Einfluss Von ADAM10, ADAM17, ADAM22 Und ADAM23 Auf Neurale Differenzierungsvorgänge

Einfluss von ADAM10, ADAM17, ADAM22 und ADAM23 auf neurale Differenzierungsvorgänge Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Rostock vorgelegt von Annett Markus, geb. in Halle aus Rostock Rostock, 2011 urn:nbn:de:gbv:28-diss2011-0170-5 Dekan: Prof. Dr. Guido Dehnhardt 1. Gutachter: Prof. Dr. med. Arndt Rolfs, Universität Rostock Direktor des Albrecht Kossel Institutes für Neuroregeneration 2. Gutachter: Prof. Dr. Dieter G. Weiss, Universität Rostock, Institut für Zellbiologie und Biosystemtechnik, Direktor der Abteilung Tierphysiologie 3. Gutachter: PD Dr. med. Jiankai Luo, Universität Rostock, Albrecht Kossel Institutes für Neuroregeneration Datum der Verteidigung: 21.11.2011 Meinen Eltern, in Liebe und Dankbarkeit gewidmet. Felix qui potuit rerum cognoscere causas. (Vergil) Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis und Abkürzungen Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis und Abkürzungen ..................................................................................I Inhaltsverzeichnis ...............................................................................................................I Abkürzungen ................................................................................................................... IV 1 Einleitung .........................................................................................................................6 1.1 Neuroregenerative Prozesse ......................................................................................6 1.2 ADAM - Proteine.........................................................................................................8 1.3 Zielstellung ...............................................................................................................11 2 Material und Methoden..................................................................................................13 2.1 Material ....................................................................................................................13 2.1.1 Technische Geräte .......................................................................................13 2.1.2 Verbrauchsmaterialien..................................................................................14 2.1.3 Software .......................................................................................................15 2.1.4 Chemikalien..................................................................................................15 2.1.5 Zellen und Gewebe.......................................................................................19 2.1.6 Antikörper .....................................................................................................20 2.1.7 Oligonukleotide.............................................................................................21 2.1.8 Vektoren .......................................................................................................23 2.1.9 Enzyme und andere Proteine........................................................................23 2.1.10 Kits ...............................................................................................................23 2.2 Mikrobielle Methoden ...............................................................................................24 2.2.1 Kultivierung von E. coli..................................................................................24 2.2.2 Präparation von Ca2+ kompetenten Zellen ....................................................24 2.2.3 Transformation von Ca2+ kompetenten Zellen...............................................24 2.3 Zellbiologische Methoden .........................................................................................25 2.3.1 Messung der Zellzahl....................................................................................25 2.3.2 Beschichtung von Plastikkulturschalen .........................................................25 2.3.3 Kultivierung und Differenzierung von ReNcell VM Zellen ..............................25 2.3.4 Kultivierung und Differenzierung von ST14A Zellen......................................26 2.3.5 Kultivierung von Embryonen .........................................................................27 2.3.6 Transfektion von ReNcell VM Zellen.............................................................27 2.3.7 Transfektion von Embryonen ........................................................................28 2.4 Molekularbiologische Methoden ...............................................................................28 Inhaltsverzeichnis II 2.4.1 Isolation von Vektor DNA..............................................................................28 2.4.2 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen .......................................29 2.4.3 Isolierung von DNA und PCR-Fragmenten ...................................................29 2.4.4 Agarose-Gelelektrophorese ..........................................................................29 2.4.5 Ligation von DNA-Fragmenten......................................................................30 2.4.6 Polymerase Kettenreaktion...........................................................................31 2.4.7 Aufreinigung von Gesamt-RNA.....................................................................32 2.4.8 Microarray.....................................................................................................32 2.4.9 cDNA Synthese ............................................................................................33 2.4.10 Quantitative Real-Time RT PCR...................................................................33 2.4.11 Photometrische DNA/RNA Konzentrationsmessung .....................................34 2.4.12 DNA Sequenzierung .....................................................................................34 2.5 Proteinchemische Methoden ....................................................................................35 2.5.1 Lyse von Zellen und Gewebe........................................................................35 2.5.2 Proteinbestimmung.......................................................................................35 2.5.3 SDS- Acrylamid- Gelelektrophorese (Laemmli, 1970)...................................36 2.5.4 Coomassie-Färbung von Proteinen (Weber und Osborn, 1969)....................36 2.5.5 Western Blot.................................................................................................36 2.5.6 FACS Analyse ..............................................................................................37 2.5.7 Immunozytochemie und Immunohistochemie ...............................................38 2.5.8 Axonmessung...............................................................................................39 2.5.9 Apoptosemessung........................................................................................40 2.5.10 Statistik.........................................................................................................40 3 Ergebnisse .....................................................................................................................41 3.1 Untersuchung des in vitro Systems...........................................................................41 3.1.1 Analyse von ADAM10...................................................................................41 3.1.2 Analyse von ADAM17...................................................................................44 3.1.3 Analyse von ADAM22...................................................................................46 3.1.4 Analyse von ADAM23...................................................................................48 3.2 Endogene Expressionsanalyse in Hühnerembryonen...............................................52 3.2.1 Charakterisierung der Antikörper ..................................................................52 3.2.2 Endogene ADAM - Proteinexpression während der Embroyentwicklung ......53 3.3 Analyse von ST14A Zellen .......................................................................................59 3.4 Analyse von transfizierten Hühnerembryonen ..........................................................60 3.5 Genexpressionsanalyse nach ADAM23 - Transfektion .............................................62 4 Diskussion .....................................................................................................................67 4.1 Einfluss von ADAM10 auf die Differenzierung ..........................................................67 Inhaltsverzeichnis III 4.2 Einfluss von ADAM17 auf die Differenzierung ..........................................................69 4.3 Einfluss von ADAM22 auf die Differenzierung ..........................................................71 4.4 Einfluss von ADAM23 auf die Differenzierung ..........................................................72 5 Zusammenfassung ........................................................................................................77 6 Ausblick..........................................................................................................................79 7 Literatur..........................................................................................................................80 8 Abblidungs- und Tabellenverzeichnis..........................................................................88

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