Universidade Estadual De Campinas Instituto De Biologia
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA KALEB PRETTO GATTO “COMPARATIVE MOLECULAR CYTOGENETICS OF GENUS Pseudis (ANURA, HYLIDAE) AND GENOMIC ANALYSIS OF THE SEX CHROMOSOMES OF Pseudis tocantins” “CITOGENÉTICA MOLECULAR COMPARATIVA DO GÊNERO Pseudis (ANURA, HYLIDAE) E ANÁLISE GENÔMICA DOS CROMOSSOMOS SEXUAIS DE Pseudis tocantins” Campinas 2018 KALEB PRETTO GATTO “COMPARATIVE MOLECULAR CYTOGENETICS OF GENUS Pseudis (ANURA, HYLIDAE) AND GENOMIC ANALYSIS OF THE SEX CHROMOSOMES OF Psesudis tocantins” “CITOGENÉTICA MOLECULAR COMPARATIVA DO GÊNERO Pseudis (ANURA, HYLIDAE) E ANÁLISE GENÔMICA DOS CROMOSSOMOS SEXUAIS DE Pseudis tocantins” Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Cell and Structural Biology, in the area of Cell Biology. Tese de doutorado apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas para a obtenção do título de Doutor em Biologia Celular e Estrutural, na área de Biologia Celular. Este arquivo digital corresponde à versão final da tese defendida pelo aluno Kaleb Pretto Gatto e orientada pela professora Dra. Luciana Bolsoni Lourenço Morandini. Orientadora: Profa. Dra. Luciana Bolsoni Lourenço Morandini Campinas 2018 3 4 BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Luciana Bolsoni Lourenço (Orientadora) Prof. Dr. Fausto Foresti Profa. Dra. Karen Ventura Profa. Dra. Cinthia Aguirre Brasileiro Profa. Dra. Mariana Lucio Lyra Os membros da Comissão Organizadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno. 5 Dedico esse trabalho a todos os mestres que, de alguma forma, me fizeram ter a paixão pela ciência e a vontade de desvendar o desconhecido na natureza. 6 Agradecimentos Agradeço a minha orientadora, professora Dra. Luciana Bolsoni Lourenço, por ter aceitado a orientação do doutorado e encarado a empreitada de desvendar um pouco mais a evolução dos cromossomos sexuais em Pseudis. Pelos incentivos prestados, pelo conhecimento passado, não só teórico em relação à pesquisa, mas também quanto a ciência em geral e a postura ética que um pesquisador deve ter. Agradeço também à professora Dra. Carmen Sílvia Busin, não só pela doação de material para a realização desse trabalho, mas principalmente por ser uma das principais responsáveis por eu estar onde estou hoje, seja com o ensino de biologia celular em sala de aula, seja como minha orientadora na iniciação científica ou como grande amiga que sempre foi. Um muito obrigado aos professores do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional pelos ensinamentos passados durante todos esses anos no Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural. Especialmente ao professor Dr. Edson Rosa Pimentel e à professora Dra. Shirlei Maria Recco-Pimentel. A special thanks to Professor Dr. Jeramiah J. Smith for accepting me in his lab for my abroad internship to perform the genomic analysis presented in this work. Dr. Smith helped a lot and provided everything that was necessary to improve the knowledge about the sex chromosomes in P. tocantins. Agradeço às professoras Dras. Ana Cristina Prado Veiga-Menoncello, Eliana Forni Martins e Maria Luiza Silveira Mello pela leitura do meu trabalho de tese e contribuições durante o exame de qualificação de doutorado. Agradeço aos professores Drs. Fausto Foresti, Karen Ventura, Cynthia Aguirre Brasileiro e Mariana Lúcio Lyra por terem aceitado fazerem parte da banca de avaliação do meu doutorado e pelas contribuições dadas ao texto da tese. Agradeço aos colegas de laboratório Karin, Ariane, Renata Tenório, Renata Alitto, Marcos, Jessika, Isabella, Stephanne, Gabriela e Letícia, que aguentaram o meu mau humor matinal, meu jeito “delicado” de ser, pelas ótimas discussões científicas e político- filosóficas e por todos os momentos em que pudemos dar umas boas risadas. Em especial, agradeço à Alessandra Ferreira da Costa por todo o auxílio dispensado durante o meu período no Laboratório de Estudos Cromossômicos, ao William, pela ajuda nas expedições de coleta e à Karin pela ajuda na realização da técnica de CGH nesse trabalho. Um agradecimento especial à “agregada” do nosso laboratório. Essa louca que me faz rir demais, que fez parte de momentos muito alegres da minha vida, que realizou comigo uma das melhores viagens que já fiz. Sim, você Denise, você foi importante demais nessa minha caminhada acadêmica. Um agradecimento e confissão de saudades aos meus ex-colegas de laboratório e do curso de pós-graduação, que tanto se fizeram presentes durante toda essa caminhada. Em especial ao professor Dr. Daniel Pacheco Bruschi pela grande amizade e contribuições na minha vida acadêmica. À Dra. Cíntia Pelegrineti Targueta de Azevedo Brito pela amizade, pelas boas discussões que tivemos e por toda a ajuda dispensada. À Dra. Juliana Nascimento, por toda a amizade que tivemos e ajuda mútua durante a nossa caminhada. 7 E ao professor Dr. Stenio Eder Vittorazzi por toda a ajuda já dispensada, pela amizade e bons momentos de descontração juntos. Agradeço às professoras Dras. Daniela de Melo e Silva e Mariana Pires de Campos Telles pela disponibilização de estrutura física em seus laboratórios na Universidade Federal de Goiás para a obtenção de preparações cromossômicas de Pseudis tocantins. Agradeço aos funcionários da secretaria da pós-graduação do Instituto de Biologia, em especial à secretaria do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural Líliam Alves Senne Panágio por toda a atenção dispensada durante o meu doutorado. I thank to Melissa Keinath, Cody Saraceno, Brad Osborne, Mackenzie Sanson, Zach Fontnebary, Vladimir Timoshevsky and Nataliya Timoshesvkaya, my labmates in the University of Kentucky during my period abroad. For all the help dispensed to me and for the reception in the lab. A special thanks to Ms. Eileen Zaah for all the help with the bureaucratic procedures that made me a student of the University of Kentucky. To my friends Andrea and Vitor that I made in USA. You were very important in my life when I was in Lexington. Without you guys it would be really difficult. Because of you I had my best moments in USA. Agradeço aos meus familiares, principalmente meus pais Neuromar e Rosmari, por todo o amor, carinho e incentivos durante toda a minha caminhada nesse mundo. Ao meu amigo que foi o grande responsável por eu saber falar um pouco de inglês hoje em dia e por todos os momentos de amizade sincera. Sim Pedro, sem você teria sido bem mais difícil. Juntamente com o Pedro, um agradecimento ao meu melhor amiguinho Costelinha (in memoriam), que foi a criatura responsável por me fazer muito feliz e me arrancar os sorrisos mais sinceros que já dei na vida. Agradeço aos meus amiguines por todos os momentos que tivemos juntos, sem vocês (Nata, Pega, Cass, Funny, Baiano, Jones, Carol e Joji,) a “bombação” não é a mesma. Agradeço a esse povo que me aguenta até no final de semana e que mora comigo, Guilherme, Paula e Carol. Por momentos divertidos ao som de “Meia Lua” ou uma polka russa qualquer, bem como por todas as “gordices” compartilhadas. Agradeço aos professores Dr. Diego José Santana, Dr. Raul Maneyro e Dr. Mauro Teixeira Jr. por gentilmente terem autorizado o uso de fotos de espécies de Pseudis que estão presentes na introdução desse trabalho. Agradeço às pessoas que me auxiliaram em expedições de coletas realizadas durante o meu doutorado: Guilherme Bouvé, Matheus Neves e Lucas Mariotto. Por último, mas não menos importante, agradeço às agências de fomento que, por meio dos impostos pagos pelo contribuinte brasileiro, possibilitaram a realização desse trabalho. À FAPESP (#2014/23542-6) pelo financiamento ao projeto, ao CNPq (#140814/2015-9) pela concessão da bolsa de estudos no Brasil e à CAPES (PDSE 99999.006901/2015-08) pela concessão da bolsa de estudos do programa PDSE que possibilitou o meu estágio no exterior. 8 I. Resumo Diversos trabalhos, principalmente com mamíferos e aves, têm acrescentado muitas informações sobre a evolução de cromossomos sexuais. Porém, poucos são os trabalhos com cromossomos sexuais de anfíbios, um grupo que apresenta espécies com diferentes níveis de heteromorfismo sexual cromossômico. Pseudis tocantins, espécie de anuro com heterogametia feminina (ZZ/ZW), possui cromossomos sexuais altamente heteromórficos, sendo o cromossomo W submetacêntrico e maior que o cromossomo Z metacêntrico. A diferença de tamanho e morfologia entre esses cromossomos é dada pela amplificação da heterocromatina intersticial em Wq, a qual apresenta grande acúmulo do DNA satélite PcP190. Os cromossomos sexuais de P. tocantins também diferem na posição das NORs, sendo esta intersticial em Zq e pericentromérica em Wq. Com base na morfologia cromossômica e localização das NORs, os cromossomos do par 7 nas outras espécies de Pseudis (par 5 em Pseudis cardosoi) são inferidos como homeólogos aos cromossomos sexuais de P. tocantins. Porém, não há evidências adicionais que corroborem essa hipótese de homeologia. Também não há qualquer informação sobre o sistema de determinação de sexo das outras espécies de Pseudis. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi analisar a diferenciação dos cromossomos sexuais em Pseudis, investigando sobre a ocorrência do DNA satélite PcP190 e de heteromorfismo sexual cromossômico em Pseudis bolbodactyla, P. cardosoi, P. fusca, P. minuta, P. paradoxa e em Pseudis sp. (aff. fusca) levando em conta as relações filogenéticas inferidas para esse grupo. Adicionalmente, a composição molecular dos cromossomos sexuais de P. tocantins foi investigada com base no sequenciamento de nova geração de cromossomos Z e W microdissecados bem como do genoma de macho e de fêmea dessa espécie. O DNA satélite PcP190 foi mapeado nos cromossomos portadores das NORs em P. bolbodactyla, P. cardosoi, P. fusca, P. minuta, P. paradoxa e em Pseudis sp., corroborando a hipótese de homeologia desses cromossomos para com os cromossomos sexuais de P. tocantins. Em P. bolbodactyla e Pseudis sp. o DNA satélite PcP190 mostrou sinais de hibridação somente em fêmeas. Experimentos de hibridação genômica comparativa confirmaram os cromossomos portadores das NORs e dos sítios PcP190 como sendo os cromossomos sexuais em P.