Universidade Estadual De Campinas Instituto De Biologia

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

KALEB PRETTO GATTO

“COMPARATIVE MOLECULAR CYTOGENETICS OF GENUS Pseudis (ANURA, HYLIDAE) AND GENOMIC ANALYSIS OF THE SEX CHROMOSOMES OF Pseudis tocantins”

“CITOGENÉTICA MOLECULAR COMPARATIVA DO GÊNERO Pseudis (ANURA, HYLIDAE) E ANÁLISE GENÔMICA DOS CROMOSSOMOS SEXUAIS DE Pseudis tocantins”

Campinas 2018

KALEB PRETTO GATTO

“COMPARATIVE MOLECULAR CYTOGENETICS OF GENUS Pseudis (ANURA, HYLIDAE) AND GENOMIC ANALYSIS OF THE SEX CHROMOSOMES OF Psesudis tocantins”

“CITOGENÉTICA MOLECULAR COMPARATIVA DO GÊNERO Pseudis (ANURA, HYLIDAE) E ANÁLISE GENÔMICA DOS CROMOSSOMOS SEXUAIS DE Pseudis tocantins”

Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Cell and Structural Biology, in the area of Cell Biology.

Tese de doutorado apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas para a obtenção do título de Doutor em Biologia Celular e Estrutural, na área de Biologia Celular.

Este arquivo digital corresponde à versão final da tese defendida pelo aluno Kaleb Pretto Gatto e orientada pela professora Dra. Luciana Bolsoni Lourenço Morandini.

Orientadora: Profa. Dra. Luciana Bolsoni Lourenço Morandini

Campinas 2018

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Luciana Bolsoni Lourenço (Orientadora)

Prof. Dr. Fausto Foresti

Profa. Dra. Karen Ventura

Profa. Dra. Cinthia Aguirre Brasileiro

Profa. Dra. Mariana Lucio Lyra

Os membros da Comissão Organizadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

Dedico esse trabalho a todos os mestres que, de alguma forma, me fizeram ter a paixão pela ciência e a vontade de desvendar o desconhecido na natureza.

Agradecimentos Agradeço a minha orientadora, professora Dra. Luciana Bolsoni Lourenço, por ter aceitado a orientação do doutorado e encarado a empreitada de desvendar um pouco mais a evolução dos cromossomos sexuais em Pseudis. Pelos incentivos prestados, pelo conhecimento passado, não só teórico em relação à pesquisa, mas também quanto a ciência em geral e a postura ética que um pesquisador deve ter. Agradeço também à professora Dra. Carmen Sílvia Busin, não só pela doação de material para a realização desse trabalho, mas principalmente por ser uma das principais responsáveis por eu estar onde estou hoje, seja com o ensino de biologia celular em sala de aula, seja como minha orientadora na iniciação científica ou como grande amiga que sempre foi. Um muito obrigado aos professores do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional pelos ensinamentos passados durante todos esses anos no Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural. Especialmente ao professor Dr. Edson Rosa Pimentel e à professora Dra. Shirlei Maria Recco-Pimentel. A special thanks to Professor Dr. Jeramiah J. Smith for accepting me in his lab for my abroad internship to perform the genomic analysis presented in this work. Dr. Smith helped a lot and provided everything that was necessary to improve the knowledge about the sex chromosomes in P. tocantins. Agradeço às professoras Dras. Ana Cristina Prado Veiga-Menoncello, Eliana Forni Martins e Maria Luiza Silveira Mello pela leitura do meu trabalho de tese e contribuições durante o exame de qualificação de doutorado. Agradeço aos professores Drs. Fausto Foresti, Karen Ventura, Cynthia Aguirre Brasileiro e Mariana Lúcio Lyra por terem aceitado fazerem parte da banca de avaliação do meu doutorado e pelas contribuições dadas ao texto da tese. Agradeço aos colegas de laboratório Karin, Ariane, Renata Tenório, Renata Alitto, Marcos, Jessika, Isabella, Stephanne, Gabriela e Letícia, que aguentaram o meu mau humor matinal, meu jeito “delicado” de ser, pelas ótimas discussões científicas e político- filosóficas e por todos os momentos em que pudemos dar umas boas risadas. Em especial, agradeço à Alessandra Ferreira da Costa por todo o auxílio dispensado durante o meu período no Laboratório de Estudos Cromossômicos, ao William, pela ajuda nas expedições de coleta e à Karin pela ajuda na realização da técnica de CGH nesse trabalho. Um agradecimento especial à “agregada” do nosso laboratório. Essa louca que me faz rir demais, que fez parte de momentos muito alegres da minha vida, que realizou comigo uma das melhores viagens que já fiz. Sim, você Denise, você foi importante demais nessa minha caminhada acadêmica. Um agradecimento e confissão de saudades aos meus ex-colegas de laboratório e do curso de pós-graduação, que tanto se fizeram presentes durante toda essa caminhada. Em especial ao professor Dr. Daniel Pacheco Bruschi pela grande amizade e contribuições na minha vida acadêmica. À Dra. Cíntia Pelegrineti Targueta de Azevedo Brito pela amizade, pelas boas discussões que tivemos e por toda a ajuda dispensada. À Dra. Juliana Nascimento, por toda a amizade que tivemos e ajuda mútua durante a nossa caminhada.

E ao professor Dr. Stenio Eder Vittorazzi por toda a ajuda já dispensada, pela amizade e bons momentos de descontração juntos. Agradeço às professoras Dras. Daniela de Melo e Silva e Mariana Pires de Campos Telles pela disponibilização de estrutura física em seus laboratórios na Universidade Federal de Goiás para a obtenção de preparações cromossômicas de Pseudis tocantins. Agradeço aos funcionários da secretaria da pós-graduação do Instituto de Biologia, em especial à secretaria do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural Líliam Alves Senne Panágio por toda a atenção dispensada durante o meu doutorado. I thank to Melissa Keinath, Cody Saraceno, Brad Osborne, Mackenzie Sanson, Zach Fontnebary, Vladimir Timoshevsky and Nataliya Timoshesvkaya, my labmates in the University of Kentucky during my period abroad. For all the help dispensed to me and for the reception in the lab. A special thanks to Ms. Eileen Zaah for all the help with the bureaucratic procedures that made me a student of the University of Kentucky. To my friends Andrea and Vitor that I made in USA. You were very important in my life when I was in Lexington. Without you guys it would be really difficult. Because of you I had my best moments in USA. Agradeço aos meus familiares, principalmente meus pais Neuromar e Rosmari, por todo o amor, carinho e incentivos durante toda a minha caminhada nesse mundo. Ao meu amigo que foi o grande responsável por eu saber falar um pouco de inglês hoje em dia e por todos os momentos de amizade sincera. Sim Pedro, sem você teria sido bem mais difícil. Juntamente com o Pedro, um agradecimento ao meu melhor amiguinho Costelinha (in memoriam), que foi a criatura responsável por me fazer muito feliz e me arrancar os sorrisos mais sinceros que já dei na vida. Agradeço aos meus amiguines por todos os momentos que tivemos juntos, sem vocês (Nata, Pega, Cass, Funny, Baiano, Jones, Carol e Joji,) a “bombação” não é a mesma. Agradeço a esse povo que me aguenta até no final de semana e que mora comigo, Guilherme, Paula e Carol. Por momentos divertidos ao som de “Meia Lua” ou uma polka russa qualquer, bem como por todas as “gordices” compartilhadas. Agradeço aos professores Dr. Diego José Santana, Dr. Raul Maneyro e Dr. Mauro Teixeira Jr. por gentilmente terem autorizado o uso de fotos de espécies de Pseudis que estão presentes na introdução desse trabalho. Agradeço às pessoas que me auxiliaram em expedições de coletas realizadas durante o meu doutorado: Guilherme Bouvé, Matheus Neves e Lucas Mariotto. Por último, mas não menos importante, agradeço às agências de fomento que, por meio dos impostos pagos pelo contribuinte brasileiro, possibilitaram a realização desse trabalho. À FAPESP (#2014/23542-6) pelo financiamento ao projeto, ao CNPq (#140814/2015-9) pela concessão da bolsa de estudos no Brasil e à CAPES (PDSE 99999.006901/2015-08) pela concessão da bolsa de estudos do programa PDSE que possibilitou o meu estágio no exterior.

I. Resumo Diversos trabalhos, principalmente com mamíferos e aves, têm acrescentado muitas informações sobre a evolução de cromossomos sexuais. Porém, poucos são os trabalhos com cromossomos sexuais de anfíbios, um grupo que apresenta espécies com diferentes níveis de heteromorfismo sexual cromossômico. Pseudis tocantins, espécie de anuro com heterogametia feminina (ZZ/ZW), possui cromossomos sexuais altamente heteromórficos, sendo o cromossomo W submetacêntrico e maior que o cromossomo Z metacêntrico. A diferença de tamanho e morfologia entre esses cromossomos é dada pela amplificação da heterocromatina intersticial em Wq, a qual apresenta grande acúmulo do DNA satélite PcP190. Os cromossomos sexuais de P. tocantins também diferem na posição das NORs, sendo esta intersticial em Zq e pericentromérica em Wq. Com base na morfologia cromossômica e localização das NORs, os cromossomos do par 7 nas outras espécies de Pseudis (par 5 em Pseudis cardosoi) são inferidos como homeólogos aos cromossomos sexuais de P. tocantins. Porém, não há evidências adicionais que corroborem essa hipótese de homeologia. Também não há qualquer informação sobre o sistema de determinação de sexo das outras espécies de Pseudis. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi analisar a diferenciação dos cromossomos sexuais em Pseudis, investigando sobre a ocorrência do DNA satélite PcP190 e de heteromorfismo sexual cromossômico em Pseudis bolbodactyla, P. cardosoi, P. fusca, P. minuta, P. paradoxa e em Pseudis sp. (aff. fusca) levando em conta as relações filogenéticas inferidas para esse grupo. Adicionalmente, a composição molecular dos cromossomos sexuais de P. tocantins foi investigada com base no sequenciamento de nova geração de cromossomos Z e W microdissecados bem como do genoma de macho e de fêmea dessa espécie. O DNA satélite PcP190 foi mapeado nos cromossomos portadores das NORs em P. bolbodactyla, P. cardosoi, P. fusca, P. minuta, P. paradoxa e em Pseudis sp., corroborando a hipótese de homeologia desses cromossomos para com os cromossomos sexuais de P. tocantins. Em P. bolbodactyla e Pseudis sp. o DNA satélite PcP190 mostrou sinais de hibridação somente em fêmeas. Experimentos de hibridação genômica comparativa confirmaram os cromossomos portadores das NORs e dos sítios PcP190 como sendo os cromossomos sexuais em P. bolbodactyla e Pseudis sp. Mapeando os dados citogenéticos em uma árvore de espécies foi possível a inferência de três eventos de inversão cromossômica: (a) uma inversão paracêntrica no ancestral comum a P. bolbodactyla + P. fusca + P. paradoxa + Pseudis sp. + P. tocantins, que levou as NORs de uma região distal (como observado em P. cardosoi, P. minuta e em quase todas as espécies de Lysapsus) para uma região mais próxima do centrômero; (b) uma inversão pericêntrica no ancestral comum a P. fusca + Pseudis sp. + P. tocantins, que levou o sítio PcP190 do braço curto (estado observado em P. bolbodactyla, P. cardosoi, P. minuta e P. paraoxa) para o braço longo e (c) uma inversão paracêntrica no cromossomo W de P. tocantins. A inversão paracêntrica no cromossomo W de P. tocantins pode estar relacionada ao acúmulo de heterocromatina observado no braço longo desse cromossomo, pois pode ter favorecido a supressão de recombinação entre os cromossomos Z e W. Por fim, o sequenciamento de amostras microdissecadas dos cromossomos sexuais de P. tocantins permitiu sugerir que estes poderiam ser pelo menos parcialmente homeólogos aos cromossomos 4 e 10 de Xenopus tropicalis. Além disso, o sequenciamento dos cromossomos Z e W bem como do genoma de macho e fêmea de P. tocantins sugere grande acúmulo de elementos transponíveis no cromossomo W de P. tocantins.

II. Abstract Several studies using mainly mammals and birds have added valuable information on sex chromosome evolution. However, there are only a few works with sex chromosomes of amphibians, which is a group with different levels of sex chromosome heteromorphism. Pseudis tocantins, an anuran species with female heterogamety (ZZ/ZW), has highly heteromorphic sex chromosomes, with the submetacentric W chromosome being larger than the metacentric Z chromosome. Size difference occurs due to amplification of the interstitial heterochromatin in Wq, which shows accumulation of PcP190 satellite DNA. Pseudis tocantins sex chromosomes also differs in NOR position, with the NOR being interstitial in Zq and pericentromeric in Wq. Based on morphology and NOR location, the chromosomes of pair 7 of other Pseudis species (pair 5 in P. cardosoi) are inferred as homeologues of the sex chromosomes of P. tocantins. However, additional evidence that corroborate with this homeology hypothesis is missing. Furthermore, there are no information about the sex determination system in the other Pseudis species. Therefore, the goal of this study was to analyze the sex chromosome differentiation in Pseudis by investigating the presence of the PcP190 satellite DNA and sex chromosome heteromorphism in P. bolbodactyla, P. cardosoi, P. fusca, P. minuta, P. paradoxa and Pseudis sp. (aff. fusca) in the light of the phylogenetic relationships previously inferred for these species. We also used next-generation sequencing of male and female genomes and microdissected samples of Z and W chromosomes to investigate the molecular composition of the sex chromosomes of P. tocantins. The PcP190 satellite DNA was mapped to the NOR-bearing chromosomes of P. bolbodactyla, P. cardosoi, P. fusca, P. minuta, P. paradoxa and Pseudis sp., corroborating the hypothesis of homeology of these chromosomes with the sex chromosomes of P. tocantins. In P. bolbodactyla and Pseudis sp. there are signals of PcP190 hybridization only in females. Comparative genomic hybridization confirmed that the chromosome that bears the NOR and PCP190 site is the W chromosome in P. bolbodactyla and Pseudis sp. By plotting the cytogenetic data in a species tree three chromosome inversions could be inferred: (a) a paracentric inversion in the common ancestor of P. bolbodactyla + P. fusca + P. paradoxa + Pseudis sp. + P. tocantins, which moved the NORs from a distal region (character state observed in P. cardosoi, P. minuta and almost all Lysapsus species) to a region closer to the centromere; (b) a pericentric inversion in the common ancestor of P. fusca + Pseudis sp. + P. tocantins, that moved the PcP190 site from the short arm (condition observed in P. bolbodactyla, P. cardosoi, P. minuta and P. paradoxa) to the long arm; and (c) a paracentric inversion in the W chromosome of P. tocantins. The paracentric inversion in the W chromosome of P. tocantins could have favored heterochromatin amplification in the long arm of this chromosome, since it may have enlarged the non-recombining region between Z and W chromosomes. Lastly, next-generation sequencing of microdissected samples of the sex chromosomes of P. tocantins and comparative analysis with published genomes suggest that the Z and W chromosomes of P. tocantins are likely homeologous to chromosomes 4 and 10 of Xenopus tropicalis. Additionally, data from Z and W chromosomes assemblies together with reads from male and female genomes suggest a large accumulation of transposable elements in the chromosome W of P. tocantins.

Sumário I. Resumo ...... 8 II. Abstract ...... 9 III. Introdução ...... 11 III.1. Cromossomos sexuais e determinação de sexo ...... 11 III.1.1. Diferenciação dos cromossomos sexuais ...... 12 III.1.2. Cromossomos sexuais em anfíbios anuros ...... 15 III.1.3. As novas tecnologias de sequenciamento e suas contribuições para os estudos de cromossomos sexuais ...... 18 III.2. DNAs repetitivos e sua participação na diferenciação de cromossomos sexuais ...... 22 III.2.1. Famílias multigênicas: genes de RNA ribossomal ...... 22 III.2.2. Elementos transponíveis ...... 23 III.2.3. DNAs satélites ...... 24 III.3. Cromossomos sexuais e DNA repetitivo em Pseudis: teria o DNA satélite PcP190 um papel importante na diferenciação de cromossomos sexuais no gênero? 29 II.3.1. Relações filogenéticas e taxonomia dos gêneros Pseudis e Lysapsus ...... 29 III.3.2. Características citogenéticas de Pseudis e Lysapsus ...... 32 IV. Objetivo ...... 33 IV.1. Objetivo geral ...... 33 IV.2. Objetivos específicos ...... 33 V. Resultados e Discussão ...... 34 Capítulo 1: Sex chromosome differentiation in the frog genus Pseudis involves satellite DNA and chromosome rearrangements ...... 36 Capítulo 2: Satellite DNA mapping and molecular phylogenetics in Pseudis fusca (Hylidae, Pseudinae) clarify sex chromosomes evolution in paradoxical frogs ...... 55 Capítulo 3: Análise da composição molecular dos cromossomos sexuais de Pseudis tocantins (Anura, Hylidae) por meio de sequenciamento de nova geração ...... 72 VI. Considerações Finais e Conclusões ...... 93 VII. Referências ...... 96 VIII. Anexo I ...... 119 IX. Anexo II ...... 120 X. Anexo III: The mitochondrial genome of the endemic Brazilian paradoxical frog Pseudis tocantins (Hylidae) ...... 121 XI. Anexo IV: Aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) ...... 128 XII. Anexo V: Declaração sobre direitos autorais ...... 129

III. Introdução Muito já se sabe sobre os processos de surgimento e diferenciação de cromossomos sexuais em grupos como mamíferos e aves (revisão de Graves 2006; Graves 2008; Ellegren 2011; Ezaz e Graves 2012). Já para outros grupos de vertebrados há pouca informação sobre cromossomos sexuais heteromórficos e, especialmente, sobre qual o gene de determinação sexual (revisão de Ezaz e Graves 2012). Na ordem Anura, são observadas tanto espécies com sistema de determinação sexual XX/XY quanto espécies com sistema ZZ/ZW, sendo encontrados cromossomos sexuais em diferentes estágios de diferenciação. Enquanto em várias espécies os cromossomos sexuais são homomórficos, outras apresentam cromossomos sexuais bastante diferenciados (revisão em Schmid et al. 2012). O estudo de grupos que apresentam espécies com cromossomos sexuais em diferentes estágios de diferenciação pode revelar interessantes aspectos da evolução desses cromossomos. III.1. Cromossomos sexuais e determinação de sexo A determinação sexual em vertebrados pode ser ativada por fatores ambientais (ESD – environmental sex determination) ou pode ser dada por ação de um gene principal que leva à diferenciação de gônadas masculinas ou femininas (GSD – genetic sex determination). No caso do mecanismo ESD, presente em vários répteis e algumas espécies de peixes, o sexo de determinado organismo será definido por fatores exógenos, como por exemplo a temperatura de incubação dos ovos, que desencadeiam a transcrição diferencial de genes que comandam a diferenciação das gônadas (revisão de Valenzuela 2004). Sobre os mecanismos moleculares de determinação de sexo durante o período termosensível pouco se conhece ainda. Diferentemente dos organismos com ESD, onde não há diferenças entre os genótipos/genomas de machos e fêmeas, nos organismos com GSD essas diferenças ocorrem, de modo que um dos sexos produz somente um tipo de gameta (sexo homogamético) enquanto o outro produz dois tipos de gametas com genótipos distintos em relação a genes de determinação de sexo (sexo heterogamético). Nos organismos GSD as diferenças genéticas podem consistir em diferenças alélicas referentes a um único locus, ou na existência de um locus sexo-específico (como SRY em mamíferos) ou em sistemas que se baseiam na dosagem de algum gene que participa da cascata de diferenciação sexual (revisão de Ayling e Griffin 2002; Ferguson-Smith 2007; Graves 2008). Os cromossomos portadores de locus de determinação de sexo constituem os cromossomos sexuais das espécies com GSD. Nos mamíferos marsupiais e placentários, o gene de determinação sexual é denominado SRY, um parálogo de SOX3 que faz parte da família de genes SOX, que codificam fatores de transcrição (Sinclair et al. 1990; Berta et al. 1990; revisão de Goodfellow e Lovell-Badge 1993; Graves 2008). O gene SRY é ativado por diversos fatores upstream, dentre eles o gene SF1 (steroidogenic fator 1). Uma vez ativado, o SRY regula a expressão do gene SOX9, que por sua vez ativa a expressão de FGF9. A expressão de FGF9 induz uma cascata que é controlada por alguns genes, dentre eles DMRT1, que culmina na diferenciação de células de Sertoli, que são cruciais para o

12 desenvolvimento das gônadas masculinas (revisão de Graves e Peichel 2010). Além de toda essa cascata de genes envolvidos na diferenciação de gônadas masculinas, a expressão de genes como SOX9 e FGF9 reprime a expressão do regulador β-catenina bem como do gene WNT4, que promovem a diferenciação de ovários (revisão de Graves e Peichel 2010). Diferentemente dos mamíferos, o sexo heterogamético em aves é o feminino, sendo que nas aves neognatas o cromossomo W degenerado é bastante menor em relação ao Z, enquanto nas aves paleognatas o cromossomo W é quase do mesmo tamanho que o Z (Ansari et al. 1988; revisão de Graves 2008). Nas aves, o gene de determinação de sexo é o DMRT1 (Smith et al. 2009), que está presente no cromossomo Z (Nanda et al. 2000), sendo assim proposto que a determinação de sexo em aves ocorra por um mecanismo dependente da dosagem do gene DMRT1, em que duas cópias do gene são necessárias para levar ao desenvolvimento de gônadas masculinas (Nanda et al. 2000; Nanda et al. 2008; revisão de Ferguson-Smith 2007; Graves 2008). Em Squamata e Testudines, nenhum gene de determinação sexual foi identificado até o momento para organismos com GSD. Já para peixes, apenas um gene de determinação sexual é conhecido, tendo sido identificado em Oryzias latipes e denominado DMY. O gene DMY, um parálogo do gene DMRT1, exerce o papel de determinação sexual, como mostrado em experimentos com reversão sexual em machos geneticamente XX e em machos nocautes para esse gene (Paul-Prasanth et al. 2006; Matsuda et al. 2007; revisão de Graves e Peichel 2010). Em anfíbios, somente um gene candidato de determinação sexual foi descrito até o momento. Em Xenopus laevis, o gene DM-W, um parálogo do gene DMRT1, foi isolado e encontra-se em uma única cópia no cromossomo W sendo altamente expresso durante a fase de determinação de sexo nessa espécie (Yoshimoto et al. 2008). Adicionalmente, Yoshimoto et al. (2010) mostram que é um gene dominante-negativo, atuando como um inibidor da cascata de diferenciação sexual que leva à formação de gônadas masculinas. Buscas no genoma de Xenopus tropicalis mostram que o gene DM-W é ausente nessa espécie. Bewick et al. (2011) isolaram por PCR o gene DM-W em outras espécies do gênero Xenopus e inferem que esse gene surgiu após a divergência entre X. laevis e X. tropicalis. III.1.1. Diferenciação dos cromossomos sexuais Os cromossomos sexuais se originam a partir de pares autossômicos após a aquisição de um locus de determinação de sexo (Ohno 1967). Após a aquisição desse locus, a supressão da recombinação nessa região leva progressivamente ao acúmulo de diferenças entre os cromossomos X/Z e Y/W (Muller 1964; revisão de Graves 2006 e 2008). A supressão de recombinação previne a quebra dos linkages de determinação sexual e possibilita que mutações sejam fixadas no cromossomo Y/W (revisão de Ayling e Griffin 2002; Bergero e Charlesworth 2009). Sendo assim, progressivamente, os cromossomos do sexo heterogamético (Y e W) perdem genes e ficam expostos a forças seletivas especiais, constituindo assim a região mais variável dos genomas dos animais (Bull, 1983; Charlesworth et al. 2005; Graves, 2008) (Figura 1). A existência de espécies com cromossomos sexuais heteromórficos, com leve heteromorfismo ou até indiferenciados morfologicamente mostra que há diferentes graus de heteromorfismo

13 resultantes de diferentes estágios e processos na evolução dos cromossomos sexuais (Bull, 1983).

Figura 1. Esquema do processo de degeneração do cromossomo Y/W, baseado em Graves (2008), desde a aquisição de um locus de determinação de sexo até a degeneração devido à falta de recombinação com o cromossomo X/Z.

Durante o processo de evolução, os cromossomos sexuais passam por diversas mudanças na sua composição molecular e morfologia (revisão de Graves 2008; Schartl et al. 2015). As diferenças podem resultar de rearranjos como inversões, translocações, bem como amplificação/deleção de segmentos heterocromáticos (revisão de Ayling e Griffin 2002). Uma das questões que, por muito tempo, ficou em debate, principalmente nos estudos dos cromossomos sexuais de serpentes, é sobre qual seria o processo inicial para a diferenciação morfológica dos cromossomos sexuais. Historicamente, diversos trabalhos em serpentes hipotetizam os passos da diferenciação morfológica e molecular

14 dos cromossomos sexuais. Ohno (1967) postula, baseado no trabalho comparativo de serpentes realizado por Beçak et al. (1964), que eventos de inversão cromossômica podem ser o primeiro passo da diferenciação morfológica dos cromossomos sexuais heteromórficos. Serpentes da família Boidae (família basal em relação à Viperidae) apresentam cromossomos sexuais homomórficos, enquanto na família Viperidae os cromossomos sexuais são altamente diferenciados, com cromossomo W bastante degenerado. Na família Colubridae, os cromossomos sexuais heteromórficos só são distinguíveis um do outro pela posição do centrômero, mostrando a ocorrência de uma inversão pericêntrica no cromossomo W, o que foi interpretado por Ohno (1967) como uma condição intermediária entre aquelas observadas em Boidae e Viperidae. Por outro lado, poucos anos após o trabalho de Ohno (1967), surgem argumentos que defendem o acúmulo de heterocromatina também como o primeiro passo na diferenciação de cromossomos sexuais (Ray-Chaudhuri et al. 1971, Singh et al. 1976, 1980). O acúmulo de segmentos de DNA repetitivo, os quais constituem os blocos heterocromáticos, podem gerar assincronia no padrão de replicação dos dois cromossomos, dessa forma auxiliando na supressão da recombinação entre Z e W (Singh et al. 1976, 1980). Análises do DNA repetitivo BKM nos cromossomos sexuais de serpentes pertencentes às mesmas famílias analisadas por Beçak et al. (1964) mostram que o mesmo já se mostra acumulado no cromossomo W em Colubridae, e padrão similar é observado em Viperidae (Singh et al. 1976, 1980). Mais recentemente, estudos filogenéticos (revisão de Oguiura et al. 2009; Pyron et al. 2013) apontam a família Boidae (cromossomos sexuais homomórficos) como mais basal em relação às outras famílias citadas e que Viperidae (cromossomos sexuais altamente diferenciados) é grupo-irmão de um grande clado que inclui, dentre outras famílias, a família Colubridae (cromossomos sexuais pouco diferenciados). Em duas espécies da família Boidae foi demonstrado haver um sistema de determinação de sexo do tipo XX/XY, sendo os cromossomos sexuais homomórficos (Gamble et al. 2017). Entretanto as serpentes das famílias Viperidae e Colubridae, que detêm sistemas de determinação de sexo do tipo ZZ/ZW, compartilham uma origem comum dos cromossomos sexuais. Porém o processo de diferenciação dos cromossomos sexuais pode ter ocorrido independentemente em cada uma das linhagens que deram origem às espécies atuais de Viperidae e Colubridae (Oguiura et al. 2009). Matsubara et al. (2006) postulam, com o uso de mapeamento citogenético de cDNAs, que provavelmente a diferenciação dos cromossomos sexuais em serpentes das famílias Viperidae e Colubridae iniciou na região distal do braço curto do proto-cromossomo sexual ancestral a partir da aquisição de um locus de determinação de sexo, que favoreceu a ocorrência de rearranjos cromossômicos. Os mesmos autores ainda sugerem que a ocorrência desses rearranjos cromossômicos teria levado à supressão da recombinação nessa região sexo-específica. Abordagens genômicas evidenciaram que a supressão da recombinação entre os cromossomos Z e W foi anterior à divergência entre Colubridae e Viperidae (Vicoso et al. 2013). Após a supressão da recombinação, pode ter ocorrido a perda de segmentos eucromáticos e posterior heterocromatinização do cromossomo W em Viperidae, já em Colubridae houve o acúmulo diferencial de heterocromatina e pouca degeneração do cromossomo W (Matsubara et al. 2006; Oguiura et al. 2009).

III.1.2. Cromossomos sexuais em anfíbios anuros Em anfíbios, cromossomos sexuais heteromórficos são raros, porém há uma grande diversidade de sistemas de determinação sexual entre as espécies, bem como de grau de diferenciação de cromossomos sexuais (revisão de Malcom et al. 2014). Tal fato foi abordado por Hillis e Green (1990), que sugeriram que o sistema de determinação ZZ/ZW seria a condição plesiomórfica para anfíbios, e que os diversos sistemas XX/XY teriam se originado independentemente em diversas linhagens evolutivas. Entretanto, Evans et al. (2012) discordam da hipótese de Hillis e Green (1990), já que, de posse de um set de dados mais abrangente, na reconstrução do estado ancestral referente à heterogametia em anfíbios não há suporte estatístico para preterir qualquer um dos sistemas como ancestral para anuros e salamandras. Além disso, Evans et al. (2012) sugerem que transições entre sistemas sexuais são comuns em anfíbios e que as mudanças de heterogametia masculina para a feminina são mais frequentes do que as inversas, embora as taxas de transições entre esses sistemas não tenham sido significativamente diferentes. A transição entre sistemas de determinação de sexo explicaria também a predominância de cromossomos sexuais homomórficos em anfíbios, já que a troca dos mesmos em um curto espaço de tempo não permitiria que ocorresse a degeneração do cromossomo Y/W (Evans et al. 2012). Entretanto, outra hipótese é postulada também para explicar a maior ocorrência de cromossomos sexuais homomórficos: a hipótese da “fonte da juventude” (Perrin, 2009). De acordo com esse modelo, a manutenção de cromossomos sexuais homomórficos se daria pelo fato de esses recombinarem ocasionalmente; sendo assim o mecanismo de Muller ratchet seria, de certa forma, driblado. Esse modelo foi baseado nos resultados obtidos por Berset-Brändli et al. (2008), que mostram evidências de eventos recentes de recombinação entre marcadores ligados ao sexo masculino e sequências do cromossomo X em Hyla arborea. Em outras espécies do grupo de H. arborea (Hyla intermedia e Hyla morelli), os mesmos marcadores microssatélites também são ligados ao sexo e presentes no cromossomo Y (Stöck et al., 2011). Mais recentemente, Dufresnes et al. (2014), utilizando uma abordagem filogeográfica, mostram que os alelos provenientes dos cromossomos X e Y em H. arborea aparecem misturados em análises de network e que não são mais divergentes em machos do que em fêmeas, o que sugere eventuais eventos de recombinação entre os cromossomos X e Y nessa espécie. Em espécies de anuros do grupo Bufotes viridis, o modelo de “fonte da juventude” também se encaixa para explicar a prevalência de cromossomos sexuais homomórficos, pois análises filogenéticas dos marcadores ligados ao sexo se agrupam por espécie e não por gametólogos (Bufo viridis em Stöck et al. 2013). Adicionalmente, há evidências que pontuam que ambos os modelos (transições XY ↔ ZW e “fonte da juventude”) poderiam ocorrer. O mesmo grupo de ligação ligado ao sexo em Hyla arborea, que mostra a existência de um sistema de determinação de sexo do tipo XX/XY, é autossômico em outras três espécies do mesmo grupo filogenético (Hyla japonica, Hyla savigny e Hyla sarda) (Dufresnes et al. 2015). Além disso, esses marcadores evidenciam que em Hyla suweonensis a heterogametia é feminina (Dufresnes et al. 2015). Dessa forma, Dufresnes e colaboradores propõem que no grupo de H. arborea a homomorfia dos cromossomos sexuais poderia ser resultado da ação tanto de

eventos eventuais de recombinação, bem como transição de sistemas de determinação de sexo. De todas as espécies de anuros já cariotipadas apenas 52 possuem cromossomos sexuais com algum grau de heteromorfismo, representando cerca de X% de todas as espécies já estudadas citogeneticamente (Tabela 1). Dentre os anuros ocorrem desde as fórmulas mais conhecidas de cromossomos sexuais (XX e XY, ZZ e ZW) até sistemas múltiplos (XXAA ♀/XYAA ou XAAY ♂) (exemplo em: Schmid et al. 2002a) ou sistemas com cromossomo supernumerário único (00/0W) (exemplo em: Green 1988a e b). Tabela 1. Espécies de anuros com cromossomos sexuais heteromórficos já descritos até o momento. Cromossomos sexuais Família/Espécies Sistema Heteromorfismo Referências Alsodidade Eupsophus insularis XX/XY ic, pbc Cuevas e Formas 1996 Eupsophus migueli XX/XY ic, pbc Iturra e Veloso 1989 Eupsophus roseus XX/XY pbc Iturra e Veloso 1989 Bufonidae Bufotes viridis ZZ/ZW pbr Odierna et al. 2007 Rhinella marina ZZ/ZW tc (Z < W), CGH Abramyan et al. 2009 Centrolenidae Vitreorana antisthenesi XX/XY ic, pbc Schmid et al. 1989 Craugastoridae Pristimantis euphronides ZZ/ZW tc (Z < W), ic, pbc Schmid et al. 2002c Pristimantis shrevei ZZ/ZW tc (Z < W), ic, pbc Schmid et al. 2002c Pristimantis pulvinatus XXAA/XYAA ou XAAY tc (X < Y), ic Schmid et al. 2010 Pristimantis riveroi XXAA/XYAA ou XAAY tc (X < Y), ic Schmid et al. 2003 Pristimantis sp. nov. H XXAA/XYAA ou XAAY tc, ic, pbc, pn Schmid et al. 2010 Strabomantis biporcatus XXAA/XYAA ou XAAY tc (X < Y), ic Schmid et al. 1992, 2002a Discroglossidae Haplobatrachus tigerinus ZZ/ZW pbc Saba e Tripathi 2014 Fejervarya limnocharis XX/XY tc, ic Patawang et al. 2014 Eleutherodactylidae Eleutherodactylus albipes ZZ/ZW tc (Z < W), pbc Schmid et al. 2010 Eleutherodactylus casparii ZZ/ZW tc (Z < W), pbc Schmid et al. 2010 Eleutherodactylus cuneatus ZZ/ZW tc (Z < W), ic, pbc Schmid et al. 2010 Eleutherodactylus emiliae ZZ/ZW tc (Z < W), pbc Schmid et al. 2010 Eleutherodactylus glamyrus ZZ/ZW tc (Z < W), ic, pbc Schmid et al. 2010 Eleutherodactylus turquinensis ZZ/ZW tc (Z < W), ic, pbc Schmid et al. 2010 Eleutherodactylus sp. nov. G ZZ/ZW tc (Z < W), pbc Schmid et al. 2010 Eleutherodactylus johnstonei XX/XY ic Schmid et al. 2010 Eleutherodactylus oxyrhyncus XX/XY tc (Z < W), pbc Schmid et al. 2010 Eleutherodactylus cavernicola XXAA/XYAA ou XAAY tc (Z < W), ic, pbc Schmid et al. 2010 Hemiphractidae Gastrotheca ovifera XX/XY tc (X > Y), pbc Schmid et al. 1988, 2002b Gastrotheca peruana XX/XY ic, pbc Schmid et al. 2012 Gastrotheca pseutes XX/XY pbc Schmid et al. 1990 Schmid et al. 1983, 1986, Gastrotheca riobambae XX/XY tc (X < Y), pbc, pn 1988, 2002b Gastrotheca walkeri XX/XY tc (X > Y), pbc Schmid et al. 1988, 2002b Hylidae Hyla femoralis XX/XY pn Schmid e Steinlein 2003 Hyloscirtus alytolylax XX/XY tc (X > Y), pbc Ferro et al. 2018 Pseudis tocantins ZZ/ZW tc (Z < W), ic, pbc, pn Busin et al. 2008 Leiopelmatidae Leiopelma archeyi ZZ/ZW tc (Z < W), ic, pbc Green 2002 Leiopelma hamiltoni ZZ/ZW tc (Z < W), pbc Green 1988 a Leiopelma hochstetteri 00/0W snu Green 1988 b Leptodactylidae Engystomops coloradorum ZZ/ZW pn Targueta et al. 2011 Engystomops freibergi XX/XY tc (X > Y), ic, pbc Targueta et al. 2010 Engystomops petersi XX/XY tc (X > Y), ic, pbc Targueta et al. 2010

X1X1X2X2X3X3X4X4X5X5 ic (X2 e Y2, X5 e Y5, X), tc Leptodactylus pentadactylus X6X6/X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4 Gazoni et al. 2018 (X3 > Y3, X4 > Y4, ) X5Y5X6Y6 Physalaemus ephippifer ZZ/ZW pbc, pn Nascimento et al. 2010 Pseudopaludicola saltica XX/XY ic Duarte et al. 2010 Microhylidae Microhyla fissipes XX/XY tc (X > Y) Sangpakdee et al. 2017 Myobatrachidae Crinia bilingua ZZ/ZW tc (Z < W), ic, pbc Mahony 1991 Odontophrynidae Ananias et al. 2007; Proceratophrys boiei ZZ/ZW pbc Amaro et al. 2012 Pyxicephalidae Pyxicephalus adspersus ZZ/ZW tc (Z > W), pbc Schmid, 1980a, 1980b Pyxicephalus edulis ZZ/ZW tc (Z > W) Schmid et al. 2012 Tomopterna delalandii ZZ/ZW ic, pbc Schmid 1980b Ranidae Pelophylax lessonae XX/XY pbr Schempp e Schmid 1981 Rana tagoi XX/XY pbr, pbc Ryuzaki et al. 1999 Rana sakurai XX/XY ic Ryuzaki et al. 1999 XX/XY ic, pbr Nishioka et al. 1993 Glandirana rugosa ZZ/ZW ic, pbr Nishioka et al. 1994 Rhacophoridae Schmid et al. 1993; Ohta et Buergeria buergeri ZZ/ZW pbc, pn al. 1999 CGH: heteromorfismo detectado após hibridação genômica comparativa; tc: heteromorfismo relativo ao tamanho cromossômico; ic: heteromorfismo relativo ao índice centromérico; pbc: heteromorfismo relativo ao padrão de banda C; pn: heteromorfismo relativo ao padrão da NOR; pbr: heteromorfismo relativo ao padrão de banda de replicação; fusão AY: fusão entre cromossomo Y e um autossomo (i.e. cromossomos sexuais múltiplos); snu: supranumerário único. *Tanto machos com cromossomo Y fundido a um autossomo como machos sem essa fusão cromossômica são encontrados.

Tanto os eventos de amplificação de heterocromatina como rearranjos cromossômicos parecem ter importantes papeis na diferenciação dos cromossomos sexuais de anuros. Em anuros há documentado casos de inversões cromossômicas como passo primordial na diferenciação de cromossomos sexuais, como em Glandirana rugosa (Nishioka et al. 1993; Nishioka et al. 1994; Miura et al. 1997). Além disso, G. rugosa mostra uma interessante variação de cromossomos sexuais de acordo com a localização geográfica das populações. Populações de Kanto e do oeste do Japão têm cromossomos sexuais homomórficos, porém há populações dessa espécie com cromossomos sexuais heteromórficos Z e W, uma população com cromossomos X e Y e uma população com o sistema neo-ZW (Miura, 2008). As populações ZZ/ZW e XX/XY tiveram origem em comum a partir de eventos de hibridação entre a população de Kanto e a população do oeste do Japão, sendo que uma inversão no cromossomo 7 dessa última levou ao surgimento dos cromossomos Z e Y. Um segundo evento de inversão no mesmo cromossomo 7, porém originário da população de Kanto, originou os cromossomos X e W (Ogata et al. 2002). Já a população com neo-ZW teria surgido a partir de um contato secundário entre os indivíduos da população XY com indivíduos da população do oeste do Japão, sendo a origem desse cromossomo W independente daquela do cromossomo W citado anteriormente (Ogata et al. 2008). Outro tipo de rearranjo reportado para anfíbios é a fusão entre cromossomo Y e um autossomo, gerando assim sistemas múltiplos de cromossomos sexuais. Os casos mais bem documentados desse tipo de rearranjo estão na família Craugastoridae. Em Strabomantis bipocartus, há populações em que 95% dos machos apresentam Y

18 fusionado a autossomos e também populações que não apresentam evidências de fusão Y-autossomo (Schmid et al. 2002b). Em Pristimantis riveroi, 46,2% dos animais analisados mostram a fusão Y-autossomo. Em anfíbios, eventos de amplificação/perda de heterocromatina são bastante documentados. Em Proceratoprhys boiei, por exemplo, os cromossomos Z e W são similares em tamanho e morfologia, entretanto o cromossomo W é quase inteiramente heterocromático, enquanto o cromossomo Z só possui heterocromatina centromérica (Ananias et al. 2007; Amaro et al. 2012). Outro interessante caso de heteromorfismo ligado à amplificação de heterocromatina é encontrado em Pristimantis euphronides e Pristimantis shrevei, cujos cromossomos W são quase inteiramente heterocromáticos. Além do heteromorfismo ligado à amplificação de heterocromatina, nessas duas espécies também são observados distintos padrões de bandamento com fluorocromos base específicos, que sugerem alta diversidade de sequências repetitivas nessa região do cromossomo W (Schmid et al. 2002a). A perda de segmentos heterocromáticos como evento relacionado com o heteromorfismo de cromossomos sexuais em anuros é exemplificado nos anuros Eupsophus insularis, Eupsophus migueli e Eupsophus roseus (Iturra e Veloso 1989; Cuevas e Formas 1996) e em Gastrotheca walkerii e Gastrotheca ovifera (Schmid et al. 1988), em que é documentada a perda de heterocromatina no cromossomo Y. Algumas análises recentes têm sugerido que certos cromossomos são mais propícios a se tornarem cromossomos sexuais. Brelsford et al. (2013) mostram que em espécies de três linhagens altamente divergentes de anuros (Bufo, Hyla e Rana) os cromossomos sexuais são homeólogos, apresentando grupos de ligação que contêm o gene DMRT1. Esse achado suporta a hipótese de que alguns cromossomos são mais propícios a se tornarem cromossomos sexuais do que outros, pelo fato de terem na sua composição genes relacionados com a cascata de diferenciação sexual (revisão de Graves e Peichel 2010; O’Meally et al. 2012). Mesmo com todo o conhecimento sobre cromossomos sexuais em anuros já reunido, ainda é pouca a quantidade de informação disponível para esse grupo. Concomitante a esse fato, são poucos os estudos que combinam as técnicas de citogenética clássica com técnicas moleculares e/ou análises filogeográficas. Dentre as técnicas de citogenética molecular que têm contribuído nos estudos dos cromossomos sexuais de anuros, destaca-se a hibridação genômica comparativa (CGH) que permitiu a identificação dos cromossomos sexuais de Rhinella marina (Abramyan et al. 2009) e mostrou evidências de que, apesar de heteromórficos, os cromossomos sexuais de Buergeria buergeri têm composição molecular bastante similar (Uno et al. 2015). O sequenciamento de nova geração é outro método que pode trazer grande avanço para o estudo dos cromossomos sexuais, como discutimos a seguir. III.1.3. As novas tecnologias de sequenciamento e suas contribuições para os estudos de cromossomos sexuais O método de sequenciamento de DNA mais empregado até a primeira metade dos anos 2000 foi desenvolvido por Sanger e Coulson (1975) e se baseia no princípio de terminação de elongação da cadeia de DNA ao usar dideoxi-nucleotídeos, que não apresentam extremidade 3’-OH livre. Diversos genomas foram sequenciados utilizando

19 esse método, como o genoma humano (IHGSC 2001) e o genoma da galinha (ICGSC 2004). O sequenciamento de genomas utilizando o sequenciamento Sanger necessita de uma etapa anterior de clonagem em BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) e mapeamento prévio desses para se conhecer a posição desses nos cromossomos (sequenciamento hierárquico) ou em vetores menores e, posterior ao sequenciamento e montagem, o ancoramento dessas sequências nos cromossomos (Whole Genome Shotgun). Recentes avanços possibilitaram a criação de novas plataformas de sequenciamento, que excluem a etapa prévia de clonagem. Dentre as vantagens dos novos métodos de sequenciamento, em comparação ao sequenciamento Sanger, estão a utilização de diversos fragmentos simultaneamente em uma mesma corrida, a obtenção de uma grande quantia de reads por corrida, bem como a geração de uma maior quantia de dados em um tempo muito mais curto (revisão de Mardis 2008; Ansorge 2009; Liu et al. 2012). Dentre as novas tecnologias de sequenciamento, uma das mais utilizadas é a que se baseia no mecanismo de sequenciamento por síntese, que é utilizado pelas plataformas Illumina. O mecanismo de sequenciamento por síntese consiste na incorporação de nucleotídeos conjugados a uma molécula fluorescente, a qual é específica para cada nucleotídeo, na extremidade 3’-OH, sendo que a cada incorporação ocorre a captura da fluorescência emitida por tal molécula. Após a captura da imagem, a molécula fluorescente é removida liberando então a extremidade 3’-OH para a incorporação de outro nucleotídeo pela DNA polimerase (revisão de Mardis 2008). O uso de novas tecnologias de sequenciamento possibilitou um maior aprofundamento em diversos estudos, desde a genômica estrutural à funcional. No que diz respeito à genômica estrutural, o projeto Genome 10K busca o sequenciamento do genoma de 10 mil espécies de vertebrados (Koepfli et al. 2015). Em relação à genômica funcional, o uso dessas novas tecnologias vem possibilitando a caracterização de transcriptomas e o uso desses em diversos estudos para entender padrões de expressão genica em diferentes tecidos (revisão de Mardis 2008; Morozova e Marra 2008; Ansorge 2009) e até mesmo de células isoladas a partir de um tecido ou em cultura (revisão de Xue et al. 2015; Gawad et al. 2016). Recentemente, o uso das novas abordagens de sequenciamento massivo paralelo possibilitaram um grande acúmulo de conhecimento sobre cromossomos sexuais e sistemas de determinação de sexo. Basicamente cinco abordagens vêm sendo utilizadas para o estudo de cromossomos sexuais: (a) ressequenciamento do genoma de indivíduos do sexo heterogamético e mapeamento das reads em genomas de referência; (b) sequenciamento do genoma de indivíduos machos e fêmeas separadamente e posterior comparação entre os mesmos; (c) sequenciamento de cromossomos Z, X, Y ou W obtidos por meio de microdissecção ou citometria de fluxo; (d) caracterização do transcriptoma das gônadas de machos e fêmeas em várias fases do desenvolvimento embrionário ou de adultos e (e) genotipagem por meio de sequenciamento e/ou análises de SNPs ou a construção de mapas genéticos de ligação. No que diz respeito ao ressequenciamento de genomas, Chen et al. (2012) sequenciaram, por meio da plataforma Illumina, o genoma de um macho de Gallus gallus (ZZ), alinharam as reads geradas no genoma de referência de uma fêmea (ZW) e com

20 base na análise de cobertura do mapeamento os autores identificaram 60 novas sequências W-específicas. Hall et al. (2013) propuseram um método para a identificação de sequências específicas do cromossomo Y para duas espécies de mosquitos do gênero Anophelles, chamado de CQ (Chromosome Quotient). Tal método se baseia no cálculo da razão do número de reads de cada sexo alinhadas, sendo possível assim a determinação de sequências ligadas a cromossomos sexuais. Tal abordagem possibilitou a identificação de seis novos genes localizados no cromossomo Y de Anopheles stephensi e Anopheles gambiae que são expressos durante as primeiras fases embrionárias. Além disso, este trabalho adiciona evidências de que os cromossomos Y de A. stephensi e A. gambiae não tiveram a mesma origem, apesar de serem espécies próximas filogeneticamente. A abordagem que utiliza o mapeamento de reads, mesmo mostrando-se eficiente, tem um empecilho: a necessidade de um genoma de referência. Muitas espécies que apresentam cromossomos sexuais heteromórficos, incluindo anuros, são muitas vezes filogeneticamente distantes de espécies do mesmo grupo que tiveram seus genomas sequenciados. Dessa maneira, métodos diferentes, baseados na montagem de novo de genomas se fazem necessários para espécies que não são modelos clássicos em pesquisa biológica. Sendo assim, outra abordagem utilizada se baseia no sequenciamento do genoma de machos e fêmeas, e a posterior montagem dessas sequências, a fim de procurar contigs e scaffolds únicos de cada montagem que, a priori, podem ser considerados sexo específicos. Vicoso et al. (2013), por exemplo, utilizando o sequenciamento do genoma de machos e fêmeas de três espécies de serpentes de diferentes famílias (Boidae, Colubridae e Viperidae), identificaram scaffolds atribuídos ao cromossomo W de duas espécies (Thamnophis elegans da família Colubridae e Sistrurus miliarius da família Viperidae), permitindo que fosse notado que tais scaffolds W-derivados não se distribuíram aleatoriamente no cromossomo Z dessas espécies. Ao contrário disso, os autores evidenciaram a existência de pelo menos dois estratos evolutivos no cromossomo Z dessas duas espécies, que diferem quanto à densidade de scaffolds homólogos aos W- derivados. Tal resultado mostra locais nos cromossomos Z e W dessas espécies que tiveram a recombinação suprimida em diferentes tempos durante a história evolutiva dos mesmos. Vicoso et al. (2013) ainda mostram que a correspondência dos estratos observados no cromossomo Z de T. elegans (Colubridae) e S. miliarus (Viperidae) permitem a inferência de que a supressão de recombinação entre os cromossomos sexuais ocorreu antes da divergência entre as famílias Colubridae e Viperidae, aproximadamente há 50 milhões de anos. Concomitantemente, os autores também encontram evidências que dão suporte à hipótese evolutiva de faster-Z para serpentes, já que as taxas de evolução dos genes exclusivos dos cromossomos Z são maiores que aquelas de genes presentes na região pseudoautossômica. O uso de cópias isoladas de cromossomos, seja por meio de citometria de fluxo (Gray et al. 1975) ou por microdissecção (Meltzer et al. 1992; Kubickova et al. 2002), foi bastante empregado em estudos de pintura cromossômica. Tais técnicas foram utilizadas ou para reconhecer a homeologia entre cromossomos de espécies relacionadas a fim de observar eventos de rearranjos estruturais durante a evolução cariotípica das mesmas ou dos cromossomos sexuais isoladamente (Yang et al. 1997; Fuková et al. 2007; Krylov et al. 2010; Cioffi et al. 2011; Parise-Maltempi et al. 2013; Pokorná et al. 2015). O isolamento de cromossomos por meio de citometria de fluxo ou microdissecção para posterior sequenciamento têm sido muito utilizados para investigações de rearranjos

21 cromossômicos causadores de síndromes (Chen et al. 2008, 2010), na identificação de scaffolds não mapeados em genomas já sequenciados (Seifertova et al. 2013; Avila et al. 2015) e também no sequenciamento de genomas poliploides complexos, como o genoma do trigo (IWGSC, 2014), ou espécies com genomas muito grandes a fim de facilitar o processo de montagem do mesmo, como na salamandra Ambystoma mexicanum (Keinath et al. 2015). No que diz respeito a cromossomos sexuais, Traut et al. (2013) utilizaram microdissecção para isolar o cromossomo W da mariposa Ephestia kuehniella, que foi sequenciado utilizando a plataforma Roche 454, após amplificação prévia com o kit Whole Genome Amplification (WGA – Sigma-Aldrich). Utilizando essa abordagem os autores conseguiram identificar sequências específicas de fêmeas, bem como sequências presentes tanto no cromossomo W quanto no genoma de machos. Além disso, Traut et al. (2013) conseguiram identificar loci com inserções de DNA mitocondrial, os quais os autores inferem como recentes, já que as sequências inseridas mostram alta similaridade com o DNA mitocondrial. A caracterização de transcritos a partir de gônadas em diferenciação tem sido bastante utilizada para a identificação de genes candidatos à determinação sexual. Em um dos mais clássicos exemplos em anuros, diversos trabalhos foram realizados para identificar o gene de determinação sexual em Glandirana rugosa (Miura et al. 1998; Takase et al. 2000; Sugita et al. 2001; Shibata et al. 2002; Aoyama et al. 2003; Ohtani et al. 2003; Kato et al. 2004; Yamamura et al. 2005; Oshima et al. 2006; Matsushita et al. 2007; Maruo et al. 2008; Oshima et al. 2009; Yokoyama et al. 2009). Essa também foi a ferramenta utilizada para identificar o gene candidato de determinação sexual DM-W em Xenopus laevis (Yoshimoto et al. 2008). O advento das novas tecnologias de sequenciamento possibilitou a caracterização de transcriptomas de diversos tecidos de uma só vez (revisão de Mardis 2008). Vicoso et al. (2013) mostram, a partir do sequenciamento do transcriptoma de duas serpentes, uma da família Boidae (que apresenta cromossomos sexuais homomórficos) e uma da família Viperidae (que apresenta cromossomos sexuais heteromórficos Z e W), a ausência de mecanismos de compensação de dosagem, já que há maior expressão de genes ligados ao Z em machos. O uso de RNA-seq também auxiliou na identificação de 41 genes diferencialmente expressos nas gônadas em desenvolvimento de machos e fêmeas da espécie de jacaré Alligator mississipensis, incluindo diversos fatores de transcrição (Yatsu et al. 2016). Em anuros, o único genoma sequenciado, com sequências ancoradas em cromossomos, é o de Xenopus tropicalis, cujo par cromossômico 7 é tido como sexual, inferido por meio de mapas de ligação (Olmstead et al. 2010; Wells et al. 2011). Bewick et al. (2013), utilizando RAD-seq (Restriction-site Associated DNA), sequenciaram independentemente o genoma de um macho e de uma fêmea de X. tropicalis e, por meio de genotipagem por sequenciamento, obtiveram evidências de que a região pseudoautossômica dos cromossomos sexuais de X. tropicalis compreende grande parte da extensão destes. Ou seja, os cromossomos sexuais nessa espécie ainda experimentam muitos eventos de recombinação entre eles, sendo a região sexo-específica muito pequena.

III.2. DNAs repetitivos e sua participação na diferenciação de cromossomos sexuais Nos genomas de eucariotos há basicamente duas classes de DNA repetitivos, classificados de acordo com a sua organização no genoma: (a) DNAs repetitivos in tandem e (b) DNA repetitivos dispersos pelo genoma (revisão de Charlesworth et al. 1994; López-Flores e Garrido-Ramos 2012). Dentre os DNAs repetitivos in tandem há aqueles que fazem parte de famílias multigênicas, como os DNAs ribossomais (DNAr) e genes de histonas e globinas, e as sequências de DNAs satélites. Já entre os DNAs repetitivos dispersos pelo genoma há basicamente três tipos: (a) transposons de DNA; (b) retrotransposons e (c) famílias gênicas como os genes de RNAs transportadores (RNAt) (revisão de Long e Dawid 1980; López-Flores e Garrido-Ramos 2012). A seguir será revisado especificamente sobre genes de RNA ribossomal (RNAr), DNAs satélites e elementos transponíveis, e suas implicações na evolução genômica e de cromossomos sexuais. III.2.1. Famílias multigênicas: genes de RNA ribossomal Os genes de RNAr estão organizados in tandem no genoma de eucariotos, sendo o DNAr organizado em dois diferentes arranjos: (a) DNAr 45S e (b) DNAr 5S (revisão de Long e Dawid 1980; Martins e Wasko 2004; López-Flores e Garrido-Ramos 2012). Frequentemente o DNAr 45S, bem como os homólogos a esse em outros eucariotos, está organizado no genoma separado do DNAr 5S; porém, em alguns protistas, fungos e invertebrados o gene de RNAr 5S faz parte da mesma unidade repetitiva em que se encontram os outros genes de RNAr (revisão de Drouin e de Sá 1995). Em gimnospermas essa característica também é observada, sendo que nesse filo de plantas genes de RNAr 5S foram inseridos no mesmo arranjo do DNAr 35S ao menos três vezes durante a história evolutiva desse grupo (Garcia e Kovařík 2013). O DNAr 45S é composto, na sua unidade repetitiva básica, pelos genes que transcrevem RNAr 5,8S e 28S, presentes na subunidade maior do ribossomo, e pelo gene transcritor de RNAr 18S, molécula de RNA presente na subunidade menor do ribossomo. Juntamente com a sequência dos três genes, ainda fazem parte do DNAr 45S dois espaçadores externos transcritos (ETS, external transcribed spacers) e dois espaçadores internos transcritos (ITS, internal transcribed spacers), além de um espaçador intergênico não transcrito (NTS, non transcribed spacer) (revisão de Raska et al. 2006; Boisvert et al. 2007; López-Flores e Garrido-Ramos 2012). As cópias in tandem dessa unidade repetitiva básica do DNAr 45S compõem as regiões organizadoras do nucléolo (NOR), as quais são presentes em número e localização variáveis nos genomas dos eucariotos (revisões de Raska et al. 2006 e Cmarko et al. 2008). Em comparação ao DNAr 45S, o DNAr 5S tem uma organização mais simples, estando sua unidade repetitiva composta por: (a) uma região transcritora de RNAr 5S, que apresenta cerca de 120 pb, altamente conservada entre eucariotos, e (b) um espaçador não transcrito (NTS), que é variável tanto em tamanho quanto em composição (revisão de Martins e Wasko 2004). Análises em diversas espécies de peixes mostram que o tamanho mínimo do NTS do DNAr 5S é entre 60 – 80 pb, que seriam necessários para a manutenção dos arranjos e dinâmica do gene transcritor de RNAr 5S nos genomas (Martins e Galetti 2001). Além disso, análises de DNAr 5S em genomas de anfíbios e

23 peixes mostram a co-existência de duas classes do mesmo. Em anuros do gênero Xenopus, um tipo de RNAr 5S foi encontrado em células somáticas e outro em ovócitos (Ford e Southern, 1973; Brown et al. 1977; Korn e Brown, 1978; Peterson et al. 1980). Dois tipos de DNAr 5S também foram isolados dos genomas dos anuros Physalaemus cuvieri (Vittorazzi et al. 2011), Engystomops petersi e Engystomops freibergi (Rodrigues et al. 2012), Pseudis tocantins (Gatto et al. 2016) e Amolops mantzorum (Liu et al., 2017). A localização cromossômica de DNAr 45S e DNAr 5S têm auxiliado na identificação de cromossomos homeólogos em estudos de citogenética comparativa (exemplos em: Ferreira et al. 2007; Aguilar e Galetti-Junior 2008; Quinderé et al. 2009). Além disso, tanto o DNAr 45S quanto o DNAr 5S mostram-se envolvidos em casos de heteromorfismo de cromossomos sexuais em vários táxons. Em anuros, mais especificamente, sete espécies têm algum heteromorfismo de cromossomos sexuais ligado a NORs (Tabela 1). Em Physalaemus ephippifer, por exemplo, uma NOR adicional contribui para o heteromorfismo dos cromossomos sexuais. Tanto o cromossomo Z quanto o W de P. ephippifer possuem uma NOR distal no braço longo, entretanto o cromossomo W possui uma NOR adicional distal no braço curto (Nascimento et al. 2010). Outros casos mostram a ocorrência de perda da região da NOR como responsável pelo heteromorfismo de cromossomos sexuais, como em Buergeria buergeri e em Hyla femoralis, nas quais a NOR, localizada na região terminal do cromossomo Z na primeira e na região intersticial do cromossomo X da segunda, está ausente no cromossomo W e Y, respectivamente (Schmid et al. 1993; Schmid e Steinlein 2003). Já em relação ao DNAr 5S, o mapeamento cromossômico auxiliou a diferenciar os cromossomos sexuais do peixe Oncorhynchus mykiss, pois o cromossomo X é portador de um sítio de DNAr 5S enquanto esse locus está ausente no cromossomo Y (Moran et al. 1996). Reed e Phillips (1997) propõem que a presença da NOR (ou outro DNAr) em cromossomos sexuais pode contribuir para a redução da recombinação entre estes, de maneira similar ao acúmulo de heterocromatina. III.2.2. Elementos transponíveis Os elementos transponíveis (TEs) são sequências de DNA que têm a habilidade de se moverem de uma região para outra dentro de um mesmo genoma primeiramente identificadas em milho, por meio do estudo de padrões variegados das sementes (McClintock, 1951, 1950). Estão presentes nos genomas tanto de procariotos quanto de eucariotos, sendo mais abundantes e diversos nesses últimos (revisão de Pritham 2009; López-Flores e Garrido-Ramos 2012; Tollis e Boissinot 2012). A proporção de TEs no genoma varia muito entre as espécies. Em humanos, por exemplo, 45% do genoma é constituído desses elementos (IHGSC 2001), enquanto 10% do genoma da tartaruga Crysemys picta e menos de 9% do genoma de Gallus gallus são compostos por TEs (ICGSC 2004; Shaffer et al. 2013). No anuro Xenopus tropicalis, 34,5% do genoma é composto por TEs e em Nanorana parkeri a abundância de TEs no genoma é de 48% (Hellsten et al. 2010; Sun et al. 2015). Os TEs são divididos em duas classes de acordo com o mecanismo de transposição utilizado: (a) retrotransposons (intermediário de RNA) e (b) transposons de DNA (sem intermediário). Os retrotransposons, ou elementos de classe I, movem-se pelo genoma através de uma molécula intermediária de RNA, que serve de molde para uma transcriptase reversa

24 que sintetiza um DNA complementar (cDNA), que é integrado em outra região do genoma (revisão de López-Flores e Garrido-Ramos, 2012; Tollis e Boissinot 2012). Os retrotransposons são divididos em 5 tipos: (a) LTRs (Long Terminal Repeats); (b) LINEs (Long Interspersed Elements); (c) SINEs (Short Interspersed Elements) e (d) Penelope. Geralmente, os retrotransposons são a classe de elementos móveis mais abundantes nos genomas, representando 7,8% do genoma de galinha e 41,85% do genoma humano (IHGSC 2001; ICGSC 2004; revisão de Toillis e Boissinot 2012). A segunda classe de TEs é a dos transposons de DNA, ou elementos de classe II. Ao contrário dos elementos de classe I, os transposons não usam um intermediário de RNA para se moverem pelo genoma (revisão de López-Flores e Garrido-Ramos 2012). Os transposons são pouco representativos nos genomas animais. Em humanos, por exemplo, apenas 2,84% do genoma é composto por transposons de DNA, sendo a superfamília hAT a mais expressiva. Em galinha, apenas 0,8% do genoma é composto por elementos de classe II (IHGSC 2001; ICGSC 2004). Entretanto, algumas espécies mostram uma grande quantidade de transposons de DNA, como X. tropicalis, que apresenta 25% do genoma composto por esse tipo de sequência, sendo a superfamília de transposon hAT a de maior representatividade (Hellsten et al. 2010). A classe de transposons de DNA mais comum é a de elementos denominados copy-and-paste, seguida dos Helitrons e Politrons (revisão de López-Flores e Garrido-Ramos; Tollis e Boissinot 2012). Muitos estudos têm reportado o envolvimento de TEs na evolução de cromossomos sexuais. A supressão da recombinação entre os cromossomos X/Z e Y/W, etapa crucial para o estabelecimento de uma região sexo específica (Ohno 1967; revisão de Charlesworth et al. 2005), favorece o acúmulo diferencial de TEs (Steinemann e Steinemann 2005; VanBuren e Ming 2013; Schartl et al. 2015; Sliwinska et al. 2016). Em diversas espécies já foi documentado o acúmulo de TEs nos cromossomos sexuais, como em Drosophila miranda, que apresenta o cromossomo Y com uma grande quantidade de retroelementos (Steinemann e Steinemann 2005). Já no peixe Cynoglossus semilaevis além de acúmulo de TEs no cromossomo W também foi identificado um acúmulo diferencial em relação ao cromossomo Z e autossomos de retrovírus endógenos (LTR retrotransposons) (Chalopin et al. 2015). Além de serem importantes nos processos de diferenciação dos cromossomos do sexo heterogamético (Y e W), é hipotetizado também que o acúmulo de TEs auxiliaria no mecanismo de compensação de dosagem do cromossomo X em mamíferos, auxiliando no silenciamento de genes bem como na heterocromatinização de uma das cópias adicionais (revisão de Lyon 2003). III.2.3. DNAs satélites Os DNAs satélites são sequências repetitivas que estão arranjadas in tandem nos genomas dos eucariotos. Essa classe de DNA repetitivo é caracterizada por ter unidades monoméricas (repeats) com 100 ou mais pb, localizadas nas regiões heterocromáticas dos genomas em arranjos que podem ser maiores que 100 mb. O número de sequências de DNAs satélites em um genoma pode variar bastante, podendo chegar a 50% da composição de um genoma (revisão de Charlesworth et al. 1994; López-Flores e Garrido- Ramos 2012; Plohl et al. 2012).

Após a sua descoberta, no início da década de 1970, essa classe de DNA repetitivo foi considerada como “DNA lixo” por não serem regiões codificadoras (revisão de Plohl et al. 2012). Entretanto, diversos estudos têm mostrado que os DNAs satélites exercem importantes papeis biológicos, dentre eles a organização dos centrômeros e a modulação da expressão gênica (revisão de Pezer et al. 2012; Plohl et al. 2012). Em humanos, por exemplo, o DNA α-satélite presente nos centrômeros contém uma sequência específica denominada de CENP-B box que serve de reconhecimento para CENP-B, uma proteína histônica específica da região centromérica (Masumoto et al. 1989; Yoda et al. 1998). Em Drosophila melanogaster, um RNA longo não codificante (RNAlnc) transcrito a partir do satélite III têm por função se ligar à proteína CENP-C que é componente do cinetocoro, além de serem necessários para a correta localização das proteínas centroméricas CENP- A e CENP-C (Rosic et al. 2014). Além de participação na biologia de centrômeros, pequenos RNAs de interferência (siRNA) transcritos a partir de DNA satélite centromérico atuam na formação de heterocromatina no genoma da levedura Schizosaccharomyces pombe (revisão de Pezer et al. 2012). A organização da heterocromatina está também ligada à transcrição de RNAs não codificantes a partir de DNAs satélites, com envolvimento na iniciação do processo de metilação de histona H3, um processo que é necessário para a formação e manutenção de regiões heterocromáticas (revisão de Biscotti et al. 2015 e Plohl et al. 2008). Além disso, transcritos de DNAs satélites podem participar de algumas funções regulatórias, inclusive atividade ribozimática (revisão de Plohl et al. 2008). Dessa maneira, a presença de DNAs satélites em cromossomos sexuais poderiam ter também um papel na determinação de sexo em si. Em Schistosoma mansoni, a transcrição de DNAs satélites presentes no cromossomo W inicia a cascata regulatória de formação da heterocromatina nesse cromossomo, podendo inclusive ter um papel na determinação do sexo nessa espécie. A formação dessa heterocromatina em S. mansoni ocorre durante a segunda fase larval (cercária), fase em que ocorre a determinação do sexo nessa espécie. Sendo assim, por posicionamento a heterocromatina no cromossomo W poderia silenciar um locus dominante para o desenvolvimento de machos. Nesse caso, a determinação de sexo em S. mansoni ocorreria pela dosagem de um locus masculino dominante, sendo que em fêmea esse locus no cromossomo W seria silenciado e teria ativo o locus presente no cromossomo Z e em machos os dois locus presentes estariam ativos, levando então à determinação de machos (Lepesant et al. 2012). Os DNAs satélites são considerados elementos muito dinâmicos dos genomas de eucariotos, e uma mesma família de sequência pode variar em número de cópias intra e interespecificamente (revisão de López-Flores e Garrido-Ramos 2012; Plohl et al. 2012). A variação de abundância de famílias de DNAs satélites entre espécies proximamente relacionadas filogeneticamente pode ser explicado pelo modelo de bibliotecas de DNAs satélites. Tal modelo explica que espécies proximamente relacionadas compartilham uma coleção de sequências de DNAs satélites que era presente no ancestral comum, entretanto a abundância das diferentes famílias nos genomas de cada espécie pode ter um perfil espécie-específico, que é consequência das flutuações no número de cópias das sequências nessa biblioteca (revisão de Ugarković e Plohl 2002). Como consequência dessas flutuações, em muitos casos há famílias de DNAs satélites que são espécie- específicas, ou seja, que só ocorrem em uma espécie de um grupo (Kuhn et al. 2008; Acosta et al. 2010; Tsoumani et al. 2013; Giovannotti et al. 2014).

Sequências de DNA repetitivo, como os DNAs satélites, evoluem de forma não independente, ou seja, clusters das unidades repetitivas não se diferenciam isoladamente, mas sim em concerto (concerted evolution). O modelo de concerted evolution explica que as mudanças nas unidades repetitivas de uma dada sequência podem se espalhar para todos os clusters que contém sequências da mesma família podendo essas mudanças serem fixadas em uma dada população por meio de um processo chamado de molecular drive (Dover 1982, 2002, revisão de Ugarković e Plohl 2002; Plohl et al. 2012). O processo de molecular drive vai depender de uma variedade de mecanismos de trocas não recíprocas, como crossing-over desigual e conversão gênica, entre os sítios portadores dessas sequências repetitivas (Dover, 1982; revisão de Plohl et al. 2012). O acúmulo de sequências de DNA satélite nas regiões heterocromáticas dos cromossomos sexuais é um dos eventos mais marcantes do processo de diferenciação desses cromossomos tanto em animais quanto em plantas (exemplos em: Singh et al. 1976; Singh et al. 1980; Tone et al. 1982; Hobza et al. 2006; Mariotti et al. 2009). Muitas vezes, os cromossomos sexuais Y e W apresentam acúmulo de sequências únicas de DNAs satélites, que não são presentes nos autossomos nem nos cromossomos X e Z. No peixe Leporinus elongatus, por exemplo, o DNA satélite L’46 está presente somente no cromossomo W1 dessa espécie (Nakayama et al. 1994). Na gaivota de asa escura (Larus fuscus) também foi identificada uma sequência de DNA satélite única do cromossomo W dessa espécie (Griffiths e Holland 1990). Em anuros são poucos os estudos em que se utilizam o isolamento, caracterização e mapeamento de DNAs satélites (Tabela 2). No gênero Rana, por exemplo, os DNAs satélites S1a e S1b, isolados originalmente do genoma de Rana italica (Rana graeca italica em Cardone et al. 1997), foram bastante utilizados em trabalhos com diversas abordagens. Picariello et al. (2002) usam as diferenças de regiões deletadas dos DNAs satélites S1a e S1b, bem como a localização cromossômica desses para propor que R. italica seja uma espécie distinta de Rana graeca. Além disso, os mesmos autores mostram que, intraespecificamente, os DNAs satélites S1a e S1b exibem uma alta homogeneidade entre os monômeros, com pouquíssimos sítios variantes. Esse alto padrão de homogeneização também é observado em outras espécies, como em Rana temporaria (Feliciello et al. 2005) e em Rana dalmatina (Feliciello et al. 2006). Baseados nesses padrões de homogeneização intraespecífica, Picariello et al. (2016) propõem que Rana camerani, Rana holtzi e Rana tavasensis sejam sinônimos juniores de Rana macrocnemis.

Tabela 2. Espécies de Anura em que foram realizados estudos de isolamento, caracterização e/ou mapeamento de DNAs satélites. Família/Espécie DNA satélite Localização cromossômica Referência Alytidae Discoglossus pictus pDS (288 pb) 1 – 14 int Odierna et al. 1999 Dp-sat1 (510 pb) 8 – 14 cen Amor et al. 2009 Dp-sat2 (143 – 148 pb) 1 – 5 e 7 cen Picariello et al. 2012 Dp-sat3 (170 – 177 pb) 1 – 5 e 7 cen Picariello et al. 2012 Bufonidae Bufotes viridis pBv (420 pb) 3p per Odierna et al. 2004 Hylidae Pseudis tocantins PcP-1a (190 pb) - Gatto et al. 2016 PcP-1b (?) Wq int Gatto et al. 2016 PcP-2 (166 – 189 pb) Wq int Gatto et al. 2016 PcP-3 (181 pb) Wq int Gatto et al. 2016 PcP-4 (173 – 181 Wq int Gatto et al. 2016 PcP-5 (204 pb) Wq int Gatto et al. 2016 PcP-6 (?) Wq int Gatto et al. 2016 PcP-7 (107 – 121 pb) Wq int Gatto et al. 2016

Hylodidae Crossodactylus PcP190 (201 pb) - Vittorazzi et al. 2014 gaudichaudii Leiopelmatidae Leiopelma hochstetteri Lh1 (392 pb) 10q int (Great Barrier Island, Big Zeyl e Green 1992 Omaha*) 11q int, B1, B2 per (Mt Moehau; Tapu*) Leptodactylidae Physalaemus albifrons PcP190 (190 pb) 3p per Vittorazzi et al. 2014 Physalaemus albonotatus PcP190 (183 pb) 3p per Vittorazzi et al. 2014 Physalaemus centralis PcP190 (190 pb) 1 - 5 cen; 3p e 4p per Vittorazzi et al. 2014 Physalaemus cicada PcP190 (200 pb) 1 cen Vittorazzi et al. 2016 Physalaemus cuvieri - BA PcP190 (190 pb) 1 – 5 cen; 3p per Vittorazzi et al. 2011 Physalaemus cuvieri - MG PcP190 (190 pb) 1 – 7 cen; 9 – 11 cen Vittorazzi et al. 2014 Physalaemus cuvieri - MS PcP190 (190 pb) 1 – 7 cen; 9p - 11p per Vittorazzi et al. 2014 Physalaemus cuvieri - RS PcP190 (190 pb) 1 – 5 cen Vittorazzi et al. 2014 Physalaemus cuvieri – PB PcP190 (190 pb) 1 – 11 cen Vittorazzi et al. 2014 Physalaemus cuvieri - TO PcP190 (190 pb) 1 – 3 cen; 4p – 7p per; 10p per Vittorazzi et al. 2014 Physalaemus ephippifer PcP190 (190 pb) 3p per; Wq int Vittorazzi et al. 2014 Physalaemus kroyeri PcP190 (190 pb) 1 cen e 3p per Vittorazzi et al. 2016 Physalaemus marmoratus PcP190 (190 pb) - Vittorazzi et al. 2014 Leptodactylus latrans PcP190 (192 pb) - Vittorazzi et al. 2014 Pipidae Xenopus laevis** Xl32 (79 pb) 1 – 9Lpqt, 1 – 9Spqt Spohr et al. 1981; Schmid e Steinlein 2015 Satellite 1 (741 pb) - Lam e Carrol 1983a PTR-2 (388 pb) - Lam e Carrol 1983b OAX (752 pb) - Ackerman 1983 REM 2 (487 pb) Disperso por todo o complemento Hummel et al. 1984 REM 3 (463 pb) 1Lp per Hummel et al. 1984 Ranidae Glandirana rugosa 41-REL (41 pb) 1pq – 13pq ter Suda et al. 2011 31-REL (31 pb) 1pq – 13pq ter; Wq per Suda et al. 2011 Lithobates catesbeianus RcS1 (360 pb) - Wu et al. 1986Wu et al. 1986 RcS2 (550 pb) - Wu et al. 1986 Pelophylax esculentus RrS1 (292 pb) 1 – 5 cen Ragghianti et al. 1995 Rana/PolII (227 – 235 pb) 1 – 13 disp Ragghianti et al. 1999 Pelophylax lessonae RrS1 (292 pb) 1 – 13 cen Ragghianti et al. 1999 Rana/PolII (227 – 235 pb) 1 – 13 disp Ragghianti et al. 1999

Pelophylax ridibundus RrS1 (292 pb) 1 – 13 cen Ragghianti et al. 1995 Rana/PolII (227 – 235 pb) 1 – 13 disp Ragghianti et al. 1999 Rana dalmatina S1a (494 pb) 1 e 2 per, 3p – 5p per, 9q – 13q per Feliciello et al. 2006 S1b (332 pb) 1 e 2 per, 3p – 5p per, 9q – 13q per Feliciello et al. 2006 Rana graeca S1b (280 pb) 1 per, 4p e 5p per, 8q per Picariello et al. 2002 Rana holtzi S1a (476 pb) - Picariello et al. 2016 Rana itálica S1a (494 pb) 1 – 13 cen Cardone et al. 1997 S1b (280 pb) 1 – 13 cen Cardone et al. 1997 Rana macrocnemis S1a (476 pb) - Picariello et al. 2016 Rana tavasensis S1a (476 pb) - Picariello et al. 2016 Rana temporaria S1a (476 pb) - Feliciello et al. 2005 p: braço curto do cromossomo; q: braço longo do cromossomo; ter: região terminal; int: região intersticial; per: região pericentromérica; cen: centromérica; disp: disperso por todo o complemento cromossômico. *Localidades dos indivíduos analisados no trabalho em questão; **Classificação dos cromossomos de Xenopus seguiu a proposta de Matsuda et al. 2015.

III.2.3.1. O DNA satélite PcP190 O DNA satélite PcP190 foi isolado inicialmente do leptodactilídeo Physalaemus cuvieri (população de Palmeiras/BA) e a sua origem foi associada ao DNAr 5S, devido à sua similaridade de mais de 60% com a região do gene de RNAr 5S (Vittorazzi et al. 2011). Além de ter sido encontrado em diferentes espécies do gênero Physalaemus, o DNA satélite PcP190 também foi encontrado em Leptodactylus latrans (Leptodactylidae), Crossodactylus gaudichaudii (Hylodidae) e Pseudis tocantins (Hylidae) (Vittorazzi et al. 2014; Gatto et al. 2016), mostrando-se um DNA satélite antigo, surgido há pelo menos 80 milhões de anos (Gatto et al. 2016, baseados em tempos de divergência obtidos por Fouquet et al. 2013) . Embora já tenham sido reportados DNAs satélites antigos e bastante conservados entre diferentes táxons (Robles et al. 2004; Plohl et al. 2010), é mais comum encontrar DNAs satélites espécie-específicos ou então restritos a um grupo de espécies relacionadas filogeneticamente (Tsoumani et al. 2013; Kopecna et al. 2014; Nishida et al. 2014). Por isso, a presença do DNA satélite PcP190 em genomas de anuros de diferentes famílias (Vittorazzi et al. 2014; Gatto et al. 2016) levanta questões do porquê desse fato. Uma das hipóteses para explicar esse fenômeno residiria no surgimento independente dessas sequências em espécies ancestrais das famílias analisadas. Porém, a existência em Pseudis tocantins de sequências com a região hipervariável altamente similar (>90%) com as encontradas em Physalaemus spp. aponta para uma origem em comum, bem como permite a inferência desse tipo de sequência como sendo a mais ancestral do DNA satélite PcP190 (Gatto et al. 2016). O acúmulo de PcP190 em regiões centroméricas levanta questões acerca da funcionalidade desse DNA satélite e de um possível papel na biologia dos centrômeros ou organização da heterocromatina (Vittorazzi et al. 2011, 2014; Gatto et al. 2016). No entanto, até o momento nenhum experimento foi realizado a fim de testar essa hipótese. O DNA satélite PcP190 tem, na sua unidade monomérica, uma região mais conservada entre todos os táxons dos quais foi isolado e uma segunda região, chamada de hipervariável, que varia tanto em tamanho quanto em composição (Gatto et al. 2016). A região mais conservada compreende justamente a parte do DNA satélite PcP190 que é

29 mais similar à região transcritora do DNAr 5S. Já a região hipervariável possibilita a identificação de diferentes grupos de sequências do DNA satélite PcP190 (Gatto et al. 2016). Gatto et al. (2016) inferem, com base na similaridade da região mais conservada de PcP190 com o DNAr 5S, que os diferentes grupos do DNA satélite PcP190 podem ter surgido a partir de eventos de recombinação ilegítima entre essas duas classes de sequências repetitivas. III.3. Cromossomos sexuais e DNA repetitivo em Pseudis: teria o DNA satélite PcP190 um papel importante na diferenciação de cromossomos sexuais no gênero? Como citado anteriormente (item III.1.2.), anfíbios anuros apresentam grande diversidade de cromossomos sexuais, principalmente no que diz respeito a estágios de diferenciação desses cromossomos sexuais (revisão de Schmid et al. 2012 e Malcom et al. 2014). Tais fatos transformam os anfíbios em ótimos modelos para o estudo da diferenciação de cromossomos sexuais, podendo obter explicações, utilizando abordagens filogenéticas, de como ocorreu o processo de diferenciação e o porquê da manutenção da homomorfia em diversos grupos (exemplos em Ogata et al. 2003; Ogata et al. 2008; Evans et al. 2012; Dufresnes et al. 2014; Dufresnes et al. 2015). Nesse âmbito, os anuros do gênero Pseudis se mostram um bom modelo para o estudo da diferenciação dos cromossomos sexuais, pois: (a) a espécie Pseudis tocantins é a única do gênero a apresentar cromossomos sexuais heteromórficos com substancial diferenciação (Busin et al. 2008; Gatto et al. 2016); (b) há marcadores cromossômicos que possibilitam a inferência de homeologia entre os cromossomos sexuais de P. tocantins e o par cromossômico 7 homomórfico de outras espécies do gênero (Busin et al. 2001, 2008); (c) as relações filogenéticas entre as espécies do gênero já foram inferidas (Duellman et al. 2016); e (d) o cromossomo W de P. tocantins apresenta um acúmulo do DNA satélite PcP190, não observado no cromossomo Z (Gatto et al. 2016) e a presença desse DNA satélite nas demais espécies do gênero ainda não foi investigada. II.3.1. Relações filogenéticas e taxonomia dos gêneros Pseudis e Lysapsus Os gêneros Pseudis Wagler, 1830 e Lysapsus Cope, 1862 compreendem espécies de anuros neotropicais que ocorrem no Brasil, bem como na Argentina, Bolívia, Guiana, Paraguai, Peru, ilha de Trinidad e Venezuela (Frost 2018) (Figura 2). Os gêneros Pseudis e Lysapsus compreendem espécies de rãs com hábito quase estritamente aquático, ocupando corpos de água permanentes (Savage e Carvalho 1953; Gallardo 1972, Duellman e Trueb 1985). Tanto Pseudis quanto Lysapsus têm atividade noturna, vocalizando parcialmente submersos nos corpos de água e apoiando os membros posteriores na vegetação aquática, no caso de Pseudis bolbodactyla (Brandão et al. 2003), ou sobre a vegetação aquática, como Lysapsus limellum (Garda et al. 2007). Ambos os gêneros têm características morfológicas similares como olhos grandes e protuberantes na porção ventral da cabeça e membranas interdigitais bastante desenvolvidas, as quais são relacionadas ao modo de vida quase estritamente aquático desses animais (Savage e Carvalho 1953). Outra interessante característica dos dois gêneros é a discrepância de tamanho entre os girinos (aproximadamente 200 mm em Pseudis paradoxa) e indivíduos adultos, sendo por esse fato chamados também de rãs paradoxais (Shaw 1802; Garda et al. 2010; Santana et al. 2016). As maiores diferenças morfológicas entre os dois gêneros se refere ao comprimento dos indivíduos adultos, que em Pseudis chegam a 70 mm de

30 comprimento, enquanto em Lysapsus o comprimento máximo é de 20 mm (Garda et al. 2010). Dentre os caracteres utilizados para identificar as espécies de Pseudis estão padrão de coloração ventral, padrão de listras longitudinais nas coxas e textura da pele, enquanto em Lysapsus a presença/ausência de tubérculos nas faces ventral e dorsal pode diferenciar Lysapsus caraya e L. limellum de L. laevis (Garda et al. 2010).

Figura 2. Distribuição geográfica das espécies atualmente incluídas no gênero Pseudis. Esse mapa foi gerado pelo software Diva-Gis (http://www.diva-gis.org/), com base em informações obtidas do banco de dados da IUCN1 (International Union for Conservation of Nature). Os gêneros Pseudis e Lysapsus têm passado por várias revisões taxonômicas com base em diversas abordagens, que incluem análises de dados morfológicos, comportamentais, moleculares e citogenéticos. Atualmente, o gênero Pseudis compreende as espécies Pseudis bolbodactyla Lutz, 1925; Pseudis cardosoi Kwet, 2000; Pseudis fusca Garman, 1883; Pseudis minuta Günter, 1858, Pseudis paradoxa (Linnaeus, 1758) e Pseudis tocantins Caramaschi e Cruz, 1998 (Figura 2). Pseudis platensis

1 Website http://www.iucnredlist.org/download_spatial_data, acessado em agosto de 2018.

Gallardo, 1961 é aqui considerada como um sinônimo júnior de P. paradoxa, com base nas observações de Garda et al. (2010) e Santana et al. (2016), que consideram que não haja caracteres nem morfológicos nem acústicos suficientes que apontem esse táxon como válido. No gênero Lysapsus há quatro espécies descritas: Lysapsus bolivianus Gallardo, 1961; Lysapsus caraya Gallardo, 1964; Lysapsus laevis (Parker, 1935) e Lysapsus limellum Cope, 1862.

Figura 3. Espécies de Pseudis descritas até o momento: Pseudis bolbodactyla2 (A), Pseudis cardosoi3 (B), Pseudis fusca3(C), Pseudis minuta4(D), Pseudis paradoxa3 (E) e Pseudis tocantins3 (F). A proximidade filogenética entre Pseudis e Lysapsus tem sido considerada desde o trabalho de Savage e Carvalho (1953). Faivovich et al. (2005), utilizando caracteres morfológicos e moleculares, conseguiram recuperar Pseudis como grupo irmão de Lysapsus, mesmo com uma baixa amostra de espécies para os dois gêneros. Inferências filogenéticas utilizando caracteres moleculares, a fim de estudar mais profundamente as relações filogenéticas entre Pseudis e Lysapsus, realizadas por Garda e Cannatella (2007) (genes mitocondriais) e Aguiar-Júnior et al. (2007) (genes mitocondriais e um gene nuclear) recuperaram três grupos: um formado pelas espécies de Lysapsus; um segundo formado por Pseudis minuta + P. cardosoi; e um terceiro formado pelas demais espécies de Pseudis. Ambos os trabalhos também apontaram o parafiletismo de Pseudis em relação a Lysapsus. Duas diferentes propostas taxonômicas foram então apresentadas para resolver o parafiletismo encontrado. Garda e Cannatella (2007) propuseram a revalidação do gênero Podonectes para alocar P. minuta e P. cardosoi, enquanto Aguiar-Júnior et al. (2007) sugeriram que Lysapsus fosse sinônimo júnior de Pseudis. Entretanto, a recuperação de Pseudis como um grupo monofilético, com o clado formado por Pseudis minuta + P. cardosoi como grupo irmão do restante das espécies de Pseudis, por Wiens et al. (2010), em uma vasta análise da família Hylidae, aponta como

2Créditos: Dr. Diego José Santana. 3Créditos: Dr. Mauro Teixeira Jr. 4Créditos: Dr. Raul Maneyro.

32 desnecessárias tanto as mudanças taxonômicas propostas por Garda e Cannatella (2007) quanto as propostas por Aguiar-Júnior et al. (2007). Além disso, os autores corroboraram o monofiletismo de Pseudis + Lysapsus. Recentemente, Duellman et al. (2016), analisando a família Hylidae, obtiveram relações similares às apresentadas por Wiens et al. (2010) em relação aos gêneros Pseudis e Lysapsus. III.3.2. Características citogenéticas de Pseudis e Lysapsus Os anuros dos gêneros Pseudis e Lysapsus apresentam 2n = 24 (Barrio e Rubel 1970; Busin et al. 2001; Busin et al. 2006; Busin et al. 2008; Suárez et al. 2013), com exceção de Pseudis cardosoi, que apresenta 2n = 28, número diploide provavelmente resultante de dois eventos de fissão cêntrica em um cariótipo ancestral com 2n = 24 (Busin et al. 2001). Majoritariamente os cariótipos das espécies de Pseudis e Lysapsus são compostos por cromossomos metacêntricos e submetacêntricos. Os estudos com técnicas clássicas de citogenética mostram a presença de segmentos heterocromáticos compartilhados entre esses gêneros, como é o caso da banda heterocromática localizada no braço curto dos cromossomo 6 desses anuros (cromossomo 4 em P. cardosoi) (Busin et al. 2001; Busin et al. 2006; Busin et al. 2008; Suárez et al. 2013), além de alguns padrões espécie-específicos, como uma banda intersticial no braço longo do cromossomo 9 e outra intersticial no braço curto do cromossomo 10 de P. tocantins (Busin et al. 2008). Além disso, também podem ser observados padrões heterocromáticos compartilhados entre as espécies de um gênero, como a presença de uma banda intersticial no braço longo do cromossomo 1 em Lysapsus (Busin et al. 2006; Suárez et al. 2013). Uma das características citogenéticas mais marcantes para o gênero Pseudis é a presença de cromossomos sexuais heteromórficos em Pseudis tocantins, que denotam a existência de um sistema de determinação do tipo ZZ/ZW (Busin et al. 2008), não detectado nas demais espécie do gênero. O par de cromossomos sexuais de P. tocantins é classificado com o sétimo em tamanho, sendo o cromossomo Z metacêntrico, enquanto o cromossomo W é submetacêntrico. Além disso, o cromossomo Z possui uma banda heterocromática pericentromérica no braço longo e adjacente a ela uma NOR distal, enquanto o cromossomo W possui um grande bloco heterocromático intersticial e a NOR localizada na região pericentromérica. Com base nesses resultados, Busin et al. (2008) inferem que a diferença de tamanho entre os cromossomos Z e W de P. tocantins se dá pela amplificação da heterocromatina no cromossomo W. Os autores também propõem a ocorrência de uma inversão durante a diferenciação dos cromossomos sexuais, baseados na posição relativa da NOR no braço longo dos cromossomos Z e W. Busin et al. (2008) inferem que ambos os eventos contribuíram para evolução do heteromorfismo entre os cromossomos Z e W em P. tocantins. Entretanto, com os dados disponíveis, não há suporte para inferir qual dos dois eventos foi primordial na diferenciação dos cromossomos Z e W de P. tocantins. A técnica de CGH mostrou forte sinal de hibridação da sonda do genoma de fêmea em toda a extensão da banda heterocromática do braço longo do cromossomo W, sugerindo uma divergência na composição molecular da heterocromatina do braço longo dos cromossomos Z e W (Gatto et al. 2016). O mapeamento do DNA satélite PcP190 revelou o acúmulo desse tipo de sequência na heterocromatina de Wq, não observado no cromossomo Z. Como a presença de sequências PcP190 foi detectada por PCR a partir

33 do DNA genômico de macho e de cromossomos Z microdissecados, é possível concluir que esse DNA satélite não é sexo-específico em Pseudis tocantins, embora esteja acumulado no cromossomo W (Gatto et al. 2016). As regiões organizadoras de nucléolos (NORs) nas demais espécies de Pseudis e nas espécies de Lysapsus estão localizadas no braço longo do par 7 (que corresponde ao par de cromossomos sexuais de Pseudis tocantins), exceto em P. cardosoi, cuja NOR está localizada no braço longo do par 5 (Busin et al. 2001; Busin et al. 2006; Busin et al. 2008; Suárez et al. 2013). Em Lysapsus caraya, a NOR do par 7 não é a principal do cariótipo, já que ocorre em condição heterozigótica, adicionalmente à NOR localizada nos cromossomos do par 6 (Busin et al. 2006). Com base na presença de NOR e de uma banda heterocromática adjacente à mesma, Busin et al. (2008) propuseram que o par 5 de P. cardosoi e os pares 7 das demais espécies de Pseudis (inclusive o par de cromossomos sexuais de P. tocantins) sejam homeólogos. A morfologia e o tamanho similares desses cromossomos estão de acordo com essa hipótese. O acúmulo do DNA satélite PcP190 no cromossomo W de Pseudis tocantins pode ter tido um importante papel na diferenciação dos cromossomos sexuais dessa espécie (Gatto et al., 2016). Porém, ainda não se faz possível inferir os passos que levaram à diferenciação desses cromossomos. Dessa maneira, o isolamento, caracterização e mapeamento do DNA satélite PcP190 em outras espécies de Pseudis poderiam auxiliar, a partir de uma abordagem filogenética, na investigação da diferenciação cromossômica que resultou nos cromossomos sexuais de P. tocantins. Aliado a essa abordagem, o uso de novas tecnologias de sequenciamento também pode auxiliar no estudo da diferenciação dos cromossomos sexuais em P. tocantins a partir de uma melhor visão da arquitetura genômica, principalmente no que diz respeito a caracterização de sequências de DNA repetitivo.

IV. Objetivo IV.1. Objetivo geral O objetivo geral do presente trabalho é analisar a diferenciação dos cromossomos sexuais de Pseudis tocantins de um ponto de vista filogenético, avaliando melhor a composição desses cromossomos e buscando entender as relações entre eles e seus possíveis homeólogos em espécies proximamente relacionadas. IV.2. Objetivos específicos 1 – Isolar, caracterizar e mapear o DNA satélite PcP190 em P. bolbodactyla, P. cardosoi, P. fusca, P. minuta, P. paradoxa e Pseudis sp.; 2 – Isolar e caracterizar o DNA satélite PcP190 em uma espécie representante do gênero Lysapsus; 3 – Utilizar a técnica de CGH em P. bolbodactyla e Pseudis sp. a fim de determinar os cromossomos sexuais nessas espécies; 4 – Utilizar abordagens genômicas para obter informações mais detalhadas acerca da composição dos cromossomos sexuais e também do genoma de P. tocantins.

V. Resultados e Discussão

Os resultados obtidos foram divididos em três capítulos, apresentados a seguir. No Capítulo 1 é analisada a presença de PcP190 nas espécies Pseudis bolbodactyla, P. cardosoi, P. minuta, P. paradoxa e em Lysapsus limellum. Pequeno heteromorfismo sexual cromossômico é reconhecido em P. bolbodactyla e a hipótese de homeologia dos cromossomos portadores das NORs em Pseudis é abordada, bem como a inferência de rearranjos cromossômicos nesse gênero. No Capítulo 2 são abordadas as variações de abundância do DNA satélite PcP190 em três populações inicialmente identificadas como sendo de P. fusca. Também nesse capítulo é apresentado o teste da hipótese de ocorrência no ancestral comum de P. tocantins + P. fusca da inversão pericentromérica que levou o sítio PcP190 do braço curto para o braço longo do cromossomo portador de NOR. Além disso, são apresentadas as relações filogenéticas das populações em estudo e pode-se evidenciar que uma delas pode representar uma espécie ainda não descrita para o gênero Pseudis. No Capítulo 3 são apresentados os dados obtidos com o sequenciamento de nova geração (NGS) dos cromossomos sexuais e do genoma de P. tocantins. A homeologia entre os cromossomos sexuais de P. tocantins para com dois cromossomos de Xenopus tropicalis é inferida e são apresentadas evidências de acúmulo no cromossomo W de P. tocantins de outras classes de DNAs repetitivos além do DNA satélite PcP190. Os experimentos de NGS realizados permitiram o sequenciamento do genoma mitocondrial de P. tocantins, e este foi descrito em um capítulo suplementar, também apresentado a seguir (Anexo III).

Capítulo 1: Sex chromosome differentiation in the frog genus Pseudis involves satellite DNA and chromosome rearrangements5 1. Abstract The genus Pseudis comprises six frogs of the family Hylidae and only P. tocantins had heteromorphic sex chromosomes detected by classical cytogenetics. In this species, the W chromosome is larger than the Z chromosome and has a large heterochromatic block located between the centromere and the nucleolus organizer region (NOR) in the long arm. This large heterochromatic band is enriched for the PcP190 satellite DNA (satDNA), whereas the Z chromosome bears a smaller C-band adjacent to the centromere in the long arm that is not detected by PcP190 probes. To assess sex chromosome differentiation in the genus Pseudis, we investigated the PcP190 satDNA in P. bolbodactyla, P. cardosoi, P. minuta, and P. paradoxa and in one species of Lysapsus, which is the sister genus of Pseudis. PcP190 sequences were isolated, and sequenced, and the diversity of this class of satDNA was analyzed. To evaluate whether sex-related variations in PcP190 satDNA were present, we used in situ hybridization (for P. bolbodactyla, P. paradoxa, P. cardosoi, and P. minuta) and Southern blotting analysis (for all species). We found a low level of sex chromosome heteromorphism in P. bolbodactyla, as a PcP190 cluster was detected in the short arm of one of the homologues of pair 7 exclusively in females. In P. paradoxa, P. minuta, and P. cardosoi, PcP190 satDNA is not sex-related, although a cluster of PcP190 sequences could be recognized in the NOR-bearing chromosomes 7 of P. paradoxa and P. minuta and their homologous chromosome 5 of P. cardosoi. By tracking cytogenetic data in a species tree, we may hypothesize that the positioning of the PcP190 site adjacently to the NOR (as observed in the long arm of the W chromosome of P. tocantins) is a derived condition with respect to the location of the PcP190 site apart from the NOR, in the short arm of the NOR-bearing chromosomes 7 (as present in P. bolbodactyla, P. paradoxa and P. minuta) or 5 (as present in P. cardosoi) and we discuss about the emergence of PcP190 satDNA as a sex-related trait. 2. Introduction In animal and plant species with genetic sex determination, sex chromosomes bear the gene responsible for sex determination (review in Graves 2008, Ellegren 2011). Sex chromosomes have an autosomal origin, and after the acquisition of a sex determination locus, recombination between the homologues is suppressed in the sex-specific region, leading to chromosome differentiation, which involves a progressive degeneration of chromosome Y/W (Muller, 1964; Ohno, 1967; review in Ellegren, 2011). Usually, during the differentiation of sex chromosomes, rearrangements (e.g., inversions) and accumulation/loss of heterochromatin segments occur (reviewed by Graves, 2008; Bergero and Charlesworth, 2009). The heterochromatin regions in eukaryotes are mainly populated by satellite DNA (satDNA), which is a class of repetitive sequences characterized by a tandem arrangement with highly repetitive monomeric units longer than 100 bp (reviewed by Charlesworth et al., 1994; Plohl et al., 2012). The accumulation of satDNA in sex chromosomes has been reported for several species of animals and plants (e.g., Nakayama et al., 1994; Hobza et al., 2006; Mariotti et al., 2009), and in

5 Artigo publicado na revista Frontiers in Genetics. Conta também com a co-autoria de Karin R. Seger e João V. Mattos.

37 addition to being a possible cause of recombinatory suppression, it may also be a consequence of this process (Charlesworth et al., 2005; Schartl et al., 2016; Singh et al., 1976, 1980). Among anurans, heteromorphic sex chromosomes are rare, but a considerable number of species that bear this feature exhibit a Y or W chromosome with heterochromatin accumulation (Schartl et al., 2016; Schmid et al., 2012). One of those species is Pseudis tocantins, which possesses a ZZ/ZW sex determination system, with the W chromosome being submetacentric and larger than the metacentric Z, mainly because of heterochromatin amplification in the long arm of the W chromosome (Wq) (Busin et al., 2008). Pseudis tocantins Wq heterochromatin is enriched for the PcP190 satDNA (Gatto et al., 2016), which is a satDNA inferred to have originated from 5S rDNA (Vittorazzi et al., 2011) and has been shown to be present in several species of the superfamily Hyloidea (Vittorazzi et al., 2014; Gatto et al., 2016). An interesting feature of the repetitive units of this satDNA is the presence of a more conserved region, which is very similar among all the taxa, and a hypervariable region that allows for the identification of several sequence groups (Gatto et al., 2016). In the P. tocantins karyotype, the only cluster of PcP190 detected by in situ hybridization of PcP190 probes is in the Wq, and Southern blotting analysis using PcP190 probes also allowed for the discrimination between males and females (Gatto et al., 2016). Besides Pseudis tocantins, the hylid genus Pseudis encompasses five other species (here we considered P. platensis as a junior synonym of P. paradoxa, based on the adult and tadpole morphological and acoustical studies from Garda et al. (2010) and Santana et al. (2016)) and none of them have sex chromosome heteromorphism detected by classical cytogenetics (Busin et al., 2001, 2008). The sex chromosome pair of P. tocantins was hypothesized to be homeologous to chromosome pair 7 in other species of Pseudis (pair 5 in Pseudis cardosoi) and chromosome pair 7 of Lysapsus based on their similar morphology and the presence of nucleolus organizer regions (NOR) (Busin et al., 2006, 2008; Suárez et al., 2013). No information regarding the presence of the PcP190 satDNA in these species is available. Considering that sex chromosome heteromorphism in Pseudis tocantins is related to the PcP190 satDNA, with the aim of investigating sex chromosome evolution in Pseudis, in this paper we analyzed the PcP190 satDNA of four other species of Pseudis (i.e., P. bolbodactyla, P. cardosoi, P. minuta, and P. paradoxa) and one species of Lysapsus, which is the sister genus of Pseudis (for phylogenetic relationships, see Wiens et al., 2010; Duellman et al., 2016). Chromosome mapping of PcP190 satDNA i) supported the NOR-bearing chromosomes of the Pseudis species as homeologous chromosomes, ii) revealed that sex chromosome heteromorphism is also present in P. bolbodactyla and iii) allowed for the inference of some chromosome rearrangements during the evolution of this genus. 3. Materials and Methods 3.1. Species and chromosome preparations We analyzed eight specimens of Pseudis bolbodactyla, seven P. cardosoi, eight P. minuta, ten P. paradoxa, and eight Lysapsus limellum (see Supplementary Table 1 for

38 details). The individuals used in this work had their karyotypes described previously by Busin et al. (2001, 2006, 2008), except for two specimens of P. minuta (ZUEC 22082 and ZUEC 22096) and one exemplar of P. bolbodactyla (ZUEC 22080), which were collected under the authorization issued by the Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade/Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (ICMBio/SISBIO) (authorization #45183-3) and deposited at the Museu de Zoologia “Prof. Adão José Cardoso”, Universidade Estadual de Campinas (ZUEC-UNICAMP). Individuals previously used by Busin et al. (2001, 2006, 2008) were collected under authorization issued by the Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Renováveis (IBAMA) (process #02001008875/01-11, license #039/03). Chromosome preparations were obtained from the cytogenetic collection deposited at the Laboratory of Chromosome Studies of the University of Campinas or directly from the captured specimens of P. bolbodactyla and P. minuta. In the latter case, the animals were injected intraperitoneally with 2% colchicine solution in distilled water (0.02 mL/g body weight), and after four hours, they were anesthetized with 2% lidocaine (50 mg/g body weight – cutaneous administration). Chromosome preparations were obtained from the intestine according to King and Rofe (1976), with some minor modifications. Briefly, the intestine was removed from anesthetized animals, cut open lengthwise and incubated for 40 minutes in a 0.9% sodium citrate solution. The intestine was then placed in a fixative solution of methanol:acetic acid (3:1) and the epithelial cells were vigorously scraped. Cell suspension was centrifuged for 5 minutes at 800 rpm, the supernatant fixative was removed and the material was washed with new fixative twice. Intestinal cell suspension was transferred to 1.5 mL tube and stocked in a freezer for further use. This protocol was approved by the Committee for Ethics in Animal Use of the University of Campinas (CEUA/UNICAMP) (protocol # 3419-1). 3.2. PcP190 satellite DNA isolation and sequencing Genomic DNA samples were obtained from liver tissue from male and female individuals of Pseudis and Lysapsus species (Supplementary Table 1) following the TNES method employed by Medeiros et al. (2013). Integrity of genomic DNA was evaluated by electrophoresis in a 0.8% agarose gel and total genomic DNA was quantified in a Nanodrop (Thermo Fisher, USA) spectrophotometer. PcP190 satDNA was isolated by PCR using the primers P190F (5’-AGACTGGCTGGGAATCCCAG-3’) and P190R (5’-AGCTGCTGCGATCTGACAAGG-3’), described previously by Vittorazzi et al. (2011). The PCR program used was: (1) 94 ºC for 8 minutes; (2) 39 cycles of 94 ºC for 30 seconds, 58 ºC for 1 minute and 72 ºC for 2.5 minutes; (3) 72 ºC for 8 minutes. PCR amplicons were purified using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) and inserted in a plasmid pGEM-T Easy Vector (Promega). Plasmids were cloned into E. coli JM-109 bacteria using the TransformAid Bacterial Transformation Kit (Fermentas), according to manufacturer instructions. Recombinant colonies were selected, plasmid DNA was extracted following Sambrook et al. (1989), and the inserts were amplified by PCR using the T7 and SP6 universal primers. After purification with the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), the cloned fragments were sequenced on both strands using BigDye Terminator (Applied Biosystems) according to manufacturer instructions.

3.3. Sequence analysis of PcP190 satellite DNA The obtained nucleotide sequences were edited using the program BioEdit v. 7.0.9.0 (Hall, 1999) and aligned with sequences from GenBank (Supplementary Table 2) using the Clustal W algorithm implemented in BioEdit. Similarity analyses were conducted by pairwise comparison using the same program. For identification of PcP190 sequence groups we followed the criteria of Gatto et al. (2016). 3.4. Southern blot analysis of PcP190 satellite DNA To evaluate the abundance of PcP190 satDNA in male and female Pseudis bolbodactyla, P. cardosoi, P. minuta, P. paradoxa, and L. limellum (see Supplementary Table 1 for specimen details), a Southern blot analysis was performed using total genomic DNA samples that were obtained by the standard phenol:chloroform method (Sambrook et al. 1989). The restriction endonucleases used to cut the genomic DNA samples and the PcP190 probes used to detect the restriction fragments were choosen based on the type of PcP190 sequence that was shown to be frequent in each species (Table 1 summarizes the types of PcP190 sequences found in each species). Enzymes that cleave a single site per monomer of PcP190 sequence were used. The PcP-2 sequences were digested in their hypervariable region by MboII or HindIII, while the PcP-3 sequences had their hypervariable region cut by HindIII. The PcP-8 sequences were digested in the CR by the endonuclease restriction StuI. Complete genomic DNA digestion was performed with 12 hours of endonuclease activity. The restriction fragments were electrophoresed in a 1.2% agarose gel and transferred to a nitrocellulose membrane according to Sambrook et al. (1989). Probes for PcP-2 (Gatto et al., 2016), PcP-3 (PcP190-3-Pmin-M-C8), and PcP-8 (PcP190-8-Llim-M-C7) sequences were labeled by PCR using the PCR Dig Probe Synthesis Kit (Roche) and hybridized overnight at 65 °C to the nitrocellulose membrane containing the restriction fragments. After hybridization, nitrocellulose membranes were washed twice in a solution of 2x SSC/0.1% SDS (5 minutes each wash) at room temperature and then washed twice in a solution of 0.1x SSC/0.1% SDS (15 minutes each) at 65 °C. Probes were detected using the DIG Nucleic Acid Detection Kit (Roche) following the manufacturer’s instructions. 3.5. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of PcP190 satellite DNA The PcP-2 sequence PcP190-2-Pbol-F-C7 and PcP-3 sequence PcP190-3-Pmin- M-C5 were labelled using the PCR Dig Probe Synthesis Kit (Roche) to generate PcP-2 and PcP-3 probes, respectively. The resulting amplicons were precipitated in the presence of sonicated salmon sperm DNA (100 ng/µL) and resuspended in hybridization solution (50% formamide, 2x SSC and 10% dextran sulfate). The PcP-2 probe was hybridized to chromosome preparations from P. bolbodactyla (four females and four males) and P. paradoxa (four females and three males), whereas the PcP-3 probe was hybridized to karyotypes from P. minuta (two females and three males) and P. cardosoi (two females and two males) (see Supplementary Table 1 for specimen details). Hybridization assays were performed according to Viegas-Péquignot (1992). Chromosome preparations were incubated at 37 °C for 45 minutes with rhodamine conjugated anti-digoxigenin (600 ng/µL) for probe detection, washed with PBT solution (1x PBS, 0.4% BSA and 0.1% Tween 20) and counterstained with 0.5 µg/µL of 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI).

Chromosome preparations were observed in an Olympus Bx-60 (Olympus, Japan) fluorescence microscope. Images were captured with a Q-Color 3 digital system and edited only using brightness and contrast options in Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems). 3.6. Comparative genomic hybridization (CGH) in Pseudis bolbodactyla Because the analysis of PcP190 sequences showed sex chromosome heteromorphism in Pseudis bolbodactyla (see Results), we employed CGH to analyze the hybridization of female-derived DNA probes to female metaphases of this species in the presence of male-derived competitor DNA. Genomic DNA samples (1 µg each) from females of P. bolbodactyla, obtained with a standard phenol:chloroform method (Sambrook et al., 1989), were labelled using the Nick Translation Kit (Roche) by incorporation of FITC-12-dUTP (Roche) or Dig-11-dUTP (Roche). Each labelled sample was precipitated and resuspended in hybridization solution (50% formamide, 2x SSC, and 10% dextran sulfate) together with fragmented male genomic DNA from P. bolbodactyla used as competitor DNA. Competitor DNA was obtained by boiling male genomic DNA, diluted in 0.3 M NaCl, in an autoclave for 30 minutes and 1.4 atm/120 °C. Samples of the fragmented DNA were submitted to electrophoresis in 1% agarose gel to check for a fragmentation length distribution between 100 and 1000 bp, purified by phenol:chloroform standard extraction and resuspended in hybridization solution (50% formamide, 2x SSC and 10% dextran sulfate). Probe/competitor DNA proportions for hybridization assays were 1:10. Hybridization assays were performed as previously mentioned on section 2.5, using chromosome preparations from two P. bolbodactyla females (see Supplementary Table 1 for specimen details). 4. Results 4.1. PcP190 satellite DNA diversity in Pseudis and Lysapsus The PCR reactions for PcP190 satDNA isolation generated fragments between 200 – 400 bp, and 69 clones were obtained. Sequences belonging to five of the seven PcP190 groups previously recognized by Gatto et al. (2016) were identified in our sample (Figure 1 and Table 1). Moreover, two new sequence groups were identified based on their hypervariable regions: the PcP-8 group for sequences isolated from Lysapsus limellum (Figure 1 and Table 1), and the PcP-9 group for one sequence found in P. minuta (Figure 2 and Table 1). The average similarity of the hypervariable region in each group was above 90%, except for the PcP-2 group (which was 79.83%) (Table 1). Pseudis bolbodactyla showed the greatest diversity with respect to PcP190 sequences, as sequences belonging to five distinct groups were identified (Table 1).

Table 1. Groups of PcP190 satellite DNA sequences found in Pseudis (present work and Gatto et al., 2016) and Lysapsus (present work). Monomer lengths and similarity in the hypervariable region are indicated for each group of PcP190 sequences. N: number of sequences. Sequence Groups found in Groups found in Groups found in Groups found in Groups found in Average similarity in groups P. tocantins1 P. bolbodactyla P. paradoxa P. minuta L. limellum hypervariable region (%) PcP-1a X (N = 7) - - X (N = 3) X (N = 1) 93.74 (N = 11) PcP-1b X (N = 10) X (N = 1) - - - 99.72 (N = 11) PcP-2 X (N = 14) X (N = 12) X (N = 6) - - 79.83 (N = 32) PcP-3 X (N = 3) - - X (N = 33) - 97.19 (N = 36) PcP-5 X (N = 4) X (N = 1) - - - 94.08 (N = 5) PcP-7 X (N = 14) X (N = 5) - - - No hypervariable region2 PcP-8 - - - - X (N = 14) 91.54 (N = 14) PcP-9 - - - X (N = 1) - ?3 1Based on Gatto et al. (2016). 2PcP-7 sequences do not present hypervariable region (see Figure 1). 3Not calculated because only one sequence was available.

Figure 1 Alignment of PcP190 satDNA sequences isolated from Pseudis bolbodactyla, Pseudis minuta, Pseudis paradoxa, and Lysapsus limellum with sequences made available at GenBank for Pseudis tocantins (KX170887.1; KX170893.1; KX170895.1; KX170898.1; KX170908.1; KX170911.1; KX170916.1; KX170922.1; KX170924; KX170929.1; KX170930.1; KX170931.1 and KX170933.1), Physalaemus cuvieri (JF281121.1; JF281124.1; KM361975.1; KM361678.1 and KM361679.1), Physalaemus centralis (KM361684.1 and KM361685.1), Physalaemus albonotatus (KM361689.1 and KM361690.1), Physalaemus albifrons (KM361694.1; KM361696.1 and KM361698.1), Physalaemus ephippifer (KM361699.1 and 361700.1), Physalaemus marmoratus (KM361701.1 and KM361703.1), Leptodactylus latrans (KM361718.1 and

KM361719.1), and Crossodactylus gaudichaudii (KM361725.1 and KM361726.1). Gray pentagons indicate the P190F and P190R primer sites. Sequences with a dark gray segment (correspondent to “N” breaks) in the central region of the more conserved region of PcP190 are partial monomers, isolated using the P190F and P190R primers. Sequences with the more conserved region completely sequenced are derived from fragments composed of multiple monomers of PcP190. This figure was created in Geneious 8.0 (Biomatters). Three of the eight cloned sequences composed of more than one monomer exhibited juxtaposed sequences from different PcP groups. These three multimeric sequences were isolated from Lysapsus limellum, Pseudis bolbodactyla and P. minuta (Figure 2). The heterogeneous multimeric fragment obtained from P. minuta (PcP-9 sequence in Figure 2) also stands out by its presence of a hypervariable region (HR) that does not match any of those recognized previously.

Figure 2 Scheme of fragments isolated from Lysapsus limellum, Pseudis bolbodactyla, and Pseudis minuta composed of different types of juxtaposed PcP190 sequences. Different colors represent distinct types of sequences based on the hypervariable region. The different shades distinguish the hypervariable region (darker shade) from more conserved region (light shade). Gray arrows indicate the P190F and P190R primer sites. Comparisons between the CR of the PcP190 sequences obtained in this work and sequences from Pseudis tocantins (Gatto et al., 2016) and anurans from the genus Physalaemus, Leptodactylus, and Crossodactylus (Vittorazzi et al., 2011, 2014) showed an average similarity of 85.12%. Another intriguing fragment (PcP190-Ppar-F-C5) was isolated from Pseudis paradoxa and included three partial CR intercalated with two HR of the PcP-2 group (Figure 3). The first partial CR was 5’-truncated and presented a duplication of the region corresponding to the reverse primer sequence (P190R). These duplicated regions differed from one another by only two sites (Figure 3). The second CR was partial due to a deletion of the first 25 bp, and the third CR was 3’-truncated as it ended at the reverse primer incorporated by PCR. One HR in this fragment was 3’-truncated and was only 41 bp, whereas a complete HR with 62 bp was also present (Figure 3).

Figure 3 Fragment PcP190-Ppar-F-C5 isolated from Pseudis paradoxa. (A) Nucleotide sequence. Dark gray and light gray arrows indicate the P190F and P190R primer sites, respectively. Dark gray and light gray underlines indicate regions with similarity to the P190F and P190R primer sites, respectively. Black underlines after P190R primer sites regions indicate the “AC” site normally found after the regions similar to the reverse primer in the PcP190 satellite DNA sequences. (B) Alignment of the sequences identified as monomers in the insert PcP190-Ppar-F-C5 with selected PcP-2 sequences of P. tocantins and P. bolbodactyla. Figure (B) was created in Geneious 8.0 (Biomaters). 4.2. Southern blotting does not detect PcP190 satDNA in male genome of Pseudis bolbodactyla Southern blotting analysis of Pseudis bolbodactyla female digested genomic DNAs probed with PcP-2 sequences showed a ladder pattern typical of satDNA sequences (Figure 4A). However, male genomic DNAs of this species did not show any hybridization signal of the PcP-2 probe in Southern blot, although PcP-1b, PcP-5 and PcP-7 sequences were isolated from the male genome of P. bolbodactyla by PCR. In contrast to P. bolbodactyla, in P. paradoxa, P. cardosoi, P. minuta, and L. limellum the Southern blotting analysis did not show sex-related patterns (Figures 4B-4E). In the latter three species, both male and female digested genomic DNAs showed the same ladder pattern when hybridized with PcP190 probes (Figures 4B, 4C and 4E). In P. paradoxa, two distinct patterns (i.e., ladder pattern and absence of hybridization signal) were observed both among the three analyzed males and among the four analyzed females (Figure 4D). 4.3. PcP190 satDNA is mapped to the NOR-bearing chromosome pair in Pseudis and reveals sex chromosome heteromorphism in Pseudis bolbodactyla Probes for the PcP190 satDNA showed strong signals of hybridization in the heterochromatic region of the short arm of one of the homologues of pair 7 in the karyotype of four females of Pseudis bolbodactyla (Figure 5A), while no hybridization

45 signal was observed in the four males of this species (see Supplementary Table 1 for number of analyzed metaphases). The karyotypes of three males and two females of P. paradoxa analyzed showed hybridization signals in one of the homologues of pair 7 (Figure 5B). Furthermore, two females of P. paradoxa (being one of them not included in the Southern blotting analysis – see Supplementary Table 1) and did not show any signals of the PcP190 probe in their karyotypes.

Figure 4 Southern blotting analysis of PcP190 sequences in female (F) and male (M) of Pseudis bolbodactyla (A), P. cardosoi (B), P. minuta (C), P. paradoxa (D), and Lysapsus limellum (E). The restriction enzyme (HindIII or StuI) and the PcP probe for more frequent sequence group in each species (PcP-2, PcP-3, or PcP-8 probe) used in each experiment are indicated. Only one representative blot of each pattern is shown. In P. minuta and P. cardosoi, males and females showed the same pattern of hybridization with the PcP190 probes. In both male and female karyotypes of P. minuta, the PcP190 satDNA was mapped to the heterochromatic block of the short arm of both pair 7 homologues, and a week hybridization signal of the PcP probes was seen in the centromeric region of chromosome pair 12 (Figure 5C). Meanwhile, in P. cardosoi, PcP190 satDNA was mapped to the heterochromatic block of the short arm of both pair 5 homologues (Figure 5D). For the number of metaphases analyzed per specimen, see Supplementary Table 1. 4.4. Sex chromosome heteromorphism in Pseudis bolbodactyla revealed by comparative genomic hybridization CGH experiments conducted on chromosome preparations from two females of Pseudis bolbodactyla showed a strong hybridization signal of the female-derived probe in exclusively one of the pair 7 homologues (a total of 15 high quality metaphases were

46 analyzed – see Supplementary Table 1) (Figure 6). The region revealed by CGH corresponds to the pericentromeric heterochromatic block in the short arm of this chromosome, which is also the same region detected by the PcP190 probes (Figure 5A).

Figure 5 Chromosome mapping of PcP190 satDNA. Fluorescent in situ hybridization of PcP-2 (A and B) and PcP- 3 (C and D) probes in female karyotypes of Pseudis bolbodactyla (A), P. paradoxa (B), P. minuta (C), and P. cardosoi (D). Insets in (C) and (D) show the pair 7 chromosomes in male P. minuta and male P. cardosoi, respectively. In P. paradoxa, besides the FISH-pattern shown in (B), two females showed no signal of the PcP190 probe in their karyotypes. Bar: 5 µm.

Figure 6 Comparative genomic hybridization (CGH) in a female Pseudis bolbodactyla. Chromosome preparations were stained with DAPI (A) and submitted to CGH (B). Pair 7 chromosomes from a and b were sequentially submitted to CGH and the Ag- NOR method, and ideogram of pair 7 is shown (C). In the

ideogram in c, black blocks represent the heterochromatic regions, the NORs sites are indicated by gray circles and the sex- specific site revealed by CGH is shown with dashed black/green. Bar: 5 µm. 5. Discussion In this work we found that PcP190 satDNA is widespread in the genus Pseudis and also present in the genus Lysapsus. Southern blotting analyses and chromosome mapping showed that PcP190 is sex-related in Pseudis bolbodactyla. Chromosome mapping of PcP190 also supports that the sex chromosomes of P. tocantins and P. bolbodactyla are homeologous to the NOR-bearing chromosomes of the other species of Pseudis. Lastly, PcP190 sat DNA mapping allowed us to infer the occurrence of rearrangements involving the NOR-bearing chromosomes of Pseudis. In the next sub- sections we discuss these findings in the light of phylogenetic relationships in the genus Pseudis. 5.1. PcP190 satellite DNA satDNAs usually exhibit species-specific profiles (Kirov et al., 2017; Tsoumani et al., 2013) or are shared by closely related species (Acosta et al., 2010; Kuhn et al., 2008). Few satDNA families are present in phylogenetically distantly related taxa (Plohl et al., 2010; Robles et al., 2004), and the PcP190 satDNA is included in this category, as it occurs in several genera of the anuran superfamily Hyloidea (Vittorazzi et al., 2011, 2014; Gatto et al., 2016). A high level of homogeneity among the monomers of a given satDNA family is expected because the monomeric units may evolve in concert (reviews in Charlesworth et al., 1994; Ugarković and Plohl, 2002; Plohl et al., 2012). According to the concerted evolution model, the changes in a repetitive unit of a tandem repetitive sequence can be spread to other monomers by a process called molecular drive, which involves unequal crossing-over, gene conversion, transpositions, and insertions of extrachromosome circular DNA (Dover, 1982, 1986; Plohl et al., 2012). However, in Pseudis tocantins seven sequence groups of PcP190 satellite sequences were identified, which could be distinguished from each other mainly by their hypervariable region, suggesting that the homogenization mechanisms are not so effective in this case (Gatto et al., 2016). In the present work, different sequence groups of PcP190 were also recognized for P. minuta, Lysapsus limellum, and particularly P. bolbodactyla, including the description of two new sequence groups (PcP-8 in L. limellum and PcP-9 in P. minuta). Despite the variation observed in the PcP190 family, we found evidence of rearrangement involving different PcP groups. One line of evidence refers to the juxtaposition of sequences that belong to different PcP-groups, as observed in Pseudis tocantins (Gatto et al., 2016), P. bolbodactyla, P. minuta, and Lysapsus limellum (present work). In addition, a cloned fragment of the PcP-2 group, isolated from P. paradoxa (PcP190-Ppar-F-C5), showed evidence of rearrangements involving the CR of the PcP190 satDNA, since the CR segment flanked by HR sequences showed a deletion of 25 bp. Moreover, the duplicated regions that correspond to the reverse primer (P190R) site, observed in the 5’ end of this fragment, may also be interpreted as a rearranged

48 segment. That is because we found the dinucleotide “AC” between these two regions that were similar to the reverse primer site, which is the same dinucleotide that follows the reverse primer site in the CR of the PcP-2 group. Due to the presence of this “AC” dinucleotide, it is unlikely that the arrangement in PcP190-Ppar-F-C5 was formed by primer ligation before the cloning procedure, and one might suggest that a rearrangement could be responsible from the deletion of a segment between two reverse primer site regions. The Southern blotting analysis of PcP190 sequences showed a sex-specific profile in P. bolbodactyla, with PcP190 bands detected only in female genomes, as was also reported for P. tocantins (Gatto et al., 2016). Because PcP190 sequences (belonging to PcP-1b, PcP-5, and PcP-7) were isolated from the male P. bolbodactyla genome, we may conclude that PcP190 sequences are not exclusive, but rather that they are amplified in female P. bolbodactyla when compared to male genome of this species, similarly to the situation previously observed in P. tocantins (Gatto et al., 2016). The detection of a cluster of PcP190 sequences exclusively in only one chromosome of the female karyotype of P. bolbodactyla is in agreement with such an interpretation (see further discussion in the next section). In contrast, in P. paradoxa, P. cardosoi, P. minuta, and L. limellum, the Southern blotting showed no sex-specific pattern. 5.2. Sex chromosomes in Pseudis Busin et al. (2008) proposed, based on the presence of NOR and chromosome morphology, that the sex chromosome pair of Pseudis tocantins is homeologous to chromosome pair 5 of P. cardosoi and chromosome pair 7 of the other species of Pseudis. The mapping of PcP190 satDNA in the heterochromatin of the short arm of chromosome 7 of P. bolbodactyla, P. paradoxa, and P. minuta and chromosome 5 of P. cardosoi corroborates this hypothesis of homeology. In Pseudis bolbodactyla, a cluster of PcP190 sequences was detected exclusively in one of the homologues of pair 7 of the female karyotype (all females showed positive hybridization signals) in a site that coincides with that revealed by CGH as the female- specific region. This sex chromosome heteromorphism had not previously been detected by classical cytogenetic techniques (Busin et al., 2008) and allowed for the recognition of the chromosome that bears the PcP190 cluster as the W chromosome of P. bolbodactyla. The presence of a PcP190 cluster in the W chromosome and its absence in the Z chromosome of P. bolbodactyla (all males analyzed showed no hybridization signals) indicates that the involvement of this satDNA in sex chromosome differentiation is not restricted to P. tocantins, although the Wq PcP190 site of P. tocantins is much larger than that observed in Wp (W chromosome short arm) of P. bolbodactyla. Meanwhile, in contrast to Pseudis tocantins (Gatto et al., 2016) and P. bolbodactyla, the mapping of PcP190 satDNA in P. paradoxa, P. minuta, and P. cardosoi karyotypes did not reveal any sex chromosome heteromorphism. Southern blotting analysis confirmed the absence of sex variation related to PcP190 sequences in these three species of Pseudis and also in Lysapsus limellum. Taken these data together, and considering the phylogenetic relationships in the genus Pseudis (Wiens et al., 2010; Duellman et al., 2016), two equally parsimonious hypotheses arise: i) the sex chromosome heteromorphism related to PcP190 satDNA has arisen after the divergence

49 of the clade composed of P. minuta and P. cardosoi from the clade that includes P. tocantins and P. bolbodactyla (which also comprises P. fusca and P. paradoxa), with the loss of a PcP190 cluster in the Z chromosome of the ancestor of the latter clade and a reversion to the ancestral condition (PcP190 satDNA not related to sex heteromorphism) in P. paradoxa; ii) the sex chromosome heteromorphism related to PcP190 satDNA has arisen independently in P. bolbodactyla and P. tocantins (Figure 7). The analysis of P. fusca, which is the sister species of P. tocantins, would be helpful to assess this question in future.

Figure 7 Evolutionary hypotheses relative to differentiation of pair 7 in the genus Pseudis, inferred by tracking the cytogenetic data obtained in this work or from Busin et al. (2008) and Gatto et al. (2016) in a species tree. The cladogram shows the phylogenetic relationships of Pseudis as inferred by Duellman et al. (2016). FISH: chromosomes hybridized with PcP190 probe. For P. paradoxa, only the heterozygous condition for the presence of the PcP190 site is shown in the FISH column. SB: Southern blotting patterns. Par inv: paracentromeric inversion that moved the NOR to a region closer to the centromere. Per inv: pericentromeric inversion that moved the PcP190 site to the long arm; it may have happened in the common ancestor of P. tocantins + P. fusca or in the linage that gave rise to P. tocantins). Par inv (W): paracentromeric inversion in the long arm of chromosome W. PcP190 amp: PcP190 amplification. The green arrows indicate the independent emergence of a sex chromosome heteromorphism

related to the PcP190 satDNA (loss of a PcP190 cluster in the Z chromosome) in P. bolbodactyla and P. tocantins, and an alternative hypothesis is indicated by the blue arrow and arrowhead, which includes the emergence of a sex-related condition regarding the PcP190 satDNA in the common ancestor of P. bolbodactyla, P. paradoxa, P. fusca and P. tocantins, and the loss of this condition in P. paradoxa. See text for details. In addition, the analysis of cytogenetic data in light of the phylogenetic relationships also suggests that the location of the PcP190 site adjacent to the NOR (as observed in P. tocantins) is a derived condition in relation to the positioning of the PcP190 site in a chromosome short arm devoid of NOR (as observed in P. bolbodactyla, P. paradoxa, and P. minuta) (Figure 7). Therefore, it is likely that the W chromosome of P. tocantins has resulted from a pericentromeric inversion that carried the PcP190 site to the long arm, followed by a paracentromeric inversion that leads to NOR being moved to a region closer the centromere and the PcP190 site to a more distal position in the long arm. In addition to this paracentromeric inversion and after the supposed pericentromeric inversion, an amplification of PcP190 sequences likely expanded the size of the heterochromatic band in Wq. Because in P. fusca, the sister species of P. tocantins, chromosome 7 does not show an amplified heterochromatic band and its NOR is not as close to the centromere as the NOR in the W chromosome of P. tocantins (see Busin et al., 2008), we may suppose that the inferred paracentromeric inversion in the long arm and PcP190 amplification have occurred in the evolutionary lineage that gave rise to P. tocantins. In contrast, based on the available data, we cannot infer whether the abovementioned putative pericentromeric inversion occurred in the P. tocantins lineage or in the common ancestor of P. tocantins and P. fusca (Figure 7). Further mapping of PcP190 sequences in the karyotype of P. fusca is thereby necessary to better elucidate this question. Finally, by tracing the NORs in a phylogenetic tree of Pseudis, it is possible to infer the occurrence of a paracentromeric inversion involving the NOR in the common ancestor of Pseudis bolbodactyla, P. fusca, P. paradoxa, and P. tocantins, which moved the NOR from a distal site to a more proximal region, since P. minuta, P. cardosoi and almost all Lysapsus species have the NOR more distally located in pair 7 (pair 5 in P. cardosoi) (Busin et al., 2001, 2006, 2008; Suárez et al., 2013) (Figure 7). In conclusion, the study of PcP190 satDNA enabled us to detect an early stage of sex chromosome heteromorphism between morphologically identical chromosomes in Pseudis bolbodactyla and to suggest that inversions and amplification of PcP190 sequences were involved in the process that leads to the high level of sex chromosome heteromorphism observed in P. tocantins. Inversions and repetitive DNA amplification, as inferred for Pseudis, are events that are expected to occur in early stages of sex chromosome differentiation, as they may play an important role in the suppression of recombination between the proto-sex chromosomes (review in Charlesworth et al., 2005). In addition, repetitive DNA is expected to accumulate rapidly after recombination between sex chromosomes is suppressed (Bergero and Charlesworth, 2009), and repetitive DNA accumulation may be related to genetic degeneration of the W or Y chromosomes (Charlesworth et al., 2005). In anurans,

51 some sex chromosomes have been described that show evidence of an inversion, such as Tomopterna delalandi (Schmid, 1980) and Glandirana rugosa (Nishioka et al., 1993, 1994), and different levels of heterochromatin accumulation have been found, from low- level heterochromatin accumulation in one of the sex chromosomes (as in Gastrotheca pseutes in Schmid et al., 1990) to highly heteromorphic sex chromosomes due to the presence of a great amount of heterochromatin (as in Pristimantis euphronides and P. shrevei in Schmid et al., 2002). In the case of P. tocantins, Wq is highly heterochromatic and further studies regarding the gene content in Z and W may be helpful to evaluate whether any evidence of genetic degeneration is already present.

Supplementary table 1 Specimens of Pseudis and Lysapsus used in this work. The specimens used for isolating PcP190 nucleotide sequences by PCR (PCR), Southern blotting analyses (SB), in situ hybridization (FISH) of PcP190 sequences and comparative genome hybridization (CGH) are indicated. In the latter two cases, the number of metaphases that showed the results described in the text is presented. In addition, the chromosome locations of the PcP190 sites are indicated by the identification of the chromosome arms that bear those sites (Wp: short arm of the W chromosome; 7p: short arm of chromosome 7; 5p: short arm of chromosome 5). Heterozygous and homozygous conditions are also indicated. ZUEC: Museu de Zoologia “Prof. Adão José Cardoso”, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas-SP, Brasil. MNRJ: Museu Nacional, Rio de Janeiro-RJ, Brasil.

FISH (number of Species/ PCR (GenBank accession CGH (number of Sex Specimen locality SB metaphases/chromosome Specimen voucher number of cloned sequences) metaphases) location of PcP site) Pseudis bolbodactyla ZUEC 22080 female Formosa/GO 13/Wp 6 MNRJ 34033 female Quirinópolis/GO 4/Wp MNRJ 34036 female Quirinópolis/GO 24/Wp MNRJ 34054 female Quirinópolis/GO MH370388 – MH370396 ladder pattern 50/Wp 9 MNRJ 34034 male Quirinópolis/GO MH370397 – MH370402 no signal 47/no signal MNRJ 34041 male Quirinópolis/GO 10/no signal MNRJ 34045 male Quirinópolis/GO 14/no signal MNRJ 34052 male Quirinópolis/GO 65/no signal Pseudis cardosoi ZUEC 11772 female São Francisco de Paula/RS ladder pattern 7/5p5p ZUEC 11774 female São Francisco de Paula/RS ladder pattern 10/5p5p ZUEC 11776 female São Francisco de Paula/RS ladder pattern ZUEC 11596 male São Francisco de Paula/RS ladder pattern 2/5p5p ZUEC 11597 male São Francisco de Paula/RS ladder pattern ZUEC 11598 male São Francisco de Paula/RS ladder pattern ZUEC 11770 male São Francisco de Paula/RS 10/5p5p Pseudis minuta ZUEC 11585 female Eldorado do Sul/RS MH370422 – MH370439; MH370441 ladder pattern 6/7p7p ZUEC 11587 female Eldorado do Sul/RS ladder pattern ZUEC 22096 female Eldorado do Sul/RS ladder pattern 18/7p7p ZUEC 11583 male Eldorado do Sul/RS MH370408 – MH370421; MH370440; MH370442 ZUEC 22082 male Eldorado do Sul/RS ladder pattern 16/7p7p

ZUEC 22083 male Eldorado do Sul/RS ladder pattern ZUEC 22084 male Eldorado do Sul/RS ladder pattern 4/7p7p ZUEC 22093 male Eldorado do Sul/RS 2/7p7p Pseudis paradoxa ZUEC 11794 female Corumbá/MS ladder pattern 17/7p ZUEC 11795 female Corumbá/MS ladder pattern ZUEC 11798 female Corumbá/MS ladder pattern 6/7p ZUEC 12829 female Bacabal/MA MH370403 – MH370407 no signal 4/no signal ZUEC 12830 female Bacabal/MA 5/no signal ZUEC 11793 male Corumbá/MS ladder pattern 4/7p ZUEC 11799 male Corumbá/MS 4/7p ZUEC 11803 male Corumbá/MS 7/7p ZUEC 11804 male Corumbá/MS no signal MNRJ 33859 male Corumbá/MS no signal

Lysapsus limellum ZUEC 12837 female Corumbá/MS ladder pattern ZUEC 12845 female Corumbá/MS ladder pattern ZUEC 12852 female Corumbá/MS ladder pattern MNRJ 34071 female Nossa Senhora do Livramento/MT MH370443 – MH370452 ZUEC 12844 male Corumbá/MS ladder pattern ZUEC 12848 male Corumbá/MS ladder pattern ZUEC 12850 male Corumbá/MS ladder pattern MNRJ 34072 male Nossa Senhora do Livramento/MT MH370453 – MH370456

Supplementary table 2. Sequences of PcP190 satellite DNA from GenBank used in the comparative analysis in the present work. PcP190 sequences GenBank accession numbers Physalaemus albifrons KM361694.1 - KM361698.1 Physalaemus albonotatus KM361689.1 - KM361693.1 JF281109 - JF281125 and KM361673.1 - Physalaemus cuvieri KM361683.1 Physalaemus centralis KM361684.1 - KM361688.1 Physalaemus ephippifer KM361699.1 and KM361700.1 Physalaemus marmoratus KM361701.1 - KM361706.1 Leptodactylus latrans KM361718.1 - KM361724.1 Crossocadctylus gaudichaudii KM361725.1 and KM361726.1 KX170908, KX170909, KX170931, Pseudis tocantins PcP-1a KX170887, KX170895 and KX170896 Pseudis tocantins PcP-1b KX170911 - KX170920 Pseudis tocantins PcP-2 KX170921 - KX170930 and KX170897 Pseudis tocantins PcP-3 KX170931 - KX170933 Pseudis tocantins PcP-4 KX170887 - KX170889 Pseudis tocantins PcP-5 KX170890, KX170892 and KX170898 Pseudis tocantins PcP-6 KX170891 Pseudis tocantins PcP-7a KX170892 - KX170894 Pseudis tocantins PcP-7b KX170892, KX170895 - KX170898

Capítulo 2: Satellite DNA mapping and molecular phylogenetics in Pseudis fusca (Hylidae, Pseudinae) clarify sex chromosomes evolution in paradoxical frogs 1. Abstract Chromosome rearrangements and heterochromatin accumulation are important events during sex chromosome differentiation. PcP190 satellite DNA accumulation was observed in the W chromosomes of Pseudis tocantins and P. bolbodactyla. Based on chromosome mapping of PcP190 sequences and NOR location, the occurrence of one pericentromeric inversion during the evolution of the W chromosome could be inferred; however, whether such an inversion had happened in the lineage of P. tocantins or in the common ancestor of P. fusca and P. tocantins remained unclear. To assess this question, we mapped PcP190 satellite DNA to the karyotypes of P. fusca and Pseudis sp., which is a group closely related to P. fusca with taxonomic uncertainties. We also generated mitochondrial DNA sequences for the cytogenetically analyzed specimens to map the chromosome characters on a species tree. PcP190 sequences were mapped to the long arm of one homologue of pair 7 exclusively in a female of Pseudis sp. and two males of P. fusca. In one female of P. fusca, PcP190 was mapped to the long arm of both homologues of pair 7. Southern blot analysis also suggested a sex-linked heteromorphism related to PcP190 satDNA in Pseudis sp. Our phylogenetic inferences placed P. fusca + Pseudis sp. as the sister group of P. tocantins, and large genetic distances were observed among Pseudis sp., P. fusca and P. tocantins, corroborating the hypothesis that Pseudis sp. could be an undescribed species. By tracing the cytogenetic characters in the species tree, we could infer that the pericentromeric inversion that moved the PcP190 site to the NOR-bearing chromosome arm of pair 7 occurred in the common ancestor of P. fusca, Pseudis sp. and P. tocantins. 2. Introduction Sex chromosomes originate from an autosomal pair after the acquisition of a sex determination locus (review in Graves, 2008; Abbott et al., 2017). During sex chromosome evolution, sex-specific genes accumulate in the sex-determining region, and suppression of recombination between the sex chromosomes occurs. Because of this recombination suppression, chromosome Y or W may undergo degeneration, which involves the loss of genes and the accumulation of repetitive DNA, leading to highly heteromorphic sex chromosomes (Charlesworth et al., 2005; Ellegren, 2011; Schartl et al., 2016). Among anurans, only 52 (review in Targueta et al., 2018; Ferro et al., 2018; Gazoni et al., 2018) of the karyotyped species show heteromorphic sex chromosomes, while most species possess homomorphic sex chromosomes, which are not differentiated by classical cytogenetic techniques. In this order of amphibians, an interesting case is observed in the genus Pseudis, in which species with different levels of sex chromosome differentiation are present. In Pseudis tocantins, the W chromosome is easily differentiated from the Z chromosome by chromosomal size and the locations of the nucleolus organizer region (NOR) and heterochromatin sites (Busin et al., 2008). The W chromosome of this species is submetacentric and larger than the Z due to accumulation/amplification of the heterochromatin in the long arm (Wq), which is enriched by the satellite DNA (satDNA) PcP190 (Busin et al., 2008; Gatto et al., 2016).

In P. bolbodactyla, sex chromosome heteromorphism can be observed only by the presence of a single cluster of PcP190 satDNA in the short arm of the W chromosome, which is absent in the Z chromosome. However, in P. paradoxa, P. minuta and P. cardosoi, no sex chromosome heteromorphism could be identified, and the abundance of PcP190 satDNA is not sex-linked. Despite this, the chromosome mapping of PcP190 sequences revealed a cluster in chromosome 7 of P. paradoxa and P. minuta and in chromosome 5 of P. cardosoi, which are homeologous chromosomes of the sex chromosomes of P. bolbodactyla and P. tocantins (Gatto et al., 2018 [Capítulo 1 desta tese]). Based on PcP190 satDNA mapping, along with the classical cytogenetic data generated by Busin et al. (2008), Gatto et al. (2018 [Capítulo 1 desta tese]) proposed the occurrence of a pericentromeric inversion that carried the PcP190 site from the short arm (as observed in Pseudis minuta, P. cardosoi, P. bolbodactyla and P. paradoxa) towards the long arm, which also bears the NOR sites (as observed in P. tocantins). However, because PcP190 mapping in the karyotype of P. fusca, the sister taxon of P. tocantins, was not available, the authors could not infer whether this event occurred in the common ancestor of P. tocantins and P. fusca or in the lineage that gave rise to P. tocantins. In the present work, we analyzed the chromosomal localization of PcP190 satDNA clusters in Pseudis fusca, aiming to test the hypothesis that the abovementioned pericentromeric inversion occurred in the common ancestor of P. tocantins and P. fusca. We included the individuals studied cytogenetically in a phylogenetic analysis along with other species of the genus Pseudis to map the obtained chromosome characters on the generated species tree. 3. Material and Methods 3.1. Cytogenetic analysis 3.1.1. Individuals, chromosome preparations and karyotype description For the cytogenetic analysis, we analyzed eight males of Pseudis fusca from Coronel Murta – MG (ZUEC 13235, 13237, and 13239 and MNRJ 35459 – 35461), a male and a female of P. fusca from Salinas – MG (ZUEC 24517 and ZUEC 24518) and three males and six females of Pseudis sp. from Carlos Chagas – MG (ZUEC 22076 – 22079, UFMG-A 17455, 17457, 17468, 17469 and 15136). A summary of all individuals and results obtained are presented in the Supplementary Table 1. All individuals were collected under authorization from Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade/Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (ICMBio/SISBIO) (authorization #45183-3) and Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais (IBAMA) (process #02001008875/01-11, license #039/03). The chromosome preparations of Pseudis fusca were obtained from suspensions of intestinal epithelial cells made available by Busin et al. (2008) at the Laboratory of Chromosome Studies (LabEsC) of the University of Campinas. The chromosome preparations of Pseudis sp. were obtained from the intestinal epithelial cells of animals previously treated with 1% colchicine solution following the method described by King and Rofe (1976) with modifications from Gatto et al. (2018 [Capítulo 1 desta tese]). This protocol was approved by Committee for Ethics in Animal Use of the University of

Campinas (CEUA/UNICAMP) (protocol # 3419-1). Chromosome preparations were subjected to conventional staining with 10% Giemsa solution, C-banding according to Sumner (1972). The metaphases subjected to C-banding were sequentially stained with the base-specific fluorochromes 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; at a final concentration of 0.5 µg/mL) and mithramycin (MM; at a final concentration of 0.5 mg/mL), after the removal of Giemsa using 70% ethanol. Chromosome preparations were also subjected to the silver impregnation technique to reveal NOR sites, according to Howell and Black (1980). 3.1.2. Isolation and analysis of PcP190 satDNA Samples of genomic DNA were obtained from liver tissue of a male and a female of Pseudis fusca (Supplementary Table 1), according to Medeiros et al. (2013). For PCR isolation of PcP190 satDNA, P190F and P190R primers were used (Vittorazzi et al., 2011). The PCR products were purified using Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega, USA). The obtained fragments were inserted into a plasmid using the pGEM- T Easy Vector kit (Promega, USA) and cloned in Escherichia coli JM109 employing the TransformAid Bacterial Transformation Kit (Fermentas, USA), according to the manufacturer’s instructions. Recombinant colonies were selected, and the plasmids were extracted according to Sambrook et al. (1989). The inserts were sequenced using the BigDye Terminator Kit (Applied Biosystems, USA) after being PCR-amplified with T7 and SP6 universal primers. Nucleotide sequences were obtained from an ABI PRISM 3130 XL Genetic Analyzer (Hitachi, Japan) by the Facility of DNA Sequencing of the Chemistry Institute of the University of São Paulo. Sequence alignment followed the proposal of Gatto et al. (2016), and a similarity analysis of more conserved and hypervariable regions was performed in BioEdit (Hall, 1999). 3.1.3. Southern blot detection of PcP190 satDNA Southern blot experiments were performed to evaluate the abundance of PcP190 in eight males and one female of Pseudis fusca and one male and one female of Pseudis sp. (see Supplementary Table 1 for details). Genomic DNA was extracted by the standard phenol:chloroform method (Sambrook et al., 1989). The obtained genomic DNA was digested with StuI or HindIII restriction endonuclease according to Gatto et al. (submitted), and the restriction fragments were applied to electrophoresis in 1.2% agarose gel. Fragments were transferred to a nitrocellulose membrane according to Sambrook et al. (1989). Probes for PcP-2 group sequences were used, and hybridization and detection assays followed Gatto et al. (2018 [Capítulo 1 desta tese]). 3.1.4. Fluorescent in situ hybridization (FISH) and comparative genomic hybridization (CGH) Probes for PcP-2 sequences were synthesized from a Pseudis fusca cloned fragment (PcP190-2-Pfus-M-C3), which was labeled by PCR using the PCR Dig Probe Synthesis Kit (Roche, Germany). The probes were ethanol precipitated in the presence of salmon sperm DNA (100 ng/µL) and resuspended in hybridization buffer (50% formamide, 2x SSC and 10% dextran sulfate). The probe hybridization and washing steps followed Viegas-Péquignot (1992). For probe detection, chromosome preparations were incubated with anti-digoxigenin (600 ng/µL) for 45 minutes, washed with PBT solution

(1x PBS, 0.4% BSA and 0.1% Tween 20) and counterstained with 0.5 µg/mL DAPI. Individuals used for FISH experiments are indicated in the Supplementary Table 1. Because no sex-specific PcP190 chromosomal site was observed in the Pseudis sp. karyotype, we also employed CGH to assess the presence of sex chromosome heteromorphism in this group. Female genomic DNA (1 µg) of Pseudis sp. was labeled with FITC-12-dUTP (Roche, Germany) by a Nick Translation Kit (Roche, Germany). The probe was ethanol precipitated and resuspended in hybridization buffer (50% formamide, 2x SSC and 10% dextran sulfate). A probe mix was made with competitor DNA from a male of Pseudis sp. obtained from genomic DNA, following Gatto et al. (2016), in a proportion of 1:10 (probe:competitor DNA). The probe hybridization and washing steps followed Viegas-Péquignot (1992), and probe detection used rhodamine- conjugated anti-digoxigenin (600 ng/µL), as mentioned above. Chromosome preparations were observed in a fluorescence microscope, the Olympus BX-60 (Olympus, Japan). Images were captured with a Q-Color 3 (Olympus, Japan) digital system and edited using only the brightness and contrast options in Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, USA). 3.2. Phylogenetic and genetic distance analyses 3.2.1. Taxon and gene sampling Nucleotide sequences of the mitochondrial H1 fragment (which includes the 12S rRNA, tRNAval and 16S rRNA genes) and cytochrome b gene were generated for specimens of Pseudis fusca from Coronel Murta – MG and Salinas – MG, and specimens of Pseudis sp. from Carlos Chagas – MG (Table 1). A H1 and cytochrome b fragment was retrieved from the mitochondrial genome of an individual of P. tocantins from Porto Nacional – TO (Gatto et al. in press. [Anexo III]) (Table 1). Nucleotide sequences from Pseudis available in GenBank were also included (Table 1). Those sequences identified in GenBank as belonging to P. platensis were considered as representative of P. paradoxa, based on the discussions provided by Garda et al. (2010) and Santana et al. (2016). As outgroup, we used the four species of the genus Lysapsus, since this genus was inferred as the sister group of Pseudis by Wiens et al. (2010) and Duellman et al. (2016). For the analyses of genetic distances, two sequences of Pseudis fusca from Jequitinhonha – MG, containing only the final portion of the 16S rRNA gene, and sequences of H1 fragment produced by Garda and Cannatella (2007) were included.

Table 1. H1 mitochondrial sequences obtained from GenBank and generated in the present work. GenBank Accession Taxon Museum Voucher Locality numbers (H1/cytb) Lysapsus bolivianus MNRJ 33883 to be deposited4 Santarém, state of Pará Lysapsus bolivianus MNRJ 33878 to be deposited4 Santarém, state of Pará Lysapsus bolivianus MNRJ 33954 to be deposited4 Guajará-Mirim, state of Rondônia Lysapsus bolivianus MNRJ 33944 to be deposited4 Guajará-Mirim, state of Rondônia Lysapsus bolivianus MNRJ 33972 to be deposited4 Guajará-Mirim, state of Rondônia Lysapsus caraya SMRP 204.16 to be deposited4 Santa Terezinha, state of Mato Grosso Lysapsus caraya ZUEC 13204 to be deposited4 Santa Terezinha, state of Mato Grosso Lysapsus laevis AM-CC 101720 AY843696/AY843941 Aishalton – GUY Lysapsus laevis FN 0115 to be deposited4 Pacaraima, state of Roraima Lysapsus laevis FN 0125 to be deposited4 Pacaraima, state of Roraima

Lysapsus limellum MACN 38645 AY843697/AY843942 Corrientes - ARG Lysapsus limellum MNRJ 34067 to be deposited4 Corumbá, state of Mato Grosso do Sul Lysapsus limellum MNRJ 34079 to be deposited4 Nossa Senhora do Livramento, state of Mato Grosso Lysapsus limellum MNRJ 34071 to be deposited4 Nossa Senhora do Livramento, state of Mato Grosso Lysapsus limellum MNRJ 34076 to be deposited4 Nossa Senhora do Livramento, state of Mato Grosso Lysapsus limellum MNRJ 34060 to be deposited4 Corumbá, state of Mato Grosso do Sul Pseudis sp.1 ZUEC 22077 to be deposited Carlos Chagas, state of Minas Gerais Pseudis sp.1 ZUEC 22078 to be deposited Carlos Chagas, state of Minas Gerais Pseudis bolbodactyla CHUNB 42764 EF153005 Aporé, state of Goiás Pseudis bolbodactyla CHUNB 42879 EF153007 Pirapora, state of Minas Gerais Pseudis bolbodactyla CHUNB 42658 EF153006 Alvorada do Norte, state of Goiás Pseudis bolbodactyla MNRJ 34041 to be deposited4 Quirinópolis, state of Goiás Pseudis cardosoi CHUNB 42610 EF152997 Jaquirana, state of Rio Grande do Sul Pseudis cardosoi ZUEC 11601 to be deposited4 Tainhas, state of Rio Grande do Sul Pseudis cardosoi CAUPF 1525 to be deposited4 São Francisco de Paula, state of Rio Grande do Sul Pseudis fusca CHUNB 42625 EF153003 Araçuaí, state of Minas Gerais Pseudis fusca ZUEC 13236 to be deposited4 Coronel Murta, state of Minas Gerais Pseudis fusca MNRJ 35459 to be deposited4 Coronel Murta, state of Minas Gerais Pseudis fusca1 ZUEC 13235 to be deposited Coronel Murta, state of Minas Gerais Pseudis fusca1 ZUEC 24518 to be deposited Salinas, state of Minas Gerais Pseudis fusca2 MTR_ALCX195P5 KU495489 Jequitinhonha, state of Minas Gerais Pseudis fusca2 MTR_ALCX197P6 KU495490 Jequitinhonha, state of Minas Gerais Pseudis minuta CHUNB 34687 EF152996 Porto Alegre, state of Rio Grande do Sul Pseudis minuta MACN 37786 AY843739/AY843985 Entre Ríos – ARG Pseudis paradoxa CHUNB 42928 EF153009 Tartarugalzinho, state of Amapá Pseudis paradoxa CHUNB 43032 EF153010 Pinheiro, state of Maranhão Pseudis paradoxa CHUNB 43002 EF153011 Boa Vista, state of Roraima Pseudis paradoxa UTA 53104 EF153012 Mabaruma – GUY Pseudis paradoxa MACN 38584 AY549364 Formosa – ARG Pseudis paradoxa DCC3284 AY364541 Brazil Pseudis paradoxa MACN 38642 AY843740/AY549417 Corrientes – ARG Pseudis paradoxa CHUNB 42848 EF153008 Corumbá, state of Mato Grosso do Sul Pseudis paradoxa DCC3284 AY326032 Luiz Antônio, state of São Paulo Pseudis paradoxa ZUEC 12828 to be deposited4 Nova Itapirema, state of São Paulo Pseudis paradoxa ZUEC 12829 to be deposited4 Bacabal, state of Maranhão Pseudis paradoxa MNRJ 33859 to be deposited4 Bacabal, state of Maranhão Pseudis paradoxa FN 1895 to be deposited4 Macapá, state of Amapá Pseudis paradoxa FN 0135 to be deposited4 Pacaraíma, state of Roraima Pseudis tocantins CHUNB 42943 EF153004 Sandolândia, state of Tocantins Pseudis tocantins ZUEC 13227 to be deposited Porto Nacional, state of Tocantins Pseudis tocantins ZUEC 13229 to be deposited Porto Nacional, state of Tocantins Pseudis tocantins MNRJ 35457 to be deposited Porto Nacional, state of Tocantins Pseudis tocantins3 ZUEC 22352 MH571152 Porto Nacional, state of Tocantins 1 Sequences generated in the present work. 2 Sequences with 521 bp used only in the genetic distance analysis. 3 Sequence retrieved from the mitochondrial genome of P. tocantins. 4 Sequences from Aguiar-Júnior et al. (2007). 5 Field number of Ulysses Caramaschi (to be accessioned in MNRJ collection). 3.2.2. DNA extraction and sequencing of H1 fragment Genomic DNA was extracted from liver samples following the protocol used by Medeiros et al. (2013). The H1 and cytochrome b (cytb) fragments were isolated by PCR using the Illustra Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare, UK) and the primers MVZ59/MVZ50 (Graybeal, 1997) and 12SL13 (Feller and Hedges, 1998)/16Sbr (Palumbi et al., 2002), in the case of the H1 fragments, and the primers MVZ15 (Moritz et al., 1992) and H15149(H) (Kocher et al., 1989), for the isolation of the cytb fragments. The resulting amplicons were purified using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA) and sequenced with the same primers used in the PCR. In the case of the amplicon obtained with the primers 12SL13 and 16Sbr, the following primers were also employed for sequencing: H1KR (Seger et al., in prep), Hedges16SL2a and Hedges16SH10 (Hedges, 1994) and 16Sar (Palumbi et al., 2002). Sequencing reactions

60 were prepared using BigDye Terminator (Applied Biosystems, USA), according to the manufacturer’s instructions. Nucleotide sequences were obtained by an automated sequencer ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer (Hitachi, Japan) at the DNA Sequencing Facility of the Chemistry Institute of University of São Paulo. 3.2.3. Sequence analyses DNA sequences were edited using BioEdit v.7.0.9.0 (Hall, 1999) and aligned using Muscle (Edgar, 2004), as implemented in Analysis Tool Web Services (McWilliam et al., 2013). A matrix containing 36 OTUs and 2724 characters of the H1 and cytb fragments was obtained and used for inferring phylogenetic relationships using Bayesian analysis in MrBayes v.3.2.6 (Ronquist et al., 2012). The evolutionary model SYM+G was inferred using Mr. Modeltest (Nylander, 2004) for both H1 and cytb partitions. A Bayesian analysis was performed using 10 million generations and sampling one tree every 100 generations. Consensus topology with posterior probability for each node was obtained after discarding the first 25% of the trees generated. As the 16S rRNA gene has been considered a valious marker for studies between candidate species of anurans (Vences et al., 2005; Fouquet et al., 2007), two different matrices were used for the analyses of genetic distance in Pseudis: (a) a matrix with 484 bp (corresponding to the final portion of the 16S rRNA gene) and 38 OTUs, including sequences of Pseudis fusca that are not present in the phylogenetic analysis (Jequitinhonha – MG) (Table 1); (b) a 2340 bp-matrix with the H1 fragments of 36 OTUs. Genetic distances (p-distance) were calculated using MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016), not considering gaps in pairwise comparisons. 4. Results 4.1. Cytogenetic analysis of Pseudis sp. from Carlos Chagas – MG The karyotype of Pseudis sp. is composed of 24 chromosomes, with six chromosome pairs being metacentric (pairs 1, 2, 7, 8, 11 and 12), five submetacentric (pairs 3, 4, 5, 9 and 10) and one subtelocentric (pair 6) (Figure 1). All of the chromosomes present centromeric heterochromatin, and pericentromeric heterochromatic blocks can be observed in the short arms of chromosomes 3 and 6 and in the long arm of chromosome 7. Small terminal blocks of heterochromatin are also observed in chromosomes 1, 2 and 3 (Figure 1).

Figure 1. Karyotype of a female Pseudis sp. (Carlos Chagas – MG) subjected to Giemsa conventional staining (A), C-banding (B), C-banding followed by DAPI (C) and MM staining (D) and silver impregnation by the Ag-NOR method (E). Bar: 5 µm. In the chromosome preparations sequentially subjected to C-banding and staining with fluorochromes, all centromeric regions revealed DAPI and MM positive staining (Figure 1C and D). However, the heterochromatic blocks in the terminal regions of chromosomes 2 and 3 showed exclusively DAPI-positive staining. C-bands stained with both fluorochromes were also present pericentromerically in the short arms of chromosomes 3 and 6 and long arm of chromosome 7. The NOR sites are located adjacent to the pericentromeric heterochromatic block in the long arm of chromosome 7 (Figure 2). The three individuals analyzed showed a NOR size heteromorphism. Furthermore, the female individual (ZUEC 22078) showed a size heteromorphism of the heterochromatin in pair 7, with the homologue that bears a small NOR presenting a large heterochromatic block that was strongly stained with both fluorochromes (Figure 2A).

Figure 2. Pair 7 of the female ZUEC 22078 (A) and the male ZUEC 22077 (B) of Pseudis sp. (Carlos Chagas – MG) sequentially subjected to C-banding (C-band), DAPI and MM staining and silver impregnation (Ag-NOR). In the ideograms (Id) of pair 7, NORs are indicated by gray circles, centromeres are in black, and adjacent to them is the heterochromatin in green and blue, representing simultaneous DAPI/MM staining. Note that the centromeres are also stained with DAPI and MM, but this is not shown in the ideograms. Bar: 5 µm. 4.2. PcP190 satDNA and CGH A total of nine clones were obtained from the male (from Coronel Murta – MG) and the female (from Salinas – MG) genomic DNA of Pseudis fusca. Based on the hypervariable region, all the sequences could be identified as belonging to the PcP-2 group (Figure 3). The similarity of the hypervariable regions of the sequences from P. fusca to the other PcP-2 sequences already isolated from Pseudis species was 83.81%. With respect to the conserved region of this satDNA, the average similarity of the sequences from P. fusca to all the PcP190 sequences already described was 75.57%, and that to the other PcP-2 sequences was 75.45%. Two sequences obtained from P. fusca (PcP190-2-Pfus-M1-C2.1 and PcP190-2-Pfus-M1-C2.1 3.1) presented an insertion of a 12 bp segment in the conserved region that was not observed in the other Pcp-2 sequences (Figure 3). When this segment was excluded from the analysis, the similarity values between the sequences from P. fusca and the other sequences of PcP190 and the PcP-2 sequence group were 78.47% and 78.81%, respectively.

Figure 3. Alignment of the PcP190 satDNA sequences isolated from Pseudis fusca with other sequences from the PcP-2 group previously isolated from P. tocantins (KX170921, KX170922, KX170923, KX170924), P. bolbodactyla and P. paradoxa. Gray arrows indicate the P190F and P190R primer annealing regions. Sequences that show the central part of the more conserved region with N breaks represent partial monomers.

Southern blot analysis of PcP-2 sequences indicated an intraspecific variation in PcP190 satDNA amount in Pseudis fusca, but this variation was not sex-related (Figure 4 and Supplementary Table 1). Among eight males of P. fusca, one individual (ZUEC 13235) showed the ladder pattern typical of satDNA that was also found in the female from Salinas – MG. The blots from other males of this species showed no hybridization signals. In the karyotype of the male ZUEC 13235, FISH analysis with PcP-2 probes detected a single hybridization signal in the pericentromeric heterochromatic region of the long arm in one of the homologues of pair 7 (Figure 5A). In contrast, the karyotype of the female from Salinas – MG showed a strong hybridization signal from the same probe in the heterochromatin of the long arms of both homologues of pair 7 (Figure 5B). Chromosome mapping of the PcP-2 sequences in the male MNRJ 35460, which was not subjected to Southern blot analysis, showed the same result as that obtained for the male ZUEC 13235 (see a summary of these results in Supplementary Table 1).

Figure 4. Representative Southern blot analysis of PcP-2 sequences from two males of Pseudis fusca from Coronel Murta – MG (lanes 1 and 2), a male and a female of P. fusca from Salinas – MG (lanes 3 and 4, respectively), a male and a female of Pseudis sp. from Carlos Chagas – MG (lanes 5 and 6, respectively) and a female of P. tocantins as a positive control (lane 7). For the individuals of Pseudis sp., only the female showed a ladder pattern for PcP-2 sequences in the Southern blot experiments (Figure 4 and Supplementary Table 1). FISH assays with PcP-2 sequences as probes in the female karyotype showed a single hybridization signal in the pericentromeric heterochromatin in the long arm of one of the homologues of pair 7 (Figure 5C), while no signal of the PcP-2 probes was observed in the male karyotypes of Pseudis sp. CGH experiments in Pseudis sp. showed a strong signal of hybridization with the female genomic DNA probe in one of the homologues of pair 7, in the same region where the PcP190 satDNA was mapped by FISH (Figure 6).

Figure 5. Fluorescent in situ hybridization of PcP190 satDNA in a male karyotype of Pseudis fusca from Coronel Murta – MG (A), a female karyotype of P. fusca from Salinas – MG (B) and a female of Pseudis sp. from Carlos Chagas – MG (C). Bar: 5 µm.

Figure 6. Comparative genomic hybridization in Pseudis sp. Chromosome preparation stained with DAPI (A) and subjected to CGH (B). C. Chromosome pair 7 from the metaphase shown in A-B stained with DAPI, subjected to CGH and silver-impregnated by the Ag-NOR method. In the ideograms, the heterochromatic regions are shown in black, the NORs in gray circles and the region revealed by CGH in dashed green. Bar: 5 µm. 4.3. Phylogenetic inferences and genetic distances In the Bayesian inference all the specimens of Pseudis fusca were grouped together in the same clade, with a high posterior probability (Figure 7). Pseudis sp. was inferred as the sister group of P. fusca with a posterior probability of 0.92 and the clade of Pseudis sp. and P. fusca had P. tocantins as sister group (Figure 7). The genetic distance analysis of a 16S rDNA segment estimated a high divergence between Pseudis

sp. and the other species of Pseudis, including P. fusca and P. tocantins (Table 2). The same was observed using the matrix of H1 fragments. Very low or no genetic distance was detected among the specimens of Pseudis sp. or those of P. fusca (Table 2 – diagonal line).

Figure 7. Phylogenetic relationships of Pseudis and Lysapsus inferred by Bayesian analysis of the mitochondrial H1 and cytb fragments. Numbers at the nodes indicate posterior probability values. Table 2. Genetic distances (%) based on a 482-bp segment of the 16S mitochondrial gene (below the diagonal) and the H1 fragment (above the diagonal) between the species of Pseudis. Note the high values of genetic distance (bold) found between Pseudis sp. and Pseudis fusca. In the diagonal, in gray, intraspecific genetic distances (%) based on the final portion of 16S segment. 1 2 3 4 5 6 7 1. P. fusca (Cel. Murta/Salinas/Araçuaí/Jequitinhonha) 0 5.98* 7.77 8.71 8.81 13.59 13.53 2. Pseudis sp. (Carlos Chagas) 7.16 0 6.30 7.79 7.82 12.64 12.85 3. P. tocantins 6.99 6.08 0.42 8.45 8.70 13.64 13.77 4. P. bolbodactyla 8.02 8.15 7.05 2.57 5.66 12.24 12.39 5. P. paradoxa 8.88 9.12 8.15 6.07 2.40 12.40 12.48 6. P. minuta 13.64 11.82 12.55 11.83 13.01 0.20 1.47 7. P. cardosoi 13.06 11.97 12.65 11.62 12.72 1.25 0.41 * Not including sequences from the Jequitinhonha, state of Minas Gerais, population, for which only the final protion of the 16S rRNA gene is available.

5. Discussion 5.1. Genetic divergence: could Pseudis sp. be a new species? Previous studies involving phylogenetic inferences with molecular data showed Pseudis fusca as the sister taxon of P. tocantins (Aguiar-Júnior et al., 2007; Garda and Cannatella, 2007; Wiens et al., 2010; Duellman et al., 2016). In the present work, P. fusca and Pseudis sp. compose the sister group of P. tocantins. Although grouped in the same clade, P. fusca and Pseudis sp. showed a high genetic divergence for both the final portion of the 16S rRNA gene (> 7%) and the H1 fragment (5.98%). These values are similar to those found between other species of Pseudis, being higher than those found between P. bolbodactyla and P. paradoxa (6.07% and 5.66% for the final portion of the 16S gene and H1 fragment, respectively), and between P. minuta and P. cardosoi (1.25% and 1.47% for the the 16S gene fragment and H1 fragment, respectively) (Table 1). Notably, our sample of P. fusca includes individuals from four different localities and their analyzed DNA sequences were very similar (99.87% similar in the H1 fragment, with no divergence present in the final portion of the 16S gene). DNA sequences have been highly important in species delimitation studies, contributing in some cases to the detection of undescribed species (Díaz et al., 2012; Nuñez et al., 2012; Bruschi et al., 2014; Evans et al., 2015). In amphibians, the 16S mitochondrial rRNA gene has been proposed as a good marker for DNA barcoding studies (Vences et al., 2005; Fouquet et al., 2007), since it shows low intraspecific genetic divergence and high interspecific genetic distances (Vences et al., 2005). Fouquet et al. (2007) proposed that a genetic distance higher than 3% in the final portion of the 16S rRNA gene could be enough to suggest the presence of unnamed species in the studied sample, and using this approach, the authors identified 129 candidate species among neotropical anurans. The high genetic divergences estimated from both the final portion of the 16S rRNA gene and the H1 fragment may indicate that Pseudis sp. is an undescribed species. However, a larger sampling from Carlos Chagas – MG and other P. fusca populations is still needed, as well as morphological and acoustical analyses, for a proper taxonomic revision of this group. 5.2. Chromosome rearrangements as a major force of sex chromosome differentiation in Pseudis The karyotype of Pseudis sp. presents 24 chromosomes, as previously observed for Pseudis species (Barrio and Rubel, 1970; Busin et al., 2001, 2008) except Pseudis cardosoi, which has 2n = 28 because of two centric fission events (Busin et al., 2001). By chromosome morphology, the karyotype of Pseudis sp. is highly similar to the 24- chromosome karyotypes of Pseudis. The heterochromatin pattern distribution in Pseudis also seems to be conserved. The distal positive C-bands in the long arms of chromosomes 2 and 3 of Pseudis bolbodactyla, P. fusca, P. paradoxa and P. tocantins (Busin et al., 2008) also occur in Pseudis sp. and can be used as cytogenetic markers that suggest the homeology between those chromosomes in these species. In addition, chromosome 7 in Pseudis sp. has the NOR sites found in all other species of Pseudis with 2n = 24 (Busin et al., 2001; Busin et al., 2008).

The presence of the ladder pattern of hybridization of the PcP190 satDNA probe in Southern blot experiments exclusively in females of Pseudis sp., the hybridization signals from a PcP190 satDNA probe in only one of the homologues of pair 7 of this species and CGH experiments suggest that pair 7 could be the sex chromosome pair of Pseudis sp.. According to this hypothesis, Pseudis sp. would have a ZZ/ZW sex determination system, with an incipient sex chromosome heteromorphism that could be detected only by mapping the PcP190 satDNA, similarly to the condition previously observed for Pseudis bolbodactyla (Gatto et al. 2018 [Capítulo 1 desta tese]). Intriguingly, in Pseudis fusca, the sister taxon of Pseudis sp., no evidence of sex- linked heteromorphism in the PcP190 satDNA exists, and the same situation is observed in P. paradoxa, P. minuta and P. cardosoi (Gatto et al. 2018 [Capítulo 1 desta tese]). Although FISH and Southern blot experiments indicate intraspecific variation (i.e., a polymorphism) in PcP190 satDNA abundance in P. fusca, this variation is not sex-linked, since among the nine analyzed males two different patterns were present, with one of them being the same pattern presented by a female (Supplementary Table 1). In the case of Pseudis sp., although nine specimens were analyzed (6 females and 3 males), we may not discard the possibility that a larger sample may show that the variation regarding the PcP190 satDNA is actually not related to sex. However, until a larger specimens sample is not available for analysis, we will take the hypothesis that the differential amount of PcP190 satDNA may be sex-related in Pseudis sp. The analysis of the cytogenetic data obtained previously in the light of the phylogenetic inferences presented here does not discriminate between three equally parsimonious hypotheses: i) PcP190 satDNA became sex-related in the common ancestor of Pseudis bolbodactyla, P. fusca, Pseudis sp., P. paradoxa and P. tocantins, and this condition was lost in P. fusca and P. paradoxa; ii) sex heteromorphism of PcP190 satDNA arose independently in the lineage that gave rise to P. bolbodactyla and in the common ancestor of P. tocantins, P. fusca and Pseudis sp., and this condition was lost in P. fusca iii) the cluster of PcP190 satDNA emerged as a sex-linked character independently in P. bolbodactyla, Pseudis sp. and P. tocantins (Figure 8). In contrast, in the present study, we may infer that the pericentromeric inversion assumed to carry the PcP190 site from the short arm to the long arm of the NOR-bearing chromosome during the evolutionary history of Pseudis (Gatto et al., 2018 [Capítulo 1 desta tese]) occurred in the common ancestor of P. fusca, Pseudis sp. and P. tocantins (Figure 8). In the previous study that proposed the occurrence of this pericentromeric inversion in Pseudis (Gatto et al., 2018 [Capítulo 1 desta tese]), the authors could not discard the hypothesis that such an inversion had occurred in the lineage that gave rise exclusively to P. tocantins, since no information was available for P. fusca. Because here we revealed that P. fusca and Pseudis sp. share with P. tocantins the positioning of a PcP190 cluster in the long arm of chromosome 7, differing from the remaining species of Pseudis, one hypothesis for the occurrence of a pericentromeric event has emerged as the most likely. In addition to the abovementioned pericentromeric inversion, the W chromosome of Pseudis tocantins shows evidence of a paracentromeric inversion that moved the NOR to a pericentromeric region (Busin et al., 2008; Gatto et al., 2018 [Capítulo 1 desta tese]). The occurrence of this paracentromeric inversion may be related to the conspicuous accumulation/amplification of repetitive sequences (such as PcP190 satDNA) in the W

68 chromosome of P. tocantins. Chromosome inversion events are considered primordial steps of sex chromosome differentiation because they create a situation where recombination suppression in the sex-specific region is positively selected (reviewed by Charlesworth et al., 2005; Graves, 2008; Ellegren, 2011). Concomitantly, repetitive DNA accumulation occurs because of the recombination suppression between Z/X and W/Y (Charlesworth et al., 2005). Interestingly, even in other lineages with sex-linked PcP190 clusters (Pseudis bolbodactyla and, probably, Pseudis sp.), no evidence of expressive accumulation/amplification of PcP190 sequences in the W chromosome is present. Therefore, we may suggest that the paracentromeric inversion that occurred in the W chromosome of P. tocantins could have favored heterochromatin accumulation in this case, because it may have contributed to recombination suppression between the Z and W chromosomes in this species. Based on these assumptions, it is expected that other satDNA sequences, as well as transposable elements, could also have accumulated in the W chromosome of P. tocantins. This situation also occurs in other organisms, such as Drosophila miranda (Steinemann and Steinemann, 2005), the fish Cynoglossus semilaevis (Chalopin et al., 2015) and the model plant species Rumex acetosa (Steflova et al., 2013). Therefore, the identification of putative transposable elements and other satDNA accumulation in the W chromosome of P. tocantins could help further investigation of the sex chromosomes of this species. In addition, we may hypothesize that only a small differential accumulation of PcP190 satellite DNA in the sex chromosomes of Pseudis may not be sufficient for the maintenance of recombination supression between their pericentromeric heterochromatic blocks. This hypothesis is raised from the mapping of PcP190 in P. fusca and P. paradoxa, which indicates the existence of polymorphic conditions of the PcP190 sites, not related to sex, since they may represent the loss of the sex-related condition (alternatives indicated as arrowheads in Figure 8), possibly achieved by the recombination between the PcP190-positive pericentromeric block of ancestral W chromosomes and the PcP190-negative pericentromeric block of ancestral Z chromosomes.

Figure 8. Evolutionary hypothesis for sex chromosome evolution in Pseudis. The cladogram shows the phylogenetic relationships inferred in the present work and the ideograms of the NOR-bearing chromosomes. In the ideograms, the regions of PcP190 satDNA are shown in pink, heterochromatic blocks in black and NOR in gray circles. Ideograms are based on data from Busin et al. (2001, 2006, 2008), Gatto et al. (2016, 2018 [Capítulo 1 desta tese]) and the present study. Character changes in the NOR- bearing chromosomes of Pseudis: (1) paracentromeric inversion that moved the NOR from a distal region to a region closer to the centromere; (2) pericentromeric inversion that moved the PcP190 site from the short arm to the long arm; (3) paracentromeric inversion that moved the NOR to a pericentromeric area and the PcP190 site to the interstitial region in the W chromosome of P. tocantins; (4) amplification of heterochromatin in the W chromosome of P. tocantins. Blue, orange and purple

70 arrows/arrowheads represent three alternative hypotheses for the sex-linked heteromorphism observed in P. tocantins, Pseudis sp. and P. bolbodactyla. Arrows indicate acquisition of sex chromosome heteromorphism related to PcP190 satDNA. Arrowheads indicate loss of sex chromosome heteromorphism related to PcP190 satDNA.

Supplementary table 1. Specimens of Pseudis fusca and Pseudis sp. used in this work. The specimens used for isolation of PcP190 nucleotide sequences by PCR (PCR), Southern blotting (SB) and fluorescent in situ hybridization (FISH). In addition, the chromosome locations of the PcP190 sites are indicated by the identification of the chromosome arms that bear those sites (7q: long arm of chromosome 7; Wq: long arm of chromosome W). Heterozygous and homozygous conditions are also presented. ZUEC: Museu de Zoologia “Prof. Adão José Cardoso”, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas-SP, Brasil. MNRJ: Museu Nacional, Rio de Janeiro-RJ, Brasil. UFMG-A: Coleção de Anfíbios da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte- MG, Brasil. Species/Specimen voucher Sex Specimen locality PCR isolation of PcP190 SB FISH Pseudis fusca ZUEC 13235 male Coronel Murta/MG X ladder pattern 7q ZUEC 13236 male Coronel Murta/MG no signal ZUEC 13237 male Coronel Murta/MG no signal ZUEC 13238 male Coronel Murta/MG no signal ZUEC 13239 male Coronel Murta/MG no signal MNRJ 35459 male Coronel Murta/MG no signal MNRJ 35460 male Coronel Murta/MG 7q MNRJ 35461 male Coronel Murta/MG no signal no signal ZUEC 24517 male Salinas/MG no signal no signal ZUEC 24518 female Salinas/MG X ladder pattern 7q/7q Pseudis sp. ZUEC 22076 female Carlos Chagas/MG ladder pattern ZUEC 22077 female Carlos Chagas/MG ladder pattern Wq UFMG-A 17455 female Carlos Chagas/MG ladder pattern UFMG-A 17457 female Carlos Chagas/MG ladder pattern UFMG-A 17468 female Carlos Chagas/MG ladder pattern UFMG-A 15136 female Carlos Chagas/MG ladder pattern UFMG-A 17469 male Carlos Chagas/MG no signal ZUEC 22078 male Carlos Chagas/MG no signal no signal ZUEC 22079 male Carlos Chagas/MG no signal

Capítulo 3: Análise da composição molecular dos cromossomos sexuais de Pseudis tocantins (Anura, Hylidae) por meio de sequenciamento de nova geração 1. Introdução Tanto em animais quanto em espécies vegetais há a ocorrência de cromossomos especiais que portam genes de determinação de sexo, chamados de cromossomos sexuais (revisão de Charlesworth et al., 2005; Graves, 2008; Abbott et al., 2017). Apesar de cromossomos sexuais terem surgido independentemente em diversas linhagens, o processo de diferenciação de cromossomos sexuais segue uma ordem geral, que envolve a supressão da recombinação na região sexo-específica, o acúmulo de sequências de DNA repetitivo e perda de conteúdo gênico (revisão de Charlesworth et al., 2005; Bergero e Charlesworth, 2009; Ellegren, 2011). Devido aos fatores citados anteriormente, o cromossomo Y/W passa por um processo chamado de degeneração, o que leva à formação de cromossomos sexuais heteromórficos (Muller, 1964; Ohno, 1967; Graves, 2008). Em anuros a ocorrência de cromossomos sexuais heteromórficos é limitada, sendo que apenas 52 das espécies de anuros já estudadas citogeneticamente possuem cromossomos sexuais heteromórficos, enquanto a maioria das espécies apresenta cromossomos sexuais homomórficos (revisão em Targueta et al., 2018; Gazoni et al., 2018; Ferro et al., 2018). A prevalência de cromossomos sexuais homomórficos pode ser explicada por uma alta taxa de transição entre sistemas de determinação de sexo que não permitiria a ocorrência da degeneração do cromossomo Y/W e o estabelecimento de cromossomos sexuais heteromórficos (Evans et al., 2012). Igualmente possível, eventos ocasionais de recombinação entre X/Z e Y/W, como explicado pela hipótese da “fonte da juventude”, poderiam evitar a atuação do mecanismo de Muller ratchet levando a um estado homomórfico dos cromossomos sexuais (Perrin 2009). Ambas as situações já foram observadas em anuros, inclusive em espécies próximas filogeneticamente (exemplos em Berset-Brändli et al., 2008; Stöck et al., 2011; Stöck et al., 2013; Dufresnes et al., 2015). Dentre os anuros que possuem cromossomos sexuais heteromórficos, encontra-se Pseudis tocantins, que apresenta um dos casos de cromossomos sexuais mais diferenciados de toda a ordem. Nessa espécie o cromossomo W submetacêntrico é maior que o cromossomo Z metacêntrico devido a eventos de acúmulo/amplificação de heterocromatina no braço longo do cromossomo W (Wq) (Busin et al., 2008). Essa heterocromatina em Wq mostra abundância de sequências do DNA satélite PcP190, sequências também observadas em blocos heterocromáticos presentes nos cromossomos sexuais de Physalaemus ephippifer e Pseudis bolbodactyla (Vittorazzi et al., 2014; Gatto et al., 2016; Gatto et al., 2018 [Capítulo 1 desta tese]) . O acúmulo dessa heterocromatina em Wq de P. tocantins pode ter ocorrido como uma consequência de um evento de inversão paracentromérica, exclusivo da linhagem que deu origem a essa espécie, a qual poderia ter contribuído ainda mais com a supressão de recombinação entre os cromossomos Z e W (Gatto et al., in prep. [Capítulo 2 desta tese]). Entretanto, há em Pseudis, bem como na maioria dos anuros que possuem cromossomos sexuais heteromórficos, uma carência de dados mais acurados sobre a arquitetura genômica nesses cromossomos. Com o advento do sequenciamento de nova geração (NGS), novas abordagens têm sido utilizadas no estudo de cromossomos sexuais.

Dentre as novas abordagens vale destacar a microdissecção cromossômica e/ou citometria de fluxo para obter cópias dos cromossomos e desvendar a arquitetura genômica dos mesmos (exemplos em Traut et al., 2013; Avila et al., 2015; Keinath et al., 2015), bem como o sequenciamento do genoma de macho e fêmea a fim se obter informações sobre a diferença da porção de sequências repetitivas nos genomas de cada sexo (exemplos em Macas et al., 2011; Steflova et al., 2013; Palacios-Gimenez et al., 2017). No presente trabalho, nós usamos cromossomos Z e W microdissecados de Pseudis tocantins, bem como genoma de macho e fêmea desse anuro, para obter mais informações sobre a composição molecular dos cromossomos sexuais dessa espécie. Com base nos resultados obtidos, propomos homeologia, pelo menos parcial, dos cromossomos sexuais de P. tocantins com os cromossomos 4 e 10 de Xenopus tropicalis. Concomitantemente, os dados obtidos sugerem grande acúmulo de diferentes classes de sequências repetitivas no cromossomo W de P. tocantins. 2. Materiais e métodos 2.1. Indivíduos e preparações cromossômicas Foram utilizadas duas fêmeas (ZUEC 22352 e 22358) e dois machos (ZUEC 22349 e 22351) de Pseudis tocantins coletados em Porto Nacional – TO, sob licença do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade/Sistema de Autorizações e Informação em Biodiversidade (ICMBio/SISBIO) (autorização #45183-3). As preparações cromossômicas foram obtidas a partir de suspensões de células epiteliais do intestino de animais previamente tratados com solução de colchicina 2% seguindo o protocolo de King e Rofe (1976). Esse protocolo foi aprovado pelo Comitê para Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Campinas (CEUA/UNICAMP) (protocolo #3419-1). Adicionalmente, uma preparação cromossômica de um indivíduo macho (MNRJ 35457) usado por Busin et al. (2008), disponível no banco de tecidos do Laboratório de Estudos Cromossômicos (LabEsc) da Unicamp, foi também empregada. 2.2. Microdissecção cromossômica e sequenciamento Preparações cromossômicas de Pseudis tocantins (ZUEC 22351, 22352 e 22358; MNRJ 35457) foram aplicadas em lâminas cobertas com polietileno-nafltalato (Zeiss), conforme descrito por Keinath et al. (2015). Os cromossomos Z e W de P. tocantins foram então microdissecados utilizando o sistema PALM Laser Microbeam (Zeiss). Como controle negativo foi utilizada uma amostra da membrana de polietileno-naftalato, sem cromossomos. Os cromossomos foram catapultados em direção à tampa adesiva de tubos de 0,2 mL (Zeiss). As cópias cromossômicas capturadas foram incubadas overnight a 55ºC em 10 µL de tampão de digestão de cromatina contendo proteinase K (Keinath et al., 2015). As amostras foram então brevemente centrifugadas e incubadas a 75ºC por 10 minutos e, posteriormente, a 95ºC por 4 minutos para inativação da proteinase K. As amostras cromossômicas foram amplificadas por meio de PicoPlex DNA-seq Kit (Rubicon Genomics), de acordo com as especificações do fabricante. Concentração e distribuição de tamanho dos fragmentos gerados foram analisados utilizando Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Ao total, 12 bibliotecas, contando com o controle negativo, foram sequenciadas em uma plataforma Illumina HiSeq 2000 no

74 serviço de sequenciamento da empresa Hudson Alpha Institute for Biotechnology (Huntsville, AR, EUA). 2.3. Análise das reads obtidas, montagem dos cromossomos Z e W e caracterização do conteúdo gênico Após o sequenciamento das bibliotecas cromossômicas, com o intuito de remover os adaptadores Illumina, editar as reads e remover reads com baixa qualidade foi empregado o software Trimmomatic (Lohse et al., 2012). Após essa etapa as bibliotecas cromossômicas foram individualmente checadas para DNA contaminante (i.e. DNA bacteriano ou humano) por meio de alinhamento de reads contra genomas bacterianos e humano de referência usando Bowtie2 (Langmead e Salzberg, 2012). Reads não mapeadas nos genomas de referência foram então extraídas usando SAMtools v1.4 (Li et al., 2009) e usadas para montagem de novo dos cromossomos Z e W, separadamente, empregando SOAPdenovo2 (Luo et al., 2012), seguindo para essa etapa as considerações de Keinath et al. (2015). A estimativa de cobertura para cada biblioteca cromossômica foi realizada usando a seguinte fórmula: C = L.N/G, na qual “C” é a cobertura, “L” é o tamanho da maioria das reads, “N” é o número total de reads e “G” é o tamanho do cromossomo em questão. O tamanho dos cromossomos Z e W de Pseudis tocantins foi inferido com base no tamanho do genoma de P. paradoxa (uma espécie próxima filogeneticamente) de 1,50 Gb (Goin et al., 1968) e o tamanho relativo desses cromossomos, calculado por Busin et al. (2008). Para obter informações sobre o conteúdo gênico das montagens dos cromossomos Z e W, buscas por BLAST (Altschul et al., 1990), por meio de blastx (comparação de sequências nucleotídicas versus um banco de dados de sequências de proteínas), foram empregadas contra a coleção de sequências de proteínas de Xenopus tropicalis (v9.1; GCA_000004195.3) e de Gallus gallus (v4.1; GCA_000002315.3). O genoma de X. tropicalis foi usado como referência por ser o genoma com a melhor montagem e anotação disponível para anfíbios, e o genoma de G. gallus foi escolhido por ser um dos genomas com melhor montagem e anotação dentre os vertebrados. Os scaffolds/contigs foram considerados correspondentes a genes dos genomas testados quando as comparações apresentaram valores de bitscore (escolhidos por meio da plotagem dos dados em um gráfico de distribuição) maior ou igual a 70. A fim de caracterizar as funções dos genes identificados nas montagens cromossômicas, listas dos genes identificados para as montagens dos cromossomos Z e W foram então submetidas a análise de Gene Ontology (GO) por meio da plataforma on line PANTHER (Thomas et al., 2003). Além disso, buscas por genes relacionados a diferenciação/determinação sexual foram conduzidas baseando-se em listas de genes previamente publicadas para vertebrados (Gerchen et al., 2016; Capel, 2017). 2.4. Isolamento e análise de sequências similares aos genes LHX9 e SOX8 Ensaios de PCR foram conduzidos com o intuito de analisar sequências reconhecidas na etapa anterior como similares aos genes LHX9 e SOX8 (ver detalhes em Resultados), genes envolvidos na diferenciação sexual de vertebrados (Birk et al., 2000; Chaboissier et al., 2004). Amostras de DNA genômico foram obtidas de três machos (MNRJ 35456 – 35458) e três fêmeas (ZUEC 13228, 13229, 22355) de Pseudis tocantins de acordo com Medeiros et al. (2013) e utilizadas em reações de PCR na presença de

75 primers, desenhados com o auxílio do software Primer 3 (Untergasser et al., 2012), para a amplificação de segmentos dos scaffolds/contigs que mostraram similaridade com os genes de interesse. Os primers usados para isolar a porção que mostrou similaridade com a do gene LHX9 foram: Ptoc-Lhx9-F (5’ ACC TTT TGG CTG TGG ACA AG 3’) e Ptoc- Lhx9-R (5’ TGG GGC GAC TCC ATA GTG TA 3’). Para isolar a região similar à do gene SOX8 foram usados os seguintes primers: Ptoc-Sox8-F (5’ CGC CCA GAA CAT TGA ACT TCA G 3’) e Ptoc-Sox8-R (5’ CAG CGT AAG ATG GTG CAG AA 3’). Reações de PCR foram aplicadas usando o seguinte mix de reação: 1x de tampão de reação (200 mM de Tris-HCl pH 8.4 e 500 mM de KCl), 6 mM de MgCl2, 3.2 mM de dNTP, 0.56 µM de cada primer, 100 ng de DNA genômico e 1 U de Taq polimerase. Os produtos de PCR foram analisados por meio de eletroforese em gel de agarose 1%, purificados e sequenciados usando o kit BigDye Terminator (Applied Biosystems). As reações de sequenciamentos foram lidas em um sequenciador ABI PRISM 3130 XL Genetic Analyzer (Hitachi). As reads geradas foram editadas e analisadas usando o software BioEdit (Hall, 1999). 2.5. Genômica comparativa e testes de homeologia Para inferir possíveis regiões de homeologia dos cromossomos Z e W de Pseudis tocantins com os genomas de Xenopus tropicalis e Gallus gallus, buscamos a localização cromossômica, nessas duas últimas espécies, dos genes que foram identificados por blastx (como descrito no item 2.3) como possivelmente presentes nos cromossomos sexuais de P. tocantins. Tais buscas foram realizadas com as ferramentas on line XenMine (Reid et al., 2017) e Ensembl BioMarts (Kinsella et al., 2011). Foram calculadas as porcentagens de contigs/scaffolds mapeados em um dado cromossomo das duas espécies aqui utilizadas nas análises comparativas. Além disso, também foi calculado quanto do total de genes em um dado cromossomo de Xenopus tropicalis e de Gallus gallus pode ser reconhecido nas montagens de P. tocantins. Com base nesses resultados pode ser avaliada a riqueza de marcadores em um dado cromossomo, o que pode sugerir hipóteses iniciais de homeologia. Foi também avaliada a densidade de marcadores ao longo dos cromossomos de Xenopus tropicalis e Gallus gallus. Para tanto, cada cromossomo foi dividido em segmentos adjacentes de 5 Mb (janelas de 5 Mb) e o número de marcadores presentes em cada segmento foi calculado. Com base na análise da distribuição do número de marcadores por segmento cromossômico de X. tropicalis, reconhecemos como segmentos com maior densidade de marcadores aqueles que tiveram mais que 4 e 5 marcadores das montagens dos cromossomos Z e W de Pseudis tocantins, respectivamente. Já para as comparações com G. gallus, as regiões com maiores densidades de marcadores foram aquelas que apresentaram mais que 4 marcadores (Anexo X.I). Foi também calculada a média e o desvio padrão de marcadores mapeados em cada cromossomo de X. tropicalis e G. gallus. A comparação estatística entre as médias de marcadores presentes nos diferentes cromossomos de cada espécie foi avaliada por teste T de Student levando em consideração valores de p ≤ 0,01, 0,05 e 0,1. Cromossomos de X. tropicalis e de G. gallus que apresentaram o maior número de comparações significativas estatisticamente foram inferidos como tendo segmentos homeólogos aos cromossomos sexuais de Pseudis tocantins.

2.6. Análise de sequências repetitivas A fim de obter informações sobre a quantidade de sequências repetitivas, bem como a classificação das mesmas, presentes nas montagens dos cromossomos Z e W, foram empregados os softwares RepeatMasker v4.0.6 (disponível em http://www.repeatmasker.org/). Buscas por sequências repetitivas foram realizadas usando as bibliotecas de vertebrados (database “vertebrate”) disponíveis no banco de dados do RepBase (Bao et al., 2015), bem como um banco de dados gerado a partir da identificação de novo de repeats (custom database) pelo software RepeatModeler (disponível em http://www.repeatmasker.org/). Sequências repetitivas identificadas em mais de 5 scaffolds/contigs das montagens cromossômicas foram submetidas a análises de máxima verossimilhança, conduzidas no software MEGA (Kumar et al., 2016), utilizando modelos evolutivos inferidos no mesmo software (Tabela 1). Tabela 1. Classes de sequências repetitivas usadas em análises de máxima verossimilhança e respectivo modelo evolutivo usado na análise. Classe Número de sequências Modelo evolutivo Retrotransposons DIRS-6A_XT 7 Kimura 2 parâmetros Gypsy-13-I_XT 7 Kimura 2 parâmetros 6 Kimura 2 parâmetros 6 Kimura 2 parâmetros L1-55_XT 6 Kimura 2 parâmetros

Transposons de DNA Mariner-1_XT 55 Tamura 3 parâmetros 17 Tamura 3 parâmetros 12 Tamura 3 parâmetros Tc1_FR 7 Kimura 2 parâmetros Tc1-8_DR 20 Tamura 3 parâmetros Tc1-10_XT 12 Kimura 2 parâmetros 13 Kimura 2 parâmetros 18 Kimura 2 parâmetros 9 Jukes-Cantor Tc1-15_XT 15 Tamura 3 parâmetros

SSRs (ATG)n 12 General Time Reversible (CACTC)n 20 General Time Reversible (GAATG)n 22 General Time Reversible

Considerando que as montagens cromossômicas obtidas foram bastante fragmentadas (ver item 3.1 e 4.1 para mais detalhes), com o intuito de obter mais dados sobre as sequências repetitivas dos cromossomos sexuais, o genoma de uma fêmea (ZUEC 22351) e o genoma de um macho (ZUEC 22349) de Pseudis tocantins foram sequenciados. Amostras de fígado foram usadas para a extração do DNA genômico total usando o método padrão de fenol:clorofórmio (Sambrook et al., 1989). Bibliotecas paired-end foram construídas empregando Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina) e sequenciadas com uma cobertura de aproximadamente 40x em uma plataforma Illumina HiX 10 pela empresa Hudson Alpha Institute for Biotechnology (Huntsville, AR, EUA). As reads obtidas foram trimadas de acordo com o item 2.3. Após o processamento, as reads de macho e fêmea restantes foram analisadas, separadamente, usando o script RepARK (Koch et al., 2014), que reconhece k-mers6 abundantes (derivadas de sequências

6 Refere-se a todas as possíveis subsequências de tamanho “k”. Por exemplo, ao decompor uma read de 150 pb com um valor de “k” igual a 25 podem ser obtidas 126 k-mers medindo 25 pb (L-k+1; onde L é o tamanho da read e k o tamanho em que a read será decomposta).

77 repetitivas) em um conjunto de dados, por meio do software Jellyfish (Marçais e Kingsford, 2011), e as utiliza em um processo de montagem, empregando o assembler Velvet (Zerbino e Birney, 2008). Os contigs de macho e fêmea, montados por essa abordagem, foram comparados entre si por meio de BLAST (Altschul et al., 1990), empregando blastn, a fim de identificar sequências exclusivas de fêmea, presumivelmente acumuladas no cromossomo W. Os contigs compartilhados entre os sexos e exclusivos de machos ou fêmeas obtidos por meio de RepARK foram então analisados para a identificação de sequências repetitivas usando RepeatMasker, com base nos mesmos parâmetros citados no parágrafo anterior. Foram obtidos valores de divergência dos repeats em comparação com as sequências consensos do RepBase. As médias gerais de divergência dentro das grandes classes de sequências repetitivas (retrotransposons, transposons de DNA, DNA satélites e SSRs) foram calculadas, tanto para repeats exclusivos de macho ou fêmea quanto para repeats compartilhados entre os sexos. No caso das sequências compartilhadas entre os dois sexos, foram comparadas a divergência nucleotídica observada dentre as sequências identificadas no genoma de macho e aquela observada nas sequências encontradas no genoma de fêmea. A mesma comparação foi realizada entre as sequências exclusivas de cada sexo (fêmea x macho) e entre as sequências compartilhadas e exclusivas de macho (exclusiva de macho x compartilhadas de macho) e fêmea (exclusiva de fêmea x compartilhadas de fêmea). A significância estatística da comparação entre as médias foi acessada por teste T de Student, considerando significativas as comparações com valor de p ≤ 0,05. 3. Resultados 3.1. Sequenciamento, montagens e caracterização dos cromossomos Z e W de Pseudis tocantins O número de reads obtidas entre as 11 bibliotecas cromossômicas variou entre 20.877.590 e 48.533.228 (Tabela 2). A checagem da porcentagem de DNA contaminante (e.g. DNA humano/bacteriano) nessas bibliotecas variou entre 10,58% (biblioteca 3851_02 W) e 64,78% (biblioteca 3851_12 Z) do total de reads obtidas. Após a filtragem dos contaminantes todas as bibliotecas continham pelo menos 3 milhões de reads utilizadas nas etapas seguintes. Já para o DNA genômico de macho e fêmea foram obtidas 455.126.706 e 458.040.596 reads, respectivamente. Após a trimagem usando o software Trimmomatic restaram 417.599.365 reads provenientes do DNA genômico de macho e 423.361.839 reads de fêmea. Tabela 2. Resumo dos dados obtidos do sequenciamento de cromossomos Z e W microdissecados de Pseudis tocantins. Nº de cópias Nº de reads após Cobertura Biblioteca Cromossomo Nº de reads microdissecadas processamento aproximada (x) 3851_01 Z 3 24.136.186 5.266.878 7,32 3851_02 W 4 35.466.180 10.729.456 9,58 3851_03 W 3 26.147.306 6.339.096 5,66 3851_04 Z 2 35.470.940 12.950.892 17,99 3851_05 Z 4 27.201.758 10.729.456 14,90 3851_06 W 2 30.517.340 3.600.740 3,21 3851_07 Z 1 15.144.798 3.892.176 5,41 3851_08 W 1 28.827.648 10.729.456 9,58 3851_09 W 1 20.877.590 4.439.654 3,96 3851_10 Controle negativo - 26.655.898 - - 3851_11 W 1 48.533.228 12.031.226 10,74 3851_12 Z 5 25.881.604 4.708.946 6,54

As reads provenientes de cromossomos Z e W microdissecados renderam duas montagens, uma para cada cromossomo (Tabela 3). A montagem do cromossomo W foi maior e apresentou um N50 também maior que a do cromossomo Z. Entretanto, o maior scaffold foi obtido para a montagem do cromossomo Z. Ambas as montagens apresentaram um alto número de singletons, comparado ao número de contigs organizados em scaffolds (Tabela 3). Com base nos valores de N50, no tamanho do maior contig/scaffold e no número de singletons pode ser observado que as montagens tanto do cromossomo Z quanto do cromossomo W se apresentaram bastante fragmentadas. Buscas por blastx contra as sequências de proteínas de X. tropicalis também indicam a fragmentação das montagens. Dos genes identificados por blastx, 21,08% e 20,02% nas montagens dos cromossomos Z e W, respectivamente, tiveram hits com dois ou mais contigs/scaffolds das montagens cromossômicas. Por exemplo, a proteína abca4 de X. tropicalis mostrou dois contigs da montagem do cromossomo W mapeados, um entre as posições 659 – 722 e o outro entre as posições 1123 – 1191 da sequência de aminoácidos dessa proteína. Tabela 3. Resumo das estatísticas das montagens (etapas de scaffolding e contiging) dos cromossomos Z (3851_Z) e W (3851_W). 3851_Z 3851_W Scaffolding Tamanho (Gb) 0,56 0,63 N50 scaffold (pb) 307 314 Maior scaffold (kb) 2,18 1,89 Menor scaffold (pb) 100 100 Contigs em scaffolds 115.682 128.385 Média de contigs/scaffold 1,8 1,7 Singletons 207.090 229.633 Contiging Tamanho (Gb) 0,44 0,49 N50 contig (pb) 125 125 Maior contig (pb) 1.739 759 Menor contig (pb) 100 100

Buscas por blastx contra a coleção de sequências proteicas de Xenopus tropicalis (Xto) identificaram regiões similares a 872 genes de proteínas já caracterizadas e 280 genes de proteínas ainda não caracterizadas na montagem do cromossomo W. Na montagem do cromossomo Z foram identificados 621 genes de proteínas conhecidas e 198 de proteínas ainda não caracterizadas. Já as buscas por blastx contra as sequências de proteínas já caracterizadas de Gallus gallus (Gga) identificaram 551 e 620 genes para as montagens dos cromossomos W e Z de Pseudis tocantins, respectivamente. Em relação a proteínas não caracterizadas de G. gallus foram identificados 58 genes na montagem do cromossomo W e 41 genes na montagem do cromossomo Z. Quanto aos aspectos funcionais dos supostos genes identificados nas montagens dos cromossomos Z e W de Pseudis tocantins, análises de Gene Ontology (GO) mostram um enriquecimento de genes relacionados a funções moleculares de “ligação” (GO: 0005488) e “atividade catalítica” (GO: 0003824) (Figura 5A). Em relação a processos biológicos, um enriquecimento pode ser observado em genes relacionados a “processos celulares” (GO: 0009987) e “processos metabólicos” (GO: 0008152) (Figura 5B). Já para processos de desenvolvimento (GO: 0032502), foi observado um enriquecimento de genes ligados a “desenvolvimento de sistemas” (GO: 0048731) (Figura 5D).

No que diz respeito à busca por genes relacionados com determinação/diferenciação sexual, 4 contigs/scaffolds da montagem do cromossomo W mostraram similaridade com dois genes relacionados a esses processos: LHX-9 e SOX-8 (Tabela 4). O isolamento desses dois tipos de sequências a partir do genoma de machos e fêmeas de P. tocantins, realizado por PCR, não mostrou qualquer diferença entre os sexos (Figura 6). Também em relação à sequência nucleotídica, os segmentos isolados de machos e fêmeas foram idênticos.

Figura 5. Análise comparativa do conteúdo gênico inferido para as montagens dos cromossomos W e Z de Pseudis tocantins. Os genes foram agrupados em três categorias: genes com função molecular (A), genes envolvidos em processos biológicos (B) e genes envolvidos em processos de desenvolvimento (C). (AAO) atividade antioxidante, (L) ligação, (AC) atividade catalítica, (ARC) atividade reguladora de canais, (AR) atividade receptora, (ATS) atividade transdutora de sinal, (AME) atividade de molécula estrutural, (ART) atividade reguladora da tradução, (AT) atividade de transporte; (AB) adesão biológica, (RB) regulação biológica, (OBCC) organização ou biogênese de componente celular, (PCE) processos celulares, (PD) processos de desenvolvimento, (PSI) processos do sistema imune, (LCZ) localização, (LCM) locomoção, (PM) processos metabólicos, (POM) processos de organismos multicelulares, (RPD) reprodução, (RPE) resposta a

80 estímulos, (PRT) processos rítmicos, (MEA) morfogênese de estrutura anatômica, (DC) diferenciação celular, (MTC) morte celular, (DET) desenvolvimento da ectoderme, (DEB) desenvolvimento embrionário, (DED) desenvolvimento da endoderme, (DMD) desenvolvimento da mesoderme, (PPE) processos de padrões específicos, (DS) desenvolvimento de sistemas.

Tabela 4. Segmentos encontrados na montagem dos cromossomos W de Pseudis tocantins que tiveram alta similaridade com (inferida por blastx) com genes relacionados a diferenciação sexual em Xenopus tropicalisa e Gallus gallusb. Montagem Scaffolds/Contigs Gene Similaridade (%) 3851_W C7758114 LHX9 94,54a 94,73a C7857945 LHX9 94,73b C7590236 SOX8 86,84a 85,00a scaffold38624 SOX8 87,50b

Figura 6. Isolamento por PCR de sequências e sequenciamento Sanger de segmentos dos genes SOX-8 (A) e LHX-9 (B) de Pseudis tocantins. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR na parte superior em A e B. Sequenciamento Sanger de produtos de PCR na parte inferior em A e B.

3.2. Análises comparativas para com os genomas de Xenopus tropicalis e Gallus gallus A análise de localização cromossômica, em Xenopus tropicalis, dos contigs/scaffolds identificados na montagem do cromossomo W de Pseudis tocantins mostrou que a maior porcentagem (18,20%) de segmentos foi mapeada no cromossomo

4 de X. tropicalis (Figura 7A). Os marcadores mapeados no cromossomo 4 de X. tropicalis representam cerca de 9% do conteúdo gênico desse cromossomo (Figura 7B). Em relação ao cariótipo de Gallus gallus, dos 1.220 contigs/scaffolds que foram identificados na montagem do cromossomo W a maioria (12,04%) mostrou similaridade com genes mapeados no cromossomo 1 dessa espécie (Figura 7C). Porém, quando estimada a porcentagem de genes de cada cromossomo representada nessa montagem, pode ser observado que a representação de genes do cromossomo 1 de G. gallus é baixa (5,01%) em relação àquela dos demais cromossomos, especialmente dos cromossomos 11 e 12 (Figura 7D). Por outro lado, os genes identificados na montagem do cromossomo W e mapeados nos cromossomos 11 e 12 de G. gallus correspondem a 9,04% e 12.28% do conteúdo gênico desses cromossomos de G. gallus (Figura 7D).

Figura 7. Análise dos genes reconhecidos por meio de blastx nas montagens dos cromossomos W (azul) e Z (laranja) de Pseudis tocantins em relação aos cariótipos de Xenopus tropicalis (Xto) (A e B) e Gallus gallus (Gga) (C e D). A, C. Distribuição (em porcentagem) dos contigs/scaffolds das montagens de W e Z nos cromossomos de Xto (A) e Gga (C). B, D. Porcentagem do conteúdo gênico de cada cromossomo de Xto (B) e Gga (D) representada dentre os genes identificados nas montagens dos cromossomos sexuais de P. tocantins. O mapeamento cromossômico dos genes identificados por blastx na montagem do cromossomo Z de Pseudis tocantins não mostrou alta concentração de contigs/scaffolds mapeados em um único cromossomo de X. tropicalis (Figura 7A). Entretanto, no que diz respeito à riqueza de genes em um dado cromossomo (porcentagem do conteúdo gênico total de um cromossomo representada nas montagens de P. tocantins), os contigs/scaffolds similares a genes localizados no cromossomo 10 de X. tropicalis representam cerca de 5% do conteúdo gênico desse cromossomo, porcentagem maior do que a observada em relação a todos os outros cromossomos (Figura 7B). O mapeamento de marcadores referentes à montagem do cromossomo Z de P. tocantins no genoma de Gallus gallus mostrou que a maior quantidade (14,83%) de contigs/scaffolds foi mapeada no cromossomo Gga 1, entretanto representando pouco menos de 5% do conteúdo gênico desse cromossomo (Figuras 7C e D). Por outro lado, a representação do conteúdo gênico do cromossomo 15 de G. gallus na montagem do cromossomo Z de P. tocantins foi de cerca de 7% (Figura 7D). A análise de densidade de marcadores ao longo do cromossomo 4 de Xenopus tropicalis mostrou dois segmentos com maior representação da montagem do

cromossomo W e um pequeno segmento para a montagem do cromossomo Z (Figura 8A e Anexo II). Adicionalmente, ambas as montagens mostraram alta densidade de marcadores na porção terminal do braço longo do cromossomo 10 de X. tropicalis (Figura 8A). As comparações das médias de marcadores a cada 5 Mb mostraram valores significativamente maiores (valor de p ≤ 0,01; p ≤ 0,05 e p ≤ 0,1) para as comparações que envolviam o cromossomo 4 ou o 10 de X. tropicalis (Figura 8B). Para o genoma de Gallus gallus, maior densidade de marcadores da montagem do cromossomo W foi observada nos cromossomos 5, 8, 11, 12, 18 e 27 (Figura 9A e 9B). As comparações entre as médias de marcadores a cada 5 Mb presentes nesses cromossomos mostraram valores significativamente maiores em relação aos outros cromossomos de G. gallus (valor de p ≤ 0,01; p ≤ 0,05 e p ≤ 0,1) (Figura 9C). Para a montagem do cromossomo Z, as comparações entre as médias de densidade de marcadores indicam que o cromossomo 18 tem uma densidade maior de marcadores em comparação aos outros cromossomos de G. gallus (valor de p ≤ 0,01; p ≤ 0,05 e p ≤ 0,1) (Figura 9B e 9C).

Figura 8. Análise da densidade de marcadores em relação aos cromossomos de Xenopus tropicalis. A. Densidade dos marcadores das montagens dos cromossomos W (3851_W) e Z (3851_Z) de Pseudis tocantins, em janelas de 5 Mb, ao longo dos cromossomos 4 e 10 de X. tropicalis. Ideogramas dos cromossomos foram obtidos a partir de Uno et al. (2012). B. Número médio de marcadores das montagens dos cromossomos W e Z de P. tocantins encontrado em cada cromossomo de X. tropicalis. Barras de erro em B indicam o desvio padrão das médias. Tamanho dos círculos em B indicam o número de comparações (no canto superior direito) em que o número médio de marcador mostrou diferença significativa considerando diferentes valores de p (círculos vermelhos, azuis e amarelos).

Figura 9. Análise da densidade de marcadores em relação aos cromossomos de Gallus gallus. A. Densidade de marcadores da montagem do cromossomo W (3851_W) e do cromossomo Z (3851_Z) de Pseudis tocantins mapeados nos cromossomos 5, 8, 11, 12, 18 e 27 de G. gallus em janelas de 5 Mb. Ideogramas e informações das localizações dos genes em A foram obtidos pela plataforma Genome Viewer disponível no banco de dados Ensembl (www.ensembl.org/Gallus_gallus/Location/Genome). Setas vermelhas em A indicam a localização dos genes identificados por blastx. B. Número médio de marcadores das montagens dos cromossomos W (azul) e Z (laranja) encontrado em cada cromossomo de G. gallus. Barras de erro em B indicam o desvio padrão das médias. Tamanho dos círculos em B indicam o número de comparações (no canto superior direito) em que o número médio de marcador mostrou diferença significativa considerando diferentes valores de p (círculos vermelhos, azuis e amarelos).

3.3. DNA repetitivo nos cromossomos sexuais de Pseudis tocantins A partir das montagens dos cromossomos Z e W, empregando os pipelines RepeatMasker/RepeatModeler, foi identificado que 4,49% e 4,93%, respectivamente, são de sequências repetitivas. A maior parte das sequências repetitivas em ambas as montagens é de elementos transponíveis ainda não classificados seguidos por retrotransposons (Tabela 5). Além disso, a montagem do cromossomo W mostrou uma composição maior de elementos transponíveis ainda não classificados quando comparada à montagem do cromossomo Z, bem como uma composição levemente maior de transposons de DNA. Como mencionado no item 3.1 e 4.1, as montagens cromossômicas obtidas foram altamente fragmentadas, o que pode justificar o alto número de repeats agrupados na categoria “não classificado”. Dessa forma, a fim de se obter dados mais fidedignos sobre a composição de sequências repetitivas dos cromossomos sexuais, foram analisadas reads do DNA genômico de macho e de fêmea, empregando o script RepARK (Koch et al., 2014). As montagens realizadas após o uso do script RepARK apresentaram melhores estatísticas (e.g. N50 2,9 kb para fêmea e 3,5 kb para macho) do que as montagens cromossômicas (Tabela 2). Sendo assim, as montagens usando reads dos genomas de macho e fêmea foram, no que diz respeito à porção repetitiva do genoma, menos fragmentadas que as montagens cromossômicas. Um total de 14.941 e 142.946 contigs de possíveis sequências repetitivas foram geradas para os genomas de macho e de fêmea de Pseudis tocantins, respectivamente. Dentre os contigs encontrados no genoma de macho foram reconhecidos, por meio de RepeatMasker, 2.391 repeats de DNA repetitivo, enquanto no genoma da fêmea foram reconhecidos 24.739 repeats referentes a DNA repetitivo. O alinhamento por blastn entre os contigs de macho e fêmea, gerados por RepARK, permitiu identificar 4.468 contigs provenientes exclusivamente das reads de macho e 115.758 provenientes exclusivamente das reads de fêmea. Adicionalmente, dentre os contigs exclusivos de macho foram reconhecidas 46 classes de sequências repetitivas e dentre os exclusivos da fêmea, 1.070. Além do maior número de sequências repetitivas, também é observada maior diversidade delas dentre os contigs exclusivos de fêmea (Tabela 5). Também vale destacar que retroelementos LINE das famílias R2/R4/NeSL, BelPao e Ty1/Copia, bem como transposons de DNA do tipo Tourist/Harbinger, foram identificados apenas nos contigs de fêmea.

Tabela 5. Classes de elementos de DNA repetitivo identificadas nas montagens dos cromossomos Z e W (3851_W e 3851_Z) e nos contigs RepARK de fêmea e macho de Pseudis tocantins. O número de repeats (NR) referentes às diferentes classes de elementos repetitivos encontrados nas referidas montagens está indicado, assim como a porcentagem das montagens representada pelos elementos repetitivos identificados. Montagem 3851_W 3851_Z RepARK fêmea RepARK macho Elementos % na Número de % na Número de % na Número de % na Número de montagem repeats montagem repeats montagem repeats montagem repeats Retrotransposons 1,17 7.695 1,65 9.403 6,47 5.772 4,81 471 SINEs 0,08 659 0,18 1.192 0,03 77 0,10 27 Penelope 0,05 353 0,03 201 0,39 442 0,07 10 LINES 0,68 4.485 0,98 5.442 2,71 2.996 2.16 282 L2/CR1/Rex 0,11 841 0,10 719 0,22 544 0,60 117 R1/LOA/Jockey 0,0003 2 0,0002 2 0,01 13 0,01 5 R2/R4/NeSL 0 0 0,0002 2 0,002 3 0 0 RTE/Bov-B 0,008 59 0,01 79 0,02 21 0,02 3 L1/CIN4 0,50 3.202 0,83 4.421 1,78 1.557 1,20 104 LTRs 0,40 2.551 0,48 2.769 3,72 2.699 2,56 162 BEL/Pao 0,006 27 0,003 17 0,23 94 0 0 Ty1/Copia 0,002 12 0,001 4 0,03 11 0 0 Gypsy/DIRS 0,15 928 0,11 628 2,72 2.095 1,98 119 Retroviral 0,21 1.427 0,34 2.000 0,28 224 0,44 27 Transposons de DNA 0,52 3.947 0,42 2.810 1,99 4.005 3,00 544 hobo-Activator 0,12 1.049 0,12 915 0,22 357 0,40 66 Tc1-IS630-Pogo 0,36 2.558 0,26 1.653 1,53 3.339 2,08 388 PiggyBac 0,003 17 0,002 9 0,03 18 0,21 9 Tourist/Harbinger 0,001 10 0,001 7 0,02 15 0 0 Não classificados 2,68 24.382 1,79 14.592 0,04 61 0,05 6 RNAs pequenos 0,04 312 0,12 732 0,16 337 0,86 125 Satélites 0,03 202 0,06 287 0,09 180 0,12 31 SSRs 0,38 5860 0,36 4931 0,14 216 0,11 20

Os repeats compartilhados entre os genomas de macho e fêmea divergiram em média 14,03% em relação às sequências consensos obtidas das bibliotecas do RepBase, sendo a classe dos retrotransposons a que mostrou maior divergência (Figura 10A). A média de divergência observada entre os repeats referentes a transposons de DNA presentes nos contigs exclusivos do genoma de fêmea foi maior do que aquela encontrada entre os repeats de transposons de DNA presentes nos contigs exclusivos de macho e naqueles compartilhados entre macho e fêmea (valor de p ≤ 0,05) (Figura 10A e 10B). Maior divergência também foi observada em relação aos DNAs satélites encontrados nos contigs exclusivos de fêmea quando comparados àqueles exclusivos dos contigs de macho (Figura 10B), porém não há significância estatística nesse caso (valor de p > 0,05). Os retrotransposons dos contigs exclusivos de macho e fêmea apresentaram as maiores médias de divergência em relação às sequências consensos das bibliotecas consultadas (Figura 10B), porém em relação a essa classe não houve diferença significativa entre os elementos encontrados nos contigs exclusivos de fêmea e aqueles de contigs exclusivos de macho (valor de p > 0,05).

Figura 10. Divergência média (em porcentagem) das sequências de DNA repetitivo identificadas nos contigs do genoma de macho e de fêmea de Pseudis tocantins em relação àquelas disponíveis no banco de dados do RepeatMasker. Em (A), análise de elementos compartilhados nas montagens de macho e fêmea. Em (B), análise dos elementos encontrados exclusivamente nos contigs de macho ou de fêmea. Barra de erro indica o desvio padrão das médias. Análises de máxima verossimilhança de sequências identificadas como retrotransposons e transposons de DNA mostram que algumas sequências provenientes da montagem do cromossomo W são bastante divergentes em relação tanto a sequências da montagem do cromossomo Z quanto a outras sequências da montagem do cromossomo W (Figuras 11 e 12). Por outro lado, análises de máxima verossimilhança usando sequências de SSRs identificadas nas montagens cromossômicas não mostraram sequências altamente divergentes entre os cromossomos Z e W (Figura 13).

Figura 11. Análise de máxima verossimilhança de sequências identificadas como retrotransposons Gypsy-13-I_XT (A), DIRS-6A_XT (B) e L1-55_XT (C) dentre os contigs/scaffolds das montagens dos cromossomos Z (vermelho) e W (azul). Sombreados em azul indicam sequências altamente divergentes em relação às demais.

Figura 12. Análise de máxima verossimilhança de sequências identificadas como transposons de DNA Tc1_FR (A), Tc1-8_DR (B), Tc1-15_XT (C) e Tc1-10_XT (D) dentre os contigs/scaffolds das montagens dos cromossomos Z (vermelho) e W (azul). Sombreado em azul estão indicadas sequências altamente divergentes em relação às demais.

Figura 13. Análise de máxima verossimilhança de sequências identificadas como SSRs (GAATG)n (A), (CACTC)n (B) e (ATG)n (C) dentre os contigs/scaffolds das montagens dos cromossomos Z e W.

4. Discussão O emprego de abordagens genômicas no estudos dos cromossomos sexuais tem auxiliado bastante tanto na caracterização molecular quanto no entendimento dos processos de diferenciação entre os cromossomos X/Z e Y/W em diversas espécies (exemplos em Gamble et al., 2015, 2017; Hall et al., 2013; Traut et al., 2013; Vicoso et al., 2013). No presente trabalho apresentamos uma visão mais profunda sobre a composição molecular dos cromossomos sexuais de um anfíbio Neotropical, Pseudis tocantins, com base em abordagens genômicas 4.1. Conteúdo gênico das montagens dos cromossomos Z e W de Pseudis tocantins O maior tamanho da montagem do cromossomo W em relação à do cromossomo Z é um resultado esperado já que o cromossomo W de Pseudis tocantins é maior que o cromossomo Z (Busin et al., 2008). Apesar do grande número de singletons presentes em ambas as montagens cromossômicas, o que pode ser sido decorrente da baixa cobertura de sequenciamento de cada biblioteca, resultados interessantes foram obtidos tanto no que diz respeito à composição de genes dos cromossomos sexuais de P. tocantins quanto à homeologia com cromossomos de Xenopus tropicalis. Dentre o conteúdo gênico dos cromossomos Z e W pode ser observada uma grande quantidade de genes ligados a atividade catalítica, no que diz respeito a função molecular, e processos celulares e processos metabólicos para processos biológicos. Genes de determinação/diferenciação sexual são classificados, em grande parte, como genes relacionados com processos de desenvolvimento. Interessante notar que ambas as montagens têm poucos genes ligados com processos de desenvolvimento. Entretanto, na montagem do cromossomo W de Pseudis tocantins foram identificados contigs/scaffolds com similaridades para dois genes ligados com o processo de diferenciação sexual em outras espécies: LHX9 e SOX8. O primeiro está ligado à diferenciação de ovários, enquanto o segundo está ligado à diferenciação de testículos (Birk et al., 2000; Chaboissier et al., 2004). Muitos genes de determinação de sexo são parálogos de genes de diferenciação sexual, como o gene DM-W em Xenopus laevis derivado do gene DMRT1 (Yoshimoto et al., 2008) e o gene SRY em humanos derivado do gene SOX3 (Berta et al., 1990). Os segmentos do cromossomo W de P. tocantins que mostraram alta similaridade com os genes LHX9 e SOX8, entretanto, parecem não ser, a priori, os genes

90 de determinação de sexo nessa espécie, já que as mesmas sequências estavam presentes tanto em machos quanto em fêmeas. 4.2. Genômica comparativa e homeologia com os cromossomos de Xenopus tropicalis A alta riqueza de marcadores das montagens dos cromossomos Z e/ou W mapeados nos cromossomos 4 e 10 de Xenopus tropicalis sugere a hipótese de homeologia, pelo menos parcial, dos cromossomos sexuais de Pseudis tocantins para com esses cromossomos de X. tropicalis. Concomitantemente, o mapeamento das montagens de Z e W de P. tocantins contra Gallus gallus sugere homeologia dos cromossomos sexuais de P. tocantins com os cromossomos 5, 8, 11 e 12 e 18 e 27. Interessante notar que os cromossomos 5, 8, 11 e 12 de G. gallus são homeólogos ao cromossomo 4 de X. tropicalis, enquanto os cromossomos 18 e 27 de G. gallus são homeólogos do cromossomos 10 de X. tropicalis (Keinath et al., 2017). Dessa forma, o mapeamento das montagens dos cromossomos Z e W de P. tocantins contra o genoma de G. gallus reforça a hipótese de homeologia entre os cromossomos sexuais de P. tocantins com o cromossomo 4 e 10 de X. tropicalis. Sendo assim, os cromossomos sexuais de P. tocantins não seriam homólogos aos cromossomos sexuais de X. tropicalis, já que são os cromossomos do par 7 aqueles inferidos como sendo os cromossomos sexuais nessa espécie (Olmstead et al., 2010; Wells et al., 2011). Ao contrário de aves, mamíferos placentários e marsupiais, em anuros não há um sistema de determinação de sexo único e homólogo, ou seja, adquirido quando as grandes linhagens ainda não tinham se diversificado (revisão de Ezaz et al. 2006; Graves 2008; Ellegren 2011). Além disso, no decorrer da história evolutiva dos anuros é observada a ocorrência de diversas transições XX/XY ↔ ZZ/ZW (Evans et al., 2012) e mesmo nos casos em que é inferida a homeologia entre os cromossomos sexuais de diferentes espécies deve-se tomar cuidado para não se rejeitar precipitadamente a hipótese de que a semelhança observada entre os cromossomos seja resultado de convergência evolutiva (Brelsford et al., 2013). A hipótese de homeologia, pelo menos parcial, dos cromossomos sexuais de P. tocantins para com dois dos cromossomos de Xenopus tropicalis (cromossomos 4 e 10) sugere a ocorrência de rearranjos cromossômicos após a divergência entre a superfamília Pipoidea, em que se encontra X. tropicalis, e a superfamília em que está alocada a espécie P. tocantins (i.e., Hyloidea). Há evidências de rearranjos envolvendo o cromossomo 4 de X. tropicalis em outra espécie da família Hylidae. Em Hyla arborea (superfamília Hyloidea, família Hylidae) o grupo de ligação 4 (LG4) é composto de regiões homeólogas aos cromossomos 4 e 7 de X. tropicalis (Brelsford et al., 2016). É hipotetizado que o cariótipo ancestral dos Tetrapoda tenha sido similar ao das aves e répteis não avianos, com um conjunto de macrocromossomos e um conjunto de microcromossomos (Voss et al., 2011; Uno et al., 2012). Eventos independentes de fusões dos microcromossomos teriam ocorrido nas linhagens que deram origem às ordens Caudata e Anura, resultando em blocos sintênicos bastante divergentes nessas duas ordens (Voss et al., 2011). Em Caudata, a ocorrência de rearranjos cromossômicos é observada quando comparados os grupos de ligação das salamandras Notophthalmus viridescens (família Salamandridae) e Ambystoma mexicanum (família Ambystomidae) (Keinath et al., 2017). Porém, os grupos de ligação identificados tanto em N. viridescens

91 quanto em A. mexicanum mostram maior grau de sintenia em relação ao genoma de Gallus gallus do que quando comparados com o genoma de X. tropicalis (Keinath et al., 2017). No caso de Anura, comparando o mapeamento dos grupos de ligação de H. arborea e as montagens dos cromossomos Z e W de P. tocantins contra o genoma de X. tropicalis, podemos notar o envolvimento do cromossomo 4 de X. tropicalis em rearranjos independentes nas linhagens que deram origem a P. tocantins (cromossomos 4 e 10 de X. tropicalis) e a H. arborea (cromossomos 4 e 7 de X. tropicalis). Entretanto, mais trabalhos envolvendo pintura cromossômica, a construção de mapas físicos de ligação e/ou sequenciamento e montagem de genomas em escala cromossômica de outras espécies de anuros e a comparação para com genomas disponíveis se fazem necessários a fim de avaliar a ocorrência de rearranjos cromossômicos ao longo da divergência das linhagens de anuros. 4.3. Sequências repetitivas nos cromossomos sexuais de Pseudis tocantins Durante o processo de degeneração dos cromossomos sexuais um dos eventos mais conhecidos é o acúmulo/amplificação de sequências de DNA repetitivo, principalmente na região heterocromática do cromossomo Y/W (revisão de Charlesworth et al., 2005; Ellegren, 2011). No presente trabalho reportamos, pela primeira vez para um anuro da superfamília Hyloidea, a diversidade de sequências de DNA repetitivo nos cromossomos sexuais. Grande parte das sequências repetitivas identificadas nas montagens de sequências dos cromossomos sexuais de Pseudis tocantins se enquadra em elementos repetitivos ainda não classificados. A baixa qualidade das montagens cromossômicas (N50 baixo e alto número de singletons) pode ter influenciado na falta de identificação da maioria dos elementos. Entretanto, o uso de reads do genoma de macho e fêmea de P. tocantins e o emprego do script RepARK pode fornecer uma melhor caracterização de sequências repetitivas tanto dos cromossomos sexuais de P. tocantins quanto do genoma dessa espécie. A obtenção de um número muito maior de contigs contendo elementos repetitivos a partir das reads do genoma de fêmea em comparação com aquele obtido com as reads do genoma de macho sugere grande acúmulo desses elementos no cromossomo W de Pseudis tocantins. Tal sugestão é corroborada pela investigação dos contigs portadores de sequências repetitivas encontrados exclusivamente na análise genômica de um dos sexos, pois o genoma de fêmea mostrou um número significativamente maior de contigs exclusivos, tendo sido identificadas classes de sequências repetitivas exclusivas da amostra de fêmea (e.g. Ty1/Copia e Tourist/Harbinger). O acúmulo de DNA repetitivo no cromossomo exclusivo do sexo heterogamético (Y/W) é estimulado pela supressão de sua recombinação com o cromossomo homólogo (X/Z), o que permite que o cromossomo exclusivo do sexo heterogamético acumule rapidamente mutações nas regiões não recombinantes (revisão de Bergero and Charlesworth, 2009; Charlesworth et al., 2005). A existência de classes de sequências repetitivas supostamente exclusivas de fêmea de Pseudis tocantins, citada anteriormente, estaria de acordo com essa teoria. Outro dado que corrobora a presença de sequências

92 específicas no cromossomo W de P. tocantins surgiu da análise da divergência nucleotídica relativa a repeats encontrados no genoma de fêmea e macho. A divergência média observada em relação a transposons de DNA exclusivos de fêmea foi maior do que aquela encontrada para transposons de DNA compartilhados entre macho e fêmea também dentre aqueles encontrados apenas na análise do genoma de macho. Além disso, a análise de máxima verossimilhança, com sequências provenientes das montagens cromossômicas, mostrou sequências bastante divergentes presentes dentre aquelas identificadas na montagem do cromossomo W. Até o momento, para o cromossomo W de Pseudis tocantins existiam evidências de acúmulo apenas para o DNA satélite PcP190 (Gatto et al., 2016). Gatto et al. (in prep [Capítulo 2 desta tese]) sugeriram que a ocorrência de uma inversão paracentromérica no cromossomo W de P. tocantins pode ter exercido importante papel no acúmulo de sequências de DNA repetitivo nesse cromossomo. No presente trabalho, sequências de DNA satélite foram encontradas em maior número na montagem do cromossomo W e no genoma de fêmea do que na montagem do cromossomo Z e no genoma de macho, respectivamente. No entanto, tanto nas montagens dos cromossomos Z e W quanto nos contigs do genoma de macho e fêmea o número de repeats de DNAs satélites encontrados foi bem inferior àquele referente aos elementos transponíveis. Essa relação, entretanto, pode não representar corretamente a abundância relativa dessas classes de sequências repetitivas no material em análise, pois os softwares aqui utilizados usaram apenas as sequências depositadas no banco de dados RepBase para a identificação de tais sequências. Muitos DNAs satélites apresentam um padrão espécie-específico (Tsoumani et al., 2013; Kirov et al., 2017) ou ocorrem apenas em espécies proximamente relacionadas (Kuhn et al., 2008; Acosta et al., 2010). Dessa forma, o catálogo de DNAs satélites do RepBase não seria tão abrangente, o que pode acarretar a subestimativa da abundância de DNAs satélites quando realizadas as análises por meio dos softwares RepeatMasker/RepeatModeler. Análises adicionais envolvendo softwares como RepeatExplorer (Novák et al., 2013) ou TAREAN (Novák et al., 2017) podem ser realizadas para a melhor caracterização da porção de DNAs satélites do genoma de P. tocantins e, consequentemente, permitirão a comparação mais acurada da abundância de DNAs satélites e elementos transponíveis no genoma dessa espécie. 5. Conclusões O uso de sequenciamento de cromossomos microdissecados, que já foi demonstrado como bastante útil em anfíbios (Seifertova et al., 2013; Keinath et al., 2015), possibilitou a análise da composição molecular dos cromossomos Z e W de Pseudis tocantins. Foi inferida a homeologia dos cromossomos sexuais de P. tocantins com os cromossomos 4 e 10 de Xenopus tropicalis. A análise de sequência repetitivas sugeriu o acúmulo desse tipo de sequência no cromossomo W de P. tocantins, tendo sido a classe de elementos transponíveis a encontrada com maior abundância.

VI. Considerações Finais e Conclusões

O DNA satélite PcP190, desde o momento em que foi isolado primeiramente de Physalaemus cuvieri, se mostrou um promissor marcador citogenético para ser usado no reconhecimento de homeologias cromossômicas em espécies de anuros. O acúmulo dessa família de DNA satélite no cromossomo W de Pseudis tocantins sugeria que o mesmo poderia ter participado na diferenciação dos cromossomos sexuais dessa espécie. Com base nos dados obtidos para o DNA satélite PcP190 no presente trabalho para as demais espécies de Pseudis e em Lysapsus limellum pode-se concluir que:  O DNA satélite PcP190, previamente encontrado altamente amplificado no cromossomo W de Pseudis tocantins, é também presente em P. bolbodactyla, P. cardosoi, P. fusca, P. minuta, P. paradoxa e Pseudis sp., bem como em Lysapsus limellum. Além disso, dois novos grupos de sequências de PcP190 foram encontrados em P. minuta (PcP-9) e em L. limellum (PcP-8).  O mapeamento citogenético e a detecção por Southern blot do DNA satélite PcP190, bem como o emprego da técnica de CGH, possibilitaram a identificação de heteromorfismo cromossômico sexual em P. bolbodactyla e possivelmente em Pseudis sp., sugerindo que essas espécies têm um sistema de determinação de sexo do tipo ZZ/ZW.  O mapeamento citogenético do DNA satélite PcP190 reforça a hipótese de homeologia dos cromossomos portadores das NOR em Pseudis.  A alta divergência genética observada tanto no fragmento H1 mitocondrial quanto para o gene de RNAr 16S mitocondrial entre P. fusca e Pseudis sp. indica que a segunda pode ser uma espécie ainda não descrita para o gênero Pseudis.  Três rearranjos cromossômicos puderam ser inferidos envolvendo os cromossomos portadores de NOR em Pseudis: (a) uma inversão paracêntrica após a divergência do clado que inclui P. minuta e P. cardosoi em relação ao clado que inclui as outras espécies de Pseudis, que levou as NORs para mais próximo do centrômero no ancestral comum à P. bolbodactyla, P. fusca, P. paradoxa, Pseudis sp. e P. tocantins; (b) uma inversão pericêntrica no ancestral comum de P. fusca, Pseudis sp. e P. tocantins que mudou a posição do cluster do DNA satélite PcP190 do braço curto para o braço longo do cromossomo 7/W e (c) uma inversão paracêntrica no cromossomo W em P. tocantins que levou a NOR à região pericentromérica e o sítio do DNA satélite PcP190 para uma região intersticial do cromossomo W.  A amplificação de heterocromatina, e consequentemente do DNA satélite PcP190, no cromossomo W de P. tocantins pode ter ocorrido após o evento de inversão paracêntrica nesse cromossomo. Tal evento teria aumentado a região não recombinante entre os cromossomos Z e W, favorecendo a amplificação/invasão de diversas de DNA repetitivo. Mesmo com diferenças relacionadas a morfologia, tamanho cromossômico, posição das NORs e acúmulo do DNA satélite PcP190 entre os cromossomos Z e W de P. tocantins, ainda faltavam informações quanto ao conteúdo gênico e à presença de outros DNAs repetitivos nos cromossomos sexuais de P. tocantins. Dessa forma, por meio do sequenciamento de cromossomos Z e W isolados por microdissecção e do sequenciamento do genoma de uma fêmea e um macho de P. tocantins foi possível concluir que:

 A partir das montagens dos cromossomos Z e W foi possível inferir que os cromossomos sexuais de P. tocantins têm segmentos homeólogos aos cromossomos 4 e 10 de Xenopus tropicalis, bem como aos cromossomos 5/8/11/12 e 18/27 de Gallus gallus, os quais também são homeólogos dos cromossomos 4 e 10 de X. tropicalis.  A partir da montagem do cromossomo W foi possível identificar contigs/scaffolds similares a dois genes ligados ao processo de diferenciação sexual em outros vertebrados, porém esses não parecem ser os genes de determinação sexual em P. tocantins devido à grande similaridade dessas sequências obtidas tanto de machos quanto de fêmeas.  A montagem do cromossomo W apresentou maior composição de elementos transponíveis que a montagem do cromossomo Z, embora a maioria dos repeats identificados tenham sido de sequências ainda não classificadas. Além disso, a partir de reads do DNA genômico de macho e fêmea, um número expressivamente maior de repeats foi encontrado dentre as reads de fêmea. Dessa forma, foi possível inferir um grande acúmulo de elementos transponíveis no cromossomo W de P. tocantins.

VII. Referências

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118

New Zealand frog Leiopelma hochstetteri. Evolution (N. Y). 46, 1891–1899.

119

VIII. Anexo I

Distribuição do número de marcadores mapeados em janelas de 5 Mb dos cromossomos de Xenopus tropicalis (A) e Gallus gallus (B).

120

IX. Anexo II

Densidade de marcadores em janelas de 5 Mb, obtidos das montagens dos cromossomos W (3851_W) e Z (3851_Z) ao longo dos cromossomos de Xenopus tropicalis (Xto), mostrados por meio de heatmaps. Escala indica o número de marcadores a cada janela de 5 Mb.

121

X. Anexo III: The mitochondrial genome of the endemic Brazilian paradoxical frog Pseudis tocantins (Hylidae)7 Kaleb Pretto Gattoa, Jeramiah J. Smithb, Luciana Bolsoni Lourençoa a Laboratory of Chromosomes Studies, Department of Structural and Functional Biology,

Institute of Biology, University of Campinas, Campinas, Brazil. bDepartment of Biology, College of Arts and Sciences, University of Kentucky, Lexington,

USA.

7 Aceito para publicação na revista Mitochondrial DNA Part B.

122

The mitochondrial genome of the endemic Brazilian paradoxical frog Pseudis tocantins (Hylidae)

Abstract

In this work we present for the first time the mitochondrial genome of a paradoxical frog

(Pseudis tocantins). This genome is 15.56 kb, excluding the control region, and is similar in gene content to other hylid mitogenomes. Maximum likelihood analysis, using the mitogenomes of several anurans, recovered P. tocantins as closely related to other hylid species.

Keywords: mitochondrion, mtDNA, Anura, next-generation sequencing, paradoxical frog.

The paradoxical frog Pseudis tocantins Caramaschi and Cruz 1998 is endemic to

Brazilian savannas associated with Araguaia and Tocantins river basins (Frost, 2018).

Interesting features of the paradoxical frogs are related to 1) their extended larval period that results in tadpoles attaining body sizes that are substantially larger than metamorphosed adults (Shaw, 1802; Garda et al. 2010; Santana et al. 2016), and 2) the study of sex chromosome differentiation, as P. tocantins has highly heteromorphic sex chromosomes (Busin et al. 2008; Gatto et al. 2016). Here we describe the complete mitochondrial genome of P. tocantins.

Total genomic DNA was isolated from liver of a female P. tocantins collected from the type locality of this species (i.e., Porto Nacional, Tocantins state in Brazil - 10°44'38.6"S

48°26'09.2"W), using a standard phenol:chloroform extraction protocol (Sambrook et al., 1989). The remaining tissue is deposited in the tissue collection of the Laboratory of

Chromosome Studies of the University of Campinas, Brazil (LabEsC – UNICAMP), under the accession number SMRP 190.15, and the specimen voucher is deposited at the

123 amphibian collection of the Museu de Zoologia Professor Adão José Cardoso at the

University of Campinas, Brazil, under the accession number ZUEC 22351. Permission for collecting the specimen was granted by SISBIO (process 45183) and Committee for

Ethics in Animal Use of the University of Campinas (CEUA/UNICAMP) (process 3419-

1).

A paired-end genomic library was prepared using Nextera DNA Flex Library Prep Kit

(Illumina, EUA) and sequenced on an Illumina HiSeq X Ten (Hudson-Alpha Institute for

Biotechnology, Alabama, USA). We detected k-mers (k = 31) occurring at high frequencies among genomic reads using RepARK script (Koch et al. 2014) and default parameters. These high-frequency k-mers were then assembled using Velvet (Zerbino and

Birney 2008) using default parameters. Genome annotation was performed by MITOS

(Bernt et al. 2013). The mitochondrial genome contig was compared with available hylid mitochondrial genomes using BLAST (Altschul et al. 1990). The complete mitochondrial genome of P. tocantins, excluding control region, was used in a phylogenetic analysis in comparison to other 13 anurans species. Sequences were aligned using Muscle (Edgar

2004) and used for a Maximum likelihood analysis in RAxML v. 0.4.1b (Stamakis 2014), under the GTR+G evolutionary model.

The assembled mitogenome of P. tocantins (GenBank accession number MH571152) spanned 15.56 kb, with a GC content of 43.16%. This genome is similar to those of other hylids in size, gene content and arrangement, with an average nucleotide similarity of

70% when compared to six species from Hyla + Dryophytes. There are 13 protein coding genes, 22 tRNA genes and two rRNA genes. These genes are coded in the heavy strand, except for eight tRNA genes (tRNA-Pro, tRNA-Gln, tRNA-Ala, tRNA-Asn, tRNA-Cys, tRNA-Tyr, tRNA-Ser, tRNA-Glu) and one protein coding gene (ND6).

124

The resulting phylogenetic tree placed P. tocantins as the sister taxon of hylid species analyzed in this paper (Figure 1). This result agrees with the large scale phylogenetic inferences published thus far as they place Pseudis as member of the Hylidae family

(Faivovich et al. 2005; Wiens et al. 2010; Pyron and Wiens 2011; Duellman et al. 2016).

Funding This work was supported by São Paulo Research Foundation (FAPESP) (#2014/23542-

6). PhD studentships were provided by National Council for Scientific and Technological

Development (CNPq) (140814/2015-9) and Coordination for the Improvement of Higher

Education Personnel (CAPES) (PDSE 99999.006901/2015-08).

Disclosure Statement No potential conflict of interest was reported by authors.

Biographical note

Kaleb Pretto Gatto is a PhD student in the Graduate Program in Cellular and Structural

Biology in the Institute of Biology at the University of Campinas. His research is focused on chromosome evolution, mainly sex chromosomes evolution, of neotropical anurans.

Jeramiah J. Smith is an Associate Professor in the Department of Biology at the

University of Kentucky. His research is focused on vertebrate genome and epigenetic reprograming, including programmed genome rearrangement.

Luciana Bolsoni Lourenço is a Professor in the Department of Structural and Functional

Biology at the University of Campinas. Her research is focused on chromosome evolution, molecular phylogenetics and speciation of neotropical anurans.

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Figure 1. Phylogenetic inference obtained using maximum likelihood based on mitochondrial genomes, excluding control region, of the anuran species Dryophytes japonicus, D. ussuriensis (as Hyla ussuriensis in Sun et al. 2017), D. suweonensis (as H. suweonensis in Lee et al. 2017), Hyla chinensis, H. annectans, H. tsinlingensis, Pseudis tocantins, Bufo gargarizans, B. tibetanus (as in Wang et al. 2013), B. stejnegeri, B. japonicus, Telmatobufo australis, Microhyla okinavensis and Lithobates catesbeianus.

M. okinavensis and L. catesbeianus were used as outgroups. The phylogenetic inference was constructed under GTR+G evolutionary model. Bootstrap analysis was performed using 1000 pseudoreplicates for node support (numbers at the nodes).

128

XI. Anexo IV: Aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA)

129

XII. Anexo V: Declaração sobre direitos autorais