(J?jpu6Ei.que de Côte cf'! 'Voire Union-Oiscipline-Trauaii 'Ministère de l''Ensei[JnementSupérieuret ae (a (J?ecfzercfie Scie11tifùiue IIVEIISITE NANGUIABROGOUA UFR des Sciences et Technologies des Aliments
Année Universitaire 2014-2015 THESE UNIQUE
Pour l'obtention du titre de Docteur de l'Université Nangui Abrogoua
Spécialité : Microbiologie et sécurité alimentaire
Numéro d'ordre Présentée par : KOSSONOU Y ao Kamelé
THEME
Caractérisation des champignons d'altération de trois fruits et légumes et évaluation de l'activité antifongique des extraits de dix plantes médicinales sur ces champignons
Commission d'examen :
- Monsieur BOHOUA Louis Guichard, Professeur Titulaire, UNA, Président - Monsieur TANO Kablan, Professeur Titulaire, UNA, Co-Directeur Soutenu publiquement - Monsieur TRA Bi Fézan Honora, Maître de Conférences, UNA, Co-Directeur Le 16/01/2016 - Monsieur ZlRIHI Guédé Noël, Professeur Titulaire, UFHB, Rapporteur -Madame KOUSSEMON Marina, Pofesseur Titulaire, UNA, Rapporteur - Monsieur KOUAKOU Tanoh Hilaire, Maître de Conférences, UNA, Examinateur - Monsieur KONE Mamidou Witabouna, Maître de Conférences, UNA, Examinateur DEDICACE
Je dédie cette thèse à : - Mon père et ma mère ,- - Mon épouse et mes enfants ; -Mon défunt grand frère Koffi Michel. REMERCIEMENTS
Il m'est particulièrement agréable d'exprimer ma très sincère gratitude à toutes les personnes qui ont contribué à la réalisation de cette thèse. Je remercie d'abord le Professeur TANO Yao, Président de l'Université Nangui Abrogoua et le Professeur COUL!BALY Lacina, Vice-Président de cette institution. Ensuite, je suis redevable à tous ceux qui, de près ou de loin, ont permis la réalisation de ce travail. Je tiens, tout particulièrement, à remercier: - le Professeur BOHOUA Louis Guichard, Professeur Titulaire, Doyen de l'UFR des Sciences et Technologies des Aliments, pour l'honneur qu'il m'a fait en acceptant de présider ce jury, malgré ses nombreuses occupations universitaires et administratives, - les Professeurs TANO Kablan et TRA Bi Fézan Honora, co-Directeurs de cette thèse, qui ont orienté et rendu possible ce travail par leurs conseils et suggestions. Pour toute l'attention et le soutien dontj'ai bénéficié de leur part,je leur exprime toute ma satisfaction et ma gratitude; - les Professeurs Z1RTHT Guédé Noël et KOUSSEMON Marina, Professeurs Titulaires respectivement à l'UFHB et à l'UNA, pour avoir accepté d'être rapporteurs de ce travail et membre de ce jury. Je vous suis très reconnaissant pour la forme donnée à ce travail, - les Professeurs KOUAKOU Tanoh Hilaire et KONE Mamidou Witabouna, Maîtres de Conférences à l'UNA, pour l'intérêt qu'ils ont porté à examiner ce travail. Merci pour la pertinence de vos critiques. -le Professeur Diallo A. Hortense, pour avoir accepté qu'une partie de ces travaux soit réalisée sous son contrôle. Je n'oublie pas le Dr KRA qui m'a aidé durant cette phase. - tous les Enseignants de l'UFR STA qui m'ont dispensé les cours tout au long de cette formation ; que tous trouvent, dans ces mots, l'expression de ma reconnaissance et de mon attachement. Mes remerciements également à l'endroit de certains ainés qui m'ont aidé durant mon apprentissage. Il s'agit notamment du Dr YUE Bi Clément, du Dr YAO Nzué. Je remercie particulièrement mon épouse, Esther KOSSONOU et mes enfants ; mes soutiens, ma fièrté.
Je voudrais remercier également, tous les camarades et amis qui ont apporté leur soutien et leur solidarité à cette ceuvre ; notamment : Guero Serge, Dr Loukou Tra, Dr Kouakou
ii Clémentine, Houngbedji Clarisse ; à tous ces camarades, je voudrais dire ma reconnaissance pour tous leurs encouragements. Je voudrais aussi témoigner toute ma reconnaissance à tous les é~~diants encadrés par le Professeur TANO Kablan, notamment ; TCHUMOU Messou, ADTNGRA Kouassi Martial, BROU Koffi Siméon, DlBY Diane. Je n'oublie pas mes amis EHOUMAN Evans, KOFFI Mesmin, MONYN Delphine qui n'ont cessé de m'assister quand j'en avais besoin. -Je ne saurai oublier tous mes parents pour leur soutien moral, matériel et surtout financier ; -Toute ma reconnaissance envers Monsieur OHOU Bi, le Dr FOFŒ Jonas, le Dr KOUAME Dominique et le Dr ASSANTl Olivier pour leur contribution à l'amélioration de ce document; -Je remercie spécialement Monsieur TANO Joseph, Directeur du cabinet Adjoint du Ministre de l'Economie et des finances, Monsieur N'GUETTlA Marcel et Monsieur AMON Koffi pour leur apport considérable. Je salue particulièrement la contribution spirituelle de toute la fraternité Puissance Divine
iii TABLE DES MATIERES LISTE DES ABREVIATIONS ET SIGLES xi LISTE DES TABLEAUX xiii LISTE DES FIGURES xvi RESUME xvii ABSTRACT xviii INTRODUCTION 1 PREMIERE PARTIE: REVUE DE LA LITTERATURE 5 1. Plantes médicinales 6 1.1. Définition 6 1.2. Etudes des plantes médicinales :·:·: 6 1.3. Intérêt de l'étude des plantes médicinales 6 1 .4. Etude ethnobotanique en Côte d'ivoire 7 1.5. Etude phytochimique et pharmacologique en Côte d'ivoire ~ 2. Molécules naturelles à activités biologiques 8 2.1. Composés phénoliques ou polyphénols 8 2. 1 . 1 . Les tanins 9 2.1.1.1. Propriétés physico-chimiques ,. .. 9 2.1.1.2. Propriétés pharmacologiques 10 2.1.2. Flavonoïdes 1 1 2.1.2.1. Propriétés physico-chimiques 11 2.1.2.2. Propriétés pharmacologiques 12 2.l.3.Coun,arines 12 2.1.3.1. Propriétés physico-chimiques 12 2.1.3.2. Propriétés pharmacologiques 13 2.1.4. Quinones et dérivés 13 2.1.4.1. Propriétés physico-chimiques 13 2.1.4.2. Propriétés pharmacologiques 14 2.2. Terpènes et stéroïdes l 4 2.2.1. Stérols et polyterpènes 14 2.2.1.1. Propriétés physico-chimiques 15 2.2.1.2. Propriétés pharmacologiques···················································:::································ 15 2.2.2. Saponosides ou Saponines 16 iv 2.2.2.1. Propriétés physico-chimiques 17 2.2.2.2. Propriétés pharmacologiques 17 2.3. Alcaloïdes 18 2.3.1. Propriétés physico-chimiques 18 2.3.2. Propriétés pharmacologiques 18 3. Généralités sur les plantes sélectionnées 19 3.1. Bridelia atroviridis Müll. Arg (Euphorbiaceae) 19 3.1.1. Description botanique :.:.:································ 19 3.1.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques 20 3.2. Erythrina senegalensis A. DC. (Fabaceae) 20 3.2.1. Description botanique 21 3 .2.2. Usages traditionnels, phytoch im ie et activités biologiques 21 3.3. Nephrolepis biserrata (Sw.) Schott (Davalliaceae / Nephrolepidaceae) 22 3.3.1. Description botanique 22 3.3.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques 23 3.4. Phymatodes scolopendria (Burm.) Ching (Polypodiaceae) 24 3.4.1. Description botanique 24 3.4.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques 26 3.5. Microgramma owariensis (Desv.) Alston (Polypodiaceae) ···········:,································· 26 3.5.1. Description botanique 26 3.5.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques 27 3.6. Trichilia heudelotii (Oliver) Planch (Meliaceae) 27 3.6.1. Description botanique 27 3.6.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques 28 3.7. Nesogordonia papaverifera (A. Chev.) R. Capuron (Sterculiaceae) 28 3.7.1. Description botanique 29 3. 7 .2. Usages traditionnels, phytochim ie et activités biologiques 29 3.8. Ce/tis mildbraedii Engl. (Ulmaceae) 30 3.8.1. Description botanique 30 3.8.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques ,, 31 3.9. Cola gigantea A. Chev. (Sterculiaceae) 31 3.9.1. Description botanique 31 3.9.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques 32 3.1 O. Triplochiton scleroxylon K. Schum (Sterculiaceae) : 33 V 3.10.1. Description botanique 33 3.10.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques 34 4. Fruits étudiés 34 4.1. Piment. 34 4.1.1. Description générale 34 ····· 4.1.2. Valeur nutritionnelle du piment... 35 4.1.3. Importance économique du piment 37 4.1 .4. Maladies et infections du piment.. 37 4.2. Tomate 38 4.2.1. Description générale 38 4.2.2. Valeur nutritionnelle de la tomate 39 4.2.3. Importance économique de la tomate 42 4.2.4. Maladies de la tomate 42 4.3. Papaye 44 4.3.1. Description générale 44 4.3.2. Le fruit :., 45 4.3.3. Valeur nutritionnelle de la papaye 45 4.3.4. Importance économique de la p~paye 47 4.3.5. Maladies de la papaye 47 4.4. Lutte contre les maladies des fruits 49 4.4.1. Les pesticides synthétiques chimiques 49 4.4.2. Les pesticides naturels 49 4.4.3. La lutte biologique 49 5. Champignons étudiés 50 5.1. Classification et caractères des principaux groupes de champignons 51 5.2. Identification morphologique des champignons 51 5.2.1. Critères d'identification macroscopique des champignons ,: 52 5.2.2. Critères d'identification microscopique des champignons 52 5.3. Structures protectrices 53 5.4. Biologie moléculaire 53 5.4.1. Méthodes et fonctionnement 54 5.4.2. Limites de la PCR-RFLP 54 DEUXIEME PARTIE: MATERIEL ET METHODES 56 1. Matériel 57 vi 1.1. Matériel pour la récolte et la mise en poudre des organes végétaux 57 1 .1.1. Matériel végétal 57 1.1.2. Matériel pour la récolte et la mise en poudre 57 1.2. Matériel pour l'isolement et l'identification des champignons pathogènes 57 1 .2.1. Matériel végétal 57 1.2.2. Matériel pour l'échantillonnage des fruits 57 1.2.3. Matériel pour l'isolement des champignons 57 1.2.4. Matériel pour l'identification moléculaire 57 1.2.4.1. Matériel pour l'extraction des ADN fongiques 57 1.2.4.2. Matériel de vérification de la purété des extraits d'ADN 58 1.2.4.3. Matériel pour la PCR des brins d'ADN 58 1.2.4.4. Matériel pour la DGGE des produits de la PCR 58 1.2.4.5. Matériel pour le séquençage des bandes d'ADN et l'dentificat.i.9n des souches 58 1.3. Matériel pour les tests antifongiques 59 1.3.1. Matériel pour la préparation des extraits végétaux 59 1.3.2. Matériel pour la réalisation des tests antifongiques 59 1.4. Matériel pour les tests phytochirniques 59 1.4.1. Matériel de laboratoire 59 1.4.2. Solvants et réactifs 59 2. Méthodes 60 2.1. Sélection, récolte des organes de plante, séchage et conditionnement des poudres 60 2.2. Extraction des principes actifs 60 2.2.1. Extraction par les solvants de polarité croissante pour les tests phytochimiques 60 2.2.2. Extraction par l'eau distillée 61 2.3. Isolement et identification moléculaire des champignons pathogènes 63 2.3.1. Isolement des champignons 63 2.3.1.1. Échantillonnage des fruits 63 2.3.1.2. Préparation des milieux de culture et de la solution de désinfection 63 2.3.1.3. Description des symptômes et isolement des champignons 63 2.3.2. Identification moléculaire 64 2.3.2.1. Extraction de I' ADN fongique total 65 2.3.2.2. Vérification de l'extraction d'ADN sur gel d'agarose 66 2.3.3. Amplification de I' ADN par la méthode de PCR 66 2.3.3.1. Amplification del' ADN des moisissures 66 vii 2.3.3.2. Conditions de la PCR 67 2.3.3.3. Vérification des produits PCR 68 2.3.4. Electrophorèse en Gel d'acrylamide avec Gradient Dénaturant (DGGE) 68 2.3.5. Séquençage des fragments d'ADN à partir des bandes DGGE 69 2.4. Tests d'inhibition des souches fongiques par les différents extraits de plante 70 2.4.1. Préparation du milieu de culture (Sabouraud) 70 2.4.2. Préparation des extraits de plante à tester 70 2.4.3. Préparation de l'inoculum 70 2.4.4. Ensemencement. 70 2.4.5. Détermination des CMJ et des Clso 72 2.4.6. Analyses statistiques des tests antifongiques 72 2.5. Tests de détection des classes de composés chimiques 73 2.5.1. Détection des terpènes et stéroïdes 73 2.5.1.1. Recherche des stérols et polyterpènes (Réaction de SALKOWSKT) 73 2.5.1.2. Recherche des saponosides (détermination de l'indice de mousse) 73 2.5.2. Détection des composés phénoliques 73 2.5.2.1. Recherche générale des polyphénols (réaction par le chlorure ferrique) 73 2.5.2.2. Recherche des Flavonoïdes 74 2.5.2.3. Recherche des anthocyanes 74 2.5.2.4. Recherche des coumarines 74 2.5.2.5. Recherche des tanins (réaction de STIASNY) '..'." 74 2.5.2.6. Recherche des quinones et dérivés (réaction de BORNTRAGER) 75 2.5.3. Recherche des alcaloïdes (Réaction de DRAGENDORFF) 75 TROISIEME PARTIE: RESULTATS ET DISCUSSION 76 CHAPITRE I: SELECTION DES PLANTES MEDICINALES ET IDENTIFICATION MOLECULAIRE DES ESPECES FONGIQUES 77 1. Plantes sélectionnées 77 2. Extraits bruts végétaux 78 3. Isolement et identification des champignons associés aux symptômes 78 3.1. Description des symptômes des maladies des souches fongiques 78 3.2. Différentes souches fongiques obtenues après isolement 80 3.3. Identification macroscopique des champignons pathogènes des fruits 80 3.4. Identification moléculaire des champignons pathogènes des fruits 82 4. Discussion 85 viii Conclusion partielle 88 CHAPITRE II : EVALUATION DE L'ACTIVITE ANTIFONGIQUE DES EXTRAITS DE PLANTE 89 1. Tests d'inhibition des souches fongiques par les différents extraits de plante 89 1.1. Effets des extraits de plante sur Colletotrichum higginsianum : 89 1.1.1. Extraits au dichlorométhane 89 1.1.2. Extraits au méthanol 92 1.1.3. Extraits à l'eau :·:·: 94 J .2. Effets des extraits de plante sur Fusarium oxysporum 96 1 .2. 1. Extraits dichlorométhaniques 96 1.2.2. Extraits méthanoliques 98 1.2.3. Extraits aqueux, 100 1.3. Effets des extraits de plante sur Geotrichum sp 102 1.3. 1. Extraits au dichlorométhane 102 1 .3.2. Extraits au méthanol 102 1.3.3. Extraits aqueux 103 1 .4. Effets des extraits de plante sur Meyerozyma guilliermondii l 07 1 .4.1 . Extraits au d ich lorométhane 107 1 .4.2. Extraits au méthanol ::·: 1 10 1 .4.3. Extraits aqueux 1 12 1 .5. Effets des extraits de plante sur Mucor circinelloidesf circinelloides 1 14 1.5. 1. Extraits au dichlorornéthane 114 1 .5.2. Extraits au méthanol 1 16 1.5.3. Extraits aqueux 118 1 .6. Effets des extraits de plante sur Mucor velutinosus 120 1 .6.1. Extraits au dichlorométhane 120 1 .6.2. Extraits au méthanol 122 1.6.3. Extraits aqueux 124 1 .7. Effets des extraits de plante sur Rhizopus oryzae 126 1.7.1. Extraits au dichlorornéthane 126 1.7.2. Extraits au méthanol 128 1.7.3. Extraitsaqueux 130 1 .8. Effets des extraits de plante sur Rhizopus stolonifer 132 1 .8.1. Extraits au dichlorornéthane 132 ix 1.8.2. Extraits au méthanol 134 1.8.3. Extraits aqueux 136 2. Discussion 138 Conclusion partielle 141 CHAPITRE III : CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE DES EXTRAITS DES PLANTES SELECTIONNEES 143 1. Groupes de composés chimiques détectés 143 2. Discussion 146 Conclusion partielle 149 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVE 150 CONCLUSION GENERALE 151 PERSPECTIVES 154 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 155 Article tiré de la thèse 179 X UI: Unité Internationale UNCTAD: United Nations Conference on Trade and Development USDA: United States Department of Agriculture UV: Ultraviolet v/v: Volume par volume WHO: World Health Organization xii LISTE DES TABLEAUX Tableau I: Teneurs des constituants majoritaires et énergétiques du piment pour 100 g de produit frais 36 Tableau II: Teneurs en constituants majoritaires et énergétiques de la tomate (pour 100 g de produit frais) 40 Tableau Ill: Teneurs des constituants majoritaires et énergétiques de la papaye (pour 100 g de produit frais) :-:·: 46 Tableau IV: Séquence des deux amorces universelles utilisées 67 Tableau V: Composition du mélange réactionnel de PCR 67 Tableau VI: Composition de gel de DGGE pour un gradient dénaturant de 40 à 70 % 69 Tableau VII: Espèces de plantes sélectionnées et organes récoltés 77 Tableau VIII: Codes des souches isolées et purifiées par type de fruit.. 80 Tableau IX : Description macroscopique des germes fongiques 81 Tableau X : Récapitulatif des souches fongiques identifiées de chaque fruit.. 83 Tableau XI : Fréquence d'apparition des souches fongiques sur les fruits 84 Tableau XII: Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Colletotrichum higginsianum aux différentes concentrations des extraits des plantes au dichlorométhane selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CM I et êÏso 9 J Tableau XIII: Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Colletotrichum higginsianum aux différentes concentrations des extraits des plantes au méthanol selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CM[ et Clso 93 Tableau XIV : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Colletotrichum higginsianum aux différentes concentrations des extraits des plantes à l'eau selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CMl et Clso 95 Tableau XV : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Fusarium oxysporum aux différentes concentrations des extraits des plantes au dichlorométhane selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CMl et Clso 97 Tableau XVI : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Fusarium oxysporum aux différentes concentrations des extraits des plantes au méthanol selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CMl et Clso 99 Tableau XVII : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Fusarium oxysporum aux différentes concentrations des extraits des plantes à l'eau selon l'échelle de Kurnar et al. (2007) et valeurs des CMI et Clso 101 xiii Tableau XVIII : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Geotrichum sp. aux différentes concentrations des extraits des plantes au dichlorométhane selon l'échelle de Kurnar et al. (2007) et valeurs des CMI et Clso ! 04 Tableau XIX : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Geotrichum sp. aux différentes concentrations des extraits des plantes au méthanol selon l'échelle de Kurnar et al. (2007) et valeurs des CMI et Clso 105 Tableau XX : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Geotrichum sp. aux différentes concentrations des extraits des plantes à l'eau selon l'échelle de Kumar el al. (2007) et valeurs des Clso et CM! 106 Tableau XXI : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Meyerozyma guilliermondii aux différentes concentrations des extraits des plantes au dichlorométhane selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CM! et Clso 109 Tableau XXII : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Meyerozyma guilliermondii aux différentes concentrations des extraits des plantes au méthanol selon l'échelle de Kurnar et al. (2007) et valeurs des CMI et Clsn 1 11 Tableau XXIII: Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Meyerozyma guilliermondii aux différentes concentrations des extraits des plantes à l'eau selon !'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CM! et Clso ! 13 Tableau XXIV : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Mucor circinelloides f circinelloides aux différentes concentrations des extraits des plantes au dichlorornéthane selon !'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CM! et Clso 115 Tableau XXV : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Mucor circinelloides f circinelloides aux différentes concentrations des extraits des plantes au méthanol selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CM! et Clso ...... 117 Tableau XXVI : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Mucor circine/loides f circinelloides aux différentes concentrations des extraits des plantes à l'eau selon !'échelle de Kurnar et al. (2007) et valeurs des CMI et Clso 119 Tableau XXVII : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Mucor velutinosus aux différentes concentrations des extraits des plantes au dich!orornéthane selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CM! et Clso ! 21 xiv Tableau XXVIII : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Mucor velutinosus aux différentes concentrations des extraits des plantes au méthanol selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CM I et Clso 123 Tableau XXIX : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Mucor velutinosus aux différentes concentrations des extraits des plantes à l'eau selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CM I et Clso 125 Tableau XXX : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Rhizopus oryzae aux différentes concentrations des extraits des plantes au dichlorométhane selon l'échelle de Kurnar et al. (2007) et valeurs des CMI et Clso 127 Tableau XXXI: Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Rhizopus oryzae aux différentes concentrations des extraits des plantes au méthanol selon l'échelle de Kurnar et al. (2007) et valeurs des CMI et Clso ::: 129 Tableau XXXII : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Rhizopus oryzae aux différentes concentrations des extraits des plantes à l'eau selon l'échelle de Kurnar et al. (2007) et valeurs des CMl et Clso 131 Tableau XXXIII : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Rhizopus stolonifer aux différentes concentrations des extraits des plantes au dichlorométhane selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CMJ et Clso 133 Tableau XXXIV : Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Rhizopus stolonifer aux différentes concentrations des extraits des plantes au méthanol selon l'échelle de Kumar et al. (2007) et valeurs des CMI et Clso 135 Tableau XXXV Réactions (Sensibilité/Résistance) in vitro de Rhizopus stolonifer aux différentes concentrations des extraits des plantes .à l'eau selon l'échelle de Kurnar et al. (2007) et valeurs des CMl et Clso 137 Tableau XXXVI : composés phytochimiques mis en évidence dans les différents organes de plante et dans les trois solvants d'extraction (eau, méthanol et dichlorornéthane) 145 XV LISTE DES FIGURES Figure 1: Structures des génines des tanins l 0 Figure 2: Quelques substitutions de flavonoïdes 1 l Figure 3: Quelques structures de coumarines 12 Figure 4: Quelques structures de quinones 14 Figure 5: Quelques structures de terpènes 15 Figure 6: Structures des génines des saponosides 17 Figure 7: Quelques structures d'alcaloïdes (Bruneton, 2009) 19 Figure 8 : Rameau feuillé portant des fruits de Bridelia atroviridis MUII. Arg 20 Figure 9 : Rameau feuillé portant des inflorescences de Erythrina senegalensis A. DC. 21 Figure 10: Feuilles fertiles de Nephrolepis biserrata (Sw.) Schott.. 23 Figure 11: Feuilles de Phymatodes scolopendria (Burrn.) Ching 25 Figure 12: Feuilles de Microgramma owariensis (Desv.) Alston sur tronc d'arbre 27 Figure 13: Trichilia heudelotii (Oliver) Planch (a: feuille; b: Rameau portant des fruits) 28 Figure 14: Nesogordonia papaverifera (A. Chev.) R.Capuron 29 Figure 15: Rameau de Celtis mildbraedii Engl. portant des fruits 3Q Figure 16: Cola gigantea A. Chev (a : arbre ; b : Feuille ; c : lnfiorescence ; d : Fruit de rne.ri.carpes ; e : grai.nes dans un me'n.carpe) . 32 Figure 17: Triplochiton scleroxylon K. Schum (a: Arbre; b: Jeune P?usse) 33 Figure 18: Symptômes fongiques sur un fruit de piment (Anthracnose) 38 Figure 19 : Pourriture de tomate causée par Rhizopus stolonifer 43 Figure 20: Maladie post-récolte causée par Rhizopus sp. de fruits de papaye 48 Figure 21: Procédé d'extraction de poudre végétale par les solvants organiques de polarité croissante 62 Figure 22 : Procédé d'extraction par infusion aqueuse de poudre végétale 62 Figure 23 : Cultures primaires des moisissures provenant des fruits du piment, de la tomate et de la papaye 64 Figure 24 : Exemple de détermination de Clse de l'extrait dichlorométhanique des feuilles de Bridelia atroviridis sur Meyerozyma guilliermondii 72 Figure 25 : Description des symptômes des maladies fongiques des fruits 79 Figure 26 : Différents groupes morphologiques des isolats 81 Figure 27: Gel d'agarose à 2 % de vérification de la PCR de l'ADN des moisissures 82 Figure 28 : Gel DOGE et souches identifiées 83 xvi RESUME Les micro-organismes d'altération constituent une grave menace pour la production, la commercialisation et la consommation des fruits frais. Les champignons sont parmi les agents pathogènes qui affectent le plus les fruits et légumes en leur causant de sérieuses maladies. En raison des règlement stricts concernant l'utilisation des pesticides chimiques, il est donc opportun de rechercher d'autres alternatives de contrôle de ces microorganismes d'entreposage. Les plantes médicinales offrent cette alternative de premier choix a~·~ pesticides chimiques. Cette étude a consisté à isoler et identifier des champignons pathogènes sur des fruits mûrs de piment, de papaye et de tomate, afin d'y effectuer des tests antifongiques à partir de quelques plantes médicinales de la flore ivoirienne. Sur les fruits mûrs de piment, de tomate et de papaye ont été isolées et identifées des souches fongiques. A partir d'extraits de plantes, des tests antifongiques ont été ensuite réalisés par la méthode de dilution sur milieu de culture en boîtes de Pétri. Avec les extraits actifs de plantes sélectionnées, un criblage phytochim ique a été réalisé pour la détection des grands groupes de composés chimiques responsables de leurs activités. Au total huit souches fongiques ont été isolées et identifiées, 36 extraits de plantes ont été préparés. Les tests antifongiques ont révélé que toutes les souches fongiques ont été sensibles ou hautement sensibles à tous les extraits à la concentration de 10 mg/111 L. Les tests phytochimiques ont permis de mettre en évidence dans les extraits la présence de terpènes et stéroides et de composés phénoliques. Les espèces végétales comme Microgramma owariensis, Nesogordonia papaverifera et Triplochiton scleroxylon ayant manifesté les plus importantes activités sur les souches fongiques peuvent être utilisées dans la formulation d'un biofongicide contre les pertes post-récoltes des fruits du piment, de la tomate et de la papaye. Mots clés : Fruits, papaye, tomate, piment, souches fongiques, organes de plantes, tests antifongiques. xvii ABSTRACT Microorganisms are a serious threat to the production, marketing and consumption of fresh fruit. Fungi, more specifically, give rise to severe diseases in fruit and are responsible for significant post-harvest losses. Due to the strict regulations regarding the use of chemical pesticides residues, it is therefore appropriate to look for others alternatives for controlling these storage microorganisms This study investigates the efficiency ofmedicinal plants as viable anti fungal alternatives to pesticides. Medicinal plants of the lvorian flora were tested against fungi that were isolated and identified on ripe chili, tornato and papaya fruit. Antifungal assays were performed by the dilution method. A phytochemical screening was performed for the detection of chemical compounds responsible for the antifungal activity. As many as eight strains were isolated and identified. Thirty-six (36) plant extracts. Ali fungal strains were sensitive or highly sensitive to all extract solutions at a concentration of 10 mg/ rnl.. Phytochemical tests suggest that the anti-fungal activity can be attributed to terpenes, steroids, saponins, alkaloids. and phenolic compounds found in ail extracts. Plant species such as Microgramma owariensis , Nesogordonia papaverifera and Triplochyton scleroxylon having 'demonstrated the most important activities on fungal strains can be used in the formulation of bio-fungicide against post-harvest losses occuring in chilli, tomato and papaya fruit. Kcywords : fruit, papaya, tomato, pepper, fungal strains, plant organs, antifungal tests. xviii INTRODUCTION La consommation des fruits et légumes frais est importante pour la santé humaine. De plus en plus consciente de leurs effets bénéfiques, les populations des pays occidentaux, ont augmenté leur apport en fruits et légumes dans la diète depuis plusieurs années (Desbordes, 2003). Les fruits et les légumes participent à la réduction des risques de maladies cardio vasculaires et peuvent, également, réduire l'incidence de certains cancers (WHO, 2009). Selon l'OMS, un apport insuffisant en fruits et légumes est à l'origine d'environ 14 % des décès provoqués par des cancers gastro-intestinaux, 11 % des décès suite à une cardiopathie ischémique et 9 % des accidents cardio-vasculaires mortels dans le monde (WHO, 2009). Le problème majeur de l'industrie avec les fruits et légumes frais est leur durée de conservation. Les fruits climactériques sont extrêmement périssables parce qu'après leur récolte, ils continuent de maintenir une activité métabolique. Les principales causes de la réduction de leur durée de vie sont la sénescence, la transpiration, l'infection fongique et bactérienne (Desbordes, 2003). Les moisissures (Botrytis cinerea, Fusarium sp., Rhizopus sp., Alternaria alternata, Sc/erotinia selerotiorum, Colletotrichum gloeosprioides et Penicillium sp.) et les bactéries pathogènes comme Pseudomonas sp. et Erwinia sp., jouent un rôle important dans les maladies et les pourritures post-récoltes de certains fruits frais, tels que la tomate, la papaye, les avocats, etc. En général, la plupart des fruits sont résistants à l'infection fongique pendant la période d'entreposage (Desbordes, 2003). Cependant, avec le mûrissement et la sénescence, ils deviennent plus sujets à l'infection par un large éventail de micro-organismes causant leur dégradation, qui se manifeste par tout changement d'état au niveau du goût, de l'odeur, de l'apparence ou de la texture rendus moins agréables, voire toxiques (Desbordes, 2003). Les champignons sont parmi les agents pathogènes qui affectent le plus les fruits et légumes en leur causant de sérieuses maladies (pourriture, gale, carie, etc.). Ces micro organismes d'altération peuvent être introduits pendant la culture, au cours de la croissance des cultures dans le champ, lors de la récolte et de la manutention post-récolte ou pendant l'entreposage et la distribution (Barth et al., 2009). Sous l'influence des facteurs environnementaux, ils constituent une grave menace pour la production, la commercialisation et la consommation des fruits frais (Akinmusire, 2011). Environ 20 à 25 % des fruits récoltés sont ainsi dépréciés par ces agents pathogènes pendant la manipulation post-récolte, même dans les pays développés, influençant ainsi négativement leur valeur économique (Droby, 2006). La détérioration des fruits et légumes par des infections peut se réduire par le maintien actif de leur résistance naturelle, le retardement de la sénescence et par la minimisation des blessures mécaniques. Cependant, ces réactions et pratiques s'avèrent insuffisantes pour leur protection adéquate contre les infections. L'utilisation de fongicides chimiques s'avère alors 2 nécessaire pour contrôler les maladies, assurer un prix de commercialisation profitable aux producteurs et une qualité gustative appréciable aux consommateurs. En effet, les produits antimicrobiens appartenant aux groupes des benzirnidazoles, les hydrocarbures aromatiques et des inhibiteurs de la biosynthèse des stérols sont souvent utilisés pour les traitements post récoltes (Hidalgo et al., 1998). Cependant, l'application à des concentrations élevées de ces produits chimiques synthétiques, dans une perspective de contrôle post-récolte des denrées alimentaires, augmente le risque de résidus toxiques dans les produits alimentaires (Moosavy et al., 2008). De plus, plusieurs agents pathogènes d'entreposage ont développé des résistances aux fongicides de synthèse. L'intérêt de plus en plus grandissant des pays développés pour une agriculture sans résidus chimiques dans les produits de consommation, se traduit par un intérêt pour les composés naturels bioactifs (Bankole, 2004). Aussi, les traitements chimiques sont-ils devenus de plus en plus chers, en plus d'être nocifs sur l'environnement et la santé du consommateur (Zirihi et al., 2008). li s'avère impératif de trouver d'autres méthodes de lutte plus adaptées aux conditions environnementales et soucieuses de la santé du consommateur. L'utilisation des plantes à activité antifongique offre, par conséquent, une alternative de premier choix aux fongicides chimiques. Des études ont montré le pouvoir inhibiteur des composés chimiques produits par ces plantes. Depuis toujours, l'homme utilise son environnement et, en particulier, les plantes pour se soigner (Newmann et al., 2007). En outre, sur environ 300 000 espèces végétales recensées, seulement 15 % avaient été étudiées sur le plan phytochimique, dont 6 % pour leurs activités biologiques jusqu'aux alentours des années 2000 (Verpoorte, 2002). Ainsi, les huiles essentielles extraites de plantes peuvent jouer un rôle dans le contrôle des attaques fongiques de plusieurs produits (Wilson et al., 1997 ; Reddy et al., 1998). Parallèlement aux huiles essentielles, les métabolites secondaires végétaux du groupe des polyphénols possèdent d'importantes activités dont la plus étudiée est l'activité antimicrobienne (Wilson et al., 1997; Reddy et al., 1998; Hamrner et al., 2003; Yéhouénou et al., 2010). L'utilisation de ces composés, en tant qu'agents antimicrobiens présente deux avantages principaux: le premier est leur origine naturelle, qui implique plus de sécurité pour la population et l'environnement; la seconde est qu'ils ont été considérés à faible risque de développement de la résistance par des microorganismes pathogènes (Tatsadjieu et al., 2010). En Afrique, aujourd'hui, de nombreuses investigations phytochimiques et biologiques ont été réalisées afin d'apporter une justification scientifique à l' uti 1 isation traditionnel le des plantes médicinales. 3 En Côte d'Ivoire, les travaux relatifs à la phytochimie et aux propriétés antifongiques consacrés aux substances naturelles d'origine végétale ont commencé avec Sey N'Draman (1995). Lis se sont poursuivis avec Guédé-Guina et al. (1997), Kra et al. (2002a et 2002b), Zirihi et al. (2003) et Thes et al. (2005). Par ailleurs, Tra Bi et al. (2008) ont mis en évidence, avec l'extrait brut au dichlorornéthane de Erigeron jloribundus une activité antifongique relativement élevée sur des souches de référence et des souches cliniques de levures. Les études bioguidées menées au cours de ces travaux ont permis l'isolement d'une lactone acétylénique (la Lachnophyllum lactone) comme molécule responsable de l'activité antifongique de E. floribundus (Tra Bi, 2008). Comme dans les cas d'infections microbiennes humaines, les composés chimiques isolés des plantes sont aussi susceptibles d'agir sur les germes pathogènes des produits végétaux. Les résultats des travaux ci-dessus énumérés constituent un réservoir important pour la mise en place de fongicides biologiques dans le traitement post-récolte des fruits et légumes. L'objectif général de cette étude est de contribuer à l'am~lioration du traitement antifongique de trois fruits, par la recherche d'extraits de plantes pouvant entrer dans le développement d'un biofongicide, en vue de réduire les pertes post-récoltes de ces fruits. Les objectifs spécifiques sont: ( 1) répertorier des plantes médicinales utilisées contre les champignons, (2) identifier les espèces fongiques sur le piment, la tomate et la papaye; (3) évaluer les activités antifongiques des plantes sélectionnées; (4) faire un screening phytochimique des plantes actives. La présente thèse comprend trois parties principales outre l'introduction, la conclusion et les perspectives. La première partie présente une revue de I ittérature portant sur les plantes médicinales et les plantes étudiées, les groupes de composés phytochimiques, les fruits étudiés et sur les champignons. La deuxième partie décrit le matériel et les méthodes utilisés. La troisième partie porte sur les résultats obtenus et leur discussion. 4 PREMIERE PARTIE: REVUE DE LA LITTERATURE 5 potentiel thérapeutique, principalement dans les maladies fongiques impliquant les muqueuses, la peau et autres infections des voies respiratoires. 1.4. Etude ethnobotanique en Côte d'ivoire Les plantes médicinales offrent de larges possibilités de traitement des maladies pour la population. Afin d'identifier ces plantes d'une importance capitale.jies enquêtes ethnobotaniques sont menées auprès des population le plus souvent rurales. En Côte d'Ivoire, par exemple, Tra Bi et al. (2008) après des enquêtes ethnobotaniques réalisées sur les marchés de la ville d'Abidjan ont inventorié 58 espèces de plantes commercialisées pour soigner l 9 maladies courantes. Trente-neuf (39) de ces plantes sont utilisées contre l'hypertension artérielle et le diabète et seulement six espèces végétales utilisées contre les dermatoses. Ces 6 espèces sont : - Calotropisprocera (Asclepiadaceae) (Ait.) Ait. f - Vernonia colorata (Willd.) Drake (Asteraceae) - Cassia alata L. (Caesalpiniaceae) - Ocimum gratissimum L (Lamiaceae) - Ficus exasperata M. Vahl. (Moraceae) - Mitracarpus scaber Zucc (Rubiaceae) 1.5. Etude phytochimique et pharmacologique en Côte d'ivoire Les analyses phytochimiques des plantes ont porté le plus souvent sur des familles ou des genres susceptibles de présenter des propriétés intéressantes pour soigner des pathologies. Plusieurs groupes de composés dont les stérols, polyterpènes, alcaloïdes, tanins, polyphénols, flavonoïdes, quinones et saponines contenus dans les extraits des plantes sont mis en évidence (Bidié et al., 2011 ; Békro et al.,2007). Atindehou et al. (2000), ont identifié les structures de trois nouveaux isoflavonoïdes prénylés de l'écorce de racine de Erythrina vogelii. Kamanzi (2002) a recherché les principes bioactifs chez plusieurs espèces de plantes. D'importants travaux d'ordre pharmacologique et phytochim ique ont été menés sur L 04 espèces de plantes médicinales de la Côte d'Ivoire. Une évaluation des activités antibactériennes, antifongiques, antipaludiques, antitrypanosomes, a été faite et la cytotoxité a été étudiée. Les travaux de Zirihi (2005) ont montré que l'activité antiplasmodiale de Funtumia elastica était due à un alcaloïde, l'holarrhesine. Dans une étude chez les Bété du Département d'lssia, les travaux de Zirihi (2006) ont permis d'isoler un alcaloïde dénommé rauvomitine dans les extraits 7 éthanoliques de Rauvolfia vomitoria, En 2007, Zirihi et al. ont indiqué que Zanthoxylum gilletii exerce son activité antipaludique grâce à un alcaloïde, la dihydronitidine. 2. Molécules naturelles à activités biologiques Les molécules naturelles à activités biologiques comprennent les métabolites secondaires, qui sont biosynthétisées à partir de métabolites primaires et qui jouent un rôle majeur dans les interactions de la plante avec son environnement, contribuant ainsi à la survie de l'organisme dans son écosystème. Plus de 8500 métabolites secondaires sont déjà connus. (Ali lou, 2012). Une des caractéristiques des plantes est leur capacité à synthétiser et à stocker une grande variété de métabolites secondaires. Contrairement aux métabolites dits primaires, essentiels pour la vie de la plante, la présence des métabolites secondaires varie d'une plante à l'autre. Ils ne sont pas indispensables au métabolisme de la plante. Pendant longtemps, ils ont été considérés comme des déchets ainsi que des composés sans utilité pour la plante (Hopkins, 2003). fi est évident aujourd'hui que ces métabolites jouent un important rôle pour la plante (celui d'agent de signalisation) ou entre la plante et d'autres plantes, microbes et herbivores. Le plus souvent, les métabolites secondaires constituent des agents de défense chimique contre les animaux, les microbes ; à savoir les bactéries et les champignons (Bruneton, 2009). Les différentes classes de métabolites secondaires sont les composés phénoliques, les terpènes et stéroïdes et les alcaloïdes (Wink, 201 1 ). 2.1. Composés phénoliques ou polyphénols Les polyphénols sont présents dans de nombreux végétaux avec plus de 8.000 structures chimiques identifiées à ce jour (Pietta et al., 2003). Le terme polyphénol peut être défini comme noyau aromatique portant un ou plusieurs groupements hydroxyles (Yermerris et Nicholson, 2007). A l'origine, les polyphénols étaient connus sous le 110111 de tanin végétal (Haslam, 1998). Ce sont des composés phénoliques hydrosolubles, ayant un poids moléculaire compris entre 500 et 3000 daltons. Selon leur structure et le nombre de noyau(x) aromatique(s), les polyphénols peuvent être classés en tanins, flavonoïdes, coumarines, quinones et dérivés, lignanes, etc (Yermerris et Nicholson, 2007). 8 2.1.1. Les tanins Les tanins sont présents dans de nombreux végétaux. Ils sont présents aussi bien chez les Angiospermes que les Gymnospermes. lis sont plus fréquents chez les Dicotylédones que chez les Monocotylédones (Hoffman, 2003). Les tanins sont des composés phénoliques, formés de nombreuses unités de flavonoïdes et hydrolysés qu'en présence d'acides forts. lis servent de défense contre les micro-organismes et sont utilisés par l'Homme depuis l'antiquité pour le tannage des peaux basés sur leur aptitude à se combiner aux protéines (Alilou, 2012). 2.1.1.1.Propriétés physico-chimiques Les tanins sont des composés phénoliques dont le poids moléculaire varie entre 500 et 3.000 daltons. Ils constituent un groupe de composés phénoliques hydrosolubles, capables de convertir les peaux d'animaux en cuir. La présence de plusieurs groupements hydroxyles phénoliques conduit à la formation de complexes avec les protéines ainsi qu'avec d'autres macromolécules telles que les polysaccharides mernbranaires (Schofield et al., 2001 ). Il est classique de distinguer deux groupes de tanins: les tanins hydrolysables et les tanins condensés. Les tanins hydrolysables sont abondants chez les Dicotylédones où certains arbres en sont des sources industrielles. Lorsqu'ils sont dégradés par hydrolyse chimique, ils libèrent une partie non phénolique pouvant être le glucose ou l'acide quinique et une partie phénolique qui peut être soit l'acide gallique (Figure la), soit un dimère de ce même acide, l'acide éllagique (Figure lb). Les tanins condensés sont des oligomères ou des polymères__ de flavane-3-ols ou de tlavane-3,4-diols. Contrairement aux tanins hydrolysables, ils sont résistants à l'hydrolyse. Les formes dimères et oligomères sont dénommées proanthocyanidines (Figure le) (Marcheix et al., 2005 ; Serrano et al., 2009). 9 HO HO H OH a) Acide gallique b) Acide éllagique c) Proanthocyanidine Figure 1: Structures des génines des tanins 2.1.1.2.Propriétés pharmacologiques Leur intérêt médicinal réside essentiellement dans leur caractère astringent : leur propriété de coaguler les albumines des muqueuses et des tissus, en créant ainsi une couche de coagulation isolante et protectrice, ayant pour effet de réduire l'irritabilité et la douleur et d'arrêter les petits saignements (Alilou, 2012). Les tanins sont responsables de l'activité antidiarrhéique de nombreuses plantes d'usage traditionnel. lis sont réputés pour leur capacité à inhiber la croissance de nombreux microorganismes dont les bactéries, les levures et les champignons (Se_pulveda et al., 2011). lis forment une classe de composés phénoliques ayant des propriétés antibactériennes, antivirales, antiparasitaires, anti-oxydantes et anti-inflammatoires (Lü et al., 2004 ; Souza et al., 2006). En thérapeutique, les tanins sont utilisés pour leur propriétés antiseptiques et bactéricides, comme agent astringent très proche d'assécher et vasoconstricteurs qui assurent une protection de la peau et des muqueuses, en imperméabilisant partiellement les couches superficielles (Bouchet, 1999). Les décoctions et les autres préparations à base de drogues riches en tanins sont employées, le plus souvent extérieurement, contre les inflammations de la cavité buccale, les catarrhes, la bronchite, les hémorragies locales, sur les brûlures et les engelures, les plaies, les intlam mations dermiques, les hémorroïdes et la transpiration excessive (Ali lou, 2012). Les plantes à tanins sont également utilisées en tant que vulnéraires; elles induisent une fermeture des plaies (Afaq et Smith, 2005). 10 2.1.2. Flavonoïdes Les flavonoïdes sont des métabolites secondaires végétaux. Ils constituent un des plus vastes groupes de polyphénols naturels et présentent un large champ d'activités biologiques aussi bien chez les animaux que chez les végétaux (Sylvestre et al., 2007). Ce sont des substances colorées responsables de la coloration de nombreux fruits, légumes et fleurs (Alilou, 2012). Les flavonoïdes sont des composés phénoliques dont le squelette de 'base est composé de 15 carbones avec deux cycles aromatiques reliés par un pont de trois carbones. On regroupe dans cette classe les anthocyanes et les aglycones qui sont très voisins chimiquement. Les flavonoïdes sont des composés phénoliques de faible poids moléculaire. Ce sont des pigments colorés des végétaux (Motohashi, 2009). lis ont en commun une même structure pyranique centrale appelée génine, dont les multiples substitutions permettent de distinguer les flavones, les flavonols (Figure 2a et 2b ), les flavonones, les flavononols, les isoflavones, les anthocyanes (Figure 2c), les chalcones, les catéchines, les aurones et autres. Le terme flavonoïde est utilisé pour désigner une classe de composé naturel de structure générale C6-CJ-C6 aussi appelée fonction phenylbenzopyrane. En fonction de la liaison de la chaîne aromatique sur la fonction phenylbenzopyrane, les flavonoïdes sont classés en flavonoïdes (2-phenylbenzopyrane), en isoflavonoïdes (3-benzopyranés) et en néoflavonoïdes (4 benzopyranes). 2.1.2.1.Propriétés physico-chimiques Tous les flavonoïdes n'ont pas les mêmes propriétés. Certains sont solubles dans l'eau et l'alcool, alors que d'autres ont des propriétés hydrosolubles extrêmement faibles (Grinkevitch et Safronitch, 1983). 0 a) Noyau flavone b) Noyau flavonol c) Noyau des anthocyanes Figure 2: Quelques substitutions de flavonoïdes 11 2.1.2.2.Propriétés pharmacologiques Ils sont très répandus dans le règne végétal où ils sont responsables de la protection des plantes contre les agents pathogènes microbiens (Santos-Buelga et al., 2011). Chez la plante, les flavonoïdes contribuent à sa protection aussi bien contre des herbivores que des insectes. Les flavonoïdes ont des propriétés antifongiques, antibactériennes et antivirales. C'est le cas de la Maackiaine (3-hydroxyl-8,9-methylenedioxypterocarpane) très connue comme agent antifongique chez les Légumineuses (Harborne et Williams, 2000). 2.1.3. Coumarines Les coumarines sont présentes dans environ 150 espèces de plantes et dans plus de 30 familles. Les sources les plus riches en coumarines sont le mélilot (Melilotus spp), la fève de tonka (Dipteryx odorata (Aubl.) Willd. Fabaceae). Le terme coumarine dérive de "Kumaru", nom vernaculaire de la fève de tonka, originaire de la langue Tupi en Guyane française. Les coumarines sont présentes dans de nombreuses familles d' Angiospermes (Leguminoseae, Solanaceae, Rutaceae et Apiaceae). Chez les Gymnospermes, on les rencontre chez les Pinaceae et, parmi les fougères, elles sont présentes chez les Polypodiaceae. 2.1.3.1.Propriétés physico-chimiques Beaucoup de coumarines présentent une forte fluorescence bleue ou verte en présence d'une Lumière UV (Vaubourdolle, 2007; Feringa et Browne, 2011). Elles se caractérisent par une odeur de foin frais. Les coumarines ont une faible solubilité dans l'eau et une forte solubilité dans les solvants organiques (Hoffman, 2003 ; Liu, 2011 ). OH / 0~ HO~O _). 0 r{:H OH a) Khelline b) Esculoside Figure 3: Quelques structures de coumarines 12 2.1.3.2.Propriétés pharmacologiques Les drogues à coumarines ont des effets variables. L'esculoside (Figure 3b) est connu comme veinotonique et vasculoprotecteur. L'extrait de mélilot est un médicament de l'insuffisance veinolymphatique fluide du sang. Certaines fucocoumarines sont photosensibilisantes et, de ce fait, ont comme indication thérapeutique le traitement du psoriasis. La khelline (figure 3a) est un puissant décontractant musculaire. Jl n'est pas exclu que les propriétés anti-inflammatoires et analgésiques attribuées au frêne soient dues aux coumarines (Bruneton, 1999). Elles ont des effets hémorragiques, pesticides, antifongiques et des propriétés antitumorales (Liu, 2011 ). 2.1.4. Quinones et dérivés Les quinones sont produites par les plantes (principalement. .les Dicotylédones), les champignons, les lichens et les insectes. Plus de 1200 quinones ont été décrites, principalement dans le règne végétal. Elles ne sont pas exceptionnelles dans le règne animal, en particulier chez les échinodermes et les arthropodes (Shah et Seth, 2012). 2.1.4.1.Propriétés physico-chimiques Les quinones sont des composés oxygénés qui correspondent à l'oxydation de dérivés aromatiques. Les propriétés fondamentales des quinones sont leur facile intraconversion en hydroquinones (agents à oxydation douce et addition de nucléophiles). Les quinones libres sont pratiquement insolubles dans l'eau et extractibles par solvants organiques usuels. Leur stabilité est assez bonne, mais la formation d'artéfacts est toujours possible. La forme réduite existe à l'état d'hétérosides (Bruneton, 1999). Les anthraquinones (Figure 4a) peuvent exister soit à l'état libre (anthraquinones libres) soit associés à un sucre, d'où le nom d'hétérosides anthraquinoniques. Les sucres les plus répandus chez les hétérosides anthraquinoniques sont le glucose et le rharnnose (Troy et Remington, 2006 ; Sarker et Nahar, 2007). Les qu inones se subdivisent en fonction du natif de base en paraquinones, naphtoquinones (Figure 4b), benzoquinones (Figure 4c) et, plus rarement, en carbazolquinones (Bruneton, 1999). 13 OH OH 0 Il C~ O 0 a) Anthraquinones b) Naphtoquinones c) Embeline (benzoquinone) Figure 4: Quelques structures de quinones 2.1.4.2.Propriétés pharmacologiques Les quinones ont des propriétés laxatives et vermifuges, antimicrobiennes et antifongiques. C'est le cas de la Rhein, présente dans Scrophularia nodota L. (Scrophulariaceae) et chez les espèces du genre Senne. La Rhein possède une activité antifongique contre les derrnatophytes (Jackson, 2000 ; Hoffman, 2003). Les hétérosides anthraquinoniques ont des propriétés antifongiques (Bajwa et al., 2007). L'embéline (Figure 4c), une benzoquinone isolée de Embelia barbayena Mez (Myrsinaceae), leur confère une forte toxicité. En dépit de cette toxicité, cette plante est couramment utilisée comme vermifuge et purgatif (Paris et Rabenoro, 1950). Cette molécule est également douée de propriétés contraceptives, analgésiques, anti-inflammatoires, antioxydantes, antiturnorales, antibactériennes (Chitra et al., 2003), dépuratives et anthelminthiques, surtout contre Taenia saginita (Boegh et al., 1996 ; Ogweno et al., 2002). 2.2.Terpènes et stéroïdes 2.2.1. Stérols et polyterpènes Le terme terpène provient de tupentine (Balsamumtere binthinae) (Breitmaier, 2006). La principale source de terpènes dans la nature vient du monde végétal bien qu'il en existe chez les animaux. Elaborés à partir des mêmes précurseurs, les terpènes et les stéroïdes constituent: sans doute, le plus vaste ensemble connu des métabolites secondaires des végétaux (Brunetton, 1999). li existe environ 30.000 terpènes connus. 14 2.2.1.1.Propriétés physico-chimiques Dans les plantes, les terpènoïdes sont représentés par les composés volatiles (monoterpènes et sesquiterpènes), la gibbérelline (diterpènes), les limonoïdes (triterpènes), les caroténoïdes (tetraterpènes), les stérols et les sapogénines (Hounsome et Hounsome, 2011 ). Les terpènes volatiles (monoterpènes et les sesquiterpènes) encore appelés huiles essentielles (HE) sont utilisés par la plante pour attirer les insectes et permettre la pollinisation. Ces substances sont formées de l'assemblage d'un nombre entier dunités pentacarbonnées ramifiées, dérivées du 2 méthylbuta-1.3 diène qui constitue l'unité isoprénique (Johns et al., 1999 ; Breitmaier, 2006). La synthèse d'une grande variété de terpénoïdes non cycliques et cycliques dans la plante, fait intervenir un nombre variable d'unités isopréniques. Selon le nombre d'unités isopréniques, on distingue les herni (Cs), mono (C10), sesqui (C1s), di (C20), sester (C2s), tri (C30), tetraterpènes (C40) et les polyterpènes (Cs), (Breitmaier, 2006). Les triterpènes (n = 6) les plus fréquents dans les plantes médicinales sont des saponosides. Tous les triterpènes ne sont pas des saponosides. Les stéroïdes sont des triterpènes modifiés qui sont dérivés également du squalène par cyclisation, instauration et substitution; le noyau de tous les stéroïdes est le gonane qui est un hydrocarbure tétracyclique. li est substitué par les groupes méthyliques à C10 et à Cu, aussi bien qu'une chaîne latérale alkyle à C17 (Johns et al., 1999). Ces composés sont solubles dans les solvants organiques et peu solubles dans l'eau (Raaman, 2006 ; Berger, 2007). H a) Menthol b) Estragol c) Sitostérol Figure 5: Quelques structures terpènes 2.2.1.2. Propriétés pharmacologiques Certaines huiles essentielles (HE) protègent la plante des champignons parasites et des bactéries (Raven el al., 2000). Les monoterpènes volatils, responsables des propriétés variées 15 des huiles essentielles sont antiseptiques, antispasmodiques (menthol) (Figure Sa). L'artémisinine, un sesquiterpène lactonique non volatil, extrait d'une armoise, est devenu, en association avec d'autres antimalariques (ou antipaludéens), un traitement de référence du paludisme (Bosman et Mendis, 2007). Il faut noter que certaines HE renferment, préférentiellement, des composés phénoliques volatils eugénol, anéthol (anis), etc. Parmi eux, d'autres sont cancérigènes comme l'estragol (Figure Sb). Les stéroïdes ont une structure proche de celle des triterpènes. Certains sont cardiotoniques (digoxine des digitales), d'autres, les polystérols, sont, entre autres, hypocholestérolémiants comme le sitostérol (Figure Sc) des margarines (Abumweis et al, 2008). Certains phytostérols, comme d'ailleurs des saponosides de nature stéroïdique, sont utilisés par l'industrie pour fabriquer des stéroïdes utilisés en thérapeutique (corticoïdes, contraceptifs, anabolisants, etc.). 2.2.2. Saponosides ou Saponines Les Saponosides constituent un vaste groupe d'hétérosides très fréquents chez les végétaux. Le terme saponosides est dérivé de la saponaire (Saponaria) qui était jadis utilisé comme substitut du savon (Hopkins, 2003). C'est d'ailleurs sur leur tentio-activité qu'est fondée l'utilisation multiséculaire de certaines drogues qui en renferment : la saponaire a, pendant longtemps, constitué un détergent ménager courant : le savon (Bruneton, 1999). Les saponosides sont des molécules de haut poids moléculaire, glycolysés, constitués d'une partie hétérosid iq ue I iée à un triterpène ou un stéroïde (Figure 6a et 6b ). l ls peuvent être des stéroides• glycolysés, des stéroïdes, des alcaloïdes glycolysés ou des hétérosides triterpéniques. lis peuvent aussi se trouver sous forme d'aglycones ; dans ce cas, ils sont appelés sapogénines (Hostettmann et Marsto, 2005). On les classe en deux grands groupes selon la nature de leur génine : - les saponosides à génine steroïdique (Figure 6b), presque exclusivement présents chez les Angiospermes Monocotylédones. On en connaît, chez les Fabaceae ou les Scrophulariaceae; - les saponosides à génine triterpénique (Figure 6a), de loin les plus nombreux. lis existent chez quelques animaux marins et pour l'essentiel, chez les Angiospermes Dicotylédones (Bruneton, 1999). 16 HO H a) Monodesmosides (génine triterpénique) b) Furostanol (génine stéroïdique) Figure 6: Structures des génines des saponosides 2.2.2.1.Propriétés physico-chimiques Les saponosides sont caractérisés par leur propriété tensio-active; ils se dissolvent dans l'eau en formant des solutions moussantes. (Hostettmann et Marsto, 2005). La combinaison d'un triterpène hydrophobe et d'un glucide hydrophile confère aux saponosides des propriétés tensio-actives ou détergentes qui, lorsqu'elles sont agitées avec de l'eau, produisent une mousse savonneuse. 2.2.2.2.Propriétés pharmacologiques li n'est pas déraisonnable de penser que, in vivo, bon nombre de saponosides assurent la défense du végétal contre les attaques microbiennes ou fongiques (évacines et rnonodesmosides (Figure 6a) de l'avoine). On leur confère une activité à l'encontre d'espèces phytopathogènes (saponosides de luzerne), ainsi que divers Candida et derrnatophytes (Bruneton, 1999). Les saponines ont des propriétés fongicides (Tsuzuki et al., 2007; Saha et al., 201 0), puis antirn icrobiennes (Maatalah et al., 2012). Certains saponosides sont actifs sur les virus et ont des propriétés hémolytiques généralement attribuées à leur interaction avec les stérols de la membrane érythrocytaire. C'est cette propriété qui explique l'activité spermicide de certaines molécules à génine terpénique. Plusieurs drogues doivent leurs propriétés anti-inflammatoires, œdémateuses, antitussives et/ ou expectorantes, analgésiques, à des saponosides. Parmi les potentialités des saponosides, on notera l'influence sur l'absorption du cholestérol, l'activité cytotoxique et immunomodulatrice (Bruneton, 1999). 17 2.3.Alcaloïdes Les alcaloïdes représentent un ensemble de molécules d'origine naturelle constituées de carbone, d'hydrogène et, plus spécifiquement, d'azote. Leur dénomination vient de l'arabe alkali à l'origine d'alcali et du grec élois (forme) et fait référence à leur caractère basique (Jacques, 1999). Les alcaloïdes sont des substances organiques azotées toxiques, même parfois à faible dose. La toxicité de la plupart des plantes est liée aux alcaloïdes, car le corps ne métabolise pas l'azote, il l'expulse immédiatement (Carillon, 2007). Cependant, ils sont utilisés en médecine en très faible quantité (Saxena, 2007 ;O'Connor, 2010). Leur masse moléculaire est généralement faible et dépasse rarement 1000 daltons. L'amertume est un caractère quasi constant (Aniszewski, 2007) qu'il n'est, cependant, pas recommandé de vérifier en raison de la toxicité des produits. 2.3.1. Propriétés physico-chimiques La plupart sont des solides cristallisés. Ils sont généralement insolubles dans l'eau, mais solubles dans les solvants organiques (alcools, acétones, chloroformes). Leurs sels ont des caractères de solubilité inverses (Jacques, 1999; Xu et al., 2012). 2.3.2. Propriétés pharmacologiques Ce sont des apéritifs amers qui ont une action directe sur le système nerveux (sympathique, parasympathique et central). L'effet sur Je système nerveux peut aller jusqu'à une action spasmodique et mydriatique, anesthésique local ou analgésique et narcotique (Afaq et Smith, 2005). Bon nombre aussi sont utilisés pour être transformés chimiquement en substances d'activité modifiée: (nalorphine, vinorelbine, etc.) ou qui ont donné naissance à des familles de médicaments synthétiques (Anonyme 1,2010) : anticholinergiques sur le modèle de l'atropine, anesthésiques locaux sur le modèle de la cocaïne, anticholinestérasiques, analgésiques sur le modèle de la morphine (Figure 7a). Entre autres alcaloïdes, on a des pyrrolizidines (comme les alcaloïdes hépatotoxiques), des tropolones (colchicine antigoutteuse), des indoles, des quinoléines et des purines dont la théophylline (Figure 7b) pour le traitement de l'asthme (Bruneton, 2009). La pilocarpine (Figure 7c) extrait du Jaborandi (Pilocarpus microphyllus, Rutaceae) a une action parasympathicomimétique qui s'exerce au niveau de l'œil et des sécrétions. Cet alcaloïde est utilisé sous forme de collyre dans le traitement du glaucome (Roger et al., 2005). Les plantes à alcaloïdes sont souvent responsables d'intoxications aigües (colchique de Datura) ou chroniques (Bruneton, 2009). 18 1-10~1 '>--. 1 N-Ci-13 . HO a) Morphine b) Théophylline c) Pilocarpine Figure 7: Quelques structures d'alcaloïdes (Bruneton, 2009) 3. Généralités sur les plantes sélectionnées La flore africaine est riche et diversifiée. Ces dernières décennies, elle a particulièrement intéressé les chercheurs et les laboratoires pharmaceutiques à la recherche de nouvelles molécules d'origine naturelle (Tra Bi, 2008). 3.1. Bridelia atroviridis Müll. Arg (Euphorbiaceae) Le synonyme de Bridelia atroviridis Müll. Arg (Euphorbiaceae) est Bridelia zenkeri Pax. 3.1.1. Description botanique Bridelia atroviridis est un arbuste ou un arbre assez ramifié, pouvant atteindre 20 mètres de hauteur, avec des branches fortement épineuses. Les feuilles, simples, entières, alternes sont elliptiques à ovales (Figure 8). Les nervures latérales sont composées de 10 à 22 paires. Les inflorescences sont des fascicules axillaires. Les fleurs, petites, verdâtres ou roses à rougeâtres, sont unisexuées. Les fruits, des drupes ovoïdes indéhiscentes, sont verdâtres et noirâtres à maturité. B. atroviridis est une espèce répandue dans toute la zone intertropicale. Elle croît dans les forêts secondaires, en lisière de forêt puis près des lacs et des fleuves (Trvine, 1961 ; Adebisi et Ladipo, 2007). 19 Figure 8 : Rameau feuillé portant des fruits de Bridelia atroviridis Müll. Arg (Kossonou, Bongouanou, août, 20 l 0) 3.1.2. Usages traditionnels, phytocbimie et activités biologiques Selon Adebisi et Ladipo (2007), l'infusion d'écorce se boit pour ses vertus purgatives et diurétiques, pour traiter l'incontinence urinaire, la fièvre, les douleurs abdominales, la dysenterie, la diarrhée et les douleurs rhumatismales. La décoction des écorces est utilisée contre la gonorrhée et autres maladies vénériennes puis comme aphrodisiaque (Abbiw, 1990). Les feuilles sont utilisées contre les eczéma (Idu et al., 2010). Les écorces de tige et les feuilles de Bridelia atroviridis contiennent des tanins, des stérols, des triterpènes, des saponines et des flavonoïdes (Agyare et al., 2006 ; Adebisi et Ladipo, 2007). Ces organes ont montré diverses activités, antimicrobienne sur Escherichia coti, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, antifongique sur Candida albicans etAspergilus niger et cardiovasculaire (Carollo et al, 1997; Neuwinger, 2000; Agyare et al., 2006; Ngueyema et al., 2009). 3.2. Erythrina senegalensis A. DC. (Fabaceae) Les synonymes d'Erythrina senegalensis A. DC. (Fabaceae) sont Erythrina latifolia Schumach. & Thom et Erythrina guineensis G .Don. 20 3.2.1. Description botanique C'est un arbre de sept mètres de hauteur, profondément fissuré (Burkill, 1995). Les branches et les écorces sont épineuses. Les feuilles, composées, possèdent trois folioles. Les inflorescences, en grands groupes, sont disposées à l'extrémité des branches (Figure 9). Les fleurs, rouges vives, mesurent de 4 à 5 cm de longueur. Les fruits, de couleur rouge, sont légèrement poilus et mesurent de 1 à 15 cm de longueur et 1 cm de largeur. Cette plante est présente dans les régions tropicales et subtropicales, dans les savanes sèches et boisées (Burkill, 1995 ; Contu, 2012). Figure 9 : Rameau feuillé portant des inflorescences de Erythrina senegalensis A. DC. (Kossonou, Bongouanou, aofit, 2010) 3.2.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques Les écorces et les feuilles sont utilisées pour panser les plaies. Selon Togola et al. (2008), E. senegalensis est utilisée contre les troubles gastro-intestinaux (ulcère gastrique, diarrhée, constipation), l'onchocercose, la malaria. Cette plante est utilisée contre les infections bronchiques, la dysenterie et contre les maladies vénériennes (Atindehou et al., 2004). L'écorce des racines de cette espèce contient des flavonoïdes (Wandji et al., 1994 ; Saidu et al., 2000 ; Igbokwe et al., 2006, des alcaloïdes (Soto-Hernàndez et al., 2012), des saponines, des tanins et des hydrates de carbone (Saidu et al., 2000 ; Igbokwe et al., 2006). Des graines de Erythrina senegalensis, ont été isolées des alcaloïdes (Wandji et al. 1995). 21 L'activité antibactérienne et antifongique de E. senegalensis a été mise en évidence par Magassouba el al. (2007) et Doughari (2010). Les écorces de tige de cette plante sont actives sur les bactéries (Staphylococcus aureus, Streptococcuspyogenes, Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa) ainsi que sur les champignons (Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Penicillium notatum). Les travaux de Koné el al. (2007) ont montré que les racines de cette plante sont actives sur les souches résistantes de Streptococcus pneumoniae. Les feuilles ont des propriétés antibactériennes (Magassouba et al., 2007). L'écorce du tronc est active contre le plasmodium et l'agent responsable de la trypanosomiase et les racines possèdent des propriétés bactéricides sur les souches de Staphylococcus aureus (Koné et al, 2004). Selon Donfack et al. (2008), l'écorce de tige de E. senegalensis possède une activité hépatoprotectrice et antioxydante par sa capacité à réduire le fer. 3.3. Nephrolepis biserrata (Sw.) Schott (Davalliaceae / Nephrolepidaceae) Les synonymes de Nephrolepis biserrata (Sw.) Schott (Davalliaceae / Nephrolepidaceae) sont : - Aspidium acutum Schkuhr. - Aspidium biserratum Sw. - Aspidium mauritianum Desv. - Aspidium splendens Willd. - Hypopeltis biserrata (Sw.) Bory. - Nephrodium splendens (Willd.) Desv. - Nephrolepis acuta (Schkuhr) C. Presl. - Nephrolepis exaltata (L.) Schott var. biserrata (Sw.) Baker. - Nephrolepis exaltata sensu Cordem. 3.3.l. Description botanique Elle est une plante terrestre ou épiphyte. Le rhizome, court, dressé, est couvert d'écailles peltées, brun-roux, lancéolées, longuement acuminées, à marge pourvue de poils fins. Les feuilles, plusieurs en touffe (Figure 10) sont composées, atteignent et dépassent 90 cm de longueur. Le limbe, herbacé, épais et plus ou moins coriace, elliptique, penné, est progressivement réduit à la base et atténué au sommet. Le rachis est pourvu d'écailles denses ou éparses, surtout sur la face supérieure. Les sores, submarginaux ou médians, sont à indusie 22 lunulée, à sinus étroit, et libres du côté de la marge des pennes (Badré, 2008). N. bisserata est répandue dans la zone pantropicale (Hovenkamp et Miyamoto, 2005; Omojola et al., 2012). Figure 10: Feuilles fertiles de Nephrolepis biserrata (Sw.) Schott (Kossonou, Nangui Abrogoua, août, 2010) 3.3.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques Les feuilles de Nephrolepis biserrata sont utilisées en médecine traditionnelle pour soigner les plaies, la toux, les abcès et pour soulager les brulures (Winter, 2003, Lai & Lim, 2011 ). Selon Rani et al. (2010), cette fougère contient des flavonoïdes, des tanins, des alcaloïdes, des sucres réducteurs, des triterpènes et des stéroïdes. Adou et al. (2014) ont également mis en évidence quelques composés de cette espèce végétale (stérols et polyterpènes, polyphénols, flavonoïdes, tanins et les substances quinoniques). Selon Rani et al. (2010), l'extrait aqueux et l'extrait chloroformique des parties aériennes de la plante sont antifongiques et antimicrobiens. Johnny et al. (2010 ; 2011) ont mis en évidence une faible activité inhibitrice des feuilles de N. biserrata sur la croissance et la sporulation du champignon Colletotrichum gloeosporioides, un agent pathogène des plantes. 23 Figure 11: Feuilles de Phymatodes scolopendria (Burm.) Ching (Kossonou, Nangui Abrogoua, août, 2010) 25 3.4.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques Les rhizomes de Phymatodes scolopendria sont recommandés dans la médecine traditionnelle créole, par les tisaneurs dans les cas de diarrhée et vers intestinaux chez les enfants. Ils sont utilisés pour le rafraîchissement dans les situations d'inflammations urinaires et intestinales. Ils sont aussi utilisés contre les hémorroïdes et pour soulager les crises d'épilepsie (Lavergne et Vera 1989; Lavergne, 1990). Selon ces auteurs, les feuilles sont antiasthmatiques. Les travaux de Ramanitrahasimbola et al. (2005) ont permis d'isoler des coumarines et des saponines des parties aériennes de la plante. L'une de ces coumarines, la 1,2-benzopyrone, possède une activité bronchodilatatrice qui permet de soulager certains cas de troubles respiratoires. 3.5. Microgramma owariensis (Desv.) Alston (Polypodiaceae) Les synonymes de Microgramma owariensis (Desv.) Alston (Polypodiaceae) sont : -Microgramma lycopodioides (L.) =Anapeltis lycopodioides (L.) J. Sm. -Anapeltis owariensis (Desv.) J. Sm. 3.5.1. Description botanique Microgramma owariensis est une plante épiphyte ou terrestre. Son rhizome, longuement rampant (Figure 12) est couvert d'écailles denses, brun-pâles, lancéolées, peltées, à marge entière; la partie supérieure des écailles et la marge deviennent blanchâtres en vieillissant. Les feuilles sont espacées, les fertiles atteignent 14 cm de longueur, généralement plus étroites et plus longues que les stériles. Le pétiole est indistinct (pseudo-pétiole). Le limbe est simple, entier, glabre sur les deux faces, oblong à elliptique-lancéolé, parfois à peine caudé au sommet, en coin et décurrent à la base en une aile très étroite jusqu'au rhizome ; les nervures sont indistinctes. Les sores arrondis, médians, non enfoncés dans le limbe, sont disposés en une rangée de chaque côté de la nervure médiane (Bradé, 2008). Présente à Madagascar, aux Comores, à l'est de l'Afrique du Sud, en Afrique de l'Est et sous les tropiques de l'Afrique et de l'Amérique, Microgramma owariensis croît sur les rochers ou sur les arbres, dans les zones intertropicales (Beni, 1982). 26 Figure 12: Feuilles de Microgramma owariensis (Desv.) Alston sur tronc d'arbre (Kossonou, Nangui Abrogoua, août, 2010) 3.5.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques La plante entière de M owariensis est utilisée chez les peuples Ehotilé (Côte d'Ivoire) pour soigner la stérilité et les dysménorrhées chez les femmes. La plante entière est macérée et diluée dans de l'eau (Malan et al., 2015). 3.6. Trichilia heudelotii (Oliver) Planch (Meliaceae) Le synonyme de Trichilia heudelotii (Oliver) Planch (Meliaceae) est Trichilia monadelpha (Thonn.) J. J. de Wilde. 3.6.1. Description botanique Arbre sempervirent, T heudelotii peut atteindre 20 m de hauteur avec un fût droit et cylindrique de 40 à 60 cm de diamètre. L'écorce lisse, est pâle. Les feuilles, alternes, sont composées, imparipennées avec trois à sept paires de folioles (Figure 13a). Les inflorescences sont des panicules axillaires pouvant atteindre 21 cm de long. Les fleurs, unisexuées, de couleur jaune-verdâtre ou blanc-verdâtre, sont odorantes. Les fruits (Figure 13b), des capsules obovoïdes à globuleuses, sont déhiscents et contiennent jusqu'à six graines (Burkill, 1997). 27 Figure 13: Trichilia heudelotii (Oliver) Planch (a: feuille; b: Rameau portant des fruits) (Kossonou, Divo, août, 2010) 3.6.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques L'écorce de Trichilia heudelotii est utilisée dans le traitement des troubles gastro intestinaux, de gonorrhée, de syphilis (lrvine, 1961 ; Lemmens, 2008). Les racines et les feuilles sont utilisées pour soigner les plaies, les ulcères (Odugbemi, 2008). Les feuilles et les écorces sont utilisées contre les candidoses (Diame, 2010). Les feuilles de cette plante se sont révélées actives contre les champignons (Aspergillus niger et Trichophyton mentagrophytes) et les bactéries à savoir Bacillus subtilis et Micrococcus luteus (Aladesanmi et Odediran, 1999 ; Aladesanmi et al., 2007). Les feuilles de Trichilia heudelotii contiennent des phénols et des diterpènes. Les études phytochimiques réalisées sur les feuilles, les écorces de tige et les écorces de racine ont révélé la présence des tanins, des saponines, des alcaloïdes et des anthraquinones (Adeniyi et al., 2008). 3.7. Nesogordonia papaverifera (A. Chev.) R. Capuron (Sterculiaceae) Les différents synonymes de Nesogordonia papaverifera (A. Chev.) R.Capuron (Sterculiaceae) sont : -Nesogordoniafouassiera (A. Chev.) Capuron -Cistanthera papaverifera A. Chev. 28 3.7.1. Description botanique Arbre atteignant 45 à 50 m de hauteur et 80 à 120 cm de diamètre, Nesogordonia papaverifera possède un fût généralement droit et cylindrique, dépourvu de branche jusqu'à 25 m de hauteur, avec des contreforts étroits jusqu'à 3 m de hauteur (Figure 14). L'écorce, fissurée et écailleuse, est blanchâtre à grise ou brun grisâtre (Figure 7). Les feuilles, simples, alternes, légèrement groupées en bouquets à l'extrémité des rameaux, possèdent un limbe elliptique à obovale. Les inflorescences sont des cymes axillaires, compactes. Ses fleurs blanches (Figure 6), sont bisexuées. N. papaverifera est plus connue, en Côte d'Ivoire, sous le nom de Kotibé (Oyen, 2005). Figure 14: Nesogordonia papaverifera (A. Chev.) R.Capuron (a: Contreforts; b : entaille du tronc; c: limbe; d: rameau feuillé; e: inflorescence) (Kossonou, Divo, août, 2010) 3.7.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques L'écorce de N. papaverifera est utilisée pour l'hygiène bucco-dentaire (Idu et al., 2010). Ayodele et al. (2007) observent qu'en présence de la sciure de bois, le temps d'émergence du champignon Lentinus squarrosulus (Mont) est plus long. L'écorce de Nesogordonia papaverifera contient des tanins et des saponines (Olufunke, 2012). Les tanins et les saponines sont utilisés contre les bactéries. 29 3.8. Celtis mildbraedii Engl. (Ulmaceae) Différents synonymes sont utilisés pour désigner Celtis mildbraedii Engl. (Ulmaceae). Ce sont: Celtis franksiae N.E.Br. Celtis usambarensis Engl. Celtis soyauxii Engl. Celtis bequaertii De Wild. Celtis compressa A.Chev. Celtis dubia De Wild. 3.8.1. Description botanique Celtis mildbraedii est un arbre à petits contreforts des forêts denses humides. Les feuilles, alternes, simples, ovales, cuminées, sont grossièrement dentées et trinervées à la base. Les nervures latérales s'anastomosent sur les bords du limbe. Les inflorescences sont des cymes axillaires, comportant de nombreuses fleurs. Les fleurs, petites, sont verdâtres. Les fruits (Figure 15), des drupes ovoïdes à ellipsoïdes, sont rougeâtres à maturité (Motte-Florac, 1980). Le genre Celtis comprend quelques 100 espèces et est répandu dans toutes les régions tropicales, subtropicales et tempérées. En Afrique australe et à Madagascar, on le trouve dans des conditions plus sèches (Burkill, 2000). Figure 15: Rameau de Celtis mildbraedii Engl. portant des fruits (Kossonou, Divo, août, 2010) 30 3.8.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques Traditionnellement, il est utilisé en construction d'habitations sous forme de poteaux et pour la confection de pilons, de manches d'outils et de cuillères (Oyen, 2012). La macération de ramilles feuillées est utilisée en bain ou en lotion contre le mal de tête et comme vermifuge (Sattarian, 2006). Les feuilles de C. mildbraedii sont utilisées comme poison de pêche (Neuwinger, 2004). Les fruits de C. mildbraedii sont utilisés en association avec les fruits de Solanum anguivi dans le traitement de la gonorrhée (Betti, 2004). L'écorce a des propriétés analgésiques. Au Cameroun, la décoction d'écorce sert de bain destiné à fortifier les nourrissons très affaiblis. En Angola, on donne aux enfants une tisane de racine en cas de constipation, mais aussi de diarrhée, de toux, d'infections des voies urinaires et de troubles cardiaques (Sattarian, 2006). 3.9. Cola gigantea A. Chev. (Sterculiaceae) 3.9.1. Description botanique Cola gigantea est un arbre pouvant atteindre 50 m de hauteur. Le fût (Figure I6a), généralement long et droit, avec de courts contreforts, possède des fissures verticales profondes ou légères. L'écorce, épaisse et rugueuse, est grise ou brune. Les feuilles, simples, oblongues à elliptiques, lobées avec un pétiole long, sont cordiforrnes (Figure 16b). Les inflorescences (Figure 16c) possèdent des fleurs à périanthe blanc devenant roses ..et odorantes. Les fruits (Figure 16d), des follicules obliquement ovoïdes à ellipsoïdes, abondamment couverts de poils étoilés roux, mesurant jusqu'à 15 cm de long, déhiscents à maturité, peuvent porter une à dix graines (Figure 16e). C. gigantea pousse dans les forêts sèches semi décidue, en Afrique de l'ouest, aux Antilles et dans l'Est de l'Inde. 31 Figure 16: Cola gigantea A. Chev (a : arbre ; b : Feuille ; c : Inflorescence ; d : Fruit de méricarpes ; e : graines dans un méricarpe) (Kossonou, Divo, août, 2010) 3.9.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques La noix de Cola gigantea, aussi appelée cola, est utilisée pour traiter la coqueluche, l'asthme, le paludisme et la fièvre (Agyare et al., 2012). D'autres utilisations traditionnelles, favorisent l'augmentation de l'effort physique, la diarrhée, la dépression et l'anxiété. L'écorce de cette plante est également utilisée pour soigner les dermatomycoses (Irvine, 1961 ; Burkill, 1995 ; Odugbemi, 2006). Des travaux antérieurs ont révélés la présence d'alcaloïdes, de tanins, de saponines et d'anthraquinones dans les feuilles de Cola gigantea (Sonibaré et al., 2009). Les feuilles de C. gigantea inhibent la croissance de Candida albicans et Aspergillus niger (Sonibaré et al., 2009). ). Les propriétés antimicrobiennes de cette plante ont été mises en évidence par Agyare et al. (2012) à partir de l'écorce de tige et des feuiJles. 32 3.10. Triplochiton scleroxylon K. Schum (Sterculiaceae) 3.10.1. Description botanique C'est un grand arbre (Figure 17a) caducifolié qui peut atteindre 50 m de hauteur. Le fût rectiligne, dépourvu de branches jusqu'à 30 m de hauteur, atteint 150 à 210 cm de diamètre, avec des contreforts. L'écorce, de 7 à 30 mm d'épaisseur, est grise à brun-jaunâtre. Les feuilles, simples, alternes, mesurent de 2 à 4 cm de long; le pétiole de 1,5 à 3 voire 10 cm de long; le limbe est palmatilobé avec cinq à sept lobes (Figure 17b). Les inflorescences sont des panicules axillaires ou terminales atteignant 10 cm de long. Les fleurs, bisexuées, sont régulières ; les pétales sont largement obovales, d'un blanc rosé mais violacé à la base (Burkill, 2000). T. scleroxylon est caractéristique de la forêt semi-décidue. On la retrouve parfois dans des clairières de la forêt dense sempervirente, et en forêt sèche. En Côte d'Ivoire, elle est connue sous le nom de "Samba" (Bosu et Krampah 2005; Vernay, 2005). Figure 17: Triplochiton scleroxylon K. Schum (a: Arbre; b: Jeune pousse) (Kossonou, Divo, Aout, 2010) 33 3.10.2. Usages traditionnels, phytochimie et activités biologiques L'écorce de Triplochiton scleroxylon sert, en médecine traditionnelle, à traiter les œdèmes et est également utilisée comme antalgique. Au Nigeria, l'écorce de son tronc est utilisée dans le traitement du diabète. Triplochiton scleroxylon contient, au plan chimique, des tanins, des flavonoïdes, des stéroïdes, des saponines (Prohp et Onoagbe, 2012b). Des activités hypoglycémiante et antidiabétique ont été mises en évidence avec l'écorce de cette espèce (Prohp et al., 2006, 2008 ; Prohp et Onoagbe 2009a, b ; Prohp et al., 2011 Prohp et Onoagbe 2012a). 4. Fruits étudiés 4.1. Piment 4.1.1. Description générale Le piment (Capsicum spp) est classé dans la catégorie des plantes annuelles. C'est un petit arbuste vivace, pouvant atteindre l à 1,5 m de hauteur selon les variétés. Les fruits sont de petites tailles variables. La forme du fruit peut être conique, avec une longueur qui varie de 2 à 10 cm. Le piment peut être de forme cylindrique avec une extrémité plus ou moins pointue. Le genre Capsicum appartient à la famille des Solanaceae. Les fruits du piment contiennent une faible quantité d'huiles essentielles qui donne leur odeur. lis contiennent également un alcaloïde, la capsaicine, à laquelle ils doivent leur saveur piquante. Cette saveur piquante sera plus ou moins forte selon le taux de capsaicine dans les fruits de la variété concernée (Ando et al., 1992). Le piment est un fruit tropical originaire du Sud et du Centre du continent Américain (Tano et al., 2008). C'est une plante des pays tropicaux dont les .fruits sont utilisés pour l'assaisonnement des sauces. Il aurait été introduit pour la première fois en Europe à partir du Brésil, en 1494, par les navigateurs espagnols. Il s'est très tôt répandu à travers le monde. Découvert à une époque où la cuisine fortement épicée était encore très à l'honneur, il a connu, à l'inverse de l'aubergine, un succès immédiat et ce, d'autant plus que l'extrême variabilité de forme, de saveur et de couleur des fruits excitait la curiosité esthétique (Chaux et al., 1994). Il est généralement cultivé pour ses fruits et remplace le poivre dans les pays tropicaux où il est aussi appelé « pili-pili ». li est utilisé sous forme de piment frais, piment séché et de 34 poudre de piment (Ando et al., J 992). De nos jours, les taxonomistes s'accordent sur 25 espèces (Baral et Bosland, 2002) dont une vingtaine d'espèces sauvages (Eshbaugh, 1980) et cinq espèces domestiquées : Capsicum annuum, Capsicum frutescens, Capsicum chinense, Capsicum pubescens et Capsicum baccatum var pendalum (Eshbaugh, 1977 ; McLeod et al., 1979 ; Pickersgill et al., 1979). Les piments les plus cultivés aujourd'hui appartiennent à l'espèce C. annuum. Les différents types de variétés de Capsicum sont communément classés selon les caractéristiques du fruit, la saveur, la couleur, la forme, le goût, la taille et l'utilisation (Bosland, 1992; Smith et al; 1987 ). Il existe des fruits brûlants (saveur piquante) et des fruits doux chez, au moins, quatre des espèces cultivées (Pochard et al., 1992). La saveur douce est souvent associée à une forme globuleuse du fruit, mais il ne s'agit là que d'un repère visuel (trompeur) à l'usage des consommateurs et non d'une liaison génétique. Le caractère brûlant est dû à la présence de composés capsaïcinoïdes, propres au genre Capsicum. Les capsaïcinoïdes ont la caractéristique d'activer les récepteurs de chaleur, d'où la sensation de brûlure, alors qu'il n'y a pas d'augmentation de la température. La capsaïne (69 %) et le dihydrocapsaïne (22 %) sont les composés capsaïcinoïdes les plus répandus et sont deux fois plus puissants, en goût, que les autres (norcapsaïcine, nordihydrocapsaïcine, nornordihydrocapsaïcine, homocapsaïcine, homodihydrocapsaïcine) qui sont considérés comme des capsaïcinoïdes mineurs en raison de leurs teneurs généralement faibles dans les fruits (Bosland, 1996). Le piment est cultivé dans de nombreux pays du monde et sa production à des fins culinaires ne cesse d'accroître d'année en année (Awole et al., 201 1 ). Les piments sont uti I isés comme un exhausteur du goût poivré et les fruits de capsicum sont connus pour leur saveur et sensation de brûlure dans la bouche (Kouassi et al., 2012). 4.1.2. Valeur nutritionnelle du piment Le piment contient des minéraux, des acides aminés et plusieurs vitamines. li contient aussi une très grande quantité d'eau, des protéines, des sucres et des lipides (Tableau 1). 35 Tableau I: Teneurs des constituants majoritaires et énergétiques du piment pour 100 g de produit frais. Composition Teneur Eau(%) 91 Energie (Kcal) 20,25 Protéines (g) 1,17 Carbohydrates (g) 2,91 Fibres (g) 3,59 Sucres (g) 149 Glucose (g) 1,38 Fructose (g) •' 1,25 Minéraux: 0,57 Calcium (mg) 11,2 Fer (µg) 750 Magnésium (mg) 12 Phosphore (mg) 29 Potassium (mg) 177 Sodium (mg) 2,75 Zinc (µg) 180 Cuivre (µg) 71,2 Aluminium (µg) 7,97 Manganèse (µg) 100 Chlorure (mg) 19 Acides aminés (mg): 34,7 Acide malique (mg) 60 Acide citrique (mg) 262 Acide oxalique total (mg) 16 Vitamines (mg) : 2,52 Vitamine C (mg) 138 Rétinol équivalent (µg) 179,77 Acide pantothénique (µg) 230 Vitamine B6 (ug) 247 Vitamine BI (ug) 52,57 Vitamine 82 (µg) 43,14 Vitamine K (µg) 14,9 Caroténoïdes totaux (mg) : 1,62 a-Carotène (µg) 87,29 P -Carotène (µg) 535 Source: Souci et al. (1994) 36 4.1.3. Importance économique du piment Le piment est consommé comme légume frais ou cuit, séché et pulvérisé sous forme de poudre comme colorant ou épice. Dans l'industrie pharmaceutique, il trouve des applications grâce aux capsaïcinoïdes (Hoffman et al., 1983), responsable du goût brûlant ; caractéristique qui a fait la célébrité du piment dans le monde. L'industrie agroalimentaire utilise le piment comme colorant et comme épice. Son utilisation comme colorant estdue à la présence de la capsanthine et la capsorubine. La production mondiale de piment était estimée à 30 millions de tonnes en 2007. Les principaux producteurs mondiaux de piments frais sont la Chine (14 millions tonnes, 47 % de la production mondiale), le Mexique (l,8 millions de tonnes) et la Turquie (1,7 million de tonnes) (Faostat, 2007). Cette performance de la Chine est plus due à l'étendue des surfaces cultivées qu'aux rendements. Selon les données de la Fao, le Cameroun a produit 9 500 tonnes de piment frais en 2007. En Afrique, le Nigéria et l'Egypte sont les premiers producteurs africains de piment frais, alors que l'Ethiopie est le premier producteur de piment sec avec 115 000 tonnes (soit 25 % de la production africaine de piment sec). L'lnde avec 1,2 mi liions de tonne est le premier producteur mondial de piment séché suivi de la Chine. Pour la productivité, les Pays-Bas détiennent le record mondial de rendement en production de piment frais avec 267 t / ha. La Réunion détient le record mondial de productivité de piment séché avec un rendement de 15,56 tonnes/ha (Faostat, 2007). 4.1.4. Maladies et infections du piment Les principaux agents pathogènes du piment sont les virus, les champignons, les bactéries, les nématodes, les insectes et les acariens (Toukam, 2010). Les moisissures et les bactéries sont les plus importants responsables des infections et des maladies du piment après récolte. L'attaque fongique représente le facteur majeur qui limite la durée de conservation du piment frais. En général, le piment, comme tous les fruits et légumes après récolte, est résistant aux infections fongiques pendant une courte période. Avec le mûrissement et l'avancement de la sénescence, il devient plus vuln~1'.able aux infections. La majorité des pertes après récolte du piment frais est causée par des pathogènes comme Botrytis cinerea et Alternaria alterna ta. Les piments frais sont aussi attaqués par des Potyvirus, dont la diversité complique la sélection pour la résistance variétale (Messiaen, 1981 ). 37 Les piments sont également attaqués par des maladies fongiques qui proviennent de l'air comme l'oïdium causé par Leveillula taurica, la cercosporiose causée par Cercospora capsici et l'anthracnose causée par Colletotrichum spp. (Figure 18). - ----,~..•-.,./ .· .. .. ~,\ . . .. ' . . t ''--~ •. ( "", Figure 18: Symptômes fongiques sur un fruit de piment (Anthracnose) (Toukam, 2010) 4.2. Tomate La tomate, Solanum lycopersicum L. (Solanaceae), est une plante vivace, généralement cultivée comme une plante annuelle. C'est une plante généralement à croissance indéterminée (tige monopodiale), mais il existe certaines variétés à croissance déterminée (tige monopodiale puis sympodiale après quatre ou cinq feuilles). La tomate est originaire des Andes d'Amérique du Sud. Elle fut domestiquée au Mexique, puis introduite en Europe en 1544. De là, sa culture s'est propagée en Asie du Sud et de l'Est, en Afrique et au Moyen-Orient. Plus récemment, la tomate sauvage a été introduite dans d'autres régions de l'Amérique du Sud et au Mexique (Sankara et al., 2005). 4.2.1. Description générale La tomate est une plante vivace herbacée mais qui est cultivée comme une annuelle. Les variétés utilisées pour la consommation en frais sont à port indéterminé, c'est-à-dire que la tige peut se développer indéfiniment par empilement de sympodes (constitués de 3 feuilles et d'un bourgeon floral) se développant à partir de bourgeons axillaires après floraison du bourgeon terminal. Ces variétés nécessitent une culture tuteurée, majoritairement conduite sous abri. A l'inverse, les variétés destinées à l'industrie sont à port déterminé entraîné par la floraison du bouquet axillaire après la production de quelques sympodes. La maturation des fruits est alors 38 plus groupée permettant une récolte mécanique en plein champ. En France, la température optimale de croissance de la tomate se situe entre 2 l et 24 °C le jour et entre 15 et 17 °C la nuit (Massot, 2010). Les fleurs de tomate sont regroupées en inflorescence formant des grappes. Elles sont hermaphrodites et autofécondes. Une fois épanouies, elles peuvent alors être fécondées, et cette période ne dure que quelques jours (Massot, 2010). La tomate est une baie qui peut être de forme, de couleur et de taille très différente suivant les variétés. Elle est constituée de plusieurs loges contenant les graines rattachées au placenta. La partie charnue, appelée péricarpe, provient de la différenciation des parois de l'ovaire de la fleur. Elle est divisée en trois parties : le péricarpe externe, le péricarpe radial et le péricarpe interne appelé columelle. Dans le péricarpe externe, on distingue l'exocarpe (membrane externe de la tomate ou peau), l'endocarpe (membrane interne qui délimite les loges) et le mésocarpe charnu constitué de plusieurs couches de cellules. Le placenta s'étend ····· dans les locules et entoure les graines. A maturité, ses tissus se séparent formant le tissu loculaire gélatineux et homogène plus communément connu sous le nom de gel (Massot, 2010). Le fruit comestible du plant de tomate a de nombreuses utilisations. li est consommé sous forme fraîche ou transformée. Les techniques de sélection ont produit des centaines de cultivars adaptés à la multitude d'utilisations en vue desquelles le fruit est cultivé. La tomate a une valeur nutritionnelle significative et constitue une source importante de lycopène, un puissant antioxydant aux effets anticarcinogènes. Elle apporte également des vitamines A, B et C, du potassium, du fer et du calcium. Les tomates cultivées sont de tailles variables, les variétés commerciales les plus courantes produisant des fruits rouges et globulaires de 5-6 cm de diamètre (Massot, 2010). 4.2.2. Valeur nutritionnelle de la tomate La tomate est majoritairement constituée d'eau (de 90 à 95 %). Les 5 à 10 % restant correspondent à la matière sèche (Tableau II). Elle est constituée de sucres (50 %), d'acide ( 13 %) et d'environ 20 rode composés pariétaux (pectine, hémicellulose). Parmi les composés d'intérêt nutritionnel, les minéraux représentent 8 % de la matière sèche et les vitamines, pigments et polyphénols, environ 2 % (USDA, 2007). La tomate est considérée comme un aliment santé car elle est faiblement calorique, riche en minéraux et contient de nombreux antioxydants (vitamine C, polyphénols ... ). Lorsque le fruit est mûr, il contient, également, des pigments de la famille des caroténoïdes; le ~-carotène possède une activité de provitamine A ; le lycopène, présent en grande quantité dans le fruit 39 mûr (entre 3 et 8 mg/100 g de matière fraîche), mais surtout dans les concentrés de tomate (30 mg pour 100 g de concentré), joue un rôle d'antioxydant dans l'alimentation humaine et la prévention de certainscancers (Nguyen and Schwartz, 1998; Giovannucci, 1999). Tableau II: Teneurs en constituants majoritaires et énergétiques de la tomate (pour 100 g de produit frais) Composition Teneurs Eau(%) 94,50 Energie (Kcal) 18 Protéines (g) 0,88 Lipides (g) 0,20 Cendres (g) 0,50 Carbohydrates (g) 3,92 Fibres (g) 1,20 Sucres (g) 2,63 Glucose (g) 1,25 Fructose (g) 1,37 Minéraux: Calcium (mg) 10 Fer (mg) 0,27 Magnésium (mg) 11 Phosphore (mg) 24 Potassium (mg) 237 Sodium (mg) 5 Zinc (mg) 0, 17 Cuivre (mg) 0,059 Manganèse (mg) 0,114 Lipides: Acides gras saturés (g) 0,045 Cl6: 0 (g) 0,033 CI8: 0 (g) 0,013 Acides gras monoinsaturés (g) 0,050 Cl 6: 1 (g) 0,002 Cl 8: 1 (g) 0,049 Acides gras Polyinsaturés (g) 0,135 CI 8 : 2 (g) 0,130 C 18: 3 (g) 0,005 Polystérols (mg) 7 Source : USDA (2007) 40 Tableau II : (Suite) Composition Teneurs Acides aminés : Tryptophane (mg) 6 Thréonine (g) 21 Isoleucine (mg) 20 Leucine (mg) 31 Lysine (mg) 31 Méthionine (g) 7 Cystine (mg) 1.1 Phénylalanine (mg) 22 Tyrosine (mg) 15 Valine (mg) 22 Arginine (g) 21 Histidine (mg) 13 Alanine (mg) 24 Acide aspartique (g) 118 Acide glutamique (g) 313 Glycine (mg) 21 Praline (mg) 16 Sérine (mg) 23 Vitamines: Vitamine C (mg) 12,7 Thiamine (ug) 37 Riboflavine (µg) 19 Niacine (mg) 0,594 Acide pantothénique (µg) 89 Vitamine B6 (µg) 80 Folates (µg) 15 Vitamine A (µg) 42 u-tocophérol (mg) 0,54 Y-tocophérol (mg) 0,12 Vitamine K (µg) 7,9 Caroténoïdes : a-Carotène (µg) 101 p --Carotène (µg) 449 Lycopène (µg) 2573 Lutéine+ Zéaxanthine (µg) 123 Source : USDA (2007) 41 infection virale provoque souvent une croissance retardée et une diminution au niveau de la production. Les dommages causés par les maladies peuvent conduire à une réduction considérable de la récolte. Les effets nocifs des moisissures se limitent, généralement, à la zone contaminée, mais il y a des moisissures qui envahissent les tissus vasculaires et se propagent dans toute la plante à savoir Fusarium et Verticillium spp. (Sankara et al., 2005). Les symptômes les plus évidents des maladies fongiques sont les taches sur les feuilles. Normalement, celles-ci sont rondes ou ovales, mais elles peuvent avoir une forme polygonale ou en fuseau (avec des extrémités pointus). Les principales infections fongiques de la tomate sont : la fusariose (F. oxysporum ), la verticilliose (V albo-atrum, V dahliae), le mal blanc ou oïdium (Leveillula taurica), l'anthracnose (Colletotrichum coccodes, l'altemariose (Alternaria solani) (Sankara et al., 2005). Des fruits plus mûrs se conservent moins longtemps, surtout s'ils ont en plus des microfissures. Les microfissures laissent échapper l'eau du fruit lentement, mais sûrement. Ces stocks sont susceptibles à divers agents pathogènes de conservation, dont le champignon Rhizopus stolonifer (Figure 19). Les tomates deviennent très molles et laissent s'écouler du liquide. Les lésions se couvrent de filaments blancs (mycélium du champignon). Plus tard, des spores noires se développent sur ces filaments. Les spores sont transportées facilement par les courants d'air et peuvent réinfecter les fruits avoisinants et perpétuer le cycle de la maladie. Figure 19 : Pourriture de tomate causée par Rhizopus stolonifer 43 La plupart des maladies bactériennes sont transmises dans des conditions d'humidité et de température élevées. Une fois que la bactérie pénètre la plante, elle aboutit généralement dans le système vasculaire des tiges, racines et feuilles, provoquant souvent le flétrissement de ces dernières. On distingue principalement le flétrissement bactérien causé par la bactérie Ralstonia solanacearum, le feu bactérien causé par la bactérie Xanthomonas axonopodis et le chancre bactérien causé par la bactérie Clavibacter michiganense (Sankara et al., 2005) . La tomate présente une sensibilité très élevées aux maladies virales. Le virus de la mosaïque du tabac, présent partout où la tomate est cultivée ou distribuée dans le monde, peut causer des pertes graves. Il est souvent propagé dans la culture par des insectes vecteurs comme les mouches blanches, les thrips et les pucerons. Les dommages provoqués par ce virus sont généralement bien plus importants que les blessures physiques causées par l'insecte vecteur (Sankara et al., 2005). Outre ces attaques, d'autres agents comme les aleurodes (Trialeuroides vapariorum et Bemesia argentifolia) endommagent la plante en suçant la sève des feuilles. En cas d'attaque sévère, un jaunissement des feuilles et un déclin général peuvent être observés. Les araignées rouges de la famille des Tetranychidae, les aphidiens (Myzus persicae) et les légionnaires du genre Spodoptera endommagent également le feu i liage et les fruits de la tomate (Sankara et al., 2005). 4.3. Papaye Le papayer est originaire d'Amérique du Sud et largement distribué, géographiquement, sur la Cordillère des Andes, couvrant l'ouest et l'est versants et les vallées inter-andines de la Colombie à la Bolivie (Sanchez, 1994). Il appartient à la famille des Caricaceae. Carica est le plus grand des quatre genres que cette famille contient avec 48 espèces, parmi lesquelles Carica papaya L. est la plus importante et la plus cultivée partout dans le monde (Badillo, 1971 Waller, 1992). 4.3.1. Description générale Le papayer (Carica papaya L.) pousse dans les régions tropicales. C'est un arbre généralement non ramifié dont le tronc, non ligneux, est fortement marqué par les cicatrices des feuilles tombées. Il peut atteindre 3 à 8 rn de haut. li se termine par une couronne de grandes feuilles longuement pétiolées, à sept lobes. C'est un arbre généralement dioïque, mais il en existe également de types hermaphrodites. 44 Les fleurs mâles, en forme d'entonnoir, apparaissent sur de longues panicules ramifiées à l'aisselle des feuilles. Les fleurs femelles, à cinq pétales, naissent isolées ou par groupe de deux ou trois sur la partie supérieure du tronc. Les fruits sont arrondis, ovoïdes ou presque filiformes selon les variétés et de couleur verte à jaunâtre à maturité. La section du fruit appelé papaye, montre une cavité centrale remplie de petites graines noires ressemblant à des petits pois, entourées d'une gaine gélatineuse (Delaveau, 1984; Le Bellec et al., 1997; Debuigne et Couplan, 2009). 4.3.2. Le fruit Le fruit est une baie à péricarpe coriace, appelée péponide, riche en vitamines, longue de 15 à 40 cm pour un diamètre de 7 à 25 cm. JI possède une forme ovoïde ou arrondie rappelant la courge ou le melon et est marquée d'angles saillants. Son poids varie de 500 g à 8 kg. Les fruits sont groupés par deux ou trois. L'écorce de la papaye passe du vert au jaune-orangé à maturité. Sa chair est de couleur orangée, parfois rouge (Sastre et Breuil, 2007 ; Delaveau, 1984). La cavité centrale renferme des graines noires ou grisâtres de saveur piquante contenues dans un mucilage (Bruneton, 2009 ; Couplan, 2009). 4.3.3. Valeur nutritionnelle de la papaye La papaye est composée d'eau (89,4 %), de lipides, de protéines et de sucres. Elle fournit environ 32 Kilocalories à l'organisme. Elle est aussi riche en minéraux; en acides aminés et en vitamines (Tableau III). 45 Tableau III: Teneurs des constituants majoritaires et énergétiques de la papaye (pour 100 g de produit frais) Composition Teneurs Eau(%) 89,4 Energie (Kcal) 32 Fibres (g) 1,9 ,,•' 7,8 Glucides disponibles (g) Glucose (g) 2,5 Fructose (g) 2,5 Saccharose (g) 2,8 Minéraux: Calcium (mg) 20 Fer (mg) 0,4 Magnésium (mg) 13 Phosphore (mg) 11 Potassium (mg) 214 Sodium (mg) 3 Acides aminés : Tryptophane (mg) 9 Thréonine (mg) 8 ... -· Jsoleucine (mg) 6 Leucine (mg) 12 Lysine (mg) 30 Phénylalanine (mg) 7 Tyrosine (mg) 4 Valine (g) 8 Arginine (mg) 8 Histidine (mg) 4 Alanine (mg) li Asparagine (mg) 38 Glutamine (mg) 25 Glycine (mg) 14 Proline (mg) 8 Sérine (mg) 12 Vitamines: ····· Vitamine C (mg) 60 Niacine (mg) 0,4 Acide pantothénique (mg) 0,22 Folates totaux (µg) 45 Source: Razafirnandimby (1998) 46 4.3.4. Importance économique de la papaye La papaye est une bonne source de vitamine A, de vitamine Cet de calcium (Arriola et al., 1980 et Hayes, 1993). Les fruits crus contiennent une enzyme dénommée "papaïne" alcaloïde ou protéolytique, qui est un produit commercial de plusieurs pays d'Amérique tropicale et utilisé dans plusieurs médicaments et préparations alimentaires. Économiquement, Carica papaya est l'une des espèces les plus importantes au sein de la famille des Caricaceae. La papaye est aussi très utilisée dans l'industrie de la cosmétologie et de la parapharmacie pour sa senteur et son pouvoir anti-oxydant. Elle est uti I isée pour la fabrication des boissons, des confitures, des glaces, des assaisonnements, des fruits secs et des sirops (Villegas, 1997 ; Ezike et al., 2009). Depuis très longtemps dans les pays tropicaux, le suc et le fruit vert du Papayer sont utilisés pour attendrir la viande. Avant l'existence des réfrigérateurs, on conservait la viande en même temps qu'elle s'attendrissait dans les feuilles de Papayer. Cet usage est longtemps resté une tradition aux Antilles (Debuigne et Couplan, 2009). Les fruits verts,__[es feuilles et les fleurs peuvent aussi être utilisées comme légumes cuits (Watson, 1997). Outre les fruits, les feuilles de la papaye peuvent aussi avoir des vertus médicinales. La papaye était utilisée du fait de sa teneur en papaïne comme anti-oedémateux, anti-inflammatoire et cicatrisant dans certaines interventions odontologiques (Girre, 2006). Les racines seraient efficaces sur les maux de dents (Boullard. 2001). Selon le même auteur, les infusions de fleurs sont à la fois béchiques et efficaces pour guérir l'aphonie (Boullard, 2001 ). La production annuelle mondiale de la papaye a été estimée à 161 793 834 tonnes environs (Faostat, 2012). Les principales régions productrices de ce fruit sont l'Asie, l'Europe, l'Amérique du nord, I'. Amérique centrale et du sud. Environ 65 % de la production mondiale provient de l'Amérique du Sud. Les 35 % restants sont de l'Amérique du Nord et l'Afrique centrale. En Inde, la papaye est cultivée à des fins de table, de l'extraction de la pectine et les concentrés dans l'état du Kerala, Orissa, du Bengale occidental, du Karnataka, de l'Assarn et du Gujarat (Singhal, 1990). 4.3.5. Maladies de la papaye La papaye est un fruit périssable. Elle est très sensible à la présence des champignons pathogènes qui envahissent les fruits pendant les opérations post-récoltes. La présence des champignons devient un facteur limitant pour sa production nette, car ils peuvent causer 25 à 40 % des pertes de fruits pendant la commercialisation (Sharma, 2015). En Côte d'Ivoire, les principales maladies de la papaye sont d'origine virale et fongique (Diallo et al., 2007). Les 47 champignons filamenteux sont jugés responsables de nombreuses pertes post-récoltes et sont donc un réel problème pour la préservation de la qualité de la papaye, surtout après la récolte. L'agent pathogène Je plus commun, dans toute la zone de culture de papaye, est Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. Prasad Verma a signalé son apparition en 1970. Sharma et Alam, (1998) et Srivastava et al. (1964) ont rapporté que Gloeosporium papayae provoquent la pourriture des fruits de papaye. La papaye est sujette à de nombreuses maladies causées par les champignons, les bactéries, les nématodes et les virus conduisant à de faibles rendements. Comme beaucoup d'autres fruits, la papaye est également affectée par diverses maladies post-récoltes comme l'anthracnose, la pourriture du pédoncule, la pourriture de chocolat due à Fusarium et à Aspergillus et la pourriture due à la moisissure chevelue, etc. L'anthracnose de la papaye causée par C. gloeosporioides semble être plus sévère, provoquant des dégâts énormes pendant le transport et le stockage. Elle est importante dans de nombreuses autres régions tropicales où la papaye est cultivée (Bolkan et al., 1976). Les premiers symptômes d'anthracnose de la papaye sont des taches rondes, détrempées sur le corps des fruits à la maturation. Les taches creuses brunes se développent sur la surface du fruit. Les symptômes apparaissent uniquement sur le fruit à la maturation et peuvent ne pas être apparents au moment de la récolte (Figure 20). La chair sous la partie affectée devient douce et commence à pourrir (Baker et al., 1940 et Dickman et Alvarez, 1983). Figure 20: Maladie post-récolte causée par Rhizopus sp. de fruits de papaye (Oniha et Egwari, 2015) 48 4.4.Lutte contre les maladies des fruits 4.4.1. Les pesticides synthétiques chimiques Les pesticides, encore appelés produits phytosanitaires, sont des substances chimiques utilisées pour la croissance, la protection et la conservation des végétaux (Khadija El Mrabet, 2006). Selon Sankara et al. (2005), les pesticides synthétiques chimiques ont été conçus par des chercheurs de sociétés chimiques et ne sont vendus que par les sociétés en question. Ces produits chimiques peuvent être toxiques (parfois même très toxiques) pour les hommes et pour les animaux. Ils sont très efficaces pour lutter contre les ravageurs et les maladies, mais ils tuent également les prédateurs naturels des ravageurs, provoquant des résurgences importantes de certains ravageurs s'ils ne sont pas appliqués au bon moment, de la bonne façon et à un dosage adéquat par hectare. Étant donné l'effet de résidus qu'ils provoquent, ils peuvent également nuire aux consommateurs et à l'environnement, c'est pourquoi il faut toujours les appliquer judicieusement et uniquement en cas d'urgence. Dans le but de limiter l'utilisation des pesticides chimiques, l'on recommande aux agriculteurs d'adhérer aux principes de la lutte intégrée. Une manière simple d'augmenter l'efficacité des fongicides est d'ajouter une cuillerée à soupe de savon de ménage à la bouillie dans le pulvérisateur. Le savon réduit la tension superficielle ; ainsi, les gouttes de la bouillie s'étendent davantage sur la surface où elles atterrissent, créant un film de pesticide. De cette manière, les agriculteurs peuvent réduire le nombre d'applications (Aubertot et al., 2005). 4.4.2. Les pesticides naturels Les pesticides naturels sont des produits comme le pyrèthre et le derris (la roténone). On les appelle « naturels» parce qu'on les trouve dans la nature. Ces insecticides sont connus et ont été utilisés depuis les temps anciens. Leur application a des effets rapides. lis peuvent être aussi toxiques pour les ennemis naturels des ravageurs de culture que les pesticides synthétiques chimiques (Sankara et al., 2005). 4.4.3. La lutte biologique Le fait de lutter contre un insecte ravageur par le biais de ses ennemis naturels est appelé lutte biologique. Les ennemis naturels peuvent être des oiseaux, des araignées, d'autres insectes et même des moisissures et des bactéries (Sankara et al., 2005). 49 5. Champignons étudiés Les champignons sont des organismes eucaryotes. Ce sont des thallophytes non chlorophylliens, hétérotrophes pour le carbone (nécessitant une source de carbone et d'azote pour leur développement), qui se nourrissent par absorption. Leur appareil végétatif, le thalle, est représenté soit par une cellule unique (thalle levuriforme), soit par un ensemble de cellules formant une structure lâche (le cœnobe), soit par des cellules associées en filaments dont l'ensemble constitue le mycélium (Ozenda, 2000). Les champignons filamenteux sont de véritables agglomérats de filaments mycéliens et d'organes fructifères capables de coloniser des substrats très divers (végétaux, papier, cuir, mur) (Semai, 1993). Incapables de réaliser la photosynthèse, ils sont obligés de vivre aux dépens de matières organiques préformées qu'ils trouvent dans le milieu extérieur. En fonction du type de substrat utilisé, ils vivent soit en parasites, soit en saprophytes, soit en commensaux, soit en symbiotes. In vitro, ils peuvent se développer sur des milieux simples, contenant une source de carbone (sucres), d'azotes (acides aminés) et des sels minéraux (sels de potassium, magnésium, fer, zinc et des phosphates) (Ozenda, 2000). Certains nécessitent, pour leur croissance, un apport de vitamines telles que la thiamine ou la biotine. Leur reproduction se fait par voie sexuée ou par voie asexuée. La reproduction asexuée est la forme la plus fréquente (Lanier et al., 1978). Elle fait intervenir une division du noyau par simple mitose et est basée essentiellement sur la production de spores, le bouturage étant possible mais restant limité. Les spores asexuées sont produites par différents types de structures selon les groupes : endospores, spores exogènes ou conidies (conidiogènese de type blastique ou thallique). La reproduction sexuée se déroule en trois phases successives qui sont la plasmogamie (fusion des protoplasmes de deux cellules fongiques), la cryogamie (fusion des noyaux) et la réduction chromatique ou méiose suivie d'une ou de plusieurs mitoses. A partir de ce schéma général, il existe de nombreuses variantes. La reproduction sexuée est très importante car elle constitue la base de la classification des champignons (Lanier et al., 1978). On distingue trois types de spores sexuées : les zygospores, les ascospores et les basidiospores. On parle de macromycètes lorsqu'il se forme, au cours du cycle de reproduction d'Û.ne espèce, une structure bien visible à l'œil nu, plus ou moins éphémère, appelée sporophore qui porte les spores de la reproduction sexuée (Ozenda, 2000). 50 5.1. Classification et caractères des principaux groupes de champignons Les champignons sont des organismes eucaryotes dépourvus de chlorophylle. Selon Semai (1993) trois divisions principales régissent la population fongique: -les Gyrnnornycota regroupent les champignons avec un appareil végétatif sans paroi ; - les Mastigornycota se reproduisent par des spores mobiles; - les Amastigornycota n'ont pas de cellules mobiles. Cette dernière division comprend quatre sous-embranchements (Botton et al., 1990; Semai, 1993): - les Zygornycotina ou Zygomycètes ont un mycélium sans cloison ; - les Ascomycotina ou Ascomycètes chez lesquels l'appareil végétatif est un thalle à mycélium septé et distingué par la présence d'une structure caractéristique appelée asque, formé au cours de la reproduction sexuée, qui renferme un nombre défini d'ascospores divisés en trois: les cléistothèques, les périthèces et les apothécies (Botton et al., 1990). - les Basidiomycotina ou Basidiomycètes comprennent les champignons pourvus d'un mycélium septé ou unicellulaire (levures) - les Deuteromycotina ou Deuteromycètes, très hétérogènes, englobent tous les champignons pour lesquels la reproduction sexuée n'est pas connue. Ces champignons sont unicellulaires ou à thalle filamenteux septé. Les Deutéromycètes sont divisés en trois classes : Les Blastomycètes (produisent des spores unicellulaires), les Hyphornycètes (les conidies naissent de cellules banales ou de cellules spécialisées souvent portées par un filament différencié, le conidiophore) et les Cœlomycètes (produisent les conidies dans des pycnides et des acervules). Les Hyphornycètes et les Cœlornycètes comprennent des agents de biodégradation mais aussi des moisissures utiles aux biotechnologies (Taboue, 2007). 5.2. Identification morphologique des champignons En général, l'identification morphologique des champignons repose sur l'observation précise des caractères culturaux et morphologiques (Semai, 1993). Les caractères culturaux comprennent : - la vitesse de croissance ; - la texture ; - la couleur; - l'odeur: - l'exsudat (présence de gouttelettes par une transpiration du mycélium). Quant aux caractères morphologiques, ils tiennent compte de l'observation microscopique du mycélium, de la nature des organes de reproduction différentiels et d'une 51 étude biométrique par la mesure ou le comptage des propagules (Semai, 1993 ; Cahagnier et Richard-Molard, 1998). 5.2.1. Critères d'identification macroscopique des champignons L'aspect des colonies représente un critère d'identification. Les champignons filamenteux forment des colonies duveteuses, laineuses, cotonneuses, veloutées, poudreuses ou granuleuses ; parfois certaines colonies peuvent avoir une apparence glabre (l'absence ou la rareté du mycélium aérien). Quant à la consistance des colonies, elle peut être molle, friable, élastique ou dure. La taille des colonies varie en fonction des genres fongiques. Par exemple, le genre Cladosporium forme une colonie de petite taille tandis que les genres Mucor et Rhizopus montrent des colonies étendues et envahissantes (Botton et al., 1990). La couleur des colonies est un important paramètre d'identification chez les champignons. Les couleurs les plus fréquentes sont le blanc, le crème, le jaune, l'orange, le rouge allant jusqu'au violet ou le bleu, le vert, le brun allant jusqu'au noir. Les pigments peuvent être localisés au niveau du mycélium (Penicillium) ou diffuser dans le 111 i lieu de culture (Fusarium) (Botton et al., l 990). 5.2.2. Critères d'identification microscopique des champignons L'examen microscopique d'une colonie fongique se fait après un montage entre lame et lamelle. Généralement, un examen au grossissement 40 est suffisant pour mettre en évidence la plupart des éléments d'identification (Cahagnier et Richard-Mollard, 1998). Selon ces auteurs, le thalle siphonné, constitué d'éléments tubulaires peu ou pas ramifiés, de large diamètre (5-15 um) et irrégulier, non cloisonné, est caractéristique des Zygomycètes. Cependant, le thalle septé, constitué de filaments de diamètre étroit (2-5 urn) et régulier, cloisonné en articles uni ou pluricellulaires est caractéristique des Ascomycètes, Basidiomycètes et Deutéromycètes. La forme, les dimensions, la couleur, la structure (unicellulaires, bicellulaires, ... ), l'ornementation des conidies représentent un ensemble de caractères très variés qui constituent des critères d'identification de genres et d'espèces fongiques (Badillet et al., 1987). Une caractéristique majeure des champignons est leurs modes de reproduction au cours desquelles, ils produisent un grand nombre de spores qui constituent un paramètre d'identification important. Les spores leur assurent un pouvoir de contamination considérable. Les champignons se reproduisent, soit par la voie asexuée (reproduction végétative), soit par la voie sexuée. Les spores qui sont le produit de la reproduction asexuée_peuvent être endogènes ou exogènes. Les spores endogènes (endospores) sont produites à l'intérieur d'un sac fermé 52 (sporange), porté par un filament spécialisé (sporangiophore). Ces spores se rencontrent par exemple chez les Mucorales. Les spores exogènes (conidies), retrouvées chez les Ascomycètes, Basidiomycètes et Deutéromycètes, sont formées par bourgeonnement à partir d'une cellule spécialisée dite cellule conidiogène (Taboue, 2007). 5.3. Structures protectrices Les structures protectrices issues de la reproduction asexuée sont les pycnides et les acervules. Les pycnides sont des nodules mycéliens, creux, composés d'une paroi épaisse formée par un feutrage compact de filaments mycéliens. La face interne de la paroi est tapissée des conidiophores produisant des conidies qui sont libérées, à maturité, par l'ostiole (Phoma) (Semai, 1993). Les acervules sont des agrégats de filaments mycéliens enchevêtrés, solidement attachés sur un végétal délimitant une cavité avec une ouverture. A l'intérieur, se trouve une assise de conidiophores produisant les conidies. Sur les milieux de culture, seules les pycnides sont visibles, les acervules ne se formant que dans les tissus de l'hôte végétal (Tabuc, 2007). Les structures protectrices issues de la reproduction sexuée observables chez les Ascomycètes sont l'ascocarpe qui peut être de plusieurs types. Dans les apothécies, l'ascocarpe est ouvert, en forme de coupe, portant les asques en surface. Dans les cléistothèques, l'ascocarpe est arrondi et lisse sans réseaux mycéliens. Dans le périthèce, l'ascocarpe a la forme d'une bouteille avec, à l'extrémité une ouverture ou ostiole (Kiffer et Morelet, 1997). Les chlamydospores sont des éléments à paroi épaisse de protection et de résistance qui sont formés à partir du filament mycélien. Elles se forment chez toutes les espèces lorsque les conditions sont défavorables et permettent d'identifier, facilement, les champignons du genre Fusarium chez lesquels elles apparaissent précocement (Semai, 1993). 5.4. Biologie moléculaire Les techniques moléculaires ont connu un progrès important et ont suscité un intérêt énorme grâce à l'émergence de la technique de réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Lorsque les caractéristiques morphologiques sont insuffisantes pour identifier un champignon, on utilise les techniques physiologiques et biochimiques. Cependant, pour des champignons filamenteux peu différenciés tels que Penicilium, Aspergillus ou A/tern_aria, ces méthodes sont laborieuses, longues et coûteuses (Frisvad et al., 1998b ; Guarro et al., 1999). 53 5.4.1. Méthodes et fonctionnement Ces méthodes sont universellement applicables et permettent d'explorer le polymorphisme à différents niveaux (comparaison entre des souches, des espèces, des genres, etc.). Elles sont basées sur l'étude d'un gène (locus), d'un fragment d'ADN défini (espaceur, intron, etc.), de plusieurs gènes (multiloci) ou encore de l' ADN total, dépendant du but ····· poursuivi. Les méthodes utilisées dans l'étude de !'ADN total sont la détermination du contenu en bases guanine et cytosine de !'ADN nucléaire ou l'étude du taux d'hybridation de l'hétéroduplex ADN-ADN dont un brin appartient à l'organisme indéterminé et l'autre à un organisme de référence. Ce hétéroduplex est comparé à l'homoduplex des souches hybrides avec elles-mêmes. Les méthodes basées sur l'étude d'un gène ou de plusieurs gènes utilisent la technique PCR (Ppolyrnerase Chain Reaction) (Mullis et al., 1986). Cette technique permet l'amplification de séquences spécifiques d'ADN via sa synthèse in vitro et l'obtention rapide et simple de microgrammes de l' ADN ciblé. La PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polyrnorphism) (digestion del' ADN par des enzymes de restriction) et le séquençage précédé d'une PCR sont basés sur l'étude d'un gène ou d'un fragment d'ADN (Frisvad et al., 1998b; Kano et al., 2000). Plusieurs auteurs ont utilisé un fragment de l'ADN ribosomial (Frisvad et al., 1998b) tel que les unités 58S (très conservées), l 8S et 25S (très conservées mais plus utiles que 58S), selon Lübeck et al. (2000) et Makirnura et al. (2001), les espaceurs (internes ou externes qui sont des régions non codantes et variables) ou encore "l'intergenic spacer" (IGS) qui sépare deux copies de I' ADN ribosomial. 5.4.2. Limites de la PCR-Rl~LP La limite de la PCR-RFLP est qu'elle fournit une information phylogénétique moindre que lors d'un séquençage. Cependant, elle peut être très utile lors d'un criblage d'isolats suspectés d'appartenir à la même souche ou espèce. En effet, bien que le séquençage soit une technique très précise, générant beaucoup d'informations, celui-ci demande un temps de mise en œuvre élevé ainsi qu'un coût important. A côté de l'étude d'un gène. les techniques de "fingerprints" (empreintes moléculaires) ciblent l'ensemble du génome. Ces techniques contiennent, entre autres, les microsatellites, les minisatellites et L'amplification aléatoire d'ADN polymorphe connue sous le nom de RAPD (pour Random Amplified Polymorphie DNA). Le RAPD utilise la technique PCR pour amplifier des segments d'ADN génomique avec des amorces d'oligonucléotides non spécifiques (Kubicek, 1995 ; Frisvad et al., 1998b). Cette technique présente le désavantage 54 d'être peu reproductible et nécessite la standardisation de la méthode d'amplification ainsi que de la visualisation des fragments obtenus (Nagy et al., 2007). Cependant, elle peut être utile lors de l'analyse rapide d'un nombre élevé d'isolats qu'on suspecte de faire partie du même taxon et dont aucune information sur la séquence d'un marqueur n'est connue. Les microsatellites (séquences répétitives de deux à cinq paires de bases réparties de manière aléatoire dans le génome) et les minisatellites (séquences répétitives d'environ 20 paires de bases) peuvent être amplifiés (Frisvad et al., 1998b). Ces techniques utilisant les micro et minisatellites sont reproductibles et nécessitent peu d'ADN. 55 DEUXIEME PARTIE : MATERIEL ET METHODES 56 1. Matériel 1.1. Matériel pour la récolte et la mise en poudre des organes végétaux 1.1.1. Matériel végétal Le matériel végétal est constitué de feuilles, d'écorces de tige et de plantes entières. 1.1.2. Matériel pour la récolte et la mise en poudre Pour le prélèvement des organes végétaux, le matériel se compose d'une machette, d'une houe, de sacs plastiques, de ruban adhésif et d'un appareil photo numérique; un broyeur électronique de marque Retsch et de type SM 100 pour la mise en poudre des organes de plantes et des bocaux pour le conditionnement des poudres. 1.2. Matériel pour l'isolement et l'identification des champignons pathogènes 1.2.1. Matériel végétal Des fruits mûrs de consommation courante tels que la tomate, le piment et la papaye ont été utilisés. 1.2.2. Matériel pour l'échantillonnage des fruits Le matériel utilisé pour l'échantillonnage des fruits se compose de thermomètre, glacière, sachets stériles, gants stériles, carboglace, sachet Stomacher. 1.2.3. Matériel pour l'isolement des champignons Le matériel est constitué de gélose et de bouillon Sabouraud au chloramphénicol (Biomérieux), de solution d'hypochlorite de sodium dilué au 1/IOème, de couteau stérile, d'explants extraits des fruits, d'une hotte aspirante, d'un bec bunsen, de boîtes de Pétri, de ruban adhésif et de cryotubes. 1.2.4. Matériel pour l'identification moléculaire 1.2.4.1. Matériel pour l'extraction des ADN fongiques Le matériel d'extraction des ADN est composé de tubes stériles, d'eau peptonée, de vortex, de tampon d'hydrolyse, de lysozyme, de protéinase K, de bain-marie, de Dodecyl 57 Sulfate de Sodium (SDS), de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1 v/v/v), d'acétate de sodium, d'isopropanol glacé, d'éthanol 70 %, de hotte et d'eau ultra-pure. 1.2.4.2. Matériel de vérification de la purété des extraits d'ADN La purété des extraits d'ADN a été vérifiée à partir de gel d'agarose, de tampon TAE IX, d'extraits d'ADN, de colorant bleu/orange, de marqueurs de taille moléculaires I kb pour les bactéries et de 16,21 kb (Invitrogen, USA) pour les levures, de bromure d 'éthidium, d'un trans i lluminateur UV à 318 nm, d'une caméra digitale et d'un système de traitement de photo Gel Smart 7.3. 1.2.4.3. Matériel pour la PCR des brins d'ADN Les extraits d'ADN ont été amplifiés par la PCR puis revérifiés par la DGGE. Pour la PCR, le matériel est composé d'une plaque de 96 puits SorensonTM, d'un thermo cycler, d'eau pure, de DMSO, d'une amorce GC U If, d'une amor_çe U2r, de chlorure de magnésium 25 mM (MgC'2), de dNTPs I OmM par dNTP, de tampon tag 1 OX, de Taq polyrnerase 5U/~LL et d'extrait d'ADN. 1.2.4.4. Matériel pour la DGGE des produits de la PCR Pour la DGGE, le matériel est composé de Acrylarnide/ bisacrylamide, de formamide, d'urée, de TAE SOX, d'eau qsp. [] est aussi composé d'un appareil pour DGGE modèle Bio-rad Dcode, de persulfate d'ammonium (APS), de Tétraméthylenediamine (TEMED), d'une pompe Percom-1 Watson-Marion, de tampon TAE lX, de colorant bleu/orange, de produits issus de la PCR, de micropipette, de Bromure d'éthidium, d'un trans-illuminateur UV à 318 nm. 1.2.4.5. Matériel pour le séquençage des bandes cl' ADN et l'dentification des souches Une caméra digitale, un système de traitement de photo Gel Smart 7.3, un scalpel stérile, un tampon TE, un kit Wizard PCR Preps DNA Purification system, des amorces sans GC-clamp et un programme BLAST, de la NCB1 (National Center for Biotechnology Lnformation databases) ont constitué ce matériel 58 1.3. Matériel pour les tests antifongiques 1.3.1. Matériel pour la préparation des extraits végétaux Le matériel pour la préparation des extraits végétaux est composé de poudres d'organes des espèces végétales, de solvants (dichlorornéthane, méthanol et eau distillée), d'agitateur magnétique (VORTEX), de papier filtre Whatmann, d'évaporateur rotatif (BÜCHI R-104), de lyophilisateur (CHRIST ALPHA 1-2), etc. 1.3.2. Matériel pour la réalisation des tests antifongiques Le matériel est constitué de tubes à essai, de pipettes, de micropipette, d'éprouvettes graduées, d'ampoules à décanter, de boîtes de Pétri, d'autoclave, de gélose Sabouraud au chloramphénicol, de DMSO, d'extraits lyophilisés, de souches fongiques. 1.4. Matériel pour les tests phytochimiques 1.4.1. Matériel de laboratoire Le matériel technique est composé d'une balance de précision de type Metler P 120, d'un bain-marie, d'un réchaud électrique, d'un agitateur magnétique et d'une lampe U.V. 1.4.2. Solvants et réactifs Les solvants utilisés pour obtenir les extraits sont le dichlorométhane, le méthanol, l'eau distillée, etc. Les réactifs utilisés pour les tests de caractérisation des groupes chimiques sont l'acide sulfurique concentré (H2S04), le chlorure ferrique (FeC'3) 2 %, l'acide chlorhydrique (!-ICI) 2 N, l'ammoniaque concentré (Nl-li), l'ammoniaque 10 %, l'ammoniaque diluée au demi, le réactif de Stiasny (composé de formol (CH20) 30 % et d'acide chlorhydrique (HCI) concentré), le sel d'acétate de sodium (CH3COONa), le chloroforme (CHCL3), le dichlorométhane (CH2Cl2) et le réactif de Dragendorff(réactifà l'iodobismuthate de potassium) 59 2. Méthodes 2.1. Sélection, récolte des organes de plante, séchage et conditionnement des poudres Les espèces végétales utilisées pour les tests ont été obtenues au cours d'une enquête semi-structurée auprès des populations. Tl s'agit de plantes utilisées en médecine traditionnelle pour lutter contre les champignons pathogènes de la peau chez l'homme en Côte d' Ivoire. Vue l'insuffisance des données de l'enquête, d'autres plantes médicinales ont été choisies sur la base bibliographique (Irvine, 1961 ; Abbiw, 1990 ; Aladesanmi et Odediran, 1999 ; Adebisi et Ladipo, 2007; Magassouba et al., 2007; Ayodele et al., 2007; Sonibaré et al., 2009; Doughari, 2010 ; Rani et al., 20 l 0). Ce sont des plantes qui ont montré des activités antimicrobiennes (antifongiques et antibactériennes) contre des champignons et bactéries pathogènes à l'homme mais avec absence de travaux sur les champignons pathogènes responsables de la pourriture des fruits sélectionnés. Les organes des plantes sélectionnées ont été récoltés en août 2010 à Bongouanou, Divo et Abidjan (Côte d'lvoire). Ils ont été séchés sous climatisation à 22°C, pendant trois semaines. Ils ont ensuite été réduits en poudre fine à l'aide d'un broyeur électronique (Retsch de de type SM 100), puis conditionnés dans des bocaux. 2.2. Extraction des principes actifs 2.2.1. Extraction par les solvants de polarité croissante pour les tests phytochimiques Les protocoles d'extraction et de caractérisation phytochimique des extraits sont ceux utilisés par Ribéreau-Gayon (1968), Randerath (1971), Rizk (1982), AI-Yahya ( 1986), Mogode (2005) puis Kpémissi (2007). lis associent, pour la préparation des extraits, deux méthodes: la macération à l'aide de solvants organiques de polarité croissante et l'infusion dans de l'eau d isti liée. L'extraction par les solvants de polarité croissante permet de tirer un grand nombre de composés de la poudre de plante. Chaque solvant permet d'extraire un ensemble de composés econdaires (Cowan, 1999). On utilise, d'abord, un solvant apolaire (le dichlorornéthane), ensuite un solvant de polarité intermédiaire (l'acétone) et enfin un solvant polaire tel que le méthanol. Des macérations successives sont réalisées à froid avec 10 g de poudre végétale dans 100 mL de dichlorométhane, à température ambiante, sous agitation mécanique, pendant 30 min. Après filtration, l'extrait dichlorométhanique est recueilli dans un bocal. L'extrait résiduel 60 (Marc 1) est séché sous climatisation, sur du papier buvard. Il est repris, par la suite, par 100 mL d'acétone, selon le même mode opératoire pour donner l'extrait acétonique. Le marc (Marc 2) résultant de cette deuxième opération est séché sous climatisation sur du papier buvard. Il est, à son tour, repris par 100 mL de méthanol pour, après filtration, conduire à l'extrait méthanolique (Figure 21). 2.2.2. Extraction par l'eau distillée Dix grammes (10 g) de poudre sont infusés pendant 15 mn, avec 100 ml d'eau distillée bouillante. La préparation est filtrée pour donner l'extrait aqueux (Figure 22). 61 10 g de poudre 30 min de 1m cération dans 100 mL deDCM + Filtrati, n Extrait au Marc 1 d ich lorométhane 30 min de macération dam 100 mL d'acétone + Filtration Extrait Marc 2 acétonique 30 mi n de macération dans 100 mL du méthanol + Filtration Extrait Marc méthanolique épuisé Figure 21: Procédé d'extraction de poudre végétale par les solvants organiques de polarité croissante 10 g de poudre Infusion avec 100 mL d'eau bouillante (15 min) + Filtration Extrait aqueux Marc Figure 22 : Procédé d'extraction par infusion aqueuse de poudre végétale 62 2.3. Isolement et identification moléculaire des champignons pathogènes 2.3.1. Isolement des champignons 2.3.1.1. Échantillonnage des fruits Trois types de fruits mûrs portant des symptômes, à savoir le piment (variété antillais), la papaye (variété solo) et la tomate (variété FI cobra) ont été prélevés dans plusieurs champs dans la zone d'Azaguié et Agboville (village de Tomassé) dans la matinée (8- 12 heures). Dans chaque champ, un échantillonnage constitué de 50 fruits a été constitué. Ainsi, pour cette étude, 50 papayes ont été prélevées dans un champ à Tomassé, 50 tomates et 50 piments ont été prélevés également dans deux champs différents à Azaguié. Les champs sont choisis en fonction de la variété du fruit, les fruits portant les symptômes, l'état de la maturité des fruits et l'accessibilité. Les fruits des champs présentant des symptômes ont été cueillis à la main munie de gants stériles sur différents plants, mis séparément et immédiatement dans des sachets stomacher stériles et stockés dans une glacière réfrigérée. 2.3.1.2. Préparation des milieux de culture et de la solution de désinfection Le milieu de culture utilisé est du Sabouraud au chloramphénicol préparé selon les prescriptions du fabricant Biomérieux. Une solution d'hypochlorite de sodium est diluée au 1/IOème pour servir d'eau de désinfection des explants extraits des fruits. 2.3.l.3. Description des symptômes et isolement des champignons Après réception des échantillons au laboratoire, les différents symptômes de contamination fongique ont été décrits avant d'isoler des fruits, des explants à proximité ou portant des symptômes à l'aide d'un couteau stérile sous forme de dé. Les explants isolés, ont été plongés dans une solution de désinfection pendant environ trois minutes. lis ont ensuite été rincés dans de l'eau distillée stérile et séchés sous une hotte aspirante à côté d'un bec Bunsen en flamme. Pour la culture primaire, les explants ont individuellement été coupés en dé puis ensemencés sur le milieu Sabouraud au chloramphénicol (Biomérieux) préparé et coulé au préalable dans des boîtes de Pétri en vue d'isoler les différentes souches de champignon. Après les ensemencements, chaque boîte de Pétri a été protégée avec du ruban adhésif. Enfin les boîtes de Pétri ont été incubées à la température ambiante de 25°C ± 2°C 63 pendant trois jours (Figure 23). Chaque souche de champignon a été repiquée sur trois boîtes de Pétri. Les souches isolées ont fait l'objet d'une caractérisation macroscopique par description de l'aspect et de la couleur des colonies. Elles ont été repiquées individuellement dans des cryotubes contenant le milieu sabouraud au chloramphénicol (Biomérieux) et du glycérol puis conservés à -80 °C pour l'identification moléculaire. Capsicum sp. Solanum lycopersicum Carica papaya v v v ( Découpage des explants en dé ) v v v Désinfection des explants à l'eau de javel dilué au 1/JOème et rinçage à l'eau distillée stérile v v v Figure 23: Cultures primaires des moisissures provenant des fruits du piment, de la tomate et de la papaye 2.3.2. Identification moléculaire Les souches fongiques ont été isolées sur le milieu Sabouraud au chloramphénicol (Biomérieux) préparé et coulé au préalable dans des boîtes puis incubées pendant trois jours à 25 °C. 64 2.3.2.1. Extraction del' ADN fongique total L'extraction de I'ADN des moisissures a été réalisée par le protocole de El Sheikha et al. (2009) qui prend en compte les méthodes de Masoud et al. (2004) et Ros-Chumillas et al. (2007). Les prélèvements des souches sur les milieux de culture après l'incubation ont été faits de façon aseptique sous une hôte à côté de la flamme d'un Bec bunsen. Chaque souche a été introduite dans un tube stérile de 50 mL contenant 10 m L d'eau peptonée tamponnée stérile. La solution a été homogénéisée au vortex (Vortex-2 Génie, Digital, UK)"â 2500 rprn pendant 30 min. L'homogénéisât obtenu a été réparti dans deux tubes Eppendorff de 2 mL puis centrifugé à l 2000x g pendant 15 min. Le eu lot a été récupéré et conservé. Les culots ont été remis en suspension dans 300 µL de tampon d'hydrolyse [2 % Triton X-100 (Prolabo, France); 1 % SOS, 1 OOMrn NaCI (Sigma, France), 1 OMm Tris pH 8,0; 1 Mm EOTA pH 8,0 (Promega, France)], puis 100 µL de TE (10Mm Tris-HCI, 1Mm EDTA (Promega, France) pH 8,0 y ont été ajoutés. Cent (100) µL de lysozyme (25 mg/ mL, Eurobio, France) et 100 µL de protéinase K (20 mg/mL, Eurobio, France) ont été ensuite ajoutés aux cellules de moisissure extraites. L'ensemble a été homogénéisé au vortex pendant I min puis incubé à 42· °ܶC (température des optimums d'activité des enzymes) au bain-marie pendant 20 min pour une hydrolyse enzymatique. Celle-ci a été suivie d'une dénaturation chimique. Ensuite 50 µL de Oodecyl Sulfate de Sodium (SOS) à 20 % ont été ajoutés à chaque mélange (extrait de cellules de bactéries comme de levures) suivie d'une incubation à 42 °C pendant 20 min. Le SOS est un détergent an ionique favorisant la déstructuration des lipides de la membrane cellulaire. Le SOS complète l'action de la protéinase K. Après la lyse cellulaire, 700 µL de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1 v/v/v, Carlo Erba, France) ont été ajoutés et les tubes ont été agités au vortex pendant 5 min, puis centrifugés à 12 OOOx g pendant 15 min. La phase aqueuse a été transférée dans un flacon Eppendorff stérile (cette étape a été reprise deux fois). Le phénol résiduel a été éliminé par extraction avec 600 µL de chloroforme/alcool isoamylique (24/1, Carlo Erba, France) et centrifugé pendant 10 min à 12 OOOxg. La phase aqueuse a été recueillie et l'ADN a été stabilisé avec 30 uL d'acétate de sodium (3 M, pH 5), suivie d'une précipitation par ajout d'un volume égal d'isopropanol glacé. L'ADN dans l'isopropanol a été conservé à -20 °C pendant 12 heures puis la solution a été centrifugée à 12 000 xg pendant 15 min. Le surnageant a été éliminé et 500 µL d'éthanol dilué à 70 % avec de l'eau distillée ont été ajoutés au culot. Les tubes ont été centrifugés à 12 000 65 pendant 24 heures. Enfin, l'ADN a été remis en suspension dans 50 ~LL d'eau ultra pure et conservé à -20 °C. 2.3.2.2. Vérification de l'extraction cl' ADN sur gel d'agarose Avant d'amplifier les séquences cibles de l'ADN extrait, une vérification de son existence et de sa pureté a été réalisée par électrophorèse en gel d'agarose (Promega, France) à 0,8 % (p/v) dans un tampon TAE IX (Eppendorf, Allemagne). Environ 5 ul, de la solution d'ADN extraits, auxquels ont été ajoutés 2 µL de la solution du colorant bleu/orange (Promega, France), ont été déposés dans chaque puits du gel. Le marqueur de taille moléculaire est un marqueur de 1 kb pour les bactéries et de 16,21 kb (lnvitrogen, USA) pour les levures. La migration a duré 45 min à 100 V. A la fin de la migration, le gel d'agarose a été immergé dans une solution de bromure d'éthidium (Promega, France) à 25 ug/rnl. pendant 15 min, puis rincé pendant 10 min à l'eau distillée avant d'être observé sur un trans-illuminateur UV à 318 nm. ····· Le gel a été photographié par une caméra digitale et la photographie a été traitée grâce au système Gel Smart 7.3 (Clara Vision, Les Ulis, France). 2.3.3. Amplification de l' ADN par la méthode de PCR 2.3.3.1. Amplification del' ADN des moisissures La région DI/D2 de l'ADNr 28S des moisissures a été amplifiée en utilisant deux couples d'amorces GC U If et U2r (Tableau IV). Le Primer Ul correspond aux coordonnées de 403 à 422, et l'amorce U2 correspond à celles de 645 à 662 d'un ADN de référence S. cerevisiae de 28S gènes (JO 1355 numéro d'accession GenBank). fis donnent un amplicon de 260 pb en cas d'utilisation en PCR (Li et al., 2008 ; Khot et al., 2009; _l;I Sheikha et al., 201 Ob, 2011). Pour la méthode DGGE, un GC-clamp de 30 nucléotides a été ajouté à l'amorce U If à l'extrémité 5' afin d'assurer que le fragment d'ADN demeurera partiellement bicaténaire (Sheffield et al., 1989). 66 Tableau IV: Séquence des deux amorces universelles utilisées Amorces Position* Séquences GCUlf 403 - 422 5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC (Sigma, France) GGG GCG GGG GTG AAA TTG TTG AAA GGG AA-3' U2r 645 - 662 5'-GAC TCC TTG GTC CGT GTT- 3' (Sigma, France) *Numérotation établie pour S. cerevisiae. 2.3.3.2. Conditions de la PCR La PCR a été réalisée dans une plaque de 96 puits SorensonTM.{BioScience, USA). Le mélange réactionnel (Tableau V) a été préparé comme décrit par El Sheikha et Montet (2011 ). Les réactions de PCR ont été réalisées dans un thermo-cycler (PTC-100 Peltier Therma Cycler, MJ Research In., USA). Lors de l'amplification, une dénaturation initiale à 94 °C pendant 3 min a été observée, suivie d'une série d'opérations répétées trente fois, incluant une dénaturation à 94 °C pendant 45 s, une hybridation à 50 °C pendant 50 s, et une élongation à 72 °C pendant 90 s. Ensuite, l'élongation finale a été réalisée à 72 °C pendant 5 min suivie d'une chute définitive de la température à 4 °C pour la stabilisation de la réaction. Tableau V: Composition du mélange réactionnel de PCR Volume Concentration finale Réactifs par puits (µL) dans le mix (50µL) Eau pure (Eppendorf, Allemagne) 16,25 / DMSO 2,5 / Amorce GC U If (Sigma, France) 10 0,2 Mm Amorce U2r (Sigma, France) 10 0,2 ~tM MgC'2 25 mM (Promega, France) l 1,5 mM dNTPs l OmM par dNTP (Promega, France 3 0,2mM Tampon tag, 1 OX (Promega, France) 5 1 Taq polymerase 5U/~tL (Promega, France) 0,25 1,25 U Extrait d'ADN 2 / 67 2.3.3.3. Vérification des produits PCR Les amplicons obtenus de la PCR ont été vérifiés par électrophorèse sur gel d'agarose (Promega, France) à 2 % (w/v) dans un tampon TAE IX (Eppendorf, Allemagne). Trois µL d'un marqueur de taille moléculaire de 100 pb (Promega, France) associés à 2 µL du bleu de charge (Promega, France) ont été déposés dans un puits du gel. A chaque puits de la plaque, 2 µL de la solution de colorant bleu (Promega, France) ont été ajoutés. Ensuite 5 µL de la solution de PCR ont été déposés dans chaque puits du gel. La migration a duré 30 min à 100 V. La taille attendue des produits PCR est 260 pb. A la fin de la migration, le gel a été immergé dans une solution de bromure d'éthidium (Promega, France) à 50 µg/mL pendant 15 min, puis rincé pendant 5 min à l'eau distillée avant l'observation sur un trans-illurninateur UV à 318 11111. Le gel a été photographié par une caméra digitale et la photographie traitée grâce au système Gel Smart 7.3 (Clara vision, Les Ulis, France). 2.3.4. Electrophorèse en Gel d'acrylamide avec Gradient Dénaturant (DGGE) Après la vérification, les fragments d' ADNr 28S amplifiés par la PCR ont été analysés par la DGGE dans un gel à 8 % d'acrylamide (37,5/1, v/v/v, Promega, France) contenant un gradient dénaturant chimique qui s'étend de 40 à 70 % d'urée et formamide (Promega, France). L'appareil utilisé pour la DGGE est le modèle Bio- rad Dcode (Bio- rad, USA). Le gel a été préparé en mélangeant, dans deux tubes de 50 m L d'un préparateur de gradient (Bio- rad Mode! 485, USA), respectivement 16 mL de chacune des solutions froides (stockées à 4°C) de 40 et 70 % (Tableau VI). A ce mélange de solution ont été ajoutés 40 mg de persulfate d'ammonium (APS) (Promega, France) et 40 µL de Tétraméthylenediamine (TEMED) (Promega, France). Le gel a été coulé dans un moule de 0, 75 mm d'épaisseur entre deux plaques de verre de 200 mm de côté. Une pompe Percorn-I, Watson-Marion (USA) réglée à 20 tours/min a permis de transférer le gel du préparateur au moule. La durée de polymérisation du gel a été d'une à quatre heures. La cuve d'électrophorèse (Bio-rad Dcode Système, USA) a été remplie de tampon TAE IX (Tris- acétate, EDTA pH 8,3), puis préchauffée pendant 1 h30 min pour atteindre la température de migration 60 °C (Diez et al., 2001 a). Ensuite, 5 µL de colorant ..bleu/orange (Promega, France) ont été ajoutés à 25 uL de produits issus de la PCR. Un volume V de ce mélange a été déposé par puits à la micropipette. Le gel DGGE a été placé dans la cuve contenant la solution préchauffée. L'électrophorèse a été exécutée en deux périodes successives; à 20 V pendant 10 min et 80 V pendant 16 heures. A la fin de la migration, le gel a été retiré des deux plaques de verre et immergé dans une solution de Bromure d'éthidium (Promega, France) à 0,5 ug/rnl, 68 pendant 30 min puis rincé à l'eau distillée pendant 10 min. Le gel a été observé sur un trans illuminateur UV à 318 nm et photographié par une caméra digitale. La photographie du gel a été traitée grâce au système Gel Smart 7.3 (Clara vision, Les Ulis, France). Tableau VI: Composition de gel de DGGE pour un gradient dénaturant de 40 à 70 % 40% 70 % Constituants de dénaturant de dénaturant 40% Acrylamide/ bisacrylamide 20 mL 20 mL Forrnamide 16 ml, 28 mL Urée 16,8 g 29,4g TAE SOX 2 mL 2 mL Eau qsp 100 mL 100 mL 2.3.5. Séquençage des fragments d'ADN à partir des bandes DGGE Les bandes visibles sur le gel de DGGE ont été découpées avec un scalpel stérile. L' ADN de chaque bande a été élué dans 100 µL du tampon TE à 4 °C pendant 24 heures. Les 100 ~LL d'ADN élué à partir de chaque bande ont été purifiés grâce au kit Wizard PCR Preps DNA Purification system (Promega, France). L'ADN purifié a été ré-amplifié dans les mêmes conditions mais avec des amorces sans GC-clamp puis, il a été expédié pour le séquençage chez GATC 8 iotech (Allemagne). L'efficacité de cette procédure a été vérifiée par l'électrophorèse des amplicons de PCR obtenus sur gel DGGE. Pour les bandes de même position sur le gel DGGE et pour des pistes différentes, une seule bande représentative a été purifiée puis ré amplifiée avec l'amorce sans GC clamp. Cependant. quelques bandes issues de la même position ont été séquencées afin de vérifier si elles n'étaient pas issues de la même espèce. Les séquences des ADNr 28S obtenues ont été comparées à celles de la banque de données disponibles sur le site de GenBank de NCB1 (National Center for Biotechnology information databases) grâce au programme BLAST afin de déterminer les séquences connues les plus proches. 69 2.4. Tests d'inhibition des souches fongiques par les différents extraits de plante 2.4.1. Préparation du milieu de culture (Sabouraud) Soixante-deux grammes de milieu Sabouraud ont été pesés puis dissouts dans J 000 mL d'eau distillée. Le tout a été porté à ébullition après avoir été homogénéisé. Après ébullition, le milieu obtenu a été stérilisé à l'autoclave pendant 15 min à 121 °C. Ce milieu stérilisé en surfusion a été par la suite cou lé dans des boîtes de Pétri, à raison de 15 m L par boîte. 2.4.2. Préparation des extraits de plante à tester Des macérations pendant 24 heures à l'eau distillée, au méthanol (99,8 %) et au dichlorométhane ont été réalisées à raison de 10 fois plus de solvant que de poudre, à la température ambiante et sous agitation mécanique. Après filtration, les différents extraits obtenus à partir des organes de plantes ont été concentrés au rotavapor. Les concentrés au méthanol récupérés dans un peu d'eau et les concentrés aqueux ont ensuite été lyophilisés. Une solution mère de concentration 100 mg/ml, a été préparée en dissolvant 1,2 grammes d'extrait lyophilisé de plante dans 12 mL de diméthylsulfoxide (DMSO). 2.4.3. Préparation de l'inoculum Les souches conservées après l'étape d'isolement ont été utilisées pour la préparation de l'innoculum. Chaque souche a été repiquée sur la gélose Sabouraud au chloramphénicol pendant 48 heures afin d'obtenir une culture jeune. La colonie de la culture jeune obtenue a été introduite dans un tube contenant un volume de 15 mL de bouillon Sabouraud au chloramphénicol. L'inoculum préparé est utilisé pour les ensemencements. 2.4.4. Ensemencement Un volume de 15 mL de la gélose en surfusion a préalablement été coulé dans chaque boite de Pétri. Avant solidification, un volume V de la solution mère d'extrait de plante est prélevé à l'aide d'une micropipette et homogénéisé dans la gélose, selon la concentration recherchée pour la réalisation du test. Ainsi, pour un milieu de culture équivalent à 15 mL de gélose, il a été ajouté: - 300 ~LL de solution mère pour une concentration équivalente de 2 mg/mL; - 600 µL de solution mère pour une concentration équivalente de 4 mg/mL ; - 1200 ~LL de solution mère pour une concentration équivalente de 8 rrrg/rn L ; 70 - 1500 µL de solution mère pour une concentration équivalente de l O mg/mL Un volume de 0,5 ~1L de l'inoculum contenant le germe a été prélevé et déposé sur les milieux sabouraud au chloramphénicol (Biomérieux) solidifiés et incorporés des différents extraits de plantes pour les traitements. Un Témoin a été préparé selon le même procédé, mais à la différence qu'il n'est pas incorporé d'extraits de plantes. Les boîtes de Pétri avec et sans extraits ont été mises en incubation pendant six jours à l'obscurité, à 25 °C ± 2 °C (température du laboratoire). Pour chaque traitement, le paramètre mesuré est le diamètre moyen de la croissance radiale du mycélium de chaque souche de champignon. Pour chaque traitement, trois boîtes de Pétri ont été utilisées et l'essai a été répété trois fois. Les mesures ont été effectuées tous les jours pendant six jours. Ensuite, le pourcentage d'inhibition de croissance a été calculé avec la moyenne de croissance radiale du mycélium pour chaque dose. Ce qui a permis de déterminer le niveau de résistance ou de sensibilité de chaque germe pour chaque extrait de plantes. Le pourcentage d'inhibition a été calculé selon la formule et l'échelle de sensibilité proposée par Kumar et al. (2007): 1(%)=\T XIOO (1) Où, I (%)=Pourcentage d'Inhibition C=Croissance radiale (cm) du témoin T=Croissance radiale (cm) du traitement Le niveau de sensibilité ou de résistance de l'isolat a été déterminé selon l'échelle de Kumar et al. (2007) qui stipule que: - pour 1 (%) > 90 %, la souche fongique est hautement sensible (HS) - pour 90 % ~ 1 (%) > 75 %, la souche fongique est sensible (S) - pour 75 % ~ I (%) > 60 %, la souche fongique est modérément résistante (MR) - pour 60 % ~ l (%) > 40 %, la souche fongique est résistante (R) - pour 1 (%) :'.S 40 %, la souche fongique est hautement résistante (HR) Le pourcentage moyen ou global d'inhibition(% lG) de chaque extriat de plante a par la suite été calculé en faisant tout simplement la moyenne arithmétique des pourcentages d'inhibition observés à chaque concentration. 71 2.4.5. Détermination des CMI et des Clso La détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) s'est réalisée par la méthode de dilution successive en milieu gélosé. Cette technique consiste à déterminer les plus petites concentrations auxquelles les extraits végétaux sont efficaces sur les souches fongiques isolées. Elle s'est faite à l'œil nu à partir les boîtes de Pétri après les six jours d'incubation. La concentration qui inhibe 50 % des germes (Clso) a été déterminée graphiquement, à l'aide du logiciel Excel, pour chaque extrait à partir du graphe du pourcentage d'inhibition de la croissance des germes fongiques, en fonction des concentrations (figure 2). ,--... 100 .'.è_f:,., Cl.) ;é-ad cd 1- Cl.) a(J Vl ..V..•l 0 50 1u- ~ Cl.) "'O i:: 0 .".P.... ,.0 ,:::i i:: 0 0 Concentration (en mg/mL) Figure 24: Exemple de détermination de Clso de l'extrait dichlorométhanique des feuilles de Bridelia atroviridis sur Meyerozyma guil/iermondii 2.4.6. Analyses statistiques des données des tests antifongiques L'exploitation statistique des résultats des tests antifongiques a été effectuée à l'aide du logiciel Statisca 7.O. Les analyses de la variance à deux facteurs (ANOVA 2) ont été utilisées pour comparer les effets inhibiteurs des extraits végétaux à différentes concentrations sur la croissance de huit germes. Ces analyses ont pour but de révéler les différences significatives éventuelles entre les effets inhibiteurs des extraits pour un germe donné. Pour la réalisation de I 'ANOVA 2, la vérification de l'égalité des variances a été d'abord faite. Cette égalité des variances a été testée à l'aide du test de Levene. Lorsqu'une différence significative est révélée entre les effets 72 inhibiteurs des extraits pour un germe, le test de la PPDS (Plus Petite Différence Significative) a été réalisé, pour déterminer les extraits dont les effets inhibiteurs diffèrent significativement des autres (Dagnelie, 1998). Le test de PPDS de Fischer est un test de comparaisons multiples de moyenne deux à deux. Ce test requiert au préalable une valeur significative du F de I' ANOVA. Les différences ont été considérées significatives pour les valeurs de P :S 0,05. 2.5. Tests de détection des classes de composés chimiques Les différents extraits obtenus ont servi pour les tests de détection des grands groupes de composés chimiques. Pour cette étude, les classes de composés chimiques recherchés sont les stérols et polyterpènes, les alcaloïdes, les saponosides, les polyphénols, les anthocyanes, les quinones (anthraquinones libres et hétérosides anthraquinoniques), les coumarines et les tanins (galliques et catéchiques). 2.5.1. Détection des terpènes et stéroïdes 2.5.1.1. Recherche des stérols et polyterpènes (Réaction de SALKOWSKI) A I mL de chaque extrait, sont ajoutés une à deux gouttes d'acide sulfurique (H2SÜ4) concentré. La présence de stérols et polyterpènes se traduit par une coloration jaune ou rouge de l'extrait. 2.5.1.2. Recherche des saponosides (détermination de l'indice de mousse) Elle est basée sur la propriété des solutions aqueuses contenant des saponosides de donner, par agitation, une mousse persistante. 2 mL d'extraits méthanolique, acétonique et dichlorométhanique sont évaporés et repris dans 5 mL d'eau. Pour l'extrait aqueux, un volume de 5 mL est directement prélevé. Chaque préparation est vigoureusement agitée et la formation d'une mousse d'une hauteur supérieure à 1 cm, stable et persistante pendant 30 min indique la présence abondante de saponosides. 2.5.2. Détection des composés phénoliques 2.5.2.1. Recherche générale des polyphénols (réaction par le chlorure ferrique) A 2 mL de chaque extrait, est ajoutée 1 goutte de solution alcoolique de chlorure ferrique 2 %. La réaction positive se traduit par l'apparition d'une coloration bleu-noirâtre ou verte plus ou moins foncée. 73 2.5.2.2. Recherche des flavonoïdes Les flavonoïdes ont été mis en évidence par la réaction à la soude. Dans un tube à essai, à 2 mL d'extrait sont ajoutées quelques gouttes d'une solution de soude diluée au 1/10. L'apparition d'une coloration jaune-orange caractérise la présence de flavonoïdes. 2.5.2.3. Recherche des anthocyanes La recherche des anthocyanes repose sur leur capacité à changer de coloration en fonction du pH du milieu. A 2 mL de chaque extrait, sont additionnés 2 mL d'acide chlorhydrique 2 N. L'apparition d'une coloration rose-rouge, qui vire au bleu violacé par addition de 0,5 mL d'ammoniaque, indique la présence d'anthocyanes. 2.5.2.4. Recherche des coumarines La recherche des coumarines est basée sur la propriété que possède la plupart des coumarines à présenter une fluorescence nette aux rayons UV. Un volume de 2 ml, de chaque extrait est examiné à la lumière UV à 366 nm. L'apparition d'une fluorescence bleue indique la présence de coumarines. 2.5.2.5. Recherche des tanins (réaction de STIASNY) • Recherche des tanins catéchiques ou condensés Cinq millilitres (5 rn l.) de chaque extrait sont évaporés. Au résidu, sont ajoutés 10 ml, d'une solution de réactif de Stiasny. L'ensemble est agité au bain-marie à 80 °C pendant 30 min et refroidi. La réaction positive se traduit par la formation de gros flocons brun-clairs ou précipités sales. 74 • Recherche de tanins galliques La solution précédente est filtrée et saturée à l'acétate de sodium avec un ajout de une à deux gouttes de solution alcoolique de chlorure de fer 2 %. La réaction positive se traduit par l'apparition d'une coloration bleu-noire intense qui caractérise les tanins galliques, non précipités par le réactif de Stiasny. 2.5.2.6. Recherche des quinones et dérivés (réaction de BORNTRAGER) • Recherche des anthraquinones libres Deux (2) mL de chaque extrait (sauf l'extrait aqueux) sont évaporés et repris avec 2 m½ d'eau distillée. Toutes les solutions sont épuisées par 4 mL de chloroforme. La solution organique est ajoutée à 0,5 mL d'une solution aqueuse d'ammoniaque à 10 %. La présence d'anthraquinones libres se traduit par une coloration rose de la phase aqueuse. • Recherche des hétérosides anthraquinoniques Après évaporation de 2 mL de chaque solution, au résidu sont ajoutés 5 mL d'acide chlorhydrique 10 %. Le mélange est porté au bain-marie bouillant pendant 30 min. Après refroidissement, l' hydrolysat est épuisé par 20 mL de chloroforme dans une ampoule à décanter. La phase organique est récupérée clans un tube à l'aide d'une poire munie d'une pipette. A cette solution organique, 0,5 mL d'ammoniaque sont additionnés. L'apparition d'une coloration rouge indique la présence d'anthraquinones combinées. 2.5.3. Recherche des alcaloïdes (Réaction de DRAGENDORFF) · · Six (6) m L de chaque extrait sont évaporés puis repris dans 6 m L d'éthanol. A la solution alcoolique, une à deux gouttes de réactif de Dragendorff sont ajoutés. L'apparition d'un précipité rouge-orangé indique la présence d'alcaloïdes. 75 TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET DISCUSSION 76 CHAPCTRE I: SELECTION DES PLANTES MEDICINALES ET IDENTIFICATION MOLECULAIRE DES ESPECES FONGIQUES 1. Plantes sélectionnées Dix espèces de plantes ont été sélectionnées pour la réalisation de l'étude. Parmi elles, cinq ont été obtenues suite à l'enquête sémi-structurée et cinq par la recherche bibliographique. Trois de ces plantes appartiennent à la famille des Sterculiaceae et deux à celle des Polypodiaceae (Tableau VII). Les espèces végétales Nephrolepis bissera/a, Phymatodes scolopendria et Microgramma owariensis sont des Ptéridophytes (ou fougères). Les organe~ prélevés pour la préparation des extraits bruts végatux sont soit les feuilles, soit les écorces de tige ou la plante entière. Pour Bridelia atroviridis et Erythrina senegalensis les feuilles et les écorces de tige ont été utilisées. Quant à Trichilia heudelotii, seules les feuilles ont été utilisées. S'agissant des trois fougères, ce sont les plantes entières qui ont été utilisées et pour les espèces Nesogordonia papaverifera, Celtis mildbraedii, Cola gigantea et Triplochiton sc/eroxylon, ce sont les écorces de tige qui ont utilisées. Douze organes de plantes au total ont récoltés pour réaliser les tests antifongiques et phytochimiques .. Tableau VII: Espèces de plantes sélectionnées et organes récoltés Organes Mode de sélection Code Espèces végétales Famille Lieu prélevés Enquête 1 ittérature Ba Bridelia atroviridis Euphorbiaceae Fe et Et Bongouanou oui Es Erythrina senegalensis Fabaceae Fe et Et Bongouanou OUI b Nephrolepis bissera/a Davalliaceae Pe Abidjan oui Ps Phymatodes sco/opandria Polypodiaceae pe Abidjan oui Mo Microgramma owariensis Polypodiaceae pe Abidjan oui Np Nesogordonia papaverifera Sterculiaceae Et Divo oui Th Trichilia heudelotii Meliaceae Fe Divo oui Cm Celtis mildbraedii Ulmaceae Et Divo oui Cg Cola gigantea Sterculiaceae Et Divo oui Ts Trip/ochiton scleroxy/on Sterculiaceae Et Divo oui Fe : Feuille ; Et : Ecorce de tige ; Pe : Plante entière 77 2. Extraits bruts végétaux A partir des 12 organes prélevés, des extraits bruts ont été préparés. Pour chaque organe, trois solvants sont utilisés, ce qui donne un rapport de trois extraits par organe de plante. De même, en considérant chaque solvant, pour 12 organes végétaux, le rapport est de 12 extraits par solvant. Ainsi, un total de 36 extraits bruts de plantes est préparé. Ces extraits bruts ont ensuite servi à la réalisation des tests antifongiques sur les souches fongiques isolées. 3. Isolement et identification des champignons associés aux syptômes 3.1. Description des symptômes des maladies des souches fongiques La Figure 25 montre des fruits mûrs de piment, de tomate et de papaye. La peau des différents fruits présente des symptômes. Les fruits du piment présentent une pourriture molle de couleur grise. Quant aux tomates, les pourritures molles et les taches noires ou blanches par endroits sont présentes. Les papayes montrent des pourritures molles rougeâtres, noirâtres ou blanchâtres. 78 Pourriture molle Tâche noire avec Ouverture avec Pourriture molle de de couleur grise avec une ouverture un halo autour substance blanche à couleur blanchâtre de couleur noire l'intérieur PAPAYE Pourriture molle noirâtre Pourriture molle avec une noire avec pâte blanchâtre et substance légèrement verdâtre blanche et tache noire Pourriture molle avec des Pourriture molle points noire rougeâtre avec une tache Figure 25 : Description des symptômes des maladies fongiques des fruits 79 3.2. Différentes souches fongiques obtenues après isolement L'isolement et la purification ont permis d'obtenir vingt-quatre souches de moisissures sur les trois types de fruits dont cinq souches sur les piments, dix souches sur les tomates et neuf souches sur les papayes (Tableau VIII). Tableau VIII: Codes des souches isolées et purifiées par type de fruit Fruits Piment Tomate Papaye Pml Tml Pal Pm2 Tm2 Pa2 Pm3 Tm3 Pa3 SOUCHES Pm4 Tm4 Pa4 TSOLEES Pm5 Tm5 Pa5 PURIFIEES Tm6 Pa6 Tm7 Pa7 Tm8 Pa8 Tm9 Pa9 Tmlû Pm : Piment ;Tm : Tomate ; Pa : Papaye Chiffres de I à 10: numéros d'ordre d'isolement des souches sur les fruits 3.3. Identification macroscopique des champignons pathogènes des fruits L'identification basée sur la description macroscopique (Tableau IX), c'est-à-dire, l'aspect et la couleur des colonies des différents germes fongiques sur le milieu Sabouraud au chloramphénicol (Biomérieux), a permis de distinguer huit souches di!férentes nommées l, 2, 3, 4, 5, 6, 7 et 8 (Figure 26). 80 1 2 3 4 5 6 7 8 Figure 26 : Différents groupes morphologiques des isolats (Chiffres de 1 à 8 : numéros des isolats) Tableau IX : Description macroscopique des germes fongiques N° isolat Description macroscopique des isolats 1 Mycélium de couleur blanchâtre avec un caractère envahissant sous forme de duvet Aspect cotonneux et globuleux qui devient brun-noir à maturité avec des ramifications 2 rampantes, fortement levées et éloignées du substrat Aspect cotonneux de couleur blanche-jaune avec un caractère envahissant. Les colonies sont en croissance rapide, plates, poudreuses à la texture cireuse, blanches à 3 la crème sur la surface Aspect cotonneux, de couleur blanche crémeuse virant ensuite au violet avec un fond 4 de couleur pourpre Colonies grises envahissantes, présentant aussi un aspect globuleux au début et 5 devenant foncées à maturité colonies cotonneuses à mycélium peu dense devenant grises à maturité avec un centre 6 jaune-blanchâtre Souche très cotonneuse, blanchâtre au début et devenant gris-brunâtre à gris-noirâtre 7 après le troisième jour Aspect cotonneux et une coloration orangée avec un fond incolore après 3 jours de 8 croissance 81 3.4. Identification moléculaire des champignons pathogènes des fruits La qualité de l'ADN a été confirmée par l'amplification par PCR avec succès de la région conservée des ADNr 28S fongiques. Les résultats de l'amplification par PCR par les amorces GC U 1 f, U2 de I' ADN des moisissures extraites des souches pures sont visibles sur la figure 3. Les produits de PCR donnent des bandes uniques, nettes et intenses situées entre 298 pb et 220 pb, ce qui correspond à la taille attendue qui est de 260 pb pour les moisissures. Le témoin négatif a été réalisé avec le mélange réactionnel sans ajout d'ADN extrait. L'absence de bande pour le témoin négatif montre qu'il n'y a pas de contamination du mélange réactionnel de PCR. Les résultats obtenus montrent que la qualité et la quantité des ADN totaux extraits des moisissures sont bonnes (Figure 27). MA•.... . •..B.. . •..C... D._. .. ._E. .. ._F. .. •..G.. .•H.....I•.. ... T pb 400 300 -- 200 100 T: Témoins (eau moléculaire); M: Marqueur; pb: Paire de bases A, B, C, D, E, F, G, H, I: puits du gel Figure 27: Gel d'agarose à 2 % de vérification de la PCR de l'ADN des moisissures L'analyse des fragments d' ADNr 28S amplifiés par PCR par DGGE, selon la méthode de El Sheikha et Montet (2011 ), a donné un profil DGGE dont la position ou l'intensité des bandes pour chaque piste correspond aux dépôts de produit de PCR obtenu à partir d'un extrait d'ADN d'une souche bien précise. L'image a été ensuite visualisée sur l'écran d'ordinateur puis enregistrée sous format tif en négatif (bandes d'ADN noires sur fond clair). Les bandes obtenues ont été enfin excisées, ré-amplifiées et soumises à un séquençage pour l'identification des souches. L'identification des souches a révélé des espèces telles que : Mucor velutinosus, Meyerozyma guilliermondii, Colletotrichum higginsianum, Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides f circinelloides, Fusarium oxysporum, Rhizopus stolonifer, Geotrichum sp. (Figure 23). 82 F G H A : Mucor velutinosus B : Meyerozyma guilliermondii C : Rhizopus oryzae D : Geotrichum sp. E : Mucor circinelloides f circinelloides F: Fusarium oxysporum G: Rhizopus stolonifer H : Mucor circinelloides f circinelloides I : Colletotrichum higginsianum Figure 28 : Gel DGGE et souches identifiées A, B, C, D, E, F, G, H, I: puits du gel de la DGGE Une forte ressemblance a été observée parmi les germes identifiés sur les papayes et les tomates montrant les rapprochements entre les échantillons des types de fruits analysés (Tableau X). Tableau X : Récapitulatif des souches fongiques identifiées de chaque fruit Souches fongiques Fruits Piment Tomate Papaye - Mucor velutinosus - + + Meyerozyma guilliermondii - - + Rhizopus oryzae + + + Geotrichum sp. - + + Mucor circinelloides + + f circinelloides Fusarium oxysporum + + + Rhizopus stolonifer + + + Colletotrichum higginsianum - + + + : Germe présent ; - : Germe absent 83 Sur le total des 24 souches isolées sur l'ensemble des fruits, quatre n'ont pas pu être identifiées. JI s'agit de Pm2 et Pm4 isolées sur le piment, et de Tm6 et Tm 10 isolées sur la tomate. Des 20 souches restantes et identifiées, 6 correspondent à Fusarium oxysporum, soit une fréquence d'apparition de 30 %, suivie de Rhizopus oryzae avec 15 % d'apparition. Meyerozyma guilliermondii qui présente la plus faible fréquence avec 5 % n'a été identifiée que 1 seul fois (Tableau XI). Tableau XI: Fréquence d'apparition des souches fongiques sur les fruits Souches fongiques des fruits Nombre Fréquence (%) Mucor velutinosus 2 10,00 Meyerozyma guilliermondii 1 5,00 Rhizopus oryzae 3 15,00 Geotrichum sp. 2 10,00 Mucor circinelloidesf circinelloides 2 10,00 Fusarium oxysporum 6 30,00 Rhizopus stolonifer 2 10,00 Colletotrichum higginsianum 2 10,00 Total 20 100,00 84 4. Discussion L'enquête ethnobotanique semi-structurée réalisée dans l'objectif d'obtenir des plantes traditionnellement utilisées dans le traitement des maladies fongiques n'a pas donné les résultats attendus. En effet le petit nombre des plantes montre que soit les maladies fongiques sont peu connues par les populations rurales ivoiriennes. Encore plus, ces maladies peuvent ne pas constituer un facteur de risque qui mettrait en jeu le pronostic vital. Cela peut se justifier ... -· par les travaux de Tra Bi et al. (2008) qui après des enquêtes ethnobotaniques réalisées sur les marchés de la ville d'Abidjan ont inventorié 58 espèces de plantes commercialisées pour soigner 19 maladies courantes. Et sur ces 58 espèces de plantes, seules six sont utilisées contre les dermatoses. Concernant la caractéristaion des champignons des fruits du piment, de la tomate et de la papaye, des symptômes de contamination microbienne ont été observés au cours de ce travail sur ces fruits et légumes collectés sur les différents sites. Ces symptômes se présentent sous la forme de nécroses, de pourritures molles, de couleur rougeâtre, noirâtre, blanchâtre, verdâtre ou grisâtre avec ou sans ouverture. La présence de taches rondes a été également notée. Ces symptômes sont caractéristiques de maladies fongiques similaires à celles décrites par Cannon et al.(2012) sur les fruits tropicaux exportés. L'analyse de la morphologie de ces moisissures après isolement et purification a permis d'obtenir huit) groupes morphologiques de souches différentes les unes des autres par leur aspect, la densité, la couleur, la taille et le mycélium. Ces résultats montrent que ces fruits et légumes constituent de véritables hôtes pour ces agents fongiques. Dans l'optique d'approfondir l'étude, il a été procédé à l'identification moléculaire par la PCR-DGGE de ces souches. Cette identification a permis d'obtenir huit souches fongiques distinctes que sont Mucor velutinosus, Meyerozyma guilliermondii, Colletotrichum higginsianum, Rhizopus oryzae, Mucor circinelloidesf circinelloides, Fusarium oxysporum, Rhizopus stolonifer, et Geotrichum sp. sur les fruits (piment, tomate et papaye) prélevés dans les différents champs. Par ces souches quatre appartiennent à une même famille : les Mucoraceae. Ce sont : Mucor velutinosus, Mucor circinelloides f .circinelloides, Rhizopus oryzae et Rhizopus stolonifer (Liu et Austin, 2011 ). La totalité de ces souches fongiques a été isolée sur la papaye pendant cette étude. Elles sont responsables des maladies l'affectant depuis les champs. Cette présence pourrait s'expliquer par le fait que la papaye est plus riche en nutriments carbonés que le piment et la tomate (Souci et al., 1994 ; USDA, 2007 ; Razafirnandirnby, 1998). Ces microorganismes, notamment les champignons sont hétérotrophes pour le carbone. Ces espèces fongiques sont aussi responsables des maladies les 85 affectant depuis les champs. Par ailleurs, d'autres auteurs (Chukwuka et al., 2010) ont récemment rapporté que Fusarium sp., Mucor sp. et autres germes sont responsables de la carie de la papaye dans les champs au sud-ouest du Nigeria. Les champignons isolés des tomates dans cette étude comprennent Fusarium oxysporium, Mucor velutinosus, Colletotrichum higginsianum, Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides f circinelloides. Rhizopus stolonifer; Geotrichum sp. La quasi-totalité des souches fongiques trouvées sur la papaye sont également présentes sur les tomates, sauf Meyerozyma guilliermondii. Ces résultats montrent que les papayes et les fruits de tomates seraient infectés par les mêmes souches responsables des maladies de ces deux fruits depuis les champs. On pourrait expliquer cette présence par la richesse de ces deux fruits en nutriments favorables à la croissance des moisissures. En effet, les champignons étant hétérotrophes, ils sont dépourvus de chlorophylle, et ne sont pas capables de fabriquer les substances organiques nécessaires à leurs cellules pour la croissance. Ils sont donc obligés de consommer des molécules fabriquées par d'autres organismes. Souci et al. ( 1994) ; USDA (2007); Razafimandimby (1998) ont par ailleurs montré que la tomate et la papaye sont très riches en nutriments carbonés. Aussi, la présence de germes sur ces...fruits étudiés serait-elle due aux conditions climatiques du pays car ces germes ont la capacité de se développerjusqu'à environ 37°C comme l'ont souligné Suigui et al., (201 1 ). Parmi ces germes isolés, Fusarium oxysporum, Rhizopus stolonifer ei Mucor sp. seraient des pathogènes à la tomate. Les études de Chuku et al. (2008) et Akinmusire (201 1) ont montré que ces germes sont responsables des pourritures molles chez la tomate. Fusariunt oxysporum a été également jugé responsable des pourritures des fruits de la papaye, la tomate, la banane et la goyave (Latiffah Zakaria et al., 2012). Cela pourrait s'expliquer en partie par la structure des organes de réserves de ces fruits. Ces fruits sont aussi riches en eau et en sucres facilement métabolisables par les champignons. Une contamination simple ou multiple des fruits peut provenir de nombreuses sources : sol, eau, irrigation, engrais (en particulier compost), matériel agricole, travailleurs, conditions de stockage et de conservation (Khaled et al., 2005). De plus, les travaux de Kleemann et al., (2008) ont associé Colletotrichum higginsianum aux maladies d'anthracnose affectant ces fruits. D'autres études sur les champignons ont montré que Fusarium oxysporum, Rhizopus stolonifer; Mucor sp. et Geotrichum sp. sont associés à la pourriture molle et aigre des fruits de tomate et de papaye (Chuku et al., 2008 ; Nnebue et al., 2013). Quant à Rhizopus oryzae, il serait responsable de la maladie entrainant la pourriture de ces fruits comme dans le cas du tournesol à cause des conditions climatiques favorables. La température optimale et l'humidité 86 relative pour le développement de la maladie causée par Rhizopus oryzae sont comprises entre 20-30 °Cet 85-90 %, respectivement (Yildz et Baysal, 2006). Cette étude a révélé la présence de Fusarium oxysporum. Rhizopus stolonifer et Rhizopus oryzae qui seraient des pathogènes au piment. Harnmami et al. (2014) ont aussi trouvé des espèces d'Aspergillus tamarii, A.flavus dans la poudre du piment d'Egypte. Les souches isolées des zones de maladies des fruits (piment, tomate et papaye) sont des pathogènes de ces fruits à des degrés variables comme l'on rapporté Akintobi et al. (201 l). Selon les travaux de ces auteurs, Rhizopus stolonifer a un degré de pathogénicité élevé par rapport à Fusarium sp sur la tomate et la papaye. Par ailleurs, Meyerozyma guilliermondii, n'a été isolé que sur la papaye dans cette étude. Bien qu' isolé sur des pourritures de ce fruit, ce germe ne serait pas nécessairement un pathogène de la papaye. Des études récentes de Su-lin el al. (2012) ont montré qu'il inhibe la croissance des moisissures pathogènes pendant le stockage du maïs au Cameroun. Cependant Mucor velutinosus isolé sur la papaye et la tomate, serait pathogène de l'homme car il lui causerait des infections de la peau comme l'ont rapporté Sugui et al. (201 I), d'où une menace pour la santé du producteur et du consommateur. Les champignons isolés, associés à la détérioration des fruits ont montré que Fusarium oxysporum est Je plus fréquemment isolé (30 %) sur les trois types de fruits. fi est suivi par Rhizopus oryzae avec un taux d'infection de I 5 % tandis que Meyerozyma guilliermondii était le moins rencontré (5 %). Par contre les travaux de Akintobi et al. (2011) ont montré Aspergillus niger comme étant l'espèce dominante sur les fruits étudiés (papaye, tomate et orange) au Nigéria, avec une fréquence de 33 %. 87 Conclusion partielle L"identification moléculaire par la PCR-DGGE suite à la description macroscopique a révélé le profil de huit champignons d'altération qui seraient responsables des pourritures et des maladies du piment, de la tomate et de la papaye depuis les champs. Ces souches fongiques pourraient être liées aux pertes post-récoltes. Certains comme Mucor velutinosus sont pathogènes aux fruits et même l'homme ; ce qui implique des mesures de lutte depuis les champs afin de garantir des produits sains à la consommation et au commerce. La prévalence élevée de certains champignons exige que des mesures de contrôle appropriées contre l'infection sur les champs, soient utilisées si les producteurs souhaitent à une bonne récolte. La détérioration des fruits peut toutefois être contrôlée depuis les champs par l'utilisation de molécules des extraits naturels des plantes antifongiques et par la manipulation correcte des fruits pendant la récolte afin d'empêcher les blessures et minimiser les pertes. 88 CHAPITRE II: EVALUATION DEL' ACTIVITE ANTIFONGIQUE DES EXTRAITS DEPLANTE l. Tests d'inhibition des souches fongiques par les différents extraits de plante 1.1. Effets des extraits de plantesur Colletotrichum higginsianum 1.1.1. Extraits au dichlorométhane Selon l'échelle de Kurnar et al. (2007), les 12 extraits de plante au dichlorométhane testés sur C. higginsianum peuvent être regroupés dans la même gamme d'activité. Pour tous les extraits le pourcentage d'inhibition global (IG) est de 60 % < LG :S 75 %. La souche leur est modérément résistante. C. higginsianum modérément résistante à tous les extraits de plantes. Les pourcentages d'inhibition les plus bas ont été enregistrés avec les extraits des feuilles de Erythrina senegalensis avec 61,41 % et des écorces de tige de E. senegalensis (Et) avec 61,64 %, suivis de Celtis mildbraedii (Et) avec 64,36 % et de Trichilia heudelotii (Fe) avec 67,09 %. Pour les autres extraits l'IG avoisine les 70 % (Tableau XII). Les niveaux de résistance ou de sensibilité de C. higginsianum varient pour tous les extraits en fonction des concentrations (doses) des extraits de plante en boîte de Pétri. L'analyse statistique a montré une différence significative entre les effets des extraits au sein d'une même concentration sur la croissance radiale de ce germe. Aux concentrations de 2 et 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale sont comprises entre 40 et 60 % ; à ces concentrations cette souche fongique a été résistante (R) à tous les extraits de plantes. A la concentration de 2 rng/rnl., pour tous les extraits de plante, l'effet inhibiteur était autour de 45 % de la croissance radiale. Et à cette concentration, le pourcentage d'inhibition le plus élevé (47,21 %) est observé avec l'extrait de l'écorce de tige de E. senegalensis ( Et). A 4 mg/mL, le pourcentage d'inhibition le plus important a été de 53,02 % avec les extraits de E. senega/ensis (Et) tandis que pour les autres extraits ce pourcentage est autour de 50 %. A la concentration de 8 mg/mL, C. higginsianum a été sensible (S) àpresque tous les extraits de plante sauf pour les extraits des feuilles et des écorces de tige de E. senegalensis (Fe et Et) et de Trichilia heudelotii où le germe y a été modérément résistant (MR). Les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale sont compris entre 60 et 75 % pour E. senegalensis (Fe), E. senegalensis (Et) et Trichilia heudelotii (Fe), tandis que pour les autres extraits les pourcentages se situent entre 75 et 90 %. 89 A la concentration de 10 mg/mL, tous les extraits de plante exceptés les feuilles et les écorces de tige de E. senegalensis et de Ce/lis mildbraedii ont montré une inhibition totale de 100 % sur la souche fongique. Les extraits de E. senegalensis (Fe et Et) et de Celtis mildbraedii ont inhibé C. higginsianum avec un taux d'inhibition de la croissance radiale entre 75 et 90 %. La souche a donc été sensible (S) aux trois derniers extraits et hautement-sensible (HS) pour tout le reste. Tous les extraits de plante ont donné des Clso (concentrations capables d'inhiber de 50 % la croissance radiale des germes) comprises entre 3,00 et 3,80 mg/mL. La concentration minimale (CMI) pour laquelle, la souche ne présente aucune résistance a été observée à partir de 10 mg/mL pour tous les extraits de plante, sauf pour les extraits de E. senegalensis o_ù la CMI est supérieure à 10 mg/mL (Tableau XII). 90 ....l :::; E ,,.., e V) Q) 0 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: IX -0 IX ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ V) C 0 ....l E ~ el) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/J .•:.... ::i: (/) (/) ::i: ::i: ::i: ::i: :r: (/) ::i: ::i: C § E :r: Q) s:: u -~ := C ~ 0 ,::: ....l u .~ E 0:: 0:: 0:: V) -t: el) (/J (/) (/J (/J (/J (/) (/) (/) (/J .8 ~ ~ ~ C 0 E ,Q_) ... 00 •Q) "'C ....l ~ .2 -0 E ü oil 0:: IX 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: X ~ .".', E :::; u 0:: ..•. e Selon l'échelle de Kumar et al. (2007), les 12 extraits de plante au méthanol testés sur C. higginsianum peuvent être regroupés dans la même gamme d'activité. Pour tous les extraits de plantes, le pourcentage d'inhibition global (IG) est compris entre 60 et 75 %. Le plus faible pourcentage d'inhibition moyen a été de 60,41 % chez E. senegalensis (Fe) et le plus élevé a été de 61,45 % chez E. senegalensis (Et). Avec ces pourcentages, la souche leur est modérément résistante (Tableau XIII). Les niveaux de résistance ou de sensibilité de C. higginsianum varient au sein d'un même extrait de plante d'une concentration à une autre. L'analyse statistique n'a montré aucune différence significative entre les effets des extraits de plante pour une.même concentration sur la croissance radiale de ce germe. A la concentration de 2 rng/ml., tous les extraits de plantes ont présenté un pourcentage d'inhibition de la croissance radiale du germe, au-dessous de 40 %. Avec ce pourcentage, 1~ germe est hautement résistant (HR) à cette concentration. A 4 mg/mL, le germe est résistant (R) aux extraits de plante et lorsqu'on passe à la concentration 8 mg/mL, le niveau de résistance devient modéré. Pour ces deux concentrations, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale ont été respectivement compris entre 40 et 60 % et entre 60 et 75 %. A 10 mg/mL, aucune résistance n'a été manifestée. La croissance de Colletotrichum higginsianum a été totalement inhibée par les extraits de plante. Le pourcentage d'inhibition a été alors de 100 %. Les Clso (concentrations capables d'inhiber de 50 % la croissance radiale des germes) pour tous les extraits sont comprises entre 5,22 et 5,42 mg/mL. La concentration minimale inhibitrice (CMI) pour laquelle, la souche ne présente aucune résistance a été observée à partir de 10 mg/ml. pour tous les extraits de plante (Tableau XIII). 92 :l (1l Cf) ::, "1g :: ~ ...S::: "'O N E" ::, .~ ~ ,!.. 0\ ~ ~ .8 -;; ~ ;; -~ "' ô.,... ..•. .,... ~ r- <.,'..). N 0.,... ô ô 0 ..:: :, 0 ' Selon l'échelle de Kumar et al. (2007), les 12 extraits aqueux testés sur Colletotrichum higginsianum ont eu une activité statistiquement égale. Pour tous les extraits de plante, le pourcentage d'inhibition global (IG) est compris entre 60 et 75 %: ... .Tous les pourcentages d'inhibition moyens étaient autour de 61 %. La souche fongique est donc modérément résistante (MR) aux différents extraits aqueux si l'on considère l'activité moyenne (Tableau XIV). Les niveaux de résistance ou de sensibilité de C. higginsianum varient au sein d'un même extrait de plante. L'analyse statistique n'a montré aucune différence significative entre les effets des extraits de plantes pour une même concentration sur la croissance radiale de cette souche fongique. Aux deux premières concentrations c'est-à-dire à 2 et à 4 mg/mL, la souche est hautement résistante avec des pourcentages d'inhibition inférieurs à 40 %. A 2 mg/mL, l'effet inhibiteur a été de l'ordre de 31,63 à 32,64 % et à 4 111g/111L, cet effet était situé entre 38,84 et 39,84 %. L'effet inhibiteur sur la croisssance radiale est passé de 73,72- à 74,73 % à la concentration de 8 mg/mL. A cette dernière concentration, Colletotrichum higginsianum est devenu modérément résistant. A 10 mg/mL, l'inhibition de la croissance radiale de C. higginsianum a été totale. Le pourcentage d'inhibition est alors de 100 %. Ce pourcentage montre qu'à 10 mg/mL, C. higginsianum a été hautement sensible aux extraits de plante. Les Clso pour tous les extraits de plante ont été de l'ordre de 5,2 et 5,32 mg/mL. La concentration minimale pour laquelle, la souche ne présente aucune résistance a été observée à partir de 10 mg/mL pour tous les extraits de plante (Tableau XIV). 94 .., C: ::i 0 E Cl) :, V, <.) :, ;:; ro "C _Cl) "C 00 C N ,ro V) ~" V, E 2 C: ro o.. V, Cl) '"O 0 := 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 .-C .PC- 0 C ~ ~ :.ë .s E ;, ,....,. _ ê z.D "' E \') Cil u u", "C 1.2. Effets des extraits de plante sur Fusarium oxysporum 1.2.1. Extraits dichlorométhaniques Les 12 extraits de plante au d ichlorométhane testés sur F. oxysporum ont présenté le même spectre d'activité selon l'échelle de Kumar et al. (2007). Pour tous les extraits de plante le pourcentage d'inhibition global (IG) est de 60 % < IG :S 75 % et cette valeur du pourcentage est d'environ 63 %. La souche est modérément résistante à tous les extraits (Tableau XV). Les niveaux de résistance ou de sensibilité de F. oxysporum varient aussi pour tous les extraits de plantes en fonction des concentrations d'extraits. L'analyse statistique montre qu'il n'y a eu aucune différence significative entre les effets des extraits au sein d'une même concentration sur la croissance radiale de ce germe. Aux concentrations de 2 et 4 mg/mL, l'inhibition de la croissance radiale est inférieure à 40 % ; à ces concentrations cette souche fongique a été hautement résistante (HR) à tous les extraits. A 2 mg/mL, le pourcentage de l'inhbition est d'environ 23 % et d'envirron 28 % pour la concentration de 4 mg/mL. Mais aux concentrations de 8 et 10 mg/mL, F. oxysporum a été hautement sensible (HS) à tous les extraits d'organes de plante. La croissance radiale de ce germe a été inhibée à 100 %. Les Clso des différents extraits sont comprises entre 5,22 et 5,25 mg/mL. La concentration minimale (CMI) pour laquelle la souche ne présente aucune résistance a été observée à partir de 8 mg/mL pour tous les extraits (Tableau XV). 96 Cl) C e<:S .c •Q) E 3 ·::: 0 E ,!:= ,... olJ .,., ...•. ...•. ...•. ...•. N .,., .,., .,., ...•. ...•. ...•. 0 N N N N N N N N N N N {: .c 5 V') V') V') .,.,· V') .,.,· .,.,· V') V') V') .,.,· .'",".·, ~ <.) ~ .::: ~ ü ] ::l ] e<:S .:: Vl Cl) 3 ë c:; F e<:S ~ o. 5 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 l: Vl ~ Cl) ~ ... -0 u !'> ~ i -~ 0 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: p:: 0:: ~ 0:: 0:: c:,, .,.... 0:: ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ .!;! 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(2007), les J 2 extraits aqueux testés sur Fusarium oxysporum peuvent être regroupés dans la même classe d'activité. Pour tous les extraits le pourcentage d'inhibition global (TG) est de 60 % < IG ~ 75 %. La souche est modérément résistante aux extraits de plante (Tableau XVII). Les niveaux de résistance ou de sensibilité de F. oxysporum varient pour tous les extraits de plante en fonction des concentrations des extraits de plante. L'analyse statistique a montré une différence significative entre les effets des extraits au sein d'une même concentration sur la croissance radiale de ce germe, sauf pour la concentration 10 mg/m L. Aux concentrations de 2 et 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale sont comprises entre 40 et 60 % ; à ces concentrations, Fusarium oxysporum a été résistante (R) à tous les extraits. A la concentration de 2 mg/mL, pour tous les extraits, l'effet inhibiteur était autour de 44,6 % de la croissance radiale, excepté l'extrait de Triplochiton scleroxylon avec un taux moyen de 46,9 %. A 4 mg/mL, c'est également T. scleroxylon qui a le taux d'inhibition le plus important avec 51,55 %, tandis que pour les autres extraits ce pourcentage est statistiquement identique avec une valeur voisine de 49,2 %. A 8 mg/mL, la souche fongique est modérément résistante à l'ensemble des extraits. Les deux valeurs extrêmes du taux dïnhibition sont comprises entre 60 et 75 %. La valeur inférieure correspond à l'effet inhibiteur de Nesogordonia papaverifera (62,09 %) et la supérieure est celle de l'effet des feuilles Bridelia atroviridis (63,88 %). A la concentration de 10 mg/mL, l'inhibition a été de 100 % pour l'ensemble des extraits de plante. La souche fongique n'a montré aucune résistance à cette concentration à tous les extraits de plante. Les Clso des différents extraits de plantes sont comprises entre 4,26 et 4,34 mg/mL. La concentration minimale pour laquelle, la souche ne présente aucune résistance (CMl) a été observée à la concentration de 10 mg/mL pour tous les extraits (Tableau XVII). 100 C: . ., 0 ~ -(1) - 5~ Cl) ,-... c::: u :l ...J .2 ::, m E ~ ~ V bl) oo -o-r-o-vooN-.:r'D - P-" • E <"'lr'lr'lr'"lNNNr'"lNr"lr'"IN ...2 -§ê - .._, 'o::t"' '"'=T V v"' ..go.. ~ v" v"' v... v" v... ~ -S -..- ~ •C':l o - -0 0 (/') ~ ~ ~ E E u .!:! ~ 11 C: ~ ~'uc.n ~ 3 ] ~ ] -~ 0.. ,- ~ A O !: C: -oi>:.O V) blJ oc - ~ ~E ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ::E ~.§ i. 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Pour tous les extraits le pourcentage d'inhibition global (lG) est de 40 % < IG ~ 60 % et cette valeur du pourcentage a été d'environ 53 %. La souche fongique est globalement résistante à tous les extraits (Tableau XVIII). En considérant chaque concentration pour tous les extraits de plante, les réactions en boîte de Pétri (résistance ou sensibilité) de Geotrichum sp. varient d'une concentration à une autre. L'analyse statistique montre qu'il n'y a eu aucune différence significative entre les effets des extraits au sein d'une même concentration sur la croissance radiale de ce germe. Aux deux premières concentrations, c'est-à-dire 2 et 4 mg/rnl., les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale ont été les mêmes et de valeurs inférieures à 40 %. Ces taux ont variées de 29,84 à 30,23 %. Ces pourcentages montrent que cette souche fongique a été hautement résistante (H R) à 2 et à 4 mg/rn L. A 8 rng/rnl., le fongique est résistant à tous les extraits. Les pourcentages d'inhibition des extraits ont été d'environ 51 %. C'est uniquement à 10 mg/mL qu'il a été observé une hypersensibilité de Geotrichum sp. vis-à-vis des extraits. L'effet inhibiteur des extraits sur cette souche a été total. Dans ce solvant, les Clso des différents extraits sont comprises entre 7,68 et 7,79 mg/mL. La concentration minimale (CMI) pour laquelle la souche ne présente aucune résistance a été observée à partir de 10 mg/mL pour tous les extraits (Tableau XVIII). 1.3.2. Extraits au méthanol Les 12 extraits de plante testés sur Geotrichum sp. peuvent être rangés dans la même classe d'activité selon l'échelle de Kumar et al. (2007). Pour tous les-extraits, le pourcentage dïnhibition global ([G) est de 60 % < lG ~ 75 % ; ce pourcentage a été d'environ 64 %. La souche est modérément résistante à tous les extraits (Tableau XIX). En considérant pour tous les extraits chaque concentration, les réactions en boîte de Pétri (résistance ou sensibilité) de Geotrichum sp. varient en fonction de la concentration. L'analyse statistique montre qu'il n'y a eu aucune différence significative entre les effets des extraits au sein d'une même concentration, sur la croissance radiale de ce germe. Aux concentrations 2 mg/ml. et 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale de chaque extrait ont été de mêmes valeurs, et ces valeurs sont toutes inférieures à 40 102 %. Ces taux sont compris entre 42,4 et 42,79 %. Ces pourcentages montrent que cette souche fongique a été résistante (R) à 2 et à 4 mg/mL. A 8 mg/rnl., le fongique devient modérément résistant à tous les extraits. Les pourcentages d'inhibition des extraits ont été d'environ 73 %. C'est seulement à 10 mg/mL qu'il a été observé une hypersensibilité (HS) de Geotrichum sp. aux extraits ede plantes. L'effet inhibiteur des extraits sur cette souche a été de 1 00 %. Les Clso des différents extraits méthanoliques sont comprises entre 4,96 et 5,04 mg/mL. La concentration minimale (CMI) pour laquelle, la souche ne présente aucune résistance a été observée à partir de 10 mg/mL pour tous les extraits (Tableau XIX). 1.3.3. Extraits aqueux Selon l'échelle de Kurnar et al. (2007), les 12 extraits aqueux testés sur Geotrichum sp. peuvent être regroupés dans la même classe d'activité. Pour tous lesextraits le pourcentage d'inhibition global (IG) est compris entre 60 % < TG ::; 75 %. La souche est globalement modérément résistante aux extraits de plantes. L'inhibition globale que chaque extrait a manifestée sur ce germe, est d'environ 65 % de sa croissance radiale (Tableau XX). En considérant pour tous les extraits chaque concentration, les réactions en boîte de Pétri (résistance ou sensibilité) de Geotrichum sp. varient en fonction de la concentration. L'analyse statistique montre qu'il n'y a eu aucune différence significative entre les effets des extraits, au sein d'une même concentration, sur la croissance radiale de ce germe. Aux concentrations 2 mg/mL et 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale de chaque extrait de plante ont respectivement été d'environ 41 % et 46 %. Ces chiffres appartiennent à l'intervalle de 40 à 60 %. Ces pourcentages montrent que cette souche fongique a été résistante (R) à 2 et à 4 rng/rnl.. A 8 mg/mL, la souche fongique a été modérément résistante à tous les extraits de plante. Les pourcentages d'inhibition des extraits de plante ont tous été d'environ 73 %. A 10 mg/ml., il a été observé un effet inhibiteur des extraits de 100 % de la croissance radiale de Geotrichum sp. Pour cette concentration, la souche est donc hautement sensible (HS). Les Clso des différents extraits méthanoliques sont comprises entre 4,52 et 4,62 mg/mL. La concentration minimale (CMI) pour laquelle, la souche ne présente aucune résistance a été observée à la concentration de 10 mg/mL pour tous les extraits (Tableau XX). 103 .., C 0 =E ~ "O 0::: ~Cl) u " ".', "0', ~" != :, ~ 0 t.) ><: ~ '::' ôj' 0 ~ 'Z;' 'v' ~ ÔJ' g? C 'Ë.g i ~"' LJJ X r..,.. tJ.l f::::,W o.. o.. ê:,UJ r..,.. ~t.J.l W ::"' Ê ::, ';'';'en';;~-;; o ';:';: E -;;';; :~·~ ~ ~ û:l c,: o::i cc UJ UJ ;z:. o.. 2 ;z:. ~ u u f-- Q.,~ ~ E (l) .-:~:: ~ ~ ·3 ..0 (!) c,: C'Q- d •.... E-< E œ"' u •."... 1.4. Effets des extraits de plante sur Meyerozyma guilliermondii 1.4.1. Extraits au dichlorométhane Sur Meyerozyma guilliermondii, les 12 extraits dichlorométhaniques testés, peuvent être regroupés dans la même classe d'activité selon l'échelle de Kumar et al. (2007). Pour tous les extraits le pourcentage d'inhibition global (fG) est de l'intervalle 60 % < TG :S 75 %. La souche est modérément résistante aux extraits de plante. Bien que modérément résistante à tous les extraits, le pourcentage d'inhibition moyen le plus bas a été observé avec l'extrait de Nesogordonia papaverifera (Et) avec 59,85 %. Les pourcentages les plus élevés sont ceux de Microgramma owariensis (71,35 %), Erythrina senegalensis (Fe et Et) et Nephrolepis bisserata, avec des pourcentages d'inhibition statistiquement identiqyes et voisins de 70 % (Tableau XXI). Les niveaux de résistance ou de sensibilité de M guilliermondii varient pour tous les extraits en fonction des concentrations des extraits de plantes. L'analyse statistique a montré une différence significative entre les effets des extraits au sein d'une même concentration sur la croissance radiale de ce germe. Aux concentrations de 2 et 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale sont compris entre 40 et 60 % ; à ces concentrations, cette souche fongique a été résistante (R) à tous les extraits. A la concentration de 2 mg/rnl., pour tous les extraits, l'effet inhibiteur a varié de 40, 19 % (Bridelia atroviridis) à 57,02 % (Microgramma owariensisï. A 4 mg/rnl., l'effet inhibiteur Je plus bas a été de 51,98 % (Phymatodes scolopandria) et l'effet le plus élevé a été celui des feuilles de E. senegalensis (57,78 %). A 8 mg/mL, cette souche fongique a été sensible aux extraits de E. senegalensis (Fe et Et) et de Nephrolepis bisserata, avec des effets inhibiteurs statistiquement égaux et légèrement supérieurs à 75 %. A cette même concentration, le fongique est résistant à l'extrait de Nesogordonia papaverifera et est modérément résistante au reste des extraits. A la concentration de 10 mg/mL, B. atroviridis (Fe) et B. atroviridis (Et) ont inhibé la croissance radiale du germe avec des taux statistiquement égaux d'environ 88 %. Les extraits de P. scolopandria et de N. papaverifera ont donné des taux respectifs de 85, 16 et de 82,28 %. Aux quatre extraits qui précedent, M guilliermondii a été sensible. Pour le reste des extraits de plante, l'inhibition a été de 100 %. La souche ne leur a donc montré aucune résistance à cette concentration. 107 Les valeurs des Clso des différents extraits de plantes sont comprises entre 1, 76 et 3,38 mg/m L. Concernant les CM I, pour la majorité des extraits, la valeur est de 10 mg/m L sauf pour B. atroviridis (Fe et Et), Phymatodes scolopandria et Nesogordonia papaverifera où les CMI sont supérieures à 10 mg/mL (Tableau XXI). 108 ::1 ro :'"; V) V) V) N 00 E 00 00 •n ..,. •n •n ::, r'l (') <'> (') r--_ (') (') <'> (') C/) <'> <:. "' <'1 0 ~ <'>, M r'l" (') <'1 <'1 ('1 ('1 <'>" r'l" ::, :E "O êi C .Q C" a. {; ::, C/) ~ Q) ~"' E "O ] .;C./..,) 0 0 ::: ::: ::: 0 ::: 0 ::: ::: ::: ::: i ·~ /\ /\ /\ /\ ~ x1-. 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Les pourcentages les plus élevés sont ceux de Erythrina senegalensis (Fe et Et) et Nephrolepis bisserata, avec des pourcentages d'inhibition statistiquement identiques et voisins de 57 % (Tableau XXII). Les niveaux de résistance ou de sensibilité de M guilliermondii varient pour tous les extraits en fonction des concentrations des extraits de plante. L'analyse statistique a montré une différence significative entre les effets des extraits, au sein d'une même concentration, sur la croissance radiale de ce germe. Aux concentrations de 2 et 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale sont inférieurs 40 % ; à ces concentrations, cette souche fongique a été hautement résistante (HR) à tous les extraits. A la concentration de 2 mg/mL, pour tous les extraits, l'effet inhibiteur a varié de 28,56 % (Phymatodes scolopandria) à 30,77 % (écorce de tige de E. Senegalensis). A 4 mg/mL, l'effet inhibiteur le plus bas a été de 36,84 % (Phymatodes scolopandria) et l'effet le plus élevé a été celui des feuilles de E. senegalensis (39,49 %). A 8 mg/mL, les taux d'inhibition de la croissance radiale varient de 53,95 à 57,91 % c'est-à dire, compris dans l'intervalle de 40 à 60 %. Ce fongique a donc été résistant à tous les extraits à cette concentration. A la concentration de 10 mg/mL, tous les extraits, à l'exception de trois ont eu un effet inhibiteur à 100 % sur la croissance radiale de M guilliermondii. Les trois extraits qui ont laissé se développer une poche de résistance au germe ont été P. scolopendria (90,48 %), B. atroviridis (Et) avec 91,25 % et B. atroviridis (Fe) avec 91,79 %. Tous les extraits ont présenté un pourcentage d'inhibition de la croissance radiale supérieur à 90 %. La souche a donc été hautement sensible à tous les extraits à cette concentration. Les valeurs des Clso des différents extraits sont comprises entre 6,34 et 7, 10 mg/mL. Concernant les CM 1, pour les neuf extraits ayant eu une inhibition totale sur la croissance du germe, la valeur de la CMI est de 10 mg/mL. Pour B. atroviridis (Fe et Et) et P. scolopendria, les CM I sont supérieures à 10 mg/mL (Tableau XXII). 110 .., 0 ::i C E ro :::, ..c (.) ,â) .g N 'Ô 00 N N 'Ô ..,. 00 ·;:; ., V ) E 00 <""' l <'l ..,. V ) V"" ) V ) V ) ..,. C: °' 'Ôn -S! C: ::::1 'Ôn -6 -.i,' -6 -6 r-'.' 'Ôn 'Ôn 'Ôn -6 -6 C<3 ~ .; ~ rr, E (lJ -:: ë J Il C<3 -:: .~ ë.. ,!:: rr, (lJ 0 -0 0 -0 ~ ~ ~ ~ ~ ~ /\ z ~ ~ ~ /1 F ~ !: .«•.i.. ~.. x(lJ ~ rr, e::: e::: e::: e::: e::: e::: e::: e::: e::: e::: e::: e::: §. (lJ -0 "" rr, g C è 0 r.n r.n r.n r.n r.n r.n r.n r.n r.n r.n r.n r.n ·.;::: :c :c :c :c :c :c :c :c :c :c :c :c 1C'. •C.<.3. .g.,,o ë (lJ ~ ü o. 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Les niveaux de résistance ou de sensibilité de M guilliermondii varient pour tous les extraits en fonction des concentrations des extraits de plante. L'analyse statistique a montré une différence significative entre les effets des extraits, au sein d'une même concentration, sur la croissance radiale de ce germe. Aux concentrations de 2 et 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale sont compris entre 40 et 60 %. Ces pourcentages ont révélé la résistante (R) à tous les extraits à ces deux concentrations. A la concentration de 2 mg/mL, pour tous les extraits, l'effet inhibiteur a varié de 43, 12 % (N. papaverifera et P. scolopandria) à 48,57 % (écorce de tige de E. senega/ensis). A 4 mg/mL, l'effet inhibiteur le plus bas a été de 47,09 % (N. papaverifera) et l'effet le plus élevé a été celui de l'écorce de tige de E. senegalensis (52,06 %). A 8 mg/mL, ce fongique a été modérément résistant à tous les extraits. Mais le taux d'inhibition le plus bas a été observé avec l'extrait de Nesogordonia papaverifera (61,07 %) et le taux le plus élevé a été pour l'extrait d'écorce de tige de E. senegalensis (66,02 %). A la concentration de 10 mg/rnl., B. atroviridis (Fe) et B. atroviridis (Et) ont inhibé la croissance radiale du germe avec des taux statistiquement égaux d'environ 88 %. L'extrait de P. scolopandria a inhibé le germe avec un taux de 85, 16 % et celui de N. papaverifera avec un taux de 82,28 %. A cette même concentration, pour le reste des extraits de plantes, l'inhibition a été de 100 %. La souche fongique ne leur a été aucunement résistante. Les valeurs des Clso des différents extraits sont comprises entre 2,96 et 4,88 mg/rnl.. Concernant les CM 1, pour la majorité des extraits, la valeur est de 10 mg/m L sauf pour B. atroviridis (Fe et Et), P. sco!opandria et N. papaverifera où les CML sont supérieures à 10 mg/mL (Tableau XXIII). 112 ·<> C: 3 0 Q) :E::, u "' :::, r:::ol "O 00 00 •.... 00 00 •.... C .QJ 00 \0 .,.., .,.., " •.... '° \O" '° 00 ,...", °' 'ri. C (') (') N°'" N°'" N°'" .,,. °rJ' -.r" (') ,...", ·Cil "' ~ E ~"' C ~ a. 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Les spectres de résistance ou de sensibilité de M circinelloidesf circinelloides varient pour tous les extraits en fonction des concentrations des extraits de plante. L'analyse statistique na montré aucune différence significative entre les effets des extraits au sein d'une même concentration, sur la croissance radiale de ce germe. A la concentration de 2 mg/mL, tous les extraits ont présenté un pourcentage d'inhibition de la croissance radiale du germe d'environ 31 % ; ce qui est inférieur à 40 %. Un tel pourcentage, montre que le germe est hautement résistant (HR) à cette concentration. A 4 mg/mL, le germe est résistant (R) aux extraits de plantes et lorsqu'on passe à la concentration de 8 mg/mL, le niveau de résistance devient modéré. Pour ces deux concentrations, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale ont été respectivement compris entre 40 et 60 % et entre 60 et 75 %. A 10 mg/mL, aucune résistance n'a été manifestée, le pourcentage d'inhibition étant de 100 %. La croissance de ce fongique a été totalement inhibée par les extraits de plante. Les Clso (concentrations capables d'inhiber de 50 % la croissance radiale des germes) pour tous les extraits sont comprises entre 5,32 et 5,39 mg/mL. La concentration minimale (CMI) pour laquelle la souche ne présente aucune résistance a été observée à partir de 10 mg/mL pour tous les extraits (Tableau XXIV). 114 Cil E s:: ~ Cil ..J ëi.. E V) V) Cil 'èb •n V) •n •n N 00 r- ,...• ,...• (") (") ,...• ,...• ,...• ,...• ,...• ,...• ,...• ,"". ..• v E li") '° li") li") li") l°i")' li") li") li") -0 '-..-' •n" ,n" •n" ,n" Cil ~ -~ ü •.... 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Extraits au méthanol L'analyse du Tableau XXV a montré qu'en considérant simultanément les quatre concentrations, Mucor circinelloidesf circinelloides a globalement été résistante à l'ensemble des extraits de plante selon l'échelle de Kumar et al. (2007). Les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale induits par les extraits sont de valeurs inférieures à 60 %, mais supérieures à 40 %. L'extrait de la plante entière de Phymatodes scolopandria a induit l'inhibition la plus basse soit 45,73 %, bien que le germe soit résistant à tous les extraits. Pour les autres extraits, les pourcentages d'inhibition ont été d'environ 58 %. Le comportement de M circinelloides f. circinelloides (résistance ou sensibilité) varie pour tous les extraits en fonction des concentrations des extraits de plante. L'analyse statistique a montré une différence significative entre les effets des extraits au sein d'une même concentration sur la croissance radiale de ce germe. Aux concentrations de 2 et 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale sont inférieurs 40 % ; à ces concentrations, cette souche fongique a été hautement résistante (HR) à tous les extraits. A 2 rng/rnl., tous les extraits ont induit un pourcentage d'inhibition de la croissance radiale du germe d'environ 18 à 19 %, sauf l'extrait de P. scolopandria avec 5,35 %. A 4 mg/mL, les inhibitions induites sont d'environ 30 % pour l'ensemble des espèces de plante et de 18,84 % pour P. scolopandria seule. A 8 mg/mL, les taux d'inhibition induits par les extraits de plante sur.la souche fongique ont statistiquement été les mêmes et de valeurs sensiblement égales à 85,5 %, excepté l'extrait de P. scolopandria avec un taux de 70,44 %. Ces taux montrent que la souche fongique a été modérément résistant (MR) à P. scolopandria et sensible (S) au reste des extraits. A la concentration de 10 mg/mL, tous les extraits ont inhibé la croissance radiale de la souche fongique à 100 % à l'exception de P. scolopandria chez qui le taux d'inhibition induit a été de 88,29 %. La souche a donc été sensible à la dernière espèce de plante et hautement sensible (HS) pour le reste des plantes. Les Clso pour tous les extraits sont comprises entre 5,43 et 6,44 mg/mL. La concentration minimale (CMI) pour laquelle la souche ne présente aucune résistance a été observée à partir de l O mg/m L pour tous les extraits quand pour P. scolopandria seule, la CMI est supérieure à 10 mg/mL (Tableau XXV). 116 ::i ,....., "v' , .E.l 2 ob se (') (') se (') ..•. se ..•. 00 or, r- or, ..•. ..•. ..•. ..•." ..•. ..•. ..•. ..•. ..•. ..•. ..•. ..•. :~ V) V) ~ s Or) or," on" V) on" sÔ V) or," or," v," .,? -a. 0~ {5 (Q/)) ü -0 ..:~:: (/) ,....., ~ ·-@ .E.l ~ b ob ~ 0 QXJ v::: '.=: /\ '.=: '.=: '.=: '.=: '.=: (/) - '.=: '.=: '.=: '.=: '.=: != Q) ~ -0 u E (/) ~ '- § <.:) ~ 0::: 0::: ~ ~ 0::: 0::: ~ ~ 0::: 0::: 0::: 0::: ~ ~ 0::: ~ .b ~ ....1 c: c E .!":"; ! 8 ~ ob (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) .g c: .s E :c: :c: :c: :c: :c: (/) :c: :c: :c: :c: :c: :c: " 8(/) -~1.) 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Q.. .::; •.. > ê E "' "' Selon l'échelle de Kumar et al. (2007), en tenant compte simultanément des quatre concentrations, Mucor circinelloidesf circinelloides a globalement été modérément résistante à 11 extraits de plante sur 12. Les pourcentages d'inhibition induits sur la croissance radiale du germe par ces 11 extraits sont compris entre 60 et 75 %. Pour le douzième extrait, c'est-à-dire, celui de Phymatodes scolopandria avec un pourcentage d'inhibition inférieur aux autres et d'environ 57,07 %, le germe a été résistant (Tableau XXVI). Le comportement de M circinelloidesf circinelloides (résistance ou sensibilité) varie pour tous les extraits en fonction des concentrations des extraits de plante. L'analyse statistique a montré une différence significative entre les effets des extraits au sein d'une même concentration sur la croissance radiale de ce germe. Aux concentrations de 2 et 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale sont inférieurs 40 % ; à ces concentrations, cette souche fongique a été hautement ····· résistante (HR) à tous les extraits. A 2 mg/mL, tous les extraits ont induit une inhibition de la croissance radiale dont les taux sont compris entre 31, 16 % (P. scolopandria) et 33,95 % (Nesogordoniapapaverifera). A 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition induits sont d'environ 39%. A 8 mg/mL, les taux d'inhibition induits par les extraits de plante sur la souche fongique ont statistiquement été les mêmes et de valeurs voisines de 85,5 %, excepté l'extrait de P. scolopandria avec un taux de 70,44 %. Ces taux montrent que le fongique a été modérément résistant (MR) à P. scolopandria et sensible (S) aux 11 autres extraits. A la concentration de 10 mg/mL, tous les extraits ont inhibé la croissance radiale de la souche fongique à 100 % à l'exception de P. scolopandria chez qui le taux d'inhibition induit a été de 88,29 %. La souche a donc été sensible à la dernière espèce de plan_t_~ et hautement sensible (HS) pour le reste des plantes. Les Clso pour tous les extraits sont comprises entre 4,94 et 5,46 mg/mL. La concentration minimale pour laquelle la souche ne présente aucune résistance a été observée à partir de 10 mg/mL pour tous les extraits quand pour P. scolopandria seule, la CMI est supérieure à 10 mg/mL (Tableau XXVI). 118 ,"3 Vl Cl) ë "3 o. ~00 ~ ~ ~00 ~ ~""' ~ ~°"" ~ ~ ~00 ~ ~ ~ v"' v" v"' V).. v" -.::i' ~ "Q') "Q') = = ~= ,-.. - - ,-.. ,-.. ~ - ,-.. C' - ·~ .2" Q) ~~~â~[~@~~§~ ~.:@ :ô CO~ t/l v,~ t/l O O. ~ C: bOVl ,::~ CS:: CO CO CJ.l t.J.l Z Q.. 2 Z f- U U f- C..~ E-< c"c' uE 1.6. Effets des extraits de plante sur Mucor velutinosus 1.6.1. Extraits au dichlorométhane L'analyse du Tableau XXVII montre qu'en considérant simultanément les quatre concentrations, Mucor velutinosus, selon l'échelle de Kumar et al. (2007), a globalement été résistante à 11 extraits de plante sur 12. Les pourcentages d'inhibition induits sur la croissance radiale de la souche fongique par ces 11 extraits sont compris entre 50,45 et 59,69 %. Le douzième extrait auquel la souche fongique a été modérément _xésistante est celui de Nephrolepis bisse rata avec un pourcentage d'inhibition d'environ 60,21 %. Le comportement de M velutinosus (résistance ou sensibilité) varie pour tous les extraits en fonction des concentrations des extraits de plante. L'analyse statistique a montré une différence significative entre les effets des extraits au sein d'une même concentration sur la croissance radiale de Mucor velutinosus, à l'exception de la concentration de 10 mg/mL. Aux concentrations de 2 et 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale ont été inférieurs à 40 %, sauf pour N. bisserata qui a induit une inhibition de 41,71 %. A 2 mg/mL, tous les extraits ont induit une inhibition de la croissance radiale dont les taux sont compris entre 1,24 % (Cola gigantea) et 15, 12 % (écorce de tige de Bridelia atroviridis). A 4 mg/rnl., les pourcentages d'inhibition induits sont compris entre 27,52 et 41,71 %. A ces deux concentrations, la souche fongique a été pour la plupart des extraits hautement résistante (HR) aux extraits, sauf pour N. bissera/a, où elle a été résistante. A 8 mg/mL, les taux d'inhibition induits par les extraits de plante sur la souche fongique peuvent être regroupés en deux catégories. La première catégorie comprend les extraits qui ont un taux compris entre 60 et 75 %. Dans cette première classe où la souche fongique a été modérément résistante, les extraits retrouvés sont B. atroviridis (Fe) (64,88 %), Celtis mildbraedii (7 l ,35 %) et C. gigantea (73,06 %). Pour la seconde catégorie, il s'agit des extraits pour lesquels les taux d'inhibition sont compris entre 75 et 90 %. A cette seconde catégorie (les neuf extraits restants), la souche fongique a été sensible. A la concentration de 10 mg/rnl., tous les extraits ont inhibé la croissance radiale de la souche fongique à 100 %. La souche a donc été hautement sensible (HS) à tous les extraits. Les Clso pour tous les extraits sont comprises entre 4,77 et 5,97 rng/mL. La concentration minimale pour laquelle la souche ne présente aucune résistance a été de l 0 mg/ml, pour tous les extraits (Tableau XXVII). 120 •C) t!.l '3 C E c: - 0) >- § .!: ~ ,., "' "•'. . :::l ~ E .!:; = v, 0 .•.. a' c,: ,-.. ,-.. 'aj' 'aj' ,-.. ..::- -~ ..Q 'aj' ..::- c.. 'aj' c.. ;fi' g E ·.= ~ W"'. . u•...3.... J.:.. UJ •...... c.. '--' W"'. . '--' s UJ ~ .b .!: '--' '--' '--' '--' '--' '--' '--' ... -~ .c >< (.) ..0 '--' 0 o. E 00 V, - c,: ., ., V, V, V, E V, UJ 'o co œ UJ UJ z c.. 2 z F u u !-- ci:~ 0) f-< u LJ". "O 1.6.2. Extraits au méthanol L'analyse du Tableau XXVIII montre qu'en considérant simultanément les quatre ····· concentrations, Mucor velutinosus, selon l'échelle de Kumar et al. (2007), a globalement été résistante (R) à tous les extraits au méthanol et hautement résistante (HR) à l'extrait de Nesogordonia papverifera seule. L'inhibition induite par N. papverifera est de 5,39 % et pour les 11 autres extraits, les pourcentages d'inhibition sont compris entre 54,24 et 59,26 %. La réaction de sensibilité ou de résistance de M velutinosus vis-à-vis des extraits varie pour tous les extraits en fonction de leurs concentrations. L'analyse statistique a montré une différence significative entre les effets des extraits, au sein d'une même concentration, sur la croissance radiale de ce germe, à l'exception de la concentration de 2 mg/rnL. A la concentration de 2 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale ont été presque nuls pour tous les extraits. La souche fongique est donc hautement résistante à cette concentration. A 4 mg/mL, le fongique a été résistant à seulement trois extraits et hautement résistant aux neuf autres. Ce sont les extraits de Trichilia heudelotii (43,72 %), Celtis mildbraedii (43,33 %) et de Triplochiton scleroxylon ( 44,26 %). Les neuf extraits restants ont eu des taux inférieurs à 40 % et le taux le plus bas a été observé à cette concentration chez N. papverifera avec 2, 17 %. A 8 mg/mL, la souche fongique a présenté trois réactions possibles. Premièrement, M velutinosus a été hautement résistante à l'extrait de N. papverifera seul (6,82 % comme taux d'inhibition). La deuxième réaction concerne les extraits dont les taux d'inhibition sont compris entre 75 et 90 %. Pour les extraits de cette seconde catégorie, la souche fongique leur a été sensible. La dernière réaction concerne l'extrait de T. scleroxylon, plus inhibiteur à cette concentration avec 90,54 % d'inhibition, mais avec une petite poche de résistance. A la concentration de 10 mg/mL, tous les extraits ont inhibé à 100 % lacroissance radiale de la souche fongique à l'exception de l'extrait de N. papverifera avec 12,48 % comme taux cl' inhibition. La souche a donc été hautement sensible (HS) à tous les extraits et hautement résistante à l'extrait de N. papverifera seul. Les Clso pour tous les extraits sont comprises entre 4,52 et 5,48 mg/mL, quand pour N. papverifera seule la Clso est supérieure à 1 Omg/mL. La concentration minimale pour laquelle la souche ne présente aucune résistance a été de 10 mg/m L pour tous les extraits, excepté pour N. papverifera où cette valeur est dépassée (Tableau XXVIII). 122 .., t:: :i 0 E Q) ~:::, C: 0 (/) .g ~ 0 ·::; :.Ô V t:: .,... ..,. ("l 00 r-- 0 N ..,. 00 N .Q ·- C: M 'N° N N N N N ..,. ":. .c: C: ..c"': on on .,..." on V) .,..." .,..." -/\ v'°" v'°" on ..,. ~ ._,5 ~ ,v .;:, -0 0 .:::: E E Il ::l .~:::: .!,! "(/' ) Q) .:: ê: 0 ~ ~ ~ ~ i= ë"' .. ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ /\ (/) E Q) :::E -0 ~•.. u !'> -~(/) -... 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'N° '° ô 'Ô' V ) on .,..." ,rï r--" Il V ~ ~ v °' Sur Mucor velutinosus, l'effet inhibiteur moyen(% IG) des extraits de plante est compris clans l'intervalle de 60 à 75 %. Selon l'échelle de Kumar et al. (2007), cette souche fongique a globalement été modérément résistante (MR) à tous les extraits aqueux (Tableau XXIX). La réaction de sensibilité ou de résistance de M velutinosus vis-à-vis des extraits varie pour tous les extraits en fonction de leurs concentrations. L'analyse statistique a montré une différence significative entre les effets des extraits aux seins des deux premières concentrations. Pour les deux dernières, les effets des extraits sont statistiquement identiques d'un extrait à un autre. A la concentration de 2 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale ont été très faibles pour tous les extraits. A cette concentration, le germe est hautement résistant. A 4 mg/mL, avec des pourcentages d'inhibition de la croissance radiale variant de 42,93 % (Cola giganlea) à 48,76 % (feuilles de Bridelia atroviridis), le germe fongique a été résistant à tous les extraits. Aux deux dernières concentrations, tous les extraits ont inhibé à 100 % la croissance radiale de ce fongique. La souche fongique a donc été hautement sensible (HS) à tous les extraits à ces deux concentrations. Les Clso pour tous les extraits sont comprises entre 4, 12 et 4,52 rng/ml., La concentration minimale pour laquelle la souche ne présente aucune résistance a été de 8 mg/mL pour tous les extraits (Tableau XXIX). 124 ~ 1.7.1. Extraits au dichlorométhane L'analyse du Tableau XXX montre qu'en considérant simultanément les quatre concentrations, Rhizopus oryzae, selon l'échelle de Kumar et al. (2007), a globalement été modérément résistante (MR) à huit extraits sur les 12. Les pourcentages d'inhibition induits par ces huit extraits sont compris entre 60, 17 et 63,86 %. Aux quatre extraits restants, à savoir Trichilia heudelotii (40,21 %), Phymatodes scolopandria (42,23 %) et les deux extraits de Bridelia atroviridis (Fe et Et) (41,36 % et 43, 10 %), le fongique a été résistant. La réaction de sensibilité ou de résistance de R. oryzae vis-à-vis des extraits varie pour tous les extraits en fonction de leurs concentrations. L'analyse statistique a montré une différence significative entre les effets des extraits, au sein d'une même concentration, sur la croissance radiale de ce germe fongique. A la concentration de 2 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale ont été pour deux extraits seulement légèrement au-dessus de 40 % (Microgramma owariensis et Nesogordonia papaverifera) et pour les 10 autres extraits inférieurs à 40 %. Le germe a été hautement résistant (HR) aux 10 extraits et résistant (R) aux deux extraits cités précédemment à cette concentration. A 4 rng/rnl., le fongique a été hautement résistant à seulement quatre extraits et résistant aux huit autres. Ces quatre extraits sont ceux de T. heudelotii (19,84 %), P. scolopandria (20,62 %) et les deux extraits de B. atroviridis (Fe et Et) (23,02 % et 22,71 %). Les huit extraits restants ont présenté des taux supérieurs à 40 %. A 8 mg/mL, les quatre extraits précédents ont présenté des taux d'inhibition compris entre 40 et 60 % et pour le reste des extraits, des taux compris entre 60 et 75 %. Selon l'échelle de Kumar et al. (2007), la souche fongique a été résistante au premier groupe d'extraits et modérément résistante au second groupe. A la concentration de 10 mg/mL, exceptés les extraits de T. heudelotii avec 85,32 %, P. scolopandria avec 87,72 % et les deux extraits de B. atroviridis (Fe et Et) avec respectivement 83,29 et 83,06 %, les huit extraits restants ont inhibé à 100 % la croissance radiale de lasouche fongique. La souche a donc été sensible (S) aux quatre premiers extraits et hautement sensible (HS) au reste des extraits. 126 •C) C :; 0 E Q) ~ ~ ~ ~ ; ~ ~ ~ ~ ~ i ~ :, V, oo" r- V"l" V")... tr)" oo" r-" -.:t" oti ,n V) ,,-,"'' ü V, Cl) C) C O C. C . Q . ~ c.c..Ê 0. 0 . C . .; ;... •... -~ ::; ~ ....J ~ ~ 00 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ "' ,'::; ~ E ~ ~ ,--, Q) ~" ~. .. OO. . ~. .. ~. . °-' 00. .. ~" M ~.. ~., ~" ~ Cl) 8 _gC: ::: ~ti Cl) Cl) es: ::, ~ "'"' "' C: .!:: = ~ "' e Q)-=°' Q) Z' ~-. Q) ,:;- 0) Z' ~ 0 ~Ë.g .c ·'= 0 LI... t..ù LL. t..ù t..ù LL. t..ù t..ù "' -~ E "0') es: co- ç:.,.._,, .._,, ..._,, e:.. :._.. e:...... _. .._, ~l:::, .._,, .._,, S. ..., Cl"'l LJ.. 'C l= u " E-< X ,-_5 0 t..ù "O al co ül ül z ~ ~ z tu u ~ ~~ Les Clso pour tous les extraits sont comprises entre 4,83 et 8,29 mg/mL. La concentration minimale inhibitrice, pour laquelle la souche ne présente aucune résistance, a été de 10 mg/ml, pour les huit extraits relativement plus actifs et supérieur à 10 mg/mL pour les quatre autres (Tableau XXX). l.7.2. Extraits au méthanol L'analyse du Tableau XXXI montre qu'en considérant simultanément les quatre concentrations, Rhizopus oryzae, selon l'échelle de Kurnar et al. (2007), a globalement été résistante (R) à 11 extraits et hautement résistante (HR) à uniquement l'extrait de Phymatodes scolopandria. Les pourcentages d'inhibition induits sur la croissance radiale de la souche fongique par ces 12 extraits sont compris entre 39,14 et 48,30 %. La réaction de R. oryzae (résistance ou sensibilité) vis-à-vis des extraits varie pour tous les extraits en fonction des concentrations des extraits de plante. L'analyse statistique a montré qu'il y a une différence significative entre les effets des extraits, au sein d'une même concentration, sur la croissance radial~ de ce germe fongique. Aux concentrations de 2 et 4 mg/mL, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale ont été inférieurs à 40 % pour tous les extraits. A 2 mg/mL, tous les extraits ont induit une inhibition de la croissance radiale dont les taux sont compris entre 0,00 % (P. scolopandria) et 8,45 % (Cola gigantea, Triplochiton scleroxylon et Microgramma owariensisi. A 4 mg/m L, les pourcentages d'inhibition induits sont compris entre 12,64 % (P. scolopandria) et 18,68 % (T. scleroxylon). A ces deux concentrations la souche fongique a été hautement résistante (HR) aux extraits. A 8 mg/mL, les taux d'inhibition induits permettent aux extraits d'être regroupés dans une seule classe d'activité. Tous les extraits ont présenté des taux compris entre 60 et 75 %. D'après l'échelle de classification, R. oryzae a modérément résisté aux extraits. A 10 mg/mL, neuf(9) extraits sur 12 ont inhibé la croissance radiale du germe fongique à 100 %. La souche a donc été hypersensible (HS) à ces neuf extraits à cette concentration. Quant aux trois extraits restants, la souche leur a montré une poche de résistance. Ce sont les extraits de l'écorce de tige de Bridelia atroviridis (88,28 %), des feuilles de B. atroviridis (88,43 %) et la plante entière de P. scolopandria (83,63 %). Avec ces taux d'inhibition, le fongique a été sensible aux trois extraits. Les Clso pour tous les extraits sont comprises entre 6,66 et 7, 18 mg/mL. Exceptés les extraits de B. atroviridis (Fe et Et) et de P. scolopandria où les CMl sont supérieures à 10 mg/mL; pour les autres extraits, elles ont été de 10 mg/mL (Tableau XXXI). 128 •C) Q) "3 Q) ,....., E ..c -;:! u= <.) C ::, -0 ~Q.) oh 00 r- 00 00 r- 00 r- 0 0 r- r- :2; °' °' "' C C: ..S. r-" r-" "' "' ,...:- sô sô .Q " sô "' sô "' "'" "' " "' "' " "' " C 0 0 "'" ~ Q) ..= .;:, ~" V, u ..:: E 0 Il C ,....., .~.:: C Les 12 extraits de plante au méthanol testés sur Rhizopus oryzae ont présenté le même spectre d'activité selon 1 'échelle de Kumar et al. (2007). Les pourcentages d'inhibition moyens (% IG) pour tous les extraits appartiennent à l'intervalle de 60 % < IG::; 75 %. Pour les deux extraits de Bridelia atroviridis (Fe et Et), ce pourcentage vaut environ 52,5 % et pour les autres extraits de plante, les valeurs des pourcentages d'inhibition sont d'environ 58,5 %. La souche a donc été modérément résistante à l'ensemble des extraits (Tableau XXXII). Les niveaux de résistance ou de sensibilité de R. oryzae varient aussi pour tous les extraits en fonction des concentrations d'extraits. L'analyse statistique a montré qu'au sein de chaque concentration, les effets des extraits ont été identiques pour tous les extraits, à l'exception des extraits de B. atroviridis. Aux concentrations de 2 et 4 mg/mL, l'inhibition de la croissance radiale est inférieure à 40 %. A ces deux premières concentrations, le fongique est hautement résistant (HR) à tous les extraits. A 2 mg/mL, le pourcentage de l'inhibition est de l'ordre de 15,27 à 15,97 % et de l'ordre de 18,06 à J 8,29 % pour la concentration de 4 mg/mL. Aux concentrations de 8 et 10 mg/mL, le fongique a été hautement sensible (HS) à tous les extraits d'organes de plante sauf pour les extraits de B. atroviridis (Fe et Et), où le fongique n'a été que sensible (S). La croissance radiale de cette souche fongique a été inhibée à 88,45 % par les feuilles B. atroviridis et à 88,29 % par l'extrait de l'écorce de tige à ces deux concentrations. Pour les autres extraits de plante, le taux d'inhibition de la croissance radiale a été de 100 %. Les Clso pour tous les extraits sont comprises entre 5,56 et 5,83 mg/mL. Exceptés les extraits de B. atroviridis (Fe et Et) où les CMI sont supérieures à ] 0 mg/mL, pour les autres extraits, les CMI Sont toutes égales à 8 mg/mL (Tableau XXXII). 130 .•.. "S E il ::, -0•.. C: <'l N 00 ,- ,- ,- 00 00 .,,-.., .,.., 0.,0.., ] C: 00 00 .,., .,., .,., ',,°., ,,., .,.., '° ,,., ''"!. .,.;· ,,., ,,.," .,-.", .,-.", V) ,/")' {; ,,.," .,-.", .,.,· .,., :::: ~ -:":':: E -J:::: -~ ...l ~ E Ôl) 0 0 != 5 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 /\ 7. 1: ~ ~•.. u ~ ~ 0:: 0:: 0:: ~ 0:: 0:: ~ 0:: IX 0:: 0:: ~ <>.. -~ ...l .g E ,_ C/J C/J C/1 C/1 C/1 C/1 C/1 C/1 C/1 C/1 Ôl) C/J C/J E :r: :r: :r: :r: :r: :r: :r: :r: :r: :r: .~., ~ o. ...l z C/J C/J C/1 C/1 C/1 C/1 C/1 C/J C/J C/1 ci::1 C/1 C/J :r: :r: :r: :c :r: :r: :r: :r: :r: :r: -~ .g E ~ C: 00 ï"': : 0 %: ·= ...l 6 u ~ s; ,."', ÔC:l) 0:: IX ~ 0:: 0:: IX 0:: 0:: 0:: ~ :r: :r: :r: :r: :r: ~ :r: :r: ~ :': C: ~ ~ :c E "C': ~•.. 0 ...l .., ·~ E 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: 0:: ~ ë Ôl) -~ :r: :r: ~ :r: :r: :r: :r: ~ :r: :r: :r: :c 0 1l E :â N 8 .g ~ .,, .,, .,, .,, .,, .,, .,, .,, .,, .,,,, .. ë.,..,, N M ,- ,- ,- <'l M 1è ..•. M M ,,.. ,,.. N <'l ,,.. ..•. °N' <'l •.• ,.., °' ,.,; ,.., M" ,.,; ...• ,-" ,-" ,.,; ,.,; ,,.." 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Extraits au dichlorométhane L'analyse du Tableau XXXIII a montré qu'en considérant simultanément les quatre concentrations, Rhizopus stolonifer a globalement été résistante à l'ensemble des extraits de plante selon l'échelle de Kumar et al. (2007). Les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale induits par les extraits ont une valeur voisine de 65 %. Les spectres de résistance ou de sensibilité de R. stolonifer varient pour tous les extraits en fonction des concentrations des extraits de plante. L'analyse statistique n'a montré aucune différence significative entre les effets des extraits au sein d'une même concentration sur la croissance radiale de ce fongique. A la concentration de 2 mg/mL, tous les extraits ont présenté un pourcentage d'inhibition de la croissance radiale de ce fongique voisin de 39 %, qui est inférieur à 40 %. Un tel pourcentage montre que la souche fongique est hautement résistante (HR) à cette concentration. A 4 mg/ml, la souche fongique est résistante (R) aux extraits de plante qui ont induit des pourcentages d'inhibition compris entre 40 et 60 %. A 8 mg/mL, quatre extraits sur les 12, à savoir les deux extraits de Erythrina senegalensis (Fe et Et), Phymatodes scolopandria et Cola gigantea ont induit des po, ...u. rcentages d'inhibition légèrement supérieurs à 75 %. Quant aux huit extraits restants, les pourcentages sont légèrement au-dessous de 75 %. L'analyse statistique n'a montré aucune différence significative entre les pourcentages d'inhibition des 12 extraits. Sur cette base, les 12 extraits peuvent être regroupés dans un même spectre d'activité sur R. stolonifer qui est alors soit légèrement sensible, soit modérément résistante aux extraits. A 10 mg/mL, aucune résistance n'a été manifestée. La croissance de R. stolonifer a été inhibée à 100 % par les extraits de plante. Les Clso pour tous les extraits sont comprises entre 4,47 et 4,53 mg/mL. La concentration minimale (CMI) pour laquelle la souche ne présente aucune résistance a été observée à 10 mg/ml, pour tous les extraits (Tableau XXXIII). 132 .., Q) "5 C 134 •C) C: 3 "3 0 E E â3 olJ (') ..•. 00 ..•. 00 00 N 'D ::, V, '° '° '° '° u s ,r, ,,., .,..,· ,,.; ,,..·. Il) ,r, .,.; lf"I. ,r, ,,..·. ,,..·. .,:,:,l 0 ~ ·::: C: .Q C 83, 1 % pour tous les extraits. La souche fongique a été sensible vis-à-vis des extraits de plante à 8 mg/mL. A 10 rng/mL, aucune résistance n'a été manifestée, le pourcentage d'inhibition étant de l 00 %. La croissance de ce fongique a été totalement inhibée par les extraits de plante. Les Clso pour tous les extraits, ont été inférieures à 2 rng/rnL (concentrations les plus basses de l'étude). La concentration minimale (CMI) pour laquelle la souche ne présente aucune résistance a été observée à 10 rng/mL pour tous les extraits (Tableau XXXV). 136 ·, 0" ~ u E ::i «l •••••• Q.) ....l ~"' 1 CQ/.)) t-: ::: ::: ::: ::: ::: ::: ::: ::: ::: ::: ::: ::: § ; o. u C/) Q.) c.:, CX: CX: CX: CX: CX: CX: CX: CX: ex: CX: CX: CX: -0 CX: ~ 2 2 2 ~ 2 2 2 2 2 2 2 2 «l ....l t: E ~ el) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) (/) en • E :r: :r: :r: :r: :r: :r: :r: :r: :r: :r: :r: :r: Q.) ~ 0 -0 ';:' ~ ] ....J o .S? E u2 ..., "' -... (/) (/) (/) (/) (/) «l Cl:: 0lJ (/) r./) r./) r./) r./) r./) r./) b E ~ 0 QC): "O"' 00 V) .., ~ B _J ·.= E o CX: CX: CX: CX: i:::; CX: ex: ex: CX: CX: u g el) .f C/l •.CU ,... 2 ~ 2 2 2 2 2 2 ~ 2 2 2 Q.) 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(2009), les feuilles de cette plante inhiberaient la croissance des champignons pathogènes humains tels que Candida albicans et Aspergillus niger. Concernant l'espèce végétale Nesogordonia papverifera, les travaux de Ayodele et al. (2007) ont montré qu'en présence de la sciure de son bois, la croissance du champignon Lentinus squarrosulus est inhibée. Les deux dernières espèces végétales, à savoir Microgramma owariensis et Tiplochiton scleroxylon, sont avec N. papverifera, les espèces ayant eu un bon poteniel antifongique dans cette étude. Bien que la littérature concernant leurs activités biologiques et usages traditionnels soit pauvre, leurs compositions en molécules naturelles pourraient expliquer leurs activités antifongiques manifestées. Par ailleurs, M owariensis est fougère comme Nephrolepis bisserata et et T. scleroxylon une Sterculiaceae comme N. papaverifera et C. gigantea. Leur appartenance à ces groupes ou des espèces ont déjà manifesté une activité peut également justifier leur effet antifongique. En considérant les solvants d'extraction, il ressort que les extraits aqueux ont été plus actifs sur six souches que sont Mucor velutinosus, Mucor circinel/oides f circinelloides, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer, Geotrichum sp. et Meyerozyma guilliermondii, Parmi les extraits végétaux organiques, ce sont les extraits dichlorométhaniques qui ont été plus actifs sur les deux souches restantes à savoir, Colletotrichum higginsainum et Fusarium oxysporum. La différence d'activité entre extraits aqueux et organiques pourrait s'expliquer par la nature des ····· molécules contenues dans chacun des types d'extraits. En effet, selon Cowan ( 1999), au cours de l'extraction, les phytomolécules sont reparties entres les solvants en fonction de leur polarité et leur solubilité. On pourrait en déduire que les substances antifongiques contenues dans les extraits de plantes pour la plupart des souches sont plus solubles dans l'eau que dans les autres solvants organiques. Cependant, il est parfois reconnu que l'activité des plantes médicinales peut être améliorée en utilisant des solvants organiques (Suffredini et al., 2004 ) comme constaté chez les souches fongiques C. higginsainum et F. oxysporum. Un autre paramètre non négligeable est la nature même des différentes souches fongiques isolées. En observant les souches fongiques très sensibles dans les extraits végétaux aqueux, le constat est que sur les six souches, quatre appartiennent à la famille des Mucoraceae. Ce sont: Mucor velutinosus, Mucor circine/loidesf circinel/oides, Rhizopus oryzae et Rhizopus stolonifer (Liu et Austin, 2011 ). Cette famille de souches fongiques serait alors sensible à un composé naturel qui serait présent des les extraits végétaux aqueux testés. 139 Il faut encore souligner qu'après Fusarium oxysporum, ces souches fongiques ont les fréquences d'apparitions les plus élevées sur les fruits étudiés. De plus, cette famille des Mucoraceae, est plus représentée avec quatre espèces sur les huit isolées. Ainsi une formulation de fongicides naturels.contre ces souches qui séraient responsables des pourritures des fruits du piment, de la tomate et de la papaye, sur la base des extraits aqueux serait plus intéressante. 140 Conclusion partielle L'évaluation de l'activité in vitro des extraits de plante sur les souches fongiques a révélé que tous les extraits testés utilisés possèdent une activité antifongique. Sur Colletotrichum higginsianum, l'espèce végétale qui a eu la meilleure activité est la plante entière de Microgramma owariensis et le solvant qui a favorisé__l_e plus l'inhibition de ce germe est le dichlorornéthane. Quant à Fusarium oxysporum, l'inhibition de la croissance radiale a été certes observée avec les trois types d'extraits, mais les extraits méthanoliques et aqueux ont été plus actifs. Cette souche fongique a également été très sensible à toutes les espèces végétales. S'agissant de Geotrichum sp., cette espèce fongique a eu une sensibilité plus grande pour les extraits aqueux. Concernant Meyerozyma guilliermondii, sa sensibilité a été plus importante aux extraits végétaux de Erythrina senegalensis, de Nephrolepis bissera/a et de Microgramma owariensis. Cependant, de ces trois espèces végétales, M owariensis a été la plus active sur cette souche fongique. Les tests antifongiques réalisés sur Mucor circinelloides f circinelloides, ont montré que la sensibilité de cette souche fongique a plus été favorisée par le solvant aqueux. Sur ce germe fongique, l'espèce végétale la plus active a été Nesogordonia papaverifera. Par contre, M circine!loides f circinelloides a montré plus de résistance aux extraits de Phymatodes scolopendria. S'agissant de Mucor velutinosus, les tests antifongiques ont montré que l'eau a également été plus favorable à l'inhibition de la croissance de cette souche fongique. Parmi les extraits aqueux, c'est celui de Triplochiton scleroxylon qui a été plus actif. Sur Rhizopus oryzae, les extraits aqueux des plantes, dans l'ensemble ont été plus inhibiteurs. Cependant les plus fortes inhibitions ont été constatées chez les extraits dichlorornéthaniques de M owariensis et N. papaverifera. Les résultats des tests antifongiques ont montré que R. stolonifer a été la plus sensible de toutes les souches fongiques. Sur cette souche fongique, les différents types d'extraits de plante ont eu de très hauts pourcentages d'inhibition. lei, ce sont les extraits aqueux qui ont fortement inhibé la croissance du champignon. Dans l'ensemble, des trois solvants d'extraction, l'eau a concentré le mieux les principes actifs des différentes espèces végétales. Les extraits aqueux ont été plus actifs sur Geotrichum sp., les deux espèces du genre Mucor, mais également les deux espèces de Rhizopus. Les extraits 141 aqueux les plus efficaces ont été les extraits de feuilles de Bridelia atroviridis et des écorces de tige de Cola gigantea et cela sur Rhizopus stolonifer. Concernant les souches de champignons, les plus sensibles à l'ensemble des extraits dans l'ordre croissant de sensibilité sont : Fusarium oxysporum, Colletotrichum higginsianum et Rhizopus sto/onifer. Quant aux différentes espèces végétales, celles qui ont présenté un fort potentiel antifongique sur l'ensemble des germes fongiques sont Microgramma owariensis, Nesogordonia papaverifera et Triplochiton sc/eroxylon. 142 CHAPITRE III : CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE DES EXTRAITS DES PLANTES SELECTIONNEES 1. Groupes de composés chimiques détectés Le tri phytoch irn ique réalisé à partir des différents organes de plante a donné les résultats consignés dans le Tableau XXXVI. Selon ces résultats, tous les extraits aqueux des organes de plante contiennent des polyphénols. Ainsi, dans le groupe des polyphénols, les tanins (galliques et catéchiques) et les flavonoïdes sont simultanément présents dans les feuilles de Bridelia atroviridis et Erythrina senegalensis et dans la plante entière de Microgramma owariensis. Ces mêmes composés, à l'exception des tanins galliques, sont présents dans la plante entière de Nephrolepis bisserata et dans les écorces de tige de B. atroviridis et Celtis mildbraedii. Les hétérosides anthraquinoniques ont été détectés dans les écorces de tige de B. atroviridis et Triplochiton scleroxylon et dans les feuilles de Trichilia heudelotii. Les flavonoïdes sont aussi présents dans la plante entière de Phymatodes scolopandria, et les tanins également présents dans les feuilles de T. heudelotii et dans les écorces de tiges de T. scleroxylon, Cola gigantea et Nesogordonia papaverifera. Le groupe de stérols et polyterpènes n'a uniquement été observé que chez N. papaverifera. Les polyphénols sont présents dans tous les extraits méthanoliques des organes de plante étudiés, de même que le groupe des stérols et polyterpènes. Ces derniers ne sont absents que dans l'écorce de tige de C. gigantea. Dans ces extraits méthanoliques, seules les feuilles de T. heudelotii contiennent des composés anthraquinoniques libres avec également la présence des tanins. Les flavonoïdes et les tanins sont présents dans les feuilles de B. atroviridis et dans la plante entière de M owariensis. Dans l'écorce de tige de E. senegalensis, la présence des flavonoïdes comme composés phénoliques a été notée. Par contre, dans les organes de feuilles de E. senegalensis et T. heudelotii, la plante entière de N. bisserata et les écorces de tige de Celtis mildbraedii, de C. gigantea, de N. papaverifera et de B. atroviridis, ce sont les tanins qui ont été mis en évidence. En ce qui concerne les extraits au dichlorométhane, les polyphénols sont présents chez la majorité des plantes à l'exception de trois extraits ; il s'agit des extraits de feuilles de B. atroviridis, de feuilles et d'écorce de tige de E. senegalensis et de l'extrait de plante entière de M owariensis. Les tanins et les flavonoïdes ont été mis en évidence dans. les extraits des écorces de tige de C. gigantea et N. papaverifera. Les tanins ont également été détectés dans les extraits de la plante entière de N. bisserata et de P. scolopandria, mais aussi dans les feuilles de T. 143 heudelotii et de l'écorce de tige de C. mildbraedii. Chez ces deux dernières espèces, la présence des anthraquinoniques libres est constatée. Quant aux stérols et polyterpènes, seuls les extraits dichlorométhaniques des écorces de tige de B. atroviridis et de E. senegalensis ont permis de les détecter. En somme, en considérant l'ensemble des 12 organes de plante et dans les trois solvants d'extraction, les espèces où il a plus été noté la présence des composés phytochimiques sont respectivement, par ordre d'importance T. heudelotii (Fe), N. papaverifera (Et), B. atroviridis (Et) et Celtis mildbraedii (Et), tandis que les plus pauvres sont Erythrina senegalensis (Et), Triplochiton scleroxylon (Et) et Phymatodes scolopandria (Pe). 144 Tableau XXXVI : composés phytochimiques mis en évidence dans les différents organes de plante et dans les trois solvants d'extraction (eau, méthanol et dichlorométhane) - Organes de plante Ba (Fe) Ba (Et) Es (Fe) Es (Et) Nb (Pe) Ps (Pe) Mo (Pe) Np (Et) Th (Fe) Cm (Et) Cg (Et) Ts (Et) + Stp 1 Pp + + + + + + + + + + + + An Ali Hal + + + EAU 1 Ac Sa Co Tc + + .+ + + + + + + + Tg + + + + FI + + + + + + + Stp + + + + + + + + + + + Pp + + + + + + + + + + + + An + Ali 1 Ha + MeOH I Ac Sa Co Tc + + + + + + + + + Tg + + FI + + + Stp + + Pp + + + + + + + + An Ali 1 + + Ha DCM I Ac Sa Co Tel + + + + + + Tg FI + + + : Présence du composé ; - : Absence du composé StP : Stérols et Polyterpènes; Pp: Polyphénols; An : Anthocyanes; Ali : Anthraquinones libres; Ha : I-létérosides antthraquinoniques ; Ac : Alcaloïdes ; Sa : Saponines; Co : Coumarines ; Tc : Tanins cathéchiques ; Tg : Tanins galliques ; FI : Flavonoïdes; MeOH : Méthanol ; DCM : Dichlorométhane. Ba : Bride/ia atroviridis ; Es : Erythrina senega/ensis; Nb : Nephrolepis bissera/a ; Ps : Phymatodes scolopandria ; Mo : Microgramma owariensis ; Np : Nesogordonia papaverifera ; Th : Trichi/ia heudelotii ; Cm : Celtis mildbraedii ; Cg: Cola gigantea ; Ts : Triplochiton sc/eroxylon ; Fe : Feuille ; Et : Ecorce de tige ; Pe : Plante entière. 145 2. Discussion Sur les 10 espèces de plante sélectionnées pour la réalisation des tests antifongiques et phytochimiques, sept sont des Angiospermes dont trois appartenant à la famille des Sterculiaceae (Nesogordonia papaverifera, Cola gigantea et Triplochiton scleroxylon) et trois sont des Pteridophytes (Nephrolepis bisserata, Phymatodes scolopendria et Microgramma owariensis) dont deux de la famille des Polypodiaceae. Le criblage phytochirnique réalisé à partir des extraits obtenus des organes de ces plantes a montré qu'ils contiennent des métabolites secondaires, particulièrement les terpènes et stéroïdes et les composés phénoliques. Le tri phytochimique de Bridelia atroviridis (feuilles et écorces de tige) a révélé la présence de stérols et polyterpènes, de polyphénols tels que les flavonoïdes, les hétérosides anthraquinoniques et les tanins. Les travaux de Agyare et al. (2006) ont également révelé dans les écorces de tige et les feu i lies de Bride lia atroviridis des tanins, des stérols et polyterpènes, des flavonoïdes et des saponosides. Outre les saponosides qui n'ont ·pas été mis en évidence dans la présente étude, les résultats des deux travaux sont comparables. Chez Erythrina senegalensis, selon plusieurs études, l'écorce des racines contient des flavonoïdes (Wandji et al., 1994 ; Saidu et al., 2000 ; Tgbokwe et al., 2006), des saponines et des tanins (Saidu et al., 2000 ; lgbokwe et al., 2006). Aussi de ses graines, ont été isolées des alcaloïdes (Wandji et al. 1995). Or dans la présente étude, il a été mis en évidence dans les extraits de feuilles et d'écorces de tige de E. senegalensis, des stérols et polyterpènes, des flavonoïdes et des tanins. Les saponines et les alcaloïdes n'ont pas été détectés ici. Les alcaloïdes mentionnés par Wandji et al. (1995) ont été mis dans les graines alors que dans le présent travail ce sont les feuilles et écorces de tige qui ont été utilisées. Quant aux saponosides, les organes aériens (feuilles et écorce de tige) utilisés ici et non l'écorce des racines, en contiendraient peu pour être mis en évidence par ces tests qui ne sont que qualitatifs. Le criblage phytochimique mené sur les extraits de la plante entière de Nephrolepis biserrata, ont montré la présence des stérols, des polyterpènes, des polyphénols, des flavonoïdes et des tanins catéchiques. Ces résultats sont comparables à ceux de Adou et al. 2014. En effet, les investigations phytochimiques menées par ces auteurs sur des extraits de cette espèce de, ont révélé la présence des stérols, des polyterpènes, des polyphénols, des flavonoïdes, des tanins catéchiques et des substances quinoniques. S'agissant de Trichilia heudelotii, les études phytochimiques réalisées par Adeniyi et al. (2008) sur les feuilles, les écorces de tige et les écorces de racine de cett espèce de plante, ont révélé la présencedes stéroïdes, des tanins, des anthraquinones et des alcaloïdes. Une autre étude, celle de Aladesanmi et al. (2007) menée uniquement sur les feuilles de T. heudelotii, a 146 révelé la présence de composés phénoliques et de diterpènes. Dans la présente étude, avec les extraits de feuilles T. heudelotii, ce sont les terpènes et stéroïdes, les tanins et les anthraquinones qui ont été décelés. L'absence des alcaloïdes peut se justifier par le fait que l'étude n'ait pas porté sur les autres organes (tige et racine) comme chez Adeniyi et al. (2008). En effet, Aladesanmi et al. (2007) qui ont également travaillé que sur les feuilles, n'ont pas décelés d'alcaloïdes. Pour l'espèce végétale Cola gigantea, le tri phytochimique des extraits des écorces de tige amis en évidence des composés phénoliques qui sont les tanins et les flavonoïdes. Outre les tanins, en comparant ces résultats à ceux de Sonibaré et al. (2009) les autres composés mis en évidence sont différents. Et cette différence peut s'expliquer par le fait les organes végétaux utilisés dans les deux travaux soient différents. En effte eux, ont utilisé les feuilles alors dans la présente étude, ce sont les écorces de tige qui ont été utilisées. Le tri phytochimique des extraits de Triplochiton scleroxylon a permis de mettre en évidence des tanins, des anthraquinones et des terpènes et stéroïdes. Pour d'autres auteurs T. scleroxylon contient, au plan chimique, des tanins, des flavonoïdes et des stéroïdes (Prohp et Onoagbe, 2012b). L'analyse phytochimique ulisés pour la mise en évidence des composés dans la présente étude n'est que qualitative. Des composés comme les flavonoïdes peuvent être présents, mais la quantité dans l'organe de plante peut être insuffisnte pour permettre leur mise en évidence par un test qui n'est pas quantitatif. S'agissant de Nesogordonia papaverifera, Olufunke (2012) a signalé que cette espèce végétale contiendrait des tanins et des stéroïdes. Les tanins et les stéroïdes, en comparant les résultats de ses travaux à ceux de l'étude présente ont été mis en évidence outre les flavonoïdes qui sont en plus présents. Pour les trois dernières espèces végétales restantes, à savoir Phymatodes scolopandria, Microgramma owariensis et Celtis mildbraedii, les travaux antérieurs se rapportant à leurs composition en phytocomposés sont encore pauvres. Cependant, dans la présente étude, il a été mis enévidence dans les trois espèces des terpènes et stéroïdes et des tanins. En plus de ces composés, il a été mis en évidence chez M owariensis des flavonoïdes et chez C. mildbraedii des anthraquinones. Les tests antifongiques réalisés sur les huit souches isolées sur les fruits de piment, de tomate et de papaye, à partir des extraits obtenus des organes de ces 10 plantes, ont montré que toutes les souches sans exception ont été sensibles à tous les extraits lorsque la concentration 147 des extraits est égale à 10 mg/mL. Les activités antifongiques manifestées sont dues en partie à la présence de ces composés phytochimiques mis en évidence. En effet, selon Bruneton (2009), les terpènes et stéroïdes et les composés phénoliques décelés sont deux classes de métabolites secondaires qui constituent des agents de lutte chimique contre les pathogènes tels que les bactéries et les champignons. Dans la classe des polyphénols, les tanins sont réputés pour leur capacité à inhiber la croissance de nombreux microorganismes dont les bactéries et les champignons (~epulveda et al., 2011). D'autres Polyphénols comme les flavonoïdes sont également doués de propriétés antifongiques et antibactériennes (Harborne et Williams, 2000). En plus de ces deux premiers groupes, il y a aussi le groupe des quinones et dérivés qui possèdent des propriétés laxatives et vermifuges, antimicrobiennes et antifongiques (Jackson, 2000; Hoffman, 2003). Selon Bajwa et al. (2007), parmi les dérivés quinoniques, les hétérosides anthraquinoniques sont particulièrement doués de propriétés antifongiques. Quant aux terpènes et stéroïdes mis en évidence, certains terpènes comme les huiles essentielles, protègent la plante des champignons parasites et des bactéries (Raven et al., 2000). De même, Soro et al.(2010) ont montré que l'huile essentielle des fruits de Xylopia aethiopica était fongicide contre le champignon Fusarium oxysporum. Ces propriétés antifongiques des ces composés terpéniques ont été confirmées par de nombreux travaux sur les souches de levures, de dermatophytes et sur Aspergillus (Pinto et al., 2003 ; Salgueiro et al., 2003), et présentent un potentiel thérapeutique principalement dans les maladies fongiques. 148 Con cl us ion partielle Au total, 10 espèces végétales ont été sélectionnées pour la réalisation des tests phytochirniques. Elles appartiennent aux familles des Euphorbiaceae, des Fabaceae, des Davalliaceae, des Polypodiaceae, des Sterculiaceae, des Meliaceae et des Cannabaceae. Parmi elles, trois appartiennent à la famille des Sterculiaceae et deux à celles d~s Polypodiaceae. Trois des espèces sont des Ptéridophytes (Nephrolepis bissera/a, Phymatodes scolopendria et Microgramma owariensis). Les différents organes utilisés pour l'étude phytochimique sont, essentiellement, les feuilles, les écorces. Avec les ptéridophytes, la plante entière a plutôt été utilisée. Les tests phytochimiques des extraits végétaux étudiés ont mis en évidence différents groupes de composés chimiques. Dans les extraits méthanoliques et aqueux, les polyphénols ont été présents chez toutes les espèces végétales. Ils sont absents dans les extraits dichlorométhaniques des feuilles de Bridelia atroviridis et Erythrina senegalensis, de celui de l'écorce de tige de E. senegalensis et la plante entière chez Microgramma owariensis. Les stérols et polyterpènes ont majoritairement été détectés dans tous les organes de plante, dans les extraits méthanoliques sauf dans celui de l'écorce de la tige de Cola gigantea, Ces résultats indiquent également l'absence des alcaloïdes, des saponosides, des anthocyanes et des coumarines dans les extraits de toutes les plantes étudiées. La présence de ces composés chimiques a permis pour certaines plantes de soutenir leur propriétés antifongiques qui ont déjà été rapporté et pour d'autres d'expliquer scientifiquement les activités antifongiques observées pour la première fois dans ce travail. 149 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES 150 CONCLUSION GENERALE Le premier objectif spécifique était de répertorier des plantes médicinales sur la base de la littérature. Ainsi, JO espèces de plantes ont été identifiées et sélectionnées selon qu'elles nont fait l'objet d'aucune étude sur les souches fongiques isolées dans cette étude, mais aussi en fonction de leur potentiel antifongique dans des études antérieures et leur disponibilité au moment de l'étude. Ces espèces sélectionnées sont regroupées au sein de sept familles qui sont les Euphorbiaceae, les Fabaceae, les Davalliaceae, les Polypodiaceae, les Sterculiaceae, les Meliaceae et les Cannabaceae. Le second objectif spécifique était d'identifier des souches de moisissure isolées sur des fruits mûrs de papayer (Carica papaya), de tomate (Lycopsersicum esculentumï et de piment (Capsicum sp). Cette étude a permis alors de faire une identification moléculaire des souches et le profil de certaines moisissures d'altération qui causeraient les pourritures associées aux maladies des fruits. Les travaux ont révélé le profil de huit champignons d'altération qui seraient responsables des pourritures et des maladies de ces fruits tropicaux dans les champs. Ces souches fongiques seraient à la base des pertes post-récoltes. Certaines souches fongiques comme Mucor ve/utinosus sont pathogènes aux fruits et même à l'homme. Des mesures de lutte depuis les champs, afin de garantir des produits sains à la consommation et au commerce, sont alors nécessaires. La prévalence élevée de certains champignons exige que des mesures de contrôle appropriées contre l'infection dans les champs, soient utilisées si les producteurs souhaitent une bonne récolte. La détérioration des fruits peut toutefois être contrôlée depuis les champs, par l'utilisation de molécules des extraits naturels des plantes antifongiques et par la manipulation correcte des fruits pendant la récolte, afin d'empêcher les blessures et minimiser les pertes. L'objectif troisième a été d'évaluer les activités antifongiques des extraits bruts des plantes sélectionnées, sur les souches isolées et identifiées. Les tests biologiques in vitro ont permis de montrer que les extraits de plante préparés possèdent des activités antifongiques sur les différentes souches isolées. Ces tests ont montré le pouvoir inhibiteur des extraits de plante utilisés à des proportions variables selon le solvant d'extraction et la concentration d'extrait. Chaque souche a été sensible à chaque extrait de plante à dose de 10 mg/mL. Sur la souche Colletotrichum higginsianum, des trois types d'extraits, les extraits au dichlorométhane ont montré plus d'activité. La plus petite dose qui" a inhibé totalement la croissance de la souche a été de 10 mg/mL pour tous les extraits de plante sauf pour Erythrina senegalensis et Celtis mildbraedii où les concentrations de 10 mg/mL sont dépassées. 151 Sur Fusarium oxysporum, les extraits dichlorométhaniques et méthanoliques ont été plus actifs. Les CMI ont été de 8 mg/mL pour ces catégories d'extraits pour toutes les plantes et pour les extraits aqueux, les CMI ont été de 10 mg/mL. En dehors des deux souches ci-dessus, sur Mucor velutinosus, Mucor circinelloides f circinelloides, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer, Geotrichum sp. et Meyerozyma guilliermondii, les extraits aqueux ont été les plus actifs. Concernant la souche Geotrichum sp., les CMI induites ont été de I Q ..mg/mL pour toutes les plantes dans les trois types de solvants, mais pour les extraits aqueux les Clso observées ont été les plus faibles. S'agissant de Meyerozyma guilliermondii, pour toutes les espèces végétales les CMI des extraits aqueux sur cette souche fongique ont été de 10 mg/mL, à l'exception de Bridelia atroviridis, Phymatodes scolopandria et de Nesogordonia papaverifera avec des CMI supérieures à cette valeur. Sur la souche Mucor circinelloides f circinelloides, les CMI observées ont été 10 mg/mL pour tous les extraits végétaux aqueux, sauf pour l'extrait de Phymatodes scolopandria qui a été l'espèce la moins active. Quant à Mucor velutinosus, souche très résistante aux basses concentrations, dans l'eau, les CMI des espèces végétales ont été de 8 mg/mL. Sur la souche Rhizopus oryzae, à l'exception de Bridelia atroviridis. le reste des extraits a induit une inhibition de la croissance radiale dont les CM! sont de 8 mg/mL. Pour ce qui concerne la souche Rhizopus stolonifer, les extraits aqueux ont induit les Clso les plus basses en comparaison aux autres souches. Ces Clso ont été au-dessous de 2 mg/ml., et pour toutes les espèces végétales les CMI ont été de 10 mg/mL. Sur six des huit souches isolées sur les fruits de papaye, de tomate et de piment, les extraits aqueux ont manifesté les meilleures activités. Ce solvant serait alors le plus approprié quant à la formulation de biofongicides contre ces six souches. Pour les deux souches restantes, à savoir Colletotrichum higginsianum es Fusarium oxysporum, les solvants dichlorométhanique et méthanolique seraient plus appropriés. Toutes les plantes sélectionnées peuvent sans exception être utilisées, avec un accent particulier sur Microgramma owariensis, Nesogordonia papaverifera et Triplochiton scleroxylon, pour une formulation de biofongicides et cela contre toutes les souches étudiées dans ce travail, afin de lutter contre les pertes post-récoltes des fruits de la papaye, de la tomate et du piment. Dans l'ensemble, des trois solvants d'extraction, l'eau a concentré le mieux les principes actifs des différents extraits de p !antes. 152 Enfin, le dernier objectif spécifique a été d'étudier la composition phytochimique des extraits végétaux obtenus à partir des plantes utilisées pour les tests antifongiques, afin de caractériser les grands groupes de molécules naturelles responsables des propriétés biologiques. L'étude phytochimique des extraits végétaux étudiés a révélé la présence des principaux ... -· groupes de composés chimiques, tels que les terpènes et stéroïdes et les composés phénoliques (flavonoïdes, tanins et quinones). La présence de ces composés chimiques et de leurs propriétés biologiques ont permis dejustifier les activités antifongiques mises en évidence dans cette étude. 153 PERSPECTIVES Il conviendrait de noter que les activités antifongiques de toutes ces espèces végétales sur l'ensemble de ces germes étudiés, sont signalées ici pour la première fois. Les CMI obtenues au cours de notre étude suggèrent de procéder à une purification ou, à défaut, à un fractionnement pour un meilleur rendement de ces extraits. Des études in vivo seront réalisées avec les extraits bruts sur des fruits mûrs de piment, de tomate et de papaye afin de confirmer les activités manifestées par ces extraits de plantes. Une analyse plus poussée par chromatographie sur couche mince et sur colonne, permettra d'isoler les différentes molécules contenues dans les différents extraits, afin de préciser la nature des molécules à activité antifongique. Par la suite, la purification de ces molécules sera faite afin détermination la structure exacte des composés actifs antifongiques suivie d'une étude de toxicité, qui permettront sans ····· doute de mettre en place une formulation naturelle efficace et adéquate contre les maladies post- récoltes des fruits et légumes. Et, faire l'étude de la pathogénicité des différentes souches fongiques sur les fruits étudiés. Enfin le mode d'action de la molécule sur les souches fongiques sera étudié. 154 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 155 Abbiw K. D. (1990). Useful Plants of Ghana, West Africa: Uses of Wild and Cultivated plants. lntermediate Technology Publication, United Kingdom p. 98-212. Abumweis S. S., Barake R. & Jones P.J. (2008). 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Diallo3 and Kablan Tano1* "Laboratory of Biochemistry and Food Technology, Department of Food Science and Technology, Nangui Abrogoua University Abidjan, 02 B.P. 801, Côte d'Ivoire. 2Biotechnology and Food Microbiology Laboratory, Department of Food Science and Technology, Nangui Abrogoua University, Abidjan, 02 B.P. 801, Côte d'Ivoire. 3Biology Laboratory and lmproving Plant Production (LBAPV), Department of Natural Sciences, Nangui Abrogoua University, Abidjan, 02 B.P. 801, Côte d'Ivoire. "Department of Natural Sciences, Nangui Abrogoua University, Abidjan, 02 B.P. 801, Côte d'Ivoire. Received 14 June, 2014; Accepted 15 August, 2014 The spoilage of pawpaw (Carica papaya L.), pepper (Capsicum sp.) and tomato (Lycopersicon esculentum) from three selected farms in Agboville area, south of Côte d'Ivoire were investigated. 50 samples of each type of fruit (pawpaw, pepper and tomato) showing spoilage signs were examined for the presence of fungal pathogens inducing spoilage. Eight fungal species, Mucor velutinosus, Meyerozyma guilliennondii, Colletotrichum higginsianum, Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides f. clrcinelloides, Fusarium oxysporum, Rhizopus stolon/fer and Geotrichum sp. identified by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE), were found associated with the deterloration of the fruit. Ali fungl found in the fruit were common to pawpaw (C. papaya) and tomato (L esculentum) except M. guilliennondii which was only found in pawpaw (C. papaya). F. oxysporum, R. stolon/fer and R. oryzae were associated with the spoilage of pepper (CBpsicum sp.). F. oxysporum had the highest rate of occurrence among the isolated fungi (30%) followed by R. oryzae with 15% occurrence. M. velutinosus, Geotrichum sp., M. circinelloides f. circinelloides, R. stolon/fer and C. higginsianum had all 10% occurrence. M. guilliennondii had the lowest rate at 5%. The result reveals that the presence of fungl before harvesting may be damageable to the fruit, so the use of natural control agents to ensure an effectiveness of the production, the marketing, product quality food safety appears to be very important. Key words: Tomato (L. esculentum), pawpaw (Carica papaya), pepper (Capsicum sp.), polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). INTRODUCTION Fruit represent an important part of food produce in in human diet through the supply of vitamins and African tropical countries and they play a significant role minerais to the organism. Tropical fruit in Côte d'Ivoire 3172 Afr. J. Microbiol. Res. include crops such as pawpaw, tomato and pepper, However, little has been done to prevent fungi spoilage of which are consumed fresh, cooked or processed to the fruit in farms of Côte d'Ivoire. These recent years, the products such as juice and jam. frequency of the fungal attack on the fruit has requires a ln 2010, wortd production of fruit and vegetables special attention of current researches in order to isolate amounted to 1,639 million tons, 67, 13, 10, 9 and 1% and identify fungi associated to these various respectively for Asia, America, Europe, Africa and deteriorations on farm fruit. The purpose of the present Oceania. Wortd trade in fresh fruit and vegetables study was to identify the fungal strains profiles associated displayed, meanwhile, 97 million tons (FAOSTAT, 2010). to the rotting of pawpaw, tomato and hot pepper in Among the various fruit grown in Côte d'Ivoire, pawpaw different farms of Côte d'Ivoire. (C. papaya, var. Solo8) is one of the most important tropical fruit exported every year toward the European Union. The pawpaw fruit contain minerais such as Na, K, MATERIALS AND METHODS Ca, Mg, P, Fe, Cu, Zn and Mn. lt is also a source of Sampling carotenoids, vitamins C, thiamin, riboflavin, vitamin 86 and vitamin K (Adetuyi et al., 2008). The hot pepper Three types of fruit (hot pepper, pawpaw, tomate) found with (Capsicum annuum) is also considered to be the most symptoms of fungal infection were sampled in three different farms known and nutritive legume. lt is rich in nutrients and is in the area of Azaguié and Tomassé in the morning (8.00 AM to used for its flavor, as a spice, and as colorant to food due 12.00PM). The fruit were harvested at random in 2011 in the region of Agneby-Tiassa. lt is located between 5° 38'00 "North and 4° 5'00" to its color properties (Mueller et al., 201 O; Kouassi and west on the road to Agboville about 35 kilorneters from Abidjan Koffi-Nevry, 2012). The hot peppers are abundant and (Côte d'Ivoire). The sequences obtained were deposited in savory during the months of August and September and GenBank. For this study, 50 samples of pawpaw were sampled in a are consumed during all year around. The tomato farm at Tomassé, 50 samples of tomatoes and 50 samples of hot (Lycopersicon esculentum) is a climacteric fruit, with very pepper were sampled in two different farms at Azaguié. The farm high nutritional qualities due to its composition which fruit presenting symptoms were harvested on the plants, placed in includes dry matter, soluble solids, amino acids, sterilized stomacher bag and stored in a cooler at 8°C. pigments, simple sugar, organic acids, citric acid and others volatile compounds and more than 400 aromatic Isolation of fungi compounds contributing to its taste, flavor, and savor (Thybo et al., 2006). However, the quality of tropical fruit After reœiving the samples, physical observation of the diseases were described. Each of the fruit was washed with (1/10) sodium is commonly affected by postharvest diseases such as hypochlorite solution. A little infected portion of each fruit was eut fruit rot, which are mostly caused by improper handling and inoculated. The various portions eut describing rots were and storage during transportation and marketing. The fruit placed directly onto sterile Sabouraud chloramphenicol medium are affected by a large range of micro-organisms such as plates (Figure 1 ). Ali plates were incubated at 25 •c for 72 h. Each pathogenic fungi, which cause their degradation as fungal strain is inoculated on three different Sabouraud indicated by the changing in the taste, the odor, the chloramphenicol medium plates for isolation and purification. The isolated strains were macroscopically characterized by a visual appearance or the texture, resulting in less appealing and observation, based on the description of the morphology and color toxic fruit. These microorganisms can contaminate the of the colonies. seed prior to sowing, during plant growth in the farms, harvesting, post-harvest handling, or while these fruit are stored and during distribution (Barth et al., 2009). About Molecular identification of fungi 20 to 25% of the harvested fruit are rotten by these The strains isolated were identified by a Denaturing Gradient Gel agents during the post-harvest handling even in the Electrophoresis -PCR (DGGE-PCR) method characterized by the developed countries, negatively influencing the economic extraction of the total fungal DNA, the amplification of the DNA by value of the fruit (Droby, 2006). The amount of global the PCR), and the DGGE separation (Li et al., 2008; El Sheikha et food losses and waste annually represents about 40-50% al., 2011 ). For the PCR amplification, the 01/02 reg ion of the 28S rONA from the fungi was amplified by two GC-rich primer set U1f of roots, fruit and vegetables (FAO, 2014). Fungal (5'- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGCGGG GCG GGG GTG activities can also lead to contamination with mycotoxins, AAA TTG TTG AAAGGG AA - 3') and U2r (5" - GAC TCC TTG GTC and could represent a health risk to the consumers. Such CGT GTT - 3'). For the DGGE method, a GC-ciamp of 30 risks could be reviewed in studies on papaya fungal and nucleotides was added to the U1f primer at the 5'-end in order to viral postharvest diseases accomplished in Côte ensure that the resulting DNA fragments will partially remain d'lvoire(Diallo et al., 2007; Koffi-Nevry et al., 2011 ). (Sheffield et al., 1989). Then the denaturing gradient gel •corresponding author. E-mail: [email protected]. Author(s) agree that this article remain permanently open acoess under the terms of the Creative Commons Attribution Liœnse 4.0lntemational License Kossonou et al. 3173 PAWPAW FRUIT Soft rot, blackish 'l\ilh a Soit rot l\ilb blackheads 6ttlc 11hitc paw and green by location HOT PEPPER FRUIT TOMATO FRUIT an ope oing So& rot gray Figure 1. Description of fungi disease symptoms on fruits. Table 1. Macroscopic description of the strains N° strains Macroscopic description of the strains Whitish myœlium with invasive character as duvet. Colony with cottony globular aspect that becomes brown-black when it is matured. There are also creeping 2 branches, markedly elevated and away from the substrate. Colony cottony, white-yellow color with invasiveness. Colonies are fast growing, fiat, dusty the waxy, white cream 3 on the surface. 4 A strain having an aspect in form cottony white, creamy white then tuming purple with a purple background color. The strain gave invasive gray colonies, presenting also a globular aspect al the beginning and becomes dark al 5 maturity. 6 A cottony colony myœlium sparse becoming gray with maturity with a yellow-whitish œnter. 7 A cottony strain, whitish al the beginning and becoming brownish gray to blackish gray after the third day. 8 A colony of cottony aspect and an orange color with a background colorless after 3 days of growth. electrophoresis (DGGE) was done after ensuring that the PCR RESULTS AND DISCUSSION product from acrylamide gel (8%) (37, 5/1, v/v/v, Promega, France) contains a chemical denaturing gradient (40 to 70 % urea) and Descriptions of the fungal symptoms on fruits formamide. The DGGE was performed according to the method used by Kouakou et al. (2012). For the sequencing of the DNA fragment from DGGE bands, the bands were eut from the DGGE Symptoms of microbial contamination occurred in the gel with a sterilized scalpel and eluted in 100 ml of TE buffer at 4°C form of necrosis of soft rots apparently reddish, blackish, for 24 h. The DNA is then re-arnpüfled in the same condition using a whitish, greenish or grayish color with or without primer without GC-ciamp before the products were sent for openings and also the presence of round spots as shown sequencing at GATC Biotech (Germany). The 28S rDNA sequenœs in Figure 1 and Table 1. These symptoms are obtained were compared with those available in GenBank characteristics of fungal diseases similar to those database, at the National Center for Biotechnology Information (NCBI) website using the program BLAST in order to determine the described by Cannon et al. (2012) on exported tropical nearest known sequenœs (Table 2). fruit. 3174 Afr. J. Microbiol. Res. Table 2. Summary of strains identified for each fruit. Strains ldentity (%) Genbank accession number Fruits Paweaw Tomato Peeeer Mucor ve/utinosus 98 JN874486 + + Meyerozyma gui/liermondii 98 JX423568 + Colletotrichum higginsianum 86 CACQ02008496 + + Geotrichum sp 97 AB741076 + + Mucor circine/loides f. circinelloides 97 JN939203 + + Fusarium oxysporum 95 JX081386 + + + Rhizopus stolonffer 100 JN938904 + + + Rhizoe_us oryzae 99 JN938902 + + + +, Strain present; -, strain absent. 1 2 3 4 5 6 7 8 Figure 2. Macroscopic description of the strains Isolation and macroscopic identification of fungal PCR amplification of the fungal conserved 28S rDNA stralns region using GC U1F ,_ CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GTG AAA TIG TIG AAA GGG From the infected fruit, 24 strains of fungi were isolated. AA - 3'), U2r (5'- GAC TCC TIG GTC CGT GTI - 3') The analysis of the morphology, after isolation and primers with control DNA from pure strains as are purification, permitted obtaining eight (08) morphological presented (Figure 3). groups strains different from each other by their PCR products provided unique, unambiguous and appearance, density, color, size, and the mycelium as intense bands between 298 and 220 bp, which described in Figure 2. corresponded to the expected size of 260 bp for fungi. The negative contrai was performed with the reaction mixture without the addition of DNA extract. The absence Molecular identification of the fungal strains of a band for the negative control showed that there was no contamination of the PCR reaction mixture. The bands Strains were identified using the molecular method of of the DGGE profile obtained were finally sequenced for PCR-DGGE. The quality of the DNA was confirmed by strains identification. Identification of strains revealed (08) Kossonou et al. 3175 M A B C D E F G H I T +-+ +-+ +-+ +-+ +-+ +-+ +-+ +-+ +-+ pb 1,500 - 400 300 200 100 Figure 3. Figure 3. Gel of PCR of fungi DNA verification. T, negative control; M, Marker; bp, base pair; ABCDEFGHI, different fungi E FG H A: Mucor velutinosus B: Meyerozyma guilliermondii C: Rhizopus oryzae D: Geotrichum sp. E: Mucor circinelloides f. circineiloides F: Fusarium oxysporum G: Rhizopus stolonifer H: Mucor circinelloides f. circine/Loides I : Colletotrichum higginsianum Figure 4. DGGE Gel and identified fungi strains. distinct species such as: M. velutinosus, M. guilliermondii, pawpaw in the Nigeria farms. M. guil/iermondii was only C. higginsianum, R. oryzae, M. circinelloides f. isolated from pawpaw sample from Tomassé farms circinelloides, F. oxysporum, R. stolonifer, and indicating that the strains vary according to the farm. Geotrichum sp. (Figure 4). Fungi isolated from tomato (L. esculentus) included F. These results show that these fruit and vegetables oxysporium, M. vetutinosus, C. higginsianum, R. oryzae, (pawpaw, tomato and chili) collected in different farms are M. circinelloides f. circinelloides, R. stolonifer and true hosts of these fungal agents. So they are Geotrichum sp. Almost all of the species found on responsible for diseases affecting pawpaw fruit on the papaya were also present on tomatoes except for M. farms. This result is in conformity with those of Chukwuka guilliermondii (Table 2). et al. (2010) who recently reported that Fusarium sp., These results show that pawpaw and tomato might be Mucor sp. and other germs were responsible for the rot of infected by the same germs, causing diseases in the 3176 Afr. J. Microbiol. Res. Table 3. Frequency of occurrence of strains on fruits Strain Number Freguenct of occurrence(%} Mucorvelutinosus 2 10 Meyerozymaguilliermondii 1 5 Colletotrichumhigginsianum 2 10 Geotrichumsp 2 10 Mucorcircinelloides f. circinelloides 2 10 Fusariumoxysporum 6 30 Rhizopusstolonifer 2 10 Rhizopusoryzae 3 15 Total 20 100 farm. The presence of these germs on these studied fruit (2011) suggesting that they represent a threat to the and vegetables would be favored by the climatic health of farmers and consumers. F. oxysporum, R. conditions of the country because these organisms have stolonifer and R. oryzae were common pathogens strains the ability to grow at 37°C as highlighted by Sugui et al. of the three types of fruit in this study. But for the (2011 ). Among the isolated germs, F. oxysporum, R. frequency of occurrence of the isolated fungi associated stolonifer and Mucor sp. were pathogenic to tomato as to the fruit deterioration, F. oxysporum was the most confirmed by studies of Chuku et al. (2008) and frequently isolated (30%) on the three types of fruit. lt Akinmusire (2011), who have taxed these germs to be was followed by R. oryzae with an infection rate of 15% responsible for soft rotting of tomate. F. oxysporum was while M. guil/iermondii was the less observed (5%) (Table also held responsible for rotting pawpaw, tomato, 3). banana, and guava (Latiffah et al., 2012). Furthermore works of Kleemann et al. (2008) associated C. higginsianum with anthracnose disease affecting these Conclusion fruit. Other studies on fungi have shown that F. oxysporum, R. stolonifer, Mucor sp., and Geotrichum sp. Eight (8) spoilage fungi such as M. velutinosus, M. were associated with soft rot and sour of tomate and guilliermondii, C. higginsianum, R. oryzae, M. pawpaw (Chuku et al., 2008; Nnebue et al., 2013). R. circinelloides f. circinelloides, F. oxysporum, R. stolonifer, oryzae would be responsible for the disease causing and Geotrichum sp. were found responsible for the rotting rotting of these fruit as in the case of sunflower due to and the diseases of local pawpaw, tomate, and chili fruit favorable climatic condition such as the temperature in the farms of south of Côte d'Ivoire with F. oxysporum (Yildz and Baysal, 2006). being the major contaminant. This result implies tough Conceming the pepper, it revealed the presence of F. realities for the farmers in guaranteeing safe products for oxysporum, R. stolonifer and R. oryzae pathogens of this consumption and for trading. The high rate of some fungi fruit. However, Hammami et al. (2014) found species of contamination requires the adoption of appropriate Aspergillus tamarii, and Aspergillus Flavus in Egyptian contrai measures against farms infection. Therefore, the chili powder. deterioration of fruit can be controlled in the farms by The germs isolated from the disease-affected zones of using natural antifungal extracts from plants and by the the fruit (pawpaw, pepper and tomate) are pathogenesis correct handling during the harvesting in order to avoid of these fruit at different levels as reported by Akintobi et cuts and reduce lasses. al. (2011). According to the works of these authors, R. stolonifer has a high degree of pathogenicity compared to Fusarium sp. Moreover M. guil/iermondii was isolated Confllct of lnterests only on the pawpaw in that study. Although it was isolated on pawpaw rots, it is not necessary a pathogen of the The authors have not declared any conflict of interests. fruit. Recent studies showed that M. guilliermondii inhibits the growth of fungi during the storage of maize in Cameroon, according to Su-lin et al. (2012). However, M. 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En raison des règlemen l'utilisation des pesticides chimiques, il est donc opportun de rechercher d'autres alternativ ces microorganismes d'entreposage. Les plantes médicinales offrent cette alternative de premier pesticides chimiques. Cette étude a consisté à isoler et identifier des champignons pathogène mûrs de piment, de papaye et de tomate, afin d'y effectuer des tests antifongiques à partir de quelques plant, médicinales de la flore ivoirienne. Sur les fruits mûrs de piment, de tomate et de papaye ont été isolé, identifiées des souches fongiques. A partir d'extraits de plantes, des tests antifongiques ont été ensuite réalisé par la méthode de dilution sur milieu de culture en boîtes de Pétri. Avec les extraits actifs de plantes sélectionnées, un criblage phytochimique a été réalisé pour la détection des grands groupes de composés chimiques responsables de leurs activités. Au total huit souches fongiques ont .é.-·t· é Isolées et identifiées. 36 extraits de plantes ont été préparés. Les tests antifongiques ont révélé que toutes les souches fongiques ont été sensibles ou hautement sensibles à tous les extraits à la concentration de 10 mg/111 L. Les test phytbchimiques ont permis de mettre en évidence dans les extraits de plantes la présence de terpènes et stéroïdes et de composés phénoliques. Les espèces végétales comme Microgramma owariensis, Nesogordonia papaverifera et Trip/ochiton scleroxy/on ayant manifestées les plus importantes activités sur les souches fongiques peuvent être utilisées dans la formulation d'un biofongicide contre les pertes post- récoltes des fruits du piment, de la tomate et de la papaye. Mots clés : Fruits, papaye, tomate, piment, souches fongiques, organes de plantes, tests antifongiques. Abstract Microorganisms are a serious threat to the production, marketing and consumption offresh fruit. Fungi, more specifically, give rise to severe diseases in fruit and are responsible for signitica111 post-harvest losses. Due to the strict regulations regarding the use of chemical pesticides residues, it is therefore appropriate to look for others alternatives for controlling these storage microorganisms. This study investigates the efficiencv of medicinal plants as viable anti-fungal alternatives to pesticides. Medicinal plants of the lvorian tlora were tested against fungi that were isolated and identified on ripe chili, tomato and papaya fruit. Antifungal assa were perforrned by the dilution rnethod. A phytochemical screening was performed for the detection of chemical compounds responsible for the antifungal activity. As many as eight strains were isolated and identified. Thirty-six (36) plant extracts. Ali fungal strains were sensitive or highly sensitive to ail extract solutions at a concentration of LO mg/ mL. Phytochemical tests suggest that the anti-fungal activity can be artributed to terpenes, steroids, saponins, alkaloids, and phenolic cornpounds found in ail ex'tracts. Pl species such as Microgramma owariensis, Nesogordonia papaverifera and Triplochyton scleroxylon dernonstrated the most important activities on the fungal strains can be used in the fonnula1i fungicide against post-harvest tosses occurring in chilli. tornato and papaya fruit., Keywords: fruit, papaya, tornato, pepper, fungal strains, plant organs, antifungal