Einfluss von ADAM10, ADAM17, ADAM22 und ADAM23 auf neurale Differenzierungsvorgänge Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Rostock vorgelegt von Annett Markus, geb. in Halle aus Rostock Rostock, 2011 urn:nbn:de:gbv:28-diss2011-0170-5 Dekan: Prof. Dr. Guido Dehnhardt 1. Gutachter: Prof. Dr. med. Arndt Rolfs, Universität Rostock Direktor des Albrecht Kossel Institutes für Neuroregeneration 2. Gutachter: Prof. Dr. Dieter G. Weiss, Universität Rostock, Institut für Zellbiologie und Biosystemtechnik, Direktor der Abteilung Tierphysiologie 3. Gutachter: PD Dr. med. Jiankai Luo, Universität Rostock, Albrecht Kossel Institutes für Neuroregeneration Datum der Verteidigung: 21.11.2011 Meinen Eltern, in Liebe und Dankbarkeit gewidmet. Felix qui potuit rerum cognoscere causas. (Vergil) Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis und Abkürzungen Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis und Abkürzungen ..................................................................................I Inhaltsverzeichnis ...............................................................................................................I Abkürzungen ................................................................................................................... IV 1 Einleitung .........................................................................................................................6 1.1 Neuroregenerative Prozesse ......................................................................................6 1.2 ADAM - Proteine.........................................................................................................8 1.3 Zielstellung ...............................................................................................................11 2 Material und Methoden..................................................................................................13 2.1 Material ....................................................................................................................13 2.1.1 Technische Geräte .......................................................................................13 2.1.2 Verbrauchsmaterialien..................................................................................14 2.1.3 Software .......................................................................................................15 2.1.4 Chemikalien..................................................................................................15 2.1.5 Zellen und Gewebe.......................................................................................19 2.1.6 Antikörper .....................................................................................................20 2.1.7 Oligonukleotide.............................................................................................21 2.1.8 Vektoren .......................................................................................................23 2.1.9 Enzyme und andere Proteine........................................................................23 2.1.10 Kits ...............................................................................................................23 2.2 Mikrobielle Methoden ...............................................................................................24 2.2.1 Kultivierung von E. coli..................................................................................24 2.2.2 Präparation von Ca2+ kompetenten Zellen ....................................................24 2.2.3 Transformation von Ca2+ kompetenten Zellen...............................................24 2.3 Zellbiologische Methoden .........................................................................................25 2.3.1 Messung der Zellzahl....................................................................................25 2.3.2 Beschichtung von Plastikkulturschalen .........................................................25 2.3.3 Kultivierung und Differenzierung von ReNcell VM Zellen ..............................25 2.3.4 Kultivierung und Differenzierung von ST14A Zellen......................................26 2.3.5 Kultivierung von Embryonen .........................................................................27 2.3.6 Transfektion von ReNcell VM Zellen.............................................................27 2.3.7 Transfektion von Embryonen ........................................................................28 2.4 Molekularbiologische Methoden ...............................................................................28 Inhaltsverzeichnis II 2.4.1 Isolation von Vektor DNA..............................................................................28 2.4.2 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen .......................................29 2.4.3 Isolierung von DNA und PCR-Fragmenten ...................................................29 2.4.4 Agarose-Gelelektrophorese ..........................................................................29 2.4.5 Ligation von DNA-Fragmenten......................................................................30 2.4.6 Polymerase Kettenreaktion...........................................................................31 2.4.7 Aufreinigung von Gesamt-RNA.....................................................................32 2.4.8 Microarray.....................................................................................................32 2.4.9 cDNA Synthese ............................................................................................33 2.4.10 Quantitative Real-Time RT PCR...................................................................33 2.4.11 Photometrische DNA/RNA Konzentrationsmessung .....................................34 2.4.12 DNA Sequenzierung .....................................................................................34 2.5 Proteinchemische Methoden ....................................................................................35 2.5.1 Lyse von Zellen und Gewebe........................................................................35 2.5.2 Proteinbestimmung.......................................................................................35 2.5.3 SDS- Acrylamid- Gelelektrophorese (Laemmli, 1970)...................................36 2.5.4 Coomassie-Färbung von Proteinen (Weber und Osborn, 1969)....................36 2.5.5 Western Blot.................................................................................................36 2.5.6 FACS Analyse ..............................................................................................37 2.5.7 Immunozytochemie und Immunohistochemie ...............................................38 2.5.8 Axonmessung...............................................................................................39 2.5.9 Apoptosemessung........................................................................................40 2.5.10 Statistik.........................................................................................................40 3 Ergebnisse .....................................................................................................................41 3.1 Untersuchung des in vitro Systems...........................................................................41 3.1.1 Analyse von ADAM10...................................................................................41 3.1.2 Analyse von ADAM17...................................................................................44 3.1.3 Analyse von ADAM22...................................................................................46 3.1.4 Analyse von ADAM23...................................................................................48 3.2 Endogene Expressionsanalyse in Hühnerembryonen...............................................52 3.2.1 Charakterisierung der Antikörper ..................................................................52 3.2.2 Endogene ADAM - Proteinexpression während der Embroyentwicklung ......53 3.3 Analyse von ST14A Zellen .......................................................................................59 3.4 Analyse von transfizierten Hühnerembryonen ..........................................................60 3.5 Genexpressionsanalyse nach ADAM23 - Transfektion .............................................62 4 Diskussion .....................................................................................................................67 4.1 Einfluss von ADAM10 auf die Differenzierung ..........................................................67 Inhaltsverzeichnis III 4.2 Einfluss von ADAM17 auf die Differenzierung ..........................................................69 4.3 Einfluss von ADAM22 auf die Differenzierung ..........................................................71 4.4 Einfluss von ADAM23 auf die Differenzierung ..........................................................72 5 Zusammenfassung ........................................................................................................77 6 Ausblick..........................................................................................................................79 7 Literatur..........................................................................................................................80 8 Abblidungs- und Tabellenverzeichnis..........................................................................88