PROBUR
Viabilidade técnico/económica da produção do Burrié, Littorina littorea (Linneaus, 1758)
NOVEMBRO 2015 Relatório Final CON-AQUA, Lda. PROBUR
Índice
Introdução ...... 3
Tarefa nº1: Avaliação do estado atual de conhecimento da biologia e produção de burrié...... 3
Tarefa nº 2: Captura por meios próprios ou aquisição de exemplares de burrié...... 4
Tarefa 3: Montagem e manutenção de sistemas com condições apropriadas para reprodutores, larvas e juvenis...... 4
Tarefa 4: Montar sistemas de engorda experimentais em aquário, piscicultura e moluscicultura...... 28
Tarefa n.º 5: Patologia, Contaminação e Sanidade ...... 34
Tarefa n.º 6: Estudos de Mercado ...... 36
Tarefa n.º 7: Avaliação dos Custos de Produção ...... 36
Tarefa n.º 8: Realização de relatório final e conclusões obtidas ...... 36
Anexo 1- Bibliografia ...... 38
Anexo 2– Descrição dos sistemas de manutenção ...... 41
Anexo 3 – Diferenciação dos sexos ...... 53
Anexo 4 – Técnica histológica e aspetos de diferentes fases de desenvolvimento das gónadas...... 54
Anexo 5 – Imagens de parasitismo na Littorina ...... 57
Anexo 6– Monodonta, Osilinus ou Phorcus – uma questão de taxonomia/nomenclatura...... 58
Anexo 7- Ciclo reprodutivo da espécie Phorcus lineatus ...... 67
2 CON-AQUA, Lda. PROBUR Introdução
Este relatório final tem como objetivo fazer uma súmula e respetiva análise dos resultados e conclusões obtidos durante a execução deste projeto. Para facilitar a interpretação e avaliação dos resultados mantemos o mesmo esquema das tarefas inicialmente previstas para a realização do PROBUR.
As tarefas desenvolvidas durante este projeto foram as seguintes: 1. Avaliação do estado atual de conhecimento da biologia e produção de burrié (L. littorea). 2. Captura por meios próprios ou aquisição de exemplares de burrié (L. littorea). 3. Montagem e manutenção de sistemas com condições apropriadas para reprodutores, larvas e juvenis. 4. Montar sistemas de engorda experimentais em aquário piscicultura e moluscicultura. 5. Patologia, contaminação e sanidade. 6. Estudos de mercado. 7. Avaliação dos custos de produção. 8. Realização de relatório final com os resultados e conclusões
Tarefa nº1: Avaliação do estado atual de conhecimento da biologia e produção de burrié.
Intervenientes: CON-AQUA, ICBAS e ELA Inicialmente, foi feita uma avaliação do estado atual de conhecimento da biologia e produção do burrié (L. littorea). Para tal, foi efetuada uma pesquisa bibliográfica detalhada de tendo-se obtido muita informação a espécie, nomeadamente no que se refere à sua biologia: ciclo de vida, fase larvar e juvenis, crescimento, reprodução e transformação. Em conjunto com outros grupos intervenientes do projeto PROBUR, foram efetuadas várias buscas bibliográficas tendo sido aumentado o número de referências apresentadas no projeto submetido de 9 para as atuais 61 referências. Todas a bibliografia recolhida está no formato PDF e acessível a todos os membros dos vários grupos intervenientes no projeto através de uma DROPBOX criada na Net. De referir que também têm sido realizadas várias buscas bibliográficas tendo em vista o estudo paralelo de outra espécie muito vulgar na nossa costa e frequentemente confundida com a espécie em estudo (Littorina) que é a espécie Phorcus lineatus (= Monodonta lineatus). No início deste trabalho fomos confrontados com a controvérsia sobre o nome da espécie em causa o que obrigou a um trabalho
3 CON-AQUA, Lda. PROBUR bibliográfico sobre esta questão taxonómica. O resultado desta pesquisa está no Anexo 6. No Anexo 7, podem ser consultados os resultados sobre o desenvolvimento reprodutivo desta espécie.
No ANEXO 1 apresenta-se uma listagem de bibliografia recolhida e analisada.
Tarefa nº 2: Captura por meios próprios ou aquisição de exemplares de burrié.
Intervenientes: CON-AQUA O objetivo principal desta tarefa foi a aquisição de exemplares para a realização das tarefas posteriores. Deste modo, a obtenção da Littorina littorea (burrié), ocorreu mensalmente através da compra direta sobretudo no mercado municipal da Costa Nova, onde os burriés são provenientes da ria de Aveiro e custaram cerca de 12,5€/kg. Nos meses em que o burrié era inexistente neste mercado, recorreu-se à sua compra em grandes superfícies comerciais (Auchan), com o custo de 7,99€/kg, mas de origem escocesa. Durante o tempo decorrido, verificou-se uma maior dificuldade na obtenção da L. littorea nos meses de maio, junho e julho. Relativamente à captura por meios próprios, não se incidiu na L. littorea mas sim na Phorcus spp., com o intuito de estudar a sua fisiologia, estado das gónadas, entre outros, a fim de perceber se esta poderia tornar-se numa alternativa viável à L. littorea. Estes estudos ficaram a cargo do ICBAS.
Tarefa 3: Montagem e manutenção de sistemas com condições apropriadas para reprodutores, larvas e juvenis.
Intervenientes: CON-AQUA, ICBAS, ELA e AQUATECNOR 3.1 Montagem dos sistemas
Nesta tarefa, a pedra angular deste projeto, proporcionou-se a criação de condições apropriadas para o desenvolvimento das diferentes fases do ciclo de vida do burrié e ainda o controlo das mesmas para a reprodução, desova, fase larvar, juvenil e engorda, por parte dos intervenientes. Os diferentes sistemas testados pelos vários intervenientes estão descritos no Anexo 2.
3.2 Identificação dos sexos
Os sexos foram identificados muito facilmente na medida em que os machos possuem um pénis bem desenvolvido e proporcionalmente bastante grande. A fertilização é interna pela 4 CON-AQUA, Lda. PROBUR introdução do pénis na abertura do oviducto paleal na cavidade do manto da fêmea durante a época de acasalamento que se prolonga durante cerca de 2 a 3 meses. Durante a cópula os espermtozóides são depositados na chamada bursa copulatrix – um saco alongado situado geralmente na terminação anterior do oviducto. Fotografias de vários exemplares previamente anestesiados no sentido de relaxar o pénis e assim ser mais facilmente visível estão no Anexo 3
3.3 Avaliação do estado de maturação das gónadas
O trabalho efetuado consistiu essencialmente na otimização da técnica histológica aplicável a gastrópodes de forma a serem visualizadas as gónadas (testículos e ovários) ao longo das várias etapas de desenvolvimento na época reprodutiva. O natural aumento das reservas lipídicas nos ovócitos maduros, o que apenas foi verificado na época de desova, implicou uma modificação na técnica previamente elaborada para fases anteriores de desenvolvimento. A técnica final pode ser consultada no ANEXO 4. Foram realizadas amostragens semanais de cerca de 10 animais por amostragem de animais provenientes do meio natural (Aveiro e Aguda) ou estabulados nos aquários do ICBAS ou da ELA. Ao longo da duração do projecto foram processados mais de 700 espécimes (incluindo neste numero algumas amostragem relativas à espécie Phorcus) e o estado do desenvolvimento gonadal estudado e classificado no sentido de apurar a época de desova nesta espécie. Ainda no ANEXO 4 poderão ser visualizadas algumas fotos de lâminas histológicas de gónadas em várias fases de desenvolvimento. Seguidamente são apresentadas as estatísticas relativas ao estudo da espécie Littorina littorea.
1º nº amostrado : 1
Último nº amostrado: 717
Total de burriés amostrados: 451
Total de amostras com lâmina corada para microscopia ótica: 345 (76,5%)
Nº de amostras submetidas a fotoperíodo condicionado: 30 (6,7%)
Nº de amostras submetidas a fotoperíodo natural: 421 (93,3%)
Nº de burriés amostrados :
5 CON-AQUA, Lda. PROBUR
no dia 1 (dia da chegada ao laboratório) 181
após 1 semana 80
após 2 semanas 30
após 3 semanas 20
após 1 mês 40
após 1 mês e 1 semana 10
após 1 mês e 2 semanas 10
após 1 mês e 3 semanas 10
após 2 meses 10
após 3 meses e 2 semanas 10
após 3 meses e 3 semanas 10
após 4 meses e 2 semanas 30
após 5 meses e 2 semanas 10
Estatísticas Descritivas (Total)
Género N Mínimo Máximo Média Desvio Padrão Tamanho (mm) 35 18,03 28,31 21,9026 2,05893 Não Id Peso (g) 35 1,99 6,33 3,5097 ,82962
Macho Tamanho (mm) 208 15,95 27,08 20,7751 1,79594 Peso (g) 208 1,68 5,75 3,1063 ,70752
Fêmea Tamanho (mm) 208 16,74 29,76 21,6966 2,29170 Peso (g) 208 1,44 6,63 3,4958 ,89901
6 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Médias de Tamanho (mm) 24
23
22
21
20
19
18 jan-14 fev-14 mar-14 abr-14 mai-14 jun-14 jul-14 ago-14 set-14 out-14 nov-14 dez-14 jan-15
Macho Fêmea
7
CON-AQUA, Lda. PROBUR
Estatísticas Descritivas (mensais)
Desvio Data N Mínimo Máximo Média Padrão
Tamanho (mm) 18 16,96 23,13 20,7806 1,71853 Macho Peso (g) 18 1,84 4,37 2,9806 ,70534
Janeiro Tamanho (mm) 11 16,74 27,09 22,6009 2,85048 Fêmea Peso (g) 11 1,44 6,63 3,9036 1,39800
Tamanho (mm) 28 18,21 24,39 20,9879 1,54382 Macho Peso (g) 28 1,93 4,78 3,1971 ,66943
Fevereiro Tamanho (mm) 22 19,79 25,92 22,3386 1,83694 Fêmea Peso (g) 22 2,69 5,66 3,7273 ,73845
Tamanho (mm) 31 18,10 24,06 20,1816 1,52439 Macho Peso (g) 31 1,68 4,68 2,8684 ,64544
Março Tamanho (mm) 29 17,46 27,87 21,1176 2,52291 Fêmea Peso (g) 29 1,98 5,52 3,2576 1,03426
Tamanho (mm) 20 15,95 22,11 20,0410 1,52737 Macho Peso (g) 20 1,87 3,77 2,8535 ,47390
Abril Tamanho (mm) 31 17,08 24,08 21,5523 1,59987 Fêmea Peso (g) 31 1,58 4,65 3,2855 ,63877
Tamanho (mm) 18 17,60 24,19 20,6678 1,59448 Macho Peso (g) 18 2,15 5,02 3,2711 ,70786
Maio Tamanho (mm) 22 18,17 24,21 21,1068 1,61736 Fêmea Peso (g) 22 2,39 5,02 3,4518 ,76559
Tamanho (mm) 15 19,03 26,02 21,3440 1,66841 Macho Peso (g) 15 2,34 5,52 3,2753 ,77712
Junho Tamanho (mm) 15 20,49 26,17 22,9813 1,92471 Fêmea Peso (g) 15 2,67 4,78 3,7887 ,71536
Tamanho (mm) 10 17,08 26,14 21,6560 2,85333 Macho Peso (g) 10 2,21 5,01 3,3830 ,97857 Julho Tamanho (mm) 20 20,44 29,76 23,2300 2,70952 Fêmea Peso (g) 20 3,14 6,33 4,1925 ,97442
Tamanho (mm) 5 18,50 23,20 21,3460 1,82651 Macho Peso (g) 5 2,38 3,50 3,0400 ,47838
Agosto Tamanho (mm) 5 19,09 24,55 21,3760 2,28897 Fêmea Peso (g) 5 2,35 4,27 3,1640 ,77310
Tamanho (mm) 17 18,03 23,22 21,7688 1,50811 Não Id Peso (g) 17 1,99 4,29 3,5082 ,64802
Tamanho (mm) 32 16,69 23,28 20,6794 1,51968 Outubro Macho Peso (g) 32 2,12 4,15 3,1188 ,49478
Tamanho (mm) 11 18,14 25,78 20,7100 2,39000 Fêmea Peso (g) 11 2,31 5,36 3,2418 ,93651
Tamanho (mm) 18 18,21 28,31 22,0289 2,51058 Não Id Peso (g) 18 2,18 6,33 3,5111 ,99061
Tamanho (mm) 16 17,03 27,08 21,2713 2,92301 Novembro Macho Peso (g) 16 1,72 5,75 3,3256 1,16210
Tamanho (mm) 17 17,88 26,57 21,7088 2,39368 Fêmea Peso (g) 17 1,94 5,73 3,3465 ,87926
Tamanho (mm) 15 18,33 22,77 21,0340 1,41035 Macho Peso (g) 15 2,00 4,31 3,1267 ,64983
Janeiro15 Tamanho (mm) 25 16,80 24,02 20,5956 2,18497 Fêmea Peso (g) 25 1,82 4,41 3,2348 ,72642
8 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Como foi referido anteriormente, foi realizado paralelamente o estudo da espécie Phorcus lineatus, cujos resultados podem ser sintetizados na estatística que a seguir se apresenta bem como nos quadros e gráficos consequentes:
Espécie: Osilinus lineatus 1º nº amostrado : 31 Último nº amostrado: 647 Total de caramujos amostrados: 266 Total de amostras com lâmina corada para microscopia ótica: 136 (51%) Nº de amostras submetidas a fotoperíodo condicionado: 0 (0%) Nº de amostras submetidas a fotoperíodo natural: 266 (100%) Nº de caramujos amostrados : no dia 1 (dia da chegada ao laboratório) 114
após 1 semana 42
após 2 semanas 30
após 3 semanas 20
após 1 mês 20
após 1 mês e 1 semana 10
após 1 mês e 2 semanas 10
após 2 meses 10
após 2 meses e 3 semanas 7
após 3 meses e 2 semanas 3
9 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Estatísticas Descritivas (Total) Género N Mínimo Máximo Média Desvio Padrão Não Id Tamanho (mm) 108 7,12 25,94 14,5415 4,10419 Peso (g) 108 ,75 8,73 3,3148 1,71985 108 Macho Tamanho (mm) 77 11,25 25,46 16,4022 3,72510 Peso (g) 77 1,66 7,44 4,0494 1,58688 77 Fêmea Tamanho (mm) 81 9,92 24,91 15,0215 3,24733 Peso (g) 81 1,12 8,40 3,7056 1,68382 81
Médias de peso (g) 7
6
5
4
3
2
1
0 jan-14 fev-14 mar-14 abr-14 mai-14 jun-14 jul-14 ago-14 set-14 out-14 nov-14
Macho Fêmea
10 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Médias de tamanho (mm) 25
20
15
10
5
0 jan-14 fev-14 mar-14 abr-14 mai-14 jun-14 jul-14 ago-14 set-14 out-14 nov-14
Macho Fêmea
Estatísticas Descritivas (mensais)
Desvio Mês Género N Mínimo Máximo Média Padrão Janeiro Macho Tamanho (mm) 1 19,03 19,03 19,0300 Peso (g) 1 2,96 2,96 2,9600
Fêmea Tamanho (mm) 4 14,84 19,91 17,5075 2,57659 Peso (g) 4 2,31 3,61 3,1025 ,55686
Fevereiro Macho Tamanho (mm) 14 11,94 21,96 15,9407 3,22457 Peso (g) 14 1,99 6,03 3,3786 1,17600
Fêmea Tamanho (mm) 6 11,13 19,75 14,4333 3,62169 Peso (g) 6 1,32 6,29 3,3800 1,76708
Março Macho Tamanho (mm) 6 11,50 15,52 12,9833 1,47569 Peso (g) 6 1,66 2,15 1,8500 ,20000
Fêmea Tamanho (mm) 15 10,15 17,95 12,8900 2,26888 Peso (g) 15 1,51 3,31 2,0480 ,46636
Abril Não Id Tamanho (mm) 5 11,20 15,61 13,0460 1,79364 Peso (g) 5 2,08 4,10 2,6520 ,83682
Macho Tamanho (mm) 8 11,25 15,00 12,7763 1,36067 Peso (g) 8 2,23 3,72 2,9250 ,56069
Fêmea Tamanho (mm) 7 9,92 16,40 12,6914 2,14852 Peso (g) 7 1,82 4,46 2,8657 ,81924
Maio Não Id Tamanho (mm) 10 7,91 18,54 14,6350 3,14260 Peso (g) 10 ,75 6,81 4,0930 1,90923
Macho Tamanho (mm) 14 11,40 19,38 15,4900 2,54522 Peso (g) 14 2,29 7,44 4,6357 1,56951
Fêmea Tamanho (mm) 16 12,37 20,57 15,2288 2,33911 Peso (g) 16 2,74 8,12 4,4825 1,57277
11 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Junho Não Id Tamanho (mm) 15 9,78 18,12 14,2980 2,10396 Peso (g) 15 1,46 5,61 3,6140 ,98781
Macho Tamanho (mm) 3 13,03 16,97 14,4500 2,18824 Peso (g) 3 3,02 5,95 4,1000 1,60963
Fêmea Tamanho (mm) 12 11,33 19,50 14,4883 2,39881 Peso (g) 12 2,10 7,71 4,0925 1,54473
Julho Macho Tamanho (mm) 5 12,92 15,03 13,9200 ,81250 Peso (g) 5 2,98 5,11 3,9040 ,85746
Fêmea Tamanho (mm) 5 13,76 18,97 16,2860 2,05142 Peso (g) 5 3,63 8,40 5,9960 1,82069
Agosto Não Id Tamanho (mm) 9 14,09 21,47 17,4167 2,20445 Peso (g) 9 3,09 6,18 4,0989 1,07824
Macho Tamanho (mm) 1 19,79 19,79 19,7900 Peso (g) 1 4,35 4,35 4,3500
Outubro Não Id Tamanho (mm) 41 7,12 25,94 13,6756 4,68987 Peso (g) 41 ,82 6,35 2,5780 1,38084
Macho Tamanho (mm) 15 12,16 25,46 20,1620 3,73558 Peso (g) 15 1,84 7,10 4,7973 1,56264
Fêmea Tamanho (mm) 14 10,02 24,91 17,4407 4,40574 Peso (g) 14 1,12 6,69 3,9571 1,52108
Novembro Não Id Tamanho (mm) 28 8,82 25,77 15,2493 4,66915 Peso (g) 28 1,19 8,73 3,8218 2,25320
Macho Tamanho (mm) 10 12,48 23,58 18,8630 2,99301 Peso (g) 10 1,75 6,61 5,4010 1,42867
Fêmea Tamanho (mm) 2 15,74 19,06 17,4000 2,34759 Peso (g) 2 3,65 6,82 5,2350 2,24153
3.4 Reprodução natural ou induzida
A reprodução natural foi obtida com relativa facilidade. Foi ainda possível, através da manipulação e controlo do fotoperíodo uma antecipação de dois meses, relativamente à desova natural observada no início do projeto. Reprodução natural - a desova natural começou no início do mês de Março de 2014, com a observação dos ovos recolhidos na rede camaroeira fina, instalada à saída do tubo que conduz a água dos quinze aquários de cada sistema para o filtro biológico. Foi também possível observar diretamente a partir do dia 7, algumas posturas de cor rosada fora da água, aderentes à margem superior seca dos aquários, apesar de se tratar de ovos pelágicos. De referir que todos os 5 lotes iniciais se reproduziram no mesmo período e em simultâneo. Um crivo de malha de 1mm já separava o material mais grosso da massa gelatinosa dos ovos. No entanto ainda passavam fezes, detritos vegetais e uma série de organismos marinhos
12 CON-AQUA, Lda. PROBUR planctónicos que posteriormente foram sendo separados dos ovos e larvas através de crivagens mais finas e sucessivas. Ovos e larvas foram recolhidos diariamente para um tanque de 130 l com arejamento e já lhes eram fornecidas microalgas como alimento até serem transportados para as instalações do CIIMAR alugadas à Aquatecnor. A desova prolongou-se por 3 meses, tendo-se efetuado a recolha de ovos e larvas diariamente em Março, Abril e Maio embora neste último mês as posturas tenham começado a diminuir em número e qualidade até terem cessado completamente.
Reprodução induzida - fotoperíodo artificial
Os primeiros cinco lotes, num total de 2434 de animais, deram entrada na ELA até 12 de Fevereiro de 2014. Logo na primeira semana de Março começaram a ser observadas posturas. A desova natural ocorreu, portanto, pouco tempo depois da chegada de 5º lote parecendo que a transição para o cativeiro não interferiu com o ciclo reprodutivo dos animais. As posturas decorreram durante 3 meses, sensivelmente. Para induzir a antecipação da época de reprodução foi manipulado um único factor, a luz. Através da programação dos temporizadores digitais iniciou-se o aumento do período de luz diário a partir do mês de Outubro de 2014, quando a duração dos dias tinha começado a diminuir e continuaria assim até ao solstício de Inverno. Os incrementos rondaram, em média, pouco mais de 1 minuto por dia de modo a obter um “crescimento” dos dias gradual à semelhança do que acontece na Natureza. Assim, houve um ganho mensal de cerca de meia hora de luz, o que superou o ritmo natural. Tal como a desova do início do ano, que se iniciou antes do equinócio da Primavera, também a desova induzida começou antes de o número de horas de luz terem igualado as de escuridão. Os primeiros ovos foram observados na primeira semana de Janeiro e também foram recolhidos durante quase 3 meses. A antecipação conseguida em relação à desova natural do ano anterior foi de 2 meses. De realçar que desovaram animais de todos os lotes, incluindo os que estavam há menos tempo em cativeiro e que começaram a chegar a partir de Setembro. Até à conclusão dos trabalhos, em Abril, não foi observada nova atividade reprodutora nestes animais. Os animais do lote designado por 10b e que permaneceram expostos ao regime de iluminação natural, iniciaram a desova mais tarde e também no início de Março.
13 CON-AQUA, Lda. PROBUR 3.5 Cultivo larvar
Testes em larvas de Littorina littorea de compostos potencialmente indutores de fixação/metamorfose nesta espécie
Pretendeu-se avaliar o efeito de vários compostos na indução da fixação e metamorfose em larvas de L. littorea. Foram testadas diferentes concentrações de ácido gama-aminobutírico (GABA), serotonina, sobre os quais há estudos que relatam o estímulo da fixação e metamorfose em gastrópodes marinhos, epinefrina, L-Dopa, dopamina e 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), com resultados semelhantes noutras espécies de moluscos e acetiltiocolina. De forma a identificar o momento apropriado para a indução do efeito desejado, o estímulo (exposição aos químicos) foi aplicado em diferentes idades das larvas: 12, 20 e 25 dias após a eclosão. Os testes foram realizados em placas de 24 poços (Fig. 1), colocando-se 10 larva em cada poço.
Figura 1. Placas de 24 poços onde foram realizados os testes de avaliação de diferentes químicos quanto à indução de fixação e metamorfose.
Considerou-se como fixação a adesão da larva à superfície do poço da placa, através do seu pé, no momento da observação. Note-se que, nesta espécie, este processo não é irreversível, isto é, larvas de idade mais avançada, têm velo e pé simultaneamente, e podem alternar entre comportamento planctónico e deslocação pelo seu pé. As larvas foram consideradas metamorfoseadas, ou seja, passadas ao estado de juvenil, quando já não possuíam velo.
Estímulo aos 12 dias de idade
Foram testadas 3 concentrações três concentrações de GABA (10-7, 10-6 e 10-5M) e uma concentração de serotonina (10-4M), devido à pouca disponibilidade de larvas naquele momento. Estabeleceram-se 3 réplicas para cada condição experimental, exceto o controlo, cujo número de réplicas foi 6. O número de larvas por réplica foi de 10. Nenhum dos dois compostos promoveu a fixação, não tendo havido diferenças significativas entre os grupos estimulados e o grupo controlo (Fig. 2), após a realização de uma análise de variância (ANOVA). 14 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Figura 2. Percentagem de fixação de larvas de Littorina littorea após 48 horas do estímulo, com GABA ou serotonina, efetuado aos 12 dias de idade, relativamente aos grupos controlo. O mesmo se verificou em relação à indução da metamorfose, sendo que em nenhum dos grupos experimentais se observaram larvas sem velo, ou seja, a ocorrência de metamorfose em larvas de 12 dias (Fig. 3).
Figura 3. Percentagem de larvas metamorfoseadas de Littorina littorea após 48 horas do estímulo com GABA ou serotonina, efetuado aos 12 dias de idade, assim no grupo controlo.
Determinou-se ainda a percentagem de mortalidade nos diferentes grupos (Fig. 4). A mortalidade mais elevada ocorreu no grupo de exposição a GABA na concentração de 10-5M (cerca de 26%), havendo uma diferença significativa em relação ao controlo (p=0,005). A segunda taxa de mortalidade mais elevada verificou-se na concentração de 10-6M de GABA (cerca de 19%), enquanto nos restantes grupos festa taxa foi inferior a 10%.
Figura 4. Percentagem de mortalidade após 48 horas do estímulo com GABA ou serotonina, efetuado aos 12 dias de idade, assim como no grupo controlo. 15
CON-AQUA, Lda. PROBUR
Os resultados sugerem que a idade de 12 dias não é propícia para efetuar o estímulo químico de fixação e metamorfose, com os dois químicos testados: GABA e serotonina. Deste modo, optámos por efetuar novos testes aos 20 dias de idade de uma nova cultura de larvas da espécie em estudo, uma vez que as do cultivo anterior se esgotaram com o ensaio do dia 12.
Estímulo aos 20 dias de idade
Larvas com 20 dias de idade foram expostas a um dos seguintes compostos: GABA (10-7, 10-6 ou 10-5M), serotonina (10-4, 10-5 ou 10-6M), epinefrina (2x10-6, 10-5 ou 5x10-5M), L-Dopa (4x10-6, 2x10-5 ou 10-4M), dopamina (4x10-6, 2x10-5 ou 10-4M), IBMX (10-6, 10-5 ou 10-4M) ou acetiltiocolina (2x10-5, 10-4 ou 5x10-4M). Passadas 48 horas procedeu-se avaliação do efeito do estímulo. O número de réplicas no grupo controlo foi 14, sendo de 6 para os restantes grupos experimentais. O número de larvas por réplica foi de 10. Na figura 5 estão representados os valores de taxa de fixação obtidos. Identificaram-se diferenças estatisticamente significativas comparativamente com o controlo nas condições: epinefrina na concentração de 5x10-5M (p=0,011); L-Dopa a 2x10-5M (p=0,007); dopamina a 10-4M (p=0,043). Estes resultados sugerem que estes três compostos, nestas concentrações, são verdadeiramente indutores do comportamento de fixação nas larvas de L. littorea com 20 dias de idade. A percentagem de fixação mais elevada foi obtida na condição epinefrina a 5x10-5M. Por outro lado, GABA, serotonina, IBMX e acetiltiocolina não revelaram qualquer estímulo deste fenómeno.
16 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Figura 5. Taxa de fixação de larvas Littorina littorea 48 horas após o estímulo, com diferentes concentrações de GABA, serotonina, epinefrina, L-Dopa, dopamina,
IBMX ou acetiltiocolina. O ensaio foi efetuado em larvas de 20 dias de idade.
Nenhum dos compostos testados induziu a metamorfose (Fig. 6), uma vez que as diferenças observadas não foram significativamente diferentes relativamente ao controlo. No entanto, há a destacar a taxa de metamorfose mais elevada atingida com exposição a dopamina a 10-4M, que foi mais do dobro da observada no controlo. À condição L-Dopa a 2x10-5M, corresponde a segunda percentagem de metamorfose mais elevada. Opostamente, não foram observadas larvas metamorfoseadas em nenhuma das concentrações testadas de acetiltiocolina.
17 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Figura 6. Percentagem de larvas metamorfoseadas de Littorina littorea 48 horas após o estímulo com diferentes concentrações de GABA, serotonina, epinefrina, L-Dopa, dopamina, IBMX ou acetiltiocolina. O ensaio foi efetuado com larvas de 20 dias de idade.
18 CON-AQUA, Lda. PROBUR A mortalidade em cada grupo experimental foi também determinada (Fig. 7). O único caso em que houve diferenças estatisticamente significativas relativamente ao controlo foi na exposição a acetiltiocolina, na concentração mais elevada (5x10-4M), cuja mortalidade atingiu o valor de 91%, o que indica que esta concentração não é adequada às larvas em estudo. A mortalidade no grupo controlo foi inferior a 10%.
Figura 7. Percentagem de mortalidade de larvas de Littorina littorea 48 horas após o estímulo com diferentes concentrações de: GABA, serotonina, epinefrina, L-Dopa, dopamina, IBMX ou acetiltiocolina. O ensaio foi efetuado com larvas de 20 dias de idade.
19 CON-AQUA, Lda. PROBUR Naturalmente, as percentagens de fixação e metamorfose no grupo controlo das larvas de 20 dias, foram superiores às verificadas no grupo controlo da experiência anterior com larvas de apenas 12 dias de idade, devido ao maior desenvolvimento das primeiras. Assim, os resultados sugerem que os 20 dias de idade é um momento mais apropriado do que os 12 dias para a indução do comportamento de fixação e, eventualmente, metamorfose.
Estímulo aos 25 dias de idade
Larvas de 25 dias de idade foram expostas a um dos seguintes compostos: GABA (10-7, 10-6 ou 10-5M), serotonina (10-4, 10-5 ou 10-6M), epinefrina (2x10-6, 10-5 ou 5x10-5M), L-Dopa (4x10-6, 2x10-5 ou 10-4M) ou dopamina (4x10-6, 2x10-5 ou 10-4M). Não foram avaliados os estímulos por acetiltiocolina e IBMX, cujos resultados na cultura de 20 dias tinham sido os menos promissores.
Figura 8. Percentagem de fixação de larvas Littorina littorea 48 horas após o estímulo com diferentes concentrações de GABA, serotonina, epinefrina, L-Dopa ou dopamina, O ensaio foi efetuado com larvas de 25 dias de idade.
20 CON-AQUA, Lda. PROBUR As larvas estimuladas aos 25 dias de idade foram observadas após 48 horas. Para cada grupo experimental, foram estabelecidas 5 réplicas, cada uma constituída por 10 larvas. Os resultados de percentagem de fixação estão representados na Fig. 9. Nenhum dos compostos evidenciou a indução do comportamento de fixação, uma vez que não houve diferenças significativas comparativamente com o controlo, contrariamente com o que se havia observado com larvas de 20 dias com os compostos epinefrina, L-DOPA e dopamina. A percentagem de fixação mais elevada foi obtida com serotonina a 10-6M, correspondendo a mais do dobro da percentagem do controlo (43%).
Figura 9. Taxa de metamorfose em larvas de Littorina littorea 48 horas após o estímulo com diferentes concentrações de GABA, serotonina, epinefrina, L-Dopa ou dopamina. O ensaio foi efetuado com larvas de 25 dias de idade.
Igualmente, não se verificou a indução da metamorfose por parte de qualquer um dos compostos testados, dado que não foram detetadas diferenças significativas entre a taxa de metamorfose dos grupos estimulados e a do grupo controlo (Fig.9). GABA a 10-7M e L-Dopa a 2x10-5M foram as condições que permitiram atingir a maior percentagem de metamorfose (95%), sendo a percentagem obtida por exposição a dopamina a 2x10-5M igualmente superior a 90% (93%). 21 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Com larvas de 25 dias os valores de mortalidade foram bastante elevados (Fig. 10), sendo que mesmo no grupo controlo foi superior a 50% (57%). Não se observaram diferenças significativas entre o grupo controlo e os restantes grupos. A taxa de mortalidade máxima resultou da exposição a epinefrina a 2x10-6M (81%), sendo os restantes valores sempre inferiores a 80%.
Figura 10. Gráficos com os resultados de percentagem de mortalidade de larvas de Littorina littorea 48 horas após o estímulo com diferentes concentrações de GABA, serotonina, epinefrina, L-Dopa ou dopamina. O ensaio foi efetuado com larvas de 25 dias de idade.
Nas larvas de 25 dias de idade não se observou indução de fixação pela exposição a epinefrina, L-Dopa e dopamina, verificada no ensaio com larvas de 20 dias de idade, nem se conseguiu induzir a metamorfose de forma significativa. No entanto, a metamorfose nestas larvas, estava já avançada, como se pode observar pela % de larvas metamorfoseadas nos grupos controlo, andando em torno a 55%. Este facto juntamente com a elevada mortalidade terá influenciado os valores de percentagem de fixação e de metamorfose obtidos, não permitindo observar diferenças significativas entre tratamentos.
22 CON-AQUA, Lda. PROBUR
3.6 Fase juvenil
Esta etapa foi a que se mostrou determinante para a execução parcial das tarefas seguintes. Os juvenis obtidos apresentaram crescimentos muito lentos e mortalidade elevada o que condicionou a montagem de sistemas de engorda. Sem haver exemplares viáveis suficientes, a realização do objetivo principal deste projeto ficou impossibilitada e apesar de inúmeras experiências realizadas deixou de fazer sentido prosseguir nos moldes inicialmente previstos. Em seguida apresentamos os resultados obtidos: Manutenção e crescimento dos juvenis de L. littorea Condições de luz/obscuridade
Efetuou-se um ensaio com a finalidade de obter indicações sobre a preferência dos juvenis da espécie L. littorea por zonas iluminadas ou em obscuridade. Para tal, os juvenis foram colocados em placas de pertri. Metade de cada placa de Petri foi coberta com papel de alumíno, resultando numa zona de obscuridade, e numa zona de luz na metade não coberta (Fig. 11). Foram utilizados 43 juvenis com cerca de 270 dias de idade, em 9 placas de Petri. Nos dois dias seguintes, de manhã, procedeu-se à contagem do número de juvenis em cada uma das metades da placa. As médias das percentagens de indivíduos em cada metade das placas encontram-se representadas na Figura 12. Após análisar os dados através de análise de variança (ANOVA) de duas vias, foram detectadas diferenças significativas (p < 0,001) entre a média das percentagens de indivíduos na zona de luz e a média das percentagens de indivíduos na zona de obscuridade, quer no dia 1, quer no dia 2 após o estabelecimento das condições experimentais. Os resultados indicam que os juvenis de L. littorea têm preferência por zonas de obscuridade, encontrando-se uma média de cerca de 30% de indivúduos nas zonas iluminadas e 70% nas zonas obscuras. Em ambos os dias.
23 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Figura 11. Placas de Petri com juvenis de Littorina littorea, estando cada metade coberta com papel de alumínio de forma a ser-lhes proporcionada a presença simultânea de uma zona de luz e outra de obscuridade.
n=31 n=29
n=12 n=14
Dia Dia
Figura 12. Média da percentagem de indivíduos na zona exposta à luz e na zona de obscuridade, no dia seguinte e após dois dias do estabelecimento das condições experimentais.
Crescimento de juvenis num sistema de recirculação
Efetuou-se a distribuição aleatória de juvenis com idades compreendidas entre os 259 e os 274 dias, que ultrapassaram as fases larvares com sucesso, por 8 grupos com 6 individuos cada, em recipientes de 100 ml, constituintes de um sistema de recirculação (Fig. 13). O volume útil destes recipientes experimentais era de 50 ml. A metade dos grupos (4) foi fornecida Ulva como alimento, e à outra metade (4) Ulva, pequenas pedras com epífitas (Fig. 14A) e pequenas pedras calcáreas (Fig. 14B).
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Figura 13. Sistema experimental com recirculação para juvenis de Littorina littorea.
O sistema de recirculação incluiu também um tanque reservatório com 40 L de água do mar, uma bomba de recirculação, um filtro mecânico (lã de vidro) e um filtro biológico tipo “bio-bolas”, por onde a água proveniente dos recipientes com os especiens era forçada a passar. A taxa de renovação de água nos recipientes experimentais era de cerca de 2 renovações por hora. A temperatura da água variou entre 18 e 20ºC.
A B
Figura 14. Fontes de alimento fornecidas aos juvenis de Littorina littorea, além de Ulva sp: pedras com epífitas (A) e pedras calcárias (B).
Na Figura 15 estão representadas as médias do comprimento, largura, distância de um ponto estabelecido na abertura da concha até ao bico da espiral (db) e volume, dos diferentes grupos de juvenis colocados no sistema experimental de recirculação, cuja determinação foi efectuadas mensalmente.
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2 .4 1 .8
Ulva )
U lva + su p le m e n to s m
2 .2 )
m
( m
1 .6
o
m
t
(
n
a
e 2 .0
r
u
m
i
g r
r 1 .4 Ulva p
a l
m 1 .8
o U lva + su p le m e n to s c 1 .6 1 .2 0 3 0 6 0 9 0 0 3 0 6 0 9 0 te m p o (d ia s ) te m p o (d ia s )
3 .6 5Ulva 3 .4 U lva + su p le m e n to s
4
) 3
) 3 .2 m
m
m 3
( m
3 .0
(
e
b
m 2
d u
2 .8 l Ulva
o V 1 2 .6 U lva + su p le m e n to s 2 .4 0 0 3 0 6 0 9 0 0 3 0 6 0 9 0 te m p o (d ia s ) te m p o (d ia s )
Figura 15. Variação do comprimento, largura, distância de um ponto estabelecido na abertura da concha até ao bico da espiral (db) e volume de juvenis de Littorina littorea, ao longo de 100 dias que permaneceram no sistema de recirculação. Quatro grupos foram alimentados apenas Ulva e outros 4 grupos foram alimentados com Ulva, pedras com epífitas e pedras calcárias (suplementos).
Realizou-se uma análise ANOVA de duas vias, considerando como variáveis independentes o alimento fornecido e a idade, e como variável dependente o comprimento (Fig. 16A), a largura (Fig. 16B), a db (Fig. 16C) ou o volume (Fig. 16D). Esta análise demonstrou que houve diferenças significativas nos parâmetros medidos ao longo do tempo (conforme se pode verificar na Figura 16, nos vários casos p<0,01), mas apenas devidos à idade e não ao alimento fornecido. Ou seja, o crescimento foi idêntico em ambos os regimes alimentares e em ambos se verificou um aumento significativo das variáveis medidas. Em todos os casos foi confirmada a homogeneidade das variâncias pelo teste de Levene (p>0,05), o que validou o uso de testes paramétricos.
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A B
C D
Figura 16. Resultados das análises two-way ANOVA, considerando com variáveis independentes o alimento fornecido e a idade e como variável dependente o comprimento (A), a largura (B), a db (C) ou o volume (D) dos juvenis de L. littorea.
Na tabela 1, encontram-se as taxas de crescimento médias dos 2 grupos alimentados com diferentes fontes de nutriente. No final do ensaio, estes valores foram sempre superiores nos grupos aos quais foi fornecida Ulva + suplementos, embora a diferença não seja significativa. Talvez uma duração temporal superior do ensaio viesse a revelar diferenças significativas entre os grupos.
Tabela 1. Valores da taxa de crescimento de juvenis de Littorina littorea obtidos com diferentes tipos de alimentação.
Ulva Ulva + suplementos Comprimento Início 1883,24 1933,66 (µm) Fim 2209,05 2268,56
Taxa de crescimento 0,0016 0,0016 Largura Início 1341,60 1388,07 (µm) Fim 1621,27 1698,52 Taxa de crescimento 0,0019 0,0020 Db Início 2651,50 2736,24 (µm) Fim 3177,08 3334,38 Taxa de crescimento 0,0018 0,0020
Volume Início 2,30144 2,50568 3 (mm ) Fim 4,17055 4,49199 Taxa de crescimento 0,0060 0,0059
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Tarefa 4: Montar sistemas de engorda experimentais em aquário, piscicultura e moluscicultura.
Intervenientes: CON-AQUA e ELA
Os sistemas de engorda experimentais desenvolvidos durante o projeto, utilizaram vários métodos: em diferentes tipos de aquário como anteriormente referido na sub-tarefa 3.1 (ver Anexo 2) e ainda em co-produção extensiva na cultura de ostras. Este sistema consistiu na utilização das mesmas estruturas para a criação de ostras. Utilizou-se sacos de ostras com malha de 0.7 cm e 0.4 cm. Nos sacos maiores colocaram-se os burriés, em diferentes densidades. No total utilizaram-se 15 sacos - 5 com 50 indivíduos, 5 com 100 indivíduos e 5 com 150 indivíduos. No interior de cada saco inseriu-se o saco de menores dimensões (0.4cm), coberto de algas, para alimentação do burrié. Contrariamente ao expectável, este sistema não funcionou motivado pela reduzida taxa de crescimento e elevada mortalidade observada.
CRESCIMENTO - REGISTOS MENSAIS DO PESO E ALTURA DA CONCHA (AC)
À chegada de cada lote de animais foram retirados mortos e conchas vazias. A mortalidade inicial foi sempre muito baixa e a adaptação às condições de cativeiro boa com o início quase imediato do consumo de alimento. Nos primeiros cinco lotes estes parâmetros já vinham avaliados e nos cinco restantes foram realizadas amostragens de 100 indivíduos para a medição e pesagem na ELA. Os valores médios iniciais de cada lote são apresentados nos gráficos seguintes (1 e 2).
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GRÁFICO 1
GRÁFICO 2
O crescimento de cada lote foi avaliado através dos parâmetros peso e altura da concha, obtidos mensalmente. Os resultados estão tabelados a seguir (Tabela 2), correspondendo os valores às médias obtidas a partir de amostras representativas de 100 indivíduos, sempre que possível. O método preconizado para a avaliação de crescimento destes animais é a medição da altura da concha mas procedeu-se igualmente à pesagem dos indivíduos. A altura da concha (AC) é a distância em cm entre o ápex da concha e a base da abertura. As medições foram efetuadas com um paquímetro digital. Antes da pesagem, os indivíduos permaneceram 10 minutos sobre papel absorvente, com a abertura voltada para baixo para eliminar a água.
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3,22 3,39 3,36 3,26 3,18 3,18 (g)P 2,2 2,17 2,19 2,18 2,17 2,17
(cm) AC LOTE 10 / 25.11.14 / 10 LOTE
3,13 3,21 3,39 3,39 3,61 3,49 P (g)P
2,13 2,18 2,21 2,22 2,22 2,21 AC (cm) AC 12.11.14 / 9 LOTE 3,3 3,4 3,02 3,11 3,17 3,38 3,32 (g)P
2,09 2,13 2,14 2,18 2,19 2,19 2,18 AC (cm) AC LOTE 8 / 22.10.14 / 8 LOTE
3,4 3,38 3,11 3,18 3,15 3,32 3,48 P (g)P
2,2 2,2 2,21 2,15 2,17 2,16 2,23 AC (cm) AC 08.10.14 / 7 LOTE 3,5 3,4 3,17 3,17 3,28 3,44 3,51 3,45 (g)P
2,17 2,12 2,14 2,19 2,19 2,19 2,17 2,19 AC (cm) AC LOTE 6 / 25.09.14 / 6 LOTE
3,36 3,39 3,11 3,23 3,28 3,14 2,96 3,13 3,02 3,13 3,23 3,22 3,13 3,26 3,22 P (g)P
2,1 2,12 2,15 2,09 2,15 2,14 2,13 2,13 2,11 2,13 2,16 2,16 2,11 2,16 2,15 AC (cm) AC
12.02.14 / 5 LOTE 3,2 3,17 3,23 3,26 3,11 3,27 2,95 2,97 3,06 3,09 3,23 3,24 2,26 3,33 3,28 3,24 (g)P 2,1 2,1 2,1 2,11 2,12 2,14 2,17 2,15 2,11 2,12 2,13 2,15 2,14 2,16 2,16 2,15
(cm) AC
LOTE 4 / 29.01.14 / 4 LOTE
3,71 3,85 3,96 3,66 3,87 3,81 3,66 3,69 3,62 3,49 3,43 3,45
(g)P
2,3 2,3 2,3 2,14 2,27 2,24 2,31 2,32 2,27 2,25 2,23 2,24 AC (cm) AC
29.01.14 / 3 LOTE : PESO (P) E ALTURA DA CONCHA (AC) INICIAIS CONCHA INICIAIS DA PESO : (AC) ALTURA E (P) 3,3 3,3 3,14 3,25 3,26 3,46 3,16 3,27 3,31 3,31 3,25 3,29
P (g)P MENSAIS
2,12 2,11 2,09 2,13 2,16 2,14 2,12 2,16 2,16 2,16 2,17 2,17 AC (cm) AC 23.01.14 / 2 LOTE 3,2 3,3 3,34 3,46 3,47 3,47 3,56 3,41 3,33 3,13 3,06 3,13 3,27 3,26 2,25 3,13
P (g)P
MENS
E MENSAIS messais MENSAIS E 2 TABELA 2,13 2,12 2,16 2,19 2,19 2,19 2,18 2,14 2,13 2,13 2,13 2,13 2,16 2,15 2,13 2,17
(cm) AC LOTE 1 / 23.01.14 / 1 LOTE jul/14 jan/14 fev/14 abr/14 jun/14 set/14 jan/15 fev/15 abr/15 ago/14 out/14 dez/14
MESES mar/14 mai/14 nov/14 mar/15
30 CON-AQUA, Lda. PROBUR MORTALIDADE / SOBREVIVÊNCIA E CRESCIMENTO
Diariamente, todos os aquários foram observados para se retirarem os animais mortos. Para além do número de baixas, também foi registada a medida da altura da concha (AC) de cada indivíduo. Apresenta-se de seguida um resumo da evolução dos parâmetros mortalidade/sobrevivência e AC/P e ainda os valores de sobrevivência de cada grupo ao longo dos meses.
LOTE 1: A mortalidade neste lote manteve-se razoavelmente baixa nos primeiros 5 meses mas a partir do mês de Junho começou a aumentar a um ritmo mais elevado, atingindo o valor total de 75 % ao fim de 11 meses altura em que os animais foram reunidos num único aquário. Em Abril, dos 575 animais iniciais restavam 105 o que corresponde a uma sobrevivência de 18,3%. A partir do 1º mês AC aumentou ligeiramente até Julho depois registaram-se pequenas alterações que parecem depender da influência da maior mortalidade. Até ao 4ºmês o peso aumentou constantemente mas a partir do 6º mês manteve-se sempre inferior ao peso médio inicial.
LOTE 2: Deu entrada no mesmo dia do lote 1 e trata-se do único lote oriundo da Escócia e não da Ria de Aveiro. Apresentou um dos dois valores mais baixos de sobrevivência registados, com uma mortalidade de 93,8 % após 9 meses de experiência. Os indivíduos começaram a morrer a grande ritmo, a partir de Abril. Apesar disso, os pesos médio mensais forem sempre superiores ao valor inicial e o mesmo aconteceu com AC exceto em Março e Agosto.
LOTE 3: À semelhança do grupo anterior, o número de mortos começou a aumentar em Abril e no fim de Maio a mortalidade já alcançou quase 90 %. Os sobreviventes, agora reunidos num aquário, mantiveram um número aproximado durante mais 4 meses sendo a mortalidade final de 88,5%. Estes animais apresentaram o mais alto valor de peso à chegada assim como ao fim de 9 meses. Os valores médios de AC também foram relativamente elevados-
LOTE 4: Chegou a 29 de Janeiro mas já se encontrava há cerca de 15 dias nas instalações do ICBAS. Foram os animais que estiveram a maior densidade (10 N/l). Ao fim de 7 meses em cativeiro a sobrevivência era de 53%. Nos outros 7 meses seguintes a sobrevivência desceu de 40 para 27,5 % final. Em 10 meses o peso oscilou à volta de 2,13 g enquanto o peso inicial foi de 2,11 g. A altura da concha também prosseguiu com subidas e descidas de pequena amplitude.
31 CON-AQUA, Lda. PROBUR LOTE 5: Este foi o único grupo a dar entrada em Fevereiro e começou a exibir valores mais altos de mortalidade a partir do mês de Maio, até aí a sobrevivência tinha-se mantido acima dos 90%. No 8º mês restavam 262 animais, dos 930 iniciais, o que corresponde a 71,8% de mortalidade. Em Maio os 189 sobreviventes deste grupo estipularam uma sobrevivência final de 20,3%. Nos valores médios mensais de AC e Peso deste grupo nota-se bem a constância dos valores sendo a pequena variabilidade, provavelmente, inerente à amostragem e sobretudo à mortalidade.
LOTE 6: O primeiro lote do Outono permaneceu no sistema até Abril mas no 3º mês pouco mais de 30% dos indivíduos estavam vivos. Entre Dezembro e o último mês a taxa de mortalidade abrandou e após 7 messes em cativeiro a sobrevivência situou-se nos 24,9%. O incremento do peso até Fevereiro (4º mês) foi de 10,7 % enquanto AC pouco variou.
LOTE 7: O numeroso conjunto de 1090 animais que deu entrada no início de Novembro já tinha perdido 42,6% dos indivíduos ao fim de 2 meses. Os números da sobrevivência estabilizaram ente Março (23,4%) e Maio como valor final de 21,6% mas a partir de Março os 255 indivíduos que restavam foram distribuídos por 5 aquários, metade do número inicial. É precisamente no 5º e 6º mês que pela primeira vez, tanto os valores médios de AC como do peso ultrapassam os valores iniciais.
LOTE 8: No 3º mês de experiência os 741 animais iniciais já estavam reduzidos a 337. Este grupo foi acompanhado até Maio, altura em que o valor da sobrevivência se situava nos 27%. O peso e AC subiram debilmente durante os 4 primeiros meses.
LOTE 9: Os 1000 animais deste primeiro lote de Novembro começaram a diminuir mais acentuadamente entre o 3º e 4º mês quando a mortalidade aumentou de 34.4 para 60,5%. A sobrevivência final foi de 33,8%. O comportamento deste grupo em relação ao crescimento foi semelhante ao do lote anterior com pequenos incrementos até ao 4º mês. O aumento de peso, sempre mais significativo, foi de 0,48 g o que corresponde a 15,5%.
LOTE 10: Os animais deste último lote foram divididos em dois grupos e distribuídos por aquários de sistemas com características diferentes, já descritos anteriormente. Os resultados da sobrevivência destes dois subgrupos (LOTE 10a e 10b) ao fim de 5 meses são significativamente diferentes com o valor de 46.3% para os animais do sistema com fotoperíodo artificial e 72,4% para os que estiveram no sistema F com luz natural. Além disso, o sub-grupo 10 b foi o único que
32 CON-AQUA, Lda. PROBUR apresentou aumentos progressivos e constantes a partir do mês de chegada, Novembro, até Maio quando foi realizado o último controlo.
Os resultados do crescimento dos lotes ao longo dos meses estão esquematizados nos gráficos seguintes (3 e 4):
GRÁFICO 3
GRÁFICO 4
33 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Tarefa n.º 5: Patologia, Contaminação e Sanidade
Esta tarefa foi realizada pela equipa do ICBAS com a colaboração da Profª. Graça Costa da Universidade da Madeira e utilizando todas as lâminas histológicas que foram analisadas para o estudo do desenvolvimento das gónadas. Foram desta forma detetadas algumas preparações com parasitas nas gónadas e tecidos envolventes. Digenea é uma das duas subclasses da classe Trematoda, que juntamente com as classes Cestoda, Monogenea e Turbellaria completam o filo Platyhelminthes. É das subclasses mais bem sucedidas, e ocorre em todas as classes de vertebrados. Alberga cerca de 25.000 espécies de parasitas com um ciclo de vida complexo e desenvolvem a sua fase larvar em moluscos marinhos e, posteriormente, atingem a sua fase adulta, maioritariamente em aves, ou peixes, incluindo em espécies com elevado valor comercial. São responsáveis por patologias que constituem um perigo não só para a saúde humana mas também para outras espécies de animais, nomeadamente bovinos, ovinos, suínos, equinos e animais domésticos. A ideia de que um parasita pode modificar o fenótipo de seu hospedeiro, ou até mesmo alterar a aparência e comportamento do hospedeiro é agora um conceito bem estabelecido no estudo do comportamento animal. Na maioria dos casos conhecidos, estas alterações são muito subtis tanto no comportamento, como na morfologia do hospedeiro, no entanto alguns casos, essas alterações são evidentes, como no caso dos trematodes. Estes, alteram de tal forma o hospedeiro que faz com que o hospedeiro intermediário fique vulnerável ao predador, o qual o seu hospedeiro definitivo.
Os parasitas podem alterar o equilíbrio das populações dos hospedeiros numa determinada região, bem como a sua representatividade. De entre os efeitos produzidos pela infestação parasitária, podem ser diagnosticada debilidade, deformações e erosão química nas conchas, hipertrofia ou atrofia dos tecidos do hospedeiro, favorecendo a deteção e a predação pelo hospedeiro definitivo, aumento do consumo de oxigénio e da taxa de metabolismo, alterações na resposta do hospedeiro ao “stress” ambiental e até mesmo a morte do hospedeiro nos casos de infestações violentas. O potencial de reprodução pode também ser influenciado, por “castração parasitária”, afetando, desta forma também, a nutrição, o crescimento e o comportamento do hospedeiro.
Devido à sobre exploração e à má gestão da pesca, tem havido uma necessidade crescente na produção de peixes, crustáceos e bivalves em condições de cativeiro, que possam resolver estes problemas causados pela sobre exploração da pesca. Porém, as pisciculturas são um local privilegiado para a ocorrência de parasitoses, uma vez que os hospedeiros intermediários
34 CON-AQUA, Lda. PROBUR (peixes/moluscos) e finais (aves) podem ocorrer em grandes densidades numa determinada área restrita, favorecendo assim as infeções por digenéticos. Assim sendo, as diferentes fases dos ciclos de vida destes trematodes interferem, a vários níveis, com diferentes organismos pertencentes à cadeia alimentar marinha, o que vai contribuir para o decréscimo da produtividade nessas explorações.
Neste trabalho, das amostras observadas, 3 estavam parasitadas. Duas fêmeas e um macho da espécie L. littorea, submetidas a períodos de luz normal, colhidas em épocas distintas, tal como refere a tabela seguinte:
Amostr Género Tamanho Peso (g) Data da Local da colheita a (mm) colheita
59 Fêmea 23,45 3,98 12/02/2014 Ria de Aveiro
199 Macho 20,10 2,86 09/04/2014 Ria de Aveiro
699 Fêmea 16,80 2,58 22/01/2015 Aguda
Após a observação das lâminas histológicas da gónada e glândula digestiva, verificou-se que os parasitas ocupavam a totalidade da gónada dos burriés. Na área que seria ocupada pela gónada, encontram-se esporocistos com cercárias no seu interior. Os esporocistos são estruturas semelhantes a um “saco” que se formam imediatamente após a transformação do miracídio após a sua penetração no hospedeiro. No interior dos esporocistos podem-se observar a presença de cercárias, forma larvar que dá continuação ao ciclo de vida, infetando o hospedeiro seguinte.
Algumas imagens obtidas destes resultados estão patentes no ANEXO 5
Dada a falta de dados morfológicos e moleculares, foi-nos impossível garantir de que espécies se tratam. Porém, através dos cortes histológicos, é possível detetar algumas características nas cercárias, nomeadamente a presença de uma cauda comprida, o que nos permite concluir que se trata de cercárias pleurolofocercas ou cisticercas, e a presença de uma ventosa oral e uma ventosa ventral (cercárias distoma), e com uma forma foliácea.
35 CON-AQUA, Lda. PROBUR Tarefa n.º 6: Estudos de Mercado
Foi realizada uma viagem de prospeção ao norte da Escócia onde se pode confirmar a grande abundância de burriés nas costas ocidental (Edinburgo) e norte (ilhas Orcades), bem como o preço relativamente baixo pago aos apanhadores (cerca de 3€/Kg). De referir que as margens de lucro para os armazenistas são elevadas mas, no entanto, estes suportam da logística/transporte. As viagens previstas à Irlanda e a França não foram realizadas, dado que a dificuldade da obtenção de juvenis com boas taxas de crescimento e sobrevivência, conjugado com a relativa abundância no meio natural neste país visitado (apesar das dificuldades climáticas para a sua recolha), não fazia sentido o estudo de outros mercados.
Tarefa n.º 7: Avaliação dos Custos de Produção
O objetivo deste projeto era verificar a viabilidade técnica e económica da produção do burrié em cativeiro num sistema de cultura rentável. No entanto, porque infelizmente não houve produção significativa de burriés juvenis que nos permitisse encarar uma cultura de burriés com viabilidade, a avaliação dos custos de produção não foi realizada na íntegra.
Tarefa n.º 8: Realização de relatório final e conclusões obtidas
A compilação e avaliação de toda a informação obtida e analisada durante a execução deste projeto permitiu-nos chegar às seguintes conclusões: 1. O objectivo principal deste projecto não foi alcançado a produção do gastrópode burrié (L. littorea) em cativeiro a nível intensivo não se mostrou possível tendo em conta os resultados obtidos principalmente com a não obtenção de juvenis de burrié em número suficiente para a realização da fase posterior ou seja a engorda. No entanto, algumas das fases de produções foram estudadas em pormenor e obtidos alguns resultados importantes que seguidamente se especificam: 2. Espécie indígena com valor comercial relativamente elevado oscilando entre os 8 e 14€. 3. Sendo um animal herbívoro/omnívoro, na base da cadeia trófica, alimenta-se de um recurso abundante e de relativo baixo custo (Ulva spp.). 4. Robusta e resistente às condições de estabulação e manipulação, suportando altas densidades (comportamento gregário). No entanto, verificamos que em condições de estabulação artificial (aquários) prolongada (mais de 4 meses) os animais perdem o perióstraco o que resulta numa despigmentação crónica baixando desta forma o seu valor
36 CON-AQUA, Lda. PROBUR comercial. Estamos porém convictos que este fenómeno não ocorreria em sistemas de produção com condições mais próximas do natural (cultivo de ostras). 5. Foi confirmado que o transporte e a conservação em vivo dos burriés, não necessitam de cuidados técnicos especiais, bastando uma simples mala térmica para o seu acondicionamento. 6. A alga verde Ulva spp., espécie abundante, forneceu as necessidades nutricionais para a manutenção do “stock” saudável de reprodutores. 7. A maturação sexual e a desova natural foram facilmente obtidas em cativeiro e ainda foi possível através do controlo do fotoperíodo alterar e controlar a época de desova natural. 8. Os resultados obtidos na reprodução e obtenção de elevadas quantidades de ovos e larvas, permite-nos encarar eventuais repovoamentos desta espécie em vários locais da costa portuguesa. 9. Paralelamente, foi avaliada a possibilidade da produção da espécie Phorcus lineata, o falso burrié, por apresentar um ciclo de vida sem fase larvar planctónica e mais abundante na nossa costa, como alternativa ao verdadeiro burrié. 10. Contrariamente ao esperado, não foi possível manter os exemplares adultos de burrié com mortalidades baixas e crescimentos substanciais. 11. Será de considerar a futura possibilidade de produção de juvenis de burrié em sistema de “Sea ranching” através da utilização de redes com malha apropriada na sua estabulação nos taludes dos molhes e esporões da costa portuguesa. 12. A facilidade com que foi possível obter elevadas quantidades de ovos e larvas foi contrariada pela elevada mortalidade de juvenis (após o aparecimento da concha) e crescimentos insignificantes dos poucos sobreviventes. Só o sucesso nesta fase do ciclo de vida do burrié nos permitiria avaliar a sua capacidade de crescimento e engorda – o objetivo principal deste projeto.
37 CON-AQUA, Lda. PROBUR Anexo 1- Bibliografia
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40 CON-AQUA, Lda. PROBUR Anexo 2– Descrição dos sistemas de manutenção
Foram instalados 3 sistemas de recirculação iguais identificados por A, B e C. Cada um inclui 15 aquários de acrílico com capacidade de 15 l, dispostos em 3 níveis de 5 aquários cada (Fig. 1). Por ajustamento da altura do tubo de escoamento da água, o volume de água em cada aquário atingiu 10 l de modo a deixar uma margem seca de 5 cm de altura à disposição dos animais (Fig. 2). Uma bomba elevatória assegurou um fluxo de 1,2 l/min, em cada aquário. O filtro biológico de cada um dos três sistemas, instalado num aquário com um volume de 140 l, combina elementos de cerâmica e areia coralina (Fig. 3). Posteriormente foi acrescentada casca de ostra para equilíbrio do pH.
Para uma parte dos animais do último lote recebido (Lote 10b de 25.11.14) foi usado um outro sistema, já instalado na ELA e exposto ao fotoperíodo natural. Doravante este sistema será designado por Sistema F (Fig. 4). O objetivo foi comparar estes indivíduos, quanto à reprodução, mortalidade e crescimento, com os do mesmo lote que ficaram sujeitos a um fotoperíodo manipulado num dos três sistemas descritos inicialmente.
A conceção de todos os sistemas é semelhante mas este último inclui tanques em maiores, com 30 l de capacidade, mas devido à margem seca o volume de água efetivo foi de 25 l. O filtro biológico tem a capacidade total de 170 l. A bomba elevatória forneceu um fluxo de 1,5 l/min a cada aquário.
A instalação principal, composta pelos três sistemas iguais já descritos, foi preparada de modo a se poder controlar o fotoperíodo (Fig. 5). Para o efeito foram instaladas cortinas de folha plástica preta espessa para isolar os aquários do regime natural de luz. Na parede atrás de cada um dos sistemas foi fixada uma lâmpada fluorescente (Fig. 6). O período diário em que as lâmpadas se encontravam ligadas foi controlado através de relógios temporizadores, digitais e programáveis, aplicados nas respetivas tomadas.
LEGENDAS
1- Sistemas (A, B e C) de manutenção dos burriés na Estação Litoral da Aguda. 2- Aquário individual com animais. 3- Filtro biológico com rede camaroeira para recolha de ovos. 4- Sistema F. 5- Sistema preparado para a manipulação do fotoperíodo.
41 CON-AQUA, Lda. PROBUR
6- Iluminação artificial. 7- Animal a alimentar-se com alga (Ulva spp.). 8- Aquário com porção de rede de saco de ostra. 9- Animais sobre pedra calcária. 10- Rede camaroeira com ovos e detritos. 11- Ovos aderentes à parede do aquário. 12- Recolha de ovos após passagem por crivo de com malha de 550 µm. 13- Indivíduos em cativeiro claros (esq.) e indivíduos selvagens (dir.) com perióstraco intacto. 14- Animal com sinais de deterioração da concha. 15- Crescimento de algas nas paredes dos aquários
FIGURA 1
FIGURA 2 42 CON-AQUA, Lda. PROBUR
FIGURA 3
FIGURA 4
43 CON-AQUA, Lda. PROBUR
FIGURA 5
FIGURA 6
44 CON-AQUA, Lda. PROBUR
FIGURA 7
FIGURA 8
45 CON-AQUA, Lda. PROBUR
FIGURA 9
FIGURA 10
FIGURA 11
46 CON-AQUA, Lda. PROBUR
FIGURA 12
FIGURA 13
FIGURA 14
47 CON-AQUA, Lda. PROBUR
FIGURA 15
48 CON-AQUA, Lda. PROBUR CON-AQUA
O aquário consiste numa estrutura paralelepipedal com comprimento de 250cm, largura de 80cm e altura de 100cm, com um volume de água de aproximadamente 1200L (Figura 16). Dentro deste inseriram-se 2 alimentadores, com dimensões de 25cmx25cmx25cm (Figura 17), a fim de diminuir a libertação de restos ou pequenos fragmentos do alimento, permitindo assim um menor esforço de limpeza pelos filtros do aquário. A alimentação consistiu em Alface-do-mar (Ulva spp) “Ad Libitum” na sua maioria, mas também foi experimentado com sucesso outros tipos de alimento (alface e couve lombarda). Como era esperado, a que apresentou mais sucesso foi a alface-do-mar. Relativamente às condições ambientais o aquário encontra-se com uma salinidade média de 2.9 e temperatura de 18ºC. A população do burrié foi de cerca de 2000 indivíduos, onde ocorreu uma mortalidade de 10%, sendo que foi na sua maioria na pós desova, muito provavelmente por ser um momento de fragilidade destes organismos. A limpeza e manutenção do aquário, realizou-se semanalmente pela CON-AQUA.
Figura 16- Aquário utilizado pela Con-aqua Lda. no armazenamento da Littorina littorea.
49 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Figura 17- Alimentadores.
AQUATECNOR
Figura 18. Placas de Petri com juvenis de Littorina littorea, estando cada metade coberta com papel de alumínio de forma a ser-lhes proporcionada a presença simultânea de uma zona de luz e outra de obscuridade.
Figura 19. Sistema experimental com recirculação para juvenis de Littorina littorea. 50 CON-AQUA, Lda. PROBUR
ICBAS No laboratório de Fisiologia Geral do ICBAS, foram montados 4 aquários de vidro, com as dimensões de 60cmx30cmx30cm, com cerca de 30 a 40 litros de água do mar, para a manutenção de espécimes de Littorina (bem como de Monodonta). As amostragens semanais, para o estudo do desenvolvimento das gónadas destas duas espécies, foram realizadas quer em meio natural (Aveiro e Aguda) quer de animais provenientes destes aquários. Dois dos aquários serviam também para estabular as macroalgas (Ulva sp.) necessárias para a alimentação dos burriés. A salinidade (cerca de 2,8%) e a temperatura foram monitorizadas, pelo menos semanalmente. No laboratório de Engenharia Aquática do ICBAS foi montado um sistema de 4 tanques cilindro-cónicos para futura manutenção de uma população que se pretende mais estável para as referidas amostragens e posteriores manipulações do meio para obtenção de desovas.
Figura 20. Sistema experimental com recirculação para reprodutores de Littorina littorea.
Figura 21. Sistema experimental com recirculação para reprodutores de Littorina littorea.
51 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Figura 22. Sistema experimental com recirculação para reprodutores de Littorina littorea.
Figura 23. Sistema experimental com recirculação para reprodutores de Littorina littorea.
52 CON-AQUA, Lda. PROBUR Anexo 3 – Diferenciação dos sexos
Figura 24. Macho de Littorina com o pénis bem evidenciado.
Figura 25. Fêmea de Littorina
53 CON-AQUA, Lda. PROBUR Anexo 4 – Técnica histológica e aspetos de diferentes fases de desenvolvimento das gónadas. Procedimento histológico detalhado para gastrópodes
1. Retirar os burriés do aquário, e deixar fora de água em papel absorvente durante 20 min (1)
2. Pesar, com uma balança semi-analítica, registar dados (0,01g);
3. Com a ajuda de um paquímetro digital (2) medir em comprimento e largura máxima, registar dados (0,01 mm);
4. Anestesiar os animais com 7% MgCl2 (3) diluído 1:1 com água do mar, durante cerca de 2 horas. Certificar que os animais se mantêm submersos. (4)
5. Com a ajuda de um martelo, quebrar a concha com cuidado de forma a não danificar os tecidos;
6. Retirar a parte mais a posterior do corpo do caramujo, onde se localiza a gónada, e na lupa (5) retirar eventuais restos de concha;
7. Seguir o seguinte PROTOCOLO HISTOLÓGICO:
7.1. Fixação
Mergulhar a peça em fixador Bouin (6) com um volume 20x superior ao tamanho da peça, até um tempo máximo de 48h à temperatura ambiente*.
7.1.1 Em caso de necessidade de suspensão do processo, no fim da fixação:
Álcool a 50% durante 1h
Álcool a 50% durante 1h
Álcool a 70% durante 1h
Álcool a 75% até poder prosseguir com o restante protocolo, sendo o passo seguinte o ponto 7.2.2 da desidratação
7.2. Desidratação
7.2.1. Álcool a 70% durante 20 min;
7.2.2. Álcool a 90% durante 45 min;
7.2.3. Álcool a 95% durante 45 min;
7.2.4. Álcool a 100% durante 45 min;
7.2.5. Álcool a 100% durante 45 min;
54 CON-AQUA, Lda. PROBUR 7.2.6. Álcool a 100% durante 45 min;
7.2.7. Xilol (7) I durante 25 min;
7.2.8. Xilol II durante 25 min;
7.3. Impregnação
• Parafina (8) I a 58°C durante ± 2 horas;
• Parafina II a 58°C durante ± 2 horas;
8. Montar bloco no dispensador de parafina (9);
9. Registar o bloco e guardá-lo no frigorífico a ± 4°C;
10. Desmontar bloco do molde, limpar o excesso de parafina;
11. Proceder a cortes de 4 µm no micrótomo (10);
12. Secar as lâminas numa estufa a 37°C durante 24h;
13. Coloração Hemalumen-Eosina:
13.1. Hidratação
13.1.1. Xilol durante 10 minutos;
13.1.2. Álcool a 100% durante 5 min;
13.1.3. Álcool a 95% durante 5 min;
13.1.4. Álcool a 75% durante 5 min;
13.1.5. Álcool a 50% durante 5 min;
13.1.6. Água corrente 2 passagens;
13.2. Coloração
13.2.1. Hematoxilina (11) durante 3 min;
13.2.2. Água corrente durante 5 min;
13.2.3. Eosina (12) durante 5 min;
13.2.4. Água corrente 3 passagens
13.3. Desidratação
13.3.1. Álcool a 50% 3 passagens
13.3.2. Álcool a 75% 3 passagens
13.3.3. Álcool a 95% durante 3 min
55 CON-AQUA, Lda. PROBUR 13.3.4. Álcool a 100% durante 3 min
13.3.5. Álcool a 100% durante 3 min
13.3.6. Xilol durante 10 min
14. Montagem da lâmina com 1 gota de DPX (13) e lamela.
15. Observação Microscópica (14), fotografar (15) e medir ovócitos (16).
FOTOS DE MOCROSCOPIA DE LUZ DE FÊMEAS E MACHOS DE Littorina
56 CON-AQUA, Lda. PROBUR Anexo 5 – Imagens de parasitismo na Littorina
Amostra nº 59 (seta azul-ventosa ventral)
Amostra nº 199 (seta azul- ventosa ventral; seta vermelha-ventosa oral; seta amarela-cauda)
Amostra nº 699 (seta azul- ventosa ventral; seta amarela-cauda)
57 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Anexo 6– Monodonta, Osilinus ou Phorcus – uma questão de taxonomia/nomenclatura
Monodonta lineata
(Phorcus lineatus, Osilinus lineatus)
Outubro 2013
58 CON-AQUA, Lda. PROBUR Ana Rita Nascimento
INTRODUÇÃO
Phorcus lineatus é um gastrópode marinho com dimensões na idade adulta compreendidas entre os 25 a 30 mm de altura assim como de largura. A sua concha é cónica podendo ser observadas até 6 espirais, sendo a cor da concha variada entre o verde, o castanho e o cinzento, apresentando ainda marcas de cor castanha ou arroxeada, bastante regulares em ziguezague ao longo de quase toda a sua superfície. A última espiral domina a concha e acaba numa abertura circular, com uma proeminência na camada interior (seta na Fig. 1). A erosão da camada exterior da concha no seu ápex é comum em animais com mais idade. O animal em si é maioritariamente cinzento- Fig. 1 - Vista anterior e posterior de um esverdeado com numerosas linhas pretas ou roxas. Tem espécimen Phorcus lineatus. dois olhos pretos associados a um par de tentáculos que TAXONOMIA estão localizados na cabeça, sobre uma ‘boca’ bem desenvolvida. O pé muscular acinzentado e bem Reino TAXONOMIAAnimalia Filo Mollusca desenvolvido tem forma mais ou menos oval e está localizado ventralmente. Três pares de tentáculos Classe Gastropoda SubclasseReino AnimaliaProsobranchia acessórios estão presentes no exterior junto ao pé e OrdemFilo MolluscaVetigastropoda estão em extensão quando o animal está activo. ClasseFamília GastropodaTrochidae SubclasseGénero ProsobranchiaPhorcus OrdemEspécie VetigastropodaPhorcus lineatus Família Trochidae Género Phorcus Espécie Phorcus lineatus NOMENCLATURA Fig. 2 - Vista anterior e posterior de um espécimen Phorcus lineatus. Há alguma controvérsia quanto ao nome deste espécimen. Segundo a Worms Register of Marine Species, Phorcus Lineatus é o nome científico actualmente aceite, mas a maioria das referências são encontradas sob o nome Osilinus Lineatus, Monodonta lineata e algumas com Trochocochlea lineata, Turbo lineatus and Trochus crassus. No entanto, várias organizações diferentes aceitam nomes diferentes:
• - Marca o nome aceite por cada organização. World Register of Marine Species (WoRMS) Nome Relação
59 CON-AQUA, Lda. PROBUR
• Phorcus lineatus (da Costa, 1778) Aceite
Osilinus lineatus (da Costa, 1778) Sinónimo
NCBI Taxonomy Nome Relação • Osilinus lineatus Aceite
Monodonta lineata Sinónimo
Species 2000 & ITIS Catalogue of Life: April 2013 Nome Relação • Phorcus lineatus (da Costa, 1778) Aceite
Osilinus lineatus (da Costa, 1778) Sinónimo
História Em 1932 usava-se o termo Monodonta lineata (da Costa, 1778) para este espécimen, sendo que a maioria dos autores continuaram o uso deste nome desde 1930 até aos anos 90, apesar de em 1943 ter sido classificado como Osilinus lineatus. Em 1986, Cesari defendeu que Monodonta seria melhor considerada da sub-família Monodontinae que era composta por 4 géneros: Monodonta Lamarck, 1799, da Papua Nova Guiné e Austrália (Índico e Pacífico); Diloma Philippi, 1845, de África do Sul, Japão e Nova Zelândia; Austrocochlea Fischer, 1855, da Austrália; e Osilinus Philippi 1847 do Atlântico e Mediterrâneo. Esta terminologia começou a ser utilizada pela maioria dos autores europeus no final dos anos 90. Infelizmente, o nome Osilinus era um substantivo sinónimo da Austrocochlea. Trochocochlea Mörch, 1852 era o próximo nome disponível para esta espécie. Gerou-se tal confusão pela transferência do Osilinus da espécie do Atlântico/Mediterrâneo para a espécie da Austrália, que uma proposta foi feita à Comissão Internacional para manter Osilinus para a espécie europeia em 1997. Enquanto a Comissão ponderava, o nome Trochocochlea fez uma aparição temporária na literatura. Finalmente, em Setembro de 1999, a comissão decidiu a favor da proposta, e Trochocochlea foi classificado como rejeitado ou inválido na lista oficial de nomes em Zoologia. Em 2012, Donald afirmou que apesar do Osilinus lineatus ser classificado como um monodonte, esta espécie é morfologicamente e geneticamente distinta da Monodonta. A partir desta data, o nome aceite passou a ser o Phorcus lineatus.
60 CON-AQUA, Lda. PROBUR DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA e HABITAT
Sendo uma espécie atlântica é encontrado junto a locais costeiros abrigados por rochas, tendo uma distribuição alargada, habitando as zonas costeiras desde as ilhas britânicas até Marrocos e Madeira (Fig. 2). Esta espécie está presente em toda a costa de Portugal assim como no sudoeste de Espanha até ao estreito de Gibraltar e daí até Marrocos (sem entrar no Mediterrâneo) No entanto, apesar do típico Phorcus lineatus ser encontrada no norte de Portugal, quando se desce a costa até ao Algarve, este torna-se muito mais difícil de identificar porque existe com muito maior variabilidade de cor. Esta espécie tem preferência pela metade superior da zona intermareal, no entanto, esta preferência altera-se consoante a estação em algumas zonas costeiras.
Madeira
ANATOMIA Fig. 3 - Distribuição geográfica da espécie Phorcus lineatus ( ). Madeira
61 CON-AQUA, Lda. PROBUR CONCHA
O Phorcus lineatus tal como outros gastrópodes produz uma concha em volta de si próprio para o proteger dos riscos bióticos e abitóticos do meio ambiente. Esta concha é impermeável a gases e líquidos e surpreendemente resistente ao esmagamento. O indivíduo jovem (no estado larvar) começa a produzir uma concha a partir do manto, adicionando Fig. 4 - Phorcus lineatus com progressivamente novos materiais ao longo da sua vida sempre desgaste do ápex. que existam condições favoráveis para tal. Assim o ápex é o Fonte:http://www.schelpengruis.nl/hed- gast/phorcus%20lineatus.htm local mais antigo da concha e o lábio junto ao opérculo o mais recente. É comum o desgaste do ápex devido a areias ou outros materiais abrasivos que podem desgastar a camada exterior (Fig.3). Existem linhas de crescimento em toda a concha, paralelas à abertura que indicam antigas posições da mesma aquando de interrupções no crescimento, pois este não é contínuo e depende das condições externas.
CORPO
O corpo é cinzento-esverdeado (Desai, 1865), e a sua anatomia está representada na Fig. 4. Os seus órgãos mantêm-se sempre no interior de uma espécie de invólucro fechado, o manto. A borda do manto tem vários órgãos sensoriais e as células responsáveis por segregar as camadas exteriores da nova concha. O interior da concha é nacarado, sendo secretado pela superfície exterior do manto. O poderoso músculo columelar mantém o animal aderente à sua concha e, por contracção, permite que o corpo se recolha com segurança para o seu interior (o topo da cabeça é recolhido em primeiro lugar, seguido da extremidade dianteira do pé e, finalmente, o opérculo - que actua como uma porta vedando a abertura). Para respirar, o Phorcus lineatus tem uma brânquia que lhe permite a oxigenação na água e uma cavidade do manto bem vascularizada que lhe permite respirar fora de água.
62 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Fig. 7 – Anatomia do Phorcus lineatus.
ALIMENTAÇÃO
Phorcus lineatus é um herbívoro micrófago, alimentando-se de algas microscópicas que raspa na superfície das rochas usando a rádula tipo escova presente na sua língua. Normalmente alimentam- se durante a noite ou quando a maré está cheia (Crothers, 2001).
REPRODUÇÃO
A reprodução do Phorcus lineatus dá-se externamente, ou seja, ambos os sexos libertam os seus gâmetas no mar, ocorrendo assim a fertilização na água. Assim, os machos emitem uma ‘nuvem’ de
63 CON-AQUA, Lda. PROBUR esperma que não mostra muito movimento inicialmente, mas que após 2-3 minutos se torna muito activa. Simultaneamente, as fêmeas libertam os ovócitos em espasmos, poucos de cada vez. Este tipo de fertilização é uma estratégia de risco e dificilmente é realizada com sucesso a não ser que a espécie em determinado local seja muito comum, isto porque a sincronização da gametogénese dentro da população, seguida da libertação simultânea dos gâmetas, por machos e fêmeas, é essencial. Em habitats sujeitos a flutuações imprevisíveis no ambiente físico, isto pode não acontecer, pois por exemplo uma mudança súbita de temperatura poderá fazer com que um grupo inteiro não se reproduza (devido a fases diferentes de maturação e libertação dos gâmetas). Nestas circunstâncias, ocorre por vezes reprodução não sincronizada durante um longo período de tempo (períodos alternados de reprodução dentro do mesmo grupo). No Phorcus lineatus já foram observados estes dois tipos de reprodução: simultânea e não sincronizada. Existem 8 estágios no seu ciclo reprodutivo: 5 correspondentes ao desenvolvimento/maturação das gónadas e 3 relativos à desova (Fig.5).
Desova completa Parcialmente Inactivo desovado
Fecundação
Desova Estágios de Início da
Desenvolvimento maturação
Maturação
Completa Desova
EstágiosViab de Desenvolvimento ilida Aumento progressivo de de tecido das gónadas
econ Fig. 8 - Fases que compõem o ciclo reprodutivo do Phorcus lineatus.
ómi Relativamente à identificação dos sexos, esta pode ser bastante difícil. Nos últimos estados de maturação das gónadas é possível distinguirca ♂e de ♀ macroscopicamente pois apresentam aspectos bastante distintos (Tabela 1). No entanto, quando o espécimen(s) a estudar não se encontram nesses estados, a única característica que os distingueciclo é abertura urogenital, que nas fêmeas apresenta os bordos amarelos e ‘inchados’, enquanto no macho os bordos são não pigmentados e mais pequenos. de Macroscopia Microscopia ♂ vida ♀ ♂ ♀ Oócitos 25µm
Estágio I Gónadas comdo coloração Ø (Final de Agosto) acastanhada Epitélio germinativo mal-definido Phor Oócitos 45µm Ø, aderentes a Epitélio Estágio II Irregularmente trabéculas num Breeding Esverdeadas germinativo com esverdeadas epitélio (Outubro) cus espermatogónias germinativo linea bem-definido, 64 tus CON-AQUA, Lda. PROBUR
separados por tecido conjuntivo Ocorre a gametogénese Oócitos (>50 µm Ø) tornam- se evidentes nas camadas Estágio III Gónadas ‘‘inchadas’’ e superficiais dos Presença de uniformemente esverdeadas ovários (Janeiro) espermátides e Estrutura espermatócitos honeycomb do tecido conjuntivo mais bem- definida Oócitos em Pigmentação vários estados amarelada/ Intensamente de maturação Espermatozóides Estágio IV rosada com pigmentado livremente presentes (Fevereiro a Maio) estrias (verde) presentes no esverdeadas tecido conjuntivo Praticamente Pigmentação Intensamente Espermatozóides todos os Estágio V amarelada ou pigmentado presentes e activos oócitos (Maio) rosada (verde) maturos Spawning (I,II e III) (Junho a final de Agosto) Tabela 1 - Aspectos macroscópicos e microscópicos das gónadas em diferentes fases do ciclo reprodutivo.
Quando se dá a desova, os ovos (165- 195μm) são expelidos pelas fêmeas, mas em contacto com a água do mar, o revestimento externo gelatinoso dilata-se fazendo com que o ovo flutue na água. Mas em 20min (15-17ºC), essa camada gelatinosa dissocia-se, fazendo com que o ovo se afunde. 29 horas depois da fecundação as larvas saem dos ovos, e em 4 dias as larvas começam a fazer várias tentativas para rastejar sobre o substrato em vez de nadar. Aos 6 dias de idade o hábito de rastejar está totalmente desenvolvido, tendo a concha cerca de 1mm de diâmetro.
Fig. 9 - Representação da expansão da camada gelatinosa do ovo. (Adaptado de Desai, 1966)
O manto começa a crescer extensivamente assim como a concha. O epipodium forma-se durante a 5ª semana de desenvolvimento. Com 2 meses de idade, o Phorcus já tem 3 tentáculos e podem observar-se movimentos de alimentação sendo que a rádula já apresenta dentes central, lateral e marginalmente, estando assim apto e semelhante a um espécimen adulto.
65 CON-AQUA, Lda. PROBUR REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Desai, B. N. (1966). The Biology of Monodonta Lineata (da Costa). Proc. malac. Soc. Land, pp. 1-17.
Underwood, A. J. (1972). Observations on the Reproductive Cycles of Monodonta lineata, Gibbula umbilicalis and G. Cineraria. Marine Biology, pp. 333-340.
Bode, A. L. (1987). Preliminary studies on the reproduction and population dynamics of Monodonta lineata and Gibbula umbilicalis (Mollusca, Gastropoda) on the central coast of Asturias (N.Spain). Hydrobiologia, pp. 31-39
Gofas, S., Jabaud, A., (1997). The relationships of the Mediterranean trochid gastropods ‘Monodonta’ mutabilis (Philippi, 1846) and ‘Gibbula’ richardi (Payraudeau, 1826). J. Moll. Stud. 63, 57–64.
Crothers, J. H. (2001). Common Topshells: An Introduction to the biology of Osilinus Lineatus with notes on other species in the genus. Field Studies, pp. 115-160.
Mieszkowska, N. H. (2007). Long-term changes in the geographic distribution and population structures of Osilinus lineatus (Gastropoda: Trochidae) in Britain and Ireland. J. Mar. Biol. Ass. U.K. , pp. 537–545.
Donald KM et al (2012). Phylogenetic relationships elucidate colonization patterns in the intertidal grazers Osilinus Philippi, 1847 and Phorcus Risso, 1826 (Gastropoda: Trochidae) in the northeastern Atlantic Ocean and Mediterranean Sea. Molecular Phylogenetics and Evolution 62: 35–45.
Journal of Molluscan Studies - British and Danish Prosobranchs: Monodonta Lineata (Da Costa). Oxford Journals.
World Register of Marine Species. Obtido em Setembro de 2013, de http://www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=689176
66 CON-AQUA, Lda. PROBUR Anexo 7- Ciclo reprodutivo da espécie Phorcus lineatus
Viabilidade económica e ciclo de vida do Phorcus lineatus
Projeto de licenciatura em Ciências do Meio Aquático
Viabilidade económica e ciclo de vida do Phorcus
lineatus
Projeto de licenciatura em Ciências do Meio Aquático
Fonte: MarLIN
Fonte: MarLIN
Sara Silva Jorge Maio de 2014 Orientador: Fernando Carvalho 67
Maio de 2014
CON-AQUA, Lda. PROBUR Introdução – O projeto
A 21 de Fevereiro de 2014, começou a ser desenvolvido no laboratório de Fisiologia Animal do Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, paralelamente ao projeto de investigação PROBUR, o projeto Phorcus lineatus. Os objetivos principais deste projeto consistem em confirmar se é viável produzir o Phorcus lineatus em cativeiro e conseguir fechar pela primeira vez o ciclo reprodutivo da espécie em questão, uma vez que este feito nunca foi alcançado anteriormente pelos investigadores a nível mundial.
1. A espécie e a respetiva distribuição
O Phorcus lineatus é um gastrópode marinho, que pode viver até aos quinze anos de idade (Crothers, J. H. 2001), contudo alguns autores consideraram que uma média de dez anos para este molusco já é excessiva, e que em baixas latitudes a esperança de vida ainda é mais reduzida. (Mieszkowska N., Hawkins S.J., Burrows M.T. and Kendall M.A. 2007).
O molusco em causa é um herbívoro raspador, alimentando-se à base de algas microscópicas predominantemente presentes nos biofilmes das superfícies rochosas (Mieszkowska N., Hawkins S.J., Burrows M.T. and Kendall M.A. 2007), o que por sua vez difere da espécie Littorina littorea que se alimenta de macroalgas.
Este gastrópode é uma espécie gregária, tendo ocupado os nichos ecológicos onde habitava o Littorina littorea. Apesar de poder ser encontrado em todas as zonas constituintes do eulitoral, este habita preferencialmente na zona intertidal, encontrando-se fixo ao substrato rochoso na mesma ou a alimentar-se na parte superior da zona intertidal. (Crothers, J. H. 2001).
A nível geográfico, habita no Atlântico Nordeste, encontrando-se os seus limites a norte no país de Gales e Irlanda, e os seus limites orientais a nível do sul de Inglaterra. A sua distribuição engloba a costa portuguesa, espanhola, francesa, e atinge os seus limites a sul em Marrocos. (Mieszkowska N., Hawkins S.J., Burrows M.T. and Kendall M.A. 2007).
2. Nomenclatura
Durante a realização da pesquisa bibliográfica deste trabalho chegou-se à conclusão de que o nome deste molusco é de facto um nome que tem sido constantemente modificado ao longo dos anos, face a uma acentuada disputa quanto à forma que se considera como correta de denomina-lo. O nome que é mundialmente aceite como o mais correto para denominar a espécie em causa segundo a ICNZ (“ Comissão Internacional de Nomenclatura Zoológica”), é Osilinus lineatus. (Crothers, J. H. 2001).
Apesar deste facto, este gastrópode é frequentemente denominado por Monodonta lineata, e em 2012 procedeu-se à substituição deste nome por Phorcus lineatus.
Deste modo, para saber dados sobre a espécie deve-se começar por pesquisar com Osilinus lineatus, 68 CON-AQUA, Lda. PROBUR seguindo-se por Monodonta lineata e finalmente por os outros sinónimos da mesma, que se encontram referidos no anexo de sistemática no fim deste trabalho. Relativamente ao nome Phorcus lineatus, por ser o nome científico mais recente, a informação disponibilizada sobre o mesmo é praticamente nula, não sendo por isso muito aconselhada.
3. Materiais e Métodos
3.1. Trabalho desenvolvido em laboratório
Em laboratório, os animais têm sido mantidos em dois aquários juntamente com a espécie Littorina littorea, sendo o número médio de Phorcus lineatus no primeiro aquário 10 e 15 no segundo. Este valor de indivíduos contudo é muito subjetivo, uma vez que estão constantemente a ser utilizados para fixação histológica, e também não se está a ter em conta o nº de indivíduos que vão chegando ao laboratório para serem utilizados no projeto de investigação.
Durante o decorrer da sifonagem dos aquários e da respetiva manutenção que era feita semanalmente, eram retirados os moluscos mortos.
Os moluscos eram capturados essencialmente na Ria de Aveiro, e o Phorcus lineatus apresentava- se sempre em maior quantidade relativamente à espécie Littorina littorea.
Até ao momento foram realizados um total de 91 blocos de parafina.
Os procedimentos histológicos aplicados desde a fixação dos animais até à coloração das lâminas são os mesmos que foram aplicados para a espécie do projeto PROBUR.
Os tempos que compõe cada uma das diferentes etapas, assim como a especificação de cada uma delas, encontram-se descritos nos anexos presentes no fim deste trabalho.
Por cada fixação que ocorre semanalmente, têm sido fixados dez moluscos.
Relativamente à mortalidade presenciada em ambos os aquários até ao momento, pode-se constatar que esta revelou-se insignificante, e verificou-se ainda que apesar de as taxas de mortalidade serem semelhantes, os indivíduos de Phorcus lineatus revelaram-se mais resistentes que os pertencentes à espécie Littorina littorea.
Para além do trabalho que tem vindo a ser desenvolvido neste período de tempo, foi realizada ainda a observação do sedimento à lupa que era recolhido durante a sifonagem dos aquários, com intuito de proceder à observação dos ovos dos seres vivos e das larvas velígeras.
A alimentação dos animais durante o período de tempo decorrido foi feita à base de ulva.
69 CON-AQUA, Lda. PROBUR 4. Caracterização da reprodução e do ciclo de vida
A espécie em estudo é gonocórica, exibindo assim sexos separados. Apesar de estes gastrópodes serem dioicos, não se consegue diferenciar os machos das fêmeas a olho nu, sendo que o único modo possível de o fazer é recorrendo a processos histológicos, quando as suas gónadas se encontram completamente maduras, ou pela aparência da abertura urogenital, cujos lábios numa fêmea matura se encontram inchados e amarelados, e despigmentados e de reduzidas dimensões nos exemplares masculinos. (Desai BN (1966); Crothers, J. H. 2001).
O autor Desai em 1959 produziu um índice gonadal baseado em um índice anteriormente feito em 1956 por Orton para o gastrópode Patella vulgatta, no qual reconheceu cinco fases de desenvolvimento das gónadas e três épocas de desova. (E. E. Williams (1965)).
Uma fêmea que se encontre no ápice do estado de maturação possui um ovário com uma cor variante entre o acinzentado e o verde, com ovócitos maturos no seu interior, e que em termos de localização vai envolver a glândula digestiva e as vísceras. O testículo de um macho maturo exibe uma coloração creme e armazenado no seu interior existem espermatozoides ativos (Desai BN (1966)).
A época de reprodução compreende os meses que vão de Junho a Novembro. (Crothers, J.H. (1994)).
Os juvenis tornam-se sexualmente maturos com dois anos de idade. (Mieszkowska N., Hawkins S.J., Burrows M.T. and Kendall M.A. (2007)).
Fora da época reprodutiva (Setembro a Fevereiro), quer a gónada feminina quer a masculina, permanecem umas estruturas com aparência vazia a acastanhada. Com o começo da gametogénese ambas as gónadas começam a inchar e adquirem cor verde. Com o amadurecimento destas, o ovário fica com uma cor entre o verde e o cinzento no fim de Maio, e o testículo adquire uma cor roseada ou creme. A desova decorre ao longo de Verão e início do Outono, e posteriormente a esta fase as gónadas retornam à sua forma original. (Underwood A.J (1972)).
A fertilização e a fecundação são externas, sendo que os ovos com 165 a 250 µm são libertados em pequena quantidade e individualmente para a coluna de água a partir dos mantos das fêmeas, enquanto os machos simultaneamente libertam esperma em grande quantidade para a mesma. Os ovos estão revestidos por uma substância gelatinosa que em contacto com água, incha, dando aos mesmos a capacidade de parcialmente flutuarem. Após 20 minutos, esta desintegra-se e os ovos afundam. Os ovos contêm vitelina, que vai servir para alimentar as larvas até à altura de eclosão, que sucede próximo das 29 horas após a fertilização. Quando a eclosão acontece as larvas apresentam-se sob a forma velígera, e passado quatro dias após a fertilização, as larvas começam com tentativas repetitivas de rastejar sob o substrato. Passados seis dias da fertilização, as larvas têm 1 mm de diâmetro e já exibem a capacidade de rastejar completamente desenvolvida. ((Crothers, J. H. (2001)).
70 CON-AQUA, Lda. PROBUR Os indivíduos mais novos geralmente aparecem anualmente na costa nos meses de Agosto ou Setembro. A passagem de juvenis a adultos é extremamente rápida, enquanto o crescimento dos gastrópodes Phorcus lineatus quando estes já são adultos ocorre lentamente (Crothers, J. H. (2003)).
Os indivíduos em estudo nunca exibiram nenhum tipo de corte, pressupondo-se assim que os cruzamentos entre os dois géneros se deu de forma aleatória (Crothers, J. H. (2003)).
5. Anatomia
Anatomicamente o Phorcus lineatus possui alguns caracteres externos que possibilitam uma distinção relativamente ao caramujo Littorina littorea. Destas características destacam-se a presença de um opérculo circular; a existência de uma camada madrepérola no interior da sua concha, que se pode tornar visível, quando ocorre a erosão da camada externa ou colorida da concha; o padrão em ziguezague na sua concha; e a existência de um umbilico. (Crothers, J. H. (2001)).
O umbilico nos indivíduos adultos contrariamente aos exemplares mais novos encontra-se fechado. (Crothers, J. H. (2003)).
O opérculo deste gastrópode visa proteger a cabeça do mesmo contra predadores. (Crothers, J. H. (2001)).
O bordo do manto suporta inúmeros órgãos sensoriais e células, cuja função consiste na secreção de camadas exteriores da concha. (Crothers, J. H. (2001)).
Estes animais possuem na sua constituição a columela, que corresponde a um músculo que “liga” o animal á sua concha, o que permite que quando ocorre o mecanismo de contração, o corpo do molusco seja recolhido para o interior da concha de uma forma segura. (Crothers, J. H. (2001)).
O Phorcus lineatus tem tentáculos sensoriais (um par na cabeça e três pares no pé) e uns olhos muito desenvolvidos, o que lhe permite fazer uma análise muito eficaz do substrato. Os tentáculos epipodiais encontram-se ausentes em grupos de caramujos mais avançados, tais como o Littorina littorea (Crothers, J. H. (2001)).
A sua brânquia está localizada numa cavidade no interior do manto, e é provida de cílios. (Crothers, J. H. (2001)). O crescimento em espessura da concha dá-se em toda região do manto, enquanto o crescimento em extensão só ocorre ao longo do bordo do manto. (Crothers, J. H. (2001)).
No Inverno, o seu crescimento fica suspenso durante vários meses, podendo ser observada na sua concha um crescimento conspícuo. A contagem dos diferentes anéis de crescimento dá uma ideia do número de invernos que a espécie sobreviveu, o que por sua vez permite determinar a sua taxa de crescimento e dividir a população em estudo em diferentes classes de idade. Este método de Figura 1 - Marcas de crescimento conspícuo determinação de idade e crescimento é contudo subjetivo, uma vez
71 CON-AQUA, Lda. PROBUR que os anéis de crescimento também se podem formar em alturas como o sofrimento de danos nesta estrutura. (Crothers, J. H. (2003)).
Na sua alimentação, estes moluscos utilizam uma estrutura denominada rádula, que se encontra situada na base da sua boca, e que consiste em filas de dentes quitinosos de pequenas dimensões que vão permitir a estes animais rasparem os alimentos. Esta atividade deixa gravado no substrato um padrão único que difere entre as diversas espécies de caramujos, uma vez que a estrutura das suas rádulas difere entre elas (Crothers, J. H. (2001.)).
72 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Figura 2 - Anatomia de uma fêmea de Phorcus lineatus
73 CON-AQUA, Lda. PROBUR 6. Patologias
Durante a realização da pesquisa bibliográfica, não foi encontrado nenhum tipo de evidência de que o Phorcus lineatus levasse ao aparecimento de algum tipo de doença específica que afetasse significativamente o ser humano ou outros seres vivos.
Esta espécie pode no entanto, servir como um bioindicador de metais pesados na água onde habita. No caso do Phorcus lineatus, este é especialmente sensível aos metais cádmio, cobre e zinco, mesmo em áreas pouco contaminadas, que devido à sua dificuldade em regular a concentração destes metais nos tecidos corporais, acabam por acumulá-los nos mesmos (I. Cunha, E. Mangas- Ramirez e L. Guilhermino; 2007).
O Phorcus lineatus assim como outros caramujos funcionam ainda como hospedeiros a uma diversidade significativa de diferentes bactérias nas suas vísceras. (Vijaya K. Pratheepa, Marisa Silva e Vitor Vasconcelos; 2014).
7. Resultados
No decorrer deste projeto, foram avaliados os parâmetros salinidade, oxigénio dissolvido, temperatura e pH da água de ambos aquários, tendo sido obtido uma média de 25,8‰ no aquário 1 e 26,8‰ no 2 para a salinidade. Em relação ao oxigénio dissolvido, foi apresentado um valor médio de 8,87 mg/L para o primeiro aquário e 8,76 mg/L para o segundo. No caso do pH, em média manteve-se um valor de 7, 76 no aquário 1 e 7,87 no 2. A temperatura média do aquário 1 até ao momento é aproximadamente 19,3 °C, e relativamente ao segundo aquário manteve-se uma média de 19,7 °C. Os indivíduos que foram fixados histologicamente apresentavam um peso médio de 2,85 gramas, e um comprimento e largura médios de 13,92 milímetros e 17,06 milímetros, respetivamente.
8. Anexos
74 CON-AQUA, Lda. PROBUR 8.1. Amostragens 8.2. Parâmetros da qualidade da água dos aquários
Origem Fixação Data de entrega Bloco Processamento e inclusão Peso (g) Comprimento (mm) Largura(mm) Aquário 2 05/02/2014 29/jan 46.2014 10/02/2014 3,48 16,33 18,51 Aquário 2 05/02/2014 29/jan 47.2014 10/02/2014 1,99 13,17 15,28 ciimar 05/02/2014 04/02/2014 48.2014 10/02/2014 1,32 11,56 12,82 ciimar 05/02/2014 04/02/2014 49.2014 10/02/2014 5 20,28 21,46 ciimar 05/02/2014 04/02/2014 50.2014 10/02/2014 2,49 14,14 17,73 ciimar 05/02/2014 04/02/2014 51.2014 10/02/2014 2,35 11,32 17,22 ciimar 05/02/2014 04/02/2014 52.2014 10/02/2014 2,58 11,13 16,3 Ria de Aveiro 12/02/2014 12/02/2014 63.2014 14/02/2014 4,74 20,83 19,51 Ria de Aveiro 12/02/2014 12/02/2014 64.2014 14/02/2014 4,47 19,75 19,21 Ria de Aveiro 12/02/2014 12/02/2014 65.2014 14/02/2014 3,05 18,27 16,47 Ria de Aveiro 13/02/2014 12/02/2014 76.2014 14/02/2014 6,29 15,89 21,4 Ria de Aveiro 13/02/2014 12/02/2014 77.2014 14/02/2014 6,03 21,96 21,53 Ria de Aveiro 13/02/2014 12/02/2014 78.2014 14/02/2014 2,9 13,87 17,44 Ria de Aveiro 13/02/2014 12/02/2014 79.2014 14/02/2014 2,69 12,72 17,06 Ria de Aveiro 13/02/2014 12/02/2014 80.2014 14/02/2014 4,03 16,67 19,24 Ria de Aveiro 13/02/2014 12/02/2014 81.2014 14/02/2014 2,45 11,94 17,71 Ria de Aveiro 13/02/2014 12/02/2014 82.2014 14/02/2014 3,44 14,5 17,7 Ria de Aveiro 13/02/2014 12/02/2014 83.2014 14/02/2014 2,74 14,83 18,84 Ria de Aveiro 13/02/2014 12/02/2014 84.2014 14/02/2014 3,27 16,95 19,21 Ria de Aveiro 13/02/2014 12/02/2014 85.2014 14/02/2014 2,27 13,66 15,3 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 136 19/03/2014 1,97 13,26 14,45 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 137 19/03/2014 1,51 10,91 13,71 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 138 19/03/2014 2 14,53 14,26 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 139 19/03/2014 2,15 15,52 15,29 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 140 19/03/2014 2,1 13,92 15,19 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 141 19/03/2014 1,89 14,81 14,35 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 142 19/03/2014 1,7 11,32 13,64 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 143 19/03/2014 1,93 11,38 14,13 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 144 19/03/2014 2,21 14,91 15,02 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 145 19/03/2014 1,83 10,2 14,21 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 146 19/03/2014 1,68 11,5 12,93 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 147 19/03/2014 2,06 11,84 14,77 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 148 19/03/2014 1,65 10,15 13,78 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 149 19/03/2014 1,98 13,99 14,36 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 150 19/03/2014 3,31 17,95 17,41 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 151 19/03/2014 2,85 14,3 16,04 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 152 19/03/2014 1,99 10,2 15,1 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 153 19/03/2014 1,71 12,94 13,72 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 154 19/03/2014 1,94 11,74 14,3 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 155 19/03/2014 1,66 12,38 13,18 Habitat natural; Praia do Norte 17/03/2014 17/03/2014 156 19/03/2014 1,7 13,5 13,33 Aquário 2 15/04/2014 12/02/2014 218 17/03/2014 4,1 15,61 19,62 Aquário 2 15/04/2014 12/02/2014 219 17/03/2014 2,13 14,05 15,15 Aquário 2 15/04/2014 12/02/2014 220 17/03/2014 4,46 14,05 19,08 Aquário 2 15/04/2014 12/02/2014 221 17/03/2014 3,43 12,72 16,43 Aquário 2 15/04/2014 12/02/2014 222 17/03/2014 3,07 13,54 16,85 Aquário 2 15/04/2014 12/02/2014 223 17/03/2014 2,6 12,15 16,73 Aquário 2 15/04/2014 12/02/2014 224 17/03/2014 2,33 11,25 15,43 Aquário 2 15/04/2014 12/02/2014 225 17/03/2014 2,72 11,55 16,26 Aquário 2 15/04/2014 12/02/2014 226 17/03/2014 2,63 11,48 16,05 Aquário 2 15/04/2014 12/02/2014 227 17/03/2014 2,71 13,52 17,14 Aquário 2 28/04/2014 12/02/2014 238 30/04/2014 3,72 14,27 18,72 Aquário 2 28/04/2014 12/02/2014 239 30/04/2014 2,23 11,83 15,48 Aquário 2 28/04/2014 12/02/2014 240 30/04/2014 2,43 11,3 15,3 Aquário 2 28/04/2014 12/02/2014 241 30/04/2014 2,62 12,63 15,98 Aquário 2 28/04/2014 12/02/2014 242 30/04/2014 2,08 11,74 15,47 Aquário 2 28/04/2014 12/02/2014 243 30/04/2014 3,52 15 17,43 Aquário 2 28/04/2014 12/02/2014 244 30/04/2014 2,74 12,07 16,58 Aquário 1 28/04/2014 15/01/2014 245 30/04/2014 1,82 9,92 14,63 Aquário 1 28/04/2014 15/01/2014 246 30/04/2014 3,05 16,4 11,14 Aquário 1 28/04/2014 15/01/2014 247 30/04/2014 2,33 11,2 14,6 Ria de Aveiro; Habitat natural 07/05/2014 07/05/2014 268 09/05/2014 6,61 19,06 21,77 Ria de Aveiro; Habitat natural 07/05/2014 07/05/2014 269 09/05/2014 6,81 18,54 22,03 Ria de Aveiro; Habitat natural 07/05/2014 07/05/2014 270 09/05/2014 6,25 18,45 22,16 Ria de Aveiro; Habitat natural 07/05/2014 07/05/2014 271 09/05/2014 6,36 16,61 21,3 Ria de Aveiro; Habitat natural 07/05/2014 07/05/2014 272 09/05/2014 4,02 13,7 19,01 Ria de Aveiro; Habitat natural 07/05/2014 07/05/2014 273 09/05/2014 3,94 15,62 18,03 Ria de Aveiro; Habitat natural 07/05/2014 07/05/2014 274 09/05/2014 7,44 17,06 21,93 Ria de Aveiro; Habitat natural 07/05/2014 07/05/2014 275 09/05/2014 2,77 14,9 16,03 Ria de Aveiro; Habitat natural 07/05/2014 07/05/2014 276 09/05/2014 6,92 20,57 22,14 Ria de Aveiro; Habitat natural 07/05/2014 07/05/2014 277 09/05/2014 3,06 15,03 16,44 Ria de Aveiro; Habitat natural 16/05/2014 07/05/2014 288 26/05/2014 4,42 15,28 20,53 Ria de Aveiro; Habitat natural 16/05/2014 07/05/2014 289 26/05/2014 6,17 16,88 23,67 Ria de Aveiro; Habitat natural 16/05/2014 07/05/2014 290 26/05/2014 3,63 15,34 18,59 Ria de Aveiro; Habitat natural 16/05/2014 07/05/2014 291 26/05/2014 2,74 12,37 16,46 Ria de Aveiro; Habitat natural 16/05/2014 07/05/2014 292 26/05/2014 5,01 16,36 20,46 Ria de Aveiro; Habitat natural 16/05/2014 07/05/2014 293 26/05/2014 2,27 11,8 15,75 Ria de Aveiro; Habitat natural 16/05/2014 07/05/2014 294 26/05/2014 3,66 13,19 18,61 Ria de Aveiro; Habitat natural 16/05/2014 07/05/2014 295 26/05/2014 6,08 17,23 23,33 Ria de Aveiro; Habitat natural 16/05/2014 07/05/2014 296 26/05/2014 3,15 13,55 17,73 Ria de Aveiro; Habitat natural 16/05/2014 07/05/2014 297 26/05/2014 5,16 17,09 21,03 Ria de Aveiro; Habitat natural 23/05/2014 07/05/2014 308 26/05/2014 3,74 13,82 18,47 Ria de Aveiro; Habitat natural 23/05/2014 07/05/2014 309 26/05/2014 3,56 12,95 17,84 Ria de Aveiro; Habitat natural 23/05/2014 07/05/2014 310 26/05/2014 0,75 7,91 11,73 Ria de Aveiro; Habitat natural 23/05/2014 07/05/2014 311 26/05/2014 6,13 16,15 21,95 Ria de Aveiro; Habitat natural 23/05/2014 07/05/2014 312 26/05/2014 3,22 12,99 18,02 Ria de Aveiro; Habitat natural 23/05/2014 07/05/2014 313 26/05/2014 3,23 13,2 18,16 Ria de Aveiro; Habitat natural 23/05/2014 07/05/2014 314 26/05/2014 4,83 15,51 20,3 Ria de Aveiro; Habitat natural 23/05/2014 07/05/2014 315 26/05/2014 4,73 17,39 19,9 Ria de Aveiro; Habitat natural 23/05/2014 07/05/2014 316 26/05/2014 8,12 19,69 23,84 Ria de Aveiro; Habitat natural 23/05/2014 07/05/2014 317 26/05/2014 4,77 15,48 20,64 75 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Data O2 dissolvido (mg/L) Temperatura (ºC) pH Salinidade (‰) Observações 30/01/2014 9,3 19,3 7,99 39,1/ Final: 28,2 SJ; Acrescentei água doce para baixar salinidade; 9h05 05/02/2014 8,84 21,3 7,63 28 SJ; Retirei bomba para diminuir a temperatura 17/02/2014 9,53 15,8 7,36 39,5/ Final : 27 SJ; Acrescentei água doce para baixar salinidade 21/02/2014 9,19 17,2 7,39 30/ Final : 27,2 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade 25/02/2014 9,82 16,4 7,56 22,3/ Final : 25 SJ; Adicionei água salgada para aumentar a salinidade; 2 Pl mortas; trocou-se as pedras difuoras entre o aquário 1 e 2 28/02/2014 8,59 19,7 7,41 23/ Final: 25 SJ; Adicionei água salgada para aumentar a salinidade; 17h02 03/03/2014 8,61 18,6 7,36 26,2 SJ; 15h37 04/03/2014 8,86 17,9 7,32 27 SJ 07/03/2014 8,82 18,3 7,93 26,1 SJ; 15h50 10/03/2014 7,54 20 7,82 26,2 SJ; 16h16 14/03/2014 6,74 19,7 7,79 26,5 SJ; Trocou-se a pedra difusora; 16h53 17/03/2014 8,53 20,2 7,8 25,1 SJ; 17:00 21/03/2014 8,77 20 7,9 29/ Final :25,9 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 15h50 24/03/2014 8,72 19,1 7,84 27,1 SJ; 1 Ll morta; 17h07 25/03/2014 8,67 19,6 7,81 27 SJ; 10h50 04/04/2014 9,09 18,6 7,81 30/ Final : 26,2 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 12h30 08/04/2014 9,04 19,2 7,6 28,8/ Final : 25,7 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 10h02 11/04/2014 8,75 20,4 8,3 31,9/ Final : 27,6 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 15h32 14/04/2014 8,68 21,3 8,24 29,4/ Final : 26,0 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidae; 14h34 17/04/2014 9,04 21 8,02 23,7 / Final :25,2 SJ; Adicionei água salgada para aumentar a salinidade; 13h24 21/04/2014 8,99 19,3 8,22 27,4 SJ; 16h14 23/04/2014 9,23 19,9 8,25 32,4/ Final: 24,6 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 13h30 28/04/2014 X X X 26,3 SJ; Aquário sem Ll ou Pl; 11h30 09/05/2014 6,69 21,3 8,05 27,5 SJ; 11h52 12/05/2014 8,61 20,5 8,17 31,1/ Final: 26,1 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 12h30 15/05/2014 8,37 21,8 8,27 40,5/ Final: 24,9 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 17h00 19/05/2014 7,93 22,7 8,5 32,1/ Final: 27,8 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 11h49 22/05/2014 8,32 20,9 8,55 29,8/ Final: 26,2 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade;18h30 26/05/2014 9,01 18,9 8,35 30,9/ Final: 25,3 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 11h48
Data O2 dissolvido (mg/L) Temperatura (ºC) pH Salinidade (‰) Observações 16/01/2014 8,76 20,7 7,07 24,5 SJ ; 9h05 20/01/2014 9,4 16,8 7,78 26,1 SJ ; 9h15 22/01/2014 9,2 18,8 7,72 26,5 SJ ; 9h15 24/01/2014 9,51 16,8 7,66 25,3 SJ ; Adicionei água ; 9h20 27/01/2014 9,02 19,2 7,64 25,6 SJ ; 4 Ll mortas ; 9h10 30/01/2014 9,66 16,1 7,81 25,5 SJ ; 1 Ll morta ; 9h05 05/02/2014 9,29 18,1 7,37 25 SJ ; 9h10 17/02/2014 9,68 16 7,27 27,7 SJ; Mudei a água ; 9h15 21/02/2014 8,61 17,5 7,27 22,5/ Final :24,8 SJ; Adicionei água salgada; 15h17 25/02/2014 9,29 16,8 7,38 23/ Final : 27 SJ; Adicionei água salgada para aumentar a salinidade; 1 Ll morta; 9h10 28/02/2014 9,13 19,6 7,47 24/ Final : 25 SJ; Adicionei água salgada para aumentar a salinidade; 17h02 03/03/2014 9,19 18,5 7,44 24,7/ Final: 25 SJ; Adicionei água salgada para aumentar a salinidade; 15h37 04/03/2014 9,55 17,1 7,3 24,5 SJ 07/03/2014 9,36 18,4 7,56 23,9/ Final: 25 SJ; Adicionei água salgada para aumentar a salinidade; 15h50 10/03/2014 8,8 19,9 7,66 28,3/ Final: 26,1 SJ Adicionei água doce para dimiuir a salinidade; 1 Ll morta; 7 Pl mortos; 16h16 14/03/2014 8,99 19,1 7,76 25,9 SJ; 16h53 17/03/2014 8,63 20,2 7,75 25,6 SJ; 17h00 21/03/2014 8,84 19,7 7,81 31,1/ Final : 26,7 SJ ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 2 Ll mortas; 15h50 24/03/2014 8,84 19,2 7,76 27,4 SJ; 1 Ll morta; 17h07 25/03/2014 9,03 19,3 7,72 27 SJ; 10h50 04/04/2014 8,91 18,6 7,5 27,1 SJ; 1 Ll morta; 12h30 08/04/2014 9,01 19,1 7,39 30,3/ Final: 26,6 SJ; Adicionei água doce para dimiuir a salinidade; 10h02 11/04/2014 8,71 20,8 8,22 32,9/ Final: 26,5 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 15h32 14/04/2014 8,09 21,5 7,95 28,6/ Final: 25,8 SJ; Adicionei água doce para dimiuir a salinidade; 14h34 17/04/2014 8,29 21,6 8,02 31,4/ Final: 27,6 SJ; Adicionei água doce para dimiuir a salinidade; 13h24 21/04/2014 8,48 19,3 7,96 29/ Final: 26 SJ; 1 Ll morta; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 16h14 23/04/2014 8,75 20 8,03 30,6/ Final: 26,6 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 13h30 28/04/2014 9,02 18,8 8,11 34,5/ Final: 26,9 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 11h30 30/04/2014 8,74 20,7 8,26 32,8/ Final : 25,2 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 14h04 05/05/2014 8,63 21,5 8,46 37,9/ Final : 28 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 2 Pl mortas; 11h50 06/05/2014 8,14 22,5 8,16 28,6/ Final: 27,4 SJ; Adicionei água doce para dimniuir a salinidade;9h49 09/05/2014 8,74 21,9 8,27 30,8/ Final: 27,9 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 3 Ll mortos; 11h52 12/05/2014 8,87 20,9 8,32 32,6/ Final: 28,0 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 3 Ll mortos; 12h30 15/05/2014 8,38 21,5 8,28 35,4/ Final: 27,8 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 5 Ll mortas; 17h00 19/05/2014 8,14 23 8,57 34,8/ Final: 28,0 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 5 Ll mortas; 11h49 22/05/2014 8,59 20,8 8,42 28,8/ Final: 24,9 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 4 Ll mortas; 18h30 26/05/2014 9,28 19 8,35 29,9/ Final: 26,8 SJ; Adicionei água doce para diminuir a salinidade; 1 Ll morta; 11h48
Legenda :
SJ - Sara Jorge Pl - Phorcus lineatus Ll - Littorina littorea 8.3. Sistemática
Reino: Animalia Filo: Mollusca
76 CON-AQUA, Lda. PROBUR Classe: Gastropoda Ordem: Archaeogastropoda Superfamília: Trochoidea Família: Trochidae Subfamília: Monodontinae Género: Monodonta Espécies (sinónimos):
o Phorcus lineatus o Throcus crassus (Pulteney, 1799) o Monodonta lineata o Osilinus lineatus o Turbo lineatus o Trochocochlea lineata o Monodonta lugubris o Osilinus colubrinus (Gould, 1849)
Nome Comum: Caramujo
9.4. Procedimento Histológico
Fixação
Esta etapa consiste na utilização de substâncias fixadoras (formol, xilol ou Bouin) com o intuito de retardar os efeitos post mortem do tecido, mantendo a sua arquitetura normal, e fornecer maior resistência para suportar as etapas seguintes.
O fixador escolhido para este projeto foi o Bouin, uma vez que apesar de ser mais caro, fixa melhor as gónadas que os restantes fixadores.
Duração desta etapa:
24 h – sem o Phorcus lineatus estar na época de reprodução. 41 a 48 h – quando o molusco se encontra na sua época reprodutiva.
Desidratação
77 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Álcool 70% 20 min
Álcool 90% 45 min
Álcool 95% 45 min
Álcool 100% 45 min
Álcool 100% 45 min
Álcool 100% 45 min
Xilol 25 min
Xilol 25 min
Impregnação
Parafina I 2h
Parafina II 2h
Inclusão
Feita em blocos com parafina líquida
Corte dos blocos (4 µm)
Hidratação
Xilol 10 min
Álcool 100 % 5 min
Álcool 95 % 5 min
Álcool 75 % 5 min
Álcool 50 % 5 min
Água Corrente 2 passagens
Coloração
Hemalúmen 3 min
Água Corrente 5 min
Eosina 5 min
Água Corrente 3 passagens
78 CON-AQUA, Lda. PROBUR
Desidratação
Álcool 50 % 3 passagens
Álcool 75 % 3 passagens
Álcool 95 % 3 min
Álcool 100 % 3 min
Álcool 100 % 3 min
Xilol 10 min
Antes da realização de todas as etapas anteriormente referidas, os diferentes indivíduos de Phorcus lineatus eram anestesiados em cloreto de magnésio a 7%. Estes ficavam no anestésico aproximadamente duas horas e eram colocados em cima de papel absorvente antes de ser feita a sua pesagem (com o intuito de se obter o peso real do animal, quando se procedesse à pesagem do mesmo). Depois deste último passo, realizava-se a medição do comprimento e da largura dos animais com o auxílio de um paquímetro, e colocava-se as amostras nas respetivas cassetes para análise histológica.
9.5. Bibliografia
Crothers, J. H. 2001. Common topshells: An introduction to the biology of Osilinus lineatus with notes on other species in the genus. Field Studies 10: 115–160.
Mieszkowska N., Hawkins S.J., Burrows M.T. and Kendall M.A. 2007. Long-term changes in the geographic distribution and population structures of Osilinus lineatus (Gastropoda: Trochidae) in Britain and Ireland. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 87, 537-545.
I. Cunha, E. Mangas-Ramirez e L. Guilhermino; 2007; “Effects of copper and cadmium on cholinesterase and glutathione S-transferase activities of two marine gastropods (Monodonta lineata and Nucella lapillus.
Vijaya K. Pratheepa, Marisa Silva e Vitor Vasconcelos; 2014; “ Viscera - Associated Bacterial Diversity Among Intertidal Gastropods from Northern – Atlantic Coast of Portugal”.
Crothers, J. H. 2003. ROCKY SHORE SNAILS AS MATERIAL FOR PROJECTS (WITH A KEY FOR THEIR IDENTIFICATION). Field Studies, 10, (2003) 601 - 634.
Underwood A.J. 1972. Observations on the Reproductive Cycles of Monodonta lineata, Gibbula umbilicalis and G. cineraria. Marine Biology 17, 333 – 340.
79 CON-AQUA, Lda. PROBUR
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Crothers, J.H. 1994. STUDENT INVESTIGATIONS ON THE POPULATION STRUCTURE OF THE COMMON TOPSHELL, MONODONTA LINEATA, ON THE GORE, SOMERSET. Field Studies, 8, 337 – 355.
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