Quantificazione Di Resveratrolo, Piceide, Pterostilbene E 11 Viniferine Indotte Da P

L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013

DOCUMENTO TECNICO

1Urska Vrhovsek 1Giulia Malacarne 1Domenico Masuero 2Luca Zulini Graziano Guella 1Marco Stefanini 1Riccardo Velasco 1Fulvio Mattivi 1Fondazione Edmund Mach, Centro Ricerca ed Innovazione - San Michele all’Adige (TN) 2Laboratorio di Chimica Bio-organica, Dipartimento di Fisica, Università di Trento U. Vrhovsek QUANTIFICAZIONE DI RESVERATROLO, PICEIDE, PTEROSTILBENE E 11 VINIFERINE INDOTTE DA P. VITICOLA IN FOGLIE DI VITI RESISTENTI Questo è il primo articolo che riporta una analisi metabolica dettagliata, con identificazione e quantificazione, delle principali viniferine presenti in foglie di vite dopo infezione con Plasmopara viticola, mediante uso degli standard corrispondenti. Lʼanalisi è stata condotta mediante LC-MS, utilizzando una colonna a fase inversa.

Introduzione essere costitutiva (Pezet e et al. 1997), in particolare Pont 1988, Korhammer et al. Langcake e Pryce (1977) Gli stilbenoidi sono fenoli 1995, Mattivi et al. 1995) o hanno caratterizzato una serie derivanti dalla via metabolica indotta in risposta a stress bio- di fitoalessine con attività dei fenilpropanoidi e dell’ace- tici ed abiotici (Langcake e antifungina in diverse specie tato-malonato, che è presente Pryce 1976 Langcake e Pryce del genere Vitis. Inoltre è stato in molte famiglie di piante. 1977, Adrian et al. 1996, dimostrato che la presenza di All’interno delle Vitaceae, gli Sarig et al. 1997, Douillet- resveratrolo è strettamente stilbenoidi costituiscono un Breuil et al 1999, Cantos et al. correlata alla resistenza alle gruppo relativamente ristretto 2001) o da elicitori (Bru et al. malattie in molte specie di di molecole che derivano 2006, Zamboni et al. 2006). vite (Dercks e Creasy 1989, dalla struttura del trans-resve- Gli stilbeni hanno suscitato Adrian et al. 1997). Oltre al Parole chiave: stilbenoidi, vi- ratrolo e rappresentano le grande interesse a causa delle resveratrolo, anche altri stilbe- niferine, HPLC-DAD-MS, principali fitoalessine note. La loro proprietà antifungine noidi derivanti dalla sua dime- Vitaceae, Plasmopara viticola sintesi di stilbeni nell’uva può (Hoos e Blaich 1990, Adrian rizzazione ossidativa, sono 85 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013

Tab. 1 - Valore medio determinato sperimentalmente del coefficiente di utilizzato è il sistema di sepa- estinzione molare e picco di assorbanza degli oligomeri usati come stan- razione HPLC, accoppiato dard esterni per la quantificazione con diversi tipi di rivelatori come DAD (Jeandet et al. peak N° name Maximal Average molar 1997, Vitrac et al. 2005), fluo- absorbance extinction coefficient rescenza (Jeandet et al. 1997) (nm) at maximal absorbance e più recentemente spettrome- 1 trans-caffeic acid and (+)-catechin tri di massa (Pezet et al 2003, condensation product 281 7340 Jean-Denis et al 2007, Jerko- vic et al 2007, Godard et al 3 ampelopsin D + quadrangularin A 314 24570 2009). La maggiore difficoltà 4 isohopeaphenol 281 10930 nell’analisi delle viniferine è la mancanza di standard 5 Z-ε-viniferin 280 9920 disponibili in commercio. 6 ampelopsin H 281 12710 Questo articolo descrive lo 7 vaticanol C-like 281 14830 sviluppo di un nuovo metodo per la separazione cromato- 8(+)-E-ε-viniferin 319 30630 grafica e quantificazione 9 Z-miyabenol C 282 14030 accurata delle viniferine. A nostra conoscenza è il primo 11 Z+E-ω-viniferin 295 13950 lavoro che descrive un’analisi 12 α-viniferin 283 6270 capace di identificare e quan- tificare con accuratezza le 13 E-cis-miyabenol C 321 11100a principali viniferine accumulate in foglie di vite in seguito ad infezione con Plasmopara Tab. 2 - Soglia di rilevabilità (LOD) e soglia di quantificazione (LOQ) per la viticola grazie all’utilizzo dei misura in UV-Vis (i valori sono espressi in mg/g fw) rispettivi standard precedentemente isolati e caratterizzati LOD (S/N> 3) LOQ (S/N> 10) nel nostro laboratorio (Mattivi et al., 2011). trans-piceid 0.02 0.08 trans-resveratrol 0.01 0.05 Materiali pallidol (as Ampelopsin H) 0.15 0.51 ampelopsin D+ quadrangularin A (1:1) 0.05 0.15 e metodi isohopeaphenol 0.20 0.67 È stata utilizzata una popo- ampelopsin H 0.23 0.78 lazione F1 derivante dall’incrocio interspecifico tra vaticanol C isomer (as Ampelopsin H) 0.15 0.51 Merzling (M) (un ibrido com- (+)-E-ε-viniferin 0.08 0.26 plesso di V. vinifera derivante Z-miyabenol C 0.03 0.09 da Vitis rupestris e Vitis lin- cecumii) e la cultivar di V. E-miyabenol C 0.05 0.15 vinifera Teroldego (T), che Z-ω-viniferin 0.29 0.97 sono rispettivamente parzial- E-ω-viniferin 0.15 0.49 mente resistente e suscettibile a Plasmopara viticola. Nel α-viniferin 0.41 1.36 primo anno, Merzling e gli individui F1 21/122 e 21/103 sono stati selezionati e utiliz- attivi contro vari patogeni fun- di stilbene (Stein et al. 1985). zati per ottimizzare un meto- gini della vite (Jeandet 2002). La tossicità di questi composti do per l’analisi del contenuto La variabilità nella produ- è risultata essere correlata alla di stilbeni nelle foglie dopo zione di stilbeni è anche loro struttura chimica. In par- inoculazione con P. viticola. influenzata dal genotipo e ticolare si è constatato che δ- I genotipi selezionati sono dallo stadio di sviluppo della viniferina, un dimero di ossi- stati replicati mediante talee vite (Barlass et al. 1987, dazione del resveratrolo, e innestate sul portinnesto Ko- Dercks e Creasy 1989, Sbaghi pterostilbene, e l’analogo 3,5- ber 5BB, che sono state man- et al. 1995, Gatto et al. 2008) dimetossi del resveratrolo, tenute in una camera di cre- o dall’età della foglia (Stein et sono gli stilbeni più tossici in scita in vasi da 1 litro piene al. 1985). In particolare, le termini di mobilità e sviluppo di terriccio:sabbia:tor-ba:ver- foglie molto vecchie e le della malattia causata dall’oo- miculite (3:1:3:3). Per F1 foglie più giovani sembrano micete Plasmopara viticola 21/103 sono state eseguite sintetizzare meno stilbeni (Pezet et al 2004a, 2004b, due ripetizioni, mentre per rispetto alle altre a causa della Schmidlin et al. 2008). F1 21/22 e Merzling sono maggior chiusura stomatica In letteratura si trovano state eseguite tre ripetizioni. che limita l’entrata del patoge- diversi metodi analitici per Gli individui F1 21/74 e F1 no e, indirettamente, la sintesi l’analisi delle viniferine, il più 21/103 sono stati campionati 86 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013 anche nelle due annate se- Tab. 3 - Accumulo di viniferine nelle foglie di 3 genotipi a diversi tempi dal- guenti per studiare la riprodu- l’infezione con P. viticola. I valori sono espressi in ug/g fw (n=3) cibilità in tre annate diverse. 0 2 dpi 6 dpi Inoculo fungino ed infezione delle piante. F1 genotype 21/122 average sd average sd average sd Sporangi di P. viticola trans-piceid nd nd 0.8 1.4 5.3 0.8 (Berk. e Curt) Berl. et De trans-resveratrol 0.2 0.4 1.73.0 8.1 1.1 Toni sono stati raccolti da foglie infette di V. vinifera pallidol (ampelopsin H) nd nd nd nd 19.24 10.70 cv Pinot Gris. Le macchie ampelopsin D+ bianche di sporulazione pre- quadrangularin A (1:1) nd nd 1.6 1.5 11.1 6.4 senti sulla pagina inferiore delle foglie sono state spaz- isohopeaphenol nd nd 12.28.8 118.1 97.5 zolate con acqua bidistillata ampelopsin H + vaticanol per ottenere una sospensione C isomer (ampelopsin H) nd nd 3.1 2.9 57.2 23.1 4 5 di conidi di 10 /10 spore/ml. (+)-E-ε-viniferin nd nd 11.1 10.8 34.5 3.4 L’inoculazione delle piante è stata ottenuta spruzzando Z+E-miyabenol C (Zmiyabenol C) nd nd 10.6 10.5 51.2 29.4 la sospensione di conidi sulla Z+E-ω-viniferin (E-ω-viniferin) nd nd 8.6 9.0 47.9 24.8 superficie inferiore di tutte le foglie completamente espan- α-viniferin nd nd 2.8 3.6 68.578.1 se in una camera climatica a E-cis-miyabenol C nd nd 3.9 3.4 49.4 46.9 24 ° C con 80% di umidità trans-pterostilbene relativa. (trans-resveratrol) nd nd 0.9 1.0 8.0 6.0 L’esperimento di infezione è stato eseguito in tre repli- F1 genotype 21/103 che. Le foglie di ogni replica trans-piceid nd nd nd nd 8.8 8.0 sono state raccolte a 0 ore, 2 giorni e 6 giorni dopo l’infe- trans-resveratrol nd nd nd nd 21.1 13.6 zione (dpi) con P. viticola. pallidol (ampelopsin H) nd nd nd nd 53.42 11.16 Tutte le foglie raccolte sono ampelopsin D+ state conservate a -20 °C quadrangularin A (1:1) nd nd nd nd 67.6 17.5 fino all’analisi. isohopeaphenol nd nd nd nd 1311.7 81.5 Reagenti chimici. ampelopsin H + vaticanol Acetonitrile, metanolo ed C isomer (ampelopsin H) nd nd nd nd 453.6 83.2 acido acetico per HPLC sono (+)-E-ε-viniferin nd nd nd nd 98.2 28.6 stati acquistati da Carlo Erba (Italia), acetato di etile da Z+E-miyabenol C (Zmiyabenol C) nd nd nd nd 121.3 26.4 BDH e acido fosforico da Z +E-ω-viniferin (E-ω-viniferin) nd nd nd nd 127.1 40.2 Merck. Il trans-resveratrolo è stato acquistato da Sigma, il α-viniferin nd nd nd nd 120.3 6.8 trans-4-hydroxystilbene da E-cis-miyabenol C nd nd nd nd 148.6 38.5 Aldrich, il cis-resveratrolo è trans-pterostilbene stato preparato dal trans- (trans-resveratrol) nd nd nd nd nd nd resveratrolo standard tramite fotoisomerizzazione (Mattivi Merzling et al., 1995), il trans-piceide trans-piceid nd nd nd nd 2.7 0.4 (trans-resveratrolo-3-O-β-D- glucopiranoside) è stato isola- trans-resveratrol nd nd nd nd 5.7 3.6 to dalle radici di Polygonum pallidol (ampelopsin H) nd nd nd nd 30.22 16.04 cuspidatum. La purezza di ampelopsin D+ ciascuno stilbenoide è stata quadrangularin A (1:1) nd nd nd nd 8.0 4.2 controllata mediante HPLC e l’identità è stata confermata isohopeaphenol nd nd nd nd 147.0 70.6 in accordo con Mattivi et al. ampelopsin H + vaticanol (1995). C isomer (ampelopsin H) nd nd nd nd 35.80 19.4 I composti (+)-E-ε-viniferina, Z- ed E-ω-viniferina, pal- (+)-E-ε-viniferin nd nd nd nd 13.1 6.9 lidolo, ampelopsina D, qua- Z+E-miyabenol C (Zmiyabenol C) nd nd nd nd 10.5 2.9 drangularina A, Z-miyabeno- Z+E-ω-viniferin (E-ω-viniferin) nd nd nd nd 9.5 2.7 lo C ed E-cis-miyabenolo C, α-viniferina, isohopeapheno- α-viniferin nd nd nd nd 15.5 7.0 lo, ampelopsina H e l’isomero E-cis-miyabenol C nd nd nd nd 16.9 20.4 vaticanolo –C-simile sono stati isolati da foglie infette di trans-pterostilbene vite in un precedente studio e (trans-resveratrol) nd nd nd nd 6.0 4.0 87 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013 Tab. 4 - Riproducibilità fra piante. Concentrazione media (ug/g fw), Deviazione standard (Sd) e Co- efficiente di variazione (cv) sono stati ottenuti considerando la seconda e terza foglia di tre repliche per genotipo. Le misure sono state effettuate a 6 dpi dopo infezione con P.viticola

transtrans- pallidol ampelop isohope Ampelop (+)-E-ε- Z+E Z+E-ω- α- E-cis trans- piceid resverat sin D+ aphenol sin H + viniferin miyabe viniferi vinifer miyaben ptero- rol quadran vaticano nol C n in ol C stilb gularin l C ene A (1:1) isomer 21/122 Average 4.9 7.2 16.40 9.0 107.4 49.6 31.8 41.2 40.9 51.8 42.1 8.1 Sd 1.3 1.0 4.22 2.4 34.3 13.3 6.8 12.4 10.3 36.2 19.1 0.8 cv (%) 25.6 14.6 25.8 27.0 31.9 26.8 21.5 30.2 25.3 69.9 45.3 10.0 Merzling Averag 1.3 4.7 25.79 5.6 135.5 32.1 12.8 9.1 7.9 11.8 15.1 5.2 Sd 0.2 2.4 15.86 2.5 67.1 18.1 7.3 4.6 0.9 7.3 14.6 2.3 cv (%) 15.2 51.6 61.5 44.9 49.6 56.5 57.4 50.1 11.3 61.5 97.1 44.2 la loro caratterizzazione strut- è stato filtrato con un filtro di di 105 °C, la temperatura di zione UV-VIS a 280 nm per turale è riportata in Mattivi et PVDF 0.22 mm (Millipore, desolvatazione 200 °C, il flus- le forme Z e 310 nm per le al. (2011). Bedford, MA) in una fiala so di gas (N2) nel cono 30 l/h, forme E con il metodo dello HPLC e poi analizzato me- il flusso del gas di desolvata- standard esterno. I monomeri Preparazione del cam- diante HPLC. zione (N2) 450 l/ora. L’uscita di trans-resveratrolo, trans- pione. del sistema di HPLC è stata piceide e IS (trans-4-hyroxy- Campioni rappresentativi Metodo HPLC-DAD-MS. suddivisa (9:1) verso l’inter- stilbene) sono stati quantifica- di foglie sono stati pesati L’analisi è stata effettuata faccia ESI dell’analizzatore di ti con rilevazione a 310 nm in (0.2-0.3 g) e ad essi sono stati con un sistema LC-MS ZQ massa. Spettri di massa elet- UV-VIS. I dimeri (+)-E-ε- aggiunti 40 ml di metanolo e Micromass (Micromass, Man- trospray con valori m/z da viniferina, Z-e E-ω viniferina, 50 ml di standard interno (4- chester, UK), dotato di un 100 a 1500 sono stati acquisiti ampelopsina D + quadrangu- hydroxystilbene, 200 mg/l). sistema Waters 2690 HPLC, in modo positivo con un larina A), i trimeri (Z-miyabe- Ogni campione è stato omo- un rivelatore DAD 996 Waters tempo di permanenza di 0,1. nolo C ed E-cis-miyabenolo genato in un frullatore ali- (Waters Corp., Miliford, MA) Alla fine dei 27 min di C e α-viniferina) e i tetrameri mentare per 30 s e poi centri- e Empower Software (Waters corsa acquisiti in modalità (isohopeaphenolo, ampelopsi- fugato a 3300xg per 7 min. Il Corp.). La separazione è stata positiva sono stati acquisiti na H e l’ isomero vaticanolo- surnatante è stato filtrato eseguita utilizzando una co- anche spettri di massa in C-simile) sono stati quantifi- (0.45 mm, Sartorius, Germa- lonna Zorbax SB-Aq (5 mm, modalità negativa per 1 min. cati utilizzando le curve di nia) e concentrato ad un volu- 2.1x150 mm) e una pre-colon- La tensione di cono (CV) è calibrazione dei singoli com- me finale di 0.5 ml mediante na Zorbax SB-Aq (5 mm, stata impostata in modalità di posti isolati. un rotavapor (Büchi, Germa- 2.1x12.5 mm) precolonna scansione ad un valore di 40 Il loro coefficiente di estin- nia) a 38 °C, trasferito in una (Agilent Technologies, Palo V per l’identificazione del zione molecolare è riportato siringa da 50 ml a cui erano Alto, CA). Le fasi mobili uti- picco basato sull’aglicone ed in Tabella 1. Il pallidolo è stati precedentemente aggiun- lizzate consistevano di 0,1% a 25 V per l’identificazione stato espresso come equiva- ti 40 ml di H2O. La siringa è (v/v) di acido acetico in H2O sulla base sia del frammento lenti di ampelopsina H, il stata posta su una cartuccia (A) e acetonitrile (B). La sepa- aglicone sia dello ione mole- trans-pterostilbene come SPE Bakerbond, SDB (ISO- razione è stata condotta a 40 colare. I seguenti ioni singoli equivalenti di trans-resvera- LUTE ENV +) 100 mg/3 ml °C in 27 min, alle seguenti (m/z) sono stati monitorati trolo, e i valori espressi in (JT Baker, Deventer, Olan- condizioni: gradiente lineare per l’identificazione: 229,1 mg/kg di peso fresco (fw). A da), che era stata precedente- da 5% B a 70% B in 25 min, a (CV 25 V) per trans- e cis- causa della coeluzione del- mente condizionata con 2 ml 95% B in 0,1 min, 95% B per resveratrolo, 229,1 (CV 40 V) l’isomero vaticanolo-C-simile di metanolo seguiti da 5 ml di 2 minuti e ritorno a 5% B in per i derivati transtrans - e con l’ampelopsina H, la H2O, e ciascun campione è 0,1 minuti. La colonna è stata cis-piceide, 455,2 (CV 60 V) somma di entrambi i compo- stato caricato sulla cartuccia equilibrata per 7 minuti prima per i dimeri stilbenoidi, 681,2 sti è stata espressa come equi- pre-condizionata. La cartuc- di ogni analisi. Il flusso è stato (CV 70 V) per i trimeri stilbe- valenti di ampelopsina H. A cia è stata quindi lavata con 5 di 0,25 ml/min e il volume di noidi, 907,2 (CV 80 V) per i causa della coeluzione di Z + ml di H2O e gli stilbeni sono iniezione 6 ml. Gli spettri tetrameri stilbenoidi. E-miyabenolo C la somma di stati eluiti mediante 2 ml di UV-VIS sono stati registrati Ciascun composto è stato entrambi i composti è stata acetato di etile. nell’intervallo 220-400 nm, la identificato sulla base dei espressa come equivalenti di La frazione di acetato di rilevazione a 310 nm. seguenti parametri: 1) tempo Z miyabenolo-C e similmente etile è stata quindi portata a La tensione applicata nel di ritenzione, 2) spettri UV- la somma di Z + E-ω-viniferi- secco a 38 °C. Il residuo è capillare è stata di 3000 V, la VIS 3) frammento base corri- na è stata espressa come equi- stato immediatamente ridi- tensione di cono di 40 V, la spondente all’aglicone 4) ione valenti di E-ω viniferina. Le sciolto in 0.5 ml di 50% (v/v) tensione di estrazione di 6 V, molecolare. I campioni sono strutture di tutti i composti metanolo in H2O. Il campione la temperatura della sorgente stati quantificati con rileva- sono riportate in Figura 1. 88 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013 Tab. 5 - Riproducibilità fra annate. Concentrazione media (ug/g fw), Deviazione standard (Sd) e Co- efficiente di variazione (cv) sono stati ottenuti considerando la seconda e terza foglia di ciascun genotipo in tre annate successive a 6 dpi dopo infezione con P. viticola

Al fine di misurare la sinte- temente (Mattivi et al., 2011). dettagliata di un genotipo Risultati e si di stilbenoidi nel tempo, la In questo lavoro per la prima resistente andrà considerato discussione terza foglia di ciascuna pianta volta la maggior parte di essi anche il tempo di induzione è stata analizzata a tempi viene incluso in un metodo delle fitoalessine, dato che Validazione del metodo. diversi dopo l’infezione (0, 2, analitico e quantificato. Con per viti infettate con Botrytis La soglia di rilevabilità 6 giorni post-infezione). La l’eccezione del trans-ptero- cinerea è stato suggerito che (LOD) e la soglia di quantifi- terza foglia è stata scelta per- stilbene nel genotipo 21/103, non solo la quantità, ma cazione (LOQ) per ogni sin- ché secondo la letteratura le tutti gli altri stilbeni sono stati anche la velocità di produzio- golo composto sono stati sti- foglie molto giovani e molto trovati in tutti i campioni ana- ne di stilbenoidi correlavano mati sperimentalmente a tre e vecchie non sintetizzano ele- lizzati. Inoltre, abbiamo con la loro resistenza alla cre- dieci volte il rapporto segna- vate concentrazioni di stilbeni osservato la formazione di un scita del micelio di Botrytis le-rumore (S/N) rispettiva- (Stein et al. 1985, Dercks e dimero fenolico (picco 1 in (Stein e Blaich 1985). mente. I valori ottenuti nelle Creasy 1989). Nelle foglie dei Figura 2) derivato dalla con- misure UV-Vis sono indicate tre genotipi raccolte al tempo densazione di (+)-catechina e Accumulo di viniferine in nella Tabella 2. Le curve di 0, non è stata trovata alcuna acido caffeico, già caratteriz- foglie diverse dopo l’infezio- calibrazione sono lineari a viniferina, con l’eccezione di zato in una parte dello studio ne con P. viticola. concentrazioni comprese tra trans-resveratrolo nel genoti- precedente (Mattivi et al., La sintesi di stilbenoidi è 0,1 - 20 mg/L. Il coefficiente po 21/122 (Tabella 3). 2011), e non ulteriormente anche strettamente dipenden- R2 era ≥ 0,9981. La ripetibili- Durante i primi due giorni indagato. te dalle condizioni ambientali tà strumentale è stato misura- post-infezione non sono state Lavorando con una popola- e dalla fase di sviluppo della ta ripetendo 14 iniezioni con- evidenziate differenze nei sin- zione di vite diversa, Pezet et pianta, in quanto esse posso- secutive della miscela stan- tomi di infezione. A 2 dpi al (2004b) hanno riportato un no influenzare il processo di dard (trans-piceide, trans- solo il genotipo 21/122 aveva precoce aumento fino a 2 dpi infezione. È stato infatti resveratrolo, isohopeaphenolo sintetizzato tutti i composti, e successiva riduzione delle riportato che le foglie molto e α-viniferina). I coefficienti ad eccezione del pallidolo, viniferine nelle foglie infetta- giovani e molto vecchie non di variazione del segnale mentre nel genotipo 21/103 e te con P. viticola. Nel nostro sintetizzano livelli elevati di DAD sono stati i seguenti: in Merzling non è stata rileva- esperimento, l’accumulo di stilbeni, probabilmente a trans-piceide CV (%) 0,3, ta alcuna viniferina. Tuttavia viniferine nelle foglie è risul- causa dello sviluppo incom- trans-resveratrolo 0.2, isoho- a 6 dpi tutti i genotipi (incluso tato ritardato rispetto agli pleto degli stomi (Stein et al. peaphenolo 1.5 e α-viniferin il 21/122) mostravano la mas- esperimenti di Pezet et al. 1985, Dercks e Creasy 1989). 2.7. Tali valori sono nel range sima concentrazione con un (2004b). Nel caso della nostra Tutte le foglie di ogni repli- tipico osservato fra ripetizioni profilo complesso di stilbeni popolazione di vite, un tempo ca state analizzate a 6 dpi, al tecniche. Questo aspetto non (Figura 2) caratterizzato dalla di induzione di 6 dpi sembra- fine di verificare la variabilità è stato indagato ulteriormen- presenza di trans-piceide, va il momento più appropria- nell’accumulo di stilbeni tra te, poiché è principalmente la trans-resveratrolo, (+) -E-ε- to per saggiare la produzione foglie diverse. E’ stato evi- variabilità biologica che deve viniferina, e anche Z + E-ω- di fitoalessine. denziato che l’accumulo di essere considerata essendo viniferina e pterostilbene, Una volta selezionato un viniferine nelle diverse foglie molto più elevata, come composto precedentemente genotipo con una elevata non era la stessa sia nei due riportato più avanti in questo segnalato come mediatore di risposta sarebbe anche inte- individui F1 che in Merzling articolo. resistenza nelle uve (Pezet et ressante dal punto di vista (Figura 3). Nel genotipo al. 2004b). Oltre a questi pratico studiare la presenza di 21/103 le concentrazioni più Analisi dell’accumulo di composti noti, siamo stati in differenti cinetiche di rispo- elevate sono state riscontrate viniferine nelle foglie in grado di rilevare e quantifica- sta, come osservato nel caso nelle foglie 2 e 3 e il più diversi momenti dopo l’in- re ulteriori 7 stilbenoidi, che di 21/122 (Tabella 3). basso nella foglia apicale. Il fezione con P. viticola. sono stati caratterizzati recen- Per una caratterizzazione contenuto di viniferine era 89 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013

Fig. 1 - Strutture delle viniferine accumulate nelle foglie degli ibridi di da Botrytis (Stein e Blaich, Vitis vinifera (Merzling x Teroldego) in seguito ad infezione con Plasmo- 1985). Nel nostro caso si può para viticola concludere che l’intensità di induzione di stilbeni non mostra una correlazione chiara e omogenea con la posizione delle foglie sul germoglio. Sulla base dei risultati ottenuti, abbiamo quindi deciso di effettuare l’analisi delle viniferine nell’incrocio Merzling x Teroldego (Malacarne et al., 2011) raggruppando le seconde e terze foglie.

L’accumulo di viniferine dopo l’infezione con P. viticola: riproducibilità tra le piante. Per questa prova sono stati scelti i genotipi 21/122 e Merzling. Per valutare la ripro- ducibilità sono state considera- te come ripetizioni la seconda e terza foglia infetta di piante differenti. La deviazione standard più alta in entrambi i campioni è stata misurata per l’α-viniferina (Tabella 4). Nel genotipo 21/122, la variabilità tra le piante è stata più bassa per trans-resveratrolo (14,6%) e trans-pterostilbene (10%), e la più alta per α- viniferina (69,9%) e E-miyabenol C (45,3%). La situazio- ne era diversa per Merzling, la variabilità minima è stata trovata per trans-piceide (15,2%) e Z + E-ω-viniferina (11,2%), mentre E-myabenolo C e pallidolo hanno mostrato la varia- bilità maggiore tra piante diverse, 97,1 % e 61,5% rispettivamente. In generale, ci si aspetterebbe che la variabili- tà dipenda fortemente dalla via biosintetica del composto, poi- ché alcuni composti, come i monomeri, devono accumular- si inizialmente e quindi dimi- nuire per generare gli oligomeri minori, che nel tempo vengono poi convertiti in oli- altamente variabile e general- accordo con la letteratura, in gomeri superiori mediante mente più alto nelle seconde, particolare per il campione meccanismi ossidativi. Pur- terze e quarte foglie (Figura Merzling, in quanto è stato troppo ad oggi, non è però 3). La seconda e quinta foglia riportato che le foglie molto disponibile un modello mecca- hanno mostrato il più alto giovani e molto vecchie non nicistico dettagliato. contenuto di viniferine nel sintetizzano elevate concen- In conclusione, i dati delle genotipo 21/122, mentre nel trazioni di stilbeni (Dercks e infezioni in vivo hanno mo- Merzling è stata osservata Creasy, 1989). Tuttavia altri strato una notevole variabilità una diversa distribuzione, autori hanno suggerito che le di tutti i composti e i risultati infatti la concentrazione più foglie giovani campionate in sperimentali ci hanno dato una alta è stata trovata nell’ottava giugno-luglio nelle posizioni stima dell’ordine di grandezza foglia e il secondo più alto comprese fra la 4a e la 7a del di variabilità biologica. La nella quarta foglia. I nostri germoglio sono le più adatte presenza di tale forte variabili- risultati non sono in completo per studiare gli stilbeni indotti tà suggerisce l’opportunità di 90 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013 Fig. 2 ‐ Cromatogramma del profilo di viniferine nel genotipo 21/122 144 ore dopo l’infezione con P. viticola (modalità SIM e traccia DAD)

Legenda: 1 prodotto di condensazione fra trans-caffeic acid e (+)-catechin; 2 pallidol, 3 ampelopsin D + quadrangularin A; 4 isohopeaphenol; 5 Z-ε-viniferin; 6 ampelopsin H; 7 vaticanol C-like; 8 (+)-E-ε- viniferin; 9 Z-miyabenol C; 10 E-miyabenol C; 11 Z +E-ω-viniferin; 12 α-viniferin; 13 E-cismiyabenol C; 14 trans-piceid; 15 trans-resveratrol; 16 trans-pterostilbene. includere un certo numero di stilbeni dei genotipi 21/103 e Tutti gli altri composti mostra- repliche biologiche (piuttosto 21/74 per tre anni consecutivi. vano CV superiori al 50%, e che tecniche) nel disegno spe- Le seconde e terze foglie sono come caso estremo per ampe- rimentale. state raccolte a 6 dpi da tre lopsina D + quadrangularina piante diverse per ogni genoti- A è stato registrato un CV di L’accumulo di viniferine po. I risultati di questo esperi- 171,2%. Tali valori di variabi- dopo l’infezione: riproduci- mento sono riportati in Ta- lità biologica non erano ina- bilità tra annate bella 5. Le variazioni tra gli spettati in quanto le barbatelle La suscettibilità di una anni erano molto più elevate e la raccolta dell’inoculo natu- pianta all’infezione va spesso rispetto alle variazioni tra rale di P. viticola sono stati verificata in diverse annate. piante dello stesso anno preparati nelle diverse stagioni Una sola osservazione non (Tabella 4). Nel caso del e sono quindi fattori di varia- può essere conclusiva, ed è genotipo 21/103 solo trans- bilità aggiuntiva. Tuttavia, possibile perdere piante o picede e trans-resveratrolo anche nei casi di estrema ripetizioni quando si lavora erano inferiori al 50% coeffi- variabilità crediamo che ci si mediante infezione in vivo di ciente di variazione (CV), possa aspettare che l’ordine di una barbatella. Per la prova di mentre nel caso di Merzling grandezza della concentrazio- riproducibilità tra gli anni è solo trans-piced aveva un CV ne assoluta di stilbeni prodotta stato analizzato il contenuto di relativamente basso (26,6%). in annate diverse sia conserva- 91 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013 Fig. 3 - Valore medio della concentrazione di viniferine totali (ug/g fw) nelle diverse foglie a 6 giorni dall’infezione con P. viticola. La deviazione standard è riportata nei casi in cui erano disponibili 2 o 3 foglie

to ed utilizzabile per eviden- Ringraziamenti. Questo lavo- A nostra conoscenza que- benic compound from gra- ziare i genotipi con risposta ro è stato supportato dal sto è il primo articolo che pevines, against Botrytis più elevata. Alla luce di questi Progetto “Resveratrolo” e riporta una analisi metabolica cinerea, the causal agent for dati è consigliabile analizzare ADP 2009, entrambi finanzia- dettagliata, con identificazio- gray mold. Journal of Che- i genotipi di vite in più stagio- ti dalla Provincia Autonoma ne e quantificazione, delle mical Ecology 23, 1689-1702. ni prima di trarre qualsiasi di Trento. principali viniferine presenti Barlass, M., Miller, R.M. conclusione così da rendere in foglie di vite dopo infezio- and Douglas, T.J. (1987) veritiera la caratterizzazione ne con Plasmopara viticola, Development of Methods for chimica. Riassunto mediante uso degli standard Screening Grapevines for corrispondenti. Resistance to Infection by Lo scopo di questo lavoro è Downy Mildew.2. Resvera- Considerazioni stato lo sviluppo di un nuovo Adattamento italiano del trol Production. American conclusive metodo di separazione croma- manoscritto dal titolo “Pro- Journal of Enology and tografica e quantificazione filing and accurate quantifi- Viticulture 38, 65-68. È stato sviluppato e valida- accurata delle viniferine pre- cation of trans-resveratrol, Bru, R., Selles, S., Casado- to su un periodo di 3 anni un senti nelle foglie di vite dopo trans-piceid, trans-pterostil- Vela, J., Belchi-Navarro, S. nuovo metodo di analisi degli l’infezione con Plasmopara bene and 11 viniferins indu- and Pedreno, M.A. (2006) stilbeni che può essere appli- viticola. È stato condotto su ced by Plasmopara viticola in Modified cyclodextrins are cato in numerosi studi. Il una popolazione interspecifi- partially resistant grapevine chemically defined glucan metodo che combina HPLC- ca F1, derivante dall’ incrocio leaves” degli autori Vrhovsek inducers of defense responses DAD e MS è stato validato tra Merzling e Teroldego, il U., Malacarne G., Masuero in grapevine cell cultures. per l’analisi dell’intera classe primo parzialmente resistente D., Zulini L., Guella G., Journal of Agricultural and degli stilbeni trovati in foglie e il secondo suscettibile a Stefanini M., Velasco R. e Food Chemistry 54, 65-71. di vite dopo l’infezione con Plasmopara viticola. L’ana- Mattivi F. pubblicato dalla Cantos, E., Espin, J.C. and P. viticola. lisi è stata condotta mediante rivista Australian Journal of Tomas-Barberan, F.A. (2001) Il processo di infezione di uno ZQ Waters LC-MS, uti- Grape and Wine Research e Postharvest induction model- questo oomicete è strettamen- lizzando una colonna a fase disponibile in versione inte- ing method using UV irradia- te dipendente dalle condizioni inversa. Il metodo è stato grale al sito http://onlineli- tion pulses for obtaining ambientali e dalle fasi di svi- validato per l’analisi metabo- brary.wiley.com/doi/10.1111/ resveratrol-enriched table luppo della pianta che si riflet- lica e permette l’accurata j.1755-0238.2011.00163.x/ grapes: A new “functional” tono sul processo di infezione identificazione e quantifica- abstract. fruit? Journal of Agricultural (Stein et al. 1985, Dercks zione di trans-resveratrolo, and Food Chemistry 49, Creasy e 1989). Quindi due trans-piceide, trans-pterostil- 5052-5058. fattori cruciali sono stati bene, un prodotto di conden- Bibliografia Dercks, W. and Creasy, valutati, il tempo di campio- sazione tra (+)-catechina e L.L. 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Inoltre l’in- 1979-1981. phytoalexin content of various piceide, pterostilbene e l’in- tensità di induzione di stilbeni Adrian, M., Jeandet, P., Vitis spp. in response to ultra- tera classe di stilbenoidi in non mostra una correlazione Veneau, J., Weston, L.A. and violet C elicitation. Journal of genotipi di vite infettati da P. chiara con la posizione delle Bessis, R. (1997) Biological Agricultural and Food Che- viticola. foglie nel germoglio. activity of resveratrol, a stil- mistry 47, 4456-4461. 92 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013

Gatto, P., Vrhovsek, U., Physiology and Plant Patholo- oxidative dimerization of Muth, J., Segala, C., Romual- gy 9, 77-86. resveratrol are respectively di, C., Fontana, P., Pruefer, D., Langcake, P. and Pryce, associated to sensitivity and Stefanini, M., Moser, C., R.J. (1977) Production of resistance of grapevine culti- Mattivi, F. and Velasco, R. resveratrol and viniferins by vars to downy mildew. (2008) Ripening and genotype grapevines in response to UV Physiological and Molecular control stilbene accumulation Irradiation. Phytochemistry Plant Pathology, 65, 297-303. in healthy grapes. Journal of 16, 1193-1196. Sarig, P., Zutkhi, Y., Agricultural and Food Che- Mattivi, F., Reniero, F. and Monjauze, A., Lisker, N. and mistry 56, 11773-11785. Korhammer, S. (1995) Isola- Ben-Arie, R. (1997) Phyto- Godard, S., Slacanin, I., tion, characterization, and alexin elicitation in grape Viret, O., Gindro, K. 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