Stephanie Kuras

Identifizierung der antimykobakteriellen Substanzen in den Wurzeln von Echinops kebericho

Diplomarbeit zur Erlangung des akademischen Grades einer Magistra der Pharmazie an der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Karl- Franzens- Universität Graz

Betreuung: Ao. Univ.-Prof. Mag. Dr. rer. nat. Franz Bucar Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, Bereich Pharmakognosie

Graz, Mai 2014 Danksagung

Zuerst möchte ich Herrn Ao. Univ.-Prof. Mag. Dr. rer. nat. Franz Bucar danken, der es mir ermöglichte in dem Bereich der Pharmakognosie zu arbeiten, für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes sowie für die stets nette und kompetente Betreuung.

Besonders danke ich Frau Ing. Elvira Knauder, die mir jederzeit mit Ratschlägen und Hilfestellungen zur Seite stand, welche mir das Laborleben um einiges erleichterten.

Dank gebührt auch Herrn Dr. rer. nat. Abraham Wube für die Bereitstellung des Pflanzenmaterials und Herrn Dr. Olaf Kunert für die Durchführung der NMR- Messungen.

Ein großes Dankeschön geht auch an Frau Mag. Sandra Prasch für die Einführung ins antimykobakterielle Arbeiten und die freundliche Hilfsbereitschaft, die sie mir ständig entgegenbrachte.

Bedanken möchte ich mich natürlich auch bei meiner Familie und meinen Freunden für die moralische Unterstützung, die Motivation und den Zuspruch. Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Problemstellung ...... 1 2 Theoretische Grundlagen ...... 2 2.1 Tuberkulose ...... 2 2.1.1 Epidemiologie ...... 2 2.1.2 Übertragbarkeit ...... 4 2.1.3 Pathogenese ...... 5 2.1.4 Immunologie und Resistenzentwicklung ...... 6 2.1.4.1 Multi Drug Resistance bei TB ...... 7 2.1.5 Diagnostik ...... 8 2.1.6 Therapie ...... 9 2.1.6.1 Therapieschema ...... 10 2.1.7 Prävention ...... 11 2.2 Mykobakterien ...... 12 2.2.1 Eigenschaften ...... 12 2.2.2 Mycobacterium tuberculosis- Komplex ...... 13 2.2.3 Mycobacterium smegmatis ...... 14 2.3 Echinops kebericho Mesfin ...... 14 2.3.1 Familie der Asteraceae/Compositae ...... 14 2.3.2 Echinops L. (Kugeldisteln) ...... 16 2.3.2.1 Inhaltsstoffe ...... 17 2.3.2.2 Pharmakologische Wirkung ...... 18 2.3.2.3 Antimikrobielle Wirkung ...... 19 2.3.2.3.1 Antimykobakterielle Wirkung ...... 19 2.3.3 Echinopsis keberichi radix ...... 20 2.3.3.1 Verbreitung ...... 20 2.3.3.2 Taxonomie ...... 21 2.3.3.3 Traditionelle Verwendung ...... 22 2.3.3.4 Inhaltsstoffe ...... 22 2.3.3.5 Wirkung ...... 23 3 Materialien und Methoden ...... 23 3.1 Pflanzenmaterial ...... 23

I 3.2 Extraktion des Pflanzenmaterials ...... 24 3.3 Dünnschichtchromatographie (DC) ...... 24 3.3.1 Analytische Dünnschichtchromatographie ...... 24 3.3.2 Präparative Dünnschichtchromatographie ...... 25 3.4 Säulenchromatographie (SC) ...... 26 3.5 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ...... 28 3.5.1 Analytische Hochleistungsflüssigchromatographie ...... 28 3.5.2 Präparative Hochleistungsflüssigchromatographie ...... 30 3.6 Massenspektrometrie (MS) ...... 31 3.6.1 GC- MS- Analyse ...... 32 3.6.2 LC- MS- Analyse ...... 33 3.7 Kernresonanzspektroskopie (NMR) ...... 35 3.8 Antimykobakerielle Testung ...... 36 3.8.1 Minimum Inhibitory Concentration- Assay (MIC- Assay) ...... 36 3.8.1.1 Durchführung des MIC-Assays ...... 36 3.8.1.2 Auswertung des MIC- Assays ...... 40 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen ...... 41 4.1 Extraktion von Echinops kebericho ...... 41 4.2 Aufarbeitung des Hexan-Extraktes ...... 41 4.2.1 Antimykobakterielle Testung des Hexan- Extraktes ...... 41 4.2.2 Grobfraktionierung mittels Säulenchromatographie ...... 41 4.2.3 Antimykobakterieller Testung der Sammelfraktionen ...... 43 4.2.3.1 Testergebnisse ...... 43 4.3 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen ...... 44 4.3.1 Fraktionierung mittels Säulenchromatographie ...... 44 4.3.1.1 EK_SF8 und EK_SF9 ...... 44 4.3.1.2 EK_SF8_SF3 ...... 47 4.3.1.3 EK_SF4 ...... 47 4.3.2 Antimykobakterielle Testung ...... 49 4.3.2.1 Testergebnisse ...... 49 4.4 Isolierung der Reinsubstanzen aus den Fraktionen ...... 50 4.4.1 Präparative HPLC ...... 50 4.4.1.1 EK_SF4_F10 ...... 51 4.4.1.2 EK_SF8_SF3 (F15- 22) ...... 52

II 4.4.2 Präparative Dünnschichtchromatographie ...... 53 4.4.2.1 EK_SF8_SF4 ...... 53 4.4.3 Übersicht- Aufarbeitung des Hexan- Extraktes ...... 55 4.5 Strukturaufklärung ...... 56 4.5.1 NMR ...... 56 4.5.1.1 EK_SF4_F10 ...... 56 4.5.1.2 EK_SF8_SF3_F15- 22- P1 ...... 59 4.5.2 GC-MS und LC-MS- Analysen ...... 59 4.5.2.1 EK_SF4_F10 ...... 59 4.5.2.2 EK_SF8_SF3_F15- 22- P1 ...... 62 4.5.2.3 EK_SF8_SF4_B1 ...... 64 5 Diskussion ...... 68 6 Zusammenfassung ...... 72 7 Literaturverzeichnis ...... 75 8 Anhang ...... 82 8.1 Herstellung der benötigten Reagenzien ...... 82 9 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ...... 84

III Kurzfassung

Noch immer ist Tuberkulose nach HIV/Aids, die Infektionskrankheit, die weltweit am meisten Menschenleben fordert. Allein im Jahr 2011 starben 1,4 Millionen Menschen an den Folgen der Erkrankung. Neben der schlechten Behandlung in den weniger entwickelten Ländern, gilt es die sich immer mehr verbreitende Resistenzentwicklung gegen die herkömmlichen Antituberkulotika in den Griff zu bekommen. Somit wird die Entdeckung von neuen antimykobakteriellen Stoffen angestrebt.

Das Ziel dieser Diplomarbeit war die Untersuchung des antimykobakteriellen Effekts der Substanzen in der äthiopischen Pflanze Echinops kebericho. Hierfür wurden die getrockneten Wurzeln verwendet, diese extrahiert und über Säulen- und Dünnschichtchromatographie getrennt. Mit den erhaltenen isolierten Fraktionen wurde ein Bioassay zur Ermittlung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) durchgeführt, wobei M. smegmatis mc2 155 als Testbakterium herangezogen wurde. In weiteren Schritten wurden die Fraktionen mit Hilfe von GC- MS, LC- MS und NMR- Analysen vermessen, um deren Strukturformeln zu ermitteln.

Dabei erwies sich der Hexanextrakt und einzelne aufgearbeiteten Fraktionen als antimykobakteriell wirksam und für weitere Untersuchungen interessant. Es konnten insgesamt drei Substanzen isoliert werden. Unter den Inhaltsstoffen befand sich ein Thiophen, welches nach vorliegenden massenspektrometrischen Daten mit 2-(Penta-1,3-diynyl)-5-(4-hydroxybut-1- ynyl)-thiophen ident sein könnte. Eine Absicherung der Struktur erfordert allerdings noch die Isolierung größerer Mengen und NMR- spektroskopische Untersuchungen. Außerdem konnten zwei weitere Stoffe aus der Klasse der Sesquiterpenlactone identifiziert werden, Dehydrocostuslacton und Costunolid, welche schon zuvor in E. kebericho gefunden wurden und vielversprechend für weitere Studien hinsichtlich deren Wirkung gegen Mykobakterien sind.

IV Abstract

Among infectious diseases, tuberculosis is still ranked second as cause of death worldwide. In 2011 about 1.4 million people died from the consequences of the illness. Besides the insufficient treatment in the poorer countries of the world, it is necessary to handle the growing multi- drug resistance to the commonly used antitubercular treatment. The discovery of new antimycobacterial agents is intended to solve this problem in the future.

The aim of this work was to investigate the antimycobacterial effect of the substances in the Ethiopian plant Echinops kebericho. Therefore, the dried roots were used to extract and separate the contents by TLC and column chromatography. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined with the received fractions, using the bacterial strain M. smegmatis mc2 155. After that the substances have been emerged by GC- MS, LC- MS and NMR to identify the structural formula.

Hence the hexan extract and single fractions showed antimycobacterial activity, they were of interest for further investigation. Three compounds have been found. Based on the received data one of them was a thiophene, which probably could be 2-(Penta-1,3-diynyl)-5-(4-hydroxybut-1- ynyl)-thiophene. It has not been reported as a constituent in E. kebericho before and needs a more detailed investigation. However, dehydrocostuslactone and costunolide, two sesquiterpene lactones, have already been isolated from the plant and were also detected in this study. The results suggest that E. kebericho could probably be of interest concerning new antitubercular agents, but further investigations are necessary for clarification.

V 1 Einleitung und Problemstellung

1 Einleitung und Problemstellung

Als Robert Koch 1882 das Mycobacterium tuberculosis als Erreger der Tuberkulose identifizierte, war dies der Beginn einer langen Reihe von naturwissenschaftlichen Studien vieler klinischer Disziplinen. Somit avancierte die TB zu einer der am meisten untersuchten Erkrankungen überhaupt (Kayser et al., 1998).

Fortschritte in der Wissenschaft und der modernen Medizin ließen die Sterberate in den 60er, 70er und 80er Jahren des 20.Jahrhunderts deutlich zurückgehen. In diesen Jahrzehnten glaubte man die Tuberkulose im Griff zu haben und hielt ein weiteres epidemisches Ausbrechen der Krankheit für unwahrscheinlich. Jedoch bemerkte man schnell die Fähigkeit des Mykobakteriums zur Mutation und die daraus resultierende Resistenzentwicklung gegenüber bisherigen hemmenden Wirkstoffen. Das Ergebnis war ein Wiederauftreten der bezwungen geglaubten TB und eine bis heute andauernde Gesundheitsbedrohung, die vor allem die weniger entwickelten Länder betrifft (Yancey, 2001).

Zuverlässige Therapeutika wie Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid oder Ethambutol verlieren aufgrund dieser Anpassungsfähigkeit der Tuberkelbakterien zunehmend an Wirksamkeit (Zumla et al., 2013). Der Bedarf an neuen antimykobakteriell aktiven Substanzen mit alternativen Wirkmechanismen ist so dringend, wie seit Jahren nicht mehr (Dhiman et al., 2013).

Hinsichtlich dieser weltweit bedrohlichen Entwicklung wurde in dieser Arbeit der Fokus auf die antimykobakterielle Aktivität des Echinops kebericho gelegt, in der Hoffnung neue, wirksame Verbindungen zu isolieren und deren Struktur aufzuklären. Ergebnisse aus vorangegangenen Studien wurden aufgegriffen und hier anhand des Pflanzenextraktes eingehender untersucht. Es wurde mit Mycobacterium smegmatis, einem nicht pathogenen Erregerstamm, gearbeitet, der als geeignet für den Vortest zur Ermittlung der minimalen Hemmkonzentration gegen TB- Bakterien gilt (Agertt et al., 2013).

1 2 Theoretische Grundlagen

2 Theoretische Grundlagen

2.1 Tuberkulose

„Die Tuberkulose ist eine in typischen Fällen chronisch verlaufende, durch Tuberkelbakterien hervorgerufene, mit spezifischen Entzündungsvorgängen einhergehende Infektionskrankheit, an der alle Säugetiere und Vögel sowie der Mensch erkranken können.“ (Rolle, 1993, S. 776- 777)

Die früher auch als Schwindsucht bezeichnete Erkrankung (Eckart, 2011) befällt primär Lunge und Atemwege, doch auch extrapulmonale Beeinträchtigungen sind im Verlauf möglich. Auslöser sind alle Erreger, die dem Mycobacterium tuberculosis- Komplex angehören (Kayser et al., 1998). Im folgenden Kapitel wird auf die Tuberkulose und deren Erreger genauer eingegangen.

2.1.1 Epidemiologie

Tuberkulose (kurz TB) ist gleich nach HIV/Aids, die Infektionskrankheit, die am meisten Menschenleben fordert. Allein 2011 gab es 8,7 Millionen Neuinfektionen und 1,4 Millionen Todesfälle. Dabei lässt sich die Verbreitung nicht auf ein spezielles Gebiet der Erde beschränken. Zweifellos ist die Zahl der Tuberkulosekranken in den Entwicklungsländern am größten, da dort die notwendigen Medikamente für die Menschen kaum erschwinglich sind. Bis zu 95% der Todesfälle treten in Ländern mit geringen Einkommen auf. Besonders unter den HIV positiven Personen ist die Infektion mit Tuberkulose gefährlich und führt in einem Viertel der Fälle zum Tod. Trotzdem kann man in den letzten Jahrzehnten einen leichten Rückgang der Neuerkrankungen erkennen, so zum Beispiel sank die Anzahl der Verstorbenen in den Jahren 1990 bis 2001 um 41% (WHO, 2013). Voraussichtlich wird somit das gesetzte Ziel, das Millenium Development Goal (MDG), zum Erhalt und Rückgang der TB- Epidemie 2015 wohl erreicht werden. Die Möglichkeit einer TB- Behandlung hat aufgrund neu ausgearbeiteter Strategien der World Health Organisation (WHO) in vielen Regionen wesentlich zugenommen. Aufgrund dessen konnten zwischen 1995 und 2011 51 Millionen Menschen erfolgreich behandelt und 20 Millionen das Leben gerettet werden (WHO, 2012b). Wie in Abbildung 2.1 ersichtlich, sind speziell Afrika und Asien die Kontinente mit den meisten

2 2 Theoretische Grundlagen

TB-Infektionen. Im Jahr 2011 waren die fünf Länder mit den höchsten Krankheitsfällen Indien mit 2,0- 2,5 Millionen Betroffenen, China (0,9- 1,1 Mio), Südafrika (0,4- 0,6 Mio), Indonesien (0,4- 0,5 Mio) und schließlich Pakistan (0,3- 0,5 Mio) (WHO, 2012a).

Abb. 2.1: Geschätzte Tuberkulose- Inzidenzrate für das Jahr 2011 (WHO, 2012a)

HIV/Aids und Tuberkulose Das Risiko sich mit Tuberkulose anzustecken, ist um 20- 37 mal höher, wenn man bereits eine HIV- Infektion hat. Unter den 8,8 Millionen Tuberkuloseerkrankten waren im Jahr 2011 1,1 Millionen HIV positiv. Das macht ein Drittel aller HIV- Positiven weltweit, von denen laut Statistik jeder vierte an den Folgen stirbt. Am meisten mit diesem Problem hat Afrika zu kämpfen, denn allein südlich der Sahara sind 79% der HIV/TB- Fälle zu verzeichnen (WHO, 2012c).

3 2 Theoretische Grundlagen

Abb. 2.2: TB-Patienten mit HIV-Infektion für das Jahr 2011 (WHO, 2012a)

TB in Österreich Tuberkulose ist in Österreich seit 1968 meldepflichtig. Anzuzeigen sind binnen 3 Tagen jede Erkrankung und jeder Todesfall, die durch Mycobacterium tuberculosis hervorgerufen wurden und ärztliche Behandlung und Kontrolle benötigen (Meldepflicht nach dem Tuberkulosegesetz, BGBl.Nr. 127/1968 idgF). Österreich ist was die TB betrifft ein Niedriginzidenzland, das heißt weniger als 10 Personen von 100 000 infizieren sich neu an der Erkrankung. Dieser schon über Jahrzehnte zu beobachtende Rückgang lässt sich durch die Möglichkeit einer guten medizinischen Versorgung, die gesetzliche Meldepflicht und den sozioökonomischen Status des Landes erklären (vgl. BMG Bundesministerium für Gesundheit, 2011).

2.1.2 Übertragbarkeit

Wie schon erwähnt wird die TB von bestimmten Mykobakterien (siehe Kapitel 2.2) übertragen, die sich zuerst in der Lunge ansiedeln, von dort aus aber im Stande sind nahezu alle Organe zu befallen. Nach einer Infektion können sich die Erreger im Körper ausbreiten, aber inaktiv bleiben und somit kann die Krankheit oft jahrelang symptomlos verlaufen. In diesem Stadium, man spricht von latenter TB, ist eine Ansteckung nicht möglich, da der Keim nicht weitergegeben werden kann, während bei der aktiven Form neben den Krankheitsbeschwerden auch

4 2 Theoretische Grundlagen

Infektionsgefahr auftritt (Wouk, 2010). Übertragen wird M. tuberculosis über Tröpfchen und das ausschließlich von Mensch zu Mensch, d.h. nur wenn der Mensch als Zwischenwirt dient, kann es auch auf Tiere übergehen. Wenn die Bakterien mit dem Sputum von weniger als 10 μm in den Alveolarbereich eindringen, kommt es zur Ausbreitung und Entzündung des pulmonalen Gewebes (Hahn et al., 2009). Bei Infektionen mit M. bovis, einer anderen Spezies von Tuberkulosebakterien, handelt es sich allerdings um eine Zoonose. Das heißt, eine wechselseitige Übertragbarkeit zwischen Mensch und Tier, in diesem Fall ausgehend vom Rind, ist möglich (Krauss et al., 2004).

2.1.3 Pathogenese

Ist das Bakterium erstmal in die Lunge gelangt, bildet sich eine Primärtuberkulose, die in 10% der Fälle in eine Sekundärtuberkulose (Syn. Postprimärtuberkulose oder Reaktivierungstuberkulose) übergeht. Deswegen muss zwischen diesen beiden Formen unterschieden werden (Kayser et al., 1998).

Primärtuberkulose Sofort nach dem Eindringen der Mykobakterien ins Lungenparenchym wandern Makrophagen ein und phagozytieren die TB, sind aber nicht in der Lage sie abzutöten (Primäraffekt) (Hahn et al., 2009). Werden bei dieser Reaktion infizierte Makrophagen entlang der Lymphgefäße in die lokalen Hiluslymphknoten verschleppt, spricht man vom Primärkomplex, der sich innerhalb von 6 Wochen bilden kann (Hien, 2012). Spezielle T- Zellen registrieren die Präsentation der Antigene der TB durch die Makrophagen. Dies führt zur Stimulation der T4- Lymphozyten und über TB- Antigene werden Zytokine freigesetzt, welche wiederum Monozyten anlocken. Aus denen bilden sich Gewebsmakrophagen mit der Aufgabe bestimmte körpereigene Hormone (Interferon- γ; Makrophagen aktivierender Faktor u.a.) anzuregen, welche schließlich in der Lage sind TB abzutöten. Am Ort der Absiedlungsstelle kommt es im Gewebe zur Granulombildung („Tuberkel“). Lokale Entzündungsherde in den Lungenspitzen fibrosieren, vernarben und verkalken schließlich. Bei etwa 90% bleibt die Primärinfektion stumm und Bakterien können erfolgreich abgewehrt und eliminiert werden (Kayser et al., 1998). Eine Primärtuberkulose kann jedoch auch fortschreiten, wenn der befallene Organismus nicht in

5 2 Theoretische Grundlagen der Lage ist die Erreger effektiv abzuwehren. Durch ungehinderte Ausbreitung der Bakterien kann es zu Komplikationen wie Bronchuskompressionen, Lymphknotendurchbruch und zur tuberkulösen Bronchitis kommen (Battegay, 2013).

Sekundärtuberkulose Unter gewissen Umständen (siehe Kapitel 2.1.4) kann der Primärinfekt direkt in eine Sekundärtuberkulose übergehen. Bei etwa der Hälfte dieser Gruppe passiert dies sofort, die andere Hälfte erkrankt erst nach Jahren an der eigentlichen Tuberkulose (Hahn et al., 2009). Kommt es zu einer Reaktivierung, nekrotisieren Granulome (Knötchen) und sondern ein Exsudat ab, das zur käsigen Pneumonie führen kann. Oft geschieht es in den Simonschen Spitzenherden, also den apikalen Lungenabschnitten, da dort die Belüftung am besten ist (Hahn et al., 2009). Entstehen durch das Einschmelzen der Granulome im Zentrum Hohlräume, so spricht man von Kavernenbildung. In diesen Gewebestörungen können sich TB- Erreger optimal vermehren und in weitere Lungenbereiche streuen. Durch die Verbindung der Kavernen mit dem Bronchialsystem, ist eine aerogene Verbreitung der TB nicht zu verhindern (offene Lungentuberkulose) (Hahn et al., 2009). Haben sich erst einmal nekrotische Läsionen gebildet, fällt es dem Immunsystem schwer diese abzugrenzen und eine hämatogene und lymphogene Streuung in jedes andere Organ ist möglich (Kayser et al., 1998). Eine extrapulmonale Tuberkulose hat sich entwickelt unter denen vor allem die Gehirntuberkulose (Meningitis tuberculosa) tödlich enden kann (Rom et al., 2004).

2.1.4 Immunologie und Resistenzentwicklung

Das menschliche Immunsystem zeigt eine gute, genetisch determinierte Resistenz gegenüber M. tuberculosis- Bakterien (MtB). Nach Erstinfektion setzt die sogenannte spezifische Immunität ein, d.h. Tuberkelbakterien können sich nicht ausbreiten und verharren an einer Stelle, dem Infektionsherd. Dieses Phänomen nach Koch (Persistenz) ist allein den T-Lymphozyten zu verdanken. Es wird angenommen, dass jene Infektionsimmunität nur so lange besteht, bis die Mykobakterien und deren Antigene den Organismus nicht verlassen haben (Kayser et al., 1998). Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Mensch an Tuberkulose erkrankt, hängt von verschiedenen Faktoren ab. Unumstritten ist dabei die Stabilität des Immunsystems, die Expositionsdauer, die Virulenz der Erreger und die Infektionsdosis (Oethinger et al., 2004).

6 2 Theoretische Grundlagen

Jedoch haben Bakterien verschiedene Mechanismen ausgebildet, um der Immunantwort eines fremden Organismus zu entgehen und in ihm weiterbestehen zu können. Gerade die Klasse der Mykobakterien hat gute Strategien entwickelt, um das Überleben innerhalb eines fremden Wirtes zu sichern. Dafür verantwortlich ist zum einen der kennzeichnende Aufbau der Zellwand von M. tuberculosis (siehe Kapitel 2.2.1), der es sehr widerstandsfähig macht. Zum anderen ist es die Art, wie es sich im Organismus ansiedelt und vermehrt. Einmal in die Wirtszelle eingedrungen, hält es sich nur in zellulären Vesikeln auf (Vollmar et al., 2005). TB- Erreger werden nun von der körpereigenen Immunabwehr erkannt und lösen diese auch aus, doch verhindern sie das Verschmelzen des Phagosoms mit dem Lysosom zum sogenannten Phagolysosom. Dieses wäre, durch die bakteriziden Inhaltsstoffe des Lysosoms, in der Lage, Bakterien zu verdauen (Deretic et al., 2006; Vollmar et al., 2005). Aufgrund der Unterdrückung der Biogenese des Phagolysosoms werden nicht nur direkte Mechanismen in Makrophagen verhindert, sondern auch Antigen- Produktion und Präsentation. M. tuberculosis kann sich nun ungehindert in der Zelle vermehren („Makrophagen- Parasitismus“), was zur chronischen Infektion führt und durch ständige Stimulation der T- Zellen und Zytokinfreisetzung schließlich auch zur Ausbildung von Granulomen (Deretic et al., 2006; Vollmar et al., 2005).

2.1.4.1 Multi Drug Resistance bei TB

Von Multiple Drug Resistance (MDR) wird gesprochen, wenn weder Isoniazid noch Rifampicin bei der TB- Therapie anschlagen und es zu keiner Reaktion kommt. In diesem Fall muss auf die Mittel zweiter Wahl zurückgegriffen werden, welche kostspieliger sind, langsamer wirken und mehr Nebenwirkungen aufweisen. Allerdings können sich bei wiederholter Falschanwendung erneut Resistenzen entwickeln und schließlich zu der umfassenderen XDR-TB (engl. extensively drug- resistant tuberculosis) führen, welche weitaus schwieriger zu behandeln ist, da diese Form der TB unempfindlich gegenüber mindestens vier erprobter Wirkstoffe ist (WHO, 2012d). Laut WHO sind die primären Gründe für die Entstehung von MDR die falsche Einnahme der Medikamente und ein Misswirtschaften bei der Behandlung der Patienten. Diese sollten für eine erfolgreiche Therapie bei dem sechsmonatigen Arzneimittelplan unterstützt und beaufsichtigt werden. Werden die Medikamente nicht oder nur unregelmäßig eingenommen, kann es zu solchen Resistenzentwicklungen kommen (WHO, 2012b).

7 2 Theoretische Grundlagen

Im Jahr 2011 gab es weltweit 630.000 MDR- TB Fälle, wovon 9% der Betroffenen der weitgreifenden Form (XDR- TB) zum Opfer fielen (WHO, 2012d).

2.1.5 Diagnostik

Zum diagnostischen Nachweis einer Tuberkulose sind einige Methoden möglich, die zur Feststellung einer Infektion beitragen (Hahn et al., 2009): • Anamnese und medizinische Untersuchungen • Radiologische Diagnostik: Eine Primärinfektion wird hiermit aber nur in den seltensten Fällen erkannt (Lange et al., 2010). • Tuberkulintest/Hauttest Infektionen mit Mykobakterien lösen im Körper Überempfindlichkeitsreaktionen aus, die meist nach dem Zweitkontakt mit dem Antigen entstehen. Wegen des zugrunde liegenden Mechanismus wird M. tuberculosis zu den T- Zell- vermittelten Reaktionen gezählt (Typ IV). Zu dieser erst verzögert eintretenden Art gehört die Tuberkulin- Reaktion, die zur Diagnose einer latenten Infektion mit TB- Bakterien und anderen intrazellulären Bakterien oder Pilzen dient. Beim Test wird flüssiges Tuberkulin (= Mykobakerium- Filtrat) intradermal verabreicht. Kommt es innerhalb der nächsten 24- 72 Stunden zu einer Rötung der Haut, hatte der Patient 6- 8 Wochen zuvor Kontakt mit dem Erreger (Kayser et al., 1998; Hahn et al., 2009). Über antigenpräsentierende Zellen, hier vermutlich die Makrophagen, werden die TH1- Zellen aktiviert (Vollmar et al., 2005). An sich ist ein positives Ergebnis noch kein Tuberkulosenachweis und muss zusätzlich durch radiologische und diagnostische Untersuchungen bestätigt werden (Hahn et al., 2009). • Interferon- γ Test (Syn. Interferon- γ Release Assay, IGRA) Ein weiteres viel versprechendes Testverfahren ist der Nachweis auf Freisetzung von Interferon- γ, durch Stimulation der Produktion im Blut (Hahn et al., 2009). Das von T- Zellen produzierte, immunmodulierende Zytokin entsteht nach Freisetzung des Interleukins IL- 2 im Zuge einer Antigenexposition, dementsprechend auch bei einer TB- Infektion. Der Test ist im Vergleich zum Tuberkulin- Hauttest sensitiver und spricht spezifischer auf MtB- Antigene an (Mutschler et al., 2012; Davies et al., 2008). • Mikroskopische Untersuchungen von Kulturen zum Nachweis von M. tuberculosis (Ziehl- Neelsen- Färbung), molekulare Prüfung oder die kulturelle Anzucht. Letztere ist

8 2 Theoretische Grundlagen

am empfindlichsten und gilt noch immer als Goldstandard in der TB- Diagnostik (Kayser et al., 1998).

Laut einem epidemiologischen Bulletin des Robert- Koch- Institutes aus dem Jahr 2011 (Nr.34) werden neue molekulardiagnostische Untersuchungen nicht nur die Identifizierung von M. tuberculosis als Erreger vereinfachen. Sie ermöglichen auch parallel die Detektion einer Rifampicin- Resistenz (RMP) aus dem Direktmaterial. Dieses Verfahren basiert auf einer Realtime Polymerase- Kettenreaktion (PCR) und garantiert durch automatisierte Arbeitsschritte eine einfache und schnelle Handhabung mit hoher Sensitivität (Robert Koch- Institut (RKI), 2011).

2.1.6 Therapie

Bei der Bekämpfung von Tuberkulosebakterien im Körper, gibt es einige Schwierigkeiten, die bei der Therapie berücksichtigt werden müssen (Mutschler et al., 2012): • Antituberkulotika sollten über eine gute Gewebegängigkeit verfügen, da der Erreger extra- und intrazellulär vorliegen kann. • Keimpersistenz kann nach Therapieende zu Rezidiven führen. • Hohe Keimzahlen v.a. in den Kavernen sorgen für Resistenzsteigerung. Ebenso berücksichtigt werden muss (Aktories et al., 2009): • die lipidreiche Zellwand, • das langsame Wachstum und • die leichte Mutation und somit das hohe Risiko der Resistenzentwicklung der Mykobakterien. Deswegen werden stets mindestens zwei Antituberkulotika mit verschiedenen Wirkstoffen gleichzeitig über eine hinreichend lange Therapiedauer eingenommen. Ununterbrochene Anwendung muss während der Einnahmezeit garantiert werden. Nach Effektivität und Art der Nebenwirkungen werden sie in Antituberkulotika der 1. und 2. Wahl eingeteilt.

9 2 Theoretische Grundlagen

Antituberkulotika der 1.Wahl zur Standardtherapie bei Tuberkulose, Lepra und atypischen Mykobakteriosen (Aktories et al., 2009): • Isoniazid • Pyrazinamid • Rifampicin • Ethambutol • Streptomycin

Isoniazid (Isonicotinsäurehydrazid, INH; Isozid®, tebesium®) ist wegen der ausgeprägten bakteriziden Wirkung das wichtigste Medikament bei der Behandlung von Tuberkulose (Mutschler et al., 2012). Das von Mykobakterien gebildete Enzym Katalase- Peroxidase wandelt das Isoniazid in ein Isonicotinsäure- Acyl- Radikal um. Dieses beeinträchtigt die Mykolsäure- Synthese, weil es in die Reduktion von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren eingreift. Darin liegt auch der große Vorteil des Isoniazids, nur selektiv die Zellwände von Mykobakterien anzugreifen, da nur wenige Bakterien Mykolsäure enthalten. Zusätzliche Angriffspunkte erklären die starke Wirkung des Arzneistoffs. Allerdings ist man auch bei der Behandlung mit INH nicht vor resistenten Bakterien gefeit. Mutationen sind nicht mehr zur enzymatischen Aktivierung in der Lage und setzten die Wirksamkeit von Isoniazid herab (Mutschler et al., 2012). Mittel zur 2. Wahl sind unter anderem Protionamid, welches dem Isoniazid chemisch ähnlich ist, p-Aminosalicylsäure und Terizidon, ein Prodrug des vormals verwendeten Cycloserin. Fluorchinolone (Moxifloxacin) gewinnen in der TB-Bekämpfung immer mehr an Bedeutung. Bei Patienten mit MDR werden auch Rifabutin, Makrolide und Clofazimin gegeben (Mutschler et al., 2012).

2.1.6.1 Therapieschema

Die Standardtherapie wird durchgeführt, wenn keine MDR und auch keine weitere Resistenz gegenüber den herkömmlichen Antituberkulotika vorliegt und die Basisstoffe gut vertragen werden (Dellas, 2006): • Initialtherapie: INH + Rifampicin + Pyrazinamid + Ethambutol (bzw. Streptomycin) über 2 Monate

10 2 Theoretische Grundlagen

• Stabilisierungsphase: INH + Rifampicin über 4 Monate • Bei vorhandener Immunschwäche (HIV- Patienten u.a.) oder bei auftretenden Rezidiven muss die Therapie auf 9- 12 Monate verlängert werden • Bei vorhandener Niereninsuffizienz muss die Dosis von Ethambutol bzw. Streptomycin reduziert werden • Bei vorhandener Leberinsuffizienz muss die Dosis von Pyrazinamid und Rifampicin reduziert werden.

2.1.7 Prävention

Grundmaßnahme bei der Vorbeugung der TB- Verbreitung ist das Einhalten von Hygienevorschriften, sowie die gesetzlich verankerte Meldepflicht bei Erkrankung und Tod. Patienten mit einer offenen TB müssen in Isolierzimmern untergebracht und infizierte Absonderungen desinfiziert werden (Kayser et al., 1998). Personengruppen die präventive Maßnahmen ergreifen sollten sind (Davies et al., 2008): • HIV positive Patienten (oder anders ausgelöster Immunsupression) mit ebenfalls positiven Tuberkulin- Test oder Interferon-γ - Test • Personen die Kontakt zu positiv getesteten TB- Patienten haben • Kinder mit positivem Tuberkulin oder Interferon-γ - Test und • Personen mit fibrotischen Lungenläsionen, zurückzuführen auf eine unbehandelte Lungentuberkulose Ermöglicht wird die Dispositionsprophylaxe durch eine Schutzimpfung oder eine medikamentöse Therapie. Als Immunserum wird ein lebender M. bovis- Stamm verwendet (Bacille Calmette- Guèrin- Impfung, BCG). Intrakutan verabreicht, bewahrt die Injektion vor allem Kleinkinder vor dem Krankheitsausbruch und somit auch vor der gefährlichen Gehirntuberkulose. Für Erwachsene ist der Schutz hingegen nicht ausreichend und die Nebenwirkung dementsprechend zu hoch (Hahn et al., 2009). Zur präventiven Medikation von Patienten mit einer klinischen stummen Infektion wird INH (300 mg/die) über 6 Monate verabreicht (Kayser et al., 1998).

11 2 Theoretische Grundlagen

2.2 Mykobakterien

Mykobakterien gehören zu den Mycobacteriaceen und sind, neben der kürzlich entdeckten Gattung der Amycolicicoccus, die einzigen Vertreter dieser Familie (Cai et al., 2011). Aufgrund ihres Krankheitsverlaufes kann man sie in zwei Gruppen einteilen: den obligat pathogenen und den atypischen Arten. Zu den obligat pathogenen und somit für den Menschen gefährlichen Erregern zählen M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae und M. africanum. Weiters gibt es auch noch atypische Arten wie M. smegmatis, M. marinum und M. avium, welche tuberkuloseähnliche Erkrankungen bewirken können, aber zwischenmenschlich nur selten übertragen werden (Mutschler et al., 2012). Sie kommen frei in der Umgebung vor und leben saprophytär, sind also nicht auf einen Wirt angewiesen (Koch et al., 2012). Daneben existieren auch noch fakultativ pathogene Erreger, die bei immungeschwächten Personen, zum Beispiel mit dem HI- Virus- Infizierte, Erkrankungen auslösen können (Kazda et al., 2009).

Die gebräuchlichste Einteilung findet man bei Konietzko und Loddenkemper (1999) (Konietzko et al., 1999): • Tuberkulose auslösende Bakterien (siehe Kapitel 2.2.2) • Mycobacterium leprae als Auslöser der Lepra • Nicht tuberkulöse Mykobakterien (MOTT, „mycobacteria other than tuberculosis“) auch atypische Mykobakterien genannt (>100 Spezies)

2.2.1 Eigenschaften

Das wohl wesentlichste Merkmal der Mykobakterien und auch die Erklärung für die hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber Antiinfektiva ist deren Säurefestigkeit. Das ohnehin schwer anzufärbende Bakterium, lässt sich einmal angefärbt, weder durch Alkohol noch durch Säure,wieder entfärben. Bedeutsam ist dabei der hohe Lipidgehalt in der Zellwand. Sie beinhaltet große Mengen an C60- C90 Fettsäuren, die auch als Mykolsäuren bezeichnet werden, und Glykolipide, die kovalent über Arabinogalaktan mit Peptidoglycanen verbunden sind. Diese Kohlenwasserstoffketten fügen sich zusammen und bilden eine Lipiddoppelschicht von außergewöhnlicher Dicke. Unterschiede im Aufbau der Mykolsäure beeinflussen die

12 2 Theoretische Grundlagen

Permeabilitat und die Fluidität dieser Doppelschicht. Letztere ist in den meisten Teilen auf der Innenseite des Bilayers niedrig, steigt aber tendenziell nach außen hin (Brennan et al., 1995). Gerade die geringe Fluidität und Permeabilität der dickeren Zellwand ist verantwortlich für die hohe Widerstandsfähigkeit gegen sowohl äußere Umwelteinflüsse, also auch Antibiotika. Es wird angenommen, dass ein Zusammenhang zwischen diesem Phänomen und dem langsamen Wachstum der meisten Mykobakterien besteht, da durch die Stärke der Zellwand die Nahrungsaufnahme ebenfalls herabgesetzt ist (Koch et al., 2012). Ein weiterer bedeutender Baustein der Zellwand ist Trehalose -6,6- dimykolat, welches auch als Cordfaktor bezeichnet wird. Dieses Mykosid soll nicht zuletzt wegen dessen zopfartigen Wachstums wichtig für die Virulenz der TB sein (Glickman et al., 2000). Aufgrund der fehlenden äußeren Membran zählen Mykobakterien zu den grampositiven Stäbchen, obwohl sie sich durch Gramfärbung nicht nachweisen lassen. Dazu ist eine spezielle Methode nötig, die Färbung nach Ziehl- Neelson (Kayser et al., 1998). Dabei wird mit Fuchsin- Phenol kurz erhitzt und mit einem Säure- Alkohol- Gemisch wieder entfärbt. Das Ergebnis ist eine rote Färbung der säurefesten Bakterien, da deren Mykolsäuren mit dem Farbstoff reagieren und sich dieser nicht mehr entfernen lässt (Koch et al., 2012). Mykobakterien brauchen Sauerstoff um zu überleben, sind also obligate Aerobier und werden zu den Prokaryonten gezählt, besitzen also weder Zellkern noch Mitochondrien (Kayser et al., 1998).

2.2.2 Mycobacterium tuberculosis- Komplex

Der Mtb- Komplex umfasst neben M. tuberculosis auch, M. bovis, M. africanum und M. microti von denen alle Tuberkulose in Mensch und Tier auslösen können (Kim et al., 2013). Während M. tuberculosis der am häufigsten diagnostizierte Erreger ist, führen die anderen Spezies eher selten zu Beschwerden beim Menschen. Die Rindertuberkulose (M. bovis) kann über Tröpfchen oder Milch von infizierten Kühen auf Menschen übertragen werden. Die zweite Zoonose dieser Gruppe wird durch M. microti verursacht, welche bei Wühlmäusen auftritt. M. africanum, ein hauptsächlich in Afrika verbreiteter Erreger, kommt eher selten vor, wird aber als Mutation von M. tuberculosis angesehen (Geginat et al., 2000). Wie die meisten obligat pathogenen Arten, zählen auch diese aufgrund der langen Generationszeit zu den langsam wachsenden Bakterien. M. tuberculosis im Speziellen muss oft bis zu 8 Wochen bei 37° bebrütet werden bis Kolonienwachstum makroskopisch erkennbar wird.

13 2 Theoretische Grundlagen

Grund dafür ist die relativ lange Generationszeit des Tuberkelbakteriums von 12- 18 Stunden. Andererseits ist das 0,4 μm breite und 3- 4 μm lange unbewegliche Stäbchen leicht zu kultivieren, da es wenig anspruchsvoll ist. Die obligaten Aerobier brauchen hierfür lediglich eine

Atmosphäre mit 5- 10% CO2 und einen lipidhältigen Nährboden (meist ein Glycerin- Eiernährboden nach Löwenstein- Jensen). Ist dies gegeben, wachsen sie in trockenen, gelben Kolonien in Form eines Blumenkohls (Kayser et al., 1998).

2.2.3 Mycobacterium smegmatis

M. smegmatis zählt zu den nicht- tuberkulösen Mykobakterien (kurz MOTT), ist also im Regelfall nicht pathogen. Benannt wurde es nach Trevisan (1989) und wurde durch Lehmann und Neumann im Jahr 1899 genauer beschrieben (Whitman et al., 2012). Die 3- 5 μm langen Stäbchen sind, wie für Mykobakterien charakteristisch, säurefest. Im Gegensatz zum TB- Erreger wachsen sie aber schnell, was auch der Grund für die häufige Anwendung in der Mikrobiologie ist, so zum Beispiel auch als Wirt zur Vermehrung von Mykobakteriophagen in der Gentechnologie (Snapper et al., 1990).

2.3 Echinops kebericho Mesfin

Bei der in dieser Arbeit untersuchten Pflanze handelt es sich um Echinops kebericho Mesfin aus der Familie der Asteraceen. In den folgenden Kapiteln wird kurz auf die Familie, die Gattung und die Pflanze selbst eingegangen und diese charakterisiert.

2.3.1 Familie der Asteraceae/Compositae

Die Asteraceae (auch Compositae) bilden mit einer Vielzahl von kosmopolitisch verbreiteten Vertretern die größte Familie der Blütenpflanzen. Entwickelt haben sie sich wahrscheinlich in der Region außerhalb des Amazonasbeckens in Südamerika. Eine Reihe von charakteristischen Merkmalen machen sie zu einer gut bestimmbaren Pflanzenfamilie (Sitte, 2002). Wesentlichstes Kennzeichen sind wohl die köpfchenförmigen Blütenstände, von denen auch die Bezeichnung Korbblütler herrührt. Diese werden von einigen Hochblättern umgeben, die die Köpfchenhülle bilden (Involucrum). Oft hat es den Anschein, dass es sich beim Blütenstand um

14 2 Theoretische Grundlagen eine Einzelblüte handelt, doch bilden zahlreiche Blüten eine große Einheit (Pseudanthien, Abb. 2.3) und locken somit Insekten zur Bestäubung an. Asteraceae besitzen entweder einen kegelig verlängerten oder einen abgeflachten Boden des Köpfchens, während schuppenförmige Spreublätter vorhanden sind oder komplett fehlen (Sitte, 2002). Es treten meist zwei verschiedene Blütentypen auf, die auch nebeneinander stehen können, einerseits radiär angeordnete 5- zählige Röhrenblüten, aber auch zygomorphe Zungenblüten. Fünf Staubblätter, deren Antheren eine Röhre bilden, um die Pollen darin besser aufnehmen zu können, befinden sich freistehend an der Krone (Sitte, 2002). Modifizierte Kelchblätter bilden einen Pappus, der in Form von Schuppen, Borsten oder Haaren auftreten kann. Dieser umhüllt die Frucht, die bei den Korbblütlern meist einer Sonderform der Nuss entspricht, der Achäne. Sie entsteht aus dem unterständigen Fruchtknoten dieser Familie, welcher aus 2 Blättern hervorgeht und einfächrig ist. Nach der Befruchtung bilden anatrope Samenanlagen die Achäne aus, die als Merkmal dicht aneinander gepresste Frucht- und Samenwände aufweist (Sitte, 2002). Auch vorhanden sind schizogene Öl- und Harzgänge und charakteristische Compositen- Drüsenhaare (Frohne et al., 1973). Als Bestandteil der ätherischen Öle bzw. auch als nichtflüchtige Sesquiterpenlactone (STL) und Bitterstoffe treten verschiedenste Polyine (Polyacetylene) und isoprenoide Substanzen innerhalb dieser Familie auf. Letztere findet man primär in den Drüsenschuppen der Exkretgänge als Monoterpene (u.a. Thujon, Cineol, Linomenen), Diterpene (Steviosid) und Sesquiterpene. Nichtflüchtige Sesquiterpenlactone sorgen oft für den etwas bitteren Geschmack in manchen Vertretern der Asteraceae wie zum Beispiel in Artemisia absinthium (Wermut) oder in Taraxacum officinale (Löwenzahn). Wird guanolidhältiges ätherisches Öl über Wasserdampf destilliert, entstehen die blau gefärbten Azulene. Weitere bekannte Inhaltsstoffe sind Flavonoide und Hydroxyzimtsäurederivate, Alkaloide und die polysacchariden Polyfructosane, welche anstelle von Stärke gespeichert werden (Frohne et al., 1973). Während Azulene antiphlogistisch wirken, werden den Flavonoiden und Polyinverbindungen spasmolytische Eigenschaften nachgesagt. Hingegen besitzen gewisse STL (Santonin aus Artemisia- Arten) und das Alantolacton (aus Inula helenium) antiparasitäre Aktivität. Alkaloide der Senecionaea sind cancerogen und hepatotoxisch. Die vorhin schon erwähnten Polyfructosane (darunter auch das Inulin) eignen sich besonders gut als Zuckerersatz für Diabetiker (Frohne et al., 1973). Auswahl pharmazeutisch wichtiger Vertreter der Korbblütler (Bühring et al., 2010):

15 2 Theoretische Grundlagen

Artischocke / Cynara cardunculus L. Echte Arnika / Arnica montana L. Echte Kamille / Matricaria recutita L. Mariendistel / Silybum marianum (L.) GAERTN Ringelblume /Calendula officinalis L.

2.3.2 Echinops L. (Kugeldisteln)

Die Gattung Echinops L. zählt innerhalb der Familie der Asteraceae (Korbblütler) zur Unterfamilie der Carduoideae und dem Tribus der Cardueae mit dem Subtribus Echinopsidinae (Gottschlich, 2005). Die meist krautigen, mehrjährigen Pflanzen können über einen Meter hoch werden und zählen zu den distelförmigen Korbblütlern. Es wird von 120 verschiedenen Arten berichtet, die sich über Osteuropa, Zentralasien und den tropischen Teil Afrikas verteilen (Mabberley, 2009). In Österreich und der nahen Umgebung sind folgende Arten zu finden (Gottschlich, 2005): Bienen- K./ E. sphaerocéphalus L. Garten- K./ E. bannáticus ROCHEL ex SCHRAD Hoch- K./ E. exaltatus SCHRAD Ruthenische (blaue) K./ E. ritro L. (siehe Abb. 2.3)

Abb. 2.3: Pseudanthium von Echinops ritro Foto: Kristian Peters (Kristian, 2006)

16 2 Theoretische Grundlagen

2.3.2.1 Inhaltsstoffe

Bereits im Jahr 1900 wurde durch Greshoff zum ersten Mal das Alkaloid Echinopsin (1- Methylchinolin-4-on, CAS Registry Nr.: 83-54-5) aus den Samen der blauen Kugeldistel (Echinops ritro L.) isoliert. Ebenso wurde es in 14 weiteren Arten gefunden (Manske et al., 1953). Seither hat es einige Untersuchungen bezüglich des Alkaloid- Gehalts in Echinops gegeben, die teils zu unterschiedlichen Ergebnissen führten.

Abb. 2.4: Strukturformel von Abb. 2.6: Strukturformel von Abb. 2.5: Strukturformel Echinopsin Echinorin von Echinopsidin

Schröder und Luckner beschrieben Echinorin (4- Methoxy-1-methylchinolin-1-ium; CAS Registry Nr.: 18095-64-2) als einziges natives Chinolinalkaloid vorkommend in den Früchten von Echinops ritro L.und E. sphaerocephalus L. Ihrer Meinung nach sind Echinopsin und Echinopsidin (4-Imino-1-methyl-1,4-dihydrochinolin; CAS Registry Nr.: 2400-75-1) nur Metaboliten des Echinorin, die durch Hydrolyse bzw. Ammonolyse entstehen (Schröder, 1969). Andere Publikationen bestätigen hingegen die Anwesenheit von nativem Echinopsin als natürliches Alkaloid. Hierfür wurden die Früchte des E. spinosus L.verwendet (Halim et al., 2011). Nachgewiesen ist auch der Gehalt an Flavonoiden, u.a. Apigenin, das in E. echinatus Roxb (Singh et al., 1993), E. ritro L. (Chevrier, 1976) und E. niveus WALL ex ROYLE (Singh et al., 1990) gefunden wurde, sowie ein neues Flavonoid aus E. niveus WALL ex ROYLE mit dem

17 2 Theoretische Grundlagen

Namen Nivegin (Singh et al., 1987). Diese sekundären Pflanzenfarbstoffe kommen zum Großteil in den Blüten der Echinops- Arten vor. Thiophene sind Inhaltsstoffe, die für Pflanzen aus der Familie der Asteraceae sehr charakteristisch sind und kommen auch gehäuft bei Echinops vor (Qiao et al., 2010). Viele Studien belegen das Vorhandensein verschiedenster Thiophenderivate in nahezu allen untersuchten Echinops- Arten, wobei ausschließlich die Wurzeln diese Substanzklasse aufwiesen (Lam et al., 1991). Unter anderem wurde das 5-(3-Buten-1-ynyl)- 2,2'- bithiophen in E. nanus Bunge gefunden (Qiao et al., 2010) sowie Arctinon b (Qiao et al., 2010). Zusätzlich sind Terpenoide (Nakano et al., 2012), Triterpene wie Lupeol und Phytosterine wie β- Sitosterol und dessen Glucosid aus E. echinatus Roxb isoliert worden (Singh et al., 1989).

2.3.2.2 Pharmakologische Wirkung

Der Gattung Echinops wird ein hoher medizinischer Wert nachgesagt, wohl aufgrund der zahlreichen bisher gefundenen Substanzklassen oder der vielfältigen traditionellen Verwendung. Die Studien von Turova et al. spezialisierten sich auf das, aus E. ritro gewonnene, Echinopsin. Dabei wurde eine stimulierende Wirkung der neuromuskulären Zentren bestätigt und eine Beschleunigung von Regenerationsprozessen des peripheren Nervensystems. In kleinen Dosen neigt es dazu, Narkosen entgegen zu wirken. In hohen Dosen wirkt es hingegen krampfauslösend

(spasmodisch). Die Toxizität des Echinopsins hat sich als recht gering herausgestellt (LD 100 = 600 mg/kg), wobei alle Versuche an Mäusen durchgeführt wurden (Turova et al., 1957). Wiederum wurde in anderen Untersuchungen die Wirkung von Echinopsin auf das Zentralnervensystem untersucht. Hierbei zeigte es erneut antinarkotive und antisedative Effekte bei Gabe von niedrigen Dosen. Nach Erhöhung der Menge verlängert es andererseits die durch Hexobarbital hervorgerufene Narkose (Daleva et al., 1980). Echinopsidin führte zur Blockade von vegetativen, autonomen Ganglien des peripheren Nervensystems. Es zeigte in klinischen Tests leichte hypotensive Eigenschaften und verringerte die neuromuskuläre Leitfähigkeit (Stefanova et al., 1972).

18 2 Theoretische Grundlagen

2.3.2.3 Antimikrobielle Wirkung

Getestet wurden MeOH- Extrakte einiger Pflanzenteile von Echinops ellenbeckii O. Hoffm. und Echinops longisetus A. Rich. Dabei zeigten die extrahierten Blätter beider Arten einen stark hemmenden Effekt auf Staphylococcus aureus- Kulturen (EE: 5 μg/μl, EL: 2,5 μg/μl). Der Extrakt aus den Blüten von E. ellenbeckii wies außerdem starke Aktivität gegen Candida albicans (10 μg/μl). Zusätzlich wirkte der Wurzelextrakt von E. ellenbeckii stark toxisch auf parasitäre Erdwürmer. Bereits bei einer Konzentration von 31,3 μg/ml ließ sich eine Mortalitätsrate von 53,3% nachweisen (Hymete et al., 2005). In einer anderen Studie wurden die Wurzeln des Echinops ritro L. auf deren fungizide Wirkung untersucht. Dabei wies der Dichlormethanextrakt die höchsten und am besten erkennbaren Hemmzonen auf. Mit Hilfe weiterer Untersuchungen und der Isolierung und Testung mehrerer Verbindungen konnten verschiedene Thiophenderivate als wirksame Komponenten ausgemacht werden (u.a. α-Terthienyl; 5-(3-Buten-1-yn-1-yl)- 2,2'-bithiophen; 2-(Penta-1,3-diynyl)-5-(4- hydroxybut-1-ynyl)thiophen; 5'-(4-hydroxybut-1-ynyl)-2,2'-bithiophen) (Fokialakis et al., 2006).

2.3.2.3.1 Antimykobakterielle Wirkung

Die in Kamerun (Zentralafrika) lokalisierte Spezies Echinops giganteus A. wurde bereits auf dessen antimykobakterielle Aktivität untersucht. Der Methanol- Extrakt, der aus den Wurzeln gewonnen wurde, zeigte dabei die beste Wirkung aller verwendeten Pflanzen gegen M. tuberculosis (Stämme H37Ra und H37Rv) mit einem MIC- Wert von 32 μg/ml bzw. 16 μg/ml (Tekwu et al., 2012). Weitere Untersuchungen über die Hemmung des Wachstums von Tuberkulosebakterien sind nicht bekannt.

19 2 Theoretische Grundlagen

2.3.3 Echinopsis keberichi radix

Abb. 2.7: Wurzeln Echinops Abb. 2.8: Echinops kebericho kebericho (Royal Museum for Central Africa, 2007)

Echinops keberichi radix sind die getrockneten Wurzeln der Äthiopischen Kugeldistel, Echinops kebericho Mesfin. (siehe Abb. 2.7) Die aufgerichtete, mehrjährige Pflanze erreicht eine Höhe von bis zu 1,2 m und wächst aus einem Wurzelstock mit blättrigen Stängeln. Die Blattlamina ist elliptisch und in zwei Segmente geteilt, die oft in Stacheln enden, während die Kronen weiß oder hellblau sind (Hymete et al., 2007).

2.3.3.1 Verbreitung

Echinops kebericho ist eine von 12 Arten die in Äthiopien beheimatet ist. Vier davon sind im Hochland auf 2300- 2600 m Höhe zu finden (Echinops kebericho Mesfin, E. buhaitensis Mesfin, E. ellenbecki O. Hoffm und E. longisetus A. Rich). Dokumentiert sind kebericho- Funde in den Provinzen Shoa und Gojam (Hymete et al., 2007). Entdeckt wurde die Pflanze auf traditionellen, äthiopischen Märkten, wo sie von Einheimischen unter dem Namen „Kebericho“ verkauft wird. Eingehende Studien haben gezeigt, dass es sich um eine neue Echinops- Art handelte, welche zum ersten Mal von Tadesse Mesfin beschrieben wurde (siehe Abbildung 2.9) (Abegaz et al., 1991).

20 2 Theoretische Grundlagen

Abb. 2.9: Holotyp von E. kebericho (Tadesse, 1988)

2.3.3.2 Taxonomie

Abteilung: Spermatophyta Klasse: Angiospermae Unterklasse: Magnoliidae Überordnung: Asteranae Ordnung: Asterales (Asternartige) Familie: Asteraceae Unterfamilie: Carduoideae Gattung: Echinops (Kugeldisteln) (Baltisberger et al., 2013)

21 2 Theoretische Grundlagen

2.3.3.3 Traditionelle Verwendung

Innerhalb der äthiopischen Bevölkerung wird die Wurzel von E. kebericho auf vielseitige Art und Weise genutzt. So wird angenommen, dass der Rauch, der beim Verbrennen der Wurzel entsteht, gegen Typhus und Fieber helfen soll und wird hauptsächlich nach der Geburt eingesetzt. In anderen Regionen des Landes werden mit dessen Hilfe Schlangen von den Behausungen ferngehalten (Hymete et al., 2007). Einheimische kauen auf den rohen Wurzeln von E. kebericho um intestinale Beschwerden zu lindern und verabreichen den Rindern aus demselben Grund ein Dekokt. Eine Besserung der Schmerzen auch beim Menschen könnte an der antihelmethischen Aktivität der Wurzeln liegen, welche bereits nachgewiesen wurde. Dabei zeigte der alkoholische Extrakt eine stark toxische Wirkung auf Erdwürmer (Tariku et al., 2011). Aufgüsse der Wurzel werden unter anderem zur Behandlung der Migräne, Diarrhoe und bei Herzbeschwerden verabreicht (Hymete et al., 2007).

2.3.3.4 Inhaltsstoffe

Vorhergehende Studien zeigten, dass die Wurzeln von E. kebericho neben nur einer weiteren Echinops- Art (E. amplexicaulis), in der Lage sind, Sesquiterpenlactone in großen Mengen zu produzieren, wobei die Hauptkomponente das Dehydrocostuslacton ist und Costunolid nur in Spuren zu finden ist (Abegaz et al., 1991). Aus den Wurzeln gewonnenes ätherisches Öl wurde eingehend untersucht dabei wurden oxidierte Sesquiterpenoide gefunden, wie zum Beispiel oxidierte Carophyllene, (E)-Nerolidol und τ- Cadinol, ebenso tricyclische (u.a. Cyperen, β- Cubeben, β- Patchoulen und Longifolen) und monocyclische Sesquiterpenoide (u.a. α- Guaien und β- Santalen). Außerdem wurden 21 Monoterpene in niedriger Konzentration aus dem flüchtigen Bestandteil des ätherischen Öls detektiert, darunter Limonen und Campher. In der Lipidfraktion wurden neben zahlreichen Fettsäuren und der Ursolsäure auch β- Sitosterol, Stigmasterol, Campesterol, β- Amyrin und Lupeol isoliert (Hymete et al., 2007).

22 2 Theoretische Grundlagen

2.3.3.5 Wirkung

Da Echinops kebericho im Speziellen noch kaum untersucht ist, liegen auch nur wenige Publikationen über dessen pharmakologische und toxikologische Eigenschaften vor. Eine davon beschreibt allerdings eine extrem toxische Wirkung des aus den Wurzelknollen gewonnenen Öls, auf begeißelte (MIC- Wert: 0,0097- 0,0765 μl/ml) sowie unbegeißelte

Leishmanien (EC50 0,00024 – 0,0005 μl/ml). Dieser Effekt konnte auch bei anderen ätherischen Ölen beobachtet werden und ist demzufolge auf die Lipidkomponenten zurückzuführen. Möglicherweise liegt es daran, dass diese Substanzen kein spezifisches Target besitzen, Zellwände leicht durchdringen können und diese durchlässig machen. Einmal eingedrungen verursachen sie dort wahrscheinlich Schäden, die zum Zelltod durch Nekrose oder Apoptose führen (Tariku et al., 2011).

3 Materialien und Methoden

3.1 Pflanzenmaterial

Das Pflanzenmaterial wurde im August 2012 auf einem Markt in der Stadt Aleta Wondo in der Sidoma- Zone im Süden Äthiopiens erstanden. Die getrockneten Wurzeln von E. kebericho (siehe Abb. 3.1) wurden mit einer Schlagkreuzmühle SK1 der Firma Retsch mit dem Sieb der Größe 1.0 zu feinem Pulver verarbeitet. Die zerkleinerte Droge wog 171,8g.

Abb. 3.1: Untersuchtes Pflanzenmaterial

23 3 Materialien und Methoden

3.2 Extraktion des Pflanzenmaterials

Zur Gewinnung des Extraktes wurde mit Hexan in einer Soxhlet- Apparatur extrahiert. Diese macht es möglich das Pflanzenmaterial kontinuierlich auszulaugen, wobei das Elutionsmittel das Extraktionsgut, welches sich in einer Cellulosehülse befindet, ständig durchströmt. Durch die auftretende Saugheberwirkung gelangt der Extrakt wieder zurück in den Kolben, und dient erneut als Lösungsmittel. Mit dieser Methode kann in kurzer Zeit die maximale Menge an Inhaltsstoffen ins Eluat überführt werden (Förstner et al., 1997). Hierfür wurde das gesamte Drogenpulver für 10 h mit dem Lösungsmittel erschöpfend extrahiert. Um das restliche Hexan abzudampfen, wurde der Extrakt in einen Rundkolben überführt und am Rotationsverdampfer Laborota 4000/W eingeengt (335mbar; 40°C). Somit wurde eine Ausbeute von 8.6 g erzielt.

3.3 Dünnschichtchromatographie (DC)

Bei der Dünnschichtchromatographie (DC; engl. thin layer chromatography, TLC) erhält man ein Chromatogramm, bei dem die getrennten Verbindungen auf der DC- Platte zurückbleiben. Vor allem bei der Trennung von Gemischen, sowie zur qualitativen- und der eher seltenen quantitativen Untersuchung von Stoffen, kommt diese Methode aufgrund der schnellen und unkomplizierten Durchführung häufig zum Einsatz (Rücker et al., 2013). Grundlage für die Trennung der Analysenprobe auf Kieselgelplatten sind Adsorptionsvorgänge, die als Wechselwirkungen auftreten. Die stationäre Phase befindet sich als dünne Schicht auf der Trägerplatte. Der in Lösung gebrachte Analyt wird punktförmig oder als Bande im unteren Bereich dieser Platte aufgetragen. Nachdem eine DC- Kammer mit ausreichend Fließmittel befüllt und gesättigt wurde, wird die DC- Platte in die Kammer gestellt. Nach dem Entwickeln wird die Platte anhand von Rf- Werten ausgewertet (Rücker et al., 2013).

3.3.1 Analytische Dünnschichtchromatographie

Als Sorbens wurden einerseits unmodifizierte Kieselgelplatten der Firma Merck verwendet mit einer Porengröße von 60 Å und einem Fluoreszenz- Indikator F254, der bei Bestrahlung mit UV Licht der Wellenlänge 254 nm zur Fluoreszenz angeregt wird. Andererseits wurden auch modifizierte Silicagelplatten zur Umkehrphasenchromatographie eingesetzt, letztere ausschließlich zur Bestimmung des Elutionsgemisches für die HPLC.

24 3 Materialien und Methoden

Das Fließmittelgemisch für die DC wurde so gewählt, dass die Banden gut sichtbar und getrennt auf den Platten erschienen.

DC- Methode:

Stationäre Phase: Kieselgelplatte 60 F254 Mobile Phase: Hexan : EtOAc (60:40, v/v) Proben: Die in Dichlormethan gelösten Proben wurden zu je 10 μl bandenförmig mit einem TLC Sampler 4 der Firma Camag aufgetragen und in die mit Fließmittel gesättigte Kammer gestellt. Laufmittelstrecke: 8 cm Detektion: Detektiert wurde bei einer Wellenlänge von 254 nm bzw. 366 nm. Zusätzlich wurde das Dragendorff- Sprühreagenz und das Anisaldehyd- Schwefelsäure- Reagenz verwendet, beide hergestellt laut den Vorschriften des Europäischen Arzneibuchs (Ph. Eur). Um die Substanzen sichtbar zu machen, wurde das mit Anisaldehyd- Schwefelsäure behandelte Chromatogramm für 10 min bei 100°C in den Trockenschrank gegeben. Für die weiteren Untersuchungen mittels DC wurde nur noch das Anisaldehyd- Schwefelsäure- Reagenz verwendet, da dieses zuvor positiv (bei EK_SF8 und EK_SF9) auf der DC- Platte reagierte.

3.3.2 Präparative Dünnschichtchromatographie

Präparative Dünnschichtchromatogramme sind in der Analytik von Substanzen eher eine Seltenheit. Bereits getrennte Substanzbanden werden mitsamt dem Trägermaterial von der DC- Platte abgekratzt und die Analysensubstanz vom Sorbens durch Extraktion getrennt. Ein Nachteil dieser off- line- Methodik ist der hohe Arbeitsaufwand, die dieses Verfahren mit sich bringt (Rücker et al., 2013). Extrahiert wurden die Substanzen aus dem Kieselgel in einem Trennsäulchen 1cm x 10cm mit Hilfe von Dichlormethan.

25 3 Materialien und Methoden

Stationäre Phase: Kieselgelplatte 60 F254 Mobile Phase: Hexan : EtOAc (60:40, v/v) Detektion: Detektiert wurde im UV- Licht bei 254 nm und 366 nm.

3.4 Säulenchromatographie (SC)

Sie zählt zu den Flüssigfestchromatographie- Verfahren und kann je nach Art der Wechselwirkungen zwischen stationärer Phase und dem zu trennenden Substanzgemisch unterschieden werden. Bei der Verwendung von Kieselgel ist der zugrunde liegende Prozess die Adsorption, weshalb die hier verwendete Methode auch zur Adsorptionschromatographie gezählt wird. Ziel der Säulenchromatographie (engl. column chromatographie) ist die Trennung von Extrakten oder Extraktfraktionen und der Erhalt einzelner Komponenten (Rücker et al., 2013). Die stationäre Phase befindet sich in einem schmalen Rohr (Trennsäule), welches vertikal befestigt wird. Diese Position macht es der mobilen Phase möglich, allein durch Schwerkraft hindurch zu wandern. Bei sehr langsamer Elution kann unter Verwendung spezieller Säulen auch Vakuum angelegt werden. Die Probe wird am oberen Ende der Säule aufgetragen und bewegt sich durch kontinuierliche Zugabe von frischer mobiler Phase (Elutionsmittel) entlang der Trennsäule. Durch unterschiedlich starke Wechselwirkungen verteilen sich die Probenkomponenten zwischen den zwei Phasen (Skoog et al., 1996). Nach dem Durchtreten wird das Eluat in geeigneten Laborgefäßen aufgefangen, mittels Dünnschichtchromatographie analysiert und eventuell zu Sammelfraktionen vereinigt. Zum Packen der Säule wurde die entsprechende Menge Kieselgel 60 mit einer Korngröße von 0,063- 0,200 mm mittels Hexan aufgeschlemmt und anschließend um Luftblasen zu vermeiden, am Ultraschallbad entgast. Im gequollenen Zustand wurde das Kieselgel nun in die Säule gefüllt. Um zu guten Trennergebnissen zu gelangen, waren mehrere säulenchromatographische Trennungen nötig, die alle demselben Prinzip entsprachen aber unterschiedliche Säulen/Varianten erforderten.

Trennsäule I Da sich der flüssige Extrakt (8,6 g) in einem Rundkolben befand, wurde dieser mit der doppelten Menge an Kieselgel (17,2 g) befüllt und am Rotavapor zur Trockenen eingedampft, danach in eine Porzellanschale überführt und angerieben. Das Probenpulver wurde vollständig auf das

26 3 Materialien und Methoden obere Ende der Säule aufgetragen und mit einer Schicht Seesand bedeckt, um ein Aufwirbeln der Probe zu verhindern.

Säule: 7 cm Durchmesser; 32 cm Länge Stationäre Phase: 100 g Kieselgel 60 mit einer Korngröße von 0,063- 0,200 mm für SC Mobile Phase: Eluationsmittelgradienten aus Hexan, EtOAc und MeOH zu je 200 ml/ Fraktion (siehe Tabelle 3.1)

Fraktionsbezeichnung Hexan [%] EtOAc [%] MeOH [%] EK_1a/1b 100 - - EK_2a/2b 95 5 - EK_3a/3b 90 10 - EK_4a/4b 80 20 - EK_5a/5b 70 30 - EK_6a/6b 60 40 - EK_7a/7b 20 80 - EK_8a/8b - 100 - EK_9a/9b - 80 20 Tabelle 3.1: Grobfraktionierung- Elutionsmittelgemisch

Trennsäule II Säule: 1 cm Durchmesser, 50 cm Länge Stationäre Phase: Kieselgel 60 mit einer Korngröße von 0,063- 0,200 mm, 30 cm Füllhöhe Mobile Phase: Hexan : EtOAc (65:35, v/v)

Trennsäule III Säule: 1 cm Durchmesser, 50 cm Länge Stationäre Phase: Kieselgel 60 mit einer Korngröße von 0,063- 0,200 mm, 30 cm Füllhöhe Mobile Phase: Hexan : EtOAc (70:30, v/v)

27 3 Materialien und Methoden

Trennsäule IV Säule: 3 cm Durchmesser, 50 cm Länge Stationäre Phase: Kieselgel 60 mit einer Korngröße von 0,063- 0,200 mm, 30 cm Füllhöhe (102,3g) Mobile Phase: Hexan : EtOAc (75:25, v/v)

3.5 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)

Die Hochleistungsflüssigchromatographie (engl. high performance liquid chromatography, HPLC) ist eine effiziente Trennmethode, die in der Lage ist, eine Mischung mit einer großen Anzahl von ähnlichen Analyten aufzutrennen. Das Chromatogramm liefert umgehend qualitative und quantitative Informationen (Meyer, 2008). Bei der HPLC wird das Elutionsgemisch (mobile Phase) mit Druck erzeugt von einer Pumpe, durch die Säule gepresst, die mit einer stationären Phase gefüllt ist. Häufig verwendete stationäre Phasen stellen die chemisch modifizierten Materialien dar, wie sie in der Umkehrphasenchromatographie (engl. reversed phase, RP) verwendet werden. Die polaren Silanolgruppen des Kieselgels werden hydrophobiert und somit unpolar (Rücker et al., 2013). Eine gesteigerte Leistungsfähigkeit verzeichnen Geräte mit sehr kurzen und dünnen Säulen, die mit sehr kleinen Trennpartikeln gepackt sind. Mit einer solchen UHPLC (engl. ultra high performance liquid chromatographie) lassen sich höhere Probendurchsätze mit kleineren Probenvolumina erreichen (Rücker et al., 2013). Bei der HPLC werden zumeist sehr hohe Trennleistungen erzielt. Registriert wird, wie bei allen äußeren Chromatogrammen, die Intensität des Detektorsignals in Relation zu der Zeit (Rücker et al., 2013). Für Substanzen, die ultraviolettes Licht absorbieren, kann ein UV- Detektor eingesetzt werden mit dem Vorteil einer hohen Empfindlichkeit. Der Dioden- Array- Detektor (DAD) erlaubt es, entsprechend der Anzahl an Dioden, verschiedene Wellenlängen gleichzeitig zu erfassen (Rücker et al., 2013).

3.5.1 Analytische Hochleistungsflüssigchromatographie

Ausgangspunkt für eine präparative Trennung ist ein analytisches Chromatogramm. Dazu müssen Bedingungen gefunden werden, welche das Probengemisch isokratisch mit guter

28 3 Materialien und Methoden

Auflösung trennen (Meyer, 2008). Um dies zu erreichen, wird zunächst mit einer Gradienten- Elution begonnen und daraus geeignete Bedingungen für eine isokratische Trennung abgeleitet.

Probenvorbereitung: Die Proben wurden mit Acetonitril auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml gebracht. Falls nötig wurde vorher mit einem Filter der Porengröße 0,45 μm membranfiltriert. Gerät: LaChrom Merck Hitachi Interface D- 7000 Diode Array Detektor L- 7455 Programmable Autosampler L- 7250 Pump L- 7100 Stationäre Phase: Agilent Zorbax SB C-18 3,5 μm 150 mm x 2,10 mm Mobile Phase: Acetonitril- Wasser- Gradient (siehe Tabelle 3.2)

Zeit [min] Wasser [%] Acetonitril[%] 0 90 10 30 0 100 40 0 100 41 90 10 51 90 10 Tabelle 3.2: Analytische HPLC: Fließmittelgradient

Einspritzvolumen: 10 μl Probenlösung Fließgeschwindigkeit: 0,250 ml/min (Gradient) Temperatur: 25 °C Detektion: Mittels Dioden- Array- Detektor (DAD) wurde bei einer definierten Wellenlänge von 220 nm detektiert.

29 3 Materialien und Methoden

3.5.2 Präparative Hochleistungsflüssigchromatographie

Für die präparative HPLC wurde aufgrund der unterschiedlich großen Substanzmengen an zwei verschiedenen Geräten gearbeitet, wobei Gerät II über das größeres Einspritzvolumen verfügte.

Gerät I: LaCHrom Merck Hitachi Interface D- 7000 Diode Array Detektor L- 7455 Programmable Autosampler L- 7250 Pump L- 7100 Probenvorbereitung: Proben wurden Acetonitril gelöst und membranfiltriert. Stationäre Phase: Merck LiChrospher 100 RP- 18 5 μm 125 mm x 4 mm Mobile Phase: Acetonitril: Wasser (60:40, v/v) Einspritzvolumen: 40 μl der Probenlösung Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min Temperatur: 25 °C Detektion: Detektiert wurde bei einer definierten Wellenlänge von 210 nm sowie im Bereich 200- 400 nm.

Gerät II: Varian Prep Star Solvent Delivery Module Model SD-1 Dynamax Absorbance Detector Model UV-1 Dynamax Solvent Delivery System Model SD-1 Probenvorbereitung: Proben wurden in Acetonitril gelöst. Stationäre Phase: UltraSep ES RP- 18, 10 μm 250 mm x 20 mm, B.652/05 Mobile Phase: Acetonitril :Wasser (70:30, v/v) Einspritzvolumen: 500 μl Fließgeschwindigkeit: 15 ml/min Temperatur: 25 °C Detektion: Gearbeitet wurde bei einer definierten Wellenlänge von 210 nm.

30 3 Materialien und Methoden

Zeit [min] Wasser [%] Acetonitril[%] 0 30 70 17 10 90 20 - 100 25 - 100 Tabelle 3.3: Präparative HPLC: Fließmittelgradient für EK_SF4 F10

3.6 Massenspektrometrie (MS)

Die massenpektrometrische Bestimmung lässt sich im Wesentlichen in drei Vorgänge unterteilen. Zuerst müssen Moleküle, die es zu analysieren gilt, in positive bzw. negative Ionen überführt werden. Ionisation kann auf verschiedene Weise hervorgerufen werden. Am häufigsten wird jedoch ein Elektronenstoßionisator (EI; engl. electron impact) als Ionenquelle eingesetzt. Die fragmentierten Ionen werden jetzt nach ihrem Masse-/ Ladungsverhältnis getrennt. Jene Massen- Fokussierung kann entweder in einem Magnetfeld (Magnet- Fokussierung) oder in einem elektrischen Feld (Elektrostatische- Fokussierung) erfolgen. Schließlich werden im letzten Schritt die bereits getrennten geladenen Teilchen nach steigender Masse und Häufigkeit erfasst (Rücker et al., 2013). Das somit erhaltene Massenspektrum gibt Auskunft über wichtige chemische Eigenschaften, wie die relative Molekülmasse, einen Nachweis verschiedener Isotope und schließlich auch über die Elementarzusammensetzung einer Verbindung (Rücker et al., 2013). Zur Identifizierung reiner Verbindungen ist die MS dementsprechend gut geeignet, doch bei der Analyse von mehreren Substanzen entstehen zu viele Fragmente mit unterschiedlichen m/z- Werten um verwertbare Ergebnisse zu liefern (Skoog et al., 1996). Aus diesem Grund fungiert die MS bei Kopplungen mit der GC oder der LC oft als Detektor. Vor allem die GC- MS ist zur Standardmethode der organisch- chemischen Analyse avanciert, da besonders niedrige Nachweisgrenzen für kleine Substanzmengen ausreichen. Die hohe Substanzspezifität und der Abgleich mit Spektren aus Bibliotheken ermöglichen eine Vielzahl an Informationen (Hesse et al., 1987).

31 3 Materialien und Methoden

3.6.1 GC- MS- Analyse

Als weitere Methode zur Trennung und Isolierung von Substanzen kann die Gaschromatographie herangezogen werden. Als mobile Phase dient hierbei ein Gas (Trägergas), während die stationäre Phase vom gewünschten Verfahren abhängt. Ist sie ein Feststoff spricht man von der Adsorptions- GC, bei flüssiger stationärer Phase von der Verteilungsgaschromatographie (Kolb, 2003).

Das Trägergas wird aus dem Druckbehälter über ein Einlaßventil in den Gaschromatographen geführt. Eine Trennsäule, die die stationäre Phase beinhaltet, befindet sich in einem thermostatisierten Ofen. Da das Ende der Säule mit einem Detektor verbunden ist, ist es möglich jede Änderung in der Zusammensetzung des Trägergases zu registrieren, sobald eine getrennte Substanz erscheint. Nach dem Umwandeln in ein elektrisches Signal, kann ein entsprechendes Datensystem die erhaltenen Informationen auswerten (Kolb, 2003). Prinzip der Trennleistung in der GC ist das Phänomen der Retention. Hierbei werden Stoffmoleküle vom Trägergas durch die Trennsäule befördert. Während die Moleküle der mobilen Phase sich stetig durch die Säule bewegen, wird der Analyt nur teilweise transportiert. Dies geschieht durch das Auftreten von Wechselwirkungen zwischen dem zu analysierenden Gemisch und der stationären Phase. Daraus resultiert eine Verzögerung der Wandergeschwindigkeit. Treten die eluierenden Substanzen am Ende der Säule in den Detektor werden sie dort als Peak registriert und umgewandelt (Kolb, 2003).

Zur Bestimmung der molaren Masse und zum Vergleich der Spektrogramme mit denen der Datenbanken wurden Proben von Echinops kebericho gaschromatographisch mit nachgeschaltetem massenselektiven Detektor vermessen. Bei der Analyse einer unbekannten Substanz mit unbekannten Eigenschaften ist es von Vorteil diese in einer parallel laufenden zweiten Messung in chemische Derivate umzuwandeln. Notwendig ist dieses Vorgehen zum Beispiel bei geringer Flüchtigkeit, hoher Polarität oder einer gewissen Zersetzungswahrscheinlichkeit beim Verdampfen u.a. (Rücker et al., 2013).

32 3 Materialien und Methoden

Als Derivatisierungsreagenz wurde vorgefertigtes Tri- Sil TBT- Reagenz verwendet, um polare funktionelle Gruppen durch Sylilierung in weniger polare Gruppen zu überführen, im gegenständlichen Fall ermöglicht es die Umwandlung von Hydroxylgruppen zu Trimethylsilylethern.

Gerät: Agilent Technologies 7890A GC- System 7683B Series Injector 5975C VL MSD Probenvorbereitung: 0,2 mg von EK_SF8_SF4 in 100 μl DCM 0,2 mg EK_SF8_SF4 in 100 μl Tri- Sil® TBT- Reagenz zur Derivatisierung der Hydroxylgruppen Stationäre Phase: Agilent 19091S-433, 30 m x 250 μm x 0,25 μm HP- 5MS 5 % Phenyl Methyl Siloxane Mobile Phase: Trägergas Helium 5.6 Datenbanken: NIST 05 Wiley 8N05

3.6.2 LC- MS- Analyse

Zum Erfassen nichtflüchtiger Proben kann auch eine HPLC mit einem Massenspektrometer gekoppelt werden, welcher als Detektor dient. Bei dieser Kopplung werden die Substanzen zuerst flüssigchromatographisch getrennt. Im Anschluss erfolgt eine Trennung aufgrund der unterschiedlichen Masse der Substanzen. Dieses Verfahren hat den Vorteil, nicht vollständig getrennte Stoffe zu identifizieren, solange sie sich in ihrer Masse unterscheiden (Rücker et al., 2013). Nach Ionisation der Analytmoleküle durch ein Ionisationsverfahren bei Atmosphärendruck (z.B. Elektrospray- Ionisation; ESI) erfolgt die Massenanalyse häufig durch eine Quadrupol- Ionenfalle, wie auch in der vorliegenden Arbeit. In diesem Fall wurde zusätzlich ein Photodioden- Array- Detektor zwischengeschalten, dabei wird die Lichtabsorption des Eluats in diesem Bereich gemessen. Das dadurch erhaltenen UV- Spektrum, bei dem die relative Absorption gegen die Wellenlänge aufgetragen wurde, gibt

33 3 Materialien und Methoden

Auskunft über die strukturellen Eigenschaften des Stoffes. Neben der schnellen Durchführung, hat diese Art der Arzneimittelanalyse auch den Vorteil einer relativ niedrigen Nachweisgrenze (Rücker et al., 2013).

Gerät: UltiMate 3000 RS Pump der Fa. Thermo Scientific UltiMate 3000 RS Autosampler UltiMate 3000 RS Column Compartment Massendetektor: LTQ XL™ Linear Ion Trap Mass Spectrometer der Fa. Thermo Scientific Probenvorbereitung: 0,2mg von EK_SF8_SF4 in 1ml Acetonitril Injektionsvolumen: 5 μl Stationäre Phase: Agilent Zorbax SB C-18 3,5 μm 150 mm x 2,1 mm Mobile Phase: Wasser mit 0,1% iger Ameisensäure, Acetonitril mit 0,1% iger Ameisensäure (siehe Tabelle 3) Durchflussrate: 0,25 ml/min Injektionstemperatur: 30 °C Kapillartemperatur: 330 °C Gasflüsse: Sheath gas flow : 50 Auxiliary gas flow: 10 Detektor: Dioden Array Detektor (DAD) detektiert bei den Wellenlängen 254 nm, 320 nm, 350 nm, 210 nm, im Wellenlängenbereich von 190- 500 nm

Zeit [min] Wasser [%] Acetonitril[%] 0 90 10 30 0 100 31 90 10 40 90 10 Tabelle 3.4: LC: Fließmittelgradient

34 3 Materialien und Methoden

3.7 Kernresonanzspektroskopie (NMR)

Die Kernresonanzspektroskopie (engl. nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) ist eine weitere Methode der Strukturaufklärung von Molekülen und stellt in der Pharmazie eine unverzichtbare Messmethode dar. Neben dem Hauptanwendungsgebiet der Strukturaufklärung, kann sie auch zur Konformationsanalyse von Arzneistoffen, Untersuchungen des Zustandes in Lösung und somit deren biologischen Wirkung, Identitätsprüfung und etwas seltener zur Reinheitsprüfung, sowie zur quantitativen Analyse herangezogen werden (Rücker et al., 2013). Untersucht wird das Verhalten von Atomkernen in Magnetfeldern, wobei nur Kerne mit Kernspin für die NMR- Spektroskopie geeignet sind. Das bedeutet sie müssen sich in einem statischen

Magnetfeld B0 um ihre eigene Achse drehen, wodurch ein nach außen wirksames magnetisches Moment entsteht. Diese Fähigkeit ist abhängig vom Aufbau der Atomkerne. Nur Elemente mit ungerader Ordnungszahl und/ oder Massenzahl besitzen einen Kernspin und sind somit für solche Messungen zugänglich (Rücker et al., 2013). Nimmt man als Beispiel ein Protonenresonanzspektrum, so werden die Kerne im Magnetfeld vom energieärmeren in den energiereicheren Zustand überführt. Die dafür benötigte Energie wird über elektromagnetische Strahlung (Radiowellen) zugeführt, die nur dann von den Atomkernen aufgenommen wird, wenn sie zur Überführung gerade ausreicht. Man spricht von Kernresonanz (Rücker et al., 2013). Von großer Bedeutung sind die Resonanzspektren von Protonen (1H) und 13C- Kernen, wobei auch andere Kerne der NMR zugänglich sind. Feststoffe müssen in Lösungsmittel aufgenommen werden, bei denen die Wasserstoffatome durch Deuteriumatome ersetzt sind. Grund dafür sind die nicht sichtbaren Kernresonanzsignale der Deuteriumatome bei den für die 1H-Spektren verwendeten experimentellen Bedingungen, obwohl sie durchaus magnetische Momente besitzen (Rücker et al., 2013). Die zwei isolierten Substanzen EK_SF4_F10 und EK_SF8_SF3_F15- 22- P1 (für Resultate siehe Kapitel 4.5.1) aus Echinops kebericho wurden mit Hilfe eines Kernresonanzspektrometers untersucht, um deren Struktur zu ermitteln.

Gerät: Varian Unitylnova 600 MHz Spectrometer

Lösungsmittel: deuteriertes Chloroform CDCl3 Messfrequenz: 1H: 400 MHz Temperatur: 25 °C

35 3 Materialien und Methoden

3.8 Antimykobakerielle Testung

3.8.1 Minimum Inhibitory Concentration- Assay (MIC- Assay)

Die minimale Hemmkonzentration (MHK; engl. minimum inhibitory concentration, MIC) ist definiert als niedrigste Konzentration einer antimikrobiell wirksamen Substanz bei der, nach 24 stündiger Inkubation, das sichtbare Wachstum eines Mikroorganismus gerade noch gehemmt wurde. Verwendung findet die MIC primär bei diagnostischen Resistenzuntersuchungen und um in vitro- Aktivitäten in neuen Antibiotika festzustellen (Andrews, 2001). Bestimmt wird der MIC- Wert durch einen Reihenverdünnungstest, hier durch einen Mikrobroth- Dilution- Assay (Coyle, 2009).

3.8.1.1 Durchführung des MIC-Assays

Gearbeitet wurde unter sterilen Bedingungen in einer Laminar Flow Box mit einem Mycobacterium smegmatis mc² 155- Stamm als Testbakterium (ATCC 14468).

Vorbereitung der Bakterienkultur Als Nährmedium wurde ein Columbia Blood Agar (CBA), ergänzt mit 5% defibriniertem Pferdeblut, verwendet. Um das benötigte Inokulum herzustellen wurde, der mit dem Mykobakterium beimpfte Agar, für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Gearbeitet wurde mit 96- Well- Platten, die es ermöglichten, für drei unterschiedliche Proben eine Doppelbestimmung durchzuführen, sowie für das als Standard- Antibiotikum eingesetzte Isoniazid. Zusätzlich wurde pro Platte jeweils eine Spalte zur Steril- und Wachstumskontrolle herangezogen.

Berechnung und Herstellung der Testlösungen Die zu untersuchenden Substanzproben wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Um die erforderlichen Startkonzentrationen zu erhalten, wurde anhand folgender Formeln die Menge DMSO berechnet:

36 3 Materialien und Methoden

[c] x 4 x V= x / 125 = Faktor

[c] ...... Startkonzentration (mg/l) der Testsubstanzen 4 ...... Verdünnungsfaktor V …...... Endvolumen in MHB (= 1ml) 125 …...... Pipettiervolumen (μl)

Faktor x 0,146 = Mindesteinwaage (mg)

0,146 …...... Mindestpipettiervolumen

Für einen Rohextrakt mit der Startkonzentration von 512 mg/l lässt sich dadurch ein Faktor von 16,384 berechnen, mit einer Mindesteinwaage von 2,392 mg. Dementsprechend wurde für einzelne Fraktionen mit einer Anfangskonzentration von 256 mg/l, bei einem Faktor von 8,192 mindestens 1,196 mg eingewogen. Mit Reinsubstanzen (Startkonzentration von 128mg/l) wurde nach dem gleichen Schema verfahren.

Einwaage (mg) / Faktor = Menge DMSO (ml)

Unter Berücksichtigung der exakten Einwaage, wurde adäquat mit DMSO verdünnt und je 50 μl dieser gelösten Proben mit 350 μl MBH (Mueller- Hinton Broth) vermischt. Für die Herstellung der INH- Lösung mit einer Startkonzentration von 16 mg/l wurde analog der Testlösungen zum aliqouten Anteil 875 μl MBH gegeben.

Abb. 3.2: Probenvorbereitung für den MIC- Assay

37 3 Materialien und Methoden

Herstellung der Bakteriensuspension Für die Herstellung der Suspension wurde die zuvor drei Tage lang inkubierte Bakterienkultur herangezogen. Mit Hilfe einer automatisierten Pipette wurden 2 ml einer 0,9 % igen NaCl- Lösung zugegeben und mittels einer sterilen Impfnadel die sichtbaren M. smegmatis Kolonien in die Flüssigkeit überführt. Um eine Bakteriendichte von 5x 105 CFU (engl. colony forming unit, kolonienbildende Einheit)/ ml zu erhalten, wurde zuerst eine Verdünnung von 108 CFU/ml angefertigt. Zu diesem Zweck wurden zu 10 ml der 0,9 % NaCl- Lösung, 100- 300 μl der Bakteriensuspension so zugegeben, dass deren Trübung optisch mit jener des McFarland- Standards 0,5 übereinstimmt. Daraus wurde 1ml entnommen und auf 10 ml mit NaCl- Lösung ergänzt. Die somit entstandene Lösung mit der Konzentration von 107 CFU/ml wurde nochmals verdünnt, diesmal im Verhältnis 1:5. Jene 20 ml mit der gewünschten Bakteriendichte von 5x 105 CFU/ml wurden für die Durchführung des Pipettierschemas verwendet.

Abb. 3.3: Herstellung der Bakteriensuspension für den MIC-Assay

Pipettierschema und Durchführung 1) Zu Beginn wurden, unter Zuhilfenahme einer Transferpette je 125 μl MHB in die Reihen A- H der Spalten 1- 11 der Microtiterplatte gegeben. 2) Nachdem die in DMSO aufgenommenen Testlösungen bzw. die Isoniazidlösung am Vortexer durchgemischt wurden, konnten jeweils 125 μl in Doppelbestimmungen in die Spalte 1 pipettiert werden.

38 3 Materialien und Methoden

3) Mit der Transferpette wurden die Lösungen nach 3- maligem Mischen der Reihe nach verdünnt. Zu diesem Zweck wurden aus allen Wells der ersten Spalte 125 μl entnommen und nach dem dritten Mal des Durchmischens in Spalte 2 überführt. Mit diesem Schema wurde bis Spalte 10 weiterverfahren. Die 125 μl wurden von dort direkt in Spalte 12 transferiert, unter Aussparung der 11. Spalte, da diese zur Wachstumskontrolle diente und später nur MBH und Bakteriensuspension enthalten sollte. 4) Im letzten Schritt wurden unter besonderer Vorsicht je 125 μl der zuvor hergestellten Bakteriensuspension ( 5x 105 CFU/ml) in alle Reihen der Spalten 1- 11 pipettiert. Vernachlässigt wurde in diesem Schritt die als Sterilkontrolle fungierende Spalte 12, die nur die Testlösungen aufwies.

Entwicklung der Mikrotiterplatten Die gefertigten Platten wurden in einer Plastikbox, unter Zugabe von Wasser, halb geöffnet in den Inkubator gegeben und exakt 72 h bei 37°C bebrütet.

Wachstumskontrolle Sterilkontrolle

Probe 1

Probe 2

Probe 3

Isoniazid

Abb. 3.4: Aufteilung der Microtiterplatte für den MIC- Assay

39 3 Materialien und Methoden

3.8.1.2 Auswertung des MIC- Assays

Um den MIC- Wert bestimmen zu können, wurde ein Indikator benötigt, der das Bakterienwachstum optisch sichtbar macht. Zweckdienlich hierfür war eine MTT- Indikator Lösung. Der wasserlösliche, gelbe Farbstoff 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromid (MTT), ein Tetrazoliumsalz, wird von lebenden, stoffwechselaktiven Zellen reduziert und zum blauen, wasserunlöslichen Formazan umgewandelt. Untersuchungen zeigten, dass die größte zelluläre MTT- Reduktion außerhalb der inneren Mitochondrialmembran auftritt und NADH und NADPH- abhängige Mechanismen umfasst. Daraus kann man schließen, dass diese Reduktionsvorgänge hauptsächlich außerhalb der Mitochondrien stattfinden und stattdessen von den Koenzymen NADH und NADPH abhängig sind, und nicht wie bisher angenommen allein von der Succinat- Dehydrogenase (Berridge et al., 1993). Während in den schwarz- blau gefärbten Wells Bakterienwachstum stattfand, wurde in den klaren, gelben Wells das Wachstum gehemmt. Die nachstehende Tabelle veranschaulicht die Konzentrationen der zu untersuchenden Substanzen in der Microtiterplatte. Der MIC- Wert wird ab dem Well abgelesen, ab dem eindeutig kein Bakterienwachstum mehr stattfand.

Well 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Rohextrakt[mg/l] 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 Fraktion [mg/l] 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0,5 INH [mg/l] 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 Tabelle 3.5: Konzentrationen der Wells auf der Mikrotiterplatte für die Auswertung des MIC- Wertes

40 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

4.1 Extraktion von Echinops kebericho

Es wurde eine Soxhlet- Extraktion der Wurzeln von Echinops kebericho durchgeführt (siehe Kapitel 3.2).

Droge Lösungsmittel Einwaage [g] Ausbeute[g] Ausbeute[%] Wurzeldroge von Hexan 171,8 8,6 5,0 E. kebericho Tabelle 4.1: Soxhlet- Extraktion- Einwaage und Ausbeute

4.2 Aufarbeitung des Hexan-Extraktes

Da die antimykobakterielle Wirkung des Rohextraktes von E. kebericho bereits in einer vorhergehenden Studie getestet wurde und einen MIC von 32 mg/l aufwies, wurde auch dieser auf seine Wirksamkeit geprüft.

4.2.1 Antimykobakterielle Testung des Hexan- Extraktes

Wie in Kapitel 3.8. beschrieben (siehe auch Durchführung), wurden für den Test ausschließlich Mykobakterien des Stammes M. smegmatis mc2 155 verwendet. Steril- und Wachstumskontrolle wurden durchgeführt, die Positivkontrolle Isoniazid wies einen MIC von 4 mg/l auf. Da es sich um einen Rohextrakt handelte, mit einer Startkonzentration von 512 mg/l, und das Bakterienwachstum ab Well 5 sichtbar war, konnte ein MIC- Wert von 64 mg/l ermittelt werden.

4.2.2 Grobfraktionierung mittels Säulenchromatographie

Nach Feststellen einer Wirksamkeit des Hexanextraktes (MIC = 64 mg/l) wurde eine säulenchromatographische Trennung durchgeführt. Für diese erste Grobfraktionierung wurden 8,6 g des Hexanextraktes eingesetzt und mit Hilfe eines Fließmittelgradienten, bestehend aus Hexan, Ethylacetat (EtOAc) und Methanol (MeOH) eluiert, wobei pro Gemisch jeweils 200 ml verwendet wurden. Für genaue Anleitung siehe Trennsäule I in Kapitel 3.4.

41 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Von den einzelnen Fraktionen wurden anschließend Dünnschichtchromatogramme angefertigt, die in den folgenden Abbildungen zu sehen sind.

Abb. 4.1: Übersichts- DC der einzelnen Fraktionen mit Anisaldehyd- H2SO4- Reagenz

Abb. 4.2: Übersichts- DC der einzelnen Fraktionen bei 254 nm

Abb. 4.3: Übersichts- DC der einzelnen Fraktionen bei 366 nm

Aufgrund der gewonnenen Informationen (siehe Abbildungen 4.1- 4.3) konnten die einzelnen Fraktionen zu Sammelfraktionen vereint werden, was eine Erleichterung bei der späteren Testung und eine größere Substanzmenge pro Fraktion zur Folge hatte.

42 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Zusammenlegung zu Sammelfraktionen: Sammelfraktion Fraktionen Ausbeute[g] EK_SF1 EK_1a-3a 0,0410 EK_SF2 EK_3b-4a 0,0095 EK_SF3 EK_4b-5a 0,7366 EK_SF4 EK_5b-6a 5,1276 EK_SF5 EK_6b 0,6354 EK_SF6 EK_7a 0,3094 EK_SF7 EK_7b 0,1297 EK_SF8 EK_8a 0,1145 EK_SF9 EK_8b-9a 0,0984 EK_SF10 EK_9b 0,0146 Tabelle 4.2: Zusammenlegung der Sammelfraktionen und deren Ausbeute

4.2.3 Antimykobakterieller Testung der Sammelfraktionen

Eine Bestimmung der antimykobakteriellen Aktivität aller Sammelfraktionen musste durchgeführt werden, da nicht bekannt war, welche Stoffgruppen für die Wirkung verantwortlich waren. Die Durchführung und Auswertung erfolgte wie in Kapitel 3.8 bereits geschildert.

4.2.3.1 Testergebnisse

Folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse (MIC- Werte) der Testung: Sammelfraktion MIC- Wert [mg/l] EK_SF1 256 EK_SF2 > 256 EK_SF3 > 256 EK_SF4 128 EK_SF5 128 EK_SF6 64 EK_SF7 64 EK_SF8 32 EK_SF9 32 EK_SF10 128 Tabelle 4.3: MIC- Werte der getesteten Fraktionen

43 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Wie aus der Tabelle zu entnehmen, zeigten die Fraktionen EK_SF8 und EK_SF9 mit einem MIC- Wert von 32 mg/l die beste antimykobakterielle Wirkung, weswegen mit diesen zuerst weitergearbeitet wurde.

4.3 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen

4.3.1 Fraktionierung mittels Säulenchromatographie

4.3.1.1 EK_SF8 und EK_SF9

Beide Sammelfraktionen enthielten noch zu viele verschiedene Komponenten, um eine Aufarbeitung mittels präparativer HPLC durchzuführen, deswegen wurden zuvor weitere säulenchromatographische Trennungen durchgeführt. Die genauen Parameter der Durchführung sind dem Kapitel 3.4 zu entnehmen.

Trennsäule II Für die Durchführung wurden 0,1145 g von EK_SF8 und 0,0984 g von EK_SF9 eingesetzt. Mit diesem SC- System wurden für beide Proben jeweils 40 Fraktionen aufgefangen, wobei die ersten drei je 10ml und die nachfolgenden je 5 ml umfassten. Als Sprühreagenz wurde diesmal Anisaldehyd- Schwefelsäure- Reagenz verwendet, da nur dieses zuvor positiv bei EK_SF8 und EK_SF9 auf der DC-Platte reagierte.

Abb. 4.4: DC der Fraktionen EK_SF8 F1-20 mit Anisaldehyd- H2SO4- Reagenz

44 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Abb. 4.5: DC der Fraktionen EK_SF8 F1-20 bei 254 nm

Abb. 4.6: DC der Fraktionen EK_SF9 F1-30 mit Anisaldehyd- H2SO4- Reagenz

Abb. 4.7: DC der Fraktionen EK_SF9 F1-30 bei 254 nm

Nach Begutachtung der angefertigten DCs wurden einzelne, ausgewählte Fraktionen aufgrund ihrer ähnlichen Banden erneut zu Sammelfraktionen vereint.

45 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Sammelfraktion Fraktionen Ausbeute[mg] EK_SF8_SF1 EK_SF8 F 2-4 16,6 EK_SF8_SF2 EK_SF8 F 5-7 14,5 EK_SF8_SF3 EK_SF8 F 8-11 15,3 EK_SF8_SF4 EK_SF8 F 12-16 10,3 EK_SF8_SF5 EK_SF8 F 17-20 3,4 EK_SF8_SF6 EK_SF8 F 21-26 3,8 EK_SF8_SF7 EK_SF8 F 27-40 4,3 Tabelle 4.4: Sammelfraktionen von EK_SF8 und deren Ausbeute

Sammelfraktion Fraktionen Ausbeute[mg] EK_SF9_SF1 EK_SF9 F2,3 3,9 EK_SF9_SF2 EK_SF9 F8-11 5,1 EK_SF9_SF3 EK_SF9 F19,20 3,1 EK_SF9_SF4 EK_SF9 F23-25 3,9 EK_SF9_SF5 EK_SF9 F 37-40 1,7 Tabelle 4.5: Sammelfraktionen von EK_SF9 und deren Ausbeute

Um zu ermitteln welche Substanzen für die antimykobakterielle Wirkung verantwortlich sind, wurde von allen vereinten Fraktionen ein MIC- Assay durchgeführt (Ergebnisse siehe Kapitel 4.3.2). Wie in den Tabellen 4.6 und 4.7 ersichtlich, waren EK_SF8_SF2, EK_SF8_SF3, EK_SF8_SF4 und EK_SF8_SF5, sowie EK_SF9_SF2 und EK_SF9_SF3 am aktivsten. Wegen der geringen Ausbeute konnte aber mit der Fraktion, die den besten MIC- Wert zeigte, EK_SF9_SF2 mit 16mg/l, keine weitere Säulentrennung durchgeführt werden. Da EK_SF8_SF3 ebenfalls einen guten MIC- Wert von 32 mg/l aufwies und mit einer Ausbeute von 15,3 mg für die SC geeignet war, wurde damit weitergearbeitet.

46 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

4.3.1.2 EK_SF8_SF3

Um für die präparative HPLC geeignet zu sein, musste die Probe eine größere Reinheit aufweisen, weswegen erneut säulenchromatographisch getrennt wurde. Trennsäule III (siehe Kapitel 3.4) Unter Verwendung der gesamten Probe (15,3 mg), wurden 40 Fraktionen zu je 5 ml aufgefangen und anhand von Dünnschichtchromatogrammen überprüft. Darauf war zu erkennen, dass sich die drei intensivsten Substanzbanden nicht über SC voneinander trennen ließen. Die Fraktionen 15- 22 wurden folglich vereinigt, um anschließend präparativ über HPLC getrennt zu werden (siehe Kapitel 4.4.1).

Abb. 4.8: DC von EK_SF8_SF3 F10-27 mit Anisaldehyd- H2SO4- Reagenz

4.3.1.3 EK_SF4

Da von EK_SF4 eine relativ hohe Ausbeute (5,1 g) erzielt wurde und von Echinops kebericho phytochemisch wenig bekannt ist, wurde auch dieses Substanzgemisch genauer untersucht. Für die Durchführung mit diesem SC- System (siehe Trennsäule IV in Kapitel 3.4) wurden 3 g der Probe auf die Säule aufgetragen und 45 Fraktionen zu je 20 ml eluiert, wobei die ersten drei zu je 50 ml aufgefangen wurden. Zur Überprüfung der Trennleistung und zur qualitativen Analyse wurden wieder DCs von allen erhaltenen Fraktionen angefertigt und mit Anisaldehyd- Schwefelsäure- Reagenz detektiert.

47 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Abb. 4.9: DC von EK_SF4 F 1- 16 mit Anisaldehyd- H2SO4- Sprühreagenz

Abb. 4.10: DC von EK_SF4 F17-32 mit Anisaldehyd- H2SO4- Sprühreagenz

Aufgrund der hohen Konzentration der Probe entstanden dementsprechend breite Banden und eventuelle Überlagerungen konnte nicht ausgeschlossen werden, weswegen zur Überprüfung der Trennleistung eine weitere DC- Analyse durchgeführt wurde. Durch die erheblich geringer konzentrierte Lösungen ließen sich klare Banden erkennen.

Abb. 4.11: DC von EK_SF4 mit Anisaldehyd- H2SO4- Sprühreagenz (weniger konzentriert)

48 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

4.3.2 Antimykobakterielle Testung

4.3.2.1 Testergebnisse

Unter Verwendung von M. smegmatis mc2 155 und einer Startkonzentration von 256 mg/l für die untersuchten Sammelfraktionen, wurde mit der zuvor schon beschriebenen Verfahrensweise weitergearbeitet (siehe Kapitel 3.9). In den nachstehenden Tabellen sind die erlangten MIC- Werte abzulesen, wobei Isoniazid bei allen Versuchen einen MIC- Wert von 4 mg/l aufwies.

Sammelfraktion MIC-Wert [mg/l] EK_SF8_SF1 64 EK_SF8_SF2 32 EK_SF8_SF3 32 EK_SF8_SF4 32 EK_SF8_SF5 32 EK_SF8_SF6 64 EK_SF8_SF7 128 Tabelle 4.6: MIC- Werte der einzelnen Sammelfraktionen von EK_SF8

Sammelfraktion MIC-Wert [mg/l] EK_SF9_SF1 256 EK_SF9_SF2 16 EK_SF9_SF3 32 EK_SF9_SF4 64 EK_SF9_SF5 256 Tabelle 4.7: MIC- Werte der einzelnen Sammelfraktionen von EK_SF9

Sammelfraktion MIC- Wert [mg/l] EK_SF4 F8 128 EK_SF4 F36-43 128 Tabelle 4.8: MIC- Werte ausgewählter Fraktionen von EK_SF4

49 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Nach Auftrennung von EK_SF8_SF4 über eine präparative DC (siehe Kapitel 4.4.2) wurden die erhaltenen Substanzen ebenfalls auf ihre antimykobakterielle Wirkung getestet.

EK_SF8_SF4 MIC- Wert [mg/l] Bande 1 16 Bande 2 32 Bande 3 >256 Tabelle 4.9: MIC- Werte einzelner Banden von EK_SF8_SF4 nach präparativer DC

Mit einem MIC- Wert von 16 mg/l wurde von allen untersuchten Proben für Bande 1 der Fraktion SF8_SF4 die beste Wirksamkeit gegen Mykobakterien erzielt. Es kann deswegen angenommen werden, dass diese Komponente einen Hauptwirkstoff darstellt. Insgesamt ist eine antimykobakterielle Wirksamkeit in mehreren Fraktionen zu finden und auch verschiedenen Substanzen zuzuordnen.

4.4 Isolierung der Reinsubstanzen aus den Fraktionen

4.4.1 Präparative HPLC

Genaue Angaben zu den Methoden und der Durchführung sind dem Kapitel 3.5 zu entnehmen. Zur Entfernung etwaiger Verunreinigungen und zur Auftrennung verschiedener Substanzen innerhalb einer Fraktion wurden die Proben EK_SF8_SF3 (F15-22), EK_SF4_F7, EK_SF4_F8 und EK_SF4_F10 mittels HPLC getrennt. Um das geeignete Laufmittelgemisch für eine optimale Auftrennung mittels HPLC zu gewährleisten, musste zuerst analytisch mit einem Gradienten (bestehend aus Acetonitril und Wasser) gearbeitet werden. Anschließend wurde eine isokratische Analyse durchgeführt, um das Mischungsverhältnis zu überprüfen und zu optimieren.

50 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Zeit [min] Wasser [%] Acetonitril[%] 0 35 65 20 35 65 Tabelle 4.10: Analytische HPLC: isokratische Elution von EK_SF8_F15-22

Zeit [min] Wasser [%] Acetonitril[%] 0 30 70 20 30 70 Tabelle 4.11: Analytische HPLC: isokratische Elution von EK_SF4_F7, EK_SF4_F8, EK_SF4_F10

4.4.1.1 EK_SF4_F10

Gearbeitet wurde auf Gerät II, wobei jeder Lauf 25 min betrug. Da nach Lösen in Acetonitril die Fraktionen einen Niederschlag aufwiesen, wurde nach dem Zentrifugieren der Überstand für die Bestimmung herangezogen (4 ml/Probe). Dabei stellte sich heraus, dass es sich bei den drei Proben aus EK_SF4 um idente Substanzen handelte, weswegen nur noch mit EK_SF4_F10 weiter gearbeitet wurde. Eingesetzte Menge vor Zugabe des ACN: 0,7075g EK_SF4_F 7 0,5824g EK_SF4_F 8 0,2541g EK_SF4_F10

Bei der Analyse der Probe auf Gerät I zeigte sich im erhaltenen Chromatogramm (siehe Abbildung 4.12) ein einzelner Peak von großer Intensität, was sich gut für ein präparatives Arbeiten eignete. Nach präparativer Trennung mit Gerät II waren am Chromatogramm neben kleineren Verunreinigungen allerdings zwei Peaks zu erkennen, wobei einer davon in Relation zum anderen, in viel höherer Konzentration vorlag. Beide wurden in 8 Läufen zu je 25 Minuten getrennt aufgefangen. Von der gewonnen Substanzmenge von 27,66 mg wurden 10 mg für die NMR- Messung benutzt.

51 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Abb. 4.12: Analytisches HPLC- Chromatogramm von EK_SF4_F10

4.4.1.2 EK_SF8_SF3 (F15- 22)

Bei dieser Probe wurde sowohl die analytische als auch die präparative Untersuchung auf Gerät 1 durchgeführt. Die genauen Messparameter sind in Kapitel 3.5.2 nachzulesen. Für die Bestimmung wurden 3,5 mg in 0,5 ml Acetonitril gelöst und ein Gemisch aus Acetonitril und Wasser als Laufmittel verwendet. Die Probe EK_SF8_SF3 F15- 22 wurde 10 mal injiziert, bei einer Messdauer von je 15 Minuten.

Zeit [min] Wasser [%] Acetonitril[%] 0 40 60 15 40 60 Tabelle 4.12: Fließmitteltabelle von EK_SF8_F15- 22

Im Chromatogramm (siehe Abbildung 4.13 und 4.14) war ein relevanter Peak zu erkennen, der neben den Verunreinigungen separat aufgefangen wurden. Mit dem Hauptpeak wurde anschließend weitergearbeitet. Die anderen Peaks aufgrund von zu geringer Ausbeute für weitere Untersuchungen verworfen. Schließlich wurde dünnschichtchromatographisch überprüft ob eine gute Trennung stattgefunden hatte.

52 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Abb. 4.13: Analytisches HPLC- Chromatogramm von EK_SF8_SF3_F15- 22

Im Endeffekt wurden dadurch 0,69 mg an Reinsubstanz gewonnen, die für die NMR verwendet werden konnten.

Abb. 4.14: Präparatives HPLC- Chromatogramm von EK_SF8_SF3_F15- 22

4.4.2 Präparative Dünnschichtchromatographie

4.4.2.1 EK_SF8_SF4

Wie der Tabelle 4.6 zu entnehmen ist, stellte sich auch die Sammelfraktion EK_SF8_SF4 als effektiv gegen die getesteten Mykobakterien heraus (MIC= 32mg/l). Leider wurde nur eine

53 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Ausbeute von 10,3 mg erreicht, die sich nach der antimykobakteriellen Testung auf 8,83 mg verringerte. Auf den angefertigten DCs waren drei eindeutige Banden zu erkennen, die eine Auftrennung durch ein präparatives DC möglich machten (Durchführung siehe Kapitel 3.3.1). Obwohl die gewonnenen Mengen sehr gering waren, ermöglichte dieses Vorgehen einen weiteren MIC- Assay und Messungen für die Strukturaufklärung, diese wird im nächsten Kapitel behandelt.

Bande Ausbeute [mg] Rf- Werte EK_SF8_SF4 B1 1,20 0,35 EK_SF8_SF4 B2 1,67 0,44 EK_SF8_SF4 B3 0,97 0,54 Tabelle 4.13: Ausbeute der einzelnen Banden von EK_SF8_SF4 nach präparativer DC

54 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

4.4.3 Übersicht- Aufarbeitung des Hexan- Extraktes

Abb. 4.15: Graphische Darstellung des Arbeitsvorganges

55 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

4.5 Strukturaufklärung

4.5.1 NMR

Zur Aufklärung der strukturellen Beschaffenheit der isolierten Reinsubstanzen wurde die NMR- Spektroskopie als Analysenmethode verwendet. Hierfür wurde ein Protonenresonanzspektrum und ein 13C- NMR- Spektrum angefertigt, um Anzahl und Kopplung der Atome zu eruieren. Zusätzlich wurde ein zweidimensionales heteronuklear korreliertes NMR- Spektrum (engl. heteronuclear single quantum coherence, HSQC) aufgenommen, in dem nur Signale von direkt gebundenen Wasserstoff- und Kohlenstoffatomen zu sehen sind. Dies erleichtert die Identifizierung der Substanzen, da es Informationen darüber liefert, welche Protonen an welche C- Atome gebunden sind (Rücker et al., 2013). Die Durchführung wird in Kapitel 3.7 beschrieben.

4.5.1.1 EK_SF4_F10

Leider führte die Auswertung der Spektren zunächst zu keinem genauen Ergebnis, da sowohl die Hauptkomponente, als auch etwaige Verunreinigungen in hoher Konzentration vorlagen. Erkennen ließ sich jedoch ein C15- Grundkörper, was auf ein Sesquiterpen schließen lässt. Als

Strukturmerkmal konnten drei endständige exozyklische CH2- Gruppen und ein Lacton ermittelt werden. Um genauere Aussagen treffen zu können, wurde eine GC- MS- Analyse durchgeführt, mit der eine molare Masse ermittelt werden konnte (siehe Kapitel 4.5.2.1). Die erhaltenen Informationen wiesen auf zwei Sesquiterpenlactone hin, Dehydrocostuslacton (DHCL) und Costunolid. Beide Substanzen wurden bereits für E. kebericho beschrieben. DHCL wurde inzwischen von R. Baptista (Baptista, 2014) aus einem weiteren Extrakt aus E. kebericho durch Kristallisation erhalten und konnte NMR- spektroskopisch vermessen werden. DHCL konnte durch das aufgenommene Protonenspektrum (Abb. 4.16), das 13C- Spektrum (Abb. 4.17) und durch das HSQC- Spektrum (Abb. 4.18) eindeutig identifiziert werden. Auch ein Vergleich der chemischen Verschiebung (δ in ppm) mit einer Publikation von Yuuya et al. (siehe Tabelle 4.14) bei der die Werte nahezu ident waren, zeigte eine Übereinstimmung (Yuuya et al., 1999).

56 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

25

15 24

23

22 10 2 9 21 1 3 8 20 5 4 19 6 7 18 11 17 12 13 14 16

15

14

13

12 11

10 9

8

7 6

5

4

3

2 1

0

-1 -2

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 f1 (ppm) Abb. 4.16: 1H- NMR- Spektrum von DHCL 7 8 0 6 8 8 8 1 1 2 7 0 5 5 7 2 1 2 1 7 1 8 ...... 1 0 6 1 2 5 9 2 1200 0 1 9 9 0 2 9 ...... 7 5 4 3 2 1 0 5 2 7 5 6 2 0 0 1 1 1 1 1 1 1 8 5 4 4 3 3 3 3

1100 C13 C4 C10 C11 C12 C15 C14 C6 C5 C1 C7 C9 C2 C3 C8 1000

15 900

10 800 2 9 1 3 8 5 700 4 6 7

600 11 13 14 12 500

400

300

200

100

0

-100

180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 f1 (ppm) Abb. 4.17: 13C- NMR- Spektrum von DHCL

57 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

20

30

40

50

60 )

70 m p p (

1 f

80

90

100

110

120

6.6 6.4 6.2 6.0 5.8 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 f2 (ppm) Abb. 4.18: HSQC- Spektrum von DHCL

Position δ 13C [ppm] δ 13C [ppm] aus Yuuya et.al, 1999 C1 47,61 47,60 C2 30,28 30,28 C3 32,57 32,57 C4 151,18 151,21 C5 52,02 52,01 C6 85,17 85,22 C7 45,12 45,11 C8 30,91 30,91 C9 36,21 36,24 C10 149,20 149,20 C11 139,76 139,73 C12 120,08 120,16 C13 170,17 170,24 C14 109,58 109,59 C15 112,58 112,60

Tabelle 4.14: NMR- Daten von DHCL (in CDCl3) und Referenzdaten (Yuuya et al., 1999)

58 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

4.5.1.2 EK_SF8_SF3_F15- 22- P1

Da die Fraktion in zu geringer Konzentration vorlag, konnte keine eindeutige Strukturaufklärung mittels NMR erfolgen. Eventuell handelt es sich um ein Thiophen, aber außer einer GC-MS- Analyse, konnten keine weiteren Untersuchungen angestellt werden.

4.5.2 GC-MS und LC-MS- Analysen

4.5.2.1 EK_SF4_F10

Im aufgenommenen Chromatogramm waren neben kleineren Verunreinigungen zwei Peaks

(Retentionszeit (tR) = 38,1 min bzw. 39,3 min; siehe Abb. 4.19) deutlich zu erkennen, die in ihrer Menge in etwa im Verhältnis 1:8 vorlagen. Dies ließ auf zwei verschiedene Substanzen schließen, welche als solche weder am Dünnschichtchromatogramm noch mit Hilfe der HPLC getrennt werden konnten. Um zu überprüfen ob freie Hydroxylgruppen im Molekül vorhanden waren, wurde eine Umsetzung mit Trimethylsilylierungsreagenz durchgeführt. Da sich die Substanzen nicht mit dem verwendeten Derivatisierungsreagenz umsetzten, kann davon ausgegangen werden, dass sie keine freien OH- Gruppen tragen.

Abb. 4.19: Gaschromatogramm EK_SF4_F10

Bei Peak 1 (tR= 38,1 min) konnte eine molare Masse von 232,2 g/mol festgestellt werden, was durchaus auf ein Sesquiterpen zutreffen könnte.

59 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Abb. 4.20: GC- MS von EK_SF4_F10 Peak 1

Bei Peak 2 (tR= 39,3) ergab die Messung eine molare Masse von 230,1 g/mol.

Abb. 4.21: GC- MS von EK_SF4_F10 Peak 2

Unter Verwendung vorhandener Literatur über die Gattung Echinops, konnten zwei Verbindungen gefunden werden, die mit diesen Daten übereinstimmen. Obwohl innerhalb der Compositae- Familie zahlreiche Sesquiterpen- Metabolite bekannt sind, gelang es Abegaz 1991 zum ersten Mal zwei bis dahin in E. kebericho unbekannte Substanzen zu isolieren. Laut dieser Publikation sind die Hauptvertreter der Sesquiterperne, die in etwa 10% des gesamten Echinops kebericho- Extraktes ausmachen, Dehydrocostuslacton und Costunolid (Abegaz et al., 1991). Beide Verbindungen sind allerdings bereits aus anderen Pflanzen bekannt.

60 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Dehydrocostuslacton Azuleno[4,5-b]furan-2(3H)-one, decahydro-3,6,9-tris(methylene)-, (3aS,6aR,9aR,9bS)- Azuleno[4,5-b]furan-2(3H)-one, decahydro-3,6,9-tris(methylene)-, [3aS-(3aα,6aα,9aα,9bβ)]-; Costus lactone, dehydro- (6CI,7CI); Guaia-4(15),10(14),11(13)-trien-12-oic acid, 6α-hydroxy-, γ-lactone (8CI); Epiligulyl oxide

Summenformel: C15H18O2 Molekulargewicht: 230,30 g/mol CAS Registry Number: 477-43-0 Diese Substanz wurde bereits in den Wurzelknollen von E. kebericho und E. amplexicaulis (Abegaz et al., 1991) und in den Wurzeln von E. kebericho (Tariku et al., 2011) und E. spinosissimus (Dawidar, 1990) gefunden.

Abb. 4.22: Strukturformel Dehydrocostuslacton

Costunolid Cyclodeca[b]furan-2(3H)-one, 3a,4,5,8,9,11a-hexahydro-6,10-dimethyl-3-methylene-, (3aS,6E,10E,11aR)- Costunolide (6CI); Germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-oic acid, 6α-hydroxy-, γ-lactone, (E,E)- (8CI); Costus lactone;

Summenformel: C15H20O2 Molekulargewicht: 232,32 g/mol CAS Registry Number: 553-21-9 Diese Substanz wurde bereits in den Wurzelknollen von Echinops kebericho gefunden (Abegaz et al., 1991).

61 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Abb. 4.23: Strukturformel Costunolid

4.5.2.2 EK_SF8_SF3_F15- 22- P1

Für EK_SF8_SF3_F15- 22 konnte eine molare Masse von 214,1 g/mol ermittelt werden. Durch Zugabe eines Sigma Sil- A- Reagenz kam es zur Umsetzung einer freien OH- Gruppe zu einem Trimethylsilylether, was die Massendifferenz Δ 72 erklärt. Die Art der Fragmentierung weist außerdem stark auf ein Thiophen hin. Schwefel kann mit einem benachbarten C- Atom zerfallen, was eine Differenz von 44 Masseneinheiten ergibt (m/z 183; m/z 139). Außerdem sind die Signale bei m/z 44 bzw. bei m/z 45 ebenfalls Indikatoren für das Vorhandensein eines heterozyklischen Schwefels (Pretsch et al., 2000).

Abb. 4.24: GC-MS von EK_SF8_SF3 F15- 22

62 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Abb. 4.25: GC- MS EK_SF8_SF3 F15-22 nach Derivatisierung mit Sigma- Sil- A

Nach Vergleich der Resultate mit den in der Gattung Echinops L. bereits identifizierten Thiophenen, konnte eine Übereinstimmung mit einer bereits publizierten Substanz gefunden werden. Diese fand bereits Erwähnung in mehreren Publikationen, allerdings wurde sie, soweit bisher bekannt, noch nie aus E. kebericho isoliert.

2-(Penta-1,3-diynyl)-5-(4-hydroxybut-1-ynyl)-thiophen 4-[5-(1,3-pentadiyn-1-yl)-2-thienyl]-3-Butyn-1-ol

Summenformel: C13 H10 O S Molekulargewicht: 214,28 g/mol CAS Registry Number: 1209-21-8 Diese Substanz wurde u.a. in den Wurzeln von E. grijsii Hance (Zhang et al., 2010); E. pappii (Äthiopien) (Abegaz, 1991); E. giganteus, E. ellenbeckii und E. longisetus gefunden (Abegaz et al., 1991).

Abb. 4.26: Strukturformel von 2-(Penta-1,3-diynyl)-5-(4-hydroxybut-1-ynyl)-thiophen

63 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Die Substanz EK_SF8_SF3_F15- 22 stimmte hinsichtlich der Molmasse, sowie dem Vorliegen einer freien Hydroxylgruppe und eines Thiophens mit dem Strukturvorschlag (siehe Abb. 4.26) überein. Eine exakte Strukturermittlung war aber aufgrund zu geringer Substanzmenge nicht möglich.

4.5.2.3 EK_SF8_SF4_B1

Aufgrund der geringen Ausbeute von 1,2 mg, war es vorteilhaft die Probe EK_SF8_SF4_B1 mit Hilfe der GC und LC gekoppelt mit massenselektiven Detektoren zu vermessen. Diese Methoden garantieren die höchste Substanzspezifität und sie reagieren bereits auf geringste Mengen empfindlich (Rücker et al., 2013). Laut einer Veröffentlichung von Lam et al. erwies es sich als schwierig den Alkohol 5'-(3-Buten- 1-yn-1-yl)-[2,2'- bithiophene]-5-methanol mittels GC- MS zu detektieren, obwohl dessen Anwesenheit in den Wurzeln von Echinops- Arten nicht auszuschließen ist (Lam et al., 1991). Bohlmann spricht in seiner Publikation von „ungewöhnlich viele[n] […] äußert schwer trennbar[en]“Acetylenkomponenten, welche erst nach mehreren säulen- und dünnschichtchromatographischen Trennungen rein vorliegen (Bohlmann et al., 1965). Beide Angaben stimmen mit den in dieser Untersuchung gewonnenen Erkenntnissen überein, reichen aber noch nicht für eine eindeutige Identifizierung. Hierfür mussten UV- Spektren und Massenspektrogramme aus vorhergehenden Studien herangezogen und gegenüber gestellt werden.

Abb. 4.27: EI- Massenspektrum von EK_SF8_SF4_B1

64 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Abb. 4.28: UV- Chromatogramm von EK_SF8_SF4_B1

Abb. 4.29: UV- Spektrum von EK_SF8_SF4_B1

Weder bei der GC- MS noch bei der LC- MS konnten die verwendeten Datenbanken der Fraktion eine bekannte Strukturformel zuordnen. Jedoch ließ sich ein Molekulargewicht von M= 246,3 g/ mol (siehe Abb. 4.27) feststellen. Anhand dieser Information konnte unter Verwendung des Chemical Abstract Services (CAS) das Molekulargewicht, der in Echinops bereits gefundenen Stoffe, mit der molaren Masse von 246,3 g/mol verglichen werden.

65 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Dies führte zu zwei Übereinstimmungen:

Arctinon b 1-[5'-(1-Propyn-1-yl)[2,2'-bithiophen]-5-yl]- ethanon

Summenformel: C13H10S2 Molekulargewicht: 246,35 g/mol CAS Registry Number: 102054-40-0 Diese Substanz wurde bereits in den Wurzeln von E. latifolius und E. grijsii gefunden (Qiao et al., 2010).

Abb. 4.30: Strukturformel von Arctinon b

5'-(3-Buten-1-yn-1-yl)-[2,2'- bithiophene]-5-methanol 2-Hydroxymethyl-5-[5-(but-3-en-1-ynyl)-2-thienyl]thiophene; 5'-Hydroxymethyl-5-(3-buten-1- ynyl)-2,2'-bithiophene

Summenformel: C13H10OS2 Molekulargewicht: 246,35 g/mol CAS Registry Number: 1211-41-2 Diese Substanz wurde bereits u.a. in den Wurzeln von E. sphaerocephalus.und E. ritro gefunden (Bohlmann et al., 1965).

Abb. 4.31: Strukturformel von 5'-(3-buten-1-yn-1-yl- [2,2'Bithiophene]-5- methanol

66 4 Experimenteller Teil mit Ergebnissen

Leider lieferte das LC- MS- Chromatogramm keine zusätzlichen Informationen, da die Verbindung weder im positiven noch im negativen Bereich ionisierbar war. Für Polyacetylene wurde dieses Phänomen ebenfalls beschrieben. Beim Vergleich, des aufgrund der vielen Absorptionsmaxima charakteristischen UV- Spektrums, konnte zwar eine Ähnlichkeit mit Arctinon b gefunden werden, allerdings keine Übereinstimmung. In vorangegangenen Studien wurden Maxima bei UV λ EtOH (nm) 370, 267, 262, 222 (Washino et al., 1986), bzw. bei UV λ MeOH (nm) 373, 262, 220, 204 (Wei et al., 1997) gemessen. Auch die Art der Fragmentierung wie sie im EI- Massenspektrum zu sehen ist (Abb. 4.27) lässt keinen Rückschluss auf Arctinon b zu. EI- MS- Daten bisheriger Studien weisen folgende Peaks auf: EIMS m/z (int.): 246 [M+] (100), 231 [M- CH3]+ (80), 203 (35), 171 (5), 159 (43), 149 (32), 115 (12), 69 (10), 57 (15) (Wei et al., 1997) Dies stimmt nicht mit den gemessenen Daten überein, somit kann die Substanz EK_SF8_SF4_B1 nicht identifiziert werden.

67 5 Diskussion

5 Diskussion

Der aus den Wurzeln von E. kebericho gewonnene Hexanextrakt wies nach antimykobakterieller Testung einen MIC- Wert von 64 mg/ml auf. Aufgrund dieses Ergebnisses wurde der Extrakt säulenchromatographisch aufgearbeitet, um dessen wirksame Komponenten zu bestimmen. Besonderes Augenmerk wurde auf die Fraktionen mit der besten Aktivität (= MIC- Wert: 16 mg/ ml bzw. 32 mg/ml) gegen das Testbakterium M. smegmatis mc2 155 gelegt. Da nach Isolierung der Reinsubstanzen aus den Fraktionen EK_SF8_SF3_F15-22 und EK_SF8_SF4 nur noch geringe Substanzmengen für die Strukturaufklärung zur Verfügung standen, konnte keine NMR- Untersuchung durchgeführt werden. Jedoch kann aufgrund von GC- MS- und LC- MS- Analysen davon ausgegangen werden, dass es sich bei beiden isolierten Stoffen um Substanzen aus der Klasse der Thiophene handelt. Diese wurden schon aus einigen Echinops- Spezies isoliert und beschrieben. Schon Bohlmann et al. berichtete in seiner Publikation über das Vorhandensein von zahlreichen Acetylenverbindungen, die ein Auftrennen des Extraktes erschweren (Bohlmann et al., 1965). Das Thiophen 2-(Penta-1,3-diynyl)-5-(4-hydroxybut-1-ynyl)-thiophen in EK_SF8_SF3_F15-22 zeigte eine übereinstimmende molare Masse von 214 g/mol, sowie eine freie Hydroxylgruppe, die sich an der Alkinkette befindet. Für eine sichere Identifizierung sind jedoch NMR- Untersuchungen notwendig. Laut Abegaz et al. (1991) ist E. kebericho thiophenfrei. Somit liegt möglicherweise eine Verunreinigung des Pflanzenmaterials mit einer thiophenhaltigen Echinops- Art vor. Dies ist nicht unwahrscheinlich, da auch die Spezies E. pappii in Äthiopien beheimatet ist und in dieser das Thiophen bereits nachgewiesen wurde (Abegaz, 1991). Auch das zweite Thiophen ließ sich nicht einwandfrei zuordnen, weiterführende Untersuchungen müssen dies erst abklären. Gewisse Übereinstimmungen mit Arctinon b, einem Bithiophen, das schon aus E. latifolius und E. grijsii isoliert wurde, konnte ebenfalls gefunden werden. Dennoch erfordert diese Identifizierung weitere Untersuchungen zur Aufklärung der Struktur.

Um Informationen zur phytochemischen Zusammensetzung von E. kebericho zu erhalten und aufgrund der vergleichsweise hohen Ausbeute (5,1g) wurde EK_SF4_F10 zur genaueren Untersuchung herangezogen. Wieder führten NMR- Messungen zu keinem genauen Ergebnis, diesmal aber infolge von Verunreinigungen, die in zu hoher Konzentration vorlagen. Die Hauptkomponenten dieser Fraktion besitzt einen C15- Grundkörper, bestehend aus mehreren

68 5 Diskussion

exozyklischen CH2- Gruppen und einem Lacton, das alles in allem auf die Struktur eines Sesquiterpenlactons hinweist. Gerade diese Substanzklasse findet man häufig in der Familie der Asteraceae (Abegaz et al., 1991). Aufgrund der durch GC- MS gefundenen molaren Massen von 230 g/mol bzw. 232 g/mol, ergaben sich Hinweise auf zwei Sesquiterpenlactone (STL), die auch oft in dieser Kombination natürlich vorkommen. Dehydrocostuslacton (DHCL; 230,30 g/mol) und Costunolid (232,32 g/mol) werden beide als Hauptkomponenten in E. kebericho beschrieben (Abegaz et al., 1991) und konnten somit auch in dieser Arbeit als Inhaltsstoffe identifiziert werden. Ein zwischenzeitlich erfolgter neuerliche Isolierungsversuch von R. Baptista (Baptista, 2014) führte zu kristallinem DHCL, das ebenfalls für NMR spektroskopische Messungen herangezogen werden konnte.

Da die aktiven Inhaltsstoffe nicht bekannt waren, erfolgte nach jeder weiteren Auftrennung des Hexanextraktes eine Testung der Fraktionen auf deren antimykobakterielle Wirkung. Vor allem die Sammelfraktionen EK_SF8 und EK_SF9 sind von Bedeutung, da beide einen MIC- Wert von 32 mg/l hatten und in beiden Thiophene nachgewiesen werden konnten, weswegen davon ausgegangen werden kann, dass diese die aktive Komponente darstellen. Unterstützt wird diese Annahme durch eine Publikation von Fokialakis et al. in der den Thiophenen aus Echinops eine insektizide und fungizide Aktivität nachgesagt wird (Fokialakis et al., 2006). In dessen Untersuchung wurde eine 100% ige Wachstumshemmung gegen Colletotrichum gloeosporioides und gegen Fusarium oxysporum durch 2-(Penta-1,3-diynyl)-5- (4-hydroxybut-1-ynyl)- thiophen nachgewiesen (Fokialakis et al., 2006). Zudem wurde die Zytotoxizität verschiedener Vertreter dieser Substanzklasse untersucht, darunter auch 2-(Penta-1,3-diynyl)-5-(4-hydroxybut-1-ynyl)-thiophen, welches aus den Wurzeln von E. grijisii Hance gewonnen wurde. Getestet wurde die Wirkung der Substanz auf humane Krebszellen (der Stämme HL60 und K562), wobei sich eine starke zytotoxische Aktivität mit einem IC50 von 0,23 μg/ml bzw. 0,47 μg/ml feststellen ließ. Verantwortlich für dieses Ergebnis sollen die substituierten Alkingruppen an den beiden Seiten des Monothiophens sein (Zhang et al., 2009).

Zahlreiche Sesquiterpenlactone (STL) wurden schon positiv auf deren antibiotische Wirkung getestet und auf unterschiedliche Bakterienstämme untersucht. Nicht ohne Grund wird auf

69 5 Diskussion

Pflanzen, die STL enthalten, in der traditionellen afrikanischen Medizin gekaut, die dort wegen ihrer antimikrobiellen Eigenschaften der Mundhygiene dienen (Bachelier et al., 2006). Auch über die Aktivität der Sesquiterpenlactone, die in der Fraktion SF4_SF10 in hoher Konzentration gefunden wurden, liegen einige Berichte vor. Dehydrocostuslacton, gewonnen aus den Wurzeln von E. kebericho, zeigte eine starke toxische Wirkung gegen begeißelte (MIC-

Wert: 0,0097- 0,0765 μl/ml) und unbegeißelte (EC50 0,00024 – 0,0005 nl/ml) Leishmanien. Da die meisten Inhaltsstoffe essentieller Öle kein spezielles Target zu haben scheinen, könnte darin die Erklärung für die antileishmanische Wirkung liegen. Lipophile Strukturen dringen leichter in die Zellwände ein, durchbrechen die Strukturen aus Polysacchariden, Fettsäuren und Phospholipiden und machen diese permeabel. Infolgedessen kommt es zur Lyse der Zellen und Freisetzung von Makromolekülen. Dies schädigt die Zelle und verhindert metabolische Vorgänge, was wiederum zum Zelltod führen kann (Tariku et al., 2011). Dehydrocostuslacton ist allerdings nicht als Bestandteil des ätherischen Öls anzusehen und weist eine kristalline Struktur auf (Fronczek et al., 1989).

Dass es auch einen Zusammenhang zwischen der Lipophilie von STL und deren antimykobakteriellen Eigenschaften gibt, bestätigt eine weitere Studie von Cantrell (Cantrell et al., 1998). Dehydrocostuslacton (DHCL) und einige Derivate wurden in vitro auf M. tuberculosis und M. avium getestet, wobei DHCL eindeutig die beste Wirkung zeigte (MIC= 2 μg/ml bzw. 16 μg/ml). Gleichzeitig war es auch die lipophilste Substanz und besitzt keine Hydroxylgruppe, die sich negativ auf die antimykobakterielle Aktivität auswirkt. Eventuell wird dies durch die erhöhte Polarität hervorgerufen, die möglicherweise den Transport durch die äußeren Schichten des Mykobakteriums verringert, was bedeuten würde, dass die Wirkung über den Transport durch die äußeren Schichten des Mykobakteriums kontrolliert werden kann (Cantrell et al., 1998). Beide in dieser Arbeit gefundenen STL (Dehydrocostuslacton und Costunolid) sind auch im ätherischen Öl von Laurus novocanariensis zu finden. Bei der Testung auf antimykobakterielle Aktivität wurden Kombinationen der reinen Lactone zu ½ , ¼, und ⅛ der zuvor definierten minimalen Hemmkonzentration von ≤ 50 mg/l des gesamten Lorbeeröls verwendet, um einen eventuellen Synergismus zwischen den beiden STL festzustellen. Dabei waren die einzelnen reinen Komponenten weniger aktiv als die gesamte Fraktion, was die Theorie eines synergistischen Effekts bestätigen würde. Erwähnenswert ist auch die eindeutige Inhibition des

70 5 Diskussion

Wachstums von M. tuberculosis, einschließlich der resistenten Formen, aber nicht gegen die nicht- pathogenen Mykobakterien (wie M. smegmatis). Erneut wird die gute Wirkung von DHCL der hohen Lipophilie zugeschrieben, da das Hinzufügen von Hydroxylgruppen die Aktivität reduzierte (Luna-Herrera et al., 2007). Auch in einer weiteren Publikation wird ein möglicher synergistischer Effekt zwischen den in E. kebericho vorhandenen kleineren Komponenten beschrieben, die eventuell gemeinsam zur biologischen Aktivität beitragen (Tariku et al., 2011).

71 6 Zusammenfassung

6 Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurden die getrockneten Wurzeln des aus Äthiopien stammenden Echinops kebericho (Asteraceae) phytochemisch untersucht und auf dessen antimykobakterielle Wirkung getestet. Hauptaugenmerk wurde dabei auf die wirksamen Inhaltsstoffe des Hexanextraktes gelegt, mit dem Ziel, neue Erkenntnisse über deren Zusammensetzung zu gewinnen. Die Inhaltsstoffe waren generell von Interesse, da über die Phytochemie von E. kebericho noch relativ wenig bekannt ist. Die wachstumshemmenden Eigenschaften des Hexanextraktes auf M. smegmatis wurden bereits in einer vorangegangenen Arbeit getestet, weshalb wieder mit diesem Lösungsmittel mittels Soxhlet extrahiert wurde. Nach Bestätigung der Wirksamkeit des Rohextraktes (MIC- Wert 64 mg/ml) konnte mit der Aufarbeitung begonnen werden. Getrennt wurde mit Kieselgel über eine Säule und einem Fließmittelgemisch bestehend aus Hexan, Ethylacetat und Methanol. Nach anschließender antimykobakterieller Testung wurden folgende Resultate erhalten:

Sammelfraktion MIC-Wert [mg/l] Ausbeute[g] EK_SF1 256 0,041 EK_SF2 > 256 0,0095 EK_SF3 > 256 0,7366 EK_SF4 128 5,1276 EK_SF5 128 0,6354 EK_SF6 64 0,3094 EK_SF7 64 0,1297 EK_SF8 32 0,1145 EK_SF9 32 0,0984 EK_SF10 128 0,0146 Tabelle 6.1: MIC- Werte und Ausbeuten der getesteten Fraktionen

Wegen der guten Wirksamkeit wurde mit den Sammelfraktionen EK_SF8 und EK_SF9 weitergearbeitet. EK_SF4 konnte aufgrund der vergleichbar hohen Ausbeute von 5,1 g genauer untersucht werden. Die Fraktionen enthielten noch einige Verbindungen und mussten erneut

72 6 Zusammenfassung säulenchromatographisch getrennt werden. Nach jeder Trennung wurde ein weiterer MIC- Assay durchgeführt, um die wirksamen Fraktionen zu eruieren. Das beste Ergebnis lieferte die Probe EK_SF8_SF4_B1 mit einem MIC- Wert von 16 mg/l. Gleich mehrere Fraktionen hatten einen Wert von 32 mg/l, davon wurde aber aus Zeitgründen nur EK_SF8_SF3 näher untersucht. Um die Reinsubstanzen zu isolieren wurde einerseits mittels präparativer HPLC getrennt, mit einem Laufmittelgemisch aus Wasser und Aceton, andererseits wurde bei EK_SF8_SF4_B1 eine präparative Dünnschichtchromatographie angewandt, da die Ausbeute für andere Methoden zu gering war. Zur Aufklärung der Struktur wurden die Proben anschließend mittels GC- MS, LC- MS und NMR- Spektroskopie vermessen. Die Zuordnung zu den letztendlich identifizierten Substanzen, erfolgte durch Vergleich von Massenspektren, UV-Spektren und der molaren Masse mit vorhandener Literatur über Echinops L.

Costunolid Dehydrocostuslacton

Substanz Isoliert aus MIC- Wert [mg/l] Thiophen (MG = 214,28 g/mol) + freie EK_SF8_SF3_F15- 32 Hydroxylgruppe 22 Dehydrocostuslacton EK_SF4_SF10 128 (im Mengenverhältnis etwa 8:1) (gesamte Fraktion) Costunolid EK_SF4_SF10 128 (im Mengenverhältnis etwa 8:1) (gesamte Fraktion) Tabelle 6.2: Isolierte Substanzen, Fraktionen und MIC- Werte

73 6 Zusammenfassung

Dehydrocostuslacton und Costunolid sind Sesquiterpenlactone, die bereits in E. kebericho beschrieben werden. Sie konnten in verhältnismäßig großer Menge aus EK_SF4_F10 gewonnen werden. Mit einem MIC- Wert von 128 mg/ml zählte die Fraktion nicht zu den antimykobakteriell Aktivsten dieser Arbeit. Eine getrennte Testung der beiden STL war leider nicht möglich, da sich die Isolierung, vermutlich aufgrund deren Ähnlichkeit, als schwierig herausstellte. Andererseits wurde bei Luna- Herrera et al. eben diese Kombination der STL als vorteilhaft beschrieben, da sie offensichtlich einen synergistischen Effekt aufweist (Luna-Herrera et al., 2007). Schon zuvor wurde über polyacetylenische Thiophene in mehreren Echinops- Arten berichtet, was sich nach vorläufigen Ergebnissen auch in der hier vorliegenden Arbeit zu bestätigten scheint. Jene Fraktionen, in denen die vermuteten Thiophene vorlagen, wiesen die stärkste antimykobakterielle Wirkung auf, jedoch ist eine weitere, vollständige Strukturaufklärung nötig, gegebenenfalls mit Hilfe einer NMR- Spektroskopie um diese Vermutung zu bestätigen. Angesichts der erzielten MIC- Werte wären eingehende phytochemische und antimykobakterielle Untersuchungen und eine größere Menge an Pflanzenmaterial in Erwägung zu ziehen. Ein synergistischer Effekt der in E. kebericho enthaltenen Wirkstoffe ist allenfalls zu untersuchen. Abschließend kann man feststellen, dass E. kebericho hinsichtlich seiner Wirkung gegen Mykobakterien ausgehend von einer größeren Menge Pflanzenmaterial detaillierter analysiert werden sollte. Das als Hexanextrakt vorliegende Sesquiterpenlacton Dehhydrocostuslacton stellt jedenfalls eine für die antimykobakterielle Wirkung wichtigen Wirkstoff dar.

74 7 Literaturverzeichnis

7 Literaturverzeichnis

Abegaz, B. M. (1991). Polyacetylenic thiophenes and terpenoids from the roots of Echinops pappii. Phytochemistry 30, 879– 81.

Abegaz, B. M., Tadesse, M., Majinda, R. (1991). Distribution of sesquiterpene lactones and polyacetylenic thiophenes in Echinops. Biochemical Systematics and Ecology 19, 323– 8.

Agertt, V. A., Marques, L. L., Bonez, P. C., Dalmolin, T. V., Manzoni de Oliveira, G. N., Campos, M. M. A. de (2013). Evaluation of antimycobacterial activity of a sulphonamide derivative. Tuberculosis (Edinburgh, Scotland) 93, 318– 321.

Aktories, K., Forth, W., Allgaier, C. (2009). Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie. Elsevier, Urban & Fischer, München.

Andrews, J. M. (2001). Determination of minimum inhibitory concentrations. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy 48, 5– 16.

Bachelier, A., Mayer, R., Klein, C. D. (2006). Sesquiterpene lactones are potent and irreversible inhibitors of the antibacterial target enzyme MurA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 16, 5605– 5609.

Baltisberger, M., Nyffeler, R. (2013). Systematische Botanik. vdf Hochschulverlag, Zürich.

Baptista, R. (2014). Antimycobacterial and resistance modifying activity of Echinops kebericho Mesfin roots. Book of Abstracts, 56.

Battegay, E. (2013,). Siegenthalers Differenzialdiagnose. Thieme, Stuttgart.

Berridge, M. V., Tan, A. S. (1993). Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics 303, 474– 482.

Bohlmann, F., Arndt, C., Kleine, K. M., Bornowski, H. (1965). Polyacetylene compounds. LXIX. The acetylene compounds of the genus Echinops. Chemische Berichte 98, 155– 63.

Brennan, P. J., Nikaido, H. (1995). The envelope of mycobacteria. Annual Review of Biochemistry 64, 29– 63.

75 7 Literaturverzeichnis

Bühring, U., Ell-Beiser, H., Girsch, M. (2010). Arbeitsheft moderne Heilpflanzenkunde. Haug, Stuttgart.

Cai, M., Chen, W., Nie, Y., Chi, C., Wang, Y., Tang, Y., Li, G., Wu, X. (2011). Complete Genome Sequence of Amycolicicoccus subflavus DQS3-9A1T, an Actinomycete Isolated from Crude Oil- Polluted Soil. Nature Reviews 193, 4538– 4539.

Cantrell, C. L., Nunez, I. S., Castaneda-Acosta, J., Foroozesh, M., Fronczek, F. R., Fischer, N. H., Franzblau, S. G. (1998). Antimycobacterial activities of dehydrocostus lactone and its oxidation products. Journal of Natural Products 61, 1181– 1186.

Chevrier, M. (1976). The flavonoids of Echinops ritro. Fitoterapia 47, 115– 17.

Daleva, L., Stefanova, D. (1980). Echinopsine - neuropharmacological study. II. Effect on drug models of excitation and depression of the central nervous system. Farmatsiya (Sofia, Bulgaria) 30, 28– 34.

Davies, P. D. O., Barnes, P. F., Gordon, S. B. (2008). Clinical tuberculosis. Hodder Arnold, London.

Dawidar, A. (1990). Sesquiterpene lactones from Echinops spinosissimus. Die Pharmazie 45, 70.

Dellas, C. (2006). Crashkurs Pharmakologie. Elsevier, Urban & Fischer, München [u.a.].

Deretic, V., Singh, S., Master, S., Harris, J., Roberts, E., Kyei, G., Davis, A., Haro, S. de, Naylor, J., Lee, H.-H., Vergne, I. (2006). Mycobacterium tuberculosis inhibition of phagolysosome biogenesis and autophagy as a host defence mechanism. Cellular Microbiology 8, 719– 727.

Dhiman, H., Dhanjal, J. K., Sharma, S., Chacko, S., Grover, S., Grover, A. (2013). Resisting resistant Mycobacterium tuberculosis naturally: mechanistic insights into the inhibition of the parasite's sole signal peptidase Leader peptidase B. Biochemical and Biophysical Research Communications 433, 552– 557.

Eckart, W. U. (2011). Illustrierte Geschichte der Medizin. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Berlin Heidelberg.

Fokialakis, N., Cantrell, C. L., Duke, S. O., Skaltsounis, A. L., Wedge, D. E. (2006). Antifungal activity of thiophenes from Echinops ritro. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54, 1651– 1655.

76 7 Literaturverzeichnis

Förstner, U., Raudschus, M., Reichert J.K. (1997). Chemie und Biologie der Altlasten. VCH, Weinheim.

Frohne, D., Jensen, U. (1973). Systematik des Pflanzenreichs. G. Fischer, Stuttgart.

Fronczek, F. R., Vargas, D., Parodi, F. J., Fischer, N. H. (1989). Structure of the guaianolide dehydrocostus lactone. Acta Crystallographica, Section C: Crystal Structure Communications 45, 1829– 31.

Geginat, G., Hof, H. (2000). Mikrobiologie. Thieme, Stuttgart.

Glickman, M. S., Cox, J. S., Jacobs Jr. , William R (2000). A Novel Mycolic Acid Cyclopropane Synthetase Is Required for Cording, Persistence, and Virulence of Mycobacterium tuberculosis. Molecular Cell 5, 717– 727.

Gottschlich, G. (2005). Exkursionsflora für Österreich, Liechtenstein und Südtirol. OÖ Landesmuseen, Linz.

Hahn, H., Kaufmann, S., Schulz, T. F., Suerbaum S. (2009). Medizinische Mikrobiologie und Infektiologie. Springer, Heidelberg.

Halim, A., Halim (2011). The fact about echinopsine and first isolation of echinorine from Echinops spinosus L. Journal of Environmental Sciences (Mansoura, Egypt) 40, 173.

Hesse, M., Meier, H., Zeeh, B. (1987). Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie. Thieme, Stuttgart [u.a.].

Hien, P. (2012). Praktische Pneumologie. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg.

Hymete, A., Iversen, T.-H., Rohloff, J., Erko, B. (2005). Screening of Echinops ellenbeckii and Echinops longisetus for biological activities and chemical constituents. Phytomedicine 12, 675– 679.

Hymete, A., Rohloff, J., Iversen, T.-H., Kjoesen, H. (2007). Volatile constituents of the roots of Echinops kebericho Mesfin. Flavour and Fragrance Journal 22, 35– 38.

Kayser, F. H., Bienz, K. A., Eckert, J., Zinkernagel, R. M. (1998). Medizinische Mikrobiologie. Thieme, Stuttgart, New York.

Kazda, J., Pavlik, I., Falkinham III, J. O., Hruska, K. (2009). The ecology of mycobacteria. Springer, Dordrecht.

77 7 Literaturverzeichnis

Kim, Y., Choi, Y., Jeon, B.-Y., Jin, H., Cho, S.-N., Lee, H. (2013). A Simple and Efficient Multiplex PCR Assay for the Identification of Mycobacterium Genus and Mycobacterium tuberculosis Complex to the Species Level. Yonsei Medical Journal 54, 1220– 1226.

Koch, O., Selzer, P. M. (2012). Biologie der Mykobakterien und neue molekulare Targets. Pharmazie in unserer Zeit 41, 19– 26.

Kolb, B. (2003). Gaschromatographie in Bildern. Wiley-VCH, Weinheim.

Krauss, H., Weber, A., Appel, M., Enders, B., Graevenitz, A., Isenberg, H. D., Schiefer, H. G., Slenczka, W., Zahner, H. (2004). Zoonosen. Dt. Ärzte-Verl, Köln.

Kristian, P. (2006). Kugeldistel Echinops ritro, URL am 03.04.2014: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Echinops_ritro.jpeg.

Lam, J., Christensen, L. P., Thomasen, T. (1991). Thiophene derivatives from Echinops species. Phytochemistry 30, 1157– 9.

Lange, S., Montag, M. (2010). Radiologische Diagnostik der Thoraxerkrankungen. Thieme, Stuttgart [u.a.].

Luna-Herrera, J., Costa, M. C., Gonzalez, H. G., Rodrigues, A. I., Castilho, P. C. (2007). Synergistic antimycobacterial activities of sesquiterpene lactones from Laurus spp. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy 59, 548– 52.

Mabberley, D. J. (2009). Mabberley's plant-book. Cambridge Univ. Press, Cambridge [u.a.].

Manske, R. H. F., Holmes, H. L. (1953). The alkaloids. Academic Press, New York.

Meyer, V. R. (2008). Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie. Wiley-VCH, Weinheim.

Mutschler, E., Geisslinger, G., Kroemer, H. K., Menzel, S., Ruth, P. (2012). Mutschler Arzneimittelwirkungen. Wiss. Verl.-Ges., Stuttgart.

Nakano, H., Cantrell, C. L., Mamonov, L. K., Kustova, T. S., Fronczek, F. R., Ross, S. A. (2012). Chemical constituents from Echinops nanus and Echinops transiliensis. Biochemical Systematics and Ecology 45, 127– 129.

Oethinger, M., Hengel, H., Wand-Württenberger, A. (2004). Mikrobiologie und Immunologie. Elsevier, Urban und Fischer, München, Jena.

78 7 Literaturverzeichnis

Pretsch, E., Bühlmann, P., Affolter, C. (2000). Structure determination of organic compounds. Springer-Verlag, Berlin.

Qiao, X., Han, J., He, W., Wu, T., Wang, B., Ye, M., Guo, D. (2010). Chemical fingerprint of commercial Radix Echinopsis and quantitative analysis of α-terthienyl. Journal of Separation Science 33, 530– 538.

Robert Koch-Institut (RKI) (2011). Epidemiologisches Bulletin 34/2011, URL am 03.04.2014: http://www.rki.de/DE/Content/Infekt/EpidBull/Archiv/2011/Ausgaben/34_11.pdf? __blob=publicationFile#page=1&zoom=130,0,848.

Rolle, M. (1993). Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre für Tierärzte, Biologen, Agrarwissenschaftler und Interessierte aus benachbarten Fachgebieten. Enke, Stuttgart.

Rom, W. N., Garay, S. M. (2004). Tuberculosis. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.

Royal Museum for Central Africa (2007). Echninops kebericho Mesfin, URL am 03.04.2014: http://www.africamuseum.be/collections/external/prelude/view_plant?pi=05195.

Rücker, G., Neugebauer, M., Willems, G. G. (2013). Instrumentelle pharmazeutische Analytik. Wiss. Verl.-Ges., Stuttgart.

Schröder, L. (1969). Zur Physiologie der Bildung des Chinolinalkaloids Echinorin bei Echinops ritro L. Planta Medica 16, 99– 108.

Singh, K. N., Pandey, V. B. (1989). Constituents of Echinops echinatus. Oriental Journal of Chemistry 5, 342– 4.

Singh, K. N., Pandey, V. B. (1993). Antifungal flavonoids of Echinops echinatus. Oriental Journal of Chemistry 9, 149– 51.

Singh, R. P., Pandey, V. B., Sepulveda, S. (1987). A new neoflavonoid from Echinops niveus. Chemistry & Industry (London, United Kingdom) 23, 828.

Singh, R. P., Singh, K. N., Pandey, V. B. (1990). Constituents of Echinops niveus. Fitoterapia 61, 279.

Sitte, P. (2002). Lehrbuch der Botanik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin.

Skoog, D. A., Leary, J. J. (1996). Instrumentelle Analytik. Springer, Berlin [u.a.].

79 7 Literaturverzeichnis

Snapper, S. B., Melton, R. E., Mustafa, S., Kieser, T., Jacobs, W. R., JR (1990). Isolation and characterization of efficient plasmid transformation mutants of Mycobacterium smegmatis. Molecular Microbiology 4, 1911– 1919.

Stefanova, D., Tyutyulkova, N., Daleva, L. (1972). Peripheral action of the alkaloid echinopsidine. Trudove na Nauchnoizsledovatelskiya Khimikofarmatsevtichen Institut 7, 271– 80.

Tadesse, M. (1988). Herbarium: Holotype of Echinops kebericho Mesfin, URL am 03.04.2014: http://plants.jstor.org/specimen/eth000000306?s=t.

Tariku, Y., Hymete, A., Hailu, A., Rohloff, J. (2011). In vitro evaluation of antileishmanial activity and toxicity of essential oils of Artemisia absinthium and Echinops kebericho. Chemistry & Biodiversity 8, 614– 23.

Tekwu, E. M., Askun, T., Kuete, V., Nkengfack, A. E., Nyasse, B., Etoa, F.-X., Beng, V. P. (2012). Antibacterial activity of selected Cameroonian dietary spices ethno-medically used against strains of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Ethnopharmacology 142, 374– 82.

Turova, A. D., Nikol'skaya, B. S., Trutneva, E. A. (1957). Pharmacology of the new alkaloid echinopsine. Farmakol. i Toksikol. 20, 23– 9.

Vollmar, A., Dingermann, T., Zündorf, I. (2005). Immunologie. Wiss. Verl.-Ges., Stuttgart.

Washino, T., Yoshikura, M., Obata, S. (1986). New sulfur-containing acetylenic compounds from Arctium lappa. Agricultural and Biological Chemistry 50, 263– 9.

Wei, H. X., Gao, W. Y., Tian, Y. J., Guan, Y. K., Huang, M. H., Cheng, D. L. (1997). New eudesmane sesquiterpene and thiophene derivatives from the roots of Rhaponticum uniflorum. Pharmazie 52, 245– 247.

Whitman, W. B., Parte, A., Goodfellow, M., Kämpfer, P., Busse, H., Trujillo, M. E., Ludwig, W., Suzuki K. (2012). Bergey's manual of systematic bacteriology: Volume 5: The Actinobacteria, Band 5,Teile 1-2. Springer, New York.

WHO (2012a). Global tuberculosis report, URL am 03.04.2014: http://www.who.int/tb/publications/global_report/gtbr12_main.pdf.

WHO (2012b). MDR, URL am 03.04.2014: http://www.who.int/tb/challenges/mdr/en/.

80 7 Literaturverzeichnis

WHO (2012c). TB/HIV, URL am 03.04.2014: http://www.who.int/tb/challenges/hiv/en/index.html.

WHO (2012d). XDR-TB, URL am 03.04.2014: http://www.who.int/tb/challenges/xdr/faqs/en/index.html.

WHO (2013). Tuberculosis fact sheets, URL am 03.04.2014: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/index.html.

Wouk, H. (2010). Tuberculosis. Marshall Cavendish Benchmark, New York.

Yancey, D. (2001). Tuberculosis. Twenty-First Century Books, Brookfield, Conn.

Yuuya, S., Hagiwara, H., Suzuki, T., Ando, M., Yamada, A., Suda, K., Kataoka, T., Nagai, K. (1999). Guaianolides as Immunomodulators. Synthesis and Biological Activities of Dehydrocostus Lactone, Mokko Lactone, Eremanthin, and Their Derivatives. Journal of Natural Products 62, 22– 30.

Zhang, P., Liang, D., Jin, W., Qu, H., Cheng, Y., Li, X., Ma, Z. (2009). Cytotoxic thiophenes from the root of Echinops grijisii Hance. Z. Naturforsch., C: J. Biosci. (Zeitschrift für Naturforschung, Journal of Biosciences) 64, 193– 196.

Zhang, X., Ma, Z. (2010). Characterization of bioactive thiophenes from the dichloromethane extract of Echinops grijsii as Michael addition acceptors. Analytical and Bioanalytical Chemistry 397, 1975– 1984.

Zumla, A., Nahid, P., Cole, S. T. (2013). Advances in the development of new tuberculosis drugs and treatment regimens. Nature Reviews 12, 388– 404.

81 8 Anhang

8 Anhang

8.1 Herstellung der benötigten Reagenzien

Dragendorff- Sprühreagenz zur Nachweisreaktion auf Alkaloide und tertiäre Amine (Ph.Eur) 1,7 g basisches Bismutnitrat wurden mit 20 g Weinsäure in 40 ml Wasser suspendiert. Anschließend mit 40 ml einer 40 % igen Kaliumiodid- Lösung versetzt. Aus der fertigen Stammlösung wurden 5 ml genommen und mit 15 ml Wasser verdünnt (Sprühlösung).

Anisaldehyd- Schwefelsäure- Sprühreagenz Bei der Herstellung musste die genau Reihenfolge der Komponenten eingehalten werden. Vorgelegt wurden 0,5 ml Anisaldehyd danach 10 ml Eisessig, 85 ml Methanol und schließlich

5ml H2SO4 conc.

Columbia Blood Agar (CBA) 39 g des CBA wurden in einem Liter MQ Wasser suspendiert und autoklaviert (121°C; 1,5 bar; 22 min). Nach dem Abkühlen auf min. 50°C wurde mit 50 ml defibrinierten Pferdeblut versetzt, portioniert und bei 2- 8° aufbewahrt.

Mueller- Hinton Broth (MHB)

Von MBH wurden 21 g mit 66 mg CaCl2 x 2 H2O und 59,6 mg MgCl2 x 6 H2O mit 1l MQ Wasser vermengt und anschließend bei 121°C und 1,5bar für 22 Minuten autoklaviert. Nach dem Abkühlen abgefüllt und im Kühlschrank (2- 8°C) gelagert.

McFarland 0,5 Trübungsstandard Es wurden 0,05 ml einer 1,175 % igen BaCl- Lösung vorsichtig mit 9,95 ml einer 1%igen Schwefelsäure gemischt und lichtgeschützt bei Raumtemperatur über 6 Monate haltbar.

MTT- Indikator- Lösung Gebraucht wurde eine Konzentration von 5 mg/ml einer methanolischen 3-(4,5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)- Lösung. In der Laminar Flow Box wurde die

82 8 Anhang

Lösung in die Reaktionsgefäße sterilfiltriert und unter UV- Schutz wiederum bei 2- 8°C verwahrt.

Tri- Sil® TBT Das für die Derivatisierung verwendete Reagenz war bereits als fertige Zubereitung vorhanden. Es besteht aus 3 Teilen TMSI (Trimethylsilylimidazol), 3 Teilen BSA (N,O-bis- (trimethylsilyl)acetamide) und zwei Teilen TMCS (Trimethylsilylchlorid) und musste nach Zugabe bei 37°C für kurze Zeit erwärmt werden, ehe es für die Messung verwendet werden konnte.

Sigma- Sil- A Das zweite Silanylierungsreagenz wurde ebenfalls als Fertigprodukt verwendet. Es besteht aus Trimethylchlorsilan, Hexamethyldisilazan und Pyridin (1:3:9).

83 9 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

9 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Abb. 2.1: Geschätzte Tuberkulose- Inzidenzrate für das Jahr 2011 (WHO, 2012a)...... 3 Abb. 2.2: TB-Patienten mit HIV-Infektion für das Jahr 2011 (WHO, 2012a)...... 4 Abb. 2.3: Pseudanthium von Echinops ritro...... 16 Abb. 2.4: Strukturformel von Echinopsin...... 17 Abb. 2.5: Strukturformel von Echinopsidin...... 17 Abb. 2.6: Strukturformel von Echinorin...... 17 Abb. 2.7: Wurzeln Echinops kebericho...... 20 Abb. 2.8: Echinops kebericho ...... 20 Abb. 2.9: Holotyp von E. kebericho (Tadesse, 1988)...... 21 Abb. 3.1: Untersuchtes Pflanzenmaterial...... 23 Abb. 3.2: Probenvorbereitung für den MIC- Assay...... 37 Abb. 3.3: Herstellung der Bakteriensuspension für den MIC-Assay...... 38 Abb. 3.4: Aufteilung der Microtiterplatte für den MIC- Assay...... 39 Abb. 4.1: Übersichts- DC der einzelnen Fraktionen mit Anisaldehyd- H2SO4- Reagenz...... 42 Abb. 4.2: Übersichts- DC der einzelnen Fraktionen bei 254 nm...... 42 Abb. 4.3: Übersichts- DC der einzelnen Fraktionen bei 366 nm...... 42 Abb. 4.4: DC der Fraktionen EK_SF8 F1-20 mit Anisaldehyd- H2SO4- Reagenz...... 44 Abb. 4.5: DC der Fraktionen EK_SF8 F1-20 bei 254 nm...... 45 Abb. 4.6: DC der Fraktionen EK_SF9 F1-30 mit Anisaldehyd- H2SO4- Reagenz...... 45 Abb. 4.7: DC der Fraktionen EK_SF9 F1-30 bei 254 nm...... 45 Abb. 4.8: DC von EK_SF8_SF3 F10-27 mit Anisaldehyd- H2SO4- Reagenz ...... 47 Abb. 4.9: DC von EK_SF4 F 1- 16 mit Anisaldehyd- H2SO4- Sprühreagenz...... 48 Abb. 4.10: DC von EK_SF4 F17-32 mit Anisaldehyd- H2SO4- Sprühreagenz...... 48 Abb. 4.11: DC von EK_SF4 mit Anisaldehyd- H2SO4- Sprühreagenz (weniger konzentriert)...48 Abb. 4.12: Analytisches HPLC- Chromatogramm von EK_SF4_F10...... 52 Abb. 4.13: Analytisches HPLC- Chromatogramm von EK_SF8_SF3_F15- 22...... 53 Abb. 4.14: Präparatives HPLC- Chromatogramm von EK_SF8_SF3_F15- 22...... 53

84 9 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abb. 4.15: Graphische Darstellung des Arbeitsvorganges...... 55 Abb. 4.16: 1H- NMR- Spektrum von DHCL...... 57 Abb. 4.17: 13C- NMR- Spektrum von DHCL...... 57 Abb. 4.18: HSQC- Spektrum von DHCL...... 58 Abb. 4.19: Gaschromatogramm EK_SF4_F10...... 59 Abb. 4.20: GC- MS von EK_SF4_F10 Peak 1...... 60 Abb. 4.21: GC- MS von EK_SF4_F10 Peak 2...... 60 Abb. 4.22: Strukturformel Dehydrocostuslacton...... 61 Abb. 4.23: Strukturformel Costunolid...... 62 Abb. 4.24: GC-MS von EK_SF8_SF3 F15- 22...... 62 Abb. 4.25: GC- MS EK_SF8_SF3 F15-22 nach Derivatisierung mit Sigma- Sil- A...... 63 Abb. 4.26: Strukturformel von 2-(Penta-1,3-diynyl)-5-(4-hydroxybut-1-ynyl)-thiophen...... 63 Abb. 4.27: EI- Massenspektrum von EK_SF8_SF4_B1...... 64 Abb. 4.28: UV- Chromatogramm von EK_SF8_SF4_B1...... 65 Abb. 4.29: UV- Spektrum von EK_SF8_SF4_B1...... 65 Abb. 4.30: Strukturformel von Arctinon b...... 66 Abb. 4.31: Strukturformel von 5'-(3-buten-1-yn-1-yl- [2,2'Bithiophene]-5-methanol...... 66

Tabellenverzeichnis

Tabelle 3.1: Grobfraktionierung- Elutionsmittelgemisch...... 27 Tabelle 3.2: Analytische HPLC: Fließmittelgradient ...... 29 Tabelle 3.3: Präparative HPLC: Fließmittelgradient für EK_SF4 F10...... 31 Tabelle 3.4: LC: Fließmittelgradient ...... 34 Tabelle 3.5: Konzentrationen der Wells auf der Mikrotiterplatte für die Auswertung des MIC- Wertes...... 40 Tabelle 4.1: Soxhlet- Extraktion- Einwaage und Ausbeute...... 41 Tabelle 4.2: Zusammenlegung der Sammelfraktionen und deren Ausbeute...... 43 Tabelle 4.3: MIC- Werte der getesteten Fraktionen...... 43 Tabelle 4.4: Sammelfraktionen von EK_SF8 und deren Ausbeute...... 46 Tabelle 4.5: Sammelfraktionen von EK_SF9 und deren Ausbeute...... 46 Tabelle 4.6: MIC- Werte der einzelnen Sammelfraktionen von EK_SF8...... 49

85 9 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Tabelle 4.7: MIC- Werte der einzelnen Sammelfraktionen von EK_SF9...... 49 Tabelle 4.8: MIC- Werte ausgewählter Fraktionen von EK_SF4...... 49 Tabelle 4.9: MIC- Werte einzelner Banden von EK_SF8_SF4 nach präparativer DC...... 50 Tabelle 4.10: Analytische HPLC: isokratische Elution von EK_SF8_F15-22...... 51 Tabelle 4.11: Analytische HPLC: isokratische Elution von EK_SF4_F7, EK_SF4_F8, EK_SF4_F10...... 51 Tabelle 4.12: Fließmitteltabelle von EK_SF8_F15- 22...... 52 Tabelle 4.13: Ausbeute der einzelnen Banden von EK_SF8_SF4 nach präparativer DC...... 54 Tabelle 4.14: NMR- Daten von DHCL (in CDCl3) und Referenzdaten (Yuuya et al., 1999)...... 58 Tabelle 6.1: MIC- Werte und Ausbeuten der getesteten Fraktionen...... 72 Tabelle 6.2: Isolierte Substanzen, Fraktionen und MIC- Werte...... 73

86