Miconia Ferruginata DC

UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI - UFVJM

POLIANA RIBEIRO BARROSO

FITOQUÍMICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE Miconia ferruginata DC. (Melastomataceae)

DIAMANTINA - MG 2015

POLIANA RIBEIRO BARROSO

FITOQUÍMICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE Miconia ferruginata DC. (Melastomataceae)

Dissertação apresentada à Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração em Ciências Farmacêuticas para obtenção do título de “Mestre” em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Elídio Gregório - UNIFESP Coorientadora: Profa. Dra. Helen Rodrigues Martins - UFVJM

DIAMANTINA - MG 2015

POLIANA RIBEIRO BARROSO

FITOQUÍMICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE Miconia ferruginata DC. (Melastomataceae)

Dissertação a ser apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Stricto Sensu da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri – UFVJM, como pré-requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Aprovada em: 24/04/2015

COMISSÃO EXAMINADORA

______Dr. Luiz Elídio Gregório – UNIFESP. (Orientador)

______Dra. Helen Rodrigues Martins –UFVJM. (Co-orientadora)

______Dr. Marcos Aurélio Santana – UFOP. (Membro externo)

______Dra. Cristiane Fernanda Fuzer Grael – UFVJM. (Membro interno)

Dedico esta conquista, aos meus pais Ailton e Siane que me criaram com muito amor e que me ensinaram a sempre buscar os meus sonhos sem ter medo das dificuldades e frustrações que possa ter pela frente.

Agradecimentos

À Deus, primeiramente pelo dom da vida, e a graça de sempre me dar força em todos os momentos da minha vida pessoal e profissional.

À minha querida FAMÍLIA que sempre esteve ao meu lado em todas as etapas do meu crescimento, além do incentivo e amor incondicional.

Ao meu namorado, Dyego que sempre me ouviu sem reclamar. Além de todo apoio e amor em todos os momentos fácies e difíceis que passei.

Aos meus amigos pessoais e de pesquisa, Kelly, Fabrício, Bethânia, Mica e Valéria, sempre me dando força e ajuda (principalmente) em todas as etapas experimentais deste trabalho.

Aos meus orientadores, Luiz Elídio e Helen, que sempre me receberam de braços abertos e me guiaram no meu crescimento pessoal, ético e profissional.

E a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para que este sonho se tornasse realidade.

Em especial, as instituições de fomento (CAPES, CNP-q e FAPEMIG) e a Universidade (UFVJM) por tornarem possível a realização deste trabalho. Com vocês, meus queridos, divido minha alegria, em poder dizer: Mais uma etapa vencida e, que venha o Doutorado!!

“A menos que modifiquemos a nossa maneira de pensar, não seremos capazes de resolver os problemas causados pela forma como nos acostumamos a ver o mundo”.

(Albert Einstein)

RESUMO

As plantas medicinais são fontes promissoras de novas drogas, em que a região do Cerrado se destaca pela sua vasta biodiversidade. Dentre as plantas medicinais utilizadas nesta região se encontra a espécie Miconia ferruginata DC. que é conhecida como pixirica-do-campo ou babatenão. Esta espécie é utilizada no tratamento de doenças de pele, e outras de origens inflamatórias, parasitárias e infecciosas, porém os estudos químicos são escassos. Assim, os objetivos deste trabalho foram avaliar o perfil químico e o potencial biológico da M. ferruginata (Melastomataceae). A espécie foi coletada no município de Diamantina, MG do qual foram preparados os extratos aquosos e etanólicos das folhas/flores e do caule. Por meio da triagem fitoquímica e das análises de CLAE-DAD-EM obteve-se um perfil químico rico em compostos fenólicos. Foi possível a identificação da presença de taninos, ácidos fenólicos, flavonoides, e derivados glicosilados da quercetina. Pela análise dos constituintes voláteis por CG-EM foi possível identificar a presença de quatorze compostos, sendo eles pertencentes as classes dos sesquiterpenos, hidrocarbonetos, monoterpenos, fenilpropanoides e alcoóis.

No qual os sesquiterpenos β-cariofileno e α-humuleno foram os compostos majoritários, os quais são associados na literatura a diversas atividades biológicas, em especial a ações anti-inflamatórias, antifúngicas e antitumorais. A análise das frações por CG-EM e CLAE-DAD foi possível identificar catequinas, ácido gálico e flavonóis nos extratos aquosos e ésteres graxos e as subclasses das flavonas e flavonóis nos extratos etanólicos. Nas avaliações biológicas os extratos etanólicos e aquosos apresentaram baixa toxicidade em células de mamíferos, em que a concentração selecionada para a avaliação das demais atividades biológicas foi de até 500 µg/mL. Para a atividade antitumoral, os extratos apresentaram um grande potencial concentração dependente, com valores de IC 50 variando de 56,44 a 180,4 µg/mL. Bem como o tempo de exposição aumentou a potência de todos os extratos. Também foi observado que os extratos aquosos promoveram a inibição da proliferação de linfócitos estimulados por mitógenos, apresentando uma eficácia em relação à dexametasona, de 39,94% para o extrato das folhas a 45 µg/mL, e de 57,3%, 137,4% e 251,8% para os extratos do caule a 15, 20 e 30 µg/mL, respectivamente. Este efeito proliferativo pode estar relacionado ao potencial anti-inflamatório da M. ferruginata, relatada na medicina popular. Possivelmente, as atividades biológicas estão relacionadas ao rico perfil químico desta espécie, principalmente em compostos fenólicos. Para as atividades antimicrobianas, tripanocida

e leishmanicida não foram observadas a inibição do crescimento ou toxicidade frentes as cepas avaliadas. Desta forma este trabalho contribuiu para o conhecimento químico e biológico da M. ferruginata . Porém ensaios futuros utilizando as frações e substâncias isoladas, se fazem necessários para fortalecer os dados aqui apresentados e para demonstrar quais os mecanismos moleculares envolvidos nas atividades biológicas investigadas.

Palavras-chaves: Miconia ferruginata DC. , Melastomataceae, plantas medicinais, fitoquímica, atividades biológicas

Abstract

Medicinal plants are reassuring sources of new drugs, in which the Cerrado region stands out for its broad biodiversity. Among the medicinal plants used in this same region is the species Miconia ferruginata DC. which is also known as pixirica-do- campo or babatenão. This species is used in the treatment of skin diseases, and other inflammatory, infectious and parasitic sources, despite the chemical studies about it are lacking. Therefore, the objectives of this study were to evaluate the chemical profile and biological potential of the M. ferruginata (Melastomataceae).The species was collected in Diamantina, MG, in which it was prepared for water and ethanol extraction of the leaves/flowers and stem. Through phytochemical screening and analysis of HPLC-MS- DAD, we obtained a rich chemical profile in phenolic compounds. The identification of tannins, phenolic acids, flavonoids, glycosides of quercetin and derivativeshas been detected. For the analysis of volatile constituents by GC-MS, it was possible to identify the presence of fourteen compounds, namely belonging classes of sesquiterpenes, hydrocarbons, monoterpenes, phenylpropanoids and alcohols. For that, α and β- caryophyllene, humulenesesquiterpenes were the main components, which are associated in the literature several biological activities, especially anti-inflammatory, antifungal and antitumor activities.In the analysis of the fractions by GC-MS and HPLC-DAD, we identified catechins, gallic acid and flavonols in aqueous extracts,including fatty esters and subclass of flavones and flavonols in ethanol extracts. Within the biological evaluations, aqueous and ethanolic extracts showed low toxicity to mammalian cells, wherein the concentration selected for analysis of other biological activities was up to 500 µg/mL. For antitumor activity, the extracts showed a great potential concentration-dependent, with IC 50 values ranging from 56.44 to 180.4 µg/mL. Just as the exposure time increased the potency of all extracts, it was also observed that aqueous extracts promoted inhibition of the proliferation of mitogen-stimulated lymphocytes, showing a efficacy when compared to dexamethasone, 39.94% for the extract from the leaves of 45 µg/mL, and 57.3%, 137.4% and 251.8% for the extracts of stem of 15.20 and 30 µg/mL, respectively. This proliferative effect may be related to the anti-inflammatory potential of M. ferruginata , reported in folk medicine. Possibly, the biological activities are related to the rich chemical profile of this species, mainly in phenolic compounds. For the antimicrobial, trypanocidal and leishmanicidal activities, we have not observed growth inhibition or toxicity fronts of the evaluated strains. Thus

this work contributed to the chemical and biological knowledge of M. ferruginata. Nevertheless, future trials using isolated fractions and substances are needed to strengthen the data presented here and to demonstrate the molecular mechanisms involved in the biological activities investigated. It is likely that the biological activities are related to the rich chemical profile of this species, mainly regarding phenolic compounds. For antimicrobial activity, trypanocidal and leishmanicidal, it was not observed growth inhibition or toxicity regarding the evaluated strains. Thus, this work contributed to the chemical and biological knowledge of the M. ferruginata . However, future trials using isolated fractions and substances are needed to strengthen the data presented here and to demonstrate the molecular mechanisms involved in the biological activities hereby investigated.

Keywords: Miconia ferruginata DC., Melastomataceae, medicinal plants, phytochemistry, biological activities.

Lista de Ilustrações

Figura 1 – Localização do Bioma Cerrado na América do Sul. Extraída de 49 BRASIL, 2009b. Figura 2 – Mapa com as áreas de ocorrência das espécies da família 51 Melastomataceae com destaque os países de maior ocorrência em preto. Fonte: Trópicos (2015). Disponível em: http://www.tropicos.org/NamePage.aspx?nameid=42000202&tab=maps . Figura 3 - Distribuição geográfica do gênero Miconia no Brasil e 54 determinação atual do número de espécies por estado. Extraída de GOLDENBERG; CADDAH (2015). Figura 4 – Espécie Miconia ferruginata. Botanical Garden, Brasília, DF, 63 Brasil; 4/2005. Disponível em: http://www.virboga.de/Miconia_ferruginata DC.htm . Figura 5 - Exsicatas e figura sistemática de Miconia ferruginta coletadas 77 na região de Cerrado em Minas Gerais. A - voucher depositado no HDJF; B - voucher depositado no DIAM; C - Figura sistemática da espécie

Miconia ferruginta. Figura 6 – Representação esquemática das análises realizadas para triagem 79 fitoquímica com a droga vegetal e com os extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata . Figura 7 – Representação da estrutura do alcaloide verdadeiro, atropina. 81 ChemDraw Ultra (2004). Figura 8 – Representação da estrutura química básica das antraquinonas. 82 ChemDraw Ultra (2004). Figura 9 – Representação da estrutura dos terpenoides e esteroides. A - 84 Monoterpeno, limoneno; B - Sesquiterpeno, α-humuleno; C - Diterpeno, cafestol; D - Triterpeno, betulina; E - Esteroide, β-sitosterol. ChemDraw Ultra (2004). Figura 10 – Representação da estrutura química básica dos flavonoides. 86 ChemDraw Ultra (2004). Figura 11 – Representação da estrutura da saponina, glicirrizina. ChemDraw 89 Ultra (2004).

Figura 12 – Representação da estr utura química básica dos taninos. A - 91 Taninos hidrolisáveis; B - Taninos condensados. ChemDraw Ultra (2004). Figura 13 – Representação esquemática para calculo do fator de retenção 93 (Rf). Figura 14 – Reação do ácido gálico com o reagente Folin-Ciocaulteu, 96 durante quantificação do teor de compostos fenólicos. ChemDraw Ultra (2004). Figura 15 – Representação do dispositivo de microextração em fase 98 sólida (SPME). A - Posição com a fibra retraída na agulha; B - Posição com a fibra exposta. Extraído de VALENTE; AUGUSTO (2000). Figura 16 – Representação esquemática do procedimento de partição 103 líquido/líquido realizada com os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. Figura 17 – Reação de oxi-redução do 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5- 106 difeniltetrazólio (MTT) em formazano após a conversão pela enzima succinato desidrogenase. ChemDraw Ultra (2004).

Figura 18 – Representação esquemática da microplaca de 96 poços na 108 avaliação da citotoxicidade em células de mamíferos L929 e atividade antitumoral (MDA-MB-231) dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. A mesma placa foi realizada tendo como poços testes os demais grupos: E3, E4 e Cloreto de cádmio. Figura 19 – Representação esquemática da microplaca de 96 poços na 110 avaliação da atividade antibacteriana e determinação da concentração inibitória mínima (CIM), utilizando os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule e o extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata. Figura 20 - Reação de oxi-redução da resazurina em resofurina após 111 conversão pelas enzimas do sistema de transporte do metabolismo celular. ChemDraw Ultra (2004).

Figura 21 - Estratégia de análise da viabilidade celular por citometria de 118 fluxo. A e C - Gráfico de distribuição pontual para a seleção da população linfocitária utilizando os parâmetros de tamanho celular (FSC) e granulosidade celular (SSC), das culturas CON e E3, respectivamente. B – Histograma de FL-3 representando o percentual de células fluorescentes positivas nas culturas CON. D – Histograma de FL-3 representando o percentual de células positivas após incubação com extrato E3 de Miconia ferruginata . E3: Extrato aquoso das folhas/flores. Figura 22 – Estratégia de análise de proliferação celular pela diluição do 121 CFSE. A e C- Gráfico de distribuição pontual para a seleção das populações de linfócitos utilizando os parâmetros de tamanho celular (FSC) e granulosidade celular (SSC) das culturas CON e PHA, respectivamente. B - Histogramas de FL-1, utilizados para definir as regiões M1 do grupo CON. D – Histograma de FL-1 utilizado para definir as regiões M1 a M8 do grupo PHA, com as quais foi obtido o índice de proliferação (IP) para a população de linfócitos.

Figura 23 – Pesquisa de alcaloides nas folhas/flores e caule de Miconia 124 ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Peumus boldus Molina ); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule; M: Reagente de Mayer; B: Reagente de Bouchardat; H: Reagente de Hager; e D: Reagente de Dragendorff. Figura 24 – Pesquisa de antraquinonas nas folhas/flores e caule de 125 Miconia ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Senna alexandrina Mill. ); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. BD: Bornträger direta; BI: Bornträger indireta . Figura 25 – Pesquisa de esteroides/triterpenos nas folhas/flores e caule de 125 Miconia ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Ginkgo biloba L.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. LB: Reação de Libermann- Burchard; S: reação de Salkowisk.

Figura 26 – Pesquisa de flavonoides nas folhas/flores e caule de Miconia 126 ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Baccharis trimera (Less.) DC.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. S: Reação de Shinoda; CF: Reação com cloreto férrico; P: Reação de Pew; e CN: controle negativo. Figura 27 – Pesquisa de saponinas nas folhas/flores e caule de Miconia 127 ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Baccharis trimera (Less.) DC.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. Figura 28 – Pesquisa de taninos nas folhas/flores e caule de Miconia 127 ferruginata. A – Controle positivo (Folhas de Hamamelis virginiana L.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. G: Reação com gelatina; AC: Reação com acetato de chumbo; CF: Reação com cloreto férrico; CN: controle negativo. Figura 29 – Cromatograma dos extratos etanólicos das folhas/flores e do 129 caule de Miconia ferruginata para pesquisa de flavonoides após revelação com vanilina sulfúrica a 1%, seguida de aquecimento a 100°C por 10 minutos. P: padrão (quercetina); E1: extrato etanólico das folhas/flores; E2: extrato etanólico do caule; E3: extrato aquoso das folhas/flores; E4: extrato aquoso do caule. Figura 30 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa 132 acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida por headspace (HS- SPME). Figura 31 – Representação estrutural das substâncias identificadas ( 1 a 14 ) 135 por análise por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME) . ChemDraw Ultra (2004). Figura 32 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia 136 líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 280 nm).

Figura 33 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia 136 líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata (λ 280 nm). Figura 34 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia 137 líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 280 nm). Figura 35 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia 137 líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato aquoso do caule de Miconia ferruginata (λ 280 nm). Figura 36 – Representação estrutural das substâncias ou classes químicas 139 identificadas ( 15 a 20 ) pela análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) para os extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores de Miconia ferruginata. Figura 37 – Cromatograma de íons totais (vermelho) e cromatograma na 142 região do ultravioleta (verde) obtidos a partir da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata. Figura 38 – Representação estrutural das substâncias ou classes químicas 143 identificadas ( 21 a 25 ) pela análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) para o extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata. Figura 39 – Curva de calibração do padrão ácido gálico traçada pelo método 145 colorimétrico de Folin-Ciocalteu. Figura 40 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta 147 eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 254nm). Figura 41 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta 148 eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 280 nm).

Figura 42 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa 150 acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração n-hexânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata. Figura 43 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa 151 acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração n-hexânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata. Figura 44 – Espectro de massas da substância palmitato de etila ( 27 ) obtido 151 para o pico com tempo de retenção de 45.950 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração n-hexânica do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata. (A) . Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 93% (B). Figura 45 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa 152 acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata . Figura 46 – Espectro de massas da substância ciclopropil metil cetona ( 28 ) 152 obtido para o pico com tempo de retenção de 9.930 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata . (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 90% (B). Figura 47 – Espectro de massas da substância 2,3-hexanodiol ( 29 ) obtido 153 para o pico com tempo de retenção de 13.010 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata . (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 100% (B).

Figura 48 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa 153 acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata . Figura 49 – Espectro de massas da substância isobutirato de etila ( 30 ) obtido 154 para o pico com tempo de retenção de 6.315 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata . (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 91% (B). Figuras 50 – Representação estrutural dos compostos identificados ( 27 a 30 ) 155 por meio da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das frações n-hexânica e diclorometânica dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. ChemDraw Ultra (2004). Figura 51 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta 156 eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata . Figura 52 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta 156 eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata. Figura 53 – Porcentagem da viabilidade de fibroblastos L929 expostos a 159 diferentes concentrações dos extratos de Miconia ferruginata . A – Extrato etanólico das folhas/flores; B- Extrato etanólico do caule; C – Extrato aquoso das folhas/flores; D – Extrato aquoso do caule. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9). * p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguida do pós-teste de Bonferroni. CON: grupo controle de viabilidade; CM: grupo controle de morte com cloreto de cádmio.

Figura 54 – Microplaca teste com os extratos etanólicos das folhas/flores e 162 do caule e o extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata, após revelação com a resazurina, para as bactérias Staphylococcus aureus (linhas 1, 2, 3 e 7) e Pseudomonas aeruginosa (linhas 4, 5, 6 e 8). Figura 55 – Porcentagem da viabilidade celular das células MDA-MB- 165 231 submetidas à exposição com os extratos de Miconia ferruginata, após 48 horas. A – Extrato etanólico das folhas/flores; B - Extrato aquoso das folhas/flores; C – Extrato etanólico do caule; D - Extrato aquoso do caule. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9).* p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido de pós-teste de Bonferroni.CON: grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do solvente; PXT: grupo com fármaco padrão Paclitaxel. Figura 56 – Porcentagem da viabilidade celular das células MDA-MB- 166 231 submetidas à exposição com os extratos de Miconia ferruginata, após 72 horas. A – Extrato etanólico das folhas/flores; B - Extrato aquoso das folhas/flores; C – Extrato etanólico do caule; D - Extrato aquoso do caule. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9). * p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido de pós-teste de Bonferroni. CON: grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do solvente; PXT: grupo com fármaco padrão Paclitaxel. Figura 57 – Porcentagem da viabilidade das formas epimastigotas das 169 cepas de Tryanosoma cruzi expostas ao extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata, após 72 horas. A – Cepa Y de T. cruzi; B – Cepa Colombiana de T. cruzi. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. CON: Grupo controle de viabilidade; BEN: Fármaco padrão benznidazol a 75 µg/mL.

Figura 58 – Porcentagem da viabilidade das cepas de Leishmania sp. 171 expostas ao extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata, após 72 horas. A – Cepa BH46 - Leishmania (leishmania) infantum; B – Cepa M2269 -L. (leishmania) amazonensis. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. CON: Grupo controle de viabilidade; ANF: Fármaco padrão anfotericida B a 1 µg/mL. Figura 59 – Percentual de viabilidade das PBMC em culturas de 24 175 horas e 5 dias submetidas aos extratos aquosos de Miconia ferruginata . A – Extrato aquoso das folhas/flores em 24 horas; B – Extrato aquoso do caule em 24 horas; C – Extrato aquoso das folhas/flores em 5 dias; D – Extrato aquoso do caule em 5 dias. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=5). *p<0,05; **p<0,01 ANOVA seguido pós-teste de Dunns . CON: grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do solvente; CdCl 2: grupo controle de morte. Figura 60 - Índice de proliferação de linfócitos expostos aos extratos 177 aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata . Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=5). *p< 0,05; **p<0,01; ***p<0,001. ANOVA seguido de Tukey em relação ao grupo PHA. DEXA: grupo controle positivo com a dexametasona 8 µg/mL; E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule. Figura 61 – Histogramas representativos da análise sobre a proliferação 178 dos linfócitos expostos aos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata . A – Histograma das culturas estimuladas com PHA; B – Histograma das culturas estimuladas com PHA e Dexametasona; C, D e E – Histograma das culturas estimuladas com PHA e E3 nas concentrações de 45, 30 e 15 µg/mL, respectivamente; F, G e H – Histograma das culturas estimuladas com PHA e E4 nas concentrações de 30 20 e 15 µg/mL, respectivamente. E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule.

Lista de Quadros

Quadro 1 - Características e aplicações das técnicas hifenadas na 47 análise de produtos naturais. Quadro 2 – Metabólitos secundários e uso medicinal e/ou estudos 53 biológicos de espécies da família Melastomataceae. Quadro 3 - Indicação etnofarmacológica de espécies do gênero 56 Miconia. Quadro 4 – Substâncias isoladas e atividades biológicas de extratos 58 vegetais de espécies do gênero Miconia. Quadro 5 – Taxonomia de Miconia ferruginata 64 Quadro 6 – Relação das reações cromogênicas e de precipitação 80 aplicada para cada classe química analisada na caracterização do perfil fitoquímico da Miconia ferruginata. Quadro 7 - Reagentes gerais para pesquisa de alcaloides. 82

Quadro 8 – Resultados da fitoquímica preliminar por meio das reações 128 cromogênicas e de precipitação das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. Quadro 9 – Características das cepas bacterianas utilizadas para 160 determinação da atividade antibacteriana dos extratos brutos de Miconia ferruginata .

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Diluição dos extratos na determinação do índice de espuma 90 para pesquisa de saponinas na Miconia ferruginata .

Tabela 2 – Gradiente utilizado nas análises em cromatografia líquida 101 de alta eficiência com detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) para análise dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata.

Tabela 3 - Rendimento dos extratos etanólicos e aquosos brutos das 122 folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata

Tabela 4 - Rendimento das frações obtidas do extrato etanólico bruto 123 das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata por meio de partição líquido-líquido com solventes de polaridades crescentes

Tabela 5 – Triagem por meio de cromatografia em camada delgada 131 comparativa (CCDC) dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata

Tabela 6 – Dados obtidos na análise em cromatografia em fase gasosa 133 acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida com headspace (HS-SPME)

Tabela 7 – Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta 138 eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata

Tabela 8 – Dados obtidos a partir da análise em cromatografia líquida 142 de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) para o extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata

Tabela 9 – Média e desvio padrão do teor de compostos fenólicos 145 totais dos extratos aquosos de folha/flores e do caule de Miconia ferruginata

Tabela 10 – Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta 149 eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) das frações 3 e 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata

Tabela 11 - Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta 157 eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) das frações acetado de etila do extrato etanólico das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata .

Tabela 12 – Determinação da atividade antibacteriana e da 161 concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos brutos de Miconia ferruginata pela técnica de microdiluição em placa utilizando a resazurina como revelador.

Tabela 13 – Valores de Concentração inibitória 50% (IC 50 ) da 167 viabilidade celular de adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231) exposto aos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata nos tempos de 48 e 72 horas de cultura.

Tabela 14 – Leucograma dos voluntários saudáveis participantes do 173 estudo de viabilidade e proliferação de celular.

Tabela 15 - Percentual do índice de proliferação de culturas não 176 estimuladas com PHA e tratadas com os extratos aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata

Lista de Abreviações

Cell Line human ovarian carcinoma – Linhagem celular de A2780 carcinoma ovariana humana Acquired Immunodeficiency Syndrome - Síndrome da AIDS Imunodeficiência Adquirida ANFB Grupo controle com fármaco padrão anfotericina B Human Hepatocellular Carcinoma Cells – Linhagem celular BEL-7402 de carcinoma hepatocelular humano BEN Grupo controle com fármaco padrão Benzonidazol BH46 Cepa de Leishmania (leishmania) infantum BHI Brain Heart Infusion Broth B. O. D Incubadora com demanda bioquímica de oxigênio CAT Enzima catalase

CC 50 Concentração citotóxica a 50% CCD Cromatografia em camada delgada

CCDC Cromatografia em camada delgada comparativa Carboxy fluorescein diacetate succinimidyl Ester - Diacetato CFSE carboxifluoresceína succinimidil éster Cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de CG-EM massas Cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de CG-EM-EM massas sequencial CIM Concentração inibitória mínima CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por CLAE-DAD arranjo de diodos Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por CLAE-DAD-EM arranjo de diodos acoplada à espectrometria de massas Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à CLAE-EM-EM espectrometria de massas sequencial Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à CLAE-EM-RMN espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear

Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à CLAE-RNM ressonância magnética nuclear CLC Cromatografia líquida clássica CL-DAD Cromatografia líquida com detecção por arranjo de diodos CL-EM Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas CM Grupo controle de mortalidade CMH Caldo Mueller Hinton CON Grupo controle Murine colon carcinoma cells- Células de carcinoma do CT26 cólon de camundongos Colon cancer cell line – Linhagem celular de câncer de DLD-1 cólon DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO dimetilsulfóxido DNA ácido desoxirribonucléico E1 Extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata

E2 Extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata E3 Extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata E4 Extrato aquoso do caule de Miconia ferruginata Ethylene diamine tetra acetic acid - Ácido etilenodiamino EDTA tetra-acético EI Electron ionization - Ionização por elétrons ESI Electrospray ionization - Ionização por Eletrospray EUA Estados Unidos da América Gpx Glutationa peroxidase FSC Forward side scatter - Dispersão da luz frontal HeLa Adenocarcinoma do colo uterino humano Human Immunodeficiency Virus serotype 1 – Vírus da HIV-1 Imunodeficiência humana sorotipo 2

High Performance Liquid Chromatography – Cromatografia HPLC líquida de alta eficiência Solid Phase Micro Extration by headspace - Microextração HS-SPME em fase sólida por headspace

HSV-2 Herpes genital do tipo 2 Human colon adenocarcinoma cells – Células de HT29 adenocarcinoma de cólon humana

IC 50 Concentração inibitória de 50% IE Índice de espuma IL-1 Interleucina 1 IL-1b Interleucina 1 b IL-2 Interleucina 2 iNOS Inducible nitric oxide synthase IP Índice de Proliferação IRR Índice de Retenção Relativa L929 Fibroblastos de mamíferos clone 929 da linhagem L de camundongos LDL Low Density Lipoproteins – Lipoproteínas de baixa densidade LIT Liver Infusion Triptose

M109 Carcinoma de Madison Lung M2269 Cepa de L. (leishmania) amazonenses M4BEU Weakly metastatic melanoma cells MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization - Dessorção/Ionização com Laser assistida por matriz MDA-MB-231 Células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-468 Células de adenocarcinoma de mama MG Minas Gerais MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina NK2 Receptors neurokinin type 2 - Receptores de neuroquina tipo 2 NMDA N-methyl-D-aspartate receptors - Receptores de N-metil-D- aspartato PA Padrão analítico Peripheral Blood Mononuclear Cell - Células PBMC Mononucleares do Sangue Periférico PBS Phosphate buffered saline - Tampão Fosfato Salino

PBS/BSA Phosphate buffered saline/Bovine serum albumin - Tampão Fosfato salina/Soro Albumina Bovina PHA Phytohemagglutinin - Fitohemaglutinina

LA 2 Phospholipase A2 – Fosfolipase A2 PXT Grupo controle com fármaco padrão Paclitaxel R Coeficiente de correlação RDC Resolução da Diretoria Colegiada Rf Fator de retenção RMN-H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio RPMI Roswell Park Memorial Institute 1640 SDS Sodium dodecyl sulfate - Dodecil sulfato de sódio SFB Soro bovino fetal inativado a 56 ºC SOD Superóxido dismutase TIC Total ion chromatogram - Cromatogramas de íons totais TNF-α Fator de necrose tumoral alfa sp. Espécie

SSC Side ligth Scatter – Dispersão da luz lateral UV Ultravioleta UV- vis Região do Ultravioleta e visível Y Cepa do protozoário Trypanosoma cruzi II

Lista de Siglas

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATCC American Type Culture Collection CDB Convenção Sobre Diversidade Biológica CEP Comitê de Ética e Pesquisa CGEN Conselho de Gestão do Patrimônio Genético CIPq-Saúde Centro Integrado de Pós-Graduação e Pesquisa em Saúde CLSI Manual Clinical and Laboratory Standards Institute ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay FIOCUZ Fundação Oswaldo Cruz Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da FCFRP-USP Universidade de São Paulo HDJF Herbário Dendrológico Jeanine Felfili INCA Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva LEFB Lista de Espécies da Flora do Brasil

LIMP Laboratório de Imunopatologia NATEP Núcleo de Apoio Técnico de Ensino e Pesquisa NEPRONAT Laboratório Núcleo de Estudos de Produtos Naturais NCTC National Collection of Type Cultures NPPNS Núcleo de Pesquisas em produtos Naturais e Sintéticos OMS Organização Mundial da Saúde SBFgnosia Sociedade Brasileira de Farmacognosia SUS Sistema Único de Saúde UFMG Universidade Federal de Minas Gerais UFOP Universidade Federal de Ouro Preto UFVJM Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri UNIFESP Universidade Federal de São Paulo UNU-IAS United Nations University - Institute of Advanced Studies WHO World Health Organization

Lista de Símbolos

°C/min Grau Celsius por minuto

CdCl 2 cloreto de cádmio células/mL células por mililitro cm centímetro cm 2 centímetros quadrados

CO 2 dióxido de carbono Da daltons eV eletron-volt Fe +3 íons férrico

FeCl 3 cloreto férrico g grama - unidade de medida de massa g unidade de gravidade g/mL gramas por mililitro

°GL Grau °Gay Lussac H2O2 peróxido de hidrogênio

H3PMo 12 O40 ácido fosfomolibídico

H3PW 12 O40 ácido fosfotúngstico KCl cloreto de potássio KPa quilopascal L litros M molar mg miligrama mg/mL miligrama por mililitro mg EAG/g miligrama de equivalentes de ácido gálico por grama min minutos mL mililitro mL/min mililitro por minuto mm milímetro mm 3 milímetro cúbico mM milimolar

no número NaCl cloreto de sódio

NaH 2PO 4 fosfato monossódico

Na 2CO 3 carbonato de sódio

Na 2MoO 4.2H 2O molibdato de sódio bihidratado NaOH hidróxido de sódio ng nanograma ng/mL nanograma por mililitro Nm nanômetro NO óxido nítrico pH potencial hidrogeniônico 4- [(PMoW 11 O4) ] complexos de molibdênio-tungstênio rpm rotações por minuto V volume v/v volume por volume UI/mL unidade internacional por mililitro

UFC/mL unidade formadora de colônias por mililitro u.m.a unidade de massa atômica US$ dólar americano µL microlitro µM micromolar µm micrômetro % porcentagem

Sumario

1. INTRODUÇÃO 39

2. OBJETIVOS 40

2. 1 Objetivo Geral 40

2. 2 Objetivos Específicos 40

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 42

3. 1 As plantas medicinais e fitoterápicos 42

3. 2 Bioprospecção e análise fitoquímica 45

3. 3 Cerrado: biodiversidade e importância 48

3. 4 Familia Melastomataceae 50

3. 5 Gênero Miconia 54

3. 5. 1 Distribuição e aspectos botânicos 54

3. 5. 2 Etnofarmacologia 55

3. 5. 3 Fitoquímica 57

3. 5. 4 Estudos biológicos com espécies do Gênero Miconia 57

3. 6 Miconia ferruginata DC. 63

4 METODOLOGIA 65

4. 1 Equipamentos 65

4. 2 Preparo de reagentes e soluções 66

4. 2. 1 Azul de Tripan 66

4. 2. 2 Caldo Muller Hinton (CMH) 66

4. 2. 3 Caldo e meio sólido Brain Heart Infusion Broth (BHI) 67

4. 2. 4 Carbonato de sódio 67

4. 2. 5 Cloreto de cádmio 2 µM 67

4. 2. 6 Meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 67 suplementado

4. 2. 7 Meio de cultura Live Infusion Tryptose (LIT) suplementado 68

4. 2.8 Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado 68

4. 2. 9 Reagente de Bouchardat/Wagner 69

4. 2. 10 Reagente de Dragendorff 69

4. 2. 11 Reagente de Hager 70

4. 2. 12 Reagente de Mayer 70

4. 2. 13 Solução de acetato de chumbo 10% 70

4. 2. 14 Solução de ácido acético 10% 70

4. 2. 15 Solução de ácido clorídrico 10% 70

4. 2. 16 Solução de ácido gálico 100 mg/mL 70

4. 2. 17 Solução de ácido sulfúrico 71

4. 2. 18 Solução de alfa-bisabolol 0,1 g/mL 71

4. 2. 19 Solução de anfotericina B 1 µg/mL 71

4. 2. 20 Solução de antibióticos e antibiótico/antimitótico 71

4. 2. 21 Solução de benznidazol 75 µg/mL 72

4. 2. 22 Solução de butilbrometo de escopolamina 0,08 mg/mL 72

4. 2. 23 Solução de cloranfenicol 30 µg/mL 72

4. 2. 24 Solução de cloreto de alumínio 5% 72

4. 2. 25 Solução de cloreto férrico 2% 73

4. 2. 26 Solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) 10% 73

4. 2. 27 Solução de etanol 73

4. 2. 28 Solução de gelatina 2,5% 73

4. 2. 29 Solução de hemina 10 mg/mL 73

4. 2. 30 Solução de hidróxido de amônia 74

4. 2. 31 Solução de hidróxido de potássio 5% 74

4. 2. 32 Solução de hidróxido de sódio 1M 74

4. 2. 33 Solução de iodeto de potássio 74

4. 2. 34 Solução de metanol 80% 74

4. 2. 35 Solução de paclitaxel 6 µM 74

4. 2. 36 Solução de quercetina 0,5 mg/mL 75

4. 2. 37 Solução de resazurina 0,01% 75

4. 2. 38 Solução de saponina 0,3 g/mL 75

4. 2. 39 Solução de vanilina sulfúrica 1% 75

4. 2. 40 Solução de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de 75 tetrazolina (MTT)

4. 2. 41 Solução salina 0,09% 76

4. 2. 42 Tampão fosfato salino (PBS) 76

4. 2. 40 Tampão Fosfato Salino /Albumina sérica bovina (PBS/BSA) 0,1% 76

4. 3 Coleta e identificação taxonômica 77

4. 4 Preparo dos extratos brutos 78

4. 5 Análises fitoquímicas preliminares 79

4. 5.1 Teste para alcaloides 80

4. 5. 2 Teste para antraquinonas 82

a) Reação de Bornträger direta 82

b) Reação de Bornträger indireta com hidrólise ácida 83

4. 5. 3 Teste de esteroides/triterpenoides 83

a) Reação com vanilina sulfúrica 85

b) Reação de Libermann-Burchard 85

c) Reação de Salkowisk 85

4. 5. 4 Teste de flavonoides 85

a) Reação de Shinoda 87

b) Reação com cloreto de alumínio 87

c) Reação com cloreto férrico 87

d) Reação com hidróxidos alcalinos 88

e) Reação de Wilson-Taubock 88

f) Reação de Pew 88

4. 5. 5 Teste de saponinas 89

a) Propriedade afrogênica 90

b) Determinação do índice de espuma 90

4. 5. 6 Teste de taninos 90

a) Reação com gelatina 91

b) Reação com cloreto férrico 91

c) Reação com acetato de chumbo 92

4. 6 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) 92

4. 6. 1 Analise de alcaloides 94

4. 6. 2 Analise de antraquinonas 94

4. 6. 3 Analise de terpenoides 94

4. 6. 4 Analise de flavonoides 94

4. 6. 5 Analise de saponinas 95

4. 6. 6 Analise de taninos 95

4. 7 Teor de compostos fenólicos 95

4. 8 Análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de 97 massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME).

4. 9 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por 99 arranjo de diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos de folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata.

4. 10 Análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por 101 arranjo de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

4. 11 Fracionamento dos extratos brutos e análise das frações 102

4. 11. 1 Extratos aquosos 102

4. 11. 2 Extratos etanólicos 102

4. 12 Atividades Biológicas dos extratos etanólicos e aquosos das 104 folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata

4. 12. 1 Preparo dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule 104 de Miconia ferruginata

4. 12. 2 Avaliação da citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata 104

4. 12. 2. 1 Linhagem celular 104

4. 12. 2. 2 Avaliação da citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata 105 sobre células de mamífero L929

4. 12. 3 Avaliação de atividade antibacteriana 108

4. 12. 3. 1 Micro-organismos 108

4. 12. 3. 2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) 109

4. 12. 4 Atividade antitumoral 111

4. 12. 4. 1 Linhagem celular 111

4. 12. 4. 2 Avaliação da atividade antitumoral dos extratos de Miconia 112 ferruginata sobre células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231

4. 12. 5 Avaliação da atividade tripanocida 113

4. 12. 5. 1 Cepas 113

4. 12. 5. 2 Avaliação da atividade tripanocida do extrato etanólico das 113 folhas/flores de M. ferruginata sobre diferentes cepas de T. cruzi

4. 12. 6 Avaliação da atividade leishmanicida 114

4. 12. 6. 1 Cepas 114

4. 12. 6. 2 Avaliação da atividade leishmanicida do extrato etanólico das 115 folhas/flores de Miconia ferruginata sobre diferentes cepas de Leishmania sp.

4. 12. 7 Avaliação da viabilidade e proliferação celular 115

4. 12. 7. 1 Amostra biológica 115

4. 12. 7. 2 Obtenção das Células Mononucleares do Sangue Periférico 116 (PBMC)

4. 11. 7. 3 Avaliação dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de 117 Miconia ferruginata sobre a viabilidade das PBMC humanas, in vitro

4. 12. 3. 4 Análise dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de 119 Miconia ferruginata sobre a proliferação de linfócitos humanos, in vitro

4. 13 Análises estatísticas 121

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 122

5. 1 Perfil químico da Miconia ferruginata 122

5. 1.1 Preparo e rendimento dos extratos e frações 122

5. 1. 2 Fitoquímica preliminar 123

5. 1. 2. 1 Reações cromogênicas e de precipitação 123

5. 1. 2. 2 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) 128

5. 2 Análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de 131 massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida por headspace

5. 3 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por 136 arranjos de diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos de folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata

5. 4 Análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por 141 arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata

5. 5 Teor de compostos fenólicos 144

5. 6 Fracionamento em coluna Sephadex LH-20 e análise por cromatografia 146 líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata

5. 7 Análise das frações dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de 150 Miconia ferruginata por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD)

5. 7. 1 Análise por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de 150 massas (CG-EM) das frações n-hexânica e diclorometânica provenientes do fracionamento dos extratos etanólicos de Miconia ferruginata

5. 7. 2 - Análise por cromatografia líquida de alta eficiência com detector por 155 arranjos de diodos (CLAE-DAD) das frações acetato de etila provenientes do fracionamento dos extratos etanólicos de Miconia ferruginata

5. 8 Ensaios Biológicos 158

5. 8. 1 Citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata sobre fibroblastos 158

5. 8. 2 Atividade antibacteriana de Miconia ferruginata 159

5. 8. 3 Efeito citotóxico de Miconia ferruginata sobre células tumorais de 164 adenocarcinoma

5. 8. 4 Atividade tripanocida do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia 169 ferruginata

5. 8. 5 Atividade leishmanicida do extrato etanólico das folhas/flores de 171 Miconia ferruginata

5. 8. 6 Ação do extrato aquoso de Miconia ferruginata sobre a viabilidade de 173 PBMC humana, in vitro

5. 8. 7 Efeito do extrato aquoso de Miconia ferruginata sobre a proliferação 175 de linfócitos humanos

6 CONCLUSÕES 180

7 PERSPECTIVAS 182

8 REFERENCIAS 183

ANEXO A - Parecer consubstanciado do comitê de ética e pesquisa 226

ANEXO B – Termo de consentimento livre e esclarecido 227

ANEXO C – Autorização para coleta da espécie Miconia ferruginata DC. 230

ANEXO D - Autorização para acesso ao patrimônio genético 231

APÊNDICE A – Espectros de Massas dos compostos identificados por meio 233 análise por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta

APÊNDICE B – Espectros de massa obtidos da análise em cromatografia 238 líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

APÊNDICE C - Espectro na região do ultravioleta-visível obtidos na análise 244 em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata

APÊNDICE D - Espectro na região do ultravioleta-visível obtidos na análise 246 em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata

APÊNDICE E - Espectros na região do Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) da 249 análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.

APÊNDICE F - Espectros na região do Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) da 253 análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata.

1 INTRODUÇÃO As plantas medicinais são comumente utilizadas pela humanidade por milhares de anos para tratamento de diversas doenças e controle de pragas, além de serem utilizadas como matéria-prima bruta e modelo para a síntese de substâncias bioativas (MACIEL et al., 2002; SIMÕES et al., 2007). Nos países em desenvolvimento as plantas muitas vezes são o único recurso terapêutico disponível para tratar doenças das populações cujo acesso a medicamentos industrializados é limitado, além da tradição do uso de plantas medicinais. Entretanto, somente o uso tradicional não é suficiente para comprovar a eficácia e segurança dos produtos naturais e, estudos científicos que comprovem estas características se fazem necessários (MACIEL et al., 2002; HIGUCHI, 2007). Assim, com base nos dados etnobotânicos, a exploração dos recursos biológicos naturais por meio da bioprospecção tem sido foco de vários estudos atualmente (FONTANA et al., 2000; BARREIRO, 2009). A bioprospecção propicia a exploração da biodiversidade e conhecimento do potencial químico e farmacológico do patrimônio genético vegetal e animal. Isso pode fornecer substâncias importantes ao ser humano, permitir a seleção de princípios ativos com potencial econômico e contribuir para melhorar a pesquisa no país (HIGUCHI, 2007; SACCARO JR, 2011; PALMA; PALMA, 2012). A partir de 2009 aumentou expressivamente o interesse dos setores governamentais e privados em tentar associar o avanço tecnológico ao conhecimento popular e ao desenvolvimento sustentável. Neste contexto, a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos tem como objetivo promover a pesquisa, desenvolvimento de tecnologias e inovações em plantas medicinais e fitoterápicos, com base na biodiversidade brasileira, abrangendo espécies vegetais nativas e exóticas adaptadas, priorizando as necessidades epidemiológicas da população nas diversas fases da cadeia produtiva (BRASIL, 2009a). Segundo a Associação Brasileira de Empresas do Setor Fitoterápico, não existem dados oficiais desse mercado e, as estimativas variam entre US$ 350 milhões a US$ 550 milhões, correspondendo a 10,5% do mercado farmacêutico. De acordo com a ANVISA, em 2013, o Brasil contava com cerca de 400 medicamentos fitoterápicos registrados. Assim em decorrência da busca de novas substâncias biologicamente ativas, o interesse sobre a diversidade dos biomas brasileiros vem crescendo em ritmo acelerado, no qual o bioma que mais se destaca é Cerrado, por apresentar a segunda maior

biodiversidade e extensão (DIAS, 1996; BRASIL, 2007). A família Melastomataceae é a sexta família em importância neste bioma, contendo cerca de 518 espécies (MENDONÇA; LINS, 2000), entre elas a espécie Miconia ferruginata DC. Esta espécie é conhecida popularmente como pixirica-do-campo ou babatenão, utilizada em forma de banhos ou infuso para tratamento de dores, doenças de pele, além de doenças de origens inflamatórias, parasitárias e infecciosas (ALMEIDA; BANDEIRA, 2010). Contudo, apesar desta ser uma espécie com utilização popular no Cerrado, os estudos científicos são escassos e, por isso, há necessidade em aprofundá-los tanto sobre a composição química quanto atividades biológicas desta espécie.

2 OBJETIVOS

2. 1 Objetivo Geral Realizar estudo fitoquímico e avaliar atividades biológicas da espécie Miconia ferruginata .

2. 2 Objetivos Específicos a) Obter extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata ; b) Realizar análises fitoquímicas preliminares, por meio de reações cromogênicas, de precipitação e cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC); c) Realizar análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata; d) Realizar análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata; e) Particionar os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule com solventes de diferentes polaridades e posterior análise das frações obtidas por meio de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD); f) Realizar o fracionamento dos extratos aquosos das folhas/flores e caule por cromatografia por exclusão utilizando coluna Sephadex LH-20 e, posterior análise das frações obtidas por CLAE-DAD;

g) Avaliar constituintes voláteis das folhas, flores e caules presentes na M. ferruginata , através de microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME) e posterior análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM); h) Avaliar a citotoxidade dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata em modelos, in vitro, sobre fibroblastos de camundongo da linhagem L929; g) Avaliar a atividade antibacteriana, in vitro, dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata ; h) Avaliar, in vitro, a atividade tripanocida do extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata; i) Avaliar, in vitro, a atividade leishmanicida do extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata; j) Avaliar, in vitro, a atividade antitumoral dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata sobre células de adenocarcinoma de mama, MDA-MB-231; k) Avaliar o efeito dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata sobre a viabilidade e proliferação de leucócitos mononucleares do sangue periférico humano.

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3. 1 As plantas medicinais e fitoterápicos O uso de plantas com fins medicinais pelo homem é uma das mais antigas práticas terapêuticas da humanidade. Existem relatos da utilização de plantas pelas comunidades egípcias, asiáticas e chinesas desde 1.600 anos antes de Cristo (a.c), incluindo, por exemplo, a mirra, o cânhamo e o ópio (SCHWAMBACH, 2007). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) define-se como planta medicinal "todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semi-sintéticos" (OMS, 1998). Assim toda planta que contém um ou mais princípios ativos em sua composição que são úteis à saúde humana e animal, são consideradas plantas medicinais (MORGAN, 1994). O conhecimento popular sobre plantas medicinais foi acumulado e transmitido verbalmente por sucessivas gerações (CUNHA, 2003), gerando uma rica cultura. Esta prática representa muitas vezes o único recurso terapêutico de várias comunidades e grupos étnicos, principalmente, nos países em desenvolvimento (MACIEL et al., 2002). Estima-se que entre 70 a 90% da população mundial já utilizou ou utiliza algum tipo de planta para tratar alguma sintomatologia (WINSLOW; KROLL, 1998; OMS, 2011). A OMS afirma que a medicina tradicional está contida em um conjunto de conhecimentos, técnicas e procedimentos baseados em teorias, crenças e experiências. Este conjunto de informações é empregado na manutenção da saúde, prevenção, diagnóstico e tratamento de enfermidades físicas e mentais (OMS, 2002). O Brasil apresenta uma grande biodiversidade e possui vasta variedade cultural e étnica, o que torna comum o uso de plantas medicinais pela sua população (BRASIL, 2006a; ALBUQUERQUE et al., 2007; FREITAS et al., 2012). Na maioria das vezes as plantas são utilizadas na forma de extratos brutos, decoctos, infusos, macerados, “garrafadas”, xaropes ou emplastros para o tratamento de diversas doenças (GURIB- FAKIM, 2006). No país o comércio de plantas medicinais é comum tanto nas regiões mais pobres como também nas grandes cidades, em feiras livres, mercados populares como também são frequentemente plantadas nos quintais das casas (MACIEL et al., 2002; HOEFFEL et al., 2011). Embora o conhecimento do potencial curativo e a utilização das plantas sejam antigos, os estudos relacionados à avaliação de suas propriedades medicinais são

recentes. Entre as 500 mil espécies de plantas catalogadas no mundo, apenas 1% foi estudada cientificamente quanto ao seu potencial químico-farmacológico (MELENDÉZ; CAPRILES, 2006). Por isso, muitas espécies vegetais têm sido utilizadas empiricamente, sem respaldo científico quanto a sua eficácia e segurança (HOLETZ et al., 2002; AGRA et al., 2008; TACHJIAN et al., 2010). O processo de descoberta e desenvolvimento de um novo fármaco ou fitoterápico é longo, complexo, caro e de alto risco, sendo dividido em duas fases: 1) a fase de descoberta denominada fase pré-clínica ou pesquisa básica que ocorre por meio de testes in vitro e in vivo e 2) a fase de desenvolvimento ou clínica, a qual se subdivide em quatro etapas experimentais em humanos (LOMBARDINO; LOWE, 2004). Contudo, após cumpridas essas fases de avaliação são poucas as moléculas ou fitoterápicos que se enquadram em todos os requisitos exigidos e são aprovados para comercialização (YUNES et al., 2001). Neste contexto, apesar da disponibilidade de tecnologia e estratégia suficiente para a obtenção de fármacos derivados exclusivamente da síntese química, em geral, os produtos naturais e, principalmente, as plantas medicinais, continuam a ser a fonte mais promissora de novos fármacos e constituintes químicos.

Seus princípios ativos servem como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e matéria prima farmacêutica, bem como para a exploração no mercado fitoterápico (BALUNAS; KINGHORN, 2005; SCHMIDT et al., 2008). Estima-se que 25% dos medicamentos atualmente utilizados na clínica médica são derivados diretamente ou indiretamente de plantas medicinais (PHILLIPSON, 2001; BRASIL, 2012). A partir da aprovação e validade das plantas medicinais e fitoterápicos com finalidade profilática e terapêutica pela OMS, o Brasil começou a valorizar e validar essas práticas por meio de programas e políticas de saúde. Essas medidas foram inicialmente implantadas por meio da Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no SUS, que é uma diretriz e linha de ação para o programa de “Plantas Medicinais e Fitoterapia no SUS”. Esta política envolve também outras formas alternativas de terapêutica, tais como a homeopatia e acupuntura (BRASIL, 2006b; BRASIL, 2008a). No que se refere às plantas medicinais e fitoterápicos, esta política fornece como objetivo geral a inclusão destes recursos terapêuticos no SUS e caracteriza fitoterápico como um produto obtido de planta medicinal ou seus derivados, com exceção de substâncias isoladas, para aplicação profilática, curativa ou paliativa, em que seu uso foi validado e comprovado cientificamente (BRASIL, 2006a). Além disso, o programa

recomenda medidas secundárias que buscam qualificar os profissionais de saúde para o conhecimento da fitoterapia, a realização de estudos epidemiológicos que identifiquem doenças passíveis de utilização da fitoterapia e, de estudos de eficácia e segurança que forneçam critérios para a inclusão e/ou exclusão de espécies vegetais em uma futura relação nacional de plantas medicinais (BRASIL, 2006b; BRASIL, 2008a). Com o intuito de fortalecer o desenvolvimento da cadeia produtiva de plantas medicinais e fitoterápicos e de sua inserção na rede pública, em 2009, o governo brasileiro aprovou a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (RODRIGUES et al., 2006a; BRASIL, 2009a). Esta política busca garantir o acesso seguro e racional de plantas medicinais e fitoterápicos, a promoção do uso sustentável da biodiversidade e o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional (BRASIL, 2009a). Em 2010, a ANVISA fundamentada nas diretrizes destas políticas nacionais, promoveu ampla revisão das legislações para o setor fitoterápico e elaborou novas normas, como a RDC nº 10/2010, que dispõe sobre a notificação de drogas vegetais. Promoveu também, por meio da Farmacopeia Brasileira a revisão das monografias de plantas medicinais (BRASIL, 2010b). Porém, apenas em 2014, foi que entrou em vigor a Resolução n° 26/2014, que define as categorias de medicamento fitoterápico e produto tradicional fitoterápico, bem como estabelece os requisitos mínimos para o registro e renovação de registro de medicamento fitoterápico e, para o registro, renovação de registro e notificação de produto tradicional fitoterápico. Neste mesmo ano, pela Instrução Normativa n° 2, foram publicados os 27 medicamentos fitoterápicos e os 16 produtos tradicionais fitoterápicos, ambos com registro simplificado (BRASIL, 2014 b e c). Em virtude da importância destes programas no contexto da fitoterapia na rede pública, o Ministério da Saúde, por meio da Portaria GM nº 886, de 20 de abril de 2010, instituiu a Farmácia Viva no âmbito do SUS. Esta portaria estabelece que este centro deve participar de todas as etapas da cadeia produtiva, desde cultivo até a dispensação de preparações magistrais e oficinais de plantas medicinais e fitoterápicos na rede pública (BRASIL, 2010c).

3. 2 Bioprospecção e análise fitoquímica O Brasil é detentor da maior biodiversidade do planeta, concentrando aproximadamente 13% de todas as espécies existentes (LEWINSOHN; PRADO, 2006). Uma das maneiras de tentar extrair o valor econômico da biodiversidade é por meio da bioprospecção. SACCARO JR (2011) a define como a busca sistemática por organismos, genes, enzimas, compostos, processos de partes provenientes de seres vivos de modo geral, com potencial econômico e, que possam ser usados para o desenvolvimento de um produto comercializável. O conjunto dos alvos levantados pela bioprospecção forma o patrimônio genético nacional. Uma das primeiras ações para a preservação da diversidade biológica foi a Convenção Sobre Diversidade Biológica (CDB), que reconheceu a soberania de cada país sobre os recursos genéticos em seu território (CDB, 2015). Esta primeira reunião ocorreu em 1992 e contou com a participação de 168 países, teve como base a conservação e a utilização sustentável da biodiversidade como preocupação comum da humanidade (BRASIL, 1992). Posteriormente, em 2001, foi criado o Conselho de Gestão do Patrimônio Genético (CGEN), o qual tem como atribuição deliberar sobre o credenciamento de instituições públicas responsáveis por analisar as solicitações de acesso aos recursos genéticos e emitir as autorizações, tanto para o acesso ao patrimônio genético e ao conhecimento tradicional quanto para sua remessa para o exterior (BRASIL, 2003; AZEVEDO, 2005). Os incentivos às ações de bioprospecção são necessários com objetivo de impedir a apropriação indevida do patrimônio genético, promover o desenvolvimento interno da pesquisa, obtenção de patentes, produção e exportação de produtos provenientes da biodiversidade e do fortalecimento tecnológico e econômico. Nesse contexto, o Brasil apresenta uma imensa vantagem, pois conta atualmente com um desenvolvido setor acadêmico e tecnológico (NEGRAES; EGLER, 2002). Estes investimentos resultam em muitos benefícios quando associados também a bioprospecção, principalmente, nos setores da saúde. Cerca de 50% dos fármacos mundiais foram desenvolvidos com base em moléculas biológicas obtidas de estudos com produtos naturais (SACCARO JR, 2011), especialmente, drogas antitumorais e antibióticos (UNU-IAS, 2005). Porém, o Brasil ainda tem pequena contribuição científica e precisa avançar ainda mais nesta área. A bioprospecção na área de plantas medicinais é realizada por meio de análises fitoquímicas e ensaios biológicos in vitro e in vivo de extratos brutos e de moléculas bioativas isoladas . A fitoquímica envolve o conhecimento sobre os constituintes

químicos produzidos pelo metabolismo secundário dos vegetais em seu processo de adaptação ao meio ambiente, por meio de isolamento e elucidação estrutural desses metabólitos (SIMÕES et al., 2007). Assim, os estudos fitoquímicos fornecem dados para obtenção e/ou desenvolvimento de novas moléculas terapêuticas, que podem ser usadas como base de matéria-prima farmacêutica, protótipos moleculares de fármacos, e no desenvolvimento de fitoterápicos (BRAZ FILHO, 2010). Os estudos fitoquímicos se dividem em duas grandes áreas: a fitoquímica clássica e a fitoquímica moderna. A primeira, envolve ensaios preliminares por meio de reações cromogênicas, de precipitação e isolamento de moléculas por métodos cromatográficos clássicos, tais como cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), cromatografia líquida clássica (CLC) e outros (BARBOSA, 2004). A fitoquímica moderna abrange os ensaios de separação anteriormente citados, porém emprega técnicas hifenadas de detecção e análise como cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (CL-EM), cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM), cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à ressonância magnética nuclear (CLAE-RNM) e outras (CROTTI et al., 2006; RODRIGUES et al., 2006b). O termo técnica hifenada refere-se ao acoplamento de duas ou mais técnicas analíticas com o objetivo de obter uma ferramenta de análise mais eficiente e rápida que as técnicas convencionais (PINTO, 2002; RODRIGUES et al., 2006b). No Quadro 1 foi apresentado resumidamente a aplicação das diferentes técnicas hifenadas na área de produtos naturais.

Quadro 1- Características e aplicações das técnicas hifenadas na análise de produtos naturais. Técnicas Características Exemplos de aplicação na Referências área de produtos naturais CG-EM Identificação de Estudo da sazonalidade de BRANCO; compostos voláteis ou algumas classes de PIZZOLATTI, volatilizáveis. metabólitos secundários, 2002; FIAMEGOS Fornece informação caracterização de aromas e et al., 2004 estrutural da molécula. identificação de Permite comparação com terpenoides. Análise de bibliotecas espectrais. flavonoides após derivatizações. CG-EM-EM Identificação de Análise de fragrâncias e GRANERO et al., . compostos voláteis ou essências. 2004 volatilizáveis. Confirmação estrutural de moléculas. CLAE-DAD Identificação de Análise de flavonoides. BRANCO; compostos Controle de qualidade de PIZZOLATTI, através da comparação do plantas medicinais, busca 2002 tempo de retenção e de metabólitos ativos, espectro UV com o estudos de ecologia padrão analítico. Fornece química e pouca ou nenhuma quimiossistemáticos. informação estrutural. CLAE-EM Raramente resulta na Análise de antocianinas SMITH et al., identificação definitiva. Quando acoplados ao 1991; COSTA et Muitas vezes acoplado ionizador tipo ESI ou al., 2000; PINTO, com CLAE-DAD para MALDI permite análise de 2002 fornecer informações moléculas termolábeis, estruturais complexos organo- complementares. metálicos Empregado na e moléculas de elevada quantificação de massa molecular incluindo compostos. polímeros e proteínas. CLAE-EM- Determinação de novos e Determinação de WOLFENDER et EM de compostos já flavonoides e saponinas. al., 1998 conhecidos com a incrível vantagem da simplicidade no preparo da amostra e rapidez na obtenção dos resultados. CLAE-RMN Constitui-se a técnica Determinação de WOLFENDER et mais poderosa na alcaloides, flavonoides al., 1998; determinação estrutural lactonas sesquiterpênicas, FERRARI et al., de substâncias inéditas esteroides, saponinas, 2000; BRANCO; com novos esqueletos e iridoides e metabólitos PIZZOLATTI, em misturas secundários aromáticos. 2002; PINTO, biologicamente ativas. 2002; ZANOLARI et al., 2003

A maior vantagem das técnicas hifenadas é a facilidade e rapidez na caracterização de compostos e/ou moléculas presentes em extratos brutos ou misturas complexas de produtos naturais (HOSTETTMANN et al., 2001; EISENREICH; BACHER, 2007). A partir de uma triagem química por meio de técnicas como CL-EM, CLAE-EM, CLAE- DAD-EM e CLAE-EM-RMN obtêm-se uma gama de informações sobre a constituição metabólica e estrutural de diferentes tipos de produtos naturais (WILSON; BRINKMAN, 2003; PATEL et al., 2010). Esta praticidade fornece uma racionalização de estudos químicos, de tempo e de custos. Essas técnicas são mais sensíveis, mesmo em baixas concentrações (na ordem de picogramas), necessitam de menores quantidades de amostra e, apresentam alta confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados. Além disso, apresenta a vantagem de gerar menor quantidade de resíduos e menor gasto de solvente quando comparado com as técnicas clássicas (COLLINS et al., 2006). Com o desenvolvimento destas técnicas para caracterização química de produtos naturais, a produção científica nesta área vem crescendo em ritmo acelerado. Um levantamento entre 1998 a 2009 em todo mundo, registrou 32.960 publicações científicas na área de fitoquímica, de acordo com o banco de dados da Web of Scienc. O

Brasil ocupa a sexta posição, com 1.762 publicações. Este reflexo é visto no aumento do número de novos medicamentos de origem vegetal, no qual das 119 drogas produzidas 75% foram extraídas de plantas superiores (PIMENTEL; ALMEIDA, 2010). Além disso, a contribuição da medicina popular na fundamentação e ponto de partida para a investigação pré-clínica não pode ser desprezada. Entre os fitoterápicos e/ou fitofármacos produzidos, 74% foram descobertos por meio de orientações baseadas na medicina popular. Assim, concomitantemente com o desenvolvimento científico da química de produtos naturais contribui-se para o avanço de outras atividades científicas e tecnológicas no país, além de fortalecer o conhecimento popular (LEMOS et al., 2007).

3. 3 Cerrado: biodiversidade e importância O Brasil apresenta a maior diversidade biológica do mundo, distribuídas em áreas vegetais de plantas nativas como a Caatinga, a Mata Atlântica, o Pantanal, os Campos, a Amazônia e o Cerrado. Este último se destaca por ser um dos principais biomas, tanto em área quanto em biodiversidade (BIZERRIL, 2003) ocupando 25% do território brasileiro (BRASIL, 2007). O Cerrado é a maior região de savana tropical da América do Sul e ocorre predominantemente no Planalto Central (Figura 1) (BRASIL, 2007). Este bioma é

encontrado no Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Tocantins, Maranhão, Bahia, Piauí, Minas Gerais, São Paulo e Paraná, abrangendo aproximadamente 1.500 municípios. Pode ser encontrado ainda em encraves isolados em quase todos os estados, nos quais se destacam: Campos de Humaitá e Campos do Puciarí (Amazonas), Serra dos Pacaás Novos (Rondônia), Serra do Cachimbo (Pará) e Chapada Diamantina (Bahia) (BRASIL, 2009b).

Bioma Cerrado

Figura 1 – Localização do Bioma Cerrado na América do Sul. Extraída de BRASIL, 2009b.

Com grande riqueza de espécies e elevada variedade, no Cerrado são observadas desde plantas herbáceas, arbustivas, arbóreas até cipós, totalizando cerca de 12.187 espécies nativas distribuídas em 181 famílias (REZENDE et al., 2008; LEFB, 2015), na qual 4.440 são endêmicas (KLINK; MACHADO, 2005). Entre as famílias que se destacam estão a Malpighiaceae, Vochysiaceae, Leguminosae e Melastomataceae (MENDONÇA et al., 1998). Apesar da diversidade biológica, o Cerrado vem sendo devastado num ritmo bastante acelerado, devido às queimadas descontroladas, a expansão não sustentável da agricultura, a caça predatória e a poluição (NEPSTAD et al., 1997; DUARTE; BRAGA, 1998). Isso ocasionou a sua inclusão na lista dos 25 hotspots de biodiversidade do mundo (SILVA; BATES, 2002). Os hotspots são áreas críticas para a conservação,

definidas com base na existência de espécies endêmicas, particularmente, as de distribuição geográfica restrita, e no grau de ameaça ambiental (MYERS et al., 2000). Também na tentativa de conservação das espécies foi elaborada a Portaria n o 443, de 17 de dezembro de 2014. Esta norma dispõe sobre a “Lista Nacional Oficial das Espécies da Flora Brasileira Ameaçadas de Extinção”, na qual das 4617 espécies ameaçadas, 2118 se encontram na Mata Atlântica e no Cerrado (BRASIL, 2014a). A grande biodiversidade vista no Cerrado ocorre devido à variedade de ambientes, observadas em sua extensão, onde se destacam os diferentes tipos de solos, relevo e fitofisionomias. Estas fitofisionomias estão representadas por formações florestais, savânicas e campestres (BRASIL, 2009b). De acordo com RIBEIRO e WALTER (2008), neste bioma são descritos onze tipos principais de vegetação distribuídos em três formações: 1) florestais (Mata Ciliar, Mata de Galeria, Mata Seca e Cerradão), 2) savânicas (Cerrado sentido restrito, Parque de Cerrado, Palmeiral e Vereda) e 3) campestres (Campo sujo, Campo limpo e Campo rupestre). Em consequência da sua elevada biodiversidade, o uso da flora e fauna do Cerrado é bastante diversificado. A população regional utiliza a riqueza vegetal para gerar alternativas sustentáveis de renda, envolvendo atividades de diferentes naturezas, tais como alimentícias, madeireiras, forrageiras, artesanais e, em especial, medicinais. Entre as espécies, se destacam o baru, a cagaita, o araticum, a guariroba, o pequi, a arnica, o barbatimão, o velame, os frutos de sucupira, a mangaba e as sempre-vivas (AGUIAR; CAMARGO, 2004; OLIVEIRA et al., 2008). No Estado de Minas Gerais o Cerrado concentra cerca de 8.155 espécies distribuídas em 175 famílias (LEFB, 2015). Entre essas regiões, o município de Diamantina localizado na região nordeste de Minas, apresenta como fitofisionomia marcante e com maior extensão o campo rupestre. De acordo com DRUMMOND et al. (2005) esta região, apresenta importância biológica e farmacológica especial, ainda pouco explorado.

3. 4 Família Melastomataceae Melastomataceae representa uma das mais importantes famílias botânicas da flora neotropical, constituída de 4.200 a 5.000 espécies distribuídas em 11 tribos e 185 gêneros (RENNER, 1993; RENNER et al., 2015) de distribuição pantropical (Figura 2) (MARCON; COSTA, 2000). Esta família tem sido reconhecida por ser característica e de grande importância, quanto ao número de espécies, ambientes ocupados, aspectos

reprodutivos, biodiversidade, e aplicações pelo homem (BORGES, 1991; ROMERO; MARTINS, 2002; SANTOS, 2003). Em geral, as suas espécies são bastante utilizadas para o reflorestamento de áreas degradadas, retirada da madeira, uso ornamental, confecção de artesanatos e aplicações medicinais (CRUZ; KAPLAN, 2004; GIL- SANTANA; MARQUES, 2008; ALMEIDA; BANDEIRA, 2010; ALBUQUERQUE et al., 2013).

Figura 2 – Mapa com as áreas de ocorrência das espécies da família Melastomataceae com destaque os países de maior ocorrência em preto. Fonte: Trópicos (2015). Disponível em: http://www.tropicos.org/NamePage.aspx?nameid=42000202&tab=maps .

Esta família é representada por árvores e arbustos, em sua maioria, e em menor parte por lianas, epífitas, ervas anuais e perenes (ROMERO; MARTINS, 2002; JUDD et al., 2010). As espécies são facilmente reconhecidas, por apresentarem características específicas, tais como folhas opostas, simples, geralmente curvinérvias, flores vistosas bissexuadas, dialipétalas, períginas ou epíginas com estames em número duplo ao de pétalas (SOUZA; LORENZI, 2005). As flores, geralmente, localizadas nas inflorescências terminais ou axilares são polinizadas por abelhas coletoras de pólen (JUDD et al., 2010). Os estames são frequentemente longos, exsertos e vistosos, anteras poricidas, normalmente falciformes, frutos capsulares ou baciformes com grande quantidade de sementes (SOUZA; LORENZI, 2008). Apresentam facilidade em adaptações, devido à grande produção de sementes, eficiente dispersão dos propágulos, altas taxas de germinação e crescimento rápido (ALBUQUERQUE et al., 2013).

No Brasil essa família é a sexta maior entre as Angiospermas, distribuídas desde a Amazônia até o Rio Grande do Sul, ocorrendo em quase todas as formações vegetacionais (ROMERO; MARTINS, 2002). Dos 185 gêneros, 17 deles são considerados endêmicos, no qual os gêneros Miconia Ruiz & Pav., Leandra Raddi e Tibouchina Aubl. são os mais representativos (BAUMGRATZ et al., 2014). O gênero Miconia representa aproximadamente 30% das espécies desta família (GOLDENBERG; CADDAH, 2013 e 2015; REZENDE, 2012) e a maioria é encontrada nas regiões tropicais e subtropicais (RENNER et al., 2015). Em Minas Gerais são encontrados aproximadamente 29 gêneros e 342 espécies desta família, com 86 espécies pertencentes ao gênero Miconia (REZENDE, 2012; BAUMGRATZ et al., 2014). Por causa da sua ampla distribuição e biodiversidade no território brasileiro, a família Melastomataceae tem proporcionado a realização de vários estudos, porém, ainda não refletem sua diversidade taxonômica no país (GOLDENBERG et al., 2012). O seu perfil químico ainda é pouco conhecido (RODRIGUES, 2007), dentre os estudos químicos, têm sido verificado a presença comum de ácidos graxos, flavonoides, taninos, triterpenoides e quinonas (CELOTTO, et al., 2003; RODRIGUES, 2007).

Na medicina popular, as espécies desta família já foram relacionadas a ações antiparasitárias, antihelminticas, antivirais, antitumorais, anti-inflamatórias, cicatrizante e anti-séptica. Também já foi registrado seu uso no tratamento da escabiose, dispepsia, hipertensão, erisipela, leucorreia, dermatoses, eupepsia, reumatismo, resfriado, febre, hematúria, insônia, dores de cabeça e diversas infecções (CALDERÓN et al., 2002; DÉVÉHAT et al., 2002; CELOTTO, et al., 2003; CUNHA et al., 2003a e b; NETO; MORAIS, 2003; CRUZ; KAPLAN, 2004; KALA, 2005; BRASILEIRO et al., 2006; FENNER et al., 2006; PINTO et al., 2006; BARDÒN et al., 2007). No Quadro 2 são descritas algumas espécies de Melastomataceae estudadas quanto ao seu perfil químico, ao uso medicinal e/ou as atividades biológicas.

Quadro 2 – Metabólitos secundários e uso medicinal e/ou estudos biológicos de espécies da família Melastomataceae. Uso medicinal/ Espécie Classe química Referência Atividade biológica Afecções de garganta RODRIGUES, 2007; Clidemia cf. rubra Antocianinas e MOURA, 2006; Mart compostos fenólicos GORDON et al.,

2011 Antidesintérico, GUARIM NETO; antisséptico, MORAIS, 2003; Clidemia hirta (L.) Antocianidinas e antiespasmótico, COSTA et al., 2006; G. Don compostos fenólicos cicatrizante, vômitos GIRALDI; e banhos genitais HANAZAKI, 2010 Henriettella Antitumoral CALDERÓN Flavonoides, fascicularis (Sw.) C. et al., 2002; terpenos e derivados Wright CALDERÓN do ácido elágico et al., 2003 Diarreia, Taninos, flavonoides, HASS; VAN Leandra australis enfermidade do antocianinas e POSER, 1990; (Cham.) Cogn. aparelho circulatório saponinas PLANTMED, 2015 e espasmos Triterpenos e Antimicrobiana Marcetia latifolia flavonoides LEITE, 2009 Naudin . polimetoxilados e glicosilados Taninos Antiviral e YOSHIDA et Melastoma hidrolisáveis e tratamento de úlceras al., 1992; DÉVÉHAT malabathricum L. flavonoides et al., 2002 Melastoma Taninos hidrolisáveis Úlceras MOREIRA, 1862 pauciflora Lam. e flavonoides Pressão alta, varizes, Mouriri elliptica Flavonoides prurido, hemorroida, Mart. glicosilados depurativo do ANDRÉO, 2008 sangue, gastrite e úlceras Pterolepis glomerata Flavonoides e Diarreia e outros SANTOS et al., 2009 (Rottb.)Miq. terpenos problemas intestinais Tibouchina asperior Flavonoides e Diurético ALICE et al., 1995 (Cham.) Cogn terpenos Dores de cabeça e YOSHIDA et Tibouchina Taninos al., 1999; PIVA, semidecandra F. hidrolisáveis cicatrizante 2002 Tibouchina Analgésica Antocianidinas TERAHARA urvilleana et al., 1993 (DC.) Cogn. Trembleya laniflora Flavanona e Antimicrobiana VENTURA et al., (D. Don) Cogn. triterpenos 2007

3. 5 Gênero Miconia

3. 5. 1 Distribuição e aspectos botânicos O gênero Miconia Ruiz & Pav., é considerado um dos maiores gêneros neotropicais de Angiospermas, apresentando entre 1.000 a 2.000 espécies publicadas (GOLDENBERG, 2000; RENNER; BECK, 2003). De acordo com ROMERO e MARTINS (2002) este gênero tem distribuição ampla nas formações florestais do neotrópico, ocorrendo desde o sul do México até o norte da Argentina e Uruguai. No Brasil é representado por 281 espécies, das quais 123 são endêmicas (GOLDENBERG; CADDAH, 2015), distribuídos em todos os estados, com predominância nas regiões Norte e Sudeste (Figura 3) (GOLDENBERG, 2000; BAUMGRATZ; CHIAVEGATTO, 2006; GOLDENBERG et al., 2012).

Figura 3 - Distribuição geográfica do gênero Miconia no Brasil e determinação atual do número de espécies por estado. Extraída de GOLDENBERG; CADDAH (2015).

As espécies deste gênero são reconhecidas pelo hábito arbustivo ou arbóreo com ramos e face abaxial das folhas densamente recobertas por tricomas dendríticos curtos, mesclados com tricomas estrelados, folhas discolores, com margem inteira. As inflorescências são terminais multiflorais, geralmente glomeruladas, mas com alguns ramos, às vezes com flores mais esparsadas e estames brancos (GOLDENBERG; REGINATO, 2006). Segundo JUDD (1989), estas características são simplesiomórficas, ou seja, são características compartilhadas por dois ou mais grupos, e por isso contribuem para problemas taxonômicos (WURDACK; RENNER, 1993; MARTINS et al., 1996).

3. 5. 2 Etnofarmacologia O uso econômico do gênero Miconia concentra-se na existência de espécies ornamentais (SOUZA; LORENZI, 2008), em que cerca de 250 são utilizadas para este fim (GIL-SANTANA; MARQUES, 2008). Devido à exibição de flores bonitas e atrativas, essas espécies, são empregadas na ornamentação de ruas, parques e praças públicas (LORENZI; SOUZA, 2001). Outra importância é sua aplicação medicinal

(CRUZ; KAPLAN, 2004), em que, essas espécies são encontradas de forma endêmica na região do Cerrado. Contudo, apesar da diversidade desse gênero poucas espécies foram exploradas quanto ao seu potencial químico-farmacológico . O uso popular ocorre principalmente na forma de infuso e extratos alcoólicos das folhas e flores para tratamento de doenças inflamatórias, infecciosas e ações antiofídicas e analgésicas (CRUZ; KAPLAN, 2004; RODRIGUES et al., 2008). As indicações medicinais de espécies do gênero Miconia relatadas na literatura se encontram resumidas no Quadro 3.

Quadro 3- Indicação etnofarmacológica de espécies do gênero Miconia. Espécie Nome popular Forma Indicação Referência utilizada popular M. albicans Canela-de- Infuso das Infecções STALCUP, Steud velha, pixirica folhas e urinárias e 2000; PAULA, ou quaresmeira caule ou genitais, regular 2009; banhos o ritmo cardíaco, ZANDONÁ, antiofídico, 2009 reumatismo e prevenir infartos M. --- Folhas Úlceras, anti- CAVALCANTE; aplostachya sépticas e FRIKEL, 1973; (Bonpl.) DC. cicatrizantes FENNER et al., 2006 M. ciliata Caiuia- branca Folhas Sedativa, HASRAT et al., (Rich.) DC. insolação, 1997 diurética, depurativa, coceira e suores noturnos

M. Mexerico, Infuso das Resfriado e febre BOSCOLO, cinnmonifolia jaguatirao folhas e 2003; (DC) Naudin caule BOSCOLO; VALLE, 2008 Miconia --- Uso tópico e Antiofídica DE PAULA, fallax DC. banhos 2009 M. Babatenão, Infusão, Anti- ALMEIDA; ferruginata pixirica banho com inflamatória, BANDEIRA, DC. as folhas infecções e dores 2010 M. Carpuna Partes aéreas Analgésico CUNHA et al., ligustroides branca 2003b; SILVA; (DC.) Naudi FRANCO, 2010

M. mirabilis Capa-de- Banho ou Descarrego e STALCUP, 2000 (Aubl.) L.O. Xangô cataplasma reumatismo Williams das folhas e flores M. rubiginosa Pixirica, Infuso dos Infecções de RODRIGUES; (Bonpl.) DC. Capiroroquinha ramos com garganta CARVALHO, folhas 2001; MOURA, 2006; MAIA; ANDRADE, 2009 Miconia sp. Pixirica, Folhas ou a Escorbuto, TENE et al., jaguatirão, planta inteira reumatismo e 2007 carrasco dores crônicas

3. 5. 3 Fitoquímica As triagens fitoquímicas com espécies deste gênero mostrou perfil químico rico em flavonoides, taninos, triterpenos, cumarinas, benzoquinonas e outros compostos fenólicos (CUNHA et al., 2003a; SERPELONI et al., 2008a e b; ZHANG et al., 2003; RODRIGUES et al., 2007; MANCINI et al., 2008; RODRIGUES et al., 2011). Uma triagem química realizada por CREVELIN e colaboradores (2006) identificaram triterpenos e esteroides em seis espécies de Miconia, como os triterpenos β-amirina e α- amirina e o esteroide β-sitosterol presentes em todas as espécies. Neste estudo observou-se ainda a presença de estigmasterol e lupeol, na maioria das espécies. Além destes compostos, os triterpenos pentacíclicos têm sido frequentemente identificados e isolados de espécies do gênero Miconia (CUNHA et al., 2003a; SPESSOTO et al., 2003; VASCONCELOS et al., 2006), entre eles o inédito acetato 28- carboxi-3-oxoolean-12-en-21 α-il (C 32 H48 O5) obtido das folhas de M. macrothyrsa (DINIZ et al., 2006). Além desses, os ácidos ursólico e oleanólico, são apontados como os constituintes majoritários deste gênero, que se encontram, principalmente, na forma de mistura isomérica (LIN et al., 2002; CUNHA et al., 2003a; DINIZ et al., 2006; VASCONCELOS et al., 2006; CUNHA et al., 2008; CUNHA et al., 2010).

3. 5. 4 Estudos biológicos com espécies do Gênero Miconia Alguns estudos tem comprovado o potencial terapêutico de espécies do gênero Miconia . Entre as atividades biológicas relatadas destacam-se os efeitos anti- inflamatórios (VASCONCELOS et al., 2006; RODRIGUES, 2007), analgésicos (HASRAT et al., 1997; SPESSOTO et al., 2003; VASCONCELOS et al., 2006), antimutagênicos (RESENDE et al., 2006; SERPELONI et al., 2008a), antioxidantes (PIERONI et al., 2011) antimicrobianos (LI et al., 2001; CELOTTO et al., 2003; ALVES et al., 2008; RODRIGUES et al., 2008), antitumoral (CUNHA et al., 2008; LIN et al., 2002; GUNATILAKA et al., 2001), tripanocida (CUNHA et al., 2003a; CUNHA et al., 2006) e leishmanicida (PEIXOTO et al., 2011). Os metabólitos secundários mais relacionados às atividades biológicos são os pertencentes à classe de triterpenos ácidos, tais como os ácidos ursólico, oleanólico, sumaresinólico, gipsogênico, hidroxiursólico, máslico, urjnólico, entre outros (LIN et al., 2002; CUNHA et al., 2003a; DINIZ et al., 2006; CUNHA et al., 2006; VASCONCELOS et al., 2006; CUNHA et al., 2008). No Quadro 4 estão resumidas as

substâncias isoladas e as atividades biológicas relatados na literatura de espécies do gênero Miconia .

Quadro 4 – Substâncias isoladas e atividades biológicas de extratos vegetais de espécies do gênero Miconia.

Espécies Extrato Classe química/ Atividades Referência substâncias biológicas isoladas M. albicans Clorofórmico Triterpenos ácidos Tripanocida CUNHA et al., (Sw.) Steud. Diclometânico (ursólico, Analgésico 2003a; Etanólico e oleanólico, Anti- VASCONCELOS Metanólico sumaresinólico e inflamatório et al., 2006; gipsogênico); Antimutagênico SERPELONI et al., Flavonoides Citoprotetor e 2008a; PEIXOTO (quercetina e Antioxidante et al., 2011; derivados SERPELONI et al., glicosilados, rutina, 2011 α-amirina e derivados, ácido epi-betulínico); compostos fenólicos e taninos M. alypifolia Metanólico Flavonoides Antioxidante MANCINI et al., Naudin. (apigenina-7-O- 2008 glucosidio, campferol-3-O- diglucosidio, kaempferol-3-O- galactosidio e quercetina-3-O- galactosidio) M. cabucu Clorofórmico e Flavonoides Antibacteriano RODRIGUES, Hoehne Metanólico glicosilados Antifúngico 2007; derivados da Antimicrobiano RODRIGUES et quercetina e Analgésico al., 2008; campferol (5- Antimutagênico SERPELONI et al., hidroxi-4’,7- Citoprotetor e 2008a; dimetoxiflavona- Anti- SERPELONI et al., (6-C-6”)-5”- inflamatório 2011 hidroxi-3”’,4”’,7”- trimetoxiflavona), ácidos fenólicos, ácido gálico e derivados, catequinas e taninos.

Continuação do Quadro 4 – Substâncias isoladas e atividades biológicas de extratos vegetais de espécies do gênero Miconia. M. fallax DC. Diclometânico Triterpenos ácidos Tripanocida e CUNHA et al., e (ursólico, Antitumoral 2003a; CUNHA et Etanólico oleanólico, al., 2008; sumaresinólico e FERREIRA et al., gipsogênico) 2013 M. langsdorffii Hidroalcoólico Ácidos ursólico e Leishmanicida PEIXOTO et al., Cogn. oleanólico 2011 M. lepidota DC. Etanólico benzoquinonas (2- Antitumoral GUNATILAKA et metoxi-6-heptil- al., 2001 1,4-benzoquinona, 2-metoxi-6-pentil- 1,4-benzoquinona, 2-metoxi-6-butil- 1,4-benzoquinona e 2-metoxi-6-decil- 1,4- benzoquinona) M. ligustroides Diclometânico Triterpenos ácidos Tripanocida e CUNHA et al., (DC.) Naudin (ursólico, Antimicrobiano 2006; CUNHA et urjinólico, al., 2010 oleanólico, mistura de acido 2 α - hidroxiursólico e ácido máslico) M. rubiginosa Hexânico Flavonoides Antibacteriano CELOTTO et al., (Bonpl.) DC. Clorofórmico glicosilados Antifúngico 2003; SPESSOTO Diclometânico derivados da Antimicrobiano et al., 2003; Etanólico quercetina (5- Analgésica RODRIGUES, Hidroalcoólico hidroxi-4’,7- Antimutagênico 2007; e Metanólico dimetoxiflavona- Citoprotetor e RODRIGUES et (6-C-6”)-5”- Anti- al., 2008; hidroxi-3”’,4”’,7”- inflamatório SERPELONI et al., trimetoxiflavona), 2008a; QUEIROZ ácidos fenólicos, et al., 2011; ácido gálico e SERPELONI et al., derivados , 2011 catequinas, taninos, α e β-amirina, lupeol, β-sitosterol e mistura de ácidos ursólico e oleanólico

Continuação do Quadro 4 – Substâncias isoladas e atividades biológicas de extratos vegetais de espécies do gênero Miconia. M. sellowiana Diclometânico Triterpenos ácidos Tripanocida CUNHA et al., Naudin. (ursólico, 2006 urjinólico, oleanólico, mistura de acido 2α - hidroxiursólico e ácido máslico) M. stenostachya Clorofórmico Flavonoides Antibacteriano CELOTTO et al., DC. Diclometânico derivados da Antifúngico 2003; CUNHA et Etanólico e quercetina e Antimicrobiano al., 2003a; Metanólico campferol, ácidos Antimutagênico RODRIGUES et fenólicos, ácido Citoprotetor e al., 2008; gálico e Tripanocida SERPELONI et al., derivados , 2008a; catequinas, taninos SERPELONI et al., e triterpenos 2011 ácidos (ursólico, oleanólico, sumaresinólico e gipsogênico)

A resistência bacteriana, principalmente na área hospitalar, tem sido considerada um grande problema de saúde pública (JACOBS et al., 2008; NGWOKE et al., 2011). Assim, a necessidade do desenvolvimento de novas drogas antibióticas, vem resgatando o interesse por novas moléculas derivadas de plantas (MAREGESI et al., 2008; SILVA JR et al., 2009). O estudo de espécies do gênero Miconia tem revelado possuir um grande potencial antimicrobiano de seus metabólitos. RODRIGUES et al. (2008) ao avaliar três espécies deste gênero verificaram que os extratos metanólicos apresentaram atividade contra Staphylococcus epidermidis, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis e Bacillus cereus . Já o extrato clorofórmico apresentou baixos valores de CIM para C. albicans . Outros estudos revelam ainda que os compostos fenólicos isolados de M. myriantha possuem efeitos inibitórios contra proteases aspárticas secretadas por C. albicans (LI et al., 2001). Confirmando esses achados, outros estudos têm mostrado de média a forte a atividade antimicrobiana para diversas espécies deste gênero (CELOTTO et al., 2003; MOURA, 2006; RODRIGUES, 2007; CUNHA et al., 2010; ARAÚJO, 2011). Esta atividade foi atribuída à presença de alguns compostos químicos, como os triterpenos ácidos: ursólico e oleanólico. Ambos compostos tem apresentado atividade contra algumas bactérias multirresistentes (HORIUCHI et al., 2007), principalmente, quando

avaliados isoladamente (CUNHA et al., 2010). Além disso, uma quinona isolada da M. eriodonta mostrou atividade antimicrobiana e antitumoral (LIMA et al., 1970). Atualmente, outra carência está relacionada à disponibilidade de novos fármacos anti-inflamatórios atuantes em diferentes vias. O processo inflamatório consiste em uma complexa resposta fisiológica frente a um agente infeccioso, um antígeno ou uma lesão tecidual (TILLEY et al., 2001) com objetivo de reparar o tecido afetado. Entretanto, os processos inflamatórios crônicos são prejudiciais, podendo promover efeitos deletérios no tecido afetado (SCHETTER et al., 2010). Consequentemente existe a necessidade em se investigar substâncias que interfiram ou inibam a inflamação por diferentes vias. Algumas espécies do gênero Miconia têm apresentado atividade moduladora do sistema imunológico, como a M. cabucu e a M. rubiginosa (RODRIGUES, 2007). Em um estudo, in vivo , realizado por VASCONCELOS et al. (2006) foi observado que os ácidos ursólico e oleanólico isolados de M. albicans reduziram o edema de pata induzido por carragenina. Além disso, os autores observaram que ambos os triterpenos exibiram uma atividade analgésica similar ao ácido acetilsalicílico na concentração 40 mg/mL. SPESSOTO et al. (2003) também verificaram atividade analgésica central e periférica dos extratos hexânico, diclorometânico e etanólico de M. rubiginosa. Segundo os autores, os prováveis mecanismos de ação dessas substâncias devem estar relacionados à inibição da via de prostaglandinas e inibição central da dor. As doenças tropicais negligenciadas são um sério problema de saúde pública que atingem populações que se encontram em estado deplorável de pobreza. Normalmente, essas doenças ocorrem de forma endêmica e atingem países em desenvolvimento, como grande parte da América Latina, África e Ásia. Estima-se que um bilhão de pessoas sejam infectadas por ano, entre as quais cerca de um milhão chegam a óbito (OMS, 2010a; GARG, 2011). Apesar destes números assustadores, o investimento em pesquisas relacionadas à busca de novas formas de diagnóstico, vacinas e fármacos ainda é escasso (OMS, 2010b). Entre as doenças negligenciadas a doença de Chagas e a leishmaniose, configuram entre as seis endemias tropicais elencadas pela OMS, devido a elevada prevalência e morbidade associadas a essas infecções. A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi , e na América Latina, representa um grande problema de saúde pública, sendo a principal causa de óbito por problemas cardíacos. Os medicamentos disponíveis para seu tratamento são escassos, ineficientes na fase crônica, apresentam tempo prolongado de uso e causam sérios efeitos colaterais (SANTORO et al., 2007; DIAS et al., 2009). Assim, a busca de novas

substâncias para a profilaxia e/ou tratamento desta endemia se faz extremamente necessária (AMBROZIN et al., 2008; FERREIRA, 2010) e o estudo de plantas medicinais tem demonstrado resultados promissores. Segundo CUNHA et al. (2003a) as espécies M. fallax DC. e M. stenostachya DC. apresentaram significativa atividade tripanocida, das quais os compostos ácidos ursólico, gipsogênico e oleanólico presentes mostraram maior potencial. A leishmaniose também apresenta altas taxas de morbidade e mortalidade (DUJARDIN, 2006; BERN; MAGUIRE; ALVAR, 2008), principalmente associada a forma visceral (LV). No Brasil observa-se um crescimento alarmante dos casos desta infecção nos centros urbanos (OMS, 2010a). O seu tratamento é baseado na administração de antimoniais pentavalentes, anfotericina B e pentamidinas, os quais são tóxicos, de custo elevado, difícil administração e podem gerar resistência ao parasito (RATH et al., 2003; CROFT; COOMBS 2003; TAKAHASHI et al., 2006). Desta forma, considerando as dificuldades de tratamento e a ausência de vacinas, há urgência na busca de novas drogas terapêuticas (CARVALHO; FERREIRA, 2001; PAULA et al., 2003; NAKAMURA et al., 2006). Assim como para a doença de Chagas, os ácidos ursólico e oleanólico têm demonstrado um grande potencial também contra as formas evolutivas do agente da leishmaniose (CUNHA et al., 2003a; TORRES-SANTOS et al., 2004; LEITE et al., 2006; HOET et al., 2007). O potencial quimiopreventivo de produtos naturais é de grande interesse para clínica médica (PARK; PEZZUTO, 2002), uma vez que o câncer está se tornando a doença que causa as maiores taxas de morbi-mortalidade (JEMAL; BRAY; FERLAY, 2011). As substâncias isoladas de extratos naturais como compostos fenólicos tem exibido efeitos antimutagênicos (KAUR et al., 2000; BELICOVA et al., 2001; POERSCH et al., 2007). De acordo com SERPELONI et al. (2008a) as espécies do gênero Miconia apresentaram atividade protetora ao DNA contra alterações induzida por ciclofosfamida, além de não apresentarem atividade mutagênica pelo teste de micronúcleos. Este efeito protetor também foi associado à presença de compostos fenólicos, tais como flavonoides e terpenos, que tem elevado potencial antioxidante e anti-carcinogênico (LIU, 2004). Em um estudo in vitro , verificou-se que tanto o extrato etanólico quanto a mistura de ácidos ursólico e oleanólico de M. fallax DC. inibiram o crescimento tumoral de adenocarcinoma uterina dose-dependente (CUNHA et al., 2008). GUNATILAKA et al. (2001) verificaram que a citotoxicidade e atividade antitumoral da M. lepidota estão relacionados à presença das benzoquinonas.

3. 6 Miconia ferruginata DC. A espécie M. ferruginata (Melastomataceae), popularmente conhecida como pixirica-do-campo ou babatenão (ALMEIDA; BANDEIRA, 2010) apresenta dispersão endozoocórica por aves e encontra-se distribuída desde o sul do México até o norte da Argentina, Uruguai e Bolívia (GOLDENBERG, 2009). No Brasil, a espécie foi descrita nos estados do Pará, Tocantins, Distrito Federal, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro, Sergipe, Bahia e Pernambuco. E está inserida nos biomas do Cerrado e da Caatinga (GOLDENBERG; CADDAH, 2013). No estado mineiro esta espécie é encontrada nos campos rupestres (Figura 4), cerrado sentido restrito e em áreas de altitude elevada (SANTOS, 2003).

Figura 4 – Espécie Miconia ferruginata. Botanical Garden, Brasília, DF, Brasil; 4/2005. Disponível em: http://www.virboga.de/Miconia_ferruginata DC.htm .

Em uma revisão do gênero Miconia, REZENDE et al. (2014), realizou uma descrição botânica detalhada da espécie M. ferruginata na qual, o autor caracteriza a planta da seguinte forma:

“Miconia ferruginata DC . caracteriza-se pelos ramos bastante robustos, rugosos, com estrias bem evidentes, grandes inflorescências escorpioides (14-38,5 cm comprimento.) e folhas discolores geralmente grandes (7-32,5 x 2,5-13 cm), indumento ferrugíneo (ocráceo) recobrindo toda a planta, baga imatura verde oliva e enegrecida quando madura, com cerca de 50 sementes por fruto e conectivo prolongado das tecas (0,6 mm comprimento), espessado no dorso com expansão dorso-basal e dois apêndices ventrais e baga verde-oliva a enegrescida, com cerca de 50 sementes.” Diferente das outras espécies, a M. ferruginata apresenta os períodos de florescência e frutificação prolongados (SANTOS, 2003), de fevereiro a outubro, e presença de frutos entre setembro a julho (REZENDE, 2012; REZENDE et al., 2014). No Quadro 5 é apresentada a taxonomia desta espécie.

Quadro 5 – Taxonomia de Miconia ferruginata

Classificação Taxonomia atribuída Classe Equisetopsida C. Agardh Subclasse Magnoliidae Novákex Takht. Superordem Rosanae Takht. Ordem Myrtales Juss. Ex Bercht. & J. Presl Família Melastomataceae Juss. Gênero Miconia Ruiz & Pav . Espécie Miconia ferruginata DC . Disponível em: http://www.tropicos.org/Name/20301059

Na região nordeste do estado de Minas Gerais, no município de Diamantina, como citado anteriormente, também tem sido registrada a presença de espécies do gênero Miconia , como a M. ferruginata. Como outras espécies do gênero, ela apresenta uso medicinal na forma de infuso e banhos (ALMEIDA; BANDEIRA, 2010), para tratamento de doenças de pele, e de origens inflamatórias, parasitárias e infecciosas (CRUZ; KAPLAN 2004; ZANDONÁ, 2009). Em estudo recente observou-se a presença de flavonoides, saponinas, cumarinas, terpenos e taninos nas folhas , por meio de análise de fitoquímica preliminar (LIMA et al., 2013). Embora esta espécie apresente uso medicinal, em levantamento bibliográfico recente não foram encontrados estudos aprofundados sobre esta espécie. Assim, este estudo teve por objetivo realizar uma

avaliação químico-farmacológica da espécie Miconia ferruginata encontrada na região de Diamantina, MG.

4 METODOLOGIA

4. 1 Equipamentos Agitador Magnético (Quimis ®, modelo Q221-1) Agitador Magnético com Aquecimento (Mhtoli ®, modelo 100M005) Agitador orbital (Fanem ® - Modelo 255-B). Autoclave (Phoenix-Luferco ®, modelo AV-137) Balança analítica (Bioprecisa ®, modelo JA3003N) Banho de Ultrassom (Unique ®, Ultra Cleaner 1400) Banho-maria (Fanen LTDA ®, modelo 102) Bombas de solvente (LC-20AD) Bomba quaternária (LC-20AT) Capela de fluxo laminar (Veco ®, modelo BIO SEG 12) e (Airstream ®, Esco, Class II

BSC) Centrifuga (Thermo ®, modelo BR4imultifunction) Citômetro de fluxo (FACScan ® - Becton-Dickinson) Computador para análise de espectros e cromatogramas (Dell ®, modelo OPTIFLEX 780) Contador automático de células (CELM ®, modelo CC-550) Cromatógrafo líquido de alta eficiência (Shimadzu ®, modelo ClassVp 20) e (Shimadzu ®, modelo Proeminence) Degaseificador (DGU-20AS) Detector por arranjo de diodos (SPD-M20A) Espectrofotômetro (Biospectro ®, modeloSP-22) e (Femto ®, modelo 600) Espectrômetro de massas (BurkerDaltonics ®, modelo MICROTOF II) e (Shimadzu ®, modelo QP2010) Estufa bacteriológica (Solab ®, modelo SL 101) e (Sterilifer ®, modelo 1.3 DMTC) Estufa de ar circulante (Biopar ®, modelo S480AT) Estufa Incubadora com demanda bioquímica de Oxigênio (B. O. D.) (Solab ® Cientifica, SL 200/364) Evaporador rotativo (Fisaton ®, modelo 801) Forno para coluna (CTO-20A)

® Incubadora de CO 2 (Ultrasafe , modelo HF 212 UV) Injetor (Rheodyne ®, modelo 7125) Injetor de amostras automatizado (SIL-20AC HT) Leitor de ELISA (Molecular Devices ®, modelo SPECTRA MAX 190) Liofilizador (Terroni ®, modelo LS3000) Microscópio óptico (Olympus ®, modelo CX 41) Microscópio Invertido (Medilux ®, modelo MDL 150 TAI) Moinho de facas (Marconi ®, modelo MA580) PHmetro (Hanna ® Instrumentos, modelo HI 3221 pH/ORP/ISE Meter) Sistema controlador para CLAE (CBM-20A) Sonicador (Quimis ®, modelo Q335D) Unidade controladora do CLAE (CBM-20A) Ultrapurificador de água (Elga ®, modelo Classic Di-MK2) Vortex (Phoenix Luferco ®, modelo AP-56)

4. 2 Preparo de reagentes e soluções

4. 2. 1 Azul de Tripan As soluções de Azul de Tripan foram preparadas a concentração de 0,4% e 0,002%. Para preparação da solução de Azul de Tripan a 0,4 % foi adicionado 0,2 g de Azul de Tripan (Sigma ®) a 50 mL de tampão PBS. Em seguida, a solução foi filtrada em filtro-seringa com membrana de 0,22 µm (TPP ®). O filtrado foi transferido para um frasco estéril hermeticamente fechado e armazenado em geladeira entre 2 e 8 °C. A solução de Azul de Tripan 0,002%, foi preparada em capela de fluxo laminar a partir de 50 µL da solução estoque de Azul de Tripana 0,4 %, que foram diluídos em 10 mL de tampão PBS. Esta solução foi preparada no momento do uso.

4. 2. 2 Caldo Muller Hinton (CMH) O CMH (Himedia ®) foi preparado a partir da dissolução de 4,2 g do meio CMH em 200 mL de água Milli-Q. A solução foi esterilizada em autoclave e armazenada a temperatura entre 2 e 8 °C por no máximo dez dias.

4. 2. 3 Caldo e meio sólido Brain Heart Infusion Broth (BHI) Para o preparo do caldo BHI (Himedia ®) foi dissolvido 7,4 g do meio BHI em 200 mL de água Milli-Q. Esta solução foi esterilizada em autoclave e armazenada a temperatura entre 2 e 8 °C por no máximo dez dias. O meio sólido de BHI, foi preparado a partir da dissolução de 7,4 g de BHI e 3,0 g de Ágar-Ágar (Isofar ®) em 200 mL de água Milli-Q. Em seguida, a solução foi esterilizada em autoclave e distribuída uniformemente, em capela de fluxo laminar, em placas de Petri estéreis (Plast-Bio ®). As placas solidificadas foram colocadas em sacos plásticos estéreis e armazenados a temperatura entre 2 e 8 °C por no máximo trinta dias.

4. 2. 4 Carbonato de sódio As soluções de carbonato de sódio foram preparadas a 10% e 0,2 M. Para o preparo destas soluções 1 e 1,06 g de carbonato de sódio (Vetec ®) foram dissolvidos para 100 e 50 mL de água Milli-Q, respectivamente. O volume das soluções foi aferido em balão volumétrico, e em seguida, foram armazenadas a temperatura ambiente em frasco âmbar.

4. 2. 5 Cloreto de cádmio 2 µM Inicialmente foi preparada uma solução estoque de 20 mM. Foi dissolvido 0,41 g de cloreto de cádmio (Proquimios ®) em 100 mL de água Milli-Q, após completa solubilização a solução foi filtrada em filtro-seringa com membrana de 0,22 µm (TPP ®), em capela de fluxo laminar. A solução foi armazenada em frasco âmbar a temperatura ambiente (ROMERO et al., 2003). Para uso, a solução de cloreto de cádmio 20 mM foi diluída em meio de cultura RPMI ou DMEM suplementados para a concentração de 2 µM, a partir de um volume de 0,1 µL da solução estoque em um volume final de 1mL.

4. 2. 6 Meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) suplementado Para preparo do meio de cultura DMEM foi utilizado o preparado em pó, sem bicarbonato de sódio, alta concentração de glicose e com L-glutamina (Sigma ®) que foi dissolvido em 900 mL de água Milli-Q. Em seguida, foi adicionado 3,7 g de bicarbonato de sódio (Vetec ®). Após completa solubilização o pH da solução foi ajustado para 7,2 utilizando o PHmetro (Hanna ®). Em balão volumétrico, o volume da solução foi completado para 1 L com água Milli-Q. Esta solução foi esterilizada por filtração a vácuo, em capela de fluxo laminar, com auxilio de um filtro com membrana

de 0,22 µM (Millipore ®). O meio foi envasado em frasco de cultura transparente estéril e, armazenado a temperatura entre 2 e 8 °C. Para aplicação nos ensaios, o meio foi suplementado, em capela de fluxo laminar, com 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado (Gibco®) e 1% de solução estabilizada de penicilina/estreptomicina (10000 U/mL e 10 mg/mL, respectivamente) (Sigma ®). Para avaliação da esterilidade uma alíquota de 5 mL foi armazenada em incubadora de

CO 2 a 37 ºC, por 24 horas com posterior análise de alteração e/ou crescimento microbiano.

4. 2. 7 Meio de cultura Liver Infusion Tryptose (LIT) suplementado O meio LIT foi preparado pela dissolução de 1,9 g de NaCl (Vetec ®), 3,75 g de ® TM ® Na 2HPO 4 (Vetec ), 4,56 g de Triptose (Difco BD ), 1,5 g de extrato de levedura (Vetec ®), 1,5 g de Liver Infusion (Difco TM BD ®) e 0,2 g de KCl (Dinâmica ®) em 350 mL de água Milli-Q. A solução foi homogeneizada em capela de fluxo laminar e, em seguida, o pH foi ajustado para 7,4 utilizando o PHmetro (Hanna ®). O volume foi acertado para 450 mL e a solução foi transferida para uma garrafa de cultura estéril. O meio foi esterilizado por 30 minutos a 120°C, em autoclave. A suplementação do meio foi realizada em capela de fluxo laminar, na qual foi adicionado 1 mL de solução de estreptomicina 100 µg/mL (Sigma ®), 0,9 mL de solução de hemina 10 mg/mL (Sigma ®) e 50 mL de SFB inativado (Gibco ®). Posteriormente a solução foi filtrada à vácuo por meio de um filtro de membrana com 0,22 µm (Millipore ®). O meio foi armazenado em frascos estéreis a temperatura entre 2 e 8 °C. Para avaliação da esterilidade, uma alíquota de 5 mL foi incubada em estufa B. O. D a temperatura de 26 °C, por 24 horas com posterior análise de alteração e/ou crescimento microbiano.

4. 2.8 Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado Para o preparo do meio, foi adicionado em um becker 10,4 g de RPMI-1640 (Sigma ®) e 2,0 g de bicarbonato de sódio (Vetec ®) e cerca de 900 mL de água Milli-Q. Após completa solubilização, o pH do meio foi acertado para 7,2 utilizando o PHmetro (Hanna ®). Em seguida, o volume foi completado para 1L com água Milli-Q, com auxilio de balão volumétrico. Em capela de fluxo laminar o meio foi esterilizado por filtração a vácuo utilizando filtro de membrana com 0,22 µm (Milipore ®) e, posteriormente, transferido para frasco estéril transparente e armazenado em geladeira a temperatura entre 2ºC e 8ºC.

Para aplicação nos ensaios, o meio foi suplementado, em capela de fluxo laminar, com 10% de SFB inativado (Gibco ®), 1,6% de L-glutamina 200 mM (Sigma ®) e 1% de solução estabilizada de penicilina/estreptomicina 10000 U/mL e 10 mg/mL, respectivamente (Sigma ®). Para avaliação da esterilidade uma alíquota de 5 mL foi armazenada em incubadora de CO 2 a 37 ºC, por 24 horas com posterior análise de alteração e/ou crescimento microbiano.

4. 2. 9 Reagente de Bouchardat/Wagner O reagente de Bouchardat/Wagner foi preparado a partir da dissolução de 1 g de iodo (Isofar ®) e 2 g de iodeto de potássio (Synth ®) em 100 mL de água Milli-Q. A solução foi transferida para em balão volumétrico de 100 mL e o volume aferido. Esta solução foi armazenada a temperatura ambiente em frasco âmbar.

4. 2. 10 Reagente de Dragendorff O reagente de Dragendorff foi utilizado como reagente geral nas reações de precipitação e reagente da Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) para detecção de alcaloides, cada um preparado distintamente. Para o preparo do reagente geral de alcaloides, 5 g de carbonato de bismuto (Vetec ®) foram dissolvidos em 50 mL de água Milli-Q. Em seguida, foram adicionados 12 mL de ácido clorídrico concentrado padrão analítico (PA) (Proquímicos ®). A esta solução foi adicionado gradativamente, 25 g de iodeto de potássio (Vetec ®) e após a dissolução completa da solução, o volume foi completado em balão volumétrico de 100 mL com água Milli-Q, e armazenada em temperatura ambiente em frasco âmbar. Para preparo do revelador da CCDC foi inicialmente confeccionado uma solução estoque composta de subnitrato de bismuto (Synth ®) e iodeto de potássio (Synth ®) dissolvendo 0,85 g de subnitrato de bismuto em 40 mL de água Milli-Q, seguida da adição de 10 mL de ácido acético glacial PA (Proquímicos ®). A solução foi aquecida em banho-maria (Fanen ®), e filtrada em papel de filtro. A esta solução foi adicionado 50 mL de solução aquosa de iodeto de potássio a 27%. A solução estoque foi armazenada em frasco âmbar a 4 ºC. Para o preparo do revelador, 1 mL da solução estoque foi misturado a 2 mL de ácido acético glacial PA e 10 mL de água Milli-Q.

4. 2. 11 Reagente de Hager No preparo do reagente de Hager foram dissolvidos 4,58 g de ácido pícrico (Isofar ®) em 100 mL de água Milli-Q. O volume foi acertado em balão volumétrico e a solução final transferida para frasco âmbar e armazenada a temperatura ambiente.

4. 2. 12 Reagente de Mayer Para o preparo deste reagente 1,35 g de cloreto de mercúrio (Belga Química ®) foi dissolvido em 60 mL de água Milli-Q. Em seguida, foram adicionados 20 mL de uma solução aquosa de iodeto de potássio 25%. Em um balão volumétrico de 100 mL, a solução teve seu volume final acertado com água Milli-Q, em seguida, a solução foi transferida para um frasco âmbar e armazenada a temperatura ambiente.

4. 2. 13 Solução de acetato de chumbo 10% A solução de acetato de chumbo 10% foi preparada dissolvendo 10 g de acetato de chumbo (Vetec ®) em 100 mL de água Milli-Q. O volume da solução foi aferida em balão volumétrico e, em seguida, armazenada em frasco transparente a temperatura ambiente.

4. 2. 14 Solução de ácido acético 10% Para preparo da solução de ácido acético 10% foi diluído 1 mL de ácido acético glacial PA (Proquímicos ®) em 100 mL de água Milli-Q. O volume da solução foi aferida em balão volumétrico e, em seguida, armazenada em frasco transparente a temperatura ambiente.

4. 2. 15 Solução de ácido clorídrico 10% Para preparo da solução de ácido clorídrico 10% foi diluído 1 mL de ácido clorídrico concentrado PA (Proquímicos ®) em 100 mL de água Milli-Q. O volume da solução foi aferida em balão volumétrico e, em seguida, armazenada em frasco transparente a temperatura ambiente.

4. 2. 16 Solução de ácido gálico 100 mg/mL A solução de ácido gálico 100 mg/mL foi preparada no momento do uso, em que foram dissolvidos 0,5 g de ácido gálico (Sigma ®) em 5 mL de água Milli-Q. O volume

da solução foi aferida em balão volumétrico e, em seguida, diluída seriadamente com água Milli-Q nas concentrações de 100 a 0,1 mg/mL.

4. 2. 17 Solução de ácido sulfúrico As soluções de ácido sulfúrico foram preparadas nas concentrações de 1 e 5%. Foram diluídos 1 e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado PA (Proquímicos ®), respectivamente, e o volume completado para 100 mL com água Milli-Q em balão volumétrico. As soluções foram armazenadas em frascos transparentes a temperatura ambiente.

4. 2. 18 Solução de alfa-bisabolol 0,1 g/mL Para a solução de alfa-bisabolol foi misturado em um becker 0,1 g de alfa- bisabolol (Biotec ®) em 1 mL de clorofórmio PA (Dinâmica ®), até completa dissolução. A solução foi armazenada em frasco de vidro a temperatura entre 2 e 8 °C.

4. 2. 19 Solução de anfotericina B 1 µg/mL

Primeiramente, foi preparado uma solução estoque de 5 mg/mL. Foram dissolvidos 10 mg de Anfotericina B (Sigma ®) em 2 mL de DMSO (Vetec ®). A solução foi submetida à agitação utilizando vortex (Phoenix Luferco ®) por 30 minutos para completa dissolução do fármaco. Em seguida, a solução foi armazenada em frasco estéril, protegido da luz, a temperatura de -20 °C. Para o uso, a solução de Anfotericina B foi diluída em meio LIT suplementado para a concentração de 1 µg/mL, a partir de um volume de 0,2 µL da solução estoque em um volume final de 1mL.

4. 2. 20 Solução de antibióticos e antibiótico/antimitótico Para o preparo da solução de estreptomicina 100 µg/mL foi dissolvido 750 mg de sulfato de estreptomicina (Sigma ®) em 15 mL de água Milli-Q, seguida de homogeneização em vortex por 5 minutos. A solução foi aliquotada em eppendorfs de 1,5 mL (LabPlast ®) que foram armazenados em freezer a -20 °C. Essa solução foi utilizada para suplementação do meio LIT. O coquetel de antibiótico/antimitótico de penicilina G 100 UI/mL, estreptomicina 100 µg/mL e anfotericina B 250 ng/mL (Sigma ®) foi aliquotada em eppendorfs de 1,5 mL e armazenados em freezer a -20 °C. Essa solução foi utilizada

para suplementação do meio RPMI para os ensaios de viabilidade e proliferação sobre células mononucleares do sangue periférico (PBMC). A solução estabilizada de penicilina/estreptomicina a 1000 U/mL e 10 mg/mL (Sigma ®) foi aliquotada em eppendorfs de 1,5 mL e armazenados em freezer a -20 °C. Essa solução foi utilizada para suplementação dos meios RPMI e DMEM para os demais ensaios biológicos.

4. 2. 21 Solução de benznidazol 75 µg/mL Inicialmente foi preparada uma solução estoque 10 mg/mL do fármaco padrão benznidazol. Foram pesados 10 mg de benznidazol (Lafepe ®) e dissolvidos em 1 mL de DMSO (Vetec ®). A solução foi submetida a banho de ultrassom por 2 horas para favorecer a dissolução completa do fármaco. Em seguida, a solução foi armazenada em frasco âmbar estéril, protegido da luz, a temperatura de -20 °C. Para o uso, a solução de benznidazol foi diluída em meio LIT suplementado para a concentração de 75 µg/mL, a partir de um volume de 7,5 µL da solução estoque em um volume final de 1 mL.

4. 2. 22 Solução de butilbrometo de escopolamina 0,08 mg/mL No preparo da solução, foram diluídos 11 gotas do medicamento butilbrometo de escopolamina (EMS ®) em 5 mL de metanol PA (Vetec ®). A solução foi transferida para frasco âmbar e armazenada protegida da luz, em local fresco a temperatura ambiente.

4. 2. 23 Solução de cloranfenicol 30 µg/mL Primeiramente foi preparado uma solução estoque de cloranfenicol 20 mg/mL. Foram dissolvidos 0,02 g de cloranfenicol (Sigma ®) em 1 mL de álcool 96° GL (Belga Química ®). Após completa dissolução, a solução foi filtrada em filtro-seringa de membrana com 0,22 µm (TPP ®), transferida para um frasco âmbar e armazenada a temperatura entre 2 e 8 °C. No momento do uso foi realizado a diluição da solução estoque em CMH para a concentração de 30 µg/mL, a partir de um volume de 3 µL em um volume final de 2 mL.

4. 2. 24 Solução de cloreto de alumínio 5% Para preparo da solução de cloreto de alumínio 5% foi dissolvido 5 g de cloreto de alumínio (Vetec ®) em 100 mLágua Milli-Q. Em seguida, o volume da solução foi

aferida em balão volumétrico e, armazenada em frasco transparente a temperatura ambiente.

4. 2. 25 Solução de cloreto férrico 2% Para preparo da solução de cloreto férrico 2% foi dissolvido 2 g de cloreto férrico (Cromato ®) em 50 mL de água Milli-Q, em seguida foi adicionado 2 mL de ácido clorídrico 10%. O volume da solução foi aferida em balão volumétrico de 100 mL e, armazenada em frasco transparente a temperatura ambiente.

4. 2. 26 Solução de sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% Para o preparo da solução de SDS 10%, foi dissolvido 50 g de SDS em 200 mL de água Milli-Q estéril. Após completa dissolução adicionou-se, em balão volumétrico, álcool isopropílico PA (Neon ®) para completar 500 mL de solução. A solução foi armazenada em frasco transparente a temperatura ambiente.

4. 2. 27 Solução de etanol

As soluções de etanol foram preparadas nas concentrações de 25 e 70%. Foram diluídos 25 e 70 mL de etanol PA (Neon ®) respectivamente, e o volume aferido em balão volumétrico de 100 mL com água Milli-Q. As soluções foram preparadas no momento do uso.

4. 2. 28 Solução de gelatina 2,5% Para preparo da solução de gelatina 2,5% foi dissolvido 0,25 g de gelatina (Isofar ®) para 10 mL de água Milli-Q. O volume da solução foi aferida em balão volumétrico e, em seguida, armazenada em frasco transparente a temperatura entre 2 e 8 ºC, por no máximo três dias.

4. 2. 29 Solução de hemina 10 mg/mL Inicialmente foi preparado uma solução estoque de hemina 20 mg/mL, pela dissolução de 0,1 g hemina (Sigma ®) em 5 mL de trietanolamina (Vetec ®), seguida de homogeneização em vortex (Phoenix Luferco ®) por 10 minutos. A solução de hemina 10 mg/mL foi preparada a partir de 5 mL da solução estoque diluída em 5 mL de água Milli-Q, seguida de homogeneização em vortex por 5 minutos. Esta solução foi armazenada em frasco âmbar estéril, protegido da luz a temperatura entre 2 e 8 °C.

4. 2. 30 Solução de hidróxido de amônia As soluções de hidróxido de amônia foram preparadas nas concentrações de 5 e 10%. Foram diluídos 5 e 10 mL de hidróxido de amônia PA (Dinâmica ®), respectivamente, e o volume final aferido para 100 mL com água Milli-Q em balão volumétrico. As soluções foram armazenadas em frascos transparentes a temperatura ambiente.

4. 2. 31 Solução de hidróxido de potássio 5% Para preparo da solução de hidróxido de potássio 5% foi dissolvido 5 g de hidróxido de potássio (Audaz ®) com etanol PA (Neon ®). O volume da solução foi aferida em balão volumétrico de 100 mL e, em seguida, armazenada em frasco transparente a temperatura ambiente.

4. 2. 32 Solução de hidróxido de sódio 1M Para preparo da solução de hidróxido de sódio 1 M foi dissolvido 3,99 g de ® hidróxido de sódio (Vetec ) em água Milli-Q. O volume da solução foi aferida em balão volumétrico de 100 mL e, em seguida, armazenada em frasco âmbar a temperatura ambiente.

4. 2. 33 Solução de iodeto de potássio As soluções de iodeto de potássio foram preparadas nas concentrações de 25 e 27%, dissolvendo 25 e 27 g de iodeto de potássio (Synth ®) respectivamente, em 100 mL de água Milli-Q. O volume das soluções foram aferidas em balão volumétrico e, em seguida, armazenadas em frascos transparentes a temperatura ambiente.

4. 2. 34 Solução de metanol 80% Para preparo da solução de metanol 80% foi diluído 80 mL de metanol PA (Vetec ®) em 100 mL de água Milli-Q. O volume da solução foi aferida em balão volumétrico e utilizada logo em seguida.

4. 2. 35 Solução de paclitaxel 6 µM Primeiramente, foi preparado uma solução estoque de paclitaxel 250 µM, em que 0,01 g de paclitaxel (Quiral Química ®) foi dissolvido em 5 mL de álcool etílico

96 °GL (Belga Química ®), o volume foi aferido em balão volumétrico de 5 mL. Em seguida, a solução foi filtrada em filtro-seringa de membrana com 0,22 µm (TPP ®), distribuída em frasco âmbar e armazenada a temperatura de -20 °C, por no máximo 30 dias. Para o uso, a solução de Paclitaxel foi diluída em meio DMEM suplementado para a concentração de 6 µM, a partir de um volume de 48 µL da solução estoque em um volume final de 2 mL.

4. 2. 36 Solução de quercetina 0,5 mg/mL No preparo desta solução foram pesados 0,020 g de quercetina (Biotec ®) e dissolvidos em 40 mL de metanol PA (Vetec ®). A solução foi armazenada em frasco transparente a temperatura ambiente.

4. 2. 37 Solução de resazurina 0,01% Para o preparo da solução reveladora de resazurina 0,01%, foram dissolvidos 0,01 g de resazurina (Sigma ®) em 100 mL de água Milli-Q estéril. O volume final foi acertado em balão volumétrico, a solução foi filtrada em filtro-seringa de membrana ® com 0,22 µm (TPP ), distribuída em frasco âmbar e armazenado a temperatura -20 °C. Para o uso, a solução reveladora foi descongelada em geladeira entre 2 e 8 °C.

4. 2. 38 Solução de saponina 0,3 g/mL Para o preparo da solução de saponina 0,3 g/mL, 1 g de saponina (Isofar ®) foi dissolvida em 3 mL de água Milli-Q. A solução foi armazenada em frasco transparente a temperatura ambiente.

4. 2. 39 Solução de vanilina sulfúrica 1% Para o preparo de vanilina sulfúrica a 1%, 1 g de vanilina (Isofar ®) foi adicionada a metanol PA (Vetec ®) até sua completa solubilização. Esta solução foi transferida para um balão volumétrico de 100 mL, no qual foi adicionado 1 mL de ácido sulfúrico concentrado PA (Proquímicos ®). O volume final acertado com metanol, e a solução foi utilizada logo após o preparo.

4. 2. 40 Solução de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT) As soluções de MTT (Sigma ®) foram preparadas nas concentrações de 0,5, 2 e 3 mg/mL. A solução de 0,5 mg/mL foi preparada em meio LIT, a partir da dissolução de

0,02 g de MTT em 40 mL de meio LIT suplementado. A solução de 2 mg/mL foi preparada em PBS, a partir da dissolução de 0,08 g de MTT em 40 mL de PBS estéril. A solução de 3 mg/mL foi preparada em meio RPMI, a partir da dissolução de 0,12 g MTT em 40 mL de meio RPMI suplementado. Todas as soluções foram armazenadas em frasco âmbar recobertos por papel alumínio a temperatura entre 2 e 8 °C, por no máximo dez dias.

4. 2. 41 Solução salina 0,09% A solução salina 0,09% foi preparada dissolvendo 1,8 g de cloreto de sódio (Vetec ®) em 200 mL de água Milli-Q. Esta solução foi esterilizada em autoclave e armazenada a temperatura entre 2 e 8 °C por no máximo de sete dias.

4. 2. 42 Tampão fosfato salino (PBS) Primeiramente, para o preparo da solução de PBS foi preparado uma solução estoque de PBS 10x concentrada, dissolvendo 0,256 g de fosfato monossódico (Vetec ®), 1,178 g de fosfato dissódico (Vetec ®) e 8,760 g de cloreto de sódio (Proquímicos ®) em ® 800 mL de água Milli-Q sob agitação em agitador magnético (Mhtoli ). Após completa solubilização, o pH da solução foi medido e acertado para 7,2 utilizando o PHmetro (Hanna ®). Em seguida, o volume da solução foi aferido em balão volumétrico para 1 L com água Milli-Q. Esta solução foi armazenada em frasco transparente fechado a temperatura entre 2 e 8 ºC. A partir da solução descrita anteriormente, foi preparado à solução PBS usada nos protocolos experimentais. Foi diluído 100 mL da solução estoque de PBS 10x em 800 mL de água Milli-Q e o pH foi acertado para 7,2. Em seguida, o volume da solução foi aferido para 1 L com água Milli-Q, em balão volumétrico. Esta solução foi esterilizada em autoclave e armazenada em frasco de vidro transparente a temperatura entre 2 e 8ºC.

4. 2. 40 Tampão Fosfato Salino /Bovine serum albumin (PBS/BSA) 0,1% Para o preparo dessa solução foi dissolvido 0,1 g de BSA (Sigma ®) em 100 mL de PBS estéril. Após completa dissolução a solução foi aliquotada em tubos côncavos estéreis e armazenada em freezer a -20°C.

4. 3 Coleta e identificação taxonômica A espécie M. ferruginata foi coletada na região norte de Minas Gerais pelo Dr. Luiz Elídio Gregório (código do coletor n° LEG 67), na comunidade Ribeirão de Areia, Diamantina – MG no dia 13 de maio de 2013. A espécie não consta da Lista Nacional Oficial das Espécies da Flora Brasileira Ameaçadas de Extinção (BRASIL, 2014a). O material coletado foi georeferenciado (18°11'08.0"S 43°42'11.0"W) e o voucher foi depositado no Herbário Dendrológico Jeanine Felfili (HDJF) e no herbário DIAM da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM) sob os números de registro HDJF2953 e DIAM 4964, respectivamente (Figura 5). A identificação foi realizada por João Paulo Goulart Mendes, aluno de Iniciação Científica do Departamento de Engenharia Florestal da UFVJM.

A B C

4 cm 24 cm 24

cm 11

Figura 5 - Exsicatas e figura sistemática de Miconia ferruginta coletadas na região de Cerrado em Minas Gerais. A - voucher depositado no HDJF; B - voucher depositado no DIAM; C - Figura sistemática da espécie Miconia ferruginta.

4. 4 Preparo dos extratos brutos A preparação dos extratos foi realizada no Laboratório do Núcleo de Estudos de Produtos Naturais (NEPRONAT) da UFVJM. O material coletado foi segregado em folhas/flores e caule, seco em estufa de ar circulante (Biopar ®) a 40 ºC, durante uma semana. Após esse período, o material foi pulverizado em moinho de facas (Marconi ®), obtendo 732,0 g de folhas/flores e 705,0 g de caule. O pó obtido foi armazenado em sacos plásticos, a temperatura ambiente, em local fresco até o momento do preparo dos extratos. Foram preparados extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata. O extrato etanólico foi preparado a partir do material pulverizado submetido à extração por maceração durante uma semana na proporção: 100 g planta para 1 L solvente (1:10). Etanol 96 °GL (Dinâmica ®) foi usado como solvente extrator e, após o período da maceração, os extratos foram filtrados em algodão e concentrados em evaporador rotativo (Fisaton ®), entre 40 e 45 °C sob pressão reduzida. Os extratos aquosos foram preparados por infusão, utilizando 50 g do material pulverizado que foi exposto a 500 mL de água Milli-Q fervente, deixado em contato por 10 minutos. Após resfriamento a temperatura ambiente, o infuso foi filtrado em algodão, congelado em nitrogênio líquido e seco em liofilizador (Terroni ®). Os extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule obtidos foram transferidos para frascos âmbar previamente tarados, os quais foram submetidos à secagem final a temperatura ambiente em dessecador sob vácuo contendo sílica gel. Os extratos obtidos foram utilizados para as análises descritas em seguida conforme esquema representado na Figura 6.

Reações cromogênicas e de precipitação e CCDC

CG-EM

Extrato etanólico PERFIL QUÍMICO Extrato aquoso CLAE-DAD CLAE-DAD

CLAE-DAD-EM Teor compostos fenólicos Partição com solventes de Fracionamento em polaridades crescentes Sephadex LH-20

CLAE-DAD Frações Frações CLAE-DAD

CG-EM Figura 6 – Representação esquemática das análises realizadas para triagem fitoquímica com a droga vegetal e com os extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata .

4. 5 Análises Fitoquímicas Preliminares As análises fitoquímicas preliminares foram realizadas no NEPRONAT da UFVJM. O estudo fitoquímico preliminar com a finalidade de identificação das principais classes de metabólitos secundários foi realizado por meio de reações cromogênicas e de precipitação e análises em cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC). As reações cromogênicas e de precipitação foram realizadas conforme descrito por SIMÕES et al. (2007), SILVA; MIRANDA; CONCEIÇÃO (2010), COSTA (2012) e pela Sociedade Brasileira de Farmacognosia (2014) e, estão descritas no Quadro 6. Para cada classe química analisada foram realizados os controles negativo com apenas adição do extrato e o controle positivo com um padrão conhecido cuja composição química está descrita na Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010a; STICHER, 1993). Os controles positivos foram adquiridos no mercado municipal de Ribeirão Preto (Casa Massaro ®, BOX 29, Industria Brasileira). As análises CCDC foram realizadas conforme descrito por WAGNER e BLADT (1995).

Quadro 6 – Relação das reações cromogênicas e de precipitação aplicada para cada classe química analisada na caracterização do perfil fitoquímico da Miconia ferruginata. Classes químicas Reações químicas inespecíficas Reações químicas específicas analisadas Reagentes gerais para Reagentes gerais de alcaloides Alcaloides alcaloides (Mayer, (Mayer, Dragendorff, Dragendorff, Bouchardat, Bouchardat, Hager) Hager) após extração alcalina Reação de Borntrager direta e Antraquinonas indireta

Esteroides / Reação de Liebermann-Burchard Reação de Salkowisk Triterpenos Reação com vanilina sulfúrica Reação de Shinoda Reação de Wilson-Taubock

Flavonoides Reação com cloreto de alumínio (flavonóis) Reação com cloreto férrico Reação de Pew Reação com hidróxidos alcalinos Reação afrogênica Saponinas Índice de espuma Reação com cloreto férrico Precipitação com gelatina Taninos Precipitação com acetato de

chumbo Fonte: SIMÕES et. al. (2007); SILVA; MIRANDA; CONCEIÇÃO (2010); COSTA (2012)

As classes químicas foram consideradas presentes quando 70% das reações realizadas apresentaram resultado positivo.

4. 5.1 Teste para alcaloides Os alcaloides são compostos orgânicos cíclicos que possuem um ou mais átomos de nitrogênio com estado de oxidação negativo pertencente ao anel heterocíclico (Figura 7). Este grupo de compostos apresenta elevada diversidade estrutural, propriedades físico-químicas e ações farmacológicas (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1997;

HENRIQUES et al., 2000). Por serem compostos nitrogenados, os alcaloides, apresentam caráter alcalino e reagem com compostos metálicos, como o mercúrio, o ouro, o iodo e a platina, formando precipitado de sais complexos. Os métodos de detecção de alcaloides são geralmente precedidos de uma extração baseada em suas propriedades de insolubilidade em água e solubilidade em solventes orgânicos e, consistem de reações de precipitação com reativos específicos. A maioria desses reagentes são soluções neutras ou levemente ácidas, como os regentes de Mayer (solução de iodeto de potássio e cloreto de mercúrio), Dragendorff (solução de iodeto de potássio e subnitrato de bismuto), Wagner ou Bouchardat (solução de iodo e iodeto de potássio) e Hager (solução saturada de ácido pícrico) (SIMÕES et al., 2007).

Figura 7 – Representação da estrutura do alcaloide verdadeiro, atropina. ChemDraw Ultra (2004).

Assim, para a pesquisa de alcaloides, foram adicionados em um becker 2 g da droga vegetal e 20 mL de ácido sulfúrico a 1%. A solução foi fervida por 2 minutos e, em seguida, filtrada. Após resfriamento, o filtrado foi dividido em duas porções (A e B). A porção A foi distribuída em cinco tubos de ensaio, em que nos quatro primeiros foram adicionadas duas gotas de reagentes gerais de alcaloides, apresentados no Quadro 7. O quinto tubo serviu de controle negativo para comparação. O resultado foi considerado positivo quando ocorreu turvação ou precipitação. Na porção B foram adicionadas gotas da solução de hidróxido de amônio 10% até atingir pH 8, medida por meio de tiras para pH (Qualividros ®). Em seguida, foram adicionados 7 mL de clorofórmio PA (Dinâmica ®). Foi feita extração durante 10 minutos. A camada clorofórmica foi coletada e levada ao banho-maria para evaporação até secura. O resíduo obtido foi suspendido em 5 mL de ácido sulfúrico a 1% que foi distribuída em cinco tubos de ensaio no qual seguiu o mesmo protocolo descrito para a porção A. O controle positivo foi realizado com folhas de Peumus boldus Molina

(boldo-do-chile). Para considerar resultado positivo pelo menos três reações da porção B devem apresentar turvação ou precipitado.

Quadro 7 - Reagentes gerais para pesquisa de alcaloides. Reagente geral de alcaloide Cor do precipitado Dragendorff Alaranjado Mayer Branco Bouchardat Marrom Hager Amarelo

4. 5. 2 Teste para antraquinonas As antraquinonas são moléculas fenólicas derivadas da dicetona do antraceno composta por dois grupamentos carbonílicos e duas ligações duplas entre carbonos (Figura 8). Estes compostos geralmente apresentam coloração alaranjada ou vermelha e são solúveis em água quente ou álcool diluído.

Figura 8 – Representação da estrutura química básica das antraquinonas. ChemDraw Ultra (2004).

Assim, para a pesquisa de antraquinonas foram realizadas as reações de Bornträger direta e indireta com hidrólise ácida. Como controle positivo foi usado folhas de Senna alexandrina Mill. (sene).

a) Reação de Bornträger direta Em um tubo de ensaio foram colocados 200 mg da droga vegetal em 5 mL de solução de hidróxido de amônio a 5%. O aparecimento de coloração rósea ou avermelhada é indicativo da presença de antraquinonas.

b) Reação de Bornträger indireta com hidrólise ácida Foram colocados em um tubo de ensaio 1 g da droga vegetal em 8 mL de solução aquosa de etanol 25%. A solução foi fervida durante 1 minuto e, em seguida, filtrada para um tubo de ensaio contendo 4 mL de ácido sulfúrico a 5%. A mistura foi aquecida levemente, posteriormente, resfriada em torneira. Foram adicionados 5 mL de clorofórmio PA (Dinâmica ®) e realizada partição líquido-líquido por 3 minutos. A camada orgânica foi recolhida para um tubo de ensaio, no qual foram adicionados 5 mL de hidróxido de amônio a 5%. O tubo foi agitado fortemente e deixado em repouso. A formação de coloração rósea ou avermelhada na fase aquosa indica presença de antraquinonas.

4. 5. 3 Teste de esteroides/triterpenoides Os terpenos são uma classe metabólitos provenientes das vias acetato- mevalonato e de oxi-celulose fosfato, por meio da condensação de unidades de isopreno podendo apresentar inúmeras formas estruturais. São classificados de acordo com o número de unidades presentes no seu esqueleto carbônico, entre os mais comuns estão os monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20) e triterpenos (C30) (Figura 9 A-D) (SIMÕES et al., 2007; BAKKALI et al., 2008). Os esteroides (C27) (Figura 9 E) produzidos a partir dos terpenos (SIMÕES, et al., 2007) apresentam um amplo espectro de ações biológicas (PATOCKA, 2003; SONBOLI; BABAKHANI; MEHRABIAN et al., 2006; COLOMA et al., 2011; LIANG et al., 2011).

H A B C HO

HO H

O H

H3C D CH C E 3 D CH3 OH CH3 CH3 H3C

HO HO Figura 9 – Representação da estrutura dos terpenoides e esteroides. A - Monoterpeno, limoneno; B - Sesquiterpeno, α-humuleno; C - Diterpeno, cafestol; D - Triterpeno, betulina; E - Esteroide, β-sitosterol. ChemDraw Ultra (2004).

Devido à presença da dupla ligação em um dos anéis do núcleo esteroidal ou triterpênico ocorre à formação de cor quando estes compostos estão em contato com ácidos inorgânicos concentrados. O princípio das reações de triagem destes compostos é baseado na desidratação e desidrogenações do núcleo fundamental da molécula por um ácido forte, com posterior formação de produtos mono ou dissulfonados (FUJIWARA, 2012). A reação de Lieberman-Burchard é o principal teste analítico para detecção de terpenoides/esteroides, em que o composto desidratado pelo ácido sulfúrico reage com o anidrido acético, formando um ácido monossulfônico, responsável pelo desenvolvimento da formação de um anel colorido. A intensidade da coloração desenvolvida é proporcional à concentração destes compostos na amostra (FUJIWARA, 2012). O mecanismo da reação de Salkowisk é semelhante a reação anterior (XIONG et al., 2007; ATINAFU; BEDEMO, 2011). Assim, para o teste de esteroides/triterpenoides foram realizadas as reações de Liebermann-Burchard, Salkowisk e reação com vanilina sulfúrica. As folhas de Ginkgo biloba L. foram utilizadas como controle positivo para o teste. Para isso foi realizado um infuso com 5 g da planta em 100 mL de água Milli-Q. O extrato aquoso obtido foi particionado, por extração líquido-líquido com três porções de 40 mL de clorofórmio

PA (Dinâmica ®). As fases orgânicas foram recolhidas em um becker e levadas ao banho-maria para concentrar o extrato, obtendo um volume de 20 mL, aproximadamente. Este extrato orgânico final foi usado para as reações descritas abaixo.

a) Reação com vanilina sulfúrica Em um tubo de ensaio foi adicionado 2,5 mL do extrato orgânico que foi evaporado em banho-maria até a secura. Após a secagem foi adicionado duas gotas de uma solução de vanilina sulfúrica 1%. O tubo foi submetido a aquecimento por alguns minutos sobre chama direta. O aparecimento de coloração violeta-azulada é indicativo de núcleos esteroidais ou triterpênicos.

b) Reação de Libermann-Burchard Foi evaporado até a secura 2,5 mL do extrato orgânico em um tubo de ensaio. Ao resíduo foi adicionado 3 mL de ácido acético glacial PA (Proquímicos ®) e, em seguida, duas gotas de cloreto férrico 2%. Pelas paredes do tubo e sem agitar, adicionou-se cuidadosamente 2 mL de ácido sulfúrico concentrado PA (Proquímicos ®).

O resultado é considerado positivo para presença de núcleo esteroidal quando há aparecimento de um anel de coloração azul ou violeta na zona de contato entre as duas camadas, enquanto que anel de coloração pardo-avermelhada ou verde indica presença de núcleo triterpênico.

c) Reação de Salkowisk Em um tubo de ensaio foram adicionados 2,5 mL do extrato orgânico que foi evaporado em banho-maria até a secura. Ao tubo foi adicionado cuidadosamente 2 mL de ácido sulfúrico concentrado PA (Proquímicos ®) pelas paredes, sem agitar. O aparecimento de anel de coloração vermelha ou pardo-acastanhado indica presença de núcleo triterpênico, enquanto que de anel de coloração rósea a violeta indica núcleo esteroidal.

4. 5. 4 Teste de flavonoides Os flavonoides constituem uma classe de compostos fenólicos de baixo peso molecular, derivados de benzo-γ-pironas (HEIM; TAGLIAFERRO; BOBILYA, 2002) provenientes das vias dos fenilpropanoides e do acetato (YOKOZAWA et al., 1997). A estrutura básica consiste em um núcleo fundamental, constituído de quinze átomos de

carbono arranjados em três anéis, sendo dois anéis fenólicos substituídos (A e B) e um anel pirano (cadeia heterocíclica C) acoplado ao anel A (DI CARLO et al., 1999), como representado na Figura 10. As principais classes dos flavonoides são as flavonas, as flavanonas, os flavonóis, as antocianidinas, as isoflavonas, leucoantocianidinas, proantocianidinas, auronas e chalconas (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1997; BRAVO, 1998). Os flavonoides frequentemente se encontram oxigenados ou conjugados com açúcares e, exercerem uma gama de propriedades biológicas (RICARDO et al., 2001; KÄHKÖNEN; HEINONEN, 2003; DASTIBAR et al., 2004; SIMÕES et al., 2007).

Figura 10 – Representação da estrutura química básica dos flavonoides. ChemDraw Ultra (2004).

As técnicas de pesquisa e isolamento dos flavonoides estão relacionadas à presença de ligações duplas alternadas que desempenham papel de cromóforos, fazendo com que estes metabólitos apresentem solubilidade em meios alcalinos, propriedades redutoras e várias reações cromáticas. Essas reações, embora não permitam identificar os flavonoides, são capazes de distinguir os subgrupos particulares como as flavonas, os flavonóis, as flavanonas, as chalconas e as isoflavonas (COSTA, 2001). Os ensaios cromáticos são importantes para análises preliminares e, em alguns casos, podem ser utilizados na dosagem dos derivados flavônicos. As cores obtidas nas reações cromogênicas variam de acordo com o núcleo, número e a disposição dos substituintes hidroxilados (SIMÕES, et al., 2007). As reação de Shinoda se baseiam na redução na posição 3 de derivados flavônicos de cor amarela, que após a adição de magnésio ou zinco metálico e ácido clorídrico, adquirem uma cor avermelhada. Apenas as flavonas, flavonóis, flavanonas e diidroflavonóis apresentam positividade para estas reações (MARTÍNEZ, 2005). A reação com o cloreto de alumínio ocorre devido à fluorescência amarela intensa de

compostos flavônicos quando submetidos à luz ultravioleta. Na reação de Taubouk, os compostos flavônicos obtidos após reação com ácido bórico apresentam fluorescência amarelo-esverdeada. Esta última é característica de flavonóis (COSTA, 2001; SIMÕES et al., 2007).

Já as reações com hidróxidos alcalinos e cloreto férrico (FeCl 3) são muito utilizadas para a identificação de fenóis, como os flavonoides. Assim, os fenóis reagem com substâncias alcalinas, como o NaOH e forma fenóxidos que sofrem facilmente oxidação pelo ar, e adquirem cor amarelada. Na reação com FeCl 3 ocorre liberação dos íons Fe +3 na solução, e, esses íons formam complexos coloridos com grupamentos fenólicos. Para esta reação as flavonas coram-se de verde-claro, flavonóis e flavanonas de verde-escuro e chalconas de amarelo (SOFIATI, 2009). Assim, para pesquisa de flavonoides, 1 g da droga vegetal e 10 mL da solução aquosa de etanol 70% foram aquecidos durante 5 minutos em banho-maria e, posteriormente, foi realizada filtração. Como controle positivo foi utilizado folhas de Baccharis trimera (Less) DC. (carqueja). A presença de flavonoides foi confirmada quando pelo menos quatro reações apresentaram resultados positivos.

a) Reação de Shinoda Foram adicionados em um tubo de ensaio 2 mL do extrato hidroalcoólico e de quatro a seis fragmentos de magnésio metálico (Vetec ®). Logo após foi adicionado 1 mL de ácido clorídrico concentrado PA (Proquímicos ®). Após alguns minutos, foi observado o aparecimento de cor na solução, que pode indicar flavonóis quando rósea ou vermelha, flavanonas quando violeta ou flavonas quando alaranjado.

b) Reação com cloreto de alumínio Uma tira de papel de filtro foi umedecida em áreas diferentes com o extrato hidroalcoólico. Em uma das regiões foi adicionada uma gota de solução de cloreto de alumínio 5%. Após evaporação do solvente, a temperatura ambiente, foi feita comparação das duas regiões sob luz ultravioleta a 254 e 366 nm (lâmpadas Sankyo Denk ®). Flavonas e flavonóis apresentam fluorescência amarelada e flavanonas azul- esverdeada.

c) Reação com cloreto férrico Em um tubo de ensaio, 1 mL do extrato hidroalcoólico foi diluído em 9 mL de água Milli-Q. Esta solução foi subdividida em dois tubos de ensaio com 5 mL cada. Em um dos tubos foi adicionado lentamente pelas paredes do tubo, uma gota de cloreto férrico 2%. O segundo tubo foi o controle negativo da reação, em que não foi adicionado nenhum reagente. Comparando os tubos, a formação de coloração verde- claro, verde-escuro ou amarelo, indica presença de flavonas, flavonóis/flavanonas ou chalconas, respectivamente.

d) Reação com hidróxidos alcalinos Foi diluído 0,5 mL do extrato hidroalcoólico em 9,5 mL de água destilada, em um tubo de ensaio. A solução foi subdividida em dois tubos de ensaio com 5 mL cada, uma delas constituindo o branco da reação. Em um dos tubos foi adicionado 15 gotas da solução de hidróxido de sódio 1 M. Comparando os tubos, o aparecimento de coloração amarela na solução, indica a presença de flavonoides com hidroxilas fenólicas livres.

e) Reação de Wilson-Taubock Em uma cápsula de porcelana foram colocados 3 mL do extrato hidroalcoólico e levado ao banho-maria até secura. Após resfriamento, o resíduo foi umedecido com algumas gotas de acetona PA (Dinâmica ®). Foram adicionados alguns cristais de ácido bórico (Proquímicos ®) e de ácido oxálico (Dinâmica®). Evaporou-se novamente em banho-maria até a secura. O resíduo foi dissolvido em 3 mL de éter etílico PA (Vetec ®) e observado sob luz ultravioleta (lâmpadas Sankyo Denk ®). A presença de fluorescência amarelado-esverdeada é indicativa da presença de flavonoides.

f) Reação de Pew Foram adicionados em uma cápsula de porcelana 3 mL do extrato hidroalcoólico e levado ao banho-maria até secura. O resíduo obtido foi dissolvido com 3 mL de metanol PA (Vetec ®) e transferido para um tubo de ensaio, usando uma pipeta de Pasteur. Foi adicionado uma pequena porção de zinco metálico (Vetec ®) e, em seguida, três gotas de ácido clorídrico concentrado PA (Proquímicos ®). O desenvolvimento lento de coloração vermelha indica a presença de flavonoides.

4. 5. 5 Teste de saponinas As saponinas são glicosídeos de esteroides ou de triterpenos que apresentam estrutura química de caráter anfifílico (Figura 11), ou seja, parte da estrutura com característica lipofílica (como um triterpeno ou esteroide) e outra hidrofílica (açúcares). Essa característica é responsável pela propriedade de redução da tensão superficial da água e suas ações detergentes e emulsificante (SCHENKEL et al., 2001), como também possibilita a formação complexos com esteroides, proteínas e fosfolipídeos de membranas a essas substâncias, o que as confere ações biológicas variadas. Assim, a formação de espuma abundante e persistente em solução aquosa é característica deste grupo metabólico (GURIB-FAKIM, 2006).

Figura 11 – Representação da estrutura da saponina, glicirrizina. ChemDraw Ultra (2004).

Para a pesquisa de saponinas foi realizado a análise da propriedade afrogênica e a determinação do índice de espuma. As folhas de Baccharis trimera (Less.) DC. (carqueja) foram utilizadas como controle positivo do teste. Para ambos os testes foi preparado um extrato aquoso, por decocção, a partir de 1 g da droga vegetal em 100 mL de água Milli-Q. Dessa forma, o decocto foi fervido em bico de Bunsen, durante 5 minutos. Após resfriamento e filtração foi adicionado gotas de carbonato de sódio 0,2 M até atingir pH 7,0, verificado em tiras para medida de pH (Qualividros ®). O extrato aquoso final foi transferido para um balão volumétrico de 100 mL e o volume completado com água Milli-Q.

a) Propriedade afrogênica Foi adicionado 5 mL do extrato aquoso, em um tubo de ensaio, submetido a agitação vigorosa por 15 segundos e deixado em repouso durante 15 minutos. Após este período foi observado se ocorreu permanência de espuma igual ou maior que 1 cm de altura, indicando a presença de saponinas.

b) Determinação do índice de espuma Foi realizada uma diluição seriada do extrato aquoso em água Milli-Q como descrito na Tabela 1. Cada tubo foi agitado vigorosamente por 15 segundos e deixado em repouso durante 15 minutos. O tubo mais diluído que apresentou espuma permanente com no mínimo 1 cm de altura, foi usado para o calculo do índice de espuma (IE) conforme a fórmula: = , em que, V é igual ao volume do extrato no tubo selecionado.

Tabela 1 - Diluição dos extratos na determinação do índice de espuma para pesquisa de saponinas na Miconia ferruginata . N° dos Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Extrato (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Água destilada (mL) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 - Volume total (mL) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

4. 5. 6 Teste de taninos Os taninos são compostos fenólicos com estruturas complexas e se apresentam sob forma de esteres ou heterosídeos solúveis em água e em solventes orgânicos polares. De acordo com a estrutura química, os taninos são classificados em dois grupos: hidrolisáveis ou condensados (Figura 12). Estes compostos possuem habilidade de formar complexos insolúveis em água com proteínas, gelatinas e alcaloides, por meio de pontes de hidrogênio entre seus grupos fenólicos e determinados sítios protéicos ou grupamentos amina. Assim, o método mais comumente utilizado é a reação com solução de gelatina, que promove a formação de precipitado esbranquiçado. Os testes com cloreto férrico e acetato de chumbo neutro ou ácido se baseiam na complexação dos taninos com sais de metais pesados com desenvolvimento de cor azul ou verde e de precipitado, respectivamente (COSTA, 2012; SIMÕES et al., 2007) .

Figura 12 – Representação da estrutura química básica dos taninos. A - Taninos hidrolisáveis; B - Taninos condensados. ChemDraw Ultra (2004).

Assim, para pesquisa de taninos foi preparado um decocto a partir de 5 g da droga vegetal em 100 mL de água Milli-Q por 15 minutos. Após resfriamento e filtração em algodão, o extrato obtido foi distribuído em quatro tubos de ensaio. Para três tubos foram adicionados os reagentes como descrito abaixo. No último tubo foi adicionado apenas o extrato servindo de controle negativo do teste. Para o controle positivo foram realizados testes com folhas de Hamamelis virginiana L. (Hamamélis).

a) Reação com gelatina Em um tubo de ensaio foram adicionados 2 mL do extrato, duas gotas de ácido clorídrico 10% e três gotas de solução de gelatina 2,5%. A formação de precipitado ou turvação é indicativa de reação positiva para a presença de taninos.

b) Reação com cloreto férrico Foram adicionados em um tubo de ensaio 2 mL do extrato, 10 mL de água Milli- Q e quatro gotas de solução de cloreto férrico 2%. O desenvolvimento de coloração azul indica a presença de taninos hidrolisáveis ou gálicos, enquanto a coloração verde indica a presença de taninos condensados ou catéquicos.

c) Reação com acetato de chumbo No terceiro tubo de ensaio foram adicionados 5 mL do extrato, 10 mL de solução de ácido acético 10% e 5 mL de solução de acetato de chumbo 10%. A formação de precipitado é indicativa da presença de taninos.

4. 6 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) Para confirmação dos resultados obtidos nos testes de triagem fitoquímica preliminar foi realizado uma CCDC específica para cada classe de metabólito secundário detectado na espécie M. ferruginata. Na análise foi utilizado padrões conhecidos, a fim de se calcular os valores dos respectivos Rfs. Assim a CCDC foi realizada para detecção da presença de flavonoides, alcaloides, terpenoides e antraquinonas conforme metodologia adaptada de WAGNER e BLADT (1995), e para a detecção de saponinas e taninos conforme descrito por KEREM; GERMAN- SHASHOUA; YARDEN (2005) e SOUZA et al. (2007a), respectivamente. A cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) é uma técnica de adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação ocorre pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura tanto pela fase estacionária quanto pela fase móvel. A aplicação de diferentes reagentes cromogênicos proporciona a obtenção de dados adicionais sobre as substâncias separadas. Esta técnica consiste em um método rápido, simples, sensível, eficiente, de baixo custo e comumente empregado no controle de qualidade de plantas medicinais, tanto em matéria-prima vegetal quanto em fitoterápicos (JULIÃO et al., 2003; VALENTE et al., 2006). Em condições padronizadas é possível caracterizar a amostra pelo valor numérico do fator de retenção (Rf) o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel, na mesma análise (Figura 13) (ZEEUW et al., 1992). Para este tipo de análise, é recomendado o uso de padrões, em virtude da dificuldade de uniformizar as condições do ensaio. Os padrões podem ser constituídos pela própria substância a ser identificada, pura, ou na sua ausência por outros compostos com valores de Rfs próximos (COSTA, 2001).

Figura 13 – Representação esquemática para calculo do fator de retenção (Rf).

Para realização da CCDC foram utilizadas cromatoplacas de sílica gel 60 (Whatman ®) 20 x 20 cm, espessura 250 µm, em cuba saturada, com migração ascendente do eluente. O eluente empregado na maioria dos casos foi uma mistura de solventes orgânicos. Os reagentes usados foram: clorofórmio PA (Dinâmica ®), metanol

PA (Vetec ®), hidróxido de amônio PA (Dinâmica ®), n-propanol PA (Vetec ®), acetato de etila PA (Vetec ®), ácido acético glacial PA (Proquímicos ®), tolueno PA (Proquímicos ®), ácido fórmico PA (Ecibra ®), n-butanol PA (Rio Lab ®). As amostras testadas foram obtidas a partir de extratos etanólicos ou aquosos das folhas/flores e caule de M. ferruginata ressuspendidos em clorofórmio:metanol na proporção 1:1 e metanol: água na proporção 8:2, respectivamente. As amostras e os padrões foram aplicados na placa com auxílio de um capilar. A detecção dos compostos foi feita por meio de revelação sob luz ultravioleta a 254 e 366 nm (lâmpadas SankyoDenk ®) e de reveladores específicos de acordo com cada metabólito secundário avaliado, conforme descrito abaixo. A partir destes dados foi calculado o fator de retenção (Rf) dos padrões e das amostras de acordo com a fórmula: = Onde, dr é a distância percorrida pela substância padrão ou amostra em centímetros e dm é a distância percorrida pela fase móvel em centímetros.

4. 6. 1 Análise de alcaloides Para determinar a presença de alcaloides na amostra foi realizado uma CCDC com fase móvel constituída de clorofórmio:metanol:hidróxido de amônio na proporção de 50:9:1. O padrão comparativo foi uma solução de butilbrometo de escopolamina a 0,08 mg/mL. Como revelador especifico foi utilizado o reagente de Dragendorff. O surgimento de manchas de cor alaranjada após revelação indica resultado positivo.

4. 6. 2 Análise de antraquinonas Para determinar a presença de antraquinonas na amostra foi realizada uma CCDC com fase móvel composto de n-propanol: acetato de etila: água Milli-Q: ácido acético glacial na proporção de 40:40:29:1. Como padrão comparativo foi preparado um extrato metanólico de folhas de Senna alexandrina Mill (sene). A solução etanólica de hidróxido de potássio a 5% foi usada como revelador específico. A observação de manchas de cor vermelha na luz visível indica presença de antraquinonas.

4. 6. 3 Análise de terpenoides

Para determinar a presença de terpenoides na amostra foi realizado um CCDC com fase móvel composta por tolueno: acetato de etila, na proporção 93:7. O padrão comparativo foi o alfa-bisabolol 0,1 g/mL. A revelação foi realizada com vanilina sulfúrica 1%. O aparecimento de manchas de cor azul-violeta, vermelho-violeta, azul, verde, vermelho ou marrom no visível é indicativo de positividade.

4. 6. 4 Análise de flavonoides Para determinar a presença de flavonoides na amostra foi realizado um CCDC com fase móvel constituída de acetato de etila:ácido fórmico: ácido acético glacial: água Milli-Q na proporção de 100:11:11:26. Quercetina a 0,5 mg/mL foi usada como padrão comparativo. A revelação foi realizada com vanilina sulfúrica a 1%. Os flavonoides apresentam coloração amarelo escuro, verde ou azul fluorescente sob luz a 366 nm. No visível, a presença de flavonoides é indicada pelo aparecimento de manchas de coloração amarelo-alaranjado ou amarelo-esverdeado.

4. 6. 5 Análise de saponinas Para determinar a presença de saponinas na amostra foi realizado um CCDC com fase móvel utilizando uma mistura de n-butanol: água Milli-Q: ácido acético na proporção 84:14:7. O padrão comparativo foi saponina 0,3 g/mL. A detecção foi realizada por meio de aspersão de etanol: ácido sulfúrico concentrado na proporção de 90:10 seguido de aquecimento a 110 ºC por 10 minutos. A observação de manchas azul- violeta no visível indica positividade.

4. 6. 6 Análise de taninos Para determinar a presença de taninos na amostra foi realizado um CCDC com fase móvel composta de clorofórmio: metanol: n-propanol: água Milli-Q, na proporção de 5:6:1:4. Como padrão comparativo foi usado extrato aquoso das folhas de Hamamelis virginiana L. O revelador foi o cloreto férrico 2%. A presença de manchas azul escuro no visível é indicativa da presença de taninos hidrolisáveis.

4. 7 Teor de compostos fenólicos

A determinação do conteúdo de fenóis totais foi realizada através do método colorimétrico com o reagente de Folin-Ciocalteu, conforme descrito por SINGLETON et al. (1999) e ANDRADE et al. (2007), com modificações. Este método foi descrito primeiramente por SINGLETON; JOSEPH; ROSSI (1965), sendo bastante eficiente para avaliar o teor de compostos fenólicos totais de produtos naturais. Ele se baseia nas reações de oxi-redução envolvendo os compostos fenólicos e os íons metálicos presentes no reagente de Folin-Ciocalteu. O Reagente de Folin-Ciocaulteu consiste em uma mistura dos ácidos fosfomolibídico (H 3PMo 12 O40 ) e fosfotúngstico (H 3PW 12 O40 ), na qual o molibdênio se encontra no estado de oxidação (VI) e apresenta cor amarela devido ao complexo formado (Na 2MoO 4.2H 2O). Em meio alcalino, ocorre uma transferência de elétrons entre os compostos fenólicos e outras espécies redutoras para o molibdênio, formando complexos azuis de 4- molibdênio-tungstênio [(PMoW 11 O4) ], nos quais o estado de oxidação dos metais está entre (V) e (VI). A intensidade de coloração obtida pode ser então monitorada espectrofotometricamente a 750-765 nm e a concentração dos compostos fenólicos redutores é determinada por meio de curvas de calibração de substâncias padrões, tais como o ácido gálico (GENOVESE et al.,2003; HUANG; PRIOR, 2005). Este método é amplamente utilizado em pesquisa de produtos naturais antioxidantes, pois apresenta

simplicidade, baixo custo, sensibilidade e precisão. A reação do ácido gálico com o reagente Folin-Ciocaulteu é mostrada na Figura 14.

Figura 14 – Reação do ácido gálico com o reagente Folin-Ciocaulteu, durante quantificação do teor de compostos fenólicos. ChemDraw Ultra (2004).

A Figura 14 apresenta a desprotonação do padrão ácido gálico em meio básico, gerando o ânion carboxilado. Em seguida, ocorre uma reação de oxi-redução entre este ânion e o reagente de Folin, na qual o molibdênio, componente do reagente de Folin, sofre redução e o meio reacional muda a coloração de amarela para azul. O teor de fenóis totais foi determinado pela interpolação da absorbância da amostra contra a curva de calibração do ácido gálico (Sigma ®) e expressos como equivalentes de ácido gálico (mg de ácido gálico/g de extrato). Primeiramente, os extratos aquosos foram ressuspendidos em uma solução de metanol 80% e deixados em repouso por 24 horas. Após este período, foi retirado o sobrenadante com auxilio de uma pipeta Pasteur, e este foi diluído 100 e 200 vezes em água Milli-Q. Em um tubo de rosca foi adicionado 1,0 mL de amostra em diferentes diluições, 1,0 mL do reagente de Folin-Ciocalteu 2 N (Sigma ®) e 2,0 mL de água Milli-Q. Após 5 minutos de repouso foi acrescentado 1,0 mL de carbonato de sódio 10%, sob agitação. Após duas horas de incubação à temperatura ambiente, a absorbância foi medida em espectrofotômetro (Biospectro ®) a 750nm. Um branco, utilizando água Milli-Q no lugar da amostra, foi conduzido nas mesmas condições descritas.

Para construção da curva de calibração foi preparado uma solução estoque de ácido gálico, em água Milli-Q, na concentração de 1,0 g/mL. A partir da solução- estoque foram realizadas diluições seriadas, obtendo as concentrações finais de 0,1 a 100 mg/mL. O padrão foi submetido à análise da mesma forma descrita para a amostra. A Equação da curva de calibração do ácido gálico foi: = , Onde C é a concentração do ácido gálico e A é a absorbância a 750 nm. O coeficiente de correlação da curva foi R=0,9956 . Todas as leituras foram realizadas em triplicata.

4. 8 Análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME). A análise em CG-EM foi realizada no Núcleo de Pesquisas em Produtos Naturais e Sintéticos (NPPNS) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade Federal de São Paulo (FCFRP-USP). A cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) é amplamente utilizada em compostos voláteis e termicamente estáveis. Podem ser analisados os metabólitos secundários com peso molecular de até 500 u.m.a. e com pontos de ebulição inferiores a 300 °C (MAHMOUD, 2010). Esta ferramenta é muito útil na identificação de compostos de produtos naturais graças à disponibilidade de bibliotecas espectrais, com detector de massas com ionização por elétrons. Na ionização por elétrons, as moléculas da amostra, depois de separadas pelo sistema cromatográfico, passam na fonte de íons onde são ionizadas pela colisão com os elétrons gerados num filamento de tungstênio ou rênio. Essa colisão leva à fragmentação e ionização das moléculas da amostra (RODRIGUES et al., 2006b). Outra forma de análise ocorre por meio do cálculo do índice de retenção relativa (IRR). Na qual os índices obtidos podem ser comparados com os descritos na literatura, e juntamente com os dados de espectrometria de massas permitem a identificação e caracterização dos constituintes (SOUZA; MELLO; LOPES, 2012). A análise em CG-EM foi realizada para as partes aéreas frescas de M. ferruginata por meio de microextração em fase sólida por headspace (HP-SPME). A SPME é uma microtécnica, em que os processos de extração e pré-concentração dos

analitos se baseiam no equilíbrio de partição ou adsorção entre a fibra e componentes da amostra ou seu headspace. O dispositivo básico consiste de um bastão de fibra, de sílica fundida recoberto com um filme fino de polímero ou de um sólido adsorvente (VALENTE; AUGUSTO, 2000) (Figura 15). Assim que o equilíbrio na fibra é alcançado, a quantidade de composto extraído está diretamente relacionada à afinidade com a fase da fibra e sua concentração na amostra. Para aplicação no cromatógrafo, os compostos são dessorvidos termicamente, sob fluxo do gás de arraste e carregados para a coluna cromatográfica no qual são separados, identificados e quantificados. Esta técnica apresenta muitas vantagens, tais como simplicidade, rapidez, não utiliza solvente, não produz artefatos, apresenta baixo custo e pode ser aplicada à análise de amostras sólidas, líquidas e gasosas, especialmente na triagem de compostos voláteis produzidas por plantas (MATA et al., 2004).

Figura 15 – Representação do dispositivo de microextração em fase sólida (SPME). A - Posição com a fibra retraída na agulha; B - Posição com a fibra exposta. Extraído de VALENTE; AUGUSTO (2000).

A análise em CG-EM foi realizada em um cromatógrafo (Shimadzu ®) acoplado a espectrômetro de massas (QP2010), equipado com injetor automático (AOC-20i). Foi utilizada coluna capilar com dimensões de 30 m de comprimento por 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de espessura como fase estacionária (DB-5MS). Para a SPME foi utilizada fibra de polidimetilsiloxano 100 µm (Sigma ®). Na extração por HP-SPME, 300 mg das partes aéreas frescas compostas de folhas, flores e caule de M. ferruginata foram pulverizadas com auxílio de nitrogênio líquido em gral com pistilo, e colocadas em vial de 4 mL. Em seguida, o preparado foi exposto à fibra de polidimetilsiloxano durante 30 minutos com aquecimento em banho- maria a 60 °C. As injeções foram realizadas no modo splitless (250 °C) utilizando hélio como gás de arraste. O fluxo na coluna foi de 1,41 mL/min, pressão de 87,1 kPa e aquecimento com programação de temperatura de 60-240 °C a razão de 3 °C/minuto. Os espectros de massas foram obtidos através de ionização por elétrons (EI) com voltagem de ionização em 70 eV, temperatura interface em 250 °C e temperatura da fonte de ionização em 200 °C. Uma série de hidrocarbonetos n-alcanos (C 9-C22 ) foi analisada concomitantemente.

Para a identificação das substâncias foram utilizadas três espectrotecas: Wiley7, Nist8 e Nist 8c e foi determinado o índice de retenção relativa (IRR) conforme descrito por ADAMS (2007) e em conformidade com a base de dados Pherobase (2014). O IRR foi calculado a partir da equação: − = 100[ + − − Em que, IRR = índice de retenção relativa de Kovats n = número de átomos de carbono do n-alcano eluído antes da substância de interesse N = número de átomos de carbono do n-alcano eluído após a substância de interesse tr = tempo de retenção

4. 9 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos de folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A análise em CLAE-DAD foi realizada em equipamento da central analítica do Núcleo de Apoio Técnico de Ensino e Pesquisa (NATEP) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Campus Diadema. A cromatografia líquida de alta eficiência

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(CLAE) é fundamentada no mecanismo de partição, na qual ocorre uma competição entre os componentes da amostra e da fase móvel, pelos sítios ativos na superfície da fase estacionária. Este tipo de equipamento permite a realização de análises qualitativas e quantitativas de modo eficaz, uma vez que esta técnica apresenta maior rapidez, alta sensibilidade e seletividade (SHARAPIN, 2000). As técnicas hifenadas, vem sendo uma importante ferramenta para identificação dos constituintes de produtos naturais (DRASARA; MORAVCOVA, 2004; LIU et al., 2007), em especial, para compostos fenólicos como a classe dos flavonoides (TARNAWSKI et al., 2006). Os detectores mais usados são os Ultravioleta-visível (UV-vis) espectrometria de massas (EM e EM- EM) e ressonância magnética nuclear (RMN) (LIANG; XIE; CHAN, 2004). O detector de UV-vis mede a quantidade de luz absorvida pelos compostos que absorvem luz na região ultravioleta do espectro eletromagnético, os ditos grupos cromóforos (RODRIGUES et al., 2006b; MAHMOUD, 2010). O detector por arranjo de diodos (DAD) é o mais vantajoso, pois permite a determinação da pureza e a identificação de alguns picos por meio da detecção de diversos comprimentos de onda e com a possibilidade de análise dos diferentes espectros (SOUZA; MELLO; LOPES,

2012). Já o detector de EM é o detector universal, além de ser mais sensível que o DAD (RODRIGUES et al., 2006b), por apresentar a possibilidade de confirmação dos compostos analisados (SILVA; COLLINS, 2011). Para isso, foi empregado cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) (Shimadzu ®), equipado com bomba quaternária (LC-20AT), degaseificador (DGU- 20AS), injetor de amostras automatizado (SIL-20AC HT), forno para coluna (CTO- 20A), detector de arranjo de diodos (SPD-M20A) e unidade controladora (CBM-20A) acoplada a computador (Dell ®). Foi utilizada coluna C18(2), com 150 mm de comprimento x 4,6 mm de diâmetro interno, tamanho de partícula de 3,0 µm, acoplada a pré-coluna do mesmo material e fabricante (Phenomenex Luna ®). Os extratos alcoólicos foram ressuspendidos em metanol grau HPLC (J.T. Baker ®) e os extratos aquosos em água ultrapurificada (Direct-Q®) na concentração de 10 mg/mL e, posteriormente, filtrados em filtros de seringa PTFE hidrofílico de 1,3 cm de diâmetro e poros de 0,22 µm (Millex ®). A eluição foi realizada por gradiente conforme descrito na Tabela 2.

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Tabela 2 – Gradiente utilizado nas análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) para análise dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. Tempo (minutos) % fase móvel A % fase móvel B 0 90 10 5 90 10 45 0 100 50 0 100 52* 90 10 60* 90 10 A – água ultrapura B – acetonitrila grau HPLC (Tedia – EUA) contendo 10% de metanol grau HPLC (J T Baker, México) *Reequilíbrio da coluna cromatográfica Fluxo: 1mL/min

4. 10 Análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata . A análise em CLAE-DAD-EM foi realizada no NPPNS da FCFRP-USP. A análise do extratos etanólicos das folhas/flores de M. ferruginata foi analisado por CLAE-DAD-EM com as mesmas condições cromatográficas (coluna e gradiente de eluição) descritas no item 4. 9. As análises foram realizados em cromatógrafo líquido de alta eficiência (Shimadzu ®) acoplado com um espectrômetro de massas (Burker Daltonics ®), equipado com uma fonte de ionização por electrospray e analisador por tempo de vôo. As amostras foram injetadas utilizando injetor (Rheodyne ®), equipado com um loop de 20 µL. Para análise, 100 mg do extrato alcoólico bruto foi ressuspendido em etanol grau HPLC em volume final de 10 mL e submetido a sonicador (Quimis ®). Posteriormente o extrato foi submetido à extração em fase sólida em coluna contendo 500 mg de C18 e finalmente filtrados em filtro seringa PTFE hidrofílico de 0,22 µm com diâmetro de 13 mm (Millex ®).

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4. 11 Fracionamento dos extratos brutos e análise das frações

4. 11. 1 Extratos aquosos Os extratos aquosos liofilizados foram submetidos a fracionamento em coluna aberta por exclusão molecular (Sephadex LH-20™). Primeiramente, 1,5 g dos extratos foram ressuspendidos em 10 mL de metanol PA (Vetec ®), o sobrenadante foi filtrado em seringa de vidro 0,45 µm (Yale BD ®). O filtrado foi aplicado cuidadosamente pelas paredes da coluna com auxilio de uma pipeta Pasteur. A eluição foi do tipo isocrática com metanol PA (Vetec ®), durante todo o fracionamento. A coleta das frações com aproximadamente 15 mL cada, foi realizada em frascos de vidro pesando entre 50 a 100 g. As frações obtidas foram armazenadas a temperatura ambiente em local fresco e protegido da luz até o momento da análise. Todas as frações recolhidas foram monitoradas por análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) com o emprego de coluna C-18, nas mesmas condições cromatográficas descritas no item 4. 9. Após serem ressuspendidas em metanol grau HPLC (J.T. Baker ®) na concentração de

10 mg/mL e filtradas em filtro de seringa PTFE hidrofílico de 0,22 µm com diâmetro de 13 mm(Millex ®).

4. 11. 2 Extratos etanólicos Os extratos etanólicos brutos secos foram fracionados por meio de partição líquido/líquido, em funil de separação. Os extratos de folhas/flores (39,0 g) e caule (12,5 g) de M. ferruginata foram ressuspendidos em solução metanol: água (9:1) e após decantação, o sobrenadante foi submetido à partição com solventes orgânicos de polaridade crescente: n-hexano (Proquímicos ®), diclorometano (Vetec ®) e acetato de etila (Vetec ®). Na Figura 16 está representado o esquema do procedimento da partição líquido/líquido. As frações n-hexânica, diclorometânica e acetato de etila foram coletadas, concentradas em evaporador rotativo e transferidas para frascos de vidro âmbar previamente pesados. Já a fração aquosa remanescente foi congelada e armazenada em freezer -20 °C. Todas as frações n-hexânica, diclorometânica e acetato de etila foram armazenados a temperatura ambiente em dessecador à vácuo até o momento da análise. O valor do peso seco foi obtido em balança analítica (Bioprecisa ®) para cálculo do rendimento das frações.

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Extrato etanólico seco

Extração com metanol : água (9:1) Partição em funil de separação

Extrato ressuspendido

Adição de n-hexano PA 3 vezes de 50 mL

Fração Fração n-hexânica aquosa

Concentração em evaporador rotativo Dobrar o volume com água Milli-Q Adição de diclorometano PA 3 vezes de 50 mL

Fração Fração aquosa diclorometânica

Concentração em evaporador rotativo Adição de acetado de etila PA 3 vezes de 50 mL

Fração aquosa Fração acetato

Congelar e liofilizar Concentração em evaporador rotativo

Figura 16 – Representação esquemática do procedimento de partição líquido/líquido realizada com os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata.

As frações hexânica e diclorometânica obtidas dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata foram avaliadas em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) como descrito no item 4.8, após serem ressuspendidas em acetato de etila PA (Synth ®) a concentração de 10 mg/mL. As frações foram submetidas à extração em fase sólida com cartucho de sílica (1000 mg/6 mL; Applied Separations ®) e injetadas em modo Split na razão 1:20. A fração acetato de etila obtidas dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata foram avaliadas em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) nas mesmas condições cromatográficas descritas no item 4. 9, após serem ressuspendidas em metanol grau HPLC (J.T. Baker ®) na concentração de 10 mg/mL.

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4. 12 Atividades Biológicas dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata Os ensaios de viabilidade e proliferação celular foram realizados no Laboratório de Imunologia do Centro Integrado de Pós-Graduação e Pesquisa em Saúde (CIPq- Saúde) da UFVJM. Os ensaios biológicos de citotoxicidade, avaliação de atividades antibacteriana, antitumoral, leishmanicida e tripanocida foram realizados no Laboratório de Doenças Parasitárias do Departamento de Farmácia (UFVJM) e Laboratório de Biotecnologia do CIPq-Saúde.

4. 12. 1 Preparo dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata Para o preparo dos extratos aquosos e etanólicos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata , 10 mg de cada extrato seco foi diluído em 100 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) (Vetec ®), em frasco estéril. Os extratos diluídos foram submetidos a banho de ultrassom (Unique ®) por 2 horas e, em seguida, foram armazenados a -20 °C até o momento do uso.

Nos ensaios de viabilidade e proliferação celular foram utilizados os extratos aquosos das folhas/flores e do caule. No ensaio antibacteriano foi utilizado o extrato aquoso das folhas/flores e etanólicos das folhas/flores e do caule. Nos ensaios de citotoxicidade sobre células de mamíferos da linhagem L929 e atividade antitumoral foram utilizados os extratos aquosos e etanólicos das folhas/flores e do caule . Para avaliação da atividade tripanocida e leishmanicida foram utilizados os extratos etanólicos das folhas/flores. A concentração de DMSO nas culturas não ultrapassou 0,5%.

4. 12. 2 Avaliação da Citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata

4. 12. 2. 1 Linhagem celular A linhagem celular utilizada foi a CLL I NCTC da American Type Culture Collection (ATCC) 929-clone da linhagem L, tecido conjuntivo de camundongo, designado L929. Esta linhagem foi adquirida do Laboratório de Imunopatologia (LIMP) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). As células L929 foram submetidas à expansão celular em cultura contendo meio

RPMI 1640 suplementado, seguida de incubação em estufa de CO 2, a 37°C, até

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obtenção de 80% de confluência. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS e, foi adicionada 1 mL de tripsina-EDTA (Sigma ®), para promover a dispersão da monocamada de células. Essa foi deixada em repouso por 3 a 5 minutos e, para favorecer o desprendimento celular foi realizado leves batidas na garrafa de cultivo. Após este período, a tripsina foi inativada com 9 mL do meio de cultura suplementado, e as células concentradas por centrifugação ( 2500 rpm, 18 °C, 10 minutos) e ressuspendidas em RPMI 1640 suplementado contendo 40% de SFB inativado (Gibco ®) e 1% de coquetel de antibióticos (penicilina G 100 UI/mL / estreptomicina 100 µg/mL - Sigma ®) e distribuídas em criotubos estéreis (Alfa ®). Em cada criotubo foram adicionados 900 µL da suspensão celular e 100 µL de DMSO (Sigma ®) destilado. Os criotubos foram devidamente identificados e vedados e congelados em freezer -80 °C, até sua utilização nos ensaios.

4. 12. 2. 2 Avaliação da citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata sobre células de mamífero L929 Os testes de viabilidade celular “ in vitro ” são utilizados para verificar a citotoxicidade aguda. Entre as diversas alternativa s encontra-se o método do MTT que foi utilizado no presente estudo. A técnica do MTT é um ensaio colorimétrico quantitativo sensível, confiável e eficaz na avaliação da viabilidade, proliferação e atividade celular (WACHESK, 2011). Ele se fundamenta na atividade de uma enzima mitocondrial específica, a succinato desidrogenase, que reage com o brometo de 3-[4,5- dimetiltiazol-2il]-2,5- difeniltetrazólio (MTT), o reduzindo apenas por mitocôndrias viáveis a formazano, um composto colorido solúvel em solventes orgânicos, como o DMSO (Figura 17). Os ensaios de citotoxicidade permitem controle do ambiente físico- químico e fisiológico o que fornece uniformidade na amostragem e reprodutibilidade dos resultados (FRESHENEY, 2005). Uma vez que os valores de absorbância medidos após a redução do sal de formazano pelas mitocôndrias é diretamente proporcional ao número de células viáveis (MOSMANN et al., 1983; GOMES et al., 2001; DUTTA et al., 2005). Além disso, as linhagens de fibroblastos de mamífero (L929) são as células mais preferíveis nos ensaios de citotoxicidade (ROGUET; SCHAEFE, 1997) por apresentarem facilidade de cultivo e manutenção em culturas in vitro, sensibilidade e correlação com dados biológicos.

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Figura 17 – Reação de oxi-redução do 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5- difeniltetrazólio (MTT) em formazano após a conversão pela enzima succinato desidrogenase. ChemDraw Ultra (2004).

Na realização dos ensaios de citotoxicidade as células da linhagem L929 foram retiradas do freezer -80 °C e descongeladas a temperatura ambiente. Em capela de fluxo laminar, a suspensão de células foi transferida para uma garrafa de cultura estéril de 75 cm 2 (TPP ®) contendo aproximadamente 9 mL do meio RPMI suplementado. As culturas foram colocadas em incubadora de CO 2 por 24 horas. Posteriormente, foi realizada uma lavagem da cultura com PBS para retirar as células mortas e/ou não aderentes, renovado o meio de cultura e realizada nova incubação nas mesma condições. A cultura foi monitorada diariamente durante todo o período experimental até obtenção da quantidade de células para realização dos ensaios, com aproximadamente uma confluência de 80%. As culturas com 80% de confluência foram submetidas à lavagem com PBS, seguida da adição de 1 mL de tripsina-EDTA (Sigma ®) por 3 a 5 minutos. Após dispersão das células, a tripsina foi inativada com 9 mL do meio RPMI suplementado. A suspensão celular foi contada em câmera hemacitométrica de Neubauer após coloração com Azul de Tripan 0,4%, e a concentração foi ajustada para 1 x 10 5 células/mL em RPMI suplementado (Sigma ®). As células foram submetidas a um novo cultivo quando necessário, por no máximo 40 passagens. Para a realização do ensaio 100 µL da suspensão celular a concentração de 1 x 10 5 células/mL em RPMI suplementado (Sigma®) foi plaqueada em microplacas de 96 ® poços (TPP ). A microplaca foi incubada por 24 horas em estufa a 37°C e 5% de CO 2 para permitir a adesão e obtenção de uma monocamada celular nos poços. Após esse período, o meio de cultura foi removido cuidadosamente e as células foram submetidas

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à exposição aos diferentes extratos de M. ferruginata nas concentrações de 500 a 7,8 µg/mL em meio RPMI suplementado (Sigma ®). O esquema da confecção das microplacas esta representada na Figura 18. Os grupos avaliados foram: grupo controle de viabilidade (CON), grupo controle do solvente (DMSO), grupo controle de mortalidade (CM) e grupo teste com diferentes concentrações dos extratos etanólicos das folhas/flores (E1), do caule (E2) e aquosos das folhas/flores (E3) e do caule (E4). As culturas controle do solvente receberam igual volume de DMSO equivalente ao volume do extrato da maior concentração, não ultrapassando 0,125%, enquanto que para o grupo controle de morte foi utilizado o cloreto de cádmio nas concentrações de 4 mM a 62,5 µM.

Após a adição dos extratos, as placas foram incubadas a 37°C e 5% de CO 2 por 72 horas, mantidas ao abrigo da luz, sendo enroladas com papel alumínio para evitar possíveis reações de foto-oxidação. Após o período de incubação, a placa foi centrifugada a 2500 rpm por 15 minutos e, em seguida, o sobrenadante foi removido e a cada poço foi adicionado 100 µL de MTT 0,5 mg/ml em RMPI suplemento (Sigma ®). A placa foi novamente incubada a 37 °C e 5% CO 2 por 4 horas e, após este período, foi novamente centrifugada a 2500 rpm por 15 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi removido e, adicionado a cada poço, 100 µl de DMSO (Vetec ®). Após completa solubilização dos cristais de formazano, a microplaca foi submetida à leitura da absorbância em leitor de ELISA (Molecular Devices ®) a 540 nm. Os extratos e os grupos controles foram testados em triplicata e, em três experimentos independentes. Os resultados obtidos foram usados para a determinação da porcentagem de citotoxicidade dos extratos em que o grupo CON correspondeu a 100% de viabilidade celular.

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Poços -Testes Controles 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

Extrato Extrato Controle do Controle de etanólico das Controle do Controle de etanólico do solvente morte folhas/flores meio cultura viabilidade caule (E2) (DMSO) Placlitaxel (E1)

Figura 18 – Representação esquemática da microplaca de 96 poços na avaliação da citotoxicidade em células de mamíferos L929 e atividade antitumoral (MDA-MB-231) dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. A mesma placa foi realizada tendo como poços testes os demais grupos: E3, E4 e Cloreto de cádmio.

4. 12. 3 Avaliação de Atividade antibacteriana

4. 12. 3. 1 Micro-organismos Para avaliação da atividade antibacteriana foram usadas 14 espécies de bactérias provenientes da coleção de culturas ATCC, que foram gentilmente doadas pelo Dra. Regina Nardi do Instituto de Ciências Biológicas – Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Os micro-organismos utilizados foram: Staphylococcus aureus (ATCC 29313), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Bacillus cereus (ATCC 11778), Shigella sonnei (ATCC), Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella enteriditis (ATCC 13076), Klebsiella oxytoca (ATCC 49131), Streptococcus agalactiae (ATCC 29313), Listeria monocytogenes (ATCC 19115),

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Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Proteus mirabilis (ATCC 25931), Streptococcus agalactiae (ATCC 29313), Micrococcus sp. (ATCC 49732), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Enterococcus faecalis (ATCC 19433). As cepas bacterianas foram mantidas em criotubos contendo caldo BHI acrescido de 30% de glicerol e mantidas a -20 °C. Para os ensaios, as cepas bacterianas foram descongeladas a temperatura ambiente, repicadas em meio BHI sólido em capela de fluxo laminar (Veco ®) e incubadas a 37 °C por 24 horas em estufa bacteriológica (Solab ®).

4. 12. 3. 2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada pela técnica de diluição em microplacas (96 poços) de acordo com a metodologia descrita no Manual do CLSI (2006) para as bactérias aeróbicas, com adaptações. Inicialmente, para obtenção das células bacterianas utilizadas nos experimentos foi realizada a padronização da suspensão bacteriana conforme descrito no manual do CLSI (2006). A partir de uma cultura de 24 horas em meio BHI sólido foram retiradas colônias isoladas, que foram ressuspendidas em solução salina 0,09% estéril até atingir turvação igual à suspensão do tubo correspondente a 0,5 da escala de McFarland. Em seguida, foi verificada a concentração de micro-organismos por leitura espectrofotométrica (Femto ®) a 620 nm, onde a faixa de absorbância deve se encontrar entre 0,08 a 0,1. Isso resulta em uma suspensão contendo aproximadamente de 1 a 2 x 10 8 UFC/mL. Posteriormente, foi realizada uma diluição na proporção de 1:10 em CMH, obtendo uma suspensão de 1,0 x 10 7 UFC/mL, a qual foi utilizada nos ensaios. Os orifícios da microplaca (Global ®) foram distribuídos de acordo com o esquema representado na Figura 19. Os poços teste foram preenchidos com 50 µL da solução dos extratos diluídos seriadamente em CMH nas concentrações de 500, 250 e 125 µg/mL. Em seguida foram acrescentado a cada poço teste 50 µL da suspensão bacteriana padronizada. Como controle positivo foi utilizado o cloranfenicol 30 µg/mL e para controle negativo foi utilizado o DMSO 0,125%. Também foram realizados o controle do meio de cultura (CMH), o controle de crescimento bacteriano (CON) e o controle de esterilidade dos extratos. Ao final da confecção das microplacas, estas foram submetidas à agitação por 20 minutos em agitador orbital (Fanem ®). As microplacas foram incubadas em estufa a 37ºC por 24 horas. Os ensaios foram realizados em triplicata em três experimentos distintos

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Figura 19 – Representação esquemática da microplaca de 96 poços na avaliação da atividade antibacteriana e determinação da concentração inibitória mínima (CIM), utilizando os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule e o extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata.

Na análise da avaliação da atividade antibacteriana foi utilizado o corante 7- hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona-10-óxido – Resazurina (Sigma ®). O mecanismo de ação baseia na reação de oxi-redução entre o corante indicador e flavinas (enzimas do sistema de transporte durante o metabolismo celular) e outros transportadores de hidrogênio constituindo uma estratégia eficiente para avaliar a viabilidade celular microbiana (PALOMINO et al., 2002; MONTEJANO; GERVALDO; BERTOLOTTI, 2005; VIRIATO, 2014). O mecanismo da reação de redução da resazurina (cor púrpura) em resofurina (cor rósea), está indicado na Figura 20. A observação da presença de cor azul representa ausência de crescimento e de cor rosa, presença de crescimento microbiano (PALOMINO et al., 2002). Desta forma a leitura visual das microplacas foi realizada após 24 horas de incubação a 37 °C, em que foi adicionado, em cada poço, 30 µL da solução aquosa de resazurina 0,01%, seguida de homogeneização em agitador orbital (Fanem ®) por 20 minutos e, reincubadas a 37 ºC por 2 horas. Foram considerados com atividade antibacteriana os extratos que cujas bactérias após tratamento não desenvolveram cor rosa em 4 horas de incubação.

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Poços -Testes Controles 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

B Bactéria 1 Bactéria C

E Bactéria 2 Bactéria F

Controles H

Extrato Extrato Extrato Controle do Controle etanólico das aquoso das Controle do Controle de etanólico do solvente positivo folhas/flores folhas/flores meio (CMH) crescimento caule (E2) (DMSO) Cloranfenicol (E1) (E3)

Figura 20 - Reação de oxi-redução da resazurina em resofurina após conversão pelas enzimas do sistema de transporte do metabolismo celular. ChemDraw Ultra (2004).

4. 12. 4 Atividade antitumoral

4. 12. 4. 1 Linhagem celular A avaliação da atividade antitumoral foi realizada sobre as células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 ATCC ® HTB-26 TM , derivada de metástase, in situ, de tecido epitelial obtida pela primeira vez por meio da efusão pleural de uma paciente em 1973 no M. D. Anderson Câncer Center (CAILLEAU et al., 1974; CAILEAU; OLIVE; GRUCIGER, 1978; BRINKLEY et al., 1980). A linhagem foi doada pelo Laboratório de Cultura Celular do Departamento de Produtos Farmacêuticas da UFMG. As células MDA-MB-231 foram submetidas à expansão celular e posterior congelamento em cultura contendo meio DMEM suplementado, conforme descrito no item 4. 12. 2. 1. A linhagem de MDA-MB-231 foi descongelada e submetida a crescimento em cultura contendo meio DMEM suplementados com 20% de SFB inativado (Gibco ®) e 1% coquetel de antibióticos (penicilina G 100 UI/mL / estreptomicina 100 µg/mL - Sigma ®)

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e 1,6% de L-glutamina (Sigma ®). A cultura celular foi monitorada diariamente durante todo o período experimental.

4. 12. 4. 2 Avaliação da atividade antitumoral dos extratos de Miconia ferruginata sobre células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 A avaliação do efeito citotóxico sobre células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 foi realizada segundo a técnica por MTT, conforme descrito anteriormente no item 4. 12. 2. 2, com adaptações. Para a realização do método, 100 µL a suspensão celular de 1 x 10 5 células/mL em DMEM (Sigma ®) suplementado foram plaqueadas em placas de 96 poços (TPP ®). As células foram incubadas durante 24 horas em estufa a 37°C e 5% de CO 2. Após esse período, o meio de cultura foi removido cuidadosamente e as células foram submetidas à exposição às diferentes concentrações dos extratos de M. ferruginata . O esquema da confecção das microplacas esta representada na Figura 18. Os grupos avaliados foram: grupo controle de viabilidade (CON), grupo controle do solvente (DMSO), grupo controle de mortalidade (CM e PXT) e grupo teste com diferentes concentrações dos extratos etanólicos das folhas/flores (E1), do caule (E2) e aquosos das folhas/flores (E3) e do caule (E4). As concentrações avaliadas foram 500 a 7,8 µg/mL em meio DMEM suplementado. O grupo CM foi realizado com cloreto de cádmio nas concentrações de 4 mM a 62,5 µM e o fármaco utilizado foi o antineoplásico paclitaxel (PXT) nas concentrações de 50 a 0,39 µM. As culturas controle do solvente receberam igual volume de DMSO equivalente ao volume do extrato da maior concentração, não ultrapassando 0,125%.

Após a adição dos extratos, as placas foram incubadas a 37 °C, 5% de CO 2 por 48 e 72 horas e mantidas ao abrigo da luz. Após o período de incubação, o meio foi removido, e a cada poço foi adicionado 100 µL de MTT (Sigma ®) 2 mg/ml em PBS estéril. A placa foi novamente incubada em incubadora de CO 2 por 4 horas. Posteriormente, a placa foi centrifugada (2500 rpm, 18 °C, 15 minutos), o sobrenadante removido e, adicionou-se 100 µL de DMSO (Vetec ®). Após completa solubilização do formazano, a placa foi submetida à agitação em agitador orbital (Fanen ®) por 15 minutos, e determinou-se a absorbância em leitor de ELISA (Molecular Devices ®) a 540 nm. Os extratos e os controles foram testados em triplicata em três experimentos independentes. Os resultados obtidos foram usados para a determinação da atividade antitumoral, a qual o grupo CON correspondeu a 0% de atividade.

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4. 12. 5 Avaliação da atividade tripanocida

4. 12. 5. 1 Cepas Nos ensaios da avaliação de atividade tripanocida foram utilizadas duas cepas do Trypanosoma cruzi com diferentes perfis de susceptibilidade ao Benznidazol e pertencentes a dois grupos genéticos distintos. A cepa Y (DTU T. cruzi II) foi isolada por xenodiagnóstico em 1950 por Pereira de Freitas, referente a caso agudo humano e representa um prótotipo de susceptibilidade parcial ao Benznidazol. A cepa Colombina (DTU T. cruzi I) representa um protótipo de resistência ao Benznidazol. Essas cepas foram cedidas pelo Laboratório de Doença de Chagas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da UFOP. As formas epimastigotas das cepas Y e Colombiana foram mantidas criopreservadas em nitrogênio líquido no banco de cepas do Laboratório de Doenças Parasitárias, UFVJM. Para realização dos ensaios, as cepas foram descongeladas a temperatura ambiente e cultivadas em garrafas de cultivo de 25 cm 2 estéreis (TPP ®) a 26 °C, em estufa de B. O. D (Solab ®), contendo meio LIT suplementado até fase estacionária de crescimento. O comportamento das cepas foi avaliado por meio do estabelecimento da curva de crescimento. No procedimento foi realizado a contagem das formas epimastigotas diariamente utilizando câmara hemacitométrica de Neubauer desde o inoculo até o término da fase estacionária. As culturas que não apresentaram qualquer alteração morfológica, contaminação e/ou perda de motilidade foram utilizadas nos ensaios. A padronização do inoculo foi realizado a partir de culturas na fase estacionária de crescimento, em que as formas epimastigotas foram contadas em câmera hemacitométrica de Neubauer, e ajustadas para 1 x 10 7 parasitos/mL em meio LIT suplementado.

4. 12. 5. 2 Avaliação da atividade tripanocida do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata sobre diferentes cepas de T. cruzi A avaliação da atividade tripanocida sobre as formas epimastigotas das cepas Y e Colombiana de T. cruzi foi realizada conforme descrito por TEMPONE et al. (2007). O método empregado para avaliação da viabilidade celular foi o MTT segundo MOSMANN et al. (1983). Foi realizado a distribuição de 50 µL da suspensão de epimastigotas na concentração de 1 x 10 7 parasitos em microplaca de cultura 96 poços

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(Global ®) e, em seguida, adicionado 50 µL das diferentes concentrações do extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata. Os grupos avaliados foram: grupo controle de viabilidade das formas epimastigotas (CON), grupo controle do solvente (DMSO), grupo controle com fármaco padrão (BEN), grupo de esterilidade do meio (LIT) e o grupo teste com as concentrações do extrato etanólico das folhas/flores (E1). As concentrações avaliadas foram 500, 250 e 125 µg/mL em meio LIT suplementado. Como fármaco padrão foi utilizado o benznidazol (Lafepe ®) a concentração de 75 µg/mL. As culturas controle do solvente receberam igual volume de DMSO equivalente ao volume do extrato da maior concentração, não ultrapassando 0,125%. Após a adição dos extratos, as placas foram incubadas por 72 horas em estufa incubadora B. O. D (Solab ®), a 26 °C e mantidas ao abrigo da luz. Após o período de incubação, a placa foi centrifugada a 4000 rpm por 30 minutos, e o sobrenadante foi removido. Em seguida, foi adicionado 100 µL da solução de MTT (Sigma ®) 3 mg/mL em meio LIT suplementado, seguida de incubação em B. O. D. a 26 °C por 4 horas. Posteriormente, foi adicionado 100 µL da solução de SDS 10%, e após completa solubilização do formazano, foi realizada a medida da absorbância em leitor de ELISA (Molecular Devices ®) a 540 nm. O extrato e os controles foram testados em triplicata em três experimentos independentes. Os resultados obtidos foram usados para a determinação da viabilidade celular das formas epimastigotas, a qual o grupo CON correspondeu a 100% de viabilidade celular.

4. 12. 6 Avaliação da atividade leishmanicida

4. 12. 6. 1 Cepas Nos ensaios para avaliação da atividade leishmanicida foram empregadas duas cepas de Leishmania sp., que causam as formas visceral e tegumentar da leishmaniose, respectivamente: cepa BH46 - Leishmania (leishmania) infantum (MHOM/BR/1070/BH46) e a cepa M2269 -Leishmania (leishmania) amazonensis (MHOM/BR/73/M2269). Essas cepas constituem amostras de referência da Organização Mundial de Saúde (OMS) que são mantidas no criobanco de cepas do Laboratório de Doenças Parasitárias. A cepa M2269 foi gentilmente cedida pelo laboratório de Imunopatologia (LIMP) do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da UFOP e a cepa BH46 pelo Laboratório de Parasitologia Celular e Molecular (LPCM)

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da Fundação René Rachou da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCUZ-MG). A obtenção das formas promastigotas das cepas BH46 e M2269 foi realizado conforme descrito no item 4. 12. 5. 1.

4. 12. 6. 2 Avaliação da atividade leishmanicida do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata sobre diferentes cepas de Leishmania sp. A determinação da atividade leishmanicida contra as formas promastigotas das cepas BH46 de L. infantum e M2269 de L. amazonensis foi realizada conforme descrito por OLIVEIRA et al. (2012), empregando a técnica de MTT anteriormente descrita no item 4. 11. 5. 2. Foi realizado a distribuição de 50 µL da suspensão de promastigotas na concentração de 1 x 10 7 parasitos/mL em microplaca de cultura 96 poços (Global ®) e, em seguida, adicionado 50 µL das diferentes concentrações do extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata. Os grupos avaliados foram: grupo controle de viabilidade das formas promastigotas (CON), grupo controle do solvente (DMSO), grupo controle com fármaco padrão (ANFB), grupo de esterilidade do meio (LIT) e o grupo teste com o extrato etanólico das folhas/flores (E1), nas concentrações de 500, 250 e 125 µg/mL. Para o grupo ANFB foi utilizado o fármaco padrão anfotericina B (Sigma ®) a 1 µg/mL. As culturas controle do solvente receberam igual volume de DMSO equivalente ao volume do extrato da maior concentração, não ultrapassando 0,125%. A seguir, foi aplicado o mesmo protocolo descrito no item 4. 12. 5. 2.

4. 12. 7 Avaliação da viabilidade e proliferação celular

4. 12. 7. 1 Amostra biológica O estudo foi realizado com aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) da UFVJM por meio de um projeto geral envolvendo plantas do Cerrado, denominado “Elaboração de extratoteca e banco de dados químicos e biológicos a partir de plantas nativas da região de Diamantina – MG (Vale do Jequitinhonha)”, sob o número de registro 28665514. 2.0000.5108 (Anexo A) A amostra biológica utilizada constituiu de 10 mL de sangue venoso coletado de forma asséptica por punção venosa em tubos a vácuo contendo heparina como anticoagulante (Vacutainer ®). Todos os indivíduos participantes deste estudo apresentavam entre 20 a 39 anos de idade e declararam não apresentar doença

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infecciosa, auto-imune, crônico degenerativa ou de hipersensibilidade bem como não estavam ou não ingeriram, cinco dias antes da coleta, medicamentos com ação anti- inflamatória e imunomoduladora. As mulheres também declararam não estar grávidas, além de preencherem os requisitos anteriormente citados. Os voluntários foram esclarecidos sobre os objetivos da pesquisa, e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo B). Os procedimentos de coleta foram conduzidos por profissional treinado e capacitado para tal de acordo com as Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica e Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso (2010). Após a utilização da amostra biológica, o material remanescente foi descartado em sacos plásticos brancos com indicação de material infectante e símbolo de risco biológico. Para todas as amostras biológicas foram realizadas avaliações dos parâmetros hematológicos. Para obtenção dos valores de leucócitos totais foi empregado contador automático de células (CELM CC-550 ®). A contagem relativa das diferentes populações leucocitárias (contagem diferencial) foi realizada por observação em microscópio óptico (Olympus ®) do esfregaço sanguíneo, após coloração com Giemsa e May-Grunwald, conforme descrito em VALLADA (1999).

4. 12. 7. 2 Obtenção das Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC) Para a análise da viabilidade e da inibição da proliferação celular das culturas de leucócitos tratadas com os extratos, obtiveram-se as PBMC a partir do sangue periférico venoso de 10 voluntários. Assim, 10 mL de sangue venoso foram diluídos na proporção 1:1 em PBS estéril. As PBMC foram obtidas após centrifugação a 400 g, 21°C por 30 minutos com Ficoll-Histopaque 1077 (Sigma ®), conforme descrito por BICALHO et al. (1981). Após centrifugação, o anel de PBMC foi recolhido com uma pipeta automática e transferido para um tubo cônico de 50 mL. As células recolhidas foram lavadas duas vezes em PBS estéril utilizando centrifugação a 250 g, 4ºC, por 15 minutos. Em seguida, as células foram ressuspensas em 1 mL de RPMI 1640 (Sigma ®) e contadas em câmara hemacitométrica de Neubauer após coloração com Azul de Tripan 0,4%. As células foram ajustadas a concentração de1 x 10 7 células/mL em RPMI suplementado. O RPMI (Sigma ®) utilizado na cultura foi suplementado com L-glutamina 2 mM (Sigma ®), 10% de SFB inativado (Gibco ®) e 1% de coquetel antibiótico/antimitótico (penicilina G 100 UI/mL, estreptomicina 100 µg/mL e anfotericina B 250 ng/mL – Sigma ®).

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4. 12. 7. 3 Avaliação dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata sobre a viabilidade das PBMC humanas, in vitro A avaliação dos extratos aquosos das folhas/flores e caule de M. ferruginata, sob a viabilidade de leucócitos humanos foi realizado pela técnica de exclusão com Azul de Tripan. Estudos mostraram que o complexo Azul de Tripan-proteína emite fluorescência passível de detecção por citometria de fluxo (KUMAR et al., 2008) se mostrando como uma técnica mais confiável e sensível em relação a convencional contagem em microscopia óptica. AVELAR-FREITAS et al. (2014) padronizaram a técnica de exclusão por Azul de Tripan através da citometria de fluxo por esta se mostrar ser mais rápida, fácil, de baixo custo, confiável e de alta sensibilidade. Assim, esta técnica tem sido muito aplicada na avaliação da toxicidade de produtos naturais, na qual as células não viáveis incorporam o corante ao citoplasma devido à perda de seletividade da membrana, enquanto as células vivas permanecem inalteradas (MASCOTTI et al., 2000; KIM et al., 2011; CASAROTO et al., 2012). Para realização deste teste, um volume de 50 µL de suspensão celular (cerca de 5 5 x 10 células) foi incubado em meio contendo RPMI suplementado. Os grupos avaliados foram: grupo controle de viabilidade (CON), grupo controle do solvente (DMSO), grupo controle de mortalidade (CM) e grupo teste com diferentes concentrações dos extratos aquosos das folhas/flores (E1) e do caule (E2). As concentrações finais avaliadas foram de 250, 125, 62,5 e 31,2 µg/mL. As culturas controle do solvente receberam igual volume de DMSO equivalente ao volume do extrato da maior concentração, não ultrapassando 0,5%. Como controle de morte celular foi utilizado uma solução de cloreto de cádmio 2 mM. As culturas foram realizadas em tubos côncavos em U (Falcon 15 - BD ®) e cada n da amostra (n=5) foi analisada após 24 horas e cinco dias de cultura a 37°C com 5%

CO 2. Após o período de incubação, as células foram removidas por lavagem com 2 mL de PBS, transferidas para tubos de poliestireno (Falcon 2059 – BD ®) e centrifugadas a 250 g, 21º C por 7 minutos. Em seguida, foi avaliada a viabilidade das suspensões celulares através da citometria de fluxo (FACScan ®), após incubação de 10 µL das suspensões de células com 190 µL de Azul de Tripan 0,002%. A aquisição foi de pelo menos 10.000 eventos, dentro de uma região ( gate ) correspondente às células de interesse.

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Para avaliação da viabilidade celular por citometria, utilizou o programa específico de análise de dados Cell-Quest (BD Biosciences ®). A estratégia de análise consistiu, primeiramente, na seleção da população linfocitária pela análise de gráficos de distribuição pontual em função do tamanho ( forward side scatter – FSC) e granulosidade ( side light scatter – SSC) celulares (Figura 21A e C). Após a seleção das células de interesse, foi determinado o percentual de células marcadas com Azul de Tripan, por meio de histogramas de intensidade de fluorescência-3 (FL-3) em função do número de células (M1, Figura 21B). Neste caso foi estabelecido um limiar de negatividade em função da curva de fluorescência obtida para o grupo controle de viabilidade (CON). O mesmo marcador foi empregado para as demais situações experimentais a fim de se obter os valores percentuais de células fluorescentes positivas, ou seja, o percentual de células mortas (Figura 21D).

A C SSC SSC

Linfócitos Linfócitos

FSC B D

2,2% 2,62% Número de NúmeroEventos

FL3 Figura 21 - Estratégia de análise da viabilidade celular por citometria de fluxo. A e C - Gráfico de distribuição pontual para a seleção da população linfocitária utilizando os parâmetros de tamanho celular (FSC) e granulosidade celular (SSC), das culturas CON e E3, respectivamente. B – Histograma de FL-3 representando o percentual de células fluorescentes positivas nas culturas CON. D – Histograma de FL-3 representando o percentual de células positivas após incubação com extrato E3 de Miconia ferruginata . E3: Extrato aquoso das folhas/flores.

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4. 12. 3. 4 Análise do extrato aquoso das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata sobre a proliferação de linfócitos humanos, in vitro A resposta proliferativa dos linfócitos na presença do extrato aquoso das folhas/flores e do caule de M. ferruginata foi avaliada para verificar a estimulação ou supressão dos linfócitos, um evento inicial da complexa gama de estímulos inflamatórios imune-mediados (ALMEIDA, 2012). Para essa análise, foi utilizada a técnica de incorporação e decaimento da fluorescência de CFSE (5-[and-6]-carboxy fluoresceindi acetate succinimidyl ester), conforme descrito por LYONS (2000). Para isso, foram isoladas PBMC de cinco voluntários na concentração de 1 x 10 7 células/mL ressuspendidas em PBS/BSA 0,1%. Para cada 500 µL da suspensão celular foi acrescentado 1 mL de CFSE 10 µM (Sigma ®) diluído em PBS/BSA 0,1%, esta solução foi homogeneizado e incubada a 37ºC, 5% de CO 2 por 10 minutos. Após a incubação, a reação foi interrompida com a adição de 13 mL de RPMI suplementado gelado, seguido de incubação em gelo por 5 minutos. Em seguida, foram realizadas duas centrifugações com RPMI suplementado a 200 g, 4º C por 10 minutos, para lavagem das células e retirada do excesso de CFSE. As células foram ressuspensas em 500 µL de RPMI suplementado e mantidas em banho de gelo até o momento do uso. Na análise do efeito inibitório do extrato sobre a proliferação de linfócitos foram confeccionadas culturas estimuladas com o mitógeno fitohemaglutinina (PHA) na presença dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata em placas cultura de 24 poços (TPP ®). Para isso 5 x 10 5 células foram incubadas em RPMI suplementado e foram estimuladas ou não com 10 µL de PHA 5 µg/mL (Sigma ®) na ausência ou presença do extrato nas concentrações finais de 45, 30, 20 e 15 µg/mL. Para o controle de inibição, células estimuladas com PHA foram também tratadas com o anti-inflamatório Dexametasona (Fosfato Dissódico de Dexametasona- Decadron ® injetável, 4 mg/mL) na concentração de 8 µg/mL que corresponde a 15 µM. Todas as culturas tiveram o volume final ajustado para 2 mL com RPMI suplementado e incubadas em estufa a 37 °C, 5% de CO 2 por 5 dias. Após o período de incubação, as células foram retiradas da placa, transferidas para tubos de poliestireno (Falcon 2059 – BD ®) e lavadas duas vezes com PBS gelado, utilizando centrifugação a 1800 rpm, 18 ºC por 7 min. A proliferação celular foi determinada pela medida do decaimento da fluorescência do CFSE, através da citometria de fluxo (FACScan ®) com aquisição de 50.000 eventos. Após aquisição dos eventos, dentro de uma região ( gate )

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correspondente à população de interesse foi feita a análise da proliferação celular utilizando o programa Cell-Quest (BD Biosciences ®). Em gráficos de distribuição pontual, através dos parâmetros FSC x SSC, a população de linfócitos foi definida pela região do gate , para culturas não estimuladas (CON) (Figura 22A) e estimuladas com PHA. Em seguida, os eventos no gate foram analisados para intensidade de fluorescência do CFSE, usando histogramas de fluorescência (FL-1) em função do número de eventos. A região M1 foi definida como células marcadas com CFSE derivadas de culturas não estimuladas (CON), que representa o pico de células quiescentes (Figura 22B). Os picos de M2 a M8 foram definidos de acordo com picos de diferentes intensidades de CFSE em culturas estimuladas com PHA (Figura 22C). Por meio do percentual de células presentes nas regiões M1 a M8 foi calculado o índice de proliferação das culturas celulares através da seguinte equação: 100 − = Em que, X x = + + + + + 2 4 8 16 32

Onde X0 representa a porcentagem de células que não se dividiram representada em M1, e X1 a X5 representam os picos de divisão gradual representadas em M2 a M8 (ÂNGULO; FULCHER, 1998).

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A C SSC SSC

FSC FSC B M D Número de NúmeroEventos

CFSE

Figura 22 – Estratégia de análise de proliferação celular pela diluição do CFSE. A e C- Gráfico de distribuição pontual para a seleção das populações de linfócitos utilizando os parâmetros de tamanho celular (FSC) e granulosidade celular (SSC) das culturas CON e PHA, respectivamente. B - Histogramas de FL-1, utilizados para definir as regiões M1 do grupo CON. D – Histograma de FL-1 utilizado para definir as regiões M1 a M8 do grupo PHA, com as quais foi obtido o índice de proliferação (IP) para a população de linfócitos.

4. 13 Análises Estatísticas As análises estatísticas foram realizadas através do software GraphPad Prism 5. Para análise da normalidade dos dados, foi utilizado o teste Shapiro-Wilk e as diferenças entre as variáveis com distribuição normal foram testadas utilizando ANOVA com pós-teste de Tukey. Para as variáveis com distribuição assimétrica, foi utilizado o teste Kruskall-Wallis com pós-teste de Dunns ou ANOVA seguido do pós- teste de Bonferroni. Diferenças significativas foram consideradas quando p<0,05, adotando intervalo de confiança de 95%.

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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Perfil químico da Miconia ferruginata

O perfil químico foi determinado por meio de análises fitoquímicas preliminares clássicas e por técnicas hifenadas dos extratos e frações das folhas/flores e caule de M. ferruginata.

5. 1.1 Preparo e rendimento dos extratos e frações O rendimento dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata estão descrito na Tabela 3 e das frações obtidas por partição líquido- líquido dos extratos etanólicos na Tabela 4. Os extratos etanólicos e aquoso das folhas/flores tiveram maior rendimento (9,02% e 5,67%) do que os do caule (3,67% e 3,38%), respectivamente. Já o rendimento das frações obtidas do extrato etanólico tanto das folhas/flores quanto do caule não ultrapassou 2%, com exceção da fração hexânica das folhas/flores que rendeu 5,10%. Para o fracionamento do extrato aquoso das folhas/flores foram obtidas 43 frações, entretanto não foi possível calcular os respectivos rendimentos devido a baixa massa obtida nas frações.

Tabela 3 - Rendimento dos extratos etanólicos e aquosos brutos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata Material vegetal Massa do extrato Rendimento Extrato usada (g) (g) (%) E1 500 45,1233 9,02

E2 500 18,3437 3,67

E3 100 5,666 5,67

E4 100 3,3847 3,38 E1: Extrato etanólico das folhas/flores; E2: Extrato etanólico do caule; E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule.

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Tabela 4- Rendimento das frações obtidas do extrato etanólico bruto das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata por meio de partição líquido-líquido com solventes de polaridades crescentes Massa do Massa da Rendimento Fração extrato (g) fração (g) (%) Fração hexânica das 1,9939 5,10 folhas/flores Fração diclorometânica das 0,2296 0,59 folhas/flores 39,0269 Fração acetato de etila das 0,6104 1,56 folhas/flores Fração hexânica do caule 0,2394 1,91 Fração diclorometânica do 12,5210 0,0896 0,72 caule Fração acetato de etila do caule 0,1005 0,80

5. 1. 2 Fitoquímica preliminar

5. 1. 2. 1 Reações cromogênicas e de precipitação A análise da fitoquímica preliminar para determinação da presença das principais classes metabólicas (alcaloides, antraquinonas, esteroides/triterpenoides, flavonoides, saponinas e taninos) das folhas/flores e do caule de M. ferruginata foram realizadas por meio de reações cromogênicas e de precipitação e cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) (WAGNER; BLADT, 1995; SIMÕES et. al., 2007; COSTA, 2012). Nas reações cromogênicas e de precipitação, a formação de precipitados ou aparecimento de cor podem ser causadas por diferentes classes de metabólitos, tais como proteínas, betalaínas, taninos, cumarinas e, outros. Assim, os resultados negativos indicam ausência ou baixa concentração do metabólito pesquisado, enquanto os resultados positivos devem ser considerados como provável presença desses metabólitos (COSTA, 2001; SIMÕES et al., 2007). Na pesquisa de alcaloides foram realizados os testes de precipitação com reagentes específicos para extrações ácida e básica. Porém, para a espécie M. ferruginata não se observou a formação de precipitado em nenhum dos reagentes

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utilizados. Assim, considera-se que esta classe de metabólito provavelmente está ausente ou em baixas concentrações na espécie (Figura 23). Esses achados estão de acordo com os encontrados para outras espécies da família Melastomataceae, como para a espécie Clidemia strigillosa e Miconia cabucu (CÓRDOBA; BÁEZ; DOMÍNGUEZ, 1995; SILVA, 2013).

A B C

MBHD MBHDMBHD Figura 23 – Pesquisa de alcaloides nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Peumus boldus Molina); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule; M: Reagente de Mayer; B: Reagente de Bouchardat; H: Reagente de Hager; e D: Reagente de Dragendorff.

Na identificação de antraquinonas foram realizadas as reações de Bornträger direta e indireta, não ocorrendo o desenvolvimento de nenhuma coloração para a espécie M. ferruginata em ambas as reações, conforme mostrado na Figura 24. A presença de antraquinonas na amostra é considerada positiva apenas se a reação confirmatória de Bornträger com hidrólise ácida apresentar formação de cor avermelhada na fase aquosa. Assim, o resultado para antraquinonas tanto nas folhas/flores quanto no caule foi considerado negativo. Para outras espécies da família Melastomataceae também não foi descrito a presença desta classe de metabólito (MARTÍNEZ, 2012), como para a espécie Miconia cabucu (SILVA, 2013).

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A BC

BD BI BD BI BD BI Figura 24 – Pesquisa de antraquinonas nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Senna alexandrina Mill.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. BD: Bornträger direta; BI: Bornträger indireta .

Na Figura 25, estão representados os resultados positivos para a presença de triterpenos e esteroides tanto para as folhas/flores quanto para o caule de M. ferruginata. As reações de Salkowisk e de Libermann-Burchard apresentaram a formação de um anel castanho-avermelhada e verde, respectivamente, indicativo da presença de anel triterpênico. Na reação com a vanilina sulfúrica foi observado a cor violeta após aquecimento direto em chama.

A B C

LB S LB S LB S Figura 25 – Pesquisa de esteroides/triterpenos nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Ginkgo biloba L.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. LB: Reação de Libermann-Burchard; S: reação de Salkowisk.

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Em inúmeros estudos com espécies do gênero Miconia tem sido observada a presença da classe dos triterpenos, sendo estes apontados como os compostos majoritários (LIN; GUO; YANG, 2002; CUNHA et al., 2003a; DINIZ et al., 2006; VASCONCELOS et al., 2006; CUNHA et al., 2008; CUNHA et al., 2010). Os triterpenoides mais descritos na literatura são os ácidos triterpênicos pentacíclicos, sendo os mais comuns o ácido ursólico e oleanólico (VASCONCELOS et al., 2006; SERPELONI et al., 2008b; PIERONI et al., 2011; RODRIGUES et al., 2008; CUNHA et al., 2008; CUNHA et al., 2006; PEIXOTO et al., 2011). Na pesquisa de flavonoides tanto as folhas/flores quanto o caule de M. ferruginata apresentaram positividade para todas as reações desse metabólito (Figura 26). Nas reações de Taubouk e hidróxidos alcalinos foi observado a coloração amarelada intensa, nas reações de Shinoda e Pew foi observada cor vermelha, indicativa da presença de flavonóis, e, nas reações com cloreto férrico foi desenvolvida cor verde- escuro indicativa de flavonóis e flavanonas. Já na reação com cloreto de alumínio foi observado sob luz UV o aparecimento de zonas de cor amarelada.

A B C

S P CF CN S CF P CN S CF P CN Figura 26 – Pesquisa de flavonoides nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Baccharis trimera (Less.) DC.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. S: Reação de Shinoda; CF: Reação com cloreto férrico; P: Reação de Pew; e CN: controle negativo.

Em outras espécies do gênero Miconia também foram identificados e isolados diversos flavonoides (ZHANG et al., 2003; RODRIGUES et al., 2007; MANCINI et al., 2008; RODRIGUES et al., 2011). Na M. alypifolia foram identificados quatro flavonoides glicosilados: apigenina-7-glucosídio, campferol -3-O-diglucosídio, campferol-3-O-galactosídio e quercetina-3-O-galactosídio (MANCINI et al., 2008). RODRIGUES e colaboradores (2007) identificaram um dímero de flavona da M. cabucu . No estudo de ZHANG et al., (2003) foi identificado na espécie M. trailii dois novos flavonoides glicosilados: os miconiosidios A e B.

127

Para a pesquisa de saponinas foi realizado a avaliação da propriedade afrogênica e a determinação do índice de espuma (Figura 27). Tanto as folhas/flores quanto o caule de M. ferruginata apresentaram positividade para a propriedade afrogênica. Na determinação do índice de espuma, apenas as folhas/flores apresentaram espuma persistente de no mínimo 1 cm no tubo com diluição de 20% v/v. No cálculo do índice de espuma foi obtido o índice de 500. Já no caule não foi observado espuma persistente de no mínimo 1 cm, assim considera-se que esta classe se encontra em baixas concentrações nesta parte da planta. Estes achados estão de acordo com os encontrados por HASS; VAN POSER (1990) e LIMA et al. (2013).

A B C

Figura 27 – Pesquisa de saponinas nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A – Controle positivo (folhas de Baccharis trimera (Less.) DC.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule.

Na identificação de taninos, a espécie M. ferruginata apresentou resultados positivos para todas as reações. Nos testes com gelatina e acetato de chumbo foi observada a formação evidente de precipitado e, no teste com cloreto férrico foi observada formação de cor azul, indicativa da presença de taninos hidrolisáveis, como indicado na Figura 28. Semelhantemente a M. ferruginata, outras espécies da família Melastomataceae tem apresentado oligômeros de taninos hidrolisáveis (LEITE, 2009). Foi sugerido à presença de taninos nas folhas das espécies: M. albicans, M. cabucu, M. rubiginosa e M. stenostachya (RODRIGUES, 2007; SERPELONI et al., 2008b).

A B C

G AC CF CN G AC CF CN G AC CF CN Figura 28 – Pesquisa de taninos nas folhas/flores e caule de Miconia ferruginata. A – Controle positivo (Folhas de Hamamelis virginiana L.); B – Extrato das folhas/flores; C – Extrato do caule. G: Reação com gelatina; AC: Reação com acetato de chumbo; CF: Reação com cloreto férrico; CN: controle negativo.

128

A síntese dos resultados obtidos para as reações cromogênicas e de precipitação estão descritos no Quadro 8, que sugerem a presença na espécie M. ferruginata de taninos, flavonoides e terpenoides, tanto nas folhas/flores quanto no caule. A classe das saponinas estava presente nas folhas/flores e possivelmente em baixas concentrações no caule. Como já relatado, algumas espécies do gênero Miconia apresentaram resultados semelhantes ao do presente estudo (RODRIGUES, 2007; RODRIGUES et al., 2007; ARAÚJO, 2011; BERALDO, 2011).

Quadro 8 – Resultados da fitoquímica preliminar por meio das reações cromogênicas e de precipitação das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. Classes Partes da planta metabólicas Subclasses Folha Caule Alcaloides --- Negativo Negativo Antraquinonas --- Negativo Negativo Flavonóis Positivo Positivo

Flavanonas Positivo Positivo Flavonoides Flavonas Positivo Positivo chalconas Negativo Negativo isoflavonas Negativo Negativo Hidrolisáveis Positivo Positivo Taninos Condensados Negativo Negativo Triterpenoides --- Positivo Positivo Saponinas --- Positivo Negativo

5. 1. 2. 2 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) Para confirmar o perfil fitoquímico preliminar obtido nas reações cromogênicas e de precipitação para M. ferruginata foram realizadas CCDC específicas para cada classe de metabólito secundário. Na análise de terpenoides à luz visível, após aplicação do reagente revelador, vanilina sulfúrica a 1%, seguida de aquecimento a 100°C por 10 minutos, evidenciou-se a presença de zonas azuis típicas desta classe de metabólito no extrato aquoso das folhas/flores e do caule de M. ferruginata. Os Rfs obtido para os componentes de ambos os extratos foram próximos ao do padrão α-bisabolol (Rf =

129

0,61), no qual para as folhas/flores o Rf foi de 0,65 e para o caule foi de 0,63. Tanto a proximidade dos valores de Rfs e a visualização de manchas azuis sugerem a presença de terpenoides na planta. A presença de flavonoides foi avaliada após revelação com vanilina sulfúrica a 1%, seguida de aquecimento a 100°C por 10 minutos. Foi possível observar sob luz visível zonas amareladas características de flavonoides nos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule (Figura 29). Os Rfs calculados foram de 0,94 tanto para as folhas/flores quanto para o caule. Esses achados confirmam a presença de flavonoides na planta, uma vez que o Rf do padrão quercetina foi de 0,95. Na análise sob a luz UV a 365 nm, os flavonoides aparecem como zonas de fluorescência amarela, verde ou azul, relativo à presença de diferentes tipos estruturais (WAGNER; BLADT, 1995). Para a amostra das folhas/flores e do caule sob luz UV evidenciou-se a presença de zonas amarelas. Ambos os componentes dos extratos apresentaram cor e formato da mancha e Rfs próximos ao padrão, o que indica que os flavonoides presentes na amostra possivelmente apresentam estrutura semelhante à quercetina.

P E1 E2 E3 E4 Figura 29 – Cromatograma dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata para pesquisa de flavonoides após revelação com vanilina sulfúrica a 1%, seguida de aquecimento a 100°C por 10 minutos. P: padrão (quercetina); E1: extrato etanólico das folhas/flores; E2: extrato etanólico do caule; E3: extrato aquoso das folhas/flores; E4: extrato aquoso do caule.

130

Na pesquisa de saponinas foi observada uma mancha azul violeta no extrato aquoso das folhas/flores, após revelação com etanol e ácido sulfúrico seguido de aquecimento. A solução padrão de saponinas apresentou Rf de 0,67 e cor azul violeta, confirmando a presença desta classe nas folhas/flores de M. ferruginata em que o Rf foi de 0,68. Assim, foi sugerida a presença de saponinas nas folhas/flores da planta. Já no caule este metabólito pode ou estar ausente ou em baixas concentrações e, por isso, não foi observado aparecimento de nenhuma mancha referente a saponinas. Na análise de taninos, a cromatoplaca foi revelada com cloreto férrico 1% em metanol, em que os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule apresentaram manchas azuis características de taninos. O Rf calculado foi de 0,87 para as folhas/flores e 0,88 para o caule. Esses achados confirmam a presença desta classe de metabólitos na planta, uma vez que o Rf do padrão (0,90) e a coloração da mancha foram muito semelhantes ao da amostra. Para as análises de alcaloides não foi observado nenhuma mancha após revelação com reagente de Dragendorff. Apenas o padrão apresentou zona alaranjada, esses achados confirmam resultado negativo para presença de alcaloides, tanto nas folhas/flores quanto no caule. Assim, como na pesquisa de antraquinonas não foram observadas manchas vermelhas indicativas deste metabólito nos extratos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata, sugerindo ausência desta classe de metabólitos na planta. Na Tabela 5 se encontra o resumo dos resultados encontrados para a CCDC realizados nas folhas/flores e caule de M. ferruginata. A partir da correlação dos resultados obtidos da CCDC com os achados nas reações cromogênicas e de precipitação é sugerida a presença de flavonoides, terpenoides e taninos nas folhas/flores e caule de M. ferruginata e, a presença de saponinas apenas nas folhas/flores. Porém, para maior confiabilidade dos resultados e indicação de prováveis estruturas de cada metabólito foram realizadas análises por meio de fracionamento e técnicas hifenadas de detecção.

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Tabela 5 – Triagem por meio de cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata Extratos

Metabólitos Padrão secundários (Rf) E1 (Rf) E2 (Rf) E3 (Rf) E4 (Rf)

Butilbrometo de Alcaloides Ausente Ausente Ausente Ausente escopolamina (0,65) Extrato das Folhas de C. Antraquinonas Ausente Ausente Ausente Ausente Senna (0,76) Presente Presente Presente Flavonoides Presente (0,94) Quercetina (0,95) (0,94) (0,94) (0,94) Extrato das folhas de Presente Taninos Presente (0,88) ND ND Hamamelis virginiana (0,87) (0,90) Presente Presente Terpenoides ND ND α-bisabolol (0,61) (0,67) (0,63) Presente Saponinas ND ND Ausente Saponina (0,67) (0,68) ND: não determinado; Rf: fator de retenção; E1: Extrato etanólico das folhas/flores; E2: Extrato etanólico do caule; E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule.

5. 2 Análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida por headspace O cromatograma obtido na análise por CG-MS está representado na Figura 30. Para análise dos picos e identificação das substâncias foram utilizadas três espectrotecas: Wiley7, Nist8 e Nist 8c. Para cada pico foi determinado o índice de retenção relativa

(IRR) em relação à injeção simultânea de hidrocarbonetos n-alcanos (C 9-C22 ), conforme descrito por ADAMS (2007) e em conformidade com a base de dados Pherobase (2014). Apenas as substâncias com índice de similaridade igual ou superior a 90% foram selecionadas para identificação. Dentre os 25 picos obtidos foram identificados 14 compostos totalizando 51,4% dos compostos presentes (Tabela 5). As respectivas estruturas das substâncias propostas estão apresentadas na Figura 31 e os seus respectivos espectros de massas estão demonstrados no apêndice A.

132

β-cariofileno TR: 24,99

8-heptadeceno TR: 35,17 Intensidade α-humuleno TR: 26,36 1-octen-3-ol TR:7,13

Minutos Figura 30 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME).

Os compostos identificados com picos de maior intensidade foram os sesquiternos β-cariofileno ( 8) (56,27%) e α-humuleno ( 9) (7,39%), o hidrocarboneto 8- heptadeceno ( 14 ) (16,81%) e o álcool 1-octen-3-ol ( 2) (9,54%). Já os compostos com picos de menor intensidade foram o hidrocarboneto hexadecano ( 12) (0,13%) e o sesquiterpeno β-cubebeno ( 6) (0,16%). Dentre os compostos identificados encontram-se seis sesquiterpenos (42,85%), quatro hidrocarbonetos (28,57%), um monoterpeno bicíclico (7,14%), um fenilpropanoide (7,14%) e dois alcoóis (14,28%). À presença de hidrocarbonetos e terpenos tem sido amplamente relatadas nas análises por CG-EM, em outras espécies do gênero Miconia , entre elas: M. cabucu, M. rubiginosa e M. stenostachya (MACARI; EMERECIANO; FERREIRA, 1990; CUNHA et al., 2003a; SPESSOTO et al., 2003; CREVELIN et al., 2006; RODRIGUES et al., 2008).

133

Tabela 6 – Dados obtidos na análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida com headspace (HS-SPME) Tempo de % Índice de Índice de Índice de Substância retenção Área Retenção Retenção similaridade** proposta (minutos) calculado Literatura* 4,165 0,24 ND ND 95% 3-hexen-1-ol ( 1) 7,137 9,54 977 ND 98% 1-octen-3-ol ( 2) 14,399 0,89 1171 1165 91% isoborneol ( 3) 22,071 1,69 1349 1351 97% Eugenol ( 4) 23,057 0,21 1372 1376 94% α-copaeno ( 5) 23,580 0,16 1385 1389 90% β-cubebeno ( 6) 23,653 0,36 1386 1391 91% β-elemeno ( 7) 24,699 0,20 1411 ND ND ND 24,994 56,27 1418 1418 95% β-cariofileno ( 8) 26,070 0,76 1444 ND ND ND

26,369 7,39 1451 1455 96% α-humuleno ( 9) 26,689 0,23 1459 ND ND ND 27,054 0,07 1468 ND ND ND 27,406 0,25 1477 1480 92% Germacreno D ( 10 ) 27,500 0,07 1479 ND ND ND 27,581 0,10 1481 ND ND ND 28,328 2,17 1499 1500 97% Pentadecano ( 11 ) 31,398 0,75 1577 ND ND ND 32,264 0,13 1598 1600 97% Hexadecano ( 12 ) 34,811 0,44 1666 ND 92% 8-Hexadecino ( 13 ) 35,176 16,81 1676 1672 97% 8-heptadeceno ( 14 ) 36,019 0,59 1698 ND ND ND 40,970 0,31 1838 ND ND ND 42,085 0,11 1871 ND ND ND 42,805 0,07 1892 ND ND ND *ADAMS (2007) e Pherobase (2014) **Espectrotecas de massas Wiley7, Nist 8 e Nist 8c ND: não determinado Total identificadO: 96,55%

134

O β-cariofileno ( 8) é um sesquiterpeno bicíclico que pode ser encontrado em óleos essenciais e resinas de uma ampla variedade de plantas (RAMOS, 2006; SOUZA et al., 2007b; ZIECH et al., 2013; MEDEIROS, 2014). Este composto ocorre normalmente na forma de mistura de isômeros com o isocariofileno e o α-humuleno ( 9) (SILVA et al., 2014). Na M. ferruginata a mistura de β-cariofileno e α- humuleno estava presente nas partes aéreas da planta. Dentre as classes dos terpenoides, os mais relatados no gênero Miconia tem sido os pertencentes a classe dos ácidos triterpênicos pentacíclicos (CUNHA et al., 2003a; VASCONCELOS et al., 2006; CUNHA et al., 2008; CUNHA et al., 2010; QUEIROZ et al., 2011; PEIXOTO et al., 2011; FERREIRA et al., 2013). Na espécie M. ferruginata foi observado a presença de um fenilpropranoide, o eugenol ( 4). Este composto é um fenol arilpropanóide, natural, aromático e farmacologicamente ativo, presente em óleos essenciais de algumas plantas do cerrado brasileiro. O germacreno D ( 10 ), é um hidrocarboneto intermediário na biossíntese de muitos sesquiterpenos (BÜLOW; KÖNIG, 2000; PROSSER et al., 2004; STELIOPOULOS et al., 2002). Tem como característica especial a capacidade de atrair insetos e outros organismos (MOZURAITIS et al., 2002;. STRANDEN; BORG- KARLSON; MUSTAPARTA, 2002; PETRAKIS et al., 2005). Outro integrante dos terpenos, o monoterpeno bicíclico isoborneol ( 3), é frequentemente encontrado em muitos óleos essenciais de plantas usadas na medicina tradicional (SANTOS, 2013), como nas partes aéreas frescas de M. ferruginata .

135

Figura 31 – Representação estrutural das substâncias identificadas ( 1 a 14 ) por análise por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas de Miconia ferruginata através de microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME) . ChemDraw Ultra (2004).

136

5. 3 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos de folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata Os extratos aquosos e etanólicos obtidos a partir de folhas/flores e caule de M. ferruginata foram analisados por CLAE-DAD. Os cromatogramas e espectros na região do UV-Vis (190-800 nm) obtidos dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata estão representados nas Figuras 32 e 33, respectivamente.

Intensidade

Minutos Figura 32 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 280 nm).

Intensidade

Minutos Figura 33 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata (λ 280 nm).

137

Os cromatogramas e espectros na região do UV-Vis (190-800 nm) obtidos dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata estão representados nas Figuras 34 e 35, respectivamente.

Intensidade

Minutos Figura 34 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 280 nm).

Intensidade

Minutos Figura 35 – Cromatograma e espectros UV-Vis da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato aquoso do caule de Miconia ferruginata (λ 280 nm).

Na Tabela 7 constam os tempos de retenção e dados de absorção na região do UV-Vis e as classes químicas propostas a partir da análise em CLAE-DAD tanto dos extratos etanólicos quanto aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata . Na Figura 36 se encontra a estrutura dos classes químicas propostas nesta análise.

138

Os dados mostram que os constituintes detectados nos extratos etanólicos foram semelhantes aos dos extratos aquosos, porém os extratos etanólicos apresentaram maior grau de complexidade em sua composição. Isso mostra que ambas as formas de extração (etanólica e aquosa) propicia a extração de compostos de polaridade próximas. E por isso, ambos os extratos etanólicos e aquosos apresentaram um perfil químico rico em compostos fenólicos, principalmente compostos pertencentes a classe dos flavonoides.

Tabela 7 – Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata Extrato etanólico das folhas/flores Tempo de retenção (min) Picos de Absorção máxima Classe química proposta (nm) 15.562 255; 354 Flavonol derivado da quercetina ( 15 ) 16.540 256; 352 Flavonol derivado da quercetina ( 15 ) 17.098 255; 346 Flavonol derivado da quercetina ( 15 ) 26.341 278; 330 Flavona ( 16 ) 31.142 274; 331 Flavona ( 16 ) 40.747 290, 310 Ácido fenólico ( 17 ) Extrato aquoso das folhas/flores Tempo de retenção (min) Picos de Absorção máxima Classe química proposta (nm) 8.790 202; 278 Catequina ( 18 ) 11.320 203; 278 Catequina ( 18 ) 15.600 254; 354 Flavonol derivado da quercetina ( 15 ) 17.127 255; 348 Flavonol derivado da quercetina ( 15 ) Extrato etanólico do caule Tempo de retenção (min) Picos de Absorção máxima Classe química proposta (nm) 15.674 204; 281 Catequina ( 18 ) 18.351 250; 350 (ombro); 365 Flavonol ( 19 ) 19.082 247; 351 (ombro); 367 Flavonol ( 19 ) Extrato aquoso do caule Tempo de retenção (min) Picos de Absorção máxima Classe química proposta (nm) 4.294 205; 264 Fenólicos ( 20 ) 5.678 203; 255; 286 Fenólicos ( 20 ) 15.716 204; 281 Catequina ( 18 )

139

16 15 H O OH

B OH HO O OH A C H 17 OH OH 18

19 20

Figura 36 – Representação estrutural das substâncias ou classes químicas identificadas ( 15 a 20 ) pela análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) para os extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores de Miconia ferruginata.

Os resultados obtidos na presente pesquisa estão de acordo com outros estudos químicos realizados com espécies da família Melastomataceae. BOMFIM-PATRÍCIO e colaboradores (2001) relataram a presença de 116 flavonoides, dos quais 69 eram flavonóis e 47 flavonas em diferentes espécies da família Melastomataceae. Existe uma ocorrência comum de flavonoides metoxilados nos diferentes gêneros pertencentes a esta família. Em outro estudo sobre a composição e distribuição de flavonoides no gênero Huberia foi possível identificar 17 compostos, como as agliconas livres, apigenina, campferol, quercetina e seus derivados glicosilados (MIMURA; SALATINO; SALATINO, 2004). Na espécie Mouriri pusa foram identificados diversos flavonoides, entre eles a epicatequina, miricetina, campferol e quercetina e seus derivados

140

glicosilados (ANDREO et al., 2006; SANTOS et al., 2008). Estes compostos fenólicos têm sido propostos como marcadores quimiotaxonômicos da família Melastomataceae. Em muitas espécies do gênero Miconia tem sido observado a presença de diversos grupos fenólicos, principalmente da classe dos flavonoides, assim como os observados na espécie em estudo. Na M. rubiginosa foi identificado onze compostos fenólicos, entre eles se encontram quercetina-o-glicosiladas, ácido gálico, epicatequina e campferol-o-glicosilados (RODRIGUES et al., 2011). Já na M. trailii foi possível identificar dois novos flavonoides, os miconiosídio A e B, além do ácido bartogênico, ácido arjunólico e ácido miriânthico (ZHANG et al., 2003). Um estudo químico do extrato metanólico das folhas de M. alypifolia mostrou a presença de quatro flavonoides: apigenina-7-O-glucosídio, campferol-3-O-diglucosídio, campferol-3-O-galactosídio e quercetina-3-O-galactosídio (MANCINI et al., 2008). RODRIGUES e colaboradores (2007) descrevem a identificação a partir do extrato metanólico de folhas de M. cabucu do primeiro dímero de flavonas metoxiladas ligadas por dois anéis aromáticos, o 5- hidróxi-4’,7-dimetoxiflavona-(6-C-6’’)-5’’- hidróxi-3’’’,4’’’,7’’’-trimetoxiflavona. O espectro de UV de um flavonoide consiste em dois picos de absorção máxima, na qual a banda I ocorre entre 300-550 nm e está relacionado ao anel B e, a banda II entre 240- 285 nm está relacionado ao anel A. A posição precisa e as intensidades relativas desses picos máximos fornecem informações sobre a natureza do flavonoide e de seu padrão de oxigenação. Assim, alterações na substituição do anel A modificam a banda II, enquanto que alterações nos anéis B e C modificam a banda I (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970; ANDERSEN; MARKHAM, 2006). RODRIGUES (2007) avaliou as espécies M. cabucu e M. rubiginosa e verificou compostos que apresentavam espectros de UV contendo duas bandas, com a banda I ocorrendo entre 328 - 357 nm, característico de flavonoides derivados, principalmente da quercetina, com glicosilações na posição 3 do anel C. Também foi observada a presença de outros compostos fenólicos como a catequina e taninos. Esses achados concordam com os encontrados para a espécie M. ferruginata . Os flavonoides (Figura 10) são considerados uma das classes químicas mais abundantes e com uma importância biológica tanto para os próprios vegetais quanto para o homem. Entre as subclasses de destaque estão às flavonas e os flavonóis, que apresentam origem biossintética próxima. Os flavonóis ( 19 ) são basicamente a estrutura das flavonas ( 16 ) com um grupo hidroxila substituído na posição C3 (SIMÕES et al., 2007). Os flavonóis mais abundantes nos vegetais e hortaliças são campferol, quercetina

141

e miricetina (FENNEMA, 1992; VOLP et al., 2008). A 3, 3`,4`,5,7-penta- hidroxiflavona, conhecida como quercetina, pertencente a este subgrupo, sendo considerado o composto mais presente na dieta humana, principalmente na forma glicosilada ( 15 ) (OLTHOF et al., 2000). O 3-flavanol é um composto fenólico conhecido como catequina ( 18 ) pertence ao grupo dos flavanóis e são constituídos por um anel floroglucinol (A), um anel pirânico (C) e um anel catecol (B) em sua estrutura. Essa molécula apresenta centros quirais que resultam na formação de quatro isômeros: (+), (-)-catequina e (+), (-)- epicatequina. São encontrados em grande quantidade em uvas e chás verde e preto (WANG; PROVAN; HELLIWELL, 2000; HOWARD et al., 2002; SABU; SMITHA; KUTTAN, 2002; SAITO et al., 2007) utilizados em muitas dietas e na prevenção de doenças crônico-degenerativas, como as cardiovasculares, neurodegenerativas e o câncer (SASKIA; BAST, 1998; UESATO et al.; 2001; GONZALO; ALONSO, 2002; HAN et al., 2004). Estes efeitos ocorrem devido à conversão dos compostos instáveis gerados por radicais livres em compostos inativos de baixa energia, pelas catequinas e outros compostos fenólicos.

5. 4 Análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata Na Figura 37 é apresentado os cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos no modo de ionização negativo e de ultravioleta (UV). Na análise foi possível identificar seis compostos e conhecer a classe química de outros cinco compostos. Na Figura 38 estão representados algumas estrutura químicas obtidas nesta análise, as demais foram representadas na Figura 36. Esses resultados estão descritos na Tabela 8. No apêndice B estão representados os espectros de massas obtidos das substâncias ou classes químicas gerados a partir da análise de CLAE-DAD-EM do extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata .

142

Intensidade

Minutos Figura 37 – Cromatograma de íons totais (vermelho) e cromatograma na região do ultravioleta (verde) obtidos a partir da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.

Tabela 8 – Dados obtidos a partir da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD- EM) para o extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata Tempo de Espectro de massas Picos de Absorção Substância / classe química retenção (-) máxima (nm) proposta 383,1212 11,3 ND Ácido quínico ( 21 ) 191,0563 353,1101 15,5 ND Ácido monocafeoilquínico ( 22 ) 191,0567 579,1537 16,2 278 Catequina ( 18 ) 289,0731 479,0858 17,1 337,0807 261; 356 Flavonol ( 19 ) 128,0339 18,2 463,0906 255; 354 Quercetina-O-hexose ( 23 ) 19,0 433,0807 254; 354 Quercetina-O-pentose ( 24 ) 19,4 447,0960 254; 348 Quercetina-O-deoxihexose ( 25 ) 595,1640 27,5 278; 330 Flavona ( 16 ) 297,0789 28,0 327,0895 277; 339 Flavona ( 16 ) 28,8 357,1007 280; 328 Flavona ( 16 ) 31,8 297,0783 274; 331 Flavona ( 16 ) ND: não determinado; UV: ultra-violeta

143

21 22

HO O

O O OH O

HO OH

23 24 OH

Figura 38 – Representação estrutural das substâncias ou classes químicas identificadas ( 21 a 25 ) pela análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) para o extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.

Os resultados encontrados nesta análise foram bastante semelhantes aos dados observados na análise anterior de CLAE-DAD, porém esta técnica permitiu identificar algumas substâncias no extrato etanólico das folhas/flores, como os derivados do ácido clorogênico e os derivados glicosilados da quercetina. Os ácidos mono ( 22 ) e

144

dicafeoilquínicos pertencem ao grupo de ácidos fenólicos, conhecidos como ácidos clorogênicos, são caracterizados pela ligação éster entre o ácido quínico ( 21 ) e uma ou mais moléculas de ácidos hidroxicinâmicos, entre eles, o ácido cafeico (BASTOS et al., 2005 e 2007; HECK; MEJIA, 2007; JAISWAIL et al., 2010). Estes esteres de ácido cafeico e outros compostos fenólicos foram apontados como responsáveis por importantes atividades, tais como antimicrobiana e antitumoral (SFORCIN; ORSI; BANKOVA, 2005). Outras espécies do gênero Miconia tem apresentado perfil químico semelhante ao encontrado para a M. ferruginata (BOMFIM-PATRÍCIO et al., 2001; RODRIGUES, 2007; MANCINI et al., 2008) . Relatos na literatura, mostraram que os flavonoides encontrados em espécies deste gênero normalmente se encontram nas formas de agliconas livres e derivados glicosilados, principalmente da apigenina, campferol e quercetina (RODRIGUES et al., 2007; MANCINI et al., 2008; RODRIGUES et al., 2008) como observado no presente estudo. Assim, os dados encontrados para a espécie M. ferruginata por meio destas análises juntamente com os resultados anteriores corroboram no estudo sobre seu perfil químico rico em compostos fenólicos, principalmente os compostos pertencentes a classe dos flavonoides.

5. 5 Teor de compostos fenólicos A curva padrão do ácido gálico foi utilizada para extrapolação do teor em miligrama de equivalentes de ácido gálico por grama de extrato (mg EAG/g) (Figura 39). Os resultados do teor de fenóis totais médios e os desvios padrões obtidos dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata estão apresentados na Tabela 9. Em ambos os extratos, o teor de compostos fenólicos foi elevado, acima de 66% do extrato seco. As folhas apresentaram maior teor de compostos fenólicos (857,64 ± 0,11 mg EAG/g) que o caule (664,50 ± 0,03 mg EAG/g). Para a espécie M. albicans também foi realizado este doseamento que revelou um conteúdo de compostos fenólicos inferior ao encontrado no presente estudo (70,04 ± 0,12 mg EAG/g) (PIERONI et al., 2011) .

145

Figura 39 – Curva de calibração do padrão ácido gálico traçada pelo método colorimétrico de Folin - Ciocalteu.

Tabela 9 – Média e desvio padrão do teor de compostos fenólicos totais dos extratos aquosos de folha/flores e do caule de Miconia ferruginata

Extrato Teor de compostos fenólicos mg EAG/g extrato Folha/Flores 857,64 ± 0,11 Caule 664,50 ± 0,03

A quantidade de compostos fenólicos tem sido associada ao potencial antioxidante encontrado em frutas, hortaliças, vegetais e outros produtos naturais (MANACH et al., 2004; ALVES, et al., 2007; ZULETA et al., 2007; REZENDE, 2010). A propriedade antioxidante dos compostos fenólicos depende de sua estrutura química, podendo ser determinada pela (1) velocidade de inativação do radical livre, (2) potencial de quelação de metais através da estrutura orto -dihidroxifenólica, (3) reatividade e estabilidade de seus radicais intermediários pelo mecanismo de ressonância ( PANNALA et al., 2001; GONZALO; ALONSO, 2002; RIBEIRO; SERAVALLI, 2004) . RICE -EVANS e colaboradores (1996) demonstram que a atividade antioxidante dos flavonoides, in vitro, é maior que a encontra para as vitaminas E e C.

146

A capacidade antioxidante dos flavonoides já tem sido bastante relatada na literatura (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996; HARBORNE; WILLIAMS, 2000; HAVENSTEEN, 2002; HEIM; TAGLIAFERRO; BOBILYA, 2002; MARTÍNEZ-FLÓREZ et al., 2002; KÄHKÖNEN; HEINONEN, 2003; GREGOR et al., 2005; HURBER; AMAYA-RODRIGUEZ, 2008; CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009; GUTIERREZ-MERINO et al., 2011). As flavonas e flavonóis são subclasses dos flavonoides de particular importância para a atividade antioxidante observado na espécie M. ferruginata . Este efeito apresenta reflexos em estudos epidemiológicos, que mostraram que o consumo diário destes metabólitos reduz o risco de câncer e outras doenças cardiovasculares (WANG; HUANG, 2004). Entre os flavonóis que se destacam quanto ao potencial antioxidante, in vitro, se encontra a quercetina. Ela atua na prevenção de peroxidação lipídica, promove efeito quelante de metais e remoção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, em especial para o ânion superóxido (HANASAKI; OGAWA; FUKUI, 1994; CUSHNIE; LAMB, 2005) e o radical óxido nítrico (VAN ACKER et al., 1995; WOJDYLO; OSZMIA ŃSKI; CZEMERYS, 2007; BOOTS; HAENEN; BAST, 2008). O mecanismo proposto está relacionado à presença dos grupos hidroxila nas posições 3`e 4` do anel B e nas posições 5 e 7 do anel A, bem como a ressonância promovida pelos anéis aromáticos e o grupo cetona do anel C (HEIM; TAGLIAFERRO; BOBILYA, 2002; AMIC´ et al., 2003; MICHALAK, 2006). Além dos flavonoides, os derivados de ácidos fenólicos como os derivados do ácido clorogênico, o ácido cafeico e seus derivados ésteres, esteróis e triterpenos também apresentam essas propriedade (ADELMANN, 2005; SIMÕES et al., 2007). O elevado teor de compostos fenólicos encontrados na espécie M. ferruginata se deve as classes dos flavonoides e taninos observados na triagem fitoquímica preliminar. Como também pelos compostos identificados por CLAE-DAD-EM e CG-EM entre eles se destacam as flavonas, catequina, ácido quínico, ácido monocafeoilquínico, sesquiterpenos e flavonóis, em especial os derivados glicosilados da quercetina.

5. 6 Fracionamento em coluna Sephadex LH-20 e análise por cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata Para o fracionamento do extrato aquoso das folhas/flores de M. ferruginata foi utilizado eluição isocrática com metanol PA em cromatografia por exclusão usando

147

coluna Sephadex LH-20. Foram obtidos 43 frações que apresentaram, após secagem, um resíduo de cor amarelada ou acastanhado, avaliadas através de CLAE-DAD. As frações com maior grau de pureza obtidas foram as de número 3 (Figuras 40) e 18 (Figuras 41), para as quais são apresentados os respectivos cromatogramas. Os espectros na região do ultravioleta-visível gerados para cada fração analisada estão representados no apêndice C e D, respectivamente. Na Tabela 10 constam os tempos de retenção e dados de absorção na região do UV-Vis e as classes químicas propostas a partir da análise em CLAE-DAD das frações 3 e 18. A representação das estruturas das classes químicas identificadas estão apresentadas na Figura 38, com exceção do ácido gálico que foi representado no apêndice C, juntamente com seu espectros na região do ultravioleta-visível.

Ácido gálico TR= 1,78

Intensidade Intensidade

Nào identificado TR= 14,15

Catequina TR= 2,49

Minutos Figura 40 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH- 20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 254nm).

148

Flavonol derivado da quercetina TR= 15,58 Intensidade Intensidade

Catequina TR= 1,77 Catequina TR= 11,23 Flavonol derivado da quercetina

TR= 13,99 TR= TR= 17,12 Catequina TR= 8,70 Flavonol derivado da quercetina

Minutos Figura 41 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH- 20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata (λ 280 nm).

A partir dos dados obtidos na análise em CLAE-DAD da fração 3 sugere-se que os picos com tempo de retenção de 1.78 ( λmáx 210 e 269 nm) e 2.49 ( λmáx 275 nm) minutos correspondem a um derivado do ácido gálico e catequina, respectivamente.

Para o pico majoritário, com tempo de retenção de 14.16 min ( λmáx 254 nm) não foi possível atribuir a classe química correspondente. A partir dos dados obtidos na análise em CLAE-DAD da fração 18 sugere-se que os picos com tempo de retenção de 1.77 min ( λmáx 200 e 279 nm) , 8.70 min ( λmáx

201 e 278 nm) e 11.23 minutos ( λmáx 197 e 278 nm) correspondam a catequinas. Os picos com tempo de retenção de 13.99 min ( λmáx 255 e 356 nm), 15.58 min ( λmáx 255 e

356 nm e 17.12 min ( λmáx 255 e 348 nm) são indicativos da presença de flavonóis derivados da quercetina. As demais frações apresentaram perfil cromatográfico mais complexo, no entanto contendo os mesmos constituintes, mas em diferentes proporções.

149

Tabela 10 – Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) das frações 3 e 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata Fração 3 Tempo de retenção (min) Picos de Absorção máxima Classe química proposta (nm) 1.78 210; 269 Ácido gálico ( 26 ) 2.49 275 Catequina ( 18 ) 14.16 254 ND Fração 18 Tempo de retenção (min) Picos de Absorção máxima Classe química proposta (nm) 1.77 200; 279 Catequina ( 18 ) 8.70 201; 278 Catequina ( 18 ) 11.23 197; 278 Catequina ( 18 ) 13.99 255; 356 Flavonol derivado da quercetina ( 15 ) 15.58 255; 356 Flavonol derivado da quercetina ( 15 ) 17.12 255; 348 Flavonol derivado da quercetina ( 15 ) ND: Não determinado

Por meio do fracionamento do extrato aquoso das folhas/flores não foi possível isolar nenhuma substância, em que o perfil cromatográfico obtido para as diferentes frações foi bastante semelhante ao extrato aquoso bruto. As classes químicas observadas nesta análise foram os flavonóis, catequinas e ácido gálico, também foram observadas na análise em CLAE-DAD-EM do extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata e foram discutidas no item 5. 3 e 5. 4.

150

5. 7 Análise das frações dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD)

5. 7. 1 Análise por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das frações n-hexânica e diclorometânica provenientes do fracionamento dos extratos etanólicos de Miconia ferruginata As frações n-hexânica e diclorometânica obtidas a partir dos extratos etanólicos das folhas e do caule por meio de partição líquido-líquido foram analisadas por CG-EM no mesmo equipamento e condições da análise por HS-SPME das partes aéreas de M. ferruginata (item 4. 8). O cromatograma obtido para a fração n-hexânica das folhas/flores está apresentado na Figura 42. Todos os índices de similaridade obtidos para os espectros de massas desta fração foram abaixo de 90% e, consequentemente, não permitiram a identificação com segurança dos seus constituintes.

Intensidade Intensidade

Minutos Figura 42 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração n-hexânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata.

Os respectivos cromatogramas e espectros de massas da fração n-hexânica do extrato etanólico do caule a partir da análise em CG-EM estão apresentado nas Figuras 43 e 44.

151

Palmitato de etila TR= 45,950 Intensidade Intensidade

Minutos Figura 43 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração n-hexânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata.

Figura 44 – Espectro de massas da substância palmitato de etila ( 27 ) obtido para o pico com tempo de retenção de 45.950 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração n-hexânica do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata. (A) . Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 93% (B).

Os respectivos cromatogramas e espectros obtidos da fração diclorometânica do extrato etanólico das folhas/flores a partir da análise em CG-EM estão apresentados nas Figuras 45 a 47.

152

Intensidade Intensidade

Ciclopropil metil cetona TR= 9,930 2,3 hexanodiol TR= 13,010

Minutos Figura 45 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

Figura 46 – Espectro de massas da substância ciclopropil metil cetona ( 28 ) obtido para o pico com tempo de retenção de 9.930 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata . (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 90% (B).

153

Figura 47 – Espectro de massas da substância 2,3-hexanodiol ( 29 ) obtido para o pico com tempo de retenção de 13.010 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata . (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 100% (B).

Os respectivos cromatogramas e espectros obtidos das frações diclorometânica do extrato etanólico do caule a partir da análise em CG-EM estão apresentados nas Figuras 48 e 49.

Palmitato de etila Isobutirato de etila TR= 45,950 TR= 6,315 Intensidade Intensidade

Minutos Figura 48 – Cromatograma da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica obtida a partir do fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata .

154

Figura 49 – Espectro de massas da substância isobutirato de etila ( 30 ) obtido para o pico com tempo de retenção de 6.315 minutos da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) da fração diclorometânica do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata . (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 91% (B).

Os compostos identificados nas análises de CG-EM das frações n-hexânica e diclorometânica obtidos do fracionamento do extrato etanólico das folhas/flores e do caule de M. ferruginata estão apresentados na Figura 50. Por meio dessas análises, alguns esteres foram encontrados nas frações n-hexânicas e diclorometânicas dos extratos etanólicos do caule de M. ferruginata . Os esteres são compostos de baixa polaridade e com ponto de ebulição menor do que os ácidos carboxílicos de peso molecular semelhante. Entre eles, o palmitato de etila ( 27 ) é um ácido graxo de cadeia longa, proveniente da reação de esterificação entre o ácido palmítico e o álcool etílico catalizado pela enzima fatty acid ethyl esteres syntase (GAGERI; KLEIN; KOREN, 2006). Este éster possui uma cadeia saturada com 15 átomos de carbono e uma extremidade esterificada com grupamento etila. Já o isobutirato de etila ( 30 ) é um éster de cadeia curta, proveniente da esterificação do ácido isobutílico e o álcool etílico. Ambos esteres são comumente empregados na fabricação de bebidas e cosméticos, por apresentar aroma e sabor agradável (MARKLEY, 1960; ALLINGER et al., 1978). Foi também detectado o ciclopropil-metil-cetona ( 28 ) que é um composto intermediário utilizado na fabricação de produtos farmacêuticos e agroquímicos.

155

28 29

Figuras 50 – Representação estrutural dos compostos identificados ( 27 a 30 ) por meio da análise em cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das frações n-hexânica e diclorometânica dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata. ChemDraw Ultra (2004).

5. 7. 2 - Análise por cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) das frações acetato de etila provenientes do fracionamento dos extratos etanólicos de Miconia ferruginata As respectivas frações acetato tanto das folhas/flores quanto do caule foram analisadas por CLAE-DAD nas mesmas condições cromatográficas descritas no item 4. 9. Os cromatogramas obtidos das frações acetato de etila do extrato etanólico das folhas/flores e do caule e os respectivos espectros na região do ultravioleta estão apresentados nas Figuras 51 e 52, e, nos apêndices E e F, respectivamente. Os dados referentes aos principais picos observados nos comatogramas e as respectivas classes químicas propostas estão listados na Tabela 11. As classes químicas observadas nesta análise foram representadas na Figura 36.

156

Flavonol Intensidade Intensidade

Flavona Flavona TR= 26,38 TR= 26,38

Minutos Figura 51 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

Flavonol Intensidade Intensidade

Flavonol TR= 20,85

Minutos Figura 52 – Cromatograma da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata.

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Tabela 11 - Dados obtidos na análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) das frações acetado de etila do extrato etanólico das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata .

Fração acetato de etila do extrato etanólico das folhas/flores Tempo de retenção (min) Picos de Absorção Classe química proposta máxima (nm) 14.01 256; 356 Flavonol ( 19 ) 14.86 263; 352 Flavonol ( 19 ) 15.14 257; 355 Flavonol ( 19 ) 15.60 254; 353 Flavonol ( 19 ) 16.58 256; 353 Flavonol ( 19 ) 17.13 255; 348 Flavonol ( 19 ) 26.38 278; 330 Flavona ( 16 ) 31.17 274; 331 Flavona ( 16 ) Fração acetato de etila do extrato etanólico do caule Tempo de retenção (min) Picos de Absorção Classe química proposta máxima (nm) 15.98 243; 367 Flavonol ( 19 ) 17.13 254; 351 Flavonol ( 19 ) 18.38 249; 350 (ombro); 365 Flavonol ( 19 ) 19.11 247; 351 (ombro); 367 Flavonol (19 ) 20.85 250; 350 (ombro); 364 Flavonol ( 19 )

A classe predominante na fração acetato de etila dos extratos etanólicos das folhas/flores e do caule foi a dos flavonoides, em especial as subclasses das flavonas e flavonóis, como observado para o extrato etanólico bruto das folhas/flores de M. ferruginata . As subclasses das flavonas ( 16 ) e flavonóis ( 19 ) são derivados do 2- fenilcromona e 3-hidróxi-2-fenilcromona, respectivamente, e se apresentam, geralmente, oxigenadas, substituídos com hidroxilas e/ou metoxilas (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996; SIMÕES et al., 2007). Estes compostos são conhecidos como protetores químicos, por promover a absorção da luz ultravioleta e proteger as células vegetais de danos causados pela fotoxidação. Além disso, favorecem a polinização por apresentam sinais atrativos visuais para os insetos, como as abelhas. Dentre os compostos mais comuns estão o campferol, fisetina, luteolina, morina, miricetina, rutina, apigenina e quercetina. O último composto foi encontrado nos diferentes extratos e frações de M. ferruginata conforme discutido nos itens 5. 3; 5. 4 e 5. 6 .

158

5. 8 Ensaios Biológicos A avaliação das atividades biológicas foi precedida da análise de citotoxicidade frente a células de mamíferos utilizando fibroblastos e leucócitos humanos. Foram investigadas as atividades (1) antibacterianas utilizando modelos de bactérias Gram negativas e Gram positivas; (2) antitumoral utilizando modelo de adenocarcinoma de mama; (3) tripanocida usando cepas parcialmente sensíveis e resistentes ao benznidazol; (4) leishmanicida usando espécies causadoras de leishmaniose visceral e tegumentar; e (5) atividade anti-proliferativa sobre linfócitos do sangue periférico.

5. 8. 1 Citotoxicidade dos extratos de Miconia ferruginata sobre fibroblastos A citotoxicidade dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e caule de M. ferruginata foram avaliados em células de fibroblastos L929 através da metodologia do MTT. De acordo com os dados obtidos apenas os extratos etanólicos na concentração de 500 µg/mL apresentou redução significativa da viabilidade celular de L929 tanto das folhas/flores quanto do caule (p<0,05). Os demais extratos nas diferentes concentrações não reduziram a viabilidade celular, ou seja, não apresentaram toxicidade frente a essa linhagem, como demonstrado na Figura 53. O grupo controle do solvente (DMSO) não apresentou diferença significativa em relação ao grupo controle na avaliação da viabilidade celular (CON: 99,67 ± 4,914; DMSO: 99,288 ± 7,22), enquanto que o controle de morte (16,98 ± 2,80) reduziu a viabilidade em 83,01%. A partir destes achados determinou-se que a concentração máxima de 500 µg/mL seria utilizada nas demais análises das atividades biológicas.

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L929 A C 100 100

75 * * 75 **

50 50

25 25 *** *** 0 0 CON CM 3,9 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 CON CM 3,9 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500

B D 100 100 % Viabilidade Celular Viabilidade % 75 * 75

50 50

25 *** 25 ***

0 0 CON CM 3,9 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 CON CM 3,9 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 Grupos (µg/mL) Figura 53 – Porcentagem da viabilidade de fibroblastos L929 expostos a diferentes concentrações dos extratos de Miconia ferruginata . A – Extrato etanólico das folhas/flores; B- Extrato etanólico do caule; C – Extrato aquoso das folhas/flores; D – Extrato aquoso do caule. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9). * p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguida do pós-teste de

Bonferroni. CON: grupo controle de viabilidade; CM: grupo controle de morte com cloreto de cádmio.

Os dados mostraram que os extratos etanólicos de M. ferruginata apresentam uma maior toxicidade frente células de mamíferos do que os extratos aquosos. Isso pode ter ocorrido devido a diferenças nas concentrações dos compostos fenólicos, uma vez que o perfil químico de ambos os extratos foi semelhante. Além disso, o extrato etanólico apresentou um perfil químico mais complexo que o extrato aquoso.

5. 8. 2 Atividade antibacteriana de Miconia ferruginata Para avaliação antibacteriana foram utilizadas seis cepas de bactérias Gram- positivas e oito cepas de Gram-negativas, que frequentemente ocasionam infecções oportunistas no homem, conforme descrito no Quadro 9. A técnica de análise empregada foi de microdiluição em placa conforme as normas do CLSI (2006), na qual foram avaliados os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule e o extrato aquoso das folhas/flores de M. ferruginata .

160

Quadro 9 – Características das cepas bacterianas utilizadas para determinação da atividade antibacteriana dos extratos brutos de Miconia ferruginata . Cepas Bacterianas Classificação Patologias causadas no Referência pelo Gram homem Bacillus cereus Gram-positivo Intoxicações alimentares SOARES et al., 2008 Enterobacter aerogenes Gram-negativo Infecção nosocomial CHANG et al., associadas aos tratos 2009 urinários e respiratórios Enterococcus faecalis Gram-positivo Infecções urinárias, PARADELLA endocardite e endodônticas et al., 2007 Escherichia coli Gram-negativo Infecções do trato urinário FRANCO, 2002 e gastrointestinais Klebsiella oxytoca Gram-negativo Infecção neonatal e emREREISS et al., 2000 recém -nascidos Listeria monocytogenes Gram-positivo Listeriose e incluem BARANCELLI septicemia, meningite, et al., 2011 encefalite, infecção cervical ou intra-uterina Micrococcus sp. Gram-positivo Infecção nosocomial, como MURRAY et abscessos intracranianos, al., 1999 pneumonia, artrite séptica, endocardite e meningite Proteus mirabilis Gram-negativo Infecções em trato MICHELIM, respiratório superior, 2008 urinárias e gastroenterites Pseudomonas Gram-negativo Infecção nosocomial NEVES et al., aeruginosa relacionadas ao trato 2011 Urinário, sistema respiratório, pele e tecidos moles, oftalmológicas, ósseas, articulares e outras infecções sistêmicas Salmonella enteritidis Gram-negativo Intoxicações alimentares CARDOSO; CARVALHO, 2006 Salmonella typhimurium Gram-negativo Gastrenterite e BOROWSKY et intoxicações alimentares al., 2006 Shigella sonnei Gram-negativo Shigelose ou disenteria PENATTI, 2007 Bacilar Staphylococcus aureus Gram-positivo Desde simples infecções DOS SANTOS, até infecções graves et al., 2007 (pneumonia, meningite, endocardite, síndrome do choque tóxico, septicemia e outras). Streptococcus agalactiae Gram-positivo Infecção neonatal CAETANO, 2008

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Entre os ensaios para avaliação antimicrobiana de produtos naturais, destacam-se os ensaios in vitro, tais como as técnicas de difusão em ágar, diluição (macro e microdiluição) e autobiografia (AGRIPINO et al., 2004; LANGFIELD et al., 2004; SASIDHARAN et al., 2011). Porém, a técnica mais amplamente utilizada, principalmente para screening e determinação da concentração inibitória mínima (CIM), é a microdiluição em placa. Esta técnica é extremamente vantajosa no estudo de produtos naturais, uma vez que são necessárias pequenas quantidades dos extratos e/ou substâncias isoladas. Além disso, apresenta baixo custo, simplicidade, rapidez, alto rendimento, permite realizar várias amostras simultaneamente, e é 30 vezes mais sensível que outros métodos relatados na literatura (LANGFIELD et al., 2004; CUSHNIE; LAMB, 2005; ALVES et al., 2008; OSTROSKY et al., 2008; SALAZAR- ARANDA et al., 2009; PALOMBO, 2011). Na Tabela 12 está indicada a atividade antibacteriana e a CIM dos extratos para cada bactéria testada.

Tabela 12 – Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos brutos de Miconia ferruginata pela técnica de microdiluição em placa utilizando a resazurina como revelador. Bactérias CIM (µg/mL)* E1 E2 E3 B. cereus > 500 > 500 > 500 E. aerogenes > 500 > 500 > 500 E. faecalis > 500 > 500 > 500 E. coli > 500 > 500 > 500 K. oxytoca > 500 > 500 > 500 L. monocytogenes > 500 > 500 > 500 Micrococcus sp. > 500 > 500 > 500 P. mirabilis > 500 > 500 > 500 P. aeruginosa > 500 > 500 > 500 S. enteriditis > 500 > 500 > 500 S. typhimurium > 500 > 500 > 500 S. sonnei > 500 > 500 > 500 S. aureus > 500 > 500 > 500 S. agalactiae > 500 > 500 > 500 *(n=9) E1: Extrato etanólico das folhas/flores; E2: Extrato etanólico do caule; E3: Extrato aquoso das folhas/flores.

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Para os extratos brutos de M. ferruginata não foi observado nenhuma atividade frente às 14 cepas bacterianas avaliadas, nas diferentes concentrações. Na Figura 54 mostra uma fotografia da microplaca após leitura com o revelador resazurina para as bactérias Staphylococcus aureus (linhas 1, 2, 3 e 7) e Pseudomonas aeruginosa (linhas 4, 5, 6 e 8). Resultados semelhantes foram encontrados por QUEIROZ et al. (2011) que avaliaram o extrato etanólico e diclometânico bruto de M. rubiginosa e substâncias isoladas (ácido ursólico e oleianólico) frente a bactérias de isolados clínicos. Neste estudo foi verificada baixa atividade do extrato bruto (CIM – 2 mg/mL e 6 mg/mL, respectivamente) e ausência de atividade para as sustâncias isoladas. Porém, ALVES et al. (2008) verificaram a existência de atividade bactericida do extrato etanólico bruto de M. rubiginosa, para as cepas ATCC de Enterococcus faecalis , Kokuria rhizophila , Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium, com os valores de CIM variando entre 250 e 400 µg/mL.

Poços testes Poços controle E1 E2 E3 E1 E2 E3

Controle de Controle do meio DMSO Clorafenicol crescimento Figura 54 – Microplaca teste com os extratos etanólicos das folhas/flores e do caule e o extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata, após revelação com a resazurina, para as bactérias Staphylococcus aureus (linhas 1, 2, 3 e 7) e Pseudomonas aeruginosa (linhas 4, 5, 6 e 8).

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Para outras espécies do gênero Miconia , tem sido demonstrado atividade antibacteriana e antifúngica (CELOTTO et al., 2003; MOURA, 2006; RODRIGUES, 2007; RODRIGUES et al., 2008; CUNHA et al., 2010; ARAÚJO, 2011; LEITE et al., 2013). RODRIGUES (2007) verificou atividade antimicrobiana para o extrato metanólico de M. rubiginosa frente a S. epidermis, C. albicans, S. aureus, M. luteus, B. subtilis e B. cereus e o extrato clorofórmico de M. cabucu frente a S. epidermis, C. albicans e S. aureus . Além disso, foi verificado que tanto a atividade antimicrobiana quanto a propriedade analgésica estavam relacionadas ao perfil químico, rico em flavonoides, principalmente, os derivados glicosilados da quercetina. Porém as concentrações que apresentaram atividade (30 a 1,5 mg/mL) estavam acima das utilizadas no presente estudo ( ≤ 500 µg/mL), o que poderia justificar a ausência de atividade antibacteriana na espécie M. ferruginata . Alguns compostos isolados do gênero Miconia tem mostrado atividade antibacteriana e antifúngica, tais como ácido ursólico e oleanólico (CUNHA et al., 2010). Além de outros compostos identificados na espécie estudada, como os sesquiterpenos cariofileno e o germacreno D ( GARG; SIDDIQUI, 1992; FORMISANO et al., 2006; MAIA et al., 2010; HUANG et al., 2012). Este último tem mostrado potente atividade antifúngica e antibacteriana principalmente para bactérias gram- positivas (NGASSAPA et al., 2003; DUARTE et al., 2005; DEUSCHLE et al., 2007; KIRAN; DEVI, 2007). Segundo GERSHENZON e DUDAREVA (2007) os sesquiterpenos dentre outras funções são os principais metabólitos antimicrobianos de origem vegetal. Como por exemplo, o α-copaeno, que é um sesquiterpeno não-oxigenado, detentor de comprovada ação contra insetos (VEIGA JR; PINTO, 2002). Entretanto estes compostos foram encontrados na planta fresca e podem estar em baixa concentração ou ausentes nos extratos testados devido aos procedimentos de secagem, o que possivelmente influenciou a ausência de atividade. As plantas são fontes ricas de uma grande variedade de metabólitos ativos tais como taninos, terpenoides e flavonoides que têm sido relatados devido às suas propriedades antimicrobiana, in vitro (HAMILTON-MILLER, 1995; KAWAI et al., 2003; PADUCH et al., 2007; ARIF; MANDAL; DABUR, 2011; SALAS et al., 2011). Entre os metabólitos que se destacam se encontra a classe dos flavonoides (CUSHNIE; LAMB, 2005). Estes compostos frequentemente se encontram oxigenados ou conjugado com açúcares e, já foram relatadas quanto as atividades antibacteriana, antifúngica e

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antiviral (DASTIBAR et al., 2004; SIMÕES et al., 2007). Os mecanismos de ação propostos são por meio da inibição da germinação de esporos patogênicos, formação de complexos com proteínas solúveis presentes nas paredes das células microbianas, redução dos efeitos indesejáveis de toxinas e capacidade de romper diretamente as membranas das células fúngicas (ARIF et al., 2011; SALAS et al., 2011). A subclasse dos flavonóis derivados da quercetina presentes tanto no extrato bruto quanto nas frações de M. ferruginata tem demonstrado um efeito significativo contra algumas espécies de bactérias Gram-positivas e leveduras bem como inibição do vírus HIV em 80% (GATTO et al., 2002). Além disso, em estudos iniciais, foi observado a inibição da enzima transcriptase reversa, podendo servir de modelo para novos fármacos utilizados no controle de infecções causadas pelos retrovírus (HIRPARA et al., 2009). Os compostos derivados dos ácidos cafeoilquínicos também tem apresentado ação potente e seletiva contra o vírus Tipo 1 da Síndrome Imuno Deficiência Adquirida (AIDS), além de inibirem a replicação viral (PEREIRA et al., 2003), e apresentarem atividades antibacterianas e antihelmínticas (SCHOLZ et al., 1993).

5. 8. 3 Efeito citotóxico de Miconia ferruginata sobre células tumorais de adenocarcinoma A avaliação da atividade antitumoral dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata foram realizados frente a linhagem de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231, em culturas de 48 e 72 horas. Os dados obtidos para a linhagem tumoral de 48 e 72 horas foram expressos como porcentagem da viabilidade celular e são mostrados nas Figuras 55 e 56, respectivamente. Os valores de IC 50 para os extratos e para os controles de mortalidade estão apresentados na Tabela 13. Após 48 horas de exposição das células MDA-MB-231 as diferentes concentrações dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata foi observado que todos os extratos se mostraram tóxicos para as células tumorais. O extrato aquoso do caule promoveu redução significativa da viabilidade celular na concentração de 500 µg/mL (p<0,05), com um IC 50 de 180,4 µg/mL. Os demais grupos apresentaram reduções significativas da viabilidade celular em concentrações menores, variando entre 62,5 µg/mL para os extratos etanólico do caule e aquoso das folhas/flores e 31,2 µg/mL para o extrato etanólico das folhas/flores

165

(p<0,01). O extrato etanólico das folhas/flores apresentou o menor IC 50 (70,15 µg/mL) do que os demais extratos, que variaram entre 180,4 a 119,2 µg/mL.

MDA-MB-231 A C 100 100

75 75 *

50 ** 50 ** *** 25 ** 25 *** *** *** *** *** *** *** *** 0 *** 0 CON DMSO PXT 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 CON DMSO PXT 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 B D

100 100 % Viabilidade Celular Viabilidade % 75 75 ** 50 *** 50 *

25 25 *** *** *** *** *** *** 0 0 CON DMSO PXT 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 CON DMSO PXT 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 Grupos (µg/mL) Figura 55 – Porcentagem da viabilidade celular das células MDA-MB-231 submetidas à exposição com os extratos de Miconia ferruginata, após 48 horas. A – Extrato etanólico das folhas/flores; B - Extrato aquoso das folhas/flores; C – Extrato etanólico do caule; D - Extrato aquoso do caule. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9).* p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido de pós-teste de Bonferroni.CON: grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do solvente; PXT: grupo com fármaco padrão Paclitaxel.

Após 72 horas de exposição a citotoxicidade sobre as células MDA-MB-231 foi aumentada para todos os extratos de M. ferruginata . A atividade antitumoral observada no tempo de 48 horas e de 72 horas se mostraram concentração dependente. A maior variação de citotoxicidade foi observada para o extrato aquoso do caule, em que o IC 50 reduziu de 180,4 µg/mL após 48 horas para 70,45 µg/mL após 72 horas, revelando que o fator tempo de exposição é essencial para a atividade antitumoral do extrato. Já o extrato etanólico das folhas/flores foi o que apresentou maior atividade, com redução significativa da viabilidade celular na concentração de 15,6 µg/mL (p<0,05), apresentando IC 50 de 56,44 µg/mL. Os demais extratos reduziram de forma significativa

à viabilidade celular a partir da concentração de 31,2 µg/mL, e o IC 50 variou entre 135,8 a 119,2 µg/mL. Isso reforça que o aumento da atividade antitumoral, de todos os

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extratos brutos, é dependente do fator tempo de exposição. Adicionalmente, é relevante comentar que após 72 horas de exposição aos extratos, estes não se apresentaram tóxicos para células normais de mamíferos nas concentrações com atividade frente a células tumorais, se tornando uma possibilidade de agente terapêutico. Porém se faz necessário outros estudos com as frações e substâncias isoladas destes extratos, bem como avaliar os prováveis mecanismos de ação.

MDA-MB-231 A C 100 100

75 75 ** * ** 50 ** 50 *** *** 25 25 *** *** *** *** *** *** *** *** *** 0 0 CON DMSO PXT 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 CON DMSO PXT 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 B D

100 100 % Viabilidade Celular Viabilidade % 75 75 * ** ** 50 *** 50 ** *** 25 *** 25 *** *** *** *** *** *** 0 0 CON DMSO PXT 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 CON DMSO PXT 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 Grupos (µg/mL) Figura 56 – Porcentagem da viabilidade celular das células MDA-MB-231 submetidas à exposição com os extratos de Miconia ferruginata, após 72 horas. A – Extrato etanólico das folhas/flores; B - Extrato aquoso das folhas/flores; C – Extrato etanólico do caule; D - Extrato aquoso do caule. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9). * p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido de pós-teste de Bonferroni. CON: grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do solvente; PXT: grupo com fármaco padrão Paclitaxel.

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Tabela 13 – Valores de Concentração inibitória 50% (IC 50 ) da viabilidade celular de adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231) exposto aos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata nos tempos de 48 e 72 horas de cultura.

IC 50 extratos (µg/mL)* Extratos 48 horas 72 horas E1 70,15 56,44 E2 119,2 79,78 E3 153,6 135,8 E4 180,4 70,45 Paclitaxel** 2,25 2,099 Cloreto de cádmio** 391,6 314,2 *(n=9) **Os valores de IC 50 dos controles foram expressos em µM. E1: Extrato etanólico das folhas/flores; E2: Extrato etanólico do caule; E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule.

Resultados semelhantes aos encontrados no presente estudo foram observados em outras espécies do gênero Miconia, entre elas a M. lepidota . Nesta espécie foram isolados derivados das benzoquinonas, como a primina, que apresentaram valores de

IC 50 entre 10 a 2,9 µg/mL frente células de carcinoma de Madison Lung (M109) e adenocarcinoma ovariano humano (A2780) (GUNATILAKA et al., 2001). CUNHA et al. (2008) avaliaram o potencial antitumoral de M. fallax frente células de adenocarcinoma do colo uterino humano (HeLa). Os autores verificaram que tanto o extrato etanólico bruto quanto a fração contendo uma mistura isomérica de ácidos triterpênicos (ursólico e oleanólico) apresentaram elevada citotoxicidade, concentração dependente, sobre as células tumorais a partir da concentração de 45 µg/mL. Outro estudo realizado por PAIS (2011) avaliou o efeito citotóxico dos extratos brutos etanólico e diclorometânico de M. latecrenata sobre diferentes linhagens tumorais. O autor verificou que ambos os extratos foram citotóxicos (IC 50 = 2,5 ug/ml e 250 ug/ml, respectivamente), porém, o etanólico apresentou maior potência e seletividade. A maior potência do extrato etanólico também foi observada no presente estudo, possivelmente devido ao perfil químico rico em compostos fenólicos. O câncer de mama representa a principal causa de morte por câncer nos países desenvolvidos e a segunda causa nos países em desenvolvimento (BRASIL, 2008b;

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JEMAL; BRAY; FERLAY, 2011). Esta patologia acomete mulheres entre 30 e 60 anos com quadros de crescimento e progressão geralmente rápidos e podem apresentar formação de metástases agravando o quadro clínico (SILVA; RIUL, 2011; ARTACHO- CORDÓN et al., 2012). Segundo o INCA, no Brasil foram estimados 57.120 novos casos para 2014 com um risco de 50 a 90 casos a cada 100 mil mulheres (INCA, 2014). As taxas de incidência de câncer de mama são influenciadas, dentre outros fatores, pela idade, história reprodutiva da mulher, predisposição genética, doença benigna prévia, estilo de vida e exposição da mama à radiação (MCPHERSON; STEEL; DIXON, 2000; TRICHOPOULOS et al., 2008). Com base no quadro histopatológico e classificação do câncer é possível estabelecer a melhor estratégia terapêutica individual. Entre as terapias mais aplicadas se encontra a remoção cirúrgica associada a sessões de radioterapia, quimioterapia, imunoterapia e terapia hormonal. Entre os fármacos mais amplamente usados no tratamento se encontram: a doxorrubicina, a ciclofosfamida e os taxanos, como o paclitaxel (SEIDMAN et al., 2008; BERTOLLO, 2010). Porém, essas estratégias terapêuticas são agressivas, dolorosas e repletas de efeitos colaterais, por essa razão se torna necessário o desenvolvimento de novos neoplásicos (IBRAHIM et al., 2002; SEIDMAN et al., 2008; BERTOLLO, 2010). Entre os compostos com potencial antineoplásico se encontram os compostos voláteis isolados das folhas/flores de M. ferruginata, como o β-cariofileno, α-humuleno e β-elemeno. Estes compostos têm apresentado citotoxicidade contra linhagens tumorais, tais como A- 549, HeLa e HT-29 DLD-1, M4BEU, Bel-7402, CT-26, com valores de

IC 50 variando entre 80.3 e 109.7 µg/mL (DUH et al., 1999; TATMAN; MO, 2002; LEGAULT et al., 2003; WANG et al., 2005; TAO et al., 2006; DA SILVA FIGUEIREDO; YANO, 2007; LEGAULT, PICHETTE, 2007). Além destes compostos, a quercetina tem sido descrita na literatura possuir um alto potencial antitumoral (MULHOLLAND et al., 2001; MATERSKA, 2008; MURAKAMI; ASHIDA; TERAO, 2008; HIRPARA et al., 2009). Os mecanismos de ação propostos estão relacionados à regulação do ciclo celular, interação com os locais de ligação do estrogênio tipo II, diminuição da resistência às drogas, indução de apoptose de células tumorais e inibição da atividade da tirosina quinase (XIAO et al., 1998; YOSHIDA et al., 1990). Um estudo realizado por FORMICA e REGELSON (1995) mostrou que a administração da quercetina previne etapas de iniciação e promoção do melanoma induzido quimicamente. Como também AVILA et al. (1994)

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observaram que a quercetina inibiu a proliferação celular da linhagem MDA-MB-468 por meio da inibição da atividade da proteína p53. Esses achados corroboram com os encontrados neste estudo, podendo ser atribuída aos compostos fenólicos, como a quercetina, ou uma ação conjunta com outras substâncias, a atividade antitumoral observada sobre as células MDA-MB-231.

5. 8. 4 Atividade tripanocida do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata A avaliação da atividade tripanocida do extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata foi realizada contra as cepas Y e Colombiana de T. cruzi, após 72 horas de exposição. Os resultados obtidos foram expressos em porcentagem de viabilidade das cepas e estão representados na Figura 57. O extrato bruto, em nenhuma das concentrações avaliadas foi capaz de inibir de forma significativa o crescimento das diferentes cepas de T. cruzi. O grupo controle do DMSO, como esperado, não alterou a porcentagem de viabilidade de nenhuma das cepas (CON: 99,9 ± 0,00; DMSO: 99,9 ± 0,00) enquanto que para o grupo com o fármaco padrão benznidazol a viabilidade das formas epimastigotas foi reduzida (Y: 51,36 ± 1,834; Colombiana: 68,01 ± 3,883) em 31,99% e 48,64% paras cepas Colombiana e Y, respectivamente.

Cepas Y e Colombiana de T. cruzi

A B

100 100

75 75 ** *** 50 50

% Viabilidade % 25 25

0 0 CON BEN125 250 500 CON BEN 125 250 500

Grupos (µg/mL) Figura 57 – Porcentagem da viabilidade das formas epimastigotas das cepas de Tryanosoma cruzi expostas ao extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata, após 72 horas. A – Cepa Y de T. cruzi; B – Cepa Colombiana de T. cruzi. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. CON: Grupo controle de viabilidade; BEN: Fármaco padrão benznidazol a 75 µg/mL.

170

Embora no presente estudo não tenha sido detectada as atividades tripanocida pelo extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata , na literaturas estão descritos atividades relacionadas às espécies deste gênero associadas à presença de ácidos triterpênicos pentacíclicos, em especial, os ácidos ursólico e oleanólico. Esses dois compostos têm sido relatados possuir potente ação tripanocida quando avaliados de forma conjugada em misturas isoméricas (SEPÚLVIDA-BOZA; CASSELS, 1996; CUNHA et al., 2006; PADUCH et al., 2007; FERREIRA et al., 2013). Porém, o mesmo não foi observado por CUNHA et al., (2003a) que verificaram uma maior atividade nas substâncias isoladas. O estudo realizado por CUNHA et al. (2006) revelou que a mistura de ácidos ursólicos e oleanólico apresentaram maior atividade tripanocida (IC 50 de 5,4 µM) que as substâncias isoladas (IC 50 de 17,1 e 12,8 µM, respectivamente). Esse maior efeito pode estar relacionado ao efeito sinérgico entre estas moléculas. Já o sal de potássio do ácido ursólico também revelou um aumento da atividade tripanocida quando comparado com a substância pura, IC 50 de 8,9 µM. Nos testes in vivo , o ácido ursólico e o seu sal derivado, mostraram uma redução significativa da parasitemia em 75,7% e 70,4% respectivamente. No entanto, o mesmo comportamento de redução da parasitemia não foi obtido frente à cepa Boliviana (FERREIRA, 2006). De acordo com FERREIRA et al. (2013) o mecanismo de ação para atividade tripanocida destas substâncias podem estar relacionados aos efeitos imunomoduladores e produção de citocinas pro- inflamatórias. Além dos terpenos, outras substâncias têm apresentado atividade tripanocida, como a miconidina (2-metoxi-6-n-pentil-1,4-dihidroxibenzeno) isolada de M. eriodonta (MARINI-BETTÓLO et al., 1971; SEPÚLVIDA-BOZA; CASSELS, 1996). E também, o cariofileno (sesquiterpeno) e o eugenol (fenilpropanoide), que promoveram a inibição de 67% e 17,34% da viabilidade da cepa Y de T. cruzi, na concentração de 100 µg/mL, respectivamente (LEITE et al., 2013). Estes resultados demonstram o potencial de espécies de Miconia sp. no estudo para a busca de produtos naturais tripanocidas (MOURA, 2006). Na literatura tem sido relatado o potencial antiparasitário dos compostos fenólicos, em especial os flavonoides (TASDEMIR et al., 2006; SEN et al., 2008). TASDEMIR et al. (2006) verificaram que a subclasse dos flavonóis e das flavonas apresentaram efeito letal aos parasitas avaliados, além de apresentarem baixa citotoxicidade em células de mamíferos. Apesar destas classes estarem presentes no

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extrato avaliado de M. ferruginata , possivelmente as concentrações destes metabólicos foram insuficientes para promover uma resposta satisfatória. Desta forma, se faz necessário o estudo das frações ricas em flavonóis e flavonas, como a fração acetato de etila obtida dos extratos etanólicos, para favorecer a avaliação da atividade tripanocida desta espécie.

5. 8. 5 Atividade leishmanicida do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata A avaliação da atividade leishmanicida do extrato etanólico das folhas/flores de M. ferruginata foi realizada frente as cepas BH46 e M2269 de Leishmania sp. Os resultados obtidos foram expressos em porcentagem de viabilidade das cepas e estão representados na Figura 58. O extrato bruto, em nenhuma das concentrações avaliadas foi capaz de inibir de forma significativa o crescimento das diferentes cepas de Leishmania sp. após 72 horas de exposição. O grupo controle do DMSO, como esperado, não alterou a porcentagem de viabilidade de nenhuma das cepas (CON: 99,9 ± 0,00; DMSO: 99,9 ± 0,00) enquanto que o grupo com o fármaco padrão anfotericina

B reduziu a viabilidade (BH46: 54,89 ± 2,435; M2269: 53,53 ± 2,191) em 45,11% e 46,48% para as cepas BH46 e M2269, respectivamente.

Cepas BH46 e M2269 de Leishmaniasp.

A B

100 100

75 75 ** * 50 50

% Viabilidade % 25 25

0 0 CON ANF125 250 500 CON ANF 125 250 500 Grupos (µg/mL) Figura 58 – Porcentagem da viabilidade das cepas de Leishmania sp. expostas ao extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata, após 72 horas. A – Cepa BH46 - Leishmania (leishmania) infantum; B – Cepa M2269 -L. (leishmania) amazonensis. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=9). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. CON: Grupo controle de viabilidade; ANF: Fármaco padrão anfotericida B a 1 µg/mL.

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Contrariamente aos achados do presente estudo, em outras espécies do gênero Miconia tem sido relatada atividade leishmanicida. Por exemplo, a espécie M. langsdorffii apresentou atividade leishmanicida moderada em ensaio in vitro, sobre as formas promastigotas de L. amazonensis. Neste estudo, o extrato bruto hidroalcoólico apresentou um valor de IC 50 de 175,4 mg/mL, enquanto que a fração contendo os ácidos ursólico e oleanólico exibiram maior atividade, com IC 50 de 4,5 µg/mL. Porém, esses triterpenos puros não exibiram atividade isoladamente (IC 50 360,3 e 439,5 respectivamente). Quando avaliados conjugados o valor de IC 50 foi aumentado (IC 50 199,6), mas inferior ao obtido pela fração anteriormente avaliada. Esses dados sugerem que os compostos minoritários presentes na fração apresentam um papel fundamental na atividade leishmanicida (PEIXOTO et al., 2011). Outros compostos, encontradas na M. ferruginata também têm demonstrado potencial leishamicida, entre eles o cariofileno (sesquiterpeno) e eugenol (fenilpropanoide). Na concentração de 100 µg/mL esses compostos promoveram a redução da viabilidade da cepa L. brasiliensis em 100 e 40%, respectivamente (LEITE et al., 2013). Em outro estudo, o eugenol (100 µg/mL) também inibiu o crescimento da cepa L. amazonensis em 100% na fase aguda da infecção, sem afetar a viabilidade das células de macrófagos (UEDA-NAKAMURA et al., 2006). Os derivados de flavonóis e flavonas, como a fisetina, 3-hidroxiflavona, luteolina e quercetina tem apresentado notável potencial leishmanicida, in vitro , com valores de IC 50 de 0,6, 0,7, 0,8, e 1,0 µg/ml, respectivamente. Já os compostos 7,8- dihidroxiflavona e quercetina revelaram maiores atividades leishmanicida e tripanocida em modelos in vivo (TASDEMIR et al., 2006). SEN et al. (2008) mostraram que a quercetina combinada com a albumina do soro aumentou a disponibilidade deste flavonol e intensificou em 75% a redução da carga parasitária de L. donovani. O mecanismo de ação proposto pelos autores, para a quercetina está relacionado à interferência no metabolismo do ferro pelo parasita. Contudo, para a espécie M. ferruginata não foi observado nenhuma atividade, podendo estar relacionado a baixa concentração dos derivado da quercetina no extrato avaliado. Consequentemente, necessita-se avaliar suas frações ricas nestes compostos.

173

5. 8. 6 Ação do extrato aquoso de Miconia ferruginata sobre a viabilidade de PBMC humana , in vitro Os valores médios e desvio padrão correspondentes aos leucogramas para os voluntários participantes do estudo para a avaliação da viabilidade e proliferação de celular estão descritos na Tabela 14. De acordo com os dados, os voluntários apresentaram leucograma dentro dos limites da normalidade para indivíduos adultos.

Tabela 14 – Leucograma dos voluntários saudáveis participantes do estudo de viabilidade e proliferação de celular.

Parâmetros (valor de referência*) Média ± desvio padrão

Número de voluntários 10

Homens 3

Mulheres 7

Idade 24 ± 6 anos

Leucócitos (3,5 - 11 x 10 3/mm 3) 6,818 x 10 3 ± 1,10 Neutrófilos (40-70%) 49,54 ± 5,33 Eosinófilo (0-8%) 2,09 ± 1,31 Linfócitos (20-50%) 44 ± 5,15 Basófilos (0-3%) 0,45 ± 0,65 Monócitos (2-20%) 2,81 ± 1,58 *Valores de referência de acordo com Xavier et al. (2010).

Nos ensaios de viabilidade e proliferação sobre PBMC humanas in vitro, foram utilizados os extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata uma vez que na medicina popular esta é a forma de extração utilizada, para tratar inflamações. O ensaio de viabilidade celular sobre leucócitos humanos foi realizado inicialmente, com o intuito de definir as concentrações não tóxicas dos extratos aquosos para realização do ensaio de proliferação. Para confiabilizar os resultados observados no ensaio posterior de proliferação, as células mononucleares devem se manter viáveis após contato com os extratos, a fim de garantir que as variações observadas não sejam devidas à morte

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celular por toxicidade (OLIVEIRA, 2010; ALMEIDA, 2012). Para isso, foi realizado o teste de exclusão com Azul de Tripan por meio da citometria de fluxo. Na Figura 59 estão representados a análise do percentual de PBMC viáveis, após incubação com os extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata nas concentrações finais de 250 µg/mL, 125 µg/mL, 62,5 µg/mL e 31,2 µg/mL, após 24 horas (Figura 59 A e B) e 5 dias (Figura 59 C e D) de exposição. Os dados mostraram que após 24 horas o extrato aquoso das folhas/flores não reduziu a viabilidade celular na concentração de 250 µg/mL, quando comparado às culturas CON (CON: 97,42 ± 0,4633; E3: 83,66 ± 5,191), enquanto o extrato aquoso do caule foi tóxico nesta concentração (CON: 97,42 ± 0,4633; E4: 82,98 ± 4,02) com p<0,05. Após 5 dias de exposição, a viabilidade celular tanto do extrato aquoso das folhas/flores quanto do caule não foi reduzida em concentrações iguais ou menores que 62,5 µg/mL (CON: 97,73 ± 0,4788; E3: 96,29 ± 0,6265; E4: 94,14 ± 0,7101). Com relação ao grupo solvente (DMSO) este não apresentou diferença significativa entre o percentual de células viáveis das culturas em comparação ao grupo CON, para os diferentes tempos avaliados (24 horas: 96,65 ± 0,8063; 5 dias: 97,40 ±

0,623). O grupo controle de morte, com cloreto de cádmio, nos tempos de 24 (7,55 ± 3,41) e 5 dias (5,77 ± 1,77) reduziu a viabilidade celular em 92,45% e 94,23%, respectivamente.

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A C

100 100 * 75 75

50 50 * * ** 25 * ** 25 **

0 0 CONDMSOCdCl 2 62,5 125 250 31,2 62,5 125 250 CON DMSO CdCl 2

B D 100 * 100 % Viabilidade Celular Viabilidade% * 75 75 * *

50 50

25 25 ** ** ** ** 0 0 CON DMSO CdCl 2 62,5 125 250 CON DMSO CdCl 2 31,2 62,5 125 250 Grupos (µg/mL) Figura 59 – Percentual de viabilidade das PBMC em culturas de 24 horas e 5 dias submetidas aos extratos aquosos de Miconia ferruginata . A – Extrato aquoso das folhas/flores em 24 horas; B – Extrato aquoso do caule em 24 horas; C – Extrato aquoso das folhas/flores em 5 dias; D – Extrato aquoso do caule em 5 dias. Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=5). *p<0,05; **p<0,01 ANOVA seguido pós-teste de Dunns . CON: grupo controle de viabilidade; DMSO: grupo controle do solvente; CdCl 2: grupo controle de morte.

5. 8. 7 Efeito do extrato aquoso de Miconia ferruginata sobre a proliferação de linfócitos humanos O sistema imunológico quando exposto a um antígeno, o reconhece especificamente e passa a secretar citocinas, entre elas a IL-2. Esta interleucina atua como fator de crescimento autócrino, promovendo a expansão clonal e a proliferação dos linfócitos, um importante evento junto à complexa rede de estímulos inflamatórios imune-mediados (BOYMAN et al., 2007; GANGULY; BANDHEKA; SAINIS, 2001). O ensaio de proliferação celular permite verificar o efeito de produtos naturais, concomitamente com mitógenos, sobre o estímulo ou supressão dos linfócitos (PANDIMA DEVI et al., 2003; PHILIPPI et al., 2010). Entre os mitógenos comumente utilizados, está uma lectina obtida de Phaseolus vulgaris , a fitohemaglutinina (PHA) (NOWELL, 1960). Assim, com o objetivo de investigar a possível atividade anti-

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inflamatória dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata , in vitro, avaliou-se o efeito dos mesmos sobre a resposta proliferativa de linfócitos estimulados ou não com o mitógeno PHA, em culturas de 5 dias de exposição. As concentrações testadas foram escolhidas de acordo com os resultados obtidos nos ensaios de viabilidade celular. Inicialmente foi verificado o índice de proliferação de culturas tratadas somente com o extrato, sem estímulo com PHA. De acordo com os resultados obtidos os extratos não induziram a proliferação dos linfócitos, como apresentado na Tabela 15, assim os extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata não possuem efeito mitogênico.

Tabela 15 - Percentual do índice de proliferação de culturas não estimuladas com PHA e tratadas com os extratos aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata Culturas Média ± Desvio padrão Controle 0,01 ± 0,001 E3 45 µg/mL 0,02 ± 0,008

E3 30 µg/mL 0,015 ± 0,004 E3 15 µg/mL 0,015 ± 0,004 E4 30 µg/mL 0,01 ± 0,008 E4 20 µg/mL 0,01 ± 0,008 E4 15 µg/mL 0,005 ± 0,04

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. *p<0,05 - ANOVA seguido de Tukey. E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule.

Os resultados da análise do extrato aquoso das folhas/flores e do caule de M. ferruginata sobre a proliferação de linfócitos estimulados com PHA estão representados na Figura 60. Os dados demonstram que tanto os extratos aquosos das folhas/flores quanto do caule reduziram a proliferação de linfócitos. Para o extrato das folhas/flores, apenas na concentração de 45 µg/mL, houve redução significativa do índice de proliferação (0,588 ± 0,216), quando comparado com as culturas controle estimuladas com PHA (1,988 ± 0,379). Para o extrato do caule houve uma redução concentração dependente do índice de proliferação (30 µg/mL: 0,093 ± 0,025; 20 µg/mL: 0,172 ± 0,053 ;15 µg/mL: 0,410 ± 0,158). Como esperado, o grupo solvente (DMSO) não

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influenciou a proliferação dos linfócitos (1,68 ± 0,310), enquanto que a dexametasona reduziu de forma expressiva a proliferação dos mesmos (0,235 ± 0,084) ambos grupos comparados com as culturas estimuladas com PHA.

2,5

2,0

1, 5

1, 0 **

Índice de Proliferação de Índice ** 0, 5 *** *** *** *** 0

PHA (5 µg/mL) + + + + + + + +

DEXA (8 µg/mL) + E3 ( µg/mL) 15 30 45

E4 ( µg/mL) 15 20 30 Figura 60 - Índice de proliferação de linfócitos expostos aos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata . Os dados foram representando como média e o desvio padrão (n=5). *p< 0,05; **p<0,01; ***p<0,001. ANOVA seguido de Tukey em relação ao grupo PHA. DEXA: grupo controle positivo com a dexametasona 8 µg/mL; E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule.

Na Figura 61 estão demonstrados histogramas representativos das análises realizadas. Os resultados indicam que tanto para o grupo dexametasona, quanto para os grupos expostos aos extrato do caule (30, 20 e 15 µg/mL) e das folhas/flores (45 µg/mL) ocorreram uma diminuição da quantidade de leucócitos, resultando em maior intensidade de fluorescência para região M1 e, refletindo em menores índices de proliferação. A eficácia na redução da proliferação pelos extratos das folhas/flores (45 µg/mL) e do caule (15, 20 e 30 µg/mL) foram de 39,94%, 57,3%, 137,4% e 251,8% em relação à dexametasona a 8 µg/mL. Esses dados mostraram um potente efeito

178

antiproliferativo do extrato do caule maior que a dexametasona. Este efeito inibitório sobre a proliferação linfocitária sugere que os componentes dos extratos aquosos de M. ferruginata , possam modular mecanismos celulares envolvidos no processo inflamatório e, assim, refletir em um possível efeito anti-inflamatório desta espécie.

A B

C D E

M M3 M2 M1 Eventos M4

M5 M6

F G H

CFSE Figura 61 – Histogramas representativos da análise sobre a proliferação dos linfócitos expostos aos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de Miconia ferruginata . A – Histograma das culturas estimuladas com PHA; B – Histograma das culturas estimuladas com PHA e Dexametasona; C, D e E – Histograma das culturas estimuladas com PHA e E3 nas concentrações de 45, 30 e 15 µg/mL, respectivamente; F, G e H – Histograma das culturas estimuladas com PHA e E4 nas concentrações de 30 20 e 15 µg/mL, respectivamente. E3: Extrato aquoso das folhas/flores; E4: Extrato aquoso do caule.

Alguns compostos identificados em M. ferruginata têm apresentado significativos efeitos anti-inflamatórios, entre eles pode-se citar a classe dos flavonoides (SANTANGELO et al., 2007), em especial, os derivados da quercetina (READ 1995; MUTOH et al., 2000; RASO et al., 2001; HAVSTEEN, 2002; ORSOLIC et al., 2004; YOON; BAEK, 2005; BIESALSKI, 2007; SANDHAR et al., 2011). Os mecanismos de ação anti-inflamatória propostos para a quercetina estão relacionados à inibição das enzimas fosfolipase A 2 (PLA 2) (KIM et al., 2004), lipo-oxigenase, ciclo-oxigenase e

179

modulação da enzima iNOS que inibe a produção de óxido nítrico (NO) (YOON; BAEK, 2005; SANTANGELO et al., 2007). Outros estudos têm demonstrado que a quercetina é capaz de inibir a secreção de citocinas pró-inflamatórias, tais como o TNF- α e IL-1 (KIM et al., 2004; LÓPEZ-POSADAS et al., 2008; CAZAROLLI et al., 2008). Além de que vários outros flavonoides também são capazes de diminuir a produção de NO e a expressão da enzima iNOS (SANTANGELO et al., 2007; CAZAROLLI et al., 2008). Além desses, os sesquiterpenos encontrados na M. ferruginata, o α-humuleno e o β-cariofileno tem apresentado propriedades anti-inflamatórias (PASSOS et al., 2007; FERNANDES et al., 2007). A partir do óleo essencial de Cordia verbenacea rico nestes sesquiterpenos foi desenvolvido o fitoterápico Acheflan ®, de grande aceitação no mercado. Este fitoterápico é indicado no tratamento de traumas, tendinites, dores musculares e miofascial (RAMOS, 2006; FERNANDES et al., 2007; MEDEIROS et al., 2007; PASSOS et al., 2007). Estudos têm mostrado que o α-humuleno apresenta rápida absorção, promovendo assim, alívio rápido da dor e inflamação quando comparado a outros anti-inflamatórios comerciais, como o diclofenaco (GREGÓRIO et al.; 2005;

CHAVES et al., 2008). Outras atividades biológicas também têm sido associadas ao α- humuleno, tais como ações inseticida, antioxidante, antimicrobiano, anticancinogênica (WEEL et al., 1999; BOUGATSOS et al., 2003; LEGAULT et al., 2003; KIM et al., 2003; YANG et al., 2003; ALMEIDA et al., 2005 a e b; FERNANDES et al., 2007). LIU et al. (2015) avaliaram o cariofileno sobre atividade convulsiva induzida por ácido caínico. Os autores verificaram que o cariofileno reduziu o score de apreensão e de mortalidade em ratos. Além disso, diminuiu significativamente a geração de malondialdeído (subproduto que induz a peroxidação lipídica) e preservou a atividade da superóxido-dismutase (SOD), catalase (CAT), e glutationa peroxidase (Gpx). Foi observado que o cariofileno também apresentou efeitos anti-inflamatórios cerebrais, reduzindo a expressão de citocinas pró-inflamatória, tais como TNF-α e IL-1b. Estes dados sugerem que o cariofileno tem um potencial protetor sobre convulsão e danos cerebrais, por meio da redução da resposta inflamatória. Assim, estes sesquiterpenos presentes em altas concentrações na M. ferruginata podem ser responsáveis ou co- auxiliar juntamente com outros compostos fenólicos, nos efeitos antiproliferativos observados. Estudos com outras espécies do gênero Miconia tem demonstrado um potencial anti- inflamatório. De acordo com RODRIGUES (2007) as espécies M. rubiginosa e M.

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cabucu podem apresentar propriedades anti-inflamatórias, avaliadas por meio das baixas dosagens de H 2O2 e baixa produção de NO e TNF-α. Em outro estudo in vivo , realizado por VASCONCELOS et al., (2006) foi avaliado o efeito anti-inflamatório dos ácidos ursólico e oleanólico de M. albicans pelo teste de edema de pata induzido por carragenina. Os resultados mostraram que ambos os ácidos apresentaram uma redução significativa do edema de pata. A mistura destes triterpenos apresentou efeito semelhante ao ácido acetilsalicílico.

6 CONCLUSÕES As espécies do gênero Miconia ainda são pouco estudadas quimicamente e farmacologicamente, por isso foi selecionado a espécie Miconia ferruginata para este estudo. Os resultados da presente pesquisa contribuíram de forma significativa para o conhecimento científico desta espécie, amplamente utilizada na medicina popular no município de Diamantina – MG. Foi traçado o perfil químico da M. ferruginata por meio de triagem fitoquímica preliminar e análises cromatográficas dos extratos e frações. A triagem fitoquímica sugeriu a presença de taninos, flavonoides e terpenoides nas folhas/flores e no caule, e de saponinas apenas nas folhas/flores. Esses dados foram confirmados em análises de CLAE-DAD dos extratos etanólicos e aquosos brutos, que evidenciaram a presença das subclasses das flavonas e flavonóis, principalmente, os derivados da quercetina. Além de outros compostos fenólicos como ácidos fenólicos e catequinas. Como também a análise em CLAE-DAD-EM permitiu identificar seis compostos pertencentes às classes químicas dos flavonoides, taninos e dos ácidos fenólicos e outros cinco compostos entre eles os derivados dos ácidos clorogênicos e derivados glicosilados da quercetina. Na análise dos constituintes voláteis por CG-EM foi possível identificar quatorze compostos, sendo eles sesquiterpenos, hidrocarbonetos, monoterpenos, fenilpropanoides e alcoóis. Dentre os compostos majoritários identificados se encontram os sesquiterpenos β-cariofileno e α-humuleno que já foram relacionados a diversas atividades biológicas, tais como antitumoral, anti-inflamatória, antioxidante e antimicrobiana. Nas análises das frações aquosas por CLAE-DAD, apenas das frações 3 e 18 foi possível traçar um perfil químico de maior grau de pureza. Em ambas as frações foi observado um perfil rico em compostos fenólicos, como as catequinas, flavonóis e flavonas. Na fração 3 foi observado também a presença do ácido gálico e na fração 18 a

181

presença da subclasse dos flavonóis derivados da quercetina. As frações obtidas do fracionamento por partição líquido-líquido foram analisadas por CG-EM e CLAE-DAD. Na análise das frações n-hexânicas e diclorometânicas foi observado a presença de esteres graxos de grande importância industrial, o palmitato de etila e o isobutirato de etila, respectivamente. Nas frações acetato foi observado perfil semelhante aos do extrato bruto, rico em flavonas e flavonóis. Os ensaios farmacológicos realizados forneceram resultados interessantes para a espécie M. ferruginata . Nos ensaios de citotoxicidade sobre células normais de mamíferos foi observado que os extratos etanólicos na maior concentração avaliada (500 µg/mL) se mostraram mais tóxicos que os extratos aquosos. Assim as concentrações para avaliar as outras atividades biológicas foi estabelecida em até 500 µg/mL. Para as atividades antibacterianas não foi observado inibição de crescimento bacteriano a 500 µg/mL, isso pode ter ocorrido devido à baixa concentração dos compostos ativos nos extratos avaliados. Contudo, se faz necessários estudos com as frações ou substâncias isoladas para melhor avaliação da atividade antimicrobiana desta espécie. Na avaliação das atividades tripanocida e leishmanicida não foi observado efeito inibitório significativo do extrato etanólico bruto das folhas/flores sobre as cepas avaliadas. Entretanto, foi avaliado apenas o extrato bruto e, por isso, são necessários a avaliação das frações e compostos isolados, que na literatura tem demonstrado potente atividade antiparasitária. Na avaliação antitumoral foi verificado que os extratos aquosos e etanólicos das folhas/flores e do caule apresentam um grande potencial citotóxico dose dependente sobre células de adenocarcinoma de mama. Os valores de IC 50 variaram de 56,44 a 180,4 µg/mL, visto que o fator tempo de exposição influenciou positivamente na resposta antitumoral. Esta atividade possivelmente está relacionada à composição dos extratos ricos em compostos fenólicos, dos quais se destaca os flavonoides. A classe dos flavonoides, em especial a quercetina glicosilada identificada nos extratos etanólicos, tem sido associada a inúmeras atividades biológicas. Em relação à avaliação do efeito citotóxico dos extratos aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata sobre leucócitos humanos, os resultados mostram que não houve indução de morte celular nas culturas tratadas com o extrato nas concentrações inferiores a 125 µg/mL em 24 horas. Já em culturas de 5 dias, a concentração não tóxica para as células foram inferiores a 62,5 µg/mL. Além disso, foi

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demonstrado que os extratos promoveram a inibição significativa da proliferação de linfócitos estimulados por mitógenos, a concentração de 45 a 15 µg/mL. A inibição da proliferação celular reflete, em parte, em uma provável atividade anti-inflamatória da espécie M. ferruginata . A partir destes resultados pode-se sugerir que os efeitos antiproliferativos observados possam estar relacionados com constituintes dos extratos aquosos dentre eles: as catequinas e outros compostos fenólicos, uma vez que o extrato aquoso do caule foi mais ativo que o extrato aquoso das folhas/flores. Provavelmente, estes compostos devem estar relacionados com a ação anti-inflamatória M. ferruginata relatada na medicina popular.

7 PERSPECTIVAS Esses resultados abrem novas perspectivas para a realização de ensaios de triagem de atividade biológica com as frações obtidas dos extratos etanólicos e aquosos das folhas/flores e do caule de M. ferruginata. Como também realizar outras formas de fracionamento para um possível isolamento e caracterização dos constituintes ativos presentes nos extratos brutos, dos quais foram observados potencial antiproliferativo e antitumoral. Além disso, devem-se verificar os prováveis mecanismos intracelulares envolvidos, tanto para os extratos brutos quanto para os possíveis compostos bioativos. Foi observado um possível potencial antioxidante para os extratos aquosos, sendo necessário avaliar e determinar este potencial por meio de outros ensaios específicos. Como também deve-se avaliar este potencial nos extratos etanólicos, uma vez que, o perfil químico destes extratos foi bastante semelhante aos extratos aquosos e, provavelmente, devem apresentar um forte potencial antioxidante. Neste trabalho foi avaliado apenas os extratos de alta polaridade, sendo necessário também avaliar o perfil químico e possíveis atividades biológicas de extratos de baixa polaridade. Isso porque, outras espécies deste gênero, apresentaram forte potencial biológico para os compostos pertencestes a classe dos triterpenos pentacíclicos, que foram obtidos a partir de extratos de baixa polaridade. Assim, se torna necessário confeccionar e avaliar o potencial biológico destes extratos para a espécie M. ferruginata . Além disso, pode-se realizar o fracionamento de tais extratos e verificar a presença e o potencial biológico deste compostos triterpênicos isolados. Sendo que estes estudos posteriores irão contribuir de forma significativa para o conhecimento científico da espécie M. ferruginata .

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226

ANEXO A – Parecer consubstanciado do comitê de ética e pesquisa

227

ANEXO B - Termo de consentimento livre e esclarecido

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Termo de esclarecimento Projeto de pesquisa

ELABORAÇÃO DE EXTRATOTECA E BANCO DE DADOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS A PARTIR DE PLANTAS NATIVAS DA REGIÃO DE DIAMANTINA – MG (VALE DO JEQUITINHONHA)

O objetivo do presente estudo é realizar uma biblioteca contendo dados químicos e atividades biológicas de plantas da região de Diamantina-MG, para o qual você foi escolhido por ter entre 20 e 39 anos, não ter doenças como catapora, lúpus, diabetes, alergia, e não fazer uso regular de anti-inflamatórios. Sua participação no estudo consistirá em doar 10 mL de sangue, que será coletado por punção venosa com tubos a vácuo (da mesma maneira que é coletado quando você faz algum exame de sangue), em data e horário a combinar. A partir do sangue serão obtidos os leucócitos para os experimentos em laboratório. Os riscos de sua participação incluem hematoma (roxo no local da coleta de sangue), dor, tontura e enjôo. A coleta será feita por pessoa treinada, em local limpo e reservado, equipado com maca, utilizando material estéril e descartável. Ao doar seu sangue para este projeto você estará contribuindo para a identificação de plantas da região de Diamantina com atividades biológicas. Os seus dados serão mantidos em sigilo e sua identidade não será revelada. Só os pesquisadores envolvidos no projeto terão acesso aos dados, que serão utilizados apenas para fins de pesquisa e divulgação científica em congressos, livros e revistas. Não está prevista qualquer forma de remuneração pela sua participação no estudo e você não terá nenhuma despesa (portanto, não está previsto nenhuma forma de ressarcimento). Quaisquer dúvidas que possam surgir durante o andamento deste estudo por parte do voluntário poderão ser esclarecidas junto aos membros da equipe responsáveis pelo projeto, pessoalmente ou por telefone. Você poderá recusar e/ou deixar de participar deste estudo a qualquer momento, sem nenhum constrangimento ou prejuízo na sua relação com os pesquisadores e a UFVJM. Os pesquisadores responsáveis por este projeto podem decidir sobre a sua exclusão do estudo por razões científicas, a respeito

228

das quais você deverá ser devidamente informado. Em caso de qualquer dúvida deverá e/ou poderá entrar em contato a qualquer hora com a pesquisadora responsável Profa. Bethânia Alves de Avelar Freitas pelo telefone 38-8837 4054 e e-mail [email protected]. Você também poderá contactar o Comitê de Ética em Pesquisa – UFVJM (35326060) para informações sobre a aprovação do projeto pelo comitê.

Termo de livre consentimento pós-informado

Eu discuti os riscos e benefícios da minha participação no estudo intitulado “Elaboração de extratoteca e banco de dados químicos e biológicos a partir de plantas nativas da região de Diamantina – MG (Vale do Jequitinhonha) ” com os pesquisadores envolvidos. Eu li e compreendi todos os procedimentos que envolvem esta pesquisa e tive tempo suficiente para considerar a minha participação no estudo. Eu perguntei e obtive as respostas para todas as minhas dúvidas. Eu sei que posso me recusar a participar deste estudo ou que posso abandoná-lo a qualquer momento sem qualquer constrangimento ou prejuízo. Eu também compreendo que os pesquisadores podem decidir a minha exclusão do estudo por razões científicas, sobre as quais eu serei devidamente informado. Não terei nenhuma remuneração e nenhum gasto por participar do projeto. Tenho uma cópia deste formulário, o qual foi assinado em duas vias idênticas e rubricadas. Portanto, aqui forneço o meu consentimento para participar do estudo intitulado ““ Elaboração de extratoteca e banco de dados químicos e biológicos a partir de plantas nativas da região de Diamantina – MG (Vale do Jequitinhonha) ”, durante todos os testes realizados. Diamantina, Assinatura do voluntário: Testemunha: ______Testemunha: ______Declaro que expliquei todos os objetivos, benefícios e riscos deste estudo ao voluntário, dentro dos limites de meus conhecimentos científicos. Pesquisador responsável: Bethânia Alves de Avelar Freitas COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFVJM

229

CAMPUS JK - RODOVIA MGT 367 – KM 583 - Nº 5000 - ALTO DA JACUBA CEP 39100-000 DIAMANTINA - MG TELEFONE: 55 XX (38) 3532-1200 COORDENAÇÃO: PROFª. THAIS PEIXOTO GAIAD MACHADO (38) 3532-1240 E 3532-1200 RAMAL 1240 [email protected]

230

ANEXO C – Autorização para coleta da espécie Miconia ferruginata .

231

ANEXO D – Autorização para acesso ao patrimônio genético

232

233

APÊNDICE A – Espectros de Massas dos compostos identificados por meio análise por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta

Espectro de massas da substância 3-hexen-1-ol ( 1) obtido para o tempo de retenção de 4,165 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 95% (B).

Espectro de massas da substância 1-octen-3-ol ( 2) obtido para o tempo de retenção de 7,137 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 98% (B).

234

Espectro de massas da substância isoborneol ( 3) obtido para o tempo de retenção de 14,399 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 91% (B).

Espectro de massas da substância eugenol ( 4) obtido para o tempo de retenção de 22,071 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 97% (B).

Espectro de massas da substância α-copaeno ( 5) obtido para o tempo de retenção de 23,057 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 94% (B).

235

Espectro de massas da substância β-cubebeno ( 6) obtido para o tempo de retenção de 23,580 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 90% (B).

Espectro de massas da substância β-elemeno ( 7) obtido para o tempo de retenção de 23,653 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 91% (B).

Espectro de massas da substância β-cariofileno ( 8) obtido para o tempo de retenção de 24,994 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta DC. (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 95% (B).

236

Espectro de massas da substância α-humuleno ( 9) obtido para o tempo de retenção de 26,369 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 96% (B).

Espectro de massas da substância germacreno D ( 10 ) obtido para o tempo de retenção de 27,406 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 92% (B).

Espectro de massas da substância pentadecano ( 11 ) obtido para o tempo de retenção de 28,328 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 97% (B).

237

Espectro de massas da substância hexadecano ( 12 ) obtido para o tempo de retenção de 32,264 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG- EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 97% (B).

Espectro de massas da substância hexadecino ( 13 ) obtido para o tempo de retenção de 34,811minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 92% (B).

Espectro de massas da substância 8-heptadeceno ( 14 ) obtido para o tempo de retenção de 35,176 minutos da análise por cromatografia em fase gasoso acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) das partes aéreas frescas de Miconia ferruginta (A). Espectro de massas obtido na espectroteca com índice de similaridade de 97% (B).

238

APÊNDICE B – Espectros de massa obtidos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata . Intensidade Intensidade

m/z Espectro de massas para o ácido quínico ( 15 ), obtido para o tempo de retenção de 11,3 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata. Intensidade Intensidade

m/z Espectro de massas para o ácido monocafeoilquínico ( 16 ), obtido para o tempo de retenção de 15,5 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

239

Intensidade Intensidade

m/z Espectro de massas para a catequina ( 17 ), obtido para o tempo de retenção de 16,2 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

m/z Espectro de massas para a subclasse do flavonol ( 18 ), obtido para o tempo de retenção de 17,1 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

240

Intensidade Intensidade

m/z Espectro de massas para a quercetina-O-hexose ( 19 ), obtido para o tempo de retenção de 18,2 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

m/z Espectro de massas para a quercetina-O-pentose ( 20 ), obtido para o tempo de retenção de 19,0 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

241

Intensidade Intensidade

m/z Espectro de massas para a quercetina-O-deoxihexose ( 21 ), obtido para o tempo de retenção de 19,4 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

m/z Espectro de massas para a subclasse das flavonas ( 22 ), obtido para o tempo de retenção de 27,5 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

242

Intensidade Intensidade

m/z Espectro de massas para a subclasse das flavonas ( 22 ), obtido para o tempo de retenção de 28,0 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

m/z Espectro de massas para a subclasse das flavonas ( 22 ), obtido para o tempo de retenção de 28,8 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

243

Intensidade Intensidade

m/z Espectro de massas para a subclasse das flavonas ( 22 ), obtido para o tempo de retenção de 31,8 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

244

APÊNDICE C - Espectro na região do ultravioleta-visível obtidos na análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata Intensidade Intensidade

nm Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 1.78 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata . Representação estrutural do ácido gálico ( 26 ) identificado neste espectro. Intensidade Intensidade

nm Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 2.49 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata .

245

Intensidade Intensidade

nm Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 14.16 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 3 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata .

246

APÊNDICE D - Espectro na região do ultravioleta-visível obtidos na análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata Intensidade Intensidade

nm Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 1.77 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata . Intensidade Intensidade

nm Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 8.70 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata .

247

Intensidade Intensidade

nm Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 11.23 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

nm Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 13.99 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata .

248

Intensidade Intensidade

nm Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 15.58 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

nm Espectro na região do ultravioleta-visível para o pico com tempo de retenção de 17.12 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração 18 obtida a partir do fracionamento em coluna Sephadex LH-20 do extrato aquoso das folhas/flores de Miconia ferruginata .

249

APÊNDICE E - Espectros na região do Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata. Intensidade Intensidade Flavona Flavona TR= 26,38 TR= 26,38

nm Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 14.01 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata . Intensidade Intensidade

nm Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 14.86 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

250

Intensidade Intensidade

nm Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 15.14 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

nm Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 15.60 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

251

Intensidade Intensidade

nm Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 16.58 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

nm Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 17.13 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

252

Intensidade Intensidade

nm Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 26.38 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

nm Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 31.17 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico das folhas/flores de Miconia ferruginata .

253

APÊNDICE F - Espectros na região do Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata. Intensidade Intensidade

nm Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 15.98 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

254

Intensidade Intensidade

nm Espectro UV-Vis do pico com tempo de retenção de 18.38 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 18.83 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata .

255

Intensidade Intensidade

nm Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 19.11 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata .

Intensidade Intensidade

nm Espectro Ultravioleta-Vísivel (UV-Vis) do pico com tempo de retenção de 20.85 minutos da análise em cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE- DAD) da fração acetato de etila obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato etanólico do caule de Miconia ferruginata .