Gli Oligomeri Del Resveratrolo Nelle Foglie Delle Viti Resistenti (Merzling X Teroldego) Infettate Da P

L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013

DOCUMENTO TECNICO

1Fulvio Mattivi 1Urska Vrhovsek 1Giulia Malacarne 1Domenico Masuero 1Luca Zulini 1Marco Stefanini 1Claudio Moser 1Riccardo Velasco 2Graziano Guella 1Fondazione Edmund Mach, Centro Ricerca ed Innovazione - San Michele all’Adige (TN) 2Laboratorio di Chimica Bio-orga- nica, Dipartimento di Fisica, Università di Trento F. Mattivi GLI OLIGOMERI DEL RESVERATROLO NELLE FOGLIE DELLE VITI RESISTENTI (MERZLING X TEROLDEGO) INFETTATE DA P. VITICOLA Scopo di questo studio era la caratterizzazione strutturale delle viniferine che si accumulano nelle foglie dei genotipi resistenti di Vitis vinifera se infettati con Plasmopara viticola. Sono state evidenziate 15 viniferine, delle quali 10 nuove per la vite, assieme ad un dimero che deriva dalla condensazione della (+)-catechina con lʼacido trans-caffeico.

Introduzione merizzazione ossidativa, sono gli stilbeni maggiormen- denominate viniferine (2). te tossici verso la mobilità e All’interno delle Vitaceae, Alcune di queste sono state sviluppo dell’oomycete P. le viniferine rappresentano un dimostrare agire biologica- viticola (2,5). gruppo relativamente ristretto mente contro diversi patogeni Gli studi pioneristici di di composti fenolici di basso fungini della vite (3-4). È Langcake e Pryce (3) hanno peso molecolare costituito da stato osservato che la tossicità chiarito le strutture di trans- derivati del trans-resveratrolo delle fitoalessine stilbeniche resveratrolo, α-viniferin ed ε- dotati di proprietà antifungi- verso i funghi è strettamente viniferin, osservando la pre- ne, che permettono alla pianta correlata alla loro struttura senza di altri composti carat- di contrastare l’attacco dei chimica. In particolare, è stato teristici della famiglia delle Parole chiave: Vitis vinifera, patogeni (1). Nella vite, la riportato che γ-viniferin, Vitaceae simili alle viniferine Plasmopara viticola, stilbe- produzione di resveratrolo dimero ossidativo del resvera- ma non caratterizzati (β-vini- ni, stilbenoidi, NMR, spet- porta alla formazione di fitoa- trolo, e pterostilbene, analogo ferin e γ-viniferin). Hanno trometria di massa lessine che derivano da oligo- metilato del resveratrolo, descritto inoltre la formazione 71 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013 Tab. 1 - Nome, quantità isolata e dati MS dei composti ottenuti da foglie di vite infettate con P. viticola.

frazione tempo quantità taglia nome formula MM ione molecolareosservato Δ massa ritenz. (min) (mg) molecolare calcolata (M-H)- (M-H)- (ppm)

1.1 17,4 0,13 di- Z-ε-viniferin (1) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1340 -0,7

1.2 17,9 2,80 di- E-ε-viniferin (2) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1323 3,1

1.4 18,5 n.a. di- E-ω-viniferin (3) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1340 -0,7

1.4 18,5 n.a. di- Z-ω-viniferin (4) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1338 -0,2

2.1 13,5 1,10 di- caffeic acid and C24H20O9 452,1107 451,1028 451,1021 1,6 catechin condensation product (5)

2.2 14,8 1,39 di- pallidol (6) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1317 4,4

3.1 15,4 0,61 tri- ampelopsin D (7) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1340 -0,7 + quadrangularin A (8)

3.2 18,9 1,13 tri- α-viniferin (9) C42H30O9 678,1890 677,1811 677,1818 -1,0

4.1 19,1 0,59 tri- E-cis-miyabenol C (10) C42H32O9 680,2046 679,1967 679,1979 -1,8

5.1 17,9 0,54 tri- Z-miyabenol C (11) C42H32O9 680,2046 679,1967 679,1974 -1,0

5.2 18,1 1,55 tri- E-miyabenol C (12) C42H32O9 680,2046 679,1967 679,1969 -0,3

6.1 16,8 5,46 tetra- isohopeaphenol (13) C56H42O12 906,2676 905,2597 905,2617 -2,2

7.1 17,5 1,04 tetra- ampelopsin H (14) C56H42O12 906,2676 905,2597 905,2620 -2,5

7.2 17,5 0,90 tetra- vaticanol C-like (15) C56H42O12 906,2676 905,2597 905,2635 -4,2 di un deidrodimero di trans- una più ampia ricerca finaliz- to (UV), dicroismo circolare Pinot Grigio. La muffa bianca resveratrolo (che successiva- zata a stabilire il ruolo dell’in- (CD) e proprietà ottiche, è emergente dalla parte inferio- mente ha preso il nome di δ- tera classe delle viniferine stato possibile identificare le re delle foglie è stata spazzo- viniferin) ad opera della nella difesa della vite nei con- dieci principali viniferine, lata in acqua bidistillata fino perossidasi da rafano e della fronti di P. viticola. Uno come pure tre viniferine ad ottenere una sospensione di 4 5 H2O2. Successivamente a que- screening preliminare condot- minori e un polifenolo dimero conidi con 10 /10 spore/mL. sti lavori c’è stato poco pro- to per mezzo di HPLC-DAD- presenti nelle foglie infettate. L’infezione delle piante è gresso nella caratterizzazione MS aveva mostrato che il Calcoli di meccanica moleco- stata ottenuta spruzzando la strutturale di questi composti 17% dei genotipi in una lare (MM) sono inoltre stati sospensione di conidi fredda bioattivi inducibili nelle foglie popolazione segregante condotti su tutti i composti sulla superficie inferiore di di vite. Altri stilbeni identifi- (Merzling x Vitis vinifera qui riportati, per individuarne tutte le foglie completamente cati in foglie infettate con P. Teroldego) presenta nelle la conformazione più stabile. estese, in una camera climati- viticola sono il monomero foglie una quantità elevata ca mantenuta a 24 °C e 80% pterostilbene (2) ed il dimero rispetto ai parentali, ed un RH. δ-viniferin (sinonimo: trans- complesso profilo di viniferi- Materiali resveratrol dehydrodimer), ne della vite note ed ignote, e metodi Composti chimici. Aceto- che sono stati descritti essere successivamente alla infezio- nitrile, metanolo e acido ace- le principali viniferine sinte- ne con P. viticola. Viti. Per l’isolamento delle tico sono stati acquistati da tizzate in foglie di V. vinifera viniferine sono stati scelti 18 Carlo Erba, etile acetato da var. Chasselas infettate da P. genotipi dai vigneti sperimen- BDH ed acido fosforico da viticola o soggette a radiazio- Scopo tali della Fondazione Edmund Merck. L’acqua era di grado ne ultravioletta (5), mentre lo del lavoro Mach in San Michele all’Adi- milliQ. I composti trans- stilbenoide α-viniferin non è ge, da una popolazione F1 resveratrolo e trans-4-hydro- più stato osservato nei lavori Lo scopo principale di que- che deriva da incrocio tra xystilbene sono stati ottenuti seguenti. La maggior parte sto studio era quindi l’isola- Merzling e V. vinifera cv da Sigma Aldrich, cis-resve- degli studi disponibili si sono mento e caratterizzazione Teroldego. Le 10 foglie api- ratrolo è stato preparato via focalizzati su presenza e ruolo strutturale delle viniferine cali di 2-3 germogli sono foto-isomerizzazione di stan- funzionale delle strutture note, presenti in alcuni genotipi state infettate con P. viticola, dard di trans-resveratrolo, concentrandosi soprattutto selezionati della popolazione e dopo 6 giorni campionate, mentre trans-piceid (trans- sugli oligomeri che manten- di viti resistente alla P. vitico- congelate e conservate a -20 resveratrol-3-O-β-D-glucopy- gono nella struttura il doppio la. Attraverso tecniche avan- °C. ranoside) era stato isolato legame stilbenico, denominati zate di spettrometria di massa dalle radici anidre di Poly- oligostilbeni (1,6) piuttosto (LC-ESI-MS e LC-ESI-Q- Infezione delle piante. gonum cuspidatum (7). La che su quei composti che la TOF) e misure estensive di Sporangiospore di P. viticola purezza di ogni monomero è hanno persa nella polimeriz- risonanza magnetica nucleare (Berk. e Curt) Berl. et De stata controllata per HPLC e zazione, detti stilbenoidi. (NMR) mono e bidimensio- Toni sono state raccolte da l’identità confermata in ac- Questo articolo è parte di nali, spettrometria ultraviolet- piante infette di V. vinifera cv cordo con Mattivi et al. (8). 72 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013

Estrazione. Il processo è Fig. 1 - Purificazione dell’estratto grezzo sulla colonna diolo stato condotto sotto azoto, al buio e in assenza di acidi minerali, per prevenire la produzione di artefatti dovuto ad ossidazione, foto-isomerizzazione ed idrolisi. Le foglie sono state pesate (517 g), macinate ed estratte per 48 h a temperatura ambiente in metanolo (10 L). Il materiale solido è stato rimosso ed il volume di estratto ridotto a 500 mL in evaporatore rotan- te a 35 °C.

Cromatografia preparativa. Sia la cromatografia flash in bassa pressione che la cromatografia liquida ad altra pressione sono state realizzate con un sistema HPLC preparativo Shimadzu SCL-10 AVP. Per guidare l’estrazione, sia l’estratto grezzo che ogni frazione intermedia sono state analizzate per HPLC- DAD-MS.

Cromatografia flash su per HPLC-DAD-MS. La fra- tate a secco e sciolte in 100 così ottenute sono state porta- Isolute ENV+. Il primo pas- zione C, con tutti i composti mL di metanolo. Questa fra- te a 1.5 mL in acetone per la saggio nella purificazione di nostro interesse, veniva zione purificata risultava ulte- caratterizzazione preliminare dell’estratto è stato condotto selezionata per ulteriore lavo- riormente arricchita nei com- con NMR. con una colonna a siringa razione, mente le altre veni- posti desiderati. Isolute da 150 mL per croma- vano eliminate. Cromatografia preparati- tografia flash, impaccata con Cromatografia preparativa in fase inversa. Una 20 g di assorbente ENV+ Cromatografia flash su va in fase normale. Per il colonna Discovery HS-C18, Isolute con diametro di 40-70 HW40S. Una seconda purifi- frazionamento dei diversi oli- 250 x 21.2 mm, 5 μm, veniva μm e dimensione media dei cazione è stata condotta sulla gomeri è stata scelta una condizionata con acqua, con pori di 60 μm, chiuso alle due stessa apparecchiatura, usan- colonna diolo, Develosil flusso 10 mL/min e collegata estremità con i dischi acces- do 20 g di resina HW40S 100DIOL-5, 300 x 20 mm. al detector operante a 280 nm. sori Isolute SPE. La resina (Toyopearl) come fase stazio- Dopo condizionamento con Ognuna delle 7 frazioni veni- veniva attivata prima di cia- naria. La soluzione in meta- acetonitrile, con flusso 20 va portata a secco, sciolta in scun uso tramite eluizione nolo (la frazione C ottenuta mL/min, è stata connessa ad 0.5 mL metanolo e filtrata su sequenziale con metanolo dalla purificazione con un rilevatore UV operante a filtro Durapore 0.22 μm prima (200 mL) ed acqua (300 mL). ENV+) è stata caricata quan- 280 nm. Aliquote di 10 mL della iniezione. La separazio- L’estratto grezzo era diviso in titativamente sulla colonna a dell’estratto metanolico puri- ne cromatografica veniva con- due frazioni da 250 mL, cia- siringa. La colonna veniva ficato contenente gli stilbeni dotta a temperatura ambiente, scuna filtrata su filtro inserita nel sistema HPLC venivano portate a secco, in 78 min, utilizzando acqua Durapore 0.22 μm, assorbita preparativo, lavata con acqua sciolte in 0.5 mL di metanolo (solvente A) e acetonitrile (B), su circa 10 g di resina attivata (500 mL) a 10 mL/min, e col- e 0.5 mL di acetone prima con questo profilo: 100% A ed asciugata sotto pressione legata al detector impostato a della iniezione. La separazio- per 3 min, poi isocratico a ridotta. La resina veniva 280 nm. Le fasi mobili erano ne cromatografica, a tempera- (30-27-32-34-32-32-32% B, sospesa in acqua ed impacca- acqua (A) e metanolo (B). La tura ambiente, era condotta percentuale variabile rispetti- ta nella colonna a siringa, che corsa cromatografica consiste utilizzando come fasi mobili vamente per le frazioni 1-7) veniva inserita in linea nel in un gradiente lineare da 50 a acetonitrile (A) e metanolo per 65 min seguito da 100% B sistema HPLC. La cromato- 100% B in 60 min, seguito da con 3% acqua (B). Il profilo per 10 min. Ogni picco (14 in grafia flash era condotta a un tratto isocratico al 100% B era il seguente: 100% A per totale) veniva raccolto separa- temperatura ambiente con un per 40 min, con flusso 10 15 min, gradiente lineare al tamente, portato a secco, flusso di 25 mL/min ed elui- mL/min. Venivano raccolte le 15% B in 30 min, gradiente sciolto in 10 mL di metanolo zione sequenziale con: A. frazioni sequenziali di 50 mL lineare al 100% B in 10 min, ed analizzato utilizzando acqua (350 mL); B. pentano : ed una aliquota di ciascuna valore mantenuto per altri 10 HPLC-DAD-MS. diclorometano 2:1 v/v (2 L); iniettata in HPLC-DAD-MS min. Ciascun picco veniva C. etile acetato (500 mL) e D. per verificarne la composizio- raccolto separatamente, porta- Analisi HPLC-DAD-MS. metanolo (500 mL). Le fra- ne. Le frazioni eluite tra 50 e to a secco, sciolto in 10 mL di Le seguenti condizioni sono zioni B, C e D venivano por- 90 min contenevano tutti gli metanolo ed analizzato per state utilizzate per monitorare tate a secco, disciolte in 50 stilbeni e stilbenoidi. Queste HPLC-DAD-MS. Le 7 fra- ogni passaggio dell’isolamen- mL di metanolo ed analizzate frazioni venivano riunite, por- zioni contenenti gli stilbeni to e sono state inoltre validate 73 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013

Fig. 2 - Il rapporto di assorbanza (A280/A230), quindi tra le bande UV II sion power di 0 db e equipag- e III degli stilbenoidi giato con pulsed-gradient field utility. La scala del chemical shift (δ) era calibrata sul segnale del protone resi- duo dell’acetone deuterato, rispettivamente a δ H 2.040 ppm e δ C 29.80 ppm. Sono stati registrati questi esperimenti: 1H-NMR; decoupled 13C-NMR; 1H-1H DQCOSY; 1H-13C HSQC; 1H-13C HMBC e 1H-1H NOESY. I calcoli di meccanica molecolare sono stati ottenuti con programma PCMOD 7.0 /GMMX versione 1.5. Tutte le strutture minimizzate che rientravano in una finestra di strain-energy di 3.0 kcal/mol venivano salvate e infine minimizzate con entrambi MMX e MM3 force fields, conservando solo quelle rien- tranti entro 2.0 kcal/mol.

Misure UV. Gli spettri UV di ciascun oligomero sono stati registrati in metanolo, su uno spettrometro Hitachi U- 2000. Valori medi venivano ottenuti attraverso misurazio- ne a due appropriate diluizio- ni, una il doppio dell’altra, tutte nel range 1.15-9.55 X 10-5 M, al fine di ottenere una lettura di assorbanza nell’in- per permettere di ottenere il zione a 280 e 310 nm. sistema di ionizzazione elet- tervallo 0.27-0.83 UA. profilo dei metaboliti delle L’uscita del sistema HPLC trospray (ESI) e software viti infettate. L’analisi è stata era splittata (9:1) all’interfac- MassLynx 4.1. L’analisi Misure polarimetriche e realizzata su un sistema cia ESI dell’analizzatore di HDMS è stata realizzata dicroismo circolare. La rota- Micromass ZQ LC-MS com- massa. Spettri di massa elet- dopo separazione nelle condi- zione ottica specifica veniva pleto di una pompa HPLC trospray nell’intervallo di m/z zioni cromatografiche descrit- misurata in metanolo a tem- Waters 2690 e detector DAD 100-1500 venivano registrati te nella sezione precedente, peratura ambiente, utilizzan- Waters 996 gestito da softwa- in modalità positiva. Il vol- con modalità negativa e nel- do un polarimetro JASCO- re Empower. La separazione taggio del cono (CV) era l’intervallo di m/z 50-3000 DP181 alla lunghezza d’onda è stata ottenuta su una colon- impostato in modalità scan- Da. Lo spettrometro era cali- di emissione del sodio e valu- na cromatografica Zorbax sione a 40 V per le identifica- brato utilizzando sodio for- tato come valori di [a]D SB-Aq, 5 um, 2.1x150 mm, zioni basate sul picco del- miato, e leucine enkephalin espressi in deg dm−1cm3 g−1 . con precolonna Zorbax SB- l’aglicone, e a 25 V per veniva usato per la lock mass. Lo spettro CD era registrato Aq, 5 um, 2.1x12.5 mm. La l’identificazione basata sia sul I dati sperimentali sono ripor- in metanolo a temperatura fase mobile consiste di acido frammento dell’aglicone che tati in Tab. 1. In queste condi- ambiente, con un dicroigrafo acetico 0.1% in H2O (A) e sullo ione molecolare. I zioni lo strumento è accredi- Jasco J-40AS e valutando Δe acetonitrile (B). La separazio- seguenti ioni (m/z) venivano tato di produrre dati speri- (dicroismo circolare molare) ne è stata condotta a 40 °C in monitorati per la quantifica- mentali con una accuratezza in cm mol-1 L alla lunghezza 27 min, nelle seguenti condi- zione: 229.1 (CV 25 V) per entro ±3 ppm. d’onda del massimo osserva- zioni: Gradienti lineari a par- trans- e cis-resveratrolo, to nello spettro CD. tire da 5% B, al 70% B in 25 229.1 (CV 40 V) per trans- e Esperimenti NMR. Gli min, al 95% B in 0.1 min, cis-piceid, 455.2 (CV 60 V ) spettri 1H (400 MHz) e 13C Dati strutturali dei com- 95% B mantenuto per 2 min, per i dimeri, 681.2 (CV 70 V) (100 MHz) NMR di tutti gli posti isolati alle condizioni iniziali (5% B) per trimeri, 907.2 (CV 80 V) oligomeri misurati sono stati Le tabelle con tutti i dati in 0.1 min. La colonna veniva per tetrameri. registrati in d6-acetone strutturali sono reperibili sul equilibrata per 7 min prima di (99.90% CD3COCD3) a 298 lavoro originale in lingua ogni analisi. Il flusso era 0.25 Analisi Q-TOF. Spettri di K su uno spettrometro NMR inglese. mL/min ed il volume di inie- massa ad alta accuratezza Bruker-Avance 400 MHz zione 6 μL. Gli spettri sono stati acquisiti mediante NMR, utilizzando un probe 5 Nomenclatura.In accordo UV/Vis venivano registrati uno spettrometro di massa mm BBI con 900 proton pulse con la corrente pratica, abbia- tra 220 e 400 nm, con rileva- HDMS-Q-TOF Synapt con length di 8.7 µs alla transmis- mo utilizzato in maniera con- 74 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013 sistente la nomenclatura Fig. 3 - Isolamento finale per cromatografia in fase inversa delle sette trans- e cis- per descrivere la frazioni ottenute dalla colonna diolo stereochimica agli anelli satu- ri, mentre si è utilizzata la nomenclatura Z-/E- per descrivere la sterochimica dei doppi legami. I nomi utilizzati in questo studio, assieme con i nomi triviali utilizzati in letteratura, sono i seguenti: Z- ε-viniferin (sin. cis-ε-viniferin); E-ε-viniferin (sin. trans- ε-viniferin); E-δ-viniferin (sin. trans-δ-viniferin, trans- resveratrol dehydrodimer); Z- miyabenol C (sin. cis-miyabenol C); E-miyabenol C (sin. trans-miyabenol C). Risultati e discussione Infezione della vite, estrazione dalle foglie e frazionamento. In una indagine preliminare a mezzo HPLC-DAD- MS, avevamo osservato che nelle foglie infette con P. viticola raccolte dalla progenie dell’incrocio di Merzling x Teroldego si notava la formazione, in aggiunta a trans- resveratrolo, trans-piceid e E- ε-viniferin, di numerosi altri stilbeni e stilbenoidi, ed in numero superiore a quello dei composti noti finora isolati nella vite (risultati non pub- blicati). La accurata identificazione e quantificazione di quantità minute di viniferine in una matrice complessa quale l’estratto da foglia è particolarmente impegnativa. A questo punto risultava ovvio che prima di poter descrivere la interazione tra vite e P. viticola in questa popolazione, era necessario isolare e caratterizzare questi nuovi metaboliti. Diciotto genotipi alti produttori di stilbenoidi sono stati selezionati da questa popolazione e queste piante sono state infettate, le loro foglie apicali raccolte, riunite ed estratte con meta- vite (9-10), una cromatografia lavaggio acquoso, con penta- ha permesso una ulteriore nolo, con una resa tale da per- flash su una resina formata dal no-diclorometano e con meta- purificazione dell’estratto, tra- metterci di intraprendere copolimero polistirene-divi- nolo. Questa purificazione ini- mite la raccolta dei soli com- l’isolamento in quantità suffi- nilbenzene (Isolute ENV+) ci ziale ha permesso di incre- posti eluenti nell’intervallo cienti alla caratterizzazione ha permesso di eliminare con mentare i segnali di stilbeni e 40-90 min. Nell’estratto puri- strutturale. efficienza la maggior parte dei stilbenoidi, in precedenza ficato così ottenuto, tutti i La pre-purificazione del- metaboliti primari, quali car- sovrapposti e parzialmente composti target sono stati l’estratto grezzo è stata realiz- boidrati, acidi organici, ami- coperti da altri interferenti, nei recuperati, finalmente rappre- zata in due passaggi. In accor- noacidi e clorofille, e metabo- cromatogrammi HPLC-DAD- sentando i principali picchi do con risultati precedenti con liti secondari quali le proanto- MS. Una seconda cromato- visibili nel cromatogramma gli stilbenoidi dalle radici di cianidine, nelle tre frazioni di grafia flash su resina HW40S HPLC-DAD-MS. 75 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013

Fig. 4 - Strutture degli stilbenoidi dimeri nelle foglie di vite: Z-ε-viniferin 281-313 nm. Mostrano tipica- (1), E-ε-viniferin (2), E-ω-viniferin (3), Z-ω-viniferin (4), pallidol (6), E-am- mente dei coefficienti di pelopsin D (7), E-quadrangularin A (8) e di un prodotto di condensazione estinzione molare elevati e tra (+)-catechina ed acido trans-caffeico (5) sono in diretta relazione alla prensenza di un doppio legame coniugato in configurazione E (cioè trans). La banda III, situata intorno ai 230 nm, è più debole ed essenzialmente dovuta alla presenza di unità fenoliche. La presenza di un cromoforo cis-stilbenico da origine ad uno spettro dif- ferente, con un massimo di assorbimento (banda II) di minore intensità e più corta lunghezza d’onda rispetto all’isomero trans (11). Oltre ai coefficienti di estinzione molare, abbiamo misu- rato il rapporto tra le assor- banze A280/A230 che era stato suggerito essere infor- mativo per l’assegnazione della struttura (12). Il rapporto A280/A230 è stato trovato assumere (Fig. 2) valori bassi (0.22-0.28) per cinque stilbenoidi oligomeri. Valori intermedi sono stati trovati per i tre oligostilbeni trimeri (0.37- 0.38) e per gli oligostilbeni dimeri (0.38-0.52). I valori più elevati erano quelli dei monomeri del trans-resvera- trol0 (1.00-1.10). Sono stati condotti molte- plici esperimenti NMR al fine di chiarire ciascuna struttura, inoltre i valori sperimentali di dicroismo circolare ed α sono stati acquisiti e successivamente discussi per ciascun composto, dove appropriato. Gli stilbenoidi oligomeri pos- siedono tre caratteristiche strutturali peculiari che devo- no essere definite con chia- rezza per poter definire le loro strutture: 1) la stereochi- La colonna diolo ci ha per- so di raccogliere 14 frazioni massa ad alta risoluzione in mica dei doppi legami esoci- messo di frazionare in manie- contenenti da 0.13 fino a 5.46 modalità negativa. Per tutti è clici, 2) la posizione regiochi- ra efficace l’estratto purifica- mg (Tab. 1) di oligomeri puri, stato possibile ottenere un mica dei gruppi 4-idrossifenil to, ottenendo sette frazioni per un totale di 14.74 mg. ottimo match rispetto alla e 3,5-diidrossifenil ai C7/C8 e che risultavano separate in Queste frazioni sono state massa teorica, inferiore a 3 3) la stereochimica relativa (o base alla loro taglia ed affinità etichettate con un codice ppm con l’eccezione di tre eventualmente assoluta) dei (Fig. 1). La caratterizzazione numerico sequenziale a due composti e comunque sempre centri chirali C7 e C8. Il dei composti ha confermato la cifre, la prima indicante l’or- inferiore a 5 ppm (Tab. 1). primo compito è semplice separazione dei dimeri (fra- dine di eluizione nella colon- Lo studio dello spettro UV dato che la grandezza del zioni 1, 2 e 3) dai trimeri (fra- na in fase normale (Fig. 1) e ci ha dato altre informazioni parametro 3J (H7,H8) è dia- zioni 3, 4 e 5) e tetrameri (fra- la seconda l’ordine di eluizio- preliminari. Il cromoforo stil- gnostica della stereochimica zioni 6 e 7). Ciascuna delle ne nella separazione in fase benico è essenzialmente del doppio legame in configu- sette frazioni ottenute per cro- inversa (Fig. 3). caratterizzato dalla presenza razione Z (11-13 Hz) o E (15- matografia in fase normale è Caratterizzazione struttu- di tre bande, convenzional- 17 Hz). Il secondo compito, la stata quindi ulteriormente rale dei composti isolati. mente chiamate come I, II e definizione della regiochimica separata per cromatografia in Una conferma della struttura III (11). La banda I è localiz- ai vari centri C7/C8, richiede fase inversa. Questa tecnica degli oligomeri isolati è stata zata tra 308 e 336 nm mentre esperimenti HMBC. Di solito, complementare ci ha permes- ottenuta per spettrometria di la banda II è nella regione l’esame delle risonanze 2D- 76 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013

HMBC degli H7 ed H8 per- Fig. 5 - Strutture degli stilbenoidi trimeri nelle foglie di vite: α-viniferin mette di definire la principale (9), E-cis-miyabenol C (10), E-miyabenol C (12), Z-miyabenol C (11) connettività tra gli atomi del- l’intero oligomero. Il terzo compito può essere considera- to il più difficile, per il fatto che negli anelli a cinque membri anche piccole modifi- che nella geometria possono alterare in modo significativo l’angolo diedro tra i nuclei accoppiati H7/H8, causando ampie variazioni nei valori delle loro costanti di accoppiamento. Nonostante sia generalmente accettato che nei 2,3-benzodiidrofurani (come pure nei 2,3-diidrofura- 3 ni) il Jcis (5-10 Hz) sia mag- 3 giore che Jtrans (1-9 Hz) (13), non si può pervenire ad una assegnazione definitiva della stereochimica usando sola- mente la dimensione degli accoppiamenti, a meno che non sia stato attentamente investigato uno specifico pattern di sostituzioni o di siste- mi eterociclici, oppure sia stata condotta una completa analisi conformazionale. Di -1 -1 conseguenza, questa assegna- re (ε 280.0 = 9920 M cm ) in corrisponde con quello di un combattere la germinazione zione stereochimica deve accordo con la presenza di un resveratrolo dimero, con dei conidi di Botrytis cinerea essere valutata mediante espe- doppio legame stilbenico in assorbimento UV e coeffi- (50% inibizione a 100 rimenti di irradiazione seletti- configurazione cis, e dati ciente di estinzione molecola- μg/mL). Inoltre, E-ε-viniferin -1 -1 va 2D-NOESY e/o NOE1D. NMR (Fig. 4) e CD in accor- re (ε 319.0 = 30633 M cm ; ε e trans-resveratrolo sono i -1 -1 Se tramite irradiazione della do con la struttura della Z-ε- 280.0 = 24781 M cm ) in mattoni utilizzati per costrui- risonanza H-7 viene osservato viniferin. In particolare, una accordo con la presenza di un re diversi alti oligomeri. un marcato NOE (» 10%) sul assegnazione completa e una doppio legame stilbenico in segnale del H-8 vicinale, que- discussione dettagliata dei configurazione E, e dati ω-viniferins (3 e 4). Lo sto implica una vicinanza spa- dati NMR per Z-ε-viniferin e NMR (vedi Supporting spettro di massa del picco iso- ziale dei protoni coinvolti e si per tutti gli altri composti noti Information, versione inglese) lato in frazione 1.4 (Fig. 3) può convalidare quindi una è disponibile nelle Supporting (Fig. 4), CD ed α in accordo corrisponde a quello di una configurazione cis al C7/C8, Information dell’articolo ori- con la struttura della (+)-E-ε- miscela di due resveratroli mentre quando si rileva solo ginale in lingua inglese, libe- viniferin (2). L’isolamento di dimeri, con assorbimento un modesto NOE (» 1-2%), i ramente scaricabili online. una sola e specificamente dis- massimo UV (294.5 nm) e due protoni sono attesi essere Questo composto è stato simmetrica struttura trans-, la coefficiente di estinzione in posizione trans. descritto come un prodotto cui configurazione assoluta molecolare intermedi (ε 294.5 = Eventualmente, gli shift 13C della isomerizzazione indotta all’anello trans-diidrobenzo- 13947 M-1 cm-1), compatibile dei C7 e C8 possono discrimi- dalla luce della E-ε-viniferin furanico è stata completamen- con la presenza di una misce- nare tra le configurazioni rela- estratta dalle foglie di vite (3). te assegnata e trovata avere la di stilbeni con il doppio tive cis e trans 2,3 a causa Considerando che questo entrambi i centri chirali in legame in configurazioni dell’effetto schermante di un composto era meno del 5% configurazione S, ha confer- Z+E. I dati NMR (Fig. 4) e atomo di carbonio in configu- dell’isomero E (Tab. 1) e che mato la alta specificità della CD erano in accordo con la razione cis- in posizione g non era osservato nelle analisi reazione di dimerizzazione presenza di una miscela di (effetto-g) (14). degli estratti da foglia freschi, del resveratrolo, come già due nuovi isomeri della ε- pensiamo che la sua presenza riportato (3). viniferin, che abbiamo chia- di dovuta alla formazione La presenza di questo mato ω-viniferine (Fig. 4). Si I composti durante l’isolamento, nono- composto è molto importan- tratta di viniferine minori, dimeri stante che l’intero processo te, data la alta bioattività dato che la quantità ottenuta sia stato fatto con protezione riportata per E-ε-viniferin era circa 6.5 inferiore rispetto Z-ε-viniferin (1). Lo spettro dalla luce. Ha conservato la contro il rilascio di zoospore a quella del maggiore dimero di massa del picco isolato stessa configurazione assoluta da sporangi di P. viticola nell’uva, E-ε-viniferin (2). nella frazione 1.1 (Fig. 3) osservata nell’isomero E (2). (50% inibizione a 19 μg/mL) I dati NMR e MS hanno corrisponde a quello di un e contro la mobilità delle suggerito che questi due resveratrolo dimero, con (+)-E-ε-viniferin (2). Lo zoospore successivo al loro dimeri del resveratrolo fosse- assorbimento UV e coeffi- spettro di massa del picco iso- rilascio (50% inibizione a ro due isomeri strutturali di ciente di estinzione molecola- lato nella frazione 1.2 (Fig. 3) 12.5 μg/mL), come pure nel E- e Z-ε-viniferin. Dato che 77 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013 Fig. 6 - Strutture degli stilbenoidi tetrameri isolati dalle foglie di vite: isohopeaphenol (13), ampelopsin H (14), isomero di vaticanol C (15) e hopeaphenol (16)

non è stato trovato alcun cam- MM per entrambe le ω-vini- isomeri, che ha permesso di configurazione al Cb è stata biamento nella connettività ferins per le quali la distanza ottenere i loro dati UV. E-ω- determinata dal pattern di tra gli atomi e/o nella posizio- H7a-H8a (2.34 Å) era trovata viniferin (3) ε 318.5 = 19966 accoppiamento di Hb con i -1 -1 -1 ne regiochimica dei nuclei essere minore rispetto ad M cm ε 280.0 = 12554 M protoni diastereotopici al Ca, -1 aromatici in base alle misure H7a—H2a/H6a (2.68 Å ) cm ; Z-ω-viniferin (4), ε 281.5 nonostante che un veloce flip- HMBC-NMR, le differenze mentre la distanza H7a— = 6754 M-1 cm-1). ping dell’anello lattone porti a osservate sui dati NMR devo- H10a/H14a era valutata esse- valori di J mediati. Piccoli no essere indotte da una diffe- re tanto lunga (4.19 Å) da Prodotto di condensazione segnali rilevabili nello spettro rente relazione stereochimica sfuggire alla rilevazione tra (+)-catechina ed acido 1H-NMR e DQCOSY di que- ai centri chirali C7a e C8a. Le NOE. Il valore della costante trans-caffeico, 5. Lo spettro sto campione hanno indicato misure NOESY ci hanno per- di accoppiamento 3J (H-7/H- MS del picco isolato in fra- la presenza di un altro com- messo di stabilire che nelle ω- 8) (8.0 Hz) è superiore che zione 2.1 (Fig. 3) suggerisce posto che potrebbe essere viniferine H7a e H8a non nelle e-viniferine, dando ulte- una struttura ricca di ossigeno assegnato come il suo Cb ste- erano stereochimicamente riore supporto alla loro confi- (Tab. 1) con un debole cro- reoisomero in base a modifi- nella correlazione trans come gurazione cis. moforo UV con massimo a che significative nei chemical -1 usuale per gli oligomeri del Alla luce della intrinseca 280.5 nm (ε 280.5 = 7344 M shifts di 2Ha e Hb, mentre i resveratrolo. Infatti, per tutti elevata capacità della tecnica cm-1), e dati NMR e CD in segnali del nucleo della cate- gli isomeri delle ω-viniferine NMR per l’analisi quantitati- accordo con la presenza di china di entrambi gli stereoi- la integrazione delle mappe va, precise misure 1H-NMR una prodotto di condensazio- someri erano quasi sovrappo- fuori-diagonale 2D-NOESY permettono di ottenere una ne tra (+) catechina e acido nibili. Una simile struttura si di H-7a mostravano un più affidabile stima del loro rap- trans-caffeico (Fig. 4). La può formare per accoppia- forte effetto dipolare con H- porto molare nella miscela. In presenza dello scheletro della mento ossidativo C-C del car- 8a che con H2a/H6a, mentre base alla integrazione della catechina ha potuto essere bonio in β al carbonile del- l’effetto NOE di H7a con area relativa dei segnali NMR dedotta dai caratteristici l’acido caffeico con il C8 H10a/H14 non era più rileva- dei protoni di E-ω-viniferin segnali per H2 a 4.41 (d, J = della catechina, che viene bile. Questo risultato, che (3) in comparazione ai segna- 8.4 Hz). 1J etero correlato a successivamente convertito indica una stereochimica 7,8 li di Z-ω-viniferin (4), la C2 (dC 82.8) che permette di nel corrispondente d lattone. cis, è in perfetto accordo con abbondanza relativa del stabilire la stereochimica al L’isolamento e caratterizza- le distanze internucleari valu- primo deve essere 66% e del C2-C3. Infatti, ci si sarebbe zione di questo prodotto di tate nella geometria moleco- secondo 33%. Questo è stato aspettato un accoppiamento condensazione ha fornito lare di questi composti come confermato tramite un succes- molto piccolo J(2,3 < 1Hz) l’evidenza che altri composti ottenuta mediante calcoli sivo frazionamento dei due per H2 nella epicatechina. La fenolici principali della vite 78 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013

-1 -1 -1 partecipano ai meccanismi di re (ε 313.5 = 24573 M cm , ε ampelopsin D (7) che qua- foro UV (ε 320,5 = 11096 M -1 -1 -1 -1 -1 ossidazione enzimatica in- 280.0 = 15261 M cm ) in drangularin A (8) in ibridi di cm , ε 280.0 = 8935 M cm ) dotti dalla interazione con il accordo con la presenza di un V. vinifera è qui riportata per compatibile con la presenza di patogeno. Questo ha fornito doppio legame stilbenico in la prima volta. un doppio legame trans-stil- una conferma indipendente configurazione E che assorbe benico nella struttura. I dati del coinvolgimento di altri a 313.5 nm, e spettri NMR in NMR e CD erano in accordo composti fenolici costitutivi accordo con la presenza di I trimeri del con un nuovo stereoisomero nella resistenza di P. viticola una miscela 1:1 di due com- resveratrolo di E-miyabenol C (Fig. 5). (15). Svariati fenoli e catecoli posti già identificati quali stil- Una attenta analisi in NMR sono peraltro stati dimostrati beni costitutivi di alcune α-viniferin (9). Lo spettro delle tracce HMBC suggeri- essere forti inibitori delle lac- Vitaceae, rispettivamente MS del picco isolato in fra- sce la stessa connettività degli casi di B. cinerea. Attraverso ampelopsin D (7) (23-24) e il zione 3.2 (Fig. 3) corrisponde atomi come per E-miyabenol l’inibizione della stilbene suo regioisomero, quadrangu- a quello di un resveratrolo tri- C (12) ma le misure NOESY ossidasi, i composti fenolici larin A (8) (25) (Fig. 4). mero, con un cromoforo UV indicavano un effetto dipolare costitutivi potrebbero attenua- L’attribuzione della struttura di media intensità (ε 282,5 = NOE molto forte del doppiet- -1 -1 re la difesa contro Botrytis, di questi isomeri trans- ha 6265 M cm ) e A280/A320 to δH 3.71 (H8a) con il suo preparando un `terreno sicu- richiesto qualche attenzione e = 0.238 (Fig. 2), compatibile protone vicinale H7a a δH ro’ per le classiche fitoalessi- la comparazione con un’altra con la presenza di anelli feno- 5.66 e un medio NOE con ne (16). struttura simile, parthenocis- lici isolati. I dati NMR, UV e H8b. Così, abbiamo ottenuto sin A (26) a causa delle infor- CD erano in accordo con la evidenza per suggerire qui la Pallidol (6). Lo spettro MS mazioni conflittuali riportate struttura nota della α-viniferin stereochimica 7a,8a cis per il del picco isolato in frazione nelle referenze citate. Al con- (Fig. 5), che era il primo stil- composto 10. Forti differenze 2.2 (Fig. 3) corrisponde a trario di quanto riportato in benoide con proprietà anti- nelle frequenze in 13C e 1H- quello di un resveratrolo letteratura (25), dove si asseri- fungine scoperto nelle foglie NMR per quasi tutti i nuclei dimero. Sia i dati NMR, che sce che “i dati NMR di ampe- di vite infettate da B. cinerea nella parte sinistra della strut- CD ed α erano in accordo con lopsin D (23) sono molto (29). Questo composto è stato tura (quella che contiene la la struttura nota del pallidol simili a quelli di quadrangula- riportato anche in foglie di giunzione con l’anello cis) e (Fig. 4) (17,19). Questo stil- rin A e la sua struttura dovreb- vite infettate con P. viticola, forti similarità dei δ per quelle benoide è conosciuto per be attualmente essere la stessa ma non in foglie irraggiate dalla parte opposta supporta- essere facilmente prodotto da di quadrangularin A”, noi con luce UV (30). Nel nostro no la nostra assegnazione. trans-resveratrolo trattato con confermiamo qui che una caso, le quantità isolate erano Anche i calcoli MM confer- colture di Botrytis cinerea attenta analisi dei dati NMR sufficienti a fornirci per la mano questa ipotesi, sugge- (20) o con perossidasi (21). del nostro campione che con- prima volta il suo spettro 13C rendo una struttura a geome- Nell’ultimo caso, è stata tiene entrambi i dimeri in NMR e potere ottico rotato- tria ottimizzata dove gli angoli riportata la produzione di (±)- quantità quasi equimolecolari rio, confermando una struttu- torsionali H7a-H7b e H8a, pallidol. La mancanza di atti- porta alla definitiva dimostra- ra dissimmetrica con [α]589 H8b sono trovati essere ri- vità ottica potrebbe non esse- zione che queste strutture (MeOH, c=0.14) = -46. spettivamente -240 e 1490, re dovuto alla racemizzazione sono diverse, in accordo con Secondo Langcake e Pryce por-tando a valutazioni di dei suoi centri chirali, ma alla la controindagine spettrosco- (3), α-viniferin inibisce il rila- J(7a,8a)=6.8 Hz e J(7b,8b) intrinsecamente bassa dissim- pica di Niwa et al (27). scio di zoospore da sporangi =8.9 Hz, in buon accordo con metria della intera molecola È stato suggerito (24) che di P. viticola, inibisce la i loro valori sperimentali. che contiene infatti un asse (-)-ampelopsin D (7) viene motilità delle zoospore dopo Questo nuovo stereoisome- interno di simmetria C2. sintetizzata dalle Vitaceae dal il loro rilascio ed è anche par- ro del miyabenol C potrebbe Sebbene, in principio, la pre- suo precursore (+)-E-ε-vini- ticolarmente attiva nei con- derivare dalla addizione di un senza di questo elemento di ferin (2), attraverso una ini- fronti della germinazione dei singolo intermedio trans- simmetria non faccia diventa- ziale protonazione acida del- conidi di B. cinerea. Dopo gli resveratrolo ossidato, con il re il pallidol una molecola l’atomo di ossigeno all’anello studi pioneristici di Pryce e radicale in posizione α sul achirale, potrebbe diminuire diidrofuranico, seguita da Langcake (29), la presenza di doppio legame stilbenico, ad le sue proprietà chirottiche. attacco nucleofilo del doppio questo composto, come pure un anello m-difenolo del Vale la pena di ricordare che i legame e formazione di un di altre presunte viniferine dimero (+)-E-ε-viniferin. La dati NMR del composto “4” anello intermedio a cinque non caratterizzate struttural- stereochimica di (+)-E-ε-vini- riportato in Kulesh et al., (22) membri, che si deprotona per mente, quali β-viniferin e γ- ferin viene completamente come (-)-pallidol otticamente formare (-)-ampelopsin D (7). viniferin (3), è stata trascura- ritenuta, mentre l’anello dii- attivo non sono in accordo Un tale meccanismo, che ta, forse per la difficoltà di drofurano di nuova formazio- con i dati NMR di campioni potrebbe giustificare la pre- identificarla e caratterizzarla. ne ha la stessa, poco comune di pallidol e sono chiaramente senza di questo composto, è Ne consegue che il nostro stu- stereochimica cis- già trovate inconsistenti con qualsiasi però incompatibile con la for- dio conferma per la prima nelle ω-viniferine (3,4). Una ragionevole struttura di dime- mazione di quadrangularin A volta la presenza di α-vinife- simile stereochimica nella ro del resveratrolo. (24,27). Una reazione stereo- rin (9) in foglie di vite infetta- condensazione della unità selettiva, che apparentemente te con P. viticola. resveratrolo terminale è già Ampelopsin D (7) e suo segue una ciclizzazione bio- stata osservata nella formazio- regioisomero, quadrangularin mimetica di stilbeni naturali E-cis-miyabenol C (10). Le ne del tetramero kobophenol A (8). Lo spettro MS del durante la oligomerizzazione strutture molecolari di 10, 11 A da E-miyabenol C nelle picco isolato in frazione 3.1 ossidativa, è stata dimostrata e 12 erano strettamente corre- radici di Carex kobomugi (Fig. 3) corrisponde a quello capace di produrre sia ampe- late. Lo spettro MS di 10, iso- Ohwi (31). di un resveratrolo dimero, con lopsin D che quadrangularin lato in frazione 4.1 (Fig. 3) assorbimento UV e coeffi- A, attraverso diversi meccani- era quello di un resveratrolo Z-Miyabenol C (11). Lo ciente di estinzione molecola- smi (28). La presenza sia di trimero, con un forte cromo- spettro MS del picco isolato in 79 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013 frazione 5.1 (Fig. 3) corrispon- e B con quelle rispettivamen- poco risolti, nel suo spettro deva ad un resveratrolo trime- I tetrameri te delle unità D e C. Una evi- 1H e per il basso rapporto ro, con forte cromoforo UV (ε del resveratrolo dente differenza con il palli- segnale rumore negli spettri -1 -1 281,5 = 14025 M cm ), in dol, è che ampelopsin H HSQC e HMBC. In particola- accordo con la presenza di un Isohopeaphenol (13). Lo mostra un forte effetto Cotton re i segnali dei protoni accop- doppio legame cis-stilbenico spettro MS del picco isolato nel suo spettro CD, indicando piati in orto ad H2c/H6c (6.92 nella struttura. Sia i dati NMR in frazione 6.1 (Fig. 3) corri- che questo composto dovreb- ppm) e H3b/H5b (6.55 ppm) che CD erano in accordo con sponde a quello di un resvera- be essere enantiomericamente appaino come dei doppietti la struttura di Z-miyabenol C trolo tetramero, con cromofo- puro. molto larghi, indicando quin- (11) (Fig. 5) (31) che non era ro UV di media intensità (ε Le unità A e D con identica di una rotazione ostacolata -1 -1 mai stato riportato in vite. 281,0 = 10929 M cm ) e configurazione relativa ed attorno al legame singolo I dati NMR per questo A280/A320 = 0.266 (Fig. 2), assoluta ai centri chirali 7a,8a C1c-C7c. Dato che quattro composto sono quasi sovrap- in accordo con la assenza di e 7d, 8d legati al sistema ad atomi di idrogeno methine ponibili a quelli di miyabenol coniugazione tra gli anelli anello interno del pallidol possono essere assegnati per C nelle unità A e B, mentre ci fenolici. I dati NMR, CD e a (unità B e C) sembra rafforza- la loro caratteristica risonanza sono significative differenze erano compatibili con la strut- re la dissimmetria complessi- H/C alle posizioni benziliche nei dintorni della unità C a tura nota del tetramero sim- va di questa molecola. 7b/8b e 7c/8c, assumiamo che conseguenza della presenza metrico isohopeaphenol (13, Questo tetramero potrebbe la struttura di questo tetrame- del doppio legame Z 7c/8c. Fig. 6), una viniferina già derivare dalla addizione di ro dovrebbe essere quella di Le stereochimiche relativa sui caratterizzata nel legno della due intermedi ossidati trans- un isomero di vaticanol C, ma centri chirali 7a/8a e 7b/8b è V. vinifera ‘Kyohou’ (34). resveratrolo, entrambi con il sono necessarie più dettaglia- stata stabilita essere trans in La struttura di isohopeaphe- radicale in posizione α, sul te misure NMR a partire da base agli effetti NOE dei cor- nol è stata chiarita per compa- doppio legame stilbenico, a una quantità maggiore di rispondenti segnali dei proto- razione con i dati NMR di ciascuno degli anelli m-dife- standard di 15 per definire la ni. Inoltre la forte NOE osser- hopeaphenol 16 (Fig. 6). La nolo del dimero pallidol (2.2). sua struttura. vata tra H8a e H8b nello spet- stereochimica relativa ai cen- La stereochimica del pallidol Il Vaticanol C non è mai tro NOESY ha suggerito una tri chirali è stata confermata viene completamente conser- stato riportato in Vitis, mentre relazione cisoide in questa da esperimenti NOESY. vata al centro del tetramero è stato già isolato nel legno struttura. (Fig. 6), mentre entrambi gli del fusto di Vatica rassak Isohopeaphenol è stato anelli diidrofuranici di nuova (Dipterocarpaceae) (35) du- E-Miyabenol C (12). Lo osservato qui per la prima formazione hanno la stereo- rante una ricerca di stilbenoi- spettro MS del picco isolato volta, come il composto isola- chimica trans, in base alle di con proprietà anticancro ed in frazione 5.2 (Fig. 3) corri- to in quantità di gran lunga misure NOESY. epatoprotettive. E’ stato tro- spondeva a quello di un maggiore dalle foglie di vite vato recentemente che è un resveratrolo trimero e sia i infettate da P. viticola (Tab. Un isomero di vaticanol-C forte inibitore delle Matrix dati NMR che CD erano in 1). Hopeaphenol, un isomero (15). Lo spettro MS del picco metalloproteinases (MMPs) accordo con la struttura di E- strutturalmente molto simile, isolato in frazione 7.2 (Fig. 3) (36). La particolare struttura miyabenol C (12, Fig. 5). I è stato isolato come stilbenoi- corrispondeva a quello di un dell’isomero di vaticanol C nostri dati NMR e CD erano de costitutivo delle radici di resveratrolo tetramero, con un potrebbe forse derivare da in buon accordo con la lette- V. vinifera cv. Chardonnay, cromoforo UV di media una condensazione diretta di -1 ratura (31-32). In particolare, dove la sua concentrazione intensità (ε 281,0 = 14832 M due unità di E-ε-viniferin, che la stereochimica dei benzodii- era nell’intervallo 0.5-8 mg/g cm-1), ed A280/A320 = 0.280 condensando attraverso i drofurani al C7a/C8a e di radice fresca (9). (Fig. 2), in accordo con l’as- doppi legami stilbenici, pro- C8a/8b è stata confermata senza di coniugazione tra gli ducono un sistema a dibenzo- essere trans e, come osserva- Ampelopsin H (14). Lo anelli fenolici. Sia i dati biciclo ottadiene. Questo to in 11, è stata osservata una spettro MS del picco isolato NMR, CD che la rotazione sarebbe consistente con il relazione cisoide di H8a in frazione 7.1 (Fig. 3) corri- ottica erano in accordo con la fatto che i dati NMR sono rispetto ad H8b. La quantità spondeva con un resveratrolo presenza di un tetramero compatibili con l’ipotesi che di 12 recuperata dalle nostre tetramero, con cromoforo UV asimmetrico, con un caratteri- sia conservata la configura- foglie di vite era la terza più di media intensità (ε 281,0 = stico sistema dibenzobici- zione di 2 ad entrambi gli alta tra tutte le viniferine, e la 12710 M-1 cm-1), e A280/ clo[3.2.1]ottadiene, contenen- anelli diidrofuranici. maggiore tra i trimeri (Tab. A320 = 0.253 (Fig. 2), in te due anelli diidrofurano con In conclusione, tre tetrameri 1). Questo è in buon accordo accordo con l’assenza di i loro costituenti fenolici in sono stati isolati per la prima con l’osservazione che la sua coniugazione tra gli anelli configurazione trans- (Fig. volta da foglie di vite infettate formazione richiede la addi- fenolici. Sia i dati NMR che 6). Mentre i dati NMR delle con P. viticola. È probabile zione di un radicale resvera- CD erano in accordo con la unità parziali A e D sono che uno di questi corrisponda trolo a 2, che è il principale presenza di un tetramero sim- facilmente assegnabili attra- con la viniferina non caratte- dimero, ripetendo lo stesso metrico, con la struttura di un verso tecniche 2D-NMR, l’in- rizzata osservata da Langcake meccanismo che aveva porta- derivato del pallidol, corri- terpretazione degli stessi dati e Pryce (3). Le quantità erano to alla formazione di 2, così spondente a quella di ampe- era molto più complessa decisamente elevate, cioè da ottenere la stereochimica lopsin H (14, Fig. 6) (23). quando si rivolge l’attenzione comparabili con quelle di E-ε- di 12. E-Miyabenol C viene Una struttura non osservata in alla parte centrale (unità B e viniferin (Tab. 1). qui riportato per la prima precedenza nella vite. C) di questo composto. volta nelle foglie di vite. Ampelopsin H è un tetra- L’analisi era complicata non Meccanismo di formazio- La vite è capace di sintetiz- mero simmetrico con un asse solo dalla limitata quantità di ne delle viniferine. Gli enzi- zarlo, dato che è già stato iso- C2 che causa l’equivalenza questo tetramero ma, princi- mi necessari per la formazio- lato tra i trimeri costitutivi dei chimica degli atomi di idro- palmente, dalla presenza di ne delle viniferine sono germogli di V. vinifera (33). geno e carbonio nelle unità A svariati picchi di scambio- espressi sia nei patogeni che 80 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013 nelle piante. La evidenza dio e quelli ottenuti negli Finanziamento. Questo lavo- della capacità della vite di studi precedenti (40,41,42, Riassunto ro ha avuto il supporto dai sintetizzare direttamente le 43,44), potrebbe essere dovu- Nelle Vitaceae, le viniferi- Progetti “Resveratrol” e ADP viniferine viene dalla loro ta a differenze nelle varietà di ne rappresentano un gruppo 2010, entrambi finanziati presenza costitutiva in grandi vite e nei metodi utilizzati, ed relativamente ristretto di oli- dalla Provincia Autonoma di quantità in alcune parti della è compatibile con l’ipotesi gomeri del trans-resveratrolo Trento, Italia. pianta, considerando che sva- che sia la pianta, piuttosto che dotati di proprietà antifungi- riati stilbeni (10,37) e stilbe- il patogeno, ad essere respon- ne, che permettono alle pian- Ringraziamenti. I nostri rin- noidi oligomeri (9) sono pre- sabile per il complesso pat- te di resistere all’attacco dei graziamenti a Francesco senti a livelli di grammi per tern di viniferine osservato patogeni. Berghi per la sua collabora- kg nelle radici di vite. ε-vini- nelle viti infettate da P. viti- Lo scopo di questo studio zione alla definizione dei ferin è stata riportata essere cola. In prospettiva, per valu- era di realizzare l’isolamento metodi di HPLC preparativo. uno stilbene costitutivo del tare se il risultato di questo e caratterizzazione strutturale raspo (38). Inoltre, la sintesi studio sia generalizzabile, dell’intera classe delle vini- Supporting Information (in di 3 dimeri (due glucosidi di sarebbe molto interessante ferine che si accumulano inglese). S1: Schema del- δ-viniferin e pallidol) è stata studiare altri genotipi resi- nelle foglie dei genotipi degli l’esperimento. S2. Dati strut- dimostrata nelle colture cellu- stenti nel confronto con diver- ibridi V. vinifera (Merzling x turali addizionali dei compo- lari di V. vinifera (39). si patogeni, al fine di analiz- Teroldego) infettati con sti isolati. Questo materiale è Viniferine “inducibili” pos- zare il profilo di accumulazio- Plasmopara viticola. Le disponibile gratuitamente via sono derivare dalla oligome- ne delle viniferine. foglie infette sono state rac- Internet (http://pubs.acs.org). rizzazione del trans-resvera- Le foglie infettate accumu- colte dalle piante resistenti 6 trolo nei tessuti della vite lano una quantità sostanziale giorni dopo l’infezione. Alla come una strategia di difesa di viniferine. Si deve osserva- estrazione con metanolo Riferimenti attiva della pianta. Sono diffi- re che gli stilbenoidi, una segue una prima purificazio- bibliografici cilmente rilevabili nelle foglie classe di viniferine “orfane”, ne mediante cromatografia sane, e svariati articoli hanno trascurata negli studi prece- flash usando le resine ENV+ 1. Bavaresco, L.; Fregoni, C.; provato la induzione di denti, erano di gran lunga la e Toyopearl HW. Due frazio- Van Zeller de Macedo Basto sostanziali accumuli di questi classe più importante dal namenti complementari, Goncalves, M.I.; Vezzulli, S. composti nelle foglie infette. punto di vista quantitativo nei rispettivamente via cromato- Physiology and molecular bio- Viniferine “metabolizzate” nostri genotipi di Mer-zling x grafia preparativa in fase logy of grapevine stilbenes: an possono essere prodotte o Teroldego (Tab. 1). normale seguita da cromato- update. In Grapevine modificate dal rilascio di Nonostante le inevitabili grafia preparativa in fase Molecular Physiology and enzimi esocellulari rilasciati perdite che si producono in inversa, hanno permesso di Biotechnology, 2nd edn., K.A., dal patogeno nel tentativo di un complesso processo di isolare 14 picchi. Roubelakis-Angelakis (ed.), eliminare indesiderabili com- isolamento, abbiamo potuto I composti isolati sono Springer Scien-ce + Business posti tossici. ricavare un totale di 14.74 stati identificati utilizzando Media B.V., London, UK 2009, Il profilo delle viniferine mg di viniferine (stilbeni e tecniche avanzate di spettro- 341-364. trovato nelle foglie infette di stilbenoidi) a partire da 517 g metria di massa, misure 2. Langcake, P.; Cornford, vite non presenta alcune delle di foglie, pari a 28.5 mg/kg estensive di risonanza ma- C.A., Pryce, R.J. Identification viniferine costitutive riportate FW. Una simile concentra- gnetica nucleare mono e of pterostilbene as a phytoale- nei tessuti di vite sani, quali zione è considerata importan- bidimensionale, UV, CD, xin from Vitis vinifera leaves. ad esempio ampelopsin A e te per spiegare la resistenza proprietà ottiche e calcolo Phytochemistry 1979, 18, hopeaphenol (9), r-viniferin della pianta, alla luce della delle meccaniche molecolari. 1025-1027. (37), r-2-viniferin (10), gnetin bassa concentrazione - usual- I risultati hanno dimostrato 3. Langcake, P.; Pryce, R.J. H (37), trans-miyabenol C mente nell’intervallo dei la presenza nelle foglie infet- A new class of phytoalexins (33), trans-amurensin B, μg/mL – richiesta per la bio- tate di sette dimeri (sei stil- from grapevines. Experientia amurensin G e ampelopsin F attività verso P. viticola. beni e uno stilbenoide), dei 1977, 33, 151-152. (45). Inoltre, si deve tenere in quali 4 nuovi per la vite 4. Jeandet P.; Douillet- Mentre la presenza nei conto che questi valori sono (ampelopsin D, quadrangula- Breuil, A.C.; Bessis, R.; nostri genotipi parzialmente stati prodotti a partire dall’in- rin A, E-ω-viniferin e Z-ω- Debord, S.; Sbaghi, M; Adrian, resistenti di numerose vinife- tera foglia, ed è noto che viniferin), quattro trimeri (tre M. Phytoa-lexins from the rine otticamente attive, piutto- sono assenti nelle foglie sane, stilbeni e uno stilbenoide), Vitaceae: biosynthesis, phytoa- sto che di racemi, suggerisce mentre la loro presenza è dei quali due (Z-miyabenol C lexin gene expression in tran- un alto livello di controllo limitata alla zona infetta e ad e E-cis-miyabenol C) nuovi sgenic plants, antifungal activi- della biosintesi, supportando una sottile zona fluorescente nella vite, quattro stilbenoidi ty, and metabolism. J. Agric. la teoria delle viniferine vicinale (2). tetrameri, tutti nuovi nella Food Chem. 2002, 50, 2731- “inducibili”, non è stato pos- È necessario ulteriore la- vite, isohopeaphenol, ampe- 2741. sibile escludere la possibile voro per valutare la bioattivi- lopsin H e un isomero simile 5. Pezet, R.; Perret C.; Jean- presenza di metaboliti dovuti tà dei nuovi oligomeri, che al vaticanol C. Denis, J.B; Tabacchi, R.; a laccasi e perossidasi fungi- nel caso di isohopeaphenol, L’isolamento di un dimero Gindro, K.; Viret, O. Delta- ne. Non abbiamo osservato la E-miyabenol C, l’isomero di che deriva dalla condensa- viniferin, a resveratrol dehy- presenza di δ-viniferin né di vaticanol C e pallidol, sono zione della (+)-catechina con drodimer: one of the major stil- alcun altro stilbenoide che sia importanti metaboliti di l’acido trans-caffeico indica benes synthesized by stressed formato attraverso il coinvol- stress che si accumulano inoltre che altri composti grapevine leaves. J. Agric. gimento di un radicale di nelle foglie infettate dei fenolici presenti vengono Food Chem. 2003, 51, 5488- resveratrolo del tipo C (21). genotipi parzialmente re- modificati strutturalmente 5492. La differenza tra il pattern sistenti di Merzling x Terol- nei tessuti infettati da P. viti- 6. Chong, J.; Poutaraud, A.; delle viniferine nel nostro stu- dego. cola. Hugueney, P. Metabolism and 81 L’ENOLOGO ❏ LUGLIO/AGOSTO 2013 roles of stilbenes in plants. Cissus pallida. Phytochemistry 29. Pryce, R.J., Langcake, P. bene dimer glucosides from Plant Sci. 2009, 177, 143-155. 1986, 25, 1945-1948. α-viniferin: an antifungal re- grape (Vitis vinifera) cell cultu- 7. Dell’Agli, M.; Galli, G.V.; 18. Ohyama, M.; Tanaka, sveratrol trimer from grapevi- res. J. Nat. Prod. 2001, 64, 136- Vrhovsek, U.; Mattivi, F.; T.; Iinuma, M.; Goto, K. 2 nes. Phytochemistry, 1977, 16, 138. Bosisio, E. In vitro inhibition of novel resveratrol trimers, lea- 1452-1454. 40. 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