Vrozených Srde Genetické Příčiny Vrozených Srdečních Vad Monika

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

Genetické příčiny vrozených srdečních vad

Diplomová práce

Monika Švarcová

VEDOUCÍ PRÁCE : Mgr. Diana Nikulenkov Grochová, Ph.D. Brno 2015

Bibliografický záznam

Autor: Bc. Monika Švarcová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce: Genetické příčiny vrozených srdečních vad

Studijní program: Experimentální biologie

Studijní obor: Molekulární biologie a genetika

Vedoucí práce: Mgr. Diana Nikulenkov Grochová, Ph.D.

Akademický rok: 2014/2015

Počet stran: 101

Klíčová slova: Vrozené srdeční vady; sekvenování nové generace; varianty DNA; Sangerovo sekvenování

Bibliographic Entry

Author: Bc. Monika Švarcová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis: Genetic causes of congenital heart defects

Degree programme: Experimental biology

Field of Study: Molecular biology and genetics

Supervisor: Mgr. Diana Nikulenkov Grochová, Ph.D.

AcademicYear: 2014/2015

Number of Pages: 101

Keywords: Congenital heart defects; next generation sequencing; DNA variants; Sanger sequencing

Abstrakt

Vrozené srdeční vady (lat. vitium cordis congenitum , VCC) jsou nejčastější skupinou vrozených vad, postihují více než 1 % narozených dětí. Etiologie většiny případů není zcela známa. Příčiny VCC lze dělit na negenetické (zevní) a genetické faktory. VCC mohou být následkem různých genetických změn, jako jsou aneuploidie, polyploidie, strukturní aberace chromozomů, ale také mutace jednotlivých genů. Tyto VCC jsou často asociovány i s malformacemi jiných orgánů (tzv. syndromové VCC). Další skupinou jsou VCC izolované, tj. bez vady dalšího orgánu, a jejich příčiny jsou méně jasné. Část izolovaných vad je následkem mutací uvnitř různých genů. U zbylých případů izolovaných VCC se předpokládá multifaktoriální příčina. Publikace z posledních let popisují řadu genů, které mají přímou souvislost s rozvojem syndromových a také izolovaných VCC. Cílem této diplomové práce bylo zmapování genetické etiologie VCC u prenatálně zjištěných případů v Centru prenatální diagnostiky, s.r.o., dále výběr kandidátních genů a detekce jejich variant s využitím přístroje pro masivně paralelní sekvenování MiSeq ® (Illumina). Celkem bylo u 41 plodů analyzováno 139 typů variant DNA. Část z nich je možné dle dostupné literatury a databází řadit mezi benigní, resp. potenciálně benigní varianty. U jednoho plodu byla detekována varianta patogenní a u dalších čtyř plodů bylo nalezeno šest potenciálně patogenních variant. Většinu variant je nutno stále řadit do skupiny s nejasným významem. Vzhledem k přitažlivosti zkoumání příčin VCC lze očekávat, že se i tyto varianty dočkají jasné klasifikace. V závěru práce je prezentována kazuistika rodiny s rekurentním výskytem VCC, u které byla detekována patogenní varianta v genu TBX5 .

Abstract

Congenital heart defects (CHD) are the most common group of birth defects, affecting more than 1 % of births. Most of the cases don´t have a completely known etiology. Some causes of CHD can be divided into two groups nongenetic (environmental) and genetic factors. CHD can be caused by various genetic changes such as an aneuploidy, a polyploidy, some structural aberrations of chromosomes or mutations in single genes. These CHD are often associated with some malformations of other organs (syndromic CHD). A next group is isolated CHD without any defects of other organs. Causes of isolated CHD are less clear. A part of isolated defects is an effect of some mutations within different genes. A multifactorial inheritance is supposed in some remaining cases of isolated CHD. Some recent publications describe a number of genes that are associated with a development of syndromal and isolated CHD. The main aim of this diploma thesis was to describe a genetic etiology of CHD in prenatally detected cases in Centrum prenatální diagnostiky, s.r.o., then to select candidate genes and detect their variants using a massively parallel sequencing by using MiSeq ® instrument (Illumina). Altogether 139 types of DNA variants were analyzed in 41 fetuses. Some of them belong into some benign, resp. potentially benign variants. One detected variant in one fetus is a pathogenic variant and six variants in four fetuses are potentially pathogenic variants. Most of the variants must be classed into a group of variants of an unknown significance. Due to an attractiveness of a mutation investigation there is a probability that also these variants will gain a clear significance in the future. The end of this thesis is focused on a case of a family with a recurrent occurrence of CHD where a pathogenic variant in a gene TBX5 was detected.

Poděkování

Na tomto místě bych ráda poděkovala Mgr. Dianě Nikulenkov Grochové, Ph.D., vedoucí této práce, a RNDr. Jitce Kadlecové, Ph.D., odborné konzultantce, za vedení, pomoc a cenné rady, jež mi věnovaly při řešení teoretické i experimentální části mé diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat Cytogenetické laboratoři Brno, s.r.o. za možnost zpracování práce na jejich pracovišti. Mé díky patří také všem jejím zaměstnankyním, které mi svým přijetím a radami usnadnily řešení zadané problematiky. Současně děkuji M.Sc. Fedoru Nikulenkovovi, Ph.D. za pomoc s grafickou úpravou. V neposlední řadě děkuji lékařům Centra prenatální diagnostiky, s.r.o., jmenovitě pak MUDr. Ilze Grochové, MUDr. Haně Jičínské, MUDr. Tomáši Freibergerovi a MUDr. Pavlu Vlašínovi, za konzultace a pomoc týkající se práce.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 25. dubna 2015 ……………………….

Bc. Monika Švarcová

Obsah 1. Úvod a problematika ...... 11 1. 1. Embryonální vývoj srdce ...... 11 1. 2. Vrozené srdeční vady ...... 12 1. 3. Příčiny vrozených srdečních vad ...... 13 1. 4. Sekvenování nové generace ...... 20 2. Cíle diplomové práce ...... 23 3. Materiál a metody ...... 24 3. 1. Materiál ...... 24 3. 2. Metody ...... 25 4. Výsledky ...... 38 4. 1. Studium databáze případů VCC, výběr vzorků pro mutační analýzu ...... 38 4. 2. Optimalizace návrhu sond pro obohacení vzorku o cílové oblasti genomu ...... 42 4. 3. Výsledky protokolu HaloPlex, příprava a úprava knihovny na sekvenování ...... 45 4. 4. Výsledné parametry kvality mutační analýzy ...... 48 4. 5. Varianty DNA nalezené mutační analýzou ...... 54 4. 6. Validované vybrané varianty DNA ...... 66 4. 7. Kazuistika HoltovéOramův syndrom ...... 72 5. Diskuze ...... 78 5. 1. Zhodnocení kvality mutační analýzy ...... 78 5. 2. Zhodnocení výsledků mutační analýzy ...... 80 5. 3. Zhodnocení kazuistiky HoltovéOramův syndrom...... 82 5. 4. Návrh dalšího průběhu studie ...... 83 6. Souhrn ...... 84 7. Summary ...... 86 8. Literatura ...... 88 8. 1. Literární zdroje ...... 88 8. 2. Elektronické zdroje ...... 98

Seznam zkratek Array CGH Komparativní genomová hybridizace na čipu (array comparative genomic hybridization) CNV Varianty v počtu kopií (copy number variations) HOS HoltovéOramův syndrom (HoltOram syndrome) MLPA Multiplexová amplifikace závislá na ligaci sond (multiplex ligation dependent probe amplification) NGS Sekvenování nové (příští) generace (next generation sequencing) QFPCR Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (quantitative fluorescent polymerase chain reaction) SBS Sekvenování syntézou (sequencing by synthesis) UTR Nepřekládaná oblast (untranslated region) VCC Vrozené srdeční vady ( vitium cordis congenitum ) VOUS Varianta DNA nejasného významu (variant of unknown significance)

1. Úvod a problematika Vrozené srdeční vady (lat. vitium cordis congenitum , VCC) představují nejčastější vrozené vývojové defekty u člověka (Hoffman et al ., 2002). Navzdory současným možnostem není etiologie mnoha případů zcela známa. Určení příčiny VCC je pro pacienta důležité z medicínského a psychosociálního hlediska, ale také s ohledem na plánování rodičovství. Nové molekulárněgenetické technologie mohou přispět k identifikaci příčin těchto malformací.

1. 1. Embryonální vývoj srdce Srdce (lat. cor ) je orgán zajišťující oběh krve lidským tělem. Je prvním orgánem, který v zárodku začíná fungovat. Formování srdce zahrnuje mnoho přesných molekulárních a morfogenetických událostí. Již jemná odchylka tohoto procesu může způsobit vznik a vývoj VCC. Zjednodušené schéma srdeční morfogeneze vykresluje obrázek č. 1 (Srivastava a Olson, 2000). Buňky srdeční svaloviny formují bijící srdeční trubici. Tento trubicovitý útvar se stáčí a dále formuje jednotlivé oddíly srdce.

15. den 21. den 28. den 50. den

Obrázek č. 1. Srdeční morfogeneze u člověka (Srivastava a Olson, 2000; upraveno). Vysvětlivky (v závorce uveden anglický výraz): A srdeční síň (atrium); V srdeční komora (ventricle); CT konotrunkální segment (conotruncal segment); AS segment budoucího oblouku aorty (aortic sac); RV pravá komora (right ventricle); LV levá komora (left ventricle); RA pravá síň (right atrium); LA levá síň (left atrium); III, IV a VI tepny aortálního oblouku (aortic arch arteries); AVV síňokomorové chlopně (atrioventricular valves); PA plicní tepna (pulmonary artery); DA ductus arteriosus (ductus arteriosus); Ao aorta (aorta); RSCA pravá podklíčková tepna (right

11 subclavian artery); LSCA levá podklíčková tepna (left subclavian artery); RCC pravá společná karotida (right common carotid); LCC levá společná karotida (left common carotid). Vypsány jsou dny po vzniku lidské zygo ty.

Pro správn ý vývoj srdce je nezbytná přesná regulace genové exprese. K časové a místní kontrole vývoje tohoto orgánu přispívají nejen t ranskripční faktory , ale také další složky buněčných signalizací. Na obrázku č. 2 je zobrazena pouze část komplexní transkripční sítě (Davidson a Erwin , 2006).

Obrázek č. 2. Příklad signalizační sítě při vývoji srdce (Davidson a Erwin, 2006; upraveno). Přerušované čáry znázorňují možné interakce proteinů.

1. 2. Vrozené srdeční vady VCC jsou strukturním postižením srdce, které je přítomné již při narození , a jsou nejčastější skupinou vrozených vývojových vad . V roce 2011 představovaly VCC v České republice 38,7 % všech vrozených vad u narozených (ÚZIS, 2013 ). Jednotlivé zdroje se v udá vání frekvence těchto vad liší (Hoffman et al ., 2002 ). Udávané hodnoty incidence VCC bývají v rozmezí od 4 až 50 případů na 1000 živě narozených . Toto široké rozmezí je zapříčiněno různými typy studií. Data z Ústavu zdravotnických informací a statistiky ČR popisující vývoj těchto vad od roku 2004 zobrazuje tabulka č. 1 (ÚZIS, 2013).

Rok Počet VCC přepočítaný na 1000 živě narozených

2004 22,51 2005 19,89 2006 20,20 2007 24,42 2008 22,73 2009 18,67 2010 23,06 2011 23,67

Tabulka č. 1. Incidence VCC v České republice přepočítána na 1000 živě narozených jedinců (ÚZIS, 2013; upraveno).

Typů a také klasifikací VCC existuje celá řada v závislosti na použitém kritériu (Šípek et al ., 2010). Tím může být hledisko anatomické či funkční, klinický stav (kritické/nekritické VCC), symptomatologie (např. cyanotické/necyanotické VCC, dle přítomnosti cyanózy, tj. modrého zbarvení kůže a sliznic v důsledku míchání okysličené krve s neokysličenou) apod. V rámci této diplomové práce byly VCC děleny na základě anatomického kritéria. VCC detekované u testovaného souboru plodů jsou shrnuty v tabulce č. 6. Tyto vady nepředstavují všechny známé VCC. VCC se mohou vyskytovat izolovaně, tj. nemají přidruženou další vadu jiného orgánu, nebo mohou být příznakem syndromů, kde je k VCC přidružen další fenotypový projev.

1. 3. Příčiny vrozených srdečních vad VCC jsou vady, jejichž etilogie není ve všech případech zcela jasná. Příčiny VCC se nejčastěji dělí na příčiny zevní, genetické a dále na jejich kombinace (multifaktoriální příčiny). Environmentální faktory jsou negenetickými příčinami VCC. Mohou jimi být zevní chemické nebo fyzikální teratogeny, maternální vlivy či infekční agens. Jako příklady mohou být jmenovány nekompenzovaný diabetes mellitus u matky před početím (Wren et al ., 2003), obezita matky (Watkins a Botto, 2001), kouření cigaret matky během těhotenství (Fung et al ., 2013), maternální horečnaté onemocnění tři měsíce před početím a tři měsíce po početí (Oster et al ., 2011) nebo užívání určitých medikamentů s vlastnostmi teratogenů v těhotenství z důvodu jeho pozdního rozpoznání (Honein et al ., 2002).

Genetické důvody VCC mohou být různé. Do této rozsáhlé skupiny můžeme řadit numerické i strukturní odchylky chromozomů a také mutace jednotlivých genů. Aneuploidie, polyploidie a strukturní aberace chromozomů jsou detekovány ve velké většině případů syndromových VCC, zatímco mutace jednotlivých genů jsou také příčinou izolovaných VCC. Aneuploidie, tj. abnormální počet jednotlivých chromozomů, jsou velmi častou příčinou VCC. Downův syndrom (trizomie 21. chromozomu) je nejčastější chromozomální anomálií u pacientů s VCC. Přibližně 40 až 50 % jedinců s Downovým syndromem má srdeční defekt (American academy of pediatrics, 2001). VCC jsou příznaky také Edwardsova syndromu (trizomie 18. chromozomu), Patauova syndromu (trizomie 13. chromozomu) či Turnerova syndromu (monozomie chromozomu X), a také triploidie, tj. abnormálního výskytu tří sad chromozomů v buňkách (Tennstedt et al ., 1999). Za strukturní odchylky chromozomů, které představují značnou příčinu VCC, jsou pokládány delece, resp. mikrodelece jaderného genetického materiálu. Často citovaný je DiGeorgeův syndrom (delece 22q11.2), u kterého průměrně 80 % postižených má VCC, především Fallotovu tetralogii (Botto et al ., 2003). Williamsův Beurenův syndrom (delece 7q11.23) představuje další možnou diagnózu u lidí s VCC (Fusco et al ., 2014). Jednou z příčin VCC jsou také monogenní varianty DNA. Následující tabulky (tabulky č. 2, 3, 4 a 5) uvádějí geny, které jsou dle literatury spojovány se vznikem syndromových, resp. izolovaných VCC. Tyto geny kódují různé proteinové produkty mající odlišné funkce v srdečních buňkách. V tabulkách je vždy uveden symbol genu, jeho celý název a možné synonymní symboly, dále pak funkce produktu daného genu, umístění genu v genomu a identifikační číslo v databázi Ensembl (www.ensembl.org). Dále sloupce tabulek popisují daný typ VCC, který je asociován s abnormální funkcí daného genu. Jedná se buď o izolovaný typ (označen I) nebo o typ syndromový (označen S). Značka HTX značí heterotaxii, tj. syndrom se spektrem srdečních a nesrdečních vad, které jsou vyvolané poruchami vývoje levopravé asymetrie (Sutherland a Ware, 2009). V posledních sloupcích tabulek jsou uvedeny odkazy na literaturu, která popisuje vztah daného genu, resp. jeho varianty, ke vzniku VCC. K získání informací o vybraných genech bylo použito více zdrojů (www.ensembl.org, www.genecards.org, www.genenames.org, www.ncbi.nlm.nih.gov,

14 www.omim.org, www.uniprot.org), včetně zdrojů literárních (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed). Tabulka č. 2 zahrnuje geny, které kódují proteiny důležité pro buněčnou signalizaci, a to například ligandy či jejich receptory. V tabulce č. 3 jsou zapsány geny strukturních proteinů. Jedná se například o srdeční kontraktilní proteiny. Geny uvedené v tabulce č. 4 tvoří proteiny pro transkripční regulaci genové exprese. Takovými proteiny jsou například transkripční faktory. Geny s jinými než výše uvedenými vlastnostmi jsou shrnuty v tabulce č. 5. Tyto geny kódují například enzymy či proteiny důležité pro buněčnou adhezi.

Synonymní Funkce Symbol Označení v Typ Vybraná Název genu symboly produktu Lokus genu Ensembl VCC reference genu genu ACVR1A, ALK2, Activin A receptor, SKR1, FOP, ENSG00000 Smith et ACVR1 Receptor 2q23q24 I type I TSRI, 115170 al. , 2009 ACTRI;ACV RLK2

Activin A receptor, ENSG00000 S Kosaki et ACVR2B ActR-IIB Receptor 3p22 type IIB 114739 (HTX) al. , 1999a

Bone morphogenetic BMPR-II, protein receptor, BMPR3, ENSG00000 Roberts et BMPR2 type II Receptor 2q33q34 I BRK-3, T- 204217 al. , 2004 (serine/threonine ALK kinase)

Signalizace, Cilia and flagella CCDC11, vývoj levo ENSG00000 S Perles et CFAP53 associated protein 18q21.1 FLJ32743 pravé 172361 (HTX) al. , 2012 53 asymetrie

Ligand S Cripto, FRL-1, CRYPTIC, ENSG00000 Goldmuntz CFC1 (EGF 2q21.2 (HTX); cryptic family 1 HTX2 136698 et al. , 2002 rodina) I Ligand Growth (BMP/ ENSG00000 Karkera et GDF1 differentiation factor - 19p13.11 I TGFbeta 130283 al. , 2007 1 rodina) CX43, ODD, Gap Gap junction protein, ENSG00000 Dasgupta GJA1 ODOD, junctions, 6q22.31 I alpha 1, 43kDa 152661 et al. , 2001 SDTY3 signalizace Gap gap junction protein, ENSG00000 Soemedi GJA5 CX40 junctions, 1q21.2 I alpha 5, 40kDa 143140 et al. , 2012 signalizace

Bauer et Ligand I; S AHD, AWS, 20p12.1 ENSG00000 al. , 2010; JAG1 Jagged 1 (receptoru (Alagi CD339, HJ1 p11.23 101384 lleův Colliton et NOTCH1) sy.) al. , 2000

Ligand Left-right LEFTA, (BMP/ ENSG00000 S Kosaki et LEFTY2 determination factor 1q42.1 LEFTYA TGFbeta 143768 (HTX) al. , 1999b 2 rodina) Ligand Nodal growth ENSG00000 S Mohapatra NODAL - (BMP/TGF 10q22.1 differentiation factor 156574 (HTX) et al. , 2009 beta rodina)

ENSG00000 McBride et NOTCH1 Notch 1 - Receptor 9q34.3 I 148400 al. , 2008

S ENSG00000 Kamath et NOTCH2 Notch 2 - Receptor 1p13p11 (Alagi 134250 lleův al. , 2012 sy.) Platelet-derived growth factor CD140a, ENSG00000 Bleyl et al. , PDGFRA Receptor 4q12 I receptor, alpha PDGFR2 134853 2010 polypeptide

Sema domain, immunoglobulin coll-5, Ligand domain (Ig), short KIAA0331, ENSG00000 S Lalani et SEMA3E (receptoru 7q21.11 basic domain, M-sema H, 170381 (CHAR al. , 2004 PLXND1) GE sy.) secreted, M-SemaK (semaphorin) 3E

Synonymní Funkce Symbol Označení v Typ Vybraná Název genu symboly produktu Lokus genu Ensembl VCC reference genu genu

BMP/ SMAD family ENSG00000 Tan et al. , SMAD6 HsT17432 TGFbeta 15q22.31 I member 6 137834 2012 modulátor TGF-beta activated TAB2 Aktivátor ENSG00000 Thienpont kinase 1/MAP3K7 KIAA0733 6q25.1 I MAP3K7 055208 et al. , 2010 binding protein 2 Teratocarcinoma- CR, Koreceptor ENSG00000 Roessler TDGF1 derived growth CRIPTO, pro ligandy 3p21.31 I 241186 et al. , 2008 factor 1 Cripto-1 TGFbeta Mitogen, Lamb Vascular endothelial VEGF-A, ENSG00000 VEGFA růstový 6p12 I rechts et growth factor A VPF 112715 faktor al. , 2005

Tabulka č. 2. Geny asociované se vznikem VCC buněčná signalizace.

Synonymní Funkce Symbol Označení v Typ Vybraná Název genu symboly produktu Lokus genu Ensembl VCC reference genu genu

Strukturní Matsson et Actin, alpha, cardiac ENSG00000 ACTC1 CMD1R protein, 15q14 I al. , muscle 1 159251 kontrakce 2008

I; S Metcalfe et Součást SVAS, 7q11.1 ENSG00000 (Willi al. , 2000; ELN Elastin elastinových WBS, WS q21.1 049540 amsův Jurado et vláken Beure nův sy.) al. , 1996

Vazba na aktinová ENSG00000 Kyndt et FLNA Filamin A, alpha ABP-280 filamenta, Xq28 I 196924 al. , 2007 remodelace cytoskeletu

Myosin binding FHC, Vazba na ENSG00000 Zahka et MYBPC3 11p11.2 I protein C, cardiac MYBP-C myosin 134571 al. , 2008

ASD3, MYHC, Myosin, heavy chain SSS3, Granados Kontraktilní 14q11.2 ENSG00000 MYH6 6, cardiac muscle, CMH14, I Riveron et protein q13 197616 alpha MYHCA, al. , 2010 CMD1EE, alpha-MHC Myosin, heavy chain Kontraktilní 14q11.2 ENSG00000 Postma et MYH7 7, cardiac muscle, CMD1S I protein q13 092054 al. , 2011 beta Strukturní Myosin heavy chain SMHC, ENSG00000 Zhu et al. , MYH11 protein, 16p13.11 I 11, smooth muscle SMMHC 133392 2006 kontrakce KIAA0673, Strukturní ENSG00000 I; S French et NPHP4 Nephronophthisis 4 POC10, protein 1p36 131697 (HTX) al. , 2012 SLSN4 (řasinky) APXL3, SHROOM Shroom family KIAA1481, Vazba na ENSG00000 S Tariq et al. , 4q21.1 3 member 3 SHRM, aktin 138771 (HTX) 2011 ShrmL

Tabulka č. 3. Geny asociované se vznikem VCC strukturní proteiny.

Synonymní Funkce Symbol Označení v Typ Vybraná Název genu symboly produktu Lokus genu Ensembl VCC reference genu genu

ALRP, C- Ankyrin repeat 193, CARP, Transkripční ENSG00000 Cinquetti ANKRD1 domain 1 (cardiac 10q23.33 I CVARP, faktor 148677 et al. , 2008 muscle) MCARP Cbp/p300- interacting transactivator, with Transkripční ENSG00000 Sperling et CITED2 MRG1 6q23.3 I Glu/Asp-rich koaktivátor 164442 al. , 2005 carboxy-terminal domain, 2

S ARA, Transkripční ENSG00000 (Axen Gripp et FOXC1 Forkhead box C1 FREAC3, 6p25 faktor 054598 feldův al. , 2012 IGDA, IHG1 Rieger ův sy.)

Transkripční ENSG00000 Roessler FOXH1 Forkhead box H1 FAST1 8q24.3 I faktor 160973 et al. , 2008

12CC4, hFKH1B, Transkripční ENSG00000 Chang et FOXP1 Forkhead box P1 3p14.1 I HSPC215, faktor 114861 al. , 2013 QRF1 Tomita GATA binding Transkripční 8p23.1 ENSG00000 GATA4 - I Mitchell et protein 4 faktor p22 136574 al. , 2007

GATA binding bB379O24., Transkripční ENSG00000 Wei et al. , GATA5 20q13.33 I protein 5 GATAS faktor 130700 2013

GATA binding Transkripční ENSG00000 Kodo et GATA6 - 18q11q12 I protein 6 faktor 141448 al. , 2009

Heart and neural bHLHa27, Transkripční ENSG00000 Esposito et HAND1 crest derivatives eHand, Hxt, 5q33 I faktor 113196 al. , 2011 expressed 1 Thing1

Heart and neural bHLHa26, Transkripční ENSG00000 Shen et HAND2 crest derivatives dHand, Hed, 4q34.1 I faktor 164107 al. , 2010 expressed 2 Thing2

Iroquois homeobox Transkripční ENSG00000 Cheng et IRX4 - 5p15.33 I 4 faktor 113430 al. , 2011

Podjednotka Mediator complex KIAA1025, multipro ENSG00000 Muncke et MED13L 12q24.22 I subunit 13-like TRAP240L teinového 123066 al. , 2003 koaktivátoru

Transkripční ENSG00000 Ransom et MYOCD Myocardin MYCD 17p11.2 I koaktivátor 141052 al. , 2008

Mc CSX1, Transkripční ENSG00000 Elhinney et NKX2.5 NK2 homeobox 5 NKX2.5, 5q34 I faktor 183072 al. , NKX4-1 2003

CSX2, Transkripční ENSG00000 Heathcote NKX2.6 NK2 homeobox 6 8p21.2 I NKX4-2 faktor 180053 et al. , 2005

Spalt-like dJ1112F19. Transkripční ENSG00000 Wang et SALL4 20q13.2 I transcription factor 4 1, ZNF797 faktor 101115 al. , 2009

Synonymní Funkce Symbol Označení v Typ Vybraná Název genu symboly produktu Lokus genu Ensembl VCC reference genu genu

I; S Gong et Transkripční ENSG00000 (Di al. , 2001 ; TBX1 T-box 1 CATCH22 22q11.21 faktor 184058 Geor Yagi et al. , geův sy.) 2003 S Linden et TBX3-ISO, Transkripční ENSG00000 (Ulnar TBX3 T-box 3 12q24.21 al. , XHL faktor 135111 ma mmary 2009 sy.) S Transkripční ENSG00000 (Holto Basson et TBX5 T-box 5 - 12q24.1 faktor 089225 véOra al. , 1999 mův sy.) Transkripční ENSG00000 Kirk et al. , TBX20 T-box 20 - 7p14.3 I faktor 164532 2007 Transcription factor Chen et AP-2 beta Transkripční ENSG00000 I; S al. , 2011; TFAP2B (activating enhancer AP2-B 6p12 faktor 008196 (Char Zhao et binding protein 2 sy.) al. , 2001 beta) FOG2, Zinc finger protein, hFOG-2, Transkripční ENSG00000 De Luca et ZFPM2 FOG family member 8q23 I ZC2HC11B, faktor 169946 al. , 2011 2 ZNF89B HTX, Transkripční Xq24 ENSG00000 S Ware et ZIC3 Zic family member 3 ZNF203 faktor q27.1 156925 (HTX) al. , 2004

Tabulka č. 4. Geny asociované se vznikem VCC transkripční regulace genové exprese.

Synonymní Funkce Symbol Označení v Typ Vybraná Název genu symboly produktu Lokus genu Ensembl VCC reference genu genu

Aldehyde ENSG00000 Pavan et ALDH1A2 dehydrogenase 1 RALDH2 Enzym 15q21.2 I 128918 al. , 2009 family, member A2 Cysteine-rich with Buněčná ENSG00000 Guo et al. , CRELD1 - 3p25.3 I EGF-like domains 1 adheze 163703 2010

Vazba Chromodomain FLJ20357, helikázy, ENSG00000 S Lalani et CHD7 helicase DNA FLJ20361, 8q12.2 remodelace 171316 (CHAR al. , 2006 binding protein 7 KIAA1416 GE sy.) chromatinu Multiple C2 FLJ11175, Vazba iontů ENSG00000 Lalani et MCTP2 domains, 2+ 15q26.2 I FLJ33303 Ca 140563 al. , 2013 transmembrane 2 DXS8237E, Post S GPATC9, transkripční (TARP RNA binding motif ENSG00000 Johnston RBM10 GPATCH9, procesy, Xp11.3 sy./ protein 10 182872 Pierre et al. , 2014 KIAA0122, alternativní Robin ZRANB5 sestřih ův sy.) ENSG00000 Stańczak TLL1 Tolloid-like 1 - Enzym 4q32q33 I 038295 et al. , 2009

Tabulka č. 5. Geny asociované se vznikem VCC ostatní funkce jiné než v tabulkách č. 2, 3, 4.

Podstata většiny VCC je obecně spojována s modelem polygenní, resp. multifaktoriální, dědičnosti. Tento model zahrnuje působení více genů s mutacemi s nízkou penetrancí (běžné varianty) nebo se středně penetrantními mutacemi (vzácné varianty) a současné působení nepříznivých environmentálních faktorů (Nora, 1968; Burn et al., 1998). Jako další možné genetické či epigenetické příčiny VCC mohou být jmenovány následující mechanismy. Varianty v počtu kopií (copy number variations, CNV) jsou variantami v počtu specifické oblasti DNA u jedince, jedná se o další typ chromozomálních anomálií. CNV jsou známy jako příčiny syndromů (např. DiGeorgeova syndromu), ale také nesyndromových VCC. Příkladem spojitosti CNV a izolované VCC může být studie vydaná v roce 2012 (Soemedi et al ., 2012). Mikroduplikace oblasti 1q21.1 genu GJA5 byla asociována s desetinásobným nárůstem rizika vzniku Fallotovy tetralogie. Jako další mechanismus, který může přispět ke vzniku VCC, se jeví epigenetická regulace genové exprese pomocí modifikace histonů a remodelace chromatinu (Zaidi et al ., 2013). Změny v expresi nekódujících RNA mohou také podporovat vznik VCC (O´Brien et al ., 2012).

1. 4. Sekvenování nové generace Genové mutace představují významné příčiny vzniku VCC. Pro detekci těchto změn na úrovni DNA lze využít metody mutační analýzy. Tyto metody se neustále zdokonalují, ať už z hlediska rozlišovací schopnosti či náročnosti časové i finanční. Technologie sekvenování „nové (příští) generace“ (next generation sequencing, NGS) našly brzy po svém vzniku v první dekádě 21. století uplatnění v postnatální i prenatální diagnostice. Metody NGS jsou schopny současně analyzovat rozsáhlé genomové oblasti a/nebo velké soubory vzorků. Sekvenačních metod NGS je celá řada, jsou založeny na různých principech a vyvinuty odlišnými společnostmi. V praxi nejčastěji používanými jsou metody pyrosekvenování (454 Life Sciences/Roche), SOLiD (Applied Biosystems) a v neposlední řadě Solexa (Illumina). NGS nabízí možnost celogenomového sekvenování, ale také analýzu vybraných oblastí DNA, tj. cílené sekvenování.

1. 4. 1. Obohacení vzorku o cílové oblasti genomu Při cíleném sekvenování technologií NGS je nejprve nutno zajistit, aby se amplifikovaly pouze vybrané oblasti DNA. V současné době je na trhu dostupných víc metod k obohacení vzorku o dané úseky. Rozhodujícími kritérii pro výběr metody využité v rámci této práce byly nízké množství vstupní DNA a také cenová dostupnost. Vybraná technologie HaloPlex Target Enrichment System (Agilent Technologies) umožňuje rychlou, jednoduchou a efektivní analýzu cílových genomových oblastí u velkého množství vzorků (www.genomics.agilent.com, a). K výběru oblastí slouží sondy navržené v programu SureDesign (Agilent Technologies). Postup návrhu sond je blíže popsán v kapitole 3. 2. 3. Návrh sond k obohacení vzorku o cílové oblasti genomu (SureDesign). Postup HaloPlex má více fází. Ze začátku se manipuluje s jednotlivými vzorky DNA zvlášť. Během procesu přípravy knihovny dojde k jejich smíchání. Tím je umožněna analýza více vzorků současně, což je výhodné z časových i finančních důvodů. Dále budou popsány základní charakteristiky jednotlivých kroků protokolu HaloPlex (obrázek č. 3; www.chem.agilent.com/Library/usermanuals/Public/G9900 90001.pdf). První fází v technologii HaloPlex je denaturace a štěpení genomové DNA jednotlivých vzorků pomocí 16 různých restrikčních enzymů (obrázek č. 3, A). Poté jsou ke vzorku přidány jednořetězcové sondy a tzv. kazeta (indexing primer cassette). Během hybridizačního kroku hybridizují konce sondy k okrajům cílové sekvence (obrázek č. 3, B). Prostřední část sondy se připojuje ke kazetě. Tato kazeta obsahuje index (osm nukleotidů sloužících k odlišení vzorků), sekvenační motivy (sekvence specifické pro navázání sekvenačního primeru 1, 2 a primeru pro čtení indexu) a adaptory (sekvence pro můstkovou amplifikaci cílových oblastí). Každá sonda je biotinylovaná, což umožňuje následnou purifikaci pomocí streptavidinových magnetických kuliček. Oblasti DNA, které se nenavázaly na sondy, jsou odstraněny. Následnou ligační reakcí dojde k cirkularizaci DNA (obrázek č. 3, C). Po uvolnění (eluci) cílových oblastí DNA z magnetických kuliček následuje polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction, PCR) cílových oblastí (obrázek č. 3, D). Každý amplikon (obrázek č. 3, D, vpravo) obsahuje jeden inzert cílové DNA (označeno modře) obklopený sekvenačními motivy (žlutě), index (zeleně) a úseky důležité pro můstkovou amplifikaci (světle a tmavě šedě).

A B Cílová oblast

Biotin

Sekvenační motiv

Index

Adaptory pro můstkovou amplifikaci

Sekvence sondy komplementární k cílové oblasti

C D PCR primery

Obrázek č. 3. Postup protokolu HaloPlex pro obohacení vzorku o cílové oblasti DNA pomocí sond (www.genomics.agilent.com , a; upraveno). Dle firmy Agilent Technologies není obrázek B zcela p řesný index je v kaz etě připojen ve vlásenkové podobě, aby nebránil hybridizaci kazety k sondě.

2. Cíle diplomové práce Tato diplomová práce byla vypracována v Cytogenetické laboratoři Brno, s.r.o. ve spolupráci s Centrem prenatální diagnostiky, s.r.o. Práce vede ke splnění níže vypsaných cílů: 1) Tvorba databáze prenatálních případů s VCC, zmapování genetické etiologie těchto vad a výběr vzorků pro provedení mutační analýzy. 2) Výběr kandidátních genů a jejich mutační analýza metodou NGS u vybraných prenatálních případů. 3) Vyhodnocení výsledků mutační analýzy. 4) Případná validace vybraných variant a segregační analýza.

3. Materiál a metody 3. 1. Materiál K provedení mutační analýzy s cílem odhalit možné příčiny VCC byly využity vzorky DNA plodů z let 2011 až 2014, u nichž byl nějaký typ vady srdce nalezen ultrazvukovým vyšetřením. Žádná vada jiného orgánu detekována u těchto plodů nebyla. Vzorky DNA, které sloužily k mutační analýze, byly uloženy při 16 až 25 °C. Vzorky byly získány z nekultivovaných, resp. kultivovaných amniocytů, tj. buněk získaných po oběru plodové vody (amniocentéze). DNA byla z buněk získána jednou ze tří následujích metod pomocí automatického izolátoru DNA MagCore, pomocí kitu FlexiGene ® DNA Kit (Qiagen), popř. pomocí technologie iGENatal kit (IGEN Biotech). Izolace DNA byla provedena podle protokolů dodávaných výrobci. Některé vzorky DNA sloužící k segregační analýze v rámci kazuistiky prezentované v kapitole 4. 7. Kazuistika HoltovéOramův syndrom, byly získány z periferní krve, resp. bukálního stěru, vyšetřovaných. DNA z těchto materiálů byla izolována automatickým izolátorem MagCore a poté uložena při 16 až 25 °C (pro dlouhodobé uchování) nebo při 2 až 8 °C pro brzké použití. K získání DNA jednoho plodu v této kazuistice musel být použitý nestandardní přístup. Jednalo se o přidání 200 l lyzačního GT pufru (součást kitu MagCore Genomic DNA Tissue Kit, RBC Bioscience) a jeho působení na podložní sklíčko s fixovanými kultivovanými amniocyty daného plodu. Tyto buňky využité v roce 2010 k určení klasického karyotypu metodou Gpruhování byly jediným zdrojem genetického materiálu plodu. Poté následovala izolace DNA v izolátoru MagCore. Všechny vzorky byly použity na základě informovaného souhlasu s genetickým laboratorním vyšetřením (www.cytogenetika.cz). Tento informovaný souhlas podepsali matky vyšetřovaných plodů, dospělí pacienti, popř. zákonní zástupci nezletilého. Mutační analýza genů asociovaných s VCC metodou NGS byla provedena ve dvou bězích, tj. pracovních cyklech (runs). V prvním běhu byla analyzovaná DNA od 23 plodů. Druhý běh testoval také 23 plodů, z toho dva plody byly stejné jako v prvním běhu. Důvodem opakování analýzy u jednoho plodu (I. běh, index 2.; II. běh, index 1.) bylo nulové čtení cílových oblastí. U druhého plodu (I. běh, index 20.; II. běh, index 2.) bylo opakování sekvenování z experimentálního důvodu, kdy se sledoval výsledek analýzy při polovičním vstupním množství vzorku. Početní zastoupení vzorků ve vztahu k jejich VCC popisuje tabulka č. 6.

Počet plodů Celkem plodů Typy vad Skupina VCC Typy vad (celý název) s daným ve skupině (zkratka) typem VCC VCC HLH Hypoplastické levé srdce 5 Vady levého srdce CoA Koarktace aorty 3 10 AS Aortální stenóza 2 PS Pulmonální stenóza 3 Vady pravého srdce 4 PA Atrézie plicnice 1

TGA Transpozice velkých tepen 3 PTA Společný arteriální trunkus 1 Konotrunkální malformace 9 DORV Dvojvýtoková pravá komora 1 TOF Fallotova tetralogie 4

Isomerismy Pravostranný isomerismus 1 1

VSD Defekt komorového septa 3 Defekty sept 7 AVSD Defekt síňokomorového septa 4

Vady se zkratem TAPVD Anomální návrat plicních žil 1 1

Plody s vícero 12 12 srdečními vadami

Celkem 44

Tabulka č. 6. Početní zastoupení vzorků ve vztahu k jejich VCC.

3. 2. Metody 3. 2. 1. Tvorba databáze prenatálních případů s VCC a výběr vzorků Veškeré informace o prenatálně detekovaných případech s VCC byly na základě studia lékařských a laboratorních záznamů shrnuty v databázi v programu MS Excel. Těmito informacemi byly příjmení a rodné číslo matky, diagnóza a anamnéza plodu, datum přijetí vzorku do laboratoře, jeho označení identifikačním číslem, koncentrace izolované DNA (měřená na přístroji NanoDrop® ND1000, resp. Qubit ® 2.0 Fluorometer), výsledek provedeného karyotypu, popř. FISH (fluorescenční in situ hybridizace) a výsledky molekulárněgenetických vyšetření. Dle typu indikace mohly těmito metodami být QFPCR (kvantitativní fluorescenční polymerázová řetezová reakce), MLPA (multiplex ligationdependent probe amplification) a DNA čipy (konkrétně array CGH, komparativní genomová hybridizace na čipu, a to se sondami v podobě BAC, popř. oligonukleotidů). Metoda QFPCR slouží v Cytogenetické laboratoři Brno, s.r.o. mimo jiné k určování aneuploidií chromozomů 13, 18, 21, X a Y. Technika MLPA je zde využíváná např. k detekci DiGeorgeova syndromu. Array CGH je metoda schopná zjistit nebalancované chromozomové přestavby s několikanásobně větším rozlišením než klasické cytogenetické vyšetření.

Vzorky pro mutační analýzu byly vybrány na základě prostudování této databáze. Jednalo se o vzorky s prozatím nenalezenou genetickou abnormalitou. Výjimkou byl vzorek s indexem 5 v prvním běhu. U tohoto plodu byla již v roce 2012 potvrzena metodou MLPA diagnóza DiGeorgeova syndromu. Vzorek byl do souboru zařazen pro snahu určit, zda je možné metodou této práce detekovat i CNV. Pro dodržení protokolu HaloPlex byla u všech vybraných vzorků koncentrace změřena znovu, a to fluorometrickým stanovením pomocí přístroje Qubit ® 2.0 Fluorometer (Invitrogen). Do mutační analýzy byly vybrány vzorky, které vyhovovaly vstupní koncentraci DNA 225 ng v 45l reakci, tj. 5 ng/l. V prvním běhu sekvenování se vyskytoval jeden vzorek (I. běh, vzorek 4.) s koncentrací pouze 2,6 ng/l z důvodu malého objemu vzorku. V druhém běhu byly celkem dva vzorky s nižší než požadovanou vstupní koncentrací. V jednom případě bylo snížení koncentrace záměrné z experimentálního důvodu (I. běh, index 20.; II. běh, index 2.), ve druhém případě bylo způsobeno nízkým množstvím DNA vzorku (II. běh, index 5.). Celogenomová amplifikace vzorků nebyla pro tuto práci doporučena firmou Agilent Technologies. Důvodem bylo riziko vnášení artefaktů do analyzovaných sekvencí.

3. 2. 2. Výběr kandidátních genů pro mutační analýzu Na základě studia literatury byly pro mutační analýzu vybrány geny s již dříve publikovanou spojitostí se vznikem různých typů VCC, a dále dva geny způsobující jiný typ srdečního onemocnění, ale mající vztah k funkci srdečních buněk (tabulka č. 7). V rámci této práce bylo pro mutační analýzu vybráno 59 genů. Z nich je 13 genů spojováno s rozvojem syndromových VCC, 38 genů se vznikem pouze izolovaných VCC. Celkem 6 testovaných genů je známo svou schopností zapříčinit syndromovou a také izolovanou formu VCC. Všechny vyšetřované geny a informace o nich jsou zapsány v tabulkách č. 2, 3, 4, 5 a 7.

Synonymní Funkce Symbol Označení v Typ Vybraná Název genu symboly produktu Lokus genu Ensembl VCC reference genu genu

MGC133384 Myosin, heavy chain Kardio , MYHa, Kontraktilní ENSG00000 Szema et MYH1 1, skeletal muscle, 17p13.1 myo MyHC-2X/D, protein 109061 al. , 2013 adult patie MYHSA1

CDCD2, CMPD2, HB1, HB2, Sodium channel, HBBD, HH1, Podjednotka Kardio ENSG00000 Kyndt et SCN5A voltage gated, type ICCD, IVF, sodíkového 3p21 myo 183873 al. , 2001 V alpha subunit LQT3, kanálku patie Nav1.5, PFHB1, SSS1

Tabulka č. 7. Geny asociované se vznikem kardiomyopatií.

3. 2. 3. Návrh sond k obohacení vzorku o cílové oblasti genomu (SureDesign) Pro analýzu variant 59 genů v testovaném souboru bylo použito cílené sekvenování vybraných úseků na přístroji MiSeq ®. Tyto cílové oblasti DNA musely být před samotným sekvenováním, tedy ve fázi přípravy knihovny, vybrány a namnoženy z celkové genomové DNA jednotlivých plodů. K tomuto byl uplatněn přístup zvaný „hybridizationbased capture“, tj. použití sond komplementárních k cílovým sekvencím. K návrhu sond byla vybrána internetová aplikace od společnosti Agilent Technologies zvaná SureDesign (http://earray.chem.agilent.com/suredesign). Sondy byly tvořeny dle referenčního lidského genomu H. sapiens, hg19, GRCh37, February 2009. Kontrola pokrytí cílových oblastí navrhnutými sondami byla prováděna pomocí programu UCSC Genome Browser (www.genome.ucsc.edu). Návrh sond byl optimalizován tak, aby pokrytí všech exonů, 5´ a 3´ nepřekládaných oblastí (untranslated regions, UTR) a 25bp intronových přesahů z obou konců exonů, bylo co nejvyšší. Program SureDesign umožňuje modifikovat parametry stringence, které charakterizují stupeň specifity, tj. komplementarity sond k DNA (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/help/WebHelp.htm). Stupeň komplementarity mohl být nejvyšší („maximize specificity“), střední („balanced coverage“), nebo nízký („maximize coverage“). Možnost „maximize specificity“ znamená, že nejméně jedno ze dvou ramen sondy se unikátně spojuje s cílovou DNA. Druhé rameno může hybridizovat s více místy v genomové sekvenci. Při variantě „balanced coverage“, SureDesign nejprve zkouší vybrat sondy, ve kterých k cíli specificky hybridizuje nejméně jedno rameno. Pak pro všechny zbylé cílové oblasti, pro

27 které stále nebyly navrhnuté vhodné sondy, program vybere sondy, jejichž jedno rameno se pojí maximálně ke dvěma místům genomové DNA (další rameno se pak může spojovat s více než dvěmi místy v genomu). Možnost „maximize coverage“ nebyla v rámci této diplomové práce využita. Konečný design obsahoval dvě skupiny genů (probegroups). První skupina obsahovala 54 genů. Při návrhu sond pro hybridizaci k cílovým oblastem těchto genů byla zvolena možnost „maximize specificity“. U skupiny druhé, tj. u 5 genů (CFC1 , LEFTY2 , MYH6 , MYH7 , NOTCH2 ), bylo nutné sondy navrhnout s využitím varianty „balanced coverage“.

3. 2. 4. Technologie HaloPlex Target Enrichment System Obohacení vzorku o oblasti zájmu technologií HaloPlex Target Enrichment System bylo provedeno dle protokolu HaloPlex Target Enrichment System For Illumina Sequencing, Protocol version D.5, May 2013, Agilent Technologies (www.chem.agilent.com/Library/usermanuals/Public/G990090001.pdf). Protokol HaloPlex byl v obou bězích proveden také na vzorku označeném Enrichment Control DNA (ECD), který byl součástí dodané sady reagencií. Tento vzorek sloužil jako kontrola kvality určitých kroků protokolu. Před zahájením protokolu HaloPlex byla u všech vybraných vzorků změřena koncentrace fluorometrickým stanovením pomocí přístroje Qubit ® 2.0 Fluorometer (Invitrogen). Kvantifikace DNA založená na fluorescenci barviček navázaných na DNA je specifičtější než metody založené na absorbanci UV světla (www.lifetechnologies.com). Měření bylo provedeno podle standardního postupu doporučeného výrobcem (www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf). Byl použit kit s označením Qubit™ dsDNA HS Assay Kit. Po změření koncentrace následovala příprava vzorků pro získání vstupní koncentrace DNA 225 ng v 45l reakci, tj. 5 ng/l. Při provádění metody HaloPlex bylo postupováno dle návodu výrobce. Výjimkou bylo nedodržení doporučené kontroly velikostní distribuce DNA, resp. její degradace pomocí gelové elektroforézy před zahájením protokolu HaloPlex. Tato validace nebyla provedena z důvodu limitovaného množství vzorků. Produkty, které vznikly při protokolu HaloPlex, byly přečištěny a připraveny k dalšímu kroku, tj. k validaci obohacení a kvantifikaci cílové DNA. Tato analýza byla provedena s použitím systému Agilent 2200 Tape Station, který pracuje na principu

28 gelové elektroforézy v malém měřítku. Byly využity dva typy tzv. ScreenTapes, tedy destiček s oddělenými prostorami, v nichž probíhá separace DNA podle velikosti. Jejich označení je D1000 a D1K (www.chem.agilent.com/library/usermanuals/Public/G2964 90002_TapeStationPalpatine_USR_EN.pdf;www.chem.agilent.com/library/usermanuals /Public/G296490001_TapeStationPalpatine_USR_EN.pdf). Výsledné elektroforetogramy každého vzorku byly analyzovány v programu 2200 TapeStation Analysis Software A.01.04. U vzorků byla určena hmotnostní koncentrace (ng/l) a molární (látková) koncentrace (molarita, nmol/l) obohacené cílové DNA pomocí integrace mezi 175 a 625 bp. Tyto údaje sloužily k poslednímu kroku protokolu HaloPlex. Jednalo se o smíchání ekvimolárních množství jednotlivých vzorků odlišených indexy.

3. 2. 5. Příprava knihovny pro sekvenování přístrojem MiSeq ® Knihovna vzorků připravená metodou HaloPlex byla dále upravena dle protokolu Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq ®, October 2013 (http://supportres.illumina.com/documents/documentation/system_documentation/miseq /preparinglibrariesforsequencingonmiseq15039740d.pdf). Úprava knihovny zahrnovala její denaturaci a naředění. K denaturaci DNA na jednotlivé řetězce sloužil čerstvě připravený 0,2N roztok NaOH. Denaturovaná knihovna se dále ředila hybridizačním pufrem (HT1) do požadované pikomolární koncentrace.

3. 2. 6. Sekvenování nové generace přístroj MiSeq® Po úpravě knihovny vzorků bylo možné přistoupit k detekci variant DNA v cílových oblastech 59 genů spojovaných se vznikem VCC. K tomuto byl vybrán přístroj MiSeq ® společnosti Illumina. Sekvenátor MiSeq ® využívá technologie NGS založenou na sekvenování syntézou (sequencing by synthesis, SBS), kdy jsou jednotlivé nukleotidy detekovány během jejich inkorporace do rostoucího řetězce DNA (www.illumina.com, a). MiSeq® umožňuje integraci více procesů (generování klastrů, sekvenování, analýzu dat) v jediném přístroji. Jeho nejčastější použití je sekvenování malých genomů či panelů vybraných genů (www.illumina.com, b). Metoda sekvenování se skládala z namnožení knihovny můstkovou amplifikací (bridge amplification), samotného sekvenování (pairedend sequencing, fragment DNA je čtený nejprve z jedné a pak i z druhé strany) a analýzy dat (www.illumina.com, a).

Při obsluze přístroje bylo postupováno dle manuálu, který je volně přístupný (http://supportres.illumina.com/documents/documentation/system_documentation/miseq /miseqsystemuserguide15027617m.pdf). Parametry analýzy přístrojem MiSeq ® se liší podle výběru kitu. V této práci byl pro oba provedené běhy vybrán kit MiSeq Reagent Kit v2 (500cycle) (www.illumina.com, c). Při obou bězích byla délka čtení rovna 250 bp. V počítači napojeném na MiSeq ® byly nainstalovány tři programy, a to MiSeq Control Software (MCS), Realtime analysis software (RTA) a MiSeq Reporter (http://supportres.illumina.com/documents/documentation/system_documentation/miseq /miseqsystemuserguide15027617m.pdf). Tyto programy sloužily ke spuštění analýzy, kontrole operací, analýze obrazu, přiřazení bazí k chromatogramu (base calling) a k určení kvality každé baze, dále také k získání informací o srovnání sekvencí (alignment), o variantách, a k sestavení kontigů. Pro nahrávání dat, jejich sdílení a kontrolu parametrů sekvenování byla využita aplikace zvaná BaseSpace (https://da1s119xsxmu0.cloudfront.net/sites/knowledgebase/userguide/07112014/UserG uide%20PDF/basespaceuserguide15044182d.pdf). Tento program poskytl informace o kvalitě obou běhů.

3. 2. 7. Vyhodnocení nalezených variant DNA Pro analýzu variant DNA u jednotlivých vzorků byl dále použit program SureCall v2.0.8 Software, resp. SureCall v2.1.1.13 (Agilent Technologies) (www.genomics.agilent.com, b). Analýza v SureCall začala s hrubými (raw) daty po sekvenování přístrojem MiSeq ®. Sekvence byly přirovnány k referenčnímu genomu (alignment). SureCall identifikoval varianty DNA a zhodnotil je na základě jejich umístění, změny aminokyseliny, efektu na funkci proteinu (Sorting Intolerant from Tolerant, SIFT) a vlivu na strukturu a funkci proteinu (Polymorphism Phenotyping v2, PolyPhen2). Další informace o mutacích program získává ze zdrojů, jako jsou NCBI, PubMed atd. Pro každý vzorek byl získán tzv. „QC report“, jenž obsahoval údaje o cílových oblastech. Důležitými údaji jsou mj. průměrná, resp. mediánová, hloubka čtení v těchto oblastech („average, resp. median read depth in analyzable target regions“) a procento těchto oblastí pokrytých (čtených) alespoň 1, 5, 10, 20, 100, 500, 1000 čteními

(„percentage of analyzable target regions covered by at least 1, 5, 10, 20, 100, 500, 1000 reads“). Analýza variant byla dále provedena v programu VariantStudio v2.1 (Illumina). Po anotaci všech variant DNA následovala aplikace konsekvenčních filtrů, tj. výběr těch variant, které mají vliv na transkript. Byly vybrány následující mutace missense (měnící smysl), frameshift (mutace posunová), stop gained (tj. nonsense, nesmyslná), stop lost (ztráta terminačního kodonu), initiator codon (varianta v iniciačním kodoně), inframe insertion (inzerce bez změny čtecího rámce), inframe deletion (delece bez změny čtecího rámce) a splice (sestřihová). Kromě výše vypsaných programů byl k vizualizaci a studiu variant DNA aplikován také program IGV 2.3 (Integrative Genomics Viewer, Broad Institute). Dalším parametrem filtrování variant byla jejich frekvence v populaci rovna či menší než 5 %. Pokud byla tato četnost vyšší než 5 %, varianta byla zařazena do kategorie benigního významu. Poměrně vysoká hranice populační frekvence 5 % byla vybrána z toho důvodu, že VCC jsou natolik heterogenní skupinou, mohou být pravděpodobně způsobeny současně více variantami DNA, mohou mít multifaktoriální dědičnost a studium příčin VCC je začínající oblastí výzkumu. K tomu, aby byla daná alternativní varianta blíže studována, musela být čtena ve 20 či více procentech čtení dané pozice DNA. Každému typu analyzované varianty byl na základě studia více parametrů přidělen nejpravděpodobnější klinický význam. K tomuto bylo využito studium informací poskytnutých programem SureCall, dále údaje z databází (www.ensembl.org, www.genecards.org, www.genenames.org, http://snpeffect.switchlab.org, www.lovd.org, www.ncbi.nlm.nih.gov, www.omim.org, www.uniprot.org) a publikací, přehledových i původních vědeckých sdělení. Filtrované varianty testovaných genů byly tříděny celkem do pěti tříd. Tento typ klasifikace byl vybrán na základě třídění variant popsaného v literatuře (den Dunnen a Antonarakis, 2000; Richards et al. , 2008; http://www.acgs.uk.com/media/774853/evaluation_and_reporting_of_sequence_variants _bpgs_june_2013__finalpdf.pdf). První třídu představují varianty s benigním významem, další třídu varianty s potenciálně benigním významem a třetí třídu pak varianty nejasného významu (variants of unknown significance, VOUS). Do skupiny VOUS byly varianty zařazeny z důvodu malého množství důkazů o jejich klinickém významu či tehdy, pokud zdroje udávaly jiné, mnohdy i protichůdné, významy těchto variant. Poslední dvě třídy tvoří potenciálně patogenní a patogenní varianty. Pokud byla

31 varianta DNA zařazena do skupiny potenciálně benigní či potenciálně patogenní, nikoliv do třídy benigní a patogenní, bylo tomu tak proto, že stanovisko o jejich významu bylo nejednoznačné. Zjednodušený postup při klasifikaci variant je zobrazen níže (obrázek č. 4).

Frekvence v populaci

> 5,0 % < 5,0 %

Benigní

Insilico predikce (SIFT, PolyPhen) Stop/frameshift varianta

Potenciálně patogenní

Rozpor/benigní Patogenní

Databáze, Databáze, publikace, publikace, segregace segregace

Patogenní Benigní Není Patogenní Benigní Není informace informace

Potenciálně Potenciálně VOUS Patogenní VOUS VOUS patogenní benigní

Obrázek č. 4. Zjednodušený harmonogram klasifikace variant do pěti tříd dle klinického významu.

3. 2. 8. Sangerovo sekvenování V této práce byla jako metoda pro potvrzení vybraných sekvenčních variant DNA a pro provedení segregační analýzy v rámci kazuistiky (4. 7. Kazuistika Holtové Oramův syndrom) vybrána metoda Sangerova sekvenování. Ta se skládala z návrhu primerů pro PCR a optimalizace podmínek PCR (množství hořečnatých iontů, počet cyklů PCR, teplota hybridizace primeru k templátu). Po nalezení nejvhodnějších podmínek pro daný pár primerů bylo možno přistoupit k testování již reálných vzorků.

Po PCR, ověření specifity primerů pro PCR a po přečištění amplikonů následovalo samotné Sangerovo sekvenování, které se skládalo z terminační reakce a přečištění jejich produktů. Ty byly následně separovány pomocí kapilární elektroforézy.

3. 2. 8. 1. Návrh primerů pro PCR Pro návrh primerů je možné využít více postupů. Postup aplikovaný v této práci probíhal následovně: 1) V bioinformatickém nástroji Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html), záložka „Human“, vyhledat gen zájmu, následně místo zájmu (místo testované varianty) v sekvenci cDNA pomocí pozice varianty. 2) Nalézt místo zájmu v sekvenci DNA. Rozšířit tuto oblast dostatečně na obě strany tak, aby se místo zájmu vyskytovalo přibližně uprostřed sekvence. 3) Vložit sekvenci do volně dostupné aplikace pro návrh primerů zvané PrimerBLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast). 4) V programu PrimerBLAST, záložka „Primer Parameters“, nastavit parametry pro návrh primerů (velikost produktu PCR, teplota tání primeru). V záložce „Primer Pair Specificity Checking Parameters“ zohlednit mj. stringenci specifity primeru. 5) Výstupem je více párů primerů. K syntéze vybrat ten nejvhodnější pár (dle specifity k templátu, umístění v sekvenci, velikosti produktu, obsahu GC, teploty tání, komplementarity v rámci primeru aj.). 6) Vybrané primery nechat syntetizovat u vybrané společnosti. 7) Primery v lyofilizované podobě rozpustit ve sterilní vodě (RNAse and DNAse free ultrapure water; např. TopBio, s.r.o.) na zásobní koncentraci 100 M a následně na pracovní koncentraci 10 M. Takto připravené roztoky primerů uchovávat při 25 °C.

3. 2. 8. 2. Optimalizace podmínek pro PCR Před PCR s reálnými vzorky bylo nutno optimalizovat podmínky reakce pro nejlepší fungování daného páru primerů. Parametry, které se dají v rámci reakce modifikovat, mohou být následující množství hořečnatých iontů, množství templátu, počet cyklů PCR a teplota hybridizace primeru k templátu. Optimalizace se projeví na kvantitě a kvalitě pruhů na gelu po provedení agarózové elektroforézy. V rámci této práce byly nakonec u čtyř studovaných variant DNA měněny jen dvě vlastnosti reakce, a to počet cyklů PCR a teplota hybridizace primeru k templátu.

Příčinou byla skutečnost, že se optimalizace množství hořečnatých iontů neprojevila jako potřebná.

3. 2. 8. 3. Příprava a průběh PCR Amplifikaci daných oblastí DNA metodou PCR byla provedena podle protokolu uvedeného v tabulce č. 8.

Objem reagencie v 25 μl Reagencie Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace reakci ( μl) JumpStartTM Taq ReadyMix TM 2× 1× 12,5 (SigmaAldrich)

Přímý (forward, F) primer 10 M 0,2 M 0,5 Zpětný (reverse, R) primer 10 M 0,2 M 0,5 Templátová DNA Různá Optimum 40 ng/reakci Různý Voda (Water PCR Reagent, Různý (dopočítaný do 25 μl) SigmaAldrich) Celkem 25

Tabulka č. 8. Reagencie pro PCR, jejich koncentrace a množství. JumpStart TM Taq ReadyMix TM (SigmaAldrich) je směs složená z 20mM TrisHCl, 100mM KCl, 3mM MgCl 2, 0,002% želatiny, 0,4mM směsi každého nukleotidu (dATP, DTP, DTP, dTTP), stabilizátorů, 0,1unit/l Taq DNA polymerázy a JumpStart Taq protilátky.

PCR probíhala v termocykleru Veriti ® 96Well Thermal Cycler (Life Technologies). Teplotní režim reakce byl specifický pro každou ze čtyř testovaných sekvencí (tabulka č. 9). Počet cyklů byl 35. Výjimkou byla amplifikace vzorku, u kterého byla testována varianta v genu CITED2 (p.Ser203_Gly204del). V tomto případě musel být počet cyklů zvýšen na 42.

Fáze PCR Teplota Doba Počet cyklů

Iniciační denaturace 94 °C 2 min Denaturace 94 °C 30 s Hybridizace primerů k templátu TBX5 p.Thr223Met 60 °C 30 s CITED2 p.His44del 60 °C 30 s 35/42 MYH6 p.Lys1731ArgfsTer61 60 °C 30 s CITED2 p.Ser203_Gly204del 54 °C 30 s Elongace (syntéza řetězců) 72 °C 1 min Finální elongace 72 °C 5 min Fáze po skončení PCR 4 °C ∞

Tabulka č. 9. Teplotní režim PCR.

3. 2. 8. 4. Ověření specifity primerů pro PCR Po provedení PCR byla k ověření specifity reakce, tj. k ověření vzniku žádaného produktu, využita agarózová gelová elektroforéza. V tabulce č. 10 jsou shrnuty vlastnosti agarózového gelu a nastavení průběhu metody.

Objem Midori Koncentrace Množství Green Objem gelu (ml) Napětí (V) Doba (min) gelu (%) agarózy (g) Advanced DNA Stain (l) 80 5 2 100 2,0 6,0 150 30

Tabulka č. 10. Parametry nastavení metody agarózové gelové elektroforézy pro ověření specifity PCR.

Do jamek gelu bylo nanášeno 12,5 l vzorku smíchaného s 4,0 l nanášecího pufru. Pro velikostní srovnání produktů PCR byl využit velikostní standard GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder readytouse (Life Technologies), do jamek byl dávkován po 2,0 l.

3. 2. 8. 5. Přečištění amplikonů po PCR K přečištění produktů PCR byl vybrán komerční kit MinElute PCR Purification Kit (Qiagen). Purifikace probíhala dle návodu výrobce bez modifikací: 1) Do zkumavky s amplikony přidat 5× objem, jež je ve zkumavce, pufru PB (Binding Buffer). 2) Celý objem přemístit do kolonky s filtrem. 3) Provést centrifugaci kolonky (1 min, 13 000 otáček). 4) Eluát odstranit a do kolonky přidat 750 l pufru PE (Wash Buffer). 5) Provést centrifugaci kolonky (1 min, 13 000 otáček), eluát odstranit a znovu provést centrifugaci (1 min, 13 000 otáček). 6) Kolonku umístit do nové zkumavky a přidat do ní 10 l pufru EB (Elution Buffer). 7) Nechat jednu minutu stát při pokojové teplotě, poté provést centrifugaci (1 min, 13 000 otáček). 8) Eluát obsahuje přečištěný produkt PCR.

3. 2. 8. 6. Sekvenační reakce Principem Sangerova sekvenování je terminační reakce (Sanger et al. , 1977). Dochází k začlenění fluorescenčně značených dideoxynukleotidů do rostoucího řetězce

DNA. Dideoxynukleotidy způsobí ukončení syntézy DNA. Jednotlivé produkty terminační reakce jsou dále separovány pomocí kapilární elektroforézy. Pro terminační reakci byla využita komerční sada BigDye ® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Jednotlivé komponenty reakce a jejich objemy byly smíchány dle následující tabulky č. 11.

Reagencie Objem reagencie v 10 μl reakci ( μl)

BigDye ® Terminator v1.1 Ready Reaction Mix 2,0 (Applied Biosystems)

5× Sequencing Buffer (Applied Biosystems) 2,0 Přímý nebo zpětný primer (10 μM) 0,5 DNA (přečištěný produkt PCR) 2,0 Voda (Water PCR Reagent, SigmaAldrich) 3,5 Celkem 10

Tabulka č. 11. Reagencie a jejich množství pro sekvenační reakci.

Program nastavený v termocykleru pro terminační reakci je zobrazen dále (tabulka č. 12). Počet cyklů byl 25.

Fáze sekvenační reakce Teplota Čas Počet cyklů

Iniciační denaturace 96 °C 1 min Denaturace 96 °C 10 s Hybridizace primerů k templátu 50 °C 5 s 25 Elongace (syntéza řetězců) 60 °C 4 min Fáze po skončení PCR 4 °C ∞

Tabulka č. 12. Teplotní režim pro sekvenační reakci.

3. 2. 8. 7. Přečištění produktů sekvenační reakce Produkty sekvenační reakce byly přečištěny především od nevyužitých dideoxynukleotidů dle návodu DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen): 1) Kolonku s gelem, dodanou jako součást kitu, jemně promíchat vortexem víčkem dolů. 2) Po povolení víčka ulomit konec kolonky a tu uložit do 2ml sběrné zkumavky. 3) Provést centrifugaci kolonky (3 min, 750 g). 4) Po přenesení kolonky do nové zkumavky aplikovat na gel 10 l produktů sekvenační reakce. 5) Provést centrifugaci kolonky (3 min, 750 g).

6) Eluát obsahuje přečištěný produkt sekvenační reakce. 7) Otevřenou zkumavku s eluátem přenést do termobloku nastaveného na 50 °C. 8) Po vysušení přidat do zkumavky 12 l formamidu. Krátce promíchat vortexem a nechat pár minut stát při pokojové teplotě. Takto připravený vzorek je připravený na provedení separace produktů metodou kapilární elektroforézy.

3. 2. 8. 8. Separace produktů sekvenační reakce a analýza dat Produkty sekvenační reakce byly separovány podle délky metodou kapilární elektroforézy v přístroji 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Výsledkem analýzy byly elektroforetogramy, které byly dále studovány v programu Sequencing Analysis v5.2.

4. Výsledky 4. 1. Studium databáze případů VCC , výběr vzorků pro mutační analýzu Po vytvoření databáze prenatálních případů VCC bylo možné konstatovat, že v Cytogenetické laboratoři Brno, s.r.o. bylo od 1. 1. 2006 do 19. 9. 2014 vyšetřeno 328 plodů, u kterých byla detekována VCC (graf č. 1, tabulka č. 13). Podle dané indikace byla DNA vyšetřována jednou či více metodami uvedenými v ýše v kapitole 3. 2. 1. Tvorba databáze prenatálních případů s VCC a výběr vzorků . Nejčastěji nalezenou abnormalitou byla trizomie 21. chromozomu. Přibližně u 55 % plodů se nepodařilo těmito technikami žádné odchylky, resp. domnělé příčiny VCC, nalézt. Z těchto plodů byly dle určitých kritérií vybrány plody pro následující mutační analýzu pomocí cíleného sekvenování 59 genů. Těmito kritér ii byly přítomnost izolované VCC plodu , rodinná anamnéza, koncentrace DNA a množství vzorku . Jediný vzorek (I . běh, index 5.) měl detekovanou genetickou abnormalitu, kterou byla delece způsobující DiGeorgeův syndrom. Varianty DNA nalezeného u tohoto vzorku nebyly blíže studovány pro zařazení do tříd dle klinického významu. Seznam a základní údaje o testovaných vz orcích lze nalézt v tabulkách č. 14 a 15.

Negativní výsledek vyšetření 54,6% Aneuploidie Aneuploidie 34,8% Triploidie

Mozaicismus

Nebalancované přestavby

Triploidie DiGeorgeův syndrom 1,8% Mozaicismus Bez výsledku 1,5% Bez výsledku 1,2% Nebalancované přestavby DiGeorgeův syndrom 3,0% Negativní výsledek vyšetření 3,0%

Graf č. 1. Výsledky cytogenetických a molekulárně genetických vyšetření celkem 328 plodů s VCC (1. 1. 2006 –19. 9. 2014). Zjednodušené grafické zobrazení tabulky č. 13. Vyšetření karyotyp; FISH; QF PCR chr. 13, 18, 21, X, Y; MLPA DiGeorgeův

38 syndrom; array CGH nebalancované přestavby. U plodů provedena vždy jen indikovaná vyšetření (nemusely se provádět všechny výše vypsané metody).

Souhrnné označení Jednotlivé výsledky vyšetření Celkem Celkem výsledků vyšetření

46,XY,+13 nebo 46,XX,+13 16

46,XY,+18 nebo 46,XX,+18 35

46,XY,+21 nebo 46,XX,+21 40

45,X 16

48,XXX,+18 1

47,XY,+20 1 Aneuploidie 114

47,XX,+22 1

46,XX,der(13;14)mat,+18 1

47,XX,+9 1

47,XX,t(4;13)mat,+13 1

46,XY,der(13;14),+13 1

69,XXX 5 Polyploidie 6 69,XXY 1

mos 47,XX,+21[60]/46,XX[40] 1

mos 45,X[5]/46,XX[95] 1

mos 47,XY,+22[14]/46,XY[11] 1 Mozaicismus 5

mos 47,XXX[3]/46,XX[17] 1

mos 45,X[2]/46,XX[14] 1

46,XY,del(21)(q22.13q22.2) 1

46,XX,der(2)t(2;10) 1

46,XY,der(15)t(5;15) 1

46,XX,del(1)(q24.2q31.3) 1

46,XY,+der(18)t(21;18),21 1

46,XY,inv(2)(p15q23),del(18)(q21.3) 1 Nebalancované přestavby 10

46,X,der(X)t(15;X) 1

46,XY,del(7)(q21.2q22.1) 1

46,XX,del(22)(q13.3) 1

46,XX,der(3)t(3;14)(pter>q25.3::q22.3>qter), 1 der(14)t(3;14)(pter>q32.2::q25.3>qter)dn DiGeorgeův syndrom (del22q11; del22q11.2; 10 DiGeorgeův syndrom 10 del22q11.22q11.23x1; del22q11.21) Bez výsledku (nenarostla buněčná kultura/ 4 Bez výsledku 4 kontaminace mateřskou DNA) Negativní výsledek vyšetření 179 Negativní výsledek vyšetření 179

Tabulka č. 13. Výsledky cytogenetických a molekulárněgenetických vyšetření celkem 328 plodů s VCC (1. 1. 2006–19. 9. 2014). Vyšetření karyotyp; FISH; QFPCR chr. 13, 18, 21, X, Y; MLPA DiGeorgeův syndrom; array CGH nebalancované přestavby.

U plodů provedena vždy jen indikovaná vyšetření (nemusely se provádět všechny výše vypsané metody).

Rok Datum Koncentrace Index Iniciály Typ narození přijetí DNA Poznámka (I. běh) matky VCC matky vzorku (ng/l)

1 A. J. 1982 1.10.2012 TOF 8,4

2 B. H. L. 1981 3.8.2012 PS 21,0

3 Č. G. 1987 20.4.2012 CoA 5,4

VCC v rodině (rodina otce plodu bratr matky zemřel ve Vícero třiceti letech na VCC, dále předpokládána 4 D. M. 1984 23.11.2012 2,6 VCC VCC u tety, která zemřela v osmnácti letech), vstupní koncentrace pouze 2,6 ng/l Vícero 5 P. D. L. 1987 20.7.2012 9,6 Pozitivní DiGeorgeův syndrom VCC 6 F. S. 1981 5.11.2012 CoA 6,7

7 M. M. 1991 2.11.2012 HLHS 14,4 Vícero 8 M. Š. 1989 26.3.2012 11,0 VCC VCC v rodině 9 K. J. 1980 9.7.2012 VSD 10,7 (rodina otce plodu syn sestřenice má VCC) VCC v rodině (rodina otce plodu sestra matky měla tři 10 Š. H. 1978 24.9.2012 AS 6,9 děti, první zemřelo ve třech letech na VCC) VCC v rodině Vícero 11 V. V. 1981 13.7.2012 31,6 (rodina matky plodu paternální bratranec VCC zemřel devátý den po narození na VCC)

12 F. P. 1985 19.4.2013 AVSD 7,3 Vícero 13 G. L. 1989 8.2.2013 10,7 VCC 14 K. M. 1974 8.2.2013 TGA 8,3 VCC v rodině 15 V. L. 1981 11.2.2013 VSD 8,4 (otec plodu TOF) VCC v rodině (otec plodu atrioventrikulární blok, viz 16 Š. E. 1981 19.4.2013 AVSD 6,8 kapitola 4. 7. Kazuistika HoltovéOramův syndrom) 17 G. K. 1985 5.8.2013 VSD 6,9

18 K. I. 1994 23.9.2013 HLHS 29,8 Vícero 19 K. M. 1993 27.11.2013 93,4 VCC Vícero 20 T. E. 1988 17.2.2014 34,4 VCC 21 A. R. 1973 14.2.2014 TGA 46,8 Vícero 22 Š. S. 1989 7.4.2014 60,6 VCC 23 P. M. 1979 28.2.2014 TAPVD 18,0

Tabulka č. 14. Seznam a údaje o vzorcích testovaných v prvním běhu mutační analýzy.

Rok Datum Koncentrace Index Iniciály Typ narození přijetí DNA Poznámka (II. běh) matky VCC matky vzorku (ng/l)

1 B. H. L. 1981 3.8.2012 PS 21,0 Opakovaná analýza NGS (I. běh, index 2.) Opakovaná analýza NGS (I. běh, index Vícero 2 T. E. 1988 17.2.2014 34,4 20.) experimentální důvod, poloviční VCC vstupní koncentrace, tj. 2,5 ng/l 3 D. L. 1980 4.7.2014 TOF 112,0

4 B. A. 1985 4.7.2014 HLH

VCC v rodině (dvakrát umělé přerušení těhotenství pro 5 N. R. 1977 26.10.2012 HLH 0,7 VCC, také jeden spontánní abort), vstupní koncentrace pouze 0,7 ng/l

6 N. L. 1981 31.1.2014 PS 54,6

7 Ch. A. 1987 16.9.2013 PA 14,6

Pravý 8 S. L. 1985 22.3.2013 isome 21,2 rismus 9 B. M. 1979 3.5.2013 AVSD 27,4

10 T. I. 1987 4.3.2011 TOF 18,6 Vícero 11 S. P. 1978 19.3.2014 18,3 VCC Vícero 12 K. L. 1980 17.1.2014 18,9 VCC 13 G. M. 1991 9.9.2013 DORV 6,0

14 L. M. 1991 17.3.2014 PS 37,6

15 K. H. 1980 26.10.2012 AS 6,4

16 Š. P. 1982 14.10.2013 CoA 8,2 VCC v rodině (rodina matky plodu matka otce zemřela v 35 letech po operaci srdce, 17 M. A. 1989 31.1.2011 PTA 18,8 pravděpodobně měla vadu chlopně, rodina otce plodu bratr dědy zemřel ve 25 letech pravděpodobně na kardiologické onemocnění) 18 K. P. 1977 3.5.2013 TGA 38,2 VCC v rodině Vícero (rodina matky plodu matka operována 19 S. M. 1973 13.4.2012 7,6 VCC na ASD, matka plodu léčena pro tachykardii) Vícero 20 K. K. 1983 30.12.2011 8,9 VCC

VCC v rodině (další plod z roku 2011 dvojvýtoková 21 C. P. 1975 7.12.2010 TOF 9,0 pravá komora, transpozice velkých tepen, stenóza plicnice)

22 N. V. 1978 21.11.2011 AVSD 5,6

23 V. G. 1985 20.7.2012 HLH 8,8

Tabulka č. 15. Seznam a údaje o vzorcích testovaných v druhém běhu mutační analýzy.

4. 2. Optimalizace návrhu sond pro obohacení vzorku o cílové oblasti genomu Pomocí programů SureDesign a UCSC Genome Browser byl návrh sond optimalizován s cílem dosáhnout co nejvyššího pokrytí vybraných oblastí genomu těmito hybridizačními sondami. Při návrhu sond bylo dosaženo následujících parametrů. Počet cílových oblastí byl 995. Jejich celková velikost byla 412 957 bp. Celkem u 59 genů bylo dosaženo průměrného 99,76% pokrytí. Z toho 100% pokrytí bylo u 38 genů. U 18 genů bylo dosaženo pokrytí jejich cílových oblastí 99 až 99,99%. Pokrytí genu ZFPM2 bylo 97,54 %, genu SEMA3E pak 98,79 %, nejnižší pokrytí bylo rovno 94,39 % u genu TDGF1 . Dle průvodce programu SureDesign se pokrytí vyšší než 90 % pokládá za pokrytí dobré (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/help/WebHelp.htm). Výstupem návrhu sond bylo mj. grafické zobrazení tzv. „missed regions“. Jedná se o úseky sekvence DNA, které dle programu SureDesign nebudou sondami zachyceny, resp. amplifikovány. Umístění těchto 29 nepokrytých oblastí celkem u 21 genů shrnuje tabulka č. 16. Tyto úseky jsou jednak v oblastech intronových, oblastech 3´ či 5´ nepřekládaných, nicméně u sedmi genů se vyskytovaly také v oblastech exonových.

Počet Pokrytí cílových Symbol genu nepokrytých Umístění nepokrytých oblastí oblastí genu (%) oblastí

BMPR2 99,38 2 UTR CRELD1 99,77 1 UTR

ELN 99,78 2 Oblast A intron, oblast B intron

FOXC1 99,49 1 Exon

FOXP1 99,91 2 Oblast A intron, oblast B intron

GJA1 99,68 1 Exon

Oblast A intron/UTR, oblast B MCTP2 99,28 5 intron, oblast C intron, oblast D intron, oblast E – intron/UTR

MED13L 99,98 1 UTR

MYH1 99,99 1 Exon

MYH11 99,39 1 Intron

NOTCH2 99,89 2 Oblast A exon , oblast B intron

SALL4 99,86 1 Intron

SCN5A 99,84 2 Oblast A exon /UTR, oblast B exon

SEMA3E 98,79 1 UTR

Počet Pokrytí cílových Symbol genu nepokrytých Umístění nepokrytých oblastí oblastí genu (%) oblastí

SHROOM3 99,93 1 Exon

TAB2 99,84 1 Intron

TBX1 99,76 1 Intron/UTR

TBX20 99,87 1 Exon

TDGF1 94,39 1 UTR

TLL1 99,95 1 UTR

ZFPM2 97,54 1 Intron

Tabulka č. 16. Predikované nepokryté oblasti („missed regions“) testovaných genů dle programu SureDesign.

Nepokryté oblasti („missed regions“) byly charakterizované buď úplnou absencí sond, které by k těmto úsekům hybridizovaly, jednak nízkým počtem predikovaných amplikonů těchto oblastí. Po mutační analýze přístrojem MiSeq ® byla provedena kontrola pokrytí těchto pravděpodobně nepokrytých oblastí u čtyř reprezentativních vzorků. Jak bylo zjištěno u intronových oblastí a UTR, tyto předpovězené oblasti nebyly vždy nepokryté. V některých případech byly tyto úseky čteny, ačkoliv s nižším pokrytím než sekvence okolní. Na druhou stranu počet čtení některých úseků byl roven nule. Dále budou popsány nepokryté oblasti („missed regions“) v exonech genů. Příloha č. 1 zobrazuje srovnání předpovězené nepokryté oblasti v exonech sedmi genů (program UCSC Genome Browser) a reálné situace po sekvenování u čtyř vybraných vzorků pomocí programu IGV (I. běh, index 20., průměrná hloubka čtení cílových oblastí byla 600; II. běh, index 13., průměrná hloubka čtení cílových oblastí byla 716; I. běh, index 4., průměrná hloubka čtení cílových oblastí byla 296; II. běh, index 6., průměrná hloubka čtení cílových oblastí byla 254). Při návrhu sond zůstala nepokryta oblast v exonu genu FOXC1 (příloha č. 1a) beze změny i při využití možností nižší specifity („balanced coverage“, „maximize coverage“). Proto byla při konečném návrhu použita varianta „maximize specificity“. Při porovnání této predikované oblasti a reálné situace u čtyř vzorků bylo detekováno nulové čtení oblasti, která byla dokonce delší než při predikci. Tato oblast je vhodným cílem pro Sangerovo sekvenování.

Pokud by byla pro finální návrh sond u genu GJA1 (příloha č. 1b) využita možnost „balanced coverage“, žádná nepokrytá oblast nebyla předpovídána. Při použití „maximize specifity“ byly v dané nepokryté oblasti zakresleny její predikované amplikony. Firma Agilent Technologies se v tomto případě přikláněla k využití možnosti „maximize specifity“ s tím, že tato oblast bude pravděpodobně namnožena. To se prokázalo i při kontrole po mutační analýze. Oblast byla čtena nižším, stále však dostačujícím počtem čtení než sousedící úseky DNA. Stejný případ nastal i u exonové nepokryté oblasti genu MYH1 (příloha č. 1c). Navíc u tohoto případu by tato oblast zůstala stejná i při použití parametru „balanced coverage“. Při návrh sond pro sekvenování vybraných oblastí genu NOTCH2 (příloha č. 1d) byla aplikována možnost „balanced coverage“. Jak bylo dokázáno při postanalyzační kontrole, nepokrytá oblast v exonu tohoto genu byla čtena s nižší, ale dostačující frekvencí než okolní sekvence. Predikovaná nepokrytá oblast označená písmenem A v exonu genu SCN5A (příloha č. 1e) byla stejná při použití vysoké i nízké specifity. Proto byl využit návrh sond v režimu „maximize specificity“. Při kontrole byl detekován nečtený úsek, který byl ještě delší než predikovaný. I v tomto případě je vhodné využít Sangerovo sekvenování pro určení sekvence dané nepokryté oblasti. Druhá exonová nepokrytá oblast genu SCN5A byla označena písmenem B (příloha č. 1f). Při návrhu sond zůstala tato oblast beze změny i při využití možnosti nižší specifity („balanced coverage“), proto byl finální návrh v režimu „maximize specifity“. Při kontrole bylo shledáno, že je oblast dostatečně čtena. Sangerovo sekvenování je doporučeno pro analýzu exonové oblasti genu SHROOM3 (příloha č. 1g). Tato nečtená oblast byla predikována jako nepokrytá při možnostech „maximize specifity“ i „balanced coverage“. V posledním případě u genu TBX20 (příloha č. 1h) byla predikována nepokrytá oblast v režimu „maximize specificity“. Při aplikaci „balanced coverage“ již předpovídána nebyla. Nicméně na doporučení firmy Agilent Technologies byla pro konečný návrh vybrána možnost „maximize specifity“, při které byly v dané oblasti zakresleny její predikované amplikony. Po kontrole bylo možno konstatovat, že daná oblast byla čtena dostačujícím počtem čtení.

4. 3. Výsledky protokolu HaloPlex, příprava a úprava knihovny na sekvenování Jedním z posledních kroků protokolu HaloPlex Target Enrichment System bylo zjištění hmotnostní (ng/l) a molární koncentrace (nmol/l) výsledných produktů metodou Agilent 2200 Tape Station. Dva příklady výstupů z této analýzy jsou zobrazeny níže (obrázek č. 5). První příklad (A) je vzorek s nejvyšší koncentrací (I. běh, index 7.). Druhým (B) je pak vzorek s nejnižší koncentrací po obohacení vzorku o cílové oblasti (II. běh, index 8.). U tohoto vzorku metoda HaloPlex selhala. Z toho důvodu nebylo možné daný vzorek dále analyzovat.

Intenzita (FU)

Velikost (bp)

Průměrná Koncentrace Podíl vybrané Od (bp) Do (bp) Molarita (nmol/l) velikost (bp) (ng/l) oblasti k celku (%) 175 626 329 12,3 61,8 90,54

Intenzita (FU)

Velikost (bp)

Průměrná Koncentrace Podíl vybrané Od (bp) Do (bp) Molarita (nmol/l) velikost (bp) (ng/l) oblasti k celku (%) 174 625 407 0,0368 0,139 7,10

Obrázek č. 5. Příklady výstupů analýzy 2200 TapeStation. Validace obohacení a kvantifikace cílových oblastí DNA. (A) vzorek s nejvyšší koncentrací DNA po provedení protokolu HaloPlex Target Enrichment System. (B) vzorek s nejnižší koncentrací DNA po provedení protokolu HaloPlex Target Enrichment System. Na elektroforetogramu tvoří osu (x) hodnoty velikosti DNA v bp, osa (y) popisuje hodnoty fluorescenčního signálu (fluorescenční jednotky, fluorescence units, FU). Píky popsané jako Lower a Upper jsou markery sloužící jako vnitřní reference k určení molekulární hmotnosti vzorku (www.chem.agilent.com/library/usermanuals/Public/G2964 90001_TapeStationPalpatine_USR_EN.pdf ). Tabulky umístěné pod elektroforetogramy shrnují údaje o cílové DNA mezi 175–625 bp.

Údaje získané z elektroforetické analýzy TapeStation byly stěžejní pro smíchání rovnoměrného množství jednotlivých vzorků. Tento postup vytvoření a následné úpravy knihovny popisují pro první běh dvě části tabulky č. 17, pro druhý běh dvě části tabulky č. 18.

Hmotnostní Molární Objem DNA k Doplnění Index koncentrace koncentrace ředění na 5,4 vodou na 6,0 (I. běh) DNA (ng/l) (nmol/l, nM) ng/l (l) * l

1 1,320 11,800 6,0 0,0 2 0,107 0,940 6,0 0,0 3 5,030 44,100 6,0 0,0 4 0,568 5,000 6,0 0,0 5 1,870 11,000 6,0 0,0 6 5,010 19,000 6,0 0,0 7 12,300 73,600 2,6 3,4 8 3,580 18,500 6,0 0,0 9 5,260 28,900 6,0 0,0 10 5,460 31,700 5,9 0,1 11 2,320 20,500 6,0 0,0 12 5,540 30,300 5,8 0,2 13 5,880 34,200 5,5 0,5 14 5,630 33,400 5,8 0,2 15 8,110 40,100 4,0 2,0 16 8,550 43,100 3,8 2,2 17 4,280 21,000 6,0 0,0 18 5,110 25,000 6,0 0,0 19 4,290 21,400 6,0 0,0 20 5,420 27,300 6,0 0,0 21 5,620 28,500 5,8 0,2 22 0,892 7,860 6,0 0,0 23 2,800 13,900 6,0 0,0

Průměrná hmotnostní koncentrace DNA vzorků (vzorky s indexem 1,2,4,22 nejsou započítány kvůli 5,4 ng/l nízkým hodnotám) Průměrná hmotnostní koncentrace DNA všech 4,6 ng/l vzorků Průměrná velikost knihovny 300 bp Přepočet 1 ng/l na nM 5,0 nM Přepočet 4,6 ng/l na nM 4,6 ng/l * 5,0 nM = 22,8 nM Naředění na 4nM knihovnu (objem 10 l) 1,8 l 22,8nM knihovny a 8,2 l vody Denaturace 4nM knihovny 5 l 4nM knihovny a 5 l 0,2N NaOH Příprava 20pM denaturované knihovny v 1mM 10 l denaturované DNA a 990 l pufru HT1 NaOH 360 l 20pM knihovny a 240 l pufru HT1 Ředění denaturované DNA na 12pM knihovnu (celý objem přenést do kazety s reagenciemi)

Tabulka č. 17. První běh mutační analýzy hodnoty hmotnostní a molární koncentrace cílových oblastí DNA jednotlivých vzorků, smíchání ekvimolárních množství vzorků do knihovny, její denaturace a ředění před sekvenováním. Poznámka (*): ze vzorku, jehož koncentrace byla menší než 5,4 ng/l, byl odebrán objem 6,0 l. Po naředění vzorku na koncentraci 5,4 ng/l, resp. odebrání neředěného vzorku, byly vzorky smíchány do jedné zkumavky po objemech 5,0 l. Tak vznikla knihovna, která byla dále ředěna na 4nM.

Hmotnostní Molární Objem DNA k Doplnění Index koncentrace koncentrace ředění na 2,2 vodou na 6,0 (II. běh) DNA (ng/l) (nmol/l, nM) ng/l (l) * l

1 0,557 3,130 6,0 0,0 2 0,328 1,530 6,0 0,0 3 1,060 5,630 6,0 0,0 4 1,270 6,450 6,0 0,0 5 0,262 1,150 6,0 0,0 6 0,995 5,330 6,0 0,0 7 2,540 12,400 5,2 0,8 8 0,036 0,137 6,0 0,0 9 3,070 16,200 4,3 1,7 10 1,360 6,860 6,0 0,0 11 1,100 5,900 6,0 0,0 12 0,041 0,158 6,0 0,0 13 2,340 11,900 5,6 0,4 14 1,940 9,280 6,0 0,0 15 6,470 31,400 2,0 4,0 16 3,100 15,000 4,3 1,7 17 1,110 5,740 6,0 0,0 18 1,650 7,950 6,0 0,0 19 0,909 4,780 6,0 0,0 20 2,440 12,000 5,4 0,6 21 2,970 14,400 4,4 1,6 22 1,430 7,140 6,0 0,0 23 4,160 20,3 3,2 2,8

Průměrná hmotnostní koncentrace DNA vzorků (vzorky s indexem 1, 2, 5, 8, 12 nejsou započítány 2,2 ng/l kvůli nízkým hodnotám) Průměrná hmotnostní koncentrace DNA všech 1,8 ng/l vzorků Průměrná velikost knihovny 300 bp Přepočet 1 ng/l na nM 5,0 nM Přepočet 1,8 ng/l na nM 1,8 ng/l * 5,0 nM = 8,9 nM Naředění na 4nM knihovnu (objem 10 l) 4,5 l 8,9nM knihovny a 5,5 l vody Denaturace 4nM knihovny 5 l 4nM knihovny a 5 l 0,2N NaOH Příprava 20pM denaturované knihovny v 1mM 10 l denaturované DNA a 990 l pufru HT1 NaOH 300 l 20pM knihovny a 300 l pufru HT1 Ředění denaturované DNA na 10pM knihovnu (celý objem přenést do kazety s reagenciemi)

Tabulka č. 18. Druhý běh mutační analýzy hodnoty hmotnostní a molární koncentrace cílových oblastí DNA jednotlivých vzorků, smíchání ekvimolárních množství vzorků do knihovny, její denaturace a ředění před sekvenováním. Poznámka (*): ze vzorku, jehož koncentrace byla menší než 2,2 ng/l, byl odebrán objem 6,0 l. Po naředění vzorku na koncentraci 2,2 ng/l, resp. odebrání neředěného vzorku, byly vzorky smíchány do jedné zkumavky po objemech 5,0 l. Tak vznikla knihovna, která byla dále ředěna na 4nM.

4. 4. Výsledné parametry kvality mutační analýzy Po provedení sekvenační analýzy pomocí přístroje MiSeq ® bylo dalším cílem zhodnocení její kvality. Program BaseSpace poskytl rozsáhlý zdroj informací o kvalitě obou sekvenačních běhů. Při kontrole kvality sekvenování bylo studováno více parametrů. Těmito parametry byly mj. „QScore Distribution“ (distribuce bazí na základě jejich skóre kvality), „% Reads Identified“ (podíl čtení přiřazených k jednotlivým vzorkům) a „Run Summary“ (tabulka se základními ukazateli o kvalitě sekvenování). Na obrázku č. 6 jsou zobrazeny distribuce skóre kvality („QScore Distribution“) prvního (A) a druhého (B) běhu sekvenování. Nastavený práh byl Q30, tj. 0,1% pravděpodobnost nesprávného nazvání baze (angl. chance of wrong base call), resp. pravděpodobnost zařazení jedné nesprávné baze z tisíce. Při použití kitu MiSeq Reagent Kit v2 (500cycle) a při čtení 2 ×250 bp je doporučeno, aby více než 75 % bazí mělo skóre kvality vyšší než Q30 (www.illumina.com, d). V případě nedodržení tohoto limitu je nutné při vyhodnocování jednotlivých variant k této skutečnosti přihlédnout. Ze snímku (obrázek č. 6) je patrné, že při prvním běhu celkem 74,0 % bazí mělo skóre kvality rovno či větší než je Q30. Znamená to tedy, že u 26,0 % bazí je

48 pravděpodobnost jejich nesprávného nazvání rovna nebo vyšší než 0,1 %. V druhém běhu mělo skóre kvality rovno či vyšší než Q30 pouze 69,1 % bazí.

Obrázek č. 6. Distribuce skóre kvality jednotlivých bazí při prvním (A) a druhém (B) běhu sekvenování.

Pomocí dalšího ukazatele zvaného „% Reads Identified (PF)“ byly získány procenta čtení přiřazených k jednotlivým indexům, resp. vzorkům. Grafické zobrazení tohoto je na obrázku č. 7. Přesné hodnoty procent čtení jednotlivých vzorků jsou vypsány v tabulce č. 19 (I. běh) a v tabulce č. 20 (II. běh). Již z grafického zobrazení je patrné, že v prvním běhu nebylo možné analyzovat vzorek č. 2, který byl čtený pouze v 0,12 % všech čtení. Tento vzorek byl proto zařazen do druhého běhu jako vzorek s indexem 1. Při druhém běhu nebylo možné vyhodnotit dva vzorky. Jednalo se o vzorek č. 8 (pouze 0,03 % všech čtení přiřazených tomuto vzorku) a č. 12 (0,17 %).

A B

Obrázek č. 7. Grafické zobrazení procent čtení přiřazených k jednotlivým indexům, resp. vzorkům („% Reads Identified (PF)“) v prvním (A) a druhém (B) běhu sekvenování. Parametr „% Reads Identified (PF)“ znamená podíl čtení přiřazených k jednotlivým vzorkům. Tato čtení vyhovují kontrole kvality čtení nastavené na přístroji MiSeq ®. (http://supportres.illumina.com/documents/documentation/system_documentation/miseq /miseqsystemuserguide15027617m.pdf). Při prvním běhu sekvenování byl celkový počet čtení („PF reads“) roven 20 051 020. V druhém běhu to bylo 20 098 264.

Dalším parametrem kvality mutační analýzy je hustota shluků DNA vytvořených na amplifikační destičce při můstkové amplifikaci vzorku. Ačkoliv byla pro první běh sekvenování připravena 12pM knihovna a pro běh druhý pak knihovna řidší (10pM), na hustotě shluků toto nebylo patrné. Při prvním běhu byla hustota shluků 1298 ± 21 K/mm 2 a při druhém běhu 1347 ± 24 K/mm 2. Průměrná a mediánová hloubka čtení cílových oblastí, která prošla kontrolou kvality čtení na přístroji MiSeq ®, a procento těchto oblastí pokrytých (čtených) alespoň 1, 5, 10, 20, 100, 500, 1000 čteními jsou pro jednotlivé vzorky vypsány v tabulkách č. 19 a 20. Grafické zobrazení procent oblastí čtených alespoň 20, 100 a 500 čteními lze nalézt dále (grafy č. 2 a 3). Výsledky analýzy vzorků č. 2 (I. běh), 8 (II. běh) a 12 (II. běh) nebyly studovány z důvodu nízké kvality sekvenování. V tabulce č. 21 byly vypočítány průměrné hodnoty vybraných parametrů bez zahrnutí těchto nevyhovujících vzorků. Pro oba běhy sekvenování byla délka čtení cílových oblastí DNA 251 bp a 8 bp pro čtení indexů.

Procenta čtení Průměrná Mediánová Procenta (%) cílových oblastí pokrytých nejméně: přiřazených hloubka hloubka Index ke vzorku čtení čtení (I. běh) (% Reads cílových cílových Identified) oblastí oblastí 1 5 10 20 100 500 1000 (%) čtením čteními čteními čteními čteními čteními čteními

1 3,05 310 275 99,33 99,23 99,04 98,94 96,63 69,81 31,35 2 0,12 0 0 27,12 2,50 0,10 0,00 0,00 0,00 0,00 3 5,43 542 483 99,33 99,33 99,33 99,33 98,37 86,83 62,88 4 3,78 296 244 99,33 99,23 99,23 99,23 95,19 64,52 32,79 5 2,06 153 135 99,42 99,13 99,04 98,75 91,63 32,79 8,27 6 4,5 499 419 99,42 99,33 99,23 99,04 97,69 80,77 54,13 7 3,35 355 251 99,33 99,23 99,13 98,65 91,25 61,35 40,19 8 5,12 493 434 99,42 99,33 99,33 99,23 97,98 84,13 57,60 9 5,82 485 414 99,33 99,33 99,23 99,23 97,6 80,77 56,92 10 7,35 751 595 99,33 99,23 99,13 99,13 98,17 84,9 68,17 11 5,16 499 440 99,33 99,33 99,33 99,13 98,08 85,29 58,85 12 4,48 435 359 99,52 99,33 99,23 99,13 96,63 75,87 51,54 13 4,7 482 387 99,33 99,23 99,13 99,13 96,44 76,35 54,42 14 5,24 516 413 99,33 99,23 99,13 99,13 97,12 77,98 56,83 15 4,36 450 377 99,42 99,33 99,23 99,13 96,92 76,83 53,94 16 5,4 513 394 99,42 99,23 99,23 99,13 96,63 75,58 56,83 17 4,02 401 362 99,42 99,33 99,33 99,23 97,79 79,33 47,4 18 5,67 544 482 99,42 99,33 99,33 99,23 98,27 86,73 62,21 19 4,55 471 403 99,42 99,33 99,23 99,04 97,31 81,63 53,56 20 6,09 600 541 99,42 99,33 99,33 99,23 98,37 89,52 68,08 21 4,54 466 411 99,42 99,33 99,23 98,94 97,5 82,02 56,25 22 0,97 76 60 99,04 98,46 97,79 96,06 75,48 9,71 3,65 23 2,87 295 253 99,42 99,13 98,94 98,75 95,67 66,73 29,42

Aritmetický průměr 419 354 96,23 95,03 94,84 94,64 91,60 69,98 46,32

Aritmetický průměr bez hodnot vzorku 438 370 99,37 99,24 99,14 98,95 95,76 73,16 48,42 s indexem 2

Tabulka č. 19. První běh mutační analýzy procenta čtení přiřazených ke vzorku, průměrná a mediánová hloubka čtení cílových oblastí a procenta těchto oblastí pokrytých (čtených) alespoň 1, 5, 10, 20, 100, 500, 1000 čteními. Zvýrazněný je vzorek č. 2, jehož sekvenování v prvním běhu neproběhlo úspěšně, a proto byl přidán do souboru vzorků pro druhý běh sekvenování. Tam byl označen indexem č. 1.

Procenta čtení Průměrná Mediánová Procenta (%) cílových oblastí pokrytých nejméně: přiřazených hloubka hloubka Index ke vzorku čtení čtení (II. běh) (% Reads cílových cílových Identified) oblastí oblastí 1 5 10 20 100 500 1000 (%) čtením čteními čteními čteními čteními čteními čteními

1 4,16 366 285 99,23 99,23 99,13 98,94 95,77 69,62 42,88 2 2,56 220 186 99,33 99,04 98,85 98,65 94,04 54,42 18,75 3 5,66 519 441 99,33 99,33 99,23 99,13 97,69 80,58 61,44 4 5,82 545 455 99,33 99,33 99,33 99,13 97,98 83,46 62,5 5 1,40 91 65 99,13 98,56 97,6 93,56 69,62 16,63 3,56 6 2,74 254 216 99,33 99,13 99,04 98,75 94,81 60,58 25,58 7 5,73 500 413 99,33 99,33 99,23 99,13 97,02 79,04 57,69 8 0,03 2 2 83,08 50,19 27,88 7,79 0,29 0,00 0,00 9 7,47 725 553 99,42 99,33 99,23 99,13 97,5 81,63 66,35 10 4,42 443 333 99,42 99,33 99,23 98,94 94,52 69,52 51,25 11 8,25 743 606 99,52 99,33 99,33 99,23 98,27 88,17 72,69 12 0,17 6 2 87,88 69,33 59,04 42,31 5,38 0,10 0,00 13 7,22 716 625 99,52 99,33 99,23 99,23 97,98 88,75 73,65 14 3,89 345 290 99,42 99,13 99,13 98,94 96,73 71,44 40,29 15 3,92 374 276 99,42 99,13 99,13 99,04 93,65 65,67 43,46 16 4,22 379 310 99,33 99,33 99,33 99,04 96,35 71,92 44,71 17 3,42 282 237 99,42 99,33 99,23 98,85 96,25 64,23 30,48 18 6,40 316 270 99,33 99,23 99,13 98,94 96,25 69,04 36,92 19 3,08 274 226 99,42 99,33 99,04 98,75 95,67 61,92 28,56 20 4,61 425 356 99,33 99,33 99,23 99,23 97,5 76,73 52,02 21 5,58 544 475 99,42 99,33 99,33 99,33 98,37 86,73 64,04 22 3,42 275 220 99,33 99,13 99,13 98,65 93,65 60,87 30,29 23 4,46 437 383 99,42 99,23 99,23 99,23 97,6 81,73 52,79

Aritmetický průměr 382 314 98,16 95,80 94,27 92,34 87,08 64,47 41,73

Aritmetický průměr bez hodnot vzorků 418 344 99,37 99,23 99,11 98,75 95,11 70,60 45,71 s indexem 8 a 12

Tabulka č. 20. Druhý běh mutační analýzy procenta čtení přiřazených ke vzorku, průměrná a mediánová hloubka čtení cílových oblastí a procenta těchto oblastí pokrytých (čtených) alespoň 1, 5, 10, 20, 100, 500, 1000 čteními. Zvýrazněny jsou vzorky č. 8 a 12, jejichž sekvenování neproběhlo úspěšně.

100

50 (%) 40

30 Procenta cílových oblastí oblastí cílových Procenta 20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Vzorky (I. běh)

Procento cílových oblastí pokrytých nejméně 20 čteními (%) Procento cílových oblastí pokrytých nejméně 100 čteními (%) Procento cílových oblastí pokrytých nejméně 500 čteními (%)

Graf č. 2. První běh mutační analýzy procenta cílových oblastí pokrytých alespoň 20, 100 a 500 čteními.

100

50 (%)

30 Procenta cílových oblastí oblastí cílových Procenta 20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Vzorky (II. běh)

Graf č. 3. Druhý běh mutační analýzy procenta cílových oblastí pokrytých alespoň 20, 100 a 500 čteními.

Procenta (%) cílových oblastí pokrytých nejméně: Průměrná Mediánová hloubka čtení hloubka čtení Běh cílových cílových oblastí oblastí 1 5 10 20 100 500 1000 čtením čteními čteními čteními čteními čteními čteními

I. běh bez hodnot vzorku 438 370 99,37 99,24 99,14 98,95 95,76 73,16 48,42 č. 2

II. běh bez hodnot vzorků 418 344 99,37 99,23 99,11 98,75 95,11 70,6 45,71 č. 8 a 12

Aritmetický 428 357 99,37 99,24 99,13 98,85 95,44 71,88 47,07 průměr

Tabulka č. 21. Průměrné hodnoty vybraných parametrů kvality všech vzorků mutační analýzy s výjimkou vzorku č. 2 (I. běh), 8 (II. běh) a 12 (II. běh). Průměrná a mediánová hloubka čtení cílových oblastí a procenta těchto oblastí pokrytých (čtených) alespoň 1, 5, 10, 20, 100, 500, 1000 čteními.

4. 5. Varianty DNA nalezené mutační analýzou Cílem mutační analýzy 59 genů u vzorků s VCC bylo nalézt a následně charakterizovat varianty, které by dané VCC způsobovaly.

4. 5. 1. Analyzované varianty DNA Mutační analýza byla provedena ve dvou bězích. Bližší studium výsledků bylo možno u vzorků celkem 42 plodů. Nicméně studium variant DNA u vzorku č. 5 (I. běh) není relevantní z toho důvodu, že u tohoto plodu byl již v minulosti potvrzen DiGeorgeův syndrom. Proto byly studovány výsledky 41 plodů. Po několikeré filtraci všech nalezených variant DNA byly změny dále analyzovány a tříděny do tříd dle svého předpokládaného klinického významu (viz kapitola 3. 2. 7. Vyhodnocení nalezených variant DNA). Celkem bylo u 41 plodů po filtraci studováno 1076 variant DNA, které představovaly 139 různých typů variant. Jim přiřazenou třídu klinického významu a procentuální rozdělení těchto tříd lze vidět na grafu č. 4.

Patogenní 1% Potenciálně Benigní patogenní Benigní 4% 31%

Potenciálně benigní

VOUS

Potenciálně patogenní

Patogenní VOUS Potenciálně benigní 47% 17%

Graf č. 4. Klinický význam 1 39 typů variant DNA nalezených mutační analýzou 59 genů asociovaných s VCC u 4 1 plodů. Zkratka VOUS značí varianty s nejasným významem.

Průměrné počty variant ve třídách popisující ch jejich význam jsou spolu se směrodatnými odchylkami znázorněny dále (graf č. 5). Zastoupení variant DNA u jednotlivých plodů je shrnuto v tabulce č. 22.

Graf č. 5. Průměrné počty a směrodatné odchylky variant v jednotlivých třídách popisujících jejich klinický význam.

Počet Počet Počet Počet Počet Počet Počet potenciálně potenciálně všech filtovaných benigních variant patogenních benigních patogenních Běh Index variant variant variant VOUS variant variant variant daného daného daného daného daného daného daného vzorku vzorku vzorku vzorku vzorku vzorku vzorku 1 412 27 24 2 1 0 0 3 427 30 23 3 4 0 0 4 347 23 23 0 0 0 0 6 438 27 23 0 4 0 0 7 330 29 23 4 2 0 0 8 423 25 19 2 1 3 0 9 420 26 24 1 1 0 0 10 405 24 21 2 1 0 0 11 460 24 22 2 0 0 0 12 387 27 22 2 3 0 0 I. 13 353 25 23 1 1 0 0 běh 14 337 27 24 2 1 0 0 15 440 28 22 3 3 0 0 16 375 27 22 3 1 0 1 17 358 30 22 1 6 1 0 18 454 25 20 3 2 0 0 19 329 22 22 0 0 0 0 20 415 29 23 3 3 0 0 21 424 28 23 1 4 0 0 22 295 23 19 3 1 0 0 23 378 27 26 1 0 0 0 1 413 28 25 3 0 0 0 3 377 30 25 2 2 1 0 4 356 21 19 0 2 0 0 5 259 22 19 1 2 0 0 6 388 31 25 4 2 0 0 7 425 22 20 2 0 0 0 9 441 25 21 4 0 0 0 10 336 24 19 4 1 0 0 11 467 31 28 2 1 0 0 II. 13 370 23 19 3 1 0 0 běh 14 389 27 23 2 1 1 0 15 372 28 21 3 4 0 0 16 370 30 22 2 6 0 0 17 418 26 19 3 4 0 0 18 419 31 27 2 2 0 0 19 340 26 21 4 1 0 0 20 324 22 19 0 3 0 0 21 418 31 26 3 2 0 0 22 354 22 20 1 1 0 0 23 353 23 20 3 0 0 0 Aritmetický 385,27 26,24 22,15 2,12 1,80 N/A N/A průměr Směrodatná 46,13 2,96 2,37 1,19 1,57 N/A N/A odchylka

Tabulka č. 22. Počet variant DNA 41 vzorků a jejich predikovaný klinický význam. Ve sloupci označeném „Počet všech variant daného vzorku“ jsou uvedeny počty všech detekovaných variant před aplikací filtrování dle kapitoly 3. 2. 7. Vyhodnocení nalezených variant DNA. Označení N/A (not applicable) znamená neuvedenou hodnotu z důvodu nízkých čísel. Uvedeny nejsou hodnoty následujících vzorků: č. 2 (I. běh) nulové čtení cílových oblastí (analýza opakována č. 1, II. běh); č. 5 (I. běh) pozitivní DiGeorgeův syndrom; č. 2 (II. běh) experiment s poloviční vstupní koncentrací DNA;

č. 8 (II. běh) nulové čtení cílových oblastí, č. 12 (II. běh) nulové čtení cílových oblastí.

4. 5. 2. Varianty potenciálně patogenní a patogenní Potenciálně patogenní, resp. patogenní, varianty DNA byly detekovány u pěti plodů s VCC (tabulka č. 23). Těchto pět plodů představuje 12,2 % ze 41 plodů. Patogenní mutace p.Thr223Met v genu TBX5 je variantou nalezenou u plodu č. 16 z prvního běhu analýzy (dále viz kapitole 4. 7. Kazuistika HoltovéOramův syndrom).

Označení Frekvence varianty Zápis Index Třída Gen Chrom. Koordináta v populaci v databázi varianty (%) dbSNP (NCBI) c.985C>T CRELD1 3 9985136 0,05 rs28942091 p.Arg329Cys 8 3 potenciálně c.7267C>T FLNA X 153578465 0,00 rs200198847 (I. běh) patogenní varianty p.Pro2423Ser c.1579C>T FLNA X 153593616 0,00 rs202029322 p.Arg527Cys 17 1 potenciálně c.56C>G GATA5 20 61050522 0,00 rs200383755 (I. běh) patogenní varianta p.Ser19Trp 3 1 potenciálně c.3286G>T MYH7 14 23890217 0,00 rs45478699 (II. běh) patogenní varianta p.Asp1096Tyr 14 1 potenciálně c.2686G>A MYBPC3 11 47357479 0,32 rs35078470 (II. běh) patogenní varianta p.Val896Met 16 1 patogenní c.668C>T TBX5 12 114823368 0,00 (I. běh) varianta p.Thr223Met

Tabulka č. 23. Potenciálně patogenní, resp. patogenní, varianty nalezeny mutační analýzou u pěti plodů s VCC. Údaje získány analýzou a studiem dat z mutačního vyšetřování vzorků. Informace v posledním sloupci tabulky získány z databáze dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp).

4. 5. 2. 1. Potenciálně patogenní varianty plodu č. 8 (I. běh) CRELD1, FLNA Plodu č. 8 mužského pohlaví z prvního běhu mutační analýzy byl diagnostikován syndrom hypoplastického levého srdce, kde jedním z příznaků byla také atrézie aorty. Žádné jiné abnormality nalezeny nebyly. Matka plodu neuvádí žádné své zdravotní komplikace. U tohoto plodu byly detekovány celkem tři potenciálně patogenní varianty, a to jedna v genu CRELD1 a dvě v genu FLNA . Mutace v heterozygotním stavu v genu CRELD1 (c.985C>T; p.Arg329Cys; p.R329C) byla predikčním programem SIFT označena jako tolerovaná (tolerated), nicméně programem PolyPhen jako pravděpodobně patogenní (probably damaging). Dle databáze dbSNP (NCBI) se jedná o rizikový faktor (risk factor)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). Varianta p.Arg329Cys se nachází v konzervovaném místě genu. Tato varianta byla v minulosti charakterizována v souvislosti s rozvojem VCC, konkrétně defektem atrioventrikulárního septa (AVSD), u lidí s i bez Downova syndromu (Ackerman et al. , 2012). Robinson et al. (2003) testovali gen CRELD1 u pacientů s AVSD bez trizomie 21. chromozomu. Mutaci p.Arg329Cys detekovali u jedince s izolovaným částečným AVSD. Po provedení segregační analýzy nalezli danou variantu také u otce, bratra a sestry pacienta. Nikdo z nich však, podle jejich slov, netrpěl VCC. U otce a sestry bylo provedeno echokardiografické vyšetření potvrzující zdravé srdce. V souboru kontrol mutace nalezena nebyla. Autoři článku se domnívají, že jejich pozorování mohou být v souladu s neúplnou penetrancí. O tři roky později byla vydána publikace, která souhlasí s výše napsanými závěry o této mutaci (Maslen et al. , 2006). Tato mutace v genu CRELD1 je považována za faktor zvyšující riziko vývoje VCC než za přímou příčinu těchto vad (Ackerman et al. , 2012). U plodu č. 8 (I. běh) byly dále detekovány potenciálně patogenní varianty c.7267C>T (p.Pro2423Ser; p.P2423S) a c.1579C>T (p.Arg527Cys; p.R527C) v genu FLNA . Varianta p.Pro2423Ser byla programem SureCall charakterizována jako nepatogenní (SIFT tolerated, PolyPhen benign, klinický význam v dbSNP není uveden). Na druhou stranu pro variantu p.Arg527Cys je předpovídán spíše patogenní význam (SIFT deleterious, PolyPhen probably damaging, dbSNP neuvedeno). Jedinou dostupnou publikací popisující tuto detekovanou komplexní mutantní alelu (R527C/P2423S) byl krátký článek nazvaný Calpain as a therapeutic target in inherited aortic aneurysm: lessons from rare mendelian disorders, který byl publikovaný na vědeckém symposiu ve Warrentonu roku 2010 (Dietz et al. , 2010). V tomto článku byla popsána detekce stejné komplexní alely, a to u pacienta mužského pohlaví s Fallotovou tetralogií a aortálním aneurysmem, tj. výdutí aorty (TOF/AAA). Tato komplexní alela genu FLNA je asociována s významnou redukcí délky proteinu filaminu A. Díky elektronické komunikaci s autorem článku byly získány podrobnější informace o daném pacientovi (Dietz H., elektronická komunikace). Jednalo se o muže italského původu trpícího TOF a vážnou dysplázií mitrální chlopně. Aortální aneurysma se u něho objevilo několik let po úspěšné operaci TOF. Jeho dalšími projevy, které byly v minulosti spojovány s deficiencí filaminu A, byly krátké střevo, trombocytopenie s megakaryocytózou a epileptické záchvaty. U matky pacienta byly dané dvě varianty genu FLNA detekovány v heterozygotním stavu. Tato žena má také záchvaty

58 s periventrikulární heterotopií. Periventrikulární heterotopie šedé hmoty je definována přítomností shluků neuronů na neobvyklém místě (www.omim.org, #300049). Příznaky této Xvázané dominantní nemoci jsou mimo jiné právě epilepsie a defekty v kardiovaskulárním systému, jako jsou patent ductus arteriosus či rozšíření aorty. Žádné z těchto příznaků nebyly v případě rodiny plodu č. 8 (I. běh) popsány. Různé změny v genu FLNA jsou spojovány i s dalšími zdravotními komplikacemi (např. Xvázanou dysplázií srdečních chlopní nebo otopalatodigitálním syndromem), nejen s periventrikulární heterotopií (www.omim.org, #300017). Nicméně mutace R527C/P2423S a její bližší charakterizace zatím nebyly, kromě daného krátkého článku, publikovány.

4. 5. 2. 2. Potenciálně patogenní varianta plodu č. 17 (I. běh) GATA5 Plod označen indexem 17 byl vyšetřován v prvním běhu sekvenování. Jednalo se o plod ženského pohlaví s defektem komorového septa (VSD). Z 30 studovaných variant DNA se potenciálně patogenní zdá varianta genu GATA5 (c.56C>G; p.Ser19Trp; p.S19W). Této mutaci byl predikčními aplikacemi přidělen patogenní potenciál (SIFT deleterious, PolyPhen probably damaging, klinický význam v dbSNP není uveden). Byly nalezeny dvě studie podporující možnou patogenitu této mutace (Francis et al. , 2014; Padang et al. , 2012). Oba týmy pracovaly se vzorky pacientů trpících bikuspidální aortální chlopní (BAV). Ačkoliv se práce z roku 2014 opírá o asociaci této varianty s patogenitou publikovanou v článku z roku 2012, přesvědčivý důkaz o jasném patogenním významu chybí. Padang et al. (2012) detekovali mutaci p.Ser19Trp v genu GATA5 u muže s BAV. Daná pozice je mezi obratlovci pozicí konzervovanou. Tato varianta byla ovšem nalezená také u dvou z 320 kontrolních alel. Autoři přiznali, že mnoho z kontrolních subjektů nepodstoupilo echokardiografické vyšetření k vyloučení BAV. Závěrem konstatovali, že vzácné nesynonymní varianty v GATA5 jsou důležitými modifikačními faktory v patogenezi BAV, a že je nutno provést další analýzy k posouzení funkčních důsledků těchto variant.

4. 5. 2. 3. Potenciálně patogenní varianta plodu č. 3 (II. běh) MYH7 Plod s indexem č. 3 s Fallotovou tetralogií byl vyšetřován v druhém běhu mutační analýzy. Jednalo se o plod s karyotypem 46,XX. Za potenciálně patogenní

59 variantu byla označena mutace v genu MYH7 , a to c.3286G>T (p.Asp1096Tyr; p.D1096Y). Této variantě byl programy SIFT i PolyPhen přidělen nebezpečný potenciál (deleterious, probably damaging). Původní záznam v databázi dbSNP označující tuto alelu jako alelu s neznámým významem byl posléze změněn na záznam „With pathogenic allele“. Proto byla daná varianta překlasifikována ze třídy VOUS do skupiny potenciálně patogenních variant. V databázi ClinVar (NCBI) existují dva zápisy nahrané dvěmi laboratořemi (Gene Dx, Maryland, USA; Laboratory for Molecular Medicine, Massachusetts, USA). Oba zápisy se shodují na pravděpodobně patogenním potenciálu této mutace. Jejich tvrzení se opírá o článek z roku 2008, ve kterém autoři nalezli danou mutaci u dvou pacientů s idiopatickou, resp. familiární dilatační kardiomyopatií a tuto mutaci označili za „možná asociovanou s nemocí“ (Hershberger et al., 2008). U kontrolního souboru 253 subjektů nebyla tato mutace detekována. Pozice mutace byla shledána konzervovanou. V článku nebyly uvedené žádné další údaje o pacientech. Pro potvrzení významu této varianty bude nutno provést další analýzy, stejně jako je tomu i u jiných nalezených variant DNA.

4. 5. 2. 4. Potenciálně patogenní varianta plodu č. 14 (II. běh) MYBPC3 Plod č. 14 ženského pohlaví z druhého běhu sekvenování trpěl stenózou plicnice. Detekovaná varianta c.2686G>A (p.Val896Met; p.V896M) v genu MYBPC3 byla u daného plodu označena za potenciálně patogenní. Závěry publikací a databází nebyly vždy jednomyslné. Již program SIFT označil tuto variantu za nebezpečnou (deleterious), zatímco PolyPhen za benigní (benign). Databáze Ensembl přidělil pravděpodobně benigní význam, stejně jako dbSNP. Veškeré dostupné publikace popisovaly tuto mutaci v rámci studie hypertrofické kardiomyopatie, tj. nemoci srdečních sarkomer projevující se hypertrofií srdečního svalu. Rizikem pro nositele patogenních mutací je srdeční selhání a náhlá srdeční smrt (MoolmanSmook et al. , 1999). Poprvé byla zde popisovaná mutace nalezena v roce 1999 u pacienta s hypertrofickou kardiomyopatií (MoolmanSmook et al. , 1999). Segregaci této mutované alely však nebylo možné v rodině probanda sledovat. Díky výskytu této varianty v konzervované pozici a díky její absenci u stočlenného kontrolního souboru byla označena za mutaci patogenní. V další studii byla tato mutace popsána u rodiny bez historie hypertrofické kardiomyopatie (Jääskeläinen et al. , 2002). Proband, jedinec trpící hypertrofickou

60 kardiomyopatií, byl heterozygotním nositelem této mutace stejně jako jeho nepostižený bratr. Jejich zdravá matka byla homozygotní a navíc tuto variantu mělo pět zdravých kontrolních subjektů v heterozygotní sestavě. Autoři práce se přiklonili k tomu, že se jedná o neutrální polymorfizmus, definitivní závěr o této variantě však nebyli schopni učinit s ohledem na dřívější závěry MoolmanSmook et al. (1999). Na stranu Jääskeläinen et al. (2002) se přiklonil švédský tým (Mörner et al. , 2003). Heterozygotní mutaci p.Val896Met nalezli u ženy s hypertrofickou kardiomyopatií, ale také u tří zdravých kontrolních jedinců. Pacientce byla detekována ještě jedna mutace, a to p.Glu924Lys v genu MYH7 , která nebyla nalezena u kontrolního souboru. Pozice této mutace je více konzervovaná nežli pozice mutace p.Val896Met. Autoři práce považují změnu p.Val896Met v MYBPC3 za polymorfizmus, zatímco p.Glu924Lys v MYH7 za pravděpodobnější příčinu kardiomyopatie u dané pacientky. Posléze byla vyřčena domněnka, že by varianta c.2686G>A (p.Val896Met; p.V896M) v genu MYBPC3 mohla být variantou modifikátorového genu, tj. genu genetického pozadí, nikoliv příčinnou mutací (Richard et al. , 2003). Také Keller et al. (2004) se přiklonili k tomu, že varianta p.Val896Met může fungovat jako modifikátor exprese fenotypu. Čínští autoři naopak publikovali závěry podporující možnost patogenity zde diskutované varianty v genu MYBPC3 (Wang et al. , 2010). U sta kontrolních jedinců tato změna nalezena nebyla. Mutace byla detekována ve dvou rodinách s kardiomyopatií. Tato varianta DNA s nemocí segregovala. Jen jeden člen rodiny byl označen za zdravého nositele mutantní alely. Jednalo se teprve o patnáctiletého chlapce, u něhož je proto nutné dlouhodobé shledování. Jak lze vidět, názory na klinický význam varianty c.2686G>A (p.Val896Met; p.V896M) genu MYBPC3 nejsou jednoznačné. Některými vědci je považována za patogenní, jinými pak za možné genetické pozadí, jež může přispívat či potlačovat projev jiného genu. U daného plodu (II. běh; index č. 14) bylo blíže studováno celkem 27 variant DNA, z toho jedna byla označena za potenciálně patogenní (p.Val896Met MYBPC3 ) a jedna za variantu VOUS. Tou je změna c.247G>T (p.Gly83Trp) v genu HAND1 (koordináta chr.5:153857322, označení rs201302313). Program SIFT ji označil za nebezpečnou (deleterious), PolyPhen za pravděpodobně škodlivou (probably damaging). Jiné záznamy o této variantě nejsou dostupné.

4. 5. 3. Varianty nejasného významu V předešlé kapitole (4. 5. 2. Varianty potenciálně patogenní a patogenní) byly blíže specifikovány změny na úrovni DNA, které byly zařazeny do třídy potenciálně patogenních variant. Ačkoliv u ostatních testovaných plodů nebyla žádná varianta označena tímto termínem, u některých z nich bylo možné vybrat varianty ze třídy VOUS, které jsou prioritními kandidáty pro další analýzu (tabulka č. 24). V budoucnu bude doporučeno začít s validací a bližším zkoumáním právě těchto vytipovaných variant, popř. provést segregační analýzy mutace s VCC v daných rodinách.

Označení varianty Běh Index Gen Chrom. Koordináta Zápis varianty v databázi Pozn. dbSNP (NCBI) c.7223T>A 3 NOTCH2 1 120458122 rs35586704 p.Leu2408His c.1941G>C 6 MYOCD 17 12656546 rs28730825 p.Gln647His c.1138G>A 9 MYH6 14 23871676 p.Glu380Lys c.1318G>A 12 IRX4 5 1878325 rs201914951 p.Asp440Asn

15 MYH6 14 23855836 c.46514C>A I. běh c.690_691delTCinsC 18 SMAD6 15 66996286 p.Arg231AlafsTer11 c.132_134delCCA Valido CITED2 6 139694962 p.His44del váno 20 c.818G>C MYH6 14 23872637 p.Arg273Pro c.4625G>A MYH11 16 15814883 rs137934837 p.Arg1542Gln 21 c.1429G>C MYBPC3 11 47364409 p.Val477Leu c.299C>T 5 MYH6 14 23874882 p.Ala100Val c.5177G>T 6 MYH1 17 10398627 rs138994893 p.Ser1726Ile c.5192_5196delAGATG Valido 10 MYH6 14 23854220 p.Lys1731ArgfsTer61 váno c.1966A>C 11 MYOCD 17 12656571 rs201621132 p.Asn656His II. 13 MYBPC3 11 47368587 c.9067G>T běh c.247G>T 14 HAND1 5 153857322 rs201302313 p.Gly83Trp c.8A>G GATA5 20 61050570 rs113068438 p.Gln3Arg c.1855G>A 15 MYBPC3 11 47362731 rs200352299 p.Glu619Lys c.2818T>C MYOCD 17 12666818 p.Trp940Arg

Označení varianty Běh Index Gen Chrom. Koordináta Zápis varianty v databázi Pozn. dbSNP (NCBI) c.421C>G NKX2-5 5 172660126 p.Pro141Ala c.1210A>T SMAD6 15 67073592 p.Asn404Tyr 16 c.214C>T LEFTY2 1 226128627 p.Arg72Cys II. c.4472C>G běh MYH7 14 23886409 rs3729823 p.Ser1491Cys c.1303T>C 17 MYH1 17 10415269 rs117790102 p.Tyr435His c.608_613delGCGGCA Valido 18 CITED2 6 139694483 p.Ser203_Gly204del váno c.4136C>T 20 MYH6 14 23858107 rs145611185 p.Thr1379Met

Tabulka č. 24. Varianty nejasného významu představující prioritní kandidáty pro další analýzy u vybraných plodů. Poznámka „Validováno“ znamená, že byla provedena validace dané varianty Sangerovou metodou sekvenování (viz kapitola 4. 6. Validované vybrané varianty DNA).

4. 5. 4. Varianty u vzorků s rodinnou anamnézou Celkem deset plodů ze souboru má uvedenou pozitivní rodinnou anamnézu na výskyt VCC. V tabulce č. 25 je uvedeno devět z nich, desátým je plod č. 16 (I. běh) s detekovanou patogenní variantou (viz kapitola 4. 7. Kazuistika HoltovéOramův syndrom). Po analýze genů asociovaných s VCC bylo možno u čtyř z těchto devíti plodů identifikovat variantu VOUS, která by mohla být kauzální. K ověření těchto hypotéz bude potřeba provést další analýzy, ať už validaci dané mutace u plodu či vyšetření DNA dalších členů dané rodiny.

Varianta Evidence susp. kauzality Typ Počet VOUS z Běh Index Rodinná anamnéza varianty VOUS z tabulky VCC variant tabulky č. 24 č. 24

Rodina otce plodu bratr matky Vícero zemřel ve třiceti letech na VCC, dále 4 23 Ne VCC předpokládaná VCC u tety, která také zemřela v osmnácti letech

SIFT (deleterious); Rodina otce plodu syn sestřenice 9 VSD 26 Ano PolyPhen má VCC I. (possibly damaging) běh Rodina otce plodu sestra matky 10 AS měla tři děti, první zemřelo ve třech 24 Ne letech na VCC

Rodina matky plodu paternální Vícero 11 bratranec zemřel devátý den po 24 Ne VCC narození na VCC

Varianta Evidence susp. kauzality Typ Počet VOUS z Běh Index Rodinná anamnéza varianty VOUS z tabulky VCC variant tabulky č. 24 č. 24

Varianta I. 15 VSD Otec plodu TOF 28 Ano v sestřihové oblasti běh (splice region variant)

Matka plodu dvakrát umělé SIFT (deleterious); 5 HLH přerušení těhotenství pro VCC, 22 Ano PolyPhen také jeden spontánní abort (possibly damaging)

Rodina matky plodu matka otce zemřela v 35 letech po operaci srdce, pravděpodobně měla vadu SIFT (deleterious); 17 PTA chlopně, rodina otce plodu bratr 26 Ano PolyPhen dědy zemřel ve 25 letech (possibly damaging) II. pravděpodobně na kardiologické běh onemocnění

Rodina matky plodu matka Vícero 19 operována na ASD, matka plodu 26 Ne VCC léčena pro tachykardii

Matka plodu další plod z roku 2011 dvojvýtoková pravá 21 TOF 31 Ne komora, transpozice velkých tepen, stenóza plicnice

Tabulka č. 25. Plody s rodinným výskytem VCC, počet blíže studovaných variant a uvedení výskytu, resp. absence, varianty varianty VOUS z tabulky č. 24. Zvýrazněné řádky značí případy, kdy VCC trpí jedinec, který je v nejbližším příbuzenském vztahu (rodič, sourozenec) s testovaným plodem.

4. 5. 5. Experiment s poloviční vstupní koncentrací DNA U jednoho testovaného plodu (I. běh, index 20.; II. běh, index 2.) byla provedena mutační analýza jeho DNA v obou bězích. Důvodem byla snaha zjistit, zda se budou výsledné varianty lišit při použití poloviční vstupní koncentraci vzorku. Před zahájením protokolu HaloPlex Target Enrichment System byla proto při druhém běhu analýzy genomová DNA plodu naředěna na koncentraci 2,5 ng/l, nikoliv na 5,0 ng/l, což je požadovaná vstupní koncentrace vzorku. Výsledek tohoto experimentu shrnuje tabulka č. 26. Graficky jsou zobrazena procenta oblastí čtených alespoň 20, 100 a 500 čteními (graf č. 6). Při analýze v prvním běhu se standardní vstupní koncentrací DNA bylo před filtrací na frekvenci čtení alternativních alel nalezeno 34 variant. Pět z nich však nebylo blíže studováno, jelikož jejich frekvence čtění byly nižší než 20 % (10,5; 11,2; 11,5; 15,7; 16,8 %). Jako takové je lze považovat za artefakt, protože se nachází v homopolymerní oblasti DNA. Blíže charakterizováno tedy bylo 29 variant DNA. Ty byly stejné jako ty, které byly detekovány při druhém běhu s poloviční koncentrací DNA.

Počet variant Procento (%) cílových oblastí Počet variant DNA bez Průměrná pokrytých nejméně: DNA po filtraci Vstupní filtrace na min. hloubka čtení na min. 20% Index koncentrace 20% frekvenci cílových frekvenci čtení (ng/l) čtení oblastí 20 100 500 alternativní alternativní čteními čteními čteními alely alely 20 5,0 600 99,23 98,37 89,52 34 29 (I. běh) 2 2,5 220 98,65 94,04 54,42 29 29 (II. běh)

Tabulka č. 26. Výsledek experimentu s poloviční (2,5ng/l) vstupní koncentrací vzorku (I. běh, index 20.; II. běh, index 2.).

100 90 80 70 Procenta cílových 60 oblastí pokrytých nejméně 20, 100 50 nebo 500 čteními 40 (%) 30 20 10 0 Koncentrace 5 ng/l Koncentrace 2,5 ng/l

Vzorky

Procento cílových oblastí pokrytých nejméně 20 čteními (%)

Procento cílových oblastí pokrytých nejméně 100 čteními (%)

Procento cílových oblastí pokrytých nejméně 500 čteními (%)

Graf č. 6. Výsledek experimentu s poloviční (2,5ng/l) vstupní koncentrací vzorku (I. běh, index 20.; II. běh, index 2.). Procenta cílových oblastí pokrytých alespoň 20, 100 a 500 čteními.

Vzhledem k tomu, že byl tento experiment s množstvím vstupní DNA proveden pouze jedenkrát, žádné obecné závěry nelze vyvodit.

4. 5. 6. Experiment se vzorkem plodu s DiGeorgeovým syndromem Pro vyzkoušení jedné z možností programu SureCall (www.genomics.agilent.com, b) byl do testovaného souboru přidán plod (index 5., I. běh) trpící VSD a PA. Metodou MLPA byla již v minulosti u tohoto plodu potvrzena diagnóza DiGeorgeova syndromu způsobená delecí 22q11 v rozsahu 2,19 Mbp.

Pro detekci CNV byla v programu SureCall vybrána možnost párové analýzy (pair analysis). Jako referenční vzorky byly vybrány vzorky 11 plodů, u kterých nebyl před mutační analýzou DiGeorgeův syndrom potvrzen. Z výsledků bylo možné potvrdit CNV ve formě delece na 22. chromozomu. Nicméně byl potvrzen předpoklad, že k detekci CNV je nutné jako referenční vzorky vybírat ty s vysokou kvalitou čtení.

4. 6. Validované vybrané varianty DNA Ze všech nalezených variant DNA byly z časových důvodů validovány metodou Sangerova sekvenování pouze čtyři z nich (tabulka č. 27). Jako první varianta, kterou bylo nutno po její detekci mutační analýzou ověřit, byla vybrána patogenní varianta v genu TBX5 (c.668C>T; p.Thr223Met; p.T223M). O této kazuistice bude pojednáno dále (kapitola 4. 7. Kazuistika HoltovéOramův syndrom). K ověření byly vybrány také tři další varianty DNA. Dvě z nich byly programem SureCall označeny za inframe delece, jedna varianta za frameshift mutaci.

Index Třída Gen Koordináta Zápis varianty (SureCall)

16 c.668C>T Patogenní TBX5 114823368 (I. běh) p.Thr223Met

20 c.132_134delCCA VOUS CITED2 139694962 (I. běh) p.His44del

10 c.5192_5196delAGATG VOUS MYH6 23854220 (II. běh) p.Lys1731ArgfsTer61

18 c.608_613delGCGGCA VOUS CITED2 139694483 (II. běh) p.Ser203_Gly204del

Tabulka č. 27. Validované varianty DNA metodou Sangerova sekvenování.

V následující tabulce jsou vlastnosti příslušných primerů, které sloužily k amplifikaci daných oblastí DNA (tabulka č. 28).

Sekvence přímého a zpětného Teplota Délka Obsah GC Index Validovaná varianta primeru tání produktu (%) (od 5´k 3´konci) (Tm, °C) (bp)

AGGCTGCATTTCCATGATATTTATT 53,3 32,0 16 TBX5 292 (I. běh) p.Thr223Met CAGGAAGGCTGGTGGAGG 58,0 66,7

CGCGGGTCTCATTATCTGCC 58,2 60,0 20 CITED2 345 (I. běh) p.His44del GGGACCCATGAACTGGGAGT 59,1 60,0

TGGAGAAAGGGTATGAAATCAGGT 55,8 41,7 10 MYH6 386 (II. běh) p.Lys1731ArgfsTer61 GGAGAGAGGTGGCAAGGAAC 57,7 60,0

CCACCAGATGAACGGGACAA 57,3 55,0 18 CITED2 361 (II. běh) p.Ser203_Gly204del CTGTTTGCACACGAAGTCCG 56,8 55,0

Tabulka č. 28. Primery navržené pro validaci čtyř vybraných variant DNA metodou Sangerova sekvenování.

4. 6. 1. CITED2 c.132_134delCCA, p.His44del Plod s č. 20 (I. běh) měl vícero VCC, a to koarktaci aorty a hypoplastickou levou komorou. Varianta DNA v druhém exonu genu CITED2 byla při identifikaci variant popsána následovně c.132_134delCCA; p.His44del. Sekvenci ověřované oblasti CITED2 zobrazuje obrázek č. 8. V této sekvenci jsou zvýrazněny úseky pro hybridizaci primerů a dále pak nukleotidy, které jsou dle programu IGV 2.3 (Integrative Genomics Viewer, Broad Institute) deletovány. Označeny jsou také nukleotidy, které jsou podle Ensembl pozicemi 132 až 134 daného genu (Ensembl Transcript: CITED2001).

ctgtggtgggcgacacgtgtgg cgcgggtctcattatctgcc cttttcacttccag

GACTGGAA ATGGCAGACCATATGATGGCCATGAACCACGGGCGCTTCCCCGACGGCACCA ATGGGCTGCACCATCACCCTGCCCACCGCATGGGCATGGGGCAGTTCCCGAGCCCCCATC ACCACCAGCAGCAGCAGCC CCA GCACGCCTTCAACGCCCTAATGGGCGAGCACATACACT ACGGCGCGGGCAACATGAATGCCACGAGCGGCATCAGGCATGCGATGGGGCCGGGGACTG TGAACGGAGGGCACCCCCCGAGCGCGCTGGCCCCCG CGGCCAGGTTTAACAACTCCCAGT TCATGGGTCCC CCGGTGGCCAG

Obrázek č. 8. Sekvence genu CITED2 pro validaci varianty c.132_134delCCA (p.His44del) (www.ensembl.org; upraveno). Vyznačené úseky (Ensembl Transcript: CITED2001) sekvence, ke kterým hybridizují primery (přímý žlutě, zpětný zeleně); podle Ensembl nukleotidové pozice 132 až 134 (růžově); podle IGV predikované deletované nukleotidy CCA (v obdelníkovém rámečku).

Sangerovým sekvenováním byla ověřena delece tří nukleotidů (CCA), která byla vyznačena v programu IGV ( v obdelníkovém rámečku na obrázku č. 8). Úsek sekvence v podobě chromatogramu s validovanou delecí lze vidět na obrázku č. 9.

Obrázek č. 9. Úsek chromatogramu analyzované oblasti genu CITED2 plodu č. 20 (I. běh) pro ověření varianty c.132_134delCCA (p.His44del) (A) . Pro srovnání je zobrazen úsek referenční DNA (B). Na sekvenci reference jsou obdélníkovým tvarem ohraničeny nuk leotidy CCA, které jsou u plodu deletovány.

Ověřenou deleci nukleotidů CCA v pozici 117 až 119 v druhém exonu genu CITED2 lze zapsat jako c.117_119delCCA (Ensembl Transcript: CITED2 001). Jelikož byl deletován počet nukleotidů, který je násobkem tří, j edná se o inframe deleci. Důsledkem pro proteinovou strukturu je ztráta jedn é aminokyseliny, a to histidinu v pozici 39 (dle Ens em bl p.His39del). Tyto zápisy jsou alternativní pro zápisy v programu SureCall c.132_134delCCA (p.His44del) (Ensembl Transcript: CITED2 202). V Ensembl jsou dva záznamy o této deleci ( www.ensembl.org ). Jeden (COSM1666547) byl zapsán projektem COSMIC j ako somatická mutace nalezená v lidském očním tumoru ( http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic ). Druhým záznamem ( TMP_ESP_6_139694963_139694965 ) je pak zápis projektu zvaného NHLBI Exome Sequencing Project (ESP) ( http://evs.gs.washington.edu/EVS ). Jeho cílem je objevovat nové geny a mechanismy přispívající ke vzniku srdečních, plicních nemocí a onemocnění krv e. Bližší informace o klinickém významu této delece zde však uvedeny nejsou. Deleci jiných nukleotidů v genu CITED2 než u zde popisovaného plodu, nicméně se stejným dopadem na primární strukturu proteinu , popisují dvě publikace (Sperling et al ., 2005; Chen et al ., 2012). V obou článcích, zkoumajících variant y daného genu

68 u pacientů s různými VCC, byla delece aminokyseliny histidinu (p.His39del) způsobena delecí nikoliv c.117_119delCCA, ale c.115_117delCAC. Autoři obou prací ovšem tuto variantu nalezli také u kontrolních jedinců, což byl důvod toho, že tuto mutaci neoznačili za příčinnou pro vznik VCC.

4. 6. 2. MYH6 c.5192_5196delAGATG, p.Lys1731ArgfsTer61 U plodu s indexem 10 (II. běh) byla ultrazvukovým vyšetřením detekována TOF. Jako potenciálně patogenní se jevila varianta v exonu č. 35 genu MYH6 , zapsaná programem SureCall jako c.5192_5196delAGATG (p.Lys1731ArgfsTer61). Mělo by se jednat o substituci lysinu v proteinové pozici 1731 za arginin a vytvoření nového čtecího rámce, který by končil terminačním kodonem v pozici 61 (počítáno od argininu jako od první aminokyseliny). Pro validaci této varianty byla amplifikována a následně Sangerovým sekvenováním analyzovaná vybraná část genu MYH6 s daným místem zájmu (obrázek č. 10) (Ensembl Transcript: MYH6201).

aaaaaaaaatgaccacctttaattctttc tggagaaaggg tatgaaat caggtaacaaagtgtagtatatatttgatcatttttctctctccatgtctag AACACCAGCCTCATCAACCAGAAGAA GA AGATG GAGTCGGATCTGACCCAGCTCCAGTCG GAAGTGGAGGAGGCAGTGCAGGAGTGCAGAAACGCCGAGGAGAAGGCCAAGAAGGCCATC ACGGAT gtaagtgaccgcccaccttccgcctcccctaaagacagaaacaaggccttgggtccaggc caggccactgtgctgtaacaccaagccaactctgcagttctgtggatttgagggcctgat gggagaaaggagatccttggggggcaaaaggccccggcccctggcccat gttccttgcca cctctctcc tgcacacag

Obrázek č. 10. Sekvence genu MYH6 pro validaci varianty c.5192_5196delAGATG (p.Lys1731ArgfsTer61). Vyznačené úseky sekvence, ke kterým hybridizují primery (přímý žlutě, zpětný zeleně); podle Ensembl nukleotidové pozice 5192 až 5196 (růžově); podle IGV predikované deletované nukleotidy AGA (v obdélníkovém rámečku).

Nukleotidy AGA (v obdelníkovém rámečku na obrázku č. 10) jsou dle Sangerového sekvenování skutečně u testovaného plodu deletovány. Výslednou sekvenci s validovanou delecí zobrazuje obrázek č. 11.

Obrázek č. 11. Úsek chromatogramu analyzované oblasti genu MYH6 plodu č. 10 (II. běh) pro ověření varianty c.5192_5196delAGATG (p.Lys17 31A rgfsTer61) (A). Na sekvenci referenční DNA (B) jsou obdélníkovým tvarem ohraničeny nukleotidy AGA, které jsou u plodu deletovány.

Tuto deleci nukleotidů AGA v pozici 5192 až 5194 genu MYH6 lze zapsat jako c.5192_5194delAGA. Jedná se o in frame deleci, která vede ke ztrátě aminokyseliny lysinu v proteinové pozici 1731 (p.Lys1731del) (Ensembl Transcript: MYH6 201). Diskrepance v popi su a klasifikaci mutace programem SureCall a validovanou variantou (frameshift vs. in frame) je zřejmě způsobena chybou v programu SureCall (tento problém se řeší se zástupci firmy A gilent Technologies).

4. 6. 3. CITED2 c.608_ 613delGCGGCA, p.Ser203_Gly204del Plodu č. 18 (II. běh) byla diagnostikována VCC ve formě TGA. Validována byla varianta v druhém exonu genu CITED2 zapsaná programem SureCall jako c.608_613delGCGGCA (p.Ser203 _Gly204del) (Ensembl Transcript: CITED2 001). Sekvence ověřované oblasti genu CITED2 je zobrazena níže (obrázek č. 12).

TGCAC CCTGCTGCAGG CCACCAGATGAACGGGACAA ACCAGCACTTCCGAGATTGCAACC CCAAGCACAGCGGCGGCAGCAGCACCCCCGGCGGCTCGGGCGGCAGCAGCACCCCCGGCG GCTCTGGCAGCAGCTCGGGCGGCGGCGCGGGCAGCAGCAACAGCGGCGGCGGCAGCGGCA GCGGCA ACATGCCCG CCTCCGTGGCCCACGTCCCCGCTGCAATGCTGCCGCCCAATGTCA TAGACACTGATTTCATCGACGAGGAAGTTCTTATGTCCTTGGTGATAGAAATGGGTTTGG ACCGCATCAAGGAGCTGCCCGAACTCTGGCTGGGGCAAAACGAGTTTGATTTTATGA CGG ACTTCGTGTGCAAACAG CAGCCCAGCAGAGTGAGCTGTTGA CTCGATCGAAACCCCGGCG

Obrázek č. 12. Sekvence genu CITED2 pro validaci varianty c.608_61 3delGCGGCA (p.Ser203_Gly204del) (www.ensembl.org; upraveno). Vyznačené úseky (Ensembl Transcript: CITED2001) sekvence, ke kterým hybridizují primery (přímý žlutě, zpětný zeleně); podle Ensembl nukleotidové pozice 608 až 61 3 (růžově); podle IGV predikované deletované nukleotidy GCGGCA (v obdélníkovém rámečku ).

Metodou Sangerova sekvenování byla u plodu ověřena delece šesti nukleotidů (GCGGCA), která byla vyznačena v programu IGV ( v obdélníkovém rámečku na obrázku č. 12). Program IGV zobrazoval deleci v heterozygotním stavu. Podle San gerova sekvenování se však jedná o deleci v homozygotním stavu. Chromatogram s fetální delecí lze vidět na obrázku č. 13 (část A). Testována byla také DNA matky plodu (čá st B) a referenční DNA (část C). U matky plodu nebyla tato delece detekována. DNA otce plodu nebyla k dispozici.

Obrázek č. 13. Úsek chromatogramu analyzované oblasti genu CITED2 plodu č. 18 (II. běh) pro ověření varianty c.608_613delGCGGCA (p.Ser203_Gly 20 4del) (A). Stejný úsek DNA matky plodu je zobrazen pod písmene m B. Na sekvenci referenční DNA (C), stejně jako na sekvenci mateřské DNA (B), jsou obdélníkovým tvarem ohraničeny nukleotidy GCGGCA, které jsou u plodu dle Sangerova sekvenování deletovány v homozygotním stavu.

Podle Ensembl se jedná o in frame deleci se zápisem c.593_ 598delGCGGCA, na proteinové úrovni o deleci dvou aminokyselin p.Ser198_Gly199del (Ensembl Transcript: CITED2001) . Tento zápis je shodný se zápisem programu SureCall u jiného transkriptu tohoto gen u c.608_613delGCGGCA ; p.Ser203_Gly204del (Ensembl Transcript: CITED2202) . Označení této delece v projektu NHLBI Exome Sequencing Project (ESP) je TMP_ESP_6_139694484_139694489 ( http://evs.gs.washington.edu/EVS ). Žádné bližší informace o této mutaci zde však zveřejněny nebyly.

Sperling et al . (2005) detekovali mutaci v genu CITED2 způsobující stejný důsledek (p. Ser198_Gly199del) jako zde popisovaná varianta. Jednalo se o variantu c.592_597delAGCGGC. Tato mutace byla nalezena v DNA pacienta s defektem síňového septa a anomálním návratem plicních žil. Příbuzní pacienta vyšetřováni nebyli. V kontrolním souboru daná změna DNA detekována nebyla. Autoři článku tuto mutaci označili za potenciální rizikový faktor pro vznik VCC.

4. 7. Kazuistika HoltovéOramův syndrom V této části práce bude prezentován případ rodiny, ve které se VCC objevila u více jedinců, resp. plodů.

4. 7. 1. Klinický popis rodiny V rodokmenu studované rodiny byly vyznačeny VCC u postižených členů (obrázek č. 14).

1 bez VCC 2 bez VCC

II.

1 AV blok 2 žádné informace o VCC

III.

1 AV blok 2 bez VCC 3 AV blok

IV. 1 AVSD 3 AVSD 4 AVSD 2 bez VCC

Obrázek č. 14. Rodokmen studované rodiny. Tmavě vyplněné znaky značí přítomnost VCC u daného jedince. Vysvětlivky: AV blok síňokomorový blok (atrioventrikulární blok), AVSD defekt síňokomorového septa (defekt atrioventrikulárního septa).

Probandem byl plod (IV 3) z roku 2013 s diagnostikovaným kompletním defektem síňokomorového septa (AVSD). Karyotyp plodu byl 46,XX. Metodou MLPA

72 nebyl potvrzen DiGeorgeův syndrom a výsledek array CGH byl standardní. Tato gravidita bylo pro matku již třetí. Její první plod (IV 1, rok 2010) měl také VCC, a to kompletní AVSD s malou levou komorou. Jednalo se o plod ženského pohlaví (46,XX) s negativním výsledkem FISH na detekci DiGeorgeova syndromu. Z druhého těhotenství se narodil syn bez VCC (IV 2, rok 2011). Roku 2014 matka podstoupila opět umělé přerušení těhotenství, jejímu dalšímu plodu (IV 4) byl diagnostikován AVSD a náznak HLH. Matka plodů (III 2, rok narození 1981) netrpí žádným typem VCC. V minulosti u ní byla při genetickém vyšetření detekována 6% mozaika aneuploidie chromozomu X (přesný nález není dostupný). Otcem všech plodů je muž (III 1, rok narození 1980) s atrioventrikulárním blokem (AV blok), tj. poruchou srdečního rytmu. Během genetické analýzy této rodiny byli vyšetřeni také její další členové, a to kvůli snaze zjistit segregaci patogenní alely. Těmito členy byli matka otce plodů (II 1, rok narození 1961) trpící AV blokem a prarodiče otce plodů (I 1, rok narození 1933; I 2, rok narození 1934), kteří neuvádějí žádnou VCC. Posledním vyšetřovaným byl bratr otce plodů (III 3, rok narození 1988), jemuž byl také diagnostikován AV blok.

4. 7. 2. Nález u probanda Prvním vyšetřovaným vzorkem z této rodiny byla DNA probanda, která byla izolovaná z buněk plodové vody. Jednalo se o vzorek s indexem č. 16 z prvního běhu mutační analýzy 59 genů asociovaných s VCC. Celkem bylo blíže specifikováno 27 nalezených variant DNA, z toho bylo 22 zařazeno do skupiny benigních variant, tři do potenciálně benigních variant, jedna do třídy VOUS a jedna do třídy patogenních mutací. Variantu VOUS představovala mutace v genu PDGFRA (c.599C>G; p.Thr200Ser; p.T200S). Její klinický význam je nejasný (SIFT tolerated, PolyPhen benign, ClinVar uncertain significance; Ensembl unknown clinical significance), v době zpracovávání této práce nebyl objeven jediný důkaz o její patogenitě. Toto tvrzení však neplatí pro jinou variantu DNA probanda, kterou je mutace v genu TBX5 (c.668C>T; p.Thr223Met; p.T223M). Při ní dochází k záměně nukleotidu dCTP za dTTP v pozici 668 cDNA příslušného genu, což se projeví na primární struktuře jeho produktu substitucí aminokyseliny threoninu za methionin v pozici 223. Aminokyselina threonin v pozici 223 se přímo účastní vazby proteinu TBX5 na DNA (Stirnimann et al ., 2010).

Mutace genu TBX5 (p.Thr223Met) byla po mutační analýze klasifikována jako patogenní. Predikční programy SIFT a PolyPhen jí přidělily patogenní potenciál (deleterious, probably damaging). Frekvence této varianty je dle programu SureCall nulová. Již v minulosti byly publikovány články popisující tuto mutaci jako mutaci kauzální pro tzv. HoltovéOramův syndrom (www.omim.org, #142900). Mutace p.Thr223Met genu TBX5 byla poprvé nalezena u osmi jedinců s HOS ve třech nepříbuzných rodinách (Brassington et al ., 2003). Všech osm jedinců mělo mírné defekty horních končetin (trifalangeální palec, syndaktylii, hypoplastickou vřetenní, pažní, loketní či záprstní kost). Pět z nich mělo vážné malformace srdce (různé typy ASD a VSD). V roce 2005 McDermott et al . detekovali danou mutaci u jedince s HOS trpícího ASD, VSD a malformacemi radiálního paprsku (tj. 1. až 3. prst a příslušné zápěstní kůstky).

4. 7. 3. HoltovéOramův syndrom a gen TBX5 HoltovéOramův syndrom (HoltOram syndrome, HOS, OMIM #142900) byl poprvé popsán v roce 1960 a pojmenován podle jeho objevitelů Mary Holtové a Samuela Orama (Holt a Oram, 1960). Ti u jedné rodiny pozorovali současný výskyt srdečních a skeletálních defektů. Srdečním defektem byl nejčastěji defekt síňového septa, často doprovázený arytmií. Za nejvíce postiženou součást kosterní soustavy pak označili ruce, resp. palce horních končetin. Dědičnost těchto příznaků byla v dané rodině dominantního typu. Od té doby bylo zveřejněno mnoho publikací, které blíže specifikují jak prevalenci HOS, tak jeho příčiny a klinické příznaky. Prevalence HOS je odhadována na 0,7 na 100 000 porodů, tj. 1 na 135 615 porodů (Barisic et al. , 2014). Toto onemocnění se vyskytuje v různých etnických i geografických územích. Jako příčina HOS byly popsány mutace v genu TBX5 (Basson et al. , 1997). Oficiální název genu TBX5 je Tbox 5 (12q24.1) (www.genanames.org; www.omim.org, #601620). Gen TBX5 je členem fylogeneticky konzervované rodiny genů, jejichž součástí je sekvence zvaná Tbox. Produktem exprese genu TBX5 je transkripční faktor délky 518 aminokyselin s Tdoménou pro vazbu na DNA cílových genů (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene). Úlohou proteinu TBX5 je transkripční regulace genů potřebných pro diferenciaci mesodermu (www.uniprot.org). Potvrzení role proteinu TBX5 ve vývoji srdce, především při vývoji síní a levé komory, bylo

74 provedeno díky studiu jeho exprese ve vyvíjejícím se srdci myšího i lidského embrya (Bruneau et al. , 1999; Li et al ., 1997). Mutační analýzy kódujících oblastí genu TBX5 nalezly různé mutace ve třech čtvrtinách případů HOS (McDermott et al ., 2005). U ostatních pacientů se předpokládají mutace v regulačních či nekódujících oblastech genu. Mnoho změn v genu TBX5 bylo již v minulosti identifikováno jako příčiny HOS (Basson et al ., 1999). Může se jednat o mutace nesmyslné (nonsense), posunové (frameshift), sestřihové (splice) či měnící smysl (missense) mutace (Brassington et al ., 2003). HOS, někdy zvaný jako „syndrom srdceruka“, je dědičné onemocnění způsobující nejčastěji anomálie srdce a horních končetin (Basson et al. , 1994). Dědičnost syndromu je autozomálně dominantní s úplnou penetrancí (NewburyEcob et al ., 1996). Klinická manifestace HOS se však může u jednotlivých jedinců lišit, může jít o subklinické nálezy detekovatelné pouze rentgenovým vyšetřením až o příznaky ohrožující život. I mezi jedinci se stejnou mutací v genu TBX5 existují významné rozdíly v typu a vážnosti malformací horních končetin i srdce (Bruneau et al. , 2001). Jako pravděpodobné vysvětlení se jeví fungování genetického pozadí, resp. modifikátorových genů. Jedním z možných vysvětlení je, že fenotyp mohou měnit polymorfní varianty vazebných partnerů proteinu TBX5, jako je např. NKX2.5. Srdečními vadami mohou být při HOS defekty síňových či síňokomorových sept. U postižených jedinců se dá také často setkat s defekty srdečních sept, abnormalitami struktur levého srdce, jako jsou např. hypoplastické levé srdce, prolaps mitrální chlopně či AV blok různého stupně (Basson et al. , 1994; NewburyEcob et al ., 1996; Bruneau et al. , 1999). Anomálie horních končetin mohou být uni nebo bilaterální a mohou postihnout různé struktury, např. vřetenní (radiální) kost, zápěstní (karpální) kosti, kosti článků palce (Basson et al. , 1994). Aplázie, hypoplázie, fúze a abnormální vývoj těchto struktur vede k širokému spektru fenotypů (např. trifalangeální palec se třemi články místo dvou, chybějící palec, zkrácené paže až fokomelie, tj. nevyvinutí paží a předloktí). Levé horní končetiny bývají postiženy vážněji než pravé (NewburyEcob et al ., 1996).

4. 7. 4. Segregační analýza Pro ověření nalezené mutace c.668C>T (p.Thr223Met; p.T223M) v genu TBX5 u probanda a pro potvrzení její kauzality byla provedena segregační analýza Sangerovou metodou sekvenování. Rodokmen rodiny s vyznačenými výsledky této analýzy představuje obrázek č. 15. Úseky chromatogramů všech testovaných členů rodiny jsou shrnuty dále (obrázek č. 16).

1 bez VCC, 2 bez VCC, c.[=]+[=] c.[=]+[=]

II.

1 AV blok, 2 žádné informace o VCC c.[668C>T]+[=]

III.

1 AV blok, 2 bez VCC, 3 AV blok, c.[668C>T]+[=] c.[=]+[=] c.[668C>T]+[=]

IV. 1 AVSD, 3 AVSD, c.[668C>T]+[=] c.[668C>T]+[=] 2 bez VCC, 4 AVSD c.[=]+[=]

Obrázek č. 15. Rodokmen sledované rodiny s vyznačenými výsledky segregační analýzy. Tmavě vyplněné znaky značí přítomnost VCC u daného jedince. Zápis c.[668C>T]+[=] znamená detekovanou mutaci c.668C>T (p.Thr223Met; p.T223M) v genu TBX5 v heterozygotním stavu. Zápis c.[=]+[=] znamená negativní výsledek analýzy, tj. přítomnost dvou, v testovaném místě, standardních alel.

Jedinec testovaný na Část chromatogramu analyzované oblasti Zápis analyzované oblasti přítomnost mutace genu TBX5 genu TBX5 p.T223M v genu TBX5

Referenční standardní DNA, tj. bez testované c.[=]+[=] mutace

I 1 c.[=]+[=] (prababička probanda)

I 2 c.[=]+[=] (praděda probanda)

II 1 (babička probanda c.[668C>T]+[=] z otcovy strany)

III 1 c.[668C>T]+[=] (otec probanda)

III 2 c.[=]+[=] (matka probanda)

III 3 (strýc probanda z otcovy c.[668C>T]+[=] strany)

IV 1 (nenarozený sourozenec c.[668C>T]+[=] probanda)

IV 2 (narozený sourozenec c.[=]+[=] probanda)

IV 3 c.[668C>T]+[=] (proband)

Obrázek č. 16 . Výsledky segregační analýzy u sledované rodiny pro ověření mutace c.668C>T (p.Thr223Met ; p.T223M) v genu TBX5. Zápis c.[668C>T]+[=] znamená detekovanou mutaci c.668C>T (p.Thr223Met; p.T223M) v genu TBX5 v heterozygotním stavu. Zápis c.[=]+[=] znamená negativní výsledek analýzy, tj. přítomnost dvou, v testovaném místě, standardních alel.

5. Diskuze Cílem této diplomové práce bylo provedení mutační analýzy kandidátních genů asociovaných se vznikem syndromových i izolovaných VCC u prenatálně zjištěných případů metodou NGS.

5. 1. Zhodnocení kvality mutační analýzy 5. 1. 1. Zhodnocení koncentrace cílové DNA po protokolu HaloPlex Target Enrichment System Protokol HaloPlex Target Enrichment System sloužil k obohacení vzorku o cílové úseky genomové DNA. V prvním běhu analýzy byla průměrná koncentrace 23 vzorků po provedení protokolu HaloPlex rovna 4,6 ng/l. V druhém běhu pak byla tato veličina u 23 vzorků rovna 1,8 ng/l. Nejvyšší hodnota koncentrace činila 12,3 ng/l (I. běh, index 7.), nejnižší pak 0,036 ng/l (II. běh, index 8.). Hodnoty koncentrace DNA byly tedy po provedení protokolu HaloPlex nízké. Tento fakt mohl být způsoben více faktory. Jedním z nich mohla být degradace vstupního vzorku DNA, která měla být zkontrolována pomocí gelové elektroforézy ještě před zahájením protokolu. Toto ověření však nebylo provedené z důvodu limitovaného množství vzorků. Chyby lidského i technologického charakteru během provádění celého obohacování DNA mohou být také jedním z vysvětlení. Dvoudenní protokol HaloPlex byl složen z kroků, které vyžadovaly přesné pipetování u více vzorků současně. Další příčinou toho, že průměrná koncentrace cílové DNA u vzorků druhého běhu byla o téměř o 3 ng/l nižší než u vzorků prvního běhu, může být využití odlišné magnetické destičky. Ta byla používána pro zachycení magnetických kuliček s navázanou DNA. V prvním běhu mutační analýzy byla využita magnetická destička Magnetic Strand 96 (Ambion), která díky magnetické síly shromažďuje magnetické kuličky ve shluku. V druhém běhu byl použit magnetický separátor Agencourt SPRIPlate 96R Ring Super Magnet Plate (Beckman Coulter). Ten přitahuje magnetické kuličky prostřednictvím magnetického pole vytvořeného v podobě tenkého prstence. Výše vypsané příčiny nízké koncentrace cílové DNA po výběru cílových oblastí genomu jsou hypotézami. Jejich ověření nebylo provedeno.

5. 1. 2. Zhodnocení parametrů kvality mutační analýzy Jako hlavní parametry pro zhodnocení kvality mutačních analýz 59 genů asociovaných s VCC byly vybrány distribuce bazí na základě jejich skóre kvality („QScore Distribution“), podíl čtení přiřazených k jednotlivým vzorkům („% Reads Identified (PF)“), hustota shluků DNA vytvořených na amplifikační destičce („Cluster Density“) a hloubka čtení cílových oblastí. Při prvním běhu analýzy byla pravděpodobnost nesprávného nazvání baze rovna či menší než 0,1 % (Q30) u 74,0 % bazí. V druhém běhu mělo 69,1 % bazí hodnotu skóre kvality vyšší než Q30. V rámci tohoto parametru byl druhý běh sekvenování méně kvalitní než běh první. Při použití kitu MiSeq Reagent Kit v2 (500cycle) a při čtení 2×250 bp je doporučeno, aby více než 75 % bazí mělo skóre kvality vyšší než Q30 (www.illumina.com, d). Tento limit nebyl ani v jednom běhu sekvenování dosažen. V prvním běhu bylo pouze 0,12 % čtení přiřazeno ke vzorku č. 2. Jeho mutační analýza byla proto opakována v druhém běhu. Jeho sekvenování poté proběhlo úspěšně. K tomuto vzorku bylo zařazeno celkem 4,16 % všech čtení. Po druhém běhu mutační analýzy nebyly vyhodnoceny vzorky č. 8 a 12. Důvodem bylo jejich neúspěšné sekvenování. To bylo pravděpodobně způsobeno, stejně jako u vzorku č. 2 z prvního běhu, minimální koncentrací DNA již po provedení protokolu HaloPlex Target Enrichment System. Při prvním běhu byla hustota shluků 1298 ± 21 K/mm 2 a při druhém běhu 1347 ± 24 K/mm 2. Tento jev nebyl v konzistenci s faktem, že pro první běh sekvenování byla připravena 12pM knihovna a pro běh druhý knihovna 10pM. V návodu na obsluhu přístroje MiSeq ® z března 2013 se píše, že optimální hustota shluků je okolo 800 K/mm 2 (http://application.sbroscoff.fr/download/fr2424/abims/corre/ngs/1_illumina/MiSeq%20 System%20User%20Guide%20%2815027617%29.pdf). Nicméně dle těchto instrukcí je rozmezí hodnot 50–1300K/mm 2 ještě akceptovatelné. Tyto údaje však již v novějších verzích manuálu chybí (http://supportres.illumina.com/documents/documentation/system_documentation/miseq /miseqsystemuserguide15027617m.pdf ). S každým vzorkem bylo zacházeno během celého postupu analýzy stejně a jednotlivé úkony byly prováděny vždy s maximální pečlivostí. Přesto lze pozorovat rozdílné výsledky sekvenování DNA jednotlivých plodů. Vzorek č. 4 (I. běh), jehož vstupní koncentrace musela být místo 5 ng/l pouhých 2,6 ng/l, měl průměrnou hloubku čtení cílových oblastí vyšší než mnohé jiné vzorky s počáteční koncentrací

5,0 ng/l. Na stranu druhou se podařilo u všech vzorků, kromě tří výše zmíněných (I. běh, index 2.; II. běh, index 8.; II. běh, index 12.), dosáhnout průměrné hloubky čtení cílových oblastí rovné 428. Celkem 98,85 % cílových oblastí bylo čteno nejméně 20 čteními, 95,44 % oblastí nejméně 100 čteními a 71,88 % oblastí cílové DNA nejméně 500 čteními.

5. 1. 3. Zhodnocení pokrytí predikovaných neamplifikovaných cílových oblastí Při návrhu sond pro obohacení vzorku o genomové oblasti zájmu pomocí programu SureDesign bylo dosaženo 99,76% pokrytí. Nicméně u sedmi genů bylo predikováno celkem osm nepokrytých exonových oblastí, tj. cílových oblastí, které dle programu nebudou v protokolu HaloPlex amplifikovány. Kontrola pokrytí předpovídaných nepokrytých oblastí v exonech byla provedena po mutační analýze u vybraných čtyř vzorků. Primárně tři tyto oblasti v genech FOXC1 (příloha č. 1a), SCN5A (příloha č. 1e) a SHROOM3 (příloha č. 1g) bude nutno v budoucnu vyšetřit pomocí metody Sangerova sekvenování u všech vyšetřovaných plodů. U plodů, které měly průměrnou hloubku čtení cílových oblastí menší než 254, bude doporučeno sekvenovat všechny predikované nepokryté oblasti, primárně ty v exonových úsecích DNA. Jedná se o čtyři plody (I. běh, index 5.; I. běh, index 22.; II. běh, index 2.; II. běh, index 5.).

5. 2. Zhodnocení výsledků mutační analýzy 5. 2. 1. Obecné zhodnocení nalezených variant DNA Metodou NGS bylo u 41 plodů s VCC po filtraci detekováno 1076 změn DNA ve srovnání s referenčním genomem. Tyto změny představovaly 139 různých typů variant. Benigních typů variant bylo 31 %, potenciálně benigních 17 %, VOUS 47 %, potenciálně patogenních 4 % a patogenních 1 %. U mnohých typů variant nebylo možno stanovit jejich přesný klinický dopad na fenotyp daného plodu. Proto byly zařazeny do skupin potenciálně benigních, potenciálně patogenních, resp. VOUS. Důvodem bylo nedostatečné množství informací, popř. jejich nejednotná klasifikace podle dostupných databází a jiných zdrojů. Právě získání velkého množství sekvenčních dat bez možnosti jejich přesné interpretace je možné v současné době považovat za jednu z nevýhod využívání velkokapacitních metodik, jako je například NGS. Podle dostupné celosvětové literatury lze konstatovat, že se zkoumání

80 genetických příčin VCC stává oblastí, na kterou bude v budoucnu kladen čím dál tím větší důraz. Lze tedy předpokládat, že budou publikovány nové studie, které pomohou ujasnit klinický význam mnohých změn DNA. V kapitole 4. 5. 3. Varianty nejasného významu byly u některých testovaných plodů označeny varianty, které představují primární kandidáty pro další analýzy. U některých vzorků se však nepodařilo tyto varianty označit. Důvodem mohla být skutečnost, že všechny studované varianty DNA byly zařazeny do skupiny benigních či potenciálně benigních změn DNA. Druhým důvodem mohlo být to, že ačkoliv byla varianta ve třídě VOUS, většina zdrojů se přikláněla k benignitě této mutace. I z tohoto důvodu je nutné dlouhodobě sledovat vývoj informací o daných variantách. Jako limitaci této práce lze chápat také to, že testované plody mohly mít kauzální mutaci v jiných než testovaných genech či cílových oblastí. Další nevýhodou při studiu příčin VCC je fakt, že tyto vady nemusí být způsobeny jen abnormalitami mendelovské dědičnosti, ale také faktory vnějšího prostředí, polygenně či multifaktoriálně.

5. 2. 2. Zhodnocení validovaných vybraných variant DNA Po analýze přístrojem MiSeq ® byly ověřeny celkem čtyři vybrané varinaty, které jsou blíže popsány v kapitole 4. 6. Validované vybrané varianty DNA. Jednou z nich byla mutace v genu TBX5 řešená v rámci kazuistiky (kapitola 4. 7. Kazuistika HoltovéOramův syndrom). Další dvě varianty představují inframe delece. Poslední varianta je delecí posunovou. Nečekaný výsledek byl získán při Sangerově sekvenování DNA plodu č. 18 (II. běh) pro ověření varianty v genu CITED2 (c.608_613delGCGGCA; p.Ser203_Gly204del). Program IGV zobrazoval u daného plodu tuto deleci šesti nukleotidů v heterozygotním stavu. Sekvence získána Sangerovou metodou však značila danou deleci v homozygotním stavu. Stejný výsledek nastal při každém ze tří opakování sekvenování. Vyšetřena byla také DNA matky plodu (ve dvou opakováních). Bylo prokázáno, že matka sledovanou deleci nenese ani ve stavu heterozygotním. DNA otce plodu nebyla k dispozici. Existuje více možných vysvětlení tohoto jevu, které budou muset být v budoucnu ověřeny. Jednou hypotézou je možnost germinálního (gonadálního) mozaicismu u matky plodu. Jako další vysvětlení přichází v úvahu delece delšího úseku DNA na druhé alele, ve kterém se nachází oblast validované varianty. Jednou z hypotéz je také uniparentální dizomie, tj. původ obou chromozomů, resp. jejich segmentů, od jednoho rodiče. Dalším

81 vysvětlením této nesrovnalosti může být tzv. alelický dropout (ADO). ADO je jev, při kterém je přednostně namnožena pomocí PCR pouze jedna ze dvou alel a druhá alela je amplifikována pod úroveň detekovatelnosti (Taberlet et al ., 1996). Pro minimalizaci ADO by bylo potřeba provést např. multiplex PCR, tj. koamplifikaci sledovaného místa s polymorfními markery. Pro potvrzení či vyvrácení artefaktů při PCR, tj. zda nedochází k preferenční amplifikaci alely s danou delecí, byl vytvořen „heterozygot“ smícháním standardního vzorku se vzorkem DNA plodu č. 18 (II. běh). Sangerovo sekvenování tuto mutaci detekovalo v heterozygotním stavu (příloha č. 2). Tento výsledek vyvrátil danou teorii.

5. 3. Zhodnocení kazuistiky HoltovéOramův syndrom Pomocí Sangerova sekvenování byla ve sledované rodině, ve které byla u probanda přístrojem MiSeq ® detekována mutace c.668C>T (p.Thr223Met; p.T223M) v genu TBX5 v heterozygotním stavu, provedena segregační analýza. Tou byl potvrzen předpoklad, že se jedná o mutaci kauzální způsobující HOS. Plody (IV 1, IV 3) trpící VCC zdědily testovanou mutaci po svém otci (III 1), jenž trpí poruchou srdečního rytmu. Syn bez srdeční vady (IV 2) sledovanou mutaci po otci nezdědil. Otec a strýc plodů (III 3) zdědili mutaci po své matce (II 1). U ní daná mutace vznikla nejpravděpodobněji de novo , jelikož její rodiče (I 1, I 2) mutaci p.Thr223Met v genu TBX5 nenesou. Dalším možným vysvětlením by mohla být nonpaternita, která však nebyla ověřena. Projevy HOS jsou heterogenní. Lze se domnívat, že horní končetiny potracených plodů (IV 1, IV 3, IV 4) byly bez malformací, nebo jejich defekty nebyly natolik rozsáhlé, aby byly ultrazvukovým vyšetřením detekovány. Jako další důkaz pro potvrzení HOS sloužily výsledky rentgenového vyšetření horních končetin otce plodů (III 1) a jeho matky (II 1). Horní končetiny otce plodů (III 1) se na pohled jeví jako normální. Rentgenové vyšetření však odhalilo různé deformační změny (naznačení srostlice u karpálních (zápěstních) kůstek při radiálním okraji vpravo, dále mírné deformační změny interfalangeálních kloubů, v kořenovém kloubu palců a v karpu (kostře zápěstí) vlevo radiálně, Madelungova deformita naznačena v radiokarpálních skloubeních). Palec levé horní končetiny babičky plodů se na první pohled jeví jako abnormální. Rentgenové vyšetření horních končetin babičky plodů (II 1) detekovalo výrazné deformační změny interfalangeálních kloubů zejména distálně, více u V. paprsků, deformační změny metakarpů (záprstních kůstek) 82 u I. paprsků (palců), hypoplastický metakarp I. paprsku vlevo. Další deformační změny byly karpálně bilaterálně radiálně a v oblasti předloketních kostí. Pomocí výsledků analýzy, publikací a rentgenových vyšetření otce a babičky plodů byla mutace c.668C>T (p.Thr223Met; p.T223M) v genu TBX5 shledána za patogenní. V případě plánování dalšího těhotenství je matka probanda (III 2) vhodným adeptem pro preimplantační genetickou diagnostiku.

5. 4. Návrh dalšího průběhu studie Z časových důvodů nebylo možné provést validaci, resp. bližší studium všech detekovaných variant DNA. Hlavním cílem pokračování práce bude ověření variant suspektních z kauzality, resp. provedení segregační analýzy v daných rodinách. Průběžné a pravidelné kontrolování dostupnosti informací o detekovaných variantách bude také náplní další práce. Vzhledem k nárůstu publikací věnujících se odhalování příčin VCC se dá očekávat přísun nových dat, která by mohla upřesnit, někdy možná i změnit, klasifikaci mutací dle jejich klinického významu. Pro zpřesnění klasifikace variant může také posloužit mutační analýza dalších případů s VCC. Dalšími možnostmi studie mohou být detekce CNV a také funkční analýzy jednotlivých mutací.

6. Souhrn Genetické příčiny vrozených srdečních vad

Cílem této diplomové práce nazvané Genetické příčiny vrozených srdečních vad bylo aplikovat masivně paralelní sekvenování pro identifikaci příčin VCC u prenatálně zjištěných případů v Centru prenatální diagnostiky, s.r.o. Celkem bylo pro analýzu vybráno 59 genů, jejichž různé varianty byly v minulosti publikovány jako příčiny vzniku izolovaných i syndromových VCC. U 41 plodů bylo po filtraci detekováno 1076 změn DNA. Ty představovaly 139 různých typů variant, které byly po bližším studiu řazeny do pěti možných tříd dle předpokládaného klinického dopadu. Jako patogenní varianta byla označena pouze jedna změna, a to mutace v genu TBX5 způsobující v dané rodině HOS. Šest potenciálně patogenních variant bylo nalezeno u čtyř plodů. Celkem 47 % typů variant bylo variant nejasného významu. V budoucnu lze očekávat zvýšené množství studií zabývajících se podobnou problematikou jako tato diplomová práce. První zveřejněnou studií, která pro hledání příčin familiárních případů VCC využila sekvenování panelu genů spojovaných se strukturními nemocemi srdce, byla publikována v prosinci 2014 (Blue et al ., 2014). Celkem 41 genů z panelu genů sekvenovaných v této studii bylo shodných s geny sekvenovanými v rámci této diplomové práce. Dá se předpokládat, že s nárůstem podobných prací poroste množství detekovaných variant genů na straně jedné a na straně druhé bude zpřesňována jejich charakteristika, včetně jejich dopadu na fenotyp. Masivně paralelním sekvenováním lze provádět molekulárněgenetickou diagnostiku příčin VCC, která byla dříve při metodě Sangerova sekvenování značně časově i finančně omezená. Budoucí snahou je mutační analýza dalších vzorků, potvrzení nalezených variant DNA a provedení segregačních analýz v rodinách. Největšími komplikacemi, kvůli nimž není v současnosti možné metodiku popsanou v této práci aplikovat do běžné klinické praxe, jsou následující. Interpretace mnohých variant DNA je složitá z důvodu neznalosti klinického dopadu dané mutace. Další komplikací je fakt, že není možné u všech testovaných jedinců nalézt příčinu VCC. Ta totiž nemusí být genetického charakteru, nebo může být genetickou změnou, ale v místě, které není při analýze místem cílovým. Další komplikací při hledání příčin VCC je skutečnost, že mnoho případů je pravděpodobně způsobeno polygenně, resp. multifaktoriálně. Jak bylo i v této práci potvrzeno, při protokolu NGS může docházet

84 k chybám, které mohou vést k nízkému pokrytí celého vzorku, resp. určitých cílových oblastí. Pak je nutno analýzu daného vzorku zopakovat, resp. jinou metodou zkontrolovat konkrétní místa DNA. Dlouhodobým cílem této práce a jejího pokračování je aplikace poznatků pro zlepšení diagnostiky, léčby a prevence VCC.

7. Summary Genetic causes of congenital heart defects

The aim of this diploma thesis called Genetic causes of congenital heart defects was to apply the massively parallel sequencing to identify some causes of CHD in prenatally detected cases in Centrum prenatální diagnostiky, s.r.o. Altogether 59 genes were selected for this analysis. These genes and their different variants have been previously published as a cause of some isolated and syndromic CHD. Altogether 1076 DNA variants were detected after a filtration in 41 fetuses. These represent 139 different types of DNA variants which were classified into five classes according to an expected clinical impact. Only one DNA variant has been reported as a pathogenic variant. It is the mutation in the gene TBX5 which causes HOS in the family. Six potentially pathogenic variants were found in four fetuses. 47% of the variants´ types were variants of unknown significance. An increased number of studies dealing with a similar issue as this thesis is expected in the future. The first published study which describes a sequencing of a panel of genes to find some causes of CHD in some familial cases was published in December 2014 (Blue et al ., 2014). Altogether 41 genes from their panel were same as genes sequenced in this diploma thesis. It is expected that an amount of some detected DNA variants of genes will increase. But on the other hand their impact on a phenotype will be more specific. A molecular genetic diagnosis of the causes of VCC can be performed by the massively parallel sequencing. This diagnosis by the Sanger sequencing was previously limited because of some time and financial reasons. The future aim is a mutational analysis of more samples, a validation of some next DNA variants and DNA segregation analyzes. The methodics described in this thesis is not able to be used in a clinical practice. An interpretation of the many DNA variants is complicated because of the unknowledge of their clinical impacts. Another complication is the fact that it is not possible to find the cause of CHD for some subjects. A next expalanation can be that it is a genetic mutation but in a location that is not the target region of the analysis. Another difficulty is a fact that many cases are probably caused by some polygenic, resp. multifactorial defects. As was also confirmed in this study some faults may occur in the NGS protocol. These can lead to a law coverage of a whole sample, resp. some certain target areas.

Then it is necessary to repeat an analysis of these samples, resp. to use another method to check these specific DNA sites. A longterm aim of this thesis is an application of its results to improve a diagnosis, treatment and prevention of CHD.

8. Literatura

8. 1. Literární zdroje

Ackerman C., Locke A. E., Feingold E., Reshey B., Espana K., Thusberg J., Mooney S., Bean L. J. H., Dooley K. J., Cua C. L., Reeves R. H., Sherman S. L., Maslen C. L. 2012. An excess of deleterious variants in VEGFA pathway genes in Downsyndromeassociated atrioventricular septal defects. Am. J. Hum. Genet. 91: 646–659.

American academy of pediatrics. 2001. Health supervision for children with Down syndrome: committee on genetics. Pediatrics. 107: 442–449.

Barisic I., Boban L., Greenlees R., Garne E., Wellesley D., Calzolari E., Andor M., Arriola L., Bergman J. E. H., Braz P., Budd J. L. S., Gatt M., Haeusler M., Khoshnood B., Klungsoyr K., McDonnell B., Nelen V., Pierini A., Queisse Wahrendorf A., Rankin J., Rissmann A., Rounding C., Tucker D., Verellen Dumoulin C., Dolk H. 2014. Holt Oram syndrome: a registrybased study in Europe. Orphanet J. Rare Dis. 9: 156.

Basson C. T., Bachinsky D. R., Lin R. C., Levi T., Elkins J. A., Skulte J., Grayzel D., Kroumpouzou E., Traill T. A., LeblancStraceski J., Renault B., Kucherlapati R., Seidman J. G., Seidman C. E. 1997. Mutations in human TBX5 cause limb and cardiac malformation in HoltOram syndrome. Nat. Genet. 15(1): 30–35.

Basson C. T., Cowley G. S., Salomon S. D., Weissman B., Poznanski A. K., Traill T. A., Seidman J. G., Seidman C. E. 1994. The clinical and genetic spectrum of the Holt Oram syndrome (hearthand syndrome). N. Engl. J. Med. 330: 885–891.

Basson C. T., Huang T., Lin R. C., Bachinsky D. R., Weremowicz S., Vaglio A., Bruzzone R., Quadrelli R., Lerone M., Romeo G., Silengo M., Pereira A., Krieger J., Mesquita S. F., Kamisago M., Morton C. C., Pierpont M. E. M., Müller C. W., Seidman J. G., Seidman C. E. 1999. Different TBX5 interactions in heart and limb defined by HoltOram syndrome mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 2919– 2924.

Bauer R. C., Laney A. O., Smith R., Gerfen J., Morrissette J. J. J., Woyciechowski S., Garbarini J., Loomes K. M., Krantz I. D., Urban Z., Gelb B. D., Goldmuntz E., Spinner N. B. 2010. Jagged1 mutations in patients with tetralogy of Fallot or pulmonic stenosis. Hum. Mutat. 31(5): 594–601.

Bleyl S. B., Saijoh Y., Bax N. A., de Groot Gittenberger A. C., Wisse L. J., Chapman S. C., Hunter J., Shiratori H., Hamada H., Yamada S., Shiota K., Klewer S. E., Leppert M. F., Schoenwolf G. C. 2010. Dysregulation of the PDGFRA gene causes inflow tract anomalies including TAPVR: integrating evidence from human genetics and model organisms. Hum. Mol. Genet. 19(7): 1286–1301.

Blue G. M., Kirk E. P., Giannoulatou E., Dunwoodie S. L., Ho J. W. K., Hilton D. C. K., White S. M., Sholler G. F., Harvey R. P. Winlaw D. D. 2014. Targeted next generation sequencing identifies pathogenic variants in familial congenital heart disease. J. Am. Coll. Cardiol. 64(23): 2498–2506.

Botto L. D., May K., Fernhoff P. M., Correa A., Coleman K., Rasmussen S. A., Meritt R. K., O´Leary L. A., Wong L., Elixson E. M., Mahle W. T., Campbell R. M. 2003. A populationbased study of the 22q11.2 deletion: phenotype, incidence, and contribution to major birth defects in the population. Pediatrics. 112: 101 –107.

Brassington A. E., Sung S. S., Toydemir R. M., Le T., Roeder A. D., Rutherford A. E., Whitby F. G., Jorde L. B., Bamshad M. J. 2003. Expressivity of HoltOram syndrome is not predicted by TBX5 genotype. Am. J. Hum. Genet. 73: 74 –85.

Bruneau B. G., Logan M., Davis N., Levi T., Tabin C., Seidman J. G., Seidman C. E. 1999. Chamberspecific cardiac expression of TBX5 and heart defects on HoltOram syndrome. Dev. Biol. 211: 100–108.

Bruneau B. G., Nemer G., Schmitt J. P., Charrron F., Robitaille L., Caron S., Conner D. A., Gessler M., Nemer M., Seidman C. E., Seidman J. G. 2001. A murine model of HoltOram syndrome defines roles of the Tbox transcription factor TBX5 in cardiogenesis and disease. Cell. 106: 709–721.

Burn J., Brennan P., Little S., Holloway S., Coffey R., Somerville J., Dennis N. R., Allan L., Arnold R., Deanfield J. E., Godman M., Houston A., Keeton B., Oakley C., Scott O., Silove E., Wilkinson J., Pembrey M., Hunter A. S. 1998. Recurrence risks in offspring of adults with major heart defects: results from first cohort of British collaborative study. Lancet. 351: 311–316.

Cinquetti R., Badi I., Campione M., Bortoletto E., Chiesa G., Parolini C., Camesasca C., Russo A., Taramelli R., Acquati F. 2008. Transcriptional deregulation and a missense mutation define ANKRD1 as a candidate gene for total anomalous pulmonary venous return. Hum. Mutat. 29(4): 468–474.

Colliton R. P., Bason L., Lu F., Piccoli D. A., Krantz I. D., Spinner N. B. 2000. Mutation analysis of Jagged1 (JAG1 ) in Alagille syndrome patients. Hum. Mutat. 17(2): 151–156.

Dasgupta C., Martinez A., Zuppan C. W., Shah M. M., Bailey L. L., Fletcher W. H. 2001. Identification of connexin43 (α1) gap junction gene mutations in patients with hypoplastic left heart syndrome by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Mutat. Res. 479: 173–186.

Davidson E. H., Erwin D. H. 2006. Gene regulatory networks and the evolution of animal body plans. Science. 311: 796–800.

De Luca A., Sarkozy A., Ferese R., Consoli F., Lepri F., Dentici M. L., Vergara P., De Zorzi A., Versacci P., Digilio M. C., Marino B., Dallapiccola B. 2011. New mutations in ZFPM2/FOG2 gene in tetralogy of Fallot and double outlet right ventricle. Clin. Genet. 80: 184–190.

Den Dunnen J. T., Antonarakis S. E. 2000. Mutation nomenclature extensions and suggestions to describe complex mutations: a discussion. Hum. Mutat. 15: 7–12.

Dietz H., Kim D., Patel N., Lindsay M., Goldmuntz E., John A., Garbarini J. 2010. Calpain as a therapeutic target in inherited aortic aneurysm: lessons from rare mendelian disorders. 8th international research symposium on Marfan syndrome, Warrenton, VA, USA.

Esposito G., Butler T. L., Blue G. M., Cole A. D., Sholler G. F., Kirk E. P., Grossfeld P., Perryman B. M., Harvey R. P., Winlaw D. S. 2011. Somatic mutations in NKX2–5, GATA4 , and HAND1 are not a common cause of tetralogy of Fallot or hypoplastic left heart. Am. J. Med. Genet. A. 155(10): 2416–2421.

Francis C., Prapa S., Abdulkareem N., John S., Buchan R., Barton P., Jahangiri M., Gatzoulis M. A., Pepper J., Cook S. A. 2014. Identification of likely pathogenic variants in patients with bicuspid aortic valve: correlation of complex genotype with a more severe aortic phenotype. Heart. 100: A55 –A56.

French V. M., van de Laar I. M. B. H., Wessels M. W., Rohe C., RoosHesselink J. W., Wang G., FrohnMulder I. M. E., Severijnen L., de Graaf B. M., Schot R., Breedveld G., Mientjes E., van Tienhoven M., Jadot E., Jiang Z., Verkerk A., Swagemakers S., Venselaar H., Rahimi Z., Najmabadi H., MeijersHeijboer H., de Graaff E., Helbing W. A., Willemsen R., Devriendt K., Belmont J. W., Oastra B. A., Amack J. D., BertoliAvella A. M. 2012. NPHP4 variants are associated with pleiotropic heart malformations. Circ. Res. 110(12): 1564–1574.

Fung A., Manlhiot C., Naik S., Rosenberg H., Smythe J., Lougheed J., Mondal T., Chitayat D., McCrindle B. W., Mital S. 2013. Impact of prenatal risk factors on congenital heart disease in the current era. J. Am. Heart. Assoc. 2(3): e000064.

Fusco C., Micale L., Augello B., Pellico M. T., Menghini D., Alfieri P., Digilio M. C., Mandriani B., Carella M., Palumbo O., Vicari S., Merla G. 2014. Smaller and larger deletions of the Williams Beuren syndrome region implicate genes involved in mild facial phenotype, epilepsy and autistic traits. Eur. J. Hum. Genet. 22: 64–70.

Goldmuntz E., Bamford R., Karkera J. D., dela Cruz J., Roessler E., Muenke M. 2002. CFC1 mutations in patients with transposition of the great arteries and doubleoutlet right ventricle. Am. J. Hum. Genet. 70: 776–780.

Gong W., Gottlieb S., Collins J., Blescia A., Dietz H., Goldmuntz E., McDonald McGinn D. M., Zackai E. H., Emanuel B. S., Driscoll D. A., Budarf M. L. 2001. Mutation analysis of TBX1 in nondeleted patients with features of DGS/VCFS or isolated cardiovascular defects. J. Med. Genet. 38: c45.

GranadosRiveron J. T., Ghosh T. K., Pope M., Bu´Lock F., Thornborough C., Eason J., Kirk E. P., Fatkin D., Feneley M. P., Harvey R. P., Armour J. A. L., Brook J. D. 2010. αcardiac myosin heavy chain (MYH6 ) mutations affecting myofibril formation are associated with congenital heart defects. Hum. Mol. Genet. 19(20): 4007–4016.

Gripp K. W., Hopkins E., Jenny K., Thacker D., Salvin J. 2012. Cardiac anomalies in AxenfeldRieger syndrome due to a novel FOXC1 mutation. Am. J. Med. Genet. A. 161: 114 –119.

Guo Y., Shen J., Yuan L., Li F., Wang J., Sun K. 2010. Novel CRELD1 gene mutations in patients with atrioventricular septal defect. World J. Pediatr. 6(4): 348– 352.

Heathcote K., Braybrook C., Abushaban L., Guy M., Khetyar M. E., Patton M. A., Carter N. D., Scambler P. J., Syrris P. 2005. Common arterial trunk associated with a homeodomain mutation of NKX2.6. Hum. Mol. Genet. 14(5): 585–593.

Hershberger R. E., Parks S. B., Kushner J. D., Li D., Ludwigsen S., Jakobs P., Nauman D., Burgess D., Partain J., Litt M. 2008. Coding sequence mutations identified in MYH7 , TNNT2 , SCN5A , CSRP3 , LBD3 , and TCAP from 313 patients with familial or idiopathic dilated cardiomyopathy. Clin. Transl. Sci. 1(1): 21–26.

Hoffman J. I. E., Kaplan S. 2002. The incidence of congenital heart disease. J. Am. Coll. Cardiol. 39(12): 1890–1900.

Holt M., Oram S. 1960. Familial heart disease with skeletal malformations. Br. Heart. J. 22(2): 236–242.

Honein M. A., Moore C. A., Daniel K. L., Erickson J. D. 2002. Problems with informing women adequately about teratogen risk: some barriers to preventing exposures to known teratogens. Teratology. 65: 199–205.

Chang S., Mislankar M., Misra C., Huang N., DaJusta D. G., Harrison S. M., McBride K. L., Baker L. A., Garg V. 2013. Genetic abnormalities in FOXP1 are associated with congenital heart defects. Hum. Mutat. 34: 1226–1230.

Chen Ch., Bentham J., Cosgrove C., Braganca J., Cuenda A., Bamforth S. D., Schneider J. E., Watkins H., Keavney B., Davies B., Bhattacharya S. 2012. Functional signifikance of SRJ domain mutations in CITED2 . PLOS ONE. 7(10): e46256.

Chen Y., Zhao W., Zhang Z., Fu Q., Shen J., Zhang Z., Ji W., Wang J., Li F. 2011. Familial nonsyndromic patent ductus arteriosus caused by mutations in TFAP2B . Pediatr. Cardiol. 32(7): 958–965.

Cheng Z., Wang J., Su D., Pan H., Huang G., Li X., Li Z., Shen A., Xie X., Wang B., Ma X. 2011. Two novel mutations of the IRX4 gene in patiens with congenital heart disease. Hum. Genet. 130: 657–662.

Jääskeläinen P., Kuusisto J., Miettinen R., Kärkkäinen S., Heikkinen S., Peltola P., Pihlajamäki J., Vauhkonen I., Laakso M. 2002. Mutations in the cardiac myosin binding protein C gene are the predominant cause of familial hypertrophic cardiomyopathy in eastern Finland. J. Mol. Med. 80: 412 –422.

Johnston J. J., Sapp J. C., Curry C., Horton M., Leon E., CusmanoOzog K., Dobyns W. B., Hudgins L., Zackai E., Biesecker L. G. 2014. Expansion of the TARP syndrome phenotype associated with de novo mutations and mosaicism. Am. J. Med. Genet. A. 164: 120–128.

Jurado L. A. P., Peoples R., Kaplan P., Hamel B. C. J., Francke U. 1996. Molecular definition of the chromosome 7 deletion in Williams syndrome and parentoforigin effects on growth. Am. J. Hum. Genet. 59: 781–792.

Kamath B. M., Bauer R. C., Loomes K. M., Chao G., Gerfen J., Hutchinson A., Hardikar W., Hirschfield G., Jara P., Krantz I. D., Lapunzina P., Leonard L., Ling S., Ng V. L., Hoang P. L., Piccoli D. A., Spinner N. B. 2012. NOTCH2 mutations in Alagille syndrome. J. Med. Genet. 49:138–144.

Karkera J. D., Lee J. S., Roessler E., BanerjeeBasu S., Ouspenskaia M. V., Mez J., Goldmuntz E., Bowers P., Towbin J., Belmont J. W., Baxevanis A. D., Schier A. F., Muenke M. 2007. Lossoffunction mutations in growth differentiation factor1 (GDF1 ) are associated with congenital heart defects in humans. Am. J. Hum. Genet. 81: 987– 994.

Keller D. I., Coirault C., Rau T., Cheav T., Weyand M., Amann K., Lecarpentier Y., Richard P., Eschenhagen T., Carrier L. 2004. Human homozygous R403W mutant cardiac myosin presents disproportionate enhancement of mechanical and enzymatic properties. J. Mol. Cell. Cardiol. 36: 355 –362.

Kirk E. P., Sunde M., Costa M. W., Rankin S. A., Wolstein O., Castro M. L., Butler T. L., Hyun C., Guo G., Otway R., Mackay J. P., Waddell L. B., Cole A. D., Hayward C., Keogh A., Macdonald P., Griffiths L., Fatkin D., Sholler G. F., Zorn A. M., Feneley M. P., Winlaw D. S., Harvey R. P. 2007. Mutations in cardiac Tbox factor gene TBX20 are associated with diverse cardiac pathologies, including defects of septation and valvulogenesis and cardiomyopathy. Am. J. Hum. Genet. 81: 280–291.

Kodo K., Nishizawa T., Furutani M., Arai S., Yamamura E., Joo K., Takahashi T., Matsuoka R., Yamagishi H. 2009. GATA6 mutations cause human cardiac outflow tract defects by disrupting semaphorinplexin signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106: 13933–13938.

Kosaki K., Bassi M. T., Kosaki R., Lewin M., Belmont J., Schauer G., Casey B. 1999b. Characterization and mutation analysis of human LEFTY A and LEFTY B , homologues of murine genes implicated in leftright axis development. Am. J. Hum. Genet. 64: 712–721.

Kosaki R., Gebbia M., Kosaki K., Lewin M., Bowers P., Towbin J. A., Casey B. 1999a. Leftright axis malformations associated with mutations in ACVR2B , the gene for human activin receptor type IIB. Am. J. Med. Genet. 82: 70–76.

Kyndt F., Gueffet J. P., Probst V., Jaafar P., Legendre A., Le Bouffant F., Toquet C., Roy E., McGregor L., Lynch S. A., NewburyEcob R., Tran V., Young I., Trochu J., Le Marec H., Schott J. 2007. Mutations in the gene encoding filamin A as a cause for familial cardiac valvular dystrophy. Circulation. 115: 40–49.

Kyndt F., Probst V., Potet F., Demolombe S., Chevallier J., Baro I., Moisan J., Boisseau P., Schott J., Escande D., Le Marec H. 2001. Novel SCN5A mutation leading either to isolated cardiac conduction defect or Brugada syndrome in a large french family. Circulation. 104: 3081–3086.

Lalani S. R., Safiullah A. M., Fernbach S. D., Harutyunyan K. G., Thaller C., Peterson L. E., McPherson J. D., Gibbs R. A., White L. D., Hefner M., Davenport S. L. H., Graham J. M., Bacino C. A., Glass N. L., Towbin J. A., Craigen W. J., Neish S. R., Lin A. E., Belmont J. W. 2006. Spectrum of CHD7 mutations in 110 individuals with CHARGE syndrome and genotypephenotype correlation. Am. J. Hum. Genet. 78: 303–314.

Lalani S. R., Safiullah A. M., Molinari L. M., Fernbach S. D., Martin D. M., Belmont J. W. 2004. SEMA3E mutation in a patient with CHARGE syndrome. J. Med. Genet. 41:e94.

Lalani S. R., Ware S. M., Wang X., Zapata G., Tian G., Franco L. M., Jiang Z., Bucasas K., Scott D. A., Campeau P. M., Hanchard N., Umaña L., Cast A., Patel A., Cheung S. W., McBride K. L., Bray M., Chinault A. C., Boggs B. A., Huang M., Baker M. R., Hamilton S., Towbin J., Jefferies J. L., Fernbach S. D., Potocki L., Belmont J. W. 2013. MCTP2 is a dosagesensitive gene required for cardiac outflow tract development. Hum. Mol. Genet. 22(21): 4339–4348.

Lambrechts D., Devriendt K., Driscoll D. A., Goldmuntz E., Gewillig M., Vlietinck R., Collen D., Carmeliet P. 2005. Low expression VEGF haplotype increases the risk for tetralogy of Fallot: a family based association study. J. Med. Genet. 42:519–522.

Li Q. Y., NewburyEcob R. A., Terrett J. A., Wilson D. I., Curtis A. R. J., Yi C. H., Gebuhr T., Bullen P. J., Robson S. C., Strachan T., Bonnet D., Lyonnet S., Young I. D., Raeburn J. A., Buckler A. J., Law D. J., Brook J. D. 1997. HoltOram syndrome is caused by mutations in TBX5 , a member of the Brachyury (T) gene family. Nat. Genet. 15: 21–29.

Linden H., Williams R., King J., Blair E., Kini U. 2009. Ulnar mammary syndrome and TBX3 : Expanding the phenotype. Am. J. Med. Genet. A. 149: 2809–2812.

Maslen C. L., Babcock D., Robinson S. W., Bean L. J. H., Dooley K. J., Willour V. L., Sherman S. L. 2006. CRELD1 mutations contribute to the occurence of cardiac atrioventricular septal defects in Down syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 140: 2501– 2505.

Matsson H., Eason J., Bookwalter C. S., Klar J., Gustavsson P., Sunnegårdh J., Enell H., Jonzon A., Vikkula M., Gutierrez I., GranadosRiveron J., Pope M., Bu´Lock F., Cox J., Robinson T. E., Song F., Brook D. J., Marston S., Trybus K. M., Dahl N. 2008. Alphacardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum. Mol. Genet. 17: 256–265.

McBride K. L., Riley M. F., Zender G. A., FitzgeraldButt S. M., Towbin J. A., Belmont J. W., Cole S. E. 2008. NOTCH1 mutations in individuals with left ventricular outflow tract malformations reduce ligandinduced signaling. Hum. Mol. Genet. 17(18): 2886–2893.

McDermott D. A., Bressan M. C., He J., Lee J. S., Aftimos S., Brueckner M., Gilbert F., Graham G. E., Hannibal M. C., Innis J. W., Pierpont M. E., Raas Rothschild A., Shanske A. L., Smith W. E., Spencer R. H., JohnSutton M. G., Van Maldergem L., Waggoner D. J., Weber M., Basson C. T. 2005. TBX5 genetic testing validates strict clinical criteria for HoltOram syndrome. Pediatr. Res. 58(5): 981 –986.

McElhinney D. B., Geiger E., Blinder J., Blinder J., Benson D. W., Goldmuntz E. 2003. NKX2.5 mutations in patients with congenital heart disease. J. Am. Coll. Cardiol. 42(9): 1650–1655.

Metcalfe K., Rucka A. K., Smoot L., Hofstadler G., Tuzler G., McKeown WP., Siu V., Rauch A., Dean J., Dennis N., Ellis I., Reardon W., Cytrynbaum C., Osborne L., Yates J. R., Read A. P., Donnai D., Tassabehji M. 2000. Elastin: mutational spectrum in supravalvular aortic stenosis. Eur. J. Hum. Genet. 8: 955–963.

Mohapatra B., Casey B., Li H., HoDawson T., Smith L., Fernbach S. D., Molinari L., Niesh S. R., Jefferies J. L., Craigen W. J., Towbin J. A., Belmont J. W., Ware S. M. 2009. Identification and functional characterization of NODAL rare variants in heterotaxy and isolated cardiovascular malformations. Hum. Mol. Genet. 18(5): 861– 871.

MoolmanSmook J. C., De Lange W. J., Bruwer E. C. D., Brink P. A., Corfield V. A. 1999. The origins of hypertrophic cardiomyopathycausing mutations in two South African subpopulations: a unique profile of both independent and founder events. Am. J. Hum. Genet. 65: 1308–1320.

Mörner S., Richard P., Kazzam E., Hellman U., Hainque B., Schwartz K., Waldenström A. 2003. Identification of the genotypes causing hypertrophic cardiomyopathy in northern Sweden. J. Mol. Cell. Cardiol. 35: 841–849.

Muncke N., Jung C., Rudiger H., Ulmer H., Roeth R., Hubert A., Goldmuntz E., Driscoll D., Goodship J., Schön K., Rappold G. 2003. Missense mutations and gene interruption in PROSIT240 , a novel TRAP240like gene, in patients with congenital heart defect (transposition of the great arteries). Circulation. 108: 2843–2850.

NewburyEcob R. A., Leanage R., Raeburn J. A., Young I. D. 1996. HoltOram syndrome: a clinical genetic study. J. Med. Genet. 33: 300 –307.

Nora J. J. 1968. Multifactorial inheritance hypothesis for the etiology of congenital heart diseases: the geneticenvironmental interaction. Circulation. 38: 604 –617.

O´Brien J. E., Kibiryeva N., Zhou X., Marshall J. A., Lofland G. K., Artman M., Chen J., Bittel D. C. 2012. Noncoding RNA expression in myocardium from infants with tetralogy of Fallot. Cir. Cardiovasc. Genet. 5(3): 279 –286.

Oster M. E., RiehleColarusso T., Alverson C. J., Correa A. 2011. Associations between maternal fever and influenza and congenital heart defects. J. Pediatr. 158: 990 –995.

Padang R., Bagnall R. D., Richmond D. R., Bannon P. G., Semsarian C. 2012. Rare nonsynonymous variations in the transcriptional activation domains of GATA5 in bicuspid aortic valve disease. J. Mol. Cell. Cardiol. 53: 277 –281.

Pavan M., Ruiz V. F., Silva F. A., Sobreira T. J., Cravo R. M., Vasconcelos M., Marques L. P., Mesquita S., Krieger J. E., Lopes A., Oliveira P. S., Pereira A. C., XavierNeto J. 2009. ALDH1A2 (RALDH2 ) genetic variation in human congenital heart disease. BMC Med. Genet. 10: 113.

Perles Z., Cinnamon Y., TaShma A., Shaag A., Einbinder T., Rein A. J. J. T., Elpeleg O. 2012. A human laterality disorder associated with recessive CCDC11 mutation. J. Med. Genet. 49: 386 –390.

Postma A. V., van Engelen K., van de Meerakker J., Rahman T., Probst S., Baars M. J. H., Bauer U., Pickardt T., Sperling S. R., Berger F., Moorman A. F. M., Mulder B. J. M., Thierfelder L., Keavney B., Goodship J., Klaassen S. 2011. Mutations in the sarcomere gene MYH7 in Ebstein anomaly. Circ. Cardiovasc. Genet. 4: 43–50.

Ransom J. F., King I. N., Garg V., Srivastava D. 2008. A rare human sequence variant reveals myocardin autoinhibition. J. Biol. Chem. 283(51): 35845–35852 .

Richard P., Charron P., Carrier L., Ledeuil C., Cheav T., Pichereau C., Benaiche A., Isnard R., Dubourg O., Burban M., Gueffet J., Millaire A., Desnos M., Schwartz K., Hainque B., Komajda M. 2003. Hypertrophic cardiomyopathy: distribution of disease genes, spectrum of mutations, and implications for a molecular diagnosis strategy. Circulation. 107: 2227–2232.

Richards C. S., Bale S., Bellissimo D. B., Das S., Grody W. W., Hegde M. R., Lyon E., Ward B. E., Molecular subcommittee of the ACMG laboratory quality assurance committee. 2008. ACMG recommendations for standards for interpretation and reporting of sequence variations: revision 2007. Genet. Med. 10(4): 294–300.

Roberts K. E., McElroy J. J., Wong W. P. K., Yen E., Widlitz A., Barst R. J., Knowles J. A., Morse J. H. 2004. BMPR2 mutations in pulmonary arterial hypertension with congenital heart disease. Eur. Respir. J. 24: 371–374.

Robinson S. W., Morris C. D., Goldmuntz E., Reller M. D., Jones M. A., Steiner R. D., Maslen C. L. 2003. Missense mutations in CRELD1 are associated with cardiac atrioventricular septal defects. Am. J. Hum. Genet. 72: 1047–1052.

Roessler E., Ouspenskaia M. V., Karkera J. D., Vélez J. I., Kantipong A., Lacbawan F., Bowers P., Belmont J. W., Towbin J. A., Goldmuntz E., Feldman B., Muenke M. 2008. Reduced NODAL signaling strength via mutation of several pathway members including FOXH1 is linked to human heart defects and holoprosencephaly. Am. J. Hum. Genet. 83: 18–29.

Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. 1977. DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74(12): 5463–5467.

Shen L., Li X., Shen A., Wang Q., Liu C., Guo Y., Song Z., Li Z. 2010. Transcription factor HAND2 mutations in sporadic Chinese patients with congenital heart disease. Chin. Med. J. 123(13):1623–1627.

Smith K. A., Joziasse I. C., Chocron S., van Dinther M., Guryev V., Verhoeven M. C., Rehmann H., van der Smagt J. J., Doevendans P. A., Cuppen E., Mulder B. J., ten Dijke P., Bakkers J. 2009. Dominantnegative ALK2 allele associates with congenital heart defects. Circulation. 119: 3062–3069.

Soemedi R., Topf A., Wilson I. J., Darlay R., Rahman T., Glen E., Hall D., Huang N., Bentham J., Bhattacharya S., Cosgrove C., Brook J. D., GranadosRiveron J., Setchfield K., Bu´Lock F., Thornborough C., Devriendt K., Breckpot J., Hofbeck M., Lathrop M., Rauch A., Blue G. M., Winlaw D. S., Hurles M., SantibanezKoref M., Cordell H. J., Goodship J. A., Keavney B. D. 2012. Phenotypespecific effect of chromosome 1q21.1 rearrangements and GJA5 duplications in 2436 congenital heart disease patients and 6760 controls. Hum. Mol. Genet. 21(7): 1513–1520.

Sperling S., Grimm C. H., Dunkel I., Mebus S., Sperling H., Ebner A., Galli R., Lehrach H., Fusch C., Berger F., Hammer S. 2005. Identification and functional analysis of CITED2 mutations in patients with congenital heart defects. Hum. Mutat. 26(6): 575–582.

Srivastava D., Olson E. N. 2000. A genetic blueprint for cardiac development. Nature. 407: 221–226.

Stańczak P., Witecka J., Szydło A., Gutmajster E., Lisik M., AuguściakDuma A., Tarnowski M., Czekaj T., Czekaj H., Sieroń A. L. 2009. Mutations in mammalian tolloidlike 1 gene detected in adult patients with ASD. Eur. J. Hum. Genet. 17: 344– 351.

Stirnimann C. U., Ptchelkine D., Grimm C., Müller C. W. 2010. Structural basis of TBX5DNA recognition: the Tbox domain in its DNAbound and unbound form. J. Mol. Biol. 400: 71–81.

Sutherland M. J., Ware S. M. 2009. Disorders of leftright asymmetry: heterotaxy and situs inversus. Am. J. Med. Genet. 151: 307 –317.

Szema A. M., Hamiti S. A., Smith S. D., Benveniste H. 2013. VIP gene deletion in mice causes cardiomyopathy associated with upregulation of heart failure genes. PLOS ONE. 8(5): e61449.

Šípek A., Gregor V., Šípek A. jr., Hudáková J., Horáček J., Klaschka J., Skibová J., Langhammer P., Petržílková L., Klímová B., Peřinová B., Wiesnerová J. 2010. Incidence vrozených srdečních vad v České republice aktuální data. Čes. Gynek. 75(3): 221–242.

Taberlet P., Griffin S., Goossens B., Questiau S., Manceau V., Escaravage N., Waits L. P., Bouvet J. 1996. Reliable genotyping of samples with very low DNA quantities using PCR. Nucleic Acids Res. 24(16): 3189–3194.

Tan H. L., Glen E., Töpf A., Hall D., O´Sullivan J. J., Sneddon L., Wren C., Avery P., Lewis R. J., ten Dijke P., Arthur H. M., Goodship J. A., Keavney B. D. 2012. Nonsynonymous variants in the SMAD6 gene predispose to congenital cardiovascular malformation. Hum. Mutat. 33: 720–727.

Tariq M., Belmont J. W., Lalani S., Smolarek T., Ware S. M. 2011. SHROOM3 is a novel candidate for heterotaxy identified by whole exome sequencing. Genome Biol. 12: R91.

Tennstedt C., Chaoui R., Körner H., Dietel M. 1999. Spectrum of congenital heart defects and extracardiac malformations associated with chromosomal abnormalities: results of a seven year necropsy study. Heart. 82: 34 –39.

Thienpont B., Zhang L., Postma A. V., Breckpot J., Tranchevent L., Van Loo P., Møllgård K., Tommerup N., Bache I., Tümer Z., van Engelen K., Menten B., Mortier G., Waggoner D., Gewillig M., Moreau Y., Devriendt K., Larsen L. A. 2010. Haploinsufficiency of TAB2 causes congenital heart defects in humans. Am. J. Hum. Genet. 86: 839–849.

TomitaMitchell A., Maslen C. L., Morris C. D., Garg V., Goldmuntz E. 2007. GATA4 sequence variants in patients with congenital heart disease. J. Med. Genet. 44: 779–783.

ÚZIS ČR. 2013. Vrozené vady u narozených v roce 2011 (Congenital malformations in births in year 2011), zdravotnická statistika. ÚZIS ČR.

Wang A., Kong D., Chen D., Wan J., Yu Y. 2010. Mutation of V896M in cardiac myosin binding proteinc gene in two Chinese families with hypertrophic cardiomyopathy. Mol. Med. Rep. 3: 759 –763.

Wang B., Li L., Xie X., Wang J., Yan J., Mu Y., Ma X. 2009. Genetic variation of SALLike 4 (SALL4 ) in ventricular septal defect. Int. J. Cardiol. 145(2): 224–226.

Ware S. M., Peng J., Zhu L., Fernbach S., Colicos S., Casey B., Towbin J., Belmont J. W. 2004. Identification and functional analysis of ZIC3 mutations in heterotaxy and related congenital heart defects. Am. J. Hum. Genet. 74: 93–105.

Watkins M. L., Botto L. D. 2001. Maternal prepregnancy weight and congenital heart defects in the offspring. Epidemiology. 12(4): 439–446.

Wei D., Bao H., Liu X., Zhou N., Wang Q., Li R., Xu Y., Yang Y. 2013. GATA5 loss offunction mutations underlie tetralogy of Fallot. Int. J. Med. Sci. 10(1): 34–42.

Wren C., Birrell G., Hawthorne G. 2003. Cardiovascular malformations in infants of diabetic mothers. Heart. 89: 1217–1220.

Yagi H., Furutani Y., Hamada H., Sasaki T., Asakawa S., Minoshima S., Ichida F., Joo K., Kimura M., Imamura S., Kamatani N., Momma K., Takao A., Nakazawa M., Shimizu N., Matsuoka R. 2003. Role of TBX1 in human del22q11.2 syndrome. Lancet. 362: 1366 –1373.

Zahka K., Kalidas K., Simpson M. A., Cross H., Keller B. B., Galambos C., Gurtz K., Patton M. A., Crosby A. H. 2008. Homozygous mutation of MYBPC3 associated with severe infantile hypertrophic cardiomyopathy at high frequency among the Amish. Heart. 94: 1326–1330.

Zaidi S., Choi M., Wakimoto H., Ma L., Jiang J., Overton J. D., RomanoAdesman A., Bjornson R. D., Breitbart R. E., Brown K. K., Carriero N. J., Cheung Y. H., Deanfield J., DePalma S., Fakhro K. A., Glessner J., Hakonarson H., Italia M. J., Kaltman J. R., Kaski J., Kim R., Kline J. K., Lee T., Leipzig J., Lopez A., Mane S. M., Mitchell L. E., Newburger J. W., Parfenov M., Pe’er I., Porter G., Roberts A. E., Sachidanandam R., Sanders S. J., Seiden H. S., State M. W., Subramanian S., Tikhonova I. R., Wang W., Warburton D., White P. S., Williams I. A., Zhao H., Seidman J. G., Brueckner M., Chung W. K., Gelb B. D., Goldmuntz E., Seidman C. E., Lifton R. P. 2013. De novo mutations in histonemodifying genes in congenital heart disease. Nature. 498: 220–224.

Zhao F., Weismann C. G., Satoda M., Pierpont M. E. M., Sweeney E., Thompson E. M., Gelb B. D. 2001. Novel TFAP2B mutations that cause Char syndrome provide a genotypephenotype correlation. Am. J. Hum. Genet. 69: 695–703.

Zhu L., Vranckx R., Khau Van Kien P., Lalande A., Boisset N., Mathieu F., Wegman M., Glancy L., Gasc J., Brunotte N., Bruneval P., Wolf J., Michel J., Jeunemaitre X. 2006. Mutations in myosin heavy chain 11 cause a syndrome associating thoracic aortic aneurysm/aortic dissection and patent ductus arteriosus. Nat. Genet. 38: 343–349.

8. 2. Elektronické zdroje

Agilent 2200 TapeStation. User manual. Edition 10/2013. Sample Preparation D1000 ScreenTape Assay. [online]. 2013. [cit. 20150224]. Dostupné z: www.chem.agilent.com/library/usermanuals/Public/G2964 90002_TapeStationPalpatine_USR_EN.pdf.

Agilent 2200 TapeStation. User manual. Edition 11/2012. Sample Preparation (D1K Assay). [online]. 2012. [cit. 20150224]. Dostupné z:

98 http://www.chem.agilent.com/library/usermanuals/Public/G2964 90001_TapeStationPalpatine_USR_EN.pdf.

Agilent Technologies, a. HaloPlex Custom Kits Details & Specifications. [online]. 2015. [cit. 20150415]. Dostupné z: http://www.genomics.agilent.com/article.jsp?crumbAction=push&pageId=3061.

Agilent Technologies, b. SureCall. [online]. 2015. [cit. 20150308]. Dostupné z: http://www.genomics.agilent.com/en/NGSDataAnalysisSoftware/SureCall/?cid=AG PT154&tabId=AGPR1196.

BaseSpace User Guide, Illumina. Part # 15044182 Rev. D, June2014. [online]. 2014. [cit. 20150226]. Dostupné z: https://da1s119xsxmu0.cloudfront.net/sites/knowledgebase/userguide/07112014/UserGu ide%20PDF/basespaceuserguide15044182d.pdf.

COSMIC Catalogue of somatic mutations in cancer. [online]. 2015. [cit. 201503 18]. Dostupné z: http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic.

Cytogenetická laboratoř Brno, s.r.o. Souhlas vyšetřované/ho (zákonného zástupce) s genetickým laboratorním vyšetřením. [online]. 2012. [cit. 20150219]. Dostupné z: http://www.cytogenetika.cz/upload/1394448757.pdf.

Dietz H. RE: Request a complex mutant allele (R527C/P2423S) of FLNA gene [elektronická pošta]. Message to: [email protected]. 20141108 [cit. 20150314]. Osobní komunikace.

Ensembl. Release 75, 76, 77, 78, 79 . [online]. 2014. [cit. 20150218]. Dostupné z: http://www.ensembl.org/index.html.

GeneCards ® The human gene compendium. [online]. 2015. [cit. 20150218]. Dostupné z: http://www.genecards.org/.

HaloPlex Target Enrichment System For Illumina Sequencing, Protocol version D.5, May 2013, Agilent Technologies. [online]. 2013. [cit. 20150224]. Dostupné z: http://www.chem.agilent.com/Library/usermanuals/Public/G990090001.pdf.

HUGO gene nomenclature committee. [online]. 2015. [cit. 20150218]. Dostupné z: http://www.genenames.org/.

Illumina, a. Sequencing by synthesis (SBS) technology. Sequencing technology video. [online]. 2015. [cit. 20150218]. Dostupné z: http://www.illumina.com/technology/nextgenerationsequencing/sequencing technology.html.

Illumina, b. Sequencing systems. [online]. 2015. [cit. 20150226]. Dostupné z: http://www.illumina.com/systems/sequencing.html .

Illumina, c. MiSeq Reagent Kits v2. [online]. 2015. [cit. 20150302]. Dostupné z: http://www.illumina.com/products/miseq_reagent_kit_v2.html. Illumina, d. MiSeq Specifications. [online]. 2015. [cit. 20150331]. Dostupné z: http://www.illumina.com/systems/miseq/performance_specifications.html.

Life Technologies. Invitrogen. Comparison of fluorescencebased quantitation with UV absorbance measurements. [online]. 2014. [cit. 20150224]. Dostupné z: https://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/global/life sciences/Laboratory%20Instruments/Files/1014/Qubitfluorometricquantitationvs spectrophotometermeasurements.pdf.

LOVD. Leiden Open Variation Database. [online]. 2015. [cit. 20150309]. Dostupné z: http://www.lovd.nl/3.0/home.

MiSeq ® System User Guide, Illumina. Part # 15027617 Rev. H, March 2013. [online]. 2013. [cit. 20150324]. Dostupné z: http://application.sb roscoff.fr/download/fr2424/abims/corre/ngs/1_illumina/MiSeq%20System%20User%20 Guide%20%2815027617%29.pdf.

MiSeq ® System User Guide, Illumina. Part # 15027617 Rev. M, January 2014. [online]. 2014. [cit. 20150226]. Dostupné z: http://supportres.illumina.com/documents/documentation/system_documentation/miseq/ miseqsystemuserguide15027617m.pdf.

NCBI National center for biotechnology information. Database ClinVar. [online]. 2014. [cit. 20150314]. Dostupné z: www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar.

NCBI National center for biotechnology information. Database dbSNP. [online]. 2014. [cit. 20150314]. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp.

NCBI National center for biotechnology information. Database Gene. [online]. 2014. [cit. 20150218]. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene.

NCBI National center for biotechnology information. Database PubMed. [online]. 2014. [cit. 20150218]. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed.

NHLBI Exome Sequencing Project (ESP). Exome variant server. [online]. 2015. [cit. 20150318]. Dostupné z: http://evs.gs.washington.edu/EVS.

OMIM ® Online mendelian inheritance in man. [online]. 2015. [cit. 20150218]. Dostupné z: http://www.omim.org/.

Practice guidelines for the evaluation of pathogenicity and the reporting of sequence variants in clinical molecular genetics. Wallis Y., Payne S., McAnulty C., Bodmer D., Sistermans E., Robertson K., Moore D., Abbs S., Deans Z., Devereau A. ACGS/VGKL. [online]. 2013. [cit. 20150209]. Dostupné z: http://www.acgs.uk.com/media/774853/evaluation_and_reporting_of_sequence_variants _bpgs_june_2013__finalpdf.pdf.

100

Preparing Libraries for Sequencing on the Miseq ®, Illumina, Part # 15039740 Rev. D, October 2013. [online]. 2013. [cit. 20150225]. Dostupné z: http://supportres.illumina.com/documents/documentation/system_documentation/miseq/ preparinglibrariesforsequencingonmiseq15039740d.pdf.

PrimerBLAST. NCBI. A tool for finding specific primers. [online]. 2015. [cit. 2015 0309]. Dostupné z: www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast.

Qubit TM dsDNA HS Assay Kits. Invitrogen. [online]. 2010. [cit. 20150224]. Dostupné z: www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf.

SNPeffect 4.0. Switch Laboratory. [online]. 2014. [cit. 20150309]. Dostupné z: http://snpeffect.switchlab.org.

SureDesign. Agilent Technologies. [online]. 2015. [cit. 20150220]. Dostupné z: https://earray.chem.agilent.com/suredesign/index.htm.

SureDesign. Agilent Technologies. Help. [online]. 2015. [cit. 20150224]. Dostupné z: https://earray.chem.agilent.com/suredesign/help/WebHelp.htm#HaloPlex_probe_group_ wizard_Add_Content_Tile_Genes_or_Regions.htm.

UCSC Genome Browser. [online]. 2015. [cit. 20150220]. Dostupné z: http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgTracks?db=hg19&position=chr1%3A5922845 147245509&hgsid=413497451_hIAoicjxnZhHKQ0mwaKdXtdvgE9n.

UniProt The universal protein resource. [online]. 2015. [cit. 20150218]. Dostupné z: http://www.uniprot.org/.

101

Přílohy

Příloha č. 1. Predikce „missed regions“ (v protokolu HaloPlex Target Enrichment System ne amplifikovaných cílových oblastí) v exonech sedmi genů (UCSC Genome Browser) a reálná NGS data po mutační anal ýze u vybraných čtyř vzorků (IGV ).

FOXC1 (predikce)

FOXC1 (reálná NGS data)

Příloha č. 1a. Predikce nepokryté oblasti v exonu genu FOXC1 (UCSC Genome Browser) a reálná NGS data po mutační analýze u vybraných čtyř vzorků (IGV).

GJA1 (predikce)

GJA1 (reálná NGS data)

Příloha č. 1b. Predikce nepokryté oblasti v exonu genu GJA1 (UCSC Genome Browser) a reálná NGS data po mutační analýze u vybraných čtyř vzorků (IGV).

MYH1 (predikce)

MYH1 (reálná NGS data)

Příloha č. 1c. Predikce nepokryté oblasti v exonu genu MYH1 (UCSC Genome Browser) a reálná NGS data po mutační analýze u vybraných čtyř vzorků (IGV).

NOTCH2 (predikce)

NOTCH2 (reálná NGS data)

Příloha č. 1d. Predikce nepokryté oblasti v exonu genu NOTCH2 (UCSC Genome Browser) a reálná NGS data po mutační analýze u vybraných čtyř vzorků (IGV).

SCN5A - oblast A (predikce)

SCN5A – oblast A (reálná NGS data)

Příloha č. 1e. Predikce nepokryté oblasti A v exonu genu SCN5A (UCSC Genome Browser) a reálná NGS data po mutační analýze u vybraných čtyř vzorků (IGV).

SCN5A - oblast B (predikce)

SCN5A - oblast B (reálná NGS data)

Příloha č. 1f. Predikce nepokryté oblasti B v exonu genu SCN5A (UCSC Genome Browser) a reálná NGS data po mutační analýze u vybraných čtyř vzorků (IGV).

SHROOM 3 (predikce)

SHROOM 3 (reálná NGS data)

Příloha č. 1g. Predikce nepokryté oblasti v exonu genu SHROOM3 (UCSC Genome Browser) a reálná NGS data po mutační analýze u vybraných čtyř vzorků (IGV).

TBX20 (predikce)

TBX20 (reálná NGS data)

Příloha č. 1h. Predikce nepokryté oblasti v exonu genu TBX20 (UCSC Genome Browser) a reálná NGS data po mutační analýze u vybraných čtyř vzorků (IGV).

Příloha č. 2. Výsledek Sangerova sekvenování experimentálně vytvořeného „heterozygota“ pro ověření možnosti preferenční amplifikace alely s delecí šesti nukleotidů v genu CITED2 .

Část A Úsek chromatogramu oblasti genu CITED2 s místem varianty c.608_613delGCGGCA ( p.Ser203_Gly204del) u experimentálně připraveného „heterozygota“ vytvořeného smícháním standardního vzorku se vzorkem DNA plodu č. 18 (II. běh) . Část B stejný úsek standardní DNA. N a sekvenci standardu je obdélníkovým rámečkem znázorněno šest nukleotidů , které jsou deletovány u heterozygota.