in the food industry, bacteria can be subjected to many stresses; thus, the expression and induction of appropriate genes and stress response proteins are required for survival. The stress response mechanisms set up by the adherent L. monocytogenes cells after hydric stress (i.e. desiccation), chemical stress (i.e. C&D), and cold stress were determined by a transcriptomic analysis. According to the criteria studied (i.e. growth, adhesion forces, spatial distribution, and physiological state of adherent cells), TSB/5 m medium was found to be a sufficient model for smoked salmon juice. In contrast, none of the tested synthetic media can replace the use of meat exudate to mimic field conditions. About the factors influencing the survival of L. monocytogenes , C&D procedures were found to only impact the culturability of adherent cells; however, drying surfaces were found to optimize the effectiveness of the C&D procedures, especially when performed daily.

Keywords: Listeria monocytogenes , persistence, cleaning & disinfection, drying, stress adaptation, viable but non culturable